BR122020001264B1 - Ácido ribonucleico de fita dupla (dsrna) para inibição da expressão de alas1, composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene alas1, métodos de inibição da expressão de alas1 em uma célula e para diminuir um nível de uma porfirina ou de um precursor de porfirina em uma célula, usos de um dsrna, método para avaliar o nível de mrna de alas1 extracelular em circulação em um indivíduo, composição e uso da mesma - Google Patents

Ácido ribonucleico de fita dupla (dsrna) para inibição da expressão de alas1, composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene alas1, métodos de inibição da expressão de alas1 em uma célula e para diminuir um nível de uma porfirina ou de um precursor de porfirina em uma célula, usos de um dsrna, método para avaliar o nível de mrna de alas1 extracelular em circulação em um indivíduo, composição e uso da mesma Download PDF

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Brian Bettencourt
Kevin Fitzgerald
William Querbes
Robert J. Desnick
Makiko Yasuda
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Icahn School Of Medicine At Mount Sinai
Alnylam Pharmaceuticals, Inc
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Abstract

A presente invenção refere-se a composições de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) se dirigindo ao gene ALAS1, e métodos de uso de tais composições de dsRNA para alterar (por exemplo, inibir) a expressão de ALAS1.

Description

Pedidos Relacionados
[0001] Este pedido reivindica prioridade para o pedido provisório U.S. número 61/887288 registrado em 4 de outubro, 2013 e para o pedido provisório U.S. número 61/983720 registrado em 24 de abril, 2014. O conteúdo inteiro de cada um dos pedidos anteriores é deste modo incorporado aqui a título de referência. Listagem de Sequências
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é deste modo incorporada a título de referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 2 de outubro, 2014, é denominada A2038- 7202WO_SL.txt e tem 1 107 486 bytes de tamanho.
Campo da Invenção
[0003] A invenção refere-se à inibição específica da expressão do gene ALAS1.
Antecedentes da Invenção
[0004] As porfirias herdadas são uma família de distúrbios resultando da atividade deficiente de enzimas específicas na via biossintética do heme, também referida aqui como a via da porfirina. A deficiência nas enzimas da via da porfirina leva a produção insuficiente de heme e a um acúmulo de precursores de porfirina e porfirinas, que são tóxicos para o tecido em elevadas concentrações.
[0005] Das porfirias herdadas, a porfiria aguda intermitente (AIP, por exemplo, AIP dominante autossomal), a porfiria variegata (VP, por exemplo, VP dominante autossomal), a coproporfiria hereditária (coproporfiria ou HCP, por exemplo, HCP dominante autossomal), e a porfiria com deficiência de ácido 5’-aminolevulínico (também conhecido como ácido δ-aminolevulinico ou ALA) desidratase (ADP, por exemplo, ADP recessiva autossomal) são classificadas como porfirias hepáticas agudas e são manifestadas por ataques neurológicos agudos que podem ser fatais. Os ataques agudos são caracterizados por sintomas nervosos autonômicos, periféricos, e centrais, incluindo dor abdominal severa, hipertensão, taquicardias, prisão de ventre, fraqueza motora, paralisia e convulsões. Se não tratados apropriadamente, podem surgir quadriplegia, enfraquecimento respiratório, e morte. Vários fatores, incluindo fármacos induzidos por citocromo P450, fazer dieta, e mudanças hormonais, podem precipitar ataques agudos por aumento da atividade da ácido 5’-aminolevulínico sintase 1 (ALAS1) hepática, a primeira e limitante da taxa enzima da via biossintética do heme. Nas porfirias agudas, por exemplo, AIP, VP, HCP e ADP, as respectivas deficiências de enzimas resultam em produção e acúmulo hepáticos de uma ou mais substâncias (por exemplo, porfirinas e/ou precursores de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG) que podem ser neurotóxicas e podem resultar na ocorrência de ataques agudos. Ver, por exemplo, Balwani, M e Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
[0006] A terapia corrente para os ataques neurológicos agudos é a administração intravenosa de hemina (Panhematin®, Lundbeck ou Normosang®, Orphan Europe), que proporciona heme exógeno para a inibição por feedback negativo de ALAS1, e, desse modo, diminui a produção de ALA e PBG. A hemina é usada para o tratamento durante um ataque agudo e para prevenção de ataques, particularmente em mulheres com as porfirias agudas que experienciam ataques frequentes com as mudanças hormonais durante seus ciclos menstruais. Embora os pacientes respondam geralmente bem, seu efeito é lento, tipicamente levando dois a quatro dias ou mais para normalizar as concentrações na urina de ALA e PBG para níveis normais. Como a hemina intravenosa é rapidamente metabolizada, três a quatro infusões são usualmente necessárias para tratar ou prevenir eficazmente um ataque agudo. Adicionalmente, infusões repetidas podem causar sobrecarga de ferro e flebite, que podem comprometer o acesso venoso periférico. Embora o transplante de fígado ortotrófico seja curativo, este procedimento tem morbidade e mortalidade significativas e a disponibilidade de dadores de fígados é limitada. Portanto, é necessária uma abordagem terapêutica alternativa que seja mais eficaz, de ação rápida, e segura. Seria particularmente vantajoso se tal tratamento pudesse ser distribuído por administração subcutânea, pois isto evitaria a necessidade de infusões e hospitalização prolongada.
[0007] A AIP, também referida como deficiência de porfobilinogênio deaminase (PBGD), ou deficiência de hidroximetilbilano sintase (HMBS), é a mais comum das porfirias hepáticas agudas. A prevalência de AIP está estimada em 5-10 em 100 000, com cerca de 5-10 % dos pacientes sendo sintomáticos. A AIP é um distúrbio dominante autossomal causado por mutações no gene HMBS que resulta em atividade reduzida, por exemplo, metade do normal da enzima. Previamente, foi gerado um modelo de AIP de camundongo que tem ~30 % de atividade de HMBS de tipo selvagem por recombinação homóloga. Como os pacientes humanos, estes camundongos aumentam a atividade de ALAS1 hepático e acumulam grandes quantidades de ALA e PBG no plasma e urina quando lhes são administrados fármacos porfirinogênicos, tais como fenobarbital. Assim, eles servem como um excelente modelo para avaliar a eficácia de novos terapêuticos para as porfirias hepáticas agudas.
Sumário da Invenção
[0008] A presente invenção descreve métodos e composições de iRNA para modulação da expressão de um gene ALAS1. Em certas modalidades, a expressão de um gene ALAS1 é reduzida ou inibida usando um iRNA específico quanto a ALAS1. Tal inibição pode ser útil no tratamento de distúrbios relacionados com expressão de ALAS1, tais como porfirias.
[0009] Por consequência, são descritas aqui composições e métodos efetuam a clivagem mediada pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA do gene ALAS1, tal como em uma célula ou em um indivíduo (por exemplo, em um mamífero, tal como um indivíduo humano). São descritas também composições e métodos para tratamento de um distúrbio relacionado com expressão de um gene ALAS1, tal como uma porfiria, por exemplo, anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), porfiria por deficiência de ALA desidratase (porfiria de Doss ou ADP), porfiria aguda intermitente (AIP), porfiria eritropoiética congênita (CEP), porfiria cutânea tardia (PCT), coproporfiria hereditária (coproporfiria, ou HCP), porfiria variegata (VP), protoporfiria eritropoiética (EPP), ou eritroporfiria transiente da infância. Em algumas modalidades, o distúrbio é uma porfiria hepática aguda, por exemplo, porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP), AIP, HCP ou VP. Em certas modalidades, o distúrbio é porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP) ou AIP.
[00010] Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática, por exemplo, uma porfiria selecionada de porfiria aguda intermitente (AIP), coproporfiria hereditária (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP), e porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática dominante homozigota (por exemplo, AIP, HCP, ou VP dominante homozigota) ou porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria dual.
[00011] Como usado aqui, o termo “iRNA”, “RNAi”, “agente de iRNA”, “agente de RNAi” ou “molécula de iRNA,” se refere a um agente que contém RNA como esse termo é definido aqui, e que medeia a clivagem dirigida de um transcrito de RNA, por exemplo, através de uma via do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Em uma modalidade, um iRNA como descrito aqui efetua inibição da expressão de ALAS1 em uma célula ou mamífero.
[00012] Os iRNAs incluídos nas composições apresentadas aqui englobam um dsRNA tendo uma fita de RNA (a fita antissenso) tendo uma região, por exemplo, uma região que tem 30 nucleotídeos ou menos, geralmente 19-24 nucleotídeos de comprimento, que é substancialmente complementar com pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene ALAS1 gene (por exemplo um gene ALAS1 de camundongo ou humano) (também referido aqui como um “iRNA específico quanto a ALAS1”). Alternativamente, ou em combinação, os iRNAs englobam um dsRNA tendo uma fita de RNA (a fita antissenso) tendo uma região que tem 30 nucleotídeos ou menos, geralmente 1924 nucleotídeos de comprimento, que é substancialmente complementar com pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene ALAS1 (por exemplo, uma variante humana 1 ou 2 de um gene ALAS1) (também referido aqui como um “iRNA específico quanto a ALAS1”).
[00013] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) descrito aqui compreende uma fita antissenso tendo uma região que é substancialmente complementar com uma região de um ALAS1 humano. Em modalidades, o ALAS1 humano tem a sequência de NM_000688.4 (SEQ ID NO:1) ou NM_000688.5 (SEQ ID NO:382). Em modalidades, o ALAS1 humano tem a sequência de NM_199166.1.
[00014] Em modalidades, a sequência antissenso do iRNA (por exemplo, dsRNA) é dirigida para a região 871 até 895 (mais ou menos 5, 4, 3, 2, ou 1 nucleotídeos em qualquer uma ou ambas as direções na extremidade 5’ e/ou 3’) no transcrito de ALAS1 NM_000688.4. Em modalidades, a sequência antissenso é dirigida para os nucleotídeos 871 até 893, 871 até 892, ou 873 até 895 no transcrito de ALAS1 NM_000688.4. Em modalidades, a sequência antissenso compreende ou consiste em uma sequência que é totalmente complementar ou substancialmente complementar aos nucleotídeos 871 até 893, 871 até 892, ou 873 até 895 no transcrito de ALAS1 NM_000688.4.
[00015] Em um aspecto, é proporcionado ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região de complementaridade com um transcrito de RNA de ALAS1, cuja fita antissenso compreende pelo menos 15 (por exemplo, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23) nucleotídeos contíguos diferindo por não mais do que 3, 2 ou 1 nucleotídeos da sequência de UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) ou UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Em modalidades, a fita antissenso compreende a sequência de UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) ou UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Em modalidades, a fita senso compreende a sequência de CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Em modalidades, um ou mais nucleotídeos da fita antissenso e/ou fita senso são modificados como descrito aqui. Em modalidades, o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60489, AD-60519, ou AD-61193 e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60489, AD-60519, ou AD-61193 (incluindo uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita antissenso e/ou fita antissenso de AD-60489, AD-60519, ou AD-61193).
[00016] Em um aspecto, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região de complementaridade com um transcrito de RNA de ALAS1, cuja fita antissenso compreende pelo menos 15 (por exemplo, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23) nucleotídeos contíguos diferindo por não mais do que 3 (por exemplo, por não mais do que 0, 1 ou 2) nucleotídeos de uma sequência antissenso listada em qualquer uma das Tabelas 21 até 40, ou uma versão não modificada de uma sequência antissenso (por exemplo, uma versão tendo a mesma sequência de nucleotídeos com a exceção de que alguns ou todos os nucleotídeos não estão modificados) listada em qualquer uma das Tabelas 21 até 40. Em uma modalidade, a sequência antissenso compreende pelo menos 15 (por exemplo, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23) nucleotídeos contíguos diferindo por não mais do que 3 (por exemplo, por não mais do que 0, 1 ou 2) nucleotídeos de (i) a sequência antissenso de AD-60489, AD-60519, ou AD-61193 ou (ii) uma versão não modificada de qualquer uma destas sequências. Em modalidades, a fita antissenso compreende pelo menos 15 (por exemplo, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23) nucleotídeos contíguos diferindo por não mais do que 3 (por exemplo, por não mais do que 0, 1 ou 2) nucleotídeos da sequência de UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) ou UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Em uma modalidade, a sequência antissenso é dirigida para as posições 871893 de NM_000688.4 (SEQ ID NO:1). Em modalidades, a fita senso compreende a sequência de CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Em modalidades, um ou mais nucleotídeos da fita antissenso e/ou fita senso são modificados como descrito aqui.
[00017] Em algumas modalidades, o dsRNA não é uma sequência senso e/ou antissenso listada em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 ou 20.
[00018] Em uma modalidade, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região de complementaridade com um transcrito de RNA de ALAS1, cuja fita antissenso compreende pelo menos 15 (por exemplo, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23) nucleotídeos contíguos diferindo por não mais do que 3 nucleotídeos, não mais do que 2 nucleotídeos, ou não mais do que um nucleotídeo, da sequência antissenso de AD-60519. Em modalidades, um ou mais nucleotídeos são modificados como descrito aqui.
[00019] Em uma modalidade, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região de complementaridade com um transcrito de RNA de ALAS1, cuja fita antissenso compreende pelo menos 15 (por exemplo, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23) nucleotídeos contíguos diferindo por não mais do que 3 (por exemplo, por não mais do que 0, 1 ou 2) nucleotídeos da sequência antissenso de AD-60489, ou um derivado de AD-60489 como descrito aqui. Em modalidades, um ou mais nucleotídeos são modificados como descrito aqui, por exemplo, um ou mais (ou todos os) nucleotídeos de AD-60489 são modificados como descrito aqui. Em modalidades, o derivado de AD-60489 é AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, ou AD-60901. Em modalidades, o derivado de AD-60489 é AD-60519. Em modalidades, o derivado de AD-60489 é AD-61193.
[00020] Em uma modalidade, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região de complementaridade com um transcrito de RNA de ALAS1, cuja fita antissenso compreende pelo menos 15 (por exemplo, pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ou 23) nucleotídeos contíguos diferindo por não mais do que 3 (por exemplo, por não mais do que 0, 1 ou 2) nucleotídeos de um derivado de AD-58632 descrito aqui. Em modalidades, um ou mais nucleotídeos são modificados como descrito aqui, por exemplo, um ou mais (ou todos) nucleotídeos de AD-58632 são modificados como descrito aqui. Em modalidades, o derivado de AD-58632 é AD-60405, AD-60887, AD- 60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD- 60925, e AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD- 61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD- 61145, AD-61146, AD-60892, ou AD-60419. Em modalidades, o derivado de AD-58632 é AD-60819.
[00021] Em algumas modalidades, o dsRNA tem uma IC50 menor do que 1 nM. Em algumas modalidades, o dsRNA tem uma IC50 situada na gama de 0,01-1 nM. Em modalidades, o dsRNA tem uma IC50 menor do que 0,05 nM. Em modalidades, o dsRNA tem uma IC50 menor do que 0,02 nM. Em modalidades, o dsRNA tem uma IC50 menor do que 0,01 nM. Em modalidades, a IC50 é determinada como descrito aqui nos Exemplos.
[00022] Em algumas modalidades, o dsRNA tem uma ED50 de dose única menor do que cerca de 10 mg/kg. Em algumas modalidades, o dsRNA tem uma ED50 de dose única menor do que cerca de 5 mg/kg. Em modalidades, a EC50 é determinada como descrito aqui nos Exemplos.
[00023] Em algumas modalidades, o dsRNA exibe atividade melhorada em comparação com AD-58632. Em algumas modalidades, o dsRNA exibe atividade melhorada em comparação com AD-60489. Em algumas modalidades, o dsRNA exibe atividade melhorada em comparação com AD-58632 e AD-60489.
[00024] Em modalidades, o dsRNA é AD-60501, AD-60519, AD- 60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD- 61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD- 60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD- 60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD- 60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD- 60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD- 60892, ou AD-60419 (por exemplo, incluindo a sequência de nucleotídeos e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações dos dsRNAs referidos anteriormente). Em modalidades, o dsRNA compreende uma fita antissenso que compreende, ou consiste em, uma sequência antissenso (e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações)) selecionada de AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD- 60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD- 60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD- 60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD- 60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD- 60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD- 60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, ou AD- 60419. Em modalidades, o dsRNA compreende uma fita senso que compreende, ou consiste em, uma sequência senso (e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações)) selecionada de AD-60501, AD- 60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD- 61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD- 60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD- 60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD- 60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD- 61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD- 61146, AD-60892, ou AD-60419.
[00025] Em modalidades, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência de UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) ou UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154) e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência de CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Em modalidades, um ou mais nucleotídeos da fita antissenso e/ou fita senso são modificados como descrito aqui.
[00026] Em modalidades, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60489 e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60489 (em que asequência senso e/ou antissenso inclui uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita senso e/ou fita antissenso de AD- 60489).
[00027] Em modalidades, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60519 e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60519 (em que a sequência senso e/ou antissenso inclui uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita senso e/ou fita antissenso de AD- 60519).
[00028] Em modalidades, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-61193 e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-61193 (em que a sequência senso e/ou antissenso inclui uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita senso e/ou fita antissenso de AD- 61193).
[00029] Em modalidades, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60819 e/ou (ii) uma sequência senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60819 (em que a sequência senso e/ou antissenso inclui uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita senso e/ou fita antissenso de AD- 60819).
[00030] Em modalidades, é proporcionado um dsRNA para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60489, AD-60519, AD-61193, ou AD-60819 (ou uma sequência antissenso não modificada correspondente) e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60489, AD-60519, AD-61193, ou AD-60819 (ou uma sequência antissenso não modificada correspondente). Em modalidades, o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que consiste na sequência antissenso de AD-60489, AD- 60519, AD-61193, ou AD-60819 e/ou (ii) uma fita senso que consiste na sequência senso de AD-60489, AD-60519, AD-61193, ou AD-60819, com a exceção de que a fita antissenso e/ou fita senso do dsRNA difere por 1, 2, ou 3 nucleotídeos da correspondente sequência antissenso e/ou senso de AD-60489, AD-60519, AD-61193, ou AD-60819.
[00031] As sequências e modificações de AD-60489, AD-60519, AD- 61193, e AD-60819 estão apresentadas na Tabela 44 em baixo. Tabela 44: Sequências e Modificações de AD-60489, AD-60519, AD- 61193, AD-60819
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em que c, a, g, u = ribonucleosídeos 2’-OMe; Af, Cf, G, Uf = ribonucleosídeos 2’F; S = fosforotioato; L96 tem a estrutura representada na Tabela 1.
[00032] Em modalidades, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60489, AD-60519, ou AD-61193 e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60489, AD-60519, ou AD-61193 (incluindo a sequência de nucleotídeos e uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita senso e/ou fita antissenso de AD-60489, AD-60519, ou AD-61193).
[00033] Em modalidades, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA é AD-60489, AD-60519, AD-61193, ou AD-60819. Em modalidades, é proporcionado um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA é AD-60489, AD-60519, ou AD- 61193 (por exemplo, incluindo a sequência de nucleotídeos e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações de AD-60489, AD- 60519, ou AD-61193).
[00034] Em modalidades, o dsRNA é, compreende, ou consiste naD- 60489 (por exemplo, incluindo a sequência de nucleotídeos e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações de AD-60489).
[00035] Em modalidades, o dsRNA é, compreende, ou consiste naD- 60519 (por exemplo, incluindo a sequência de nucleotídeos e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações de AD-60519).
[00036] Em modalidades, o dsRNA é, compreende, ou consiste naD- 61193 (por exemplo, incluindo a sequência de nucleotídeos e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações de AD-61193).
[00037] Em modalidades, o dsRNA é, compreende, ou consiste naD- 60819 (por exemplo, incluindo a sequência de nucleotídeos e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações de AD-60819).
[00038] Em modalidades, o dsRNA (por exemplo, AD-60489, AD- 60519, AD-61193, AD-60819, ou outro dsRNA revelado aqui em qualquer uma das Tabelas 21 até 40) é eficaz para suprimir o nível no fígado de mRNA de ALAS1, por exemplo, para alcançar silenciamento de pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, ou 80 % (por exemplo, de modo que os níveis de mRNA de ALAS1 são diminuídos para 90 % ou menos, 80 % ou menos, 70 % ou menos, 60% ou menos, 50 % ou menos, 40 % ou menos, 30 % ou menos, ou 20 % ou menos de um nível de controle de mRNA de ALAS1 no fígado, por exemplo, o nível em um indivíduo ou grupo de indivíduos não tratados, por exemplo, um indivíduo ou grupo de indivíduos tratados apenas com PBS). Em modalidades, a eficácia do dsRNA na supressão de o nível no fígado de mRNA de ALAS1 é avaliada usando um modelo de primata não humano, por exemplo, como descrito aqui nos Exemplos.
[00039] Em modalidades, o dsRNA (por exemplo, AD-60489, AD- 60519, AD-61193, AD-60819, ou outro dsRNA revelado aqui em qualquer uma das Tabelas 21 até 40) é eficaz para suprimir o nível em circulação de mRNA de ALAS1, por exemplo, para alcançar silenciamento de pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70%, ou 80 % (por exemplo, de modo que os níveis de mRNA de ALAS1 são diminuídos para 90 % ou menos, 80 % ou menos, 70 % ou menos, 60 % ou menos, 50 % ou menos, 40 % ou menos, 30 % ou menos, ou 20 % ou menos de um nível de controle de mRNA de ALAS1 em circulação, por exemplo, o nível antes de tratamento com o dsRNA, ou o nível em um indivíduo ou grupo de indivíduos não tratados). Em modalidades, a eficácia do dsRNA na supressão do nível em circulação de mRNA de ALAS1 é avaliada usando um modelo de primata não humano, por exemplo, como descrito aqui nos Exemplos. Em modalidades, o nível em circulação de mRNA de ALAS1 é avaliada usando um ensaio de detecção de RNA extracelular em circulação (cERD), por exemplo, como descrito aqui ou em Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (Pôster apresentado em 9 de fevereiro, 2012 no simpósio Keystone Gene Silencing by small RNAs (Vancouver, 7-12 de fevereiro, 2012) ou Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, publicado online em 19 de dezembro, 2013.
[00040] O método cERD pode ser aplicado a qualquer amostra biológica apropriada. Em modalidades, o nível em circulação de mRNA de ALAS1 é avaliado usando uma amostra de sangue, por exemplo, uma amostra de soro. Em modalidades, o nível em circulação de mRNA de ALAS1 é avaliado usando uma amostra de urina.
[00041] Em modalidades, o dsRNA é um derivado de AD-60489 que é revelado aqui, por exemplo, em qualquer uma das tabelas apresentadas aqui. Em modalidades, o dsRNA exibe atividade melhorada em comparação com AD-60489. Em algumas de tais modalidades, o dsRNA é AD-60519.
[00042] Em modalidades, o dsRNA é um derivado de AD-58632 que é revelado aqui, por exemplo, em qualquer uma das tabelas apresentadas aqui. Em modalidades, o dsRNA exibe atividade melhorada em comparação com AD-58632.
[00043] Em modalidades, a atividade melhorada é indicada por uma IC50 mais baixa, por exemplo, como determinado com base em ensaios in vitro, por exemplo, como descrito aqui, por exemplo, nos Exemplos.
[00044] Em modalidades, a atividade melhorada é indicada por uma dose eficaz mais baixa. A dose eficaz pode ser determinada com base na administração de uma única dose ou de múltiplas doses repetidas. Em modalidades, a dose eficaz é determinada com base na ED50 de dose única. Em modalidades, a dose eficaz ou a ED50 de dose única é determinada com base em um ensaio in vivo. Em modalidades, o ensaio in vivo é conduzido em um animal não humano, por exemplo, em um rato, em um primata não humano, ou em um camundongo.
[00045] Em modalidades, a dose eficaz é determinada com base na dose requerida para obter uma redução de um nível de mRNA de ALAS1 (por exemplo, um nível no fígado de mRNA de ALAS1 e/ou um nível em circulação de mRNA de ALAS1), por exemplo, como descrito aqui nos Exemplos. Em modalidades, mRNA em circulação é avaliado usando o ensaio cERD.
[00046] Em modalidades, a dose eficaz é determinada com base na dose requerida para obter uma redução de um nível (por exemplo, um nível na urina e/ou plasma) de ALA e/ou PBG.
[00047] Em modalidades, a dose eficaz é determinada com base na dose requerida para obter um efeito de tratamento particular descrito aqui, por exemplo, prevenção ou redução de sintomas associados a uma porfiria.
[00048] Em modalidades, a atividade melhorada é indicada pela obtenção de um nível mais elevado no fígado do dsRNA. Em modalidades, obtém-se um nível mais elevado no fígado após uma única dose de dsRNA (por exemplo, uma dose de 1, 2,5, 3, 5, ou 10 mg/kg). Em modalidades, um nível mais elevado no fígado é obtido depois de múltiplas doses de dsRNA terem sido administradas (por exemplo, 2-10 doses diárias ou semanais de 1, 2,5, 3, 5, ou 10 mg/kg).
[00049] Em uma modalidade, o iRNA engloba um dsRNA tendo uma fita de RNA (a fita antissenso) tendo uma região que é substancialmente complementar com uma porção de um mRNA de ALAS1, por exemplo, um mRNA de ALAS1 humano (por exemplo um mRNA de ALAS1 humano como proporcionado em SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:382).
[00050] Em uma modalidade, um iRNA para inibição de um gene ALAS1 inclui pelo menos duas sequências que são complementares uma com a outra. O iRNA inclui uma fita senso tendo uma primeira sequência e uma fita antissenso tendo uma segunda sequência. a fita antissenso inclui uma sequência de nucleotídeos que é substancialmente complementar com pelo menos parte de um mRNA codificando um transcrito de ALAS1, e a região de complementaridade tem 30 nucleotídeos ou menos, e pelo menos 15 nucleotídeos, de comprimento. Geralmente, o iRNA tem 19 a 24 nucleotídeos de comprimento.
[00051] Em algumas modalidades, o iRNA tem 19-21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o iRNA tem 19-21 nucleotídeos de comprimento e está em uma formulação de lipídeos, por exemplo, uma formulação de nanopartículas de lipídeos (LNP) (por exemplo, uma formulação LNP11),
[00052] Em algumas modalidades, o iRNA tem 21-23 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o iRNA tem 21-23 nucleotídeos de comprimento e está na forma de um conjugado, por exemplo, conjugado com um ou mais derivados de GalNAc como descrito aqui.
[00053] Em algumas modalidades, o iRNA tem de cerca de 15 e cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, e em outras modalidades o iRNA tem de cerca de 25 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Um iRNA se dirigindo a ALAS1, após contato com uma célula expressando ALAS1, inibe a expressão de um gene ALAS1 por pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 % ou pelo menos 40 % ou mais, tal como quando avaliado por um método como descrito aqui. Em uma modalidade, o iRNA se dirigindo a ALAS1 é formulado em uma partícula de lipídeo de ácido nucleico estável (SNALP).
[00054] Em uma modalidade, um iRNA (por exemplo, um dsRNA) apresentado aqui inclui uma primeira sequência de um dsRNA que é selecionada do grupo consistindo nas sequências senso das Tabelas 21 até 40 e uma segunda sequência que é selecionada do grupo consistindo nas correspondentes sequências antissenso das Tabelas 21 até 40.
[00055] As moléculas de iRNA apresentadas aqui podem incluir nucleotídeos ocorrendo naturalmente ou podem incluir pelo menos um nucleotídeo modificado. Em modalidades, o pelo menos um nucleotídeo modificado inclui uma ou mais de uma modificação no nucleotídeo escolhidas do grupo consistindo em um ácido nucleico trancado (LNA), um nucleotídeo acíclico, um ácido hexitol ou hexose nucleico (HNA), um ácido ciclo-hexeno nucleico (CeNA), 2'-metoxietila, 2'-O-alquila, 2'-O- alila, 2'-C-alila, 2'-flúor, 2'-deóxi, 2’-hidroxila, ou qualquer sua combinação. Em uma modalidade, o pelo menos um nucleotídeo modificado inclui, mas não está limitado a um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila, nucleotídeo modificado por 2'-flúor, um nucleotídeo tendo um grupo 5'-fosforotioato, e um nucleotídeo terminal ligado a um ligante, por exemplo, uma N-acetilgalactosamina (GalNAc) ou um derivado colesterila. Alternativamente, o nucleotídeo modificado pode ser escolhido do grupo de: um nucleotídeo modificado por 2'-deóxi-2'- flúor, um nucleotídeo modificado por 2'-deóxi, um nucleotídeo trancado, um nucleotídeo acíclico, um nucleotídeo abásico, nucleotídeo modificado por 2’-amino, nucleotídeo modificado por 2’-alquila, nucleotídeo morfolino, um fosforamidato, e um nucleotídeo compreendendo uma base não natural. Tal sequência modificada pode ser baseada, por exemplo, em uma primeira sequência do referido iRNA selecionada do grupo consistindo nas sequências senso reveladas nas Tabelas 21-40, e uma segunda sequência selecionada do grupo consistindo das correspondentes sequências antissenso reveladas nas Tabelas 21-40.
[00056] Em uma modalidade, um iRNA como descrito aqui se dirige a uma variante do transcrito de RNA de ALAS1 de tipo selvagem, e em outra modalidade, o iRNA se dirige a um transcrito mutante (por exemplo, um RNA de ALAS1 transportando uma variante alélica). Por exemplo, um iRNA apresentado na invenção pode se dirigir a uma variante polimórfica, tal como um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), de ALAS1. Em outra modalidade, o iRNA se dirige a um transcrito de ALAS1 de tipo selvagem e mutante. Ainda em outra modalidade, o iRNA se dirige a uma variante de transcrito particular de ALAS1 (por exemplo, variante de ALAS1 humano 1). Ainda em outra modalidade, o agente de iRNA se dirige a múltiplas variantes de transcrito (por exemplo, ambas a variante 1 e a variante 2 de ALAS1 humano).
[00057] Em uma modalidade, um iRNA apresentado na invenção se dirige a uma região não codificante de um transcrito de RNA de ALAS1, tal como a região não traduzida 5’ ou 3’ de um transcrito.
[00058] Em algumas modalidades, um iRNA como descrito aqui está na forma de um conjugado, por exemplo, um conjugado de carboidrato, que pode servir como uma fração de direcionamento e/ou ligante, como descrito aqui. Em uma modalidade, o conjugado está anexado à extremidade 3' da fita senso do dsRNA. Em algumas modalidades, o conjugado está anexado através de um ligador, por exemplo, através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente.
[00059] Em algumas modalidades, o conjugado compreende um ou mais derivados de N-acetilgalactosamina (GalNAc). Um tal conjugado é também referido aqui como um conjugado GalNAc. Em algumas modalidades, o conjugado dirige o agente de iRNA a uma célula particular, por exemplo, uma célula do fígado, por exemplo, um hepatócito. Os derivados de GalNAc podem ser anexados através de um ligador, por exemplo, um ligador ramificado bivalente ou trivalente. Em modalidades particulares, o conjugado é
Figure img0002
[00060] Em algumas modalidades, o agente de iRNA está anexado ao conjugado de carboidrato através de um ligador, por exemplo, um ligador como mostrado no seguinte esquema, em que X é O ou S
Figure img0003
[00061] Em algumas modalidades, X é O. Em algumas modalidades, X é S.
[00062] Em algumas modalidades, o agente de iRNA é conjugado a L96 como definido na Tabela 1 e mostrado em baixo
Figure img0004
[00063] Em uma modalidade, o dsRNA tem um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis ou todos os seguintes: (i) é sintetizado quimicamente, por exemplo, é sintetizado por síntese de oligonucleotídeos em fase sólida; (ii) todos os nucleotídeos do dsRNA são modificados, por exemplo, todos os nucleotídeos são modificados por 2’-OMe ou 2’-F, ou uma combinação de modificação por 2’-OMe e 2’-F; (iii) todos os nucleotídeos são conectados através de ligações 3’-5’ fosfodiéster; (iv) a fita senso compreende ou consiste em 21 nucleotídeos; (v) a fita antissenso senso compreende ou consiste em 23 nucleotídeos; (vi) tem uma extremidade não coesiva na extremidade 3’ da fita senso; (vii) tem uma saliência 3', por exemplo, tem uma saliência de dois nucleotídeos, na extremidade 3' da fita antissenso; (viii) é covalentemente anexado a um ligante contendo três frações N-acetilgalactosamina (GalNAc); (ix) a extremidade 3' da fita senso é conjugada à fração GalNAc triantenária (por exemplo, referida aqui como L96 como definido na Tabela 1). Em uma modalidade, a extremidade 3' é ligada à fração GalNAc triantenária através de uma ligação fosfodiéster; (x) tem uma fita antissenso que compreende uma ou mais (por exemplo, quatro) ligações fosforotioato. Em uma modalidade, as ligações fosforotioato estão localizadas na extremidade 3' e na extremidade 5' da fita antissenso. Em uma modalidade, duas ligações fosforotioato estão localizadas na extremidade 3' e duas ligações fosforotioato estão localizadas na extremidade 5' da fita antissenso; (xi) tem uma fita senso que compreende uma ou mais (por exemplo, duas) ligações fosforotioato. Em uma modalidade, a uma ou mais (por exemplo, duas) ligações fosforotioato estão localizadas na extremidade 5' da fita senso; (xii) 21 nucleotídeos da fita senso hibridam com os 21 nucleotídeos complementares da fita antissenso; (xiii) forma 21 pares de bases nucleotídicas e uma saliência de duas bases na extremidade 3' da fita antissenso; (xiv) compreende, ou consiste em, uma fita senso e antissenso tendo a sequência de AD-60519; (xv) tem uma fita senso com 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20 ou todas as modificações da fita senso de AD-60519; (xvi) tem uma fita antissenso com 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20 ou todas as modificações da fita antissenso de AD-60519; ou (xvii) tem a sequência de dúplex e todas as modificações de AD- 60519.
[0064] Em modalidades, o dsRNA está na forma de um conjugado tendo a estrutura seguinte (também referida aqui como AD-60519 ou ALN-60519) (SEQ ID NOS 5238-5239, respectivamente, por ordem de aparecimento):
Figure img0005
[0065] Em um aspecto, é proporcionada aqui uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, que inclui um ou mais dos iRNAs descritos aqui e um transportador ou veículo de administração farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição é usada para inibir a expressão de um gene ALAS1 em um organismo, geralmente um indivíduo humano. Em uma modalidade, a composição é usada para tratamento de uma porfiria, por exemplo, AIP.
[0066] Em um aspecto, um iRNA proporcionado aqui é um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de ALAS1, em que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso com 15-30 pares de bases de comprimento e a fita antissenso é complementar com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1 ou 382.
[0067] Em um aspecto adicional, um iRNA proporcionado aqui é um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) compreendendo uma fita senso complementar com uma fita antissenso, em que a referida fita antissenso compreende uma região de complementaridade com um transcrito de RNA de ALAS1, em que cada fita tem cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos, em que o referido agente de iRNA de fita dupla é representado pela fórmula (III): senso: 5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' antissenso: 3' np‘-Na‘-(X‘X‘X‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(Z‘Z‘Z‘)i-Na‘-nq‘ 5' (III) em que: i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1; p, p’, q, e q‘ são cada um independentemente 0-6; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados; cada Nb e Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos que estão ou modificados ou não modificados ou suas combinações; cada p, np\ nq, e nq‘ representa independentemente um nucleotídeo da saliência; XXX, YYY, ZZZ, X‘X‘X‘, Y‘Y‘Y‘, e Z‘Z‘Z‘ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos; as modificações em Nb diferem da modificação em Y e as modificações em Nb’ diferem da modificação em Y‘.
[0068] Em modalidades, a fita senso é conjugada com pelo menos um ligante.
[0069] Em modalidades, i é 1; j é 1; ou ambos i e j são 1.
[0070] Em modalidades, k é 1; l é 1; ou ambos k e l são 1.
[0071] Em modalidades, XXX é complementar com X’X’X’, YYY é complementar com Y‘Y‘Y‘, e ZZZ é complementar com Z‘Z‘Z‘.
[0072] Em modalidades, o motivo Y‘Y‘Y‘ ocorre nas posições 11, 12 e 13 da fita antissenso a partir da extremidade 5'.
[0073] Em modalidades, o Y‘ é 2-O-metila.
[0074] Em modalidades, a região de dúplex tem 15-30 pares de nucleotídeos de comprimento.
[0075] Em modalidades, a região de dúplex tem 17-23 pares de nucleotídeos de comprimento.
[0076] Em modalidades, a região de dúplex tem 19-21 pares de nucleotídeos de comprimento.
[0077] Em modalidades, a região de dúplex tem 21-23 pares de nucleotídeos de comprimento.
[0078] Em modalidades, a modificação no nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em um ácido nucleico trancado (LNA), um nucleotídeo acíclico, um ácido hexitol ou hexose nucleico (HNA), um ácidociclo-hexeno nucleico (CeNA), 2'-metoxietila, 2'-O-alquila, 2'-O- alila, 2'-C-alila, 2'-flúor,2'-deóxi, 2’-hidroxila, e qualquer sua combinação.
[0079] Em modalidades, as modificações nos nucleotídeos são selecionadas do grupo consistindo em LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietila, 2'-O-alquila, 2'-O-alila, 2'-C-alila, 2'-flúor, 2'-deóxi, 2’-hidroxila, e suas combinações.
[0080] Em modalidades, as modificações nos nucleotídeos são 2'- O-metila, 2'-flúor ou ambos.
[0081] Em modalidades, o ligante compreende um carboidrato.
[0082] Em modalidades, o ligante é anexado através de um ligador.
[0083] Em modalidades, o ligador é um ligador ramificado bivalente ou trivalente.
[0084] Em modalidades, o ligante é
Figure img0006
[0085] Em modalidades, o ligante e ligador são como mostrado na Fórmula XXIV:
Figure img0007
[0086] Em modalidades, o ligante é anexado à extremidade 3' da fita senso.
[0087] Em modalidades, o dsRNA consiste em ou compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de sequências proporcionadas nas Tabelas 21-40.
[0088] Em um aspecto adicional, um iRNA proporcionado aqui é um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de ALAS1, em que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso, compreendendo a fita antissenso uma região de complementaridade com um transcrito de RNA de ALAS1, cuja fita antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo por não mais do que 3 nucleotídeos de uma das sequências antissenso listadas em qualquer uma das Tabelas 21-40. Em modalidades, os nucleotídeos da fita antissenso têm menos modificações, mais modificações, ou diferentes modificações em comparação com as sequências antissenso listadas em qualquer uma das Tabelas 21-40.
[0089] Em modalidades, as sequências senso e antissenso são selecionadas daquelas dos dúplices AD-59453, AD-59395, AD-59477, e AD-59492. Em modalidades, as sequências senso e antissenso são aquelas de um dúplex divulgado aqui que suprime a expressão de mRNA de ALAS1 por pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 % ou 90 %, por exemplo, como avaliado usando um ensaio divulgado nos Exemplos proporcionados aqui.
[0090] Em modalidades, a expressão de mRNA de ALAS1 é avaliada com base em um nível de mRNA de ALAS1 no fígado, por exemplo, como avaliado usando uma amostra de biopsia do fígado. Em modalidades, a expressão de mRNA de ALAS1 é avaliada com base em um nível de mRNA de ALAS1 em um fluido biológico, por exemplo, sangue, soro, plasma, fluido cerebrospinal, ou urina. Em modalidades, a expressão de mRNA de ALAS1 é avaliada usando um ensaio de detecção de RNA extracelular em circulação (cERD), por exemplo, um ensaio cERD como descrito aqui ou em Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (Pôster apresentado em 9 de fevereiro, 2012 no simpósio Keystone Gene Silencing by small RNAs (Vancouver, 7-12 de fevereiro, 2012) ou Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, publicado online em 19 de dezembro, 2013.
[0091] Em algumas modalidades, o dsRNA compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.
[0092] Em algumas modalidades, pelo menos um dos nucleotídeos modificados é escolhido do grupo consistindo em: um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'-fosforotioato, e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesterila ou grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico.
[0093] Em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado é escolhido do grupo consistindo em: um nucleotídeo modificado por 2'- deóxi-2'-flúor, um nucleotídeo modificado por 2'-deóxi, um nucleotídeo trancado, um nucleotídeo acíclico, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo modificado por 2'-amino, um nucleotídeo modificado por 2'- alquila, um nucleotídeo de morfolino, um fosforamidato, e um nucleotídeo compreendendo uma base não natural.
[0094] Em algumas modalidades, a região de complementaridade tem pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento.
[0095] Em algumas modalidades, a região de complementaridade tem entre 19 e 21 nucleotídeos de comprimento.
[0096] Em algumas modalidades, a região de complementaridade tem 19 nucleotídeos de comprimento.
[0097] Em algumas modalidades, cada fita tem não mais do que 30 nucleotídeos de comprimento.
[0098] Em algumas modalidades, pelo menos uma fita compreende uma saliência 3' de pelo menos 1 nucleotídeo. Em modalidades, a fita antissenso compreende uma saliência 3' de pelo menos 1 nucleotídeo.
[0099] Em algumas modalidades, pelo menos uma fita compreende uma saliência 3' de pelo menos 2 nucleotídeos. Em modalidades, a fita antissenso compreende uma saliência 3' de pelo menos 2 nucleotídeos. Em modalidades, a fita antissenso compreende uma saliência 3' de 2 nucleotídeos.
[00100] Em algumas modalidades, um dsRNA descrito aqui compreende adicionalmente um ligante.
[00101] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante GalNAc.
[00102] Em algumas modalidades, o ligante dirige o dsRNA a hepatócitos.
[00103] Em algumas modalidades, o ligante é conjugado à extremidade 3' da fita senso do dsRNA.
[00104] Em algumas modalidades, a região de complementaridade consiste em uma sequência antissenso selecionada das sequências antissenso listadas nas Tabelas 21-40, ou uma sequência antissenso correspondente na qual algum ou todos os nucleotídeos não são modificados. Em modalidades, a região de complementaridade consiste na sequência UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) ou UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Em algumas modalidades, a região de complementaridade consiste na sequência antissenso do dúplex AD-60489. Em algumas modalidades, a região de complementaridade consiste na sequência antissenso do dúplex AD-60519.
[00105] Em modalidades, a região de complementaridade consiste em uma sequência antissenso selecionada de um dúplex divulgado aqui que suprime a expressão de mRNA de ALAS1 por pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 % ou 90 %, por exemplo, como avaliado usando um ensaio divulgado nos Exemplos proporcionados aqui.
[00106] Em algumas modalidades, o dsRNA compreende uma fita senso consistindo em uma sequência de fita senso selecionada das Tabelas 21-40, e uma fita antissenso consistindo em uma sequência antissenso selecionada das Tabelas 21-40. Em modalidades, o dsRNA compreende um par de sequências senso e antissenso correspondentes selecionadas daquelas dos dúplices divulgados nas Tabelas 21-40.
[00107] Em um aspecto, a invenção proporciona uma célula contendo pelo menos um dos iRNAs (por exemplo, dsRNAs) apresentados aqui. A célula é geralmente uma célula de mamífero, tal como uma célula de humano. Em algumas modalidades, a célula é uma célula eritroide. Em outras modalidades, a célula é uma célula do fígado (por exemplo, um hepatócito).
[00108] Em um aspecto é proporcionada aqui uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene ALAS1, compreendendo a composição um iRNA (por exemplo, um dsRNA) descrito aqui.
[00109] Em modalidades das composições farmacêuticas descritas aqui, o iRNA (por exemplo, dsRNA) é administrado em uma solução não tamponada. Em modalidades, a solução não tamponada é salino ou água, por exemplo, água para injeção.
[00110] Em modalidades, a composição farmacêutica compreende AD-60519 e água para injeção. Em modalidades, a composição compreende cerca de 100 até 300 mg/mL, por exemplo, 200 mg/mL, de AD-60519. Em modalidades, a composição tem um pH de 6,0-7,5, por exemplo, cerca de 7,0. Em modalidades, a composição é para injeção subcutânea. Em modalidades, a composição farmacêutica é embalada em um recipiente (por exemplo, um frasco de vidro, por exemplo, um frasco de vidro de 2 mL) a um volume de cerca de 0,3 até 1 mL, por exemplo, 0,55 mL. Em modalidades, a composição farmacêutica é ALN- AS1 como descrito aqui nos exemplos.
[00111] Em modalidades das composições farmacêuticas descritas aqui, o iRNA (por exemplo, dsRNA) é administrado com uma solução tampão. Em modalidades, a solução tampão compreende acetato, citrato, prolamina, carbonato, ou fosfato ou qualquer sua combinação. Em modalidades, a solução tampão é salino tamponado com fosfato (PBS).
[00112] Em modalidades das composições farmacêuticas descritas aqui, o iRNA (por exemplo, dsRNA) é dirigido a hepatócitos.
[00113] Em modalidades das composições farmacêuticas descritas aqui, a composição é administrada intravenosamente.
[00114] Em modalidades das composições farmacêuticas descritas aqui, a composição é administrada subcutaneamente.
[00115] Em modalidades, uma composição farmacêutica compreende um iRNA (por exemplo, um dsRNA) descrito aqui que compreende um ligante (por exemplo, um ligante GalNAc) que dirige o iRNA (por exemplo, dsRNA) a hepatócitos.
[00116] Em modalidades, uma composição farmacêutica compreende um iRNA (por exemplo, um dsRNA) descrito aqui que compreende um ligante (por exemplo, um ligante GalNAc), e a composição farmacêutica é administrada subcutaneamente. Em modalidades, o ligante dirige o iRNA (por exemplo, dsRNA) a hepatócitos.
[00117] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica, por exemplo, uma composição descrita aqui, inclui uma formulação de lipídeos. Em algumas modalidades, o agente de iRNA está em uma formulação LNP, por exemplo, uma formulação MC3. Em algumas modalidades, a formulação LNP dirige o agente de iRNA a uma célula particular, por exemplo, uma célula do fígado, por exemplo, um hepatócito. Em modalidades, a formulação de lipídeos é uma formulação LNP11. Em modalidades, a composição é administrada intravenosamente.
[00118] Em outra modalidade, a composição farmacêutica é formulada para administração de acordo com um regime de dosagem descrito aqui, por exemplo, não mais do que uma vez a cada quatro semanas, não mais do que uma vez a cada três semanas, não mais do que uma vez a cada duas semanas, ou não mais do que uma vez a cada semana. Em outra modalidade, a administração da composição farmacêutica pode ser mantida durante ou mês ou mais, por exemplo, um, dois, três, ou seis meses, ou um ano ou mais.
[00119] Em outra modalidade, uma composição contendo um iRNA apresentado na invenção, por exemplo, um dsRNA se dirigindo a ALAS1, é administrado com um agente terapêutico não iRNA, tal como um agente que se sabe que trata uma porfiria (por exemplo, AIP), ou um sintoma de uma porfiria (por exemplo, dor). Em outra modalidade, uma composição contendo um iRNA apresentado na invenção, por exemplo, um dsRNA se dirigindo a ALAS1, é administrado em conjunto com um regime terapêutico não iRNA, tal como hemina ou glicose (por exemplo, infusão de glicose (e.g., glicose IV)). Por exemplo, um iRNA apresentado na invenção pode ser administrado antes de, após, ou concomitante com glicose, dextrose, ou um tratamento que serve para restaurar o balanço de energia (por exemplo, nutrição parenteral total). Um iRNA apresentado na invenção pode ser também administrado antes de, após, ou concomitante com a administração de um produto de heme (por exemplo, hemina, arginato de heme, ou albumina de heme), e opcionalmente também em combinação com uma glicose (por exemplo, glicose IV) ou similares.
[00120] Tipicamente, a glicose administrada para o tratamento de uma porfiria é administrada intravenosamente (IV). A administração de glicose intravenosamente é referida aqui como "glicose IV". No entanto, modalidades alternativas nas quais a glicose é administrada por outros meios estão também englobadas.
[00121] Em uma modalidade, um iRNA de ALAS1 é administrado a um paciente, e depois o agente ou regime terapêutico não iRNA (por exemplo, glicose e/ou um produto de heme) é administrado ao paciente (ou vice-versa). Em outra modalidade, um iRNA de ALAS1 e o agente ou regime terapêutico não iRNA são administrados ao mesmo tempo.
[00122] Em um aspecto é proporcionado aqui um método de inibição da expressão de ALAS1 em uma célula, compreendendo o método: (a) introdução na célula de um iRNA (por exemplo, um dsRNA) descrito aqui e (b) manutenção da célula do passo (a) durante um tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA de um gene ALAS1, inibindo desse modo a expressão do gene ALAS1 na célula.
[00123] Em um aspecto é proporcionado aqui um métodopara redução ou inibição da expressão de um gene ALAS1 em uma célula (por exemplo, uma célula eritroide ou uma célula do fígado, tal como, por exemplo, um hepatócito). O método inclui: a) introdução na célula de um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA), em que o dsRNA inclui pelo menos duas sequências que são complementares uma com a outra. O dsRNA tem uma fita senso tendo uma primeira sequência e uma fita antissenso tendo uma segunda sequência; a fita antissenso tem uma região de complementaridade que é substancialmente complementar com pelo menos uma parte de um mRNA codificando ALAS1, e onde a região de complementaridade tem 30 nucleotídeos ou menos, i.e., 15-30 nucleotídeos de comprimento, e geralmente 19-24 nucleotídeos de comprimento, e onde o dsRNA, após contato com uma célula expressando ALAS1, inibe a expressão de um gene ALAS1 por pelo menos 10 %, por exemplo, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 % ou mais; e b) manutenção da célula do passo (a) durante um tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA do gene ALAS1, reduzindo ou inibindo desse modo a expressão de um gene ALAS1 na célula.
[00124] Em modalidades dos métodos acima mencionados de inibição da expressão de ALAS1 em uma célula, a célula é tratada ex vivo, in vitro, ou in vivo. Em modalidades, a célula é um hepatócito.
[00125] Em modalidades, a célula está presente em um indivíduo com necessidade de tratamento, prevenção e/ou gestão de um distúrbio relacionado com expressão de ALAS1.
[00126] Em modalidades, o distúrbio é uma porfiria. Em modalidades, a porfiria é porfiria aguda intermitente ou porfiria por deficiência de ALA desidratase.
[00127] Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática, por exemplo, uma porfiria selecionada de porfiria aguda intermitente (AIP), coproporfiria hereditária (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP), e porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática dominante homozigota (por exemplo, AIP, HCP, ou VP dominante homozigota) ou porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria dual.
[00128] Em modalidades, a expressão de ALAS1 é inibida por pelo menos 30%.
[00129] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) tem uma IC50 na gama de 0,01-1 nM.
[00130] Em certas modalidades, a célula (por exemplo, o hepatócito) é uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula de humano, primata não humano, ou roedor).
[00131] Em uma modalidade, a célula é tratada ex vivo, in vitro, ou in vivo (por exemplo, a célula está presente em um indivíduo (por exemplo, um paciente com necessidade de tratamento, prevenção e/ou gestão de um distúrbio relacionado com expressão de ALAS1)).
[00132] Em uma modalidade, o indivíduo é um mamífero (por exemplo, um humano) em risco de, ou diagnosticado com, uma porfiria, por exemplo, anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP ou porfiria de Doss), porfiria aguda intermitente (AIP), porfiria eritropoiética congênita (CEP), porfiria cutânea tardia (PCT), coproporfiria hereditária (coproporfiria, ou HCP), porfiria variegata (VP), protoporfiria eritropoiética (EPP), ou eritroporfiria transiente da infância. Em algumas modalidades, o distúrbio é uma porfiria hepática aguda, por exemplo, porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP), AIP, HCP ou VP. Em modalidades específicas, o distúrbio é porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP) ou AIP.
[00133] Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática, por exemplo, uma porfiria selecionada de porfiria aguda intermitente (AIP), coproporfiria hereditária (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP), e porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática dominante homozigota (por exemplo, AIP, HCP, ou VP dominante homozigota) ou porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria dual.
[00134] Em uma modalidade, o dsRNA introduzido reduz ou inibe a expressão de um gene ALAS1 na célula.
[00135] Em uma modalidade, o dsRNA introduzido reduz ou inibe a expressão de um gene ALAS1, ou o nível de uma ou mais porfirinas ou precursores de porfirina (por exemplo, ácido δ-aminolevulinico (ALA), porfobilinogênio (PBG), hidroximetilbilano (HMB), uroporfirinogênio I ou III, coproporfirinogênio I ou III, protoporfirinogênio IX, e protoporfirina IX) ou produtos ou metabolitos de porfirina, por pelo menos 5 %, 10 %, 15%, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % ou mais em comparação com uma referência (por exemplo, uma célula não tratada ou uma célula tratada com um dsRNA de controle não se dirigindo). Sem estar limitado pela teoria, ALAS1 é a primeira enzima da via da porfirina. Assim, é provável que a redução da expressão do gene ALAS1 reduza o nível de um ou mais precursores de porfirina, porfirinas ou produtos ou metabolitos de porfirina.
[00136] Em outros aspectos, a invenção proporciona métodos para tratamento, prevenção ou gestão de processos patológicos relacionados com expressão de ALAS1 (por exemplo, processos patológicos envolvendo porfirinas, precursores de porfirina, ou defeitos na via da porfirina, tais como, por exemplo, porfirias). Em uma modalidade, o método inclui administração a um indivíduo, por exemplo, um paciente com necessidade de tal tratamento, prevenção ou gestão, de uma quantidade eficaz (por exemplo, terapeuticamente ou profilaticamente eficaz) de um ou mais dos iRNAs apresentados aqui.
[00137] Em um aspecto é proporcionado aqui um método de tratamento e/ou prevenção de um distúrbio relacionado com expressão de ALAS1 compreendendo administração a um indivíduo com necessidade de tal tratamento de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um iRNA (por exemplo, um dsRNA) descrito aqui, ou uma composição compreendendo um iRNA (por exemplo, um dsRNA) descrito aqui.
[00138] Em um aspecto é proporcionado aqui um método de tratamento e/ou prevenção de uma porfiria compreendendo administração a um indivíduo com necessidade de tal tratamento de um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA), em que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso com 15-30 pares de bases de comprimento e a fita antissenso é complementar com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:382.
[00139] Em uma modalidade, o indivíduo (por exemplo, o paciente) tem uma porfiria. Em outra modalidade, o indivíduo (por exemplo, paciente) está em risco de desenvolver uma porfiria. Em algumas modalidades, a administração do iRNA se dirigindo a ALAS1 alivia ou atenua a gravidade de pelo menos um sintoma de um distúrbio relacionado com ALAS1 no paciente.
[00140] Em uma modalidade, o indivíduo é um mamífero (por exemplo, um humano) em risco de, ou que foi diagnosticado com, um distúrbio relacionado com expressão de ALAS1, por exemplo, uma porfiria, por exemplo, anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), porfiria por deficiência de ALA desidratase (porfiria de Doss), porfiria aguda intermitente (AIP), porfiria eritropoiética congênita (CEP), porfiria cutânea tardia (PCT), coproporfiria hereditária (coproporfiria, ou HCP), porfiria variegata (VP), protoporfiria eritropoiética (EPP), ou eritroporfiria transiente da infância. Em uma modalidade adicional, a porfiria é uma porfiria hepática aguda, por exemplo, porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP), AIP, HCP ou VP. Em algumas tais modalidades, o distúrbio é porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP) ou AIP.
[00141] Em modalidades, o indivíduo tem, ou está em risco de desenvolver, uma porfiria. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática, por exemplo, uma porfiria selecionada de porfiria aguda intermitente (AIP), coproporfiria hereditária (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP), e porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática dominante homozigota (por exemplo, AIP, HCP, ou VP dominante homozigota) ou porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria dual.
[00142] Em modalidades, uma porfiria, um sintoma de porfiria, um pródromo, ou um ataque de porfiria é induzido por exposição a um fator precipitante, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o fator precipitante é uma exposição química. Em algumas modalidades, o fator precipitante é um fármaco, por exemplo, um fármaco de prescrição ou um fármaco sem receita médica. Em algumas modalidades, o fator precipitante é o ciclo menstrual, por exemplo, uma fase particular do ciclo menstrual, por exemplo, a fase lútea.
[00143] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado após um ataque agudo de porfiria.
[00144] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado durante um ataque agudo de porfiria.
[00145] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado profilaticamente para prevenir um ataque agudo de porfiria.
[00146] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) é formulado como uma formulação LNP.
[00147] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) está na forma de um conjugado GalNAc.
[00148] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) é administrado a uma dose de 0,05-50 mg/kg.
[00149] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) é administrado a uma concentração de 0,01 mg/kg-5 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
[00150] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) é formulado como uma formulação LNP e é administrado a uma dose de 0,05-5 mg/kg.
[00151] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) está na forma de um conjugado GalNAc e é administrado a uma dose de 0,5-50 mg/kg. Em certas modalidades, o iRNA no conjugado de GalNAc é administrado a uma dose menor do que 10 mg/kg (por exemplo, 5 mg/kg ou menos) por exemplo, uma vez por semana; por exemplo, uma dose de 1 mg/kg ou menos, 2,5 mg/kg ou menos, ou 5 mg/kg ou menos, por exemplo, uma vez por semana. Em uma modalidade, iRNA no conjugado de GalNAc é administrado a uma dose de cerca de 2,5 mg/kg ou menos, por exemplo, uma vez por semana. Em uma modalidade, a administração do iRNA no conjugado de GalNAc é subcutânea.
[00152] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) está na forma de um conjugado de GalNAc e é administrado, por exemplo, subcutaneamente, a uma dose de 0-5 mg/kg, por exemplo 0-2,5 mg/kg ou 1-2,5 mg/kg. Em modalidades, o iRNA é administrado semanalmente. Em modalidades, o iRNA é administrado na forma de uma composição compreendendo o iRNA e água para injeção. Em modalidades, o iRNA é AD-60519. Em modalidades, a composição compreende o iRNA, por exemplo, AD-60519, a uma concentração de cerca de 200 mg/mL.
[00153] Em modalidades, o método diminui um nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina no indivíduo.
[00154] Em modalidades, o nível é diminuído por pelo menos 10 %, 20%, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 %. Em uma modalidade, o nível é diminuído por pelo menos 30 %.
[00155] Em modalidades, o precursor de porfirina é ácido δ- aminolevulínico (ALA) ou porfobilinogênio (PBG).
[00156] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) tem uma IC50 na gama de 0,01-1 nM.
[00157] Em modalidades, o método descrito aqui (i) melhora um sintoma associado a um distúrbio relacionado com ALAS1 (por exemplo, uma porfiria) (ii) inibe a expressão de ALAS1 no indivíduo (por exemplo, como avaliado usando o ensaio cERD), (iii) diminui um nível de um precursor de porfirina (por exemplo, ALA ou PBG) ou uma porfirina no indivíduo, (iv) diminui a frequência de ataques agudos de sintomas associados a uma porfiria no indivíduo, ou (v) diminui a incidência de ataques agudos de sintomas associados a uma porfiria no indivíduo quando o indivíduo é exposto a um fator precipitante (por exemplo, a fase pré-menstrual ou a fase lútea).
[00158] Em modalidades, o método melhora a dor e/ou neuropatia progressiva.
[00159] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado de acordo com um regime de dosagem.
[00160] Em algumas modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado antes de ou durante um ataque agudo de porfiria. Em algumas modalidades, o iRNA é administrado antes de um ataque agudo de porfiria.
[00161] Em algumas modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado durante um pródromo. Em modalidades, o pródromo é caracterizado por dor abdominal, náusea, sintomas psicológicos (por exemplo, ansiedade), inquietação e/ou insônia.
[00162] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado durante uma fase particular do ciclo menstrual, por exemplo, durante a fase lútea. Em modalidades, o método melhora ou previne ataques cíclicos de porfiria, por exemplo, por redução da gravidade, duração, ou frequência de ataques. Em modalidades, os ataques cíclicos estão associados a um fator precipitante. Em modalidades, o fator precipitante é o ciclo menstrual, por exemplo, uma fase particular do ciclo menstrual, por exemplo, a fase lútea.
[00163] Em modalidades, o indivíduo tem um elevado nível de ALA e/ou PBG. Em modalidades, o nível de ALA e/ou PBG está elevado no plasma ou urina do indivíduo. Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, uma porfiria hepática. Em modalidades, o indivíduo está assintomático. Em modalidades, o indivíduo transporta uma alteração genética (por exemplo, uma mutação de gene) associada a uma porfiria, como descrito aqui.
[00164] Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria e sofre de dor (por exemplo, dor crônica, por exemplo, dor neuropática crônica) e/ou neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva). Em modalidades, o indivíduo não sofre de ataques agudos mas sofre de dor (por exemplo, dor crônica, por exemplo, dor neuropática crônica) e/ou neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva). Em modalidades, a dor é dor abdominal.
[00165] Em modalidades, o indivíduo (a) tem um elevado nível de ALA e/ou PBG e (b) sofre de dor (por exemplo, dor crônica, por exemplo, dor neuropática crônica) e/ou neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva). Em modalidades, a dor é dor abdominal.
[00166] Em modalidades, o indivíduo tem um nível no plasma e/ou na urina de ALA e/ou PBG que é elevado. Em modalidades, o elevado nível de ALA e/ou PBS é acompanhado por outros sintomas, por exemplo, dor (por exemplo, dor crônica, por exemplo, dor neuropática crônica) ou neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva). Em modalidades, a dor é dor abdominal. Em modalidades, o indivíduo está assintomático. Em modalidades, o indivíduo tem uma mutação genética associada a uma porfiria, por exemplo, uma mutação como descrito aqui.
[00167] Em modalidades, o indivíduo tem um nível (por exemplo, um nível no plasma ou um nível na urina) de um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG, que é elevado, por exemplo, o nível é maior do que, ou maior do que ou igual a um valor de referência. Em modalidades, o nível é maior do que o valor de referência. Em modalidades, o valor de referência é dois desvios padrão acima do nível médio em uma amostra de indivíduos saudáveis. Em modalidades, o valor de referência é um limite de referência superior.
[00168] Em modalidades, o indivíduo tem um nível no plasma e/ou um nível na urina de ALA e/ou PBG que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, ou 5 vezes, aquele de um limite de referência superior. Como usado aqui, um "limite de referência superior" se refere a um nível que é o limite superior do intervalo de confiança de 95 % para uma amostra de referência, por exemplo, uma amostra de indivíduos normais (por exemplo, tipo selvagem) ou saudáveis, por exemplo, indivíduos que não transportam uma mutação genética associada a uma porfiria e/ou indivíduos que não sofrem de uma porfiria. Em modalidades, o indivíduo tem um nível na urina de ALA e/ou PBG que é maior do que 2 a 4 vezes aquele de um limite de referência superior. Em modalidades, o indivíduo tem um nível na urina de ALA e/ou PBG que é maior do que 4 vezes aquele de um limite de referência superior.
