BR112013033260B1 - Ácido ribonucleico de fita dupla (dsrna) para inibir a expressão de angptl3, composição farmacêutica e método in vitro para inibir a expressão de angptl3 em uma célula - Google Patents

Ácido ribonucleico de fita dupla (dsrna) para inibir a expressão de angptl3, composição farmacêutica e método in vitro para inibir a expressão de angptl3 em uma célula Download PDF

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Maria Frank-Kamenetsky
Stuart Milstein
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Abstract

COMPOSIÇÕES DE iRNA PARA ANGIOPOIETINA DO TIPO 3 (ANGPTL3) E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a composições de ácidos ribonucleicos de fita dupla (dsRNA) que têm como alvo o gene ANGP-TL3, bem como métodos de inibição da expressão de ANGPTL3 e métodos de tratamento de indivíduos tendo um distúrbio do metabolismo de lipídeo, tal como hiperlipidemia ou hipertrigliceridemia, utilizando tais composições dsRNA.

Description

Pedidos Relacionados
[001] Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. N° 61/499,620, depositado em 21 de junho, 2011, e para o Pedido Provisório U.S. N° 61/638,288, depositado em 25 de abril, 2012, em que a totalidade do conteúdo de cada um é desse modo aqui incorporada a título de referência.
Listagem de Sequências
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e desse modo é aqui incorporada na sua totalidade a título de referência. Essa cópia ASCII, criada em 11 de julho, 2012, é chamada de 12130100.txt e tem 444 346 bytes de tamanho.
Antecedentes da Invenção
[003] Angiopoietina do tipo 3 (ANGPTL3) é um membro da família do tipo angiopoietina de fatores segregados que regula o metabolismo de lipídeos e que é predominantemente expresso no fígado (Koishi, R. et al., (2002) Nat. Genet. 30(2):151-157). O ANGPTL3 inibe dualmente as atividades catalíticas da lipoproteína lipase (LPL), que catalisa a hidrólise de triglicerídeos, e da lipase endotelial (EL), que hidrolisa fosfolipídeos de lipoproteínas de alta densidade (HDL). Em camundongos KK/Snk hipolipidêmicos, mas obesos, uma redução da expressão de ANGPTL3 tem um efeito protetor contra hiperlipidemia e arterosclerose ao promover a eliminação de triglicerídeos (Ando et al., (2003) J. Lipid Res., 44:1216-1223). Concentrações no plasma de ANGPTL3 humana estão positivamente correlacionadas com níveis plasmáticos de colesterol HDL e fosfolipídeos HDL (Shimamura et al., (2007) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 27:366-372).
[004] Distúrbios do metabolismo de lipídeos podem conduzir a níveis acrescidos de lipídeos do soro, tais como triglicerídeos e/ou colesterol. Lipídeos aumentados do soro estão fortemente associados a alta pressão sanguínea, doença cardiovascular, diabetes e outras condições médicas patológicas. Hipertrigliceridemia é um exemplo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos caracterizado por altos níveis sanguíneos de triglicerídeos. Foi associado a aterosclerose, mesmo na ausência de altos níveis de colesterol (hipercolesterolemia). Quando as concentrações de triglicerídeos são excessivas (isto é, maiores do que 1000 mg/dL ou 12 mmol/L), a hipertrigliceridemia também pode conduzir a pancreatite. Hiperlipidemia é outro exemplo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos caracterizado por níveis acrescidos de qualquer um ou de todos os lipídeos e/ou lipoproteínas no sangue. Tratamentos correntes para distúrbios do metabolismo de lipídeos, incluindo dieta, exercício e tratamento com estatinas e outros fármacos, nem sempre são eficazes. Em conformidade, são necessários na área tratamentos alternativos para sujeitos sofrendo de distúrbios do metabolismo de lipídeos.
Sumário da Invenção
[005] A presente invenção proporciona composições de iRNA que procedem à clivagem, mediada pelo complexo silenciador induzido por RNA (RISC), de transcritos de RNA de um gene ANGPL3. O gene ANGPL3 pode estar dentro de uma célula, por exemplo, uma célula presente em um sujeito, como um humano. A presente invenção também proporciona métodos de utilização das composições de iRNA da invenção para inibir a expressão de um gene ANGPL3 e/ou para tratar um sujeito que beneficiará da inibição ou redução da expressão de um gene ANGPL3, por exemplo, um sujeito que sofre ou propenso a sofrer de um distúrbio do metabolismo de lipídeos, como um sujeito que sofre ou propenso a sofrer de hiperlipidemia ou hipertrigliceridemia.
[006] Em conformidade, em um aspecto, a presente invenção proporciona ácidos ribonucleicos de fita dupla (dsRNAs) para inibir a expressão de ANGPTL3. Os dsRNAs compreendem uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais de 3 nucleotídeos relativamente à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1 e a fita antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais de 3 nucleotídeos relativamente à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5.
[007] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona ácidos ribonucleicos de fita dupla (dsRNAs) para inibir a expressão de ANGPTL3. Os dsRNAs compreendem uma fita senso e uma fita antissenso, em que a fita antissenso compreende uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais de 3 nucleotídeos relativamente a qualquer uma das sequências antissenso listadas nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10.
[008] Em uma modalidade, as fitas senso e antissenso compreendem sequências selecionadas do grupo consistindo em AD- 53063.1, AD-53001.1, AD-53015.1, AD-52986.1, AD-52981.1, AD- 52953.1, AD-53024.1, AD-53033.1, AD-53030.1, AD-53080.1, AD- 53073.1, AD-53132.1, AD-52983.1, AD-52954.1, AD-52961.1, AD- 52994.1, AD-52970.1, AD-53075.1, AD-53147.1, AD-53077.1 das Tabelas 7 e 8.
[009] Em certas modalidades da invenção, os dsRNAs compreendem pelo menos um nucleotídeo modificado. Em uma modalidade, pelo menos um dos nucleotídeos modificados é selecionado do grupo consistindo em um nucleotídeo com modificação 2'-O-metila, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'-fosforotioato, e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado colesterila ou um grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico. Em outra modalidade, o nucleotídeo modificado é selecionado do grupo consistindo em um nucleotídeo com modificação 2'-desóxi-2'-fluoro, um nucleotídeo com modificação 2'-desóxi, um nucleotídeo trancado, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo com modificação 2'-amino, um nucleotídeo com modificação 2'-alquila, um nucleotídeo morfolino, um fosforamidato, e um nucleotídeo compreendendo uma base não natural.
[0010] A região de complementaridade dos dsRNAs pode ter pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento, entre 19 e 21 nucleotídeos de comprimento, ou 19 nucleotídeos de comprimento.
[0011] Em uma modalidade, cada fita de um dsRNA tem não mais do que 30 nucleotídeos de comprimento.
[0012] Pelo menos uma fita de um dsRNA pode compreender uma protuberância 3' de pelo menos 1 nucleotídeo ou pelo menos 2 nucleotídeos.
[0013] Em certas modalidades, um dsRNA também compreende um ligante. Em uma modalidade, o ligante é conjugado à extremidade 3' da fita senso do dsRNA.
[0014] Em algumas modalidades, o ligante consiste em um ou mais derivados N-acetilgalactosamina (GalNAc) ligados através de um ligador ramificado bivalente ou trivalente. Em modalidades particulares, o ligante é
Figure img0001
[0015] Em algumas modalidades, o agente de RNAi é conjugado ao ligante como mostrado no esquema seguinte
Figure img0002
[0016] Em algumas modalidades, o agente de RNAi inclui adicionalmente pelo menos uma ligação internucleotídeos fosforotioato ou metilfosfonato. Em algumas modalidades, a ligação internucleotídeos fosforotioato ou metilfosfonato está situada na terminação 3' de uma fita. Em algumas modalidades, a fita é a fita antissenso. Em outras modalidades, a fita é a fita senso.
[0017] Em uma modalidade, a região de complementaridade de um dsRNA consiste em uma das sequências antissenso das Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10.
[0018] Em outra modalidade, um dsRNA compreende uma fita senso consistindo em uma sequência de fita senso selecionada das sequências das Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10, e uma fita antissenso consistindo em uma sequência antissenso selecionada das sequências das Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10.
[0019] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma célula, por exemplo, um hepatócito, contendo um dsRNA da invenção.
[0020] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um vetor codificando pelo menos uma fita de um dsRNA, em que o dsRNA compreende uma região de complementaridade com pelo menos uma parte de um mRNA codificando ANGPTL3, em que o dsRNA tem 30 pares de bases ou menos de comprimento, e em que o dsRNA tem como alvo o mRNA para clivagem. A região de complementaridade pode ter pelo menos 15 nucleotídeos de comprimento ou 19 até 21 nucleotídeos de comprimento.
[0021] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma célula compreendendo um vetor codificando pelo menos uma fita de um dsRNA, em que o dsRNA compreende uma região de complementaridade com pelo menos uma parte de um mRNA codificando ANGPTL3, em que o dsRNA tem 30 pares de bases ou menos de comprimento, e em que o dsRNA tem como alvo o mRNA para clivagem.
[0022] Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para inibir a expressão de um gene ANGPTL3, compreendendo um dsRNA ou vetor da invenção.
[0023] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende uma formulação lipídica, como uma formulação de MC3, SNALP ou XTC.
[0024] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos de inibição da expressão de ANGPTL3 em uma célula. Os métodos incluem contatar a célula com um dsRNA ou um vetor da invenção, e manter a célula produzida por um período de tempo suficiente para se obter degradação do transcrito de mRNA de um gene ANGPTL3, desse modo inibindo a expressão do gene ANGPTL3 na célula.
[0025] A célula pode se encontrar no interior de um sujeito, como um sujeito humano, por exemplo, um sujeito humano sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos, por exemplo, hiperlipidemia ou hipertrigliceridemia.
[0026] Em uma modalidade dos métodos da invenção, a expressão de ANGPTL3 é inibida em pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%.
[0027] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos de tratamento de um sujeito sofrendo de um distúrbio que irá beneficiar da redução da expressão de ANGPTL3, por exemplo, um distúrbio do metabolismo de lipídeos, como hiperlipidemia ou hipertrigliceridemia. Os métodos incluem administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dsRNA ou de um vetor da invenção, desse modo tratando o sujeito.
[0028] O distúrbio pode ser um distúrbio do metabolismo de lipídeos, como hiperlipidemia ou hipertrigliceridemia
[0029] Em uma modalidade, a administração do dsRNA ao sujeito causa um decréscimo do nível de um lipídeo do soro, triglicerídeos, colesterol e/ou ácidos graxos livres; e/ou um decréscimo do acúmulo da proteína ANGPTL3. Em uma modalidade, a administração do dsRNA ao sujeito causa um decréscimo do nível de LDL-C, HDL-C, VLDL-C, IDLC e/ou colesterol total.
[0030] Em uma modalidade, o dsRNA é administrado a uma dose de cerca de 0,01 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,05 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 1 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 2 mg/kg até cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 3 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 3,5 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 5,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 6 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 6,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 7 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 7,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 8 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 8,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 9 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, ou cerca de 9,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[0031] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado a uma dose de cerca de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ou cerca de 10 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[0032] Em outra modalidade, o dsRNA é administrado a uma dose de cerca de 0,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 50 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 50 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 40 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 45 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 45 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 45 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 40 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 40 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 40 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 30 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 30 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 20 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 20 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 15 até cerca de 20 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[0033] Por exemplo, aos sujeitos pode ser administrada uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou cerca de 50 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[0034] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona métodos de inibição da expressão de ANGPTL3 em um sujeito. Os métodos incluem administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dsRNA ou de um vetor da invenção, desse modo inibindo a expressão de ANGPTL3 no sujeito.
[0035] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona estojos para implementar os métodos da invenção. Em um aspecto, a invenção proporciona um estojo para implementar um método de inibição da expressão de um gene ANGPTL3 em uma célula por contato de uma célula com um agente de RNAi de fita dupla em uma quantidade eficaz para inibir a expressão do ANGPTL3 na célula. O estojo compreende um agente de RNAi e instruções de uso e, opcionalmente, meios de administração do agente de RNAi a um sujeito.
Breve Descrição das Figuras
[0036] A Figura 1 é uma representação esquemática do procedimento experimental usado para testes in vivo descritos no Exemplo 2.
[0037] A Figura 2, Painel A, é um gráfico que mostra níveis mensurados da proteína ANGPTL3 em camundongos TS após tratamento com o iRNA indicado ou um controle. A Figura 2, Painel B, é um gráfico que mostra níveis mensurados da proteína ANGPTL3 em camundongos ob/ob após tratamento com o iRNA indicado ou um controle.
[0038] A Figura 3, Painel A, é um gráfico que mostra níveis mensurados de LDL-c em camundongos TS após tratamento com o iRNA indicado ou um controle. A Figura 3, Painel B, é um gráfico que mostra níveis mensurados de LDL-c em camundongos ob/ob após tratamento com o iRNA indicado ou um controle.
[0039] A Figura 4, Painel A, é um gráfico que mostra níveis mensurados de triglicerídeos em camundongos TS após tratamento com o iRNA indicado ou um controle. A Figura 4, Painel B, é um gráfico que mostra níveis mensurados de triglicerídeos em camundongos ob/ob após tratamento com o iRNA indicado ou um controle.
[0040] A Figura 5, Painel A, é um gráfico que mostra níveis mensurados de colesterol total (TC) em camundongos TS após tratamento com o iRNA indicado ou um controle. A Figura 5, Painel B, é um gráfico que mostra níveis mensurados de colesterol total (TC) em camundongos ob/ob após tratamento com o iRNA indicado ou um controle.
[0041] A Figura 6, Painel A, é um gráfico que mostra níveis mensurados de HDL-c em camundongos TS após tratamento com o iRNA indicado ou um controle. A Figura 6, Painel B, é um gráfico que mostra níveis mensurados de HDL-c em camundongos ob/ob após tratamento com o iRNA indicado ou um controle.
[0042] A Figura 7 é um gráfico que mostra níveis mensurados de proteína ANGPTL3 em camundongos transgênicos em PCS humano após tratamento com uma única dose do iRNA indicado ou um controle. Descrição Detalhada da Invenção
[0043] A presente invenção proporciona composições de iRNA que procedem à clivagem, mediada pelo complexo silenciador induzido por RNA (RISC), de transcritos de RNA de um gene ANGPTL3. O gene ANGPTL3 pode estar dentro de uma célula, por exemplo, uma célula presente em um sujeito, como um humano. A presente invenção também proporciona métodos de utilização das composições de iRNA da invenção para inibir a expressão de um gene ANGPTL3 e/ou para tratar um sujeito sofrendo de um distúrbio que irá beneficiar da inibição ou redução da expressão de um gene ANGPTL3, por exemplo, um distúrbio do metabolismo de lipídeos, como hiperlipidemia ou hipertrigliceridemia.
[0044] Os iRNAs da invenção incluem uma fita de RNA (a fita antissenso) possuindo uma região que tem um comprimento de cerca de 30 nucleotídeos ou menos, por exemplo, um comprimento de 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ou 21-22 nucleotídeos, cuja região é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene ANGPTL3. A utilização desses iRNAs permite a degradação direcionada de mRNAs de um gene ANGPTL3 em mamíferos. Dosagens muito baixas de iRNAs de ANGPTL3, em particular, podem mediar específica e eficientemente a interferência de RNA (RNAi), originando inibição significativa da expressão de um gene ANGPTL3. Usando ensaios baseados em células, os presentes inventores demonstraram que iRNAs tendo como alvo ANGPTL3 podem mediar RNAi, originando inibição significativa da expressão de um gene ANGPTL3. Assim, métodos e composições incluindo esses iRNAs são úteis para o tratamento de um sujeito que irá beneficiar de uma redução dos níveis e/ou atividade de uma proteína ANGPTL3, como um sujeito sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos, como hiperlipidemia ou hipertrigliceridemia.
[0045] A seguinte descrição detalhada revela como preparar e usar composições contendo iRNAs para inibir a expressão de um gene ANGPTL3, bem como composições e métodos de tratamento de sujeitos sofrendo de doenças e distúrbios que irão beneficiar de inibição e/ou redução da expressão desse gene.
Definições
[0046] Para que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, alguns termos são definidos em primeiro lugar. Adicionalmente, deve ser notado que, sempre que um valor ou intervalo de valores de um parâmetro for relatado, é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores relatados também façam parte desta invenção.
[0047] Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para referir um ou mais do que um (isto é, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título exemplificativo, "um elemento" significa um elemento ou mais do que um elemento, por exemplo, uma pluralidade de elementos.
[0048] O termo "incluindo" é usado aqui para designar, e é usado alternadamente com, a frase "incluindo mas não se limitando a". O termo "ou" é usado aqui para designar, e é usado alternadamente com, o termo "e/ou", a menos que o contexto claramente indique o contrário.
[0049] O termo "ANGPTL3" refere-se a uma proteína angiopoietina do tipo 3 possuindo uma sequência de aminoácidos de qualquer fonte de vertebrado ou mamífero, incluindo mas não se limitando a humano, bovino, de galinha, roedor, camundongo, rato, porcino, ovino, primata, macaco, e porquinho-da-índia, a menos que especificado de outro modo. O termo também se refere a fragmentos e variantes de ANGPTL3 nativa que mantêm pelo menos uma atividade in vivo ou in vitro de uma ANGPTL3 nativa. O termo abrange formas precursoras completas não processadas de ANGPTL3 bem como formas maduras resultantes de clivagem pós-tradução do peptídeo sinal e formas resultantes de processamento proteolítico do domínio do tipo fibrinogênio. A sequência de um transcrito de mRNA de ANGPTL3 humana pode ser encontrada, por exemplo, no N° de Acesso da GenBank GI: 41327750 (NM_ 014495.2; SEQ ID NO:1). A sequência prevista de mRNA de ANGPTL3 de rhesus pode ser encontrada, por exemplo, no N° de Acesso da GenBank GI: 297278846 (XM_001086114.2; SEQ ID NO:2). A sequência de mRNA de ANGPTL3 de camundongo pode ser encontrada, por exemplo, no N° de Acesso da GenBank GI: 142388354 (NM_ 013913.3; SEQ ID NO:3). A sequência de mRNA de ANGPTL3 de rato pode ser encontrada, por exemplo, no N° de Acesso da GenBank GI: 68163568 (NM_001025065.1; SEQ ID NO:4).
[0050] O termo "ANGPTL3", como usado aqui, também se refere a um polipeptídeo particular expresso em uma célula por variações de sequências de DNA de ocorrência natural do gene ANGPTL3, como um polimorfismo de nucleotídeo único no gene ANGPTL3. Foram identificados numerosos SNPs no gene ANGPTL3, e podem ser encontrados, por exemplo, na dbSNP do NCBI (ver, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Exemplos não limitadores de SNPs no gene ANGPTL3 podem ser encontrados nos N°s de Acesso da dbSNP do NCBI rs193064039; rs192778191; rs192764027; rs192528948; rs191931953; rs191293319; rs191171206; rs191145608; rs191086880; rs191012841; ou rs190255403.
[0051] Como usado aqui, "sequência alvo" refere-se a uma porção contígua da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene ANGPTL3, incluindo mRNA que é um produto de processamento de RNA de um produto de transcrição primária. Em uma modalidade, a porção alvo da sequência terá um comprimento pelo menos suficiente para servir de substrato para clivagem dirigida por iRNA nessa porção ou perto dessa porção da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene ANGPTL3.
[0052] A sequência alvo pode ter entre cerca de 9-36 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, cerca de 15-30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, o comprimento da sequência alvo pode ser cerca de 15-30 nucleotídeos, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ou 21-22 nucleotídeos. Também é contemplado que intervalos e comprimentos intermédios dos intervalos e comprimentos listados acima façam parte da invenção.
[0053] Como usado aqui, o termo "fita compreendendo uma sequência" refere-se a um oligonucleotídeo compreendendo uma cadeia de nucleotídeos que é descrita pela sequência referida usando a nomenclatura comum de nucleotídeos.
[0054] Cada um de "G", "C", "A", "T" e "U" designa genericamente um nucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timidina e uracila como base, respectivamente. No entanto, será entendido que o termo "ribonucleotídeo" ou "nucleotídeo" também pode referir-se a um nucleotídeo modificado, como adicionalmente detalhado embaixo, ou uma fração de substituição suplente. O versado na técnica está bem ciente de que guanina, citosina, adenina, e uracila podem ser substituídas por outras frações sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento de bases de um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo contendo tal fração de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo compreendendo inosina como sua base pode sofrer emparelhamento de bases com nucleotídeos contendo adenina, citosina, ou uracila. Assim, nucleotídeos contendo uracila, guanina, ou adenina podem ser substituídos, nas sequências de nucleotídeos de dsRNA apresentadas na invenção, por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Em outro exemplo, adenina e citosina em qualquer parte do oligonucleotídeo podem ser substituídos por guanina e uracila, respectivamente, para formar emparelhamento de bases Oscilantes ("Wobble") G-U com o mRNA alvo. Sequências contendo tais frações de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na invenção.
[0055] Os termos "iRNA", "agente de RNAi", "agente de iRNA", "agente de interferência de RNA", usados aqui de modo alternado, referem-se a um agente que contém RNA tal como o termo é definido aqui, e que medeia a clivagem direcionada de um transcrito de RNA por uma via do complexo silenciador induzido por RNA (RISC). iRNA dirige a degradação sequência-específica de mRNA mediante um processo chamado de interferência de RNA (RNAi). O iRNA modula, por exemplo, inibe, a expressão de ANGPTL3 em uma célula, por exemplo, uma célula no interior de um sujeito, como um sujeito mamífero.
[0056] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção inclui um RNA de fita simples que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA alvo de ANGPTL3, para dirigir a clivagem do RNA alvo. Sem pretender ficar restringido pela teoria, RNA longo de fita dupla introduzido em células é degradado em siRNA por uma endonuclease do Tipo III chamada de Dicer (Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485). Dicer, uma enzima do tipo ribonuclease-III, processa o dsRNA em RNAs interferentes pequenos de 19-23 pares de bases com protuberâncias 3' de duas bases características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são então incorporados em um complexo silenciador induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam o duplex de siRNA, permitindo que a fita antissenso complementar oriente o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Por ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases presentes no RISC procedem à clivagem do alvo para induzir silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev.15:188). Assim, em um aspecto, a invenção refere-se a um RNA de fita simples (siRNA) gerado dentro de uma célula e que promove a formação de um complexo RISC para efetivar o silenciamento do gene alvo, isto é, um gene ANGPTL3. Em conformidade, o termo "siRNA" também é usado aqui para referir um RNAi como descrito acima.
[0057] Em outro aspecto, o agente de RNAi é uma molécula de RNA antissenso de fita simples. Uma molécula de RNA antissenso é complementar a uma sequência presente no mRNA alvo. RNA antissenso pode inibir a tradução de um modo estequiométrico por emparelhamento de bases com o mRNA e obstrução física da maquinaria de tradução, ver Dias, N. et al., (2002) Mol. Cancer Ther.1:347-355. A molécula de RNA antissenso de fita simples pode ter cerca de 13 até cerca de 30 nucleotídeos de comprimento e tem uma sequência que é complementar a uma sequência alvo. Por exemplo, a molécula de RNA antissenso de fita simples pode compreender uma sequência que tem pelo menos cerca de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleotídeos contíguos de uma das sequências antissenso das Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10.
[0058] Em outra modalidade, um "iRNA" para utilização nas composições e métodos da invenção é um RNA de fita dupla e é chamado aqui de "agente de RNAi de fita dupla", "molécula de RNA de fita dupla (dsRNA)", "agente de dsRNA", ou "dsRNA". O termo "dsRNA" refere-se a um complexo de moléculas de ácidos ribonucleicos, possuindo uma estrutura de duplex compreendendo duas fitas de ácidos nucleicos antiparalelas e substancialmente complementares, sendo referidas como tendo orientações "senso" e "antissenso" relativamente a um RNA alvo, isto é, um gene ANGPTL3. Em algumas modalidades da invenção, um RNA de fita dupla (dsRNA) desencadeia a degradação de um RNA alvo, por exemplo, um mRNA, mediante um mecanismo de silenciamento genético pós-transcrição chamado aqui de interferência de RNA ou RNAi.
[0059] A região de duplex pode ter qualquer comprimento que permita a degradação específica de um RNA alvo desejado através de uma via de RISC, e o comprimento pode variar desde cerca de 9 até 36 pares de bases, por exemplo, cerca de 15-30 pares de bases de comprimento, por exemplo, cerca de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, ou 36 pares de bases de comprimento, tal como cerca de 15-30, 15-29, 1528, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 1518, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 1822, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 1923, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 2024, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21 24, 21-23, ou 21-22 pares de bases de comprimento. Também é contemplado que intervalos e comprimentos intermédios dos intervalos e comprimentos listados acima façam parte da invenção.
[0060] As duas fitas que formam a estrutura do duplex podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior, ou podem ser moléculas de RNA separadas. Quando as duas fitas fazem parte de uma molécula maior, e consequentemente estão conectadas por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de uma fita e a extremidade 5' da outra fita respectiva que formam a estrutura de duplex, a cadeia de RNA conectora é chamada de "alça em grampo". Uma alça em grampo pode compreender pelo menos um nucleotídeo desemparelhado. Em algumas modalidades, a alça em grampo pode compreender pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 23 ou mais nucleotídeos desemparelhados.
[0061] Quando as duas fitas substancialmente complementares de um dsRNA são compreendidas de moléculas de RNA separadas, não é necessário mas pode acontecer que essas moléculas estejam conectadas de modo covalente. Quando as duas fitas estiverem conectadas de modo covalente por um meio diferente de uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de uma fita e a extremidade 5' da outra fita respectiva que formam a estrutura de duplex, a estrutura conectora é chamada de "ligador". As fitas de RNA podem ter um número igual ou diferente de nucleotídeos. O número máximo de pares de bases é o número de nucleotídeos na fita mais curta de dsRNA menos quaisquer protuberâncias que estejam presentes no duplex. Para além da estrutura de duplex, um RNAi pode compreender uma ou mais protuberâncias nucleotídicas.
[0062] Como usado aqui, o termo "protuberância nucleotídica" refere-se a pelo menos um nucleotídeo desemparelhado que sobressai da estrutura de duplex de um iRNA, por exemplo, um dsRNA. Por exemplo, quando uma extremidade 3' de uma fita de um dsRNA se estende para além da extremidade 5' da outra fita, ou vice versa, há uma protuberância nucleotídica. Um dsRNA pode compreender uma protuberância de pelo menos um nucleotídeo; em alternativa, a protuberância pode compreender pelo menos dois nucleotídeos, pelo menos três nucleotídeos, pelo menos quatro nucleotídeos, pelo menos cinco nucleotídeos ou mais. Uma protuberância nucleotídica pode compreender ou consistir de um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) protuberância(s) pode(m) estar na fita senso, na fita antissenso ou qualquer combinação das mesmas. Além disso, o(s) nucleotídeo(s) de uma protuberância pode(m) estar presente(s) na extremidade 5', extremidade 3' ou ambas as extremidades de uma fita antissenso ou senso de um dsRNA.
[0063] Em uma modalidade, a fita antissenso de um dsRNA tem uma protuberância de 1-10 nucleotídeos, por exemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3' e/ou na extremidade 5'. Em uma modalidade, a fita senso de um dsRNA tem uma protuberância de 1-10 nucleotídeos, por exemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3' e/ou na extremidade 5'. Em outra modalidade, um ou mais dos nucleotídeos presentes na protuberância são substituídos por um nucleosídeo tiofosfato.
[0064] Os termos "coesivo" ou "de extremidades coesivas", como usado aqui relativamente a um dsRNA, significam que não há nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos desemparelhados em uma dada extremidade terminal de um dsRNA, isto é, nenhuma protuberância nucleotídica. Uma ou ambas as extremidades de um dsRNA podem ser coesivas. Quando ambas as extremidades de um dsRNA são coesivas, é afirmado que o dsRNA tem extremidades coesivas. Para ser claro, um dsRNA "de extremidades coesivas" é um dsRNA que é coesivo em ambas as extremidades, isto é, sem protuberância nucleotídica em qualquer uma das extremidades da molécula. O mais frequente é essa molécula ser de fita dupla em todo o seu comprimento.
[0065] O termo "fita antissenso" ou "fita guia" refere-se à fita de um iRNA, por exemplo, um dsRNA, que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma sequência alvo, por exemplo, um mRNA de ANGPTL3. Como usado aqui, o termo "região de complementaridade" refere-se à região da fita antissenso que é substancialmente complementar a uma sequência, por exemplo, uma sequência alvo, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos de ANGPTL3, como definido aqui. Quando a região de complementaridade não é totalmente complementar à sequência alvo, os emparelhamentos defeituosos podem ocorrer nas regiões internas ou terminais da molécula. Em geral, os emparelhamentos defeituosos mais tolerados estão localizados nas regiões terminais, por exemplo, a 5, 4, 3, ou 2 nucleotídeos da terminação 5' e/ou 3' do iRNA.
[0066] O termo "fita senso" ou "fita passageiro", como usado aqui, refere-se à fita de um iRNA que inclui uma região substancialmente complementar a uma região da fita antissenso, tal como o termo é definido aqui.
[0067] Como usado aqui, e a menos que indicado em contrário, o termo "complementar", quando usado para descrever uma primeira sequência de nucleotídeos relativamente a uma segunda sequência de nucleotídeos, refere-se à capacidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência de nucleotídeos para hibridizar e formar uma estrutura de duplex, em certas condições, com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência de nucleotídeos, como será entendido pelo versado na técnica. Tais condições podem, por exemplo, ser condições estringen- tes, em que condições estringentes podem incluir: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50 oC ou 70 oC por 12-16 horas seguido de lavagem (ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Podem ser aplicadas outras condições, como condições fisiologicamente relevantes, como as que podem ser encontradas dentro de um organismo. O versado na técnica será capaz de determinar o conjunto de condições mais apropriadas para um teste de complementaridade de duas sequências de acordo com a aplicação final dos nucleotídeos hibridizados.
