EA036477B1 - Композиции и способы ингибирования экспрессии гена alas1 - Google Patents
Композиции и способы ингибирования экспрессии гена alas1 Download PDFInfo
- Publication number
- EA036477B1 EA036477B1 EA201690685A EA201690685A EA036477B1 EA 036477 B1 EA036477 B1 EA 036477B1 EA 201690685 A EA201690685 A EA 201690685A EA 201690685 A EA201690685 A EA 201690685A EA 036477 B1 EA036477 B1 EA 036477B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- dsrna
- alas1
- porphyria
- sequence
- antisense
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 173
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 135
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 39
- 101000843649 Homo sapiens 5-aminolevulinate synthase, nonspecific, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 257
- 102100030755 5-aminolevulinate synthase, nonspecific, mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract description 252
- 101150038201 ALAS1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 379
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 307
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 270
- QSHWIQZFGQKFMA-UHFFFAOYSA-N Porphobilinogen Natural products NCC=1NC=C(CCC(O)=O)C=1CC(O)=O QSHWIQZFGQKFMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 184
- 241000097929 Porphyria Species 0.000 claims description 170
- 208000010642 Porphyrias Diseases 0.000 claims description 168
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 164
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 145
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 138
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 119
- 206010036182 Porphyria acute Diseases 0.000 claims description 104
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 96
- 208000005452 Acute intermittent porphyria Diseases 0.000 claims description 81
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 claims description 67
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 65
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 63
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 53
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 48
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 46
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 43
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 42
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 40
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 claims description 36
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 33
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 32
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 claims description 31
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 claims description 31
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 31
- 208000033552 hepatic porphyria Diseases 0.000 claims description 29
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 29
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 claims description 28
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 24
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 22
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 claims description 21
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 20
- 201000010275 acute porphyria Diseases 0.000 claims description 19
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 19
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 18
- OOOQNKMJLOLMHC-UHFFFAOYSA-N 5-[[3,4-diethyl-5-[[5-formyl-3-(3-hydroxypropyl)-4-methyl-1h-pyrrol-2-yl]methyl]-1h-pyrrol-2-yl]methyl]-4-(3-hydroxypropyl)-3-methyl-1h-pyrrole-2-carbaldehyde Chemical compound N1C(CC2=C(C(C)=C(C=O)N2)CCCO)=C(CC)C(CC)=C1CC=1NC(C=O)=C(C)C=1CCCO OOOQNKMJLOLMHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 claims description 17
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 208000003914 Acute hepatic porphyria Diseases 0.000 claims description 15
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 13
- 108700016481 Acute Hepatic Porphyria Proteins 0.000 claims description 12
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 claims description 10
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 claims description 9
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 claims description 7
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 4
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- BMUDPLZKKRQECS-UHFFFAOYSA-K 3-[18-(2-carboxyethyl)-8,13-bis(ethenyl)-3,7,12,17-tetramethylporphyrin-21,24-diid-2-yl]propanoic acid iron(3+) hydroxide Chemical compound [OH-].[Fe+3].[N-]1C2=C(C)C(CCC(O)=O)=C1C=C([N-]1)C(CCC(O)=O)=C(C)C1=CC(C(C)=C1C=C)=NC1=CC(C(C)=C1C=C)=NC1=C2 BMUDPLZKKRQECS-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 claims description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 2
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 229940109738 hematin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 claims description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 claims description 2
- YPHQRHBJEUDWJW-UHFFFAOYSA-N porphobilinogen Chemical compound NCC1=NC=C(CCC(O)=O)[C]1CC(O)=O YPHQRHBJEUDWJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 10
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 claims 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 25
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 93
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 87
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 86
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 85
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 78
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 69
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 66
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 49
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 46
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 45
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 44
- -1 nucleic acid lipid Chemical class 0.000 description 44
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 43
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 42
- 108010056651 Hydroxymethylbilane synthase Proteins 0.000 description 40
- 102100034391 Porphobilinogen deaminase Human genes 0.000 description 39
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 39
- 208000000627 Hereditary Coproporphyria Diseases 0.000 description 34
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 29
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 description 28
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 28
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 28
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 28
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 27
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 27
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 27
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 25
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 24
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 24
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 23
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 20
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 20
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 19
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol group Chemical group [C@@H]1(CC[C@H]2[C@@H]3CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)[C@H](C)CCCC(C)C HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 18
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 16
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 16
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 15
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 15
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 15
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 14
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 14
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 13
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 13
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 13
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 12
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 12
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 10
- 208000007209 Erythropoietic Porphyria Diseases 0.000 description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 208000006756 X-linked sideroblastic anemia Diseases 0.000 description 10
- 208000022440 X-linked sideroblastic anemia 1 Diseases 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 10
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 10
- 102000056533 human ALAS1 Human genes 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 201000007245 sideroblastic anemia 1 Diseases 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 9
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 9
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 9
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 9
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 9
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 9
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 8
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 208000034958 Congenital erythropoietic porphyria Diseases 0.000 description 8
- 101001067100 Homo sapiens Uroporphyrinogen-III synthase Proteins 0.000 description 8
- 206010036186 Porphyria non-acute Diseases 0.000 description 8
- 101100016705 Rattus norvegicus Alas1 gene Proteins 0.000 description 8
- 102100034397 Uroporphyrinogen-III synthase Human genes 0.000 description 8
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 8
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 201000008220 erythropoietic protoporphyria Diseases 0.000 description 8
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 8
- 208000033685 pterin-4 alpha-carbinolamine dehydratase 1 deficiency Diseases 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 7
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 7
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 7
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 7
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 7
- WDFJYRZCZIUBPR-UHFFFAOYSA-N preuroporphyrinogen Chemical compound OC(=O)CC1=C(CO)NC(CC2=C(C(CCC(O)=O)=C(CC3=C(C(CCC(O)=O)=C(CC4=C(C(CCC(O)=O)=CN4)CC(O)=O)N3)CC(O)=O)N2)CC(O)=O)=C1CCC(O)=O WDFJYRZCZIUBPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 7
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 7
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 6
- 101001021103 Homo sapiens Oxygen-dependent coproporphyrinogen-III oxidase, mitochondrial Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 102100036201 Oxygen-dependent coproporphyrinogen-III oxidase, mitochondrial Human genes 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 6
- 208000001871 Tachycardia Diseases 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 6
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 230000006794 tachycardia Effects 0.000 description 6
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 6
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 6
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 6
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 6
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 5
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 5
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 5
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 5
- 208000003591 Hepatoerythropoietic Porphyria Diseases 0.000 description 5
- 101100016698 Homo sapiens ALAS1 gene Proteins 0.000 description 5
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 5
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 5
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 5
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 5
- 201000008230 cutaneous porphyria Diseases 0.000 description 5
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 5
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 5
- 230000008058 pain sensation Effects 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 208000001297 phlebitis Diseases 0.000 description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 5
- 208000024624 porphyria due to ALA dehydratase deficiency Diseases 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 101710184696 5-aminolevulinate synthase, nonspecific, mitochondrial Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O Chemical compound CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 4
- 206010065973 Iron Overload Diseases 0.000 description 4
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 101100230720 Mus musculus Alas1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 4
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 4
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 4
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 4
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 4
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 229910052758 niobium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 4
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 4
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 4
- 229950003776 protoporphyrin Drugs 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- IHLOTZVBEUFDMD-UUOKFMHZSA-N 7-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2,2-dioxo-1h-imidazo[4,5-c][1,2,6]thiadiazin-4-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NS(=O)(=O)NC2=O)=C2N=C1 IHLOTZVBEUFDMD-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 3
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016761 Haem oxygenases Human genes 0.000 description 3
- 108050006318 Haem oxygenases Proteins 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 206010028817 Nausea and vomiting symptoms Diseases 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 3
- XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N acetic acid;adamantane Chemical compound CC(O)=O.C1C(C2)CC3CC1CC2C3 XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 210000003403 autonomic nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- WIUGGJKHYQIGNH-UHFFFAOYSA-N coproporphyrinogen I Chemical compound C1C(=C(C=2C)CCC(O)=O)NC=2CC(=C(C=2C)CCC(O)=O)NC=2CC(N2)=C(CCC(O)=O)C(C)=C2CC2=C(CCC(O)=O)C(C)=C1N2 WIUGGJKHYQIGNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NIUVHXTXUXOFEB-UHFFFAOYSA-J coproporphyrinogen III(4-) Chemical compound C1C(=C(C=2C)CCC([O-])=O)NC=2CC(=C(C=2C)CCC([O-])=O)NC=2CC(N2)=C(CCC([O-])=O)C(C)=C2CC2=C(C)C(CCC([O-])=O)=C1N2 NIUVHXTXUXOFEB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 3
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 229940059489 heme arginate Drugs 0.000 description 3
- BTIJJDXEELBZFS-UHFFFAOYSA-K hemin Chemical compound [Cl-].[Fe+3].[N-]1C(C=C2C(=C(C)C(C=C3C(=C(C)C(=C4)[N-]3)C=C)=N2)C=C)=C(C)C(CCC(O)=O)=C1C=C1C(CCC(O)=O)=C(C)C4=N1 BTIJJDXEELBZFS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 125000001921 locked nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 3
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940055741 panhematin Drugs 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 3
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- UHSGPDMIQQYNAX-UHFFFAOYSA-N protoporphyrinogen Chemical compound C1C(=C(C=2C=C)C)NC=2CC(=C(C=2CCC(O)=O)C)NC=2CC(N2)=C(CCC(O)=O)C(C)=C2CC2=C(C)C(C=C)=C1N2 UHSGPDMIQQYNAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 201000005060 thrombophlebitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 3
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 3
- QTTNOSKSLATGQB-UHFFFAOYSA-N uroporphyrinogen I Chemical compound C1C(=C(C=2CCC(O)=O)CC(O)=O)NC=2CC(=C(C=2CCC(O)=O)CC(O)=O)NC=2CC(N2)=C(CC(O)=O)C(CCC(=O)O)=C2CC2=C(CC(O)=O)C(CCC(O)=O)=C1N2 QTTNOSKSLATGQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HUHWZXWWOFSFKF-UHFFFAOYSA-N uroporphyrinogen-III Chemical compound C1C(=C(C=2CCC(O)=O)CC(O)=O)NC=2CC(=C(C=2CCC(O)=O)CC(O)=O)NC=2CC(N2)=C(CC(O)=O)C(CCC(=O)O)=C2CC2=C(CCC(O)=O)C(CC(O)=O)=C1N2 HUHWZXWWOFSFKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 3
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 3
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 3
- QGVQZRDQPDLHHV-DPAQBDIFSA-N (3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3-thiol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](S)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 QGVQZRDQPDLHHV-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-(octadecanoyloxy)propyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)NC1=O UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 7-deaza-adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1C=CN2 PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 7-methyladenine Chemical compound C1=NC(N)=C2N(C)C=NC2=N1 HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 2
- 101800002011 Amphipathic peptide Proteins 0.000 description 2
- 108010087765 Antipain Proteins 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 2
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010014418 Electrolyte imbalance Diseases 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- XKVYZLLWKHGKMT-BEJOYRPXSA-N Gemin D Natural products O([C@@H]([C@@H](O)C=O)[C@@H]1[C@@H](O)COC(=O)c2c(c(O)c(O)c(O)c2)-c2c(O)c(O)c(O)cc2C(=O)O1)C(=O)c1cc(O)c(O)c(O)c1 XKVYZLLWKHGKMT-BEJOYRPXSA-N 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 208000004547 Hallucinations Diseases 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010021036 Hyponatraemia Diseases 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N Lithocholsaeure Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 2
- 208000008457 Neurologic Manifestations Diseases 0.000 description 2
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 2
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 2
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 2
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N Pyridoxal Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 2
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 206010046555 Urinary retention Diseases 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- RLXCFCYWFYXTON-JTTSDREOSA-N [(3S,8S,9S,10R,13S,14S,17R)-3-hydroxy-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-16-yl] N-hexylcarbamate Chemical group C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC(OC(=O)NCCCCCC)[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 RLXCFCYWFYXTON-JTTSDREOSA-N 0.000 description 2
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 125000004450 alkenylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 2
- 229940125681 anticonvulsant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 2
- SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N antipain Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N 0.000 description 2
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- HGCIXCUEYOPUTN-UHFFFAOYSA-N cis-cyclohexene Natural products C1CCC=CC1 HGCIXCUEYOPUTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N dodecane-1,1-diol Chemical group CCCCCCCCCCCC(O)O GTZOYNFRVVHLDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 229930192479 gemin Natural products 0.000 description 2
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 208000003243 intestinal obstruction Diseases 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 description 2
- SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N lithocholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N 0.000 description 2
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- QTNLALDFXILRQO-UHFFFAOYSA-N nonadecane-1,2,3-triol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)CO QTNLALDFXILRQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002811 oleoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- ONTNXMBMXUNDBF-UHFFFAOYSA-N pentatriacontane-17,18,19-triol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCC ONTNXMBMXUNDBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 2
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 2
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 229940083542 sodium Drugs 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 2
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- YIMATHOGWXZHFX-WCTZXXKLSA-N (2r,3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-(2-methoxyethoxy)oxolane-2,4-diol Chemical compound COCCO[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O YIMATHOGWXZHFX-WCTZXXKLSA-N 0.000 description 1
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazine Chemical class C1=CN=NC=N1 FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIZMDHZLHJBNSQ-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydrophenazine Chemical compound C1=CC=C2N=C(C=CCC3)C3=NC2=C1 ZIZMDHZLHJBNSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1 RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIGHLLZHFAOEHO-PKPIPKONSA-N 1-[(2s)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)pyrrolidin-1-yl]ethanone Chemical compound CC(=O)N1CC(O)C[C@H]1CO KIGHLLZHFAOEHO-PKPIPKONSA-N 0.000 description 1
- MZMNEDXVUJLQAF-UHFFFAOYSA-N 1-o-tert-butyl 2-o-methyl 4-hydroxypyrrolidine-1,2-dicarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC(O)CN1C(=O)OC(C)(C)C MZMNEDXVUJLQAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazo[4,5-c]pyridin-4-amine Chemical compound NC1=NC=CC2=C1N=CN2 UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNYCHCAYYYRJSH-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrazole-5-carboxamide Chemical class NC(=O)C1=CC=NN1 BNYCHCAYYYRJSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RSMRWWHFJMENJH-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC RSMRWWHFJMENJH-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- AZUHIVLOSAPWDM-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-imidazol-2-yl)-1h-imidazole Chemical compound C1=CNC(C=2NC=CN=2)=N1 AZUHIVLOSAPWDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminopropyl)-7h-purin-6-amine Chemical compound CC(N)CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WROUWQQRXUBECT-UHFFFAOYSA-N 2-ethylacrylic acid Chemical compound CCC(=C)C(O)=O WROUWQQRXUBECT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004200 2-methoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- XISVWWMYWHFIBB-UHFFFAOYSA-N 2-methylprop-2-ene-1,1-diol Chemical group CC(=C)C(O)O XISVWWMYWHFIBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCFFYALKHPIRKJ-UHFFFAOYSA-N 3-[18-(2-carboxylatoethyl)-8,13-bis(ethenyl)-3,7,12,17-tetramethyl-22,23-dihydroporphyrin-21,24-diium-2-yl]propanoate Chemical compound N1C(C=C2C(=C(C)C(=CC=3C(C)=C(CCC(O)=O)C(N=3)=C3)N2)C=C)=C(C)C(C=C)=C1C=C1C(C)=C(CCC(O)=O)C3=N1 ZCFFYALKHPIRKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJTUDXZGHPGLLC-IMJSIDKUSA-N 4511-42-6 Chemical compound C[C@@H]1OC(=O)[C@H](C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1,5-dihydroimidazo[4,5-c]pyridin-4-one Chemical compound O=C1NC(N)=CC2=C1N=CN2 KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)N=C1N QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062307 AAVALLPAVLLALLAP Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 101710170876 Antileukoproteinase Proteins 0.000 description 1
- 206010002942 Apathy Diseases 0.000 description 1
- 101150102415 Apob gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010061666 Autonomic neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 206010049612 Autonomic seizure Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710112538 C-C motif chemokine 27 Proteins 0.000 description 1
- KERQKKXVHHBJKM-RGURZIINSA-N CCCCCC(=O)N1CC(O)C[C@H]1CO Chemical compound CCCCCC(=O)N1CC(O)C[C@H]1CO KERQKKXVHHBJKM-RGURZIINSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010008796 Chromaturia Diseases 0.000 description 1
- 206010009192 Circulatory collapse Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000029767 Congenital, Hereditary, and Neonatal Diseases and Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- LAJXCUNOQSHRJO-ZYGJITOWSA-N Cytochalasin E Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H]([C@]3(O[C@H]3[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)C(=O)[C@](C)(O)/C=C/OC(=O)O[C@@]23C(=O)N1)C)C)C1=CC=CC=C1 LAJXCUNOQSHRJO-ZYGJITOWSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 206010061619 Deformity Diseases 0.000 description 1
- 206010012218 Delirium Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical class S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIUZTXTZRGLYTI-UHFFFAOYSA-N Dihydrogriseofulvin Natural products COC1CC(=O)CC(C)C11C(=O)C(C(OC)=CC(OC)=C2Cl)=C2O1 IIUZTXTZRGLYTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 108700006830 Drosophila Antp Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- JMBQKKAJIKAWKF-UHFFFAOYSA-N Glutethimide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)CCC(=O)NC1=O JMBQKKAJIKAWKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- UXWOXTQWVMFRSE-UHFFFAOYSA-N Griseoviridin Natural products O=C1OC(C)CC=C(C(NCC=CC=CC(O)CC(O)C2)=O)SCC1NC(=O)C1=COC2=N1 UXWOXTQWVMFRSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 101150034920 Hmbs gene Proteins 0.000 description 1
- 101000780643 Homo sapiens Protein argonaute-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004356 Hysteria Diseases 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- LEROTMJVBFSIMP-UHFFFAOYSA-N Mebutamate Chemical compound NC(=O)OCC(C)(C(C)CC)COC(N)=O LEROTMJVBFSIMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N Meprobamate Chemical compound NC(=O)OCC(C)(CCC)COC(N)=O NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- SIDLZWOQUZRBRU-UHFFFAOYSA-N Methyprylon Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NCC(C)C1=O SIDLZWOQUZRBRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 1
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N Naproxen Natural products C1=C(C(C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- DDUHZTYCFQRHIY-UHFFFAOYSA-N Negwer: 6874 Natural products COC1=CC(=O)CC(C)C11C(=O)C(C(OC)=CC(OC)=C2Cl)=C2O1 DDUHZTYCFQRHIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229910004679 ONO2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000026251 Opioid-Related disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 206010033864 Paranoia Diseases 0.000 description 1
- 208000027099 Paranoid disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034620 Peripheral sensory neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010069381 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102100034207 Protein argonaute-2 Human genes 0.000 description 1
- 101000781681 Protobothrops flavoviridis Disintegrin triflavin Proteins 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 208000001431 Psychomotor Agitation Diseases 0.000 description 1
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037714 Quadriplegia Diseases 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 1
- 208000010476 Respiratory Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010041349 Somnolence Diseases 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101100054666 Streptomyces halstedii sch3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940123317 Sulfonamide antibiotic Drugs 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N Vinyl ether Chemical compound C=COC=C QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- NRLNQCOGCKAESA-KWXKLSQISA-N [(6z,9z,28z,31z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl] 4-(dimethylamino)butanoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCCC(OC(=O)CCCN(C)C)CCCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC NRLNQCOGCKAESA-KWXKLSQISA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical group OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000005024 alkenyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005083 alkoxyalkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005213 alkyl heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 125000004419 alkynylene group Chemical group 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 102000018568 alpha-Defensin Human genes 0.000 description 1
- 108050007802 alpha-defensin Proteins 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005122 aminoalkylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 229960003473 androstanolone Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 125000005018 aryl alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005015 aryl alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000025261 autosomal dominant disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- RHISNKCGUDDGEG-UHFFFAOYSA-N bactenecin Chemical compound CCC(C)C1NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(N)CCCN=C(N)N)CSSCC(C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CCCN=C(N)N)NC1=O RHISNKCGUDDGEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016341 bactenecin Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 229940097320 beta blocking agent Drugs 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050002883 beta-defensin Proteins 0.000 description 1
- 102000012265 beta-defensin Human genes 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000746 body region Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940116229 borneol Drugs 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003563 calcium carbonate Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000019577 caloric intake Nutrition 0.000 description 1
- 229960000623 carbamazepine Drugs 0.000 description 1
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- OFZCIYFFPZCNJE-UHFFFAOYSA-N carisoprodol Chemical compound NC(=O)OCC(C)(CCC)COC(=O)NC(C)C OFZCIYFFPZCNJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004587 carisoprodol Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N chembl269478 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- DGBIGWXXNGSACT-UHFFFAOYSA-N clonazepam Chemical compound C12=CC([N+](=O)[O-])=CC=C2NC(=O)CN=C1C1=CC=CC=C1Cl DGBIGWXXNGSACT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003120 clonazepam Drugs 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 208000012839 conversion disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 229960000766 danazol Drugs 0.000 description 1
- POZRVZJJTULAOH-LHZXLZLDSA-N danazol Chemical compound C1[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=CC2=C1C=NO2 POZRVZJJTULAOH-LHZXLZLDSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000008380 degradant Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N di-n-propyl-acetic acid Natural products CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001259 diclofenac Drugs 0.000 description 1
- DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N diclofenac Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000916 dilatatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 206010013990 dysuria Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000913 erythropoietic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003687 estradiol congener Substances 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910001447 ferric ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002972 glutethimide Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940074045 glyceryl distearate Drugs 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- DDUHZTYCFQRHIY-RBHXEPJQSA-N griseofulvin Chemical compound COC1=CC(=O)C[C@@H](C)[C@@]11C(=O)C(C(OC)=CC(OC)=C2Cl)=C2O1 DDUHZTYCFQRHIY-RBHXEPJQSA-N 0.000 description 1
- 229960002867 griseofulvin Drugs 0.000 description 1
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004447 heteroarylalkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004446 heteroarylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005312 heteroarylalkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004415 heterocyclylalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000002657 hormone replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000000231 kidney cortex Anatomy 0.000 description 1
- 150000002597 lactoses Polymers 0.000 description 1
- DDVBPZROPPMBLW-ZJBINBEQSA-N latrunculin a Chemical compound C([C@H]1[C@@]2(O)C[C@H]3C[C@H](O2)CC[C@@H](/C=C\C=C/CC\C(C)=C/C(=O)O3)C)SC(=O)N1 DDVBPZROPPMBLW-ZJBINBEQSA-N 0.000 description 1
- DDVBPZROPPMBLW-UHFFFAOYSA-N latrunculin-A Natural products O1C(=O)C=C(C)CCC=CC=CC(C)CCC(O2)CC1CC2(O)C1CSC(=O)N1 DDVBPZROPPMBLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 125000002960 margaryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960004119 mebutamate Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003821 menstrual periods Effects 0.000 description 1
- 229960004815 meprobamate Drugs 0.000 description 1
- 230000006609 metabolic stress Effects 0.000 description 1
- WDWDWGRYHDPSDS-UHFFFAOYSA-N methanimine Chemical compound N=C WDWDWGRYHDPSDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- IDBOAVAEGRJRIZ-UHFFFAOYSA-N methylidenehydrazine Chemical group NN=C IDBOAVAEGRJRIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000316 methyprylon Drugs 0.000 description 1
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 description 1
- 208000022084 motor paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000018731 motor weakness Diseases 0.000 description 1
- ONKSSDKXDIVIHK-UHFFFAOYSA-N n,n-didecyldodecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(CCCCCCCCCC)CCCCCCCCCC ONKSSDKXDIVIHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002009 naproxen Drugs 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N naproxen Chemical compound C1=C([C@H](C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007830 nerve conduction Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036403 neuro physiology Effects 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 125000001893 nitrooxy group Chemical group [O-][N+](=O)O* 0.000 description 1
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000820 nonprescription drug Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 201000005040 opiate dependence Diseases 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 1
- 229940000673 orphan drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002859 orphan drug Substances 0.000 description 1
- 239000003953 ovulation stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N penetratin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002990 phenothiazines Chemical class 0.000 description 1
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 1
- 208000019899 phobic disease Diseases 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036211 photosensitivity Effects 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 1
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 230000002117 porphyrinogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- DQMZLTXERSFNPB-UHFFFAOYSA-N primidone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NCNC1=O DQMZLTXERSFNPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002393 primidone Drugs 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 150000003146 progesterones Chemical class 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 229960005206 pyrazinamide Drugs 0.000 description 1
- IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N pyrazinecarboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CN=CC=N1 IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003581 pyridoxal Drugs 0.000 description 1
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 description 1
- 239000011674 pyridoxal Substances 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000006950 reactive oxygen species formation Effects 0.000 description 1
- 239000002265 redox agent Substances 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004202 respiratory function Effects 0.000 description 1
- 210000003019 respiratory muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005572 sensory peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000005808 skin problem Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid Chemical group NS(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N sulfanyl Chemical class [SH] PXQLVRUNWNTZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical group 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical group 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N thiouracil Chemical compound O=C1C=CNC(=S)N1 ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 1
- 235000021476 total parenteral nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O triethylammonium ion Chemical compound CC[NH+](CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000000876 trifluoromethoxy group Chemical group FC(F)(F)O* 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M valproate semisodium Chemical compound [Na+].CCCC(C(O)=O)CCC.CCCC(C([O-])=O)CCC MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000834 vinyl ether Drugs 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- SFVVQRJOGUKCEG-OPQSFPLASA-N β-MSH Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H]2C(COC(=O)[C@@](O)([C@@H](C)O)C(C)C)=CCN21 SFVVQRJOGUKCEG-OPQSFPLASA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01037—5-Aminolevulinate synthase (2.3.1.37)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/322—2'-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
- C12N2310/3521—Methyl
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
- C12N2310/3533—Halogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pathology (AREA)
Abstract
Изобретение относится к композициям на основе двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), нацеленной на ген ALAS1, и способам применения таких композиций на основе dsRNA для изменения (например, ингибирования) экспрессии ALAS1.
Description
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 61/887288, поданной 4 октября 2013 г., и предварительной заявки на патент США № 61/983720, поданной 24 апреля 2014
г. Полное содержание каждой из упомянутых выше заявок, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка включает перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате с кодировкой ASCII и, таким образом, включен в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте. Указанная копия файла с кодировкой ASCII, созданная 2 октября 2014 г., имеет название A2038-7202WO_SL.txt, и ее размер составляет 1107486 байт.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к специфическому ингибированию экспрессии гена ALAS 1.
Уровень техники
Врожденные порфирии представляют собой семейство нарушений, возникающих в результате недостаточной активности определенных ферментов в рамках пути биосинтеза гема, также называемым в данном документе порфириновым путем. Недостаточность ферментов порфиринового пути приводит к неполному образованию гема и к накоплению предшественников порфиринов и порфиринов, которые в высоких концентрациях токсичны для ткани.
Из ряда врожденных порфирии, острая перемежающаяся порфирия (AIP, например, аутосомнодоминантная AIP), вариегатная порфирия (VP, например, аутосомно-доминантная VP), наследственная копропорфирия (копропорфирия или НСР, например, аутосомно-доминантная НСР), и порфирия, обусловленная недостаточностью дегидратазы 5'-аминолевулиновой кислоты (также известной как 5аминолевулиновая кислота или ALA) (ADP, например, аутосомно-рецессивная ADP) классифицируются как острые печеночные порфирии и проявляются острыми неврологическими приступами, которые могут быть опасными для жизни. Острые приступы характеризуются симптомами, связанными с вегетативной, периферической и центральной нервной системы, в том числе болью в животе, гипертензией, тахикардией, запором, двигательной слабостью, параличом и судорогами. При ненадлежащем лечении может наступать квадриплегия, нарушение функции дыхания и смерть. Различные факторы, включая лекарственные средства, индуцирующие цитохромы Р450, режим питания и гормональные изменения, могут провоцировать острые приступы вследствие повышения активности синтазы 5' -аминолевулиновой кислоты печени 1 (ALAS1), первого и скорость-лимитирующего фермента пути биосинтеза гема. При острых порфириях, например, AIP, VP, НСР и ADP, недостаточность соответствующего фермента приводит к образованию и накоплению в печени одного или нескольких веществ (например, порфиринов и/или предшественников порфиринов, например, ALA и/или PBG), которые могут быть нейротоксичными и могут приводить к возникновению острых приступов. См., например, Balwani, M and Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
Современная терапия острых неврологических приступов заключается во внутривенном введении гемина (пангематина®, Lundbeck, или нормосанга®, Orphan Europe), который предусматривает экзогенный гем для ингибирования ALAS1 посредством отрицательной обратной связи, и, тем самым, снижает образование ALA и PBG. Гемин используют для лечения во время острого приступа и для предупреждения приступов, особенно у женщин с острыми порфириями, которые испытывают частые приступы при гормональных изменениях во время менструальных циклов. Хотя в целом у пациентов наблюдается хороший ответ на лечение, его эффект является медленным, при этом, как правило, требуется от двух до четырех дней или дольше для приведения концентраций ALA и PBG в моче к нормальным значениям.
Поскольку при внутривенном введении гемин быстро метаболизируется, как правило, требуется от трех до четырех инфузий для эффективного лечения или предупреждения острого приступа. Кроме того, повторяющиеся инфузий могут вызывать перенасыщение железом и флебит, который может нарушать доступ к периферическим венам. Несмотря на то, что ортотопическая трансплантация печени имеет лечебный эффект, эта процедура характеризуется серьезными осложнениями и смертностью, а наличие доноров печени ограничено. Таким образом, требуется альтернативный терапевтический подход, который является более эффективным, быстродействующим и безопасным. Было бы особенно предпочтительным, если бы такое лечение могло осуществляться с помощью подкожного введения, поскольку это исключило бы необходимость в инфузиях и длительной госпитализации.
AIP, также называемая недостаточностью порфобилиногендезаминазы (PBGD), или недостаточностью гидроксиметилбилансинтазы (HMBS), является наиболее распространенной среди острых печеночных порфирий. Распространенность AIP по оценкам составляет 5-10 на 100000, при этом приблизительно у 5-10% пациентов наблюдаются симптомы. AIP представляет собой аутосомно-доминантное нарушение, вызванное мутациями в гене HMBS, что приводит к пониженной, например, составляющей половину от нормы, активности фермента. Ранее мышиную модель AIP, характеризующуюся ~30% активности HMBS дикого типа, получали с помощью гомологичной рекомбинации. Как и у пациентов-людей, у этих мышей повышается активность печеночной ALAS1 и накапливаются большие количества ALA и PBG в плазме и моче при введении порфириногенных лекарственных средств, таких как фенобарбитал. В связи
- 1 036477 с этим, они являются отличной моделью для оценки эффективности новых терапевтических средств для лечения острых печеночных порфирий.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение описывает способы и композиции на основе iRNA для модулирования экспрессии гена ALAS1. Согласно определенным вариантам осуществления уровень экспрессии гена ALAS1 снижают или ингибируют с применением iRNA, специфической по отношению к ALAS1. Такое ингибирование может быть пригодным при лечении нарушений, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирий.
Соответственно, в данном документе описаны композиции и способы, которые влияют на расщепление РНК-транскриптов гена ALAS1, опосредованное индуцируемым РНК комплексом сайленсинга (RISC), например, в клетке или у субъекта (например, у млекопитающего, такого как человек). Также описаны композиции и способы лечения нарушения, связанного с экспрессией гена ALAS1, такого как порфирия, например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (порфирия Досса или ADP), острая перемежающаяся порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия (СЕР), поздняя кожная порфирия (РСТ), наследственная копропорфирия (копропорфирия, или НСР), вариегатная порфирия (VP), эритропоэтическая протопорфирия (ЕРР) или транзиторная эритропорфирия детского возраста. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP), AIP, НСР или VP. Согласно определенным вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию, обусловленную недостаточностью ALAдегидратазы (ADP) или AIP.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP) и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, AIP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Используемое в данном документе выражение iRNA, RNAi, средство на основе iRNA, средство для RNAi, или молекула iRNA относится к средству, которое содержит РНК в том значении, в каком это выражение определено в данном документе, и которое опосредует целевое расщепление РНКтранскрипта, например, через путь с участием индуцируемого РНК комплекса сайленсинга (RISC). Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, влияет на ингибирование экспрессии ALAS1 в клетке или у млекопитающего.
Включенные в композиции iRNA, описанные в данном документе, охватывают dsRNA с нитью РНК (антисмысловой нитью), имеющей участок, например, участок, который составляет 30 нуклеотидов или менее, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, который практически комплементарен по меньшей мере части mRNA-транскрипта гена ALAS1 (например, гена ALAS1 мыши или человека) (также называемого в данном документе iRNA, специфическая по отношению к ALAS1). Альтернативно, или в комбинации, iRNA охватывают dsRNA с нитью РНК (антисмысловой нитью), имеющей участок, который составляет 30 нуклеотидов или менее, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, который практически комплементарен по меньшей мере части mRNA-транскрипта гена ALAS1 (например, варианта 1 или 2 гена ALAS1 человека) (также называемого в данном документе iRNA, специфическая по отношению к ALAS1).
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA), описанная в данном документе, содержит антисмысловую нить с участком, который практически комплементарен участку ALAS1 человека. Согласно вариантам осуществления ALAS1 человека имеет последовательность NM_000688.4 (SEQ ID NO:1) или NM_000688.5 (SEQ ID NO:382). Согласно вариантам осуществления ALAS1 человека имеет последовательность NM_199166.1.
Согласно вариантам осуществления антисмысловая последовательность iRNA (например, dsRNA) нацелена на участок 871-895 (плюс или минус 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотид в каком-либо одном или обоих направлениях относительно 5' и/или 3' конца) транскрипта ALAS I NM_000688.4. Согласно вариантам осуществления антисмысловая последовательность нацелена на нуклеотиды 871-893, 871-892 или 873895 транскрипта ALAS1 NM_000688.4. Согласно вариантам осуществления антисмысловая последовательность содержит последовательность или состоит из последовательности, которая полностью комплементарна или практически комплементарна нуклеотидам 871-893, 871-892 или 873-895 транскрипта ALAS1 NM_000688.4.
Согласно одному аспекту представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем по 3, 2 или 1 нуклеотиду от последова- 2 036477 тельности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит последовательность UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Согласно вариантам осуществления смысловая нить содержит последовательность CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193 в том числе одной или нескольких (например, всех) из модификаций антисмысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489, AD-60519 или AD-61193).
Согласно одному аспекту представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от антисмысловой последовательности, приведенной в любой из табл. 1-40, или немодифицированного варианта антисмысловой последовательности (например, варианте с аналогичной нуклеотидной последовательностью, за исключением того, что некоторые или все из нуклеотидов немодифицированы), приведенной в любой из табл. 21-40. Согласно одному варианту осуществления антисмысловая последовательность содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от (i) антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193 или (ii) немодифицированного варианта любой из этих последовательностей. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Согласно варианту осуществления антисмысловая последовательность нацелена на положения 871-893 NM_000688.4 (SEQ ID NO:1). Согласно вариантам осуществления смысловая нить содержит последовательность CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA не включает смысловую и/или антисмысловую последовательность, приведенную в любой из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20.
Согласно одному варианту осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНКтранскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами, не более чем 2 нуклеотидами или не более чем одним нуклеотидом от антисмысловой последовательности AD-60519. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов модифицированы, как описано выше.
Согласно одному варианту осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНКтранскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от антисмысловой последовательности AD-60489 или производного AD-60489, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов модифицированы, как описано в данном документе, например, один или несколько (или все) нуклеотидов AD-60489 модифицированы, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления производное AD-60489 представляет собой AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD61193, AD-60519, AD-60519 или AD-60901. Согласно вариантам осуществления производное AD-60489 представляет собой AD-60519. Согласно вариантам осуществления производное AD-60489 представляет собой AD-61193.
Согласно одному варианту осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНКтранскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (напри
- 3 036477 мер, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от производного AD-58632, описанного в данном документе. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов модифицированы, как описано в данном документе, например, один или несколько (или все) нуклеотидов AD-58632 модифицированы, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления производное AD-58632 представляет собой AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD60925, и AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, или AD-60419. Согласно вариантам осуществления производное AD-58632 представляет собой AD-60819.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 1 нМ. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50 B диапазоне 0,01-1 нМ. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 0,05 нМ. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением ICso> составляющим менее 0,02 нМ. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 0,01 нМ. Согласно вариантам осуществления IC50 определяют, как описано в данном документе в примерах.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется разовой дозой ED50 менее чем приблизительно 10 мг/кг. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется разовой дозой ED50 менее чем приблизительно 5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления ЕС50 опре деляют, как описано в данном документе в примерах.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-60489. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632 и AD-60489.
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, или AD60419 (например, включающую нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций упомянутых выше dsRNA). Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций)), выбранной из AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191,
AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD61145, AD-61146, AD-60892, или AD-60419. Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций)), выбранной из AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD61146, AD-60892, или AD-60419.
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154), и/или (ii) смысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе.
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60519 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну
- 4 036477 или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60519).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-61193 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-61193).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60819, и/или (ii) смысловую последовательность, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60819 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60819).
Согласно вариантам осуществления представлена dsRNA для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности), и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности). Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, и/или (ii) смысловую нить, которая состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD61193 или AD-60819, за исключением того, что антисмысловая нить и/или смысловая нить dsRNA отличается 1, 2 или 3 нуклеотидами от соответствующей антисмысловой и/или смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819.
Последовательности и модификации AD-60489, AD-60519, AD-61193 и AD-60819 показаны ниже в табл. 44.
Таблица 44. Последовательности и модификации AD-60489, AD-60519, AD-61193, AD-60819
Целевые сайты антисмыс левой последов ательност и NM_0006 SS.4 | Назван ие дуплек са | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') | Соответствующая немодифицированна я смысловая последовательность | Соответствующая немодифицированна я антисмысловая последовательность |
871-893 | AD60489 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuC faUfcUfuAfL96 (SEQ ID NO: 4156) | u s Afs a G f a U f gAfg Af са c U f cU f u UfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4157) | CAGAAAGAGUGUCUC AUCUUAfSEQID NO: 4158) | UAAGAUGAGACACUC UUUCUGGU (SEQID NO: 4159) |
871-893 | AD60519 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfauc uuaL96 (SEQ ID NO: 4160) | u s Afs Af G f a U f g Af gAf c Af c U f cU f uUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4161) | CAGAAAGAGUGUCUC AUCUUAfSEQID NO: 4162) | UAAGAUGAGACACUC UUUCUGGU (SEQID NO: 4163) |
871-893 | AD61193 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfauc uuaL96 (SEQ ID NO: 4164) | u s Afs a G f a U f gAfg Af са c U f cdTu UfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4165) | CAGAAAGAGUGUCUC AUCUUAfSEQID NO: 4166) | UAAGAUGAGACACUC TUUCUGGU (SEQID NO: 4167) |
873-895 | AD60819 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuCfuuL96 (SEQ ID NO: 4168) | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucu uucsusg (SEQ ID NO: 4169) | GAAAGAGUGUCUCAU CUUCUU (SEQ ID NO: 4170) | AAGAAGAUGAGACAC UCUUUCUG (SEQID NO: 4171) |
где с, a, g, u = 2'-OMe рибонуклеозиды; Af, Cf, G, Uf = 2'F рибонуклеозиды; S = фосфотиоат; L96 имеет структуру, обозначенную в табл. 1.
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD60519 или AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193 (в том числе нуклеотидной последовательности и одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489, AD-60519 или AD-61193).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA)
- 5 036477 для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA представляет собой AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819. Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA представляет собой AD-60489, AD-60519 или AD-61193 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60489, AD-60519 или AD-61193).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60489, содержит AD-60489 или состоит из AD-60489 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60489).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60519, содержит AD-60519 или состоит из AD-60519 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60519).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-61193, содержит AD-61193 или состоит из AD-61193 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-61193).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60819, содержит AD-60819 или состоит из AD-60819 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60819).
Согласно вариантам осуществления dsRNA (например, AD-60489, AD-60519, AD-61193, AD-60819 или другая dsRNA, раскрытая в данном документе в любой из табл. 21-40) является эффективной для подавления уровня mRNA ALAS 1 в печени, например, для достижения сайленсинга по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% (например, так, чтобы уровни mRNA ALAS1 снижены до 90% или менее, 80% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее или 20% или менее относительно контрольного уровня mRNA ALAS1 в печени, например, уровня у индивида, не получавшего лечение, или группы индивидов, например, индивида или группы индивидов, получавших лечение только PBS). Согласно вариантам осуществления эффективность dsRNA в отношении подавления уровня mRNA ALAS1 в печени оценивают с применением модели на низших приматах, например, описанной в данном документе в примерах.
Согласно вариантам осуществления dsRNA (например, AD-60489, AD-60519, AD-61193, AD-60819 или другая dsRNA, раскрытая в данном документе в любой из табл. 21-40) является эффективной для подавления уровня циркулирующей mRNA ALAS1, например, для достижения сайленсинга по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% (например, так, чтобы уровни mRNA ALAS1 снизились до 90% или менее, 80% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее или 20% или менее относительно контрольного уровня циркулирующей mRNA ALAS1, например, уровня, который наблюдался до лечения dsRNA или уровня у не получавшего лечения индивида или группы индивидов). Согласно вариантам осуществления эффективность dsRNA в отношении подавления уровня циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением модели на низших приматах, например, описанной в данном документе в примерах. Согласно вариантам осуществления уровень циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением анализа по выявлению циркулирующей внеклеточной РНК (cERD), например, как описано в данном документе или в Sehgal A. et al. Quantitation of tissuespecific target gene modulation using circulating RNA (постер, представленный 9 февраля 2012 г. на симпозиуме Keystone Gene Silencing by small RNAs (Ванкувер, 7-12 февраля, 2012 г.) или Sehgal A. et al. Tissuespecific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, опубликованном в Интернете 19 декабря 2013 г.
Способ cERD можно применять относительно любого соответствующего биологического образца. Согласно вариантам осуществления уровень циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением образца крови, например, образца сыворотки. Согласно вариантам осуществления уровень циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением образца мочи.
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой производное AD-60489, раскрытой в данном документе, например, в любой из табл. в данном документе. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-60489. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60519.
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой производное AD-58632, раскрытой в данном документе, например, в любой из табл. в данном документе. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632.
Согласно вариантам осуществления на повышенную активность указывает более низкое значение IC50, например, как определено на основании анализов in vitro, например, описанных в данном документе, например, в примерах.
Согласно вариантам осуществления на повышенную активность указывает более низкая эффективная доза. Эффективную дозу можно определить на основе введения разовой дозы или нескольких повторяющихся доз. Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе разовой дозы ED50. Согласно вариантам осуществления эффективную дозу или разовую дозу ED50 определяют на основе in vivo анализа. Согласно вариантам осуществления in vivo анализ проводят для низшего жи- 6 036477 вотного, например, для крысы, для низшего примата или для мыши.
Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе дозы, необходимой для получения снижения уровня mRNA ALAS 1 (например, уровня mRNA ALAS 1 в печени и/или уровня циркулирующей mRNA ALAS1), например, как описано в данном документе в примерах. Согласно вариантам осуществления циркулирующую mRNA оценивают с применением анализа cERD.
Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе дозы, требуемой для получения снижения уровня (например, уровня в моче и/или плазме) ALA и/или PBG.
Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе дозы, требуемой для получения конкретного лечебного эффекта, описанного в данном документе, например, предупреждения или облегчения симптомов, связанных с порфирией.
Согласно вариантам осуществления на повышенную активность указывает достижение более высокого уровня dsRNA в печени. Согласно вариантам осуществления более высокий уровень в печени получают после разовой дозы dsRNA (например, дозы по 1, 2,5, 3, 5 или 10 мг/кг). Согласно вариантам осуществления более высокий уровень в печени получают после введения нескольких доз dsRNA (например, 2-10 ежедневных или еженедельных доз по 1, 2,5, 3, 5 или 10 мг/кг).
Согласно одному варианту осуществления iRNA охватывает dsRNA с нитью РНК (антисмысловой нитью), имеющей участок, который практически комплементарен части mRNA ALAS1, например, mRNA ALAS1 человека (например, mRNA ALAS1 человека, представленной под SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO: 382).
Согласно одному варианту осуществления iRNA для ингибирования экспрессии гена ALAS1 включает по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. iRNA включает смысловую нить с первой последовательностью и антисмысловую нить со второй последовательностью. Антисмысловая нить включает нуклеотидную последовательность, которая практически комплементарна по меньшей мере части mRNA, кодирующей транскрипт ALAS1, и при этом участок комплементарности составляет 30 нуклеотидов или менее, и по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину. Как правило, iRNA составляет 19-24 нуклеотида в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 19-21 нуклеотид в длину. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 19-21 нуклеотид в длину и находится в липидном составе, например, составе на основе липидных наночастиц (LNP) (например, составе LNP11).
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 21-23 нуклеотида в длину. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 21-23 нуклеотида в длину и находится в форме конъюгата, например, конъюгата с одним или несколькими производными GalNAc, описанными в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет от приблизительно 15 до приблизительно 25 нуклеотидов в длину, и согласно другим вариантам осуществления iRNA составляет от приблизительно 25 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину. iRNA, нацеленная на ALAS1, при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35% или по меньшей мере на 40% или более, например, при анализе с помощью способа, описанного в данном документе. Согласно одному варианту осуществления iRNA, нацеленная на ALAS1, составлена как компонент стабильной частицы нуклеиновая кислота-липид (SNALP).
Согласно одному варианту осуществления iRNA (например, dsRNA), описанная в данном документе, включает первую последовательность dsRNA, которую выбирают из группы, состоящей из смысловых последовательностей из табл. 21-40, и вторую последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей из табл. 21-40.
Молекулы iRNA, описанные в данном документе, могут включать встречающиеся в природе нуклеотиды или могут включать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. Согласно вариантам осуществления по меньшей мере один модифицированный нуклеотид включает одну или несколько из модификаций нуклеотида, выбранных из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), ациклического нуклеотида, гекситной или гексозной нуклеиновой кислоты (HNA), циклогексеновой нуклеиновой кислоты (CeNA), 2'-метоксиэтила, 2'-О-алкила, 2'-О-аллила, 2'-С-аллила, 2'-фтора, 2'дезокси, 2'-гидроксила или любой их комбинации. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один модифицированный нуклеотид включает без ограничения 2'-О-метилодифицированный нуклеотид, 2'-фтормодифицированный нуклеотид, нуклеотид с 5'-фосфотиоатной группой, и концевой нуклеотид, связанный с лигандом, например, N-ацетилгалактозамином (GalNAc) или производным холестерила. Альтернативно, модифицированный нуклеотид можно выбрать из группы: 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, запертого нуклеотида, ациклического нуклеотида, нуклеотида с удаленными основаниями, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего не встречающиеся в природе основания. Такая модифицированная последовательность может быть основана, например, на первой последовательности упомянутой iRNA, выбранной из группы, состоящей из смысловых последовательностей, раскрытых в табл. 21-40, и второй последова- 7 036477 тельности, выбранной из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей, раскрытых в табл.1-40.
Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, нацелена на вариант РНК-транскрипта ALAS1 дикого типа, и согласно другому варианту осуществления iRNA нацелена на мутантный транскрипт (например, РНК ALAS1, несущей аллельный вариант). Например, iRNA, описанная в настоящем изобретении, может быть нацелена на полиморфный вариант, такой как однонуклеотидный полиморфизм (SNP) ALAS1. Согласно другому варианту осуществления iRNA нацелена на транскрипт ALAS 1 как дикого, так и мутантного типа. Согласно еще одному варианту осуществления iRNA нацелена на конкретный вариант транскрипта ALAS1 (например, вариант 1 ALAS1 человека). Согласно еще одному варианту осуществления средство на основе iRNA нацелено на несколько вариантов транскриптов (например, как вариант 1, так и вариант 2 ALAS1 человека).
Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном изобретении, нацелена на некодирующий участок РНК-транскрипта ALAS1, такой как 5' или 3' нетранслируемый участок транскрипта.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA, описанная в данном документе, находится в форме конъюгата, например, углеводного конъюгата, который может выполнять роль целевого фрагмента и/или лиганда, описанного в данном документе. Согласно одному варианту осуществления конъюгат присоединен к 3'-концу смысловой нити dsRNA. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат присоединен с помощью линкера, например, с помощью двухвалентного или трехвалентного раз ветвленного линкера.
Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат содержит одну или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Такой конъюгат также называется в данном документе конъюгат GalNAc. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат нацеливает средство для RNAi на конкретную клетку, например клетку печени, например гепатоцит. Производные GalNAc могут быть присоединены с помощью линкера, например, двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. Согласно конкретным вариантам осуществления конъюгат представляет собой
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi присоединено к углеводному конъюгату с помощью линкера, например линкера, как показано в следующей схеме, где X представляет собой О или S
Согласно некоторым вариантам осуществления X представляет собой О. Согласно некоторым вариантам осуществления X представляет собой S.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi конъюгировано с L96, как определено в табл. 1 и показано ниже.
Согласно одному варианту осуществления dsRNA характеризуется одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью, десятью, одиннадцатью, двенадцатью, тринадцатью, четырнадцатью, пятнадцатью, шестнадцатью или всем из следующего:
(i) синтезирована химическим путем, например синтезирована с помощью твердофазного синтеза олигонуклеотидов;
- 8 036477 (ii) все нуклеотиды в dsRNA модифицированы, например все нуклеотиды являются 2'-ОМе или 2'F-модифицированными, или представляют собой комбинацию из 2'-ОМе и 2'-Е-модифицированных;
(iii) все нуклеотиды связаны 3'-5' фосфодиэфирными связями;
(iv) смысловая нить содержит 21 нуклеотид или состоит из 21 нуклеотида;
(v) антисмысловая нить содержит 23 нуклеотида или состоит из 23 нуклеотидов;
(vi) имеет тупой конец на 3'-конце смысловой нити;
(vii) имеет 3'-выступающий конец, например имеет выступающий конец из двух нуклеотидов на 3'конце антисмысловой нити;
(viii) присоединена ковалентными связями к лиганду, содержащему три фрагмента Nацетилгалактозамина (GalNAc);
(ix) 3'-конец смысловой нити конъюгирован с фрагментом GalNAc с тремя разветвлениями (например, называемым в данном документе L96, как определено в табл.1). Согласно одному варианту осуществления 3'-конец присоединен к фрагменту GalNAc с тремя разветвлениями при помощи фосфодиэфирной связи;
(х) имеет антисмысловую нить, которая содержит одну или несколько (например, четыре) фосфотиоатных связей. Согласно одному варианту осуществления фосфотиоатные связи расположены на 3' конце и на 5' конце антисмысловой нити. Согласно одному варианту осуществления две фосфотиоатные связи расположены на 3' конце и две фосфотиоатные связи расположены на 5' конце антисмысловой нити;
(xi) имеет смысловую нить, которая содержит одну или несколько (например, две) фосфотиоатных связей. Согласно одному варианту осуществления одна или несколько (например, две) фосфотиоатных связей расположены на 5' конце смысловой нити;
(xii) 21 нуклеотид смысловой нити гибридизируется с комплементарным 21 нуклеотидом антисмысловой нити;
(xiii) образует 21 пару нуклеотидных оснований и выступающий конец из двух оснований на 3'конце антисмысловой нити;
(xiv) содержит смысловую или антисмысловую нить или состоит из смысловой или антисмысловой нити с последовательностью AD-60519;
(xv) имеет смысловую нить с 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20 или всеми из модификаций смысловой нити AD-60519;
(xvi) имеет антисмысловую нить с 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20 или всеми из модификаций антисмысловой нити AD-60519; или (xvii) имеет последовательность дуплекса и все модификации AD-60519.
Согласно вариантам осуществления dsRNA находится в форме конъюгата следующей структуры (также называемой в данном документе AD-60519 или ALN-60519) (SEQ ID NOS 5238-5239 соответственно, по порядку):
Na
S’ S’ 0' О О' 0' С О С О’ 0 0’ 0’ 0 0 0 0 0 0 0' 0' СМцитьВЯЯ 7 НС Р Р Р ? Р . Р F ? Р = Р Р Р I F Р Р Р ' ? Н L963 о А о ό с о о ό АI о о с и ।6 с h о ό 6 с о
Cm Am Cm Am Am Am Gf Am Gf Um Gf Um Cf Um Cf Am Um Cm Um Um Am
Um Gm Gm Ui Cm Ui Um Uf Cm Uf Cm Af Cm Af Gm Af Gm Uf Am Gf Af Af Um
Антисмысловая у 0 $ θ : θ $ θ 6 б О О О О ООО 0 0:0 Ο , 0 нить j· НО 1 Ρ Μ ? ? ί Ρ ? I Μ Ρ ’ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ' Ρ Ρ Ρ ' Ρ иь У
S S о о о о о о о о о о ό О О О О О О О S' $·
Na”
AIN-60519
Af, Cf, Gf, Uf = 2’-F рибонуклеозиды
Am, Cm, Gm, Um = 2’-OMe рибонуклеозиды
S = фосфотиоат
Согласно одному аспекту в данном документе представлена композиция, например фармацевтическая композиция, которая включает одну или несколько из iRNA, описанных в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или средство доставки. Согласно одному варианту осуществления композиция применяется для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в организме, как правило, у человека. Согласно одному варианту осуществления композиция применяется для лечения порфирии, например AIP.
- 9 036477
Согласно одному аспекту iRNA, представленная в данном документе, представляет собой двунитевую рибонуклеиновую кислоту (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить из 15-30 пар оснований в длину, и антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам под SEQ ID NO: 1 или 382.
Согласно дополнительному аспекту iRNA, представленная в данном документе, представляет собой двунитевую RNAi (dsRNA), содержащую смысловую нить, комплементарную антисмысловой нити, где упомянутая антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, где каждая нить имеет от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где упомянутое средство для двунитевой RNAi представлено формулой (III):
смысловая:
антисмысловая:
3' np'-Na'-iX'X'X'^-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-iZ'Z'Z'X-Na'- nq' 5' (III) где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;
каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными, либо их комбинациями, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два неодинаково модифицированных нуклеотида;
каждый Nb и Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными, либо их комбинациями;
каждый np, np', nq и nq' независимо представляет собой выступающий нуклеотид;
каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов;
модификации Nb отличаются от модификации Y, а модификации Nb' отличаются от модификации Y'.
Согласно вариантам осуществления смысловая нить конъюгирована по меньшей мере с одним лигандом.
Согласно вариантам осуществления i равняется 1;
j равняется 1, или как i, так и j равняются l.
Согласно вариантам осуществления k равняется 1; l равняется 1, или как k, так и l равняются l.
Согласно вариантам осуществления XXX комплементарен X'X'X', YYY комплементарен Y'Y'Y', a ZZZ комплементарен Z'Z'Z'.
Согласно вариантам осуществления мотив Y'Y'Y' находится в 11, 12 и 13 положениях антисмысловой нити от 5'-конца.
Согласно вариантам осуществления Y' представляет собой 2'-О-метил.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 15-30 пар нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 17-23 пары нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 19-21 пары нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 21-23 пары нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления модификация нуклеотида выбрана из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), ациклического нуклеотида, гекситной или гексозной нуклеиновой кислоты (HNA), циклогексеновой нуклеиновой кислоты (CeNA), 2'-метоксиэтил, 2'-О-алкил, 2'-О-аллил, 2'-С-аллил, 2'-фтор, 2'-дезокси, 2'-гидроксил и любой их комбинации.
Согласно вариантам осуществления модификации нуклеотидов выбраны из группы, состоящей из LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтила, 2'-О-алкила, 2'-О-аллила, 2'-С-аллила, 2'-фтора, 2'-дезокси, 2'гидроксила и их комбинаций.
Согласно вариантам осуществления модификациями нуклеотидов являются 2'-О-метил-, 2'-фтор или обе.
Согласно вариантам осуществления лиганд содержит углевод.
Согласно вариантам осуществления лиганд присоединен с помощью линкера.
Согласно вариантам осуществления линкер является двухвалентным или трехвалентным разветвленным линкером.
- 10 036477
Согласно вариантам осуществления лиганд представляет собой
Согласно вариантам осуществления лиганд и линкер показаны в формуле XXIV
Согласно вариантам осуществления лиганд присоединен к 3'-концу смысловой нити.
Согласно вариантам осуществления dsRNA состоит из нуклеотидной последовательности или содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в табл. 21-40.
Согласно дополнительному аспекту представленная в данном документе iRNA представляет собой двунитевую рибонуклеиновую кислоту (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS 1, эта антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из табл. 21-40. Согласно вариантам осуществления нуклеотиды антисмысловой нити имеют меньше модификаций, больше модификаций или другие модификации относительно антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из табл.21-40.
Согласно вариантам осуществления смысловые и антисмысловые последовательности являются последовательностями дуплекса, раскрытого в данном документе, который подавляет экспрессию mRNA ALAS1 по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 85 или 90%, например, при оценке с применением анализа, раскрытого в примерах, представленных в данном документе.
Согласно вариантам осуществления экспрессию mRNA ALAS1 оценивают исходя из уровня mRNA ALAS1 в печени, например, при оценке с применением образца для биопсии печени. Согласно вариантам осуществления экспрессию mRNA ALAS1 оценивают исходя из уровня mRNA ALAS1 в биологической жидкости, например, крови, сыворотке, плазме, спинномозговой жидкости или моче. Согласно вариантам осуществления уровень экспрессии mRNA ALAS1 оценивают с применением анализа по выявлению внеклеточной РНК в кровотоке (cERD), например, анализа cERD, описанного в данном документе или в Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (постер, представленный 9 февраля 2012 г. на симпозиуме Keystone Gene Silencing by small RNAs (Ванкувер, 7-12 февраля, 2012 г.) или Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, опубликованном в Интернете 19 декабря 2013 г.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из 2'-О-метил-модифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-фосфотиоатную группу, и концевого нуклеотида, присоединенного к группе производного холестерила или бисдециламида додекановой кислоты.
Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фтормодифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, запертого нуклеотида, ациклического нуклеотида, нуклеотида с удаленными основаниями, 2'аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего не встречающиеся в природе основания.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности составляет по меньшей мере 17 нуклеотидов в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности составляет 19-21 нуклеотид в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности составляет 19 нуклеотидов в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления каждая нить составляет не более 30 нуклеотидов в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна нить содержит 3'выступающий конец по меньшей мере из 1 нуклеотида. Согласно вариантам осуществления антисмысло- 11 036477 вая нить содержит З'-выступающий конец по меньшей мере из 1 нуклеотида.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна нить содержит 3'выступающий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит 3'-выступающий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит 3'-выступающий конец из 2 нуклеотидов.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA, описанная в данном документе, дополнительно содержит лиганд.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд представляет собой лиганд GalNAc.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд нацеливает dsRNA в гепатоциты.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой нити dsRNA.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из антисмысловых последовательностей, приведенных в табл.2140, или соответствующей антисмысловой последовательности, в которой некоторые или все из нуклеотидов немодифицированы. Согласно вариантам осуществления участок комплементарности состоит из последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154). Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности дуплекса AD-60489. Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности дуплекса AD-60519.
Согласно вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из дуплекса, раскрытого в данном документе, который подавляет экспрессию mRNA ALAS1 по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 85 или 90%, например, как определено с помощью анализа, раскрытого в примерах, представленных в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA содержит смысловую нить, состоящую из последовательности смысловой нити, выбранной из табл. 21-40, и антисмысловой нити, состоящей из антисмысловой последовательности, выбранной из табл. 21-40. Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит пару соответствующих смысловой и антисмысловой последовательностей, выбранных из таковых дуплексов, раскрытых в табл. 21-40.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение представляет клетку, содержащую по меньшей мере одну из iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе. Клетка, как правило, представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку. Согласно другим вариантам осуществления клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит).
Согласно одному аспекту в данном документе представлена фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, при этом композиция содержит iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, iRNA (например, dsRNA) вводят в составе безбуферного раствора.
Согласно вариантам осуществления безбуферным раствором является солевой раствор или вода, например вода для инъекций.
Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит AD-60519 и воду для инъекций. Согласно вариантам осуществления композиция содержит приблизительно 100-300 мг/мл, например 200 мг/мл AD-60519. Согласно вариантам осуществления композиции характеризуются рН 6,07,5, например приблизительно 7,0. Согласно вариантам осуществления композиция предназначена для подкожной инъекции. Согласно вариантам осуществления фармацевтическую композицию фасуют в упаковку (например, стеклянный флакон, например, 2 мл стеклянный флакон) объемом приблизительно 0,3-1 мл, например 0,55 мл. Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция представляет собой ALN-AS1, описанную в данном документе в примерах.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, iRNA (например, dsRNA) вводят с буферным раствором. Согласно вариантам осуществления буферный раствор содержит ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. Согласно вариантам осуществления буферный раствор представляет собой забуференный фосфатом солевой раствор (PBS).
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, iRNA (например, dsRNA) нацелена на гепатоциты.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, композицию вводят внутривенно.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, композицию вводят подкожно.
Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе, которая содержат лиганд (например, лиганд, представляющий
- 12 036477 собой GalNAc), который нацеливает iRNA (например, dsRNA) в гепатоциты.
Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе, которая содержат лиганд (например, лиганд, представляющий собой GalNAc), и при этом фармацевтическую композицию вводят подкожно. Согласно вариантам осуществления лиганд нацеливает iRNA (например, dsRNA) в гепатоциты.
Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтическая композиция, например композиция, описанная в данном документе, включает липидный состав. Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi представляет собой состав LNP, например состав МС3. Согласно некоторым вариантам осуществления состав LNP нацеливает средство для RNAi в конкретную клетку, например, клетку печени, например, гепатоцит. Согласно вариантам осуществления липидный состав представляет собой состав LNP11. Согласно вариантам осуществления композицию вводят внутривенно.
Согласно другому варианту осуществления фармацевтическая композиция составлена для введения согласно схеме дозирования, описанной в данном документе, например, не более одного раза каждые четыре недели, не более одного раза каждые три недели, не более одного раза каждые две недели или не более одного раза каждую неделю. Согласно другому варианту осуществления введение фармацевтической композиции может продолжаться в течение месяца или дольше, например, одного, двух, трех или шести месяцев, или одного года или дольше.
Согласно другому варианту осуществления композицию, содержащую iRNA, описанную в настоящем изобретении, например dsRNA, нацеленную на ALAS1, вводят с терапевтическим средством без iRNA, как например, средством, известным для лечения порфирии (например, AIP) или симптома порфирии (например, болевых ощущений). Согласно другому варианту осуществления композицию, содержащую iRNA, описанную в настоящем изобретении, например, dsRNA, нацеленную на AIP, вводят в сочетании со схемой лечения для средства без iRNA, такого как гемин или глюкоза (например, инфузия глюкозы (например, IV глюкозы)). Например, iRNA, описанную в настоящем изобретении, можно вводить до, после или одновременно с глюкозой, декстрозой или подобным лечением, которое помогает восстановить энергетический баланс (например, полное парентеральное питание). iRNA, описанную в настоящем изобретении, можно также вводить до, после или одновременно с введением препарата на основе гема (например, гемина, аргината гема или гемальбумина), а также необязательно в комбинации с глюкозой (например, IV глюкозой) или т.п.
Как правило, глюкозу, вводимую для лечения порфирии, вводят внутривенно (IV). Внутривенное введение глюкозы называют в данном документе IV глюкозой. Однако, также охвачены альтернативные варианты осуществления, согласно которым глюкозу вводят другими способами.
Согласно одному варианту осуществления iRNA ALAS 1 вводят пациенту, а затем пациенту назначают схему введения средства или лечебного средства, не содержащего iRNA (например, глюкозы и/или препарата на основе гема) (или наоборот). Согласно другому варианту осуществления iRNA ALAS1 и терапевтическое средство без iRNA или схему лечения назначают в одно и то же время.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, при этом способ включает:
(а) введение в клетку iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе, и (b) поддержание клетки, полученной на стадии (а), в течение времени, достаточного для обеспечения разрушения mRNAтранскрипта гена ALAS1, вследствие чего происходит ингибирование экспрессии гена ALAS1 в клетке.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ снижения или ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке (например, эритроидной клетке или клетке печени, такой как, например, гепатоцит).
Способ включает:
(а) введение в клетку двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), где dsRNA включает по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. dsRNA содержит смысловую нить с первой последовательностью и антисмысловую нить со второй последовательностью; антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который практически комплементарен по меньшей мере части mRNA, кодирующей ALAS1, и при этом участок комплементарности составляет 30 нуклеотидов или менее, например 15-30 нуклеотидов в длину, и, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, и где dsRNA при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1 по меньшей мере на 10%, например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или более; и (b) поддержание клетки, полученной на стадии (а), в течение времени, достаточного для обеспечения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS1, вследствие чего происходит снижение или ингибирование экспрессии гена ALAS1 в клетке.
Согласно вариантам осуществления изложенных выше способов ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo. Согласно вариантам осуществления клетка представляет собой гепатоцит.
Согласно вариантам осуществления клетка принадлежит субъекту, нуждающемуся в лечении, предупреждении и/или контроле нарушения, связанного с экспрессией ALAS 1.
- 13 036477
Согласно вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой острую перемежающуюся порфирию или порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленная недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, AIP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно вариантам осуществления экспрессию ALAS1 ингибируют по меньшей мере на 30%.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) характеризуется значением IC50 B диапазоне 0,01-1 нМ.
Согласно определенным вариантам осуществления клетка (например, гепатоцит) представляет собой клетку млекопитающего (например, клетку человека, низшего примата или грызуна).
Согласно одному варианту осуществления клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка принадлежит субъекту (например, пациенту, нуждающемуся в лечении, предупреждении и/или контроле нарушения, связанного с экспрессией ALAS1)).
Согласно одному варианту осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека) с риском возникновения порфирии, или диагностированной порфирией, например, Хсцепленной сидеробластической анемией (XLSA), порфирией, обусловленной недостаточностью дегидратазы ALA (ADP или порфирией Досса), острой перемежающейся порфирией (AIP), врожденной эритропоэтической порфирией (СЕР), поздней кожной порфирией (РСТ), наследственной копропорфирией (копропорфирией, или НСР), вариегатной порфирией (VP), эритропоэтической протопорфирией (ЕРР) или транзиторной эритропорфирией детского возраста. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), AIP, НСР или VP. Согласно конкретным вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP) или AIP.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленная недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, AIP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно одному варианту осуществления введенная dsRNA снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 в клетке.
Согласно одному варианту осуществления введенная dsRNA снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 или уровень одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, 8-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфобилиногена (PBG), гидроксиметилбилана (НМВ), уропорфириногена I или III, копропорфириногена I или III, протопорфириногена IX и протопорфирина IX) или продуктов или метаболитов порфирина по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50% или более относительно эталонного образца (например, необработанной клетки или клетки, обработанной нецелевой контрольной dsRNA). Без привязки к конкретной теории, ALAS1 является первым ферментом в рамках порфиринового пути. Таким образом, снижение экспрессии гена ALAS1, по-видимому, снижает уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов.
Согласно другим аспектам в настоящем изобретении представлены способы лечения, предупреждения или контроля патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1 (например, патологических процессов, в которые вовлечены порфирины, предшественники порфиринов, или нарушения в рамках порфиринового пути, как например, порфирии). Согласно одному варианту осуществления способ включает введение субъекту, например, пациенту, нуждающемуся в таком лечении, предупреждении или контроле, эффективного (например, терапевтически или профилактически эффективного) количества одного или нескольких из iRNA, описанных в данном документе.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения и/или предупреждения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе, или композиции, содержащей iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения и/или предупреждения порфирии, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить из 15- 14 036477 пар оснований в длину, и при этом антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам под SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO: 382.
Согласно одному варианту осуществления субъект (например, пациент) страдает порфирией. Согласно другому варианту осуществления субъект (например, пациент) подвержен риску развития порфирии. Согласно некоторым вариантам осуществления введение iRNA, нацеленной на ALAS1, ослабляет или облегчает у пациента тяжесть по меньшей мере одного симптома нарушения, связанного с ALAS 1.
Согласно одному варианту осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека) с риском возникновения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, или диагностированным нарушением, связанным с экспрессией ALAS1, например порфирией, например, Х-сцепленной сидеробластической анемией (XLSA), порфирией, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (порфирией Досса), острой перемежающейся порфирией (AIP), врожденной эритропоэтической порфирией (СЕР), поздней кожной порфирией (РСТ), наследственной копропорфирией (копропорфирией, или НСР), вариегатной порфирией (VP), эритропоэтической протопорфирией (ЕРР) или транзиторной эритропорфирией детского возраста. Согласно дополнительному варианту осуществления порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), AIP, НСР или VP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP) или AIP.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленной недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, AIP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно вариантам осуществления порфирию, симптом порфирии, продром или приступ порфирии индуцирован воздействием провоцирующего фактора, описанного в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является химическое воздействие. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является лекарственное средство, например, лекарственное средство рецептурного отпуска или отпускаемое без рецепта лекарственное средство. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, лютеиновая фаза.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят после острого приступа порфирии.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят во время острого приступа порфирии.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят профилактически с целью предупреждения острого приступа порфирии.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в виде состава LNP.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) находится в форме конъюгата GalNAc.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) вводят в дозе 0,05-50 мг/кг.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) вводят в концентрации 0,01-5 мг/кг веса тела субъекта.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в виде состава LNP и его вводят в дозе 0,05-5 мг/кг.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в форме конъюгата GalNAc и его вводят в дозе 0,5-50 мг/кг. Согласно определенным вариантам осуществления iRNA в конъюгате GalNAc вводят в дозе менее 10 мг/кг (например, 5 мг/кг или менее), например, один раз в неделю; например, в дозе 1 мг/кг или менее, 2,5 мг/кг или менее, или 5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю. Согласно одному варианту осуществления iRNA в конъюгате GalNAc вводят в дозе приблизительно 2,5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю. Согласно одному варианту осуществления введение iRNA в конъюгате GalNAc представляет собой подкожное введение.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в форме конъюгата GalNAc и его вводят, например, подкожно, в дозе 0-5 мг/кг, например, 0-2,5 мг/кг или 1-2,5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления iRNA вводят еженедельно. Согласно вариантам осуществления iRNA вводят в виде композиции, содержащей iRNA и воду для инъекции. Согласно вариантам осуществления iRNA представляет собой AD-60519. Согласно вариантам осуществления композиция содержит iRNA, например AD-60519, в концентрации приблизительно 200 мг/мл.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа снижают уровень порфирина или предшественника порфирина у субъекта.
- 15 036477
Согласно вариантам осуществления уровень снижают по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, или 90%. Согласно варианту осуществления уровень снижают по меньшей мере на 30%.
Согласно вариантам осуществления предшественником порфирина является 5-аминолевулиновая кислота (ALA) или порфобилиноген (PBG).
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) характеризуется значением IC50 в диапазоне 0,01-1 нМ.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа, описанного в данном документе, (i) облегчают симптом, ассоциированный с нарушением, связанным с ALAS1 (например, порфирией), (ii) ингибируют экспрессию ALAS1 у субъекта (например, при оценке с помощью анализа cERD), (iii) снижают уровень предшественника порфирина (например, ALA или PBG) или порфирина у субъекта, (iv) снижают частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта, или (v) снижает у субъекта частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, при воздействии в отношении субъекта провоцирующего фактора (например, предменструальной фазы или лютеиновой фазы).
Согласно вариантам осуществления с помощью способа облегчают болевые ощущения и/или прогрессирующую нейропатию.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят согласно схеме дозирования.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят до или во время острого приступа порфирии.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят до острого приступа порфирии.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят во время продрома. Согласно вариантам осуществления продром характеризуется болью в животе, тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), возбужденным состоянием и/или бессонницей.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят во время конкретной фазы менструального цикла, например, во время лютеиновой фазы.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа облегчают или предупреждают периодические приступы порфирии, например, путем снижения тяжести, продолжительности или частоты приступов. Согласно вариантам осуществления периодические приступы ассоциированы с провоцирующим фактором. Согласно вариантам осуществления провоцирующим фактором является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, лютеиновая фаза.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления уровень ALA и/или PBG повышен в плазме или моче субъекта. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например, печеночной порфирии. Согласно вариантам осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение (например, мутацию гена), ассоциированное с порфирией, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии и испытывает болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления субъект не испытывает острых приступов, но испытывает болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе.
Согласно вариантам осуществления субъект (а) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и (b) испытывает болевые ощущения (например, хроническую боль, например хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень ALA и/или PBG в плазме и/или в моче. Согласно вариантам осуществления повышенный уровень ALA и/или PBG сопровождается другими симптомами, например, болевыми ощущениями (например, хронической болью, например, хронической нейропатической болью) или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе. Согласно вариантам осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, например мутацию, описанную в данном документе.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) предшественника порфирина, например ALA и/или PBG, например, уровень выше нормального значения, или выше или равен нормальному значению. Согласно вариантам осуществления упомянутый уровень выше нормального значения. Согласно вариантам осуществления нормаль- 16 036477 ное значение соответствует двум стандартным отклонениям выше среднего уровня в образце здоровых индивидов. Согласно вариантам осуществления нормальное значение соответствует верхнему пределу нормального диапазона значений.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет уровень ALA и/или PBG в плазме или уровень ALA и/или PBG в моче, который выше, или выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5кратному уровню верхнего предела нормального диапазона значений. Используемый в данном документе верхний предел нормального диапазона значений относится к уровню, который представляет собой верхний предел 95% доверительного интервала для эталонного образца, например, образца индивидов с нормальными показателями (например, дикого типа) или здоровых индивидов, например, индивидов, которые не несут генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или индивидов, которые не страдают порфирией. Согласно вариантам осуществления у субъекта уровень ALA и/или PBG в моче составляет выше 2-4-кратного уровня относительно верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно вариантам осуществления у субъекта уровень ALA и/или PBG в моче составляет выше 4кратного уровня относительно верхнего предела нормального диапазона значений.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,12, 0,24, 0,36, 0,48 или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в моче составляет 1,2 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0,12, 0,24, 0,36, 0,48 или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в моче, который выше, или выше или равен 3,1, 6,2, 9,3, 12,4 или 15,5 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают один или несколько признаков или симптомов порфирии. Согласно вариантам осуществления с помощью способа снижают повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе. Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой нейропатическую боль (например, боль, ассоциированную с прогрессирующей нейропатией при острых порфириях). Уменьшение болевых ощущений может включать, например, предупреждение болевых ощущений, задержку начала проявления болевых ощущений, снижение частоты болевых ощущений и/или снижение тяжести болевых ощущений. Согласно вариантам осуществления уменьшение болевых ощущений оценивают на основе применения субъектом антиболевой терапии.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа облегчают или предупреждают острые приступы порфирии, например, путем снижения тяжести, продолжительности или частоты приступов.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают или предупреждают повреждение нервов.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа предупреждают ухудшение клинических показателей (например, предупреждают развитие патологических изменений) или результатом является улучшение клинических показателей, например, клинических показателей функции мышц и/или нервов, например, EMG и/или показателей скорости проводимости нерва.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают применение субъектом гема.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают применение субъектом антиболевой терапии.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа снижают риск госпитализации.
Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG (например, уровня ALA и/или PBG в плазме или в моче). Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для получения заранее определенного снижения повышенного уровня ALA и/или PBG.
Согласно вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение
- 17 036477 до значения, меньшего или равного нормальному значению. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение соответствует верхнему пределу нормального диапазона значений. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение соответствует значению, равному двум стандартным отклонениям выше среднего уровня в эталонном образце.
Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG у субъекта до уровня, который в два раза ниже верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня ALA в два раза ниже верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня PBG в два раза ниже верхнего референтного предела.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят в виде разовой дозы или нескольких доз, например, согласно схеме дозирования.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят субъекту, подверженному риску развития порфирии, профилактически. Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят профилактически, начиная с периода полового созревания. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или имеет повышенный уровень ALA и/или PBG (например, повышенный уровень ALA и/или PBG в плазме или моче). Согласно вариантам осуществления мутация способствует восприимчивости субъекта к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, пребывания на диете или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, раскрытого в данном документе). Согласно вариантам осуществления мутация ассоциирована с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). Согласно вариантам осуществления мутация ассоциирована с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией).
Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в гене ALAS1. Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в промоторе гена ALAS1, или в участках, расположенных выше или ниже относительно гена ALAS1. Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в гене, который кодирует фермент в рамках пути биосинтеза гема.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA или ее конъюгат) или композицию, содержащую iRNA, вводят подкожно. Согласно вариантам осуществления iRNA находится в форме конъюгата GalNAc. Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) вводят в дозе 0,5-50 мг/кг. Согласно определенным вариантам осуществления iRNA вводят в дозе менее 10 мг/кг (например, 5 мг/кг или менее) один раз в неделю; например, в дозе 1 мг/кг или менее, 2,5 мг/кг или менее, или 5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю. Согласно одному варианту осуществления iRNA вводят в дозе приблизительно 2,5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю.
Согласно вариантам осуществления у субъекта, который подлежит лечению, не наблюдаются симптомы, и он имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией, например, AIP. Согласно вариантам осуществления пациент испытывает рецидивирующие приступы порфирии.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, AD-60519) вводят в дозе менее 5 мг/кг, например, по 0,1, 0,35, 1,0 или 2,5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления iRNA (например, AD-60519) вводят в повторяющихся дозах, например, еженедельных дозах.
Согласно одному варианту осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы, и он имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и iRNA (например, AD-60519) вводят в разовых дозах, например, по 0,1, 0,35, 1,0 или 2,5 мг/кг; или в повторяющихся еженедельных дозах, например, по 1 и 2,5 мг/кг в течение нескольких недель (например, в течение 4 недель).
Согласно одному варианту осуществления субъект имеет AIP, например, является пациентом с AIP, при этом iRNA (например, AD-60519) вводят в дозе 1-2,5 мг/кг еженедельно.
Согласно вариантам осуществления используют схему лечения, при которой iRNA изначально вводят более часто, с последующим менее частым введением. Согласно вариантам осуществления iRNA изначально вводят один раз в день в течение нескольких дней (например, в течение 2-14 дней, например, в течение 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней). Согласно вариантам осуществления iRNA затем вводят один раз в неделю. Согласно вариантам осуществления iRNA затем вводят один раз каждые две недели. Согласно вариантам осуществления iRNA затем вводят с частотой, эффективной для уменьшения одного или нескольких признаков или симптомов порфирии.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение субъекту двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить из 15-30 пар оснований в длину и антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам под SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:382.
- 18 036477
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества dsRNA или композиции, содержащей dsRNA, описанной в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы, описанные в данном документе, эффективны для снижения уровня ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень ALA и/или PBG снижают так, чтобы он был меньше, или меньше или равен нормальному значению, например, верхнему пределу нормального диапазона значений.
Согласно вариантам осуществления у субъекта, который подлежит лечению, не наблюдаются симптомы, и он имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией, например AIP.
Согласно вариантам осуществления iRNA вводят в дозе менее 5 мг/кг, например по 0,1, 0,35, 1,0 или 2,5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления iRNA вводят в повторяющихся дозах, например, еженедельных дозах.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлены способы снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке (например, эритроидной клетке или клетке печени, такой как, например, гепатоцит). Согласно одному варианту осуществления клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка принадлежит субъекту (например, пациенту, нуждающемуся в лечении, предупреждении и/или контроле нарушения, связанного с экспрессией ALAS1)). Способ включает приведение клетки в контакт с эффективным количеством одной или нескольких из iRNA, нацеленных на ALAS1, например одной или нескольких из iRNA, раскрытых в данном документе, вследствие чего происходит снижение уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке; или снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в других клетках, тканях или жидкостях субъекта, в организме которого находится клетка, относительно уровня, предшествующего приведению в контакт. Такие способы можно применять для лечения (например, облегчения тяжести) нарушений, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии, например, AIP или порфирия, обусловленная недостаточностью дегидратазы ALA.
Согласно одному варианту осуществления стадия приведения в контакт является эффективной ex vivo, in vitro или in vivo. Например, клетка может принадлежать субъекту, например, млекопитающему (например, человеку), с риском возникновения порфирии или субъекту с диагностированной порфирией. Согласно варианту осуществления порфирия представляет собой острую печеночную порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP), порфирии, обусловленной недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирии. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, ALP, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке, включающий приведение клетки в контакт с iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе, в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке.
Согласно вариантам осуществления клетка представляет собой гепатоцит. Согласно вариантам осуществления порфирин или предшественник порфирина представляет собой 8-аминолевулиновую кислоту (ALA), порфобилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (НМВ), уропорфириноген I или III, копропорфириноген I или III, протопорфириноген IX или протопорфирин IX. Согласно вариантам осуществления предшественником порфирина является ALA или PBG.
Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку. Согласно дополнительному варианту осуществления клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит).
Согласно одному аспекту в данном документе представлен вектор, кодирующий по меньшей мере одну нить iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен вектор, кодирующий по меньшей мере одну нить dsRNA, где упомянутая dsRNA содержит участок комплементарности по меньшей мере к части mRNA, кодирующей ALAS1, где упомянутая dsRNA составляет 30 пар оснований или менее в длину, и где упомянутая dsRNA нацелена на упомянутую mRNA для расщепления.
Согласно вариантам осуществления участок комплементарности составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок комплементарности составляет 19-21 нуклеотид в длину.Согласно одному аспекту в настоящем изобретении представлен вектор для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. Согласно одному варианту осуществления вектор содержит iRNA, описанную в данном документе. Согласно одному варианту осуществления вектор включает по меньшей мере одну регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью,
- 19 036477 которая кодирует по меньшей мере одну нить iRNA, описанную в данном документе. Согласно одному варианту осуществления вектор содержит по меньшей мере одну нить iRNA ALAS1.
Согласно одному аспекту в данном документе представлена клетка, содержащая вектор, описанный в данном документе. Согласно одному аспекту представлена клетка, содержащая вектор для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. Вектор включает регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну нить из iRNA, описанных в данном документе. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит). Согласно другому варианту осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку.
Согласно другому аспекту представлен способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает выявление (например, измерение) уровня mRNA ALAS1 в образце биологической жидкости (например, образце крови (например, образце сыворотки или плазмы), образце спинномозговой жидкости или мочи субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1, таким образом анализируют уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
Согласно другому аспекту представлен способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает (i) получение РНК (например, внеклеточной РНК) из образца биологической жидкости (например, образца крови или плазмы) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1; (ii) получение cDNA ALAS1 из mRNA ALAS1; (iii) приведение в контакт cDNA ALAS1 с нуклеиновой кислотой (например, зондом и/или праймером), комплементарной cDNA ALAS1 или ее частью, с получением реакционной смеси; и (iv) выявление (например, измерение) уровня cDNA ALAS1 в реакционной смеси, где уровень cDNA ALAS1 указывает на уровень mRNA ALAS1, таким образом, анализируют уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец крови. Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец сыворотки. Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец мочи.
Согласно вариантам осуществления способ включает PCR, qPCR или 5'-RACE.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота представляет собой зонд или праймер.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота содержит выявляемый фрагмент, и при этом уровень mRNA ALAS1 определяют путем выявления количества выявляемого фрагмента.
Согласно вариантам осуществления упомянутый способ дополнительно включает получение образца биологической жидкости от субъекта. Согласно вариантам осуществления образец биологической жидкости является отделенным от ткани и содержит экзосомы. Согласно вариантам осуществления этих способов эффективность лечения порфирии оценивают на основании сравнения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS 1 у субъекта относительно нормального значения.
Согласно вариантам осуществления снижение уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, в ответ на лечение порфирии, относительно нормального значения, указывает на то, что лечение порфирии является эффективным. Согласно вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта до лечения порфирии.
Все публикации, заявки на патент, патенты и другие литературные источники, упомянутые в данном документе, включены при помощи ссылки во всей своей полноте.
Подробная информация о различных вариантах осуществления настоящего изобретения изложена ниже в описании. Другие характеристики, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и графических материалов, а также из формулы изобретения.
Описание графических материалов
На фиг. 1 обозначен путь биосинтеза гема.
На фиг. 2А и 2В показана таблица, в которой приведены определенные порфирии, ассоциированные с генетическими ошибками в рамках метаболизма гема.
На фиг. 3А и 3В обозначен транскрипт mRNA ALAS1 человека (эталонная последовательность NM_000688.4 (GL40316942, дата регистрации 19 ноября 2011 г.), SEQ ID NO: 1).
На фиг. 4А и фиг. 4В обозначен транскрипт mRNA ALAS 1 человека (эталонная последовательность NM_000688.5 (GI: 362999011, дата регистрации 1 апреля 2012 г.), SEQ ID NO: 382).
На фиг. 5 показан дозозависимый эффект siRNA AD-53558 при подавлении mRNA ALAS1 мыши (mALAS1) относительно PBS в качестве контроля. Также показаны результаты для контроля AD-1955 с люциферазой (LUC).
На фиг. 6 показан дозозависимый эффект siRNA AD-53558 при подавлении mRNA ALAS1 у крыс относительно PBS в качестве контроля. Также показаны результаты для контроля AD-1955 с люциферазой (LUC).
- 20 036477
На фиг. 7 показана продолжительность подавления mRNA ALAS1 мыши (mALASl) с помощью siRNA AD-53558 относительно PBS в качестве контроля.
На фиг. 8 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровней ALA в плазме (в мкМ) на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом в экспериментальной (siRNA ALAS1) и контрольной (siRNA LUC) группах.
На фиг. 9 показаны уровни ALA в плазме (в мкМ) отдельных животных на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у животных, которые были подвержены обработке siRNA ALAS1 и контролем (siRNA LUC).
На фиг. 10 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровней PBG в плазме (в мкМ) на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у животных, которые были подвержены обработке siRNA ALAS1 и контролем (siRNA LUC).
На фиг. 11 показаны уровни PBG в плазме (в мкМ) отдельных животных на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у животных, которые были подвержены обработке siRNA ALAS1 и контролем (siRNA LUC).
На фиг. 12 показан относительный уровень mRNA mALAS1 в печени на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у отобранных типичных экспериментальных (siRNA ALAS1) и контрольных (PBS) животных.
На фиг. 13 показаны эффекты трех siRNA mALAS1, конъюгированных с GalNAc, в отношении экспрессии mALAS1 (относительно PBS в качестве контроля) в ткани печени мыши.
На фиг. 14 показаны уровни ALA и PBG в плазме в динамике после введения фенобарбитала и обработки siRNA ALAS1 или контрольной siRNA LUC.
На фиг. 15 показаны эффекты siRNA ALAS1, конъюгированных с GalNAc, в отношении уровней ALA и PBG в плазме в мышиной модели индукции AIP фенобарбиталом.
На фиг. 16 показаны дозозависимые эффекты siRNA ALAS1 в отношении уровней ALA и PBG в плазме в мышиной модели индукции AIP фенобарбиталом. Для животных, которые получали siRNA ALAS1, доза вводимой siRNA (0,05, 0,1, 0,5 или 1,0 мг/кг) показана на горизонтальной оси.
На фиг. 17 на верхней части рисунка показана схема эксперимента, применяемая для исследования подавления ALA и PBG с помощью siRNA ALAS1. На нижней части рисунка показаны уровни ALA и PBG в плазме на исходном уровне, в контрольном (Luc) состоянии и после обработки siRNA ALAS1 на 0, 2 и 4 неделе.
На фиг. 18 показана схема эксперимента, применяемая для сравнения эффектов лечения siRNA ALAS1 или гемином в отношении животной модели ALP (вверху), и результаты по уровням ALA (мкмоль/л) в плазме (в середине) и уровням PBG (мкмоль/л) в плазме (внизу).
На фиг. 19 показаны относительные уровни mRNA (ALAS1/GAPDH) у животных, обработанных 30, 10 или 3 мг/кг AD-58632, относительно животных, обработанных PBS в качестве контроля.
На фиг. 20 показана схема эксперимента, применяемая для изучения эффекта доза-ответ конъюгата GalNAc с AD-58632 ALAS1 в крысиной модели AIP.