[00169] Em modalidades, o valor de referência para PBG no plasma é 0,12 μmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de PBG no plasma que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 0,12 μmol/L, 0,24 μmol/L, 0,36 μmol/L, 0,48 μmol/L, ou 0,60 μmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível no plasma de PBG que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 0,48 μmol/L.
[00170] Em modalidades, o valor de referência para PBG na urina é 1,2 mmol/mol de creatinina. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de PBG na urina que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 1,2 mmol/mol de creatinina, 2,4 mmol/mol de creatinina, 3,6 mmol/mol de creatinina, 4,8 mmol/mol de creatinina, ou 6,0 mmol/mol de creatinina. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível na urina de PBG que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 4,8 mmol/mol de creatinina.
[00171] Em modalidades, o valor de referência para ALA no plasma é 0,12 μmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de ALA no plasma que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 0,12 μmol/L, 0,24 μmol/L, 0,36 μmol/L, 0,48 μmol/L, ou 0,60 μmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de ALA no plasma que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 0,48 μmol/L.
[00172] Em modalidades, o valor de referência para ALA na urina é 3,1 mmol/mol de creatinina. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de ALA na urina que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 3,1 mmol/mol de creatinina, 6,2 mmol/mol de creatinina, 9,3 mmol/mol de creatinina, 12,4 mmol/mol de creatinina, ou 15,5 mmol/mol de creatinina.
[00173] Em modalidades, o método diminui um ou mais sinais ou sintomas de uma porfiria. Em modalidades, o método diminui um elevado nível de ALA e/ou PBG. Em modalidades, o método diminui a dor (por exemplo, dor crônica, por exemplo, dor neuropática crônica) e/ou neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva). Em modalidades, a dor é dor abdominal. Em modalidades, a dor é dor neuropática (por exemplo, dor associada à neuropatia progressiva de porfirias agudas). A diminuição na dor pode incluir, por exemplo, prevenção da dor, atraso no início da dor, redução na frequência da dor, e/ou redução na gravidade da dor. Em modalidades, a diminuição da dor é avaliada com base no uso pelo indivíduo de medicação para a dor.
[00174] Em modalidades, o método melhora ou previne ataques agudos de porfiria, por exemplo, por redução da gravidade, duração, ou frequência de ataques.
[00175] Em modalidades, o método diminui ou previne lesões nos nervos.
[00176] Em modalidades, o método previne deterioração (por exemplo, previne desenvolvimento de anormalidades) de ou resulta em uma melhoria de medidas clínicas, por exemplo, medidas clínicas da função dos músculos e/ou nervos, por exemplo, EMG e/ou velocidades de condução nervosa.
[00177] Em modalidades, o método diminui o uso de heme pelo indivíduo.
[00178] Em modalidades, o método diminui o uso de medicação para a dor pelo indivíduo.
[00179] Em modalidades, o método reduz a hospitalização.
[00180] Em modalidades, o método é eficaz para reduzir um nível de ALA e/ou PBG (por exemplo, um nível no plasma ou na urina de ALA e/ou PBG). Em modalidades, o método é eficaz para produzir uma redução pré-determinada no elevado nível de ALA e/ou PBG.
[00181] Em modalidades, a redução pré-determinada é uma redução até um valor que é menos do que ou igual a um valor de referência. Em algumas modalidades, o valor de referência é um limite de referência superior. Em algumas modalidades, o valor de referência é o valor que é dois desvios padrão acima do nível médio em uma amostra de referência.
[00182] Em modalidades, o método é eficaz para reduzir o nível de ALA e/ou PBG em um indivíduo para um nível que é menor do que duas vezes o limite superior de referência. Em modalidades, o método é eficaz para reduzir o nível de ALA para menos do que duas vezes o limite superior de referência. Em modalidades, o método é eficaz para reduzir o nível de PBG para menos do que duas vezes o limite superior de referência.
[00183] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado como uma única dose ou em múltiplas doses, por exemplo, de acordo com um regime de dosagem.
[00184] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado profilaticamente a um indivíduo que está em risco de desenvolver uma porfiria. Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) ou composição compreendendo o iRNA é administrado profilaticamente começando na puberdade. Em modalidades, o indivíduo transporta uma mutação genética associada a uma porfiria e/ou tem um elevado nível de ALA e/ou PBG (por exemplo, um elevado nível no plasma ou na urina de ALA e/ou PBG). Em modalidades, a mutação torna um indivíduo suscetível a um ataque agudo (por exemplo, após exposição a um fator precipitante, por exemplo, um fármaco, fazer dieta ou outro fator precipitante, por exemplo, um fator precipitante como divulgado aqui). Em modalidades, a mutação está associada a elevados níveis de uma porfirina ou um precursor de porfirina (por exemplo, ALA e/ou PBG). Em modalidades, a mutação está associada a dor crônica (por exemplo, dor neuropática crônica) e/ou neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva).
[00185] Em modalidades, a mutação é uma mutação no gene ALAS1. Em modalidades, a mutação é uma mutação no promotor do gene ALAS1, ou em regiões a montante ou a jusante do gene ALAS1. Em modalidades, a mutação é uma mutação em fatores de transcrição ou outros genes que interatuam com ALAS1. Em modalidades, a mutação é uma mutação em um gene que codifica uma enzima na via biossintética do heme.
[00186] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNAou um seu conjugado) ou composição compreendendo o iRNA é administrado subcutaneamente. Em modalidades, o iRNA está na forma de um conjugado GalNAc. Em modalidades, o iRNA (por exemplo, dsRNA) é administrado a uma dose de 0,5-50 mg/kg. Em certas modalidades, o iRNA é administrado a uma dose menor do que 10 mg/kg (por exemplo, 5 mg/kg ou menos) uma vez por semana; por exemplo, uma dose de 1 mg/kg ou menos, 2,5 mg/kg ou menos, ou 5 mg/kg ou menos, por exemplo, uma vez por semana. Em uma modalidade, iRNA é administrado a uma dose de cerca de 2,5 mg/kg ou menos, por exemplo, uma vez por semana.
[00187] Em modalidades, o indivíduo a ser tratado é assintomático e tem um nível elevado de ALA e/ou PBG. Em modalidades, o indivíduo tem uma porfiria, por exemplo, AIP. Em modalidades, o paciente sofre de ataques porfíricos recorrentes.
[00188] Em modalidades, o iRNA (por exemplo, AD-60519) é administrado a uma dose menor do que 5 mg/kg, por exemplo, a 0,1, 0,35, 1,0, ou 2,5 mg/kg. Em modalidades, o iRNA (por exemplo, AD- 60519) é administrado em doses repetidas, por exemplo, doses semanais.
[00189] Em uma modalidade, o indivíduo é assintomático e tem um nível elevado de ALA e/ou PBG, e o iRNA (por exemplo, AD-60519) é administrado a doses únicas, por exemplo, a 0,1, 0,35, 1,0, ou 2,5 mg/kg; ou em dosagens repetidamente semanais, por exemplo, de 1 e 2,5 mg/kg durante várias semanas (por exemplo, durante 4 semanas).
[00190] Em uma modalidade, o indivíduo tem AIP, por exemplo, é um paciente com AIP, o iRNA (por exemplo, AD-60519) é administrado a uma dose de 1-2,5 mg/kg semanalmente.
[00191] Em modalidades, é empregue um regime de tratamento em que o iRNA é inicialmente administrado mais frequentemente, seguido de administração menos frequente. Em modalidades, o iRNA é inicialmente administrado uma vez por dia durante múltiplos dias (por exemplo, durante 2-14 dias, por exemplo, durante 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 dias). Em modalidades, o iRNA é subsequentemente administrado uma vez por semana. Em modalidades, o iRNA é subsequentemente administrado uma vez em cada duas semanas. Em modalidades, o iRNA é subsequentemente administrado a uma frequência que é eficaz para reduzir um ou mais sinais ou sintomas de uma porfiria.
[00192] Em um aspecto é proporcionado aqui um método de tratamento de um indivíduo com um elevado nível de ALA e/ou PBG, compreendendo o método administração ao indivíduo de um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA), em que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso com 15-30 pares de bases de comprimento e a fita antissenso é complementar com pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:382.
[00193] Em um aspecto é proporcionado aqui um método de tratamento de um indivíduo com um elevado nível de ALA e/ou PBG, compreendendo o método administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dsRNA ou uma composição compreendendo dsRNA, como descrito aqui.
[00194] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui são eficazes para diminui o nível de ALA e/ou PBG. Em algumas modalidades, o nível de ALA e/ou PBG é diminuído tal que seja menos do que, ou menos do que ou igual a um valor de referência, por exemplo, um limite de referência superior.
[00195] Em modalidades, o indivíduo a ser tratado é assintomático e tem um nível elevado de ALA e/ou PBG. Em modalidades, o indivíduo tem uma porfiria, por exemplo, AIP.
[00196] Em modalidades, o iRNA é administrado a uma dose menor do que 5 mg/kg, por exemplo, a 0,1, 0,35, 1,0, ou 2,5 mg/kg. Em modalidades, o iRNA é administrado em doses repetidas, por exemplo, doses semanais.
[00197] Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para diminuição de um nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina em uma célula (por exemplo, uma célula eritroide ou uma célula do fígado, tal como, por exemplo, um hepatócito). Em uma modalidade, a célula é tratada ex vivo, in vitro, ou in vivo (por exemplo, a célula está presente em um indivíduo (por exemplo, um paciente com necessidade de tratamento, prevenção e/ou gestão de um distúrbio relacionado com expressão de ALAS1)). O método inclui contato da célula com uma quantidade eficaz de um ou mais dos iRNAs se dirigindo a ALAS1, por exemplo, um ou mais dos iRNAs divulgados aqui, diminuindo desse modo o nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina na célula; ou diminuindo o nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina em outras células, tecidos, ou fluidos dentro de um indivíduo no qual a célula está localizada; em relação ao nível antes do contato. Tais métodos podem ser usados para tratar (por exemplo, melhorar a gravidade) de distúrbios relacionados com expressão de ALAS1, tais como porfirias, por exemplo, AIP ou porfiria por deficiência de ALA desidratase.
[00198] Em uma modalidade, o passo de contato é efetuado ex vivo, in vitro, ou in vivo. Por exemplo, a célula pode estar presente em um indivíduo, por exemplo, um mamífero (por exemplo, um humano) em risco, ou que foi diagnosticado com uma porfiria. Em uma modalidade, a porfiria é uma porfiria hepática aguda. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática, por exemplo, uma porfiria selecionada de porfiria aguda intermitente (AIP), coproporfiria hereditária (HCP), porfiria variegata (VP), porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP), e porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática dominante homozigota (por exemplo, AIP, HCP, ou VP dominante homozigota) ou porfiria hepatoeritropoiética. Em modalidades, a porfiria é uma porfiria dual.
[00199] Em um aspecto é proporcionado aqui um método para diminuição de um nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina (por exemplo, ALA ou PBG) em uma célula, compreendendo contato da célula com um iRNA (por exemplo, um dsRNA), como descrito aqui, em uma quantidade eficaz para diminuir o nível da porfirina ou do precursor de porfirina na célula.
[00200] Em modalidades, a célula é um hepatócito. Em modalidades, a porfirina ou precursor de porfirina é ácido δ-aminolevulinico (ALA), porfobilinogênio (PBG), hidroximetilbilano (HMB), uroporfirinogênio I ou III, coproporfirinogênio I ou III, protoporfirinogênio IX, ou protoporfirina IX. Em modalidades, o precursor de porfirina é ALA ou PBG.
[00201] Em uma modalidade, a célula é uma célula eritroide. Em uma modalidade adicional, a célula é uma célula do fígado (por exemplo, um hepatócito).
[00202] Em um aspecto é proporcionado aqui um vetor codificando pelo menos uma fita de um iRNA (por exemplo, um dsRNA) como descrito aqui.
[00203] Em um aspecto é proporcionado aqui um vetor codificando pelo menos uma fita de um dsRNA, em que o referido dsRNA compreende uma região de complementaridade com pelo menos uma parte de um mRNA codificando ALAS1, em que o referido dsRNA tem 30 pares de bases ou menos de comprimento, e em que o referido dsRNA se dirige ao referido mRNA para clivagem.
[00204] Em modalidades, a região de complementaridade tem pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento.
[00205] Em modalidades, a região de complementaridade tem 19 a 21 nucleotídeos de comprimento. Em um aspecto, a invenção proporciona um vetor para inibição da expressão de um gene ALAS1 em uma célula. Em uma modalidade, o vetor compreende um iRNA como descrito aqui. Em uma modalidade, o vetor inclui pelo menos uma sequência reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma fita de um iRNA como descrito aqui. Em uma modalidade, o vetor compreende pelo menos uma fita de um iRNA de ALAS1.
[00206] Em um aspecto é proporcionada aqui uma célula compreendendo um vetor como descrito aqui. Em um aspecto é proporcionada aqui uma célula contendo um vetor para inibição da expressão de um gene ALAS1 em uma célula. O vetor inclui uma sequência reguladora operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma fita de um dos iRNAs como descrito aqui. Em uma modalidade, a célula é uma célula do fígado (por exemplo, um hepatócito). Em outra modalidade, a célula é uma célula eritroide.
[00207] Em outro aspecto, é proporcionado um método para avaliar o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação em um indivíduo, em que o referido método compreende detectar (por exemplo, medir) o nível de mRNA de ALAS1 em uma amostra de fluido biológico (por exemplo, uma amostra de sangue (por exemplo, uma amostra de soro ou plasma), uma amostra de fluido cerebrospinal, ou uma amostra de urina do indivíduo, em que a referida amostra de fluido biológico compreende o mRNA de ALAS1, desse modo avaliando o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo.
[00208] Em outro aspecto, é proporcionado um método para avaliar o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação em um indivíduo, em que o referido método compreende (i) proporcionar RNA (por exemplo, RNA extracelular) de uma amostra de fluido biológico (por exemplo, amostra de sangue ou plasma) do indivíduo, em que a referida amostra de fluido biológico compreende o mRNA de ALAS1; (ii) obter um cDNA de ALAS1 a partir do mRNA de ALAS1; (iii) contatar o cDNA de ALAS1 com um ácido nucleico complementar (por exemplo, sonda e/ou iniciador) ao cDNA de ALAS1 ou uma sua porção, desse modo produzindo uma mistura reacional; e (iv) detectar (por exemplo, medir) o nível de cDNA de ALAS1 na mistura reacional, em que o nível de cDNA de ALAS1 é indicativo do nível de mRNA de ALAS1, desse modo avaliando o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo.
[00209] Em modalidades, a referida amostra de fluido biológico é uma amostra de sangue. Em modalidades, a referida amostra de fluido biológico é uma amostra de soro. Em modalidades, a referida amostra de fluido biológico é uma amostra de urina.
[00210] Em modalidades, o método compreende PCR, qPCR ou 5’- RACE.
[00211] Em modalidades, o referido ácido nucleico é uma sonda ou iniciador.
[00212] Em modalidades, o referido ácido nucleico compreende uma fração detectável e o nível de mRNA de ALAS1 é determinado por detecção da quantidade da fração detectável.
[00213] Em modalidades, o referido método compreende adicionalmente obter a amostra de fluido biológico do indivíduo. Em modalidades, a amostra de fluido biológico é separada do tecido e contém exossomos. Em modalidades destes métodos, a eficácia do tratamento de uma porfiria é avaliada com base em uma comparação do nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo relativamente a um valor de referência.
[00214] Em modalidades, um decréscimo do nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo em resposta ao tratamento de porfiria, relativamente ao valor de referência, indica que o tratamento de porfiria é eficaz. Em modalidades, o valor de referência é o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo antes do tratamento de porfiria.
[00215] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência na sua totalidade.
[00216] Os detalhes de várias modalidades da invenção são apresentados na descrição em baixo. Outras características, objetivos, e vantagens da invenção serão aparentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.
Descrição dos Desenhos
[00217] A FIG. 1 ilustra a via biossintética do heme.
[00218] A FIG. 2A e FIG. 2B mostram uma tabela que resume certas porfirias associadas a erros genéticos no metabolismo do heme.
[00219] A FIG. 3A e FIG. 3B ilustram uma variante do transcrito da sequência de mRNA de ALAS1 1 (Seq. Ref. NM_000688.4 (GI:40316942, registro datado de 19 de novembro, 2011), SEQ ID NO: 1).
[00220] A FIG. 4A e FIG. 4B ilustram uma variante do transcrito da sequência de mRNA de ALAS1 2 (Seq. Ref. NM_000688.5 (GI: 362999011, registro datado de 1 de abril, 2012), SEQ ID NO: 382).
[00221] A FIG. 5 mostra a resposta à dose do siRNA AD-53558 na supressão de mRNA de ALAS1 (mALAS1) de camundongo em relação a um controle de PBS. Os resultados para o controle de luciferase (LUC) AD-1955 são também mostrados.
[00222] A FIG. 6 mostra a resposta à dose do siRNA AD-53558 na supressão de mRNA de ALAS1 em ratos em relação a um controle de PBS. Os resultados para o controle de luciferase (LUC) AD-1955 são também mostrados.
[00223] A FIG. 7 mostra a durabilidade da supressão de mRNA de ALAS1 (mALAS1) de camundongo pelo siRNA AD-53558 em relação a um controle de PBS.
[00224] A FIG. 8 mostra médias ± desvios padrões de níveis de ALA no plasma (em μM) à linha de base, e após tratamento com fenobarbital nos grupos experimental (siRNA de ALAS1) e de controle (siRNA de LUC).
[00225] A FIG. 9 mostra os níveis de ALA no plasma (em μM) de animais individuais à linha de base, e após tratamento com fenobarbital em animais que receberam tratamento de siRNA de ALAS1 e de controle (siRNA de LUC).
[00226] A FIG. 10 mostra médias ± desvios padrões de níveis de PBG no plasma (em μM) à linha de base, e após tratamento com fenobarbital em animais que receberam tratamento de siRNA de ALAS1 e de controle (siRNA de LUC).
[00227] A FIG. 11 mostra os níveis de PBG no plasma (em μM) de animais individuais à linha de base, e após tratamento com fenobarbital em animais que receberam tratamento de siRNA de ALAS1 e de controle (siRNA de LUC).
[00228] A FIG. 12 mostra o nível de mALAS1mRNA relativo no fígado à linha de base, e após tratamento com fenobarbital em animais experimentais representativos selecionados (siRNA de ALAS1) e de controle (PBS).
[00229] A FIG. 13 mostra os efeitos de três siRNAs de mALAS1 conjugados com GalNAc na expressão de mALAS1 (em relação a um controle de PBS) em tecido do fígado de camundongos.
[00230] A FIG. 14 mostra os níveis de ALA e PBG no plasma ao longo do tempo após administração de fenobarbital e tratamento com siRNA de ALAS1 ou siRNA de LUC de controle.
[00231] A FIG. 15 mostra os efeitos de siRNA de ALAS1 conjugado com GalNAc nos níveis de ALA no plasma e PBG no plasma no modelo de indução por fenobarbital de AIP de camundongo.
[00232] A FIG. 16 mostra efeitos dependentes da dose de um siRNA de ALAS1 em níveis de ALA e PBG no plasma no modelo de indução por fenobarbital de AIP no camundongo. Para os animais que receberam siRNA de ALAS1, a dose de siRNA administrada (0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, ou 1,0 mg/kg) é mostrada no eixo horizontal.
[00233] A FIG. 17, painel superior mostra o desenho experimental usado para estudar a supressão de ALA e PBG com um siRNA de ALAS1. O painel inferior mostra os níveis de ALA e PBG no plasma na referência, na condição de controle (Luc), e tratamento seguinte com um siRNA de ALAS1 na semana 0, semana 2, e semana 4.
[00234] A FIG. 18 mostra o desenho experimental usado para comparar os efeitos do tratamento com siRNA de ALAS1 ou hemina em um modelo animal de AIP (superior) e os resultados para níveis no plasma de ALA (μmol/L) (meio) e níveis de PBG no plasma (μmol/L) (inferior).
[00235] A FIG. 19 mostra níveis relativos de mRNA (ALAS1/GAPDH) em animais tratados com 30 mg/kg, 10 mg/kg, ou 3 mg/kg de AD-58632 em comparação com animais tratados com controle de PBS.
[00236] A FIG. 20 mostra o desenho experimental usado para pesquisar o efeito de resposta à dose do conjugado de ALAS1 de GalNAc AD-58632 em um modelo de AIP de rato.
[00237] A FIG. 21 mostra níveis relativos de mRNA de PBGD no fígado (gráfico superior) e níveis relativos de mRNA de ALAS1 no fígado (gráfico inferior) em um modelo de AIP de rato. Grupos de animais foram indivíduos a um de quatro tratamentos: (1) tratamento apenas com fenobarbital (PB), (2) tratamento com fenobarbital e siRNA de porfobilinogênio deaminase (PBGD), (3) fenobarbital, siRNA de PBGD, e 30 mg/kg de siRNA de ALAS1, (4) fenobarbital, siRNA de PBGD, e 10 mg/kg de siRNA de ALAS1.
[00238] A FIG. 22 mostra níveis urinários de PBG (painel superior) e ALA (painel inferior) relativamente a níveis de creatinina em um modelo de AIP de rato. Grupos de animais foram indivíduos a um de quatro tratamentos: (1) tratamento apenas com fenobarbital (PB), (2) tratamento com fenobarbital e siRNA de porfobilinogênio deaminase (PBGD), (3) fenobarbital, siRNA de PBGD, e 30 mg/kg de siRNA de ALAS1, (4) fenobarbital, siRNA de PBGD, e 10 mg/kg de siRNA de ALAS1.
[00239] A FIG. 23 mostra a supressão de mRNA de ALAS-1 por AD- 58632, em comparação com controle de PBS, em grupos de ratos que receberam cinco doses diárias de siRNA a 6 mg/kg, 2 mg/kg, ou 1 mg/kg versus doses únicas de bolus de siRNA a 30 mg/kg, 10 mg/kg, ou 5 mg/kg.
[00240] A FIG. 24 mostra a supressão de mRNA de ALAS-1 por AD- 58632, em comparação com controle de PBS, em grupos de ratos que receberam quatro doses semanais de siRNA a 10 mg/kg, 5 mg/kg, ou 2,5 mg/kg.
[00241] A FIG. 25 mostra a supressão de mRNA de ALAS-1 por AD- 58632 e por cinco dúplices de 19/19meros.
[00242] A FIG. 26 mostra os resultados de uma avaliação do efeito do comprimento da fita e saliências nos dois melhores 19meros.
[00243] A FIG. 27 é um gráfico que mostra os níveis de mRNA de ALAS1 no fígado (barras da esquerda) e no soro (barras da direita) para cada grupo de tratamento no estudo de NHP descrito no Exemplo 34.
[00244] A FIG. 28 mostra a supressão de mRNA de ALAS-1, em comparação com controle de PBS, em grupos de ratos que receberam 3 mg/kg ou 10 mg/kg de AD-58632 ou AD-60489.
[00245] A FIG. 29 mostra o desenho experimental usado para pesquisar a eficácia dos siRNAs de ALAS1 AD-58632 e AD-60489 na supressão de mRNA no fígado em primatas não humanos.
[00246] A FIG. 30 mostra a supressão dependente da dose de mRNA no fígado em primatas não humanos após tratamento com 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, ou 5 mg/kg de AD-58632 ou AD-60489.
[00247] A FIG. 31 mostra uma comparação dos resultados de supressão de mRNA obtidos de biopsias do fígado e do ensaio cERD em um estudo em primatas não humanos.
[00248] A FIG. 32 mostra a progressão temporal da supressão de mRNA avaliada usando o ensaio cERD em um estudo em primatas não humanos. O eixo horizontal mostra o tempo de acordo com o dia do estudo.
[00249] A FIG. 33 mostra a supressão de mRNA de ALAS1 em ratos que receberam PBS ou uma única dose de 5 mg/kg de um dos dúplices de siRNA indicados.
[00250] A FIG. 34 mostra as concentrações no fígado do siRNA em ratos que receberam uma única dose de 5 mg/kg do siRNA indicado.
[00251] A FIG. 35 (superior) mostra o desenho experimental usado para pesquisar a eficácia terapêutica de AD-60925 e AD-60926. A FIG. 35 (inferior) mostra os níveis relativos de mRNA de ALAS1/GAPDH de rato em ratos tratados com (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD e PB, (3) AF-11PBGD, PB, e 3 mg/kg de AD-60925, ou (4) AF11-PBGD, PB, e AD-60926.
[00252] A FIG. 36 mostra os níveis relativos de PBG na urina (superior) e ALA na urina (inferior) em ratos tratados com (1) AF11- PBGD, (2) AF11-PBGD e PB, (3) AF-11PBGD, PB, e 3 mg/kg de AD- 60925, ou (4) AF11-PBGD, PB, e AD-60926.
[00253] A FIG. 37 mostra os níveis relativos de PBG na urina (superior) e ALA na urina (inferior) ao longo do tempo em ratos tratados com (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD e PB, (3) AF-11PBGD, PB, e 3 mg/kg de AD-60925, ou (4) AF11-PBGD, PB, e AD-60926. As setas indicam os instantes em que PB foi administrado.
[00254] A FIG. 38 mostra os níveis relativos de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) em ratos que receberam 4 doses de PBS ou 2,5 mg/kg de um dos siRNAs indicados.
[00255] A FIG. 39 mostra os níveis relativos de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) em ratos que receberam uma única dose de PBS ou 2,5 mg/kg de um dos siRNAs indicados.
[00256] A FIG. 40 (superior) mostra os níveis relativos de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) em ratos que receberam uma única dose de PBS ou 3 mg/kg de um dos siRNA indicados. A FIG. 40 (inferior) mostra a concentração de siRNA no fígado.
[00257] A FIG. 41 (superior) mostra a supressão de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) por AD-60489, AD-60519, e AD-60901. A FIG. 41 (inferior) mostra a concentração de siRNA no fígado.
[00258] A FIG. 42 mostra os níveis relativos de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) em ratos que foram tratados com uma única dose de PBS ou 2,5 mg/kg de um dos siRNAs indicados.
[00259] A FIG. 43 mostra os níveis relativos de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) em ratos que foram tratados com PBS ou um dos siRNAs indicados a uma dose de 2,5 mg/kg duas vezes por semana durante 2 semanas.
[00260] A FIG. 44 (superior) mostra um diagrama esquemático do desenho experimental usado para pesquisar a eficácia terapêutica de múltiplas doses bissemanais de AD-60519. A FIG. 44 (inferior) mostra gráficos que ilustram a supressão de PBG na urina e ALA na urina em ratos que foram tratados com (i) siRNA de PBGD e seis doses de PBS, (ii) siRNA de PBGD, PB, e seis doses de PBS, (iii) siRNA de PBGD, PB, e seis doses de 2,5 mg/kg de AD-60519, ou (iv) siRNA de PBGD, PB, e seis doses de 5 mg/kg de AD-60519.
[00261] A FIG. 45 mostra gráficos que ilustram a supressão de PBG no soro (gráfico superior) e ALA no soro (gráfico inferior) em um modelo de AIP de camundongo que foram tratados com (i) siRNA de PBGD e seis doses de PBS (Referência), (ii) siRNA de PBGD, PB, e seis doses de PBS (Salina), (iii) siRNA de PBGD, PB, e seis doses de 2,5 mg/kg de AD-60519, ou (iv) siRNA de PBGD, PB, e seis doses de 5 mg/kg de AD- 60519.
[00262] A FIG. 46 (superior) mostra um diagrama esquemático do desenho experimental usado para pesquisar a eficácia terapêutica de múltiplas doses semanais de AD-60519. A FIG. 46 (inferior) mostra um gráfico ilustrando os níveis relativos de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1/GAPDH) em ratos que foram tratados com (i) siRNA de PBGD e quatro doses de PBS, (ii) siRNA de PBGD, PB, e quatro doses de PBS, (iii) siRNA de PBGD, PB, e quatro doses de 3 mg/kg de AD-60519, (iv) siRNA de PBGD, PB, e quatro doses de 1 mg/kg de AD-60519, ou (v) siRNA de PBGD, PB, e quatro doses de 0,3 mg/kg de AD-60519.
[00263] A FIG. 47 mostra gráficos ilustrando os níveis de PBG na urina (gráfico superior) e ALA na urina (gráfico inferior) em ratos que foram tratados com (i) siRNA de PBGD e quatro doses de PBS, (ii) siRNA de PBGD, PB, e quatro doses de PBS, (iii) siRNA de PBGD, PB, e quatro doses de 3 mg/kg de AD-60519, (iv) siRNA de PBGD, PB, e quatro doses de 1 mg/kg de AD-60519, ou (v) siRNA de PBGD, PB, e quatro doses de 0,3 mg/kg de AD-60519.
[00264] A FIG. 48 é um diagrama esquemático que mostra o desenho de um estudo em primatas não humanos em que foram pesquisados efeitos de conjugados de GalNAc de siRNA de ALAS1 na supressão de mRNA de ALAS1 no fígado e mRNA de ALAS1 em circulação.
[00265] A FIG. 49 é um gráfico que mostra a supressão de mRNA no fígado em primatas não humanos (NHPs) após tratamento com conjugados de GalNAc de siRNA de ALAS1.
[00266] A FIG. 50 é um gráfico que mostra os níveis normalizados no soro de mRNA de ALAS1 em primatas não humanos (NHPs) em vários instantes durante a progressão de um estudo em que foram pesquisados efeitos do tratamento com conjugados de GalNAc de siRNA de ALAS1. Os dias no eixo horizontal correspondem aos dias no diagrama esquemático da FIG. 48.
[00267] A FIG. 51 mostra os níveis normalizados de mRNA de ALAS1 (mostrados como uma fração do nível pré-dose) avaliados em um estudo de dose única em ratos que usou cERD na urina para monitorar a supressão de ALAS1.
[00268] A FIG. 52 é um diagrama esquemático que mostra o desenho de um estudo em primatas não humanos em que foram pesquisados efeitos de múltiplas doses e dose única de AD-60519 na supressão de mRNA de ALAS1 no fígado e mRNA de ALAS1 em circulação.
[00269] A FIG. 53 é um gráfico de barras que mostra os níveis médios relativos de mRNA de ALAS1 no fígado (% de controle de PBS) no dia do estudo 24 (grupos de múltiplas doses) ou no dia do estudo 4 (grupos de dose única).
[00270] A FIG. 54 é um gráfico que mostra níveis normalizados de mRNA de ALAS1 no soro (mostrados como uma fração do nível pré- dose) avaliados usando cERD para os grupos de múltiplas doses (gráfico superior, mostrando resultados até ao dia 24) e grupos de dose única (gráfico inferior, mostrando resultados até ao dia 22).
[00271] A FIG. 55 é um gráfico que mostra os níveis de mRNA no fígado, mRNA no soro, e mRNA na urina no dia do estudo 4 (nos grupos de dose única) ou no dia do estudo 24 (nos grupos de múltiplas doses). São mostrados dados para animais individuais e as médias para cada grupo.
[00272] A FIG. 56 é um gráfico que mostra níveis normalizados de mRNA no soro de ALAS1 (mostrados como uma fração do nível pré- dose) após 8 semanas, avaliados usando cERD para os grupos de múltiplas doses. Cada ponto do gráfico representa o mRNA de ALAS1 restante para a média do grupo de 3 amostras de animais ± o desvio padrão do grupo.
[00273] A FIG. 57 é um diagrama esquemático da estrutura de ALN- 60519 (também referida aqui como AD-60519). A FIG. 57 revela as SEQ ID NOS 5238-5239, respectivamente, por ordem de aparecimento.
[00274] A FIG. 58 mostra níveis de mRNA de ALAS1 avaliados em amostras correspondentes de soro ou urina obtidas de pacientes com AIP ou voluntários saudáveis normais (NHV). Os níveis de mRNA de ALAS1 no soro ou urina foram medidos usando o método cERD. Nos pacientes com AIP A e B, foi recolhido um segundo conjunto de amostras de soro e urina para avaliar a variabilidade de mRNA de ALAS1 ao longo do tempo.
Descrição Detalhada da Invenção
[00275] O iRNA dirige a degradação específica quanto à sequência de mRNA através de um processo conhecido como interferência de RNA (RNAi). São descritos aqui iRNAs e métodos de uso dos mesmos para inibição da expressão de um gene ALAS1 em uma célula ou um mamífero onde o iRNA se dirige a um gene ALAS1. São proporcionadas também composições e métodos para distúrbios relacionados com expressão de ALAS1, tais como porfirias (por exemplo, porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP ou porfiria de Doss), porfiria aguda intermitente, porfiria eritropoiética congênita, porfiria cutânea tardia, coproporfiria hereditária (coproporfiria), porfiria variegata, protoporfiria eritropoiética (EPP), anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), e eritroporfiria transiente da infância).
[00276] As porfirias são distúrbios herdados ou adquiridos que podem ser causados por atividade diminuída ou intensificada de enzimas específicas na via biossintética do heme, também referida aqui como a via da porfirina (Ver FIG. 1). As porfirinas são os principais precursores do heme. As porfirinas e precursores de porfirina incluem ácido δ-aminolevulinico (ALA), porfobilinogênio (PBG), hidroximetilbilano (HMB), uroporfirinogênio I ou III, coproporfirinogênio I ou III, protoporfirinogênio IX, e protoporfirina IX. O heme é uma parte essencial da hemoglobina, mioglobina, catalases, peroxidases, e citocromos, incluindo estes últimos os citocromos do fígado P450 e respiratórios. O heme é sintetizado na maioria das ou em todas as células humanas. Cerca de 85 % do heme é fabricado em células eritroides, principalmente para hemoglobina. A maioria do heme restante é fabricada no fígado, 80 % do qual é usado para síntese de citocromos. A deficiência de enzimas específicas na via da porfirina leva a produção insuficiente de heme e também a um acúmulo de precursores de porfirina e/ou porfirinas, que podem ser tóxicos para a função de células ou órgãos em elevadas concentrações.
[00277] As porfirias podem se manifestar com complicações neurológicas ("aguda"), problemas na pele ("cutâneas"), ou ambos. As porfirias podem ser classificadas pelo principal local da sobreprodução e acúmulo de porfirinas ou seus precursores. Nas porfirias hepáticas, as porfirinas e precursores de porfirina são sobreproduzidos predominantemente no fígado, ao passo que, nas porfirias eritropoiéticas, as porfirinas são sobreproduzidas nas células eritroides no osso. As porfirias agudas ou hepáticas levam a disfunção do sistema nervoso e manifestações neurológicas que podem afetar o sistema nervoso central e periférico, resultando em sintomas tais como, por exemplo, dor (por exemplo, dor abdominal e/ou dor neuropática crônica), vómitos, neuropatia (por exemplo, neuropatia aguda, neuropatia progressiva), fraqueza muscular, convulsões, perturbações mentais (por exemplo, alucinações, ansiedade depressiva, paranoia), arritmias cardíacas, taquicardia, prisão de ventre, e diarreia. As porfirias cutâneas ou eritropoiéticas afetam principalmente a pele, causando sintomas tais como fotossensibilidade que pode ser dolorosa, bolhas, necrose, comichão, inchaço, e crescimento aumentado do cabelo em áreas tais como a testa. A infecção subsequente de lesões da pele pode levar a perda de osso e tecido, bem como cicatrizes, desfiguração, e perda de dígitos (por exemplo, dedos da mão, dedos do pé). A maioria das porfirias é causada por mutações que codificam enzimas na via biossintética do heme. Um sumário das porfirias associadas a erros genéticos no metabolismo do heme é proporcionado na FIG. 2.
[00278] Nem todas as porfirias são genéticas. Por exemplo, os pacientes com doença do fígado podem desenvolver porfiria como resultado de disfunção do fígado, e uma forma transiente de eritroporfiria (eritroporfiria transiente da infância) foi descrita na infância (ver Crawford, R.I. et al. J Am Acad Dermatol. Ag 1995; 33(2 Pt 2):333- 6.) Os pacientes com PCT podem adquirir a atividade deficiente de uroporfirinogênio descarboxilase (URO-D), devido à formação de uma enzima ORO-D com atividade enzimática menor do que o normal (ver Phillips et al.Blood, 98:3179-3185, 2001.)
[00279] A porfiria aguda intermitente (AIP) (também referida como deficiência de porfobilinogênio (PBG) deaminase, ou deficiência de hidroximetilbilano sintase (HMBS)) é o tipo mais comum de porfiria hepática aguda. Outros tipos de porfirias hepáticas agudas incluem coproporfiria hereditária (HCP), porfiria variegata (VP), e porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP). As porfirias hepáticas agudas são descritas, por exemplo, em Balwani, M e Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
[00280] A AIP é tipicamente uma doença dominante autossomal que é caracterizada por uma deficiência da enzima porfobilinogênio deaminase (PBG deaminase); esta enzima é também conhecida como hidroximetilbilano sintase (HMB sintase ou HMBS). A PBG deaminase é a terceira enzima da via biossintética do heme (ver FIG. 1) e catalisa a condensação cabeça com cauda de quatro moléculas de porfobilinogênio no tetrapirrol linear, hidroximetilbilano (HMB). Alternativamente, foram descritas variantes de transcrito processadas codificando diferentes isoformas da PBG deaminase. As mutações na PBG deaminase estão associadas à AIP. Tais mutações podem levar a quantidade diminuídas de PBG deaminase e/ou atividade diminuída de PBG deaminase (os indivíduos afetados têm tipicamente redução de ~50 % na atividade da PBG deaminase).
[00281] Existem pelo menos dois modelos diferentes da patofisiologia da AIP e outras porfirias hepáticas agudas (ver, por exemplo, Lin CS-Y et al., Clinical Neurophysiology, 2011; 122:2336-44). De acordo com um modelo, a produção diminuída do heme resultando da deficiência de PBG deaminase causa falha de energia e degeneração axonal. De acordo com o outro modelo, correntemente mais favorecido, o acúmulo de precursores de porfirina (por exemplo, ALA e PBG) resulta em neurotoxicidade.
[00282] Se descobriu que a AIP tem uma prevalência tão elevada quanto 1 em 10.000 em certas populações (por exemplo, no Norte da Suécia; ver Floderus Y, et al.Clin Genet. 2002;62:288-97). Se estima que a prevalência na população geral nos Estados Unidos e Europa, excluindo o R.U., seja cerca de 1 em 10.000 a 1 em 20.000. A doença clínica se manifesta em somente aproximadamente 10-15 % dos indivíduos que transportam mutações que se sabe que estão associadas à AIP. No entanto, a penetração é tão elevada quanto 40 % em indivíduos com certas mutações (por exemplo, a mutação W198X). A AIP está tipicamente latente antes da puberdade. Os sintomas são mais comuns em mulheres do que em homens. A prevalência da doença está provavelmente subestimada devido à sua penetração incompleta e longos períodos de latência. Nos Estados Unidos, se estima que existam cerca de 2000 pacientes que sofreram pelo menos um ataque. Se estima que existam cerca de 150 casos recorrentes ativos em França, Suécia, no R.U., e Polônia; estes pacientes são predominantemente mulheres jovens, com uma idade média de 30. Ver, por exemplo, Elder et al., J Inherit Metab Dis., publicado online a 1 de nov, 2012.
[00283] A AIP afeta, por exemplo, os sistemas nervosos visceral, periférico, autonômico, e central. Os sintomas da AIP são variáveis e incluem sintomas gastrointestinais (por exemplo, dor abdominal grave e fracamente localizada, náusea/vómitos, prisão de ventre, diarreia, íleo), sintomas urinários (disúria, retenção/incontinência urinária, ou urina escura, por exemplo, urina vermelho escuro), sintomas neurológicos (por exemplo, neuropatia sensorial, neuropatia motora (por exemplo, afetando os nervos cranianos e/ou levando a fraqueza nos braços e pernas)), convulsões, dor neuropática (por exemplo, dor associada a neuropatia progressiva, por exemplo, dor neuropática crônica), sintomas neuropsiquiátricos (por exemplo, confusão mental, ansiedade, agitação, alucinação, histeria, delírio, apatia, depressão, fobias, psicose, insônia, sonolência, coma), envolvimento do sistema nervoso autonômico (resultando, por exemplo, em sintomas cardiovasculares tais como taquicardia, hipertensão, e/ou arritmias, bem como outros sintomas, tais como, por exemplo, níveis aumentados de catecolamina em circulação, transpiração, inquietação, e/ou tremor), desidratação, e anormalidades nos eletrólitos. Os sintomas mais comuns são dor abdominal e taquicardia. Manifestações neurológicas include neuropatia motora e autonômica e ataques. Os pacientes têm frequentemente dor neuropática crônica e desenvolvem uma neuropatia progressiva. Os pacientes com ataques recorrentes têm frequentemente um pródromo. Pode ocorrer paralisia permanente após um ataque grave. A recuperação de vários ataques que não sejam prontamente tratados pode levar semanas ou meses. Um ataque agudo pode ser fatal, por exemplo, devido a paralisia dos músculos respiratórios ou falha cardiovascular do desequilíbrio nos eletrólitos. (Ver, por exemplo, Thunell S. Hydroxymethylbilane Synthase Deficiency. 27 set 2005 [Atualizado 1 set 2011]. Em: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editores. GeneReviews™ [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993 (doravante Thunell (1993)), que é incorporado aqui por referência na sua totalidade). Antes da disponibilidade de tratamentos com Hemina, até 20 % dos pacientes com AIP morria da doença.
[00284] Em indivíduos que transportam genes para a AIP, o risco de câncer hepatocelular é aumentado. Naqueles com ataques recorrentes, o risco de câncer hepatocelular é particularmente grave: após a idade de 50, o risco é quase 100 vezes maior do que na população geral.
[00285] Os ataques de porfiria aguda podem ser precipitados por fatores endógenos ou exógenos. Os mecanismos pelos quais tais fatores induzem ataques podem incluir, por exemplo, procura aumentada por enzimas P450 hepáticas e/ou indução de atividade de ALAS1 no fígado. A procura aumentada por enzimas P450 hepáticas resulta em heme livre hepático diminuído, induzindo desse modo a síntese de ALAS1 hepático.
[00286] Fatores precipitantes incluem jejum (ou outras formas de toma de calorias reduzida ou inadequada, devido a dietas rápidas, atletas de longa distância, etc.), estresses metabólicos (por exemplo, infecções, cirurgia, viagens aéreas internacionais, e estresse psicológico), hormônios endógenos (por exemplo, progesterona), tabagismo, químicos estranhos solúveis em lipídeos (incluindo, por exemplo, químicos presentes no fumo do tabaco, certos fármacos de prescrição, solventes orgânicos, biocidas, componentes em bebidas alcoólicas), fatores endócrinos (por exemplo, hormônios reprodutores (as mulheres podem experienciar exacerbações durante o período pré- menstrual), estrogênios sintéticos, progesteronas, estimulantes da ovulação, e terapia de substituição de hormônios). Ver, por exemplo, Thunell (1993).
[00287] Mais do que 1000 fármacos estão contraindicados nas porfirias hepáticas agudas (por exemplo, AIP, HCP, ADP, e VP) incluindo, por exemplo, álcool, barbituratos, Carbamazepina, Carisoprodol, Clonazepam (doses elevadas), Danazol, Diclofenac e possivelmente outros NSAIDS, Ergots, estrogênios, Eticlorvinol, Glutetimida, Griseofulvina, Mefenitoína, Meprobamato (também mebutamato e tibutamato), Metiprilon, Metodopramida, Fenitoína, Primidona, progesterona e progestinas sintéticas, Pirazinamida, Pirazolonas (aminopirina e antipirina), Rifampin, Succinimidas (etosuximida e metsuximida), antibióticos de sulfonamida, e Ácido valproico.
[00288] Sinais objetivos da AIP incluem descoloração da urina durante um ataque agudo (a urina pode aparecer vermelha ou marrom- avermelhada), e concentrações aumentadas de PBG e ALA na urina durante um ataque agudo. O teste genético molecular identifica mutações no gene da PBG deaminase (também conhecida como HMBS) em mais do que 98 % dos indivíduos afetados. Thunell (1993).
[00289] O diagnóstico de porfiria pode envolver avaliação do historial familiar, avaliação de níveis de precursores de porfirina na urina, sangue, ou fezes, e/ou avaliação da atividade enzimática e análise de mutação de DNA. O diagnóstico diferencial de porfirias pode envolver determinação do tipo de porfiria por medição de níveis individuais de porfirinas ou precursores de porfirina (por exemplo, ALA, PBG) na urina, fezes, e/ou plasma (por exemplo, por cromatografia e fluorometria) durante um ataque. O diagnóstico de AIP pode ser confirmado por estabelecimento de que a atividade de PBG deaminase dos eritrócitos está a 50 % ou menos do nível normal. O teste de DNA quanto a mutações pode ser levado a cabo em pacientes e membros da família em risco. O diagnóstico de AIP é tipicamente confirmado por teste de DNA para identificar uma mutação de gene causadora específica (por exemplo, uma mutação de HMBS).
[00290] A gestão corrente de ataques agudos de AIP envolve hospitalização, monitoração de sintomas, e remoção de fármacos que não sejam seguros. O tratamento de ataques agudos requer tipicamente hospitalização para controlar e tratar sintomas agudos, incluindo, por exemplo, dor abdominal, convulsões, desidratação/hiponatremia, náusea/vómitos, taquicardia/hipertensão, retenção urinária/íleo. Por exemplo, a dor abdominal pode ser tratada, por exemplo, com analgésicos narcóticos, as convulsões podem ser tratadas com precauções contra as convulsões e possivelmente medicações (embora muitas medicações anticonvulsões sejam contraindicados), náusea/vómitos podem ser tratados, por exemplo, com fenotiazinas, e taquicardia/hipertensão podem ser tratados, por exemplo, com beta bloqueantes. O tratamento pode incluir retirada de medicações inseguros, monitorização da função respiratória, bem como força muscular e estado neurológico. Os ataques ligeiros (por exemplo, aqueles com nenhuma paresia ou hiponatremia) podem ser tratados com pelo menos 300 g de glicose a 10 % intravenosa por dia, embora cada vez mais seja proporcionada imediatamente hemina. Os ataques graves são tipicamente tratados o mais cedo possível com hemina intravenosa (3-4 mg/kg diariamente durante 4-14 dias) e com glicose IV enquanto se espera que a hemina IV tenha efeito. Tipicamente, os ataques são tratados com hemina IV durante 4 dias e com glicose IV enquanto se espera pela administração da hemina IV. Em um período de 3-4 dias após o início da administração de hemina, habitualmente ocorre uma melhoria clínica acompanhada de uma diminuição dos níveis de ALA e PBG.
[00291] A hemina (Panhematin® ou hemina para injeção, previamente conhecida como hematina) é o único produto de heme aprovado para uso nos Estados Unidos e foi o primeiro fármaco aprovado sob a Lei dos Medicamentos Órfãos. A Panhematin® é hemina derivada de células dos glóbulos vermelhos processadas (PRBCs), e é Protoporfirina IX contendo um íon de ferro férrico (Heme B) com um ligante de cloreto. O heme atua para limitar a síntese hepática e/ou na medula óssea da porfirina. O mecanismo exato pelo qual a hemina produz melhoria sintomática em pacientes com episódios agudos das porfirias hepáticas não foi elucidado; no entanto, a sua ação é provavelmente devido à inibição (feedback) da ácido δ- aminolevulínico sintase (ALA), a enzima que limita a taxa da via biossintética da porfirina/heme. Ver rótulo do produto Panhematin®, Lundbeck, Inc., outubro 2010. A inibição da ALA sintase deve resultar em produção reduzida de ALA e PBG bem como porfirinas e intermediários da porfirina.
[00292] As desvantagens produtos de heme (por exemplo, hemina) incluem um impacto retardado em sintomas clínicos e falha em prevenir a recorrência de ataques. Reações adversas associadas a administração de heme (por exemplo, hemina) podem incluir flebite (por exemplo, tromboflebite), dificuldade com o acesso venoso, anticoagulação (ou coagulopatias), trombocitopenia, paragem renal, ou sobrecarga de ferro, que é particularmente provável em pacientes requerendo múltiplos tratamentos de hemina para ataques recorrentes. Para prevenir flebite, um cateter venoso permanente é necessário para acessar em pacientes com ataques recorrentes. Podem ocorrer danos renais com doses elevadas. Efeitos secundários raramente relatados incluem febre, dores, mal-estar, hemólise, anafilaxia, e colapso respiratório. Ver Anderson, K.E., Approaches to Treatment and Prevention of Human Porphyrias, em The Porphyrin Handbook: Medical Aspects of Porphyrins, Editado por Karl M. Kadish, Kevin M. Smith, Roger Guilard (2003) (doravante Anderson).
[00293] O heme é difícil de preparar em uma forma estável para administração intravenosa. É insolúvel a pH neutro mas pode ser preparado como hidróxido de heme a pH 8 ou mais elevado. Anderson. A panhematina é uma preparação de hemina liofilizada. Quando a hemina liofilizada é solubilizada para administração intravenosa, se formam rapidamente produtos de degradação; estes produtos de degradação são responsáveis por um efeito anticoagulante transiente e por flebite no local de infusão. Anderson. A albumina de heme e o arginato de heme (Normosang, a versão europeia da hemina) são mais estáveis e podem potencialmente causar menos tromboflebite. No entanto, o arginato de heme não está aprovado para uso nos Estados Unidos. A panhemina pode ser estabilizada por sua solubilização para infusão em albumina humana a 30 % em vez de em água estéril; no entanto, a albumina adicionada efeitos de expansão do volume intravascular e aumenta o custo de tratamento bem como risco de patogênios uma vez que é isolada a partir de sangue humano. Ver, por exemplo, Anderson, supra.
[00294] O tratamento bem-sucedido de um ataque agudo não previne ou atrasa a recorrência. Existe uma questão de se a própria hemina consegue desencadear ataques recorrentes devido a indução da heme oxigenase. Em todo o caso, em algumas áreas (especialmente França), as mulheres jovens com ataques recorrentes múltiplos estão sendo tratadas com hemina semanalmente com o objetivo de alcançar profilaxia.
[00295] A experiência limitada com transplante de fígado sugere que, se bem-sucedido, é um tratamento eficaz para a AIP. Existiram aproximadamente 12 transplantes na Europa em pacientes humanos, com efeitos curativos ou variáveis. O transplante de fígado pode restaurar a excreção normal de ALA e PBG e prevenir ataques agudos. Ver, por exemplo, Dar, F.S. et al. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 9(1):93-96 (2010). Além do mais, se o fígado de um paciente com AIP for transplantado em outro paciente ("transplante em dominó"), o paciente recebendo o transplante pode desenvolver AIP.
[00296] Entre os efeitos clínicos a longo prazo de porfirias agudas está a dor neuropática crônica que pode resultar de uma neuropatia progressiva devido a efeitos neurotóxicos, por exemplo, de elevados percursores de porfirina (por exemplo, ALA e/ou PBG). Os efeitos neurotóxicos podem estar associados à produção de intermediários de heme tóxicos, por exemplo, sinalização de GABA alterada e/ou produção de oxidação mediada por ferro e de espécies de oxigênio reativas (ROS). Os pacientes podem sofrer de dor neuropática antes de ou durante um ataque agudo. Os pacientes mais velhos podem experienciar dor neuropática aumentada com a idade para a qual são tipicamente prescritos vários fármacos narcóticos. Anormalidades no eletromiograma e tempos de condução diminuídos foram documentados em pacientes com porfirias hepáticas agudas. De nota, camundongos não tratados, não induzidos com AIP (deficiência de PBG deaminase) desenvolvem uma neuropatia motora progressiva que se mostrou que causa degeneração e perda progressivas dos axônios nervosos do quadríceps presumivelmente devido a níveis constitutivamente elevados de precursor de porfirina (ALA & PBG), porfirinas e/ou deficiência de heme (Lindberg et al., J. Clin.Invest., 103(8): 1127-1134, 1999). Em pacientes com porfiria aguda (por exemplo, ADP, AIP, HCP ou VP), os níveis de precursores de porfirina (ALA & PBG) estão frequentemente elevados em pacientes assintomáticos e em pacientes sintomáticos entre ataques. Assim, se espera que a redução dos precursores de porfirina e a retomada da biossíntese normal do heme por redução do nível da expressão e/ou atividade de ALAS1 previnam e/ou minimizem o desenvolvimento de neuropatia crônica e progressiva. O tratamento, por exemplo, tratamento crônico (por exemplo, tratamento periódico com iRNA como descrito aqui, por exemplo, tratamento de acordo com um regime de dosagem como descrito aqui, por exemplo, tratamento semanalmente ou bissemanalmente) pode reduzir continuamente a expressão de ALAS1 em pacientes com porfiria aguda que têm elevados níveis de precursores de porfirina, porfirinas, produtos de porfirina ou seus metabolitos. Tal tratamento pode ser proporcionado como necessário para prevenir ou reduzir a frequência ou gravidade dos sintomas (por exemplo, dor e/ou neuropatia) de um paciente individual e/ou reduzir um nível de um precursor de porfirina, porfirina, produto ou metabolito de porfirina.
[00297] Existe a necessidade de identificar novos terapêuticos que possam ser usados para o tratamento de porfirias. Como discutido acima, os tratamentos existentes tais como produtos de heme (por exemplo, hemina) têm numerosas desvantagens. Por exemplo, o impacto da hemina nos sintomas clínicos é atrasado, é caro, e pode ter efeitos secundários (por exemplo, tromboflebite, anticoagulação, trombocitopenia, sobrecarga de ferro, insuficiência renal). Os novos terapêuticos tais como aqueles descritos aqui podem considerar estas desvantagens e as necessidades não satisfeitas de pacientes por, por exemplo, atuando mais tempo, não induzindo flebite, proporcionando a conveniência de administração subcutânea, prevenindo com sucesso ataques recorrentes, prevenindo ou melhorando a dor (por exemplo, dor neuropática crônica) e/ou neuropatia progressiva, e/ou não causando efeitos adversos associados à hemina (por exemplo, sobrecarga de ferro, risco aumentado de câncer hepatocelular).
[00298] Pacientes com AIA incluem aqueles que sofrem de ataques recorrentes e aqueles que sofrem de ataques agudos, esporádicos. Nos pacientes que sofrem de ataques recorrentes, cerca de 5-10 % têm ataques intermitentes recorrentes (2-3 ataques por ano) ou ataques recorrentes (>4 ataques por ano). É muito provável que estes pacientes considerem transplante do fígado ou recebam infusões profiláticas de heme (por exemplo, hemina). É provável que os pacientes com ataques recorrentes tenham fraca qualidade de vida devido a longas hospitalizações, dependência de opiatos, e/ou toxicidade na rede venosa. A administração crônica de heme pode induzir heme oxigenase (HO-1). Assim, pode ser difícil despegar pacientes do heme e alguns requerem tratamento mais frequente. Em consequência, alguns médicos estão restringindo o uso de heme aos ataques mais graves. Em conformidade, há uma necessidade ainda não satisfeita de profilaxia e tratamentos convenientes, eficazes com melhor tolerabilidade.
[00299] Para pacientes que sofrem de ataques agudos, as diretrizes clínicas sugerem a administração de heme tão cedo quanto possível. No entanto, dados os desafios do diagnóstico e ausência de disponibilidade imediata de fármacos, a administração pode ser retardada. O surgimento lento dos efeitos de heme (por exemplo, hemina) e a sua fraca tolerabilidade abrandam o período de tempo até ocorrerem melhorias. A persistência de dor abdominal grave, mesmo após a administração de heme, pode impor que os pacientes recebam opiatos durante múltiplos dias.
[00300] A administração retardada de heme ou exposição continuada a fatores precipitantes pode conduzir a complicações mais graves, incluindo neuropatia motora e sintomas acompanhantes (por exemplo, fraqueza, paresia). Falha respiratória e paralisia podem ocorrer em casos graves. A recuperação de sintomas neurológicos pode levar muito mais tempo a resolver. Em conformidade, no contexto de ataques agudos, são necessários tratamentos que tenham um início de ação mais rápido e melhor tolerabilidade.
[00301] A validação farmacológica de ALAS1 como alvo do silenciamento de mRNA é suportada pelo menos pelas descobertas seguintes: o mRNA de ALAS1 é fortemente regulado positivamente durante um ataque; a pan hematina modula negativamente o ALAS-1; e a adição de heme a células do fígado em cultura conduz a mRNA de ALAS-1 reduzido. Várias descobertas também indicam que a supressão de mRNA de ALAS1 pode ser alcançada por direcionamento para o fígado. Por exemplo, tem sido verificado que o transplante de fígado é curativo; e metabólitos derivados do fígado levam à ocorrência de ataques (ver, por exemplo, Dar et al. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9:93-6 (2010); Dowman et al. Ann Intern Med 154:571-2 (2011); e Wu et al. Genes Dev 23:2201-2209 (2009). Assim, a redução da expressão de ALAS1, por exemplo, no fígado, usando composições de iRNA pode ser usada para tratar uma porfiria. Em certas modalidades, composições de iRNA podem ser usadas para profilaxia e tratamento agudo de porfirias. Por exemplo, composições de iRNA podem ser usadas profilaticamente em um cenário de ataques recorrentes para induzir supressão de longa duração ou crônica da expressão de ALAS1 (conducente a supressão de longa duração ou crônica de ALA/PBG), e assim atenuar a regulação positiva de ALAS1 recorrente que leva à ocorrência dos ataques. Tal tratamento profilático pode reduzir o número e a gravidade dos ataques. Durante um cenário de ataque agudo, a administração de uma composição de iRNA pode tratar um ataque agudo, por exemplo, por redução dos níveis de ALA/PBG.
[00302] A presente divulgação proporciona métodos e composições de iRNA para modulação da expressão de um gene ALAS1. Em certas modalidades, a expressão de ALAS1 é reduzida ou inibida usando um iRNA específico quanto a ALAS1, levando desse modo a uma expressão diminuída de um gene ALAS1. A expressão reduzida de um gene ALAS1 pode reduzir o nível de um ou mais precursores de porfirina, porfirinas, ou produtos ou metabolitos de porfirina. A expressão diminuída de um gene ALAS1, bem como diminuições relacionadas no nível de um ou mais precursores de porfirina e/ou porfirinas, pode ser útil no tratamento de distúrbios relacionados com expressão de ALAS1, por exemplo, porfirias.
[00303] Os iRNAs das composições apresentadas aqui incluem uma fita de RNA (a fita antissenso) tendo uma região que tem 30 nucleotídeos de comprimento, i.e., 15-30 nucleotídeos de comprimento, geralmente 19-24 nucleotídeos de comprimento, cuja região é substancialmente complementar com pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene ALAS1 (também referido como um "iRNA específico quanto a ALAS1"). O uso de um tal iRNA permite a degradação direcionada de mRNAs de genes que estão implicados em patologias associadas a expressão de ALAS1 em mamíferos, por exemplo, porfirias tais como porfiria por deficiência de ALA desidratase (também conhecida como porfiria de Doss ou plumboporfiria) ou porfiria aguda intermitente. Dosagens muito baixas de iRNAs específicos quanto a ALAS1 podem especificamente e eficazmente mediar RNAi, resultando em inibição significativa da expressão de um gene ALAS1. Os iRNAs se dirigindo a ALAS1 podem especificamente e eficazmente mediar RNAi, resultando em inibição significativa da expressão de um gene ALAS1, por exemplo, em ensaios baseados em células. Assim, métodos e composições incluindo estes iRNAs são úteis para tratamento de processos patológicos relacionados com expressão de ALAS1, tais como porfirias (por exemplo, anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), porfiria por deficiência de ALA desidratase (porfiria de Doss), porfiria aguda intermitente (AIP), porfiria eritropoiética congênita, porfiria cutânea tardia, coproporfiria hereditária (coproporfiria), porfiria variegata, protoporfiria eritropoiética (EPP), e eritroporfiria transiente da infância).
[00304] A seguinte descrição divulga como preparar e usar composições contendo iRNAs para inibir a expressão de um gene ALAS1, bem como composições e métodos para tratamento de doenças e distúrbios causados pela ou modulados pela expressão deste gene. Modalidades das composições farmacêuticas apresentadas na invenção incluem um iRNA tendo uma fita antissenso compreendendo uma região que tem 30 nucleotídeos ou menos de comprimento, geralmente 19-24 nucleotídeos de comprimento, cuja região é substancialmente complementar com pelo menos parte de um transcrito de RNA de um gene ALAS1, em conjunto com um transportador farmaceuticamente aceitável. Modalidades das composições apresentadas na invenção incluem também um iRNA tendo uma fita antissenso tendo uma região de complementaridade que tem 30 nucleotídeos ou menos de comprimento, geralmente 19-24 nucleotídeos de comprimento, e é substancialmente complementar com parte de um transcrito de RNA de um gene ALAS1.
[00305] Por consequência, em alguns aspectos, composições farmacêuticas contendo um iRNA de ALAS1 e um transportador farmaceuticamente aceitável, métodos de uso das composições para inibir a expressão de um gene ALAS1, e métodos de uso das composições farmacêuticas para tratar distúrbios relacionados com expressão de ALAS1 são apresentadas na invenção.
I. Definições
[00306] Por conveniência, o significado de certos termos e frases usados na especificação, exemplos, e reivindicações anexadas, é proporcionado em baixo. Se existir uma discrepância aparente entre o uso de um termo em outras partes desta especificação e a sua definição em esta seção, a definição em esta seção imperará.
[00307] “G”, “C”, “A”, “T” e “U” designam cada um geralmente um nucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timidina e uracila como uma base, respectivamente. No entanto, será entendido que o termo “ribonucleotídeo” ou “nucleotídeo” pode também se referir a um nucleotídeo modificado, como detalhado adicionalmente em baixo, ou uma fração de substituição suplente. A pessoa perita está bem ciente de que guanina, citosina, adenina, e uracila podem ser substituídas por outras frações sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento de bases de um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo transportando tal fração de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo compreendendo inosina como sua base pode sofrer emparelhamento de bases com nucleotídeos contendo adenina, citosina ou uracila. Consequentemente, nucleotídeos contendo uracila, guanina, ou adenina podem ser substituídos nas sequências de nucleotídeos de dsRNA apresentadas na invenção por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Em outro exemplo, adenina e citosina em qualquer parte do oligonucleotídeo podem ser substituídas por guanina e uracila, respectivamente, para formar emparelhamento de bases Oscilantes G-U com o mRNA alvo. Sequências contendo tais frações de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na invenção.