[0068] Sequências complementares em um iRNA, por exemplo, em um dsRNA como descrito aqui, incluem emparelhamento de bases do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeos com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo uma segunda sequência de nucleotídeos ao longo de todo o comprimento de uma ou de ambas as sequências de nucleotí- deos. Tais sequências podem ser chamadas aqui de "totalmente complementares" uma relativamente à outra. No entanto, quando uma primeira sequência é chamada aqui de "substancialmente complementar" relativamente a uma segunda sequência aqui, as duas sequências podem ser totalmente complementares, ou podem formar um ou mais, mas geralmente não mais do que 5, 4, 3 ou 2 pares de bases com emparelhamento defeituoso por hibridização para formar um duplex de até 30 pares de bases, retendo a capacidade de hibridizar nas condições mais relevantes para a sua aplicação final, por exemplo, inibição da expressão genética por uma via de RISC. Todavia, quando dois oligonucleotídeos são planejados para formar, por hibridização, uma ou mais protuberâncias de fita simples, tais protuberâncias não devem ser consideradas emparelhamentos defeituosos relativamente à determinação da complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonucleotídeo com 21 nucleotídeos de comprimento e outro oligonucleotídeo com 23 nucleotídeos de comprimento, em que o oligonucleotídeo maior compreende uma sequência de 21 nucleotídeos que é totalmente complementar ao oligonucleotídeo mais pequeno, pode ainda ser chamado de "totalmente complementar" para as finalidades descritas aqui.
[0069] Sequências "complementares", como usado aqui, também podem incluir, ou ser inteiramente formadas de pares de bases não de Watson-Crick e/ou pares de bases formados a partir de nucleotídeos não naturais e modificados, desde que sejam cumpridos os requisitos acima relativamente à sua capacidade de hibridização. Tais pares de bases não de Watson-Crick incluem mas não estão limitados aos emparelhamentos de bases Wobble G:U ou de Hoogstein.
[0070] Os termos "complementar", "totalmente complementar" e "substancialmente complementar" podem ser usados aqui relativamente ao emparelhamento de bases entre a fita senso e a fita antissenso de um dsRNA, ou entre a fita antissenso de um agente de iRNA e uma sequência alvo, como será entendido pelo contexto da sua utilização.
[0071] Como usado aqui, um polinucleotídeo que é "substancial mente complementar a pelo menos parte de" um RNA mensageiro (mRNA) refere-se a um polinucleotídeo que é substancialmente complementar a uma porção contígua do mRNA de interesse (por exemplo, um mRNA codificando ANGPTL3). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA de ANGPTL3 se a sequência for substancialmente complementar a uma porção não interrompida de um mRNA codificando ANGPTL3.
[0072] Em geral, a maior parte dos nucleotídeos de cada fita são ribonucleotídeos mas, como descrito em detalhe aqui, cada uma ou ambas as fitas também podem incluir um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Adicionalmente, um "iRNA" pode incluir ribonucleotídeos com modificações químicas. Essas modificações podem incluir todos os tipos de modificações reveladas aqui ou conhecidas na área. Quaisquer dessas modificações, usadas em uma molécula de iRNA, estão abrangidas por "iRNA" para as finalidades desta especificação e reivindicações.
[0073] O termo "inibir", como usado aqui, é usado alternadamente com "reduzir", "silenciar", "regular negativamente", "suprimir" e outros termos similares, e inclui qualquer nível de inibição.
[0074] A frase "inibição da expressão de um ANGPTL3", como usada aqui, inclui inibição da expressão de qualquer gene ANGPTL3 (como, por exemplo, um gene ANGPTL3 de camundongo, um gene ANGPTL3 de rato, um gene ANGPTL3 de macaco, ou um gene ANGPTL3 humano), bem como variantes ou mutantes de um gene ANGPTL3 que codifica uma proteína ANGPTL3.
[0075] "Inibição da expressão de um gene ANGPTL3" inclui qualquer nível de inibição de um gene ANGPTL3, por exemplo, pelo menos supressão parcial da expressão de um gene ANGPTL3, como uma inibição em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%.
[0076] A expressão de um gene ANGPTL3 pode ser avaliada com base no nível de qualquer variável associada à expressão do gene ANGPTL3, por exemplo, nível de mRNA de ANGPTL3 ou nível de proteína ANGPTL3. A expressão de um ANGPTL3 também pode ser avaliada indiretamente com base nos níveis de um lipídeo do soro, um triglicerídeo, colesterol (incluindo LDL-C, HDL-C, VLDL-C, IDL-C e colesterol total), ou ácidos graxos livres. A inibição pode ser avaliada por um decréscimo de um nível absoluto ou relativo de uma ou mais dessas variáveis em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser qualquer tipo de nível de controle que seja utilizado na área, por exemplo, um nível de referência pré-dose, ou um nível determinado a partir de um sujeito, célula, ou amostra similar não tratado ou tratado com um controle (tal como, por exemplo, controle só de tampão ou controle de agente inativo).
[0077] Em uma modalidade, a supressão pelo menos parcial da expressão de um gene ANGPTL3 é avaliada por uma redução da quantidade de mRNA de ANGPTL3 que pode ser isolada ou detectada em uma primeira célula ou grupo de células onde um gene ANGPTL3 é transcrito e que foi ou foram tratadas de modo que a expressão de um gene ANGPTL3 é inibida, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntica à primeira célula ou grupo de células mas que não foi ou não foram tratadas desse modo (células de controle). O grau de inibição pode ser expresso em termos de:
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[0078] A frase "contatar uma célula com um agente de RNAi", como um dsRNA, como usada aqui, inclui contatar uma célula por quaisquer meios possíveis. Contatar uma célula com um agente de RNAi inclui contatar uma célula in vitro com o iRNA ou contatar uma célula in vivo com o iRNA. O contato pode ser feito direta ou indiretamente. Assim, por exemplo, o agente de RNAi pode ser colocado em contato físico com a célula pelo indivíduo que implementa o método ou, em alternativa, o agente de RNAi pode ser colocado em uma situação que irá permitir ou fazer com que entre subsequentemente em contato com a célula.
[0079] O contato de uma célula in vitro pode ser efetuado, por exemplo, incubando a célula com o agente de RNAi. O contato de uma célula in vivo pode ser efetuado, por exemplo, injetando o agente de RNAi no interior ou próximo do tecido onde a célula está localizada, ou injetando o agente de RNAi em outra área, por exemplo, na corrente sanguínea ou no espaço subcutâneo, de modo que o agente irá subsequentemente alcançar o tecido onde está localizada a célula a ser contatada. Por exemplo, o agente de RNAi pode conter e/ou estar acoplado a um ligante, por exemplo, GalNAc3, que dirige o agente de RNAi para um sítio de interesse, por exemplo, o fígado. Combinações de métodos de contato in vitro e in vivo também são possíveis. Por exemplo, uma célula também pode ser contatada in vitro com um agente de RNAi e subsequentemente ser transplantada para um sujeito.
[0080] Em uma modalidade, contatar uma célula com um iRNA inclui "introduzir" ou "distribuir o iRNA no interior da célula" facilitando ou efetivando a captação ou absorção para o interior da célula. A absorção ou captação de um iRNA pode ocorrer mediante processos celulares difusivos ou ativos sem auxílio, ou mediante agentes ou dispositivos auxiliares. A introdução de um iRNA em uma célula pode ser realizada in vitro e/ou in vivo. Por exemplo, para introdução in vivo, iRNA pode ser injetado em um sítio tecidual ou administrado sistemicamente. A administração in vivo também pode ser realizada por um sistema de distribuição de beta-glucana, como os descritos nas Patentes U.S. N°s 5,032,401 e 5,607,677, e Publicação U.S. N° 2005/0281781, cuja totalidade do conteúdo é desse modo incorporada aqui a título de referência. A introdução in vitro em uma célula inclui métodos conhecidos na área, como eletroporação e lipofeção. Outras abordagens são descritas aqui embaixo e/ou são conhecidas na área.
[0081] O termo "SNALP" refere-se a uma partícula estável de ácido nucleico-lipídeo. Um SNALP é uma vesícula de lipídeos revestindo um interior aquoso reduzido compreendendo um ácido nucleico, como um iRNA, ou um plasmídeo de onde é transcrito um iRNA. SNALPs são descritos, por exemplo, nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. N°s 20060240093, 20070135372, e no Pedido Internacional N° WO 2009082817, cuja totalidade do conteúdo é desse modo incorporada aqui a título de referência. Exemplos de formulações de "SNALP" são descritos embaixo.
[0082] Como usado aqui, um "sujeito" é um animal, como um mamífero, incluindo um primata (como um humano, um primata não humano, por exemplo, um macaco, e um chimpanzé), um não primata (como uma vaca, um porco, um camelo, um lama, um cavalo, uma cabra, um coelho, um borrego, um hamster, um porquinho-da-índia, um gato, um cão, um rato, um camundongo, um cavalo, e uma baleia), ou um pássaro (por exemplo, um pato ou um ganso). Em uma modalidade, o sujeito é um humano, como um humano a ser tratado ou avaliado quanto a uma doença, distúrbio ou condição médica que irá beneficiar de redução da expressão de ANGPTL3; um humano em risco de contrair uma doença, distúrbio ou condição médica que irá beneficiar de redução da expressão de ANGPTL3; um humano sofrendo de uma doença, distúrbio ou condição médica que irá beneficiar de redução da expressão de ANGPTL3; e/ou humano a ser tratado quanto a uma doença, distúrbio ou condição médica que irá beneficiar de redução da expressão de ANGPTL3 como descrito aqui. Como usados aqui, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se a um resultado benéfico ou desejado, incluindo decréscimo dos níveis de triglicerídeos em um sujeito. Os termos "tratar" ou "tratamento" também incluem mas não estão limitados a alívio ou melhoria de um ou mais sintomas de um distúrbio do metabolismo de lipídeos, como, por exemplo, uma diminuição do tamanho de xantomas eruptivos. "Tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada na ausência de tratamento.
[0083] Por "menor", no contexto de um marcador ou sintoma de doença, pretende-se significar um decréscimo estatisticamente significativo desse nível. O decréscimo pode ser, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40% ou mais, e preferivelmente vai até um nível aceite como estando dentro do intervalo normal para um indivíduo sem esse distúrbio. Como usado aqui, "prevenção" ou "prevenir", quando usado relativamente a uma respectiva doença, distúrbio ou condição médica que irá beneficiar de uma redução da expressão de um gene ANGPTL3, refere-se a uma redução da probabilidade de um sujeito vir a desenvolver um sintoma associado a essa doença, distúrbio, ou condição médica, por exemplo, níveis altos de triglicerídeos ou xantoma eruptivo. A probabilidade de desenvolver níveis altos de triglicerídeos ou xantoma eruptivo é reduzida, por exemplo, quando um indivíduo com um ou mais fatores de risco para níveis altos de triglicerídeos ou xantoma eruptivo não desenvolve níveis altos de triglicerídeos ou xantoma eruptivo, ou desenvolve níveis altos de triglicerídeos ou xantoma eruptivo com menos gravidade relativamente a uma população com os mesmos fatores de risco e não recebendo tratamento como descrito aqui. O não desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição médica, ou a redução do desenvolvimento de um sintoma associado a essa doença, distúrbio ou condição médica i (por exemplo, em pelo menos cerca de 10% em uma escala clinicamente aceite para essa doença ou distúrbio), ou a exibição de sintomas retardados (por exemplo, por dias, semanas, meses ou anos) é considerado prevenção efetiva.
[0084] Como usado aqui, o termo "lipídeo do soro" refere-se a qualquer lipídeo maioritário presente no sangue. Lipídeos do soro podem estar presentes no sangue em forma livre ou como parte de um complexo proteico, por exemplo, um complexo lipoproteico. Exemplos não limitadores de lipídeos do soro podem incluir triglicerídeos e colesterol, como colesterol total (TG), colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (LDL-C), colesterol de lipoproteínas de alta densidade (HDL-C), colesterol de lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDLC) e colesterol de lipoproteínas de densidade intermédia (IDL-C).
[0085] Como usado aqui, um "distúrbio do metabolismo de lipídeos" refere-se a qualquer distúrbio associado ou causado por uma perturbação do metabolismo de lipídeos. Por exemplo, esse termo inclui qualquer distúrbio, doença ou condição médica que possa conduzir a hiperlipidemia, ou condição médica caracterizada por aumento anormal dos níveis de quaisquer ou de todos os lipídeos e/ou lipoproteínas no sangue. Esse termo refere-se a um distúrbio hereditário, como hipertrigliceridemia familiar, ou um distúrbio adquirido, como um distúrbio adquirido devido a uma dieta ou ingestão de certos fármacos. Distúrbios exemplificativos do metabolismo de lipídeos incluem mas não estão limitados a aterosclerose, dislipidemia, hipertrigliceridemia (incluindo hipertrigliceridemia induzida por fármacos, hipertrigliceridemia induzida por um estado diurético, hipertrigliceridemia induzida por álcool, hipertrigliceridemia induzida por agentes bloqueadores e-adrenérgicos, hipertrigliceridemia induzida por estrogênio, hipertrigliceridemia induzida por glucocorticoides, hipertrigliceridemia induzida por retinoides, hipertrigliceridemia induzida por cimetidina, e hipertrigliceridemia familiar), pancreatite aguda associada a hipertrigliceridemia, síndrome de quilomicronemia, quilomicronemia familiar, deficiência ou resistência a Apo-E, deficiência ou hipoatividade de LPL, hiperlipidemia (incluindo hiperlipidemia combinada familiar), hipercolesterolemia, gota associada a hipercolesterolemia, xantomatose (depósitos subcutâneos de colesterol).
[0086] Doenças cardiovasculares associadas a distúrbios do metabolismo de lipídeos também são consideradas "distúrbios do metabolismo de lipídeos", como definido aqui. Essas doenças podem incluir doença das artérias coronárias (também chamada de doença cardíaca isquêmica), inflamação associada a doença das artérias coronárias, restenose, doenças vasculares periféricas, e acidente vascular cerebral.
[0087] Distúrbios relacionados ao peso do corpo também são considerados "distúrbios do metabolismo de lipídeos", como definido aqui. Esses distúrbios podem incluir obesidade, síndrome metabólica incluindo componentes independentes de síndrome metabólica (por exemplo, obesidade central, FBG/pré-diabetes/diabetes, hipercolestero- lemia, hipertrigliceridemia, e hipertensão), hipotireoidismo, uremia, e outras condições médicas associadas a ganho de peso (incluindo ganho de peso rápido), perda de peso, manutenção da perda de peso, ou risco de novo ganho de peso após perda de peso.
[0088] Distúrbios de açúcar no sangue são adicionalmente considerados "distúrbios do metabolismo de lipídeos", como definido aqui. Esses distúrbios podem incluir diabetes, hipertensão, e síndrome do ovário policístico relacionada a resistência à insulina. Outros distúrbios exemplificativos do metabolismo de lipídeos também podem incluir transplantação renal, síndrome nefrótica, síndrome de Cushing, acromegalia, lúpus eritematoso sistêmico, disglobulinemia, lipodistrofia, glicogenose do tipo I, e doença de Addison.
[0089] É pretendido que "quantidade terapeuticamente eficaz", como usado aqui, inclua a quantidade de um agente de RNAi que, quando administrada a um sujeito com um distúrbio do metabolismo de lipídeos, é suficiente para efetivar o tratamento da doença (por exemplo, diminuindo, melhorando ou mantendo a doença existente ou um ou mais sintomas de doença). A "quantidade terapeuticamente eficaz" pode variar dependendo do agente de RNAi, o modo como o agente é administrado, a doença e sua gravidade, e o historial, idade, peso, historial familiar, constituição genética, os tipos de tratamentos precedentes ou concomitantes, se existentes, e outras características individuais do sujeito a ser tratado.
[0090] É pretendido que "quantidade profilaticamente eficaz", como usado aqui, inclua a quantidade de um iRNA que, quando administrada a um sujeito com um distúrbio do metabolismo de lipídeos, é suficiente para prevenir ou melhorar a doença ou um ou mais sintomas da doença. Melhorar a doença inclui abrandar a progressão da doença ou reduzir a gravidade da doença com desenvolvimento posterior. A "quantidade profilaticamente eficaz" pode variar dependendo do iRNA, o modo como o agente é administrado, o grau de risco da doença, e o historial, idade, peso, historial familiar, constituição genética, os tipos de tratamentos precedentes ou concomitantes, se existentes, e outras características individuais do paciente a ser tratado.
[0091] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade profilaticamente eficaz" também inclui uma quantidade de um agente de RNAi que produz algum efeito local ou sistêmico desejado a uma proporção razoável de benefício/risco aplicável a qualquer tratamento. O iRNA empregue nos métodos da presente invenção pode ser administrado em uma quantidade suficiente para produzir uma proporção razoável de benefício/risco aplicável a esse tratamento.
[0092] A frase "farmaceuticamente aceitável" é empregue aqui para referir aqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas galênicas que são, no escopo de uma avaliação médica fundamentada, adequados para utilização em contato com os tecidos de sujeitos humanos e sujeitos animais sem excessiva toxicidade, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação razoável de benefício/risco.
[0093] A frase "veículo farmaceuticamente aceitável", como usada aqui, significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, como um agente de enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação (por exemplo, lubrificante, talco, estearato de magnésio, cálcio ou zinco, ou ácido esteárico), ou material de encapsulação de solvente, envolvido no carregamento ou transporte do composto em questão de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada veículo deve ser "aceitável" no senso de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não ser prejudicial para o sujeito a ser tratado. Alguns exemplos de materiais que podem servir de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, como lactose, glucose e sucrose; (2) amidos, como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, como carboximetil celulose sódica, etil celulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, como estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, como manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, como óleo de amendoim, óleo de sementes de algodão, óleo de açafrão, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, como propileno glicol; (11) polióis, como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água desprovida de pirogênios; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções com pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes diluentes, como polipeptídeos e aminoácidos; (23) componente do soro, como albumina do soro, HDL e LDL; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregues em formulações farmacêuticas.
[0094] O termo "amostra", como usado aqui, inclui uma coleção de fluidos, células, ou tecidos similares isolados de um sujeito, bem como fluidos, células, ou tecidos presentes em um sujeito. Exemplos de fluidos biológicos incluem sangue, soro e fluidos serosos, plasma, fluido cerebroespinhal, fluidos oculares, linfa, urina, saliva, e afins. Amostras teciduais podem incluir amostras de tecidos, órgãos ou regiões localizadas. Por exemplo, amostras podem ser derivadas de órgãos particulares, partes de órgãos, ou fluidos ou células no interior desses órgãos. Em certas modalidades, amostras podem ser derivadas do fígado (por exemplo, fígado completo ou certos segmentos do fígado ou certos tipos de células do fígado, tais como, por exemplo, hepatócitos). Em algumas modalidades, uma "amostra derivada de um sujeito" refere- se a sangue ou plasma coletado do sujeito. iRNAs da Invenção
[0095] São descritos aqui iRNAs que inibem a expressão de um gene ANGPTL3. Em uma modalidade, o agente de iRNA inclui moléculas de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de um gene ANGPTL3 em uma célula, como uma célula presente em um sujeito, por exemplo, um mamífero, como um humano, sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos, por exemplo, hiperlipidemia familiar. O dsRNA inclui uma fita antissenso possuindo uma região de complementaridade que é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão de um gene ANGPTL3. A região de complementaridade tem cerca de 30 nucleotídeos ou menos de comprimento (por exemplo, cerca de 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, ou 18 nucleotídeos ou menos de comprimento). Por contato com uma célula expressando o gene ANGPTL3, o iRNA inibe a expressão do gene ANGPTL3 (por exemplo, um gene ANGPTL3 humano, de primata, de não primata, ou de pássaro) em pelo menos cerca de 10%, avaliado, por exemplo, por um método à base de PCR ou DNA ramificado (bDNA), ou por um método à base de proteínas, tal como por análise de imunofluorescência, usando, por exemplo, Western Blotting ou técnicas de citometria de fluxo.
[0096] Um dsRNA inclui duas fitas de RNA que são complemen tares e hibridizam para formar uma estrutura de duplex em condições em que o dsRNA será utilizado. Uma fita de um dsRNA (a fita antissenso) inclui uma região de complementaridade que é substancialmente complementar, e em geral totalmente complementar, a uma sequência alvo. A sequência alvo pode ser derivada da sequência de um mRNA formado durante a expressão de um gene ANGPTL3. A outra fita (a fita senso) inclui uma região que é complementar à fita antissenso, de modo que as duas fitas hibridizam e formam uma estrutura de duplex quando combinadas em condições adequadas. Como descrito aqui em outro local e conhecido na área, as sequências complementares de um dsRNA também podem estar contidas como regiões autocomple- mentares de uma única molécula de ácido nucleico, em oposição a estarem em oligonucleotídeos separados.
[0097] Em geral, a estrutura do duplex tem entre 15 e 30 pares de bases de comprimento, por exemplo, entre 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ou 21-22 pares de bases de comprimento. Também é contemplado que intervalos e comprimentos intermédios dos intervalos e comprimentos listados acima façam parte da invenção.
[0098] De modo similar, a região de complementaridade com a sequência alvo tem entre 15 e 30 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, entre 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ou 21-22 nucleotídeos de comprimento. Também é contemplado que intervalos e comprimentos intermédios dos intervalos e comprimentos listados acima façam parte da invenção.
[0099] Em algumas modalidades, o dsRNA tem entre cerca de 15 e cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, ou entre cerca de 25 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Em geral, o dsRNA é suficientemente longo para servir de substrato para a enzima Dicer. Por exemplo, é bem conhecido na área que dsRNAs maiores do que cerca de 21-23 nucleotídeos podem servir de substratos para Dicer. Como será reconhecido pelo versado na técnica, a região de um RNA que é alvo de clivagem será muitas vezes parte de uma molécula de RNA maior, muitas vezes uma molécula de mRNA. Sempre que for relevante, uma "parte" de um alvo de mRNA é uma sequência contígua de um alvo de mRNA com um comprimento suficiente para permitir que seja um substrato para clivagem dirigida por RNAi (isto é, clivagem através de uma via de RISC).
[00100] O versado na técnica também reconhecerá que a região de duplex é uma porção funcional primária de um dsRNA, por exemplo, uma região de duplex de cerca de 9 até 36 pares de bases, por exemplo, cerca de 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 1534, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 1531, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 1521, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 1825, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 1926, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 2027, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21 27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, ou 21-22 pares de bases. Assim, em uma modalidade, tanto quanto é processada em um duplex funcional, por exemplo, de 15-30 pares de bases, que tem como alvo um RNA desejado para clivagem, uma molécula de RNA ou complexo de moléculas de RNA com uma região de duplex maior do que 30 pares de bases é um dsRNA. Assim, um versado na técnica reconhecerá que, em uma modalidade, um miRNA é um dsRNA. Em outra modalidade, um dsRNA não é um miRNA de ocorrência natural. Em outra modalidade, um agente de iRNA útil para ter como alvo a expressão de ANGPTL3 não é gerado na célula alvo por clivagem de um dsRNA maior.
[00101] Um dsRNA como descrito aqui também pode incluir uma ou mais protuberâncias nucleotídicas de fita simples, por exemplo, 1, 2, 3, ou 4 nucleotídeos. dsRNAs possuindo pelo menos uma protuberância nucleotídica podem ter propriedades inibidoras inesperadamente superiores relativamente aos seus correspondentes de extremidades coesivas. Uma protuberância nucleotídica pode compreender ou consistir de um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) protuberância(s) pode(m) estar localizadas na fita senso, na fita antissenso ou qualquer combinação das mesmas. Além disso, o(s) nucleotídeo(s) de uma protuberância pode(m) estar presente(s) na extremidade 5', extremidade 3' ou ambas as extremidades de uma fita antissenso ou senso de um dsRNA.
[00102] Um dsRNA pode ser sintetizado por métodos comuns conhecidos na área como adicionalmente discutido embaixo, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado, como os disponibilizados comercialmente, por exemplo, pela Biosearch, Applied Biosystems, Inc.
[00103] Compostos de iRNA da invenção podem ser preparados usando um procedimento em duas etapas. Em primeiro lugar, as fitas individuais da molécula de RNA de fita dupla são preparadas separadamente. Em seguida, as fitas componentes são hibridizadas. As fitas individuais do composto siRNA podem ser preparadas usando síntese orgânica em fase de solução ou fase sólida ou ambas. A síntese orgânica oferece a vantagem de as fitas oligonucleotídicas compreendendo nucleotídeos não naturais ou modificados poderem ser facilmente preparadas. Oligonucleotídeos de fita simples da invenção podem ser preparados usando síntese orgânica em fase de solução ou fase sólida ou ambas.
[00104] Em um aspecto, um dsRNA da invenção inclui pelo menos duas sequências de nucleotídeos, uma sequência senso e uma sequência antissenso. A fita senso é selecionada do grupo de sequências proporcionadas nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10, e a fita antissenso correspondente à fita senso é selecionada do grupo de sequências das Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10. Neste aspecto, uma das duas sequências é complementar à outra das duas sequências, com uma das sequências sendo substancialmente complementar a uma sequência de um mRNA gerado na expressão de um gene ANGPTL3. Como tal, em este aspecto, um dsRNA irá incluir dois oligonucleotídeos, em que um oligonucleotídeo é descrito como sendo a fita senso nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10, e o segundo oligonucleotídeo é descrito como sendo a fita antissenso correspondente à fita senso nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10. Em uma modalidade, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em oligonucleotídeos separados. Em outra modalidade, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em um único oligonucleotídeo.
[00105] O versado na técnica está bem ciente de que dsRNAs possuindo uma estrutura de duplex de entre cerca de 20 e 23 pares de bases, por exemplo, 21 pares de bases, têm sido aclamados como sendo particularmente eficazes na indução de interferência de RNA (Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20:6877-6888). Contudo, outros verificaram que estruturas de duplex de RNA menores ou maiores também podem ser eficazes (Chu e Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). Nas modalidades descritas acima, em virtude da natureza das sequências oligonucleotídicas proporcionadas nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10, dsRNAs descritos aqui podem incluir pelo menos uma fita com um comprimento mínimo de 21 nucleotídeos. Pode ser razoavelmente esperado que duplexes menores possuindo uma das sequências das Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10 menos apenas alguns nucleotídeos em uma ou ambas as extremidades podem ser similarmente eficazes em comparação com os dsRNAs descritos acima. Assim, dsRNAs possuindo uma sequência com pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleotídeos contíguos derivada de uma das sequências das Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10, e diferindo na sua capacidade para inibir a expressão de um gene ANGPTL3 em não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20, 25, ou 30% de inibição relativamente a um dsRNA compreendendo a sequência completa, são contemplados como pertencendo ao escopo da presente invenção.
[00106] Adicionalmente, os RNAs proporcionados nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10 identificam sítio(s) em um transcrito de ANGPTL3 que é(são) suscetível(suscetíveis) a clivagem mediada por RISC. Como tal, a presente invenção apresenta adicionalmente iRNAs que têm como alvo um desses sítios. Como usado aqui, é afirmado que um iRNA tem como alvo um sítio particular de um transcrito de RNA se o iRNA promover a clivagem do transcrito em qualquer parte dentro desse sítio particular. Esse iRNA incluirá geralmente pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos de uma das sequências proporcionadas nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10 acoplados a sequências de nucleotídeos adicionais tomadas da região contígua à sequência selecionada em um gene ANGPTL3.
[00107] Enquanto uma sequência alvo tem geralmente cerca de 1530 nucleotídeos de comprimento, há uma grande variação na conveniência de sequências particulares em essa gama para dirigir a clivagem de qualquer RNA alvo determinado. Vários pacotes de "software" e as diretrizes apresentadas aqui proporcionam orientação para a identificação de sequências alvo ótimas para qualquer alvo genético determinado, mas também pode ser seguida uma abordagem empírica na qual uma "janela" ou "máscara" de uma dada dimensão (como exemplo não limitador, 21 nucleotídeos) é literal ou figurativamente (incluindo, por exemplo, in silico) colocada na sequência de RNA alvo para identificar sequências no intervalo de dimensões que possam servir de sequências alvo. Ao mover progressivamente a "janela" da sequência um nucleotídeo para cima ou para baixo de uma localização inicial da sequência alvo, a sequência alvo potencial seguinte pode ser identificada, até ser identificado o conjunto completo de sequências possíveis para uma dada dimensão alvo selecionada. Este processo, acoplado a síntese sistemática e teste das sequências identificadas (usando ensaios como descrito aqui ou conhecidos na área) para identificar aquelas sequências que têm um desempenho ótimo, pode identificar aquelas sequências de RNA que, quando são alvo de um agente de iRNA, medeiam a melhor inibição da expressão do gene alvo. Assim, enquanto as sequências identificadas, por exemplo, nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10 representam sequências alvo efetivas, é contemplado que pode ser alcançada otimização adicional da eficiência da inibição ao progressivamente "caminhar na janela" um nucleotídeo para cima ou para baixo das sequências determinadas para identificar sequências com características de inibição iguais ou melhores.
[00108] Além disso, é contemplado que, para qualquer sequência identificada, por exemplo, nas Tabelas 2, 3, 7, 8, 9 e 10, pode ser alcançada otimização adicional mediante a adição ou remoção sistemática de nucleotídeos para gerar sequências maiores ou menores e teste daquelas sequências geradas ao caminhar em uma janela, do tamanho maior ou menor, para cima ou para baixo do RNA alvo a partir desse ponto. Mais uma vez, acoplar essa abordagem de geração de novos alvos candidatos ao teste de eficácia de iRNAs com base naquelas sequências alvo em um ensaio de inibição conhecido na área e/ou descrito aqui pode conduzir a aperfeiçoamentos adicionais da eficiência da inibição. Ainda adicionalmente, tais sequências otimizadas podem ser ajustadas, por exemplo, pela introdução de nucleotídeos modificados como descrito aqui ou conhecido na área, adição ou alterações em protuberâncias, ou outras modificações conhecidas na área e/ou discutidas aqui para otimizar adicionalmente a molécula (por exemplo, aumentando a estabilidade no soro ou semivida em circulação, aumentando a estabilidade térmica, intensificando a distribuição transmembranar, dirigindo para uma localização ou tipo de célula particular, aumentando a interação com enzimas da via de silenciamento, aumentando a liberação a partir de endossomos) como inibidor da expressão.