На фиг. 21 показаны относительные уровни mRNA PBGD в печени (верхний график) и относительные уровни mRNA ALAS1 в печени (нижний график) в крысиной модели AIP. Группы животных подлежали одной из четырех обработок: (1) обработка только фенобарбиталом (РВ), (2) обработка фенобарбиталом и siRNA порфобилиногендезаминазы (PBGD), (3) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 30 мг/кг siRNA ALAS1, (4) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 10 мг/кг siRNA ALAS1.
На фиг. 22 показаны уровни PBG (верхняя часть рисунка) и ALA (нижняя часть рисунка) в моче относительно уровней креатинина в крысиной модели ALP. Группы животных подлежали одной из четырех обработок: (1) обработка только фенобарбиталом (РВ), (2) обработка фенобарбиталом и siRNA порфобилиногендезаминазы (PBGD), (3) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 30 мг/кг siRNA ALAS1, (4) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 10 мг/кг siRNA ALAS1.
На фиг. 23 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 с помощью AD-58632, относительно PBS в качестве контроля, в группах крыс, которые получали пять суточных доз siRNA по 6, 2 или 1 мг/кг по отношению к однократным болюсным дозам siRNA по 30, 10 или 5 мг/кг.
На фиг. 24 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 с помощью AD-58632, относительно PBS в качестве контроля, в группах крыс, которые получали четыре еженедельные дозы siRNA по 10, 5 или 2,5 мг/кг.
На фиг. 25 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 с помощью AD-58632 и с помощью пяти дуплексов из 19/19 мономеров .
На фиг. 26 показаны результаты оценки исследования эффекта длины нити и выступающих концов в отношении наиболее оптимальных двух дуплексов из 19 мономеров.
На фиг. 27 представлен график, на котором показаны уровни mRNA ALAS1 в печени (левые столбцы) и в сыворотке (правые столбцы) для каждой группы, подлежащей обработке при исследовании NHP, описанном в примере 34.
На фиг. 28 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 относительно PBS в качестве контроля,
- 21 036477 в группах крыс, которые получали 3 или 10 мг/кг AD-58632 или AD-60489.
На фиг. 29 показана схема эксперимента, применяемая для изучения эффективности siRNA ALAS1
AD-58632 и AD-60489 в отношении подавления mRNA в печени у низших приматов.
На фиг. 30 показаны результаты дозозависимого подавления mRNA в печени у низших приматов после обработки 1,25, 2,5 или 5 мг/кг AD-58632 или AD-60489.
На фиг. 31 показано сравнение результатов подавления mRNA, полученных исходя из биоптатов печени и исходя из анализа cERD при исследовании на низших приматах.
На фиг. 32 показана динамика подавления mRNA, оцененного с применением анализа cERD при исследовании на низших приматах. На горизонтальной оси указано время согласно дню исследования.
На фиг. 33 показаны результаты подавления mRNA ALAS1 у крыс, которые получали PBS или разовую дозу, составляющую 5 мг/кг одного из указанных дуплексов siRNA.
На фиг. 34 приведены концентрации siRNA в печени крыс, которые получали разовую дозу, составляющую 5 мг/кг указанной siRNA.
На фиг. 35 (вверху) показан схема эксперимента, применяемая для изучения терапевтической эффективности AD-60925 и AD-60926. На фиг. 35 (внизу) показаны относительные уровни mRNA ALAS1/GAPDH крысы у крыс, обработанных (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD и РВ, (3) AF-11PBGD, РВ и 3 мг/кг AD-60925, или (4) AF11-PBGD, РВ и AD-60926.
На фиг. 36 показаны относительные уровни PBG в моче (вверху) и ALA в моче (внизу) у крыс, обработанных (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD и РВ, (3) AF-11PBGD, РВ и 3 мг/кг AD-60925, или (4) AF11PBGD, РВ и AD-60926.
На фиг. 37 показаны относительные уровни PBG в моче (вверху) и ALA в моче (внизу) в динамике у крыс, обработанных (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD и РВ, (3) AF-11PBGD, РВ и 3 мг/кг AD-60925, или (4) AF11-PBGD, РВ и AD-60926. Стрелки указывают на временные точки при введении РВ.
На фиг. 38 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которые получали 4 дозы PBS или 2,5 мг/кг одной из указанных siRNA.
На фиг. 39 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которые получали разовую дозу PBS или 2,5 мг/кг одной из указанных siRNA.
На фиг. 40 (вверху) показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которые получали разовую дозу PBS или 3 мг/кг одной из указанных siRNA. На фиг. 40 (внизу) показана концентрация siRNA в печени.
На фиг. 41 (вверху) показаны результаты подавления mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы с помощью AD-60489, AD-60519 и AD-60901. На фиг. 41 (внизу) приведена концентрация siRNA в печени.
На фиг. 42 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которых обрабатывали разовой дозой PBS или 2,5 мг/кг одной из указанных siRNA.
На фиг. 43 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крысы у крыс, которых обрабатывали PBS или одной из указанных siRNA в дозе 2,5 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель.
На фиг. 44 (вверху) показана схема эксперимента, применяемая для изучения терапевтической эффективности нескольких доз AD-60519 два раза в неделю. На фиг. 44 (внизу) показаны графики, обозначающие подавление PBG и ALA в моче у крыс, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и шестью дозами PBS, (ii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами PBS, (iii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 2,5 мг/кг AD60519, или (iv) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 5 мг/кг AD-60519.
На фиг. 45 показаны графики, обозначающие подавление PBG (верхний график) и ALA (нижний график) в сыворотке в мышиной модели AIP, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и шестью дозами PBS (исходный уровень), (ii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами PBS (солевой раствор), (iii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 2,5 мг/кг AD-60519, или (iv) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 5 мг/кг AD60519.
На фиг. 46 (вверху) показана схема эксперимента, применяемая для изучения терапевтической эффективности нескольких еженедельных доз AD-60519. На фиг. 46 (внизу) показан график, обозначающий относительные уровни mRNA ALAS1 (rALAS1/GAPDH) крысы у крыс, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и четырьмя дозами PBS, (ii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами PBS, (iii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 3 мг/кг AD-60519, (iv) siRNA PBGD, PB и четырьмя дозами 1 мг/кг AD-60519, или (v) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 0,3 мг/кг AD-60519.
На фиг. 47 показаны графики, обозначающие уровни PBG (верхний график) и ALA (нижний график) в моче у крыс, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и четырьмя дозами PBS, (ii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами PBS, (iii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 3 мг/кг AD-60519, (iv) siRNA PBGD, PB и четырьмя дозами 1 мг/кг AD-60519 или (v) siRNA PBGD, PB и четырьмя дозами 0,3 мг/кг AD-60519.
На фиг. 48 представлена диаграмма, на которой показана схема исследования на низших приматах, в котором изучали эффекты конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в отношении подавления mRNA ALAS1 в печени и mRNA ALAS1 в крови.
На фиг. 49 представлен график, на котором показаны результаты подавления mRNA в печени у низших приматов (NHP) после обработки конъюгатами GalNAc с siRNA ALAS1.
- 22 036477
На фиг. 50 представлен график, на котором показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 в сыворотке у низших приматов (NHP) в различные периоды времени в ходе проведения исследования, в котором изучали эффекты обработки конъюгатами GalNAc с siRNA ALAS1. Дни на горизонтальной оси соответствуют дням на диаграмме из фиг. 48.
На фиг. 51 показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 (показано в виде доли уровня дозы до приема лекарственного средства), при оценке в исследовании для разовой дозы у крыс, в котором применяли cERD в моче для отслеживания подавления ALAS1.
На фиг. 52 представлена схема, на которой показана схема исследования на низших приматах, в котором изучали эффекты нескольких доз и разовой дозы AD-60519 в отношении подавления mRNA ALAS1 в печени и mRNA ALAS1 в крови.
На фиг. 53 представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны средние относительные уровни mRNA ALAS1 в печени (% PBS в качестве контроля) на 24 день исследования (группы с несколькими дозами) или на 4 день исследования (группы с разовой дозой).
На фиг. 54 представлен график, на котором показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 в сыворотке (показано в виде доли уровня дозы до приема лекарственного средства) при оценке с применением cERD для групп с несколькими дозами (верхний график, показывающий результаты вплоть до 24 дня) и групп с разовой дозой (нижний график, показывающий результаты вплоть до 22 дня).
На фиг. 55 представлен график, на котором показаны уровни mRNA в печени, mRNA в сыворотке и mRNA в моче на 4 день исследования (в группах с разовой дозой) или на 24 день исследования (в группах с несколькими дозами). Показаны данные для отдельных животных и средние величины для каждой группы.
На фиг. 56 представлен график, на котором показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 в сыворотке (показано в виде доли уровня дозы до приема лекарственного средства) через 8 недель при оценке с применением cERD для групп с несколькими дозами. Каждая точка на графике представляет остаточную mRNA ALAS1 для средней величины группы образцов 3 животных ± стандартное отклонение группы.
На фиг. 57 представлена схема структуры ALN-60519 (также называемая в данном документе AD60519). На фиг. 57 раскрыты SEQ ID NO 5238-5239 соответственно, по порядку.
На фиг. 58 показаны уровни mRNA ALAS1 при оценке соответствующих образцов сыворотки и мочи или от пациентов с ALP, или от здоровых добровольцев (NHV). Уровни mRNA ALAS1 в сыворотке или моче измеряли с применением способа cERD. Для пациентов А и В с ALP проводили забор второго набора образцов сыворотки и мочи для оценки изменений mRNA ALAS1 в динамике.
Подробное описание изобретения iRNA управляет специфическим в отношении последовательности разрушением mRNA посредством процесса, известного как РНК-интерференция (RNAi). В данном документе описаны iRNA и способы их применения для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или у млекопитающего, где iRNA нацелена на ген ALAS1. Также представлены композиции и способы лечения нарушений, связанных с экспрессией ALAS1, таких как порфирии (например, порфирия, обусловленная недостаточностью ALAдегидратазы (ADP или порфирия Досса), острая перемежающаяся порфирия, врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), вариегатная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (ЕРР), Х-сцепленная сидеробластическая анемия (XLSA) и транзиторная эритропорфирия детского возраста).
Порфирии представляют собой врожденные или приобретенные нарушения, причиной которых может быть пониженная или повышенная активность определенных ферментов в пути биосинтеза гема, также называемого в данном документе порфириновым путем (см. фиг. 1). Порфирины являются основными предшественниками гема. Порфирины или предшественники порфирина включают 5аминолевулиновую кислоту (ALA), порфобилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (НМВ), уропорфириноген I или III, копропорфириноген I или III, протопорфириноген LX и протопорфирин IX. Г ем является неотъемлемой частью гемоглобина, миоглобина, каталаз, пероксидаз и цитохромов, при этом последние включают цитохромы легких и цитохромы Р450 печени. Гем синтезируется в большинстве или во всех клетках организма человека. Приблизительно 85% гема образуется в эритроидных клетках, преимущественно для гемоглобина. Большая часть оставшегося гема образуется в печени, 80% которого используется для синтеза цитохромов. Недостаточность определенных ферментов в порфириновом пути приводит к недостаточному образованию гема, а также к накоплению предшественников порфиринов и/или порфиринов, которые в высоких концентрациях могут быть токсичны для работы клеток или органов.
Порфирии могут проявляться на ряду с неврологическими осложнениями (острые), проблемами с кожей (кожные) или обоими. Порфирии можно классифицировать по основному сайту локализации сверхсинтеза и накопления порфиринов или их предшественников. При печеночных порфириях порфирины и предшественники порфиринов сверхсинтезируются преимущественно в печени, в то время как при эритропоэтических порфириях порфирины сверхсинтезируются в эритроидных клетках в кости. Острые и печеночные порфирии приводят к нарушению работы нервной системы и неврологическим проявлениям, которые влияют как на центральную, так и на периферическую нервную систему, что при- 23 036477 водит к появлению симптомов, таких как, например, болевые ощущения (например, боль в животе и/или хроническая нейропатическая боль), рвота, нейропатия (например, острая нейропатия, прогрессирующая нейропатия), мышечная слабость, судороги, расстройства психики (например, галлюцинации, депрессия, тревожность, паранойя), сердечные аритмии, тахикардия, запор и диарея. Кожные или эритропоэтические порфирии преимущественно поражают кожу, вызывая симптомы, такие как фотосенсибилизация, которая может быть болезненной, пузыри, некроз, зуд, отечность и усиленный рост волос в определенных областях, таких как лоб. Последующая инфекция повреждений кожи может приводить к потери костей и тканей, а также образованию шрамов, обезображиванию и потере пальцев (например, пальцев рук, пальцев ног). Большинство порфирии вызваны мутациями генов, которые кодируют ферменты в рамках пути биосинтеза гема. Краткое описание порфирии, связанных с генетическими ошибками в метаболизме гема, представлено на фиг. 2.
Не все порфирии являются генетически обусловленными. Например, у пациентов с заболеванием печени может развиться порфирия в результате нарушения работы печени, а транзиторная форма эритропорфирии (транзиторная эритропорфирия детского возраста) была описана для детского возраста (см. Crawford, R.I. et al, JAmAcad Dermatol. 1995 авг; 33(2 Pt 2): 333-6.). У пациентов с РСТ может быть приобретенная недостаточная активность уропорфиногендекарбоксилазы (URO-D) вследствие образования фермента ORO-D с более низкой, чем нормальная, активностью фермента (см. Phillips et al. Blood, 98: 3179-3185, 2001.)
Острая перемежающаяся порфирия (AIP) (также называемая недостаточностью порфобилиногендезаминазы (PBG), или недостаточностью гидроксиметилбилансинтазы (HMBS)), является наиболее распространенным типом острой печеночной порфирии. Другие типы острых печеночных порфирий включат наследственную копропорфирию (НСР), вариегатную порфирию (VP) и порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP). Острые печеночные порфирий описаны, например, в Balwani, M and Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
AIP является, как правило, аутосомно-доминантным заболеванием, которое характеризуется недостаточностью фермента порфобилиногендезаминазы (PBG-дезаминаза); этот фермент также известен как гидроксиметилбилансинтаза (НМВ синтаза или HMBS). PBG-дезаминаза является третьим ферментом в пути биосинтеза гема (см. фиг. 1) и катализирует реакцию конденсации по типу голова к хвосту четырех молекул порфобилиногена в линейный тетрапиррол, гидроксиметилбилан (НМВ). Были описаны образованные в результате альтернативного сплайсинга варианты транскриптов, кодирующие различные изоформы PBG-дезаминазы. Мутации в гене PBG-дезаминазы ассоциированы с AIP. Такие мутации могут приводить к пониженному количеству PBG-дезаминазы и/или пониженной активности PBGдезаминазы (индивиды, пораженные заболеванием, как правило, имеют ~50% снижение активности PB G-дезаминазы).
Существует по меньшей мере две различные модели патофизиологии AIP и других острых печеночных порфирий (см., например, Lin CS-Y et al., Clinical Neurophysiology, 2011; 122:2336-44). Согласно одной модели, сниженный уровень образования гема вследствие недостаточности PBG-дезаминазы вызывает энергетический дефицит и дегенерацию аксонов. Согласно другой, на сегодняшний день более предпочтительной модели, накопление предшественников порфиринов (например, ALA и PBG) приводит к нейротоксичности.
Было обнаружено, что AIP распространена в определенных популяциях с частотой до 1 на 10000 (например, в Северной Швеции; см. Floderus Y., et al. Clin Genet. 2002;62:288-97). По оценкам, распространенность в общей популяции в Соединенных Штатах и Европе, за исключением Великобритании, составляет приблизительно от 1 на 10000 до 1 на 20000. Собственно клиническое заболевание проявляется лишь у приблизительно 10-15% индивидов, которые несут мутации, которые, как известно, ассоциированы с AIP. Однако, у индивидов с определенными мутациями пенетрантность составляет до 40% (например, мутация W198X). AIP, как правило, находится в латентной форме до периода полового созревания. Симптомы более распространены у женщин, чем у мужчин. Распространенность заболевания вероятно занижена вследствие его неполной пенетрантности и длительных латентных периодов. В Соединенных Штатах по оценкам насчитывается приблизительно 2000 пациентов, которые испытали по меньшей мене один приступ. По оценкам насчитывается приблизительно 150 активных рецидивирующих случаев во Франции, Швеции, Великобритании и Польше; этими пациентами являются преимущественно молодые женщины со средним возрастом 30 лет. См., например, Elder et al, J Inherit Metab Dis., опубликованную в Интернете 1 ноября 2012 г.
AIP поражает, например, висцеральную, периферическую, вегетативную и центральную нервную системы. Симптомы ALP разнообразны и включают симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта (например, сильную и нечетко локализированную боль в животе, тошноту/рвоту, запор, диарею, непроходимость кишечника), симптомы со стороны мочевыводящих путей (дизурия, задержка мочеиспускания/недержание мочи или темная моча, например, темно-красная моча), неврологические симптомы (например, сенсорная нейропатия, моторная нейропатия (например, поражение черепных нервов и/или приведение к слабости в руках и ногах), судороги, нейропатическая боль (например, боль, ассоциированная с прогессирующей нейропатией, например, хроническая нейропатическая боль), психоневрологические
- 24 036477 симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинации, истерия, делирий, апатия, депрессия, фобии, психоз, бессонница, сонливость, кома), поражение вегетативной нервной системы (приводящее, например, к симптомам со стороны сердечно-сосудистой системы, таким как тахикардия, гипертензия и/или аритмии, а также другим симптомам, таким как, например, повышенные уровни катехоламинов в крови, потение, возбужденное состояние и/или тремор), обезвоживание и нарушения баланса электролитов. Наиболее распространенными симптомами являются боль в животе и тахикардия. Неврологические проявления включают моторную и вегетативную нейропатию и судороги. У пациентов часто наблюдается хроническая нейропатическая боль и развивается прогрессирующая нейропатия. Пациенты с рецидивирующими приступами часто имеют продром. После тяжелого приступа может возникать необратимый паралич. Нормализация после тяжелых приступов, которые своевременно не лечили, может занять недели или месяцы. Острый приступ может быть летальным, например, вследствие паралича дыхательных мышц или сердечно-сосудистой недостаточности вследствие нарушения баланса электролитов. (См., например, Thunell S. Hydroxymethylbilane Synthase Deficiency. 2005 сентября 27 [обновлено 1 сентября 2011 г.]. В: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editors. GeneReviews™ [интернет]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993 (далее в данном документе Thunell (1993)), который включен, таким образом, при помощи ссылки во всей своей полноте.) До того, как лечение гемином стало доступным, до 20% пациентов с ALP умирали от заболевания.
Индивиды, которые несут гены ALP, подвержены повышенному риску возникновения гепатоцеллюлярного рака. У индивидов с рецидивирующими приступами риск гепатоцеллюлярного рака является особенно серьезным: после 50 лет риск почти в 100 раз выше, чем в общей популяции.
Приступы острой порфирии могут провоцироваться эндогенными или экзогенными факторами. Механизмы, с помощью которых такие факторы индуцируют приступы, могут включать, например, повышенную потребность в ферментах Р450 печени и/или индукцию активности ALAS1 в печени. Повышенная потребность в ферментах Р450 печени приводит к сниженному содержанию свободного гема в печени, тем самым индуцируя синтез ALAS1 печени.
Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или недостаточной калорийности потребляемой пищи вследствие жестких диет, занятий спортом, связанных с длинными дистанциями и т. д.), формы стресса, связанные с метаболизмом (например, инфекции, оперативное вмешательство, международные авиаперелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, жирорастворимые чужеродные химические соединения (в том числе, например, химические соединения, присутствующие в табачном дыме, определенные лекарственные средства рецептурного отпуска, органические растворители, биоциды, соединения в алкогольных напитках), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения болезни во время менструального периода), синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормональная заместительная терапия). См., например, Thunell (1993).
Свыше 1000 лекарственных средств противопоказаны при острых печеночных порфириях (например, AIP, HCP, ADP и VP), в том числе, например, спирт, барбитураты, карбамазепин, каризопродол, клоназепам (высокие дозы), даназол, диклофенак и другие допустимые NSAIDS, препараты спорыньи, эстрогены, этхлорвинол, глютетимид, гризеофульвин, мефенитоин, мепробамат (также мебутамат и тибутамат), метиприлон, методопрамид, фенитоин, примидон, прогестерон и синтетические прогестины, пиразинамид, пиразолоны (аминопирин и антипирин), рифампин, сукцинимиды (этосукцимид и метсукцимид), сульфонамидные антибиотики и вальпроевая кислота.
Объективные признаки AIP включают изменение цвета мочи во время острого приступа (моча может выглядеть красной или красно-коричневой) и повышенные концентрации PBG и ALA в моче во время острого приступа. Молекулярно-генетическое тестирование позволяет идентифицировать мутации в гене PBG-дезаминазы (также известной как HMBS) у более 98% пораженных заболеванием индивидов. Thunell (1993).
Диагностика порфирии может включать оценку семейного анамнеза, оценку уровней предшественников порфиринов в моче, крови или кале, и/или оценку активности ферментов и анализ мутаций ДНК. Дифференциальная диагностика порфирии может включать определение типа порфирии на основе измерений отдельных уровней порфиринов или предшественников порфиринов (например, ALA, PBG) в моче, кале и/или плазме (например, при помощи хроматографии или флуорометрии) во время приступа. Диагноз AIP может быть подтвержден установлением того, что активность PBG-дезаминазы в эритроцитах составляет 50% или менее относительно нормального уровня. ДНК-тестирование в отношении мутаций можно проводить для пациентов и членов семей с повышенным риском. Диагноз AIP, как правило, подтверждается по ДНК-тестированию для идентификации конкретной вызывающей болезнь мутации гена (например, мутации HMBS).
Общепринятый контроль острых приступов AIP включает госпитализацию, отслеживание симптомов и устранение небезопасных лекарственных средств. Лечение острых приступов, как правило, требует госпитализации для контроля и лечения острых симптомов, в том числе, например, боли в животе, судорог, обезвоживания/гипонатриемии, тошноты/рвоты, тахикардии/гипертензии, задержки мочеиспускания/непроходимости кишечника. Например, боль в животе можно лечить, например, наркотическими
- 25 036477 анальгетиками, судороги можно лечить профилактическими противосудорожными средствами и допустимыми лекарственными препаратами (хотя многие противосудорожные препараты противопоказаны), тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотиазинами, и тахикардию/гипертензию можно лечить, например, бета-блокаторами. Лечение может включать отказ от небезопасных лекарственных препаратов, отслеживание дыхательной функции, а также мышечной силы и неврологического статуса. Умеренные приступы (например, приступы без пареза или гипонатриемии) можно лечить по меньшей мере 300 г внутривенной 10% глюкозы в день, хотя незамедлительно обеспечивают повышенное введение гемина. Тяжелые приступы, как правило, лечат как можно раньше гемином с внутривенным введением (3-4 мг/кг в сутки в течение 4-14 дней) и IV глюкозой при ожидании начала действия IV гемина. Как правило, приступы лечат IV гемином в течение 4 дней и IV глюкозой при ожидании введения IV гемина. В течение 3 4 дней после начала введения гемина часто наблюдается клиническое улучшение, сопровождающееся понижением уровней ALA и PBG.
Гемин (пангематин® или гемин для инъекции, ранее известный как гематин) является единственным препаратом, одобренным для применения в Соединенных Штатах, и был первым лекарственным средством, одобренным Законом об орфанных лекарственных препаратах. Пангематин® представляет собой гемин, полученный из обработанных эритроцитов (PRBC), и представляет собой протопорфирин IX, содержащий ион трехвалентного железа (гем В) с хлоридным лигандом. Гем служит для ограничения синтеза порфирина в печени и/или костного мозге. Точный механизм, с помощью которого гемин приводит к симптоматическому улучшению у пациентов с острыми случаями печеночных порфирий, пока не был выяснен; однако, его действие, по-видимому, связано с (механизм обратной связи) ингибированием синтазы 8-аминолевулиновой кислоты (ALA), фермента, который ограничивает скорость пути биосинтеза порфирина/гема. См. Panhematin® product label, Lundbeck, Inc., октябрь 2010 г. Ингибирование ALAсинтазы должно приводить к пониженному образованию ALA и PBG, а также порфиринов и промежуточных соединений порфиринов.
Недостатки препаратов на основе тема (например, гемина) включают отсроченное влияние в отношении клинических симптомов и неспособность предотвратить рецидив приступов. Побочные реакции, ассоциированные с введением тема (например, гемина) могут включать флебит (например, тромбофлебит), затрудненность венозного доступа, антикоагуляцию (или коагулопатии), тромбоцитопению, отказ почек или перенасыщение железом, что особенно вероятно в случае пациентов, требующих нескольких курсов лечения гемином при рецидивирующих приступах. У пациентов с рецидивирующими приступами для предупреждения флебита необходим постоянный венозный катетер для возможности доступа. При высоких дозах может происходить повреждение почек. Редкие зарегистрированные побочные эффекты включают лихорадку, боль, чувство общего недомогания, гемолиз, анафилаксию и острую сосудистую недостаточность. См. Anderson К.Е., Approaches to Treatment and Prevention of Human Porphyrias, в The Porphyrin Handbook: Medical Aspects of Porphyrins, Edited by Karl M. Kadish, Kevin M. Smith, Roger Guilard (2003) (далее в данном документе Anderson).
Гем сложно получать в стабильной форме для внутривенного введения. Он нерастворим при нейтральном рН, но его можно получать в виде гидроксида гема при рН 8 или выше. Anderson. Пангематин представляет собой лиофилизированный препарат гемина. При растворении лиофилизированного гемина для внутривенного введения быстро образуются продукты распада; эти продукты распада обуславливают временный антикоагулянтный эффект и флебит в участке инфузии. Anderson. Гемальбумин и аргинат гема (нормосанг, европейский вариант гемина) являются более стабильными и потенциально могут приводить к менее интенсивному тромбофлебиту. Однако, в Соединенных Штатах аргинат гема не одобрен для применения. Пангемин можно стабилизировать путем растворения его для инфузии в 30% альбумине человека вместо стерильной воды; однако, альбумин увеличивает внутрисосудистый объем и расширяющие эффекты и повышает стоимость лечения, а также риск, связанный с патогенами, поскольку его выделяют из крови человека. См., например, Anderson, выше.
Успешное лечение острого приступа не предупреждает или отсрочивает рецидив. Стоит вопрос о том, может ли сам гемин вызывать рецидивирующие приступы вследствие индукции гемоксигеназы. Несмотря на это, в некоторых областях (особенно Франции), молодых женщин с несколькими рецидивирующими приступами с целью осуществления профилактики подвергают лечению гемином еженедельно.
Небольшой опыт трансплантации печени указывает на то, что при успешном исходе это можно считать эффективным лечением AIP. В Европе насчитывалось примерно 12 трансплантаций у пациентов, с лечебным или отличающимся эффектами. Трансплантация печени может восстанавливать нормальную экскрецию ALA и PBG и предупреждать острые приступы. См., например, Dar, F.S. et al. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 9(1): 93-96 (2010). Кроме того, если печень пациента с ALP пересаживают другому пациенту (домино-трансплантат), у пациента, получающего трансплантат, может развиться AIP. Среди отдаленных клинических эффектов острых порфирий имеет место хроническая нейропатическая боль, которая может быть следствием прогрессирующей нейропатии, обусловленной нейротоксическими эффектами, например, повышенным содержанием предшественников порфиринов (например, ALA и/или
- 26 036477
PBG). Нейротоксические эффекты могут быть ассоциированы с образованием токсических промежуточных соединений гема, например, измененной передачей сигналов GABA и/или опосредованного железом окисления и образованием активных форм кислорода (ROS). Пациенты могут испытывать нейропатическую боль до или во время острого приступа. Пациенты старшего возраста могут испытывать усиленную нейропатическую боль с возрастом, для лечения которой, как правило, назначают различные наркотические лекарственные средства. У пациентов с острыми печеночными порфириями были зафиксированы нарушения электромиограммы и уменьшение времени проведения возбуждения. Следует отметить, что у мышей с ALP (недостаточность PBG-дезаминазы), которых не подвергали обработке и стимуляции, развивается прогрессирующая моторная нейропатия, которая, как было показано, вызывает прогрессирующую дегенерацию и гибель аксонов нерва, контролирующего четырехглавую мышцу, предположительно, вследствие постоянно повышенных уровней предшественников порфиринов (ALA и PBG), порфиринов и/или недостатка гема (Lindberg et al., J. Clin. Invest., 103(8): 1127-1134, 1999). Среди пациентов с острой порфирией (например, ADP, AIP, HCP или VP) между приступами уровни предшественников порфиринов (ALA и PBG) часто повышены у пациентов, у которых не наблюдаются симптомы и у пациентов, у которых наблюдаются симптомы. Таким образом, ожидается, что снижение количества предшественников порфиринов и возобновление нормального биосинтеза гема посредством снижения уровня экспрессии и/или активности ALAS1, будет предупреждать и/или минимизировать развитие хронической и прогрессирующей нейропатии. Лечение, например, длительное лечение (например, периодическое лечение с помощью iRNA, описанной в данном документе, например, лечение согласно схеме дозирования, описанной в данном документе, например, еженедельное лечение или лечение два раза в неделю) может непрерывно снижать экспрессию ALAS1 у пациентов с острой порфирией, которые имеют повышенные уровни предшественников порфиринов, порфиринов, продуктов порфиринов или их метаболитов. Такое лечение может быть предусмотрено при необходимости предупреждения или снижения частоты или тяжести отдельных симптомов у пациента (например, боли и/или нейропатии) и/или снижения уровня предшественника порфирина, порфирина, продукта порфирина или метаболита.
Существует необходимость идентификации новых терапевтических средств, которые можно применять для лечения порфирий. Как было описано ранее, существующие варианты лечения, такие как продукты на основе гема (например, гемин), имеют многочисленные недостатки. Например, влияние гемина на клинические симптомы является отсроченным, он является дорогостоящим и может оказывать побочные эффекты (например, тромбофлебит, антикоагуляцию, тромбоцитопению, перенасыщение железом, отказ почек). Новые терапевтические средства, такие как описанные в данном документе, могут быть направлены на эти недостатки и неудовлетворенные потребности пациентов, с более быстрым действием, без индуцирования флебита, с обеспечением возможности подкожного введения, успешным предупреждением рецидивирующих приступов, предупреждением или облегчением болевых ощущений (например, хронической нейропатической боли) и/или прогрессирующей нейропатии, и/или они не вызывают определенных побочных эффектов, ассоциированных с гемином (например, перенасыщение железом, повышенный риск гепатоцеллюлярного рака).
Пациенты с AIA включают пациентов, которые испытывают рецидивирующие приступы, и пациентов, которые испытывают острые, единичные приступы. Среди пациентов, которые испытывают рецидивирующие приступы, приблизительно 5-10% страдают от рецидивирующих перемежающихся приступов (2-3 приступа в год) или рецидивирующих приступов (>4 приступов в год). Для этих пациентов вероятнее всего рассматривается вопрос о трансплантации печени или получении профилактических инфузий гема (например, гемина). Пациенты с рецидивирующими приступами вероятнее всего имеют низкое качество жизни вследствие длительных пребываний в больнице, опиатной зависимости и/или токсичности для венозной сети. Длительное введение гема может индуцировать гемоксигеназу (НО-1). Таким образом, постепенное снижение дозы гема пациентам может составлять сложность, и некоторым требуется более частое введение. Некоторые врачи в связи с этим ограничивают применение гема до случаев с наиболее серьезными приступами. Соответственно, существует неудовлетворенная потребность в подходящей, эффективной профилактике и вариантах лечения с лучшей переносимостью.
Для пациентов, которые испытывают острые приступы, клинические рекомендации предполагают введение гема как можно раньше. Однако, учитывая трудности диагностики и отсутствие незамедлительной доступности лекарственных препаратов, введение может быть отсроченным. Медленное начало проявления эффектов гема (например, гемина) и его плохая переносимость замедляют наступление улучшения. В связи с наличием продолжительной сильной боли в животе, даже после введения гема, может потребоваться, чтобы пациенты получали опиаты в течение нескольких дней.
Отсроченное введение гема или продолжающееся воздействие провоцирующих факторов может приводить к более серьезным осложнениям, в том числе моторной нейропатии и сопутствующих симптомов (например, слабости, пареза). В тяжелых случаях может возникать дыхательная недостаточность и паралич. Восстановление от неврологических симптомов может потребовать намного дольше времени для выздоровления. Соответственно в контексте острых приступов необходимы варианты лечения, харастеризующиеся ускоренным началом действия и лучшей переносимостью. Фармакологическая валидность ALAS1 в качестве цели для сайленсинга mRNA основана, по меньшей мере, на следующих резуль
- 27 036477 татах: mRNA ALAS1 в значительной степени активирована во время приступа; пангематин подавляет ALAS-1, а добавление гема к клеткам печени в культуре приводит к пониженному количеству mRNA ALAS-1. Некоторые результаты также указывают на то, что подавление mRNA ALAS1 может быть достигнуто путем нацеливания на печень. Например, было показано, что трансплантация печени характеризуется лечебным эффектом, а метаболиты из печени стимулируют приступы (см., например, Dar et al. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9: 93-6 (2010); Dowman et al. Ann Intern Med 154: 571-2 (2011) и Wu et al. Genes Dev 23:2201-2209 (2009). Поэтому снижение уровня экспрессии ALAS1, например, в печени, с применением композиций на основе iRNA, можно применять для лечения порфирии. Согласно определенным вариантам осуществления композиции на основе iRNA можно применять для профилактики и неотложного лечения порфирии. Например, композиции на основе iRNA можно применять профилактически при наступлении рецидивирующих приступов для индуцирования длительного или хронического подавления экспрессии ALAS1 (что приводит к длительному или хроническому подавлению ALA/PBG), и, таким образом, ослаблению рецидивирующей активации ALAS1, которая стимулирует приступы. Такое профилактическое лечение может снижать число и тяжесть приступов. Во время наступления острого приступа введение композиции на основе iRNA может оказывать лечебный эффект в отношении острого приступа, например, посредством снижения уровней ALA/PBG.
В настоящем раскрытии представлены способы и композиции на основе iRNA для модулирования экспрессии гена ALAS1. Согласно определенным вариантам осуществления экспрессию ALAS1 снижают или ингибируют с применением iRNA, специфической по отношению к ALAS1, что, таким образом, приводит к пониженной экспрессии гена ALAS1. Сниженная экспрессия гена ALAS1 может снижать уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов. Пониженная экспрессия гена ALAS1, а также связанное с этим снижение уровня одного или нескольких предшественников порфиринов и/или порфиринов, может быть пригодным при лечении нарушений, связанных с экспрессией ALAS1, например, порфириями.
iRNA композиций, описанных в данном документе, включают нить РНК (антисмысловую нить) с участком, который составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, например, 15-30 нуклеотидов в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, этот участок практически комплементарен по меньшей мере части mRNA-транскрипта гена ALAS1 (также называемого в данном документе iRNA, специфическая по отношению к ALAS1). Применение такой iRNA обеспечивает целевое разрушение mRNA генов, которые вовлечены в патологии, ассоциированные с экспрессией ALAS1 у млекопитающих, например, порфирии, такие как порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (также известная как порфирия Досса или плюмбопорфирия) или острая перемежающаяся порфирия. Очень низкие дозы iRNA, специфических по отношению к ALAS1, могут специфично и эффективно опосредовать RNAi, что приводит к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1. iRNA, нацеленные на ALAS1, могут специфично и эффективно опосредовать RNAi, что приводит к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1, например, в анализах на клетках. Таким образом, способы и композиции, включающие эти iRNA, пригодны для лечения патологических процессов, связанных с экспрессией гена ALAS1, таких как порфирии (например, Х-сцепленная сидеробластическая анемия (XLSA), порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (порфирия Досса), острая перемежающаяся порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), вариегатная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (ЕРР) и транзиторная эритропорфирия детского возраста).
В следующем описание раскрывается, как получать и применять композиции, содержащие iRNA, для ингибирования экспрессии гена ALAS1, а также композиции и способы лечения заболеваний и нарушений, вызванных или модулируемых экспрессией этого гена. Варианты осуществления фармацевтических композиций, описанных в настоящем изобретении, включают iRNA с антисмысловой нитью, содержащей участок, который составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, при этом этот участок практически комплементарен по меньшей мере части РНКтранскрипта гена ALAS1, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Варианты осуществления композиций, описанных в настоящем изобретении, также включают iRNA с антисмысловой нитью с участком комплементарности, который составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, и практически комплементарен по меньшей мере части РНК-транскрипта гена ALAS1.
Соответственно, согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении описаны фармацевтические композиции, содержащие iRNA ALAS1 и фармацевтически приемлемый носитель, способы применения композиций для ингибирования экспрессии гена ALAS1, и способы применения фармацевтических композиций для лечения нарушений, связанных с экспрессией ALAS1.
I. Определения
В целях удобства значение определенных выражений и фраз, используемых в настоящем описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения, представлены ниже. При наличии очевидного несоответствия между использованием выражения в других частях настоящего описания и его определением, представленным в этом разделе, определение, данное в этом разделе, будет иметь преимущественную
- 28 036477 силу.
Каждый из G, С, А, Т и U, как правило, означает нуклеотид, который в качестве основания содержит гуанин, цитозин, аденин, тимидин и урацил соответственно. Однако, понятно, что выражение рибонуклеотид, или нуклеотид также может означать модифицированный нуклеотид, который подробнее описан ниже, или заменяющий фрагмент в качестве заместителя. Специалисту в данной области хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть замещены другими фрагментами без значительного изменения свойств в отношении спаривания оснований олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такой заменяющий фрагмент. Например, без ограничения, нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может образовывать пару оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть замещены в нуклеотидных последовательностях dsRNA, описанных в настоящем изобретении, нуклеотидами, содержащими, например, инозин. Согласно другому примеру аденин и цитозин в любом месте в олигонуклеотиде могут быть замещены гуанином и урацилом соответственно, с образованием неоднозначного спаривания оснований G-U с целевой mRNA. Последовательности, содержащие такие заменяющие фрагменты, пригодны для композиций и способов, описанных в настоящем изобретении. Используемое в данном документе выражение ALAS1 (также известное как ALAS-1; δаминолевулинатсинтаза 1; δ-ALA синтаза 1; синтаза 5' -аминолевулиновой кислоты 1; ALAS-H; ALASH; ALAS-N; ALAS3; ЕС2.3.1.37; 5-аминолевулинатсинтаза, неспецифическая, митохондриальная; ALAS; MIG4; OTTHUMP00000212619; OTTHUMP00000212620; OTTHUMP00000212621; OTTHUMP00000212622; индуцирующий миграцию белок 4; ЕС 2.3.1) относится к кодируемому ядром митохондриальному ферменту, который является первым и, как правило, скорость-лимитирующим ферментом в пути биосинтеза гема млекопитающих. ALAS 1 катализирует конденсацию глицина с сукцинил-КоА с образованием δ-аминолевулиновой кислоты (ALA). Ген ALAS1 человека экспрессируется повсеместно, находится в хромосоме 3р21.1 и, как правило, кодирует последовательность из 640 аминокислот. В отличие от этого, ген ALAS-2, который кодирует изозим, экспрессируется только в эритроцитах, находится в хромосоме Хр 11.21 и, как правило, кодирует последовательность из 550 аминокислот. Используемое в данном документе выражение белок ALAS1 означает любой вариант белка ALAS1 из любого вида (например, человека, мыши, низшего примата), а также его любые мутанты и фрагменты, которые сохраняют активность ALAS1. Аналогично, транскрипт ALAS1 относится к любому варианту транскрипта ALAS1 из любого вида (например, человека, мыши, низшего примата). Последовательность mRNA-транскрипта ALAS1 человека можно найти как NM_000688.4 (фиг. 3А и 3В; SEQ ID NO:1). Другой mRNA-транскрипт ALAS1 человека можно найти как NM_000688.5 (фиг. 4А и фиг. 4В; SEQ ID NO: 382). Уровень зрелого кодируемого белка ALAS1 регулируется гемом: высокие уровни гема подавляют зрелый фермент в митохондрии, в то время как низкие уровни гема активируют его. Было выявлено несколько образованных в результате альтернативного сплайсинга вариантов, кодирующих этот же белок.
Используемое в данном документе выражение iRNA, RNAi, средство на основе iRNA или средство для RNAi относится к средству, которое содержит РНК в том значении, в каком это выражение определено в данном документе, и которое опосредует целевое расщепление РНК-транскрипта, например, через путь с участием индуцируемого РНК комплекса сайленсинга (RISC). Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, влияет на ингибирование экспрессии ALAS1. Ингибирование экспрессии ALAS1 можно оценивать по снижению уровня mRNA ALAS1 или снижению уровня белка ALAS1. Использованное в данном документе выражение целевая последовательность относится к непрерывной части нуклеотидной последовательности молекулы mRNA, образованной в процессе транскрипции гена ALAS1, в том числе к mRNA, которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции. Целевая часть последовательности будет по меньшей мере достаточно длинной для того, чтобы выполнять роль субстрата для iRNA-направленного расщепления в этой части или рядом с этой частью. Например, целевая последовательность будет, как правило, составлять 9-36 нуклеотидов в длину, например, 15-30 нуклеотидов в длину, в том числе все поддиапазоны между ними. В качестве неограничивающих примеров целевая последовательность может состоять из 15-30 нуклеотидов, 15-26 нуклеотидов, 15-23 нуклеотидов, 15-22 нуклеотидов, 15-21 нуклеотида, 15-20 нуклеотидов, 15-19 нуклеотидов, 15-18 нуклеотидов, 15-17 нуклеотидов, 18-30 нуклеотидов, 18-26 нуклеотидов, 18-23 нуклеотидов, 18-22 нуклеотидов, 18-21 нуклеотида, 18-20 нуклеотидов, 19-30 нуклеотидов, 19-26 нуклеотидов, 19-23 нуклеотидов, 19-22 нуклеотидов, 19-21 нуклеотида, 19-20 нуклеотидов, 2030 нуклеотидов, 20-26 нуклеотидов, 20-25 нуклеотидов, 20-24 нуклеотидов, 20-23 нуклеотидов, 20-22 нуклеотидов, 20-21 нуклеотида, 21-30 нуклеотидов, 21-26 нуклеотидов, 21-25 нуклеотидов, 21-24 нуклеотидов, 21-23 нуклеотидов или 21-22 нуклеотидов.
Используемое в данном документе выражение нить, содержащая последовательность относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь из нуклеотидов, которая характеризуется последовательностью, обозначаемой с применением стандартной номенклатуры нуклеотидов.
Используемое в данном документе, и если не указано иное, выражение комплементарный при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению ко второй нуклео
- 29 036477 тидной последовательности означает способность олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизироваться и образовывать дуплексную структуру при определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как будет понятно специалисту в данной области. Такие условия, например, могут представлять собой жесткие условия, где жесткие условия могут включать: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES pH 6,4, 1 мМ EDTA, 50°С или 70°С в течение 12-16 ч с последующим отмыванием. Можно применять другие условия, такие как физиологически соответствующие условия, характерные для организма. Специалист в данной области сможет определить набор условий, наиболее подходящих для тестирования комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизированных нуклеотидов.
Комплементарные последовательности в iRNA, например, в dsRNA, описанных в данном документе, включают образование пар оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую полинуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность по всей длине одной или обеих нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности могут быть указаны в данном документе как полностью комплементарные по отношению друг к другу. Однако при указании первой последовательности как практически комплементарной по отношению ко второй последовательности, две последовательности могут быть полностью комплементарными, или они могут образовывать одну или несколько, но, как правило, не более 5, 4, 3 или 2 ошибочно спаренных пар оснований при гибридизации с образованием дуплекса вплоть до 30 пар оснований, с сохранением при этом способности гибридизоваться при условиях, наиболее соответствующих их конечному применению, например, ингибировании экспрессии гена посредством пути RISC. Однако когда два олигонуклеотида предназначены образовывать при гибридизации один или несколько однонитевых выступов, то такие выступы не будут считаться ошибочными спариваниями применительно к определению комплементарности. Например, dsRNA, содержащая один олигонуклеотид из 21 нуклеотида в длину и другой олигонуклеотид из 23 нуклеотидов в длину, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая полностью комплементарна более короткому олигонуклеотиду, может быть указана как полностью комплементарная для целей, описанных в данном документе.
Комплементарные последовательности, используемые в данном документе, могут также включать или могут быть образованы полностью из пар оснований, образованных не по модели Уотсона-Крика, и/или пар оснований, образованных из не встречающихся в природе и модифицированных нуклеотидов, в такой степени, при которой выполняются вышеуказанные требования по отношению к их способности гибридизоваться. Такие пары оснований, образованные не по модели Уотсона-Крика, включают без ограничения неоднозначное или хугстиновское спаривание оснований G:U.
Выражения комплементарный, полностью комплементарный и практически комплементарный в настоящем документе могут быть использованы по отношению к совпадению оснований между смысловой нитью и антисмысловой нитью dsRNA или между антисмысловой нитью средства на основе iRNA и целевой последовательностью, как будет понятно из контекста их использования.
Используемый в данном документе полинуклеотид, который практически комплементарен по меньшей мере части матричной РНК (mRNA) относится к полинуклеотиду, который практически комплементарен непрерывной части mRNA, представляющей интерес, (например, mRNA, кодирующей белок ALAS1). Например, полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части mRNA ALAS1, если последовательность практически комплементарна непрерывной части mRNA, кодирующей ALAS1. В качестве другого примера полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части mRNA ALAS1, если последовательность практически комплементарна непрерывной части mRNA, кодирующей ALAS1.
Выражение двунитевая РНК или dsRNA, используемое в данном документе, относится к iRNA, которая включает молекулу РНК или комплекс молекул с гибридизированным участком дуплекса, который содержит две антипараллельные и практически комплементарные нити нуклеиновых кислот, которые будут указаны как характеризующиеся смысловой и антисмысловой ориентацией по отношению к целевой РНК. Участок дуплекса может быть любой длины, обеспечивающей специфическое разрушение требуемой целевой РНК, например, посредством пути RISC, но диапазон длины которой, как правило, будет составлять 9-36 пар оснований, например, 15-30 пар оснований в длину. С учетом дуплекса из 9-36 пар оснований, дуплекс может быть любой длины в этом диапазоне, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 или в любом поддиапазоне между ними, в том числе без ограничения 15-30 пар оснований, 15-26 пар оснований, 15-23 пары оснований, 15-22 пары оснований, 15-21 пару оснований, 15-20 пар оснований, 15-19 пар оснований, 1518 пар оснований, 15-17 пар оснований, 18-30 пар оснований, 18-26 пар оснований, 18-23 пары оснований, 18-22 пары оснований, 18-21 пару оснований, 18-20 пар оснований, 19-30 пар оснований, 19-26 пар оснований, 19-23 пары оснований, 19-22 пары оснований, 19-21 пару оснований, 19-20 пар оснований, 20-30 пар оснований, 20-26 пар оснований, 20-25 пар оснований, 20-24 пары оснований, 20-23 пары оснований, 20-22 пары оснований, 20-21 пару оснований, 21-30 пар оснований, 21-26 пар оснований, 21-25 пар оснований, 21-24 пары оснований, 21-23 пары оснований или 21-22 пары оснований. dsRNA, образо
- 30 036477 ванные в клетке при обработке дайсером и подобными ферментами, как правило, находятся в диапазоне 19-22 пар оснований в длину. Одна нить участка дуплекса dsDNA содержит последовательность, которая практически комплементарна участку целевой РНК. Две нити, образующие дуплексную структуру, могут быть получены из одной молекулы РНК по меньшей мере с одним самокомплементарным участком, или могут быть получены из двух или более отдельных молекул РНК. Если участок дуплекса образован из двух нитей одной молекулы, то молекула может иметь участок дуплекса, отделенный однонитевой цепью нуклеотидов (называемой в данном документе петля шпилька) между 3'-концом одной нити и 5'концом соответствующей другой нити, образующей дуплексную структуру. Петля шпилька может содержать по меньшей мере один неспаренный нуклеотид; согласно некоторым вариантам осуществления петля шпилька может содержать по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 23 или более неспаренных нуклеотидов. Если две практически комплементарные нити dsRNA составлены из отдельных молекул РНК, то эти молекулы не должны, но могут быть соединены ковалентной связью. Если эти две нити ковалетно соединены посредством способов, отличных от петли шпильки, то соединяющая структура называется линкер. Выражение siRNA также используют в данном документе для обозначения dsRNA, описанной выше.
Согласно другому варианту осуществления средство на основе iRNA может быть однонитевой siRNA, которую вводят в клетку или организм для ингибирования целевой mRNA. Однонитевые средства для RNAi связываются с Argonaute 2 комплекса RISC, обладающим эндонуклеазной активностью, который затем расщепляет целевую mRNA. Однонитевые siRNA, как правило, составляют 15-30 нуклеотидов и химически модифицированы. Конструирование и тестирование однонитевых siRNA описаны в патенте США № 8101348 и в Lima et al. (2012) Cell 150: 883-894, полное содержание каждого из которых, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки.
Любые из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе (например, последовательностей, представленные в табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20 или в табл.21-40), можно применять в качестве однонитевой siRNA, описанной в данном документе или химически модифицированной способами, описанными в Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894.
Согласно другому аспекту средство на основе РНК представляет собой молекулу однонитевой антисмысловой РНК. Молекула однонитевой антисмысловой РНК комплементарна последовательности в целевой mRNA. Молекулы однонитевой антисмысловой РНК могут ингибировать трансляцию стехиометрическим образом путем спаривания оснований с mRNA и физического нарушения механизма трансляции, см., Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1: 347-355. Альтернативно, однонитевые антисмысловые молекулы ингибируют целевую mRNA путем гибридизации с целью и расщепления цели посредством расщепления с помощью RNaseH. Молекула однонитевой антисмысловой РНК может составлять от приблизительно 10 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину и иметь последовательность, которая комплементарна целевой последовательности. Например, молекула однонитевой антисмысловой РНК может содержать последовательность, которая включает по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов из любой из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, например, последовательностей, представленных в любой из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20 или в табл. 21-40.
Специалист в данной области поймет, что выражение молекула РНК или молекула рибонуклеиновой кислоты охватывает не только молекулы РНК, экспрессируемые или встречающиеся в природе, но также аналоги и производные РНК, содержащие один или несколько рибонуклеотидных/рибонуклеозидных аналогов или производных, описанных в данном документе или известных из уровня техники. Строго говоря, рибонуклеозид включает нуклеозидное основание и рибозу, а рибунуклеотид представляет собой рибонуклеозид с одной, двумя или тремя фосфатными фрагментами. Однако, выражения рибунуклеозид и рибонуклеотид, используемые в данном документе, можно считать эквивалентными. РНК можно модифицировать в отношении структуры нуклеотидных оснований, структуры рибозы или структуры рибозо-фосфатного остова, например, как описано ниже в данном документе. Однако, молекулы, содержащие рибонуклеозидные аналоги или производные, должны сохранять способность образовывать дуплекс. В качестве неограничивающих примеров молекула РНК также может включать по меньшей мере один модифицированный рибонуклеозид, в том числе без ограничения 2'-О-метил-модифицированный нуклеозид, нуклеозид, содержащий 5' фосфотиоатную группу, концевой нуклеозид, соединенный с группой производного холестерила или группой бисдециламида додекановой кислоты, запертый нуклеозид, ациклический нуклеозид, нуклеозид с удаленными основаниями, 2'дезокси-2'-фтормодифицированный нуклеозид, 2'-аминомодифицированный нуклеозид, 2'-алкилмодифицированный нуклеозид, морфолиновый нуклеозид, фосфорамидат или нуклеозид, содержащий не встречающиеся в природе основания, или их комбинацию. Альтернативно, молекула РНК может содержать по меньшей мере два модифицированных рибонуклеозида, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или более, вплоть до полной длины молекулы dsRNA. Модификации не обязательно должны быть одинаковыми для каждого из такого множества
- 31 036477 модифицированных рибонуклеозидов в молекуле РНК. Согласно одному варианту осуществления модифицированные РНК, предполагаемые для применения в способах и композициях, описанных в данном документе, представляют собой пептидо-нуклеиновые кислоты (PNA), которые характеризуются способностью образовывать необходимую дуплексную структуру, и которые обеспечивают или опосредуют специфическое разрушение целевой РНК, например, посредством пути RISC.
Согласно одному аспекту модифицированный рибонуклеозид включает дезоксирибонуклеозид. В таком случае средство на основе iRNA может содержать один или несколько дезоксирибонуклеозидов, в том числе, например, дезоксирибонуклеозидный(дезоксирибонуклеозидные) выступающий(выступающие) конец(концы) или один или несколько дезоксинуклеозидов в двунитевой части dsRNA. Согласно определенным вариантам осуществления процентное содержание в молекуле РНК дезоксирибонуклеозидов составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или выше (но не 100%) дезоксирибонуклеозидов, например, в одной или обеих нитях. Согласно другим вариантам осуществления выражение iRNA не охватывает двунитевую молекулу ДНК (например, встречающуюся в природе двунитевую молекулу ДНК или молекулу ДНК, содержащую 100% дезоксинуклеозидов). Согласно одному аспекту средство для РНК-интерференции включает однонитевую РНК, которая взаимодействует с целевой последовательностью РНК для расщепления целевой РНК. Без углубления в теорию, длинная двунитевая РНК, введенная в клетки, разрезается на siRNA эндонуклеазой III типа, известной как дайсер (Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485). Дайсер, фермент, подобный рибонуклеазе III типа, обеспечивает процессинг dsRNA на короткие интерферирующие РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными 3'-выступающими концами из двух оснований (Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). siRNA затем включаются в индуцируемый РНК комплекс сайленсинга (RISC), в котором одна или несколько хеликаз раскручивают дуплекс siRNA, что позволяет комплементарной антисмысловой нити направлять целевое распознавание (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). После связывания с соответствующей целевой mRNA одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляет цель для индукции сайленсинга (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Таким образом, согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к однонитевой РНК, которая способствует образованию RISC-комплекса с осуществлением сайленсинга целевого гена.
Используемое в данном документе выражение нуклеотидный выступающий конец относится по меньшей мере к одному неспаренному нуклеотиду, который выступает из дуплексной структуры iRNA, например, dsRNA. Например, если 3'-конец одной нити dsRNA выходит за пределы 5'-конца другой нити или наоборот, то образуется нуклеотидный выступающий конец. dsRNA может содержать выступающий конец по меньшей мере из одного нуклеотида; альтернативно, выступающий конец может содержать по меньшей мере два нуклеотида, по меньшей мере три нуклеотида, по меньшей мере четыре нуклеотида, по меньшей мере пять нуклеотидов или более. Нуклеотидный выступающий конец может содержать нуклеотидный/нуклеозидный аналог или состоять из нуклеотидного/нуклеозидного аналога, в том числе дезоксинуклеотида/нуклеозида. Выступающий(выступающие) конец(концы) может(могут) находиться в пределах смысловой нити, антисмысловой нити или их комбинации. Кроме того, нуклеотид(нуклеотиды) выступающего конца может(могут) присутствовать на 5'-конце, 3'-конце или обоих концах или антисмысловой, или смысловой нити dsRNA.
Согласно одному варианту осуществления антисмысловая нить dsRNA имеет выступающий конец из 1-10 нуклеотидов на 3'-конце и/или 5'-конце. Согласно одному варианту осуществления смысловая нить dsRNA имеет выступающий конец из 1-10 нуклеотидов на 3'-конце и/или 5'-конце. Согласно другому варианту осуществления один или несколько нуклеотидов выступающего конца замещают нуклеозидтрифосфатом.
Выражение тупой конец или с тупыми концами, используемые в данном документе в отношении dsRNA, означают, что на данном терминальном конце dsRNA отсутствуют неспаренные нуклеотиды или нуклеотидные аналоги, т. е., отсутствует нуклеотидный выступающий конец. Один или оба конца dsRNA могут быть тупыми. Если оба конца dsRNA являются тупыми, то dsRNA называется dsRNA с тупыми концами. Для внесения ясности, dsRNA с тупыми концами представляет собой dsRNA, которая является тупой по обоим концам, т. е., ни на одном из концов молекулы нет нуклеотидного выступающего конца. Чаще всего такая молекула будет двунитевой по всей длине.
Выражение антисмысловая нить или направляющая нить относится к нити iRNA, например dsRNA, которая включает участок, который практически комплементарен целевой последовательности. Используемое в данном документе выражение участок комплементарности относится к участку антисмысловой нити, который практически комплементарен последовательности, например, целевой последовательности, определенной выше. Если участок комплементарности не полностью комплементарен целевой последовательности, то ошибочные спаривания могут находиться во внутренних или концевых участках молекулы. Как правило, допустимые в наибольшей степени ошибочные спаривания находятся в концевых участках, например, по 5, 4, 3 или 2 нуклеотиду 5'- и/или 3'-конца.
Выражение смысловая нить, или сопровождающая нить, используемое в данном документе, относится к нити iRNA, которая включает участок, практически комплементарный участку антисмысловой нити, как это выражение определено выше.
- 32 036477
Используемое в данном документе выражение SNALP относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид. SNALP представляет собой везикулу из липидов, покрывающих внутреннее пространство со сниженным водным содержимым, содержащий нуклеиновую кислоту, такую как iRNA, или плазмиду, из которой транскрибируется iRNA. SNALP описаны, например, в опубликованных патентных заявках США №№ 20060240093, 20070135372 и международной заявке № WO 2009082817. Эти заявки включены в данный документ при помощи ссылки по всей своей полноте.
Специалистам в данной области понятно, что введение в клетку в отношении iRNA означает облегчение или осуществление захвата или абсорбции клеткой. Абсорбция или захват iRNA может происходить путем спонтанных диффузионных или активных клеточных процессов, или при помощи вспомогательных средств или приспособлений. Значение этого выражения не ограничено клетками in vitro; iRNA также может быть введена в клетку, при этом клетка является частью живого организма. В таком случае введение в клетку будет включать доставку в организм. Например, в случае in vivo доставки iRNA может быть инъецирована в определенный участок ткани или введена системно. In vivo доставку также можно осуществлять с помощью системы доставки на основе Р-глюкана, такой как описанные в патентах США №№ 5032401 и 5607677, и публикации патента США № 2005/0281781, которые включены в данный документ при помощи ссылки во всей свой полноте. In vitro введение в клетку включает известные из уровня техники способы, такие как электропорация и липофекция. Дополнительные подходы описаны ниже в данном документе или известны из уровня техники.
Используемое в данном документе выражение модулировать экспрессию относится по меньшей мере к частичному ингибированию или частичной активации экспрессии гена ALAS1 в клетке, обработанной композицией на основе iRNA, описанной в данном документе, относительно экспрессии ALAS1 в контрольной клетке. Контрольная клетка включает необработанную клетку, или клетку, обработанную нецелевой контрольной iRNA.
Выражения активировать, усиливать, активировать экспрессию, повышать экспрессию и т. п., в части данного документа, где они относятся к гену ALAS1, относятся по меньшей мере к частичной активации экспрессии гена ALAS1, которая проявляется в повышении количества mRNA ALAS I, которую можно выделить из первой клетки или группы клеток или выявить в первой клетке или группе клеток, в которой ген ALAS1 транскрибируется, и которая была обработана или которые были обработаны с повышением экспрессии гена ALAS1 относительно второй клетки или группы клеток, практически идентичных первой клетке или группе клеток, но которая не была обработана или которые не были обработаны подобным образом (контрольные клетки).
Согласно одному варианту осуществления экспрессия гена ALAS1 активирована по меньшей мере приблизительно на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% путем введения iRNA, описанной в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления ген ALAS1 активирован по меньшей мере приблизительно на 60, 70 или 80% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия гена ALAS1 активирована по меньшей мере приблизительно на 85, 90 или 95% или более путем введения iRNA, описанной в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия гена ALAS1 повышена по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 1000 раз или более в клетках, обработанных iRNA, описанной в данном документе, относительно экспрессии в необработанных клетках. Активация экспрессии малыми dsRNA описана, например, в Li et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:17337-42, и в US20070111963 и US2005226848, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
Выражения осуществлять сайленсинг, ингибировать экспрессию, осуществлять негативную регуляцию, подавлять экспрессию и т. п. в части данного документа, где они относятся к гену ALAS1, относятся по меньшей мере к частичному подавлению экспрессии гена ALAS1, что оценивают, например, по экспрессии mRNA ALAS1, экспрессии белка ALAS1 или другому показателю, функционально связанному с экспрессией гена ALAS1 (например, концентрациям ALA или PBG в плазме или моче). Например, ингибирование экспрессии ALAS1 может проявляться в снижении количества mRNA ALAS I, которая может быть выделена из первой клетки или группы клеток или выявлена в первой клетке или группе клеток, в которых ген ALAS1 транскрибируется, и которая была обработана или которые были обработаны так, что экспрессия гена ALAS1 ингибируется относительно контроля. Контролем может быть вторая клетка или группа клеток, практически идентичная первой клетке или группе клеток, за исключением того, что вторая клетка или группа клеток не была обработана подобным образом (контрольные клетки). Степень ингибирования, как правило, выражена в виде процента контрольного уровня, например, ( mRNA в контрольных клетках) - (mRNA в обработанных клетках) θθο/ (mRNA в контрольных клетках)
Альтернативно, степень ингибирования может быть выражена с точки зрения снижения показателя, который функционально связан с экспрессией гена ALAS1, например количества белка, кодируемого геном ALAS 1, или уровня одного или нескольких порфиринов. Снижение показателя, функционально
- 33 036477 связанного с экспрессией гена ALAS 1, подобным образом может быть выражено в виде процента от контрольного уровня. В целом, сайленсинг гена ALAS1 можно определять в любой клетке, экспрессирующей ALAS1 либо конститутивно, либо при помощи генной инженерии, и при помощи любого подходящего анализа. Однако, если требуется информация для определения, ингибирует ли данная iRNA экспрессию гена ALAS 1 в определенной степени и, таким образом, охватывается настоящим изобретением, роль такой информации будут выполнять анализы, представленные ниже в примерах.
Например, в некоторых случаях экспрессия гена ALAS1 подавляется по меньшей мере приблизительно на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления ген ALAS1 подавляется по меньшей мере на приблизительно 60, 65, 70, 75 или 80% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления ген ALAS 1 подавляется по меньшей мере приблизительно на 85, 90, 95, 98 или 99% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении.
Используемые в контексте экспрессии ALAS1 выражения лечить, осуществлениея лечения, лечение т.п. относятся к ослаблению или облегчению патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS 1 (например, патологических процессов, включающих порфирины или нарушения в рамках порфиринового пути, такие как, например, порфирии). В контексте настоящего изобретения в части, касающейся любых из других состояний, упомянутых ниже в данном документе (кроме патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1), выражения лечить, лечение и т.п. означают предупреждение, облегчение или ослабление по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с таким состоянием, или замедление или устранение прогрессирования или прогнозирование прогрессирования такого состояния. Например, способы, описанные в данном документе, при использовании для лечения порфирии, могут служить для облегчения или предупреждения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией (например, болевых ощущений), снижения тяжести или частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, возникнет при воздействии провоцирующего фактора, укорочения приступа, связанного с порфирией, и/или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, гепатоцеллюлярного рака или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии)). Таким образом, если контекст явно не указывает на иное, предполагается, что выражения лечить, лечение и т.п. охватывают профилактику, например предупреждение нарушения и/или симптомов нарушений, связанных с экспрессией ALAS1.
Под выражением снижать в контексте маркера или симптома нарушения понимают статистически или клинически значимое снижение такого уровня. Снижение, например, может составлять по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или более и, как правило, вплоть до уровня, соответствующего уровню в пределах нормы для индивида без такого нарушения.
Используемые в данном документе фразы терапевтически эффективное количество и профилактически эффективное количество относятся к количеству, которое дает терапевтическое преимущество при лечении, предупреждении или контроле патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1. Конкретное количество, которое является терапетически эффективным, может быть легко определено рядовым врачом, и может варьировать в зависимости от факторов, известных в уровне техники, таких как, например, тип патологического процесса, история болезни и возраст пациента, стадия патологического процесса и введение других средств.
Используемое в данном документе выражение фармацевтическая композиция содержит фармакологически эффективное количество iRNA и фармацевтически приемлемый носитель. Используемое в данном документе выражение фармакологически эффективное количество, терапевтически эффективное количество или просто эффективное количество относится к такому количеству iRNA, эффективному для получения предполагаемого фармакологического, терапевтического или превентивного результата. Например, в способе лечения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1 (например, в способе лечения порфирии), эффективное количество включает количество, эффективное для облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, количество, эффективное для снижения частоты приступов, количество, эффективное для снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, возникнет при воздействии провоцирующего фактора, или количество, эффективное для снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака). Например, если определенное клиническое лечение считается эффективным, когда имеет место по меньшей мере 10% снижение измеряемого показателя, ассоциированного с заболеванием или нарушением, то терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения этого заболевания или нарушения представляет собой количество, необходимое для получения по меньшей мере 10% снижения этого значения. Например, терапевтически эффективное количество iRNA, нацеленной на ALAS1, может снижать уровни белка ALAS1 на любое измеряемое количество, например по меньшей мере на 10, 20, 30, 40 или 50%.
Выражение фармацевтически приемлемый носитель относится к носителю для введения терапевтического средства. Такие носители включают без ограничения солевой раствор, забуференный солевой
- 34 036477 раствор, декстрозу, воду, глицерол, этанол и их комбинацию. Выражение, в частности, исключает среду для культивирования клеток. Для лекарственных средств, вводимых перорально, фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения фармацевтически приемлемые вспомогательные средства, такие как инертные разбавители, средства для улучшения распадаемости, связывающие средства, смазывающие средства, подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты. Подходящие инертные разбавители включают карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция и лактозу, в то время как кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются подходящими средствами для улучшения распадаемости. Связывающие средства могут включать крахмал и желатин, в то время как смазывающие средства, если присутствуют, будут представлять собой, как правило, стеарат магния, стеариновую кислоту и тальк. При необходимости, таблетки могут быть покрыты веществом, таким как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для задержки всасывания в желудочнокишечном тракте. Средства, включенные в составы лекарственных средств, дополнительно описаны ниже в данном документе.
Выражение приблизительно в отношении числа или числового диапазона означает, что указанное число или числовой диапазон является приближением в пределах колебания экспериментальных данных (или в пределах статистической ошибки эксперимента), и, таким образом, число или числовой диапазон могут варьировать, например, от 1 до 15% указанного числа или числового диапазона.
II. Средства на основе iRNA
В данном документе описаны средства на основе iRNA, которые ингибируют экспрессию гена ALAS 1. Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA включает молекулы двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA) для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или у субъекта (например, у млекопитающего, например, у человека с порфирией), где dsRNA включает антисмысловую нить с участком комплементарности, который комплементарен по меньшей мере части mRNA, образованной в результате экспрессии гена ALAS1, и где участок комплементарности составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, и где dsRNA при контакте с клеткой, экспрессирующей ген ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1 по меньшей мере на 10%, при анализе, например, с помощью PCR или способа на основе разветвленной ДНК (bDNA), или с помощью способа на основе определения белков, такого как вестерн-блоттинг. Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA активирует экспрессию гена ALAS1 в клетке или у млекопитающего. Экспрессию гена ALAS1 в культуре клеток, таких как клетки COS, клетки HeLa, первичные гепатоциты, клетки HepG2, первичные культивируемые клетки, или в биологическом образце от субъекта, можно анализировать путем измерения уровней mRNA ALAS1, например, с помощью анализа bDNA или TaqMan, или путем измерения уровней белка, например, с помощью имунофлуоресцентного анализа, с применением, например, методик вестерн-блоттинга или проточной цитометрии.
dsRNA включает две нити РНК, которые достаточно комплементарны для гибридизации, с образованием дуплексной структуры при условиях, в которых dsRNA будет применяться. Одна нить dsRNA (антисмысловая нить) включает участок комплементарности, который практически комплементарен, и, как правило, полностью комплементарен целевой последовательности, полученной из последовательности mRNA, образованной в ходе экспрессии гена ALAS 1. Другая нить (смысловая нить) включает участок, который комплементарен антисмысловой нити, таким образом, что две нити гибридизируются и образуют дуплексную структуру при объединении при подходящих условиях. Как правило, дуплексная структура составляет 15-30 включительно, чаще 18-25 включительно, еще чаще 19-24 включительно, и чаще всего 19-21 пару оснований в длину включительно. Аналогично, участоккомплементарности целевой последовательности составляет 15-30 включительно, чаще 18-25 включительно, еще чаще 19-24 включительно, и чаще всего 19-21 нуклеотид в длину включительно. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA составляет 15-20 нуклеотидов в длину включительно, и согласно другим вариантам осуществления dsRNA составляет 25-30 нуклеотидов в длину включительно. Специалисту в данной области будет понятно, что целевой участок РНК, предназначенный для расщепления, зачастую будет представлять собой часть более крупной молекулы РНК, обычно молекулы mRNA. При необходимости, часть целевой mRNA представляет собой непрерывную последовательность целевой mRNA достаточной длины, чтобы быть субстратом для RNAi-направленного расщепления (т.е., расщепления посредством пути RISC). dsRNA с дуплексами по меньшей мере из 9 пар оснований могут при некоторых обстоятельствах опосредовать RNAi-направленное расщепление РНК. Наиболее часто цель будет составлять по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину, например 15-30 нуклеотидов в длину.
Специалисту в данной области также будет понятно, что участок дуплекса представляет собой основную функциональную часть dsRNA, например, участок дуплекса из 9-36, например, 15-30 пар оснований. Таким образом, согласно одному варианту осуществления в том случае, когда он процессирован до функционального дуплекса, например, из 15-30 пар оснований, который нацелен на необходимую РНК для расщепления, молекула РНК или комплекс из молекул РНК с участком дуплекса из более 30 пар оснований представляет собой dsRNA. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что согласно одному варианту осуществления miRNA представляет собой dsRNA. Согласно другому варианту осуществления dsRNA представляет собой не встречающуюся в природе miRNA. Согласно другому варианту осуществления средство на основе iRNA, пригодное для нацеливания экспрессии ALAS1, не
- 35 036477 образуется в целевой клетке путем расщепления более крупной dsRNA.
dsRNA, описанная в данном документе, может дополнительно включать один или несколько однонитевых нуклеотидных выступающих концов. dsRNA может быть синтезирована при помощи стандартных способов, известных из уровня техники, дополнительно описанных ниже, например, с применением автоматического синтезатора ДНК, такого как коммерчески доступные, например, от Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Согласно одному варианту осуществления ген ALAS1 представляет собой ген ALAS1 человека. Согласно другому варианту осуществления ген ALAS1 представляет собой ген ALAS1 мыши или крысы.
Согласно конкретным вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность, раскрытую в данном документе, например, в табл. 21-40, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность, раскрытую в данном документе, например, в табл. 21-40.
Согласно конкретным вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность из табл. 2 или таблицы 3, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность из табл. 2 или 3. Согласно вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15. Согласно вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20.
Согласно одному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из смысловых последовательностей, представленных в данном документе, например, в табл. 21-40, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из антисмысловых последовательностей, представленных в данном документе, например, в табл. 21-40.
Согласно одному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из группы последовательностей, представленных в табл. 2 и 3, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из табл. 2 и 3. Согласно дополнительному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из группы последовательностей, представленных в табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из табл. 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15. Согласно дополнительному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из табл. 2, 3,
6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20.
Согласно вариантам осуществления iRNA представляет собой AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876,AD61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892,AD60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140,AD61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892 илиAD60419 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций упомянутых выше dsRNA). Согласно вариантам осуществления iRNA содержит антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности (в том числе одной или нескольких (например, всех модификаций)), выбранной из антисмысловой последовательности AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892 или AD-60419. Согласно вариантам осуществления iRNA содержит смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности (и/или одной или нескольких (например, всех модификаций)), выбранной из AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892 или AD-60419.
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит по- 36 036477 следовательность или состоит из последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе.
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60519 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-61193 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60819, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60819 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления представлена iRNA для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности), и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности). Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, и/или (ii) смысловую нить, которая состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, за исключением того, что антисмысловая нить и/или смысловая нить dsRNA отличается 1, 2 или 3 нуклеотидами от соответствующей антисмысловой и/или смысловой последовательности AD60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819.
Последовательности и модификации AD-60489, AD-60519, AD-61193 и AD-60819, раскрытые в данном документе, показаны в табл. 44.
Согласно одному варианту осуществления iRNA представляет собой ALN-60519. ALN-60519 представляет собой химически синтезированный двунитевой олигонуклеотид, ковалентно связанный с лигандом, содержащим три остатка N-ацетилгалактозамина (GalNAc) (обозначенных на фиг. 57). Согласно одному варианту осуществления все нуклеотиды ALN-60519 являются 2'-ОМе или 2'-Fмодифицированными и соединены посредством 3'-5'-фосфодиэфирных связей с образованием сахарофосфатного остова олигонуклеотида. Смысловая нить и антисмысловая нить ALN-60519 содержат 21 и 23 нуклеотида соответственно. 3'-конец смысловой нити ALN-60519 конъюгирован с фрагментом GalNAc с тремя разветвлениями (называемым в данном документе L96) посредством фосфодиэфирной связи. Антисмысловая нить содержит четыре фосфотиоатных связи - две на 3'-конце и две на 5'-конце.
Смысловая нить ALN-60519 содержит две фосфотиоатных связи на 5'-конце. 21 нуклеотид смысловой нити ALN-60519 гибридизируется с комплементарным 21 нуклеотидом антисмысловой нити, образуя, таким образом, 21 пару нуклеотидных оснований и выступающий конец из двух оснований на 3'конце антисмысловой нити. Две одиночные нити, смысловая нить и антисмысловая нить ALN-60519 могут быть синтезированы при помощи стандартного твердофазного синтеза олигонуклеотидов, с использованием стандартной химической структуры фосфородиамита с 5'-гидроксильной группой, защищенной в виде диметокситрифенилметилового (DMT) эфира. Каждая нить может быть собрана от 3'-5'-конца последовательным добавлением защищенных нуклеозидных фосфорамидитов.
Согласно этим аспектам одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, при этом одна из последовательностей практически комплементарна последовательности mRNA, полученной в результате экспрессии гена ALAS1. Соответственно dsRNA будет включать два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан в данном документе как смысловая нить, и второй олигонуклеотид описан как соответствующая антисмысловая нить. Описанные в другой части в данном документе и известные из уровня техники комплементарные последовательности dsRNA также мо- 37 036477 гут содержаться в виде самокомплементарных участков одной молекулы нуклеиновой кислоты, в отличие от пребывания с составе отдельных олигонуклеотидов.
Специалисту в данной области хорошо известно, что dsRNA с дуплексной структурой из 20-23, в частности, из 21 пары оснований были признаны особенно эффективными в индуцировании РНКинтерференции (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Однако другими исследователями было обнаружено, что более короткие или более длинные дуплексные структуры РНК также могут быть эффективными. Согласно вариантам осуществления, описанным выше, в соответствии с природой олигонуклеотидных последовательностей, представленных в таблицах в данном документе, dsRNA, описанные в данном документе, могут включать по меньшей мере одну нить длиной минимум 21 нуклеотид. С достаточной вероятностью можно предполагать, что более короткие дуплексы с одной из последовательностей, раскрытых в данном документе, за исключением лишь нескольких нуклеотидов на одном или обоих концах, могут быть так же эффективны относительно dsRNA, описанных выше. Поэтому, согласно настоящему изобретению рассматриваются dsRNA с частичной последовательностью по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, раскрытых в данном документе, и различающихся их способностью ингибировать экспрессию гена ALAS1 не более чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от dsRNA, содержащей полную последовательность.
Кроме того, РНК, представленные в таблицах в данном документе, идентифицируют сайт в ALAS1транскрипте, который восприимчив к RISC-опосредованному расщеплению. Соответственно, настоящее изобретение также описывает iRNA, которые нацелены на одну из таких последовательностей. В контексте данного документа подразумевают, что iRNA нацелена на конкретный сайт РНК-транскрипта, если iRNA способствует расщеплению транскрипта в любом месте в этом конкретном сайте. Такая iRNA будет, как правило, включать по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, представленных в данном документе, например, в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18, 20 и в табл. 21-40, объединенных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, полученными из участка, прилегающего к выбранной последовательности в гене ALAS1.
Хотя целевая последовательность, как правило, составляет 15-30 нуклеотидов в длину, имеет место широкий спектр пригодности конкретных последовательностей в этом диапазоне для направления расщепления любой определенной целевой РНК. Ряд пакетов программного обеспечения и рекомендации, изложенные в данном документе, служат в качестве руководства для идентификации оптимальных целевых последовательностей для любого данного целевого гена, но также можно воспользоваться эмпирическим подходом, в котором окно или рамку данного размера (в качестве неограничивающего примера 21 нуклеотид) буквально или условно (в том числе, например, in silico) накладывают на целевую последовательность РНК для идентификации последовательностей в размерном диапазоне, которые могут выполнять роль целевых последовательностей. Передвигая окно последовательности постепенно на один нуклеотид выше или ниже относительно исходного расположения целевой последовательности, можно идентифицировать следующую потенциальную целевую последовательность, до тех пор, пока не будет идентифицирован полный набор возможных последовательностей для каждого данного выбранного целевого размера. С помощью этого способа, вместе с системным синтезом и тестированием идентифицированных последовательностей (с помощью анализов, описанных в данном документе, или известных из уровня техники) для идентификации таких последовательностей с оптимальными качествами, можно идентифицировать те последовательности РНК, которые при нацеливании средством на основе iRNA опосредуют наилучшее ингибирование экспрессии целевых генов. Таким образом, в то время как идентифицированные последовательности, например, в таблицах в данном документе, представляют эффективные целевые последовательности, предполагается, что дополнительная оптимизация эффективности ингибирования может быть достигнута путем постепенного перемещения окна на один нуклеотид выше или ниже относительно определенных последовательностей для идентификации последовательностей с такими же или лучшими характеристиками ингибирования.
Также предполагается, что для любой идентифицированной последовательности, например, в таблицах в данном документе, дополнительная оптимизация может быть достигнута целенаправленно либо добавлением, либо удалением нуклеотидов для получения более длинных или более коротких последовательностей, и тестированием таких последовательностей и последовательностей, полученных путем перемещения окна более длинного или более короткого размера выше или ниже относительно целевой РНК от данной точки. Также объединение этого подхода для получения новых кандидатных целей вместе с тестированием эффективности iRNA на основе этих целевых последовательностей в анализе ингибирования, известного из уровня техники или описанного в данном документе, может иметь результатом дополнительные улучшения в эффективности ингибирования. Более того, такие оптимизированные последовательности можно корректировать, например, введением модифицированных нуклеотидов, описанных в данном документе или известных из уровня техники, добавлением или изменениями выступающего конца, или другими модификациями, известными из уровня техники и/или описанными в данном документе для дополнительной оптимизации молекулы (например, повышения стабильности в сыворотке или периода полужизни в крови, повышения термостабильности, улучшения трансмембранной доставки, нацеливания на конкретную локацию или тип клеток, повышения степени взаимодействия с
- 38 036477 ферментами в рамках пути сайленсинга, повышения уровня высвобождения из эндосом и т. д.) в качестве ингибитора экспрессии.
iRNA, описанная в данном документе, может содержать одно или несколько ошибочно спаренных оснований относительно целевой последовательности. Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, содержит не более 3 ошибочно спаренных оснований. Если антисмысловая нить iRNA содержит ошибочно спаренные основания относительно целевой последовательности, предпочтительно, чтобы эта область ошибочно спаренных оснований не располагалась в центре участка комплементарности. Если антисмысловая нить iRNA содержит ошибочно спаренные основания относительно целевой последовательности, предпочтительно, чтобы ошибочно спаренное основание было ограничено расположением по меньшей мере в последних 5 нуклеотидах либо от 5'- либо 3'-конца участка комплементарности. Например, для средства на основе iRNA из 23 нуклеотидов, нить РНК которой комплементарна участку гена ALAS1, нить РНК, как правило, не содержит ошибочно спаренного основания в центральных 13 нуклеотидах. Способы, описанные в данном документе, или способы, известные из уровня техники, можно применять для определения того, является ли iRNA, содержащая ошибочно спаренное основание относительно целевой последовательности, эффективной в ингибировании экспрессии гена ALAS 1. Рассмотрение эффективности iRNA с ошибочно спаренными основаниями в ингибировании экспрессии гена ALAS1 является важным, особенно, если известно, что конкретный участок комплементарности в гене ALAS1 характеризуется вариацией полиморфных последовательностей в популяции.
Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один конец dsRNA имеет однонитевой нуклеотидный выступающий конец из 1-4, как правило 1 или 2 нуклеотидов. dsRNA по меньшей мере с одним нуклеотидным выступающим концом неожиданным образом характеризуются более высокими ингибиторными свойствами относительно своих аналогов с тупыми концами. Согласно еще одному варианту осуществления РНК из iRNA, например, dsRNA, химически модифицирована для усиления стабильности или других предпочтительных характеристик. Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем изобретении, могут быть синтезированы и/или модифицированы способами, хорошо известными из уровня техники, такими как описанные в Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et at. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, который включен, таким образом, в данный документ при помощи ссылки. Модификации включают, например, (а) концевые модификации, например 5'концевые модификации (фосфорилирование, конъюгацию, инвертированные связи и т.д.), 3'-концевые модификации (конъюгацию, нуклеотиды ДНК, инвертированные связи и т.д.), (b) модификации оснований, например, замещение стабилизирующими основаниями, дестабилизирующими основаниями или основаниями, которые образуют пару оснований с широким спектром партнеров, удаление оснований (нуклеотиды с удаленными основаниями) или конъюгированные основания, (с) модификации сахаров (например, в 2'-положении или 4'-положении, или наличие ациклического сахара) или замещение сахара, а также (d) модификации остовов, в том числе модификацию или замещение фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры соединений РНК, пригодных в настоящем изобретении, включают без ограничения РНК, содержащие модифицированные остовы или отличные от природных межнуклеозидные связи. РНК с модифицированными скелетами включают, среди прочих, такие, которые не содержат атом фосфора в остове. Применительно к настоящему описанию, а также некоторым упоминаниям из уровня техники, модифицированные РНК без атома фосфора в пределах их межнуклеозидного остова также могут считаться олигонуклеозидами. Согласно конкретным вариантам осуществления модифицированные РНК будут содержать атом фосфора в их межнуклеозидном остове.
Остовы модифицированной РНК включают, например, фосфотиоаты, хиральные фосфотиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфотриэфиры, сложные аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другой алкил-фосфонаты, в том числе 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные тионоалкилфосфотриэфиры и борофосфаты с типичными 3'-5'-связями, их 2'-5'связанные аналоги и таковые, имеющие обратную ориентацию, где соседние пары нуклеозидных единиц связываются 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение приведенных выше фосфорсодержащих связей, включают без ограничения патенты США №№ 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821;5541316; 5550111;5563253; 5571799;5587361; 5625050; 6028188; 6124445; 6160109; 6169170; 6172209; 6239265; 6277603; 6326199; 6346614; 6444423; 6531590; 6534639; 6608035; 6683167; 6858715; 6867294; 6878805; 7015315; 7041816; 7273933; 7321029 и патент США RE39464, каждый из которых включен в даннй документ при помощи ссылки.
Остовы модифицированных РНК, которые не имеют атом фосфора, включают остовы, образованные короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы с морфолиновыми связями (частично образованные из части нуклеозида, содер- 39 036477 жащей сахар); силоксановые скелеты; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; содержащие алкен остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие, содержащие части смешанных компонентов N, О, S и СН2.
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение приведенных выше олигонуклеозидов, включают без ограничения патенты США №№ 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938;5434257; 5466677;5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
В других миметиках РНК, подходящих или предполагаемых для применения в iRNA, как сахар, так и межнуклеозидная связь, т.е. остов нуклеотидных единиц, замещены новыми группами. Единицы оснований сохраняются для гибридизации с соответствующим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик РНК, который, как было показано, обладает очень хорошими свойствами для гибридизации, называется пептидо-нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA остов РНК, содержащий сахар, замещен содержащим амид остовом, в частности аминоэтилглициновым остовом. Нуклеотидные основания сохраняются и соединяются непосредственно или опосредованно с атомами аза-азота в амидной части остова. Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение соединений PNA, включают без ограничения патенты США №№ 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки. Дополнительное описание соединений PNA можно найти, например, в Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящем изобретении, включают РНК с фосфотиоатными остовами и олигонуклеозиды с остовами с гетероатомами и, в частности, --CH2--NH--CH2--, --СН2-МСН3,)--О--СН2--[известный как метилен (метилимино) или MMI скелет], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --СН2-N(CH3)--N(CH3)--CH2-- и --N(CH3)--CH2--CH2-- [где нативный скелет сложного фосфодиэфира представлен как --О--Р--О--СН2--] упомянутого выше патента США № 5489677 и амидные остовы упомянутого выше патента США № 5602240. Согласно некоторым вариантам осуществления РНК, описанные в настоящем документе, характеризуются структурами морфолинового скелета согласно упомянутому выше патенту США № 5034506.
Модифицированные РНК также могут содержать один или несколько фрагментов с замещенным сахаром. iRNA, например, dsRNA, описанные в настоящем документе, могут включать в 2'-положении одно из следующих: ОН; F; О-, S- или N-алкил; О-, S- или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил или О-алкилО-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенными или незамещенными Ц-С^алкилом или С2-С10алкенилом и алкинилом. Иллюстративные пригодные модификации включают О^СН^ОЦСЩ, О(СН2)-пОСН3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, где n и m составляют от 1 до приблизительно 10. Согласно другим вариантам осуществления dsRNA включают в 2'-положении одно из следующих: низший Ц-С^алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств iRNA или группу для улучшения фармакодинамических свойств iRNA и другие заместители с подобными свойствами. Согласно некоторым вариантам осуществления модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'О--СН2СН2ОСН3, также известный как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), т.е. алкокси-алкоксигруппу. Другой иллюстративной модификацией является 2'диметиламинооксиэтокси, т.е. группа O(CH2)2ON(CH3)2, также известная как 2'-DMAOE, как описано ниже в примерах в данном документе, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известный из уровня техники как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е. 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2, также описанный ниже в примерах в данном документе.
Согласно другим вариантам осуществления средство на основе iRNA содержит один или несколько (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) ациклических нуклеотидов (или нуклеозидов). Согласно определенным вариантам осуществления смысловая нить или антисмысловая нить, или как смысловая нить, так и антисмысловая нить, включают менее пяти ациклических нуклеотидов на нить (например, четыре, три, два или один ациклический нуклеотид на нить). Один или несколько ациклических нуклеотидов могут быть расположены, например, в двунитевом участке смысловой или антисмысловой нити, или обеих нитей; на 5'-конце, 3'-конце, как 5'-, так и 3'-концах смысловой или антисмысловой нити, или обеих нитей средства на основе iRNA.
Согласно одному варианту осуществления один или несколько ациклических нуклеотидов находятся в положениях 1-8 смысловой или антисмысловой нити, или обеих. Согласно одному варианту осуществления один или несколько ациклических нуклеотидов находятся в антисмысловой нити в положениях 4-10 (например, положениях 6-8) от 5'-конца антисмысловой нити. Согласно другому варианту осуществления один или несколько ациклических нуклеотидов находятся на одном или обеих 3'-концевых выступающих концах средства на основе iRNA.
- 40 036477
Выражение ациклический нуклеотид или ациклический нуклеозид, используемое в данном документе, относится к любому нуклеотиду или нуклеозиду с ациклическим сахаром, например, ациклической рибозой. Иллюстративный ациклический нуклеотид или нуклеозид может включать нуклеотидное основание, например, встречающееся в природе или модифицированное нуклеотидное основание (например, нуклеотидное основание, описанное в данном документе). Согласно определенным вариантам осуществления связь между любыми из углеродов рибозы (С1, С2, С3, С4 или С5), независимо или в комбинации, отсутствует со стороны нуклеотида. Согласно одному варианту осуществления связь между углеродами С2-С3 рибозного кольца отсутствует, например, мономер ациклического 2'-3'-секонуклеотида. Согласно другим вариантам осуществления связь между С1-С2, С3-С4 или С4-С5 отсутствует (например, мономер 1'-2', 3'-4' или 4'-5'-секо-нуклеотида). Иллюстративные ациклические нуклеотиды раскрыты в US 8314227, включенном в данный документе при помощи ссылки во всей своей полноте. Например, ациклический нуклеотид может включать любой из мономеров D-J на фиг. 1-2 согласно US 8314227. Согласно одному варианту осуществления ациклический нуклеотид включает следующий мономер:
О-Р=О I где основание представляет собой нуклеотидное основание, например, встречающееся в природе или модифицированное нуклеотидное основание (например, нуклеотидное основание, описанное в данном документе).