[00308] Como usado aqui, “ALAS1” (também conhecido como ALAS- 1; δ-aminolevulinato sintase 1; δ-ALA sintase 1; ácido 5’-aminolevulínico sintase 1; ALAS-H; ALASH; ALAS-N; ALAS3; EC2.3.1.37; 5- aminolevulinato sintase, não específica, mitocondrial; ALAS; MIG4; OTTHUMP00000212619; OTTHUMP00000212620; OTTHUMP00000212621; OTTHUMP00000212622; proteína indutora da migração 4; EC 2.3.1) se refere a uma enzima mitocondrial codificada no núcleo que é a primeira e tipicamente limitante da taxa enzima na via biossintética do heme de mamífero. ALAS1 catalisa a condensação de glicina com succinil-CoA para formar ácido δ-aminolevulinico (ALA). O gene ALAs1 humano é expresso ubiquamente, é encontrado no cromossomo 3p21.1 e codifica tipicamente uma sequência de 640 aminoácidos. Em contraste, o gene ALAS-2, que codifica uma isozima, é expresso somente em eritrócitos, é encontrado no cromossomo Xp11.21, e codifica tipicamente uma sequência de 550 aminoácidos. Como usado aqui, uma “proteína ALAS1” significa qualquer variante de proteína de ALAS1 de qualquer espécie (por exemplo, humano, camundongo, primata não humano), bem como quaisquer seus mutantes e fragmentos que retenham uma atividade de ALAS1. Similarmente, um "transcrito de ALAS1" se refere a qualquer variante de transcrito de ALAS1, de qualquer espécie (por exemplo, humano, camundongo, primata não humano). Uma sequência de um transcrito de mRNA da variante 1 de ALAS1 de humano pode ser encontrada em NM_000688.4 (FIG. 3A e 3B; SEQ ID NO:1). Outro transcrito de mRNA de ALAS1 de humano, pode ser encontrada em NM_000688.5 (FIG. 4A e 4B; SEQ ID NO:382). O nível da proteína ALAS1 codificada madura é regulado pelo heme: elevados níveis de heme regulam por baixo a enzima madura na mitocôndria, enquanto baixos níveis de heme regulam por cima. Foram identificadas múltiplas variantes alternativamente processadas, codificando a mesma proteína.
[00309] Como usado aqui, o termo “iRNA”, “RNAi”, “agente de iRNA”, ou “agente de RNAi” se refere a um agente que contém RNA como esse termo é definido aqui, e que medeia a clivagem dirigida de um transcrito de RNA, por exemplo, através de uma via do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Em uma modalidade, um iRNA como descrito aqui efetua inibição da expressão de ALAS1. A inibição da expressão de ALAS1 pode ser avaliada com base em uma redução no nível de mRNA de ALAS1 ou uma redução no nível da proteína ALAS1. Como usado aqui, “sequência alvo” se refere a uma porção contígua da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene ALAS1, incluindo mRNA que é um produto do processamento de RNA de um produto de transcrição primária. A porção alvo da sequência será pelo menos longa o suficiente para servir como um substrato para clivagem dirigida por iRNA na ou próximo dessa porção. Por exemplo, a sequência alvo terá geralmente de 9-36 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 15-30 nucleotídeos de comprimento, incluindo todas as subgamas entre os mesmos. Como exemplos não limitantes, a sequência alvo pode ter de 15-30 nucleotídeos, 15-26 nucleotídeos, 15-23 nucleotídeos, 15-22 nucleotídeos, 15-21 nucleotídeos, 15-20 nucleotídeos, 15-19 nucleotídeos, 15-18 nucleotídeos, 15-17 nucleotídeos, 18-30 nucleotídeos, 18-26 nucleotídeos, 18-23 nucleotídeos, 18-22 nucleotídeos, 18-21 nucleotídeos, 18-20 nucleotídeos, 19-30 nucleotídeos, 19-26 nucleotídeos, 19-23 nucleotídeos, 19-22 nucleotídeos, 19-21 nucleotídeos, 19-20 nucleotídeos, 20-30 nucleotídeos, 20-26 nucleotídeos, 20-25 nucleotídeos, 20-24 nucleotídeos,20-23 nucleotídeos, 20-22 nucleotídeos, 20-21 nucleotídeos, 21-30 nucleotídeos, 21-26 nucleotídeos, 21-25 nucleotídeos, 21-24 nucleotídeos, 21-23 nucleotídeos, ou 21-22 nucleotídeos.
[00310] Como usado aqui, o termo “fita compreendendo uma sequência” se refere a um oligonucleotídeo compreendendo uma cadeia de nucleotídeos que é descrita pela sequência referida usando a nomenclatura de nucleotídeo padrão.
[00311] Como usado aqui, e a não ser que indicado de outro modo, o termo “complementar”, quando usado para descrever uma primeira sequência de nucleotídeos em relação a uma segunda sequência de nucleotídeos, se refere à capacidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência de nucleotídeos de hibridar e formar uma estrutura de dúplex sob certas condições com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência de nucleotídeos, como será entendido pela pessoa perita. Tais condições podem, por exemplo, ser condições estringentes, onde condições estringentes podem incluir: NaCl a 400 mM, PIPES a 40 mM pH 6,4, EDTA a 1 mM, 50 oC ou 70 oC durante 12-16 horas seguido de lavagem. Podem ser aplicadas outras condições, tais como condições fisiologicamente relevantes como pode ser encontrado dentro de um organismo. A pessoa perita será capaz de determinar o conjunto de condições mais apropriadas para um teste de complementaridade de duas sequências de acordo com a aplicação final dos nucleotídeos hibridados.
[00312] Sequências complementares dentro de um iRNA, por exemplo, dentro um dsRNA como descrito aqui, incluem emparelhamento de bases do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeos com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo uma segunda sequência de nucleotídeos ao longo do comprimento inteiro de uma ou de ambas as sequências de nucleotídeos. Tais sequências podem ser referidas como “totalmente complementares” uma no que diz respeito à outra. No entanto, onde uma primeira sequência é referida como “substancialmente complementar” no que diz respeito a uma segunda sequência aqui, as duas sequências podem ser totalmente complementares, ou podem formar um ou mais, mas geralmente não mais do que 5, 4, 3 ou 2 pares de bases sem correspondência após hibridação para formar um dúplex de até 30 pares de bases, enquanto retêm a capacidade de hibridar sob as condições mais relevantes para a sua aplicação final, por exemplo, inibição da expressão de genes através de uma via de RISC. No entanto, onde dois oligonucleotídeos são desenhados para formar, após hibridação, uma ou mais saliências de fita única, tais saliências não devem ser consideradas não correspondências no que diz respeito à determinação da complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonucleotídeo com 21 nucleotídeos de comprimento e outro oligonucleotídeo com 23 nucleotídeos de comprimento, em que o oligonucleotídeo mais longo compreende uma sequência de 21 nucleotídeos que é totalmente complementar com o oligonucleotídeo mais curto, pode ser ainda referido como “totalmente complementar” para os propósitos descritos aqui.
[00313] Sequências “complementares”, como usado aqui, podem também incluir, ou ser inteiramente formadas de pares de bases não de Watson-Crick e/ou pares de bases formados a partir de nucleotídeos não naturais e modificados, desde que sejam cumpridos os requisitos acima no que diz respeito à sua capacidade de hibridação. Tais pares de bases não de Watson-Crick incluem os, mas não estão limitados aos, emparelhamentos de bases Oscilantes G:U ou de Hoogstein.
[00314] Os termos “complementar”, “totalmente complementar” e “substancialmente complementar” aqui podem ser usados no que diz respeito ao emparelhamento de bases entre a fita senso e a fita antissenso de um dsRNA, ou entre a fita antissenso de um agente de iRNA e uma sequência alvo, como será entendido a partir do contexto do seu uso.
[00315] Como usado aqui, um polinucleotídeo que é “substancialmente complementar com pelo menos parte de” um RNA mensageiro (mRNA) se refere a um polinucleotídeo que é substancialmente complementar com uma porção contígua do mRNA de interesse (por exemplo, um mRNA codificando uma proteína ALAS1). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar com pelo menos uma parte de um mRNA de ALAS1 se a sequência for substancialmente complementar com uma porção não interrompida de um mRNA codificando ALAS1. Como outro exemplo, um polinucleotídeo é complementar com pelo menos uma parte de um mRNA de ALAS1 se a sequência for substancialmente complementar com uma porção não interrompida de um mRNA codificando ALAS1.
[00316] O termo "RNA de fita dupla" ou "dsRNA", como usado aqui, se refere a um iRNA que inclui uma molécula de RNA ou complexo de moléculas tendo uma região de dúplex hibridada que compreende duas fitas de ácido nucleico antiparalelas e substancialmente complementares, que serão referidas como tendo orientações "senso" e "antissenso" no que diz respeito a um RNA alvo. A região de dúplex pode ter qualquer comprimento que permita degradação específica de um RNA alvo desejado, por exemplo, através de uma via de RISC, mas variará tipicamente de 9 a 36 pares de bases de comprimento, por exemplo, 15-30 pares de bases de comprimento. Considerando um dúplex entre 9 e 36 pares de bases, o dúplex pode ter qualquer comprimento em esta gama, por exemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, ou 36 e qualquer subgama entre elas, incluindo, mas não se limitando a, 15-30 pares de bases, 15-26 pares de bases, 15-23 pares de bases, 15-22 pares de bases, 15-21 pares de bases, 15-20 pares de bases, 15- 19 pares de bases, 15-18 pares de bases, 15-17 pares de bases, 18-30 pares de bases, 21-24 pares de bases, 21-23 pares de bases, ou 21-22 pares de bases. Os dsRNAs gerados na célula por processamento com Dicer e enzimas similares estão geralmente na gama de 19-22 pares de bases de comprimento. Uma fita da região de dúplex de um dsRNA compreende uma sequência que é substancialmente complementar com uma região de um RNA alvo. As duas fitas formando a estrutura de dúplex podem ser de uma única molécula de RNA tendo pelo menos uma região autocomplementar, ou podem ser formadas a partir de duas ou mais moléculas de RNA separadas. Onde a região de dúplex é formada a partir de duas fitas de uma única molécula, a molécula pode ter uma região de dúplex separada por uma cadeia de fita única de nucleotídeos (aqui referida como uma "alça em grampo") entre a extremidade 3’ de uma fita e a extremidade 5’ da respectiva outra fita formando a estrutura de dúplex. A alça em grampo pode compreender pelo menos um nucleotídeo não emparelhado; em algumas modalidades, a alça em grampo pode compreender pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 23 ou mais nucleotídeos não emparelhados. Onde as duas fitas substancialmente complementares de um dsRNA são compreendidas por moléculas de RNA separadas, essas moléculas não necessitam de, mas podem estar covalentemente conectadas. Onde as duas fitas estão covalentemente conectadas sem ser por meio de uma alça em grampo, a estrutura conectante é referida como um "ligador". O termo “siRNA” é também usado aqui para se referir a um RNAi como descrito acima.
[00317] Em outra modalidade, o agente de iRNA pode ser um "siRNA de fita única" que é introduzido em uma célula ou organismo para inibir um mRNA alvo. O agente de RNAi de fita única se liga ao endonuclease Argonauta 2 do RISC, que cliva depois o mRNA alvo. Os siRNAs de fita única têm geralmente 15-30 nucleotídeos e estão quimicamente modificados. O desenho e teste de siRNAs de fita única são descritos na Patente dos E.U.A. No. 8,101,348 e em Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894, os conteúdos inteiros de cada um dos quais são deste modo incorporados aqui por referência. Qualquer uma das sequências de nucleotídeos antissenso descritas aqui (por exemplo, sequências proporcionadas nas Tabelas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 e 20 ou nas Tabelas 21-40) pode ser usada como um siRNA de fita única como descrito aqui ou como quimicamente modificada pelos métodos descritos em Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894.
[00318] Em outro aspecto, o agente de RNA é uma "molécula de RNA antissenso de fita única". Uma molécula de RNA antissenso de fita única é complementar com uma sequência dentro do mRNA alvo. As moléculas de RNA antissenso de fita única podem inibir a tradução de um modo estequiométrico por emparelhamento de bases com o mRNA e obstrução física da maquinaria de tradução, ver Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Alternativamente, as moléculas antissenso de fita única inibem um mRNA alvo por hibridação com o alvo e clivagem do alvo através de um evento de clivagem RNaseH. A molécula de RNA antissenso de fita única pode ter cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento e ter uma sequência que é complementar com uma sequência alvo. Por exemplo, a molécula de RNA antissenso de fita única pode compreender uma sequência que tem pelo menos cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos antissenso descritas aqui, por exemplo, sequências proporcionadas em qualquer uma das Tabelas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 e 20 ou nas Tabelas 21-40.
[00319] O especialista perito reconhecerá que o termo "molécula de RNA" ou "molécula de ácido ribonucleico" engloba não só moléculas de RNA como expressas ou encontradas na natureza, mas também análogos e derivados de RNA compreendendo um ou mais análogos ou derivados de ribonucleotídeo/ribonucleosídeo como descrito aqui ou como conhecido na técnica. Estritamente falando, um "ribonucleosídeo" inclui uma base nucleosídeo e um açúcar de ribose, e um "ribonucleotídeo" é um ribonucleosídeo com uma, duas ou três frações fosfato. No entanto, os termos "ribonucleosídeo" e "ribonucleotídeo" podem ser considerados como sendo equivalentes como usado aqui. O RNA pode estar modificado na estrutura de nucleobase, na estrutura de ribose ou na estrutura principal da ribose-fosfato, por exemplo, como descrito aqui em baixo. No entanto, as moléculas compreendendo análogos ou derivados de ribonucleosídeos têm de reter a capacidade de formar um dúplex. Como exemplos não limitantes, uma molécula de RNA pode também incluir pelo menos um ribonucleosídeo modificado incluindo mas não se limitando a um nucleosídeo modificado por 2'-O- metila, um nucleosídeo compreendendo um grupo 5'-fosforotioato, um nucleosídeo terminal ligado a um derivado de colesterila ou grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico, um nucleosídeo trancado, um nucleosídeo abásico, um nucleosídeo acíclico, um nucleosídeo modificado por 2'-deóxi-2'-flúor, um nucleosídeo modificado por 2'- amino, um nucleosídeo modificado por 2'-alquila, um nucleosídeo de morfolino, um fosforamidato ou um nucleosídeo compreendendo uma base não natural, ou qualquer sua combinação. Alternativamente, uma molécula de RNA pode compreender pelo menos dois ribonucleosídeos modificados, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20 ou mais, até ao comprimento total da molécula de dsRNA. As modificações não necessitam de ser as mesmas para cada um de uma tal pluralidade de ribonucleosídeos modificados em uma molécula de RNA. Em uma modalidade, os RNAs modificados contemplados para uso nos métodos e composições descritos aqui são ácidos nucleicos de peptídeo (PNAs) que têm a capacidade de formar a estrutura de dúplex requerida e que permitem ou medeiam a degradação específica de um RNA alvo, por exemplo, através de uma via de RISC.
[00320] Em um aspecto, um ribonucleosídeo modificado inclui um deoxirribonucleosídeo. Em um tal caso, um agente de iRNA pode compreender um ou mais deoxinucleosídeos, incluindo por exemplo, uma saliência(s) de deoxinucleosídeo, ou um ou mais ribonucleosídeos dentro da porção de fita dupla de um dsRNA. Em certas modalidades, a molécula de RNA compreende uma percentagem de deoxirribonucleoses de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 % ou mais elevada (mas não 100 %) de deoxirribonucleosídeos, por exemplo, emuma ou ambas as fitas. Em outras modalidades, o termo “iRNA” não abrange uma molécula de DNA de fita dupla (por exemplo, uma molécula de DNA de fita dupla de ocorrência natural ou uma molécula de DNA contendo 100 % de deoxinucleosídeos). Em um aspecto, um agente de interferência de RNA inclui um RNA de fita única que interatua com uma sequência de RNA alvo para dirigir a clivagem do RNA alvo. Sem desejar ser limitado pela teoria, o RNA de fita dupla longo introduzido nas células é degradado em siRNA por uma endonuclease do Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485). Dicer, uma enzima do tipo ribonuclease III, processa o dsRNA em curtos RNAs interferentes com 19-23 pares de bases com saliências 3' de duas bases características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são então incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam o dúplex de siRNA, permitindo que a fita antissenso complementar oriente o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Após ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Assim, em um aspecto, a invenção se relaciona com um RNA de fita único que promove a formação de um complexo RISC para efetuar o silenciamento do gene alvo.
[00321] Como usado aqui, o termo "saliência de nucleotídeo" se refere a pelo menos um nucleotídeo não emparelhado que sobressai da estrutura de dúplex de um iRNA, por exemplo, um dsRNA. Por exemplo, quando uma extremidade 3' de uma fita de um dsRNA se estende para além da extremidade 5' da outra fita, ou vice-versa, existe uma saliência de nucleotídeo. Um dsRNA pode compreender uma saliência de pelo menos um nucleotídeo; alternativamente, a saliência pode compreender pelo menos dois nucleotídeos, pelo menos três nucleotídeos, pelo menos quatro nucleotídeos, pelo menos cinco nucleotídeos ou mais. Uma saliência de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um deoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) saliência(s) pode(m) estar na fita senso, na fita antissenso ou qualquer sua combinação. Além do mais, o(s) nucleotídeo(s) de uma saliência pode(m) estar presente(s) na extremidade 5', extremidade 3' ou ambas as extremidades de uma fita antissenso ou senso de um dsRNA.
[00322] Em uma modalidade, a fita antissenso de um dsRNA tem uma saliência de 1-10 nucleotídeos na extremidade 3' e/ou na extremidade 5'. Em uma modalidade, a fita senso de um dsRNA tem uma saliência de 1-10 nucleotídeos na extremidade 3' e/ou na extremidade 5'. Em outra modalidade, um ou mais dos nucleotídeos na saliência estão substituídos por um nucleosídeo tiofosfato.
[00323] Os termos “coesivo” ou “de extremidades coesivas”, como usados aqui em referência a um dsRNA, significam que não existem nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos não emparelhados em uma dada extremidade terminal de um dsRNA, i.e., nenhuma saliência de nucleotídeo. Uma ou ambas as extremidades de um dsRNA podem ser coesivas. Onde ambas as extremidades de um dsRNA são coesivas, se diz que o dsRNA tem extremidades coesivas. Para ser claro, um dsRNA “de extremidades coesivas” é um dsRNA que é coesivo em ambas as extremidades, i.e., sem saliência de nucleotídeo em qualquer uma das extremidades da molécula. O mais frequentemente, uma tal molécula terá fita dupla ao longo de todo o seu comprimento.
[00324] O termo “fita antissenso” ou "fita guia" se refere à fita de um iRNA, por exemplo, um dsRNA, que inclui uma região que é substancialmente complementar com uma sequência alvo. Como usado aqui, o termo “região de complementaridade” se refere à região da fita antissenso que é substancialmente complementar com uma sequência, por exemplo, uma sequência alvo, como definido aqui. Onde a região de complementaridade não é totalmente complementar com a sequência alvo, as não correspondências podem estar nas regiões internas ou terminais da molécula. Geralmente, as não correspondências mais toleradas estão nas regiões terminais, por exemplo, a 5, 4, 3, ou 2 nucleotídeos do terminal 5’ e/ou 3’.
[00325] O termo “fita senso”, ou "fita passageira", como usado aqui, se refere à fita de um iRNA que inclui uma região que é substancialmente complementar com uma região da fita antissenso tal como esse termo é definido aqui.
[00326] Como usado aqui, o termo "SNALP" se refere a uma partícula estável de ácido nucleico-lipídeo. Um SNALP é uma vesícula de lipídeos revestindo um interior aquoso reduzido compreendendo um ácido nucleico tal como um iRNA, ou um plasmídeo a partir do qual é transcrito um iRNA. Os SNALPs são descritos, por exemplo, nas Publicações de Pedidos de Patentes dos E.U.A. Nos. 20060240093, 20070135372, e no Pedido Internacional No. WO 2009082817. Estes pedidos são incorporados aqui por referência na sua totalidade.
[00327] "Introdução em uma célula", quando se refere a um iRNA, significa facilitação ou efetuação de captação ou absorção na célula, como é entendido por aqueles peritos na técnica. A absorção ou captação de um iRNA pode ocorrer através de processos celulares difusivos ou ativos sem auxílio, ou por agentes ou dispositivos auxiliares. O significado deste termo não está limitado a células in vitro; um iRNA pode ser também "introduzido em uma célula", em que a célula é parte de um organismo vivo. Em um tal caso, a introdução na célula incluirá a distribuição ao organismo. Por exemplo, para distribuição in vivo, o iRNA pode ser injetado em um local do tecido ou administrado sistemicamente. A distribuição in vivo pode ser também ser por um sistema de distribuição de β-glucana, tais como aqueles descritos nas Patentes dos E.U.A. Nos. 5,032,401 e 5,607.677. e Publicação dos E.U.A. No. 2005/0281781, que são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. A introdução in vitro em uma célula inclui métodos conhecidos na técnica tais como eletroporação e lipofecção. Abordagens adicionais são descritas aqui em baixo ou conhecidas na técnica.
[00328] Como usado aqui, o termo "modular a expressão de" se refere a uma "inibição" pelo menos parcial ou "ativação" parcial da expressão de um gene ALAS1 em uma célula tratada com uma composição de iRNA como descrito aqui em comparação com a expressão de ALAS1 em uma célula de controle. Uma célula de controle inclui uma célula não tratada, ou uma célula tratada com um iRNA de controle não dirigido.
[00329] Os termos "ativar", "intensificar", "regular por cima a expressão de", "aumentar a expressão de", e similares, desde que se refiram a um gene ALAS1, se referem aqui à ativação pelo menos parcial da expressão de um gene ALAS1, como manifestado por um aumento na quantidade de mRNA de ALAS1, que pode ser isolado de ou detectado em uma primeira célula ou grupo de células no qual um gene ALAS1 é transcrito e que foi ou foram tratadas tal que a expressão de um gene ALAS seja aumentada, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntico à primeira célula ou grupo de células mas que não foi ou não foram assim tratado (células de controle).
[00330] Em uma modalidade, a expressão de um gene ALAS1 é ativada por pelo menos cerca de 10 %, 15 %, 20 %,25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, ou 50 % por administração de um iRNA como descrito aqui. Em algumas modalidades, um gene ALAS1 é ativado por pelo menos cerca de 60 %, 70 %, ou 80 % por administração de um iRNA apresentado na invenção. Em algumas modalidades, a expressão de um gene ALAS1 é ativada por pelo menos cerca de 80 %, 90 %, ou 95% ou mais por administração de um iRNA como descrito aqui. Em algumas modalidades, a expressão do gene ALAS1 é aumentada por pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais em células tratadas com um iRNA como descrito aqui em comparação com a expressão em uma célula não tratada. A ativação da expressão por pequenos dsRNAs é descrita, por exemplo, em Li et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:17337-42, e em US20070111963 e US2005226848, cada um dos quais é incorporado aqui por referência.
[00331] Os termos "silencia", "inibe a expressão de", "regula por baixo a expressão de", "suprime a expressão de", e similares, desde que se refiram a um gene ALAS1, se referem aqui à supressão pelo menos parcial da expressão de um gene ALAS1, como avaliado, por exemplo, com base na expressão de mRNA de ALAS1, expressão da proteína ALAS1, ou outro parâmetro funcionalmente ligado à expressão do gene ALAS1 (por exemplo, concentrações de ALA ou PBG no plasma ou urina). Por exemplo, a inibição da expressão de ALAS1 pode ser manifestada por uma redução da quantidade de mRNA de ALAS1 que pode ser isolado de ou detectado em uma primeira célula ou grupo de células no qual um gene ALAS1 é transcrito e que foi ou foram tratados tal que a expressão de um gene ALAS1 seja inibida, em comparação com um controle. O controle pode ser uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntico à primeira célula ou grupo de células, exceto que a segunda célula ou grupo de células não foi assim tratado (células de controle). O grau de inibição é usualmente expresso como uma percentagem de um nível de controle, por exemplo,
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[00332] Alternativamente, o grau de inibição pode ser dado em termos de uma redução de um parâmetro que esteja funcionalmente ligado à expressão do gene ALAS1, por exemplo, a quantidade de proteína codificada por um gene ALAS1, ou o nível de uma ou mais porfirinas. A redução de um parâmetro funcionalmente ligado à expressão do gene ALAS1 pode ser similarmente expressa como uma percentagem de um nível de controle. Em princípio, o silenciamento do gene ALAS1 pode ser determinado em qualquer célula expressando ALAS1, constitutivamente ou por manipulação genética, e por qualquer ensaio apropriado. No entanto, quando é necessária uma referência de modo a determinar se um dado iRNA inibe a expressão do gene ALAS1 por um certo grau e, portanto, é englobada pela presente invenção, os ensaios proporcionados nos Exemplos em baixo devem servir como tal referência.
[00333] Por exemplo, em certos casos, a expressão de um gene ALAS1 é suprimida por pelo menos cerca de 10 %, 15 %, 20 %,25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, ou 50 % por administração de um iRNA apresentado na invenção. Em algumas modalidades, um gene ALAS1 é suprimido por pelo menos cerca de 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, ou 80 % por administração de um iRNA apresentado na invenção. Em algumas modalidades, um gene ALAS1 é suprimido por pelo menos cerca de 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou mais por administração de um iRNA como descrito aqui.
[00334] Como usados aqui no contexto da expressão de ALAS1, os termos "tratar", "tratando", "tratamento", e similares, se referem ao aliviar de ou alívio de processos patológicos relacionados com expressão de ALAS1 (por exemplo, processos patológicos envolvendo porfirinas ou defeitos na via da porfirina, tal como, por exemplo, porfirias). No contexto da presente invenção desde que se relacionem com qualquer uma das outras condições recitadas aqui em baixo (sem ser os processos patológicos relacionados com expressão de ALAS1), os termos "tratar", "tratamento", e similares significam prevenir, atenuar ou aliviar pelo menos um sintoma associado a tal condição, para atrasar ou reverter o progresso ou progresso antecipado de tal condição. Por exemplo, os métodos apresentados aqui, quando empregues para tratar a porfiria, podem servir para reduzir ou prevenir um ou mais sintomas associados à porfiria (por exemplo, dor), reduzir a gravidade ou frequência de ataques associados à porfiria, reduzir a probabilidade de que um ataque de um ou mais sintomas associados à porfiria ocorra após exposição a uma condição precipitante, encurtar um ataque associado à porfiria, e/ou reduzir o risco de desenvolver condições associadas à porfiria (por exemplo, câncer hepatocelular ou neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva)). Assim, a não ser que o contexto indique claramente de outro modo, os termos "tratar", "tratamento", e similares se destinam a englobar profilaxia, por exemplo, prevenção de distúrbios e/ou sintomas de distúrbios relacionados com expressão de ALAS1.
[00335] Por “menor” no contexto de um marcador ou sintoma de doença se significa uma diminuição estatisticamente ou clinicamente significativa em tal nível. A diminuição pode ser, por exemplo, pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 % ou mais, e vai tipicamente até um nível aceite como dentro da gama de normalidade para um indivíduo sem tal distúrbio.
[00336] Como usadas aqui, as frases "quantidade terapeuticamente eficaz" e "quantidade profilaticamente eficaz" se referem a uma quantidade que proporciona um benefício terapêutico no tratamento, prevenção, ou gestão de processos patológicos relacionados com expressão de ALAS1. A quantidade específica que é terapeuticamente eficaz pode ser prontamente determinada por um praticante médico ordinário, e pode variar dependendo de fatores conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, o tipo de processo patológico, o historial e idade do paciente, a etapa de processo patológico, e a administração de outros agentes.
[00337] Como usado aqui, uma "composição farmacêutica" compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um iRNA e um transportador farmaceuticamente aceitável. Como usado aqui, "quantidade farmacologicamente eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou simplesmente "quantidade eficaz" se refere àquela quantidade de um iRNA eficaz para produzir o resultado farmacológico, terapêutico ou preventivo pretendido. Por exemplo, em um método de tratamento de um distúrbio relacionado com expressão de ALAS1 (por exemplo, em um método de tratamento de uma porfiria), uma quantidade eficaz inclui uma quantidade eficaz para reduzir um ou mais sintomas associados a um porfiria, uma quantidade eficaz para reduzir a frequência de ataques, uma quantidade eficaz para reduzir a probabilidade de que um ataque de um ou mais sintomas associados à porfiria ocorra após exposição a um fator precipitante, ou uma quantidade eficaz para reduzir o risco de desenvolver condições associadas à porfiria (por exemplo, neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva), câncer hepatocelular). Por exemplo, de um dado tratamento clínico é considerado eficaz onde existe uma redução de pelo menos 10 % em um parâmetro mensurável associado a uma doença ou distúrbio, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco para o tratamento dessa doença ou distúrbio é a quantidade necessária para efetuar uma redução de pelo menos 10 % em esse parâmetro. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um iRNA se dirigindo a ALAS1 pode reduzir os níveis da proteína ALAS1 por qualquer quantidade mensurável, por exemplo, por pelo menos 10%, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 %.
[00338] O termo "transportador farmaceuticamente aceitável" se refere a um transportador para administração de um agente terapêutico. Tais transportadores incluem, mas não estão limitados a salino, salino tamponado, dextrose, água, glicerol, etanol, e suas combinações. O termo exclui especificamente meio de cultura de células. Para fármacos administrados oralmente, transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como diluentes inertes, agentes desintegrantes, agentes ligantes, agentes lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes corantes e conservantes. Diluentes inertes adequados incluem carbonato de sódio e cálcio, fosfato de sódio e cálcio, e lactose, enquanto amido de milho e ácido algínico são agentes desintegrantes adequados. Agentes ligantes podem incluir amido e gelatina, enquanto o agente lubrificante, se presente, será geralmente estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos com um material tal como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila, para atrasar a absorção no trato gastrointestinal. Os agentes incluídos em formulações de fármacos são adicionalmente descritos aqui em baixo.
[00339] O termo "cerca de" quando se refere a um número ou uma gama numérica significa que o número ou gama numérica referido é uma aproximação dentro da variabilidade experimental (ou dentro do erro experimental estatístico), e assim o número ou gama numérica pode variar de, por exemplo, entre 1 % e 15 % do número ou gama numérica indicado.
II. Agentes de iRNA
[00340] São descritos aqui agentes de iRNA que inibem a expressão de um gene ALAS1. Em uma modalidade, o agente de iRNA inclui moléculas de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de um gene ALAS1 em uma célula ou em um indivíduo (por exemplo, em um mamífero, por exemplo, em um humano tendo uma porfiria), onde o dsRNA inclui uma fita antissenso tendo uma região de complementaridade que é complementar com pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão de um gene ALAS1, e onde a região de complementaridade tem 30 nucleotídeos ou menos de comprimento, geralmente 19-24 nucleotídeos de comprimento, e onde o dsRNA, após contato com uma célula expressando o gene ALAS1, inibe a expressão do gene ALAS1 por pelo menos 10 % como avaliado por, por exemplo, uma PCR ou método baseado em DNA ramificado (bDNA), ou por um método baseado em proteína, tal como por transferência de Western. Em uma modalidade, o agente de iRNA ativa a expressão de um gene ALAS1 em uma célula ou mamífero. A expressão de um gene ALAS1 em cultura de células, tal como em células COS, células HeLa, hepatócitos primários, células HepG2, células primárias cultivadas ou em uma amostra biológica de um indivíduo, pode ser avaliada por medição dos níveis de mRNA de ALAS1, tal como por ensaio de bDNA ou TaqMan, ou por medição dos níveis de proteína, tal como por análise de imunofluorescência, usando, por exemplo, Transferência de Western ou técnicas citométricas de fluxo.
[00341] Um dsRNA inclui duas fitas de RNA que são suficientemente complementares para hibridarem para formar uma estrutura de dúplex sob condições nas quais o dsRNA será usado. uma fita de um dsRNA (a fita antissenso) inclui uma região de complementaridade que é substancialmente complementar, e geralmente completamente complementar, com uma sequência alvo, derivada da sequência de um mRNA formado durante a expressão de um gene ALAS1. A outra fita (a fita senso) inclui uma região que é complementar com a fita antissenso, tal que as duas fitas hibridem e formem uma estrutura de dúplex quando combinadas sob condições adequadas. Geralmente, a estrutura de dúplex tem entre 15 e 30 inclusive, mais geralmente entre 18 e 25 inclusive, ainda mais geralmente entre 19 e 24 inclusive, e o mais geralmente entre 19 e 21 pares de bases de comprimento, inclusive. Similarmente, a região de complementaridade com a sequência alvo tem entre 15 e 30 inclusive, mais geralmente entre 18 e 25 inclusive, ainda mais geralmente entre 19 e 24 inclusive, e o mais geralmente entre 19 e 21 pares de bases de comprimento, inclusive. Em algumas modalidades, o dsRNA tem entre 15 e 20 nucleotídeos de comprimento, inclusive, e em outras modalidades, o dsRNA tem entre 25 e 30 nucleotídeos de comprimento, inclusive. Como a pessoa ordinariamente perita reconhecerá, a região direcionada de um RNA direcionado para clivagem será o mais frequentemente parte de uma molécula de RNA maior, frequentemente uma molécula de mRNA. Onde relevante, uma "parte" de um lavo de um mRNA alvo é uma sequência contígua de um mRNA alvo de comprimento suficiente para ser um substrato para clivagem direcionada por RNA1 (i.e., clivagem através de uma via de RISC). dsRNAs tendo dúplices tão curtos quanto 9 pares de bases podem, sob algumas circunstâncias, mediar a clivagem de RNA direcionada por RNAi. O mais frequentemente, um alvo terá pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 15-30 nucleotídeos de comprimento.
[00342] Um com perícia na técnica reconhecerá também que a região de dúplex é uma porção funcional primária de um dsRNA, por exemplo, uma região de dúplex de 9 a 36, por exemplo, 15-30 pares de bases. Assim, em uma modalidade, na medida em que se torne processado em um dúplex funcional de, por exemplo, 15-30 pares de bases que se dirija a um RNA desejado para clivagem, uma molécula de RNA ou complexo de moléculas de RNA tendo uma região de dúplex maior do que 30 pares de bases é um dsRNA. Assim, um especialista ordinariamente perito reconhecerá que, em uma modalidade, então, um miRNA é um dsRNA. Em outra modalidade, um dsRNA não é um miRNA ocorrendo naturalmente. Em outra modalidade, um agente de iRNA útil para se dirigir à expressão de ALAS1 não é gerado na célula alvo por clivagem de um dsRNA maior.
[00343] Um dsRNA como descrito aqui pode adicionalmente incluir uma ou mais saliências de nucleotídeo de fita única. Um dsRNA pode ser sintetizado por métodos padrão conhecidos na área como adicionalmente discutido em baixo, por exemplo, por uso de um sintetizador de DNA automatizado, tal como estão comercialmente disponíveis da, por exemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Em uma modalidade, um gene ALAS1 é um gene ALAS1 humano. Em outra modalidade, o gene ALAS1 é um gene ALAS1 de camundongo ou rato.
[00344] Em modalidades específicas, a primeira sequência é uma fita senso de um dsRNA que inclui uma sequência senso revelada aqui, por exemplo, nas Tabelas 21-40, e a segunda sequência é uma fita antissenso de um dsRNA que inclui uma sequência antissenso revelada aqui, por exemplo, nas Tabelas 21-40.
[00345] Em modalidades específicas, a primeira sequência é uma fita senso de um dsRNA que inclui uma sequência senso da Tabela 2 ou Tabela 3, e a segunda sequência é uma fita antissenso de um dsRNA que inclui uma sequência antissenso da Tabela 2 ou Tabela 3. Em modalidades específicas, a primeira sequência é uma fita senso de um dsRNA que inclui uma sequência senso da Tabela 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, ou 15, e a segunda sequência é uma fita antissenso de um dsRNA que inclui uma sequência antissenso da Tabela 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, ou 15. Em modalidades específicas, a primeira sequência é uma fita senso de um dsRNA que inclui uma sequência senso da Tabela 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 ou 20, e a segunda sequência é uma fita antissenso de um dsRNA que inclui uma sequência antissenso da Tabela 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 ou 20.
[00346] Em um aspecto, um dsRNA pode incluir pelo menos sequências de nucleotídeos senso e antissenso, onde a fita senso é selecionada das sequências senso proporcionadas aqui, por exemplo, nas Tabelas 21-40, e a correspondente fita antissenso da fita senso é selecionada das sequências antissenso proporcionadas aqui, por exemplo, nas Tabelas 21-40.
[00347] Em um aspecto, um dsRNA pode incluir pelo menos sequências de nucleotídeos senso e antissenso, onde a fita senso é selecionada dos grupos de sequências proporcionadas nas Tabelas 2 e 3, e a correspondente fita antissenso da fita senso é selecionada das Tabelas 2 e 3. Em um aspecto adicional, um dsRNA pode incluir pelo menos sequências de nucleotídeos senso e antissenso, onde a fita senso é selecionada dos grupos de sequências proporcionadas nas Tabelas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 e 15, e a correspondente fita antissenso da fita senso é selecionada das Tabelas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, e 15. Em um aspecto adicional, um dsRNA pode incluir pelo menos sequências de nucleotídeos senso e antissenso, de modo que a fita senso é selecionada dos grupos de sequências proporcionados nas Tabelas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 e 20, e a correspondente fita antissenso da fita senso é selecionada das Tabelas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 e 20.
[00348] Em modalidades, o iRNA é AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, ou AD-60419 (por exemplo, incluindo a sequência de nucleotídeos e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações dos dsRNAs referidos anteriormente). Em modalidades, o iRNA compreende uma fita antissenso que compreende, ou consiste em, uma sequência antissenso (incluindo uma ou mais (por exemplo, todas)das modificações)) selecionada da sequência antissenso de AD-60501, AD- 60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD- 61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD- 60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD- 60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD- 60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD- 61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD- 61146, AD-60892, ou AD-60419. Em modalidades, o iRNA compreende uma fita senso que compreende, ou consiste em, uma sequência senso (e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações) selecionada deAD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, ou AD-60419.
[00349] Em modalidades, o iRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência de UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU ou UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência de CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA. Em modalidades, um ou mais nucleotídeos da fita antissenso e/ou fita senso são modificados como descrito aqui.
[00350] Em modalidades, o iRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60489 e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60489 (e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita senso e/ou fita antissenso de AD-60489).
[00351] Em modalidades, o iRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60519 e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60519 (e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita senso e/ou fita antissenso de AD-60489).
[00352] Em modalidades, o iRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-61193 e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-61193 (e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita senso e/ou fita antissenso de AD-60489).
[00353] Em modalidades, o iRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60819 e/ou (ii) uma sequência senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60819 (e/ou uma ou mais (por exemplo, todas) das modificações da fita senso e/ou fita antissenso de AD-60489).
[00354] Em modalidades, é proporcionado o iRNA para inibir a expressão de ALAS1, em que o dsRNA compreende (i) uma fita antissenso que compreende, ou consiste na sequência antissenso de AD-60489, AD-60519, AD-61193, ou AD-60819 (ou uma sequência antissenso não modificada correspondente) e/ou (ii) uma fita senso que compreende, ou consiste na sequência senso de AD-60489, AD-60519, AD-61193, ou AD-60819 (ou uma sequência antissenso não modificada correspondente). Em modalidades, o iRNA compreende (i) uma fita antissenso que consiste na sequência antissenso de AD-60489, AD- 60519, AD-61193, ou AD-60819 e/ou (ii) uma fita senso que consiste na sequência senso de AD-60489, AD-60519, AD-61193, ou AD-60819, com a exceção de que a fita antissenso e/ou fita senso do dsRNA difere por 1, 2, ou 3 nucleotídeos da correspondente sequência antissenso e/ou senso de AD-60489, AD-60519, AD-61193, ou AD-60819.
[00355] As sequências e modificações de AD-60489, AD-60519, AD- 61193, e AD-60819 estão apresentadas na Tabela 44 revelada aqui.
[00356] Em uma modalidade, o iRNA é ALN-60519. ALN-60519 é um oligonucleotídeo de fita dupla sintetizado quimicamente ligado covalentemente a um ligante contendo três resíduos N- acetilgalactosamina (GalNAc) (representado na FIG. 57). Em uma modalidade, todos os nucleotídeos de ALN-60519 são modificados por 2’-OMe ou 2’-F e são conectados através de ligações fosfodiéster 3’-5’, desse modo formando a cadeia principal açúcar-fosfato do oligonucleotídeo. a fita senso e a fita antissenso de ALN-60519 contêm 21 e 23 nucleotídeos, respectivamente. A extremidade 3' da fita senso de ALN-60519 é conjugada à fração GalNAc triantenária (referida como L96) através de uma ligação fosfodiéster. a fita antissenso contém quatro ligações fosforotioato - duas na extremidade 3' e duas na extremidade 5'. a fita senso de ALN-60519 contém duas ligações fosforotioato na extremidade 5'. Os 21 nucleotídeos da fita senso de ALN-60519 hibridam com os 21 nucleotídeos complementares da fita antissenso, desse modo formando 21 pares de bases de nucleotídeos e uma saliência de duas bases na extremidade 3' da fita antissenso. As duas fitas isoladas, a fita senso e a fita antissenso, de ALN-60519 podem ser sintetizadas por síntese convencional de oligonucleotídeos em fase sólida, empregando química comum de fosforamidite com o grupo 5’-hidroxila protegido na forma de éter de dimetoxitrifenilmetila (DMT). Cada fita pode ser montada desde o terminal 3’ para o 5’ por adição sequencial de fosforamidites nucleosídicas protegidas.
[00357] Em estes aspectos, uma das duas sequências é complementar com a outra das duas sequências, com uma das sequências sendo substancialmente complementar com uma sequência de um mRNA gerado pela expressão de um gene ALAS1. Como tal, um dsRNA incluirá dois oligonucleotídeos, onde um oligonucleotídeo é descrito aqui como a fita senso, e o segundo oligonucleotídeo é descrito como a correspondente fita antissenso. Como descrito em outro lugar aqui e como conhecido na técnica, as sequências complementares de um dsRNA podem também estar contidas como regiões autocomplementares de uma única molécula de ácido nucleico, em oposição a estarem em oligonucleotídeos separados.
[00358] A pessoa perita está bem ciente de que dsRNAs tendo uma estrutura de dúplex de entre 20 e 23, mas especificamente 21 pares de bases, têm sido aclamados como particularmente eficazes na indução da interferência de RNA (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). No entanto, outros descobriram que estruturas de dúplex de RNA mais curtas ou mais longas podem ser igualmente eficazes. Nas modalidades descritas acima, em virtude da natureza das sequências de oligonucleotídeos proporcionadas nas tabelas aqui, os dsRNAs descritos aqui podem incluir pelo menos uma fita com um comprimento mínimo de 21 nucleotídeos. Pode ser razoavelmente esperado que dúplices mais curtos tendo uma das sequências reveladas aqui menos apenas alguns nucleotídeos em uma ou ambas as extremidades possam ser similarmente eficazes em comparação com os dsRNAs descritos acima. Consequentemente, os dsRNAs tendo uma sequência parcial com pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleotídeos contíguos de uma das sequências reveladas aqui, e diferindo na sua capacidade de inibir a expressão de um gene ALAS1 por não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20, 25, ou 30 % de inibição de um dsRNA compreendendo a sequência completa, estão contemplados de acordo com a invenção.
[00359] Adicionalmente, os RNAs proporcionados nas tabelas aqui, identificam um sítio em um transcrito de ALAS1 que é suscetível a clivagem mediada por RISC. Como tal, a presente invenção apresenta adicionalmente iRNAs se dirigem a uma das tais sequências. Como usado aqui, se diz que um iRNA se dirige a um sítio particular de um transcrito de RNA se o iRNA promover a clivagem do transcrito em qualquer parte dentro desse sítio particular. Um tal iRNA incluirá geralmente pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma das sequências proporcionadas aqui, por exemplo, nas Tabelas 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18, 20 e nas Tabelas 21-40 acoplados a sequências de nucleotídeos adicionais tomadas da região contígua à sequência selecionada em um gene ALAS1.
[00360] Enquanto uma sequência alvo tem geralmente 15-30 nucleotídeos de comprimento, existe uma ampla variação na adequabilidade de sequências particulares em esta gama para dirigir a clivagem de qualquer RNA alvo dado. Vários pacotes de software e as linhas de orientação apresentados aqui proporcionam orientação para a identificação de sequências alvo ótimas para qualquer alvo genético dado, mas pode ser também tomada uma abordagem empírica na qual uma “janela” ou “máscara” de um dado tamanho (como um exemplo não limitante, 21 nucleotídeos) é literalmente ou figurativamente (incluindo, por exemplo, in silico) colocada na sequência de RNA alvo para identificar sequências na gama de tamanhos que possam servir como sequências alvo. Ao mover a “janela” da sequência progressivamente um nucleotídeo a montante ou a jusante de uma localização inicial da sequência alvo, a próxima sequência alvo potencial pode ser identificada, até ser identificado o conjunto completo de sequências possíveis para qualquer dado tamanho alvo selecionado. Este processo, acoplado a síntese sistemática e teste das sequências identificadas (usando ensaios como descrito aqui ou como conhecido na técnica) para identificar aquelas sequências que têm um desempenho ótimo, pode identificar aquelas sequências de RNA que, quando são dirigidas por um agente de iRNA, medeiam a melhor inibição da expressão do gene alvo. Assim, enquanto as sequências identificadas, por exemplo, nas tabelas aqui, representam sequências alvo efetivas, é contemplado que pode ser alcançada otimização adicional da eficácia da inibição ao progressivamente “caminhar na janela” um nucleotídeo a montante ou a jusante das sequências dadas para identificar sequências com características de inibição iguais ou melhores.
[00361] Adicionalmente, é contemplado que, para qualquer sequência identificada, por exemplo, nas tabelas aqui, pode ser alcançada otimização adicional por adição ou remoção sistemática de nucleotídeos para gerar sequências mais longas ou mais curtas e teste dessas e sequências geradas ao caminhar em uma janela do tamanho maior ou menor para cima ou para baixo do RNA alvo a partir desse ponto. Mais uma vez, o acoplamento desta abordagem para geração de novos alvos candidatos ao teste quanto à eficácia de iRNAs com base nessas sequências alvo em um ensaio de inibição como conhecido na técnica ou como descrito aqui pode levar a melhorias adicionais na eficácia da inibição. Adicionalmente ainda, tais sequências otimizadas podem ser ajustadas pela, por exemplo, introdução de nucleotídeos modificados como descrito aqui ou como conhecido na técnica, adição ou mudanças em saliências, ou outras modificações como conhecido na técnica e/ou discutido aqui para otimizar adicionalmente a molécula (por exemplo, aumentando a estabilidade no soro ou semivida em circulação, aumentando a estabilidade térmica, intensificando a distribuição transmembrana, dirigindo para uma localização ou tipo de célula particular, aumentando a interação com enzimas da via de silenciamento, aumentando a liberação a partir de endossomos, etc.) como um inibidor da expressão.
[00362] Um iRNA como descrito aqui pode conter uma ou mais não correspondências com a sequência alvo. Em uma modalidade, um iRNA como descrito aqui contém não mais do que 3 não correspondências. Se a fita antissenso do iRNA contiver não correspondências com uma sequência alvo, é preferencial que a área das não correspondências não esteja localizada no centro da região de complementaridade. Se a fita antissenso do iRNA contiver não correspondências com a sequência alvo, é preferencial que não correspondências esteja restrita a se situar dentro dos últimos 5 nucleotídeos a partir da extremidade 5’ ou 3' da região de complementaridade. Por exemplo, para uma fita de RNA do agente de iRNA de 23 nucleotídeos que é complementar com uma região de um gene ALAS1, a fita de RNA não contém geralmente qualquer não correspondência dentro dos 13 nucleotídeos centrais. Os métodos descritos aqui ou métodos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar se um iRNA contendo uma não correspondência com uma sequência alvo é eficaz na inibição da expressão de um gene ALAS1. A consideração da eficácia de iRNAs com não correspondências na inibição da expressão de um gene ALAS1 é importante, especialmente se se souber que a região de complementaridade particular em um gene ALAS1 tem variação de sequências polimórficas dentro da população.
[00363] Em uma modalidade, pelo menos uma das extremidades de um dsRNA tem uma saliência de nucleotídeo de fita única de 1 a 4, geralmente 1 ou 2 nucleotídeos. dsRNAs tendo pelo menos uma saliência de nucleotídeo têm propriedades inibidoras inesperadamente superiores em relação às suas contrapartidas de extremidades coesivas. Ainda em outra modalidade, o RNA de um iRNA, por exemplo, um dsRNA, é quimicamente modificado para intensificar a estabilidade ou outras características benéficas. Os ácidos nucleicos apresentados na invenção podem ser sintetizados e/ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica, tais como aqueles descritos em “Current protocols in nucleic acid chemistry”, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, NI, EUA, que é deste modo incorporado aqui por referência. As modificações incluem, por exemplo, (a) modificações nas extremidades, por exemplo, modificação na extremidade 5’ (fosforilação, conjugação, ligações invertidas, etc.) modificações na extremidade 3' (conjugação, nucleotídeos de DNA, ligações invertidas, etc.), (b) modificações de bases, por exemplo, substituição com bases estabilizantes, bases desestabilizantes, ou bases que formam pares de bases com um repertório expandido de parceiros, remoção de bases (nucleotídeos abásicos), ou bases conjugadas, (c) modificações de açúcares (por exemplo, na posição 2’ ou posição 4’, ou tendo um açúcar acíclico) ou substituição do açúcar, bem como (d) modificações na estrutura principal, incluindo modificação ou substituição das ligações fosfodiéster. Exemplos específicos de compostos de RNA úteis em esta invenção incluem, mas não estão limitados a RNAs contendo estruturas principais modificadas ou sem ligações internucleosídicas naturais. RNAs tendo estruturas principais modificadas incluem, entre outros, aqueles que não têm um átomo de fósforo na estrutura principal. Para os propósitos desta especificação, e como por vezes referido na técnica, RNAs modificados que não têm um átomo de fósforo em sua estrutura principal internucleosídica podem ser também considerados como sendo oligonucleosídeos. Em modalidades particulares, o RNA modificado terá um átomo de fósforo em sua estrutura principal internucleosídica.
[00364] Estruturas principais de RNA modificado incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metila e outras alquila incluindo fosfonatos de 3'-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos, incluindo fosforamidato de 3'-amino e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, e boranofosfatos tendo ligações normais 3'-5', análogos ligados em 2'-5' destes, e aqueles tendo polaridade invertida em que os pares adjacentes de unidades de nucleosídeos estão ligados 3'-5' para 5'-3' ou 2'-5' para 5'-2'. Vários sais, sais mistos e formas de ácido livre estão também incluídos.
[00365] Patentes dos E.U.A. representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo incluem as, mas não estão limitadas às, Pat. dos E.U.A. Nos. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6.239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; e Pat dos EUA RE39464, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[00366] Estruturas principais de RNA modificado que não incluem um átomo de fósforo são estruturas principais que são formadas por ligações internucleosídicas de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomos mistos e ligações internucleosídicas de alquila ou cicloalquila, ou uma ou mais ligações internucleosídicas heteroatómicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estas incluem aquelas tendo ligações morfolino (formadas em parte a partir da porção de açúcar de um nucleosídeo); estruturas principais de siloxano; estruturas principais de sulfureto, sulfóxido e sulfona; estruturas principais de formacetila e tioformacetila; estruturas principais de metileno formacetila e tioformacetila; estruturas principais contendo alqueno; estruturas principais de sulfamato; estruturas principais de metilenoimino e metilenohidrazino; estruturas principais de sulfonato e sulfonamida; estruturas principais de amida; e outras tendo partes mistas dos componentes N, O, S e CH2.
[00367] Patentes dos E.U.A. representativas que ensinam a preparação dos oligonucleosídeos acima incluem as, mas não estão limitadas às, Pat. dos E.U.A. Nos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[00368] Em outros miméticos de RNA adequados ou contemplados para uso em iRNAs, ambos o açúcar e a ligação internucleosídica, i.e., a estrutura principal, das unidades de nucleotídeos estão substituídos por grupos novos. As unidades de base são mantidas para hibridação com um composto alvo de ácido nucleico apropriado. Um tal composto oligomérico, um mimético de RNA que se mostrou que tem excelentes propriedades de hibridação, é referido como ácido nucleico de peptídeo (PNA). Em compostos de PNA, a estrutura principal de açúcar de um RNA está substituída por uma estrutura principal contendo amida, em particular uma estrutura principal de aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e são ligadas diretamente ou indiretamente a átomos de nitrogênio aza da porção amida da estrutura principal. Patentes dos E.U.A. representativas que ensinam a preparação de compostos de PNA incluem as, mas não estão limitadas às, Pat. dos E.U.A. Nos. 5,539,082; 5,714,331; e 5,719,262, cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Ensinamento adicional de compostos de PNA pode ser encontrado, por exemplo, em Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[00369] Algumas modalidades apresentadas na invenção incluem RNAs com estruturas principais de fosforotioato e oligonucleosídeos com estruturas principais de heteroátomos, e em particular --CH2--NH-- CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[conhecido como estrutura principal de metileno (metilimino) ou MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)- -N(CH3)--CH2-- e --N(CH3)--CH2--CH2-- [em que a estrutura principal de fosfodiéster nativa é representada por --O--P--O--CH2--] da Patente dos E.U.A. No. 5.489.677 acima referida, e as estruturas principais de amida da Patente dos E.U.A. No. 5.602.240 acima referida. Em algumas modalidades, os RNAs apresentados aqui têm estruturas da estrutura principal de morfolino da Patente dos E.U.A. No. 5.034.506 acima referida.
[00370] RNAs modificados podem também conter uma ou mais frações de açúcar substituídas. Os iRNAs, por exemplo, dsRNAs, apresentados aqui podem incluir um dos seguintes na posição 2': OH; F; O-, S-, ou N-alquila; O-, S-, ou N-alquenila; O-, S- ou N-alquinila; ou O-alquil-O-alquila, em que a alquila, alquenila e alquinila podem ser alquila C1 a C10 ou alquenila ou alquinila C2 até C10 substituídas ou não substituídas. Modificações adequadas exemplares incluem O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, e O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, onde n e m são de 1 a cerca de 10. Em outras modalidades, os dsRNAs incluem um dos seguintes na posição 2': alquila C1 a C10 de cadeia curta, alquila de cadeia curta substituída, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituída, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhoria das propriedades farmacocinéticas de um iRNA, ou um grupo para melhoria das propriedades farmacodinâmicas de um iRNA, e outros substituintes tendo propriedades similares. Em algumas modalidades, a modificação inclui um 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH3, também conhecido como 2'-O-(2-metoxietil) ou 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), i.e., um grupo alcóxi-alcoxi. Outra modificação exemplar é 2'-dimetilaminooxietóxi, i.e., um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2'-DMAOE, como descrito nos exemplos aqui em baixo, e 2'-dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietila ou 2'-DMAEOE), i.e., 2'-O--CH2--O--CH2-- N(CH2)2, também descrito nos exemplos aqui em baixo.
[00371] Em outras modalidades, um agente de iRNA compreende um ou mais (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais) nucleotídeos (ou nucleosídeos) acíclicos. Em certas modalidades, a fita senso ou a fita antissenso, ou a fita senso e a fita antissenso, incluem menos do que cinco nucleotídeos acíclicos por fita (por exemplo, quatro, três, dois ou um nucleotídeos acíclicos por fita). O um ou mais nucleotídeos acíclicos podem estar presentes, por exemplo, na região de fita dupla, da fita senso ou antissenso, ou em ambas as fitas; na extremidade 5', na extremidade 3', em ambas as extremidades 5' e 3' da fita senso ou antissenso, ou em ambas as fitas, do agente de iRNA. Em uma modalidade, um ou mais nucleotídeos acíclicos estão presentes nas posições 1 até 8 da fita senso ou antissenso, ou em ambas. Em uma modalidade, um ou mais nucleotídeos acíclicos estão presentes na fita antissenso nas posições 4 até 10 (por exemplo, posições 6-8) desde a extremidade 5' da fita antissenso. Em outra modalidade, o um ou mais nucleotídeos acíclicos estão presentes em uma ou ambas das saliências 3'-terminais do agente de iRNA.
[00372] O termo "nucleotídeo acíclico" ou “nucleosídeo acíclico”, como usado aqui, refere-se a qualquer nucleotídeo ou nucleosídeo tendo um açúcar acíclico, por exemplo, uma ribose acíclica. Um nucleotídeo ou nucleosídeo acíclico exemplar pode incluir uma nucleobase, por exemplo, uma nucleobase de ocorrência natural ou modificada (por exemplo, uma nucleobase como descrito aqui). Em certas modalidades, uma ligação entre quaisquer dos carbonos da ribose (C1, C2, C3, C4 ou C5), está independentemente, ou em combinação, ausente do nucleotídeo. Em uma modalidade, a ligação entre os carbonos C2-C3 do anel ribose está ausente, por exemplo, um monômero de nucleotídeo acíclico 2’-3’-seco. Em outras modalidades, a ligação entre C1-C2, C3-C4, ou C4-C5 está ausente (por exemplo, um monômero de nucleotídeo 1’-2’, 3'-4' ou 4’-5’-seco). Nucleotídeos acíclicos exemplares são revelados em US 8.314.227, incorporado aqui a título de referência na sua totalidade. Por exemplo, um nucleotídeo acíclico pode incluir qualquer um dos monômeros D-J nas Figuras 1-2 de US 8.314.227. Em uma modalidade, o nucleotídeo acíclico inclui o seguinte monômero:
Figure img0009
em que Base é uma nucleobase, por exemplo, uma nucleobase de ocorrência natural ou modificada (por exemplo, uma nucleobase como descrito aqui).
[00373] Em certas modalidades, o nucleotídeo acíclico pode ser modificado ou derivatizado, por exemplo, por acoplamento do nucleotídeo acíclico a outra fração, por exemplo, um ligante (por exemplo, um ligante GalNAc, colesterol), um alquila, uma poliamina, um açúcar, um polipeptídeo, entre outros.
[00374] Em outras modalidades, o agente de iRNA inclui um ou mais nucleotídeos acíclicos e um ou mais LNAs (por exemplo, um LNA como descrito aqui). Por exemplo, um ou mais nucleotídeos acíclicos e/ou um ou mais LNAs podem estar presentes na fita senso, na fita antissenso, ou ambas. O número de nucleotídeos acíclicos presentes em uma fita pode ser igual ou diferente do número de LNAs presentes na fita oposta. Em certas modalidades, a fita senso e/ou a fita antissenso compreendem menos do que cinco LNAs (por exemplo, quatro, três, dois ou um LNAs) localizados na região de fita dupla ou uma saliência 3'. Em outras modalidades, um ou dois LNAs estão localizados na região de fita dupla ou na saliência 3' da fita senso. Alternativamente, ou em combinação, a fita senso e/ou fita antissenso compreendem menos do que cinco nucleotídeos acíclicos (por exemplo, quatro, três, dois ou um nucleotídeos acíclicos) na região de fita dupla ou uma saliência 3'. Em uma modalidade, a fita senso do agente de iRNA compreende um ou dois LNAs na saliência 3' da fita senso, e um ou dois nucleotídeos acíclicos na região de fita dupla da fita antissenso (por exemplo, nas posições 4 até 10 (por exemplo, posições 6-8) desde a extremidade 5' da fita antissenso) do agente de iRNA.
[00375] Em outras modalidades, a inclusão de um ou mais nucleotídeos acíclicos (isoladamente ou para além de um ou mais LNAs) no agente de iRNA resulta em um ou mais (ou todos) de: (i) uma redução em um efeito fora do alvo; (ii) uma redução na participação da fita passageira em RNAi; (iii) um aumento da especificidade da fita guia para o seu mRNA alvo; (iv) uma redução em um efeito fora do alvo de microRNA; (v) um aumento da estabilidade; ou (vi) um aumento da resistência à degradação, da molécula de iRNA.
[00376] Outras modificações incluem 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'- aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) e 2'-flúor (2'-F). Modificações similares podem ser também feitas em outras posições do RNA de um iRNA, particularmente na posição 3' do açúcar no nucleotídeo 3' terminal ou em dsRNAs ligados em 2'-5' e na posição 5' do nucleotídeo 5' terminal. Os iRNAs podem ter também miméticos de açúcar tais como frações ciclobutila em lugar do açúcar de pentofuranosila. Patentes dos E.U.A. representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcares modificadas incluem as mas não estão limitadas às, Patentes dos E.U.A. Nos. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; e 5.700.920, certas das quais são propriedade comum com o presente pedido, e cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[00377] Um iRNA pode também incluir modificações ou substituições de nucleobase (frequentemente referidos na técnica simplesmente como “base”). Como usado aqui, nucleobases “não modificadas” ou “naturais” incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G), e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). Nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais tais como 5-metilcitosina (5-me-C), citosina de 5-hidroximetila, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metila e outros de alquila de adenina e guanina, derivados de 2-propila e outros de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, uracila e citosina de 5-propinila, uracila de 6-azo, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, adeninas e guaninas substituídas por 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras em 8, uracilas e citosinas substituídas por 5-halo, particularmente 5- bromo, 5-trifluorometila e outras em 5, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-desazaguanina e 7-desazaadenina e 3-desazaguanina e 3-desazaadenina. Nucleobases adicionais incluem aquelas divulgadas na Patente dos E.U.A. No. 3.687.808, aquelas divulgadas em Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; aquelas divulgadas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas divulgadas por Englisch et al., Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, 30, 613, e aquelas divulgadas por Sanghvi, Y S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Certas destas nucleobases são particularmente úteis para aumento da afinidade de ligação dos compostos oligoméricos apresentados na invenção. Estas incluem pirimidinas substituídas em 5, 6-azapirimidinas e purinas substituídas em N-2, N-6 e 0-6, incluindo 2-aminopropiladenina, 5- propiniluracila e 5-propinilcitosina. Foi mostrado que substituições de 5- metilcitosina aumentam a estabilidade do dúplex de ácido nucleico em 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. e Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) e são substituições de bases exemplares, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar 2'-O-metoxietila.