[00109] Um iRNA como descrito aqui pode conter um ou mais emparelhamentos defeituosos com a sequência alvo. Em uma modalidade, um iRNA como descrito aqui contém não mais de 3 emparelhamentos defeituosos. Se a fita antissenso do iRNA contiver emparelhamentos defeituosos com uma sequência alvo, é preferível que a área dos emparelhamentos defeituosos não esteja localizada no centro da região de complementaridade. Se a fita antissenso do iRNA contiver emparelhamentos defeituosos com uma sequência alvo, é preferível que o emparelhamento defeituoso seja restrito a situar-se dentro dos últimos 5 nucleotídeos da extremidade 5' ou 3' da região de complementaridade. Por exemplo, para um agente de iRNA de 23 nucleotídeos, a fita que é complementar a uma região de um gene ANGPTL3 geralmente não contém nenhum emparelhamento defeituoso nos 13 nucleotídeos centrais. Os métodos descritos aqui ou métodos conhecidos na área podem ser usados para determinar se um iRNA contendo um emparelhamento defeituoso com uma sequência alvo é eficaz na inibição da expressão de um gene ANGPTL3. A consideração da eficácia de iRNAs com emparelhamentos defeituosos na inibição da expressão de um gene ANGPTL3 é importante, em especial se for conhecido que a região de complementaridade particular em um gene ANGPTL3 tem variação de sequências polimórficas dentro da população. iRNAs Modificados da Invenção
[00110] Em uma modalidade, o RNA de um iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA, é quimicamente modificado para aumentar a estabilidade ou outras características benéficas. Os ácidos nucleicos apresentados na invenção podem ser sintetizados e/ou modificados por métodos bem estabelecidos na área, como os descritos em "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Editores), John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, NY, EUA, que desse modo é aqui incorporado a título de referência. Modificações incluem, por exemplo, modificações nas extremidades, por exemplo, modificações na extremidade 5' (fosforilação, conjugação, ligações invertidas) ou modificações na extremidade 3' (conjugação, nucleotídeos de DNA, ligações invertidas, etc.); modificações de bases, por exemplo, substituição com bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras, ou bases que formam pares de bases com um repertório expandido de parceiros, remoção de bases (nucleotídeos abásicos), ou bases conjugadas; modificações de açúcares (por exemplo, na posição 2' ou posição 4') ou substituição do açúcar; e/ou modificações na cadeia principal, incluindo modificação ou substituição das ligações fosfodiéster. Exemplos específicos de compostos de iRNA úteis nas modalidades descritas aqui incluem mas não estão limitados a RNAs contendo cadeias principais modificadas ou sem ligações internucleosídicas naturais. RNAs com cadeias principais modificadas incluem, entre outros, os que não têm um átomo de fósforo na cadeia principal. Para as finalidades desta especificação, e como por vezes referido na área, RNAs modificados que não têm um átomo de fósforo em sua cadeia principal internucleosídica também podem ser considerados oligonucleosídeos. Em algumas modalidades, um iRNA modificado terá um átomo de fósforo em sua cadeia principal internucleosídica.
[00111] Cadeias principais de RNA modificado incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil e outros alquil fosfonatos, incluindo 3'- alquileno fosfonatos e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos, incluindo 3'-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofos- foramidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, e borano- fosfatos com ligações normais 3'-5', análogos 2'-5'-ligados destes, e aqueles com polaridade invertida em que os pares adjacentes de unidades nucleosídicas estão ligados 3'-5' para 5'-3' ou 2'-5' para 5'-2'. Vários sais, sais mistos e formas de ácido livre estão também incluídos.
[00112] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem mas não estão limitadas às Patentes U.S. N°s 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6.239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; e Patente US RE39464, em que a totalidade do conteúdo de cada uma é desse modo incorporada aqui a título de referência.
[00113] Cadeias principais de RNA modificado que não incluem um átomo de fósforo são cadeias principais que são formadas por ligações internucleosídicas de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomos mistos e ligações internucleosídicas de alquila ou cicloalquila, ou uma ou mais ligações internucleosídicas heteroatómicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estas incluem as que têm ligações morfolino (formadas parcialmente a partir da porção de açúcar de um nucleosídeo); cadeias principais de siloxano; cadeias principais de sulfureto, sulfóxido e sulfona; cadeias principais de formacetila e tioformacetila; cadeias principais de metileno formacetila e tioformacetila; cadeias principais contendo alceno; cadeias principais de sulfamato; cadeias principais de metilenoimino e metilenohidrazino; cadeias principais de sulfonato e sulfonamida; cadeias principais de amida; e outras possuindo partes mistas de componentes N, O, S e CH2.
[00114] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação dos oligonucleosídeos acima incluem mas não estão limitadas às Patentes U.S. N°s 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439, em que a totalidade do conteúdo de cada uma é desse modo incorporada aqui a título de referência.
[00115] Em outras modalidades, miméticos de RNA adequados são contemplados para utilização em iRNAs, em que tanto o açúcar como a ligação internucleosídica, isto é, a cadeia principal, das unidades nucleotídicas são substituídos por grupos novos. As unidades de base são mantidas para hibridização com um composto alvo de ácido nucleico apropriado. Um tal composto oligomérico, um mimético de RNA que foi mostrado possuir excelentes propriedades de hibridização, é chamado de ácido nucleico peptídico (PNA). Em compostos de PNA, a cadeia principal de açúcar de um RNA é substituída por uma cadeia principal contendo amida, em particular uma cadeia principal de aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e são ligadas, direta ou indiretamente, a átomos de nitrogênio aza da porção amida da cadeia principal. Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de compostos de PNA incluem mas não estão limitadas às Patentes U.S. N°s 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262, em que a totalidade do conteúdo de cada uma é desse modo incorporada aqui a título de referência. Compostos de PNA adicionais adequados para utilização nos iRNAs da invenção são descritos, por exemplo, em Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[00116] Algumas modalidades apresentadas na invenção incluem RNAs com cadeias principais fosforotioato e oligonucleosídeos com cadeias principais heteroatômicas, e em particular --CH2--NH--CH2-, -- CH2--N(CH3)--O--CH2--[chamada de cadeia principal de metileno (metilimino) ou MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)- -CH2-- e --N(CH3)--CH2--CH2--[em que a cadeia principal fosfodiéster nativa é representada por --O--P--O--CH2--] da Patente U.S. N° 5.489.677 acima referida, e as cadeias principais de amida da Patente U.S. N° 5.602.240 acima referida. Em algumas modalidades, os RNAs apresentados aqui têm estruturas da cadeia principal de morfolino da Patente U.S. N° 5.034.506 acima referida.
[00117] RNAs modificados também podem conter uma ou mais frações de açúcar substituídas. Os iRNAs, por exemplo, dsRNAs, apresentados aqui podem incluir um dos seguintes na posição 2': OH; F; O-, S-, ou N-alquila; O-, S-, ou N-alcenila; O-, S- ou N-alcinila; ou O-alquil- O-alquila, em que a alquila, alcenila e alcinila podem ser C1 até C10 alquila ou C2 até C10 alcenila e alcinila substituídas ou não substituídas. Modificações adequadas exemplificativas incluem O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, e O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, em que n e m vão desde 1 até cerca de 10. Em outras modalidades, dsRNAs incluem um dos seguintes na posição 2': C1 até C10 alquila de cadeia curta, alquila de cadeia curta substituída, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituída, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um iRNA, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um iRNA, e outros substituintes possuindo propriedades similares. Em algumas modalidades, a modificação inclui um 2'-metoxietóxi (2'-O-- CH2CH2OCH3, também chamado de 2'-O-(2-metoxietila) ou 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) isto é, um grupo alcóxi- alcóxi. Outra modificação exemplificativa é 2'-dimetilamino-oxietóxi, isto é, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também chamado de 2'-DMAOE, como descrito aqui nos exemplos embaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietóxi (também conhecido na área como 2'-O-dimetilaminoetoxietila ou 2'- DMAEOE), isto é, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2.
[00118] Outras modificações incluem 2'-metóxi (2'-OCH3), 2'- aminopropóxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) e 2'-fluoro (2'-F). Modificações similares também podem ser feitas em outras posições do RNA de um iRNA, em particular na posição 3' do açúcar no nucleotídeo 3' terminal ou em dsRNAs 2'-5' ligados e na posição 5' do nucleotídeo 5' terminal. iRNAs também podem ter miméticos de açúcar, como frações ciclobutila, em vez do açúcar pentofuranosila. Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcares modificadas incluem mas não estão limitadas às Patentes U.S. N°s 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; e 5.700.920, em que algumas são propriedade comum com o presente pedido. A totalidade do conteúdo de cada uma das anteriores é desse modo aqui incorporada a título de referência.
[00119] Um iRNA também pode incluir modificações ou substituições de nucleobase (muitas vezes chamada na área simplesmente de "base"). Como usado aqui, nucleobases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G), e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). Nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais, como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5- halouracila e citosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8- tioalquil, 8-hidroxil e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil e outras uracilas e citosinas 5- substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-aza- adenina, 7-desazaguanina e 7-desaza-adenina e 3-desazaguanina e 3- desaza-adenina. Outras nucleobases incluem as reveladas na Patente U.S. N° 3.687.808, as reveladas em "Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine", Herdewijn, P. editor Wiley- VCH, 2008; as reveladas na "The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering", páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, editor John Wiley & Sons, 1990, as reveladas por Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613, e as reveladas por Sanghvi, Y S., Capítulo 15, "dsRNA Research and Applications", páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B., Editores, CRC Press, 1993. Algumas dessas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos apresentados na invenção. Estas incluem pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5- propinilcitosina. Foi mostrado que substituições 5-metilcitosina aumentam a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. e Lebleu, B., Editores, "dsRNA Research and Applications", CRC Press, Boca Raton, 1993, páginas 276-278) e são substituições de bases exemplificativas, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar 2'-O-metoxietila.
[00120] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de algumas das nucleobases modificadas acima notadas, bem como de outras nucleobases modificadas, incluem mas não estão limitadas às Patentes U.S. acima notadas N°s 3.687.808. 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; e 7.495.088, em que a totalidade do conteúdo de cada uma é desse modo incorporada aqui a título de referência.
[00121] O RNA de um iRNA também pode ser modificado de modo a incluir um ou mais ácidos nucleicos trancados (LNA). Um ácido nucleico trancado é um nucleotídeo possuindo uma fração ribose modificada em que a fração ribose compreende uma ponte extra conectando os carbonos 2' e 4'. Esta estrutura "tranca" efetivamente a ribose na conformação estrutural 3'-endo. Foi mostrado que a adição de ácidos nucleicos trancados a siRNAs aumenta a estabilidade do siRNA no soro, e reduz efeitos fora do alvo (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
[00122] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de nucleotídeos de ácidos nucleicos trancados incluem mas não estão limitadas às seguintes: Patentes U.S. N°s 6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; e 7.399.845, em que a totalidade do conteúdo de cada uma é desse modo incorporada aqui a título de referência.
[00123] Modificações potencialmente estabilizadoras nas extremidades de moléculas de RNA podem incluir N-(acetilaminocaproil)-4- hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N- (acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-0-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoil- uridino-3"- fosfato, dT de base invertida (idT) e outras. A revelação dessa modificação pode ser encontrada na Publicação PCT N° WO 2011/005861. iRNAs Conjugados a Ligantes
[00124] Outra modificação do RNA de um iRNA da invenção envolve a ligação química ao RNA de um ou mais ligantes, frações ou conjugados que aumentam a atividade, distribuição celular ou captação celular do iRNA. Tais frações incluem mas não estão limitadas a frações lipídicas, como uma fração de colesterol (Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., (1994) Biorg. Med. Chem. Let., 4:1053-1060), um tioéter, por exemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306309; Manoharan et al., (1993) Biorg. Med. Chem. Let., 3:2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res., 20:533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, dodecandiol ou resíduos undecila (Saison-Behmoaras et al., (1991) EMBO J, 10:1111-1118; Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259:327-330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie, 75:49-54), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-fosfonato de trietil-amônio (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18:3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14:969973), ou adamantano de ácido acético (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654), uma fração palmitila (Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta,1264:229-237), ou uma fração octadecilamina ou hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277:923-937).
[00125] Em uma modalidade, um ligante altera a distribuição, direcionamento ou tempo de vida de um agente de iRNA no qual é incorporado. Em modalidades preferidas, um ligante proporciona uma afinidade acrescida para um alvo selecionado, por exemplo, molécula, célula ou tipo de célula, compartimento, por exemplo, um compartimento celular ou de órgão, tecido, órgão ou região do corpo, por exemplo, em comparação com uma espécie desprovida de tal ligante. Ligantes preferidos não farão parte do emparelhamento de duplex em um ácido nucleico em duplex.
[00126] Ligantes podem incluir uma substância de ocorrência natural, como uma proteína (por exemplo, albumina do soro humano (HSA), lipoproteína de baixa densidade (LDL), ou globulina); carboidrato (por exemplo, uma dextrana, pululana, quitina, quitosana, inulina, ciclodextrina, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina ou ácido hialurônico); ou um lipídeo. O ligante também pode ser uma molécula recombinante ou sintética, como um polímero sintético, por exemplo, um poliaminoácido sintético. Exemplos de poliaminoácidos incluem poliaminoácido que é uma polilisina (PLL), poli ácido L-aspártico, poli ácido L-glutâmico, copolímero de estireno-anidrido do ácido maleico, copolímero poli(L-láctido-co-glicólido), copolímero de éter de divinila- anidrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietileno glicol (PEG), álcool de polivinila (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida, ou polifosfazina. Exemplos de poliaminas incluem: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina peptidomimético, poliamina dendrimérica, arginina, amidina, protamina, lipídeo catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina, ou um peptídeo alfa helicoidal.
[00127] Ligantes também podem incluir grupos de direcionamento, por exemplo, um agente de direcionamento para células ou tecidos, por exemplo, uma lectina, glicoproteína, lipídeo ou proteína, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo especificado de células, como uma célula renal. Um grupo de direcionamento pode ser uma tirotropina, melanotro- pina, lectina, glicoproteína, proteína tensoativo A, Carboidrato de mucina, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N- acetil-gulucosamina, manose multivalente, fucose multivalente, poliamino- ácidos glicosilados, galactose multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, um lipídeo, colesterol, um esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina, ou peptídeo RGD ou mimético de peptídeo RGD.
[00128] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercaladores (por exemplo, acridinas), agentes de reticulação (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, dihidrofenazina), endonucleases artificiais (por exemplo, EDTA), moléculas lipofílicas, por exemplo, colesterol, ácido cólico, adamantano de ácido acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis- O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico, dimetoxitritila, ou fenoxazina) e conjugados peptídicos (por exemplo, peptídeo de antennapedia, peptídeo Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquila, alquila substituída, marcadores etiquetados de modo radioativo, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), agentes que facilitam o transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agregados de imidazol, conjugados acridina-imidazol, complexos Eu3+ de tetra-azamacrociclos), dinitrofenila, HRP, ou AP.
[00129] Ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteínas, ou peptídeos, por exemplo, moléculas possuindo uma afinidade específica para um coligante, ou anticorpos, por exemplo, um anticorpo que se liga a um tipo especificado de células, como uma célula hepática. Ligantes também podem incluir hormônios e receptores de hormônios. Também podem incluir espécies não peptídicas, como lipídeos, lectinas, carboidratos, vitaminas, cofatores, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina, manose multivalente, ou fucose multivalente. O ligante pode ser, por exemplo, um lipopolissaca- rídeo, um ativador de p38 MAP cinase, ou um ativador de NF-KB.
[00130] O ligante pode ser uma substância, por exemplo, um fármaco, que pode aumentar a captação do agente de iRNA para o interior da célula, por exemplo, ao fragmentar o citoesqueleto da célula, por exemplo, ao fragmentar os microtúbulos, microfilamentos, e/ou filamentos intermédios da célula. O fármaco pode ser, por exemplo, táxon, vincristina, vimblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina, ou mioservina.
[00131] Em algumas modalidades, um ligante conectado a um iRNA como descrito aqui atua como modulador farmacocinético (modulador FC). Moduladores FC incluem lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolipídeos, peptídeos, agentes de ligação a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Moduladores FC exemplificativos incluem mas não estão limitados a colesterol, ácidos graxos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicerídeos, diacilglicerídeo, fosfolipídeos, esfingolipídeos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. Oligonucleotídeos que compreendem algumas ligações fosforotioato também são conhecidos por se ligarem a proteínas do soro; assim, oligonucleotídeos curtos, por exemplo, oligonucleotídeos com cerca de 5 bases, 10 bases, 15 bases ou 20 bases, compreendendo um múltiplo de ligações fosforotioato na cadeia principal também podem ser utilizados, na presente invenção, como ligantes (por exemplo, como ligantes de modulação FC). Adicionalmente, aptâmeros que se ligam a componentes do soro (por exemplo, proteínas do soro) também são adequados para utilização como ligantes de modulação FC nas modalidades descritas aqui.
[00132] Oligonucleotídeos conjugados a ligantes da invenção podem ser sintetizados usando um oligonucleotídeo que contém uma funcionalidade reativa pendente, como a derivada da conexão de uma molécula de ligação ao oligonucleotídeo (descrito embaixo). Esse oligonucleotídeo reativo pode reagir diretamente com ligantes disponíveis no mercado, ligantes que são sintetizados contendo qualquer um de uma variedade de grupos protetores, ou ligantes que têm uma fração de ligação a eles conectada.
[00133] Os oligonucleotídeos usados nos conjugados da presente invenção podem ser conveniente e rotineiramente preparados pela técnica bem conhecida de síntese em fase sólida. O equipamento para essa síntese é disponibilizado por vários vendedores, incluindo, por exemplo, a Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). Quaisquer outros meios para essa síntese conhecidos na área podem ser adicional ou alternativamente empregues. Também é conhecida a utilização de técnicas similares para preparar outros oligonucleotídeos, como os fosforotioatos e derivados alquilados.
[00134] Nos oligonucleotídeos conjugados a ligantes e nucleosídeos ligados a sequências específicas contendo moléculas de ligantes da presente invenção, os oligonucleotídeos e oligonucleosídeos podem ser montados em um sintetizador de DNA adequado usando precursores comuns de nucleotídeos ou nucleosídeos, ou precursores de conjugados de nucleotídeos ou nucleosídeos que já contêm a fração de ligação, precursores de conjugados de ligante-nucleotídeo ou nucleosídeo que já contêm a molécula de ligante, ou blocos de construção contendo não nucleosídeo ligante.
[00135] Ao usar precursores de conjugados de nucleotídeos que já contêm uma fração de ligação, a síntese dos nucleosídeos ligados a sequências específicas é tipicamente completada, e a molécula de ligante reage então com a fração de ligação para formar o oligonucleotídeo conjugado a ligante. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos ou nucleosídeos ligados da presente invenção são sintetizados com um sintetizador automatizado usando fosforamidites derivados de conjugados ligante-nucleosídeo para além de fosforamidites comuns e fosforamidites não comuns que estão disponíveis no mercado e são rotineiramente usados na síntese de oligonucleotídeos.
Conjugados de Lipídeos
[00136] Em uma modalidade, o ligante ou conjugado é um lipídeo ou molécula à base de lipídeo. Esse lipídeo ou molécula à base de lipídeo liga-se preferivelmente a uma proteína do soro, por exemplo, albumina do soro humano (HSA). Um ligante de conexão a HSA permite a distribuição do conjugado em um tecido alvo, por exemplo, um tecido alvo do corpo diferente de rim. Por exemplo, o tecido alvo pode ser o fígado, incluindo células parenquimais do fígado. Outras moléculas que podem ligar-se a HSA também podem ser usadas como ligantes. Por exemplo, pode ser usada neproxina ou aspirina. Um ligante de lipídeo ou à base de lipídeo pode (a) aumentar a resistência do conjugado a degradação, (b) aumentar o direcionamento ou transporte para uma célula ou membrana celular alvo, e/ou (c) ser usado para ajustar a ligação a uma proteína do soro, por exemplo, HSA.
[00137] Um ligante à base de lipídeo pode ser usado para inibir, por exemplo, controlar, a ligação do conjugado a um tecido alvo. Por exemplo, será menos provável que um ligante de lipídeo ou à base de lipídeo que se liga a HSA mais fortemente seja direcionado para o rim e, consequentemente, será menos provável que seja eliminado do corpo. Um ligante de lipídeo ou à base de lipídeo que se liga a HSA menos fortemente pode ser usado para direcionar o conjugado para o rim.
[00138] Em uma modalidade preferida, o ligante à base de lipídeo liga-se a HSA. De preferência, liga-se a HSA com uma afinidade suficiente para que o conjugado seja preferivelmente distribuído em um tecido diferente de rim. No entanto, é preferido que a afinidade não seja tão forte que a ligação HSA-ligante não possa ser revertida.
[00139] Em outra modalidade preferida, o ligante à base de lipídeo liga-se a HSA de modo fraco ou nulo, de modo que o conjugado será preferivelmente distribuído no rim. Também podem ser usadas outras frações de direcionamento para células do rim em vez ou para além do ligante à base de lipídeo.
[00140] Em outro aspecto, o ligante é uma fração, por exemplo, uma vitamina, que é coletada por uma célula alvo, por exemplo, uma célula em proliferação. Estes são particularmente úteis para tratar distúrbios caracterizados por proliferação indesejada de células, por exemplo, do tipo maligno ou não maligno, por exemplo, células cancerosas. Vitaminas exemplificativas incluem vitamina A, E, e K. Outras vitaminas exemplificativas incluídas são vitamina B, por exemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal ou outras vitaminas ou nutrientes coletados por células alvo, como células do fígado. Também estão incluídos HSA e lipoproteína de baixa densidade (LDL). B. Agentes de Permeação de Células
[00141] Em outro aspecto, o ligante é um agente de permeação de células, de preferência um agente de permeação de células helicoidal. De preferência, o agente é anfipático. Um agente exemplificativo é um peptídeo, como tat ou de antennopedia. Se o agente for um peptídeo, pode ser modificado, incluindo um mimético de peptidila, invertômeros, ligações não peptídicas ou pseudopeptídicas, e utilização de D-aminoácidos. O agente helicoidal é preferivelmente um agente alfa-helicoidal, que preferivelmente tem uma fase lipofílica e uma lipofóbica.
[00142] O ligante pode ser um peptídeo ou peptidomimético. Um peptidomimético (também chamado aqui de oligopeptidomimético) é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida similar a um peptídeo natural. A ligação de peptídeos e peptidomiméticos a agentes de iRNA pode afetar a distribuição farmacocinética do iRNA, tal como aumentando o reconhecimento e absorção celulares. A fração peptídica ou peptidomimética pode ter cerca de 5-50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 aminoácidos de comprimento.
[00143] Um peptídeo ou peptidomimético pode ser, por exemplo, um peptídeo de permeação de células, peptídeo catiônico, peptídeo anfipático, ou peptídeo hidrofóbico (por exemplo, consistindo maioritariamente de Tyr, Trp ou Phe). A fração peptídica pode consistir em um peptídeo dendrimérico, peptídeo restringido ou peptídeo reticulado. Em outra alternativa, a fração peptídica pode incluir uma sequência de translocação membranar (MTS) hidrofóbica. Um peptídeo exemplificativo contendo MTS hidrofóbica é RFGF com a sequência de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 13). Um análogo de RFGF (por exemplo, a sequência de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:10) contendo uma MTS hidrofóbica também pode ser uma fração de direcionamento. A fração peptídica pode ser um peptídeo de "distribuição", que pode transportar grandes moléculas polares, incluindo peptídeos, oligonucleotídeos, e proteínas, através de membranas celulares. Por exemplo, foi verificado que sequências da proteína Tat do HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO:11) e da proteína de Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:12) são capazes de funcionar como peptídeos de distribuição. Um peptídeo ou peptidomimético pode ser codificado por uma sequência aleatória de DNA, como um peptídeo identificado de uma biblioteca de expressão em fagos, ou biblioteca combinatorial uma-esférula-um-composto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Exemplos de um peptídeo ou peptidomimético preso a um agente de dsRNA via uma unidade monomérica incorporada para finalidades de direcionamento para células é um peptídeo arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), ou imitação de RGD. O comprimento de uma fração peptídica pode variar desde cerca de 5 aminoácidos até cerca de 40 aminoácidos. As frações peptídicas podem ter uma modificação estrutural, tal como para aumentar a estabilidade ou dirigir propriedades conformacionais. Podem ser usadas quaisquer das modificações estruturais descritas embaixo.
[00144] Um peptídeo RGD para utilização nas composições e métodos da invenção pode ser linear ou cíclico, e pode ser modificado, por exemplo, glicosilado ou metilado, para facilitar o direcionamento para tecido(s) específico(s). Peptídeos e peptidomiméticos contendo RGD podem incluir D-aminoácidos, bem como imitações sintéticas de RGD. Para além de RGD, é possível usar outras frações de direcionamento do ligante integrina. Conjugados preferidos deste ligante têm como alvo PECAM-1 ou VEGF.
[00145] Um "peptídeo de permeação de células" é capaz de permear uma célula, por exemplo, uma célula microbiana, como uma célula bacteriana ou fúngica, ou uma célula de mamífero, como uma célula humana. Um peptídeo de permeação de células microbianas pode ser, por exemplo, um peptídeo linear α-helicoidal (por exemplo, LL-37 ou Ceropina P1), um peptídeo contendo ligações dissulfureto (por exemplo, α- defensina, β-defensina ou bactenecina), ou um peptídeo contendo somente um ou dois aminoácidos dominantes (por exemplo, PR-39 ou indolicidina). Um peptídeo de permeação de células também pode incluir um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, um peptídeo de permeação de células pode ser um peptídeo anfipático bipartido, como MPG, que é derivado do domínio peptídico de fusão de gp41 do HIV-1 e do NLS do antígeno T grande do SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003). C. Conjugados de Carboidratos
[00146] Em algumas modalidades das composições e métodos da invenção, um oligonucleotídeo de iRNA também compreende um carboidrato. Os iRNA conjugados a carboidratos são vantajosos para a administração in vivo de ácidos nucleicos, bem como composições adequadas para utilização terapêutica in vivo, como descrito aqui. Como usado aqui, "carboidrato" refere-se a um composto que é um carboidrato per se constituído de uma ou mais unidades monossacarídicas possuindo pelo menos 6 átomos de carbono (que podem ser lineares, ramificadas ou cíclicas) com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono; ou um composto em que uma parte consiste em uma fração carboidrato constituída de uma ou mais unidades monossacarídicas em que cada uma possui pelo menos seis átomos de carbono (que pode ser linear, ramificada ou cíclica), com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono. Carboidratos representativos incluem os açúcares (mono-, di-, tri- e oligossacarídeos contendo desde cerca de 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 unidades monossacarídicas), e polissacarídeos, como amidos, glicogênio, celulose e gomas polissacarídicas. Monossaca- rídeos específicos incluem açúcares C5 e superiores (por exemplo, C5, C6, C7, ou C8); di- e trissacarídeos incluem açúcares possuindo duas ou três unidades monossacarídicas (por exemplo, C5, C6, C7, ou C8).
[00147] Em uma modalidade, um conjugado de carboidrato para utilização nas composições e métodos da invenção é um monossacarídeo. Em uma modalidade, o monossacarídeo é uma N-acetilgalactosamina, como
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[00148] Em outra modalidade, um conjugado de carboidrato para utilização nas composições e métodos da invenção é selecionado do grupo consistindo em:
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[00149] Outro conjugado de carboidrato representativo para utilização nas modalidades descritas aqui inclui mas não está limitado a
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[00150] em que, quando um dos X ou Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio.
[00151] Em algumas modalidades, o conjugado de carboidrato também compreende um ou mais ligantes adicionais como descrito acima, tais como mas não se limitando a um modulador FC e/ou um peptídeo de permeação de células.
D. Ligadores
[00152] Em algumas modalidades, o conjugado ou ligante descrito aqui pode ser ligado a um oligonucleotídeo de iRNA com vários ligadores que podem ser cliváveis ou não cliváveis.
[00153] O termo "ligador" ou "grupo de ligação" significa uma fração orgânica que conecta duas partes de um composto, por exemplo, liga de modo covalente duas partes de um composto. Ligadores compreendem tipicamente uma ligação direta ou um átomo, como oxigênio ou enxofre, uma unidade como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ou uma cadeia de átomos, tais como mas não se limitando a alquila substituída ou não substituída, alcenila substituída ou não substituída, alcinila substituída ou não substituída, arilalquila, arilalcenila, arilalcinila, heteroarilalquila, heteroarilalcenila, heteroarilal- cinila, heterociclilalquila, heterociclilalcenila, heterociclilalcinila, arila, heteroarila, heterociclila, cicloalquila, cicloalcenila, alquilarilalquila, alquilarilalcenila, alquilarilalcinila, alcenilarilalquila, alcenilarilalcenila, alcenilarilalcinila, alcinilarilalquila, alcinilarilalcenila, alcinilarilalcinila, alquilheteroarilalquila, alquilheteroarilalcenila, alquilheteroarilalcinila, alcenilheteroarilalquila, alcenilheteroarilalcenila, alcenilheteroarilalcinila, alcinilheteroarilalquila, alcinilheteroarilalcenila, alcinilheteroarilalcinila, alquilheterociclilalquila, alquilheterociclilalcenila, alquilheterocicli- lalcinila, alcenilheterociclilalquila, alcenilheterociclilalcenila, alcenilhete- rociclilalcinila, alcinilheterociclilalquila, alcinilheterociclilalcenila, alcini- lheterociclilalcinila, alquilarila, alcenilarila, alcinilarila, alquilheteroarila, alcenilheteroarila, alcinilhereroarila, em que um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, heterocíclico substituído ou não substituído; em que R8 é hidrogênio, acila, alifático ou alifático substituído. Em uma modalidade, o ligador tem entre cerca de 1-24 átomos, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 átomos, 7-17, 8-17, 6-16, 7-17, ou 8-16 átomos.
