EA036477B1 - Композиции и способы ингибирования экспрессии гена alas1 - Google Patents

Композиции и способы ингибирования экспрессии гена alas1 Download PDF

Info

Publication number
EA036477B1
EA036477B1 EA201690685A EA201690685A EA036477B1 EA 036477 B1 EA036477 B1 EA 036477B1 EA 201690685 A EA201690685 A EA 201690685A EA 201690685 A EA201690685 A EA 201690685A EA 036477 B1 EA036477 B1 EA 036477B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
dsrna
alas1
porphyria
sequence
antisense
Prior art date
Application number
EA201690685A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201690685A1 (ru
Inventor
Брайан Беттенкорт
Кевин Фитцжеральд
Уилльям Куэрбс
Роберт Дж. Десник
Макико Ясуда
Original Assignee
Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Икан Скул Оф Медсин Эт Маунт Синай
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Элнилэм Фармасьютикалз, Инк., Икан Скул Оф Медсин Эт Маунт Синай filed Critical Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201690685A1 publication Critical patent/EA201690685A1/ru
Publication of EA036477B1 publication Critical patent/EA036477B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01037—5-Aminolevulinate synthase (2.3.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pathology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к композициям на основе двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), нацеленной на ген ALAS1, и способам применения таких композиций на основе dsRNA для изменения (например, ингибирования) экспрессии ALAS1.

Description

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 61/887288, поданной 4 октября 2013 г., и предварительной заявки на патент США № 61/983720, поданной 24 апреля 2014
г. Полное содержание каждой из упомянутых выше заявок, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка включает перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате с кодировкой ASCII и, таким образом, включен в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте. Указанная копия файла с кодировкой ASCII, созданная 2 октября 2014 г., имеет название A2038-7202WO_SL.txt, и ее размер составляет 1107486 байт.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к специфическому ингибированию экспрессии гена ALAS 1.
Уровень техники
Врожденные порфирии представляют собой семейство нарушений, возникающих в результате недостаточной активности определенных ферментов в рамках пути биосинтеза гема, также называемым в данном документе порфириновым путем. Недостаточность ферментов порфиринового пути приводит к неполному образованию гема и к накоплению предшественников порфиринов и порфиринов, которые в высоких концентрациях токсичны для ткани.
Из ряда врожденных порфирии, острая перемежающаяся порфирия (AIP, например, аутосомнодоминантная AIP), вариегатная порфирия (VP, например, аутосомно-доминантная VP), наследственная копропорфирия (копропорфирия или НСР, например, аутосомно-доминантная НСР), и порфирия, обусловленная недостаточностью дегидратазы 5'-аминолевулиновой кислоты (также известной как 5аминолевулиновая кислота или ALA) (ADP, например, аутосомно-рецессивная ADP) классифицируются как острые печеночные порфирии и проявляются острыми неврологическими приступами, которые могут быть опасными для жизни. Острые приступы характеризуются симптомами, связанными с вегетативной, периферической и центральной нервной системы, в том числе болью в животе, гипертензией, тахикардией, запором, двигательной слабостью, параличом и судорогами. При ненадлежащем лечении может наступать квадриплегия, нарушение функции дыхания и смерть. Различные факторы, включая лекарственные средства, индуцирующие цитохромы Р450, режим питания и гормональные изменения, могут провоцировать острые приступы вследствие повышения активности синтазы 5' -аминолевулиновой кислоты печени 1 (ALAS1), первого и скорость-лимитирующего фермента пути биосинтеза гема. При острых порфириях, например, AIP, VP, НСР и ADP, недостаточность соответствующего фермента приводит к образованию и накоплению в печени одного или нескольких веществ (например, порфиринов и/или предшественников порфиринов, например, ALA и/или PBG), которые могут быть нейротоксичными и могут приводить к возникновению острых приступов. См., например, Balwani, M and Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
Современная терапия острых неврологических приступов заключается во внутривенном введении гемина (пангематина®, Lundbeck, или нормосанга®, Orphan Europe), который предусматривает экзогенный гем для ингибирования ALAS1 посредством отрицательной обратной связи, и, тем самым, снижает образование ALA и PBG. Гемин используют для лечения во время острого приступа и для предупреждения приступов, особенно у женщин с острыми порфириями, которые испытывают частые приступы при гормональных изменениях во время менструальных циклов. Хотя в целом у пациентов наблюдается хороший ответ на лечение, его эффект является медленным, при этом, как правило, требуется от двух до четырех дней или дольше для приведения концентраций ALA и PBG в моче к нормальным значениям.
Поскольку при внутривенном введении гемин быстро метаболизируется, как правило, требуется от трех до четырех инфузий для эффективного лечения или предупреждения острого приступа. Кроме того, повторяющиеся инфузий могут вызывать перенасыщение железом и флебит, который может нарушать доступ к периферическим венам. Несмотря на то, что ортотопическая трансплантация печени имеет лечебный эффект, эта процедура характеризуется серьезными осложнениями и смертностью, а наличие доноров печени ограничено. Таким образом, требуется альтернативный терапевтический подход, который является более эффективным, быстродействующим и безопасным. Было бы особенно предпочтительным, если бы такое лечение могло осуществляться с помощью подкожного введения, поскольку это исключило бы необходимость в инфузиях и длительной госпитализации.
AIP, также называемая недостаточностью порфобилиногендезаминазы (PBGD), или недостаточностью гидроксиметилбилансинтазы (HMBS), является наиболее распространенной среди острых печеночных порфирий. Распространенность AIP по оценкам составляет 5-10 на 100000, при этом приблизительно у 5-10% пациентов наблюдаются симптомы. AIP представляет собой аутосомно-доминантное нарушение, вызванное мутациями в гене HMBS, что приводит к пониженной, например, составляющей половину от нормы, активности фермента. Ранее мышиную модель AIP, характеризующуюся ~30% активности HMBS дикого типа, получали с помощью гомологичной рекомбинации. Как и у пациентов-людей, у этих мышей повышается активность печеночной ALAS1 и накапливаются большие количества ALA и PBG в плазме и моче при введении порфириногенных лекарственных средств, таких как фенобарбитал. В связи
- 1 036477 с этим, они являются отличной моделью для оценки эффективности новых терапевтических средств для лечения острых печеночных порфирий.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение описывает способы и композиции на основе iRNA для модулирования экспрессии гена ALAS1. Согласно определенным вариантам осуществления уровень экспрессии гена ALAS1 снижают или ингибируют с применением iRNA, специфической по отношению к ALAS1. Такое ингибирование может быть пригодным при лечении нарушений, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирий.
Соответственно, в данном документе описаны композиции и способы, которые влияют на расщепление РНК-транскриптов гена ALAS1, опосредованное индуцируемым РНК комплексом сайленсинга (RISC), например, в клетке или у субъекта (например, у млекопитающего, такого как человек). Также описаны композиции и способы лечения нарушения, связанного с экспрессией гена ALAS1, такого как порфирия, например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (порфирия Досса или ADP), острая перемежающаяся порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия (СЕР), поздняя кожная порфирия (РСТ), наследственная копропорфирия (копропорфирия, или НСР), вариегатная порфирия (VP), эритропоэтическая протопорфирия (ЕРР) или транзиторная эритропорфирия детского возраста. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP), AIP, НСР или VP. Согласно определенным вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию, обусловленную недостаточностью ALAдегидратазы (ADP) или AIP.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP) и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, AIP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Используемое в данном документе выражение iRNA, RNAi, средство на основе iRNA, средство для RNAi, или молекула iRNA относится к средству, которое содержит РНК в том значении, в каком это выражение определено в данном документе, и которое опосредует целевое расщепление РНКтранскрипта, например, через путь с участием индуцируемого РНК комплекса сайленсинга (RISC). Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, влияет на ингибирование экспрессии ALAS1 в клетке или у млекопитающего.
Включенные в композиции iRNA, описанные в данном документе, охватывают dsRNA с нитью РНК (антисмысловой нитью), имеющей участок, например, участок, который составляет 30 нуклеотидов или менее, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, который практически комплементарен по меньшей мере части mRNA-транскрипта гена ALAS1 (например, гена ALAS1 мыши или человека) (также называемого в данном документе iRNA, специфическая по отношению к ALAS1). Альтернативно, или в комбинации, iRNA охватывают dsRNA с нитью РНК (антисмысловой нитью), имеющей участок, который составляет 30 нуклеотидов или менее, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, который практически комплементарен по меньшей мере части mRNA-транскрипта гена ALAS1 (например, варианта 1 или 2 гена ALAS1 человека) (также называемого в данном документе iRNA, специфическая по отношению к ALAS1).
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA), описанная в данном документе, содержит антисмысловую нить с участком, который практически комплементарен участку ALAS1 человека. Согласно вариантам осуществления ALAS1 человека имеет последовательность NM_000688.4 (SEQ ID NO:1) или NM_000688.5 (SEQ ID NO:382). Согласно вариантам осуществления ALAS1 человека имеет последовательность NM_199166.1.
Согласно вариантам осуществления антисмысловая последовательность iRNA (например, dsRNA) нацелена на участок 871-895 (плюс или минус 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотид в каком-либо одном или обоих направлениях относительно 5' и/или 3' конца) транскрипта ALAS I NM_000688.4. Согласно вариантам осуществления антисмысловая последовательность нацелена на нуклеотиды 871-893, 871-892 или 873895 транскрипта ALAS1 NM_000688.4. Согласно вариантам осуществления антисмысловая последовательность содержит последовательность или состоит из последовательности, которая полностью комплементарна или практически комплементарна нуклеотидам 871-893, 871-892 или 873-895 транскрипта ALAS1 NM_000688.4.
Согласно одному аспекту представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем по 3, 2 или 1 нуклеотиду от последова- 2 036477 тельности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит последовательность UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Согласно вариантам осуществления смысловая нить содержит последовательность CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193 в том числе одной или нескольких (например, всех) из модификаций антисмысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489, AD-60519 или AD-61193).
Согласно одному аспекту представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от антисмысловой последовательности, приведенной в любой из табл. 1-40, или немодифицированного варианта антисмысловой последовательности (например, варианте с аналогичной нуклеотидной последовательностью, за исключением того, что некоторые или все из нуклеотидов немодифицированы), приведенной в любой из табл. 21-40. Согласно одному варианту осуществления антисмысловая последовательность содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от (i) антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193 или (ii) немодифицированного варианта любой из этих последовательностей. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Согласно варианту осуществления антисмысловая последовательность нацелена на положения 871-893 NM_000688.4 (SEQ ID NO:1). Согласно вариантам осуществления смысловая нить содержит последовательность CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA не включает смысловую и/или антисмысловую последовательность, приведенную в любой из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20.
Согласно одному варианту осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНКтранскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами, не более чем 2 нуклеотидами или не более чем одним нуклеотидом от антисмысловой последовательности AD-60519. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов модифицированы, как описано выше.
Согласно одному варианту осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНКтранскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от антисмысловой последовательности AD-60489 или производного AD-60489, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов модифицированы, как описано в данном документе, например, один или несколько (или все) нуклеотидов AD-60489 модифицированы, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления производное AD-60489 представляет собой AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD61193, AD-60519, AD-60519 или AD-60901. Согласно вариантам осуществления производное AD-60489 представляет собой AD-60519. Согласно вариантам осуществления производное AD-60489 представляет собой AD-61193.
Согласно одному варианту осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНКтранскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (напри
- 3 036477 мер, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от производного AD-58632, описанного в данном документе. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов модифицированы, как описано в данном документе, например, один или несколько (или все) нуклеотидов AD-58632 модифицированы, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления производное AD-58632 представляет собой AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD60925, и AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, или AD-60419. Согласно вариантам осуществления производное AD-58632 представляет собой AD-60819.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 1 нМ. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50 B диапазоне 0,01-1 нМ. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 0,05 нМ. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением ICso> составляющим менее 0,02 нМ. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 0,01 нМ. Согласно вариантам осуществления IC50 определяют, как описано в данном документе в примерах.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется разовой дозой ED50 менее чем приблизительно 10 мг/кг. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется разовой дозой ED50 менее чем приблизительно 5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления ЕС50 опре деляют, как описано в данном документе в примерах.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-60489. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632 и AD-60489.
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, или AD60419 (например, включающую нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций упомянутых выше dsRNA). Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций)), выбранной из AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191,
AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD61145, AD-61146, AD-60892, или AD-60419. Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций)), выбранной из AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD61146, AD-60892, или AD-60419.
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154), и/или (ii) смысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе.
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60519 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну
- 4 036477 или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60519).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-61193 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-61193).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60819, и/или (ii) смысловую последовательность, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60819 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60819).
Согласно вариантам осуществления представлена dsRNA для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности), и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности). Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, и/или (ii) смысловую нить, которая состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD61193 или AD-60819, за исключением того, что антисмысловая нить и/или смысловая нить dsRNA отличается 1, 2 или 3 нуклеотидами от соответствующей антисмысловой и/или смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819.
Последовательности и модификации AD-60489, AD-60519, AD-61193 и AD-60819 показаны ниже в табл. 44.
Таблица 44. Последовательности и модификации AD-60489, AD-60519, AD-61193, AD-60819
Целевые сайты антисмыс левой последов ательност и NM_0006 SS.4 Назван ие дуплек са Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') Соответствующая немодифицированна я смысловая последовательность Соответствующая немодифицированна я антисмысловая последовательность
871-893 AD60489 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuC faUfcUfuAfL96 (SEQ ID NO: 4156) u s Afs a G f a U f gAfg Af са c U f cU f u UfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4157) CAGAAAGAGUGUCUC AUCUUAfSEQID NO: 4158) UAAGAUGAGACACUC UUUCUGGU (SEQID NO: 4159)
871-893 AD60519 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfauc uuaL96 (SEQ ID NO: 4160) u s Afs Af G f a U f g Af gAf c Af c U f cU f uUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4161) CAGAAAGAGUGUCUC AUCUUAfSEQID NO: 4162) UAAGAUGAGACACUC UUUCUGGU (SEQID NO: 4163)
871-893 AD61193 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfauc uuaL96 (SEQ ID NO: 4164) u s Afs a G f a U f gAfg Af са c U f cdTu UfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4165) CAGAAAGAGUGUCUC AUCUUAfSEQID NO: 4166) UAAGAUGAGACACUC TUUCUGGU (SEQID NO: 4167)
873-895 AD60819 GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuCfuuL96 (SEQ ID NO: 4168) asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucu uucsusg (SEQ ID NO: 4169) GAAAGAGUGUCUCAU CUUCUU (SEQ ID NO: 4170) AAGAAGAUGAGACAC UCUUUCUG (SEQID NO: 4171)
где с, a, g, u = 2'-OMe рибонуклеозиды; Af, Cf, G, Uf = 2'F рибонуклеозиды; S = фосфотиоат; L96 имеет структуру, обозначенную в табл. 1.
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD60519 или AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193 (в том числе нуклеотидной последовательности и одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489, AD-60519 или AD-61193).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA)
- 5 036477 для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA представляет собой AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819. Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA представляет собой AD-60489, AD-60519 или AD-61193 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60489, AD-60519 или AD-61193).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60489, содержит AD-60489 или состоит из AD-60489 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60489).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60519, содержит AD-60519 или состоит из AD-60519 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60519).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-61193, содержит AD-61193 или состоит из AD-61193 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-61193).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60819, содержит AD-60819 или состоит из AD-60819 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60819).
Согласно вариантам осуществления dsRNA (например, AD-60489, AD-60519, AD-61193, AD-60819 или другая dsRNA, раскрытая в данном документе в любой из табл. 21-40) является эффективной для подавления уровня mRNA ALAS 1 в печени, например, для достижения сайленсинга по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% (например, так, чтобы уровни mRNA ALAS1 снижены до 90% или менее, 80% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее или 20% или менее относительно контрольного уровня mRNA ALAS1 в печени, например, уровня у индивида, не получавшего лечение, или группы индивидов, например, индивида или группы индивидов, получавших лечение только PBS). Согласно вариантам осуществления эффективность dsRNA в отношении подавления уровня mRNA ALAS1 в печени оценивают с применением модели на низших приматах, например, описанной в данном документе в примерах.
Согласно вариантам осуществления dsRNA (например, AD-60489, AD-60519, AD-61193, AD-60819 или другая dsRNA, раскрытая в данном документе в любой из табл. 21-40) является эффективной для подавления уровня циркулирующей mRNA ALAS1, например, для достижения сайленсинга по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% (например, так, чтобы уровни mRNA ALAS1 снизились до 90% или менее, 80% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее или 20% или менее относительно контрольного уровня циркулирующей mRNA ALAS1, например, уровня, который наблюдался до лечения dsRNA или уровня у не получавшего лечения индивида или группы индивидов). Согласно вариантам осуществления эффективность dsRNA в отношении подавления уровня циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением модели на низших приматах, например, описанной в данном документе в примерах. Согласно вариантам осуществления уровень циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением анализа по выявлению циркулирующей внеклеточной РНК (cERD), например, как описано в данном документе или в Sehgal A. et al. Quantitation of tissuespecific target gene modulation using circulating RNA (постер, представленный 9 февраля 2012 г. на симпозиуме Keystone Gene Silencing by small RNAs (Ванкувер, 7-12 февраля, 2012 г.) или Sehgal A. et al. Tissuespecific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, опубликованном в Интернете 19 декабря 2013 г.
Способ cERD можно применять относительно любого соответствующего биологического образца. Согласно вариантам осуществления уровень циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением образца крови, например, образца сыворотки. Согласно вариантам осуществления уровень циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением образца мочи.
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой производное AD-60489, раскрытой в данном документе, например, в любой из табл. в данном документе. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-60489. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60519.
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой производное AD-58632, раскрытой в данном документе, например, в любой из табл. в данном документе. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632.
Согласно вариантам осуществления на повышенную активность указывает более низкое значение IC50, например, как определено на основании анализов in vitro, например, описанных в данном документе, например, в примерах.
Согласно вариантам осуществления на повышенную активность указывает более низкая эффективная доза. Эффективную дозу можно определить на основе введения разовой дозы или нескольких повторяющихся доз. Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе разовой дозы ED50. Согласно вариантам осуществления эффективную дозу или разовую дозу ED50 определяют на основе in vivo анализа. Согласно вариантам осуществления in vivo анализ проводят для низшего жи- 6 036477 вотного, например, для крысы, для низшего примата или для мыши.
Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе дозы, необходимой для получения снижения уровня mRNA ALAS 1 (например, уровня mRNA ALAS 1 в печени и/или уровня циркулирующей mRNA ALAS1), например, как описано в данном документе в примерах. Согласно вариантам осуществления циркулирующую mRNA оценивают с применением анализа cERD.
Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе дозы, требуемой для получения снижения уровня (например, уровня в моче и/или плазме) ALA и/или PBG.
Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе дозы, требуемой для получения конкретного лечебного эффекта, описанного в данном документе, например, предупреждения или облегчения симптомов, связанных с порфирией.
Согласно вариантам осуществления на повышенную активность указывает достижение более высокого уровня dsRNA в печени. Согласно вариантам осуществления более высокий уровень в печени получают после разовой дозы dsRNA (например, дозы по 1, 2,5, 3, 5 или 10 мг/кг). Согласно вариантам осуществления более высокий уровень в печени получают после введения нескольких доз dsRNA (например, 2-10 ежедневных или еженедельных доз по 1, 2,5, 3, 5 или 10 мг/кг).
Согласно одному варианту осуществления iRNA охватывает dsRNA с нитью РНК (антисмысловой нитью), имеющей участок, который практически комплементарен части mRNA ALAS1, например, mRNA ALAS1 человека (например, mRNA ALAS1 человека, представленной под SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO: 382).
Согласно одному варианту осуществления iRNA для ингибирования экспрессии гена ALAS1 включает по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. iRNA включает смысловую нить с первой последовательностью и антисмысловую нить со второй последовательностью. Антисмысловая нить включает нуклеотидную последовательность, которая практически комплементарна по меньшей мере части mRNA, кодирующей транскрипт ALAS1, и при этом участок комплементарности составляет 30 нуклеотидов или менее, и по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину. Как правило, iRNA составляет 19-24 нуклеотида в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 19-21 нуклеотид в длину. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 19-21 нуклеотид в длину и находится в липидном составе, например, составе на основе липидных наночастиц (LNP) (например, составе LNP11).
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 21-23 нуклеотида в длину. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 21-23 нуклеотида в длину и находится в форме конъюгата, например, конъюгата с одним или несколькими производными GalNAc, описанными в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет от приблизительно 15 до приблизительно 25 нуклеотидов в длину, и согласно другим вариантам осуществления iRNA составляет от приблизительно 25 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину. iRNA, нацеленная на ALAS1, при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35% или по меньшей мере на 40% или более, например, при анализе с помощью способа, описанного в данном документе. Согласно одному варианту осуществления iRNA, нацеленная на ALAS1, составлена как компонент стабильной частицы нуклеиновая кислота-липид (SNALP).
Согласно одному варианту осуществления iRNA (например, dsRNA), описанная в данном документе, включает первую последовательность dsRNA, которую выбирают из группы, состоящей из смысловых последовательностей из табл. 21-40, и вторую последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей из табл. 21-40.
Молекулы iRNA, описанные в данном документе, могут включать встречающиеся в природе нуклеотиды или могут включать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. Согласно вариантам осуществления по меньшей мере один модифицированный нуклеотид включает одну или несколько из модификаций нуклеотида, выбранных из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), ациклического нуклеотида, гекситной или гексозной нуклеиновой кислоты (HNA), циклогексеновой нуклеиновой кислоты (CeNA), 2'-метоксиэтила, 2'-О-алкила, 2'-О-аллила, 2'-С-аллила, 2'-фтора, 2'дезокси, 2'-гидроксила или любой их комбинации. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один модифицированный нуклеотид включает без ограничения 2'-О-метилодифицированный нуклеотид, 2'-фтормодифицированный нуклеотид, нуклеотид с 5'-фосфотиоатной группой, и концевой нуклеотид, связанный с лигандом, например, N-ацетилгалактозамином (GalNAc) или производным холестерила. Альтернативно, модифицированный нуклеотид можно выбрать из группы: 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, запертого нуклеотида, ациклического нуклеотида, нуклеотида с удаленными основаниями, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего не встречающиеся в природе основания. Такая модифицированная последовательность может быть основана, например, на первой последовательности упомянутой iRNA, выбранной из группы, состоящей из смысловых последовательностей, раскрытых в табл. 21-40, и второй последова- 7 036477 тельности, выбранной из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей, раскрытых в табл.1-40.
Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, нацелена на вариант РНК-транскрипта ALAS1 дикого типа, и согласно другому варианту осуществления iRNA нацелена на мутантный транскрипт (например, РНК ALAS1, несущей аллельный вариант). Например, iRNA, описанная в настоящем изобретении, может быть нацелена на полиморфный вариант, такой как однонуклеотидный полиморфизм (SNP) ALAS1. Согласно другому варианту осуществления iRNA нацелена на транскрипт ALAS 1 как дикого, так и мутантного типа. Согласно еще одному варианту осуществления iRNA нацелена на конкретный вариант транскрипта ALAS1 (например, вариант 1 ALAS1 человека). Согласно еще одному варианту осуществления средство на основе iRNA нацелено на несколько вариантов транскриптов (например, как вариант 1, так и вариант 2 ALAS1 человека).
Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном изобретении, нацелена на некодирующий участок РНК-транскрипта ALAS1, такой как 5' или 3' нетранслируемый участок транскрипта.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA, описанная в данном документе, находится в форме конъюгата, например, углеводного конъюгата, который может выполнять роль целевого фрагмента и/или лиганда, описанного в данном документе. Согласно одному варианту осуществления конъюгат присоединен к 3'-концу смысловой нити dsRNA. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат присоединен с помощью линкера, например, с помощью двухвалентного или трехвалентного раз ветвленного линкера.
Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат содержит одну или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Такой конъюгат также называется в данном документе конъюгат GalNAc. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат нацеливает средство для RNAi на конкретную клетку, например клетку печени, например гепатоцит. Производные GalNAc могут быть присоединены с помощью линкера, например, двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. Согласно конкретным вариантам осуществления конъюгат представляет собой
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi присоединено к углеводному конъюгату с помощью линкера, например линкера, как показано в следующей схеме, где X представляет собой О или S
Согласно некоторым вариантам осуществления X представляет собой О. Согласно некоторым вариантам осуществления X представляет собой S.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi конъюгировано с L96, как определено в табл. 1 и показано ниже.
Согласно одному варианту осуществления dsRNA характеризуется одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью, десятью, одиннадцатью, двенадцатью, тринадцатью, четырнадцатью, пятнадцатью, шестнадцатью или всем из следующего:
(i) синтезирована химическим путем, например синтезирована с помощью твердофазного синтеза олигонуклеотидов;
- 8 036477 (ii) все нуклеотиды в dsRNA модифицированы, например все нуклеотиды являются 2'-ОМе или 2'F-модифицированными, или представляют собой комбинацию из 2'-ОМе и 2'-Е-модифицированных;
(iii) все нуклеотиды связаны 3'-5' фосфодиэфирными связями;
(iv) смысловая нить содержит 21 нуклеотид или состоит из 21 нуклеотида;
(v) антисмысловая нить содержит 23 нуклеотида или состоит из 23 нуклеотидов;
(vi) имеет тупой конец на 3'-конце смысловой нити;
(vii) имеет 3'-выступающий конец, например имеет выступающий конец из двух нуклеотидов на 3'конце антисмысловой нити;
(viii) присоединена ковалентными связями к лиганду, содержащему три фрагмента Nацетилгалактозамина (GalNAc);
(ix) 3'-конец смысловой нити конъюгирован с фрагментом GalNAc с тремя разветвлениями (например, называемым в данном документе L96, как определено в табл.1). Согласно одному варианту осуществления 3'-конец присоединен к фрагменту GalNAc с тремя разветвлениями при помощи фосфодиэфирной связи;
(х) имеет антисмысловую нить, которая содержит одну или несколько (например, четыре) фосфотиоатных связей. Согласно одному варианту осуществления фосфотиоатные связи расположены на 3' конце и на 5' конце антисмысловой нити. Согласно одному варианту осуществления две фосфотиоатные связи расположены на 3' конце и две фосфотиоатные связи расположены на 5' конце антисмысловой нити;
(xi) имеет смысловую нить, которая содержит одну или несколько (например, две) фосфотиоатных связей. Согласно одному варианту осуществления одна или несколько (например, две) фосфотиоатных связей расположены на 5' конце смысловой нити;
(xii) 21 нуклеотид смысловой нити гибридизируется с комплементарным 21 нуклеотидом антисмысловой нити;
(xiii) образует 21 пару нуклеотидных оснований и выступающий конец из двух оснований на 3'конце антисмысловой нити;
(xiv) содержит смысловую или антисмысловую нить или состоит из смысловой или антисмысловой нити с последовательностью AD-60519;
(xv) имеет смысловую нить с 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20 или всеми из модификаций смысловой нити AD-60519;
(xvi) имеет антисмысловую нить с 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20 или всеми из модификаций антисмысловой нити AD-60519; или (xvii) имеет последовательность дуплекса и все модификации AD-60519.
Согласно вариантам осуществления dsRNA находится в форме конъюгата следующей структуры (также называемой в данном документе AD-60519 или ALN-60519) (SEQ ID NOS 5238-5239 соответственно, по порядку):
Na
S’ S’ 0' О О' 0' С О С О’ 0 0’ 0’ 0 0 0 0 0 0 0' 0' СМцитьВЯЯ 7 НС Р Р Р ? Р . Р F ? Р = Р Р Р I F Р Р Р ' ? Н L963 о А о ό с о о ό АI о о с и ।6 с h о ό 6 с о
Cm Am Cm Am Am Am Gf Am Gf Um Gf Um Cf Um Cf Am Um Cm Um Um Am
Um Gm Gm Ui Cm Ui Um Uf Cm Uf Cm Af Cm Af Gm Af Gm Uf Am Gf Af Af Um
Антисмысловая у 0 $ θ : θ $ θ 6 б О О О О ООО 0 0:0 Ο , 0 нить j· НО 1 Ρ Μ ? ? ί Ρ ? I Μ Ρ ’ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ' Ρ Ρ Ρ ' Ρ иь У
S S о о о о о о о о о о ό О О О О О О О S' $·
Na”
AIN-60519
Af, Cf, Gf, Uf = 2’-F рибонуклеозиды
Am, Cm, Gm, Um = 2’-OMe рибонуклеозиды
S = фосфотиоат
Согласно одному аспекту в данном документе представлена композиция, например фармацевтическая композиция, которая включает одну или несколько из iRNA, описанных в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или средство доставки. Согласно одному варианту осуществления композиция применяется для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в организме, как правило, у человека. Согласно одному варианту осуществления композиция применяется для лечения порфирии, например AIP.
- 9 036477
Согласно одному аспекту iRNA, представленная в данном документе, представляет собой двунитевую рибонуклеиновую кислоту (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить из 15-30 пар оснований в длину, и антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам под SEQ ID NO: 1 или 382.
Согласно дополнительному аспекту iRNA, представленная в данном документе, представляет собой двунитевую RNAi (dsRNA), содержащую смысловую нить, комплементарную антисмысловой нити, где упомянутая антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, где каждая нить имеет от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где упомянутое средство для двунитевой RNAi представлено формулой (III):
смысловая:
антисмысловая:
3' np'-Na'-iX'X'X'^-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-iZ'Z'Z'X-Na'- nq' 5' (III) где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;
каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными, либо их комбинациями, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два неодинаково модифицированных нуклеотида;
каждый Nb и Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными, либо их комбинациями;
каждый np, np', nq и nq' независимо представляет собой выступающий нуклеотид;
каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов;
модификации Nb отличаются от модификации Y, а модификации Nb' отличаются от модификации Y'.
Согласно вариантам осуществления смысловая нить конъюгирована по меньшей мере с одним лигандом.
Согласно вариантам осуществления i равняется 1;
j равняется 1, или как i, так и j равняются l.
Согласно вариантам осуществления k равняется 1; l равняется 1, или как k, так и l равняются l.
Согласно вариантам осуществления XXX комплементарен X'X'X', YYY комплементарен Y'Y'Y', a ZZZ комплементарен Z'Z'Z'.
Согласно вариантам осуществления мотив Y'Y'Y' находится в 11, 12 и 13 положениях антисмысловой нити от 5'-конца.
Согласно вариантам осуществления Y' представляет собой 2'-О-метил.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 15-30 пар нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 17-23 пары нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 19-21 пары нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 21-23 пары нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления модификация нуклеотида выбрана из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), ациклического нуклеотида, гекситной или гексозной нуклеиновой кислоты (HNA), циклогексеновой нуклеиновой кислоты (CeNA), 2'-метоксиэтил, 2'-О-алкил, 2'-О-аллил, 2'-С-аллил, 2'-фтор, 2'-дезокси, 2'-гидроксил и любой их комбинации.
Согласно вариантам осуществления модификации нуклеотидов выбраны из группы, состоящей из LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтила, 2'-О-алкила, 2'-О-аллила, 2'-С-аллила, 2'-фтора, 2'-дезокси, 2'гидроксила и их комбинаций.
Согласно вариантам осуществления модификациями нуклеотидов являются 2'-О-метил-, 2'-фтор или обе.
Согласно вариантам осуществления лиганд содержит углевод.
Согласно вариантам осуществления лиганд присоединен с помощью линкера.
Согласно вариантам осуществления линкер является двухвалентным или трехвалентным разветвленным линкером.
- 10 036477
Согласно вариантам осуществления лиганд представляет собой
Согласно вариантам осуществления лиганд и линкер показаны в формуле XXIV
Согласно вариантам осуществления лиганд присоединен к 3'-концу смысловой нити.
Согласно вариантам осуществления dsRNA состоит из нуклеотидной последовательности или содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в табл. 21-40.
Согласно дополнительному аспекту представленная в данном документе iRNA представляет собой двунитевую рибонуклеиновую кислоту (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS 1, эта антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из табл. 21-40. Согласно вариантам осуществления нуклеотиды антисмысловой нити имеют меньше модификаций, больше модификаций или другие модификации относительно антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из табл.21-40.
Согласно вариантам осуществления смысловые и антисмысловые последовательности являются последовательностями дуплекса, раскрытого в данном документе, который подавляет экспрессию mRNA ALAS1 по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 85 или 90%, например, при оценке с применением анализа, раскрытого в примерах, представленных в данном документе.
Согласно вариантам осуществления экспрессию mRNA ALAS1 оценивают исходя из уровня mRNA ALAS1 в печени, например, при оценке с применением образца для биопсии печени. Согласно вариантам осуществления экспрессию mRNA ALAS1 оценивают исходя из уровня mRNA ALAS1 в биологической жидкости, например, крови, сыворотке, плазме, спинномозговой жидкости или моче. Согласно вариантам осуществления уровень экспрессии mRNA ALAS1 оценивают с применением анализа по выявлению внеклеточной РНК в кровотоке (cERD), например, анализа cERD, описанного в данном документе или в Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (постер, представленный 9 февраля 2012 г. на симпозиуме Keystone Gene Silencing by small RNAs (Ванкувер, 7-12 февраля, 2012 г.) или Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, опубликованном в Интернете 19 декабря 2013 г.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из 2'-О-метил-модифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-фосфотиоатную группу, и концевого нуклеотида, присоединенного к группе производного холестерила или бисдециламида додекановой кислоты.
Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, запертого нуклеотида, ациклического нуклеотида, нуклеотида с удаленными основаниями, 2'аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего не встречающиеся в природе основания.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности составляет по меньшей мере 17 нуклеотидов в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности составляет 19-21 нуклеотид в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности составляет 19 нуклеотидов в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления каждая нить составляет не более 30 нуклеотидов в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна нить содержит 3'выступающий конец по меньшей мере из 1 нуклеотида. Согласно вариантам осуществления антисмысло- 11 036477 вая нить содержит З'-выступающий конец по меньшей мере из 1 нуклеотида.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна нить содержит 3'выступающий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит 3'-выступающий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит 3'-выступающий конец из 2 нуклеотидов.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA, описанная в данном документе, дополнительно содержит лиганд.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд представляет собой лиганд GalNAc.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд нацеливает dsRNA в гепатоциты.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой нити dsRNA.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из антисмысловых последовательностей, приведенных в табл.2140, или соответствующей антисмысловой последовательности, в которой некоторые или все из нуклеотидов немодифицированы. Согласно вариантам осуществления участок комплементарности состоит из последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности дуплекса AD-60489. Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности дуплекса AD-60519.
Согласно вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из дуплекса, раскрытого в данном документе, который подавляет экспрессию mRNA ALAS1 по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 85 или 90%, например, как определено с помощью анализа, раскрытого в примерах, представленных в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA содержит смысловую нить, состоящую из последовательности смысловой нити, выбранной из табл. 21-40, и антисмысловой нити, состоящей из антисмысловой последовательности, выбранной из табл. 21-40. Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит пару соответствующих смысловой и антисмысловой последовательностей, выбранных из таковых дуплексов, раскрытых в табл. 21-40.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение представляет клетку, содержащую по меньшей мере одну из iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе. Клетка, как правило, представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку. Согласно другим вариантам осуществления клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит).
Согласно одному аспекту в данном документе представлена фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, при этом композиция содержит iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, iRNA (например, dsRNA) вводят в составе безбуферного раствора.
Согласно вариантам осуществления безбуферным раствором является солевой раствор или вода, например вода для инъекций.
Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит AD-60519 и воду для инъекций. Согласно вариантам осуществления композиция содержит приблизительно 100-300 мг/мл, например 200 мг/мл AD-60519. Согласно вариантам осуществления композиции характеризуются рН 6,07,5, например приблизительно 7,0. Согласно вариантам осуществления композиция предназначена для подкожной инъекции. Согласно вариантам осуществления фармацевтическую композицию фасуют в упаковку (например, стеклянный флакон, например, 2 мл стеклянный флакон) объемом приблизительно 0,3-1 мл, например 0,55 мл. Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция представляет собой ALN-AS1, описанную в данном документе в примерах.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, iRNA (например, dsRNA) вводят с буферным раствором. Согласно вариантам осуществления буферный раствор содержит ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. Согласно вариантам осуществления буферный раствор представляет собой забуференный фосфатом солевой раствор (PBS).
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, iRNA (например, dsRNA) нацелена на гепатоциты.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, композицию вводят внутривенно.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, композицию вводят подкожно.
Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе, которая содержат лиганд (например, лиганд, представляющий
- 12 036477 собой GalNAc), который нацеливает iRNA (например, dsRNA) в гепатоциты.
Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе, которая содержат лиганд (например, лиганд, представляющий собой GalNAc), и при этом фармацевтическую композицию вводят подкожно. Согласно вариантам осуществления лиганд нацеливает iRNA (например, dsRNA) в гепатоциты.
Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтическая композиция, например композиция, описанная в данном документе, включает липидный состав. Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi представляет собой состав LNP, например состав МС3. Согласно некоторым вариантам осуществления состав LNP нацеливает средство для RNAi в конкретную клетку, например, клетку печени, например, гепатоцит. Согласно вариантам осуществления липидный состав представляет собой состав LNP11. Согласно вариантам осуществления композицию вводят внутривенно.
Согласно другому варианту осуществления фармацевтическая композиция составлена для введения согласно схеме дозирования, описанной в данном документе, например, не более одного раза каждые четыре недели, не более одного раза каждые три недели, не более одного раза каждые две недели или не более одного раза каждую неделю. Согласно другому варианту осуществления введение фармацевтической композиции может продолжаться в течение месяца или дольше, например, одного, двух, трех или шести месяцев, или одного года или дольше.
Согласно другому варианту осуществления композицию, содержащую iRNA, описанную в настоящем изобретении, например dsRNA, нацеленную на ALAS1, вводят с терапевтическим средством без iRNA, как например, средством, известным для лечения порфирии (например, AIP) или симптома порфирии (например, болевых ощущений). Согласно другому варианту осуществления композицию, содержащую iRNA, описанную в настоящем изобретении, например, dsRNA, нацеленную на AIP, вводят в сочетании со схемой лечения для средства без iRNA, такого как гемин или глюкоза (например, инфузия глюкозы (например, IV глюкозы)). Например, iRNA, описанную в настоящем изобретении, можно вводить до, после или одновременно с глюкозой, декстрозой или подобным лечением, которое помогает восстановить энергетический баланс (например, полное парентеральное питание). iRNA, описанную в настоящем изобретении, можно также вводить до, после или одновременно с введением препарата на основе гема (например, гемина, аргината гема или гемальбумина), а также необязательно в комбинации с глюкозой (например, IV глюкозой) или т.п.
Как правило, глюкозу, вводимую для лечения порфирии, вводят внутривенно (IV). Внутривенное введение глюкозы называют в данном документе IV глюкозой. Однако, также охвачены альтернативные варианты осуществления, согласно которым глюкозу вводят другими способами.
Согласно одному варианту осуществления iRNA ALAS 1 вводят пациенту, а затем пациенту назначают схему введения средства или лечебного средства, не содержащего iRNA (например, глюкозы и/или препарата на основе гема) (или наоборот). Согласно другому варианту осуществления iRNA ALAS1 и терапевтическое средство без iRNA или схему лечения назначают в одно и то же время.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, при этом способ включает:
(а) введение в клетку iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе, и (b) поддержание клетки, полученной на стадии (а), в течение времени, достаточного для обеспечения разрушения mRNAтранскрипта гена ALAS1, вследствие чего происходит ингибирование экспрессии гена ALAS1 в клетке.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ снижения или ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке (например, эритроидной клетке или клетке печени, такой как, например, гепатоцит).
Способ включает:
(а) введение в клетку двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), где dsRNA включает по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. dsRNA содержит смысловую нить с первой последовательностью и антисмысловую нить со второй последовательностью; антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который практически комплементарен по меньшей мере части mRNA, кодирующей ALAS1, и при этом участок комплементарности составляет 30 нуклеотидов или менее, например 15-30 нуклеотидов в длину, и, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, и где dsRNA при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1 по меньшей мере на 10%, например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или более; и (b) поддержание клетки, полученной на стадии (а), в течение времени, достаточного для обеспечения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS1, вследствие чего происходит снижение или ингибирование экспрессии гена ALAS1 в клетке.
Согласно вариантам осуществления изложенных выше способов ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo. Согласно вариантам осуществления клетка представляет собой гепатоцит.
Согласно вариантам осуществления клетка принадлежит субъекту, нуждающемуся в лечении, предупреждении и/или контроле нарушения, связанного с экспрессией ALAS 1.
- 13 036477
Согласно вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой острую перемежающуюся порфирию или порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленная недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, AIP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно вариантам осуществления экспрессию ALAS1 ингибируют по меньшей мере на 30%.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) характеризуется значением IC50 B диапазоне 0,01-1 нМ.
Согласно определенным вариантам осуществления клетка (например, гепатоцит) представляет собой клетку млекопитающего (например, клетку человека, низшего примата или грызуна).
Согласно одному варианту осуществления клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка принадлежит субъекту (например, пациенту, нуждающемуся в лечении, предупреждении и/или контроле нарушения, связанного с экспрессией ALAS1)).
Согласно одному варианту осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека) с риском возникновения порфирии, или диагностированной порфирией, например, Хсцепленной сидеробластической анемией (XLSA), порфирией, обусловленной недостаточностью дегидратазы ALA (ADP или порфирией Досса), острой перемежающейся порфирией (AIP), врожденной эритропоэтической порфирией (СЕР), поздней кожной порфирией (РСТ), наследственной копропорфирией (копропорфирией, или НСР), вариегатной порфирией (VP), эритропоэтической протопорфирией (ЕРР) или транзиторной эритропорфирией детского возраста. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), AIP, НСР или VP. Согласно конкретным вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP) или AIP.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленная недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, AIP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно одному варианту осуществления введенная dsRNA снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 в клетке.
Согласно одному варианту осуществления введенная dsRNA снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 или уровень одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, 8-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфобилиногена (PBG), гидроксиметилбилана (НМВ), уропорфириногена I или III, копропорфириногена I или III, протопорфириногена IX и протопорфирина IX) или продуктов или метаболитов порфирина по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50% или более относительно эталонного образца (например, необработанной клетки или клетки, обработанной нецелевой контрольной dsRNA). Без привязки к конкретной теории, ALAS1 является первым ферментом в рамках порфиринового пути. Таким образом, снижение экспрессии гена ALAS1, по-видимому, снижает уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов.
Согласно другим аспектам в настоящем изобретении представлены способы лечения, предупреждения или контроля патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1 (например, патологических процессов, в которые вовлечены порфирины, предшественники порфиринов, или нарушения в рамках порфиринового пути, как например, порфирии). Согласно одному варианту осуществления способ включает введение субъекту, например, пациенту, нуждающемуся в таком лечении, предупреждении или контроле, эффективного (например, терапевтически или профилактически эффективного) количества одного или нескольких из iRNA, описанных в данном документе.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения и/или предупреждения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе, или композиции, содержащей iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения и/или предупреждения порфирии, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить из 15- 14 036477 пар оснований в длину, и при этом антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам под SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO: 382.
Согласно одному варианту осуществления субъект (например, пациент) страдает порфирией. Согласно другому варианту осуществления субъект (например, пациент) подвержен риску развития порфирии. Согласно некоторым вариантам осуществления введение iRNA, нацеленной на ALAS1, ослабляет или облегчает у пациента тяжесть по меньшей мере одного симптома нарушения, связанного с ALAS 1.
Согласно одному варианту осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека) с риском возникновения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, или диагностированным нарушением, связанным с экспрессией ALAS1, например порфирией, например, Х-сцепленной сидеробластической анемией (XLSA), порфирией, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (порфирией Досса), острой перемежающейся порфирией (AIP), врожденной эритропоэтической порфирией (СЕР), поздней кожной порфирией (РСТ), наследственной копропорфирией (копропорфирией, или НСР), вариегатной порфирией (VP), эритропоэтической протопорфирией (ЕРР) или транзиторной эритропорфирией детского возраста. Согласно дополнительному варианту осуществления порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), AIP, НСР или VP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP) или AIP.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленной недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, AIP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно вариантам осуществления порфирию, симптом порфирии, продром или приступ порфирии индуцирован воздействием провоцирующего фактора, описанного в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является химическое воздействие. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является лекарственное средство, например, лекарственное средство рецептурного отпуска или отпускаемое без рецепта лекарственное средство. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, лютеиновая фаза.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят после острого приступа порфирии.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят во время острого приступа порфирии.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят профилактически с целью предупреждения острого приступа порфирии.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в виде состава LNP.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) находится в форме конъюгата GalNAc.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) вводят в дозе 0,05-50 мг/кг.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) вводят в концентрации 0,01-5 мг/кг веса тела субъекта.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в виде состава LNP и его вводят в дозе 0,05-5 мг/кг.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в форме конъюгата GalNAc и его вводят в дозе 0,5-50 мг/кг. Согласно определенным вариантам осуществления iRNA в конъюгате GalNAc вводят в дозе менее 10 мг/кг (например, 5 мг/кг или менее), например, один раз в неделю; например, в дозе 1 мг/кг или менее, 2,5 мг/кг или менее, или 5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю. Согласно одному варианту осуществления iRNA в конъюгате GalNAc вводят в дозе приблизительно 2,5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю. Согласно одному варианту осуществления введение iRNA в конъюгате GalNAc представляет собой подкожное введение.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в форме конъюгата GalNAc и его вводят, например, подкожно, в дозе 0-5 мг/кг, например, 0-2,5 мг/кг или 1-2,5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления iRNA вводят еженедельно. Согласно вариантам осуществления iRNA вводят в виде композиции, содержащей iRNA и воду для инъекции. Согласно вариантам осуществления iRNA представляет собой AD-60519. Согласно вариантам осуществления композиция содержит iRNA, например AD-60519, в концентрации приблизительно 200 мг/мл.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа снижают уровень порфирина или предшественника порфирина у субъекта.
- 15 036477
Согласно вариантам осуществления уровень снижают по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, или 90%. Согласно варианту осуществления уровень снижают по меньшей мере на 30%.
Согласно вариантам осуществления предшественником порфирина является 5-аминолевулиновая кислота (ALA) или порфобилиноген (PBG).
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) характеризуется значением IC50 в диапазоне 0,01-1 нМ.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа, описанного в данном документе, (i) облегчают симптом, ассоциированный с нарушением, связанным с ALAS1 (например, порфирией), (ii) ингибируют экспрессию ALAS1 у субъекта (например, при оценке с помощью анализа cERD), (iii) снижают уровень предшественника порфирина (например, ALA или PBG) или порфирина у субъекта, (iv) снижают частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта, или (v) снижает у субъекта частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, при воздействии в отношении субъекта провоцирующего фактора (например, предменструальной фазы или лютеиновой фазы).
Согласно вариантам осуществления с помощью способа облегчают болевые ощущения и/или прогрессирующую нейропатию.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят согласно схеме дозирования.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят до или во время острого приступа порфирии.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят до острого приступа порфирии.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят во время продрома. Согласно вариантам осуществления продром характеризуется болью в животе, тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), возбужденным состоянием и/или бессонницей.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят во время конкретной фазы менструального цикла, например, во время лютеиновой фазы.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа облегчают или предупреждают периодические приступы порфирии, например, путем снижения тяжести, продолжительности или частоты приступов. Согласно вариантам осуществления периодические приступы ассоциированы с провоцирующим фактором. Согласно вариантам осуществления провоцирующим фактором является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, лютеиновая фаза.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления уровень ALA и/или PBG повышен в плазме или моче субъекта. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например, печеночной порфирии. Согласно вариантам осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение (например, мутацию гена), ассоциированное с порфирией, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии и испытывает болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления субъект не испытывает острых приступов, но испытывает болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе.
Согласно вариантам осуществления субъект (а) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и (b) испытывает болевые ощущения (например, хроническую боль, например хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень ALA и/или PBG в плазме и/или в моче. Согласно вариантам осуществления повышенный уровень ALA и/или PBG сопровождается другими симптомами, например, болевыми ощущениями (например, хронической болью, например, хронической нейропатической болью) или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе. Согласно вариантам осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, например мутацию, описанную в данном документе.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) предшественника порфирина, например ALA и/или PBG, например, уровень выше нормального значения, или выше или равен нормальному значению. Согласно вариантам осуществления упомянутый уровень выше нормального значения. Согласно вариантам осуществления нормаль- 16 036477 ное значение соответствует двум стандартным отклонениям выше среднего уровня в образце здоровых индивидов. Согласно вариантам осуществления нормальное значение соответствует верхнему пределу нормального диапазона значений.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет уровень ALA и/или PBG в плазме или уровень ALA и/или PBG в моче, который выше, или выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5кратному уровню верхнего предела нормального диапазона значений. Используемый в данном документе верхний предел нормального диапазона значений относится к уровню, который представляет собой верхний предел 95% доверительного интервала для эталонного образца, например, образца индивидов с нормальными показателями (например, дикого типа) или здоровых индивидов, например, индивидов, которые не несут генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или индивидов, которые не страдают порфирией. Согласно вариантам осуществления у субъекта уровень ALA и/или PBG в моче составляет выше 2-4-кратного уровня относительно верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно вариантам осуществления у субъекта уровень ALA и/или PBG в моче составляет выше 4кратного уровня относительно верхнего предела нормального диапазона значений.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,12, 0,24, 0,36, 0,48 или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в моче составляет 1,2 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0,12, 0,24, 0,36, 0,48 или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в моче, который выше, или выше или равен 3,1, 6,2, 9,3, 12,4 или 15,5 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают один или несколько признаков или симптомов порфирии. Согласно вариантам осуществления с помощью способа снижают повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе. Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой нейропатическую боль (например, боль, ассоциированную с прогрессирующей нейропатией при острых порфириях). Уменьшение болевых ощущений может включать, например, предупреждение болевых ощущений, задержку начала проявления болевых ощущений, снижение частоты болевых ощущений и/или снижение тяжести болевых ощущений. Согласно вариантам осуществления уменьшение болевых ощущений оценивают на основе применения субъектом антиболевой терапии.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа облегчают или предупреждают острые приступы порфирии, например, путем снижения тяжести, продолжительности или частоты приступов.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают или предупреждают повреждение нервов.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа предупреждают ухудшение клинических показателей (например, предупреждают развитие патологических изменений) или результатом является улучшение клинических показателей, например, клинических показателей функции мышц и/или нервов, например, EMG и/или показателей скорости проводимости нерва.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают применение субъектом гема.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают применение субъектом антиболевой терапии.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа снижают риск госпитализации.
Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG (например, уровня ALA и/или PBG в плазме или в моче). Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для получения заранее определенного снижения повышенного уровня ALA и/или PBG.
Согласно вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение
- 17 036477 до значения, меньшего или равного нормальному значению. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение соответствует верхнему пределу нормального диапазона значений. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение соответствует значению, равному двум стандартным отклонениям выше среднего уровня в эталонном образце.
Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG у субъекта до уровня, который в два раза ниже верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня ALA в два раза ниже верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня PBG в два раза ниже верхнего референтного предела.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят в виде разовой дозы или нескольких доз, например, согласно схеме дозирования.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят субъекту, подверженному риску развития порфирии, профилактически. Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят профилактически, начиная с периода полового созревания. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или имеет повышенный уровень ALA и/или PBG (например, повышенный уровень ALA и/или PBG в плазме или моче). Согласно вариантам осуществления мутация способствует восприимчивости субъекта к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, пребывания на диете или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, раскрытого в данном документе). Согласно вариантам осуществления мутация ассоциирована с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). Согласно вариантам осуществления мутация ассоциирована с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией).
Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в гене ALAS1. Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в промоторе гена ALAS1, или в участках, расположенных выше или ниже относительно гена ALAS1. Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в гене, который кодирует фермент в рамках пути биосинтеза гема.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA или ее конъюгат) или композицию, содержащую iRNA, вводят подкожно. Согласно вариантам осуществления iRNA находится в форме конъюгата GalNAc. Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) вводят в дозе 0,5-50 мг/кг. Согласно определенным вариантам осуществления iRNA вводят в дозе менее 10 мг/кг (например, 5 мг/кг или менее) один раз в неделю; например, в дозе 1 мг/кг или менее, 2,5 мг/кг или менее, или 5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю. Согласно одному варианту осуществления iRNA вводят в дозе приблизительно 2,5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю.
Согласно вариантам осуществления у субъекта, который подлежит лечению, не наблюдаются симптомы, и он имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией, например, AIP. Согласно вариантам осуществления пациент испытывает рецидивирующие приступы порфирии.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, AD-60519) вводят в дозе менее 5 мг/кг, например, по 0,1, 0,35, 1,0 или 2,5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления iRNA (например, AD-60519) вводят в повторяющихся дозах, например, еженедельных дозах.
Согласно одному варианту осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы, и он имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и iRNA (например, AD-60519) вводят в разовых дозах, например, по 0,1, 0,35, 1,0 или 2,5 мг/кг; или в повторяющихся еженедельных дозах, например, по 1 и 2,5 мг/кг в течение нескольких недель (например, в течение 4 недель).
Согласно одному варианту осуществления субъект имеет AIP, например, является пациентом с AIP, при этом iRNA (например, AD-60519) вводят в дозе 1-2,5 мг/кг еженедельно.
Согласно вариантам осуществления используют схему лечения, при которой iRNA изначально вводят более часто, с последующим менее частым введением. Согласно вариантам осуществления iRNA изначально вводят один раз в день в течение нескольких дней (например, в течение 2-14 дней, например, в течение 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней). Согласно вариантам осуществления iRNA затем вводят один раз в неделю. Согласно вариантам осуществления iRNA затем вводят один раз каждые две недели. Согласно вариантам осуществления iRNA затем вводят с частотой, эффективной для уменьшения одного или нескольких признаков или симптомов порфирии.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение субъекту двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить из 15-30 пар оснований в длину и антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам под SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:382.
- 18 036477
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества dsRNA или композиции, содержащей dsRNA, описанной в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы, описанные в данном документе, эффективны для снижения уровня ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень ALA и/или PBG снижают так, чтобы он был меньше, или меньше или равен нормальному значению, например, верхнему пределу нормального диапазона значений.
Согласно вариантам осуществления у субъекта, который подлежит лечению, не наблюдаются симптомы, и он имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией, например AIP.
Согласно вариантам осуществления iRNA вводят в дозе менее 5 мг/кг, например по 0,1, 0,35, 1,0 или 2,5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления iRNA вводят в повторяющихся дозах, например, еженедельных дозах.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлены способы снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке (например, эритроидной клетке или клетке печени, такой как, например, гепатоцит). Согласно одному варианту осуществления клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка принадлежит субъекту (например, пациенту, нуждающемуся в лечении, предупреждении и/или контроле нарушения, связанного с экспрессией ALAS1)). Способ включает приведение клетки в контакт с эффективным количеством одной или нескольких из iRNA, нацеленных на ALAS1, например одной или нескольких из iRNA, раскрытых в данном документе, вследствие чего происходит снижение уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке; или снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в других клетках, тканях или жидкостях субъекта, в организме которого находится клетка, относительно уровня, предшествующего приведению в контакт. Такие способы можно применять для лечения (например, облегчения тяжести) нарушений, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии, например, AIP или порфирия, обусловленная недостаточностью дегидратазы ALA.
Согласно одному варианту осуществления стадия приведения в контакт является эффективной ex vivo, in vitro или in vivo. Например, клетка может принадлежать субъекту, например, млекопитающему (например, человеку), с риском возникновения порфирии или субъекту с диагностированной порфирией. Согласно варианту осуществления порфирия представляет собой острую печеночную порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленной недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, ALP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке, включающий приведение клетки в контакт с iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе, в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке.
Согласно вариантам осуществления клетка представляет собой гепатоцит. Согласно вариантам осуществления порфирин или предшественник порфирина представляет собой 8-аминолевулиновую кислоту (ALA), порфобилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (НМВ), уропорфириноген I или III, копропорфириноген I или III, протопорфириноген IX или протопорфирин IX. Согласно вариантам осуществления предшественником порфирина является ALA или PBG.
Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку. Согласно дополнительному варианту осуществления клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит).
Согласно одному аспекту в данном документе представлен вектор, кодирующий по меньшей мере одну нить iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен вектор, кодирующий по меньшей мере одну нить dsRNA, где упомянутая dsRNA содержит участок комплементарности по меньшей мере к части mRNA, кодирующей ALAS1, где упомянутая dsRNA составляет 30 пар оснований или менее в длину, и где упомянутая dsRNA нацелена на упомянутую mRNA для расщепления.
Согласно вариантам осуществления участок комплементарности составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок комплементарности составляет 19-21 нуклеотид в длину.Согласно одному аспекту в настоящем изобретении представлен вектор для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. Согласно одному варианту осуществления вектор содержит iRNA, описанную в данном документе. Согласно одному варианту осуществления вектор включает по меньшей мере одну регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью,
- 19 036477 которая кодирует по меньшей мере одну нить iRNA, описанную в данном документе. Согласно одному варианту осуществления вектор содержит по меньшей мере одну нить iRNA ALAS1.
Согласно одному аспекту в данном документе представлена клетка, содержащая вектор, описанный в данном документе. Согласно одному аспекту представлена клетка, содержащая вектор для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. Вектор включает регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну нить из iRNA, описанных в данном документе. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит). Согласно другому варианту осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку.
Согласно другому аспекту представлен способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает выявление (например, измерение) уровня mRNA ALAS1 в образце биологической жидкости (например, образце крови (например, образце сыворотки или плазмы), образце спинномозговой жидкости или мочи субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1, таким образом анализируют уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
Согласно другому аспекту представлен способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает (i) получение РНК (например, внеклеточной РНК) из образца биологической жидкости (например, образца крови или плазмы) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1; (ii) получение cDNA ALAS1 из mRNA ALAS1; (iii) приведение в контакт cDNA ALAS1 с нуклеиновой кислотой (например, зондом и/или праймером), комплементарной cDNA ALAS1 или ее частью, с получением реакционной смеси; и (iv) выявление (например, измерение) уровня cDNA ALAS1 в реакционной смеси, где уровень cDNA ALAS1 указывает на уровень mRNA ALAS1, таким образом, анализируют уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец крови. Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец сыворотки. Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец мочи.
Согласно вариантам осуществления способ включает PCR, qPCR или 5'-RACE.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота представляет собой зонд или праймер.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота содержит выявляемый фрагмент, и при этом уровень mRNA ALAS1 определяют путем выявления количества выявляемого фрагмента.
Согласно вариантам осуществления упомянутый способ дополнительно включает получение образца биологической жидкости от субъекта. Согласно вариантам осуществления образец биологической жидкости является отделенным от ткани и содержит экзосомы. Согласно вариантам осуществления этих способов эффективность лечения порфирии оценивают на основании сравнения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS 1 у субъекта относительно нормального значения.
Согласно вариантам осуществления снижение уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, в ответ на лечение порфирии, относительно нормального значения, указывает на то, что лечение порфирии является эффективным. Согласно вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта до лечения порфирии.
Все публикации, заявки на патент, патенты и другие литературные источники, упомянутые в данном документе, включены при помощи ссылки во всей своей полноте.
Подробная информация о различных вариантах осуществления настоящего изобретения изложена ниже в описании. Другие характеристики, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и графических материалов, а также из формулы изобретения.
Описание графических материалов
На фиг. 1 обозначен путь биосинтеза гема.
На фиг. 2А и 2В показана таблица, в которой приведены определенные порфирии, ассоциированные с генетическими ошибками в рамках метаболизма гема.
На фиг. 3А и 3В обозначен транскрипт mRNA ALAS1 человека (эталонная последовательность NM_000688.4 (GL40316942, дата регистрации 19 ноября 2011 г.), SEQ ID NO: 1).
На фиг. 4А и фиг. 4В обозначен транскрипт mRNA ALAS 1 человека (эталонная последовательность NM_000688.5 (GI: 362999011, дата регистрации 1 апреля 2012 г.), SEQ ID NO: 382).
На фиг. 5 показан дозозависимый эффект siRNA AD-53558 при подавлении mRNA ALAS1 мыши (mALAS1) относительно PBS в качестве контроля. Также показаны результаты для контроля AD-1955 с люциферазой (LUC).
На фиг. 6 показан дозозависимый эффект siRNA AD-53558 при подавлении mRNA ALAS1 у крыс относительно PBS в качестве контроля. Также показаны результаты для контроля AD-1955 с люциферазой (LUC).
- 20 036477
На фиг. 7 показана продолжительность подавления mRNA ALAS1 мыши (mALASl) с помощью siRNA AD-53558 относительно PBS в качестве контроля.
На фиг. 8 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровней ALA в плазме (в мкМ) на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом в экспериментальной (siRNA ALAS1) и контрольной (siRNA LUC) группах.
На фиг. 9 показаны уровни ALA в плазме (в мкМ) отдельных животных на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у животных, которые были подвержены обработке siRNA ALAS1 и контролем (siRNA LUC).
На фиг. 10 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровней PBG в плазме (в мкМ) на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у животных, которые были подвержены обработке siRNA ALAS1 и контролем (siRNA LUC).
На фиг. 11 показаны уровни PBG в плазме (в мкМ) отдельных животных на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у животных, которые были подвержены обработке siRNA ALAS1 и контролем (siRNA LUC).
На фиг. 12 показан относительный уровень mRNA mALAS1 в печени на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у отобранных типичных экспериментальных (siRNA ALAS1) и контрольных (PBS) животных.
На фиг. 13 показаны эффекты трех siRNA mALAS1, конъюгированных с GalNAc, в отношении экспрессии mALAS1 (относительно PBS в качестве контроля) в ткани печени мыши.
На фиг. 14 показаны уровни ALA и PBG в плазме в динамике после введения фенобарбитала и обработки siRNA ALAS1 или контрольной siRNA LUC.
На фиг. 15 показаны эффекты siRNA ALAS1, конъюгированных с GalNAc, в отношении уровней ALA и PBG в плазме в мышиной модели индукции AIP фенобарбиталом.
На фиг. 16 показаны дозозависимые эффекты siRNA ALAS1 в отношении уровней ALA и PBG в плазме в мышиной модели индукции AIP фенобарбиталом. Для животных, которые получали siRNA ALAS1, доза вводимой siRNA (0,05, 0,1, 0,5 или 1,0 мг/кг) показана на горизонтальной оси.
На фиг. 17 на верхней части рисунка показана схема эксперимента, применяемая для исследования подавления ALA и PBG с помощью siRNA ALAS1. На нижней части рисунка показаны уровни ALA и PBG в плазме на исходном уровне, в контрольном (Luc) состоянии и после обработки siRNA ALAS1 на 0, 2 и 4 неделе.
На фиг. 18 показана схема эксперимента, применяемая для сравнения эффектов лечения siRNA ALAS1 или гемином в отношении животной модели ALP (вверху), и результаты по уровням ALA (мкмоль/л) в плазме (в середине) и уровням PBG (мкмоль/л) в плазме (внизу).
На фиг. 19 показаны относительные уровни mRNA (ALAS1/GAPDH) у животных, обработанных 30, 10 или 3 мг/кг AD-58632, относительно животных, обработанных PBS в качестве контроля.
На фиг. 20 показана схема эксперимента, применяемая для изучения эффекта доза-ответ конъюгата GalNAc с AD-58632 ALAS1 в крысиной модели AIP.
На фиг. 21 показаны относительные уровни mRNA PBGD в печени (верхний график) и относительные уровни mRNA ALAS1 в печени (нижний график) в крысиной модели AIP. Группы животных подлежали одной из четырех обработок: (1) обработка только фенобарбиталом (РВ), (2) обработка фенобарбиталом и siRNA порфобилиногендезаминазы (PBGD), (3) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 30 мг/кг siRNA ALAS1, (4) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 10 мг/кг siRNA ALAS1.
На фиг. 22 показаны уровни PBG (верхняя часть рисунка) и ALA (нижняя часть рисунка) в моче относительно уровней креатинина в крысиной модели ALP. Группы животных подлежали одной из четырех обработок: (1) обработка только фенобарбиталом (РВ), (2) обработка фенобарбиталом и siRNA порфобилиногендезаминазы (PBGD), (3) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 30 мг/кг siRNA ALAS1, (4) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 10 мг/кг siRNA ALAS1.
На фиг. 23 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 с помощью AD-58632, относительно PBS в качестве контроля, в группах крыс, которые получали пять суточных доз siRNA по 6, 2 или 1 мг/кг по отношению к однократным болюсным дозам siRNA по 30, 10 или 5 мг/кг.
На фиг. 24 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 с помощью AD-58632, относительно PBS в качестве контроля, в группах крыс, которые получали четыре еженедельные дозы siRNA по 10, 5 или 2,5 мг/кг.
На фиг. 25 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 с помощью AD-58632 и с помощью пяти дуплексов из 19/19 мономеров .
На фиг. 26 показаны результаты оценки исследования эффекта длины нити и выступающих концов в отношении наиболее оптимальных двух дуплексов из 19 мономеров.
На фиг. 27 представлен график, на котором показаны уровни mRNA ALAS1 в печени (левые столбцы) и в сыворотке (правые столбцы) для каждой группы, подлежащей обработке при исследовании NHP, описанном в примере 34.
На фиг. 28 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 относительно PBS в качестве контроля,
- 21 036477 в группах крыс, которые получали 3 или 10 мг/кг AD-58632 или AD-60489.
На фиг. 29 показана схема эксперимента, применяемая для изучения эффективности siRNA ALAS1
AD-58632 и AD-60489 в отношении подавления mRNA в печени у низших приматов.
На фиг. 30 показаны результаты дозозависимого подавления mRNA в печени у низших приматов после обработки 1,25, 2,5 или 5 мг/кг AD-58632 или AD-60489.
На фиг. 31 показано сравнение результатов подавления mRNA, полученных исходя из биоптатов печени и исходя из анализа cERD при исследовании на низших приматах.
На фиг. 32 показана динамика подавления mRNA, оцененного с применением анализа cERD при исследовании на низших приматах. На горизонтальной оси указано время согласно дню исследования.
На фиг. 33 показаны результаты подавления mRNA ALAS1 у крыс, которые получали PBS или разовую дозу, составляющую 5 мг/кг одного из указанных дуплексов siRNA.
На фиг. 34 приведены концентрации siRNA в печени крыс, которые получали разовую дозу, составляющую 5 мг/кг указанной siRNA.
На фиг. 35 (вверху) показан схема эксперимента, применяемая для изучения терапевтической эффективности AD-60925 и AD-60926. На фиг. 35 (внизу) показаны относительные уровни mRNA ALAS1/GAPDH крысы у крыс, обработанных (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD и РВ, (3) AF-11PBGD, РВ и 3 мг/кг AD-60925, или (4) AF11-PBGD, РВ и AD-60926.
На фиг. 36 показаны относительные уровни PBG в моче (вверху) и ALA в моче (внизу) у крыс, обработанных (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD и РВ, (3) AF-11PBGD, РВ и 3 мг/кг AD-60925, или (4) AF11PBGD, РВ и AD-60926.
На фиг. 37 показаны относительные уровни PBG в моче (вверху) и ALA в моче (внизу) в динамике у крыс, обработанных (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD и РВ, (3) AF-11PBGD, РВ и 3 мг/кг AD-60925, или (4) AF11-PBGD, РВ и AD-60926. Стрелки указывают на временные точки при введении РВ.
На фиг. 38 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которые получали 4 дозы PBS или 2,5 мг/кг одной из указанных siRNA.
На фиг. 39 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которые получали разовую дозу PBS или 2,5 мг/кг одной из указанных siRNA.
На фиг. 40 (вверху) показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которые получали разовую дозу PBS или 3 мг/кг одной из указанных siRNA. На фиг. 40 (внизу) показана концентрация siRNA в печени.
На фиг. 41 (вверху) показаны результаты подавления mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы с помощью AD-60489, AD-60519 и AD-60901. На фиг. 41 (внизу) приведена концентрация siRNA в печени.
На фиг. 42 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которых обрабатывали разовой дозой PBS или 2,5 мг/кг одной из указанных siRNA.
На фиг. 43 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которых обрабатывали PBS или одной из указанных siRNA в дозе 2,5 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель.
На фиг. 44 (вверху) показана схема эксперимента, применяемая для изучения терапевтической эффективности нескольких доз AD-60519 два раза в неделю. На фиг. 44 (внизу) показаны графики, обозначающие подавление PBG и ALA в моче у крыс, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и шестью дозами PBS, (ii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами PBS, (iii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 2,5 мг/кг AD60519, или (iv) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 5 мг/кг AD-60519.
На фиг. 45 показаны графики, обозначающие подавление PBG (верхний график) и ALA (нижний график) в сыворотке в мышиной модели AIP, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и шестью дозами PBS (исходный уровень), (ii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами PBS (солевой раствор), (iii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 2,5 мг/кг AD-60519, или (iv) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 5 мг/кг AD60519.
На фиг. 46 (вверху) показана схема эксперимента, применяемая для изучения терапевтической эффективности нескольких еженедельных доз AD-60519. На фиг. 46 (внизу) показан график, обозначающий относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1/GAPDH) крысы у крыс, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и четырьмя дозами PBS, (ii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами PBS, (iii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 3 мг/кг AD-60519, (iv) siRNA PBGD, PB и четырьмя дозами 1 мг/кг AD-60519, или (v) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 0,3 мг/кг AD-60519.
На фиг. 47 показаны графики, обозначающие уровни PBG (верхний график) и ALA (нижний график) в моче у крыс, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и четырьмя дозами PBS, (ii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами PBS, (iii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 3 мг/кг AD-60519, (iv) siRNA PBGD, PB и четырьмя дозами 1 мг/кг AD-60519 или (v) siRNA PBGD, PB и четырьмя дозами 0,3 мг/кг AD-60519.
На фиг. 48 представлена диаграмма, на которой показана схема исследования на низших приматах, в котором изучали эффекты конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в отношении подавления mRNA ALAS1 в печени и mRNA ALAS1 в крови.
На фиг. 49 представлен график, на котором показаны результаты подавления mRNA в печени у низших приматов (NHP) после обработки конъюгатами GalNAc с siRNA ALAS1.
- 22 036477
На фиг. 50 представлен график, на котором показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 в сыворотке у низших приматов (NHP) в различные периоды времени в ходе проведения исследования, в котором изучали эффекты обработки конъюгатами GalNAc с siRNA ALAS1. Дни на горизонтальной оси соответствуют дням на диаграмме из фиг. 48.
На фиг. 51 показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 (показано в виде доли уровня дозы до приема лекарственного средства), при оценке в исследовании для разовой дозы у крыс, в котором применяли cERD в моче для отслеживания подавления ALAS1.
На фиг. 52 представлена схема, на которой показана схема исследования на низших приматах, в котором изучали эффекты нескольких доз и разовой дозы AD-60519 в отношении подавления mRNA ALAS1 в печени и mRNA ALAS1 в крови.
На фиг. 53 представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны средние относительные уровни mRNA ALAS1 в печени (% PBS в качестве контроля) на 24 день исследования (группы с несколькими дозами) или на 4 день исследования (группы с разовой дозой).
На фиг. 54 представлен график, на котором показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 в сыворотке (показано в виде доли уровня дозы до приема лекарственного средства) при оценке с применением cERD для групп с несколькими дозами (верхний график, показывающий результаты вплоть до 24 дня) и групп с разовой дозой (нижний график, показывающий результаты вплоть до 22 дня).
На фиг. 55 представлен график, на котором показаны уровни mRNA в печени, mRNA в сыворотке и mRNA в моче на 4 день исследования (в группах с разовой дозой) или на 24 день исследования (в группах с несколькими дозами). Показаны данные для отдельных животных и средние величины для каждой группы.
На фиг. 56 представлен график, на котором показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 в сыворотке (показано в виде доли уровня дозы до приема лекарственного средства) через 8 недель при оценке с применением cERD для групп с несколькими дозами. Каждая точка на графике представляет остаточную mRNA ALAS1 для средней величины группы образцов 3 животных ± стандартное отклонение группы.
На фиг. 57 представлена схема структуры ALN-60519 (также называемая в данном документе AD60519). На фиг. 57 раскрыты SEQ ID NO 5238-5239 соответственно, по порядку.
На фиг. 58 показаны уровни mRNA ALAS1 при оценке соответствующих образцов сыворотки и мочи или от пациентов с ALP, или от здоровых добровольцев (NHV). Уровни mRNA ALAS1 в сыворотке или моче измеряли с применением способа cERD. Для пациентов А и В с ALP проводили забор второго набора образцов сыворотки и мочи для оценки изменений mRNA ALAS1 в динамике.
Подробное описание изобретения iRNA управляет специфическим в отношении последовательности разрушением mRNA посредством процесса, известного как РНК-интерференция (RNAi). В данном документе описаны iRNA и способы их применения для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или у млекопитающего, где iRNA нацелена на ген ALAS1. Также представлены композиции и способы лечения нарушений, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии (например, порфирия, обусловленная недостаточностью ALAдегидратазы (ADP или порфирия Досса), острая перемежающаяся порфирия, врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), вариегатная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (ЕРР), Х-сцепленная сидеробластическая анемия (XLSA) и транзиторная эритропорфирия детского возраста).
Порфирии представляют собой врожденные или приобретенные нарушения, причиной которых может быть пониженная или повышенная активность определенных ферментов в пути биосинтеза гема, также называемого в данном документе порфириновым путем (см. фиг. 1). Порфирины являются основными предшественниками гема. Порфирины или предшественники порфирина включают 5аминолевулиновую кислоту (ALA), порфобилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (НМВ), уропорфириноген I или III, копропорфириноген I или III, протопорфириноген LX и протопорфирин IX. Г ем является неотъемлемой частью гемоглобина, миоглобина, каталаз, пероксидаз и цитохромов, при этом последние включают цитохромы легких и цитохромы Р450 печени. Гем синтезируется в большинстве или во всех клетках организма человека. Приблизительно 85% гема образуется в эритроидных клетках, преимущественно для гемоглобина. Большая часть оставшегося гема образуется в печени, 80% которого используется для синтеза цитохромов. Недостаточность определенных ферментов в порфириновом пути приводит к недостаточному образованию гема, а также к накоплению предшественников порфиринов и/или порфиринов, которые в высоких концентрациях могут быть токсичны для работы клеток или органов.
Порфирии могут проявляться на ряду с неврологическими осложнениями (острые), проблемами с кожей (кожные) или обоими. Порфирии можно классифицировать по основному сайту локализации сверхсинтеза и накопления порфиринов или их предшественников. При печеночных порфириях порфирины и предшественники порфиринов сверхсинтезируются преимущественно в печени, в то время как при эритропоэтических порфириях порфирины сверхсинтезируются в эритроидных клетках в кости. Острые и печеночные порфирии приводят к нарушению работы нервной системы и неврологическим проявлениям, которые влияют как на центральную, так и на периферическую нервную систему, что при- 23 036477 водит к появлению симптомов, таких как, например, болевые ощущения (например, боль в животе и/или хроническая нейропатическая боль), рвота, нейропатия (например, острая нейропатия, прогрессирующая нейропатия), мышечная слабость, судороги, расстройства психики (например, галлюцинации, депрессия, тревожность, паранойя), сердечные аритмии, тахикардия, запор и диарея. Кожные или эритропоэтические порфирии преимущественно поражают кожу, вызывая симптомы, такие как фотосенсибилизация, которая может быть болезненной, пузыри, некроз, зуд, отечность и усиленный рост волос в определенных областях, таких как лоб. Последующая инфекция повреждений кожи может приводить к потери костей и тканей, а также образованию шрамов, обезображиванию и потере пальцев (например, пальцев рук, пальцев ног). Большинство порфирии вызваны мутациями генов, которые кодируют ферменты в рамках пути биосинтеза гема. Краткое описание порфирии, связанных с генетическими ошибками в метаболизме гема, представлено на фиг. 2.
Не все порфирии являются генетически обусловленными. Например, у пациентов с заболеванием печени может развиться порфирия в результате нарушения работы печени, а транзиторная форма эритропорфирии (транзиторная эритропорфирия детского возраста) была описана для детского возраста (см. Crawford, R.I. et al, JAmAcad Dermatol. 1995 авг; 33(2 Pt 2): 333-6.). У пациентов с РСТ может быть приобретенная недостаточная активность уропорфиногендекарбоксилазы (URO-D) вследствие образования фермента ORO-D с более низкой, чем нормальная, активностью фермента (см. Phillips et al. Blood, 98: 3179-3185, 2001.)
Острая перемежающаяся порфирия (AIP) (также называемая недостаточностью порфобилиногендезаминазы (PBG), или недостаточностью гидроксиметилбилансинтазы (HMBS)), является наиболее распространенным типом острой печеночной порфирии. Другие типы острых печеночных порфирий включат наследственную копропорфирию (НСР), вариегатную порфирию (VP) и порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP). Острые печеночные порфирий описаны, например, в Balwani, M and Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
AIP является, как правило, аутосомно-доминантным заболеванием, которое характеризуется недостаточностью фермента порфобилиногендезаминазы (PBG-дезаминаза); этот фермент также известен как гидроксиметилбилансинтаза (НМВ синтаза или HMBS). PBG-дезаминаза является третьим ферментом в пути биосинтеза гема (см. фиг. 1) и катализирует реакцию конденсации по типу голова к хвосту четырех молекул порфобилиногена в линейный тетрапиррол, гидроксиметилбилан (НМВ). Были описаны образованные в результате альтернативного сплайсинга варианты транскриптов, кодирующие различные изоформы PBG-дезаминазы. Мутации в гене PBG-дезаминазы ассоциированы с AIP. Такие мутации могут приводить к пониженному количеству PBG-дезаминазы и/или пониженной активности PBGдезаминазы (индивиды, пораженные заболеванием, как правило, имеют ~50% снижение активности PB G-дезаминазы).
Существует по меньшей мере две различные модели патофизиологии AIP и других острых печеночных порфирий (см., например, Lin CS-Y et al., Clinical Neurophysiology, 2011; 122:2336-44). Согласно одной модели, сниженный уровень образования гема вследствие недостаточности PBG-дезаминазы вызывает энергетический дефицит и дегенерацию аксонов. Согласно другой, на сегодняшний день более предпочтительной модели, накопление предшественников порфиринов (например, ALA и PBG) приводит к нейротоксичности.