Согласно определенным вариантам осуществления ациклический нуклеотид может быть модифицированным или дериватизированным, например, при объединении ациклического нуклеотида с другим фрагментом, например, лигандом (например, GalNAc, холестерином в качестве лигандов), алкилом, полиамином, сахаром, полипептидом, среди прочих.
Согласно другим вариантам осуществления средство на основе iRNA включает один или несколько ациклических нуклеотидов и одну или несколько LNA (например, LNA, описанную в данном документе). Например, один или несколько ациклических нуклеотидов и/или одна или несколько LNA могут находиться в смысловой нити, антисмысловой нити или обеих. Число ациклических нуклеотидов в одной нити может быть одинаковым или может отличаться от числа LNA в противоположной нити. Согласно определенным вариантам осуществления смысловая нить и/или антисмысловая нить содержит менее пяти LNA (например, четыре, три, два или одну LNA), расположенных в двунитевом участке или 3'выступающем конце. Согласно другим вариантам осуществления одна или две LNA расположены в двунитевом участке 3' -выступающего конца смысловой нити. Альтернативно, или в комбинации, смысловая нить и/или антисмысловая нить содержит менее пяти ациклических нуклеотидов (например, четыре, три, два или один ациклический нуклеотид) в двунитевом участке или 3' -выступающем конце. Согласно одному варианту осуществления смысловая нить средства на основе iRNA содержит одну или две LNA в 3'-выступающем конце смысловой нити, и один или два ациклических нуклеотида в двунитевом участке антисмысловой нити (например, в положениях 4-10 (например, положениях 6-8) от 5'-конца антисмысловой нити) средства на основе iRNA.
Согласно другим вариантам осуществления включение одного или нескольких ациклических нуклеотидов (отдельно или в дополнение к одной или нескольким LNA) в средство на основе iRNA приводит к одному или нескольким (или всем) из следующего: (i) снижению нецелевого эффекта; (ii) снижению участия сопровождающей нити в RNAi; (iii) повышению специфичности ведущей нити к ее целевой mRNA; (iv) снижению нецелевого эффекта microRNA; (v) повышению стабильности или (vi) повышению устойчивости к разрушению молекулы iRNA.
Другие модификации включают 2'-метокси (2'-ОСН3), 2'-аминопропокси (2'-OCH2CH2CH2NH2) и 2'фтор (2'-F). Подобные модификации также могут быть осуществлены в других положениях РНК из iRNA, в частности, в 3'-положении сахара в З'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных dsRNA и в 5'положении 5'-концевого нуклеотида. iRNA также могут содержать миметики Сахаров, такие как циклобутиловые фрагменты, вместо пентофуранозильного сахара. Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение таких структур с модифицированными сахарами, включают без ограничения патенты США №№ 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878;5446137;5466786;5514785;5519134;5567811;
5576427;5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 и 5700920, некоторые из которых принадлежат авторам настоящей заявки и каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
iRNA также может включать в себя модификации и замещения нуклеотидного основания (часто называемого в уровне техники просто основанием). Используемые в данном документе выражения немодифицированные или природные нуклеотидные основания включают пуриновые основания аденин
- 41 036477 (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотидные основания включают другие синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как 5-метилцитозин (5-те-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкил-производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкил-производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, δ-амино-, 8-тиол-, 8тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности, 5-бром-, 5трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, а также 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные нуклеотидные основания включают раскрытые в патенте США № 3687808, раскрытые в Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; раскрытые в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, раскрытые в Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, а также раскрытые в Sanghvi Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, В., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидных оснований особенно пригодны для повышения аффинности связывания олигомерных соединений, описанных в настоящем изобретении. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что 5-метилцитозиновые замещения повышают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,61,2°С (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. Т. and Lebleu, В., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и представляют собой иллюстративные замещения оснований, еще более конкретно при комбинировании с 2'-О-метоксиэтильными модификациями сахаров.
Иллюстративные патенты США, которые описывают получение определенных указанных выше модифицированных нуклеотидных оснований, а также других модифицированных нуклеотидных оснований, включают без ограничения указанный выше патент США №3687808, а также патенты США №№ 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066;5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5681941; 6015886; 6147200; 6166197; 6222025; 6235887; 6380368; 6528640; 6639062; 6617438; 7045610; 7427672 и 7495088, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки, и патент США № 5750692, также включенный в данный документ при помощи ссылки.
РНК из iRNA также может быть модифицирована с включением одной или нескольких (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) запертых нуклеиновых кислот (LNA) (также называемых в данном документе запертыми нуклеотидами). Согласно одному варианту осуществления запертая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотид с модифицированным рибозным фрагментом, в котором рибозный фрагмент содержит дополнительные мостиковые соединяющие, например, 2'- и 4'углероды. Такая структура эффективно запирает рибозу в 3'-эндо структурной конформации. Было показано, что добавление запертых нуклеиновых кислот в siRNA повышает стабильность siRNA в сыворотке, повышает термостабильность и снижает нецелевые эффекты (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(l): 439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Cane Ther 6(3): 833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12): 3185-3193).
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение нуклеотидов с запертыми нуклеиновыми кислотами, включают в себя без ограничения следующие: патенты США №№ 6268490; 6670461; 6794499; 6998484; 7053207; 7084125; 7399845 и 8314227, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте. Иллюстративные LNA включают без ограничения 2', 4'-С-метиленбициклонуклеотид (см., например, Wengel et al., международную публикацию согласно РСТ № WO 00/66604 и WO 99/14226).
Согласно другим вариантам осуществления средства на основе iRNA включают один или несколько (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) нуклеотидов с G-зажимом. Нуклеотид с G-зажимом представляет собой модифицированный аналог цитозина, где модификации придают способность связываться водородными связями как по Уотсону и Крику, так и по Хугстину, с комплементарным гуанином в дуплексе, см., например, Lin and Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc, 120, 8531-8532. Замещение одного аналога с G-зажимом в олигонуклеотиде может приводить к значительно повышенной термостабильности спирали и распознаванию ошибочно спаренных оснований при гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами. Включение таких нуклеотидов в молекулы iRNA может приводить к повышенной аффинности и специфичности к мишеням нуклеиновых кислот, комплементарным последовательностям или матричным нитям.
Потенциально стабилизирующие модификации на концах молекул РНК могут включать в себя N[(ацетиламинокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-NHAc), №(капроил-4-гидроксипролинол (Нур-С6), №(ацетил-4-гидроксипролинол (Hyp-NHAc), тимидин-2'-О-дезокситимидин (эфир), ^-(аминокапроил)4-гидроксипролинол (Нур-С6-амино), 2-докозаноил-уридин-3-фосфат, инвертированное основание dT(idT) и другие. Раскрытие такой модификации можно найти в публикации РСТ № WO 2011/005861.
- 42 036477
Мотивы iRNA
Согласно одному варианту осуществления последовательность смысловой нити может быть представлена формулой (I):
где каждая из i и j независимо равняется 0 или 1;
каждая из р и q независимо равняется 0-6;
каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 025 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;
каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 010 модифицированных нуклеотидов;
каждая np и nq независимо представляет собой выступающий нуклеотид; где Nb и Y имеют неодинаковую модификацию; и каждый из XXX, YYY и ZZZ независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов. Предпочтительно в YYY все нуклеотиды 2'-Fмодифицированы.
Согласно одному варианту осуществления Na и/или Nb имеет модификации чередующегося паттерна.
Согласно одному варианту осуществления мотив YYY находится в сайте расщепления смысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит участок дуплекса, составляющий 1723 нуклеотида в длину, то мотив YYY может находиться в сайте расщепления или рядом с ним (например, может находиться в положениях 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12 или 11, 12, 13) в смысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца.
Согласно одному варианту осуществления i равняется 1, a j равняется 0, или i равняется 0, a j равняется 1, или как i, так и j равняются 1. Смысловая нить, таким образом, может быть представлена следующими формулами:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (1с); или
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ib), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ic), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Id), каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно, Nb равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Каждая из X, Y и Z может быть одинаковой или отличной от остальных.
Согласно другим вариантам осуществления i равняется 0, a j равняется 0 и смысловая нить может быть представлена формулой:
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ia), каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Согласно одному варианту осуществления последовательность антисмысловой нити RNAi может быть представлена формулой (II):
где каждая из k и l независимо равняется 0 или 1;
каждая из р' и q' независимо равняется 0-6;
каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;
каждая Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую
- 43 036477
0-10 модифицированных нуклеотидов;
каждая np' и nq' независимо представляет собой выступающий нуклеотид;
где Nb' и Y' имеют неодинаковую модификацию и каждый из Х'Х'Х', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов.
Согласно одному варианту осуществления Na' и/или Nb' содержит модификации чередующегося паттерна.
Мотив Y'Y'Y' находится в сайте расщепления антисмысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит участок дуплекса, составляющий 17-23 нуклеотида в длину, то мотив Y'Y'Y' может находиться в положениях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 или 13, 14, 15 антисмысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца. Предпочтительно мотив Y'Y'Y' находится в положениях 11, 12, 13.
Согласно одному варианту осуществления в мотиве Y'Y'Y' все нуклеотиды 2'-ОМемодифицированы.
Согласно одному варианту осуществления k равняется 1, а l равняется 0, или k равняется 0, а l равняется 1, или как k, так и l равняются 1.
Антисмысловая нить, таким образом, может быть представлена следующими формулами:
5' η^-ΝΛΖΈ'Ζ W-Y'Y'Y'-Na'-nP’ 3' (ПЬ);
5' nq’-Na'-YY'Y'-Nb'-X'X'X'-np’ 3' (Пс); или
5' nq’-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-nP’ 3' (lid).
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIb), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IIc), Nb' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (IId), каждый Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно Nb равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Согласно другим вариантам осуществления k равняется 0, а l равняется 0 и антисмысловая нить может быть представлена формулой:
5'nP’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3'(1а).
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена как формула (IIa), каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Каждая из X', Y' и Z' может быть одинаковой или отличной от остальных.
Каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо может быть модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-О-метилом, 2'-О-аллилом, 2'-С-аллилом, 2'-гидроксилом или 2'фтором. Например, каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован 2'-О-метилом или 2'-фтором. Каждая X, Y, Z, X', Y' и Z', в частности, может представлять собой 2'-Ометил-модификацию или 2'-фтор-модификацию.
Согласно одному варианту осуществления смысловая нить средства для RNAi может содержать мотив YYY, находящийся в 9, 10 и 11 положениях нити, в тех случаях, когда участок дуплекса составляет 21 нуклеотид, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y представляет собой 2'-Fмодификацию. Смысловая нить может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из XXX и ZZZ независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'^-модификацию.
Согласно одному варианту осуществления антисмысловая нить может содержать мотив Y'Y'Y', находящийся в положениях 11, 12, 13 нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y' представляет собой 2'-О-метил-модификацию. Антисмысловая нить может дополнительно содержать мотив Х'Х'Х' или мотивы Z'Z'Z' в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка и каждый из Х'Х'Х' и Z'Z'Z' независимо представляет собой 2'-OMe-модификацию или 2'^-модификацию.
Смысловая нить, представленная любой из вышеприведенных формул (Ia), (Ib), (Ic) и (Id), образует
- 44 036477 дуплекс с антисмысловой нитью, представленной любой из формул (IIa), (IIb), (IIc) и (IId) соответственно.
Соответственно средства для RNAi для применения в способах согласно настоящему изобретению могут содержать смысловую нить и антисмысловую нить, при этом каждая нить содержит 14-30 нуклеотидов, дуплекс для RNAi, представленный формулой (III):
смысловая:
антисмысловая:
3’ np’-Na’-(X’X'X')k-Nb’-Y'Y'Y'-Nb’-(Z'Z'Z')i-Na’-nq 5’ (III) где каждый из i, j, k и l независимо равняется 0 или 1;
каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;
каждая Na и Na независимо представляют собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;
каждая Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
где каждая np', np, nq' и nq, каждая из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид и каждый из XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов.
Согласно одному варианту осуществления i равняется 0, a j равняется 0; или i равняется 1, a j равняется 0; или i равняется 0, a j равняется 1; или как i, так и j равняются 0; или как i, так и j равняются 1. Согласно другому варианту осуществления k равняется 0, а l равняется 0; или k равняется 1, а l равняется 0; k равняется 0, а l равняется 1; или как k, так и l равняются 0; или как k, так и l равняются 1.
Иллюстративные комбинации смысловой нити и антисмысловой нити, образующих дуплекс для RNAi, включают формулы, приведенные ниже:
5'пр-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3' Пр’-Na-ΥΎΎ' -Na nq’ 5' (Ша)
5' np -Na -YYY -Nb -ZZZ -Na-nq 3'
3' Пр’-Na -Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'-Na nq 5' (Illb)
5' Пр-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3'
3' np-Na-X'X'X'-Nb-ΥΎΎ'-Na-nq 5' (IIIc)
5' np -Na -XXX -Nb-Y Y Y -Nb- ZZZ -Na-nq 3'
3' Пр’-Na -X'X'X'-Nb-Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'-Na-nq 5' (Illd)
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIa), каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIb), каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1 -10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIc), каждая Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), каждая Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na, Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждая из Na, Na', Nb и Nb' независимо содержит модификации чередующегося паттерна.
- 45 036477
Каждая из X, Y и Z в формулах (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) может быть одинаковой или отличной от остальных.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов Y может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Y'. Альтернативно, по меньшей мере два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'; или все три из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIb) или (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Z'. Альтернативно, по меньшей мере два из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'; или все три из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено в качестве формулы (IIIc) или (IIId), по меньшей мере один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов X'. Альтернативно, по меньшей мере два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'; или все три из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.
Согласно одному варианту осуществления модификация нуклеотида Y отличается от модификации нуклеотида Y', модификация нуклеотида Z отличается от модификации нуклеотида Z', и/или модификация нуклеотида X отличается от модификации нуклеотида X'.
Согласно одному варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации. Согласно другому варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации и np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи. Согласно еще одному варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0, и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, а смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. Согласно другому варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIId), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0 и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
Согласно одному варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (IIIa), модификациями Na являются 2'-O-метил- или 2'-фтор-модификации, np'>0 и по меньшей мере один np' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
Согласно одному варианту осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим по меньшей мере два дуплекса, представленных формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
Согласно одному варианту осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим три, четыре, пять, шесть или более дуплексов, представленных формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
Согласно одному варианту осуществления два средства для RNAi, представленные формулой (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId), соединены друг с другом на 5'-конце, и один или оба 3'-конца необязательно конъюгированы с лигандом. Каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген или на два различных гена или каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
Конъюгаты iRNA
Средства на основе iRNA, раскрытые в данном документе, могут находиться в форме конъюгатов. Конъюгат может быть прикреплен в любом подходящем положении в молекуле iRNA, например, на 3'конце или 5'-конце смысловой или антисмысловой нити. Конъюгат необязательно прикреплен с помо- 46 036477 щью линкера.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство на основе iRNA, описанное в данном документе, связано химически с одним или несколькими лигандами, фрагментами или конъюгатами, которые могут придавать функциональность, например, с влиянием на (например, с усилением) активность, распределение в клетке или захват клеткой iRNA. Такие фрагменты включают без ограничения липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), холевая кислота (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), тиоэфир, например, берил-Е-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), алифатическая цепь, например додекандиоловые или ундециловые остатки (SaisonBehmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett, 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-Огексадецил-рац-глицеро-3-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:36513654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), полиамин или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), или октадециламин, или гексиламино-карбонил-оксихолестериновый фрагмент (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).
Согласно одному варианту осуществления лиганд изменяет распределение, нацеливание или время существования средства на основе iRNA, в которое он введен. Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд обеспечивает повышенную аффинность в отношении выбранной цели, например, молекулы, клетки или типа клеток, компартмента, например, клеточного компартмента или части органа, ткани, органа или участка тела, например, по сравнению с видами, у которых отсутствует такой лиганд. Типичные лиганды не будут принимать участия в спаривании дуплекса в дуплексной нуклеиновой кислоте.
Лиганды могут включать встречающееся в природе вещество, такое как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновую кислоту) или липид. Лиганд также может быть рекомбинантной или синтетической молекулой, такой как синтетический полимер, например, синтетическая полиаминокислота. Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту, представляющую собой полилизин (PLL), поли-Ь-аспарагиновую кислоту, поли-Lглутаминовую кислоту, сополимер стирола и ангидрида малеиновой кислоты, сополимер L-лактида и гликолида, сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, N[-(2гидроксипропил)меакриламидный сополимер (НМРА), полиэтиленгликоль (PEG), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), N-изопропилакриламидные полимеры или полифосфазин. Примеры полиаминов включают полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, полиамин-пептидомиметик, полиамин-дендример, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, соль четвертичного полиамина или α-спиральный пептид.
Лиганды также включают нацеливающие группы, например нацеливающее на определенную клетку или ткань средство, например лектин, гликопротеин, липид или белок, например антитело, которое связывается с конкретным типом клетки, таким как клетка почки. Нацеливающая группа может представлять собой тиреотропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностный белок А, углеводмуцин, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу, поливалентную фукозу, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентнную галактозу, трансферрин, бисфосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчную кислоту, фолат, витамин В12, биотин или RGD-пептид или миметик RGD-пептида.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд представляет собой GalNAc, который содержит одну или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Дополнительное описание лигандов GalNAc представлено в разделе под названием Углеводные конъюгаты.
Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие средства (например, акридины), кросс-линкеры (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например, EDTA), липофильные молекулы, например, холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бис-О(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецил-глицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, О3-(олеоил)литохолевую кислоту, О3(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин и пептидные конъюгаты (например, пептид antennapedia, Tat-пептид), алкилирующие средства, фосфат, амино, меркапто, PEG (например, PEG40K), MPEG, [MPEG] 2, полиамино, алкил, замещенный алкил, меченные радиоизотопом маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), помощники транспорта/всасывания (например, аспирин, витамин Е, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеотиды (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, конъюгаты акридин-имидазол, комплекс Eu3+тетраазамакроциклы), динитрофенил,
- 47 036477
HRP или АР.
Лигандами могут быть белки, например, гликопротеины, или пептиды, например, молекулы со специфической аффинностью в отношении ко-лиганда, или антитела, например, антитело, которое связывается с определенным типом клетки, таким как раковая клетка, эндотелиальная клетка или костная клетка. Лиганды могут также включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать отличные от пептидов виды, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу или мультивалентную фукозу. Лигандом может быть, например, липополисахарид, активатор МАР-киназы р38 или активатор NF-кВ.
Лигандом может быть вещество, например, лекарственное средство, которое может улучшать захват средства на основе iRNA клеткой, например, путем разрушения цитоскелета клетки, например, путем разрушения микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов клетки. Лекарственным средством может быть, например, таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, яплакинолид, латрункулин А, фаллоидин, свинголид А, инданоцин или миосервин.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд, присоединенный к iRNA, описанной в данном документе, выполняет роль фармакокинетического модулятора (PK-модулятора). PK-модуляторы включают липофильные соединения, желчные кислоты, стероиды, фосфолипидные аналоги, пептиды, средства, связывающие белки, PEG, витамины и т.д. Иллюстративные PK-модуляторы включают без ограничения холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицериды, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин Е, биотин и т.д. Также известно, что олигонуклеотиды, которые содержат несколько фосфотиоатных связей, связываются с белком сыворотки, таким образом, короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды из приблизительно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие несколько из фосфотиоатных связей в остове, также пригодны согласно настоящему изобретению в качестве лигандов (например, PK-модулирующих лигандов). Кроме того, аптамеры, которые связывают компоненты сыворотки (например, белки сыворотки) также пригодны для применения в качестве PK-модулирующих лигандов согласно вариантам осуществления, описанным в данном документе.
Конъюгированные с лигандами олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы с применением олигонуклеотида, который обладает реакционно-способной функциональностью, обусловленной боковой цепью, как например, полученной в результате присоединения связывающей молекулы к олигонуклеотиду (описанному ниже). Этот реакционно-способный олигонуклеотид может вступать в реакцию непосредственно с коммерчески доступными лигандами, лигандами, которые синтезируют с любой из ряда защитных групп или лигандами со связывающим фрагментом, прикрепленным к ним.
Олигонуклеотиды, применяемые в конъюгатах согласно настоящему изобретению, можно получать удобным и обычным способом с помощью хорошо известной методики твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими поставщиками, в том числе, например, Applied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния). Дополнительно или альтернативно можно использовать любые другие средства для такого синтеза, известные в уровне техники. Также известно применение подобных методик для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфотиоаты и алкилированные производные.
В конъюгированных с лигандами олигонуклеотидах и нуклеозидах, связанных с определенными последовательностями, несущими молекулы лигандов, по настоящему изобретению, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды могуть быть собраны на подходящем синтезаторе ДНК, с использованием предшественников стандартных нуклеотидов и нуклеозидов, или предшественников конъюгатов нуклеотидов или нуклеозидов, которые уже несут связывающий фрагмент, предшественников конъюгатов нуклеотидов или нуклеозидов с лигандами, которые уже несут молекулу лиганда, или ненуклеозидные несущие лиганд структурные элементы.
При применении предшественников конъюгатов нуклеотидов, которые уже несут связывающий фрагмент, синтез нуклеозидов, связанных с определенными последовательностями, как правило, является завершенным, а молекула лиганда затем вступает в реакцию со связывающим фрагментом с образованием конъюгированного с лигандом олигонуклеотида. Согласно некоторым вариантам осуществления олигонуклеотиды или связанные олигонуклеозиды согласно настоящему изобретению синтезированы автоматическим синтезатором с применением фосфорамидатов, полученных из конъюгатов нуклеозидов с лигандами, в дополнение к стандартным фосфорамидатам и не стандартным фосфорамидатам, которые коммерчески доступны и, как правило, применяют в синтезе олигонуклеотидов.
Конъюгаты липидов
Согласно одному варианту осуществления лиганд представляет собой липид или липидную молекулу. Такой липид или липидная молекулу могут, как правило, связываться с сывороточным белком, таким как сывороточный альбумин человека (HSA). Связывающийся с HSA лиганд делает возможным распределение конъюгата в целевой ткани, например, отличной от ткани почек целевой ткани организма. Например, целевой тканью может быть печень, в том числе паренхиматозные клетки печени. Также в качестве лигандов можно применять другие молекулы, которые могут связываться с HSA. Например,
- 48 036477 можно применять непроксин или аспирин. Липид или липидный лиганд может (а) повышать устойчивость к разрушению конъюгата, (b) улучшать нацеливание или транспорт в целевую клетку или клеточную мембрану и/или (с) может быть применен для корректировки связывания с сывороточным белком, например HSA.
Липидный лиганд можно применять для модулирования, например, регулирования (например, ингибирования) связывания конъюгата с целевой тканью. Например, менее вероятно, что липид или липидный лиганд, который связывается с HSA более сильно, будет нацелен на почки и, таким образом, менее вероятно, что он будет выведен из организма. Липид или липидный лиганд, который связывается с HSA менее сильно, можно применять для нацеливания конъюгата на почки.
Согласно одному варианту осуществления липидный лиганд связывается с HSA. Например, лиганд может связываться с HSA с достаточной аффинностью, таким образом, распределение конъюгата в отличной от ткани почек ткани усиливается. Однако, как правило, аффинность не является настолько сильной, что связывание HSA-лиганда не может быть необратимым.
Согласно другому варианту осуществления липидный лиганд связывается с HSA слабо или вообще не связывается, так что распределение конъюгата в почке будет усиливаться. Другие фрагменты, которые нацелены на клетки почек, также можно применять вместо или в дополнение к липидным лигандам.
Согласно другому аспекту лигандом является фрагмент, например, витамин, который поглощается целевой клеткой, например, пролиферирующей клеткой. Такие варианты являются особенно пригодными для лечения нарушений, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, например, злокачественного или доброкачественного типа, например, раковых клеток. Иллюстративные витамины включают витамин А, Е и K. Другие иллюстративные витамины включают витамин В, например фолиевую кислоту, В12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль или другие витамины или биогенные вещества, поглощаемые раковыми клетками. Также включены HSA и липопротеин низкой плотности (LDL).
Средства, обеспечивающие проникновение в клетку
Согласно другому аспекту лигандом является средство, обеспечивающее проникновение в клетку, такое как спиральное средство для проникновения в клетку. Согласно одному варианту осуществления средство является амфипатическим. Иллюстративным средством является пептид, такой как tat или antennopedia. Если средство представляет собой пептид, то он может быть модифицированным, при этом средство может включать пептидилмиметик, инвертомеры, отличные от пептидных или псевдопептидные связи и применение D-аминокислот. Спиральное средство, как правило, представляет собой α-спиральное средство и может характеризоваться липофильной и липофобной фазой.
Лигандом может быть пептид или пептидомиметик. Пептидомиметик (также называемый в данном документе олигопептидомиметиком) является молекулой, способной сворачиваться в определенную трехмерную структуру, подобную природному пептиду. Присоединение пептида или пептидомиметика к средствам на основе iRNA может влиять на фармакокинетическое распределение iRNA, например, посредством усиления распознавания клеток и абсорбции клетками. Фрагмент, представляющий собой пептид или пептидомиметик, может составлять примерно 5-50 аминокислот в длину, например, примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот в длину.
Пептидом или пептидомиметиком, может быть, например, пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, катионный пептид, амфипатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий главным образом из Tyr, Trp или Phe). Фрагментом, представляющим собой пептид, может быть пептид-дендример, пептид с ограниченной конформационной свободой или перекрестно сшитый пептид. Согласно другому альтернативному варианту фрагмент, представляющий собой пептид, может включать гидрофобную последовательность, контролирующую перенос через мембрану (MTS). Иллюстративный содержащий гидрофобную MTS пептид представляет собой RFGF с аминокислотной последовательностью AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 3367). RFGF-аналог (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:3368)), содержащий гидрофобную MTS, также может быть нацеливающим фрагментом. Фрагмент, представляющий собой пептид, может быть пептидом для доставки, который может переносить большие полярные молекулы, в том числе пептиды, олигонуклеотиды и белки, через клеточные мембраны. Например, последовательности белка Tat HIV (GRKKRRQRRRPPQ SEQ ID NO:3369)) и белка Antennapedia Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 3370)) способны функционировать в качестве пептидов для доставки. Пептид или пептидомиметик могут кодироваться случайными последовательностями ДНК, как, например, пептид, идентифицированный из библиотеки фагового дисплея или комбинаторной библиотеки одна гранула-одно соединение (ОВОС) (Lam et al., Nature, 354: 82-84, 1991). Как правило, пептид или пептидомиметик, связанный со средством на основе dsRNA посредством введенной мономерной единицы, представляет собой нацеливающий на клетку пептид, такой как содержащий аргинин-глицин-аспарагиновую кислоту (RGD) пептид или RGD-миметик. Фрагмент, представляющий собой пептид, может характеризоваться длиной в диапазоне от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 40 аминокислот. Фрагменты, представляющие собой пептиды, могут характеризоваться структурной модификацией, как например, для повышения стабильности или управления конформационными свойствами. Можно использовать любые из структурных модификаций, описанных ниже.
- 49 036477
RGD-пептид для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным, например, гликозилированным или метилированным, для облегчения нацеливания на конкретную(определенные) ткань(ткани). RGDсодержащие пептиды и пептидомиметики могут включать D-аминокислоты, а также синтетические RGD-миметики. В дополнение к RGD можно применять другие фрагменты, которые нацелены на лиганд интегрин. Предпочтительные конъюгаты этого лиганда нацелены на РЕСАМ-1 или VEGF.
Фрагмент, представляющий собой RGD-пептид, можно применять для нацеливания на конкретный тип клетки, например, опухолевую клетку, такую как эндотелиальная опухолевая клетка или опухолевая клетка рака молочной железы (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD-пептид может облегчать нацеливание средства на основе dsRNA на опухоли ряда других тканей, в том числе легкого, почки, селезенки или печени (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Как правило, RGD-пептид будет облегчать нацеливание средства на основе iRNA на почку. RGD-пептид может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным, например, гликозилированным или метилированным, для облегчения нацеливания на конкретные ткани. Например, гликозилированный RGD-пептид может доставлять средство на основе iRNA к опухолевой клетке, экспрессирующей aVe3(Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42: 326-336, 2001).
Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку способен проникать в клетку, например, микробную клетку, такую как клетка бактерии или гриба, или клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Пептидом, обеспечивающим проникновение в микробную клетку, например, может быть αспиральный линейный пептид (например, LL-37 или Ceropin PI), содержащий дисульфидную связь пептид (например, α-дефензин, β-дефензин или бактенецин) или пептид, содержащий только одну или две преобладающие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, также может включать клеточный сигнал внутриядерной локализации (NLS). Например, пептидом, обеспечивающим проникновение в клетку, может быть двухкомпонентный амфипатический пептид, такой как MPG, который получен из домена слитого пептида gp41 HIV-1 и NLS из большого Т-антигена SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31: 2717-2724, 2003).
Углеводные конъюгаты
Согласно некоторым вариантам осуществления композиций и способов по настоящему изобретению олигонуклеотид iRNA дополнительно содержит углевод. Конъюгированная с углеводом iRNA является предпочтительной для in vivo доставки нуклеиновых кислот, а также композиций, пригодных для in vivo терапевтического применения, описанного в данном документе. Используемое в данном документе выражение углевод относится к соединению, которое представляет собой углевод per se, образованный из одного или нескольких единиц моносахаридов, имеющих по меньшей мере 6 атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода; или соединению, имеющему в качестве его части углеводный фрагмент, образованный из одного или нескольких единиц моносахаридов, каждая из которых имеет по меньшей мере шесть атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода. Типичные углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие от приблизительно 4, 5, 6, 7, 8 или 9 единиц моносахаридов) и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные смолы. Определенные моносахариды включают С5 и более (например, С5, С6, С7 или С8) сахара; ди- и трисахариды включают сахара с двумя или тремя единицами моносахаридов (например, С5, С6, С7 или С8).
Согласно одному варианту осуществления углеводный конъюгат содержит моносахарид. Согласно одному варианту осуществления моносахаридом является N-ацетилгалактозамин (GalNAc). Конъюгаты GalNAc описаны, например, в патенте США № 8106022, все содержимое которого, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc выполняет роль лиганда, который нацеливает iRNA к конкретным клеткам. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc нацеливает iRNA к клеткам печени, например, выполняя роль лиганда для рецептора асиалогликопротеина в клетках печени (например, гепатоцитах).
Согласно некоторым вариантам осуществления углеводный конъюгат содержит одно или несколько производных GalNAc. Производные GalNAc могут быть присоединены с помощью линкера, например, двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд GalNAc конъюгирован с 3'-концом смысловой нити. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc конъюгирован со средством на основе iRNA (например, с 3'-концом смысловой нити) с помощью линкера, например, линкера, описанного в данном документе.
- 50 036477
Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc представляет собой
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi присоединено к углеводному конъюгату с помощью линкера, как показано в следующей схеме, где X представляет собой О или S
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi конъюгировано с L96, как определено в табл. 1 и показано ниже
Согласно некоторым вариантам осуществления углеводный конъюгат для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению выбирают из группы, состоящей из
- 51 036477
- 53 036477
Другой типичный углеводный конъюгат для применения в вариантах осуществления, описанных в данном документе, включает без ограничения
(Формула XXIII), где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.
Согласно некоторым вариантам осуществления углеводный конъюгат дополнительно содержит один или несколько дополнительных лигандов, описанных выше, таких как без ограничения Pkмодулятор и/или пептид, обеспечивающий проникновение в клетку.
Согласно одному варианту осуществления iRNA согласно настоящему изобретению конъюгирована с углеводом с помощью линкера. Неограничивающие примеры углеводных конъюгатов с iRNA с линкерами композиций и способов согласно настоящему изобретению включают без ограничения
- 54 036477
(Формула XXX), где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.
Линкеры
Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат или лиганд, описанные в данном документе, могут быть присоединены к олигонуклеотиду iRNA с помощью различных линкеров, которые могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.
Выражение линкер или линкерная группа означает органический фрагмент, который соединяет две части соединения, например, связывает ковалентными связями две части соединения. Линкеры, как правило, содержат прямую связь или атом, такой как кислород или сера, единицу, такую как NR8, С(О), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH или цепь из атомов, такую как без ограничения замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклиалкенил, гетероциклиалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкерингетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкерилгетероалкинил, алкилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетероциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил, алкинилгетероциклилалкенил, алкинилгетероциклилалкинил, алкиларил, алкениларил, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, в которых один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться О, S, S(O), SO2, N(R8), С(О), замещенным или незамещенным арилом, замещенным или незамещенным гетероарилом, замещенным или незамещенным гетероциклилом; где R8 представляет собой водород, ацил, алифатический или замещенный алифатический компонент. Согласно одному варианту осуществления линкер составляет приблизительно 1-24 атома, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 624, 6-18, 7-18, 8-18 атомов, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 или 8-16 атомов.
Согласно одному варианту осуществления dsRNA согласно настоящему изобретению конъюгирована с двухвалентным и трехвалентным разветвленным линкером, выбранным из группы структур, показанных в любой из формул (XXXI)-(XXXIV):
- 55 036477
Формула XXXIII > или
Формула XXXIV где q2A, q2B, q3 A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B и q5C независимо представляют собой для каждого случая 0-20, и где повторяющаяся единица может быть рдинаковой или различной;
каждая из Р2А, Р2В, Р3А, P3B, Р4А, Р4В, Р5А, Р5В, Р5С, Т2А, Т2В, Т3А, T3B, Т4А, Т4В, Т4А, Т5В, Т5С независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой СО, NH, О, S, ОС(О), NHC(O), CH2, CH2NH или СН2О;
q2a, q2b, q3a, q3b, q4a, q4b, q5a, q5b, q5c независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой алкилен, замещенный алкилен, где один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться одним или несколькими из О, S, S(O), SO2, N(Rn ), C(R’)=C(R), С=С или С(О);
каждый из R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой NH, О, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
или гетероциклил;
L2a, l2b, l3a, l3b, l4a, l4b, l5a, l5b и l5C представляют собой лиганд; т.е. независимо для каждого случая моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид; и Ra представляет собой Н или аминокислотную боковую цепь. Трехвалентные конъюгирующие производные GalNAc особенно пригодны для применения со средствами на основе RNAi для ингибирования экспрессии целевого гена, такие как из формулы (XXXV):
Формула XXXV
I ρ5Α_θ5Α_ρ5Α I т5А-|_5А г
I p5B_Q5B_R5B j Т5В_|_5В \_____I р5С q5C r5C 1_____-|-5С_|_5С
Г Jq5C где L5A, L5B и L5C представляют собой моносахарид, такой как производное GalNAc.
Примеры подходящих двухвалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп, конъюгирующих производные GalNAc, включают без ограничения структуры, приведенные выше в виде формул II, VII, XI, X и XIII.
Расщепляемая линкерная группа представляет собой группу, которая достаточно стабильна вне клетки, но которая при вхождении в целевую клетку расщепляется с высвобождением двух частей, которые линкер удерживает вместе. Согласно предпочтительному варианту осуществления расщепляемая линкерная группа расщепляется приблизительно в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 раз или более, или по меньшей мере приблизительно в 100 раз быстрее в целевой клетке или при первом упомянутом условии (которое можно, например, выбрать для имитации или моделировании внутриклеточных условий), чем в крови субъекта или при втором упомянутом условии (которое можно, например, выбрать для имитации или моделирования условий, которые имеют место в крови или сыворотке).
Расщепляемые линкерные группы восприимчивы к средствам расщепления, например, рН, редокспотенциалу или присутствию разрушающих молекул. Как правило, средства расщепления более распространены или встречаются при более высоких уровнях или при большей активности внутри клетки, чем в сыворотке или крови. Примеры таких разрушающих средств включают окислительно-восстановительные средства, которые выбирают для конкретных субстратов или которые не обладают специфичностью к субстратам, в том числе, например, окислительные или восстановительные ферменты или восстановительные средства, такие как меркаптаны, присутствующие в клетках, которые могут разрушать редоксрасщепляемую линкерную группу путем восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые мо- 56 036477 гут создавать кислую среду, например, таковые, которые приводят к рН, равному пять или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать расщепляемую кислотой линкерную группу, действуя в качестве универсальной кислоты, пептидазы (которые могут быть субстрат-специфичными) и фосфатазы.
Расщепляемая линкерная группа, такая как дисульфидная связь, может быть восприимчивой к рН. рН сыворотки человека составляет 7,4, в то время как средняя внутриклеточная рН немного ниже, и находится в диапазоне приблизительно 7,1-7,3. Эндосомы характеризуются более кислым рН в диапазоне 5,5-6,0, а лизосомы характеризуются еще более кислым рН, приблизительно 5,0. Некоторые линкеры будут содержать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется при предпочтительном рН, тем самым высвобождается катионный липид из лиганда внутрь клетки или в предпочтительный компартмент клетки.
Линкер может включать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется конкретным ферментом. Тип расщепляемой линкерной группы, включенной в линкер, может зависеть от клетки, подлежащей нацеливанию. Например, лиганд, нацеливаемый на печень, может быть связан с катионным липидом с помощью линкера, который включает эфирную группу. Клетки печени содержат много эстераз, и, таким образом, линкер может быть расщеплен более эффективно в клетках печени, чем в клетках, которые не содержат много эстераз. Другие типы клеток с высоким содержанием эстераз включают клетки легкого, коры почек и семенника.
Линкеры, которые содержат пептидные связи, можно применять при нацеливании на другие типы клеток с высоким содержанием пептидаз, такие как клетки печени и синовиоциты.
Как правило, пригодность кандидатной расщепляемой линкерной группы может быть оценена с помощью тестирования способности разрушающего средства (или условия) расщеплять линкерную группу. Кроме того, желательным также является тестирование кандидатной расщепляемой линкерной группы в отношении способности выдерживать расщепление в крови или при контакте с другой нецелевой тканью. Таким образом, можно определить относительную восприимчивость расщеплению между первым и вторым условием, где первое выбирают в качестве показателя расщепления в целевой клетке и второе выбирают в качестве показателя расщепления в других тканях или биологическим жидкостях, например, крови или сыворотке. Оценки можно проводить в бесклеточных системах, в клетках, в культуре клеток, в культуре органов или тканей или для целых животных. Может быть полезным выполнять первоначальные измерения в условиях бесклеточной системы или в условиях культуры, а подтверждать с помощью дополнительных измерений на целых животных. Согласно предпочтительным вариантам осуществления пригодные кандидатные соединения расщепляются по меньшей мере приблизительно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или приблизительно в 100 раз быстрее в клетке (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью или сывороткой (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внеклеточных условий).
Расщепляемые с помощью редокс-потенциала линкерные группы
Согласно одному варианту осуществления расщепляемая линкерная группа представляет собой расщепляемую с помощью редокс-потенциала линкерную группу, которая расщепляется при восстановлении или окислении. Примером расщепляемой при восстановлении линкерной группы является дисульфидная линкерная группа (-S-S-). Для определения того, является ли кандидатная расщепляемая линкерная группа подходящей расщепляемой при восстановлении линкерной группой или, например, подходящей для применения с определенным фрагментом iRNA и определенным нацеливающим средством, можно обратиться к способам, описанным в данном документе. Например, кандидат может быть оценен при помощи инкубирования с дитиотреитолом (DTT) или другим восстанавливающим средством с применением реактивов, известных в уровне техники, которые имитируют скорость расщепления, которая наблюдалась бы в клетке, например, целевой клетке. Кандидаты также могут быть оценены в условиях, которые выбирают для имитации условий в крови или сыворотке. Согласно одному варианту кандидатные соединения расщепляются в наибольшей степени приблизительно на 10% в крови. Согласно другим вариантам осуществления пригодные кандидатные соединения разрушаются по меньшей мере приблизительно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или приблизительно в 100 раз быстрее в клетке (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внеклеточных условий). Скорость расщепления кандидатных соединений может быть определена при помощи стандартных анализов ферментативной кинетики в условиях, выбранных для имитации внутриклеточных сред, и по сравнению с условиями, выбранными для имитации внеклеточных сред.
Фосфатные расщепляемые линкерные группы
Согласно другому варианту осуществления расщепляемый линкер содержит фосфатную расщепляемую линкерную группу. Фосфатная расщепляемая линкерная группа расщепляется средствами, которые разрушают или гидролизуют фосфатную группу. Примером средства, которое расщепляет фосфатные группы в клетках, являются ферменты, такие как клеточные фосфатазы. Примерами фосфатных линкерных групп являются -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -OP(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S- 57 036477
P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-. Предпочтительными вариантами осуществления являются -О-Р(О)(ОН)-О-, -O-P(S)(OH)-C-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -SP(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-,
-S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительным вариантом осуществления является -О-Р(О)(ОН)-О-.
Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Расщепляемые кислотами линкерные группы
Согласно другому варианту осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую кислотой линкерную группу. Расщепляемая кислотой линкерная группа представляет собой линкерную группу, которая расщепляется при кислых условиях. Согласно предпочтительным вариантам осуществления расщепляемые кислотой линкерные группы расщепляются в кислой среде с рН приблизительно 6,5 или ниже (например, приблизительно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 или ниже), или с помощью средств, таких как ферменты, которые могут выступать в роли универсальной кислоты. В клетке определенные органеллы с низким рН, такие как эндосомы и лизосомы, обеспечивают среду расщепления для расщепляемых кислотами линкерных групп. Примеры расщепляемых кислотами линкерных групп включают без ограничения гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Расщепляемые кислотами группы могут характеризоваться общей формулой -C=NN-, C(O)O или -ОС(О). Предпочтительным вариантом осуществления является случай, когда углерод, присоединяемый к кислороду сложного эфира (алкоксигруппе), представляет собой арильную группу, замещенную алкильную группу или четвертичную алкильную группу, такую как диметилпентил или трет-бутил. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Сложноэфирные расщепляемые линкерные группы
Согласно другому варианту осуществления расщепляемый линкер содержит сложноэфирную расщепляемую линкерную группу. Сложноэфирная расщепляемая линкерная группа расщепляется ферментами, такими как клеточные эстеразы и амидазы. Примеры сложноэфирных расщепляемых линкерных групп включают без ограничения сложные эфиры с алкиленовыми, алкениленовыми и алкиниленовыми группами. Сложноэфирные расщепляемые линкерные группы характеризуются общей формулой С(О)О- или -ОС(О)-. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Пептидные расщепляемые линкерные группы
Согласно еще одному варианту осуществления расщепляемый линкер содержит пептидную расщепляемую линкерную группу. Пептидная расщепляемая линкерная группа расщепляется ферментами, такими как клеточные пептидазы и протеазы. Пептидные расщепляемые линкерные группы представляют собой пептидные связи, образованные между аминокислотами с получением олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.д.) и полипептидов. Пептидные расщепляемые группы не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может образовываться между любым алкиленом, алкениленом или алкинеленом. Пептидная связь представляет собой особый тип амидной связи, образованной между аминокислотами с получением пептидов и белков. Пептидная расщепляемая группа, как правило, ограничена пептидной связью (т. е. амидной связью), образованной между аминокислотами, с образованием пептидов и белков, и не включает всю амидную функциональную группу. Пептидные расщепляемые линкерные группы характеризуются общей формулой - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, где RA и RB представляют собой R-группы двух соседних аминокислот. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение конъюгатов РНК, включают без ограничения патенты США №№ 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730;5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603;5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830;
5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873;
5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142;
5585,481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941; 6294664; 6320017; 6576752; 6783931;
6900297; 7037646; 8106022, полное содержание каждого из которых включено в данный документ при помощи ссылки.
Нет необходимости, чтобы все положения в данном соединении были единообразно модифицированными, и, фактически, более чем одна из вышеупомянутых модификаций может быть включена в одно соединение или даже в один нуклеозид в iRNA. Настоящее изобретение также предусматривает соединения iRNA, которые являются химерными соединениями.
Химерные соединения iRNA, или химеры, в контексте настоящего изобретения представляют собой соединения iRNA, например, dsRNA, которые содержат две или более химически разных участка, при этом каждый состоит по меньшей мере из одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида, в случае соединения dsRNA. Такие iRNA, как правило, содержат по меньшей мере один участок, где РНК модифицируют так, чтобы придать iRNA повышенную устойчивость к разрушению нуклеазой, улучшенный захват клеткой и/или повышенную аффинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой. Дополнительный участок iRNA может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гиб
- 58 036477 риды РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера, РНКаза Н является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет нить РНК дуплекса РНК ДНК Активация РНКазы Н, следовательно, приводит к расщеплению целевой РНК со значительным повышением, таким образом, эффективности ингибирования экспрессии гена посредством iRNA. Следовательно, при применении химерных dsRNA сравниваемые результаты часто могут быть получены для более коротких iRNA по сравнению с фосфотиоатдезокси dsRNA, гибридизирующимися с тем же целевым участком. Расщепление целевой РНК, как правило, можно выявить путем гель-электрофореза и при необходимости с помощью ассоциированных с гибридизацией нуклеиновых кислот методик, известных в уровне техники.
В некоторых случаях РНК из iRNA может быть модифицирована группой, не являющейся лигандом. Ряд молекул, не являющихся лигандами, конъюгировали с iRNA для усиления активности, распределения в клетке или клеточного захвата iRNA, и процедуры для выполнения таких типов конъюгирования доступны в научной литературе. В такие фрагменты, не являющиеся лигандами, включены липидные фрагменты, такие как холестерин (Kubo, Т. et al., Biochem. Biophys. Res. Comrn., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), холевая кислота (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), тиоэфир, например, гексил-Е-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), алифатическая цепь, например, додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett, 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например ди-гексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-Огексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777), полиамин или полиэтиленгликольная цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), или октадециламин, или гексиламино-карбонил-оксихолестериновый фрагмент (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Then, 1996, 277:923). Иллюстративные патенты Соединенных Штатов, которые описывают получение таких конъюгатов РНК, были приведены выше. Типичные протоколы конъюгирования предусматривают синтез РНК, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях последовательности. Затем проводят реакцию аминогруппы с молекулой, подлежащей конъюгированию, при помощи соответствующих реагентов конденсации или активации. Реакция конъюгирования может быть выполнена либо с РНК, все еще связанной с твердой подложкой, либо после расщепления РНК в фазе раствора. Очистка конъюгата РНК с помощью HPLC, как правило, дает чистый конъюгат.
Доставка iRNA
Доставка iRNA нуждающемуся в этом субъекту может быть осуществлена несколькими различными путями. Доставку in vivo можно осуществлять непосредственно путем введения субъекту композиции, содержащей iRNA, например dsRNA. Альтернативно, доставку можно осуществлять опосредованно путем введения одного или нескольких векторов, которые кодируют и направляют экспрессию iRNA. Такие альтернативные случаи описаны далее ниже.
Прямая доставка
Как правило, любой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты может быть адаптирован для применения с iRNA (см., например, Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5): 139-144 и WO 94/02595, которые включены в данный документ при помощи ссылки в своей полноте). Однако, существуют три фактора, которые необходимо учитывать для успешной доставки молекулы iRNA in vivo: (а) биологическая стабильность доставляемой молекулы, (2) предупреждение неспецифических эффектов, и (3) накопление доставляемой молекулы в целевой ткани. Неспецифические эффекты iRNA могут быть сведены к минимуму путем локального введения, например, путем прямой инъекции, или вживления в ткань (в качестве неограничивающего примера опухоли), или местного введения препарата. Локальное введение в место обработки максимально увеличивает локальную концентрацию средства, ограничивает воздействие средства на системные ткани, которые в ином случае могут быть повреждены средством или которые могут разрушить средство, и позволяет вводить более низкую общую дозу молекулы iRNA. В нескольких исследованиях был показан эффективный нокдаун генных продуктов при введении iRNA локально. Например, было показано, что внутриглазная доставка dsRNA к VEGF как путем инъекции в стекловидное тело макаков-крабоедов (Tolentino, MJ., et al. (2004) Retina 24: 132-138), так и субретинальных инъекций мышам (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9: 210-216) предупреждают неоваскуляризацию в экспериментальной модели возрастной дегенерации макулы. Кроме того, прямая внутриопухолевая инъекция dsRNA мышам снижает объем опухолей (Pille, J., et al. (2005) Mol. Ther. 11: 267-274) и может увеличивать выживаемость мышей с опухолями (Kim, WJ., et al. (2006) Mol. Ther. 14: 343-350; Li, S., et al. (2007) Mol. Ther. 15: 515-523). РНК-интерференция также была успешной при локальной доставке к CNS путем прямой инъекции (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93: 594-602) и к легким путем интраназального введения (Howard, KA., et al. (2006) Mol. Ther. 14: 476-484; Zhang, X., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al. (2005) Nat. Med.
- 59 036477
11:50-55). Что касается системного введения iRNA для лечения заболевания, РНК может быть модифицирована или, альтернативно, доставлена при помощи системы доставки лекарственного средства; оба способа служат для предупреждения быстрого разрушения dsRNA эндо- и экзонуклеазами in vivo.
Модификация РНК или фармацевтический носитель также могут обеспечивать нацеливание композиции на основе iRNA на целевую ткань, и с их помощью можно избежать нежелательных нецелевых эффектов. Молекулы iRNA можно модифицировать при помощи химической конъюгации с другими группами, например, липидной или углеводной группой, описанными в данном документе. Такие конъюгаты можно применять для нацеливания iRNA на определенные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты. Например, конъюгаты GalNAc или составы на основе липидов (например, LNP) можно применять для нацеливания iRNA на определенные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты.
Липофильные группы, такие как холестерин, улучшают захват клеткой и предупреждают разрушение. Например, направленную против АроВ iRNA, конъюгированную с фрагментом, представляющим собой липофильный холестерин, инъецировали системно мышам, что приводило к нокдауну mRNA apoB как в печени, так и в тонкой кишке (Soutschek, J., et al. (2004) Nature 432:173-178). Как было показано, конъюгация iRNA с аптамером способствует ингибированию роста опухоли и опосредует регресс опухоли на мышиных моделях рака предстательной железы (McNamara, JO., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1005-1015). Согласно альтернативному варианту осуществления iRNA можно доставлять с помощью систем доставки лекарственных средств, таких как наночастица, дендример, полимер, липосомы или катионная система доставки. Положительно заряженные катионные системы доставки способствуют связыванию молекулы iRNA (отрицательно заряженной) и также увеличивают взаимодействия на отрицательно заряженной клеточной мембране с обеспечением эффективного захвата iRNA клеткой. Катионные липиды, дендримеры или полимеры могут либо быть связанными с iRNA, либо их индуцируют с целью образования везикулы или мицеллы (см., например, Kim SH., et al. (2008) Journal of Controlled Release 129(2): 107-116), которые заключают в себя iRNA. Образование везикул или мицелл также предупреждает разрушение iRNA при введении системно. Способы получения и введения катионных комплексов с iRNA находятся в пределах квалификации специалиста в данной области (см., например, Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327: 761-766; Verma, UN., et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9: 12911300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205, которые включены в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте). Некоторые неограничивающие примеры систем доставки лекарственных средств, пригодных для системной доставки iRNA, включают DOTAP (Sorensen, DR., et al. (2003), выше; Verma, UN., et al. (2003), выше), олигофектамин, твердые частицы с нуклеиновой кислотой-липидом (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), кардиолипин (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), полиэтиленимин (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. электронная публикация перед печатью 16 августа; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), содержащие Arg-Gly-Asp (RGD) пептиды (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) и полиамидоамины (Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:17991804). Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA образуют комплекс с циклодекстрином для системного введения. Способы введения и фармацевтические композиции на основе iRNA и циклодекстринов можно найти в патенте США № 7427605, который включен в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте.
Кодируемые векторами iRNA
Согласно другому аспекту iRNA, нацеленная на ген ALAS1, может экспрессироваться из транскрипционных единиц, вставленных в ДНК- или РНК-векторы (см., например, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., международную публикацию согласно РСТ № WO 00/22113, Conrad, международную публикацию согласно РСТ № WO 00/22114 и Conrad, патент США № 6054299). Экспрессия может быть временной (порядка от часов до недель) или длительной (от недель до месяцев или дольше) в зависимости от конкретной применяемой конструкции и целевой ткани или типа клеток. Такие трансгены можно вводить в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может быть интегрирующим или неинтегрирующим вектором. Трансген также может быть сконструирован с возможностью наследования его в виде экстрахромосомной плазмиды (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292).
Отдельные нить или нити iRNA могут транскрибироваться с промотора вектора экспрессии. В тех случаях, когда необходимо экспрессировать две отдельные нити с получением, например, dsRNA, тогда в целевую клетку можно совместно вводить два отдельных вектора экспрессии (например, путем трансфекции или инфекции). Альтернативно, каждая отдельная нить dsRNA может транскрибироваться с участием промоторов, оба из которых расположены в одной и той же плазмиде экспрессии. Согласно одному варианту осуществления dsRNA экспрессируется в инвертированном повторе, соединенном линкерной полинуклеотидной последовательностью, таким образом, что dsRNA имеет структуру типа стебельпетля.
Вектор экспрессии с iRNA, как правило, является ДНК-плазмидой или вирусным вектором. Вектор экспрессии, совместимый с эукариотическими клетками, например, с клетками позвоночных, можно
- 60 036477 применять для получения рекомбинантных конструкций для экспрессии iRNA, как описано в данном документе. Векторы экспрессии для эукариотических клеток хорошо известны в уровне техники и доступны от ряда коммерческих источников. Как правило, такие векторы содержат удобные сайты рестрикции для вставки необходимого сегмента нуклеиновой кислоты. Доставка векторов, экспрессирующих iRNA, может быть системной, как, например, путем внутривенного или внутримышечного введения, путем введения в целевые клетки, эксплантированные от пациента, с последующим обратным введением пациенту или путем любого другого способа, который обеспечивает возможность введения в необходимую целевую клетку.
Плазмиду экспрессии iRNA можно трансфицировать в целевую клетку в виде комплекса с носителем на основе катионного липида (например, олигофектамином) или носителем на основе некатионных липидов (например, Transit-TKO™). В настоящем изобретением также рассматриваются множественные трансфекции при помощи липидов для iRNA-опосредованного нокдауна, нацеленного на различные участки целевой РНК, на протяжении недели или более. Успешное введение векторов в клетки хозяина можно контролировать при помощи разнообразных известных способов. Например, о временной трансфекции может сообщать репортер, такой как флуоресцентный маркер, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP). Стабильная трансфекция клеток ex vivo может быть подтверждена с применением маркеров, которые обеспечивают устойчивость трансфицированной клетки к определенным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), как например, устойчивость к гигромицину В.
Системы вирусных векторов, которые можно использовать для способов и композиций, описанных в данном документе, включают, без ограничения, (а) аденовирусные векторы; (b) ретровирусные векторы, в том числе без ограничения лентивирусные векторы, вирус мышиного лейкоза Молони и т.д.; (с) векторы на основе аденоассоциированного вируса; (d) векторы на основе вируса простого герпеса; (е) векторы на основе SV40; (f) векторы на основе вируса полиомы; (g) векторы на основе вируса папилломы; (h) векторы на основе пикорнавируса; (i) векторы на основе поксвируса, такого как ортопоксвирус, например, векторы на основе вируса осповакцины или авипокс, например, канарипокс или вируса оспы кур и (j) хелпер-зависимый или слабый аденовирус. Также преимущественными могут быть вирусы с нарушенной репликацией. Различные векторы будут или не будут встраиваться в геном клеток. При необходимости, конструкции могут включать вирусные последовательности для трансфекции. Альтернативно, конструкция может быть включена в векторы, способные к эписомальной репликации, например, векторы на основе EPV и EBV. В конструкциях для рекомбинантной экспрессии iRNA, как правило, будут необходимы регуляторные элементы, например, промоторы, энхансеры и т.д. для обеспечения экспрессии iRNA в целевых клетках. Другие аспекты, учитываемые в отношении векторов и конструкций, описаны далее ниже.
Векторы, пригодные для доставки iRNA, будут включать регуляторные элементы (промотор, энхансер и т.д.), достаточные для экспрессии iRNA в необходимой целевой клетке или ткани. Регуляторные элементы можно выбирать для получения либо конститутивной, либо регулируемой/индуцибельной экспрессии.
Экспрессия iRNA может быть точно регулируемой, например, путем применения индуцибельной регуляторной последовательности, которая чувствительна к определенным физиологическим регуляторам, например, уровням циркулирующей глюкозы или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8: 2024). Такие индуцибельные экспрессирующие системы, подходящие для управления экспрессией dsRNA в клетках или у млекопитающих, включают, например, регулирование при помощи экдизона, при помощи эстрогена, прогестерона, тетрациклина, химических индукторов димеризации и изопропил-Р-Э1тиогалактопиранозида (IPTG). Специалист в данной области сможет выбрать соответствующую регуляторную/промоторную последовательность, опираясь на предполагаемое использование трансгена iRNA.
Согласно конкретному варианту осуществления можно применять вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA. Например, можно применять ретровирусный вектор (см. Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Такие ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA, клонируют в один или несколько векторов, которые облегчают доставку нуклеиновой кислоты в организм пациента. Более подробное описание ретровирусных векторов можно найти, например, в Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), в котором описано применение ретровирусного вектора для доставки гена mdr1 к гемопоэтическим стволовым клеткам для придания стволовым клеткам лучшей устойчивости к химиотерапии. Другими источниками, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); и Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Лентивирусные векторы, предусматриваемые для применения, включают, например, векторы на основе HIV, описанные в патентах США №№ 6143520; 5665557 и 5981276, которые включены в данный документ при помощи ссылки.
Аденовирусы также предусматриваются для применения при доставке iRNA. Аденовирусы пред
- 61 036477 ставляют собой особенно перспективные проводники, например, для доставки генов к респираторному эпителию. Аденовирусы естественным образом инфицируют респираторный эпителий, где они вызывают заболевание с легким течением. Другими целями для основанных на аденовирусах системах доставки являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышцы. Аденовирусы обладают преимуществом в том смысле, что они способны инфицировать неделящиеся клетки. В Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) представлена обзорная статья о генной терапии на основе аденовирусов. В Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) показано применение аденовирусных векторов для переноса генов в респираторный эпителий макак-резус. Другие примеры применения аденовирусов в генной терапии можно найти в Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993); публикации согласно РСТ WO94/12649 и Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Подходящий AV вектор для экспрессии iRNA, описанной в настоящем изобретении, способ конструирования рекомбинантного AV вектора и способ доставки вектора в целевые клетки описаны в Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
Также предусмотрено применение векторов на основе адено-ассоциированного вируса (AAV) (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Sci., USA 204:289-300 (1993); патент США № 5436146). Согласно одному варианту осуществления iRNA может экспрессироваться в виде двух отдельных комплементарных однонитевых молекул РНК при помощи рекомбинантного AAV-вектора, например, либо с РНК-промоторами, U6 или H1, либо с промотором цитомегаловируса (CMV). Подходящие AAV-векторы для экспрессии dsRNA, описанной в настоящем изобретении, способы конструирования рекомбинантного AV вектора и способы доставки векторов в целевые клетки описаны в Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; патенте США № 5252479; патенте США № 5139941; международной заявке на патент № WO 94/13788 и международной заявке на патент № WO 93/24641, полное раскрытие которых включено в данный документ при помощи ссылки.
Другой типичный вирусный вектор представляет собой поксвирус, такой как вирус осповакцины, например, аттенуированный вирус осповакцины, как, например, модифицированный вирус Анкара (MVA) или NYVAC, авипокс, как, например, вирус оспы кур или канарипокс.
Тропизм вирусных векторов может быть модифицирован путем псевдотипирования векторов белками оболочки или другими поверхностными антигенами из других вирусов или путем замещения различных вирусных капсидных белков, в случае необходимости. Например, лентивирусные векторы можно подвергать псевдотипированию поверхностными белками из вируса везикулярного стоматита (VSV), вируса бешенства, вируса Эбола, вируса Мокола и т.п. AAV-векторы можно получать для нацеливания на различные клетки путем конструирования векторов так, чтобы они экспрессировали различные серотипы капсидных белков; см., например, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76: 791-801, полное раскрытие которого включено в данный документ при помощи ссылки.
Фармацевтический препарат вектора может включать вектор в приемлемом разбавителе или может включать матрицу замедленного высвобождения, в которую включено средство доставки генов. Альтернативно, в случае, когда вектор доставки целого гена может вырабатываться нативно рекомбинантными клетками, например, ретровирусные векторы, тогда фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, которые предусматривают систему доставки генов.
III. Фармацевтические композиции, содержащие iRNA
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции, содержащие iRNA, которые описаны в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая iRNA, является применимой для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией или активностью гена ALAS1 (например, нарушения, включающего порфириновый путь). Такие фармацевтические композиции составляют, исходя из способа доставки. Например, композиции могут быть составлены для системного введения посредством доставки парентеральным путем, например, путем внутривенной (IV) доставки. Согласно некоторым вариантам осуществления композицию, представленную в данном документе (например, состав LNP), составляют для внутривенной доставки. Согласно некоторым вариантам осуществления композицию, представленную в данном документе (например, композицию, содержащую конъюгат GalNAc), составляют для подкожной доставки.
Фармацевтические композици, описанные в данном документе, вводят в дозе, достаточной для ингибирования экспрессии гена ALAS1. Как правило, подходящая доза iRNA будет находиться в диапазоне от 0,01 до 200,0 миллиграмм на килограмм массы тела реципиента в сутки, как правило, в диапазоне от 1 до 50 мг на килограмм массы тела в сутки. Например, dsRNA можно вводить по 0,05, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 10, 20, 30, 40 или 50 мг/кг на разовую дозу. Фармацевтическую композицию можно вводить один раз в сутки или iRNA можно вводить в виде двух, трех или более частей дозы через определенные интервалы на протяжении дня или даже с применением непрерывной инфузии, или доставки с помощью состава с контролируемым высвобождением. В таком случае количество iRNA, содержащееся в каждой части дозы, должно быть соответственно меньше, чтобы обеспечить общую суточную дозу. Единица дозирования
- 62 036477 также может быть составлена для доставки в течение нескольких дней, например, с применением традиционного состава с замедленным высвобождением, который предусматривает замедленное высвобождение iRNA в течение периода в несколько дней. Составы с замедленным высвобождением хорошо известны из уровня техники и особенно пригодны для доставки средств в определенный участок, например, их можно применять со средствами по настоящему изобретению. Согласно такому варианту осуществления единица дозирования содержит соответствующее количество суточной дозы.
Эффект разовой дозы в отношении уровней ALAS 1 может быть длительным, так что последующие дозы вводят с интервалами не более 3, 4 или 5 дней или с интервалами не более 1, 2, 3 или 4 недель.
Специалисту в данной области будет понятно, что определенные факторы могут влиять на дозу и временные рамки, необходимые для эффективного лечения субъекта, в том числе без ограничения тяжесть заболевания или нарушения, варианты предшествующего лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие имеющиеся заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать один период лечения или серию периодов лечения. Расчеты эффективных доз и времени полужизни in vivo для отдельных iRNA, охваченных настоящим изобретением, можно проводить с применением традиционных методологий, или на основании тестирования in vivo с применением соответствующей животной модели, как описано в другой части в данном документе.
Достижения в области генетики мыши привели к созданию ряда мышиных моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические процессы, связанные с экспрессией ALAS1 (например, патологические процессы, включающие порфирины или нарушения в рамках порфиринового пути, такие как, например, порфирии). Такие модели можно применять для in vivo тестирования iRNA, а также для определения терапевтически эффективной дозы и/или эффективной схемы дозирования.
Подходящей мышиной моделью, например, является мышь, содержащая трансген, экспрессирующий ALAS1 человека. Мыши с мутациями нокин (например, мутациями, которые ассоциированы с острыми печеночными порфириями у людей) можно применять для определения терапевтически эффективной дозы и/или длительности введения siRNA ALAS1. Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, которые включают соединения iRNA, описанные в настоящем изобретении. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить различными путями в зависимости от того, необходимо ли локальное или же системное лечение, и от области, подлежащей лечению. Введение может быть местным (например, при помощи трансдермального пластыря), легочным, например, путем ингаляции или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе при помощи ингалятора; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; субдермальное, например посредством вживленного устройства; или интракраниальное, например, интрапаренхиматозное, интратекальное или интравентрикулярное введение.
iRNA можно доставлять таким образом, чтобы происходило нацеливание на конкретную ткань, такую как, ткань, которая вырабатывает эритроциты. Например, iRNA может быть доставлена в костный мозг, печень (например, гепатоциты печени), лимфатические узлы, селезенку, легкие (например, плевру легких) или позвоночник. Согласно одному варианту осуществления iRNA доставляется в костный мозг.
Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Необходимыми или желательными могут быть общепринятые фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.д. Также можно использовать презервативы с покрытием, перчатки и т.п. Подходящие составы для местного применения включают составы, в которых iRNA, описанные в настоящем изобретении, находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие средства и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоил фосфатидилэтаноламин (DOPE), димиристоил фосфатидилхолин (DMPC), дистеароил фосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристоил фосфатидилглицерин (DMPG)) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил (DOTAP) и диолеоил фосфатидилэтаноламин (DOTMA)). iRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомах или могут образовывать комплексы с ними, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, iRNA могут образовывать комплексы с липидами, в частности, с катионными липидами. Подходящие жирные кислоты и сложные эфиры включают без ограничения арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или Cl-20алкиловые сложные эфиры (например, изопропилмиристат (LPM)), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль. Составы для местного применения подробно описаны в патенте США № 6747014, который включен в данный документ при помощи ссылки.
- 63 036477
Липосомные составы
Существует много упорядоченных поверхностно-активных структур, помимо микроэмульсий, которые были исследованы и которые применяют для состава лекарственных средств. Они включают монослои, мицеллы, бислои и везикулы. Везикулы, такие как липосомы, привлекли к себе большой интерес в связи со своей специфичностью и длительностью действия, которую они обеспечивают с точки зрения доставки лекарственных средств. Используемое в настоящем изобретении выражение липосома означает везикулу, состоящую из амфифильных липидов, упорядоченных в сферический бислой или бислои.
Липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала, и водное внутреннее пространство. Водная часть содержит композицию, подлежащую доставке. Катионные липосомы обладают преимуществом в том смысле, что они способны сливаться с клеточной стенкой. Некатионные липосомы, хотя и не могут сливаться настолько эффективно с клеточной стенкой, поглощаются макрофагами in vivo.
Для того, чтобы пройти через интактную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны пройти через ряд мелких пор, каждая с диаметром менее 50 нм, под воздействием подходящего трансдермального градиента. Таким образом, желательно применять липосому с высокой способностью к деформации и способностью проходить через такие мелкие поры.
Дополнительные преимущества липосом включают: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, биосовместимы и биоразрушаемы; липосомы могут включать широкий диапазон воды и жирорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства во внутренних отделениях от метаболизма и разрушения (Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245). Важными аспектами в получении липосомных составов являются заряд поверхности липида, размер пузырька и водный объем липосом.
Липосомы являются пригодными для переноса и доставки активных ингредиентов к участку действия. Поскольку мембрана липосом структурно подобна биологическим мембранам, при нанесении липосом на ткань, липосомы начинают сливаться с клеточными мембранами и по мере продолжения слияния липосомы и клетки, содержимое липосом выбрасывается в клетку, где может действовать активное средство.
Липосомные составы были предметом обширного исследования в качестве способа доставки многих лекарственных средств. Существует все больше данных о том, что в случае местного применения липосомы проявляют некоторые преимущества по сравнению с другими составами. Такие преимущества включают сниженное побочное действие, связанное с высокой степенью системной абсорбции введенного лекарственного средства, повышенное накопление введенного лекарственного средства в необходимой цели и возможность вводить в кожу широкий спектр лекарственных средств, как гидрофильных, так и гидрофобных.
В нескольких отчетах подробна описана способность липосом доставлять в кожу средства, в том числе ДНК с высоким молекулярным весом. В кожу вводили соединения, в том числе анальгетики, антитела, гормоны и ДНК с высоким молекулярным весом. Результатом большей части было нацеливание в верхний слой эпидермиса.
Липосомы делятся на два широких класса. Катионные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосомы связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализируется в эндосому. Вследствие того, что внутри эндосомы кислый рН, липосомы разрываются, высвобождая свое содержимое в цитоплазму клетки (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 1987, 147, 980-985).
Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно-заряженными, захватывают ДНК вместо образования комплекса с ними. Поскольку как ДНК, так и липид имеют одинаковый заряд, то происходит отталкивание вместо образования комплекса. Тем не менее, некоторая часть ДНК захватывается водным внутренним пространством этих липосом. рН-чувствительные липосомы применяли для доставки ДНК, кодирующей ген тимидинкиназы, к монослоям клеток в культуре. Экспрессию экзогенного гена выявляли в целевых клетках (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Один основной тип липосомных композиций включает фосфолипиды, отличные от фосфатидилхолина природного происхождения. Композиции нейтральных липосом, например, могут быть образованы из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Композиции анионных липосом, как правило, образованы из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные фузогенные липосомы образованы главным образом из диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомных композиций образован из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, PC соевых бобов и PC яиц. Другой тип образован из смесей фосфолипида, и/или фосфатидилхолина, и/или холестерина.
В некоторые исследованиях оценивали местную доставку липосомных лекарственных составов в кожу. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морских свинок, приводило к уменьшению герпетических поражений кожи, в то время как доставка интерферона другими способами (например, в
- 64 036477 виде раствора или эмульсии) была неэффективной (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405410). Также в дополнительном исследовании тестировали эффективность интерферона, вводимого в виде части липосомного состава, по сравнению с введением интерферона с применением водной системы, и сделали заключение, что липосомный состав был более эффективным по сравнению с водным введением (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
Неионные липосомные системы также исследовали для определения их пригодности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные составы, содержащие Novasome™ I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome™ II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), применяли для доставки циклоспорина-А в слой дермы кожи мышей. Результаты показали, что такие неионные липосомные системы были эффективны в облегчении депонирования циклоспорина-А в различных слоях кожи (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Липосомы также включают пространственно стабилизированные липосомы, выражение, используемое в данном документе, относится к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к увеличению времени жизни в крови по сравнению с липосомами, у которых отсутствуют такие специализированные липиды. Примерами пространственно стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть липидной составляющей, образующей везикулу липосомы (А), содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид GM1, ИЛИ (В), полученная из одного или нескольких гидрофильных полимеров, таких как полиэтиленгликолевый (PEG) фрагмент. Без углубления в теорию, в уровне техники полагают, что по меньшей мере для пространственно стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или PEG-производные липиды, увеличенное время полужизни в кровотоке этих пространственно стабилизированных липосом является следствием сниженной степени захвата клетками ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Разнообразные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны из уровня техники. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) описали способность моносиалоганглиозида GM1, сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозитола увеличивать время полужизни липосом в крови. Эти результаты были интерпретированы Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). В патентах США № 4837028 и WO 88/04924, оба из которых принадлежат Allen et al., раскрыты липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GM1 ИЛИ сложные эфиры сульфата галактоцереброзида. В патенте США № 5543152 (Webb et al.) раскрыты липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn-димиристоилфосфaтидилхолин, раскрыты в WO 97/13499 (Lim et al.).
В уровне техники известно много липосом, содержащих липиды, полученные с помощью одного или нескольких гидрофильных полимеров, и способы их получения. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) описали липосомы, содержащие неионный детергент, 2C1215G который содержит PEG-фрагмент. Ilium et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) обнаружили, что гидрофильное покрытие полистиреновых частиц полимерными гликолями приводит к значительно увеличенному времени полужизни в крови. Синтетические фосфолипиды, модифицированные присоединением карбоновых групп полиалкиленгликолей (например, PEG), описаны Sears (патенты США №№ 4426330 и 4534899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) описали эксперименты, демонстрирующие, что липосомы, содержащие фосфатидилэтаноламин (РЕ), полученный с помощью PEG или PEG стеарата, характеризуются значительным увеличением времени полужизни в крови. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) расширили такие наблюдения в отношении других дериватизированных PEG фосфолипидов, например, DSPE-PEG, образованный в результате комбинации дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE) и PEG. Липосомы, содержащие ковалентно связанные PEG-фрагменты на своей внешней поверхности, описаны в европейском патенте № ЕР 0445131 В1 и WO 90/04384 Fisher. Липосомные композиции, содержащие 120 мольных процентов РЕ, дериватизированных PEG, и способы их получения описаны Woodle et al. (патенты США №№ 5013556 и 5356633) и Martin et al. (патент США № 5213804 и европейский патент № ЕР 0496813 В1). Липосомы, содержащие ряд других конъюгатов липид-полимер раскрыты в WO 91/05545 и патенте США № 5225212 (оба из которых принадлежат Martin et al.) и в WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Липосомы, содержащие PEG-модифицированный церамид, раскрыты в WO 96/10391 (Choi et al). В патенте США № 5540935 (Miyazaki et al) и патенте США № 5556948 (Tagawa et al.) описаны PEGсодержащие липосомы, которые могут быть дополнительно дериватизированы функциональными фрагментами на их поверхностях.
В уровне техники известен ряд липосом, содержащих нуклеиновые кислоты. В WO 96/40062 Thierry et al. раскрываты способы инкапсулирования в липосомы нуклеиновых кислот с высоким молекулярным весом. В патенте США № 5264221 Tagawa et al. раскрыты связанные с белком липосомы и заявлено, что содержимое таких липосом может включать dsRNA. В патенте США № 5665710 Rahman et al. описаны определенные способы инкапсулирования в липосомы олигодезоксинуклеотидов. В WO 97/04787 Love et
- 65 036477 al. раскрыты липосомы, содержащие dsRNA, нацеленные на ген raf.
Трансферсомы представляют собой еще один тип липосом и представляют собой липидные агрегаты с высокой способностью деформироваться, они являются перспективными кандидатами как средства доставки лекарственных средств. Трансферсомы могут быть описаны как липидные капельки, которые обладают настолько высокой способностью деформироваться, что они легко могут проникать через поры, меньшие, чем капелька. Трансферсомы являются приспосабливающимися к окружающей среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (приспосабливающимися к форме пор кожи), самовосстанавливающимися, зачастую достигают мишеней без разделения на фрагменты и часто могут быть самозагружающимися. Для получения трансфертом можно добавлять поверхностные пограничные активаторы, обычно поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомной композиции. Трансферсомы применяли для доставки сывороточного альбумина в кожу. Как было показано, опосредованная трансферсомами доставка сывороточного альбумина была такой же эффективной, как подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин.
Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в составах, таких как эмульсии (в том числе микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным способом классифицирования и ранжирования свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ, как природных, так и синтетических, является применение гидролипидного баланса (HLB). Природа гидрофильной группы (также известной как головка) предоставляет наиболее эффективное средство для распределения по категориям различных поверхностно-активных веществ, применяемых в составах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Если молекула поверхностно-активного вещества не ионизирована, то ее классифицируют как неионное поверхностно-активное вещество. Неионные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах, и их можно применять при широком диапазоне значений рН. Обычно их значения HLB находятся в диапазоне от 2 до приблизительно 18, в зависимости от их структуры. Неионные поверхностно-активные вещества включают неионные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, сложные эфиры глицерила, сложные эфиры полиглицерила, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионные алканоамиды и эфиры, как, например, этоксилаты жирного спирта, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блоксополимеры, также включены в данный класс. Полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества являются наиболее распространенными представителями класса неионных поверхностно-активных веществ.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как анионное. Анионные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, как, например, омыляющие вещества, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными представителями класса анионных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и омыляющие вещества.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как катионное. Катионные поверхностно-активные вещества включают четвертичные соли аммония и этоксилированные амины. Четвертичные соли аммония являются наиболее применяемыми представителями данного класса.
Если молекула поверхностно-активного вещества обладает способностью нести либо положительный, либо отрицательный заряд, то поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.
Было рассмотрено применение поверхностно-активных веществ в готовых лекарственных формах, составах и в эмульсиях (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Частицы нуклеиновая кислота-липид
Согласно одному варианту осуществления dsRNA ALAS1, описанная в настоящем изобретении, полностью инкапсулирована в липидный состав, например, с образованием SPLP, pSPLP, SNALP или другой частицы нуклеиновая кислота-липид. Используемое в данном документе выражение SNALP относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид, в том числе SPLP. Используемое в данном документе выражение SPLP относится к частице нуклеиновая кислота-липид, содержащей плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидной везикуле. SNALP и SPLP, как правило, содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предупреждает агрегацию частиц (например, конъюгат PEGлипид). SNALP и SPLP особенно пригодны для системных применений, поскольку они характеризуются длительным временем жизни в крови после внутривенной (i.v.) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, участках, физически отделенных от места введения). SPLP включают pSPLP, которая включает инкапсулированный комплекс конденсирующее средство-нуклеиновая кислота, который приведен в публикации согласно РСТ № WO 00/03683. Частицы согласно настоящему изобретению
- 66 036477 обычно имеют средний диаметр от приблизительно 50 до приблизительно 150 нм, чаще от приблизительно 60 до приблизительно 130 нм, чаще от приблизительно 70 до приблизительно 110 нм, наиболее часто от приблизительно 70 до приблизительно 90 нм и практически нетоксичны. Кроме того, нуклеиновые кислоты, когда присутствуют в частицах нуклеиновая кислота-липид согласно настоящему изобретению, устойчивы в водном растворе к разрушению нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и способ их получения раскрыты, например, в патентах США №№ 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432; публикации согласно РСТ № WO 96/40964.
Согласно одному варианту осуществления соотношение липида и лекарственного средства (соотношение масса/масса) (например, соотношение липида и dsRNA) будет находится в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 25:1, от приблизительно 3:1 до приблизительно 15:1, от приблизительно 4:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 5:1 до приблизительно 9:1 или от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1.
Катионный липид может представлять собой, например, хлорид КН-диолеил-КН-диметиламмония (DODAC), бромид КН-дистеарил-КН-диметиламмония (DDAB), хлорид Н-(1-(2,3-диолеоилокси)пропил)-ККН-триметиламмония (DOTAP), хлорид Н-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-Н,Н,Нтриметиламмония (DOTMA), Н,Н-диметил-2,3-диолеилокси)пропиламин (DODMA), 1,2-дилинолеилокси-Н,Н-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-Н,Н-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолеилокси3-(диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеилокси-3-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2дилинолеоил-3-диметиламинопропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилтио-3-диметиламинопропан (DLin-SDMA), 1-линолеоил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлористую соль 1,2дилинолеилокси-3-триметиламинопропана (DLin-TMA.Cl), хлористую соль 1,2-дилинолеоил-3триметиламинопропана (DLin-TAP.Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(Н-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(Н,Н-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(Н,Н-диолеиламино)-1,2-пропандиол (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-Н,Н-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 1,2-дилиноленилокси-Н,Н-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или его аналоги, (3aR,5s,6aS)-N,N-диметил-2,2-ди((9Z,12Z)-октадека-9,12диенил)тетрагидро-3аН-циклопентаЩ[1,3]диоксол-5-амин (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат(МС3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (Tech G1) или их смесь. Катионный липид может содержать от приблизительно 20 до приблизительно 50 мол.% или приблизительно 40 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Согласно другому варианту осуществления можно применять соединение 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан для получения наночастиц липид -siRNA. Синтез 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолана описан в предварительной заявке на патент США № 61/107998, поданной 23 октября 2008 г., которая включена в данный документ при помощи ссылки.
Согласно одному варианту осуществления частицы липид-siRNA включают 40% 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан; 10%DSPC; 40% холестерин; 10% PEG-C-DOMG (мольный процент) с размером частиц 63,0 ± 20 нм и соотношением siRNA/липид 0,027.
Некатионный липид может представлять собой анионный липид или нейтральный липид, в том числе без ограничения дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоил-фосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоил-фосфатидилэтаноламин-4-(Нмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароил-фосфатидил-этаноламин (DSPE), 16-О-монометилРЕ, 16-О-диметил-РЕ, 18-1-транс-РЕ, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Некатионный липид может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 90 мол. %, приблизительно 10 или приблизительно 58 мол.%, если холестерин включен, от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Конъюгированный липид, который ингибирует агрегацию частиц, может представлять собой, например, конъюгат полиэтиленгликоль (РЕО)-липид, в том числе, без ограничения, PEG-диацилглицерин (DAG), PEG-диалкилоксипропил (DAA), PEG-фосфолипид, PEG-церамид (Сег) или их смесь. Конъюгат PEG-DAA может представлять собой, например, PEG-дилаурилоксипропил (С1г), PEGдимиристоилоксипропил (Ci4), PEG-дипальмитилоксипропил (Ci6) или PEG-дистеарилоксипропил (Ci8). Конъюгированный липид, который предупреждает агрегацию частиц, может составлять от 0 до приблизительно 20 мол.% или приблизительно 2 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Согласно некоторым вариантам осуществления частицы нуклеиновая кислота-липид дополнительно включают холестерин в количестве, например, от приблизительно 10 до приблизительно 60 мол.% или приблизительно 48 мол.% от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составлена в виде липидной наночастицы
- 67 036477 (LNP).
LNP01
Согласно одному варианту осуществления липидоид ND98-4HC1 (MW 1487) (см. заявку на патент США № 12/056230, поданную 26 марта 2008 г., которая включена в данный документ при помощи ссылки), холестерин (Sigma-Aldrich) и PEG-церамид С16 (Avanti Polar Lipids) можно применять для получения наночастицы липид-dsRNA (т. е. частиц LNP01). Маточные растворы каждого в этаноле могут быть получены следующим образом: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, PEG-церамид С16, 100 мг/мл. Маточные растворы ND98, холестерина и PEG-церамида С16 можно затем объединять, например, в мольрном соотношении 42:48:10. Объединенный липидный раствор можно смешивать с водным раствором dsRNA (например, в ацетате натрия, рН 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла приблизительно 35-45%, а конечная концентрация ацетата натрия составляла приблизительно 100-300 мМ. Наночастицы липид-dsRNA обычно образуются самопроизвольно при смешивании. В зависимости от необходимого распределения частиц по размеру, полученную смесь наночастиц можно продавливать через поликарбонатную мембрану (например, с отсечением по размеру в 100 нм) с применением, например, экструдера с термоцилиндром, как, например, Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадию экструзии можно пропустить. Удаление этанола и одновременная замена буфера могут быть осуществлены, например, при помощи диализа или тангенциальной поточной фильтрации. Буфер можно заменить, например, забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) с рН приблизительно 7, например, рН приблизительно 6,9, рН приблизительно 7,0, рН приблизительно 7,1, рН приблизительно 7,2, рН приблизительно 7,3 или рН приблизительно 7,4.
н н
Изомер IND98
Формула 1
Составы LNP01 описаны, например, в публикации международной заявки № WO 2008/042973, которая включена, таким образом, при помощи ссылки.
Дополнительные иллюстративные составы с липидом-dsRNA представлены в следующей таблице.
Таблица 10. Иллюстративные липидные составы
Катионный липид | Катионный липид/некатионный липид/холестерин/конъюгат PEGлипид Соотношение липид: siRNA | |
SNALP | 1,2-дилинолс н илокси-Х ,Х- диметиламинопропан (DLinDMA) | DLinDMA/DPPC7.\onccTcpnH/PEG- cDMA (57,1/7,1/34,4/1,4) липид: siRNA -7:1 |
S-XTC | 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) | ХТС/ОРРС/холестерин/РЕО-сОМА 57,1/7,1/34,4/1,4 липид: siRNA ~ 7:1 |
LNP05 | 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) | XTC/DSPC/xonecTepnH/PEG-DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 липид: siRNA-6:1 |
LNP06 | 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) | XTC/DSPC/xonecTepHH/PEG-DMG 57,5/7,5/31,5/3,5 липид: siRNA -11:1 |
- 68 036477
LNP07 | 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) | ХТС/08РС/холестерин/РЕО-ОМО 60/7,5/31/1,5, липид: siRNA ~ 6:1 |
LNP08 | 2,2-дилинолеил-4- диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) | XTC/DSPC/xonecTepnH/PEG-DMG 60/7,5/31/1,5, липид: siRNA - 11:1 |
LNP09 | 2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС) | XTC/DSPC/xonecTepnH/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липидщПША 10:1 |
LNP10 | (3aR,5s,6aS)-N,N-,gHMeiwi-2,2ди((92,12Z)-октадека-9,12диенил)тетрагидро -ЗаНциклопента[(1] [1,3]диоксол-5-амин (ALN100) | ALN100/D SPC/xo лестерин/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липидщПША 10:1 |
LNP11 | (6Z,9Z,28Z,31 г)-гептатриаконта- 6,9,28,31-тетраен-19-ил-4- (диметиламино)бутаноат (МСЗ) | MC-3/D 8РС/холестерин/РЕС-ОМС 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA 10:1 |
LNP12 | 1,Г-(2-(4-(2-((2-(бис(2- гидроксидодецил)амино)этил)(2гидроксидодецил)амино)этил)пипера зин-1 -ил)этилазанедиил)дидодекан2-ол (С 12-200) | С12-200/D SPC/xo лестерин/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA 10:1 |
LNP13 | ХТС | XTC/DSPC/xon/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 33:1. |
LNP14 | МСЗ | MC3/DSPC/xofl/PEG-DMG 40/15/40/5 липид: siRNA: 11:1. |
LNP15 | МСЗ | MC3/DSPC/xon/PEG-DSG/GalNAc- PEG-DSG 50/10/35/4,5/0,5 липид: siRNA: 11:1. |
LNP 16 | MC3 | MC3/DSPC/xon/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 7:1. |
LNP 17 | MC3 | MC3/DSPC/xon/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA: 10:1. |
LNP 18 | MC3 | MC3/DSPC/xon/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA: 12:1. |
LNP 19 | MC3 | MC3/DSPC/xon/PEG-DMG 50/10/35/5 липид:siRNA: 8:1. |
LNP20 | MC3 | MC3/DSPC/xon/PEG-DPG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA: 10:1. |
LNP21 | Cl 2-200 | C12-200/DSPC/xon/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 липид:siRNA: 7:1. |
LNP22 | XTC | XTC/DSPC/xon/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 .™nng:siRNA: 10:1. |
DSPC: дистеароилфосфатидилхолин;
DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин;
PEG-DMG: PEG-дидимиристоилглицерин (С 14-PEG или PEG-C14) (PEG со ср. мол.весом 2000);
PEG-DSG: PEG-дистирилглицерин (C18-PEG или PEG-C18) (PEG со ср. мол.весом 2000);
PEG-cDMA: PEG-карбамоил-1,2-димиристоилоксипропиламин (PEG со ср. мол.весом 2000).
- 69 036477
Составы, содержащие SNALP (1.2-дилиноленилокси-Х.Х-диметиламинопропан (DLinDMA)), описаны в международной публикации № WO 2009/127060, поданной 15 апреля 2009 г., которая включена, таким образом, при помощи ссылки.
ХТС-содержащие составы описаны, например, в предварительной заявке США с серийным № 61/148366, поданной 29 января 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/156851, поданной 2 марта 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № , поданной 10 июня 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/228373, поданной 24 июля 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/239686, поданной 3 сентября 2009 г., и международной заявке № PCT/US 2010/022614, поданной 29 января 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.
МС3-содержащие составы описаны, например, в предварительной заявке США с серийным № 61/244834, поданной 22 сентября 2009 г., предварительной заявке США с серийным № 61/185800, поданной 10 июня 2009 г., и международной заявке № PCT/US 10/28224, поданной 10 июня 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.
ALNY-100-содержащие составы описаны, например, в международной заявке на патент с номером PCT/US09/63933, поданной 10 ноября 2009 г., которая, таким образом, включена при помощи ссылки.