[00154] Um grupo de ligação clivável é tal que é suficientemente estável fora da célula mas que, ao entrar em uma célula alvo, é clivado, liberando as duas partes que o ligador mantém juntas. Em uma modalidade preferida, o grupo de ligação clivável é clivado pelo menos cerca de 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou mais, ou pelo menos cerca de 100 vezes mais rapidamente em uma célula alvo ou sob uma primeira condição de referência (que pode ser selecionada, por exemplo, de modo a imitar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um sujeito, ou sob uma segunda condição de referência (que pode ser selecionada, por exemplo, de modo a imitar ou representar condições encontradas no sangue ou soro).
[00155] Grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, pH, potencial redox ou a presença de moléculas de degradação. Em geral, agentes de clivagem são mais prevalentes ou encontram-se em níveis ou a atividades mais altos dentro de células do que em soro ou sangue. Exemplos de tais agentes de degradação incluem: agentes redox que são selecionados para substratos particulares ou que não têm especificidade para substratos, incluindo, por exemplo, enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores, como mercap- tanas, presentes em células, que podem degradar por redução um grupo de ligação clivável por redox; esterases; endossomos ou agentes que podem criar um ambiente acídico, por exemplo, aqueles que originam um pH de cinco ou menor; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável por ácido ao atuarem como um ácido geral, peptidases (que podem ser específicas para substratos), e fosfatases.
[00156] Um grupo de ligação clivável, como uma ligação dissulfureto, pode ser suscetível ao pH. O pH do soro humano é 7,4, ao passo que o pH intracelular médio é ligeiramente menor, variando entre cerca de 7,1-7,3. Endossomos têm um pH mais acídico, situado no intervalo de 5,56,0, e lisossomos têm um pH ainda mais acídico, de cerca de 5,0. Alguns ligadores terão um grupo de ligação clivável que é clivado a um pH preferido, desse modo liberando um lipídeo catiônico do ligante dentro da célula, ou no interior do compartimento desejado da célula.
[00157] Um ligador pode incluir um grupo de ligação clivável que pode ser clivado por uma enzima particular. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligador pode depender da célula alvo. Por exemplo, um ligante tendo como alvo o fígado pode ser ligado a um lipídeo catiônico através de um ligador que inclui um grupo éster. As células do fígado são ricas em esterases, e consequentemente o ligador será clivado de modo mais eficiente em células do fígado do que em tipos de células que não são ricas em esterases. Outros tipos de células ricas em esterases incluem células do pulmão, córtex renal, e testículos.
[00158] Ligadores que contêm ligações peptídicas podem ser usados quando o alvo são tipos de células ricas em peptidases, como células do fígado e sinoviócitos.
[00159] Em geral, a conveniência de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada testando a capacidade de um agente (ou condição) de degradação para clivar o grupo de ligação candidato. Também será desejável testar o grupo de ligação clivável candidato quanto à capacidade para resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Assim, é possível determinar a suscetibilidade relativa à clivagem entre uma primeira e uma segunda condição, em que a primeira é selecionada de modo a ser indicadora de clivagem em uma célula alvo e a segunda é selecionada de modo a ser indicadora de clivagem em outros tecidos ou fluidos biológicos, por exemplo, sangue ou soro. As avaliações podem ser realizadas em sistemas desprovidos de células, em células, em cultura de células, em cultura de órgãos ou tecidos, ou em animais completos. Pode ser útil fazer avaliações iniciais em condições desprovidas de células ou de cultura e confirmar, mediante avaliações adicionais, em animais completos. Em modalidades preferidas, compostos candidatos úteis são clivados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou cerca de 100 vezes mais rapidamente na célula (ou em condições in vitro selecionadas de modo a imitarem condições intracelulares) em comparação com sangue ou soro (ou em condições in vitro selecionadas de modo a imitarem condições extracelulares). Grupos de ligação cliváveis por redox
[00160] Em uma modalidade, um grupo de ligação clivável é um grupo de ligação clivável por redox que é clivado por redução ou oxidação. Um exemplo de um grupo de ligação clivável de modo redutor é um grupo de ligação dissulfureto (-S-S-). Para determinar se um grupo de ligação clivável candidato é um "grupo de ligação clivável de modo redutor" adequado, ou, por exemplo, é adequado para utilização com uma fração de iRNA particular e agente de direcionamento particular, é possível considerar métodos descritos aqui. Por exemplo, um candidato pode ser avaliado por incubação com ditiotreitol (DTT), ou outro agente redutor usando reagentes conhecidos na área, que imita a taxa de clivagem que seria observada em uma célula, por exemplo, uma célula alvo. Os candidatos também podem ser avaliados em condições que são selecionadas de modo a imitar condições do sangue ou soro. Em uma dessas, compostos candidatos são clivados no máximo em cerca de 10% no sangue. Em outras modalidades, compostos candidatos úteis são degradados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou cerca de 100 vezes mais rapidamente na célula (ou em condições in vitro selecionadas de modo a imitarem condições intracelulares) em comparação com sangue (ou em condições in vitro selecionadas de modo a imitarem condições extracelulares). A taxa de clivagem de compostos candidatos pode ser determinada usando ensaios comuns de cinética enzimática em condições escolhidas de modo a imitarem meios intracelulares e comparando com condições escolhidas de modo a imitarem meios extracelulares. Grupos de ligação cliváveis à base de fosfato
[00161] Em outra modalidade, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de fosfato. Um grupo de ligação clivável à base de fosfato é clivado por agentes que degradam ou hidrolisam o grupo fosfato. Um exemplo de um agente que procede à clivagem de grupos fosfato em células consiste em enzimas, como fosfatases em células. Exemplos de grupos de ligação baseados em fosfato são -O- P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, - O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S- P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Modalidades preferidas são -O-P(O)(OH)- O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O- P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Uma modalidade preferida é -O-P(O)(OH)-O-. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima. Grupos de ligação cliváveis por ácido
[00162] Em outra modalidade, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável por ácido. Um grupo de ligação clivável por ácido é um grupo de ligação que é clivado em condições acídicas. Em modalidades preferidas, grupos de ligação cliváveis por ácido são clivados em um ambiente acídico com um pH de cerca de 6,5 ou menor (por exemplo, cerca de 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0, ou menor), ou por agentes, como enzimas, que podem atuar como um ácido geral. Em uma célula, organelos específicos de pH baixo, como endossomos e lisossomos, podem proporcionar um ambiente de clivagem para grupos de ligação cliváveis por ácido. Exemplos de grupos de ligação cliváveis por ácido incluem mas não estão limitados a hidrazonas, ésteres, e ésteres de aminoácidos. Grupos cliváveis por ácido podem ter a fórmula geral -C=NN-, C(O)O, ou -OC(O). Uma modalidade preferida é quando o carbono ligado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquila substituído, ou grupo alquila terciário, como dimetil pentila ou t-butila. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima. Grupos de ligação à base de éster
[00163] Em outra modalidade, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de éster. Um grupo de ligação clivável à base de éster é clivado por enzimas, como esterases e amidases, em células. Exemplos de grupos de ligação cliváveis à base de éster incluem mas não estão limitados a ésteres de grupos alquileno, alcenileno e alcinileno. Grupos de ligação cliváveis com éster têm a fórmula geral -C(O)O-, ou -OC(O)-. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima. Grupos de clivagem à base de peptídeo
[00164] Ainda em outra modalidade, um ligador clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de peptídeo. Um grupo de ligação clivável à base de peptídeo é clivado por enzimas, como peptidases e proteases, em células. Grupos de ligação cliváveis à base de peptídeo são ligações peptídicas formadas entre aminoácidos para originar oligopeptídeos (por exemplo, dipeptídeos, tripeptídeos, etc.) e polipeptídeos. Grupos cliváveis à base de peptídeo não incluem o grupo amida (-C(O)NH-). O grupo amida pode ser formado entre qualquer alquileno, alcenileno ou alcinileno. Uma ligação peptídica é um tipo especial de ligação amida formada entre aminoácidos para dar origem a peptídeos e proteínas. O grupo de clivagem à base de peptídeo está geralmente limitado à ligação peptídica (isto é, a ligação amida) formada entre aminoácidos, dando origem a peptídeos e proteínas, e não inclui a totalidade do grupo funcional amida. Grupos de ligação cliváveis à base de peptídeo têm a fórmula geral -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, em que RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.
[00165] Em uma modalidade, um iRNA da invenção é conjugado a um carboidrato através de um ligador. Exemplos não limitadores de conjugados de iRNA carboidrato com ligadores das composições e métodos da invenção incluem mas não estão limitados a
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(Fórmula XXX),
[00166] em que, quando um de X ou Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio.
[00167] Em certas modalidades das composições e métodos da invenção, um ligante consiste em um ou mais derivados GalNAc (N- acetilgalactosamina) ligados mediante um ligador ramificado bivalente ou trivalente.
[00168] Em uma modalidade, um dsRNA da invenção é conjugado a um ligador ramificado bivalente ou trivalente selecionado do grupo de estruturas apresentadas em quaisquer das fórmulas (XXXI) - (XXXIV): Fórmula XXXI Fórmula XXXII,
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[00169] em que:
[00170] q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B e q5C representam, independentemente para cada ocorrência, 0-20 e em que a unidade repetida pode ser igual ou diferente;
[00171] P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C, cada um independentemente para cada ocorrência, estão ausentes, são CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ou CH2O;
[00172] Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C, cada um independentemente para cada ocorrência, estão ausentes, são alquileno, alquileno substituído em que um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por um ou mais de O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C C ou C(O);
[00173] R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C, cada um independentemente para cada ocorrência, estão ausentes, são NH, O, s, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, O HO H CH=N-O,
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[00174] L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B e L5C representam o ligante; isto é, cada um independentemente, para cada ocorrência, é um monossacarídeo (como GalNAc), dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo, ou polissacarídeo; e Ra é H ou cadeia lateral de um aminoácido. A conjugação trivalente de derivados GalNAc é particularmente útil para utilização com agentes de RNAi para inibir a expressão de um gene alvo, como os de fórmula (XXXV): Fórmula XXXV
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[00175] em que L5A, L5B e L5C representam um monossacarídeo, como um derivado GalNAc.
[00176] Exemplos de grupos ligadores ramificados bivalentes e trivalentes adequados de conjugação a derivados GalNAc incluem mas não estão limitados às estruturas apresentadas acima das fórmulas II_VII, XI, X, e XIII.
[00177] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de conjugados de RNA incluem mas não estão limitadas às Patentes U.S. N°s 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646; 8.106.022, em que a totalidade do conteúdo de cada uma é desse modo incorporada aqui a título de referência.
[00178] Não é necessário que todas as posições de um dado composto sejam uniformemente modificadas, e, de fato, mais do que uma das modificações acima mencionadas podem ser incorporadas em um único composto ou mesmo em um único nucleosídeo em um iRNA. A presente invenção também inclui compostos de iRNA que são compostos quiméricos.
[00179] Compostos de iRNA "quiméricos" ou "quimeras", no contexto desta invenção, são compostos de iRNA, de preferência dsRNAs, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma constituída de pelo menos uma unidade monomérica, isto é, um nucleotídeo no caso de um composto de dsRNA. Esses iRNAs contêm tipicamente pelo menos uma região em que o RNA é modificado de modo a conferir ao iRNA resistência acrescida a degradação por nucleases, captação celular acrescida, e/ou afinidade de ligação acrescida para o ácido nucleico alvo. Uma região adicional do iRNA pode servir de substrato para enzimas capazes de clivar híbridos RNA:DNA ou RNA:RNA. A título exemplificativo, RNase H é uma endonuclease celular que procede à clivagem da fita de RNA de um duplex RNA:DNA. Assim, a ativação de RNase H origina a clivagem do alvo de RNA, desse modo aumentando muito a eficiência da inibição da expressão genética pelo iRNA. Em consequência, é frequente poderem ser obtidos resultados comparáveis com iRNAs mais curtos quando são usados dsRNAs quiméricos, em comparação com desoxi dsRNAs de fosforotioato que hibridizam com a mesma região alvo. A clivagem do alvo de RNA pode ser rotineiramente detectada por eletroforese em gel e, se necessário, técnicas associadas de hibridização de ácidos nucleicos conhecidas na área.
[00180] Em certos casos, o RNA de um iRNA pode ser modificado por um grupo não ligante. Algumas moléculas não ligantes foram conjugadas a iRNAs para aumentar a atividade, distribuição celular ou captação celular do iRNA, e procedimentos para efetuar tais conjugações estão disponíveis na literatura científica. Tais frações não ligantes têm incluído frações lipídicas, como colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), uma cadeia alifática, por exemplo, dodecandiol ou resíduos undecila (Saison- Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O- hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamônio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), ou adamantano de ácido acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), uma fração palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ou uma fração octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de RNA foram listadas acima. Protocolos de conjugação típicos envolvem a síntese de RNAs contendo um ligador amino em uma ou mais posições da sequência. O grupo amino reage então com a molécula a ser conjugada usando reagentes apropriados de acoplamento ou ativação. A reação de conjugação pode ser realizada com o RNA ainda ligado ao suporte sólido ou após clivagem do RNA, em fase de solução. A purificação do conjugado de RNA por HPLC origina tipicamente o conjugado puro. Administração de um iRNA da Invenção
[00181] A administração de um iRNA da invenção em uma célula, por exemplo, uma célula em um sujeito, como um sujeito humano (por exemplo, um sujeito necessitado, como um sujeito sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos) pode ser efetuada de alguns modos diferentes. Por exemplo, a administração pode ser realizada contatando uma célula com um iRNA da invenção in vitro ou in vivo. A administração in vivo também pode ser realizada diretamente por administração de uma composição compreendendo um iRNA, por exemplo, um dsRNA, a um sujeito. Em alternativa, a administração in vivo pode ser realizada indiretamente por administração de um ou mais vetores que codificam a dirigem a expressão do iRNA. Estas alternativas são adicionalmente discutidas embaixo.
[00182] Em geral, qualquer método de administração de uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptado para utilização com um iRNA da invenção (ver, por exemplo, Akhtar S. e Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 e WO94/02595, que são aqui incorporados na sua totalidade a título de referência). Para administração in vivo, fatores a ter em consideração para administrar uma molécula de iRNA incluem, por exemplo, estabilidade biológica da molécula administrada, prevenção de efeitos inespecíficos, e acúmulo da molécula administrada no tecido alvo. Os efeitos inespecíficos de um iRNA podem ser minimizados por administração local, por exemplo, mediante injeção ou implantação direta em um tecido ou administrando topicamente a preparação. A administração local em um sítio de tratamento maximiza a concentração local do agente, limita a exposição do agente a tecidos sistêmicos que, de outro modo, poderiam ser danificados pelo agente ou que poderiam degradar o agente, e permite uma dose total menor da molécula de iRNA a ser administrada. Vários estudos mostraram o silenciamento bem sucedido de produtos genéticos quando um iRNA é administrado localmente. Por exemplo, foi mostrado que a administração intraocular de um dsRNA de VEGF por injeção intravítrea em macacos cynomolgus (Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24:132-138) e injeções subretinianas em camundongos (Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216) previnem a neovascularização em um modelo experimental de degeneração macular relacionada à idade. Adicionalmente, a injeção intratumoral direta de um dsRNA em camundongos reduz o volume tumoral (Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther.11:267-274) e pode prolongar a sobrevivência de camundongos com tumores (Kim, WJ. et al., (2006) Mol. Ther.14:343-350; Li, S. et al., (2007) Mol. Ther.15:515-523). A interferência de RNA também revelou êxito com administração local no SNC por injeção direta (Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther.12:59- 66; Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.101:17270-17275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) e nos pulmões por administração intranasal (Howard, KA. et al., (2006) Mol. Ther.14:476-484; Zhang, X. et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med.11:50-55). Para a administração sistêmica de um iRNA para o tratamento de uma doença, o RNA pode ser modificado ou, em alternativa, administrado usando um sistema de administração de fármacos; a ação de ambos os métodos consiste em prevenir a degradação rápida do dsRNA por endo- e exonucleases in vivo. A modificação do RNA ou do veículo farmacêutico também pode permitir o direcionar a composição de iRNA para o tecido alvo e evitar efeitos fora do alvo indesejáveis. Moléculas de iRNA podem ser modificadas por conjugação química a grupos lipofílicos, como colesterol, para aumentar a captação celular e prevenir a degradação. Por exemplo, um iRNA dirigido contra ApoB conjugado a uma fração de colesterol lipofílica foi injetado sistemicamente em camundongos e originou silenciamento de mRNA de apoB no fígado e jejuno (Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432:173-178). Foi mostrado que a conjugação de um iRNA a um aptâmero inibe o crescimento tumoral e medeia a regressão tumoral em um modelo de camundongo de câncer da próstata (McNamara, JO. et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). Em uma modalidade alternativa, o iRNA pode ser administrado usando sistemas de administração de fármacos, como uma nanopartícula, um dendrímero, um polímero, lipossomos, ou um sistema de administração catiônico. Sistemas de administração catiônicos de carga positiva facilitam a ligação de uma molécula de iRNA (de carga negativa) e também aumentam interações na membrana celular de carga negativa para permitir a captação eficiente de um iRNA pela célula. Lipídeos, dendrímeros, ou polímeros catiônicos podem ser ligados a um iRNA, ou induzidos a formar uma vesícula ou micélio (ver, por exemplo, Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que encerra um iRNA. A formação de vesículas ou micélios previne adicionalmente a degradação do iRNA quando administrado sistemicamente. Métodos de preparação e administração de complexos de iRNA catiônicos pertencem às capacidades do versado na técnica (ver por exemplo, Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al., (2007) J. Hypertens. 25:197-205, que são incorporados aqui na sua totalidade a título de referência). Alguns exemplos não limitadores de sistemas de administração de fármacos úteis para administração sistêmica de iRNAs incluem DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN. et al., (2003), supra), Oligofectamina, "partículas sólidas de ácido nucleico lipídeo" (Zimmermann, TS. et al., (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY. et al., (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328; Pal, A. et al., (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenoimina (Bonnet ME. et al., (2008) Pharm. Res. 16 agosto Epub anterior à publicação impressa; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), peptídeos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), e poliamidoaminas (Tomalia, DA. et al., (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm. Res.16:1799-1804). Em algumas modalidades, um iRNA forma um complexo com ciclodextrina para administração sistêmica. Métodos de administração e composições farmacêuticas de iRNAs e ciclodextrinas podem ser encontrados na Patente U.S. N° 7.427.605, que é aqui incorporada a título de referência na sua totalidade. iRNAs da Invenção codificados por Vetores
[00183] iRNA tendo como alvo o gene ANGPTL3 pode ser expresso a partir de unidades de transcrição inseridas em vetores de DNA ou RNA (ver, por exemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Publicação PCT Internacional N° WO 00/22113, Conrad, Publicação PCT Internacional N° WO 00/22114, e Conrad, Patente U.S. N° 6.054.299). A expressão pode ser transitória (da ordem de horas até semanas) ou prolongada (semanas até meses ou mais), dependendo da construção específica usada e do tipo de tecido ou célula alvo. Esses transgenes podem ser introduzidos na forma de uma construção linear, um plasmídeo circular, ou um vetor viral, que pode ser um vetor integrante ou não integrante. O transgene também pode ser construído de modo a permitir que seja herdado como um plasmídeo extracromossômico (Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1292).
[00184] A fita individual ou fitas de um iRNA podem ser transcritas a partir de um promotor em um vetor de expressão. Quando for desejado expressar duas fitas separadas para gerar, por exemplo, um dsRNA, dois vetores de expressão separados podem ser cointroduzidos (por exemplo, por transfeção ou infecção) em uma célula alvo. Em alternativa, cada fita individual de um dsRNA pode ser transcrita por promotores em que ambos estão localizados no mesmo plasmídeo de expressão. Em uma modalidade, um dsRNA é expresso na forma de polinucleotídeos com repetições invertidas ligados por uma sequência polinucleotídica ligadora, de modo que o dsRNA tem uma estrutura de haste e alça.
[00185] Vetores de expressão de iRNA são geralmente plasmídeos de DNA ou vetores virais. Vetores de expressão compatíveis com células eucarióticas, de preferência os compatíveis com células de vertebrado, podem ser usados para produzir construções recombinantes para a expressão de um iRNA como descrito aqui. Vetores de expressão de células eucarióticas são bem conhecidos na área e são disponibilizados por algumas fontes comerciais. Tipicamente, esses vetores são proporcionados contendo sítios de restrição convenientes para inserção do segmento de ácido nucleico desejado. A administração de vetores expressando iRNA pode ser sistêmica, como por administração intravenosa ou intramuscular, por administração em células alvo explantadas do paciente seguido de reintrodução no paciente, ou por qualquer outro meio que permita a introdução em uma célula alvo desejada.
[00186] Plasmídeos de expressão de iRNA podem ser transfetados para o interior de células alvo na forma de um complexo com veículos lipídicos catiônicos (por exemplo, Oligofectamina) ou veículos à base de lipídeos não catiônicos (por exemplo, Transit-TKOTM). Múltiplas transfeções de lipídeos para silenciamentos mediados por iRNA tendo como alvo diferentes regiões de um RNA alvo ao longo de um período de uma semana ou mais também são contempladas pela invenção. A introdução bem sucedida de vetores em células hospedeiras pode ser monitorada usando vários métodos conhecidos. Por exemplo, a transfeção transitória pode ser sinalizada com um repórter, tal como um marcador fluorescente, como Proteína Verde Fluorescente (GFP). A transfeção estável de células ex vivo pode ser assegurada usando marcadores que dotam a célula transfetada de resistência a fatores ambientais específicos (por exemplo, antibióticos e fármacos), como resistência a higromicina B.
[00187] Sistemas de vetores virais que podem ser utilizados com os métodos e composições descritos aqui incluem mas não estão limitados a (a) vetores de adenovírus; (b) vetores de retrovírus, incluindo mas não se limitando a vetores lentivirais, vírus da leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vetores de vírus adeno-associados; (d) vetores de vírus herpes simplex; (e) vetores de SV 40; (f) vetores de vírus polioma; (g) vetores de vírus papiloma; (h) vetores de picornavírus; (i) vetores de pox vírus, como ortopox, por exemplo, vetores de vírus vacínia, ou avipox, por exemplo, varíola dos canários ou varíola das aves domésticas; e (j) um adenovírus dependente de auxiliares ou "gutless". Vírus defeituosos para replicação também podem ser vantajosos. Diferentes vetores serão ou não serão incorporados no genoma das células. As construções podem incluir sequências virais para transfeção, se desejado. Em alternativa, a construção pode ser incorporada em vetores capazes de replicação epissômica, por exemplo, vetores de EPV e EBV. Construções para a expressão recombinante de um iRNA irão geralmente requerer elementos reguladores, por exemplo, promotores, intensificadores, etc., para assegurar a expressão do iRNA em células alvo. Outros aspectos a ter em consideração para vetores e construções são adicionalmente descritos embaixo.
[00188] Vetores úteis para a administração de um iRNA incluirão elementos reguladores (promotor, intensificador, etc.) suficientes para a expressão do iRNA na célula ou tecido alvo desejado. Os elementos reguladores podem ser escolhidos de modo a proporcionar expressão constitutiva ou regulada/induzível.
[00189] A expressão do iRNA pode ser regulada de modo preciso, por exemplo, usando uma sequência reguladora induzível que é sensível a certos reguladores fisiológicos, por exemplo, níveis de glucose em circulação, ou hormônios (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Tais sistemas de expressão induzível, adequados para o controle da expressão de dsRNA em células ou em mamíferos incluem, por exemplo, regulação por ecdisona, por estrogênio, progesterona, tetraciclina, indutores químicos da dimerização, e isopropil-beta-D1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). O versado na técnica será capaz de escolher a sequência reguladora/promotora apropriada com base na utilização pretendida do transgene de iRNA.
[00190] Podem ser usados vetores virais que contêm sequências de ácidos nucleicos codificando um iRNA. Por exemplo, pode ser usado um vetor retroviral (ver Miller et al., (1993) Meth. Enzymol. 217:581-599). Esses vetores retrovirais contêm os componentes necessários para o empacotamento correto do genoma viral e integração no DNA da célula hospedeira. As sequências de ácidos nucleicos codificando um iRNA são clonadas em um ou mais vetores, o que facilita a administração do ácido nucleico em um paciente. Mais detalhes sobre vetores retrovirais podem ser encontrados, por exemplo, em Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que descreve a utilização de um vetor retroviral para administrar o gene mdr1 em células tronco hematopoiéticas de modo a tornar as células tronco mais resistentes a quimioterapia. Outras referências que ilustram a utilização de vetores retrovirais em terapia genética são: Clowes et al., (1994) J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al., (1994) Blood 83:1467-1473; Salmons e Gunzberg, (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; e Grossman e Wilson, (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114. Vetores lentivirais contemplados para utilização incluem, por exemplo, os vetores à base de HIV descritos nas Patentes U.S. N°s 6.143.520; 5.665.557; e 5.981.276, que são aqui incorporadas a título de referência.
[00191] Adenovírus também são contemplados para utilização na administração de iRNAs da invenção. Adenovírus são veículos especialmente atrativos, por exemplo, para a administração de genes em epitélios respiratórios. Os adenovírus infectam naturalmente epitélios respiratórios, onde causam uma doença ligeira. Outros alvos de sistemas de administração baseados em adenovírus são o fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais, e músculo. Os adenovírus têm a vantagem de serem capazes de infectar células não em divisão. Kozarsky e Wilson, (1993) Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 apresentam uma revisão de terapia genética baseada em adenovírus. Bout et al., (1994) Human Gene Therapy 5:3- 10 demonstraram a utilização de vetores de adenovírus para transferir genes para os epitélios respiratórios de macacos rhesus. Outros casos de utilização de adenovírus em terapia genética podem ser encontrados em Rosenfeld et al., (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155; Mastrangeli et al., (1993) J. Clin. Invest. 91:225234; Publicação PCT WO94/12649; e Wang et al., (1995) Gene Therapy 2:775-783. Um vetor AV adequado para expressão de um iRNA apresentado na invenção, um método de construção do vetor AV recombinante, e um método de administração do vetor em células alvo, são descritos em Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010.
[00192] Vetores de vírus adeno-associados (AAV) também podem ser usados para administrar um iRNA da invenção (Walsh et al., (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300; Patente U.S. N° 5.436.146). Em uma modalidade, o iRNA pode ser expresso na forma de duas moléculas separadas de RNA de fita simples complementares a partir de um vetor AAV recombinante possuindo, por exemplo, o promotor de RNA U6 ou H1, ou o promotor do citomegalovírus (CMV). Vetores AAV adequados para expressão do dsRNA apresentado na invenção, métodos de construção do vetor AV recombinante, e métodos de administração dos vetores em células alvo são descritos em Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Patente U.S. N° 5,252,479; Patente U.S. N° 5,139,941; Pedido de Patente Internacional N° WO 94/13788; e Pedido de Patente Internacional N° WO 93/24641, em que a totalidade das revelações é aqui incorporada a título de referência.
[00193] Outro vetor viral adequado para administração de um iRNA da invenção é um pox vírus, como um vírus vacínia, por exemplo, vacínia atenuado, como Vírus Ancara Modificado (MVA) ou NYVAC, um avipox, como varíola das aves domésticas ou varíola dos canários.
[00194] O tropismo de vetores virais pode ser modificado por pseudotipagem dos vetores com proteínas do envelope ou outros antígenos de superfície de outros vírus, ou por substituição de diferentes proteínas capsídicas virais, consoante o apropriado. Por exemplo, vetores lentivirais podem ser submetidos a pseudotipagem com proteínas de superfície do vírus da estomatite vesicular (VSV), raiva, Ébola, Mokola, e afins. Vetores AAV podem ser fabricados de modo a terem como alvo diferentes células por manipulação dos vetores para expressarem diferentes serótipos de proteínas capsídicas; ver, por exemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801, em que a totalidade da revelação é aqui incorporada a título de referência.
[00195] A preparação farmacêutica de um vetor pode incluir o vetor em um diluente aceitável, ou pode incluir uma matriz de liberação lenta onde está embutido o veículo de administração genética. Em alternativa, quando o vetor completo de administração genética puder ser produzido intacto a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode incluir uma ou mais células que produzem o sistema de administração genética. Composições Farmacêuticas da Invenção
[00196] A presente invenção também inclui composições e formulações farmacêuticas que incluem os iRNAs da invenção. Em uma modalidade, são proporcionadas aqui composições farmacêuticas contendo um iRNA, como descrito aqui, e um veículo farmacêuticamente aceitável. As composições farmacêuticas contendo o iRNA são úteis para tratar uma doença ou distúrbio associado à expressão ou atividade de um gene ANGPTL3, por exemplo, um distúrbio do metabolismo de lipídeos, como hipertrigliceridemia.
[00197] Tais composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de administração. Um exemplo consiste em composições que são formuladas para administração sistêmica via administração parentérica, por exemplo, por administração intravenosa (IV), ou para administração subcutânea. Outro exemplo consiste em composições que são formuladas para administração direta no fígado, por exemplo, por infusão no fígado, como por infusão contínua com bomba.
[00198] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em dosagens suficientes para inibir a expressão de um gene ANGPTL3. Em geral, uma dose adequada de um iRNA da invenção estará situada no intervalo de cerca de 0,001 até cerca de 200,0 miligramas por quilograma de peso do corpo do receptor por dia, em geral no intervalo de cerca de 1 até 50 mg por quilograma de peso do corpo por dia. Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado a cerca de 0,01 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, ou cerca de 50 mg/kg por dose única.