Было обнаружено, что AIP распространена в определенных популяциях с частотой до 1 на 10000 (например, в Северной Швеции; см. Floderus Y., et al. Clin Genet. 2002;62:288-97). По оценкам, распространенность в общей популяции в Соединенных Штатах и Европе, за исключением Великобритании, составляет приблизительно от 1 на 10000 до 1 на 20000. Собственно клиническое заболевание проявляется лишь у приблизительно 10-15% индивидов, которые несут мутации, которые, как известно, ассоциированы с AIP. Однако, у индивидов с определенными мутациями пенетрантность составляет до 40% (например, мутация W198X). AIP, как правило, находится в латентной форме до периода полового созревания. Симптомы более распространены у женщин, чем у мужчин. Распространенность заболевания вероятно занижена вследствие его неполной пенетрантности и длительных латентных периодов. В Соединенных Штатах по оценкам насчитывается приблизительно 2000 пациентов, которые испытали по меньшей мене один приступ. По оценкам насчитывается приблизительно 150 активных рецидивирующих случаев во Франции, Швеции, Великобритании и Польше; этими пациентами являются преимущественно молодые женщины со средним возрастом 30 лет. См., например, Elder et al, J Inherit Metab Dis., опубликованную в Интернете 1 ноября 2012 г.
AIP поражает, например, висцеральную, периферическую, вегетативную и центральную нервную системы. Симптомы ALP разнообразны и включают симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта (например, сильную и нечетко локализированную боль в животе, тошноту/рвоту, запор, диарею, непроходимость кишечника), симптомы со стороны мочевыводящих путей (дизурия, задержка мочеиспускания/недержание мочи или темная моча, например, темно-красная моча), неврологические симптомы (например, сенсорная нейропатия, моторная нейропатия (например, поражение черепных нервов и/или приведение к слабости в руках и ногах), судороги, нейропатическая боль (например, боль, ассоциированная с прогессирующей нейропатией, например, хроническая нейропатическая боль), психоневрологические
- 24 036477 симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинации, истерия, делирий, апатия, депрессия, фобии, психоз, бессонница, сонливость, кома), поражение вегетативной нервной системы (приводящее, например, к симптомам со стороны сердечно-сосудистой системы, таким как тахикардия, гипертензия и/или аритмии, а также другим симптомам, таким как, например, повышенные уровни катехоламинов в крови, потение, возбужденное состояние и/или тремор), обезвоживание и нарушения баланса электролитов. Наиболее распространенными симптомами являются боль в животе и тахикардия. Неврологические проявления включают моторную и вегетативную нейропатию и судороги. У пациентов часто наблюдается хроническая нейропатическая боль и развивается прогрессирующая нейропатия. Пациенты с рецидивирующими приступами часто имеют продром. После тяжелого приступа может возникать необратимый паралич. Нормализация после тяжелых приступов, которые своевременно не лечили, может занять недели или месяцы. Острый приступ может быть летальным, например, вследствие паралича дыхательных мышц или сердечно-сосудистой недостаточности вследствие нарушения баланса электролитов. (См., например, Thunell S. Hydroxymethylbilane Synthase Deficiency. 2005 сентября 27 [обновлено 1 сентября 2011 г.]. В: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editors. GeneReviews™ [интернет]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993 (далее в данном документе Thunell (1993)), который включен, таким образом, при помощи ссылки во всей своей полноте.) До того, как лечение гемином стало доступным, до 20% пациентов с ALP умирали от заболевания.
Индивиды, которые несут гены ALP, подвержены повышенному риску возникновения гепатоцеллюлярного рака. У индивидов с рецидивирующими приступами риск гепатоцеллюлярного рака является особенно серьезным: после 50 лет риск почти в 100 раз выше, чем в общей популяции.
Приступы острой порфирии могут провоцироваться эндогенными или экзогенными факторами. Механизмы, с помощью которых такие факторы индуцируют приступы, могут включать, например, повышенную потребность в ферментах Р450 печени и/или индукцию активности ALAS1 в печени. Повышенная потребность в ферментах Р450 печени приводит к сниженному содержанию свободного гема в печени, тем самым индуцируя синтез ALAS1 печени.
Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или недостаточной калорийности потребляемой пищи вследствие жестких диет, занятий спортом, связанных с длинными дистанциями и т. д.), формы стресса, связанные с метаболизмом (например, инфекции, оперативное вмешательство, международные авиаперелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, жирорастворимые чужеродные химические соединения (в том числе, например, химические соединения, присутствующие в табачном дыме, определенные лекарственные средства рецептурного отпуска, органические растворители, биоциды, соединения в алкогольных напитках), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения болезни во время менструального периода), синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормональная заместительная терапия). См., например, Thunell (1993).
Свыше 1000 лекарственных средств противопоказаны при острых печеночных порфириях (например, AIP, HCP, ADP и VP), в том числе, например, спирт, барбитураты, карбамазепин, каризопродол, клоназепам (высокие дозы), даназол, диклофенак и другие допустимые NSAIDS, препараты спорыньи, эстрогены, этхлорвинол, глютетимид, гризеофульвин, мефенитоин, мепробамат (также мебутамат и тибутамат), метиприлон, методопрамид, фенитоин, примидон, прогестерон и синтетические прогестины, пиразинамид, пиразолоны (аминопирин и антипирин), рифампин, сукцинимиды (этосукцимид и метсукцимид), сульфонамидные антибиотики и вальпроевая кислота.
Объективные признаки AIP включают изменение цвета мочи во время острого приступа (моча может выглядеть красной или красно-коричневой) и повышенные концентрации PBG и ALA в моче во время острого приступа. Молекулярно-генетическое тестирование позволяет идентифицировать мутации в гене PBG-дезаминазы (также известной как HMBS) у более 98% пораженных заболеванием индивидов. Thunell (1993).
Диагностика порфирии может включать оценку семейного анамнеза, оценку уровней предшественников порфиринов в моче, крови или кале, и/или оценку активности ферментов и анализ мутаций ДНК. Дифференциальная диагностика порфирии может включать определение типа порфирии на основе измерений отдельных уровней порфиринов или предшественников порфиринов (например, ALA, PBG) в моче, кале и/или плазме (например, при помощи хроматографии или флуорометрии) во время приступа. Диагноз AIP может быть подтвержден установлением того, что активность PBG-дезаминазы в эритроцитах составляет 50% или менее относительно нормального уровня. ДНК-тестирование в отношении мутаций можно проводить для пациентов и членов семей с повышенным риском. Диагноз AIP, как правило, подтверждается по ДНК-тестированию для идентификации конкретной вызывающей болезнь мутации гена (например, мутации HMBS).
Общепринятый контроль острых приступов AIP включает госпитализацию, отслеживание симптомов и устранение небезопасных лекарственных средств. Лечение острых приступов, как правило, требует госпитализации для контроля и лечения острых симптомов, в том числе, например, боли в животе, судорог, обезвоживания/гипонатриемии, тошноты/рвоты, тахикардии/гипертензии, задержки мочеиспускания/непроходимости кишечника. Например, боль в животе можно лечить, например, наркотическими
- 25 036477 анальгетиками, судороги можно лечить профилактическими противосудорожными средствами и допустимыми лекарственными препаратами (хотя многие противосудорожные препараты противопоказаны), тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотиазинами, и тахикардию/гипертензию можно лечить, например, бета-блокаторами. Лечение может включать отказ от небезопасных лекарственных препаратов, отслеживание дыхательной функции, а также мышечной силы и неврологического статуса. Умеренные приступы (например, приступы без пареза или гипонатриемии) можно лечить по меньшей мере 300 г внутривенной 10% глюкозы в день, хотя незамедлительно обеспечивают повышенное введение гемина. Тяжелые приступы, как правило, лечат как можно раньше гемином с внутривенным введением (3-4 мг/кг в сутки в течение 4-14 дней) и IV глюкозой при ожидании начала действия IV гемина. Как правило, приступы лечат IV гемином в течение 4 дней и IV глюкозой при ожидании введения IV гемина. В течение 3 4 дней после начала введения гемина часто наблюдается клиническое улучшение, сопровождающееся понижением уровней ALA и PBG.
Гемин (пангематин® или гемин для инъекции, ранее известный как гематин) является единственным препаратом, одобренным для применения в Соединенных Штатах, и был первым лекарственным средством, одобренным Законом об орфанных лекарственных препаратах. Пангематин® представляет собой гемин, полученный из обработанных эритроцитов (PRBC), и представляет собой протопорфирин IX, содержащий ион трехвалентного железа (гем В) с хлоридным лигандом. Гем служит для ограничения синтеза порфирина в печени и/или костного мозге. Точный механизм, с помощью которого гемин приводит к симптоматическому улучшению у пациентов с острыми случаями печеночных порфирий, пока не был выяснен; однако, его действие, по-видимому, связано с (механизм обратной связи) ингибированием синтазы 8-аминолевулиновой кислоты (ALA), фермента, который ограничивает скорость пути биосинтеза порфирина/гема. См. Panhematin® product label, Lundbeck, Inc., октябрь 2010 г. Ингибирование ALAсинтазы должно приводить к пониженному образованию ALA и PBG, а также порфиринов и промежуточных соединений порфиринов.
Недостатки препаратов на основе тема (например, гемина) включают отсроченное влияние в отношении клинических симптомов и неспособность предотвратить рецидив приступов. Побочные реакции, ассоциированные с введением тема (например, гемина) могут включать флебит (например, тромбофлебит), затрудненность венозного доступа, антикоагуляцию (или коагулопатии), тромбоцитопению, отказ почек или перенасыщение железом, что особенно вероятно в случае пациентов, требующих нескольких курсов лечения гемином при рецидивирующих приступах. У пациентов с рецидивирующими приступами для предупреждения флебита необходим постоянный венозный катетер для возможности доступа. При высоких дозах может происходить повреждение почек. Редкие зарегистрированные побочные эффекты включают лихорадку, боль, чувство общего недомогания, гемолиз, анафилаксию и острую сосудистую недостаточность. См. Anderson К.Е., Approaches to Treatment and Prevention of Human Porphyrias, в The Porphyrin Handbook: Medical Aspects of Porphyrins, Edited by Karl M. Kadish, Kevin M. Smith, Roger Guilard (2003) (далее в данном документе Anderson).
Гем сложно получать в стабильной форме для внутривенного введения. Он нерастворим при нейтральном рН, но его можно получать в виде гидроксида гема при рН 8 или выше. Anderson. Пангематин представляет собой лиофилизированный препарат гемина. При растворении лиофилизированного гемина для внутривенного введения быстро образуются продукты распада; эти продукты распада обуславливают временный антикоагулянтный эффект и флебит в участке инфузии. Anderson. Гемальбумин и аргинат гема (нормосанг, европейский вариант гемина) являются более стабильными и потенциально могут приводить к менее интенсивному тромбофлебиту. Однако, в Соединенных Штатах аргинат гема не одобрен для применения. Пангемин можно стабилизировать путем растворения его для инфузии в 30% альбумине человека вместо стерильной воды; однако, альбумин увеличивает внутрисосудистый объем и расширяющие эффекты и повышает стоимость лечения, а также риск, связанный с патогенами, поскольку его выделяют из крови человека. См., например, Anderson, выше.
Успешное лечение острого приступа не предупреждает или отсрочивает рецидив. Стоит вопрос о том, может ли сам гемин вызывать рецидивирующие приступы вследствие индукции гемоксигеназы. Несмотря на это, в некоторых областях (особенно Франции), молодых женщин с несколькими рецидивирующими приступами с целью осуществления профилактики подвергают лечению гемином еженедельно.
Небольшой опыт трансплантации печени указывает на то, что при успешном исходе это можно считать эффективным лечением AIP. В Европе насчитывалось примерно 12 трансплантаций у пациентов, с лечебным или отличающимся эффектами. Трансплантация печени может восстанавливать нормальную экскрецию ALA и PBG и предупреждать острые приступы. См., например, Dar, F.S. et al. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 9(1): 93-96 (2010). Кроме того, если печень пациента с ALP пересаживают другому пациенту (домино-трансплантат), у пациента, получающего трансплантат, может развиться AIP. Среди отдаленных клинических эффектов острых порфирий имеет место хроническая нейропатическая боль, которая может быть следствием прогрессирующей нейропатии, обусловленной нейротоксическими эффектами, например, повышенным содержанием предшественников порфиринов (например, ALA и/или
- 26 036477
PBG). Нейротоксические эффекты могут быть ассоциированы с образованием токсических промежуточных соединений гема, например, измененной передачей сигналов GABA и/или опосредованного железом окисления и образованием активных форм кислорода (ROS). Пациенты могут испытывать нейропатическую боль до или во время острого приступа. Пациенты старшего возраста могут испытывать усиленную нейропатическую боль с возрастом, для лечения которой, как правило, назначают различные наркотические лекарственные средства. У пациентов с острыми печеночными порфириями были зафиксированы нарушения электромиограммы и уменьшение времени проведения возбуждения. Следует отметить, что у мышей с ALP (недостаточность PBG-дезаминазы), которых не подвергали обработке и стимуляции, развивается прогрессирующая моторная нейропатия, которая, как было показано, вызывает прогрессирующую дегенерацию и гибель аксонов нерва, контролирующего четырехглавую мышцу, предположительно, вследствие постоянно повышенных уровней предшественников порфиринов (ALA и PBG), порфиринов и/или недостатка гема (Lindberg et al., J. Clin. Invest., 103(8): 1127-1134, 1999). Среди пациентов с острой порфирией (например, ADP, AIP, HCP или VP) между приступами уровни предшественников порфиринов (ALA и PBG) часто повышены у пациентов, у которых не наблюдаются симптомы и у пациентов, у которых наблюдаются симптомы. Таким образом, ожидается, что снижение количества предшественников порфиринов и возобновление нормального биосинтеза гема посредством снижения уровня экспрессии и/или активности ALAS1, будет предупреждать и/или минимизировать развитие хронической и прогрессирующей нейропатии. Лечение, например, длительное лечение (например, периодическое лечение с помощью iRNA, описанной в данном документе, например, лечение согласно схеме дозирования, описанной в данном документе, например, еженедельное лечение или лечение два раза в неделю) может непрерывно снижать экспрессию ALAS1 у пациентов с острой порфирией, которые имеют повышенные уровни предшественников порфиринов, порфиринов, продуктов порфиринов или их метаболитов. Такое лечение может быть предусмотрено при необходимости предупреждения или снижения частоты или тяжести отдельных симптомов у пациента (например, боли и/или нейропатии) и/или снижения уровня предшественника порфирина, порфирина, продукта порфирина или метаболита.
Существует необходимость идентификации новых терапевтических средств, которые можно применять для лечения порфирий. Как было описано ранее, существующие варианты лечения, такие как продукты на основе гема (например, гемин), имеют многочисленные недостатки. Например, влияние гемина на клинические симптомы является отсроченным, он является дорогостоящим и может оказывать побочные эффекты (например, тромбофлебит, антикоагуляцию, тромбоцитопению, перенасыщение железом, отказ почек). Новые терапевтические средства, такие как описанные в данном документе, могут быть направлены на эти недостатки и неудовлетворенные потребности пациентов, с более быстрым действием, без индуцирования флебита, с обеспечением возможности подкожного введения, успешным предупреждением рецидивирующих приступов, предупреждением или облегчением болевых ощущений (например, хронической нейропатической боли) и/или прогрессирующей нейропатии, и/или они не вызывают определенных побочных эффектов, ассоциированных с гемином (например, перенасыщение железом, повышенный риск гепатоцеллюлярного рака).
Пациенты с AIA включают пациентов, которые испытывают рецидивирующие приступы, и пациентов, которые испытывают острые, единичные приступы. Среди пациентов, которые испытывают рецидивирующие приступы, приблизительно 5-10% страдают от рецидивирующих перемежающихся приступов (2-3 приступа в год) или рецидивирующих приступов (>4 приступов в год). Для этих пациентов вероятнее всего рассматривается вопрос о трансплантации печени или получении профилактических инфузий гема (например, гемина). Пациенты с рецидивирующими приступами вероятнее всего имеют низкое качество жизни вследствие длительных пребываний в больнице, опиатной зависимости и/или токсичности для венозной сети. Длительное введение гема может индуцировать гемоксигеназу (НО-1). Таким образом, постепенное снижение дозы гема пациентам может составлять сложность, и некоторым требуется более частое введение. Некоторые врачи в связи с этим ограничивают применение гема до случаев с наиболее серьезными приступами. Соответственно, существует неудовлетворенная потребность в подходящей, эффективной профилактике и вариантах лечения с лучшей переносимостью.
Для пациентов, которые испытывают острые приступы, клинические рекомендации предполагают введение гема как можно раньше. Однако, учитывая трудности диагностики и отсутствие незамедлительной доступности лекарственных препаратов, введение может быть отсроченным. Медленное начало проявления эффектов гема (например, гемина) и его плохая переносимость замедляют наступление улучшения. В связи с наличием продолжительной сильной боли в животе, даже после введения гема, может потребоваться, чтобы пациенты получали опиаты в течение нескольких дней.
Отсроченное введение гема или продолжающееся воздействие провоцирующих факторов может приводить к более серьезным осложнениям, в том числе моторной нейропатии и сопутствующих симптомов (например, слабости, пареза). В тяжелых случаях может возникать дыхательная недостаточность и паралич. Восстановление от неврологических симптомов может потребовать намного дольше времени для выздоровления. Соответственно в контексте острых приступов необходимы варианты лечения, харастеризующиеся ускоренным началом действия и лучшей переносимостью. Фармакологическая валидность ALAS1 в качестве цели для сайленсинга mRNA основана, по меньшей мере, на следующих резуль
- 27 036477 татах: mRNA ALAS1 в значительной степени активирована во время приступа; пангематин подавляет ALAS-1, а добавление гема к клеткам печени в культуре приводит к пониженному количеству mRNA ALAS-1. Некоторые результаты также указывают на то, что подавление mRNA ALAS1 может быть достигнуто путем нацеливания на печень. Например, было показано, что трансплантация печени характеризуется лечебным эффектом, а метаболиты из печени стимулируют приступы (см., например, Dar et al. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9: 93-6 (2010); Dowman et al. Ann Intern Med 154: 571-2 (2011) и Wu et al. Genes Dev 23:2201-2209 (2009). Поэтому снижение уровня экспрессии ALAS1, например, в печени, с применением композиций на основе iRNA, можно применять для лечения порфирии. Согласно определенным вариантам осуществления композиции на основе iRNA можно применять для профилактики и неотложного лечения порфирии. Например, композиции на основе iRNA можно применять профилактически при наступлении рецидивирующих приступов для индуцирования длительного или хронического подавления экспрессии ALAS1 (что приводит к длительному или хроническому подавлению ALA/PBG), и, таким образом, ослаблению рецидивирующей активации ALAS1, которая стимулирует приступы. Такое профилактическое лечение может снижать число и тяжесть приступов. Во время наступления острого приступа введение композиции на основе iRNA может оказывать лечебный эффект в отношении острого приступа, например, посредством снижения уровней ALA/PBG.
В настоящем раскрытии представлены способы и композиции на основе iRNA для модулирования экспрессии гена ALAS1. Согласно определенным вариантам осуществления экспрессию ALAS1 снижают или ингибируют с применением iRNA, специфической по отношению к ALAS1, что, таким образом, приводит к пониженной экспрессии гена ALAS1. Сниженная экспрессия гена ALAS1 может снижать уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов. Пониженная экспрессия гена ALAS1, а также связанное с этим снижение уровня одного или нескольких предшественников порфиринов и/или порфиринов, может быть пригодным при лечении нарушений, связанных с экспрессией ALAS1, например, порфириями.
iRNA композиций, описанных в данном документе, включают нить РНК (антисмысловую нить) с участком, который составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, например, 15-30 нуклеотидов в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, этот участок практически комплементарен по меньшей мере части mRNA-транскрипта гена ALAS1 (также называемого в данном документе iRNA, специфическая по отношению к ALAS1). Применение такой iRNA обеспечивает целевое разрушение mRNA генов, которые вовлечены в патологии, ассоциированные с экспрессией ALAS1 у млекопитающих, например, порфирии, такие как порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (также известная как порфирия Досса или плюмбопорфирия) или острая перемежающаяся порфирия. Очень низкие дозы iRNA, специфических по отношению к ALAS1, могут специфично и эффективно опосредовать RNAi, что приводит к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1. iRNA, нацеленные на ALAS1, могут специфично и эффективно опосредовать RNAi, что приводит к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1, например, в анализах на клетках. Таким образом, способы и композиции, включающие эти iRNA, пригодны для лечения патологических процессов, связанных с экспрессией гена ALAS1, таких как порфирии (например, Х-сцепленная сидеробластическая анемия (XLSA), порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (порфирия Досса), острая перемежающаяся порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), вариегатная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (ЕРР) и транзиторная эритропорфирия детского возраста).
В следующем описание раскрывается, как получать и применять композиции, содержащие iRNA, для ингибирования экспрессии гена ALAS1, а также композиции и способы лечения заболеваний и нарушений, вызванных или модулируемых экспрессией этого гена. Варианты осуществления фармацевтических композиций, описанных в настоящем изобретении, включают iRNA с антисмысловой нитью, содержащей участок, который составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, при этом этот участок практически комплементарен по меньшей мере части РНКтранскрипта гена ALAS1, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Варианты осуществления композиций, описанных в настоящем изобретении, также включают iRNA с антисмысловой нитью с участком комплементарности, который составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, и практически комплементарен по меньшей мере части РНК-транскрипта гена ALAS1.
Соответственно, согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении описаны фармацевтические композиции, содержащие iRNA ALAS1 и фармацевтически приемлемый носитель, способы применения композиций для ингибирования экспрессии гена ALAS1, и способы применения фармацевтических композиций для лечения нарушений, связанных с экспрессией ALAS1.
I. Определения
В целях удобства значение определенных выражений и фраз, используемых в настоящем описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения, представлены ниже. При наличии очевидного несоответствия между использованием выражения в других частях настоящего описания и его определением, представленным в этом разделе, определение, данное в этом разделе, будет иметь преимущественную
- 28 036477 силу.
Каждый из G, С, А, Т и U, как правило, означает нуклеотид, который в качестве основания содержит гуанин, цитозин, аденин, тимидин и урацил соответственно. Однако, понятно, что выражение рибонуклеотид, или нуклеотид также может означать модифицированный нуклеотид, который подробнее описан ниже, или заменяющий фрагмент в качестве заместителя. Специалисту в данной области хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть замещены другими фрагментами без значительного изменения свойств в отношении спаривания оснований олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такой заменяющий фрагмент. Например, без ограничения, нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может образовывать пару оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть замещены в нуклеотидных последовательностях dsRNA, описанных в настоящем изобретении, нуклеотидами, содержащими, например, инозин. Согласно другому примеру аденин и цитозин в любом месте в олигонуклеотиде могут быть замещены гуанином и урацилом соответственно, с образованием неоднозначного спаривания оснований G-U с целевой mRNA. Последовательности, содержащие такие заменяющие фрагменты, пригодны для композиций и способов, описанных в настоящем изобретении. Используемое в данном документе выражение ALAS1 (также известное как ALAS-1; δаминолевулинатсинтаза 1; δ-ALA синтаза 1; синтаза 5' -аминолевулиновой кислоты 1; ALAS-H; ALASH; ALAS-N; ALAS3; ЕС2.3.1.37; 5-аминолевулинатсинтаза, неспецифическая, митохондриальная; ALAS; MIG4; OTTHUMP00000212619; OTTHUMP00000212620; OTTHUMP00000212621; OTTHUMP00000212622; индуцирующий миграцию белок 4; ЕС 2.3.1) относится к кодируемому ядром митохондриальному ферменту, который является первым и, как правило, скорость-лимитирующим ферментом в пути биосинтеза гема млекопитающих. ALAS 1 катализирует конденсацию глицина с сукцинил-КоА с образованием δ-аминолевулиновой кислоты (ALA). Ген ALAS1 человека экспрессируется повсеместно, находится в хромосоме 3р21.1 и, как правило, кодирует последовательность из 640 аминокислот. В отличие от этого, ген ALAS-2, который кодирует изозим, экспрессируется только в эритроцитах, находится в хромосоме Хр 11.21 и, как правило, кодирует последовательность из 550 аминокислот. Используемое в данном документе выражение белок ALAS1 означает любой вариант белка ALAS1 из любого вида (например, человека, мыши, низшего примата), а также его любые мутанты и фрагменты, которые сохраняют активность ALAS1. Аналогично, транскрипт ALAS1 относится к любому варианту транскрипта ALAS1 из любого вида (например, человека, мыши, низшего примата). Последовательность mRNA-транскрипта ALAS1 человека можно найти как NM_000688.4 (фиг. 3А и 3В; SEQ ID NO:1). Другой mRNA-транскрипт ALAS1 человека можно найти как NM_000688.5 (фиг. 4А и фиг. 4В; SEQ ID NO: 382). Уровень зрелого кодируемого белка ALAS1 регулируется гемом: высокие уровни гема подавляют зрелый фермент в митохондрии, в то время как низкие уровни гема активируют его. Было выявлено несколько образованных в результате альтернативного сплайсинга вариантов, кодирующих этот же белок.
Используемое в данном документе выражение iRNA, RNAi, средство на основе iRNA или средство для RNAi относится к средству, которое содержит РНК в том значении, в каком это выражение определено в данном документе, и которое опосредует целевое расщепление РНК-транскрипта, например, через путь с участием индуцируемого РНК комплекса сайленсинга (RISC). Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, влияет на ингибирование экспрессии ALAS1. Ингибирование экспрессии ALAS1 можно оценивать по снижению уровня mRNA ALAS1 или снижению уровня белка ALAS1. Использованное в данном документе выражение целевая последовательность относится к непрерывной части нуклеотидной последовательности молекулы mRNA, образованной в процессе транскрипции гена ALAS1, в том числе к mRNA, которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции. Целевая часть последовательности будет по меньшей мере достаточно длинной для того, чтобы выполнять роль субстрата для iRNA-направленного расщепления в этой части или рядом с этой частью. Например, целевая последовательность будет, как правило, составлять 9-36 нуклеотидов в длину, например, 15-30 нуклеотидов в длину, в том числе все поддиапазоны между ними. В качестве неограничивающих примеров целевая последовательность может состоять из 15-30 нуклеотидов, 15-26 нуклеотидов, 15-23 нуклеотидов, 15-22 нуклеотидов, 15-21 нуклеотида, 15-20 нуклеотидов, 15-19 нуклеотидов, 15-18 нуклеотидов, 15-17 нуклеотидов, 18-30 нуклеотидов, 18-26 нуклеотидов, 18-23 нуклеотидов, 18-22 нуклеотидов, 18-21 нуклеотида, 18-20 нуклеотидов, 19-30 нуклеотидов, 19-26 нуклеотидов, 19-23 нуклеотидов, 19-22 нуклеотидов, 19-21 нуклеотида, 19-20 нуклеотидов, 2030 нуклеотидов, 20-26 нуклеотидов, 20-25 нуклеотидов, 20-24 нуклеотидов, 20-23 нуклеотидов, 20-22 нуклеотидов, 20-21 нуклеотида, 21-30 нуклеотидов, 21-26 нуклеотидов, 21-25 нуклеотидов, 21-24 нуклеотидов, 21-23 нуклеотидов или 21-22 нуклеотидов.
Используемое в данном документе выражение нить, содержащая последовательность относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь из нуклеотидов, которая характеризуется последовательностью, обозначаемой с применением стандартной номенклатуры нуклеотидов.
Используемое в данном документе, и если не указано иное, выражение комплементарный при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению ко второй нуклео
- 29 036477 тидной последовательности означает способность олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизироваться и образовывать дуплексную структуру при определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как будет понятно специалисту в данной области. Такие условия, например, могут представлять собой жесткие условия, где жесткие условия могут включать: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES pH 6,4, 1 мМ EDTA, 50°С или 70°С в течение 12-16 ч с последующим отмыванием. Можно применять другие условия, такие как физиологически соответствующие условия, характерные для организма. Специалист в данной области сможет определить набор условий, наиболее подходящих для тестирования комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизированных нуклеотидов.
Комплементарные последовательности в iRNA, например, в dsRNA, описанных в данном документе, включают образование пар оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую полинуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность по всей длине одной или обеих нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности могут быть указаны в данном документе как полностью комплементарные по отношению друг к другу. Однако при указании первой последовательности как практически комплементарной по отношению ко второй последовательности, две последовательности могут быть полностью комплементарными, или они могут образовывать одну или несколько, но, как правило, не более 5, 4, 3 или 2 ошибочно спаренных пар оснований при гибридизации с образованием дуплекса вплоть до 30 пар оснований, с сохранением при этом способности гибридизоваться при условиях, наиболее соответствующих их конечному применению, например, ингибировании экспрессии гена посредством пути RISC. Однако когда два олигонуклеотида предназначены образовывать при гибридизации один или несколько однонитевых выступов, то такие выступы не будут считаться ошибочными спариваниями применительно к определению комплементарности. Например, dsRNA, содержащая один олигонуклеотид из 21 нуклеотида в длину и другой олигонуклеотид из 23 нуклеотидов в длину, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая полностью комплементарна более короткому олигонуклеотиду, может быть указана как полностью комплементарная для целей, описанных в данном документе.
Комплементарные последовательности, используемые в данном документе, могут также включать или могут быть образованы полностью из пар оснований, образованных не по модели Уотсона-Крика, и/или пар оснований, образованных из не встречающихся в природе и модифицированных нуклеотидов, в такой степени, при которой выполняются вышеуказанные требования по отношению к их способности гибридизоваться. Такие пары оснований, образованные не по модели Уотсона-Крика, включают без ограничения неоднозначное или хугстиновское спаривание оснований G:U.
Выражения комплементарный, полностью комплементарный и практически комплементарный в настоящем документе могут быть использованы по отношению к совпадению оснований между смысловой нитью и антисмысловой нитью dsRNA или между антисмысловой нитью средства на основе iRNA и целевой последовательностью, как будет понятно из контекста их использования.
Используемый в данном документе полинуклеотид, который практически комплементарен по меньшей мере части матричной РНК (mRNA) относится к полинуклеотиду, который практически комплементарен непрерывной части mRNA, представляющей интерес, (например, mRNA, кодирующей белок ALAS1). Например, полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части mRNA ALAS1, если последовательность практически комплементарна непрерывной части mRNA, кодирующей ALAS1. В качестве другого примера полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части mRNA ALAS1, если последовательность практически комплементарна непрерывной части mRNA, кодирующей ALAS1.
Выражение двунитевая РНК или dsRNA, используемое в данном документе, относится к iRNA, которая включает молекулу РНК или комплекс молекул с гибридизированным участком дуплекса, который содержит две антипараллельные и практически комплементарные нити нуклеиновых кислот, которые будут указаны как характеризующиеся смысловой и антисмысловой ориентацией по отношению к целевой РНК. Участок дуплекса может быть любой длины, обеспечивающей специфическое разрушение требуемой целевой РНК, например, посредством пути RISC, но диапазон длины которой, как правило, будет составлять 9-36 пар оснований, например, 15-30 пар оснований в длину. С учетом дуплекса из 9-36 пар оснований, дуплекс может быть любой длины в этом диапазоне, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 или в любом поддиапазоне между ними, в том числе без ограничения 15-30 пар оснований, 15-26 пар оснований, 15-23 пары оснований, 15-22 пары оснований, 15-21 пару оснований, 15-20 пар оснований, 15-19 пар оснований, 1518 пар оснований, 15-17 пар оснований, 18-30 пар оснований, 18-26 пар оснований, 18-23 пары оснований, 18-22 пары оснований, 18-21 пару оснований, 18-20 пар оснований, 19-30 пар оснований, 19-26 пар оснований, 19-23 пары оснований, 19-22 пары оснований, 19-21 пару оснований, 19-20 пар оснований, 20-30 пар оснований, 20-26 пар оснований, 20-25 пар оснований, 20-24 пары оснований, 20-23 пары оснований, 20-22 пары оснований, 20-21 пару оснований, 21-30 пар оснований, 21-26 пар оснований, 21-25 пар оснований, 21-24 пары оснований, 21-23 пары оснований или 21-22 пары оснований. dsRNA, образо
- 30 036477 ванные в клетке при обработке дайсером и подобными ферментами, как правило, находятся в диапазоне 19-22 пар оснований в длину. Одна нить участка дуплекса dsDNA содержит последовательность, которая практически комплементарна участку целевой РНК. Две нити, образующие дуплексную структуру, могут быть получены из одной молекулы РНК по меньшей мере с одним самокомплементарным участком, или могут быть получены из двух или более отдельных молекул РНК. Если участок дуплекса образован из двух нитей одной молекулы, то молекула может иметь участок дуплекса, отделенный однонитевой цепью нуклеотидов (называемой в данном документе петля шпилька) между 3'-концом одной нити и 5'концом соответствующей другой нити, образующей дуплексную структуру. Петля шпилька может содержать по меньшей мере один неспаренный нуклеотид; согласно некоторым вариантам осуществления петля шпилька может содержать по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 23 или более неспаренных нуклеотидов. Если две практически комплементарные нити dsRNA составлены из отдельных молекул РНК, то эти молекулы не должны, но могут быть соединены ковалентной связью. Если эти две нити ковалетно соединены посредством способов, отличных от петли шпильки, то соединяющая структура называется линкер. Выражение siRNA также используют в данном документе для обозначения dsRNA, описанной выше.
Согласно другому варианту осуществления средство на основе iRNA может быть однонитевой siRNA, которую вводят в клетку или организм для ингибирования целевой mRNA. Однонитевые средства для RNAi связываются с Argonaute 2 комплекса RISC, обладающим эндонуклеазной активностью, который затем расщепляет целевую mRNA. Однонитевые siRNA, как правило, составляют 15-30 нуклеотидов и химически модифицированы. Конструирование и тестирование однонитевых siRNA описаны в патенте США № 8101348 и в Lima et al. (2012) Cell 150: 883-894, полное содержание каждого из которых, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки.
Любые из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе (например, последовательностей, представленные в табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20 или в табл.21-40), можно применять в качестве однонитевой siRNA, описанной в данном документе или химически модифицированной способами, описанными в Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894.
Согласно другому аспекту средство на основе РНК представляет собой молекулу однонитевой антисмысловой РНК. Молекула однонитевой антисмысловой РНК комплементарна последовательности в целевой mRNA. Молекулы однонитевой антисмысловой РНК могут ингибировать трансляцию стехиометрическим образом путем спаривания оснований с mRNA и физического нарушения механизма трансляции, см., Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1: 347-355. Альтернативно, однонитевые антисмысловые молекулы ингибируют целевую mRNA путем гибридизации с целью и расщепления цели посредством расщепления с помощью RNaseH. Молекула однонитевой антисмысловой РНК может составлять от приблизительно 10 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину и иметь последовательность, которая комплементарна целевой последовательности. Например, молекула однонитевой антисмысловой РНК может содержать последовательность, которая включает по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов из любой из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, например, последовательностей, представленных в любой из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20 или в табл. 21-40.
Специалист в данной области поймет, что выражение молекула РНК или молекула рибонуклеиновой кислоты охватывает не только молекулы РНК, экспрессируемые или встречающиеся в природе, но также аналоги и производные РНК, содержащие один или несколько рибонуклеотидных/рибонуклеозидных аналогов или производных, описанных в данном документе или известных из уровня техники. Строго говоря, рибонуклеозид включает нуклеозидное основание и рибозу, а рибунуклеотид представляет собой рибонуклеозид с одной, двумя или тремя фосфатными фрагментами. Однако, выражения рибунуклеозид и рибонуклеотид, используемые в данном документе, можно считать эквивалентными. РНК можно модифицировать в отношении структуры нуклеотидных оснований, структуры рибозы или структуры рибозо-фосфатного остова, например, как описано ниже в данном документе. Однако, молекулы, содержащие рибонуклеозидные аналоги или производные, должны сохранять способность образовывать дуплекс. В качестве неограничивающих примеров молекула РНК также может включать по меньшей мере один модифицированный рибонуклеозид, в том числе без ограничения 2'-О-метил-модифицированный нуклеозид, нуклеозид, содержащий 5' фосфотиоатную группу, концевой нуклеозид, соединенный с группой производного холестерила или группой бисдециламида додекановой кислоты, запертый нуклеозид, ациклический нуклеозид, нуклеозид с удаленными основаниями, 2'дезокси-2'-фтормодифицированный нуклеозид, 2'-аминомодифицированный нуклеозид, 2'-алкилмодифицированный нуклеозид, морфолиновый нуклеозид, фосфорамидат или нуклеозид, содержащий не встречающиеся в природе основания, или их комбинацию. Альтернативно, молекула РНК может содержать по меньшей мере два модифицированных рибонуклеозида, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или более, вплоть до полной длины молекулы dsRNA. Модификации не обязательно должны быть одинаковыми для каждого из такого множества
- 31 036477 модифицированных рибонуклеозидов в молекуле РНК. Согласно одному варианту осуществления модифицированные РНК, предполагаемые для применения в способах и композициях, описанных в данном документе, представляют собой пептидо-нуклеиновые кислоты (PNA), которые характеризуются способностью образовывать необходимую дуплексную структуру, и которые обеспечивают или опосредуют специфическое разрушение целевой РНК, например, посредством пути RISC.
Согласно одному аспекту модифицированный рибонуклеозид включает дезоксирибонуклеозид. В таком случае средство на основе iRNA может содержать один или несколько дезоксирибонуклеозидов, в том числе, например, дезоксирибонуклеозидный(дезоксирибонуклеозидные) выступающий(выступающие) конец(концы) или один или несколько дезоксинуклеозидов в двунитевой части dsRNA. Согласно определенным вариантам осуществления процентное содержание в молекуле РНК дезоксирибонуклеозидов составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или выше (но не 100%) дезоксирибонуклеозидов, например, в одной или обеих нитях. Согласно другим вариантам осуществления выражение iRNA не охватывает двунитевую молекулу ДНК (например, встречающуюся в природе двунитевую молекулу ДНК или молекулу ДНК, содержащую 100% дезоксинуклеозидов). Согласно одному аспекту средство для РНК-интерференции включает однонитевую РНК, которая взаимодействует с целевой последовательностью РНК для расщепления целевой РНК. Без углубления в теорию, длинная двунитевая РНК, введенная в клетки, разрезается на siRNA эндонуклеазой III типа, известной как дайсер (Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485). Дайсер, фермент, подобный рибонуклеазе III типа, обеспечивает процессинг dsRNA на короткие интерферирующие РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными 3'-выступающими концами из двух оснований (Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). siRNA затем включаются в индуцируемый РНК комплекс сайленсинга (RISC), в котором одна или несколько хеликаз раскручивают дуплекс siRNA, что позволяет комплементарной антисмысловой нити направлять целевое распознавание (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). После связывания с соответствующей целевой mRNA одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляет цель для индукции сайленсинга (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Таким образом, согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к однонитевой РНК, которая способствует образованию RISC-комплекса с осуществлением сайленсинга целевого гена.
Используемое в данном документе выражение нуклеотидный выступающий конец относится по меньшей мере к одному неспаренному нуклеотиду, который выступает из дуплексной структуры iRNA, например, dsRNA. Например, если 3'-конец одной нити dsRNA выходит за пределы 5'-конца другой нити или наоборот, то образуется нуклеотидный выступающий конец. dsRNA может содержать выступающий конец по меньшей мере из одного нуклеотида; альтернативно, выступающий конец может содержать по меньшей мере два нуклеотида, по меньшей мере три нуклеотида, по меньшей мере четыре нуклеотида, по меньшей мере пять нуклеотидов или более. Нуклеотидный выступающий конец может содержать нуклеотидный/нуклеозидный аналог или состоять из нуклеотидного/нуклеозидного аналога, в том числе дезоксинуклеотида/нуклеозида. Выступающий(выступающие) конец(концы) может(могут) находиться в пределах смысловой нити, антисмысловой нити или их комбинации. Кроме того, нуклеотид(нуклеотиды) выступающего конца может(могут) присутствовать на 5'-конце, 3'-конце или обоих концах или антисмысловой, или смысловой нити dsRNA.
Согласно одному варианту осуществления антисмысловая нить dsRNA имеет выступающий конец из 1-10 нуклеотидов на 3'-конце и/или 5'-конце. Согласно одному варианту осуществления смысловая нить dsRNA имеет выступающий конец из 1-10 нуклеотидов на 3'-конце и/или 5'-конце. Согласно другому варианту осуществления один или несколько нуклеотидов выступающего конца замещают нуклеозидтрифосфатом.
Выражение тупой конец или с тупыми концами, используемые в данном документе в отношении dsRNA, означают, что на данном терминальном конце dsRNA отсутствуют неспаренные нуклеотиды или нуклеотидные аналоги, т. е., отсутствует нуклеотидный выступающий конец. Один или оба конца dsRNA могут быть тупыми. Если оба конца dsRNA являются тупыми, то dsRNA называется dsRNA с тупыми концами. Для внесения ясности, dsRNA с тупыми концами представляет собой dsRNA, которая является тупой по обоим концам, т. е., ни на одном из концов молекулы нет нуклеотидного выступающего конца. Чаще всего такая молекула будет двунитевой по всей длине.
Выражение антисмысловая нить или направляющая нить относится к нити iRNA, например dsRNA, которая включает участок, который практически комплементарен целевой последовательности. Используемое в данном документе выражение участок комплементарности относится к участку антисмысловой нити, который практически комплементарен последовательности, например, целевой последовательности, определенной выше. Если участок комплементарности не полностью комплементарен целевой последовательности, то ошибочные спаривания могут находиться во внутренних или концевых участках молекулы. Как правило, допустимые в наибольшей степени ошибочные спаривания находятся в концевых участках, например, по 5, 4, 3 или 2 нуклеотиду 5'- и/или 3'-конца.
Выражение смысловая нить, или сопровождающая нить, используемое в данном документе, относится к нити iRNA, которая включает участок, практически комплементарный участку антисмысловой нити, как это выражение определено выше.
- 32 036477
Используемое в данном документе выражение SNALP относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид. SNALP представляет собой везикулу из липидов, покрывающих внутреннее пространство со сниженным водным содержимым, содержащий нуклеиновую кислоту, такую как iRNA, или плазмиду, из которой транскрибируется iRNA. SNALP описаны, например, в опубликованных патентных заявках США №№ 20060240093, 20070135372 и международной заявке № WO 2009082817. Эти заявки включены в данный документ при помощи ссылки по всей своей полноте.
Специалистам в данной области понятно, что введение в клетку в отношении iRNA означает облегчение или осуществление захвата или абсорбции клеткой. Абсорбция или захват iRNA может происходить путем спонтанных диффузионных или активных клеточных процессов, или при помощи вспомогательных средств или приспособлений. Значение этого выражения не ограничено клетками in vitro; iRNA также может быть введена в клетку, при этом клетка является частью живого организма. В таком случае введение в клетку будет включать доставку в организм. Например, в случае in vivo доставки iRNA может быть инъецирована в определенный участок ткани или введена системно. In vivo доставку также можно осуществлять с помощью системы доставки на основе Р-глюкана, такой как описанные в патентах США №№ 5032401 и 5607677, и публикации патента США № 2005/0281781, которые включены в данный документ при помощи ссылки во всей свой полноте. In vitro введение в клетку включает известные из уровня техники способы, такие как электропорация и липофекция. Дополнительные подходы описаны ниже в данном документе или известны из уровня техники.
Используемое в данном документе выражение модулировать экспрессию относится по меньшей мере к частичному ингибированию или частичной активации экспрессии гена ALAS1 в клетке, обработанной композицией на основе iRNA, описанной в данном документе, относительно экспрессии ALAS1 в контрольной клетке. Контрольная клетка включает необработанную клетку, или клетку, обработанную нецелевой контрольной iRNA.
Выражения активировать, усиливать, активировать экспрессию, повышать экспрессию и т. п., в части данного документа, где они относятся к гену ALAS1, относятся по меньшей мере к частичной активации экспрессии гена ALAS1, которая проявляется в повышении количества mRNA ALAS I, которую можно выделить из первой клетки или группы клеток или выявить в первой клетке или группе клеток, в которой ген ALAS1 транскрибируется, и которая была обработана или которые были обработаны с повышением экспрессии гена ALAS1 относительно второй клетки или группы клеток, практически идентичных первой клетке или группе клеток, но которая не была обработана или которые не были обработаны подобным образом (контрольные клетки).
Согласно одному варианту осуществления экспрессия гена ALAS1 активирована по меньшей мере приблизительно на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% путем введения iRNA, описанной в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления ген ALAS1 активирован по меньшей мере приблизительно на 60, 70 или 80% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия гена ALAS1 активирована по меньшей мере приблизительно на 85, 90 или 95% или более путем введения iRNA, описанной в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия гена ALAS1 повышена по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 1000 раз или более в клетках, обработанных iRNA, описанной в данном документе, относительно экспрессии в необработанных клетках. Активация экспрессии малыми dsRNA описана, например, в Li et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:17337-42, и в US20070111963 и US2005226848, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
Выражения осуществлять сайленсинг, ингибировать экспрессию, осуществлять негативную регуляцию, подавлять экспрессию и т. п. в части данного документа, где они относятся к гену ALAS1, относятся по меньшей мере к частичному подавлению экспрессии гена ALAS1, что оценивают, например, по экспрессии mRNA ALAS1, экспрессии белка ALAS1 или другому показателю, функционально связанному с экспрессией гена ALAS1 (например, концентрациям ALA или PBG в плазме или моче). Например, ингибирование экспрессии ALAS1 может проявляться в снижении количества mRNA ALAS I, которая может быть выделена из первой клетки или группы клеток или выявлена в первой клетке или группе клеток, в которых ген ALAS1 транскрибируется, и которая была обработана или которые были обработаны так, что экспрессия гена ALAS1 ингибируется относительно контроля. Контролем может быть вторая клетка или группа клеток, практически идентичная первой клетке или группе клеток, за исключением того, что вторая клетка или группа клеток не была обработана подобным образом (контрольные клетки). Степень ингибирования, как правило, выражена в виде процента контрольного уровня, например, ( mRNA в контрольных клетках) - (mRNA в обработанных клетках) θθο/ (mRNA в контрольных клетках)
Альтернативно, степень ингибирования может быть выражена с точки зрения снижения показателя, который функционально связан с экспрессией гена ALAS1, например количества белка, кодируемого геном ALAS 1, или уровня одного или нескольких порфиринов. Снижение показателя, функционально
- 33 036477 связанного с экспрессией гена ALAS 1, подобным образом может быть выражено в виде процента от контрольного уровня. В целом, сайленсинг гена ALAS1 можно определять в любой клетке, экспрессирующей ALAS1 либо конститутивно, либо при помощи генной инженерии, и при помощи любого подходящего анализа. Однако, если требуется информация для определения, ингибирует ли данная iRNA экспрессию гена ALAS 1 в определенной степени и, таким образом, охватывается настоящим изобретением, роль такой информации будут выполнять анализы, представленные ниже в примерах.
Например, в некоторых случаях экспрессия гена ALAS1 подавляется по меньшей мере приблизительно на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления ген ALAS1 подавляется по меньшей мере на приблизительно 60, 65, 70, 75 или 80% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления ген ALAS 1 подавляется по меньшей мере приблизительно на 85, 90, 95, 98 или 99% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении.
Используемые в контексте экспрессии ALAS1 выражения лечить, осуществлениея лечения, лечение т.п. относятся к ослаблению или облегчению патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS 1 (например, патологических процессов, включающих порфирины или нарушения в рамках порфиринового пути, такие как, например, порфирии). В контексте настоящего изобретения в части, касающейся любых из других состояний, упомянутых ниже в данном документе (кроме патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1), выражения лечить, лечение и т.п. означают предупреждение, облегчение или ослабление по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с таким состоянием, или замедление или устранение прогрессирования или прогнозирование прогрессирования такого состояния. Например, способы, описанные в данном документе, при использовании для лечения порфирии, могут служить для облегчения или предупреждения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией (например, болевых ощущений), снижения тяжести или частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, возникнет при воздействии провоцирующего фактора, укорочения приступа, связанного с порфирией, и/или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, гепатоцеллюлярного рака или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии)). Таким образом, если контекст явно не указывает на иное, предполагается, что выражения лечить, лечение и т.п. охватывают профилактику, например предупреждение нарушения и/или симптомов нарушений, связанных с экспрессией ALAS1.
Под выражением снижать в контексте маркера или симптома нарушения понимают статистически или клинически значимое снижение такого уровня. Снижение, например, может составлять по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или более и, как правило, вплоть до уровня, соответствующего уровню в пределах нормы для индивида без такого нарушения.
Используемые в данном документе фразы терапевтически эффективное количество и профилактически эффективное количество относятся к количеству, которое дает терапевтическое преимущество при лечении, предупреждении или контроле патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1. Конкретное количество, которое является терапетически эффективным, может быть легко определено рядовым врачом, и может варьировать в зависимости от факторов, известных в уровне техники, таких как, например, тип патологического процесса, история болезни и возраст пациента, стадия патологического процесса и введение других средств.
Используемое в данном документе выражение фармацевтическая композиция содержит фармакологически эффективное количество iRNA и фармацевтически приемлемый носитель. Используемое в данном документе выражение фармакологически эффективное количество, терапевтически эффективное количество или просто эффективное количество относится к такому количеству iRNA, эффективному для получения предполагаемого фармакологического, терапевтического или превентивного результата. Например, в способе лечения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1 (например, в способе лечения порфирии), эффективное количество включает количество, эффективное для облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, количество, эффективное для снижения частоты приступов, количество, эффективное для снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, возникнет при воздействии провоцирующего фактора, или количество, эффективное для снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака). Например, если определенное клиническое лечение считается эффективным, когда имеет место по меньшей мере 10% снижение измеряемого показателя, ассоциированного с заболеванием или нарушением, то терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения этого заболевания или нарушения представляет собой количество, необходимое для получения по меньшей мере 10% снижения этого значения. Например, терапевтически эффективное количество iRNA, нацеленной на ALAS1, может снижать уровни белка ALAS1 на любое измеряемое количество, например по меньшей мере на 10, 20, 30, 40 или 50%.
Выражение фармацевтически приемлемый носитель относится к носителю для введения терапевтического средства. Такие носители включают без ограничения солевой раствор, забуференный солевой
- 34 036477 раствор, декстрозу, воду, глицерол, этанол и их комбинацию. Выражение, в частности, исключает среду для культивирования клеток. Для лекарственных средств, вводимых перорально, фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения фармацевтически приемлемые вспомогательные средства, такие как инертные разбавители, средства для улучшения распадаемости, связывающие средства, смазывающие средства, подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты. Подходящие инертные разбавители включают карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция и лактозу, в то время как кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются подходящими средствами для улучшения распадаемости. Связывающие средства могут включать крахмал и желатин, в то время как смазывающие средства, если присутствуют, будут представлять собой, как правило, стеарат магния, стеариновую кислоту и тальк. При необходимости, таблетки могут быть покрыты веществом, таким как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для задержки всасывания в желудочнокишечном тракте. Средства, включенные в составы лекарственных средств, дополнительно описаны ниже в данном документе.
Выражение приблизительно в отношении числа или числового диапазона означает, что указанное число или числовой диапазон является приближением в пределах колебания экспериментальных данных (или в пределах статистической ошибки эксперимента), и, таким образом, число или числовой диапазон могут варьировать, например, от 1 до 15% указанного числа или числового диапазона.
II. Средства на основе iRNA
В данном документе описаны средства на основе iRNA, которые ингибируют экспрессию гена ALAS 1. Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA включает молекулы двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA) для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или у субъекта (например, у млекопитающего, например, у человека с порфирией), где dsRNA включает антисмысловую нить с участком комплементарности, который комплементарен по меньшей мере части mRNA, образованной в результате экспрессии гена ALAS1, и где участок комплементарности составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, и где dsRNA при контакте с клеткой, экспрессирующей ген ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1 по меньшей мере на 10%, при анализе, например, с помощью PCR или способа на основе разветвленной ДНК (bDNA), или с помощью способа на основе определения белков, такого как вестерн-блоттинг. Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA активирует экспрессию гена ALAS1 в клетке или у млекопитающего. Экспрессию гена ALAS1 в культуре клеток, таких как клетки COS, клетки HeLa, первичные гепатоциты, клетки HepG2, первичные культивируемые клетки, или в биологическом образце от субъекта, можно анализировать путем измерения уровней mRNA ALAS1, например, с помощью анализа bDNA или TaqMan, или путем измерения уровней белка, например, с помощью имунофлуоресцентного анализа, с применением, например, методик вестерн-блоттинга или проточной цитометрии.
dsRNA включает две нити РНК, которые достаточно комплементарны для гибридизации, с образованием дуплексной структуры при условиях, в которых dsRNA будет применяться. Одна нить dsRNA (антисмысловая нить) включает участок комплементарности, который практически комплементарен, и, как правило, полностью комплементарен целевой последовательности, полученной из последовательности mRNA, образованной в ходе экспрессии гена ALAS 1. Другая нить (смысловая нить) включает участок, который комплементарен антисмысловой нити, таким образом, что две нити гибридизируются и образуют дуплексную структуру при объединении при подходящих условиях. Как правило, дуплексная структура составляет 15-30 включительно, чаще 18-25 включительно, еще чаще 19-24 включительно, и чаще всего 19-21 пару оснований в длину включительно. Аналогично, участоккомплементарности целевой последовательности составляет 15-30 включительно, чаще 18-25 включительно, еще чаще 19-24 включительно, и чаще всего 19-21 нуклеотид в длину включительно. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA составляет 15-20 нуклеотидов в длину включительно, и согласно другим вариантам осуществления dsRNA составляет 25-30 нуклеотидов в длину включительно. Специалисту в данной области будет понятно, что целевой участок РНК, предназначенный для расщепления, зачастую будет представлять собой часть более крупной молекулы РНК, обычно молекулы mRNA. При необходимости, часть целевой mRNA представляет собой непрерывную последовательность целевой mRNA достаточной длины, чтобы быть субстратом для RNAi-направленного расщепления (т.е., расщепления посредством пути RISC). dsRNA с дуплексами по меньшей мере из 9 пар оснований могут при некоторых обстоятельствах опосредовать RNAi-направленное расщепление РНК. Наиболее часто цель будет составлять по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину, например 15-30 нуклеотидов в длину.
Специалисту в данной области также будет понятно, что участок дуплекса представляет собой основную функциональную часть dsRNA, например, участок дуплекса из 9-36, например, 15-30 пар оснований. Таким образом, согласно одному варианту осуществления в том случае, когда он процессирован до функционального дуплекса, например, из 15-30 пар оснований, который нацелен на необходимую РНК для расщепления, молекула РНК или комплекс из молекул РНК с участком дуплекса из более 30 пар оснований представляет собой dsRNA. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что согласно одному варианту осуществления miRNA представляет собой dsRNA. Согласно другому варианту осуществления dsRNA представляет собой не встречающуюся в природе miRNA. Согласно другому варианту осуществления средство на основе iRNA, пригодное для нацеливания экспрессии ALAS1, не
- 35 036477 образуется в целевой клетке путем расщепления более крупной dsRNA.
dsRNA, описанная в данном документе, может дополнительно включать один или несколько однонитевых нуклеотидных выступающих концов. dsRNA может быть синтезирована при помощи стандартных способов, известных из уровня техники, дополнительно описанных ниже, например, с применением автоматического синтезатора ДНК, такого как коммерчески доступные, например, от Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Согласно одному варианту осуществления ген ALAS1 представляет собой ген ALAS1 человека. Согласно другому варианту осуществления ген ALAS1 представляет собой ген ALAS1 мыши или крысы.
Согласно конкретным вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность, раскрытую в данном документе, например, в табл. 21-40, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность, раскрытую в данном документе, например, в табл. 21-40.
Согласно конкретным вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность из табл. 2 или таблицы 3, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность из табл. 2 или 3. Согласно вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15. Согласно вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20.
Согласно одному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из смысловых последовательностей, представленных в данном документе, например, в табл. 21-40, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из антисмысловых последовательностей, представленных в данном документе, например, в табл. 21-40.
Согласно одному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из группы последовательностей, представленных в табл. 2 и 3, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из табл. 2 и 3. Согласно дополнительному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из группы последовательностей, представленных в табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15. Согласно дополнительному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из табл. 2, 3,
6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20.
Согласно вариантам осуществления iRNA представляет собой AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876,AD61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892,AD60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140,AD61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892 илиAD60419 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций упомянутых выше dsRNA). Согласно вариантам осуществления iRNA содержит антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности (в том числе одной или нескольких (например, всех модификаций)), выбранной из антисмысловой последовательности AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892 или AD-60419. Согласно вариантам осуществления iRNA содержит смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности (и/или одной или нескольких (например, всех модификаций)), выбранной из AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892 или AD-60419.
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит по- 36 036477 следовательность или состоит из последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе.
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60519 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-61193 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60819, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60819 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления представлена iRNA для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности), и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности). Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, и/или (ii) смысловую нить, которая состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, за исключением того, что антисмысловая нить и/или смысловая нить dsRNA отличается 1, 2 или 3 нуклеотидами от соответствующей антисмысловой и/или смысловой последовательности AD60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819.
Последовательности и модификации AD-60489, AD-60519, AD-61193 и AD-60819, раскрытые в данном документе, показаны в табл. 44.
Согласно одному варианту осуществления iRNA представляет собой ALN-60519. ALN-60519 представляет собой химически синтезированный двунитевой олигонуклеотид, ковалентно связанный с лигандом, содержащим три остатка N-ацетилгалактозамина (GalNAc) (обозначенных на фиг. 57). Согласно одному варианту осуществления все нуклеотиды ALN-60519 являются 2'-ОМе или 2'-Fмодифицированными и соединены посредством 3'-5'-фосфодиэфирных связей с образованием сахарофосфатного остова олигонуклеотида. Смысловая нить и антисмысловая нить ALN-60519 содержат 21 и 23 нуклеотида соответственно. 3'-конец смысловой нити ALN-60519 конъюгирован с фрагментом GalNAc с тремя разветвлениями (называемым в данном документе L96) посредством фосфодиэфирной связи. Антисмысловая нить содержит четыре фосфотиоатных связи - две на 3'-конце и две на 5'-конце.
Смысловая нить ALN-60519 содержит две фосфотиоатных связи на 5'-конце. 21 нуклеотид смысловой нити ALN-60519 гибридизируется с комплементарным 21 нуклеотидом антисмысловой нити, образуя, таким образом, 21 пару нуклеотидных оснований и выступающий конец из двух оснований на 3'конце антисмысловой нити. Две одиночные нити, смысловая нить и антисмысловая нить ALN-60519 могут быть синтезированы при помощи стандартного твердофазного синтеза олигонуклеотидов, с использованием стандартной химической структуры фосфородиамита с 5'-гидроксильной группой, защищенной в виде диметокситрифенилметилового (DMT) эфира. Каждая нить может быть собрана от 3'-5'-конца последовательным добавлением защищенных нуклеозидных фосфорамидитов.
Согласно этим аспектам одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, при этом одна из последовательностей практически комплементарна последовательности mRNA, полученной в результате экспрессии гена ALAS1. Соответственно dsRNA будет включать два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан в данном документе как смысловая нить, и второй олигонуклеотид описан как соответствующая антисмысловая нить. Описанные в другой части в данном документе и известные из уровня техники комплементарные последовательности dsRNA также мо- 37 036477 гут содержаться в виде самокомплементарных участков одной молекулы нуклеиновой кислоты, в отличие от пребывания с составе отдельных олигонуклеотидов.
Специалисту в данной области хорошо известно, что dsRNA с дуплексной структурой из 20-23, в частности, из 21 пары оснований были признаны особенно эффективными в индуцировании РНКинтерференции (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Однако другими исследователями было обнаружено, что более короткие или более длинные дуплексные структуры РНК также могут быть эффективными. Согласно вариантам осуществления, описанным выше, в соответствии с природой олигонуклеотидных последовательностей, представленных в таблицах в данном документе, dsRNA, описанные в данном документе, могут включать по меньшей мере одну нить длиной минимум 21 нуклеотид. С достаточной вероятностью можно предполагать, что более короткие дуплексы с одной из последовательностей, раскрытых в данном документе, за исключением лишь нескольких нуклеотидов на одном или обоих концах, могут быть так же эффективны относительно dsRNA, описанных выше. Поэтому, согласно настоящему изобретению рассматриваются dsRNA с частичной последовательностью по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, раскрытых в данном документе, и различающихся их способностью ингибировать экспрессию гена ALAS1 не более чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от dsRNA, содержащей полную последовательность.
Кроме того, РНК, представленные в таблицах в данном документе, идентифицируют сайт в ALAS1транскрипте, который восприимчив к RISC-опосредованному расщеплению. Соответственно, настоящее изобретение также описывает iRNA, которые нацелены на одну из таких последовательностей. В контексте данного документа подразумевают, что iRNA нацелена на конкретный сайт РНК-транскрипта, если iRNA способствует расщеплению транскрипта в любом месте в этом конкретном сайте. Такая iRNA будет, как правило, включать по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, представленных в данном документе, например, в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18, 20 и в табл. 21-40, объединенных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, полученными из участка, прилегающего к выбранной последовательности в гене ALAS1.
Хотя целевая последовательность, как правило, составляет 15-30 нуклеотидов в длину, имеет место широкий спектр пригодности конкретных последовательностей в этом диапазоне для направления расщепления любой определенной целевой РНК. Ряд пакетов программного обеспечения и рекомендации, изложенные в данном документе, служат в качестве руководства для идентификации оптимальных целевых последовательностей для любого данного целевого гена, но также можно воспользоваться эмпирическим подходом, в котором окно или рамку данного размера (в качестве неограничивающего примера 21 нуклеотид) буквально или условно (в том числе, например, in silico) накладывают на целевую последовательность РНК для идентификации последовательностей в размерном диапазоне, которые могут выполнять роль целевых последовательностей. Передвигая окно последовательности постепенно на один нуклеотид выше или ниже относительно исходного расположения целевой последовательности, можно идентифицировать следующую потенциальную целевую последовательность, до тех пор, пока не будет идентифицирован полный набор возможных последовательностей для каждого данного выбранного целевого размера. С помощью этого способа, вместе с системным синтезом и тестированием идентифицированных последовательностей (с помощью анализов, описанных в данном документе, или известных из уровня техники) для идентификации таких последовательностей с оптимальными качествами, можно идентифицировать те последовательности РНК, которые при нацеливании средством на основе iRNA опосредуют наилучшее ингибирование экспрессии целевых генов. Таким образом, в то время как идентифицированные последовательности, например, в таблицах в данном документе, представляют эффективные целевые последовательности, предполагается, что дополнительная оптимизация эффективности ингибирования может быть достигнута путем постепенного перемещения окна на один нуклеотид выше или ниже относительно определенных последовательностей для идентификации последовательностей с такими же или лучшими характеристиками ингибирования.
Также предполагается, что для любой идентифицированной последовательности, например, в таблицах в данном документе, дополнительная оптимизация может быть достигнута целенаправленно либо добавлением, либо удалением нуклеотидов для получения более длинных или более коротких последовательностей, и тестированием таких последовательностей и последовательностей, полученных путем перемещения окна более длинного или более короткого размера выше или ниже относительно целевой РНК от данной точки. Также объединение этого подхода для получения новых кандидатных целей вместе с тестированием эффективности iRNA на основе этих целевых последовательностей в анализе ингибирования, известного из уровня техники или описанного в данном документе, может иметь результатом дополнительные улучшения в эффективности ингибирования. Более того, такие оптимизированные последовательности можно корректировать, например, введением модифицированных нуклеотидов, описанных в данном документе или известных из уровня техники, добавлением или изменениями выступающего конца, или другими модификациями, известными из уровня техники и/или описанными в данном документе для дополнительной оптимизации молекулы (например, повышения стабильности в сыворотке или периода полужизни в крови, повышения термостабильности, улучшения трансмембранной доставки, нацеливания на конкретную локацию или тип клеток, повышения степени взаимодействия с
- 38 036477 ферментами в рамках пути сайленсинга, повышения уровня высвобождения из эндосом и т. д.) в качестве ингибитора экспрессии.
iRNA, описанная в данном документе, может содержать одно или несколько ошибочно спаренных оснований относительно целевой последовательности. Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, содержит не более 3 ошибочно спаренных оснований. Если антисмысловая нить iRNA содержит ошибочно спаренные основания относительно целевой последовательности, предпочтительно, чтобы эта область ошибочно спаренных оснований не располагалась в центре участка комплементарности. Если антисмысловая нить iRNA содержит ошибочно спаренные основания относительно целевой последовательности, предпочтительно, чтобы ошибочно спаренное основание было ограничено расположением по меньшей мере в последних 5 нуклеотидах либо от 5'- либо 3'-конца участка комплементарности. Например, для средства на основе iRNA из 23 нуклеотидов, нить РНК которой комплементарна участку гена ALAS1, нить РНК, как правило, не содержит ошибочно спаренного основания в центральных 13 нуклеотидах. Способы, описанные в данном документе, или способы, известные из уровня техники, можно применять для определения того, является ли iRNA, содержащая ошибочно спаренное основание относительно целевой последовательности, эффективной в ингибировании экспрессии гена ALAS 1. Рассмотрение эффективности iRNA с ошибочно спаренными основаниями в ингибировании экспрессии гена ALAS1 является важным, особенно, если известно, что конкретный участок комплементарности в гене ALAS1 характеризуется вариацией полиморфных последовательностей в популяции.
Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один конец dsRNA имеет однонитевой нуклеотидный выступающий конец из 1-4, как правило 1 или 2 нуклеотидов. dsRNA по меньшей мере с одним нуклеотидным выступающим концом неожиданным образом характеризуются более высокими ингибиторными свойствами относительно своих аналогов с тупыми концами. Согласно еще одному варианту осуществления РНК из iRNA, например, dsRNA, химически модифицирована для усиления стабильности или других предпочтительных характеристик. Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем изобретении, могут быть синтезированы и/или модифицированы способами, хорошо известными из уровня техники, такими как описанные в Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et at. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, который включен, таким образом, в данный документ при помощи ссылки. Модификации включают, например, (а) концевые модификации, например 5'концевые модификации (фосфорилирование, конъюгацию, инвертированные связи и т.д.), 3'-концевые модификации (конъюгацию, нуклеотиды ДНК, инвертированные связи и т.д.), (b) модификации оснований, например, замещение стабилизирующими основаниями, дестабилизирующими основаниями или основаниями, которые образуют пару оснований с широким спектром партнеров, удаление оснований (нуклеотиды с удаленными основаниями) или конъюгированные основания, (с) модификации сахаров (например, в 2'-положении или 4'-положении, или наличие ациклического сахара) или замещение сахара, а также (d) модификации остовов, в том числе модификацию или замещение фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры соединений РНК, пригодных в настоящем изобретении, включают без ограничения РНК, содержащие модифицированные остовы или отличные от природных межнуклеозидные связи. РНК с модифицированными скелетами включают, среди прочих, такие, которые не содержат атом фосфора в остове. Применительно к настоящему описанию, а также некоторым упоминаниям из уровня техники, модифицированные РНК без атома фосфора в пределах их межнуклеозидного остова также могут считаться олигонуклеозидами. Согласно конкретным вариантам осуществления модифицированные РНК будут содержать атом фосфора в их межнуклеозидном остове.
Остовы модифицированной РНК включают, например, фосфотиоаты, хиральные фосфотиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфотриэфиры, сложные аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другой алкил-фосфонаты, в том числе 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные тионоалкилфосфотриэфиры и борофосфаты с типичными 3'-5'-связями, их 2'-5'связанные аналоги и таковые, имеющие обратную ориентацию, где соседние пары нуклеозидных единиц связываются 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение приведенных выше фосфорсодержащих связей, включают без ограничения патенты США №№ 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821;5541316; 5550111;5563253; 5571799;5587361; 5625050; 6028188; 6124445; 6160109; 6169170; 6172209; 6239265; 6277603; 6326199; 6346614; 6444423; 6531590; 6534639; 6608035; 6683167; 6858715; 6867294; 6878805; 7015315; 7041816; 7273933; 7321029 и патент США RE39464, каждый из которых включен в даннй документ при помощи ссылки.
Остовы модифицированных РНК, которые не имеют атом фосфора, включают остовы, образованные короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы с морфолиновыми связями (частично образованные из части нуклеозида, содер- 39 036477 жащей сахар); силоксановые скелеты; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; содержащие алкен остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие, содержащие части смешанных компонентов N, О, S и СН2.
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение приведенных выше олигонуклеозидов, включают без ограничения патенты США №№ 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938;5434257; 5466677;5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
В других миметиках РНК, подходящих или предполагаемых для применения в iRNA, как сахар, так и межнуклеозидная связь, т.е. остов нуклеотидных единиц, замещены новыми группами. Единицы оснований сохраняются для гибридизации с соответствующим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик РНК, который, как было показано, обладает очень хорошими свойствами для гибридизации, называется пептидо-нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA остов РНК, содержащий сахар, замещен содержащим амид остовом, в частности аминоэтилглициновым остовом. Нуклеотидные основания сохраняются и соединяются непосредственно или опосредованно с атомами аза-азота в амидной части остова. Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение соединений PNA, включают без ограничения патенты США №№ 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки. Дополнительное описание соединений PNA можно найти, например, в Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящем изобретении, включают РНК с фосфотиоатными остовами и олигонуклеозиды с остовами с гетероатомами и, в частности, --CH2--NH--CH2--, --СН2-МСН3,)--О--СН2--[известный как метилен (метилимино) или MMI скелет], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --СН2-N(CH3)--N(CH3)--CH2-- и --N(CH3)--CH2--CH2-- [где нативный скелет сложного фосфодиэфира представлен как --О--Р--О--СН2--] упомянутого выше патента США № 5489677 и амидные остовы упомянутого выше патента США № 5602240. Согласно некоторым вариантам осуществления РНК, описанные в настоящем документе, характеризуются структурами морфолинового скелета согласно упомянутому выше патенту США № 5034506.
Модифицированные РНК также могут содержать один или несколько фрагментов с замещенным сахаром. iRNA, например, dsRNA, описанные в настоящем документе, могут включать в 2'-положении одно из следующих: ОН; F; О-, S- или N-алкил; О-, S- или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил или О-алкилО-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенными или незамещенными Ц-С^алкилом или С2-С10алкенилом и алкинилом. Иллюстративные пригодные модификации включают О^СН^ОЦСЩ, О(СН2)-пОСН3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, где n и m составляют от 1 до приблизительно 10. Согласно другим вариантам осуществления dsRNA включают в 2'-положении одно из следующих: низший Ц-С^алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств iRNA или группу для улучшения фармакодинамических свойств iRNA и другие заместители с подобными свойствами. Согласно некоторым вариантам осуществления модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'О--СН2СН2ОСН3, также известный как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), т.е. алкокси-алкоксигруппу. Другой иллюстративной модификацией является 2'диметиламинооксиэтокси, т.е. группа O(CH2)2ON(CH3)2, также известная как 2'-DMAOE, как описано ниже в примерах в данном документе, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известный из уровня техники как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е. 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2, также описанный ниже в примерах в данном документе.
Согласно другим вариантам осуществления средство на основе iRNA содержит один или несколько (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) ациклических нуклеотидов (или нуклеозидов). Согласно определенным вариантам осуществления смысловая нить или антисмысловая нить, или как смысловая нить, так и антисмысловая нить, включают менее пяти ациклических нуклеотидов на нить (например, четыре, три, два или один ациклический нуклеотид на нить). Один или несколько ациклических нуклеотидов могут быть расположены, например, в двунитевом участке смысловой или антисмысловой нити, или обеих нитей; на 5'-конце, 3'-конце, как 5'-, так и 3'-концах смысловой или антисмысловой нити, или обеих нитей средства на основе iRNA.
Согласно одному варианту осуществления один или несколько ациклических нуклеотидов находятся в положениях 1-8 смысловой или антисмысловой нити, или обеих. Согласно одному варианту осуществления один или несколько ациклических нуклеотидов находятся в антисмысловой нити в положениях 4-10 (например, положениях 6-8) от 5'-конца антисмысловой нити. Согласно другому варианту осуществления один или несколько ациклических нуклеотидов находятся на одном или обеих 3'-концевых выступающих концах средства на основе iRNA.
- 40 036477
Выражение ациклический нуклеотид или ациклический нуклеозид, используемое в данном документе, относится к любому нуклеотиду или нуклеозиду с ациклическим сахаром, например, ациклической рибозой. Иллюстративный ациклический нуклеотид или нуклеозид может включать нуклеотидное основание, например, встречающееся в природе или модифицированное нуклеотидное основание (например, нуклеотидное основание, описанное в данном документе). Согласно определенным вариантам осуществления связь между любыми из углеродов рибозы (С1, С2, С3, С4 или С5), независимо или в комбинации, отсутствует со стороны нуклеотида. Согласно одному варианту осуществления связь между углеродами С2-С3 рибозного кольца отсутствует, например, мономер ациклического 2'-3'-секонуклеотида. Согласно другим вариантам осуществления связь между С1-С2, С3-С4 или С4-С5 отсутствует (например, мономер 1'-2', 3'-4' или 4'-5'-секо-нуклеотида). Иллюстративные ациклические нуклеотиды раскрыты в US 8314227, включенном в данный документе при помощи ссылки во всей своей полноте. Например, ациклический нуклеотид может включать любой из мономеров D-J на фиг. 1-2 согласно US 8314227. Согласно одному варианту осуществления ациклический нуклеотид включает следующий мономер:
О-Р=О I где основание представляет собой нуклеотидное основание, например, встречающееся в природе или модифицированное нуклеотидное основание (например, нуклеотидное основание, описанное в данном документе).
Согласно определенным вариантам осуществления ациклический нуклеотид может быть модифицированным или дериватизированным, например, при объединении ациклического нуклеотида с другим фрагментом, например, лигандом (например, GalNAc, холестерином в качестве лигандов), алкилом, полиамином, сахаром, полипептидом, среди прочих.
Согласно другим вариантам осуществления средство на основе iRNA включает один или несколько ациклических нуклеотидов и одну или несколько LNA (например, LNA, описанную в данном документе). Например, один или несколько ациклических нуклеотидов и/или одна или несколько LNA могут находиться в смысловой нити, антисмысловой нити или обеих. Число ациклических нуклеотидов в одной нити может быть одинаковым или может отличаться от числа LNA в противоположной нити. Согласно определенным вариантам осуществления смысловая нить и/или антисмысловая нить содержит менее пяти LNA (например, четыре, три, два или одну LNA), расположенных в двунитевом участке или 3'выступающем конце. Согласно другим вариантам осуществления одна или две LNA расположены в двунитевом участке 3' -выступающего конца смысловой нити. Альтернативно, или в комбинации, смысловая нить и/или антисмысловая нить содержит менее пяти ациклических нуклеотидов (например, четыре, три, два или один ациклический нуклеотид) в двунитевом участке или 3' -выступающем конце. Согласно одному варианту осуществления смысловая нить средства на основе iRNA содержит одну или две LNA в 3'-выступающем конце смысловой нити, и один или два ациклических нуклеотида в двунитевом участке антисмысловой нити (например, в положениях 4-10 (например, положениях 6-8) от 5'-конца антисмысловой нити) средства на основе iRNA.
Согласно другим вариантам осуществления включение одного или нескольких ациклических нуклеотидов (отдельно или в дополнение к одной или нескольким LNA) в средство на основе iRNA приводит к одному или нескольким (или всем) из следующего: (i) снижению нецелевого эффекта; (ii) снижению участия сопровождающей нити в RNAi; (iii) повышению специфичности ведущей нити к ее целевой mRNA; (iv) снижению нецелевого эффекта microRNA; (v) повышению стабильности или (vi) повышению устойчивости к разрушению молекулы iRNA.
Другие модификации включают 2'-метокси (2'-ОСН3), 2'-аминопропокси (2'-OCH2CH2CH2NH2) и 2'фтор (2'-F). Подобные модификации также могут быть осуществлены в других положениях РНК из iRNA, в частности, в 3'-положении сахара в З'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных dsRNA и в 5'положении 5'-концевого нуклеотида. iRNA также могут содержать миметики Сахаров, такие как циклобутиловые фрагменты, вместо пентофуранозильного сахара. Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение таких структур с модифицированными сахарами, включают без ограничения патенты США №№ 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878;5446137;5466786;5514785;5519134;5567811;
5576427;5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 и 5700920, некоторые из которых принадлежат авторам настоящей заявки и каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
iRNA также может включать в себя модификации и замещения нуклеотидного основания (часто называемого в уровне техники просто основанием). Используемые в данном документе выражения немодифицированные или природные нуклеотидные основания включают пуриновые основания аденин
- 41 036477 (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотидные основания включают другие синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как 5-метилцитозин (5-те-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкил-производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкил-производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, δ-амино-, 8-тиол-, 8тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности, 5-бром-, 5трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, а также 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные нуклеотидные основания включают раскрытые в патенте США № 3687808, раскрытые в Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; раскрытые в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, раскрытые в Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, а также раскрытые в Sanghvi Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, В., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидных оснований особенно пригодны для повышения аффинности связывания олигомерных соединений, описанных в настоящем изобретении. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что 5-метилцитозиновые замещения повышают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,61,2°С (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. Т. and Lebleu, В., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и представляют собой иллюстративные замещения оснований, еще более конкретно при комбинировании с 2'-О-метоксиэтильными модификациями сахаров.
Иллюстративные патенты США, которые описывают получение определенных указанных выше модифицированных нуклеотидных оснований, а также других модифицированных нуклеотидных оснований, включают без ограничения указанный выше патент США №3687808, а также патенты США №№ 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066;5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5681941; 6015886; 6147200; 6166197; 6222025; 6235887; 6380368; 6528640; 6639062; 6617438; 7045610; 7427672 и 7495088, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки, и патент США № 5750692, также включенный в данный документ при помощи ссылки.
РНК из iRNA также может быть модифицирована с включением одной или нескольких (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) запертых нуклеиновых кислот (LNA) (также называемых в данном документе запертыми нуклеотидами). Согласно одному варианту осуществления запертая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотид с модифицированным рибозным фрагментом, в котором рибозный фрагмент содержит дополнительные мостиковые соединяющие, например, 2'- и 4'углероды. Такая структура эффективно запирает рибозу в 3'-эндо структурной конформации. Было показано, что добавление запертых нуклеиновых кислот в siRNA повышает стабильность siRNA в сыворотке, повышает термостабильность и снижает нецелевые эффекты (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(l): 439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Cane Ther 6(3): 833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12): 3185-3193).