С12-200-содержащие составы описаны в предварительной заявке США с серийным № 61/175770, поданной 5 мая 2009 г., и международной заявке № PCT/US 10/33777, поданной 5 мая 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.
Синтез катионных липидов
Любое из соединений, например, катионные липиды и т.п., применяемые в частицах нуклеиновая кислота-липид, описанные в настоящем изобретении, можно получить при помощи известных методик органического синтеза, включая способы, описанные более подробно в примерах. Все заместители являются такими, как определено ниже, если не указано иное.
Алкил означает углеводород с прямой цепью или разветвленный, нециклический или циклический, насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 24 атомов углерода. Типичные насыщенные алкилы с прямой цепью включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п.; тогда как насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и т.п. Типичные насыщенные циклические алкилы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.; тогда как ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил и циклогексенил и т.п.
Алкенил означает алкил, который определен выше, содержащий по меньшей мере одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы включают как цис-, так и транс-изомеры. Типичные алкенилы с прямой цепью и разветвленные алкенилы включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2бутенил и т.п.
Алкинил означает любой алкил или алкенил, которые определены выше, которые дополнительно содержат по меньшей мере одну тройную связь между соседними атомами углерода. Типичные алкинилы с прямой цепью и разветвленные алкинилы включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутинил и т.п.
Ацил означает любой алкил, алкенил или алкинил, в которых атом углерода в точке присоединения замещен оксогруппой, которая определена ниже. Например, -С(=О)алкил, -С(=О)алкенил и -С(=О)алкинил представляют собой ацильные группы.
Гетероцикл означает 5-7-членное моноциклическое или 7-10-членное бициклическое, гетероциклическое кольцо, которое является либо насыщенным, ненасыщенным, либо ароматическим, и которое содержит 1 или 2 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и где гетероатомы азота и серы необязательно могут быть окислены, и гетероатом азота необязательно может быть кватернизирован, в том числе бициклические кольца, в которых любой из вышеперечисленных гетероциклов слит с бензольным кольцом. Гетероцикл может быть присоединен через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы включают гетероарилы, которые определены ниже. Гетероциклы включают морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и т.п.
Выражения необязательно замещенный алкил, необязательно замещенный алкенил, необязательно замещенный алкинил, необязательно замещенный ацил и необязательно замещенный гетероцикл означают, что при замещении по меньшей мере один атом водорода заменяется заместителем. В случае оксозаместителя (=O) замещаются два атома водорода. В этом отношении заместители включают оксо, галоген, гетероцикл, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx и -SOnNRxRy, где n равняется 0, 1 или 2, Rx и Ry являются одинаковыми или отличаются и независимо являются водородом, алкилом или гетероциклом, и каждый из упомянутых алкильных или гетероциклических заместителей может быть дополнительно замещен одним или несколькими из оксо, галогена, -ОН, -CN, алкила, -ORx, гетероцикла, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx,
- 70 036477
-C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx и -SOnNRxRy.
Галоген означает фтор, хлор, бром и йод.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы, описанные в настоящем изобретении, могут потребовать применение защитных групп. Методика с применением защитных групп хорошо известна специалистам в данной области (см., например, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Вкратце, защитные группы в контексте настоящего изобретения представляют собой любую группу, которая снижает или устраняет нежелательную химическую активность функциональной группы. Защитную группу можно добавлять к функциональной группе для блокирования ее химической активности во время определенных реакций и затем удалять с открытием исходной функциональной группы. Согласно некоторым вариантам осуществления применяют защитную группу для спиртовой группы. Защитная группа для спиртовой группы представляет собой любую группу, которая снижает или устраняет нежелательную химическую активность спиртовой функциональной группы. Защитные группы можно добавлять и удалять при помощи методик, хорошо известных в уровне техники.
Синтез формулы А
Согласно одному варианту осуществления частицы нуклеиновая кислота-липид, описанные в настоящем изобретении, составляют с применением катионного липида формулы А:
R3 \
где R1 и R2 независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, при этом каждый необязательно может быть замещен, a R3 и R4 независимо представляют собой низший алкил, или R3 и R4 могут, взятые вместе, образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо. Согласно некоторым вариантам осуществления катионный липид представляет собой ХТС, (2,2-дилинолеил-4диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан). Как правило, липид формулы А, приведенной выше, может быть получен при помощи следующих схем реакций 1 или 2, где все заместители являются такими, как опре делено выше, если не указано иное.
Схема 1
Липид А, где R1 и R2 независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, при этом каждый необязательно может быть замещен, а R3 и R4 независимо представляют собой низший алкил или R3 и R4 могут, взятые вместе, образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо, может быть получен согласно схеме 1. Кетон 1 и бромид 2 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалисту в данной области. Реакция между 1 и 2 дает кеталь 3. Обработка кеталя 3 амином 4 дает липиды формулы А. Липиды формулы А можно превращать в соответствующую аммонийную соль при помощи органической соли формулы 5, где X представляет собой анион, противоион, выбранный из галогена, гидроксида, фосфата, сульфата или т.п.
Схема 2
Альтернативно, исходный материал в виде кетона 1 может быть получен согласно схеме 2. Реактив Гриньяра 6 и цианид 7 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалисту в данной области. Реакция между 6 и 7 дает кетон 1. Превращение кетона 1 в соответствующие ли
- 71 036477 пиды формулы А является таким, как описано на схеме 1.
Синтез МС3
Получение DLin-M-C3-DMA (т.е. (62,92,282,312)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноата) было следующим. Раствор (62,92,282,312)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19ола (0,53 г), гидрохлорида 4-Ы,Ы-диметиламиномасляной кислоты (0,51 г), 4-Ы,Ы-диметиламинопиридина (0,61 г) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (0,53 г) в дихлорметане (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, за которой следовал разбавленный водный бикарбонат натрия. Органические фракции высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и растворитель удаляли при помощи роторного вакуумного испарителя. Остаток пропускали через колонку с силикагелем (20 г) с применением градиента элюирования 1-5% метанол/дихлорметан. Фракции, содержащие очищенный продукт, объединяли и растворитель удаляли с получением бесцветного масла (0,54 г).
Синтез ALNY-100
Синтез кеталя 519 [ALNY-100] осуществляли с применением следующей схемы 3:
Синтез 515:
К перемешиваемой суспензии LiAlH4 (3,74 г, 0,09852 моль) в 200 мл безводного THF в двугорлой RBF (1л) медленно добавляли раствор 514 (10 г, 0,04926 моль) в 70 мл THF при 0°С в атмосфере азота. После завершения добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и затем нагревали до появления конденсации в течение 4 ч. Течение реакции отслеживали при помощи TLC. После завершения реакции (определяли при помощи TLC) смесь охлаждали до 0°С и гасили аккуратным добавлением насыщенного раствора Na2SO4. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре и отфильтровывали. Остаток хорошо промывали THF. Фильтрат и осадок, полученный при промывке, смешивали, и разбавляли 400 мл диоксана и 26 мл конц. HCl, и перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Летучие вещества отгоняли в вакууме с получением хлористоводородной соли 515 в виде белого твердого вещества. Выход: 7,12 г 1Н-ЯМР (DMSO, 400 МГц): δ= 9,34 (широкий, 2Н), 5,68 (s, 2Н), 3,74 (m, 1H), 2,66-2,60 (m, 2Н), 2,502,45 (m, 5Н).
Синтез 516:
К перемешиваемому раствору соединения 515 в 100 мл сухого DCM в 250 мл двухгорлой RBF добавляли NEt3 (37,2 мл, 0,2669 моль) и охлаждали до 0°С в атмосфере азота. После медленного добавления ^-(бензилоксикарбонилокси)сукцинимида (20 г, 0,08007 моль) в 50 мл сухого DCM реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры. После завершения реакции (2-3 ч., определяли при помощи TLC) смесь промывали последовательно раствором 1 н. HCl (1 х 100 мл) и насыщенным раствором NaHCO3 (1 х 50 мл). Органический слой затем высушивали над безводн. Na2SO4 и растворитель выпаривали с получением неочищенного материала, который очищали при помощи колоночной хроматографии с силикагелем с получением 516 в виде липкой массы. Выход: 11 г (89%).
1Н-ЯМР (CDC13, 400 МГц): δ = 7,36-7,27(m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2Н), 4,96 (br., 1Н) 2,74 (s, 3Н), 2,60(m, 2Н), 2,30-2,25(m, 2Н). LC-MS [М+Н] -232,3 (96,94%).
Синтез 517А и 517В:
Циклопентен 516 (5 г, 0,02164 моль) растворяли в растворе 220 мл ацетона и воды (10:1) в одногорлой 500 мл RBF и к нему добавляли №метилморфолин-№оксид (7,6 г, 0,06492 моль), за которым следовали 4,2 мл 7,6% раствора OsO4 (0,275 г, 0,00108 моль) в трет-бутаноле при комнатной температуре. После завершения реакции (~3 ч) смесь гасили при помощи добавления твердого Na2SO3 и полученную смесь перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли DCM (300 мл) и промывали водой (2х 100 мл), после чего следовал насыщенный раствор NaHCO3 (1 х 50 мл), вода (1х30 мл) и в конце соляной раствор (1х50 мл). Органическую фазу высушивали над безводн. Na2SO4 и растворитель удаляли в вакууме. В результате очистки неочищенного материала при помощи колоночной хроматографии с силикагелем получали смесь диастереоизомеров, которые разделяли при помощи преп. HPLC. Выход: - 6 г неочищенного продукта.
517А - пик-1 (белое твердое вещество), 5,13 г (96%).
1Н-ЯМР (DMSO, 400 МГц): δ=7,39-7,31 (m, 5Н), 5,04 (s, 2Н), 4,78-4,73 (m, 1H), 4,48-4,47 (d, 2Н), 3,94-3,93 (m, 2Н), 2,71 (s, 3Н), 1,72-1,67 (m, 4Н). LC-MS - [М+Н]-266,3, [M+NH4+]-283,5 присутствует, HPLC-97,86%. Стереохимию подтверждали при помощи рентгенограммы.
- 72 036477
Синтез 518:
При помощи процедуры, аналогичной описанной для синтеза соединения 505, соединение 518 (1,2 г, 41%) получали в виде бесцветного масла.
1Н-ЯМР (CDC13, 400 МГц): δ=7,35-7,33 (m, 4Н), 7,30-7,27 (m, 1H), 5,37-5,27 (m, 8Н), 5,12 (s, 2H), 4,75 (m, 1H), 4,58-4,57 (m, 2H), 2,78-2,74 (m, 7H), 2,06-2,00 (m,8H), l,96-l,91 (m, 2H), l,62 (m, 4H), 1,48 (m, 2H), 1,37-1,25 (br m, 36H), 0,87 (m, 6H). HPLC-98,65%.
Общая процедура для синтеза соединения 519:
Раствор соединения 518 (1 экв.) в гексане (15 мл) добавляли по каплям к охлажденному на льду раствору LAH в THF (1 М, 2 экв.). После завершения добавления смесь нагревали при 40°С в течение 0,5 ч, затем охлаждали снова на ледяной бане. Смесь аккуратно гидролизовали насыщенным водным Na2SO4, затем фильтровали через целит и переводили в масло. С помощью колоночной хроматографии получали чистое 519 (1,3 г, 68%), которое получали в виде бесцветного масла.
13С ЯМР = 130,2, 130,1 (х2), 127,9 (х3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (х2), 29,7, 29,6 (х2), 29,5 (х3), 29,3 (х2), 27,2 (х3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; MS с электрораспылением (+ve): Молекулярный вес для C44H80NO2 (М + Н)+ вычисл. 654,6, обнаруженный 654,6.
Составы, полученные либо при помощи стандартного способа, либо при помощи способа без экструзии, можно характеризовать одинаковым образом. Например, составы, как правило, характеризуют при помощи визуального осмотра. Это должны быть белесые прозрачные растворы, в которых нет агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение частиц по размеру липидных наночастиц можно измерять при помощи рассеяния света, с применением, например, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, С111а). Размеры частиц должны составлять приблизительно 20-300 нм, например 40-100 нм. Распределение частиц по размеру должно быть одновершинным. Общую концентрацию dsRNA в составе, а также захваченную фракцию определяют при помощи анализа на исключение красителя. Образец составленной dsRNA можно инкубировать со связывающимся с РНК красителем, например Ribogreen (Molecular Probes), в присутствии или в отсутствие разрушающего состав поверхностно-активного вещества, например, 0,5% Triton-XlOO. Общую dsRNA в составе можно определять по сигналу от образца, содержащего поверхностно-активное вещество, по отношению к калибовочной кривой. Захваченную фракцию определяют путем вычитания содержания свободной dsRNA (которое измерено по сигналу при отсутствии поверхностно-активного вещества) из общего содержания dsRNA. Процент захваченной dsRNA, как правило, составляет >85%. Для состава SNALP размер частиц составляет по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящий диапазон, как правило, составляет от приблизительно по меньшей мере 50 до приблизительно по меньшей мере 110 нм, от приблизительно по меньшей мере 60 до приблизительно по меньшей мере 100 нм или от приблизительно по меньшей мере 80 до приблизительно по меньшей мере 90 нм.
Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастица, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводной среде, капсулы, желатиновые капсулы, пакетики с порошком для приготовления раствора, таблетки или минитаблетки. Могут быть необходимы загустители, ароматизирующие вещества, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие средства или связующие вещества. Согласно некоторым вариантам осуществления пероральные составы являются такими, в которых dsRNA, описанные в настоящем изобретении, вводят в сочетании с одним или несколькими веществами, способствующими проникновению, поверхностно-активными вещества и хелаторами. Подходящие поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящие желчные кислоты/соли желчных кислот включают хенодезоксихолевую кислоту (CDCA) и урсодезоксихенодезоксихолевую кислоту (UDCA), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25дигидрофузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящие жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил 1-монокапрат, 1додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, натриевую). Согласно некоторым вариантам осуществления применяют комбинации веществ, способствующих проникновению, например, жирные кислоты/соли жирных кислот в комбинации с желчными кислотами/солями желчных кислот. Одной иллюстративной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA.
Дополнительные вещества, способствующие проникновению, включают полиоксиэтилен-9лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. dsRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть доставлены перорально, в форме гранул, в том числе распыляемых высушенных частиц, или формируют комплексы с образованием микро- или наночастиц. Комплексообразующие средства для
- 73 036477 dsRNA включают полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты; катионизированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (PEG) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; DEAE-производные полиимины, пуллуланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящие комплексообразующие средства включают хитозан, Nтриметилхитозан, поли-к-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен (PTDAE), полиаминостирол (например, р-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианакрилат), поли(изобутилцианакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAEальбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(О.Е-молочную кислоту), сополимер DL-молочной и гликолевой кислоты (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (PEG). Пероральные составы для dsRNA и их получение описаны подробно в патенте США № 6887906, публикации США № 20030027780 и патенте США № 6747014, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
Композиции и составы для парентерального, интрапаренхиматозного (в головной мозг), интратекального, интравентрикулярного или внутрипеченочного введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие соответствующие добавки, такие как, без ограничения, вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают, без ограничения, растворы, эмульсии и содержащие липосомы составы. Такие композиции могут быть получены из ряда компонентов, которые включают, без ограничения, предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.
Фармацевтические составы, описанные в настоящем изобретении, которые в целях удобства могут находиться в виде единичной лекарственной формы, можно получать согласно традиционным методикам, хорошо известным в фармацевтической промышленности. Такие методики включают стадию приведения активных ингредиентов во взаимодействие с фармацевтическим(фармацевтическими) носителем(носителями) или наполнителем(наполнителями). Как правило, составы получают путем равномерного и тщательного приведения активных ингредиентов во взаимодействие с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями или и теми, и другими, а затем, при необходимости, придания продукту формы.
Композиции, описанные в настоящем изобретении, могут быть составлены в виде любых из многих возможных лекарственных форм, как, например, без ограничения, таблеток, капсул, желатиновых капсул, жидких сиропов, пластичных гелей, суппозиториев и клизмы. Композиции также могут быть составлены в виде суспензий в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии дополнительно могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
Дополнительные составы
Эмульсии
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены и составлены в виде эмульсий. Эмульсии, как правило, являются гетерогенными системами одной жидкости, диспергированной в другой, в форме капелек, диаметр которых обычно превышает 0,1 мкм (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245; Block в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 2, p. 335; Higuchi et al. в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301).
Эмульсии часто представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешиваемые жидкие фазы, тщательно перемешанные и диспрегированные одна в другой. Как правило, эмульсии могут представлять собой либо эмульсии по типу вода в масле (w/o), либо масло в воде (o/w). В тех случаях, когда водная фаза является мелкораспыленной в общем объеме масляной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу вода в масле (w/o). Альтернативно, в тех случаях, когда масляная фаза является мелкораспыленной в общем объеме водной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу масло в воде (o/w). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты вдобавок к диспергированным фазам и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора либо в водной фазе, либо в масляной фазе, либо само по себе в качестве отдельной фазы. При необходимости в эмульсиях могут присутствовать фармацевтические наполнители, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты. Фармацевтические эмульсии также могут представлять собой множественные эмульсии, которые состоят из более чем двух фаз, как например, в случае эмульсий по типу масло-в-воде-в-масле (o/w/o) и вода-в-масле-в-воде (w/o/w). Такие
- 74 036477 сложные составы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые двухкомпонентные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых отдельные масляные капельки эмульсии o/w включают маленькие водные капельки, составляющие эмульсию w/o/w. Аналогично этому система масляных капелек, заключенная в каплях воды, стабилизированных в масляной диспергирующей фазе, обеспечивает эмульсию o/w/o.
Эмульсии характеризуются малой термодинамической устойчивостью, или она отсутствует. Часто диспергированная или дисперсная фаза эмульсии хорошо диспергирована в дисперсионной или диспергирующей фазе и поддерживается в такой форме при помощи эмульгаторов или вязкости состава. Любая фаза эмульсии может быть полутвердой или твердой, как и в случае мазевых основ, подобных эмульсии, и кремов. Другие способы стабилизации эмульсий охватывают применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы в целом могут быть разделены на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества, встречающиеся в природе эмульгаторы, абсорбционные базы и высокодисперные твердые вещества (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 199).
Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как сурфактанты, нашли широкое применение в составе эмульсий, и они рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 285; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, vol. 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Соотношение гидрофильной и гидрофобной природы поверхностно-активного вещества называют гидрофильно-липофильным балансом (HLB), и оно является ценным инструментом при распределении на категории и выборе поверхностно-активных веществ при получении составов. Поверхностно-активные вещества можно разделять на различные классы, исходя из природы гидрофильной группы: неионные, анионные, катионные и амфотерные (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 285).
Встречающиеся в природе эмульгаторы, применяемые в составах эмульсий, включают ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и гуммиарабик. Абсорбционные базы, такие как безводный ланолин и гидрофильный вазелин, обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием эмульсий w/o, с сохранением их полутвердой консистенции. Мелкоизмельченные твердые вещества также применяли в качестве подходящих эмульгаторов, в частности, в комбинации с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Они включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, неразбухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или глицерила тристеарат.
Большое разнообразие неэмульгирующих материалов также включают в составы эмульсий и они вносят вклад в свойства эмульсий. Они включают жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 335; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 199).
Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают встречающиеся в природе смолы и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, гуммиарабик, агар, альгиновую кислоту, каррагенан, гуаровую камедь, камедь карайи и трагакант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу и карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии путем образования крепких межфазных пленок вокруг капелек диспергированной фазы, а также путем повышения вязкости дисперсионной фазы.
Поскольку эмульсии зачастую содержат некоторое количество ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые легко способствуют росту микроорганизмов, то такие составы зачастую включают консерванты. Широко применяемые консерванты, включенные в составы эмульсий, включают метилпарабен, пропилпарабен, четвертичные соли аммония, бензалкония хлорид, сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также обычно добавляют к составам эмульсий для предупреждения старения состава. Применяемые антиоксиданты могут представлять собой ловушки свободных радикалов, как, например, токоферолы, алкил галлаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановители, как, например, аскорбиновая
- 75 036477 кислота и метабисульфит натрия, и синергистами антиоксидантов, как, например, лимонная кислота, винная кислота и лецитин.
Применение составов эмульсий с помощью дерматологического, перорального и парентерального путей и способы их получения рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 199). Составы эмульсий для пероральной доставки являются очень распространенными для применения в связи с удобством составления, а также с точки зрения эффективности при всасывании и биодоступности (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Слабительные средства на основе минеральных масел, жирорастворимые витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира являются одними из материалов, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий o/w.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения композиции iRNA и нуклеиновые кислоты составлены в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система воды, масла и амфифильного вещества, которая является отдельным оптически изотропным и термодинамически устойчивым жидким раствором (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel hC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245). Обычно микроэмульсии представляют собой системы, которые получают путем сперва диспергирования масла в водном растворе поверхностно-активного вещества, а затем добавления достаточного количества четвертого компонента, как правило, спирта со средней длиной цепи с получением прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии также были описаны как термодинамически устойчивые, изотропически чистые дисперсии двух несмешиваемых жидкостей, которые стабилизируются межфазными пленками поверхностно-активных молекул (Leung и Shah, в Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Микроэмульсии обычно получают путем объединения от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. То, является ли микроэмульсия эмульсией по типу вода в масле (w/o) или по типу масло в воде (o/w), зависит от свойств применяемого масла и поверхностно-активного вещества, а также от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов молекул поверхностно-активного вещества (Schott, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
Активно изучался феноменологический подход с использованием фазовых диаграмм, и с его помощью специалистами в данной области были получены обширные данные о том, как составлять микроэмульсии (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 335). По сравнению с традиционными эмульсиями микроэмульсии предлагают преимущество стабилизации водонерастворимых лекарственных средств в составе термодинамически устойчивых капелек, которые образуются самопроизвольно.
Поверхностно-активные вещества, применяемые для получения микроэмульсий, включают без ограничения ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, Brij 96, полиоксиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры жирных кислот и полиглицерина, тетраглицерина монолаурат (ML310), тетраглицерина моноолеат (МО310), гексаглицерина моноолеат (РО310), гексаглицерина пентаолеат (РО500), декаглицерина монокапрат (МСА750), декаглицерина моноолеат (МО750), декаглицерина секвиолеат (SO750), декаглицерина декаолеат (DAO750) отдельно или в комбинации со вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, обычно являющееся спиртом с короткой цепью, таким как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для увеличения межфазной текучести путем проникновения в пленку из поверхностно-активного вещества и соответственно создания неупорядоченной пленки из-за пустого пространства, образующегося среди молекул поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены без применения вторичных поверхностно-активных веществ, и в уровне техники известны самоэмульгирующиеся системы микроэмульсий без спирта. Водной фазой, как правило, может быть вода, водный раствор лекарственного средства, глицерин, PEG300, PEG400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может включать без ограничения материалы, такие как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, среднецепочечные (С8-С12) моно-, ди- и триглицериды, полиоксиэтилированные сложные эфиры жирных кислот и глицерина, жирные спирты, полигликолизированные
- 76 036477 глицериды, насыщенные полигликолизированные С8-С10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло.
Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения растворимости лекарственного средства и повышенной абсорбции лекарственных средств. Липидные микроэмульсии (как o/w, так и w/o) были предложены для увеличения пероральной биодоступности лекарственных средств, включая пептиды (см., например, патент США №№ 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Микроэмульсии обеспечивают преимущества в виде улучшенной растворимости лекарственного средства, защиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного повышенной абсорбции лекарственного средства за счет индуцированных поверхностно-активным веществом изменений текучести мембран и проницаемости, удобства получения, удобства перорального введения по сравнению с твердой лекарственной формой, улучшенной клинической действенности и пониженной токсичности (см., например, патент США №№ 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться самопроизвольно, когда их компоненты объединяют при температуре окружающей среды. Это может быть в особенности преимущественным, когда составляют термолабильные лекарственные средства, пептиды или iRNA. Микроэмульсии также были эффективными при трансдермальной доставке активных компонентов как при косметических, так и при фармацевтических применениях. Предполагается, что композиции и составы микроэмульсий согласно настоящему изобретению будут способствовать повышенной системной абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также улучшать локальный клеточный захват iRNA и нуклеиновых кислот.
Микроэмульсии согласно настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как сорбитанмоностеарат (Grill 3), Labrasol и вещества, способствующие проникновению, для улучшения свойств состава и для повышения абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Вещества, способствующие проникновению, применяемые в микроэмульсиях согласно настоящему изобретению, могут быть классифицированы, как принадлежащие к одной из пяти основных категорий: поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатирующие поверхностно-неактивные вещества (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов рассматривался выше.
Вещества, способствующие проникновению
Согласно одному варианту осуществления в настоящем изобретении используют разнообразные вещества, способствующие проникновению, для воздействия на эффективную доставку нуклеиновых кислот, в частности iRNA, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствуют в растворе как в ионизированной, так и в неионизированной формах. Однако, как правило, только жирорастворимые или липофильные лекарственные средства легко проходят через клеточные мембраны. Было установлено, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проходить через клеточные мембраны, если мембрана, через которую необходимо пройти, обработана веществом, способствующим проникновению. Вдобавок к обеспечению диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны вещества, способствующие проникновению, также повышают проницаемость для липофильных лекарственных средств.
Вещества, способствующие проникновению, можно классифицировать как принадлежащие к одной из пяти основных категорий, т. е. поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатриующие поверхностно-неактивные вещества (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из вышеуказанных классов веществ, способствующих проникновению, описан ниже более подробно.
Поверхностно-активные вещества:
В связи с настоящим изобретением поверхностно-активные вещества (или сурфактанты) являются химическими структурными единицами, которые при растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, в результате чего абсорбция iRNA через слизистую повышается. Помимо солей желчных кислот и жирных кислот, эти вещества, способствующие проникновению, включают, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92) и перфторированные эмульсии, такие как FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Жирные кислоты:
Разнообразные жирные кислоты и их производные, которые действуют как вещества, способствующие проникновению, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рацглицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерин-1-монокапрат, 1- 77 036477 додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их С1-20алкиловые сложные эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и их моно- и диглицериды (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т. д.) (см., например, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Соли желчных кислот: Физиологическая роль желчи включает содействие в распределении и всасывании липидов и жирорастворимых витаминов (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 в Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934935). Разные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как вещества, способствующие проникновению. Таким образом, выражение соли желчных кислот включают любые встречающиеся в природе компоненты желчи, а также любое из их синтетических производных. Подходящие соли желчных кислот включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюхолевую кислоту (глюхолат натрия), глихолевую кислоту (глихолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидро-фузидат (STDHF) натрия, гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (РОЕ) (см., например, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Хелатирующие средства:
Хелатирующие средства, используемые применительно к настоящему изобретению, можно определить как соединения, которые удаляют ионы металла из раствора путем образования комплексов с ними, в результате чего абсорбция iRNA через слизистую повышается. В отношении их применения в качестве веществ, способствующих проникновению, в настоящем изобретении хелатирующие средства обладают дополнительным преимуществом, также выступая в качестве ингибиторов ДНКазы, поскольку большинство охарактеризованных ДНК-нуклеаз требуют двухвалентный ион металла для катализа и, таким образом, ингибируются хелатирующими средствами (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатирующие средства включают, без ограничения, двунатриевый этилендиаминтетраацетат (EDTA), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомовалинат), Nацилпроизводные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацилпроизводные Р-дикетонов (енамины)(см., например, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Нехелатирующие поверхностно-неактивные вещества: Используемые в данном документе нехелатирующие поверхностно-неактивные соединения, способствующие проникновению, могут быть определены как соединения, которые проявляют небольшую активность как хелатирующие средства или как поверхностно-активные вещества, но которые тем не менее повышают абсорбцию iRNA через слизистую пищеварительного тракта (см., например, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Этот класс веществ, способствующих проникновению, включает, например, ненасыщенные цикломочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазацикло-алканона (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92) и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак натрия, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
Средства, которые усиливают захват iRNA на клеточном уровне, также можно добавлять к фармацевтическим и другим композициям согласно настоящему изобретению. Например, катионные липиды, такие как липофектин (Junichi et al, патент США № 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo et al., заявка согласно РСТ WO 97/30731), также, как известно, усиливают клеточный захват dsRNA. Примеры коммерчески доступных реагентов для трансфекции включают среди прочего, например, Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), 293fectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Cellfectin™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), DMRIE-C™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), RNAiMAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Oligofectamine™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Optifect™ (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), реагент
- 78 036477 для трансфекции X-tremeGENE Q2 (Roche; Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOTAP (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOSPER (Грензахерштрассе, Швейцария) или Fugene (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент Transfectam® (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент для трансфекции TransFast™ (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-20 (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx™-50 (Promega; Мэдисон, Висконсин), DreamFect™ (OZ Biosciences; Марсель, Франция), EcoTransfect (OZ Biosciences; Марсель, Франция), реагент для трансфекции TransPassa D1 (New England Biolabs; Ипсвич, Массачусетс, США), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции PerFectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции NeuroPORTER (Genlantis; СанДиего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER 2 (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции Cytofectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции BaculoPORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции TroganPORTER™ (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), RiboFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), PlasFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), UniFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США), SureFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США) или HiFect™ (B-Bridge International, Маунтин-Вью, Калифорния, США)
Для усиления проникновения введенных нуклеиновых кислот можно использовать другие средства, в том числе гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.
Носители
Определенные композиции согласно настоящему изобретению также содержат в составе соединения-носители. Используемые в данном документе выражения соединение-носитель или носитель могут означать нуклеиновую кислоту или ее аналог, которые являются инертными (т.е. не обладают биологической активностью per se), но распознаются в качестве нуклеиновой кислоты in vivo процессами, которые снижают биодоступность нуклеиновой кислоты с биологической активностью, например, путем разрушения биологически активной нуклеиновой кислоты или путем содействия ее удалению из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего вещества, может привести к существенному сокращению количества нуклеиновой кислоты, перерабатываемой печенью, почками или другими внесосудистыми депо, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, переработка частично фосфотиоатной dsRNA печеночной тканью может быть снижена при ее совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо4'изотиоциано-стильбен-2,2'-дисульфокислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
Наполнители
В отличие от соединения-носителя фармацевтический носитель или наполнитель представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующее средство или любую другую фармакологически инертную среду для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Наполнитель может быть жидким или твердым веществом и его выбирают с учетом предполагаемого способа введения с тем, чтобы обеспечить необходимый объем, консистенцию и т.д., при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают без ограничения связывающие средства (например, прежелатинизированный маисовый крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или вторичный кислый фосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, кремнезем, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металла, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.д.); разрыхлители (например, крахмал, натрия крахмалгликолат и т.д.); и смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия и т.д).
Фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, которые не реагируют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами, также можно применять для составления композиций согласно настоящему изобретению. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т. п.
Составы для местного применения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в обычных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Растворы также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Можно применять фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, кото- 79 036477 рые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами.
Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители включают, без ограничения, воду, солевые растворы, спирт, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.
Другие компоненты
Композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно встречающиеся в фармацевтических композициях, при применении в уровнях, установленных в уровне техники. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные материалы, пригодные для физического составления композиций согласно настоящему изобретению в различных лекарственных формах, такие как красители, ароматизирующие средства, консерванты, антиоксиданты, замутнители, загустители и стабилизаторы. Однако, такие материалы при добавлении не должны чрезмерно вступать в конфликт с биологическими активностями компонентов композиций согласно настоящему изобретению. Составы могут быть стерильными и при необходимости их можно смешивать со вспомогательными средствами, например смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, эмульгаторами, солями для оказания влияния на осмотическое давление, буферами, красящими веществами, ароматизаторами и/или отдушками и т.п., которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновой(нуклеиновыми) кислотой(кислотами) состава.
Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, включают (а) одно или несколько соединений, представляющих собой iRNA, и (b) одно или несколько биологических средств, которые действуют по механизму, отличному от RNAi. Примеры таких биологических средств включают средства, препятствующие взаимодействию ALAS1 и по меньшей мере одного связывающего партнера ALAS1.
Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз между токсичным и терапевтическим действием представляет собой терапевтический индекс, и его можно выражать как соотношение LD50/ED50. Типичными являются соединения, которые характеризуются высоким терапевтическим индексом.
Данные, полученные при анализах клеточных культур и исследованиях на животных, можно применять при составлении ряда доз для применения у людей. Доза композиций, описанных в настоящем изобретении, как правило, находится в диапазоне концентраций в крови, который включают ED50 с малой токсичностью или юез токсичности. Доза может варьировать в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, применяемого в способах, описанных в настоящем изобретении, терапевтически эффективную дозу можно первоначально установить по результатам анализов на клеточной культуре. Доза может быть составлена для животных моделей для получения диапазона концентрации в плазме соединения или, при необходимости, полипептидного продукта целевой последовательности (например, достижения уменьшенной концентрации полипептида), что включает IC50 (т.е. концентрацию исследуемого соединения, при помощи которой достигают полумаксимальное ингибирование симптомов), при определении на клеточной культуре. Такую информацию можно применять для более точного определения пригодной дозы у людей. Уровни в плазме можно определять, например, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В дополнение к их введению, рассматриваемому выше, iRNA, описанные в настоящем изобретении, можно вводить в комбинации с другими известными средствами, эффективными в лечении заболеваний или нарушений, связанных с экспрессией ALAS1. В любом случае, курирующий врач может корректировать количество и временные рамки введения iRNA, исходя из результатов, наблюдаемых при применении стандартных средств измерения эффективности, известных в данной области или описанных в данном документе.
Способы лечения заболеваний, связанных с экспрессией гена ALAS1
Настоящее изобретение относится, в частности, к применению iRNA, нацеленная на ALAS1, для ингибирования экспрессии ALAS1 и/или лечения заболевания, нарушения или патологического процесса, который связан с экспрессией ALAS1.
Используемое в данном документе выражение нарушение, связанное с экспрессией ALAS1, заболевание, связанное с экспрессией ALAS1, патологический процесс, связанный с экспрессией ALAS1 или т. п. включает состояние, нарушение или заболевание, в котором экспрессия ALAS1 изменена (например, повышена), уровень одного или нескольких порфиринов изменен (например, повышен),
- 80 036477 уровень или активность одного или нескольких ферментов в пути биосинтеза гема (порфириновом пути) изменен, или другие механизмы, которые ведут к патологическим изменениям в пути биосинтезе гема. Например, iRNA, нацеленную на ген ALAS1 или ее комбинацию, можно применять для лечения состояний, в которых уровни порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) повышены (например, определенные порфирии), или состояний, в которых имеются нарушения ферментов пути биосинтеза гема (например, определенные порфирии). Нарушения, связанные с экспрессией ALAS1, включают, например, Х-сцепленную сидеробластическую анемию (XLSA), порфирию, обусловленную недостаточностью ALA (порфирию Досса), острую перемежающуюся порфирию (AIP), врожденную эритропоэтическую порфирию, позднюю кожную порфирию, наследственную копропорфирию (копропорфирию), вариегатную порфирию, эритропоэтическую протопорфирию (ЕРР) и транзиторную эритропорфирию детского возраста.
Используемое в данном документе выражение субъект, подлежащий лечению согласно способам, описанным в данном документе, включает человека или отличное от человека животное, например, млекопитающее. Млекопитающим может быть, например, грызун (например, крыса или мышь) или примат (например, обезьяна). Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является человек.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает нарушением, связанным с экспрессией ALAS1 (например, с диагностированной порфирией или испытывал один или несколько симптомов порфирии и является носителем мутации, связанной с порфирией) или подвержен риску развития нарушения, связанного с экспрессией ALAS1 (например, субъект с семейной историей порфирии или субъект, который является носителем генетической мутации, связанной с порфирией).
Классификации порфирии, в том числе острых печеночных порфирии, описаны, например, в Balwani, M. & Desnick, R.J., Blood, 120(23), опубликованном online в виде Blood First Edition paper, 12, 102; DOI 10.1182/blood-2012-05-423186. Как описано в Balwain & Desnick, острая перемежающаяся порфирия (AIP), наследственная копропорфирия (НСР), вариегатная порфирия (VP) являются аутосомнодоминантными порфириями, а порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP), является аутосомно-рецессивной. В редких случаях AIP, НСР и VP возникают как гомозиготные доминантные формы. Кроме того, существует редкая гомозиготная рецессивная форма поздней кожной порфирии (РСТ), которая является единственной печеночно-кожной порфирией и также известной как гепатоэритропоэтическая порфирия. Клинические и лабораторные характеристики этих порфирии описаны ниже в табл. 11.
Таблица 11. Печеночные порфирии человека: клинические и лабораторные характеристики
Порфирия | Фермент с недостаточн остью | Наследова ние | Основные симптомы, NV или СР | Активно сть фермент а, % нормы | Повышенное содержание предшественников порфиринов и/или порфиринов* Эритроциты Моча Кал | ||
Острые печеночные порфирии | |||||||
ADP | ALAдегидратаза | AR | NV | -5 | Zn-протопорфирин | ALA, копропорфири нП! | - |
AIP | нмв- синтаза | AD | NV | -50 | - | ALA, PBG, уропорфирин | - |
НСР | COPROоксидаза | AD | NV и СР | -50 | - | ALA, PBG, копропорфири н III | копропор фирин III |
VP | PROTO- оксидаза | AD | NV и СР | -50 | - | ALA, PBG, копропорфири нШ | копропор фирин III, протопор фирин |
Печеночно-кожные порфирии | |||||||
РСТ | UROдекарбоксил аза | Спорадиче екая или AD | СР | <20 | уропорфирин , порфирин7карбоксилат | уропорфи рин, порфирин -7карбокси лат |
AR означает аутосомно-рецессивный;
AD - аутосомно-доминантный;
NV - нейровисцеральный;
СР - кожная фоточувствительность и не применимо.
^Повышения, которые могут быть важны для диагноза.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например AIP, HCP, VP, ADP или гематоэритропоэтической порфирии.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, острую печеночную порфирию выбирают из острой перемежающейся порфирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP) и порфирии, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP).
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию, например, по меньшей мере две формы порфирии. Согласно некоторым вариантам осуществления двойная порфирия представляет две или более форм порфирии, выбранных из острой перемежающейся пор- 81 036477 фирии (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирии (VP) и порфирии, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP).
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой гомозиготную доминатную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную AIP, НСР или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP, НСР, VP или гепатоэритропоэтическую порфирию или их комбинацию (например, двойную порфирию). Согласно некоторым вариантам осуществления AIP, НСР или VP является либо гетерозиготной доминантной либо гомозиготной доминантной.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет порфирию или имеет риск развития порфирии, например, ADP, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA и/или копропорфирина III. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например ADP, и характеризуется повышенным уровнем Znпротопорфирина в эритроцитах.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например, AIP, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA, PBG и/или уропорфирина.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет порфирию или имеет риск развития порфирии, например, НСР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA, PBG и/или копропорфирина III. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например НСР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в кале) копропорфирина III.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например VP, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA, PBG и/или копропорфирина III.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например НСР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в кале) копропорфирина III и/или протопорфирина.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например, РСТ (например, гепатоэритропоэтической порфирии), и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) уропорфирина и/или порфирин-7-карбоксилата. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например РСТ (например, гепатоэритропоэтической порфирии), и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в кале) уропорфирина и/или порфирин-7-карбоксилата.
Мутация, связанная с порфирией, включает любую мутацию в гене, кодирующем фермент в пути биосинтеза порфирина (порфириновый путь), или гена, который изменяет экспрессию гена в пути биосинтеза гема. Согласно многим вариантам осуществления субъект несет одну или несколько мутаций в ферменте порфиринового пути (например, мутацию в ALA-дегидратазе или PBG-дезаминазе). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает острой порфирией (например, AIP, порфирией, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы).
В некоторых случаях пациенты с острой печеночной порфирией (например, AIP) или пациенты, которые несут мутации, ассоциированные с острой печеночной порфирией (например, AIP), но у которых не наблюдаются симптомы, имеют повышенные уровни ALA и/или PBG по сравнению со здоровыми индивидами. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. В таких случаях уровень ALA и/или PBG может быть повышен даже в том случае, если пациента не страдает от приступа или никогда не страдал. В некоторых таких случаях у пациента, в остальном, полностью не наблюдаются симптомы. В некоторых таких случаях пациент испытывает болевые ощущения, например, нейропатическую боль, которая может представлять собой хроническую боль (например, хроническую нейропатическую боль). В некоторых случаях пациент страдает от нейропатии. В некоторых случаях пациент страдает от прогрессирующей нейропатии.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, который подлежит лечению согласно способам, описанным в данном документе, имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Уровни порфирина или предшественника порфирина могут быть оценены при помощи способов, известных из уровня техники, или способов, описанных в данном документе. Например, способы оценки уровней ALA и PBG в моче и плазме, а также уровней порфиринов в моче и плазме, раскрыты в Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; и Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007; полное содержание которых тем самым включено в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой животную модель порфирии, например мышиную модель порфирии (например, мутантную мышь, описанную в Lindberg et al. Nature Genetics, 12: 195-199, 1996). Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является человек, например человек, который страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, как описано в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления субъекта не страдает от
- 82 036477 острого приступа порфирии. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект никогда не страдал от приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления пациент испытывает хроническую боль. Согласно некоторым вариантам осуществления пациент страдает от повреждения нервов. Согласно вариантам осуществления у субъекта наблюдаются изменения EMG и/или изменения в скорости проводимости нерва. Согласно некоторым вариантам осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект подвержен риску развития порфирии (например, имеет мутацию гена, ассоциированную с порфирией), но у него не наблюдаются симптомы. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект ранее страдал от острого приступа, но у него не наблюдаются симптомы во время лечения.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект подвержен риску развития порфирии и получает профилактическое лечение для предупреждения развития порфирии. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления профилактическое лечение начинается в период полового созревания. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение снижает уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение предупреждает развитие повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение предупреждает развитие симптома, ассоциированного с порфирией, например болевого ощущения или повреждения нервов, или снижает частоту или тяжесть симптомов.
Согласно некоторым вариантам осуществления уровень порфирина или предшественника порфирина, например ALA или PBG, повышен, например, в образце плазмы или мочи от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе абсолютного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе относительного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления относительный уровень представлен относительно уровня другого белка или соединения, например, уровня креатинина, в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец мочи. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец плазмы. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом является образец кала.
Повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, может быть установлен, например, путем демонстрации того, что субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG (например, уровень ALA и/или PBG в плазме или моче), который выше нормального значения или выше или равен нормальному значению. Врач с опытом лечения порфирий сможет определить, является ли уровень порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) повышенным, например, с целью диагностирования порфирий или для определения того, подвержен ли субъект риску развития порфирий, например, субъект может иметь предрасположенность к острому приступу или к патологии, ассоциированной с порфирией, такой как, например, хроническая боль (например, нейропатическая боль) и нейропатия (например, прогрессирующая нейропатия).
Используемое в данном документе выражение нормальное значение относится к значению, полученному от субъекта, когда субъект не находится в состоянии заболевания, или значению, полученному от субъекта с нормальными показателями или здорового субъекта, или значению, полученному от эталонной выборки или популяции, например, группы субъектов с нормальными показателями или здоровых субъектов (например, группы субъектов, которые не несут мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или группы субъектов, которые не испытывают симптомов, ассоциированных с порфирией).
Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень до болезни у одного и того же индивида. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень в эталонной выборке или популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет среднее или медианное значение в эталонной выборке или популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, равное двум стандартным отклонениям выше среднего в эталонной выборке или популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, которое равно 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5 стандартным отклонениям выше среднего в эталонной выборке или популяции.
Согласно некоторым вариантам осуществления, где субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, субъект имеет уровень ALA и/или PBG, который по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% выше нормального значения. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, который по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз выше нормаль
- 83 036477 ного значения.
Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение соответствует верхнему пределу нормального диапазона значений. Используемый в данном документе верхний предел нормального диапазона значений относится к уровню, который представляет собой верхний предел 95% доверительного интервала для эталонной выборки или популяции, например, группы индивидов с нормальными показателями (например, дикого типа) или здоровых индивидов, например, индивидов, которые не несут генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или индивидов, которые не страдают порфирией. Соответственно, нижний предел нормального диапазона значений относится к уровню, который представляет собой нижний предел того же 95% доверительного интервала.
Согласно некоторым вариантам осуществления, где субъект имеет повышенный уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче, порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, этот уровень выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5-кратному уровню относительно нормального значения, например, верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в моче, который составляет выше 4-кратного уровня относительно верхнего предела нормального диапазона значений.
Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, представленное в Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006 или Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, представленное в табл. 1 Sardh et al.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина. Согласно определенным вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,10, 0,12, 0,24, 0,36, 0,48 или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в моче составляет 1,2 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 1,0, 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0.10, 0,12, 0,24, 0,36, 0,48 или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень ALA в моче, который выше, или выше или равен 2,5 ммоль/моль креатинина, 3,1 ммоль/моль креатинина, 6,2 ммоль/моль креатинина, 9,3 ммоль/моль креатинина, 12,4 ммоль/моль креатинина или 15,5 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для порфирина в плазме составляет 10 нмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень порфирина в плазме, который выше, или выше или равен 10 нмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень порфирина в плазме, который выше, или выше или равен 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нмоль/л. Субъектом является человек, и субъект имеет уровень порфирина в плазме, который выше, или выше или равен 40 нмоль/л. Согласно вариантам осуществления нормальное значение для порфирина в моче составляет 25 мкмоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и субъект имеет уровень порфирина в моче, который выше, или выше или равен 25 мкмоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень порфирина в моче, который выше или равен 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80 мкмоль/моль креатинина.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень, например уровень в плазме или уровень в моче, порфирина или предшественника порфирина, например ALA или PBG, который выше чем уровень 99% индивидов в выборке здоровых индивидов.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче, ALA или PBG, который выше на два стандартных отклонения среднего уровня в выборке здоровых индивидов.
- 84 036477
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень ALA в моче, который составляет 1,6 или более кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями (например, субъекта, который не несет мутацию, ассоциированную с порфирией). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень ALA в плазме, который составляет 2- или 3кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень PBG в моче, который составляет четыре или более кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень PBG в плазме, который составляет четыре или более кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для получения заранее определенного снижения повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение по меньшей мере на 10, 20, 30, 40 или 50%. Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое эффективно для предупреждения или облегчения симптомов, например, болевых ощущений или рецидивирующих приступов.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое составляет по меньшей мере 1,2,3 или более стандартных отклонений, где стандартное отклонение определяют на основе значений из эталонной выборки, например, эталонной выборки, описанной в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое доводит уровень порфирина или предшественника порфирина до уровня, который меньше нормального значения, или до уровня, который меньше или равен нормальному значению (например, нормальному значению, описанному в данном документе).
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, который подлежит лечению согласно описанным способам, испытывает болевые ощущения, например, хроническую боль. Согласно некоторым вариантам осуществления страдает порфирией или подвержен риску развития порфирии, например, острой печеночной порфирии, например, AIP. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для лечения болевых ощущений, например, путем уменьшения тяжести болевых ощущений или излечения болевых ощущений. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения или предупреждения повреждения нервов.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, который подлежит лечению согласно способам, описанным в данном документе, (а) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и (b) испытывает болевые ощущения, например, хроническую боль. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения повышенного уровня ALA и/или PBG, и/или для лечения болевых ощущений, например, путем уменьшения тяжести болевых ощущений или излечения болевых ощущений.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является животное, которое служит в качестве модели нарушения, связанного с экспрессией ALAS 1.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является животное, которое служит в качестве модели порфирии (например, генетически модифицированное животное с одним или несколькими мутациями). Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP, и субъектом является животная модель AIP. Согласно одному такому варианту осуществления субъектом является генетически модифицированная мышь, которая характеризуется недостаточностью порфобилиногендезаминазы, например, такая как мышь, описанная в Lindberg et al., Nature Genetics, 12:195-199, 1996, или гомозиготная мышь R167Q, описанная в Yasuda, M., Yu, С. Zhang, J., Clavero, S., Edelmann, W., Gan, L., Phillips, J.D., & Desnick, R.J. Acute intermittent porphyria: A severely affected knock-in mouse that mimics the human homozygous dominant phenotype. (резюме презентации, представленной 14 октября 2011 г. в Американском обществе генетики человека; № 1308F в программе; доступно он-лайн с 4 апреля 2012 года на ichg201 l.org/cgi-bin/showdetail.pl?absno=21167); оба из этих источников тем самым включены в данный документ во всей своей полноте. Были получены несколько моделей с нокином для обеспечения мутаций, вызывающих гомозиготную доминантную ALP у человека. Используемые мутации включают, например, R167Q, R173Q и R173W в PBG-дезаминазе. Жизнеспособные гомозиготы включали R167Q/R176Q и R167Q/R173Q, обе которые проявляют постоянно повышенные уровни ALA и PBG, аналогичные фенотипу при гомозиготной доминантной ALP человека; согласно некоторым вариантам осуществления субъект является такой жизнеспособной мышиной моделью гомозиготной AIP.
Согласно одному варианту осуществления субъект, который подлежит лечению согласно методам, описанным в данном документе (например, субъект-человек или пациент-человек), подвержен риску развития нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, или у него диагностировано нарушение, связанное с экспрессией ALAS1, например, порфирия. Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является субъект, который испытывал один или несколько острых приступов с одним или несколькими симптомами порфирии. Согласно другим вариантам осуществления субъектом является субъект,
- 85 036477 который хронически испытывал один или несколько симптомов порфирии (например, болевые ощущения, например, нейропатическую боль, и/или нейропатию, например, прогрессирующую нейропатию). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение (например, мутацию), описанное в данном документе, но, в остальном, у него не наблюдаются симптомы. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект ранее подвергался лечению препаратом на основе гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином), описанным в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект (например, субъект с порфирией, такой как, например, AIP), который подлежит лечению согласно способам, описанным в данном документе, недавно испытывал или в настоящее время испытывает продром. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъекту вводят комбинированное лечение, например, iRNA, описанную в данном документе, и один или несколько дополнительных лекарственных препаратов, которые, как известно, являются эффективными против порфирии (например, глюкоза и/или препарат на основе гема, такой как гемин, описанный в данном документе) или ассоциированных с ней симптомов.
Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанную в данном документе, вводят в комбинации с глюкозой или декстрозой. Например, может предусматриваться внутривенное введение 10-20% декстрозы в физиологическом растворе. Как правило, если вводится глюкоза, по меньшей мере 300 г 10% глюкозы вводят внутривенно ежедневно. iRNA (например, iRNA в составе LNP) можно также вводить внутривенно, как часть той же инфузии, которую используют для введения глюкозы или декстрозы, или в виде отдельной инфузии, которую вводят до, одновременно или после введения глюкозы или декстрозы. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят при помощи другого пути введения (например, подкожно). Согласно еще одному варианту осуществления iRNA вводят в комбинации с полным парентеральным питанием. iRNA можно вводить до, одновременно или после введения полного парентерального питания.
Согласно одному варианту осуществления iRNA вводят в комбинации с препаратом на основе гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином). Согласно дополнительному варианту осуществления iRNA вводят в комбинации с препаратом на основе гема и глюкозой, препаратом на основе гема и декстрозой или препаратом на основе гема и полным парентеральным питанием.
Используемое в данном документе выражение продром предусматривает любой симптом, который отдельный субъект испытывал заранее, непосредственно перед развитием острого приступа. Типичные симптомы продрома включают, например, боль в животе, тошноту, головные боли, психологические симптомы (например, тревожность), возбужденное состояние и/или бессонницу. Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект испытывает болевые ощущения (например, боль в животе и/или головную боль). Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект испытывает тошноту. Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект испытывает психологические симптомы (например, тревожность). Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект становится возбужденным и /или страдает от бессонницы.
Острый приступ порфирии включает проявление одного или нескольких симптомов порфирии, как правило, у пациента, который имеет мутацию, ассоциированную с порфирией (например, мутацию в гене, который кодирует фермент в порфириновом пути).
Согласно определенным вариантам осуществления введение iRNA ALAS1 приводит к снижению уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов, описанных в данном документе (например, ALA и/или PBG). Снижение может измерять относительно соответствующего контрольного или нормального значения. Например, снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов можно установить у отдельного субъекта, например, как снижение по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50% или более по сравнению с уровнем, который наблюдался до лечения (например, непосредственно перед лечением). Снижение уровня предшественника порфирина, порфирина или метаболита порфирина можно измерять при помощи любого способа, известного из уровня техники. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценивать при помощи теста Уотсона-Шварца, ионообменной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии. См., например, Thunell (1993).
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG у субъекта. Уровень ALA или PBG у субъекта можно оценивать, например, на основе абсолютного уровня ALA или PBG, или на основе относительного уровня ALA или PBG (например, относительно уровня другого белка или соединения, например, уровня креатинина) в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец мочи. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец плазмы.
Согласно определенным вариантам осуществления iRNA, которая нацелена на ALAS1, вводят в комбинации с одним или несколькими дополнительными лекарственными препаратами, например, другим препаратом, который, как известно, является эффективным в лечении порфирии или симптомов порфирии. Например, другим лекарственным препаратом может быть глюкоза (например, IV глюкоза) или препарат на основе гема (например, гемин, аргинат гема или гемальбумин). Дополнительный лекарственный препарат(ы) можно вводить до, после или одновременно с введением iRNA.
- 86 036477 iRNA и дополнительное терапевтическое средство можно вводить в комбинации в одной и той же композиции, например, внутривенно, или дополнительное терапевтическое средство можно вводить как часть отдельной композиции или другим способом, описанным в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение iRNA или введение iRNA в комбинации с одним или несколькими дополнительными лекарственными препаратами (например, глюкозой, декстрозой и т.п.), снижает частоту острых приступов (например, путем предупреждения острых приступов так, что они больше не возникают, или путем снижения числа приступов, которые возникают в определенный период времени, например, меньшее число приступов возникает за год). Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA вводят согласно схеме дозирования с регулярными интервалами, например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят после острого приступа порфирии. Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA находится в композиции, например, композиции, содержащей липидный состав, например состав LNP.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят во время острого приступа порфирии. Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA находится в композиции, например, композиции, содержащей липидный состав (например, состав LNP), или композиции, содержащей конъюгат GalNAc.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения тяжести приступа (например, путем облегчения одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для сокращения продолжительности приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для прекращения приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят профилактически для предупреждения острого приступа порфирии. Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA находится в форме конъюгата GalNAc, например, в композиции, содержащей конъюгат GalNAc. Согласно некоторым вариантам осуществления профилактическое введение выполняют до, во время или после воздействия или возникновения провоцирующего фактора. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект подвержен риску развития порфирии.
Согласно некоторым вариантам осуществления siRNA вводят во время продрома. Согласно некоторым вариантам осуществления продром характеризуется болевыми ощущениями (например, головной болью и/или болью в животе), тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), возбужденным состоянием и/или бессонницей.
Согласно некоторым вариантам осуществления siRNA вводят во время определенной фазы менструального цикла, например, во время лютеиновой фазы.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для предупреждения приступов (например, рецидивирующих приступов, которые ассоциированы с продромом и/или с провоцирующим фактором, например, с определенной фазой менструального цикла, например, лютеиновой фазой). Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения частоты приступов. Согласно вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения тяжести приступа (например, путем облегчения одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для сокращения продолжительности приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для прекращения приступа.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для предупреждения или снижения частоты или тяжести болевых ощущений, например, нейропатической боли.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для предупреждения или снижения частоты или тяжести нейропатии.
Эффекты введения siRNA ALAS1 могут быть установлены, например, путем сравнения с соответствующим контролем. Например, снижение частоты острых приступов, а также снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов у группы пациентов с AIP может быть установлено, например, как пониженная частота по сравнению с соответствующей контрольной группой. Контрольная группа (например, группа из подобных индивидов или та же группа индивидов в перекрестном исследовании) может включать, например, популяцию, не получавшую лечения, популяцию, которую лечили при помощи традиционного лекарственного препарата от порфирии (например, традиционный лекарственный препарат от AIP может включать глюкозу, гемин или оба); популяцию, которую лечили при помощи плацебо или нецелевой iRNA, необязательно в комбинации с одним или несколькими традиционными лекарственными препаратами от порфирии (например, глюкозой, например, IV глюкозой) и т.п.
Используемое в данном документе выражение подверженный риску развития порфирии включает субъекта со случаями заболевания порфирией в семье и/или одним или несколькими рецидивирующими
- 87 036477 или хроническими симптомами порфирии в анамнезе, и/или субъекта, который имеет генетическое изменение (например, мутацию) в гене, кодирующем фермент в рамках пути биосинтеза гема, и субъекта, который имеет генетическое изменение, например, мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией.
Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, способствует восприимчивости индивида к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, пребывания на диете или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, раскрытого в данном документе). Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, ассоциировано с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, ассоциировано с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, ассоциировано с изменениями EMG и/или скорости проводимости нервов.
Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой мутацию в гене ALAS1. Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой мутацию в промоторе гена ALAS1 или в участках, расположенных выше или ниже гена ALAS1. Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой мутацию в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой изменение, например мутацию, в гене, который кодирует фермент в рамках пути биосинтеза гема.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение, описанное в данном документе (например, генетическую мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией). Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в моче или плазме) ALA и/или PBG. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект не имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение, описанное в данном документе, и имеет другие симптомы, например, хроническую боль, изменения EMG, изменения скорости проводимости нервов и/или другие симптомы, ассоциированные с порфирией. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение, но не испытывает острых приступов.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет мутацию, ассоциированную с AIP, НСР, VP или ADP.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например, по меньшей мере одну мутацию, в гене PBG-дезаминазы. Многие мутации PBG-дезаминазы известны из уровня техники, например, описанные в Hrdinka, M. et at. Physiological Research, 55 (Suppl 2):S119-136 (2006). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект является гетерозиготным по мутации PBG-дезаминазы. Согласно другим вариантам осуществления субъект является гомозиготным по мутации PBG-дезаминазы. Гомозиготный субъект может иметь две идентичные мутации или две различные мутации в гене PBGдезаминазы.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой НСР. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например по меньшей мере одну мутацию, в гене, который кодирует фермент копропорфириноген III оксидазу.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой VP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например по меньшей мере одну мутацию, в гене, который кодирует протопорфириногеноксидазу.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой ADP, например аутосомнорецессивную ADP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например по меньшей мере одну мутацию, в гене, который кодирует ALA-дегидратазу.
Способы лечения, представленные в данном документе, могут служить для облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, возникнет при воздействии провоцирующего фактора, и/или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака). Кроме того, способы, представленные в данном документе, могут служить для снижения уровня одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов и/или связанных продуктов или метаболитов порфирина. Уровень предшественника порфирина или порфирина можно измерять в любом биологическом образце, таком как, например, моча, кровь, кал, спинномозговая жидкость или образец ткани. Образец может находиться в субъекте или может быть получен или выделен из субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP, а уровень PBG и/или ALA снижен. Согласно некоторым вариантам осуществления продукт или метаболит порфирина представляет собой порфобилин, порфобилиноген или уропорфирин. Снижение уровня продукта или метаболита порфирина можно измерять при помощи любого способа, известного из уровня техники. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценивать при по- 88 036477 мощи теста Уотсона-Шварца, ионообменной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии. См., например, Thunell (1993).
Способы, описанные в данном документе, могут также служить для снижения хронически повышенных уровней предшественников порфиринов (например, ALA и/или PBG) у субъектов, страдающих порфирией (например, острой печеночной порфирией, например, AIP) или подверженных риску развития порфирии. Способы оценки уровней (например, хронически повышенных уровней) предшественников порфиринов в плазме и моче включают, например, HPLC-масс-спектрометрию и ионообменную хроматографию. Уровни предшественников порфиринов можно выражать в виде уровня относительно другого белка или соединения, например, креатинина. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007.
Используемое в данном документе выражение провоцирующий фактор относится к эндогенному или экзогенному фактору, который может индуцировать острый приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией. Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или недостаточной калорийности потребляемой пищи вследствие жестких диет, занятий спортом, связанных с длинными дистанциями и т. д.), формы стресса, связанные с метаболизмом (например, инфекции, оперативное вмешательство, международные авиаперелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, жирорастворимые чужеродные химические соединения (в том числе, например, химические соединения, присутствующие в табачном дыме, определенные лекарственные средства рецептурного отпуска, органические растворители, биоциды, соединения в алкогольных напитках), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения болезни во время менструального периода), синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормональная заместительная терапия). См., например, Thunell (1993). Распространенные провоцирующие факторы включают лекарственные средства, индуцирующие цитохром Р450, и фенобарбитал.
Симптомы, ассоциированные с порфирией, могут включать боль или спазмы в животе, головные боли, эффекты, вызванные патологиями нервной системы, и светочувствительность, вызывающую появление сыпи, образование волдырей и рубцов на коже (фотодерматит). Согласно определенным вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP. Симптомы AIP включают симптомы, связанные с желудочно-кишечным трактом (например, сильная и плохо локализуемая боль в животе, тошнота/рвота, запор, диарея, непроходимость кишечника), симптомы, связанные с мочевой системой (дизурия, задержка мочеиспускания/недержание мочи или темная моча), неврологические симптомы (например, сенсорная нейропатия, моторная нейропатия (например, поражающая черепные нервы и/или приводящая к слабости мышц в руках или ногах), судороги, нейропатическую боль, прогрессирующую нейропатию, головные боли, нейропсихиатрические симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинация, истерия, делирий, апатия, депрессия, фобии, психоз, бессонница, сонливость, кома), вовлечение автономной нервной системы (приводящее, например, к симптомам, связанным с сердечно-сосудистой системой, таким как тахикардия, гипертензия и/или аритмии, а также другим симптомам, таким как, например, повышенные уровни катехоламинов в крови, потение, возбужденность и/или тремор), обезвоживание и нарушения баланса электролитов.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA, нацеленную на ALAS1, вводят вместе (например, до, после или одновременно) с другим лекарственным препаратом, который может служить для ослабления одного или нескольких из упомянутых выше симптомов. Например, боль в животе можно лечить, например, наркотическими анальгетиками, судороги можно лечить, например, противосудорожными препаратами, тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотиазинами, и тахикардию/гипертензию можно лечить, например, бета-блокаторами.
Выражение снижать (или повышать), как предполагается, относится к измеряемому изменению, например, статистически значимому изменению. Изменение может составлять, например, изменение (например, снижение (или повышение) относительно нормального значения, например, эталонной величины, где iRNA не вводят) по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40, 50% или более.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению iRNA или фармацевтической композиции на ее основе, например, для лечения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, в комбинации с другими фармацевтическими препаратами и/или другими терапевтическими способами, например, с известными фармацевтическими препаратами и/или известными терапевтическими способами, такими как, например, применяемые в настоящее время для лечения нарушения. Согласно одному варианту осуществления iRNA или фармацевтическую композицию на ее основе можно вводить совместно с препаратом на основе гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином, описанными в данном документе) и/или совместно с внутривенными инфузиями глюкозы. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA или фармацевтическую композицию на ее основе применяют профилактически, например, для предупреждения или облегчения симптомов прогнозируемого приступа острой порфирии. Профилактическое применение может планироваться по времени в соответствии с воздействием или прогнозируемым воздействием провоцирующего фактора на субъекта. Описанный в данном документе провоцирующий фактор может представлять собой любой эндогенный или экзогенный фактор, который,
- 89 036477 как известно, провоцирует острый приступ. Например, предменструальная фаза представляет собой эндогенный провоцирующий фактор, а лекарственное средство, провоцирующее цитохром Р450, представляет собой экзогенный провоцирующий фактор.
Количество, эффективное для лечения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1 (например, порфирии, такой как AIP), зависит от типа нарушения, подлежащего лечению, тяжести симптомов, субъекта, который подлежит лечению, пола, возраста и общего состояния субъекта, способа введения и т.д. Для каждого отдельно взятого случая соответствующее эффективное количество может определить специалист в данной области с помощью стандартного проведения экспериментов. Контролирование эффективности лечения или предупреждения путем измерения любого из таких показателей или любой комбинации показателей относится к компетенции специалиста в данной области. Применительно к введению iRNA, нацеленной на ALAS1, или фармацевтической композиции на ее основе выражение эффективный против нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, указывает, что введение способом, принятым в клинической практике, приводит к благоприятному эффекту, например, для отдельного пациента или по меньшей мере для части пациентов, например, статистически значимой части пациентов. Благоприятные эффекты включают, например, предупреждение или снижение симптомов, или другие эффекты. Например, благоприятные эффекты включают, например, улучшение (например, снижение тяжести или частоты) симптомов, снижение тяжести или частоты приступов, сниженный риск развития сопутствующего заболевания (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака), повышенную способность переносить провоцирующий фактор, улучшение качества жизни, снижение экспрессии ALAS1, снижение уровня (например, уровня в плазме или моче) порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) или другой эффект, как правило, расцениваемый как положительный лечащими врачами, хорошо осведомленными в лечении определенного типа нарушения.
Эффект лечения или предупреждения является очевидным, когда наблюдается улучшение, например, статистически значимое улучшение, одного или нескольких показателей болезненного состояния, или когда отсутствует усугубление или развитие симптомов в тех случаях, когда, при иных обстоятельствах, они прогнозировались. В качестве примера, положительное изменение измеряемого показателя заболевания по меньшей мере на 10%, например, по меньшей мере на 20, 30, 40, 50% или более, может служить признаком эффективного лечения. Об эффективности данного лекарственного средства на основе iRNA или состава с таким лекарственным средством можно также судить при помощи экспериментальной животной модели данного заболевания, которая известна из уровня техники. При использовании экспериментальной животной модели эффективность лечения подтверждается, когда наблюдают статистически значимое снижение маркера (например, ALA или PBG в плазме или моче) или ослабление симптома.
Пациентам можно вводить терапевтическое количество iRNA. Терапевтическое количество может составлять, например, 0,05-50 мг/кг. Например, терапевтическое количество может составлять 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0 или 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг dsRNA.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составлена в виде липидного состава, например, состава LNP, описанного в данном документе. Согласно некоторым таким вариантам осуществления терапевтическое количество может составлять 0,05-5 мг/кг, например, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 или 5,0 мг/кг dsRNA. Согласно некоторым вариантам осуществления липидный состав, например, состав LNP, вводят внутривенно.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят путем внутривенной инфузии в течение определенного периода времени, как, например, в течение периода 5, 10, 15, 20 или 25 мин.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA находится в форме конъюгата GalNAc, описанного в данном документе. Согласно некоторым таким вариантам осуществления терапевтическое количество может составлять 0,5-50 мг, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг dsRNA. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc вводят подкожно.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение повторяют, например, регулярно, как, например, ежедневно, раз в две недели (т.е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или дольше. После осуществления схемы первичного лечения лекарственные препараты можно вводить менее часто. Например, после введения раз в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять один раз в месяц в течение шести месяцев, или года, или дольше.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство на основе iRNA вводят двумя или более дозами. Согласно некоторым вариантам осуществления число или величина последующих доз зависят от достижения необходимого эффекта, например, подавления гена ALAS, снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG), или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или предупреждения одного или нескольких симптомов, ассциированных с порфирией (например, болевых ощущений, например, нейропатической боли), и/или
- 90 036477 предупреждения приступов или снижения частоты и/или тяжести приступов, ассоциированных с порфирией.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство на основе iRNA вводят в соответствии со схемой. Например, средство на основе iRNA можно вводить раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю или пять раз в неделю. Согласно некоторым вариантам осуществления схема предусматривает введения с равными интервалами, например, ежечасно, каждые четыре часа, каждые шесть часов, каждые восемь часов, каждые двенадцать часов, ежедневно, каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц. Согласно вариантам осуществления средство на основе iRNA вводят еженедельно или раз в две недели для достижения необходимого эффекта, например, снижения уровня ALA и/или PBG, уменьшения болевых ощущений и/или предупреждения острых приступов.
Согласно вариантам осуществления схема предусматривает введения с небольшими интервалами с последующим более длительным периодом времени, в течение которого средство не вводят. Например, схема может предусматривать первоначальный набор доз, которые вводят за относительно короткий период времени (например, приблизительно каждые 6 ч, приблизительно каждые 12 ч, приблизительно каждые 24 ч, приблизительно каждые 48 ч или приблизительно каждые 72 ч) с последующим более длительным периодом времени (например, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5 приблизительно 6 н приблизительно 7 или приблизительно 8 недель), в течение которого средство на основе iRNA не вводят. Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA первоначально вводят ежечасно, а впоследствии вводят с более длительными интервалами (например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц). Согласно другому варианту осуществления средство на основе iRNA первоначально вводят ежедневно, а впоследствии вводят с более длительными интервалами (например, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц). Согласно определенным вариантам осуществления более длительный интервал увеличивается со временем, или его определяют на основе достижения необходимого эффекта. Согласно конкретному варианту осуществления средство на основе iRNA вводят один раз в день в течение острого приступа с последующим еженедельным введением доз, начиная с восьмого дня введения. Согласно другому конкретному варианту осуществления средство на основе iRNA вводят через день в течение первой недели с последующим еженедельным введением доз, начиная с восьмого дня введения.
Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA вводят для предупреждения или снижения тяжести или частоты рецидивирующих приступов, например циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является менструальный цикл. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят периодически, например, через равные промежутки для предупреждения или снижения тяжести или частоты рецидивирующих приступов, например, циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором, например, менструальным циклом, например, определенной фазой менструального цикла, например, лютеиновой фазой. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят во время определенной фазы менструального цикла или на основе уровней гормонов у пациента, получающего лечение (например, на основе уровней гормонов, которые ассоциированы с определенной фазой менструального цикла). Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят в один или несколько определенных дней менструального цикла, например, в 1-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-й, 9-й, 10-й, 11-й, 12-й, 13-й, 14-й, 15-й, 16-й, 17-й, 18-й, 19-й, 20-й, 21-й, 22-й, 23-й, 24-й, 25-й, 26-й, 27-й день или в 28-й день (или более поздний день для субъектов, которые имеют более длинный менструальный цикл). Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят во время лютеиновой фазы, например, в один или несколько дней между 14-м - 28-м днями менструального цикла (или позже у субъектов, которые имеют менструальный цикл, который составляет более 28 дней). Согласно некоторым вариантам осуществления у субъекта оценивают время наступления овуляции (например, с помощью анализа крови или мочи, который определяет гормон, ассоциированный с овуляцией, например, LH) и iRNA вводят через заранее определенный интервал после овуляции. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят непосредственно после овуляции. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 дней после овуляции. Любую из этих схем необязательно можно повторять в течение одного или нескольких циклов. Число циклов может зависеть от достижения необходимого эффекта, например подавления гена ALAS1 и/или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или предупреждения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией.
Согласно некоторым вариантам осуществления вводят первоначальную дозу средства на основе iRNA и проверяют уровень ALA или PBG, например через 1-48 ч, например 2, 4, 8, 12 или 24 ч, после введения первоначальной дозы. Согласно некоторым вариантам осуществления, если уровень ALA и/или PBG снизился (например, с достижением заранее определенного снижения, например, нормализации), и/или если симптомы, ассоциированные с порфирией (например, болевые ощущения), улучшились (например, так что у пациента не наблюдаются симптомы), дальнейшую дозу не вводят, в то же время, если
- 91 036477 уровень ALA и/или PBG не снизился (например, не достиг заранее определенного снижения, например, не нормализовался), то дальнейшую дозу ALA или PBG вводят. Согласно некоторым вариантам осуществления дальнейшую дозу вводят через 12, 24, 36, 48, 60 или 72 ч после первоначальной дозы. Согласно некоторым вариантам осуществления, если первоначальная доза не является эффективной в снижении уровня ALA и/или PBG, то дальнейшую дозу модифицируют, например повышают, для достижения необходимого понижения (например, заранее определенного снижения, например, нормализации) уровней ALA или PBG.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой понижение по меньшей мере на 10, 20, 30, 40 или 50%. Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое является эффективным в предупреждении или облегчении симптомов, например, болевых ощущений, продромальных симптомов, или рецидивирующих приступов.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение по меньшей мере на 1, 2, 3 или более стандартных отклонений, где стандартное отклонение определяют на основе значений из эталонной выборки, например, эталонной выборки, описанной в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое доводит уровень порфирина или предшественника порфирина до уровня, который меньше нормального значения, или до уровня, который меньше или равен нормальному значению (например, нормальному значению, описанному в данном документе).
Используемое в данном документе выражение нормализация уровней ALA или PBG (или нормальный или нормализованный уровень) относится к уровню (например, уровню в моче и/или плазме) либо ALA, либо PBG, либо обоих, который находится в пределах ожидаемого диапазона для здорового индивида, индивида, у который не наблюдаются симптомы (например, индивида, который не испытывает болевых ощущений и/или не страдает нейропатией), или индивида, который не имеет мутации, ассоциированной с порфирией. Например, согласно некоторым вариантам осуществления нормализованный уровень находится в пределах двух стандартных отклонений от нормального среднего. Согласно некоторым вариантам осуществления нормализованный уровень находится в пределах нормального диапазона значений, например, в пределах 95% доверительного интервала для соответствующей контрольной выборки, например, выборки здоровых индивидов или индивидов, которые не имеют генной мутации, ассоциированной с порфирией. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень ALA и/или PBG у субъекта (например, уровень ALA и/или PBG в плазме и/или крови) отслеживают через определенные промежутки времени, при этом дальнейшую дозу средства на основе iRNA вводят, если уровень повышается выше нормального значения.
Введение iRNA может снижать уровни mRNA или белка ALAS1, например, в клетке, ткани, крови, моче или другой части организма пациента по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80 % или по меньшей мере на 90% или более. Введение iRNA может снижать уровни продуктов, ассоциированных с экспрессией гена ALAS1, например, уровни одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, уровень ALA и/или PBG). Введение средства на основе iRNA также может ингибировать или предупреждать повышение уровней mRNA или белка ALAS1 во время острого приступа AIP.
Перед введением полной дозы iRNA пациентам можно вводить меньшую дозу, такую как 5% инфузионную дозу, и отслеживать у них побочные эффекты, такие как аллергическая реакция, или повышенные уровни липидов или кровяного давления.
Согласно другому варианту осуществления у пациента можно отслеживать нежелательные эффекты.
Способы модулирования экспрессии гена ALAS1
Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении представлен способ модулирования (например, ингибирования или активации) экспрессии гена ALAS1, например, в клетке или у субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку или гепатоцит. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится внутри субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект (например, человек) подвержен риску заболевания, связанного с экспрессией ALAS1, или у него диагностировано такое заболевание, как описано выше.
Согласно одному варианту осуществления способ включает приведение клетки в контакт с iRNA, описанной в данном документе, в количестве, эффективном для снижения экспрессии гена ALAS1 в клетке. Используемое в данном документе выражение приведение в контакт включает непосредственное приведение клетки в контакт, а также опосредованное приведение клетки в контакт. Например, клетка внутри субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть
- 92 036477 приведена в контакт, когда композицию, содержащую iRNA, вводят (например, внутривенно или подкожно) субъекту.
Экспрессию гена ALAS1 можно оценивать на основе уровня экспрессии mRNA ALAS1, белка ALAS1 или уровня показателя, функционально связанного с уровнем экспрессии гена ALAS1 (например, уровня порфирина или частоты или тяжести симптома, связанного с порфирией). Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия ALAS1 ингибируется по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на
30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на
50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на
70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на
90% или по меньшей мере на 95%. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA характеризуется IC50 B диапазоне 0,001-0,01 нМ, 0,001-0,10 нМ, 0,001-1,0 нМ, 0,001-10 нМ, 0,01-0,05 нМ, 0,01-0,50 нМ, 0,02-0,60 нМ, 0,01-1,0 нМ, 0,01-1,5 нМ, 0,01-10 нМ. Значение IC50 может быть нормализовано относительно соответствующего контрольного значения, например, IC50 нецелевой iRNA.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает введение в клетку iRNA, описанной в данном документе, и поддержание клетки в течение времени, достаточного для достижения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS1, вследствие чего ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке.
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает введение композиции, описанной в данном документе, например, композиции, содержащей iRNA, которая нацеливается на ALAS1, млекопитающему так, что экспрессия целевого гена ALAS1 понижается, например, на протяжении длительного периода времени, например, по меньшей мере двух, трех, четырех дней или более, например, одной недели, двух недель, трех недель или четырех недель или дольше. Согласно некоторым вариантам осуществления понижение экспрессии ALAS1 можно выявлять в течение 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч или 24 ч после первого введения.
Согласно другому варианту осуществления способ предусматривает введение композиции, описанной в данном документе, млекопитающему так, что экспрессия целевого гена ALAS1 повышается, например, по меньшей мере на 10% по сравнению с необработанным животным. Согласно некоторым вариантам осуществления активация ALAS1 наблюдается на протяжении длительного периода времени, например, по меньшей мере двух, трех, четырех дней или более, например, одной недели, двух недель, трех недель, четырех недель или более. Не желая быть связанными теорией, iRNA может активировать экспрессию ALAS1 путем стабилизации mRNA-транскрипта ALAS1, взаимодействия с промотором в геноме и/или подавления ингибитора экспрессии ALAS 1.
iRNA, применимые для способов и композиций, описанных в настоящем изобретении, специфично нацелены на РНК (первичные или процессированные) гена ALAS1. Композиции для ингибирования экспрессии гена ALAS1 с использованием iRNA можно получать, а способы такого ингибирования можно осуществлять, как описано в другой части данного документа.
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает введение композиции, содержащей iRNA, где iRNA содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна по меньшей мере части РНК-транскрипта гена ALAS1 млекопитающего, который подлежит лечению. Если организм, который подлежит лечению, представляет собой млекопитающего, такого как человек, то композицию можно вводить любым способом, известным из уровня техники, в том числе без ограничения с помощью перорального, внутрибрюшинного или парентерального пути введения, в том числе с помощью интракраниального (например, интравентрикулярного, интрапаренхиматозного и интратекального), внутривенного, внутримышечного, подкожного, трансдермального, воздушного (аэрозольного), назального, ректального и местного (в том числе буккального и сублингвального) введения.
Согласно определенным вариантам осуществления композиции вводят путем внутривенной инфузии или инъекции. Согласно некоторым таким вариантам осуществления композиции содержат siRNA, находящуюся в липидном составе (например, в составе LNP, таком как состав LNP11) для внутривенной инфузии. Согласно определенным вариантам осуществления такие композиции можно применять для лечения острых приступов порфирии и/или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).
Согласно другим вариантам осуществления композиции вводят подкожно. Согласно некоторым таким вариантам осуществления композиции содержат iRNA, конъюгированную с лигандом GalNAc. Согласно определенным вариантам осуществления такие композиции можно применять для лечения острых приступов порфирии или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).
Способы снижения уровня порфирина или предшественника порфирина
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлен способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина, например, в клетке или у субъекта.
Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку или гепато- 93 036477 цит. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой гепатоцит. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится внутри субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек).
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект (например, человек) подвержен риску развития порфирии или у него диагностирована порфирия, как описано в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления способ является эффективным для лечения порфирии, как описано в данном документе (например, путем облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет возникать при воздействии провоцирующего фактора, и/или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака). Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает приведение клетки в контакт с RNAi, как описано в данном документе, в количестве, достаточном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке, или в другой соответствующей клетке или группе клеток, или у субъекта. Используемое в данном документе выражение приведение в контакт включает непосредственное приведение клетки в контакт, а также опосредованное приведение клетки в контакт. Например, клетка внутри субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть приведена в контакт, когда композицию, содержащую RNAi, вводят (например, внутривенно или подкожно) субъекту. Используемое в данном документе выражение другая соответствующая клетка или группа клеток включает любую клетку или группу клеток, в которых уровень порфирина или предшественника порфирина снижается в результате приведения в контакт. Например, клетка может быть частью ткани, находящейся внутри субъекта (например, клеткой печени, находящейся внутри субъекта), и приведение в контакт клетки внутри субъекта (например, приведение в контакт одной или нескольких клеток печени, находящихся внутри субъекта) с RNAi может приводить к снижению уровня порфирина или предшественника порфирина в другой соответствующей клетке или группе клеток (например, нервных клетках субъекта), или в ткани или жидкости субъекта (например, в моче, крови, плазме или спинномозговой жидкости субъекта).
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирин или предшественник порфирина выбирается из группы, состоящей из δ-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфобилиногена (PBG), гидкросиметилбилана (НМВ), уропорфиногена III, копропорфиногена III, протопорфиногена IX и протопорфирина IX. Согласно некоторым вариантам осуществления предшественник порфирина представляет собой ALA. Согласно некоторым вариантам осуществления предшественник порфирина представляет собой PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления способ снижает уровень ALA и PBG. Уровень порфирина или предшественника порфирина можно измерять, как описано в данном документе и как известно из уровня техники.
Анализы и способы отслеживания активности RNAi
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлены анализы и способы отслеживания уровней mRNA ALAS 1. Активность RNAi в печени можно отслеживать с помощью определения уровней mRNA или продукта 5'RACE в ткани, или с помощью определения уровня секретируемого белка в крови.
Альтернативно или в комбинации, можно определять уровни циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1, например, при помощи анализов cERD (Circulating Extracellular RNA Detection). Согласно некоторым вариантам осуществления уровень mRNA ALAS1 можно определять в образце биологической жидкости, например образце сыворотки или мочи. Согласно некоторым вариантам осуществления в биологические жидкости из различных типов клеток выделяются экзосомы, которые содержат mRNA и miRNA, происходящие из исходной ткани. Такие экзосомы можно использовать для отслеживания уровня циркулирующей RNAi. Согласно одному варианту осуществления образец, например, образец сыворотки или мочи от субъекта, получающего лечение посредством iRNA, описанной в данном документе, может быть очищен при помощи низкоскоростного центрифугирования, затем при помощи центрифугирования со скоростью приблизительно 160000g в течение приблизительно 2 ч с образованием осадка. RNA можно экстрагировать и анализировать для измерения уровней mRNA ALAS1. Иллюстративные способы и анализы раскрыты в PCT/US 2012/043584, опубликованном как WO 2012/177906, содержание которых включено при помощи ссылки.
Соответственно, представлен анализ или способ определения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта. Анализ или способ предусматривают получение РНК (например, внеклеточной РНК) из образца биологической жидкости (например, образца мочи, крови или плазмы) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1; и определение в образце уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1.
Согласно одному варианту осуществления анализ или способ предусматривают стадию получения cDNA ALAS1 из mRNA ALAS1; и приведения в контакт cDNA ALAS1 с нуклеиновой кислотой (например, зондом и/или праймером), комплементарной cDNA ALAS1 или ее части, что тем самым приводит к образованию реакционной смеси; и определения (например, измерения) уровня cDNA ALAS1 в реакци- 94 036477 онной смеси, где уровень cDNA ALAS1 является показателем уровня mRNA ALAS1, тем самым анализируют уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
Согласно одному варианту осуществления анализ или способ предусматривают получение образца биологической жидкости от субъекта, где биологический образец отделяют от ткани и где биологический образец содержит экзосомы. Анализ или способ могут дополнительно предусматривать определение уровней РНК в биологическом образце, где РНК экспрессируется за счет гена в ткани субъекта, где экзосомы не очищают от биологического образца перед определением уровней РНК в биологическом образце.
Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец крови. Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец сыворотки. Согласно другому варианту осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец мочи.
Согласно вариантам осуществления способ включает PCR, qPCR или 5'-RACE.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота представляет собой зонд или праймер.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота содержит выявляемый фрагмент и уровень mRNA ALAS1 определяют по выявлению количества выявляемого фрагмента.
Согласно вариантам осуществления упомянутый способ дополнительно предусматривает получение образца биологической жидкости от субъекта.
Согласно вариантам осуществления этих способов эффективность лечения порфирии оценивают на основе сравнения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта по отношению к нормальному значению.
Согласно вариантам осуществления снижение уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта в ответ на лечение порфирии относительно нормального значения указывает на то, что лечение порфирии является эффективным. Согласно вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта до лечения порфирии.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные таковым, описанным в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или исследовании iRNA и способов, описанных в настоящем изобретении, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие литературные источники, которые упоминаются в данном документе, включены при помощи ссылки во всей своей полноте. В случае противоречия настоящее описание, в том числе определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не подразумеваются как ограничивающие.
Примеры
Пример 1. Синтез siRNA
Источник реагентов
Если источник реагента конкретным образом не указан в данном документе, такой реагент может быть получен от любого поставщика реагентов для целей использования в молекулярной биологии в количестве/с чистотой, стандартными для применения в молекулярной биологии.
Синтез олигонуклеотидов
Все олигонуклеотиды синтезировали на синтезаторе AKTAoligopilot. Для синтеза олигонуклеотидов применяли коммерчески доступную твердую подложку из стекла с контролируемым размером пор (dT-CPG, 500 A, Prime Synthesis) и РНК-фосфорамидиты со стандартными защитными группами, 5'-Oдиметокситритил^6-бензоил-2'-трет-бутилдиметилсилил-аденозин-3'-О-^№-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5-О-диметокситритил-№-ацетил-2'-трет-бутилдиметилсилил-цитидин-3'-О-^№диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-О-диметилокситритил-№-изобутрил-2'-трет-бутилдиметилсилил-гуанозин-3'-О-^^-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-О-диметокситритил-2'-третбутилдиметилсилил-уридин-3'-О-^№-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит (Pierce Nucleic Acids Technologies). 2'-Е-фосфорамидиты, 5'-О-диметокситритил-№-ацетил-2'-фтор-цитидин-3'-О-^№диизопропил-2-цианоэтил-фосфорамидит и 5'-О-диметокситритил-2'-фторуридин-3 '-O-N.N'-диизопропил-2-цианоэтил-фосфорамидит приобретали у Promega. Все фосфорамидиты применяли в концентрации 0,2 М в ацетонитриле (CH3CN), за исключением гуанозина, который применяли в концентрации 0,2 М в 10% THF/ANC (объем/объем). Время связывания/рециркуляции составляло 16 мин. Активатор представляет собой 5-этилтиотетразол (0,75 М, American International Chemicals); для РО-окисления применяли йод/воду/пиридин, а для PS-окисления применяли PADS (2%) в смеси 2,6-лутидин/ACN (1:1 объем/объем).
З'-Лиганд-конъюгированные нити синтезировали с помощью твердой подложки, содержащей соответствующий лиганд. Например, введение единицы холестерина в последовательность выполняли от фосфорамидита гидроксипролинол-холестерина. Холестерин привязывали к транс-4-гидроксипролинолу с помощью 6-аминогексаноатной связи с получением фрагмента, представляющего собой гидроксипро
- 95 036477 линол-холестерин. iRNA, меченые на 5'-конце Су-3 и Су-5.5 (флуорофором), синтезировали из соответствующего фосфорамидита Quasar-570 (Су-3), приобретенного у Biosearch Technologies. Конъюгацию лигандов с 5'-концом и/или внутренним положением достигали с помощью соответствующим образом защищенного лиганд-фосфорамидитного строительного блока. В течение 15 мин дополнительно выполняли связывание 0,1 М раствора фосфорамидита в безводном CH3CN в присутствии активатора 5(этилтио)-Ш-тетразола со связанным с твердой подложкой олигонуклеотидом. Окисление межнуклеотидного фосфита до фосфата выполняли с использованием стандартной смеси йод-вода, которая описана (1), или путем обработки смесью трет-бутилгидропероксида/ацетонитрила/воды (10: 87: 3) с конъюгированным олигонуклеотидом при времени задержки окисления 10 мин. Фосфоротиоат вводили с помощью окисления фосфита до фосфоротиоата с использованием реагента для переноса серы, такого как DDTT (приобретенного у AM Chemicals), PADS и/или реагента Бокажа. Холестерин-фосфорамидит синтезировали своими силами и использовали в концентрации 0,1 М в дихлорметане. Время связывания для холестерин-фосфорамидита составляло 16 мин.