[00199] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado a uma dose de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ou cerca de 10 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[00200] Em outra modalidade, o dsRNA é administrado a uma dose de cerca de 0,1 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 50 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 50 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 40 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 45 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,1 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 45 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 45 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 40 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,1 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 40 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 40 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,1 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 30 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 30 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,1 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 20 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 20 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 15 até cerca de 20 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[00201] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado a uma dose de cerca de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ou cerca de 10 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[00202] Em outra modalidade, o dsRNA é administrado a uma dose de cerca de 0,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 50 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 50 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 40 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 45 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 45 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 45 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 40 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 40 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 40 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 30 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 30 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 20 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 20 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 15 até cerca de 20 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[00203] Por exemplo, aos sujeitos pode ser administrada uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou cerca de 50 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[00204] A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez ao dia, ou o iRNA pode ser administrado na forma de duas, três, ou mais subdoses em intervalos apropriados ao longo do dia, ou mesmo usando infusão ou administração contínua mediante uma formulação de liberação controlada. Nesse caso, a quantidade do iRNA contida em cada subdose deve ser correspondentemente menor para alcançar a dosagem diária total. A unidade de dosagem também pode ser composta para administração ao longo de vários dias, por exemplo, usando uma formulação convencional de liberação prolongada que proporciona liberação prolongada do iRNA ao longo de um período de vários dias. Formulações de liberação prolongada são bem conhecidas na área e são particularmente úteis para a administração de agentes em um sítio particular, como pode ser usado com os agentes da presente invenção. Em essa modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária.
[00205] O efeito de uma única dose nos níveis de ANGPTL3 pode ser duradouro, de modo que doses subsequentes são administradas em intervalos de não mais do que 3, 4, ou 5 dias, ou em intervalos de não mais do que 1, 2, 3, ou 4 semanas.
[00206] O versado na técnica apreciará que certos fatores podem influenciar a dosagem e calendarização requeridas para tratar eficazmente um sujeito, incluindo mas não se limitando à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos prévios, o estado geral de saúde e/ou idade do sujeito, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um sujeito com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. Podem ser feitas estimativas de dosagens eficazes e semividas in vivo para os iRNAs individuais abrangidos pela invenção usando metodologias convencionais ou com base em testes in vivo usando um modelo animal apropriado, como descrito aqui em outro local.
[00207] Progressos em genética murina geraram alguns modelos de camundongo para o estudo de várias doenças humanas, como distúrbios do metabolismo de lipídeos, que irão beneficiar de redução da expressão de ANGPTL3. Esses modelos podem ser usados para teste in vivo de iRNA, bem como para determinar uma dose terapeuticamente eficaz. Modelos adequados de camundongo são conhecidos na área e incluem, por exemplo, um camundongo obeso (ob/ob) contendo uma mutação no gene obeso (ob) (Wiegman et al., (2003) Diabetes, 52:1081-1089); um camundongo contendo nocaute homozigótico de um receptor de LDL (camundongo LDLR -/-; Ishibashi et al., (1993) J Clin Invest 92(2):883-893); modelo de camundongo de aterosclerose induzida por dieta (Ishida et al., (1991) J. Lipid. Res., 32:559-568); e modelo de camundongo nocaute em lipoproteína lipase heterozigótica (Weistock et al., (1995) J. Clin. Invest. 96(6):2555-2568).
[00208] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de alguns modos, dependendo de se é desejado tratamento local ou sistêmico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (por exemplo, mediante um emplastro transdérmico), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica, oral ou parentérica. A administração parentérica inclui injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; subdérmica, por exemplo, via um dispositivo implantado; ou intracraniana, por exemplo, por administração intraparênquima, intratecal ou intraventricular.
[00209] O iRNA pode ser administrado de um modo tendo como alvo um tecido particular, como o fígado (por exemplo, os hepatócitos do fígado).
[00210] Composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizações, líquidos e pós. Veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e afins podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e afins também podem ser úteis. Formulações tópicas adequadas incluem aquelas em que os iRNAs apresentados na invenção estão misturados com um agente de administração tópica, como lipídeos, lipossomos, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos. Lipídeos e lipossomos adequados incluem neutros (por exemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfos- fatidil colina DMPC, diestearolifosfatidil colina), negativos (por exemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) e catiônicos (por exemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP e dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). iRNAs apresentados na invenção podem ser encapsulados no interior de lipossomos ou podem formar complexos com os mesmos, em particular com lipossomos catiônicos. Em alternativa, iRNAs podem ser complexados com lipídeos, em particular com lipídeos catiônicos. Ácidos graxos e ésteres adequados incluem mas não estão limitados a ácido araquidônico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um éster de C1-20 alquila (por exemplo, miristato de isopropila IPM), monoglicerídeo, diglicerídeo ou respectivo sal farmaceuticamente aceitável. Formulações tópicas são descritas em detalhe na Patente U.S. N° 6.747.014, que é incorporada aqui a título de referência. Formulações de iRNA Compreendendo Montagens Moleculares Membranosas
[00211] Um iRNA para utilização nas composições e métodos da invenção pode ser formulado para administração em uma montagem molecular membranosa, por exemplo, um lipossomo ou um micélio. Como usado aqui, o termo "lipossomo" refere-se a uma vesícula composta de lipídeos anfifílicos dispostos em pelo menos uma bicamada, por exemplo, uma bicamada ou uma pluralidade de bicamadas. Lipossomos incluem vesículas unilamelares e multilamelares que têm uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição de iRNA. O material lipofílico isola o interior aquoso de um exterior aquoso, que tipicamente não inclui a composição de iRNA, apesar de poder fazê-lo, em alguns exemplos. Lipossomos são úteis para a transferência e distribuição de ingredientes ativos no sítio de ação. Uma vez que a membrana lipossômica é estruturalmente similar a membranas biológicas, quando lipossomos são aplicados em um tecido, a bicamada lipossômica é fundida à bicamada das membranas celulares. À medida que a fusão do lipossomo e célula progride, o conteúdo aquoso interno que inclui o iRNA é distribuído no interior da célula onde o iRNA pode se ligar especificamente a um RNA alvo e pode mediar RNAi. Em alguns casos, os lipossomos também são especificamente direcionados, por exemplo, para dirigir o iRNA para tipos de células particulares.
[00212] Um lipossomo contendo um agente de RNAi pode ser preparado por uma variedade de métodos. Em um exemplo, o componente lipídico de um lipossomo é dissolvido em um detergente, de modo que são formados micélios com o componente lipídico. Por exemplo, o componente lipídico pode ser um lipídeo ou conjugado lipídico catiônico anfipático. O detergente pode ter uma alta concentração crítica de micélios e pode ser não iônico. Detergentes exemplificativos incluem colato, CHAPS, octilglucosídeo, desoxicolato, e lauroil sarcosina. A preparação do agente de RNAi é então adicionada aos micélios que incluem o componente lipídico. Os grupos catiônicos presentes no lipídeo interagem com o agente de RNAi e condensam em redor do agente de RNAi, formando um lipossomo. Após a condensação, o detergente é removido, por exemplo, mediante diálise, dando origem a uma preparação lipossômica de agente de RNAi.
[00213] Se necessário, um composto veículo que auxilia a condensação pode ser adicionado durante a reação de condensação, por exemplo, mediante adição controlada. Por exemplo, o composto veículo pode ser um polímero diferente de um ácido nucleico (por exemplo, espermina ou espermidina). O pH também pode ser ajustado para favorecer a condensação.
[00214] Métodos de produção de veículos de administração de polinucleotídeos estáveis, que incorporam um complexo polinucleo- tídeo/lipídeo catiônico como componentes estruturais do veículo de administração, são adicionalmente descritos, por exemplo, em WO 96/37194, cuja totalidade do conteúdo é aqui incorporada a título de referência. A formação de lipossomos também pode incluir um ou mais aspectos de métodos exemplificativos descritos em Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417; Patente U.S. N° 4.897.355; Patente U.S. N° 5.171.678; Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol. 23:238; Olson et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9; Szoka et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169; Kim et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339; e Fukunaga et al., (1984) Endocrinol.115:757. Técnicas habitualmente usadas de preparação de agregados lipídicos com dimensão apropriada para utilização como veículos de administração incluem sonicação e congelação-descongelação mais extrusão (ver, por exemplo, Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161. Pode ser usada microfluidização quando forem desejados agregados consistentemente pequenos (50 até 200 nm) e relativamente uniformes (Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169. Esses métodos são facilmente adaptados ao empacotamento de preparações de agente de RNAi em lipossomos.
[00215] Os lipossomos caiem em duas grandes classes. Lipossomos catiônicos são lipossomos de carga positiva que interagem com as moléculas de ácidos nucleicos de carga negativa para formar um complexo estável. O complexo ácido nucleico/lipossomo de carga positiva liga-se à superfície celular de carga negativa e é interiorizado em um endossomo. Devido ao pH acídico dentro do endossomo, os lipossomos sofrem ruptura, liberando o seu conteúdo no citoplasma da célula (Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980-985).
[00216] Os lipossomos, que são sensíveis ao pH ou de carga negativa, armadilham ácidos nucleicos em vez de complexarem com eles. Uma vez que o ácido nucleico e o lipídeo têm carga similar, ocorre repulsão em vez de formação de complexo. Ainda assim, algum ácido nucleico é armadilhado no interior aquoso destes lipossomos. Lipossomos sensíveis ao pH têm sido usados para distribuir ácidos nucleicos codificando o gene da timidina cinase em monocamadas de células em cultura. A expressão do gene exógeno foi detectada nas células alvo (Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19:269-274).
[00217] Um grande tipo de composição lipossômica inclui fosfolipídeos diferentes de fosfatidilcolina de derivação natural. Composições lipossômicas neutras, por exemplo, podem ser formadas de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Composições lipossômicas aniônicas são geralmente formadas de dimiristoil fosfatidilglicerol, ao passo que lipossomos fusogênicos aniônicos são formados principalmente de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossômica é formada de fosfatidilcolina (PC), tal como, por exemplo, PC de soja, e PC de ovo. Outro tipo é formado de misturas de fosfolipídeo e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[00218] Exemplos de outros métodos para introduzir lipossomos em células in vitro e in vivo incluem a Patente U.S. N° 5.283.185; Patente U.S. N° 5.171.678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, (1994) J. Biol. Chem. 269:2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3:649; Gershon, (1993) Biochem. 32:7143; e Strauss, (1992) EMBO J.11:417.
[00219] Sistemas lipossômicos não iônicos também foram examinados para determinar a sua utilidade na administração de fármacos na pele, em particular sistemas compreendendo tensoativo não iônico e colesterol. Formulações lipossômicas não iônicas compreendendo NovasomeTM I (dilaurato de glicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) e NovasomeTM II (diestearato de glicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) foram usadas para administrar ciclosporina-A na derme da pele de camundongo. Os resultados indicaram que esses sistemas lipossômicos não iônicos conseguiram facilitar a deposição de ciclosporina A em diferentes camadas da pele (Hu et al., (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466).
[00220] Lipossomos também incluem lipossomos "estericamente estabilizados", um termo que, como usado aqui, refere-se a lipossomos compreendendo um ou mais lipídeos especializados que, quando incorporados em lipossomos, originam tempos de vida em circulação aumentados relativamente a lipossomos desprovidos desses lipídeos especializados. Exemplos de lipossomos estericamente estabilizados são aqueles em que parte da porção lipídica formadora de vesícula do lipossomo (A) compreende um ou mais glicolipídeos, como monossialogangliosídeo GM1, ou (B) é derivatizada com um ou mais polímeros hidrofílicos, como uma fração de polietileno glicol (PEG). Sem pretender ficar restringido por qualquer teoria particular, crê-se na área que, pelo menos para lipossomos estericamente estabilizados contendo gangliosídeos, esfingomielina, ou lipídeos derivatizados com PEG, a semivida em circulação acrescida destes lipossomos estericamente estabilizados deriva de uma captação reduzida para o interior de células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53:3765).
[00221] Vários lipossomos compreendendo um ou mais glicolipídeos são conhecidos na área. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507:64) relataram a capacidade de monossialogangliosídeo GM1, sulfato de galactocerebrosídeo e fosfatidilinositol para melhorar as semividas no sangue de lipossomos. Estas descobertas foram expostas por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85,:6949). A Patente U.S. N° 4.837.028 e WO 88/04924, ambas atribuídas a Allen et al., revelam lipossomos compreendendo (1) esfingomielina e (2) o gangliosídeo GM1 ou um éster de sulfato de galactocerebrosídeo. A Patente U.S. N° 5.543.152 (Webb et al.) revela lipossomos compreendendo esfingomielina. Lipossomos compreendendo 1,2-sn- dimiristoilfosfatidilcolina são revelados em WO 97/13499 (Lim et al).
[00222] Em uma modalidade são usados lipossomos catiônicos. Os lipossomos catiônicos têm a vantagem de conseguirem se fundir à membrana celular. Lipossomos não catiônicos, apesar de não conseguirem se fundir tão eficientemente à membrana plasmática, são coletados por macrófagos in vivo e podem ser usados para distribuir agentes de RNAi em macrófagos.
[00223] Outras vantagens de lipossomos incluem: lipossomos obtidos de fosfolipídeos naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; lipossomos podem incorporar uma gama ampla de fármacos solúveis em água e lipídeos; lipossomos podem proteger agentes de RNAi encapsulados em seus compartimentos internos de metabolismo e degradação (Rosoff, em "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, volume 1, página 245). Considerações importantes na preparação de formulações de lipossomos são a carga superficial do lipídeo, dimensão da vesícula e o volume aquoso dos lipossomos.
[00224] Um lipídeo catiônico sintético de carga positiva, cloreto de N- [1-(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), pode ser usado para formar lipossomos pequenos que interagem espontaneamente com ácido nucleico para formar complexos lipídeo-ácido nucleico que são capazes de se fundir aos lipídeos de carga negativa das membranas celulares de células de cultura de tecidos, resultando na distribuição do agente de RNAi (ver, por exemplo, Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417, e Patente U.S. N° 4.897.355 quanto a uma descrição de DOTMA e sua utilização com DNA).
[00225] Um análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoilóxi)-3- (trimetilamônia)propano (DOTAP), pode ser usado em combinação com um fosfolipídeo para formar vesículas que complexam com DNA. Lipofectina™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) é um agente eficaz para a administração de ácidos nucleicos altamente aniônicos em células de cultura de tecidos vivos que compreendem lipossomos de DOTMA de carga positiva que interagem espontaneamente com polinucleotídeos de carga negativa para formar complexos. Quando são usados lipossomos com carga suficientemente positiva, a carga líquida dos complexos resultantes também é positiva. Complexos de carga positiva preparados desse modo ligam-se espontaneamente a superfícies celulares de carga negativa, fundem-se à membrana plasmática, e distribuem eficientemente ácidos nucleicos funcionais, por exemplo, em células de cultura de tecidos. Outro lipídeo catiônico disponível no mercado, 1,2-bis(oleoilóxi)-3,3-(trimetilamônia) propano ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) difere de DOTMA pelo fato de as frações oleoíla estarem ligadas por ligações éster, em vez de éter.
[00226] Outros compostos de lipídeos catiônicos relatados incluem os que foram conjugados a uma variedade de frações, incluindo, por exemplo, carboxiespermina que foi conjugada a um de dois tipos de lipídeos e inclui compostos como dioctaoleoilamida de 5-carboxiesper- milglicina ("DOGS") (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) e 5-carboxiespermil-amida de dipalmitoilfosfatidiletanolamina ("DPPES") (ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5.171.678).
[00227] Outro conjugado de lipídeo catiônico inclui derivatização do lipídeo com colesterol ("DC-Chol") que foi formulado em lipossomos em combinação com DOPE (Ver Gao, X. e Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun.179:280). Foi relatado que lipopolilisina, preparada por conjugação de polilisina a DOPE, é eficaz para transfeção na presença de soro (Zhou, X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065:8). Para certas linhagens de células, é afirmado que estes lipossomos contendo lipídeos catiônicos conjugados exibem menor toxicidade e proporcionam transfeção mais eficiente do que as composições contendo DOTMA. Outros produtos de lipídeos catiônicos disponíveis no mercado incluem DMRIE e DMRIE-HP (Vical, La Jolla, Califórnia) e Lipofectamina (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Outros lipídeos catiônicos adequados para distribuição de oligonucleotídeos são descritos nos documentos WO 98/39359 e WO 96/37194.
[00228] Formulações lipossômicas são particularmente adequadas para administração tópica; os lipossomos apresentam várias vantagens relativamente a outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos secundários reduzidos relacionados a alta absorção sistêmica do fármaco administrado, acúmulo acrescido do fármaco administrado no alvo desejado, e a capacidade de administrar um agente de RNAi na pele. Em algumas implementações, lipossomos são usados para administrar um agente de RNAi em células da epiderme e também para intensificar a penetração do agente de RNAi em tecidos da derme, por exemplo, na pele. Por exemplo, os lipossomos podem ser aplicados topicamente. A administração tópica na pele de fármacos formulados como lipossomos foi documentada (ver, por exemplo, Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, volume 2,405-410 e du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18:259-265; Mannino, R. J. e Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6:682-690; Itani, T. et al., (1987) Gene 56:267276; Nicolau, C. et al. (1987) Meth. Enzymol.149:157-176; Straubinger, R. M. e Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol.101:512-527; Wang, C. Y. e Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855).
[00229] Sistemas lipossômicos não iônicos também foram examinados para determinar a sua utilidade na administração de fármacos na pele, em particular sistemas compreendendo tensoativo não iônico e colesterol. Formulações lipossômicas não iônicas compreendendo Novasome I (dilaurato de glicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) e Novasome II (diestearato de glicerila/colesterol/éter de polioxietileno-10-estearila) foram usadas para administrar um fármaco na derme da pele de camundongo. Tais formulações com agente de RNAi são úteis para tratar um distúrbio dermatológico.
[00230] Lipossomos que incluem iRNA podem ser tornados altamente deformáveis. Essa deformabilidade pode permitir que os lipossomos penetrem através de poros menores do que o raio médio do lipossomo. Por exemplo, transfersomos são um tipo de lipossomos deformáveis. Transferossomos podem ser preparados adicionando ativadores de borda de superfície, habitualmente tensoativos, a uma composição lipossômica comum. Transfersomos que incluem um agente de RNAi podem ser administrados, por exemplo, subcutaneamente por infecção para administrar o agente de RNAi em queratinócitos da pele. Para atravessarem pele intata de mamífero, vesículas lipídicas devem passar por uma série de poros finos, cada um com um diâmetro menor do que 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Adicionalmente, devido às propriedades lipídicas, estes transferossomos podem sofrer auto-otimização (adaptação ao formato dos poros, por exemplo, na pele), autorreparação, e frequentemente conseguem alcançar seus alvos sem fragmentação, e muitas vezes autocarga.
[00231] Outras formulações convenientes para a presente invenção são descritas nos pedidos provisórios dos Estados Unidos N°s de série 61/018.616, depositada em 2 de janeiro, 2008; 61/018.611, depositada em 2 de janeiro, 2008; 61/039.748, depositada em 26 de março, 2008; 61/047,087, depositada em 22 de abril, 2008, e 61/051.528, depositada em 8 de maio, 2008. O pedido PCT no. PCT/US2007/080331, depositada em 3 de outubro, 2007, também descreve formulações que são convenientes para a presente invenção.
[00232] Transfersomos são ainda outro tipo de lipossomos, e são agregados lipídicos altamente deformáveis que são candidatos atrativos para veículos de administração de fármacos. Os transfersomos podem ser descritos como gotículas lipídicas que são tão altamente deformáveis que conseguem facilmente penetrar em poros menores do que a gotícula. Os transfersomos são adaptáveis ao ambiente onde são usados, por exemplo, sofrem auto-otimização (adaptação ao formato dos poros na pele), autorreparação, frequentemente alcançam seus alvos sem fragmentação, e muitas vezes autocarga. Para preparar transfersomos é possível adicionar ativadores de borda de superfície, habitualmente tensoativos, a uma composição lipossômica comum. Transfersomos têm sido usados para administrar albumina do soro na pele. Foi mostrado que a administração de albumina do soro mediada por transfersomos é tão eficaz quanto uma injeção subcutânea de uma solução contendo albumina do soro.
[00233] Os tensoativos têm grande aplicação em formulações como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomos. O modo mais comum de classificar e ordenar as propriedades dos muitos tipos diferentes de tensoativos, naturais e sintéticos, consiste em usar o equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB). A natureza do grupo hidrofílico (também chamado de "cabeça") proporciona o meio mais útil de categorizar os diferentes tensoativos usados em formulações (Rieger, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., 1988, página 285).
[00234] Se a molécula de tensoativo não estiver ionizada, é classificada como tensoativo não iônico. Tensoativos não iônicos têm aplicação vasta em produtos farmacêuticos e cosméticos e podem ser usados em uma gama larga de valores de pH. Em geral, seus valores HLB variam desde 2 até cerca de 18, dependendo da sua estrutura. Tensoativos não iônicos incluem ésteres não iônicos, como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de glicerila, ésteres de poliglicerila, ésteres de sorbitana, ésteres de sucrose, e ésteres etoxilados. Alcanolamidas e éteres não iônicos, como etoxilados de álcoois graxos, álcoois propoxilados, e polímeros em bloco etoxilados/ propoxilados, também estão incluídos em essa classe. Os tensoativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe de tensoativos não iônicos.
[00235] Se a molécula de tensoativo tiver uma carga negativa quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como aniônico. Tensoativos aniônicos incluem carboxilatos, como sabões, lactilatos de acila, acil amidas de aminoácidos, ésteres do ácido sulfúrico, como alquil sulfatos e alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos, como alquil benzeno sulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos e sulfossuccinatos, e fosfatos. Os membros mais importantes da classe dos tensoativos aniônicos são os alquil sulfatos e os sabões.
[00236] Se a molécula de tensoativo tiver uma carga positiva quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como catiônico. Tensoativos catiônicos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas. Os sais de amônio quaternário são os membros mais usados desta classe.
[00237] Se a molécula de tensoativo for capaz de ter uma carga positiva ou negativa, o tensoativo é classificado como anfotérico. Tensoativos anfotéricos incluem derivados do ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.
[00238] A utilização de tensoativos em produtos, formulações e emulsões de fármacos foi revista (Rieger, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., 1988, página 285).
[00239] O iRNA para utilização nos métodos da invenção também pode ser proporcionado na forma de formulações micelares. "Micélios" são definidos aqui como um tipo particular de montagem molecular em que moléculas anfipáticas são dispostas em uma estrutura esférica de modo que todas as porções hidrofóbicas das moléculas estão dirigidas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contato com a fase aquosa envolvente. Existe a disposição inversa se o ambiente for hidrofóbico.
[00240] Uma formulação micelar mista adequada para administração através de membranas transdérmicas pode ser preparada misturando uma solução aquosa da composição de siRNA, um C8 até C22 alquil sulfato de metal alcalino, e compostos formadores de micélios. Compostos formadores de micélios exemplificativos incluem lecitina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis do ácido hialurônico, ácido glicólico, ácido láctico, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, mono-oleína, mono-oleatos, monolauratos, óleo de borragem, óleo de círio-do-norte, mentol, trihidroxi oxo colanil glicina e respectivos sais farmaceuticamente aceitáveis, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno e respectivos análogos, éteres de alquila de polidocanol e respectivos análogos, quenodesoxicolato, desoxicolato, e respectivas misturas. Os compostos formadores de micélios podem ser adicionados ao mesmo tempo ou após a adição do alquil sulfato de metal alcalino. Micélios mistos serão formados com substancialmente qualquer tipo de mistura dos ingredientes, mas mistura vigorosa para proporcionar micélios de menores dimensões.
[00241] Em um método é preparada uma primeira composição micelar que contém a composição de siRNA e pelo menos o alquil sulfato de metal alcalino. A primeira composição micelar é então misturada com pelo menos três compostos formadores de micélios, para formar uma composição micelar mista. Em outro método, a composição micelar é preparada misturando a composição de siRNA, o alquil sulfato de metal alcalino e pelo menos um dos compostos formadores de micélios, seguido da adição dos restantes compostos formadores de micélios, com mistura vigorosa.
[00242] Fenol e/ou m-cresol podem ser adicionados à composição micelar mista para estabilizar a formulação e protegê-la contra crescimento bacteriano. Em alternativa, fenol e/ou m-cresol podem ser adicionados com os ingredientes formadores de micélios. Um agente isotônico, como glicerina, também pode ser adicionado após a formação da composição micelar mista.
[00243] Para administração da formulação micelar como uma pulverização, a formulação pode ser colocada em um distribuidor de aerossol e o distribuidor é carregado com um propulsor. O propulsor, que está sob pressão, está em forma líquida no distribuidor. As proporções dos ingredientes são ajustadas de modo que as fases aquosa e propulsora se tornem uma, isto é, há uma fase. Se houver duas fases, é necessário agitar o distribuidor antes de distribuir uma porção do conteúdo, por exemplo, através de uma válvula calibrada. A dose distribuída do agente farmacêutico é propelida da válvula calibrada em uma pulverização fina.
[00244] Propulsores podem incluir clorofluorocarbonetos contendo de hidrogênio, fluorocarbonetos contendo de hidrogênio, éter de dimetila e éter de dietila. Em certas modalidades pode ser usado HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoroetano).
[00245] As concentrações específicas dos ingredientes essenciais podem ser determinadas por experimentação relativamente simples. Para absorção através das cavidades orais, é muitas vezes desejável aumentar, por exemplo, pelo menos duplicar ou triplicar, a dosagem para administração mediante injeção ou administração através do trato gastrointestinal.
Partículas de ácido nucleico lipídeo
[00246] iRNAs, por exemplo, dsRNAs, da invenção podem ser totalmente encapsulados na formulação lipídica, por exemplo, para formar uma SPLP, pSPLP, SNALP, ou outra partícula de ácido nucleico- lipídeo. Como usado aqui, o termo "SNALP" refere-se a uma partícula estável de ácido nucleico-lipídeo, incluindo SPLP. Como usado aqui, o termo "SPLP" refere-se a uma partícula de ácido nucleico-lipídeo compreendendo DNA plasmídico encapsulado dentro de uma vesícula lipídica. SNALPs e SPLPs contêm tipicamente um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico, e um lipídeo que previne a agregação da partícula (por exemplo, um conjugado PEG-lipídeo). SNALPs e SPLPs são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, pois exibem tempos de vida em circulação prolongados após injeção intravenosa (i.v.) e acumulam-se em sítios distais (por exemplo, sítios fisicamente separados do sítio da administração). SPLPs incluem "pSPLP," que incluem um complexo de agente de condensação-ácido nucleico encapsulado como apresentado na Publicação PCT N° WO 00/03683. As partículas da presente invenção têm tipicamente um diâmetro médio de cerca de 50 nm até cerca de 150 nm, mais tipicamente cerca de 60 nm até cerca de 130 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm até cerca de 110 nm, muito tipicamente cerca de 70 nm até cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicas. Adicionalmente, os ácidos nucleicos, quando presentes nas partículas ácido nucleico-lipídeo da presente invenção, são resistentes em solução aquosa a degradação com uma nuclease. Partículas de ácido nucleico-lipídeo e seu método de preparação são revelados, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410; 6.815.432; Publicação U.S. N° 2010/0324120 e Publicação PCT N° WO 96/40964.
[00247] Em uma modalidade, a proporção entre lipídeo e fármaco (proporção massa/massa) (por exemplo, proporção entre lipídeo e dsRNA) estará situada no intervalo desde cerca de 1:1 até cerca de 50:1, desde cerca de 1:1 até cerca de 25:1, desde cerca de 3:1 até cerca de 15:1, desde cerca de 4:1 até cerca de 10:1, desde cerca de 5:1 até cerca de 9:1, ou cerca de 6:1 até cerca de 9:1. Também é contemplado que intervalos intermédios dos intervalos listados acima façam parte da invenção.
[00248] O lipídeo catiônico pode ser, por exemplo, cloreto de N,N- dioleil-N,N-dimetilamônio (DODAC), brometo de N,N-diestearil-N,N- dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(1-(2,3- dioleoilóxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTAP), cloreto de N-(1-(2,3-dioleilóxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleilóxi)propilamina (DODMA), 1,2-DiLinoleilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), l,2-Dilinolenilóxi- N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-Dilinoleilcarbamoilóxi-3- dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleióxi-3- (dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleióxi-3- morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1- Linoleoil-2-linoleilóxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal cloreto de 1,2-Dilinoleilóxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal cloreto de 1,2-Dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleilóxi-3- (N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), ou 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2- propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2- Dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), l,2- Dilinolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) ou respectivos análogos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro- 3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4- (dimetilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-ila (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2- hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodi-il)didodecan-2-ol (Tech G1), ou uma mistura respectiva. O lipídeo catiônico pode compreender desde cerca de 20% molar até cerca de 50% molar ou cerca de 40% molar do lipídeo total presente na partícula.
[00249] Em outra modalidade, o composto 2,2-Dilinoleil-4-dimetil- aminoetil-[1,3]-dioxolano pode ser usado para preparar nanopartículas de lipídeo-siRNA. A síntese de 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]- dioxolano é descrita no pedido de patente provisória dos Estados Unidos número 61/107.998 depositada em 23 de outubro, 2008, que é aqui incorporada a título de referência.
[00250] Em uma modalidade, a partícula de lipídeo-siRNA inclui 40% 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano:10% DSPC: 40% Colesterol:10% PEG-C-DOMG (porcentagem molar) com uma dimensão das partículas de 63,0 ± 20 nm e uma Proporção de siRNA/Lipídeo de 0,027.
[00251] O lipídeo ionizável/não catiônico pode ser um lipídeo aniônico ou um lipídeo neutro, incluindo mas não se limitando a diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1- carboxilato de dioleoil- fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil- etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil- fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol, ou uma respectiva mistura. O lipídeo não catiônico pode compreender desde cerca de 5% molar até cerca de 90% molar, cerca de 10% molar, ou cerca de 58% molar se colesterol estiver incluído, do lipídeo total presente na partícula.