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение нуклеотидов с запертыми нуклеиновыми кислотами, включают в себя без ограничения следующие: патенты США №№ 6268490; 6670461; 6794499; 6998484; 7053207; 7084125; 7399845 и 8314227, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте. Иллюстративные LNA включают без ограничения 2', 4'-С-метиленбициклонуклеотид (см., например, Wengel et al., международную публикацию согласно РСТ № WO 00/66604 и WO 99/14226).
Согласно другим вариантам осуществления средства на основе iRNA включают один или несколько (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) нуклеотидов с G-зажимом. Нуклеотид с G-зажимом представляет собой модифицированный аналог цитозина, где модификации придают способность связываться водородными связями как по Уотсону и Крику, так и по Хугстину, с комплементарным гуанином в дуплексе, см., например, Lin and Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc, 120, 8531-8532. Замещение одного аналога с G-зажимом в олигонуклеотиде может приводить к значительно повышенной термостабильности спирали и распознаванию ошибочно спаренных оснований при гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами. Включение таких нуклеотидов в молекулы iRNA может приводить к повышенной аффинности и специфичности к мишеням нуклеиновых кислот, комплементарным последовательностям или матричным нитям.
Потенциально стабилизирующие модификации на концах молекул РНК могут включать в себя N[(ацетиламинокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-NHAc), №(капроил-4-гидроксипролинол (Нур-С6), №(ацетил-4-гидроксипролинол (Hyp-NHAc), тимидин-2'-О-дезокситимидин (эфир), ^-(аминокапроил)4-гидроксипролинол (Нур-С6-амино), 2-докозаноил-уридин-3-фосфат, инвертированное основание dT(idT) и другие. Раскрытие такой модификации можно найти в публикации РСТ № WO 2011/005861.
- 42 036477
Мотивы iRNA
Согласно одному варианту осуществления последовательность смысловой нити может быть представлена формулой (I):
где каждая из i и j независимо равняется 0 или 1;
каждая из р и q независимо равняется 0-6;
каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 025 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;
каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 010 модифицированных нуклеотидов;
каждая np и nq независимо представляет собой выступающий нуклеотид; где Nb и Y имеют неодинаковую модификацию; и каждый из XXX, YYY и ZZZ независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов. Предпочтительно в YYY все нуклеотиды 2'-Fмодифицированы.
Согласно одному варианту осуществления Na и/или Nb имеет модификации чередующегося паттерна.
Согласно одному варианту осуществления мотив YYY находится в сайте расщепления смысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит участок дуплекса, составляющий 1723 нуклеотида в длину, то мотив YYY может находиться в сайте расщепления или рядом с ним (например, может находиться в положениях 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12 или 11, 12, 13) в смысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца.
Согласно одному варианту осуществления i равняется 1, a j равняется 0, или i равняется 0, a j равняется 1, или как i, так и j равняются 1. Смысловая нить, таким образом, может быть представлена следующими формулами:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (1с); или
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ib), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ic), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Id), каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно, Nb равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Каждая из X, Y и Z может быть одинаковой или отличной от остальных.
Согласно другим вариантам осуществления i равняется 0, a j равняется 0 и смысловая нить может быть представлена формулой:
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ia), каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Согласно одному варианту осуществления последовательность антисмысловой нити RNAi может быть представлена формулой (II):
где каждая из k и l независимо равняется 0 или 1;
каждая из р' и q' независимо равняется 0-6;
каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;
каждая Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую
- 43 036477
0-10 модифицированных нуклеотидов;
каждая np' и nq' независимо представляет собой выступающий нуклеотид;
где Nb' и Y' имеют неодинаковую модификацию и каждый из Х'Х'Х', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов.
Согласно одному варианту осуществления Na' и/или Nb' содержит модификации чередующегося паттерна.
Мотив Y'Y'Y' находится в сайте расщепления антисмысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит участок дуплекса, составляющий 17-23 нуклеотида в длину, то мотив Y'Y'Y' может находиться в положениях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 или 13, 14, 15 антисмысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца. Предпочтительно мотив Y'Y'Y' находится в положениях 11, 12, 13.
Согласно одному варианту осуществления в мотиве Y'Y'Y' все нуклеотиды 2'-ОМемодифицированы.
Согласно одному варианту осуществления k равняется 1, а l равняется 0, или k равняется 0, а l равняется 1, или как k, так и l равняются 1.
Антисмысловая нить, таким образом, может быть представлена следующими формулами:
5' η^-ΝΛΖΈ'Ζ W-Y'Y'Y'-Na'-nP’ 3' (ПЬ);
5' nq’-Na'-YY'Y'-Nb'-X'X'X'-np’ 3' (Пс); или
5' nq’-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-nP’ 3' (lid).
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIb), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIc), Nb' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IId), каждый Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно Nb равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Согласно другим вариантам осуществления k равняется 0, а l равняется 0 и антисмысловая нить может быть представлена формулой:
5'nP’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3'(1а).
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена как формула (IIa), каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Каждая из X', Y' и Z' может быть одинаковой или отличной от остальных.
Каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо может быть модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-О-метилом, 2'-О-аллилом, 2'-С-аллилом, 2'-гидроксилом или 2'фтором. Например, каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован 2'-О-метилом или 2'-фтором. Каждая X, Y, Z, X', Y' и Z', в частности, может представлять собой 2'-Ометил-модификацию или 2'-фтор-модификацию.
Согласно одному варианту осуществления смысловая нить средства для RNAi может содержать мотив YYY, находящийся в 9, 10 и 11 положениях нити, в тех случаях, когда участок дуплекса составляет 21 нуклеотид, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y представляет собой 2'-Fмодификацию. Смысловая нить может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из XXX и ZZZ независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'^-модификацию.
Согласно одному варианту осуществления антисмысловая нить может содержать мотив Y'Y'Y', находящийся в положениях 11, 12, 13 нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y' представляет собой 2'-О-метил-модификацию. Антисмысловая нить может дополнительно содержать мотив Х'Х'Х' или мотивы Z'Z'Z' в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка и каждый из Х'Х'Х' и Z'Z'Z' независимо представляет собой 2'-OMe-модификацию или 2'^-модификацию.
Смысловая нить, представленная любой из вышеприведенных формул (Ia), (Ib), (Ic) и (Id), образует
- 44 036477 дуплекс с антисмысловой нитью, представленной любой из формул (IIa), (IIb), (IIc) и (IId) соответственно.
Соответственно средства для RNAi для применения в способах согласно настоящему изобретению могут содержать смысловую нить и антисмысловую нить, при этом каждая нить содержит 14-30 нуклеотидов, дуплекс для RNAi, представленный формулой (III):
смысловая:
антисмысловая:
3’ np’-Na’-(X’X'X')k-Nb’-Y'Y'Y'-Nb’-(Z'Z'Z')i-Na’-nq 5’ (III) где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;
каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;
каждая Na и Na независимо представляют собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;
каждая Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
где каждая np', np, nq' и nq, каждая из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид и каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов.
Согласно одному варианту осуществления i равняется 0, a j равняется 0; или i равняется 1, a j равняется 0; или i равняется 0, a j равняется 1; или как i, так и j равняются 0; или как i, так и j равняются 1. Согласно другому варианту осуществления k равняется 0, а l равняется 0; или k равняется 1, а l равняется 0; k равняется 0, а l равняется 1; или как k, так и l равняются 0; или как k, так и l равняются 1.
Иллюстративные комбинации смысловой нити и антисмысловой нити, образующих дуплекс для RNAi, включают формулы, приведенные ниже:
5'пр-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3' Пр’-Na-ΥΎΎ' -Na nq’ 5' (Ша)
5' np -Na -YYY -Nb -ZZZ -Na-nq 3'
3' Пр’-Na -Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'-Na nq 5' (Illb)
5' Пр-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3'
3' np-Na-X'X'X'-Nb-ΥΎΎ'-Na-nq 5' (IIIc)
5' np -Na -XXX -Nb-Y Y Y -Nb- ZZZ -Na-nq 3'
3' Пр’-Na -X'X'X'-Nb-Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'-Na-nq 5' (Illd)
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIa), каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIb), каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1 -10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIc), каждая Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), каждая Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na, Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждая из Na, Na', Nb и Nb' независимо содержит модификации чередующегося паттерна.
- 45 036477
Каждая из X, Y и Z в формулах (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) может быть одинаковой или отличной от остальных.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов Y может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Y'. Альтернативно, по меньшей мере два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'; или все три из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIb) или (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Z'. Альтернативно, по меньшей мере два из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'; или все три из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено в качестве формулы (IIIc) или (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов X'. Альтернативно, по меньшей мере два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'; или все три из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.
Согласно одному варианту осуществления модификация нуклеотида Y отличается от модификации нуклеотида Y', модификация нуклеотида Z отличается от модификации нуклеотида Z', и/или модификация нуклеотида X отличается от модификации нуклеотида X'.
Согласно одному варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации. Согласно другому варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации и np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи. Согласно еще одному варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, а смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. Согласно другому варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0 и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
Согласно одному варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIa), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0 и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
Согласно одному варианту осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим по меньшей мере два дуплекса, представленных формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
Согласно одному варианту осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим три, четыре, пять, шесть или более дуплексов, представленных формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
Согласно одному варианту осуществления два средства для RNAi, представленные формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), соединены друг с другом на 5'-конце, и один или оба 3'-конца необязательно конъюгированы с лигандом. Каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген или на два различных гена или каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
Конъюгаты iRNA
Средства на основе iRNA, раскрытые в данном документе, могут находиться в форме конъюгатов. Конъюгат может быть прикреплен в любом подходящем положении в молекуле iRNA, например, на 3'конце или 5'-конце смысловой или антисмысловой нити. Конъюгат необязательно прикреплен с помо- 46 036477 щью линкера.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство на основе iRNA, описанное в данном документе, связано химически с одним или несколькими лигандами, фрагментами или конъюгатами, которые могут придавать функциональность, например, с влиянием на (например, с усилением) активность, распределение в клетке или захват клеткой iRNA. Такие фрагменты включают без ограничения липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), холевая кислота (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), тиоэфир, например, берил-Е-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), алифатическая цепь, например додекандиоловые или ундециловые остатки (SaisonBehmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett, 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-Огексадецил-рац-глицеро-3-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:36513654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), полиамин или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), или октадециламин, или гексиламино-карбонил-оксихолестериновый фрагмент (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).
Согласно одному варианту осуществления лиганд изменяет распределение, нацеливание или время существования средства на основе iRNA, в которое он введен. Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд обеспечивает повышенную аффинность в отношении выбранной цели, например, молекулы, клетки или типа клеток, компартмента, например, клеточного компартмента или части органа, ткани, органа или участка тела, например, по сравнению с видами, у которых отсутствует такой лиганд. Типичные лиганды не будут принимать участия в спаривании дуплекса в дуплексной нуклеиновой кислоте.
Лиганды могут включать встречающееся в природе вещество, такое как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновую кислоту) или липид. Лиганд также может быть рекомбинантной или синтетической молекулой, такой как синтетический полимер, например, синтетическая полиаминокислота. Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту, представляющую собой полилизин (PLL), поли-Ь-аспарагиновую кислоту, поли-Lглутаминовую кислоту, сополимер стирола и ангидрида малеиновой кислоты, сополимер L-лактида и гликолида, сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, N[-(2гидроксипропил)меакриламидный сополимер (НМРА), полиэтиленгликоль (PEG), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), N-изопропилакриламидные полимеры или полифосфазин. Примеры полиаминов включают полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, полиамин-пептидомиметик, полиамин-дендример, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, соль четвертичного полиамина или α-спиральный пептид.
Лиганды также включают нацеливающие группы, например нацеливающее на определенную клетку или ткань средство, например лектин, гликопротеин, липид или белок, например антитело, которое связывается с конкретным типом клетки, таким как клетка почки. Нацеливающая группа может представлять собой тиреотропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностный белок А, углеводмуцин, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу, поливалентную фукозу, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентнную галактозу, трансферрин, бисфосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчную кислоту, фолат, витамин В12, биотин или RGD-пептид или миметик RGD-пептида.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд представляет собой GalNAc, который содержит одну или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Дополнительное описание лигандов GalNAc представлено в разделе под названием Углеводные конъюгаты.
Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие средства (например, акридины), кросс-линкеры (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например, EDTA), липофильные молекулы, например, холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бис-О(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецил-глицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, О3-(олеоил)литохолевую кислоту, О3(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин и пептидные конъюгаты (например, пептид antennapedia, Tat-пептид), алкилирующие средства, фосфат, амино, меркапто, PEG (например, PEG40K), MPEG, [MPEG] 2, полиамино, алкил, замещенный алкил, меченные радиоизотопом маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), помощники транспорта/всасывания (например, аспирин, витамин Е, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеотиды (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, конъюгаты акридин-имидазол, комплекс Eu3+тетраазамакроциклы), динитрофенил,
- 47 036477
HRP или АР.
Лигандами могут быть белки, например, гликопротеины, или пептиды, например, молекулы со специфической аффинностью в отношении ко-лиганда, или антитела, например, антитело, которое связывается с определенным типом клетки, таким как раковая клетка, эндотелиальная клетка или костная клетка. Лиганды могут также включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать отличные от пептидов виды, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу или мультивалентную фукозу. Лигандом может быть, например, липополисахарид, активатор МАР-киназы р38 или активатор NF-кВ.
Лигандом может быть вещество, например, лекарственное средство, которое может улучшать захват средства на основе iRNA клеткой, например, путем разрушения цитоскелета клетки, например, путем разрушения микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов клетки. Лекарственным средством может быть, например, таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, яплакинолид, латрункулин А, фаллоидин, свинголид А, инданоцин или миосервин.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд, присоединенный к iRNA, описанной в данном документе, выполняет роль фармакокинетического модулятора (PK-модулятора). PK-модуляторы включают липофильные соединения, желчные кислоты, стероиды, фосфолипидные аналоги, пептиды, средства, связывающие белки, PEG, витамины и т.д. Иллюстративные PK-модуляторы включают без ограничения холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицериды, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин Е, биотин и т.д. Также известно, что олигонуклеотиды, которые содержат несколько фосфотиоатных связей, связываются с белком сыворотки, таким образом, короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды из приблизительно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие несколько из фосфотиоатных связей в остове, также пригодны согласно настоящему изобретению в качестве лигандов (например, PK-модулирующих лигандов). Кроме того, аптамеры, которые связывают компоненты сыворотки (например, белки сыворотки) также пригодны для применения в качестве PK-модулирующих лигандов согласно вариантам осуществления, описанным в данном документе.
Конъюгированные с лигандами олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы с применением олигонуклеотида, который обладает реакционно-способной функциональностью, обусловленной боковой цепью, как например, полученной в результате присоединения связывающей молекулы к олигонуклеотиду (описанному ниже). Этот реакционно-способный олигонуклеотид может вступать в реакцию непосредственно с коммерчески доступными лигандами, лигандами, которые синтезируют с любой из ряда защитных групп или лигандами со связывающим фрагментом, прикрепленным к ним.
Олигонуклеотиды, применяемые в конъюгатах согласно настоящему изобретению, можно получать удобным и обычным способом с помощью хорошо известной методики твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими поставщиками, в том числе, например, Applied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния). Дополнительно или альтернативно можно использовать любые другие средства для такого синтеза, известные в уровне техники. Также известно применение подобных методик для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфотиоаты и алкилированные производные.
В конъюгированных с лигандами олигонуклеотидах и нуклеозидах, связанных с определенными последовательностями, несущими молекулы лигандов, по настоящему изобретению, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды могуть быть собраны на подходящем синтезаторе ДНК, с использованием предшественников стандартных нуклеотидов и нуклеозидов, или предшественников конъюгатов нуклеотидов или нуклеозидов, которые уже несут связывающий фрагмент, предшественников конъюгатов нуклеотидов или нуклеозидов с лигандами, которые уже несут молекулу лиганда, или ненуклеозидные несущие лиганд структурные элементы.
При применении предшественников конъюгатов нуклеотидов, которые уже несут связывающий фрагмент, синтез нуклеозидов, связанных с определенными последовательностями, как правило, является завершенным, а молекула лиганда затем вступает в реакцию со связывающим фрагментом с образованием конъюгированного с лигандом олигонуклеотида. Согласно некоторым вариантам осуществления олигонуклеотиды или связанные олигонуклеозиды согласно настоящему изобретению синтезированы автоматическим синтезатором с применением фосфорамидатов, полученных из конъюгатов нуклеозидов с лигандами, в дополнение к стандартным фосфорамидатам и не стандартным фосфорамидатам, которые коммерчески доступны и, как правило, применяют в синтезе олигонуклеотидов.
Конъюгаты липидов
Согласно одному варианту осуществления лиганд представляет собой липид или липидную молекулу. Такой липид или липидная молекулу могут, как правило, связываться с сывороточным белком, таким как сывороточный альбумин человека (HSA). Связывающийся с HSA лиганд делает возможным распределение конъюгата в целевой ткани, например, отличной от ткани почек целевой ткани организма. Например, целевой тканью может быть печень, в том числе паренхиматозные клетки печени. Также в качестве лигандов можно применять другие молекулы, которые могут связываться с HSA. Например,
- 48 036477 можно применять непроксин или аспирин. Липид или липидный лиганд может (а) повышать устойчивость к разрушению конъюгата, (b) улучшать нацеливание или транспорт в целевую клетку или клеточную мембрану и/или (с) может быть применен для корректировки связывания с сывороточным белком, например HSA.
Липидный лиганд можно применять для модулирования, например, регулирования (например, ингибирования) связывания конъюгата с целевой тканью. Например, менее вероятно, что липид или липидный лиганд, который связывается с HSA более сильно, будет нацелен на почки и, таким образом, менее вероятно, что он будет выведен из организма. Липид или липидный лиганд, который связывается с HSA менее сильно, можно применять для нацеливания конъюгата на почки.
Согласно одному варианту осуществления липидный лиганд связывается с HSA. Например, лиганд может связываться с HSA с достаточной аффинностью, таким образом, распределение конъюгата в отличной от ткани почек ткани усиливается. Однако, как правило, аффинность не является настолько сильной, что связывание HSA-лиганда не может быть необратимым.
Согласно другому варианту осуществления липидный лиганд связывается с HSA слабо или вообще не связывается, так что распределение конъюгата в почке будет усиливаться. Другие фрагменты, которые нацелены на клетки почек, также можно применять вместо или в дополнение к липидным лигандам.
Согласно другому аспекту лигандом является фрагмент, например, витамин, который поглощается целевой клеткой, например, пролиферирующей клеткой. Такие варианты являются особенно пригодными для лечения нарушений, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, например, злокачественного или доброкачественного типа, например, раковых клеток. Иллюстративные витамины включают витамин А, Е и K. Другие иллюстративные витамины включают витамин В, например фолиевую кислоту, В12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль или другие витамины или биогенные вещества, поглощаемые раковыми клетками. Также включены HSA и липопротеин низкой плотности (LDL).
Средства, обеспечивающие проникновение в клетку
Согласно другому аспекту лигандом является средство, обеспечивающее проникновение в клетку, такое как спиральное средство для проникновения в клетку. Согласно одному варианту осуществления средство является амфипатическим. Иллюстративным средством является пептид, такой как tat или antennopedia. Если средство представляет собой пептид, то он может быть модифицированным, при этом средство может включать пептидилмиметик, инвертомеры, отличные от пептидных или псевдопептидные связи и применение D-аминокислот. Спиральное средство, как правило, представляет собой α-спиральное средство и может характеризоваться липофильной и липофобной фазой.
Лигандом может быть пептид или пептидомиметик. Пептидомиметик (также называемый в данном документе олигопептидомиметиком) является молекулой, способной сворачиваться в определенную трехмерную структуру, подобную природному пептиду. Присоединение пептида или пептидомиметика к средствам на основе iRNA может влиять на фармакокинетическое распределение iRNA, например, посредством усиления распознавания клеток и абсорбции клетками. Фрагмент, представляющий собой пептид или пептидомиметик, может составлять примерно 5-50 аминокислот в длину, например, примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот в длину.
Пептидом или пептидомиметиком, может быть, например, пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, катионный пептид, амфипатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий главным образом из Tyr, Trp или Phe). Фрагментом, представляющим собой пептид, может быть пептид-дендример, пептид с ограниченной конформационной свободой или перекрестно сшитый пептид. Согласно другому альтернативному варианту фрагмент, представляющий собой пептид, может включать гидрофобную последовательность, контролирующую перенос через мембрану (MTS). Иллюстративный содержащий гидрофобную MTS пептид представляет собой RFGF с аминокислотной последовательностью AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 3367). RFGF-аналог (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:3368)), содержащий гидрофобную MTS, также может быть нацеливающим фрагментом. Фрагмент, представляющий собой пептид, может быть пептидом для доставки, который может переносить большие полярные молекулы, в том числе пептиды, олигонуклеотиды и белки, через клеточные мембраны. Например, последовательности белка Tat HIV (GRKKRRQRRRPPQ SEQ ID NO:3369)) и белка Antennapedia Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 3370)) способны функционировать в качестве пептидов для доставки. Пептид или пептидомиметик могут кодироваться случайными последовательностями ДНК, как, например, пептид, идентифицированный из библиотеки фагового дисплея или комбинаторной библиотеки одна гранула-одно соединение (ОВОС) (Lam et al., Nature, 354: 82-84, 1991). Как правило, пептид или пептидомиметик, связанный со средством на основе dsRNA посредством введенной мономерной единицы, представляет собой нацеливающий на клетку пептид, такой как содержащий аргинин-глицин-аспарагиновую кислоту (RGD) пептид или RGD-миметик. Фрагмент, представляющий собой пептид, может характеризоваться длиной в диапазоне от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 40 аминокислот. Фрагменты, представляющие собой пептиды, могут характеризоваться структурной модификацией, как например, для повышения стабильности или управления конформационными свойствами. Можно использовать любые из структурных модификаций, описанных ниже.
- 49 036477
RGD-пептид для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным, например, гликозилированным или метилированным, для облегчения нацеливания на конкретную(определенные) ткань(ткани). RGDсодержащие пептиды и пептидомиметики могут включать D-аминокислоты, а также синтетические RGD-миметики. В дополнение к RGD можно применять другие фрагменты, которые нацелены на лиганд интегрин. Предпочтительные конъюгаты этого лиганда нацелены на РЕСАМ-1 или VEGF.
Фрагмент, представляющий собой RGD-пептид, можно применять для нацеливания на конкретный тип клетки, например, опухолевую клетку, такую как эндотелиальная опухолевая клетка или опухолевая клетка рака молочной железы (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD-пептид может облегчать нацеливание средства на основе dsRNA на опухоли ряда других тканей, в том числе легкого, почки, селезенки или печени (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Как правило, RGD-пептид будет облегчать нацеливание средства на основе iRNA на почку. RGD-пептид может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным, например, гликозилированным или метилированным, для облегчения нацеливания на конкретные ткани. Например, гликозилированный RGD-пептид может доставлять средство на основе iRNA к опухолевой клетке, экспрессирующей aVe3(Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42: 326-336, 2001).
Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку способен проникать в клетку, например, микробную клетку, такую как клетка бактерии или гриба, или клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Пептидом, обеспечивающим проникновение в микробную клетку, например, может быть αспиральный линейный пептид (например, LL-37 или Ceropin PI), содержащий дисульфидную связь пептид (например, α-дефензин, β-дефензин или бактенецин) или пептид, содержащий только одну или две преобладающие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, также может включать клеточный сигнал внутриядерной локализации (NLS). Например, пептидом, обеспечивающим проникновение в клетку, может быть двухкомпонентный амфипатический пептид, такой как MPG, который получен из домена слитого пептида gp41 HIV-1 и NLS из большого Т-антигена SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31: 2717-2724, 2003).
Углеводные конъюгаты
Согласно некоторым вариантам осуществления композиций и способов по настоящему изобретению олигонуклеотид iRNA дополнительно содержит углевод. Конъюгированная с углеводом iRNA является предпочтительной для in vivo доставки нуклеиновых кислот, а также композиций, пригодных для in vivo терапевтического применения, описанного в данном документе. Используемое в данном документе выражение углевод относится к соединению, которое представляет собой углевод per se, образованный из одного или нескольких единиц моносахаридов, имеющих по меньшей мере 6 атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода; или соединению, имеющему в качестве его части углеводный фрагмент, образованный из одного или нескольких единиц моносахаридов, каждая из которых имеет по меньшей мере шесть атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода. Типичные углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие от приблизительно 4, 5, 6, 7, 8 или 9 единиц моносахаридов) и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные смолы. Определенные моносахариды включают С5 и более (например, С5, С6, С7 или С8) сахара; ди- и трисахариды включают сахара с двумя или тремя единицами моносахаридов (например, С5, С6, С7 или С8).
Согласно одному варианту осуществления углеводный конъюгат содержит моносахарид. Согласно одному варианту осуществления моносахаридом является N-ацетилгалактозамин (GalNAc). Конъюгаты GalNAc описаны, например, в патенте США № 8106022, все содержимое которого, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc выполняет роль лиганда, который нацеливает iRNA к конкретным клеткам. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc нацеливает iRNA к клеткам печени, например, выполняя роль лиганда для рецептора асиалогликопротеина в клетках печени (например, гепатоцитах).
Согласно некоторым вариантам осуществления углеводный конъюгат содержит одно или несколько производных GalNAc. Производные GalNAc могут быть присоединены с помощью линкера, например, двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд GalNAc конъюгирован с 3'-концом смысловой нити. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc конъюгирован со средством на основе iRNA (например, с 3'-концом смысловой нити) с помощью линкера, например, линкера, описанного в данном документе.
- 50 036477
Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc представляет собой
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi присоединено к углеводному конъюгату с помощью линкера, как показано в следующей схеме, где X представляет собой О или S
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi конъюгировано с L96, как определено в табл. 1 и показано ниже
Согласно некоторым вариантам осуществления углеводный конъюгат для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению выбирают из группы, состоящей из
- 51 036477
- 53 036477
Другой типичный углеводный конъюгат для применения в вариантах осуществления, описанных в данном документе, включает без ограничения
(Формула XXIII), где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.
Согласно некоторым вариантам осуществления углеводный конъюгат дополнительно содержит один или несколько дополнительных лигандов, описанных выше, таких как без ограничения Pkмодулятор и/или пептид, обеспечивающий проникновение в клетку.
Согласно одному варианту осуществления iRNA согласно настоящему изобретению конъюгирована с углеводом с помощью линкера. Неограничивающие примеры углеводных конъюгатов с iRNA с линкерами композиций и способов согласно настоящему изобретению включают без ограничения
- 54 036477
(Формула XXX), где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.
Линкеры
Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат или лиганд, описанные в данном документе, могут быть присоединены к олигонуклеотиду iRNA с помощью различных линкеров, которые могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.
Выражение линкер или линкерная группа означает органический фрагмент, который соединяет две части соединения, например, связывает ковалентными связями две части соединения. Линкеры, как правило, содержат прямую связь или атом, такой как кислород или сера, единицу, такую как NR8, С(О), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH или цепь из атомов, такую как без ограничения замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклиалкенил, гетероциклиалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкерингетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкерилгетероалкинил, алкилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетероциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил, алкинилгетероциклилалкенил, алкинилгетероциклилалкинил, алкиларил, алкениларил, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, в которых один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться О, S, S(O), SO2, N(R8), С(О), замещенным или незамещенным арилом, замещенным или незамещенным гетероарилом, замещенным или незамещенным гетероциклилом; где R8 представляет собой водород, ацил, алифатический или замещенный алифатический компонент. Согласно одному варианту осуществления линкер составляет приблизительно 1-24 атома, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 624, 6-18, 7-18, 8-18 атомов, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 или 8-16 атомов.
Согласно одному варианту осуществления dsRNA согласно настоящему изобретению конъюгирована с двухвалентным и трехвалентным разветвленным линкером, выбранным из группы структур, показанных в любой из формул (XXXI)-(XXXIV):
- 55 036477
Формула XXXIII > или
Формула XXXIV где q2A, q2B, q3 A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B и q5C независимо представляют собой для каждого случая 0-20, и где повторяющаяся единица может быть рдинаковой или различной;
каждая из Р2А, Р2В, Р3А, P3B, Р4А, Р4В, Р5А, Р5В, Р5С, Т2А, Т2В, Т3А, T3B, Т4А, Т4В, Т4А, Т5В, Т5С независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой СО, NH, О, S, ОС(О), NHC(O), CH2, CH2NH или СН2О;
q2a, q2b, q3a, q3b, q4a, q4b, q5a, q5b, q5c независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой алкилен, замещенный алкилен, где один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться одним или несколькими из О, S, S(O), SO2, N(Rn ), C(R’)=C(R), С=С или С(О);
каждый из R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой NH, О, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
или гетероциклил;
L2a, l2b, l3a, l3b, l4a, l4b, l5a, l5b и l5C представляют собой лиганд; т.е. независимо для каждого случая моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид; и Ra представляет собой Н или аминокислотную боковую цепь. Трехвалентные конъюгирующие производные GalNAc особенно пригодны для применения со средствами на основе RNAi для ингибирования экспрессии целевого гена, такие как из формулы (XXXV):
Формула XXXV
I ρ5Α_θ5Α_ρ5Α I т5А-|_5А г
I p5B_Q5B_R5B j Т5В_|_5В \_____I р5С q5C r5C 1_____-|-5С_|_5С
Г Jq5C где L5A, L5B и L5C представляют собой моносахарид, такой как производное GalNAc.
Примеры подходящих двухвалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп, конъюгирующих производные GalNAc, включают без ограничения структуры, приведенные выше в виде формул II, VII, XI, X и XIII.
Расщепляемая линкерная группа представляет собой группу, которая достаточно стабильна вне клетки, но которая при вхождении в целевую клетку расщепляется с высвобождением двух частей, которые линкер удерживает вместе. Согласно предпочтительному варианту осуществления расщепляемая линкерная группа расщепляется приблизительно в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 раз или более, или по меньшей мере приблизительно в 100 раз быстрее в целевой клетке или при первом упомянутом условии (которое можно, например, выбрать для имитации или моделировании внутриклеточных условий), чем в крови субъекта или при втором упомянутом условии (которое можно, например, выбрать для имитации или моделирования условий, которые имеют место в крови или сыворотке).
Расщепляемые линкерные группы восприимчивы к средствам расщепления, например, рН, редокспотенциалу или присутствию разрушающих молекул. Как правило, средства расщепления более распространены или встречаются при более высоких уровнях или при большей активности внутри клетки, чем в сыворотке или крови. Примеры таких разрушающих средств включают окислительно-восстановительные средства, которые выбирают для конкретных субстратов или которые не обладают специфичностью к субстратам, в том числе, например, окислительные или восстановительные ферменты или восстановительные средства, такие как меркаптаны, присутствующие в клетках, которые могут разрушать редоксрасщепляемую линкерную группу путем восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые мо- 56 036477 гут создавать кислую среду, например, таковые, которые приводят к рН, равному пять или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать расщепляемую кислотой линкерную группу, действуя в качестве универсальной кислоты, пептидазы (которые могут быть субстрат-специфичными) и фосфатазы.
Расщепляемая линкерная группа, такая как дисульфидная связь, может быть восприимчивой к рН. рН сыворотки человека составляет 7,4, в то время как средняя внутриклеточная рН немного ниже, и находится в диапазоне приблизительно 7,1-7,3. Эндосомы характеризуются более кислым рН в диапазоне 5,5-6,0, а лизосомы характеризуются еще более кислым рН, приблизительно 5,0. Некоторые линкеры будут содержать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется при предпочтительном рН, тем самым высвобождается катионный липид из лиганда внутрь клетки или в предпочтительный компартмент клетки.
Линкер может включать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется конкретным ферментом. Тип расщепляемой линкерной группы, включенной в линкер, может зависеть от клетки, подлежащей нацеливанию. Например, лиганд, нацеливаемый на печень, может быть связан с катионным липидом с помощью линкера, который включает эфирную группу. Клетки печени содержат много эстераз, и, таким образом, линкер может быть расщеплен более эффективно в клетках печени, чем в клетках, которые не содержат много эстераз. Другие типы клеток с высоким содержанием эстераз включают клетки легкого, коры почек и семенника.
Линкеры, которые содержат пептидные связи, можно применять при нацеливании на другие типы клеток с высоким содержанием пептидаз, такие как клетки печени и синовиоциты.
Как правило, пригодность кандидатной расщепляемой линкерной группы может быть оценена с помощью тестирования способности разрушающего средства (или условия) расщеплять линкерную группу. Кроме того, желательным также является тестирование кандидатной расщепляемой линкерной группы в отношении способности выдерживать расщепление в крови или при контакте с другой нецелевой тканью. Таким образом, можно определить относительную восприимчивость расщеплению между первым и вторым условием, где первое выбирают в качестве показателя расщепления в целевой клетке и второе выбирают в качестве показателя расщепления в других тканях или биологическим жидкостях, например, крови или сыворотке. Оценки можно проводить в бесклеточных системах, в клетках, в культуре клеток, в культуре органов или тканей или для целых животных. Может быть полезным выполнять первоначальные измерения в условиях бесклеточной системы или в условиях культуры, а подтверждать с помощью дополнительных измерений на целых животных. Согласно предпочтительным вариантам осуществления пригодные кандидатные соединения расщепляются по меньшей мере приблизительно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или приблизительно в 100 раз быстрее в клетке (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью или сывороткой (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внеклеточных условий).
Расщепляемые с помощью редокс-потенциала линкерные группы
Согласно одному варианту осуществления расщепляемая линкерная группа представляет собой расщепляемую с помощью редокс-потенциала линкерную группу, которая расщепляется при восстановлении или окислении. Примером расщепляемой при восстановлении линкерной группы является дисульфидная линкерная группа (-S-S-). Для определения того, является ли кандидатная расщепляемая линкерная группа подходящей расщепляемой при восстановлении линкерной группой или, например, подходящей для применения с определенным фрагментом iRNA и определенным нацеливающим средством, можно обратиться к способам, описанным в данном документе. Например, кандидат может быть оценен при помощи инкубирования с дитиотреитолом (DTT) или другим восстанавливающим средством с применением реактивов, известных в уровне техники, которые имитируют скорость расщепления, которая наблюдалась бы в клетке, например, целевой клетке. Кандидаты также могут быть оценены в условиях, которые выбирают для имитации условий в крови или сыворотке. Согласно одному варианту кандидатные соединения расщепляются в наибольшей степени приблизительно на 10% в крови. Согласно другим вариантам осуществления пригодные кандидатные соединения разрушаются по меньшей мере приблизительно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или приблизительно в 100 раз быстрее в клетке (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внеклеточных условий). Скорость расщепления кандидатных соединений может быть определена при помощи стандартных анализов ферментативной кинетики в условиях, выбранных для имитации внутриклеточных сред, и по сравнению с условиями, выбранными для имитации внеклеточных сред.
Фосфатные расщепляемые линкерные группы
Согласно другому варианту осуществления расщепляемый линкер содержит фосфатную расщепляемую линкерную группу. Фосфатная расщепляемая линкерная группа расщепляется средствами, которые разрушают или гидролизуют фосфатную группу. Примером средства, которое расщепляет фосфатные группы в клетках, являются ферменты, такие как клеточные фосфатазы. Примерами фосфатных линкерных групп являются -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -OP(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S- 57 036477
P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-. Предпочтительными вариантами осуществления являются -О-Р(О)(ОН)-О-, -O-P(S)(OH)-C-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -SP(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-,
-S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительным вариантом осуществления является -О-Р(О)(ОН)-О-.
Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Расщепляемые кислотами линкерные группы
Согласно другому варианту осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую кислотой линкерную группу. Расщепляемая кислотой линкерная группа представляет собой линкерную группу, которая расщепляется при кислых условиях. Согласно предпочтительным вариантам осуществления расщепляемые кислотой линкерные группы расщепляются в кислой среде с рН приблизительно 6,5 или ниже (например, приблизительно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 или ниже), или с помощью средств, таких как ферменты, которые могут выступать в роли универсальной кислоты. В клетке определенные органеллы с низким рН, такие как эндосомы и лизосомы, обеспечивают среду расщепления для расщепляемых кислотами линкерных групп. Примеры расщепляемых кислотами линкерных групп включают без ограничения гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Расщепляемые кислотами группы могут характеризоваться общей формулой -C=NN-, C(O)O или -ОС(О). Предпочтительным вариантом осуществления является случай, когда углерод, присоединяемый к кислороду сложного эфира (алкоксигруппе), представляет собой арильную группу, замещенную алкильную группу или четвертичную алкильную группу, такую как диметилпентил или трет-бутил. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Сложноэфирные расщепляемые линкерные группы
Согласно другому варианту осуществления расщепляемый линкер содержит сложноэфирную расщепляемую линкерную группу. Сложноэфирная расщепляемая линкерная группа расщепляется ферментами, такими как клеточные эстеразы и амидазы. Примеры сложноэфирных расщепляемых линкерных групп включают без ограничения сложные эфиры с алкиленовыми, алкениленовыми и алкиниленовыми группами. Сложноэфирные расщепляемые линкерные группы характеризуются общей формулой С(О)О- или -ОС(О)-. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Пептидные расщепляемые линкерные группы
Согласно еще одному варианту осуществления расщепляемый линкер содержит пептидную расщепляемую линкерную группу. Пептидная расщепляемая линкерная группа расщепляется ферментами, такими как клеточные пептидазы и протеазы. Пептидные расщепляемые линкерные группы представляют собой пептидные связи, образованные между аминокислотами с получением олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.д.) и полипептидов. Пептидные расщепляемые группы не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может образовываться между любым алкиленом, алкениленом или алкинеленом. Пептидная связь представляет собой особый тип амидной связи, образованной между аминокислотами с получением пептидов и белков. Пептидная расщепляемая группа, как правило, ограничена пептидной связью (т. е. амидной связью), образованной между аминокислотами, с образованием пептидов и белков, и не включает всю амидную функциональную группу. Пептидные расщепляемые линкерные группы характеризуются общей формулой - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, где RA и RB представляют собой R-группы двух соседних аминокислот. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение конъюгатов РНК, включают без ограничения патенты США №№ 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730;5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603;5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830;
5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873;
5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142;
5585,481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941; 6294664; 6320017; 6576752; 6783931;
6900297; 7037646; 8106022, полное содержание каждого из которых включено в данный документ при помощи ссылки.
Нет необходимости, чтобы все положения в данном соединении были единообразно модифицированными, и, фактически, более чем одна из вышеупомянутых модификаций может быть включена в одно соединение или даже в один нуклеозид в iRNA. Настоящее изобретение также предусматривает соединения iRNA, которые являются химерными соединениями.
Химерные соединения iRNA, или химеры, в контексте настоящего изобретения представляют собой соединения iRNA, например, dsRNA, которые содержат две или более химически разных участка, при этом каждый состоит по меньшей мере из одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида, в случае соединения dsRNA. Такие iRNA, как правило, содержат по меньшей мере один участок, где РНК модифицируют так, чтобы придать iRNA повышенную устойчивость к разрушению нуклеазой, улучшенный захват клеткой и/или повышенную аффинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой. Дополнительный участок iRNA может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гиб
- 58 036477 риды РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера, РНКаза Н является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет нить РНК дуплекса РНК ДНК Активация РНКазы Н, следовательно, приводит к расщеплению целевой РНК со значительным повышением, таким образом, эффективности ингибирования экспрессии гена посредством iRNA. Следовательно, при применении химерных dsRNA сравниваемые результаты часто могут быть получены для более коротких iRNA по сравнению с фосфотиоатдезокси dsRNA, гибридизирующимися с тем же целевым участком. Расщепление целевой РНК, как правило, можно выявить путем гель-электрофореза и при необходимости с помощью ассоциированных с гибридизацией нуклеиновых кислот методик, известных в уровне техники.
В некоторых случаях РНК из iRNA может быть модифицирована группой, не являющейся лигандом. Ряд молекул, не являющихся лигандами, конъюгировали с iRNA для усиления активности, распределения в клетке или клеточного захвата iRNA, и процедуры для выполнения таких типов конъюгирования доступны в научной литературе. В такие фрагменты, не являющиеся лигандами, включены липидные фрагменты, такие как холестерин (Kubo, Т. et al., Biochem. Biophys. Res. Comrn., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), холевая кислота (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), тиоэфир, например, гексил-Е-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), алифатическая цепь, например, додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett, 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например ди-гексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-Огексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777), полиамин или полиэтиленгликольная цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), или октадециламин, или гексиламино-карбонил-оксихолестериновый фрагмент (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Then, 1996, 277:923). Иллюстративные патенты Соединенных Штатов, которые описывают получение таких конъюгатов РНК, были приведены выше. Типичные протоколы конъюгирования предусматривают синтез РНК, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях последовательности. Затем проводят реакцию аминогруппы с молекулой, подлежащей конъюгированию, при помощи соответствующих реагентов конденсации или активации. Реакция конъюгирования может быть выполнена либо с РНК, все еще связанной с твердой подложкой, либо после расщепления РНК в фазе раствора. Очистка конъюгата РНК с помощью HPLC, как правило, дает чистый конъюгат.
Доставка iRNA
Доставка iRNA нуждающемуся в этом субъекту может быть осуществлена несколькими различными путями. Доставку in vivo можно осуществлять непосредственно путем введения субъекту композиции, содержащей iRNA, например dsRNA. Альтернативно, доставку можно осуществлять опосредованно путем введения одного или нескольких векторов, которые кодируют и направляют экспрессию iRNA. Такие альтернативные случаи описаны далее ниже.
Прямая доставка
Как правило, любой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты может быть адаптирован для применения с iRNA (см., например, Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5): 139-144 и WO 94/02595, которые включены в данный документ при помощи ссылки в своей полноте). Однако, существуют три фактора, которые необходимо учитывать для успешной доставки молекулы iRNA in vivo: (а) биологическая стабильность доставляемой молекулы, (2) предупреждение неспецифических эффектов, и (3) накопление доставляемой молекулы в целевой ткани. Неспецифические эффекты iRNA могут быть сведены к минимуму путем локального введения, например, путем прямой инъекции, или вживления в ткань (в качестве неограничивающего примера опухоли), или местного введения препарата. Локальное введение в место обработки максимально увеличивает локальную концентрацию средства, ограничивает воздействие средства на системные ткани, которые в ином случае могут быть повреждены средством или которые могут разрушить средство, и позволяет вводить более низкую общую дозу молекулы iRNA. В нескольких исследованиях был показан эффективный нокдаун генных продуктов при введении iRNA локально. Например, было показано, что внутриглазная доставка dsRNA к VEGF как путем инъекции в стекловидное тело макаков-крабоедов (Tolentino, MJ., et al. (2004) Retina 24: 132-138), так и субретинальных инъекций мышам (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9: 210-216) предупреждают неоваскуляризацию в экспериментальной модели возрастной дегенерации макулы. Кроме того, прямая внутриопухолевая инъекция dsRNA мышам снижает объем опухолей (Pille, J., et al. (2005) Mol. Ther. 11: 267-274) и может увеличивать выживаемость мышей с опухолями (Kim, WJ., et al. (2006) Mol. Ther. 14: 343-350; Li, S., et al. (2007) Mol. Ther. 15: 515-523). РНК-интерференция также была успешной при локальной доставке к CNS путем прямой инъекции (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93: 594-602) и к легким путем интраназального введения (Howard, KA., et al. (2006) Mol. Ther. 14: 476-484; Zhang, X., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al. (2005) Nat. Med.
- 59 036477
11:50-55). Что касается системного введения iRNA для лечения заболевания, РНК может быть модифицирована или, альтернативно, доставлена при помощи системы доставки лекарственного средства; оба способа служат для предупреждения быстрого разрушения dsRNA эндо- и экзонуклеазами in vivo.
Модификация РНК или фармацевтический носитель также могут обеспечивать нацеливание композиции на основе iRNA на целевую ткань, и с их помощью можно избежать нежелательных нецелевых эффектов. Молекулы iRNA можно модифицировать при помощи химической конъюгации с другими группами, например, липидной или углеводной группой, описанными в данном документе. Такие конъюгаты можно применять для нацеливания iRNA на определенные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты. Например, конъюгаты GalNAc или составы на основе липидов (например, LNP) можно применять для нацеливания iRNA на определенные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты.
Липофильные группы, такие как холестерин, улучшают захват клеткой и предупреждают разрушение. Например, направленную против АроВ iRNA, конъюгированную с фрагментом, представляющим собой липофильный холестерин, инъецировали системно мышам, что приводило к нокдауну mRNA apoB как в печени, так и в тонкой кишке (Soutschek, J., et al. (2004) Nature 432:173-178). Как было показано, конъюгация iRNA с аптамером способствует ингибированию роста опухоли и опосредует регресс опухоли на мышиных моделях рака предстательной железы (McNamara, JO., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1005-1015). Согласно альтернативному варианту осуществления iRNA можно доставлять с помощью систем доставки лекарственных средств, таких как наночастица, дендример, полимер, липосомы или катионная система доставки. Положительно заряженные катионные системы доставки способствуют связыванию молекулы iRNA (отрицательно заряженной) и также увеличивают взаимодействия на отрицательно заряженной клеточной мембране с обеспечением эффективного захвата iRNA клеткой. Катионные липиды, дендримеры или полимеры могут либо быть связанными с iRNA, либо их индуцируют с целью образования везикулы или мицеллы (см., например, Kim SH., et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2): 107-116), которые заключают в себя iRNA. Образование везикул или мицелл также предупреждает разрушение iRNA при введении системно. Способы получения и введения катионных комплексов с iRNA находятся в пределах квалификации специалиста в данной области (см., например, Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327: 761-766; Verma, UN., et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9: 12911300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205, которые включены в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте). Некоторые неограничивающие примеры систем доставки лекарственных средств, пригодных для системной доставки iRNA, включают DOTAP (Sorensen, DR., et al. (2003), выше; Verma, UN., et al. (2003), выше), олигофектамин, твердые частицы с нуклеиновой кислотой-липидом (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), кардиолипин (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), полиэтиленимин (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. электронная публикация перед печатью 16 августа; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), содержащие Arg-Gly-Asp (RGD) пептиды (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) и полиамидоамины (Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:17991804). Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA образуют комплекс с циклодекстрином для системного введения. Способы введения и фармацевтические композиции на основе iRNA и циклодекстринов можно найти в патенте США № 7427605, который включен в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте.
Кодируемые векторами iRNA
Согласно другому аспекту iRNA, нацеленная на ген ALAS1, может экспрессироваться из транскрипционных единиц, вставленных в ДНК- или РНК-векторы (см., например, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., международную публикацию согласно РСТ № WO 00/22113, Conrad, международную публикацию согласно РСТ № WO 00/22114 и Conrad, патент США № 6054299). Экспрессия может быть временной (порядка от часов до недель) или длительной (от недель до месяцев или дольше) в зависимости от конкретной применяемой конструкции и целевой ткани или типа клеток. Такие трансгены можно вводить в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может быть интегрирующим или неинтегрирующим вектором. Трансген также может быть сконструирован с возможностью наследования его в виде экстрахромосомной плазмиды (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292).
Отдельные нить или нити iRNA могут транскрибироваться с промотора вектора экспрессии. В тех случаях, когда необходимо экспрессировать две отдельные нити с получением, например, dsRNA, тогда в целевую клетку можно совместно вводить два отдельных вектора экспрессии (например, путем трансфекции или инфекции). Альтернативно, каждая отдельная нить dsRNA может транскрибироваться с участием промоторов, оба из которых расположены в одной и той же плазмиде экспрессии. Согласно одному варианту осуществления dsRNA экспрессируется в инвертированном повторе, соединенном линкерной полинуклеотидной последовательностью, таким образом, что dsRNA имеет структуру типа стебельпетля.
Вектор экспрессии с iRNA, как правило, является ДНК-плазмидой или вирусным вектором. Вектор экспрессии, совместимый с эукариотическими клетками, например, с клетками позвоночных, можно
- 60 036477 применять для получения рекомбинантных конструкций для экспрессии iRNA, как описано в данном документе. Векторы экспрессии для эукариотических клеток хорошо известны в уровне техники и доступны от ряда коммерческих источников. Как правило, такие векторы содержат удобные сайты рестрикции для вставки необходимого сегмента нуклеиновой кислоты. Доставка векторов, экспрессирующих iRNA, может быть системной, как, например, путем внутривенного или внутримышечного введения, путем введения в целевые клетки, эксплантированные от пациента, с последующим обратным введением пациенту или путем любого другого способа, который обеспечивает возможность введения в необходимую целевую клетку.
Плазмиду экспрессии iRNA можно трансфицировать в целевую клетку в виде комплекса с носителем на основе катионного липида (например, олигофектамином) или носителем на основе некатионных липидов (например, Transit-TKO™). В настоящем изобретением также рассматриваются множественные трансфекции при помощи липидов для iRNA-опосредованного нокдауна, нацеленного на различные участки целевой РНК, на протяжении недели или более. Успешное введение векторов в клетки хозяина можно контролировать при помощи разнообразных известных способов. Например, о временной трансфекции может сообщать репортер, такой как флуоресцентный маркер, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP). Стабильная трансфекция клеток ex vivo может быть подтверждена с применением маркеров, которые обеспечивают устойчивость трансфицированной клетки к определенным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), как например, устойчивость к гигромицину В.
Системы вирусных векторов, которые можно использовать для способов и композиций, описанных в данном документе, включают, без ограничения, (а) аденовирусные векторы; (b) ретровирусные векторы, в том числе без ограничения лентивирусные векторы, вирус мышиного лейкоза Молони и т.д.; (с) векторы на основе аденоассоциированного вируса; (d) векторы на основе вируса простого герпеса; (е) векторы на основе SV40; (f) векторы на основе вируса полиомы; (g) векторы на основе вируса папилломы; (h) векторы на основе пикорнавируса; (i) векторы на основе поксвируса, такого как ортопоксвирус, например, векторы на основе вируса осповакцины или авипокс, например, канарипокс или вируса оспы кур и (j) хелпер-зависимый или слабый аденовирус. Также преимущественными могут быть вирусы с нарушенной репликацией. Различные векторы будут или не будут встраиваться в геном клеток. При необходимости, конструкции могут включать вирусные последовательности для трансфекции. Альтернативно, конструкция может быть включена в векторы, способные к эписомальной репликации, например, векторы на основе EPV и EBV. В конструкциях для рекомбинантной экспрессии iRNA, как правило, будут необходимы регуляторные элементы, например, промоторы, энхансеры и т.д. для обеспечения экспрессии iRNA в целевых клетках. Другие аспекты, учитываемые в отношении векторов и конструкций, описаны далее ниже.
Векторы, пригодные для доставки iRNA, будут включать регуляторные элементы (промотор, энхансер и т.д.), достаточные для экспрессии iRNA в необходимой целевой клетке или ткани. Регуляторные элементы можно выбирать для получения либо конститутивной, либо регулируемой/индуцибельной экспрессии.
Экспрессия iRNA может быть точно регулируемой, например, путем применения индуцибельной регуляторной последовательности, которая чувствительна к определенным физиологическим регуляторам, например, уровням циркулирующей глюкозы или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8: 2024). Такие индуцибельные экспрессирующие системы, подходящие для управления экспрессией dsRNA в клетках или у млекопитающих, включают, например, регулирование при помощи экдизона, при помощи эстрогена, прогестерона, тетрациклина, химических индукторов димеризации и изопропил-Р-Э1тиогалактопиранозида (IPTG). Специалист в данной области сможет выбрать соответствующую регуляторную/промоторную последовательность, опираясь на предполагаемое использование трансгена iRNA.
Согласно конкретному варианту осуществления можно применять вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA. Например, можно применять ретровирусный вектор (см. Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Такие ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA, клонируют в один или несколько векторов, которые облегчают доставку нуклеиновой кислоты в организм пациента. Более подробное описание ретровирусных векторов можно найти, например, в Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), в котором описано применение ретровирусного вектора для доставки гена mdr1 к гемопоэтическим стволовым клеткам для придания стволовым клеткам лучшей устойчивости к химиотерапии. Другими источниками, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); и Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Лентивирусные векторы, предусматриваемые для применения, включают, например, векторы на основе HIV, описанные в патентах США №№ 6143520; 5665557 и 5981276, которые включены в данный документ при помощи ссылки.
Аденовирусы также предусматриваются для применения при доставке iRNA. Аденовирусы пред
- 61 036477 ставляют собой особенно перспективные проводники, например, для доставки генов к респираторному эпителию. Аденовирусы естественным образом инфицируют респираторный эпителий, где они вызывают заболевание с легким течением. Другими целями для основанных на аденовирусах системах доставки являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышцы. Аденовирусы обладают преимуществом в том смысле, что они способны инфицировать неделящиеся клетки. В Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) представлена обзорная статья о генной терапии на основе аденовирусов. В Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) показано применение аденовирусных векторов для переноса генов в респираторный эпителий макак-резус. Другие примеры применения аденовирусов в генной терапии можно найти в Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993); публикации согласно РСТ WO94/12649 и Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Подходящий AV вектор для экспрессии iRNA, описанной в настоящем изобретении, способ конструирования рекомбинантного AV вектора и способ доставки вектора в целевые клетки описаны в Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
Также предусмотрено применение векторов на основе адено-ассоциированного вируса (AAV) (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Sci., USA 204:289-300 (1993); патент США № 5436146). Согласно одному варианту осуществления iRNA может экспрессироваться в виде двух отдельных комплементарных однонитевых молекул РНК при помощи рекомбинантного AAV-вектора, например, либо с РНК-промоторами, U6 или H1, либо с промотором цитомегаловируса (CMV). Подходящие AAV-векторы для экспрессии dsRNA, описанной в настоящем изобретении, способы конструирования рекомбинантного AV вектора и способы доставки векторов в целевые клетки описаны в Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; патенте США № 5252479; патенте США № 5139941; международной заявке на патент № WO 94/13788 и международной заявке на патент № WO 93/24641, полное раскрытие которых включено в данный документ при помощи ссылки.
Другой типичный вирусный вектор представляет собой поксвирус, такой как вирус осповакцины, например, аттенуированный вирус осповакцины, как, например, модифицированный вирус Анкара (MVA) или NYVAC, авипокс, как, например, вирус оспы кур или канарипокс.
Тропизм вирусных векторов может быть модифицирован путем псевдотипирования векторов белками оболочки или другими поверхностными антигенами из других вирусов или путем замещения различных вирусных капсидных белков, в случае необходимости. Например, лентивирусные векторы можно подвергать псевдотипированию поверхностными белками из вируса везикулярного стоматита (VSV), вируса бешенства, вируса Эбола, вируса Мокола и т.п. AAV-векторы можно получать для нацеливания на различные клетки путем конструирования векторов так, чтобы они экспрессировали различные серотипы капсидных белков; см., например, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76: 791-801, полное раскрытие которого включено в данный документ при помощи ссылки.
Фармацевтический препарат вектора может включать вектор в приемлемом разбавителе или может включать матрицу замедленного высвобождения, в которую включено средство доставки генов. Альтернативно, в случае, когда вектор доставки целого гена может вырабатываться нативно рекомбинантными клетками, например, ретровирусные векторы, тогда фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, которые предусматривают систему доставки генов.
III. Фармацевтические композиции, содержащие iRNA
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции, содержащие iRNA, которые описаны в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая iRNA, является применимой для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией или активностью гена ALAS1 (например, нарушения, включающего порфириновый путь). Такие фармацевтические композиции составляют, исходя из способа доставки. Например, композиции могут быть составлены для системного введения посредством доставки парентеральным путем, например, путем внутривенной (IV) доставки. Согласно некоторым вариантам осуществления композицию, представленную в данном документе (например, состав LNP), составляют для внутривенной доставки. Согласно некоторым вариантам осуществления композицию, представленную в данном документе (например, композицию, содержащую конъюгат GalNAc), составляют для подкожной доставки.
Фармацевтические композици, описанные в данном документе, вводят в дозе, достаточной для ингибирования экспрессии гена ALAS1. Как правило, подходящая доза iRNA будет находиться в диапазоне от 0,01 до 200,0 миллиграмм на килограмм массы тела реципиента в сутки, как правило, в диапазоне от 1 до 50 мг на килограмм массы тела в сутки. Например, dsRNA можно вводить по 0,05, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 10, 20, 30, 40 или 50 мг/кг на разовую дозу. Фармацевтическую композицию можно вводить один раз в сутки или iRNA можно вводить в виде двух, трех или более частей дозы через определенные интервалы на протяжении дня или даже с применением непрерывной инфузии, или доставки с помощью состава с контролируемым высвобождением. В таком случае количество iRNA, содержащееся в каждой части дозы, должно быть соответственно меньше, чтобы обеспечить общую суточную дозу. Единица дозирования
- 62 036477 также может быть составлена для доставки в течение нескольких дней, например, с применением традиционного состава с замедленным высвобождением, который предусматривает замедленное высвобождение iRNA в течение периода в несколько дней. Составы с замедленным высвобождением хорошо известны из уровня техники и особенно пригодны для доставки средств в определенный участок, например, их можно применять со средствами по настоящему изобретению. Согласно такому варианту осуществления единица дозирования содержит соответствующее количество суточной дозы.
Эффект разовой дозы в отношении уровней ALAS 1 может быть длительным, так что последующие дозы вводят с интервалами не более 3, 4 или 5 дней или с интервалами не более 1, 2, 3 или 4 недель.
Специалисту в данной области будет понятно, что определенные факторы могут влиять на дозу и временные рамки, необходимые для эффективного лечения субъекта, в том числе без ограничения тяжесть заболевания или нарушения, варианты предшествующего лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие имеющиеся заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать один период лечения или серию периодов лечения. Расчеты эффективных доз и времени полужизни in vivo для отдельных iRNA, охваченных настоящим изобретением, можно проводить с применением традиционных методологий, или на основании тестирования in vivo с применением соответствующей животной модели, как описано в другой части в данном документе.
Достижения в области генетики мыши привели к созданию ряда мышиных моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические процессы, связанные с экспрессией ALAS1 (например, патологические процессы, включающие порфирины или нарушения в рамках порфиринового пути, такие как, например, порфирии). Такие модели можно применять для in vivo тестирования iRNA, а также для определения терапевтически эффективной дозы и/или эффективной схемы дозирования.
Подходящей мышиной моделью, например, является мышь, содержащая трансген, экспрессирующий ALAS1 человека. Мыши с мутациями нокин (например, мутациями, которые ассоциированы с острыми печеночными порфириями у людей) можно применять для определения терапевтически эффективной дозы и/или длительности введения siRNA ALAS1. Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, которые включают соединения iRNA, описанные в настоящем изобретении. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить различными путями в зависимости от того, необходимо ли локальное или же системное лечение, и от области, подлежащей лечению. Введение может быть местным (например, при помощи трансдермального пластыря), легочным, например, путем ингаляции или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе при помощи ингалятора; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; субдермальное, например посредством вживленного устройства; или интракраниальное, например, интрапаренхиматозное, интратекальное или интравентрикулярное введение.
iRNA можно доставлять таким образом, чтобы происходило нацеливание на конкретную ткань, такую как, ткань, которая вырабатывает эритроциты. Например, iRNA может быть доставлена в костный мозг, печень (например, гепатоциты печени), лимфатические узлы, селезенку, легкие (например, плевру легких) или позвоночник. Согласно одному варианту осуществления iRNA доставляется в костный мозг.
Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Необходимыми или желательными могут быть общепринятые фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.д. Также можно использовать презервативы с покрытием, перчатки и т.п. Подходящие составы для местного применения включают составы, в которых iRNA, описанные в настоящем изобретении, находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие средства и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоил фосфатидилэтаноламин (DOPE), димиристоил фосфатидилхолин (DMPC), дистеароил фосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристоил фосфатидилглицерин (DMPG)) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил (DOTAP) и диолеоил фосфатидилэтаноламин (DOTMA)). iRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомах или могут образовывать комплексы с ними, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, iRNA могут образовывать комплексы с липидами, в частности, с катионными липидами. Подходящие жирные кислоты и сложные эфиры включают без ограничения арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или Cl-20алкиловые сложные эфиры (например, изопропилмиристат (LPM)), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль. Составы для местного применения подробно описаны в патенте США № 6747014, который включен в данный документ при помощи ссылки.
- 63 036477
Липосомные составы
Существует много упорядоченных поверхностно-активных структур, помимо микроэмульсий, которые были исследованы и которые применяют для состава лекарственных средств. Они включают монослои, мицеллы, бислои и везикулы. Везикулы, такие как липосомы, привлекли к себе большой интерес в связи со своей специфичностью и длительностью действия, которую они обеспечивают с точки зрения доставки лекарственных средств. Используемое в настоящем изобретении выражение липосома означает везикулу, состоящую из амфифильных липидов, упорядоченных в сферический бислой или бислои.
Липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала, и водное внутреннее пространство. Водная часть содержит композицию, подлежащую доставке. Катионные липосомы обладают преимуществом в том смысле, что они способны сливаться с клеточной стенкой. Некатионные липосомы, хотя и не могут сливаться настолько эффективно с клеточной стенкой, поглощаются макрофагами in vivo.
Для того, чтобы пройти через интактную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны пройти через ряд мелких пор, каждая с диаметром менее 50 нм, под воздействием подходящего трансдермального градиента. Таким образом, желательно применять липосому с высокой способностью к деформации и способностью проходить через такие мелкие поры.
Дополнительные преимущества липосом включают: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, биосовместимы и биоразрушаемы; липосомы могут включать широкий диапазон воды и жирорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства во внутренних отделениях от метаболизма и разрушения (Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245). Важными аспектами в получении липосомных составов являются заряд поверхности липида, размер пузырька и водный объем липосом.
Липосомы являются пригодными для переноса и доставки активных ингредиентов к участку действия. Поскольку мембрана липосом структурно подобна биологическим мембранам, при нанесении липосом на ткань, липосомы начинают сливаться с клеточными мембранами и по мере продолжения слияния липосомы и клетки, содержимое липосом выбрасывается в клетку, где может действовать активное средство.
Липосомные составы были предметом обширного исследования в качестве способа доставки многих лекарственных средств. Существует все больше данных о том, что в случае местного применения липосомы проявляют некоторые преимущества по сравнению с другими составами. Такие преимущества включают сниженное побочное действие, связанное с высокой степенью системной абсорбции введенного лекарственного средства, повышенное накопление введенного лекарственного средства в необходимой цели и возможность вводить в кожу широкий спектр лекарственных средств, как гидрофильных, так и гидрофобных.
В нескольких отчетах подробна описана способность липосом доставлять в кожу средства, в том числе ДНК с высоким молекулярным весом. В кожу вводили соединения, в том числе анальгетики, антитела, гормоны и ДНК с высоким молекулярным весом. Результатом большей части было нацеливание в верхний слой эпидермиса.
Липосомы делятся на два широких класса. Катионные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосомы связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализируется в эндосому. Вследствие того, что внутри эндосомы кислый рН, липосомы разрываются, высвобождая свое содержимое в цитоплазму клетки (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 1987, 147, 980-985).
Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно-заряженными, захватывают ДНК вместо образования комплекса с ними. Поскольку как ДНК, так и липид имеют одинаковый заряд, то происходит отталкивание вместо образования комплекса. Тем не менее, некоторая часть ДНК захватывается водным внутренним пространством этих липосом. рН-чувствительные липосомы применяли для доставки ДНК, кодирующей ген тимидинкиназы, к монослоям клеток в культуре. Экспрессию экзогенного гена выявляли в целевых клетках (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Один основной тип липосомных композиций включает фосфолипиды, отличные от фосфатидилхолина природного происхождения. Композиции нейтральных липосом, например, могут быть образованы из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Композиции анионных липосом, как правило, образованы из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные фузогенные липосомы образованы главным образом из диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомных композиций образован из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, PC соевых бобов и PC яиц. Другой тип образован из смесей фосфолипида, и/или фосфатидилхолина, и/или холестерина.
В некоторые исследованиях оценивали местную доставку липосомных лекарственных составов в кожу. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морских свинок, приводило к уменьшению герпетических поражений кожи, в то время как доставка интерферона другими способами (например, в
- 64 036477 виде раствора или эмульсии) была неэффективной (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405410). Также в дополнительном исследовании тестировали эффективность интерферона, вводимого в виде части липосомного состава, по сравнению с введением интерферона с применением водной системы, и сделали заключение, что липосомный состав был более эффективным по сравнению с водным введением (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
Неионные липосомные системы также исследовали для определения их пригодности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные составы, содержащие Novasome™ I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome™ II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), применяли для доставки циклоспорина-А в слой дермы кожи мышей. Результаты показали, что такие неионные липосомные системы были эффективны в облегчении депонирования циклоспорина-А в различных слоях кожи (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Липосомы также включают пространственно стабилизированные липосомы, выражение, используемое в данном документе, относится к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к увеличению времени жизни в крови по сравнению с липосомами, у которых отсутствуют такие специализированные липиды. Примерами пространственно стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть липидной составляющей, образующей везикулу липосомы (А), содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид GM1, ИЛИ (В), полученная из одного или нескольких гидрофильных полимеров, таких как полиэтиленгликолевый (PEG) фрагмент. Без углубления в теорию, в уровне техники полагают, что по меньшей мере для пространственно стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или PEG-производные липиды, увеличенное время полужизни в кровотоке этих пространственно стабилизированных липосом является следствием сниженной степени захвата клетками ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Разнообразные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны из уровня техники. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) описали способность моносиалоганглиозида GM1, сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозитола увеличивать время полужизни липосом в крови. Эти результаты были интерпретированы Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). В патентах США № 4837028 и WO 88/04924, оба из которых принадлежат Allen et al., раскрыты липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GM1 ИЛИ сложные эфиры сульфата галактоцереброзида. В патенте США № 5543152 (Webb et al.) раскрыты липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn-димиристоилфосфaтидилхолин, раскрыты в WO 97/13499 (Lim et al.).
В уровне техники известно много липосом, содержащих липиды, полученные с помощью одного или нескольких гидрофильных полимеров, и способы их получения. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) описали липосомы, содержащие неионный детергент, 2C1215G который содержит PEG-фрагмент. Ilium et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) обнаружили, что гидрофильное покрытие полистиреновых частиц полимерными гликолями приводит к значительно увеличенному времени полужизни в крови. Синтетические фосфолипиды, модифицированные присоединением карбоновых групп полиалкиленгликолей (например, PEG), описаны Sears (патенты США №№ 4426330 и 4534899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) описали эксперименты, демонстрирующие, что липосомы, содержащие фосфатидилэтаноламин (РЕ), полученный с помощью PEG или PEG стеарата, характеризуются значительным увеличением времени полужизни в крови. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) расширили такие наблюдения в отношении других дериватизированных PEG фосфолипидов, например, DSPE-PEG, образованный в результате комбинации дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE) и PEG. Липосомы, содержащие ковалентно связанные PEG-фрагменты на своей внешней поверхности, описаны в европейском патенте № ЕР 0445131 В1 и WO 90/04384 Fisher. Липосомные композиции, содержащие 120 мольных процентов РЕ, дериватизированных PEG, и способы их получения описаны Woodle et al. (патенты США №№ 5013556 и 5356633) и Martin et al. (патент США № 5213804 и европейский патент № ЕР 0496813 В1). Липосомы, содержащие ряд других конъюгатов липид-полимер раскрыты в WO 91/05545 и патенте США № 5225212 (оба из которых принадлежат Martin et al.) и в WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Липосомы, содержащие PEG-модифицированный церамид, раскрыты в WO 96/10391 (Choi et al). В патенте США № 5540935 (Miyazaki et al) и патенте США № 5556948 (Tagawa et al.) описаны PEGсодержащие липосомы, которые могут быть дополнительно дериватизированы функциональными фрагментами на их поверхностях.
В уровне техники известен ряд липосом, содержащих нуклеиновые кислоты. В WO 96/40062 Thierry et al. раскрываты способы инкапсулирования в липосомы нуклеиновых кислот с высоким молекулярным весом. В патенте США № 5264221 Tagawa et al. раскрыты связанные с белком липосомы и заявлено, что содержимое таких липосом может включать dsRNA. В патенте США № 5665710 Rahman et al. описаны определенные способы инкапсулирования в липосомы олигодезоксинуклеотидов. В WO 97/04787 Love et
- 65 036477 al. раскрыты липосомы, содержащие dsRNA, нацеленные на ген raf.
Трансферсомы представляют собой еще один тип липосом и представляют собой липидные агрегаты с высокой способностью деформироваться, они являются перспективными кандидатами как средства доставки лекарственных средств. Трансферсомы могут быть описаны как липидные капельки, которые обладают настолько высокой способностью деформироваться, что они легко могут проникать через поры, меньшие, чем капелька. Трансферсомы являются приспосабливающимися к окружающей среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (приспосабливающимися к форме пор кожи), самовосстанавливающимися, зачастую достигают мишеней без разделения на фрагменты и часто могут быть самозагружающимися. Для получения трансфертом можно добавлять поверхностные пограничные активаторы, обычно поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомной композиции. Трансферсомы применяли для доставки сывороточного альбумина в кожу. Как было показано, опосредованная трансферсомами доставка сывороточного альбумина была такой же эффективной, как подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин.
Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в составах, таких как эмульсии (в том числе микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным способом классифицирования и ранжирования свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ, как природных, так и синтетических, является применение гидролипидного баланса (HLB). Природа гидрофильной группы (также известной как головка) предоставляет наиболее эффективное средство для распределения по категориям различных поверхностно-активных веществ, применяемых в составах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Если молекула поверхностно-активного вещества не ионизирована, то ее классифицируют как неионное поверхностно-активное вещество. Неионные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах, и их можно применять при широком диапазоне значений рН. Обычно их значения HLB находятся в диапазоне от 2 до приблизительно 18, в зависимости от их структуры. Неионные поверхностно-активные вещества включают неионные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, сложные эфиры глицерила, сложные эфиры полиглицерила, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионные алканоамиды и эфиры, как, например, этоксилаты жирного спирта, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блоксополимеры, также включены в данный класс. Полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества являются наиболее распространенными представителями класса неионных поверхностно-активных веществ.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как анионное. Анионные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, как, например, омыляющие вещества, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными представителями класса анионных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и омыляющие вещества.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как катионное. Катионные поверхностно-активные вещества включают четвертичные соли аммония и этоксилированные амины. Четвертичные соли аммония являются наиболее применяемыми представителями данного класса.
Если молекула поверхностно-активного вещества обладает способностью нести либо положительный, либо отрицательный заряд, то поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.
Было рассмотрено применение поверхностно-активных веществ в готовых лекарственных формах, составах и в эмульсиях (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Частицы нуклеиновая кислота-липид
Согласно одному варианту осуществления dsRNA ALAS1, описанная в настоящем изобретении, полностью инкапсулирована в липидный состав, например, с образованием SPLP, pSPLP, SNALP или другой частицы нуклеиновая кислота-липид. Используемое в данном документе выражение SNALP относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид, в том числе SPLP. Используемое в данном документе выражение SPLP относится к частице нуклеиновая кислота-липид, содержащей плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидной везикуле. SNALP и SPLP, как правило, содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предупреждает агрегацию частиц (например, конъюгат PEGлипид). SNALP и SPLP особенно пригодны для системных применений, поскольку они характеризуются длительным временем жизни в крови после внутривенной (i.v.) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, участках, физически отделенных от места введения). SPLP включают pSPLP, которая включает инкапсулированный комплекс конденсирующее средство-нуклеиновая кислота, который приведен в публикации согласно РСТ № WO 00/03683. Частицы согласно настоящему изобретению
- 66 036477 обычно имеют средний диаметр от приблизительно 50 до приблизительно 150 нм, чаще от приблизительно 60 до приблизительно 130 нм, чаще от приблизительно 70 до приблизительно 110 нм, наиболее часто от приблизительно 70 до приблизительно 90 нм и практически нетоксичны. Кроме того, нуклеиновые кислоты, когда присутствуют в частицах нуклеиновая кислота-липид согласно настоящему изобретению, устойчивы в водном растворе к разрушению нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и способ их получения раскрыты, например, в патентах США №№ 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432; публикации согласно РСТ № WO 96/40964.
Согласно одному варианту осуществления соотношение липида и лекарственного средства (соотношение масса/масса) (например, соотношение липида и dsRNA) будет находится в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 25:1, от приблизительно 3:1 до приблизительно 15:1, от приблизительно 4:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 5:1 до приблизительно 9:1 или от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1.
Катионный липид может представлять собой, например, хлорид КН-диолеил-КН-диметиламмония (DODAC), бромид КН-дистеарил-КН-диметиламмония (DDAB), хлорид Н-(1-(2,3-диолеоилокси)пропил)-ККН-триметиламмония (DOTAP), хлорид Н-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-Н,Н,Нтриметиламмония (DOTMA), Н,Н-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA), 1,2-дилинолеилокси-Н,Н-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-Н,Н-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолеилокси3-(диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеилокси-3-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2дилинолеоил-3-диметиламинопропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (DLin-SDMA), 1-линолеоил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлористую соль 1,2дилинолеилокси-3-триметиламинопропана (DLin-TMA.Cl), хлористую соль 1,2-дилинолеоил-3триметиламинопропана (DLin-TAP.Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(Н-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(Н,Н-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(Н,Н-диолеиламино)-1,2-пропандиол (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-Н,Н-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 1,2-дилиноленилокси-Н,Н-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или его аналоги, (3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12диенил)тетрагидро-3аН-циклопентаЩ[1,3]диоксол-5-амин (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат(МС3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (Tech G1) или их смесь. Катионный липид может содержать от приблизительно 20 до приблизительно 50 мол.% или приблизительно 40 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Согласно другому варианту осуществления можно применять соединение 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан для получения наночастиц липид -siRNA. Синтез 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолана описан в предварительной заявке на патент США № 61/107998, поданной 23 октября 2008 г., которая включена в данный документ при помощи ссылки.
Согласно одному варианту осуществления частицы липид-siRNA включают 40% 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан; 10%DSPC; 40% холестерин; 10% PEG-C-DOMG (мольный процент) с размером частиц 63,0 ± 20 нм и соотношением siRNA/липид 0,027.
Некатионный липид может представлять собой анионный липид или нейтральный липид, в том числе без ограничения дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоил-фосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоил-фосфатидилэтаноламин-4-(Нмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароил-фосфатидил-этаноламин (DSPE), 16-О-монометилРЕ, 16-О-диметил-РЕ, 18-1-транс-РЕ, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Некатионный липид может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 90 мол. %, приблизительно 10 или приблизительно 58 мол.%, если холестерин включен, от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Конъюгированный липид, который ингибирует агрегацию частиц, может представлять собой, например, конъюгат полиэтиленгликоль (РЕО)-липид, в том числе, без ограничения, PEG-диацилглицерин (DAG), PEG-диалкилоксипропил (DAA), PEG-фосфолипид, PEG-церамид (Сег) или их смесь. Конъюгат PEG-DAA может представлять собой, например, PEG-дилаурилоксипропил (С1г), PEGдимиристоилоксипропил (Ci4), PEG-дипальмитилоксипропил (Ci6) или PEG-дистеарилоксипропил (Ci8). Конъюгированный липид, который предупреждает агрегацию частиц, может составлять от 0 до приблизительно 20 мол.% или приблизительно 2 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Согласно некоторым вариантам осуществления частицы нуклеиновая кислота-липид дополнительно включают холестерин в количестве, например, от приблизительно 10 до приблизительно 60 мол.% или приблизительно 48 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составлена в виде липидной наночастицы
- 67 036477 (LNP).
LNP01
Согласно одному варианту осуществления липидоид ND98-4HC1 (MW 1487) (см. заявку на патент США № 12/056230, поданную 26 марта 2008 г., которая включена в данный документ при помощи ссылки), холестерин (Sigma-Aldrich) и PEG-церамид С16 (Avanti Polar Lipids) можно применять для получения наночастицы липид-dsRNA (т. е. частиц LNP01). Маточные растворы каждого в этаноле могут быть получены следующим образом: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, PEG-церамид С16, 100 мг/мл. Маточные растворы ND98, холестерина и PEG-церамида С16 можно затем объединять, например, в мольрном соотношении 42:48:10. Объединенный липидный раствор можно смешивать с водным раствором dsRNA (например, в ацетате натрия, рН 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла приблизительно 35-45%, а конечная концентрация ацетата натрия составляла приблизительно 100-300 мМ. Наночастицы липид-dsRNA обычно образуются самопроизвольно при смешивании. В зависимости от необходимого распределения частиц по размеру, полученную смесь наночастиц можно продавливать через поликарбонатную мембрану (например, с отсечением по размеру в 100 нм) с применением, например, экструдера с термоцилиндром, как, например, Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадию экструзии можно пропустить. Удаление этанола и одновременная замена буфера могут быть осуществлены, например, при помощи диализа или тангенциальной поточной фильтрации. Буфер можно заменить, например, забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) с рН приблизительно 7, например, рН приблизительно 6,9, рН приблизительно 7,0, рН приблизительно 7,1, рН приблизительно 7,2, рН приблизительно 7,3 или рН приблизительно 7,4.
н н
Изомер IND98
Формула 1
Составы LNP01 описаны, например, в публикации международной заявки № WO 2008/042973, которая включена, таким образом, при помощи ссылки.
Дополнительные иллюстративные составы с липидом-dsRNA представлены в следующей таблице.
Таблица 10. Иллюстративные липидные составы
Катионный липид Катионный липид/некатионный липид/холестерин/конъюгат PEGлипид Соотношение липид: siRNA
SNALP 1,2-дилинолс н илокси-Х ,Х- диметиламинопропан (DLinDMA) DLinDMA/DPPC7.\onccTcpnH/PEG- cDMA (57,1/7,1/34,4/1,4) липид: siRNA -7:1
S-XTC 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) ХТС/ОРРС/холестерин/РЕО-сОМА 57,1/7,1/34,4/1,4 липид: siRNA ~ 7:1
LNP05 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) XTC/DSPC/xonecTepnH/PEG-DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 липид: siRNA-6:1
LNP06 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) XTC/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 липид: siRNA -11:1
- 68 036477
LNP07 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) ХТС/08РС/холестерин/РЕО-ОМО 60/7,5/31/1,5, липид: siRNA ~ 6:1
LNP08 2,2-дилинолеил-4- диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) XTC/DSPC/xonecTepnH/PEG-DMG 60/7,5/31/1,5, липид: siRNA - 11:1
LNP09 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) XTC/DSPC/xonecTepnH/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липидщПША 10:1
LNP10 (3aR,5s,6aS)-N,N-,gHMeiwi-2,2ди((92,12Z)-октадека-9,12диенил)тетрагидро -ЗаНциклопента[(1] [1,3]диоксол-5-амин (ALN100) ALN100/D SPC/xo лестерин/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липидщПША 10:1
LNP11 (6Z,9Z,28Z,31 г)-гептатриаконта- 6,9,28,31-тетраен-19-ил-4- (диметиламино)бутаноат (МСЗ) MC-3/D 8РС/холестерин/РЕС-ОМС 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA 10:1
LNP12 1,Г-(2-(4-(2-((2-(бис(2- гидроксидодецил)амино)этил)(2гидроксидодецил)амино)этил)пипера зин-1 -ил)этилазанедиил)дидодекан2-ол (С 12-200) С12-200/D SPC/xo лестерин/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA 10:1
LNP13 ХТС XTC/DSPC/xon/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 33:1.