[00378] Patentes dos E.U.A. representativas que ensinam a preparação de certas das nucleobases modificadas acima notadas bem como outras nucleobases modificadas incluem as, mas não estão limitadas às, Pat. dos E.U.A. No. 3.687.808 acima notadas, bem como Pat. dos E.U.A. Nos. 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; e 7.495.088, cada uma das quais é aqui incorporada por referência, e Pat. dos E.U.A. No. 5.750.692, também aqui incorporada por referência.
[00379] O RNA de um iRNA pode ser também modificado para incluir um ou mais (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais) ácidos nucleicos trancados (LNA), (também referidos aqui como“nucleotídeos trancados”). Em uma modalidade, um ácido nucleico trancado é um nucleotídeo tendo uma fração ribose modificada na qual a fração ribose compreende uma ponte extra conectando, por exemplo, os carbonos 2' e 4'. Esta estrutura "tranca" efetivamente a ribose na conformação estrutural 3'-endo. Foi mostrado que a adição de ácidos nucleicos trancados a siRNAs aumenta a estabilidade do siRNA no soro, aumenta a estabilidade térmica e reduz efeitos fora do alvo (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
[00380] Patentes dos E.U.A. representativas que ensinam a preparação de nucleotídeos de ácidos nucleicos trancados incluem as, mas não estão limitadas às, seguintes: Pat. dos E.U.A. Nos. 6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; 7.399.845;e 8.314.227, cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade. LNAs exemplares incluem mas não estão limitados a, um nucleotídeo 2', 4'-C metileno bicíclico (ver, por exemplo, Wengel et al., PublicaçãoPCT Internacional No. WO 00/66604 e WO 99/14226).
[00381] Em outras modalidades, os agentes de iRNA incluem um ou mais (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais) nucleotídeos de grampo de G. Um nucleotídeo de grampo de G é um análogo citosina modificado em que as modificações conferem a capacidade de estabelecer ligações de hidrogênio com faces Watson- Crick e Hoogsteen de uma guanina complementar em um dúplex, ver, por exemplo, Lin e Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc., 120, 8531-8532. Uma única substituição de análogo de grampo de G em um oligonucleotídeo pode resultar em estabilidade térmica helicoidal substancialmente aumentada e discriminação de emparelhamentos defeituosos aquando de hibridação com oligonucleotídeos complementares. A inclusão de tais nucleotídeos nas moléculas de iRNA pode resultar em afinidade e especificidade aumentadas para alvos de ácidos nucleicos, sequências complementares, ou fitas modelo.
[00382] Modificações potencialmente estabilizantes às extremidades de moléculas de RNA podem incluir N-(acetilaminocaproil)-4- hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-O-deoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoil- uridino-3"-fosfato, dT de base invertida (idT) e outras. A divulgação desta modificação pode ser encontrada na Publicação PCT No. WO 2011/005861. Motivos de iRNA
[00383] Em uma modalidade, a sequência da fita senso pode ser representada pela fórmula (I): 5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' (I) em que: i e j são cada um independentemente 0 ou 1; p e q são cada um independentemente 0-6; cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados; cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados; cada np e nq representa independentemente um nucleotídeo da saliência; em que Nb e Y não têm a mesma modificação; e XXX, YYY e ZZZ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. Preferencialmente, YYY é nucleotídeos todos modificados por 2’-F.
[00384] Em uma modalidade o Na e/ou Nb compreendem modificações de padrão alternado.
[00385] Em uma modalidade, o motivo de YYY ocorre no ou próximo do local de clivagem da fita senso. Por exemplo, quando o agente de iRNA tem uma região de dúplex com 17-23 nucleotídeos de comprimento, o motivo YYY pode ocorrer no ou na vizinhança do local de clivagem (por exemplo: pode ocorrer nas posições 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11,12 ou 11, 12, 13) da fita senso, começando a contagem a partir do 1o nucleotídeo, a partir da extremidade 5'; ou opcionalmente, começando a contagem a partir do 1o nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, a partir da extremidade 5’.
[00386] Em uma modalidade, i é 1 e j é 0, ou i é 0 e j é 1, ou ambos i e j são 1. a fita senso pode ser portanto representada pelas seguintes fórmulas: 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib); 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); ou 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
[00387] Quando a fita senso é representada pela fórmula (Ib), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00388] Quando a fita senso é representada pela fórmula (Ic), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00389] Quando a fita senso é representada pela fórmula (Id), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Preferencialmente, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 210 nucleotídeos modificados.
[00390] Cada um de X, Y e Z pode ser o mesmo ou diferente uns dos outros.
[00391] Em outras modalidades, i é 0 e j é 0, e a fita senso pode ser representada pela fórmula: 5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia).
[00392] Quando a fita senso é representada pela fórmula (Ia), Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00393] Em uma modalidade, a sequência da fita antissenso do RNAi pode ser representada pela fórmula (II): 5' nq’-Na‘-(Z’Z‘Z‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(X‘X‘X‘)i-N‘a-np‘ 3‘ (II) em que: k e l são cada um independentemente 0 ou 1; p’ e q’ são cada um independentemente 0-6; cada Na' representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados; cada Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados; cada np’ e nq’ representa independentemente um nucleotídeo da saliência; em que Nb’ e Y’ não têm a mesma modificação; e X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[00394] Em uma modalidade o Na’ e/ou Nb’ compreendem modificações de padrão alternado.
[00395] O motivo Y’Y’Y’ ocorre no ou próximo do local de clivagem da fita antissenso. Por exemplo, quando o agente de iRNA tem uma região de dúplex com 17-23 nucleotídeos de comprimento, o motivo Y’Y’Y’ pode ocorrer nas posições 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ou 13, 14, 15 da fita antissenso, começando a contagem a partir do 1o nucleotídeo, a partir da extremidade 5'; ou opcionalmente, começando a contagem a partir do 1o nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, a partir da extremidade 5’. Preferencialmente, o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12, 13.
[00396] Em uma modalidade, o motivo Y’Y’Y’ é todos os nucleotídeos modificados por 2’-OMe.
[00397] Em uma modalidade, k é 1 e l é 0, ou k é 0 e l é 1, ou ambos k e l são 1.
[00398] A fita antissenso pode ser portanto representada pelas seguintes fórmulas: 5' nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’ 3' (IIb); 5' nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’ 3' (IIc); ou 5' nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na’-np’ 3' (Ild).
[00399] Quando a fita antissenso é representada pela fórmula (IIb), Nb’ representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 010, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00400] Quando a fita antissenso é representada pela fórmula (IIc), Nb’ representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 010, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00401] Quando a fita antissenso é representada pela fórmula (IId), Nb’ representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 010, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados. Preferencialmente, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[00402] Em outras modalidades, k é 0 e I é 0 e a fita antissenso pode ser representada pela fórmula:
[00403] 5' np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 3' (Ia).
[00404] Quando a fita antissenso é representada como fórmula (IIa), cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00405] Cada um de X‘, Y‘ e Z‘ pode ser o mesmo ou diferente uns dos outros.
[00406] Cada nucleotídeo da fita senso e fita antissenso pode ser independentemente modificado por LNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’- O-metila, 2’-O-alila, 2’-C-slila, 2’-hidroxila, ou 2’-flúor. Por exemplo, cada nucleotídeo da fita senso e fita antissenso pode está independentemente modificado por 2’-O-metila ou 2’-flúor. Cada X, Y, Z, X’, Y’ e Z’, em particular, pode representar uma modificação de 2‘-O- metila ou uma modificação de 2’-flúor.
[00407] Em uma modalidade, a fita senso do agente de RNAi pode conter o motivo YYY ocorrendo a 9, 10 e 11 posições da fita quando a região de dúplex tem 21 nt, começando a contagem a partir do 1o nucleotídeo a partir da extremidade 5', ou opcionalmente, começando a contagem a partir do 1o nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, a partir da extremidade 5’; e Y representa modificação de 2’-F. a fita senso pode adicionalmente conter motivo XXX ou motivos ZZZ como modificações em asa na extremidade oposta da região de dúplex; e XXX e ZZZ representam independentemente cada um uma modificação de 2’-OMe ou uma modificação 2’-F.
[00408] Em uma modalidade, a fita antissenso pode conter o motivo Y‘Y‘Y‘ ocorrendo a 11, 12, 13 posições da fita, começando a contagem a partir do 1o nucleotídeo a partir da extremidade 5', ou opcionalmente, começando a contagem a partir do 1o nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, a partir da extremidade 5’; e Y' representa modificação de 2’-O-metila. A fita antissenso pode adicionalmente conter motivo X’X’X’ ou motivos Z’Z’Z’ como modificações em asa na extremidade oposta da região de dúplex; e X’X’X’ e Z’Z’Z’ representam independentemente cada um uma modificação de 2’-OMe ou uma modificação 2’-F.
[00409] A fita senso representado por qualquer uma das fórmulas (Ia), (Ib), (Ic), e (Id) acima forma um dúplex com uma fita antissenso sendo representado por qualquer uma das fórmulas (IIa), (IIb), (IIc), e (IId), respectivamente.
[00410] Por consequência, os agentes de RNAi para uso nos métodos da invenção podem compreender uma fita senso e uma fita antissenso, tendo cada fita 14 a 30 nucleotídeos, o dúplex de RNAi representado pela fórmula (III): senso: 5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' ’’ ’ ’ ’’ antissenso: 3 np -Na -(XXX)k-Nb-YYY-Nb -(ZZZ)l-Na-nq 5 (III) em que: i, j, k, e l são cada um independentemente 0 ou 1; p, p‘, q, e q‘ são cada um independentemente 0-6; cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, compreendendo cada sequência pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados; cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados; em que cada np’, np, nq’, e nq, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo da saliência; e XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’, e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[00411] Em uma modalidade, i é 0 e j é 0; ou i é 1 e j é 0; ou i é 0 e j é 1; ou ambos i e j são 0; ou ambos i e j são 1. Em outra modalidade, k é 0 e l é 0; ou k é 1 e l é 0; k é 0 e l é 1; ou ambos k e l são 0; ou ambos k e l são 1.
[00412] Combinações exemplares da fita senso e fita antissenso formando um dúplex de RNAi incluem as fórmulas em baixo: 5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3' ’ ’ ’’ 3 np-Na-YYY-Na nq 5 (IIIa) 5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3' ’ ’ ’ ’’ 3 np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na nq 5 (IIIb) 5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3' ’’ ’ ’’ 3 np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 5 (IIIc) 5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3' ’’ ’ ’ ’ 3 np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 5 (IIId)
[00413] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00414] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIb), cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 1-10, 1-7, 1-5 ou 1-4 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00415] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula (IIIc), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00416] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula (IIId), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na, Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2-20, 2-15, ou 210 nucleotídeos modificados. Cada um de Na, Na’, Nb e Nb’ representa independentemente modificações de padrão alternado.
[00417] Cada um de X, Y e Z nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId) pode ser o mesmo ou diferentes uns dos outros.
[00418] Quando o agente de RNAi é representado pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Y pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos Y'. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Y podem formar pares de bases com os correspondentes nucleotídeos Y'; ou todos os três nucleotídeos Y formam pares de bases com os correspondentes nucleotídeos Y'.
[00419] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIb) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Z pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos Z'. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Z podem formar pares de bases com os correspondentes nucleotídeos Z'; ou todos os três nucleotídeos Z formam pares de bases com os correspondentes nucleotídeos Z'.
[00420] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula (IIIc) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos X pode formar um par de bases com um dos nucleotídeos X'. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos X podem formar pares de bases com os correspondentes nucleotídeos X'; ou todos os três nucleotídeos X formam pares de bases com os correspondentes nucleotídeos X'.
[00421] Em uma modalidade, a modificação no nucleotídeo Y é diferente do que a modificação no nucleotídeo Y', a modificação no nucleotídeo Z é diferente do que a modificação no nucleotídeo Z', e/ou a modificação no nucleotídeo X é diferente do que a modificação no nucleotídeo X'.
[00422] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor. Em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor e np‘ >0 e pelo menos um np‘ está ligado a um nucleotídeo da vizinhança através de uma ligação de fosforotioato. Ainda em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor, np‘ >0 e pelo menos um np‘ está ligado a um nucleotídeo da vizinhança através de ligação de fosforotioato, e a fita senso está conjugado com um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente. Em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor, np‘ >0 e pelo menos um np‘ está ligado a um nucleotídeo da vizinhança através de ligação de fosforotioato, a fita senso compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato, e a fita senso está conjugado com um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente.
[00423] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), as modificações de Na são modificações de 2'-O-metila ou 2'-flúor, np‘ >0 e pelo menos um np‘ está ligado a um nucleotídeo da vizinhança através de ligação de fosforotioato, a fita senso compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato, e a fita senso está conjugado com um ou mais derivados de GalNAc anexados através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente.
[00424] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um multímero contendo pelo menos dois dúplices representados pela fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId), em que os dúplices estão conectados por um ligador. O ligador pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende adicionalmente um ligante. Cada um dos dúplices pode se dirigir ao mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos dúplices pode se dirigir ao mesmo gene em dois locais alvo diferentes.
[00425] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um multímero contendo três, quatro, cinco, seis ou mais dúplices representados pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId), em que os dúplices estão conectados por um ligador. O ligador pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende adicionalmente um ligante. Cada um dos dúplices pode se dirigir ao mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos dúplices pode se dirigir ao mesmo gene em dois locais alvo diferentes.
[00426] Em uma modalidade, dois agentes de RNAi representados pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), e (IIId) estão ligados um ao outro na extremidade 5’, e uma ou ambas as extremidades 3’ e estão opcionalmente conjugadas com um ligante. Cada um dos agentes pode se dirigir ao mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos agentes pode se dirigir ao mesmo gene em dois locais alvo diferentes. Conjugados de iRNA
[00427] Os agentes de iRNA divulgados aqui podem estar na forma de conjugados. O conjugado pode estar anexado em qualquer localização adequada na molécula de iRNA, por exemplo, na extremidade 3' ou 5' da fita senso ou antissenso. Os conjugados estão opcionalmente anexados através de um ligador.
[00428] Em algumas modalidades, um agente de iRNA descrito aqui está quimicamente ligado a um ou mais ligantes, frações ou conjugados, que podem conferir funcionalidade, por exemplo, afetando (por exemplo, intensificando) a atividade, distribuição celular ou captação celular do iRNA. Tais frações incluem mas não estão limitadas a frações de lipídeos tais como uma fração de colesterol (Letsinger et al., (1989) Proc.Natl.Acid.Sci.USA, 1989, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg.Med.Chem.Let., 1994, 4:1053-1060), um tioéter, por exemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann.N.Y.Acad.Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg.Med.Chem.Let., 1993, 3:27652770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl.Acids Res., 1992, 20:533), uma cadeia alifática, por exemplo, dodecandiol ou resíduos undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil- rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil- amônio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl.Acids Res., 1990, 18:3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), ou adamantano de ácido acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), uma fração palmitila (Mishra et al., Biochim.Biophys.Acta, 1995, 1264:229-237), ou uma fração octadecilamina ou hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol.Exp.Ther., 1996, 277:923-937).
[00429] Em uma modalidade, um ligante altera a distribuição, direcionamento ou tempo de vida de um agente de iRNA no qual é incorporado. Em algumas modalidades, um ligante proporciona uma afinidade intensificada para um alvo selecionado, por exemplo, molécula, célula ou tipo de célula, compartimento, por exemplo, um compartimento celular ou de órgão, tecido, órgão ou região do corpo, por exemplo, em comparação com uma espécie desprovida de um tal ligante. Ligantes típicos não farão parte do emparelhamento de dúplex em um ácido nucleico em dúplex.
[00430] Os ligantes podem incluir uma substância ocorrendo naturalmente, tal como uma proteína (por exemplo, albumina do soro humano (HSA), lipoproteína de baixa densidade (LDL), ou globulina); carboidrato (por exemplo, uma dextrana, pululana, quitina, quitosana, inulina, ciclodextrina ou ácido hialurônico); ou um lipídeo. O ligante pode também uma molécula recombinante ou sintética, tal como um polímero sintético, por exemplo, um poliaminoácido sintético. Exemplos de poliaminoácidos incluem poliaminoácido é uma polilisina (PLL), poliácido L-aspártico, poliácido L-glutâmico, copolímero de estireno- anidrido do ácido maleico, copolímero poli(L-lactídeo-co-glicolídeo), copolímero de éter de divinila-anidrido maleico, copolímero de N-(2- hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietileno glicol (PEG), álcool de polivinila (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N- isopropilacrilamida, ou polifosfazina. Exemplos de poliaminas incluem: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina peptidomimético, poliamina dendrimérica, arginina, amidina, protamina, lipídeo catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina, ou um peptídeo α- helicoidal.
[00431] Os ligantes podem também incluir grupos de direcionamento, por exemplo, um agente de direcionamento para células ou tecidos, por exemplo, uma lectina, glicoproteína, lipídeo ou proteína, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo especificado de células, tal como uma célula renal. Um grupo de direcionamento pode ser uma tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensioativa A, Carboidrato de mucina, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina, manose multivalente, fucose multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactose multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, um lipídeo, colesterol, um esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina, ou peptídeo RGD ou mimético de peptídeo RGD.
[00432] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante GalNAc que compreende um ou mais derivados de N-acetilgalactosamina (GalNAc). Descrição adicional de ligantes GalNAc é proporcionada na seção intitulada Conjugados de Carboidrato.
[00433] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercaladores (por exemplo, acridinas), reticulantes (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, diidrofenazina), endonucleases artificias (por exemplo, EDTA), moléculas lipofílicas, por exemplo, colesterol, ácido cólico, adamantano de ácido acético, ácido 1-pireno butírico, diidrotestosterona, 1,3-Bis- O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico, dimetoxitritila, ou fenoxazina e conjugados de peptídeo (por exemplo, peptídeo de antennapedia, peptídeo Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquila, alquila substituída, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), facilitadores do transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, aglomerados de imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complexos Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenila, HRP, ou AP.
[00434] Os ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteínas, ou peptídeos, por exemplo, moléculas tendo uma afinidade específica para um coligante, ou anticorpos, por exemplo, um anticorpo que se liga a um tipo especificado de células, tal como uma célula cancerígena, câncer endotelial, ou célula óssea. Os ligantes podem também incluir hormônios e receptores de hormônios. Podem também incluir espécies não peptídicas, tais como lipídeos, lectinas, carboidratos, vitaminas, cofatores, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina, manose multivalente, ou fucose multivalente. O ligante pode ser, por exemplo, um lipopolissacarídeo, um ativador de p38 MAP cinase, ou um ativador de NF-KB.
[00435] O ligante pode ser uma substância, por exemplo, um fármaco, que pode aumentar a captação do agente de iRNA na célula, por exemplo, por disrupção do citoesqueleto da célula, por exemplo, por disrupção dos microtúbulos, microfilamentos, e/ou filamentos intermediários da célula. O fármaco pode ser, por exemplo, taxon, vincristina, vimblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina ou mioservina.
[00436] Em algumas modalidades, um ligante anexado a um iRNA como descrito aqui atua como um modulador farmacocinético (modulador PK). Os moduladores PK incluem lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolipídeo, peptídeos, agentes de ligação de proteína, PEG, vitaminas, etc. Moduladores PK exemplares incluem, mas não estão limitados a, colesterol, ácidos graxos, ácido cólico, ácido litocólico, diaquilglicerídeos, diacilglicerídeos, fosfolipídeos, esfingolipídeos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. Se sabe também que oligonucleotídeos que compreendem um número de ligações de fosforotioato se ligam a proteína do soro, logo, oligonucleotídeos curtos, por exemplo, oligonucleotídeos de cerca de 5 bases, 10 bases, 15 bases ou 20 bases, compreendendo múltiplas de ligações de fosforotioato na estrutura principal são também passíveis na presente invenção como ligantes (por exemplo, como ligantes de modulação PK). Adicionalmente, aptâmeros que se ligam a componentes do soro (por exemplo, proteínas do soro) são também adequados para uso como ligantes de modulação PK nas modalidades descritas aqui.
[00437] Oligonucleotídeos conjugados com ligantes da invenção podem ser sintetizados pelo uso de um oligonucleotídeo que transporta uma funcionalidade reativa pendente, tal como aquela derivada da anexação de uma molécula de ligação ao oligonucleotídeo (descrito em baixo). Este oligonucleotídeo reativo pode reagir diretamente com ligantes comercialmente disponíveis, ligantes que são sintetizados transportando qualquer um de uma variedade de grupos protetores, ou ligantes que têm uma fração de ligação anexada a eles.
[00438] Os oligonucleotídeos usados nos conjugados da presente invenção podem ser convenientemente e rotineiramente preparados através da técnica bem conhecida de síntese em fase sólida. Equipamento para tal síntese é vendido por vários vendedores, incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Quaisquer outros meios para tal síntese conhecidos na área podem ser adicionalmente ou alternativamente empregues. Também se sabe usar de técnicas similares para preparar outros oligonucleotídeos, tais como os fosforotioatos e derivados alquilados.
[00439] Nos oligonucleotídeos conjugados com ligantes e nucleosídeos ligados específicos quanto a sequências transportando moléculas de ligantes da presente invenção, os oligonucleotídeos e oligonucleosídeos podem ser montados em um sintetizador de DNA adequado utilizando precursores de nucleotídeos ou nucleosídeos padrão, ou precursores de conjugados de nucleotídeos ou nucleosídeos que já transportam a fração de ligação, precursores de conjugados de ligante-nucleotídeo ou nucleosídeo que já transportam a molécula de ligante, ou blocos de construção não transportando nucleosídeo ligante.
[00440] Quando se usa precursores de conjugados de nucleotídeos que já transportam uma fração de ligação, a síntese dos nucleosídeos ligados específicos quanto a sequências é tipicamente completada, e a molécula de ligante é então reagida com a fração de ligação para formar o oligonucleotídeo conjugado com ligante. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos ou nucleosídeos ligados da presente invenção são sintetizados por um sintetizador automatizado usando fosforamiditas derivadas de conjugados de ligante-nucleosídeo adicionalmente fosforamiditas padrão e fosforamiditas não padrão que estão comercialmente disponíveis e são rotineiramente usados na síntese de oligonucleotídeos. Conjugados de Lipídeos
[00441] Em uma modalidade, o ligante é um lipídeo ou molécula baseada em lipídeo. Um tal lipídeo ou molécula baseada em lipídeo se pode ligar tipicamente a uma proteína do soro, tal como albumina do soro humano (HSA). Um ligante de ligação a HSA permite distribuição do conjugado em um tecido alvo, por exemplo, um tecido alvo do corpo diferente de rim. Por exemplo, o tecido alvo pode ser o fígado, incluindo células parenquimais do fígado. Outras moléculas que podem se ligar a HSA podem ser também usadas como ligantes. Por exemplo, pode ser usada neproxina ou aspirina. Um ligante de lipídeo ou baseado em lipídeo pode (a) aumentar a resistência à degradação do conjugado, (b) aumentar o direcionamento ou transporte a uma célula ou membrana celular alvo, e/ou (c) ser usado para ajustar a ligação a uma proteína do soro, por exemplo, HSA.
[00442] Um ligante baseado em lipídeo pode ser usado para modular, por exemplo, controlar (por exemplo, inibir) a ligação do conjugado a um tecido alvo. Por exemplo, será menos provável que um ligante de lipídeo ou baseado em lipídeo que se liga a HSA mais fortemente seja dirigido ao rim e, portanto, será menos provável que seja eliminado do corpo. Um ligante de lipídeo ou baseado em lipídeo que se liga a HSA menos fortemente pode ser usado para dirigir o conjugado ao rim.
[00443] Em uma modalidade, o ligante baseado em lipídeo se liga a HSA. Por exemplo, o ligante pode se ligar a HSA com uma afinidade suficiente tal que a distribuição do conjugado com um tecido diferente de rim seja intensificada. No entanto, é preferencial que a afinidade não seja tipicamente tão forte que a ligação HSA-ligante não possa ser revertida.
[00444] Em outra modalidade, o ligante baseado em lipídeo se liga a HSA fracamente ou não de todo, tal que a distribuição do conjugado no rim seja intensificada. Outras frações que se dirigem a células do rim podem ser também usadas em lugar do ou adicionalmente ao ligante baseado em lipídeo.
[00445] Em outro aspecto, o ligante é uma fração, por exemplo, uma vitamina, que é absorvida por uma célula alvo, por exemplo, uma célula em proliferação. Estes são particularmente úteis para tratamento de distúrbios caracterizados por proliferação indesejada de células, por exemplo, do tipo maligno ou não maligno, por exemplo, células cancerígenas. Vitaminas exemplares incluem vitamina A, E, e K. Outras vitaminas exemplares incluem são vitamina B, por exemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal ou outras vitaminas ou nutrientes absorvidos por células cancerígenas. Também estão incluídos HSA e lipoproteína de baixa densidade (LDL).
Agentes de Permeação de Células
[00446] Em outro aspecto, o ligante é um agente de permeação de células, tal como um agente de permeação de células helicoidal. Em uma modalidade, o agente é anfipático. Um agente exemplar é um peptídeo tal como tat ou de antennopedia. Se o agente for um peptídeo, pode ser modificado, incluindo um mimético de peptidila, invertômeros, ligações não de peptídeo ou de pseudopeptídeo, e uso de D- aminoácidos. O agente helicoidal é tipicamente um agente α-helicoidal, e pode ter uma fase lipofílica e uma lipofóbica.
[00447] O ligante pode ser um peptídeo ou peptidomimético. Um peptidomimético (também referido aqui como oligopeptidomimético) é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida similar a um peptídeo natural. A ligação de peptídeos e peptidomiméticos a agentes de iRNA pode afetar a distribuição farmacocinética do iRNA, tal como por intensificação do reconhecimento e absorção celulares. A fração de peptídeo ou peptidomimética pode ter cerca de 5-50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 aminoácidos de comprimento.
[00448] Um peptídeo ou peptidomimético pode ser, por exemplo, um peptídeo de permeação de células, peptídeo catiônico, peptídeo anfipático, ou peptídeo hidrofóbico (por exemplo, consistindo maioritariamente de Tyr, Trp ou Phe). A fração de peptídeo pode ser um peptídeo de dendrímeros, peptídeo restringido ou peptídeo reticulado. Em outra alternativa, a fração de peptídeo pode incluir uma sequência de translocação membranar (MTS) hidrofóbica. Um peptídeo exemplar contendo MTS hidrofóbica é RFGF tendo a sequência de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:3367). Um análogo de RFGF (por exemplo, a sequência de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:3368)) contendo uma MTS hidrofóbica pode ser também uma fração de direcionamento. A fração de peptídeo pode ser um peptídeo de “distribuição”, que pode transportar grandes moléculas polares incluindo peptídeos, oligonucleotídeos, e proteína através de membranas celulares. Por exemplo, se descobriu que sequências da proteína Tat do HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:3369)) e da proteína de Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 3370)) são capazes de funcionar como peptídeos de distribuição. Um peptídeo ou peptidomimético pode ser codificado por uma sequência aleatória de DNA, tal como um peptídeo identificado de uma biblioteca de exibição em fagos, ou biblioteca combinatorial uma-esférula-um- composto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Tipicamente, o peptídeo ou peptidomimético preso a um agente de dsRNA através de uma unidade de monômero incorporada é um peptídeo de direcionamento de células tal como um peptídeo arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), ou mímico de RGD. O comprimento de uma fração de peptídeo pode variar de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos. As frações de peptídeo podem ter uma modificação estrutural, tal como para aumentar a estabilidade ou dirigir propriedades conformacionais. Podem ser usadas qualquer uma das modificações estruturais descritas em baixo.
[00449] Um peptídeo RGD para uso nas composições e métodos da invenção pode ser linear ou cíclico, e pode ser modificado, por exemplo, glicosilado ou metilado, para facilitar o direcionamento a tecido(s) específico(s). Peptídeos e peptidomiméticos contendo RGD podem incluir D-aminoácidos, bem como mímicos sintéticos de RGD. Adicionalmente a RGD, se pode usar outras frações que se dirigem ao ligante de integrina. Conjugados preferenciais deste ligante se dirigem a PECAM-1 ou VEGF.
[00450] Uma fração de peptídeo RGD pode ser usada para se dirigir a um tipo de célula particular, por exemplo, uma célula tumoral, tal como uma célula tumoral endotelial ou uma célula tumoral cancerígena da ama (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). Um peptídeo RGD pode facilitar o direcionamento de um agente de dsRNA a tumores de uma variedade de outros tecidos, incluindo o pulmão, rim, baço, ou fígado (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Tipicamente, o peptídeo RGD facilitará o direcionamento de um agente de iRNA ao rim. O peptídeo RGD pode ser linear ou cíclico, e pode ser modificado, por exemplo, glicosilado ou metilado para facilitar direcionamento a tecidos específicos. Por exemplo, um peptídeo RGD glicosilado pode distribuir um agente de iRNA a uma célula tumoral expressando αvβ3 (Haubner et al., Jour.Nucl.Med., 42:326-336, 2001).
[00451] Um “peptídeo de permeação de células” é capaz de permear uma célula, por exemplo, uma célula microbiana, como uma célula bacteriana ou fúngica, ou uma célula de mamífero, como uma célula humana. Um peptídeo de permeação de células microbianas pode ser, por exemplo, um peptídeo linear α-helicoidal (por exemplo, LL-37 ou Ceropina P1), um peptídeo contendo ligações dissulfeto (por exemplo, α-defensina, β-defensina ou bactenecina), ou um peptídeo contendo somente um ou dois aminoácidos dominantes (por exemplo, PR-39 ou indolicidina). Um peptídeo de permeação de células pode também incluir um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, um peptídeo de permeação de células pode ser um peptídeo anfipático bipartido, tal como MPG, que é derivado do domínio do peptídeo de fusão de gp41 do HIV-1 e do NLS do antígeno T grande do SV40 (Simeoni et al., Nucl.Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
Conjugados de Carboidratos
[00452] Em algumas modalidades das composições e métodos da invenção, um oligonucleotídeo de iRNA compreende adicionalmente um carboidrato. Os iRNA conjugados com carboidratos são vantajosos para administração in vivo de ácidos nucleicos, bem como composições adequadas para uso terapêutico in vivo, como descrito aqui. Como usado aqui, “carboidrato” se refere a um composto que é um carboidrato per se constituído por uma ou mais unidades de monossacarídeo tendo pelo menos 6 átomos de carbono (que podem ser lineares, ramificadas ou cíclicas) com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono; ou um composto tendo como uma sua parte uma fração carboidrato constituída por uma ou mais unidades de monossacarídeo tendo cada uma pelo menos seis átomos de carbono (que pode ser linear, ramificada ou cíclica), com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono. Carboidratos representativos incluem os açúcares (mono-, di-, tri- e oligossacarídeos contendo de cerca de 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 unidades de monossacarídeo), e polissacarídeos tais como amidos, glicogênio, celulose e gomas de polissacarídeos. Monossacarídeos específicos incluem açúcares C5 e superiores (por exemplo, C5, C6, C7 ou C8); di- e trissacarídeos incluem açúcares tendo duas ou três unidades de monossacarídeo (por exemplo, C5, C6, C7 ou C8).
[00453] Em uma modalidade, um conjugado de carboidrato compreende um monossacarídeo. Em uma modalidade, o monossacarídeo é uma N-acetilgalactosamina (GalNAc). Conjugados GalNAc são descritos, por exemplo, na Patente dos E.U.A. No. 8,106,022, o conteúdo inteiro da qual é deste modo incorporada aqui por referência. Em algumas modalidades, o conjugado GalNAc serve como um ligante que dirige o iRNA a células particulares. Em algumas modalidades, o conjugado GalNAc dirige o iRNA a células do fígado, por exemplo, servindo como um ligante para o receptor de asiaglicoproteína de células do fígado (por exemplo, hepatócitos).
[00454] Em algumas modalidades, o conjugado de carboidrato compreende um ou mais derivados de GalNAc. Os derivados de GalNAc podem ser anexados através de um ligador, por exemplo, um ligador ramificado bivalente ou trivalente. Em algumas modalidades, o conjugado GalNAc é conjugado à extremidade 3' da fita senso. Em algumas modalidades, o conjugado GalNAc é conjugado com o agente de iRNA (por exemplo, à extremidade 3' da fita senso) através de um ligador, por exemplo, um ligador como descrito aqui.
[00455] Em algumas modalidades, o conjugado GalNAc é
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[00456] Em algumas modalidades, o agente de RNAi está anexado ao conjugado de carboidrato através de um ligador como mostrado no esquema seguinte, em que X é O ou S
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[00457] Em algumas modalidades, o agente de iRNA é conjugado a L96 como definido na Tabela 1 e mostrado em baixo
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[00458] Em algumas modalidades, um conjugado de carboidrato para uso nas composições e métodos da invenção é selecionado do grupo consistindo em:
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[00459] Outro conjugado de carboidrato representativo para uso nas modalidades descritas aqui inclui, mas não está limitado a,
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(Fórmula XXIII), quando um de X e Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio.
[00460] Em algumas modalidades, o conjugado de carboidrato compreende adicionalmente um ou mais ligantes adicionais como descrito acima, tais como, mas não se limitando a, um modulador PK e/ou um peptídeo de permeação de células.
[00461] Em uma modalidade, um iRNA da invenção é conjugado com um carboidrato através de um ligador. Exemplos não limitantes de conjugados de carboidrato de iRNA com ligadores das composições e métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a (Fórmula XXVIII),
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(Fórmula XXX), quando um de X ou Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio. Ligadores
[00462] Em algumas modalidades, o conjugado ou ligante descrito aqui pode ser anexado a um oligonucleotídeo de iRNA com vários ligadores que podem ser cliváveis ou não cliváveis.
[00463] O termo "ligador" ou “grupo de ligação” significa uma fração orgânica que conecta duas partes de um composto, por exemplo, anexa covalentemente duas partes de um composto. Ligadores compreendem tipicamente uma ligação direta ou um átomo tal como oxigênio ou enxofre, uma unidade tal como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ou uma cadeia de átomos, tal como, mas não se limitando a, alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substituída ou não substituída, arilalquila, arilalquenila, arilalquinila, heteroarilalquila, heteroarilalquenila, heteroarilalquinila, heterociclilalquila, heterociclilalquenila, heterociclilalquinila, arila, heteroarila, heterociclila, cicloalquila, cicloalquenila, alquilarilalquila, alquilarilalquenila, alquilarilalquinila, alquenilarilalquila, alquenilarilalquenila, alquinilarilalquenila, alquilheteroarilalquenila, alquenilheteroarilalquila, alquenilheteroarilalquinila, alquinilheteroarilalquenila, alquilheterociclilalquila, alquilheterociclilalquinila, alquenilheterociclilalquenila, alquinilheterociclilalquila, alquinilheterociclilalquinila, alquilarila, alquenilarila, alquinilarila, alquilheteroarila, alquenilheteroarila, alquinilhereroarila, cujos um ou mais metilenos podem estar interrompidos ou terminados por O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, heterocíclico substituído ou não substituído; onde R8 é hidrogênio, acila, alifático ou alifático substituído. Em uma modalidade, o ligador tem entre cerca de 1-24 átomos, 2-24, 324, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 átomos, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16, ou 8-16 átomos.
[00464] Em uma modalidade, um dsRNA da invenção é conjugado com um ligador ramificado bivalente ou trivalente selecionado do grupo de estruturas apresentadas em qualquer uma das fórmulas (XXXI) - (XXXIV):
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Fórmula XXXIV em que: q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B e q5C representam independentemente para cada ocorrência 0-20 e em que a unidade repetida pode ser a mesma ou diferente; P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C estão cada um independentemente para cada ocorrência ausentes, são CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ou CH2O; Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C estão cada um independentemente para cada ocorrência ausentes, são alquileno, alquileno substituído em que um ou mais metilenos podem estar interrompidos ou terminados por um ou mais de O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R’)=C(R’’), C=C ou C(O); R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C estão cada um independentemente para cada ocorrência ausentes, são NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
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ou heterociclila; L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B e L5C representam o ligante; i.e., cada um independentemente, para cada ocorrência um monossacarídeo (tal como GalNAc), dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo, ou polissacarídeo; e Ra é H ou cadeia lateral de um aminoácido. Derivados de GalNAc conjugantes trivalentes são particularmente úteis para uso com agentes de RNAi para inibição da expressão de um gene alvo, tal como aquelas da fórmula (XXXV): Fórmula XXXV
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em que L5A, L5B e L5C representam um monossacarídeo, tal como um derivado de GalNAc.
[00465] Exemplos de derivados de GalNAc conjugantes com grupos ligadores ramificados bivalentes e trivalentes adequados incluem as, mas não estão limitados às estruturas enumeradas acima como fórmulas II, VII, XI, X, e XIII.
[00466] Um grupo de ligação clivável é um que seja suficientemente estável fora da célula, mas que, após entrada em uma célula alvo, seja clivado para liberar as duas partes que o ligador mantém juntas. Em uma modalidade preferencial, o grupo de ligação clivável é clivado pelo menos cerca de 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou mais, ou pelo menos cerca de 100 vezes mais rapidamente em uma célula alvo ou sob uma primeira condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para mimetizar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um indivíduo, ou sob uma segunda condição de referência (que pode ser, por exemplo, selecionada para mimetizar ou representar condições encontradas no sangue ou soro).
[00467] Grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, pH, potencial redox ou a presença de moléculas de degradação. Geralmente, os agentes de clivagem são mais prevalentes ou encontrados a níveis ou atividades mais elevadas dentro de células do que no soro ou sangue. Exemplos de tais agentes de degradação incluem: agentes redox que são selecionados para substratos particulares ou que não têm especificidade para substratos, incluindo, por exemplo, enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores tais como mercaptanas, presentes em células, que podem degradar um grupo de ligação clivável por redox por redução; esterases; endossomos ou agentes que podem criar um ambiente ácido, por exemplo, aqueles que resultam em um pH de cinco ou menor; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável por ácido por atuação como um ácido geral, peptidases (que podem ser específicas quanto a substratos), e fosfatases.
[00468] Um grupo de ligação clivável, tal como uma ligação dissulfeto, pode ser suscetível ao pH. O pH do soro humano é 7,4, enquanto o pH intracelular médio é ligeiramente menor, variando de cerca de 7,1-7,3. Os endossomos têm um pH mais ácido, na gama de 5,5-6,0, e os lisossomos têm um pH ainda mais ácido em torno de 5,0. Alguns ligadores terão um grupo de ligação clivável que é clivado a um pH preferencial, liberando desse modo um lipídeo catiônico do ligante dentro da célula, ou no compartimento desejado da célula.
[00469] Um ligador pode incluir um grupo de ligação clivável que é clivável por uma enzima particular. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligador pode depender da célula alvo. Por exemplo, um ligante se dirigindo ao fígado pode ser ligado a um lipídeo catiônico através de um ligador que inclui um grupo éster. As células do fígado são ricas em esterase, e portanto o ligador será clivado mais eficazmente em células do fígado do que em tipos de células que não são ricas em esterases. Outros tipos de células ricas em esterases incluem células do pulmão, córtex renal, e testículos.
[00470] Ligadores que contêm ligações de peptídeo podem ser usados quando se direcionam tipos de células ricas em peptidases, tais como células do fígado e sinoviócitos.
[00471] Em geral, a adequabilidade de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada por teste da capacidade de um agente (ou condição) de degradação para clivar o grupo de ligação candidato. Será também desejável testar o grupo de ligação clivável candidato quanto à capacidade para resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Assim, é possível determinar a suscetibilidade relativa à clivagem entre uma primeira e uma segunda condição, onde a primeira é selecionada para ser indicativa de clivagem em uma célula alvo e a segunda é selecionada para ser indicativa de clivagem em outros tecidos ou fluidos biológicos, por exemplo, sangue ou soro. As avaliações podem ser levadas a cabo em sistemas isentos de células, em células, em cultura de células, em cultura de órgãos ou tecidos, ou em animais inteiros. Pode ser útil fazer avaliações iniciais em condições isentas de células ou de cultura e confirmar por avaliações adicionais em animais inteiros. Em modalidades preferenciais, compostos candidatos úteis são clivados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou cerca de 100 vezes mais rapidamente na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizarem condições intracelulares) em comparação com sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizarem condições extracelulares). Grupos de ligação cliváveis por redox
[00472] Em uma modalidade, um grupo de ligação clivável é um grupo de ligação clivável por redox que é clivado após redução ou oxidação. Um exemplo de um grupo de ligação redutoramente clivável é um grupo de ligação dissulfeto (-S-S-). Para determinar se um grupo de ligação clivável candidato é um “grupo de ligação redutoramente clivável” adequado, ou por exemplo é adequado para uso com uma fração de iRNA particular e agente de direcionamento particular, é possível considerar métodos descritos aqui. Por exemplo, um candidato pode ser avaliado por incubação com ditiotreitol (DTT), ou outro agente redutor usando reagentes conhecidos na técnica, que mimetizam a taxa de clivagem que seria observada em uma célula, por exemplo, uma célula alvo. Os candidatos podem ser também avaliados sob condições que são selecionadas para mimetizar condições do sangue ou soro. Em uma, os compostos candidatos são clivados por no máximo cerca de 10% no sangue. Em outras modalidades, os compostos candidatos úteis são degradados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou cerca de 100 vezes mais rapidamente na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizarem condições intracelulares) em comparação com sangue (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizarem condições extracelulares). A taxa de clivagem de compostos candidatos pode ser determinada usando ensaios de cinética enzimática padrão sob condições escolhidas para mimetizarem meios intracelulares e comparando com condições escolhidas para mimetizarem meios extracelulares. Grupos de ligação cliváveis baseados em fosfato
[00473] Em outra modalidade, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável baseado em fosfato. Um grupo de ligação clivável baseado em fosfato é clivado por agentes que degradam ou hidrolisam o grupo fosfato. Um exemplo de um agente que cliva grupos fosfato em células é enzimas tais como fosfatases em células. Exemplos de grupos de ligação baseados em fosfato são -O-P(O)(ORk)-O-, -O- P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, - S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, - O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O- P(S)(Rk)-S-. Modalidades preferenciais são -O-P(O)(OH)-O-, -O- P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S- P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O- P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S- . Uma modalidade preferencial é -O-P(O)(OH)-O-. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima. Grupos de ligação cliváveis por ácido
[00474] Em outra modalidade, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável por ácido. Um grupo de ligação clivável por ácido é um grupo de ligação que é clivado sob condições ácidas. Em modalidades preferenciais, grupos de ligação cliváveis por ácido são clivados em um ambiente ácido com um pH de cerca de 6,5 ou menor (por exemplo, cerca de 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0, ou menor), ou por agentes tais como enzimas que podem atuar como um ácido geral. Em uma célula, organelos específicos de pH baixo, tais como endossomos e lisossomos, podem proporcionar um ambiente de clivagem para grupos de ligação cliváveis por ácido. Exemplos de grupos de ligação cliváveis por ácido incluem mas não estão limitados a hidrazonas, ésteres, e ésteres de aminoácidos. Grupos cliváveis por ácido podem ter a fórmula geral -C=NN-, C(O)O, ou -OC(O). Uma modalidade preferencial é quando o carbono anexado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquila substituído, ou grupo alquila terciário tal como dimetil pentila ou t-butila. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima. Grupos de ligação cliváveis baseados em éster
[00475] Em outra modalidade, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de éster. Um grupo de ligação clivável à base de éster é clivado por enzimas tais como esterases e amidases em células. Exemplos de grupos de ligação cliváveis à base de éster incluem mas não estão limitados a ésteres de grupos alquileno, alquenileno e alquinileno. Grupos de ligação cliváveis com éster têm a fórmula geral -C(O)O-, ou -OC(O)-. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima. Grupos de ligação cliváveis baseados em peptídeo
[00476] Ainda em outra modalidade, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável baseado em peptídeo. Um grupo de ligação clivável baseado em peptídeo é clivado por enzimas tais como peptidases e proteases em células. Grupos de ligação cliváveis baseados em peptídeo são ligações de peptídeo formadas entre aminoácidos para originar oligopeptídeos (por exemplo, dipeptídeos, tripeptídeos, etc.) e polipeptídeos. Grupos cliváveis baseados peptídeo não incluem o grupo amida (-C(O)NH-). O grupo amida pode ser formado entre qualquer alquileno, alquenileno ou alquinileno. Uma ligação de peptídeo é um tipo especial de ligação amida formada entre aminoácidos para originar peptídeos e proteínas. O grupo de clivagem baseado em peptídeo está geralmente limitado à ligação de peptídeo (i.e., a ligação amida) formada entre aminoácidos, originando peptídeos e proteínas e não inclui o grupo funcional amida inteiro. Os grupos de ligação cliváveis baseados em peptídeo têm a fórmula geral - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)- onde RA e RB são os grupos R de dois aminoácidos adjacentes. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
[00477] Patentes dos E.U.A. representativas que ensinam a preparação de conjugados de RNA incluem as, mas não estão limitadas às, Pat. dos E.U.A. Nos. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646; 8.106.022, os conteúdos inteiros de cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[00478] Não é necessário que todas as posições de um dado composto sejam uniformemente modificadas, e de fato mais do que uma das modificações acima mencionadas podem ser incorporadas em um único composto ou mesmo em um único nucleosídeo dentro de um iRNA. A presente invenção inclui também compostos de iRNA que são compostos quiméricos.
[00479] Compostos de iRNA “quiméricos” ou “quimeras”, no contexto da presente invenção, são compostos de iRNA, por exemplo, dsRNAs, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma constituída por pelo menos uma unidade de monômero, i.e., um nucleotídeo no caso de um composto de dsRNA. Estes iRNAs contêm tipicamente pelo menos uma região em que o RNA é modificado de modo a conferir ao iRNA resistência aumentada a degradação por nucleases, captação celular aumentada, e/ou afinidade de ligação aumentada para o ácido nucleico alvo. Uma região adicional do iRNA pode servir como um substrato para enzimas capazes de clivar híbridos RNA:DNA ou RNA:RNA. A título de exemplo, RNase H é uma endonuclease celular que cliva a fita de RNA de um dúplex RNA:DNA. A ativação de RNase H, portanto, resulta em clivagem do alvo de RNA, intensificando desse modo grandemente a eficácia da inibição da expressão de genes pelo iRNA. Consequentemente, podem ser frequentemente obtidos resultados comparáveis com iRNAs mais curtos quando são usados dsRNAs quiméricos, em comparação com deoxi dsRNAs de fosforotioato hibridando com a mesma região alvo. A clivagem do alvo de RNA pode ser rotineiramente detectada por eletroforese em gel e, se necessário, técnicas associadas de hibridação de ácidos nucleicos conhecidas na técnica.
[00480] Em certos casos, o RNA de um iRNA pode ser modificado por um grupo não ligante. Um número de moléculas não ligante foram conjugadas com iRNAs de modo a intensificar a atividade, distribuição celular ou captação celular do iRNA, e procedimentos para realização de tais conjugações estão disponíveis na literatura científica. Tais frações não ligante têm incluído frações de lipídeos, tais como colesterol (Kubo, T. et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg.Med.Chem.Lett., 1994, 4:1053), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann.N.Y.Acad.Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg.Med.Chem.Let., 1993, 3:2765), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl.Acids Res., 1992, 20:533), uma cadeia alifática, por exemplo, dodecandiol ou resíduos undecila (Saison- Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O- hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamônio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl.Acids Res., 1990, 18:3777), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), ou adamantano de ácido acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), uma fração palmitila (Mishra et al., Biochim.Biophys.Acta, 1995, 1264:229), ou uma fração octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol.Exp.Ther., 1996, 277:923). Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de RNA foram listadas acima. Protocolos de conjugação típicos envolvem a síntese de um RNA transportando um ligador amino em uma ou mais posições da sequência. O grupo amino é depois reagido com a molécula sendo conjugada usando reagentes apropriados de acoplamento ou ativação. A reação de conjugação pode ser realizada com o RNA ainda ligado ao suporte sólido ou após clivagem do RNA, em fase de solução. A purificação do conjugado de RNA por HPLC origina tipicamente o conjugado puro.
Distribuição do iRNA
[00481] A distribuição de um iRNA a um indivíduo com sua necessidade pode ser alcançada em um número de diferentes maneiras. A distribuição in vivo pode ser realizada diretamente por administração de uma composição compreendendo um iRNA, por exemplo, um dsRNA, a um indivíduo. Alternativamente, a distribuição pode ser realizada indiretamente por administração de um ou mais vetores que codificam e dirigem a expressão do iRNA. Estas alternativas são adicionalmente discutidas em baixo.
Distribuição direta
[00482] Em geral, qualquer método de distribuição de uma molécula de ácido nucleico pode ser adaptado para uso com um iRNA (ver, por exemplo, Akhtar S. e Julian RL. (1992) Trends Cell.Biol. 2(5):139-144 e WO94/02595, que são incorporados aqui por referência nas suas totalidades). No entanto, existem três fatores que são importantes de considerar de modo a distribuir com sucesso uma molécula de iRNA in vivo: (a) estabilidade biológica da molécula distribuída, (2) prevenção de efeitos não específicos, e (3) acúmulo da molécula distribuída no tecido alvo. Os efeitos não específicos de um iRNA podem ser minimizados por administração local, por exemplo por injeção ou implantação direta em um tecido (como um exemplo não limitante, um tumor) ou administração tópica da preparação. A administração local a um local de tratamento maximiza a concentração local do agente, limita a exposição do agente a tecidos sistêmicos que poderiam de outro modo ser danificados pelo agente ou que poderiam degradar o agente, e permite uma dose total menor da molécula de iRNA a ser administrada. Vários estudos mostraram o silenciamento bem-sucedido de produtos de gene quando um iRNA é administrado localmente. Por exemplo, se mostrou que a distribuição intraocular de VEGF dsRNA por injeção intravítrea em macacos cinomólogos (Tolentino, MJ., et al. (2004) Retina 24:132-138) e injeções subretinais em camundongos (Reich, SJ., et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216) previnem a neovascularização em um modelo experimental de degeneração macular relacionada com a idade. Adicionalmente, a injeção intratumoral direta de um dsRNA em camundongos reduz o volume tumoral (Pille, J., et al. (2005) Mol.Ther.11:267-274) e pode prolongar a sobrevivência de camundongos transportando tumores (Kim, WJ., et al. (2006) Mol.Ther. 14:343-350; Li, S., et al. (2007) Mol.Ther. 15:515-523). A interferência de RNA mostrou também êxito com administração local ao SNC por injeção direta (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) e aos pulmões por administração intranasal (Howard, KA., et al. (2006) Mol.Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al. (2004) J. Biol.Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al. (2005) Nat. Med. 11:50-55). Para administração de um iRNA sistemicamente para o tratamento de uma doença, o RNA pode ser modificado ou alternativamente distribuído usando um sistema de administração de fármacos; ambos os métodos atuam para prevenir a degradação rápida do dsRNA por endo- e exo-nucleases in vivo.
[00483] A modificação do RNA ou do transportador farmacêutico pode também permitir direcionamento da composição de iRNA ao tecido alvo e evitar efeitos fora do alvo indesejáveis. As moléculas de iRNA podem ser modificadas por conjugação química com grupos, por exemplo, um lipídeo ou carboidrato como descrito aqui. Tais conjugados podem ser usados para dirigir iRNA a células particulares, por exemplo, células do fígado, por exemplo, hepatócitos. Por exemplo, conjugados GalNAc ou formulações de lipídeo (por exemplo, LNP) podem ser usados para dirigir iRNA a células particulares, por exemplo, células do fígado, por exemplo, hepatócitos.
[00484] Grupos lipofílicos tais como colesterol para intensificar captação celular e prevenir degradação. Por exemplo, um iRNA dirigido contra ApoB conjugado com uma fração de colesterol lipofílica foi injetado sistemicamente em camundongos e resultou em silenciamento de mRNA de apoB no fígado e jejuno (Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432:173-178). Foi mostrado que a conjugação de um iRNA com um aptâmero inibe o crescimento tumoral e medeia a regressão tumoral em um modelo de camundongo de câncer da próstata (McNamara, JO., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). Em uma modalidade alternativa, o iRNA pode ser distribuído usando sistemas de administração de fármacos tais como uma nanopartícula, um dendrímero, um polímero, lipossomos, ou um sistema de distribuição catiônico. Sistemas de distribuição catiônicos positivamente carregados facilitam a ligação de uma molécula de iRNA (negativamente carregada) e também intensificam interações na membrana celular negativamente carregada para permitir captação eficaz de um iRNA pela célula. Lipídeos catiônicos, dendrímeros, ou polímeros podem ser ligados a um iRNA, ou induzidos para formar uma vesícula ou micélio (ver por exemplo, Kim SH., et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que encerra um iRNA. A formação de vesículas ou micélios previne adicionalmente a degradação do iRNA quando administrado sistemicamente. Métodos para preparação e administração de complexos de iRNA catiônicos estão bem dentro das capacidades de um perito na técnica (ver por exemplo, Sorensen, DR., et al. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al. (2003) Clin.Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205, que são incorporados aqui por referência na sua totalidade). Alguns exemplos não limitantes de sistemas de distribuição de fármacos úteis para distribuição sistêmica de iRNAs incluem DOTAP (Sorensen, DR., et al. (2003), supra; Verma, UN., et al. (2003), supra), Oligofectamina, "partículas de lipídeo de ácido nucleico sólidas" (Zimmermann, TS., et al. (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY., et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al. (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenoimina (Bonnet ME., et al. (2008) Pharm.Res. 16 ag Epub antes da impressão; Aigner, A. (2006) J. Biomed.Biotechnol. 71659), peptídeos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol.Pharm. 3:472487), e poliamidoaminas (Tomalia, DA., et al. (2007) Biochem.Soc.Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al. (1999) Pharm.Res. 16:1799-1804). Em algumas modalidades, um iRNA forma um complexo com ciclodextrina para administração sistêmica. Métodos para administração e composições farmacêuticas de iRNAs e ciclodextrinas podem ser encontrados na Patente dos E.U.A. No. 7.427.605, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. iRNAs codificados por vetor
[00485] Em outro aspecto, o iRNA se dirigindo ao gene ALAS1 pode ser expresso a partir de unidades de transcrição inseridas em vetores de DNA ou RNA (ver, por exemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:510; Skillern, A., et al., Publicação PCT Internacional No. WO 00/22113, Conrad, Publicação PCT Internacional No. WO 00/22114, e Conrad, Pat. dos E.U.A. No. 6,054,299). A expressão pode ser transiente (da ordem de horas a semanas) ou sustentada (semanas a meses ou mais), dependendo do constructo específico usado e do tipo de tecido ou célula alvo. Estes transgenes podem ser introduzidos como um constructo linear, um plasmídeo circular, ou um vetor viral, que pode ser um vetor integrante ou não integrante. O transgene pode ser também construído para permitir que seja herdado como um plasmídeo extracromossômico (Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[00486] A fita individual ou fitas de um iRNA podem ser transcritos a partir de um promotor em um vetor de expressão. Onde duas fitas separadas são para ser expressos para gerar, por exemplo, um dsRNA, dois vetores de expressão separados podem ser cointroduzidos (por exemplo, por transfecção ou infecção) em uma célula alvo. Alternativamente, cada fita individual de um dsRNA pode ser transcrita por promotores, ambos os quais estão localizados no mesmo plasmídeo de expressão. Em uma modalidade, um dsRNA é expresso como uma repetição invertida por uma sequência de polinucleotídeos ligador tal que o dsRNA tenha uma estrutura de haste e alça.
[00487] Um vetor de expressão de iRNA é tipicamente um plasmídeo de DNA ou vetor viral. Um vetor de expressão compatível com células eucarióticas, por exemplo, com células de vertebrado, pode ser usado para produzir constructos recombinantes para a expressão de um iRNA como descrito aqui. Vetores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis de um número de fontes comerciais. Tipicamente, tais vetores contêm locais de restrição convenientes para inserção do segmento de ácido nucleico desejado. A distribuição de vetores expressando iRNA pode ser sistêmica, tal como por administração intravenosa ou intramuscular, por administração a células alvo explantadas do paciente seguido de reintrodução no paciente, ou por qualquer outro meio que permita introdução em uma célula alvo desejada.
[00488] Um plasmídeo de expressão de iRNA pode ser transfectado em uma célula alvo como um complexo com um transportador de lipídeo catiônico (por exemplo, Oligofectamina) ou um transportador baseado em lipídeo não catiônico (por exemplo, Transit-TKOTM). Múltiplas transfecções de lipídeos para silenciamentos mediados por iRNA se dirigindo a diferentes regiões de um RNA alvo ao longo de um período de uma semana ou mais estão também contempladas pela invenção. A introdução bem-sucedida de vetores em células hospedeiras pode ser monitorada usando vários métodos conhecidos. Por exemplo, a transfecção transiente pode ser sinalizada com um repórter, tal como um marcador fluorescente, tal como Proteína Verde Fluorescente (GFP). A transfecção estável de células ex vivo pode ser assegurada usando marcadores que proporcionam à célula transfectada resistência a fatores ambientais específicos (por exemplo, antibióticos e fármacos), tal como resistência a higromicina B.
[00489] Sistemas de vetores virais que podem ser utilizados com os métodos e composições descritos aqui incluem, mas não estão limitados a, (a) vetores de adenovírus; (b) vetores de retrovírus, incluindo mas não se limitando a vetores lentivirais, vírus da leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vetores de vírus adeno-associados; (d) vetores do vírus herpes simplex; (e) vetores de SV40; (f) vetores do vírus do polioma; (g) vetores de vírus do papiloma; (h) vetores de picornavírus; (i) vetores do vírus da varíola tais como um ortopox, por exemplo, vetores de vírus vaccinia, ou avipox, por exemplo, varíola dos canários ou varíola das aves domésticas; e (j) um adenovírus dependente de auxiliares ou cobarde. Vírus deficientes quanto à replicação podem ser também vantajosos. Diferentes vetores serão ou não incorporados no genoma das células. Os constructos podem incluir sequências virais para transfecção, se desejado. Alternativamente, o constructo pode ser incorporado em vetores capazes de replicação epissômica, por exemplo, vetores de EPV e EBV. Constructos para a expressão recombinante de um iRNA irão geralmente requerer elementos reguladores, por exemplo, promotores, intensificadores, etc., para assegurar a expressão do iRNA em células alvo. Outros aspectos a ter em consideração para vetores e constructos são adicionalmente descritos em baixo.
[00490] Vetores úteis para a distribuição de um iRNA incluirão elementos reguladores (promotor, intensificador, etc.) suficientes para expressão do iRNA na célula ou tecido alvo desejado. Os elementos reguladores podem ser escolhidos para proporcionarem expressão constitutiva ou regulada/induzível.
[00491] A expressão do iRNA pode ser precisamente regulada, por exemplo, por uso de uma sequência reguladora induzível que é sensível a certos reguladores fisiológicos, por exemplo, níveis de glicose em circulação, ou hormônios (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Tais sistemas de expressão induzível, adequados para o controle da expressão de dsRNA em células ou em mamíferos incluem, por exemplo, regulação por ecdisona, por estrogênio, progesterona, tetraciclina, indutores químicos da dimerização, e isopropil-β-D1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). Uma pessoa perita na técnica seria capaz de escolher a sequência reguladora/promotora apropriada com base no uso pretendido do transgene de iRNA.
[00492] Em uma modalidade específica, podem ser usados vetores virais que contêm sequências de ácidos nucleicos codificando um iRNA. Por exemplo, pode ser usado um vetor retroviral (ver Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estes vetores retrovirais contêm os componentes necessários para o empacotamento correto do genoma viral e integração no DNA da célula hospedeira. As sequências de ácidos nucleicos codificando um iRNA são clonadas em um ou mais vetores, o que facilita a distribuição do ácido nucleico a um paciente. Mais detalhes sobre vetores retrovirais podem ser encontrados, por exemplo, em Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que descreve o uso de um vetor retroviral para distribuir o gene mdr1 a células-tronco hematopoiéticas de modo a tornar as células-tronco mais resistentes a quimioterapia. Outras referências que ilustram o uso de vetores retrovirais em terapia genética são: Clowes et al., J. Clin.Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr.Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Vetores lentivirais contemplados para uso incluem, por exemplo, os vetores baseados em HIV descritos nas Patentes dos E.U.A. Nos. 6,143,520; 5,665,557; e 5,981,276 que são aqui incorporadas por referência.
[00493] Adenovírus são também contemplados para uso na distribuição de iRNAs. Os adenovírus são veículos especialmente atrativos, por exemplo, para distribuição de genes a epitélios respiratórios. Os adenovírus infectam naturalmente epitélios respiratórios onde causam uma doença ligeira. Outros alvos de sistemas de administração baseados em adenovírus são fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais, e músculo. Os adenovírus têm a vantagem de serem capazes de infectar células não em divisão. Kozarsky e Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) apresentam uma revisão de terapia de genes baseada em adenovírus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demonstraram o uso de vetores de adenovírus para transferir genes para os epitélios respiratórios de macacos rhesus. Outros casos de uso de adenovírus em terapia de genes podem ser encontrados em Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin.Invest. 91:225-234 (1993); Publicação PCT WO94/12649; e Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Um vetor AV adequado para expressão de um iRNA apresentado na invenção, um método para construção do vetor AV recombinante, e um método para distribuição do vetor a células alvo, são descritos em Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
[00494] O uso de vetores de vírus adenoassociados (AAV) está também contemplado (Walsh et al., Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 204:289300 (1993); Pat. dos E.U.A. No. 5,436,146). Em uma modalidade, o iRNA pode ser expresso como duas moléculas de RNA de fita simples complementares, separadas a partir de um vetor AAV recombinante tendo, por exemplo, o promotor de RNA U6 ou H1, ou o promotor do citomegalovírus (CMV). Vetores AAV adequados para expressão do dsRNA apresentado na invenção, métodos para construção do vetor AV recombinante, e métodos para distribuição dos vetores a células alvo são descritos em Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Pat. dos E.U.A. No. 5,252,479; Pat. dos E.U.A. No. 5,139,941; Pedido de Patente Internacional No. WO 94/13788; e Pedido de Patente Internacional No. WO 93/24641, as divulgações inteiras dos quais são aqui incorporadas por referência.