Снятие защиты I (снятие защиты с нуклеотидного основания)
После завершения синтеза подложку переносили в 100 мл стеклянный флакон (VWR). Олигонуклеотид отделяли от подложки с одновременным снятием защиты с основных и фосфатных групп с использованием 80 мл смеси этанольного аммиака [аммиак:этанол (3:1)] в течение 6,5 ч при 55°С. Флакон быстро охлаждали на льду и затем смесь этанольного аммиака фильтровали в новый 250-мл флакон. CPG промывали с помощью 2 х 40 мл частей смеси этанола/воды (1:1 объем/объем). Объем смеси затем сокращали до ~30 мл при помощи роторного испарителя. Затем смесь замораживали на сухом льду и сушили в условиях вакуума на скоростной вакуумной установке.
Снятие защиты II (удаление группы 2'-TBDMS)
Высушенный остаток ресуспендировали в 26 мл триэтиламина, триэтиламинтригидрофторида (TEA-3HF) или смеси пиридина-HF и DMSO (3:4:6) и нагревали при 60°С в течение 90 минут для удаления групп трет-бутилдиметилсилила (TBDMS) в 2'-положении. Затем реакционную смесь гасили 50 мл 20 мМ ацетата натрия и рН корректировали до 6,5. Олигонуклеотид хранили в холодильнике до очистки.
Анализ
Перед очисткой олигонуклеотиды анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), а выбор буфера и колонки зависел от природы последовательности и/или конъюгированного лиганда.
Очистка при помощи HPLC
Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды очищали при помощи препаративной HPLC с обращенной фазой. Неконъюгированные олигонуклеотиды очищали при помощи анионообменной HPLC на колонке TSKgel, полученной своими силами. Буферами являются 20 мМ фосфат натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN (буфер А) и 20 мМ фосфат натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN, 1 M NaBr (буфер В). Фракции, содержащие олигонуклеотиды полной длины, объединяли, обессоливали и лиофилизировали. Приблизительно 0,15 OD обессоленных олигонуклеотидов разбавляли в воде до 150 мкл и затем отмеряли пипеткой в специальные виалы для CGE- и LC/MS-анализа. Затем соединения анализировали при помощи LC-ESMS и CGE.
Получение siRNA
Для общего получения siRNA эквимольрные количества смысловой и антисмысловой нитей нагревали в 1xPBS при 95°С в течение 5 мин и медленно охлаждали до комнатной температуры. Целостность дуплекса подтверждали с помощью HPLC-анализа.
Последовательности нуклеиновых кислот представлены ниже с использованием стандартной номенклатуры и, в частности, сокращений табл. 1.
Таблица 1. Сокращения нуклеотидных мономеров, используемые в представлении последовательности нуклеиновой кислоты. Будет понятно, что данные мономеры при их присутствии в олигонуклеотиде взаимно связываются с помощью 5'-3'-фосфодиэфирных связей.
Сокращение | Нуклеотид(ы)/Нуклеозиды |
А | аденозин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’-фторуридин-5’-фосфат или аденозин |
АЬ | бета-Ь-аденозин-З'-фосфат, бета-Ь-аденозин-5'-фосфат или бета-Ь-аденозин |
- 96 036477
Abs | бета-Ь-аденозин-З'-фосфоротиоат |
Af | 2’-дезокси-2’-фтораденозин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’фтораденозин-5’-фосфат или 2’-дезокси-2’-фтораденозин |
Afs | 2’-дезокси-2’-фтораденозин-3’-фосфоротиоат |
As | аденозин-3’-фосфоротиоат |
C | цитидин-3’-фосфат, цитидин-5’-фосфат или цитидин |
Cb | бета-Ь-цитидин-З'-фосфат или бета-Ь-цитидин |
Cbs | бета-Ь-цитидин-З'-фосфоротиоат |
Cf | 2’-дезокси-2’ -фторцитидин-3 ’ -фосфат, 2’ -дезокси-2’фторцитидин-5’-фосфат или 2’-дезокси-2’-фторцитидин |
Cfs | 2 ’ - дезокси-2 ’ -фторцитидин-3 ’ -фосфоротиоат |
(Chd) | 2'-О-гексадецил-цитидин-3'-фосфат или 2'-О-гексадецилцитидин |
(Chds) | 2'-О-гексадецил-цитидин-3'-фосфоротиоат |
Cs | цитидин-3 ’-фосфоротиоат |
G | гуанозин-3’-фосфат, гуанозин-5’-фосфат или гуанозин |
Gb | бета-Ь-гуанозин-З'-фосфат, бета-L-гуанозин-5'-фосфат или бета-L-гуанозин |
Gbs | бета-Ь-гуанозин-З'-фосфоротиоат |
Gf | 2’-дезокси-2’-фторгуанозин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’фторгуанозин-5’-фосфат или 2’-дезокси-2’-фторгуанозин |
Gfs | 2’-дезокси-2’-фторгуанозин-3’-фосфоротиоат |
Gs | гуанозин-3 ’ -фосфоротиоат |
T | 5’-метилуридин-3’-фосфат, 5’-метилуридин-5’-фосфат или 5’метилуридин |
Tb | бета-Ь-тимидин-З'-фосфат, бета-Ь-тимидин-б'-фосфат или бетаL-тимидин |
Tbs | бета-Ь-тимидин-З'-фосфоротиоат |
Tf | 2’-дезокси-2’-фтор-5-метилуридин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’фтор-5-метилуридин-З’-фосфат или 2’-дезокси-2’-фтор-5метилуридин |
Tfs | 2 ’ - дезокси-2 ’ -фтор-5-метилур идин-3 ’ -фосфоротиоат |
Ts | 5-метилур идин-3 ’ -фосфоротиоат |
U | уридин-3’-фосфат, уридин-5’-фосфат или уридин |
Ub | бета-Ь-уридин-З'-фосфат, бета-Ь-уридин-б'-фосфат или бета-Lуридин |
Ubs | бета-Ь-уридин-З'-фосфоротиоат |
Uf | 2’-дезокси-2’-фторуридин-3’-фосфат, 2’-дезокси-2’-фторуридин или 2’-дезокси-2’-фторуридин-3’-фосфат |
- 97 036477
Ufs | 2’-дезокси-2’-фторуридин-3 ’-фосфоротиоат |
(Uhd) | 2'-О-гексадецил-уридин-3'-фосфат, 2'-О-гексадецил-уридин-6'фосфат или 2'-О-гексадецил-уридин |
(Uhds) | 2'-О-гексадецил-уридин-3'-фосфоротиоат |
Us | уридин-3 ’ -фосфоротиоат |
N | любой нуклеотид (G, А, С, Т или U) |
a | 2’-О-метиладенозин-3’-фосфат, 2’-О-метиладенозин-5’-фосфат или 2’-О-метиладенозин |
as | 2'-О-метиладенозин-3 ’ -фосфоротиоат |
c | 2’-О-метилцитидин-3 ’ -фосфат, 2’ -О-метилцитидин-5’-фосфат или 2’-О-метилцитидин |
CS | 2'-О-метилцитидин-3’-фосфоротиоат |
g | 2’-О-метилгуанозин-3’-фосфат, 2’-О-метилгуанозин-5’-фосфат или 2’-О-метилгуанозин |
gs | 2'-О-метилгуанозин-3 ’ -фосфоротиоат |
t | 2’-О-метил-5-метилуридин-3’-фосфат, 2’-О-метил-5метилуридин-5’-фосфат или 2’-О-метил-5-метилуридин |
ts | 2’-О-метил-5-метилуридин-3’-фосфоротиоат |
u | 2’-О-метилуридин-3’-фосфат, 2’-О-метилуридин-5’-фосфат или 2’-О-метилуридин |
US | 2'-О-метилур идин-3 ’ -фосфоротиоат |
dA | 2'-дезоксиаденозин-3'-фосфат, 2' -дезоксиаденозин-5'-фосфат или 2' -дезоксиаденозин |
dAs | 2'-дезоксиаденозин-3'-фосфоротиоат |
dC | 2'-дезоксицитидин-3'-фосфат, 2'-дезоксицитидин-5'-фосфат или 2'-дезоксицитидин |
dCs | 2'-дезоксицитидин-3'-фосфоротиоат |
dG | 2'-дезоксигуанозин-3'-фосфат, 2' -дезоксигуанозин-5'-фосфат или 2' -дезоксигуанозин |
dGs | 2'-дезоксигуанозин-3'-фосфоротиоат или 2'-дезоксигуанозин |
dT | 2'-дезокситимидин-3 ’-фосфат, 2'-дезокситимидин-5’-фосфат или 2'-дезокситимидин |
dTs | 2'-дезокситимидин-3'-фосфоротиоат |
dU | 2'-дезоксиуридин-3'-фосфат, 2'-дезоксиуридин-5'-фосфат или 2' - дезоксиуридин |
s | фосфоротиоатная связь |
L961 | М-[трис(ОаШАс-алкил)-амидодеканоил)]-4-гидроксипролинолНур-(ОаП4Ас-алкил)3 |
- 98 036477
(Аео) | 2’-О-метоксиэтиладенозин-3 ’-фосфат, 2’ -0- метоксиэтиладенозин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтиладенозин |
(Aeos) | 2’-О-метоксиэтиладенозин-3’-фосфоротиоат |
(Сео) | 2’-О-метоксиэтилцитидин-3 ’-фосфат, 2’ -Ометоксиэтилцитидин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтилцитидин |
(Ceos) | 2’-О-метоксиэтилцитидин-3’-фосфоротиоат |
(Geo) | 2’-О-метоксиэтилгуанозин-3’-фосфат, 2’-О- метоксиэтилгуанозин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтилгуанозин |
(Geos) | 2’-О-метоксиэтилгуанозин-3’-фосфоротиоат |
(Тео) | 2’-О-метоксиэтил-5-метилуридин-3’-фосфат, 2’-О-метоксиэтил5-метилуридин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтил-5-метилуридин |
(Teos) | 2’-О-метоксиэтил-5-метилуридин-3 ’-фосфоротиоат |
(m5Ceo) | 2’-О-метоксиэтил-5-метилцитидин-3’-фосфат, 2’-Ометоксиэтил-5-метилцитидин-5’-фосфат или 2’-О-метоксиэтил5-метилцитидин |
(m5Ceos) | 2’-О-метоксиэтил-5-метилцитидин-3’-фосфоротиоат |
(Agn) | 1-(2,3-дигидроксипропил)аденин-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)аденин-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил)аденин |
(Agns) | 1-(2,3-дигидроксипропил)аденин-2-фосфоротиоат |
(Cgn) | 1-(2,3-дигидроксипропил)цитозин-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)цитозин-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил)цитозин |
(Cgns) | 1-(2,3-дигидроксипропил)цитозин-2-фосфоротиоат |
(Ggn) | 1-(2,3-дигидроксипропил)гуанин-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)гуанин-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил)гуанин |
(Ggns) | 1-(2,3-дигидроксипропил)гуанин-2-фосфоротиоат |
(Tgn) | 1-(2,3-дигидроксипропил )тимин-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)тимин-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил )тимин |
(Tgns) | 1-(2,3-дигидроксипропил )тимин-2-фосфоротиоат |
(Ugn) | 1-(2,3-дигидроксипропил )урацил-2-фосфат, 1-(2,3дигидроксипропил)урацил-3-фосфат или 1-(2,3дигидроксипропил)тимин |
(Ugns) | 1-(2,3-дигидроксипропил )урацил-2-фосфоротиоат |
Химическая структура L96 представлена ниже
Пример 2. Конструирование и синтез siRNA ALAS1
Экспериментальные способы
Биоинформатика
Транскрипты
Конструирование siRNA выполняли для выявления siRNA, нацеливающихся на транскрипты ALAS1 человека, макака-резуса (Масаса mulatto), мыши и крысы, аннотированные в базе данных генов NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). При конструировании использовали следующие транскрипты из коллекции эталонных последовательностей в NCBI: человек - NM_000688.4 (см. фиг. 3), NM_199166.1; макак-резус - ХМ_001090440.2, ХМ_001090675.2; мышь - NM_020559.2; крыса NM_024484.2. Вследствие высокого расхождения последовательностей примат/грызун дуплексы siRNA конструировали в нескольких отдельных партиях, в том числе без ограничения партиях, содержащих дуплексы, соответствующие только транскриптам человека и макака-резуса; только транскриптам человека, макака-резуса, мыши и крысы и только транскриптам мыши и крысы. Большинство дуплексов siRNA конструировали так, чтобы они были на 100% идентичны приведенному транскрипту человека и транскриптам других видов, рассмотренным в каждой партии конструирования (выше). В некоторых случаях (см. таблицу 8) ошибочные спаривания между дуплексом и целевой mRNA допускались в первом антисмысловом (последнем смысловом) положении, в тех случаях если комплементарной парой оснований антисмысловой нити щелевой mRNA была пара GC или CG. В этих случаях дуплексы конструировали с парами UA или AU в качестве первой антисмысловой:последней смысловой пары. Таким
- 99 036477 образом, дуплексы сохраняли комплементарность, но являлись несовпадающими по отношению к мишени (U:C, U:G, А:С или A:G). Восемнадцать из этих дуплексов с UA-заменами конструировали как часть набора человек/макак-резус/мышь/крыса (см. дуплексы в табл. 8 с пометками C19U, G19U, С 19А или G19A в столбце положения).
Прогнозирование конструирования, специфичности и эффективности siRNA Прогнозируемую специфичность всех возможных олигомеров из 19 нуклеотидов прогнозировали исходя из каждой последовательности. Затем выбирали кандидатные олигомеры из 19 нуклеотидов, у которых отсутствовали повторы длиннее 7 нуклеотидов. Эти siRNA, 1510 кандидатных человека/макака-резуса, 114 человека/макака-резуса/мыши/крысы и 717 мыши/крысы, использовали при обширных поисках в отношении соответствующих транскриптом (определенные как набор из записей NM_ и ХМ_ в пределах наборов эталонных последовательностей человека, макака-резуса, собаки, мыши или крысы в NCBI) с применением исчерпывающего алгоритма грубой силы, включенного в скрипт питон BruteForce.py. Скрипт затем разбирал выравнивания транскрипт-олигомер с получением балла, основанного на положении и количестве ошибочных спариваний между siRNA и любым потенциальным нецелевым транскриптом. Нецелевой балл взвешивали для усиления различий в затравочном участке siRNA в положениях 2-9 с 5'-конца молекулы. Каждой паре олигомер-транскрипт из поиска грубой силы присваивали балл для ошибочного спаривания путем суммирования отдельных баллов для ошибочного спаривания; ошибочные спаривания в положениях 2-9 определяли как 2,8, ошибочные спаривания в положениях сайта расщепления 10-11 определяли как 1,2 и ошибочные спаривания в участке 12-19 определяли как 1,0. Дополнительное нецелевое прогнозирование выполняли путем сравнения встречаемости гептамеров и октамеров, полученных из 3 отличных полученных из затравки гексамеров каждого олигомера. Гексамеры из положений 2-7 по отношению к 5'-началу использовали для создания 2 гептамеров и одного октамера. 'ГептамерГ создавали путем добавления А на 3'-конец гексамера; гептамер2 создавали путем добавления А на 5'-конец гексамера; октамер создавали путем добавления А как на 5'-конец, так и на 3'-конец гексамера. Заранее вычисляли встречаемость октамеров и гептамеров в 3'UTRome человека, макака-резуса, мыши или крысы (определенные как подпоследовательности транскриптом из базы данных эталонных последовательностей в NCBI, где конец кодирующего участка, 'CDS', является четко определенным). Встречаемость октамеров нормализовали по отношению к встречаемости гептамеров с использованием медианного значения из диапазона встречаемостей октамеров. Затем вычисляли 'mirSeedScore' путем вычисления суммы ( (3 X нормализованное подсчитанное число для октамеров ) + ( 2 X подсчитанное число для гептамера2) + (1 X подсчитанное число для гептамера1)).
Обоим нитям siRNA присваивали категорию специфичности согласно рассчитанным баллам: балл выше 3 оценивали как высоко специфичная, равный 3 как специфичная и от 2,2 до 2,8 оценивали как умеренно специфичная. Упорядочивание проводили по специфичности антисмысловой нити. Затем отбирали дуплексы, у антисмысловых олигонуклеотидов которых отсутствовала GC в первом положении, отсутствовал G в обоих положениях 13 и 14 и присутствовали 3 или более Us или As в затравочном участке (характеристики дуплексов с высокой прогнозированной эффективностью).
Кандидатные коньюгированные с GalNAc дуплексы, 21 и 23 нуклеотида в длину для смысловой и антисмысловой нитей соответственно, конструировали путем удлинения антисмысловых олигомеров из 19 нуклеотидов 4 дополнительными нуклеотидами в 3'-направлении (сохраняя полную комплиментарность с целевым транскриптом). Смысловую нить описывали как обратную комплементарную последовательность первых 21 нуклеотида антисмыслового олигомера из 23 нуклеотидов. Выбирали такие дуплексы, которые сохраняли полные соответствия ко всем выбранным транскриптам видов на протяжении всех 23 нуклеотидов.
Отбор последовательностей siRNA
Синтезировали олигонуклеотиды siRNA из 19 нуклеотидов, являющиеся дуплексами человека/макака-резуса, полученными в общей сложности из 90 смысловых и 90 антисмысловых, человека/макака-резуса/мыши/крысы полученными в общей сложности из 40 смысловых и 40 антисмысловых, и мыши/крысы, полученными в общей сложности из 40 смысловых и 40 антисмысловых, и составляли в дуплексы. Синтезировали олигонуклеотиды из 21/23 нуклеотидов, являющиеся дуплексами человека/макака-резус, полученными в общей сложности из 45 смысловых и 45 антисмысловых, с получением 45 конъюгированных с GalNAc дуплексов.
Последовательности смысловой и антисмысловой нитей модифицированных дуплексов показаны в табл. 2, а последовательности смысловой и антисмысловой нитей немодифицированных дуплексов показаны в табл. 3.
Синтез последовательностей ALAS1
Последовательности ALAS1 синтезировали на синтезаторе MerMade 192 с масштабом либо 1, либо 0,2 мкмоль. Одиночные нити получали с модификациями 2Ю-метила для in vitro скрининга с использованием реагентов для трансфекции. 3'-Конъюгаты GalNAc получали с последовательностями, содержащими модификации 2'F и 2'-О-метила смысловой нити в конструкциях из 21-23 нуклеотидов для свободного захвата в клетках. Для всех последовательностей в перечне из 21 нуклеотида использовали химию 'endolight', подробно описанную ниже.
- 100 036477
Все пиримидины (цитозин и уридин) в смысловой нити содержали 2'-О-метиловые основания (2'-Ометил-С и 2'-О-метил-и).
В антисмысловой нити пиримидины, расположенные рядом с (по направлению к 5'-положению) рибунуклеозидом А, замещали их соответствующими 2-О-метил-нуклеозидами.
Вводили удлинение из двух оснований dTsdT на 3'-конце как смысловой, так и антисмысловой последовательностей.
Файл последовательности конвертировали в текстовый файл, чтобы сделать его совместимым для загрузки в компьютерную программу синтеза MerMade 192.
Для конъюгированных с GalNAc смысловых нитей и комплементарных антисмысловых последовательностей 2'F и другие модифицированные нуклеозиды вводили в комбинации с 2'0метилрибонуклеозидами. Синтез осуществляли на модифицированной GalNAc CPG-подложке для смысловой нити, а для антисмысловой последовательности на CPG, модифицированной универсальной подложке.
Синтез, расщепление и снятие защиты
В синтезе последовательностей ALAS1 применяли синтез нуклеотидов на твердой подложке с использованием химии фосфорамидитов. Для последовательностей, отвечающих химии endolight, из 21 нуклеотида в качестве твердой подложки использовали дезокситимидин-CPG, в то время как для конъюгатов GalNAc для смысловой нити использовали твердую подложку GalNAc, а для антисмысловой нити универсальную CPG.
Синтез упомянутых выше последовательностей выполняли с масштабом либо 1, либо 0,2 мкм в 96луночных планшетах. Растворы амидитов получали при концентрации 0,1 М, а этилтиотетразол (0,6 М в ацетонитриле) использовали в качестве активатора.
Синтезированные последовательности расщепляли и снимали защиту в 96-луночных планшетах, используя метиламин на первой стадии и фторидный реагент на второй стадии. Для последовательностей, содержащих GalNAc и 2Т'-нуклеозид, условия снятия защиты модифицировали. После расщепления и снятия защиты последовательности осаждали с использованием смеси ацетон:этанол (80:20) и осадок ресуспендировали в 0,2 М натрий-ацетатном буфере. Образцы из каждой последовательности анализировали при помощи LC-MS для подтверждения идентичности, УФ - для количественного определения, а выбранный набор образцов анализировали при помощи IEX-хроматографии для определения чистоты.
Очистка и обессоливание
Последовательности ALAS1 осаждали и очищали на системе очистки AKTA с использованием колонки с Sephadex. ALAS1 исследовали при температуре окружающей среды. Введение и сбор образца выполняли в 96-луночных (лунка с глубиной 1,8 мл) планшетах. В элюенте собирали один пик, соответствующий последовательности полной длины. Обессоленные последовательности ALAS1 анализировали в отношении концентрации (УФ-измерением при А260) и чистоты (ионообменной хроматографией HPLC). Комплементарные одиночные нити затем объединяли в стехиометрическом соотношении 1:1 с образованием дуплексов siRNA.
- 101 036477
Таблица 2. Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQID NO: (смысло -вая) | SEQID NO: (антисмысло -вая) | Положение на транскрипте NM_ 000688.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
2 | 3 | 522-540 | AD-55078.2 | cuccGGccAGuGAGAAAGAdTsd Т | UCUUUCUcACUGGCCGGAGdTs dT |
4 | 5 | 669-687 | AD-55084.2 | uGGcAGcAcAGAuGAAucAdTsd Т | UGAUUcAUCUGUGCUGCcAdTs dT |
6 | 7 | 790-808 | AD-55090.2 | cAGuGuGGuuAGuGuGAAAdTs dT | UUUcAcACuAACcAcACUGdTsdT |
8 | 9 | 853-871 | AD-55096.2 | cAu cAu GcAAAAG cAAAG AdT sd T | UCUUUGCUUUUGcAUGAUGdTs dT |
10 | 11 | 876-894 | AD-55102.2 | AAAGAGuGucucAucuucudTsd T | AGAAGAUGAG AcACUCU U U dTs dT |
12 | 13 | 877-895 | AD-55106.2 | AAGAGuGucucAucuucuudTsd T | AAGAAGAUGAGAcACUCUUdTs dT |
14 | 15 | 914-932 | AD-55111.2 | ucuGuuuccAcuuuucAGudTsdT | ACU G AAAAG U G G AAAcAG AdTs dT |
16 | 17 | 923-941 | AD-55073.2 | AcuuuucAGuAuGAucGuudTsd T | AACGAUcAuACUGAAAAGUdTsd T |
18 | 19 | 926-944 | AD-55079.2 | uuucAGuAuGAucGuuucudTsd T | AGAAACGAUcAuACUGAAAdTsd T |
20 | 21 | 927-945 | AD-55085.2 | uucAGuAuGAucGuuucuudTsd T | AAGAAACGAUcAuACUGAAdTsd T |
22 | 23 | 928-946 | AD-55091.2 | ucAGuAuGAucGuuucuuudTsd T | AAAGAAACGAUcAuACUGAdTsd T |
24 | 25 | 932-950 | AD-55097.2 | uAuGAucGuuucuuuGAGAdTsd T | UCUcAAAGAAACGAUcAuAdTsd T |
26 | 27 | 973-991 | AD-55103.2 | uGAccAcAccuAucGAGuudTsdT | AACUCGAuAGGUGUGGUcAdTs dT |
28 | 29 | 975-993 | AD-55107.2 | AccAcAccuAucGAGuuuudTsdT | AAAACUCGAuAGGUGUGGUdTs dT |
30 | 31 | 1029-1047 | AD-55112.2 | uGGcAGAuGAcuAuucAGAdTsd T | UCUGAAuAGUcAUCUGCcAdTsd T |
32 | 33 | 1077-1095 | AD-55074.2 | ucuGGuGcAGuAAuGAcuAdTsd T | uAGUcAUuACUGcACcAGAdTsd T |
34 | 35 | 1124-1142 | AD-55080.2 | uGuGGGGcAGuuAuGGAcAdTs dT | UGUCcAuAACUGCCCcAcAdTsdT |
36 | 37 | 1137-1155 | AD-55086.2 | uGGAcAcuuu G AAAcAAcAdT sd T | UGUUGUUUcAAAGUGUCcAdTs dT |
38 | 39 | 1182-1200 | AD-55098.2 | AuAuuucuGGAAcuAGuAAdTsd T | UuACuAGUUCcAGAAAuAUdTsd T |
40 | 41 | 1184-1202 | AD-55104.2 | AuuucuGGAAcuAGuAAAudTsd T | AUUuACuAGUUCcAGAAAUdTsd T |
- 102 036477
42 | 43 | 1185-1203 | AD-55108.2 | uuucuGGAAcuAGuAAAuudTsd T | AAU U uACuAG U UCcAGAAAdTsd T |
44 | 45 | 1188-1206 | AD-55113.2 | cuGGAAcuAG uAAAu uccAdT sd T | UGGAAUUuACuAGUUCcAGdTs dT |
46 | 47 | 1325-1343 | AD-55075.2 | uGuGAGAuuuAcucuGAuudTsd T | AAUcAGAGuAAAUCUcAcAdTsd T |
48 | 49 | 1364-1382 | AD-55081.2 | AuccAAGGGAuucGAAAcAdTsd T | UGUUUCGAAUCCCUUGGAUdTs dT |
50 | 51 | 1382-1400 | AD-55087.2 | AGccGAGuGccAAAGuAcAdTsd T | UGuACUUUGGcACUCGGCUdTs dT |
52 | 53 | 1478-1496 | AD-55093.2 | uuuGAAAcuGuccAuucAAdTsd T | UUGAAUGGAcAGUUUcAAAdTs dT |
54 | 55 | 1531-1549 | AD-55099.2 | uGAuGuGGcccAuGAGuuudTsd T | AAACUcAUGGGCcAcAUcAdTsd T |
56 | 57 | 1631-1649 | AD-53573.3 | G u cAu G ccAAAAAuG G AcAdT sd T | UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTs dT |
58 | 59 | 1637-1655 | AD-55109.2 | ccAAAAAuGGAcAucAuuudTsd T | AAAUGAUGUCcAUUUUUGGdTs dT |
60 | 61 | 1706-1724 | AD-55114.2 | AcGAGuucucuGAuuGAcAdTsd T | UGUcAAUcAGAGAACUCGUdTs dT |
62 | 63 | 1962-1980 | AD-55076.2 | AAGucuGuGAuGAAcuAAudTsd T | AUuAGUUcAUcAcAGACUUdTsd T |
64 | 65 | 1967-1985 | AD-55082.2 | uGuGAuGAAcuAAuGAGcAdTs dT | UGCUcAUuAGUUcAUcAcAdTsd T |
66 | 67 | 1977-1995 | AD-55088.2 | uAAuGAGcAGAcAuAAcAudTsd T | AUGUuAUGUCUGCUcAUuAdTs dT |
68 | 69 | 2189-2207 | AD-55094.2 | uuuGAAGuGAuGAGuGAAAdTs dT | UUUcACUcAUcACUUcAAAdTsd T |
70 | 71 | 2227-2245 | AD-55100.2 | AGGcuuGAGcAAGuuGGuAdTs dT | uACcAACUUGCUcAAGCCUdTsd T |
72 | 73 | 2313-2331 | AD-55105.2 | ucuucAGAGuuGucuuuAudTsd T | AuAAAGAcAACUCUGAAGAdTsd T |
74 | 75 | 2317-2335 | AD-55110.2 | cAGAGuuGucuuuAuAuGudTsd T | AcAuAuAAAGAcAACUCUGdTsd T |
76 | 77 | 2319-2337 | AD-55115.2 | GAGuuGucuuuAuAuGuGAdTs dT | UcAcAuAuAAAGAcAACUCdTsdT |
78 | 79 | 2320-2338 | AD-55077.2 | AGuuGucuuuAuAuGuGAAdTsd T | UUcAcAuAuAAAGAcAACUdTsd T |
80 | 81 | 2344-2362 | AD-55083.2 | uuAuAuuAAAuuuuAAucudTsd T | AGAU uAAAAU U uAAuAuAAdTsd T |
82 | 83 | 2352-2370 | AD-55089.2 | AAuuuuAAucuAuAGuAAAdTsd T | UUuACuAuAGAUuAAAAUUdTs dT |
84 | 85 | 2353-2371 | AD-55095.2 | AuuuuAAucuAuAGuAAAAdTsd T | U U U uACuAuAGAU uAAAAUdTs dT |
86 | 87 | 2376-2394 | AD-55101.2 | AGuccuGGAAAuAAAuucudTsd T | AGAAUUuAUUUCcAGGACUdTs dT |
88 | 89 | 358-376 | AD-53511.1 | cuGcccAuucuuAucccGAdTsdT | UCGGGAuAAGAAUGGGcAGdTs dT |
90 | 91 | 789-807 | AD-53512.1 | ccAGuGuGGuuAGuGuGAAdTs dT | UUcAcACuAACcAcACUGGdTsdT |
92 | 93 | 1076-1094 | AD-53513.1 | GucuGGuGcAGuAAuGAcudTsd T | AGUcAUuACUGcACcAGACdTsd T |
94 | 95 | 1253-1271 | AD-53514.1 | GcAcucuuGuuuuccucGudTsdT | ACGAGGAAAAcAAGAGUGCdTs dT |
96 | 97 | 1544-1562 | AD-53515.1 | GAGuuuGGAGcAAucAccudTsd T | AGGUGAUUGCUCcAAACUCdTs dT |
103 036477
98 | 99 | 2228-2246 | AD-53516.1 | GGcuuGAGcAAGuuGGuAudTs dT | AuACcAACUUGCUcAAGCCdTsd T |
100 | 101 | 404-422 | AD-53517.1 | GGcAAAucucuGuuGuucudTsd T | AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsd T |
102 | 103 | 404-422 | AD-53517.1 | GGcAAAucucuGuuGuucudTsd T | AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsd T |
104 | 105 | 866-884 | AD-53518.1 | cAAAGAccAGAAAGAGuGudTs dT | AcACUCUUUCUGGUCUUUGdTs dT |
106 | 107 | 1080-1098 | AD-53519.1 | GGuGcAGuAAuGAcuAccudTsd T | AGGuAGUcAUuACUGcACCdTsd T |
108 | 109 | 1258-1276 | AD-53520.1 | cuuGuuuuccucGuGcuuudTsdT | AAAG cACG AGG AAAAcAAG dTsd T |
110 | 111 | 1616-1634 | AD-53521.1 | GGGGAucGGGAuGGAGucAdTs dT | UGACUCcAUCCCGAUCCCCdTsd T |
112 | ИЗ | 2230-2248 | AD-53522.1 | cuuGAGcAAGuuGGuAucudTsd T | AGAuACcAACUUGCUcAAGdTsd T |
114 | 115 | 436-454 | AD-53523.1 | ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsd T | AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTs dT |
116 | 117 | 436-454 | AD-53523.1 | ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsd T | AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTs dT |
118 | 119 | 885-903 | AD-53524.1 | cucAucuucuucAAGAuAAdTsdT | UuAUCUUGAAGAAGAUGAGdTs dT |
120 | 121 | 1127-1145 | AD-53525.1 | GGGGcAGuuAuGGAcAcuudTs dT | AAGUGUCcAuAACUGCCCCdTsd T |
122 | 123 | 1315-1333 | AD-53526.1 | GAuGccAGGcuGuGAGAuudTs dT | AAUCUcAcAGCCUGGcAUCdTsd T |
124 | 125 | 1870-1888 | AD-53527.1 | GAGAcAGAuGcuAAuGGAudTs dT | AUCcAUuAGcAUCUGUCUCdTsd T |
126 | 127 | 2286-2304 | AD-53528.1 | ccccAGGccAuuAucAuAudTsdT | AuAUGAuAAUGGCCUGGGGdTs dT |
128 | 129 | 489-507 | AD-53529.1 | cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT | UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTs dT |
130 | 131 | 489-507 | AD-53529.1 | cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT | UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTs dT |
132 | 133 | 915-933 | AD-53530.1 | cuGuuuccAcuuuucAGuAdTsdT | uACUGAAAAGUGGAAAcAGdTs dT |
134 | 135 | 1138-1156 | AD-53531.1 | GGAcAcuuuGAAAcAAcAudTsd T | AUGUUGUUUcAAAGUGUCCdTs dT |
136 | 137 | 1324-1342 | AD-53532.1 | cuGuGAGAuuuAcucuGAudTsd T | AUcAGAGuAAAUCUcAcAGdTsd T |
138 | 139 | 1927-1945 | AD-53533.1 | cccuGuGcGGGuuGcAGAudTsd T | AUCUGcAACCCGcAcAGGGdTsd T |
140 | 141 | 2312-2330 | AD-53534.1 | GucuucAGAGuuGucuuuAdTsd T | uAAAGAcAACUCUGAAGACdTsd T |
142 | 143 | 646-664 | AD-53535.1 | cAcuGcAAGcAAAuGcccudTsdT | AGGGcAUUUGCUUGcAGUGdTs dT |
144 | 145 | 922-940 | AD-53536.1 | cAcuuuucAGuAuGAucGudTsd T | ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTs dT |
146 | 147 | 1163-1181 | AD-53537.1 | GGGGcAGGuGGuAcuAGAAdTs dT | UUCuAGuACcACCUGCCCCdTsd T |
148 | 149 | 1347-1365 | AD-53538.1 | GGAAccAuGccuccAuGAudTsdT | AUcAUGGAGGcAUGGUUCCdTs dT |
150 | 151 | 1964-1982 | AD-53539.1 | GucuGuGAuGAAcuAAuGAdTs dT | UcAUuAGUUcAUcAcAGACdTsd T |
152 | 153 | 2321-2339 | AD-53540.1 | GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsd T | AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsdT |
154 | 155 | 671-689 | AD-53541.1 | GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsd T | UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdTs dT |
156 | 157 | 924-942 | AD-53542.1 | cuuuucAGuAuGAucGuuudTsd T | AAACGAUcAuACUGAAAAGdTsd T |
158 | 159 | 1164-1182 | AD-53543.1 | GGGcAGGuGGuAcuAGAAAdTs dT | UUUCuAGuACcACCUGCCCdTsd T |
160 | 161 | 1460-1478 | AD-53544.1 | GuccccAAGAuuGuGGcAudTsd T | AUGCcAcAAUCUUGGGGACdTsd T |
162 | 163 | 1976-1994 | AD-53545.1 | cuAAuGAGcAGAcAuAAcAdTsd T | UGUuAUGUCUGCUcAUuAGdTs dT |
164 | 165 | 786-804 | AD-53546.1 | GccccAGuGuGGuuAGuGudTsd T | AcACuAACcAcACUGGGGCdTsdT |
166 | 167 | 935-953 | AD-53547.1 | GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsd T | UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTs dT |
168 | 169 | 1165-1183 | AD-53548.1 | GGcAGGuGGuAcuAGAAAudTs dT | AUUUCuAGuACcACCUGCCdTsd T |
170 | 171 | 1530-1548 | AD-53549.1 | GuGAuGuGGcccAuGAGuudTsd T | AACUcAUGGGCcAcAUcACdTsdT |
172 | 173 | 2003-2021 | AD-53550.1 | cAAGcAAucAAuuAcccuAdTsdT | uAGGGuAAUUGAUUGCUUGdTs dT |
174 | 175 | 788-806 | AD-53551.1 | cccAGuGuGGuuAGuGuGAdTsd T | UcAcACuAACcAcACUGGGdTsdT |
176 | 177 | 974-992 | AD-53552.1 | GAccAcAccuAucGAGuuudTsdT | AAACUCGAuAGGUGUGGUCdTs dT |
178 | 179 | 1191-1209 | AD-53553.1 | GAAcu AGu AAAu uccAuG udT sd T | AcAUGGAAUUuACuAGUUCdTs dT |
180 | 181 | 1541-1559 | AD-53554.1 | cAuGAGuuuGGAGcAAucAdTsd T | UGAUUGCUCcAAACUcAUGdTs dT |
182 | 183 | 2075-2093 | AD-53555.1 | ccccAGAuGAuGAAcuAcudTsdT | AGuAGUUcAUcAUCUGGGGdTs dT |
184 | 185 | 360-378 | AD-53561.1 | GcccAuucuuAucccGAGudTsdT | ACUCGGGAuAAGAAUGGGCdTs dT |
186 | 187 | 1356-1374 | AD-53567.1 | ccuccAuGAuccAAGGGAudTsdT | AUCCCUUGGAUcAUGGAGGdTs dT |
188 | 189 | 1631-1649 | AD-53573.1 | G u cAu G ccAAAAAuG G AcAdT sd T | UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTs dT |
190 | 191 | 1634-1652 | AD-53579.1 | AuGccAAAAAuGGAcAucAdTsd T | UGAUGUCcAUUUUUGGcAUdTs dT |
- 104 036477
Таблица 3. Немодифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQID NO: (смысло -вая) | SEQIDNO: (антисмысловая ) | Положение на транс- крипте NM_ 000688.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
192 | 193 | 522-540 | AD-55078.2 | CUCCGGCCAGUGAGAAAGA | UCUUUCUCACUGGCCGGAG |
194 | 195 | 669-687 | AD-55084.2 | UGGCAGCACAGAUGAAUCA | UGAUUCAUCUGUGCUGCCA |
196 | 197 | 790-808 | AD-55090.2 | CAGUGUGGUUAGUGUGAAA | UUUCACACUAACCACACUG |
198 | 199 | 853-871 | AD-55096.2 | CAUCAUGCAAAAGCAAAGA | UCUUUGCUUUUGCAUGAU G |
200 | 201 | 876-894 | AD-55102.2 | AAAGAGUGUCUCAUCUUCU | AGAAGAU GAGACACUCU U U |
202 | 203 | 877-895 | AD-55106.2 | AAGAGUGUCUCAUCUUCUU | AAGAAGAUGAGACACUCUU |
204 | 205 | 914-932 | AD-55111.2 | UCUGUUUCCACUUUUCAGU | ACUGAAAAGUGGAAACAGA |
206 | 207 | 923-941 | AD-55073.2 | ACUUUUCAGUAUGAUCGUU | AACGAUCAUACUGAAAAGU |
208 | 209 | 926-944 | AD-55079.2 | UUUCAGUAUGAUCGUUUCU | AGAAACGAUCAUACUGAAA |
210 | 211 | 927-945 | AD-55085.2 | UUCAGUAUGAUCGUUUCUU | AAGAAACGAUCAUACUGAA |
212 | 213 | 928-946 | AD-55091.2 | UCAGUAUGAUCGUUUCUUU | AAAGAAACGAUCAUACUGA |
214 | 215 | 932-950 | AD-55097.2 | UAUGAUCGUUUCUUUGAGA | UCUCAAAGAAACGAUCAUA |
216 | 217 | 973-991 | AD-55103.2 | UGACCACACCUAUCGAGUU | AACUCGAUAGGUGUGGUCA |
218 | 219 | 975-993 | AD-55107.2 | ACCACACCUAUCGAGUUUU | AAAACUCGAUAGGUGUGGU |
220 | 221 | 1029-1047 | AD-55112.2 | UGGCAGAUGACUAUUCAGA | UCUGAAUAGUCAUCUGCCA |
222 | 223 | 1077-1095 | AD-55074.2 | UCUGGUGCAGUAAUGACUA | UAGUCAUUACUGCACCAGA |
224 | 225 | 1124-1142 | AD-55080.2 | UGUGGGGCAGUUAUGGACA | UGUCCAUAACUGCCCCACA |
226 | 227 | 1137-1155 | AD-55086.2 | UGGACACUUUGAAACAACA | UGUUGUUUCAAAGUGUCCA |
228 | 229 | 1182-1200 | AD-55098.2 | AUAUUUCUGGAACUAGUAA | UUACUAGUUCCAGAAAUAU |
230 | 231 | 1184-1202 | AD-55104.2 | AUUUCUGGAACUAGUAAAU | AUUUACUAGUUCCAGAAAU |
232 | 233 | 1185-1203 | AD-55108.2 | UUUCUGGAACUAGUAAAUU | AAUUUACUAGUUCCAGAAA |
234 | 235 | 1188-1206 | AD-55113.2 | CUGGAACUAGUAAAUUCCA | UGGAAUUUACUAGUUCCAG |
236 | 237 | 1325-1343 | AD-55075.2 | UGUGAGAUUUACUCUGAUU | AAUCAGAGUAAAUCUCACA |
238 | 239 | 1364-1382 | AD-55081.2 | AUCCAAGGGAUUCGAAACA | UGUUUCGAAUCCCUUGGAU |
240 | 241 | 1382-1400 | AD-55087.2 | AGCCGAGUGCCAAAGUACA | UGUACUUUGGCACUCGGCU |
242 | 243 | 1478-1496 | AD-55093.2 | UUUGAAACUGUCCAUUCAA | UUGAAUGGACAGUUUCAAA |
244 | 245 | 1531-1549 | AD-55099.2 | UGAUGUGGCCCAUGAGUUU | AAACUCAUGGGCCACAUCA |
246 | 247 | 1631-1649 | AD-53573.3 | GUCAUGCCAAAAAUGGACA | UGUCCAUUUUUGGCAUGAC |
248 | 249 | 1637-1655 | AD-55109.2 | CCAAAAAUGGACAUCAUUU | AAAUGAUGUCCAUUUUUGG |
250 | 251 | 1706-1724 | AD-55114.2 | ACGAGUUCUCUGAUUGACA | UGUCAAUCAGAGAACUCGU |
252 | 253 | 1962-1980 | AD-55076.2 | AAGUCUGUGAUGAACUAAU | AUUAGUUCAUCACAGACUU |
254 | 255 | 1967-1985 | AD-55082.2 | UGUGAUGAACUAAUGAGCA | UGCUCAUUAGUUCAUCACA |
256 | 257 | 1977-1995 | AD-55088.2 | UAAUGAGCAGACAUAACAU | AUGUUAUGUCUGCUCAUUA |
258 | 259 | 2189-2207 | AD-55094.2 | UUUGAAGUGAUGAGUGAAA | UUUCACUCAUCACUUCAAA |
260 | 261 | 2227-2245 | AD-55100.2 | AGGCUUGAGCAAGUUGGUA | UACCAACUUGCUCAAGCCU |
262 | 263 | 2313-2331 | AD-55105.2 | UCUUCAGAGUUGUCUUUAU | AUAAAGACAACUCUGAAGA |
264 | 265 | 2317-2335 | AD-55110.2 | CAGAGUUGUCUUUAUAUGU | ACAUAUAAAGACAACUCUG |
266 | 267 | 2319-2337 | AD-55115.2 | GAGUUGUCUUUAUAUGUG А | UCACAUAUAAAGACAACUC |
268 | 269 | 2320-2338 | AD-55077.2 | AGUUGUCUUUAUAUGUGA А | UUCACAUAUAAAGACAACU |
270 | 271 | 2344-2362 | AD-55083.2 | UUAUAUUAAAUUUUAAUCU | AGAUUAAAAUUUAAUAUAA |
272 | 273 | 2352-2370 | AD-55089.2 | AAUUUUAAUCUAUAGUAAA | UUUACUAUAGAUUAAAAUU |
274 | 275 | 2353-2371 | AD-55095.2 | AUUUUAAUCUAUAGUAAAA | UUUUACUAUAGAUUAAAAU |
105 036477
276 | 277 | 2376-2394 | AD-55101.2 | AGUCCUGGAAAUAAAUUCU | AGAAUUUAUUUCCAGGACU |
278 | 279 | 358-376 | AD-53511.1 | CUGCCCAUUCUUAUCCCGA | UCGGGAUAAGAAUGGGCAG |
280 | 281 | 789-807 | AD-53512.1 | CCAGUGUGGUUAGUGUGAA | UUCACACUAACCACACUGG |
282 | 283 | 1076-1094 | AD-53513.1 | GUCUGGUGCAGUAAUGACU | AGUCAUUACUGCACCAGAC |
284 | 285 | 1253-1271 | AD-53514.1 | GCACUCUUGUUUUCCUCGU | ACGAGGAAAACAAGAGUGC |
286 | 287 | 1544-1562 | AD-53515.1 | GAGUUUGGAGCAAUCACCU | AGGUGAUUGCUCCAAACUC |
288 | 289 | 2228-2246 | AD-53516.1 | GGCUUGAGCAAGUUGGUAU | AUACCAACUUGCUCAAGCC |
290 | 291 | 404-422 | AD-53517.1 | GGCAAAUCUCUGUUGUUCU | AG AACAACAG AGAU U UG СС |
292 | 293 | 404-422 | AD-53517.1 | GGCAAAUCUCUGUUGUUCU | AG AACAACAG AGAU U UG СС |
294 | 295 | 866-884 | AD-53518.1 | CAAAGACCAGAAAGAGUGU | ACACUCUUUCUGGUCUUUG |
296 | 297 | 1080-1098 | AD-53519.1 | GGUGCAGUAAUGACUACCU | AGGUAGUCAUUACUGCACC |
298 | 299 | 1258-1276 | AD-53520.1 | CUUGUUUUCCUCGUGCUUU | AAAGCACGAGGAAAACAAG |
300 | 301 | 1616-1634 | AD-53521.1 | GGGGAUCGGGAUGGAGUCA | UGACUCCAUCCCGAUCCCC |
302 | 303 | 2230-2248 | AD-53522.1 | CUUGAGCAAGUUGGUAUCU | AGAUACCAACUUGCUCAAG |
304 | 305 | 436-454 | AD-53523.1 | CCCCAAGAUGAUGGAAGUU | AACUUCCAUCAUCUUGGGG |
306 | 307 | 436-454 | AD-53523.1 | CCCCAAGAUGAUGGAAGUU | AACUUCCAUCAUCUUGGGG |
308 | 309 | 885-903 | AD-53524.1 | CUCAUCUUCUUCAAGAUAA | UUAUCUUGAAGAAGAUGAG |
310 | 311 | 1127-1145 | AD-53525.1 | GGGGCAGUUAUGGACACUU | AAGUGUCCAUAACUGCCCC |
312 | 313 | 1315-1333 | AD-53526.1 | GAUGCCAGGCUGUGAGAUU | AAUCUCACAGCCUGGCAUC |
314 | 315 | 1870-1888 | AD-53527.1 | GAGACAGAUGCUAAUGGAU | AUCCAUUAGCAUCUGUCUC |
316 | 317 | 2286-2304 | AD-53528.1 | CCCCAGGCCAUUAUCAUAU | AUAUGAUAAUGGCCUGGGG |
318 | 319 | 489-507 | AD-53529.1 | CAGCAGUACACUACCAACA | UGUUGGUAGUGUACUGCU G |
320 | 321 | 489-507 | AD-53529.1 | CAGCAGUACACUACCAACA | UGUUGGUAGUGUACUGCU G |
322 | 323 | 915-933 | AD-53530.1 | CUGUUUCCACUUUUCAGUA | UACUGAAAAGUGGAAACAG |
324 | 325 | 1138-1156 | AD-53531.1 | GGACACUUUGAAACAACAU | AUGUUGUUUCAAAGUGUCC |
326 | 327 | 1324-1342 | AD-53532.1 | CUGUGAGAUUUACUCUGAU | AUCAGAGUAAAUCUCACAG |
328 | 329 | 1927-1945 | AD-53533.1 | CCCUGUGCGGGUUGCAGAU | AU CU G CAACCCG САСAG G G |
330 | 331 | 2312-2330 | AD-53534.1 | GUCUUCAGAGUUGUCUUUA | UAAAGACAACUCUGAAGAC |
332 | 333 | 646-664 | AD-53535.1 | CACUGCAAGCAAAUGCCCU | AGGGCAUUUGCUUGCAGUG |
334 | 335 | 922-940 | AD-53536.1 | CACUUUUCAGUAUGAUCGU | ACGAUCAUACUGAAAAGUG |
336 | 337 | 1163-1181 | AD-53537.1 | GGGGCAGGUGGUACUAGAA | UUCUAGUACCACCUGCCCC |
338 | 339 | 1347-1365 | AD-53538.1 | GGAACCAUGCCUCCAUGAU | AUCAUGGAGGCAUGGUUCC |
340 | 341 | 1964-1982 | AD-53539.1 | GUCUGUGAUGAACUAAUGA | UCAUUAGUUCAU СACAG АС |
342 | 343 | 2321-2339 | AD-53540.1 | GUUGUCUUUAUAUGUGAA и | AUUCACAUAUAAAGACAAC |
344 | 345 | 671-689 | AD-53541.1 | GCAGCACAGAUGAAUCAGA | UCUGAUUCAUCUGUGCUGC |
346 | 347 | 924-942 | AD-53542.1 | CUUUUCAGUAUGAUCGUUU | AAACGAUCAUACUGAAAAG |
348 | 349 | 1164-1182 | AD-53543.1 | GGGCAGGUGGUACUAGAAA | UUUCUAGUACCACCUGCCC |
350 | 351 | 1460-1478 | AD-53544.1 | GUCCCCAAGAUUGUGGCAU | AUGCCACAAUCUUGGGGAC |
352 | 353 | 1976-1994 | AD-53545.1 | CUAAUGAGCAGACAUAACA | UGUUAUGUCUGCUCAUUAG |
354 | 355 | 786-804 | AD-53546.1 | GCCCCAGUGUGGUUAGUGU | ACACUAACCACACUGGGGC |
356 | 357 | 935-953 | AD-53547.1 | GAUCGUUUCUUUGAGAAAA | UUUUCUCAAAGAAACGAUC |
358 | 359 | 1165-1183 | AD-53548.1 | GGCAGGUGGUACUAGAAAU | AUUUCUAGUACCACCUGCC |
360 | 361 | 1530-1548 | AD-53549.1 | GUGAUGUGGCCCAUGAGUU | AACUCAUGGGCCACAUCAC |
362 | 363 | 2003-2021 | AD-53550.1 | CAAGCAAUCAAUUACCCUA | UAGGGUAAUUGAUUGCUU G |
364 | 365 | 788-806 | AD-53551.1 | CCCAGUGUGGUUAGUGUGA | UCACACUAACCACACUGGG |
366 | 367 | 974-992 | AD-53552.1 | GACCACACCU AUCG AG U U U | AAACUCGAUAGGUGUGGUC |
368 | 369 | 1191-1209 | AD-53553.1 | GAACUAGUAAAUUCCAUGU | ACAUGGAAUUUACUAGUUC |
370 | 371 | 1541-1559 | AD-53554.1 | CAUGAGUUUGGAGCAAUCA | UGAUUGCUCCAAACUCAUG |
372 | 373 | 2075-2093 | AD-53555.1 | CCCCAGAUGAUGAACUACU | AGUAGUUCAUCAUCUGGGG |
374 | 375 | 360-378 | AD-53561.1 | GCCCAUUCUUAUCCCGAGU | ACUCGGGAUAAGAAUGGGC |
376 | 377 | 1356-1374 | AD-53567.1 | CCUCCAUGAUCCAAGGGAU | AUCCCUUGGAUCAUGGAGG |
378 | 379 | 1631-1649 | AD-53573.1 | GUCAUGCCAAAAAUGGACA | UGUCCAUUUUUGGCAUGAC |
380 | 381 | 1634-1652 | AD-53579.1 | AUGCCAAAAAUGGACAUCA | UGAUGUCCAUUUUUGGCAU |
Пример 3. In vitro скрининг дуплексов siRNA ALAS1 в отношении нокдауна активности ALAS1.
Дуплексы siRNA ALAS1 подвергали скринингу в отношении способности снижать экспрессию ALAS1 in vitro.
In vitro скрининг
Клеточная культура и трансфекции
Клетки Нер3В (АТСС, Манассас, Вирджиния) выращивали практически до слияния при 37°С в атмосфере 5% СО2 в MEM (АТСС), дополненной 10% FBS, до отделения от чашки Петри путем обработки трипсином. Трансфекцию выполняли путем добавления 14,8 мкл Opti-MEM с 0,2 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по кат. 13778-150) к 5 мкл дуплексов siRNA на лунку в 96-луночном планшете и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. 80 мкл
106 036477 полных питательных сред, содержащих ~2х104 клеток НерЗВ, затем добавляли к смеси siRNA. Клетки инкубировали в течение либо 24 либо 120 ч перед очисткой РНК. Эксперименты с использованием разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 10 нМ и 0,1 нМ, а эксперименты в отношении зависимости эффекта от дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 10, 1,67, 0,27, 0,046,
0,0077, 0,0013, 0,00021, 0,00004 нМ.
Выделение общей РНК с использованием набора DYNABEADS mRNA Isolation Kit (Invitrogen, № по кат. 610-12)
Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем смешивали в течение 5 мин при 850 об./мин с помощью Eppendorf Thermomixer (скорость смешивания была одинаковой на протяжении процесса). Десять микролитров магнитных гранул и 80 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера добавляли в круглодонный планшет и смешивали в течение 1 мин. Магнитные гранулы фиксировали при помощи магнитного стенда и супернатант удаляли без смещения гранул. После удаления супернатанта лизированные клетки добавляли к оставшимся гранулам и смешивали в течение 5 мин. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и смешивали в течение 1 мин. Гранулы опять фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл промывочного буфера В, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл элюирующего буфера, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулам давали возможность высохнуть в течение 2 мин. После высыхания добавляли 50 мкл элюирующего буфера и смешивали в течение 5 мин при 70°С. Гранулы фиксировали на магните на 5 мин. Удаляли 40 мкл супернатанта и добавляли в другой 96-луночный планшет.
Синтез cDNA с использованием набора ABI High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813)
Мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл Н2О на реакцию добавляли в 10 мкл общей РНК. cDNA получали с использованием термоциклера Bio-Rad С-1000 или S-1000 (Hercules, Калифорния) посредством следующих стадий: 25°С 10 мин, 37°С 120 мин, 85°С 5 с, хранение при 4°С.
PCR в режиме реального времени мкл cDNA добавляли к мастер-миксу, содержащему 0,5 мкл зонда TaqMan для GAPDH (Applied Biosystems, № по кат. 4326317Е), 0,5 мкл зонда TaqMan для ALAS1 (Applied Biosystems, № по кат. Hs00167441_m1) и 5 мкл мастер-микса с зондом Lightcycler 480 (Roche, № по кат. 04887301001) на лунку в 384-луночные планшеты (Roche, № по кат. 04887301001). PCR в режиме реального времени выполняли в системе Roche LC480 Real Time PCR system (Roche) с применением ΔΔCt(RQ)-анализа. Каждый дуплекс исследовали при двух независимых трансфекциях с двумя биологическими повторами каждый и каждую трансфекцию оценивали в двух параллельных испытаниях, если не указано иное в итоговых таблицах.
Для вычисления относительного кратного изменения данные в реальном времени анализировали с применением ΔΔCt-способа и нормализовали в соответствии с таковыми анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или имитационными трансфицированными клетками. IC50 вычисляли с применением модели согласования по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали в соответствии с данными для клеток, трансфицированных AD-1955, или наивных клеток в таком же диапазоне доз или в отношении его наиболее низкой дозы.
In vitro нокдаун эндогенной экспрессии ALAS1 дуплексами siRNA ALAS1
В табл. 4 показан нокдаун ALAS1 в клетках Нер3В с помощью модифицированных ALAS1 дуплексов siRNA (см. табл. 2). Сайленсинг выражали в виде доли оставшегося транскрипта РНК относительно отрицательного контроля (с люциферазой) siRNA AD-1955. Данные получали, как описано выше, после трансфекции 10 или 0,1 нМ каждой siRNA. qPCR проводили с использованием зонда TaqMan ALAS1 Hs00167441 m1.
- 107 036477
Таблица 4. Экспрессия ALAS1 в клетках НерЗВ после трансфекции siRNA ALAS1 I ID дуплекса | 10 нМ, | ОД нМ, | 10 нМ, STDEV | ОД нМ, STDEV |
средн. | средн. | |||
AD-55078.2 | 0,7 | 0,87 | 0,001 | 0,089 |
AD-55084.2 | 0,08 | 0,3 | 0 | 0,04 |
AD-55090.2 | 0,06 | 0,08 | 0,002 | 0,003 |
AD-55096.2 | 0,61 | 0,92 | 0,171 | 0,34 |
AD-55102.2 | 0,63 | 0,62 | 0,005 | 0,069 |
AD-551O6.2 | 0,07 | 0,08 | 0,004 | 0,027 |
AD-55111.2 | 0,06 | 0,23 | 0,013 | 0,062 |
AD-55073.2 | 0,21 | 0,4 | 0,018 | 0,061 |
AD-55079.2 | 0,17 | 0,43 | 0,033 | 0,089 |
AD-55085.2 | 0,13 | 0,21 | 0,011 | 0,019 |
AD-55091.2 | 0,27 | 0,55 | 0,033 | 0,009 |
AD-55097.2 | 0,31 | 0,38 | 0,051 | 0,059 |
AD-55103.2 | 0,05 | 0,11 | 0,017 | 0,006 |
AD-55107.2 | 0,12 | 0,24 | 0,007 | 0,008 |
AD-55112.2 | 0,15 | 0,2 | 0,036 | 0,025 |
AD-55074.2 | 0,16 | 0,45 | 0,008 | 0,002 |
AD-55080.2 | 0,79 | 0,99 | 0,095 | 0,304 |
AD-55086.2 | 0,09 | 0,22 | 0,005 | 0,035 |
AD-55098.2 | 0,25 | 0,51 | 0,03 | 0,07 |
AD-55104.2 | 0,06 | од | 0,017 | 0,001 |
AD-55108.2 | 0,47 | 0,65 | 0,03 | 0,015 |
AD-55113.2 | 0,38 | 0,62 | 0,068 | 0,039 |
AD-55075.2 | 0,12 | 0,28 | 0,007 | 0,051 |
AD-55081.2 | 0,21 | 0,51 | 0,036 | 0,066 |
AD-55087.2 | од | 0,19 | 0,017 | 0,02 |
AD-55093.2 | 0,24 | 0,56 | 0,029 | 0,053 |
AD-55099.2 | 0,05 | 0,18 | 0,001 | 0,038 |
AD-53573.3 | 0,67 | 1,07 | 0,16 | 0,153 |
AD-55109.2 | 0,07 | 0,23 | 0,006 | 0,052 |
AD-55114.2 | 0,08 | 0,16 | 0,004 | 0,017 |
AD-55076.2 | 0,05 | 0,14 | 0,007 | 0,035 |
AD-55082.2 | 0,08 | 0,3 | 0,019 | 0,016 |
AD-55088.2 | 0,06 | 0,12 | 0,008 | 0,02 |
AD-55094.2 | 0,06 | 0,18 | 0,005 | 0,023 |
AD-55100.2 | 0,45 | 0,83 | 0,02 | 0,05 |
AD-55105.2 | 0,02 | 0,05 | 0,005 | 0,004 |
AD-55110.2 | 0,15 | 0,19 | 0,031 | 0,016 |
AD-55115.2 | 0,35 | 0,58 | 0,045 | 0,052 |
- 108 036477
AD-55077.2 | 0,14 | 0,14 | 0,006 | 0,019 |
AD-55083.2 | 0,56 | 0,98 | 0,24 | 0,188 |
AD-55089.2 | 0,62 | 0,79 | 0,036 | 0,094 |
AD-55095.2 | 0,59 | 0,92 | 0,12 | 0,079 |
AD-55101.2 | 0,71 | 0,97 | 0,074 | 0,097 |
AD-1955 | 1,00 | 1,01 | 0,03 | 0,04 |
AD-53511.1 | 0,84 | 1,08 | 0,028 | 0,0515 |
AD-53512.1 | 0,15 | 0,65 | 0,062 | 0,023 |
AD-53513.1 | 0,34 | 0,86 | 0,055 | 0,011 |
AD-53514.1 | 0,12 | 0,61 | 0,003 | 0,008 |
AD-53515.1 | 0,25 | 0,66 | 0,005 | 0,004 |
AD-53516.1 | 1,05 | 1,02 | 0,032 | 0,011 |
AD-53517.1 | 0,145 | 0,725 | 0,025 | 0,0155 |
AD-53518.1 | 0,72 | 0,85 | 0,045 | 0,028 |
AD-53519.1 | 0,18 | 0,66 | 0,061 | 0,004 |
AD-53520.1 | 0,18 | 0,9 | 0,041 | 0,001 |
AD-53521.1 | 0,97 | 1,07 | 0,01 | 0,003 |
AD-53522.1 | 0,87 | 1,1 | 0,065 | 0,112 |
AD-53523.1 | 0,48 | 0,96 | 0,0305 | 0,0255 |
AD-53524.1 | 0,11 | 0,66 | 0,02 | 0,006 |
AD-53525.1 | 0,71 | 1,03 | 0,016 | 0,01 |
AD-53526.1 | 0,23 | 0,85 | 0,075 | 0,01 |
AD-53527.1 | 0,25 | 0,83 | 0,015 | 0,017 |
AD-53528.1 | 0,44 | 0,93 | 0,037 | 0,006 |
AD-53529.1 | 0,185 | 0,73 | 0,015 | 0,014 |
AD-53530.1 | 0,1 | 0,62 | 0,02 | 0,003 |
AD-53531.1 | 0,48 | 0,93 | 0,019 | 0,045 |
AD-53532.1 | 0,06 | 0,17 | 0 | 0,003 |
AD-53533.1 | 0,36 | 0,93 | 0,025 | 0,034 |
AD-53534.1 | 0,1 | 0,36 | 0,014 | 0,012 |
AD-53535.1 | 0,58 | 1,05 | 0,036 | 0,071 |
AD-53536.1 | 0,12 | 0,45 | 0,009 | 0,026 |
AD-53537.1 | 0,73 | 0,96 | 0,101 | 0,015 |
AD-53538.1 | 0,74 | 1,07 | 0 | 0,046 |
AD-53539.1 | 0,52 | 0,97 | 0,057 | 0,032 |
AD-53540.1 | 0,1 | 0,47 | 0,017 | 0,012 |
AD-53541.1 | 0,11 | 0,29 | 0,026 | 0,015 |
AD-53542.1 | 0,08 | 0,23 | 0,008 | 0,006 |
AD-53543.1 | 0,62 | 1,01 | 0,027 | 0,014 |
AD-53544.1 | 0,8 | 1,04 | 0,002 | 0,001 |
AD-53545.1 | 0,17 | 0,73 | 0,007 | 0,007 |
AD-53546.1 | 0,27 | 0,93 | 0,058 | 0,019 |
AD-53547.1 | 0,12 | 0,28 | 0,008 | 0,01 |
AD-53548.1 | 0,1 | 0,34 | 0,022 | 0,002 |
AD-53549.1 | 0,8 | 1,04 | 0,011 | 0,026 |
AD-5355O.1 | 0,05 | 0,54 | 0,02 | 0,003 |
AD-53551.1 | 0,96 | 1,16 | 0,029 | 0,044 |
AD-53552.1 | 0,13 | 0,5 | 0,002 | 0,009 |
AD-53553.1 | 0,92 | 1,1 | 0,027 | 0,02 |
AD-53554.1 | 0,76 | 0,67 | 0,005 | 0,004 |
AD-53555.1 | 0,11 | 0,53 | 0,009 | 0,007 |
AD-53561.1 | 0,72 | 0,94 | 0,014 | 0,001 |
AD-53567.1 | 0,16 | 0,66 | 0,019 | 0,003 |
AD-53573.1 | 1,06 | 1,10 | 0,019 | 0,037 |
AD-53579.1 | 0,19 | 0,76 | 0,036 | 0,019 |
IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS1 в in vitro скрининге
В табл. 5 показаны IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS1, определенные в результате нокдауна эндогенно экспрессируемой ALAS1 в клеточной линии Нер3В с помощью модифицированных ALAS1 дуплексов siRNA (см. табл. 2). Данные были получены, как описано выше, через 24 или 120 ч после трансфекции каждого дуплекса siRNA. В этом примере сайленсинг ALAS1 выражают в виде доли оставшегося транскрипта mRNA относительно siRNA AD-1955, нецелевой siRNA, которую использовали в качестве отрицательного контроля. Данные из повторных экспериментов по трансфекции использовали
- 109 036477 для приведения в соответствие одиночной линии для определения IC50. Несколько из дуплексов (например, AD-53541.1, AD-53542.1 и AD-53547.1) характеризовались IC50 до приблизительно 0,03 нМ через 24 ч. Многие дуплексы характеризовались IC50 до 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53536.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53548.1, AD-53550.1, AD-53552.1) через 24 часа, и некоторые из них также характеризовались IC50 ДО 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD53542.1, AD-53547.1, AD-53552.1) через 120 ч.
Таблица 5. IC50 выбранных дуплексов siRNA ALAS1, нормализованных относительно AD-1955
1С50(нМ) | ||
ID дуплекса | 24 часа | 120 часов |
AD-53534.1 | 0,045 | 0,076 |
AD-53536.1 | 0,049 | 0,105 |
AD-53540.1 | 0,054 | 0,077 |
AD-53541.1 | 0,032 | 0,062 |
AD-53542.1 | 0,028 | 0,093 |
AD-53547.1 | 0,03 | 0,062 |
AD-53548.1 | 0,044 | 0,101 |
AD-53550.1 | 0,085 | 0,152 |
AD-53552.1 | 0,077 | 0,063 |
AD-53567.1 | 0,219 | 0,357 |
AD-53579.1 | 0,217 | 0,566 |
Пример 4. In vivo сайленсинг с применением siRNA ALAS1 мыши/крысы, находящейся в составе в виде LNP
Последовательности модифицированных дуплексов AD-53558 показаны ниже в табл. 6.
Таблица 6. Последовательности дуплекса siRNA ALAS1 AD-53558.4
SEQID NO: (смысловая) | SEQID NO: (антисмысловая) | Исходное положение на транскрипте NM_ 020559.2 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
383 | 384 | 1184 | AD-53558 | cuGuGAAAuuu AcucuGAudTsdT | AUcAGAGuAAA UUUcAcAGdTsdT |
Данный дуплекс помещали в состав в виде состава LNP11 (см. табл.10 выше). siRNA AD-53558, находящуюся в составе LNP, исследовали in vivo у мышей (N=25 животных; 5 животных на группу) и крыс (N=20 животных; 4 животных на группу) и было доказано, что она in vivo подвергает сайленсингу mRNA ALAS1. Результаты показаны на фиг. 5 и фиг. 6.
На фиг. 5 показано, что у мышей siRNA характеризовалась эффектом доза-ответ. Экспрессия mRNA ALAS1 (mALAS1) мыши снижалась приблизительно на 78%, когда siRNA вводили в количестве 1 мг/кг; mRNA ALAS1 мыши снижалась приблизительно на 60%, когда siRNA вводили в количестве 0,3 мг/кг и mRNA ALAS1 мыши снижалась приблизительно на 49%, когда siRNA вводили в количестве 0,1 мг/кг. Эти снижения выражали относительно контроля PBS. Также использовали контроль AD-1955 LUC, как показано на фиг. 5.
Аналогично, на фиг. 6 показано, что у крыс siRNA характеризовалась эффектом доза-ответ. Экспрессия mRNA ALAS1 крысы снижалась приблизительно на 70%, когда siRNA вводили в количестве 1 мг/кг; mRNA ALAS1 снижалась приблизительно на 62%, когда siRNA вводили в количестве 0,3 мг/кг, и mRNA ALAS1 снижалась приблизительно на 34%, когда siRNA вводили в количестве 0,1 мг/кг.
Также исследовали длительность сайленсинга у мышей (N=15; 3 животных на временную точку). Результаты показаны на фиг. 7, на которой показано, что AD-53558 подавлял mRNA mALAS1 приблизительно на 80% в течение по меньшей мере 9 дней. Подавление по меньшей мере на 50% сохранялось по меньшей мере в течение 14 дней.
Пример 5. Эффективность siRNA ALAS1 на мышиной модели AIP
Эффекты состава LNP11 с AD-53558 (siRNA ALAS1 мыши/крысы, описанная в предыдущем примере) исследовали на мышиной модели AIP. PBGD нокаут является нежизнеспособным (-/-, 0% активности). Гетерозиготные PBGD нокаутированные мыши (+/-, ~50% активности) способны иметь, но не имеют полный биохимический фенотип и, таким образом, не повторяют фенотип заболевания человека. В связи с этим была разработана мышиная модель AIP, которая представляет собой сложную гетерозиготу с аллелями Т1/Т2, включая нарушение промотора Т1 (+/-) и изменение сайта сплайсинга Т2 (-/-). Было показано, что эти мыши характеризуются остаточной активностью PBGD в печени, которая составляет приблизительно ~30% от уровня дикого типа и нормальными или незначительно повышенными исходными уровнями ALA и PBG в плазме. Было обнаружено, что мыши имеют нормальный вид в ранний период жизни, а с возрастом становятся несколько более вялыми и атаксичными. При медико
- 110 036477 патологическом исследовании было отмечено, что к возрасту шести месяцев у мышей развивались нарушенная координация движений и мышечная работа, а также дегенерация аксонов. Исследование патологии мышиной модели показало дегенерацию аксонов, нарушенную координацию движений и мышечную работу у более старых мышей. Было обнаружено, что уровни ALA и PBG в моче и плазме заметно повышаются при последовательном интраперитонеальном введении фенобарбитала (см. Lindberg et al., (1996), Nature Genetics, 12:195-219 и Lindberg et al., (1999), Journal of Clinical Investigation, 103:1127-34). Мышей восстанавливали при помощи AAV-опосредованной экспрессии PBGD в печени (Yasuda et al. (2010), Molecular Medicine, 1:17-22 и Unzu et al. (2011), Molecular Medicine, 2:243-50).
Ha 1 день мышам вводили 1 мг/кг siRNA ALAS1 (n=5) или контрольного LUC AD-1955 (n=3) путем внутривенной инъекции. Вводили три инъекции фенобарбитала (1 инъекция в сутки на 2, 3 и 4 дни) для индукции ALAS1 в печени и предшественников порфирина, ALA и PBG. Образцы плазмы и ночной мочи собирали на 5 день, а уровни метаболитов измеряли при помощи LC-MS. Уровни метаболитов измеряли в плазме при помощи LC-MS и также измеряли в моче. Исходные уровни метаболитов измеряли перед первой обработкой на 1 день. Результаты показаны на фиг. 8-12 и в табл.12 и 13.
На фиг. 8 и 9 показаны уровни ALA в плазме в мкМ. Исходные уровни ALA были низкими (n=4), а обработка фенобарбиталом индуцировала значимые повышения уровней ALA в плазме у контрольных животных, обработанных siRNA LUC (n=3). Обработка siRNA ALAS1 ингибировала индукцию ALA в плазме (n=5), как показано на фиг. 8. siRNA ALAS1 была неизменно эффективной при блокировании индукции ALA в плазме у каждого из отдельных изученных животных (см. фиг. 9). Данные результаты указывают на то, что обработка siRNA ALAS1 была эффективной в предупреждении повышений уровня ALA в плазме, связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели AIP.
На фиг. 10 и 11 показаны уровни PBG в плазме в мкМ. Исходные уровни PBG были низкими (n=4), а обработка фенобарбиталом индуцировала значимые повышения уровней PBG у контрольных животных, обработанных siRNA LUC (n=3). Обработка siRNA ALAS1 ингибировала индукцию PBG в плазме (n=5), как показано на фиг. 10. siRNA ALAS1 была неизменно эффективной при блокировании индукции PBG в плазме у каждого из отдельных изученных животных (см. фиг. 11). Данные результаты указывают на то, что обработка siRNA ALAS1 была эффективной в предупреждении повышений уровня PBG в плазме, связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели AIP.
В табл. 12 и 13 показаны уровни ALA и PBG в моче на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у контрольных животных, обработанных siRNA LUC (n=2) (CTR, которая относится к животному, обработанному PBS буфером, n=1), и животных, обработанных siRNA ALAS1 (n=5).
Таблица 12. Данные по образцам мочи от отдельных животных, показывающие предупреждение индуцированного острого приступа
ID мыши | ALA (микро М/л) | PBG (микро М/л) | Креатинин (мг/дл) | ALA (микроМ/мг креатинина) | PBG (микроМ/мг креатинина) | siRNA | РВ |
На-17-4-6 | 29,7 | 7,9 | Исходный уровень | - | |||
На-19-5-4/2 | 15,7 | 5,1 | Исходный уровень | - | |||
На-20-394/3 | 28,6 | 6,7 | Исходный уровень | - | |||
На-20-38-4 | 21,4 | 4,7 | Исходный уровень | - | |||
На-21-33-4 | 934,92 | 483,71 | 0,4205 | 222,33 | 115,03 | Luc | + |
На-21-36-9 | 944,08 | 563,53 | 0,5055 | 186,76 | 111,48 | Luc | + |
На-21-18-8 | 32,88 | 8,69 | 0,133 | 24,72 | 6,53 | ALAS1; 1 мг/кг | + |
На-21-33-7 | 83,07 | 23,28 | 0,426 | 19,50 | 5,46 | ALAS1; 1 мг/кг | + |
На-21-34-5 | 59,15 | 18,41 | 0,263 | 22,49 | 7,00 | ALAS1; 1 мг/кг | + |
РВ означает фенобарбитал. А + указывает, что вводили фенобарбитал.
Таблица 13. Средние данные по образцам мочи
Состояние | Среднее значение ALA (микроМ/мг креатинина) | Среднее значение PBG (микроМ/мг креатинина) |
Исходный уровень AIP | 23,8 | 6,1 |
Luc-siRNA | 204,55 | 113,26 |
ALAS1-siRNA | 22,24 | 6,33 |
Обработка фенобарбиталом индуцировала сильные повышения (~25-30-кратные повышения) ALA (~9-кратное по сравнению с исходными уровнями) и PBG (~ 19-кратное по сравнению с исходными уровнями) в моче у мышей, обработанных siRNA LUC, т.е. контроле, в то время как такие повышения не наблюдались у животных, обработанных siRNA ALAS1. Таким образом, siRNA ALAS1 блокировала индуцированные фенобарбиталом повышения уровней ALA и PBG в моче. Данные результаты согласуются с измерениями в плазме и показывают, что обработка siRNA ALAS1 была эффективной в предупреждении
- 111 036477 повышений уровней метаболитов в моче (ALA и PBG), связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели AIP.
В дополнительных экспериментах (фиг. 12) было обнаружено, что обработка фенобарбиталом индуцировала большие повышения (~25-кратные) экспрессии mRNA ALAS1 в печени в мышиной модели. Введение siRNA ALAS1 полностью блокировало эту индукцию mRNA ALAS1. Данные результаты представляют дополнительное доказательство того, что siRNA ALAS1 является эффективной в животной модели AIP.
В обобщенном смысле из результатов, представленных в этом примере, видно, что siRNA ALAS1 является эффективной в лечении острых приступов в животной модели острой печеночной порфирии, AIP. Измерения нескольких результатов подтверждают это заключение, в том числе уровни ALA в плазме, уровни PBG в плазме, уровни ALA в моче, уровни PBG в моче и уровни экспрессии mRNA ALAS1 в печени.
Пример 6. In vivo сайленсинг при помощи конъюгированных с GalNAc siRNA ALAS1 мыши
В экспериментах, описанных в этом примере, исследовали in vivo эффективность трех конъюгированных с GalNAc siRNA (см. табл.7). Эти siRNA конструировали и получали при помощи способов, таких как описанные в примере 2.
Таблица 7. Последовательности AD-57929
SEQID NO: (смысл овая) | SEQIDNO: (антисмыс ловая) | Положение смысловой последователь | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') | Положение антисмысловой последовательности на транскрипте |
ности на транскрипте NM_ 020559.2 | NM_ 020559.2 | |||||
385 | 386 | 775-795 | AD-56211 | AfaGfuCfuGfuUfUfCfc AfcUfuUfuCfaAfL96 | uUfgAfaAfaGfuGfgaa AfcAfgAfcUfusUfsg | 773-795 |
387 | 388 | 2168-2188 | AD-56173 | AfcAfuAfgUfaGfCfCfa GfaAfuUfgUfcUfL96 | aGfaCfaAfuUfcUfggc UfaCfuAfuGfusGfsg | 2166-2188 |
389 | 390 | 775-795 | AD-57929 | AfsasGfuCfuGfuUfUfC fcAfcUfuUfuCfaAfL96 | usUfsgAfaAfaGfuGfga aAfcAfgAfcUfususg | 773-795 |
Мышей (n=40; n=4 на экспериментальное условие) разделяли на группы, которые получали PBS или дозы по 3 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг siRNA, вводимые подкожно. Уровень mRNA mALAS1/mGAPDH относительно контроля PBS определяли в клетках печени через 72 часа после введения. Результаты показаны на фиг. 13. Наблюдался нечеткий эффект доза-ответ для siRNA AD-56211 и AD56173. В отличие от этого, siRNA ALAS1 AD-57929 проявил эффект доза-ответ при ингибировании экспрессии mALAS1. По данным результатам видно, что конъюгат GalNAc с ALAS1 был эффективным при ингибировании экспрессии mRNA ALAS1 in vivo и проявлял эффект доза-ответ.
Пример 7. siRNA человека
Дополнительные siRNA человека конструировали и получали, как описано в примере 2. Лучшие 45 siRNA отбирали на основании их прогнозируемой эффективности. Последовательности из этих 45 siRNA представлены в табл. 8 и при этом прилагается перечень последовательностей (например, смысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с нечетным номером, идентифицированных под SEQ ID NO: 391-551, и антисмысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с четным номером, идентифицированных под SEQ ID NO: 392-552 соответственно). Табл. 8 раскрыта в международной публикации № WO 2013/155204A2. Содержимое WO 2013/155204 и перечень последовательностей, в том числе таблица 8, явным образом включены при помощи ссылки.
Пример 8. siRNA человека
Получали дополнительные siRNA человека из 19 нуклеотидов. Последовательности из этих siRNA представлены в табл. 9 и при этом прилагается перечень последовательностей (например, смысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с нечетным номером, идентифицированных под SEQ ID NO: 553-3365, и антисмысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с четным номером, идентифицированных под SEQ ID NO: 554-3366 соответственно). Табл. 9 раскрыта в международной публикации № WO 2013/155204A2. Содержимое WO 2013/155204 и перечень последовательностей, в том числе табл. 9, явным образом включены при помощи ссылки. Эти siRNA можно исследовать в отношении эффективности с помощью способов, описанных в данном документе, и/или способов, известных из уровня техники.
Пример 9. Подавление предшественников порфиринов при помощи siRNA ALAS1 при парадигме неотложного лечения
Мышиную модель AIP (см. пример 5) использовали для исследования того, будет ли siRNA ALAS1 функционировать в качестве парадигмы неотложного лечения для снижения уже повышенных уровней
- 112 036477
ALA и PBG, которые бы присутствовали, например, когда пациент-человек с порфирией испытывает острый приступ. Введение siRNA состава LNP11 с AD-53558 в количестве 1 мг/кг через 12 ч после последней дозы фенобарбитала быстро снижало уровни как ALA, так и PBG в плазме мышей, в то время как у контрольных животных, обработанных Luc, уровни продолжали расти (фиг. 14). Эти результаты указывали на то, что siRNA ALAS является эффективной для лечения острого приступа. siRNA ALAS1 была эффективной для снижения и предупреждения дальнейших повышений уровней ALA и PBG.
Как можно видеть на фиг. 14, siRNA ALAS характеризовалась быстрым началом действия в снижении уровней ALA и PBG. Начало действия происходило в течение нескольких часов после введения siRNA. Эффект на уровень ALA в плазме мог наблюдаться в течение 4 ч после введения siRNA (см. фиг. 14; siRNA вводили через 12 ч после последней дозы фенобарбитала, а снижение уровня ALA в плазме относительно контроля можно было наблюдать через 16 ч после последней дозы фенобарбитала). Эффект на уровень PBG в плазме мог наблюдаться в течение 8 ч после введения siRNA (см. фиг. 14; siRNA вводили через 12 ч после последней дозы фенобарбитала, а снижение уровня ALA в плазме относительно контроля можно было наблюдать через 20 ч после последней дозы фенобарбитала).
Пример 10. siRNA, которые нацелены на ALAS1
Конструировали дополнительные немодифицированные и модифицированные последовательности siRNA, которые нацеливают siRNA ALAS1, и получали их, как описано в примере 2. Активность in vitro модифицированных дуплексов исследовали, как описано ниже.
Способы Опосредованная липидами трансфекция
Для Нер3В, РМН и первичных гепатоцитов Cynomolgus трансфекцию выполняли путем добавления 14,8 мкл Opti-MEM с 0,2 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по кат. 13778-150) к 5 мкл каждого дуплекса siRNA в отдельной лунке в 96-луночном планшете. Смесь затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Восемьдесят мкл полных питательных сред без антибиотика, содержащих соответствующее число клеток, затем добавляли к смеси siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК.
Эксперименты в отношении разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса, модифицированного GalNAc, 1 мкМ, 500, 20, 10 и 0,2 нМ.
Трансфекция посредством свободного поглощения
Криоконсервированные первичные гепатоциты Cynomolgus (Celsis In Vitro Technologies, M003055P) размораживали на водяной бане при 37°С непосредственно перед использованием и ресуспендировали в количестве 0,26x106 клеток/мл в среде InVitroGRO СР (с покрытием) (Celsis In Vitro Technologies, № по кат. Z99029). Во время трансфекций клетки помещали в 96-луночный планшет с коллагеном BD BioCoat (BD, 356407) по 25000 клеток на лунку и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. Эксперименты по свободному поглощению выполняли путем добавления 10 мкл дуплексов siRNA в PBS на лунку в 96луночном (96w) планшете. Девяносто мкл полных питательных сред, содержащих соответствующее число клеток для типа клеток, затем добавляли к siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 ч перед очисткой РНК. Эксперименты в отношении разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 1 мкМ, 500, 20 и 10 нМ.
Выделение общей РНК с использованием набора DYNABEADS mRNA Isolation Kit (Invitrogen, № no кат. 610-12)
Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем перемешивали в течение 5 мин при 850 об./мин. с помощью Eppendorf Thermomixer (скорость перемешивания была одинаковой на протяжении процесса). Десять микролитров магнитных гранул и 80 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера добавляли в круглодонный планшет и перемешивали в течение 1 мин. Магнитные гранулы фиксировали при помощи магнитного стенда и супернатант удаляли без смещения гранул. После удаления супернатанта лизированные клетки добавляли к оставшимся гранулам и перемешивали в течение 5 мин. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и перемешивали в течение 1 мин. Гранулы снова фиксировали, а супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл промывочного буфера В, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл элюирующего буфера, фиксировали и супернатант удаляли. В конце гранулы оставляли высыхать в течение 2 мин. После высыхания добавляли 50 мкл элюирующего буфера и смешивали в течение 5 мин при 70°С. Гранулы фиксировали на магните на 5 мин. Удаляли сорок пять мкл супернатанта и добавляли в другой 96-луночный планшет.
Синтез cDNA с использованием набора ABI High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813)
Получали мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл Н2О на реакцию. Равные объемы мастермикса и РНК смешивали для конечного объема в 12 мкл для in vitro отслеживаемых образцов или 20 мкл для in vivo отслеживаемых образцов. cDNA получали с использованием термоциклера Bio-Rad С-1000 или S-1000 (Hercules, Калифорния) посредством следующих стадий: 25°С 10 мин, 37°С 120 мин, 85°С 5 с
- 113 036477 и хранение при 4°С.
PCR в режиме реального времени
Два мкл cDNA добавляли к мастер-миксу, содержащему 2 мкл Н2О, 0,5 мкл зонда TaqMan GAPDH (Life Technologies, № по кат. 4326317Е для клеток Нер3В, № по кат. 352339Е для первичных гепатоцитов мыши или сделанный по индивидуальному заказу зонд для первичных гепатоцитов макак-крабоедов), 0,5 мкл зонда TaqMan C5 (Life Technologies, № по кат. Hs00167441_ml для клеток Нер3В или Mm00457879_m1 для первичных гепатоцитов мыши или сделанный по индивидуальному заказу зонд для первичных гепатоцитов макак-крабоедов) и 5 мкл мастер-микса с зондом Lightcycler 480 (Roche, № по кат. 04887301001) на лунку в 384-луночных (384 w) планшетах (Roche, № по кат. 04887301001). PCR в режиме реального времени выполняли в системе Roche LC480 Real Time PCR system (Roche) с применением ΔΔCt(RQ)-анализа. Для in vitro скрининга каждый дуплекс исследовали с двумя биологическими повторами, если не указано иное, и каждую PCR в реальном времени выполняли с двойными техническими повторами. Для in vivo скрининга каждый дуплекс исследовали в одном или нескольких экспериментах (3 мыши на группу) и каждую PCR в реальном времени выполняли с двойными техническими повторами.
Для вычисления относительного кратного изменения уровней mRNA ALAS1 данные в реальном времени анализировали с применением ΔΔCt-способа и нормализовали в соответствии с таковыми анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или имитационными трансфицированными клетками. IC50 рассчитывали с применением модели согласования по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали в соответствии с данными для клеток, трансфицированных AD-1955, в таком же диапазоне доз или в отношении его наиболее низкой дозы.
Смысловая и антисмысловая последовательности AD-1955 являются такими, которые приведены ниже.
Смысловая: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 3682);
Антисмысловая: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 3683).
Последовательности одиночных нитей и дуплексов модифицированных и немодифицированных siRNA представлены в табл. 14 и 5 соответственно.
- 114 036477
Таблица 14. Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов
ALAS1 человека
SEQID NO: (смысл овая) | SEQ ID NO: (анти смыс лова я) | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') | Целевые сайты антисмысло вой последовате льности NM_ 0006SS.4 |
3371 | 3372 | AD-58848 | CfsasUfgCfcAfaAfAfAfuGfgAfcAfu CfaUfL96 | asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgCfaUf gsAfsc | 1635-1657 |
3373 | 3374 | AD-58849 | AfsusUfuUfgAfaGfUfGfaUfgAfgUf gAfaAfL96 | usUfsuCfaCfuCfaUfcacUfuCfaAfaAfu sGfsc | 2189-2211 |
3375 | 3376 | AD-58850 | Af sgs U f u Af u Af u U f Af Af a UfuUfuAf aUfcUfL96 | asGfsaUfuAfaAfaUfuuaAfuAfuAfaCf usUfsa | 2344-2366 |
3377 | 3378 | AD-58851 | GfscsAfuUfuUfgAfAfGfuGfaUfgAf gUfgAfL96 | us Cfs a Cf u Cf a U f c Af c u u Cf a Af a Af u G f c sAfsg | 2187-2209 |
3379 | 3380 | AD-58852 | GfsasAfcUfaAfuGfAfGfcAfgAfcAfu AfaCfL96 | gsUfsuAfuGfuCfuGfcucAfuUfaGfuUf csAfsu | 1975-1997 |
3381 | 3382 | AD-58853 | AfsasUfgAfcCfaCfAfCfcUfaUfcGfa GfuUfL96 | asAfscUfcGfaUfaGfgugUfgGfuCfaUf usCfsu | 973-995 |
3383 | 3384 | AD-58854 | UfsasAfaUfuUfuAfAfUfcUfaUfaGf uAfaAfL96 | usUfsuAfcUfaUfaGfauuAfaAfaUfuUf asAfsu | 2352-2374 |
3385 | 3386 | AD-58855 | UfsusCfaGfuAfuGfAfUfcGfuUfuCf uUfuGfL96 | csAfsaAfgAfaAfcGfaucAfuAfcUfgAfa sAfsa | 929-951 |
3387 | 3388 | AD-58856 | CfsasCfuUfuUfcAfGfUfaUfgAfuCf gUfuUfL96 | asAfsaCfgAfuCfaUfacuGfaAfaAfgUfg sGfsa | 924-946 |
3389 | 3390 | AD-58857 | AfsasAfuCfuGfuUfUfCfcAfcUfuUf uCfaGfL96 | csUfsgAfaAfaGfuGfgaaAfcAfgAfuUf usUfsg | 913-935 |
3391 | 3392 | AD-58858 | CfsasUfuUfgAfaAfCfUfgUfcCfaUf uCfaAfL96 | usUfsgAfaUfgGfaCfaguUfuCfaAfaUf gsCfsc | 1478-1500 |
3393 | 3394 | AD-58859 | CfscsUfaUfcGfaGfUfUfuUfuAfaAf aCfuGfL96 | csAfsgUfuUfuAfaAfaacUfcGfaUfaGf gsUfsg | 983-1005 |
3395 | 3396 | AD-58861 | GfsasCfcAfgAfaAfGfAfgUfgUfcUfc AfuCfL96 | gsAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfuGfgUf csUfsu | 872-894 |
3397 | 3398 | AD-58862 | AfscsCfaGfaAfaGfAfGfuGfuCfuCfa UfcUfL96 | asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcUfgGf usCfsu | 873-895 |
3399 | 3400 | AD-58863 | AfscsUfaAfuGfaGfCfAfgAfcAfuAfa CfaUfL96 | asUfsgUfuAfuGfuCfugcUfcAfuUfaGf usUfsc | 1977-1999 |
3401 | 3402 | AD-58864 | UfsasGfuAfaAfaAfCfAfuAfgUfcCfu GfgAfL96 | usCfscAfgGfaCfuAfuguUfuUfuAfcUf asUfsa | 2366-2388 |
3403 | 3404 | AD-58865 | UfsasUfuUfcUfgGfAfAfcUfaGfuAf aAfuUfL96 | asAfsuUfuAfcUfaGfuucCfaGfaAfaUf asUfsu | 1185-1207 |
3405 | 3406 | AD-58867 | U fs us Cf u G f c Af a Af G f Cf c Afg U f c U f u GfaGfL96 | csUfscAfaGfaCfuGfgcuUfuGfcAfgAfa sGfsa | 706-728 |
3407 | 3408 | AD-58868 | GfsasGfgAfaAfgAfGfGfuUfgCfuGf aAfaCfL96 | gs U fs u U f c AfgCf a Af cc u Cf u U f u Cf c U f c sAfsc | 759-781 |
- 115 036477
3409 | 3410 | AD-58869 | GfsgsUfaCfuAfgAfAfAfuAfuUfuCf uGfgAfL96 | usCfscAfgAfaAfuAfuuuCfuAfgUfaCfc sAfsc | 1174-1196 |
3411 | 3412 | AD-58870 | GfsasCfaUfcAfuGfCfAfaAfaGfcAfa AfgAfL96 | usCfsuUfuGfcUfuUfugcAfuGfaUfgUf csCfsu | 853-875 |
3413 | 3414 | AD-58871 | AfsasAfuUfuUfaAfUfCfuAfuAfgUf aAfaAfL96 | usUfsuUfaCfuAfuAfgauUfaAfaAfuUf usAfsa | 2353-2375 |
3415 | 3416 | AD-58873 | Cfs a s U f gAf u Cf c Af Af Gf gGf a U f u Cfg AfaAfL96 | usUfsuCfgAfaUfcCfcuuGfgAfuCfaUf gsGfsa | 1362-1384 |
3417 | 3418 | AD-58874 | Af sgs Af cCf a G f a AfAf G f a G f u G f u Cf uCfaUfL96 | a s U f sg Af g Af c Af c UfcuuUfcUfgGfuCf usUfsu | 871-893 |
3419 | 3420 | AD-58875 | Af s u sCf c U fg Af a G fAf G f cG f c U f g Afg GfgAfL96 | usCfscCfuCfaGfcGfcucUfuCfaGfgAfu sCfsc | 1810-1832 |
3421 | 3422 | AD-58876 | GfsusCfuGfuGfaUfGfAfaCfuAfaUf gAfgCfL96 | gsCfsuCfaUfuAfgUfucaUfcAfcAfgAfc sUfsu | 1966-1988 |
3423 | 3424 | AD-58877 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfuCfL96 | gsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sGfsu | 875-897 |
3425 | 3426 | AD-58878 | AfscsUfuUfuCfaGfUfAfuGfaUfcGf uUfuCfL96 | gsAfsaAfcGfaUfcAfuacUfgAfaAfaGfu sGfsg | 925-947 |
3427 | 3428 | AD-58879 | UfscsAfuGfcCfaAfAfAfaUfgGfaCfa UfcAfL96 | usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcAfuGf asCfsu | 1634-1656 |
3429 | 3430 | AD-58880 | AfsasUfaUfuUfcUfGfGfaAfcUfaGf uAfaAfL96 | usUfsuAfcUfaGfuUfccaGfaAfaUfaUf usUfsc | 1183-1205 |
3431 | 3432 | AD-58881 | CfsusUfcUfuCfaAfGfAfuAfaCfuUf gCfcAfL96 | usGfsgCfaAfgUfuAfucuUfgAfaGfaAf gsAfsu | 892-914 |
3433 | 3434 | AD-58882 | UfsusUfcAfgUfaUfGfAfuCfgUfuUf cUfuUfL96 | a s Afs a Gf a Af a Cfg Af u ca U f a Cf u G f a Af a sAfsg | 928-950 |
3435 | 3436 | AD-58883 | CfscsCfaGfuGfuGfGfUfuAfgUfgUf gAfaAfL96 | us U fs u Cf a Cf a Cf u Af a cc Af c Af c U fgG fg sGfsc | 790-812 |
3437 | 3438 | AD-58884 | GfscsUfgUfgAfgAfUfUfuAfcUfcUf gAfuUfL96 | asAfsuCfaGfaGfuAfaauCfuCfaCfaGfc sCfsu | 1325-1347 |
3439 | 3440 | AD-58885 | AfsgsGfcUfuGfaGfCfAfaGfuUfgGf uAfuCfL96 | gsAfsuAfcCfaAfcUfugcUfcAfaGfcCfu sGfsa | 2229-2251 |
3441 | 3442 | AD-58886 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf uCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc sUfsg | 877-899 |
3443 | 3444 | AD-58887 | AfsusUfuCfu Gf g Af Af Cf u Afg U f a Af aUfuCfL96 | gsAfsaUfuUfaCfuAfguuCfcAfgAfaAf us Afs u | 1186-1208 |
3445 | 3446 | AD-58888 | UfsgsUfgAfuGfuGfGfCfcCfaUfgAf gUfuUfL96 | asAfsa Cf u Cfa UfgGfgccAfcAf u Cfa Cfa sCfsa | 1531-1553 |
3447 | 3448 | AD-58889 | AfsasGfaGfaGfaAfGfUfcCfuAfuUf uCfuCfL96 | gsAfsgAfaAfuAfgGfacuUfcUfcUfcUf usUfsc | 2208-2230 |
3449 | 3450 | AD-58890 | UfsgsGfcAfgCfaCfAfGfaUfgAfaUfc AfgAfL96 | usCfsuGfaUfuCfaUfcugUfgCfuGfcCf asGfsg | 671-693 |
3451 | 3452 | AD-58891 | AfsusGfaUfcGfuUfUfCfuUfuGfaGf aAfaAfL96 | usUfsuUfcUfcAfa Af ga aAfcGfaUfcAf usAfsc | 935-957 |
3453 | 3454 | AD-58892 | UfscsUfgGfaAfcUfAfGfuAfaAfuUf cCfaUfL96 | asUfsgGfaAfuUfuAfcuaGfuUfcCfaGf asAfsa | 1189-1211 |
3455 | 3456 | AD-59095 | GfscsCfcAfuUfcUfUfAfuCfcCfgAfg UfL96 | asCfsuCfgGfgAfuAfagaAfuGfgsgsc | 360-382 |
3457 | 3458 | AD-59096 | Gfsgs Af a CfcAf u Gf Cf Cf u Cf cAf u Gfa UfL96 | asUfscAfuGfgAfgGfcauGfgUfuscsc | 1347-1369 |
3459 | 3460 | AD-59097 | UfsgsGfaGfuCfuGfUfGfcGfgAfuCf cUfL96 | asGfsgAfuCfcGfcAfcagAfcUfcscsa | 1794-1816 |
3461 | 3462 | AD-59098 | CfsasCfcCfaCfgGfGfUfgUfgUfgGfg AfL96 | usCfscCfaCfaCfaCfccgUfgGfgsusg | 1112-1134 |
3463 | 3464 | AD-59099 | GfsgsAfgUfcUfgUfGfCfgGfaUfcCf uAfL96 | usAfsgGfaUfcCfgCfacaGfaCfuscsc | 1795-1817 |
- 116 036477
3465 | 3466 | AD-59100 | Cfs a s Af a Af c U f gCf Cf Cf c Af a G f a U fg AfL96 | usCfsaUfcUfuGfgGfgcaGfuUfususg | 428-450 |
3467 | 3468 | AD-59101 | GfscsCfuCfcAfuGfAfUfcCfaAfgGfg AfL96 | usCfscCfuUfgGfaUfcauGfgAfgsgsc | 1355-1377 |
3469 | 3470 | AD-59102 | CfsasUfcAfuCfcCfUfGfuGfcGfgGfu UfL96 | asAfscCfcGfcAfcAfgggAfuGfasusg | 1921-1943 |
3471 | 3472 | AD-59103 | AfscsCfcAfcGfgGfUfGfuGfuGfgGf gAfL96 | usCfscCfcAfcAfcAfcccGfuGfgsgsu | 1113-1135 |
3473 | 3474 | AD-59104 | CfsasCfaUfcAfuCfCfCfuGfuGfcGfg AfL96 | usCfscGfcAfcAfgGfgauGfaUfgsusg | 1919-1941 |
3475 | 3476 | AD-59105 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfL96 | asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcsusg | 873-895 |
3477 | 3478 | AD-59106 | CfscsUfcCfaUfgAfUfCfcAfaGfgGfa UfL96 | asUfscCfcUfuGfgAfucaUfgGfasgsg | 1356-1378 |
3479 | 3480 | AD-59107 | UfsgsCfcCfaUfuCfUfUfaUfcCfcGfa AfL96 | usUfscGfgGfaUfaAfgaaUfgGfgscsa | 359-381 |
3481 | 3482 | AD-59108 | CfsusUfcAfcCfcUfGfGfcUfaAfgAfu AfL96 | usAfsuCfuUfaGfcCfaggGfuGfasasg | 1297-1319 |
3483 | 3484 | AD-59109 | AfsusCfaUfcCfcUfGfUfgCfgGfgUfu AfL96 | usAfsaCfcCfgCfaCfaggGfaUfgsasu | 1922-1944 |
3485 | 3486 | AD-59110 | Af sgs Af a Af gAf gU f Gf U f c UfcAfuCfu UfL96 | asAfsgAfuGfaGfaCfacuCfuUfuscsu | 874-896 |
3487 | 3488 | AD-59111 | CfsusCfcAfuGfaUfCfCfa AfgG fg Af u UfL96 | asAfsuCfcCfuUfgGfaucAfuGfgsasg | 1357-1379 |
3489 | 3490 | AD-59112 | CfscsAfuUfcUfuAfUfCfcCfgAfgUfc AfL96 | usGfsaCfuCfgGfgAfuaaGfaAfusgsg | 362-384 |
3491 | 3492 | AD-59113 | CfsasCfcCfuGfgCfUfAfaGfaUfgAfu AfL96 | usAfsuCfaUfcUfuAfgccAfgGfgsusg | 1300-1322 |
3493 | 3494 | AD-59114 | UfscsAfuCfcCfuGfUfGfcGfgGfuUf gAfL96 | usCfsaAfcCfcGfcAfcagGfgAfusgsa | 1923-1945 |
3495 | 3496 | AD-59115 | AfsasGfaGfuGfuCfUfCfaUfcUfuCf uUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcsusu | 877-899 |
3497 | 3498 | AD-59116 | GfsusCfaUfgCfcAfAfAfaAfuGfgAfc AfL96 | usGfsuCfcAfuUfuUfuggCfaUfgsasc | 1631-1653 |
3499 | 3500 | AD-59117 | CfsasUfuCfuUfaUfCfCfcGfaGfuCfc AfL96 | usGfsgAfcUfcGfgGfauaAfgAfasusg | 363-385 |
3501 | 3502 | AD-59118 | AfscsCfcUfgGfcUfAfAfgAfuGfaUfg AfL96 | usCfsaUfcAfuCfuUfagcCfaGfgsgsu | 1301-1323 |
3503 | 3504 | AD-59119 | CfsusCfuUfcAfcCfCfUfgGfcUfaAfg AfL96 | usCfsuUfaGfcCfaGfgguGfaAfgsasg | 1295-1317 |
3505 | 3506 | AD-59120 | Af s u s Gf cCf a Af a AfAf U fgG f a Cf a U f c AfL96 | usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcsasu | 1634-1656 |
3507 | 3508 | AD-59121 | UfsgsCfcCfcAfaGfAfUfgAfuGfgAfa UfL96 | asUfsuCfcAfuCfaUfcuuGfgGfgscsa | 434-456 |
3509 | 3510 | AD-59122 | GfsasAfcCfa UfgCfCf UfcCfa UfgAf u AfL96 | usAfsuCfaUfgGfaGfgcaUfgGfususc | 1348-1370 |
3511 | 3512 | AD-59123 | UfscsUfuCfaCfcCfUfGfgCfuAfaGfa UfL96 | asUfscUfuAfgCfcAfgggUfgAfasgsa | 1296-1318 |
3513 | 3514 | AD-59124 | UfsgsCfcAfaAfaAfUfGfgAfcAfuCfa UfL96 | asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgscsa | 1635-1657 |
3515 | 3516 | AD-59125 | Cfs cs Afg Af a Af g Af G f U fg U f c U f c Af u AfL96 | usAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfusgsg | 872-894 |
3517 | 3518 | AD-59126 | GfsasAfaCfuGfuCfCfAfuUfcAfaUfg AfL96 | usCfsaUfuGfaAfuGfgacAfgUfususc | 1481-1503 |
3519 | 3520 | AD-59127 | UfscsAfcCfcUfgGfCfUfaAfgAfuGfa UfL96 | asUfscAfuCfuUfaGfccaGfgGfusgsa | 1299-1321 |
3521 | 3522 | AD-59128 | CfscsCfuGfgAfgUfCfUfgUfgCfgGfa UfL96 | asUfscCfgCfaCfaGfacuCfcAfgsgsg | 1791-1813 |
3523 | 3524 | AD-59129 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf uAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfususc | 875-897 |
3525 | 3526 | AD-59130 | UfsgsGfaGfcCfcUfGfGfaGfuCfuGf uAfL96 | us Af sc Af gAf c UfcCfaggGfcUfcscsa | 1786-1808 |
- 117 036477
Таблица 15. Немодифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов
ALAS1 человека
SEQID NO: (смысл овая) | SEQ ID NO: (анти смыс лова я) | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') | Целевые сайты антисмысло вой последовате льности NM_ 0006SS.4 |
3684 | 3527 | AD-58848 | CAUGCCAAAAAUGGACAUCAU | AUGAUGUCCAUUUUUGGCAUGAC | 1635-1657 |
3528 | 3529 | AD-58849 | AUUUUGAAGUGAUGAGUGAAA | U U U CACU CAU СACU UCAAAAU G С | 2189-2211 |
3530 | 3531 | AD-58850 | AGUUAUAUUAAAUUUUAAUCU | AGAUUAAAAUUUAAUAUAACUUA | 2344-2366 |
3532 | 3533 | AD-58851 | GCAUUUUGAAGUGAUGAGUGA | UCACUCAUCACUUCAAAAUGCAG | 2187-2209 |
3534 | 3535 | AD-58852 | GAACUAAUGAGCAGACAUAAC | GUUAUGUCUGCUCAUUAGUUCAU | 1975-1997 |
3536 | 3537 | AD-58853 | AAUGACCACACCUAUCGAGUU | AACUCGAUAGGUGUGGUCAUUCU | 973-995 |
3538 | 3539 | AD-58854 | UAAAUUUUAAUCUAUAGUAAA | UUUACUAUAGAUUAAAAUUUAAU | 2352-2374 |
3540 | 3541 | AD-58855 | UUCAGUAUGAUCGUUUCUUUG | CAAAGAAACGAUCAUACUGAAAA | 929-951 |
3542 | 3543 | AD-58856 | CACUUUUCAGUAUGAUCGUUU | AAACGAUCAUACUGAAAAGUGGA | 924-946 |
3544 | 3545 | AD-58857 | AAAUCUGUUUCCACUUUUCAG | CUGAAAAGUGGAAACAGAUUUUG | 913-935 |
3546 | 3547 | AD-58858 | CAUUUGAAACUGUCCAUUCAA | UUGAAUGGACAGUUUCAAAUGCC | 1478-1500 |
3548 | 3549 | AD-58859 | CCUAUCGAGUUUUUAAAACUG | CAGUUUUAAAAACUCGAUAGGUG | 983-1005 |
3550 | 3551 | AD-58861 | GACCAGAAAGAGUGUCUCAUC | GAUGAGACACUCUUUCUGGUCUU | 872-894 |
3552 | 3553 | AD-58862 | ACCAGAAAGAGUGUCUCAUCU | AGAUGAGACACUCUUUCUGGUCU | 873-895 |
3554 | 3555 | AD-58863 | ACUAAUGAGCAGACAUAACAU | AUGUUAUGUCUGCUCAUUAGUUC | 1977-1999 |
3556 | 3557 | AD-58864 | UAGUAAAAACAUAGUCCUGGA | UCCAGGACUAUGUUUUUACUAUA | 2366-2388 |
3558 | 3559 | AD-58865 | UAUUUCUGGAACUAGUAAAUU | AAU U UACUAG U UCCAGAAAUAU U | 1185-1207 |
3560 | 3561 | AD-58867 | UUCUGCAAAGCCAGUCUUGAG | CUCAAGACUGGCUUUGCAGAAGA | 706-728 |
3562 | 3563 | AD-58868 | GAGGAAAGAGGUUGCUGAAAC | GUUUCAGCAACCUCUUUCCUCAC | 759-781 |
3564 | 3565 | AD-58869 | GGUACUAGAAAUAUUUCUGGA | UCCAGAAAUAUUUCUAGUACCAC | 1174-1196 |
3566 | 3567 | AD-58870 | GACAUCAUGCAAAAGCAAAGA | UCUUUGCUUUUGCAUGAUGUCCU | 853-875 |
3568 | 3569 | AD-58871 | AAAUUUUAAUCUAUAGUAAAA | UUUUACUAUAGAUUAAAAUUUAA | 2353-2375 |
3570 | 3571 | AD-58873 | CAUGAUCCAAGGGAUUCGAAA | UUUCGAAUCCCUUGGAUCAUGGA | 1362-1384 |
3572 | 3573 | AD-58874 | AGACCAGAAAGAGUGUCUCAU | AUGAGACACUCUUUCUGGUCUUU | 871-893 |
3574 | 3575 | AD-58875 | AUCCUGAAGAGCGCUGAGGGA | UCCCUCAGCGCUCUUCAGGAUCC | 1810-1832 |
3576 | 3577 | AD-58876 | GUCUGUGAUGAACUAAUGAGC | GCUCAUUAGUUCAUCACAGACUU | 1966-1988 |
3578 | 3579 | AD-58877 | CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUC | GAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU | 875-897 |
- 118 036477
3580 | 3581 | AD-58878 | ACUUUUCAGUAUGAUCGUUUC | G AAACGAUCAUACU GAAAAG UG G | 925-947 |
3582 | 3583 | AD-58879 | UCAUGCCAAAAAUGGACAUCA | UGAUGUCCAUUUUUGGCAUGACU | 1634-1656 |
3584 | 3585 | AD-58880 | AAUAUUUCUGGAACUAGUAAA | UUUACUAGUUCCAGAAAUAUUUC | 1183-1205 |
3586 | 3587 | AD-58881 | CUUCUUCAAGAUAACUUGCCA | UGGCAAGUUAUCUUGAAGAAGAU | 892-914 |
3588 | 3589 | AD-58882 | UUUCAGUAUGAUCGUUUCUUU | AAAGAAACGAUCAUACUGAAAAG | 928-950 |
3590 | 3591 | AD-58883 | CCCAGUGUGGUUAGUGUGAAA | UUUCACACUAACCACACUGGGGC | 790-812 |
3592 | 3593 | AD-58884 | GCUGUGAGAUUUACUCUGAUU | AAUCAGAGUAAAUCUCACAGCCU | 1325-1347 |
3594 | 3595 | AD-58885 | AGGCUUGAGCAAGUUGGUAUC | GAUACCAACUUGCUCAAGCCUGA | 2229-2251 |
3596 | 3597 | AD-58886 | GAAAGAGUGUCUCAUCUUCUU | AAGAAGAUGAGACACUCUUUCUG | 877-899 |
3598 | 3599 | AD-58887 | AUUUCUGGAACUAGUAAAUUC | GAAUUUACUAGUUCCAGAAAUAU | 1186-1208 |
3600 | 3601 | AD-58888 | UGUGAUGUGGCCCAUGAGUUU | AAACUCAUGGGCCACAUCACACA | 1531-1553 |
3602 | 3603 | AD-58889 | AAGAGAGAAGUCCUAUUUCUC | GAGAAAUAGGACUUCUCUCUUUC | 2208-2230 |
3604 | 3605 | AD-58890 | UGGCAGCACAGAUGAAUCAGA | UCUGAUUCAUCUGUGCUGCCAGG | 671-693 |
3606 | 3607 | AD-58891 | AUGAUCGUUUCUUUGAGAAAA | UUUUCUCAAAGAAACGAUCAUAC | 935-957 |
3608 | 3609 | AD-58892 | UCUGGAACUAGUAAAUUCCAU | AUGGAAUUUACUAGUUCCAGAAA | 1189-1211 |
3610 | 3611 | AD-59095 | GCCCAUUCUUAUCCCGAGU | ACUCGGGAUAAGAAUGGGC | 360-382 |
3612 | 3613 | AD-59096 | GGAACCAUGCCUCCAUGAU | AUCAUGGAGGCAUGGUUCC | 1347-1369 |
3614 | 3615 | AD-59097 | UGGAGUCUGUGCGGAUCCU | AGGAUCCGCACAGACUCCA | 1794-1816 |
3616 | 3617 | AD-59098 | CACCCACGGGUGUGUGGGA | UCCCACACACCCGUGGGUG | 1112-1134 |
3618 | 3619 | AD-59099 | GGAGUCUGUGCGGAUCCUA | UAGGAUCCGCACAGACUCC | 1795-1817 |
3620 | 3621 | AD-59100 | CAAAACUGCCCCAAGAUGA | UCAUCUUGGGGCAGUUUUG | 428-450 |
3622 | 3623 | AD-59101 | GCCUCCAUGAUCCAAGGGA | UCCCUUGGAUCAUGGAGGC | 1355-1377 |
3624 | 3625 | AD-59102 | CAUCAUCCCUGUGCGGGUU | AACCCGCACAGGGAUGAUG | 1921-1943 |
3626 | 3627 | AD-59103 | ACCCACGGGUGUGUGGGGA | UCCCCACACACCCGUGGGU | 1113-1135 |
3628 | 3629 | AD-59104 | CACAUCAUCCCUGUGCGGA | UCCGCACAGGGAUGAUGUG | 1919-1941 |
3630 | 3631 | AD-59105 | CAGAAAGAGUGUCUCAUCU | AGAUGAGACACUCUUUCUG | 873-895 |
3632 | 3633 | AD-59106 | CCUCCAUGAUCCAAGGGAU | AUCCCUUGGAUCAUGGAGG | 1356-1378 |
3634 | 3635 | AD-59107 | UGCCCAUUCUUAUCCCGAA | UUCGGGAUAAGAAUGGGCA | 359-381 |
3636 | 3637 | AD-59108 | CUUCACCCUGGCUAAGAUA | UAUCUUAGCCAGGGUGAAG | 1297-1319 |
3638 | 3639 | AD-59109 | AUCAUCCCUGUGCGGGUUA | UAACCCGCACAGGGAUGAU | 1922-1944 |
3640 | 3641 | AD-59110 | AGAAAGAGUGUCUCAUCUU | AAGAUGAGACACUCUUUCU | 874-896 |
3642 | 3643 | AD-59111 | CUCCAUGAUCCAAGGGAUU | AAUCCCUUGGAUCAUGGAG | 1357-1379 |
3644 | 3645 | AD-59112 | CCAUUCUUAUCCCGAGUCA | UGACUCGGGAUAAGAAUGG | 362-384 |
3646 | 3647 | AD-59113 | CACCCUGGCUAAGAUGAUA | UAUCAUCUUAGCCAGGGUG | 1300-1322 |
3648 | 3649 | AD-59114 | UCAUCCCUGUGCGGGUUGA | UCAACCCGCACAGGGAUGA | 1923-1945 |
3650 | 3651 | AD-59115 | AAGAGUGUCUCAUCUUCUU | AAGAAGAUGAGACACUCUU | 877-899 |
3652 | 3653 | AD-59116 | GUCAUGCCAAAAAUGGACA | UGUCCAUUUUUGGCAUGAC | 1631-1653 |
3654 | 3655 | AD-59117 | CAUUCUUAUCCCGAGUCCA | UGGACUCGGGAUAAGAAUG | 363-385 |
3656 | 3657 | AD-59118 | ACCCUGGCUAAGAUGAUGA | UCAUCAUCUUAGCCAGGGU | 1301-1323 |
3658 | 3659 | AD-59119 | CUCUUCACCCUGGCUAAGA | UCUUAGCCAGGGUGAAGAG | 1295-1317 |
3660 | 3661 | AD-59120 | AUGCCAAAAAUGGACAUCA | UGAUGUCCAUUUUUGGCAU | 1634-1656 |
3662 | 3663 | AD-59121 | UGCCCCAAGAUGAUGGAAU | AUUCCAUCAUCUUGGGGCA | 434-456 |
3664 | 3665 | AD-59122 | GAACCAUGCCUCCAUGAUA | UAUCAUGGAGGCAUGGUUC | 1348-1370 |
3666 | 3667 | AD-59123 | UCUUCACCCUGGCUAAGAU | AUCUUAGCCAGGGUGAAGA | 1296-1318 |
3668 | 3669 | AD-59124 | UGCCAAAAAUGGACAUCAU | AUGAUGUCCAUUUUUGGCA | 1635-1657 |
3670 | 3671 | AD-59125 | CCAGAAAGAGUGUCUCAUA | UAUGAGACACUCUUUCUGG | 872-894 |
3672 | 3673 | AD-59126 | GAAACUGUCCAUUCAAUGA | UCAUUGAAUGGACAGUUUC | 1481-1503 |
3674 | 3675 | AD-59127 | UCACCCUGGCUAAGAUGAU | AUCAUCUUAGCCAGGGUGA | 1299-1321 |
3676 | 3677 | AD-59128 | CCCUGGAGUCUGUGCGGAU | AUCCGCACAGACUCCAGGG | 1791-1813 |
3678 | 3679 | AD-59129 | GAAAGAGUGUCUCAUCUUA | UAAGAUGAGACACUCUUUC | 875-897 |
3680 | 3681 | AD-59130 | UGGAGCCCUGGAGUCUGUA | UACAGACUCCAGGGCUCCA | 1786-1808 |
Результаты этих анализов in vitro представлены в табл.16. В табл.16 также указаны целевые виды каждой из siRNA.
- 119 036477
Таблица 16. Результаты функциональных анализов
Свободное поглощения для макаккрабоедов | Трансфекция для макак-крабоедов | Трансфекция НерЗЬ | ||||||||
ID дуплекса | Целевые виды | Тип | 1 мкМ, средн. | 500 нМ | 20 нМ, средн. | 10 нМ | 20 нМ, средн. | 0,2 нМ, средн. | 10 нМ, средн. | 0,1 нМ, средн. |
AD-58848 | M/R/Rh/ Н | 21/23 | 131,6 | 176,0 | 104,4 | 128,0 | 43,5 | 44,8 | 25,3 | 76,8 |
AD-58849 | H/Rh | 21/23 | 91,9 | 88,1 | 92,2 | 105,0 | 29,4 | 35,4 | 11,5 | 47,1 |
AD-58850 | H/Rh | 21/23 | 79,4 | 103,4 | 80,0 | 111,2 | Н.Д. | 62,2 | 31,3 | 72,0 |
AD-58851 | H/Rh | 21/23 | 99,7 | 74,7 | 94,8 | 104,7 | Н.Д. | 40,7 | 8,6 | 81,3 |
AD-58852 | H/Rh | 21/23 | 108,1 | 91,8 | 103,3 | 111,9 | 101,1 | 128,8 | 43,4 | 129,0 |
AD-58853 | H/Rh | 21/23 | 74,8 | 67,7 | 84,2 | 93,5 | 24,7 | 52,9 | 14,1 | 61,2 |
AD-58854 | H/Rh | 21/23 | 145,9 | 124,1 | 106,6 | 115,3 | 119,0 | 83,9 | 85,0 | 84,0 |
AD-58855 | H/Rh | 21/23 | 81,5 | 97,9 | 92,7 | 101,8 | 39,5 | 40,3 | 15,3 | 67,6 |
AD-58856 | H/Rh | 21/23 | 74,1 | 90,6 | 84,6 | 82,6 | 22,4 | 30,7 | 8,7 | 33,3 |
AD-58857 | H/Rh | 21/23 | 64,7 | 91,4 | 62,3 | 87,1 | 22,0 | 31,6 | 9,8 | 106,3 |
AD-58858 | H/Rh | 21/23 | 67,4 | 91,7 | 68,6 | 98,3 | 27,9 | 40,3 | 17,4 | 44,8 |
AD-58859 | H/Rh | 21/23 | 71,2 | 77,2 | 92,4 | 90,1 | 19,1 | 34,3 | 13,1 | 39,7 |
AD-58861 | H/Rh | 21/23 | 104,6 | 107,2 | 102,0 | 100,6 | 25,9 | 35,1 | 18,0 | 69,8 |
AD-58862 | H/Rh | 21/23 | 66,8 | 77,0 | 68,7 | 88,5 | 20,3 | 31,1 | 24,2 | 49,9 |
AD-58863 | H/Rh | 21/23 | 70,8 | 66,8 | 76,8 | 98,5 | 21,5 | 29,7 | 8,7 | 54,9 |
AD-58864 | H/Rh | 21/23 | 76,2 | 85,6 | 83,7 | 100,8 | 60,4 | 61,0 | 56,4 | 87,3 |
AD-58865 | H/Rh | 21/23 | 67,9 | 77,9 | 95,9 | 98,4 | 21,3 | 38,6 | 15,5 | 81,4 |
AD-58867 | H/Rh | 21/23 | 95,9 | 93,3 | 107,0 | 97,5 | 32,3 | 42,7 | 16,6 | 79,8 |
AD-58868 | H/Rh | 21/23 | 95,2 | 92,1 | 116,2 | 94,7 | 54,6 | 69,2 | 61,5 | 105,9 |
AD-58869 | H/Rh | 21/23 | 65,0 | 78,2 | 75,8 | 88,2 | 17,4 | 25,0 | 13,0 | 63,9 |
AD-58870 | H/Rh | 21/23 | 69,4 | 92,3 | 81,0 | 88,1 | 29,2 | 43,8 | 33,7 | 79,1 |
AD-58871 | H/Rh | 21/23 | 61,2 | 77,3 | 88,2 | 77,0 | 71,2 | 73,2 | 36,7 | 110,3 |
AD-58873 | H/Rh | 21/23 | 95,2 | 100,9 | 83,3 | 94,6 | 54,2 | 52,8 | 36,6 | 73,3 |
AD-58874 | H/Rh | 21/23 | 75,8 | 76,8 | 63,8 | 85,3 | 22,3 | 31,2 | 15,0 | 38,2 |
AD-58875 | H/Rh | 21/23 | 80,7 | 88,7 | 78,6 | 97,9 | 48,6 | 73,6 | 61,2 | 90,6 |
AD-58876 | H/Rh | 21/23 | 90,8 | 93,1 | 82,5 | 100,2 | 41,1 | 56,9 | 21,2 | 58,7 |
AD-58877 | H/Rh | 21/23 | 68,3 | 85,1 | 51,2 | 78,7 | 18,5 | 46,6 | 11,9 | 27,4 |
AD-58878 | H/Rh | 21/23 | 78,3 | 68,3 | 81,2 | 91,2 | 24,1 | 23,4 | 6,2 | 37,1 |
AD-58879 | H/Rh | 21/23 | 87,9 | 94,1 | 79,7 | 95,4 | 32,0 | 47,8 | 15,7 | 82,5 |
AD-58880 | H/Rh | 21/23 | 74,9 | 72,2 | 88,9 | 88,1 | 20,1 | 27,5 | 14,0 | 60,7 |
AD-58881 | H/Rh | 21/23 | 85,9 | 76,8 | 78,8 | 118,0 | 22,2 | 36,7 | 27,6 | 71,6 |
AD-58882 | H/Rh | 21/23 | 54,1 | 53,4 | 60,3 | 85,8 | 14,6 | 27,2 | 8,2 | 23,8 |
AD-58883 | H/Rh | 21/23 | 80,4 | 69,9 | 75,7 | 80,3 | 31,8 | 25,8 | 12,3 | 63,0 |
AD-58884 | H/Rh | 21/23 | 57,7 | 55,3 | 64,8 | 78,2 | 20,0 | 30,0 | 11,8 | 68,9 |
AD-58885 | H/Rh | 21/23 | 101,8 | 91,8 | 104,1 | 101,5 | 85,9 | 71,9 | 61,8 | 71,2 |
AD-58886 | M/R/Rh/ H | 21/23 | 47,1 | 58,0 | 36,3 | 93,3 | 16,0 | 26,6 | 9,2 | 32,0 |
AD-58887 | H/Rh | 21/23 | 73,6 | 98,7 | 82,6 | 95,2 | 28,5 | 33,5 | 12,8 | 65,2 |
AD-58888 | H/Rh | 21/23 | 90,2 | 69,9 | 69,4 | 85,6 | 46,9 | 45,0 | 16,6 | 72,0 |
AD-58889 | H/Rh | 21/23 | 83,6 | 98,6 | 82,4 | 92,2 | 36,5 | 40,3 | 31,6 | 99,4 |
AD-58890 | H/Rh | 21/23 | 69,5 | 95,4 | 84,2 | 88,2 | 50,8 | 45,6 | 21,7 | 92,9 |
120 036477
AD-58891 | H/Rh | 21/23 | 62,8 | 75,7 | 75,4 | 109,2 | 23,6 | 34,3 | 15,6 | 55,8 |
AD-58892 | H/Rh | 21/23 | 60,2 | 92,9 | 89,8 | 92,9 | 22,8 | 43,3 | 20,2 | 75,6 |
AD-59O95 | М/R/Rh/ Η | 19me г | 88,9 | н.Д. | 132,8 | н.Д. | 48,3 | 97,4 | 54,3 | 99,0 |
AD-59O96 | М/R/Rh/ Η | 19me г | 95,5 | н.Д. | 90,5 | н.Д. | 105,7 | 138,6 | 131,4 | 120,7 |
AD-59O97 | М/R/Rh/ Η | 19me г | 92,5 | н.Д. | 84,2 | н.Д. | 75,0 | н.Д. | 94,7 | 108,5 |
AD-59098 | М/R/Rh/ Η | 19me г | 84,0 | н.Д. | 87,7 | н.Д. | 109,3 | н.Д. | 130,0 | 87,3 |
AD-59O99 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 89,7 | н.Д. | 90,0 | н.Д. | 77,8 | 85,4 | 46,8 | 74,9 |
AD-591OO | M/R/Rh/ Η | 19me г | 84,8 | н.Д· | 144,3 | н.Д· | 70,6 | 108,1 | 91,5 | 117,6 |
AD-591O1 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 79,0 | н.Д· | 103,8 | н.Д· | 89,8 | 102,9 | 124,2 | 107,0 |
AD-59102 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 85,9 | Н.Д. | 100,6 | Н.Д. | 72,2 | 68,5 | 87,9 | 95,1 |
AD-591O3 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 86,0 | н.Д· | 91,1 | н.Д· | 93,0 | 81,3 | 130,0 | 96,0 |
AD-59104 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 92,6 | н.Д· | 96,9 | н.Д· | 94,9 | 91,4 | 124,4 | 83,1 |
AD-591O5 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 48,9 | н.Д. | 101,7 | н.Д. | 18,4 | 48,9 | 17,0 | 34,7 |
AD-591O6 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 63,2 | Н.Д. | 76,7 | Н.Д. | 28,5 | 40,7 | 28,6 | 46,4 |
AD-591O7 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 71,4 | н.Д. | 68,7 | н.Д. | 37,1 | 45,3 | 26,8 | 63,6 |
AD-591O8 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 70,7 | н.Д. | 85,1 | н.Д. | 89,9 | 84,8 | 139,2 | 101,7 |
AD-591O9 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 86,1 | н.Д. | 83,4 | н.Д. | 84,9 | 96,2 | 131,7 | 86,7 |
AD-5911O | M/R/Rh/ Η | 19me г | 70,8 | н.Д. | 119,7 | н.Д. | 38,5 | 60,4 | 67,4 | 80,3 |
AD-59111 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 66,1 | н.Д. | 76,5 | н.Д. | 52,2 | 61,0 | 69,7 | 87,6 |
AD-59112 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 71,2 | н.Д. | 80,2 | н.Д. | 91,2 | 83,4 | 127,4 | 89,0 |
AD-59113 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 67,0 | н.Д. | 77,8 | н.Д. | 49,1 | 59,0 | 66,8 | 91,4 |
AD-59114 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 81,7 | н.Д. | 79,3 | н.Д. | 96,3 | 88,0 | 129,6 | 72,4 |
AD-59115 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 40,4 | н.Д. | 69,6 | н.Д. | 19,6 | 35,7 | 9,3 | 16,9 |
AD-59116 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 72,2 | н.Д. | 78,3 | н.Д. | 53,5 | 77,8 | 70,1 | 107,8 |
AD-59117 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 70,7 | н.Д. | 75,6 | н.Д. | 75,8 | 74,9 | 129,0 | 103,5 |
AD-59118 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 68,8 | н.Д. | 75,9 | н.Д. | 81,4 | 82,1 | 114,1 | 89,7 |
AD-59119 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 64,9 | н.Д. | 86,5 | н.Д. | 85,1 | 125,1 | 122,8 | 124,8 |
AD-5912O | M/R/Rh/ Η | 19me г | 63,5 | н.Д. | 75,1 | н.Д. | 29,9 | 52,0 | 16,1 | 54,1 |
AD-59121 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 67,6 | Н.Д. | 72,0 | Н.Д. | 88,8 | 77,4 | 108,0 | 103,1 |
AD-59122 | M/R/Rh/ Η | 19me | 60,2 | Н.Д. | 62,3 | Н.Д. | 25,1 | 45,3 | 16,2 | 54,8 |
AD-59123 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 68,6 | Н.Д. | 108,2 | Н.Д. | 59,2 | 84,6 | 80,0 | 97,7 |
AD-59124 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 47,5 | Н.Д. | 56,5 | Н.Д. | 23,9 | 40,0 | 9,8 | 18,9 |
AD-59125 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 45,4 | Н.Д. | 47,2 | Н.Д. | 15,2 | 40,7 | 14,7 | 15,1 |
AD-59126 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 64,3 | Н.Д. | 74,6 | Н.Д. | 51,6 | 57,1 | 35,5 | 54,4 |
AD-59127 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 103,4 | Н.Д. | 105,8 | Н.Д. | 94,0 | 156,4 | 135,9 | 113,7 |
AD-59128 | M/R/Rh/ Η | 19me г | 102,4 | Н.Д. | 81,4 | Н.Д. | 66,3 | 89,3 | 60,2 | 74,9 |
AD-59129 | M/R/Rh/ Η | 19me | 41,3 | Н.Д. | 38,8 | Н.Д. | 17,9 | 41,4 | 8,6 | 12,6 |
AD-5913O | M/R/Rh/ Η | 19me r | 58,3 | Н.Д. | 80,8 | Н.Д. | 94,9 | 78,3 | 106,7 | 88,0 |
В табл. 17 показаны IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS1. IC50 определяли в результате нокдауна эндогенно экспрессируемой ALAS1 в клеточной линии Нер3В через 24 ч после трансфекции каждого модифицированного ALAS1 дуплекса siRNA (см. табл.4). По меньшей мере семь дуплексов, в том числе AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 и AD-59129, неизменно проявляли IC50 менее 0,1 нм, указывая на то, что эти дуплексы были особенно эффективными в подавлении экспрессии ALAS1.
- 121 036477
Таблица 17. IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS1
Ш дуплекса | 384w 1С50 (нМ) | 96w IC50 (нМ) |
AD-58882 | 0,008 | 0,014 |
AD-58878 | 0,040 | 0,031 |
AD-58886 | 0,037 | 0,033 |
AD-58877 | 0,031 | 0,034 |
AD-59115 | 0,093 | 0,052 |
AD-58856 | 0,061 | 0,066 |
AD-59129 | 0,085 | 0,071 |
AD-59124 | 0,572 | 0,078 |
AD-58874 | 0,140 | 0,102 |
AD-59125 | 0,118 | 0,115 |
AD-59105 | 0,511 | 0,144 |
AD-59120 | 180,592 | 0,498 |
AD-59122 | 36,646 | 0,646 |
AD-59106 | 7,906 | 0,847 |
AD-59126 | н.д. | 1,014 |
AD-59107 | Н.д. | 1,971 |
Пример 11. Активность ALAS1-GalNAc в мышиной модели при индукции AIP фенобарбиталом
Мышиную модель AIP использовали для исследования эффекта siRNA, которая представляла собой конъюгат ALAS1-GalNAc. siRNA характеризовалась последовательностью дуплекса AD-58632 (см. табл. 20).
Таблица 20. Последовательности дуплекса AD-58632 с siRNA ALAS1
SEQID NO: (смысловая) | SEQIDNO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
4149 | 4150 | 873-895 | AD-58632 | GfsasAfaGfaGfuGfUf CfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg |
Мышей с AIP не обрабатывали (исходный уровень) или им вводили подкожно на 1 день солевой раствор или конъюгат ALAS1-GalNAc в количестве 20 мг/кг. На 2, 3 и 4 дни их оставляли необработанными (исходный уровень) или им вводили интраперитонеально инъекции фенобарбитала. На 5 день забирали плазму и измеряли уровни ALA и PBG с использованием анализа LC-MS. Как показано на фиг. 15, конъюгат ALAS1-GalNAc снижал образование ALA и PBG в плазме приблизительно на 84 и 80% соответственно. По данным результатам видно, что обработка конъюгатом ALAS1-GalNAc была эффективной в предупреждении повышений уровней как ALA, так и PBG в плазме, связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели AIP.
Пример 12. Дополнительные siRNA, которые нацелены на ALAS1 и ингибируют экспрессию ALAS1
Конструировали модифицированные последовательности siRNA, которые нацеливают siRNA ALAS1, и получали их, как описано в примере 2. Последовательности представлены в табл. 18. Активность in vitro модифицированных дуплексов исследовали, как описано ниже.
- 122 036477
Таблица 18. Модифицированные последовательности одиночных нитей и дуплексов ALAS1 человека
SEQID NO: (смысло вая) | SEQID NO: (антисмыслова я) | Названи е дуплекс а | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') | Целевые сайты антисмысловой последовательн ости NM_ 000688.4 |
3685 | 3686 | AD- 59453 | CAGGCAAAUCUCUGUUGUUdT dT | AACAACAGAGAUUUGCCUGdT dT | 402-420 |
3687 | 3688 | AD- 59395 | GAAAAAAAUUGAUGAGAAAdT dT | UUUCUCAUCAAUUUUUUUCdT dT | 949-967 |
3689 | 3690 | AD- 59477 | GGAAAGAUGCCGCACUCUUdT dT | AAGAGUGCGGCAUCUUUCCdT dT | 1242-1260 |
3691 | 3692 | AD- 59492 | UGUCUCAUCUUCUUCAAGAdT dT | UCUUGAAGAAGAUGAGACAdT dT | 882-900 |
3693 | 3694 | AD- 59361 | ACAUCUACGUGCAAGCAAUdT dT | AUUGCUUGCACGUAGAUGUdT dT | 1992-2010 |
3695 | 3696 | AD- 59462 | UUCUCUGAUUGACACCGUAdT dT | UACGGUGUCAAUCAGAGAAdT dT | 1711-1729 |
3697 | 3698 | AD- 59433 | GCUGCUGGCUUCAUCUUCAdT dT | UGAAGAUGAAGCCAGCAGCdT dT | 1739-1757 |
3699 | 3700 | AD- 59424 | AG CG CAACG U СAAAC U CAU dT dT | AUGAGUUUGACGUUGCGCUd TdT | 1851-1869 |
3701 | 3702 | AD- 59414 | UAUUUCUGGAACUAGUAAAd TdT | UUUACUAGUUCCAGAAAUAdT dT | 1183-1201 |
3703 | 3704 | AD- 59539 | GGUUGUGUUGGAGGGUACAd TdT | U G UACCCU CCAACACAACCdTd T | 1679-1697 |
3705 | 3706 | AD- 59400 | GUGUCAGUCUGGUGCAGUAd TdT | UACUGCACCAGACUGACACdTd T | 1070-1088 |
3707 | 3708 | AD- 59551 | CUUUGUGGCCAAUGACUCAdT dT | UGAGUCAUUGGCCACAAAGdT dT | 1273-1291 |
3709 | 3710 | AD- 59482 | AGAUGCUGCUAAAAACACAdT dT | UGUGUUUUUAGCAGCAUCUd TdT | 1942-1960 |
3711 | 3712 | AD- 59448 | GAGUCAUGCCAAAAAUGGAdT dT | UCCAUUUUUGGCAUGACUCdT dT | 1629-1647 |
3713 | 3714 | AD- 59392 | CUGUGCGGAUCCUGAAGAGdT dT | CUCUUCAGGAUCCGCACAGdT dT | 1800-1818 |
3715 | 3716 | AD- 59469 | CACUUUGAAACAACAUGGUdT dT | ACCAUGUUGUUUCAAAGUGdT dT | 1141-1159 |
3717 | 3718 | AD- 59431 | AAGUGAUGAGUGAAAGAGAd TdT | UCUCUUUCACUCAUCACUUdT dT | 2193-2211 |
3719 | 3720 | AD- 59423 | AUCUGCUAGUCACAUGGAAdT dT | UUCCAUGUGACUAGCAGAUdT dT | 2103-2121 |
3721 | 3722 | AD- 59517 | UGGGGCAGGUGGUACUAGAd TdT | UCUAGUACCACCUGCCCCAdTd T | 1162-1180 |
3723 | 3724 | AD- 59578 | GCAGAUGACUAUUCAGACUdT dT | AGUCUGAAUAGUCAUCUGCdT dT | 1031-1049 |
3725 | 3726 | AD- 59495 | GCCUCAUUCCUCAGCUGAGdT dT | CUCAGCUGAGGAAUGAGGCdT dT | 2143-2161 |
3727 | 3728 | AD- 59432 | GUAUGAUCGUUUCUUUGAGd TdT | CUCAAAGAAACGAUCAUACdT dT | 931-949 |
3729 | 3730 | AD- 59382 | UAUCCAGAUGGUCUUCAGAdT dT | UCUGAAGACCAUCUGGAUAdT dT | 2302-2320 |
3731 | 3732 | AD- 59472 | UAGUGUGAAAACCGAUGGAdT dT | UCCAUCGGUUUUCACACUAdT dT | 799-817 |
3733 | 3734 | AD- 59459 | UCCCCAUGGCAGAUGACUAdT dT | UAGUCAUCUGCCAUGGGGAdT dT | 1023-1041 |
3735 | 3736 | AD- 59413 | CCACUGCAGCAGUACACUAdT dT | UAGUGUACUGCUGCAGUGGd TdT | 483-501 |
3737 | 3738 | AD- 59478 | CUGUGAACCGGCGAGCACAdT dT | UGUGCUCGCCGGUUCACAGdT dT | 999-1017 |
3739 | 3740 | AD- 59376 | GGUCCUAUGCUGCUGGCUUd TdT | AAGCCAGCAGCAUAGGACCdTd T | 1731-1749 |
3741 | 3742 | AD- 59556 | AGCCUUUGGUUGUGUUGGAd TdT | и CCAACACAACCAAAG GCU dTd T | 1672-1690 |
3743 | 3744 | AD- 59399 | AAUUCCAUGUGGACUUAGAdT dT | UCUAAGUCCACAUGGAAUUdT dT | 1200-1218 |
3745 | 3746 | AD- 59474 | CCAGGGCACUGCAAGCAAAdT dT | UUUGCUUGCAGUGCCCUGGdT dT | 640-658 |
3747 | 3748 | AD- 53542 | cuuuucAGuAuGAucGuuudTsd T | AAACGAUcAuACUGAAAAGdTs dT | 924-942 |
3749 | 3750 | AD- 59480 | GAAUCAGAGAGGCAGCAGUdT dT | ACUGCUGCCUCUCUGAUUCdT dT | 682-700 |
3751 | 3752 | AD- 59549 | GCAAAGAUCUGACCCCUCAdT dT | UGAGGGGUCAGAUCUUUGCd TdT | 1441-1459 |
3753 | 3754 | AD- 59515 | GGAGAAGAGCUCCUACGGAdT dT | UCCGUAGGAGCUCUUCUCCdT dT | 2033-2051 |
3755 | 3756 | AD- 59427 | CCAUGAGUUUGGAGCAAUCdT dT | GAUUGCUCCAAACUCAUGGdT dT | 1540-1558 |
3757 | 3758 | AD- 59390 | CUUUGAGAAAAAAAUUGAUdT dT | AUCAAUUUUUUUCUCAAAGdT dT | 943-961 |
3759 | 3760 | AD- 59511 | UGAGCAGACAUAACAUCUAdT dT | UAGAUGUUAUGUCUGCUCAdT dT | 1980-1998 |
3761 | 3762 | AD- 59532 | CGUGCAAGCAAUCAAUUACdT dT | GUAAUUGAUUGCUUGCACGdT dT | 1999-2017 |
3763 | 3764 | AD- 59562 | AAAGCAAAGACCAGAAAGAdT dT | UCUUUCUGGUCUUUGCUUUd TdT | 862-880 |
3765 | 3766 | AD- 59513 | GGAUGUGCAGGAAAUGAAUd TdT | AUUCAUUUCCUGCACAUCCdT dT | 733-751 |
123 036477
3767 | 3768 | AD59362 | CAGCAUACUUCCUGAACAUdT dT | AUGUUCAGGAAGUAUGCUGd TdT | 321-339 |
3769 | 3770 | AD53541 | GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsd T | UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdT sdT | 671-689 |
3771 | 3772 | AD59490 | UCUGUUGUUCUAUGCCCAAdT dT | UUGGGCAUAGAACAACAGAdT dT | 412-430 |
3773 | 3774 | AD59422 | UGAGACAGAUGCUAAUGGAdT dT | UCCAUUAGCAUCUGUCUCAdT dT | 1869-1887 |
3775 | 3776 | AD59467 | GCCAAUGACUCAACCCUCUdT dT | AGAGGGUUGAGUCAUUGGCd TdT | 1280-1298 |
3777 | 3778 | AD59579 | GAGUGCAACUUCUGCAGGAdT dT | UCCUGCAGAAGUUGCACUCdT dT | 2159-2177 |
3779 | 3780 | AD59426 | GUGAAAGAGAGAAGUCCUAdT dT | UAGGACUUCUCUCUUUCACdT dT | 2202-2220 |
3781 | 3782 | AD59363 | UAACUUGCCAAAAUCUGUUdT dT | AACAGAUUUUGGCAAGUUAdT dT | 901-919 |
3783 | 3784 | AD59436 | AAGCCAGUCUUGAGCUUCAdT dT | UGAAGCUCAAGACUGGCUUdT dT | 711-729 |
3785 | 3786 | AD53536 | cAcuuuucAGuAuGAucGudTsd T | ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTs dT | 922-940 |
3787 | 3788 | AD59491 | GCAGCAGUGUCUUCUGCAAdT dT | UUGCAGAAGACACUGCUGCdT dT | 693-711 |
3789 | 3790 | AD59500 | UCCUGAACAUGGAGAGUGUdT dT | ACACUCUCCAUGUUCAGGAdT dT | 330-348 |
3791 | 3792 | AD59394 | AUUUCUGGAACACUUGGCAdT dT | U GCCAAG U G U U CCAG AAAU dT dT | 1652-1670 |
3793 | 3794 | AD59441 | CAG UACACUACCAACAGAU dT dT | AUCUGUUGGUAGUGUACUGd TdT | 492-510 |
3795 | 3796 | AD59365 | GCAUGACCUCAAUUAUUUCdT dT | GAAAUAAUUGAGGUCAUGCdT dT | 2261-2279 |
3797 | 3798 | AD59411 | AGAACUGCUGCAAAGAUCUdT dT | AGAUCUUUGCAGCAGUUCUdT dT | 1432-1450 |
3799 | 3800 | AD59544 | CACCCCAGAUGAUGAACUAdT dT | UAGUUCAUCAUCUGGGGUGd TdT | 2073-2091 |
3801 | 3802 | AD59428 | GAUCCAAGGGAUUCGAAACdT dT | GUUUCGAAUCCCUUGGAUCdT dT | 1363-1381 |
3803 | 3804 | AD59471 | CU CAU CACCAAAAAG CAAG dTd T | CUUGCUUUUUGGUGAUGAGd TdT | 1052-1070 |
3805 | 3806 | AD59518 | ACAACAUGGUGCUGGGGCAdT dT | UGCCCCAGCACCAUGUUGUdT dT | 1150-1168 |
3807 | 3808 | AD53547 | GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsd T | UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTs dT | 935-953 |
3809 | 3810 | AD59573 | CAGCACGAGUUCUCUGAUUdT dT | AAUCAGAGAACUCGUGCUGdT dT | 1702-1720 |
3811 | 3812 | AD59473 | AAUGAUGUCAGCCACCUCAdT dT | UGAGGUGGCUGACAUCAUUdT dT | 1412-1430 |
3813 | 3814 | AD59412 | AG U U AU GG ACACU U U GAAAdT dT | UUUCAAAGUGUCCAUAACUdT dT | 1132-1150 |
3815 | 3816 | AD59522 | GAUGAUGAACUACUUCCUUdT dT | AAGGAAGUAGUUCAUCAUCdT dT | 2080-2098 |
3817 | 3818 | AD59502 | GCAGGAAAUGAAUGCCGUGdT dT | CACGGCAUUCAUUUCCUGCdT dT | 739-757 |
3819 | 3820 | AD59499 | UCUUCAAGAUAACUUGCCAdT dT | UGGCAAGUUAUCUUGAAGAdT dT | 892-910 |
3821 | 3822 | AD59520 | CGAUGGAGGGGAUCCCAGUdT dT | ACUGGGAUCCCCUCCAUCGdT dT | 811-829 |
- 124 036477
3823 | 3824 | AD59581 | CCAAAAAGC AAG U G U CAG U dT dT | ACUGACACUUGCUUUUUGGdT dT | 1059-1077 |
3825 | 3826 | AD59461 | GAUUGGGGAUCGGGAUGGAd TdT | UCCAUCCCGAUCCCCAAUCdTd T | 1612-1630 |
3827 | 3828 | AD- 59370 | CCCUGGAGUCUGUGCGGAUdT dT | AUCCGCACAGACUCCAGGGdT dT | 1791-1809 |
3829 | 3830 | AD53540 | GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsd T | AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsd T | 2321-2339 |
3831 | 3832 | AD59574 | CGGGCAUUGUCCACUGCAGdT dT | CUGCAGUGGACAAUGCCCGdT dT | 473-491 |
3833 | 3834 | AD59375 | UAUUCAGACUCCCUCAUCAdT dT | UGAUGAGGGAGUCUGAAUAd TdT | 1040-1058 |
3835 | 3836 | AD59387 | CACUGCAUUUUGAAGUGAUd TdT | AUCACUUCAAAAUGCAGUGdT dT | 2181-2199 |
3837 | 3838 | AD59397 | CCAGAAAGAGUGUCUCAUCdT dT | GAUGAGACACUCUUUCUGGdT dT | 872-890 |
3839 | 3840 | AD59396 | AGGCGGAGGGAUUGGGGAUd TdT | AUCCCCAAUCCCUCCGCCUdTd T | 1603-1621 |
3841 | 3842 | AD59393 | AGACCUCCAUGGGAAAGAUdT dT | AUCUUUCCCAUGGAGGUCUdT dT | 1231-1249 |
3843 | 3844 | AD59483 | GCAGGAGGCCACUGCAUUUdT dT | AAAUGCAGUGGCCUCCUGCdT dT | 2172-2190 |
3845 | 3846 | AD59430 | AUCUGUUUCCACUUUUCAGdT dT | CUGAAAAGUGGAAACAGAUdT dT | 913-931 |
3847 | 3848 | AD59463 | AGAGAAGUCCUAUUUCUCAdT dT | UGAGAAAUAGGACUUCUCUdT dT | 2209-2227 |
3849 | 3850 | AD53534 | GucuucAGAGuuGucuuuAdTsd T | uAAAGAcAACUCUGAAGACdTs dT | 2312-2330 |
3851 | 3852 | AD59514 | GGCUGGAACUGAAGCCUCAdT dT | UGAGGCUUCAGUUCCAGCCdT dT | 2130-2148 |
3853 | 3854 | AD59575 | GCCAUUAUCAUAUCCAGAUdT dT | AUCUGGAUAUGAUAAUGGCdT dT | 2292-2310 |
3855 | 3856 | AD- 59364 | AGCAGGCCCCAGUGUGGUUdT dT | AACCACACUGGGGCCUGCUdT dT | 781-799 |
3857 | 3858 | AD59402 | UCAGCUGAGUGCAACUUCUdT dT | AGAAGUUGCACUCAGCUGAdT dT | 2153-2171 |
3859 | 3860 | AD59479 | GAGCACACAUCU UCCCCAUdT dT | AUGGGGAAGAUGUGUGCUCd TdT | 1011-1029 |
3861 | 3862 | AD59481 | ACU U CCAG G ACAU CAU G CAdT dT | UGCAUGAUGUCCUGGAAGUdT dT | 843-861 |
3863 | 3864 | AD- 59530 | CCUAUCGAGUUUUUAAAACdT dT | GUUUUAAAAACUCGAUAGGdT dT | 981-999 |
3865 | 3866 | AD59582 | CUUCCUUGAGAAUCUGCUAdT dT | UAGCAGAUUCUCAAGGAAGdT dT | 2092-2110 |
3867 | 3868 | AD59506 | ACCAACAGAUCAAAGAAACdTd T | GUUUCUUUGAUCUGUUGGUd TdT | 501-519 |
3869 | 3870 | AD59567 | UAACCCCAGGCCAU UAUCAdT dT | UGAUAAUGGCCUGGGGUUAd TdT | 2283-2301 |
3871 | 3872 | AD59485 | CCAUGCCUCCAUGAUCCAAdT dT | UUGGAUCAUGGAGGCAUGGd TdT | 1351-1369 |
3873 | 3874 | AD59525 | UGAUGAACUAAUGAGCAGAdT dT | UCUGCUCAUUAGUUCAUCAdT dT | 1969-1987 |
3875 | 3876 | AD59566 | CCUGAAGAGCGCUGAGGGAdT dT | UCCCUCAGCGCUCUUCAGGdT dT | 1810-1828 |
3877 | 3878 | AD59580 | AACACUUGGCAAAGCCUUUdT dT | AAAGGCUUUGCCAAGUGUUdT dT | 1660-1678 |
- 125 036477
3879 | 3880 | AD59512 | UCUGCAGAAAGCAGGCAAAdT dT | UUUGCCUGCUUUCUGCAGAdT dT | 391-409 |
3881 | 3882 | AD59475 | CCGGCCUCCCUGUUGUCCAdT dT | UGGACAACAGGGAGGCCGGdT dT | 1890-1908 |
3883 | 3884 | AD59438 | CAUCAUCCCUGUGCGGGUUdT dT | AACCCGCACAGGGAUGAUGdT dT | 1921-1939 |
3885 | 3886 | AD59442 | UGUGCGGGUUGCAGAUGCUd TdT | AGCAUCUGCAACCCGCACAdTd T | 1930-1948 |
3887 | 3888 | AD59516 | GGAAAGAGGUUGCUGAAACdT dT | GUUUCAGCAACCUCUUUCCdT dT | 759-777 |
3889 | 3890 | AD59429 | AGGUCCACGCAGUGGGGCUdT dT | AGCCCCACUGCGUGGACCUdT dT | 1572-1590 |
3891 | 3892 | AD59510 | UGCCGUGAGGAAAGAGGUUd TdT | AACCUCUUUCCUCACGGCAdTd T | 751-769 |
3893 | 3894 | AD59457 | GCUAAUGGAUGCCGGCCUCdT dT | GAGGCCGGCAUCCAUUAGCdT dT | 1879-1897 |
3895 | 3896 | AD59434 | GAAGCAAGUGGGGCUGGAAd TdT | UUCCAGCCCCACUUGCUUCdT dT | 2119-2137 |
3897 | 3898 | AD59454 | CAUCUUCCGCCACAAUGAUdT dT | AUCAUUGUGGCGGAAGAUGd TdT | 1399-1417 |
3899 | 3900 | AD59468 | AUUUCUCAGGCUUGAGCAAdT dT | UUGCUCAAGCCUGAGAAAUdT dT | 2220-2238 |
3901 | 3902 | AD59565 | CCCGAGUCCCCCAGGCCUUdTd T | AAGGCCUGGGGGACUCGGGdT dT | 372-390 |
3903 | 3904 | AD59416 | CAAGCAAAU GCCCU U UCCU dT dT | AGGAAAGGGCAUUUGCUUGd TdT | 651-669 |
3905 | 3906 | AD59420 | CCCCUCAGUCCCCAAGAUUdTd T | AAUCUUGGGGACUGAGGGGd TdT | 1453-1471 |
3907 | 3908 | AD59552 | CUACGGUGCCCCGGGGAGAdT dT | UCUCCCCGGGGCACCGUAGdT dT | 2019-2037 |
3909 | 3910 | AD59558 | AAAACUGCCCCAAGAUGAUdT dT | AUCAUCUUGGGGCAGUUUUd TdT | 429-447 |
3911 | 3912 | AD59404 | ACAAAACUGCUAAGGCCAAdT dT | UUGGCCUUAGCAGUUUUGUd TdT | 540-558 |
3913 | 3914 | AD59455 | GAUUCUGGGAACCAUGCCUdT dT | AGGCAUGGUUCCCAGAAUCdT dT | 1340-1358 |
3915 | 3916 | AD59496 | CCAGAUGGCACACAGCUUCdT dT | GAAGCUGUGUGCCAUCUGGdT dT | 593-611 |
3917 | 3918 | AD59446 | AGGGAUUCGAAACAGCCGAdT dT | UCGGCUGUUUCGAAUCCCUdT dT | 1369-1387 |
3919 | 3920 | AD59435 | CUCUGCAGUCCUCAGCGCAdT dT | UGCGCUGAGGACUGCAGAGdT dT | 109-127 |
3921 | 3922 | AD59419 | CCGCCGCCUCUGCAGUCCUdT dT | AGGACUGCAGAGGCGGCGGdT dT | 102-120 |
3923 | 3924 | AD59533 | CUGGCUGGAGCCCUGGAGUdT dT | ACUCCAGGGCUCCAGCCAGdTd T | 1781-1799 |
3925 | 3926 | AD59366 | GACAUCAUG CAAAAGCAAAdT dT | UUUGCUUUUGCAUGAUGUCd TdT | 851-869 |
3927 | 3928 | AD59521 | GCUUGAGCAAGUUGGUAUCd TdT | GAUACCAACUUGCUCAAGCdT dT | 2229-2247 |
3929 | 3930 | AD59563 | CAGGCUGUGAGAUUUACUCdT dT | GAGU AAAU C U CACAG CCU G dT dT | 1320-1338 |
3931 | 3932 | AD59534 | AGAGCUGUGUGAUGUGGCCd TdT | GGCCACAUCACACAGCUCUdTd T | 1522-1540 |
3933 | 3934 | AD59407 | GGAGCUGGCAGACCUCCAUdT dT | AUGGAGGUCUGCCAGCUCCdT dT | 1222-1240 |
- 126 036477
3935 | 3936 | AD59445 | AUCCCAGUGGACUGCUGAAdT dT | UUCAGCAGUCCACUGGGAUdT dT | 822-840 |
3937 | 3938 | AD59546 | GUCAAACUCAUGAGACAGAdT dT | UCUGUCUCAUGAGUUUGACdT dT | 1859-1877 |
3939 | 3940 | AD59456 | CUUUCCUGGCAGCACAGAUdT dT | AUCUGUGCUGCCAGGAAAGdT dT | 663-681 |
3941 | 3942 | AD59503 | CCCUCCGGCCAGUGAGAAAdT dT | UUUCUCACUGGCCGGAGGGdT dT | 520-538 |
3943 | 3944 | AD59536 | CUACCUAGGAAUGAGUCGCdT dT | GCGACUCAUUCCUAGGUAGdT dT | 1093-1111 |
3945 | 3946 | AD59385 | CCCAAGAUUGUGGCAUUUGdT dT | CAAAUGCCACAAUCUUGGGdT dT | 1463-1481 |
3947 | 3948 | AD59367 | GAGCAAUCACCUUCGUGGAdT dT | UCCACGAAGGUGAUUGCUCdT dT | 1551-1569 |
3949 | 3950 | AD59458 | UGCCCAUUCUUAUCCCGAGdT dT | CUCGGGAUAAGAAUGGGCAdT dT | 359-377 |
3951 | 3952 | AD59381 | AAGGCCAAGGUCCAACAGAdT dT | UCUGUUGGACCUUGGCCUUdT dT | 551-569 |
3953 | 3954 | AD59538 | CACACAGCUUCCGUCUGGAdT dT | UCCAGACGGAAGCUGUGUGdT dT | 601-619 |
3955 | 3956 | AD59421 | UUAUGGGGCUCGAGGCGGAd TdT | UCCGCCUCGAGCCCCAUAAdTd T | 1591-1609 |
3957 | 3958 | AD59388 | UGUCUUCUGCAAAGCCAGUdT dT | ACUGGCUUUGCAGAAGACAdT dT | 700-718 |
3959 | 3960 | AD59444 | AGGCCUGAGCAUGACCUCAdT dT | UGAGGUCAUGCUCAGGCCUdT dT | 2253-2271 |
3961 | 3962 | AD59528 | AUGUGAAUUAAGUUAUAUUd TdT | AAUAUAACUUAAUUCACAUdT dT | 2332-2350 |
3963 | 3964 | AD59498 | ACUGCUGAAGAACUUCCAGdT dT | CUGGAAGUUCUUCAGCAGUdT dT | 832-850 |
3965 | 3966 | AD59497 | UGAGAAAGACAAAACUGCUdT dT | AGCAGUUUUGUCUUUCUCAdT dT | 532-550 |
3967 | 3968 | AD59384 | UCAGCCACCUCAGAGAACUdT dT | AGUUCUCUGAGGUGGCUGAd TdT | 1419-1437 |
3969 | 3970 | AD59452 | GGCAACGAGCGUUUCGUUUd TdT | AAACGAAACGCUCGUUGCCdT dT | 51-69 |
3971 | 3972 | AD59379 | CCUGAUGGAUCCCAGCAGAdT dT | UCUGCUGGGAUCCAUCAGGdT dT | 572-590 |
3973 | 3974 | AD59529 | UGUGCCCACUGGAAGAGCUdT dT | AGCUCUUCCAGUGGGCACAdT dT | 1509-1527 |
3975 | 3976 | AD59389 | CCACAGGAGCCAGCAUACUdT dT | AGUAUGCUGGCUCCUGUGGdT dT | 311-329 |
3977 | 3978 | AD59585 | GUGGUACUAGAAAUAUUUCd TdT | GAAAUAUUUCUAGUACCACdT dT | 1170-1188 |
3979 | 3980 | AD59570 | UUCGCCGCUGCCCAUUCUUdT dT | AAGAAUGGGCAGCGGCGAAdT dT | 351-369 |
3981 | 3982 | AD59415 | CCGCCAGCACCAGCGCAACdTd T | GUUGCGCUGGUGCUGGCGGd TdT | 1840-1858 |
3983 | 3984 | AD59505 | CGCUGAGGGACGGGUGCUUd TdT | AAGCACCCGUCCCUCAGCGdTd T | 1819-1837 |
3985 | 3986 | AD59557 | UGGACUUCUCGACUUGAGUd TdT | ACUCAAGUCGAGAAGUCCAdT dT | 69-87 |
3987 | 3988 | AD59548 | AAAGAAACCCCUCCGGCCAdTd T | UGGCCGGAGGGGUUUCUUUd TdT | 512-530 |
3989 | 3990 | AD59487 | UUGACACCGUACGGUCCUAdT dT | UAGGACCGUACGGUGUCAAdT dT | 1719-1737 |
127 036477
3991 | 3992 | AD59550 | CCCUCUUCACCCUGGCUAAdT dT | UUAGCCAGGGUGAAGAGGGdT dT | 1293-1311 |
3993 | 3994 | AD59572 | CCCCCAGGCCUUUCUGCAGdT dT | CUGCAGAAAGGCCUGGGGGdT dT | 379-397 |
3995 | 3996 | AD59554 | AUG CCCAAAAC U GCCCCAAdTd T | UUGGGGCAGUUUUGGGCAUd TdT | 423-441 |
3997 | 3998 | AD59437 | CUUGAGUGCCCGCCUCCUUdT dT | AAGGAGGCGGGCACUCAAGdT dT | 81-99 |
3999 | 4000 | AD59584 | GGGUACAUCGCCAGCACGAdT dT | UCGUGCUGGCGAUGUACCCdT dT | 1691-1709 |
4001 | 4002 | AD59373 | GUGUGGGGCAGUUAUGGACd TdT | GUCCAUAACUGCCCCACACdTd T | 1123-1141 |
4003 | 4004 | AD59545 | ACAUAGUCCUGGAAAUAAAdT dT | UUUAUUUCCAGGACUAUGUdT dT | 2372-2390 |
4005 | 4006 | AD59547 | AUCCCAGCAGAGUCCAGAUdT dT | AUCUGGACUCUGCUGGGAUdT dT | 580-598 |
4007 | 4008 | AD59470 | CUAGAUUCUUUCCACAGGAdT dT | UCCUGUGGAAAGAAUCUAGdT dT | 300-318 |
4009 | 4010 | AD59417 | UUGUUUUCCUCGUGCUUUGd TdT | CAAAGCACGAGGAAAACAAdTd T | 1259-1277 |
4011 | 4012 | AD59535 | CCUCCUUCGCCGCCGCCUCdTd T | GAGGCGGCGGCGAAGGAGGdT dT | 93-111 |
4013 | 4014 | AD59507 | UGAGGCUGCUCCCGGACAAdT dT | UUGUCCGGGAGCAGCCUCAdT dT | 31-49 |
4015 | 4016 | AD59519 | CCAACAGACUCCUGAUGGAdT dT | UCCAUCAGGAGUCUGUUGGdT dT | 562-580 |
4017 | 4018 | AD59391 | UCACAUGGAAGCAAGUGGGdT dT | CCCACUUGCUUCCAUGUGAdT dT | 2112-2130 |
4019 | 4020 | AD59537 | CAUUCAAUGGAUGGGGCGGd TdT | CCGCCCCAUCCAUUGAAUGdTd T | 1490-1508 |
4021 | 4022 | AD59450 | AGGAAUGAGUCGCCACCCAdT dT | UGGGUGGCGACUCAUUCCUdT dT | 1099-1117 |
4023 | 4024 | AD59449 | UGGACUUAGAGCGGGAGCUd TdT | AGCUCCCGCUCUAAGUCCAdTd T | 1209-1227 |
4025 | 4026 | AD59418 | CUAAAAACACAGAAGUCUGdT dT | CAGACUUCUGUGUUUUUAGd TdT | 1950-1968 |
4027 | 4028 | AD59561 | CCCUCACCACACACCCCAGdTd T | CUGGGGUGUGUGGUGAGGGd TdT | 2062-2080 |
4029 | 4030 | AD59460 | AAUCCUUGCUUCAGGGACUdT dT | AGUCCCUGAAGCAAGGAUUdT dT | 171-189 |
4031 | 4032 | AD59409 | UUGUGGCAUUUGAAACUGUd TdT | ACAGUUUCAAAUGCCACAAdT dT | 1470-1488 |
4033 | 4034 | AD59476 | UCAAUUACCCUACGGUGCCdT dT | GGCACCGUAGGGUAAUUGAdT dT | 2010-2028 |
4035 | 4036 | AD59406 | CAAGCCAGCCCCUCGGGCAdTd T | UGCCCGAGGGGCUGGCUUGdT dT | 460-478 |
4037 | 4038 | AD59569 | GAGUCUUCCCUGCCUGGAUdT dT | AUCCAGGCAGGGAAGACUCdT dT | 259-277 |
4039 | 4040 | AD59451 | UGGAGAGUGUUGUUCGCCGd TdT | CGGCGAACAACACUCUCCAdTd T | 339-357 |
4041 | 4042 | AD- 59553 | ACCCCUUGCCUGCCACAAGdTd T | CUUGUGGCAGGCAAGGGGUdT dT | 621-639 |
4043 | 4044 | AD59372 | CUGGAUGGAUGAGUGGCUUd TdT | AAGCCACUCAUCCAUCCAGdTd T | 272-290 |
4045 | 4046 | AD59377 | CAAGAUGAUGGAAGUUGGGd TdT | CCCAACUUCCAUCAUCUUGdT dT | 439-457 |
- 128 036477
4047 | 4048 | AD59531 | UUUCGUUUGGACUUCUCGAd TdT | UCGAGAAGUCCAAACGAAAdT dT | 62-80 |
4049 | 4050 | AD59560 | UCAUCUUCACCACCUCUCUdT dT | AGAGAGGUGGUGAAGAUGAd TdT | 1749-1767 |
4051 | 4052 | AD59489 | UGCCCAGUUCUUCCCGCUGdT dT | CAGCGGGAAGAACUGGGCAdT dT | 132-150 |
4053 | 4054 | AD59540 | AAAAAUGGACAUCAUUUCUdT dT | AGAAAUGAUGUCCAUUUUUdT dT | 1639-1657 |
4055 | 4056 | AD59378 | CUUGAGCUUCAGGAGGAUGd TdT | CAUCCUCCUGAAGCUCAAGdT dT | 719-737 |
4057 | 4058 | AD59403 | CCUCUCUGCCACCCAUGCUdTd T | AGCAUGGGUGGCAGAGAGGdT dT | 1761-1779 |
4059 | 4060 | AD59493 | AAAGUCAGGAUCCCUAAGAdT dT | UCUUAGGGAUCCUGACUUUdT dT | 242-260 |
4061 | 4062 | AD59374 | CGACCACGGAGGAAUCCUUdT dT | AAGGAUUCCUCCGUGGUCGdT dT | 159-177 |
4063 | 4064 | AD59380 | UUCCGUCUGGACACCCCUUdT dT | AAGGGGUGUCCAGACGGAAdT dT | 609-627 |
4065 | 4066 | AD59576 | CCACCCAUGCUGCUGGCUGdT dT | CAG CCAG CAGC AU G G G U G G dT dT | 1769-1787 |
4067 | 4068 | AD59425 | UGAGAAAAAGAAUGACCACdT dT | GUGGUCAUUCUUUUUCUCAd TdT | 961-979 |
4069 | 4070 | AD- 59509 | UAAGAUGAUGCCAGGCUGUdT dT | ACAGCCUGGCAUCAUCUUAdT dT | 1309-1327 |
4071 | 4072 | AD59488 | AGUUAUAUUAAAUUUUAAUd TdT | AUUAAAAUUUAAUAUAACUdT dT | 2342-2360 |
4073 | 4074 | AD59486 | UCUUCCCGCUGUGGGGACAdT dT | UGUCCCCACAGCGGGAAGAdT dT | 140-158 |
4075 | 4076 | AD59465 | UGCCACAAGCCAGGGCACUdT dT | AGUGCCCUGGCUUGUGGCAdT dT | 631-649 |
4077 | 4078 | AD59484 | AGCGCAGUUAUGCCCAGUUdT dT | AACUGGGCAUAACUGCGCUdT dT | 122-140 |
4079 | 4080 | AD59368 | GGACCAGGAGAAAGUCAGGdT dT | CCUGACUUUCUCCUGGUCCdT dT | 232-250 |
4081 | 4082 | AD59464 | UGUCCACUGCCCCAGCCACdTd T | GUGGCUGGGGCAGUGGACAdT dT | 1903-1921 |
4083 | 4084 | AD59386 | AUCGCGGCCUGAGGCUGCUdT dT | AGCAGCCUCAGGCCGCGAUdT dT | 22-40 |
4085 | 4086 | AD59439 | GGGGAUGUGGGGACCAGGAd TdT | UCCUGGUCCCCACAUCCCCdTd T | 222-240 |
4087 | 4088 | AD59440 | CUGGAAAUAAAUUCUUGCUdT dT | AGCAAGAAUUUAUUUCCAGdT dT | 2380-2398 |
4089 | 4090 | AD59542 | U U GAAACU G U CCAU U CAAU dT dT | AU U G AAU G G ACAG U U U CAAdT dT | 1479-1497 |
4091 | 4092 | AD59559 | GUGGGGACACGACCACGGAdT dT | UCCGUGGUCGUGUCCCCACdT dT | 150-168 |
4093 | 4094 | AD59586 | CGCAGUGGGGCUUUAUGGGd TdT | CCCAUAAAGCCCCACUGCGdTd T | 1579-1597 |
4095 | 4096 | AD59408 | UUGUCUUUAUAUGUGAAUUd TdT | AAUUCACAUAUAAAGACAAdT dT | 2322-2340 |
4097 | 4098 | AD59568 | UCACCCUGGCUAAGAUGAUdT dT | AUCAUCUUAGCCAGGGUGAdT dT | 1299-1317 |
4099 | 4100 | AD59398 | GUAUCUGCUCAGGCCUGAGdT dT | CUCAGGCCUGAGCAGAUACdT dT | 2243-2261 |
4101 | 4102 | AD59508 | AUGAGUGGCUUCUUCUCCAdT dT | UGGAGAAGAAGCCACUCAUdT dT | 280-298 |
- 129 036477
4103 | 4104 | AD59523 | G AAG U U G G GG CCAAG CCAGdT dT | CUGGCUUGGCCCCAACUUCdT dT | 449-467 |
4105 | 4106 | AD59410 | UCAGGGACUCGGGACCCUGdT dT | CAGGGUCCCGAGUCCCUGAdT dT | 181-199 |
4107 | 4108 | AD59541 | UCCUACGGAUUGCCCCCACdT dT | GUGGGGGCAAUCCGUAGGAdT dT | 2043-2061 |
4109 | 4110 | AD59524 | UUACUCUGAUUCUGGGAACdT dT | GUUCCCAGAAUCAGAGUAAdT dT | 1333-1351 |
4111 | 4112 | AD59501 | AUCCCUAAGAGUCUUCCCUdT dT | AGGGAAGACUCUUAGGGAUdT dT | 251-269 |
4113 | 4114 | AD59383 | UGCCAAAGUACAUCUUCCGdT dT | CGGAAGAUGUACUUUGGCAdT dT | 1389-1407 |
4115 | 4116 | AD59577 | UCCUCGGGUUUAGGGGAUGd TdT | CAUCCCCUAAACCCGAGGAdTd T | 210-228 |
4117 | 4118 | AD59447 | UGCUGAAACCUCAGCAGGCdT dT | GCCUGCUGAGGUUUCAGCAdT dT | 769-787 |
4119 | 4120 | AD59555 | CCACCCACGGGUGUGUGGGdT dT | CCCACACACCCG UGGGUGGdT dT | 1111-1129 |
4121 | 4122 | AD59405 | UGGUGCAGUAAUGACUACCdT dT | GGUAGUCAUUACUGCACCAdT dT | 1079-1097 |
4123 | 4124 | AD59371 | UUCUCCACCUAGAUUCUUUdT dT | AAAGAAUCUAGGUGGAGAAdT dT | 292-310 |
4125 | 4126 | AD59443 | UAAGGCGCCGGCGAUCGCGdT dT | CGCGAUCGCCGGCGCCUUAdT dT | 9-27 |
4127 | 4128 | AD59401 | UGGAACUAGUAAAUUCCAUdT dT | AUGGAAUUUACUAGUUCCAdT dT | 1189-1207 |
4129 | 4130 | AD59494 | GGACCCUGCUGGACCCCUUdT dT | AAGGGGUCCAGCAGGGUCCdT dT | 192-210 |
4131 | 4132 | AD59504 | UCAAUUAUUUCACUUAACCdT dT | GGUUAAGUGAAAUAAUUGAd TdT | 2269-2287 |
4133 | 4134 | AD59369 | CCCGGACAAGGGCAACGAGdT dT | CUCGUUGCCCUUGUCCGGGdT dT | 41-59 |
4135 | 4136 | AD59571 | UUUUAAAACUGUGAACCGGdT dT | CCGG U UCACAG U U U U AAAAdT dT | 991-1009 |
4137 | 4138 | AD59527 | GUGCUUCGCCGCCAGCACCdT dT | GGUGCUGGCGGCGAAGCACdT dT | 1832-1850 |
4139 | 4140 | AD59466 | UGGACCCCUUCCUCGGGUUdT dT | AACCCGAGGAAGGGGUCCAdT dT | 201-219 |
4141 | 4142 | AD59526 | CUGUAUAUUAAGGCGCCGGdT dT | CCGGCGCCUUAAUAUACAGdT dT | 1-19 |
4143 | 4144 | AD59543 | UUGCCCCCACCCCUCACCAdTd T | UGGUGAGGGGUGGGGGCAAd TdT | 2052-2070 |
4145 | 4146 | AD59564 | AUGGGGCGGUGUGCCCACUdT dT | AGUGGGCACACCGCCCCAUdTd T | 1500-1518 |
4147 | 4148 | AD59583 | CUAUAGUAAAAACAUAGUCdT dT | GACUAUGUUUUUACUAUAGd TdT | 2361-2379 |
In vitro активность siRNA в подавлении mRNA ALAS1 исследовали в скрининге разовой дозы в клетках Нер3В, которые трансфицировали с использованием Lipofectamine2000 в качестве средства трансфекции. Эксперименты по разовой дозе выполняли при концентрации дуплекса 10 нМ и анализировали при помощи анализа с разветвленной ДНК (bDNA). Результаты показаны в табл. 19 и выражены в виде процента оставшейся mRNA.