LNP14 МСЗ MC3/DSPC/xofl/PEG-DMG 40/15/40/5 липид: siRNA: 11:1.
LNP15 МСЗ MC3/DSPC/xon/PEG-DSG/GalNAc- PEG-DSG 50/10/35/4,5/0,5 липид: siRNA: 11:1.
LNP 16 MC3 MC3/DSPC/xon/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 7:1.
LNP 17 MC3 MC3/DSPC/xon/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA: 10:1.
LNP 18 MC3 MC3/DSPC/xon/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA: 12:1.
LNP 19 MC3 MC3/DSPC/xon/PEG-DMG 50/10/35/5 липид:siRNA: 8:1.
LNP20 MC3 MC3/DSPC/xon/PEG-DPG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA: 10:1.
LNP21 Cl 2-200 C12-200/DSPC/xon/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 7:1.
LNP22 XTC XTC/DSPC/xon/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA: 10:1.
DSPC: дистеароилфосфатидилхолин;
DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин;
PEG-DMG: PEG-дидимиристоилглицерин (С 14-PEG или PEG-C14) (PEG со ср. мол.весом 2000);
PEG-DSG: PEG-дистирилглицерин (C18-PEG или PEG-C18) (PEG со ср. мол.весом 2000);
PEG-cDMA: PEG-карбамоил-1,2-димиристоилоксипропиламин (PEG со ср. мол.весом 2000).
- 69 036477
Составы, содержащие SNALP (1.2-дилиноленилокси-Х.Х-диметиламинопропан (DLinDMA)), описаны в международной публикации № WO 2009/127060, поданной 15 апреля 2009 г., которая включена, таким образом, при помощи ссылки.
ХТС-содержащие составы описаны, например, в предварительной заявке США с серийным № 61/148366, поданной 29 января 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/156851, поданной 2 марта 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № , поданной 10 июня 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/228373, поданной 24 июля 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/239686, поданной 3 сентября 2009 г., и международной заявке № PCT/US 2010/022614, поданной 29 января 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.
МС3-содержащие составы описаны, например, в предварительной заявке США с серийным № 61/244834, поданной 22 сентября 2009 г., предварительной заявке США с серийным № 61/185800, поданной 10 июня 2009 г., и международной заявке № PCT/US 10/28224, поданной 10 июня 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.
ALNY-100-содержащие составы описаны, например, в международной заявке на патент с номером PCT/US09/63933, поданной 10 ноября 2009 г., которая, таким образом, включена при помощи ссылки.
С12-200-содержащие составы описаны в предварительной заявке США с серийным № 61/175770, поданной 5 мая 2009 г., и международной заявке № PCT/US 10/33777, поданной 5 мая 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.
Синтез катионных липидов
Любое из соединений, например, катионные липиды и т.п., применяемые в частицах нуклеиновая кислота-липид, описанные в настоящем изобретении, можно получить при помощи известных методик органического синтеза, включая способы, описанные более подробно в примерах. Все заместители являются такими, как определено ниже, если не указано иное.
Алкил означает углеводород с прямой цепью или разветвленный, нециклический или циклический, насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 24 атомов углерода. Типичные насыщенные алкилы с прямой цепью включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п.; тогда как насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и т.п. Типичные насыщенные циклические алкилы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.; тогда как ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил и циклогексенил и т.п.
Алкенил означает алкил, который определен выше, содержащий по меньшей мере одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы включают как цис-, так и транс-изомеры. Типичные алкенилы с прямой цепью и разветвленные алкенилы включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2бутенил и т.п.
Алкинил означает любой алкил или алкенил, которые определены выше, которые дополнительно содержат по меньшей мере одну тройную связь между соседними атомами углерода. Типичные алкинилы с прямой цепью и разветвленные алкинилы включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутинил и т.п.
Ацил означает любой алкил, алкенил или алкинил, в которых атом углерода в точке присоединения замещен оксогруппой, которая определена ниже. Например, -С(=О)алкил, -С(=О)алкенил и -С(=О)алкинил представляют собой ацильные группы.
Гетероцикл означает 5-7-членное моноциклическое или 7-10-членное бициклическое, гетероциклическое кольцо, которое является либо насыщенным, ненасыщенным, либо ароматическим, и которое содержит 1 или 2 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и где гетероатомы азота и серы необязательно могут быть окислены, и гетероатом азота необязательно может быть кватернизирован, в том числе бициклические кольца, в которых любой из вышеперечисленных гетероциклов слит с бензольным кольцом. Гетероцикл может быть присоединен через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы включают гетероарилы, которые определены ниже. Гетероциклы включают морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и т.п.
Выражения необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный ацил и необязательно замещенный гетероцикл означают, что при замещении по меньшей мере один атом водорода заменяется заместителем. В случае оксозаместителя (=O) замещаются два атома водорода. В этом отношении заместители включают оксо, галоген, гетероцикл, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx и -SOnNRxRy, где n равняется 0, 1 или 2, Rx и Ry являются одинаковыми или отличаются и независимо являются водородом, алкилом или гетероциклом, и каждый из упомянутых алкильных или гетероциклических заместителей может быть дополнительно замещен одним или несколькими из оксо, галогена, -ОН, -CN, алкила, -ORx, гетероцикла, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx,
- 70 036477
-C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx и -SOnNRxRy.
Галоген означает фтор, хлор, бром и йод.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы, описанные в настоящем изобретении, могут потребовать применение защитных групп. Методика с применением защитных групп хорошо известна специалистам в данной области (см., например, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Вкратце, защитные группы в контексте настоящего изобретения представляют собой любую группу, которая снижает или устраняет нежелательную химическую активность функциональной группы. Защитную группу можно добавлять к функциональной группе для блокирования ее химической активности во время определенных реакций и затем удалять с открытием исходной функциональной группы. Согласно некоторым вариантам осуществления применяют защитную группу для спиртовой группы. Защитная группа для спиртовой группы представляет собой любую группу, которая снижает или устраняет нежелательную химическую активность спиртовой функциональной группы. Защитные группы можно добавлять и удалять при помощи методик, хорошо известных в уровне техники.
Синтез формулы А
Согласно одному варианту осуществления частицы нуклеиновая кислота-липид, описанные в настоящем изобретении, составляют с применением катионного липида формулы А:
R3 \
где R1 и R2 независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, при этом каждый необязательно может быть замещен, a R3 и R4 независимо представляют собой низший алкил, или R3 и R4 могут, взятые вместе, образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо. Согласно некоторым вариантам осуществления катионный липид представляет собой ХТС, (2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан). Как правило, липид формулы А, приведенной выше, может быть получен при помощи следующих схем реакций 1 или 2, где все заместители являются такими, как опре делено выше, если не указано иное.
Схема 1
Липид А, где R1 и R2 независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, при этом каждый необязательно может быть замещен, а R3 и R4 независимо представляют собой низший алкил или R3 и R4 могут, взятые вместе, образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо, может быть получен согласно схеме 1. Кетон 1 и бромид 2 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалисту в данной области. Реакция между 1 и 2 дает кеталь 3. Обработка кеталя 3 амином 4 дает липиды формулы А. Липиды формулы А можно превращать в соответствующую аммонийную соль при помощи органической соли формулы 5, где X представляет собой анион, противоион, выбранный из галогена, гидроксида, фосфата, сульфата или т.п.
Схема 2
Альтернативно, исходный материал в виде кетона 1 может быть получен согласно схеме 2. Реактив Гриньяра 6 и цианид 7 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалисту в данной области. Реакция между 6 и 7 дает кетон 1. Превращение кетона 1 в соответствующие ли
- 71 036477 пиды формулы А является таким, как описано на схеме 1.
Синтез МС3
Получение DLin-M-C3-DMA (т.е. (62,92,282,312)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноата) было следующим. Раствор (62,92,282,312)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19ола (0,53 г), гидрохлорида 4-Ы,Ы-диметиламиномасляной кислоты (0,51 г), 4-Ы,Ы-диметиламинопиридина (0,61 г) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (0,53 г) в дихлорметане (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, за которой следовал разбавленный водный бикарбонат натрия. Органические фракции высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и растворитель удаляли при помощи роторного вакуумного испарителя. Остаток пропускали через колонку с силикагелем (20 г) с применением градиента элюирования 1-5% метанол/дихлорметан. Фракции, содержащие очищенный продукт, объединяли и растворитель удаляли с получением бесцветного масла (0,54 г).
Синтез ALNY-100
Синтез кеталя 519 [ALNY-100] осуществляли с применением следующей схемы 3:
Синтез 515:
К перемешиваемой суспензии LiAlH4 (3,74 г, 0,09852 моль) в 200 мл безводного THF в двугорлой RBF (1л) медленно добавляли раствор 514 (10 г, 0,04926 моль) в 70 мл THF при 0°С в атмосфере азота. После завершения добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и затем нагревали до появления конденсации в течение 4 ч. Течение реакции отслеживали при помощи TLC. После завершения реакции (определяли при помощи TLC) смесь охлаждали до 0°С и гасили аккуратным добавлением насыщенного раствора Na2SO4. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре и отфильтровывали. Остаток хорошо промывали THF. Фильтрат и осадок, полученный при промывке, смешивали, и разбавляли 400 мл диоксана и 26 мл конц. HCl, и перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Летучие вещества отгоняли в вакууме с получением хлористоводородной соли 515 в виде белого твердого вещества. Выход: 7,12 г 1Н-ЯМР (DMSO, 400 МГц): δ= 9,34 (широкий, 2Н), 5,68 (s, 2Н), 3,74 (m, 1H), 2,66-2,60 (m, 2Н), 2,502,45 (m, 5Н).
Синтез 516:
К перемешиваемому раствору соединения 515 в 100 мл сухого DCM в 250 мл двухгорлой RBF добавляли NEt3 (37,2 мл, 0,2669 моль) и охлаждали до 0°С в атмосфере азота. После медленного добавления ^-(бензилоксикарбонилокси)сукцинимида (20 г, 0,08007 моль) в 50 мл сухого DCM реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры. После завершения реакции (2-3 ч., определяли при помощи TLC) смесь промывали последовательно раствором 1 н. HCl (1 х 100 мл) и насыщенным раствором NaHCO3 (1 х 50 мл). Органический слой затем высушивали над безводн. Na2SO4 и растворитель выпаривали с получением неочищенного материала, который очищали при помощи колоночной хроматографии с силикагелем с получением 516 в виде липкой массы. Выход: 11 г (89%).
1Н-ЯМР (CDC13, 400 МГц): δ = 7,36-7,27(m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2Н), 4,96 (br., 1Н) 2,74 (s, 3Н), 2,60(m, 2Н), 2,30-2,25(m, 2Н). LC-MS [М+Н] -232,3 (96,94%).
Синтез 517А и 517В:
Циклопентен 516 (5 г, 0,02164 моль) растворяли в растворе 220 мл ацетона и воды (10:1) в одногорлой 500 мл RBF и к нему добавляли №метилморфолин-№оксид (7,6 г, 0,06492 моль), за которым следовали 4,2 мл 7,6% раствора OsO4 (0,275 г, 0,00108 моль) в трет-бутаноле при комнатной температуре. После завершения реакции (~3 ч) смесь гасили при помощи добавления твердого Na2SO3 и полученную смесь перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли DCM (300 мл) и промывали водой (2х 100 мл), после чего следовал насыщенный раствор NaHCO3 (1 х 50 мл), вода (1х30 мл) и в конце соляной раствор (1х50 мл). Органическую фазу высушивали над безводн. Na2SO4 и растворитель удаляли в вакууме. В результате очистки неочищенного материала при помощи колоночной хроматографии с силикагелем получали смесь диастереоизомеров, которые разделяли при помощи преп. HPLC. Выход: - 6 г неочищенного продукта.
517А - пик-1 (белое твердое вещество), 5,13 г (96%).
1Н-ЯМР (DMSO, 400 МГц): δ=7,39-7,31 (m, 5Н), 5,04 (s, 2Н), 4,78-4,73 (m, 1H), 4,48-4,47 (d, 2Н), 3,94-3,93 (m, 2Н), 2,71 (s, 3Н), 1,72-1,67 (m, 4Н). LC-MS - [М+Н]-266,3, [M+NH4+]-283,5 присутствует, HPLC-97,86%. Стереохимию подтверждали при помощи рентгенограммы.
- 72 036477
Синтез 518:
При помощи процедуры, аналогичной описанной для синтеза соединения 505, соединение 518 (1,2 г, 41%) получали в виде бесцветного масла.
1Н-ЯМР (CDC13, 400 МГц): δ=7,35-7,33 (m, 4Н), 7,30-7,27 (m, 1H), 5,37-5,27 (m, 8Н), 5,12 (s, 2H), 4,75 (m, 1H), 4,58-4,57 (m, 2H), 2,78-2,74 (m, 7H), 2,06-2,00 (m,8H), l,96-l,91 (m, 2H), l,62 (m, 4H), 1,48 (m, 2H), 1,37-1,25 (br m, 36H), 0,87 (m, 6H). HPLC-98,65%.
Общая процедура для синтеза соединения 519:
Раствор соединения 518 (1 экв.) в гексане (15 мл) добавляли по каплям к охлажденному на льду раствору LAH в THF (1 М, 2 экв.). После завершения добавления смесь нагревали при 40°С в течение 0,5 ч, затем охлаждали снова на ледяной бане. Смесь аккуратно гидролизовали насыщенным водным Na2SO4, затем фильтровали через целит и переводили в масло. С помощью колоночной хроматографии получали чистое 519 (1,3 г, 68%), которое получали в виде бесцветного масла.
13С ЯМР = 130,2, 130,1 (х2), 127,9 (х3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (х2), 29,7, 29,6 (х2), 29,5 (х3), 29,3 (х2), 27,2 (х3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; MS с электрораспылением (+ve): Молекулярный вес для C44H80NO2 (М + Н)+ вычисл. 654,6, обнаруженный 654,6.
Составы, полученные либо при помощи стандартного способа, либо при помощи способа без экструзии, можно характеризовать одинаковым образом. Например, составы, как правило, характеризуют при помощи визуального осмотра. Это должны быть белесые прозрачные растворы, в которых нет агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение частиц по размеру липидных наночастиц можно измерять при помощи рассеяния света, с применением, например, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, С111а). Размеры частиц должны составлять приблизительно 20-300 нм, например 40-100 нм. Распределение частиц по размеру должно быть одновершинным. Общую концентрацию dsRNA в составе, а также захваченную фракцию определяют при помощи анализа на исключение красителя. Образец составленной dsRNA можно инкубировать со связывающимся с РНК красителем, например Ribogreen (Molecular Probes), в присутствии или в отсутствие разрушающего состав поверхностно-активного вещества, например, 0,5% Triton-XlOO. Общую dsRNA в составе можно определять по сигналу от образца, содержащего поверхностно-активное вещество, по отношению к калибовочной кривой. Захваченную фракцию определяют путем вычитания содержания свободной dsRNA (которое измерено по сигналу при отсутствии поверхностно-активного вещества) из общего содержания dsRNA. Процент захваченной dsRNA, как правило, составляет >85%. Для состава SNALP размер частиц составляет по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящий диапазон, как правило, составляет от приблизительно по меньшей мере 50 до приблизительно по меньшей мере 110 нм, от приблизительно по меньшей мере 60 до приблизительно по меньшей мере 100 нм или от приблизительно по меньшей мере 80 до приблизительно по меньшей мере 90 нм.
Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастица, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводной среде, капсулы, желатиновые капсулы, пакетики с порошком для приготовления раствора, таблетки или минитаблетки. Могут быть необходимы загустители, ароматизирующие вещества, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие средства или связующие вещества. Согласно некоторым вариантам осуществления пероральные составы являются такими, в которых dsRNA, описанные в настоящем изобретении, вводят в сочетании с одним или несколькими веществами, способствующими проникновению, поверхностно-активными вещества и хелаторами. Подходящие поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящие желчные кислоты/соли желчных кислот включают хенодезоксихолевую кислоту (CDCA) и урсодезоксихенодезоксихолевую кислоту (UDCA), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25дигидрофузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящие жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил 1-монокапрат, 1додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, натриевую). Согласно некоторым вариантам осуществления применяют комбинации веществ, способствующих проникновению, например, жирные кислоты/соли жирных кислот в комбинации с желчными кислотами/солями желчных кислот. Одной иллюстративной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA.
Дополнительные вещества, способствующие проникновению, включают полиоксиэтилен-9лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. dsRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть доставлены перорально, в форме гранул, в том числе распыляемых высушенных частиц, или формируют комплексы с образованием микро- или наночастиц. Комплексообразующие средства для
- 73 036477 dsRNA включают полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты; катионизированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (PEG) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; DEAE-производные полиимины, пуллуланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящие комплексообразующие средства включают хитозан, Nтриметилхитозан, поли-к-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен (PTDAE), полиаминостирол (например, р-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианакрилат), поли(изобутилцианакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAEальбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(О.Е-молочную кислоту), сополимер DL-молочной и гликолевой кислоты (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (PEG). Пероральные составы для dsRNA и их получение описаны подробно в патенте США № 6887906, публикации США № 20030027780 и патенте США № 6747014, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
Композиции и составы для парентерального, интрапаренхиматозного (в головной мозг), интратекального, интравентрикулярного или внутрипеченочного введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие соответствующие добавки, такие как, без ограничения, вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают, без ограничения, растворы, эмульсии и содержащие липосомы составы. Такие композиции могут быть получены из ряда компонентов, которые включают, без ограничения, предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.
Фармацевтические составы, описанные в настоящем изобретении, которые в целях удобства могут находиться в виде единичной лекарственной формы, можно получать согласно традиционным методикам, хорошо известным в фармацевтической промышленности. Такие методики включают стадию приведения активных ингредиентов во взаимодействие с фармацевтическим(фармацевтическими) носителем(носителями) или наполнителем(наполнителями). Как правило, составы получают путем равномерного и тщательного приведения активных ингредиентов во взаимодействие с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями или и теми, и другими, а затем, при необходимости, придания продукту формы.
Композиции, описанные в настоящем изобретении, могут быть составлены в виде любых из многих возможных лекарственных форм, как, например, без ограничения, таблеток, капсул, желатиновых капсул, жидких сиропов, пластичных гелей, суппозиториев и клизмы. Композиции также могут быть составлены в виде суспензий в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии дополнительно могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
Дополнительные составы
Эмульсии
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены и составлены в виде эмульсий. Эмульсии, как правило, являются гетерогенными системами одной жидкости, диспергированной в другой, в форме капелек, диаметр которых обычно превышает 0,1 мкм (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245; Block в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 2, p. 335; Higuchi et al. в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301).
Эмульсии часто представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешиваемые жидкие фазы, тщательно перемешанные и диспрегированные одна в другой. Как правило, эмульсии могут представлять собой либо эмульсии по типу вода в масле (w/o), либо масло в воде (o/w). В тех случаях, когда водная фаза является мелкораспыленной в общем объеме масляной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу вода в масле (w/o). Альтернативно, в тех случаях, когда масляная фаза является мелкораспыленной в общем объеме водной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу масло в воде (o/w). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты вдобавок к диспергированным фазам и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора либо в водной фазе, либо в масляной фазе, либо само по себе в качестве отдельной фазы. При необходимости в эмульсиях могут присутствовать фармацевтические наполнители, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты. Фармацевтические эмульсии также могут представлять собой множественные эмульсии, которые состоят из более чем двух фаз, как например, в случае эмульсий по типу масло-в-воде-в-масле (o/w/o) и вода-в-масле-в-воде (w/o/w). Такие
- 74 036477 сложные составы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые двухкомпонентные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых отдельные масляные капельки эмульсии o/w включают маленькие водные капельки, составляющие эмульсию w/o/w. Аналогично этому система масляных капелек, заключенная в каплях воды, стабилизированных в масляной диспергирующей фазе, обеспечивает эмульсию o/w/o.
Эмульсии характеризуются малой термодинамической устойчивостью, или она отсутствует. Часто диспергированная или дисперсная фаза эмульсии хорошо диспергирована в дисперсионной или диспергирующей фазе и поддерживается в такой форме при помощи эмульгаторов или вязкости состава. Любая фаза эмульсии может быть полутвердой или твердой, как и в случае мазевых основ, подобных эмульсии, и кремов. Другие способы стабилизации эмульсий охватывают применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы в целом могут быть разделены на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, встречающиеся в природе эмульгаторы, абсорбционные базы и высокодисперные твердые вещества (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 199).
Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как сурфактанты, нашли широкое применение в составе эмульсий, и они рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 285; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, vol. 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Соотношение гидрофильной и гидрофобной природы поверхностно-активного вещества называют гидрофильно-липофильным балансом (HLB), и оно является ценным инструментом при распределении на категории и выборе поверхностно-активных веществ при получении составов. Поверхностно-активные вещества можно разделять на различные классы, исходя из природы гидрофильной группы: неионные, анионные, катионные и амфотерные (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 285).
Встречающиеся в природе эмульгаторы, применяемые в составах эмульсий, включают ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и гуммиарабик. Абсорбционные базы, такие как безводный ланолин и гидрофильный вазелин, обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием эмульсий w/o, с сохранением их полутвердой консистенции. Мелкоизмельченные твердые вещества также применяли в качестве подходящих эмульгаторов, в частности, в комбинации с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Они включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, неразбухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или глицерила тристеарат.
Большое разнообразие неэмульгирующих материалов также включают в составы эмульсий и они вносят вклад в свойства эмульсий. Они включают жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 335; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 199).
Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают встречающиеся в природе смолы и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, гуммиарабик, агар, альгиновую кислоту, каррагенан, гуаровую камедь, камедь карайи и трагакант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу и карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии путем образования крепких межфазных пленок вокруг капелек диспергированной фазы, а также путем повышения вязкости дисперсионной фазы.
Поскольку эмульсии зачастую содержат некоторое количество ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые легко способствуют росту микроорганизмов, то такие составы зачастую включают консерванты. Широко применяемые консерванты, включенные в составы эмульсий, включают метилпарабен, пропилпарабен, четвертичные соли аммония, бензалкония хлорид, сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также обычно добавляют к составам эмульсий для предупреждения старения состава. Применяемые антиоксиданты могут представлять собой ловушки свободных радикалов, как, например, токоферолы, алкил галлаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановители, как, например, аскорбиновая
- 75 036477 кислота и метабисульфит натрия, и синергистами антиоксидантов, как, например, лимонная кислота, винная кислота и лецитин.
Применение составов эмульсий с помощью дерматологического, перорального и парентерального путей и способы их получения рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 199). Составы эмульсий для пероральной доставки являются очень распространенными для применения в связи с удобством составления, а также с точки зрения эффективности при всасывании и биодоступности (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Слабительные средства на основе минеральных масел, жирорастворимые витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира являются одними из материалов, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий o/w.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения композиции iRNA и нуклеиновые кислоты составлены в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система воды, масла и амфифильного вещества, которая является отдельным оптически изотропным и термодинамически устойчивым жидким раствором (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel hC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245). Обычно микроэмульсии представляют собой системы, которые получают путем сперва диспергирования масла в водном растворе поверхностно-активного вещества, а затем добавления достаточного количества четвертого компонента, как правило, спирта со средней длиной цепи с получением прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии также были описаны как термодинамически устойчивые, изотропически чистые дисперсии двух несмешиваемых жидкостей, которые стабилизируются межфазными пленками поверхностно-активных молекул (Leung и Shah, в Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Микроэмульсии обычно получают путем объединения от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. То, является ли микроэмульсия эмульсией по типу вода в масле (w/o) или по типу масло в воде (o/w), зависит от свойств применяемого масла и поверхностно-активного вещества, а также от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов молекул поверхностно-активного вещества (Schott, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
Активно изучался феноменологический подход с использованием фазовых диаграмм, и с его помощью специалистами в данной области были получены обширные данные о том, как составлять микроэмульсии (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 335). По сравнению с традиционными эмульсиями микроэмульсии предлагают преимущество стабилизации водонерастворимых лекарственных средств в составе термодинамически устойчивых капелек, которые образуются самопроизвольно.
Поверхностно-активные вещества, применяемые для получения микроэмульсий, включают без ограничения ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, Brij 96, полиоксиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры жирных кислот и полиглицерина, тетраглицерина монолаурат (ML310), тетраглицерина моноолеат (МО310), гексаглицерина моноолеат (РО310), гексаглицерина пентаолеат (РО500), декаглицерина монокапрат (МСА750), декаглицерина моноолеат (МО750), декаглицерина секвиолеат (SO750), декаглицерина декаолеат (DAO750) отдельно или в комбинации со вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, обычно являющееся спиртом с короткой цепью, таким как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для увеличения межфазной текучести путем проникновения в пленку из поверхностно-активного вещества и соответственно создания неупорядоченной пленки из-за пустого пространства, образующегося среди молекул поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены без применения вторичных поверхностно-активных веществ, и в уровне техники известны самоэмульгирующиеся системы микроэмульсий без спирта. Водной фазой, как правило, может быть вода, водный раствор лекарственного средства, глицерин, PEG300, PEG400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может включать без ограничения материалы, такие как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, среднецепочечные (С8-С12) моно-, ди- и триглицериды, полиоксиэтилированные сложные эфиры жирных кислот и глицерина, жирные спирты, полигликолизированные
- 76 036477 глицериды, насыщенные полигликолизированные С8-С10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло.
Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения растворимости лекарственного средства и повышенной абсорбции лекарственных средств. Липидные микроэмульсии (как o/w, так и w/o) были предложены для увеличения пероральной биодоступности лекарственных средств, включая пептиды (см., например, патент США №№ 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Микроэмульсии обеспечивают преимущества в виде улучшенной растворимости лекарственного средства, защиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного повышенной абсорбции лекарственного средства за счет индуцированных поверхностно-активным веществом изменений текучести мембран и проницаемости, удобства получения, удобства перорального введения по сравнению с твердой лекарственной формой, улучшенной клинической действенности и пониженной токсичности (см., например, патент США №№ 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться самопроизвольно, когда их компоненты объединяют при температуре окружающей среды. Это может быть в особенности преимущественным, когда составляют термолабильные лекарственные средства, пептиды или iRNA. Микроэмульсии также были эффективными при трансдермальной доставке активных компонентов как при косметических, так и при фармацевтических применениях. Предполагается, что композиции и составы микроэмульсий согласно настоящему изобретению будут способствовать повышенной системной абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также улучшать локальный клеточный захват iRNA и нуклеиновых кислот.
Микроэмульсии согласно настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как сорбитанмоностеарат (Grill 3), Labrasol и вещества, способствующие проникновению, для улучшения свойств состава и для повышения абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Вещества, способствующие проникновению, применяемые в микроэмульсиях согласно настоящему изобретению, могут быть классифицированы, как принадлежащие к одной из пяти основных категорий: поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатирующие поверхностно-неактивные вещества (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов рассматривался выше.
Вещества, способствующие проникновению
Согласно одному варианту осуществления в настоящем изобретении используют разнообразные вещества, способствующие проникновению, для воздействия на эффективную доставку нуклеиновых кислот, в частности iRNA, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствуют в растворе как в ионизированной, так и в неионизированной формах. Однако, как правило, только жирорастворимые или липофильные лекарственные средства легко проходят через клеточные мембраны. Было установлено, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проходить через клеточные мембраны, если мембрана, через которую необходимо пройти, обработана веществом, способствующим проникновению. Вдобавок к обеспечению диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны вещества, способствующие проникновению, также повышают проницаемость для липофильных лекарственных средств.
Вещества, способствующие проникновению, можно классифицировать как принадлежащие к одной из пяти основных категорий, т. е. поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатриующие поверхностно-неактивные вещества (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из вышеуказанных классов веществ, способствующих проникновению, описан ниже более подробно.
Поверхностно-активные вещества:
В связи с настоящим изобретением поверхностно-активные вещества (или сурфактанты) являются химическими структурными единицами, которые при растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, в результате чего абсорбция iRNA через слизистую повышается. Помимо солей желчных кислот и жирных кислот, эти вещества, способствующие проникновению, включают, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92) и перфторированные эмульсии, такие как FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Жирные кислоты:
Разнообразные жирные кислоты и их производные, которые действуют как вещества, способствующие проникновению, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рацглицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерин-1-монокапрат, 1- 77 036477 додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их С1-20алкиловые сложные эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и их моно- и диглицериды (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т. д.) (см., например, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Соли желчных кислот: Физиологическая роль желчи включает содействие в распределении и всасывании липидов и жирорастворимых витаминов (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 в Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934935). Разные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как вещества, способствующие проникновению. Таким образом, выражение соли желчных кислот включают любые встречающиеся в природе компоненты желчи, а также любое из их синтетических производных. Подходящие соли желчных кислот включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюхолевую кислоту (глюхолат натрия), глихолевую кислоту (глихолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидро-фузидат (STDHF) натрия, гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (РОЕ) (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Хелатирующие средства:
Хелатирующие средства, используемые применительно к настоящему изобретению, можно определить как соединения, которые удаляют ионы металла из раствора путем образования комплексов с ними, в результате чего абсорбция iRNA через слизистую повышается. В отношении их применения в качестве веществ, способствующих проникновению, в настоящем изобретении хелатирующие средства обладают дополнительным преимуществом, также выступая в качестве ингибиторов ДНКазы, поскольку большинство охарактеризованных ДНК-нуклеаз требуют двухвалентный ион металла для катализа и, таким образом, ингибируются хелатирующими средствами (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатирующие средства включают, без ограничения, двунатриевый этилендиаминтетраацетат (EDTA), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомовалинат), Nацилпроизводные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацилпроизводные Р-дикетонов (енамины)(см., например, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Нехелатирующие поверхностно-неактивные вещества: Используемые в данном документе нехелатирующие поверхностно-неактивные соединения, способствующие проникновению, могут быть определены как соединения, которые проявляют небольшую активность как хелатирующие средства или как поверхностно-активные вещества, но которые тем не менее повышают абсорбцию iRNA через слизистую пищеварительного тракта (см., например, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Этот класс веществ, способствующих проникновению, включает, например, ненасыщенные цикломочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазацикло-алканона (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92) и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак натрия, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
Средства, которые усиливают захват iRNA на клеточном уровне, также можно добавлять к фармацевтическим и другим композициям согласно настоящему изобретению. Например, катионные липиды, такие как липофектин (Junichi et al, патент США № 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo et al., заявка согласно РСТ WO 97/30731), также, как известно, усиливают клеточный захват dsRNA. Примеры коммерчески доступных реагентов для трансфекции включают среди прочего, например, Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), 293fectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Cellfectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), DMRIE-C™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), RNAiMAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Oligofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Optifect™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), реагент
- 78 036477 для трансфекции X-tremeGENE Q2 (Roche; Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOTAP (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOSPER (Грензахерштрассе, Швейцария) или Fugene (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент Transfectam® (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент для трансфекции TransFast™ (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-20 (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-50 (Promega; Мэдисон, Висконсин), DreamFect™ (OZ Biosciences; Марсель, Франция), EcoTransfect (OZ Biosciences; Марсель, Франция), реагент для трансфекции TransPassa D1 (New England Biolabs; Ипсвич, Массачусетс, США), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции PerFectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции NeuroPORTER (Genlantis; СанДиего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER 2 (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции Cytofectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции BaculoPORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции TroganPORTER™ (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), RiboFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), PlasFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), UniFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США), SureFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США) или HiFect™ (B-Bridge International, Маунтин-Вью, Калифорния, США)
Для усиления проникновения введенных нуклеиновых кислот можно использовать другие средства, в том числе гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.
Носители
Определенные композиции согласно настоящему изобретению также содержат в составе соединения-носители. Используемые в данном документе выражения соединение-носитель или носитель могут означать нуклеиновую кислоту или ее аналог, которые являются инертными (т.е. не обладают биологической активностью per se), но распознаются в качестве нуклеиновой кислоты in vivo процессами, которые снижают биодоступность нуклеиновой кислоты с биологической активностью, например, путем разрушения биологически активной нуклеиновой кислоты или путем содействия ее удалению из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего вещества, может привести к существенному сокращению количества нуклеиновой кислоты, перерабатываемой печенью, почками или другими внесосудистыми депо, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, переработка частично фосфотиоатной dsRNA печеночной тканью может быть снижена при ее совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо4'изотиоциано-стильбен-2,2'-дисульфокислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
Наполнители
В отличие от соединения-носителя фармацевтический носитель или наполнитель представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующее средство или любую другую фармакологически инертную среду для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Наполнитель может быть жидким или твердым веществом и его выбирают с учетом предполагаемого способа введения с тем, чтобы обеспечить необходимый объем, консистенцию и т.д., при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают без ограничения связывающие средства (например, прежелатинизированный маисовый крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или вторичный кислый фосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, кремнезем, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металла, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); разрыхлители (например, крахмал, натрия крахмалгликолат и т.д.); и смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия и т.д).
Фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, которые не реагируют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами, также можно применять для составления композиций согласно настоящему изобретению. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т. п.
Составы для местного применения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в обычных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Растворы также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Можно применять фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, кото- 79 036477 рые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами.
Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители включают, без ограничения, воду, солевые растворы, спирт, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.
Другие компоненты
Композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно встречающиеся в фармацевтических композициях, при применении в уровнях, установленных в уровне техники. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные материалы, пригодные для физического составления композиций согласно настоящему изобретению в различных лекарственных формах, такие как красители, ароматизирующие средства, консерванты, антиоксиданты, замутнители, загустители и стабилизаторы. Однако, такие материалы при добавлении не должны чрезмерно вступать в конфликт с биологическими активностями компонентов композиций согласно настоящему изобретению. Составы могут быть стерильными и при необходимости их можно смешивать со вспомогательными средствами, например смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, эмульгаторами, солями для оказания влияния на осмотическое давление, буферами, красящими веществами, ароматизаторами и/или отдушками и т.п., которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновой(нуклеиновыми) кислотой(кислотами) состава.
Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, включают (а) одно или несколько соединений, представляющих собой iRNA, и (b) одно или несколько биологических средств, которые действуют по механизму, отличному от RNAi. Примеры таких биологических средств включают средства, препятствующие взаимодействию ALAS1 и по меньшей мере одного связывающего партнера ALAS1.
Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз между токсичным и терапевтическим действием представляет собой терапевтический индекс, и его можно выражать как соотношение LD50/ED50. Типичными являются соединения, которые характеризуются высоким терапевтическим индексом.
Данные, полученные при анализах клеточных культур и исследованиях на животных, можно применять при составлении ряда доз для применения у людей. Доза композиций, описанных в настоящем изобретении, как правило, находится в диапазоне концентраций в крови, который включают ED50 с малой токсичностью или юез токсичности. Доза может варьировать в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, применяемого в способах, описанных в настоящем изобретении, терапевтически эффективную дозу можно первоначально установить по результатам анализов на клеточной культуре. Доза может быть составлена для животных моделей для получения диапазона концентрации в плазме соединения или, при необходимости, полипептидного продукта целевой последовательности (например, достижения уменьшенной концентрации полипептида), что включает IC50 (т.е. концентрацию исследуемого соединения, при помощи которой достигают полумаксимальное ингибирование симптомов), при определении на клеточной культуре. Такую информацию можно применять для более точного определения пригодной дозы у людей. Уровни в плазме можно определять, например, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В дополнение к их введению, рассматриваемому выше, iRNA, описанные в настоящем изобретении, можно вводить в комбинации с другими известными средствами, эффективными в лечении заболеваний или нарушений, связанных с экспрессией ALAS1. В любом случае, курирующий врач может корректировать количество и временные рамки введения iRNA, исходя из результатов, наблюдаемых при применении стандартных средств измерения эффективности, известных в данной области или описанных в данном документе.
Способы лечения заболеваний, связанных с экспрессией гена ALAS1
Настоящее изобретение относится, в частности, к применению iRNA, нацеленная на ALAS1, для ингибирования экспрессии ALAS1 и/или лечения заболевания, нарушения или патологического процесса, который связан с экспрессией ALAS1.
Используемое в данном документе выражение нарушение, связанное с экспрессией ALAS1, заболевание, связанное с экспрессией ALAS1, патологический процесс, связанный с экспрессией ALAS1 или т. п. включает состояние, нарушение или заболевание, в котором экспрессия ALAS1 изменена (например, повышена), уровень одного или нескольких порфиринов изменен (например, повышен),
- 80 036477 уровень или активность одного или нескольких ферментов в пути биосинтеза гема (порфириновом пути) изменен, или другие механизмы, которые ведут к патологическим изменениям в пути биосинтезе гема. Например, iRNA, нацеленную на ген ALAS1 или ее комбинацию, можно применять для лечения состояний, в которых уровни порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) повышены (например, определенные порфирии), или состояний, в которых имеются нарушения ферментов пути биосинтеза гема (например, определенные порфирии). Нарушения, связанные с экспрессией ALAS1, включают, например, Х-сцепленную сидеробластическую анемию (XLSA), порфирию, обусловленную недостаточностью ALA (порфирию Досса), острую перемежающуюся порфирию (AIP), врожденную эритропоэтическую порфирию, позднюю кожную порфирию, наследственную копропорфирию (копропорфирию), вариегатную порфирию, эритропоэтическую протопорфирию (ЕРР) и транзиторную эритропорфирию детского возраста.
Используемое в данном документе выражение субъект, подлежащий лечению согласно способам, описанным в данном документе, включает человека или отличное от человека животное, например, млекопитающее. Млекопитающим может быть, например, грызун (например, крыса или мышь) или примат (например, обезьяна). Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является человек.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает нарушением, связанным с экспрессией ALAS1 (например, с диагностированной порфирией или испытывал один или несколько симптомов порфирии и является носителем мутации, связанной с порфирией) или подвержен риску развития нарушения, связанного с экспрессией ALAS1 (например, субъект с семейной историей порфирии или субъект, который является носителем генетической мутации, связанной с порфирией).
Классификации порфирии, в том числе острых печеночных порфирии, описаны, например, в Balwani, M. & Desnick, R.J., Blood, 120(23), опубликованном online в виде Blood First Edition paper, 12, 102; DOI 10.1182/blood-2012-05-423186. Как описано в Balwain & Desnick, острая перемежающаяся порфирия (AIP), наследственная копропорфирия (НСР), вариегатная порфирия (VP) являются аутосомнодоминантными порфириями, а порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP), является аутосомно-рецессивной. В редких случаях AIP, НСР и VP возникают как гомозиготные доминантные формы. Кроме того, существует редкая гомозиготная рецессивная форма поздней кожной порфирии (РСТ), которая является единственной печеночно-кожной порфирией и также известной как гепатоэритропоэтическая порфирия. Клинические и лабораторные характеристики этих порфирии описаны ниже в табл. 11.
Таблица 11. Печеночные порфирии человека: клинические и лабораторные характеристики
Порфирия Фермент с недостаточн остью Наследова ние Основные симптомы, NV или СР Активно сть фермент а, % нормы Повышенное содержание предшественников порфиринов и/или порфиринов* Эритроциты Моча Кал
Острые печеночные порфирии
ADP ALAдегидратаза AR NV -5 Zn-протопорфирин ALA, копропорфири нП! -
AIP нмв- синтаза AD NV -50 - ALA, PBG, уропорфирин -
НСР COPROоксидаза AD NV и СР -50 - ALA, PBG, копропорфири н III копропор фирин III
VP PROTO- оксидаза AD NV и СР -50 - ALA, PBG, копропорфири нШ копропор фирин III, протопор фирин
Печеночно-кожные порфирии
РСТ UROдекарбоксил аза Спорадиче екая или AD СР <20 уропорфирин , порфирин7карбоксилат уропорфи рин, порфирин -7карбокси лат
AR означает аутосомно-рецессивный;
AD - аутосомно-доминантный;
NV - нейровисцеральный;
СР - кожная фоточувствительность и не применимо.
^Повышения, которые могут быть важны для диагноза.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например AIP, HCP, VP, ADP или гематоэритропоэтической порфирии.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, острую печеночную порфирию выбирают из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP) и порфирии, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP).
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию, например, по меньшей мере две формы порфирии. Согласно некоторым вариантам осуществления двойная порфирия представляет две или более форм порфирии, выбранных из острой перемежающейся пор- 81 036477 фирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP) и порфирии, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP).
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой гомозиготную доминатную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, НСР или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP, НСР, VP или гепатоэритропоэтическую порфирию или их комбинацию (например, двойную порфирию). Согласно некоторым вариантам осуществления AIP, НСР или VP является либо гетерозиготной доминантной либо гомозиготной доминантной.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет порфирию или имеет риск развития порфирии, например, ADP, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA и/или копропорфирина III. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например ADP, и характеризуется повышенным уровнем Znпротопорфирина в эритроцитах.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например, AIP, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA, PBG и/или уропорфирина.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет порфирию или имеет риск развития порфирии, например, НСР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA, PBG и/или копропорфирина III. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например НСР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в кале) копропорфирина III.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например VP, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA, PBG и/или копропорфирина III.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например НСР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в кале) копропорфирина III и/или протопорфирина.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например, РСТ (например, гепатоэритропоэтической порфирии), и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) уропорфирина и/или порфирин-7-карбоксилата. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например РСТ (например, гепатоэритропоэтической порфирии), и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в кале) уропорфирина и/или порфирин-7-карбоксилата.
Мутация, связанная с порфирией, включает любую мутацию в гене, кодирующем фермент в пути биосинтеза порфирина (порфириновый путь), или гена, который изменяет экспрессию гена в пути биосинтеза гема. Согласно многим вариантам осуществления субъект несет одну или несколько мутаций в ферменте порфиринового пути (например, мутацию в ALA-дегидратазе или PBG-дезаминазе). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает острой порфирией (например, AIP, порфирией, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы).
В некоторых случаях пациенты с острой печеночной порфирией (например, AIP) или пациенты, которые несут мутации, ассоциированные с острой печеночной порфирией (например, AIP), но у которых не наблюдаются симптомы, имеют повышенные уровни ALA и/или PBG по сравнению со здоровыми индивидами. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. В таких случаях уровень ALA и/или PBG может быть повышен даже в том случае, если пациента не страдает от приступа или никогда не страдал. В некоторых таких случаях у пациента, в остальном, полностью не наблюдаются симптомы. В некоторых таких случаях пациент испытывает болевые ощущения, например, нейропатическую боль, которая может представлять собой хроническую боль (например, хроническую нейропатическую боль). В некоторых случаях пациент страдает от нейропатии. В некоторых случаях пациент страдает от прогрессирующей нейропатии.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, который подлежит лечению согласно способам, описанным в данном документе, имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Уровни порфирина или предшественника порфирина могут быть оценены при помощи способов, известных из уровня техники, или способов, описанных в данном документе. Например, способы оценки уровней ALA и PBG в моче и плазме, а также уровней порфиринов в моче и плазме, раскрыты в Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; и Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007; полное содержание которых тем самым включено в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой животную модель порфирии, например мышиную модель порфирии (например, мутантную мышь, описанную в Lindberg et al. Nature Genetics, 12: 195-199, 1996). Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является человек, например человек, который страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, как описано в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления субъекта не страдает от
- 82 036477 острого приступа порфирии. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект никогда не страдал от приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления пациент испытывает хроническую боль. Согласно некоторым вариантам осуществления пациент страдает от повреждения нервов. Согласно вариантам осуществления у субъекта наблюдаются изменения EMG и/или изменения в скорости проводимости нерва. Согласно некоторым вариантам осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект подвержен риску развития порфирии (например, имеет мутацию гена, ассоциированную с порфирией), но у него не наблюдаются симптомы. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект ранее страдал от острого приступа, но у него не наблюдаются симптомы во время лечения.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект подвержен риску развития порфирии и получает профилактическое лечение для предупреждения развития порфирии. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления профилактическое лечение начинается в период полового созревания. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение снижает уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение предупреждает развитие повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение предупреждает развитие симптома, ассоциированного с порфирией, например болевого ощущения или повреждения нервов, или снижает частоту или тяжесть симптомов.
Согласно некоторым вариантам осуществления уровень порфирина или предшественника порфирина, например ALA или PBG, повышен, например, в образце плазмы или мочи от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе абсолютного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе относительного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления относительный уровень представлен относительно уровня другого белка или соединения, например, уровня креатинина, в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец мочи. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец плазмы. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом является образец кала.
Повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, может быть установлен, например, путем демонстрации того, что субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG (например, уровень ALA и/или PBG в плазме или моче), который выше нормального значения или выше или равен нормальному значению. Врач с опытом лечения порфирий сможет определить, является ли уровень порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) повышенным, например, с целью диагностирования порфирий или для определения того, подвержен ли субъект риску развития порфирий, например, субъект может иметь предрасположенность к острому приступу или к патологии, ассоциированной с порфирией, такой как, например, хроническая боль (например, нейропатическая боль) и нейропатия (например, прогрессирующая нейропатия).
Используемое в данном документе выражение нормальное значение относится к значению, полученному от субъекта, когда субъект не находится в состоянии заболевания, или значению, полученному от субъекта с нормальными показателями или здорового субъекта, или значению, полученному от эталонной выборки или популяции, например, группы субъектов с нормальными показателями или здоровых субъектов (например, группы субъектов, которые не несут мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или группы субъектов, которые не испытывают симптомов, ассоциированных с порфирией).
Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень до болезни у одного и того же индивида. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень в эталонной выборке или популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет среднее или медианное значение в эталонной выборке или популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, равное двум стандартным отклонениям выше среднего в эталонной выборке или популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, которое равно 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5 стандартным отклонениям выше среднего в эталонной выборке или популяции.
Согласно некоторым вариантам осуществления, где субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, субъект имеет уровень ALA и/или PBG, который по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% выше нормального значения. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, который по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз выше нормаль
- 83 036477 ного значения.
Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение соответствует верхнему пределу нормального диапазона значений. Используемый в данном документе верхний предел нормального диапазона значений относится к уровню, который представляет собой верхний предел 95% доверительного интервала для эталонной выборки или популяции, например, группы индивидов с нормальными показателями (например, дикого типа) или здоровых индивидов, например, индивидов, которые не несут генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или индивидов, которые не страдают порфирией. Соответственно, нижний предел нормального диапазона значений относится к уровню, который представляет собой нижний предел того же 95% доверительного интервала.
Согласно некоторым вариантам осуществления, где субъект имеет повышенный уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче, порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, этот уровень выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5-кратному уровню относительно нормального значения, например, верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в моче, который составляет выше 4-кратного уровня относительно верхнего предела нормального диапазона значений.
Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, представленное в Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006 или Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, представленное в табл. 1 Sardh et al.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина. Согласно определенным вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,10, 0,12, 0,24, 0,36, 0,48 или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в моче составляет 1,2 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 1,0, 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0.10, 0,12, 0,24, 0,36, 0,48 или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень ALA в моче, который выше, или выше или равен 2,5 ммоль/моль креатинина, 3,1 ммоль/моль креатинина, 6,2 ммоль/моль креатинина, 9,3 ммоль/моль креатинина, 12,4 ммоль/моль креатинина или 15,5 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для порфирина в плазме составляет 10 нмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень порфирина в плазме, который выше, или выше или равен 10 нмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень порфирина в плазме, который выше, или выше или равен 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нмоль/л. Субъектом является человек, и субъект имеет уровень порфирина в плазме, который выше, или выше или равен 40 нмоль/л. Согласно вариантам осуществления нормальное значение для порфирина в моче составляет 25 мкмоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень порфирина в моче, который выше, или выше или равен 25 мкмоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень порфирина в моче, который выше или равен 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80 мкмоль/моль креатинина.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень, например уровень в плазме или уровень в моче, порфирина или предшественника порфирина, например ALA или PBG, который выше чем уровень 99% индивидов в выборке здоровых индивидов.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче, ALA или PBG, который выше на два стандартных отклонения среднего уровня в выборке здоровых индивидов.
- 84 036477
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень ALA в моче, который составляет 1,6 или более кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями (например, субъекта, который не несет мутацию, ассоциированную с порфирией). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень ALA в плазме, который составляет 2- или 3кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень PBG в моче, который составляет четыре или более кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень PBG в плазме, который составляет четыре или более кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для получения заранее определенного снижения повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение по меньшей мере на 10, 20, 30, 40 или 50%. Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое эффективно для предупреждения или облегчения симптомов, например, болевых ощущений или рецидивирующих приступов.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое составляет по меньшей мере 1,2,3 или более стандартных отклонений, где стандартное отклонение определяют на основе значений из эталонной выборки, например, эталонной выборки, описанной в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое доводит уровень порфирина или предшественника порфирина до уровня, который меньше нормального значения, или до уровня, который меньше или равен нормальному значению (например, нормальному значению, описанному в данном документе).
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, который подлежит лечению согласно описанным способам, испытывает болевые ощущения, например, хроническую боль. Согласно некоторым вариантам осуществления страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например, острой печеночной порфирии, например, AIP. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для лечения болевых ощущений, например, путем уменьшения тяжести болевых ощущений или излечения болевых ощущений. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения или предупреждения повреждения нервов.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, который подлежит лечению согласно способам, описанным в данном документе, (а) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и (b) испытывает болевые ощущения, например, хроническую боль. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения повышенного уровня ALA и/или PBG, и/или для лечения болевых ощущений, например, путем уменьшения тяжести болевых ощущений или излечения болевых ощущений.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является животное, которое служит в качестве модели нарушения, связанного с экспрессией ALAS 1.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является животное, которое служит в качестве модели порфирии (например, генетически модифицированное животное с одним или несколькими мутациями). Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP, и субъектом является животная модель AIP. Согласно одному такому варианту осуществления субъектом является генетически модифицированная мышь, которая характеризуется недостаточностью порфобилиногендезаминазы, например, такая как мышь, описанная в Lindberg et al., Nature Genetics, 12:195-199, 1996, или гомозиготная мышь R167Q, описанная в Yasuda, M., Yu, С. Zhang, J., Clavero, S., Edelmann, W., Gan, L., Phillips, J.D., & Desnick, R.J. Acute intermittent porphyria: A severely affected knock-in mouse that mimics the human homozygous dominant phenotype. (резюме презентации, представленной 14 октября 2011 г. в Американском обществе генетики человека; № 1308F в программе; доступно он-лайн с 4 апреля 2012 года на ichg201 l.org/cgi-bin/showdetail.pl?absno=21167); оба из этих источников тем самым включены в данный документ во всей своей полноте. Были получены несколько моделей с нокином для обеспечения мутаций, вызывающих гомозиготную доминантную ALP у человека. Используемые мутации включают, например, R167Q, R173Q и R173W в PBG-дезаминазе. Жизнеспособные гомозиготы включали R167Q/R176Q и R167Q/R173Q, обе которые проявляют постоянно повышенные уровни ALA и PBG, аналогичные фенотипу при гомозиготной доминантной ALP человека; согласно некоторым вариантам осуществления субъект является такой жизнеспособной мышиной моделью гомозиготной AIP.
Согласно одному варианту осуществления субъект, который подлежит лечению согласно методам, описанным в данном документе (например, субъект-человек или пациент-человек), подвержен риску развития нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, или у него диагностировано нарушение, связанное с экспрессией ALAS1, например, порфирия. Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является субъект, который испытывал один или несколько острых приступов с одним или несколькими симптомами порфирии. Согласно другим вариантам осуществления субъектом является субъект,
- 85 036477 который хронически испытывал один или несколько симптомов порфирии (например, болевые ощущения, например, нейропатическую боль, и/или нейропатию, например, прогрессирующую нейропатию). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение (например, мутацию), описанное в данном документе, но, в остальном, у него не наблюдаются симптомы. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект ранее подвергался лечению препаратом на основе гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином), описанным в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект (например, субъект с порфирией, такой как, например, AIP), который подлежит лечению согласно способам, описанным в данном документе, недавно испытывал или в настоящее время испытывает продром. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъекту вводят комбинированное лечение, например, iRNA, описанную в данном документе, и один или несколько дополнительных лекарственных препаратов, которые, как известно, являются эффективными против порфирии (например, глюкоза и/или препарат на основе гема, такой как гемин, описанный в данном документе) или ассоциированных с ней симптомов.
Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанную в данном документе, вводят в комбинации с глюкозой или декстрозой. Например, может предусматриваться внутривенное введение 10-20% декстрозы в физиологическом растворе. Как правило, если вводится глюкоза, по меньшей мере 300 г 10% глюкозы вводят внутривенно ежедневно. iRNA (например, iRNA в составе LNP) можно также вводить внутривенно, как часть той же инфузии, которую используют для введения глюкозы или декстрозы, или в виде отдельной инфузии, которую вводят до, одновременно или после введения глюкозы или декстрозы. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят при помощи другого пути введения (например, подкожно). Согласно еще одному варианту осуществления iRNA вводят в комбинации с полным парентеральным питанием. iRNA можно вводить до, одновременно или после введения полного парентерального питания.
Согласно одному варианту осуществления iRNA вводят в комбинации с препаратом на основе гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином). Согласно дополнительному варианту осуществления iRNA вводят в комбинации с препаратом на основе гема и глюкозой, препаратом на основе гема и декстрозой или препаратом на основе гема и полным парентеральным питанием.
Используемое в данном документе выражение продром предусматривает любой симптом, который отдельный субъект испытывал заранее, непосредственно перед развитием острого приступа. Типичные симптомы продрома включают, например, боль в животе, тошноту, головные боли, психологические симптомы (например, тревожность), возбужденное состояние и/или бессонницу. Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект испытывает болевые ощущения (например, боль в животе и/или головную боль). Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект испытывает тошноту. Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект испытывает психологические симптомы (например, тревожность). Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект становится возбужденным и /или страдает от бессонницы.
Острый приступ порфирии включает проявление одного или нескольких симптомов порфирии, как правило, у пациента, который имеет мутацию, ассоциированную с порфирией (например, мутацию в гене, который кодирует фермент в порфириновом пути).
Согласно определенным вариантам осуществления введение iRNA ALAS1 приводит к снижению уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов, описанных в данном документе (например, ALA и/или PBG). Снижение может измерять относительно соответствующего контрольного или нормального значения. Например, снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов можно установить у отдельного субъекта, например, как снижение по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50% или более по сравнению с уровнем, который наблюдался до лечения (например, непосредственно перед лечением). Снижение уровня предшественника порфирина, порфирина или метаболита порфирина можно измерять при помощи любого способа, известного из уровня техники. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценивать при помощи теста Уотсона-Шварца, ионообменной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии. См., например, Thunell (1993).
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG у субъекта. Уровень ALA или PBG у субъекта можно оценивать, например, на основе абсолютного уровня ALA или PBG, или на основе относительного уровня ALA или PBG (например, относительно уровня другого белка или соединения, например, уровня креатинина) в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец мочи. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец плазмы.
Согласно определенным вариантам осуществления iRNA, которая нацелена на ALAS1, вводят в комбинации с одним или несколькими дополнительными лекарственными препаратами, например, другим препаратом, который, как известно, является эффективным в лечении порфирии или симптомов порфирии. Например, другим лекарственным препаратом может быть глюкоза (например, IV глюкоза) или препарат на основе гема (например, гемин, аргинат гема или гемальбумин). Дополнительный лекарственный препарат(ы) можно вводить до, после или одновременно с введением iRNA.
- 86 036477 iRNA и дополнительное терапевтическое средство можно вводить в комбинации в одной и той же композиции, например, внутривенно, или дополнительное терапевтическое средство можно вводить как часть отдельной композиции или другим способом, описанным в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение iRNA или введение iRNA в комбинации с одним или несколькими дополнительными лекарственными препаратами (например, глюкозой, декстрозой и т.п.), снижает частоту острых приступов (например, путем предупреждения острых приступов так, что они больше не возникают, или путем снижения числа приступов, которые возникают в определенный период времени, например, меньшее число приступов возникает за год). Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA вводят согласно схеме дозирования с регулярными интервалами, например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят после острого приступа порфирии. Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA находится в композиции, например, композиции, содержащей липидный состав, например состав LNP.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят во время острого приступа порфирии. Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA находится в композиции, например, композиции, содержащей липидный состав (например, состав LNP), или композиции, содержащей конъюгат GalNAc.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения тяжести приступа (например, путем облегчения одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для сокращения продолжительности приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для прекращения приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят профилактически для предупреждения острого приступа порфирии. Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA находится в форме конъюгата GalNAc, например, в композиции, содержащей конъюгат GalNAc. Согласно некоторым вариантам осуществления профилактическое введение выполняют до, во время или после воздействия или возникновения провоцирующего фактора. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект подвержен риску развития порфирии.
Согласно некоторым вариантам осуществления siRNA вводят во время продрома. Согласно некоторым вариантам осуществления продром характеризуется болевыми ощущениями (например, головной болью и/или болью в животе), тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), возбужденным состоянием и/или бессонницей.
Согласно некоторым вариантам осуществления siRNA вводят во время определенной фазы менструального цикла, например, во время лютеиновой фазы.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для предупреждения приступов (например, рецидивирующих приступов, которые ассоциированы с продромом и/или с провоцирующим фактором, например, с определенной фазой менструального цикла, например, лютеиновой фазой). Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения частоты приступов. Согласно вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения тяжести приступа (например, путем облегчения одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для сокращения продолжительности приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для прекращения приступа.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для предупреждения или снижения частоты или тяжести болевых ощущений, например, нейропатической боли.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для предупреждения или снижения частоты или тяжести нейропатии.
Эффекты введения siRNA ALAS1 могут быть установлены, например, путем сравнения с соответствующим контролем. Например, снижение частоты острых приступов, а также снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов у группы пациентов с AIP может быть установлено, например, как пониженная частота по сравнению с соответствующей контрольной группой. Контрольная группа (например, группа из подобных индивидов или та же группа индивидов в перекрестном исследовании) может включать, например, популяцию, не получавшую лечения, популяцию, которую лечили при помощи традиционного лекарственного препарата от порфирии (например, традиционный лекарственный препарат от AIP может включать глюкозу, гемин или оба); популяцию, которую лечили при помощи плацебо или нецелевой iRNA, необязательно в комбинации с одним или несколькими традиционными лекарственными препаратами от порфирии (например, глюкозой, например, IV глюкозой) и т.п.
Используемое в данном документе выражение подверженный риску развития порфирии включает субъекта со случаями заболевания порфирией в семье и/или одним или несколькими рецидивирующими
- 87 036477 или хроническими симптомами порфирии в анамнезе, и/или субъекта, который имеет генетическое изменение (например, мутацию) в гене, кодирующем фермент в рамках пути биосинтеза гема, и субъекта, который имеет генетическое изменение, например, мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией.
Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, способствует восприимчивости индивида к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, пребывания на диете или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, раскрытого в данном документе). Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, ассоциировано с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, ассоциировано с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, ассоциировано с изменениями EMG и/или скорости проводимости нервов.
Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой мутацию в гене ALAS1. Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой мутацию в промоторе гена ALAS1 или в участках, расположенных выше или ниже гена ALAS1. Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой мутацию в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой изменение, например мутацию, в гене, который кодирует фермент в рамках пути биосинтеза гема.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение, описанное в данном документе (например, генетическую мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией). Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в моче или плазме) ALA и/или PBG. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект не имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение, описанное в данном документе, и имеет другие симптомы, например, хроническую боль, изменения EMG, изменения скорости проводимости нервов и/или другие симптомы, ассоциированные с порфирией. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение, но не испытывает острых приступов.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет мутацию, ассоциированную с AIP, НСР, VP или ADP.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например, по меньшей мере одну мутацию, в гене PBG-дезаминазы. Многие мутации PBG-дезаминазы известны из уровня техники, например, описанные в Hrdinka, M. et at. Physiological Research, 55 (Suppl 2):S119-136 (2006). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект является гетерозиготным по мутации PBG-дезаминазы. Согласно другим вариантам осуществления субъект является гомозиготным по мутации PBG-дезаминазы. Гомозиготный субъект может иметь две идентичные мутации или две различные мутации в гене PBGдезаминазы.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой НСР. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например по меньшей мере одну мутацию, в гене, который кодирует фермент копропорфириноген III оксидазу.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой VP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например по меньшей мере одну мутацию, в гене, который кодирует протопорфириногеноксидазу.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой ADP, например аутосомнорецессивную ADP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например по меньшей мере одну мутацию, в гене, который кодирует ALA-дегидратазу.
Способы лечения, представленные в данном документе, могут служить для облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, возникнет при воздействии провоцирующего фактора, и/или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака). Кроме того, способы, представленные в данном документе, могут служить для снижения уровня одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов и/или связанных продуктов или метаболитов порфирина. Уровень предшественника порфирина или порфирина можно измерять в любом биологическом образце, таком как, например, моча, кровь, кал, спинномозговая жидкость или образец ткани. Образец может находиться в субъекте или может быть получен или выделен из субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP, а уровень PBG и/или ALA снижен. Согласно некоторым вариантам осуществления продукт или метаболит порфирина представляет собой порфобилин, порфобилиноген или уропорфирин. Снижение уровня продукта или метаболита порфирина можно измерять при помощи любого способа, известного из уровня техники. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценивать при по- 88 036477 мощи теста Уотсона-Шварца, ионообменной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии. См., например, Thunell (1993).
Способы, описанные в данном документе, могут также служить для снижения хронически повышенных уровней предшественников порфиринов (например, ALA и/или PBG) у субъектов, страдающих порфирией (например, острой печеночной порфирией, например, AIP) или подверженных риску развития порфирии. Способы оценки уровней (например, хронически повышенных уровней) предшественников порфиринов в плазме и моче включают, например, HPLC-масс-спектрометрию и ионообменную хроматографию. Уровни предшественников порфиринов можно выражать в виде уровня относительно другого белка или соединения, например, креатинина. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007.
Используемое в данном документе выражение провоцирующий фактор относится к эндогенному или экзогенному фактору, который может индуцировать острый приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией. Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или недостаточной калорийности потребляемой пищи вследствие жестких диет, занятий спортом, связанных с длинными дистанциями и т. д.), формы стресса, связанные с метаболизмом (например, инфекции, оперативное вмешательство, международные авиаперелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, жирорастворимые чужеродные химические соединения (в том числе, например, химические соединения, присутствующие в табачном дыме, определенные лекарственные средства рецептурного отпуска, органические растворители, биоциды, соединения в алкогольных напитках), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения болезни во время менструального периода), синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормональная заместительная терапия). См., например, Thunell (1993). Распространенные провоцирующие факторы включают лекарственные средства, индуцирующие цитохром Р450, и фенобарбитал.
Симптомы, ассоциированные с порфирией, могут включать боль или спазмы в животе, головные боли, эффекты, вызванные патологиями нервной системы, и светочувствительность, вызывающую появление сыпи, образование волдырей и рубцов на коже (фотодерматит). Согласно определенным вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP. Симптомы AIP включают симптомы, связанные с желудочно-кишечным трактом (например, сильная и плохо локализуемая боль в животе, тошнота/рвота, запор, диарея, непроходимость кишечника), симптомы, связанные с мочевой системой (дизурия, задержка мочеиспускания/недержание мочи или темная моча), неврологические симптомы (например, сенсорная нейропатия, моторная нейропатия (например, поражающая черепные нервы и/или приводящая к слабости мышц в руках или ногах), судороги, нейропатическую боль, прогрессирующую нейропатию, головные боли, нейропсихиатрические симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинация, истерия, делирий, апатия, депрессия, фобии, психоз, бессонница, сонливость, кома), вовлечение автономной нервной системы (приводящее, например, к симптомам, связанным с сердечно-сосудистой системой, таким как тахикардия, гипертензия и/или аритмии, а также другим симптомам, таким как, например, повышенные уровни катехоламинов в крови, потение, возбужденность и/или тремор), обезвоживание и нарушения баланса электролитов.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA, нацеленную на ALAS1, вводят вместе (например, до, после или одновременно) с другим лекарственным препаратом, который может служить для ослабления одного или нескольких из упомянутых выше симптомов. Например, боль в животе можно лечить, например, наркотическими анальгетиками, судороги можно лечить, например, противосудорожными препаратами, тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотиазинами, и тахикардию/гипертензию можно лечить, например, бета-блокаторами.
Выражение снижать (или повышать), как предполагается, относится к измеряемому изменению, например, статистически значимому изменению. Изменение может составлять, например, изменение (например, снижение (или повышение) относительно нормального значения, например, эталонной величины, где iRNA не вводят) по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40, 50% или более.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению iRNA или фармацевтической композиции на ее основе, например, для лечения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, в комбинации с другими фармацевтическими препаратами и/или другими терапевтическими способами, например, с известными фармацевтическими препаратами и/или известными терапевтическими способами, такими как, например, применяемые в настоящее время для лечения нарушения. Согласно одному варианту осуществления iRNA или фармацевтическую композицию на ее основе можно вводить совместно с препаратом на основе гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином, описанными в данном документе) и/или совместно с внутривенными инфузиями глюкозы. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA или фармацевтическую композицию на ее основе применяют профилактически, например, для предупреждения или облегчения симптомов прогнозируемого приступа острой порфирии. Профилактическое применение может планироваться по времени в соответствии с воздействием или прогнозируемым воздействием провоцирующего фактора на субъекта. Описанный в данном документе провоцирующий фактор может представлять собой любой эндогенный или экзогенный фактор, который,
- 89 036477 как известно, провоцирует острый приступ. Например, предменструальная фаза представляет собой эндогенный провоцирующий фактор, а лекарственное средство, провоцирующее цитохром Р450, представляет собой экзогенный провоцирующий фактор.
Количество, эффективное для лечения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1 (например, порфирии, такой как AIP), зависит от типа нарушения, подлежащего лечению, тяжести симптомов, субъекта, который подлежит лечению, пола, возраста и общего состояния субъекта, способа введения и т.д. Для каждого отдельно взятого случая соответствующее эффективное количество может определить специалист в данной области с помощью стандартного проведения экспериментов. Контролирование эффективности лечения или предупреждения путем измерения любого из таких показателей или любой комбинации показателей относится к компетенции специалиста в данной области. Применительно к введению iRNA, нацеленной на ALAS1, или фармацевтической композиции на ее основе выражение эффективный против нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, указывает, что введение способом, принятым в клинической практике, приводит к благоприятному эффекту, например, для отдельного пациента или по меньшей мере для части пациентов, например, статистически значимой части пациентов. Благоприятные эффекты включают, например, предупреждение или снижение симптомов, или другие эффекты. Например, благоприятные эффекты включают, например, улучшение (например, снижение тяжести или частоты) симптомов, снижение тяжести или частоты приступов, сниженный риск развития сопутствующего заболевания (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака), повышенную способность переносить провоцирующий фактор, улучшение качества жизни, снижение экспрессии ALAS1, снижение уровня (например, уровня в плазме или моче) порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) или другой эффект, как правило, расцениваемый как положительный лечащими врачами, хорошо осведомленными в лечении определенного типа нарушения.
Эффект лечения или предупреждения является очевидным, когда наблюдается улучшение, например, статистически значимое улучшение, одного или нескольких показателей болезненного состояния, или когда отсутствует усугубление или развитие симптомов в тех случаях, когда, при иных обстоятельствах, они прогнозировались. В качестве примера, положительное изменение измеряемого показателя заболевания по меньшей мере на 10%, например, по меньшей мере на 20, 30, 40, 50% или более, может служить признаком эффективного лечения. Об эффективности данного лекарственного средства на основе iRNA или состава с таким лекарственным средством можно также судить при помощи экспериментальной животной модели данного заболевания, которая известна из уровня техники. При использовании экспериментальной животной модели эффективность лечения подтверждается, когда наблюдают статистически значимое снижение маркера (например, ALA или PBG в плазме или моче) или ослабление симптома.
Пациентам можно вводить терапевтическое количество iRNA. Терапевтическое количество может составлять, например, 0,05-50 мг/кг. Например, терапевтическое количество может составлять 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0 или 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг dsRNA.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составлена в виде липидного состава, например, состава LNP, описанного в данном документе. Согласно некоторым таким вариантам осуществления терапевтическое количество может составлять 0,05-5 мг/кг, например, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 или 5,0 мг/кг dsRNA. Согласно некоторым вариантам осуществления липидный состав, например, состав LNP, вводят внутривенно.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят путем внутривенной инфузии в течение определенного периода времени, как, например, в течение периода 5, 10, 15, 20 или 25 мин.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA находится в форме конъюгата GalNAc, описанного в данном документе. Согласно некоторым таким вариантам осуществления терапевтическое количество может составлять 0,5-50 мг, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг dsRNA. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc вводят подкожно.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение повторяют, например, регулярно, как, например, ежедневно, раз в две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или дольше. После осуществления схемы первичного лечения лекарственные препараты можно вводить менее часто. Например, после введения раз в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять один раз в месяц в течение шести месяцев, или года, или дольше.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство на основе iRNA вводят двумя или более дозами. Согласно некоторым вариантам осуществления число или величина последующих доз зависят от достижения необходимого эффекта, например, подавления гена ALAS, снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG), или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или предупреждения одного или нескольких симптомов, ассциированных с порфирией (например, болевых ощущений, например, нейропатической боли), и/или
- 90 036477 предупреждения приступов или снижения частоты и/или тяжести приступов, ассоциированных с порфирией.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство на основе iRNA вводят в соответствии со схемой. Например, средство на основе iRNA можно вводить раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю или пять раз в неделю. Согласно некоторым вариантам осуществления схема предусматривает введения с равными интервалами, например, ежечасно, каждые четыре часа, каждые шесть часов, каждые восемь часов, каждые двенадцать часов, ежедневно, каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц. Согласно вариантам осуществления средство на основе iRNA вводят еженедельно или раз в две недели для достижения необходимого эффекта, например, снижения уровня ALA и/или PBG, уменьшения болевых ощущений и/или предупреждения острых приступов.
Согласно вариантам осуществления схема предусматривает введения с небольшими интервалами с последующим более длительным периодом времени, в течение которого средство не вводят. Например, схема может предусматривать первоначальный набор доз, которые вводят за относительно короткий период времени (например, приблизительно каждые 6 ч, приблизительно каждые 12 ч, приблизительно каждые 24 ч, приблизительно каждые 48 ч или приблизительно каждые 72 ч) с последующим более длительным периодом времени (например, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5 приблизительно 6 н приблизительно 7 или приблизительно 8 недель), в течение которого средство на основе iRNA не вводят. Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA первоначально вводят ежечасно, а впоследствии вводят с более длительными интервалами (например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц). Согласно другому варианту осуществления средство на основе iRNA первоначально вводят ежедневно, а впоследствии вводят с более длительными интервалами (например, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц). Согласно определенным вариантам осуществления более длительный интервал увеличивается со временем, или его определяют на основе достижения необходимого эффекта. Согласно конкретному варианту осуществления средство на основе iRNA вводят один раз в день в течение острого приступа с последующим еженедельным введением доз, начиная с восьмого дня введения. Согласно другому конкретному варианту осуществления средство на основе iRNA вводят через день в течение первой недели с последующим еженедельным введением доз, начиная с восьмого дня введения.
Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA вводят для предупреждения или снижения тяжести или частоты рецидивирующих приступов, например циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является менструальный цикл. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят периодически, например, через равные промежутки для предупреждения или снижения тяжести или частоты рецидивирующих приступов, например, циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором, например, менструальным циклом, например, определенной фазой менструального цикла, например, лютеиновой фазой. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят во время определенной фазы менструального цикла или на основе уровней гормонов у пациента, получающего лечение (например, на основе уровней гормонов, которые ассоциированы с определенной фазой менструального цикла). Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят в один или несколько определенных дней менструального цикла, например, в 1-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-й, 9-й, 10-й, 11-й, 12-й, 13-й, 14-й, 15-й, 16-й, 17-й, 18-й, 19-й, 20-й, 21-й, 22-й, 23-й, 24-й, 25-й, 26-й, 27-й день или в 28-й день (или более поздний день для субъектов, которые имеют более длинный менструальный цикл). Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят во время лютеиновой фазы, например, в один или несколько дней между 14-м - 28-м днями менструального цикла (или позже у субъектов, которые имеют менструальный цикл, который составляет более 28 дней). Согласно некоторым вариантам осуществления у субъекта оценивают время наступления овуляции (например, с помощью анализа крови или мочи, который определяет гормон, ассоциированный с овуляцией, например, LH) и iRNA вводят через заранее определенный интервал после овуляции. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят непосредственно после овуляции. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 дней после овуляции. Любую из этих схем необязательно можно повторять в течение одного или нескольких циклов. Число циклов может зависеть от достижения необходимого эффекта, например подавления гена ALAS1 и/или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или предупреждения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией.
Согласно некоторым вариантам осуществления вводят первоначальную дозу средства на основе iRNA и проверяют уровень ALA или PBG, например через 1-48 ч, например 2, 4, 8, 12 или 24 ч, после введения первоначальной дозы. Согласно некоторым вариантам осуществления, если уровень ALA и/или PBG снизился (например, с достижением заранее определенного снижения, например, нормализации), и/или если симптомы, ассоциированные с порфирией (например, болевые ощущения), улучшились (например, так что у пациента не наблюдаются симптомы), дальнейшую дозу не вводят, в то же время, если
- 91 036477 уровень ALA и/или PBG не снизился (например, не достиг заранее определенного снижения, например, не нормализовался), то дальнейшую дозу ALA или PBG вводят. Согласно некоторым вариантам осуществления дальнейшую дозу вводят через 12, 24, 36, 48, 60 или 72 ч после первоначальной дозы. Согласно некоторым вариантам осуществления, если первоначальная доза не является эффективной в снижении уровня ALA и/или PBG, то дальнейшую дозу модифицируют, например повышают, для достижения необходимого понижения (например, заранее определенного снижения, например, нормализации) уровней ALA или PBG.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой понижение по меньшей мере на 10, 20, 30, 40 или 50%. Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое является эффективным в предупреждении или облегчении симптомов, например, болевых ощущений, продромальных симптомов, или рецидивирующих приступов.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение по меньшей мере на 1, 2, 3 или более стандартных отклонений, где стандартное отклонение определяют на основе значений из эталонной выборки, например, эталонной выборки, описанной в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое доводит уровень порфирина или предшественника порфирина до уровня, который меньше нормального значения, или до уровня, который меньше или равен нормальному значению (например, нормальному значению, описанному в данном документе).
Используемое в данном документе выражение нормализация уровней ALA или PBG (или нормальный или нормализованный уровень) относится к уровню (например, уровню в моче и/или плазме) либо ALA, либо PBG, либо обоих, который находится в пределах ожидаемого диапазона для здорового индивида, индивида, у который не наблюдаются симптомы (например, индивида, который не испытывает болевых ощущений и/или не страдает нейропатией), или индивида, который не имеет мутации, ассоциированной с порфирией. Например, согласно некоторым вариантам осуществления нормализованный уровень находится в пределах двух стандартных отклонений от нормального среднего. Согласно некоторым вариантам осуществления нормализованный уровень находится в пределах нормального диапазона значений, например, в пределах 95% доверительного интервала для соответствующей контрольной выборки, например, выборки здоровых индивидов или индивидов, которые не имеют генной мутации, ассоциированной с порфирией. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень ALA и/или PBG у субъекта (например, уровень ALA и/или PBG в плазме и/или крови) отслеживают через определенные промежутки времени, при этом дальнейшую дозу средства на основе iRNA вводят, если уровень повышается выше нормального значения.
Введение iRNA может снижать уровни mRNA или белка ALAS1, например, в клетке, ткани, крови, моче или другой части организма пациента по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80 % или по меньшей мере на 90% или более. Введение iRNA может снижать уровни продуктов, ассоциированных с экспрессией гена ALAS1, например, уровни одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, уровень ALA и/или PBG). Введение средства на основе iRNA также может ингибировать или предупреждать повышение уровней mRNA или белка ALAS1 во время острого приступа AIP.
Перед введением полной дозы iRNA пациентам можно вводить меньшую дозу, такую как 5% инфузионную дозу, и отслеживать у них побочные эффекты, такие как аллергическая реакция, или повышенные уровни липидов или кровяного давления.
Согласно другому варианту осуществления у пациента можно отслеживать нежелательные эффекты.
Способы модулирования экспрессии гена ALAS1
Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении представлен способ модулирования (например, ингибирования или активации) экспрессии гена ALAS1, например, в клетке или у субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку или гепатоцит. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится внутри субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект (например, человек) подвержен риску заболевания, связанного с экспрессией ALAS1, или у него диагностировано такое заболевание, как описано выше.
Согласно одному варианту осуществления способ включает приведение клетки в контакт с iRNA, описанной в данном документе, в количестве, эффективном для снижения экспрессии гена ALAS1 в клетке. Используемое в данном документе выражение приведение в контакт включает непосредственное приведение клетки в контакт, а также опосредованное приведение клетки в контакт. Например, клетка внутри субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть
- 92 036477 приведена в контакт, когда композицию, содержащую iRNA, вводят (например, внутривенно или подкожно) субъекту.
Экспрессию гена ALAS1 можно оценивать на основе уровня экспрессии mRNA ALAS1, белка ALAS1 или уровня показателя, функционально связанного с уровнем экспрессии гена ALAS1 (например, уровня порфирина или частоты или тяжести симптома, связанного с порфирией). Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия ALAS1 ингибируется по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на
30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на
50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на
70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на
90% или по меньшей мере на 95%. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA характеризуется IC50 B диапазоне 0,001-0,01 нМ, 0,001-0,10 нМ, 0,001-1,0 нМ, 0,001-10 нМ, 0,01-0,05 нМ, 0,01-0,50 нМ, 0,02-0,60 нМ, 0,01-1,0 нМ, 0,01-1,5 нМ, 0,01-10 нМ. Значение IC50 может быть нормализовано относительно соответствующего контрольного значения, например, IC50 нецелевой iRNA.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает введение в клетку iRNA, описанной в данном документе, и поддержание клетки в течение времени, достаточного для достижения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS1, вследствие чего ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке.