[00252] O lipídeo conjugado que inibe a agregação de partículas pode ser, por exemplo, um polietilenoglicol (PEG)-lipídeo incluindo, sem limitação, um PEG-diacilglicerol (DAG), um PEG-dialquiloxipropila (DAA), um PEG-fosfolipídeo, um PEG-ceramida (Cer), ou uma respectiva mistura. O conjugado PEG-DAA pode ser, por exemplo, um PEG-dilauriloxipropila (Ci2), um PEG-dimiristiloxipropila (Ci4), um PEG- dipalmitiloxipropila (Ci6), ou um PEG- diesteariloxipropila (C]8). O lipídeo conjugado que previne a agregação de partículas pode compreender desde 0% molar até cerca de 20% molar ou cerca de 2% molar do lipídeo total presente na partícula.
[00253] Em algumas modalidades, a partícula de ácido nucleico- lipídeo inclui adicionalmente colesterol, por exemplo, a cerca de 10% molar até cerca de 60% molar ou cerca de 48% molar do lipídeo total presente na partícula.
[00254] Em uma modalidade, o lipidoide ND98-4HCI (PM 1487) (ver Pedido de Patente U.S. N° 12/056.230, depositada em 3/26/2008, que é incorporada aqui a título de referência), Colesterol (Sigma-Aldrich), e PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) podem ser usados para preparar nanopartículas de lipídeo-dsRNA (isto é, partículas LNP01). Soluções de estoque de cada em etanol podem ser preparadas do modo seguinte: ND98, 133 mg/mL; Colesterol, 25 mg/mL, PEG-Ceramida C16, 100 mg/mL. As soluções de estoque de ND98, Colesterol, e PEG- Ceramida C16 podem então ser combinadas, por exemplo, em uma proporção molar 42:48:10. A solução lipídica combinada pode ser misturada com dsRNA aquoso (por exemplo, em acetato de sódio pH 5) de modo que a concentração final de etanol é cerca de 35-45% e a concentração final de acetato de sódio é cerca de 100-300 mM. Tipicamente, nanopartículas de lipídeo-dsRNA são formadas espontaneamente por mistura. Dependendo da distribuição desejada da dimensão das partículas, a mistura de nanopartículas resultante pode ser extrudada através de uma membrana de policarbonato (por exemplo, limite de 100 nm) usando, por exemplo, uma extrusora "thermobarrel", como Extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc). Em alguns casos, a etapa de extrusão pode ser omitida. A remoção de etanol e troca simultânea de tampão podem ser realizadas, por exemplo, por diálise ou filtração com fluxo tangencial. O tampão pode ser trocado, por exemplo, por solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3, ou cerca de pH 7,4.
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[00255] Formulações de LNP01 são descritas, por exemplo, na Publicação do Pedido Internacional N° WO 2008/042973, que desse modo é incorporada a título de referência.
[00256] Formulações de lipídeo-dsRNA exemplificativas adicionais são descritas na tabela embaixo.
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DSPC: diestearoilfosfatidilcolina DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina PEG-DMG: PEG-didimiristoil glicerol (C14-PEG, ou PEG-C14) (PEG com peso molecular médio de 2000) PEG-DSG: PEG-diestiril glicerol (C18-PEG, ou PEG-C18) (PEG com peso molecular médio de 2000) PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG com peso molecular médio de 2000)
[00257] Formulações compreendendo SNALP (l,2-Dilinolenilóxi-N,N- dimetilaminopropano (DLinDMA)) são descritas na Publicação Internacional N° WO2009/127060, depositada em 15 de abril, 2009, que desse modo é incorporada a título de referência.
[00258] Formulações compreendendo XTC são descritas, por exemplo, no Pedido Provisório U.S. N° de Série 61/148.366, depositado em 29 de janeiro, 2009; Pedido Provisório U.S. N° de Série 61/156.851, depositado em 2 de março, 2009; Pedido Provisório U.S. N° de Série depositado em 10 de junho, 2009; Pedido Provisório U.S. N° de Série 61/228.373, depositado em 24 de julho, 2009; Pedido Provisório U.S. N° de Série 61/239.686, depositado em 3 de setembro, 2009, e Pedido Internacional N° PCT/US2010/022614, depositado em 29 de janeiro, 2010, que são desse modo incorporados a título de referência.
[00259] Formulações compreendendo MC3 são descritas, por exemplo, na Publicação U.S. N° 2010/0324120, depositada em 10 de junho, 2010, cuja totalidade do conteúdo é desse modo incorporada a título de referência.
[00260] Formulações compreendendo ALNY-100 são descritas, por exemplo, no Pedido de patente internacional número PCT/US09/63933, depositada em 10 de novembro, 2009, que desse modo é incorporada a título de referência.
[00261] Formulações compreendendo C12-200 são descritas no Pedido Provisório U.S. N° de Série 61/175.770, depositado em 5 de maio, 2009, e Pedido Internacional N° PCT/US10/33777, depositada em 5 de maio, 2010, que desse modo são incorporados a título de referência. Síntese de lipídeos ionizáveis/catiônicos
[00262] Quaisquer dos compostos, por exemplo, lipídeos catiônicos e afins, usados nas partículas de ácido nucleico-lipídeo da invenção podem ser preparados por técnicas conhecidas de síntese orgânica, incluindo os métodos descritos em mais detalhe nos Exemplos. Todos os substituintes são como definidos embaixo, a menos que indicado em contrário.
[00263] "Alquila" significa um hidrocarboneto alifático saturado, de cadeia linear ou ramificado, não cíclico ou cíclico contendo desde 1 até 24 átomos de carbono. Alquilas saturadas de cadeia linear representativas incluem metila, etila, n-propila, n-butila, n-pentila, n- hexila, e afins; ao passo que alquilas saturadas ramificadas incluem isopropila, sec-butila, isobutila, tert-butila, isopentila, e afins. Alquilas cíclicas saturadas representativas incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, e afins; ao passo que alquilas cíclicas insaturadas incluem ciclopentenila e ciclohexenila, e afins.
[00264] "Alcenila" significa uma alquila, como definido acima, contendo pelo menos uma ligação dupla entre átomos de carbono adjacentes. Alcenilas incluem isômeros cis e trans. Alcenilas representativas de cadeia linear e ramificadas incluem etilenila, propilenila, 1-butenila, 2-butenila, isobutilenila, 1-pentenila, 2- pentenila, 3-metil-1-butenila, 2-metil-2-butenila, 2,3-dimetil-2- butenila, e afins.
[00265] "Alcinila" significa qualquer alquila ou alcenila, como definido acima, que contém adicionalmente pelo menos uma ligação tripla entre carbonos adjacentes. Alcinilas representativas de cadeia linear e ramificadas incluem acetilenila, propinila, 1 -butinila, 2-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3-metil-1 butinila, e afins.
[00266] "Acila" significa qualquer alquila, alcenila, ou alcinila em que o carbono no ponto de ligação está substituído por um grupo oxo, como definido embaixo. Por exemplo, -C(=O)alquila, -C(=O)alcenila, e -C(=O)alcinila são grupos acila.
[00267] "Heterociclo" significa um anel heterocíclico monocíclico de 5 até 7 membros, ou bicíclico de 7 até 10 membros, que é saturado, insaturado, ou aromático, e que contém desde 1 ou 2 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio e enxofre, e em que os heteroátomos de nitrogênio e enxofre podem estar opcionalmente oxidados, e o heteroátomo de nitrogênio pode estar opcionalmente quaternizado, incluindo anéis bicíclicos em que quaisquer dos heterociclos acima estão fundidos a um anel benzeno. O heterociclo pode estar ligado via qualquer heteroátomo ou átomo de carbono. Heterociclos incluem heteroarilas como definido embaixo. Heterociclos incluem morfolinila, pirrolidinonila, pirrolidinila, piperidinila, piperizinila, hidantoinila, valerolactamila, oxiranila, oxetanila, tetrahidrofuranila, tetrahidropiranila, tetrahidro- piridinila, tetrahidroprimidinila, tetrahidrotiofenila, tetrahidrotiopiranila, tetrahidropirimidinila, tetrahidrotiofenila, tetrahidrotiopiranila, e afins.
[00268] Os termos "alquila opcionalmente substituída", "alcenila opcionalmente substituída", "alcinila opcionalmente substituída", "acila opcionalmente substituída", e "heterociclo opcionalmente substituído" significam que, quando estiverem substituídos, pelo menos um átomo de hidrogênio é substituído por um substituinte. No caso de um substituinte oxo (=O), são substituídos dois átomos de hidrogênio. A esse respeito, substituintes incluem oxo, halogênio, hetero- ciclo, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(= O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx e -SOnNRxRy, em que n é 0, 1 ou 2, Rx e Ry são iguais ou diferentes e são independentemente hidrogênio, alquila ou heterociclo, e cada um dos referidos substituintes de alquila e heterociclo pode estar adicionalmente substituído com um ou mais de oxo, halogênio, -OH, -CN, alquila, -ORx, heterociclo, - NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, - C(=O)NRxRy, -SOnRx e -SOnNRxRy.
[00269] "Halogênio" significa fluoro, cloro, bromo e iodo.
[00270] Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem requerer a utilização de grupos protetores. A metodologia de grupos protetores é bem conhecida dos versados na técnica (ver, por exemplo, "Protective Groups in Organic Synthesis", Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, Cidade de Nova Iorque, 1999). Em resumo, grupos protetores, no contexto desta invenção, são quaisquer grupos que reduzem ou eliminam a reatividade indesejada de um grupo funcional. Um grupo protetor pode ser adicionado a um grupo funcional para mascarar a sua reatividade durante certas reações e então é removido para revelar o grupo funcional original. Em algumas modalidades é usado um "grupo protetor de álcool". Um "grupo protetor de álcool" é qualquer grupo que decresce ou elimina a reatividade indesejada de um grupo funcional álcool. Grupos protetores podem ser adicionados e removidos usando técnicas bem conhecidas na área.
Síntese da Fórmula A
[00271] Em algumas modalidades, partículas de ácido nucleico- lipídeo da invenção são formuladas usando um lipídeo catiônico de fórmula A:
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[00272] em que R1 e R2 são independentemente alquila, alcenila ou alcinila, em que cada um pode estar opcionalmente substituído, e R3 e R4 são independentemente alquila de cadeia curta ou R3 e R4 podem ser tomados em conjunto para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é XTC (2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano). Em geral, o lipídeo de fórmula A acima pode ser preparado pelos seguintes Esquemas Reacionais 1 ou 2, em que todos os substituintes são como definido acima a menos que indicado em contrário. Esquema 1
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[00273] O lipídeo A, em que R1 e R2 são independentemente alquila, alcenila ou alcinila, em que cada um pode estar opcionalmente substituído, e R3 e R4 são independentemente alquila de cadeia curta ou R3 e R4 podem ser tomados em conjunto para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, pode ser preparado de acordo com o Esquema 1. A cetona 1 e brometo 2 podem ser adquiridos ou preparados de acordo com métodos conhecidos dos versados na técnica. A reação de 1 e 2 dá origem ao cetal 3. O tratamento do cetal 3 com a amina 4 origina lipídeos de fórmula A. Os lipídeos de fórmula A podem ser convertidos no correspondente sal de amônio com um sal orgânico de fórmula 5, em que X é um contraíon aniônico selecionado de halogênio, hidróxido, fosfato, sulfato, ou afins. Esquema 2
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[00274] Em alternativa, o material de partida cetona 1 pode ser preparado de acordo com o Esquema 2. O reagente de Grignard 6 e o cianeto 7 podem ser adquiridos ou preparados de acordo com métodos conhecidos dos versados na técnica. A reação de 6 e 7 origina a cetona 1. A conversão da cetona 1 nos correspondentes lipídeos de fórmula A ocorre como descrito no Esquema 1. Síntese de MC3
[00275] A preparação de DLin-M-C3-DMA (isto é, 4-(dimetilamino) butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ila) foi realizada do modo seguinte. Uma solução de (6Z,9Z,28Z,31Z)- heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ol (0,53 g), cloridrato do ácido 4- N,N-dimetilaminobutírico (0,51 g), 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,61 g) e cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (0,53 g) em diclorometano (5 mL) foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. A solução foi lavada com ácido clorídrico diluído seguido de bicarbonato de sódio aquoso diluído. As frações orgânicas foram secas em sulfato de magnésio anidro, foram filtradas e o solvente foi removido em um evaporador rotativo. O resíduo foi passado em uma coluna de sílica-gel (20 g) usando um gradiente de eluição de 1-5% metanol/diclorometano. As frações contendo o produto purificado foram combinadas e o solvente foi removido, dando origem a um óleo incolor (0,54 g). Síntese de ALNY-100
[00276] A síntese do cetal 519 [ALNY-100] foi realizada usando o seguinte esquema 3:
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Síntese de 515
[00277] A uma suspensão agitada de LiAlH4 (3,74 g, 0,09852 mol) em 200 mL de THF anidro em um BFR de duas tubuladuras (1 L) foi adicionada uma solução de 514 (10 g, 0,04926 mol) em 70 mL de THF, lentamente a 0 0C sob atmosfera de nitrogênio. Depois de completada a adição, a mistura reacional foi aquecida para a temperatura ambiente e então foi aquecida para o refluxo por 4 horas. A progressão da reação foi monitorada por TLC. Depois de completada a reação (por TLC), a mistura foi esfriada para 0 °C e foi extinta mediante adição cuidadosa de solução saturada de Na2SO4. A mistura reacional foi agitada por 4 horas à temperatura ambiente e foi removida mediante filtração. O resíduo foi bem lavado com THF. O filtrado e as lavagens foram misturados e diluídos com 400 mL de dioxano e 26 mL de HCl concentrado e foram agitados por 20 minutos à temperatura ambiente. As volatilidades foram extraídas sob vácuo, dando origem ao sal cloridrato de 515 na forma de um sólido branco. Rendimento: 7,12 g 1H- RMN (DMSO, 400 MHz): δ= 9,34 (largo, 2H), 5,68 (s, 2H), 3,74 (m, 1H), 2,66-2,60 (m, 2H), 2,50-2,45 (m, 5H). Síntese de 516
[00278] A uma solução agitada de composto 515 em 100 mL de DCM seco em um BFR de duas tubuladuras de 250 mL foi adicionado NEt3 (37,2 mL, 0,2669 mol) e o sistema foi esfriado para 0 0C sob atmosfera de nitrogênio. Após uma adição lenta de N-(benzilóxi-carbonilóxi)- succinimida (20 g, 0,08007 mol) em 50 mL de DCM seco, a mistura reacional foi deixada aquecer para a temperatura ambiente. Depois de completada a reação (2-3 horas por TLC), a mistura foi lavada sucessivamente com solução 1 N HCl (1 x 100 mL) e solução saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL). A camada orgânica foi então seca em Na2SO4 anidro e o solvente foi evaporado, dando origem a um material bruto que foi purificado por cromatografia em coluna em sílica-gel, dando origem a 516 na forma de uma massa pegajosa. Rendimento: 11 g (89%). 1H- RMN (CDCl3, 400 MHz): δ = 7,36-7,27 (m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,96 (largo, 1H), 2,74 (s, 3H), 2,60 (m, 2H), 2,30-2,25 (m, 2H). LC- MS [M+H] -232,3 (96,94%). Síntese de 517A e 517B
[00279] O ciclopenteno 516 (5 g, 0,02164 mol) foi dissolvido em uma solução de 220 mL de acetona e água (10:1) em um BFR de uma tubuladura de 500 mL e adicionou-se ao sistema N-metil morfolina-N- óxido (7,6 g, 0,06492 mol) seguido de 4,2 mL de solução 7,6% de OsO4 (0,275 g, 0,00108 mol) em tert-butanol à temperatura ambiente. Depois de completada a reação (~ 3 horas), a mistura foi extinta com a adição de Na2SO3 sólido e a mistura resultante foi agitada por 1,5 horas à temperatura ambiente. A mistura reacional foi diluída com DCM (300 mL) e lavada com água (2 x 100 mL), seguido de solução saturada de NaHCO3 (1 x 50 mL), água (1 x 30 mL) e finalmente solução salina (1x 50 mL). A fase orgânica foi seca em Na2SO4 anidro e o solvente foi removido sob vácuo. A purificação cromatográfica, em coluna de sílica- gel, do material bruto originou uma mistura de diastereômeros, que foram separados por HPLC preparativa. Rendimento: - 6 g bruto
[00280] 517A - Pico-1 (sólido branco), 5,13 g (96%). 1H-RMN (DMSO, 400 MHz): δ= 7,39-7,31 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 4,78-4,73 (m, 1H), 4,48-4,47 (d, 2H), 3,94-3,93 (m, 2H), 2,71 (s, 3H), 1,72-1,67 (m, 4H). LC-MS - [M+H]-266,3, [M+NH4 +]-283,5 presente, HPLC-97,86%. Estereoquímica confirmada por raios X. Síntese de 518
[00281] Usando um procedimento análogo ao descrito para a síntese do composto 505 obteve-se o composto 518 (1,2 g, 41%) na forma de um óleo incolor. 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): δ= 7,35-7,33 (m, 4H), 7,30-7,27 (m, 1H), 5,37-5,27 (m, 8H), 5,12 (s, 2H), 4,75 (m, 1H), 4,58-4,57 (m, 2H), 2,78-2,74 (m, 7H), 2,06-2,00 (m, 8H), 1,96-1,91 (m, 2H), 1,62 (m, 4H), 1,48 (m, 2H), 1,37-1,25 (m largo, 36H), 0,87 (m, 6H). HPLC-98,65%. Procedimento Geral para a Síntese do Composto 519
[00282] Uma solução de composto 518 (1 eq) em hexano (15 mL) foi adicionada, de um modo gota a gota, a uma solução gelada de LAH em THF (1 M, 2 eq). Depois de completada a adição, a mistura foi aquecida a 40 oC ao longo de 0,5 horas e então foi esfriada de novo em um banho de gelo. A mistura foi cuidadosamente hidrolisada com Na2SO4 aquoso saturado, então foi filtrada em celite e reduzida a um óleo. Cromatografia em coluna proporcionou 519 puro (1,3 g, 68%) que foi obtido na forma de um óleo incolor. 13C RMN δ = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 (x2), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; MS Eletropulverização (+ve): Peso molecular para C44H80NO2 (M + H)+ Calculado 654,6, Experimental 654,6.
[00283] Formulações preparadas pelo método comum ou desprovido de extrusão podem ser caracterizadas de modos similares. Por exemplo, formulações são tipicamente caracterizadas mediante inspeção visual. Devem ser soluções translúcidas esbranquiçadas desprovidas de agregados ou sedimento. A dimensão das partículas e a distribuição da dimensão das partículas de nanopartículas lipídicas podem ser mensuradas por dispersão de luz usando, por exemplo, um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EUA). A dimensão das partículas deve ser cerca de 20-300 nm, como 40-100 nm. A distribuição da dimensão das partículas deve ser unimodal. A concentração total de dsRNA na formulação, bem como a fração encerrada, é estimada usando um ensaio de exclusão de corante. Uma amostra do dsRNA formulado pode ser incubada com um corante de ligação a RNA, como Ribogreen (Molecular Probes), na presença ou ausência de um tensoativo que desagrega a formulação, por exemplo, 0,5% Triton- X100. O dsRNA total presente na formulação pode ser determinado pelo sinal da amostra contendo o tensoativo, relativamente a uma curva padrão. A fração encerrada é determinada subtraindo o teor de dsRNA "livre" (mensurado pelo sinal na ausência de tensoativo) do teor de dsRNA total. A porcentagem de dsRNA encerrado é tipicamente >85%. Para a formulação de SNALP, a dimensão das partículas é pelo menos 30 nm, pelo menos 40 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 60 nm, pelo menos 70 nm, pelo menos 80 nm, pelo menos 90 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 110 nm, e pelo menos 120 nm. O intervalo adequado é tipicamente cerca de pelo menos 50 nm até cerca de pelo menos 110 nm, cerca de pelo menos 60 nm até cerca de pelo menos 100 nm, ou cerca de pelo menos 80 nm até cerca de pelo menos 90 nm.
[00284] Composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, microparticulados, nanoparticulados, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Podem ser desejáveis espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes. Em algumas modalidades, formulações orais são aquelas nas quais dsRNAs apresentados na invenção são administrados em conjunção com um ou mais tensoativos intensificadores da penetração e queladores. Tensoativos adequados incluem ácidos graxos e/ou respectivos ésteres ou sais, ácidos biliares e/ou respectivos sais. Ácidos biliares/sais adequados incluem ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucocólico, ácido glicocólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sódio e glicodihidrofusidato de sódio. Ácidos graxos adequados incluem ácido araquidônico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono- oleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1-dodecilazacicloheptan-2- ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina, ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um respectivo sal farmaceuticamente aceitável (por exemplo, sódio). Em algumas modalidades são usadas combinações de intensificadores da penetração, por exemplo, ácidos graxos/sais em combinação com ácidos biliares/sais. Uma combinação exemplificativa é o sal de sódio do ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Intensificadores da penetração adicionais incluem éter de polioxietileno-9-laurila, éter de polioxietileno-20-cetila. DsRNAs apresentados na invenção podem ser administrados oralmente, em forma granular incluindo partículas secas pulverizadas, ou complexados para formarem micro ou nanopartículas. Agentes de complexação de dsRNA incluem poli-aminoácidos; poli- iminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoa- crilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacrilatos; poli-iminas derivatizadas com DEAE, pululanas, celuloses e amidos. Agentes de complexação adequados incluem quitosana, N-trimetilquitosana, poli-L- lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiri- dina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por exemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato), poli(isohexilciano- acrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrana, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA), alginato, e polietilenoglicol (PEG). Formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas em detalhe na Patente U.S. 6.887.906, Publicação US N° 20030027780, e patente U.S. N° 6.747.014, cada uma das quais é aqui incorporada a título de referência.
[00285] Composições e formulações para administração parentérica, intraparênquima (no interior do cérebro), intratecal, intraventricular ou intrahepática podem incluir soluções aquosas esterilizadas que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados, tais como mas não se limitando a intensificadores da penetração, compostos veículos e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00286] Composições farmacêuticas da presente invenção incluem mas não estão limitadas a soluções, emulsões, e formulações contendo lipossomos. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem mas não estão limitados a líquidos pré-formados, sólidos autoemulsificantes e semissólidos autoemulsificantes. São particularmente preferidas formulações que têm como alvo o fígado ao tratar distúrbios hepáticos, como carcinoma hepático.
[00287] As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas em forma galênica unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Essas técnicas incluem a etapa de associar os ingredientes ativos ao(s) veículo(s) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas por associação uniforme e íntima dos ingredientes ativos a veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, configuração do produto.
[00288] As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma de muitas formas galênicas possíveis, tais como mas não se limitando a comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis moles, supositórios, e enemas. As composições da presente invenção também podem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem adicionalmente conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão também pode conter estabilizadores. Formulações Adicionais Emulsões
[00289] As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. Emulsões são tipicamente sistemas heterogêneos de um líquido disperso noutro na forma de gotículas com um diâmetro habitualmente excedendo 0,1 μm (ver, por exemplo, "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a edição), Nova Iorque, NY; Idson, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 199; Rosoff, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., Volume 1, página 245; Block em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 2, página 335; Higuchi et al., em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, página 301). Emulsões são muitas vezes sistemas bifásicos compreendendo duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersas entre si. Em geral, emulsões podem ser da variedade água- em-óleo (w/o) ou óleo-em-água (o/w). Quando uma fase aquosa é finamente dividida e dispersa, na forma de gotículas muito pequenas, em uma fase oleosa volúmica, a composição resultante é chamada de emulsão água-em-óleo (w/o). Em alternativa, quando uma fase oleosa é finamente dividida e dispersa, na forma de gotículas muito pequenas, em uma fase aquosa volúmica, a composição resultante é chamada de emulsão óleo-em-água (o/w). As emulsões podem conter componentes adicionais para além das fases dispersas, e o fármaco ativo, que pode estar presente como uma solução em qualquer uma da fase aquosa, fase oleosa ou o próprio como uma fase separada. Excipientes farmacêuticos, como emulsificantes, estabilizadores, corantes, e antioxidantes, também podem estar presentes em emulsões, consoante o necessário. Emulsões farmacêuticas também podem ser emulsões múltiplas que são compreendidas de mais de duas fases, tais como, por exemplo, no caso de emulsões óleo-em-água-em-óleo (o/w/o) e água- em-óleo-em-água (w/o/w). É frequente tais formulações complexas proporcionarem certas vantagens que emulsões binárias simples não apresentam. Emulsões múltiplas em que gotículas oleosas individuais de uma emulsão o/w encerram pequenas gotículas de água constituem uma emulsão w/o/w. De igual modo, um sistema de gotículas oleosas encerradas em glóbulos de água estabilizados em uma fase oleosa contínua proporciona uma emulsão o/w/o.
[00290] As emulsões são caracterizadas por uma estabilidade termodinâmica pequena ou nula. Muitas vezes, a fase dispersa ou descontínua da emulsão é bem dispersa na fase externa ou contínua e é mantida nessa forma através de emulsificantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer uma das fases da emulsão pode ser um semissólido ou um sólido, como no caso de bases e cremes de unguentos do estilo emulsão. Outros meios de estabilizar emulsões implicam a utilização de emulsificantes que podem ser incorporados em qualquer uma das fases da emulsão. Os emulsificantes podem ser classificados de modo lato em quatro categorias: tensoativos sintéticos, emulsificantes de ocorrência natural, bases de absorção, e sólidos finamente dispersos (ver, por exemplo, "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a edição), Nova Iorque, NY; Idson, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 199).
[00291] Os tensoativos, também chamados de agentes com atividade de superfície, sintéticos têm grande aplicabilidade na formulação de emulsões e foram revistos na literatura (ver, por exemplo, "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a edição), Nova Iorque, NY; Rieger, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 285; Idson, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., 1988, volume 1, página 199). Os tensoativos são tipicamente anfifílicos e compreendem uma porção hidrofílica e uma hidrofóbica. A proporção entre a natureza hidrofílica e a hidrofóbica do tensoativo foi chamada de equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma ferramenta de valor na categorização e seleção de tensoativos na preparação de formulações. Os tensoativos podem ser classificados em diferentes classes com base na natureza do grupo hidrofílico: não iônico, aniônico, catiônico e anfotérico (ver, por exemplo, "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a edição), Nova Iorque, NY, Rieger, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 285).
[00292] Emulsificantes de ocorrência natural usados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelhas, fosfatídeos, lecitina e acácia. Bases de absorção possuem propriedades hidrofílicas de modo que podem embeber água para formar emulsões w/o mas retêm suas consistências semissólidas, como lanolina anidra e petrolato hidrofílico. Sólidos finamente divididos também têm sido usados como bons emulsificantes, especialmente em combinação com tensoativos e em preparações viscosas. Esses incluem sólidos inorgânicos polares, como hidróxidos de metais pesados, argilas não expansíveis, como bentonita, atapulgita, hectorita, caulim, montmorilonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio e magnésio coloidal, pigmentos e sólidos não polares, como carbono ou triestearato de glicerila.
[00293] Uma grande variedade de materiais não emulsificantes também é incluída em formulações de emulsão, contribuindo para as propriedades de emulsões. Esses incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, álcoois graxos, ésteres graxos, umectantes, coloides hidrofílicos, conservantes e antioxidantes (Block, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 335; Idson, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 199).
[00294] Coloides hidrofílicos ou hidrocoloides incluem gomas de ocorrência natural e polímeros sintéticos, como polissacarídeos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenano, goma de guar, goma Karaya, e tragacanto), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose), e polímeros sintéticos (por exemplo, carbômeros, éteres de celulose, e polímeros de carboxivinila). Estes dispersam ou dilatam em água, formando soluções coloidais que estabilizam emulsões por formação de filmes interfaciais fortes em redor das gotículas da fase dispersa e por aumento da viscosidade da fase externa.
[00295] Uma vez que emulsões contêm muitas vezes alguns ingredientes, tais como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos, que podem facilmente suportar o crescimento de micróbios, é frequente estas formulações incorporarem conservantes. Conservantes habitualmente usados incluídos em formulações de emulsão incluem metil parabeno, propil parabeno, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, e ácido bórico. Antioxidantes também são habitualmente adicionados a formulações de emulsão para prevenir a deterioração da formulação. Os antioxidantes usados podem ser agentes de remoção de radicais livres, tais como tocoferóis, galatos de alquila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes redutores, tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio, e agentes sinérgicos antioxidantes, como ácido cítrico, ácido tartárico, e lecitina.
[00296] A aplicação de formulações de emulsão pelas vias dermatológica, oral e parentérica e métodos para a sua preparação foram revistos na literatura (ver, por exemplo, "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a edição), Nova Iorque, NY; Idson, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 199). Formulações de emulsão para administração oral têm sido amplamente usadas devido à facilidade de formulação, bem como eficácia do ponto de vista da absorção e biodisponibilidade (ver, por exemplo, "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a edição), Nova Iorque, NY; Rosoff, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 245; Idson, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 199). Laxantes à base de óleos minerais, vitaminas solúveis em óleo e preparações nutritivas com alto teor de gordura são alguns dos materiais que habitualmente têm sido administrados pela via oral na forma de emulsões o/w. ii. Microemulsões
[00297] Em uma modalidade da presente invenção, as composições de iRNAs e ácidos nucleicos são formuladas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifílico que é uma solução líquida única opticamente isotrópica e termodinamicamente estável (ver, por exemplo, "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a edição), Nova Iorque, NY; Rosoff, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 245). Tipicamente, microemulsões são sistemas que são preparados dispersando primeiramente um óleo em uma solução aquosa de tensoativo e então adicionando uma quantidade suficiente de um quarto componente, em geral um álcool com comprimento intermédio da cadeia, para formar um sistema transparente. Em consequência, microemulsões também têm sido descritas como dispersões termodinamicamente estáveis, isotropicamente transparentes de dois líquidos imiscíveis que são estabilizadas por filmes interfaciais de moléculas com atividade de superfície (Leung e Shah, em: "Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems", Rosoff, M., Editor, 1989, VCH Publishers, Nova Iorque, páginas 185-215). As microemulsões são habitualmente preparadas via uma combinação de três até cinco componentes que incluem óleo, água, tensoativo, cotensoativo e eletrólito. A microemulsão ser do tipo água-em-óleo (w/o) ou óleo-em-água (o/w) depende das propriedades do óleo e tensoativo usados e da estrutura e empacotamento geométrico das cabeças polares e caudas hidrocarbonadas das moléculas de tensoativo (Schott, em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, página 271).
[00298] A abordagem fenomenológica usando diagramas de fase tem sido extensamente estudada e permitiu um entendimento abrangente, para o versado na técnica, de como formular microemulsões (ver, por exemplo, "Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a edição), Nova Iorque, NY; Rosoff, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 245; Block, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger e Banker (Editores), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y., volume 1, página 335). Em comparação com emulsões convencionais, as microemulsões oferecem a vantagem de solubilizar fármacos insolúveis em água em uma formulação de gotículas termodinamicamente estáveis que se formam espontaneamente.
[00299] Os tensoativos usados na preparação de microemulsões incluem mas não estão limitados a tensoativos iônicos, tensoativos não iônicos, Brij 96, éteres de oleíla e polioxietileno, ésteres de ácidos graxos e poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), mono-oleato de tetraglicerol (MO310), mono-oleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), mono-oleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), isoladamente ou em combinação com cotensoativos. O cotensoativo, habitualmente um álcool de cadeia curta, como etanol, 1-propanol, e 1- butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial ao penetrar no filme de tensoativo e consequentemente criar um filme desordenado devido ao espaço vazio gerado entre moléculas de tensoativo. No entanto, microemulsões podem ser preparadas sem a utilização de cotensoativos, e sistemas de microemulsão autoemulsificantes desprovidos de álcool são conhecidos na área. A fase aquosa pode tipicamente ser, mas não está limitada a água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propileno glicóis, e derivados de etileno glicol. A fase oleosa pode incluir, mas não está limitada a materiais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos graxos, mono, di, e triglicerídeos de cadeia média (C8-C12), ésteres de ácidos graxos e glicerila polietoxilados, álcoois graxos, glicerídeos poliglicolizados, C8-C10 glicerídeos saturados poliglicolizados, óleos vegetais e óleo de silicone.
[00300] Microemulsões são particularmente interessantes do ponto de vista da solubilização de fármacos e da absorção acrescida de fármacos. Microemulsões à base de lipídeos (o/w e w/o) têm sido propostas para aumentar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo peptídeos (ver, por exemplo, Patentes U.S. N°s 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). As microemulsões proporcionam vantagens de solubilização melhorada de fármacos, proteção de fármacos contra hidrólise enzimática, possível intensificação da absorção de fármacos devido a alterações, induzidas por tensoativos, da fluidez e permeabilidade membranares, facilidade de preparação, facilidade de administração oral relativamente a formas galênicas sólidas, potência clínica melhorada, e toxicidade decrescida (ver, por exemplo, Patentes U.S. N°s 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Muitas vezes, microemulsões podem se formar espontaneamente quando seus componentes são reunidos à temperatura ambiente. Isto pode ser particularmente vantajoso na formulação de fármacos termicamente instáveis, peptídeos ou iRNAs. Microemulsões também têm sido eficazes na administração transdérmica de componentes ativos em aplicações cosméticas e farmacêuticas. É esperado que as composições e formulações de microemulsão da presente invenção facilitem a absorção sistêmica aumentada de iRNAs e ácidos nucleicos a partir do trato gastrointestinal, bem como melhorem a captação celular local de iRNAs e ácidos nucleicos.
[00301] Microemulsões da presente invenção também podem conter componentes e aditivos suplementares, como monoestearato de sorbitana (Grill 3), Labrasol, e intensificadores da penetração para melhorar as propriedades da formulação e intensificar a absorção dos iRNAs e ácidos nucleicos da presente invenção. Intensificadores da penetração usados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencentes a uma de cinco grandes categorias - tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensoativos não quelantes (Lee et al., "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1991, página 92). Cada uma dessas classes foi discutida acima. iii. Micropartículas
[00302] Um agente de RNAi da invenção pode ser incorporado em uma partícula, por exemplo, uma micropartícula. Micropartículas podem ser produzidas mediante secagem por pulverização, mas também podem ser produzidas por outros métodos, incluindo liofilização, evaporação, secagem em leito fluidizado, secagem por vácuo, ou uma combinação dessas técnicas. iv. Intensificadores da Penetração
[00303] Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários intensificadores da penetração para efetivar a administração eficiente de ácidos nucleicos, em particular iRNAs, na pele de animais. A maior parte dos fármacos está presente em solução em ambas as formas ionizada e não ionizada. Todavia, habitualmente apenas fármacos solúveis em lipídeos ou lipofílicos atravessam facilmente membranas celulares. Foi descoberto que mesmo fármacos não lipofílicos conseguem atravessar membranas celulares se a membrana a ser atravessada for tratada com um intensificador da penetração. Para além de auxiliarem a difusão de fármacos não lipofílicos através de membranas celulares, os intensificadores da penetração também aumentam a permeabilidade de fármacos lipofílicos.
[00304] Os intensificadores da penetração podem ser classificados como pertencendo a uma de cinco grandes categorias, isto é, tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes, e não tensoativos não quelantes (ver, por exemplo, Malmsten, M. "Surfactants and polymers in drug delivery", Informa Health Care, Nova Iorque, NY, 2002; Lee et al., "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1991, página 92). Cada uma das classes acima mencionadas de intensificadores da penetração é descrita embaixo em mais detalhe.
[00305] Tensoativos (ou "agentes com atividade de superfície") são entidades químicas que, quando dissolvidas em uma solução aquosa, reduzem a tensão superficial da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, com o resultado de a absorção de iRNAs através da mucosa ser intensificada. Para além de sais biliares e ácidos graxos, esses intensificadores da penetração incluem, por exemplo, lauril sulfato de sódio, éter de polioxietileno-9-laurila e éter de polioxietileno-20-cetila (ver, por exemplo, Malmsten, M. "Surfactants and polymers in drug delivery", Informa Health Care, Nova Iorque, NY, 2002; Lee et al., "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1991, página 92); e emulsões perfluoroquímicas, como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[00306] Vários ácidos graxos e seus derivados que atuam como intensificadores da penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína (1-mono-oleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidônico, 1-monocaprato de glicerol, 1- dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, respectivos ésteres de C1-20 alquila (por exemplo, metila, isopropila e t-butila), e respectivos mono- e diglicerídeos (isto é, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (ver, por exemplo, Touitou, E., et al. "Enhancement in Drug Delivery", CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1991, página 92; Muranishi, "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[00307] O papel fisiológico da bílis inclui facilitar a dispersão e absorção de lipídeos e vitaminas solúveis em gordura (ver, por exemplo, Malmsten, M. "Surfactants and polymers in drug delivery", Informa Health Care, Nova Iorque, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38 em: "Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics", 9a Edição, Hardman et al. Editores, McGraw-Hill, Nova Iorque, 1996, páginas 934-935). Vários sais biliares naturais, e seus derivados sintéticos, atuam como intensificadores da penetração. Assim, o termo "sais biliares" inclui quaisquer dos componentes de ocorrência natural da bílis, bem como quaisquer de seus derivados sintéticos. Sais biliares adequados incluem, por exemplo, ácido cólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocólico (desidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucocólico (glucocolato de sódio), ácido glicocólico (glicocolato de sódio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sódio), ácido quenodeso- xicólico (quenodesoxicolato de sódio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sódio (STDHF), glicodihidrofusidato de sódio e éter de polioxietileno-9-laurila (POE) (ver, por exemplo, Malmsten, M. "Surfactants and polymers in drug delivery", Informa Health Care, Nova Iorque, NY, 2002; Lee et al., "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 Em: "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18a Edição, Gennaro, editor, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[00308] Agentes quelantes, como usado em conexão com a presente invenção, podem ser definidos como compostos que removem íons metálicos da solução por formação de complexos com os mesmos, com o resultado de a absorção de iRNAs através da mucosa ser intensificada. Relativamente à sua utilização como intensificadores da penetração na presente invenção, agentes quelantes têm a vantagem adicional de também servirem de inibidores de DNase, pois a maior parte das DNA nucleases caracterizadas requer um íon metálico divalente para catálise e, assim, são inibidas por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Agentes quelantes adequados incluem mas não estão limitados a etilenodiaminotetra- acetato dissódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por exemplo, salicilato de sódio, 5-metoxisalicilato e homovanilato), derivados N-acila de colágeno, derivados lauret-9 e N-amino acila de beta-dicetonas (enaminas) (ver, por exemplo, Katdare, A. et al., "Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery", CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1991, página 92; Muranishi, "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[00309] Como usado aqui, compostos intensificadores da penetração não tensoativos não quelantes podem ser definidos como compostos que demonstram atividade insignificante como agentes quelantes ou como tensoativos mas que ainda assim intensificam a absorção de iRNAs através da mucosa alimentar (ver, por exemplo, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Essa classe de intensificadores da penetração inclui, por exemplo, ureias cíclicas insaturadas, derivados 1-alquil- e 1-alcenilazaciclo- alcanona (Lee et al., "Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems", 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não esteroides, como diclofenac sódio, indometacina e fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[00310] Agentes que aumentam a captação de iRNAs ao nível celular também podem ser adicionados à composição farmacêutica e outras composições da presente invenção. Por exemplo, lipídeos catiônicos, como lipofectina (Junichi et al, Patente U.S. N° 5.705.188), derivados catiônicos de glicerol, e moléculas policatiônicas, como polilisina (Lollo et al., Pedido PCT WO 97/30731), também são conhecidos por aumentarem a captação celular de dsRNAs. Exemplos reagentes de transfeção disponíveis no mercado incluem, por exemplo, Lipofectamina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamina 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStile™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamina™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamina™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Reagente de Transfeção X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suiça), Reagente de Transfeção Lipossômica DOTAP (Grenzacherstrasse, Suiça), Reagente de Transfeção Lipossômica DOSPER (Grenzacherstrasse, Suiça), ou Fugene (Grenzacherstrasse, Suiça), Reagente Transfectam® (Promega; Madison, WI), Reagente de Transfeção TransFast™ (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marselha, França), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marselha, França), Reagente de Transfeção TransPassa D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EUA), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfeção PerFectina (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfeção NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), reagente de Transfeção GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), reagente de Transfeção GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfeção Cytofectina (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfeção BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de transfeção TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EUA), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EUA), SureFECTOR (B- Bridge International; Mountain View, CA, EUA), ou HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EUA), entre outros.
[00311] Podem ser utilizados outros agentes para intensificar a penetração dos ácidos nucleicos administrados, incluindo glicóis, como etileno glicol e propileno glicol, pirróis, como 2-pirrol, azonas, e terpenos, como limoneno e mentona. v. Veículos
[00312] Certas composições da presente invenção também incorporam na formulação compostos veículos. Como usado aqui, "composto veículo" ou "veículo" pode referir-se a um ácido nucleico, ou respectivo análogo, que é inerte (isto é, não possui atividade biológica per se) mas que é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico possuindo atividade biológica, por exemplo, por degradação do ácido nucleico biologicamente ativo ou promoção da sua remoção da circulação. A coadministração de um ácido nucleico e um composto veículo, tipicamente com um excesso da última substância, pode originar uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperada no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido a competição entre o composto veículo e o ácido nucleico para um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um dsRNA parcialmente de fosforotioato em tecido hepático pode ser reduzida quando é coadministrado com ácido poli-inosínico, sulfato de dextrana, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4'isotiociano- estilbeno-2,2'-dissulfônico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183. Excipientes
[00313] Em contraste com um composto veículo, um "veículo farmacêutico" ou "excipiente" é um solvente, agente de suspensão farmaceuticamente aceitável ou qualquer outro veículo farmacológica-mente inerte para administração de um ou mais ácidos nucleicos em um animal. O excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, tendo em mente o modo de administração planejado, de modo a proporcionar o volume, consistência, etc., desejados quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Veículos farmacêuticos típicos incluem mas não estão limitados a agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré- gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose, etc.); agentes de enchimento (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etil celulose, poliacrilatos ou hidrogenofosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, glicolato de amido sódico, etc.); e agentes umedecedores (por exemplo, lauril sulfato de sódio, etc.).
[00314] Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parentérica que não reagem prejudicialmente com ácidos nucleicos também podem ser usados para formular as composições da presente invenção. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem mas não estão limitados a água, soluções salinas, álcoois, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e afins.
[00315] Formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas esterilizadas ou não esterilizadas, soluções não aquosas em solventes comuns, como álcoois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases oleosas líquidas ou sólidas. As soluções também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Podem ser usados excipientes orgânicos ou inorgânicos farmacêutica-mente aceitáveis adequados para administração não parentérica que não reagem prejudicialmente com ácidos nucleicos.
[00316] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem mas não estão limitados a água, soluções salinas, álcool, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirro- lidona e afins. Outros Componentes
[00317] As composições da presente invenção podem adicionalmente conter outros componentes adjuntos convencionalmente presentes em composições farmacêuticas, a seus níveis de utilização estabelecidos na área. Assim, por exemplo, as composições podem conter materiais adicionais, compatíveis e farmaceuticamente ativos, tais como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de várias formas galênicas das composições da presente invenção, como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizadores. Contudo, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente nas atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizadores, agentes umedecedores, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, substâncias corantes, aromatizantes e/ou aromáticas e afins que não interajam prejudicialmente com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação.
[00318] Suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, sorbitol e/ou dextrana. A suspensão também pode conter estabilizadores.
[00319] Em algumas modalidades, composições farmacêuticas apresentadas na invenção incluem (a) um ou mais compostos de iRNA e (b) um ou mais agentes que funcionam por um mecanismo diferente de RNAi e que são úteis no tratamento de um distúrbio do metabolismo de lipídeos. Exemplos de tais agentes incluem mas não estão limitados a um agente anti-inflamatório, agente antiesteatose, agente antiviral, e/ou antifibrose. Adicionalmente, outras substâncias habitualmente usadas para proteger o fígado, como silimarina, também podem ser usadas em conjunção com os iRNAs descritos aqui. Outros agentes úteis para o tratamento de doenças do fígado incluem telbivudina, entecavir, e inibidores de proteases, como telaprevir, e outros revelados, por exemplo, em Tung et al., Publicações de Pedidos U.S. N°s 2005/0148548, 2004/0167116, e 2003/0144217; e em Hale et al., Publicação de Pedido U.S. N° 2004/0127488.
[00320] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas mediante procedimentos farmacêuticos comuns em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar o valor LD50 (a dose letal para 50% da população) e o valor ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A proporção na dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expresso na forma da proporção LD50/ED50. São preferidos compostos que exibem altos índices terapêuticos.
[00321] Os dados obtidos de ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagens para uso em humanos. A dosagem de composições apresentadas aqui na invenção está geralmente situada dentro de um intervalo de concentrações em circulação que incluem o valor ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama, dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado nos métodos apresentados na invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais de modo a alcançar um intervalo de concentrações no plasma em circulação do composto ou, quando apropriado, do produto polipeptídico de uma sequência alvo (por exemplo, alcançar uma concentração decrescida do polipeptídeo) que inclui o valor IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que permite alcançar uma inibição semimáxima de sintomas), determinado em cultura de células. Essa informação pode ser usada para determinar de modo mais preciso doses úteis em humanos. Níveis no plasma podem ser mensurados, por exemplo, mediante cromatografia líquida de alto desempenho.
[00322] Para além da sua administração, como discutido acima, os iRNAs apresentados na invenção podem ser administrados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes no tratamento de processos patológicos mediados por expressão de ANGPTL3. Em qualquer caso, o médico que administra o agente pode ajustar a quantidade e calendarização da administração de iRNA com base em resultados observados usando medições comuns de eficácia conhecidas na área ou descritas aqui. Métodos da Invenção
[00323] A presente invenção também proporciona métodos de utilização de um iRNA da invenção e/ou de uma composição contendo um iRNA da invenção para reduzir e/ou inibir a expressão de ANGPTL3 em uma célula. Os métodos incluem contatar a célula com um dsRNA da invenção e manter a célula por um período de tempo suficiente para se obter degradação do transcrito de mRNA de um gene ANGPTL3, desse modo inibindo a expressão do gene ANGPTL3 na célula. A redução da expressão genética pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na área. Por exemplo, pode ser determinada uma redução da expressão de ANGPTL3 determinando o nível de expressão de mRNA de ANGPTL3 usando métodos rotineiros para o versado na técnica, por exemplo, Northern blotting, qRT-PCR; determinando o nível de proteína de ANGPTL3 usando métodos rotineiros para o versado na técnica, como Western blotting, técnicas imunológicas. Uma redução da expressão de ANGPTL3 também pode ser avaliada indiretamente mensurando um decréscimo da atividade biológica de ANGPTL3, por exemplo, um decréscimo do nível de lipídeos do soro, triglicerídeos, colesterol e/ou ácidos graxos livres.
[00324] Nos métodos da invenção, a célula pode ser contatada in vitro ou in vivo, isto é, a célula pode estar dentro de um sujeito.
[00325] Uma célula adequada para tratamento usando os métodos da invenção pode ser qualquer célula que expressa um gene ANGPTL3. Uma célula adequada para utilização nos métodos da invenção pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula de primata (como uma célula humana ou uma célula de primata não humano, por exemplo, uma célula de macaco ou uma célula de chimpanzé), uma célula não de primata (como uma célula de vaca, uma célula de porco, uma célula de camelo, uma célula de lama, uma célula de cavalo, uma célula de cabra, uma célula de coelho, uma célula de borrego, uma célula de hamster, de porquinho-da-índia, uma célula de gato, uma célula de cão, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de leão, uma célula de tigre, uma célula de urso, ou uma célula de búfalo), uma célula de pássaro (por exemplo, uma célula de pato ou uma célula de ganso), ou uma célula de baleia. Em uma modalidade, a célula é uma célula humana, por exemplo, uma célula humana de fígado.
[00326] A expressão de ANGPTL3 é inibida na célula em pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou cerca de 100%.
[00327] Os métodos in vivo da invenção podem incluir administrar a um sujeito uma composição contendo um iRNA, em que o iRNA inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos uma parte de um transcrito de RNA do gene ANGPTL3 do mamífero a ser tratado. Quando o organismo a ser tratado é um mamífero, como um humano, a composição pode ser administrada por quaisquer meios conhecidos na área, incluindo mas não se limitando às vias oral, intraperitoneal, ou parentérica, incluindo administração intracraniana (por exemplo, intraventricular, intraparênquima e intratecal), intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, pelas vias aéreas (aerossol), nasal, retal, e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas modalidades, as composições são administradas por infusão ou injeção intravenosa. Em certas modalidades, as composições são administradas por injeção subcutânea.
[00328] Em algumas modalidades, a administração é efetuada via uma injeção de depósito. Uma injeção de depósito pode liberar o iRNA de um modo consistente ao longo de um período de tempo prolongado. Assim, uma injeção de depósito pode reduzir a frequência da dosagem necessária para se obter um efeito desejado, por exemplo, uma inibição desejada de ANGPTL3, ou um efeito terapêutico ou profilático. Uma injeção de depósito também pode proporcionar concentrações no soro mais consistentes. Injeções de depósito podem incluir injeções subcutâneas ou injeções intramusculares. Em modalidades preferidas, a injeção de depósito é uma injeção subcutânea.
[00329] Em algumas modalidades, a administração é efetuada via uma bomba. A bomba pode ser uma bomba externa ou uma bomba cirurgicamente implantada. Em certas modalidades, a bomba é uma bomba osmótica implantada subcutaneamente. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba de infusão. Uma bomba de infusão pode ser usada para infusões intravenosa, subcutânea, arterial, ou epidural. Em modalidades preferidas, a bomba de infusão é uma bomba de infusão subcutânea. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba cirurgicamente implantada que administra o iRNA no fígado.
[00330] O modo de administração pode ser escolhido com base em ser desejado um tratamento local ou sistêmico e com base na área a ser tratada. A via e sítio de administração podem ser escolhidos para aumentar o direcionamento para o alvo.
[00331] Em um aspecto, a presente invenção também proporciona métodos para inibir a expressão de um gene ANGPTL3 em um mamífero. Os métodos incluem administrar ao mamífero uma composição compreendendo um dsRNA que tem como alvo um gene ANGPTL3 em uma célula do mamífero e manter o mamífero por um período de tempo suficiente para se obter degradação do transcrito de mRNA do gene ANGPTL3, desse modo inibindo a expressão do gene ANGPTL3 na célula. A redução da expressão genética pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na área e mediante métodos, por exemplo, qRT-PCR, descritos aqui. A redução da produção proteica pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na área e mediante métodos, por exemplo, ELISA, descritos aqui. Em uma modalidade, uma amostra de punção biopsia do fígado serve de material tecidual para monitorar a redução da expressão genética e/ou proteica de ANGPTL3.
[00332] A presente invenção também proporciona métodos de tratamento de um sujeito necessitado. Os métodos de tratamento da invenção incluem administrar um iRNA da invenção a um sujeito, por exemplo, um sujeito que irá beneficiar de uma redução e/ou inibição da expressão de ANGPTL3, em uma quantidade terapeuticamente eficaz, de um iRNA tendo como alvo um gene ANGPTL3 ou de uma composição farmacêutica compreendendo um iRNA tendo como alvo um gene ANGPTL3.
[00333] Um iRNA da invenção pode ser administrado na forma de um "iRNA livre". Um iRNA livre é administrado na ausência de uma composição farmacêutica. O iRNA nu pode estar em uma solução tampão adequada. A solução tampão pode compreender acetato, citrato, prolamina, carbonato, ou fosfato, ou qualquer combinação respectiva. Em uma modalidade, a solução tampão consiste em solução salina tamponada com fosfato (PBS). O pH e a osmolaridade da solução tampão contendo o iRNA podem ser ajustados de modo que a solução seja adequada para administração a um sujeito.
[00334] Em alternativa, um iRNA da invenção pode ser administrado na forma de uma composição farmacêutica, como uma formulação lipossômica de dsRNA.
[00335] Sujeitos que irão beneficiar de uma redução e/ou inibição da expressão genética de ANGPTL3 são os sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos, por exemplo, um distúrbio do metabolismo de lipídeos hereditário ou um distúrbio do metabolismo de lipídeos adquirido. Em uma modalidade, um sujeito sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos sofre de hiperlipidemia. Em outra modalidade, um sujeito sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos sofre de hipertrigliceridemia. O tratamento de um sujeito que irá beneficiar de uma redução e/ou inibição da expressão genética de ANGPTL3 inclui tratamento terapêutico (por exemplo, um sujeito sofrendo de xantomas eruptivos) e tratamento profilático (por exemplo, o sujeito não sofre de xantomas eruptivos ou um sujeito pode estar em risco de desenvolver xantomas eruptivos).
[00336] A invenção também proporciona métodos de utilização de um iRNA ou de uma respectiva composição farmacêutica, por exemplo, para o tratamento de um sujeito que irá beneficiar de redução e/ou inibição da expressão de ANGPTL3, por exemplo, um sujeito sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos, em combinação com outros agentes farmacêuticos e/ou outros métodos terapêuticos, por exemplo, com agentes farmacêuticos conhecidos e/ou métodos terapêuticos conhecidos, tais como, por exemplo, os que são correntemente empregues para o tratamento desses distúrbios. Por exemplo, em certas modalidades, um iRNA tendo como alvo ANGPTL3 é administrado em combinação, por exemplo, com um agente útil no tratamento de um distúrbio do metabolismo de lipídeos, como descrito aqui em outro local. Por exemplo, agentes adicionais adequados para tratamento de um sujeito que irá beneficiar de redução da expressão de ANGPTL3, por exemplo, um sujeito sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos, podem incluir agentes que diminuem um ou mais lipídeos do soro. Exemplos não limitadores de tais agentes podem incluir inibidores da síntese do colesterol, como inibidores de HMG-CoA redutase, por exemplo, estatinas. Estatinas podem incluir atorvastatina (Lipitor), fluvastatina (Lescol), lovastatina (Mevacor), lovastatina de liberação prolongada (Altoprev), pitavastatina (Livalo), pravastatina (Pravachol), rosuvastatina (Crestor), e sinvastatina (Zocor). Outros agentes úteis no tratamento de um distúrbio do metabolismo de lipídeos podem incluir agentes sequestradores de bílis, como colestiramina e outras resinas; inibidores da secreção de VLDL, como niacina; antioxidantes lipofílicos, como Probucol; inibidores da acil-CoA colesterol acil transferase; antagonistas de receptores farnesoides X; ativadores da proteína ativadora da clivagem da proteína de ligação ao elemento regulador de esterol (SCAP); inibidores da proteína de transferência microssômica de triglicerídeos (MTP); peptídeo relacionado a ApoE; e anticorpos terapêuticos contra ANGPTL3. Os agentes terapêuticos adicionais também podem incluir agentes aumentam o nível de lipoproteína de alta densidade (HDL), como inibidores da proteína de transferência de éster de colesterila (CETP). Além disso, os agentes terapêuticos adicionais também podem incluir suplementos dietéticos, por exemplo, óleo de peixe. O iRNA e agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados ao mesmo tempo e/ou na mesma combinação, por exemplo, parentericamente, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou em instantes separados e/ou mediante outro método conhecido na área ou descrito aqui.
[00337] Em uma modalidade, o método inclui administrar uma composição apresentada aqui de modo que a expressão do gene ANGPTL3 alvo seja decrescida, tal como por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24 horas, 28, 32, ou cerca de 36 horas. Em uma modalidade, a expressão do gene ANGPTL3 alvo é decrescida por um período prolongado, por exemplo, pelo menos por cerca de dois, três, quatro dias ou mais, por exemplo, cerca de uma semana, duas semanas, três semanas, ou quatro semanas ou mais.
[00338] De preferência, os iRNAs úteis para os métodos e composições apresentados aqui têm especificamente como alvo RNAs (primários ou processados) do gene ANGPTL3 alvo. Composições e métodos para inibir a expressão desses genes usando iRNAs podem ser preparadas e implementados como descrito aqui.
[00339] A administração do dsRNA de acordo com os métodos da invenção pode originar uma redução da gravidade, sinais, sintomas, e/ou marcadores dessas doenças ou distúrbios em um paciente sofrendo de um distúrbio do metabolismo de lipídeos. Por "redução", nesse contexto, pretende-se significar um decréscimo estatisticamente significativo desse nível. A redução pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou cerca de 100%.
[00340] A eficácia do tratamento ou prevenção de doença pode ser avaliada, por exemplo, mensurando a progressão da doença, remissão da doença, gravidade de sintomas, redução de dor, qualidade de vida, dose de uma medicação requerida para manter um efeito do tratamento, nível de um marcador de doença ou qualquer outro parâmetro mensurável apropriado para uma doença determinada sendo tratada ou sendo o alvo de prevenção. Pertence à capacidade do versado na técnica monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção mensurando qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Por exemplo, a eficácia do tratamento de um distúrbio do metabolismo de lipídeos pode ser avaliada, por exemplo, mediante monitoração periódica de um ou mais níveis de lipídeos do soro. Comparações das últimas leituras com as leituras iniciais dão a um médico uma indicação da eficácia do tratamento. Pertence à capacidade do versado na técnica monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção mensurando qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Em conexão com a administração de um iRNA tendo como alvo ANGPTL3 ou respectiva composição farmacêutica, "eficaz contra" um distúrbio do metabolismo de lipídeos indica que a administração de um modo clinicamente apropriado origina um efeito benéfico para pelo menos uma fração estatisticamente significativa de pacientes, como uma melhoria de sintomas, uma cura, uma redução da doença, extensão do tempo de vida, melhoria da qualidade de vida, ou outro efeito geralmente reconhecido como sendo positivo por médicos familiarizados com o tratamento de distúrbios do metabolismo de lipídeos e das causas relacionadas.
[00341] Um efeito de tratamento ou preventivo é evidente quando ocorre uma melhoria estatisticamente significativa de um ou mais parâmetros do estado de doença, ou por uma ausência do agravamento ou do desenvolvimento de sintomas que de outro modo seriam antecipados. Como exemplo, uma alteração favorável de pelo menos 10% em um parâmetro mensurável de doença, e preferivelmente pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou mais, pode ser indicador de tratamento eficaz. A eficácia de um dado fármaco de iRNA ou formulação desse fármaco também pode ser avaliada usando um modelo animal experimental para a doença determinada, como conhecido na área. Ao usar um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando é observada uma redução estatisticamente significativa em um marcador ou sintoma.
[00342] Em alternativa, a eficácia pode ser mensurada por uma redução da gravidade da doença, determinada pelo versado na técnica do diagnóstico, com base em uma escala de gradação da gravidade de doença clinicamente aceite, apenas como um exemplo a classificação de Child-Pugh (por vezes a classificação de Child-Turcotte-Pugh). Qualquer alteração positiva resultante, por exemplo, em atenuação da gravidade de doença mensurada usando a escala apropriada representa um tratamento adequado usando um iRNA ou formulação de iRNA como descrito aqui.
[00343] Aos sujeitos pode ser administrada uma quantidade terapêutica de dsRNA, tal como cerca de 0,01 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 1 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 2 mg/kg até cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 3 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 3,5 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg até cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 5,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 6 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 6,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 7 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 7,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 8 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 8,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, cerca de 9 mg/kg até cerca de 10 mg/kg, ou cerca de 9,5 mg/kg até cerca de 10 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[00344] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado a uma dose de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ou cerca de 10 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[00345] Em outras modalidades, por exemplo, quando uma composição da invenção compreende um dsRNA como descrito aqui e uma N- acetilgalactosamina, aos sujeitos pode ser administrada uma quantidade terapêutica de dsRNA, tal como uma dose de cerca de 0,1 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 50 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 50 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 40 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 45 até cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,1 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 45 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 45 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 40 até cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,1 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 40 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 40 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 30 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 35 até cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,1 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 30 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 30 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 15 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 até cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,1 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,25 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,75 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 até cerca de 20 mg/mg, cerca de 1,5 até cerca de 20 mg/kb, cerca de 2 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 3 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 3,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 4 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 4,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 7,5 até cerca de 20 mg/kg, cerca de 10 até cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 15 até cerca de 20 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[00346] Por exemplo, aos sujeitos pode ser administrada uma quantidade terapêutica de dsRNA, tal como cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou cerca de 50 mg/kg. Também é pretendido que valores e intervalos intermédios dos valores listados façam parte desta invenção.
[00347] O iRNA pode ser administrado por infusão intravenosa ao longo de um período de tempo, tal como ao longo de um período de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou cerca de 25 minutos. A administração pode ser repetida, por exemplo, em uma base regular, como bissemanalmente (isto é, a cada duas semanas) por um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente. Por exemplo, após administração bissemanal por três meses, a administração pode ser repetida uma vez ao mês, por seis meses ou um ano ou mais. A administração do iRNA pode reduzir os níveis de ANGPTL3, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento do paciente em pelo menos cerca de 5%, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 39, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou pelo menos cerca de 99% ou mais.
[00348] Antes da administração de uma dose completa do iRNA, aos pacientes pode ser administrada uma dose menor, como uma reação de infusão 5%, e podem ser monitorados quanto a efeitos adversos, como uma reação alérgica. Em outro exemplo, o paciente pode ser monitorado quanto a efeitos imunoestimuladores indesejados, como níveis acrescidos de citocinas (por exemplo, TNF-alfa ou INF-alfa).
[00349] Em alternativa, o iRNA pode ser administrado subcutâneamente, isto é, mediante injeção subcutânea. Uma ou mais injeções podem ser usadas para administrar a dose diária desejada de iRNA a um sujeito. As injeções podem ser repetidas ao longo de um período de tempo, como ao longo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 15 dias. A administração pode ser repetida, por exemplo, em uma base regular, como bissemanalmente (isto é, a cada duas semanas) por um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente. Em algumas modalidades, uma única dose de iRNA é seguida de dosagem mensal. Em algumas modalidades, a dosagem pode compreender uma fase de carga de múltiplas doses em dias consecutivos.
[00350] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comummente entendido por um versado na técnica à qual pertence esta invenção. Apesar de métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui poderem ser usados na prática ou teste dos iRNAs e métodos apresentados na invenção, métodos e materiais adequados são descritos embaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas a título de referência na sua totalidade. No caso de haver conflito controlará a presente especificação, incluindo definições. Adicionalmente, os materiais, métodos, e exemplos são somente ilustrativos, não sendo pretendido que sejam limitadores.
EXEMPLOS Exemplo 1. Síntese de iRNA Fonte de reagentes
[00351] Quando não for especificamente apresentada aqui a fonte de um reagente, esse reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular com um padrão de qualidade/pureza para aplicação em biologia molecular.
Transcritos
[00352] siRNA foi planejado para identificar siRNAs tendo como alvo o transcrito de ANGPTL3 humano anotado na base de dados de Genes do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) e um transcrito de ANGPTL3 de macaco cynomolgus (Macaca fascicularis; daqui em diante "cyno") produzido via sequenciamento de cDNA preparado a partir de RNA de fígado. O sequenciamento de mRNA de ANGPTL3 cyno foi efetuado internamente, e a sequência de mRNA está apresentada na SEQ ID NO:9.
[00353] O planejamento empregou os seguintes transcritos da coleção do NCBI: Humano - NM_014495.2 (SEQ ID NO:1); Camundongo - NM_013913.3 (SEQ ID NO:2). Foram planejados todos os duplexes de siRNA que partilhavam 100% de identidade com os transcritos humano e cyno listados. Um subconjunto de duplexes de siRNA, descrito embaixo, também partilhou 100% de identidade com o transcrito de ANGPTL3 de camundongo (Mus musculus) presente na base de dados de Genes do NCBI. Planejamento, Especificidade, e Previsão da Eficácia de siRNA
[00354] A especificidade prevista de todos os possíveis 19meros foi determinada a partir de cada sequência. Foram então selecionados os 19meros candidatos desprovidos de repetições mais longas do que 7 nucleotídeos. Esses 977 siRNAs candidatos humanos/cyno, e um subconjunto de 38 também correspondentes a camundongo ("siRNAs candidatos humanos/cyno/de camundongo") foram então usados em uma pesquisa extensa contra o transcritoma humano (definido como o conjunto de registros NM_ e XM_ no conjunto de Refseq humanas do NCBI) usando um algoritmo exaustivo de "força bruta" implementado no "script" de Python 'BruteForce.py'. Em seguida, o "script" analisou os alinhamentos transcrito-oligo para gerar uma pontuação baseada na posição e número de emparelhamentos defeituosos entre o siRNA e qualquer transcrito potencial 'fora do alvo'. A pontuação fora do alvo é ponderada para enfatizar diferenças na região de 'semente' de siRNAs, nas posições 2-9 desde a extremidade 5' da molécula. A cada par oligo- transcrito da pesquisa de força bruta foi atribuída uma pontuação de emparelhamentos defeituosos mediante a soma das pontuações dos emparelhamentos defeituosos individuais; os emparelhamentos defeituosos na posição 2-9 contaram como 2,8, os emparelhamentos defeituosos nas posições de sítios de clivagem 10-11 contaram como 1,2, e os emparelhamentos defeituosos presentes na região 12-19 contaram como 1,0. Foi efetuada uma previsão adicional fora do alvo comparando a frequência de heptâmeros e octômeros derivados de 3 hexâmeros distintos, derivados da semente, de cada oligo. Os hexâmeros das posições 2-7 relativamente ao início 5' foram usados para criar 2 heptâmeros e um octômero. O 'heptâmero1' foi criado mediante a adição de um 3' A ao hexâmero; o 'heptâmero2' foi criado mediante a adição de um 5' A ao hexâmero; o octômero foi criado mediante a adição de um A a ambas as extremidades 5' e 3' do hexâmero. A frequência de octômeros e heptâmeros no 3'UTRoma humano (definido como a subsequência do transcritoma da base de dados Refseq do NCBI onde a extremidade da região codificadora, a 'CDS', está claramente definida) foi pré-calculada. A frequência dos octômeros foi normalizada para a frequência dos heptâmeros usando o valor mediano do intervalo das frequências de octômeros. Foi então calculado um valor 'mirSeedScore' computando a soma de ((3 X contagem de octômeros normalizada) + (2 X contagem de heptâmero2) + (1 X contagem de heptâmero1)).
[00355] Ambas as fitas dos siRNAs foram atribuídas a uma categoria de especificidade de acordo com as pontuações calculadas: uma pontuação acima de 3 é qualificada de altamente específica, igual a 3 como específica e entre 2,2 e 2,8 como moderadamente específica. A triagem foi efetuada pela especificidade da fita antissenso. Depois foram selecionados duplexes do conjunto humano/cyno com oligos antissenso desprovidos de emparelhamentos com sementes de miRNA, pontuações de 3 ou melhores, teor global de GC menor do que 65%, sem GC na primeira posição, 4 ou mais Us ou As na região de semente, e GC na décima nona posição. Também foram selecionados duplexes do conjunto humano/cyno/camundongo com oligos antissenso possuindo pontuações de 2 ou melhores, teor global de GC menor do que 65%, e sem GC na primeira posição. Seleção de sequências de siRNA
[00356] Um total de oligos de siRNA derivados 47 senso e 47 antissenso do conjunto humano/cyno foi sintetizado e formado em duplexes. Um total de siRNAs derivados 15 senso e 15 antissenso do conjunto humano/cyno/camundongo foi sintetizado e formado em duplexes. Síntese de sequências de ANGPTL3
[00357] Sequências de ANGPTL3 foram sintetizadas em um sintetizador MerMade 192 a uma escala de 1 ou 0,2 μmol. Fitas simples foram sintetizadas com modificações 2'O-metila para rastreio in vitro baseado em transfeção. Para utilização em ensaios de rastreio de captação livre, conjugados 3' GalNAc foram preparados com modificações químicas 2'F e 2'-O-metila. Nesses planos, a fração GalNAc foi colocada na extremidade 3' da fita senso. A sequência antissenso tinha 23 nucleotídeos de comprimento e também continha modificações químicas 2'F e 2'Ometila com duas ligações fosforotioato na extremidade 3'.
[00358] Em um conjunto de fitas simples e duplexes 21meros foi aplicada química 'endoleve', como detalhado embaixo.
[00359] Todas as pirimidinas (citosina e uridina) na fita senso foram modificadas com 2'-O-Metil nucleotídeos (2' O-Metil C e 2'-O-Metil U).
[00360] Na fita antissenso, pirimidinas adjacentes (na direção da posição 5') a ribo A nucleosídeo foram substituídas pelos seus correspondentes 2'-O-Metil nucleosídeos.
[00361] Foi introduzida uma extensão dTsdT de duas bases na extremidade 3' de ambas as sequências senso e antissenso.
[00362] Para sequências senso de 21meros conjugadas a GalNAc e sequências antissenso complementares de 23meros, foram sintetizadas fitas simples com modificação 2'F e 2'OMetila. A síntese foi realizada em um suporte de CPG com modificação GalNAc para a fita senso e CPG modificado com suporte universal para a sequência antissenso à escala de 1 μmol. Foi aplicado o motivo de sequência chamado de TOFFEE, no qual a fita senso continha um motivo de três nucleotídeos 2'F-modificado nas posições 9, 10 e 11 e, na fita antissenso, foi incluído um motivo 2'OMetil-modificado nas posições 11, 12 e 13. Síntese, Clivagem e Desproteção
[00363] A síntese de sequências de ANGPTL3 empregou síntese de oligonucleotídeos com suporte sólido usando química de fosforamidite. Para sequências endoleves de 21 meros, um desoxi timidina CPG foi usado como suporte sólido, ao passo que, para os conjugados de GalNAc, foi usado um suporte sólido de GalNAc para a fita senso e um CPG universal para a fita antissenso.
[00364] A síntese das sequências acima foi realizada a uma escala de 1 ou 0,2 μm em placas de 96 poços. As soluções de amidite foram preparadas à concentração de 0,1 M e utilizou-se etil tio tetrazol (0,6 M em Acetonitrila) como ativador.
[00365] As sequências sintetizadas foram clivadas e desprotegidas em placas de 96 poços, usando metilamina na primeira etapa e reagente de fluoreto na segunda etapa. Para sequências contendo GalNAc e 2'F nucleosídeo, as condições de desproteção foram modificadas. As sequências após a clivagem e desproteção foram precipitadas usando uma mistura acetona: etanol (80:20) e os péletes foram ressuspensos em tampão 0,2 M acetato de sódio. Amostras de cada sequência foram analisadas por LC-MS para confirmar a identidade, UV para quantificação e um conjunto selecionado de amostras por cromatografia IEX para determinar a pureza. Purificação, Dessalinização e Hibridização
[00366] Sequências de ANGPTL3 foram precipitadas e purificadas em um sistema Purificador AKTA usando uma coluna de Sephadex. O ANGPTL3 foi processado à temperatura ambiente. A injeção e coleta de amostras foram realizadas em placas de 96 poços com poços de 1,8 mL de profundidade. Um único pico correspondente à sequência completa foi coletado no eluente. As sequências de ANGPTL3 dessalinizadas foram analisadas quanto à concentração (por medição de UV a A260) e pureza (mediante HPLC de troca iônica). As fitas simples complementares foram então combinadas em uma proporção estequiométrica 1:1 para formar duplexes de siRNA.
Exemplo 2. Rastreio in vitro Cultura e transfeções de células
[00367] Células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) cresceram quase até à confluência a 37°C em uma atmosfera de 5% CO2 em RPMI (ATCC) suplementado com 10% FBS, estreptomicina, e glutamina (ATCC) antes de serem liberadas da placa mediante tripsinação. A transfeção foi efetuada adicionando 14,8 μL de Opti-MEM mais 0,2 μL de Lipofectamina RNAiMax por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. catálogo # 13778-150) a 5 μL de duplexes de siRNA por poço em uma placa de 96 poços e o sistema foi incubado à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, 80 μL de meio de crescimento completo sem antibiótico contendo ~2 x104 células Hep3B foram adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas por 24 ou 120 horas antes da purificação do RNA. Realizaram-se experimentos de dose única à concentração final do duplex de 10 nM e 0,1 nM e realizaram-se experimentos de resposta à dose à concentração final do duplex de 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 e 0,00001 nM, a menos que afirmado em contrário. Transfeção de captação livre
[00368] Cinco microlitros de cada siRNA conjugado a GalNac em PBS foram combinados com 4X104 hepatócitos de macaco Cynomolgus crioconservados e descongelados de fresco ressuspensos em 95 μL de meio In Vitro Gro CP (In Vitro Technologies- Celsis, Baltimore, MD) em cada poço de uma placa de 96 poços. A mistura foi incubada por cerca de 24 horas a 37°C em uma atmosfera de 5% CO2. Os siRNAs foram testados às concentrações finais de 500 nM, 100 nM e 10 nM para ensaios de eficácia da captação livre. Para rastreios de resposta à dose, as concentrações finais de siRNA foram 500 nM, 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0,8 nM, 0,16 nM, 0,032 nM e 0,0064 nM. Isolamento de RNA total usando o Estojo de Isolamento de mRNA DYNABEADS (Invitrogen, parte #: 610-12)
[00369] As células foram coletadas e submetidas a lise em 150 μL de Tampão de Lise/Ligação, então foram misturadas por 5 minutos a 850 rpm usando um Termomisturador Eppendorf (a velocidade de mistura foi igual em todo o processo). Dez microlitros de esférulas magnéticas e 80 μL de mistura de Tampão de Lise/Ligação foram adicionados a uma placa de fundo redondo e o sistema foi misturado por 1 minuto. As esférulas magnéticas foram capturadas usando um suporte magnético e o sobrenadante foi removido sem perturbar as esférulas. Após a remoção do sobrenadante, as células submetidas a lise foram adicionadas às esférulas remanescentes e misturadas por 5 minutos. Após a remoção do sobrenadante, as esférulas magnéticas foram lavadas 2 vezes com 150 μL de Tampão de Lavagem A e foram misturadas por 1 minuto. As esférulas foram capturadas de novo e o sobrenadante foi removido. As esférulas foram então lavadas com 150 μL de Tampão de Lavagem B, foram capturadas, e o sobrenadante foi removido. As esférulas foram seguidamente lavadas com 150 μL de Tampão de Eluição, foram capturadas, e o sobrenadante foi removido. As esférulas foram deixadas secar por 2 minutos. Após a secagem adicionaram-se 50 μL de Tampão de Eluição e o sistema foi misturado por 5 minutos a 70°C. As esférulas foram capturadas em magneto por 5 minutos. Quarenta microlitros de sobrenadante foram removidos e adicionados a outra placa de 96 poços. Síntese de cDNA usando o Estojo de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, Catálogo #4368813)
[00370] Uma mistura mãe de 2 μL de 10X Tampão, 0,8 μL de 25X dNTPs, 2 μL de "Primers" aleatórios, 1 μL de Transcriptase Reversa, 1 μL de inibidor de RNase e 3,2 μL de H2O por reação foi adicionada a 10 μL de RNA total. Foi gerado cDNA, usando um termociclador Bio-Rad C-1000 ou S-1000 (Hercules, CA), mediante as etapas seguintes: 25 oC 10 minutos, 37 oC 120 minutos, 85 oC 5 segundos, manter 4 oC. PCR em tempo real
[00371] Adicionaram-se 2 μL de cDNA a uma mistura mãe contendo 0,5 μL de Sonda Taqman para GAPDH (Applied Biosystems Catálogo #4326317E), 0,5 μL de sonda Taqman para ANGPTL (Applied Biosystems catálogo # Hs00205581_m1) e 5 μL de mistura mãe de sonda Lightcycler 480 (Roche Catálogo #04887301001) por poço em 50 placas de 384 poços (Roche catálogo # 04887301001). PCR em tempo real foi realizado em um sistema de PCR em Tempo Real ABI 7900HT (Applied Biosystems) usando o ensaio de ΔΔCt(RQ). Cada duplex foi testado em duas transfeções independentes, e cada transfeção foi avaliada em duplicado, a menos que notado em contrário nas tabelas de sumário.
[00372] Para calcular a alteração relativa do número de vezes, os dados de tempo real foram analisados usando o método ΔΔCt e foram normalizados para ensaios realizados com células transfetadas com 10 nM AD-1955, ou células pseudotransfetadas. Os valores IC50s foram calculados usando um modelo de ajustamento de 4 parâmetros empregando XLFit e foram normalizados para células transfetadas com AD-1955 ou células não manipuladas ao longo do mesmo intervalo de doses, ou para a sua própria dose mais baixa. A sequência AD-1955, usada como controle negativo, tem como alvo luciferase e tem a seguinte sequência: senso: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 14); antissenso: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 15). Rastreios de viabilidade
[00373] A viabilidade celular foi mensurada nos dias 3 e 6 em células HeLa e Hep3B após transfeção com 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05 nM siRNA. As células foram plaqueadas, a uma densidade de 10 000 células por poço, em placas de 96 poços. Cada siRNA foi avaliado em triplicado e foi feita a média dos dados. siRNAs tendo como alvo PLK1 e AD-19200 foram incluídos como controles positivos para perda de viabilidade, e células transfetadas com AD-1955 e pseudotransfetadas como controles negativos. PLK1 e AD-19200 originam uma perda de viabilidade dependente da dose. Para mensurar a viabilidade, 20 μL de CellTiter Blue (Promega) foram adicionados a cada poço das placas de 96 poços passados 3 ou 6 dias e os sistemas foram incubados a 37 oC por 2 horas. As placas foram então lidas em um Espectrofotômetro (Molecular Devices) a 560Ex/590Em. A viabilidade foi expressa como o valor médio de unidades luminosas de três transfeções repetidas +/- desvio padrão. A viabilidade relativa foi avaliada fazendo primeiramente a média das três transfeções repetidas e então normalizando para células Pseudotransfetadas. Os dados estão expressos em % de células viáveis. Tabela 1: Abreviaturas de monômeros nucleotídicos usados na representação de sequências de ácidos nucleicos.
[00374] Será entendido que esses monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, estão mutuamente ligados por ligações 5'-3'- fosfodiéster.
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Tabela 4. Resultados do rastreio de dose única usando sequências de dsRNA de ANGPTL3
[00375] Os experimentos foram conduzidos usando duplexes oligonucleotídicos modificados listados na Tabela 3. A sequência de AD- 15838.2 é idêntica à sequência de AD-15838.1. A administração de duplexes de siRNA foi efetuada usando LNPs.
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Tabela 5. Resultados do rastreio de resposta à dose para sequências de dsRNA de ANGPTL3
[00376] Os experimentos foram conduzidos usando duplexes oligonucleotídicos modificados listados na Tabela 3. A sequência de AD- 15838.2 é idêntica à sequência de AD-15838.1.
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Tabela 6. Resultados de rastreios de viabilidade celular usando sequências de dsRNA de ANGPTL3 modificadas
[00377] Os experimentos foram conduzidos usando duplexes oligonucleotídicos modificados listados na Tabela 3. A sequência de AD-15838.2 é idêntica à sequência de AD-15838.1. Os dados de viabilidade estão expressos em % de viáveis relativamente a células pseudotratadas.
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[00378] Nucleotídeos em letra minúscula (a, u, g, c) são 2'-O-metil nucleotídeos; Nf (por exemplo, Af) é um 2'-fluoro nucleotídeo; s é uma ligação fosfotiorato; L96 indica um ligante de GalNAc. Tabela 9. Sequências não modificadas de fitas Senso e antissenso de dsRNAs de ANGPTL3 sem conjugação a GalNal
[00379] Essas sequências são iguais às sequências listadas na Tabela 7 com a exceção de não conterem conjugação a GalNal.
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Tabela 10. Sequências modificadas de fitas Senso e antissenso de dsRNAs de ANGPTL3 sem conjugação a GalNal
[00380] Essas sequências são iguais às sequências listadas na Tabela 8 com a exceção de não conterem conjugação a GalNal.
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Tabela 11. Resultados do rastreio de dose única usando dsRNA conjugado a GalNac de ANGPTL3
[00381] siRNAs modificados foram testados mediante transfeção em células Hep3b e mediante captação livre em células primárias de macaco cynomolgus (PCH) às doses acima listadas.
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Tabela 12. Resultados do rastreio de resposta à dose para sequências de dsRNA conjugadas a GalNac de ANGPTL3
[00382] Um subconjunto de siRNAs ativos do rastreio de dose única (referência aos dados na Tabela 11) foi testado em um experimento de resposta à dose por captação livre em células PCH. Um subconjunto destes siRNAs ativos também foi testado em resposta à dose em células Hep3B por transfeção.
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Tabela 14. Resultados de um rastreio de resposta à dose usando um subconjunto de sequências da Tabela 13.
[00383] Um subconjunto de siRNAs ativos de ANGPTL3 da Tabela 10 foi testado por transfeção em células Hep3B em rastreios de resposta à dose.
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Tabela 15. IDs de pares de duplexes para os quais foram sintetizadas e testadas uma versão não conjugada e uma versão conjugada a GalNac
[00384] Esses duplexes têm a mesma sequência e padrão de modificação.
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Artigos de teste
[00385] Foram conduzidos experimentos in vivo usando sequências de dsRNA da invenção. A sequência de dsRNA usada nos experimentos foi AD-52981 conjugada a GalNac ("ANG", sequência senso: AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96 (SEQ ID NO: 657); sequência antissenso: aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg (SEQ ID NO: 842)). A sequência de dsRNA usada como controle negativo foi AD- 48399B1 conjugada a luciferase ("Luc", sequência senso: CfaCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAfL96 (SEQ ID NO: 1728), sequência antissenso: uCfgAfaGfuAfcUfcAfgCfgUfaAfgUfgsAfsu (SEQ ID NO: 1729)). Também foi usado, como controle negativo, AD-1955 conjugada a GalNal contendo modificações alternadas 2'-metila e 2' fluoro. Procedimento experimental
[00386] As sequências de dsRNA foram testadas em camundongos C57BL/6 (TS) e ob/ob. Os camundongos TS receberam cinco doses diárias de dsRNAs em PBS, Luc a 20 mg/kg, ou ANG a 5 ou 20 mg/kg; e os camundongos ob/ob receberam cinco doses diárias de NPLs formuladas com Luc a 20 mg/kg ou ANG a 20 mg/kg. Todos os artigos de teste foram administrados por injeção subcutânea de acordo com o procedimento mostrado na Figura 1. De modo específico, cinco doses diárias dos artigos de teste foram administradas em cinco dias consecutivos (dia 0, 1, 2, 3 e 4), e amostras de sangue foram coletadas 5, 3 ou 1 dia antes da administração, bem como nos dias 0, 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 15, 18, 21, 25, 30, 37, 45 e 50 pós-administração. As amostras sanguíneas coletadas foram usadas para mensurar a expressão da proteína ANGPTL3 usando um ensaio ELISA. Níveis no soro de triglicerídeos (TGs), colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (LDLc), colesterol de lipoproteínas de alta densidade (HDLc) e colesterol total (TC) foram também mensurados usando um Analisador Olympus. Resultados
[00387] Na Figura 2, Painel A, são mostrados os níveis de proteína ANGPTL3 murina (mANGPTL3) mensurados em camundongos TS após administração de controle ou ANG a 5 ou 20 mg/kg. Na Figura 2, Painel B, também estão apresentados níveis de proteína mANGPTL3 mensurados em camundongos ob/ob após administração de controle ou ANG a 20 mg/kg. Os dados indicam que, para camundongos TS e ob/ob, a administração de ANG origina níveis decrescidos de proteína mANGPTL3, em comparação com controles.
[00388] Na Figura 3, Painel A, são mostrados níveis de LDL-c mensurados em camundongos TS após administração de controle ou ANG a 20 mg/kg. Na Figura 3, Painel B, estão apresentados níveis de LDL-c mensurados em camundongos ob/ob após administração de controle ou ANG a 20 mg/kg. Os dados indicam que a administração de ANG origina níveis decrescidos de LDL-c, particularmente em camundongos ob/ob, em comparação com controles.
[00389] Na Figura 4, Painel A, são mostrados níveis de triglicerídeos mensurados em camundongos TS após administração de controle ou ANG a 20 mg/kg. Na Figura 4, Painel B, estão apresentados níveis de triglicerídeos mensurados em camundongos ob/ob após administração de controle ou ANG a 20 mg/kg. Os dados indicam que a administração de ANG origina níveis decrescidos de triglicerídeos, particularmente em camundongos ob/ob, em comparação com controles.
[00390] Na Figura 5, Painel A e B, são mostrados níveis de colesterol total (TC) mensurados em camundongos TS e ob/ob, respectivamente, após administração de controle ou ANG a 20 mg/kg. Os dados indicam que a administração de ANG origina um decréscimo moderado dos níveis de TC em camundongos ob/ob, mas não em camundongos TS. De modo similar, a administração de ANG causa um decréscimo moderado dos níveis de HDL-c em camundongos ob/ob, mas não em camundongos TS, como mostrado nos gráficos da Figura 6.
Exemplo 4. Artigo de teste
[00391] Foi testado o efeito de uma única injeção de uma sequência de dsRNA da invenção no nível da proteína ANGPTL3. A sequência de dsRNA usada nos experimentos foi AD-52981 conjugada a GalNac ("ANG", sequência senso: AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96 (SEQ ID NO: 657); sequência antissenso: aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg (SEQ ID NO: 842)). PBS foi usado como controle negativo. Procedimento experimental
[00392] As sequências de dsRNA foram testadas em camundongo Transgênico em PCS Humano caracterizado por expressão fígado- específica do gene PCSK9 humano completo. Camundongos transgênicos em PCS humano foram doseados com AD-52981 ou PBS usando uma única injeção subcutânea. Os camundongos foram divididos em quatro grupos, com cada grupo consistindo em dois machos e duas fêmeas. Cada grupo recebeu uma injeção de PBS ou uma dose de 5 mg/kg, 20 mg/kg ou 60 mg/kg de AD-52981. Amostras de sangue foram coletadas no dia 1 e dia 0 antes da dosagem, e às 72 horas pós-dosagem. Os níveis de proteína ANGPTL3 foram mensurados por ELISA e comparados com os níveis no dia 1 e dia 0 antes da dosagem. Resultados
[00393] Na Figura 7 são mostrados níveis de proteína ANGPTL3 murina (mANGPTL3) mensurados em Camundongos transgênicos em PCS Humano. Os dados apresentados estão expressos relativamente ao controle de PBS e representam uma média para 2 machos e 2 fêmeas em cada grupo. As barras de erro representam o desvio padrão. Os dados indicam que a administração de uma única injeção de AD- 52981 reduz os níveis da proteína ANGPTL3 nos camundongos de um modo dependente da dose, com a dose de 60 mg/kg decrescendo os níveis da proteína ANGPTL3 mais do que cinco vezes (ver Figura 7).

Claims (9)

1. Ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão de ANGPTL3, caracterizado pelo fato de que compreende uma fita senso e uma fita antissenso formando uma região de fita dupla, em que a fita senso e a fita antissenso têm cada uma, independentemente, 17-23 nucleotídeos de comprimento, em que a fita senso compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos e a fita antissenso compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos a partir de qualquer uma das sequências senso e antissenso a seguir: 5’-CAUAUUUGAUCAGUCUUUUUA-3’ (SEQ ID NO: 387) e 5’-UAAAAAGACUGAUCAAAUAUGUU-3’ (SEQ ID NO: 572); 5’-ACAUAUUUGAUCAGUCUUUUU-3’ (SEQ ID NO: 287) e 5’-AAAAAGACUGAUCAAAUAUGUUG-3’ (SEQ ID NO: 472); 5’-AACAUAUUUGAUCAGUCUUUU-3’ (SEQ ID NO: 303) e 5’-AAAAGACUGAUCAAAUAUGUUGA-3’ (SEQ ID NO: 488); 5’-ACAUAUUUGAUCAGUCUUU-3’ (SEQ ID NO: 39) e 5’-AAAGACUGAUCAAAUAUGU-3’ (SEQ ID NO: 101); 5’-CAACAUAUUUGAUCAGUCUUU-3’ (SEQ ID NO: 294) e 5’-AAAGACUGAUCAAAUAUGUUGAG-3’ (SEQ ID NO: 479); 5’-UCAACAUAUUUGAUCAGUCUU-3’ (SEQ ID NO: 358) e 5’-AAGACUGAUCAAAUAUGUUGAGU-3’ (SEQ ID NO: 543); e 5’-CAACAUAUUUGAUCAGUCU-3’ (SEQ ID NO: 64) e 5’-AGACUGAUCAAAUAUGUUG-3’ (SEQ ID NO: 126), em que todos os nucleotídeos da fita senso e todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, em que pelo menos um dos nucleotídeos modificados é selecionado a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo modificado 2'-O-metil, um nucleotídeo modificado 2'-fluoro, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'-fosforotioato e um nucleotídeo 2'-amino modificado, e em que o referido dsRNA compreende um ligante compreendendo um derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc).
2. dsRNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dsRNA compreende pelo menos uma ligação internucleotídeo fosforotioato ou metilfosfonato.
3. dsRNA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o derivado GalNAc (N-acetilgalactosamina) é ligado por meio de um ligante bivalente ou trivalente ramificado.
4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que é para inibir a expressão de um gene ANGPTL3 que compreende o dsRNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
5. Método in vitro para inibir a expressão de ANGPTL3 em uma célula, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar a célula com o dsRNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3; e (b) manter a célula produzida na etapa (a) por um período de tempo suficiente para se obter degradação do transcrito de mRNA de um gene ANGPTL3, desse modo inibindo a expressão do gene ANGPTL3 na célula.
6. dsRNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para uso no método de tratamento de um indivíduo com um distúrbio que se beneficiaria com a redução na expressão de ANGPTL3.
7. dsRNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio do metabolismo lipídico, em que o distúrbio do metabolismo lipídico é preferencialmente hiperlipidemia ou hipertrigliceridemia.
8. dsRNA para uso, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que compreende um agente terapêutico adicional.
9. dsRNA para uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é uma estatina.
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