[00495] Outro vetor viral típico é um vírus da varíola como um vírus vaccinia, por exemplo um vaccinia atenuado tal como Vírus Ancara Modificado (MVA) ou NYVAC, um avipox tal como varíola das aves domésticas ou varíola dos canários.
[00496] O tropismo dos vetores virais pode ser modificado por pseudotipagem dos vetores com proteínas do envelope ou outros antígenos de superfície de outros vírus, ou por substituição de diferentes proteínas da cápside viral, como apropriado. Por exemplo, os vetores lentivirais podem ser pseudotipados com proteínas de superfície do vírus da estomatite vesicular (VSV), raiva, Ebola, Mokola e similares. Os vetores AAV podem ser fabricados para se dirigem a diferentes células por manipulação dos vetores para expressarem diferentes serótipos de proteínas da cápside; ver, por exemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801, a divulgação inteira do qual é aqui incorporado por referência.
[00497] A preparação farmacêutica de um vetor pode incluir o vetor em um diluente aceitável, ou pode incluir uma matriz de liberação lenta na qual o veículo de distribuição de genes está embebido. Alternativamente, onde o vetor completo de distribuição de genes puder ser produzido intacto a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode incluir uma ou mais células que produzem o sistema de distribuição de genes.
III. Composições farmacêuticas contendo iRNA
[00498] Em uma modalidade, a invenção proporciona composições farmacêuticas contendo um iRNA, como descrito aqui, e um transportador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica contendo o iRNA é útil para tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com a expressão ou atividade de um gene ALAS1 (por exemplo, um distúrbio envolvendo a via da porfirina). Tais composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de distribuição. Por exemplo, as composições podem ser formuladas para administração sistêmica através de distribuição parenteral, por exemplo, por distribuição intravenosa (IV). Em algumas modalidades, uma composição proporcionada aqui (por exemplo, uma formulação LNP) é formulada para distribuição intravenosa. Em algumas modalidades, uma composição proporcionada aqui (por exemplo, uma composição compreendendo um conjugado GalNAc) é formulada para distribuição subcutânea.
[00499] As composições farmacêuticas apresentadas aqui são administradas em uma dosagem suficiente para inibir a expressão de um gene ALAS1. Em geral, uma dose adequada de iRNA estará na gama de 0,01 a 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do recipiente por dia, geralmente na gama de 1 a 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado a 0,05 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, ou 50 mg/kg por dose única. A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez diariamente, ou o iRNA pode ser administrado como duas, três, ou mais subdoses em intervalos apropriados ao longo do dia ou mesmo usando infusão ou administração contínua através de uma formulação de liberação controlada. Nesse caso, o iRNA contido em cada subdose tem de ser correspondentemente menor para alcançar a dosagem diária total. A unidade de dosagem pode ser também composta para distribuição ao longo de vários dias, por exemplo, usando uma formulação convencional de liberação sustentada que proporciona liberação sustentada do iRNA ao longo de um período de vários dias. Formulações de liberação sustentada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para distribuição de agentes a um local particular, tal como pode ser usado com os agentes da presente invenção. Em esta modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária.
[00500] O efeito de uma única dose nos níveis de ALAS1 pode ser duradouro, tal que doses subsequentes sejam administradas em intervalos de não mais do que 3, 4, ou 5 dias, ou em intervalos de não mais do que 1, 2, 3, ou 4 semanas.
[00501] O especialista perito apreciará que certos fatores podem influenciar a dosagem e calendarização requeridas para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo mas não se limitando à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos prévios, o estado geral de saúde e/ou idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. Podem ser feitas estimativas de dosagens eficazes e semividas in vivo para os iRNAs individuais englobados pela invenção usando metodologias convencionais ou com base em testes in vivo usando um modelo animal apropriado, como descrito em outro lugar aqui.
[00502] Avanços na genética de camundongos geraram um número de modelos de camundongos para o estudo de várias doenças humanas, tais como processos patológicos relacionados com a expressão de ALAS1 (por exemplo, processos patológicos envolvendo porfirinas ou defeitos na via da porfirina, tais como, por exemplo, porfirias). Tais modelos podem ser usados para teste in vivo de iRNA, bem como para determinação de uma dose terapeuticamente eficaz e/ou um regime de dosagem eficaz.
[00503] Um modelo de camundongo adequado é, por exemplo, um camundongo contendo um transgene expressando ALAS1 humano. Camundongos que tenham mutações knock-in (por exemplo, mutações que estão associadas a porfirias hepáticas agudas em humanos) podem ser usados para determinar a dosagem terapeuticamente eficaz e/ou duração da administração de siRNA de ALAS1. A presente invenção inclui também composições e formulações farmacêuticas que incluem os compostos de iRNA apresentados na invenção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em um número de maneiras dependendo de se é desejado tratamento local ou sistêmico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (por exemplo, por um penso transdérmico), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parenteral. A administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; subdérmica, por exemplo, através de um dispositivo implantado; ou intracraniana, por exemplo, por administração intraparenquimal, intratecal ou intraventricular.
[00504] O iRNA pode ser distribuído de uma maneira para se dirigir a um tecido particular, tal como um tecido que produza eritrócitos. Por exemplo, o iRNA pode ser distribuído à medula óssea, fígado (por exemplo, hepatócitos do fígado), glândulas linfáticas, baço, pulmões (por exemplo, pleura dos pulmões) ou coluna vertebral. Em uma modalidade, o iRNA é distribuído à medula óssea.
[00505] As composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir pensos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizações, líquidos e pós. Transportadores farmacêuticos convencionais, bases aquosas, pulverulentas ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e similares podem ser também úteis. Formulações tópicas adequadas incluem aquelas nas quais os iRNAs apresentados na invenção estão em mistura com um agente de distribuição tópica tal como lipídeos, lipossomos, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos. Lipídeos e lipossomos adequados incluem neutros (por exemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, diestearolifosfatidil colina), negativos (por exemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) e catiônicos (por exemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP e dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). Os iRNAs apresentados na invenção podem ser encapsulados dentro de lipossomos ou podem formar complexos com eles, em particular com lipossomos catiônicos. Alternativamente, os iRNAs podem ser complexados com lipídeos, em particular com lipídeos catiônicos. Ácidos graxos e ésteres adequados incluem mas não estão limitados a ácido araquidônico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1- dodecilazacicloheptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um éster de alquila C1-20 (por exemplo, miristato de isopropila IPM), monoglicerídeo, diglicerídeo ou seu sal farmaceuticamente aceitável. Formulações tópicas são descritas em detalhe na Patente dos E.U.A. No. 6,747,014, que é incorporada aqui por referência.
Formulações de lipossomos
[00506] Existem muitas estruturas tensioativas organizadas para além de microemulsões que foram estudadas e usadas para a formulação de fármacos. Estas incluem monocamadas, micélios, bicamadas e vesículas. As vesículas, tais como lipossomos, têm atraído grande interesse devido à sua especificidade e a duração da ação que elas oferecem do ponto de vista da distribuição de fármacos. Como usado na presente invenção, o termo "lipossomo" significa uma vesícula composta por lipídeos anfifílicos dispostos em uma bicamada ou bicamadas esféricas.
[00507] Os lipossomos são vesículas unilamelares ou multilamelares que têm uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição a ser distribuída. Os lipossomos catiônicos possuem a vantagem de serem capazes de se fundir à parede celular. Os lipossomos não catiônicos, embora não capazes de se fundir tão eficazmente à parede celular, são absorvidos por macrófagos in vivo.
[00508] De modo a atravessarem a pele intacta de mamífero, as vesículas de lipídeo têm de passar por uma série de poros finos, cada um com um diâmetro menor do que 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Portanto, é desejável usar um lipossomo que seja altamente deformável e capaz de passar através de tais poros finos.
[00509] Vantagens adicionais de lipossomos incluem; os lipossomos obtidos de fosfolipídeos naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; os lipossomos podem incorporar uma ampla gama de fármacos solúveis em água e lipídeos; os lipossomos podem proteger agentes de RNAi encapsulados em seus compartimentos internos de metabolismo e degradação (Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245). Considerações importantes na preparação de formulações de lipossomos são a carga superficial do lipídeo, tamanho da vesícula e o volume aquoso dos lipossomos.
[00510] Os lipossomos são úteis para a transferência e distribuição de ingredientes ativos ao local de ação. Porque a membrana dos lipossomos é estruturalmente similar a membranas biológicas, quando são aplicados lipossomos a um tecido, os lipossomos começar a se fundir com as membranas celulares e, à medida que a fusão do lipossomo e a célula progride, os conteúdos dos lipossomos são esvaziados na célula onde o agente ativo pode atuar.
[00511] As formulações de lipossomos têm sido o foco de extensa investigação como o modo de distribuição para muitos fármacos. Existe evidência crescente de que, para administração tópica, os lipossomos apresentam várias vantagens em relação a outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos secundários reduzidos relacionados com elevada absorção sistêmica do fármaco administrado, acúmulo aumentado do fármaco administrado no alvo desejado, e a capacidade de administrar uma ampla variedade de fármacos, hidrofílicos e hidrofóbicos, à pele.
[00512] Vários relatórios detalharam a capacidade dos lipossomos de distribuir agentes incluindo DNA de elevado peso molecular à pele. Compostos incluindo analgésicos, hormônios e DNAs de elevado peso molecular têm sido administrados à pele. A maioria das aplicações resultou no direcionamento à epiderme superior.
[00513] Os lipossomos são classificados em duas amplas classes. Os lipossomos catiônicos são lipossomos positivamente carregados que interatuam com as moléculas de DNA negativamente carregadas para formar um complexo estável. O complexo DNA/lipossomo positivamente carregado se liga à superfície celular negativamente carregada e é interiorizado em um endossomo. Devido ao pH ácido dentro do endossomo, os lipossomos sofrem ruptura, liberando seus conteúdos no citoplasma da célula (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[00514] Os lipossomos que são sensíveis ao pH ou negativamente carregados aprisionam o DNA em vez de se complexarem com ele. Uma vez que o DNA e o lipídeo estão ambos similarmente carregados, ocorre repulsão em vez de formação de complexo. Independentemente, algum DNA é aprisionado dentro do interior aquoso destes lipossomos. Os lipossomos sensíveis ao pH têm sido usados para distribuir DNA codificando o gene da timidina cinase a monocamadas de células em cultura. A expressão do gene exógeno foi detectada nas células alvo (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[00515] Um grande tipo de composição de lipossomos inclui fosfolipídeos sem serem fosfatidilcolina naturalmente derivada. Composições de lipossomos neutras, por exemplo, podem ser formadas a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Composições de lipossomos aniônicas são geralmente formadas a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, enquanto lipossomos fusogênicos aniônicos são formados principalmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição de lipossomos é formada a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, PC de soja, e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de fosfolipídeo e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[00516] Vários estudos avaliaram a distribuição tópica de formulações de fármacos de lipossomos à pele. A aplicação de lipossomos contendo interferon à pele de porquinhos-da-índia em uma redução de soros de herpes da pele enquanto a distribuição de interferon através de outros meios (por exemplo, como uma solução ou como uma emulsão) foi ineficaz (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Adicionalmente, um estudo adicional testou a eficácia de interferon administrados como parte de uma formulação de lipossomos à administração de interferon usando um sistema aquoso, e concluiu que a formulação de lipossomos era superior à administração aquosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
[00517] Sistemas de lipossomos não iônicos foram também examinados para determinar a sua utilidade na distribuição de fármacos à pele, em particular sistemas compreendendo tensoativo não iônico e colesterol. Formulações de lipossomos não iônicas compreendendo NovasomeTM I (dilaurato de glicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10- estearila) e NovasomeTM II (diestearato de glicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) foram usadas para distribuir ciclosporina-A à derme de pele de camundongos. Os resultados indicaram que tais sistemas de lipossomos não iônicos foram eficazes na facilitação da deposição de ciclosporina A em diferentes camadas da pele (Hu et al. S.T.P.Pharma.Sci., 1994, 4, 6, 466).
[00518] Os lipossomos incluem também lipossomos “estericamente estabilizados”, um termo que, como usado aqui, se refere a lipossomos compreendendo um ou mais lipídeos especializados que, quando incorporados em lipossomos, resultam em tempos de vida em circulação intensificados em relação a lipossomos não tendo tais lipídeos especializados. Exemplos de lipossomos estericamente estabilizados são aqueles nos quais parte da porção de lipídeo formadora de vesícula do lipossomo (A) compreende um ou mais glicolipídeos, tais como monossialogangliosídeo GM1, ou (B) é derivatizada com um ou mais polímeros hidrofílicos, tais como uma fração de polietileno glicol (PEG). Embora não desejando estar limitar por qualquer teoria particular, se pensa na técnica que, pelo menos para lipossomos estericamente estabilizados contendo gangliosídeos, esfingomielina, ou lipídeos derivatizados com PEG, a semivida em circulação intensificada destes lipossomos estericamente estabilizados deriva de uma captação reduzida em células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53:3765).
[00519] Vários lipossomos compreendendo um ou mais glicolipídeos são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann.N.Y.Acad.Sci., 1987, 507, 64) relataram a capacidade de monossialogangliosídeo GM1, sulfato de galactocerebrosídeo e fosfatidilinositol de melhorar as semividas no sangue de lipossomos. Estas descobertas foram expostas por Gabizon et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1988, 85, 6949). As Pat. dos E.U.A. No. 4,837,028 e WO 88/04924, ambas em nome de Allen et al., divulgam lipossomos compreendendo (1) esfingomielina e (2) o gangliosídeo GM1 ou um éster de sulfato de galactocerebrosídeo. A Pat. dos E.U.A. No. 5,543,152 (Webb et al.) divulga lipossomos compreendendo esfingomielina. Lipossomos compreendendo 1,2-sn- dimiristoilfosfatidilcolina são divulgados em WO 97/13499 (Lim et al.).
[00520] Muitos lipossomos compreendendo lipídeos derivatizados com um ou mais polímeros hidrofílicos, e métodos de sua preparação, são conhecidos na técnica. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) descreveram lipossomos compreendendo um detergente não iônico, 2C1215G, que contém uma fração de PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) notaram que o revestimento hidrofílico de partículas de polistireno com glicóis poliméricos resulta em semividas no sangue significativamente intensificadas. Fosfolipídeos sintéticos modificados pela anexação de grupos carboxílicos de polialquilenos glicóis (por exemplo, PEG) são descritos por Sears (Pat. dos E.U.A. Nos. 4,426,330 e 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) descreverem experiências demonstrando que lipossomos compreendendo fosfatidiletanolamina (PE) derivatizada com PEG ou estearato de PEG têm aumentos significativos nas semividas em circulação no sangue. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) prolongaram tais observações a outros fosfolipídeos derivatizados de PEG, por exemplo, DSPE-PEG, formados a partir da combinação de distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) e PEG. Lipossomos tendo frações de PEG covalentemente ligadas na sua superfície externa são descritos na Patente Europeia No. EP 0 445 131 B1 e WO 90/04384 em nome de Fisher. Composições de lipossomos contendo 1-20 mole percentual de PE derivatizado com PEG, e métodos de seu uso, são descritas por Woodle et al. (Pat. dos E.U.A. Nos. 5,013,556 e 5,356,633) e Martin et al. (Pat. dos E.U.A. No. 5,213,804 e Patente Europeia No. EP 0 496 813 B1). Lipossomos compreendendo um número de outros conjugados lipídeo-polímero são divulgados em WO 91/05545 e Pat. dos E.U.A. No. 5,225,212 (ambas em nome de Martin et al.) e em WO 94/20073 (Zalipsky et al.) Lipossomos compreendendo lipídeos de ceramida modificados por PEG são descritos em WO 96/10391 (Choi et al.). A Pat. dos E.U.A. No. 5,540,935 (Miyazaki et al.) e a Pat. dos E.U.A. No. 5,556,948 (Tagawa et al.) descrevem lipossomos contendo PEG que podem ser adicionalmente derivatizados com frações funcionais nas suas superfícies.
[00521] Um número de lipossomos compreendendo ácidos nucleicos é conhecido na técnica. WO 96/40062 em nome de Thierry et al. divulga métodos para encapsulação de ácidos nucleicos de elevado peso molecular em lipossomos. A Pat. dos E.U.A. No. 5.264.221 em nome de Tagawa et al. divulga lipossomos ligados a proteínas e afirma que os conteúdos de tais lipossomos podem incluir um dsRNA. A Pat. dos E.U.A. No. 5,665,710 em nome de Rahman et al. descreve certos métodos de encapsulação de oligodeoxinucleotídeos em lipossomos. WO 97/04787 em nome Love et al. divulga lipossomos compreendendo dsRNAs dirigidos ao gene raf.
[00522] Transfersomos são ainda outro tipo de lipossomos, e são agregados de lipídeos altamente deformáveis que são candidatos atrativos para veículos de distribuição de fármacos. Os transfersomos podem ser descritos como gotículas de lipídeos que são tão altamente deformáveis que são facilmente capazes de penetrar em poros que são menores do que a gotícula. Os transfersomos são adaptáveis ao ambiente no qual são usados, por exemplo, são auto-otimizantes (adaptativos à forma dos poros na pele), autorreparantes, frequentemente alcançam seus alvos sem fragmentação, e frequentemente autocarregantes. Para preparar transfersomos é possível adicionar ativadores de borda de superfície, habitualmente tensoativos, a uma composição de lipossomos padrão. Transfersomos têm sido usados para distribuir albumina do soro à pele. Foi mostrado que a distribuição de albumina do soro mediada por transfersomos é tão eficaz como injeção subcutânea de uma solução contendo albumina do soro.
[00523] Os tensoativos encontram ampla aplicação em formulações tais como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomos. O modo mais comum de classificar e ordenar as propriedades dos muitos tipos diferentes de tensoativos, naturais e sintéticos, é pelo uso do equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB). A natureza do grupo hidrofílico (também conhecido como a "cabeça") proporciona o meio mais útil de categorização dos diferentes tensoativos usados em formulações (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1988, p. 285).
[00524] Se a molécula de tensoativo não estiver ionizada, é classificada como um tensoativo não iônico. Os tensoativos não iônicos encontram ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e são usáveis em uma ampla gama de valores de pH. Em geral, seus valores HLB variam de 2 a cerca de 18, dependendo da sua estrutura. Tensoativos não iônicos incluem ésteres não iônicos tais como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de glicerila, ésteres de poliglicerila, ésteres de sorbitana, ésteres de sacarose, e ésteres etoxilados. Alcanolamidas e éteres não iônicos tais como etoxilados de álcoois graxos, álcoois propoxilados, e polímeros em bloco etoxilados/propoxilados, estão também incluídos em esta classe. Os tensoativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe dos tensoativos não iônicos.
[00525] Se a molécula de tensoativo transportar uma carga negativa quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como aniônico. Tensoativos aniônicos incluem carboxilatos tais como sabões, lactilatos de acila, amidas de acila de aminoácidos, ésteres do ácido sulfúrico tais como sulfatos de alquila e sulfatos de alquila etoxilados, sulfonatos tais como benzenossulfonatos de alquila, isetionatos de acila, tauratos de acila e sulfossuccinatos, e fosfatos. Os membros mais importantes da classe dos tensoativos aniônicos são os sulfatos de alquila e os sabões.
[00526] Se a molécula de tensoativo transportar uma carga positiva quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como catiônico. Tensoativos catiônicos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas. Os sais de amônio quaternário são os membros mais usados desta classe.
[00527] Se a molécula de tensoativo tiver a capacidade de transportar uma carga positiva ou negativa, o tensoativo é classificado como anfotérico. Tensoativos anfotéricos incluem derivados do ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.
[00528] O uso de tensoativos em produtos, formulações e em emulsões de fármacos foi revisto (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1988, p. 285).
Partículas de ácido nucleico lipídeo
[00529] Em uma modalidade, um dsRNA de ALAS1 apresentado na invenção está totalmente encapsulado na formulação de lipídeo, por exemplo, para formar uma SPLP, pSPLP, SNALP, ou outra partícula de ácido nucleico-lipídeo. Como usado aqui, o termo "SNALP" se refere a uma partícula estável de ácido nucleico-lipídeo, incluindo SPLP. Como usado aqui, o termo "SPLP" se refere a uma partícula de ácido nucleico- lipídeo compreendendo DNA de plasmídeo encapsulado dentro de uma vesícula de lipídeo. As SNALPs e SPLPs contêm tipicamente um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico, e um lipídeo que previne agregação da partícula (por exemplo, um conjugado PEG-lipídeo). As SNALPs e SPLPs são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, pois exibem tempos de vida em circulação prolongados após injeção intravenosa (i.v.) e se acumulam em locais distais (por exemplo, locais fisicamente separados do local de administração). As SPLPs incluem "pSPLP", que incluem um complexo de agente de condensação-ácido nucleico encapsulado como apresentado na Publicação PCT No. WO 00/03683. As partículas da presente invenção têm tipicamente um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, mais tipicamente cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, o mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicas. Adicionalmente, os ácidos nucleicos, quando presentes nas partículas ácido nucleico-lipídeo da presente invenção, são resistentes em solução aquosa a degradação com uma nuclease. Partículas de ácido nucleico-lipídeo e seu método de preparação são divulgados nas, por exemplo, Patentes dos E.U.A. Nos. 5,976,567; 5.981.501; 6.534.484; 6,586,410; 6,815,432; e Publicação PCT No. WO 96/40964.
[00530] Em uma modalidade, a razão de lipídeo em relação ao fármaco (razão massa/massa) (por exemplo, razão de lipídeo e dsRNA) estará na gama de cerca de 1:1 a cerca de 50:1, de cerca de 1:1 a cerca de 25:1, de cerca de 3:1 a cerca de 15:1, de cerca de 4:1 a cerca de 10:1, de cerca de 5:1 a cerca de 9:1, ou cerca de 6:1 a cerca de 9:1.
[00531] O lipídeo catiônico pode ser, por exemplo, cloreto de N,N- dioleil-N,N-dimetilamônio (DODAC), brometo de N,N-diestearil-N,N- dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(1-(2,3-dioleoilóxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTAP), cloreto de N-(1-(2,3-dioleilóxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleilóxi)propilamina (DODMA), 1,2-DiLinoleilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2- Dilinolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2- Dilinoleilcarbamoilóxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2- Dilinoleióxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2- Dilinoleióxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3- dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-Dilinoleiltio-3- dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-Linoleoil-2-linoleilóxi-3- dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal cloreto de 1,2-Dilinoleilóxi-3- trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal cloreto de 1,2-Dilinoleoil-3- trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleilóxi-3-(N- metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), ou 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2- propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2-Dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) ou seus análogos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12- dienil)tetraidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4- (dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ila (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2- hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1- il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1), ou uma sua mistura. O lipídeo catiônico pode compreender de cerca de 20 % molar a cerca de 50 % molar ou cerca de 40 % molar do lipídeo total presente na partícula.
[00532] Em outra modalidade, o composto 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano pode ser usado para preparar nanopartículas de lipídeo-siRNA. A síntese de 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano é descrita no pedido de patente provisória dos Estados Unidos número 61/107,998 depositada a 23 de outubro, 2008, que é aqui incorporada por referência.
[00533] Em uma modalidade, a partícula de lipídeo-siRNA inclui 2,2- Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano a 40 %: DSPC a 10 %: Colesterol a 40 %: PEG-C-DOMG a 10 % (percentagem molar) com um tamanho das partículas de 63,0 ± 20 nm e uma Razão de siRNA/Lipídeo de 0,027.
[00534] O lipídeo não catiônico pode ser um lipídeo aniônico ou um lipídeo neutro incluindo, mas não se limitando a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclo- hexano-1-carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), etanolamina de dipalmitoíla e fosfatidila (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), PE de 16-O-monometila, PE de 16-O-dimetila, PE de 18-1- trans, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol, ou uma sua mistura. O lipídeo não catiônico pode ser de cerca de 5 % molar a cerca de 90 % molar, cerca de 10 % molar, ou cerca de 58 % molar se colesterol estiver incluído, do lipídeo total presente na partícula.
[00535] O lipídeo conjugado que inibe a agregação de partículas pode ser, por exemplo, um polietilenoglicol (PEG)-lipídeo incluindo, sem limitação, um PEG-diacilglicerol (DAG), um PEG-dialquiloxipropila (DAA), um PEG-fosfolipídeo, um PEG-ceramida (Cer), ou uma sua mistura. O conjugado PEG-DAA pode ser, por exemplo, um PEG- dilauriloxipropila (Ci2), um PEG-dimiristiloxipropila (Ci4), um PEG- dipalmitiloxipropila (Ci6), ou um PEG-diesteariloxipropila (C]8). O lipídeo conjugado que previne a agregação de partículas pode ser de 0 % molar a cerca de 20 % molar ou cerca de 2 % molar do lipídeo total presente na partícula.
[00536] Em algumas modalidades, a partícula de ácido nucleico- lipídeo inclui adicionalmente colesterol a, por exemplo, cerca de 10 % molar a cerca de 60 % molar ou cerca de 48 % molar do lipídeo total presente na partícula.
[00537] Em algumas modalidades, o iRNA é formulado em uma nanopartícula de lipídeo (LNP). LNP01
[00538] Em uma modalidade, o lipidoide ND98-4HCI (PM 1487) (ver Pedido de Patente dos E.U.A. No. 12/056,230, depositada a 26/3/2008, que é aqui incorporada por referência), Colesterol (Sigma-Aldrich), e PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) podem ser usados para preparar nanopartículas de lipídeo-dsRNA (por exemplo, partículas LNP01). Soluções de estoque de cada em etanol podem ser preparadas como se segue: ND98, 133 mg/mL; Colesterol, 25 mg/mL, PEG- Ceramida C16, 100 mg/mL. As soluções de estoque de ND98, Colesterol, e PEG-Ceramida C16 podem ser depois combinadas em uma, por exemplo, razão molar 42:48:10. A solução de lipídeo combinada pode ser misturada com dsRNA aquoso (por exemplo, em acetato de sódio pH 5) tal que a concentração final de etanol seja cerca de 35-45 % e a concentração final de acetato de sódio seja cerca de 100-300 mM. As nanopartículas de lipídeo-dsRNA são tipicamente formadas espontaneamente após mistura. Dependendo da distribuição do tamanho das partículas desejada, a mistura de nanopartículas resultante pode ser extrudada através de uma membrana de policarbonato (por exemplo, limite de exclusão de 100 nm) usando, por exemplo, uma extrusora thermobarrel, tal como Extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc). Em alguns casos, o passo de extrusão pode ser omitido. A remoção de etanol e mudança de tampão simultânea podem ser alcançadas por, por exemplo, diálise ou filtração com fluxo tangencial. O tampão pode ser mudado com, por exemplo, salino tamponada com fosfato (PBS) a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3, ou cerca de pH 7,4.
Figure img0026
Fórmula 1
[00539] Formulações de LNP01 são descritas, por exemplo, na Publicação do Pedido Internacional No. WO 2008/042973, que é deste modo incorporado por referência.
[00540] Formulações de lipídeo-dsRNA exemplares adicionais são proporcionadas na seguinte tabela. Tabela 10: Formulações de lipídeo exemplares
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DSPC: distearoilfosfatidilcolina DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina PEG-DMG: PEG-didimiristoil glicerol (C14-PEG, ou PEG-C14) (PEG com peso molecular médio de 2000) PEG-DSG: PEG-diestiril glicerol (C18-PEG, ou PEG-C18) (PEG com peso molecular médio de 2000) PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG com peso molecular médio de 2000)
[00541] Formulações compreendendo SNALP (1,2-Dilinolenilóxi- N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA)) são descritas na Publicação Internacional No. WO2009/127060, depositada a 15 de abril, 2009, que é deste modo incorporada por referência.
[00542] Formulações compreendendo XTC são descritas, por exemplo, no Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/148,366, depositado a 29 de janeiro, 2009; Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/156,851, depositado a 2 de março, 2009; Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série depositado a 10 de junho, 2009; Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/228,373, depositado a 24 de julho, 2009; Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/239,686, depositado a 3 de setembro, 2009, e Pedido Internacional No. PCT/US2010/022614, depositado a 29 de janeiro, 2010, que são deste modo incorporados por referência.
[00543] Formulações compreendendo MC3 são descritas, por exemplo, no Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/244,834, depositado a 22 de setembro, 2009, Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/185,800, depositado a 10 de junho, 2009, e Pedido Internacional No. PCT/US10/28224, depositado a 10 de junho, 2010, que são deste modo incorporados por referência.
[00544] Formulações compreendendo ALNY-100 são descritas, por exemplo, no Pedido de patente internacional número PCT/US09/63933, depositado a 10 de novembro, 2009, que é deste modo incorporado por referência.
[00545] Formulações compreendendo C12-200 são descritas no Pedido Provisório dos E.U.A. No. de Série 61/175,770, depositado a 5 de maio, 2009, e Pedido Internacional No. PCT/US10/33777, depositado a 5 de maio, 2010, que são deste modo incorporados por referência. Síntese de lipídeos catiônicos
[00546] Qualquer um dos compostos, por exemplo, lipídeos catiônicos e similares, usados nas partículas de ácido nucleico-lipídeo apresentadas na invenção podem ser preparados por técnicas conhecidas de síntese orgânica, incluindo os métodos descritos em mais detalhe nos Exemplos. Todos os substituintes são como definidos em baixo a não ser que indicado de outro modo.
[00547] “Alquila” significa um hidrocarboneto alifático saturado, de cadeia linear ou ramificado, não cíclico ou cíclico contendo de 1 a 24 átomos de carbono. Alquilas saturadas de cadeia linear representativas incluem metila, etila, n-propila, n-butila, n-pentila, n-hexila, e similares; enquanto alquilas saturadas ramificadas incluem isopropila, sec-butila, isobutila, tert-butila, isopentila e similares. Alquilas cíclicas saturadas representativas incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila e similares; enquanto alquilas cíclicas insaturadas incluem ciclopentenila e ciclo-hexenila, e similares.
[00548] “Alquenila” significa uma alquila, como definido acima, contendo pelo menos uma ligação dupla entre átomos de carbono adjacentes. Alquenilas incluem isômeros cis e trans. Alquenilas representativas de cadeia linear e ramificadas incluem etilenila, propilenila, 1-butenila, 2-butenila, isobutilenila, 1-pentenila, 2-pentenila, 3-metil-1-butenila, 2-metil-2-butenila, 2,3-dimetil-2-butenila, e similares.
[00549] “Alquinila” significa qualquer alquila ou alquenila, como definido acima, que contém adicionalmente pelo menos uma ligação tripla entre carbonos adjacentes. Alquinilas representativas de cadeia linear e ramificadas incluem acetilenila, propinila, 1-butinila, 2-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3-metil-1 butinila, e similares.
[00550] “Acila” significa qualquer alquila, alquenila, ou alquinila em que o carbono no ponto de anexação está substituído por um grupo oxo, como definido em baixo. Por exemplo, -C(=O)alquila, -C(=O)alquenila, e -C(=O)alquinila são grupos acila.
[00551] “Heterociclo” significa um anel heterocíclico monocíclico com 5 a 7 membros, ou bicíclico com 7 a 10 membros, que é saturado, insaturado, ou aromático, e que contém de 1 ou 2 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio e enxofre, e em que os heteroátomos de nitrogênio e enxofre podem estar opcionalmente oxidados, e o heteroátomo de nitrogênio pode estar opcionalmente quaternizado, incluindo anéis bicíclicos nos quais qualquer um dos heterociclos acima está fundido com um anel benzeno. O heterociclo pode estar anexado através de qualquer heteroátomo ou átomo de carbono. Heterociclos incluem heteroarilas como definido em baixo. Heterociclos incluem morfolinila, pirrolidinonila, pirrolidinila, piperidinila, piperizinila, hidantoinila, valerolactamila, oxiranila, oxetanila, tetraidrofuranila, tetraidropiranila, tetraidropiridinila, tetraidroprimidinila, tetraidrotiofenila, tetraidrotiopiranila, tetraidropirimidinila, tetraidrotiofenila, tetraidrotiopiranila, e similares
[00552] Os termos “alquila opcionalmente substituída”, “alquenila opcionalmente substituída”, “alquinila opcionalmente substituída”, “acila opcionalmente substituída”, e “heterociclo opcionalmente substituído” significam que, quando substituídos, pelo menos um átomo de hidrogênio está substituído por um substituinte. No caso de um substituinte oxo (=O), estão substituídos dois átomos de hidrogênio. A este respeito, os substituintes incluem oxo, halogênio, heterociclo, -CN, x xy x y x y x x -OR , -NR Ry, -NR C(=O)Ry, -NR SO2Ry, -C(=O)R , -C(=O)OR , - C(=O)NRxRy, -SOnRx e -SOnNRxRy, em que n é 0, 1 ou 2, Rx e Ry são o mesmo ou diferentes e são independentemente hidrogênio, alquila ou heterociclo, e cada um dos referidos substituintes de alquila e heterociclo pode estar adicionalmente substituído por um ou mais de oxo, halogênio, -OH, -CN, alquila, -ORx, heterociclo, -NRxRy, - x y x y x x xy x NR C(=O)Ry, -NR SO2Ry, -C(=O)R , -C(=O)OR , -C(=O)NR Ry, -SOnR e -SOnNRxRy.
[00553] “Halogênio” significa flúor, cloro, bromo e iodo.
[00554] Em algumas modalidades, os métodos apresentados na invenção podem requerer o uso de grupos protetores. A metodologia de grupos protetores é bem conhecida daqueles peritos na técnica (ver, por exemplo, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, Cidade de Nova Iorque, 1999). Brevemente, grupos protetores, dentro do contexto desta invenção, são qualquer grupo que reduza ou elimine a reatividade indesejada de um grupo funcional. Um grupo protetor pode ser adicionado a um grupo funcional para mascarar a sua reatividade durante certas reações e depois é removido para revelar o grupo funcional original. Em algumas modalidades é usado um “grupo protetor de álcool”. Um “grupo protetor de álcool” é qualquer grupo que diminua ou elimine a reatividade indesejada de um grupo funcional álcool. Grupos protetores podem ser adicionados e removidos usando técnicas bem conhecidas na técnica. Síntese da Fórmula A
[00555] Em algumas modalidades, partículas de ácido nucleico- lipídeo da invenção são formuladas usando um lipídeo catiônico da fórmula A:
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[00556] onde R1 e R2 são independentemente alquila, alquenila ou alquinila, cada um pode estar opcionalmente substituído, e R3 e R4 são independentemente alquila inferior ou R3 e R4 podem ser tomados em conjunto para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é XTC (2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano). Em geral, o lipídeo da fórmula A acima pode ser preparado pelos seguintes Esquemas de Reação 1 ou 2, em que todos os substituintes são como definido acima a não ser que indicado de outro modo. Esquema 1
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[00557] O lipídeo A, em que R1 e R2 são independentemente alquila, alquenila ou alquinila, cada um pode estar opcionalmente substituído, e R3 e R4 são independentemente alquila inferior ou R3 e R4 podem ser tomados em conjunto para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, pode ser preparado de acordo com o Esquema 1. A cetona 1 e o brometo 2 podem ser comprados ou preparados de acordo com métodos conhecidos daqueles com perícia ordinária na técnica. A reação de 1 e 2 origina o cetal 3. O tratamento do cetal 3 com a amina 4 origina lipídeos da fórmula A. Os lipídeos da fórmula A podem ser convertidos no correspondente sal de amônio com um sal orgânico da fórmula 5, onde X é um contraíon aniônico selecionado de halogênio, hidróxido, fosfato, sulfato ou similares.
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[00558] Alternativamente, o material de início cetona 1 pode ser preparado de acordo com o Esquema 2. O reagente de Grignard 6 e o cianeto 7 podem ser comprados ou preparados de acordo com métodos conhecidos daqueles com perícia ordinária na técnica. A reação de 6 e 7 origina a cetona 1. A conversão da cetona 1 nos correspondentes lipídeos de fórmula A é como descrito no Esquema 1. Síntese de MC3
[00559] A preparação de DLin-M-C3-DMA (i.e., 4- (dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ila) foi como se segue. Uma solução de (6Z,9Z,28Z,31Z)- heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ol (0,53 g), hidrocloreto do ácido 4- N,N-dimetilaminobutírico (0,51 g), 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,61 g) e hidrocloreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,53 g) em diclorometano (5 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante uma noite. A solução foi lavada com ácido clorídrico diluído seguido de bicarbonato de sódio aquoso diluído. As frações orgânicas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro, filtradas e o solvente foi removido em um rotovap. O resíduo foi passado em uma coluna de sílica gel (20 g) usando um gradiente de eluição de metanol/diclorometano a 1-5 %. As frações contendo o produto purificado foram combinadas e o solvente removido, originando um óleo incolor (0,54 g). Síntese de ALNY-100
[00560] A síntese do cetal 519 [ALNY-100] foi realizada usando o seguinte esquema 3:
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Síntese de 515:
[00561] A uma suspensão agitada de LiAlH4 (3,74 g, 0,09852 mol) em 200 mL de THF anidro em um BFR de duas tubuladuras (1 L) foi adicionada uma solução de 514 (10 g, 0,04926 mol) em 70 mL de THF lentamente a 0 °C sob atmosfera de nitrogênio. Após adição completa, a mistura reacional foi aquecida até à temperatura ambiente e depois aquecida até ao refluxo durante 4 horas. A progressão da reação foi monitorada por TLC. Após término da reação (por TLC), a mistura foi resfriada até 0 °C e extinta com adição cuidadosa de solução saturada de Na2SO4. A mistura reacional foi agitada durante 4 horas à temperatura ambiente e filtrada. O resíduo foi bem lavado com THF. O filtrado e as lavagens foram misturados e diluídos com 400 mL de dioxano e 26 mL de HCl conc. e agitados durante 20 minutos à temperatura ambiente. As volatilidades foram extraídas sob vácuo para originar o sal hidrocloreto de 515 como um sólido branco. Rendimento: 7,12 g 1H-RMN (DMSO, 400 MHz): δ= 9,34 (largo, 2H), 5,68 (s, 2H), 3,74 (m, 1H), 2,66-2,60 (m, 2H), 2,50-2,45 (m, 5H). Síntese de 516:
[00562] A uma solução agitada do composto 515 em 100 mL de DCM seco em um BFR de duas tubuladuras de 250 mL foi adicionado NEt3 (37,2 mL, 0,2669 mol) e resfriado até 0 °C sob atmosfera de nitrogênio. Após uma adição lenta de N-(benzilóxi-carbonilóxi)-succinimida (20 g, 0,08007 mol) em 50 mL de DCM seco, se permitiu que a mistura reacional aquecesse até à temperatura ambiente. Após término da reação (2-3 h por TLC), a mistura foi lavada sucessivamente com solução de HCl a 1 N (1 x 100 mL) e solução saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL). A camada orgânica foi depois seca sobre Na2SO4 anid. e o solvente foi evaporado para dar material em bruto que foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel para se obter 516 como massa pegajosa. Rendimento: 11g (89 %). 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): δ = 7,36-7,27 (m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,96 (la., 1H), 2,74 (s, 3H), 2.60 (m, 2H), 2,30-2,25 (m, 2H). LC-MS [M+H] -232,3 (96,94 %). Síntese de 517A e 517B:
[00563] O ciclopenteno 516 (5 g, 0,02164 mol) foi dissolvido em uma solução de 220 mL de acetona e água (10:1) em um BFR de uma tubuladura de 500 mL e foi-lhe adicionado morfolina-N-óxido de N-metila (7,6 g, 0,06492 mol) seguido de 4,2 mL de solução de OsO4 a 7,6 % (0,275 g, 0,00108 mol) em tert-butanol à temperatura ambiente. Após término da reação (~ 3 h), a mistura foi extinta com adição de Na2SO3 sólido e a mistura resultante foi agitada durante 1,5 h à temperatura ambiente. A mistura reacional foi diluída com DCM (300 mL) e lavada com água (2 x 100 mL) seguido de solução saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL), água (1 x 30 mL) e finalmente com salmoura (1x 50 mL). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 an. e o solvente foi removido in vacuo. A purificação cromatográfica em coluna de sílica gel do material em bruto foi originada uma mistura de diastereômeros, que foram separados por HPLC prepa. Rendimento: - 6 g em bruto
[00564] 517A - Pico 1 (sólido branco), 5,13 g (96 %). 1H-RMN (DMSO, 400 MHz): δ= 7,39-7,31 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 4,78-4,73 (m, 1H), 4,48-4,47 (d, 2H), 3,94-3,93 (m, 2H), 2,71 (s, 3H), 1,72-1,67 (m, 4H). LC-MS - [M+H]-266,3, [M+NH4+]-283,5 presente, HPLC-97,86 %. Estereoquímica confirmada por raios X. Síntese de 518:
[00565] Usando um procedimento análogo àquele descrito para a síntese do composto 505, o composto 518 (1,2 g, 41 %) foi obtido como um óleo incolor. 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): δ= 7,35-7,33 (m, 4H), 7,307,27 (m, 1H), 5,37-5,27 (m, 8H), 5,12 (s, 2H), 4,75 (m, 1H), 4,58-4,57 (m, 2H), 2,78-2,74 (m,7H), 2,06-2,00 (m, 8H), 1,96-1,91 (m, 2H), 1,62 (m, 4H), 1,48 (m, 2H), 1,37-1,25 (m la, 36H), 0,87 (m, 6H). HPLC- 98,65%. Procedimento Geral para a Síntese do Composto 519:
[00566] Uma solução do composto 518 (1 eq) em hexano (15 mL) foi adicionada de um modo gota a gota a uma solução gelada de LAH em THF (1 M, 2 eq). Após adição completa, a mistura foi aquecida a 40 oC ao longo de 0,5 h, depois resfriada novamente em um banho de gelo. A mistura foi cuidadosamente hidrolisada com Na2SO4 aquoso saturado, depois filtrada através de celite e reduzida a um óleo. A cromatografia em coluna proporcionou o 519 puro (1,3 g, 68 %) que foi obtido como um óleo incolor. 13C RMN = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 (x2), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 2,6, 14,1; Eletropulverização MS (+ve): Peso molecular para C44H80NO2 (M + H)+ Calc. 654,6, Experimental 654,6.
[00567] As formulações preparadas pelo método padrão ou isento de extrusão podem ser caracterizadas de modos similares. Por exemplo, as formulações são tipicamente caracterizadas por inspeção visual. Devem ser soluções translúcidas esbranquiçadas isentas de agregados ou sedimento. O tamanho das partículas e a distribuição do tamanho das partículas de nanopartículas de lipídeo podem ser medidos por dispersão de luz usando, por exemplo, um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EUA). As partículas devem ter um tamanho de cerca de 20300 nm, tal como 40-100 nm. A distribuição do tamanho das partículas deve ser unimodal. A concentração total de dsRNA na formulação, bem como a fração aprisionada, é estimada usando um ensaio de exclusão de corante. Uma amostra do dsRNA formulado pode ser incubada com um corante de ligação a RNA, tal como Ribogreen (Molecular Probes), na presença ou ausência de um tensoativo desagregador da formulação, por exemplo, Triton-X100 a 0,5 %. O dsRNA total presente na formulação pode ser determinado pelo sinal da amostra contendo o tensoativo, em relação a uma curva padrão. A fração aprisionada é determinada por subtração do conteúdo de dsRNA “livre” (como medido pelo sinal na ausência de tensoativo) do conteúdo de dsRNA total. A percentagem de dsRNA aprisionado é tipicamente >85 %. Para a formulação de SNALP, o tamanho das partículas é pelo menos 30 nm, pelo menos 40 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 60 nm, pelo menos 70 nm, pelo menos 80 nm, pelo menos 90 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 110 nm, e pelo menos 120 nm. A gama adequado é tipicamente cerca de pelo menos 50 nm a cerca de pelo menos 110 nm, cerca de pelo menos 60 nm a cerca de pelo menos 100 nm, ou cerca de pelo menos 80 nm a cerca de pelo menos 90 nm.
[00568] Composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, saquetas, comprimidos ou minicomprimidos. Podem ser desejáveis espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou ligantes. Em algumas modalidades, as formulações orais são aquelas nas quais os dsRNAs apresentados na invenção são administrados em conjunção com um ou mais tensoativos intensificadores da penetração e quelantes. Tensoativos adequados incluem ácidos graxos e/ou seus ésteres ou sais, ácidos biliares e/ou seus sais. Ácidos biliares/sais adequados incluem ácido quenodeoxicólico (CDCA) e ácido ursodeoxiquenodeoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido desidrocólico, ácido deoxicólico, ácido glucocólico, ácido glicocólico, ácido glicodeoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodeoxicólico, tauro-24,25-diidro-fusidato de sódio e glicodi- hidrofusidato de sódio. Ácidos graxos adequados incluem ácido araquidônico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um seu sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, sódio). Em algumas modalidades são usadas combinações de intensificadores da penetração, por exemplo, ácidos graxos/sais em combinação com ácidos biliares/sais. Uma combinação exemplar é o sal de sódio do ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Intensificadores da penetração adicionais incluem éter de polioxietileno-9-laurila, éter de polioxietileno- 20-cetila. Os dsRNAs apresentados na invenção podem ser distribuídos oralmente, em forma granular incluindo partículas secas pulverizadas, ou complexados para formarem micro ou nanopartículas. Agentes de complexação de dsRNA incluem poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivatizadas com DEAE, pululanas, celuloses e amidos. Agentes de complexação adequados incluem quitosana, N-trimetilquitosana, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por exemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrana, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co- glicólico) (PLGA), alginato, e polietilenoglicol (PEG). Formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas em detalhe na Patente dos E.U.A. 6,887,906, PubIn dos EUA No. 20030027780, e Patente dos E.U.A. No. 6,747,014, cada uma das quais é incorporada aqui por referência.
[00569] As composições e formulações para administração parenteral, intraparenquimal (no cérebro), intratecal, intraventricular ou intrahepática podem incluir soluções aquosas estéreis que podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, mas não se limitando a, intensificadores da penetração, compostos transportadores e outros transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00570] As composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a soluções, emulsões, e formulações contendo lipossomos. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não estão limitados a líquidos pré-formados, sólidos autoemulsificantes e semissólidos autoemulsificantes.
[00571] As formulações farmacêuticas apresentadas na presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem o passo de colocar em associação os ingredientes ativos com o(s) transportador(es) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas por colocação em associação uniforme e íntima dos ingredientes ativos com transportadores líquidos ou transportadores sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, moldagem do produto.
[00572] As composições apresentadas na presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma de muitas formas de dosagem possíveis tais como, mas não se limitando a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis moles, supositórios e enemas. As composições podem ser também formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem adicionalmente conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão pode também conter estabilizantes. Formulações Adicionais
Emulsões
[00573] As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. As emulsões são tipicamente sistemas heterogêneos de um líquido disperso em outro na forma de gotículas usualmente excedendo 0,1 μm em diâmetro (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., Volume 1, p. 245; Block em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 2, p. 335; Higuchi et al., em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). As emulsões são frequentemente sistemas bifásicos compreendendo duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersas entre si. Em geral, as emulsões podem ser da variedade água-em-óleo (w/o) ou óleo-em-água (o/w). Quando uma fase aquosa é finamente dividida e dispersa como gotículas mínimas em uma fase oleosa volumosa, a composição resultante é chamada uma emulsão água-em-óleo (w/o). Alternativamente, quando uma fase oleosa é finamente dividida e dispersa como gotículas mínimas em uma fase aquosa volumosa, a composição resultante é chamada uma emulsão óleo-em-água (o/w). As emulsões podem conter componentes adicionais adicionalmente às fases dispersas, e o fármaco ativo, que pode estar presente como uma solução na fase aquosa, fase oleosa ou ele próprio como uma fase separada. Excipientes farmacêuticos tais como emulsificantes, estabilizantes, corantes, e antioxidantes podem estar também presentes em emulsões como necessário. As emulsões farmacêuticas podem também ser emulsões múltiplas que são compreendidas por mais do que duas fases tal como, por exemplo, no caso de emulsões óleo-em-água-em-óleo (o/w/o) e água-em-óleo-em- água (w/o/w). Tais formulações complexas proporcionam frequentemente certas vantagens que emulsões binárias simples não apresentam. Emulsões múltiplas nas quais gotículas de óleo individuais de uma emulsão o/w encerram pequenas gotículas de água constituem uma emulsão w/o/w. Do mesmo modo, um sistema de gotículas de óleo encerradas em glóbulos de água estabilizados em uma fase oleosa contínua proporciona uma emulsão o/w/o.
[00574] As emulsões são caracterizadas por estabilidade termodinâmica pequena ou nula. Frequentemente, a fase dispersa ou descontínua da emulsão é bem dispersa na fase externa ou contínua e mantida em esta forma através dos meios de emulsificantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer uma das fases da emulsão pode ser um semissólido ou um sólido, como é o caso de bases e cremes de pomadas do estilo emulsão. Outros meios de estabilização de emulsões implicam o uso de emulsificantes que podem ser incorporados em qualquer uma das fases da emulsão. Os emulsificantes podem ser amplamente classificados em quatro categorias: tensoativos sintéticos, emulsificantes ocorrendo naturalmente, bases de absorção, e sólidos finamente dispersos (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199).
[00575] Os tensoativos, também conhecidos como agentes com superfície ativa, sintéticos têm encontrado ampla aplicabilidade na formulação de emulsões e foram revistos na literatura (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 285; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., 1988, volume 1, p. 199). Os tensoativos são tipicamente anfifílicos e compreendem uma porção hidrofílica e uma hidrofóbica. A razão da natureza hidrofílica em relação à hidrofóbica do tensoativo foi denominada equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma ferramenta valiosa na categorização e seleção de tensoativos na preparação de formulações. Os tensoativos podem ser classificados em diferentes classes com base na natureza do grupo hidrofílico: não iônico, aniônico, catiônico e anfotérico (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI, Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 285).
[00576] Os emulsificantes ocorrendo naturalmente usados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelhas, fosfatídeos, lecitina e acácia. As bases de absorção possuem propriedades hidrofílicas tal que possam embeber água para formar emulsões w/o retendo, no entanto, suas consistências semissólidas, tais como lanolina anidra e petrolato hidrofílico. Sólidos finamente divididos têm também sido usados como bons emulsificantes, especialmente em combinação com tensoativos e em preparações viscosas. Estes incluem sólidos inorgânicos polares, tais como hidróxidos de metais pesados, argilas não expansíveis tais como bentonita, atapulgita, hectorita, caulim, montmorilonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio e magnésio coloidal, pigmentos e sólidos não polares tais como carbono ou triestearato de glicerila.
[00577] Uma grande variedade de materiais não emulsificantes está também incluída em formulações de emulsão e contribui para as propriedades de emulsões. Estes incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, álcoois graxos, ésteres graxos, umectantes, coloides hidrofílicos, conservantes e antioxidantes (Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 335; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p.199).
[00578] Coloides hidrofílicos ou hidrocoloides incluem gomas ocorrendo naturalmente e polímeros sintéticos tais como polissacarídeos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenano, goma de guar, goma Karaya, e tragacanto), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose), e polímeros sintéticos (por exemplo, carbômeros, éteres de celulose, e polímeros de carboxivinila). Estes se dispersam ou dilatam em água par formar soluções coloidais que estabilizam emulsões por formação de filmes interfaciais fortes em redor das gotículas da fase dispersa e por aumento da viscosidade da fase externa.
[00579] Uma vez que as emulsões contêm frequentemente um número de ingredientes tais como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos que podem prontamente suportar o crescimento de micróbios, estas formulações incorporam frequentemente conservantes. Conservantes comumente usados incluídos em formulações de emulsão incluem parabeno de metila, parabeno de propila, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres do ácido p-hidroxibenzoico, e ácido bórico. Antioxidantes são também comumente adicionados a formulações de emulsão para prevenir deterioração da formulação. Os antioxidantes usados podem ser agentes de remoção de radicais livres tais como tocoferóis, galatos de alquila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes redutores tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio, e agentes sinérgicos antioxidantes tais como ácido cítrico, ácido tartárico, e lecitina.
[00580] A aplicação de formulações de emulsão através de rotas dermatológica, oral e parenteral e métodos para sua preparação foram revistos na literatura (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Edits.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199). Formulações de emulsão para distribuição oral têm sido muito amplamente usadas devido à facilidade de formulação, bem como eficácia do ponto de vista da absorção e biodisponibilidade (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 199). Laxantes à base de óleos minerais, vitaminas solúveis em óleo e preparações nutritivas com elevado conteúdo de gordura estão entre os materiais que têm sido comumente administrados oralmente como emulsões o/w.
[00581] Em uma modalidade da presente invenção, as composições de iRNAs e ácidos nucleicos são formuladas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifilo que é uma solução líquida única oticamente isotrópica e termodinamicamente estável (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245). Tipicamente, as microemulsões são sistemas que são preparados primeiramente por dispersão de um óleo em uma solução aquosa de tensoativo e depois adição de uma quantidade suficiente de um quarto componente, geralmente um álcool com comprimento intermédio da cadeia, para formar um sistema transparente. Portanto, as microemulsões têm sido também descritas como dispersões termodinamicamente estáveis, isotropicamente límpidas de dois líquidos imiscíveis que são estabilizadas por filmes interfaciais de moléculas com superfície ativa (Leung e Shah, em: Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nova Iorque, páginas 185-215). As microemulsões são comumente preparadas através de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensoativo, cotensoativo e eletrólito. Se a microemulsão é do tipo água-em-óleo (w/o) ou óleo-em- água (o/w) está dependente das propriedades do óleo e tensoativo usados e da estrutura e empacotamento geométrico das cabeças polares e caudas de hidrocarbonetos das moléculas de tensoativo (Schott, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
[00582] A abordagem fenomenológica utilizando diagramas de fase tem sido extensamente estudada e originou um entendimento abrangente, a um perito na técnica, de como formular microemulsões (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nova Iorque, NI; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 245; Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.I., volume 1, p. 335). Em comparação com emulsões convencionais, as microemulsões oferecem a vantagem de solubilização de fármacos insolúveis em água em uma formulação de gotículas termodinamicamente estáveis que se formam espontaneamente.
[00583] Os tensoativos usados na preparação de microemulsões incluem, mas não estão limitados a, tensoativos iônicos, tensoativos não iônicos, Brij 96, éteres de oleíla e polioxietileno, ésteres de ácidos graxos e poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), sozinhos ou em combinação com cotensoativos. O cotensoativo, usualmente um álcool de cadeia curta tal como etanol, 1-propanol, e 1-butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial por penetração no filme de tensoativo e consequentemente criação de um filme desordenado devido ao espaço vazio gerado entre moléculas de tensoativo. As microemulsões podem, no entanto, ser preparadas sem o uso de cotensoativos e sistemas de microemulsão autoemulsificantes isentos de álcool são conhecidos na técnica. A fase aquosa pode tipicamente ser, mas não está limitada a água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propileno glicóis, e derivados de etileno glicol. A fase de óleo pode incluir, mas não está limitada a materiais tais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos graxos, mono, di, e triglicerídeos de cadeia média (C8-C12), ésteres de ácidos graxos e glicerila polietoxilados, álcoois graxos, glicerídeos poliglicolizados, C8-C10 glicerídeos saturados poliglicolizados, óleos vegetais e óleo de silicone.
[00584] As microemulsões são particularmente de interesse do ponto de vista da solubilização de fármacos e da absorção intensificada de fármacos. Microemulsões baseadas em lipídeos (o/w e w/o) têm sido propostas para intensificar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo peptídeos (ver, por exemplo, Patentes dos E.U.A. Nos. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol., 1993, 13, 205). As microemulsões proporcionam vantagens de solubilização melhorada de fármacos, proteção de fármacos contra hidrólise enzimática, possível intensificação da absorção de fármacos devido a alterações induzidas por tensoativos na fluidez e permeabilidade da membrana, facilidade de preparação, facilidade de administração oral em relação a formas de dosagem sólidas, potência clínica melhorada, e toxicidade diminuída (ver, por exemplo, Patentes dos E.U.A. Nos. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm.Sci., 1996, 85, 138-143). Frequentemente, as microemulsões podem se formar espontaneamente quando seus componentes são colocados em conjunto à temperatura ambiente. Isto pode ser particularmente vantajoso quando se formulam fármacos termicamente instáveis, peptídeos ou iRNAs. As microemulsões têm sido também eficazes na distribuição transdérmica de componentes ativos em aplicações cosméticas e farmacêuticas. É esperado que as composições e formulações de microemulsão da presente invenção facilitarão a absorção sistêmica aumentada de iRNAs e ácidos nucleicos a partir do trato gastrointestinal, bem como melhorem a captação celular local de iRNAs e ácidos nucleicos.
[00585] As microemulsões da presente invenção podem também conter componentes e aditivos adicionais tais como monoestearato de sorbitana (Grill 3), Labrasol, e intensificadores da penetração para melhorar as propriedades da formulação e intensificar a absorção dos iRNAs e ácidos nucleicos da presente invenção. Os intensificadores da penetração usados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencentes a uma de cinco amplas categorias - tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensoativos não quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Cada uma destas classes foi discutida acima.
Intensificadores da Penetração
[00586] Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários intensificadores da penetração para efetuar a distribuição eficaz de ácidos nucleicos, particularmente iRNAs, à pele de animais. A maioria dos fármacos está presente em solução em ambas as formas ionizada e não ionizada. No entanto, usualmente apenas fármacos solúveis em lipídeos ou lipofílicos atravessam prontamente membranas celulares. Foi descoberto que mesmo fármacos não lipofílicos conseguem atravessar membranas celulares se a membrana a ser atravessada for tratada com um intensificador da penetração. Adicionalmente a auxiliarem a difusão de fármacos não lipofílicos através de membranas celulares, os intensificadores da penetração intensificam também a permeabilidade de fármacos lipofílicos.
[00587] Os intensificadores da penetração podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco amplas categorias, i.e., tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensoativos não quelantes (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NI, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada uma das classes acima mencionadas de intensificadores da penetração é descrita em baixo em mais detalhe.
[00588] Tensoativos: Em conexão com a presente invenção, tensoativos (ou "agentes com superfície ativa") são entidades químicas que, quando dissolvidas em uma solução aquosa, reduzem a tensão superficial da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, com o resultado de a absorção de iRNAs através da mucosa ser intensificada. Adicionalmente aos sais biliares e ácidos graxos, estes intensificadores da penetração incluem, por exemplo, lauril sulfato de sódio, éter de polioxietileno-9-laurila e éter de polioxietileno-20-cetila (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NI, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); e emulsões perfluoroquímicas, tais como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm.Pharmacol., 1988, 40, 252).
[00589] Ácidos graxos: Vários ácidos graxos e seus derivados que atuam como intensificadores da penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidônico, 1-monocaprato de glicerol, 1- dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, seus ésteres de alquila C1-20 (por exemplo, metila, isopropila e t-butila), e seus mono- e di-glicerídeos (i.e., oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (ver por exemplo, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm.Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[00590] Sais biliares: O papel fisiológico da bílis inclui a facilitação da dispersão e absorção de lipídeos e vitaminas solúveis em gordura (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NI, 2002; Brunton, Capítulo 38 em: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nova Iorque, 1996, pp. 934-935). Vários sais biliares naturais, e seus derivados sintéticos, atuam como intensificadores da penetração. Assim, o termo "sais biliares" inclui qualquer um dos componentes ocorrendo naturalmente da bílis bem como qualquer um de seus derivados sintéticos. Sais biliares adequados incluem, por exemplo, ácido cólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocólico (desidrocolato de sódio), ácido deoxicólico (deoxicolato de sódio), ácido glucocólico (glucocolato de sódio), ácido glicocólico (glicocolato de sódio), ácido glicodeoxicólico (glicodeoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodeoxicólico (taurodeoxicolato de sódio), ácido quenodeoxicólico (quenodeoxicolato de sódio), ácido ursodeoxicólico (UDCA), tauro-24,25-diidro-fusidato de sódio (STDHF), glicodiidrofusidato de sódio e éter de polioxietileno-9- laurila (POE) (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nova Iorque, NI, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Swinyard, Capítulo 39 Em: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm.Exp.Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm.Sci., 1990, 79, 579-583).
[00591] Agentes Quelantes Agentes quelantes, como usado em conexão com a presente invenção, podem ser definidos como compostos que removem íons metálicos da solução por formação de complexos com eles, com o resultado de a absorção de iRNAs através da mucosa ser intensificada. No que respeito ao seu uso como intensificadores da penetração na presente invenção, os agentes quelantes têm a vantagem adicional de também servirem como inibidores de DNase, pois a maioria das DNA nucleases caracterizadas requer um íon metálico divalente para catálise e é assim inibida por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Agentes quelantes adequados incluem mas não estão limitados a etilenodiaminotetraacetato dissódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por exemplo, salicilato de sódio, 5-metoxisalicilato e homovanilato), derivados N-acila de colagênio, derivados de lauret-9 e N-amino acila de β-dicetonas (enaminas) (ver, por exemplo, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[00592] Não tensoativos não quelantes: Como usado aqui, compostos intensificadores da penetração não tensoativos não quelantes podem ser definidos como compostos que demonstram atividade insignificante como agentes quelantes ou como tensoativos mas que ainda assim intensificam a absorção de iRNAs através da mucosa alimentar (ver, por exemplo, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta classe de intensificadores da penetração inclui, por exemplo, ureias cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- e 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não esteroides tais como diclofenac sódio, indometacina e fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm.Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[00593] Agentes que intensificam a captação de iRNAs ao nível celular podem ser também adicionados à composição farmacêutica e outras da presente invenção. Por exemplo, se sabe que os lipídeos catiônicos, tais como lipofectina (Junichi et al., Patente dos E.U.A. No. 5,705,188), derivados catiônicos de glicerol, e moléculas policatiônicas, tais como polilisina (Lollo et al., Pedido PCT WO 97/30731), intensificam também a captação celular de dsRNAs. Exemplos reagentes de transfecção comercialmente disponíveis, por exemplo, Lipofectamina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamina 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamina™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Reagente de Transfecção X- tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suiça), Reagente de Transfecção Lipossômica DOTAP (Grenzacherstrasse, Suiça), Reagente de Transfecção Lipossômica DOSPER (Grenzacherstrasse, Suiça), ou Fugene (Grenzacherstrasse, Suiça), Reagente Transfectam® (Promega; Madison, WI), Reagente de Transfecção TransFast™ (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marselha, França), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marselha, França), Reagente de Transfecção TransPassa D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EUA), LyoVec™/LipoGen™ (Invivogen; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção PerFectina (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), reagente de Transfecção GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), reagente de Transfecção GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção Cytofectina (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de transfecção TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EUA), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EUA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EUA), ou HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EUA), entre outros.
[00594] Podem ser utilizados outros agentes para intensificar a penetração dos ácidos nucleicos administrados, incluindo glicóis tais como etileno glicol e propileno glicol, pirróis tais como 2-pirrol, azonas, e terpenos tais como limoneno e mentona.
Transportadores
[00595] Certas composições da presente invenção incorporam também compostos transportadores na formulação. Como usado aqui, “composto transportador” ou “transportador” pode se referir a um ácido nucleico, ou seu análogo, que é inerte (i.e., não possui atividade biológica per se) mas que é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico tendo atividade biológica por, por exemplo, degradação do ácido nucleico biologicamente ativo ou promoção da sua remoção da circulação. A coadministração de um ácido nucleico e um composto transportador, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperada no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido a competição entre o composto transportador e o ácido nucleico para um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um dsRNA parcialmente de fosforotioato em tecido hepático pode ser reduzida quando é coadministrado com ácido poliinosínico, sulfato de dextrana, ácido policitídico ou ácido 4- acetamido-4'-isotiociano-estilbeno-2,2'-dissulfônico (Miyao et al., DsRNA Res.Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
Excipientes
[00596] Em contraste com um composto transportador, um “transportador farmacêutico” ou “excipiente” é um solvente, agente de suspensão farmaceuticamente aceitável ou qualquer outro veículo farmacologicamente inerte para distribuição de um ou mais ácidos nucleicos a um animal. O excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, tendo em mente o modo de administração planejado, de modo a proporcionar o volume, consistência, etc., desejados quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Transportadores farmacêuticos típicos incluem, mas não estão limitados a, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou metilcelulose de hidroxipropila, etc.); enchimentos (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, celulose de etila, poliacrilatos ou hidrogenofosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, glicolato de amido sódico, etc.); e agentes molhantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio, etc.).
[00597] Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não reagem prejudicialmente com ácidos nucleicos podem ser também usados para formular as composições da presente invenção. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a água, soluções salinas, álcoois, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares.
[00598] As formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas estéreis e não estéreis, soluções não aquosas em solventes comuns tais como álcoois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases de óleo líquidas ou sólidas. As soluções podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Podem ser usados excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não reagem prejudicialmente com ácidos nucleicos.
[00599] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem mas, não estão limitados a, água, soluções salinas, álcool, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similares.
Outros Componentes
[00600] As composições da presente invenção podem adicionalmente conter outros componentes adjuntos convencionalmente presentes em composições farmacêuticas, a seus níveis de uso estabelecidos na técnica. Assim, por exemplo, as composições podem conter materiais farmaceuticamente ativos, compatíveis, adicionais tais como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizantes. No entanto, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsificantes, sais para influência da pressão osmótica, tampões, substâncias corantes, aromatizantes e/ou aromáticas e similares que não interajam prejudicialmente com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação.
[00601] As suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão pode também conter estabilizantes.
[00602] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas apresentadas na invenção incluem (a) um ou mais compostos de iRNA e (b) um ou mais agentes biológicos que funcionam por um mecanismo não de RNAi. Exemplos de tais agentes biológicos incluem agentes que interferem com uma interação de ALAS1 e pelo menos um parceiro de ligação de ALAS1.
[00603] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinação da LD50 (a dose letal para 50 % da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50 % da população). A razão de doses entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. São típicos compostos que exibem elevados índices terapêuticos.
[00604] Os dados obtidos de ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagens para uso em humanos. A dosagem de composições apresentadas na invenção está geralmente dentro de uma gama de concentrações em circulação que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem empregue e da rota de administração utilizada. Para qualquer composto usado nos métodos apresentados na invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma gama de concentrações no plasma em circulação do composto ou, quando apropriado, do produto de polipeptídeo de uma sequência alvo (por exemplo, alcance de uma concentração diminuída do polipeptídeo) que inclui a IC50 (i.e., a concentração do composto de teste que alcança uma inibição semimáxima de sintomas) como determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar mais precisamente doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de elevado desempenho.
[00605] Adicionalmente à sua administração, como discutido acima, os iRNAs apresentados na invenção podem ser administrados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes no tratamento de doenças ou distúrbios relacionados com a expressão de ALAS1. Em qualquer caso, o médico administrador pode ajustar a quantidade e calendarização da administração de iRNA com base em resultados observados usando medições de eficácia padrão conhecidas na técnica ou descritas aqui. Métodos para tratamento de doenças relacionadas com a expressão de um gene ALAS1
[00606] A invenção se relaciona em particular com o uso de um iRNA se dirigindo a ALAS1 para inibir a expressão de ALAS1 e/ou para tratar uma doença, distúrbio, ou processo patológico que esteja relacionado com a expressão de ALAS1.
[00607] Como usado aqui, "um distúrbio relacionado com a expressão de ALAS1", "uma doença relacionada com a expressão de ALAS1", "um processo patológico relacionado com a expressão de ALAS1", ou similar inclui qualquer condição, distúrbio, ou doença no qual a expressão de ALAS1 é alterada (por exemplo, elevada), o nível de uma ou mais porfirinas é alterado (por exemplo, elevado), o nível ou atividade de uma ou mais enzimas na via biossintética do heme (via da porfirina) é alterado, ou outros mecanismos que levam a mudanças patológicas na via biossintética do heme. Por exemplo, um iRNA se dirigindo a um gene ALAS1, ou uma sua combinação, pode ser usado para tratamento de condições nas quais os níveis de uma porfirina ou um precursor de porfirina (por exemplo, ALA ou PBG) estão elevados (por exemplo, certas porfirias), ou condições nas quais existem defeitos nas enzimas da via biossintética do heme (por exemplo, certas porfirias). Distúrbios relacionados com a expressão de ALAS1 incluem, por exemplo, anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), porfiria por deficiência de ALA desidratase (porfiria de Doss), porfiria aguda intermitente (AIP), porfiria eritropoiética congênita, porfiria cutânea tardia, coproporfiria hereditária (coproporfiria), porfiria variegata, protoporfiria eritropoiética (EPP), e eritroporfiria transiente da infância.
[00608] Como usado aqui, um "indivíduo" a ser tratado de acordo com os métodos descritos aqui inclui um humano ou animal não humano, por exemplo, um mamífero. O mamífero pode ser, por exemplo, um roedor (por exemplo, um rato ou camundongo) ou um primata (por exemplo, um macaco). Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano.
[00609] Em algumas modalidades, o indivíduo está sofrendo de um distúrbio relacionado a expressão de ALAS1 (por exemplo, foi diagnosticado com uma porfiria ou tem sofrido de um ou mais sintomas de porfiria e é um transportador de uma mutação associada a porfiria) ou está em risco de desenvolver um distúrbio relacionado com a expressão de ALAS1 (por exemplo, um indivíduo com um historial familiar de porfiria, ou um indivíduo que é um transportador de uma mutação genética associada a porfiria).
[00610] Classificações de porfirias, incluindo porfirias hepáticas agudas, são descritas, por exemplo, em Balwani, M. & Desnick, R.J., Blood, 120(23), publicado online como Blood artigo de Primeira Edição, 12 de julho, 102; DOI 10.1182/blood-2012-05-423186. Como descrito em Balwain & Desnick, a porfiria aguda intermitente (AIP), a coproporfiria hereditária (HCP), a porfiria variegata (VP) são porfirias dominantes autossomais e a porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP) é recessiva autossomal. Em casos raros, AIP, HCP, e VP ocorrem como formas dominantes homozigotas. Adicionalmente, existe uma forma recessiva homozigota rara de porfiria cutânea tardia (PCT), que é a porfiria cutânea hepática única, e é também conhecida como porfiria hepatoeritropoiética. As características clínicas e laboratoriais destas porfirias são descritas na Tabela 11 em baixo. Porfiria Enzima deficiente Herança Sintomas principais, NV ou CP Atividade de enzima, % do normal Precursores de porfirina e/ou porfirinas aumentados* Eritrócitos Urina Fezes Porfirias hepáticas agudas ADP ALA desidratase AR NV ~5 Zn- protoporfirina ALA, coproporfirina III AIP HMB-sintase AD NV ~50 ALA, PBG, uroporfirina HCP COPRO- oxidase AD NV e CP ~50 ALA, PBG, coproporfirina III coproporfirina III VP PROTO-oxidase AD NV e CP ~50 ALA, PBG, coproporfirina III coproporfirina III, protoporfirina Porfirias cutâneas agudas PCT URO- descarboxilase Esporádica ou AD CP <20 uroporfirina, 7- carboxilato porfirina uroporfirina, 7- carboxilato porfirina Tabela 11: Porfirias hepáticas humanas: características clínicas e laboratoriais
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AR indica recessiva autossomal; AD, dominante autossomal; NV, neurovisceral; CP, fotossensibilidade cutânea; e -, não aplicável. *Aumentos que podem ser importantes para diagnóstico.
[00611] Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, uma porfiria hepática, por exemplo, AIP, HCP, VP, ADP, ou porfiria hepatoeritropoiética.
[00612] Em algumas modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática aguda, por exemplo, uma porfiria hepática aguda selecionada de porfiria aguda intermitente (AIP), coproporfiria hereditária (HCP), porfiria variegata (VP), e porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP).
[00613] Em algumas modalidades, a porfiria é uma porfiria dual, por exemplo, pelo menos duas porfirias. Em algumas modalidades, a porfiria dual compreende duas ou mais porfirias selecionadas de porfiria aguda intermitente (AIP), coproporfiria hereditária (HCP), porfiria variegata (VP), e porfiria por deficiência de ALA desidratase (ADP).
[00614] Em algumas modalidades, a porfiria é uma porfiria hepática dominante homozigota (por exemplo, AIP, HCP, ou VP dominante homozigoto) ou porfiria hepatoeritropoiética. Em algumas modalidades, a porfiria é AIP, HCP, VP, ou porfiria hepatoeritropoiética, ou uma sua combinação (por exemplo, uma porfiria dual). Em modalidades, a AIP, HCP, ou VP é dominante heterozigota ou dominante homozigota.
[00615] Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, ADP, e mostra um elevado nível (por exemplo, um elevado nível na urina) de ALA e/ou coproporfirina III. Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, ADP, e mostra um elevado nível de eritrócito Zn- protoporfirina.
[00616] Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, ADP, e mostra um elevado nível (por exemplo, um elevado nível na urina) de ALA, PBG, e/ou uroporfirina.
[00617] Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, HCP, e mostra um elevado nível (por exemplo, um elevado nível na urina) de ALA, PBG, e/ou coproporfirina III. Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, HCP, e mostra um elevado nível (por exemplo, um elevado nível nas fezes) de coproporfirina III.
[00618] Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, VP, e mostra um elevado nível (por exemplo, um elevado nível na urina) de ALA, PBG, e/ou coproporfirina III.
[00619] Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, HCP, e mostra um elevado nível (por exemplo, um elevado nível nas fezes) de coproporfirina III e/ou protoporfirina.
[00620] Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, PCT (por exemplo, porfiria hepatoeritropoiética) e mostra um elevado nível (por exemplo, um elevado nível na urina) de uroporfirina e/ou 7-carboxilato porfirina. Em modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, PCT (por exemplo, porfiria hepatoeritropoiética) e mostra um elevado nível (por exemplo, um elevado nível nas fezes) de uroporfirina e/ou 7-carboxilato porfirina.
[00621] Uma mutação associada a porfiria inclui qualquer mutação em um gene codificando uma enzima na via biossintética do heme (via da porfirina) ou um gene que altera a expressão de um gene na via biossintética do heme. Em muitas modalidades, o indivíduo transporta uma ou mais mutações em uma enzima da via da porfirina (por exemplo, uma mutação na ALA desidratase ou PBG deaminase). Em algumas modalidades, o indivíduo está sofrendo de uma porfiria aguda (por exemplo, AIP, porfiria por deficiência de ALA desidratase).
[00622] Em alguns casos, os pacientes com uma porfiria hepática aguda (por exemplo, AIP), ou pacientes que transportam mutações associadas a uma porfiria hepática aguda (por exemplo, AIP) mas que estão assintomáticos, têm elevados níveis de ALA e/ou PBG em comparação com indivíduos saudáveis. Ver, por exemplo, Floderus, Y. et al., Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. Em tais casos, o nível de ALA e/ou PBG pode estar elevado mesmo quando o paciente não está tendo, ou nunca teve, um ataque. Em alguns tais casos, o paciente está de outro modo completamente assintomático. Em alguns tais casos, o paciente sofre de dor, por exemplo, dor neuropática, que pode ser dor crônica (por exemplo, dor neuropática crônica). Em alguns casos, o paciente tem uma neuropatia. Em alguns casos, o paciente tem uma neuropatia progressiva.
[00623] Em algumas modalidades, o indivíduo a ser tratado de acordo com os métodos descritos aqui tem um elevado nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG. Os níveis de uma porfirina ou um precursor de porfirina podem ser avaliados usando métodos conhecidos na técnica ou métodos descritos aqui. Por exemplo, os métodos de avaliação de níveis de ALA e PBG na urina e no plasma, bem como níveis de porfirina na urina e no plasma, são divulgados em Floderus, Y. et al., Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; e Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335349, 2007, os conteúdos inteiros dos quais são deste modo incorporados na sua totalidade.
[00624] Em algumas modalidades, o indivíduo é um modelo animal de uma porfiria, por exemplo, um modelo de camundongo de uma porfiria (por exemplo, um camundongo mutante como descrito em Lindberg et al. Nature Genetics, 12: 195-199, 1996). Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano, por exemplo, um humano que tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o indivíduo não está tendo um ataque agudo de porfiria. Em algumas modalidades, o indivíduo não teve um ataque. Em algumas modalidades, o paciente sofre de dor crônica. Em algumas modalidades, o paciente tem lesões nos nervos. Em modalidades, o indivíduo tem mudanças na EMG e/ou mudanças na velocidade de condução nervosa. Em algumas modalidades, o indivíduo está assintomático. Em algumas modalidades, o indivíduo está em risco de desenvolver uma porfiria (por exemplo, transporta uma mutação de genes associada a uma porfiria) e está assintomático. Em algumas modalidades, o indivíduo teve previamente um ataque agudo mas está assintomático aquando do tratamento.
[00625] Em algumas modalidades, o indivíduo está em risco de desenvolver uma porfiria e é tratado profilaticamente para prevenir o desenvolvimento de uma porfiria. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um elevado nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG. Em algumas modalidades, o tratamento profilático começa na puberdade. Em algumas modalidades, o tratamento diminui o nível (por exemplo, o nível no plasma ou o nível na urina) de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG. Em algumas modalidades, o tratamento previne o desenvolvimento de um elevado nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG. Em algumas modalidades, o tratamento previne o desenvolvimento de, ou diminui a frequência ou gravidade de, um sintoma associado a uma porfiria, por exemplo, dor ou lesões nos nervos.
[00626] Em algumas modalidades, o nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA ou PBG, está elevado, por exemplo, em uma amostra de plasma ou urina do indivíduo. Em algumas modalidades, o nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA ou PBG, no indivíduo é avaliado com base no nível absoluto da porfirina ou do precursor de porfirina, por exemplo, ALA ou PBG, em uma amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, o nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA ou PBG, no indivíduo é avaliado com base no nível relativo da porfirina ou do precursor de porfirina, por exemplo, ALA ou PBG, em uma amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, o nível relativo é em relação ao nível de outra proteína ou composto, por exemplo, o nível de creatinina, em uma amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de urina. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de fezes.
[00627] Um elevado nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG, pode ser estabelecido, por exemplo, mostrando que o indivíduo tem um nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG (por exemplo, um nível no plasma ou na urina de ALA e/ou PBG) que é maior do que, ou maior do que ou igual a um valor de referência. Um médico com experiência no tratamento de porfirias seria capaz de determinar se o nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina (por exemplo, ALA e/ou PBG) está elevado, por exemplo, para o propósito de diagnóstico de uma porfiria ou para determinação de se um indivíduo está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, um indivíduo pode estar predisposto a um ataque agudo ou a patologia associada a uma porfiria, tal como, por exemplo, dor crônica (por exemplo, dor neuropática) e neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva).
[00628] Como usado aqui, um "valor de referência" se refere a um valor do indivíduo quando o indivíduo não está em um estado de doença, ou um valor de um indivíduo normal ou saudável, ou um valor de uma amostra ou população de referência, por exemplo, um grupo de indivíduos normais ou saudáveis (por exemplo, um grupo de indivíduos que não transporta uma mutação associada a uma porfiria e/ou um grupo de indivíduos que não sofre de sintomas associados a uma porfiria).
[00629] Em algumas modalidades, o valor de referência é um nível pré-doença no mesmo indivíduo. Em algumas modalidades, o valor de referência é um nível em uma amostra ou população de referência. Em algumas modalidades, o valor de referência é o valor médio ou mediano em uma amostra ou população de referência. Em algumas modalidades, o valor de referência o valor que é dois desvios padrão acima da média em uma amostra ou população de referência. Em algumas modalidades, o valor de referência é o valor que é 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, ou 5 desvios padrão acima da média em uma amostra ou população de referência.
[00630] Em algumas modalidades, em que o indivíduo tem um elevado nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG, o indivíduo tem um nível de ALA e/ou PBG que é pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % mais elevado do que um valor de referência. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG, que é pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 vezes mais elevado do que um valor de referência.
[00631] Em algumas modalidades, o valor de referência é um limite de referência superior. Como usado aqui, um "limite de referência superior" se refere a um nível que é o limite superior do intervalo de confiança de 95 % para uma amostra ou população de referência, por exemplo, um grupo de indivíduos normais (por exemplo, tipo selvagem) ou saudáveis, por exemplo, indivíduos que não transportam uma mutação genética associada a uma porfiria e/ou indivíduos que não sofrem de uma porfiria. Por consequência, um limite de referência inferior se refere a um nível que é o limite inferior do mesmo intervalo de confiança de 95 %.
[00632] Em algumas modalidades em que o indivíduo tem um elevado nível, por exemplo, um nível no plasma ou um nível da urina, de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA ou PBG, o nível é maior do que ou igual a 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, ou 5 vezes aquele de um valor de referência, por exemplo, um limite de referência superior. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um nível na urina de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA ou PBG, que é maior do que 4 vezes aquele de um limite de referência superior.
[00633] Em algumas modalidades, o valor de referência é um valor proporcionado em Floderus, Y. et al., Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006 ou Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. Em algumas modalidades, o valor de referência é um valor proporcionado na Tabela 1 de Sardh et al.
[00634] Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível na urina de PBG que é maior do que ou igual a 4,8 mmol/mol de creatinina. Em certas modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível na urina de PBG que é maior do que, ou maior do que ou igual a, cerca de 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 mmol/mol de creatinina.
[00635] Em modalidades, o valor de referência para PBG no plasma é 0,12 μmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de PBG no plasma que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 0,10 μmol/L, 0,12 μmol/L, 0,24 μmol/L, 0,36 μmol/L, 0,48 μmol/L, ou 0,60 μmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível no plasma de PBG que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 0,48 μmol/L.
[00636] Em modalidades, o valor de referência para PBG na urina é 1,2 mmol/mol de creatinina. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de PBG na urina que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 1,0 mmol/mol de creatinina, 1,2 mmol/mol de creatinina, 2,4 mmol/mol de creatinina, 3,6 mmol/mol de creatinina, 4,8 mmol/mol de creatinina, ou 6,0 mmol/mol de creatinina. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível na urina de PBG que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 4,8 mmol/mol de creatinina.
[00637] Em modalidades, o valor de referência para ALA no plasma é 0,12 μmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de ALA no plasma que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 0,10 μmol/L, 0,12 μmol/L, 0,24 μmol/L, 0,36 μmol/L, 0,48 μmol/L, ou 0,60 μmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de ALA no plasma que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 0,48 μmol/L.
[00638] Em modalidades, o valor de referência para ALA na urina é 3,1 mmol/mol de creatinina. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de ALA na urina que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 2,5 mmol/mol de creatinina, 3,1 mmol/mol de creatinina, 6,2 mmol/mol de creatinina, 9,3 mmol/mol de creatinina, 12,4 mmol/mol de creatinina, ou 15,5 mmol/mol de creatinina.
[00639] Em modalidades, o valor de referência para porfirina no plasma é 10 nmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de porfirina no plasma que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 10 nmol/L. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de porfirina no plasma que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 nmol/L. O indivíduo é um humano e tem um nível de porfirina no plasma que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 40 nmol/L. Em modalidades, o valor de referência para porfirina na urina é 25 μmol/mol de creatinina. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de porfirina na urina que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 25 μmol/mol de creatinina. Em modalidades, o indivíduo é um humano e tem um nível de porfirina na urina que é maior do que, ou maior do que ou igual a, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, ou 80 μmol/mol de creatinina.
[00640] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um nível, por exemplo, um nível no plasma ou um nível na urina, de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA ou PBG, que é maior do que aquele de 99 % de indivíduos em uma amostra de indivíduos saudáveis.
[00641] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um nível, por exemplo, um nível no plasma ou um nível na urina, de ALA ou PBG, que é maior do que dois desvios padrão acima do nível médio em uma amostra de indivíduos saudáveis.
[00642] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um nível na urina de ALA que é 1,6 ou mais vezes aquele do nível médio em um indivíduo normal (por exemplo, um indivíduo que não transporta uma mutação associação a uma porfiria). Em algumas modalidades, o indivíduo tem um nível no plasma de ALA que é 2 ou 3 vezes aquele do nível médio em um indivíduo normal. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um nível na urina de PBG que é quatro ou mais vezes aquele do nível médio em um indivíduo normal. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um nível no plasma de PBG que é quatro ou mais vezes aquele do nível médio em um indivíduo normal.
[00643] Em algumas modalidades, o método é eficaz para diminuir o nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, ALA e/ou PBG. Em modalidades, o método é eficaz para produzir uma redução pré-determinada no elevado nível de uma porfirina ou precursor de porfirina, por exemplo, ALA ou PBG. Em algumas modalidades, a redução pré-determinada é uma diminuição de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, ou 50%. Em algumas modalidades, a redução pré- determinada é uma redução que é eficaz para prevenir ou melhorar sintomas, por exemplo, dor ou ataques recorrentes.
[00644] Em algumas modalidades, a redução pré-determinada é uma redução que é pelo menos 1, 2, 3, ou mais desvios padrão, em que o desvio padrão é determinado com base nos valores de uma amostra de referência, por exemplo, uma amostra de referência como descrito aqui.
[00645] Em algumas modalidades, a redução pré-determinada é uma redução que leva o nível da porfirina ou precursor de porfirina até um nível que é menos do que, ou até um nível que é menos do que ou igual a um valor de referência (por exemplo, um valor de referência como descrito aqui).
[00646] Em algumas modalidades, o indivíduo a ser tratado de acordo com os métodos descritos sofre de dor, por exemplo, dor crônica. Em algumas modalidades, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma porfiria, por exemplo, uma porfiria hepática aguda, por exemplo, AIP. Em modalidades, o método é eficaz para tratar a dor, por exemplo, por redução da gravidade da dor ou cura da dor. Em modalidades, o método é eficaz para diminuir ou prevenir lesões nos nervos.
[00647] Em algumas modalidades, o indivíduo a ser tratado de acordo com os métodos descritos aqui tem um elevado nível de ALA e/ou PBG e (b) sofre de dor, por exemplo, dor crônica. Em modalidades, o método é eficaz para diminuir um elevado nível de ALA e/ou PBG e/ou tratar a dor, por exemplo, por redução da gravidade da dor ou cura da dor.
[00648] Em algumas modalidades, o indivíduo é um animal que serve como um modelo para um distúrbio relacionado a expressão de ALAS1.
[00649] Em algumas modalidades, o indivíduo é um animal que serve como um modelo para porfiria (por exemplo, um animal geneticamente modificado com uma ou mais mutações). Em algumas modalidades, a porfiria é AIP e o indivíduo é um modelo animal da AIP. Em uma tal modalidade, o indivíduo é um camundongo geneticamente modificado que é deficiente em porfobilinogênio deaminase, tal como, por exemplo, o camundongo descrito em Lindberg et al., Nature Genetics, 12:195199, 1996, ou o camundongo R167Q descrito em Yasuda, M., Yu, C. Zhang, J., Clavero, S., Edelmann, W., Gan, L., Phillips, J.D., & Desnick, R.J. Acute intermittent porphyria:A severely affected knock-in mouse that mimics the human homozygous dominant phenotype. (Resumo da Apresentação em 14 de outubro, 2011 na American Society of Human Genetics; Programa No. 1308F; acedido online em 4 de abril, 2012 em ichg2011.org/cgi-bin/showdetail.pl?absno=21167); ambas estas referências são deste modo incorporadas aqui na sua totalidade. Vários modelos knock-in para mutações causando AIP dominante homozigota em humanos foram gerados. As mutações empregues incluem, por exemplo, R167Q, R173Q, e R173W na PBG deaminase. Homozigotos viáveis incluem os R167Q/R176Q e R167Q/R173Q, ambos os quais exibem níveis constitutivamente elevados de ALA e PBG análogos ao fenótipo em AIP dominante homozigota humana; em algumas modalidades, um tal modelo de camundongo de AIP homozigota viável é o indivíduo.
[00650] Em uma modalidade, um indivíduo a ser tratado de acordo com os métodos descritos aqui (por exemplo, um indivíduo ou paciente humano) está em risco de desenvolver, ou foi diagnosticado com um distúrbio relacionado com a expressão de ALAS1, por exemplo, uma porfiria. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo que sofreu um ou mais ataque agudos de um ou mais sintomas de porfiria. Em outras modalidades, o indivíduo é um indivíduo que sofreu cronicamente de um ou mais sintomas de porfiria (por exemplo, dor, por exemplo, dor neuropática e ou neuropatia, por exemplo, neuropatia progressiva). Em algumas modalidades, o indivíduo transporta uma alteração genética (por exemplo, uma mutação) como descrito aqui mas está de outro modo assintomático. Em algumas modalidades, o indivíduo foi previamente tratado com um produto de heme (por exemplo, hemina, arginato de heme, ou albumina de heme), como descrito aqui.
[00651] Em algumas modalidades, um indivíduo (por exemplo, um indivíduo com uma porfiria, tal como, por exemplo, AIP) a ser tratado de acordo com os métodos descritos aqui experienciou recentemente ou está correntemente experienciando um pródromo. Em algumas tais modalidades, é administrado ao indivíduo um tratamento de combinação, por exemplo, um iRNA como descrito aqui, e um ou mais tratamentos adicionais que se sabe que são eficazes contra a porfiria (por exemplo, glicose e/ou um produto de heme tal como hemina, como descrito aqui) ou seus sintomas associados.
[00652] Em uma modalidade, um iRNA como descrito aqui é administrado em combinação com glicose ou dextrose. Por exemplo, dextrose a 10-20% em salino normal pode ser proporcionada intravenosamente. Tipicamente, quando é administrada glicose, pelo menos 300 g de glicose a 10 % são administrados intravenosamente diariamente. O iRNA (por exemplo, um iRNA em uma formulação LNP) pode ser também administrado intravenosamente, como parte da mesma infusão que é usada para administrar a glicose ou dextrose, ou como uma infusão separada que é administrada antes da, concorrentemente com, ou após a administração da glicose ou dextrose. Em algumas modalidades, o IRNA é administrado através de uma diferente rota de administração (por exemplo, subcutaneamente). Ainda em outra modalidade, o IRNA é administrado em combinação com nutrição parenteral total. O iRNA pode ser administrado antes da, concorrente com, ou após a administração de nutrição parenteral total.
[00653] Em uma modalidade, o iRNA é administrado em combinação com um produto de heme (por exemplo, hemina, arginato de heme, ou albumina de heme). Em uma modalidade adicional, o iRNA é administrado em combinação com um produto de heme e glicose, um produto de heme e dextrose, ou um produto de heme e nutrição parenteral total.
[00654] Um "pródromo", como usado aqui, inclui qualquer sintoma que o indivíduo individual experienciou previamente imediatamente antes de desenvolver um ataque agudo. Sintomas típicos de um pródromo incluem, por exemplo, dor abdominal, náusea, dores de cabeça, sintomas psicológicos (por exemplo, ansiedade), inquietação e/ou insônia. Em algumas modalidades, o indivíduo experiencia dor (por exemplo, dor abdominal e/ou uma dor de cabeça) durante o pródromo. Em algumas modalidades, o indivíduo experiencia náusea durante o pródromo. Em algumas modalidades, o indivíduo experiencia sintomas psicológicos (por exemplo, ansiedade) durante o pródromo. Em algumas modalidades, o indivíduo se torna inquieto e/ou sofre de insônia durante o pródromo.
[00655] Um ataque "agudo" de porfiria envolve o início de um ou mais sintomas da porfiria, tipicamente em um paciente que transporta uma mutação associação a porfiria (por exemplo, uma mutação em um gene que codifica uma enzima na via da porfirina).
[00656] Em certas modalidades, a administração de um iRNA de ALAS1 resulta em uma diminuição no nível de uma ou mais porfirinas ou precursores de porfirina, como descrito aqui (por exemplo, ALA e/ou PBG). A diminuição pode ser medida em relação a qualquer controle ou valor de referência apropriado. Por exemplo, a diminuição no nível de uma ou mais porfirinas ou precursores de porfirina pode ser estabelecida em um indivíduo individual, por exemplo, como uma diminuição de pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % ou mais em comparação com o nível antes do tratamento (por exemplo, imediatamente antes do tratamento). Uma diminuição no nível de um precursor de porfirina, uma porfirina, ou um metabolito de porfirina pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, o nível de PBG e/ou ALA na urina ou plasma pode ser avaliado, usando o teste de Watson-Schwartz, cromatografia de permuta iônica, ou cromatografia líquida de elevado desempenho - espectroscopia de massa. Ver, por exemplo Thunell (1993).
[00657] Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para reduzir o nível de ALA e/ou PBG no indivíduo. O nível de ALA ou PBG no indivíduo pode ser avaliado, por exemplo, com base no nível absoluto de ALA ou PBG, ou com base no nível relativo de ALA ou PBG (por exemplo, em relação ao nível de outra proteína ou composto, por exemplo, o nível de creatinina) em uma amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de urina. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de plasma.
[00658] Em certas modalidades, um iRNA que se dirige a ALAS1 é administrado em combinação com um ou mais tratamentos adicionais, por exemplo, outro tratamento que se sabe que é mais eficaz no tratamento de porfiria ou sintomas da porfiria. Por exemplo, o outro tratamento pode ser glicose (por exemplo, glicose IV) ou um produto de heme (por exemplo, hemina, arginato de heme, ou albumina de heme). O(s) tratamento(s) adicional(ais) pode(m) ser administrado(s) antes da, após, ou concorrente com a administração de iRNA.
[00659] O iRNA e um agente terapêutico adicional podem ser administrados em combinação na mesma composição, por exemplo, intravenosamente, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou por outro método descrito aqui.
[00660] Em algumas modalidades, a administração de iRNA, ou administração de iRNA em combinação um ou mais tratamentos adicionais (por exemplo, glicose, dextrose ou similar), diminui a frequência de ataques agudos (por exemplo, por prevenção de ataques agudos tal que não ocorram mais, ou por redução do número de ataques que ocorrem em um certo período de tempo, por exemplo, menos ataques ocorrem por ano). Em algumas tais modalidades, o iRNA é administrado de acordo com um regime de dosagem regular, por exemplo, diariamente, semanalmente, bissemanalmente ou mensalmente.
[00661] Em algumas modalidades, o iRNA é administrado após um ataque agudo de porfiria. Em algumas tais modalidades, o iRNA está em uma composição, por exemplo, uma composição compreendendo uma formulação de lipídeo, por exemplo, uma formulação LNP.
[00662] Em algumas modalidades, o iRNA é administrado durante um ataque agudo de porfiria. Em algumas tais modalidades, o iRNA está em uma composição, por exemplo, uma composição compreendendo uma formulação de lipídeo (por exemplo, uma formulação LNP) ou uma composição compreendendo um conjugado GalNAc.
[00663] Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para atenuar a gravidade do ataque (por exemplo, por melhoria de um ou mais sinais ou sintomas associados ao ataque). Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para encurtar a duração de um ataque. Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para parar um ataque. Em algumas modalidades, o iRNA é administrado profilaticamente para prevenir um ataque agudo de porfiria. Em algumas tais modalidades, o iRNA está na forma de um conjugado GalNAc, por exemplo, em uma composição compreendendo um conjugado GalNAc. Em algumas modalidades, a administração profilática é antes da, durante, ou após a exposição a ou ocorrência de um fator precipitante. Em algumas modalidades, o indivíduo está em risco de desenvolver porfiria.
[00664] Em algumas modalidades, o siRNA é administrado durante um pródromo. Em algumas modalidades, o pródromo é caracterizado por dor (por exemplo, cor de cabeça e/ou dor abdominal), náusea, sintomas psicológicos (por exemplo, ansiedade), inquietação e/ou insônia.
[00665] Em algumas modalidades, o siRNA é administrado durante uma fase particular do ciclo menstrual, por exemplo, durante a fase lútea.
[00666] Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para prevenir ataques (por exemplo, ataques recorrentes que estão associados a um pródromo e/ou a um fator precipitante, por exemplo, a uma fase particular do ciclo menstrual, por exemplo, a fase lútea). Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para reduzir a frequência de ataques. Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para atenuar a gravidade do ataque (por exemplo, por melhoria de um ou mais sinais ou sintomas associados ao ataque). Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para encurtar a duração de um ataque. Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para parar um ataque.
[00667] Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para prevenir ou diminuir a frequência ou gravidade da dor, por exemplo, dor neuropática.
[00668] Em algumas modalidades, a administração de um siRNA de ALAS1 é eficaz para prevenir ou diminuir a frequência ou gravidade da neuropatia.
[00669] Os efeitos da administração de um siRNA de ALAS1 podem ser estabelecidos, por exemplo, por comparação com um controle adequado. Por exemplo, uma diminuição na frequência de ataques agudos, bem como uma diminuição no nível de uma ou mais porfirinas ou precursores de porfirina, pode ser estabelecida, por exemplo, em um grupo de pacientes com AIP, como uma frequência diminuída em comparação com um grupo de controle apropriado. Um grupo de controle (por exemplo, um grupo de indivíduos similares ou o mesmo grupo de indivíduos em um desenho cruzado) pode incluir, por exemplo, uma população não tratada, uma população que foi tratada com um tratamento convencionalmente para a porfiria (por exemplo, um tratamento convencional para a AIP pode incluir glicose, hemina, ou ambas); uma população que foi tratada com placebo, ou um iRNA não dirigido, opcionalmente em combinação com um ou mais tratamentos convencionais para a porfiria (por exemplo, glicose, por exemplo, glicose IV), e similares.
[00670] Um indivíduo "em risco" de desenvolver porfiria, como usado aqui, inclui um indivíduo com um historial familiar de porfiria e/ou um historial de um ou mais sintomas porfíricos recorrentes ou crônicos, e/ou um indivíduo que transporta uma alteração genética (por exemplo, uma mutação) em um gene codificando uma enzima da vida biossintética do heme, e um indivíduo que transporta uma alteração genética, por exemplo, uma mutação que se sabe que está associada a porfiria.
[00671] Em modalidades, a alteração, por exemplo, a mutação, torna um indivíduo suscetível a um ataque agudo (por exemplo, após exposição a um fator precipitante, por exemplo, um fármaco, fazer dieta ou outro fator precipitante, por exemplo, um fator precipitante como divulgado aqui). Em modalidades, a alteração, por exemplo, a mutação, está associada a elevados níveis de uma porfirina ou um precursor de porfirina (por exemplo, ALA e/ou PBG). Em modalidades, a alteração, por exemplo, a mutação, está associada a dor crônica (por exemplo, dor neuropática crônica) e/ou neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva). Em modalidades, a alteração, por exemplo, a mutação, está associada a mudanças na EMG e/ou velocidades de condução nervosa.
[00672] Em modalidades, a alteração é uma mutação no gene ALAS1. Em modalidades, a alteração é uma mutação no promotor do gene ALAS1, ou em regiões a montante ou a jusante do gene ALAS1. Em modalidades, a alteração é uma mutação nos fatores de transcrição ou outros genes que interatuam com ALAS1. Em modalidades, a alteração é uma alteração, por exemplo, uma mutação, em um gene que codifica uma enzima na via biossintética do heme.
[00673] Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma alteração genética como descrito aqui (por exemplo, uma mutação genética que se sabe que está associada a uma porfiria). Em algumas tais modalidades, o indivíduo tem um elevado nível (por exemplo, nível na urina ou plasma) de ALA e/ou PBG. Em algumas tais modalidades, o indivíduo não tem um elevado nível de ALA e/ou PBG. Em modalidades, o indivíduo tem uma alteração genética como descrito aqui e tem outros sintomas, por exemplo, dor crônica, mudanças na EMG, mudanças na velocidade de condução nervosa, e/ou outros sintomas associados a uma porfiria. Em modalidades, o indivíduo tem uma alteração genética mas não sofre de ataques agudos.
[00674] Em modalidades, o indivíduo tem uma mutação associada a AIP, HCP, VP, ou ADP.
[00675] Em algumas modalidades, a porfiria é AIP. Em algumas tais modalidades, o indivíduo tem uma alteração, por exemplo, pelo menos uma mutação, no gene PBG deaminase. Muitas mutações de PBG são conhecidas na técnica, por exemplo, como relatado em Hrdinka, M. et al.Physiological Research, 55 (Supl 2):S119-136 (2006). Em algumas modalidades, o indivíduo é heterozigoto para uma mutação de PBG deaminase. Em outras modalidades, o indivíduo é homozigoto para uma mutação de PBG deaminase. Um indivíduo homozigoto pode transportar duas mutações idênticas ou duas mutações diferentes no gene da PBG deaminase.
[00676] Em algumas modalidades, a porfiria é HCP. Em algumas tais modalidades, o indivíduo tem uma alteração, por exemplo, pelo menos uma mutação, no gene que codifica a enzima coproporfirinogênio III oxidase.
[00677] Em algumas modalidades, a porfiria é VP. Em algumas tais modalidades, o indivíduo tem uma alteração, por exemplo, pelo menos uma mutação, no gene que codifica protoporfirinogênio oxidase.
[00678] Em modalidades, a porfiria é ADP, por exemplo, ADP recessiva autossomal. Em algumas tais modalidades, o indivíduo tem uma alteração, por exemplo, pelo menos uma mutação, no gene que codifica ALA desidratase.
[00679] Os métodos de tratamento proporcionados aqui podem servir para melhorar um ou mais sintomas associados a porfiria, para reduzir a frequência de ataques associados a porfiria, para reduzir a probabilidade de que um ataque de um ou mais sintomas associados a porfiria ocorra após exposição a um fator precipitante, ou para reduzir o risco de desenvolver condições associadas a porfiria (por exemplo, neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva), câncer hepatocelular). Adicionalmente, os métodos proporcionados aqui podem servir para diminuir o nível de um ou mais precursores de porfirina, porfirinas e/ou produtos ou metabolitos de porfirina relacionados. O nível de um precursor de porfirina ou uma porfirina pode ser medido em qualquer amostra biológica, tal como, por exemplo, urina, sangue, fezes, líquido cefalorraquidiano, ou uma amostra de tecido. A amostra pode estar presente dentro de um indivíduo ou pode ser obtida ou extraída do indivíduo. Em algumas modalidades, a porfiria é AIP, e o nível de PBG e/ou ALA está diminuído. Em algumas modalidades, o produto ou metabolito de porfirina é porfobilina, porfobilinogênio, ou uroporfirina. Uma diminuição no nível de um produto ou metabolito de porfirina pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, o nível de PBG e/ou ALA na urina ou plasma pode ser avaliado, usando o teste de Watson- Schwartz, cromatografia de permuta iônica, ou cromatografia líquida de elevado desempenho - espectroscopia de massa. Ver, por exemplo Thunell (1993).
[00680] Os métodos descritos aqui podem também servir para reduzir níveis cronicamente elevados de precursores de porfirina (por exemplo, ALA e/ou PBG) em indivíduos sofrendo de uma porfiria (por exemplo, uma porfiria hepática aguda, por exemplo, AIP) ou em risco de desenvolver uma porfiria. Métodos para avaliação dos níveis no plasma e urina (por exemplo, níveis cronicamente elevados) de precursores de porfirina incluem, por exemplo, HPLC-espectrometria de massa e cromatografia de permuta iônica. Os níveis de precursores de porfirina podem ser expressos como o nível em relação a outra proteína ou composto, por exemplo, creatinina. Ver, por exemplo, Floderus, Y. et al., Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007.
[00681] Um "fator precipitante", como usado aqui, se refere a um fator endógeno ou exógeno que pode induzir um ataque agudo de um ou mais sintomas associados a porfiria. Fatores precipitantes incluem jejum (ou outras formas de toma de calorias reduzida ou inadequada, devido a dietas rápidas, atletas de longa distância, etc.), estresses metabólicos (por exemplo, infecções, cirurgia, viagens aéreas internacionais, e estresse psicológico), hormônios endógenos (por exemplo, progesterona), tabagismo, químicos estranhos solúveis em lipídeos (incluindo, por exemplo, químicos presentes no fumo do tabaco, certos fármacos de prescrição, solventes orgânicos, biocidas, componentes em bebidas alcoólicas), fatores endócrinos (por exemplo, hormônios reprodutores (as mulheres podem experienciar exacerbações durante o período pré-menstrual), estrogênios sintéticos, progesteronas, estimulantes da ovulação, e terapia de substituição de hormônios). Ver, por exemplo, Thunell (1993). Fatores precipitantes comuns incluem fármacos indutores de citocromo P450 e fenobarbital.
[00682] Sintomas associados a porfiria podem incluir dor abdominal ou cólicas, dores de cabeça, efeitos causados por anormalidades do sistema nervoso, e sensibilidade à luz, causando erupções cutâneas, bolhas e cicatrizes da pele (fotodermatite). Em certas modalidades, a porfiria é AIP. Os sintomas da AIP incluem sintomas gastrointestinais (por exemplo, dor abdominal grave e fracamente localizada, náusea/vómitos, prisão de ventre, diarreia, íleo), sintomas urinários (disúria, retenção/incontinência urinária, ou urina escura), sintomas neurológicos (por exemplo, neuropatia sensorial, neuropatia motora (por exemplo, afetando os nervos cranianos e/ou levando a fraqueza nos braços e pernas)), convulsões, dor neuropática, neuropatia progressiva, dores de cabeça, sintomas neuropsiquiátricos (por exemplo, confusão mental, ansiedade, agitação, alucinação, histeria, delírio, apatia, depressão, fobias, psicose, insônia, sonolência, coma), envolvimento do sistema nervoso autonômico (resultando, por exemplo, em sintomas cardiovasculares tais como taquicardia, hipertensão, e/ou arritmias, bem como outros sintomas, tais como, por exemplo, níveis aumentados de catecolamina em circulação, transpiração, inquietação, e/ou tremor), desidratação, e anormalidades nos eletrólitos.
[00683] Em algumas modalidades, um iRNA se dirigindo a ALAS1 é administrado em conjunto com (por exemplo, antes de, após, ou concorrente com) outro tratamento que pode servir para aliviar um ou mais dos sintomas acima. Por exemplo, a dor abdominal pode ser tratada, por exemplo, com analgésicos narcóticos, as convulsões podem ser tratadas, por exemplo, com medicações anticonvulsão, naúsea/vómitos podem ser tratados, por exemplo, com fenotiazinas, e taquicardia/hipertensão podem ser tratadas, por exemplo, com beta bloqueantes.
[00684] O termo "diminuição" (ou "aumento") se destina a se referir a uma mudança mensurável, por exemplo, uma mudança estatisticamente significativa. A mudança pode ser, por exemplo, pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % ou mais mudança (por exemplo, diminuição (ou aumento) em relação a um valor de referência, por exemplo, uma referência onde não é proporcionado nenhum iRNA).
[00685] A invenção refere-se adicionalmente ao uso de um iRNA ou uma sua composição farmacêutica, por exemplo, para tratamento de um distúrbio relacionado com a expressão de ALAS1, em combinação com outros farmacêuticos e/ou outros métodos terapêuticos, por exemplo com farmacêuticos conhecidos e/ou métodos terapêuticos conhecidos, tais como, por exemplo, aqueles que são correntemente empregues para tratamento do distúrbio. Em uma modalidade, o iRNA ou sua composição farmacêutica pode ser administrado em conjunto com um produto do heme (por exemplo, hemina, arginato de heme, ou albumina de heme, como descrito aqui) e/ou em conjunto um infusões de glicose intravenosa. Em algumas modalidades, o iRNA ou sua composição farmacêutica é usado profilaticamente, por exemplo, para prevenir ou melhorar sintomas de um ataque antecipado de porfiria aguda. O uso profilático pode ser programa de acordo com a exposição ou exposição antecipada do indivíduo a um fator precipitante. Como descrito aqui, um fator precipitante pode ser qualquer fator endógeno ou exógeno que se sabe que precipita um ataque agudo. Por exemplo, a fase pré-menstrual é um fator precipitante endógeno, e um fármaco indutor de citocromo P450 é um fator precipitante exógeno.
[00686] A quantidade eficaz para o tratamento de um distúrbio relacionado com a expressão de ALAS1 (por exemplo, uma porfiria tal como AIP) depende do tipo de distúrbio a ser tratado, da gravidade dos sintomas, do indivíduo sendo tratado, do sexo, idade e condição geral do indivíduo, do modo de administração e assim por diante. Para qualquer dado caso, uma "quantidade eficaz" pode ser determinada por um com perícia ordinária na técnica usando experimentação de rotina. Está bem dentro da capacidade de um perito na técnica monitorizar a eficácia do tratamento ou prevenção por medição de qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Em conexão com a administração de um iRNA ou sua composição farmacêutica se dirigindo a ALAS1, "eficaz contra" um distúrbio relacionado com a expressão de ALAS1 indica que a administração de um modo clinicamente apropriado resulta em um efeito benéfico, por exemplo, para um paciente individual ou para pelo menos uma fração dos pacientes, por exemplo, uma fração estatisticamente significativa dos pacientes. Os efeitos benéficos incluem, por exemplo, prevenção de ou redução de sintomas ou outros efeitos. Por exemplo, os efeitos benéficos incluem, por exemplo, uma melhoria (por exemplo, diminuição na gravidade ou frequência) de sintomas, uma redução na gravidade ou frequência de ataques, um risco reduzido de desenvolver doença associada (por exemplo, neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva), câncer hepatocelular), uma capacidade melhorada de tolerar um fator precipitante, uma melhoria na qualidade de vida, uma redução na expressão de ALAS1, uma redução em um nível (por exemplo, um nível no plasma ou urina) de uma porfirina ou um precursor de porfirina (por exemplo, ALA e/ou PBG) ou outro efeito geralmente reconhecido como positivo por médicos familiares com o tratamento do tipo particular de distúrbio.
[00687] Um efeito de tratamento ou preventivo é evidente quando existe uma melhoria, por exemplo, uma melhoria estatisticamente significativa em um ou mais parâmetros do estado de doença, ou por uma falha em agravar ou desenvolver sintomas onde seriam de outro modo antecipados. Como um exemplo, uma mudança favorável de pelo menos 10 % em um parâmetro mensurável da doença, por exemplo, pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 % ou mais pode ser indicativa de tratamento eficaz. A eficácia de um dado fármaco de iRNA ou formulação desse fármaco pode ser também avaliada usando um modelo animal experimental para a dada doença como conhecido na técnica. Quando se usa um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando é observada uma redução estatisticamente significativa em um marcador (por exemplo, ALA ou PBG no plasma ou na urina) ou sintoma.
[00688] Pode ser administrada aos pacientes uma quantidade terapêutica de iRNA. A quantidade terapêutica pode ser, por exemplo, 0,05-50 mg/kg. Por exemplo, a quantidade terapêutica pode ser 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, ou 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 mg/kg de dsRNA.
[00689] Em algumas modalidades, o iRNA é formulado como uma formulação de lipídeo, por exemplo, uma formulação LNP como descrito aqui. Em algumas tais modalidades, a quantidade terapêutica é 0,05-5 mg/kg, por exemplo, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, ou 5,0 mg/kg de dsRNA. Em algumas modalidades, a formulação de lipídeo, por exemplo, formulação LNP, é administrada intravenosamente.
[00690] Em algumas modalidades, o iRNA é administrado por infusão intravenosa ao longo de um período de tempo, tal como ao longo de um período de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, ou 25 minutos.
[00691] Em algumas modalidades, o iRNA está na forma de um conjugado GalNAc como descrito aqui. Em algumas tais modalidades, a quantidade terapêutica é 0,5-50 mg, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 mg/kg de dsRNA. Em algumas modalidades, o conjugado GalNAc é administrado subcutaneamente.
[00692] Em algumas modalidades, a administração é repetida, por exemplo, em uma base regular, tal como diariamente, bissemanalmente (i.e., a cada duas semanas) durante um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente. Por exemplo, após administração bissemanal durante três meses, a administração pode ser repetida uma vez por mês, durante seis meses ou um ano ou mais.
[00693] Em algumas modalidades, o agente de iRNA é administrado em duas ou mais doses. Em algumas modalidades, o número ou quantidade de doses subsequentes está dependente do alcance de um efeito desejado, por exemplo, supressão de um gene ALAS, redução de um nível de uma porfirina ou precursor de porfirina (por exemplo, ALA e/ou PBG), ou do alcance de um efeito terapêutico ou profilático, por exemplo, redução ou prevenção de um ou mais sintomas associados a porfiria (por exemplo, dor, por exemplo, dor neuropática), e/ou prevenção de ataques ou redução na frequência e/ou gravidade de ataques associados a porfiria.
[00694] Em algumas modalidades, o agente de iRNA é administrado de acordo com um programa. Por exemplo, o agente de iRNA pode ser administrado uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana, ou cinco vezes por semana. Em algumas modalidades, o programa envolve administrações regularmente espaçadas, por exemplo, de hora em hora, a cada quatro horas, a cada seis horas, a cada oito horas, a cada doze horas, diariamente, a cada 2 dias, a cada 3 dias, a cada 4 dias, a cada 5 dias, semanalmente, bissemanalmente, ou mensalmente. Em modalidades, o agente de iRNA é administrado semanalmente ou bissemanalmente para alcançar um efeito desejado, por exemplo, para diminuir o nível de ALA e/ou PBG, para diminuir a dor, e/ou para prevenir ataques agudos.
[00695] Em modalidades, o programa envolve administrações estreitamente espaçadas seguidas por um período de tempo mais longo durante o qual o agente não é administrado. Por exemplo, o programa pode envolver um conjunto inicial de doses que são administradas em um período de tempo relativamente curto (por exemplo, cerca de a cada 6 horas, cerca de a cada12 horas, cerca de a cada 24 horas, cerca de a cada 48 horas, ou cerca de a cada 72 horas) seguido por um período de tempo mais longo (por exemplo, cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, ou cerca de 8 semanas) durante o qual o agente de iRNA não é administrado. Em uma modalidade, o agente de iRNA é inicialmente administrado de hora em hora e é mais tarde administrado em um intervalo mais longo (por exemplo, diariamente, semanalmente, bissemanalmente ou mensalmente). Em outra modalidade, o agente de iRNA é inicialmente administrado diariamente e é mais tarde administrado em um intervalo mais longo (por exemplo, diariamente, semanalmente, bissemanalmente ou mensalmente). Em certas modalidades, o intervalo mais longo aumenta ao longo do tempo ou é determinado com base no alcance de um efeito desejado. Em uma modalidade específica, o agente de iRNA é administrado uma vez diariamente durante um ataque agudo, seguido por dosagem semanal começando ao oitavo dia de administração. Em outra modalidade específica, o agente de iRNA é administrado a cada dois dias durante uma primeira semana, seguido por dosagem semanal começando ao oitavo dia de administração.
[00696] Em uma modalidade, o agente de iRNA é administrado para prevenir ou reduzir a gravidade ou frequência de ataques recorrentes, por exemplo, ataques cíclicos associados a um fator precipitante. Em algumas modalidades, o fator precipitante é o ciclo menstrual. Em algumas modalidades, o iRNA é administrado repetidamente, por exemplo, em intervalos regulares para prevenir ou reduzir a gravidade ou frequência de ataques recorrentes, por exemplo, ataques cíclicos associados a um fator precipitante, por exemplo, o ciclo menstrual, por exemplo, uma fase particular do ciclo menstrual, por exemplo, a fase lútea. Em algumas modalidades, o iRNA é administrado durante uma fase particular do ciclo menstrual ou com base nos níveis de hormônios do paciente sendo tratado (por exemplo, com base nos níveis de hormônios que estão associados a uma fase particular do ciclo menstrual). Em algumas modalidades, o iRNA é administrado em um ou mais dias particulares do ciclo menstrual, por exemplo, ao dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou ao dia 28 (ou dia mais tarde para indivíduos que tenham um ciclo menstrual mais longo). Em algumas modalidades, o iRNA é administrado durante a fase lútea, por exemplo, em um ou mais dias entre os dias 14-28 do ciclo menstrual (ou mais tarde, em indivíduos que tenham um ciclo menstrual mais longo do que 28 dias). Em algumas modalidades, a ovulação do indivíduo é avaliada (por exemplo, usando um teste de sangue ou urina que detecta um hormônio associado à ovulação, por exemplo, LH) e o iRNA é administrado a um intervalo pré- determinado após ovulação. Em algumas modalidades, o iRNA é administrado imediatamente após a ovulação. Em algumas modalidades, o iRNA é administrado 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 dias após ovulação. Qualquer um destes programas pode ser opcionalmente repetido para uma ou mais iterações. O número de iterações pode depender do alcance de um efeito desejado, por exemplo, a supressão de um gene ALAS1 e/ou o alcance de um efeito terapêutico ou profilático, por exemplo, reduzir ou prevenir um ou mais sintomas associados a porfiria, para reduzir a frequência de ataques associados a porfiria.
[00697] Em algumas modalidades, uma dose inicial do agente de iRNA é administrada e o nível de ALA ou PBG é testado, por exemplo, 1-48 horas, por exemplo, 2, 4, 8, 12, ou 24 horas após administração da dose inicial. Em algumas modalidades, se o nível de ALA e/ou PBG diminuiu (por exemplo, para alcançar uma redução pré-determinada, por exemplo, uma normalização), e/ou se os sintomas associados a porfiria (por exemplo, dor) melhoraram (por exemplo, tal que o paciente esteja assintomático), não é administrada nenhuma dose adicional, ao passo que, se o nível de ALA e/ou PBG não tiver diminuído (por exemplo, não alcançou uma redução pré-determinada, por exemplo, não foi normalizado), uma dose adicional de ALA ou PBG é administrada. Em algumas modalidades, a dose adicional é administrada 12, 24, 36, 48, 60, ou 72 horas após a dose inicial. Em algumas modalidades, se a dose inicial não for eficaz para diminuir o nível de ALA e/ou PBG, a dose adicional é modificada, por exemplo, melhorada para alcançar uma diminuição desejada (por exemplo, uma redução pré-determinada, por exemplo, uma normalização) nos níveis de ALA ou PBG.
[00698] Em algumas modalidades, a redução pré-determinada é uma diminuição de pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, ou 50 %. Em algumas modalidades, a redução pré-determinada é uma redução que é eficaz para prevenir ou melhorar os sintomas, por exemplo, dor, sintomas prodrômicos, ou ataques recorrentes.
[00699] Em algumas modalidades, a redução pré-determinada é uma redução de pelo menos 1, 2, 3, ou mais desvios padrão, em que o desvio padrão é determinado com base nos valores de uma amostra de referência, por exemplo, uma amostra de referência como descrito aqui.
[00700] Em algumas modalidades, a redução pré-determinada é uma redução que leva o nível da porfirina ou precursor de porfirina até um nível que é menos do que, ou até um nível que é menos do que ou igual a um valor de referência (por exemplo, um valor de referência como descrito aqui).
[00701] Como usado aqui, uma "normalização" nos níveis de ALA ou PBG (ou um nível "normal" ou "normalizado") se refere a um nível (por exemplo, um nível na urina e/ou plasma) de ALA, ou PBG, ou ambos, que está dentro da gama esperada para um indivíduo saudável, um indivíduo que esteja assintomático (por exemplo, um indivíduo que não experiencia dor e/ou sofre de neuropatia), ou um indivíduo que não tem uma mutação associada a uma porfiria. Por exemplo, em algumas modalidades, um nível normalizado está dentro de dois desvios padrão da média normal. Em algumas modalidades, um nível normalizado está dentro de limites de referência normais, por exemplo, dentro do intervalo de confiança de 95 % para uma amostra de controle apropriada, por exemplo, uma amostra de indivíduos saudáveis ou indivíduos que não transportam uma mutação de gene associada a uma porfiria. Em algumas modalidades, o nível de ALA e/ou PBG do indivíduo (por exemplo, o nível de ALA e/ou PBG na urina e/ou plasma) é monitorizado em intervalos, uma dose adicional do agente de iRNA é administrada quando o nível aumenta acima do valor de referência.
[00702] A administração do iRNA pode reduzir os níveis de mRNA de ou proteína ALAS1, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento do paciente por pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70%, pelo menos 80 % ou pelo menos 90 % ou mais. A administração do iRNA pode reduzir os níveis de produtos associados à expressão do gene ALAS1, por exemplo, os níveis de uma ou mais porfirinas ou precursores de porfirinas (por exemplo, o nível de ALA e/ou PBG). A administração do agente de iRNA pode também exibir ou prevenir a regulação por cima de mRNA de ou proteína ALAS1 durante um ataque agudo de AIP.
[00703] Antes da administração de uma dose completa do iRNA, pode ser administrada aos pacientes uma dose mais pequena, tal como uma dose de infusão a 5 %, e estes podem ser monitorados quanto a efeitos adversos, tais como uma reação alérgica, ou quanto a elevados níveis de lipídeos ou pressão sanguínea. Em outro exemplo, o paciente pode ser monitorizado quanto a efeitos indesejados. Métodos para modulação da expressão de um geneALASI
[00704] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um método para modulação (por exemplo, inibição ou ativação) da expressão de um gene ALAS1, por exemplo, em uma célula ou em um indivíduo. Em algumas modalidades, a célula está ex vivo, in vitro, ou in vivo. Em algumas modalidades, a célula é uma célula eritroide ou um hepatócito. Em algumas modalidades, a célula está em um indivíduo (por exemplo, um mamífero, tal como, por exemplo, um humano). Em algumas modalidades, o indivíduo (por exemplo, o humano) está em risco de, ou está diagnosticado com, uma doença relacionada com a expressão de ALAS1, como descrito acima.
[00705] Em uma modalidade, o método inclui contato da célula com um iRNA como descrito aqui, em uma quantidade eficaz para diminuir a expressão de um gene ALAS1 na célula. "Contato", como usado aqui, inclui contato direto de uma célula, bem como contato indireto de uma célula. Por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo (por exemplo, uma célula eritroide ou uma célula do fígado, tal como um hepatócito) pode ser contatada quando uma composição compreendendo um iRNA é administrada (por exemplo, intravenosamente ou subcutaneamente) ao indivíduo.
[00706] A expressão de um gene ALAS1 pode ser avaliada com base no nível de expressão de um mRNA de ALAS1, uma proteína ALAS1, ou no nível de um parâmetro funcionalmente ligado ao nível de expressão de um gene ALAS1 (por exemplo, o nível de uma porfirina ou a incidência ou gravidade de um sintoma relacionado com uma porfiria). Em algumas modalidades, a expressão de ALAS1 é inibida por pelo menos 5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 %. Em algumas modalidades, o iRNA tem uma IC50 na gama de 0,001-0,01 nM, 0,001-0,10 nM, 0,001-1,0 nM, 0,001-10 nM, 0,01-0,05 nM, 0,01-0,50 nM, 0,02-0,60 nM, 0,01-1,0 nM, 0,01-1,5 nM, 0,01-10 nM. O valor de IC50 pode ser normalizado em relação a um valor de controle apropriado, por exemplo, a IC50 de um iRNA não dirigido.
[00707] Em algumas modalidades, o método inclui introdução na célula de um iRNA como descrito aqui e manutenção da célula durante um tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA de um gene ALAS1, inibindo desse modo a expressão do gene ALAS1 na célula.
[00708] Em uma modalidade, o método inclui administração de uma composição descrita aqui, por exemplo, uma composição compreendendo um iRNA que se dirige a ALAS1, ao mamífero tal que a expressão do gene ALAS1 alvo seja diminuída, tal como durante uma duração prolongada, por exemplo, pelo menos dois, três, quatro dias ou mais, por exemplo, uma semana, duas semanas, três semanas, ou quatro semanas ou mais. Em algumas modalidades, a diminuição na expressão de ALAS1 é detectável no espaço de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, ou 24 horas da primeira administração.
[00709] Em outra modalidade, o método inclui administração de uma composição como descrito aqui a um mamífero tal que a expressão do gene ALAS1 alvo seja aumentada por, por exemplo, pelo menos 10 % em comparação com um animal não tratado. Em algumas modalidades, a ativação de ALAS1 ocorre ao longo de uma duração prolongada, por exemplo, pelo menos por dois, três, quatro dias ou mais, por exemplo, uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, ou mais. Sem desejar estar limitado pela teoria, um iRNA pode ativar a expressão de ALAS1 por estabilização do transcrito de mRNA de ALAS1, interação com um promotor no genoma, e/ou inibição de um inibidor da expressão de ALAS1.
[00710] Os iRNAs úteis para os métodos e composições apresentados na invenção se dirigem especificamente a RNAs alvo (primários ou processados) de um gene ALAS1. Composições e métodos para inibição da expressão de um gene ALAS1 usando iRNAs podem ser preparados e realizados como descrito em outro lugar aqui.
[00711] Em uma modalidade, o método inclui administração de uma composição contendo um iRNA, onde o iRNA inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar com pelo menos uma parte de um transcrito de RNA do gene ALAS1 do mamífero a ser tratado. Quando o organismo a ser tratado é um mamífero tal como um humano, a composição pode ser administrada por quaisquer meios conhecidos na técnica incluindo as, mas não se limitando às vias oral, intraperitoneal, ou parenteral, incluindo administração intracraniana (por exemplo, intraventricular, intraparenquimal e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, pelas vias aéreas (aerossol), nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual).
[00712] Em certas modalidades, as composições são administradas por infusão ou injeção intravenosa. Em algumas tais modalidades, as composições compreendem um siRNA formulado com lipídeos (por exemplo, uma formulação LNP, tal como uma formulação LNP11) para infusão intravenosa. Em modalidades particulares, tais composições podem ser usadas para tratar ataques agudos de porfiria e/ou para profilaxia (por exemplo, para diminuir a gravidade ou frequência de ataques).
[00713] Em outras modalidades, as composições são administradas subcutaneamente. Em algumas tais modalidades, as composições compreendem um iRNA conjugado com um ligante GalNAc. Em modalidades particulares, tais composições podem ser usadas para tratar ataques agudos de porfiria ou para profilaxia (por exemplo, para diminuir a gravidade ou frequência de ataques). Métodos para diminuição de um nível de uma porfirina ou precursor de porfirina
[00714] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para diminuição de um nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina, por exemplo, em uma célula ou em um indivíduo.
[00715] Em algumas modalidades, a célula está ex vivo, in vitro, ou in vivo. Em algumas modalidades, a célula é uma célula eritroide ou um hepatócito. Em algumas modalidades, a célula é um hepatócito. Em algumas modalidades, a célula está em um indivíduo (por exemplo, um mamífero, tal como, por exemplo, um ser humano).
[00716] Em algumas modalidades, o indivíduo (por exemplo, o humano) está em risco de, ou está diagnosticado com uma porfiria, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o método é eficaz para tratar uma porfiria como descrito aqui (por exemplo, por melhoria de um ou mais sintomas associados a uma porfiria, redução da frequência de ataques associados a uma porfiria, redução da probabilidade de que um ataque de um ou mais sintomas associados à porfiria ocorra após exposição a um fator precipitante, ou redução do risco de desenvolver condições associadas a uma porfiria (por exemplo, neuropatia (por exemplo, neuropatia progressiva), câncer hepatocelular)). Em uma modalidade, o método inclui contato da célula com um RNAi, como descrito aqui, em uma quantidade suficiente para diminuir o nível da porfirina ou precursor de porfirina (por exemplo, ALA ou PBG) na célula, ou em outra célula ou grupo de células relacionado, ou no indivíduo. "Contato", como usado aqui, inclui contato direto de uma célula, bem como contato indireto de uma célula. Por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo (por exemplo, uma célula eritroide ou uma célula do fígado, tal como um hepatócito) pode ser contatada quando uma composição compreendendo um RNAi é administrada (por exemplo, intravenosamente ou subcutaneamente) ao indivíduo. "Outra célula ou grupos de células relacionado", como usado aqui, inclui qualquer célula ou grupo de células no qual o nível da porfirina ou precursor de porfirina diminui como resultado do contato. Por exemplo, a célula pode ser parte de um tecido presente dentro de um indivíduo (por exemplo, uma célula do fígado presente dentro de um indivíduo), e contato da célula dentro do indivíduo (por exemplo, contato de uma ou mais células do fígado presentes dentro de um indivíduo) com o RNAi pode resultar em uma diminuição no nível da porfirina ou precursor de porfirina em outra célula ou grupo de células relacionado (por exemplo, células nervosas do indivíduo), ou em um tecido ou fluido do indivíduo (por exemplo, na urina, sangue, plasma, ou líquido cefalorraquidiano do indivíduo).
[00717] Em algumas modalidades, a porfirina ou precursor de porfirina é selecionado do grupo consistindo em ácido δ-aminolevulinico (ALA), porfobilinogênio (PBG), hidroximetilbilano (HMB), uroporfirinogênio III, coproporfirinogênio III, protoporfirinogênio IX, e protoporfirina IX. Em algumas modalidades, o precursor de porfirina é ALA. Em algumas modalidades, o precursor de porfirina é PBG. Em algumas modalidades, o método diminui o nível de ALA e PBG. O nível de uma porfirina ou um precursor de porfirina pode ser medido como descrito aqui e como conhecido na técnica. Ensaios e Métodos para Monitorar a atividade de RNAi
[00718] Em outro aspecto, a invenção proporciona ensaios e métodos para monitorar níveis de mRNA de ALAS1. A atividade de RNAi no fígado pode ser monitorada detectando níveis de mRNA ou produto de 5’RACE em tecido, ou detectando o nível de proteína secretada em circulação.
[00719] Alternativamente, ou em combinação, níveis extracelulares em circulação de mRNA de ALAS1 podem ser detectados, por exemplo, por ensaios cERD (Detecção de RNA Extracelular em Circulação). Em algumas modalidades, o nível de mRNA de ALAS1 pode ser detectado em uma amostra de fluido corporal, por exemplo, uma amostra de soro ou urina. Em algumas modalidades, exossomos são liberados para fluidos corporais a partir de diferentes tipos de células, que contêm mRNA e miRNA derivados de um tecido de origem. Tais exossomos podem ser usados para monitorar o nível de RNAi em circulação. Em uma modalidade, uma amostra, por exemplo, uma amostra de soro ou urina de um indivíduo tratado com um iRNA descrito aqui pode ser purificada com rotação a baixa velocidade, seguido de uma rotação a cerca de 160 000g por cerca de 2 horas para formar um pélete. O RNA pode ser extraído e analisado para medir os níveis de mRNA de ALAS1. Métodos e ensaios exemplares são revelados em PCT/US2012/043584, publicado como WO 2012/177906, cujo conteúdo é incorporado a título de referência.
[00720] Em conformidade, é proporcionado um ensaio, ou método, para detectar o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação em um indivíduo. O ensaio, ou método inclui proporcionar RNA (por exemplo, RNA extracelular) de uma amostra de fluido biológico (por exemplo, amostra de urina, sangue ou plasma) do indivíduo, em que a referida amostra de fluido biológico compreende o mRNA de ALAS1; e detectar o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação na amostra.
[00721] Em uma modalidade, o ensaio ou método inclui a etapa de obter um cDNA de ALAS1 a partir do mRNA de ALAS1; e contatar o cDNA de ALAS1 com um ácido nucleico complementar (por exemplo, sonda e/ou iniciador) ao cDNA de ALAS1 ou uma sua porção, desse modo produzindo uma mistura reacional; e detectar (por exemplo, medir) o nível de cDNA de ALAS1 na mistura reacional, em que o nível de cDNA de ALAS1 é indicativo do nível de mRNA de ALAS1, desse modo avaliando o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo.
[00722] Em uma modalidade, o ensaio ou método inclui adquirir uma amostra de fluido biológico de um indivíduo, em que a amostra biológica é separada do tecido, e em que a amostra biológica contém exossomos. O ensaio ou método também pode incluir detectar os níveis de um RNA na amostra biológica, em que o RNA é expresso a partir do gene no tecido do indivíduo, em que os exossomos não são purificados da amostra biológica antes da detecção dos níveis de RNA na amostra biológica.
[00723] Em modalidades, a referida amostra de fluido biológico é uma amostra de sangue. Em modalidades, a referida amostra de fluido biológico é uma amostra de soro. Em outra modalidade, a amostra de fluido biológico é uma amostra de urina.
[00724] Em modalidades, o método compreende PCR, qPCR ou 5’- RACE.
[00725] Em modalidades, o referido ácido nucleico é uma sonda ou iniciador.
[00726] Em modalidades, o referido ácido nucleico compreende uma fração detectável e o nível de mRNA de ALAS1 é determinado por detecção da quantidade da fração detectável.
[00727] Em modalidades, o referido método compreende adicionalmente obter a amostra de fluido biológico do indivíduo.
[00728] Em modalidades destes métodos, a eficácia do tratamento de uma porfiria é avaliada com base em uma comparação do nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo relativamente a um valor de referência.
[00729] Em modalidades, um decréscimo do nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo em resposta ao tratamento de porfiria, relativamente ao valor de referência, indica que o tratamento de porfiria é eficaz. Em modalidades, o valor de referência é o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo antes do tratamento de porfiria.
[00730] A não ser que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um com perícia ordinária na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui poderem ser usados na prática ou teste dos iRNAs e métodos apresentados na invenção, métodos e materiais adequados são descritos em baixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência na sua totalidade. No caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, controlará. Adicionalmente, os materiais, métodos, e exemplos são somente ilustrativos e não se destinam a ser limitantes. EXEMPLOS Exemplo 1. síntese de siRNA Fonte de reagentes
[00731] Onde a fonte de um reagente não for especificamente dada aqui, tal reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular a um padrão de qualidade/pureza para aplicação em biologia molecular. Síntese de Oligonucleotídeos.
[00732] Todos os oligonucleotídeos são sintetizados em um sintetizador AKTAoligopilot. Suporte sólido de vidro de poro controlado (dT-CPG, 500Â, Prime Synthesis) e fosforamiditas de RNA com grupos protetores padrão, 5’-O-dimetoxitritil-N6-benzoil-2’-t-butildimetilsilil- adenosina-3’-O-N,N’-diisopropil-2-cianoetilfosforamidita, 5’-O- dimetoxitritil-N4-acetil-2’-t-butildimetilsilil-citidina-3’-O-N,N’-diisopropil- 2-cianoetilfosforamidita, 5’-O-dimetoxitritil-N2--isobutiril-2’-t- butildimetilsilil-guanosina-3’-O-N,N’-diisopropil-2-cianoetilfosforamidita, e 5’-O-dimetoxitritil-2’-t-butildimetilsilil-uridina-3’-O-N,N’-diisopropil-2- cianoetilfosforamidita (Pierce Nucleic Acids Technologies) comercialmente disponíveis foram usados para a síntese de oligonucleotídeos. As 2’-F fosforamiditas, 5’-O-dimetoxitritil-N4-acetil-2’- fluro-citidina-3’-O-N,N’-diisopropil-2-cianoetil-fosforamidita e 5’-O- dimetoxitritil-2’-fluro-uridina-3’-O-N,N’-diisopropil-2-cianoetil- fosforamidita são comprados da (Promega). Todas as fosforamiditas são usadas a uma concentração de 0,2 M em acetonitrila (CH3CN) exceto para guanosina que é usada a concentração de 0,2 M em THF/ANC a 10 % (v/v). É usado tempo de acoplamento/reciclagem de 16 minutos. O ativador é tiotetrazol de 5-etila (0,75 M, American International Chemicals); para a oxidação PO, é usado iodo/água/piridina e, para a oxidação, é usado PADS (2 %) em 2,6- lutidina/ACN (1:1 v/v).
[00733] As fitas conjugadas com ligante em 3' são sintetizadas usando suporte sólido contendo o ligante correspondente. Por exemplo, a introdução de unidade de colesterol na sequência é realizada a partir de uma fosforamidita de hidroxiprolinol-colesterol. O colesterol está preso a trans-4-hidroxiprolinol através de uma ligação de 6- aminohexanoato para obter uma fração hidroxiprolinol-colesterol. iRNAs marcados com Cy-3 e Cy-5.5 (fluoróforo) na extremidade 5' são sintetizados a partir da correspondente fosforamidita Quasar-570 (Cy-3) são comprados da Biosearch Technologies. A conjugação de ligantes com a extremidade 5' e ou posição interna é alcançada por uso de bloco de construção de ligante-fosforamidita apropriadamente protegido. Um acoplamento prolongado de 15 min de solução de fosforamidita a 0,4 M em CH3CN anidro na presença de ativador de 5-(etiltio)-1H-tetrazol com um oligonucleotídeo ligado a suporte sólido. A oxidação do fosfito internucleotídico no fosfato é levada a cabo usando iodo-água padrão como relatado (1) ou por tratamento com hidroperóxido de tert- butila/acetonitrila/água (10: 87: 3) com oligonucleotídeo conjugado com tempo de espera de oxidação de 10 min. O fosforotioato é introduzido pela oxidação de fosfito em fosforotioato por uso de um reagente de transferência de enxofre DDTT (comprado da AM Chemicals), PADS e ou reagente de Beaucage. A fosforamidita de colesterol é sintetizada no laboratório e usada a uma concentração de 0,1 M em diclorometano. O tempo de acoplamento para a fosforamidita de colesterol é 16 minutos. Desproteção I (Desproteção da Nucleobase)
[00734] Após término da síntese, o suporte é transferido para uma garrafa de vidro de 100 mL (VWR). O oligonucleotídeo é clivado do suporte com desproteção simultânea de base e grupos fosfato com 80 mL de uma mistura de amônia etanólica [amônia: etanol (3:1)] durante 6,5 h a 55 oC. A garrafa é brevemente resfriada em gelo e depois a mistura de amônia etanólica é filtrada para uma nova garrafa de 250 mL. O CPG é lavado com 2 x 40 mL porções de etanol/água (1:1 v/v). O volume da mistura é depois reduzido a ~ 30 mL por roto-vap. A mistura é depois congelada em gelo seco e seca sob vácuo em um vac. de velocidade. Desproteção II (Remoção do grupo TBDMS em 2’)
[00735] O resíduo seco é ressuspenso em 26 mL de trietilamina, triidrofluoreto de trietilamina (TEA^3HF) ou piridina-HF e DMSO (3:4:6) e aquecido a 60oC durante 90 minutos para remover os grupos tert- butildimetilsilila (TBDMS) na posição 2’. A reação é depois extinta com 50 mL de acetato de sódio a 20 mM e o pH é ajustado para 6,5. O oligonucleotídeo é armazenado em um congelador até à purificação. Análise
[00736] Os oligonucleotídeos são analisados por cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) antes de purificação e a seleção do tampão e coluna depende da natureza da sequência e ou ligante conjugado. Purificação por HPLC
[00737] Os oligonucleotídeos conjugados com ligante são purificados por HPLC preparativa de fase reversa. Os oligonucleotídeos não conjugados são purificados por HPLC de permuta iônica em uma coluna de gel TSK empacotada no laboratório. Os tampões são fosfato de sódio a 20 mM (pH 8,5) em CH3CN a 10 % (tampão A) e fosfato de sódio a 20 mM (pH 8,5) em CH3CN a 10 %, NaBr a 1 M (tampão B). As frações contendo oligonucleotídeos de comprimento total são agrupadas, dessalinizadas e liofilizadas. Aproximadamente 0,15 OD de oligonucleotídeos dessalinizados são diluídos em água até 150 μL e depois pipetados em frascos especiais para análise de CGE e LC/MS. Os compostos são depois analisados por LC-ESMS e CGE. Preparação de siRNA
[00738] Para a preparação geral de siRNA, quantidades equimolares de fita senso e antissenso são aquecidas em IxPBS a 95 °C durante 5 min e lentamente resfriadas até à temperatura ambiente. A integridade do dúplex é confirmada por análise de HPLC.
[00739] As sequências de ácidos nucleicos estão representadas em baixo usando nomenclatura padrão, e especificamente as abreviaturas da Tabela 1. Tabela 1: Abreviaturas de monômeros nucleotídicos usados na representação de sequências de ácidos nucleicos. Será entendido que estes monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, estão mutuamente ligados por ligações 5'-3'-fosfodiéster.
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(viii) 1A estrutura química de L96 é como se segue:
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Exemplo 2. Desenho e Síntese de siRNA de ALAS1 Métodos Experimentais Bioinformática
Transcritos
[00740] O desenho de foi levado a cabo para identificar siRNAs se dirigindo a transcritos de ALAS1 de humano, rhesus (Macaca mulatta), camundongo, e rato anotados na base de dados Gene do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). O desenho usou os seguintes transcritos da coleção RefSeq do NCBI: Humano -NM_000688.4 (ver FIG.3), NM_199166.1; Rhesus - XM_001090440.2, XM_001090675.2; Camundongo - NM_020559.2; Rato -NM_024484.2. Devido à elevada divergência de sequências de primatas/roedores, os dúplices de siRNA foram desenhador em vários lotes separados, incluindo mas não se limitando a lotes contendo dúplices correspondendo somente a transcritos humanos e de rhesus; somente transcritos humanos, de rhesus, de camundongo, e de rato; e somente transcritos de camundongo e rato. A maioria dos dúplices de siRNA foi desenhada de modo a partilhar 100 % de identidade o transcrito humano e transcritos de outras espécies listados considerados em cada lote de desenho (acima). Em alguns casos (ver Tabela 8), não correspondências entre o dúplex e o alvo de mRNA foram permitidas na primeira posição antissenso (última senso) quando o par de bases complementar com fita antissenso:mRNA alvo era um par GC ou CG. Em estes casos, foram desenhados dúplices com pares UA ou AU no par primeiro antissenso:último senso. Assim, os dúplices mantiveram a complementaridade mas tinham não correspondências em relação ao alvo (U:C, U:G, A:C, ou A:G). Dezoito destes dúplices com “troca de UA” foram desenhados como parte do conjunto humano/rhesus/camundongo/rato (ver dúplices na Tabela 8 com marcações “C19U”, “G19U”, “C19A”, ou “G19A” na coluna da Posição). Desenho, Especificidade, e Previsão da Eficácia de siRNA
[00741] A especificidade prevista de todos os possíveis 19meros foi prevista a partir de cada sequência. Foram depois selecionados os 19meros candidatos que não tinham repetições mais longas do que 7 nucleotídeos. Estes 1510 siRNAs de humano/rhesus, 114 humano/rhesus/camundongo/rato, e 717 camundongo/rato candidatos foram usados em procuras abrangentes contra os transcritomas apropriados (definidos como o conjunto de registros NM_ e XM_ dentro dos conjuntos Refseq de humano, rhesus, cão, camundongo, ou rato do NCBI) usando um algoritmo "de força bruta" abrangente implementado no script Python "BruteForce.py". O script analisou de seguida os alinhamentos transcrito-oligo para gerar uma pontuação baseada na posição e número de não correspondências entre o siRNA e qualquer transcrito potencial "fora do alvo". A pontuação fora do alvo é ponderada para enfatizar diferenças na região de 'semente' de siRNAs, nas posições 2-9 a partir da extremidade 5' da molécula. A cada par oligo- transcrito da pesquisa de força bruta foi dada uma pontuação de não correspondências por soma das pontuações das não correspondências individuais; as não correspondências na posição 2-9 foram contabilizadas como 2,8, as não correspondências nas posições dos locais de clivagem 10-11 foram contabilizadas como 1,2, e as não correspondências presentes na região 12-19 contabilizaram como 1,0. Foi levada cabo uma previsão adicional fora do alvo por comparação da frequência de heptâmeros e octômeros derivados de 3 hexâmeros distintos, derivados da semente, de cada oligo. Os hexâmeros das posições 2-7 em relação ao início 5’ foram usados para criar 2 heptâmeros e um octômero. Criámos "heptâmero1" por adição de um 3’ A ao hexâmero; criámos "heptâmero2" por adição de um 5’ A ao hexâmero; criámos o octômero por adição de um A a ambas as extremidades 5’ e 3’ do hexâmero. A frequência de octômeros e heptâmeros no 3’UTRoma humano, de rhesus, de camundongo, ou de rato (definido como a subsequência do transcritoma da base de dados Refseq do NCBI onde a extremidade da região codificante, a "CDS", está claramente definida) foi pré-calculada. A frequência dos octômeros foi normalizada para a frequência dos heptâmeros usando o valor mediano da gama de frequências de octômeros. Uma "mirSeedScore" foi depois calculada por cálculo da soma de ((3 X contagem de octômeros normalizada) + (2 X contagem de heptâmero2) + (1 X contagem de heptâmero1)).
[00742] Ambas as fitas dos siRNAs foram atribuídas a uma categoria de especificidade de acordo com as pontuações calculadas: uma pontuação acima de 3 se qualifica como altamente específica, igual a 3 como específica e entre 2,2 e 2,8 como moderadamente específica. Separámos pela especificidade da fita antissenso. Selecionámos depois dúplices cujos oligos antissenso não tinham GC na primeira posição, não tinham G em ambas as posições 13 e 14, e tinham 3 ou mais Us ou As na região de semente (características de dúplices com elevada eficácia prevista).
[00743] Os dúplices conjugados com GalNAc candidatos, com 21 e 23 nucleotídeos de comprimento nas fitas senso e antissenso, respectivamente, foram desenhados por prolongamento dos 19meros 4 nucleotídeos adicionais na direção 3' (conservando complementaridade perfeita com o transcrito alvo). a fita senso foi especificada como o complemento reverso dos primeiros 21 nucleotídeos do 23mero antissenso. Foram selecionados dúplices que mantinham correspondências perfeitas com todos os transcritos de espécies selecionadas ao longo de todos os 23 nucleotídeos. Seleção de sequências de siRNA
[00744] Um total de 90 oligos de 19mero de siRNAs senso e 90 antissenso derivados de humano/rhesus, 40 senso e 40 antissenso derivados de humano/rhesus/camundongo/camundongo/rato, e 40 senso e 40 antissenso derivados de camundongo/rato foi sintetizado e formado em dúplices. Um total de 45 oligos de 21/23meros senso e 45 antissenso derivados de humano/rhesus foi sintetizado para originar 45 dúplices conjugados com GalNAc.
[00745] As sequências das fitas senso e antissenso dos dúplices modificados são mostradas na Tabela 2, e as sequências das fitas senso e antissenso dos dúplices não modificados são mostradas na Tabela 3. Síntese de sequências de ALAS1
[00746] Sequências de ALAS1 foram sintetizadas em um sintetizador MerMade 192 a uma escala de 1 ou 0,2 umol. Foram preparadas fitas únicas com modificações de 2’-O-metila para rastreio in vivo usando reagentes de transfecção. Foram preparados conjugados 3’ GalNAc com sequências contendo modificações de 2’-F e 2’-O-metila na fita senso nos desenhos de 21-23mero para captação livre em células. Para todas as sequências de 21mero na lista, foi aplicada química "endoleve" como detalhado em baixo. • Todas as pirimidinas (citosina e uridina) na fita senso continham bases de 2’-O-Metila (C com 2’-O-Metil e U com 2’-O-Metila) • Na fita antissenso, as pirimidinas adjacentes a (na direção da posição 5') ribo A nucleosídeo foram substituídas pelos seus correspondentes nucleosídeos de 2-O-Metila • Uma extensão dTsdT de duas bases na extremidade 3’ de ambas as sequências senso e antissenso foi introduzida • O ficheiro da sequência foi convertido em um ficheiro de texto para o tornar compatível para introdução no software de síntese MerMade 192
[00747] Para as fitas senso conjugados com GalNAc e sequências antissenso complementares, nucleosídeos modificados por 2'F e outros foram introduzidos em combinação com ribo com nucleosídeos de 2'O- Metila. A síntese foi realizada em um suporte de CPG com modificado por GalNAc para a fita senso e CPG modificado com suporte universal na sequência antissenso. Síntese, Clivagem e desproteção:
[00748] A síntese de sequências de ALAS1 usou síntese de oligonucleotídeos suportada por sólido usando química de fosforamidita. Para sequências endoleves de 21meros, um CPG com deoxitimina foi usado como o suporte sólido, enquanto, para os conjugados de GalNAc, foram usados um suporte sólido de GalNAc para a fita senso e um CPG universal para a fita antissenso.
[00749] A síntese das sequências acima foi realizada a uma escala de 1 ou 0,2 um em placas de 96 poços. As soluções de amidita foram preparadas a concentração de 0,1 M e tiotetrazol de etila (0,6 M em Acetonitrila) foi usado como ativador.
[00750] As sequências sintetizadas foram clivadas e desprotegidas em placas de 96 poços, usando metilamina no primeiro passo e reagente de fluoreto no segundo passo. Para sequências contendo GalNAc e nucleosídeo de 2'F, as condições de desproteção foram modificadas. As sequências após clivagem e desproteção foram precipitadas usando uma mistura acetona: etanol (80:20) e os péletes foram ressuspensos em tampão de acetato de sódio a 0,2 M. Amostras de cada sequência foram analisadas por LC-MS para confirmar a identidade, UV para quantificação e um conjunto selecionado de amostras por cromatografia IEX para determinar a pureza.
Purificação e dessalinização:
[00751] As sequências de ALAS1 foram precipitadas e purificadas em um sistema AKTA Purifier usando coluna de Sephadex. O ALAS1 foi processado à temperatura ambiente. A injeção e coleta de amostras foram realizadas em placas de 96 poços (poços com 1,8 mL de profundidade). Um único pico correspondendo à sequência de comprimento total foi coletado no eluente. As sequências de ALAS1 dessalinizadas foram analisadas quanto à concentração (por medição de UV a A260) e pureza (por HPLC de permuta iônica). As fitas complementares únicas foram depois combinadas em uma razão estequiométrica de 1:1 para formar dúplices de siRNA. Tabela 2: Sequências de fitas Únicas Modificadas e de Dúplices de ALAS1 de Humano
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Tabela 3: Sequências de fitas Únicas Não Modificadas e de Dúplices de ALAS1 de Humano
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Exemplo 3. Rastreio in vitro de dúplices de siRNA de ALAS1 quanto a atividade de silenciamento de ALAS1
[00752] Os dúplices de siRNA de ALAS1 foram rastreados quanto à capacidade de silenciarem a expressão de ALAS1 in vitro. Rastreio in vitro Cultura e transfecções de células
[00753] Células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas até à quase confluência a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5 % em MEM (ATCC) suplementado com FBS a 10 %, antes de serem liberadas da placa por tripsinação. A transfecção foi levada a cabo por adição de 14,8 μL de Opti-MEM mais 0,2 μL de Lipofectamina RNAiMax por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. # de cat 13778-150) a 5 μL de dúplices de siRNA por poço em uma placa de 96 poços e incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos. 80 μL de meio de crescimento completo contendo ~2 x104 células Hep3B foram depois adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas durante 24 ou 120 horas antes da purificação do RNA. Experiências de dose única foram realizadas às concentrações finais dos dúplices de 10 nM e 0 nM e experiências de resposta à dose foram feitas às concentrações finais dos dúplices de 10, 1,67, 0,27, 0,046, 0,0077, 0,0013, 0,00021, 0,00004 nM. Isolamento de RNA total usando Conjunto de Isolamento de mRNA DYNABEADS (Invitrogen, # da parte: 610-12)
[00754] As células foram coletadas e lisadas em 150 μL de Tampão de Lise/Ligação, depois misturadas durante 5 minutos a 850 rpm usando um Termomisturador Eppendorf (a velocidade de mistura foi a mesma ao longo do processo). Dez microlitros de esférulas magnéticas e 80 μL de mistura de Tampão de Lise/Ligação foram adicionados a uma placa de fundo redondo e misturados durante 1 minuto. As esférulas magnéticas foram capturadas usando suporte magnético e o sobrenadante foi removido sem perturbar as esférulas. Após remoção do sobrenadante, as células lisadas foram adicionadas às esférulas restantes e misturadas durante 5 minutos. Após remoção do sobrenadante, as esférulas magnéticas foram lavadas 2 vezes com 150 μL de Tampão de Lavagem A e misturadas durante 1 minuto. As esférulas foram capturadas novamente e o sobrenadante removido. As esférulas foram depois lavadas com 150 μL de Tampão de Lavagem B, capturadas e o sobrenadante foi removido. As esférulas foram de seguida lavadas com 150 μL de Tampão de Eluição, capturadas e o sobrenadante removido. Se permitiu que as esférulas secassem durante 2 minutos. Após secagem, 50 μL de Tampão de Eluição foram adicionados e misturados durante 5 minutos a 70 °C. As esférulas foram capturadas em magneto durante 5 minutos. 40 μL de sobrenadante foram removidos e adicionados a outra placa de 96 poços. Síntese de cDNA usando conjunto de transcrição reversa de cDNA de elevada capacidade ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, # de Cat 4368813)
[00755] Uma mistura mãe de 2 μL de 10X Tampão, 0,8 μL de 25X dNTPs, 2 μL de Iniciadores aleatórios, 1 μL de Transcriptase Reversa, 1 μL de inibidor de RNase e 3,2 μL de H2O por reação foi adicionada a 10 μL de RNA total. Foi gerado cDNA usando um termociclador C-1000 ou S-1000 Bio-Rad (Hercules, CA) através dos seguintes passos: 25 oC 10 min, 37 oC 120 min, 85 oC 5 seg, manutenção a 4 oC. PCR em tempo real
[00756] 2 μL de cDNA foram adicionados a uma mistura mãe contendo 0,5 μL de Sonda Taqman para GAPDH (# de Cat 4326317E da Applied Biosystems), 0,5 μL de sonda Taqman para ALAS1 (# de cat Hs00167441_m1 da Applied Biosystems) e 5 μL de mistura mãe de sonda Lightcycler 480 (# de Cat 04887301001 da Roche) por poço em placas de 384 poços (# de cat 04887301001 da Roche). PCR em tempo real foi realizado em um sistema de PCR em Tempo Real LC480 da Roche (Roche) usando o ensaio de ΔΔCt(RQ). Cada dúplex foi testado em duas transfecções independentes com dois replicados biológicos cada um, e cada transfecção foi avaliada em duplicado, a não ser que notado de outro modo nas tabelas de sumário.
[00757] Para calcular a mudança relativa do número de vezes, os dados de tempo real foram analisados usando o método ΔΔCt e normalizados para ensaios realizados com células transfectadas com AD-1955 a 10 nM, ou células pseudotransfectadas. As IC50s foram calculadas usando um modelo de ajustamento de 4 parâmetros usando XLFit e normalizadas para células transfectadas com AD-1955 ou células ingênuas ao longo da mesma gama de doses, ou para a sua própria dose mais baixa. Silenciamento in vitro da expressão de ALAS1 endógeno por dúplices de siRNA de ALAS1
[00758] A Tabela 4 ilustra o silenciamento de ALAS1 em células Hep3B por dúplices de siRNA modificados de ALAS1 (Ver Tabela 2). O silenciamento é expresso como a fração de RNA mensageiro restante em relação ao siRNA de controle negativo (luciferase) AD-1995. Os dados foram gerados como descrito acima após transfecção de 10 nM ou 0,1 nM de cada siRNA. qPCR foi realizada usando a sonda TaqMan para ALAS1 Hs00167441_m1. Tabela 4: Expressão de ALAS1 em células Hep3B após transfecção com siRNA de ALAS1
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IC50S de dúplices de siRNA de ALAS1 se ecionados em rastreio in vitro
[00759] A Tabela 5 ilustra as IC50s de dúplices de siRNA de ALAS1 selecionados determinadas a partir do silenciamento de ALAS1 endogenamente expresso na linha celular Hep3B, por dúplices de siRNA de ALAS modificados (ver Tabela 2). Os dados foram gerados como descrito acima, às 24 ou 120 horas após transfecção de cada dúplex de siRNA. Neste exemplo, o silenciamento de ALAS1 é expresso como a fração de mRNA mensageiro restante em relação ao siRNA AD- 1955, um siRNA não dirigido que foi usado como um controle negativo. Os dados de experiências de transfecção em replicado foram usados para ajustar uma única linha para determinar a IC50. Vários dos dúplices (por exemplo, AD-53541.1, AD-53542.1, e AD-53547.1) tinham uma IC50 tão baixa quanto 0,03 nM às 24 horas. Numerosos dúplices tinham uma IC50 de menos do que 0,1 nM (por exemplo, AD-53534.1, AD- 53536.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD- 53548.1, AD-53550.1, AD-53552.1) às 24 horas, e alguns destes tinham também uma IC50 de menos do que 0,1 nM (por exemplo, AD-53534.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53552.1) às 120 horas. Tabela 5: IC50S de dúplices de siRNA de ALAS1 selecionados normalizadas em relação a AD-1955
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Exemplo 4. Silenciamento In vivo usando um siRNA de ALAS1 de camundongo/rato formulado como uma LNP
[00760] As sequências do dúplex modificado AD-53558 são mostradas na Tabela 6 em baixo. Tabela 6: Sequências do Dúplex de siRNA de ALAS1 AD-53558.4
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[00761] Este dúplex foi formulado como uma formulação LNP11 (ver Tabela 10 acima). O siRNA AD-53558 formulado em LNP foi testado em in vivo em camundongos (N=25 animais; 5 animais por grupo) e ratos (N=20 animais; 4 animais por grupo) e se confirmou que silenciava mRNA de ALAS1 in vivo. Os resultados são mostrados nas FIG. 5 e FIG. 6.
[00762] A FIG. 5 mostra que o siRNA demonstrou um efeito de resposta à dose em camundongos. A expressão do mRNA de ALAS1 de camundongo (mALAS1) foi reduzida por cerca de 78 % quando o siRNA foi administrado a 1 mg/kg; o mRNA de ALAS1 de camundongo foi reduzido por cerca de 60 % quando o siRNA foi administrado a 0,3 mg/kg; e o mRNA de ALAS1 de camundongo foi reduzido por cerca de 49 % quando o siRNA foi administrado a 0,1 mg/kg. Estas reduções são expressas em relação a um controle de PBS. Um controle de LUC de AD-1955 LUC foi também empregue, como mostrado na FIG. 5.
[00763] Similarmente, a FIG. 6 mostra que o siRNA demonstrou um efeito de resposta à dose em ratos. A expressão do RNA de ALAS1 foi reduzida por cerca de 70 % quando o siRNA foi administrado a 1 mg/kg; o mRNA de ALAS1 foi reduzido por cerca de 62 % quando o siRNA foi administrado a 0,3 mg/kg; e o mRNA de ALAS1 foi reduzido por cerca de 34 % quando o siRNA foi administrado a 0,1 mg/kg.
[00764] A durabilidade do silenciamento foi também testada em camundongos (N=15; 3 animais por ponto temporal). Os resultados são mostrados nas FIG. 7, que mostra que AD-53558 suprimiu mRNA de mALAS1 por cerca de 80 % durante pelo menos 9 dias. A supressão de pelo menos cerca de 50 % persistiu durante pelo menos 14 dias. Exemplo 5. Eficácia de siRNA de ALAS1 em um Modelo Animal da AIP
[00765] Os efeitos da formulação LNP11 de AD-53558 (um siRNA de ALAS1 de camundongo/rato descrito no exemplo prévio) foram investigados em um modelo de camundongo da AIP. O silenciamento de PBGD não é viável (-/-, 0% de atividade). Camundongos heterozigotos com silenciamento de PBGD (+/-, ~50% de atividade) estão disponíveis mas não têm o fenótipo bioquímico completo e assim não recapitulam o fenótipo da doença humana. Assim, foi desenvolvido um modelo de camundongo da AIP que é um composto heterozigoto com alelos T1/T2, incluindo disrupção do promotor T1 (+/-) e alteração local de processamento T2 (-/-). Se mostrou que estes camundongos têm atividade de PBGD hepática residual que é cerca de ~30 % do nível de tipo selvagem e níveis de ALA e PBG no plasma de linha de base normais ou ligeiramente elevados. Se descobriu que os camundongos parecem normais no início da vida e se tornam ligeiramente mais lentos e atáxicos com a idade. Aos seis meses de idade, se documentou que os camundongos desenvolvem coordenação motora e desempenho muscular deficientes e degeneração axonal após exame patológico. A investigação da patologia do modelo de camundongo tem mostrado degeneração axonal, coordenação motora e desempenho muscular deficientes em camundongos mais velhos. Se descobriu que ALA e PBG na urina e plasma aumentam marcadamente com administração i.p. em série de fenobarbital (ver Lindberg et al., (1996), Nature Genetics, 12:195-219 e Lindberg et al., (1999), Journal of Clinical Investigation, 103:1127-34). Os camundongos foram salvos por expressão mediada por AAV de PBGD no fígado (Yasuda et al. (2010), Molecular Medicine, 1:17-22 e Unzu et al. (2011), Molecular Medicine, 2:243-50).
[00766] Ao dia 1, foi administrado aos camundongos siRNA de ALAS1 de 1 mg/kg (n=5) ou controle de LUC AD-1955 (n=3) por injeção i.v. Foram dadas três injeções de fenobarbital (1 injeção por dia aos dias 2, 3, e 4) para induzir ALAS1 hepático e os precursores de porfirina, ALA e PBG. Os espécimes no plasma e na urina durante a noite foram coletados ao dia 5 e os níveis de metabolitos foram medidos por LC- MS. Os níveis de metabolitos foram medidos no plasma por LC-MS e foram também medidos na urina. Os níveis da linha de base de metabolitos foram medidos antes do primeiro tratamento ao dia 1. Os resultados são mostrados nas FIGs. 8-12 e nas Tabelas 12 e 13.
[00767] A FIG. 8 e a FIG. 9 mostram os níveis de ALA no plasma em μM. Os níveis de ALA da linha de base foram baixos, (n=4), e o tratamento com fenobarbital induziu aumentos nos níveis de ALA no plasma nos animais tratados com siRNA de LUC de controle (n=3). O tratamento com siRNA de ALAS1 inibiu a indução de ALA no plasma (n=5), como mostrado na FIG. 8. O siRNA de ALAS1 foi consistentemente eficaz no bloqueio da indução de ALA no plasma em cada um dos animais individuais estudados (ver FIG. 9). Estes resultados indicam que o tratamento com siRNA de ALAS1 foi eficaz na prevenção dos aumentos de ALA no plasma associados aos ataques agudos induzidos por fenobarbital em este modelo animal da AIP.
[00768] A FIG. 10 e a FIG. 11 mostram os níveis de PBG no plasma em μM. Os níveis de PBG da linha de base foram baixos (n=4), e o tratamento com fenobarbital induziu aumentos significativos nos níveis de PBG no plasma nos animais tratados com siRNA de LUC de controle (n=3). O tratamento com siRNA de ALAS1 inibiu a indução de PBG no plasma (n=5), como mostrado na FIG. 10. O siRNA de ALAS1 foi consistentemente eficaz no bloqueio da indução de PBG no plasma em cada um dos animais individuais estudados (ver FIG. 11). Estes resultados indicam que o tratamento com siRNA de ALAS1 foi eficaz na prevenção dos aumentos de PBG no plasma associados aos ataques agudos induzidos por fenobarbital em este modelo animal da AIP.
[00769] As Tabelas 12 e 13 mostram níveis de ALA e PBG na urina à linha de base e após tratamento com fenobarbital em controle de siRNA de LUC (n=2) (CTR, que se refere a um animal tratado com tampão de PBS, n=1) e animais tratados com siRNA de ALAS1 (n=5). Tabela 12: Dados de urina de animais individuais mostrando prevenção de ataque agudo induzido
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PB significa fenobarbital. Um "+" indica que foi administrado fenobarbital. Tabela 13: Dados Média da Urina
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[00770] O tratamento com fenobarbital induziu fortes aumentos (aumentos de ~25-30 vezes) em ALA (~9 vezes em relação a níveis da linha de base) e PBG (~19 vezes em relação a níveis da linha de base) na urina nos camundongos tratados com siRNA de LUC, controle, ao passo que tais aumentos não foram observados nos animais tratados com siRNA de ALAS1. Assim, o siRNA de ALAS1 bloqueou aumentos induzidos por fenobarbital em ALA e PBG na urina. Estes resultados são consistentes com as medições no plasma e mostram que o tratamento com siRNA de ALAS1 foi eficaz na prevenção de aumentos nos metabolitos (ALA e PBG) na urina associados aos ataques agudos induzidos por fenobarbital em este modelo animal da AIP.
[00771] Em experiências adicionais (FIG. 12), se descobriu que o tratamento com fenobarbital induziu grandes aumentos (~25 vezes) na expressão de mRNA de ALAS1 no fígado do modelo de camundongo. A administração de siRNA de ALAS1 bloqueou completamente esta indução de mRNA de ALAS1. Estes resultados proporcionam evidência crescente de que siRNA de ALAS1 é eficaz em um modelo animal da AIP.
[00772] Coletivamente, os resultados proporcionados em este Exemplo mostram que siRNA de ALAS1 foi eficaz no tratamento de ataques agudos em um modelo animal da porfiria hepática aguda AIP. Múltiplas medidas de resultados apoiam esta conclusão, incluindo níveis de ALA no plasma, níveis de PBG no plasma, níveis de ALA na urina, níveis de PBG na urina, e níveis de expressão de mRNA de ALAS1 no fígado. Exemplo 6. Silenciamento In Vivo usando siRNA de ALAS1 de Camundongo Conjugado com GalNAc
[00773] As experiências descritas em este exemplo investigaram a eficácia in vivo de três siRNAs conjugados com GalNAc (ver Tabela 7). Estes siRNAs foram desenhados e produzidos com métodos tais como aqueles descritos no Exemplo 2. Tabela 7: Sequências AD-57929
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[00774] Os camundongos (n=40; n=4 por condição experimental) foram divididos em grupos que receberam PBS ou doses de 3 mg/kg, 10 mg/kg, ou 30 mg/kg de siRNA administrado subcutaneamente. O nível de mALAS1/mRNA de mGAPDH, em relação ao controle de PBS, foi determinado em células do fígado às 72 horas pós-administração. Os resultados são mostrados nas FIG. 13. Não existe um efeito de resposta à dose claro para os siRNAs AD-56211 e AD-56173. Em contraste, o siRNA de ALAS1 AD-57929 mostrou um efeito de resposta à dose na inibição da expressão de mALAS1. Estes resultados demonstram que um conjugado ALAS1 GalNAc era eficaz na inibição da expressão de mRNA de ALAS1 in vivo e mostrava um efeito de resposta à dose. Exemplo 7. siRNAs Humanos
[00775] siRNAs humanos adicionais foram desenhados e produzidos como descrito no Exemplo 2. Os melhores 45 siRNAs foram selecionados com base na sua eficácia prevista. As sequências destes 45 siRNAs são proporcionadas na Tabela 8 e na Listagem de Sequências anexada juntamente (por exemplo, uma sequência senso correspondente a uma das sequências de numeração ímpar identificadas como SEQ ID NOs: 391 até 551, e uma sequência antissenso correspondente a uma das sequências de numeração par identificadas como SEQ ID NOs: 392 até 552, respectivamente). A Tabela 8 é revelada na publicação Internacional No. WO2013/155204A2. O conteúdo de WO 2013/155204 e a Listagem de Sequências, incluindo a Tabela 8, são expressamente incorporados a título de referência. Exemplo 8. siRNAs Humanos
[00776] siRNAs humanos 19mero adicionais foram gerados. As sequências destes siRNAs são proporcionadas na Tabela 9 e na Listagem de Sequências anexada juntamente (por exemplo, uma sequência senso correspondente a uma das sequências de numeração ímpar identificadas como SEQ ID NOs: 553 até 3365, e uma sequência antissenso correspondente a uma das sequências de numeração par identificadas como SEQ ID NOs: 554 até 3366, respectivamente). A Tabela 9 é revelada na publicação Internacional No. WO2013/155204A2. O conteúdo de WO 2013/155204 e a Listagem de Sequências, incluindo a Tabela 9, são expressamente incorporados a título de referência. Estes siRNAs podem ser testados quanto à eficácia usando métodos descritos aqui e/ou métodos conhecidos na técnica. Exemplo 9. Supressão de Precursores de Porfirina Usando siRNA de ALAS1 em um Paradigma de Tratamento Agudo
[00777] O modelo de camundongo da AIP (ver Exemplo 5) foi usado para investigar se siRNA de ALAS1 funcionaria em um paradigma de tratamento agudo para diminuir níveis já elevados de ALA e PBG, como estariam presentes, por exemplo, quando um paciente humano com porfiria sofre de um ataque agudo. A administração do siRNA como formulação LNP11 AD-53558 LNP11 a uma dose de1 mg/kg 12 horas após a última dose de fenobarbital diminuiu rapidamente os níveis de ALA e PBG no plasma de camundongo, ao passo que, em animais tratados com controle de LUC, os níveis continuaram a subir (FIG. 14). Estes resultados indicam que siRNA de ALAS1 é eficaz para tratamento de um ataque agudo. O siRNA de ALAs1 foi eficaz para diminuir e prevenir aumentos adicionais nos níveis de ALA e PBG.
[00778] Como pode ser observado na FIG. 14, siRNA de ALAS teve um efeito com início rápido na redução dos níveis de ALA e PBG. O início do efeito ocorreu em um período de horas após a administração do siRNA. O efeito em ALA no plasma pôde ser observado em um período de 4 horas da administração do siRNA (ver FIG. 14; o siRNA foi administrado às 12 horas após a última dose de fenobarbital, e a redução do ALA no plasma relativamente ao controle pode ser observada às 16 horas após a última dose de fenobarbital). O efeito em PBG no plasma pôde ser observado em um período de 8 horas da administração do siRNA (ver FIG. 14; o siRNA foi administrado às 12 horas após a última dose de fenobarbital, e uma redução em ALA no plasma relativamente ao controle pode ser observada às 20 horas após a última dose de fenobarbital). Exemplo 10. siRNAs que se dirigem a ALAS1
[00779] Sequências de siRNA não modificadas e modificadas adicionais que se dirigem a siRNA de ALAS1 foram desenhadas e produzidas como descrito no Exemplo 2. A atividade in vitro dos dúplices modificados foi testada como descrito em baixo
Métodos Transfecção mediada por lipídeos
[00780] Para Hep3B, PMH, e hepatócitos primários de Cynomolgus, a transfecção foi levada a cabo por adição de 14,8 μL de Opti-MEM mais 0,2 μL de Lipofectamina RNAiMax por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. número do catálogo 13778-150) a 5 μL de cada dúplex de siRNA a um poço individual em uma placa de 96 poços. A mistura foi depois incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. 80 μL de meio de crescimento completo sem antibiótico contendo o número apropriado de células foram depois adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas durante 24 horas antes da purificação do RNA.
[00781] Experiências de dose única foram realizadas a concentrações finais de dúplex de 1 uM, 500 nM, 20 nM, 10 nM e 0,2 nM para modificado por GalNAc. Transfecção de captação livre
[00782] Hepatócitos Primários Criopreservados de Cynomolgus (Celsis In Vitro Technologies, M003055-P) foram descongelados com banho de água a 37°C imediatamente antes de uso e ressuspensos em 0,26x106 células/mL em meio (de plaqueamento) InVitroGRO CP (Celsis In Vitro Technologies, número de catálogo Z99029). Durante as transfecções, as células foram plaqueadas em uma placa de colagênio de 96 poços BD BioCoat (BD, 356407) a 25.000 células por poço e incubadas a 37°C em uma atmosfera de CO2 a 5%. Experiências de Captação Livre foram realizadas por adição de 10 μL de dúplices de siRNA em PBS por poço em uma placa de 96 poços (96w). Noventa μL de meio de crescimento completo contendo número apropriado de células para o tipo de células foram depois adicionados ao siRNA. As células foram incubadas durante 24 horas antes da purificação do RNA. As experiências de dose única foram realizadas a dúplex final de 1 uM, 500 nM, 20 nM e 10 nM. Isolamento de RNA total usando Conjunto de Isolamento de mRNA DYNABEADS (Invitrogen, # da parte: 610-12)
[00783] As células foram coletadas e lisadas em 150 μL de Tampão de Lise/Ligação, depois misturadas durante 5 minutos a 850 rpm usando um Termomisturador Eppendorf (a velocidade de mistura foi a mesma ao longo do processo). Dez microlitros de esférulas magnéticas e 80 μL de mistura de Tampão de Lise/Ligação foram adicionados a uma placa de fundo redondo e misturados durante 1 minuto. As esférulas magnéticas foram capturadas usando suporte magnético e o sobrenadante foi removido sem perturbar as esférulas. Após remoção do sobrenadante, as células lisadas foram adicionadas às esférulas restantes e misturadas durante 5 minutos. Após remoção do sobrenadante, as esférulas magnéticas foram lavadas 2 vezes com 150 L de Tampão de Lavagem A e misturadas durante 1 minuto. As esférulas foram capturadas novamente e o sobrenadante removido. As esférulas foram depois lavadas com 150 μL de Tampão de Lavagem B, capturadas e o sobrenadante foi removido. As esférulas foram de seguida lavadas com 150 μL de Tampão de Eluição, capturadas e o sobrenadante removido. Se permitiu que as esférulas secassem durante 2 minutos. Após secagem, 50 μL de Tampão de Eluição foram adicionados e misturados durante 5 minutos a 70°C. As esférulas foram capturadas em magneto durante 5 minutos. Quarenta e cinco μL de sobrenadante foram removidos e adicionados a outra placa de 96 poços. Síntese de cDNA usando conjunto de transcrição reversa de cDNA de elevada capacidade ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, # de Cat 4368813)
[00784] Uma mistura mãe de 2 μL de 10X Tampão, 0,8 μL de 25X dNTPs, 2 μL de Iniciadores aleatórios, 1 μL de Transcriptase Reversa, 1 μL de inibidor de RNase e 3,2 μL de H2O por reação é preparada. Volumes iguais de mistura mãe foram misturados para um volume final de12 μL para amostras rastreadas in vitro ou 20 μL para rastreadas in vivo. Foi gerado cDNA usando um termociclador C-1000 ou S-1000 Bio-Rad (Hercules, CA) através dos seguintes passos: 25 oC durante 10 minutos, 37oC durante 120 minutos, 85oC durante 5 segundos, e manutenção a 4oC. PCR em tempo real
[00785] Dois μL de cDNA foram adicionados a uma mistura mãe contendo 2 μL H2O, 0,5 μL de Sonda Taqman para GAPDH (número de catálogo 4326317E da Life Technologies para células Hep3B, número de catálogo 352339E para hepatócitos primários de camundongo ou sonda customizada para hepatócitos primários de cinomólogo), 0,5 μL de sonda Taqman para C5 (número de catálogo Hs00167441_m1 da Life Technologies para células Hep3B ou Mm00457879_m1 para Hepatócitos Primários de Camundongos ou sonda customizada para hepatócitos primários de cinomólogo) e 5 μL de mistura mãe de sonda Lightcycler 480 (número de catálogo 04887301001 da Roche) por poço em placas de 384 poços (384 w) (número de catálogo 04887301001 da Roche). PCR em tempo real foi realizado em um sistema de PCR em Tempo Real LC480 da Roche (Roche) usando o ensaio de ΔΔCt(RQ). Para rastreio in vitro, cada dúplex foi testado em dois replicados biológicos a não ser que notado de outro modo e cada PCR em Tempo Real foi realizada em replicados técnicos em duplicado. Para rastreio in vivo, cada dúplex foi testado em uma ou mais experiências (3 camundongos por grupo) e cada PCR em Tempo Real foi realizada em replicados técnicos em duplicado.
[00786] Para calcular a mudança relativa do número de vezes nos níveis de mRNA de ALAS1, os dados de tempo real foram analisados usando o método ΔΔCt e normalizados para ensaios realizados com células transfectadas com AD-1955 a 10 nM, ou células pseudotransfectadas. As IC50s foram calculadas usando um modelo de ajustamento de 4 parâmetros usando XLFit e normalizadas para células transfectadas com AD-1955 ao longo da mesma gama de doses, ou para a sua própria dose mais baixa.
[00787] As sequências senso e antissenso de AD-1955 são: SENSO: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO:3682) ANTISSENSO: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO:3683).
[00788] As sequências de fita única e dúplex dos siRNAs modificados e não modificados são proporcionadas na Tabela 14 e Tabela 15, respectivamente. Tabela 14: Sequências de fitas Únicas Modificadas e de Dúplices de ALAS1 de Humano
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Tabela 15: Sequências de fitas Únicas Não Modificadas e de Dúplices de ALAS1 de Humano
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[00789] Os resultados dos ensaios in vitro são proporcionados na Tabela 16. A Tabela 16 nota também a espécie alvo de cada um dos siRNAs. Tabela 16: Resultados de Ensaios Funcionais
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[00790] A Tabela 17 ilustra as IC50s de dúplices de siRNA de ALAS1 selecionados. As IC50s foram determinadas a partir do silenciamento de ALAS1 endogenamente expresso na linha celular Hep3B, às 24 horas após transfecção de cada dúplex de siRNA modificado de ALAS1 (ver Tabela 14). Pelo menos sete dúplices, incluindo AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856, e AD-59129, demonstraram consistentemente IC50s de menos do que 0,1 nm, indicando que estes dúplices foram particularmente eficazes na supressão da expressão de ALAS1. Tabela 17: IC50S de dúplices de siRNA de ALAS1 selecionados
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Exemplo 11. Atividade de ALASI-GalNAc em modelo de camundongo de indução por Fenobarbital da AIP
[00791] O modelo de camundongo da AIP foi usado para investigar o efeito de um siRNA que era um conjugado ALAS1-GalNAc. O siRNA tinha a sequência do dúplex AD-58632 (ver Tabela 20). Tabela 20: Sequências do Dúplex de siRNA de ALAS1 AD-58632
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[00792] Os camundongos com AIP não foram tratados (linha de base), ou foram injetados subcutaneamente ao dia 1 com salino ou o conjugado ALAS1-GalNAc a uma dose de 20 mg/kg. Aos Dias 2, 3, e 4, foram deixados não tratados (linha de base) ou foram tratados com injeções IP de Fenobarbital. Ao Dia 5, o plasma foi coletado e os níveis de ALA e PBG foram medidos usando um ensaio LC-MS. Como mostrado na FIG. 15, o conjugado ALAS1-GalNAc mitigou a produção de ALA e PBG no plasma em cerca de 84 e 80 %, respectivamente. Estes resultados indicam que o tratamento com um conjugado ALAS1- GalNAc foi eficaz na prevenção de aumentos em ALA e PBG no plasma associados a ataques agudos induzidos por fenobarbital em este modelo animal da AIP. Exemplo 12. siRNAs adicionais que Se Dirigem a ALAS1 e Inibem a Expressão de ALAS1
[00793] Sequências de siRNAs modificadas que se dirigem a siRNA de ALAS1 foram desenhas e produzidas como descrito no Exemplo 2. As sequências são proporcionadas na Tabela 18. A atividade in vitro dos dúplices modificados foi testada como descrito em baixo Tabela 18: Sequências de fitas Únicos Modificados e de Dúplices de ALAS1 de Humano
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[00794] A atividade in vitro dos siRNAs na supressão de mRNA de ALAS1 foi testada em um rastreio de dose única em células Hep3B que foram transfectadas usando Lipofectamina2000 como um reagente de transfecção. Experiências de dose única foram realizadas a concentração de dúplex de 10 nM e analisadas por ensaio de DNA ramificado (bDNA). Os resultados são mostrados na Tabela 19 e são expressos como percentagem de mRNA restante. Tabela 19: Supressão de mRNA de ALAS1 como avaliada por ensaio de bDNA
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[00795] Os duzentos e trinta e dois dúplices que foram testados suprimiram mRNA de ALAS1 em graus variáveis em este ensaio de dose única. De acordo com este ensaio, pelo menos quatro dos dúplices (AD-59453, AD-59395, AD-59477, e AD-59492) suprimiram mRNA de ALAS1 em 85 % ou mais, 39 dos dúplices suprimiram mRNA de ALAS1 em 80 % ou mais, 101 dos dúplices suprimiram mRNA de ALAS1 em 70 % ou mais, e 152 dos dúplices suprimiram mRNA de ALAS1 em 50 % ou mais. Em contraste, alguns dúplices não mostraram supressão apreciável em este ensaio. Exemplo 13: Inibição responsiva à dose dos precursores de porfirinas ALA e PBG usando siRNA de ALAS1
[00796] Os efeitos de resposta à dose de um siRNA de ALAS1 foram pesquisados em um modelo de camundongo de AIP (ver Exemplo 5). Este modelo mostra ~30 % de atividade residual de PBGD, um aumento de ~2 vezes nos níveis basais de ALA e PBG, um aumento de ~30-100 vezes nos níveis de ALA e PBG após indução por injeções de Fenobarbital uma vez ao dia por 3-4 dias. Os animais mais velhos têm degenerescência axonal e função motora enfraquecida.
[00797] O siRNA de ALAS1 usado neste exemplo foi o dúplex AD- 53558 na formulação AF11. No dia 1, aos camundongos foram administrados 1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,1 mg/kg, ou 0,05 mg/kg de siRNA de ALAS1 ou controle de LUC AD-1955 por injeção i.v. Foram administradas três injeções de fenobarbital (1 injeção por dia nos dias 2, 3, e 4) para induzir ALAS1 hepático e os precursores de porfirinas, ALA e PBG. Os espécimens de plasma e urina durante a noite foram coletados no dia 5 e os níveis de metabólitos foram medidos por LC- MS. Mediram-se níveis de referência de ALA e PBG antes do primeiro tratamento no dia 1. Os resultados estão apresentados na FIG. 16. O siRNA de ALAS1 inibiu níveis de ALA e PBG de um modo dependente da dose. O efeito inibidor em níveis de ALA no plasma foi observado a doses de siRNA de ALAS1 tão baixas quanto 0,05 mg/kg, e o efeito inibidor em níveis de PBG no plasma foi observado a doses de siRNA tão baixas quanto 0,1 mg/kg. Exemplo 14: Inibição duradoura dos precursores de porfirinas ALA e PBG usando SiRNA de ALAS1
[00798] A durabilidade dos efeitos de um siRNA de ALAS1 foram pesquisados em um modelo de camundongo de AIP (ver Exemplo 5). O siRNA de ALAS1 usado neste exemplo foi o dúplex AD-53558 na formulação AF11. O desenho experimental e resultados deste experimento estão apresentados na FIG. 17. No dia 1, aos camundongos foi administrado 1 mg/kg de siRNA de ALAS1 ou controle de LUC AD-1955 por injeção i.v. Três injeções de fenobarbital foram administradas na semana 0 (1 injeção por dia nos dias 2, 3, e 4), semana 2 (1 injeção por dia nos dias 15, 16, e 17), e semana 4 (1 injeção por dia nos dias 29, 30, e 31) para induzir ALAS1 hepático e os precursores de porfirinas ALA e PBG. Os espécimens de plasma e urina durante a noite foram coletados nos dias 5, 18, e 32 e os níveis de metabólitos foram medidos por LC-MS. Os níveis de referência de ALA e PBG foram medidos antes do primeiro tratamento no dia 1.
[00799] Como mostrado na FIG. 17, o siRNA de ALAS1 teve um efeito duradouro na redução dos níveis de ALA e PBG no plasma. A administração do siRNA de ALAS1 suprimiu os níveis de ALA e PBG no plasma durante pelo menos 2 semanas. Estes resultados indicam que o siRNA de ALAS1 é um tratamento eficaz para diminuir níveis elevados de ALA e PBG e assim pode ser usado em profilaxia, por exemplo, para diminuir níveis cronicamente elevados de ALA e PBG e para prevenir ataques porfíricos recorrentes. Exemplo 15: SiRNA de ALAS1 proporciona um início de ação mais rápido em comparação com o tratamento com hemina
[00800] Os efeitos do tratamento com um siRNA de ALAS1 foram comparados com os efeitos do tratamento com hemina em um modelo de camundongo de AIP (ver Exemplo 5). O siRNAde ALAS1 usado neste exemplo foi o dúplex AD-53558 na formulação AF11. O desenho experimental e resultados deste experimento estão apresentados na FIG. 18. Fenobarbital (PB) e ditiocarbamato de dietila (DDC) foram administrados nos dias 1, 2, e 3. DDC é outro indutor de p450 que, tal como o Fenobarbital, aumenta a demanda de heme e ajuda a prolongar a indução de metabólitos de ALA/PBG.
[00801] Hemina a uma dose de 4 mg/kg, siRNA de ALAS1 a uma dose de 2 mg/kg, ou tratamento de controle foi administrado intravenosamente às 8 horas após a última administração de PB e DDC.
[00802] Como mostrado na FIG. 18, o início dos efeitos do tratamento foi mais rápido com tratamento com siRNA de ALAS1 em comparação com o tratamento com hemina. A redução rápida de ALA e PBG com tratamento com siRNA indica que o siRNA é um tratamento eficaz para ataques agudos, pois é esperado que uma melhoria rápida dos sintomas clínicos acompanhe a redução em níveis de ALA e PBG. Exemplo 16: Efeitos do conjugado de GalNAc de SiRNA de ALAS1 AD-58632
[00803] O AD-58632 é um 21/23mero revelado no Exemplo 11. O AD-58632 dirige o transcrito humano NM_ 000688.4 e é também reativo de forma cruzada com transcritos de mRNA de camundongo, rato, e macaco cynomolgous. O AD-58632 foi o único 21/23mero reativo de forma cruzada identificado de um rastreio de cerca de 45 compostos. Outros experimentos com este dúplex são descritos neste exemplo. Efeitos dependentes da dose de AD-58632 na supressão de mRNA de ALAS1
[00804] O efeito de resposta à dose de AD-58632 na supressão de mRNA de ALAS1, relativamente a mRNA de GAPDH, foi pesquisado em ratos. Foram testadas doses de 30 mg/kg, 10 mg/kg, e 3 mg/kg. Os níveis de mRNA de ALAS1 foram medidos em fígado às 72 horas após a última dose. O AD-58632, em comparação com o controle de PBS, suprimiu mRNA de ALAS1 de um modo dependente da dose (ver FIG. 19). O AD-58632 teve uma ED50 de dose única de cerca de 10 mg/kg. Efeitos de AD-58632 no Modelo de AIP de Rato
[00805] O efeito de resposta à dose do conjugado de siRNA de ALAS1 de GalNAc AD-58632 foi adicionalmente pesquisado em um modelo de AIP de rato. Neste modelo, siRNA em uma LNP é usado para silenciar o nível de PBGD especificamente no fígado antes da indução da demanda de heme com fenobarbital. O modelo de AIP de rato exibe silenciamento transitório de siRNA de PBGD no fígado, tem ~15 % de mRNA de PBGD residual, e exibe um aumento de cerca de 10-50 vezes em níveis de ALA e PBG por indução mediante injeção diária de Fenobarbital por três dias.
[00806] O desenho experimental está representado na FIG. 20. Estudaram-se quatro grupos de ratos. Um grupo foi tratado somente com fenobarbital (PB) nos instantes indicados. Um segundo grupo foi tratado com fenobarbital e siRNA de porfobilinogênio deaminase (PBGD). Um terceiro grupo recebeu fenobarbital, siRNA de PBGD, e uma dose de 30 mg/kg do siRNA de ALAS1. Um quarto grupo recebeu fenobarbital, siRNA de PBGD, e uma dose de 10 mg/kg do siRNA de ALAS1. Como mostrado na FIG. 20, o siRNA de PBGD foi administrado intravenosamente no dia 1. O siRNA de ALAS1 GalNAc foi administrado no dia 4. Injeções de fenobarbital foram administradas nos dias 4, 5, 6, e 7. Urina foi coletada por um período de 24 horas começando no dia 7 e terminando no dia 8. Os níveis de mRNA de PBGD, mRNA de GAPDH, e mRNA de ALAS-1 no fígado foram avaliados no dia 8 usando um ensaio de bDNA. Os níveis de PBG e ALA na urina foram determinados usando LC-MS.