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает введение композиции, описанной в данном документе, например, композиции, содержащей iRNA, которая нацеливается на ALAS1, млекопитающему так, что экспрессия целевого гена ALAS1 понижается, например, на протяжении длительного периода времени, например, по меньшей мере двух, трех, четырех дней или более, например, одной недели, двух недель, трех недель или четырех недель или дольше. Согласно некоторым вариантам осуществления понижение экспрессии ALAS1 можно выявлять в течение 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч или 24 ч после первого введения.
Согласно другому варианту осуществления способ предусматривает введение композиции, описанной в данном документе, млекопитающему так, что экспрессия целевого гена ALAS1 повышается, например, по меньшей мере на 10% по сравнению с необработанным животным. Согласно некоторым вариантам осуществления активация ALAS1 наблюдается на протяжении длительного периода времени, например, по меньшей мере двух, трех, четырех дней или более, например, одной недели, двух недель, трех недель, четырех недель или более. Не желая быть связанными теорией, iRNA может активировать экспрессию ALAS1 путем стабилизации mRNA-транскрипта ALAS1, взаимодействия с промотором в геноме и/или подавления ингибитора экспрессии ALAS 1.
iRNA, применимые для способов и композиций, описанных в настоящем изобретении, специфично нацелены на РНК (первичные или процессированные) гена ALAS1. Композиции для ингибирования экспрессии гена ALAS1 с использованием iRNA можно получать, а способы такого ингибирования можно осуществлять, как описано в другой части данного документа.
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает введение композиции, содержащей iRNA, где iRNA содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна по меньшей мере части РНК-транскрипта гена ALAS1 млекопитающего, который подлежит лечению. Если организм, который подлежит лечению, представляет собой млекопитающего, такого как человек, то композицию можно вводить любым способом, известным из уровня техники, в том числе без ограничения с помощью перорального, внутрибрюшинного или парентерального пути введения, в том числе с помощью интракраниального (например, интравентрикулярного, интрапаренхиматозного и интратекального), внутривенного, внутримышечного, подкожного, трансдермального, воздушного (аэрозольного), назального, ректального и местного (в том числе буккального и сублингвального) введения.
Согласно определенным вариантам осуществления композиции вводят путем внутривенной инфузии или инъекции. Согласно некоторым таким вариантам осуществления композиции содержат siRNA, находящуюся в липидном составе (например, в составе LNP, таком как состав LNP11) для внутривенной инфузии. Согласно определенным вариантам осуществления такие композиции можно применять для лечения острых приступов порфирии и/или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).
Согласно другим вариантам осуществления композиции вводят подкожно. Согласно некоторым таким вариантам осуществления композиции содержат iRNA, конъюгированную с лигандом GalNAc. Согласно определенным вариантам осуществления такие композиции можно применять для лечения острых приступов порфирии или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).
Способы снижения уровня порфирина или предшественника порфирина
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлен способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина, например, в клетке или у субъекта.
Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку или гепато- 93 036477 цит. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой гепатоцит. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится внутри субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек).
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект (например, человек) подвержен риску развития порфирии или у него диагностирована порфирия, как описано в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления способ является эффективным для лечения порфирии, как описано в данном документе (например, путем облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет возникать при воздействии провоцирующего фактора, и/или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака). Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает приведение клетки в контакт с RNAi, как описано в данном документе, в количестве, достаточном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке, или в другой соответствующей клетке или группе клеток, или у субъекта. Используемое в данном документе выражение приведение в контакт включает непосредственное приведение клетки в контакт, а также опосредованное приведение клетки в контакт. Например, клетка внутри субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть приведена в контакт, когда композицию, содержащую RNAi, вводят (например, внутривенно или подкожно) субъекту. Используемое в данном документе выражение другая соответствующая клетка или группа клеток включает любую клетку или группу клеток, в которых уровень порфирина или предшественника порфирина снижается в результате приведения в контакт. Например, клетка может быть частью ткани, находящейся внутри субъекта (например, клеткой печени, находящейся внутри субъекта), и приведение в контакт клетки внутри субъекта (например, приведение в контакт одной или нескольких клеток печени, находящихся внутри субъекта) с RNAi может приводить к снижению уровня порфирина или предшественника порфирина в другой соответствующей клетке или группе клеток (например, нервных клетках субъекта), или в ткани или жидкости субъекта (например, в моче, крови, плазме или спинномозговой жидкости субъекта).
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирин или предшественник порфирина выбирается из группы, состоящей из δ-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфобилиногена (PBG), гидкросиметилбилана (НМВ), уропорфиногена III, копропорфиногена III, протопорфиногена IX и протопорфирина IX. Согласно некоторым вариантам осуществления предшественник порфирина представляет собой ALA. Согласно некоторым вариантам осуществления предшественник порфирина представляет собой PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления способ снижает уровень ALA и PBG. Уровень порфирина или предшественника порфирина можно измерять, как описано в данном документе и как известно из уровня техники.
Анализы и способы отслеживания активности RNAi
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлены анализы и способы отслеживания уровней mRNA ALAS 1. Активность RNAi в печени можно отслеживать с помощью определения уровней mRNA или продукта 5'RACE в ткани, или с помощью определения уровня секретируемого белка в крови.
Альтернативно или в комбинации, можно определять уровни циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1, например, при помощи анализов cERD (Circulating Extracellular RNA Detection). Согласно некоторым вариантам осуществления уровень mRNA ALAS1 можно определять в образце биологической жидкости, например образце сыворотки или мочи. Согласно некоторым вариантам осуществления в биологические жидкости из различных типов клеток выделяются экзосомы, которые содержат mRNA и miRNA, происходящие из исходной ткани. Такие экзосомы можно использовать для отслеживания уровня циркулирующей RNAi. Согласно одному варианту осуществления образец, например, образец сыворотки или мочи от субъекта, получающего лечение посредством iRNA, описанной в данном документе, может быть очищен при помощи низкоскоростного центрифугирования, затем при помощи центрифугирования со скоростью приблизительно 160000g в течение приблизительно 2 ч с образованием осадка. RNA можно экстрагировать и анализировать для измерения уровней mRNA ALAS1. Иллюстративные способы и анализы раскрыты в PCT/US 2012/043584, опубликованном как WO 2012/177906, содержание которых включено при помощи ссылки.
Соответственно, представлен анализ или способ определения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта. Анализ или способ предусматривают получение РНК (например, внеклеточной РНК) из образца биологической жидкости (например, образца мочи, крови или плазмы) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1; и определение в образце уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1.
Согласно одному варианту осуществления анализ или способ предусматривают стадию получения cDNA ALAS1 из mRNA ALAS1; и приведения в контакт cDNA ALAS1 с нуклеиновой кислотой (например, зондом и/или праймером), комплементарной cDNA ALAS1 или ее части, что тем самым приводит к образованию реакционной смеси; и определения (например, измерения) уровня cDNA ALAS1 в реакци- 94 036477 онной смеси, где уровень cDNA ALAS1 является показателем уровня mRNA ALAS1, тем самым анализируют уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
Согласно одному варианту осуществления анализ или способ предусматривают получение образца биологической жидкости от субъекта, где биологический образец отделяют от ткани и где биологический образец содержит экзосомы. Анализ или способ могут дополнительно предусматривать определение уровней РНК в биологическом образце, где РНК экспрессируется за счет гена в ткани субъекта, где экзосомы не очищают от биологического образца перед определением уровней РНК в биологическом образце.
Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец крови. Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец сыворотки. Согласно другому варианту осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец мочи.
Согласно вариантам осуществления способ включает PCR, qPCR или 5'-RACE.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота представляет собой зонд или праймер.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота содержит выявляемый фрагмент и уровень mRNA ALAS1 определяют по выявлению количества выявляемого фрагмента.
Согласно вариантам осуществления упомянутый способ дополнительно предусматривает получение образца биологической жидкости от субъекта.
Согласно вариантам осуществления этих способов эффективность лечения порфирии оценивают на основе сравнения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта по отношению к нормальному значению.
Согласно вариантам осуществления снижение уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта в ответ на лечение порфирии относительно нормального значения указывает на то, что лечение порфирии является эффективным. Согласно вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта до лечения порфирии.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные таковым, описанным в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или исследовании iRNA и способов, описанных в настоящем изобретении, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие литературные источники, которые упоминаются в данном документе, включены при помощи ссылки во всей своей полноте. В случае противоречия настоящее описание, в том числе определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не подразумеваются как ограничивающие.
Примеры
Пример 1. Синтез siRNA
Источник реагентов
Если источник реагента конкретным образом не указан в данном документе, такой реагент может быть получен от любого поставщика реагентов для целей использования в молекулярной биологии в количестве/с чистотой, стандартными для применения в молекулярной биологии.
Синтез олигонуклеотидов
Все олигонуклеотиды синтезировали на синтезаторе AKTAoligopilot. Для синтеза олигонуклеотидов применяли коммерчески доступную твердую подложку из стекла с контролируемым размером пор (dT-CPG, 500 A, Prime Synthesis) и РНК-фосфорамидиты со стандартными защитными группами, 5'-Oдиметокситритил^6-бензоил-2'-трет-бутилдиметилсилил-аденозин-3'-О-^№-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5-О-диметокситритил-№-ацетил-2'-трет-бутилдиметилсилил-цитидин-3'-О-^№диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-О-диметилокситритил-№-изобутрил-2'-трет-бутилдиметилсилил-гуанозин-3'-О-^^-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-О-диметокситритил-2'-третбутилдиметилсилил-уридин-3'-О-^№-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит (Pierce Nucleic Acids Technologies). 2'-Е-фосфорамидиты, 5'-О-диметокситритил-№-ацетил-2'-фтор-цитидин-3'-О-^№диизопропил-2-цианоэтил-фосфорамидит и 5'-О-диметокситритил-2'-фторуридин-3 '-O-N.N'-диизопропил-2-цианоэтил-фосфорамидит приобретали у Promega. Все фосфорамидиты применяли в концентрации 0,2 М в ацетонитриле (CH3CN), за исключением гуанозина, который применяли в концентрации 0,2 М в 10% THF/ANC (объем/объем). Время связывания/рециркуляции составляло 16 мин. Активатор представляет собой 5-этилтиотетразол (0,75 М, American International Chemicals); для РО-окисления применяли йод/воду/пиридин, а для PS-окисления применяли PADS (2%) в смеси 2,6-лутидин/ACN (1:1 объем/объем).
З'-Лиганд-конъюгированные нити синтезировали с помощью твердой подложки, содержащей соответствующий лиганд. Например, введение единицы холестерина в последовательность выполняли от фосфорамидита гидроксипролинол-холестерина. Холестерин привязывали к транс-4-гидроксипролинолу с помощью 6-аминогексаноатной связи с получением фрагмента, представляющего собой гидроксипро
- 95 036477 линол-холестерин. iRNA, меченые на 5'-конце Су-3 и Су-5.5 (флуорофором), синтезировали из соответствующего фосфорамидита Quasar-570 (Су-3), приобретенного у Biosearch Technologies. Конъюгацию лигандов с 5'-концом и/или внутренним положением достигали с помощью соответствующим образом защищенного лиганд-фосфорамидитного строительного блока. В течение 15 мин дополнительно выполняли связывание 0,1 М раствора фосфорамидита в безводном CH3CN в присутствии активатора 5(этилтио)-Ш-тетразола со связанным с твердой подложкой олигонуклеотидом. Окисление межнуклеотидного фосфита до фосфата выполняли с использованием стандартной смеси йод-вода, которая описана (1), или путем обработки смесью трет-бутилгидропероксида/ацетонитрила/воды (10: 87: 3) с конъюгированным олигонуклеотидом при времени задержки окисления 10 мин. Фосфоротиоат вводили с помощью окисления фосфита до фосфоротиоата с использованием реагента для переноса серы, такого как DDTT (приобретенного у AM Chemicals), PADS и/или реагента Бокажа. Холестерин-фосфорамидит синтезировали своими силами и использовали в концентрации 0,1 М в дихлорметане. Время связывания для холестерин-фосфорамидита составляло 16 мин.
Снятие защиты I (снятие защиты с нуклеотидного основания)
После завершения синтеза подложку переносили в 100 мл стеклянный флакон (VWR). Олигонуклеотид отделяли от подложки с одновременным снятием защиты с основных и фосфатных групп с использованием 80 мл смеси этанольного аммиака [аммиак:этанол (3:1)] в течение 6,5 ч при 55°С. Флакон быстро охлаждали на льду и затем смесь этанольного аммиака фильтровали в новый 250-мл флакон. CPG промывали с помощью 2 х 40 мл частей смеси этанола/воды (1:1 объем/объем). Объем смеси затем сокращали до ~30 мл при помощи роторного испарителя. Затем смесь замораживали на сухом льду и сушили в условиях вакуума на скоростной вакуумной установке.
Снятие защиты II (удаление группы 2'-TBDMS)
Высушенный остаток ресуспендировали в 26 мл триэтиламина, триэтиламинтригидрофторида (TEA-3HF) или смеси пиридина-HF и DMSO (3:4:6) и нагревали при 60°С в течение 90 минут для удаления групп трет-бутилдиметилсилила (TBDMS) в 2'-положении. Затем реакционную смесь гасили 50 мл 20 мМ ацетата натрия и рН корректировали до 6,5. Олигонуклеотид хранили в холодильнике до очистки.
Анализ
Перед очисткой олигонуклеотиды анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), а выбор буфера и колонки зависел от природы последовательности и/или конъюгированного лиганда.
Очистка при помощи HPLC
Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды очищали при помощи препаративной HPLC с обращенной фазой. Неконъюгированные олигонуклеотиды очищали при помощи анионообменной HPLC на колонке TSKgel, полученной своими силами. Буферами являются 20 мМ фосфат натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN (буфер А) и 20 мМ фосфат натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN, 1 M NaBr (буфер В). Фракции, содержащие олигонуклеотиды полной длины, объединяли, обессоливали и лиофилизировали. Приблизительно 0,15 OD обессоленных олигонуклеотидов разбавляли в воде до 150 мкл и затем отмеряли пипеткой в специальные виалы для CGE- и LC/MS-анализа. Затем соединения анализировали при помощи LC-ESMS и CGE.
Получение siRNA
Для общего получения siRNA эквимольрные количества смысловой и антисмысловой нитей нагревали в 1xPBS при 95°С в течение 5 мин и медленно охлаждали до комнатной температуры. Целостность дуплекса подтверждали с помощью HPLC-анализа.
Последовательности нуклеиновых кислот представлены ниже с использованием стандартной номенклатуры и, в частности, сокращений табл. 1.
Таблица 1. Сокращения нуклеотидных мономеров, используемые в представлении последовательности нуклеиновой кислоты. Будет понятно, что данные мономеры при их присутствии в олигонуклеотиде взаимно связываются с помощью 5'-3'-фосфодиэфирных связей.
Сокращение Нуклеотид(ы)/Нуклеозиды
А аденозин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’-фторуридин-5’-фосфат или аденозин
АЬ бета-Ь-аденозин-З'-фосфат, бета-Ь-аденозин-5'-фосфат или бета-Ь-аденозин
- 96 036477
Abs бета-Ь-аденозин-З'-фосфоротиоат
Af 2’-дезокси-2’-фтораденозин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’фтораденозин-5’-фосфат или 2’-дезокси-2’-фтораденозин
Afs 2’-дезокси-2’-фтораденозин-3’-фосфоротиоат
As аденозин-3’-фосфоротиоат
C цитидин-3’-фосфат, цитидин-5’-фосфат или цитидин
Cb бета-Ь-цитидин-З'-фосфат или бета-Ь-цитидин
Cbs бета-Ь-цитидин-З'-фосфоротиоат
Cf 2’-дезокси-2’ -фторцитидин-3 ’ -фосфат, 2’ -дезокси-2’фторцитидин-5’-фосфат или 2’-дезокси-2’-фторцитидин
Cfs 2 ’ - дезокси-2 ’ -фторцитидин-3 ’ -фосфоротиоат
(Chd) 2'-О-гексадецил-цитидин-3'-фосфат или 2'-О-гексадецилцитидин
(Chds) 2'-О-гексадецил-цитидин-3'-фосфоротиоат
Cs цитидин-3 ’-фосфоротиоат
G гуанозин-3’-фосфат, гуанозин-5’-фосфат или гуанозин
Gb бета-Ь-гуанозин-З'-фосфат, бета-L-гуанозин-5'-фосфат или бета-L-гуанозин
Gbs бета-Ь-гуанозин-З'-фосфоротиоат
Gf 2’-дезокси-2’-фторгуанозин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’фторгуанозин-5’-фосфат или 2’-дезокси-2’-фторгуанозин
Gfs 2’-дезокси-2’-фторгуанозин-3’-фосфоротиоат
Gs гуанозин-3 ’ -фосфоротиоат
T 5’-метилуридин-3’-фосфат, 5’-метилуридин-5’-фосфат или 5’метилуридин
Tb бета-Ь-тимидин-З'-фосфат, бета-Ь-тимидин-б'-фосфат или бетаL-тимидин
Tbs бета-Ь-тимидин-З'-фосфоротиоат
Tf 2’-дезокси-2’-фтор-5-метилуридин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’фтор-5-метилуридин-З’-фосфат или 2’-дезокси-2’-фтор-5метилуридин
Tfs 2 ’ - дезокси-2 ’ -фтор-5-метилур идин-3 ’ -фосфоротиоат
Ts 5-метилур идин-3 ’ -фосфоротиоат
U уридин-3’-фосфат, уридин-5’-фосфат или уридин
Ub бета-Ь-уридин-З'-фосфат, бета-Ь-уридин-б'-фосфат или бета-Lуридин
Ubs бета-Ь-уридин-З'-фосфоротиоат
Uf 2’-дезокси-2’-фторуридин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’-фторуридин или 2’-дезокси-2’-фторуридин-3’-фосфат
- 97 036477
Ufs 2’-дезокси-2’-фторуридин-3 ’-фосфоротиоат
(Uhd) 2'-О-гексадецил-уридин-3'-фосфат, 2'-О-гексадецил-уридин-6'фосфат или 2'-О-гексадецил-уридин
(Uhds) 2'-О-гексадецил-уридин-3'-фосфоротиоат
Us уридин-3 ’ -фосфоротиоат
N любой нуклеотид (G, А, С, Т или U)
a 2’-О-метиладенозин-3’-фосфат, 2’-О-метиладенозин-5’-фосфат или 2’-О-метиладенозин
as 2'-О-метиладенозин-3 ’ -фосфоротиоат
c 2’-О-метилцитидин-3 ’ -фосфат, 2’ -О-метилцитидин-5’-фосфат или 2’-О-метилцитидин
CS 2'-О-метилцитидин-3’-фосфоротиоат
g 2’-О-метилгуанозин-3’-фосфат, 2’-О-метилгуанозин-5’-фосфат или 2’-О-метилгуанозин
gs 2'-О-метилгуанозин-3 ’ -фосфоротиоат
t 2’-О-метил-5-метилуридин-3’-фосфат, 2’-О-метил-5метилуридин-5’-фосфат или 2’-О-метил-5-метилуридин
ts 2’-О-метил-5-метилуридин-3’-фосфоротиоат
u 2’-О-метилуридин-3’-фосфат, 2’-О-метилуридин-5’-фосфат или 2’-О-метилуридин
US 2'-О-метилур идин-3 ’ -фосфоротиоат
dA 2'-дезоксиаденозин-3'-фосфат, 2' -дезоксиаденозин-5'-фосфат или 2' -дезоксиаденозин
dAs 2'-дезоксиаденозин-3'-фосфоротиоат
dC 2'-дезоксицитидин-3'-фосфат, 2'-дезоксицитидин-5'-фосфат или 2'-дезоксицитидин
dCs 2'-дезоксицитидин-3'-фосфоротиоат
dG 2'-дезоксигуанозин-3'-фосфат, 2' -дезоксигуанозин-5'-фосфат или 2' -дезоксигуанозин
dGs 2'-дезоксигуанозин-3'-фосфоротиоат или 2'-дезоксигуанозин
dT 2'-дезокситимидин-3 ’-фосфат, 2'-дезокситимидин-5’-фосфат или 2'-дезокситимидин
dTs 2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат
dU 2'-дезоксиуридин-3'-фосфат, 2'-дезоксиуридин-5'-фосфат или 2' - дезоксиуридин
s фосфоротиоатная связь
L961 М-[трис(ОаШАс-алкил)-амидодеканоил)]-4-гидроксипролинолНур-(ОаП4Ас-алкил)3
- 98 036477
(Аео) 2’-О-метоксиэтиладенозин-3 ’-фосфат, 2’ -0- метоксиэтиладенозин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтиладенозин
(Aeos) 2’-О-метоксиэтиладенозин-3’-фосфоротиоат
(Сео) 2’-О-метоксиэтилцитидин-3 ’-фосфат, 2’ -Ометоксиэтилцитидин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтилцитидин
(Ceos) 2’-О-метоксиэтилцитидин-3’-фосфоротиоат
(Geo) 2’-О-метоксиэтилгуанозин-3’-фосфат, 2’-О- метоксиэтилгуанозин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтилгуанозин
(Geos) 2’-О-метоксиэтилгуанозин-3’-фосфоротиоат
(Тео) 2’-О-метоксиэтил-5-метилуридин-3’-фосфат, 2’-О-метоксиэтил5-метилуридин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтил-5-метилуридин
(Teos) 2’-О-метоксиэтил-5-метилуридин-3 ’-фосфоротиоат
(m5Ceo) 2’-О-метоксиэтил-5-метилцитидин-3’-фосфат, 2’-Ометоксиэтил-5-метилцитидин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтил5-метилцитидин
(m5Ceos) 2’-О-метоксиэтил-5-метилцитидин-3’-фосфоротиоат
(Agn) 1-(2,3-дигидроксипропил)аденин-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)аденин-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил)аденин
(Agns) 1-(2,3-дигидроксипропил)аденин-2-фосфоротиоат
(Cgn) 1-(2,3-дигидроксипропил)цитозин-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)цитозин-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил)цитозин
(Cgns) 1-(2,3-дигидроксипропил)цитозин-2-фосфоротиоат
(Ggn) 1-(2,3-дигидроксипропил)гуанин-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)гуанин-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил)гуанин
(Ggns) 1-(2,3-дигидроксипропил)гуанин-2-фосфоротиоат
(Tgn) 1-(2,3-дигидроксипропил )тимин-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)тимин-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил )тимин
(Tgns) 1-(2,3-дигидроксипропил )тимин-2-фосфоротиоат
(Ugn) 1-(2,3-дигидроксипропил )урацил-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)урацил-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил)тимин
(Ugns) 1-(2,3-дигидроксипропил )урацил-2-фосфоротиоат
Химическая структура L96 представлена ниже
Пример 2. Конструирование и синтез siRNA ALAS1
Экспериментальные способы
Биоинформатика
Транскрипты
Конструирование siRNA выполняли для выявления siRNA, нацеливающихся на транскрипты ALAS1 человека, макака-резуса (Масаса mulatto), мыши и крысы, аннотированные в базе данных генов NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). При конструировании использовали следующие транскрипты из коллекции эталонных последовательностей в NCBI: человек - NM_000688.4 (см. фиг. 3), NM_199166.1; макак-резус - ХМ_001090440.2, ХМ_001090675.2; мышь - NM_020559.2; крыса NM_024484.2. Вследствие высокого расхождения последовательностей примат/грызун дуплексы siRNA конструировали в нескольких отдельных партиях, в том числе без ограничения партиях, содержащих дуплексы, соответствующие только транскриптам человека и макака-резуса; только транскриптам человека, макака-резуса, мыши и крысы и только транскриптам мыши и крысы. Большинство дуплексов siRNA конструировали так, чтобы они были на 100% идентичны приведенному транскрипту человека и транскриптам других видов, рассмотренным в каждой партии конструирования (выше). В некоторых случаях (см. таблицу 8) ошибочные спаривания между дуплексом и целевой mRNA допускались в первом антисмысловом (последнем смысловом) положении, в тех случаях если комплементарной парой оснований антисмысловой нити щелевой mRNA была пара GC или CG. В этих случаях дуплексы конструировали с парами UA или AU в качестве первой антисмысловой:последней смысловой пары. Таким
- 99 036477 образом, дуплексы сохраняли комплементарность, но являлись несовпадающими по отношению к мишени (U:C, U:G, А:С или A:G). Восемнадцать из этих дуплексов с UA-заменами конструировали как часть набора человек/макак-резус/мышь/крыса (см. дуплексы в табл. 8 с пометками C19U, G19U, С 19А или G19A в столбце положения).
Прогнозирование конструирования, специфичности и эффективности siRNA Прогнозируемую специфичность всех возможных олигомеров из 19 нуклеотидов прогнозировали исходя из каждой последовательности. Затем выбирали кандидатные олигомеры из 19 нуклеотидов, у которых отсутствовали повторы длиннее 7 нуклеотидов. Эти siRNA, 1510 кандидатных человека/макака-резуса, 114 человека/макака-резуса/мыши/крысы и 717 мыши/крысы, использовали при обширных поисках в отношении соответствующих транскриптом (определенные как набор из записей NM_ и ХМ_ в пределах наборов эталонных последовательностей человека, макака-резуса, собаки, мыши или крысы в NCBI) с применением исчерпывающего алгоритма грубой силы, включенного в скрипт питон BruteForce.py. Скрипт затем разбирал выравнивания транскрипт-олигомер с получением балла, основанного на положении и количестве ошибочных спариваний между siRNA и любым потенциальным нецелевым транскриптом. Нецелевой балл взвешивали для усиления различий в затравочном участке siRNA в положениях 2-9 с 5'-конца молекулы. Каждой паре олигомер-транскрипт из поиска грубой силы присваивали балл для ошибочного спаривания путем суммирования отдельных баллов для ошибочного спаривания; ошибочные спаривания в положениях 2-9 определяли как 2,8, ошибочные спаривания в положениях сайта расщепления 10-11 определяли как 1,2 и ошибочные спаривания в участке 12-19 определяли как 1,0. Дополнительное нецелевое прогнозирование выполняли путем сравнения встречаемости гептамеров и октамеров, полученных из 3 отличных полученных из затравки гексамеров каждого олигомера. Гексамеры из положений 2-7 по отношению к 5'-началу использовали для создания 2 гептамеров и одного октамера. 'ГептамерГ создавали путем добавления А на 3'-конец гексамера; гептамер2 создавали путем добавления А на 5'-конец гексамера; октамер создавали путем добавления А как на 5'-конец, так и на 3'-конец гексамера. Заранее вычисляли встречаемость октамеров и гептамеров в 3'UTRome человека, макака-резуса, мыши или крысы (определенные как подпоследовательности транскриптом из базы данных эталонных последовательностей в NCBI, где конец кодирующего участка, 'CDS', является четко определенным). Встречаемость октамеров нормализовали по отношению к встречаемости гептамеров с использованием медианного значения из диапазона встречаемостей октамеров. Затем вычисляли 'mirSeedScore' путем вычисления суммы ( (3 X нормализованное подсчитанное число для октамеров ) + ( 2 X подсчитанное число для гептамера2) + (1 X подсчитанное число для гептамера1)).
Обоим нитям siRNA присваивали категорию специфичности согласно рассчитанным баллам: балл выше 3 оценивали как высоко специфичная, равный 3 как специфичная и от 2,2 до 2,8 оценивали как умеренно специфичная. Упорядочивание проводили по специфичности антисмысловой нити. Затем отбирали дуплексы, у антисмысловых олигонуклеотидов которых отсутствовала GC в первом положении, отсутствовал G в обоих положениях 13 и 14 и присутствовали 3 или более Us или As в затравочном участке (характеристики дуплексов с высокой прогнозированной эффективностью).
Кандидатные коньюгированные с GalNAc дуплексы, 21 и 23 нуклеотида в длину для смысловой и антисмысловой нитей соответственно, конструировали путем удлинения антисмысловых олигомеров из 19 нуклеотидов 4 дополнительными нуклеотидами в 3'-направлении (сохраняя полную комплиментарность с целевым транскриптом). Смысловую нить описывали как обратную комплементарную последовательность первых 21 нуклеотида антисмыслового олигомера из 23 нуклеотидов. Выбирали такие дуплексы, которые сохраняли полные соответствия ко всем выбранным транскриптам видов на протяжении всех 23 нуклеотидов.
Отбор последовательностей siRNA
Синтезировали олигонуклеотиды siRNA из 19 нуклеотидов, являющиеся дуплексами человека/макака-резуса, полученными в общей сложности из 90 смысловых и 90 антисмысловых, человека/макака-резуса/мыши/крысы полученными в общей сложности из 40 смысловых и 40 антисмысловых, и мыши/крысы, полученными в общей сложности из 40 смысловых и 40 антисмысловых, и составляли в дуплексы. Синтезировали олигонуклеотиды из 21/23 нуклеотидов, являющиеся дуплексами человека/макака-резус, полученными в общей сложности из 45 смысловых и 45 антисмысловых, с получением 45 конъюгированных с GalNAc дуплексов.
Последовательности смысловой и антисмысловой нитей модифицированных дуплексов показаны в табл. 2, а последовательности смысловой и антисмысловой нитей немодифицированных дуплексов показаны в табл. 3.
Синтез последовательностей ALAS1
Последовательности ALAS1 синтезировали на синтезаторе MerMade 192 с масштабом либо 1, либо 0,2 мкмоль. Одиночные нити получали с модификациями 2Ю-метила для in vitro скрининга с использованием реагентов для трансфекции. 3'-Конъюгаты GalNAc получали с последовательностями, содержащими модификации 2'F и 2'-О-метила смысловой нити в конструкциях из 21-23 нуклеотидов для свободного захвата в клетках. Для всех последовательностей в перечне из 21 нуклеотида использовали химию 'endolight', подробно описанную ниже.
- 100 036477
Все пиримидины (цитозин и уридин) в смысловой нити содержали 2'-О-метиловые основания (2'-Ометил-С и 2'-О-метил-и).
В антисмысловой нити пиримидины, расположенные рядом с (по направлению к 5'-положению) рибунуклеозидом А, замещали их соответствующими 2-О-метил-нуклеозидами.
Вводили удлинение из двух оснований dTsdT на 3'-конце как смысловой, так и антисмысловой последовательностей.
Файл последовательности конвертировали в текстовый файл, чтобы сделать его совместимым для загрузки в компьютерную программу синтеза MerMade 192.
Для конъюгированных с GalNAc смысловых нитей и комплементарных антисмысловых последовательностей 2'F и другие модифицированные нуклеозиды вводили в комбинации с 2'0метилрибонуклеозидами. Синтез осуществляли на модифицированной GalNAc CPG-подложке для смысловой нити, а для антисмысловой последовательности на CPG, модифицированной универсальной подложке.
Синтез, расщепление и снятие защиты
В синтезе последовательностей ALAS1 применяли синтез нуклеотидов на твердой подложке с использованием химии фосфорамидитов. Для последовательностей, отвечающих химии endolight, из 21 нуклеотида в качестве твердой подложки использовали дезокситимидин-CPG, в то время как для конъюгатов GalNAc для смысловой нити использовали твердую подложку GalNAc, а для антисмысловой нити универсальную CPG.
Синтез упомянутых выше последовательностей выполняли с масштабом либо 1, либо 0,2 мкм в 96луночных планшетах. Растворы амидитов получали при концентрации 0,1 М, а этилтиотетразол (0,6 М в ацетонитриле) использовали в качестве активатора.
Синтезированные последовательности расщепляли и снимали защиту в 96-луночных планшетах, используя метиламин на первой стадии и фторидный реагент на второй стадии. Для последовательностей, содержащих GalNAc и 2Т'-нуклеозид, условия снятия защиты модифицировали. После расщепления и снятия защиты последовательности осаждали с использованием смеси ацетон:этанол (80:20) и осадок ресуспендировали в 0,2 М натрий-ацетатном буфере. Образцы из каждой последовательности анализировали при помощи LC-MS для подтверждения идентичности, УФ - для количественного определения, а выбранный набор образцов анализировали при помощи IEX-хроматографии для определения чистоты.
Очистка и обессоливание
Последовательности ALAS1 осаждали и очищали на системе очистки AKTA с использованием колонки с Sephadex. ALAS1 исследовали при температуре окружающей среды. Введение и сбор образца выполняли в 96-луночных (лунка с глубиной 1,8 мл) планшетах. В элюенте собирали один пик, соответствующий последовательности полной длины. Обессоленные последовательности ALAS1 анализировали в отношении концентрации (УФ-измерением при А260) и чистоты (ионообменной хроматографией HPLC). Комплементарные одиночные нити затем объединяли в стехиометрическом соотношении 1:1 с образованием дуплексов siRNA.
- 101 036477
Таблица 2. Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQID NO: (смысло -вая) SEQID NO: (антисмысло -вая) Положение на транскрипте NM_ 000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
2 3 522-540 AD-55078.2 cuccGGccAGuGAGAAAGAdTsd Т UCUUUCUcACUGGCCGGAGdTs dT
4 5 669-687 AD-55084.2 uGGcAGcAcAGAuGAAucAdTsd Т UGAUUcAUCUGUGCUGCcAdTs dT
6 7 790-808 AD-55090.2 cAGuGuGGuuAGuGuGAAAdTs dT UUUcAcACuAACcAcACUGdTsdT
8 9 853-871 AD-55096.2 cAu cAu GcAAAAG cAAAG AdT sd T UCUUUGCUUUUGcAUGAUGdTs dT
10 11 876-894 AD-55102.2 AAAGAGuGucucAucuucudTsd T AGAAGAUGAG AcACUCU U U dTs dT
12 13 877-895 AD-55106.2 AAGAGuGucucAucuucuudTsd T AAGAAGAUGAGAcACUCUUdTs dT
14 15 914-932 AD-55111.2 ucuGuuuccAcuuuucAGudTsdT ACU G AAAAG U G G AAAcAG AdTs dT
16 17 923-941 AD-55073.2 AcuuuucAGuAuGAucGuudTsd T AACGAUcAuACUGAAAAGUdTsd T
18 19 926-944 AD-55079.2 uuucAGuAuGAucGuuucudTsd T AGAAACGAUcAuACUGAAAdTsd T
20 21 927-945 AD-55085.2 uucAGuAuGAucGuuucuudTsd T AAGAAACGAUcAuACUGAAdTsd T
22 23 928-946 AD-55091.2 ucAGuAuGAucGuuucuuudTsd T AAAGAAACGAUcAuACUGAdTsd T
24 25 932-950 AD-55097.2 uAuGAucGuuucuuuGAGAdTsd T UCUcAAAGAAACGAUcAuAdTsd T
26 27 973-991 AD-55103.2 uGAccAcAccuAucGAGuudTsdT AACUCGAuAGGUGUGGUcAdTs dT
28 29 975-993 AD-55107.2 AccAcAccuAucGAGuuuudTsdT AAAACUCGAuAGGUGUGGUdTs dT
30 31 1029-1047 AD-55112.2 uGGcAGAuGAcuAuucAGAdTsd T UCUGAAuAGUcAUCUGCcAdTsd T
32 33 1077-1095 AD-55074.2 ucuGGuGcAGuAAuGAcuAdTsd T uAGUcAUuACUGcACcAGAdTsd T
34 35 1124-1142 AD-55080.2 uGuGGGGcAGuuAuGGAcAdTs dT UGUCcAuAACUGCCCcAcAdTsdT
36 37 1137-1155 AD-55086.2 uGGAcAcuuu G AAAcAAcAdT sd T UGUUGUUUcAAAGUGUCcAdTs dT
38 39 1182-1200 AD-55098.2 AuAuuucuGGAAcuAGuAAdTsd T UuACuAGUUCcAGAAAuAUdTsd T
40 41 1184-1202 AD-55104.2 AuuucuGGAAcuAGuAAAudTsd T AUUuACuAGUUCcAGAAAUdTsd T
- 102 036477
42 43 1185-1203 AD-55108.2 uuucuGGAAcuAGuAAAuudTsd T AAU U uACuAG U UCcAGAAAdTsd T
44 45 1188-1206 AD-55113.2 cuGGAAcuAG uAAAu uccAdT sd T UGGAAUUuACuAGUUCcAGdTs dT
46 47 1325-1343 AD-55075.2 uGuGAGAuuuAcucuGAuudTsd T AAUcAGAGuAAAUCUcAcAdTsd T
48 49 1364-1382 AD-55081.2 AuccAAGGGAuucGAAAcAdTsd T UGUUUCGAAUCCCUUGGAUdTs dT
50 51 1382-1400 AD-55087.2 AGccGAGuGccAAAGuAcAdTsd T UGuACUUUGGcACUCGGCUdTs dT
52 53 1478-1496 AD-55093.2 uuuGAAAcuGuccAuucAAdTsd T UUGAAUGGAcAGUUUcAAAdTs dT
54 55 1531-1549 AD-55099.2 uGAuGuGGcccAuGAGuuudTsd T AAACUcAUGGGCcAcAUcAdTsd T
56 57 1631-1649 AD-53573.3 G u cAu G ccAAAAAuG G AcAdT sd T UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTs dT
58 59 1637-1655 AD-55109.2 ccAAAAAuGGAcAucAuuudTsd T AAAUGAUGUCcAUUUUUGGdTs dT
60 61 1706-1724 AD-55114.2 AcGAGuucucuGAuuGAcAdTsd T UGUcAAUcAGAGAACUCGUdTs dT
62 63 1962-1980 AD-55076.2 AAGucuGuGAuGAAcuAAudTsd T AUuAGUUcAUcAcAGACUUdTsd T
64 65 1967-1985 AD-55082.2 uGuGAuGAAcuAAuGAGcAdTs dT UGCUcAUuAGUUcAUcAcAdTsd T
66 67 1977-1995 AD-55088.2 uAAuGAGcAGAcAuAAcAudTsd T AUGUuAUGUCUGCUcAUuAdTs dT
68 69 2189-2207 AD-55094.2 uuuGAAGuGAuGAGuGAAAdTs dT UUUcACUcAUcACUUcAAAdTsd T
70 71 2227-2245 AD-55100.2 AGGcuuGAGcAAGuuGGuAdTs dT uACcAACUUGCUcAAGCCUdTsd T
72 73 2313-2331 AD-55105.2 ucuucAGAGuuGucuuuAudTsd T AuAAAGAcAACUCUGAAGAdTsd T
74 75 2317-2335 AD-55110.2 cAGAGuuGucuuuAuAuGudTsd T AcAuAuAAAGAcAACUCUGdTsd T
76 77 2319-2337 AD-55115.2 GAGuuGucuuuAuAuGuGAdTs dT UcAcAuAuAAAGAcAACUCdTsdT
78 79 2320-2338 AD-55077.2 AGuuGucuuuAuAuGuGAAdTsd T UUcAcAuAuAAAGAcAACUdTsd T
80 81 2344-2362 AD-55083.2 uuAuAuuAAAuuuuAAucudTsd T AGAU uAAAAU U uAAuAuAAdTsd T
82 83 2352-2370 AD-55089.2 AAuuuuAAucuAuAGuAAAdTsd T UUuACuAuAGAUuAAAAUUdTs dT
84 85 2353-2371 AD-55095.2 AuuuuAAucuAuAGuAAAAdTsd T U U U uACuAuAGAU uAAAAUdTs dT
86 87 2376-2394 AD-55101.2 AGuccuGGAAAuAAAuucudTsd T AGAAUUuAUUUCcAGGACUdTs dT
88 89 358-376 AD-53511.1 cuGcccAuucuuAucccGAdTsdT UCGGGAuAAGAAUGGGcAGdTs dT
90 91 789-807 AD-53512.1 ccAGuGuGGuuAGuGuGAAdTs dT UUcAcACuAACcAcACUGGdTsdT
92 93 1076-1094 AD-53513.1 GucuGGuGcAGuAAuGAcudTsd T AGUcAUuACUGcACcAGACdTsd T
94 95 1253-1271 AD-53514.1 GcAcucuuGuuuuccucGudTsdT ACGAGGAAAAcAAGAGUGCdTs dT
96 97 1544-1562 AD-53515.1 GAGuuuGGAGcAAucAccudTsd T AGGUGAUUGCUCcAAACUCdTs dT
103 036477
98 99 2228-2246 AD-53516.1 GGcuuGAGcAAGuuGGuAudTs dT AuACcAACUUGCUcAAGCCdTsd T
100 101 404-422 AD-53517.1 GGcAAAucucuGuuGuucudTsd T AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsd T
102 103 404-422 AD-53517.1 GGcAAAucucuGuuGuucudTsd T AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsd T
104 105 866-884 AD-53518.1 cAAAGAccAGAAAGAGuGudTs dT AcACUCUUUCUGGUCUUUGdTs dT
106 107 1080-1098 AD-53519.1 GGuGcAGuAAuGAcuAccudTsd T AGGuAGUcAUuACUGcACCdTsd T
108 109 1258-1276 AD-53520.1 cuuGuuuuccucGuGcuuudTsdT AAAG cACG AGG AAAAcAAG dTsd T
110 111 1616-1634 AD-53521.1 GGGGAucGGGAuGGAGucAdTs dT UGACUCcAUCCCGAUCCCCdTsd T
112 ИЗ 2230-2248 AD-53522.1 cuuGAGcAAGuuGGuAucudTsd T AGAuACcAACUUGCUcAAGdTsd T
114 115 436-454 AD-53523.1 ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsd T AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTs dT
116 117 436-454 AD-53523.1 ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsd T AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTs dT
118 119 885-903 AD-53524.1 cucAucuucuucAAGAuAAdTsdT UuAUCUUGAAGAAGAUGAGdTs dT
120 121 1127-1145 AD-53525.1 GGGGcAGuuAuGGAcAcuudTs dT AAGUGUCcAuAACUGCCCCdTsd T
122 123 1315-1333 AD-53526.1 GAuGccAGGcuGuGAGAuudTs dT AAUCUcAcAGCCUGGcAUCdTsd T
124 125 1870-1888 AD-53527.1 GAGAcAGAuGcuAAuGGAudTs dT AUCcAUuAGcAUCUGUCUCdTsd T
126 127 2286-2304 AD-53528.1 ccccAGGccAuuAucAuAudTsdT AuAUGAuAAUGGCCUGGGGdTs dT
128 129 489-507 AD-53529.1 cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTs dT
130 131 489-507 AD-53529.1 cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTs dT
132 133 915-933 AD-53530.1 cuGuuuccAcuuuucAGuAdTsdT uACUGAAAAGUGGAAAcAGdTs dT
134 135 1138-1156 AD-53531.1 GGAcAcuuuGAAAcAAcAudTsd T AUGUUGUUUcAAAGUGUCCdTs dT
136 137 1324-1342 AD-53532.1 cuGuGAGAuuuAcucuGAudTsd T AUcAGAGuAAAUCUcAcAGdTsd T
138 139 1927-1945 AD-53533.1 cccuGuGcGGGuuGcAGAudTsd T AUCUGcAACCCGcAcAGGGdTsd T
140 141 2312-2330 AD-53534.1 GucuucAGAGuuGucuuuAdTsd T uAAAGAcAACUCUGAAGACdTsd T
142 143 646-664 AD-53535.1 cAcuGcAAGcAAAuGcccudTsdT AGGGcAUUUGCUUGcAGUGdTs dT
144 145 922-940 AD-53536.1 cAcuuuucAGuAuGAucGudTsd T ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTs dT
146 147 1163-1181 AD-53537.1 GGGGcAGGuGGuAcuAGAAdTs dT UUCuAGuACcACCUGCCCCdTsd T
148 149 1347-1365 AD-53538.1 GGAAccAuGccuccAuGAudTsdT AUcAUGGAGGcAUGGUUCCdTs dT
150 151 1964-1982 AD-53539.1 GucuGuGAuGAAcuAAuGAdTs dT UcAUuAGUUcAUcAcAGACdTsd T
152 153 2321-2339 AD-53540.1 GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsd T AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsdT
154 155 671-689 AD-53541.1 GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsd T UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdTs dT
156 157 924-942 AD-53542.1 cuuuucAGuAuGAucGuuudTsd T AAACGAUcAuACUGAAAAGdTsd T
158 159 1164-1182 AD-53543.1 GGGcAGGuGGuAcuAGAAAdTs dT UUUCuAGuACcACCUGCCCdTsd T
160 161 1460-1478 AD-53544.1 GuccccAAGAuuGuGGcAudTsd T AUGCcAcAAUCUUGGGGACdTsd T
162 163 1976-1994 AD-53545.1 cuAAuGAGcAGAcAuAAcAdTsd T UGUuAUGUCUGCUcAUuAGdTs dT
164 165 786-804 AD-53546.1 GccccAGuGuGGuuAGuGudTsd T AcACuAACcAcACUGGGGCdTsdT
166 167 935-953 AD-53547.1 GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsd T UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTs dT
168 169 1165-1183 AD-53548.1 GGcAGGuGGuAcuAGAAAudTs dT AUUUCuAGuACcACCUGCCdTsd T
170 171 1530-1548 AD-53549.1 GuGAuGuGGcccAuGAGuudTsd T AACUcAUGGGCcAcAUcACdTsdT
172 173 2003-2021 AD-53550.1 cAAGcAAucAAuuAcccuAdTsdT uAGGGuAAUUGAUUGCUUGdTs dT
174 175 788-806 AD-53551.1 cccAGuGuGGuuAGuGuGAdTsd T UcAcACuAACcAcACUGGGdTsdT
176 177 974-992 AD-53552.1 GAccAcAccuAucGAGuuudTsdT AAACUCGAuAGGUGUGGUCdTs dT
178 179 1191-1209 AD-53553.1 GAAcu AGu AAAu uccAuG udT sd T AcAUGGAAUUuACuAGUUCdTs dT
180 181 1541-1559 AD-53554.1 cAuGAGuuuGGAGcAAucAdTsd T UGAUUGCUCcAAACUcAUGdTs dT
182 183 2075-2093 AD-53555.1 ccccAGAuGAuGAAcuAcudTsdT AGuAGUUcAUcAUCUGGGGdTs dT
184 185 360-378 AD-53561.1 GcccAuucuuAucccGAGudTsdT ACUCGGGAuAAGAAUGGGCdTs dT
186 187 1356-1374 AD-53567.1 ccuccAuGAuccAAGGGAudTsdT AUCCCUUGGAUcAUGGAGGdTs dT
188 189 1631-1649 AD-53573.1 G u cAu G ccAAAAAuG G AcAdT sd T UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTs dT
190 191 1634-1652 AD-53579.1 AuGccAAAAAuGGAcAucAdTsd T UGAUGUCcAUUUUUGGcAUdTs dT
- 104 036477
Таблица 3. Немодифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQID NO: (смысло -вая) SEQIDNO: (антисмысловая ) Положение на транс- крипте NM_ 000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
192 193 522-540 AD-55078.2 CUCCGGCCAGUGAGAAAGA UCUUUCUCACUGGCCGGAG
194 195 669-687 AD-55084.2 UGGCAGCACAGAUGAAUCA UGAUUCAUCUGUGCUGCCA
196 197 790-808 AD-55090.2 CAGUGUGGUUAGUGUGAAA UUUCACACUAACCACACUG
198 199 853-871 AD-55096.2 CAUCAUGCAAAAGCAAAGA UCUUUGCUUUUGCAUGAU G
200 201 876-894 AD-55102.2 AAAGAGUGUCUCAUCUUCU AGAAGAU GAGACACUCU U U
202 203 877-895 AD-55106.2 AAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUU
204 205 914-932 AD-55111.2 UCUGUUUCCACUUUUCAGU ACUGAAAAGUGGAAACAGA
206 207 923-941 AD-55073.2 ACUUUUCAGUAUGAUCGUU AACGAUCAUACUGAAAAGU
208 209 926-944 AD-55079.2 UUUCAGUAUGAUCGUUUCU AGAAACGAUCAUACUGAAA
210 211 927-945 AD-55085.2 UUCAGUAUGAUCGUUUCUU AAGAAACGAUCAUACUGAA
212 213 928-946 AD-55091.2 UCAGUAUGAUCGUUUCUUU AAAGAAACGAUCAUACUGA
214 215 932-950 AD-55097.2 UAUGAUCGUUUCUUUGAGA UCUCAAAGAAACGAUCAUA
216 217 973-991 AD-55103.2 UGACCACACCUAUCGAGUU AACUCGAUAGGUGUGGUCA
218 219 975-993 AD-55107.2 ACCACACCUAUCGAGUUUU AAAACUCGAUAGGUGUGGU
220 221 1029-1047 AD-55112.2 UGGCAGAUGACUAUUCAGA UCUGAAUAGUCAUCUGCCA
222 223 1077-1095 AD-55074.2 UCUGGUGCAGUAAUGACUA UAGUCAUUACUGCACCAGA
224 225 1124-1142 AD-55080.2 UGUGGGGCAGUUAUGGACA UGUCCAUAACUGCCCCACA
226 227 1137-1155 AD-55086.2 UGGACACUUUGAAACAACA UGUUGUUUCAAAGUGUCCA
228 229 1182-1200 AD-55098.2 AUAUUUCUGGAACUAGUAA UUACUAGUUCCAGAAAUAU
230 231 1184-1202 AD-55104.2 AUUUCUGGAACUAGUAAAU AUUUACUAGUUCCAGAAAU
232 233 1185-1203 AD-55108.2 UUUCUGGAACUAGUAAAUU AAUUUACUAGUUCCAGAAA
234 235 1188-1206 AD-55113.2 CUGGAACUAGUAAAUUCCA UGGAAUUUACUAGUUCCAG
236 237 1325-1343 AD-55075.2 UGUGAGAUUUACUCUGAUU AAUCAGAGUAAAUCUCACA
238 239 1364-1382 AD-55081.2 AUCCAAGGGAUUCGAAACA UGUUUCGAAUCCCUUGGAU
240 241 1382-1400 AD-55087.2 AGCCGAGUGCCAAAGUACA UGUACUUUGGCACUCGGCU
242 243 1478-1496 AD-55093.2 UUUGAAACUGUCCAUUCAA UUGAAUGGACAGUUUCAAA
244 245 1531-1549 AD-55099.2 UGAUGUGGCCCAUGAGUUU AAACUCAUGGGCCACAUCA
246 247 1631-1649 AD-53573.3 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
248 249 1637-1655 AD-55109.2 CCAAAAAUGGACAUCAUUU AAAUGAUGUCCAUUUUUGG
250 251 1706-1724 AD-55114.2 ACGAGUUCUCUGAUUGACA UGUCAAUCAGAGAACUCGU
252 253 1962-1980 AD-55076.2 AAGUCUGUGAUGAACUAAU AUUAGUUCAUCACAGACUU
254 255 1967-1985 AD-55082.2 UGUGAUGAACUAAUGAGCA UGCUCAUUAGUUCAUCACA
256 257 1977-1995 AD-55088.2 UAAUGAGCAGACAUAACAU AUGUUAUGUCUGCUCAUUA
258 259 2189-2207 AD-55094.2 UUUGAAGUGAUGAGUGAAA UUUCACUCAUCACUUCAAA
260 261 2227-2245 AD-55100.2 AGGCUUGAGCAAGUUGGUA UACCAACUUGCUCAAGCCU
262 263 2313-2331 AD-55105.2 UCUUCAGAGUUGUCUUUAU AUAAAGACAACUCUGAAGA
264 265 2317-2335 AD-55110.2 CAGAGUUGUCUUUAUAUGU ACAUAUAAAGACAACUCUG
266 267 2319-2337 AD-55115.2 GAGUUGUCUUUAUAUGUG А UCACAUAUAAAGACAACUC
268 269 2320-2338 AD-55077.2 AGUUGUCUUUAUAUGUGA А UUCACAUAUAAAGACAACU
270 271 2344-2362 AD-55083.2 UUAUAUUAAAUUUUAAUCU AGAUUAAAAUUUAAUAUAA
272 273 2352-2370 AD-55089.2 AAUUUUAAUCUAUAGUAAA UUUACUAUAGAUUAAAAUU
274 275 2353-2371 AD-55095.2 AUUUUAAUCUAUAGUAAAA UUUUACUAUAGAUUAAAAU
105 036477
276 277 2376-2394 AD-55101.2 AGUCCUGGAAAUAAAUUCU AGAAUUUAUUUCCAGGACU
278 279 358-376 AD-53511.1 CUGCCCAUUCUUAUCCCGA UCGGGAUAAGAAUGGGCAG
280 281 789-807 AD-53512.1 CCAGUGUGGUUAGUGUGAA UUCACACUAACCACACUGG
282 283 1076-1094 AD-53513.1 GUCUGGUGCAGUAAUGACU AGUCAUUACUGCACCAGAC
284 285 1253-1271 AD-53514.1 GCACUCUUGUUUUCCUCGU ACGAGGAAAACAAGAGUGC
286 287 1544-1562 AD-53515.1 GAGUUUGGAGCAAUCACCU AGGUGAUUGCUCCAAACUC
288 289 2228-2246 AD-53516.1 GGCUUGAGCAAGUUGGUAU AUACCAACUUGCUCAAGCC
290 291 404-422 AD-53517.1 GGCAAAUCUCUGUUGUUCU AG AACAACAG AGAU U UG СС
292 293 404-422 AD-53517.1 GGCAAAUCUCUGUUGUUCU AG AACAACAG AGAU U UG СС
294 295 866-884 AD-53518.1 CAAAGACCAGAAAGAGUGU ACACUCUUUCUGGUCUUUG
296 297 1080-1098 AD-53519.1 GGUGCAGUAAUGACUACCU AGGUAGUCAUUACUGCACC
298 299 1258-1276 AD-53520.1 CUUGUUUUCCUCGUGCUUU AAAGCACGAGGAAAACAAG
300 301 1616-1634 AD-53521.1 GGGGAUCGGGAUGGAGUCA UGACUCCAUCCCGAUCCCC
302 303 2230-2248 AD-53522.1 CUUGAGCAAGUUGGUAUCU AGAUACCAACUUGCUCAAG
304 305 436-454 AD-53523.1 CCCCAAGAUGAUGGAAGUU AACUUCCAUCAUCUUGGGG
306 307 436-454 AD-53523.1 CCCCAAGAUGAUGGAAGUU AACUUCCAUCAUCUUGGGG
308 309 885-903 AD-53524.1 CUCAUCUUCUUCAAGAUAA UUAUCUUGAAGAAGAUGAG
310 311 1127-1145 AD-53525.1 GGGGCAGUUAUGGACACUU AAGUGUCCAUAACUGCCCC
312 313 1315-1333 AD-53526.1 GAUGCCAGGCUGUGAGAUU AAUCUCACAGCCUGGCAUC
314 315 1870-1888 AD-53527.1 GAGACAGAUGCUAAUGGAU AUCCAUUAGCAUCUGUCUC
316 317 2286-2304 AD-53528.1 CCCCAGGCCAUUAUCAUAU AUAUGAUAAUGGCCUGGGG
318 319 489-507 AD-53529.1 CAGCAGUACACUACCAACA UGUUGGUAGUGUACUGCU G
320 321 489-507 AD-53529.1 CAGCAGUACACUACCAACA UGUUGGUAGUGUACUGCU G
322 323 915-933 AD-53530.1 CUGUUUCCACUUUUCAGUA UACUGAAAAGUGGAAACAG
324 325 1138-1156 AD-53531.1 GGACACUUUGAAACAACAU AUGUUGUUUCAAAGUGUCC
326 327 1324-1342 AD-53532.1 CUGUGAGAUUUACUCUGAU AUCAGAGUAAAUCUCACAG
328 329 1927-1945 AD-53533.1 CCCUGUGCGGGUUGCAGAU AU CU G CAACCCG САСAG G G
330 331 2312-2330 AD-53534.1 GUCUUCAGAGUUGUCUUUA UAAAGACAACUCUGAAGAC
332 333 646-664 AD-53535.1 CACUGCAAGCAAAUGCCCU AGGGCAUUUGCUUGCAGUG
334 335 922-940 AD-53536.1 CACUUUUCAGUAUGAUCGU ACGAUCAUACUGAAAAGUG
336 337 1163-1181 AD-53537.1 GGGGCAGGUGGUACUAGAA UUCUAGUACCACCUGCCCC
338 339 1347-1365 AD-53538.1 GGAACCAUGCCUCCAUGAU AUCAUGGAGGCAUGGUUCC
340 341 1964-1982 AD-53539.1 GUCUGUGAUGAACUAAUGA UCAUUAGUUCAU СACAG АС
342 343 2321-2339 AD-53540.1 GUUGUCUUUAUAUGUGAA и AUUCACAUAUAAAGACAAC
344 345 671-689 AD-53541.1 GCAGCACAGAUGAAUCAGA UCUGAUUCAUCUGUGCUGC
346 347 924-942 AD-53542.1 CUUUUCAGUAUGAUCGUUU AAACGAUCAUACUGAAAAG
348 349 1164-1182 AD-53543.1 GGGCAGGUGGUACUAGAAA UUUCUAGUACCACCUGCCC
350 351 1460-1478 AD-53544.1 GUCCCCAAGAUUGUGGCAU AUGCCACAAUCUUGGGGAC
352 353 1976-1994 AD-53545.1 CUAAUGAGCAGACAUAACA UGUUAUGUCUGCUCAUUAG
354 355 786-804 AD-53546.1 GCCCCAGUGUGGUUAGUGU ACACUAACCACACUGGGGC
356 357 935-953 AD-53547.1 GAUCGUUUCUUUGAGAAAA UUUUCUCAAAGAAACGAUC
358 359 1165-1183 AD-53548.1 GGCAGGUGGUACUAGAAAU AUUUCUAGUACCACCUGCC
360 361 1530-1548 AD-53549.1 GUGAUGUGGCCCAUGAGUU AACUCAUGGGCCACAUCAC
362 363 2003-2021 AD-53550.1 CAAGCAAUCAAUUACCCUA UAGGGUAAUUGAUUGCUU G
364 365 788-806 AD-53551.1 CCCAGUGUGGUUAGUGUGA UCACACUAACCACACUGGG
366 367 974-992 AD-53552.1 GACCACACCU AUCG AG U U U AAACUCGAUAGGUGUGGUC
368 369 1191-1209 AD-53553.1 GAACUAGUAAAUUCCAUGU ACAUGGAAUUUACUAGUUC
370 371 1541-1559 AD-53554.1 CAUGAGUUUGGAGCAAUCA UGAUUGCUCCAAACUCAUG
372 373 2075-2093 AD-53555.1 CCCCAGAUGAUGAACUACU AGUAGUUCAUCAUCUGGGG
374 375 360-378 AD-53561.1 GCCCAUUCUUAUCCCGAGU ACUCGGGAUAAGAAUGGGC
376 377 1356-1374 AD-53567.1 CCUCCAUGAUCCAAGGGAU AUCCCUUGGAUCAUGGAGG
378 379 1631-1649 AD-53573.1 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
380 381 1634-1652 AD-53579.1 AUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAU
Пример 3. In vitro скрининг дуплексов siRNA ALAS1 в отношении нокдауна активности ALAS1.
Дуплексы siRNA ALAS1 подвергали скринингу в отношении способности снижать экспрессию ALAS1 in vitro.
In vitro скрининг
Клеточная культура и трансфекции
Клетки Нер3В (АТСС, Манассас, Вирджиния) выращивали практически до слияния при 37°С в атмосфере 5% СО2 в MEM (АТСС), дополненной 10% FBS, до отделения от чашки Петри путем обработки трипсином. Трансфекцию выполняли путем добавления 14,8 мкл Opti-MEM с 0,2 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по кат. 13778-150) к 5 мкл дуплексов siRNA на лунку в 96-луночном планшете и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. 80 мкл
106 036477 полных питательных сред, содержащих ~2х104 клеток НерЗВ, затем добавляли к смеси siRNA. Клетки инкубировали в течение либо 24 либо 120 ч перед очисткой РНК. Эксперименты с использованием разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 10 нМ и 0,1 нМ, а эксперименты в отношении зависимости эффекта от дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 10, 1,67, 0,27, 0,046,
0,0077, 0,0013, 0,00021, 0,00004 нМ.
Выделение общей РНК с использованием набора DYNABEADS mRNA Isolation Kit (Invitrogen, № по кат. 610-12)
Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем смешивали в течение 5 мин при 850 об./мин с помощью Eppendorf Thermomixer (скорость смешивания была одинаковой на протяжении процесса). Десять микролитров магнитных гранул и 80 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера добавляли в круглодонный планшет и смешивали в течение 1 мин. Магнитные гранулы фиксировали при помощи магнитного стенда и супернатант удаляли без смещения гранул. После удаления супернатанта лизированные клетки добавляли к оставшимся гранулам и смешивали в течение 5 мин. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и смешивали в течение 1 мин. Гранулы опять фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл промывочного буфера В, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл элюирующего буфера, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулам давали возможность высохнуть в течение 2 мин. После высыхания добавляли 50 мкл элюирующего буфера и смешивали в течение 5 мин при 70°С. Гранулы фиксировали на магните на 5 мин. Удаляли 40 мкл супернатанта и добавляли в другой 96-луночный планшет.
Синтез cDNA с использованием набора ABI High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813)
Мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл Н2О на реакцию добавляли в 10 мкл общей РНК. cDNA получали с использованием термоциклера Bio-Rad С-1000 или S-1000 (Hercules, Калифорния) посредством следующих стадий: 25°С 10 мин, 37°С 120 мин, 85°С 5 с, хранение при 4°С.
PCR в режиме реального времени мкл cDNA добавляли к мастер-миксу, содержащему 0,5 мкл зонда TaqMan для GAPDH (Applied Biosystems, № по кат. 4326317Е), 0,5 мкл зонда TaqMan для ALAS1 (Applied Biosystems, № по кат. Hs00167441_m1) и 5 мкл мастер-микса с зондом Lightcycler 480 (Roche, № по кат. 04887301001) на лунку в 384-луночные планшеты (Roche, № по кат. 04887301001). PCR в режиме реального времени выполняли в системе Roche LC480 Real Time PCR system (Roche) с применением ΔΔCt(RQ)-анализа. Каждый дуплекс исследовали при двух независимых трансфекциях с двумя биологическими повторами каждый и каждую трансфекцию оценивали в двух параллельных испытаниях, если не указано иное в итоговых таблицах.
Для вычисления относительного кратного изменения данные в реальном времени анализировали с применением ΔΔCt-способа и нормализовали в соответствии с таковыми анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или имитационными трансфицированными клетками. IC50 вычисляли с применением модели согласования по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали в соответствии с данными для клеток, трансфицированных AD-1955, или наивных клеток в таком же диапазоне доз или в отношении его наиболее низкой дозы.
In vitro нокдаун эндогенной экспрессии ALAS1 дуплексами siRNA ALAS1
В табл. 4 показан нокдаун ALAS1 в клетках Нер3В с помощью модифицированных ALAS1 дуплексов siRNA (см. табл. 2). Сайленсинг выражали в виде доли оставшегося транскрипта РНК относительно отрицательного контроля (с люциферазой) siRNA AD-1955. Данные получали, как описано выше, после трансфекции 10 или 0,1 нМ каждой siRNA. qPCR проводили с использованием зонда TaqMan ALAS1 Hs00167441 m1.
- 107 036477
Таблица 4. Экспрессия ALAS1 в клетках НерЗВ после трансфекции siRNA ALAS1 I ID дуплекса | 10 нМ, | ОД нМ, | 10 нМ, STDEV | ОД нМ, STDEV |
средн. средн.
AD-55078.2 0,7 0,87 0,001 0,089
AD-55084.2 0,08 0,3 0 0,04
AD-55090.2 0,06 0,08 0,002 0,003
AD-55096.2 0,61 0,92 0,171 0,34
AD-55102.2 0,63 0,62 0,005 0,069
AD-551O6.2 0,07 0,08 0,004 0,027
AD-55111.2 0,06 0,23 0,013 0,062
AD-55073.2 0,21 0,4 0,018 0,061
AD-55079.2 0,17 0,43 0,033 0,089
AD-55085.2 0,13 0,21 0,011 0,019
AD-55091.2 0,27 0,55 0,033 0,009
AD-55097.2 0,31 0,38 0,051 0,059
AD-55103.2 0,05 0,11 0,017 0,006
AD-55107.2 0,12 0,24 0,007 0,008
AD-55112.2 0,15 0,2 0,036 0,025
AD-55074.2 0,16 0,45 0,008 0,002
AD-55080.2 0,79 0,99 0,095 0,304
AD-55086.2 0,09 0,22 0,005 0,035
AD-55098.2 0,25 0,51 0,03 0,07
AD-55104.2 0,06 од 0,017 0,001
AD-55108.2 0,47 0,65 0,03 0,015
AD-55113.2 0,38 0,62 0,068 0,039
AD-55075.2 0,12 0,28 0,007 0,051
AD-55081.2 0,21 0,51 0,036 0,066
AD-55087.2 од 0,19 0,017 0,02
AD-55093.2 0,24 0,56 0,029 0,053
AD-55099.2 0,05 0,18 0,001 0,038
AD-53573.3 0,67 1,07 0,16 0,153
AD-55109.2 0,07 0,23 0,006 0,052
AD-55114.2 0,08 0,16 0,004 0,017
AD-55076.2 0,05 0,14 0,007 0,035
AD-55082.2 0,08 0,3 0,019 0,016
AD-55088.2 0,06 0,12 0,008 0,02
AD-55094.2 0,06 0,18 0,005 0,023
AD-55100.2 0,45 0,83 0,02 0,05
AD-55105.2 0,02 0,05 0,005 0,004
AD-55110.2 0,15 0,19 0,031 0,016
AD-55115.2 0,35 0,58 0,045 0,052
- 108 036477
AD-55077.2 0,14 0,14 0,006 0,019
AD-55083.2 0,56 0,98 0,24 0,188
AD-55089.2 0,62 0,79 0,036 0,094
AD-55095.2 0,59 0,92 0,12 0,079
AD-55101.2 0,71 0,97 0,074 0,097
AD-1955 1,00 1,01 0,03 0,04
AD-53511.1 0,84 1,08 0,028 0,0515
AD-53512.1 0,15 0,65 0,062 0,023
AD-53513.1 0,34 0,86 0,055 0,011
AD-53514.1 0,12 0,61 0,003 0,008
AD-53515.1 0,25 0,66 0,005 0,004
AD-53516.1 1,05 1,02 0,032 0,011
AD-53517.1 0,145 0,725 0,025 0,0155
AD-53518.1 0,72 0,85 0,045 0,028
AD-53519.1 0,18 0,66 0,061 0,004
AD-53520.1 0,18 0,9 0,041 0,001
AD-53521.1 0,97 1,07 0,01 0,003
AD-53522.1 0,87 1,1 0,065 0,112
AD-53523.1 0,48 0,96 0,0305 0,0255
AD-53524.1 0,11 0,66 0,02 0,006
AD-53525.1 0,71 1,03 0,016 0,01
AD-53526.1 0,23 0,85 0,075 0,01
AD-53527.1 0,25 0,83 0,015 0,017
AD-53528.1 0,44 0,93 0,037 0,006
AD-53529.1 0,185 0,73 0,015 0,014
AD-53530.1 0,1 0,62 0,02 0,003
AD-53531.1 0,48 0,93 0,019 0,045
AD-53532.1 0,06 0,17 0 0,003
AD-53533.1 0,36 0,93 0,025 0,034
AD-53534.1 0,1 0,36 0,014 0,012
AD-53535.1 0,58 1,05 0,036 0,071
AD-53536.1 0,12 0,45 0,009 0,026
AD-53537.1 0,73 0,96 0,101 0,015
AD-53538.1 0,74 1,07 0 0,046
AD-53539.1 0,52 0,97 0,057 0,032
AD-53540.1 0,1 0,47 0,017 0,012
AD-53541.1 0,11 0,29 0,026 0,015
AD-53542.1 0,08 0,23 0,008 0,006
AD-53543.1 0,62 1,01 0,027 0,014
AD-53544.1 0,8 1,04 0,002 0,001
AD-53545.1 0,17 0,73 0,007 0,007
AD-53546.1 0,27 0,93 0,058 0,019
AD-53547.1 0,12 0,28 0,008 0,01
AD-53548.1 0,1 0,34 0,022 0,002
AD-53549.1 0,8 1,04 0,011 0,026
AD-5355O.1 0,05 0,54 0,02 0,003
AD-53551.1 0,96 1,16 0,029 0,044
AD-53552.1 0,13 0,5 0,002 0,009
AD-53553.1 0,92 1,1 0,027 0,02
AD-53554.1 0,76 0,67 0,005 0,004
AD-53555.1 0,11 0,53 0,009 0,007
AD-53561.1 0,72 0,94 0,014 0,001
AD-53567.1 0,16 0,66 0,019 0,003
AD-53573.1 1,06 1,10 0,019 0,037
AD-53579.1 0,19 0,76 0,036 0,019
IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS1 в in vitro скрининге
В табл. 5 показаны IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS1, определенные в результате нокдауна эндогенно экспрессируемой ALAS1 в клеточной линии Нер3В с помощью модифицированных ALAS1 дуплексов siRNA (см. табл. 2). Данные были получены, как описано выше, через 24 или 120 ч после трансфекции каждого дуплекса siRNA. В этом примере сайленсинг ALAS1 выражают в виде доли оставшегося транскрипта mRNA относительно siRNA AD-1955, нецелевой siRNA, которую использовали в качестве отрицательного контроля. Данные из повторных экспериментов по трансфекции использовали
- 109 036477 для приведения в соответствие одиночной линии для определения IC50. Несколько из дуплексов (например, AD-53541.1, AD-53542.1 и AD-53547.1) характеризовались IC50 до приблизительно 0,03 нМ через 24 ч. Многие дуплексы характеризовались IC50 до 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53536.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53548.1, AD-53550.1, AD-53552.1) через 24 часа, и некоторые из них также характеризовались IC50 ДО 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD53542.1, AD-53547.1, AD-53552.1) через 120 ч.
Таблица 5. IC50 выбранных дуплексов siRNA ALAS1, нормализованных относительно AD-1955
1С50(нМ)
ID дуплекса 24 часа 120 часов
AD-53534.1 0,045 0,076
AD-53536.1 0,049 0,105
AD-53540.1 0,054 0,077
AD-53541.1 0,032 0,062
AD-53542.1 0,028 0,093
AD-53547.1 0,03 0,062
AD-53548.1 0,044 0,101
AD-53550.1 0,085 0,152
AD-53552.1 0,077 0,063
AD-53567.1 0,219 0,357
AD-53579.1 0,217 0,566
Пример 4. In vivo сайленсинг с применением siRNA ALAS1 мыши/крысы, находящейся в составе в виде LNP
Последовательности модифицированных дуплексов AD-53558 показаны ниже в табл. 6.
Таблица 6. Последовательности дуплекса siRNA ALAS1 AD-53558.4
SEQID NO: (смысловая) SEQID NO: (антисмысловая) Исходное положение на транскрипте NM_ 020559.2 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
383 384 1184 AD-53558 cuGuGAAAuuu AcucuGAudTsdT AUcAGAGuAAA UUUcAcAGdTsdT
Данный дуплекс помещали в состав в виде состава LNP11 (см. табл.10 выше). siRNA AD-53558, находящуюся в составе LNP, исследовали in vivo у мышей (N=25 животных; 5 животных на группу) и крыс (N=20 животных; 4 животных на группу) и было доказано, что она in vivo подвергает сайленсингу mRNA ALAS1. Результаты показаны на фиг. 5 и фиг. 6.
На фиг. 5 показано, что у мышей siRNA характеризовалась эффектом доза-ответ. Экспрессия mRNA ALAS1 (mALAS1) мыши снижалась приблизительно на 78%, когда siRNA вводили в количестве 1 мг/кг; mRNA ALAS1 мыши снижалась приблизительно на 60%, когда siRNA вводили в количестве 0,3 мг/кг и mRNA ALAS1 мыши снижалась приблизительно на 49%, когда siRNA вводили в количестве 0,1 мг/кг. Эти снижения выражали относительно контроля PBS. Также использовали контроль AD-1955 LUC, как показано на фиг. 5.
Аналогично, на фиг. 6 показано, что у крыс siRNA характеризовалась эффектом доза-ответ. Экспрессия mRNA ALAS1 крысы снижалась приблизительно на 70%, когда siRNA вводили в количестве 1 мг/кг; mRNA ALAS1 снижалась приблизительно на 62%, когда siRNA вводили в количестве 0,3 мг/кг, и mRNA ALAS1 снижалась приблизительно на 34%, когда siRNA вводили в количестве 0,1 мг/кг.
Также исследовали длительность сайленсинга у мышей (N=15; 3 животных на временную точку). Результаты показаны на фиг. 7, на которой показано, что AD-53558 подавлял mRNA mALAS1 приблизительно на 80% в течение по меньшей мере 9 дней. Подавление по меньшей мере на 50% сохранялось по меньшей мере в течение 14 дней.
Пример 5. Эффективность siRNA ALAS1 на мышиной модели AIP
Эффекты состава LNP11 с AD-53558 (siRNA ALAS1 мыши/крысы, описанная в предыдущем примере) исследовали на мышиной модели AIP. PBGD нокаут является нежизнеспособным (-/-, 0% активности). Гетерозиготные PBGD нокаутированные мыши (+/-, ~50% активности) способны иметь, но не имеют полный биохимический фенотип и, таким образом, не повторяют фенотип заболевания человека. В связи с этим была разработана мышиная модель AIP, которая представляет собой сложную гетерозиготу с аллелями Т1/Т2, включая нарушение промотора Т1 (+/-) и изменение сайта сплайсинга Т2 (-/-). Было показано, что эти мыши характеризуются остаточной активностью PBGD в печени, которая составляет приблизительно ~30% от уровня дикого типа и нормальными или незначительно повышенными исходными уровнями ALA и PBG в плазме. Было обнаружено, что мыши имеют нормальный вид в ранний период жизни, а с возрастом становятся несколько более вялыми и атаксичными. При медико
- 110 036477 патологическом исследовании было отмечено, что к возрасту шести месяцев у мышей развивались нарушенная координация движений и мышечная работа, а также дегенерация аксонов. Исследование патологии мышиной модели показало дегенерацию аксонов, нарушенную координацию движений и мышечную работу у более старых мышей. Было обнаружено, что уровни ALA и PBG в моче и плазме заметно повышаются при последовательном интраперитонеальном введении фенобарбитала (см. Lindberg et al., (1996), Nature Genetics, 12:195-219 и Lindberg et al., (1999), Journal of Clinical Investigation, 103:1127-34). Мышей восстанавливали при помощи AAV-опосредованной экспрессии PBGD в печени (Yasuda et al. (2010), Molecular Medicine, 1:17-22 и Unzu et al. (2011), Molecular Medicine, 2:243-50).
Ha 1 день мышам вводили 1 мг/кг siRNA ALAS1 (n=5) или контрольного LUC AD-1955 (n=3) путем внутривенной инъекции. Вводили три инъекции фенобарбитала (1 инъекция в сутки на 2, 3 и 4 дни) для индукции ALAS1 в печени и предшественников порфирина, ALA и PBG. Образцы плазмы и ночной мочи собирали на 5 день, а уровни метаболитов измеряли при помощи LC-MS. Уровни метаболитов измеряли в плазме при помощи LC-MS и также измеряли в моче. Исходные уровни метаболитов измеряли перед первой обработкой на 1 день. Результаты показаны на фиг. 8-12 и в табл.12 и 13.
На фиг. 8 и 9 показаны уровни ALA в плазме в мкМ. Исходные уровни ALA были низкими (n=4), а обработка фенобарбиталом индуцировала значимые повышения уровней ALA в плазме у контрольных животных, обработанных siRNA LUC (n=3). Обработка siRNA ALAS1 ингибировала индукцию ALA в плазме (n=5), как показано на фиг. 8. siRNA ALAS1 была неизменно эффективной при блокировании индукции ALA в плазме у каждого из отдельных изученных животных (см. фиг. 9). Данные результаты указывают на то, что обработка siRNA ALAS1 была эффективной в предупреждении повышений уровня ALA в плазме, связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели AIP.
На фиг. 10 и 11 показаны уровни PBG в плазме в мкМ. Исходные уровни PBG были низкими (n=4), а обработка фенобарбиталом индуцировала значимые повышения уровней PBG у контрольных животных, обработанных siRNA LUC (n=3). Обработка siRNA ALAS1 ингибировала индукцию PBG в плазме (n=5), как показано на фиг. 10. siRNA ALAS1 была неизменно эффективной при блокировании индукции PBG в плазме у каждого из отдельных изученных животных (см. фиг. 11). Данные результаты указывают на то, что обработка siRNA ALAS1 была эффективной в предупреждении повышений уровня PBG в плазме, связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели AIP.
В табл. 12 и 13 показаны уровни ALA и PBG в моче на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у контрольных животных, обработанных siRNA LUC (n=2) (CTR, которая относится к животному, обработанному PBS буфером, n=1), и животных, обработанных siRNA ALAS1 (n=5).
Таблица 12. Данные по образцам мочи от отдельных животных, показывающие предупреждение индуцированного острого приступа
ID мыши ALA (микро М/л) PBG (микро М/л) Креатинин (мг/дл) ALA (микроМ/мг креатинина) PBG (микроМ/мг креатинина) siRNA РВ
На-17-4-6 29,7 7,9 Исходный уровень -
На-19-5-4/2 15,7 5,1 Исходный уровень -
На-20-394/3 28,6 6,7 Исходный уровень -
На-20-38-4 21,4 4,7 Исходный уровень -
На-21-33-4 934,92 483,71 0,4205 222,33 115,03 Luc +
На-21-36-9 944,08 563,53 0,5055 186,76 111,48 Luc +
На-21-18-8 32,88 8,69 0,133 24,72 6,53 ALAS1; 1 мг/кг +
На-21-33-7 83,07 23,28 0,426 19,50 5,46 ALAS1; 1 мг/кг +
На-21-34-5 59,15 18,41 0,263 22,49 7,00 ALAS1; 1 мг/кг +
РВ означает фенобарбитал. А + указывает, что вводили фенобарбитал.