- 130 036477
Таблица 19. Подавление mRNA ALAS1, определенное при помощи анализа с bDNA
Дуплекс | % оставшейся mRNA | SD |
AD-59453 | 11,2 | 1,5 |
AD-59395 | 12,7 | 1,1 |
AD-59477 | 14,5 | 2,0 |
AD-59492 | 14,8 | 2,1 |
AD-59361 | 15,1 | 4,9 |
AD-59462 | 15,4 | 2,6 |
AD-59433 | 15,8 | 2,7 |
AD-59424 | 16,0 | 1,7 |
AD-59414 | 16,1 | 1,3 |
AD-59539 | 16,2 | 2,6 |
AD-59400 | 16,2 | 1,8 |
AD-59551 | 16,3 | 2,3 |
AD-59482 | 16,6 | 2,1 |
AD-59448 | 16,6 | 3,7 |
AD-59392 | 16,9 | 3,5 |
AD-59469 | 16,9 | 2,2 |
AD-59431 | 17,0 | 2,0 |
AD-59423 | 17,1 | 3,8 |
AD-59517 | 17,2 | 1,5 |
AD-59578 | 17,3 | 3,1 |
AD-59495 | 17,7 | 3,7 |
AD-59432 | 17,7 | 2,8 |
AD-59382 | 17,9 | 3,2 |
AD-59472 | 18,6 | 3,5 |
AD-59459 | 18,7 | 3,8 |
AD-59413 | 18,8 | 2,4 |
AD-59478 | 18,9 | 3,0 |
AD-59376 | 18,9 | 3,2 |
AD-59556 | 18,9 | 2,4 |
AD-59399 | 19,0 | 4,1 |
AD-59474 | 19,4 | 1,6 |
AD-53542 | 19,4 | 1,7 |
AD-59480 | 19,6 | 1,6 |
AD-59549 | 19,7 | 2,1 |
AD-59515 | 19,8 | 4,4 |
AD-59427 | 19,9 | 3,2 |
AD-59390 | 19,9 | 3,4 |
AD-59511 | 19,9 | 2,2 |
- 131 036477
AD-59532 | 20,0 | 2,4 |
AD-59562 | 20,2 | 2,6 |
AD-59513 | 20,3 | 3,9 |
AD-59362 | 20,6 | 2,5 |
AD-53541 | 20,6 | 2,2 |
AD-59490 | 20,7 | 2,3 |
AD-59422 | 20,8 | 4,5 |
AD-59467 | 21,2 | 2,3 |
AD-59579 | 21,2 | 3,3 |
AD-59426 | 21,7 | 2,3 |
AD-59363 | 21,7 | 2,7 |
AD-59436 | 21,7 | 2,7 |
AD-53536 | 21,9 | 1,5 |
AD-59491 | 21,9 | 2,6 |
AD-59500 | 22,2 | 2,8 |
AD-59394 | 22,3 | 10,1 |
AD-59441 | 22,3 | 2,6 |
AD-59365 | 22,4 | 4,2 |
AD-59411 | 22,5 | 2,9 |
AD-59544 | 22,5 | 2,1 |
AD-59428 | 22,7 | 4,7 |
AD-59471 | 22,9 | 5,0 |
AD-59518 | 22,9 | 2,3 |
AD-53547 | 22,9 | 1,5 |
AD-59573 | 23,0 | 4,2 |
AD-59473 | 23,2 | 1,8 |
AD-59412 | 23,4 | 2,5 |
AD-59522 | 23,4 | 3,3 |
AD-59502 | 23,6 | 2,7 |
AD-59499 | 23,6 | 1,6 |
AD-59520 | 23,8 | 3,8 |
AD-59581 | 23,9 | 6,0 |
AD-59461 | 24,3 | 4,2 |
AD-59370 | 24,3 | 5,6 |
AD-53540 | 24,4 | 2,1 |
AD-59574 | 24,5 | 2,0 |
AD-59375 | 24,6 | 2,3 |
AD-59387 | 24,8 | 7,2 |
AD-59397 | 24,9 | 9,6 |
AD-59396 | 25,0 | 10,2 |
AD-59393 | 25,3 | 11,6 |
AD-59483 | 25,4 | 3,8 |
- 132 036477
AD-59430 | 25,5 | 1,8 |
AD-59463 | 25,6 | 4,8 |
AD-53534 | 25,9 | 3,1 |
AD-59514 | 26,2 | 5,7 |
AD-59575 | 26,2 | 3,2 |
AD-59364 | 26,2 | 4,5 |
AD-59402 | 26,3 | 3,1 |
AD-59479 | 26,3 | 2,5 |
AD-59481 | 26,4 | 2,2 |
AD-59530 | 26,4 | 4,4 |
AD-59582 | 26,6 | 3,9 |
AD-59506 | 27,0 | 4,1 |
AD-59567 | 27,3 | 1,1 |
AD-59485 | 27,7 | 4,7 |
AD-59525 | 28,3 | 3,1 |
AD-59566 | 28,5 | 0,6 |
AD-59580 | 28,7 | 7,1 |
AD-59512 | 29,5 | 2,5 |
AD-59475 | 29,6 | 4,2 |
AD-59438 | 29,6 | 3,3 |
AD-59442 | 29,9 | 2,8 |
AD-59516 | 30,4 | 3,8 |
AD-59429 | 30,8 | 4,3 |
AD-59510 | 31,3 | 1,9 |
AD-59457 | 31,4 | 1,2 |
AD-59434 | 31,6 | 3,5 |
AD-59454 | 32,0 | 1,9 |
AD-59468 | 32,2 | 3,2 |
AD-59565 | 32,4 | 1,5 |
AD-59416 | 32,7 | 1,7 |
AD-59420 | 33,2 | 3,1 |
AD-59552 | 33,2 | 2,2 |
AD-59558 | 33,8 | 3,8 |
AD-59404 | 34,0 | 5,4 |
AD-59455 | 34,8 | 1,3 |
AD-59496 | 34,9 | 5,2 |
AD-59446 | 35,5 | 1,7 |
AD-59435 | 35,9 | 1,2 |
AD-59419 | 36,0 | 1,4 |
AD-59533 | 36,7 | 3,7 |
AD-59366 | 36,7 | 6,0 |
AD-59521 | 36,9 | 4,3 |
- 133 036477
AD-59563 | 36,9 | 4,1 |
AD-59534 | 36,9 | 3,3 |
AD-59407 | 37,1 | 4,7 |
AD-59445 | 37,2 | 3,2 |
AD-59546 | 37,9 | 4,9 |
AD-59456 | 38,3 | 4,0 |
AD-59503 | 38,8 | 5,0 |
AD-59536 | 39,8 | 4,2 |
AD-59385 | 39,9 | 13,7 |
AD-59367 | 40,0 | 3,6 |
AD-59458 | 40,0 | 3,4 |
AD-59381 | 40,3 | 9,9 |
AD-59538 | 40,8 | 4,9 |
AD-59421 | 40,9 | 6,4 |
AD-59388 | 41,0 | 9,1 |
AD-59444 | 41,1 | 2,7 |
AD-59528 | 41,9 | 3,3 |
AD-59498 | 42,2 | 3,3 |
AD-59497 | 42,4 | 4,9 |
AD-59384 | 42,7 | 17,6 |
AD-59452 | 42,7 | 3,1 |
AD-59379 | 43,6 | 2,6 |
AD-59529 | 43,8 | 4,8 |
AD-59389 | 44,1 | 6,4 |
AD-59585 | 44,3 | 3,2 |
AD-59570 | 45,1 | 4,0 |
AD-59415 | 46,6 | 2,3 |
AD-59505 | 47,5 | 6,2 |
AD-59557 | 48,1 | 4,4 |
AD-59548 | 49,9 | 4,0 |
AD-59487 | 50,7 | 3,2 |
AD-59550 | 50,8 | 5,8 |
AD-59572 | 51,1 | 4,0 |
AD-59554 | 51,3 | 6,0 |
AD-59437 | 52,2 | 4,8 |
AD-59584 | 54,9 | 2,7 |
AD-59373 | 55,3 | 20,1 |
AD-59545 | 55,4 | 3,4 |
AD-59547 | 55,9 | 4,7 |
AD-59470 | 56,0 | 2,7 |
AD-59417 | 56,4 | 7,7 |
AD-59535 | 57,6 | 5,1 |
- 134 036477
AD-59507 | 58,8 | 4,7 |
AD-59519 | 59,1 | 5,6 |
AD-59391 | 60,1 | 12,5 |
AD-59537 | 60,6 | 9,1 |
AD-59450 | 60,7 | 7,2 |
AD-59449 | 61,6 | 6,8 |
AD-59418 | 61,8 | 8,4 |
AD-59561 | 62,2 | 7,2 |
AD-59460 | 62,8 | 4,7 |
AD-59409 | 64,4 | 9,0 |
AD-59476 | 65,2 | 5,6 |
AD-59406 | 65,6 | 3,5 |
AD-59569 | 66,7 | 7,6 |
AD-59451 | 66,9 | 2,9 |
AD-59553 | 67,2 | 8,8 |
AD-59372 | 67,3 | 25,6 |
AD-59377 | 68,7 | 5,1 |
AD-59531 | 68,7 | 9,0 |
AD-59560 | 68,7 | 12,7 |
AD-59489 | 69,6 | 8,9 |
AD-59540 | 70,1 | 10,1 |
AD-59378 | 70,6 | 14,1 |
AD-59403 | 71,4 | 3,3 |
AD-59493 | 72,3 | 3,5 |
AD-59374 | 75,9 | 5,1 |
AD-59380 | 76,4 | 11,1 |
AD-59576 | 77,5 | 16,2 |
AD-59425 | 77,9 | 10,6 |
AD-59509 | 78,0 | 3,2 |
AD-59488 | 78,6 | 7,1 |
AD-59486 | 79,4 | 5,0 |
AD-59465 | 79,5 | 5,1 |
AD-59484 | 79,8 | 3,2 |
AD-59368 | 80,0 | 11,9 |
AD-59464 | 80,2 | 9,3 |
AD-59386 | 80,6 | 33,2 |
AD-59439 | 80,9 | 4,0 |
AD-59440 | 82,2 | 1,9 |
AD-59542 | 83,3 | 10,6 |
AD-59559 | 83,7 | 9,1 |
AD-59586 | 83,8 | 11,5 |
AD-59408 | 86,3 | 2,8 |
AD-59568 | 86,8 | 4,2 |
AD-59398 | 87,4 | 24,9 |
AD-59508 | 87,5 | 2,5 |
AD-59523 | 87,6 | 11,8 |
AD-59410 | 88,8 | 8,3 |
AD-59541 | 88,9 | 10,8 |
AD-59524 | 89,5 | 12,1 |
AD-59501 | 89,9 | 5,1 |
AD-59383 | 90,8 | 27,4 |
AD-59577 | 91,1 | 2,3 |
AD-59447 | 91,3 | 12,9 |
AD-59555 | 91,7 | 3,4 |
AD-59405 | 92,5 | 5,7 |
AD-59371 | 93,5 | 31,7 |
AD-59443 | 93,8 | 9,0 |
AD-59401 | 94,5 | 7,1 |
AD-59494 | 95,1 | 9,1 |
AD-59504 | 96,8 | 11,7 |
AD-59369 | 96,8 | 4,8 |
AD-59571 | 97,4 | 7,0 |
AD-59527 | 98,6 | 7,8 |
AD-59466 | 99,7 | 14,0 |
AD-59526 | 102,9 | 4,6 |
AD-59543 | 103,7 | 3,0 |
AD-59564 | 103,7 | 12,1 |
AD-59583 | 112,4 | 13,2 |
- 135 036477
Двести тридцать два дуплекса, которые были исследованы, подавляли mRNA ALAS1 в различной степени в этом анализе разовой дозы. Согласно этому анализу, по меньшей мере четыре из дуплексов (AD-59453, AD-59395, aD-59477 и AD-59492) подавляли mRNA ALAS1 на 85% или более, 39 из дуплексов подавляли mRNA ALAS1 на 80% или более, 101 из дуплексов подавляли mRNA ALAS1 на 70% или более, и 152 из дуплексов подавляли mRNA ALAS1 на 50% или более. В противоположность, некоторые дуплексы не характеризовались заметным подавлением в данном анализе.
Пример 13. Дозочувствительное ингибирование предшественников порфиринов ALA и PBG при помощи siRNA ALAS1
Дозочувствительные эффекты siRNA ALAS1 исследовали в мышиной модели AIP (см. пример 5). В этой модели показана ~30% остаточная активность PBGD, ~2-кратное повышение исходных уровней ALA и PBG, ~30-100-кратное повышение уровней ALA и PBG после индукции инъекциями фенобарбитала раз в день в течение 3-4 дней. У более старых животных наблюдалась дегенерация аксонов и нарушенная двигательная функция.
siRNA ALAS1, используемая в этом примере, представляла собой дуплекс AD-53558 в составе AF11. На 1 день мышам вводили 1, 0,5, 0,1 или 0,05 мг/кг siRNA ALAS1 или контроль LUC AD-1955 путем внутривенной инъекции. Вводили три инъекции фенобарбитала (1 инъекция в сутки на 2, 3 и 4 дни) для индукции ALAS1 в печени и предшественников порфирина, ALA и PBG. Образцы плазмы и ночной мочи собирали на 5 день, а уровни метаболитов измеряли при помощи LC-MS. Исходные уровни ALA и PBG измеряли перед первой обработкой на 1 день. Результаты показаны на фиг. 16. siRNA ALAS1 ингибировала уровни ALA и PBG дозозависимым образом. Ингибиторный эффект на уровни ALA в плазме наблюдали в дозах siRNA ALAS1 до 0,05 мг/кг, а ингибиторный эффект на уровни PBG в плазме отмечали в дозах siRNA до 0,1 мг/кг.
Пример 14. Стойкое ингибирование предшественников порфиринов ALA и PBG ПРИ помощи siRNA ALAS1
Стойкость эффектов siRNA ALAS1 исследовали в мышиной модели AIP (см. пример 5). siRNA ALAS1, используемая в этом примере, представляла собой дуплекс AD-53558 в составе AF11. Схема эксперимента и результаты этого эксперимента показаны на фиг. 17. На 1 день мышам вводили 1 мг/кг siRNA ALAS1 или контроль LUC AD-1955 путем внутривенной инъекции. Три инъекции фенобарбитала вводили на 0 неделе (1 инъекция в день на 2, 3 и 4 дни), 2 неделе (1 инъекция в день на 15, 16 и 17 дни) и 4 неделе (1 инъекция в день на 29, 30 и 31 дни) для индукции ALAS1 в печени и предшественников порфиринов ALA и PBG. Образцы плазмы и ночной мочи собирали на 5, 18 и 32 дни, а уровни метаболитов измеряли при помощи LC-MS. Исходные уровни ALA и PBG измеряли перед первой обработкой на 1 день.
Как показано на фиг. 17, siRNA ALAS1 оказывала стойкий эффект в снижении уровней ALA и PBG в плазме. Введение siRNA ALAS1 подавляло уровни ALA и PBG в плазме по меньшей мере в течение 2 недель. Из этих результатов видно, что siRNA ALAS1 является эффективным лекарственным препаратом для снижения повышенных уровней ALA и PBG и, таким образом, может использоваться в профилактике, например, для снижения хронически повышенных уровней ALA и PBG и для предупреждения рецидивирующих приступов порфирии.
Пример 15. siRNA ALAS1 обеспечивает более быстрое наступление действия по сравнению с лечением гемином
Эффекты обработки siRNA ALAS 1 сравнивали с эффектами обработки гемином в мышиной модели AIP (см. пример 5). siRNA ALAS1, используемая в этом примере, представляла собой дуплекс AD-53558 в составе AF11. Схема эксперимента и результаты этого эксперимента показаны на фиг. 18. Фенобарбитал (РВ) и диэтилдитиокарбамат (DDC) вводили на 1, 2 и 3 дни. DDC представляет собой другой индуктор р450, который, как и фенобарбитал, повышает потребность в геме и способствует продлению индукции метаболитов ALA/PBG.
Гемин в дозе 4 мг/кг, siRNA ALAS1 в дозе 2 мг/кг или контрольный лекарственный препарат вводили внутривенно через 8 ч после последней дозы РВ и DDC.
Как показано на фиг. 18, наступление действия лекарственного препарата было более быстрым при лечении siRNA ALAS1 по сравнению с лечением гемином. Быстрое снижение уровней ALA и PBG при лечении siRNA указывает на то, что siRNA является эффективным лекарственным препаратом для лечения острых приступов, поскольку ожидается, что быстрое улучшение клинических симптомов будет сопровождаться снижением уровней ALA и PBG.
Пример 16. Эффекты AD-58632 на основе конъюгата GalNAc с siRNA ALAS1
AD-58632 представляет собой дуплекс из 21/23 нуклеотидов, раскрытых в примере 11. AD-58632 нацелен на транскрипт человека NM_ 000688.4, а также является кросс-реактивным по отношению к mRNA-транскриптам мышей, крыс и макак-крабоедов. AD-58632 был единственным кросс-реактивным дуплексом из 21/23 нуклеотидов, идентифицированным в результате скрининга приблизительно 45 соединений. Дополнительные эксперименты с этим дуплексом описаны в данном примере.
- 136 036477
Дозозависимые эффекты AD-58632 в подавлении mRNA ALAS1
У крыс исследовали дозозависимый эффект AD-58632 в подавлении mRNA ALAS1 относительно mRNA GAPDH. Исследовали дозы 30, 10 и 3 мг/кг. Уровни mRNA ALAS1 измеряли в печени через 72 часа после последней дозы. AD-58632, по сравнению с контролем PBS, подавлял mRNA ALAS1 дозозависимым образом (см. фиг. 19). AD-58632 характеризовался разовой дозой ED50 приблизительно 10 мг/кг.
Эффекты AD-58632 в крысиной модели AIP
Дозозависимый эффект конъюгата AD-58632 на основе GalNAc с siRNA ALAS1 дополнительно исследовали в крысиной модели AIP. В этой модели siRNA в LNP использовали для нокдауна уровня PBGD исключительно в печени до индукции потребности в геме фенобарбиталом. Крысиная модель AIP характеризуется временным нокдауном siRNA PBGD в печени, характеризуется ~15% остаточной активностью mRNA PBGD и характеризуется приблизительно 10-50-кратным повышением уровней ALA и PBG при индукции суточной инъекцией фенобарбитала в течение трех дней.
Схема эксперимента показана на фиг. 20. Исследовали четыре группы крыс. Одну группу обрабатывали только фенобарбиталом (РВ) в указанные временные точки. Вторую группу обрабатывали фенобарбиталом и siRNA порфобилиногендезаминазы (PBGD). Третья группа получала фенобарбитал, siRNA PBGD и дозу в 30 мг/кг siRNA ALAS1. Четвертая группа получала фенобарбитал, siRNA PBGD и дозу в 10 мг/кг siRNA ALAS1. Как показано на фиг. 20, siRNA PBGD вводили внутривенно на 1 день. siRNA ALAS1 с GalNAc вводили на 4 день. Инъекции фенобарбитала вводили на 4, 5, 6 и 7 дни. Мочу собирали в течение 24-часового периода, начиная на 7 день и заканчивая на 8 день. Уровни mRNA PBGD, mRNA GAPDH и mRNA ALAS-1 оценивали на 8 день при помощи анализа с bDNA. Уровни PBG и ALA в моче определяли при помощи LC-MS.
Результаты по mRNA показаны на фиг. 21. siRNA PBGD снижала уровень mRNA PBGD, но не снижала уровень mRNA ALAS1. siRNA ALAS1 снижала уровни mRNA ALAS1 дозозависимым образом (см. фиг. 21). Результаты по уровням ALA и PBG показаны на фиг. 22. siRNA ALAS1 снижала уровни ALA и PBG дозозависимым образом (см. фиг. 22).
Пример 17. Введение дробных доз AD-58632
Эффективность конъюгата GalNAc с siRNA ALAS1 AD-58632 исследовали в двух отдельных парадигмах с введением дробных доз. Для каждого из этих исследований использовали самок крыс линии Sprague Dawley. Крыс содержали в SCLR (комната со световым циклом, в которой в течение 12 ч свет включен и в течение 12 ч свет выключен) и выводили из эксперимента через 72 ч после последней инъекции. Уровни mRNA ALAS1 и GAPDH в печени измеряли при помощи анализа с разветвленной ДНК (bDNA).
Парадигма пяти суточных доз против разовой болюсной дозы
В первой парадигме группам крыс вводили либо пять доз siRNA (по одной дозе каждый день), либо разовую болюсную дозу, которая содержала такую же общую концентрацию, как и сумма из пяти отдельных доз. В частности, крыс закрепляли за одним из следующих условий обработки: (1) подкожная инъекция по 6 мг/кг siRNA раз в день в течение пяти дней, (2) подкожная инъекция по 2 мг/кг siRNA раз в день в течение пяти дней, (3) подкожная инъекция по 1 мг/кг siRNA раз в день в течение пяти дней, (4) подкожная инъекция разовой болюсной дозы из 30 мг/кг siRNA, (5) подкожная инъекция разовой болюсной дозы из 10 мг/кг siRNA, (6) подкожная инъекция разовой болюсной дозы из 5 мг/кг siRNA или (7) контрольный лекарственный препарат, представляющий собой PBS.
Результаты показаны на фиг. 23. В этой парадигме разовая болюсная доза siRNA оказывала большее подавление mRNA ALAS1, чем повторное введение доз той же концентрации siRNA в течение пяти дней. Это было справедливо для всех изученных доз.
Введение дозы раз в неделю в течение четырех недель
При второй парадигме крысам вводили подкожные инъекции siRNA в одной из трех доз (10 мг/кг, 5 мг/кг или 2,5 мг/кг) раз в неделю в течение четырех недель. Контрольная группа получала инъекции PBS.
Результаты показаны на фиг. 24. По сравнению с введением разовой дозы, введение четырех доз раз в неделю по 10 мг/кг повышало достигаемый максимальный нокдаун (ED50 составляет 10 мг/кг в разовой дозе). В отличие от этого введение нескольких доз по 5 и 2,5 мг/кг в неделю при этой парадигме не повышало сайленсинг.
Пример 18. Идентификация и исследование siRNA ALAS1 с более КОРОТКИМИ смысловой и антисмысловой нитями
Дополнительные эксперименты проводили для исследования эффектов укорочения дуплексов siRNA до 19-19 нуклеотидов. Были выявлены пять дополнительных новых кросс-реактивных дуплексов из 19-19 нуклеотидов, которые связываются с mRNA-транскриптами ALAS1 человека (h) (NM_000688.4), макака-резус (rh) (XM_001090440.2), мыши (m) (NM_020559.2) и крысы (r) (NM_024484.2). Ни один из этих дуплексов не характеризовался такими же хорошими результатами, как AD-58632 из 21/23 нуклеотидов (см. фиг. 25).
Исследовали эффекты модификации длины и выступающих концов в отношении двух лучших дуплексов из 19-19 нуклеотидов (AD-59115 и AD-59125) (фиг. 26 и 27). Модифицированные последователь- 137 036477 ности показаны в табл. 21.
Таблица 21. Последовательности для оценки длины/выступающего конца лучших двух дуплексов из 19-19 нуклеотидов
SEQ ID NO: (смы слов ая) | SEQ ID NO: (антисмысл о вая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_ 000688.4 | Кроссреактивность | Выступающий конец | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5’-3’) | Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3) |
4172 | 4173 | 877-895 | h/rh/m/r | 19/19 | AD-59115 | AfsasGfaGfuGfu CfUfCfaUfcUfuC fuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcsusu |
4174 | 4175 | 875-895 | h/rh/m/r | 19/21 | AD-60090 | AfsasGfaGfuGfu CfUfCfaUfcUfuC fuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcUfususc |
4176 | 4177 | 877-895 | NC ОН* | 19/21 | AD-60091 | AfsasGfaGfuGfu CfUfCfaUfcUfuC fuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcUfusasa |
4178 | 4179 | 873-895 | h/rh/m/r | 21/23 | AD-58632 | GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcUfuUfcsusg |
4180 | 4181 | 875-895 | NC ОН* | 21/23 | AD-60092 | GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfg ac AfcUfcUfuUfcsasa |
4182 | 4183 | 875-893 | h/rh/m/r | 19/19 | AD-59129 | GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfususc |
4184 | 4185 | 873-893 | h/rh/m/r | 19/21 | AD-60093 | GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcsusg |
4186 | 4187 | 875-893 | NC OH* | 19/21 | AD-60094 | GfsasAfaGfaGfu GfUfCfuCfaUfcU fuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcsasa |
4188 | 4189 | 871-893 | h/rh | 21/23 | AD-60095 | CfsasGfaAfaGfa GfuGfUfCfuCfaU fcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcUfgsgsu |
4190 | 4191 | 871-893 | m/r | 21/23 | AD-60096 | CfsasGfaAfaGfa GfuGfUfCfuCfaU fcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcUfgsgsc |
*Некомплементарный выступающий конец
Выступающие концы повышали эффективность. Они также представляли дополнительную производную последовательность (AD-60489, который был основан на AD-60095) для дополнительных исследований связи структура-активность (SAR) (1 ошибочно спаренное основание в положении 23 грызуна).
Пример 19. Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1
Исследовали эффекты дополнительного дуплекса AD-60489 на основе конъюгата GalNAc с siRNA ALAS1 и сравнивали их с эффектами AD-58632. Последовательности таких дуплексов показаны в табл. 22А. AD-60489 содержит одно ошибочно спаренное основание по отношению к mRNA ALAS1 грызуна на 3'-конце антисмысловой нити. Таким образом, в случае если AD-58632 полностью комплементарен последовательностям человека, макака-крабоеда, мыши и крысы, то AD-60489 полностью комплементарен только последовательностям человека и макака-крабоеда.
Таблица 22А. Последовательности дуплексов AD-58632 и AD-60489 с siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысловая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_ 000688.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
4149 | 4150 | 873-895 | AD-58632 | GfsasAfaGfaGfuGfUf CfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg |
4151 | 4152 | 871-893 | AD-60489 | CfsasGfaAfaGfaGfUf GfuCfuCfaUfcUfuAfL96 | u s Afs a G f a U f gAfg Af ca c UfcUfuUfcUfgsgsu |
Подавление mRNA ALAS1 показано на фиг. 28. По сравнению с AD-58632, AD-60489 обеспечивал более эффективное подавление при 3 и 10 мг/кг и характеризовался приблизительно двукратным улучшением ED50. Разовая доза ED50 AD-60489 составляла приблизительно 5 мг/кг.
Пример 20. Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в исследованиях на отличных от человека приматах
Эффективность AD-58632 и AD-60489 в подавлении mRNA в печени исследовали у отличных от человека приматов. Схема эксперимента показана на фиг. 29. Дозы siRNA (5, 2,5 или 1,25 мг/кг) или контроля PBS в объеме 2 мл/кг вводили подкожно каждый день в течение 5 дней, затем каждые 2 дня в течение 3 недель. Сайленсинг mRNA
ALAS1 оценивали в ткани печени, полученной в результате биопсии печени на 15 день. Биопсию брали после забора сыворотки и до введения дозы 10 (см. фиг. 29). Образцы сыворотки для способа оп- 138 036477 ределения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) (см. пример 21) собирали на -10, -3, 7, 15, 23, 31 и дни. Сыворотки собирали для биохимического анализа крови на -3, 6, 30 и 43 дни. Биохимический анализ включал оценку уровней аланинтрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и щелочной фосфатазы (ALP).
AD-58632 и AD-60489 подавляли уровни mRNA ALAS1 в печени дозозависимым образом (см. фиг. 30). AD-60489 характеризовался более высокой эффективностью, чем AD-58632. Например, в наименьшей изученной дозе (1,25 мг/кг) AD-60489 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 42% от контрольного уровня, в то время как AD-58632 характеризовался незначительным подавлением в этой дозе. При 2,5 мг/кг AD-60489 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 26% от контрольного уровня, в то время как AD-58632 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 64% от контрольного уровня. При 5 мг/кг AD-60489 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 21% от контрольного уровня, a AD-58632 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 55% от контрольного уровня.
Результаты клинической биохимии указывали, что длительный нокдаун ALAS1 при помощи siRNA ALAS1 был безопасным и хорошо переносился. Повышений уровней ALT, AST или ALP отмечено не было.
Пример 21. Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в исследованиях на отличных от человека приматах, которые оценивали при помощи анализа cERD
Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 оценивали у отличных от человека приматов при помощи способа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD). Этот способ описан, например, в Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (постер, представленный 9 февраля 2012 г. на симпозиуме Keystone Gene Silencing by small RNAs (Ванкувер, 7-12 февраля, 2012 г.) и Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, опубликованном во всемирной сети Интернет 19 декабря 2013 г. Как показано на фиг. 29, образцы сыворотки для способа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) собирали на -10, -3, 7, 15, 23, 31 и 43 дни.
Для анализа cERD образцы сыворотки размораживали на льду. 375-400 мкл 8 М LiCl добавляли к 33,5 мл сыворотки в ультрацентрифужные (UC) пробирки и инкубировали при температуре 4°С в течение по меньшей мере 1 ч. PBS добавляли сверху каждой UC пробирки, оставляя приблизительно 1 см сухого пространства сверху, чтобы предупредить сжатие стенок пробирок во время вращения. Пробирки сушили с удалением любого конденсата вследствие инкубации на льду. Образцы загружали в МС 55 Rotor под крышку и образцы центрифугировали при 150000-200000 g в течение 100-120 мин. Супернатант удаляли из осадка. 1 мл тризола добавляли к осадку в UC пробирке, пробирку перемешивали на вортексе и содержимое переносили в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. В каждую пробирку добавляли 200 мкл хлороформа и пробирку несколько раз опрокидывали верх дном для перемешивания. За один раз получали один образец. Образцы центрифугировали при 13000 об./мин в течение 10-20 мин при 4°С. Верхнюю водную фазу переносили в свежую 1,5 мл пробирку (объем ~500 мкл). Равные объемы 100% изопропанола, 1 мкл линейного акриламида (4°) и 1/10ую объема 3M NaoAc с рН 5,5 или менее добавляли к каждому образцу (как правило, 500 мкл изопропанола и 50 мкл NaoAc). Образец центрифугировали при 13000 об./мин в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты откладывали. Осадок промывали два раза охлажденным 70% EtOH (500 мкл при каждой промывке) и центрифугировали при 13000 об./мин в течение ~5 мин при 4°С после каждой промывки. Осадку позволяли высохнуть на воздухе в течение ~5 мин и затем ресуспендировали в 20 мкл NF Н2О. 10 мкл использовали в реакции с cDNA. Ресуспендированную РНК хранили при -80°С.
Результаты
Нокдаун mRNA в сыворотке, как было оценено при помощи анализа cERD, коррелировал с результатами, полученными в результате биопсии печени. См. фиг. 31. Это является неожиданным результатом, поскольку ALAS1 не является сывороточным белком. Анализ cERD, представленный в данном документе, способствует отслеживанию циркулирующей mRNA ALAS1. Это имеет преимущество, например, в том, что уровни mRNA ALAS1 можно измерять со временем без периодических биопсий печени, что было бы технически сложным и дорогостоящим.
Кинетику нокдауна mRNA определяли с помощью результатов анализа cERD. См. фиг. 32. AD60489 обеспечивал более чем 50% нокдаун, даже в дозе лишь 1,25 мг/кг.
Пример 22. Исследования безопасности siRNA ALAS1
Дополнительные исследования безопасности указывают на то, что длительный нокдаун ALAS1 является безопасным и хорошо переносится.
Исследования на отличных от человека приматах
Как описано выше (см. пример 20), в исследованиях на отличных от человека приматах повышений уровней ALT, AST или ALP после введения AD-60489 и AD-58632 не наблюдали.
Исследования на крысах
На крысах в течение четырех недель проводили исследование с применением AD-58632. siRNA
- 139 036477 вводили каждый день в течение 5 дней по 10 мг/кг в первую неделю, затем через день по 10 мг/кг в течение 2-4 недель исследования. Общее воздействие составило 140 мг. Побочных клинических признаков или изменений веса тела не наблюдали. Изменений, связанных с исследуемым препаратом, в параметрах крови или свертываемости крови не наблюдали. Кроме того, не наблюдали побочной гистопатологической картины. Наблюдали минимальную вакуолизацию в селезенке и минимальный субкапсулярный фиброз в почке.
Исследования на мышах
У мышей mRNA P450 оценивали после нокдауна ALAS1. Наблюдали незначительные дозозависимые повышения Сур2Ы0 через 48 ч после введения состава LNP с ALAS1. Через 168 ч происходил возврат к норме.
Пример 23. Идентификация дополнительных эффективных siRNA ALAS1 с помощью исследований связи структура-активность
Исследования связи структура-активность (SAR), в том числе исследования, описанные в других примерах в данном документе, проводили для идентификации дополнительных эффективных siRNA ALAS1, полученных из таковых, которые уже были идентифицированы, например, AD-58632 и AD60489. Исследовали эффекты химических модификаций. Химические модификации включают 1) 2'-Ометил- против 2'-фтор-модификаций, 2) снижение 2'Uf (2'-фтор-модификации), 3) добавление PS (фосфоротиоата), 4) использование внутренних dT, и/или 5) гликоль-нуклеиновые кислоты (GNA). Не желая быть связанными теорией, модификации могут усиливать эффективность, например, посредством 1) лучшего раскручивания или повышенной нагрузки RISC или 2) лучшим каталитическим захватом цели. Модификации также могут усиливать стабильность таким образом, что соединения могут накапливаться и функционировать эффективнее при введении нескольких доз.
Повышенную активность относительно других дуплексов (например, AD-58632 и/или AD-60489) наблюдали в некоторых случаях (см. табл. 22В), в то время как в других случаях наблюдали подобную активность (см. табл. 23) или сниженную активность (табл. 24). Эти случаи представлены лишь в качестве примеров на основании скрининга более чем 150 siRNA. В данном документе представлены дополнительные примеры исследований SAR.
Таблица 22В. Повышенная активность относительно исходных соединений
Дуплекс* | IC50 | Смысловая (от 5' к 3') | Антисмысловая (от 5' к 3') |
AD58632.10 (исходное) | 0,017 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 (SEQ ID NO: 4192) | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg (SEQ ID NO: 4193) |
AD- 80643.1 | 0,004 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 (SEQ ID NO: 4194) | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg (SEQ ID NO: 4195) |
AD60489.3 (исходное) | 0,010 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 (SEQ ID NO: 4196) | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4197) |
AD- 60879.1 | 0,001 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfscUfsuAfsL96 (SEQ ID NO: 4198) | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4199) |
*Число после десятичной точки в названии дуплекса в этой и других таблицах относится просто к серийному номеру изделия.
- 140 036477
Таблица 23. Подобная активность относительно исходных соединений и повышенная стабильность
Таблица 24. Сниженная активность относительно исходных соединений
Пример 24. In vitro исследования связи структура-активность AD-58632
Получали AD-58632 и производные siRNA AD-58632 и некоторые siRNA отслеживали in vitro в отношении активности. Сокращения химических модификаций представлены в табл.1. In vitro активность при 10 и 0,1 нМ siRNA
In vitro активность siRNA в подавлении mRNA ALAS1 исследовали в клетках Нер3В, которые трансфицировали с использованием Lipofectamine2000 в качестве средства трансфекции. Эксперименты проводили при указанных концентрациях siRNA (например, 0,1, 10 нМ) и анализировали при помощи анализа с разветвленной ДНК (bDNA) через 24 ч после трансфекции. Результаты выражали в виде процента оставшейся mRNA относительно siRNA AD-1955, нецелевой siRNA, которую использовали в каче стве отрицательного контроля.
Последовательности siRNA и результаты in vitro исследования представлены в табл. 25, 26 и 27.
Таблица 25. Последовательности и результаты in vitro скрининга для siRNA AD-58632 и siRNA производных AD-58632
SEQ ID NO: (смысловая ) | SEQ ID NO: (антисмысл овая) | Целевые сайты антисмысл овой последоват ельности NM_000688 .4 | Дуплекс* | Смысловая последовательность (5’-3’) | Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3) | Сред 10 нМ | SD 10 нМ | Средн 0,1 нМ | SD o,1 нМ |
4208 | 4209 | 873-895 | AD-58632.8 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 11,79 | 2,70 | 46,65 | 4,21 |
4210 | 4211 | 873-895 | AD-60405.1 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 15,61 | 4,49 | 63,49 | 10,51 |
4212 | 4213 | 873-895 | AD-60411.1 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 15,04 | 6,13 | 62,59 | 10,05 |
4214 | 4215 | 873-895 | AD-60417.1 | GfsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 13,96 | 5,47 | 66,10 | 8,21 |
4216 | 4217 | 873-895 | AD-60423.1 | gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 12,59 | 3,03 | 41,47 | 3,77 |
4218 | 4219 | 873-895 | AD-60423.2 | gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 13,79 | 3,38 | 55,93 | 7,90 |
4220 | 4221 | 873-895 | AD-60434.1 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 14,74 | 2,76 | 48,68 | 6,64 |
4222 | 4223 | 873-895 | AD-60440.1 | gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 28,31 | 8,68 | 77,01 | 3,99 |
4224 | 4225 | 873-895 | AD-60400.1 | gsasaagaguGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 39,90 | 5,67 | 99,64 | 8,58 |
4226 | 4227 | 873-895 | AD-60406.1 | gsasaagagugucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 56,06 | 2,08 | 95,83 | 17,01 |
4228 | 4229 | 873-895 | AD-60412.1 | GfsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 43,09 | 2,23 | 87,52 | 8,10 |
4230 | 4231 | 873-895 | AD-60418.1 | gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcsusg | 65,84 | 7,75 | 108,07 | 21,88 |
4232 | 4233 | 873-895 | AD-60424.1 | gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa Ufg Afg Af cAf cu cuuUfcsusg | 45,51 | 11,82 | 84,40 | 10,69 |
4234 | 4235 | 873-895 | AD-60429.1 | gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa Ufg Afg Af cAf cu cuuucsusg | 63,96 | 13,25 | 81,21 | 1,96 |
4236 | 4237 | 873-895 | AD-60435.1 | gsasaagaGfuGfucucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 80,12 | 10,02 | 95,33 | 23,09 |
4238 | 4239 | 873-895 | AD-60441.1 | gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 63,29 | 17,48 | 97,07 | 8,04 |
4240 | 4241 | 873-895 | AD-60401.1 | gsasaaGfAfGfuGfucucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 55,27 | 10,26 | 109,06 | 4,23 |
4242 | 4243 | 873-895 | AD-60407.1 | GfsasaaGfAfGfuGfucucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 47,39 | 1,88 | 98,04 | 22,58 |
4244 | 4245 | 873-895 | AD-60413.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 55,60 | 11,65 | 92,88 | 5,65 |
4246 | 4247 | 873-895 | AD-60419.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 20,82 | 15,07 | 57,82 | 8,31 |
4248 | 4249 | 873-895 | AD-60425.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfudCucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 35,58 | 13,30 | 73,46 | 10,91 |
4250 | 4251 | 873-895 | AD-60430.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucdTcaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 40,54 | 1,41 | 81,87 | 11,23 |
4252 | 4253 | 873-895 | AD-60436.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucudCaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 60,12 | 11,74 | 81,51 | 7,41 |
4254 | 4255 | 873-895 | AD-60442.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucdAucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 40,82 | 12,61 | 83,06 | 1,05 |
4256 | 4257 | 873-895 | AD-60402.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucadTcuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 62,16 | 11,24 | 123,60 | 6,71 |
4258 | 4259 | 873-895 | AD-60408.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucaudCuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 45,39 | 15,50 | 86,69 | 6,12 |
4260 | 4261 | 873-895 | AD-60414.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucudTcuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 32,56 | 3,52 | 84,21 | 0,24 |
4262 | 4263 | 873-895 | AD-60420.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucuudCuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 52,57 | 10,77 | 94,45 | 3,43 |
4264 | 4265 | 873-895 | AD-60426.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucuucudTL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAfcu cuuucsusg | 52,49 | 1,91 | 91,15 | 14,49 |
4266 | 4267 | 873-895 | AD-60431.1 | gsasaaGfaGfuGfudCudCaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 26,66 | 1,16 | 73,09 | 6,83 |
4268 | 4269 | 873-895 | AD-60437.1 | gsasaaGfaGfuGfudCucadTcuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAfcu cuuucsusg | 32,80 | 4,58 | 69,03 | 3,02 |
4270 | 4271 | 873-895 | AD-60443.1 | gsasaaGfaGfuGfudCucaucdTucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 35,10 | 7,10 | 69,92 | 17,93 |
- 141 036477
4272 | 4273 | 873 - 895 | AD-60403.1 | gsasaaGfaGfuGfudCudCaucdTucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 25,28 | 1,68 | 105,23 | 23,99 |
4274 | 4275 | 873 - 895 | AD-60409.1 | gsasaaGfaGfuGfudCudCadTcdTucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 30,48 | 1,88 | 72,34 | 3,34 |
4276 | 4277 | 873 - 895 | AD-60415.1 | gsasaaGfaGfuGfudCudCadTcdTudCuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 25,28 | 7,10 | 69,53 | 10,72 |
4278 | 4279 | 873 - 895 | AD-60421.1 | gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfadTgAfgAfcAfcucuuucsusg | 59,28 | 5,83 | 66,88 | 0,63 |
4280 | 4281 | 873 - 895 | AD-60427.1 | gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcdTcuuucsusg | 34,80 | 8,13 | 79,65 | 11,25 |
4282 | 4283 | 873 - 895 | AD-60432.1 | gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucdTuucsusg | 46,78 | 6,42 | 79,19 | 16,72 |
4284 | 4285 | 873 - 895 | AD-60438.1 | gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfadTgAfgAfcAfcdTcuuucsusg | 32,07 | 9,46 | 57,87 | 10,18 |
4286 | 4287 | 873 - 895 | AD-60444.1 | gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfadTgAfgAfcAfcucdTuucsusg | 55,55 | 10,17 | 89,52 | 3,91 |
4288 | 4289 | 873 - 895 | AD-60404.1 | gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfa(Tgn)gAfgAfcAfcucuuucsusg | 50,06 | 9,17 | 93,46 | 2,56 |
4290 | 4291 | 873 - 895 | AD-60410.1 | gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfc(Tgn)cuuucsusg | 44,40 | 13,93 | 88,96 | 6,06 |
4292 | 4293 | 873 - 895 | AD-60416.1 | gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu c(Tgn)uucsusg | 28,56 | 7,82 | 76,36 | 19,47 |
4294 | 4295 | 873 - 895 | AD-60422.1 | GfsasAfaGfAfGfuGf(Tgn)cucaucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 40,37 | 10,86 | 84,06 | 12,08 |
4296 | 4297 | 873 - 895 | AD-60428.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfuc(Tgn)caucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 56,81 | 22,64 | 92,15 | 0,26 |
4298 | 4299 | 873 - 895 | AD-60433.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc(Agn)ucuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 36,78 | 5,31 | 67,92 | 12,55 |
4300 | 4301 | 873 - 895 | AD-60439.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuca(Tgn)cuucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 32,81 | 6,72 | 77,93 | 13,33 |
4302 | 4303 | 873 - 895 | AD-60445.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 13,25 | 3,28 | 78,08 | 4,05 |
4304 | 4305 | 873 - 895 | AD-60451.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucu(Tgn)cuuL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 34,74 | 11,06 | 88,93 | 5,19 |
4306 | 4307 | 873 - 895 | AD-60457.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucuuc(Tgn)uL96 | as Afs GfAfa Gfa ug Afg AfcAf cu cuuucsusg | 41,26 | 6,16 | 92,15 | 0,64 |
4308 | 4309 | 873 - 895 | AD-60463.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuAfL96 | usAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 19,58 | 7,98 | 69,67 | 4,64 |
4310 | 4311 | 873 - 895 | AD-60469.1 | CfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfgsasc | 19,35 | 9,30 | 72,30 | 0,50 |
4312 | 4313 | 873 - 895 | AD-60474.1 | CfsusAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuAfgsasc | 21,60 | 4,27 | 76,35 | 11,71 |
4314 | 4315 | 873 - 895 | AD-60479.1 | CfsusUfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfaAfgsasc | 28,01 | 4,45 | 76,55 | 27,32 |
4316 | 4317 | 873 - 895 | AD-60484.1 | CfsusUfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfaAfgsusg | 20,31 | 3,08 | 71,99 | 9,53 |
4318 | 4319 | 873 - 895 | AD-60446.1 | GfsusUfuGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcAfaAfcsusg | 18,65 | 5,11 | 73,52 | 17,87 |
4320 | 4321 | 873 - 895 | AD-60452.1 | GfsasUfuCfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfgAfaUfcsusg | 28,72 | 1,21 | 83,09 | 15,75 |
4322 | 4323 | 873 - 895 | AD-60458.1 | GfsasAfuCfuGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcAfgAfuUfcsusg | 50,15 | 13,02 | 114,93 | 11,58 |
4324 | 4325 | 873 - 895 | AD-60464.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | (Ag n)AfsgAfaGfaUfgAfg acAfcUfcUfu Ufcsusg | 35,71 | 5,07 | 103,88 | 3,01 |
4326 | 4327 | 873 - 895 | AD-60470.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfs(Ggn)AfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g | 17,59 | 0,78 | 73,15 | 11,75 |
4328 | 4329 | 873 - 895 | AD-60475.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsg(Agn)aGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 22,07 | 4,57 | 68,64 | 25,12 |
4330 | 4331 | 873 - 895 | AD-60480.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAf(Agn)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g | 15,54 | 1,22 | 66,39 | 14,34 |
4332 | 4333 | 873 - 895 | н.Д. | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfa(Ggn)aUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg |
4334 | 4335 | 873 - 895 | AD-60447.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGf(Agn)UfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g | 31,33 | 4,75 | 104,36 | 7,71 |
4336 | 4337 | 873 - 895 | AD-60453.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfa(T g n)g Afg acAfcUfcUfu Ufcsusg | 15,42 | 0,90 | 76,29 | 0,41 |
4338 | 4339 | 873 - 895 | AD-60459.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUf(Gg n)Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g | 27,70 | 10,91 | 89,20 | 3,46 |
4340 | 4341 | 873 - 895 | AD-60465.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfg(Agn)gacAfcUfcUfuUfcsusg | 28,44 | 6,84 | 87,28 | 5,73 |
4342 | 4343 | 873 - 895 | AD-60471.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAf(Ggn)acAfcUfcUfuUfcsus g | 24,03 | 8,87 | 85,86 | 14,62 |
4344 | 4345 | 873 - 895 | AD-60476.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfg(Agn)cAfcUfcUfuUfcsus g | 21,48 | 5,53 | 88,73 | 25,48 |
4346 | 4347 | 873 - 895 | AD-60481.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfu(Tgn) L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 15,18 | 4,19 | 68,10 | 6,86 |
4348 | 4349 | 873 - 895 | AD-60486.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCf(Tgn)U fL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 15,31 | 0,31 | 74,06 | 8,48 |
4350 | 4351 | 873 - 895 | AD-60448.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfu(Cgn)uUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 14,89 | 1,35 | 59,22 | 6,64 |
4352 | 4353 | 873 - 895 | AD-60454.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf(Tgn)CfuU fL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 19,24 | 5,72 | 75,90 | 1,27 |
4354 | 4355 | 873 - 895 | AD-60460.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 14,91 | 5,84 | 60,11 | 6,01 |
4356 | 4357 | 873 - 895 | AD-60466.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfuU fL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 13,99 | 7,53 | 56,83 | 11,59 |
4358 | 4359 | 873 - 895 | AD-60472.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfa(Tgn)cUfuCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 12,35 | 0,60 | 64,36 | 11,74 |
4360 | 4361 | 873 - 895 | AD-60477.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCf(Agn)UfcUfuCfuU fL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 15,62 | 1,76 | 65,96 | 7,77 |
4362 | 4363 | 873 - 895 | AD-60482.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu(Cgn)aUfcUfuCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 18,58 | 6,43 | 66,67 | 2,31 |
4364 | 4365 | 873 - 895 | AD-60487.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCf(Tgn)CfaUfcUfuCfuU fL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 34,89 | 15,62 | 86,39 | 6,10 |
4366 | 4367 | 873 - 895 | AD-60449.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUf(Cgn)uCfaUfcUfuCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 22,65 | 80,09 | 0,75 | |
4368 | 4369 | 873 - 895 | AD-60455.1 | GfsasAfaGfaGfuGf(Tgn)CfuCfaUfcUfuCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 31,05 | 2,82 | 104,24 | 23,01 |
4370 | 4371 | 873 - 895 | AD-60461.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfu(Cgn)uUf L96 | asAfs(Ggn)AfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g | 16,30 | 2,08 | 85,78 | 22,00 |
4372 | 4373 | 873 - 895 | AD-60467.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf(Tgn)CfuU fL96 | asAfsg(Agn)aGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 17,77 | 8,38 | 82,16 | 18,92 |
4374 | 4375 | 873 - 895 | AD-60473.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 | asAfsgAf(Agn)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g | 14,64 | 4,25 | 61,05 | 7,88 |
4376 | 4377 | 873 - 895 | н.Д. | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfuU fL96 | asAfsgAfa(Ggn)aUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | ||||
4378 | 4379 | 873 - 895 | AD-60483.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfa(Tgn)cUfuCfuUf L96 | asAfsgAfaGf(Agn)UfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g | 26,18 | 2,83 | 91,12 | 16,03 |
4380 | 4381 | 873 - 895 | AD-60488.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCf(Agn)UfcUfuCfuU fL96 | asAfsgAfaGfa(T g n)g Afg acAfcUfcUfu Ufcsusg | 24,74 | 0,56 | 87,66 | 7,90 |
4382 | 4383 | 873 - 895 | AD-60450.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu(Cgn)aUfcUfuCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUf(Gg n)Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g | 37,09 | 2,89 | 111,90 | 1,97 |
4384 | 4385 | 873 - 895 | AD-60456.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCf(Tgn)CfaUfcUfuCfuU fL96 | asAfsgAfaGfaUfg(Agn)gacAfcUfcUfuUfcsusg | 41,82 | 0,60 | 102,56 | 11,25 |
4386 | 4387 | 873 - 895 | AD-60462.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUf(Cgn)uCfaUfcUfuCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAf(Ggn)acAfcUfcUfuUfcsus g | 38,91 | 3,89 | 122,47 | 35,17 |
4388 | 4389 | 873 - 895 | AD-60468.1 | GfsasAfaGfaGfuGf(Tgn)CfuCfaUfcUfuCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfg(Agn)cAfcUfcUfuUfcsus g | 28,44 | 3,05 | 97,09 | 2,66 |
4390 | 4391 | 873 - 895 | AD-60550.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfsL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 20,35 | 0,63 | 69,13 | 22,65 |
4392 | 4393 | 873 - 895 | AD-60555.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfscUfsuCfuUfs L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 19,17 | 8,76 | 68,86 | 17,72 |
4394 | 4395 | 873 - 895 | AD-60560.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfsL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfscUfsuUfscsusg | 25,71 | 5,66 | 67,63 | 27,72 |
4396 | 4397 | 873 - 895 | AD-60565.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfscUfsuCfuUfs L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfscUfsuUfscsusg | 22,78 | 7,32 | 74,11 | 1,85 |
Как показано в табл. выше, в данном in vitro скрининге siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 80% подавление, так что оставалось менее 20% mRNA) при концентрации 10 нМ, включали AD-58632, AD-60472, AD-60423, AD-60445, AD-60423, AD-60417, AD60466, AD-60473, AD-60434, AD-60448, AD-60460, AD-60411, AD-60481, AD-60486, AD-60453, AD60480, AD-60405, AD-60477, AD-60461, AD-60470, AD-60467, AD-60482, AD-60446, AD-60555, AD60454, AD-60469 и AD-60463. Кроме того, в данном in vitro скрининге siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 30% подавление, так что оставалось менее 70%
142 mRNA) при концентрации 0,1 нМ, включали AD-60423, AD-58632, AD-60434, AD-60423, AD-60466, AD60419, AD-60438, AD-60448, AD-60460, AD-60473, AD-60411, AD-60405, AD-60472, AD-60477, AD60417, AD-60480, AD-60482, AD-60421, AD-60560, AD-60433, AD-60481, AD-60475, AD-60555, AD60437, AD-60550, AD-60415, AD-60463 и AD-60443.
Как показано в табл. ниже, исследование дополнительных siRNA показало, что следующие дуплексы обеспечивали более чем 80% подавление при концентрации 10 нМ: AD-58632, AD-60405, AD-60423, AD-60434, AD-60445, AD-60480, AD-60460 и AD-60466, а следующие дуплексы обеспечивали более чем 30% подавление при концентрации 0,1 нм: AD-58632, AD-60405, AD-60423, AD-60434, AD-60419, AD60480, AD-60460 и AD-60466.
Таблица 26. Дополнительные последовательности и результаты in vitro скрининга для siRNA AD-58632 и siRNA производных AD-58632
SEQ ID NO: (смысл овая) | SEQ ID NO: (антисмысл овая) | Целевые сайты антисмысловой последовательно сти NM_000688.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5’-3’) | Антисмысловая (AS) последовательность (5-3) | Средн . 10 нМ | SD 10 нМ | Средн 0,1 нМ | SD 0,1 нМ |
4398 | 4399 | 873 - 895 | AD-58632.8 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 11,8 | 2,7 | 46,7 | 4,2 |
4400 | 4401 | 873 - 895 | AD-60405.1 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 15,6 | 4,5 | 63,5 | 10,5 |
4402 | 4403 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg | |||||
4404 | 4405 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 | as Afsg Afa Gf au g Afg AfcAfcu cu u u cs u sg | |||||
4406 | 4407 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4408 | 4409 | 873 - 895 | AD-60423.2 | gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 13,8 | 3,4 | 55,9 | 7,9 |
4410 | 4411 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | |||||
4412 | 4413 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg | |||||
4414 | 4415 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | as Afsg Afa Gfau g Afg AfcAfcu cu u u cs u sg | |||||
4416 | 4417 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4418 | 4419 | 873 - 895 | AD-60434.1 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcsusg | 14,7 | 2,8 | 48,7 | 6,6 |
4420 | 4421 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | |||||
4422 | 4423 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg | |||||
4424 | 4425 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 | as Afsg Afa Gfau g Afg AfcAfcu cu u u cs u sg | |||||
4426 | 4427 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4428 | 4429 | 873 - 895 | AD-60419.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg | 20,8 | 15,1 | 57,8 | 8,3 |
4430 | 4431 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | |||||
4432 | 4433 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg | |||||
4434 | 4435 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg | |||||
4436 | 4437 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4438 | 4439 | 873 - 895 | AD-60445.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg | 13,3 | 3,3 | 78,1 | 4,0 |
4440 | 4441 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | |||||
4442 | 4443 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg | |||||
4444 | 4445 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg | |||||
4446 | 4447 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4448 | 4449 | 873 - 895 | AD-60480.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 | asAfsgAf(Ag n)GfaUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g | 15,5 | 1,2 | 66,4 | 14,3 |
4450 | 4451 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsgAf(Ag n)GfaUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g | |||||
4452 | 4453 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 | asAfsgAf(Ag n)GfaUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g | |||||
4454 | 4455 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus g | |||||
4456 | 4457 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAf(Ag n)GfaUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus g | |||||
4458 | 4459 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucs(Tgns)ucuuL9 6 | asAfsgAfs(Agns)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcs usg | |||||
4460 | 4461 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 | asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4462 | 4463 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4464 | 4465 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4466 | 4467 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4468 | 4469 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4470 | 4471 | 873 - 895 | Gfs as Af aGfAfGfu Gfucucaucs(Tgns)ucuuL9 6 | asAfsgAfs(Agns)GfaugAfgacAfcucuuucsusg | |||||
4472 | 4473 | 873 - 895 | AD-58632.8 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 11,8 | 2,7 | 46,7 | 4,2 |
4474 | 4475 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | |||||
4476 | 4477 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4478 | 4479 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4480 | 4481 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfsuCfsuUf sL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4482 | 4483 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfsucsuUfs L96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4484 | 4485 | 873 - 895 | AD-60460.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 14,9 | 5,8 | 60,1 | 6,0 |
4486 | 4487 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | |||||
4488 | 4489 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4490 | 4491 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4492 | 4493 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)suCfsu UfsL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg |
- 143 036477
4494 | 4495 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)sucsu UfsL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4496 | 4497 | 873 - 895 | AD-60466.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 14,0 | 7,5 | 56,8 | 11,6 |
4498 | 4499 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | |||||
4500 | 4501 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4502 | 4503 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4504 | 4505 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)UfsuCfs uUfsL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg | |||||
4506 | 4507 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)Ufsucs uUfsL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg |
Таблица 27. Дополнительные последовательности siRNA производных AD-58632
SEQIDNO: (Смыслова я) | SEQIDNO: (антисмыслова я) | Целевые сайты антисмысловой последовательное ти NM_ | Названи е дуплекс а | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая поел e до в ател ьн о ст ь (5'-3') |
4508 | 4509 | 873 - 895 | AD58632 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc U fuCfuUfL96 | as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc U fcUfuUfcsusg |
4510 | 4511 | 873 - 895 | AD60405.1 | Gfs as Af aGfaGfu Gfu Cfu Cfa u cu и C fuuL96 | as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc U fcUfuUfcsusg |
4512 | 4513 | 873 - 895 | AD60887 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuu C fuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAf cu cuuucsusg |
4514 | 4515 | 873 - 895 | AD60923 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuu C fuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc Afc UfcUfuUfcsusg |
4516 | 4517 | 873 - 895 | AD60434.1 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuu L9 6 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc Afc UfcUfuUfcsusg |
4518 | 4519 | 873 - 895 | AD60892 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuu L9 6 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAf cu cuuucsusg |
4520 | 4521 | 873 - 895 | AD60891 | gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuu L9 6 | as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc U fcUfuUfcsusg |
4522 | 4523 | 873 - 895 | AD60419.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuu cu uL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAf c ucuuucsusg |
4524 | 4525 | 873 - 895 | AD60924 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuu cu uL96 | as Afs GfAfa Gfa Ufg Afg Afc Af cUfcUfuUfcsusg |
4526 | 4527 | 873 - 895 | AD60885 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuu cu uL96 | as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc UfcUfuUfcsusg |
4528 | 4529 | 873 - 895 | AD60445.1 | Gfs as Af aGfAfGfu Gfucucau c(T g n)u cuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAf c ucuuucsusg |
4530 | 4531 | 873 - 895 | AD60925 | Gfs as Af aGfAfGfu Gfucucau c(T g n)u cuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc Af cUfcUfuUfcsusg |
4532 | 4533 | 873 - 895 | AD60890 | Gfs as Af aGfAfGfu Gfucucau c(T g n)u cuuL96 | as Afsg Af aGfa Ufg Afg acAfc U fcUfuUfcsusg |
4534 | 4535 | 873 - 895 | AD60926 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc Uf uCfuUfL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc Af cUfcUfuUfcsusg |
IC50 на основе активности in vitro
Аналогично экспериментам, описанным выше, проводили дополнительные эксперименты дозаответ при конечной концентрации дуплексов 10, 1,66667, 0,277778, 0,046296, 0,007716, 0,001286, 0,000214 и 3,57Е-05 нМ и рассчитывали величины IC50.
- 144 036477
Таблица 28. Дополнительные последовательности и IC50 siRNA AD-58632 и siRNA производных AD-58632
SEQID NO: (Смыслова я) | SEQ ID NO: (антисмыслова я) | Целевые сайты антисмысло вой последоват ельности NM_000688. 4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5-3) | Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3) | IC50 |
4536 | 4537 | 873 - 895 | AD-58632.10 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,017 |
4538 | 4539 | 873 - 895 | AD-60405.2 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfu CfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,070 |
4540 | 4541 | 873 - 895 | AD-60887.1 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfu CfaucuuCfuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg | 0,120 |
4542 | 4543 | 873 - 895 | AD-60819.1 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfu CfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg | 0,009 |
4544 | 4545 | 873 - 895 | AD-60823.1 | GfsasAfaGfaGfuGfuCfu CfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg | 0,032 |
4546 | 4547 | 873 - 895 | AD-60423.3 | gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgA fcAfcUfcUfuUfcsusg | 0,020 |
4548 | 4549 | 873 - 895 | AD-60889.1 | gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg | 0,242 |
4550 | 4551 | 873 - 895 | AD-60827.1 | gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg | 0,044 |
4552 | 4553 | 873 - 895 | AD-60831.1 | gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg | 0,077 |
4554 | 4555 | 873 - 895 | AD-60434.2 | gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgA fcAfcUfcUfuUfcsusg | 0,028 |
4556 | 4557 | 873 - 895 | AD-60891.1 | gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,078 |
4558 | 4559 | 873 - 895 | AD-60892.1 | gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg | 0,138 |
4560 | 4561 | 873 - 895 | AD-60835.1 | gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg | 0,015 |
4562 | 4563 | 873 - 895 | AD-60839.1 | gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg | 0,014 |
4564 | 4565 | 873 - 895 | AD-60419.2 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg | 0,014 |
4566 | 4567 | 873 - 895 | AD-60885.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,091 |
4568 | 4569 | 873 - 895 | AD-60419.3 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg | 0,026 |
4570 | 4571 | 873 - 895 | AD-60843.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg | 0,004 |
4572 | 4573 | 873 - 895 | AD-60847.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg | 0,012 |
- 145 036477
4574 | 4575 | 873 - 895 | AD-60445.2 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg | 0,077 |
4576 | 4577 | 873 - 895 | AD-60890.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 1,201 |
4578 | 4579 | 873 - 895 | AD-60445.3 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 | asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg | 0,302 |
4580 | 4581 | 873 - 895 | AD-60820.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg | 0,006 |
4582 | 4583 | 873 - 895 | AD-60824.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgac Afcucuuucsusg | 0,032 |
4584 | 4585 | 873 - 895 | AD-60480.2 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg | 0,066 |
4586 | 4587 | 873 - 895 | AD-60893.1 | gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg | 0,034 |
4588 | 4589 | 873 - 895 | AD-60884.1 | gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg | 0,157 |
4590 | 4591 | 873 - 895 | AD-60886.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg | 0,801 |
4592 | 4593 | 873 - 895 | AD-60888.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg | 0,201 |
4594 | 4595 | 873 - 895 | AD-60828.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc aucs(Tgns)ucuuL96 | asAfsgAfs(Agns)GfaUf gAfgacAfcUfcUfuUfcsu sg | 0,145 |
4596 | 4597 | 873 - 895 | AD-60832.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg | 0,036 |
4598 | 4599 | 873 - 895 | AD-60836.1 | gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg | 0,076 |
4600 | 4601 | 873 - 895 | AD-60840.1 | gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg | 0,033 |
4602 | 4603 | 873 - 895 | AD-60844.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg | 0,017 |
4604 | 4605 | 873 - 895 | AD-60848.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg | 0,007 |
4606 | 4607 | 873 - 895 | AD-60821.1 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuc aucs(Tgns)ucuuL96 | asAfsgAfs(Agns)Gfaug AfgacAfcucuuucsusg | 0,076 |
4608 | 4609 | 873 - 895 | AD-58632.11 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,063 |
4610 | 4611 | 873 - 895 | AD-60825.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,031 |
4612 | 4613 | 873 - 895 | AD-60829.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg | 0,033 |
4614 | 4615 | 873 - 895 | AD-60833.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg | 0,100 |
4616 | 4617 | 873 - 895 | AD-60837.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfsuCfsuUfsL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg | 0,031 |
4618 | 4619 | 873 - 895 | AD-60841.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfsucsuUfsL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfga cAfcdTcUfuUfcsusg | 0,010 |
4620 | 4621 | 873 - 895 | AD-60460.2 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfc(Tgn)uCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,009 |
4622 | 4623 | 873 - 895 | AD-60845.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)uCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,002 |
4624 | 4625 | 873 - 895 | AD-60849.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfc(Tgn)uCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg | 0,005 |
4626 | 4627 | 873 - 895 | AD-60822.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)uCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg | 0,007 |
4628 | 4629 | 873 - 895 | AD-60826.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)suCfsuUfs L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg | 0,009 |
4630 | 4631 | 873 - 895 | AD-60830.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)sucsuUfsL 96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfga cAfcdT cUfuUfcsusg | 0,019 |
4632 | 4633 | 873 - 895 | AD-60466.2 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUf(Cgn)UfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,066 |
4634 | 4635 | 873 - 895 | AD-60834.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfuCfuUfL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg | 0,024 |
4636 | 4637 | 873 - 895 | AD-60838.1 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUf(Cgn)UfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg | 0,013 |
4638 | 4639 | 873 - 895 | AD-60842.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfuCfuUfL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg | 0,010 |
4640 | 4641 | 873 - 895 | AD-60846.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfsuCfsuUf sL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg | 0,011 |
4642 | 4643 | 873 - 895 | AD-60850.1 | GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfsucsuUfs L96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfga cAfcdTcUfuUfcsusg | 0,018 |
Как показано в табл. 28, следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,01 нМ: AD60845, AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, AD-60460.
Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,02 нМ: AD-60845, AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, AD-60460, AD-60841, AD-60842, AD-60846, AD60847, AD-60838, AD-60419, AD-60839, AD-60835, AD-586320, AD-60844, AD-60850 и AD-60830.
Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,05 нМ: AD-60845, AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, и AD-60460, AD-60841, AD-60842, AD-60846, AD-60847, AD-60838, AD-60419, AD-60839, AD-60835, AD-586320, AD-60844, AD-60850, AD-60830, AD60423, AD-60834, AD-60419, AD-60434, AD-60825, AD-60837, AD-60823, AD-60824, AD-60840, AD60829, AD-60893, AD-60832 и AD-60827.
Пример 25. In vivo исследования связи структура-активность AD-58632
Получали производные исходной siRNA AD-58632 и подвергали скринингу in vivo на крысах. Последовательности siRNA, которые отслеживали, представлены в табл. ниже.
- 146 036477
Таблица 29. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысло вая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_0006SS.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
4644 | 4645 | 873-895 | AD-58632 | GfsasAfaGfaGfuGfUfC fuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAf cUfcUfuUfcsusg |
4646 | 4647 | 873-895 | AD-60405 | GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAf cUfcUfuUfcsusg |
4648 | 4649 | 873-895 | AD-60887 | GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 | a s Afs Gf Af a G f a u g Af gAf c A fcucuuucsusg |
4650 | 4651 | 873-895 | AD-60923 | gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 | a s Afs Gf Af a G f a U f gAfg Af c AfcUfcUfuUfcsusg |
4652 | 4653 | 873-895 | AD-60434 | gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 | a s Afs Gf Af a G f a U f gAfg Af c AfcUfcUfuUfcsusg |
4654 | 4655 | 873-895 | AD-60892 | gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 | a s Afs Gf Af a G f a u g Af gAf c A fcucuuucsusg |
4656 | 4657 | 873-895 | AD-60419 | GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 | a s Afs Gf Af a G f a u g Af gAf c A fcucuuucsusg |
4658 | 4659 | 873-895 | AD-60924 | GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg |
4660 | 4661 | 873-895 | AD-60445 | GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 | a s Afs Gf Af a G f a u g Af gAf c A fcucuuucsusg |
4662 | 4663 | 873-895 | AD-60925 | GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg |
4664 | 4665 | 873-895 | AD-60926 | GfsasAfaGfaGfuGfUfC fuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsGfAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg |
Вводили разовую дозу 5 мг/кг siRNA. Через 5 дней после введения siRNA, проводили измерения уровней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH), при помощи анализа с bDNA, и уровни лекарственного средства в ткани определяли при помощи qPCR. Результаты представлены на фиг. 33 и 34. Как показано на фиг. 33, по меньшей мере десять дуплексов (AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925 и AD-60926), которые отслеживали, характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-58632. Кроме того, как показано на фиг. 34, эти дуплексы (за исключением AD-60926) обеспечивали более высокие концентрации в печени, чем AD-58632.
Пример 26. Эффективность AD-60925 и AD-60926 в крысиной модели AIP
Терапевтическую эффективность AD-60925 и AD-60926 (описанных в предыдущем примере) исследовали на крысиной модели AIP. Схема эксперимента показана вверху фиг. 35. Крыс обрабатывали PBS или 3 мг/кг siRNA ALAS1-GalNAc t.i.w., фенобарбиталом (РВ) и siRNA PBGD в составе LNP с AF11 (AF11-PBGD) в периоды времени, указанные на фиг. 35. Контрольные крысы получали только siRNA PBGD без индукции фенобарбиталом.
Результаты показаны на фиг. 35, 36 и 37. Введение фенобарбитала индуцировало экспрессию mRNA ALAS1 и повышало уровни PBG и ALA в моче по сравнению с контролем. Обработка суммарно восемью дозами в 3 мг/кг AD-60925 или AD-60926 три раза в неделю подавляла mRNA ALAS1 (фиг. 35), PBG в моче (фиг. 36 и 37, вверху) и ALA в моче (фиг. 36 и 37, внизу). Фенобарбитал индуцировал повышения mRNA ALAS1, PBG и ALA в моче. Динамика эффектов лечения показана на фиг. 37. Стрелки указывают на временные точки при введении РВ. Обработка siRNA предупреждала индуцированные фенобарбиталом повышения mRNA ALAS1, PBG и ALA в моче.
Как AD-60925, так и AD-60926 характеризовались терапевтической эффективностью лечения AIP. AD-60925 был более эффективным, чем AD-60926 в подавлении mRNA ALAS1, ALA в моче и PBG в моче.
Пример 27. Дополнительные in vivo исследования связи структура-активность AD-58632
Получали производные исходной siRNA AD-58632 и подвергали скринингу in vivo на крысах.
In vivo скрининг, часть I
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в таблице ниже.
- 147 036477
Таблица 30. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысло вая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_0006SS.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
4666 | 4667 | 873-895 | AD-58632 | GfsasAfaGfaGfuGfUfC fuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcU fcUfuUfcsusg |
4668 | 4669 | 873 - 895 | AD-60820 | GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 | a s Af sgAf a G f a u g Af gAf c Af c u cuuucsusg |
4670 | 4671 | 873 - 895 | AD-60824 | GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 | a s Af sgAf a G f a u g Af ga c Af c u c uuucsusg |
4672 | 4673 | 873 - 895 | AD-61137 | GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcsusg |
4674 | 4675 | 873 - 895 | AD-60843 | GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 | a s Af sgAf a G f a u g Af gAf c Af c u cuuucsusg |
4676 | 4677 | 873 - 895 | AD-60847 | GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 | a s Af sgAf a G f a u g Af ga c Af c u c uuucsusg |
4678 | 4679 | 873 - 895 | AD-61138 | GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcsusg |
4680 | 4681 | 873 - 895 | AD-60819 | GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 | a s Af sgAf a G f a u g Af gAf c Af c u cuuucsusg |
4682 | 4683 | 873 - 895 | AD-60823 | GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 | a s Af sgAf a G f a u g Af ga c Af c u c uuucsusg |
4684 | 4685 | 873 - 895 | AD-61139 | GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcsusg |
4686 | 4687 | 873 - 895 | AD-61140 | GfsasAfaGfaGfuGfdTC fuCfaUfc(Tgn)uCfuUfL 96 | a s Af sgAf a G f a u g Af gAf c Af c u cuuucsusg |
Крысам вводили четыре дозы по 2,5 мг/кг siRNA дважды в неделю (два раза в неделю) в течение двух недель. Через 72 ч после введения последней дозы siRNA животных выводили из эксперимента и выполняли измерения уровней mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH) при помощи анализа с bDNA.
Как показано на фиг. 38, по меньшей мере четыре из siRNA (AD-60820, AD-60843, AD-60819 и AD61140), которые исследовали, характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-58632.
In vivo скрининг, часть II
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в табл. ниже.
Таблица 31. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысло вая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_0006SS.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
4688 | 4689 | 873 - 895 | AD-58632 | GfsasAfaGfaGfuGfUfC fuCfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg |
4690 | 4691 | 873 - 895 | AD-61141.2 | GfsasAfaGfaGfuGfdTC fuCfaUfc(Tgn)uCfuUfL 96 | asAfsgAfaGfaugAfgacA fcucuuucsusg |
4692 | 4693 | 873 - 895 | AD-61142.2 | GfsasAfaGfaGfuGfdTC fuCfaUfc(Tgn)uCfuUfL 96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg |
4694 | 4695 | 873 - 895 | AD-60835 | gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg |
4696 | 4697 | 873 - 895 | AD-60839 | gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacA fcucuuucsusg |
4698 | 4699 | 873 - 895 | AD-61143.2 | gsasaagaGfuGfuCfuca ucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg |
4700 | 4701 | 873 - 895 | AD-61144.1 | gsasaagaGfuGfdTCfuc aucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcucuuucsusg |
4702 | 4703 | 873 - 895 | AD-61145.1 | gsasaagaGfuGfdTCfuc aucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacA fcucuuucsusg |
4704 | 4705 | 873 - 895 | AD-61146.1 | gsasaagaGfuGfdTCfuc aucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcsusg |
Крысам вводили разовую дозу 2,5 мг/кг siRNA. Через 72 ч после введения siRNA измерения уров- 148 036477 ней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALASl) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH) выполняли при помощи анализа с bDNA.
Как показано на фиг. 39, siRNA AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144,
AD-61145 и AD-61146 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD58632. siRNA, которая обеспечивала наибольшее подавление в этом эксперименте, была AD-60835.
Пример 28. In vitro исследования связи структура-активность AD-60489
Получали AD-60489 и производные siRNA AD-60489 и некоторые siRNA подвергали скринингу in vitro в отношении активности. In vitro активность siRNA в подавлении mRNA ALAS1 исследовали, как описано в примере 24. Последовательности siRNA и результаты in vitro исследования представлены ниже в таблицах.
Таблица 32. Последовательности и результаты in vitro скрининга для siRNA AD-60489 и siRNA производных AD-60489
SEQID NO: (смысл овая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM 000688.4 | Название дуплекса* | Смысловая последовательность (5’-3’) | Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3’) | Средн. 10 нМ | SD 10 нМ | Средн. 0,1 нМ | SD o,1 нМ |
4706 | 4707 | 871-893 | AD-60489.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu | 17,02 | 0,18 | 50,65 | 5,11 |
4708 | 4709 | 871-893 | AD-60495.1 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu | 17,13 | 5,94 | 63,58 | 18,6 1 |
4710 | 4711 | 871-893 | AD-60501.1 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu | 11,90 | 0,66 | 45,19 | 8,93 |
4712 | 4713 | 871-893 | AD-60507.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucu uAfL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu | 14,63 | 7,85 | 48,50 | 19,5 5 |
4714 | 4715 | 871-893 | AD-60513.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucu uaL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu | 14,39 | 2,44 | 51,03 | 7,01 |
4716 | 4717 | 871-893 | AD-60519.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu | 14,67 | 4,88 | 51,70 | 7,72 |
4718 | 4719 | 871-893 | AD-60525.1 | csasgaaaGfaGfuguCfuCfaucuua L96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu | 45,24 | 18,16 | 105,09 | 14,1 7 |
4720 | 4721 | 871-893 | AD-60531.1 | csasgaaaGfaGfugucuCfaucuuaL 96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu | 62,19 | 12,47 | 107,18 | 1,37 |
4722 | 4723 | 871-893 | AD-60490.1 | csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcU fgsgsu | 39,06 | 10,92 | 82,70 | 10,6 7 |
4724 | 4725 | 871-893 | AD-60496.1 | csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcu gsgsu | 48,90 | 1,85 | 71,55 | 5,47 |
4726 | 4727 | 871-893 | AD-60502.1 | csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuucug sgsu | 51,83 | 12,62 | 81,85 | 4,25 |
4728 | 4729 | 871-893 | AD-60508.1 | csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcuuucugs gsu | 65,34 | 21,75 | 89,23 | 11,0 8 |
4730 | 4731 | 871-893 | AD-60514.1 | csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcucuuucugsg SU | 97,13 | 3,47 | 102,94 | 7,36 |
4732 | 4733 | 871-893 | AD-60520.1 | csasgaaaGfaGfugucucaucuuaL9 6 | u s Afs Af Gf au gAfg Af cAfcu cu u u cugsg s u | 104,97 | 0,93 | 126,75 | 20,4 7 |
4734 | 4735 | 871-893 | AD-60526.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcu cu u u cugsg s u | 61,48 | 15,44 | 81,28 | 7,99 |
4736 | 4737 | 871-893 | AD-60532.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu | 83,47 | 13,36 | 94,13 | 8,11 |
4738 | 4739 | 871-893 | AD-60491.1 | csasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 | UsAfsAfGfaugAfgAfcAfcdTcuuucugs gsu | 109,05 | 0,43 | 97,85 | 9,77 |
4740 | 4741 | 871-893 | AD-60497.1 | CfsasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu | 73,81 | 10,17 | 95,01 | 5,40 |
4742 | 4743 | 871-893 | AD-60503.1 | csasgaaaGfAfGfudGucucaucuua L96 | usAfsAfGfaugAfgAfcAfcdTcuuucugs gsu | 75,30 | 11,29 | 96,03 | 6,30 |
4744 | 4745 | 871-893 | AD-60509.1 | csasgaaaGfAfGfugudCucaucuua L96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu | 71,37 | 24,41 | 104,36 | 18,6 2 |
4746 | 4747 | 871-893 | AD-60515.1 | csasgaaaGfAfGfugucudCaucuua L96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu | 64,16 | 13,95 | 98,80 | 0,92 |
4748 | 4749 | 871-893 | AD-60521.1 | csasgaaaGfAfGfugucucadTcuua L96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu | 73,99 | 36,39 | 99,96 | 7,29 |
4750 | 4751 | 871-893 | AD-60527.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucdTua L96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu | 82,69 | 26,56 | 114,13 | 4,81 |
4752 | 4753 | 871-893 | AD-60533.1 | csasgaaaGfAfGfudGudCucaucu uaL96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu | 89,41 | 4,69 | 107,40 | 9,67 |
4754 | 4755 | 871-893 | AD-60492.1 | csasgaaaGfAfGfudGucudCaucu uaL96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu | 83,52 | 1,56 | 100,70 | 0,79 |
4756 | 4757 | 871-893 | AD-60498.1 | csasgaaaGfAfGfudGucucadTcuu aL96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cu u u cug s gsu | 64,64 | 16,21 | 98,41 | 19,6 0 |
4758 | 4759 | 871-893 | AD-60504.1 | csasgaaaGfAfGfudGudCucadTc uuaL96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cuuucugs gsu | 57,55 | 5,13 | 93,14 | 0,41 |
4760 | 4761 | 871-893 | AD-60510.1 | csasgaaaGfAfGfudGudCudCadT cuuaL96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfcdT cuuucugs gsu | 58,88 | 25,48 | 91,39 | 2,06 |
4762 | 4763 | 871-893 | AD-60516.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 | u s Afs Af Gf ad T g Afg AfcAfcd Tcu u u cu g sgsu | 53,24 | 6,56 | 84,40 | 2,73 |
4764 | 4765 | 871-893 | AD-60522.1 | csasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 | u s Afs Af Gf ad T gAfg AfcAfcd Tcu u u cu g sgsu | 67,17 | 6,48 | 91,62 | 5,43 |
4766 | 4767 | 871-893 | AD-60528.1 | CfsasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 | u s Afs Af Gf ad T gAfg AfcAfcd Tcu u u cu g sgsu | 81,44 | 37,04 | 89,71 | 8,60 |
4768 | 4769 | 871-893 | AD-60534.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 | usAfsAfGfaugAfgAfcAfcdT cdTuucug sgsu | 62,63 | 20,55 | 99,62 | 7,37 |
4770 | 4771 | 871-893 | AD-60493.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 | usAfsAfGfaugAfgAfcAfcdT cuudT cug sgsu | 107,18 | 0,11 | 87,98 | 2,41 |
4772 | 4773 | 871-893 | AD-60499.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 | u s Afs Af Gf ad T gAfg AfcAfcd Tcu ud Tcu gsgsu | 35,92 | 13,78 | 77,52 | 6,68 |
4774 | 4775 | 871-893 | AD-60505.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfc(T g n) cu u u cu gsgsu | 66,77 | 16,45 | 109,82 | 2,48 |
4776 | 4777 | 871-893 | AD-60511.1 | csasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfc(T g n) cu u u cu gsgsu | 82,10 | 10,11 | 95,50 | 14,7 3 |
4778 | 4779 | 871-893 | AD-60517.1 | CfsasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96 | u s Afs AfGfau gAfg Af cAfc(T g n) cu u u cu gsgsu | 80,83 | 29,69 | 93,57 | 18,4 1 |
4780 | 4781 | 871-893 | AD-60523.1 | GfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfc scsa | 29,60 | 1,64 | 67,16 | 8,40 |
4782 | 4783 | 871-893 | AD-60529.1 | GfsusGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcAfc scsa | 21,15 | 1,21 | 79,02 | 28,9 9 |
4784 | 4785 | 871-893 | AD-60535.1 | GfsusGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfgAfc scsa | 31,78 | 13,54 | 79,36 | 26,5 6 |
4786 | 4787 | 871-893 | AD-60494.1 | GfsusGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfgAfc sgsu | 30,14 | 3,42 | 81,46 | 12,8 8 |
4788 | 4789 | 871-893 | AD-60500.1 | CfsusCfuAfaGfaGfUfGfuCfuCfaU fcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuAfgAfg sgsu | 29,85 | 11,78 | 72,14 | 4,56 |
4790 | 4791 | 871-893 | AD-60506.1 | CfsusCfuUfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfaAfgUfg sgsu | 19,06 | 1,98 | 88,93 | 11,1 3 |
- 149 036477
Таблица 33. Последовательности и результаты in vitro скрининга для siRNA AD-60489 и siRNA производных AD-60489
4792 | 4793 | 871-893 | AD-60512.1 | CfsusGfuUfuGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | u s Afs a Gf aUfg Afg Afca cUfcAf aAfcUfg sgsu | 29,71 | 1,79 | 86,32 | 17,6 9 |
4794 | 4795 | 871-893 | AD-60518.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | (Tgns)AfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | 27,47 | 2,59 | 81,03 | 10,9 3 |
4796 | 4797 | 871-893 | AD-60524.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfs(Agn)GfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | 17,02 | 1,39 | 71,65 | 17,4 2 |
4798 | 4799 | 871-893 | н.Д. | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsa(Ggn)aUfgAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu | ||||
4800 | 4801 | 871-893 | AD-60536.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGf(Agn)aUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu | 61,77 | 10,19 | 91,55 | 2,20 |
4802 | 4803 | 871-893 | AD-60541.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfa(Tgn)gAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu | 25,47 | 2,83 | 54,36 | 15,0 2 |
4804 | 4805 | 871-893 | AD-60546.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUf(Ggn)AfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | 49,32 | 1,50 | 90,79 | 11,3 6 |
4806 | 4807 | 871-893 | AD-60551.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfg(Agn)gAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu | 24,37 | 1,11 | 76,80 | 24,9 9 |
4808 | 4809 | 871-893 | AD-60556.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAf(Ggn)AfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | 21,43 | 4,71 | 61,90 | 5,64 |
4810 | 4811 | 871-893 | AD-60561.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfg(Agn)cacUfcUfuUfc Ufgsgsu | 28,25 | 6,41 | 71,84 | 27,0 1 |
4812 | 4813 | 871-893 | AD-60566.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAf(Cgn)acUfcUfuUf cUfgsgsu | 27,57 | 4,87 | 67,91 | 18,2 8 |
4814 | 4815 | 871-893 | AD-60570.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfc(Agn)cUfcUfuUf cUfgsgsu | 24,11 | 0,04 | 58,75 | 21,0 2 |
4816 | 4817 | 871-893 | AD-60583.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfu(Agn)L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 15,32 | 4,78 | 42,01 | 9,51 |
4818 | 4819 | 871-893 | AD-60585.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUf(Tgn)AfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 21,15 | 4,14 | 49,54 | 13,3 4 |
4820 | 4821 | 871-893 | AD-60587.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Ufc(Tgn)uAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 14,66 | 1,73 | 41,47 | 13,2 0 |
4822 | 4823 | 871-893 | AD-60589.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Uf(Cgn)UfuAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 20,77 | 5,12 | 43,97 | 15,6 3 |
4824 | 4825 | 871-893 | AD-60591.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa( Tgn)cUfuAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 13,66 | 0,05 | 36,42 | 16,9 4 |
4826 | 4827 | 871-893 | AD-60592.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(A gn)UfcUfuAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 13,35 | 4,11 | 35,43 | 11,3 6 |
4828 | 4829 | 871-893 | AD-60593.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn )aUfcUfuAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 15,13 | 0,28 | 39,99 | 19,3 9 |
4830 | 4831 | 871-893 | AD-60582.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCf(Tgn) CfaUfcUfuAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 19,56 | 8,17 | 51,59 | 1,11 |
4832 | 4833 | 871-893 | AD-60584.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu(Cgn)uC faUfcUfuAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 23,36 | 6,63 | 58,79 | 10,3 5 |
4834 | 4835 | 871-893 | AD-60586.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGf(Tgn)Cfu CfaUfcUfuAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 27,78 | 2,20 | 76,86 | 6,81 |
4836 | 4837 | 871-893 | AD-60588.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUf(Ggn)uCfuC faUfcUfuAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 105,27 | 14,25 | 99,26 | 19,6 2 |
4838 | 4839 | 871-893 | AD-60590.1 | CfsasGfaAfaGfaGf(Tgn)GfuCfuC faUfcUfuAfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg | 28,74 | 1,66 | 81,88 | 22,0 4 |
4840 | 4841 | 871-893 | AD-60558.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Ufc(Tgn)uAfL96 | usAfs(Agn)GfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | 22,74 | 14,85 | 60,42 | 19,3 8 |
4842 | 4843 | 871-893 | н.Д. | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Uf(Cgn)UfuAfL96 | usAfsa(Ggn)aUfgAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu | ||||
4844 | 4845 | 871-893 | AD-60568.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa( Tgn)cUfuAfL96 | usAfsaGf(Agn)aUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu | 86,66 | 21,93 | 110,05 | 16,4 4 |
4846 | 4847 | 871-893 | AD-60572.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(A gn)UfcUfuAfL96 | usAfsaGfa(Tgn)gAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu | 22,37 | 4,86 | 71,24 | 22,1 9 |
4848 | 4849 | 871-893 | AD-60539.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn )aUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUf(Ggn)AfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | 43,35 | 14,53 | 104,44 | 2,51 |
4850 | 4851 | 871-893 | AD-60544.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCf(Tgn) CfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfg(Agn)gAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu | 25,85 | 1,18 | 69,98 | 5,86 |
4852 | 4853 | 871-893 | AD-60549.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu(Cgn)uC faUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAf(Ggn)AfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | 29,40 | 4,62 | 72,98 | 20,1 6 |
4854 | 4855 | 871-893 | AD-60554.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGf(Tgn)Cfu CfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfg(Agn)cacUfcUfuUfc Ufgsgsu | 33,74 | 0,45 | 75,36 | 19,3 9 |
4856 | 4857 | 871-893 | н.Д. | CfsasGfaAfaGfaGfUf(Ggn)uCfuC faUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAf(Cgn)acUfcUfuUf cUfgsgsu | ||||
4858 | 4859 | 871-893 | AD-60564.1 | CfsasGfaAfaGfaGf(Tgn)GfuCfuC faUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfc(Agn)cUfcUfuUf cUfgsgsu | 27,77 | 10,34 | 77,01 | 11,5 1 |
4860 | 4861 | 871-893 | AD-60569.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfsL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu | 20,34 | 5,29 | 59,40 | 19,7 4 |
4862 | 4863 | 871-893 | AD-60573.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfscUfsuAfsL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu | 20,07 | 3,83 | 60,80 | 14,9 3 |
4864 | 4865 | 871-893 | AD-60540.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfsL96 | usAfsaGfaUfsgAfgAfcacUfcUfsuUfsc Ufgsgsu | 24,36 | 0,56 | 75,75 | 14,9 7 |
4866 | 4867 | 871-893 | н.Д. | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfscUfsuAfsL96 | usAfsaGfaUfsgAfgAfcacUfcUfsuUfsc Ufgsgsu |
В in vitro скрининге, для которого результаты показаны в таблицах выше, siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 80% подавления, так что оставалось менее 20% mRNA) при концентрации 10 нМ, включали AD-60501, AD-60592, AD-60591, AD-60513, AD-60507, AD-60587, AD-60519, AD-60593, AD-60583, AD-60524, AD-60489, AD-60495, AD-60506, и AD-60582.
В in vitro скрининге, для которого результаты показаны в таблицах выше, siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 30% подавления, так что оставалось менее 70% mRNA) при концентрации 0,1 нМ, включали AD-60592, AD-60591, AD-60593, AD-60587, AD-60583, AD-60589, AD-60501, AD-60507, AD-60585, AD-60489, AD-60513, AD-60582, AD-60519, AD-60541, AD60570, AD-60584, AD-60569, AD-60558, AD-60573, AD-60556, AD-60495, AD-60523, AD-60566 и AD60544.
Как показано в табл. ниже, исследование дополнительных siRNA показало, что следующие дуплексы обеспечивали более чем 80% подавление при концентрации 10 нМ: AD-60489, AD-60495, AD-60501, AD-60507, AD-60513, AD-60519, AD-60583, AD-60591, AD-60592 и AD-60593, а следующие дуплексы обеспечивали более чем 30% подавление при концентрации 0,1 нм: AD-60489, AD-60495, AD-60501, AD60507, AD-60513, AD-60519, AD-60583, AD-60591, AD-60592 и AD-60593.
- 150 036477
Таблица 34. Дополнительные последовательности siRNA производных AD-60489
SEQ ID NO: (смысловая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательност и NM 000688.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5-3’) | Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3) | Средн. 10 нМ | SD 10 HM | Средн 0,1 нМ | SD 0,1 hM | ||
4868 | 4869 | 871-893 | AD-60489.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaU fcUfuAfL96 | UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu | 17,0 | 0,2 | 50,7 | 5,1 | ||
4870 | 4871 | 871-893 | AD-60495.1 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 | UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu | 17,1 | 5,9 | 63,6 | 18,6 | ||
4872 | 4873 | 871-893 | AD-60501.1 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 | UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu | 11,9 | 0,7 | 45,2 | 8,9 | ||
4874 | 4875 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 | u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu | |||||||
4876 | 4877 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 | UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdT cuud Tcugsgsu | |||||||
4878 | 4879 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu | |||||||
4880 | 4881 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu | |||||||
4882 | 4883 | 871-893 | AD-60507.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 | UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu | 14,6 | 7,8 | 48,5 | 19,6 | ||
4884 | 4885 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | |||||||
4886 | 4887 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 | u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu | |||||||
4888 | 4889 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 | UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdT cuud Tcugsgsu | |||||||
4890 | 4891 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu | |||||||
4892 | 4893 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu | |||||||
4894 | 4895 | 871-893 | AD-60513.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 | UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu | 14,4 | 2,4 | 51,0 | 7,0 | ||
4896 | 4897 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 | UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | |||||||
4898 | 4899 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 | u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu | |||||||
4900 | 4901 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 | UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdT cuud Tcugsgsu | |||||||
4902 | 4903 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu | |||||||
4904 | 4905 | 871-893 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu | |||||||
4906 | 4907 | 871-893 | AD-60519.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 | UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu | 14,7 | 4,9 | 51,7 | 7,7 | ||
4908 | 4909 | 871-893 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 | UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu | |||||||
4910 4912 4914 4916 4918 4920 4922 4924 4926 4928 4930 4932 4934 4936 4938 4940 4942 4944 4946 4948 4950 4952 4954 4956 4958 4960 4962 4964 4966 4968 4970 4972 4974 4976 4978 4980 | 4911 4913 4915 4917 4919 4921 4923 4925 4927 4929 4931 4933 4935 4937 4939 4941 4943 4945 4947 4949 4951 4953 4955 4957 4959 4961 4963 4965 4967 4969 4971 4973 4975 4977 4979 4981 | 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 871-893 | AD-60499.1 AD-60583.1 AD-60591.1 AD-60592.1 AD-60593.1 AD-60489.1 AD-60591.1 AD-60592.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfu(Agn)L96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn) aUfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUf cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUf cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUf scUfsuAfsL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUf scusuAfsL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(T gn)cUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(T gn)scUfsuAfsL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(T gn)scusuAfsL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96 | u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu u s Afs AfGfau g Afg Af cAfcu cu u u cu gsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUf cUfgsgsu u s Afs a Gf aUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUf cUfgsgsu usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuU fcUfgsgsu asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUf cUfgsgsu UsAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuU fcUfgsgsu asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu | 35,9 15,3 13,7 13,4 15,1 17,0 13,7 13,4 | 13,8 4,8 0,0 4,1 0,3 0,2 0,0 4,1 | 77,5 42,0 36,4 35,4 40,0 50,7 36,4 35,4 | 6,7 9,5 16,9 11,4 19,4 5,1 16,9 11,4 | ||
4982 | 4983 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Ag n)UfscUfsuAfsL96 | u s Afs a GfaUfg Afg Afca cUfcd Tu Uf cUfgsgsu | |||||||
4984 | 4985 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Ag n)UfscusuAfsL96 | UsAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuU fcUfgsgsu | |||||||
4986 | 4987 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(A gns)UfscUfsuAfsL96 | UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUf cUfgsgsu | |||||||
4988 | 4989 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(A gns)UfscusuAfsL96 | UsAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuU fcUfgsgsu |
- 151 036477
SEQ ID NO: (смысловая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM 000688.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5’-3’) | Антисмысловая последовательность (5’-3’) |
4990 | 4991 | 871-893 | AD60489 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfc UfuUfcUfgsgsu |
4992 | 4993 | 871-893 | AD60501.1 | Cfs as GfaAfa GfaGfu Gfu CfuCfaucuuAfL96 | UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcUfgsgsu |
4994 | 4995 | 871-893 | AD60900.1 | Cfs as GfaAfa GfaGfu Gfu CfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu |
4996 | 4997 | 871-893 | AD60519.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 | UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcUfgsgsu |
4998 | 4999 | 871-893 | AD60905.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 | UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu |
5000 | 5001 | 871-893 | AD60901.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfc UfuUfcUfgsgsu |
5002 | 5003 | 871-893 | AD60495.2 | csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfc UfuUfcUfgsgsu |
5004 | 5005 | 871-893 | AD60935.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUf uAfL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfc UfuUfcUfgsgsu |
Таблица 35. Дополнительные последовательности и IC50 siRNA AD-60489 и siRNA производных
AD-60489
SEQ ID NO: (смысловая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM 000688.4 | Название дуплекса* | Смысловая последовательность (5’-3’) | Антисмысловая (AS) последовательность (5’-3’) | IC50 |
5006 | 5007 | 871-893 | AD-60489.3 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,010 |
5008 | 5009 | 871-893 | AD-60495.2 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,254 |
5010 | 5011 | 871-893 | AD-60501.2 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,006 |
5012 | 5013 | 871-893 | AD-60898.1 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu | н.Д. |
5014 | 5015 | 871-893 | AD-60900.1 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu | 0,151 |
5016 | 5017 | 871-893 | AD-60851.1 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu | 0,033 |
5018 | 5019 | 871-893 | AD-60855.1 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu | 0,065 |
5020 | 5021 | 871-893 | AD-60507.2 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,029 |
5022 | 5023 | 871-893 | AD-60902.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,024 |
5024 | 5025 | 871-893 | AD-60904.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu | н.Д. |
5026 | 5027 | 871-893 | AD-60894.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu | 0,011 |
5028 | 5029 | 871-893 | AD-60860.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu | 0,249 |
5030 | 5031 | 871-893 | AD-60864.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu | 1,899 |
5032 | 5033 | 871-893 | AD-60513.2 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,019 |
5034 | 5035 | 871-893 | AD-60896.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,034 |
5036 | 5037 | 871-893 | AD-60899.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu | н.Д. |
5038 | 5039 | 871-893 | AD-60868.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu | 0,249 |
5040 | 5041 | 871-893 | AD-60872.1 | CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu | 0,014 |
5042 | 5043 | 871-893 | AD-60519.2 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,026 |
5044 | 5045 | 871-893 | AD-60901.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,080 |
5046 | 5047 | 871-893 | AD-60903.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu | н.Д. |
5048 | 5049 | 871-893 | AD-60905.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu | 0,018 |
5050 | 5051 | 871-893 | AD-60876.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu | 0,091 |
5052 | 5053 | 871-893 | AD-60880.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuuaL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu | 0,131 |
5054 | 5055 | 871-893 | AD-60499.2 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 | usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu | н.Д. |
5056 | 5057 | 871-893 | AD-60895.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | н.Д. |
5058 | 5059 | 871-893 | AD-60897.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu | н.Д. |
5060 | 5061 | 871-893 | AD-60526.2 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 | usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu | н.Д. |
5062 | 5063 | 871-893 | AD-60852.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu | 4,970 |
5064 | 5065 | 871-893 | AD-60856.1 | csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu | н.Д. |
5066 | 5067 | 871-893 | AD-60861.1 | csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,019 |
5068 | 5069 | 871-893 | AD-60865.1 | csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,061 |
5070 | 5071 | 871-893 | AD-60869.1 | csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 | usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu | н.Д. |
5072 | 5073 | 871-893 | AD-60873.1 | csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 | usAfsAfGfadT gAfgAfcAfcdT cuudTcugsgsu | 0,009 |
5074 | 5075 | 871-893 | AD-60877.1 | csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu | 0,008 |
5076 | 5077 | 871-893 | AD-60881.1 | csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu | 0,025 |
5078 | 5079 | 871-893 | AD-60583.2 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfu(Agn)L9 6 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,022 |
5080 | 5081 | 871-893 | AD-60591.3 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,031 |
5082 | 5083 | 871-893 | AD-60592.3 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,010 |
5084 | 5085 | 871-893 | AD-60593.2 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn)aUfcUfuAfL 96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,006 |
5086 | 5087 | 871-893 | AD-60489.4 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,011 |
5088 | 5089 | 871-893 | AD-60857.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu | 0,019 |
5090 | 5091 | 871-893 | AD-60862.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,012 |
5092 | 5093 | 871-893 | AD-60866.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,015 |
5094 | 5095 | 871-893 | AD-60870.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfscUfsuAfsL9 6 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,012 |
5096 | 5097 | 871-893 | AD-60874.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfscusuAfsL9 6 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,003 |
5098 | 5099 | 871-893 | AD-60591.2 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 0,014 |
5100 | 5101 | 871-893 | AD-60878.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 0,008 |
5102 | 5103 | 871-893 | AD-60882.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,003 |
5104 | 5105 | 871-893 | AD-60853.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,007 |
5106 | 5107 | 871-893 | AD-60858.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)scUfsuAf sL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,013 |
5108 | 5109 | 871-893 | AD-60863.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)scusuAfs L96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,002 |
5110 | 5111 | 871-893 | AD-60592.2 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 0,013 |
5112 | 5113 | 871-893 | AD-60867.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg | 0,084 |
- 152 036477
5114 | 5115 | 871-893 | AD-60871.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,008 |
5116 | 5117 | 871-893 | AD-60875.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,004 |
5118 | 5119 | 871-893 | AD-60879.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfscUfsuA fsL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,001 |
5120 | 5121 | 871-893 | AD-60883.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfscusuAf sL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,004 |
5122 | 5123 | 871-893 | AD-60854.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(Agns)UfscUfs uAfsL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,002 |
5124 | 5125 | 871-893 | AD-60859.1 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(Agns)Ufscusu AfsL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu | 0,002 |
Как показано в табл. выше, несколько дуплексов характеризовались эффективностью в подавлении mRNA ALAS1. Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,01 нМ: AD-60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874, AD-60883, AD-60875, AD-60501, AD-60593, AD-60853, AD60877, AD-60878, AD-60871, и AD-60873. Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,02 нМ: AD-60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874, AD-60883, AD-60875, AD-60501, AD-60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD-60871, AD-60873, AD-60489, AD-60592, AD-60894, AD60489, AD-60870, AD-60862, AD-60858, AD-60592, AD-60591, AD-60872, AD-60866, AD-60905, AD60857, AD-60513, и AD-60861. Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,05 нМ:AD60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874 , AD-60883, AD-60875, AD-60501,AD60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD-60871, AD-60873, AD-60489, AD-60592, AD-60894,AD60489, AD-60870, AD-60862, AD-60858, AD-60592, AD-60591, AD-60872, AD-60866, AD-60905,AD60857, AD-60513, AD-60861, AD-60583.2, AD-60902.1, AD-60881.1, AD-60519.2, AD-60507.2, AD60591.3, AD-60851.1, AD-60896.1 и AD-60537.2.
Пример 29. In vivo исследования связи структура-активность AD-60489
Получали производные исходной siRNA AD-60489 и подвергали скринингу in vivo на крысах.
In vivo скрининг 1 производных AD-60489
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в табл. ниже.
Таблица 36. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысло вая) | SEQ ID NO: (антисмыслова я) | Целевые сайты антисмысловой последовательное ти NM_000588.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
5126 | 5127 | 871-893 | AD-60489 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfc UfuUfcUfgsgsu |
5128 | 5129 | 871-893 | AD-60501.2 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfu CfuCfaucuuAfL96 | us Afs AfGf a UfgAfgAf c AfcUfcUfuUfcUfgsgsu |
5130 | 5131 | 871-893 | AD-60519.2 | csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 | us Afs Af Gfa UfgAfgAf c AfcUfcUfuUfcUfgsgsu |
5132 | 5133 | 871-893 | AD-60901.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcUfgsgsu |
5134 | 5135 | 871-893 | AD-60495.2 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfu CfuCfaucuuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcac UfcUfuUfcUfgsgsu |
5136 | 5137 | 871-893 | AD-60900.1 | CfsasGfaAfaGfaGfuGfu CfuCfaucuuAfL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfc AfcdTcuudTcugsgsu |
5138 | 5139 | 871-893 | AD-60935.1 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUfuAfL96 | us Afs Af Gfa UfgAfgAf cAfc UfcUfuUfcUfgsgsu |
5140 | 5141 | 871-893 | AD-60905.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 | usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu |
Крысам вводили разовую дозу 3 мг/кг siRNA. Через 5 дней после введения siRNA, проводили измерения уровней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH), при помощи анализа с bDNA, и уровни лекарственного средства в ткани (siRNA) определяли при помощи qPCR.
Как показано на фиг. 40 (вверху), siRNA AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900 и AD-60935 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-60489. siRNA AD-60519, AD-60901, AD-60495 и AD-60935 обеспечивали более высокие уровни в печени, чем AD60489 (см. фиг. 40, внизу). Таким образом, большинство из дуплексов, которые обеспечивали повышенное подавление mRNA ALAS1, также достигали более высоких уровней в печени.
По меньшей мере для дуплексов AD-60489, AD-60519 и AD-60901 эффективность коррелировала с уровнями siRNA в печени (см. фиг. 41), так что более высокий уровень siRNA в печени был связан с более высоким подавлением mRNA ALAS 1.
In vivo скрининг 2 производных AD-60489
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в табл. ниже.
- 153 036477
Таблица 37. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смысл овая) | SEQ ID NO: (антисмыслова я) | Целевые сайты антисмысловой последовательное ти NM_0006S8.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
5142 | 5143 | 871-893 | AD-60489 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu CfaUfcUfuAfL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu |
5144 | 5145 | 871-893 | AD-6O879 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfu Cf(Agn)UfscUfsuAfsL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdT u UfcUfgsgsu |
5146 | 5147 | 871-893 | AD-61190 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfu CfuCf(Agn)UfscUfsuAfsL96 | u s Afs Af G f a U f g Af gAf c Af c U f c UfuUfcUfgsgsu |
5148 | 5149 | 871-893 | AD-61191 | CfsasGfaAfaGfaGfdTGfu CfuCf(Agn)UfscUfsuAfsL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfc UfuUfcUfgsgsu |
5150 | 5151 | 871-893 | AD-6O877 | csasgaaaGfAfGfugucuca (Tgn)cuuaL96 | UsAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu |
5152 | 5153 | 871-893 | AD-61192 | csasgaaaGfAfGfugucuca (Tgn)cuuaL96 | UsAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu |
5154 | 5155 | 871-893 | AD-6O865 | csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 | UsAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu |
5156 | 5157 | 871-893 | AD-6O861 | csasgaaaGfAfGfugucuca (Tgn)cuuaL96 | u s Afs a G f a U f gAfg Af ca c U f c UfuUfcUfgsgsu |
5158 | 5159 | 871-893 | AD-6O876 | csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96 | usAfsaGfadT g Af g Af c Af cd TcuudTcugsgsu |
5160 | 5161 | 871-893 | AD-61193 | csasgaaaGfaGfuGfu CfuCfaucuuaL96 | u s Afs a G f a U f gAfg Af ca c UfcdTuUfcUfgsgsu |
5162 | 5163 | 871-893 | AD-6O519 | csasgaaaGfaGfuGfu CfuCfaucuuaL96 | u s Afs Af G f a U f g Af gAf c Af c UfcUfuUfcUfgsgsu |
Крысам вводили разовую дозу 2,5 мг/кг siRNA. Через 5 дней после введения siRNA измерения уровней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH), выполняли при помощи анализа с bDNA.
Как показано на фиг. 42, siRNA AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193 и AD-60519 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD60489.
Пример 30. Введение нескольких доз повышает эффективность
Для исследования эффектов введения нескольких доз siRNA крысам (n=3 на группу) вводили PBS или siRNA (AD-58632, AD-60925, AD-60419, AD-60445, AD-60892, AD-60489, AD-60519 или AD-60901) в дозе 2,5 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель. Уровни mRNA ALAS1 крыс (rALAS1) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH) оценивали при помощи анализа с bDNA.
Таблица 38. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQ ID NO: (смыслов ая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM-000688.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5'-3') | Антисмысловая последовательность (5'-3') |
5164 | 5165 | 873 - 895 | AD-58632 | GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgacA fcUfcUfuUfcsusg |
5166 | 5167 | 873 - 895 | AD-60925 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuca uc(Tgn)ucuuL96 | asAfsGfAfa Gfa UfgAfgAf cAfcUfcUfuUfcsusg |
5168 | 5169 | 873 - 895 | AD-60419 | GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96 | asAfsGfAfa Gfa ugAfgAfc Afcucuuucsusg |
5170 | 5171 | 873 - 895 | AD-60445 | GfsasAfaGfAfGfuGfucuca uc(Tgn)ucuuL96 | asAfsGfAfa Gfa ugAfgAfc Afcucuuucsusg |
5172 | 5173 | 873 - 895 | AD-60892 | gsasaagaGfuGfuCfucauc uucuuL96 | asAfsGfAfa Gfa ugAfgAfc Afcucuuucsusg |
5174 | 5175 | 871-893 | AD-60489 | CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu CfuCfaUfcUfuAfL96 | UsAfsaGfaUfgAfgAfcacU fcUfuUfcUfgsgsu |
5176 | 5177 | 871-893 | AD-60519.2 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCf aucuuaL96 | usAfsAfGfa UfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcUfgsgsu |
5178 | 5179 | 871-893 | AD-60901.1 | csasgaaaGfaGfuGfuCfuCf aucuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfcacU fcUfuUfcUfgsgsu |
Как показано на фиг. 43, производные siRNA AD-58632, AD-60892, AD-60419, AD-60445 и AD60925 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с исходным AD-58632. Кроме того, производные siRNA AD-60489, AD-60519 и AD-60901 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с исходным AD-60489.
- 154 036477
Пример 31. Исследования введения нескольких доз AD-60519 и AD-60489
Терапевтическую эффективность AD-60519 исследовали на крысиной модели AIP. Схема эксперимента показана на фиг. 44 (вверху). Крыс обрабатывали PBS или siRNA ALAS1-GalNAc либо в количестве 2,5 мг/кг, либо в количестве 5 мг/кг два раза в неделю в течение трех недель. Фенобарбитал (фенобарб) и siRNA PBGD в составе LNP с AF11 вводили в периоды времени, указанные на фиг. 44. Контрольная группа получала только PBS и siRNA PBGD, без индукции фенобарбиталом. Мочу собирали на 18-19 дни исследования.
Результаты показаны на фиг. 44 (внизу). Введение фенобарбитала и PBS индуцировало экспрессию mRNA ALAS1 и повышало уровни PBG и ALA в моче (см. фиг. 44) по сравнению только с PBS. Обработка суммарно 2,5 или 5 мг/кг из шести доз AD-60519 два раза в неделю подавляла индуцированные фенобарбиталом повышения уровней PBG в моче и ALA в моче (фиг. 44). Эти результаты показывают, что AD-60519 является эффективным в подавлении уровней ALA и PBG при введении повторных доз до 2,5 мг/кг. В частности, AD-60519 был эффективным в снижении повышений уровней PBG и ALA в моче, связанных с острыми приступами в крысиной модели AIP.
В дополнительных исследованиях с использованием такой же схемы эксперимента, но в мышиной модели (см. схему вверху фиг. 44) исследовали терапевтическую эффективность AD-60519 и AD-60489 в подавлении индуцированных фенобарбиталом повышений уровней PBG и ALA в сыворотке. В контрольной группе PBS (физиологического раствора) введение фенобарбитала повышало уровни PBG и ALA в сыворотке (см. фиг. 45) по сравнению только с PBS. Обработка суммарно шестью дозами в 2,5 или 5 мг/кг AD-60519 или AD-60489 два раза в неделю подавляла индуцированные фенобарбиталом повышения уровней PBG в сыворотке и ALA в сыворотке (фиг. 44). Эти результаты показывают, что как AD-60519, так и AD-60489, являются эффективным в подавлении уровней ALA и PBG при введении повторных доз до 2,5 мг/кг. В частности, AD-60519 и AD-60489 были эффективными в снижении повышений уровней PBG и ALA в сыворотке, связанных с острыми приступами.
Поскольку лекарственные препараты в этом примере вводили до индукции фенобарбиталом, эти результаты указывают, что AD-60519 и AD-60489 оказывают профилактические эффекты.
Пример 32. Дополнительные последовательности siRNA
Получали следующие последовательности производных siRNA AD-58632 (табл. 39) и AD-60489 (табл. 40).
Таблица 39. Производные последовательности AD-58632
SEQ ID NO: (смысловая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM 000688.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5-3) | Антисмысловая последовательность (5’-3) |
5180 | 5181 | 873 - 895 | AD-60802 | GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg |
5182 | 5183 | 873 - 895 | AD-60824 | GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg |
5184 | 5185 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfuc ucauc(Tgn)ucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg | |
5186 | 5187 | 873 - 895 | AD-60843 | GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg |
5188 | 5189 | 873 - 895 | AD-60847 | GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg |
5190 | 5191 | 873 - 895 | GfsasAfaGfAfGfuGfdT cucaucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg | |
5192 | 5193 | 873 - 895 | AD-60819 | GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg |
5194 | 5195 | 873 - 895 | AD-60823 | GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg |
5196 | 5197 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfuCf uCfaucuuCfuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg | |
5198 | 5199 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdT CfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg | |
5200 | 5201 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdT CfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg | |
5202 | 5203 | 873 - 895 | GfsasAfaGfaGfuGfdT CfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg | |
5204 | 5205 | 873 - 895 | AD-60853 | gsasaagaGfuGfuCfuc aucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg |
5206 | 5207 | 873 - 895 | AD-60839 | gsasaagaGfuGfuCfuc aucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg |
5208 | 5209 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfuCfuc aucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg | |
5210 | 5211 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfdTCfu caucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfc ucuuucsusg | |
5212 | 5213 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfdTCfu caucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg | |
5214 | 5215 | 873 - 895 | gsasaagaGfuGfdTCfu caucuucuuL96 | asAfsgAfaGfaUfgAfgAfcAf cUfcUfuUfcsusg |
Таблица 40. Производные последовательности AD-60489
SEQ ID NO: (смысловая) | SEQ ID NO: (антисмысловая) | Целевые сайты антисмысловой последовательности NM_000688.4 | Название дуплекса | Смысловая последовательность (5-3) | Антисмысловая последовательность (5-3) |
5216 | 5217 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfdT Gfu Cfu Cf(Agn)UfscUfs uAfsL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcA fcdTcuudTcugsgsu |
- 155 036477
5218 | 5219 | 871-893 | AD-60879 | CfsasGfaAfaGfaGfdT GfuCfuCf(Agn)UfscUfs uAfsL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcdTuUfcUfgsgsu |
5220 | 5221 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfdT GfuCfuCf(Agn)UfscUfs uAfsL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcUfgsgsu | |
5222 | 5223 | 871-893 | CfsasGfaAfaGfaGfdT GfuCfuCf(Agn)UfscUfs uAfsL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcUfuUfcUfgsgsu | |
5224 | 5225 | 871-893 | AD-60877 | csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcA fcdTcuudTcugsgsu |
5226 | 5227 | 871-893 | csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcdTuUfcUfgsgsu | |
5228 | 5229 | 871-893 | AD-60865 | csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcUfgsgsu |
5230 | 5231 | 871-893 | AD-60861 | csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcUfuUfcUfgsgsu |
5232 | 5233 | 871-893 | AD-60876 | csasgaaaGfaGfuGfuCf uCfaucuuaL96 | usAfsaGfadTgAfgAfcA fcdT cuudTcugsgsu |
5234 | 5235 | 871-893 | csasgaaaGfaGfuGfuCf uCfaucuuaL96 | usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcdTuUfcUfgsgsu | |
5236 | 5237 | 871-893 | AD-60519 | csasgaaaGfaGfuGfuCf uCfaucuuaL96 | usAfsAfGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcUfgsgsu |
Пример 33. Дополнительные исследования введения нескольких доз AD-60519
Терапевтическую эффективность AD-60519 исследовали в крысиной модели AIP, подобной той, которую использовали в примере 31. Схема эксперимента показана на фиг. 46 (вверху). Крыс обрабатывали PBS или siRNA ALAS1-GalNAc в количестве 3, 1 или 0,3 мг/кг раз в неделю в течение четырех недель (обработка на 0, 7, 14 и 21 день). Фенобарбитал (фенобарб) и siRNA PBGD в составе LNP с AF11 вводили в периоды времени, указанные на фиг. 46. Контрольная группа получала только PBS и siRNA PBGD без индукции фенобарбиталом. Мочу собирали на 25 день исследования.
Результаты показаны на фиг. 46 (внизу) и на фиг. 47. Введение фенобарбитала и PBS индуцировало экспрессию mRNA ALAS1 и повышало уровни PBG и ALA в моче по сравнению только с PBS. Обработка суммарно четырьмя дозами в 3, 1 или 0,3 мг/кг AD-60519 раз в неделю подавляла индуцированные фенобарбиталом повышения уровней mRNA ALAS1 крыс в печени дозозависимым образом (см. фиг. 46). (Уровни mRNA ALAS1 (rALAS1) крыс в печени выражали относительно уровней mRNA GAPDH крыс). Уровни PBG в моче и ALA в моче также характеризовались дозозависимыми эффектами.
Повторные дозы AD-60519 раз в неделю были эффективными в подавлении экспрессии mRNA ALAS1 и в снижении повышенных уровней ALA и PBG, связанных с индуцированными острыми приступами в крысиной модели AIP. Эти эффекты лечения были дозозависимыми. Данные результаты показывают, что AD-60519 может действовать профилактически при введении доз до приступа.
Пример 34. Эффекты введения нескольких доз конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 у отличных от человека приматов
Эффекты конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в подавлении mRNA ALAS1 в печени и mRNA ALAS1 в крови исследовали в исследовании на отличных от человека приматах (NHP). Использовали конъюгаты GalNAc AD-58632, AD-60519, AD-61193 и AD-60819. Схема исследования показана в табл. 41 и на фиг. 48.
Таблица 41. Схема исследования NHP
Исследуемый объект | № группы | N | Уровень дозы (мг/кг) | Конц, дозы (мг/мл) | Частота введения дозы | Дни введения дозы | Объем дозы (мл/кг) | Путь введения дозы |
AD-5 8632 | 1 | 3 | 2,5 | 1,25 | Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 недели | 1,2, 3,4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, 25 | 2 | SC |
AD-60519 | 3 | 1,25 | 0,625 | Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 недели | ||||
3 | 3 | 2,5 | 1,25 | Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 недели | ||||
4 | 3 | 2,5 | 1,25 | Раз в день, 5 дней, 1 неделя; раз в неделю, 2-4 недели | 1,2, 3,4, 5, И, 18, 25 | |||
5 | 3 | 5 | 2,5 | Раз в день, 5 дней, 1 неделя; раз в неделю, 2-4 недели | ||||
AD-61193 | 6 | 3 | 2,5 | 1,25 | Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 недели | 1,2, 3,4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, 25 | ||
AD-60819 | 7 | 3 | 2,5 | 1,25 | Раз в день, 5 дней, 1 неделя; два раза в неделю, 2-4 | 1,2, 3,4, 5, 8, И, 15, 18, 22, 25 |
| недели
- 156 036477
Каждая группа получала несколько подкожных доз конъюгата GalNAc с ALAS1 siRNA в объеме дозы 2 мг/мл. Группа 1 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-58632 на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 2 (n=3) получала 1,25 мг/кг с 0,625 мг/мл AD-60519 на 1,2, 3,4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 3 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-60519 на 1,2, 3,4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 4 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-60519 на 1, 2, 3, 4, 5, 11, 18 и 25 дни. Группа 5 (n=3) получала 5 мг/кг с 2,5 мг/мл AD-60519 на 1, 2, 3, 4, 5, 11, 18 и 25 дни. Группа 6 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-61193 на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 7 (n=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD60819 на 1,2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни.
Образцы сыворотки для анализа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) (см. пример 21) собирали на - 3, 7, 13, 21, 27, 39, 46 и 60 дни (на фиг. 48, PD заборы указывает дни, в которые собирали сыворотку). Сыворотки собирали для биохимического анализа крови на - 3 и 6 дни. Биохимический анализ включал оценку уровней аланинтрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и щелочной фосфатазы (ALP). Сайленсинг mRNA ALAS1 оценивали в ткани печени, полученной в результате биопсии печени на 21 день (см. фиг. 48). Биопсию выполняли после забора сыворотки.
Подавление уровней mRNA ALAS1 в печени
Уровни mRNA ALAS1 в печени на 21 день исследования показаны на фиг. 49. Результаты показаны в виде процента от среднего уровня, наблюдаемого в контрольной группе, обработанной PBS. Результаты показаны в виде средних величин для каждой группы обработки.
Эти результаты, представленные на фиг. 49 показывают, что по сравнению с контрольными животными, которые получали обработку PBS, все из условий обработки были эффективными в подавлении уровней mRNA ALAS1 в печени. Обработки обеспечивали сайленсинг mRNA, находящийся в диапазоне приблизительно от 20 до 80% (соответствующий уровням mRNA ALAS1, находящимся в диапазоне приблизительно от 80 до 20% от контрольных уровней). Отдельные животные, которые получали AD-58632, характеризовались сайленсингом приблизительно 20-50%, при этом средний уровень сайленсинга составлял приблизительно 40% (уровни mRNA ALAS1 составляли в среднем приблизительно 60% от контрольных уровней). При всех используемых схемах введения доз AD-60519 был высокоэффективным в подавлении уровней mRNA ALAS1. Отдельные животные, которые получали AD-60519, характеризовались сайленсингом приблизительно 60-80% (уровни mRNA ALAS1 составляли приблизительно 20-40% от контрольных уровней). В среднем, режимы обработки AD-60519 обеспечивали сайленсинг приблизительно 65-75%. Как раскрыто в данном документе, AD-60519 является производным AD-60489. Подобные результаты для AD-60489 раскрыты в примере 20 и показаны на фиг. 30. Кроме того, AD-61193 (производное AD-60489) и AD-60819 (производное AD-58632) также обеспечивали сайленсинг на более чем 50%. Заслуживает внимания, что уровни сайленсинга, описанные в этом примере и в примере 20 (например, приблизительно 20-80%), достигались даже в неиндуцированном состоянии; ожидается, что в индуцированном состоянии, например, когда уровни ALAS 1 остро или хронически повышены (например, у пациента, имеющего порфирию или с риском развития порфирии, например, острой печеночной порфирии, например, AIP), более низкие уровни сайленсинга, например, снижение уровней mRNA ALAS1 до нормальных уровней или уровней до приступа, могут быть достаточными для достижения терапевтической эффективности.
Подавление уровней циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1
На фиг. 50 показаны уровни циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 (средние величины и стандартные отклонения) в каждой временной точке в течение исследования, когда получали образцы сыворотки. Результаты по циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 показывают эффективность сайленсинга mRNA после обработки несколькими дозами каждой из изученных siRNA (AD60519, AD61193, AD-60819 и AD-58632). Во всех группах наибольший эффект подавления на циркулирующую mRNA ALAS1 наблюдали на 27 день, после конечной дозы siRNA на 25 день. Во всех группах обработки в течение нескольких недель после прекращения обработки уровни mRNA ALAS1 постепенно повышались и возвращались к исходному уровню при конечном измерении на 60 день.
Наиболее выраженное подавление циркулирующей mRNA ALAS1 (максимальный сайленсинг около 80%) наблюдали в группе 3 (2,5 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, два раза в неделю, 3 недели) и группе 5 (5 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, раз в неделю, 3 недели). Группа 2 (1,25 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, два раза в неделю, 3 недели), группа 4 (2,5 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, раз в неделю, 3 недели), группа 7 (2,5 мг/кг AD-60819, раз в день, 5 дней, два раза в неделю, 3 недели) и группа 6 (2,5 мг/кг AD-61193, раз в день, 5 дней, раз в неделю, 3 недели) также характеризовались отличным подавлением, при максимальном сайленсинге (27 день) более чем 50%. В группе 1 также был достигнут заметный сайленсинг (более чем 30% на 27 день).
Эти результаты согласуются с результатами по mRNA ALAS1 в печени и подтверждают высокую активность AD-60519. При уровнях доз до 1,25 мг/кг AD-60519 обеспечивал 65-75% сайленсинг.
Корреляция между уровнями циркулирующей mRNA ALAS1 и печени
На фиг. 27 показаны уровни mRNA ALAS1 в печени (левые столбцы) и в сыворотке (правые столбцы). Имеется высокая корреляция между относительными уровнями mRNA ALAS1, измеренными в печени и в сыворотке, указывая на то, что эти измерения представляют надежные результаты.
- 157 036477
Пример 35. Исследование введения разовой дозы AD-60519 и AD-60589 крысам при помощи анализа cERD мочи для отслеживания длительности подавления mRNA ALAS1
Исследование введения разовой дозы проводили у крыс с использованием конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 AD-60489 и AD-60519. Эффективность этих конъюгатов GalNAc в ингибировании экспрессии mRNA ALAS1 отслеживали на основании оценок мочи при помощи анализа определения циркулирующей внеклеточной РНК. Анализ был подобным анализу, используемому в примерах 21 и 34, за исключением того, что использовали образцы мочи. Образцы мочи лиофилизировали для ее концентрирования. Лиофилизированную мочу ресуспендировали в 4 мл dH2O и перемешивали на вортексе. Затем образец центрифугировали при 4000xg в течение 10-20 мин для осаждения любых клеточных остатков. Оставшиеся стадии были подобны таковым, описанным в примере 21.
Группам крыс вводили разовую дозу 10 мг/кг AD-60489 или AD-60519. Нормализованные уровни mRNA ALAS1 в различные временные точки в течение исследования показаны на фиг. 51. Временная точка, указанная как 0 часов представлена для исходного, до введения дозы, образца мочи, отобранного непосредственно перед введением mRNA ALAS1. Результаты для следующих временных точке выражены в виде доли от уровня до введения дозы.
Как можно увидеть исходя из результатов, показанных на фиг. 51, AD-60519 представлял повышенную эффективность по сравнению с AD-60489. При этой максимальной величине разовая доза AD60519 обеспечивала подавление до приблизительно 80%, при этом подавление, предоставленное AD60489, составляло приблизительно 60%. Эффект разовой дозы 10 мг/кг этих siRNA ALAS1 в подавлении mRNA ALAS1 длился приблизительно 21 день. Эти результаты показывают валидность анализа cERD мочи для отслеживания уровней mRNA ALAS1.
Пример 36. Фармакологические эффекты AD-60519 у отличных от человека приматов
Дополнительное исследование эффектов конъюгата GalNAc AD-60519 с siRNA ALAS1 проводили у отличных от человека приматов. В исследовании изучали эффект введения доз раз в неделю по сравнению с ведением доз два раза в неделю, использования нагрузочной дозы по сравнению с использованием не нагрузочной дозы, а также кинетику сайленсинга mRNA ALAS1 после разовой дозы. Схема исследования показана в табл. 42 и на фиг. 52.
Таблица 42. Схема фармакологического исследования для исследования с применением AD-60519
№ группы | N | Уровень дозы (мг/кг) | Частота введения дозы | Потреб ность в вещест ве (мг)* | Объем дозы (мл/кг) | Дни введен ня дозы | Конц, дозы (мг/мл) | Путь введен ня дозы |
1 | 3 | 2,5 | Раз в неделю, 8 недель | 210 | 0,125 | 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50 | ||
2 | 3 | 5 | Раз в неделю, 8 недель | 420 | 0,25 | |||
3 | 3 | Нагрузка раз в день, 3 дня, 5 мг/кг, | Нагрузка, 1-3 ДНИ, раз в неделю, | 525 | 0,25/25 | 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29, |
поддерж. - 5 мг/кг | 7 недель | 36, 43, 50 | 20 | SC | ||||
4 | 3 | Нагрузка Раз в день, 3 дня, 5 мг/кг, поддерж. 2,5 мг/кг | Нагрузка, 1-3 дни, раз в неделю, 7 недель | 270 | 0,25/0,125 | |||
5 | 3 | 5 | Раз в две недели, 8 недель | 924 | 0,25 | 1,4, 8, И, 15, 18,22 25, 29, 32, 36, 39, 43, 46, 50, 53 | ||
6 | 3 | 1 | Разовая доза | 12 | 0,05 | 1 | ||
7 | 3 | 10 | Разовая доза | 116 | 0,5 | 1 |
Каждая группа получала одну или несколько подкожных доз AD-60519, как представлено в табл.42. Группа 1 (n=3) получала 2,5 мг/кг в объеме дозы 0,125 мл/кг раз в неделю в течение 8 недель (дозы вводили на 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 2 (n=3) получала 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мг/мл раз в неделю в течение 8 недель (дозы вводили на 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 3 (n=3) получала нагрузочную дозу 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мл/кг раз в день в течение трех дней с последующим поддержанием дозы 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мл/кг раз в неделю в течение 7 недель (дозы вводили на 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 4 (n=3) получала нагрузочную дозу 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мл/кг раз в день в течение трех дней с последующим поддержанием дозы 2,5 мг/кг в объеме дозы 0,125 мл/кг раз в неделю в течение 7 недель (дозы вводили на 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 5 (n=3) получала 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мг/мл два раза в неделю в течение 8 недель (дозы вводили на 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 39, 43, 46, 50 и 53 дни). Группа 6 (n=3) получала разовую дозу 1 мг/кг в объеме дозы 0,05 мл/кг на 1 день. Группа 7 (n=3) получала разовую дозу 10 мг/кг в объеме дозы 0,5
- 158 036477 мл/кг на 1 день.
Образцы сыворотки (приведенные в виде PD заборов на фиг. 52), образцы плазмы (приведенные в виде PK заборов на фиг. 52) и образцы мочи собирали, как указано на фиг. 52 и в табл. 43. Образцы мочи и сыворотки подлежали анализу cERD. Все образцы крови и мочи, собранные в день биопсии печени, собирали до биопсии печени.
Таблица 43. График забора образцов
Сыворотка для определения mRNA | Биопсия печени | Моча для определения mRNA** | Плазма для РК | ||||
Группы 1-4 | -3 день и 5, 10, 17, 24, 31,38, 45, 52, 57, 64, 78,92 дни | Группы 1-5 | 24 день* | Группы 1-5 | -3 день и 24*, 52 Дни | Группа 7 | -3 день и 1 день, через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 часов и 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 15, 22, 29, 36 дни |
Группа 5 | -3 день иЗ, 10, 17, 24, 31,38, 45, 52, 60, 67, 81,95 дни | Г руппы 6-7 | 4 день* | ||||
Группы 6-7 | -3 день и 2, 4, 6, 9, 15, 22, 29,36 дни | Группы 6-7 | -3 день и 4*, 36 дни | ||||
*Все образцы крови и мочи собирали до биопсии печени Забор первой утренней мочи |
Результаты по mRNA ALAS1 в печени показаны на фиг. 53. Значимого подавления mRNA ALAS1 достигали во всех условиях введения. До 75-80% сайленсинга ALAS1 достигали при схемах введения нескольких доз с использованием AD-60519. Через три дня после разовой дозы достигали сайленсинг приблизительно 15% при использовании разовой дозы 1 мг/кг и достигали сайленсинг приблизительно 70% при использовании разовой дозы 10 мг/кг (см. фиг. 53). Сравнение данных из групп 1 и 7 показывает небольшую разницу в кинетике после разовой дозы (в группе 7) по сравнению с введением нескольких доз (группа 1) при одинаковом суммарном количестве (введено 30 мг), как оценено через 3 дня после введения дозы в группе 7 и через два дня после четвертой дозы в группе 1. В частности, более сильный сайленсинг наблюдали после разовой дозы (сайленсинг приблизительно 70% в среднем в группе 7 по сравнению с сайленсингом приблизительно 45% в среднем в группе 1). См. фиг. 54. Такой же результат также наблюдали в исследованиях на крысах.
Результаты по mRNA ALAS1 в сыворотке до 22 дня показаны на фиг. 54 (вверху). Корреляция между mRNA ALAS1 в печени, mRNA ALAS1 в сыворотке и mRNA ALAS1 в плазме показаны на фиг. 55. Данные результаты показывают высокую корреляцию между уровнями mRNA ALAS1 в печени, сыворотке и моче. Результаты также представляют дополнительное доказательство, показывающее высокую активность AD-60519. Сайленсинг на 55-75% наблюдали при всех уровнях дозы во всех схемах введения нескольких доз. Введение нагрузочных доз (раз в день в течение 3 дней, как в группах 3 и 4) приводило к несколько более быстрому снижению mRNA ALAS1. Группы, которые получали дозы раз в неделю (группы 1 и 2) или два раза в неделю (группа 5) в итоге характеризовались сопоставимыми уровнями подавления mRNA ALAS1, указывая на то, что накопление в течение времени обеспечивает длительный нокдаун.
Результаты, показывающие кинетику сайленсинга mRNA ALAS 1 после разовой дозы, представлены на фиг. 54 (внизу). В группе введения 1 мг/кг подавление mRNA ALAS1 приблизительно на 20% наблюдали на 6 день. В группе введения 10 мг/кг отмечали быстрое, приблизительно 70% подавление mRNA ALAS1 на 4 день, при этом восстановление до 20% от исходного уровня наблюдали на 22 день (через 21 день после введения дозы). Уровни mRNA ALAS1 в сыворотке возвращались к исходному уровню приблизительно через 2 или 4 недели после введения разовой дозы 1 или 10 мг/кг соответственно.
Полная динамика mRNA ALAS в сыворотке до 8 недели после введения AD-60519 показана на фиг. 56. Все группы достигали максимальной величины 80% подавления mRNA ALAS1 через 5-8 недель после введения дозы ALN-AS1. Группы введения трех суточных доз на 1 неделе (раз в день, 3 дня) характеризовалась более быстрым наступлением подавления mRNA ALAS1, чем таковые с введением одной дозы на первой неделе (раз в неделю, 8 недель). Все животные возвращались к исходным уровням ALAS1 приблизительно через 30-40 дней после последней дозы.
Пример 37. Получение лекарственного препарата на основе siRNA
ALN-60519 (фиг. 57) представляет собой химически синтезированный двунитевой олигонуклеотид,
- 159 036477 связанный ковалентными связями с лигандом, содержащим три остатка N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Все нуклеотиды являются 2'-OMe- или 2'-Е-модифицированными и соединены посредством 3'5'-фосфодиэфирных связей, образуя, таким образом, сахаро-фосфатный скелет олигонуклеотида. Смысловая нить и антисмысловая нить содержат 21 и 23 нуклеотида соответственно. 3'-конец смысловой нити конъюгирован с фрагментом GalNAc с тремя разветвлениями (называемым в данном документе L96) посредством фосфодиэфирной связи. Антисмысловая нить содержит четыре фосфоротиоатных связи две на 3'-конце и две на 5'-конце. Смысловая нить содержит две фосфоротиоатных связи на 5'-конце. 21 нуклеотид смысловой нити гибридизируется с комплементарным 21 нуклеотидом антисмысловой нити, образуя, таким образом, 21 пару нуклеотидных оснований и выступающий конец из двух оснований на 3'-конце антисмысловой нити. Две одиночные нити, смысловую нить и антисмысловую нить, синтезировали при помощи стандартного твердо-фазного синтеза олигонуклеотидов, используя стандартную химическую структуру фосфорамидита с 5'-гидроксильной группой, защищенной в виде диметокситрифенилметилового (DMT) эфира. Каждую нить собирали от 3'- к 5'-концу последовательным добавлением защищенных нуклеозидных фосфорамидитов.
AD-60519, также обозначаемый в данном документе ALN-60519, помещали в состав в виде раствора для инъекции для подкожного применения, обозначаемый в данном документе ALN-AS1. ALN-60519 растворяли в воде для инъекции (WFI) и корректировали рН (целевой 7,0). Определяли концентрацию ALN-60519 и корректировали ее добавлением WFI. Раствор с конечной концентрацией приблизительно 200 мг/мл затем стерилизовали посредством фильтрации и наполняли в 2 мл стеклянные ампулы типа I. Выбирали объем наполнения примерно 0,55 мл для обеспечения полного изъятия 0,5 мл лекарственного препарата.
Пример 38. Измерение уровней mRNA ALAS1 в сыворотке или моче пациентов с AIP или здоровых добровольцев при помощи способа cERD
Исследования фармакологии на отличных от человека приматах с использованием ALN-AS1 указывало на то, что способ определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) для измерения mRNA ALAS1 в сыворотке или моче был надежным и воспроизводимым. Анализ cERD также использовали для измерения уровней mRNA ALAS1 в сыворотке и моче от пациентов с AIP и здоровых добровольцев. Уровни mRNA ALAS1, как правило, были повышенными у пациентов с AIP относительно здоровых добровольцев, что согласуется с ролью индукции ALAS1, которую она играет в патофизиологии заболевания (фиг. 58). Важно, что уровни ALAS1 в сыворотке и моче у одного и того же пациента коррелировали друг с другом. У двух пациентов, которые имели повторные заборы мочи и сыворотки, уровень mRNA ALAS1 был стабильным в течение времени. Образно говоря, эти данные указывают на то, что mRNA ALAS1 можно измерять в образцах сыворотки и мочи от субъектов, в том числе пациентов с AIP, a способ cERD является применимым для отслеживания фармакодинамической активности ALN-AS1.
Пример 39. Иллюстративные клинические исследования
Можно провести исследование на человеке для определения безопасности и переносимости ALNAS1 при введении в виде разовой дозы и нескольких доз пациентам с AIP, которые являются бессимптомными выраженными экскреторам (ASHE) (пациентам, которые имеют повышенные уровни ALA и/или PBG, как описано в данном документе) или пациентам с AIP, которые имеют рецидивирующие приступы.
Вторичные цели включают характеристику PK в плазме и моче для ALN-AS1, а также оценку влияния ALN-AS1 после введения дозы на уровни ALA и PBG как в плазме, так и в моче. Анализ cERD, при помощи которого измеряют mRNA в экзосомах, использовали для измерения 5-аминолевулинатсинтазы (mRNA ALAS-1) в сыворотке (или плазме) и моче.
Бессимптомным выраженным экскреторам ALN-AS1 вводят в разовых дозах, например, по 0,1, 0,35 1,0 или 2,5 мг/кг, или повторных дозах раз в неделю, например, по 1 и 2,5 мг/кг, в течение нескольких недель (например, в течение 4 недель). В качестве сравнения вводят контрольный лекарственный препарат (например, плацебо). Оценивают безопасность, фармакокинетику и эффекты лекарственного средства на уровни ALA и PBG. Дозу ALN-AS1, которая снижает ALA и PBG до нормального референтного диапазона (например, дозу, которая нормализует уровни ALA и/или PBG до уровней ниже 2 верхних референтных величин) можно выбрать для последующих исследований, например, у пациентов с AIP.
У пациентов с AIP частоту приступов и исходные симптомы оценивают во время вводного периода без введения доз (например, в 12 недель). Пациентам вводили ALN-AS1, например, в дозе 1-2,5 мг/кг раз в неделю. Оценивали безопасность, фармакокинетику и эффекты лекарственного средства на уровни ALA и PBG. Кроме того, отслеживали изменения числа приступов, применения гема, применения обезболивающего средства и госпитализации.
Эквиваленты
Специалисты в данной области распознают или будут способны определить, используя лишь стандартный экспериментальный подход, многие эквиваленты к конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения, описанным в данном документе. Предполагается, что такие эквиваленты охвачены следующей формулой изобретения.
Claims (61)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии синтазы 5'аминолевулиновой кислоты печени 1 (ALAS1), где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, которая включает участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1 (например, SEQ ID NO:1) и содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154).
- 2. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, которая включает участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1 (например, SEQ ID NO:1) и содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из (i) антисмысловой последовательности, приведенной в любой из табл. 21-40, или (ii) немодифицированного варианта антисмысловой последовательности, приведенной в любой из табл. 2140 (SEQ ID NO: 4172-5237).
- 3. DsRNA по п.2, где упомянутая dsRNA содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
- 4. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где дуплексный участок составляет 17-23 пары нук леотидов в длину.
- 5. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере одна нить содержит 3'выступающий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов.
- 6. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где каждая нить составляет не более 26 нуклеотидов в длину.
- 7. DsRNA по п.3, где по меньшей мере один модифицированный нуклеотид выбран из 2'-O-метила, 2'-фтор-модифицированного нуклеотида и необязательно одной или нескольких 5'-фосфотиоатных групп или любой их комбинации.
- 8. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая лиганд, при этом лиганд конъюгирован либо с 3'-концом, либо с 5'-концом смысловой нити dsRNA.
- 9. DsRNA по п.8, где лиганд содержит углевод, при этом лиганд необязательно представляет собой лиганд GalNAc.
- 10. DsRNA по п.9, где лиганд представляет собой
- 11. DsRNA по любому из пп.8-10, где лиганд присоединен с помощью двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
- 12. DsRNA по п.11, где лиганд и линкер показаны в формуле XXIV
- 13. DsRNA по п.8, где dsRNA конъюгирована с лигандом L96 с помощью линкера, как показано ниже
- 14. DsRNA по любому из пп.8-13, где лиганд нацеливает dsRNA в гепатоциты.
- 15. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA содержит смысловую нить, состоящую из последовательности, выбранной из последовательностей, приведенных в табл. 21-40, и антисмысловой нити, состоящей из последовательности, выбранной из последовательностей, приведенных в табл. 21-40.- 161 036477
- 16. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 1 нМ, менее 0,05 нМ, менее 0,02 нМ или менее 0,01 нМ.
- 17. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA характеризуется разовой дозой ED50, составляющей менее приблизительно 10 мг/кг или менее приблизительно 5 мг/кг.
- 18. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где смысловая нить содержит последовательность CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155) или состоит из нее.
- 19. DsRNA no п.1 или 2, где:(i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60519, где антисмысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;(ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, где антисмысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;(iii) смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60519, где смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;(iv) смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60519, где смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;(v) смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60519, а антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60519, где смысловая и антисмысловая последовательности содержат все модифицированные нуклеотиды из AD-60519, или (vi) смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60519, а антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, где смысловая и антисмысловая последовательности содержат все модифицированные нуклеотиды из AD-60519.
- 20. DsRNA по п.1 или 2, где:(i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60489 и/или смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60489, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60489, или (ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60489 и/или смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60489, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60489.
- 21. DsRNA по п.1 или 2, где:(i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-61193 и/или смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-61193, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-61193, или (ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-61193 и/или смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-61193, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-61193.
- 22. DsRNA по п.2, где:(i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60819 и/или смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60819, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60819, или (ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60819 и/или смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60819, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60819.
- 23. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, причем антисмысловая нить включает участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, причем указанная dsRNA находится в форме конъюгата, имеющего следующую структуру:$ S О О- О О- О- 0- 0 0 О- О О- О 0 0- О О О 0 0’ смысловая 5' НО'',Р', Кр' ,/,/ ,р%рJ'',./,/ ,/ ,Р—LS63'-ть 3 U О Γό Й &ί> ύ ό'δ 0 0 й'ГйCm Am Gm Am Am Am if Am Gf Um Gf Um Cf Um Cf Am Um Cm Um Um Am (SEQ ID NO: 32-40Г)Um Gm Gm Uf Cm Uf Um Uf Cm Uf Cm Af Cm Af Gm Af Gm Uf Am Gf Af Af Um (SEQ ID NO: j241i антисмысловая 0 0 нить j·5’ S’00000000000000000000 ι .. II . ii . ι,. ι . 11,. ii , ii . ι. , \ . :ι , n , n , ιι , и,. :i,. Il , II . I, 1,.,,P\.PZP xp / ΖΛΛ? /Z// ζρ· ,.Ρ ,.Ρ ,Ρ ,Ρ\.ΟΗ 5' ό· ό· ό· ό· ό· ό· ο· ο· 6· ό· σ ο· ό· ό- ό- ό· ό· ό· s- sили его фармацевтически приемлемой соли, где Af, Cf, Gf, Uf = 2'F рибонуклеозиды;Am, Cm, Gm, Um = 2'- OMe рибонуклеозиды;s = фосфоротиоат;оII „ 'IO’ = фосфодиэфир и где- 162 036477
- 24. Клетка, содержащая dsRNA по любому из пп.1-23.
- 25. Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, при этом композиция содержит dsRNA по любому из пп.1-23.
- 26. Фармацевтическая композиция по п.25, где dsRNA вводится в безбуферном солевом или водном растворе.
- 27. Фармацевтическая композиция по п.25 или 26, где упомянутая композиция является пригодной для подкожного введения.
- 28. Способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, при этом способ включает:(a) введение в клетку dsRNA по любому из пп.1-22 и (b) поддержание клетки, полученной на стадии (а), в течение времени, достаточного для обеспечения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS1, с ингибированием тем самым экспрессии гена ALAS1 в клетке, при этом экспрессия ALAS1 необязательно ингибируется по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 30%.
- 29. Способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке (например, гепатоците), включающий приведение клетки в контакт с dsRNA по любому из пп.1-22 в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке.
- 30. Способ лечения порфирии, при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества:(i) dsRNA по любому из пп.1-22 или (ii) композиции по любому из пп.25-27, с осуществлением тем самым лечения порфирии.
- 31. Способ по п.30, где субъектом является субъект с риском развития порфирии или с диагностированной порфирией.
- 32. Способ по п.30 или 31, где порфирия представляет собой острую перемежающуюся порфирию или порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы.
- 33. Способ по любому из пп.30-32, где:(i) dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят после острого приступа порфирии, (ii) dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят во время острого приступа порфирии или (iii) dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят профилактически для предупреждения острого приступа порфирии.
- 34. Способ по любому из пп.30-33, где dsRNA вводят в дозе 0,05-50 мг/кг веса тела субъекта, например в дозе 0,01-5 мг/кг веса тела субъекта.
- 35. Способ по любому из пп.30-34, где с помощью способа:(i) снижают уровень порфирина или предшественника порфирина (например, 5-аминолевулиновой кислоты (ALA) или порфобилиногена (PBG)) у субъекта, при этом необязательно уровень снижают по меньшей мере на 30%, и/или (ii) ингибируют экспрессию ALAS 1 у субъекта.
- 36. Способ по любому из пп.30-35, где с помощью упомянутого способа:(i) облегчают симптом, ассоциированный с нарушением, связанным с ALAS1 (например, порфирией), (ii) снижают частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта и/или (iii) снижают вероятность возникновения острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта в случае, когда субъект подвержен воздействию провоцирующего фактора, например предменструальной фазы.
- 37. Способ по любому из пп.30-36, где dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят согласно схеме дозирования, например еженедельно, один раз в две недели или ежемесячно.
- 38. Способ по любому из пп.30-37, где dsRNA вводят до острого приступа порфирии, например во время продрома.
- 39. Способ по любому из пп.30-38, где субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в плазме или моче) ALA и/или PBG и при этом необязательно субъект испытывает хроническую боль.
- 40. Способ по любому из пп.30-39, где с помощью способа снижают повышенный уровень ALA и/или PBG.
- 41. Способ по любому из пп.30-40, где с помощью способа снижают или предупреждают боль, нейропатию и/или повреждение нервов.- 163 036477
- 42. Способ по любому из пп.30-41, где с помощью способа предупреждают острые приступы порфирии.
- 43. Способ по любому из пп.30-42, где dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят систематически.
- 44. Способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества:(i) dsRNA по любому из пп.1-22 или (ii) композиции по любому из пп.26-28, при этом необязательно способ является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG.
- 45. Способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение dsRNA по любому из пп.1-23 по 1, 2,5 или 5 мг/кг один раз в неделю в течение по меньшей мере десяти недель со снижением тем самым уровня ALA и/или PBG у упомянутого субъекта.
- 46. Способ лечения пациента-человека с AIP, который испытывал несколько рецидивирующих приступов, при этом способ включает введение dsRNA по любому из пп.1-22 в дозе 2,5 мг/кг в течение по меньшей мере 6 месяцев с осуществлением тем самым лечения упомянутого пациента, при этом необязательно с помощью упомянутого способа:(i) снижают частоту приступов, (ii) сокращают применение гематина, (iii) снижают риск госпитализации и/или (iv) повышают качество жизни.
- 47. Способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает выявление (например, измерение) уровня mRNA ALAS1 в образце биологической жидкости (например, образце крови, образце плазмы, образце сыворотки или образце мочи) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1, с осуществлением тем самым анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
- 48. Способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает:(i) получение РНК (например, внеклеточной РНК) из образца биологической жидкости (например, образца крови, образца плазмы, образца сыворотки или образца мочи) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1;(ii) получение cDNA ALAS1 с mRNA ALAS1;(iii) приведение в контакт cDNA ALAS1 с нуклеиновой кислотой, комплементарной (например, зондом и/или праймером) cDNA ALAS1 или ее части, с получением тем самым реакционной смеси, и (iv) выявление (например, измерение) уровня cDNA ALAS1 в реакционной смеси, где уровень cDNA ALAS1 указывает на уровень mRNA ALAS1, с осуществлением тем самым анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
- 49. Способ по п.48, причем:(a) способ включает PCR, qPCR или 5'-RACE, (b) нуклеиновая кислота представляет собой зонд или праймер и/или (c) нуклеиновая кислота содержит выявляемый фрагмент, а уровень mRNA ALAS1 определяют посредством выявления количества выявляемого фрагмента.
- 50. Способ по п.49, где эффективность лечения порфирии оценивают на основании сравнения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта с нормальным значением.
- 51. Способ по п.49, где снижение уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта в ответ на лечение порфирии относительно нормального значения указывает на то, что лечение порфирии является эффективным.
- 52. Способ по любому из пп.49-51, дополнительно включающий получение образца биологической жидкости от субъекта.
- 53. Способ по п.52, в котором образец биологической жидкости является отделенным от ткани и при этом образец биологической жидкости содержит экзосомы.
- 54. Композиция, содержащая dsRNA по п.19 и воду для инъекции.
- 55. Композиция по п.54, содержащая приблизительно 200 мг/мл dsRNA по п.20.
- 56. Композиция по п.54 или 55, где композиция характеризуется значением рН 6,0-7,5.
- 57. Композиция по любому из пп.54-56, где композиция составлена для подкожной инъекции.
- 58. Способ лечения субъекта с порфирией (например, AIP) или повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает подкожное введение субъекту композиции по любому из пп.53-56.
- 59. Способ по п.58, где композицию вводят в дозе 0-5 мг/кг, например в дозе 2,5 мг/кг или менее или в дозе 1-2,5 мг/кг.
- 60. Способ по п.59, где композицию вводят еженедельно.
- 61. DsRNA по п.1 или 2 или фармацевтическая композиция по п.25 для применения в лечении порфирии у пациента, причем порфирия необязательно представляет собой печеночную порфирию или ост-- 164 036477 рую перемежающуюся порфирию (AIP), причем порфирия необязательно представляет собой острую печеночную порфирию.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361887288P | 2013-10-04 | 2013-10-04 | |
US201461983720P | 2014-04-24 | 2014-04-24 | |
PCT/US2014/059160 WO2015051318A1 (en) | 2013-10-04 | 2014-10-03 | Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA201690685A1 EA201690685A1 (ru) | 2016-07-29 |
EA036477B1 true EA036477B1 (ru) | 2020-11-16 |
Family
ID=51932569
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA201690685A EA036477B1 (ru) | 2013-10-04 | 2014-10-03 | Композиции и способы ингибирования экспрессии гена alas1 |
Country Status (36)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10119143B2 (ru) |
EP (2) | EP3052628B1 (ru) |
JP (3) | JP6613227B2 (ru) |
KR (3) | KR102307389B1 (ru) |
CN (1) | CN105980559B (ru) |
AU (3) | AU2014331604B2 (ru) |
BR (2) | BR112016007226B1 (ru) |
CA (2) | CA3227061A1 (ru) |
CL (2) | CL2016000772A1 (ru) |
CR (1) | CR20160195A (ru) |
CY (2) | CY1122975T1 (ru) |
DK (1) | DK3052628T3 (ru) |
DO (2) | DOP2016000073A (ru) |
EA (1) | EA036477B1 (ru) |
ES (1) | ES2804510T3 (ru) |
GT (1) | GT201600066A (ru) |
HK (1) | HK1221738A1 (ru) |
HR (1) | HRP20200822T1 (ru) |
HU (2) | HUE049227T2 (ru) |
IL (3) | IL282747B2 (ru) |
LT (2) | LT3052628T (ru) |
MX (2) | MX2016004319A (ru) |
MY (2) | MY183490A (ru) |
NL (1) | NL301061I2 (ru) |
NZ (2) | NZ757749A (ru) |
PE (2) | PE20161130A1 (ru) |
PH (1) | PH12016500574A1 (ru) |
PL (1) | PL3052628T3 (ru) |
PT (1) | PT3052628T (ru) |
SG (2) | SG11201602631XA (ru) |
SI (1) | SI3052628T1 (ru) |
TN (1) | TN2016000114A1 (ru) |
TW (3) | TW202310853A (ru) |
UA (1) | UA124961C2 (ru) |
WO (1) | WO2015051318A1 (ru) |
ZA (2) | ZA201602931B (ru) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9133461B2 (en) | 2012-04-10 | 2015-09-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene |
NZ757749A (en) | 2013-10-04 | 2022-07-01 | Icahn School Med Mount Sinai | Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene |
NZ730296A (en) | 2014-08-20 | 2023-09-29 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Modified double-stranded rna agents |
WO2016061487A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Polynucleotide agents targeting aminolevulinic acid synthase-1 (alas1) and uses thereof |
WO2017048843A1 (en) | 2015-09-14 | 2017-03-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene |
US20200368268A1 (en) | 2018-01-08 | 2020-11-26 | Novartis Ag | Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy |
KR20220144837A (ko) * | 2020-02-21 | 2022-10-27 | 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 | Htt 발현을 감소시키기 위한 방법 |
WO2023060064A1 (en) | 2021-10-06 | 2023-04-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Renal injury biomarkers as biomarkers for acute hepatic porphyria (ahp) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2213738A2 (en) * | 2002-11-14 | 2010-08-04 | Dharmacon, Inc. | siRNA molecules targeting Bcl-2 |
WO2013155204A2 (en) * | 2012-04-10 | 2013-10-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene |
Family Cites Families (243)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US513030A (en) | 1894-01-16 | Machine for waxing or coating paper | ||
US564562A (en) | 1896-07-21 | Joseph p | ||
US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US4426330A (en) | 1981-07-20 | 1984-01-17 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US4534899A (en) | 1981-07-20 | 1985-08-13 | Lipid Specialties, Inc. | Synthetic phospholipid compounds |
US5023243A (en) | 1981-10-23 | 1991-06-11 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same |
US4476301A (en) | 1982-04-29 | 1984-10-09 | Centre National De La Recherche Scientifique | Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon |
JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
FR2540122B1 (fr) | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
US4824941A (en) | 1983-03-10 | 1989-04-25 | Julian Gordon | Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems |
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
US5118802A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside |
US5118800A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide |
US5550111A (en) | 1984-07-11 | 1996-08-27 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof |
FR2567892B1 (fr) | 1984-07-19 | 1989-02-17 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons |
US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
US5258506A (en) | 1984-10-16 | 1993-11-02 | Chiron Corporation | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains |
US5367066A (en) | 1984-10-16 | 1994-11-22 | Chiron Corporation | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites |
US4828979A (en) | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
FR2575751B1 (fr) | 1985-01-08 | 1987-04-03 | Pasteur Institut | Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US5235033A (en) | 1985-03-15 | 1993-08-10 | Anti-Gene Development Group | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5405938A (en) | 1989-12-20 | 1995-04-11 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US4762779A (en) | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
US5317098A (en) | 1986-03-17 | 1994-05-31 | Hiroaki Shizuya | Non-radioisotope tagging of fragments |
JPS638396A (ja) | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体 |
US4920016A (en) | 1986-12-24 | 1990-04-24 | Linear Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5276019A (en) | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US4904582A (en) | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
CA1340032C (en) | 1987-06-24 | 1998-09-08 | Jim Haralambidis | Lucleoside derivatives |
US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US5188897A (en) | 1987-10-22 | 1993-02-23 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates |
US4924624A (en) | 1987-10-22 | 1990-05-15 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof |
US5525465A (en) | 1987-10-28 | 1996-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same |
DE3738460A1 (de) | 1987-11-12 | 1989-05-24 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierte oligonukleotide |
US5082830A (en) | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
EP0406309A4 (en) | 1988-03-25 | 1992-08-19 | The University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates |
US5278302A (en) | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5109124A (en) | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
US5175273A (en) | 1988-07-01 | 1992-12-29 | Genentech, Inc. | Nucleic acid intercalating agents |
US5262536A (en) | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
GB8824593D0 (en) | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Liposomes |
US5512439A (en) | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
US5599923A (en) | 1989-03-06 | 1997-02-04 | Board Of Regents, University Of Tx | Texaphyrin metal complexes having improved functionalization |
US5457183A (en) | 1989-03-06 | 1995-10-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydroxylated texaphyrins |
US5391723A (en) | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US4958013A (en) | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
US5032401A (en) | 1989-06-15 | 1991-07-16 | Alpha Beta Technology | Glucan drug delivery system and adjuvant |
US5451463A (en) | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
US5134066A (en) | 1989-08-29 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs |
US5436146A (en) | 1989-09-07 | 1995-07-25 | The Trustees Of Princeton University | Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors |
US5254469A (en) | 1989-09-12 | 1993-10-19 | Eastman Kodak Company | Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures |
US5591722A (en) | 1989-09-15 | 1997-01-07 | Southern Research Institute | 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity |
US5013556A (en) | 1989-10-20 | 1991-05-07 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5225212A (en) | 1989-10-20 | 1993-07-06 | Liposome Technology, Inc. | Microreservoir liposome composition and method |
US5356633A (en) | 1989-10-20 | 1994-10-18 | Liposome Technology, Inc. | Method of treatment of inflamed tissues |
US5399676A (en) | 1989-10-23 | 1995-03-21 | Gilead Sciences | Oligonucleotides with inverted polarity |
DK0942000T3 (da) | 1989-10-24 | 2004-11-01 | Isis Pharmaceuticals Inc | 2'-modificerede oligonukleotider |
US5264564A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5292873A (en) | 1989-11-29 | 1994-03-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe |
US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
CA2029273A1 (en) | 1989-12-04 | 1991-06-05 | Christine L. Brakel | Modified nucleotide compounds |
US5486603A (en) | 1990-01-08 | 1996-01-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide having enhanced binding affinity |
US5670633A (en) | 1990-01-11 | 1997-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5587361A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5646265A (en) | 1990-01-11 | 1997-07-08 | Isis Pharmceuticals, Inc. | Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites |
US7037646B1 (en) | 1990-01-11 | 2006-05-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
US5681941A (en) | 1990-01-11 | 1997-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
US5587470A (en) | 1990-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US5852188A (en) | 1990-01-11 | 1998-12-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages |
US5578718A (en) | 1990-01-11 | 1996-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized nucleosides |
US6783931B1 (en) | 1990-01-11 | 2004-08-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
US5459255A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
US5214136A (en) | 1990-02-20 | 1993-05-25 | Gilead Sciences, Inc. | Anthraquinone-derivatives oligonucleotides |
WO1991013080A1 (en) | 1990-02-20 | 1991-09-05 | Gilead Sciences, Inc. | Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers |
US5321131A (en) | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
US5470967A (en) | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
US5665710A (en) | 1990-04-30 | 1997-09-09 | Georgetown University | Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions |
GB9009980D0 (en) | 1990-05-03 | 1990-06-27 | Amersham Int Plc | Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides |
ES2116977T3 (es) | 1990-05-11 | 1998-08-01 | Microprobe Corp | Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente. |
US5981276A (en) | 1990-06-20 | 1999-11-09 | Dana-Farber Cancer Institute | Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof |
CA2088258C (en) | 1990-07-27 | 2004-09-14 | Phillip Dan Cook | Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5489677A (en) | 1990-07-27 | 1996-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5541307A (en) | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
US5618704A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-08 | Isis Pharmacueticals, Inc. | Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling |
US5677437A (en) | 1990-07-27 | 1997-10-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5623070A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
US5688941A (en) | 1990-07-27 | 1997-11-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds |
US5610289A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogues |
US5218105A (en) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
WO1992002534A2 (en) | 1990-08-03 | 1992-02-20 | Sterling Drug, Inc. | Compounds and methods for inhibiting gene expression |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
US5214134A (en) | 1990-09-12 | 1993-05-25 | Sterling Winthrop Inc. | Process of linking nucleosides with a siloxane bridge |
US5561225A (en) | 1990-09-19 | 1996-10-01 | Southern Research Institute | Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages |
CA2092002A1 (en) | 1990-09-20 | 1992-03-21 | Mark Matteucci | Modified internucleoside linkages |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
DE69132510T2 (de) | 1990-11-08 | 2001-05-03 | Hybridon, Inc. | Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden |
GB9100304D0 (en) | 1991-01-08 | 1991-02-20 | Ici Plc | Compound |
US7015315B1 (en) | 1991-12-24 | 2006-03-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligonucleotides |
JP3220180B2 (ja) | 1991-05-23 | 2001-10-22 | 三菱化学株式会社 | 薬剤含有タンパク質結合リポソーム |
US5719262A (en) | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5371241A (en) | 1991-07-19 | 1994-12-06 | Pharmacia P-L Biochemicals Inc. | Fluorescein labelled phosphoramidites |
US5571799A (en) | 1991-08-12 | 1996-11-05 | Basco, Ltd. | (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response |
EP0538194B1 (de) | 1991-10-17 | 1997-06-04 | Novartis AG | Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte |
US5594121A (en) | 1991-11-07 | 1997-01-14 | Gilead Sciences, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
US5484908A (en) | 1991-11-26 | 1996-01-16 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines |
US6235887B1 (en) | 1991-11-26 | 2001-05-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines |
US5359044A (en) | 1991-12-13 | 1994-10-25 | Isis Pharmaceuticals | Cyclobutyl oligonucleotide surrogates |
US6277603B1 (en) | 1991-12-24 | 2001-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
ATE515510T1 (de) | 1991-12-24 | 2011-07-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | Durch dna-abschnitte unterbrochene modifizierte oligonukleotide |
US5595726A (en) | 1992-01-21 | 1997-01-21 | Pharmacyclics, Inc. | Chromophore probe for detection of nucleic acid |
US5565552A (en) | 1992-01-21 | 1996-10-15 | Pharmacyclics, Inc. | Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis |
FR2687679B1 (fr) | 1992-02-05 | 1994-10-28 | Centre Nat Rech Scient | Oligothionucleotides. |
DE4203923A1 (de) | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Henkel Kgaa | Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis |
US5633360A (en) | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
US5434257A (en) | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
EP0577558A2 (de) | 1992-07-01 | 1994-01-05 | Ciba-Geigy Ag | Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte |
US5272250A (en) | 1992-07-10 | 1993-12-21 | Spielvogel Bernard F | Boronated phosphoramidate compounds |
JPH07509133A (ja) | 1992-07-17 | 1995-10-12 | リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 動物疾患の処置のための方法および剤 |
US6346614B1 (en) | 1992-07-23 | 2002-02-12 | Hybridon, Inc. | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
CA2145641C (en) | 1992-12-03 | 2008-05-27 | Richard J. Gregory | Pseudo-adenovirus vectors |
US5478745A (en) | 1992-12-04 | 1995-12-26 | University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
JP3351476B2 (ja) | 1993-01-22 | 2002-11-25 | 三菱化学株式会社 | リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム |
US5476925A (en) | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
US6020317A (en) | 1993-02-19 | 2000-02-01 | Nippon Shinyaku Co. Ltd. | Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition |
US5395619A (en) | 1993-03-03 | 1995-03-07 | Liposome Technology, Inc. | Lipid-polymer conjugates and liposomes |
GB9304618D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Chemical compounds |
WO1994022864A1 (en) | 1993-03-30 | 1994-10-13 | Sterling Winthrop Inc. | Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them |
WO1994022891A1 (en) | 1993-03-31 | 1994-10-13 | Sterling Winthrop Inc. | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
DE4311944A1 (de) | 1993-04-10 | 1994-10-13 | Degussa | Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen |
US6191105B1 (en) | 1993-05-10 | 2001-02-20 | Protein Delivery, Inc. | Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin |
US5955591A (en) | 1993-05-12 | 1999-09-21 | Imbach; Jean-Louis | Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation |
US6015886A (en) | 1993-05-24 | 2000-01-18 | Chemgenes Corporation | Oligonucleotide phosphate esters |
US6294664B1 (en) | 1993-07-29 | 2001-09-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Synthesis of oligonucleotides |
US5502177A (en) | 1993-09-17 | 1996-03-26 | Gilead Sciences, Inc. | Pyrimidine derivatives for labeled binding partners |
IL111659A0 (en) | 1993-11-16 | 1995-01-24 | Genta Inc | Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages |
US5540935A (en) | 1993-12-06 | 1996-07-30 | Nof Corporation | Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle |
US5457187A (en) | 1993-12-08 | 1995-10-10 | Board Of Regents University Of Nebraska | Oligonucleotides containing 5-fluorouracil |
US5446137B1 (en) | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
US5519134A (en) | 1994-01-11 | 1996-05-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Pyrrolidine-containing monomers and oligomers |
US5599922A (en) | 1994-03-18 | 1997-02-04 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties |
US5596091A (en) | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
US5627053A (en) | 1994-03-29 | 1997-05-06 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid |
US5625050A (en) | 1994-03-31 | 1997-04-29 | Amgen Inc. | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics |
US6054299A (en) | 1994-04-29 | 2000-04-25 | Conrad; Charles A. | Stem-loop cloning vector and method |
WO2000022114A1 (en) | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Ingene, Inc. | PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO) |
US5525711A (en) | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
US5543152A (en) | 1994-06-20 | 1996-08-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US5597696A (en) | 1994-07-18 | 1997-01-28 | Becton Dickinson And Company | Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates |
US5597909A (en) | 1994-08-25 | 1997-01-28 | Chiron Corporation | Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use |
US5580731A (en) | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
US5820873A (en) | 1994-09-30 | 1998-10-13 | The University Of British Columbia | Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof |
US6608035B1 (en) | 1994-10-25 | 2003-08-19 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
US5665557A (en) | 1994-11-14 | 1997-09-09 | Systemix, Inc. | Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof |
JP3269301B2 (ja) | 1994-12-28 | 2002-03-25 | 豊田合成株式会社 | ガラスラン用ゴム配合物 |
US6166197A (en) | 1995-03-06 | 2000-12-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions |
AU5359496A (en) | 1995-03-06 | 1996-09-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom |
IL122290A0 (en) | 1995-06-07 | 1998-04-05 | Inex Pharmaceuticals Corp | Lipid-nucleic acid complex its preparation and use |
US7422902B1 (en) | 1995-06-07 | 2008-09-09 | The University Of British Columbia | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US5981501A (en) | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
US5756122A (en) | 1995-06-07 | 1998-05-26 | Georgetown University | Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells |
BR9609944A (pt) | 1995-08-01 | 1999-05-18 | Novartis Ag | Composições de oligonucleotídeo lipossomal |
US5858397A (en) | 1995-10-11 | 1999-01-12 | University Of British Columbia | Liposomal formulations of mitoxantrone |
EP0857217B1 (en) | 1995-10-16 | 2005-04-13 | Dana-Farber Cancer Institute | Novel expression vectors and methods of use |
US6160109A (en) | 1995-10-20 | 2000-12-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers |
US5858401A (en) | 1996-01-22 | 1999-01-12 | Sidmak Laboratories, Inc. | Pharmaceutical composition for cyclosporines |
US5994316A (en) | 1996-02-21 | 1999-11-30 | The Immune Response Corporation | Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells |
US6444423B1 (en) | 1996-06-07 | 2002-09-03 | Molecular Dynamics, Inc. | Nucleosides comprising polydentate ligands |
US6172209B1 (en) | 1997-02-14 | 2001-01-09 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same |
US6576752B1 (en) | 1997-02-14 | 2003-06-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Aminooxy functionalized oligomers |
US6639062B2 (en) | 1997-02-14 | 2003-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom |
JP3756313B2 (ja) | 1997-03-07 | 2006-03-15 | 武 今西 | 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体 |
JP2002510319A (ja) | 1997-07-01 | 2002-04-02 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法 |
US6794499B2 (en) | 1997-09-12 | 2004-09-21 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
KR100414936B1 (ko) | 1997-09-12 | 2004-01-13 | 엑시콘 에이/에스 | 이환 및 삼환 뉴클레오시드, 뉴클레오타이드 및올리고뉴클레오타이드 동족체 |
US6617438B1 (en) | 1997-11-05 | 2003-09-09 | Sirna Therapeutics, Inc. | Oligoribonucleotides with enzymatic activity |
US6528640B1 (en) | 1997-11-05 | 2003-03-04 | Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated | Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity |
US6320017B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-11-20 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Polyamide oligomers |
US7273933B1 (en) | 1998-02-26 | 2007-09-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for synthesis of oligonucleotides |
US7045610B2 (en) | 1998-04-03 | 2006-05-16 | Epoch Biosciences, Inc. | Modified oligonucleotides for mismatch discrimination |
US6531590B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds |
US6867294B1 (en) | 1998-07-14 | 2005-03-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages |
JP2002520038A (ja) | 1998-07-20 | 2002-07-09 | アイネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション | リポソームカプセル化核酸複合体 |
US6537777B1 (en) | 1998-07-27 | 2003-03-25 | Hemebiotech A/S | Human porphobilinogen deaminase sequences |
BR9914772A (pt) | 1998-10-09 | 2001-12-11 | Ingene Inc | Conjunto de elementos genéticos, vetor, célulahospedeira, conjunto para a produção de umasequência de ácido nucléico, método para aprodução in vivo ou in vitro de uma sequência deácido nucléico, transcrição de cdna, molécula deácido nucléico inibidor, transcrição de mrna,molécula heteroduplex e composiçãofarmacêutica |
US6465628B1 (en) | 1999-02-04 | 2002-10-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Process for the synthesis of oligomeric compounds |
AU3243300A (en) | 1999-02-23 | 2000-09-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Multiparticulate formulation |
US7084125B2 (en) | 1999-03-18 | 2006-08-01 | Exiqon A/S | Xylo-LNA analogues |
ATE356824T1 (de) | 1999-05-04 | 2007-04-15 | Santaris Pharma As | L-ribo-lna analoge |
US6593466B1 (en) | 1999-07-07 | 2003-07-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof |
US6147200A (en) | 1999-08-19 | 2000-11-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers |
US7321029B2 (en) | 2000-01-21 | 2008-01-22 | Geron Corporation | 2′-arabino-fluorooligonucleotide N3′→P5′ phosphoramidates: their synthesis and use |
IT1318539B1 (it) | 2000-05-26 | 2003-08-27 | Italfarmaco Spa | Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente |
US6998484B2 (en) | 2000-10-04 | 2006-02-14 | Santaris Pharma A/S | Synthesis of purine locked nucleic acid analogues |
US7063860B2 (en) | 2001-08-13 | 2006-06-20 | University Of Pittsburgh | Application of lipid vehicles and use for drug delivery |
ES2550609T3 (es) | 2002-07-10 | 2015-11-11 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Interferencia de ARN mediante de moléculas de ARN de cadena sencilla |
US6878805B2 (en) | 2002-08-16 | 2005-04-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide-conjugated oligomeric compounds |
US8092992B2 (en) | 2003-05-29 | 2012-01-10 | Salk Institute For Biological Studies | Transcriptional regulation of gene expression by small double-stranded modulatory RNA |
JP5183064B2 (ja) | 2003-07-02 | 2013-04-17 | エムユーエスシー ファウンデイション フォー リサーチ デべロップメント | 甲殻類動物、及び他の無脊椎動物における、dsRNAで誘導された特異的、及び非特異的免疫、及びそこで使用する生物送達媒体 |
AU2004257373B2 (en) | 2003-07-16 | 2011-03-24 | Arbutus Biopharma Corporation | Lipid encapsulated interfering RNA |
US7683036B2 (en) | 2003-07-31 | 2010-03-23 | Regulus Therapeutics Inc. | Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs |
ES2382807T3 (es) | 2003-08-28 | 2012-06-13 | Takeshi Imanishi | Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación |
JPWO2005116204A1 (ja) | 2004-05-11 | 2008-06-19 | 株式会社アルファジェン | Rna干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法 |
US7740861B2 (en) | 2004-06-16 | 2010-06-22 | University Of Massachusetts | Drug delivery product and methods |
DK1866414T3 (da) | 2005-03-31 | 2012-04-23 | Calando Pharmaceuticals Inc | Inhibitorer af ribonukleotidreduktase-underenhed 2 og anvendelser deraf. |
US8101741B2 (en) | 2005-11-02 | 2012-01-24 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
AU2006336624B2 (en) | 2005-11-17 | 2010-11-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA |
CN102908630B (zh) | 2006-01-27 | 2014-11-19 | Isis制药公司 | 6-修饰的双环核酸类似物 |
TWI322690B (en) | 2006-05-11 | 2010-04-01 | Flysun Dev Co Ltd | Short interference ribonucleic acids for treating allergic dieases |
EP2520935A3 (en) | 2006-08-09 | 2013-02-13 | Homestead Clinical Corporation | Organ-specific proteins and methods of their use |
CA2927045A1 (en) | 2006-10-03 | 2008-04-10 | Muthiah Manoharan | Lipid containing formulations |
EP2121923A1 (en) | 2007-03-02 | 2009-11-25 | MDRNA, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof |
EP2162538B1 (en) | 2007-05-22 | 2016-04-20 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Oligomers for therapeutics |
EP4223299A3 (en) | 2007-12-04 | 2023-08-30 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides |
JP5697988B2 (ja) | 2007-12-27 | 2015-04-08 | プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド | 干渉rnaを使用したポロ様キナーゼ発現のサイレンシング方法 |
JP2011511004A (ja) | 2008-01-31 | 2011-04-07 | アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | PCSK9遺伝子を標的とするdsRNAを送達するための最適化された方法 |
US20110269814A1 (en) | 2008-03-26 | 2011-11-03 | Alnylam Pharamaceuticals, Inc. | 2'-f modified rna interference agents |
US8058069B2 (en) | 2008-04-15 | 2011-11-15 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Lipid formulations for nucleic acid delivery |
AU2010260148A1 (en) | 2009-06-15 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated dsRNA targeting the PCSK9 gene |
US9512164B2 (en) | 2009-07-07 | 2016-12-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide end caps |
AP3284A (en) | 2010-02-24 | 2015-05-31 | Arrowhead Res Corp | Compositions for targeted delivery of SIRNA |
US20140275211A1 (en) | 2011-06-21 | 2014-09-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject |
KR102689177B1 (ko) | 2011-11-18 | 2024-07-30 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 변형된 RNAi 제제 |
NZ757749A (en) | 2013-10-04 | 2022-07-01 | Icahn School Med Mount Sinai | Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene |
WO2017048843A1 (en) | 2015-09-14 | 2017-03-23 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene |
-
2014
- 2014-10-03 NZ NZ757749A patent/NZ757749A/en unknown
- 2014-10-03 CN CN201480062979.3A patent/CN105980559B/zh active Active
- 2014-10-03 SG SG11201602631XA patent/SG11201602631XA/en unknown
- 2014-10-03 PE PE2016000454A patent/PE20161130A1/es unknown
- 2014-10-03 TW TW111121394A patent/TW202310853A/zh unknown
- 2014-10-03 DK DK14800179.5T patent/DK3052628T3/da active
- 2014-10-03 KR KR1020167011726A patent/KR102307389B1/ko active IP Right Grant
- 2014-10-03 SG SG10201910929QA patent/SG10201910929QA/en unknown
- 2014-10-03 MY MYPI2016000562A patent/MY183490A/en unknown
- 2014-10-03 AU AU2014331604A patent/AU2014331604B2/en active Active
- 2014-10-03 SI SI201431579T patent/SI3052628T1/sl unknown
- 2014-10-03 CA CA3227061A patent/CA3227061A1/en active Pending
- 2014-10-03 KR KR1020227040207A patent/KR20220159478A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-10-03 PT PT148001795T patent/PT3052628T/pt unknown
- 2014-10-03 HU HUE14800179A patent/HUE049227T2/hu unknown
- 2014-10-03 JP JP2016519974A patent/JP6613227B2/ja active Active
- 2014-10-03 BR BR112016007226-0A patent/BR112016007226B1/pt active IP Right Grant
- 2014-10-03 EP EP14800179.5A patent/EP3052628B1/en active Active
- 2014-10-03 WO PCT/US2014/059160 patent/WO2015051318A1/en active Application Filing
- 2014-10-03 PE PE2021000554A patent/PE20211249A1/es unknown
- 2014-10-03 TW TW109113729A patent/TWI768330B/zh active
- 2014-10-03 IL IL282747A patent/IL282747B2/en unknown
- 2014-10-03 US US15/027,176 patent/US10119143B2/en active Active
- 2014-10-03 LT LTEP14800179.5T patent/LT3052628T/lt unknown
- 2014-10-03 TW TW103134649A patent/TWI694080B/zh active
- 2014-10-03 EA EA201690685A patent/EA036477B1/ru unknown
- 2014-10-03 MX MX2016004319A patent/MX2016004319A/es unknown
- 2014-10-03 TN TN2016000114A patent/TN2016000114A1/en unknown
- 2014-10-03 KR KR1020217030663A patent/KR102469850B1/ko active IP Right Grant
- 2014-10-03 CR CR20160195A patent/CR20160195A/es unknown
- 2014-10-03 MY MYPI2020006311A patent/MY197646A/en unknown
- 2014-10-03 CA CA2925357A patent/CA2925357C/en active Active
- 2014-10-03 BR BR122020001264-1A patent/BR122020001264B1/pt active IP Right Grant
- 2014-10-03 UA UAA201604801A patent/UA124961C2/uk unknown
- 2014-10-03 ES ES14800179T patent/ES2804510T3/es active Active
- 2014-10-03 EP EP20154129.9A patent/EP3693463A1/en active Pending
- 2014-10-03 PL PL14800179T patent/PL3052628T3/pl unknown
- 2014-10-03 IL IL302726A patent/IL302726A/en unknown
- 2014-10-03 NZ NZ718995A patent/NZ718995A/en unknown
-
2016
- 2016-03-24 IL IL244749A patent/IL244749B/en active IP Right Grant
- 2016-03-29 PH PH12016500574A patent/PH12016500574A1/en unknown
- 2016-04-01 CL CL2016000772A patent/CL2016000772A1/es unknown
- 2016-04-04 DO DO2016000073A patent/DOP2016000073A/es unknown
- 2016-04-04 MX MX2022001017A patent/MX2022001017A/es unknown
- 2016-04-04 GT GT201600066A patent/GT201600066A/es unknown
- 2016-04-29 ZA ZA2016/02931A patent/ZA201602931B/en unknown
- 2016-08-18 HK HK16109909.3A patent/HK1221738A1/zh unknown
-
2018
- 2018-01-19 CL CL2018000158A patent/CL2018000158A1/es unknown
- 2018-05-04 ZA ZA2018/02919A patent/ZA201802919B/en unknown
- 2018-09-20 US US16/137,046 patent/US11028392B2/en active Active
-
2019
- 2019-11-01 JP JP2019199538A patent/JP7289254B2/ja active Active
-
2020
- 2020-05-21 HR HRP20200822TT patent/HRP20200822T1/hr unknown
- 2020-05-27 CY CY20201100482T patent/CY1122975T1/el unknown
- 2020-08-18 CY CY2020029C patent/CY2020029I2/el unknown
- 2020-08-26 NL NL301061C patent/NL301061I2/nl unknown
- 2020-08-26 LT LTPA2020527C patent/LTC3052628I2/lt unknown
- 2020-08-26 HU HUS2000034C patent/HUS2000034I1/hu unknown
- 2020-12-11 AU AU2020286311A patent/AU2020286311B2/en active Active
-
2021
- 2021-05-04 US US17/307,846 patent/US20230026968A1/en active Pending
-
2022
- 2022-04-19 DO DO2022000085A patent/DOP2022000085A/es unknown
-
2023
- 2023-05-30 JP JP2023088554A patent/JP2023120219A/ja active Pending
- 2023-11-16 AU AU2023266354A patent/AU2023266354A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2213738A2 (en) * | 2002-11-14 | 2010-08-04 | Dharmacon, Inc. | siRNA molecules targeting Bcl-2 |
WO2013155204A2 (en) * | 2012-04-10 | 2013-10-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
"ALAS1 Pre-design Chimera RNAi", INTERNET CITATION, 22 January 2010 (2010-01-22), pages 1-2, XP002701598, Retrieved from the Internet: URL:http://www.abnova.com/PDFServer/outputs/H00000211-R02.pdf [retrieved on 2013-07-11] * |
HOMEDAN CHADI; LAAFI JIHANE; SCHMITT CAROLINE; GUEGUEN NA�G; LEFEBVRE THIBAUD; KARIM ZOUBIDA; DESQUIRET-DUMAS VAL�RIE; WETTERWALD : "Acute intermittent porphyria causes hepatic mitochondrial energetic failure in a mouse model", INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY, PERGAMON, GB, vol. 51, 13 April 2014 (2014-04-13), GB, pages 93 - 101, XP029026620, ISSN: 1357-2725, DOI: 10.1016/j.biocel.2014.03.032 * |
J. L. ESTALL, J. L. RUAS, C. S. CHOI, D. LAZNIK, M. BADMAN, E. MARATOS-FLIER, G. I. SHULMAN, B. M. SPIEGELMAN: "PGC-1� negatively regulates hepatic FGF21 expression by modulating the heme/Rev-Erb� axis", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 106, no. 52, 29 December 2009 (2009-12-29), pages 22510 - 22515, XP055071011, ISSN: 00278424, DOI: 10.1073/pnas.0912533106 * |
L. YIN, N. WU, J. C. CURTIN, M. QATANANI, N. R. SZWERGOLD, R. A. REID, G. M. WAITT, D. J. PARKS, K. H. PEARCE, G. B. WISELY, M. A.: "Rev-erb�, a Heme Sensor That Coordinates Metabolic and Circadian Pathways", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, vol. 318, no. 5857, 14 December 2007 (2007-12-14), pages 1786 - 1789, XP055071004, ISSN: 00368075, DOI: 10.1126/science.1150179 * |
M. BALWANI, R. J. DESNICK: "The porphyrias: advances in diagnosis and treatment", BLOOD, vol. 120, no. 23, 29 November 2012 (2012-11-29), pages 4496 - 4504, XP055093645, ISSN: 00064971, DOI: 10.1182/blood-2012-05-423186 * |
M. YASUDA, L. GAN, B. CHEN, S. KADIRVEL, C. YU, J. D. PHILLIPS, M. I. NEW, A. LIEBOW, K. FITZGERALD, W. QUERBES, R. J. DESNICK: "RNAi-mediated silencing of hepatic Alas1 effectively prevents and treats the induced acute attacks in acute intermittent porphyria mice", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 111, no. 21, 27 May 2014 (2014-05-27), pages 7777 - 7782, XP055165224, ISSN: 00278424, DOI: 10.1073/pnas.1406228111 * |
NARESH KUMAR, LAURA A. SOLT, YONGJUN WANG, PAMELA M. ROGERS, GARGI BHATTACHARYYA, THEODORE M. KAMENECKA, KEITH R. STAYROOK, CHRIST: "Regulation of Adipogenesis by Natural and Synthetic REV-ERB Ligands", ENDOCRINOLOGY, ASSOCIATION FOR THE STUDY OF INTERNAL SECRETIONS, vol. 151, no. 7, 1 July 2010 (2010-07-01), pages 3015 - 3025, XP055100265, ISSN: 00137227, DOI: 10.1210/en.2009-0800 * |
YAO, X. ; BALAMURUGAN, P. ; ARVEY, A. ; LESLIE, C. ; ZHANG, L.: "Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM NL, vol. 403, no. 1, 3 December 2010 (2010-12-03), Amsterdam NL, pages 30 - 35, XP027536757, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/j.bbrc.2010.10.101 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7377246B2 (ja) | Alas1遺伝子の発現を阻害する組成物および方法 | |
JP7289254B2 (ja) | Alas1遺伝子の発現を阻害する組成物および方法 | |
WO2017048843A1 (en) | Compositions and methods for inhibiting expression of the alas1 gene |