[00807] Os resultados de mRNA estão apresentados na FIG. 21. O siRNA de PBGD diminuiu o nível de mRNA de PBGD mas não diminuiu o nível de mRNA de ALAS1. O siRNA de ALAS1 diminuiu níveis de mRNA de ALAS1 de um modo dependente da dose (ver FIG. 21). Os resultados de ALA e PBG estão apresentados na FIG. 22. O siRNA de ALAS1 diminuiu os níveis de ALA e PBG de um modo dependente da dose (ver FIG. 22). Exemplo 17: Dosagem separada com AD-58632
[00808] A eficácia do conjugado de siRNA de ALAS1 GalNAc AD- 58632 foi pesquisada em dois paradigmas distintos de dosagem separada. Para cada um destes estudos foram usados ratos Sprague Dawley fêmeas. Os ratos foram alojados em SCLR (um quarto com ciclos de luz que tem 12 horas de luz ligada e 12 horas de luz desligada) e foram sacrificados às 72 horas após a última injeção. Os níveis de mRNA de ALAS1 e de GAPDH no fígado foram medidos usando um ensaio de DNA ramificado (bDNA). Paradigma de cinco doses diárias versus uma dose de bolus
[00809] No primeiro paradigma, grupos de ratos receberam cinco doses de siRNA (uma dose a cada dia) ou uma única dose de bolus que tinha a mesma concentração total da soma das cinco doses individuais. Especificamente, os ratos foram atribuídos a uma das seguintes condições de tratamento: (1) injeção subcutânea de 6 mg/kg de siRNA uma vez por dia por cinco dias (2) injeção subcutânea de 2 mg/kg de siRNA uma vez por dia por cinco dias, (3) injeção subcutânea de 1 mg/kg de siRNA uma vez por dia por cinco dias, (4) injeção subcutânea de uma dose única de bolus de 30 mg/kg de siRNA (5) injeção subcutânea de uma dose única de bolus de 10 mg/kg de siRNA, (6) injeção subcutânea de uma dose única de bolus de 5 mg/kg de siRNA, ou (7) tratamento com controle de PBS.
[00810] Os resultados estão apresentados na FIG. 23. Neste paradigma, uma única dose de bolus de siRNA proporcionou maior supressão de mRNA de ALAS1 do que a dosagem repetida da mesma concentração de siRNA ao longo de cinco dias. Isto verificou-se para todas as doses estudadas. Dosagem uma vez por semana durante quatro semanas
[00811] No segundo paradigma, os ratos receberam injeções subcutâneas de siRNA a uma de três doses (10 mg/kg, 5 mg/kg, ou 2,5 mg/kg) uma vez por semana durante quatro semanas. Um grupo de controle recebeu injeções de PBS.
[00812] Os resultados estão apresentados na FIG. 24. Em comparação com a dosagem única, administrar quatro doses semanais a 10 mg/kg melhorou o silenciamento máximo alcançado (ED50 é 10 mg/kg a uma única dose). Em contraste, a dosagem múltipla a 5 e 2,5 mg/kg por semana não melhorou o silenciamento neste paradigma. Exemplo 18: Identificação e teste de SiRNAs de ALAS1 com fitas senso e antissenso mais curtas
[00813] Conduziram-se experimentos adicionais para explorer os efeitos do encurtamento dos dúplices de siRNA para 19-19meros. Identificaram-se mais cinco novos dúplices de 19-19meros reativos de forma cruzada que se ligam a transcritos de mRNA de ALAS1 humano (h) (NM_000688.4), de macaco rhesus (rh) (XM_001090440.2), camundongo (m) (NM_020559.2), e rato (r) (NM_024484.2). Nenhum destes dúplices exibiu resultados tão bons quanto o 21/23 mero AD- 58632 (ver FIG. 25).
[00814] Os efeitos da modificação do comprimento e saliências nos dois melhores 19-19meros (AD-59115 e AD-59125) foram pesquisados (FIG. 26 e 27). As sequências modificadas estão apresentadas na Tabela 21. Tabela 21: Sequências para avaliação do comprimento/saliências dos dois melhores 19-19meros
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[00815] As saliências melhoraram a potência. Também proporcionaram outra sequência derivada (AD-60489, que foi baseada em AD-60095) para estudos adicionais da relação estrutura atividade (SAR) (1 emparelhamento defeituoso na pos23 com roedor). Exemplo 19: Efeitos dos conjugados de GalNAc de SiRNA de ALAS1 AD-60489 e AD-58632
[00816] Os efeitos de outro dúplex de conjugado de GalNAc de siRNA de ALAS1 AD-60489 foram pesquisados e comparados com os efeitos de AD-58632. As sequências destes dúplices estão apresentadas na Tabela 22A. O AD-60489 tem um único emparelhamento defeituoso com mRNA de ALAS1 de roedor na extremidade 3' da sequência antissenso. Assim, enquanto AD-58632 é totalmente complementar a sequências humanas, de macaco cynomolgous, camundongo, e rato, o AD-60489 é totalmente complementar apenas a sequências humanas e de macaco cynomolgous. Tabela 22A: Sequências de SiRNA de Dúplices ALAS1 AD-58632 e AD-60489
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[00817] A supressão de mRNA de ALAS1 está apresentada na FIG. 28. Em comparação com AD-58632, o AD-60489 proporcionou supressão mais eficaz a 3 mg/kg e 10 mg/kg e exibiu uma melhoria de cerca de duas vezes na ED50. A ED50 de dose única de AD-60489 foi cerca de 5 mg/kg. Exemplo 20: Efeitos dos conjugados de GalNAc de SiRNA de ALAS1 AD-60489 e AD-58632 em estudos com primatas não humanos
[00818] A eficácia de AD-58632 e AD-60489 na supressão de mRNA no fígado foi pesquisada em primatas não humanos. O desenho experimental está apresentado na FIG. 29. Doses de siRNA (5 mg/kg, 2,5 mg/kg, ou 1,25 mg/kg) ou controle de PBS em um volume de 2 mL/kg foram administradas subcutaneamente cada dia durante 5 dias, depois a cada 2 dias durante 3 semanas. O silenciamento de mRNA de ALAS1 foi avaliado em tecido do fígado obtido de uma biopsia do fígado coletada no dia 15. A biopsia foi coletada após uma recolha de soro e antes da administração da dose 10 (ver FIG. 29). Amostras de soro para o método de detecção de RNA extracelular em circulação (cERD) (ver Exemplo 21) foram recolhidas nos dias -10, -3, 7, 15, 23, 31, e 43. Foi coletado soro para um painel de química clínica nos dias -3, 6, 30, e 43. O painel de química clínica incluiu a avaliação dos níveis de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), e fosfatase alcalina (ALP).
[00819] AD-58632 e AD-60489 suprimiram mRNA de ALAS1 em fígado de um modo dependente da dose (ver FIG. 30). O AD-60489 exibiu maior eficácia do que AD-58632. Por exemplo, à dose mais baixa estudada (1,25 mg/kg), o AD-60489 suprimiu a mensagem de ALAS1 relativa para cerca de 42 % do nível de controle, ao passo que o AD- 58632 exibiu pouca supressão a esta dose. A 2,5 mg/kg, o AD-60489 suprimiu a mensagem de ALAS1 relativa para cerca de 26 % do nível de controle, ao passo que o AD-58632 suprimiu a mensagem de ALAS1 relativa para cerca de 64 % do nível de controle. A 5 mg/kg, o AD-60489 suprimiu a mensagem de ALAS1 relativa para cerca de 21 % do nível de controle, e o AD-58632 suprimiu a mensagem de ALAS1 relativa para cerca de 55 % do nível de controle.
[00820] Os resultados de química clínica indicaram que o silenciamento sustentado de ALAS1 usando o s siRNAs de ALAS1 foi seguro e bem tolerado. Não foram observados aumentos de ALT, AST, ou ALP. Exemplo 21: Efeitos dos conjugados de GalNAc de SiRNA de ALAS1 AD-60489 e AD-58632 em estudos de primatas não humanos avaliados usando o ensaio cERD
[00821] Os efeitos dos conjugados de GalNAc de siRNA de ALAS1 AD-60489 e AD-58632 foram avaliados em primatas não humanos usando o método de detecção de RNA extracelular em circulação (cERD). Este método é descrito, por exemplo, em Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (Pôster apresentado em 9 de fevereiro, 2012 no simpósio Keystone Gene Silencing by small RNAs (Vancouver, 7-12 de fevereiro, 2012) e em Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, publicado online em 19 de dezembro, 2013. Como mostrado na FIG. 29, amostras de soro para o método de detecção de RNA extracelular em circulação (cERD) foram coletadas nos dias -10, -3, 7, 15, 23, 31, e 43.
[00822] Para o ensaio de cERD, amostras de soro foram descongeladas em gelo. Adicionaram-se 375-400 μL de LiCl 8 M a 33,5 mL de soro em tubos de ultracentrifugação (UC), e foram incubados a uma temperatura de 4°C durante pelo menos 1 hora. Adicionou-se PBS ao topo de cada tubo UC, deixando cerca de 1 cm de espaço vazio no topo do tubo para evitar o colapso das paredes dos tubos durante a rotação. Os tubos foram secos para remover qualquer condensação que pudesse ser incubada em gelo. As amostras foram carregadas em um Rotor MC 55 sob uma capela, e as amostras foram submetidas a rotação a 150 000-200 000 g por 100-120 minutos. O sobrenadante foi descartado do pélete. Adicionou-se 1 mL de Trizol ao pélete no tubo UC, o tubo foi submetido a vórtice, e o conteúdo foi transferido para um tubo de microcentrifugação de 1,5 mL. A cada tubo adicionaram-se 200 μL de clorofórmio, e o tubo foi invertido várias vezes para efetivar a mistura. Foi preparada uma amostra de cada vez. As amostras foram submetidas a rotação a 13 000 RPM por 10-20 minutos a 4°C. A fase aquosa superior foi transferida para um tubo fresco de 1,5 mL (~500 μL de volume). Um volume igual de isopropanol 100%, 1 μL de acrilamida linear (4°), e 1/10o do volume de NaoAc 3 M pH 5,5 ou menos foram adicionados a cada amostra (tipicamente 500 μL de isopropanol e 50 μL de NaoAc). A amostra foi submetida a rotação a 13 000 RPM por 10 min a 4°C. Os sobrenadantes foram reservados. O pélete foi lavado duas vezes com EtOH 70 % gelado (500 μL em cada lavagem) e foi submetido a rotação a 13 000 RPM por ~5 min. a 4°C após cada lavagem. O pélete foi deixado secar ao ar por ~5 minutos e então foi ressuspenso em 20 μL de NF H2O. Usaram-se 10 μL na reação de cDNA. O RNA ressuspenso foi armazenado a -80°C. Resultados
[00823] O silenciamento do mRNA no soro, avaliado usando o ensaio cERD, estava correlacionado com os resultados obtidos da biopsia do fígado. Ver FIG. 31. Este resultado é surpreendente, pois ALAS1 não é uma proteína do soro. O ensaio cERD proporcionado aqui permite a monitoração de mRNA de ALAS1 em circulação. Isto tem a vantagem, por exemplo, de os níveis de mRNA de ALAS1 poderem ser medidos ao longo do tempo sem efetuar biopsias do fígado em série, o que seria tecnicamente difícil e dispendioso.
[00824] A cinética do silenciamento de mRNA foi determinada usando os resultados do ensaio cERD. Ver FIG. 32. O AD-60489 alcançou um silenciamento maior do que 50%, mesmo a uma dose de apenas 1,25 mg/kg. Exemplo 22: Estudos de segurança de SiRNAs de ALAS1
[00825] Os seguintes estudos de segurança indicam que o silenciamento sustentado de ALAS1 é seguro e bem tolerado. Estudos em primatas não humanos
[00826] Como descrito acima (ver Exemplo 20), em estudos em primatas não humanos, não foram observados aumentos de ALT, AST, ou ALP após administração de AD-60489 e AD-58632. Estudos em ratos
[00827] Em ratos, foi conduzido um estudo de quatro semanas com AD-58632. O siRNA foi administrado a cada dia por 5 dias a 10 mg/kg na primeira semana, então em dias alternados a 10 mg/kg durante as semanas 2-4 do estudo. A exposição total foi 140 mg. Não foram observados sinais clínicos adversos nem alterações de pesos corporais. Não foram observadas alterações, relacionadas ao artigo de teste, na hematologia ou parâmetros de coagulação. Adicionalmente, não foi observada nenhuma histopatologia adversa. Observou-se vacuolização mínima no baço e fibrose subcapsular mínima no rim. Estudos em camundongos
[00828] Em camundongos, mRNAs de P450 foram avaliados após silenciamento de ALAS1. Observaram-se aumentos muito pequenos, dependentes da dose, em Cyp2b10 às 48 horas após a administração de uma formulação LNP de ALAS1. Ficou resolvido pelas 168 horas. Exemplo 23: Identificação de outros SiRNAs de ALAS1 eficazes usando estudos da relação estrutura atividade
[00829] Foram efetuados estudos da relação estrutura atividade (SAR), incluindo estudos descritos em outros exemplos aqui, para identificar outros siRNAs de ALAS1 eficazes derivados dos que já foram identificados, por exemplo, AD-58632 e AD-60489. Efeitos de modificações químicas foram pesquisados. Modificações químicas incluem 1) modificações 2'-O-metila versus 2’-flúor, 2) Decréscimo em 2’Uf (modificações 2’flúor), 3) Adição de PS (fosforotioato), 4) Uso de dTs internos, e/ou 5) ácidos glicol nucleicos (GNAs). Sem pretender ficar restringido pela teoria, modificações podem aumentar a potência, por exemplo, através de 1) melhor desenrolamento ou carga aumentada de RISC, ou 2) melhor engrenagem de alvos catalíticos. Modificações também podem aumentar a estabilidade de modo que os compostos se possam acumular e ter melhor desempenho quando são administradas múltiplas doses.
[00830] Foi observada atividade melhorada relativamente a outros dúplices (por exemplo, AD-58632 e/ou AD-60489) em alguns casos (ver Tabela 22B), ao passo que foi observada atividade similar (ver Tabela 23) ou atividade reduzida (Tabela 24) em outros casos. Estes casos são meramente apresentados como exemplos com base no rastreio de mais de 150 siRNAs. Exemplificação adicional de estudos de SAR é proporcionada aqui. Tabela 22B: Atividade Melhorada Relativamente a Paterno
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*O número após o ponto d ecimal no nome de um dúplex, nesta e em outras tabelas, refere-se meramente a um Tabela 23: Atividade Similar Relativamente a Paterno mas Estabilidade Acrescida
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Tabela 24: Atividade Reduzida Relativamente a Paterno
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Exemplo 24: Estudos in vitro da relação estrutura atividade de AD- 58632
[00831] AD-58632 e derivados de siRNA de AD-58632 foram gerados, e alguns siRNAs foram rastreados in vitro quanto à atividade. As abreviaturas de modificações químicas são proporcionadas na Tabela 1. Atividade in vitro de siRNA a 10 nM e 0,1 nM
[00832] A atividade in vitro dos siRNAs na supressão de mRNA de ALAS1 foi testada em células Hep3B que foram transfectadas usando Lipofectamine2000 como reagente de transfecção. Os experimentos foram realizados às concentrações indicadas de siRNA (por exemplo, 0,1 nM, 10 nM) e foram analisados por ensaio de DNA ramificado (bDNA) às 24 horas pós-transfecção. Os resultados estão expressos em percentagem de mRNA remanescente relativamente ao siRNA AD- 1955, um siRNA não de direcionamento que foi usado como controle negativo.
[00833] As sequências de siRNAs e resultados do teste in vitro são proporcionados na Tabela 25, Tabela 26, e Tabela 27. Tabela 25: Sequências e resultados do rastreio in vitro para siRNAs derivados de AD-58632 e AD-58632
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[00834] Como mostrado na tabela acima, neste rastreio in vitro, os siRNAs que proporcionaram a maior supressão de mRNA de ALAS1 (supressão maior do que 80 %, de modo que restou menos do que 20% de mRNA) à concentração de 10 nM incluíram AD-58632, AD-60472, AD-60423, AD-60445, AD-60423, AD-60417, AD-60466, AD-60473, AD-60434, AD-60448, AD-60460, AD-60411, AD-60481, AD-60486, e AD-60453, AD-60480, AD-60405, AD-60477, AD-60461, AD-60470, AD-60467, AD-60482, AD-60446, AD-60555, AD-60454, AD-60469 e AD-60463. Adicionalmente, neste rastreio in vitro, os siRNAs que proporcionaram a maior supressão de mRNA de ALAS1 (supressão maior do que 30 %, de modo que restou menos do que 70 % de mRNA) à concentração de 0,1 nM incluíram AD-60423, AD-58632, AD-60434, AD-60423, AD-60466, AD-60419, AD-60438, AD-60448, AD-60460, AD-60473, AD-60411, AD-60405, AD-60472, AD-60477, AD-60417, AD-60480, AD-60482, AD-60421, AD-60560, AD-60433, AD-60481, AD-60475, AD-60555, AD-60437, AD-60550, AD-60415, AD-60463, e AD-60443.
[00835] Como mostrado na tabela em baixo, o teste de outros siRNAs revelou que os seguintes dúplices proporcionaram uma supressão maior do que 80 % a uma concentração de 10 nM: AD-58632, AD-60405, AD-60423, AD-60434, AD-60445, AD-60480, AD-60460, e AD-60466, e os seguintes dúplices proporcionaram uma supressão maior do que 30 % a uma concentração de 0,1 nM: AD-58632, AD- 60405, AD-60423, AD-60434, AD-60419, AD-60480, AD-60460, e AD- 60466. Tabela 26: Outras sequências e resultados de rastreio in vitro para siRNAs derivados de AD-58632 e AD- 58632
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Tabela 27: Outras sequências de siRNAs derivados de AD-58632
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IC50s com base na atividade in vitro
[00836] De modo similar aos experimentos descritos acima, foram realizados experimentos adicionais de resposta à dose à concentração do dúplex final de 10 nM, 1,66667 nM, 0,277778 nM, 0,046296 nM, 0,007716 nM, 0,001286 nM, 0,000214 nM, e 3,57E-05 nM, e calcularam- se valores de IC50. Tabela 28: Outras sequências e IC50s de siRNAs derivados de AD-58632 e AD-58632
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[00837] Como mostrado na Tabela 28, os seguintes dúplices exibiram um valor de IC50 menor do que 0,01 nM: AD-60845, AD- 60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD- 60819, e AD-60460.
[00838] Os seguintes dúplices exibiram um valor de IC50 menor do que 0,02 nM: AD-60845, AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, e AD-60460, AD-60841, AD-60842, AD-60846, AD-60847, AD-60838, AD-60419, AD-60839, AD-60835, AD-586320, AD-60844, AD-60850, e AD-60830.
[00839] Os seguintes dúplices exibiram um valor de IC50 menor do que 0,05 nM: AD-60845, AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, e AD-60460, AD-60841, AD-60842, AD-60846, AD-60847, AD-60838, AD-60419, AD-60839, AD-60835, AD-586320, AD-60844, AD-60850, AD-60830, AD-60423, AD-60834, AD-60419, AD-60434, AD-60825, AD-60837, AD-60823, AD-60824, AD-60840, AD-60829, AD-60893, AD-60832, e AD-60827. Exemplo 25: Estudos in vivo da relação estrutura atividade de AD- 58632
[00840] Derivados do siRNA paterno AD-58632 foram gerados e rastreados in vivo em ratos. As sequências de siRNAs que foram rastreadas são proporcionadas na tabela em baixo. Tabela 29: Sequências de Dúplices de SiRNA de ALAS1
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[00841] Foi administrada uma única dose de 5 mg/kg de siRNA. Aos 5 dias após a administração do siRNA, efetuaram-se medições de mRNA de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) e mRNA de GAPDH de rato (rGAPDH) usando o ensaio de bDNA, e os níveis de fármaco em tecidos foram determinados usando qPCR. Os resultados são apresentados na FIG. 33 e FIG. 34. Como mostrado na FIG. 33, pelo menos dez dúplices (AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD- 60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, e AD-60926) que foram rastreados exibiram supressão melhorada de mRNA de ALAS1 em comparação com AD-58632. Adicionalmente, como mostrado na FIG. 34, estes dúplices (com a exceção de AD-60926) alcançaram concentrações mais elevadas no fígado do que AD-58632. Exemplo 26: Eficácia de AD-60925 e AD-60926 em um modelo de AIP de rato
[00842] A eficácia terapêutica de AD-60925 e AD-60926 (descritos no exemplo anterior) foi pesquisada em um modelo de AIP de rato. O desenho experimental está apresentado no topo da FIG. 35. Os ratos foram tratados com PBS ou 3 mg/kg de siRNA de ALAS1-GalNAc três vezes por semana, Fenobarbital (PB), e um siRNA de PBGD em uma formulação de LNP AF11 (AF11-PBGD) nos instantes indicados na FIG. 35. Os ratos de controle receberam somente o siRNA de PBGD, sem indução por Fenobarbital.
[00843] Os resultados estão apresentados na FIG. 35, FIG. 36 e FIG. 37. A administração de Fenobarbital induziu expressão de mRNA de ALAS1 e níveis acrescidos de PBG e ALA na urina, em comparação com o controle. O tratamento com um total de oito doses de 3 mg/kg de AD-60925 ou AD-60926 três vezes por semana suprimiu mRNA de ALAS1 (FIG. 35), PBG na urina (FIG. 36 e FIG. 37, topo), e ALA na urina (FIG. 36 e FIG. 37, base). O Fenobarbital induziu aumentos em mRNA de ALAS1, PBG na urina, e ALA. A progressão temporal dos efeitos do tratamento está apresentada na FIG. 37. As setas indicam os instantes em que PB foi administrado. O tratamento com siRNA preveniu aumentos induzidos pelo fenobarbital em mRNA de ALAS1, PBG na urina, e ALA.
[00844] Tanto AD-60925 quanto AD-60926 exibiram tratamento de AIP com eficácia terapêutica. O AD-60925 foi ainda mais eficaz do que o AD-60926 na supressão de mRNA de ALAS1, ALA na urina, e PBG na urina. Exemplo 27: Estudos adicionais in vivo da relação estrutura atividade de AD-58632
[00845] Derivados do siRNA paterno AD-58632 foram gerados e rastreados in vivo em ratos. Rastreio in vivo, parte I
[00846] As sequências dos siRNAs que foram rastreados são proporcionadas na tabela em baixo. Tabela 30: Sequências de SiRNA de Dúplices de ALAS1
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[00847] Aos ratos foram administradas quatro doses de 2,5 mg/kg de siRNA bissemanalmente (duas vezes por semana) durante duas semanas. Às 72 horas após a administração da última dose de siRNA, os animais foram sacrificados e efetuaram-se medições dos níveis de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) e mRNA de GAPDH de rato (rGAPDH) usando o ensaio de bDNA.
[00848] Como mostrado na FIG. 38, pelo menos quatro dos siRNAs (AD-60820, AD-60843, AD-60819, e AD-61140) que foram testados exibiram supressão melhorada de mRNA de ALAS1 em comparação com AD-58632. Rastreio in vivo, parte II
[00849] As sequências dos siRNAs que foram rastreados são proporcionadas na tabela em baixo. Tabela 31 Sequências de Dúplices de SiRNA de ALAS1
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[00850] Aos ratos foi administrada uma única dose de 2,5 mg/kg de siRNA. Às 72 horas após a administração do siRNA, efetuaram-se medições de mRNA de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) e mRNA de GAPDH de rato (rGAPDH) usando o ensaio de bDNA.
[00851] Como mostrado na FIG. 39, os siRNAs AD-61141, AD- 61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, e AD- 61146 exibiram supressão melhorada de mRNA de ALAS1 em comparação com AD-58632. O siRNA que proporcionou a maior supressão neste experimento foi AD-60835. Exemplo 28: Estudos in vitro da relação estrutura atividade de AD- 60489
[00852] AD-60489 e derivados de siRNA de AD-60489 foram gerados, e alguns siRNAs foram rastreados in vitro quanto à atividade. A atividade in vitro dos siRNAs na supressão de mRNA de ALAS1 foi testada como descrito no Exemplo 24. As sequências de siRNAs e resultados do teste in vitro são proporcionados nas tabelas em baixo. Tabela 32: Sequências e resultados de rastreio in vitro para siRNAs derivados de AD-60489 e AD-60489
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[00853] No rastreio in vitro cujos resultados estão apresentados na tabela acima, os siRNAs que proporcionaram a maior supressão de mRNA de ALAS1 (supressão maior do que 80 %, de modo que restou menos do que 20 % de mRNA) à concentração de 10 nM incluíram AD- 60501, AD-60592, AD-60591, AD-60513, AD-60507, AD-60587, AD- 60519, AD-60593, AD-60583, AD-60524, AD-60489, AD-60495, AD- 60506, e AD-60582.
[00854] No rastreio in vitro cujos resultados estão apresentados na tabela acima, os siRNAs que proporcionaram a maior supressão de mRNA de ALAS1 (supressão maior do que 30 %, de modo que restou menos do que 70 % de mRNA) à concentração de 0,1 nM incluíram AD- 60592, AD-60591, AD-60593, AD-60587, AD-60583, AD-60589, AD- 60501, AD-60507, AD-60585, AD-60489, AD-60513, AD-60582, AD- 60519, AD-60541, AD-60570, AD-60584, AD-60569, AD-60558, AD- 60573, AD-60556, AD-60495, AD-60523, AD-60566, e AD-60544.
[00855] Como mostrado na tabela em baixo, o teste de outros siRNAs revelou que os seguintes dúplices proporcionaram supressão maior do que 80 % à concentração de 10 nM: AD-60489, AD-60495, AD-60501, AD-60507, AD-60513, AD-60519, AD-60583, AD-60591, AD-60592, e AD-60593, e os seguintes dúplices proporcionaram supressão maior do que 30 % à concentração de 0,1 nM: AD-60489, AD-60495, AD-60501, AD-60507, AD-60513, AD-60519, AD-60583, AD-60591, AD-60592, e AD-60593. Tabela 33: Sequências e resultados do rastreio in vitro para siRNAs derivados de AD-60489 e AD-60489
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Tabela 34: Outras sequências de siRNAs derivados de AD-60489
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Tabela 35: Outras sequências e IC50s de siRNAs derivados de AD-60489 e AD-60489
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[00856] Como mostrado na tabela acima, alguns dúplices exibiram eficácia na supressão de mRNA de ALAS1. Os seguintes dúplices exibiram um valor de IC50 menor do que 0,01 nM: AD-60879, AD- 60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874, AD-60883, AD- 60875, AD-60501, AD-60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD- 60871, e AD-60873. Os seguintes dúplices exibiram um valor de IC50 menor do que 0,02 nM: AD-60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874, AD-60883, AD-60875, AD-60501, AD-60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD-60871, AD-60873, AD-60489, AD-60592, AD-60894, AD-60489, AD-60870, AD-60862, AD-60858, AD-60592, AD-60591, AD-60872, AD-60866, AD-60905, AD-60857, AD-60513, e AD-60861. Os seguintes dúplices exibiram um valor de IC50 menor do que 0,05 nM: AD-60879, AD-60859, AD-60863, AD- 60854, AD-60882, AD-60874, AD-60883, AD-60875, AD-60501, AD- 60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD-60871, AD-60873, AD- 60489, AD-60592, AD-60894, AD-60489, AD-60870, AD-60862, AD- 60858, AD-60592, AD-60591, AD-60872, AD-60866, AD-60905, AD- 60857, AD-60513, AD-60861, AD-60583.2, AD-60902.1, AD-60881.1, AD-60519.2, AD-60507.2, AD-60591.3, AD-60851.1, AD-60896.1, e AD- 60537.2. Exemplo 29: Estudos in vivo da relação estrutura atividade de AD- 60489
[00857] Derivados do siRNA paterno AD-60489 foram gerados e rastreados in vivo em ratos. Rastreio in vivo 1 de derivados de AD-60489
[00858] As sequências dos siRNAs que foram rastreados são proporcionadas na tabela em baixo. Tabela 36: Sequências de Dúplices de SiRNA de ALAS1
Figure img0132
[00859] Aos ratos foi administrada uma única dose de 3 mg/kg de siRNA. Aos 5 dias após a administração do siRNA, foram efetuadas medições de mRNA de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) e mRNA de GAPDH de rato (rGAPDH) usando o ensaio de bDNA, e níveis de fármaco (siRNA) em tecidos foram determinados usando qPCR.
[00860] Como mostrado na FIG. 40 (superior), os siRNAs AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, e AD-60935 exibiram supressão melhorada de mRNA de ALAS1 em comparação com AD- 60489. Os siRNAs AD-60519, AD-60901, AD-60495, e AD-60935 alcançaram níveis mais elevados no fígado do que AD-60489 (ver FIG. 40, base). Assim, a maior parte dos dúplices que proporcionaram supressão melhorada de mRNA de ALAS1 também alcançou níveis mais elevados no fígado.
[00861] Pelo menos para os dúplices AD-60489, AD-60519, e AD- 60901, a eficácia estava correlacionada com níveis no fígado do siRNA (ver FIG. 41), de modo que um nível mais elevado de siRNA no fígado foi associado a maior supressão de mRNA de ALAS1. Rastreio in vivo 2 de derivados de AD-60489
[00862] As sequências dos siRNAs que foram rastreados são proporcionadas na tabela em baixo. Tabela 37: Sequências de SiRNA de Dúplices de ALAS1
Figure img0133
[00863] Aos ratos foi administrada uma única dose de 2,5 mg/kg de siRNA. Aos 5 dias após a administração do siRNA, foram efetuadas medições de mRNA de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) e mRNA de GAPDH de rato (rGAPDH) usando o ensaio de bDNA.
[00864] Como mostrado na FIG. 42, os siRNAs AD-60879, AD- 61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, e AD- 60519 exibiram supressão melhorada de mRNA de ALAS1 em comparação com AD-60489. Exemplo 30: A multidosagem melhora a potência
[00865] Para pesquisar os efeitos da administração de múltiplas doses de siRNA, a ratos (n=3 por grupo) foi administrado PBS ou um siRNA (AD-58632, AD-60925, AD-60419, AD-60445, AD-60892, AD- 60489, AD-60519, ou AD-60901) a uma dose de 2,5 mg/kg duas vezes por semana durante 2 semanas. Os níveis de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) e mRNA de GAPDH de rato (rGAPDH) foram avaliados usando o ensaio de bDNA. Tabela 38: Sequências de SiRNA de Dúplices de ALAS1
Figure img0134
[00866] Como mostrado na FIG. 43, os siRNAs derivados de AD- 58632 AD-60892, AD-60419, AD-60445, e AD-60925 exibiram supressão melhorada de mRNA de ALAS1 em comparação com o AD- 58632 paterno. Adicionalmente, os siRNAs derivados de AD-60489 AD- 60519 e AD-60901 exibiram supressão melhorada de mRNA de ALAS1 em comparação com o AD-60489 paterno. Exemplo 31: Estudos de multidosagem com AD-60519 e AD-60489
[00867] A eficácia terapêutica de AD-60519 foi pesquisada em um modelo de AIP de rato. O desenho experimental está apresentado na FIG. 44 (superior). Os ratos foram tratados com PBS ou siRNA de ALAS1-GalNAc a 2,5 mg/kg ou 5 mg/kg duas vezes por semana durante três semanas. Administraram-se Fenobarbital (Phenobarb) e um siRNA de PBGD em uma formulação de LNP AF11 nos instantes indicados na FIG. 44. Um grupo de controle recebeu somente PBS e o siRNA de PBGD, sem indução por Fenobarbital. Urina foi coletada nos dias 18-19 do estudo.
[00868] Os resultados estão apresentados na FIG. 44 (inferior). A administração de fenobarbital e PBS induziu expressão de mRNA de ALAS1 e níveis aumentados de PBG e ALA na urina (ver FIG. 44), em comparação com PBS isoladamente. O tratamento com um total de seis doses de 2,5 ou 5 mg/kg de AD-60519 duas vezes por semana suprimiu os aumentos induzidos pelo fenobarbital em PBG na urina e ALA na urina (FIG. 44). Estes resultados demonstram que AD-60519 é eficaz na supressão de ALA e PBG quando são administradas doses repetidas tão baixas quanto 2,5 mg/kg. Em particular, o AD-60519 foi eficaz na redução de aumentos em níveis na urina de PBG e ALA associados a ataques agudos no modelo de AIP de rato.
[00869] Em estudos adicionais usando o mesmo desenho experimental mas em um modelo de camundongo (ver diagrama esquemático no topo da FIG. 44), foi pesquisada a eficácia terapêutica de AD-60519 e AD-60489 na supressão de aumentos induzidos por fenobarbital em PBG e ALA no soro. No grupo de controle de PBS (“Salina”), a administração de fenobarbital aumentou os níveis de PBG e ALA no soro (ver FIG. 45), em comparação com PBS isoladamente. O tratamento com um total de seis doses de 2,5 ou 5 mg/kg de AD- 60519 ou AD-60489 duas vezes por semana suprimiu os aumentos induzidos por fenobarbital em PBG no soro e ALA no soro (FIG. 44). Estes resultados demonstram que AD-60519 e AD-60489 são eficazes na supressão de ALA e PBG quando são administradas doses repetidas tão baixas quanto 2,5 mg/kg. Em particular, AD-60519 e AD-60489 foram eficazes na redução de aumentos em PBG e ALA no soro associados a ataques agudos.
[00870] Uma vez que os tratamentos neste exemplo foram administrados antes da indução por fenobarbital, estes resultados indicam que o AD-60519 e AD-60489 têm efeitos profiláticos. Exemplo 32: Outras sequências de siRNA
[00871] As seguintes sequências de siRNA derivadas de AD-58632 (Tabela 39) e derivadas de AD-60489 (Tabela 40) também foram geradas. Tabela 39: Sequências derivadas de AD-58632
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Tabela 40: Sequências derivadas de AD-60489
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Exemplo 33: Outros estudos multidose com AD-60519
[00872] A eficácia terapêutica de AD-60519 foi pesquisada em um modelo de AIP de rato como o usado no Exemplo 31. O desenho experimental está apresentado na FIG. 46 (superior). Os ratos foram tratados com PBS ou siRNA de ALAS1-GalNAc a 3 mg/kg, 1 mg/kg, ou 0,3 mg/kg uma vez por semana durante quatro semanas (tratamento no dia 0, dia 7, dia 14, e dia 21). Fenobarbital (Phenobarb) e um siRNA de PBGD em uma formulação de LNP AF11 foram administrados nos instantes indicados na FIG. 46. Um grupo de controle recebeu somente PBS e o siRNA de PBGD, sem indução por fenobarbital. Urina foi coletada no dia 25 do estudo.
[00873] Os resultados estão apresentados na FIG. 46 (inferior) e na FIG. 47. A administração de fenobarbital e PBS induziu expressão de mRNA de ALAS1 e níveis acrescidos de PBG e ALA na urina, em comparação com PBS isoladamente. O tratamento com um total de quatro doses de 3 mg/kg, 1 mg/kg, ou 0,3 mg/kg de AD-60519 uma vez por semana suprimiu aumentos induzidos por fenobarbital em níveis de mRNA de ALAS1 de rato no fígado de um modo dependente da dose (ver FIG. 46). (Os níveis de mRNA de ALAS1 de rato (rALAS1) no fígado estão expressos relativamente aos níveis de mRNA de GAPDH de rato.) Os níveis de PBG na urina e ALA na urina também exibiram efeitos do tratamento dependentes da dose.
[00874] Doses semanais repetidas de AD-60519 foram eficazes na supressão da expressão de mRNA de ALAS1 e na redução de níveis elevados de ALA e PBG associados a ataques agudos induzidos em um modelo de AIP de rato. Estes efeitos do tratamento dependeram da dose. Estes resultados ilustram que AD-60519 pode atuar profilaticamente quando doseado antes de um ataque. Exemplo 34: Efeitos multidose de conjugados de SiRNA de ALAS1 de GalNAc em primatas não humanos
[00875] Os efeitos de conjugados de siRNA de ALAS1 de GalNAc na supressão de mRNA de ALAS1 no fígado e mRNA de ALAS1 em circulação foram pesquisados em um estudo com primatas não humanos (NHP). Empregaram-se os conjugados de GalNAc AD-58632, AD-60519, AD-61193, e AD-60819. O desenho do estudo está apresentado na Tabela 41 e na FIG. 48. Tabela 41: Desenho do estudo de NHP
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[00876] Cada grupo recebeu múltiplas doses subcutâneas de um conjugado de siRNA de ALAS1 GalNAc a um volume da dose de 2 mg/mL. O Grupo 1 (n=3) recebeu 2,5 mg/kg de 1,25 mg/mL de AD- 58632 nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, e 25. O Grupo 2 (n=3) recebeu 1,25 mg/kg de 0,625 mg/mL de AD-60519 em 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, e 25. O Grupo 3 (n=3) recebeu 2,5 mg/kg de 1,25 mg/mL de AD-60519 nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, e 25. O Grupo 4 (n=3) recebeu 2,5 mg/kg de 1,25 mg/mL de AD-60519 nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 11, 18, e 25. O Grupo 5 (n=3) recebeu 5 mg/kg de 2,5 mg/mL de AD-60519 nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 11, 18, e 25. O Grupo 6 (n=3) recebeu 2,5 mg/kg de 1,25 mg/mL de AD-61193 nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, e 25. O Grupo 7 (n=3) recebeu 2,5 mg/kg de 1,25 mg/mL de AD- 60819 nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, e 25.
[00877] Amostras de soro para o ensaio de detecção de RNA extracelular em circulação (cERD) (ver Exemplo 21) foram coletadas nos dias -3, 7, 13, 21, 27, 39, 46, e 60 (na FIG. 48, “Recolhas PD” indica os dias em que o soro foi coletado). Foi coletado soro para um painel de química clínica nos dias -3 e 6. O painel de química clínica incluiu a avaliação dos níveis de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), e fosfatase alcalina (ALP). O silenciamento de mRNA de ALAS1 foi avaliado em tecido do fígado obtido de uma biopsia do fígado recolhida no dia 21 (ver FIG. 48). A biopsia foi coletada após uma recolha de soro. Supressão de níveis de mRNA de ALAS1 no fígado
[00878] Os níveis de mRNA de ALAS 1 no fígado no dia do estudo 21 estão apresentados na FIG. 49. Os resultados são mostrados como percentagem do nível médio observado em um grupo de controle tratado com PBS. Os resultados são mostrados como os valores médios para cada grupo de tratamento.
[00879] Estes resultados apresentados na FIG. 49 demonstram que, em comparação com animais de controle que receberam tratamento com PBS, todas as condições de tratamento foram eficazes na supressão de níveis de mRNA de ALAS1 no fígado. Os tratamentos alcançaram silenciamento de mRNA variando desde cerca de 20 % até 80 % (correspondentes a níveis de mRNA de ALAS1 variando desde cerca de 80 % até 20 % dos níveis de controle). Os animais individuais que receberam AD-58632 exibiram silenciamento de cerca de 20-50 %, sendo o nível médio de silenciamento cerca de 40 % (os níveis de mRNA de ALAS1 foram, em média, cerca de 60 % dos níveis de controle). Com todas as calendarizações de dosagem empregues, o AD-60519 foi altamente eficaz na supressão de níveis de mRNA de ALAS1. Os animais individuais que receberam AD-60519 exibiram silenciamento entre cerca de 60 % e 80 % (os níveis de mRNA de ALAS1 foram cerca de 20 % até 40 % dos níveis de controle). Em média, os regimes de tratamento com AD-60519 alcançaram silenciamento entre cerca de 65 % e 75 %. Como revelado aqui, AD-60519 é um derivado de AD-60489. Resultados similares para AD-60489 são descritos no Exemplo 20 e estão apresentados na FIG. 30. Adicionalmente, AD-61193 (um derivado de AD-60489) e AD-60819 (um derivado de AD-58632) também alcançaram silenciamento maior do que 50 %. É de notar que os níveis de silenciamento relatados neste exemplo e no Exemplo 20 (por exemplo, cerca de 20 % até 80 %) foram alcançados mesmo em um estado “não induzido”; antecipa-se que, em um estado induzido, por exemplo, quando os níveis de ALAS1 estão elevados de modo agudo ou crônico (por exemplo, em um paciente sofrendo ou em risco de sofrer de uma porfiria, por exemplo, uma porfiria hepática aguda, por exemplo, AIP), níveis menores de silenciamento, por exemplo, redução de níveis de mRNA de ALAS1 para níveis normal ou pré-ataque, podem ser suficientes para alcançar eficácia terapêutica. Supressão de níveis de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação
[00880] A FIG. 50 mostra níveis de mRNA de ALAS 1 extracelular em circulação (médias e desvios-padrão) em cada instante ao longo do estudo quando foram obtidas amostras de soro. Os resultados do mRNA de ALAS1 extracelular em circulação demonstram eficácia do silenciamento de mRNA após tratamento multidose com cada um dos siRNAs estudados (AD60519, AD-61193, AD-60819, e AD-58632). Em todos os grupos, o maior efeito de supressão em mRNA de ALAS1 em circulação foi observado no dia 27, após a dose final de siRNA no dia 25. Em todos os grupos de tratamento, durante as semanas depois de cessar o tratamento, os níveis de mRNA de ALAS1 aumentaram gradualmente e regressaram à referência no período da medição final no dia 60.
[00881] A supressão mais acentuada de mRNA de ALAS1 em circulação (silenciamento máximo de quase 80 %) foi observada no Grupo 3 (2,5 mg/kg de AD-60519 QDx5, BIWx3) e Grupo 5 (5 mg/kg de AD-60519, QDx5, QWx3). O Grupo 2 (1,25 mg/kg de AD-60519, QDx5, BIWx3), o Grupo 4 (2,5 mg/kg de AD-60519, QDx5, QWx3), o Grupo 7 (2,5 mg/kg de AD-60819, QDx5, BIWx3), e o Grupo 6 (2,5 mg/kg de AD- 61193, QDx5, BIWx3) também exibiram excelente supressão, com silenciamento máximo (dia 27) maior do que 50 %. No grupo 1, também foi alcançado um silenciamento notável (mais do que 30 % no dia 27).
[00882] Estes resultados são consistentes com os resultados de mRNA de ALAS1 no fígado e confirmam a potente atividade de AD- 60519. A níveis de dose tão baixos quanto 1,25 mg/kg, o AD-60519 proporcionou 65-75 % de silenciamento. Correlação entre níveis de mRNA de ALAS1 em circulação e no fígado
[00883] A FIG. 27 mostra os níveis do mRNA de ALAS1 no fígado (barras da esquerda) e no soro (barras da direita). Há uma boa correlação entre os níveis relativos de mRNA de ALAS1 medidos no fígado e no soro, indicando que estas medições proporcionam resultados consistentes. Exemplo 35: Estudo em ratos de dose única de AD-60519 e AD- 60589 usando um ensaio de cERD na urina para monitorar a duração da supressão de mRNA de ALAS1
[00884] Um estudo de dose única foi conduzido em ratos usando os conjugados de GalNAc de siRNA de ALAS1 AD-60489 e AD-60519. A eficácia destes conjugados de GalNAc na inibição da expressão de mRNA de ALAS1 foi monitorada usando avaliações de urina com um ensaio de detecção de RNA extracelular em circulação. O ensaio foi similar ao ensaio usado nos Exemplos 21 e 34, com a exceção de terem sido usadas amostras de urina. As amostras de urina foram liofilizadas para concentrá-las. A urina liofilizada foi ressuspensa em 4 mL de dH2O e submetida a vórtice. Então a amostra foi centrifugada a 4 000xg por 10-20 minutos para peletizar quaisquer detritos. As etapas remanescentes foram similares às descritas no Exemplo 21.
[00885] A grupos de ratos foi administrada uma única dose de 10 mg/kg de AD-60489 ou AD-60519. Os níveis normalizados de mRNA de ALAS1 em vários instantes ao longo do estudo estão apresentados na FIG. 51. O instante indicado como “0 horas” é para a amostra de urina pré-dose de referência recolhida imediatamente antes da administração do mRNA de ALAS1. Os resultados para instantes subsequentes estão expressos como uma fração do nível pré-dose.
[00886] Como pode ser observado dos resultados apresentados na FIG. 51, o AD-60519 proporcionou potência melhorada em comparação com AD-60489. Ao seu máximo, a dose única de AD-60519 proporcionou uma supressão de até cerca de 80 %, ao passo que a supressão proporcionada por AD-60489 foi cerca de 60 %. O efeito de uma dose única de 10 mg/kg destes siRNAs de ALAS1 na supressão de mRNA de ALAS1 durou cerca de 21 dias. Estes resultados demonstram a validade do ensaio cERD de urina para monitorar níveis de mRNA de ALAS1. Exemplo 36: Efeitos farmacológicos de AD-60519 em primatas não humanos
[00887] Um estudo adicional dos efeitos do conjugado de siRNA de ALAS1 GalNAc AD-60519 foi conduzido em primatas não humanos. O estudo pesquisou o efeito de dosagem semanal versus bissemanal, uso de uma dose de carga versus nenhuma dose de carga, e a cinética do silenciamento de mRNA de ALAS1 após uma única dose. O desenho do estudo está apresentado na Tabela 42 e na FIG. 52. Tabela 42: Desenho do Estudo de Farmacologia para o Estudo com AD-60519
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[00888] Cada grupo recebeu uma ou mais doses subcutâneas de AD-60519 como indicado na Tabela 42. O Grupo 1 (n=3) recebeu 2,5 mg/kg a um volume de dose de 0,125 mL/kg uma vez por semana durante 8 semanas (as doses foram administradas nos dias de dose 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, e 50). O Grupo 2 (n=3) recebeu 5 mg/kg a um volume de dose de 0,25 mg/mL uma vez por semana durante 8 semanas (as doses foram administradas nos dias de dose 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, e 50). O Grupo 3 (n=3) recebeu uma dose de carga de 5 mg/kg a um volume de dose de 0,25 mL/kg uma vez por dia durante três dias seguido de uma dose de manutenção de 5 mg/kg a um volume de dose de 0,25 mL/kg uma vez por semana durante 7 semanas (as doses foram administradas nos dias 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29, 36, 43, e 50). O Grupo 4 (n=3) recebeu uma dose de carga de 5 mg/kg a um volume de dose de 0,25 mL/kg uma vez por dia durante três dias seguido de uma dose de manutenção de 2,5 mg/kg a um volume de dose de 0,125 mL/kg uma vez por semana durante 7 semanas (as doses foram administradas nos dias 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29, 36, 43, e 50). O Grupo 5 (n=3) recebeu 5 mg/kg a um volume de dose de 0,25 mL/kg duas vezes por semana durante 8 semanas (as doses foram administradas nos dias de dose 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 39, 43, 46, 50, e 53). O Grupo 6 (n=3) recebeu uma única dose de 1 mg/kg a um volume de dose de 0,05 mL/kg no dia 1. O Grupo 7 (n=3) recebeu uma única dose de 10 mg/kg a um volume de dose de 0,5 mL/kg no dia 1.
[00889] Amostras de soro (listadas como “Recolhas PD” na FIG 52), amostras de plasma (listadas como “Recolhas PK” na FIG 52) e amostras de urina foram coletadas como indicado na FIG. 52 e na Tabela 43. As amostras de urina e soro foram sujeitas ao ensaio de cERD. Todas as amostras de sangue e urina coletadas no dia de uma biopsia do fígado foram recolhidas antes da biopsia do fígado. Tabela 43: Calendarização da Recolha de Amostras
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[00890] Os resultados de mRNA de ALAS1 no fígado estão apresentados na FIG. 53. Foi alcançada supressão significativa de mRNA de ALAS1 em todas as condições do estudo. Foi alcançado um silenciamento de até 75-80 % de ALAS1 ao longo dos regimes multidose usando AD-60519. Aos três dias após uma única dose, foi alcançado um silenciamento de cerca de 15 % com uma única dose de 1 mg/kg, e foi alcançado silenciamento de cerca de 70 % com uma única dose de 10 mg/kg (ver FIG. 53). A comparação dos dados dos grupos 1 e 7 revela uma cinética ligeiramente diferente após uma única dose (no grupo 7) versus múltiplas doses (grupo 1) da mesma quantidade cumulativa (30 mg administrados), como avaliado aos 3 dias pós-dose no grupo 7 e aos dois dias após a quarta dose no grupo 1. Em particular, foi observado silenciamento maior após uma única dose (silenciamento de cerca de 70% em média no grupo 7 versus silenciamento de cerca de 45% em média no grupo 1). Ver FIG. 54. Este tipo de resultado também foi observado em estudos com ratos.
[00891] Os resultados de mRNA de ALAS1 no soro até ao dia 22 estão apresentados na FIG. 54 (superior). A correlação entre mRNA de ALAS1 no fígado, mRNA de ALAS1 no soro, e mRNA de ALAS1 no plasma está apresentada na FIG. 55. Estes resultados demonstram uma boa correlação entre os níveis de mRNA de ALAS1 no fígado, soro e urina. Os resultados também proporcionam evidências adicionais demonstrando atividade potente de AD-60519. Foi observado silenciamento de 55-75 % a todos os níveis de dose ao longo de todos os regimes de dosagem multidose. A administração de doses de carga (uma vez por dia durante 3 dias, tal como nos grupos 3 e 4) resultou em regulação negativa ligeiramente mais rápida de mRNA de ALAS1. Os grupos que receberam doses semanais (grupos 1 e 2) ou doses bissemanais (grupo 5) acabaram por exibir níveis comparáveis de supressão de mRNA de ALAS1, indicando que o acúmulo ao longo do tempo proporciona silenciamento sustentado.
[00892] Resultados mostrando a cinética do silenciamento de mRNA de ALAS1 após uma única dose estão apresentados na FIG. 54 (inferior). No grupo de 1 mg/kg, foi observada uma supressão de mRNA de ALAS1 de cerca de 20 % pelo dia 6. No grupo de 10 mg/kg, ocorreu uma redução rápida, de cerca de 70 % do mRNA de ALAS1 pelo dia 4, com recuperação para dentro de 20 % da referência no dia 22 (21 dias pós-dose). Os níveis de mRNA de ALAS1 no soro regressaram à referência depois de cerca de 2 semanas ou 4 semanas após uma única dose de 1 mg/kg ou 10 mg/kg, respectivamente.
[00893] A progressão temporal completa do mRNA de ALAS no soro até às 8 semanas após a administração de AD-60519 está apresentada na FIG. 56. Todos os grupos alcançaram uma supressão máxima de 80% de mRNA de ALAS1 após 5 até 8 semanas de dosagem de ALN- AS1. Os grupos com três doses diárias na semana 1 (QDx3) exibiram um início mais rápido de supressão de mRNA de ALAS1 do que os doseados apenas uma vez na primeira semana (QWx8). Todos os animais regressaram a níveis de ALAS1 de referência, aproximadamente 30-40 dias após a última dose. Exemplo 37: Preparação de um Produto de Fármaco de siRNA
[00894] ALN-60519 (FIG. 57) é um oligonucleotídeo de fita dupla sintetizado quimicamente ligado covalentemente a um ligante contendo três resíduos N-acetilgalactosamina (GalNAc). Todos os nucleotídeos são modificados por 2’-OMe ou 2’-F e são conectados através de ligações 3’-5’ fosfodiéster, desse modo formando a cadeia principal açúcar-fosfato do oligonucleotídeo. a fita senso e a fita antissenso contêm 21 e 23 nucleotídeos, respectivamente. A extremidade 3' da fita senso é conjugada à fração GalNAc triantenária (denominada L96) através de uma ligação fosfodiéster. A fita antissenso contém quatro ligações fosforotioato - duas na extremidade 3' e duas na extremidade 5'. a fita senso contém duas ligações fosforotioato na extremidade 5'. Os 21 nucleotídeos da fita senso hibridam com os 21 nucleotídeos complementares da fita antissenso, desse modo formando 21 pares de bases nucleotídicas e uma saliência de duas bases na extremidade 3' da fita antissenso. As duas fitas isoladas, a fita senso e a fita antissenso, foram sintetizadas por síntese convencional de oligonucleotídeos em fase sólida, empregando química de fosforamidite padrão com o grupo 5’-hidroxila protegido como éter de dimetoxitrifenilmetila (DMT). Cada fita foi montada desde o terminal 3’ para o 5’ por adição sequencial de fosforamidites nucleosídicas protegidas.
[00895] AD-60519, também referido aqui como ALN-60519, foi formulado como uma solução para Injeção para uso subcutâneo, referido aqui como ALN-AS1. O ALN-60519 foi dissolvido em água para injeção (API) e o pH foi ajustado (alvo 7,0). A concentração de ALN- 60519 foi determinada e ajustada por adição de API. A solução com uma concentração final de approximadamente 200 mg/mL foi então esterilizada por filtração e cheia em frascos de vidro do Tipo I de 2 mL. Foi escolhido um volume de enchimento de aproximadamente 0,55 mL para permitir a remoção completa de 0,5 mL de produto de fármaco. Exemplo 38: Medição de Níveis de mRNA de ALAS1 no Soro ou Urina em Pacientes com AIP ou Voluntários Saudáveis Usando o Método cERD
[00896] Estudos de farmacologia em primatas não humanos com ALN-AS1 indicaram que o método de detecção de RNA extracelular em circulação (cERD) para medir o mRNA de ALAS1 no soro ou urina foi robusto e reproduzível. O ensaio cERD também foi usado para medir níveis de mRNA de ALAS1 em soro e urina de pacientes com AIP e voluntários saudáveis. Os níveis de mRNA de ALAS1 no soro estavam geralmente aumentados em pacientes com AIP relativamente a voluntários saudáveis, o que é consistente com o papel que a indução de ALAS1 desempenha na patofisiologia da doença (FIG. 58). É importante notar que os níveis de ALAS1 no soro e urina do mesmo paciente estavam correlacionados entre si. Em dois pacientes submetidos a recolhas repetidas de urina e soro, o nível de mRNA de ALAS1 foi consistente ao longo do tempo. Coletivamente, estes dados indicam que mRNA de ALAS1 pode ser medido em amostras de soro e urina de indivíduos humanos incluindo pacientes com AIP, e o método cERD é útil para seguir a atividade farmacodinâmica de ALN-AS1. Exemplo 39: Estudos Clínicos Exemplares
[00897] Pode ser conduzido um estudo humano para determinar a segurança e tolerabilidade de ALN-AS1 quando administrado como uma única dose e múltiplas doses a pacientes com AIP que são excretores elevados assintomáticos (ASHE) (pacientes que têm níveis elevados de ALA e/ou PBG, como descrito aqui) ou pacientes com AIP que têm ataques recorrentes.
[00898] Objetivos secundários incluem a caracterização de PK no plasma e urina para ALN-AS1 bem como a avaliação pós-dose do impacto de ALN-AS1 nos níveis no plasma e urinários de ALA e PBG. O ensaio cERD que mede mRNA em exossomos é usado para medir 5- aminolevulinato sintase (mRNA de ALAS-1) no soro (ou plasma) e urinário.
[00899] Nos excretores elevados assintomáticos, ALN-AS1 é administrado a doses únicas, por exemplo, a 0,1, 0,35 1,0, ou 2,5 mg/kg, ou em doses semanais repetidas, por exemplo, de 1 e 2,5 mg/kg, durante várias semanas (por exemplo, durante 4 semanas). Como comparação, é administrado um tratamento de controle (por exemplo, placebo). É avaliada a segurança, farmacocinética e efeitos do fármaco em níveis de ALA e PBG. Uma dose de ALN-AS1 que diminua ALA e PBG para dentro da gama normal de referência (por exemplo, uma dose que normalize ALA e/ou PBG para níveis menores 2x do que o valor de referência superior) pode ser selecionada para estudos subsequentes, por exemplo, em pacientes com AIP.
[00900] Nos pacientes com AIP, a taxa de ataques e sintomas de referência são avaliados durante um período de pré-tratamento pré- dosagem (por exemplo, de 12 semanas). Aos pacientes é administrado ALN-AS1, por exemplo, a uma dose de 1-2,5 mg/kg semanalmente. São avaliadas a segurança, farmacocinética e efeitos do fármaco em níveis de ALA e PBG. Adicionalmente, são monitoradas alterações do número de ataques, uso de heme, uso de medicação para a dor, e hospitalização.
Equivalentes
[00901] Aqueles peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de averiguar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita aqui. Tais equivalentes se destinam a estar englobados pelas seguintes reivindicações.

Claims (15)

1. Ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de ALAS1, caracterizado pelo fato de que o referido dsRNA compreende uma fita senso e uma fita antissenso, a fita antissenso compreendendo uma região de complementaridade com um transcrito de RNA de ALAS1 (por exemplo, SEQ ID NO: 1), cuja fita antissenso compreende pelo menos 21 nucleotídeos contíguos da sequência antissenso de usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4152), usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu (SEQ ID NO: 5137), usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu (SEQ ID NO: 5151), ou usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 5161).
2. dsRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma fita senso compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAf (SEQ ID NO: 4151), csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua (SEQ ID NO: 5133), CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAf (SEQ ID NO: 5135), ou csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuua (SEQ ID NO: 5151).
3. dsRNA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: (I) a fita antissenso compreende a sequência de usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4152), e/ou a fita senso compreende a sequência de CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAf (SEQ ID NO: 4151); (II) a fita antissenso consiste na sequência de usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4152), e/ou a fita senso consiste na sequência de CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAf (SEQ ID NO: 4151); (III) a fita antissenso compreende a sequência de usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 5161), e/ou a fita senso compreende a sequência de csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua (SEQ ID NO: 5160); ou (IV) a fita antissenso consiste na sequência de usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 5161), e/ou a fita senso consiste na sequência de csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua (SEQ ID NO: 5160).
4. dsRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ligante, opcionalmente em que o ligante é conjugado à extremidade 3' da fita senso do dsRNA.
5. dsRNA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o dsRNA tem um ou mais dos seguintes: (i) o ligante é um ligante GalNAc; (ii) o ligante é:
Figure img0141
(iii) o ligante está ligado através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente; (iv) o ligante está ligado através de um ligante como mostrado na Fórmula XXIV:
Figure img0142
(v) o dsRNA é conjugado ao ligante L96 através de um ligante como mostrado abaixo:
Figure img0143
; e direciona o dsRNA para os hepatócitos.
6. dsRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido dsRNA tem um ou mais dos seguintes: (a) compreende uma região duplex que tem 17-23 pares de nucleotídeos de comprimento; (b) pelo menos uma fita compreende uma saliência 3' de pelo menos 2 nucleotídeos; ou (c) cada fita não tem mais de 26 nucleotídeos de comprimento.
7. dsRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido dsRNA tem um ou mais dos seguintes: (i) é sintetizado quimicamente; (ii) todos os nucleotídeos no dsRNA são modificados; (iii) todos os nucleotídeos estão conectados através de ligações fosfodiéster 3’-5’; (iv) a fita senso compreende ou consiste em 21 nucleotídeos; (v) a fita antissenso compreende ou consiste em 23 nucleótidos; (vi) tem uma extremidade cega na extremidade 3' da fita senso; (vii) tem uma saliência 3'; (viii) está ligado covalentemente a um ligante contendo três porções N-acetilgalactosamina (GalNAc); (ix) a extremidade 3' da fita senso está conjugada com a fração GalNAc triantenária; (x) tem uma fita senso que compreende uma ou mais ligações fosforotioato; (xi) 21 nucleotídeos da fita senso hibridizam com os 21 nucleotídeos complementares da fita antissenso; ou (xii) forma 21 pares de bases de nucleotídeos e uma saliência de duas bases na extremidade 3' da fita antissenso.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o dsRNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o dsRNA inibe a expressão de um gene ALAS1.
9. Método de inibição da expressão de ALAS1 em uma célula, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) introdução na célula do dsRNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 8, e (b) manutenção da célula da etapa (a) durante um tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA de um gene ALAS1, inibindo desse modo a expressão do gene ALAS1 na célula, opcionalmente em que a expressão de ALAS1 é inibida por pelo menos 20 % ou pelo menos 30 %, opcionalmente sendo que a expressão de ALAS1 em uma célula de fígado é inibida em pelo menos 80% a 10 nM do dsRNA.
10. Método para diminuir um nível de uma porfirina ou de um precursor de porfirina (por exemplo, ALA ou PBG) em uma célula (por exemplo, um hepatócito), caracterizado pelo fato de que compreende contatar a célula com o dsRNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em uma quantidade eficaz para diminuir o nível da porfirina ou do precursor de porfirina na célula.
11. Uso de um dsRNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratar uma porfiria em um indivíduo.
12. Método para avaliar o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: detectar (por exemplo, medir) o nível de mRNA de ALAS1 em uma amostra de fluido biológico (por exemplo, uma amostra de sangue, uma amostra de plasma, uma amostra de soro, ou uma amostra de urina) do indivíduo, em que a referida amostra de fluido biológico compreende o mRNA de ALAS1, desse modo avaliando o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo, opcionalmente, em que o método compreende (i) fornecer RNA (por exemplo, RNA extracelular) de uma amostra de fluido biológico (por exemplo, uma amostra de sangue, uma amostra de plasma, uma amostra de soro, ou amostra de urina) do indivíduo, em que a referida amostra de fluido biológico compreende o mRNA de ALAS1; (ii) obter um cDNA de ALAS1 a partir do mRNA de ALAS1; (iii) contatar o cDNA de ALAS1 com ácido nucleico complementar (por exemplo, sonda e/ou iniciador) ao cDNA de ALAS1 ou uma porção do mesmo, desse modo produzindo uma mistura reacional; e (iv) detectar (por exemplo, medir) o nível de cDNA de ALAS1 na mistura reacional, em que o nível de cDNA de ALAS1 é indicativo do nível de mRNA de ALAS1, desse modo avaliando o nível de mRNA de ALAS1 extracelular em circulação no indivíduo, opcionalmente em que (a) o método compreende PCR, qPCR ou 5’-RACE, (b) o ácido nucleico é uma sonda ou iniciador, e/ou (c) o ácido nucleico compreende uma fração detectável e o nível de mRNA de ALAS1 é determinado por detecção da quantidade da fração detectável.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda adquirir a amostra de fluido biológico de um indivíduo, opcionalmente em que a amostra de fluido biológico é separada do tecido, e em que a amostra de fluido biológico contém exossomos.
14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o dsRNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e água para injeção.
15. Uso de uma composição, como definida na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento de porfiria (por exemplo, AIP) ou um nível elevado de ALA e/ou PBG em um indivíduo, sendo que a composição é administrada subcutaneamente.
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