Таблица 13. Средние данные по образцам мочи
Состояние Среднее значение ALA (микроМ/мг креатинина) Среднее значение PBG (микроМ/мг креатинина)
Исходный уровень AIP 23,8 6,1
Luc-siRNA 204,55 113,26
ALAS1-siRNA 22,24 6,33
Обработка фенобарбиталом индуцировала сильные повышения (~25-30-кратные повышения) ALA (~9-кратное по сравнению с исходными уровнями) и PBG (~ 19-кратное по сравнению с исходными уровнями) в моче у мышей, обработанных siRNA LUC, т.е. контроле, в то время как такие повышения не наблюдались у животных, обработанных siRNA ALAS1. Таким образом, siRNA ALAS1 блокировала индуцированные фенобарбиталом повышения уровней ALA и PBG в моче. Данные результаты согласуются с измерениями в плазме и показывают, что обработка siRNA ALAS1 была эффективной в предупреждении
- 111 036477 повышений уровней метаболитов в моче (ALA и PBG), связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели AIP.
В дополнительных экспериментах (фиг. 12) было обнаружено, что обработка фенобарбиталом индуцировала большие повышения (~25-кратные) экспрессии mRNA ALAS1 в печени в мышиной модели. Введение siRNA ALAS1 полностью блокировало эту индукцию mRNA ALAS1. Данные результаты представляют дополнительное доказательство того, что siRNA ALAS1 является эффективной в животной модели AIP.
В обобщенном смысле из результатов, представленных в этом примере, видно, что siRNA ALAS1 является эффективной в лечении острых приступов в животной модели острой печеночной порфирии, AIP. Измерения нескольких результатов подтверждают это заключение, в том числе уровни ALA в плазме, уровни PBG в плазме, уровни ALA в моче, уровни PBG в моче и уровни экспрессии mRNA ALAS1 в печени.
Пример 6. In vivo сайленсинг при помощи конъюгированных с GalNAc siRNA ALAS1 мыши
В экспериментах, описанных в этом примере, исследовали in vivo эффективность трех конъюгированных с GalNAc siRNA (см. табл.7). Эти siRNA конструировали и получали при помощи способов, таких как описанные в примере 2.
Таблица 7. Последовательности AD-57929
SEQID NO: (смысл овая) SEQIDNO: (антисмыс ловая) Положение смысловой последователь Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') Положение антисмысловой последовательности на транскрипте
ности на транскрипте NM_ 020559.2 NM_ 020559.2
385 386 775-795 AD-56211 AfaGfuCfuGfuUfUfCfc AfcUfuUfuCfaAfL96 uUfgAfaAfaGfuGfgaa AfcAfgAfcUfusUfsg 773-795
387 388 2168-2188 AD-56173 AfcAfuAfgUfaGfCfCfa GfaAfuUfgUfcUfL96 aGfaCfaAfuUfcUfggc UfaCfuAfuGfusGfsg 2166-2188
389 390 775-795 AD-57929 AfsasGfuCfuGfuUfUfC fcAfcUfuUfuCfaAfL96 usUfsgAfaAfaGfuGfga aAfcAfgAfcUfususg 773-795
Мышей (n=40; n=4 на экспериментальное условие) разделяли на группы, которые получали PBS или дозы по 3 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг siRNA, вводимые подкожно. Уровень mRNA mALAS1/mGAPDH относительно контроля PBS определяли в клетках печени через 72 часа после введения. Результаты показаны на фиг. 13. Наблюдался нечеткий эффект доза-ответ для siRNA AD-56211 и AD56173. В отличие от этого, siRNA ALAS1 AD-57929 проявил эффект доза-ответ при ингибировании экспрессии mALAS1. По данным результатам видно, что конъюгат GalNAc с ALAS1 был эффективным при ингибировании экспрессии mRNA ALAS1 in vivo и проявлял эффект доза-ответ.
Пример 7. siRNA человека
Дополнительные siRNA человека конструировали и получали, как описано в примере 2. Лучшие 45 siRNA отбирали на основании их прогнозируемой эффективности. Последовательности из этих 45 siRNA представлены в табл. 8 и при этом прилагается перечень последовательностей (например, смысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с нечетным номером, идентифицированных под SEQ ID NO: 391-551, и антисмысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с четным номером, идентифицированных под SEQ ID NO: 392-552 соответственно). Табл. 8 раскрыта в международной публикации № WO 2013/155204A2. Содержимое WO 2013/155204 и перечень последовательностей, в том числе таблица 8, явным образом включены при помощи ссылки.
Пример 8. siRNA человека
Получали дополнительные siRNA человека из 19 нуклеотидов. Последовательности из этих siRNA представлены в табл. 9 и при этом прилагается перечень последовательностей (например, смысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с нечетным номером, идентифицированных под SEQ ID NO: 553-3365, и антисмысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с четным номером, идентифицированных под SEQ ID NO: 554-3366 соответственно). Табл. 9 раскрыта в международной публикации № WO 2013/155204A2. Содержимое WO 2013/155204 и перечень последовательностей, в том числе табл. 9, явным образом включены при помощи ссылки. Эти siRNA можно исследовать в отношении эффективности с помощью способов, описанных в данном документе, и/или способов, известных из уровня техники.
Пример 9. Подавление предшественников порфиринов при помощи siRNA ALAS1 при парадигме неотложного лечения
Мышиную модель AIP (см. пример 5) использовали для исследования того, будет ли siRNA ALAS1 функционировать в качестве парадигмы неотложного лечения для снижения уже повышенных уровней
- 112 036477
ALA и PBG, которые бы присутствовали, например, когда пациент-человек с порфирией испытывает острый приступ. Введение siRNA состава LNP11 с AD-53558 в количестве 1 мг/кг через 12 ч после последней дозы фенобарбитала быстро снижало уровни как ALA, так и PBG в плазме мышей, в то время как у контрольных животных, обработанных Luc, уровни продолжали расти (фиг. 14). Эти результаты указывали на то, что siRNA ALAS является эффективной для лечения острого приступа. siRNA ALAS1 была эффективной для снижения и предупреждения дальнейших повышений уровней ALA и PBG.
Как можно видеть на фиг. 14, siRNA ALAS характеризовалась быстрым началом действия в снижении уровней ALA и PBG. Начало действия происходило в течение нескольких часов после введения siRNA. Эффект на уровень ALA в плазме мог наблюдаться в течение 4 ч после введения siRNA (см. фиг. 14; siRNA вводили через 12 ч после последней дозы фенобарбитала, а снижение уровня ALA в плазме относительно контроля можно было наблюдать через 16 ч после последней дозы фенобарбитала). Эффект на уровень PBG в плазме мог наблюдаться в течение 8 ч после введения siRNA (см. фиг. 14; siRNA вводили через 12 ч после последней дозы фенобарбитала, а снижение уровня ALA в плазме относительно контроля можно было наблюдать через 20 ч после последней дозы фенобарбитала).
Пример 10. siRNA, которые нацелены на ALAS1
Конструировали дополнительные немодифицированные и модифицированные последовательности siRNA, которые нацеливают siRNA ALAS1, и получали их, как описано в примере 2. Активность in vitro модифицированных дуплексов исследовали, как описано ниже.
Способы Опосредованная липидами трансфекция
Для Нер3В, РМН и первичных гепатоцитов Cynomolgus трансфекцию выполняли путем добавления 14,8 мкл Opti-MEM с 0,2 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по кат. 13778-150) к 5 мкл каждого дуплекса siRNA в отдельной лунке в 96-луночном планшете. Смесь затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Восемьдесят мкл полных питательных сред без антибиотика, содержащих соответствующее число клеток, затем добавляли к смеси siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК.
Эксперименты в отношении разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса, модифицированного GalNAc, 1 мкМ, 500, 20, 10 и 0,2 нМ.
Трансфекция посредством свободного поглощения
Криоконсервированные первичные гепатоциты Cynomolgus (Celsis In Vitro Technologies, M003055P) размораживали на водяной бане при 37°С непосредственно перед использованием и ресуспендировали в количестве 0,26x106 клеток/мл в среде InVitroGRO СР (с покрытием) (Celsis In Vitro Technologies, № по кат. Z99029). Во время трансфекций клетки помещали в 96-луночный планшет с коллагеном BD BioCoat (BD, 356407) по 25000 клеток на лунку и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. Эксперименты по свободному поглощению выполняли путем добавления 10 мкл дуплексов siRNA в PBS на лунку в 96луночном (96w) планшете. Девяносто мкл полных питательных сред, содержащих соответствующее число клеток для типа клеток, затем добавляли к siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК. Эксперименты в отношении разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 1 мкМ, 500, 20 и 10 нМ.
Выделение общей РНК с использованием набора DYNABEADS mRNA Isolation Kit (Invitrogen, № no кат. 610-12)
Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем перемешивали в течение 5 мин при 850 об./мин. с помощью Eppendorf Thermomixer (скорость перемешивания была одинаковой на протяжении процесса). Десять микролитров магнитных гранул и 80 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера добавляли в круглодонный планшет и перемешивали в течение 1 мин. Магнитные гранулы фиксировали при помощи магнитного стенда и супернатант удаляли без смещения гранул. После удаления супернатанта лизированные клетки добавляли к оставшимся гранулам и перемешивали в течение 5 мин. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и перемешивали в течение 1 мин. Гранулы снова фиксировали, а супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл промывочного буфера В, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл элюирующего буфера, фиксировали и супернатант удаляли. В конце гранулы оставляли высыхать в течение 2 мин. После высыхания добавляли 50 мкл элюирующего буфера и смешивали в течение 5 мин при 70°С. Гранулы фиксировали на магните на 5 мин. Удаляли сорок пять мкл супернатанта и добавляли в другой 96-луночный планшет.
Синтез cDNA с использованием набора ABI High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813)
Получали мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл Н2О на реакцию. Равные объемы мастермикса и РНК смешивали для конечного объема в 12 мкл для in vitro отслеживаемых образцов или 20 мкл для in vivo отслеживаемых образцов. cDNA получали с использованием термоциклера Bio-Rad С-1000 или S-1000 (Hercules, Калифорния) посредством следующих стадий: 25°С 10 мин, 37°С 120 мин, 85°С 5 с
- 113 036477 и хранение при 4°С.
PCR в режиме реального времени
Два мкл cDNA добавляли к мастер-миксу, содержащему 2 мкл Н2О, 0,5 мкл зонда TaqMan GAPDH (Life Technologies, № по кат. 4326317Е для клеток Нер3В, № по кат. 352339Е для первичных гепатоцитов мыши или сделанный по индивидуальному заказу зонд для первичных гепатоцитов макак-крабоедов), 0,5 мкл зонда TaqMan C5 (Life Technologies, № по кат. Hs00167441_ml для клеток Нер3В или Mm00457879_m1 для первичных гепатоцитов мыши или сделанный по индивидуальному заказу зонд для первичных гепатоцитов макак-крабоедов) и 5 мкл мастер-микса с зондом Lightcycler 480 (Roche, № по кат. 04887301001) на лунку в 384-луночных (384 w) планшетах (Roche, № по кат. 04887301001). PCR в режиме реального времени выполняли в системе Roche LC480 Real Time PCR system (Roche) с применением ΔΔCt(RQ)-анализа. Для in vitro скрининга каждый дуплекс исследовали с двумя биологическими повторами, если не указано иное, и каждую PCR в реальном времени выполняли с двойными техническими повторами. Для in vivo скрининга каждый дуплекс исследовали в одном или нескольких экспериментах (3 мыши на группу) и каждую PCR в реальном времени выполняли с двойными техническими повторами.
Для вычисления относительного кратного изменения уровней mRNA ALAS1 данные в реальном времени анализировали с применением ΔΔCt-способа и нормализовали в соответствии с таковыми анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или имитационными трансфицированными клетками. IC50 рассчитывали с применением модели согласования по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали в соответствии с данными для клеток, трансфицированных AD-1955, в таком же диапазоне доз или в отношении его наиболее низкой дозы.
Смысловая и антисмысловая последовательности AD-1955 являются такими, которые приведены ниже.
Смысловая: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 3682);
Антисмысловая: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 3683).
Последовательности одиночных нитей и дуплексов модифицированных и немодифицированных siRNA представлены в табл. 14 и 5 соответственно.
- 114 036477
Таблица 14. Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов
ALAS1 человека
SEQID NO: (смысл овая) SEQ ID NO: (анти смыс лова я) Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') Целевые сайты антисмысло вой последовате льности NM_ 0006SS.4
3371 3372 AD-58848 CfsasUfgCfcAfaAfAfAfuGfgAfcAfu CfaUfL96 asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgCfaUf gsAfsc 1635-1657
3373 3374 AD-58849 AfsusUfuUfgAfaGfUfGfaUfgAfgUf gAfaAfL96 usUfsuCfaCfuCfaUfcacUfuCfaAfaAfu sGfsc 2189-2211
3375 3376 AD-58850 Af sgs U f u Af u Af u U f Af Af a UfuUfuAf aUfcUfL96 asGfsaUfuAfaAfaUfuuaAfuAfuAfaCf usUfsa 2344-2366
3377 3378 AD-58851 GfscsAfuUfuUfgAfAfGfuGfaUfgAf gUfgAfL96 us Cfs a Cf u Cf a U f c Af c u u Cf a Af a Af u G f c sAfsg 2187-2209
3379 3380 AD-58852 GfsasAfcUfaAfuGfAfGfcAfgAfcAfu AfaCfL96 gsUfsuAfuGfuCfuGfcucAfuUfaGfuUf csAfsu 1975-1997
3381 3382 AD-58853 AfsasUfgAfcCfaCfAfCfcUfaUfcGfa GfuUfL96 asAfscUfcGfaUfaGfgugUfgGfuCfaUf usCfsu 973-995
3383 3384 AD-58854 UfsasAfaUfuUfuAfAfUfcUfaUfaGf uAfaAfL96 usUfsuAfcUfaUfaGfauuAfaAfaUfuUf asAfsu 2352-2374
3385 3386 AD-58855 UfsusCfaGfuAfuGfAfUfcGfuUfuCf uUfuGfL96 csAfsaAfgAfaAfcGfaucAfuAfcUfgAfa sAfsa 929-951
3387 3388 AD-58856 CfsasCfuUfuUfcAfGfUfaUfgAfuCf gUfuUfL96 asAfsaCfgAfuCfaUfacuGfaAfaAfgUfg sGfsa 924-946
3389 3390 AD-58857 AfsasAfuCfuGfuUfUfCfcAfcUfuUf uCfaGfL96 csUfsgAfaAfaGfuGfgaaAfcAfgAfuUf usUfsg 913-935
3391 3392 AD-58858 CfsasUfuUfgAfaAfCfUfgUfcCfaUf uCfaAfL96 usUfsgAfaUfgGfaCfaguUfuCfaAfaUf gsCfsc 1478-1500
3393 3394 AD-58859 CfscsUfaUfcGfaGfUfUfuUfuAfaAf aCfuGfL96 csAfsgUfuUfuAfaAfaacUfcGfaUfaGf gsUfsg 983-1005
3395 3396 AD-58861 GfsasCfcAfgAfaAfGfAfgUfgUfcUfc AfuCfL96 gsAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfuGfgUf csUfsu 872-894
3397 3398 AD-58862 AfscsCfaGfaAfaGfAfGfuGfuCfuCfa UfcUfL96 asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcUfgGf usCfsu 873-895
3399 3400 AD-58863 AfscsUfaAfuGfaGfCfAfgAfcAfuAfa CfaUfL96 asUfsgUfuAfuGfuCfugcUfcAfuUfaGf usUfsc 1977-1999
3401 3402 AD-58864 UfsasGfuAfaAfaAfCfAfuAfgUfcCfu GfgAfL96 usCfscAfgGfaCfuAfuguUfuUfuAfcUf asUfsa 2366-2388
3403 3404 AD-58865 UfsasUfuUfcUfgGfAfAfcUfaGfuAf aAfuUfL96 asAfsuUfuAfcUfaGfuucCfaGfaAfaUf asUfsu 1185-1207
3405 3406 AD-58867 U fs us Cf u G f c Af a Af G f Cf c Afg U f c U f u GfaGfL96 csUfscAfaGfaCfuGfgcuUfuGfcAfgAfa sGfsa 706-728
3407 3408 AD-58868 GfsasGfgAfaAfgAfGfGfuUfgCfuGf aAfaCfL96 gs U fs u U f c AfgCf a Af cc u Cf u U f u Cf c U f c sAfsc 759-781
- 115 036477
3409 3410 AD-58869 GfsgsUfaCfuAfgAfAfAfuAfuUfuCf uGfgAfL96 usCfscAfgAfaAfuAfuuuCfuAfgUfaCfc sAfsc 1174-1196
3411 3412 AD-58870 GfsasCfaUfcAfuGfCfAfaAfaGfcAfa AfgAfL96 usCfsuUfuGfcUfuUfugcAfuGfaUfgUf csCfsu 853-875
3413 3414 AD-58871 AfsasAfuUfuUfaAfUfCfuAfuAfgUf aAfaAfL96 usUfsuUfaCfuAfuAfgauUfaAfaAfuUf usAfsa 2353-2375
3415 3416 AD-58873 Cfs a s U f gAf u Cf c Af Af Gf gGf a U f u Cfg AfaAfL96 usUfsuCfgAfaUfcCfcuuGfgAfuCfaUf gsGfsa 1362-1384
3417 3418 AD-58874 Af sgs Af cCf a G f a AfAf G f a G f u G f u Cf uCfaUfL96 a s U f sg Af g Af c Af c UfcuuUfcUfgGfuCf usUfsu 871-893
3419 3420 AD-58875 Af s u sCf c U fg Af a G fAf G f cG f c U f g Afg GfgAfL96 usCfscCfuCfaGfcGfcucUfuCfaGfgAfu sCfsc 1810-1832
3421 3422 AD-58876 GfsusCfuGfuGfaUfGfAfaCfuAfaUf gAfgCfL96 gsCfsuCfaUfuAfgUfucaUfcAfcAfgAfc sUfsu 1966-1988
3423 3424 AD-58877 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfuCfL96 gsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sGfsu 875-897
3425 3426 AD-58878 AfscsUfuUfuCfaGfUfAfuGfaUfcGf uUfuCfL96 gsAfsaAfcGfaUfcAfuacUfgAfaAfaGfu sGfsg 925-947
3427 3428 AD-58879 UfscsAfuGfcCfaAfAfAfaUfgGfaCfa UfcAfL96 usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcAfuGf asCfsu 1634-1656
3429 3430 AD-58880 AfsasUfaUfuUfcUfGfGfaAfcUfaGf uAfaAfL96 usUfsuAfcUfaGfuUfccaGfaAfaUfaUf usUfsc 1183-1205
3431 3432 AD-58881 CfsusUfcUfuCfaAfGfAfuAfaCfuUf gCfcAfL96 usGfsgCfaAfgUfuAfucuUfgAfaGfaAf gsAfsu 892-914
3433 3434 AD-58882 UfsusUfcAfgUfaUfGfAfuCfgUfuUf cUfuUfL96 a s Afs a Gf a Af a Cfg Af u ca U f a Cf u G f a Af a sAfsg 928-950
3435 3436 AD-58883 CfscsCfaGfuGfuGfGfUfuAfgUfgUf gAfaAfL96 us U fs u Cf a Cf a Cf u Af a cc Af c Af c U fgG fg sGfsc 790-812
3437 3438 AD-58884 GfscsUfgUfgAfgAfUfUfuAfcUfcUf gAfuUfL96 asAfsuCfaGfaGfuAfaauCfuCfaCfaGfc sCfsu 1325-1347
3439 3440 AD-58885 AfsgsGfcUfuGfaGfCfAfaGfuUfgGf uAfuCfL96 gsAfsuAfcCfaAfcUfugcUfcAfaGfcCfu sGfsa 2229-2251
3441 3442 AD-58886 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf uCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc sUfsg 877-899
3443 3444 AD-58887 AfsusUfuCfu Gf g Af Af Cf u Afg U f a Af aUfuCfL96 gsAfsaUfuUfaCfuAfguuCfcAfgAfaAf us Afs u 1186-1208
3445 3446 AD-58888 UfsgsUfgAfuGfuGfGfCfcCfaUfgAf gUfuUfL96 asAfsa Cf u Cfa UfgGfgccAfcAf u Cfa Cfa sCfsa 1531-1553
3447 3448 AD-58889 AfsasGfaGfaGfaAfGfUfcCfuAfuUf uCfuCfL96 gsAfsgAfaAfuAfgGfacuUfcUfcUfcUf usUfsc 2208-2230
3449 3450 AD-58890 UfsgsGfcAfgCfaCfAfGfaUfgAfaUfc AfgAfL96 usCfsuGfaUfuCfaUfcugUfgCfuGfcCf asGfsg 671-693
3451 3452 AD-58891 AfsusGfaUfcGfuUfUfCfuUfuGfaGf aAfaAfL96 usUfsuUfcUfcAfa Af ga aAfcGfaUfcAf usAfsc 935-957
3453 3454 AD-58892 UfscsUfgGfaAfcUfAfGfuAfaAfuUf cCfaUfL96 asUfsgGfaAfuUfuAfcuaGfuUfcCfaGf asAfsa 1189-1211
3455 3456 AD-59095 GfscsCfcAfuUfcUfUfAfuCfcCfgAfg UfL96 asCfsuCfgGfgAfuAfagaAfuGfgsgsc 360-382
3457 3458 AD-59096 Gfsgs Af a CfcAf u Gf Cf Cf u Cf cAf u Gfa UfL96 asUfscAfuGfgAfgGfcauGfgUfuscsc 1347-1369
3459 3460 AD-59097 UfsgsGfaGfuCfuGfUfGfcGfgAfuCf cUfL96 asGfsgAfuCfcGfcAfcagAfcUfcscsa 1794-1816
3461 3462 AD-59098 CfsasCfcCfaCfgGfGfUfgUfgUfgGfg AfL96 usCfscCfaCfaCfaCfccgUfgGfgsusg 1112-1134
3463 3464 AD-59099 GfsgsAfgUfcUfgUfGfCfgGfaUfcCf uAfL96 usAfsgGfaUfcCfgCfacaGfaCfuscsc 1795-1817
- 116 036477
3465 3466 AD-59100 Cfs a s Af a Af c U f gCf Cf Cf c Af a G f a U fg AfL96 usCfsaUfcUfuGfgGfgcaGfuUfususg 428-450
3467 3468 AD-59101 GfscsCfuCfcAfuGfAfUfcCfaAfgGfg AfL96 usCfscCfuUfgGfaUfcauGfgAfgsgsc 1355-1377
3469 3470 AD-59102 CfsasUfcAfuCfcCfUfGfuGfcGfgGfu UfL96 asAfscCfcGfcAfcAfgggAfuGfasusg 1921-1943
3471 3472 AD-59103 AfscsCfcAfcGfgGfUfGfuGfuGfgGf gAfL96 usCfscCfcAfcAfcAfcccGfuGfgsgsu 1113-1135
3473 3474 AD-59104 CfsasCfaUfcAfuCfCfCfuGfuGfcGfg AfL96 usCfscGfcAfcAfgGfgauGfaUfgsusg 1919-1941
3475 3476 AD-59105 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfL96 asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcsusg 873-895
3477 3478 AD-59106 CfscsUfcCfaUfgAfUfCfcAfaGfgGfa UfL96 asUfscCfcUfuGfgAfucaUfgGfasgsg 1356-1378
3479 3480 AD-59107 UfsgsCfcCfaUfuCfUfUfaUfcCfcGfa AfL96 usUfscGfgGfaUfaAfgaaUfgGfgscsa 359-381
3481 3482 AD-59108 CfsusUfcAfcCfcUfGfGfcUfaAfgAfu AfL96 usAfsuCfuUfaGfcCfaggGfuGfasasg 1297-1319
3483 3484 AD-59109 AfsusCfaUfcCfcUfGfUfgCfgGfgUfu AfL96 usAfsaCfcCfgCfaCfaggGfaUfgsasu 1922-1944
3485 3486 AD-59110 Af sgs Af a Af gAf gU f Gf U f c UfcAfuCfu UfL96 asAfsgAfuGfaGfaCfacuCfuUfuscsu 874-896
3487 3488 AD-59111 CfsusCfcAfuGfaUfCfCfa AfgG fg Af u UfL96 asAfsuCfcCfuUfgGfaucAfuGfgsasg 1357-1379
3489 3490 AD-59112 CfscsAfuUfcUfuAfUfCfcCfgAfgUfc AfL96 usGfsaCfuCfgGfgAfuaaGfaAfusgsg 362-384
3491 3492 AD-59113 CfsasCfcCfuGfgCfUfAfaGfaUfgAfu AfL96 usAfsuCfaUfcUfuAfgccAfgGfgsusg 1300-1322
3493 3494 AD-59114 UfscsAfuCfcCfuGfUfGfcGfgGfuUf gAfL96 usCfsaAfcCfcGfcAfcagGfgAfusgsa 1923-1945
3495 3496 AD-59115 AfsasGfaGfuGfuCfUfCfaUfcUfuCf uUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcsusu 877-899
3497 3498 AD-59116 GfsusCfaUfgCfcAfAfAfaAfuGfgAfc AfL96 usGfsuCfcAfuUfuUfuggCfaUfgsasc 1631-1653
3499 3500 AD-59117 CfsasUfuCfuUfaUfCfCfcGfaGfuCfc AfL96 usGfsgAfcUfcGfgGfauaAfgAfasusg 363-385
3501 3502 AD-59118 AfscsCfcUfgGfcUfAfAfgAfuGfaUfg AfL96 usCfsaUfcAfuCfuUfagcCfaGfgsgsu 1301-1323
3503 3504 AD-59119 CfsusCfuUfcAfcCfCfUfgGfcUfaAfg AfL96 usCfsuUfaGfcCfaGfgguGfaAfgsasg 1295-1317
3505 3506 AD-59120 Af s u s Gf cCf a Af a AfAf U fgG f a Cf a U f c AfL96 usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcsasu 1634-1656
3507 3508 AD-59121 UfsgsCfcCfcAfaGfAfUfgAfuGfgAfa UfL96 asUfsuCfcAfuCfaUfcuuGfgGfgscsa 434-456
3509 3510 AD-59122 GfsasAfcCfa UfgCfCf UfcCfa UfgAf u AfL96 usAfsuCfaUfgGfaGfgcaUfgGfususc 1348-1370
3511 3512 AD-59123 UfscsUfuCfaCfcCfUfGfgCfuAfaGfa UfL96 asUfscUfuAfgCfcAfgggUfgAfasgsa 1296-1318
3513 3514 AD-59124 UfsgsCfcAfaAfaAfUfGfgAfcAfuCfa UfL96 asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgscsa 1635-1657
3515 3516 AD-59125 Cfs cs Afg Af a Af g Af G f U fg U f c U f c Af u AfL96 usAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfusgsg 872-894
3517 3518 AD-59126 GfsasAfaCfuGfuCfCfAfuUfcAfaUfg AfL96 usCfsaUfuGfaAfuGfgacAfgUfususc 1481-1503
3519 3520 AD-59127 UfscsAfcCfcUfgGfCfUfaAfgAfuGfa UfL96 asUfscAfuCfuUfaGfccaGfgGfusgsa 1299-1321
3521 3522 AD-59128 CfscsCfuGfgAfgUfCfUfgUfgCfgGfa UfL96 asUfscCfgCfaCfaGfacuCfcAfgsgsg 1791-1813
3523 3524 AD-59129 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf uAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfususc 875-897
3525 3526 AD-59130 UfsgsGfaGfcCfcUfGfGfaGfuCfuGf uAfL96 us Af sc Af gAf c UfcCfaggGfcUfcscsa 1786-1808
- 117 036477
Таблица 15. Немодифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов
ALAS1 человека
SEQID NO: (смысл овая) SEQ ID NO: (анти смыс лова я) Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') Целевые сайты антисмысло вой последовате льности NM_ 0006SS.4
3684 3527 AD-58848 CAUGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCAUGAC 1635-1657
3528 3529 AD-58849 AUUUUGAAGUGAUGAGUGAAA U U U CACU CAU СACU UCAAAAU G С 2189-2211
3530 3531 AD-58850 AGUUAUAUUAAAUUUUAAUCU AGAUUAAAAUUUAAUAUAACUUA 2344-2366
3532 3533 AD-58851 GCAUUUUGAAGUGAUGAGUGA UCACUCAUCACUUCAAAAUGCAG 2187-2209
3534 3535 AD-58852 GAACUAAUGAGCAGACAUAAC GUUAUGUCUGCUCAUUAGUUCAU 1975-1997
3536 3537 AD-58853 AAUGACCACACCUAUCGAGUU AACUCGAUAGGUGUGGUCAUUCU 973-995
3538 3539 AD-58854 UAAAUUUUAAUCUAUAGUAAA UUUACUAUAGAUUAAAAUUUAAU 2352-2374
3540 3541 AD-58855 UUCAGUAUGAUCGUUUCUUUG CAAAGAAACGAUCAUACUGAAAA 929-951
3542 3543 AD-58856 CACUUUUCAGUAUGAUCGUUU AAACGAUCAUACUGAAAAGUGGA 924-946
3544 3545 AD-58857 AAAUCUGUUUCCACUUUUCAG CUGAAAAGUGGAAACAGAUUUUG 913-935
3546 3547 AD-58858 CAUUUGAAACUGUCCAUUCAA UUGAAUGGACAGUUUCAAAUGCC 1478-1500
3548 3549 AD-58859 CCUAUCGAGUUUUUAAAACUG CAGUUUUAAAAACUCGAUAGGUG 983-1005
3550 3551 AD-58861 GACCAGAAAGAGUGUCUCAUC GAUGAGACACUCUUUCUGGUCUU 872-894
3552 3553 AD-58862 ACCAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUGGUCU 873-895
3554 3555 AD-58863 ACUAAUGAGCAGACAUAACAU AUGUUAUGUCUGCUCAUUAGUUC 1977-1999
3556 3557 AD-58864 UAGUAAAAACAUAGUCCUGGA UCCAGGACUAUGUUUUUACUAUA 2366-2388
3558 3559 AD-58865 UAUUUCUGGAACUAGUAAAUU AAU U UACUAG U UCCAGAAAUAU U 1185-1207
3560 3561 AD-58867 UUCUGCAAAGCCAGUCUUGAG CUCAAGACUGGCUUUGCAGAAGA 706-728
3562 3563 AD-58868 GAGGAAAGAGGUUGCUGAAAC GUUUCAGCAACCUCUUUCCUCAC 759-781
3564 3565 AD-58869 GGUACUAGAAAUAUUUCUGGA UCCAGAAAUAUUUCUAGUACCAC 1174-1196
3566 3567 AD-58870 GACAUCAUGCAAAAGCAAAGA UCUUUGCUUUUGCAUGAUGUCCU 853-875
3568 3569 AD-58871 AAAUUUUAAUCUAUAGUAAAA UUUUACUAUAGAUUAAAAUUUAA 2353-2375
3570 3571 AD-58873 CAUGAUCCAAGGGAUUCGAAA UUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGGA 1362-1384
3572 3573 AD-58874 AGACCAGAAAGAGUGUCUCAU AUGAGACACUCUUUCUGGUCUUU 871-893
3574 3575 AD-58875 AUCCUGAAGAGCGCUGAGGGA UCCCUCAGCGCUCUUCAGGAUCC 1810-1832
3576 3577 AD-58876 GUCUGUGAUGAACUAAUGAGC GCUCAUUAGUUCAUCACAGACUU 1966-1988
3578 3579 AD-58877 CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUC GAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU 875-897
- 118 036477
3580 3581 AD-58878 ACUUUUCAGUAUGAUCGUUUC G AAACGAUCAUACU GAAAAG UG G 925-947
3582 3583 AD-58879 UCAUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAUGACU 1634-1656
3584 3585 AD-58880 AAUAUUUCUGGAACUAGUAAA UUUACUAGUUCCAGAAAUAUUUC 1183-1205
3586 3587 AD-58881 CUUCUUCAAGAUAACUUGCCA UGGCAAGUUAUCUUGAAGAAGAU 892-914
3588 3589 AD-58882 UUUCAGUAUGAUCGUUUCUUU AAAGAAACGAUCAUACUGAAAAG 928-950
3590 3591 AD-58883 CCCAGUGUGGUUAGUGUGAAA UUUCACACUAACCACACUGGGGC 790-812
3592 3593 AD-58884 GCUGUGAGAUUUACUCUGAUU AAUCAGAGUAAAUCUCACAGCCU 1325-1347
3594 3595 AD-58885 AGGCUUGAGCAAGUUGGUAUC GAUACCAACUUGCUCAAGCCUGA 2229-2251
3596 3597 AD-58886 GAAAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUUUCUG 877-899
3598 3599 AD-58887 AUUUCUGGAACUAGUAAAUUC GAAUUUACUAGUUCCAGAAAUAU 1186-1208
3600 3601 AD-58888 UGUGAUGUGGCCCAUGAGUUU AAACUCAUGGGCCACAUCACACA 1531-1553
3602 3603 AD-58889 AAGAGAGAAGUCCUAUUUCUC GAGAAAUAGGACUUCUCUCUUUC 2208-2230
3604 3605 AD-58890 UGGCAGCACAGAUGAAUCAGA UCUGAUUCAUCUGUGCUGCCAGG 671-693
3606 3607 AD-58891 AUGAUCGUUUCUUUGAGAAAA UUUUCUCAAAGAAACGAUCAUAC 935-957
3608 3609 AD-58892 UCUGGAACUAGUAAAUUCCAU AUGGAAUUUACUAGUUCCAGAAA 1189-1211
3610 3611 AD-59095 GCCCAUUCUUAUCCCGAGU ACUCGGGAUAAGAAUGGGC 360-382
3612 3613 AD-59096 GGAACCAUGCCUCCAUGAU AUCAUGGAGGCAUGGUUCC 1347-1369
3614 3615 AD-59097 UGGAGUCUGUGCGGAUCCU AGGAUCCGCACAGACUCCA 1794-1816
3616 3617 AD-59098 CACCCACGGGUGUGUGGGA UCCCACACACCCGUGGGUG 1112-1134
3618 3619 AD-59099 GGAGUCUGUGCGGAUCCUA UAGGAUCCGCACAGACUCC 1795-1817
3620 3621 AD-59100 CAAAACUGCCCCAAGAUGA UCAUCUUGGGGCAGUUUUG 428-450
3622 3623 AD-59101 GCCUCCAUGAUCCAAGGGA UCCCUUGGAUCAUGGAGGC 1355-1377
3624 3625 AD-59102 CAUCAUCCCUGUGCGGGUU AACCCGCACAGGGAUGAUG 1921-1943
3626 3627 AD-59103 ACCCACGGGUGUGUGGGGA UCCCCACACACCCGUGGGU 1113-1135
3628 3629 AD-59104 CACAUCAUCCCUGUGCGGA UCCGCACAGGGAUGAUGUG 1919-1941
3630 3631 AD-59105 CAGAAAGAGUGUCUCAUCU AGAUGAGACACUCUUUCUG 873-895
3632 3633 AD-59106 CCUCCAUGAUCCAAGGGAU AUCCCUUGGAUCAUGGAGG 1356-1378
3634 3635 AD-59107 UGCCCAUUCUUAUCCCGAA UUCGGGAUAAGAAUGGGCA 359-381
3636 3637 AD-59108 CUUCACCCUGGCUAAGAUA UAUCUUAGCCAGGGUGAAG 1297-1319
3638 3639 AD-59109 AUCAUCCCUGUGCGGGUUA UAACCCGCACAGGGAUGAU 1922-1944
3640 3641 AD-59110 AGAAAGAGUGUCUCAUCUU AAGAUGAGACACUCUUUCU 874-896
3642 3643 AD-59111 CUCCAUGAUCCAAGGGAUU AAUCCCUUGGAUCAUGGAG 1357-1379
3644 3645 AD-59112 CCAUUCUUAUCCCGAGUCA UGACUCGGGAUAAGAAUGG 362-384
3646 3647 AD-59113 CACCCUGGCUAAGAUGAUA UAUCAUCUUAGCCAGGGUG 1300-1322
3648 3649 AD-59114 UCAUCCCUGUGCGGGUUGA UCAACCCGCACAGGGAUGA 1923-1945
3650 3651 AD-59115 AAGAGUGUCUCAUCUUCUU AAGAAGAUGAGACACUCUU 877-899
3652 3653 AD-59116 GUCAUGCCAAAAAUGGACA UGUCCAUUUUUGGCAUGAC 1631-1653
3654 3655 AD-59117 CAUUCUUAUCCCGAGUCCA UGGACUCGGGAUAAGAAUG 363-385
3656 3657 AD-59118 ACCCUGGCUAAGAUGAUGA UCAUCAUCUUAGCCAGGGU 1301-1323
3658 3659 AD-59119 CUCUUCACCCUGGCUAAGA UCUUAGCCAGGGUGAAGAG 1295-1317
3660 3661 AD-59120 AUGCCAAAAAUGGACAUCA UGAUGUCCAUUUUUGGCAU 1634-1656
3662 3663 AD-59121 UGCCCCAAGAUGAUGGAAU AUUCCAUCAUCUUGGGGCA 434-456
3664 3665 AD-59122 GAACCAUGCCUCCAUGAUA UAUCAUGGAGGCAUGGUUC 1348-1370
3666 3667 AD-59123 UCUUCACCCUGGCUAAGAU AUCUUAGCCAGGGUGAAGA 1296-1318
3668 3669 AD-59124 UGCCAAAAAUGGACAUCAU AUGAUGUCCAUUUUUGGCA 1635-1657
3670 3671 AD-59125 CCAGAAAGAGUGUCUCAUA UAUGAGACACUCUUUCUGG 872-894
3672 3673 AD-59126 GAAACUGUCCAUUCAAUGA UCAUUGAAUGGACAGUUUC 1481-1503
3674 3675 AD-59127 UCACCCUGGCUAAGAUGAU AUCAUCUUAGCCAGGGUGA 1299-1321
3676 3677 AD-59128 CCCUGGAGUCUGUGCGGAU AUCCGCACAGACUCCAGGG 1791-1813
3678 3679 AD-59129 GAAAGAGUGUCUCAUCUUA UAAGAUGAGACACUCUUUC 875-897
3680 3681 AD-59130 UGGAGCCCUGGAGUCUGUA UACAGACUCCAGGGCUCCA 1786-1808
Результаты этих анализов in vitro представлены в табл.16. В табл.16 также указаны целевые виды каждой из siRNA.
- 119 036477
Таблица 16. Результаты функциональных анализов
Свободное поглощения для макаккрабоедов Трансфекция для макак-крабоедов Трансфекция НерЗЬ
ID дуплекса Целевые виды Тип 1 мкМ, средн. 500 нМ 20 нМ, средн. 10 нМ 20 нМ, средн. 0,2 нМ, средн. 10 нМ, средн. 0,1 нМ, средн.
AD-58848 M/R/Rh/ Н 21/23 131,6 176,0 104,4 128,0 43,5 44,8 25,3 76,8
AD-58849 H/Rh 21/23 91,9 88,1 92,2 105,0 29,4 35,4 11,5 47,1
AD-58850 H/Rh 21/23 79,4 103,4 80,0 111,2 Н.Д. 62,2 31,3 72,0
AD-58851 H/Rh 21/23 99,7 74,7 94,8 104,7 Н.Д. 40,7 8,6 81,3
AD-58852 H/Rh 21/23 108,1 91,8 103,3 111,9 101,1 128,8 43,4 129,0
AD-58853 H/Rh 21/23 74,8 67,7 84,2 93,5 24,7 52,9 14,1 61,2
AD-58854 H/Rh 21/23 145,9 124,1 106,6 115,3 119,0 83,9 85,0 84,0
AD-58855 H/Rh 21/23 81,5 97,9 92,7 101,8 39,5 40,3 15,3 67,6
AD-58856 H/Rh 21/23 74,1 90,6 84,6 82,6 22,4 30,7 8,7 33,3
AD-58857 H/Rh 21/23 64,7 91,4 62,3 87,1 22,0 31,6 9,8 106,3
AD-58858 H/Rh 21/23 67,4 91,7 68,6 98,3 27,9 40,3 17,4 44,8
AD-58859 H/Rh 21/23 71,2 77,2 92,4 90,1 19,1 34,3 13,1 39,7
AD-58861 H/Rh 21/23 104,6 107,2 102,0 100,6 25,9 35,1 18,0 69,8
AD-58862 H/Rh 21/23 66,8 77,0 68,7 88,5 20,3 31,1 24,2 49,9
AD-58863 H/Rh 21/23 70,8 66,8 76,8 98,5 21,5 29,7 8,7 54,9
AD-58864 H/Rh 21/23 76,2 85,6 83,7 100,8 60,4 61,0 56,4 87,3
AD-58865 H/Rh 21/23 67,9 77,9 95,9 98,4 21,3 38,6 15,5 81,4
AD-58867 H/Rh 21/23 95,9 93,3 107,0 97,5 32,3 42,7 16,6 79,8
AD-58868 H/Rh 21/23 95,2 92,1 116,2 94,7 54,6 69,2 61,5 105,9
AD-58869 H/Rh 21/23 65,0 78,2 75,8 88,2 17,4 25,0 13,0 63,9
AD-58870 H/Rh 21/23 69,4 92,3 81,0 88,1 29,2 43,8 33,7 79,1
AD-58871 H/Rh 21/23 61,2 77,3 88,2 77,0 71,2 73,2 36,7 110,3
AD-58873 H/Rh 21/23 95,2 100,9 83,3 94,6 54,2 52,8 36,6 73,3
AD-58874 H/Rh 21/23 75,8 76,8 63,8 85,3 22,3 31,2 15,0 38,2
AD-58875 H/Rh 21/23 80,7 88,7 78,6 97,9 48,6 73,6 61,2 90,6
AD-58876 H/Rh 21/23 90,8 93,1 82,5 100,2 41,1 56,9 21,2 58,7
AD-58877 H/Rh 21/23 68,3 85,1 51,2 78,7 18,5 46,6 11,9 27,4
AD-58878 H/Rh 21/23 78,3 68,3 81,2 91,2 24,1 23,4 6,2 37,1
AD-58879 H/Rh 21/23 87,9 94,1 79,7 95,4 32,0 47,8 15,7 82,5
AD-58880 H/Rh 21/23 74,9 72,2 88,9 88,1 20,1 27,5 14,0 60,7
AD-58881 H/Rh 21/23 85,9 76,8 78,8 118,0 22,2 36,7 27,6 71,6
AD-58882 H/Rh 21/23 54,1 53,4 60,3 85,8 14,6 27,2 8,2 23,8
AD-58883 H/Rh 21/23 80,4 69,9 75,7 80,3 31,8 25,8 12,3 63,0
AD-58884 H/Rh 21/23 57,7 55,3 64,8 78,2 20,0 30,0 11,8 68,9
AD-58885 H/Rh 21/23 101,8 91,8 104,1 101,5 85,9 71,9 61,8 71,2
AD-58886 M/R/Rh/ H 21/23 47,1 58,0 36,3 93,3 16,0 26,6 9,2 32,0
AD-58887 H/Rh 21/23 73,6 98,7 82,6 95,2 28,5 33,5 12,8 65,2
AD-58888 H/Rh 21/23 90,2 69,9 69,4 85,6 46,9 45,0 16,6 72,0
AD-58889 H/Rh 21/23 83,6 98,6 82,4 92,2 36,5 40,3 31,6 99,4
AD-58890 H/Rh 21/23 69,5 95,4 84,2 88,2 50,8 45,6 21,7 92,9
120 036477
AD-58891 H/Rh 21/23 62,8 75,7 75,4 109,2 23,6 34,3 15,6 55,8
AD-58892 H/Rh 21/23 60,2 92,9 89,8 92,9 22,8 43,3 20,2 75,6
AD-59O95 М/R/Rh/ Η 19me г 88,9 н.Д. 132,8 н.Д. 48,3 97,4 54,3 99,0
AD-59O96 М/R/Rh/ Η 19me г 95,5 н.Д. 90,5 н.Д. 105,7 138,6 131,4 120,7
AD-59O97 М/R/Rh/ Η 19me г 92,5 н.Д. 84,2 н.Д. 75,0 н.Д. 94,7 108,5
AD-59098 М/R/Rh/ Η 19me г 84,0 н.Д. 87,7 н.Д. 109,3 н.Д. 130,0 87,3
AD-59O99 M/R/Rh/ Η 19me г 89,7 н.Д. 90,0 н.Д. 77,8 85,4 46,8 74,9
AD-591OO M/R/Rh/ Η 19me г 84,8 н.Д· 144,3 н.Д· 70,6 108,1 91,5 117,6
AD-591O1 M/R/Rh/ Η 19me г 79,0 н.Д· 103,8 н.Д· 89,8 102,9 124,2 107,0
AD-59102 M/R/Rh/ Η 19me г 85,9 Н.Д. 100,6 Н.Д. 72,2 68,5 87,9 95,1
AD-591O3 M/R/Rh/ Η 19me г 86,0 н.Д· 91,1 н.Д· 93,0 81,3 130,0 96,0
AD-59104 M/R/Rh/ Η 19me г 92,6 н.Д· 96,9 н.Д· 94,9 91,4 124,4 83,1
AD-591O5 M/R/Rh/ Η 19me г 48,9 н.Д. 101,7 н.Д. 18,4 48,9 17,0 34,7
AD-591O6 M/R/Rh/ Η 19me г 63,2 Н.Д. 76,7 Н.Д. 28,5 40,7 28,6 46,4
AD-591O7 M/R/Rh/ Η 19me г 71,4 н.Д. 68,7 н.Д. 37,1 45,3 26,8 63,6
AD-591O8 M/R/Rh/ Η 19me г 70,7 н.Д. 85,1 н.Д. 89,9 84,8 139,2 101,7
AD-591O9 M/R/Rh/ Η 19me г 86,1 н.Д. 83,4 н.Д. 84,9 96,2 131,7 86,7
AD-5911O M/R/Rh/ Η 19me г 70,8 н.Д. 119,7 н.Д. 38,5 60,4 67,4 80,3
AD-59111 M/R/Rh/ Η 19me г 66,1 н.Д. 76,5 н.Д. 52,2 61,0 69,7 87,6
AD-59112 M/R/Rh/ Η 19me г 71,2 н.Д. 80,2 н.Д. 91,2 83,4 127,4 89,0
AD-59113 M/R/Rh/ Η 19me г 67,0 н.Д. 77,8 н.Д. 49,1 59,0 66,8 91,4
AD-59114 M/R/Rh/ Η 19me г 81,7 н.Д. 79,3 н.Д. 96,3 88,0 129,6 72,4
AD-59115 M/R/Rh/ Η 19me г 40,4 н.Д. 69,6 н.Д. 19,6 35,7 9,3 16,9
AD-59116 M/R/Rh/ Η 19me г 72,2 н.Д. 78,3 н.Д. 53,5 77,8 70,1 107,8
AD-59117 M/R/Rh/ Η 19me г 70,7 н.Д. 75,6 н.Д. 75,8 74,9 129,0 103,5
AD-59118 M/R/Rh/ Η 19me г 68,8 н.Д. 75,9 н.Д. 81,4 82,1 114,1 89,7
AD-59119 M/R/Rh/ Η 19me г 64,9 н.Д. 86,5 н.Д. 85,1 125,1 122,8 124,8
AD-5912O M/R/Rh/ Η 19me г 63,5 н.Д. 75,1 н.Д. 29,9 52,0 16,1 54,1
AD-59121 M/R/Rh/ Η 19me г 67,6 Н.Д. 72,0 Н.Д. 88,8 77,4 108,0 103,1
AD-59122 M/R/Rh/ Η 19me 60,2 Н.Д. 62,3 Н.Д. 25,1 45,3 16,2 54,8
AD-59123 M/R/Rh/ Η 19me г 68,6 Н.Д. 108,2 Н.Д. 59,2 84,6 80,0 97,7
AD-59124 M/R/Rh/ Η 19me г 47,5 Н.Д. 56,5 Н.Д. 23,9 40,0 9,8 18,9
AD-59125 M/R/Rh/ Η 19me г 45,4 Н.Д. 47,2 Н.Д. 15,2 40,7 14,7 15,1
AD-59126 M/R/Rh/ Η 19me г 64,3 Н.Д. 74,6 Н.Д. 51,6 57,1 35,5 54,4
AD-59127 M/R/Rh/ Η 19me г 103,4 Н.Д. 105,8 Н.Д. 94,0 156,4 135,9 113,7
AD-59128 M/R/Rh/ Η 19me г 102,4 Н.Д. 81,4 Н.Д. 66,3 89,3 60,2 74,9
AD-59129 M/R/Rh/ Η 19me 41,3 Н.Д. 38,8 Н.Д. 17,9 41,4 8,6 12,6
AD-5913O M/R/Rh/ Η 19me r 58,3 Н.Д. 80,8 Н.Д. 94,9 78,3 106,7 88,0
В табл. 17 показаны IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS1. IC50 определяли в результате нокдауна эндогенно экспрессируемой ALAS1 в клеточной линии Нер3В через 24 ч после трансфекции каждого модифицированного ALAS1 дуплекса siRNA (см. табл.4). По меньшей мере семь дуплексов, в том числе AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 и AD-59129, неизменно проявляли IC50 менее 0,1 нм, указывая на то, что эти дуплексы были особенно эффективными в подавлении экспрессии ALAS1.
- 121 036477
Таблица 17. IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS1
Ш дуплекса 384w 1С50 (нМ) 96w IC50 (нМ)
AD-58882 0,008 0,014
AD-58878 0,040 0,031
AD-58886 0,037 0,033
AD-58877 0,031 0,034
AD-59115 0,093 0,052
AD-58856 0,061 0,066
AD-59129 0,085 0,071
AD-59124 0,572 0,078
AD-58874 0,140 0,102
AD-59125 0,118 0,115
AD-59105 0,511 0,144
AD-59120 180,592 0,498
AD-59122 36,646 0,646
AD-59106 7,906 0,847
AD-59126 н.д. 1,014
AD-59107 Н.д. 1,971
Пример 11. Активность ALAS1-GalNAc в мышиной модели при индукции AIP фенобарбиталом
Мышиную модель AIP использовали для исследования эффекта siRNA, которая представляла собой конъюгат ALAS1-GalNAc. siRNA характеризовалась последовательностью дуплекса AD-58632 (см. табл. 20).
Таблица 20. Последовательности дуплекса AD-58632 с siRNA ALAS1
SEQID NO: (смысловая) SEQIDNO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
4149 4150 873-895 AD-58632 GfsasAfaGfaGfuGfUf CfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
Мышей с AIP не обрабатывали (исходный уровень) или им вводили подкожно на 1 день солевой раствор или конъюгат ALAS1-GalNAc в количестве 20 мг/кг. На 2, 3 и 4 дни их оставляли необработанными (исходный уровень) или им вводили интраперитонеально инъекции фенобарбитала. На 5 день забирали плазму и измеряли уровни ALA и PBG с использованием анализа LC-MS. Как показано на фиг. 15, конъюгат ALAS1-GalNAc снижал образование ALA и PBG в плазме приблизительно на 84 и 80% соответственно. По данным результатам видно, что обработка конъюгатом ALAS1-GalNAc была эффективной в предупреждении повышений уровней как ALA, так и PBG в плазме, связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели AIP.
Пример 12. Дополнительные siRNA, которые нацелены на ALAS1 и ингибируют экспрессию ALAS1
Конструировали модифицированные последовательности siRNA, которые нацеливают siRNA ALAS1, и получали их, как описано в примере 2. Последовательности представлены в табл. 18. Активность in vitro модифицированных дуплексов исследовали, как описано ниже.
- 122 036477
Таблица 18. Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQID NO: (смысло вая) SEQID NO: (антисмыслова я) Названи е дуплекс а Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') Целевые сайты антисмысловой последовательн ости NM_ 000688.4
3685 3686 AD- 59453 CAGGCAAAUCUCUGUUGUUdT dT AACAACAGAGAUUUGCCUGdT dT 402-420
3687 3688 AD- 59395 GAAAAAAAUUGAUGAGAAAdT dT UUUCUCAUCAAUUUUUUUCdT dT 949-967
3689 3690 AD- 59477 GGAAAGAUGCCGCACUCUUdT dT AAGAGUGCGGCAUCUUUCCdT dT 1242-1260
3691 3692 AD- 59492 UGUCUCAUCUUCUUCAAGAdT dT UCUUGAAGAAGAUGAGACAdT dT 882-900
3693 3694 AD- 59361 ACAUCUACGUGCAAGCAAUdT dT AUUGCUUGCACGUAGAUGUdT dT 1992-2010
3695 3696 AD- 59462 UUCUCUGAUUGACACCGUAdT dT UACGGUGUCAAUCAGAGAAdT dT 1711-1729
3697 3698 AD- 59433 GCUGCUGGCUUCAUCUUCAdT dT UGAAGAUGAAGCCAGCAGCdT dT 1739-1757
3699 3700 AD- 59424 AG CG CAACG U СAAAC U CAU dT dT AUGAGUUUGACGUUGCGCUd TdT 1851-1869
3701 3702 AD- 59414 UAUUUCUGGAACUAGUAAAd TdT UUUACUAGUUCCAGAAAUAdT dT 1183-1201
3703 3704 AD- 59539 GGUUGUGUUGGAGGGUACAd TdT U G UACCCU CCAACACAACCdTd T 1679-1697
3705 3706 AD- 59400 GUGUCAGUCUGGUGCAGUAd TdT UACUGCACCAGACUGACACdTd T 1070-1088
3707 3708 AD- 59551 CUUUGUGGCCAAUGACUCAdT dT UGAGUCAUUGGCCACAAAGdT dT 1273-1291
3709 3710 AD- 59482 AGAUGCUGCUAAAAACACAdT dT UGUGUUUUUAGCAGCAUCUd TdT 1942-1960
3711 3712 AD- 59448 GAGUCAUGCCAAAAAUGGAdT dT UCCAUUUUUGGCAUGACUCdT dT 1629-1647
3713 3714 AD- 59392 CUGUGCGGAUCCUGAAGAGdT dT CUCUUCAGGAUCCGCACAGdT dT 1800-1818
3715 3716 AD- 59469 CACUUUGAAACAACAUGGUdT dT ACCAUGUUGUUUCAAAGUGdT dT 1141-1159
3717 3718 AD- 59431 AAGUGAUGAGUGAAAGAGAd TdT UCUCUUUCACUCAUCACUUdT dT 2193-2211
3719 3720 AD- 59423 AUCUGCUAGUCACAUGGAAdT dT UUCCAUGUGACUAGCAGAUdT dT 2103-2121
3721 3722 AD- 59517 UGGGGCAGGUGGUACUAGAd TdT UCUAGUACCACCUGCCCCAdTd T 1162-1180
3723 3724 AD- 59578 GCAGAUGACUAUUCAGACUdT dT AGUCUGAAUAGUCAUCUGCdT dT 1031-1049
3725 3726 AD- 59495 GCCUCAUUCCUCAGCUGAGdT dT CUCAGCUGAGGAAUGAGGCdT dT 2143-2161
3727 3728 AD- 59432 GUAUGAUCGUUUCUUUGAGd TdT CUCAAAGAAACGAUCAUACdT dT 931-949
3729 3730 AD- 59382 UAUCCAGAUGGUCUUCAGAdT dT UCUGAAGACCAUCUGGAUAdT dT 2302-2320
3731 3732 AD- 59472 UAGUGUGAAAACCGAUGGAdT dT UCCAUCGGUUUUCACACUAdT dT 799-817
3733 3734 AD- 59459 UCCCCAUGGCAGAUGACUAdT dT UAGUCAUCUGCCAUGGGGAdT dT 1023-1041
3735 3736 AD- 59413 CCACUGCAGCAGUACACUAdT dT UAGUGUACUGCUGCAGUGGd TdT 483-501
3737 3738 AD- 59478 CUGUGAACCGGCGAGCACAdT dT UGUGCUCGCCGGUUCACAGdT dT 999-1017
3739 3740 AD- 59376 GGUCCUAUGCUGCUGGCUUd TdT AAGCCAGCAGCAUAGGACCdTd T 1731-1749
3741 3742 AD- 59556 AGCCUUUGGUUGUGUUGGAd TdT и CCAACACAACCAAAG GCU dTd T 1672-1690
3743 3744 AD- 59399 AAUUCCAUGUGGACUUAGAdT dT UCUAAGUCCACAUGGAAUUdT dT 1200-1218
3745 3746 AD- 59474 CCAGGGCACUGCAAGCAAAdT dT UUUGCUUGCAGUGCCCUGGdT dT 640-658
3747 3748 AD- 53542 cuuuucAGuAuGAucGuuudTsd T AAACGAUcAuACUGAAAAGdTs dT 924-942
3749 3750 AD- 59480 GAAUCAGAGAGGCAGCAGUdT dT ACUGCUGCCUCUCUGAUUCdT dT 682-700
3751 3752 AD- 59549 GCAAAGAUCUGACCCCUCAdT dT UGAGGGGUCAGAUCUUUGCd TdT 1441-1459
3753 3754 AD- 59515 GGAGAAGAGCUCCUACGGAdT dT UCCGUAGGAGCUCUUCUCCdT dT 2033-2051
3755 3756 AD- 59427 CCAUGAGUUUGGAGCAAUCdT dT GAUUGCUCCAAACUCAUGGdT dT 1540-1558
3757 3758 AD- 59390 CUUUGAGAAAAAAAUUGAUdT dT AUCAAUUUUUUUCUCAAAGdT dT 943-961
3759 3760 AD- 59511 UGAGCAGACAUAACAUCUAdT dT UAGAUGUUAUGUCUGCUCAdT dT 1980-1998
3761 3762 AD- 59532 CGUGCAAGCAAUCAAUUACdT dT GUAAUUGAUUGCUUGCACGdT dT 1999-2017
3763 3764 AD- 59562 AAAGCAAAGACCAGAAAGAdT dT UCUUUCUGGUCUUUGCUUUd TdT 862-880
3765 3766 AD- 59513 GGAUGUGCAGGAAAUGAAUd TdT AUUCAUUUCCUGCACAUCCdT dT 733-751
123 036477
3767 3768 AD59362 CAGCAUACUUCCUGAACAUdT dT AUGUUCAGGAAGUAUGCUGd TdT 321-339
3769 3770 AD53541 GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsd T UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdT sdT 671-689
3771 3772 AD59490 UCUGUUGUUCUAUGCCCAAdT dT UUGGGCAUAGAACAACAGAdT dT 412-430
3773 3774 AD59422 UGAGACAGAUGCUAAUGGAdT dT UCCAUUAGCAUCUGUCUCAdT dT 1869-1887
3775 3776 AD59467 GCCAAUGACUCAACCCUCUdT dT AGAGGGUUGAGUCAUUGGCd TdT 1280-1298
3777 3778 AD59579 GAGUGCAACUUCUGCAGGAdT dT UCCUGCAGAAGUUGCACUCdT dT 2159-2177
3779 3780 AD59426 GUGAAAGAGAGAAGUCCUAdT dT UAGGACUUCUCUCUUUCACdT dT 2202-2220
3781 3782 AD59363 UAACUUGCCAAAAUCUGUUdT dT AACAGAUUUUGGCAAGUUAdT dT 901-919
3783 3784 AD59436 AAGCCAGUCUUGAGCUUCAdT dT UGAAGCUCAAGACUGGCUUdT dT 711-729
3785 3786 AD53536 cAcuuuucAGuAuGAucGudTsd T ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTs dT 922-940
3787 3788 AD59491 GCAGCAGUGUCUUCUGCAAdT dT UUGCAGAAGACACUGCUGCdT dT 693-711
3789 3790 AD59500 UCCUGAACAUGGAGAGUGUdT dT ACACUCUCCAUGUUCAGGAdT dT 330-348
3791 3792 AD59394 AUUUCUGGAACACUUGGCAdT dT U GCCAAG U G U U CCAG AAAU dT dT 1652-1670
3793 3794 AD59441 CAG UACACUACCAACAGAU dT dT AUCUGUUGGUAGUGUACUGd TdT 492-510
3795 3796 AD59365 GCAUGACCUCAAUUAUUUCdT dT GAAAUAAUUGAGGUCAUGCdT dT 2261-2279
3797 3798 AD59411 AGAACUGCUGCAAAGAUCUdT dT AGAUCUUUGCAGCAGUUCUdT dT 1432-1450
3799 3800 AD59544 CACCCCAGAUGAUGAACUAdT dT UAGUUCAUCAUCUGGGGUGd TdT 2073-2091
3801 3802 AD59428 GAUCCAAGGGAUUCGAAACdT dT GUUUCGAAUCCCUUGGAUCdT dT 1363-1381
3803 3804 AD59471 CU CAU CACCAAAAAG CAAG dTd T CUUGCUUUUUGGUGAUGAGd TdT 1052-1070
3805 3806 AD59518 ACAACAUGGUGCUGGGGCAdT dT UGCCCCAGCACCAUGUUGUdT dT 1150-1168
3807 3808 AD53547 GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsd T UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTs dT 935-953
3809 3810 AD59573 CAGCACGAGUUCUCUGAUUdT dT AAUCAGAGAACUCGUGCUGdT dT 1702-1720
3811 3812 AD59473 AAUGAUGUCAGCCACCUCAdT dT UGAGGUGGCUGACAUCAUUdT dT 1412-1430
3813 3814 AD59412 AG U U AU GG ACACU U U GAAAdT dT UUUCAAAGUGUCCAUAACUdT dT 1132-1150
3815 3816 AD59522 GAUGAUGAACUACUUCCUUdT dT AAGGAAGUAGUUCAUCAUCdT dT 2080-2098
3817 3818 AD59502 GCAGGAAAUGAAUGCCGUGdT dT CACGGCAUUCAUUUCCUGCdT dT 739-757
3819 3820 AD59499 UCUUCAAGAUAACUUGCCAdT dT UGGCAAGUUAUCUUGAAGAdT dT 892-910
3821 3822 AD59520 CGAUGGAGGGGAUCCCAGUdT dT ACUGGGAUCCCCUCCAUCGdT dT 811-829
- 124 036477
3823 3824 AD59581 CCAAAAAGC AAG U G U CAG U dT dT ACUGACACUUGCUUUUUGGdT dT 1059-1077
3825 3826 AD59461 GAUUGGGGAUCGGGAUGGAd TdT UCCAUCCCGAUCCCCAAUCdTd T 1612-1630
3827 3828 AD- 59370 CCCUGGAGUCUGUGCGGAUdT dT AUCCGCACAGACUCCAGGGdT dT 1791-1809
3829 3830 AD53540 GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsd T AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsd T 2321-2339
3831 3832 AD59574 CGGGCAUUGUCCACUGCAGdT dT CUGCAGUGGACAAUGCCCGdT dT 473-491
3833 3834 AD59375 UAUUCAGACUCCCUCAUCAdT dT UGAUGAGGGAGUCUGAAUAd TdT 1040-1058
3835 3836 AD59387 CACUGCAUUUUGAAGUGAUd TdT AUCACUUCAAAAUGCAGUGdT dT 2181-2199
3837 3838 AD59397 CCAGAAAGAGUGUCUCAUCdT dT GAUGAGACACUCUUUCUGGdT dT 872-890
3839 3840 AD59396 AGGCGGAGGGAUUGGGGAUd TdT AUCCCCAAUCCCUCCGCCUdTd T 1603-1621
3841 3842 AD59393 AGACCUCCAUGGGAAAGAUdT dT AUCUUUCCCAUGGAGGUCUdT dT 1231-1249
3843 3844 AD59483 GCAGGAGGCCACUGCAUUUdT dT AAAUGCAGUGGCCUCCUGCdT dT 2172-2190
3845 3846 AD59430 AUCUGUUUCCACUUUUCAGdT dT CUGAAAAGUGGAAACAGAUdT dT 913-931
3847 3848 AD59463 AGAGAAGUCCUAUUUCUCAdT dT UGAGAAAUAGGACUUCUCUdT dT 2209-2227
3849 3850 AD53534 GucuucAGAGuuGucuuuAdTsd T uAAAGAcAACUCUGAAGACdTs dT 2312-2330
3851 3852 AD59514 GGCUGGAACUGAAGCCUCAdT dT UGAGGCUUCAGUUCCAGCCdT dT 2130-2148
3853 3854 AD59575 GCCAUUAUCAUAUCCAGAUdT dT AUCUGGAUAUGAUAAUGGCdT dT 2292-2310
3855 3856 AD- 59364 AGCAGGCCCCAGUGUGGUUdT dT AACCACACUGGGGCCUGCUdT dT 781-799
3857 3858 AD59402 UCAGCUGAGUGCAACUUCUdT dT AGAAGUUGCACUCAGCUGAdT dT 2153-2171
3859 3860 AD59479 GAGCACACAUCU UCCCCAUdT dT AUGGGGAAGAUGUGUGCUCd TdT 1011-1029
3861 3862 AD59481 ACU U CCAG G ACAU CAU G CAdT dT UGCAUGAUGUCCUGGAAGUdT dT 843-861
3863 3864 AD- 59530 CCUAUCGAGUUUUUAAAACdT dT GUUUUAAAAACUCGAUAGGdT dT 981-999
3865 3866 AD59582 CUUCCUUGAGAAUCUGCUAdT dT UAGCAGAUUCUCAAGGAAGdT dT 2092-2110
3867 3868 AD59506 ACCAACAGAUCAAAGAAACdTd T GUUUCUUUGAUCUGUUGGUd TdT 501-519
3869 3870 AD59567 UAACCCCAGGCCAU UAUCAdT dT UGAUAAUGGCCUGGGGUUAd TdT 2283-2301
3871 3872 AD59485 CCAUGCCUCCAUGAUCCAAdT dT UUGGAUCAUGGAGGCAUGGd TdT 1351-1369
3873 3874 AD59525 UGAUGAACUAAUGAGCAGAdT dT UCUGCUCAUUAGUUCAUCAdT dT 1969-1987
3875 3876 AD59566 CCUGAAGAGCGCUGAGGGAdT dT UCCCUCAGCGCUCUUCAGGdT dT 1810-1828
3877 3878 AD59580 AACACUUGGCAAAGCCUUUdT dT AAAGGCUUUGCCAAGUGUUdT dT 1660-1678
- 125 036477
3879 3880 AD59512 UCUGCAGAAAGCAGGCAAAdT dT UUUGCCUGCUUUCUGCAGAdT dT 391-409
3881 3882 AD59475 CCGGCCUCCCUGUUGUCCAdT dT UGGACAACAGGGAGGCCGGdT dT 1890-1908
3883 3884 AD59438 CAUCAUCCCUGUGCGGGUUdT dT AACCCGCACAGGGAUGAUGdT dT 1921-1939
3885 3886 AD59442 UGUGCGGGUUGCAGAUGCUd TdT AGCAUCUGCAACCCGCACAdTd T 1930-1948
3887 3888 AD59516 GGAAAGAGGUUGCUGAAACdT dT GUUUCAGCAACCUCUUUCCdT dT 759-777
3889 3890 AD59429 AGGUCCACGCAGUGGGGCUdT dT AGCCCCACUGCGUGGACCUdT dT 1572-1590
3891 3892 AD59510 UGCCGUGAGGAAAGAGGUUd TdT AACCUCUUUCCUCACGGCAdTd T 751-769
3893 3894 AD59457 GCUAAUGGAUGCCGGCCUCdT dT GAGGCCGGCAUCCAUUAGCdT dT 1879-1897
3895 3896 AD59434 GAAGCAAGUGGGGCUGGAAd TdT UUCCAGCCCCACUUGCUUCdT dT 2119-2137
3897 3898 AD59454 CAUCUUCCGCCACAAUGAUdT dT AUCAUUGUGGCGGAAGAUGd TdT 1399-1417
3899 3900 AD59468 AUUUCUCAGGCUUGAGCAAdT dT UUGCUCAAGCCUGAGAAAUdT dT 2220-2238
3901 3902 AD59565 CCCGAGUCCCCCAGGCCUUdTd T AAGGCCUGGGGGACUCGGGdT dT 372-390
3903 3904 AD59416 CAAGCAAAU GCCCU U UCCU dT dT AGGAAAGGGCAUUUGCUUGd TdT 651-669
3905 3906 AD59420 CCCCUCAGUCCCCAAGAUUdTd T AAUCUUGGGGACUGAGGGGd TdT 1453-1471
3907 3908 AD59552 CUACGGUGCCCCGGGGAGAdT dT UCUCCCCGGGGCACCGUAGdT dT 2019-2037
3909 3910 AD59558 AAAACUGCCCCAAGAUGAUdT dT AUCAUCUUGGGGCAGUUUUd TdT 429-447
3911 3912 AD59404 ACAAAACUGCUAAGGCCAAdT dT UUGGCCUUAGCAGUUUUGUd TdT 540-558
3913 3914 AD59455 GAUUCUGGGAACCAUGCCUdT dT AGGCAUGGUUCCCAGAAUCdT dT 1340-1358
3915 3916 AD59496 CCAGAUGGCACACAGCUUCdT dT GAAGCUGUGUGCCAUCUGGdT dT 593-611
3917 3918 AD59446 AGGGAUUCGAAACAGCCGAdT dT UCGGCUGUUUCGAAUCCCUdT dT 1369-1387
3919 3920 AD59435 CUCUGCAGUCCUCAGCGCAdT dT UGCGCUGAGGACUGCAGAGdT dT 109-127
3921 3922 AD59419 CCGCCGCCUCUGCAGUCCUdT dT AGGACUGCAGAGGCGGCGGdT dT 102-120
3923 3924 AD59533 CUGGCUGGAGCCCUGGAGUdT dT ACUCCAGGGCUCCAGCCAGdTd T 1781-1799
3925 3926 AD59366 GACAUCAUG CAAAAGCAAAdT dT UUUGCUUUUGCAUGAUGUCd TdT 851-869
3927 3928 AD59521 GCUUGAGCAAGUUGGUAUCd TdT GAUACCAACUUGCUCAAGCdT dT 2229-2247
3929 3930 AD59563 CAGGCUGUGAGAUUUACUCdT dT GAGU AAAU C U CACAG CCU G dT dT 1320-1338
3931 3932 AD59534 AGAGCUGUGUGAUGUGGCCd TdT GGCCACAUCACACAGCUCUdTd T 1522-1540
3933 3934 AD59407 GGAGCUGGCAGACCUCCAUdT dT AUGGAGGUCUGCCAGCUCCdT dT 1222-1240
- 126 036477
3935 3936 AD59445 AUCCCAGUGGACUGCUGAAdT dT UUCAGCAGUCCACUGGGAUdT dT 822-840
3937 3938 AD59546 GUCAAACUCAUGAGACAGAdT dT UCUGUCUCAUGAGUUUGACdT dT 1859-1877
3939 3940 AD59456 CUUUCCUGGCAGCACAGAUdT dT AUCUGUGCUGCCAGGAAAGdT dT 663-681
3941 3942 AD59503 CCCUCCGGCCAGUGAGAAAdT dT UUUCUCACUGGCCGGAGGGdT dT 520-538
3943 3944 AD59536 CUACCUAGGAAUGAGUCGCdT dT GCGACUCAUUCCUAGGUAGdT dT 1093-1111
3945 3946 AD59385 CCCAAGAUUGUGGCAUUUGdT dT CAAAUGCCACAAUCUUGGGdT dT 1463-1481
3947 3948 AD59367 GAGCAAUCACCUUCGUGGAdT dT UCCACGAAGGUGAUUGCUCdT dT 1551-1569
3949 3950 AD59458 UGCCCAUUCUUAUCCCGAGdT dT CUCGGGAUAAGAAUGGGCAdT dT 359-377
3951 3952 AD59381 AAGGCCAAGGUCCAACAGAdT dT UCUGUUGGACCUUGGCCUUdT dT 551-569
3953 3954 AD59538 CACACAGCUUCCGUCUGGAdT dT UCCAGACGGAAGCUGUGUGdT dT 601-619
3955 3956 AD59421 UUAUGGGGCUCGAGGCGGAd TdT UCCGCCUCGAGCCCCAUAAdTd T 1591-1609
3957 3958 AD59388 UGUCUUCUGCAAAGCCAGUdT dT ACUGGCUUUGCAGAAGACAdT dT 700-718
3959 3960 AD59444 AGGCCUGAGCAUGACCUCAdT dT UGAGGUCAUGCUCAGGCCUdT dT 2253-2271
3961 3962 AD59528 AUGUGAAUUAAGUUAUAUUd TdT AAUAUAACUUAAUUCACAUdT dT 2332-2350
3963 3964 AD59498 ACUGCUGAAGAACUUCCAGdT dT CUGGAAGUUCUUCAGCAGUdT dT 832-850
3965 3966 AD59497 UGAGAAAGACAAAACUGCUdT dT AGCAGUUUUGUCUUUCUCAdT dT 532-550
3967 3968 AD59384 UCAGCCACCUCAGAGAACUdT dT AGUUCUCUGAGGUGGCUGAd TdT 1419-1437
3969 3970 AD59452 GGCAACGAGCGUUUCGUUUd TdT AAACGAAACGCUCGUUGCCdT dT 51-69
3971 3972 AD59379 CCUGAUGGAUCCCAGCAGAdT dT UCUGCUGGGAUCCAUCAGGdT dT 572-590
3973 3974 AD59529 UGUGCCCACUGGAAGAGCUdT dT AGCUCUUCCAGUGGGCACAdT dT 1509-1527
3975 3976 AD59389 CCACAGGAGCCAGCAUACUdT dT AGUAUGCUGGCUCCUGUGGdT dT 311-329
3977 3978 AD59585 GUGGUACUAGAAAUAUUUCd TdT GAAAUAUUUCUAGUACCACdT dT 1170-1188
3979 3980 AD59570 UUCGCCGCUGCCCAUUCUUdT dT AAGAAUGGGCAGCGGCGAAdT dT 351-369
3981 3982 AD59415 CCGCCAGCACCAGCGCAACdTd T GUUGCGCUGGUGCUGGCGGd TdT 1840-1858
3983 3984 AD59505 CGCUGAGGGACGGGUGCUUd TdT AAGCACCCGUCCCUCAGCGdTd T 1819-1837
3985 3986 AD59557 UGGACUUCUCGACUUGAGUd TdT ACUCAAGUCGAGAAGUCCAdT dT 69-87
3987 3988 AD59548 AAAGAAACCCCUCCGGCCAdTd T UGGCCGGAGGGGUUUCUUUd TdT 512-530
3989 3990 AD59487 UUGACACCGUACGGUCCUAdT dT UAGGACCGUACGGUGUCAAdT dT 1719-1737
127 036477
3991 3992 AD59550 CCCUCUUCACCCUGGCUAAdT dT UUAGCCAGGGUGAAGAGGGdT dT 1293-1311
3993 3994 AD59572 CCCCCAGGCCUUUCUGCAGdT dT CUGCAGAAAGGCCUGGGGGdT dT 379-397
3995 3996 AD59554 AUG CCCAAAAC U GCCCCAAdTd T UUGGGGCAGUUUUGGGCAUd TdT 423-441
3997 3998 AD59437 CUUGAGUGCCCGCCUCCUUdT dT AAGGAGGCGGGCACUCAAGdT dT 81-99
3999 4000 AD59584 GGGUACAUCGCCAGCACGAdT dT UCGUGCUGGCGAUGUACCCdT dT 1691-1709
4001 4002 AD59373 GUGUGGGGCAGUUAUGGACd TdT GUCCAUAACUGCCCCACACdTd T 1123-1141
4003 4004 AD59545 ACAUAGUCCUGGAAAUAAAdT dT UUUAUUUCCAGGACUAUGUdT dT 2372-2390
4005 4006 AD59547 AUCCCAGCAGAGUCCAGAUdT dT AUCUGGACUCUGCUGGGAUdT dT 580-598
4007 4008 AD59470 CUAGAUUCUUUCCACAGGAdT dT UCCUGUGGAAAGAAUCUAGdT dT 300-318
4009 4010 AD59417 UUGUUUUCCUCGUGCUUUGd TdT CAAAGCACGAGGAAAACAAdTd T 1259-1277
4011 4012 AD59535 CCUCCUUCGCCGCCGCCUCdTd T GAGGCGGCGGCGAAGGAGGdT dT 93-111
4013 4014 AD59507 UGAGGCUGCUCCCGGACAAdT dT UUGUCCGGGAGCAGCCUCAdT dT 31-49
4015 4016 AD59519 CCAACAGACUCCUGAUGGAdT dT UCCAUCAGGAGUCUGUUGGdT dT 562-580
4017 4018 AD59391 UCACAUGGAAGCAAGUGGGdT dT CCCACUUGCUUCCAUGUGAdT dT 2112-2130
4019 4020 AD59537 CAUUCAAUGGAUGGGGCGGd TdT CCGCCCCAUCCAUUGAAUGdTd T 1490-1508
4021 4022 AD59450 AGGAAUGAGUCGCCACCCAdT dT UGGGUGGCGACUCAUUCCUdT dT 1099-1117
4023 4024 AD59449 UGGACUUAGAGCGGGAGCUd TdT AGCUCCCGCUCUAAGUCCAdTd T 1209-1227
4025 4026 AD59418 CUAAAAACACAGAAGUCUGdT dT CAGACUUCUGUGUUUUUAGd TdT 1950-1968
4027 4028 AD59561 CCCUCACCACACACCCCAGdTd T CUGGGGUGUGUGGUGAGGGd TdT 2062-2080
4029 4030 AD59460 AAUCCUUGCUUCAGGGACUdT dT AGUCCCUGAAGCAAGGAUUdT dT 171-189
4031 4032 AD59409 UUGUGGCAUUUGAAACUGUd TdT ACAGUUUCAAAUGCCACAAdT dT 1470-1488
4033 4034 AD59476 UCAAUUACCCUACGGUGCCdT dT GGCACCGUAGGGUAAUUGAdT dT 2010-2028
4035 4036 AD59406 CAAGCCAGCCCCUCGGGCAdTd T UGCCCGAGGGGCUGGCUUGdT dT 460-478
4037 4038 AD59569 GAGUCUUCCCUGCCUGGAUdT dT AUCCAGGCAGGGAAGACUCdT dT 259-277
4039 4040 AD59451 UGGAGAGUGUUGUUCGCCGd TdT CGGCGAACAACACUCUCCAdTd T 339-357
4041 4042 AD- 59553 ACCCCUUGCCUGCCACAAGdTd T CUUGUGGCAGGCAAGGGGUdT dT 621-639
4043 4044 AD59372 CUGGAUGGAUGAGUGGCUUd TdT AAGCCACUCAUCCAUCCAGdTd T 272-290
4045 4046 AD59377 CAAGAUGAUGGAAGUUGGGd TdT CCCAACUUCCAUCAUCUUGdT dT 439-457
- 128 036477
4047 4048 AD59531 UUUCGUUUGGACUUCUCGAd TdT UCGAGAAGUCCAAACGAAAdT dT 62-80
4049 4050 AD59560 UCAUCUUCACCACCUCUCUdT dT AGAGAGGUGGUGAAGAUGAd TdT 1749-1767
4051 4052 AD59489 UGCCCAGUUCUUCCCGCUGdT dT CAGCGGGAAGAACUGGGCAdT dT 132-150
4053 4054 AD59540 AAAAAUGGACAUCAUUUCUdT dT AGAAAUGAUGUCCAUUUUUdT dT 1639-1657
4055 4056 AD59378 CUUGAGCUUCAGGAGGAUGd TdT CAUCCUCCUGAAGCUCAAGdT dT 719-737
4057 4058 AD59403 CCUCUCUGCCACCCAUGCUdTd T AGCAUGGGUGGCAGAGAGGdT dT 1761-1779
4059 4060 AD59493 AAAGUCAGGAUCCCUAAGAdT dT UCUUAGGGAUCCUGACUUUdT dT 242-260
4061 4062 AD59374 CGACCACGGAGGAAUCCUUdT dT AAGGAUUCCUCCGUGGUCGdT dT 159-177
4063 4064 AD59380 UUCCGUCUGGACACCCCUUdT dT AAGGGGUGUCCAGACGGAAdT dT 609-627
4065 4066 AD59576 CCACCCAUGCUGCUGGCUGdT dT CAG CCAG CAGC AU G G G U G G dT dT 1769-1787
4067 4068 AD59425 UGAGAAAAAGAAUGACCACdT dT GUGGUCAUUCUUUUUCUCAd TdT 961-979
4069 4070 AD- 59509 UAAGAUGAUGCCAGGCUGUdT dT ACAGCCUGGCAUCAUCUUAdT dT 1309-1327
4071 4072 AD59488 AGUUAUAUUAAAUUUUAAUd TdT AUUAAAAUUUAAUAUAACUdT dT 2342-2360
4073 4074 AD59486 UCUUCCCGCUGUGGGGACAdT dT UGUCCCCACAGCGGGAAGAdT dT 140-158
4075 4076 AD59465 UGCCACAAGCCAGGGCACUdT dT AGUGCCCUGGCUUGUGGCAdT dT 631-649
4077 4078 AD59484 AGCGCAGUUAUGCCCAGUUdT dT AACUGGGCAUAACUGCGCUdT dT 122-140
4079 4080 AD59368 GGACCAGGAGAAAGUCAGGdT dT CCUGACUUUCUCCUGGUCCdT dT 232-250
4081 4082 AD59464 UGUCCACUGCCCCAGCCACdTd T GUGGCUGGGGCAGUGGACAdT dT 1903-1921
4083 4084 AD59386 AUCGCGGCCUGAGGCUGCUdT dT AGCAGCCUCAGGCCGCGAUdT dT 22-40
4085 4086 AD59439 GGGGAUGUGGGGACCAGGAd TdT UCCUGGUCCCCACAUCCCCdTd T 222-240
4087 4088 AD59440 CUGGAAAUAAAUUCUUGCUdT dT AGCAAGAAUUUAUUUCCAGdT dT 2380-2398
4089 4090 AD59542 U U GAAACU G U CCAU U CAAU dT dT AU U G AAU G G ACAG U U U CAAdT dT 1479-1497
4091 4092 AD59559 GUGGGGACACGACCACGGAdT dT UCCGUGGUCGUGUCCCCACdT dT 150-168
4093 4094 AD59586 CGCAGUGGGGCUUUAUGGGd TdT CCCAUAAAGCCCCACUGCGdTd T 1579-1597
4095 4096 AD59408 UUGUCUUUAUAUGUGAAUUd TdT AAUUCACAUAUAAAGACAAdT dT 2322-2340
4097 4098 AD59568 UCACCCUGGCUAAGAUGAUdT dT AUCAUCUUAGCCAGGGUGAdT dT 1299-1317
4099 4100 AD59398 GUAUCUGCUCAGGCCUGAGdT dT CUCAGGCCUGAGCAGAUACdT dT 2243-2261
4101 4102 AD59508 AUGAGUGGCUUCUUCUCCAdT dT UGGAGAAGAAGCCACUCAUdT dT 280-298
- 129 036477
4103 4104 AD59523 G AAG U U G G GG CCAAG CCAGdT dT CUGGCUUGGCCCCAACUUCdT dT 449-467
4105 4106 AD59410 UCAGGGACUCGGGACCCUGdT dT CAGGGUCCCGAGUCCCUGAdT dT 181-199
4107 4108 AD59541 UCCUACGGAUUGCCCCCACdT dT GUGGGGGCAAUCCGUAGGAdT dT 2043-2061
4109 4110 AD59524 UUACUCUGAUUCUGGGAACdT dT GUUCCCAGAAUCAGAGUAAdT dT 1333-1351
4111 4112 AD59501 AUCCCUAAGAGUCUUCCCUdT dT AGGGAAGACUCUUAGGGAUdT dT 251-269
4113 4114 AD59383 UGCCAAAGUACAUCUUCCGdT dT CGGAAGAUGUACUUUGGCAdT dT 1389-1407
4115 4116 AD59577 UCCUCGGGUUUAGGGGAUGd TdT CAUCCCCUAAACCCGAGGAdTd T 210-228
4117 4118 AD59447 UGCUGAAACCUCAGCAGGCdT dT GCCUGCUGAGGUUUCAGCAdT dT 769-787
4119 4120 AD59555 CCACCCACGGGUGUGUGGGdT dT CCCACACACCCG UGGGUGGdT dT 1111-1129
4121 4122 AD59405 UGGUGCAGUAAUGACUACCdT dT GGUAGUCAUUACUGCACCAdT dT 1079-1097
4123 4124 AD59371 UUCUCCACCUAGAUUCUUUdT dT AAAGAAUCUAGGUGGAGAAdT dT 292-310
4125 4126 AD59443 UAAGGCGCCGGCGAUCGCGdT dT CGCGAUCGCCGGCGCCUUAdT dT 9-27
4127 4128 AD59401 UGGAACUAGUAAAUUCCAUdT dT AUGGAAUUUACUAGUUCCAdT dT 1189-1207
4129 4130 AD59494 GGACCCUGCUGGACCCCUUdT dT AAGGGGUCCAGCAGGGUCCdT dT 192-210
4131 4132 AD59504 UCAAUUAUUUCACUUAACCdT dT GGUUAAGUGAAAUAAUUGAd TdT 2269-2287
4133 4134 AD59369 CCCGGACAAGGGCAACGAGdT dT CUCGUUGCCCUUGUCCGGGdT dT 41-59
4135 4136 AD59571 UUUUAAAACUGUGAACCGGdT dT CCGG U UCACAG U U U U AAAAdT dT 991-1009
4137 4138 AD59527 GUGCUUCGCCGCCAGCACCdT dT GGUGCUGGCGGCGAAGCACdT dT 1832-1850
4139 4140 AD59466 UGGACCCCUUCCUCGGGUUdT dT AACCCGAGGAAGGGGUCCAdT dT 201-219
4141 4142 AD59526 CUGUAUAUUAAGGCGCCGGdT dT CCGGCGCCUUAAUAUACAGdT dT 1-19
4143 4144 AD59543 UUGCCCCCACCCCUCACCAdTd T UGGUGAGGGGUGGGGGCAAd TdT 2052-2070
4145 4146 AD59564 AUGGGGCGGUGUGCCCACUdT dT AGUGGGCACACCGCCCCAUdTd T 1500-1518
4147 4148 AD59583 CUAUAGUAAAAACAUAGUCdT dT GACUAUGUUUUUACUAUAGd TdT 2361-2379
In vitro активность siRNA в подавлении mRNA ALAS1 исследовали в скрининге разовой дозы в клетках Нер3В, которые трансфицировали с использованием Lipofectamine2000 в качестве средства трансфекции. Эксперименты по разовой дозе выполняли при концентрации дуплекса 10 нМ и анализировали при помощи анализа с разветвленной ДНК (bDNA). Результаты показаны в табл. 19 и выражены в виде процента оставшейся mRNA.
- 130 036477
Таблица 19. Подавление mRNA ALAS1, определенное при помощи анализа с bDNA
Дуплекс % оставшейся mRNA SD
AD-59453 11,2 1,5
AD-59395 12,7 1,1
AD-59477 14,5 2,0
AD-59492 14,8 2,1
AD-59361 15,1 4,9
AD-59462 15,4 2,6
AD-59433 15,8 2,7
AD-59424 16,0 1,7
AD-59414 16,1 1,3
AD-59539 16,2 2,6
AD-59400 16,2 1,8
AD-59551 16,3 2,3
AD-59482 16,6 2,1
AD-59448 16,6 3,7
AD-59392 16,9 3,5
AD-59469 16,9 2,2
AD-59431 17,0 2,0
AD-59423 17,1 3,8
AD-59517 17,2 1,5
AD-59578 17,3 3,1
AD-59495 17,7 3,7
AD-59432 17,7 2,8
AD-59382 17,9 3,2
AD-59472 18,6 3,5
AD-59459 18,7 3,8
AD-59413 18,8 2,4
AD-59478 18,9 3,0
AD-59376 18,9 3,2
AD-59556 18,9 2,4
AD-59399 19,0 4,1
AD-59474 19,4 1,6
AD-53542 19,4 1,7
AD-59480 19,6 1,6
AD-59549 19,7 2,1
AD-59515 19,8 4,4
AD-59427 19,9 3,2
AD-59390 19,9 3,4
AD-59511 19,9 2,2
- 131 036477
AD-59532 20,0 2,4
AD-59562 20,2 2,6
AD-59513 20,3 3,9
AD-59362 20,6 2,5
AD-53541 20,6 2,2
AD-59490 20,7 2,3
AD-59422 20,8 4,5
AD-59467 21,2 2,3
AD-59579 21,2 3,3
AD-59426 21,7 2,3
AD-59363 21,7 2,7
AD-59436 21,7 2,7
AD-53536 21,9 1,5
AD-59491 21,9 2,6
AD-59500 22,2 2,8
AD-59394 22,3 10,1
AD-59441 22,3 2,6
AD-59365 22,4 4,2
AD-59411 22,5 2,9
AD-59544 22,5 2,1
AD-59428 22,7 4,7
AD-59471 22,9 5,0
AD-59518 22,9 2,3
AD-53547 22,9 1,5
AD-59573 23,0 4,2
AD-59473 23,2 1,8
AD-59412 23,4 2,5
AD-59522 23,4 3,3
AD-59502 23,6 2,7
AD-59499 23,6 1,6
AD-59520 23,8 3,8
AD-59581 23,9 6,0
AD-59461 24,3 4,2
AD-59370 24,3 5,6
AD-53540 24,4 2,1
AD-59574 24,5 2,0
AD-59375 24,6 2,3
AD-59387 24,8 7,2
AD-59397 24,9 9,6
AD-59396 25,0 10,2
AD-59393 25,3 11,6
AD-59483 25,4 3,8
- 132 036477
AD-59430 25,5 1,8
AD-59463 25,6 4,8
AD-53534 25,9 3,1
AD-59514 26,2 5,7
AD-59575 26,2 3,2
AD-59364 26,2 4,5
AD-59402 26,3 3,1
AD-59479 26,3 2,5
AD-59481 26,4 2,2
AD-59530 26,4 4,4
AD-59582 26,6 3,9
AD-59506 27,0 4,1
AD-59567 27,3 1,1
AD-59485 27,7 4,7
AD-59525 28,3 3,1
AD-59566 28,5 0,6
AD-59580 28,7 7,1
AD-59512 29,5 2,5
AD-59475 29,6 4,2
AD-59438 29,6 3,3
AD-59442 29,9 2,8
AD-59516 30,4 3,8
AD-59429 30,8 4,3
AD-59510 31,3 1,9
AD-59457 31,4 1,2
AD-59434 31,6 3,5
AD-59454 32,0 1,9
AD-59468 32,2 3,2
AD-59565 32,4 1,5
AD-59416 32,7 1,7
AD-59420 33,2 3,1
AD-59552 33,2 2,2
AD-59558 33,8 3,8
AD-59404 34,0 5,4
AD-59455 34,8 1,3
AD-59496 34,9 5,2
AD-59446 35,5 1,7
AD-59435 35,9 1,2
AD-59419 36,0 1,4
AD-59533 36,7 3,7
AD-59366 36,7 6,0
AD-59521 36,9 4,3
- 133 036477
AD-59563 36,9 4,1
AD-59534 36,9 3,3
AD-59407 37,1 4,7
AD-59445 37,2 3,2
AD-59546 37,9 4,9
AD-59456 38,3 4,0
AD-59503 38,8 5,0
AD-59536 39,8 4,2
AD-59385 39,9 13,7
AD-59367 40,0 3,6
AD-59458 40,0 3,4
AD-59381 40,3 9,9
AD-59538 40,8 4,9
AD-59421 40,9 6,4
AD-59388 41,0 9,1
AD-59444 41,1 2,7
AD-59528 41,9 3,3
AD-59498 42,2 3,3
AD-59497 42,4 4,9
AD-59384 42,7 17,6
AD-59452 42,7 3,1
AD-59379 43,6 2,6
AD-59529 43,8 4,8
AD-59389 44,1 6,4
AD-59585 44,3 3,2
AD-59570 45,1 4,0
AD-59415 46,6 2,3
AD-59505 47,5 6,2
AD-59557 48,1 4,4
AD-59548 49,9 4,0
AD-59487 50,7 3,2
AD-59550 50,8 5,8
AD-59572 51,1 4,0
AD-59554 51,3 6,0
AD-59437 52,2 4,8
AD-59584 54,9 2,7
AD-59373 55,3 20,1
AD-59545 55,4 3,4
AD-59547 55,9 4,7
AD-59470 56,0 2,7
AD-59417 56,4 7,7
AD-59535 57,6 5,1
- 134 036477
AD-59507 58,8 4,7
AD-59519 59,1 5,6
AD-59391 60,1 12,5
AD-59537 60,6 9,1
AD-59450 60,7 7,2
AD-59449 61,6 6,8
AD-59418 61,8 8,4
AD-59561 62,2 7,2
AD-59460 62,8 4,7
AD-59409 64,4 9,0
AD-59476 65,2 5,6
AD-59406 65,6 3,5
AD-59569 66,7 7,6
AD-59451 66,9 2,9
AD-59553 67,2 8,8
AD-59372 67,3 25,6
AD-59377 68,7 5,1
AD-59531 68,7 9,0
AD-59560 68,7 12,7
AD-59489 69,6 8,9
AD-59540 70,1 10,1
AD-59378 70,6 14,1
AD-59403 71,4 3,3
AD-59493 72,3 3,5
AD-59374 75,9 5,1
AD-59380 76,4 11,1
AD-59576 77,5 16,2
AD-59425 77,9 10,6
AD-59509 78,0 3,2
AD-59488 78,6 7,1
AD-59486 79,4 5,0
AD-59465 79,5 5,1
AD-59484 79,8 3,2
AD-59368 80,0 11,9
AD-59464 80,2 9,3
AD-59386 80,6 33,2
AD-59439 80,9 4,0
AD-59440 82,2 1,9
AD-59542 83,3 10,6
AD-59559 83,7 9,1
AD-59586 83,8 11,5
AD-59408 86,3 2,8
AD-59568 86,8 4,2
AD-59398 87,4 24,9
AD-59508 87,5 2,5
AD-59523 87,6 11,8
AD-59410 88,8 8,3
AD-59541 88,9 10,8
AD-59524 89,5 12,1
AD-59501 89,9 5,1
AD-59383 90,8 27,4
AD-59577 91,1 2,3
AD-59447 91,3 12,9
AD-59555 91,7 3,4
AD-59405 92,5 5,7
AD-59371 93,5 31,7
AD-59443 93,8 9,0
AD-59401 94,5 7,1
AD-59494 95,1 9,1
AD-59504 96,8 11,7
AD-59369 96,8 4,8
AD-59571 97,4 7,0
AD-59527 98,6 7,8
AD-59466 99,7 14,0
AD-59526 102,9 4,6
AD-59543 103,7 3,0
AD-59564 103,7 12,1
AD-59583 112,4 13,2
- 135 036477
Двести тридцать два дуплекса, которые были исследованы, подавляли mRNA ALAS1 в различной степени в этом анализе разовой дозы. Согласно этому анализу, по меньшей мере четыре из дуплексов (AD-59453, AD-59395, aD-59477 и AD-59492) подавляли mRNA ALAS1 на 85% или более, 39 из дуплексов подавляли mRNA ALAS1 на 80% или более, 101 из дуплексов подавляли mRNA ALAS1 на 70% или более, и 152 из дуплексов подавляли mRNA ALAS1 на 50% или более. В противоположность, некоторые дуплексы не характеризовались заметным подавлением в данном анализе.
Пример 13. Дозочувствительное ингибирование предшественников порфиринов ALA и PBG при помощи siRNA ALAS1
Дозочувствительные эффекты siRNA ALAS1 исследовали в мышиной модели AIP (см. пример 5). В этой модели показана ~30% остаточная активность PBGD, ~2-кратное повышение исходных уровней ALA и PBG, ~30-100-кратное повышение уровней ALA и PBG после индукции инъекциями фенобарбитала раз в день в течение 3-4 дней. У более старых животных наблюдалась дегенерация аксонов и нарушенная двигательная функция.
siRNA ALAS1, используемая в этом примере, представляла собой дуплекс AD-53558 в составе AF11. На 1 день мышам вводили 1, 0,5, 0,1 или 0,05 мг/кг siRNA ALAS1 или контроль LUC AD-1955 путем внутривенной инъекции. Вводили три инъекции фенобарбитала (1 инъекция в сутки на 2, 3 и 4 дни) для индукции ALAS1 в печени и предшественников порфирина, ALA и PBG. Образцы плазмы и ночной мочи собирали на 5 день, а уровни метаболитов измеряли при помощи LC-MS. Исходные уровни ALA и PBG измеряли перед первой обработкой на 1 день. Результаты показаны на фиг. 16. siRNA ALAS1 ингибировала уровни ALA и PBG дозозависимым образом. Ингибиторный эффект на уровни ALA в плазме наблюдали в дозах siRNA ALAS1 до 0,05 мг/кг, а ингибиторный эффект на уровни PBG в плазме отмечали в дозах siRNA до 0,1 мг/кг.
Пример 14. Стойкое ингибирование предшественников порфиринов ALA и PBG ПРИ помощи siRNA ALAS1
Стойкость эффектов siRNA ALAS1 исследовали в мышиной модели AIP (см. пример 5). siRNA ALAS1, используемая в этом примере, представляла собой дуплекс AD-53558 в составе AF11. Схема эксперимента и результаты этого эксперимента показаны на фиг. 17. На 1 день мышам вводили 1 мг/кг siRNA ALAS1 или контроль LUC AD-1955 путем внутривенной инъекции. Три инъекции фенобарбитала вводили на 0 неделе (1 инъекция в день на 2, 3 и 4 дни), 2 неделе (1 инъекция в день на 15, 16 и 17 дни) и 4 неделе (1 инъекция в день на 29, 30 и 31 дни) для индукции ALAS1 в печени и предшественников порфиринов ALA и PBG. Образцы плазмы и ночной мочи собирали на 5, 18 и 32 дни, а уровни метаболитов измеряли при помощи LC-MS. Исходные уровни ALA и PBG измеряли перед первой обработкой на 1 день.
Как показано на фиг. 17, siRNA ALAS1 оказывала стойкий эффект в снижении уровней ALA и PBG в плазме. Введение siRNA ALAS1 подавляло уровни ALA и PBG в плазме по меньшей мере в течение 2 недель. Из этих результатов видно, что siRNA ALAS1 является эффективным лекарственным препаратом для снижения повышенных уровней ALA и PBG и, таким образом, может использоваться в профилактике, например, для снижения хронически повышенных уровней ALA и PBG и для предупреждения рецидивирующих приступов порфирии.
Пример 15. siRNA ALAS1 обеспечивает более быстрое наступление действия по сравнению с лечением гемином
Эффекты обработки siRNA ALAS 1 сравнивали с эффектами обработки гемином в мышиной модели AIP (см. пример 5). siRNA ALAS1, используемая в этом примере, представляла собой дуплекс AD-53558 в составе AF11. Схема эксперимента и результаты этого эксперимента показаны на фиг. 18. Фенобарбитал (РВ) и диэтилдитиокарбамат (DDC) вводили на 1, 2 и 3 дни. DDC представляет собой другой индуктор р450, который, как и фенобарбитал, повышает потребность в геме и способствует продлению индукции метаболитов ALA/PBG.
Гемин в дозе 4 мг/кг, siRNA ALAS1 в дозе 2 мг/кг или контрольный лекарственный препарат вводили внутривенно через 8 ч после последней дозы РВ и DDC.
Как показано на фиг. 18, наступление действия лекарственного препарата было более быстрым при лечении siRNA ALAS1 по сравнению с лечением гемином. Быстрое снижение уровней ALA и PBG при лечении siRNA указывает на то, что siRNA является эффективным лекарственным препаратом для лечения острых приступов, поскольку ожидается, что быстрое улучшение клинических симптомов будет сопровождаться снижением уровней ALA и PBG.
Пример 16. Эффекты AD-58632 на основе конъюгата GalNAc с siRNA ALAS1
AD-58632 представляет собой дуплекс из 21/23 нуклеотидов, раскрытых в примере 11. AD-58632 нацелен на транскрипт человека NM_ 000688.4, а также является кросс-реактивным по отношению к mRNA-транскриптам мышей, крыс и макак-крабоедов. AD-58632 был единственным кросс-реактивным дуплексом из 21/23 нуклеотидов, идентифицированным в результате скрининга приблизительно 45 соединений. Дополнительные эксперименты с этим дуплексом описаны в данном примере.
- 136 036477
Дозозависимые эффекты AD-58632 в подавлении mRNA ALAS1
У крыс исследовали дозозависимый эффект AD-58632 в подавлении mRNA ALAS1 относительно mRNA GAPDH. Исследовали дозы 30, 10 и 3 мг/кг. Уровни mRNA ALAS1 измеряли в печени через 72 часа после последней дозы. AD-58632, по сравнению с контролем PBS, подавлял mRNA ALAS1 дозозависимым образом (см. фиг. 19). AD-58632 характеризовался разовой дозой ED50 приблизительно 10 мг/кг.
Эффекты AD-58632 в крысиной модели AIP
Дозозависимый эффект конъюгата AD-58632 на основе GalNAc с siRNA ALAS1 дополнительно исследовали в крысиной модели AIP. В этой модели siRNA в LNP использовали для нокдауна уровня PBGD исключительно в печени до индукции потребности в геме фенобарбиталом. Крысиная модель AIP характеризуется временным нокдауном siRNA PBGD в печени, характеризуется ~15% остаточной активностью mRNA PBGD и характеризуется приблизительно 10-50-кратным повышением уровней ALA и PBG при индукции суточной инъекцией фенобарбитала в течение трех дней.
Схема эксперимента показана на фиг. 20. Исследовали четыре группы крыс. Одну группу обрабатывали только фенобарбиталом (РВ) в указанные временные точки. Вторую группу обрабатывали фенобарбиталом и siRNA порфобилиногендезаминазы (PBGD). Третья группа получала фенобарбитал, siRNA PBGD и дозу в 30 мг/кг siRNA ALAS1. Четвертая группа получала фенобарбитал, siRNA PBGD и дозу в 10 мг/кг siRNA ALAS1. Как показано на фиг. 20, siRNA PBGD вводили внутривенно на 1 день. siRNA ALAS1 с GalNAc вводили на 4 день. Инъекции фенобарбитала вводили на 4, 5, 6 и 7 дни. Мочу собирали в течение 24-часового периода, начиная на 7 день и заканчивая на 8 день. Уровни mRNA PBGD, mRNA GAPDH и mRNA ALAS-1 оценивали на 8 день при помощи анализа с bDNA. Уровни PBG и ALA в моче определяли при помощи LC-MS.
Результаты по mRNA показаны на фиг. 21. siRNA PBGD снижала уровень mRNA PBGD, но не снижала уровень mRNA ALAS1. siRNA ALAS1 снижала уровни mRNA ALAS1 дозозависимым образом (см. фиг. 21). Результаты по уровням ALA и PBG показаны на фиг. 22. siRNA ALAS1 снижала уровни ALA и PBG дозозависимым образом (см. фиг. 22).
Пример 17. Введение дробных доз AD-58632
Эффективность конъюгата GalNAc с siRNA ALAS1 AD-58632 исследовали в двух отдельных парадигмах с введением дробных доз. Для каждого из этих исследований использовали самок крыс линии Sprague Dawley. Крыс содержали в SCLR (комната со световым циклом, в которой в течение 12 ч свет включен и в течение 12 ч свет выключен) и выводили из эксперимента через 72 ч после последней инъекции. Уровни mRNA ALAS1 и GAPDH в печени измеряли при помощи анализа с разветвленной ДНК (bDNA).
Парадигма пяти суточных доз против разовой болюсной дозы
В первой парадигме группам крыс вводили либо пять доз siRNA (по одной дозе каждый день), либо разовую болюсную дозу, которая содержала такую же общую концентрацию, как и сумма из пяти отдельных доз. В частности, крыс закрепляли за одним из следующих условий обработки: (1) подкожная инъекция по 6 мг/кг siRNA раз в день в течение пяти дней, (2) подкожная инъекция по 2 мг/кг siRNA раз в день в течение пяти дней, (3) подкожная инъекция по 1 мг/кг siRNA раз в день в течение пяти дней, (4) подкожная инъекция разовой болюсной дозы из 30 мг/кг siRNA, (5) подкожная инъекция разовой болюсной дозы из 10 мг/кг siRNA, (6) подкожная инъекция разовой болюсной дозы из 5 мг/кг siRNA или (7) контрольный лекарственный препарат, представляющий собой PBS.
Результаты показаны на фиг. 23. В этой парадигме разовая болюсная доза siRNA оказывала большее подавление mRNA ALAS1, чем повторное введение доз той же концентрации siRNA в течение пяти дней. Это было справедливо для всех изученных доз.
Введение дозы раз в неделю в течение четырех недель
При второй парадигме крысам вводили подкожные инъекции siRNA в одной из трех доз (10 мг/кг, 5 мг/кг или 2,5 мг/кг) раз в неделю в течение четырех недель. Контрольная группа получала инъекции PBS.
Результаты показаны на фиг. 24. По сравнению с введением разовой дозы, введение четырех доз раз в неделю по 10 мг/кг повышало достигаемый максимальный нокдаун (ED50 составляет 10 мг/кг в разовой дозе). В отличие от этого введение нескольких доз по 5 и 2,5 мг/кг в неделю при этой парадигме не повышало сайленсинг.
Пример 18. Идентификация и исследование siRNA ALAS1 с более КОРОТКИМИ смысловой и антисмысловой нитями
Дополнительные эксперименты проводили для исследования эффектов укорочения дуплексов siRNA до 19-19 нуклеотидов. Были выявлены пять дополнительных новых кросс-реактивных дуплексов из 19-19 нуклеотидов, которые связываются с mRNA-транскриптами ALAS1 человека (h) (NM_000688.4), макака-резус (rh) (XM_001090440.2), мыши (m) (NM_020559.2) и крысы (r) (NM_024484.2). Ни один из этих дуплексов не характеризовался такими же хорошими результатами, как AD-58632 из 21/23 нуклеотидов (см. фиг. 25).
Исследовали эффекты модификации длины и выступающих концов в отношении двух лучших дуплексов из 19-19 нуклеотидов (AD-59115 и AD-59125) (фиг. 26 и 27). Модифицированные последователь- 137 036477 ности показаны в табл. 21.
Таблица 21. Последовательности для оценки длины/выступающего конца лучших двух дуплексов из 19-19 нуклеотидов
SEQ ID NO: (смы слов ая) SEQ ID NO: (антисмысл о вая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_ 000688.4 Кроссреактивность Выступающий конец Название дуплекса Смысловая последовательность (5’-3’) Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3)
4172 4173 877-895 h/rh/m/r 19/19 AD-59115 AfsasGfaGfuGfu CfUfCfaUfcUfuC fuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcsusu
4174 4175 875-895 h/rh/m/r 19/21 AD-60090 AfsasGfaGfuGfu CfUfCfaUfcUfuC fuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcUfususc
4176 4177 877-895 NC ОН* 19/21 AD-60091 AfsasGfaGfuGfu CfUfCfaUfcUfuC fuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcUfusasa
4178 4179 873-895 h/rh/m/r 21/23 AD-58632 GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcUfuUfcsusg
4180 4181 875-895 NC ОН* 21/23 AD-60092 GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcUfuUfcsasa
4182 4183 875-893 h/rh/m/r 19/19 AD-59129 GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfususc
4184 4185 873-893 h/rh/m/r 19/21 AD-60093 GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcsusg
4186 4187 875-893 NC OH* 19/21 AD-60094 GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcsasa
4188 4189 871-893 h/rh 21/23 AD-60095 CfsasGfaAfaGfa GfuGfUfCfuCfaU fcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcUfgsgsu
4190 4191 871-893 m/r 21/23 AD-60096 CfsasGfaAfaGfa GfuGfUfCfuCfaU fcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcUfgsgsc
*Некомплементарный выступающий конец
Выступающие концы повышали эффективность. Они также представляли дополнительную производную последовательность (AD-60489, который был основан на AD-60095) для дополнительных исследований связи структура-активность (SAR) (1 ошибочно спаренное основание в положении 23 грызуна).
Пример 19. Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1
Исследовали эффекты дополнительного дуплекса AD-60489 на основе конъюгата GalNAc с siRNA ALAS1 и сравнивали их с эффектами AD-58632. Последовательности таких дуплексов показаны в табл. 22А. AD-60489 содержит одно ошибочно спаренное основание по отношению к mRNA ALAS1 грызуна на 3'-конце антисмысловой нити. Таким образом, в случае если AD-58632 полностью комплементарен последовательностям человека, макака-крабоеда, мыши и крысы, то AD-60489 полностью комплементарен только последовательностям человека и макака-крабоеда.
Таблица 22А. Последовательности дуплексов AD-58632 и AD-60489 с siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_ 000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
4149 4150 873-895 AD-58632 GfsasAfaGfaGfuGfUf CfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
4151 4152 871-893 AD-60489 CfsasGfaAfaGfaGfUf GfuCfuCfaUfcUfuAfL96 u s Afs a G f a U f gAfg Af ca c UfcUfuUfcUfgsgsu
Подавление mRNA ALAS1 показано на фиг. 28. По сравнению с AD-58632, AD-60489 обеспечивал более эффективное подавление при 3 и 10 мг/кг и характеризовался приблизительно двукратным улучшением ED50. Разовая доза ED50 AD-60489 составляла приблизительно 5 мг/кг.
Пример 20. Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в исследованиях на отличных от человека приматах
Эффективность AD-58632 и AD-60489 в подавлении mRNA в печени исследовали у отличных от человека приматов. Схема эксперимента показана на фиг. 29. Дозы siRNA (5, 2,5 или 1,25 мг/кг) или контроля PBS в объеме 2 мл/кг вводили подкожно каждый день в течение 5 дней, затем каждые 2 дня в течение 3 недель. Сайленсинг mRNA
ALAS1 оценивали в ткани печени, полученной в результате биопсии печени на 15 день. Биопсию брали после забора сыворотки и до введения дозы 10 (см. фиг. 29). Образцы сыворотки для способа оп- 138 036477 ределения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) (см. пример 21) собирали на -10, -3, 7, 15, 23, 31 и дни. Сыворотки собирали для биохимического анализа крови на -3, 6, 30 и 43 дни. Биохимический анализ включал оценку уровней аланинтрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и щелочной фосфатазы (ALP).
AD-58632 и AD-60489 подавляли уровни mRNA ALAS1 в печени дозозависимым образом (см. фиг. 30). AD-60489 характеризовался более высокой эффективностью, чем AD-58632. Например, в наименьшей изученной дозе (1,25 мг/кг) AD-60489 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 42% от контрольного уровня, в то время как AD-58632 характеризовался незначительным подавлением в этой дозе. При 2,5 мг/кг AD-60489 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 26% от контрольного уровня, в то время как AD-58632 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 64% от контрольного уровня. При 5 мг/кг AD-60489 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 21% от контрольного уровня, a AD-58632 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 55% от контрольного уровня.
Результаты клинической биохимии указывали, что длительный нокдаун ALAS1 при помощи siRNA ALAS1 был безопасным и хорошо переносился. Повышений уровней ALT, AST или ALP отмечено не было.
Пример 21. Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в исследованиях на отличных от человека приматах, которые оценивали при помощи анализа cERD
Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 оценивали у отличных от человека приматов при помощи способа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD). Этот способ описан, например, в Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (постер, представленный 9 февраля 2012 г. на симпозиуме Keystone Gene Silencing by small RNAs (Ванкувер, 7-12 февраля, 2012 г.) и Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, опубликованном во всемирной сети Интернет 19 декабря 2013 г. Как показано на фиг. 29, образцы сыворотки для способа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) собирали на -10, -3, 7, 15, 23, 31 и 43 дни.
Для анализа cERD образцы сыворотки размораживали на льду. 375-400 мкл 8 М LiCl добавляли к 33,5 мл сыворотки в ультрацентрифужные (UC) пробирки и инкубировали при температуре 4°С в течение по меньшей мере 1 ч. PBS добавляли сверху каждой UC пробирки, оставляя приблизительно 1 см сухого пространства сверху, чтобы предупредить сжатие стенок пробирок во время вращения. Пробирки сушили с удалением любого конденсата вследствие инкубации на льду. Образцы загружали в МС 55 Rotor под крышку и образцы центрифугировали при 150000-200000 g в течение 100-120 мин. Супернатант удаляли из осадка. 1 мл тризола добавляли к осадку в UC пробирке, пробирку перемешивали на вортексе и содержимое переносили в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. В каждую пробирку добавляли 200 мкл хлороформа и пробирку несколько раз опрокидывали верх дном для перемешивания. За один раз получали один образец. Образцы центрифугировали при 13000 об./мин в течение 10-20 мин при 4°С. Верхнюю водную фазу переносили в свежую 1,5 мл пробирку (объем ~500 мкл). Равные объемы 100% изопропанола, 1 мкл линейного акриламида (4°) и 1/10ую объема 3M NaoAc с рН 5,5 или менее добавляли к каждому образцу (как правило, 500 мкл изопропанола и 50 мкл NaoAc). Образец центрифугировали при 13000 об./мин в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты откладывали. Осадок промывали два раза охлажденным 70% EtOH (500 мкл при каждой промывке) и центрифугировали при 13000 об./мин в течение ~5 мин при 4°С после каждой промывки. Осадку позволяли высохнуть на воздухе в течение ~5 мин и затем ресуспендировали в 20 мкл NF Н2О. 10 мкл использовали в реакции с cDNA. Ресуспендированную РНК хранили при -80°С.
Результаты
Нокдаун mRNA в сыворотке, как было оценено при помощи анализа cERD, коррелировал с результатами, полученными в результате биопсии печени. См. фиг. 31. Это является неожиданным результатом, поскольку ALAS1 не является сывороточным белком. Анализ cERD, представленный в данном документе, способствует отслеживанию циркулирующей mRNA ALAS1. Это имеет преимущество, например, в том, что уровни mRNA ALAS1 можно измерять со временем без периодических биопсий печени, что было бы технически сложным и дорогостоящим.
Кинетику нокдауна mRNA определяли с помощью результатов анализа cERD. См. фиг. 32. AD60489 обеспечивал более чем 50% нокдаун, даже в дозе лишь 1,25 мг/кг.
Пример 22. Исследования безопасности siRNA ALAS1
Дополнительные исследования безопасности указывают на то, что длительный нокдаун ALAS1 является безопасным и хорошо переносится.
Исследования на отличных от человека приматах
Как описано выше (см. пример 20), в исследованиях на отличных от человека приматах повышений уровней ALT, AST или ALP после введения AD-60489 и AD-58632 не наблюдали.
Исследования на крысах
На крысах в течение четырех недель проводили исследование с применением AD-58632. siRNA
- 139 036477 вводили каждый день в течение 5 дней по 10 мг/кг в первую неделю, затем через день по 10 мг/кг в течение 2-4 недель исследования. Общее воздействие составило 140 мг. Побочных клинических признаков или изменений веса тела не наблюдали. Изменений, связанных с исследуемым препаратом, в параметрах крови или свертываемости крови не наблюдали. Кроме того, не наблюдали побочной гистопатологической картины. Наблюдали минимальную вакуолизацию в селезенке и минимальный субкапсулярный фиброз в почке.
Исследования на мышах
У мышей mRNA P450 оценивали после нокдауна ALAS1. Наблюдали незначительные дозозависимые повышения Сур2Ы0 через 48 ч после введения состава LNP с ALAS1. Через 168 ч происходил возврат к норме.
Пример 23. Идентификация дополнительных эффективных siRNA ALAS1 с помощью исследований связи структура-активность
Исследования связи структура-активность (SAR), в том числе исследования, описанные в других примерах в данном документе, проводили для идентификации дополнительных эффективных siRNA ALAS1, полученных из таковых, которые уже были идентифицированы, например, AD-58632 и AD60489. Исследовали эффекты химических модификаций. Химические модификации включают 1) 2'-Ометил- против 2'-фтор-модификаций, 2) снижение 2'Uf (2'-фтор-модификации), 3) добавление PS (фосфоротиоата), 4) использование внутренних dT, и/или 5) гликоль-нуклеиновые кислоты (GNA). Не желая быть связанными теорией, модификации могут усиливать эффективность, например, посредством 1) лучшего раскручивания или повышенной нагрузки RISC или 2) лучшим каталитическим захватом цели. Модификации также могут усиливать стабильность таким образом, что соединения могут накапливаться и функционировать эффективнее при введении нескольких доз.
Повышенную активность относительно других дуплексов (например, AD-58632 и/или AD-60489) наблюдали в некоторых случаях (см. табл. 22В), в то время как в других случаях наблюдали подобную активность (см. табл. 23) или сниженную активность (табл. 24). Эти случаи представлены лишь в качестве примеров на основании скрининга более чем 150 siRNA. В данном документе представлены дополнительные примеры исследований SAR.
Таблица 22В. Повышенная активность относительно исходных соединений
Дуплекс* IC50 Смысловая (от 5' к 3') Антисмысловая (от 5' к 3')
AD58632.10 (исходное) 0,017 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 (SEQ ID NO: 4192) asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg (SEQ ID NO: 4193)
AD- 80643.1 0,004 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 (SEQ ID NO: 4194) asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg (SEQ ID NO: 4195)
AD60489.3 (исходное) 0,010 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 (SEQ ID NO: 4196) usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4197)
AD- 60879.1 0,001 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfscUfsuAfsL96 (SEQ ID NO: 4198) usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4199)
*Число после десятичной точки в названии дуплекса в этой и других таблицах относится просто к серийному номеру изделия.
- 140 036477
Таблица 23. Подобная активность относительно исходных соединений и повышенная стабильность
Таблица 24. Сниженная активность относительно исходных соединений
Пример 24. In vitro исследования связи структура-активность AD-58632
Получали AD-58632 и производные siRNA AD-58632 и некоторые siRNA отслеживали in vitro в отношении активности. Сокращения химических модификаций представлены в табл.1. In vitro активность при 10 и 0,1 нМ siRNA
In vitro активность siRNA в подавлении mRNA ALAS1 исследовали в клетках Нер3В, которые трансфицировали с использованием Lipofectamine2000 в качестве средства трансфекции. Эксперименты проводили при указанных концентрациях siRNA (например, 0,1, 10 нМ) и анализировали при помощи анализа с разветвленной ДНК (bDNA) через 24 ч после трансфекции. Результаты выражали в виде процента оставшейся mRNA относительно siRNA AD-1955, нецелевой siRNA, которую использовали в каче стве отрицательного контроля.
Последовательности siRNA и результаты in vitro исследования представлены в табл. 25, 26 и 27.
Таблица 25. Последовательности и результаты in vitro скрининга для siRNA AD-58632 и siRNA производных AD-58632
SEQ ID NO: (смысловая ) SEQ ID NO: (антисмысл овая) Целевые сайты антисмысл овой последоват ельности NM_000688 .4 Дуплекс* Смысловая последовательность (5’-3’) Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3) Сред 10 нМ SD 10 нМ Средн 0,1 нМ SD o,1 нМ
4208 4209 873-895 AD-58632.8 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 11,79 2,70 46,65 4,21
4210 4211 873-895 AD-60405.1 GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 15,61 4,49 63,49 10,51
4212 4213 873-895 AD-60411.1 GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 15,04 6,13 62,59 10,05
4214 4215 873-895 AD-60417.1 GfsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 13,96 5,47 66,10 8,21
4216 4217 873-895 AD-60423.1 gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 12,59 3,03 41,47 3,77
4218 4219 873-895 AD-60423.2 gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 13,79 3,38 55,93 7,90
4220 4221 873-895 AD-60434.1 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 14,74 2,76 48,68 6,64
4222 4223 873-895 AD-60440.1 gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 28,31 8,68 77,01 3,99
4224 4225 873-895 AD-60400.1 gsasaagaguGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 39,90 5,67 99,64 8,58
4226 4227 873-895 AD-60406.1 gsasaagagugucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 56,06 2,08 95,83 17,01
4228 4229 873-895 AD-60412.1 GfsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 43,09 2,23 87,52 8,10
4230 4231 873-895 AD-60418.1 gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcsusg 65,84 7,75 108,07 21,88
4232 4233 873-895 AD-60424.1 gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa Ufg Afg Af cAf cu cuuUfcsusg 45,51 11,82 84,40 10,69
4234 4235 873-895 AD-60429.1 gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa Ufg Afg Af cAf cu cuuucsusg 63,96 13,25 81,21 1,96
4236 4237 873-895 AD-60435.1 gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 80,12 10,02 95,33 23,09
4238 4239 873-895 AD-60441.1 gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 63,29 17,48 97,07 8,04
4240 4241 873-895 AD-60401.1 gsasaaGfAfGfuGfucucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 55,27 10,26 109,06 4,23
4242 4243 873-895 AD-60407.1 GfsasaaGfAfGfuGfucucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 47,39 1,88 98,04 22,58
4244 4245 873-895 AD-60413.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 55,60 11,65 92,88 5,65
4246 4247 873-895 AD-60419.1 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 20,82 15,07 57,82 8,31
4248 4249 873-895 AD-60425.1 GfsasAfaGfAfGfuGfudCucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 35,58 13,30 73,46 10,91
4250 4251 873-895 AD-60430.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucdTcaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 40,54 1,41 81,87 11,23
4252 4253 873-895 AD-60436.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucudCaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 60,12 11,74 81,51 7,41
4254 4255 873-895 AD-60442.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucdAucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 40,82 12,61 83,06 1,05
4256 4257 873-895 AD-60402.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucadTcuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 62,16 11,24 123,60 6,71
4258 4259 873-895 AD-60408.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucaudCuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 45,39 15,50 86,69 6,12
4260 4261 873-895 AD-60414.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucudTcuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 32,56 3,52 84,21 0,24
4262 4263 873-895 AD-60420.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucuudCuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 52,57 10,77 94,45 3,43
4264 4265 873-895 AD-60426.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucuucudTL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAfcu cuuucsusg 52,49 1,91 91,15 14,49
4266 4267 873-895 AD-60431.1 gsasaaGfaGfuGfudCudCaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 26,66 1,16 73,09 6,83
4268 4269 873-895 AD-60437.1 gsasaaGfaGfuGfudCucadTcuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAfcu cuuucsusg 32,80 4,58 69,03 3,02
4270 4271 873-895 AD-60443.1 gsasaaGfaGfuGfudCucaucdTucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 35,10 7,10 69,92 17,93
- 141 036477
4272 4273 873 - 895 AD-60403.1 gsasaaGfaGfuGfudCudCaucdTucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 25,28 1,68 105,23 23,99
4274 4275 873 - 895 AD-60409.1 gsasaaGfaGfuGfudCudCadTcdTucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 30,48 1,88 72,34 3,34
4276 4277 873 - 895 AD-60415.1 gsasaaGfaGfuGfudCudCadTcdTudCuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 25,28 7,10 69,53 10,72
4278 4279 873 - 895 AD-60421.1 gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfadTgAfgAfcAfcucuuucsusg 59,28 5,83 66,88 0,63
4280 4281 873 - 895 AD-60427.1 gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcdTcuuucsusg 34,80 8,13 79,65 11,25
4282 4283 873 - 895 AD-60432.1 gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucdTuucsusg 46,78 6,42 79,19 16,72
4284 4285 873 - 895 AD-60438.1 gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfadTgAfgAfcAfcdTcuuucsusg 32,07 9,46 57,87 10,18
4286 4287 873 - 895 AD-60444.1 gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfadTgAfgAfcAfcucdTuucsusg 55,55 10,17 89,52 3,91
4288 4289 873 - 895 AD-60404.1 gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfa(Tgn)gAfgAfcAfcucuuucsusg 50,06 9,17 93,46 2,56
4290 4291 873 - 895 AD-60410.1 gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfc(Tgn)cuuucsusg 44,40 13,93 88,96 6,06
4292 4293 873 - 895 AD-60416.1 gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu c(Tgn)uucsusg 28,56 7,82 76,36 19,47
4294 4295 873 - 895 AD-60422.1 GfsasAfaGfAfGfuGf(Tgn)cucaucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 40,37 10,86 84,06 12,08
4296 4297 873 - 895 AD-60428.1 GfsasAfaGfAfGfuGfuc(Tgn)caucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 56,81 22,64 92,15 0,26
4298 4299 873 - 895 AD-60433.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc(Agn)ucuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 36,78 5,31 67,92 12,55
4300 4301 873 - 895 AD-60439.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucuca(Tgn)cuucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 32,81 6,72 77,93 13,33
4302 4303 873 - 895 AD-60445.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 13,25 3,28 78,08 4,05
4304 4305 873 - 895 AD-60451.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucu(Tgn)cuuL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 34,74 11,06 88,93 5,19
4306 4307 873 - 895 AD-60457.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucuuc(Tgn)uL96 as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg 41,26 6,16 92,15 0,64
4308 4309 873 - 895 AD-60463.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuAfL96 usAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 19,58 7,98 69,67 4,64
4310 4311 873 - 895 AD-60469.1 CfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfgsasc 19,35 9,30 72,30 0,50
4312 4313 873 - 895 AD-60474.1 CfsusAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuAfgsasc 21,60 4,27 76,35 11,71
4314 4315 873 - 895 AD-60479.1 CfsusUfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfaAfgsasc 28,01 4,45 76,55 27,32
4316 4317 873 - 895 AD-60484.1 CfsusUfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfaAfgsusg 20,31 3,08 71,99 9,53
4318 4319 873 - 895 AD-60446.1 GfsusUfuGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcAfaAfcsusg 18,65 5,11 73,52 17,87
4320 4321 873 - 895 AD-60452.1 GfsasUfuCfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfgAfaUfcsusg 28,72 1,21 83,09 15,75
4322 4323 873 - 895 AD-60458.1 GfsasAfuCfuGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcAfgAfuUfcsusg 50,15 13,02 114,93 11,58
4324 4325 873 - 895 AD-60464.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 (Ag n)AfsgAfaGfaUfgAfg acAfcUfcUfu Ufcsusg 35,71 5,07 103,88 3,01
4326 4327 873 - 895 AD-60470.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfs(Ggn)AfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g 17,59 0,78 73,15 11,75
4328 4329 873 - 895 AD-60475.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsg(Agn)aGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 22,07 4,57 68,64 25,12
4330 4331 873 - 895 AD-60480.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAf(Agn)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g 15,54 1,22 66,39 14,34
4332 4333 873 - 895 н.Д. GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfa(Ggn)aUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4334 4335 873 - 895 AD-60447.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGf(Agn)UfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g 31,33 4,75 104,36 7,71
4336 4337 873 - 895 AD-60453.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfa(T g n)g Afg acAfcUfcUfu Ufcsusg 15,42 0,90 76,29 0,41
4338 4339 873 - 895 AD-60459.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUf(Gg n)Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g 27,70 10,91 89,20 3,46
4340 4341 873 - 895 AD-60465.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfg(Agn)gacAfcUfcUfuUfcsusg 28,44 6,84 87,28 5,73
4342 4343 873 - 895 AD-60471.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAf(Ggn)acAfcUfcUfuUfcsus g 24,03 8,87 85,86 14,62
4344 4345 873 - 895 AD-60476.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfg(Agn)cAfcUfcUfuUfcsus g 21,48 5,53 88,73 25,48
4346 4347 873 - 895 AD-60481.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfu(Tgn) L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 15,18 4,19 68,10 6,86
4348 4349 873 - 895 AD-60486.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCf(Tgn)U fL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 15,31 0,31 74,06 8,48
4350 4351 873 - 895 AD-60448.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfu(Cgn)uUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 14,89 1,35 59,22 6,64
4352 4353 873 - 895 AD-60454.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf(Tgn)CfuU fL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 19,24 5,72 75,90 1,27
4354 4355 873 - 895 AD-60460.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 14,91 5,84 60,11 6,01
4356 4357 873 - 895 AD-60466.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfuU fL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 13,99 7,53 56,83 11,59
4358 4359 873 - 895 AD-60472.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfa(Tgn)cUfuCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 12,35 0,60 64,36 11,74
4360 4361 873 - 895 AD-60477.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCf(Agn)UfcUfuCfuU fL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 15,62 1,76 65,96 7,77
4362 4363 873 - 895 AD-60482.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu(Cgn)aUfcUfuCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 18,58 6,43 66,67 2,31
4364 4365 873 - 895 AD-60487.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCf(Tgn)CfaUfcUfuCfuU fL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 34,89 15,62 86,39 6,10
4366 4367 873 - 895 AD-60449.1 GfsasAfaGfaGfuGfUf(Cgn)uCfaUfcUfuCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 22,65 80,09 0,75
4368 4369 873 - 895 AD-60455.1 GfsasAfaGfaGfuGf(Tgn)CfuCfaUfcUfuCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 31,05 2,82 104,24 23,01
4370 4371 873 - 895 AD-60461.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfu(Cgn)uUf L96 asAfs(Ggn)AfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g 16,30 2,08 85,78 22,00
4372 4373 873 - 895 AD-60467.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf(Tgn)CfuU fL96 asAfsg(Agn)aGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 17,77 8,38 82,16 18,92
4374 4375 873 - 895 AD-60473.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 asAfsgAf(Agn)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g 14,64 4,25 61,05 7,88
4376 4377 873 - 895 н.Д. GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfuU fL96 asAfsgAfa(Ggn)aUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4378 4379 873 - 895 AD-60483.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfa(Tgn)cUfuCfuUf L96 asAfsgAfaGf(Agn)UfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g 26,18 2,83 91,12 16,03
4380 4381 873 - 895 AD-60488.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCf(Agn)UfcUfuCfuU fL96 asAfsgAfaGfa(T g n)g Afg acAfcUfcUfu Ufcsusg 24,74 0,56 87,66 7,90
4382 4383 873 - 895 AD-60450.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu(Cgn)aUfcUfuCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUf(Gg n)Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g 37,09 2,89 111,90 1,97
4384 4385 873 - 895 AD-60456.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCf(Tgn)CfaUfcUfuCfuU fL96 asAfsgAfaGfaUfg(Agn)gacAfcUfcUfuUfcsusg 41,82 0,60 102,56 11,25
4386 4387 873 - 895 AD-60462.1 GfsasAfaGfaGfuGfUf(Cgn)uCfaUfcUfuCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAf(Ggn)acAfcUfcUfuUfcsus g 38,91 3,89 122,47 35,17
4388 4389 873 - 895 AD-60468.1 GfsasAfaGfaGfuGf(Tgn)CfuCfaUfcUfuCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfg(Agn)cAfcUfcUfuUfcsus g 28,44 3,05 97,09 2,66
4390 4391 873 - 895 AD-60550.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfsL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 20,35 0,63 69,13 22,65
4392 4393 873 - 895 AD-60555.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfscUfsuCfuUfs L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 19,17 8,76 68,86 17,72
4394 4395 873 - 895 AD-60560.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfsL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfscUfsuUfscsusg 25,71 5,66 67,63 27,72
4396 4397 873 - 895 AD-60565.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfscUfsuCfuUfs L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfscUfsuUfscsusg 22,78 7,32 74,11 1,85
Как показано в табл. выше, в данном in vitro скрининге siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 80% подавление, так что оставалось менее 20% mRNA) при концентрации 10 нМ, включали AD-58632, AD-60472, AD-60423, AD-60445, AD-60423, AD-60417, AD60466, AD-60473, AD-60434, AD-60448, AD-60460, AD-60411, AD-60481, AD-60486, AD-60453, AD60480, AD-60405, AD-60477, AD-60461, AD-60470, AD-60467, AD-60482, AD-60446, AD-60555, AD60454, AD-60469 и AD-60463. Кроме того, в данном in vitro скрининге siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 30% подавление, так что оставалось менее 70%
142 mRNA) при концентрации 0,1 нМ, включали AD-60423, AD-58632, AD-60434, AD-60423, AD-60466, AD60419, AD-60438, AD-60448, AD-60460, AD-60473, AD-60411, AD-60405, AD-60472, AD-60477, AD60417, AD-60480, AD-60482, AD-60421, AD-60560, AD-60433, AD-60481, AD-60475, AD-60555, AD60437, AD-60550, AD-60415, AD-60463 и AD-60443.
Как показано в табл. ниже, исследование дополнительных siRNA показало, что следующие дуплексы обеспечивали более чем 80% подавление при концентрации 10 нМ: AD-58632, AD-60405, AD-60423, AD-60434, AD-60445, AD-60480, AD-60460 и AD-60466, а следующие дуплексы обеспечивали более чем 30% подавление при концентрации 0,1 нм: AD-58632, AD-60405, AD-60423, AD-60434, AD-60419, AD60480, AD-60460 и AD-60466.
Таблица 26. Дополнительные последовательности и результаты in vitro скрининга для siRNA AD-58632 и siRNA производных AD-58632
SEQ ID NO: (смысл овая) SEQ ID NO: (антисмысл овая) Целевые сайты антисмысловой последовательно сти NM_000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5’-3’) Антисмысловая (AS) последовательность (5-3) Средн . 10 нМ SD 10 нМ Средн 0,1 нМ SD 0,1 нМ
4398 4399 873 - 895 AD-58632.8 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 11,8 2,7 46,7 4,2
4400 4401 873 - 895 AD-60405.1 GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 15,6 4,5 63,5 10,5
4402 4403 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg
4404 4405 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 as Afsg Afa Gf au g Afg AfcAfcu cu u u cs u sg
4406 4407 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg
4408 4409 873 - 895 AD-60423.2 gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 13,8 3,4 55,9 7,9
4410 4411 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4412 4413 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg
4414 4415 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 as Afsg Afa Gfau g Afg AfcAfcu cu u u cs u sg
4416 4417 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg
4418 4419 873 - 895 AD-60434.1 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg 14,7 2,8 48,7 6,6
4420 4421 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4422 4423 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg
4424 4425 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 as Afsg Afa Gfau g Afg AfcAfcu cu u u cs u sg
4426 4427 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg
4428 4429 873 - 895 AD-60419.1 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg 20,8 15,1 57,8 8,3
4430 4431 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4432 4433 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg
4434 4435 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg
4436 4437 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg
4438 4439 873 - 895 AD-60445.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg 13,3 3,3 78,1 4,0
4440 4441 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4442 4443 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg
4444 4445 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg
4446 4447 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg
4448 4449 873 - 895 AD-60480.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 asAfsgAf(Ag n)GfaUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g 15,5 1,2 66,4 14,3
4450 4451 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsgAf(Ag n)GfaUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g
4452 4453 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 asAfsgAf(Ag n)GfaUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g
4454 4455 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g
4456 4457 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAf(Ag n)GfaUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g
4458 4459 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucs(Tgns)ucuuL9 6 asAfsgAfs(Agns)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcs usg
4460 4461 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg
4462 4463 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg
4464 4465 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg
4466 4467 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg
4468 4469 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg
4470 4471 873 - 895 Gfs as Af aGfAfGfu Gfucucaucs(Tgns)ucuuL9 6 asAfsgAfs(Agns)GfaugAfgacAfcucuuucsusg
4472 4473 873 - 895 AD-58632.8 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 11,8 2,7 46,7 4,2
4474 4475 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4476 4477 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4478 4479 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4480 4481 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfsuCfsuUf sL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4482 4483 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfsucsuUfs L96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4484 4485 873 - 895 AD-60460.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 14,9 5,8 60,1 6,0
4486 4487 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4488 4489 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4490 4491 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4492 4493 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)suCfsu UfsL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
- 143 036477
4494 4495 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)sucsu UfsL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4496 4497 873 - 895 AD-60466.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 14,0 7,5 56,8 11,6
4498 4499 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4500 4501 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4502 4503 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4504 4505 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)UfsuCfs uUfsL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4506 4507 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)Ufsucs uUfsL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
Таблица 27. Дополнительные последовательности siRNA производных AD-58632
SEQIDNO: (Смыслова я) SEQIDNO: (антисмыслова я) Целевые сайты антисмысловой последовательное ти NM_ Названи е дуплекс а Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая поел e до в ател ьн о ст ь (5'-3')
4508 4509 873 - 895 AD58632 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc U fuCfuUfL96 as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc U fcUfuUfcsusg
4510 4511 873 - 895 AD60405.1 Gfs as Af aGfaGfu Gfu Cfu Cfa u cu и C fuuL96 as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc U fcUfuUfcsusg
4512 4513 873 - 895 AD60887 GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuu C fuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAf cu cuuucsusg
4514 4515 873 - 895 AD60923 GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuu C fuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc Afc UfcUfuUfcsusg
4516 4517 873 - 895 AD60434.1 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuu L9 6 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc Afc UfcUfuUfcsusg
4518 4519 873 - 895 AD60892 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuu L9 6 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAf cu cuuucsusg
4520 4521 873 - 895 AD60891 gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuu L9 6 as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc U fcUfuUfcsusg
4522 4523 873 - 895 AD60419.1 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuu cu uL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAf c ucuuucsusg
4524 4525 873 - 895 AD60924 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuu cu uL96 as Afs GfAfa Gfa Ufg Afg Afc Af cUfcUfuUfcsusg
4526 4527 873 - 895 AD60885 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuu cu uL96 as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc UfcUfuUfcsusg
4528 4529 873 - 895 AD60445.1 Gfs as Af aGfAfGfu Gfucucau c(T g n)u cuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAf c ucuuucsusg
4530 4531 873 - 895 AD60925 Gfs as Af aGfAfGfu Gfucucau c(T g n)u cuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc Af cUfcUfuUfcsusg
4532 4533 873 - 895 AD60890 Gfs as Af aGfAfGfu Gfucucau c(T g n)u cuuL96 as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc U fcUfuUfcsusg
4534 4535 873 - 895 AD60926 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc Uf uCfuUfL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc Af cUfcUfuUfcsusg
IC50 на основе активности in vitro
Аналогично экспериментам, описанным выше, проводили дополнительные эксперименты дозаответ при конечной концентрации дуплексов 10, 1,66667, 0,277778, 0,046296, 0,007716, 0,001286, 0,000214 и 3,57Е-05 нМ и рассчитывали величины IC50.
- 144 036477
Таблица 28. Дополнительные последовательности и IC50 siRNA AD-58632 и siRNA производных AD-58632
SEQID NO: (Смыслова я) SEQ ID NO: (антисмыслова я) Целевые сайты антисмысло вой последоват ельности NM_000688. 4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5-3) Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3) IC50
4536 4537 873 - 895 AD-58632.10 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,017
4538 4539 873 - 895 AD-60405.2 GfsasAfaGfaGfuGfuCfu CfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,070
4540 4541 873 - 895 AD-60887.1 GfsasAfaGfaGfuGfuCfu CfaucuuCfuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg 0,120
4542 4543 873 - 895 AD-60819.1 GfsasAfaGfaGfuGfuCfu CfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg 0,009
4544 4545 873 - 895 AD-60823.1 GfsasAfaGfaGfuGfuCfu CfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg 0,032
4546 4547 873 - 895 AD-60423.3 gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgA fcAfcUfcUfuUfcsusg 0,020
4548 4549 873 - 895 AD-60889.1 gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg 0,242
4550 4551 873 - 895 AD-60827.1 gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg 0,044
4552 4553 873 - 895 AD-60831.1 gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg 0,077
4554 4555 873 - 895 AD-60434.2 gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgA fcAfcUfcUfuUfcsusg 0,028
4556 4557 873 - 895 AD-60891.1 gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,078
4558 4559 873 - 895 AD-60892.1 gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg 0,138
4560 4561 873 - 895 AD-60835.1 gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg 0,015
4562 4563 873 - 895 AD-60839.1 gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg 0,014
4564 4565 873 - 895 AD-60419.2 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg 0,014
4566 4567 873 - 895 AD-60885.1 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,091
4568 4569 873 - 895 AD-60419.3 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg 0,026
4570 4571 873 - 895 AD-60843.1 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg 0,004
4572 4573 873 - 895 AD-60847.1 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg 0,012
- 145 036477
4574 4575 873 - 895 AD-60445.2 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg 0,077
4576 4577 873 - 895 AD-60890.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 1,201
4578 4579 873 - 895 AD-60445.3 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg 0,302
4580 4581 873 - 895 AD-60820.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg 0,006
4582 4583 873 - 895 AD-60824.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg 0,032
4584 4585 873 - 895 AD-60480.2 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg 0,066
4586 4587 873 - 895 AD-60893.1 gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg 0,034
4588 4589 873 - 895 AD-60884.1 gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg 0,157
4590 4591 873 - 895 AD-60886.1 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg 0,801
4592 4593 873 - 895 AD-60888.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg 0,201
4594 4595 873 - 895 AD-60828.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc aucs(Tgns)ucuuL96 asAfsgAfs(Agns)GfaUf gAfgacAfcUfcUfuUfcsu sg 0,145
4596 4597 873 - 895 AD-60832.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg 0,036
4598 4599 873 - 895 AD-60836.1 gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg 0,076
4600 4601 873 - 895 AD-60840.1 gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg 0,033
4602 4603 873 - 895 AD-60844.1 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg 0,017
4604 4605 873 - 895 AD-60848.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg 0,007
4606 4607 873 - 895 AD-60821.1 GfsasAfaGfAfGfuGfucuc aucs(Tgns)ucuuL96 asAfsgAfs(Agns)Gfaug AfgacAfcucuuucsusg 0,076
4608 4609 873 - 895 AD-58632.11 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,063
4610 4611 873 - 895 AD-60825.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,031
4612 4613 873 - 895 AD-60829.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg 0,033
4614 4615 873 - 895 AD-60833.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg 0,100
4616 4617 873 - 895 AD-60837.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfsuCfsuUfsL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg 0,031
4618 4619 873 - 895 AD-60841.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfsucsuUfsL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfga cAfcdTcUfuUfcsusg 0,010
4620 4621 873 - 895 AD-60460.2 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfc(Tgn)uCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,009
4622 4623 873 - 895 AD-60845.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)uCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,002
4624 4625 873 - 895 AD-60849.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfc(Tgn)uCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg 0,005
4626 4627 873 - 895 AD-60822.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)uCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg 0,007
4628 4629 873 - 895 AD-60826.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)suCfsuUfs L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg 0,009
4630 4631 873 - 895 AD-60830.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)sucsuUfsL 96 asAfsGfAfaGfaUfgAfga cAfcdT cUfuUfcsusg 0,019
4632 4633 873 - 895 AD-60466.2 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUf(Cgn)UfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,066
4634 4635 873 - 895 AD-60834.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfuCfuUfL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg 0,024
4636 4637 873 - 895 AD-60838.1 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUf(Cgn)UfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg 0,013
4638 4639 873 - 895 AD-60842.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfuCfuUfL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg 0,010
4640 4641 873 - 895 AD-60846.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfsuCfsuUf sL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg 0,011
4642 4643 873 - 895 AD-60850.1 GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfsucsuUfs L96 asAfsGfAfaGfaUfgAfga cAfcdTcUfuUfcsusg 0,018
Как показано в табл. 28, следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,01 нМ: AD60845, AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, AD-60460.
Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,02 нМ: AD-60845, AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, AD-60460, AD-60841, AD-60842, AD-60846, AD60847, AD-60838, AD-60419, AD-60839, AD-60835, AD-586320, AD-60844, AD-60850 и AD-60830.
Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,05 нМ: AD-60845, AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, и AD-60460, AD-60841, AD-60842, AD-60846, AD-60847, AD-60838, AD-60419, AD-60839, AD-60835, AD-586320, AD-60844, AD-60850, AD-60830, AD60423, AD-60834, AD-60419, AD-60434, AD-60825, AD-60837, AD-60823, AD-60824, AD-60840, AD60829, AD-60893, AD-60832 и AD-60827.
Пример 25. In vivo исследования связи структура-активность AD-58632
Получали производные исходной siRNA AD-58632 и подвергали скринингу in vivo на крысах. Последовательности siRNA, которые отслеживали, представлены в табл. ниже.
- 146 036477
Таблица 29. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысло вая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_0006SS.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
4644 4645 873-895 AD-58632 GfsasAfaGfaGfuGfUfC fuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAf cUfcUfuUfcsusg
4646 4647 873-895 AD-60405 GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAf cUfcUfuUfcsusg
4648 4649 873-895 AD-60887 GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 a s Afs Gf Af a G f a u g Af gAf c A fcucuuucsusg
4650 4651 873-895 AD-60923 gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 a s Afs Gf Af a G f a U f gAfg Af c AfcUfcUfuUfcsusg
4652 4653 873-895 AD-60434 gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 a s Afs Gf Af a G f a U f gAfg Af c AfcUfcUfuUfcsusg
4654 4655 873-895 AD-60892 gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 a s Afs Gf Af a G f a u g Af gAf c A fcucuuucsusg
4656 4657 873-895 AD-60419 GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 a s Afs Gf Af a G f a u g Af gAf c A fcucuuucsusg
4658 4659 873-895 AD-60924 GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg
4660 4661 873-895 AD-60445 GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 a s Afs Gf Af a G f a u g Af gAf c A fcucuuucsusg
4662 4663 873-895 AD-60925 GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg
4664 4665 873-895 AD-60926 GfsasAfaGfaGfuGfUfC fuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg
Вводили разовую дозу 5 мг/кг siRNA. Через 5 дней после введения siRNA, проводили измерения уровней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH), при помощи анализа с bDNA, и уровни лекарственного средства в ткани определяли при помощи qPCR. Результаты представлены на фиг. 33 и 34. Как показано на фиг. 33, по меньшей мере десять дуплексов (AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925 и AD-60926), которые отслеживали, характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-58632. Кроме того, как показано на фиг. 34, эти дуплексы (за исключением AD-60926) обеспечивали более высокие концентрации в печени, чем AD-58632.
Пример 26. Эффективность AD-60925 и AD-60926 в крысиной модели AIP
Терапевтическую эффективность AD-60925 и AD-60926 (описанных в предыдущем примере) исследовали на крысиной модели AIP. Схема эксперимента показана вверху фиг. 35. Крыс обрабатывали PBS или 3 мг/кг siRNA ALAS1-GalNAc t.i.w., фенобарбиталом (РВ) и siRNA PBGD в составе LNP с AF11 (AF11-PBGD) в периоды времени, указанные на фиг. 35. Контрольные крысы получали только siRNA PBGD без индукции фенобарбиталом.
Результаты показаны на фиг. 35, 36 и 37. Введение фенобарбитала индуцировало экспрессию mRNA ALAS1 и повышало уровни PBG и ALA в моче по сравнению с контролем. Обработка суммарно восемью дозами в 3 мг/кг AD-60925 или AD-60926 три раза в неделю подавляла mRNA ALAS1 (фиг. 35), PBG в моче (фиг. 36 и 37, вверху) и ALA в моче (фиг. 36 и 37, внизу). Фенобарбитал индуцировал повышения mRNA ALAS1, PBG и ALA в моче. Динамика эффектов лечения показана на фиг. 37. Стрелки указывают на временные точки при введении РВ. Обработка siRNA предупреждала индуцированные фенобарбиталом повышения mRNA ALAS1, PBG и ALA в моче.
Как AD-60925, так и AD-60926 характеризовались терапевтической эффективностью лечения AIP. AD-60925 был более эффективным, чем AD-60926 в подавлении mRNA ALAS1, ALA в моче и PBG в моче.
Пример 27. Дополнительные in vivo исследования связи структура-активность AD-58632
Получали производные исходной siRNA AD-58632 и подвергали скринингу in vivo на крысах.
In vivo скрининг, часть I
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в таблице ниже.
- 147 036477
Таблица 30. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысло вая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_0006SS.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
4666 4667 873-895 AD-58632 GfsasAfaGfaGfuGfUfC fuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcU fcUfuUfcsusg
4668 4669 873 - 895 AD-60820 GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 a s Af sgAf a G f a u g Af gAf c Af c u cuuucsusg
4670 4671 873 - 895 AD-60824 GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 a s Af sgAf a G f a u g Af ga c Af c u c uuucsusg
4672 4673 873 - 895 AD-61137 GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcsusg
4674 4675 873 - 895 AD-60843 GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 a s Af sgAf a G f a u g Af gAf c Af c u cuuucsusg
4676 4677 873 - 895 AD-60847 GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 a s Af sgAf a G f a u g Af ga c Af c u c uuucsusg
4678 4679 873 - 895 AD-61138 GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcsusg
4680 4681 873 - 895 AD-60819 GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 a s Af sgAf a G f a u g Af gAf c Af c u cuuucsusg
4682 4683 873 - 895 AD-60823 GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 a s Af sgAf a G f a u g Af ga c Af c u c uuucsusg
4684 4685 873 - 895 AD-61139 GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcsusg
4686 4687 873 - 895 AD-61140 GfsasAfaGfaGfuGfdTC fuCfaUfc(Tgn)uCfuUfL 96 a s Af sgAf a G f a u g Af gAf c Af c u cuuucsusg
Крысам вводили четыре дозы по 2,5 мг/кг siRNA дважды в неделю (два раза в неделю) в течение двух недель. Через 72 ч после введения последней дозы siRNA животных выводили из эксперимента и выполняли измерения уровней mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH) при помощи анализа с bDNA.
Как показано на фиг. 38, по меньшей мере четыре из siRNA (AD-60820, AD-60843, AD-60819 и AD61140), которые исследовали, характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-58632.
In vivo скрининг, часть II
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в табл. ниже.
Таблица 31. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысло вая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_0006SS.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
4688 4689 873 - 895 AD-58632 GfsasAfaGfaGfuGfUfC fuCfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
4690 4691 873 - 895 AD-61141.2 GfsasAfaGfaGfuGfdTC fuCfaUfc(Tgn)uCfuUfL 96 asAfsgAfaGfaugAfgacA fcucuuucsusg
4692 4693 873 - 895 AD-61142.2 GfsasAfaGfaGfuGfdTC fuCfaUfc(Tgn)uCfuUfL 96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg
4694 4695 873 - 895 AD-60835 gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg
4696 4697 873 - 895 AD-60839 gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacA fcucuuucsusg
4698 4699 873 - 895 AD-61143.2 gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg
4700 4701 873 - 895 AD-61144.1 gsasaagaGfuGfdTCfuc aucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg
4702 4703 873 - 895 AD-61145.1 gsasaagaGfuGfdTCfuc aucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacA fcucuuucsusg
4704 4705 873 - 895 AD-61146.1 gsasaagaGfuGfdTCfuc aucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg
Крысам вводили разовую дозу 2,5 мг/кг siRNA. Через 72 ч после введения siRNA измерения уров- 148 036477 ней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALASl) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH) выполняли при помощи анализа с bDNA.
Как показано на фиг. 39, siRNA AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144,
AD-61145 и AD-61146 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD58632. siRNA, которая обеспечивала наибольшее подавление в этом эксперименте, была AD-60835.
Пример 28. In vitro исследования связи структура-активность AD-60489
Получали AD-60489 и производные siRNA AD-60489 и некоторые siRNA подвергали скринингу in vitro в отношении активности. In vitro активность siRNA в подавлении mRNA ALAS1 исследовали, как описано в примере 24. Последовательности siRNA и результаты in vitro исследования представлены ниже в таблицах.
Таблица 32. Последовательности и результаты in vitro скрининга для siRNA AD-60489 и siRNA производных AD-60489
SEQID NO: (смысл овая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM 000688.4 Название дуплекса* Смысловая последовательность (5’-3’) Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3’) Средн. 10 нМ SD 10 нМ Средн. 0,1 нМ SD o,1 нМ
4706 4707 871-893 AD-60489.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu 17,02 0,18 50,65 5,11
4708 4709 871-893 AD-60495.1 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu 17,13 5,94 63,58 18,6 1
4710 4711 871-893 AD-60501.1 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu 11,90 0,66 45,19 8,93
4712 4713 871-893 AD-60507.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucu uAfL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu 14,63 7,85 48,50 19,5 5
4714 4715 871-893 AD-60513.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucu uaL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu 14,39 2,44 51,03 7,01
4716 4717 871-893 AD-60519.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu 14,67 4,88 51,70 7,72
4718 4719 871-893 AD-60525.1 csasgaaaGfaGfuguCfuCfaucuua L96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu 45,24 18,16 105,09 14,1 7
4720 4721 871-893 AD-60531.1 csasgaaaGfaGfugucuCfaucuuaL 96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu 62,19 12,47 107,18 1,37
4722 4723 871-893 AD-60490.1 csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu 39,06 10,92 82,70 10,6 7
4724 4725 871-893 AD-60496.1 csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcu gsgsu 48,90 1,85 71,55 5,47
4726 4727 871-893 AD-60502.1 csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuucug sgsu 51,83 12,62 81,85 4,25
4728 4729 871-893 AD-60508.1 csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcuuucugs gsu 65,34 21,75 89,23 11,0 8
4730 4731 871-893 AD-60514.1 csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcucuuucugsg SU 97,13 3,47 102,94 7,36
4732 4733 871-893 AD-60520.1 csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 u s Afs Af Gf au gAfg Af cAfcu cu u u cugsg s u 104,97 0,93 126,75 20,4 7
4734 4735 871-893 AD-60526.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcu cu u u cugsg s u 61,48 15,44 81,28 7,99
4736 4737 871-893 AD-60532.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu 83,47 13,36 94,13 8,11
4738 4739 871-893 AD-60491.1 csasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 UsAfsAfGfaugAfgAfcAfcdTcuuucugs gsu 109,05 0,43 97,85 9,77
4740 4741 871-893 AD-60497.1 CfsasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu 73,81 10,17 95,01 5,40
4742 4743 871-893 AD-60503.1 csasgaaaGfAfGfudGucucaucuua L96 usAfsAfGfaugAfgAfcAfcdTcuuucugs gsu 75,30 11,29 96,03 6,30
4744 4745 871-893 AD-60509.1 csasgaaaGfAfGfugudCucaucuua L96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu 71,37 24,41 104,36 18,6 2
4746 4747 871-893 AD-60515.1 csasgaaaGfAfGfugucudCaucuua L96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu 64,16 13,95 98,80 0,92
4748 4749 871-893 AD-60521.1 csasgaaaGfAfGfugucucadTcuua L96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu 73,99 36,39 99,96 7,29
4750 4751 871-893 AD-60527.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucdTua L96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu 82,69 26,56 114,13 4,81
4752 4753 871-893 AD-60533.1 csasgaaaGfAfGfudGudCucaucu uaL96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu 89,41 4,69 107,40 9,67
4754 4755 871-893 AD-60492.1 csasgaaaGfAfGfudGucudCaucu uaL96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu 83,52 1,56 100,70 0,79
4756 4757 871-893 AD-60498.1 csasgaaaGfAfGfudGucucadTcuu aL96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu 64,64 16,21 98,41 19,6 0
4758 4759 871-893 AD-60504.1 csasgaaaGfAfGfudGudCucadTc uuaL96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cuuucugs gsu 57,55 5,13 93,14 0,41
4760 4761 871-893 AD-60510.1 csasgaaaGfAfGfudGudCudCadT cuuaL96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cuuucugs gsu 58,88 25,48 91,39 2,06
4762 4763 871-893 AD-60516.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 u s Afs Af Gf ad T g Afg AfcAfcd Tcu u u cu g sgsu 53,24 6,56 84,40 2,73
4764 4765 871-893 AD-60522.1 csasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 u s Afs Af Gf ad T gAfg AfcAfcd Tcu u u cu g sgsu 67,17 6,48 91,62 5,43
4766 4767 871-893 AD-60528.1 CfsasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 u s Afs Af Gf ad T gAfg AfcAfcd Tcu u u cu g sgsu 81,44 37,04 89,71 8,60
4768 4769 871-893 AD-60534.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 usAfsAfGfaugAfgAfcAfcdT cdTuucug sgsu 62,63 20,55 99,62 7,37
4770 4771 871-893 AD-60493.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 usAfsAfGfaugAfgAfcAfcdT cuudT cug sgsu 107,18 0,11 87,98 2,41
4772 4773 871-893 AD-60499.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 u s Afs Af Gf ad T gAfg AfcAfcd Tcu ud Tcu gsgsu 35,92 13,78 77,52 6,68
4774 4775 871-893 AD-60505.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfc(T g n) cu u u cu gsgsu 66,77 16,45 109,82 2,48
4776 4777 871-893 AD-60511.1 csasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfc(T g n) cu u u cu gsgsu 82,10 10,11 95,50 14,7 3
4778 4779 871-893 AD-60517.1 CfsasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 u s Afs AfGfau gAfg Af cAfc(T g n) cu u u cu gsgsu 80,83 29,69 93,57 18,4 1
4780 4781 871-893 AD-60523.1 GfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfc scsa 29,60 1,64 67,16 8,40
4782 4783 871-893 AD-60529.1 GfsusGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcAfc scsa 21,15 1,21 79,02 28,9 9
4784 4785 871-893 AD-60535.1 GfsusGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfgAfc scsa 31,78 13,54 79,36 26,5 6
4786 4787 871-893 AD-60494.1 GfsusGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfgAfc sgsu 30,14 3,42 81,46 12,8 8
4788 4789 871-893 AD-60500.1 CfsusCfuAfaGfaGfUfGfuCfuCfaU fcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuAfgAfg sgsu 29,85 11,78 72,14 4,56
4790 4791 871-893 AD-60506.1 CfsusCfuUfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfaAfgUfg sgsu 19,06 1,98 88,93 11,1 3
- 149 036477
Таблица 33. Последовательности и результаты in vitro скрининга для siRNA AD-60489 и siRNA производных AD-60489
4792 4793 871-893 AD-60512.1 CfsusGfuUfuGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 u s Afs a Gf aUfg Afg Afca cUfcAf aAfcUfg sgsu 29,71 1,79 86,32 17,6 9
4794 4795 871-893 AD-60518.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 (Tgns)AfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu 27,47 2,59 81,03 10,9 3
4796 4797 871-893 AD-60524.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfs(Agn)GfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu 17,02 1,39 71,65 17,4 2
4798 4799 871-893 н.Д. CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsa(Ggn)aUfgAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu
4800 4801 871-893 AD-60536.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGf(Agn)aUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu 61,77 10,19 91,55 2,20
4802 4803 871-893 AD-60541.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfa(Tgn)gAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu 25,47 2,83 54,36 15,0 2
4804 4805 871-893 AD-60546.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUf(Ggn)AfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu 49,32 1,50 90,79 11,3 6
4806 4807 871-893 AD-60551.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfg(Agn)gAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu 24,37 1,11 76,80 24,9 9
4808 4809 871-893 AD-60556.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAf(Ggn)AfcacUfcUfuUf cUfgsgsu 21,43 4,71 61,90 5,64
4810 4811 871-893 AD-60561.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfg(Agn)cacUfcUfuUfc Ufgsgsu 28,25 6,41 71,84 27,0 1
4812 4813 871-893 AD-60566.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAf(Cgn)acUfcUfuUf cUfgsgsu 27,57 4,87 67,91 18,2 8
4814 4815 871-893 AD-60570.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfc(Agn)cUfcUfuUf cUfgsgsu 24,11 0,04 58,75 21,0 2
4816 4817 871-893 AD-60583.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfu(Agn)L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 15,32 4,78 42,01 9,51
4818 4819 871-893 AD-60585.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUf(Tgn)AfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 21,15 4,14 49,54 13,3 4
4820 4821 871-893 AD-60587.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Ufc(Tgn)uAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 14,66 1,73 41,47 13,2 0
4822 4823 871-893 AD-60589.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Uf(Cgn)UfuAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 20,77 5,12 43,97 15,6 3
4824 4825 871-893 AD-60591.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa( Tgn)cUfuAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 13,66 0,05 36,42 16,9 4
4826 4827 871-893 AD-60592.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(A gn)UfcUfuAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 13,35 4,11 35,43 11,3 6
4828 4829 871-893 AD-60593.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn )aUfcUfuAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 15,13 0,28 39,99 19,3 9
4830 4831 871-893 AD-60582.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCf(Tgn) CfaUfcUfuAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 19,56 8,17 51,59 1,11
4832 4833 871-893 AD-60584.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu(Cgn)uC faUfcUfuAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 23,36 6,63 58,79 10,3 5
4834 4835 871-893 AD-60586.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGf(Tgn)Cfu CfaUfcUfuAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 27,78 2,20 76,86 6,81
4836 4837 871-893 AD-60588.1 CfsasGfaAfaGfaGfUf(Ggn)uCfuC faUfcUfuAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 105,27 14,25 99,26 19,6 2
4838 4839 871-893 AD-60590.1 CfsasGfaAfaGfaGf(Tgn)GfuCfuC faUfcUfuAfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg 28,74 1,66 81,88 22,0 4
4840 4841 871-893 AD-60558.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Ufc(Tgn)uAfL96 usAfs(Agn)GfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu 22,74 14,85 60,42 19,3 8
4842 4843 871-893 н.Д. CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Uf(Cgn)UfuAfL96 usAfsa(Ggn)aUfgAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu
4844 4845 871-893 AD-60568.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa( Tgn)cUfuAfL96 usAfsaGf(Agn)aUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu 86,66 21,93 110,05 16,4 4
4846 4847 871-893 AD-60572.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(A gn)UfcUfuAfL96 usAfsaGfa(Tgn)gAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu 22,37 4,86 71,24 22,1 9
4848 4849 871-893 AD-60539.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn )aUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUf(Ggn)AfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu 43,35 14,53 104,44 2,51
4850 4851 871-893 AD-60544.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCf(Tgn) CfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfg(Agn)gAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu 25,85 1,18 69,98 5,86
4852 4853 871-893 AD-60549.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu(Cgn)uC faUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAf(Ggn)AfcacUfcUfuUf cUfgsgsu 29,40 4,62 72,98 20,1 6
4854 4855 871-893 AD-60554.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGf(Tgn)Cfu CfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfg(Agn)cacUfcUfuUfc Ufgsgsu 33,74 0,45 75,36 19,3 9
4856 4857 871-893 н.Д. CfsasGfaAfaGfaGfUf(Ggn)uCfuC faUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAf(Cgn)acUfcUfuUf cUfgsgsu
4858 4859 871-893 AD-60564.1 CfsasGfaAfaGfaGf(Tgn)GfuCfuC faUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfc(Agn)cUfcUfuUf cUfgsgsu 27,77 10,34 77,01 11,5 1
4860 4861 871-893 AD-60569.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfsL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu 20,34 5,29 59,40 19,7 4
4862 4863 871-893 AD-60573.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfscUfsuAfsL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu 20,07 3,83 60,80 14,9 3
4864 4865 871-893 AD-60540.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfsL96 usAfsaGfaUfsgAfgAfcacUfcUfsuUfsc Ufgsgsu 24,36 0,56 75,75 14,9 7
4866 4867 871-893 н.Д. CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfscUfsuAfsL96 usAfsaGfaUfsgAfgAfcacUfcUfsuUfsc Ufgsgsu
В in vitro скрининге, для которого результаты показаны в таблицах выше, siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 80% подавления, так что оставалось менее 20% mRNA) при концентрации 10 нМ, включали AD-60501, AD-60592, AD-60591, AD-60513, AD-60507, AD-60587, AD-60519, AD-60593, AD-60583, AD-60524, AD-60489, AD-60495, AD-60506, и AD-60582.
В in vitro скрининге, для которого результаты показаны в таблицах выше, siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 30% подавления, так что оставалось менее 70% mRNA) при концентрации 0,1 нМ, включали AD-60592, AD-60591, AD-60593, AD-60587, AD-60583, AD-60589, AD-60501, AD-60507, AD-60585, AD-60489, AD-60513, AD-60582, AD-60519, AD-60541, AD60570, AD-60584, AD-60569, AD-60558, AD-60573, AD-60556, AD-60495, AD-60523, AD-60566 и AD60544.
Как показано в табл. ниже, исследование дополнительных siRNA показало, что следующие дуплексы обеспечивали более чем 80% подавление при концентрации 10 нМ: AD-60489, AD-60495, AD-60501, AD-60507, AD-60513, AD-60519, AD-60583, AD-60591, AD-60592 и AD-60593, а следующие дуплексы обеспечивали более чем 30% подавление при концентрации 0,1 нм: AD-60489, AD-60495, AD-60501, AD60507, AD-60513, AD-60519, AD-60583, AD-60591, AD-60592 и AD-60593.
- 150 036477
Таблица 34. Дополнительные последовательности siRNA производных AD-60489
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательност и NM 000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5-3’) Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3) Средн. 10 нМ SD 10 HM Средн 0,1 нМ SD 0,1 hM
4868 4869 871-893 AD-60489.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaU fcUfuAfL96 UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu 17,0 0,2 50,7 5,1
4870 4871 871-893 AD-60495.1 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu 17,1 5,9 63,6 18,6
4872 4873 871-893 AD-60501.1 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu 11,9 0,7 45,2 8,9
4874 4875 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu
4876 4877 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdT cuud Tcugsgsu
4878 4879 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu
4880 4881 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu
4882 4883 871-893 AD-60507.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu 14,6 7,8 48,5 19,6
4884 4885 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
4886 4887 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu
4888 4889 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdT cuud Tcugsgsu
4890 4891 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu
4892 4893 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu
4894 4895 871-893 AD-60513.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu 14,4 2,4 51,0 7,0
4896 4897 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
4898 4899 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu
4900 4901 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdT cuud Tcugsgsu
4902 4903 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu
4904 4905 871-893 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu
4906 4907 871-893 AD-60519.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu 14,7 4,9 51,7 7,7
4908 4909 871-893 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
4910 4912 4914 4916 4918 4920 4922 4924 4926 4928 4930 4932 4934 4936 4938 4940 4942 4944 4946 4948 4950 4952 4954 4956 4958 4960 4962 4964 4966 4968 4970 4972 4974 4976 4978 4980 4911 4913 4915 4917 4919 4921 4923 4925 4927 4929 4931 4933 4935 4937 4939 4941 4943 4945 4947 4949 4951 4953 4955 4957 4959 4961 4963 4965 4967 4969 4971 4973 4975 4977 4979 4981 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 AD-60499.1 AD-60583.1 AD-60591.1 AD-60592.1 AD-60593.1 AD-60489.1 AD-60591.1 AD-60592.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfu(Agn)L96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn) aUfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUf cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUf cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUf scUfsuAfsL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUf scusuAfsL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(T gn)scUfsuAfsL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(T gn)scusuAfsL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUf cUfgsgsu u s Afs a Gf aUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUf cUfgsgsu usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuU fcUfgsgsu asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUf cUfgsgsu UsAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuU fcUfgsgsu asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu 35,9 15,3 13,7 13,4 15,1 17,0 13,7 13,4 13,8 4,8 0,0 4,1 0,3 0,2 0,0 4,1 77,5 42,0 36,4 35,4 40,0 50,7 36,4 35,4 6,7 9,5 16,9 11,4 19,4 5,1 16,9 11,4
4982 4983 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Ag n)UfscUfsuAfsL96 u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu
4984 4985 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Ag n)UfscusuAfsL96 UsAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuU fcUfgsgsu
4986 4987 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(A gns)UfscUfsuAfsL96 UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUf cUfgsgsu
4988 4989 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(A gns)UfscusuAfsL96 UsAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuU fcUfgsgsu
- 151 036477
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM 000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5’-3’) Антисмысловая последовательность (5’-3’)
4990 4991 871-893 AD60489 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfc UfuUfcUfgsgsu
4992 4993 871-893 AD60501.1 Cfs as GfaAfa GfaGfu Gfu CfuCfaucuuAfL96 UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcUfgsgsu
4994 4995 871-893 AD60900.1 Cfs as GfaAfa GfaGfu Gfu CfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
4996 4997 871-893 AD60519.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcUfgsgsu
4998 4999 871-893 AD60905.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
5000 5001 871-893 AD60901.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfc UfuUfcUfgsgsu
5002 5003 871-893 AD60495.2 csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfc UfuUfcUfgsgsu
5004 5005 871-893 AD60935.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUf uAfL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfc UfuUfcUfgsgsu
Таблица 35. Дополнительные последовательности и IC50 siRNA AD-60489 и siRNA производных
AD-60489
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM 000688.4 Название дуплекса* Смысловая последовательность (5’-3’) Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3’) IC50
5006 5007 871-893 AD-60489.3 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,010
5008 5009 871-893 AD-60495.2 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,254
5010 5011 871-893 AD-60501.2 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu 0,006
5012 5013 871-893 AD-60898.1 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu н.Д.
5014 5015 871-893 AD-60900.1 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu 0,151
5016 5017 871-893 AD-60851.1 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu 0,033
5018 5019 871-893 AD-60855.1 CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu 0,065
5020 5021 871-893 AD-60507.2 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu 0,029
5022 5023 871-893 AD-60902.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,024
5024 5025 871-893 AD-60904.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu н.Д.
5026 5027 871-893 AD-60894.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu 0,011
5028 5029 871-893 AD-60860.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu 0,249
5030 5031 871-893 AD-60864.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu 1,899
5032 5033 871-893 AD-60513.2 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu 0,019
5034 5035 871-893 AD-60896.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,034
5036 5037 871-893 AD-60899.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu н.Д.
5038 5039 871-893 AD-60868.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu 0,249
5040 5041 871-893 AD-60872.1 CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu 0,014
5042 5043 871-893 AD-60519.2 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu 0,026
5044 5045 871-893 AD-60901.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,080
5046 5047 871-893 AD-60903.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu н.Д.
5048 5049 871-893 AD-60905.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu 0,018
5050 5051 871-893 AD-60876.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu 0,091
5052 5053 871-893 AD-60880.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu 0,131
5054 5055 871-893 AD-60499.2 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu н.Д.
5056 5057 871-893 AD-60895.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu н.Д.
5058 5059 871-893 AD-60897.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu н.Д.
5060 5061 871-893 AD-60526.2 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu н.Д.
5062 5063 871-893 AD-60852.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu 4,970
5064 5065 871-893 AD-60856.1 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu н.Д.
5066 5067 871-893 AD-60861.1 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,019
5068 5069 871-893 AD-60865.1 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu 0,061
5070 5071 871-893 AD-60869.1 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu н.Д.
5072 5073 871-893 AD-60873.1 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu 0,009
5074 5075 871-893 AD-60877.1 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu 0,008
5076 5077 871-893 AD-60881.1 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu 0,025
5078 5079 871-893 AD-60583.2 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfu(Agn)L9 6 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,022
5080 5081 871-893 AD-60591.3 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,031
5082 5083 871-893 AD-60592.3 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,010
5084 5085 871-893 AD-60593.2 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn)aUfcUfuAfL 96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,006
5086 5087 871-893 AD-60489.4 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,011
5088 5089 871-893 AD-60857.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu 0,019
5090 5091 871-893 AD-60862.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,012
5092 5093 871-893 AD-60866.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,015
5094 5095 871-893 AD-60870.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfscUfsuAfsL9 6 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,012
5096 5097 871-893 AD-60874.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfscusuAfsL9 6 usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,003
5098 5099 871-893 AD-60591.2 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 0,014
5100 5101 871-893 AD-60878.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 0,008
5102 5103 871-893 AD-60882.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,003
5104 5105 871-893 AD-60853.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,007
5106 5107 871-893 AD-60858.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)scUfsuAf sL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,013
5108 5109 871-893 AD-60863.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)scusuAfs L96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,002
5110 5111 871-893 AD-60592.2 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 0,013
5112 5113 871-893 AD-60867.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg 0,084
- 152 036477
5114 5115 871-893 AD-60871.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,008
5116 5117 871-893 AD-60875.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,004
5118 5119 871-893 AD-60879.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfscUfsuA fsL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,001
5120 5121 871-893 AD-60883.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfscusuAf sL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,004
5122 5123 871-893 AD-60854.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(Agns)UfscUfs uAfsL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,002
5124 5125 871-893 AD-60859.1 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(Agns)Ufscusu AfsL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu 0,002
Как показано в табл. выше, несколько дуплексов характеризовались эффективностью в подавлении mRNA ALAS1. Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,01 нМ: AD-60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874, AD-60883, AD-60875, AD-60501, AD-60593, AD-60853, AD60877, AD-60878, AD-60871, и AD-60873. Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,02 нМ: AD-60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874, AD-60883, AD-60875, AD-60501, AD-60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD-60871, AD-60873, AD-60489, AD-60592, AD-60894, AD60489, AD-60870, AD-60862, AD-60858, AD-60592, AD-60591, AD-60872, AD-60866, AD-60905, AD60857, AD-60513, и AD-60861. Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,05 нМ:AD60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874 , AD-60883, AD-60875, AD-60501,AD60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD-60871, AD-60873, AD-60489, AD-60592, AD-60894,AD60489, AD-60870, AD-60862, AD-60858, AD-60592, AD-60591, AD-60872, AD-60866, AD-60905,AD60857, AD-60513, AD-60861, AD-60583.2, AD-60902.1, AD-60881.1, AD-60519.2, AD-60507.2, AD60591.3, AD-60851.1, AD-60896.1 и AD-60537.2.
Пример 29. In vivo исследования связи структура-активность AD-60489
Получали производные исходной siRNA AD-60489 и подвергали скринингу in vivo на крысах.
In vivo скрининг 1 производных AD-60489
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в табл. ниже.
Таблица 36. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысло вая) SEQ ID NO: (антисмыслова я) Целевые сайты антисмысловой последовательное ти NM_000588.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
5126 5127 871-893 AD-60489 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfc UfuUfcUfgsgsu
5128 5129 871-893 AD-60501.2 CfsasGfaAfaGfaGfuGfu CfuCfaucuuAfL96 us Afs AfGf a UfgAfgAf c AfcUfcUfuUfcUfgsgsu
5130 5131 871-893 AD-60519.2 csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 us Afs Af Gfa UfgAfgAf c AfcUfcUfuUfcUfgsgsu
5132 5133 871-893 AD-60901.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcUfgsgsu
5134 5135 871-893 AD-60495.2 CfsasGfaAfaGfaGfuGfu CfuCfaucuuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcUfgsgsu
5136 5137 871-893 AD-60900.1 CfsasGfaAfaGfaGfuGfu CfuCfaucuuAfL96 usAfsAfGfadTgAfgAfc AfcdTcuudTcugsgsu
5138 5139 871-893 AD-60935.1 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUfuAfL96 us Afs Af Gfa UfgAfgAf cAfc UfcUfuUfcUfgsgsu
5140 5141 871-893 AD-60905.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
Крысам вводили разовую дозу 3 мг/кг siRNA. Через 5 дней после введения siRNA, проводили измерения уровней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH), при помощи анализа с bDNA, и уровни лекарственного средства в ткани (siRNA) определяли при помощи qPCR.
Как показано на фиг. 40 (вверху), siRNA AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900 и AD-60935 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-60489. siRNA AD-60519, AD-60901, AD-60495 и AD-60935 обеспечивали более высокие уровни в печени, чем AD60489 (см. фиг. 40, внизу). Таким образом, большинство из дуплексов, которые обеспечивали повышенное подавление mRNA ALAS1, также достигали более высоких уровней в печени.
По меньшей мере для дуплексов AD-60489, AD-60519 и AD-60901 эффективность коррелировала с уровнями siRNA в печени (см. фиг. 41), так что более высокий уровень siRNA в печени был связан с более высоким подавлением mRNA ALAS 1.
In vivo скрининг 2 производных AD-60489
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в табл. ниже.
- 153 036477
Таблица 37. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысл овая) SEQ ID NO: (антисмыслова я) Целевые сайты антисмысловой последовательное ти NM_0006S8.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
5142 5143 871-893 AD-60489 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu CfaUfcUfuAfL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu
5144 5145 871-893 AD-6O879 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfu Cf(Agn)UfscUfsuAfsL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdT u UfcUfgsgsu
5146 5147 871-893 AD-61190 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfu CfuCf(Agn)UfscUfsuAfsL96 u s Afs Af G f a U f g Af gAf c Af c U f c UfuUfcUfgsgsu
5148 5149 871-893 AD-61191 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfu CfuCf(Agn)UfscUfsuAfsL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfc UfuUfcUfgsgsu
5150 5151 871-893 AD-6O877 csasgaaaGfAfGfugucuca (Tgn)cuuaL96 UsAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
5152 5153 871-893 AD-61192 csasgaaaGfAfGfugucuca (Tgn)cuuaL96 UsAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
5154 5155 871-893 AD-6O865 csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 UsAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
5156 5157 871-893 AD-6O861 csasgaaaGfAfGfugucuca (Tgn)cuuaL96 u s Afs a G f a U f gAfg Af ca c U f c UfuUfcUfgsgsu
5158 5159 871-893 AD-6O876 csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 usAfsaGfadT g Af g Af c Af cd TcuudTcugsgsu
5160 5161 871-893 AD-61193 csasgaaaGfaGfuGfu CfuCfaucuuaL96 u s Afs a G f a U f gAfg Af ca c UfcdTuUfcUfgsgsu
5162 5163 871-893 AD-6O519 csasgaaaGfaGfuGfu CfuCfaucuuaL96 u s Afs Af G f a U f g Af gAf c Af c UfcUfuUfcUfgsgsu
Крысам вводили разовую дозу 2,5 мг/кг siRNA. Через 5 дней после введения siRNA измерения уровней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH), выполняли при помощи анализа с bDNA.
Как показано на фиг. 42, siRNA AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193 и AD-60519 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD60489.
Пример 30. Введение нескольких доз повышает эффективность
Для исследования эффектов введения нескольких доз siRNA крысам (n=3 на группу) вводили PBS или siRNA (AD-58632, AD-60925, AD-60419, AD-60445, AD-60892, AD-60489, AD-60519 или AD-60901) в дозе 2,5 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель. Уровни mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH) оценивали при помощи анализа с bDNA.
Таблица 38. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смыслов ая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM-000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3')
5164 5165 873 - 895 AD-58632 GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgacA fcUfcUfuUfcsusg
5166 5167 873 - 895 AD-60925 GfsasAfaGfAfGfuGfucuca uc(Tgn)ucuuL96 asAfsGfAfa Gfa UfgAfgAf cAfcUfcUfuUfcsusg
5168 5169 873 - 895 AD-60419 GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 asAfsGfAfa Gfa ugAfgAfc Afcucuuucsusg
5170 5171 873 - 895 AD-60445 GfsasAfaGfAfGfuGfucuca uc(Tgn)ucuuL96 asAfsGfAfa Gfa ugAfgAfc Afcucuuucsusg
5172 5173 873 - 895 AD-60892 gsasaagaGfuGfuCfucauc uucuuL96 asAfsGfAfa Gfa ugAfgAfc Afcucuuucsusg
5174 5175 871-893 AD-60489 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUfuAfL96 UsAfsaGfaUfgAfgAfcacU fcUfuUfcUfgsgsu
5176 5177 871-893 AD-60519.2 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCf aucuuaL96 usAfsAfGfa UfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcUfgsgsu
5178 5179 871-893 AD-60901.1 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCf aucuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfcacU fcUfuUfcUfgsgsu
Как показано на фиг. 43, производные siRNA AD-58632, AD-60892, AD-60419, AD-60445 и AD60925 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с исходным AD-58632. Кроме того, производные siRNA AD-60489, AD-60519 и AD-60901 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с исходным AD-60489.
- 154 036477
Пример 31. Исследования введения нескольких доз AD-60519 и AD-60489
Терапевтическую эффективность AD-60519 исследовали на крысиной модели AIP. Схема эксперимента показана на фиг. 44 (вверху). Крыс обрабатывали PBS или siRNA ALAS1-GalNAc либо в количестве 2,5 мг/кг, либо в количестве 5 мг/кг два раза в неделю в течение трех недель. Фенобарбитал (фенобарб) и siRNA PBGD в составе LNP с AF11 вводили в периоды времени, указанные на фиг. 44. Контрольная группа получала только PBS и siRNA PBGD, без индукции фенобарбиталом. Мочу собирали на 18-19 дни исследования.
Результаты показаны на фиг. 44 (внизу). Введение фенобарбитала и PBS индуцировало экспрессию mRNA ALAS1 и повышало уровни PBG и ALA в моче (см. фиг. 44) по сравнению только с PBS. Обработка суммарно 2,5 или 5 мг/кг из шести доз AD-60519 два раза в неделю подавляла индуцированные фенобарбиталом повышения уровней PBG в моче и ALA в моче (фиг. 44). Эти результаты показывают, что AD-60519 является эффективным в подавлении уровней ALA и PBG при введении повторных доз до 2,5 мг/кг. В частности, AD-60519 был эффективным в снижении повышений уровней PBG и ALA в моче, связанных с острыми приступами в крысиной модели AIP.
В дополнительных исследованиях с использованием такой же схемы эксперимента, но в мышиной модели (см. схему вверху фиг. 44) исследовали терапевтическую эффективность AD-60519 и AD-60489 в подавлении индуцированных фенобарбиталом повышений уровней PBG и ALA в сыворотке. В контрольной группе PBS (физиологического раствора) введение фенобарбитала повышало уровни PBG и ALA в сыворотке (см. фиг. 45) по сравнению только с PBS. Обработка суммарно шестью дозами в 2,5 или 5 мг/кг AD-60519 или AD-60489 два раза в неделю подавляла индуцированные фенобарбиталом повышения уровней PBG в сыворотке и ALA в сыворотке (фиг. 44). Эти результаты показывают, что как AD-60519, так и AD-60489, являются эффективным в подавлении уровней ALA и PBG при введении повторных доз до 2,5 мг/кг. В частности, AD-60519 и AD-60489 были эффективными в снижении повышений уровней PBG и ALA в сыворотке, связанных с острыми приступами.
Поскольку лекарственные препараты в этом примере вводили до индукции фенобарбиталом, эти результаты указывают, что AD-60519 и AD-60489 оказывают профилактические эффекты.
Пример 32. Дополнительные последовательности siRNA
Получали следующие последовательности производных siRNA AD-58632 (табл. 39) и AD-60489 (табл. 40).
Таблица 39. Производные последовательности AD-58632
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM 000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5-3) Антисмысловая последовательность (5’-3)
5180 5181 873 - 895 AD-60802 GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg
5182 5183 873 - 895 AD-60824 GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg
5184 5185 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg
5186 5187 873 - 895 AD-60843 GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg
5188 5189 873 - 895 AD-60847 GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg
5190 5191 873 - 895 GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg
5192 5193 873 - 895 AD-60819 GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg
5194 5195 873 - 895 AD-60823 GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg
5196 5197 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg
5198 5199 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdT CfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg
5200 5201 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdT CfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg
5202 5203 873 - 895 GfsasAfaGfaGfuGfdT CfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg
5204 5205 873 - 895 AD-60853 gsasaagaGfuGfuCfuc aucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg
5206 5207 873 - 895 AD-60839 gsasaagaGfuGfuCfuc aucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg
5208 5209 873 - 895 gsasaagaGfuGfuCfuc aucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg
5210 5211 873 - 895 gsasaagaGfuGfdTCfu caucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg
5212 5213 873 - 895 gsasaagaGfuGfdTCfu caucuucuuL96 asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg
5214 5215 873 - 895 gsasaagaGfuGfdTCfu caucuucuuL96 asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg
Таблица 40. Производные последовательности AD-60489
SEQ ID NO: (смысловая) SEQ ID NO: (антисмысловая) Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_000688.4 Название дуплекса Смысловая последовательность (5-3) Антисмысловая последовательность (5-3)
5216 5217 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfdT Gfu Cfu Cf(Agn)UfscUfs uAfsL96 usAfsaGfadTgAfgAfcA fcdTcuudTcugsgsu
- 155 036477
5218 5219 871-893 AD-60879 CfsasGfaAfaGfaGfdT GfuCfuCf(Agn)UfscUfs uAfsL96 usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcdTuUfcUfgsgsu
5220 5221 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfdT GfuCfuCf(Agn)UfscUfs uAfsL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcUfgsgsu
5222 5223 871-893 CfsasGfaAfaGfaGfdT GfuCfuCf(Agn)UfscUfs uAfsL96 usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcUfuUfcUfgsgsu
5224 5225 871-893 AD-60877 csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96 usAfsaGfadTgAfgAfcA fcdTcuudTcugsgsu
5226 5227 871-893 csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcdTuUfcUfgsgsu
5228 5229 871-893 AD-60865 csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcUfgsgsu
5230 5231 871-893 AD-60861 csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcUfuUfcUfgsgsu
5232 5233 871-893 AD-60876 csasgaaaGfaGfuGfuCf uCfaucuuaL96 usAfsaGfadTgAfgAfcA fcdT cuudTcugsgsu
5234 5235 871-893 csasgaaaGfaGfuGfuCf uCfaucuuaL96 usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcdTuUfcUfgsgsu
5236 5237 871-893 AD-60519 csasgaaaGfaGfuGfuCf uCfaucuuaL96 usAfsAfGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcUfgsgsu
Пример 33. Дополнительные исследования введения нескольких доз AD-60519
Терапевтическую эффективность AD-60519 исследовали в крысиной модели AIP, подобной той, которую использовали в примере 31. Схема эксперимента показана на фиг. 46 (вверху). Крыс обрабатывали PBS или siRNA ALAS1-GalNAc в количестве 3, 1 или 0,3 мг/кг раз в неделю в течение четырех недель (обработка на 0, 7, 14 и 21 день). Фенобарбитал (фенобарб) и siRNA PBGD в составе LNP с AF11 вводили в периоды времени, указанные на фиг. 46. Контрольная группа получала только PBS и siRNA PBGD без индукции фенобарбиталом. Мочу собирали на 25 день исследования.
Результаты показаны на фиг. 46 (внизу) и на фиг. 47. Введение фенобарбитала и PBS индуцировало экспрессию mRNA ALAS1 и повышало уровни PBG и ALA в моче по сравнению только с PBS. Обработка суммарно четырьмя дозами в 3, 1 или 0,3 мг/кг AD-60519 раз в неделю подавляла индуцированные фенобарбиталом повышения уровней mRNA ALAS1 крыс в печени дозозависимым образом (см. фиг. 46). (Уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крыс в печени выражали относительно уровней mRNA GAPDH крыс). Уровни PBG в моче и ALA в моче также характеризовались дозозависимыми эффектами.
Повторные дозы AD-60519 раз в неделю были эффективными в подавлении экспрессии mRNA ALAS1 и в снижении повышенных уровней ALA и PBG, связанных с индуцированными острыми приступами в крысиной модели AIP. Эти эффекты лечения были дозозависимыми. Данные результаты показывают, что AD-60519 может действовать профилактически при введении доз до приступа.
Пример 34. Эффекты введения нескольких доз конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 у отличных от человека приматов
Эффекты конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в подавлении mRNA ALAS1 в печени и mRNA ALAS1 в крови исследовали в исследовании на отличных от человека приматах (NHP). Использовали конъюгаты GalNAc AD-58632, AD-60519, AD-61193 и AD-60819. Схема исследования показана в табл. 41 и на фиг. 48.
Таблица 41. Схема исследования NHP
Исследуемый объект № группы N Уровень дозы (мг/кг) Конц, дозы (мг/мл) Частота введения дозы Дни введения дозы Объем дозы (мл/кг) Путь введения дозы
AD-5 8632 1 3 2,5 1,25 Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 недели 1,2, 3,4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, 25 2 SC
AD-60519 3 1,25 0,625 Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 недели
3 3 2,5 1,25 Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 недели
4 3 2,5 1,25 Раз в день, 5 дней, 1 неделя; раз в неделю, 2-4 недели 1,2, 3,4, 5, И, 18, 25
5 3 5 2,5 Раз в день, 5 дней, 1 неделя; раз в неделю, 2-4 недели
AD-61193 6 3 2,5 1,25 Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 недели 1,2, 3,4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, 25
AD-60819 7 3 2,5 1,25 Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 1,2, 3,4, 5, 8, И, 15, 18, 22, 25
| недели
- 156 036477
Каждая группа получала несколько подкожных доз конъюгата GalNAc с ALAS1 siRNA в объеме дозы 2 мг/мл. Группа 1 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-58632 на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 2 (n=3) получала 1,25 мг/кг с 0,625 мг/мл AD-60519 на 1,2, 3,4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 3 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-60519 на 1,2, 3,4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 4 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-60519 на 1, 2, 3, 4, 5, 11, 18 и 25 дни. Группа 5 (n=3) получала 5 мг/кг с 2,5 мг/мл AD-60519 на 1, 2, 3, 4, 5, 11, 18 и 25 дни. Группа 6 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-61193 на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 7 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD60819 на 1,2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни.
Образцы сыворотки для анализа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) (см. пример 21) собирали на - 3, 7, 13, 21, 27, 39, 46 и 60 дни (на фиг. 48, PD заборы указывает дни, в которые собирали сыворотку). Сыворотки собирали для биохимического анализа крови на - 3 и 6 дни. Биохимический анализ включал оценку уровней аланинтрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и щелочной фосфатазы (ALP). Сайленсинг mRNA ALAS1 оценивали в ткани печени, полученной в результате биопсии печени на 21 день (см. фиг. 48). Биопсию выполняли после забора сыворотки.
Подавление уровней mRNA ALAS1 в печени
Уровни mRNA ALAS1 в печени на 21 день исследования показаны на фиг. 49. Результаты показаны в виде процента от среднего уровня, наблюдаемого в контрольной группе, обработанной PBS. Результаты показаны в виде средних величин для каждой группы обработки.
Эти результаты, представленные на фиг. 49 показывают, что по сравнению с контрольными животными, которые получали обработку PBS, все из условий обработки были эффективными в подавлении уровней mRNA ALAS1 в печени. Обработки обеспечивали сайленсинг mRNA, находящийся в диапазоне приблизительно от 20 до 80% (соответствующий уровням mRNA ALAS1, находящимся в диапазоне приблизительно от 80 до 20% от контрольных уровней). Отдельные животные, которые получали AD-58632, характеризовались сайленсингом приблизительно 20-50%, при этом средний уровень сайленсинга составлял приблизительно 40% (уровни mRNA ALAS1 составляли в среднем приблизительно 60% от контрольных уровней). При всех используемых схемах введения доз AD-60519 был высокоэффективным в подавлении уровней mRNA ALAS1. Отдельные животные, которые получали AD-60519, характеризовались сайленсингом приблизительно 60-80% (уровни mRNA ALAS1 составляли приблизительно 20-40% от контрольных уровней). В среднем, режимы обработки AD-60519 обеспечивали сайленсинг приблизительно 65-75%. Как раскрыто в данном документе, AD-60519 является производным AD-60489. Подобные результаты для AD-60489 раскрыты в примере 20 и показаны на фиг. 30. Кроме того, AD-61193 (производное AD-60489) и AD-60819 (производное AD-58632) также обеспечивали сайленсинг на более чем 50%. Заслуживает внимания, что уровни сайленсинга, описанные в этом примере и в примере 20 (например, приблизительно 20-80%), достигались даже в неиндуцированном состоянии; ожидается, что в индуцированном состоянии, например, когда уровни ALAS 1 остро или хронически повышены (например, у пациента, имеющего порфирию или с риском развития порфирии, например, острой печеночной порфирии, например, AIP), более низкие уровни сайленсинга, например, снижение уровней mRNA ALAS1 до нормальных уровней или уровней до приступа, могут быть достаточными для достижения терапевтической эффективности.
Подавление уровней циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1
На фиг. 50 показаны уровни циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 (средние величины и стандартные отклонения) в каждой временной точке в течение исследования, когда получали образцы сыворотки. Результаты по циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 показывают эффективность сайленсинга mRNA после обработки несколькими дозами каждой из изученных siRNA (AD60519, AD61193, AD-60819 и AD-58632). Во всех группах наибольший эффект подавления на циркулирующую mRNA ALAS1 наблюдали на 27 день, после конечной дозы siRNA на 25 день. Во всех группах обработки в течение нескольких недель после прекращения обработки уровни mRNA ALAS1 постепенно повышались и возвращались к исходному уровню при конечном измерении на 60 день.
Наиболее выраженное подавление циркулирующей mRNA ALAS1 (максимальный сайленсинг около 80%) наблюдали в группе 3 (2,5 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, два раза в неделю, 3 недели) и группе 5 (5 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, раз в неделю, 3 недели). Группа 2 (1,25 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, два раза в неделю, 3 недели), группа 4 (2,5 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, раз в неделю, 3 недели), группа 7 (2,5 мг/кг AD-60819, раз в день, 5 дней, два раза в неделю, 3 недели) и группа 6 (2,5 мг/кг AD-61193, раз в день, 5 дней, раз в неделю, 3 недели) также характеризовались отличным подавлением, при максимальном сайленсинге (27 день) более чем 50%. В группе 1 также был достигнут заметный сайленсинг (более чем 30% на 27 день).
Эти результаты согласуются с результатами по mRNA ALAS1 в печени и подтверждают высокую активность AD-60519. При уровнях доз до 1,25 мг/кг AD-60519 обеспечивал 65-75% сайленсинг.
Корреляция между уровнями циркулирующей mRNA ALAS1 и печени
На фиг. 27 показаны уровни mRNA ALAS1 в печени (левые столбцы) и в сыворотке (правые столбцы). Имеется высокая корреляция между относительными уровнями mRNA ALAS1, измеренными в печени и в сыворотке, указывая на то, что эти измерения представляют надежные результаты.
- 157 036477
Пример 35. Исследование введения разовой дозы AD-60519 и AD-60589 крысам при помощи анализа cERD мочи для отслеживания длительности подавления mRNA ALAS1
Исследование введения разовой дозы проводили у крыс с использованием конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 AD-60489 и AD-60519. Эффективность этих конъюгатов GalNAc в ингибировании экспрессии mRNA ALAS1 отслеживали на основании оценок мочи при помощи анализа определения циркулирующей внеклеточной РНК. Анализ был подобным анализу, используемому в примерах 21 и 34, за исключением того, что использовали образцы мочи. Образцы мочи лиофилизировали для ее концентрирования. Лиофилизированную мочу ресуспендировали в 4 мл dH2O и перемешивали на вортексе. Затем образец центрифугировали при 4000xg в течение 10-20 мин для осаждения любых клеточных остатков. Оставшиеся стадии были подобны таковым, описанным в примере 21.
Группам крыс вводили разовую дозу 10 мг/кг AD-60489 или AD-60519. Нормализованные уровни mRNA ALAS1 в различные временные точки в течение исследования показаны на фиг. 51. Временная точка, указанная как 0 часов представлена для исходного, до введения дозы, образца мочи, отобранного непосредственно перед введением mRNA ALAS1. Результаты для следующих временных точке выражены в виде доли от уровня до введения дозы.
Как можно увидеть исходя из результатов, показанных на фиг. 51, AD-60519 представлял повышенную эффективность по сравнению с AD-60489. При этой максимальной величине разовая доза AD60519 обеспечивала подавление до приблизительно 80%, при этом подавление, предоставленное AD60489, составляло приблизительно 60%. Эффект разовой дозы 10 мг/кг этих siRNA ALAS1 в подавлении mRNA ALAS1 длился приблизительно 21 день. Эти результаты показывают валидность анализа cERD мочи для отслеживания уровней mRNA ALAS1.
Пример 36. Фармакологические эффекты AD-60519 у отличных от человека приматов
Дополнительное исследование эффектов конъюгата GalNAc AD-60519 с siRNA ALAS1 проводили у отличных от человека приматов. В исследовании изучали эффект введения доз раз в неделю по сравнению с ведением доз два раза в неделю, использования нагрузочной дозы по сравнению с использованием не нагрузочной дозы, а также кинетику сайленсинга mRNA ALAS1 после разовой дозы. Схема исследования показана в табл. 42 и на фиг. 52.
Таблица 42. Схема фармакологического исследования для исследования с применением AD-60519
№ группы N Уровень дозы (мг/кг) Частота введения дозы Потреб ность в вещест ве (мг)* Объем дозы (мл/кг) Дни введен ня дозы Конц, дозы (мг/мл) Путь введен ня дозы
1 3 2,5 Раз в неделю, 8 недель 210 0,125 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50
2 3 5 Раз в неделю, 8 недель 420 0,25
3 3 Нагрузка раз в день, 3 дня, 5 мг/кг, Нагрузка, 1-3 ДНИ, раз в неделю, 525 0,25/25 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29,
поддерж. - 5 мг/кг 7 недель 36, 43, 50 20 SC
4 3 Нагрузка Раз в день, 3 дня, 5 мг/кг, поддерж. 2,5 мг/кг Нагрузка, 1-3 дни, раз в неделю, 7 недель 270 0,25/0,125
5 3 5 Раз в две недели, 8 недель 924 0,25 1,4, 8, И, 15, 18,22 25, 29, 32, 36, 39, 43, 46, 50, 53
6 3 1 Разовая доза 12 0,05 1
7 3 10 Разовая доза 116 0,5 1
Каждая группа получала одну или несколько подкожных доз AD-60519, как представлено в табл.42. Группа 1 (n=3) получала 2,5 мг/кг в объеме дозы 0,125 мл/кг раз в неделю в течение 8 недель (дозы вводили на 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 2 (n=3) получала 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мг/мл раз в неделю в течение 8 недель (дозы вводили на 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 3 (n=3) получала нагрузочную дозу 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мл/кг раз в день в течение трех дней с последующим поддержанием дозы 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мл/кг раз в неделю в течение 7 недель (дозы вводили на 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 4 (n=3) получала нагрузочную дозу 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мл/кг раз в день в течение трех дней с последующим поддержанием дозы 2,5 мг/кг в объеме дозы 0,125 мл/кг раз в неделю в течение 7 недель (дозы вводили на 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 5 (n=3) получала 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мг/мл два раза в неделю в течение 8 недель (дозы вводили на 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 39, 43, 46, 50 и 53 дни). Группа 6 (n=3) получала разовую дозу 1 мг/кг в объеме дозы 0,05 мл/кг на 1 день. Группа 7 (n=3) получала разовую дозу 10 мг/кг в объеме дозы 0,5
- 158 036477 мл/кг на 1 день.
Образцы сыворотки (приведенные в виде PD заборов на фиг. 52), образцы плазмы (приведенные в виде PK заборов на фиг. 52) и образцы мочи собирали, как указано на фиг. 52 и в табл. 43. Образцы мочи и сыворотки подлежали анализу cERD. Все образцы крови и мочи, собранные в день биопсии печени, собирали до биопсии печени.
Таблица 43. График забора образцов
Сыворотка для определения mRNA Биопсия печени Моча для определения mRNA** Плазма для РК
Группы 1-4 -3 день и 5, 10, 17, 24, 31,38, 45, 52, 57, 64, 78,92 дни Группы 1-5 24 день* Группы 1-5 -3 день и 24*, 52 Дни Группа 7 -3 день и 1 день, через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 часов и 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 29, 36 дни
Группа 5 -3 день иЗ, 10, 17, 24, 31,38, 45, 52, 60, 67, 81,95 дни Г руппы 6-7 4 день*
Группы 6-7 -3 день и 2, 4, 6, 9, 15, 22, 29,36 дни Группы 6-7 -3 день и 4*, 36 дни
*Все образцы крови и мочи собирали до биопсии печени Забор первой утренней мочи
Результаты по mRNA ALAS1 в печени показаны на фиг. 53. Значимого подавления mRNA ALAS1 достигали во всех условиях введения. До 75-80% сайленсинга ALAS1 достигали при схемах введения нескольких доз с использованием AD-60519. Через три дня после разовой дозы достигали сайленсинг приблизительно 15% при использовании разовой дозы 1 мг/кг и достигали сайленсинг приблизительно 70% при использовании разовой дозы 10 мг/кг (см. фиг. 53). Сравнение данных из групп 1 и 7 показывает небольшую разницу в кинетике после разовой дозы (в группе 7) по сравнению с введением нескольких доз (группа 1) при одинаковом суммарном количестве (введено 30 мг), как оценено через 3 дня после введения дозы в группе 7 и через два дня после четвертой дозы в группе 1. В частности, более сильный сайленсинг наблюдали после разовой дозы (сайленсинг приблизительно 70% в среднем в группе 7 по сравнению с сайленсингом приблизительно 45% в среднем в группе 1). См. фиг. 54. Такой же результат также наблюдали в исследованиях на крысах.
Результаты по mRNA ALAS1 в сыворотке до 22 дня показаны на фиг. 54 (вверху). Корреляция между mRNA ALAS1 в печени, mRNA ALAS1 в сыворотке и mRNA ALAS1 в плазме показаны на фиг. 55. Данные результаты показывают высокую корреляцию между уровнями mRNA ALAS1 в печени, сыворотке и моче. Результаты также представляют дополнительное доказательство, показывающее высокую активность AD-60519. Сайленсинг на 55-75% наблюдали при всех уровнях дозы во всех схемах введения нескольких доз. Введение нагрузочных доз (раз в день в течение 3 дней, как в группах 3 и 4) приводило к несколько более быстрому снижению mRNA ALAS1. Группы, которые получали дозы раз в неделю (группы 1 и 2) или два раза в неделю (группа 5) в итоге характеризовались сопоставимыми уровнями подавления mRNA ALAS1, указывая на то, что накопление в течение времени обеспечивает длительный нокдаун.
Результаты, показывающие кинетику сайленсинга mRNA ALAS 1 после разовой дозы, представлены на фиг. 54 (внизу). В группе введения 1 мг/кг подавление mRNA ALAS1 приблизительно на 20% наблюдали на 6 день. В группе введения 10 мг/кг отмечали быстрое, приблизительно 70% подавление mRNA ALAS1 на 4 день, при этом восстановление до 20% от исходного уровня наблюдали на 22 день (через 21 день после введения дозы). Уровни mRNA ALAS1 в сыворотке возвращались к исходному уровню приблизительно через 2 или 4 недели после введения разовой дозы 1 или 10 мг/кг соответственно.
Полная динамика mRNA ALAS в сыворотке до 8 недели после введения AD-60519 показана на фиг. 56. Все группы достигали максимальной величины 80% подавления mRNA ALAS1 через 5-8 недель после введения дозы ALN-AS1. Группы введения трех суточных доз на 1 неделе (раз в день, 3 дня) характеризовалась более быстрым наступлением подавления mRNA ALAS1, чем таковые с введением одной дозы на первой неделе (раз в неделю, 8 недель). Все животные возвращались к исходным уровням ALAS1 приблизительно через 30-40 дней после последней дозы.
Пример 37. Получение лекарственного препарата на основе siRNA
ALN-60519 (фиг. 57) представляет собой химически синтезированный двунитевой олигонуклеотид,
- 159 036477 связанный ковалентными связями с лигандом, содержащим три остатка N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Все нуклеотиды являются 2'-OMe- или 2'-Е-модифицированными и соединены посредством 3'5'-фосфодиэфирных связей, образуя, таким образом, сахаро-фосфатный скелет олигонуклеотида. Смысловая нить и антисмысловая нить содержат 21 и 23 нуклеотида соответственно. 3'-конец смысловой нити конъюгирован с фрагментом GalNAc с тремя разветвлениями (называемым в данном документе L96) посредством фосфодиэфирной связи. Антисмысловая нить содержит четыре фосфоротиоатных связи две на 3'-конце и две на 5'-конце. Смысловая нить содержит две фосфоротиоатных связи на 5'-конце. 21 нуклеотид смысловой нити гибридизируется с комплементарным 21 нуклеотидом антисмысловой нити, образуя, таким образом, 21 пару нуклеотидных оснований и выступающий конец из двух оснований на 3'-конце антисмысловой нити. Две одиночные нити, смысловую нить и антисмысловую нить, синтезировали при помощи стандартного твердо-фазного синтеза олигонуклеотидов, используя стандартную химическую структуру фосфорамидита с 5'-гидроксильной группой, защищенной в виде диметокситрифенилметилового (DMT) эфира. Каждую нить собирали от 3'- к 5'-концу последовательным добавлением защищенных нуклеозидных фосфорамидитов.
AD-60519, также обозначаемый в данном документе ALN-60519, помещали в состав в виде раствора для инъекции для подкожного применения, обозначаемый в данном документе ALN-AS1. ALN-60519 растворяли в воде для инъекции (WFI) и корректировали рН (целевой 7,0). Определяли концентрацию ALN-60519 и корректировали ее добавлением WFI. Раствор с конечной концентрацией приблизительно 200 мг/мл затем стерилизовали посредством фильтрации и наполняли в 2 мл стеклянные ампулы типа I. Выбирали объем наполнения примерно 0,55 мл для обеспечения полного изъятия 0,5 мл лекарственного препарата.
Пример 38. Измерение уровней mRNA ALAS1 в сыворотке или моче пациентов с AIP или здоровых добровольцев при помощи способа cERD
Исследования фармакологии на отличных от человека приматах с использованием ALN-AS1 указывало на то, что способ определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) для измерения mRNA ALAS1 в сыворотке или моче был надежным и воспроизводимым. Анализ cERD также использовали для измерения уровней mRNA ALAS1 в сыворотке и моче от пациентов с AIP и здоровых добровольцев. Уровни mRNA ALAS1, как правило, были повышенными у пациентов с AIP относительно здоровых добровольцев, что согласуется с ролью индукции ALAS1, которую она играет в патофизиологии заболевания (фиг. 58). Важно, что уровни ALAS1 в сыворотке и моче у одного и того же пациента коррелировали друг с другом. У двух пациентов, которые имели повторные заборы мочи и сыворотки, уровень mRNA ALAS1 был стабильным в течение времени. Образно говоря, эти данные указывают на то, что mRNA ALAS1 можно измерять в образцах сыворотки и мочи от субъектов, в том числе пациентов с AIP, a способ cERD является применимым для отслеживания фармакодинамической активности ALN-AS1.
Пример 39. Иллюстративные клинические исследования
Можно провести исследование на человеке для определения безопасности и переносимости ALNAS1 при введении в виде разовой дозы и нескольких доз пациентам с AIP, которые являются бессимптомными выраженными экскреторам (ASHE) (пациентам, которые имеют повышенные уровни ALA и/или PBG, как описано в данном документе) или пациентам с AIP, которые имеют рецидивирующие приступы.
Вторичные цели включают характеристику PK в плазме и моче для ALN-AS1, а также оценку влияния ALN-AS1 после введения дозы на уровни ALA и PBG как в плазме, так и в моче. Анализ cERD, при помощи которого измеряют mRNA в экзосомах, использовали для измерения 5-аминолевулинатсинтазы (mRNA ALAS-1) в сыворотке (или плазме) и моче.
Бессимптомным выраженным экскреторам ALN-AS1 вводят в разовых дозах, например, по 0,1, 0,35 1,0 или 2,5 мг/кг, или повторных дозах раз в неделю, например, по 1 и 2,5 мг/кг, в течение нескольких недель (например, в течение 4 недель). В качестве сравнения вводят контрольный лекарственный препарат (например, плацебо). Оценивают безопасность, фармакокинетику и эффекты лекарственного средства на уровни ALA и PBG. Дозу ALN-AS1, которая снижает ALA и PBG до нормального референтного диапазона (например, дозу, которая нормализует уровни ALA и/или PBG до уровней ниже 2 верхних референтных величин) можно выбрать для последующих исследований, например, у пациентов с AIP.
У пациентов с AIP частоту приступов и исходные симптомы оценивают во время вводного периода без введения доз (например, в 12 недель). Пациентам вводили ALN-AS1, например, в дозе 1-2,5 мг/кг раз в неделю. Оценивали безопасность, фармакокинетику и эффекты лекарственного средства на уровни ALA и PBG. Кроме того, отслеживали изменения числа приступов, применения гема, применения обезболивающего средства и госпитализации.
Эквиваленты
Специалисты в данной области распознают или будут способны определить, используя лишь стандартный экспериментальный подход, многие эквиваленты к конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения, описанным в данном документе. Предполагается, что такие эквиваленты охвачены следующей формулой изобретения.

Claims (61)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии синтазы 5'аминолевулиновой кислоты печени 1 (ALAS1), где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, которая включает участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1 (например, SEQ ID NO:1) и содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154).
  2. 2. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, которая включает участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1 (например, SEQ ID NO:1) и содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из (i) антисмысловой последовательности, приведенной в любой из табл. 21-40, или (ii) немодифицированного варианта антисмысловой последовательности, приведенной в любой из табл. 2140 (SEQ ID NO: 4172-5237).
  3. 3. DsRNA по п.2, где упомянутая dsRNA содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
  4. 4. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где дуплексный участок составляет 17-23 пары нук леотидов в длину.
  5. 5. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере одна нить содержит 3'выступающий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов.
  6. 6. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где каждая нить составляет не более 26 нуклеотидов в длину.
  7. 7. DsRNA по п.3, где по меньшей мере один модифицированный нуклеотид выбран из 2'-O-метила, 2'-фтор-модифицированного нуклеотида и необязательно одной или нескольких 5'-фосфотиоатных групп или любой их комбинации.
  8. 8. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая лиганд, при этом лиганд конъюгирован либо с 3'-концом, либо с 5'-концом смысловой нити dsRNA.
  9. 9. DsRNA по п.8, где лиганд содержит углевод, при этом лиганд необязательно представляет собой лиганд GalNAc.
  10. 10. DsRNA по п.9, где лиганд представляет собой
  11. 11. DsRNA по любому из пп.8-10, где лиганд присоединен с помощью двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
  12. 12. DsRNA по п.11, где лиганд и линкер показаны в формуле XXIV
  13. 13. DsRNA по п.8, где dsRNA конъюгирована с лигандом L96 с помощью линкера, как показано ниже
  14. 14. DsRNA по любому из пп.8-13, где лиганд нацеливает dsRNA в гепатоциты.
  15. 15. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA содержит смысловую нить, состоящую из последовательности, выбранной из последовательностей, приведенных в табл. 21-40, и антисмысловой нити, состоящей из последовательности, выбранной из последовательностей, приведенных в табл. 21-40.
    - 161 036477
  16. 16. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 1 нМ, менее 0,05 нМ, менее 0,02 нМ или менее 0,01 нМ.
  17. 17. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA характеризуется разовой дозой ED50, составляющей менее приблизительно 10 мг/кг или менее приблизительно 5 мг/кг.
  18. 18. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где смысловая нить содержит последовательность CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155) или состоит из нее.
  19. 19. DsRNA no п.1 или 2, где:
    (i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60519, где антисмысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;
    (ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, где антисмысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;
    (iii) смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60519, где смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;
    (iv) смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60519, где смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;
    (v) смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60519, а антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60519, где смысловая и антисмысловая последовательности содержат все модифицированные нуклеотиды из AD-60519, или (vi) смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60519, а антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, где смысловая и антисмысловая последовательности содержат все модифицированные нуклеотиды из AD-60519.
  20. 20. DsRNA по п.1 или 2, где:
    (i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60489 и/или смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60489, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60489, или (ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60489 и/или смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60489, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60489.
  21. 21. DsRNA по п.1 или 2, где:
    (i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-61193 и/или смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-61193, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-61193, или (ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-61193 и/или смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-61193, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-61193.
  22. 22. DsRNA по п.2, где:
    (i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60819 и/или смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60819, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60819, или (ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60819 и/или смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60819, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60819.
  23. 23. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, причем антисмысловая нить включает участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, причем указанная dsRNA находится в форме конъюгата, имеющего следующую структуру:
    $ S О О- О О- О- 0- 0 0 О- О О- О 0 0- О О О 0 0’ смысловая 5' НО'',Р', Кр' ,/,/ ,р%рJ'',./,/ ,/ ,Р—LS63'
    -ть 3 U О Γό Й &ί> ύ ό'δ 0 0 й'Гй
    Cm Am Gm Am Am Am if Am Gf Um Gf Um Cf Um Cf Am Um Cm Um Um Am (SEQ ID NO: 32-40Г)
    Um Gm Gm Uf Cm Uf Um Uf Cm Uf Cm Af Cm Af Gm Af Gm Uf Am Gf Af Af Um (SEQ ID NO: j241i антисмысловая 0 0 нить j·
    5’ S’
    00000000000000000000 ι .. II . ii . ι,. ι . 11,. ii , ii . ι. , \ . :ι , n , n , ιι , и,. :i,. Il , II . I, 1,.
    ,,P\.PZP xp / ΖΛΛ? /Z// ζρ· ,.Ρ ,.Ρ ,Ρ ,Ρ\.ΟΗ 5' ό· ό· ό· ό· ό· ό· ο· ο· 6· ό· σ ο· ό· ό- ό- ό· ό· ό· s- sили его фармацевтически приемлемой соли, где Af, Cf, Gf, Uf = 2'F рибонуклеозиды;
    Am, Cm, Gm, Um = 2'- OMe рибонуклеозиды;
    s = фосфоротиоат;
    о
    II „ 'I
    O’ = фосфодиэфир и где
    - 162 036477
  24. 24. Клетка, содержащая dsRNA по любому из пп.1-23.
  25. 25. Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, при этом композиция содержит dsRNA по любому из пп.1-23.
  26. 26. Фармацевтическая композиция по п.25, где dsRNA вводится в безбуферном солевом или водном растворе.
  27. 27. Фармацевтическая композиция по п.25 или 26, где упомянутая композиция является пригодной для подкожного введения.
  28. 28. Способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, при этом способ включает:
    (a) введение в клетку dsRNA по любому из пп.1-22 и (b) поддержание клетки, полученной на стадии (а), в течение времени, достаточного для обеспечения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS1, с ингибированием тем самым экспрессии гена ALAS1 в клетке, при этом экспрессия ALAS1 необязательно ингибируется по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 30%.
  29. 29. Способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке (например, гепатоците), включающий приведение клетки в контакт с dsRNA по любому из пп.1-22 в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке.
  30. 30. Способ лечения порфирии, при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества:
    (i) dsRNA по любому из пп.1-22 или (ii) композиции по любому из пп.25-27, с осуществлением тем самым лечения порфирии.
  31. 31. Способ по п.30, где субъектом является субъект с риском развития порфирии или с диагностированной порфирией.
  32. 32. Способ по п.30 или 31, где порфирия представляет собой острую перемежающуюся порфирию или порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы.
  33. 33. Способ по любому из пп.30-32, где:
    (i) dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят после острого приступа порфирии, (ii) dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят во время острого приступа порфирии или (iii) dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят профилактически для предупреждения острого приступа порфирии.
  34. 34. Способ по любому из пп.30-33, где dsRNA вводят в дозе 0,05-50 мг/кг веса тела субъекта, например в дозе 0,01-5 мг/кг веса тела субъекта.
  35. 35. Способ по любому из пп.30-34, где с помощью способа:
    (i) снижают уровень порфирина или предшественника порфирина (например, 5-аминолевулиновой кислоты (ALA) или порфобилиногена (PBG)) у субъекта, при этом необязательно уровень снижают по меньшей мере на 30%, и/или (ii) ингибируют экспрессию ALAS 1 у субъекта.
  36. 36. Способ по любому из пп.30-35, где с помощью упомянутого способа:
    (i) облегчают симптом, ассоциированный с нарушением, связанным с ALAS1 (например, порфирией), (ii) снижают частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта и/или (iii) снижают вероятность возникновения острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта в случае, когда субъект подвержен воздействию провоцирующего фактора, например предменструальной фазы.
  37. 37. Способ по любому из пп.30-36, где dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят согласно схеме дозирования, например еженедельно, один раз в две недели или ежемесячно.
  38. 38. Способ по любому из пп.30-37, где dsRNA вводят до острого приступа порфирии, например во время продрома.
  39. 39. Способ по любому из пп.30-38, где субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в плазме или моче) ALA и/или PBG и при этом необязательно субъект испытывает хроническую боль.
  40. 40. Способ по любому из пп.30-39, где с помощью способа снижают повышенный уровень ALA и/или PBG.
  41. 41. Способ по любому из пп.30-40, где с помощью способа снижают или предупреждают боль, нейропатию и/или повреждение нервов.
    - 163 036477
  42. 42. Способ по любому из пп.30-41, где с помощью способа предупреждают острые приступы порфирии.
  43. 43. Способ по любому из пп.30-42, где dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят систематически.
  44. 44. Способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества:
    (i) dsRNA по любому из пп.1-22 или (ii) композиции по любому из пп.26-28, при этом необязательно способ является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG.
  45. 45. Способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение dsRNA по любому из пп.1-23 по 1, 2,5 или 5 мг/кг один раз в неделю в течение по меньшей мере десяти недель со снижением тем самым уровня ALA и/или PBG у упомянутого субъекта.
  46. 46. Способ лечения пациента-человека с AIP, который испытывал несколько рецидивирующих приступов, при этом способ включает введение dsRNA по любому из пп.1-22 в дозе 2,5 мг/кг в течение по меньшей мере 6 месяцев с осуществлением тем самым лечения упомянутого пациента, при этом необязательно с помощью упомянутого способа:
    (i) снижают частоту приступов, (ii) сокращают применение гематина, (iii) снижают риск госпитализации и/или (iv) повышают качество жизни.
  47. 47. Способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает выявление (например, измерение) уровня mRNA ALAS1 в образце биологической жидкости (например, образце крови, образце плазмы, образце сыворотки или образце мочи) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1, с осуществлением тем самым анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
  48. 48. Способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает:
    (i) получение РНК (например, внеклеточной РНК) из образца биологической жидкости (например, образца крови, образца плазмы, образца сыворотки или образца мочи) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1;
    (ii) получение cDNA ALAS1 с mRNA ALAS1;
    (iii) приведение в контакт cDNA ALAS1 с нуклеиновой кислотой, комплементарной (например, зондом и/или праймером) cDNA ALAS1 или ее части, с получением тем самым реакционной смеси, и (iv) выявление (например, измерение) уровня cDNA ALAS1 в реакционной смеси, где уровень cDNA ALAS1 указывает на уровень mRNA ALAS1, с осуществлением тем самым анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
  49. 49. Способ по п.48, причем:
    (a) способ включает PCR, qPCR или 5'-RACE, (b) нуклеиновая кислота представляет собой зонд или праймер и/или (c) нуклеиновая кислота содержит выявляемый фрагмент, а уровень mRNA ALAS1 определяют посредством выявления количества выявляемого фрагмента.
  50. 50. Способ по п.49, где эффективность лечения порфирии оценивают на основании сравнения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта с нормальным значением.
  51. 51. Способ по п.49, где снижение уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта в ответ на лечение порфирии относительно нормального значения указывает на то, что лечение порфирии является эффективным.
  52. 52. Способ по любому из пп.49-51, дополнительно включающий получение образца биологической жидкости от субъекта.
  53. 53. Способ по п.52, в котором образец биологической жидкости является отделенным от ткани и при этом образец биологической жидкости содержит экзосомы.
  54. 54. Композиция, содержащая dsRNA по п.19 и воду для инъекции.
  55. 55. Композиция по п.54, содержащая приблизительно 200 мг/мл dsRNA по п.20.
  56. 56. Композиция по п.54 или 55, где композиция характеризуется значением рН 6,0-7,5.
  57. 57. Композиция по любому из пп.54-56, где композиция составлена для подкожной инъекции.
  58. 58. Способ лечения субъекта с порфирией (например, AIP) или повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает подкожное введение субъекту композиции по любому из пп.53-56.
  59. 59. Способ по п.58, где композицию вводят в дозе 0-5 мг/кг, например в дозе 2,5 мг/кг или менее или в дозе 1-2,5 мг/кг.
  60. 60. Способ по п.59, где композицию вводят еженедельно.
  61. 61. DsRNA по п.1 или 2 или фармацевтическая композиция по п.25 для применения в лечении порфирии у пациента, причем порфирия необязательно представляет собой печеночную порфирию или ост-
    - 164 036477 рую перемежающуюся порфирию (AIP), причем порфирия необязательно представляет собой острую печеночную порфирию.
EA201690685A 2013-10-04 2014-10-03 Композиции и способы ингибирования экспрессии гена alas1 EA036477B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361887288P 2013-10-04 2013-10-04
US201461983720P 2014-04-24 2014-04-24
PCT/US2014/059160 WO2015051318A1 (en) 2013-10-04 2014-10-03 Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201690685A1 EA201690685A1 (ru) 2016-07-29
EA036477B1 true EA036477B1 (ru) 2020-11-16

Family

ID=51932569

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201690685A EA036477B1 (ru) 2013-10-04 2014-10-03 Композиции и способы ингибирования экспрессии гена alas1

Country Status (36)

Country Link
US (3) US10119143B2 (ru)
EP (2) EP3052628B1 (ru)
JP (3) JP6613227B2 (ru)
KR (3) KR102307389B1 (ru)
CN (1) CN105980559B (ru)
AU (3) AU2014331604B2 (ru)
BR (2) BR112016007226B1 (ru)
CA (2) CA3227061A1 (ru)
CL (2) CL2016000772A1 (ru)
CR (1) CR20160195A (ru)
CY (2) CY1122975T1 (ru)
DK (1) DK3052628T3 (ru)
DO (2) DOP2016000073A (ru)
EA (1) EA036477B1 (ru)
ES (1) ES2804510T3 (ru)
GT (1) GT201600066A (ru)
HK (1) HK1221738A1 (ru)
HR (1) HRP20200822T1 (ru)
HU (2) HUE049227T2 (ru)
IL (3) IL282747B2 (ru)
LT (2) LT3052628T (ru)
MX (2) MX2016004319A (ru)
MY (2) MY183490A (ru)
NL (1) NL301061I2 (ru)
NZ (2) NZ757749A (ru)
PE (2) PE20161130A1 (ru)
PH (1) PH12016500574A1 (ru)
PL (1) PL3052628T3 (ru)
PT (1) PT3052628T (ru)
SG (2) SG11201602631XA (ru)
SI (1) SI3052628T1 (ru)
TN (1) TN2016000114A1 (ru)
TW (3) TW202310853A (ru)
UA (1) UA124961C2 (ru)
WO (1) WO2015051318A1 (ru)
ZA (2) ZA201602931B (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9133461B2 (en) 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
NZ757749A (en) 2013-10-04 2022-07-01 Icahn School Med Mount Sinai Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene
NZ730296A (en) 2014-08-20 2023-09-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded rna agents
WO2016061487A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting aminolevulinic acid synthase-1 (alas1) and uses thereof
WO2017048843A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene
US20200368268A1 (en) 2018-01-08 2020-11-26 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
KR20220144837A (ko) * 2020-02-21 2022-10-27 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Htt 발현을 감소시키기 위한 방법
WO2023060064A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Renal injury biomarkers as biomarkers for acute hepatic porphyria (ahp)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2213738A2 (en) * 2002-11-14 2010-08-04 Dharmacon, Inc. siRNA molecules targeting Bcl-2
WO2013155204A2 (en) * 2012-04-10 2013-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene

Family Cites Families (243)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
CA1340032C (en) 1987-06-24 1998-09-08 Jim Haralambidis Lucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5032401A (en) 1989-06-15 1991-07-16 Alpha Beta Technology Glucan drug delivery system and adjuvant
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
DK0942000T3 (da) 1989-10-24 2004-11-01 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modificerede oligonukleotider
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
CA2088258C (en) 1990-07-27 2004-09-14 Phillip Dan Cook Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
WO1992002534A2 (en) 1990-08-03 1992-02-20 Sterling Drug, Inc. Compounds and methods for inhibiting gene expression
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
CA2092002A1 (en) 1990-09-20 1992-03-21 Mark Matteucci Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
DE69132510T2 (de) 1990-11-08 2001-05-03 Hybridon, Inc. Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
ATE515510T1 (de) 1991-12-24 2011-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc Durch dna-abschnitte unterbrochene modifizierte oligonukleotide
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
CA2145641C (en) 1992-12-03 2008-05-27 Richard J. Gregory Pseudo-adenovirus vectors
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US6020317A (en) 1993-02-19 2000-02-01 Nippon Shinyaku Co. Ltd. Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
WO1994022864A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
IL111659A0 (en) 1993-11-16 1995-01-24 Genta Inc Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
US5540935A (en) 1993-12-06 1996-07-30 Nof Corporation Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
WO2000022114A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO)
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
JP3269301B2 (ja) 1994-12-28 2002-03-25 豊田合成株式会社 ガラスラン用ゴム配合物
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
AU5359496A (en) 1995-03-06 1996-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
IL122290A0 (en) 1995-06-07 1998-04-05 Inex Pharmaceuticals Corp Lipid-nucleic acid complex its preparation and use
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
BR9609944A (pt) 1995-08-01 1999-05-18 Novartis Ag Composições de oligonucleotídeo lipossomal
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
EP0857217B1 (en) 1995-10-16 2005-04-13 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
JP2002510319A (ja) 1997-07-01 2002-04-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
KR100414936B1 (ko) 1997-09-12 2004-01-13 엑시콘 에이/에스 이환 및 삼환 뉴클레오시드, 뉴클레오타이드 및올리고뉴클레오타이드 동족체
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
JP2002520038A (ja) 1998-07-20 2002-07-09 アイネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション リポソームカプセル化核酸複合体
US6537777B1 (en) 1998-07-27 2003-03-25 Hemebiotech A/S Human porphobilinogen deaminase sequences
BR9914772A (pt) 1998-10-09 2001-12-11 Ingene Inc Conjunto de elementos genéticos, vetor, célulahospedeira, conjunto para a produção de umasequência de ácido nucléico, método para aprodução in vivo ou in vitro de uma sequência deácido nucléico, transcrição de cdna, molécula deácido nucléico inibidor, transcrição de mrna,molécula heteroduplex e composiçãofarmacêutica
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
AU3243300A (en) 1999-02-23 2000-09-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Multiparticulate formulation
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
ATE356824T1 (de) 1999-05-04 2007-04-15 Santaris Pharma As L-ribo-lna analoge
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US7321029B2 (en) 2000-01-21 2008-01-22 Geron Corporation 2′-arabino-fluorooligonucleotide N3′→P5′ phosphoramidates: their synthesis and use
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
US6998484B2 (en) 2000-10-04 2006-02-14 Santaris Pharma A/S Synthesis of purine locked nucleic acid analogues
US7063860B2 (en) 2001-08-13 2006-06-20 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
ES2550609T3 (es) 2002-07-10 2015-11-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Interferencia de ARN mediante de moléculas de ARN de cadena sencilla
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
US8092992B2 (en) 2003-05-29 2012-01-10 Salk Institute For Biological Studies Transcriptional regulation of gene expression by small double-stranded modulatory RNA
JP5183064B2 (ja) 2003-07-02 2013-04-17 エムユーエスシー ファウンデイション フォー リサーチ デべロップメント 甲殻類動物、及び他の無脊椎動物における、ｄｓＲＮＡで誘導された特異的、及び非特異的免疫、及びそこで使用する生物送達媒体
AU2004257373B2 (en) 2003-07-16 2011-03-24 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
US7683036B2 (en) 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
JPWO2005116204A1 (ja) 2004-05-11 2008-06-19 株式会社アルファジェン Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
US7740861B2 (en) 2004-06-16 2010-06-22 University Of Massachusetts Drug delivery product and methods
DK1866414T3 (da) 2005-03-31 2012-04-23 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitorer af ribonukleotidreduktase-underenhed 2 og anvendelser deraf.
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
AU2006336624B2 (en) 2005-11-17 2010-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA
CN102908630B (zh) 2006-01-27 2014-11-19 Isis制药公司 6-修饰的双环核酸类似物
TWI322690B (en) 2006-05-11 2010-04-01 Flysun Dev Co Ltd Short interference ribonucleic acids for treating allergic dieases
EP2520935A3 (en) 2006-08-09 2013-02-13 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
CA2927045A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Muthiah Manoharan Lipid containing formulations
EP2121923A1 (en) 2007-03-02 2009-11-25 MDRNA, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof
EP2162538B1 (en) 2007-05-22 2016-04-20 Arcturus Therapeutics, Inc. Oligomers for therapeutics
EP4223299A3 (en) 2007-12-04 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
JP5697988B2 (ja) 2007-12-27 2015-04-08 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 干渉ｒｎａを使用したポロ様キナーゼ発現のサイレンシング方法
JP2011511004A (ja) 2008-01-31 2011-04-07 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを送達するための最適化された方法
US20110269814A1 (en) 2008-03-26 2011-11-03 Alnylam Pharamaceuticals, Inc. 2'-f modified rna interference agents
US8058069B2 (en) 2008-04-15 2011-11-15 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid formulations for nucleic acid delivery
AU2010260148A1 (en) 2009-06-15 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsRNA targeting the PCSK9 gene
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
AP3284A (en) 2010-02-24 2015-05-31 Arrowhead Res Corp Compositions for targeted delivery of SIRNA
US20140275211A1 (en) 2011-06-21 2014-09-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
KR102689177B1 (ko) 2011-11-18 2024-07-30 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 변형된 ＲＮＡｉ 제제
NZ757749A (en) 2013-10-04 2022-07-01 Icahn School Med Mount Sinai Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene
WO2017048843A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2213738A2 (en) * 2002-11-14 2010-08-04 Dharmacon, Inc. siRNA molecules targeting Bcl-2
WO2013155204A2 (en) * 2012-04-10 2013-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"ALAS1 Pre-design Chimera RNAi", INTERNET CITATION, 22 January 2010 (2010-01-22), pages 1-2, XP002701598, Retrieved from the Internet: URL:http://www.abnova.com/PDFServer/outputs/H00000211-R02.pdf [retrieved on 2013-07-11] *
HOMEDAN CHADI; LAAFI JIHANE; SCHMITT CAROLINE; GUEGUEN NA�G; LEFEBVRE THIBAUD; KARIM ZOUBIDA; DESQUIRET-DUMAS VAL�RIE; WETTERWALD : "Acute intermittent porphyria causes hepatic mitochondrial energetic failure in a mouse model", INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY, PERGAMON, GB, vol. 51, 13 April 2014 (2014-04-13), GB, pages 93 - 101, XP029026620, ISSN: 1357-2725, DOI: 10.1016/j.biocel.2014.03.032 *
J. L. ESTALL, J. L. RUAS, C. S. CHOI, D. LAZNIK, M. BADMAN, E. MARATOS-FLIER, G. I. SHULMAN, B. M. SPIEGELMAN: "PGC-1� negatively regulates hepatic FGF21 expression by modulating the heme/Rev-Erb� axis", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 106, no. 52, 29 December 2009 (2009-12-29), pages 22510 - 22515, XP055071011, ISSN: 00278424, DOI: 10.1073/pnas.0912533106 *
L. YIN, N. WU, J. C. CURTIN, M. QATANANI, N. R. SZWERGOLD, R. A. REID, G. M. WAITT, D. J. PARKS, K. H. PEARCE, G. B. WISELY, M. A.: "Rev-erb�, a Heme Sensor That Coordinates Metabolic and Circadian Pathways", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, vol. 318, no. 5857, 14 December 2007 (2007-12-14), pages 1786 - 1789, XP055071004, ISSN: 00368075, DOI: 10.1126/science.1150179 *
M. BALWANI, R. J. DESNICK: "The porphyrias: advances in diagnosis and treatment", BLOOD, vol. 120, no. 23, 29 November 2012 (2012-11-29), pages 4496 - 4504, XP055093645, ISSN: 00064971, DOI: 10.1182/blood-2012-05-423186 *
M. YASUDA, L. GAN, B. CHEN, S. KADIRVEL, C. YU, J. D. PHILLIPS, M. I. NEW, A. LIEBOW, K. FITZGERALD, W. QUERBES, R. J. DESNICK: "RNAi-mediated silencing of hepatic Alas1 effectively prevents and treats the induced acute attacks in acute intermittent porphyria mice", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 111, no. 21, 27 May 2014 (2014-05-27), pages 7777 - 7782, XP055165224, ISSN: 00278424, DOI: 10.1073/pnas.1406228111 *
NARESH KUMAR, LAURA A. SOLT, YONGJUN WANG, PAMELA M. ROGERS, GARGI BHATTACHARYYA, THEODORE M. KAMENECKA, KEITH R. STAYROOK, CHRIST: "Regulation of Adipogenesis by Natural and Synthetic REV-ERB Ligands", ENDOCRINOLOGY, ASSOCIATION FOR THE STUDY OF INTERNAL SECRETIONS, vol. 151, no. 7, 1 July 2010 (2010-07-01), pages 3015 - 3025, XP055100265, ISSN: 00137227, DOI: 10.1210/en.2009-0800 *
YAO, X. ; BALAMURUGAN, P. ; ARVEY, A. ; LESLIE, C. ; ZHANG, L.: "Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM NL, vol. 403, no. 1, 3 December 2010 (2010-12-03), Amsterdam NL, pages 30 - 35, XP027536757, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/j.bbrc.2010.10.101 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL244749A0 (en) 2016-04-21
PE20161130A1 (es) 2016-11-25
ZA201802919B (en) 2019-07-31
KR20210122877A (ko) 2021-10-12
CA2925357A1 (en) 2015-04-09
PE20211249A1 (es) 2021-07-13
HK1221738A1 (zh) 2017-06-09
MX2016004319A (es) 2016-07-12
JP6613227B2 (ja) 2019-11-27
TW202310853A (zh) 2023-03-16
DK3052628T3 (da) 2020-06-02
LTPA2020527I1 (lt) 2020-09-25
EP3052628A1 (en) 2016-08-10
UA124961C2 (uk) 2021-12-22
PL3052628T3 (pl) 2020-08-24
AU2020286311B2 (en) 2023-08-31
PT3052628T (pt) 2020-06-01
BR122020001264B1 (pt) 2022-11-22
CA2925357C (en) 2024-02-27
TW201524991A (zh) 2015-07-01
TWI694080B (zh) 2020-05-21
ES2804510T3 (es) 2021-02-08
GT201600066A (es) 2018-12-18
JP2016539623A (ja) 2016-12-22
AU2014331604A1 (en) 2016-04-21
MX2022001017A (es) 2022-02-22
NL301061I2 (nl) 2020-10-08
AU2014331604B2 (en) 2021-01-07
CA3227061A1 (en) 2015-04-09
US20160244766A1 (en) 2016-08-25
TW202106697A (zh) 2021-02-16
IL282747A (en) 2021-06-30
CN105980559A (zh) 2016-09-28
EP3693463A1 (en) 2020-08-12
CY1122975T1 (el) 2020-11-25
AU2020286311A1 (en) 2021-01-21
TN2016000114A1 (en) 2017-07-05
DOP2016000073A (es) 2016-10-30
KR102307389B1 (ko) 2021-09-30
CR20160195A (es) 2016-09-05
NZ718995A (en) 2022-07-01
SG11201602631XA (en) 2016-05-30
EA201690685A1 (ru) 2016-07-29
JP2020096582A (ja) 2020-06-25
MY197646A (en) 2023-06-30
IL302726A (en) 2023-07-01
KR20220159478A (ko) 2022-12-02
CL2016000772A1 (es) 2016-12-02
KR102469850B1 (ko) 2022-11-23
IL282747B1 (en) 2023-06-01
EP3052628B1 (en) 2020-02-26
IL244749B (en) 2021-05-31
KR20160079793A (ko) 2016-07-06
LT3052628T (lt) 2020-09-10
CN105980559B (zh) 2020-11-06
CL2018000158A1 (es) 2018-07-20
JP7289254B2 (ja) 2023-06-09
LTC3052628I2 (lt) 2022-04-11
CY2020029I1 (el) 2020-11-25
NZ757749A (en) 2022-07-01
AU2023266354A1 (en) 2023-12-07
MY183490A (en) 2021-02-22
HUS2000034I1 (hu) 2020-09-28
ZA201602931B (en) 2018-07-25
US10119143B2 (en) 2018-11-06
BR112016007226A2 (pt) 2017-09-12
PH12016500574A1 (en) 2016-05-23
SI3052628T1 (sl) 2020-07-31
US11028392B2 (en) 2021-06-08
DOP2022000085A (es) 2022-09-15
US20230026968A1 (en) 2023-01-26
CY2020029I2 (el) 2020-11-25
IL282747B2 (en) 2023-10-01
HRP20200822T1 (hr) 2020-08-07
BR112016007226B1 (pt) 2021-12-07
US20190144870A1 (en) 2019-05-16
NL301061I1 (ru) 2020-08-27
WO2015051318A1 (en) 2015-04-09
HUE049227T2 (hu) 2020-09-28
JP2023120219A (ja) 2023-08-29
TWI768330B (zh) 2022-06-21
SG10201910929QA (en) 2020-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7377246B2 (ja) Ａｌａｓ１遺伝子の発現を阻害する組成物および方法
JP7289254B2 (ja) Ａｌａｓ１遺伝子の発現を阻害する組成物および方法
WO2017048843A1 (en) Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene