JP2023521347A - アンジオポエチン様３（ａｎｇｐｔｌ３）をサイレンシングするための遺伝子構築物及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子の発現をノックダウンするためのＲＮＡ分子、前記ＲＮＡ分子を含む組成物、前記組成物の医学的使用、及び脂質異常症の治療に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子の発現をノックダウンするためのＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子を含む組成物、組成物の医学的使用、並びに脂質異常症の治療及び／又は予防に関する。

脂質異常症は、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害である。脂質異常症患者では、総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、及びトリグリセリド（ＴＧ）の濃度レベルが上昇し、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）のレベルが低下している。ＴＧリッチリポタンパク質のレベルの上昇は、急性膵炎を引き起こす可能性があり、ＬＤＬ－Ｃ、レムナントリポタンパク質（つまり、非常に低密度のリポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ－Ｃ）、中密度のリポタンパク質コレステロール（ＩＤＬ－Ｃ））及びリポタンパク質（Ｌｐ）（ａ）のレベルの上昇は、アテローム性動脈硬化を引き起こす可能性がある（Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ，Ｂ．Ｇ．ら、２０１８；Ｒｏｊａｓ，Ｍ．Ｐ．ら、２０１８）。したがって、脂質異常症は、アテローム性心血管疾患等の他の疾患と関連していることが見出され、これらの疾患は、脂質異常症の治療の治療及び／又は予防を開始するための指標である。

スタチンは、脂質異常症患者及び冠動脈性心疾患患者の治療のために知られている薬物のクラスである。スタチンはＬＤＬ－Ｃレベルを低下させることができ、一定の冠動脈疾患リスクを有する患者の治療のために使用することができる（Ｌｉｎｇ，Ｈ．ら、２０１５；Ｔｏｔｈ，Ｐ．Ｐ．ら、２０１８）。しかし、スタチンにはいくつかの問題がある。スタチンは、高度に上昇したＴＧレベルを低下させることはできないことが分かっている（Ｔｏｔｈ，Ｐ．Ｐ．ら、２０１８）。さらに、一部の患者はスタチンに対する忍容性が低い。また、スタチンは、心不全又は末期腎疾患を有する患者には適していない（Ｌｉｎｇ，Ｈ．ら、２０１５）。他の薬物、例えば、エゼチミブ又はタンパク質変換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）阻害剤は、脂質レベルを低下させることができるが、これらの薬物の１つを単独で使用しても、アテローム性動脈硬化のリスクは低下しない。したがって、脂質異常症を治療するための現在知られている薬物は、医師及び／又は患者のニーズを満たしていない。

アンジオポエチン様３タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ３）、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ（ＡｐｏＣ－ＩＩＩ）、コレステロールエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、及びＬｐ（ａ）等のいくつかのタンパク質は、脂質異常症と関連していることが特定されており、コレステロール又はＴＧ代謝におけるそれらの役割が検討された。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の活性、したがって脂肪組織及び筋肉の毛細血管におけるＴＧの加水分解、並びに血清ＨＤＬ－Ｃレベルに影響を及ぼす内皮リパーゼ（ＥＬ）の活性を阻害することができる（Ｏｌｋｋｏｎｅｎ，Ｖ．Ｍ．ら、２０１８）。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０２８１６９．１；配列番号１）のヌルバリアントに対してホモ接合型又は複合ヘテロ接合型である人は、そのようなバリアントを有さない人よりも、血漿ＬＤＬ－Ｃ及びＴＧのレベルが約７０％低い。また、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のヌルバリアントに対してホモ接合又は複合接合型である人は、脂肪性肝疾患の罹患率の増加又は心血管疾患の明らかなリスクの増加なしに、インスリン感受性が向上している（Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｊ．ら、２０１７）。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の機能喪失変異は、疾患の症状なしに自然発生し、それによって変異は安全であると考えられることも分かった。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルが低い個体は、全身のコレステロール恒常性に対する有害な影響を示さず、病理学的状態も示さなかった（Ｍｉｎｉｃｏｃｃｉ，Ｉ．ら、２０１２）。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の操作に基づいて、ＦＤＡ承認薬物であるＡＲＯ－ＡＮＧ３が開発された。この薬物は、複数の前臨床脂質異常症の小型及び大型動物モデルにおいて、肝臓及び血清のＴＧ及びＬＤＬ－ＣにおけるＡＮＧＰＴＬ３発現を低下させる効果を示す。またＡＲＯ－ＡＰＯＣ３と呼ばれる別の薬物が、重度の高トリグリセリド血症（ＨＴＧ）及び家族性カイロミクロン血症症候群の治療のためのｓｉＲＮＡの操作に基づいて設計された。

しかしながら、これらの薬物は、人体への頻繁な注射を必要とし、それによって、これらの薬物の使用は、医師及び／又は患者にとって利便性が低い。さらに、そのような投与投薬レジームは、高い医療コストを生じ得る。したがって、それらの効果にもかかわらず、これらの薬物は、医師及び／又は患者にとって満足度が低いままである。

以上のことから、脂質異常症を治療するための、上記の全てのニーズを満たす薬物が必要とされている。

本発明によれば、核酸が提供される。前記核酸は、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含み、前記第１のＲＮＡ配列は、前記第２のＲＮＡ配列に実質的に相補的であり、前記第１のＲＮＡ配列は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子によってコードされているＲＮＡに含まれる標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である配列を含み、前記標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である前記配列は、少なくとも１９個のヌクレオチドを有する。前記ＲＮＡ分子は、上述のように、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はＲＮＡヘアピンを含み、前記ｄｓＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡ、前記ｍｉＲＮＡ、前記ｓｈＲＮＡ又は前記ＲＮＡヘアピンの第１の配列は、標的配列に実質的に相補的な配列を含む。

前記第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、上述のように、前記標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的であり、それにより、前記ＲＮＡ分子は、上述のように、前記標的ＲＮＡ配列に結合特異性を有する。前記第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列を、前記ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードし、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている標的ＲＮＡ配列に結合させた後、続いて、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を切断し、それにより、前記転写物を減少させる及び／又はノックダウンする。好適には、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物は、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡである。結果として、人体におけるＬＰＬ及びＥＬの活性は阻害されることなく残り、ＬＤＬ－Ｃ、ＴＣ、及び／又はＴＧのレベルが低下する。また、アテローム性動脈硬化症や心血管疾患のリスクが低下する。

上記及び本明細書に記載されるように、前記核酸を使用することにより、血漿中のコレステロールレベル、リン脂質レベル、ＴＣ、ＬＤＬ－Ｃ、及び／又はＴＧレベルが低減する及び／又は阻害される。

さらに、前記核酸は、上述のように、肝臓への投与が安全である。

上述のように、前記核酸の安全性は、血漿中のアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性レベル及び／又は血漿中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）活性レベルを測定することによって、好ましくは両方を測定することによって評価される。肝臓が損傷すると、肝臓に元々存在していたＡＳＴが血液中に放出され、それによって血漿中のＡＳＴレベルが上昇する。したがって、血漿中のＡＳＴ活性レベルの上昇は、肝障害の指標である。ＡＳＴと同様に、ＡＬＴレベルの上昇も、肝障害の指標である。

上述のような前記核酸の使用は、ＡＳＴ及びＡＬＴ活性レベルの永続的な上昇をもたらさない。したがって、前記核酸を哺乳類に投与することは安全である。

さらに、アテローム性動脈硬化の病変は、前記核酸を使用することによって阻害及び／又は低減される。したがって、前記核酸は、脂肪線条としても知られる初期病変（Ｉ～ＩＩ型）、軽度病変（ＩＩＩ型）、及び／又は（線維）アテローム病変としても知られる重度病変（ＩＶ～Ｖ型）の治療及び／又は予防に有用である。アテローム性動脈硬化病変の大きさ及び重症度を決定するために、米国心臓協会により、病変は５つのカテゴリーに分類された（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）：上記及び本明細書に記載のＩ型は初期脂肪線条であり、上記及び本明細書に記載のＩＩ型は定型脂肪線条であり、上記及び本明細書に記載のＩＩＩ型は軽度プラークであり、上記のＩＶ型は中等度プラークであり、上記及び本明細書に記載のＶ型は重度プラークである。

好ましくは、上述のように、前記ＲＮＡ分子に含まれる前記第１のＲＮＡ配列は、前記第２のＲＮＡ配列に対して実質的に相補的である。

好ましくは、上述のように、前記ＲＮＡ分子に含まれる前記第１のＲＮＡ配列は、前記第２のＲＮＡ配列に相補的であり、それにより、前記第１のＲＮＡ配列は、前記第２のＲＮＡ配列に結合する。

上述のように、前記核酸は、本明細書及び以下に記載されるように、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビヒクルによって、標的細胞内に送達される。前記核酸は、続いて上述のようにＲＮＡ分子に転写される。前記標的細胞の核において、前記ＲＮＡ分子は、上述のように、Ｄｒｏｓｈａ（つまり、クラス２のリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素）によって、ＲＮＡ分子の５’端及び３’端に隣接領域を有さずにｓｈＲＮＡ及び／又はＲＮＡヘアピンへと切断される。続いて、切断されたＲＮＡ分子は細胞の細胞質に輸送される。ここで、前記切断されたＲＮＡ分子は、エンドリボヌクレアーゼダイサーによってさらに切断されないが、前記切断されたＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）のＡｒｇｏｎａｕｔｅ－２（ＡＧＯ－２）によってさらに切断され、特に、前記切断されたＲＮＡ分子の第２のＲＮＡ配列は、上述のように、前記切断されたＲＮＡ分子からトリミングされる（つまり、分解される）。したがって、前記ＲＮＡ分子の前記第２のＲＮＡ配列のオフターゲットｍＲＮＡへの部分的相補性及び前記オフターゲットｍＲＮＡへの結合から生じる「オフターゲット」問題が低減及び／又は抑制される。前記第２のＲＮＡ配列はパッセンジャー鎖とも呼ばれる。これにより、ガイド鎖としても知られる前記第１のＲＮＡ配列の、前記標的ＲＮＡ配列への結合が改善される。

好適には、上述のように、前記第１のＲＮＡ配列に相補的な配列は、上述のように、前記第２のＲＮＡ配列とは異なる、少なくとも５、６、７、８、９、１０、又は１１個のヌクレオチドを含む。

好適には、上述のように、前記第１のＲＮＡ配列に相補的な配列は、前記第２のＲＮＡ配列とは異なる、最大で１２、１３、１４、１５、又は１６個のヌクレオチドを含む。

前記第１のＲＮＡ配列及び前記第２のＲＮＡ配列が、前記第２のＲＮＡ配列に対して十分な結合特異性を有するままであるのに対し、前記第１のＲＮＡ配列及び前記第２のＲＮＡ配列は、上述のように、複数のヌクレオチドにおいて相補的でない場合がある。したがって、前記第１及び第２のＲＮＡ配列は、上述のように、前記「オフターゲット」問題を阻害及び／又は低減するなどの、上述のニーズを満たすために使用することができる。好ましくは、上述のように前記核酸によってコードされているＲＮＡ分子は、上述のように、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はＲＮＡヘアピンを含む二次構造を有し、前記ｄｓＲＮＡ又は前記ＲＮＡヘアピンの第１の配列は、標的配列に実質的に相補的である配列を含む。

前記核酸は、上述のように、前記ＲＮＡ分子へ転写することができる。前記ＲＮＡ分子は、上述のように、前記「オフターゲット」問題を阻害及び／又はさらに低減するために、本発明において有用である。好ましくは、上述のように、前記ＲＮＡヘアピンは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はロングヘアピンＲＮＡ（ｌｈＲＮＡ）である。より好ましくは、上述のように、ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ－４５１を含む。さらに好ましくは、前記ＲＮＡ分子は、改変ｍｉＲ－４５１をコードする核酸配列である配列番号１２４からコードされている。配列番号１２４などの核酸配列又は前記ｍｉＲ－４５１をコードする配列は、ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルなどの遺伝子治療ビヒクルで構成されるベクターに含められて標的臓器に送達されるのに好適である。さらに、前記核酸配列によってコードされている前記ＲＮＡ分子を使用することによる前記「オフターゲット」問題は低減する及び／又は阻害される。これにより、前記核酸は、上述のようなニーズを満たす。

上述のように、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、任意選択で少なくとも１５個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも１６個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも１７個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも１８個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも１９個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも２０個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも２１個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも２２個のヌクレオチド、又は任意選択で少なくとも２４個のヌクレオチドを有する。さらに、上述のように、前記第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、任意選択で最大３０個のヌクレオチド、任意選択で最大２８個のヌクレオチド、又は任意選択で最大２６個のヌクレオチドを有する。上述のように、異なるヌクレオチドを含む前記第１のＲＮＡ配列は、上述のように、前記標的ＲＮＡ配列に対して十分な結合特異性を有し、それにより、前記第１のＲＮＡ配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物の低減及び／又はノックダウンに有用である。さらに、上述のように、異なる長さを有する前記第１のＲＮＡ配列の１つをコードする核酸配列を含む核酸は、遺伝子治療ビヒクルに含まれるベクターに好適及び／又は容易に埋め込むことができ、上述のように前記ＲＮＡ二次構造にさらにフォールディングさせることができる。したがって、上述のように、異なるヌクレオチドを含む前記第１のＲＮＡ配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を標的化、結合、切断、及び／又はノックダウンするために使用するのに好適であり、上述のように、ニーズも満たす。

上述のように、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、以下に記載されるようにＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれる保存配列に基づいて設計される。

好ましくは、前記保存配列は、哺乳類保存配列であり、前記哺乳類保存配列は、マウスなどのげっ歯類、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、及びヒトから選択されることが好ましい。

前記標的ＲＮＡ配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている配列に含まれる。好ましくは、上記及び本明細書に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、マウスＡＮＧＰＴＬ３遺伝子などの哺乳類ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子である。より好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子である。最も好ましくは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子である。

上述のように、前記第１のＲＮＡ配列をコードする核酸配列を含む前記核酸、前記第１のＲＮＡ配列を含む前記ＲＮＡ分子は、哺乳類におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンするのに有用であり得る。

好ましくは、上述のように、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、配列番号８～２５からなる群から選択されるものである。より好ましくは、上述のように、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、配列番号８～１７及び１９～２５からなる群から選択される配列である。さらにより好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる配列は、配列番号１１、１２、１６、１７、２０及び２５からなる群から選択される配列である。なおより好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる配列は、配列番号１１、１２、１７、２０及び２５からなる群から選択される配列である。最も好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、配列番号１２を含む。

上述のように、前記核酸がＲＩＳＣ複合体にロードされると、前記第１のＲＮＡ配列をコードする核酸配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ等のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンすることができる。したがって、血漿中のコレステロールレベル、血漿中のリン脂質レベル、アテローム性動脈硬化病変、及び／又はＴＧ ＴＣ）、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルが哺乳類において低下する。

上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている前記標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている少なくとも１つの保存配列の全部又は一部を含むように設計される。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の保存配列のいくつかを特定し、本発明のために選択する。好ましくは、保存された配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１、エクソン３、エクソン５、又はエクソン６に含まれる。より好ましくは、前記標的配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１、エクソン５又はエクソン６における保存配列の全部又は一部を含む。さらにより好ましくは、前記標的配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１又はエクソン５における保存配列の全部又は一部を含む。

上述のように、前記第１のＲＮＡ配列は、上記又は下記のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１、エクソン５又はエクソン６に含まれる前記保存された配列を標的にする、及び／又は結合することができ、それにより、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の前記転写物を減少させる及び／又はノックダウンする。続いて、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させ及び／又は阻害し、それによって血漿中のコレステロールレベル、血漿中のリン脂質レベル、アテローム性動脈硬化病変、及び／又は哺乳類におけるトリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、及び／又は低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルを低下させる及び／又は阻害する。

前記標的配列は、上述のように、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされているＲＮＡに含まれる。好ましくは、前記標的配列は、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれる１つのエクソンの少なくとも一部によってコードされているＲＮＡに含まれる。さらに好ましくは、前記標的配列は、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれる、上述の１つのエクソンに含まれる少なくとも１つの保存配列によってコードされているＲＮＡに含まれる。より好ましくは、上述のように、前記エクソンは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれるエクソン１、エクソン３、エクソン５、又はエクソン６である。さらにより好ましくは、上述のように、前記エクソンは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれるエクソン１、エクソン５、又はエクソン６である。なお好ましくは、少なくとも１つの保存配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１に含まれる保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４：１３９～１６６位のヌクレオチド、以下、配列番号３）、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１に含まれる保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４：２６７～２９２位のヌクレオチド、以下、配列番号４）、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン３に含まれる保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４、７０６～７２８位のヌクレオチド、以下、配列番号５）、エクソン５に含まれる保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４：８８５～９０７位のヌクレオチド、以下、配列番号６）、又はエクソン６に含まれる保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４：１１３４～１１６０位のヌクレオチド、以下、配列番号７）である。上述のように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の前記位置を、前記第１のＲＮＡ配列で標的化することにより、上述のように、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の前記転写物をノックダウンし、それにより、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡを減少させる及び／又はノックダウンすることが見出された。それにより、血漿中のコレステロールレベル、血漿中のリン脂質レベル、アテローム性動脈硬化病変、及び／又はＴＧ、ＴＣ、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルが、哺乳類において低減した。

前記アテローム性動脈硬化病変は、初期病変、軽度病変、及び／又は重度病変を含む。

アテローム性動脈硬化病変は、米国心臓協会に従ってＩ～Ｖ型に分類される（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）。前記初期病変は、Ｉ～ＩＩ型を含む。前記軽度病変はＩＩＩ型を含む。前記重度病変はＩＶ～Ｖ型を含む。

したがって、上述の前記位置を標的化することにより、前記核酸は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、混合高リポタンパク血症、及び／又は脂質異常症、並びに非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害の治療及び／又は予防に使用され得る。

本発明によれば、上記ＲＮＡ分子をコードする核酸を含む組成物が提供される。

前記ＲＮＡ分子は、上述のように第２の構造にあり、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンするために有用であり、それによって、血漿中のコレステロールレベル、血漿中のリン脂質レベル、アテローム性動脈硬化病変、並びに／又はトリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、及び／若しくは低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルが、哺乳類において低減する及び／又は阻害される。

好ましくは、前記組成物は、血漿コレステロールレベル、重度のアテローム性動脈硬化病変、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルをさらに低減させる及び／又は阻害する少なくとも１つの分子をさらに含む。

前記少なくとも１つの分子を加えることにより、血漿コレステロールレベル、重度のアテローム性動脈硬化病変、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルをさらに低減させる及び／又は阻害することができる。

さらに、組成物の使用は、血漿中のＡＳＴ及びＡＬＴ活性レベルの永続的な上昇をもたらさない。そのため、肝障害は引き起こされない。したがって、上述のように、前記組成物を哺乳類に投与することは安全である。

好ましくは、前記少なくとも１つの分子は、スタチンの群のうちの少なくとも１つを含む。

好ましくは、前記少なくとも１つのスタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチンからなる群から選択される。

前記スタチンは、上述のように、前記組成物と共に、血漿中のコレステロールレベル、ＬＤＬ－Ｃレベル、及び／又は重度のアテローム性動脈硬化病変をさらに低減させる及び／又は阻害するために使用することができる。上述のように、前記重度のアテローム性動脈硬化病変は、米国心臓協会に従ってＩＶ～Ｖ型を含む（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）。

より好ましくは、前記少なくとも１つの分子は、アトルバスタチン及び／又はシンバスタチンを含む。

前記組成物とアトルバスタチン及び／又はシンバスタチンとの併用は、哺乳類における血漿中のコレステロールレベル、重度のアテローム性動脈硬化病変、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルの低減及び／又は阻害に有用である。

本発明によれば、上述のように、組成物が医薬として使用される。上述のように、前記核酸の治療効果が本発明によって見出された。これにより、前記核酸を含む組成物は、医薬として使用することができる。

さらに、本発明によれば、組成物は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンするための医薬として使用される。上述のように、前記核酸を含む前記組成物は治療効果を有するため、疾患を治療するために使用することができる。上述のように、本発明の前記組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンすることができる。前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の前記転写物は、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされているｍＲＮＡを含む。それにより、前記組成物は医薬として使用することができる。

また好ましくは、組成物は、上述のように、血漿中のコレステロールレベル、アテローム性動脈硬化病変、血漿中のリン脂質、ＬＤＬ－Ｃ、及び／又はＴＣレベル、及び／又はＴＧレベルを低減させる及び／又は阻害するための医薬として使用される。上述のように、前記組成物を使用することによって、血漿中のコレステロール、アテローム性動脈硬化病変、血漿中のリン脂質、ＬＤＬ－Ｃレベル、ＴＣレベル、及び／又はＴＧレベルを低減させる及び／又は阻害することができる。

前記アテローム性動脈硬化病変は、初期病変、軽度病変、及び／又は重度病変を含む。

アテローム性動脈硬化病変は、米国心臓協会に従ってＩ～Ｖ型に分類される（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）。前記初期病変はＩ～ＩＩ型を含む。前記軽度病変はＩＩＩ型を含む。前記重度病変は上述のようにＩＶ～Ｖ型を含む。

より好ましくは、組成物は、上述のように、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害の治療及び／又は予防のための医薬として使用される。

より好ましくは、組成物は、上述のように、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、混合高リポタンパク血症、脂質異常症、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療及び／又は予防のために、上述のように医薬として使用される。

前記組成物は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を低減させる及び／又は阻害することができ、また、上述のように、血漿コレステロールレベル、アテローム性動脈硬化病変、血漿中のリン脂質レベル、ＬＤＬ－Ｃ、ＴＣ及び／又はＴＧを低減させる及び／又は阻害することができる。したがって、前記組成物は、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害、例えば高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、混合高リポタンパク血症、脂質異常症、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの治療及び／又は予防にも使用することができる。

最も好ましくは、組成物は、上述のように、脂質異常症の治療及び／又は予防のための医薬として使用される。本発明によれば、上記組成物の製造方法が提供される。前記方法は、上述のような前記核酸、又は上述のような前記ＲＮＡ分子を、前記組成物に加えるステップを含む。

任意選択で、前記組成物は、水性液体、有機溶媒、緩衝液、及び賦形剤からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む。任意選択で、水性液体は水である。また任意選択で、前記緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、トリス、ヒスチジン、及び４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）からなる群から選択される。さらに任意選択で、有機溶媒は、エタノール、メタノール、及びジクロロメタンからなる群から選択される。さらに、賦形剤は、塩、糖、コレステロール又は脂肪酸である。さらに任意選択で、前記塩は、上述のように、塩化ナトリウム、塩化カリウムからなる群から選択される。さらに、任意選択で、前記糖類は、上述のように、スクロース、マンニトール、トレハロース、及び／又はデキストランである。

本発明によれば、ＤＮＡ発現カセットが提供される。本発明のＤＮＡ発現カセットは、上述のように、前記ＲＮＡ分子をコードするための核酸配列と、プロモーターと、ポリＡテールとを含む。前記ＤＮＡ発現カセットは、２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）によって隣接されている。

前記ＤＮＡ発現カセットに含まれる前記核酸は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンするのに有用である。上述のように、前記核酸を含む前記ＤＮＡ発現カセットは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルス遺伝子治療ビヒクルに含めることができ、その後、標的臓器に送達することができる。したがって、前記ＤＮＡ発現カセットは、脂質異常症などの脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害に罹患しているヒト対象を治療及び／又は予防するために有用である。好ましくは、前記プロモーターは、ｐｏｌ Ｉプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、誘導性プロモーター、α１－抗トリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロビン）プロモーター、ＨＣＲ－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、及びアポリポタンパク質Ｅプロモーター、ＨＬＰ、最小ＴＴＲプロモーター、ＦＶＩＩＩプロモーター、ハイペロンエンハンサー、ｅａｌｂ－ｈＡＡＴ、ＥＦ１－αプロモーター、シンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｕ１－１ ｓｎＲＮＡプロモーター、アポリポタンパク質プロモーター、ＴＲＥプロモーター、ｒｔＴＡ－ＴＲＥ（誘導性プロモーター）、ＬＰ１プロモーター、Ｑ１プロモーター、Ｑ１－プライムプロモーター、Ｃ１４プロモーター、Ｃ１６プロモーター、並びに配列番号８４～８７、及び１０８～１０９、及び１１２～１１５から選択される任意の合成プロモーター、並びにそのバリアントからなる群から選択される。

前記プロモーターは、上述のように、前記ＤＮＡ発現カセットに含まれる前記核酸の発現を開始するために有用である。

好ましくは、前記プロモーターは、上述のように、肝臓特異的プロモーターである。

より好ましくは、上記の肝臓特異的プロモーターは、α１－抗トリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロビン）プロモーター、ＨＣＲ－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－２０ ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、アポリポタンパク質Ｅプロモーター、ＬＰ１、ＨＬＰ、最小ＴＴＲプロモーター、ＦＶＩＩＩプロモーター、ｅａｌｂ－ｈＡＡＴ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、アポリポタンパク質プロモーター、テトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＬＰ１プロモーター、Ｑ１プロモーター、Ｑ１－プライムプロモーター、Ｃ１４プロモーター、Ｃ１６プロモーター、並びに配列番号８４～８７及び１０８～１０９、及び１１２～１１５から選択される任意の合成プロモーター、並びにそのバリアントからなる群から選択される。

前記ＤＮＡ発現カセットにおいて前記肝臓特異的プロモーターを使用することにより、肝臓における前記核酸の発現が誘導され、このことは、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物が主に肝臓において発現されるため、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物をノックダウンするために有用である。

さらにより好ましくは、前記プロモーターは、上述のように、前記Ｑ１－プライムプロモーターを含む。

前記Ｑ１－プライムプロモーターは、肝臓特異的プロモーターであり、前記Ｑ１－プライムプロモーターは、上述のように、肝臓における前記核酸の発現をさらに増強することができる。

任意選択で、前記配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５のバリアントはそれぞれ、配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５と本質的に同一の核酸配列を有し、前記バリアントは、上述のように、前記ＲＮＡ分子をコードする核酸配列の転写を開始する配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５と実質的に同じ機能を有する。

任意選択で、配列番号８４～８７、１０８～１０９、及び１１２～１１５の前記バリアントのそれぞれは、配列番号８４～８７、及び１０８～１０９、及び１１２～１１５の配列とは異なる、少なくとも１、２、３、４、又は５個のヌクレオチドを含む核酸配列を有する。

任意選択で、配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５の前記バリアントのそれぞれは、配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５の配列とは異なる、最大で４０、３５、３０、２５、又は２０個のヌクレオチドを含む核酸配列を有する。

好ましくは、前記ＤＮＡ発現カセットに含まれる前記ポリＡテールは、上述のように、前記ＲＮＡ分子の３’末端に作動可能に連結している。好ましくは、前記ポリＡテールは、サルウイルス４０ポリアデニル化（ＳＶ４０ポリＡ）、合成ポリアデニル化、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨポリＡ）である。

前記ＤＮＡ発現カセットに隣接する前記ＩＴＲは、上述のように、前記プロモーターに、及び上述のように、前記ポリＡテールに、作動可能に連結されている。好ましくは、前記ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列からなる群から選択される。より好ましくは、前記ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ８ ＩＴＲ配列を含む。任意選択で、前記２つのＩＴＲ配列は、両方のＡＡＶ１、両方のＡＡＶ２、両方のＡＡＶ５、両方のＡＡＶ６、又は両方のＡＡＶ８ ＩＴＲ配列を含む。また任意選択で、前記ＤＮＡ発現カセットの５’末端の前記ＩＴＲ配列は、前記ＤＮＡ発現カセットの３’末端の前記ＩＴＲ配列とは異なり、前記ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ８ ＩＴＲ配列から選択されるものである。本発明によれば、上述のように、前記ＲＮＡ分子をコードする前記核酸配列を含む前記ＤＮＡ発現カセットを含むウイルスビヒクルが提供される。

上述のように、前記核酸は、前記ウイルスビヒクルに含まれる前記ＤＮＡ発現カセットに含めることができ、それにより、肝臓などの標的臓器に送達することができる。前記ウイルスビヒクルの使用により、反復投与が最小限に抑えられるため、ヒト対象に治療部分を注射する頻度が最小限に抑えられる。それによって、免疫応答を低減させる及び／又は阻害することができ、及び／又は前記ヒト対象の生活の質がさらに改善される。

任意選択で、上述のように、前記ウイルスビヒクルは、アルファウイルス、フラビウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。

好ましくは、上述のように、ＲＮＡ分子をコードするための核酸は、上述のように、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルに含まれる前記ＤＮＡ発現カセットに含まれる。

ＡＡＶが、上述のように、前記核酸又は前記ＤＮＡ発現カセットを哺乳類に送達するための有用な遺伝子治療ビヒクルであることが分かった。ＡＡＶは、分裂ヒト細胞だけでなく、非分裂ヒト細胞にも効率的に感染する能力を有する。さらに、ＡＡＶは、いずれの疾患にも関連しない。

さらに好ましくは、上述のように、ＤＮＡ発現カセットは、上述のように、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルに含まれる。

前記核酸又は前記ＤＮＡ発現カセットは、上述のように、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルに含めて、続いて標的臓器に送達することができる。前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを使用することにより、前記核酸又は前記ＤＮＡ発現カセットを、免疫応答のリスクが最小限で、及び／又は治療過程中の反復注射なしで、ヒト対象に導入することができる。

好ましくは、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドは、上述のように、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列を含む。さらに好ましくは、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドは、上述のように、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質配列を含む。さらに好ましくは、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドは、上述のように、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列を含む。

前記キャプシドタンパク質配列を含むＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、上述のように、本発明で使用されるのに好適である。詳細には、抗ＡＡＶ５中和抗体（Ｎａｂ）の有病率が他の血清型よりも低いため、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列を含む前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルが本発明のために有用である。加えて、ＡＡＶ５に対する既存の抗体（Ａｂ）又は低既存の抗体は、標的臓器における前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルの形質導入、及び／又は前記核酸の発現に影響を及ぼさない。さらに、ＡＡＶ５に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答は、臨床試験において見出されていない。任意選択で、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドは、上述のように、ＡＡＶ５／ＡＡＶ２ハイブリッドキャプシドタンパク質配列を含む。任意選択で、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドは、上述のように、ＡＡＶ５／ＡＡＶ８ハイブリッドキャプシドタンパク質配列を含む。

前記ハイブリッドキャプシドタンパク質配列を含む前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、記載されるように、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルの標的臓器への形質導入有効性を向上させ、並びに／又は前記標的臓器への標的化及び／若しくは結合を改善するために有用であり得る。

本発明によれば、上述のように、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む組成物が提供される。

前記組成物において、上述のように、前記組成物中に含まれる前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、上述のように、前記ＤＮＡ発現カセットを含む。前記ＤＮＡ発現カセットは、上述のように、前記ＩＴＲ配列に隣接しており、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質又はＡＡＶ５／ＡＡＶ２ハイブリッドキャプシドタンパク質を含む。さらに、前記ＤＮＡ発現カセットは、第１のＲＮＡ配列をコードする配列を含む。好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる配列は、配列番号１１、１２、１６、１７、２０及び２５からなる群から選択される配列である。さらに好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる配列は、配列番号１１、１２、１７、２０及び２５からなる群から選択される配列である。最も好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、配列番号１２を含む。さらに最も好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、上述のように、配列番号１２からなる。

前記ビヒクルは、前記ＲＮＡ分子又は前記ＤＮＡ発現カセットをコードする前記核酸配列を標的臓器に送達させ、それによって、前記ＲＮＡ分子又は前記ＤＮＡ発現カセットを前記標的臓器内で安定して発現させるのに有用である。

前記ビヒクルは、本明細書に記載されるように、前記ＤＮＡ発現カセットを標的臓器に移行するために使用され、それによって、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を阻害及び／又はノックダウンする上述の前記ＲＮＡ分子の発現を達成し得る。

そのようなＤＮＡ発現カセットを含むＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルの好適な作製方法は、上述のように、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０４６７０３号、国際公開第２００７／１４８９７１号、国際公開第２００９／０１４４４５号、国際公開第２００９／１０４９６４号、国際公開第２０１１／１２２９５０号、及び国際公開第２０１３／０３６１１８号に記載されている。

前記組成物は、上述のように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンすることができ、それにより、上述のように、血漿コレステロールレベル、アテローム性動脈硬化病変、血漿中のリン脂質、ＬＤＬ－Ｃ、ＴＣ及び／又はＴＧのレベルを低減させる及び／又は阻害することができることが見出された。したがって、前記組成物は、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害、例えば高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、混合高リポタンパク血症、脂質異常症、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの治療及び／又は予防にも使用することができる。

前記アテローム性動脈硬化病変は、初期病変、軽度病変、及び／又は重度病変を含む。

アテローム性動脈硬化病変は、米国心臓協会に従ってＩ～Ｖ型に分類される（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）。前記初期病変はＩ～ＩＩ型を含む。前記軽度病変はＩＩＩ型を含む。前記重度病変はＩＶ～Ｖ型を含む。

好ましくは、少なくとも１つの分子をさらに含む前記組成物は、血漿中のコレステロールレベル、重度のアテローム性動脈硬化病変、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルをさらに低減させる及び／又は阻害する。

前記少なくとも１つの分子を前記組成物に加えることにより、上述のように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、重度のアテローム性動脈硬化病変、血漿中のコレステロールレベル、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルをさらに低下させることができることが見出された。

さらに、前記少なくとも１つの分子を前記組成物に加えることは、上述のように、血漿中のＡＬＴ及びＡＳＴ活性レベルの永続的な上昇をもたらさない。これにより、肝障害は生じない。したがって、前記組成物を、上述のように哺乳類に投与することは安全である。

好ましくは、上述のように、前記少なくとも１つの分子は、スタチンのうちの少なくとも１つを含む。

好ましくは、前記少なくとも１つのスタチンは、上述のように、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチンからなる群から選択される。

前記スタチンは、上述のように、血漿コレステロールレベル、重度のアテローム性動脈硬化病変、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルをさらに低減させる及び／又は阻害するために、前記組成物と共に使用することができる。

より好ましくは、前記組成物において、上述のように、前記少なくとも１つの分子は、アトルバスタチン及び／又はシンバスタチンを含む。

記載されるように、前記組成物の使用と比較して、アトルバスタチン及び／又はシンバスタチンと前記組成物との併用は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、哺乳類における血漿中のコレステロールレベル、重度のアテローム性動脈硬化病変、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルを低減させる及び／又は阻害することに有用であることが見出された。

任意選択で、前記組成物は、上述のように、水性液体、有機溶媒、緩衝液、及び賦形剤からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む。任意選択で、水性液体は水である。また任意選択で、前記緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、トリス、ヒスチジン、及び４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）からなる群から選択される。さらに任意選択で、有機溶媒は、エタノール、メタノール、及びジクロロメタンからなる群から選択される。さらに、賦形剤は、塩、糖、コレステロール又は脂肪酸である。さらに任意選択で、前記塩は、上述のように、塩化ナトリウム、塩化カリウムからなる群から選択される。さらに、任意選択で、前記糖は、上述のように、スクロース、マンニトール、トレハロース、及び／又はデキストランである。

本発明によれば、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は上記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む前記組成物の医薬としての使用が提供される。

上述のように、本発明によって、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む前記組成物の治療効果が実証される。したがって、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル及び前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む組成物は、上述のように、医薬として使用することができる。

好ましくは、前記医薬は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている転写物を減少させる及び／又はノックダウンする。

前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む前記組成物は、上述のように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンする機能を有することが見出された。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の前記転写物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされているｍＲＮＡを含む。それによって、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは医薬として使用することができる。

好ましくは、前記医薬は、血漿中のコレステロールレベル、リン脂質レベル、初期、軽度及び／若しくは重度のアテローム性動脈硬化病変、ＴＣレベル、ＴＧレベル、並びに／又はＬＤＬ－Ｃレベルを阻害する及び／又は低下させるために使用することができる。

前記ＡＡＶ遺伝子療法ビヒクルの投与によって得られる治療効果は、血漿中のコレステロールレベルの低下、リン脂質レベルの低下、初期、軽度、及び／若しくは重度のアテローム性動脈硬化病変の減少、並びに／又はＴＣ、ＴＧ、及び／若しくはＬＤＬ－Ｃレベルの低下を実証するｉｎ ｖｉｖｏ試験において示された。

前記アテローム性動脈硬化病変は、初期病変、軽度病変、及び／又は重度病変を含む。

アテローム性動脈硬化病変は、米国心臓協会に従ってＩ～Ｖ型に分類される（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）。前記初期の病変はＩ～ＩＩ型を含む。前記軽度病変はＩＩＩ型を含む。前記重度病変はＩＶ～Ｖ型を含む。

より好ましくは、前記医薬は、上述のように、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害の治療及び／又は予防のために使用される。

さらにより好ましくは、前記医薬は、上述のように、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、混合高リポタンパク血症、脂質異常症、及び／又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療及び／又は予防のために使用される。

前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを投与することにより、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物が減少し、及び／又はノックダウンされ、それによって、血漿中のコレステロールレベルが低下し、リン脂質のレベルが低下し、並びに／又は初期、軽度及び／若しくは重度のアテローム性動脈硬化病変が減少し、並びに／又は総コレステロール（ＴＣ）レベル、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、及び／若しくは低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）が低下することが見出された。したがって、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、脂質異常症などの脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害の予防及び／又は治療に有用である。

アテローム性動脈硬化病変は、米国心臓協会に従ってＩ～Ｖ型に分類される（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）。前記初期の病変はＩ～ＩＩ型を含む。前記軽度病変はＩＩＩ型を含む。前記重度病変はＩＶ～Ｖ型を含む。

最も好ましくは、前記医薬は、上述のように、脂質異常症の治療及び／又は予防のために使用される。

前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルの投与が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンすることが実証されたように、ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子が関与する疾患の治療及び／又は予防に有用である。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ実験にも示されるように、血漿中のコレステロールレベル、リン脂質レベル、アテローム性動脈硬化病変、ＴＣ、ＴＧ、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルが低減する及び／又は阻害される。したがって、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、脂質異常症の治療及び／又は予防において医薬として使用され得る。

好ましくは、前記医薬は、上述のように、血漿コレステロールレベル、レベル、ＬＤＬ－Ｃレベル、及び／又は重度のアテローム性動脈硬化病変を低減させる及び／又は阻害する、少なくとも１つの分子をさらに含む。

前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む前記組成物の投与に加えて、上述のように、前記少なくとも１つの化合物を加えることは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、血漿中のコレステロールレベル、重度のアテローム性動脈硬化病変、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルのさらなる低減及び／又は阻害等の少なくとも１つの治療効果をさらに増強することができることが見出された。

さらに、血漿中のＡＳＴ及びＡＬＴ活性レベルの永続的な上昇が生じず、それによって、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル及び前記分子の併用によって肝障害が引き起こされないことがｉｎ ｖｉｖｏで実証された。したがって、前記併用は、肝臓にとって安全である。

より好ましくは、前記少なくとも１つの分子は、スタチンのうちの少なくとも１つを含む。さらにより好ましくは、前記少なくとも１つの分子は、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチンからなる群から選択される。最も好ましくは、前記少なくとも１つの分子は、アトルバスタチン及び／又はシンバスタチンを含む。

前記少なくとも１つのスタチンを、上述のように、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む前記組成物にさらに加えることにより、血漿中のコレステロールレベル、重度のアテローム性動脈硬化病変、及び／又はＬＤＬ－Ｃレベルがさらに低減することが見出された。また、ｉｎ ｖｉｖｏ試験から、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む前記組成物を、前記スタチンのうちの少なくとも１つと併用すると、上述のように、ＡＳＴ及びＡＬＴの活性レベルの永続的な上昇をもたらさないことが実証された。これにより、肝障害は生じなかった。したがって、上述のような前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルと、上述のような前記少なくとも１つのスタチンとを組み合わせて哺乳類に投与することは、安全である。これにより、前記併用は、哺乳類にとって安全である。

本発明によれば、上述のように、前記ＲＮＡ分子をコードするための前記核酸を含むキットが提供される。

本発明によれば、上述のように、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含むキットが提供される。好ましくは、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む前記キットは、上述のように、血漿中のコレステロールレベル、ＬＤＬ－Ｃレベル、及び／又は重度のアテローム性動脈硬化病変を低減及び／又は阻害する化合物をさらに含む。

本発明によれば、上述のように、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む前記組成物を含むキットが提供される。

本発明によれば、上述のように、前記キットを製造する方法が提供される。

示される選択された保存標的ＲＮＡ配列（配列番号３～７）を有するアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｃＤＮＡ配列の概略図。列挙される配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４、そのヌクレオチド（ｎｔ）１～１２７８の一部であり、ＡＮＧＰＴＬ３転写物（の一部）のＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を表す。したがって、対応するＲＮＡは、図１－１～１－４に示されるように、Ｔの代わりにＵを有することを除いて、同一の配列を有する。ヌクレオチド１～５４２はエクソン１を表し、ｎｔ５４３～６５３はエクソン２を表し、ｎｔ６５４～７６８はエクソン３を表し、ｎｔ７６９～８８２はエクソン４を表し、ｎｔ８８３～９７８はエクソン５を表し、ｎｔ９７９～１２４５はエクソン６を表す。選択された標的ＲＮＡ配列、つまり、それに対応するＤＮＡ配列もまた、図１－１～１－４に示される。配列番号３は、エクソン１のｎｔ１３９～１６６に対応し、配列番号４は、エクソン１のｎｔ２６７～２９２に対応し、配列番号５は、エクソン３のｎｔ７０６～７２８に対応し、配列番号６は、エクソン５のｎｔ８８５～９０７に対応し、配列番号７は、エクソン６のｎｔ１１３４～１１６０に対応する。 図１－１の続きである。 図１－２の続きである。 図１－３の続きである。 ｍｉＲＢａｓｅデータベース（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）からのホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ｐｒｉ－ｍｉＲ－４５１。（Ａ）２２ｎｔのガイド鎖（下線付き）を、成熟ｍｉＡＮＧ又はｍｉＡＮＧ－ＳＣＲに置き換えた。（Ｂ）アポリポタンパク質Ｅ遺伝子座制御領域、ヒトα１－アンチトリプシン（ＨＣＲ－ｈＡＡＴ）、ヘアピンの５’及び３’に９０ｎｔの隣接部（ｆｌａｎｋ）を有する、ｐｒｉ－ｍｉＡＮＧからなるプロモーター、及びシミアンウイルス４０ポリアデニル化（ＳＶ４０ポリＡ）シグナルによる終結で構成された、発現カセットの概略図。（Ｃ）ウミシイタケルシフェラーゼカセット（ＲＬ）の下流にＡＮＧＰＴＬ３標的配列を含有し、ｍｉＡＮＧ構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングに使用される、２つのＬｕｃレポーターの概略図。 Ｌｕｃレポーターで試験された１７個のｍｉＡＮＧ構築物のノックダウン有効性。ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｕｈ－７）に、５０ｎｇ若しくは２５０ｎｇのｍｉＡＮＧ構築物及び５０ｎｇのＬｕｃＡＮＧ－Ａ若しくはＬｕｃＡＮＧ－Ｂのレポーターをコトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）及びホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）を、トランスフェクション２日後に測定し、ＲＬをＦＬ発現に対して正規化した。スクランブル（ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１）は、陰性対照として機能し、１００％に設定した。データは、ｍｉＡＮＧ１５、ｍｉＡＮＧ１７及びｍｉＡＮＧ１８についての３回の独立した実験又は２回の独立した実験を代表するものである。 滴定実験における６つのｍｉＡＮＧ構築物のノックダウン効力。ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｕｈ－７）に１０ｎｇのＬｕｃＡＮＧ－Ａ若しくはＬｕｃＡＮＧ－Ｂレポーター、及び１、１０、５０、若しくは２５０ｎｇのｍｉＡＮＧ構築物をコトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）及びホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）を、トランスフェクション２日後に測定し、ＲＬをＦＬ発現に対して正規化した。スクランブル（ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１）は、陰性対照として機能し、１００％に設定した。データは、３つの独立した実験を代表するものである。 プラスミドのトランスフェクションの際のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのノックダウン。Ｈｕｈ－７に、（Ａ）２５０ｎｇ又は（Ｂ）４００ｎｇのｍｉＡＮＧ５、ｍｉＡＮＧ１０及びｍｉＡＮＧ１３の構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション２日後の細胞単層を、全ＲＮＡ抽出のために収集し、ＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡレベルを、ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＱＰＣＲによって測定した。相対的ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、データをヒトβ－アクチンｍＲＮＡレベルで正規化することによって取得した。ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１試料中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを１００％に設定した。 ｍｉＡＮＧ５ ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡへのリードのマッピングの配列分布（％）。Ｈｕｈ－７に、（Ａ）２５０ｎｇ又は（Ｂ）４００ｎｇのｍｉＡＮＧ５構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション２日後の細胞単層を、全ＲＮＡ抽出のために収集した。低分子ＲＮＡ次世代シーケンシングからの結果は、上位５０位の最も豊富なｍｉＲＮＡを示しており、ｍｉＡＮＧ５の発現レベルが強調して示されている。 ｍｉＡＮＧ１０ ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡへのリードのマッピングの配列分布（％）。Ｈｕｈ－７に、（Ａ）２５０ｎｇ又は（Ｂ）４００ｎｇのｍｉＡＮＧ１０構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション２日後の細胞単層を、全ＲＮＡ抽出のために収集した。低分子ＲＮＡ次世代シーケンシングからの結果は、上位５０位の最も豊富なｍｉＲＮＡを示しており、ｍｉＡＮＧ１０の発現レベルが強調して示されている。 ｍｉＡＮＧ１３ ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡへのリードのマッピングの配列分布（％）。Ｈｕｈ－７に、（Ａ）２５０ｎｇ又は（Ｂ）４００ｎｇのｍｉＡＮＧ１３構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション２日後の細胞単層を、全ＲＮＡ抽出のために収集した。低分子ＲＮＡ次世代シーケンシングからの結果は、上位５０位の最も豊富なｍｉＲＮＡを示しており、ｍｉＡＮＧ１３の発現レベルが強調して示されている。 ＮＧＳによって決定された発現ｍｉＡＮＧ５ ｍｉＲＮＡの長さの分布。Ｈｕｈ－７に、（Ａ）２５０ｎｇ又は（Ｂ）４００ｎｇのｍｉＡＮＧ５構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション２日後の細胞単層を、全ＲＮＡ抽出のために収集した。ＲＮＡをＤＮＡｓｅで処理し、低分子ＲＮＡ ＮＧＳのために外部委託した。２％未満を示したリードは図から外した。 ＮＧＳによって決定された発現ｍｉＡＮＧ１０ ｍｉＲＮＡの長さの分布。Ｈｕｈ－７に、（Ａ）２５０ｎｇ又は（Ｂ）４００ｎｇのｍｉＡＮＧ１０構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション２日後の細胞単層を、全ＲＮＡ抽出のために収集した。ＲＮＡをＤＮＡｓｅで処理し、低分子ＲＮＡ ＮＧＳのために外部委託した。２％未満を示したリードは図から外した。 ＮＧＳによって決定された発現ｍｉＡＮＧ１３ ｍｉＲＮＡの長さの分布。Ｈｕｈ－７に、（Ａ）２５０ｎｇ又は（Ｂ）４００ｎｇのｍｉＡＮＧ１３構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション２日後の細胞単層を、全ＲＮＡ抽出のために収集した。ＲＮＡをＤＮＡｓｅで処理し、低分子ＲＮＡ ＮＧＳのために外部委託した。２％未満を示したリードは図から外した。 ビヒクル又はＡＡＶ５を注射した野生型マウスの肝臓における、ゲノムＤＮＡのｇｃ／μｇとして表した、ベクターＤＮＡレベル。 ビヒクル又はＡＡＶ５を注射した野生型マウスの肝臓におけるマウスＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡレベル。データは、１００％に設定したビヒクル群に対する相対値として示す。 ビヒクル又はＡＡＶ５を注射した野生型マウスの肝臓における（Ａ）２４ｎｔアッセイ又は（Ｂ）２３ｎｔアッセイのバリアントＴで測定したｍｉＡＮＧ５発現レベル。データは、分子／細胞として表す。ＬＬＯＱ：定量の下限。 ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル（ｎｇ／ｍｌ）を、ビヒクル又はＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５又はｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を注射した野生型マウスの血漿中で測定した。統計分析：Ｄｕｎｎｅｔｔ事後検定を伴ったＡＮＯＶＡ。^＊：ｐ≦０．０５、^＊＊：ｐ≦０．０１、^＊＊＊：ｐ≦０．００１。 ビヒクル又はＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５又はｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を注射した野生型マウスの血漿中で測定したアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性レベル（ｍＵ／ｍｌ）。統計分析：Ｄｕｎｎｅｔｔ事後検定を伴ったＡＮＯＶＡ。^＊：ｐ≦０．０５。 ビヒクル、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５又はｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を注射した野生型マウスの血漿中で測定したアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性レベル（ｍＵ／ｍｌ）。統計分析：Ｄｕｎｎｅｔｔ事後検定を伴ったＡＮＯＶＡ又はＤｕｎｎ事後検定を伴ったＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ。^＊：ｐ≦０．０５。 ビヒクル、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５又はｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を注射した野生型マウスにおける（Ａ）コレステロール及び（Ｂ）トリグリセリドの血漿レベル。統計分析：Ｄｕｎｎｅｔｔ事後検定を伴ったＡＮＯＶＡ。^＊＊：ｐ≦０．０１。 ビヒクル又はＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの肝臓における、ゲノムＤＮＡのｇｃ／μｇとして表した、ベクターＤＮＡレベル。^＊ ビヒクル又はＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの肝臓におけるマウスＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡレベル。データは、１００％に設定したビヒクル群に対する相対値として示す。 ビヒクルＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの肝臓において、（Ａ）２４ｎｔアッセイ又は（Ｂ）２３ｎｔアッセイのバリアントＴ発現レベルで測定したｍｉＡＮＧ５。データは、分子／細胞として表す。ＬＬＯＱ：定量の下限。 ビヒクル又はＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの、記録された（Ａ）体重及び（Ｂ）食物摂取。 ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３又はｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中の、測定された（Ａ）総コレステロール及び（Ｂ）トリグリセリド。統計分析：Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴ったＡＮＯＶＡ。^＊：ｐ≦０．０５、^＊＊：ｐ≦０．０１、^＊＊＊：ｐ≦０．００１対ビヒクル群；＃：ｐ≦０．０５、＃＃：ｐ≦０．０１、＃＃＃：ｐ≦０．００１対ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群。 ＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中のＡＡＶ注射前のリポタンパク質プロファイル（コレステロール及びリン脂質）。 ＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中のＡＡＶ注射後４週目のリポタンパク質プロファイル（コレステロール及びリン脂質）。 ＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中のＡＡＶ注射後８週目のリポタンパク質プロファイル（コレステロール及びリン脂質）。 ＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中のＡＡＶ注射後１２週目のリポタンパク質プロファイル（コレステロール及びリン脂質）。 ＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中のＡＡＶ注射後１６週目のリポタンパク質プロファイル（コレステロール及びリン脂質）。 ビヒクル又はＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中の（Ａ）ＡＬＴ及び（Ｂ）ＡＳＴの活性レベル。 ＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中のマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル。統計分析：Ｄｕｎｎ事後検定を伴ったＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ。^＊：ｐ≦０．０５；^＊＊：ｐ≦０．０１；^＊＊＊：ｐ≦０．００１。 アトルバスタチンの存在下又は非存在下でのＡＡＶ－ｍｉＡＮＧ５を試験するためのＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスのマウス研究の概略図。 ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びシンバスタチンを試験するための食事誘発性脂質異常症ＮＨＰの概略図。 ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおけるＮＧＳにより決定した発現ｍｉＡＮＧ５ ｍｉＲＮＡの長さの分布（ｎ＝５、ＡＡＶ用量：５Ｅ＋１３ｇｃ／ｋｇ）。マウス１１。全ＲＮＡを肝臓試料から単離し、ＤＮＡｓｅで処理し、低分子ＲＮＡ ＮＧＳのために外部委託した。２％未満を示したリードは図から外した。 ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおけるＮＧＳにより決定した発現ｍｉＡＮＧ５ ｍｉＲＮＡの長さの分布（ｎ＝５、ＡＡＶ用量：５Ｅ＋１３ｇｃ／ｋｇ）。マウス１２。全ＲＮＡを肝臓試料から単離し、ＤＮＡｓｅで処理し、低分子ＲＮＡ ＮＧＳのために外部委託した。２％未満を示したリードは図から外した。 ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおけるＮＧＳにより決定した発現ｍｉＡＮＧ５ ｍｉＲＮＡの長さの分布（ｎ＝５、ＡＡＶ用量：５Ｅ＋１３ｇｃ／ｋｇ）。マウス１３。全ＲＮＡを肝臓試料から単離し、ＤＮＡｓｅで処理し、低分子ＲＮＡ ＮＧＳのために外部委託した。２％未満を示したリードは図から外した。 ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおけるＮＧＳにより決定した発現ｍｉＡＮＧ５ ｍｉＲＮＡの長さの分布（ｎ＝５、ＡＡＶ用量：５Ｅ＋１３ｇｃ／ｋｇ）。マウス１４。全ＲＮＡを肝臓試料から単離し、ＤＮＡｓｅで処理し、低分子ＲＮＡ ＮＧＳのために外部委託した。２％未満を示したリードは図から外した。 ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおけるＮＧＳにより決定した発現ｍｉＡＮＧ５ ｍｉＲＮＡの長さの分布（ｎ＝５、ＡＡＶ用量：５Ｅ＋１３ｇｃ／ｋｇ）。マウス１５。全ＲＮＡを肝臓試料から単離し、ＤＮＡｓｅで処理し、低分子ＲＮＡ ＮＧＳのために外部委託した。２％未満を示したリードは図から外した。 ビヒクル又はＡＡＶ５を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの肝臓における、ゲノムＤＮＡのｇｃ／μｇとして表した、ベクターＤＮＡレベル。ＬＬＯＱ：定量の下限。 ビヒクル又はＡＡＶ５を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの肝臓におけるマウスＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡレベル。データは、１００％に設定したビヒクル群に対する相対値として示す。 ビヒクル ＡＡＶ５を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの肝臓におけるｍｉＡＮＧ５（２３ｎｔ）発現レベル。データは、分子／細胞として表す。ＬＬＯＱ：定量の下限。 ビヒクル又はＡＡＶ５を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの、記録された（Ａ）体重及び（Ｂ）食物摂取。 ビヒクル、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５又はｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの、測定された（Ａ）血漿総コレステロールレベル、及び計算された（Ｂ）コレステロール曝露。統計分析：Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴ったＡＮＯＶＡ。^＊：ｐ≦０．０５、^＊＊：ｐ≦０．０１、^＊＊＊：ｐ≦０．００１対ビヒクル群；＃：ｐ≦０．０５、＃＃：ｐ≦０．０１、＃＃＃：ｐ≦０．００１対ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群；（Ａ）＆＆：ｐ≦０．０１、＆＆＆：ｐ≦０．００１対ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１＋アトルバスタチン群；（Ｂ）＆＆＆：ｐ≦０．００１。 ビヒクル、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５又はｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの、測定された（Ａ）血漿トリグリセリドレベル、及び計算された（Ｂ）トリグリセリド曝露。統計解析：Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴ったＡＮＯＶＡ。^＊＊：ｐ≦０．０１、^＊＊＊：ｐ≦０．００１対ビヒクル群；＃＃：ｐ≦０．０１、＃＃＃：ｐ≦０．００１対ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群；（Ａ）＆＆：ｐ≦０．０１、＆＆＆：ｐ≦０．００１対ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１＋アトルバスタチン群；（Ｂ）＆＆＆：ｐ≦０．００１。 ＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中の、（Ａ）ＡＡＶ注射前、並びにＡＡＶ注射後（Ｂ）４週目、（Ｃ）８週目、及び（Ｄ）１２週目の、プールされたコレステロールリポタンパク質プロファイルの測定値。 ＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中の、（Ａ）ＡＡＶ注射前、並びにＡＡＶ注射後（Ｂ）４週目、（Ｃ）８週目、及び（Ｄ）１２週目の、プールされたリン脂質リポタンパク質プロファイルの測定値。 ＡＡＶ５を注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中の、ＡＡＶ注射後１６週目の（Ａ）コレステロール、（Ｂ）リン脂質、及び（Ｃ）トリグリセリドリポタンパク質プロファイルの個々の測定値。 ビヒクル又はＡＡＶ５を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中で測定したＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル（ｎｇ／ｍｌ）。統計解析：Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を伴ったＡＮＯＶＡ又はＤｕｎｎ事後検定を伴ったＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ。^＊：ｐ≦０．０５；^＊＊：ｐ≦０．０１；^＊＊＊：ｐ≦０．００１。 ビヒクル又はＡＡＶ５を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿中の（Ａ）ＡＬＴ及び（Ｂ）ＡＳＴの活性レベル。 ビヒクル又はＡＡＶ５を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの大動脈根における、測定されたアテローム性動脈硬化の全病変面積。統計解析：Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、続いて個別のＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。^＊＊：ｐ≦０．０１、^＊＊＊：ｐ≦０．００１対ビヒクル群；＃＃＃：ｐ≦０．００１対ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群；＾＾＾：ｐ≦０．００１；＆＆＆：ｐ≦０．００１。 ビヒクル又はＡＡＶ５を（単独で又はアトルバスタチンとの併用で）注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおける、断面あたりの決定されたアテローム性動脈硬化（Ａ）病変の重症度（Ｂ）病変の数。統計解析：Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、続いて個別のＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。^＊：ｐ≦０．０５、^＊＊：ｐ≦０．０１、^＊＊＊：ｐ≦０．００１対ビヒクル群；＃：ｐ≦０．０５、＃＃：ｐ≦０．０１、＃＃＃：ｐ≦０．００１対ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群；＆：ｐ≦０．０５、＆＆：ｐ≦０．０１；＾：ｐ≦０．０５、＾＾：ｐ≦０．０１。 ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びビヒクルを投与した脂質異常性ＮＨＰの血漿脂質レベル（トリグリセリド及びＬＤＬ－コレステロール）。Ｃ１～Ｃ３：ビヒクル投与動物。Ｔ１～Ｔ５：ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５投与動物。投与前の－４０日目から－２７日目まで、及び投与後の５７日目から８４日目までの間に、動物にシンバスタチンを共投与した。 ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びビヒクルを投与した脂質異常性ＮＨＰの血漿脂質レベル（ＨＤＬ－コレステロール及び総コレステロール）。Ｃ１～Ｃ３：ビヒクル投与動物。Ｔ１～Ｔ５：ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５投与動物。投与前の－４０日目から－２７日目まで、及び投与後の５７日目から８４日目までの間に、動物にシンバスタチンを共投与した。 対照群及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５投与群について、投与前のレベル（ベースライン）と比較して、投与後９０日の平均パーセンテージ変化を算出した。この算出のため、投与前及び投与後９０日の期間にわたって曲線下面積を計算した。 ビヒクル又はＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を投与したＮＨＰにおける血漿ＡＬＴ及びＡＳＴレベル。Ｃ１～Ｃ３：ビヒクル投与動物。Ｔ１～Ｔ５：ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５投与動物。

本発明は、遺伝子治療に関するものであり、特に、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子、好ましくはヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝（ＯＭＩＭ：６０４７７４、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／）によってコードされているＲＮＡを標的化するための遺伝子治療におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用に関する。

本発明の目的の一つは、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子であって、前記第１のＲＮＡ配列が、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされているＲＮＡに含まれる標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列を含み、前記標的ＲＮＡ配列に相補的な前記配列が少なくとも１９ヌクレオチドを有する、ＲＮＡ分子を提供することである。

本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」という用語は、２つの核酸配列が互いに相補的かつ逆平行であり、それによって、２つの核酸配列が互いに結合することを指す。「実質的に」という用語は、２つの配列間の相補性が、少なくとも部分的な阻害効果を有するのに十分な時間にわたって互いに結合するのに十分であることを意味する。相補性が完全であることが当然ながら好ましいが、いくつかのギャップ及び／又はミスマッチは許容され得る。ミスマッチの数は１０％以下であるべきである。重要な特徴は、相補性が、２本鎖のｉｎ ｓｉｔｕでの結合を可能にするために十分であることである。結合は、阻害効果を発揮するために十分に強いものでなければならない。

完全又は部分的な第１のＲＮＡ配列は、上述のように、ガイド鎖内にある。ガイド鎖は、センス標的ＲＮＡ配列に対して相補的（「アンチ」）であるため、アンチセンス鎖とも呼ばれる。センス標的ＲＮＡ配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされているＲＮＡに含まれる。

前記第２のＲＮＡ配列は、本明細書で記載される場合、前記標的ＲＮＡ配列と、本明細書で記載されるような実質的に同一の配列同一性を有する「センス鎖」を指す。第１及び第２のＲＮＡ配列は、二本鎖ＲＮＡに含まれ、実質的に相補的である。本発明による前記二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘導し、それによってＡＮＧＰＴＬ３転写物の発現を低減することである。

前記ＲＮＡ分子において、上述のように、第１のＲＮＡ配列に含まれる配列は、任意選択で、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、好ましくはヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされているＲＮＡに含まれる前記標的配列の相補配列とは異なる、最大４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、又は６個のヌクレオチドを有する。任意選択で、第１のＲＮＡ配列に含まれる配列は、任意選択で、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、好ましくはヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされているＲＮＡに含まれる前記標的配列の相補配列とは異なる、少なくとも１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、又は３個のヌクレオチドを有する。任意選択で、前記第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、好ましくは前記ヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされているＲＮＡに含まれる前記標的配列の相補配列と同一である。

これにより、前記ＲＮＡ分子は、上述のように、ＲＮＡｉを誘導することができる。また、これにより、前記ＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ配列を含む配列に配列特異的に結合する。したがって、前記第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている前記標的ＲＮＡ配列に配列特異的結合を有する。

好ましくは、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、本明細書に記載されるように、哺乳類ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子である。より好ましくは、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、マウスＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子である。最も好ましくは、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（ＯＭＩＭ：６０４７７４）である。

好ましくは、前記標的ＲＮＡ配列は、本明細書に記載されるように、図１－１～１－４に示されるＤＮＡ配列（配列番号２のヌクレオチド１～２９２６）によってコードされているＲＮＡ配列に含まれる。前記ＤＮＡ配列は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライシングｍＲＮＡをコードする。

本発明によれば、配列番号１は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の参照遺伝子配列（つまり、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０２８１６９．１）として使用される。それにより、配列番号１のエクソン１～７配列は、図１－１～１－４に示されるように、配列番号２のエクソン１～７に対応する。つまり、配列番号１のエクソン１は、配列番号２のヌクレオチド５００５～５５４６に対応し、配列番号１のエクソン２は、配列番号２のヌクレオチド６１８１～６２９１に対応し、配列番号１のエクソン３は、配列番号２のヌクレオチド８５６７～８６８１に対応し、配列番号１のエクソン４は、配列番号２のヌクレオチド９２５４～９３６７に対応し、配列番号１のエクソン５は、配列番号２のヌクレオチド９７７０～９８６５に対応し、配列番号１のエクソン６は、配列番号２のヌクレオチド１１４５４～１１７２０に対応し、配列番号１のエクソン７は、配列番号２のヌクレオチド１２１１８～１３７９８に対応する。

本明細書で記載される場合、「少なくとも１つ」という用語は、本明細書に記載されるように、示された対象、例えばエクソンが、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の量であることを指す。

本明細書で記載される場合、「保存配列」又は「保存領域」という用語は、高いレベルの類似性で様々な種に見出すことができる、短い長さの配列を指す。保存配列は、同一のＲＮＡ又は同一のタンパク質をコードするための様々な種由来のいくつかの核酸配列を整列させることによって同定することができ、それによって配列の一部が実質的に同一であることが見出され得る。用語「保存（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）配列」は、「保存（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）配列」又は「保存領域」としても知られる。

本明細書で記載される場合、「エクソン」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子の領域を指す。

ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている前記標的配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている少なくとも１つの保存配列の全部又は一部を含むように設計される。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の保存配列のいくつかを特定し、本発明のために選択する。

好ましくは、保存配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１、エクソン３、エクソン５又はエクソン６に含まれる。より好ましくは、前記標的配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１、エクソン５又はエクソン６における保存配列の全部又は一部を含む。さらにより好ましくは、前記標的配列は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１又はエクソン５における保存配列の全部又は一部を含む。

上述のように、本発明によるＲＮＡ分子は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物をノックダウンする。さらに、ＲＮＡ分子は、上述のように、ＲＮＡｉに基づく遺伝子治療に典型的に存在する「オフターゲット」問題を改善する。本明細書で記載される場合、「オフターゲット」問題は、本明細書に記載されるように、ＲＮＡ分子の前記第２のＲＮＡ配列が、意図されていない標的ＲＮＡ配列に結合することを指す。したがって、ＲＮＡ分子は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写を効果的に抑制又は阻害することができる。

さらに、ＲＮＡ分子を用いて、上述のように、医師及び／又は患者は、前記ＲＮＡ分子、組成物、ＡＡＶビヒクル、又は前記ＲＮＡ分子を含む製剤を、簡便かつ単純な方法でヒト体内に投与することができる。したがって、ＲＮＡ分子は、上述のように、脂質異常症の治療及び／又は予防に対する前述のニーズを満たす。好ましくは、前記ＲＮＡ分子において、上述のように、前記第１のＲＮＡ配列は、前記第２のＲＮＡ配列に対して実質的に相補的である。

前記ＲＮＡ分子は、上述のように、好ましくはＲＮＡヘアピン又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。より好ましくは、前記ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ－４５１を含む。

本明細書で記載される場合、「ＲＮＡヘアピン」という用語は、互いに相補的である２つの鎖を含み、さらに２つの鎖を接続するループを含む、ＲＮＡの二次構造を指す。ＲＮＡヘアピンは、ＲＮＡフォールディングを導き、リボザイム内の相互作用を決定し、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解から保護し、ＲＮＡ結合タンパク質の認識モチーフとして機能することができる。

本明細書で記載される場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的かつ逆平行である２つの核酸鎖を指す。２つの鎖は水素結合によって安定化されている。

本明細書で記載される場合、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡを分解若しくは切断するためのＲＮＡｉにおいて使用され得るか、又は標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制し得る、ヘアピン構造を有する人工ＲＮＡ分子を指す。

本明細書で記載される場合、「ｍｉＲ－４５１」という用語は、マイクロＲＮＡ４５１ａから得られる特定の骨格を指す。ｍｉＲ－４５１のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格を図２のＡに示す。この骨格は、特に、ＲＮＡｉがこの骨格のガイド鎖によって誘導されるという点で、ＲＮＡｉを誘導することを可能にする。ｐｒｉ－ｍｉＲ４５１骨格は、古典的ｍｉＲＮＡプロセシング経路とはプロセシングが異なるため、パッセンジャー鎖をもたらさない（Ｃｈｅｌｏｕｆｉ，Ｓ．ら、２０１０及びＹａｎｇ，Ｊ．Ｓ．ら、２０１０）。したがって、ｍｉＲ－４５１の使用は、パッセンジャー鎖による望ましくない潜在的なオフターゲティングが起こる可能性を防止又は低減することができる。

前記ＲＮＡ分子において、上述のように、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、任意選択で少なくとも１５個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも１６個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも１７個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも１８個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも１９個のヌクレオチド、任意選択で少なくとも２２個のヌクレオチド、又は任意選択で少なくとも２４個のヌクレオチドを有する。また、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、上述のように、任意選択で最大３０個のヌクレオチド、任意選択で最大２８個のヌクレオチド、又は任意選択で最大２６個のヌクレオチドを有する。

好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、上述のように、配列番号８～２５からなる群から選択される配列である。より好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、上述のように、配列番号８～１７及び１９～２５からなる群から選択される配列である。さらにより好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、配列番号１１、１２、１６、１７、２０及び２５からなる群から選択される配列である。なお好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、配列番号１１、１２、１７、２０及び２５からなる群から選択される配列である。最も好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、配列番号１２を含む。さらに最も好ましくは、第１のＲＮＡ配列に含まれる配列は、上述のように、配列番号１２からなる。

前記ＲＮＡ分子において、上述のように、前記第１のＲＮＡ配列は、本明細書に記載されるように、前記標的配列に実質的に相補的な配列を含む。

第１のＲＮＡ配列に含まれる前記配列は、上述のように、エクソンの１つに含まれる保存配列の１つに基づいて、上述のように、設計される。

そのような第１のＲＮＡ配列は、第２のＲＮＡ配列と組み合わされる。当業者は、上述のように、細胞内のＲＮＡｉを誘導する、前記第１のＲＮＡ配列と組み合わせるのに好適な第２のＲＮＡ配列を設計及び選択することができる。好適な第２のＲＮＡ配列は、下記の表２に列挙する。

好ましくは、前記第１のＲＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡ骨格、より好ましくはｍｉＲ－４５１骨格に含まれる。

前記第１及び第２のＲＮＡ配列を含む好ましい骨格は、上述のように、表３及び４に列挙される配列の群から選択される配列を含む。

任意選択で、表３に列挙される配列は、さらなる配列を含む。また、任意選択で、表３に列挙される配列は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格、好ましくは表４のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ骨格の配列に含まれる。

前記ＲＮＡ分子において、上述のように、前記標的配列は、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされているＲＮＡに含まれる。好ましくは、少なくとも１つのエクソンの一部によってコードされているＲＮＡに含まれる前記標的配列は、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれる。さらに好ましくは、前記エクソンは、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれるエクソン１、エクソン３、エクソン５、又はエクソン６である。より好ましくは、前記エクソンは、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれるエクソン１、エクソン５、又はエクソン６である。さらにより好ましくは、ＲＮＡに含まれる前記標的配列は、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている。好ましくは、ＲＮＡに含まれる前記標的配列は、上述のように、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれる１つのエクソンに含まれる少なくとも１つの保存配列によってコードされている。好ましくは、保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４：１３９～１６６位のヌクレオチド、以下、配列番号３と称する）は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１に含まれ、保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４：２６７～２９２位のヌクレオチド、以下、配列番号４と称する）は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン１に含まれ、保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４：７０６～７２８位のヌクレオチド、以下、配列番号５と称する）は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のエクソン３に含まれ、保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４：８８５～９０７位のヌクレオチド、以下、配列番号６と称する）は、エクソン５に含まれ、又は保存配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４：１１３４～１１６０位のヌクレオチド、以下、配列番号７と称する）は、エクソン６に含まれる。

配列番号３～７は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１４４９５．４（配列番号２））のエクソンに含まれる。配列番号３：エクソン１の１３９～１６６、配列番号４：エクソン１の２６７～２９２、配列番号５：エクソン３の７０６～７２８、配列番号６：エクソン５の８８５～９０７、配列番号７：エクソン６の１１３４～１１６０。標的ＲＮＡ配列の配列番号３、４、５、及び６は、ヒト、サル、マウス、及びラットなどのいくつかの動物において完全に又は本質的に保存されている。標的ＲＮＡ配列の配列番号７を、（Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｊ．ら、２０１７）によって示されるように選択して、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ＩＯＮＩＳ－ＡＮＧＰＴＬ３－Ｌ_ＲＸの標的ＲＮＡ配列とした。

本発明の目的の一つは、上述のように、前記ＲＮＡを含む組成物、又は、上述のように、前記ＲＮＡをコードする核酸、又は前記ＲＮＡを含むＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを提供することである。

上記及び本明細書で使用される場合、「血漿コレステロールレベル」又は「血漿中のコレステロールレベル」という用語は、血漿中に存在するコレステロールの量を指す。

上記及び本明細書で使用される場合、「ＴＣ」という用語は、血漿及び血清中に存在するコレステロールの量を指す。

任意選択で、前記組成物は、添加剤をさらに含む。前記添加剤は、より長い保存期間、容易な保管、容易な輸送、及び／又は、より少ない分解など、前記組成物の安定性をさらに向上させるためのものである。

上記及び本明細書で記載される場合、「添加剤」という用語は、上記組成物の特性をさらに増強するために、又は上記組成物の有効性及び／若しくは特性を変更又は影響することなく充填剤として機能するために、前記組成物にさらに添加される物質を指す。

本発明の目的の一つは、上述のように、医薬としての前記組成物の使用である。好ましくは、上述のように、前記組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物をノックダウンするための医薬として用いられる。

上記及び本明細書で使用される場合、「転写物」という用語は、上述のように、遺伝子、例えばＡＮＧＰＴＬ３遺伝子などによってコードされている遺伝子産物を指す。前記遺伝子産物は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子からコードされているＲＮＡ、及びＡＮＧＰＴＬ３遺伝子からコードされているタンパク質を含む。

本明細書で使用される場合、「ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）」、「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）」、又は「ノックダウンする（ｋｎｏｃｋｉｎｇ ｄｏｗｎ）」という用語は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物のレベルを、低下させる、低減させる、抑制する、及び／又は減少させることを指す。また、本明細書で使用される場合、「ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）」、「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）」、又は「ノックダウンする（ｋｎｏｃｋｉｎｇ ｄｏｗｎ）」という用語は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物のレベルを阻害するか、又はサイレンシングすることを指す。

ＲＮＡ分子は、上述のように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物をノックダウンする。したがって、上述のように、組成物は、リン脂質、血漿コレステロールレベル、ＬＤＬ－Ｃ、ＴＣ及び／若しくはＴＧのレベルを低下させ、及び／若しくは阻害し、並びに／又はヒト体内の初期、軽度及び／若しくは重度のアテローム性動脈硬化病変を低減させ、及び／若しくは阻害し、それにより、前記組成物は、上述のように、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害の治療及び／又は予防のために使用される。好ましくは、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害は、家族性高コレステロール血症、ＬＤＬ－高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、混合高リポタンパク血症、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの高脂血症を含む。好ましくは、組成物は、上述のように、脂質異常症の治療及び／又は予防のための医薬として使用される。

「アテローム性動脈硬化病変」という用語は、アテローム性動脈硬化の病変の重症度及び／又は病変の大きさを意味する。前記アテローム性動脈硬化病変は、米国心臓協会に従って５つのカテゴリーに分類される（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）：Ｉ型は早期脂肪線条であり、ＩＩ型は定型脂肪線条であり、ＩＩＩ型は軽度のプラークであり、ＩＶ型は中等度のプラークであり、Ｖ型は重度のプラークである。上記及び本明細書で使用されるアテローム性動脈硬化病変は、初期病変、軽度病変、及び／又は重度病変を含む。

「初期病変」という用語は、上記及び本明細書で記載される場合、早期及び定型脂肪線条を含むものとして称される。このことはまた、初期病変が、米国心臓協会（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）に従ったＩ～ＩＩ型を含むことを意味する。

上記及び本明細書で記載される場合、「軽度病変」という用語は、軽度プラークを含むものとして称される。このことはまた、軽度病変が、米国心臓協会（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）に従ったＩＩＩ型を含むことを意味する。

本明細書に記載される「重度病変」という用語は、中等度のプラーク及び重度のプラークを含むものとして称される。このことはまた、重度病変が、米国心臓協会（Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．ら、１９９５；Ｓｔａｒｙ，Ｈ．Ｃ．、２０００）に従ったＩＶ型及びＶ型を含むことを意味する。

本発明の目的の一つは、ＤＮＡ発現カセットを提供することである。

本明細書で記載される場合、「ＤＮＡ発現カセット」という用語は、ＲＮＡ分子をコードする遺伝子又は核酸配列、プロモーター、及びポリＡテールをコードする核酸配列を含むＤＮＡ核酸配列を指す。前記ＤＮＡ発現カセットは、ＩＴＲに隣接しており、ウイルスビヒクルに含まれ、その後、肝臓等の標的臓器に送達される。

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ分子」という用語は、ヘアピン、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を指す。前記ヘアピンは、好ましくは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はロングヘアピンＲＮＡ（ｌｈＲＮＡ）である。より好ましくは、前記ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ－４５１、又は配列番号１２４によってコードされているＲＮＡ分子である。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、連結された核酸配列の転写を駆動又は開始するための、典型的には、転写開始部位の５’末端に位置するＤＮＡ配列を指す。好ましくは、前記プロモーターは、ＡＮＧＰＴＬ３が主に肝臓で発現されるので、肝臓特異的プロモーターを含む。

より好ましくは、前記プロモーターは、上述のように、ｐｏｌ Ｉプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、誘導性又は抑制性プロモーター、α１－抗トリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロビン）プロモーター、ＨＣＲ－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、及びアポリポタンパク質Ｅプロモーター、ＨＬＰ、最小ＴＴＲプロモーター、ＦＶＩＩＩプロモーター、ハイペロンエンハンサー、ｅａｌｂ－ｈＡＡＴ、ＥＦ１－αプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｕ１－１ ｓｎＲＮＡプロモーター、アポリポタンパク質プロモーター、ＴＲＥプロモーター、ｒｔＴＡ－ＴＲＥ（誘導性プロモーター）、ＬＰ１プロモーター、Ｑ１プロモーター、Ｑ１－プライムプロモーター、Ｃ１４プロモーター、Ｃ１６プロモーター、又は配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５から選択される任意の合成プロモーター、並びにこれらのバリアントからなる群から選択される。

任意選択で、配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５の前記バリアントはそれぞれ、上述のように、配列番号８４～８７、１０８～１０９及び１１２～１１５と実質的に同一の配列を有し、前記バリアントは、配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５と実質的に同一の機能を有する。

任意選択で、配列番号８４～８７、１０８～１０９及び１１２～１１５の前記バリアントのそれぞれは、上述のように、配列番号８４～８７及び１０８～１０９、及び１１２～１１５の配列とは異なる、少なくとも１、２、３、４、又は５個のヌクレオチドを含む核酸配列を有する。

任意選択で、配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５の前記バリアントのそれぞれは、配列番号８４～８７及び１０８～１０９及び１１２～１１５の配列とは異なる最大で４０、３５、３０、２５、又は２０個のヌクレオチドを含む核酸配列を有する。

本明細書で記載される場合、「ポリＡテール」という用語は、ＲＮＡ分子の安定性を増加させるためにｍＲＮＡ分子に付加される、アデニンヌクレオチドの長鎖を指す。好ましくは、ポリＡテールは、サルウイルス４０ポリアデニル化（ＳＶ４０ポリＡ；配列番号８８）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化、及び合成ポリアデニル化である。

本明細書で記載される場合、「ＲＮＡ分子をコードする核酸配列」という用語は、ヘアピン、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのＲＮＡ分子をコードする核酸配列を指す。好ましくは、前記核酸配列は、ｍｉＲ４５１骨格に基づくマイクロＲＮＡをコードする。好ましくは、前記核酸配列は、配列番号１２４を含む。前記ＲＮＡ分子は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を低減させる及び／又はノックダウンするのに使用することができる。

本明細書で記載される場合、「逆位末端配列（ＩＴＲ）」という用語は、上述のように、ＤＮＡ複製の起点及びウイルスのパッケージングシグナルとしてｃｉｓで機能する、前記ＤＮＡ発現カセットの５’及び３’末端における配列を指す。前記ＩＴＲは、好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ配列からなる群から選択される。より好ましくは、前記ＩＴＲ配列は、両方がＡＡＶ１、両方がＡＡＶ２、両方がＡＡＶ５、両方がＡＡＶ６、又は両方がＡＡＶ５のＩＴＲ配列である。また、より好ましくは、前記ＤＮＡ発現カセットの５’末端の前記ＩＴＲ配列は、前記ＤＮＡ発現カセットの３’末端の前記ＩＴＲ配列とは異なり、前記ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ８のＩＴＲ配列から選択される。

本発明の目的の一つは、上述のように、前記ＲＮＡ分子をコードする前記ＤＮＡ発現カセットを含むウイルスビヒクルを提供することである。

本明細書で記載される場合、「遺伝子治療ビヒクル」、「ウイルスビヒクル」又は「ウイルスのビヒクル」という用語は、目的の遺伝子、目的の核酸、目的の遺伝子を含むベクター、又は目的の核酸を含むベクター、又はＲＮＡ分子をコードする前記遺伝子若しくは核酸を含むＤＮＡ発現カセット等の遺伝子材料を、標的細胞、臓器又は組織内に運ぶためのビヒクルとして機能する野生型又は組換えウイルスを指す。好適なウイルスビヒクルは、アルファウイルス、フラビウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、シミアンウイルス４０、麻疹ウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡＶであり得る。好ましくは、前記ウイルスビヒクルはＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルであり、上述のように、前記ＤＮＡ発現カセットを含む、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルである。より好ましくは、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、前記ＤＮＡ発現カセットを含み、前記ＤＮＡ発現カセットは、上述のようなＲＮＡ分子をコードする核酸配列、上述のようなプロモーター、及び上述のようなポリＡテールを含み、前記ＤＮＡ発現カセットの末端のそれぞれが、上述のように、ＩＴＲ配列に隣接している。

本明細書で記載される場合、「ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル」という用語は、アデノ随伴ウイルス遺伝子治療ビヒクルである。ＡＡＶウイルスは、ウイルスキャプシドタンパク質（ＶＰ）配列及び抗原性に基づいて、いくつかのクレードに分類される。本明細書に記載の好適なＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２／５ハイブリッド、ＡＡＶ７、又はＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列を有するキャプシドタンパク質を含む。好ましくは、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２／５ハイブリッド、ＡＡＶ３又はＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列を有する。より好ましくは、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドタンパク質は、上述のように、ＡＡＶ２／５ハイブリッド又はＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列によってコードされている。

また、本明細書に記載されるように、好適なＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、又はＡＡＶ８のキャプシドタンパク質配列を有するキャプシドタンパク質、又は例えば、キャプシドシャッフリング技術及びＡＡＶキャプシドライブラリによって得られる新たに開発されたＡＡＶ様粒子を含む。

任意選択で、本発明において使用されるキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３は、既知の４２の血清型から選択される。

任意選択で、本明細書に記載される、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルの前記キャプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３を含む。また、任意選択で、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルの前記キャプシドタンパク質は、本明細書に記載されるように、ＶＰ１及び／又はＶＰ３を含む。

任意選択で、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、前記ＤＮＡ発現カセットを含み、前記ＤＮＡ発現カセットは、ＲＮＡ分子をコードする配列番号１２４を含むか、又は前記ＤＮＡ発現カセットは、ｍｉＲ－４５１をコードし、前記ＲＮＡ分子は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を標的化、切断及び／又はノックダウンすることができ、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２／５ハイブリッドキャプシドタンパク質配列によって、又はＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列によってコードされている。

本発明の目的の一つは、上述のように、上記ウイルスビヒクルを医薬として使用することである。好ましくは、前記医薬は、本明細書に記載されるように、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を減少させる及び／又はノックダウンするための医薬として使用される。好ましくは、前記ウイルスビヒクルは、上述のように、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルである。さらに好ましくは、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、上述のように、ヒト対象等の哺乳類における血漿中のコレステロールレベル、ＬＤＬ－Ｃレベル、ＴＣレベル、ＴＧレベル、リン脂質レベル、並びに／又は軽度、中等度、及び／若しくは重度のアテローム性動脈硬化病変を低減させる及び／又は阻害するための医薬として使用される。したがって、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、上述のように、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害の治療及び／又は予防のために使用される。好ましくは、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害は、家族性高コレステロール血症、ＬＤＬ－高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、混合高リポタンパク血症、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの高脂血症を含む。好ましくは、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、上述のように、脂質異常症の治療及び／又は予防のために使用される。

本明細書で使用される場合、「組成物」という用語は、上述の核酸又は上述のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む、混合物、組合せ、及び／又は製剤を指す。好ましくは、血漿中のコレステロールレベル、ＬＤＬ－Ｃレベル、及び／又は重度のアテローム性動脈硬化病変を低減させる及び／又は阻害することが可能な少なくとも１つの分子が、前記組成物にさらに含まれる。

任意選択で、前記組成物は、水性液体、有機溶媒、緩衝液、及び賦形剤からなる群から選択される少なくとも１つの添加剤をさらに含む。任意選択で、水性液体は水である。また、任意選択で、前記緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、トリス、ヒスチジン、及び４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）からなる群から選択される。さらに任意選択で、有機溶媒は、エタノール、メタノール、及びジクロロメタンからなる群から選択される。さらに、賦形剤は、塩、糖、コレステロール又は脂肪酸である。さらに任意選択で、前記塩は、上述のように、塩化ナトリウム、塩化カリウムからなる群から選択される。さらに任意選択で、前記糖は、上述のように、スクロース、マンニトール、トレハロース、及び／又はデキストランである。

本発明の目的の一つは、上述のような前記核酸、上述のような前記ＲＮＡ分子、上述のような前記ＲＮＡ分子を含む前記組成物、上述のような前記核酸を含む前記組成物、又は上述のような前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含むキットを提供することである。

上述のような疾患又は障害を治療及び／又は予防する目的のために、上述のように、前記組成物、及び任意選択で上述の賦形剤等の少なくとも１つの添加剤を、キットに都合よく組み合わせることができる。したがって、本明細書に記載される「キット」という用語は、上述の少なくとも前記核酸、上述の少なくとも前記ＲＮＡ分子、上述の少なくとも前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル、又は上述の前記組成物、並びに前記核酸、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル、前記ＲＮＡ分子、又は前記組成物を保持するための手段、例えば容器若しくはボトルを保持するための手段を含む。

好適には、上記及び本明細書に記載されるように前記ＲＮＡ分子を含む組成物、及び／又は上記及び本明細書に記載されるように前記核酸を含む前記組成物は、キットに含まれる容器に保持される。医師及び患者は、上述のように前記組成物及び／又は前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルをヒト対象などの哺乳類に適用するための標識及び／又は指示を容易に理解することができる。

脂質異常症治療の主な適応は、アテローム性心血管疾患の予防である。脂質障害のある患者は、薬物療法が処方されているかどうかに関わらず、健康的なライフスタイル（心臓に優しい食事、定期的な運動、禁煙、健康的な体重の維持）をとる必要がある。スタチンは、脂質を低下させるために好ましい薬物である。ＰＣＳＫ９阻害剤であるエゼチミブなど、脂質を減少させる薬剤としてさらなる薬剤が出現している。しかしながら、これらの薬物だけでは、アテローム性動脈硬化症のリスクは低下しない。一次予防のためには推奨されない薬理学的介入には、フィブラート、胆汁酸結合樹脂、オメガ３脂肪酸サプリメント、植物ステロール又はスタノール、及びナイアシンが含まれる（Ｋｏｐｉｎ，Ｌ．及びＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃ．、２０１７）。食事や脂質低下薬に反応しない非常に高いレベルのＬＤＬ－Ｃを有する人のためには、コレステロールレベルを低下させる医学的処置（リポタンパク質アフェレーシスなど）が用意される。そのような人には、家族性高コレステロール血症を有する人が含まれる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ４２５７００／）。大きく上昇したレムナントリポタンパク質、トリグリセリドリッチリポタンパク質及び／又はＬｐ（ａ）のレベルを低下させることができる有効な薬剤は、現在、ほとんどない。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質の産生又は除去において重要な役割を果たすタンパク質を標的とすることによって、ＡＳＯ阻害及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）技術などの新規の遺伝子サイレンシング手法を使用して低減することができる（Ｎｏｒｄｅｓｔｇａａｒｄ，Ｂ．Ｇ．ら、２０１８）。アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）タンパク質は、ＴＧ及びトリグリセリドリッチリポタンパク質（ＴＲＬ）代謝の中心的な調節因子の１つであり、魅力的な治療標的と考えられる（Ｏｌｋｋｏｎｅｎ，Ｖ．Ｍ．ら、２０１８）。以前の研究において、機能を喪失させる変異が天然に生じているＡＮＧＰＴＬ３を標的とすることは安全であると報告されている。循環ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質が欠損又は減少した個体は、全身のコレステロール恒常性に乱れがなく、病理学的状態と関連しなかった（Ｍｉｎｉｃｏｃｃｉ，Ｉ．ら、２０１２）。

本発明者らは、血清型５のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ５）で送達されるマイクロＲＮＡ構築物を用いてヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現をサイレンシングすることによって、ヒトへの使用のために安全かつ有効である脂質異常症の治療のための遺伝子治療アプローチを提供することを追求する。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、ヒト、さらに理想的にはげっ歯類にわたるＡＮＧＰＴＬ３の保存された標的領域を、マイクロＲＮＡ構築物（ｍｉＡＮＧ）を使用して標的化する。１８個の構築物を生成し、ヒト肝臓細胞におけるルシフェラーゼレポーター構築物及び内因性ｍＲＮＡ発現をノックダウンする能力についてスクリーニングした。げっ歯類及び脂質異常マウスモデルにおけるＡＡＶベクターを使用したさらなる試験のために、３つの有力なサイレンシング構築物を選択した。小動物における首尾のよい概念実証（ＰｏＣ）にあたり、ＡＡＶを、脂質異常マウス及びＮＨＰにおいて、スタチンと組み合わせて試験した。

［アンジオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）を標的とする治療用ｍｉＲＮＡの設計］
ＡＮＧＰＴＬ３ ＲＮＡ標的配列解析及びガイド鎖設計
異なる種にわたるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の保存されたＲＮＡ配列を標的とするｍｉＲＮＡガイド鎖であるｍｉＡＮＧを設計した。選択された種（ホモ・サピエンス、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１４４９５．４、配列番号２、マカカ・ファスシクラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００５５４３１８５．２、配列番号８９、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１３９１３．４、配列番号９０、ラッツス・ノルベジクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１０２５０６５．１、配列番号９１）のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列の全長を整列させた。Ｌｏｇ－Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏ（ＭＵＳＣＬＥ）アラインメントツールによる複数の配列比較を用いて、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列のデフォルト設定（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）とのアラインメントを行った。ヒト、サル、マウス、及びラットにおけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列の４つの保存配列（配列番号３～６）を同定し、１４個のｍｉＲＮＡ（配列番号８～２１）の設計に使用した。保存された配列の各々を、「タイリング戦略」で２２個のヌクレオチド（ｎｔ）を有するいくつかの異なるガイド鎖を生成するために使用した。この戦略は、２２ｎｔを超える保存配列を完全に覆うように、又は保存配列が１９ｎｔより短い場合に保存配列を５’若しくは３’方向に伸長するように、重複する２２ｎｔのガイドを設計することから構成された。ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする７つのガイド（名称ｍｉＡＮＧ１～ｍｉＡＮＧ７、配列番号８～１４）を、エクソン１に位置する第１の保存領域（ＮＭ＿０１４４９５．４：１３９～１６６位のｎｔ）に設計した。ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする３つのガイド（名称ｍｉＡＮＧ８～ｍｉＡＮＧ１０、配列番号１５～１７）を、エクソン１に位置する第２の保存領域（ＮＭ＿０１４４９５．４：２６７～２９２位のｎｔ）に設計した。ＡＮＧＰＴＬ３標的とする２つのガイド（名称ｍｉＡＮＧ１１及びｍｉＡＮＧ１２、配列番号１８及び１９）を、エクソン３に位置する第３の保存領域（ＮＭ＿０１４４９５．４：７０６～７２８位のｎｔ）に設計した。ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする２つのガイド（名称ｍｉＡＮＧ１３及びｍｉＡＮＧ１４、配列番号２０及び２１）を、エクソン５に位置する第４の保存領域（ＮＭ＿０１４４９５．４：８８５～９０７位のｎｔ）に設計した。Ｉｏｎｉｓによって開発されたＡＳＯ ＩＯＮＩＳ－ＡＮＧＰＬＴ３Ｒｘを重複させることにより、４つのガイド（配列番号２２～２５）を設計した。ＩＯＮＩＳ－ＡＮＧＰＴＬ３Ｒｘ（配列番号７）は、ヌクレオチド配列５’－ＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡ－３’からなるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列を標的とする第二世代２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド薬物である（Ｇｒａｈａｍ，Ｍ．Ｊ．ら、２０１７）。ＩＯＮＩＳ－ＡＮＧＰＴＬ３Ｒｘのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ ＮＭ＿０１４４９５．４を有する配列の１１３６～１１５５位のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡコード配列のエクソン６内の２０ｎｔ配列に相補的である。新たに設計された配列ｍｉＡＮＧ１５、ｍｉＡＮＧ１６及びｍｉＡＮＧ１７（配列番号２２～２４）は、それぞれ、ＡＳＯ ＩＯＮＩＳ－ＡＮＧＰＴＬ３Ｒｘに対して配列の５’にさらに２つのｎｔを有するもの、配列の５’及び３’にさらに１つのヌクレオチドを有するもの、並びに配列の３’にさらに２つのｎｔを有するものと同一であった（ＮＭ＿０１４４９５．４：１１３４～１１５７位）。ｍｉＡＮＧ１８（配列番号２５）は、ＡＳＯ ＩＯＮＩＳ－ＡＮＧＰＴＬ３Ｒｘ（ＮＭ＿０１４４９５．４：１１３９～１１５５位）と重複する１７ｎｔの配列と、配列の３’にさらに４つのヌクレオチド（ＮＭ＿０１４４９５．４：１１５６～１１６０位）とを有する。陰性対照を生成するために、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ｃｒｅａｔｅ－ｓｃｒａｍｂｌｅｄ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を使用して、ｍｉＡＮＧ６及びガイドをスクランブルした。スクランブルガイドは、ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ２（配列番号９２及び９３）と命名した。

ＤＮＡ構築物
ｍｉＡＮＧ及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ対照を、９０ｎｔの５’及び３’隣接領域に隣接するヒトのｐｒｅ－ｍｉＲ－４５１骨格（図２のＡ）に埋め込んだ。ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩの制限部位をそれぞれ５’及び３’に加え、完全な配列を遺伝子合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ｐｒｉ－ｍｉＡＮＧカセットを、ＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーター（アポリポタンパク質Ｅ遺伝子座制御領域、ヒトα１－アンチトリプシン、配列番号９４）から発現させ、サルウイルス４０ポリアデニル化（ＳＶ４０ポリＡ、配列番号８８）シグナルによって終結させた（図２のＢ）。２つのルシフェラーゼレポーターのＬｕｃＡＮＧ－Ａ（配列番号９５）及びＬｕｃＡＮＧ－Ｂ（配列番号９６）を、それぞれエクソン１、３、４、５（ＮＭ＿０１４４９５．４：１２８～１７７位、２５５～３０４位、６９２～７４１位、８７１～９２０位；図２のＣ）並びにエクソン６及び７（ＮＭ＿０１４４９５．４：１１２１～１１７０位；図２のＣ）の断片を組み合わせることによって生成した。５’及び３’の隣接領域は、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ制限部位と共に含めた。ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）遺伝子の３’ＵＴＲにおける完全な配列とクローニングを、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成し、クローニングした。ＲＮＡ転写物の二次構造は、ｍｆｏｌｄプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ、Ｚｕｃｋｅｒ ２０１３）を使用して予測した。

［材料及び方法］
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験

トランスフェクションアッセイ及び細胞
ヒト肝細胞由来細胞癌Ｈｕｈ－７細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｋｒｅｍｓｍｕｅｎｓｔｅｒ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃及び５％ＣＯ_２で維持した。ルシフェラーゼアッセイ及び低分子ＲＮＡ ＮＧＳについては、細胞を、トランスフェクションの１日前に、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に、ウェルあたり１Ｅ＋０５細胞の密度で２４ウェルプレートに播種した。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の説明書に従って行った。

デュアルレポータールシフェラーゼアッセイ
Ｈｕｈ－７細胞に、ｍｉＡＮＧ発現構築物、及びＡＮＧＰＴＬ３標的配列に融合したＲＬ遺伝子とホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）遺伝子との両方を含むルシフェラーゼレポーターを三連でコトランスフェクトした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを添加して等量のＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクト後４８時間で、１００μｌの１×受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、室温で１５分間穏やかに揺らすことによってアッセイした。細胞溶解物を４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１０μｌの上清を用いて、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＦＬ活性及びＲＬ活性を測定した。相対的ルシフェラーゼ活性は、ＲＬ活性とＦＬ活性との比として計算した。

ＲＮＡ単離及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）
Ｈｕｈ－７細胞に、２５０ｎｇ又は４００ｎｇのｍｉＡＮＧ５、ｍｉＡＮＧ１０、及びｍｉＡＮＧ１３の構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、全ＲＮＡを細胞から単離した。ＲＮＡ試料を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのｄｓＤＮａｓｅで、製造業者の説明書に従って処理した。シーケンシングについて、ｍｉＡＮＧ５、ｍｉＡＮＧ１０、ｍｉＡＮＧ１３及び未トランスフェクトＨｕｈ－７からの全ＲＮＡ試料を、低分子ＲＮＡシーケンシングのために外部に送付した（ＢａｓｅＣｌｅａｒ Ｂ．Ｖ．）。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム用の低分子ＲＮＡシーケンシングライブラリを、ＢａｓｅＣｌｅａｒ Ｂ．Ｖ．で調製してシーケンシングした。

ＮＧＳデータ解析
トランスフェクトしたＨｕｈ－７細胞におけるｍｉＲＮＡの発現及びプロセシングの解析は、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ１０を使用して行った。得られたリードをアダプタートリミングした。トリミングに使用したカスタムアダプター配列は、プラス鎖ではＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧであり、マイナス鎖ではＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡであった。第２のトリミングを実施し、各リードの５’及び３’から４ｎｔを除去した。曖昧Ｎ記号を含むリード、１５ｎｔより短いリード又は７０ｎｔより長いリードの全てを除外した。次に、得られた独自の低分子ＲＮＡリードを、ｍｉＲＮＡヒトデータベース（ｍｉＲＢａｓｅ）を使用してアノテーションし、ｐｒｉ－ｍｉＡＮＧ構築物の参照配列に整列させた。内因性ｍｉＲＮＡの総プールにおけるｍｉＡＮＧ５、ｍｉＡＮＧ１０及びｍｉＡＮＧ１３の発現のパーセンテージを、アノテーション処理中にソフトウェアＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ１０によって計算した。ｍｉＡＮＧ５、ｍｉＡＮＧ１０及びｍｉＡＮＧ１３のプロセシングを調べるために、それぞれの成熟ｍｉＲＮＡ種の長さ及び割合を、適切なｐｒｉ－ｍｉＡＮＧ配列（配列番号６６、７７及び７５）に対する上位２０位の最も豊富なアノテーション（１００％に設定）を考慮することによって評価した。

内因性Ｈｕｈ－７ ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡノックダウンの測定
ＲＴ－ＱＰＣＲを実施して、内因性ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのノックダウンによるｍｉＲＮＡの発現を確認した。Ｈｕｈ－７細胞に、ｍｉＡＮＧ５、ｍｉＡＮＧ１０、ｍｉＡＮＧ１３、ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ２の構築物をトランスフェクトした。トランスフェクション２日後に、培地を新しいものにした。トランスフェクション４８時間後にＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞単層を回収し、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，）を製造業者の説明書に従って使用して、ＲＮＡを単離した。ＤＮａｓｅ処理及びｃＤＮＡ合成は、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標）ＤＮａｓｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＭａｘｉｍａ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って使用して実施した。ＱＰＣＲは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からのＴａｑＭａｎ即時使用型プライマー－プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）：ＡＮＧＰＴＬ３（アッセイＩＤ：Ｈｓ００２０５５８１＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．）、及びハウスキーピング遺伝子としてのβ－アクチン（ＡＣＴＢ）（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。相対遺伝子発現データを、ヒトＡＣＴＢを基準遺伝子としてＡＮＧＰＴＬ３データを正規化して得た。１００％に設定したｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１試料と比較して、結果を示す。

バキュロウイルスのシード生成のためのＤＮＡ構築物
発現カセットを、ＡＡＶ ＩＴＲをコードするプラスミドに組み込んだ。発現カセットは、ＡＮＧＰＬＴ３を標的とするｍｉＲＮＡの発現を駆動するプロモーター配列を含む。例で使用される発現カセットは、例えば、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子座制御領域（ＨＣＲ）を表す配列番号９４に列挙されるものなどのプロモーター配列、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター（ＨＲＣ－ｈＡＡＴ）を、例えば、配列番号６６（ｐｒｉ－ｍｉＡＮＧ５）に列挙されるものなどのｍｉＲＮＡコード配列との組合せで含む。本研究で使用される例示的な発現カセットを、配列番号９７（ｈＡＡＴ－ｐｒｉ－ｍｉＡＮＧ５）に列挙する。代表的なウイルスベクターゲノムの例を、ｈＡＡＴ－ｐｒｉ－ｍｉＡＮＧ５発現カセットを含む配列番号９８に列挙する。

ＡＡＶ５ベクター
発現カセットを保有する組換えＡＡＶ５（配列番号９９）は、ＳＦ＋昆虫細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、及び導入遺伝子をコードする２つのバキュロウイルスを感染させることによって産生させた。ＡＶＢセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、ＧＥ３０ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の標準的なタンパク質精製手順に従って、ＱＰＣＲを用いて精製ＡＡＶの力価を決定した。

Ｈｕｈ－７細胞のＡＡＶ５形質導入
ヒト肝細胞由来細胞癌Ｈｕｈ－７細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃及び５％ＣＯ_２で維持した。形質導入アッセイのために、細胞を、２４ウェルプレートに、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、ウェルあたり１Ｅ＋０５細胞の密度で、形質導入の１日前に播種した。細胞を、１細胞あたり１Ｅ＋０５、１Ｅ＋０６及び１Ｅ＋０７ゲノムコピー（ｇｃ）の多重感染度（ＭＯＩ）で、１００μＬのＡＡＶ５ベクターを用いて三連で形質導入した。形質導入の３日後、単層を２００μｌのＲＴＬ＋緩衝液（ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）中で採取した。同じ条件に属する３つのウェルを、ＤＮＡ抽出のためにプールした。

細胞からのベクターＤＮＡの単離及び定量
ＤＮＡ抽出は、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、製造業者の説明書に従って実施した。ＴａｑＭａｎ ＱＰＣＲアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（配列番号１００～１０２）を用いてベクターゲノムコピーを定量化し、ＡＣＴＢ ＳｙｂｒＧｒｅｅｎアッセイを、ローディング対照遺伝子（配列番号１０３及び配列番号１０４）として使用した。

動物研究

マウス研究
ＡＡＶ５ベクターのＩＶ注射後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ及びタンパク質の低減を研究するために、６～８週齢の雄野生型Ｃ５７／ＢＬ６ＪＲｊマウス（ｎ＝６）に、１Ｅ＋１３、５Ｅ＋１３及び２．５Ｅ＋１４ｇｃ／ｋｇのＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５並びに２．５Ｅ＋１４ｇｃ／ｋｇのＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１のベクターをマウス尾静脈に投与した。投与後２、４、６、８週間で、血液試料を採取して、血漿中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル、総コレステロール（ＴＣ）レベル、及びＴＧレベルを決定した。８週目に、動物を屠殺し、マウスから肝臓を採取して、ベクターゲノム定量のためのＤＮＡ、並びにマウスＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ発現及びｍｉＡＮＧ５定量のためのＲＮＡを抽出した。

ＡＮＧＰＴＬ３のＡＡＶ媒介遺伝子サイレンシングが血漿脂質代謝及びアテローム性動脈硬化の発症に及ぼす効果を検討するために、ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスを使用した（ＴＮＯ、オランダ）。約８～１０週齢の８２匹のＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰトランスジェニック雌マウスに、０．１５％のコレステロール及び１５％の飽和脂肪を含む西洋型食事（ＷＴＤ）を与えた。３週間の慣らし期間の後、１７匹の低応答マウスを研究から除き、残りの６５匹のマウスを４つの群に細分した。２０匹のマウスの１群を除き、全ての群はｎ＝１５であり、４時間の絶食後、年齢、体重、血漿総ＴＣ、及びＴＧを整合させた。０週目に、ＡＡＶ５ベクターのＩＶ尾静脈注射を、５Ｅ＋１３ｇｃ／ｋｇのＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１（群２）又はＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５（群３）又はＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３（群４）の用量でマウスに投与した。対照群（群１）には、製剤緩衝液（ビヒクル）のみを投与した。０、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、及び１６週目に、体重（個体）及び食物摂取（ケージあたり）を決定した。血漿総コレステロール及びトリグリセリドを、０、２、４、６、８、１０、１２、１４、及び１６週目に測定した。肝障害のマーカーとしての血漿ＡＬＴ及びＡＳＴを、群のプールされた血漿試料を使用して、０、１、４、８、１２、及び１６週目に測定した。０、４、８、１２及び１６週目に、群のプールされた血漿試料を用いてリポタンパク質プロファイルを測定した。１２週目に、群１の５匹のマウスを、絶食させずにＣＯ_２窒息を介して屠殺し、大動脈根部におけるアテローム性動脈硬化の発症を評価した。パイロット屠殺で選択されたマウスにおけるコレステロール曝露及びアテローム性動脈硬化の発症、対照群における残りのマウスのコレステロール曝露、並びに病変部とコレステロール曝露との関係を示す曲線に基づいて、研究を、ＡＡＶ注射後、合計１６週まで延長した。ＡＡＶ注射後、１６週目において、マウスを、絶食させずにＣＯ_２窒息を介して屠殺した。ＥＤＴＡ－血漿を、心臓穿刺を介して得た。心臓、大動脈、肝臓、脾臓組織を回収した。肝臓を使用して、ベクターゲノム定量のためのＤＮＡ、並びにマウスＡｎｇｐｌｔ３発現及びｍｉＡＮＧ５レベルのためのＲＮＡを抽出した。

ＡｐｏＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウス（ＴＮＯ、オランダ）において、ＡＮＧＰＴＬ３のＡＡＶ媒介遺伝子サイレンシングが単独で及びアトルバスタチン投与との組合せでアテローム性動脈硬化の発症に与える効果を検討するための研究を行った。約８～１２週齢の１００匹の雌ＡＰＯＥ＊３Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスに、０．１５％のコレステロール及び１５％の飽和脂肪を含む西洋型食事（ＷＴＤ）を与えた。３週間の慣らし期間の後、２０匹の低応答マウスを研究から除き、残りの８０匹のマウスを、２０匹のマウスの１つの対照群（群１）及び４つのＡＡＶ投与群に細分した。投与群を、４時間絶食後、年齢、体重、血漿コレステロール、及びトリグリセリドについて整合させる。動物に、ＩＶ尾静脈注射を介して１Ｅ＋１４ｇｃ／ｋｇのＡＡＶベクターを投与する。アトルバスタチンを、０，００３５％（ｗ／ｗ）の濃度（約３．５ｍｇ／ｋｇ体重／日）で、食事への混合物によって投与する。群は以下のとおりである：群１：製剤緩衝液（ビヒクル）ｎ＝２０、群２：ＡＡＶ－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ ｎ＝１５、群３：ＡＡＶ－ｍｉＡＮＧ５ ｎ＝１５、群４：ＡＡＶ－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ＋アトルバスタチン ｎ＝１５、及び群５：ＡＡＶ－ｍｉＡＮＧ５＋アトルバスタチン。体重（個体）及び食物摂取（ケージあたり）を、０、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、及び１６週目に決定する。血漿総コレステロール及びトリグリセリドを、０、２、４、６、８、１０、１２、１４、及び１６週目に測定する。肝障害のマーカーとしての血漿ＡＬＴ及びＡＳＴを、群のプールされた血漿試料を使用して、０、１、４、８、１２、及び１６週目に測定する。０週目、４週目、８週目、１２週目、及び１６週目において、リポタンパク質プロファイルを、群のプールされた血漿試料を使用して測定する。プールには、血漿コレステロール及び／又はトリグリセリドへの効果が確認されたマウスの試料を含め、注射の失敗により正確なＡＡＶ用量を投与されていないマウスの包含は排除する。１２週目に、群１の５匹のマウスを、絶食させずにＣＯ２窒息を介して屠殺し、大動脈根部におけるアテローム性動脈硬化の発症を評価する。約２８０ｍＭの数週のコレステロール曝露（血漿コレステロール濃度×持続時間）により、約１６０，０００μｍ２の予測病変面積（病変面積とコレステロール曝露との関係を示す曲線に基づくデータで、ＴＮＯにより実施された雌Ｅ３Ｌ．ＣＥＴＰトランスジェニックマウスにおける以前の研究を基礎に作成したデータ）が観察される。パイロット屠殺で選択されたマウスにおけるコレステロール曝露及びアテローム性動脈硬化の発症、対照群における残りのマウスのコレステロール曝露、並びに病変部とコレステロール曝露との関係を示す曲線に基づいて、対照群のアテローム動脈硬化の発症予想値の予測を行う。対照群のアテローム性動脈硬化の発症予想値が１００，０００μｍ２未満の場合、治験委託者と協議の上、治験計画を調整し、治験を２週間延長して、ＡＡＶ注射後合計１８週間としてもよい。これに当てはまらない場合、残りのマウスは１６週目に屠殺する。ＡＡＶ注射後１６週目又は１８週目に、絶食させずに、ＣＯ_２窒息を介してマウスを屠殺する。ＥＤＴＡ－血漿は心臓穿刺を介して取得する。心臓、大動脈、肝臓、腎臓、脾臓の組織を回収する。

カニクイザルにおける食事誘発性脂質異常症におけるＡＡＶ試験
生体内実験手順は、動物愛護法、実験動物の管理及び使用に関する指針、実験動物愛護局に準拠した。動物は、個々にステンレス鋼ケージに収容する（混合の期間を除く）。動物は、ＡＡＶ注射前の少なくとも８週間、少なくとも１日２回、Ｔｅｋｌａｄ ＴＤ１１００８４又はＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）５ＡＶＯ（ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）５０４０ｗ／高フルクトース、脂肪、及び０．２５％コレステロール）又はＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）９ＧＡ６（ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）５０４０ｗ／高フルクトース、脂肪、及び０．０５％コレステロール）（ＬａｂＤｉｅｔ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）のいずれかを受ける。測定されたトリグリセリドレベルが少なくとも８５ｍｇ／ｄＬの動物のみを研究に含める。さらに、動物を、それらのＡＡＶ５中和抗体価、標的領域の配列（肝生検）、血漿脂質プロファイル、及び食事の嗜好について事前にスクリーニングして、動物を投与群に割り当てる。

雄カニクイザルマカク（マカカ・ファスシクラリス；１群あたりｎ＝３）に、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｍｉＲＮＡをコードする１Ｅ＋１４ｇｃ／ｋｇの用量のＡＡＶ又は製剤緩衝液を単回静脈内投与した。ＡＡＶ注射前に及び研究期間を通じて血液を収集し、ＡＮＧＰＴＬ３及びｍｉＲＮＡのレベル、脂質プロファイル、ベクタークリアランス、臨床化学及び血液マーカーを検出する。ＡＡＶ注射後５７～８４日目に、２０ｍｇ／ｋｇの用量でシンバスタチンを動物に毎日投与し、シンバスタチンと組み合わせた遺伝子治療の効果を研究した。食事前、食事直後、及びＡＡＶ投与後２９日目、５７日目、８５日目及び１２０日目に、動物に、麻酔及び鎮痛下で外科的肝生検を行った。投与後１４１日目に、動物を屠殺し、検査する。副腎、脳、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、精巣、肺、皮下腹部白色脂肪を含むいくつかの臓器を収集する。

マウス及びサル肝臓におけるベクターＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｍｉＡＮＧ５の定量
ＤＮｅａｓｙ（登録商標）血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を、供給業者のプロトコルに従って使用して、肝臓由来のＤＮＡを抽出する。ベクターゲノムコピーを、「細胞からのベクターＤＮＡの単離及び定量」の項に記載のとおりに定量する。肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルは、「内因性Ｈｕｈ－７ ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡノックダウンの測定」の項で先に記載しているように決定する。ｍｉＡＮＧ５を定量化するために、２４ｎｔ（プライマー標的配列、配列番号１０５）又は２３ｎｔ（バリアントＴ）処理されたｍｉＡＮＧ５（プライマー標的配列、配列番号１２５）に特異的な逆転写プライマーを有するＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、肝臓由来のＲＮＡを逆転写する。２つのカスタムＴａｑＭａｎ ＱＰＣＲ低分子ＲＮＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を実施して、２４ｎｔ（アッセイＩＤ ＣＴＦＶＫＺＴ、ラックＩＤ、配列番号１０６）又は２３ｎｔ（バリアントＴ）の長さ（アッセイＩＤ ＣＴＧＺＦＪＰ、配列番号１２６）の最も豊富なｍｉＡＮＧ５種を測定する。合成ＲＮＡオリゴの連続希釈を標準として使用して、肝臓試料あたりのｍｉＡＮＧ５の２４ｎｔ（配列番号１０７）又は２３ｎｔ（バリアントＴ；配列番号１２７）分子／細胞の量を計算する（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

マウスＡＮＧＰＴＬ３ ＥＬＩＳＡ
血漿中のマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を、製造業者の説明書に従って、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットのＲＡＢ０７５６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で決定した。提供された希釈緩衝液中で血漿試料を希釈し、基準標準曲線に適合する光学密度（Ｏ．Ｄ．）値を得、各血漿試料を二重に測定した。基準曲線は、供給業者のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡキットに含まれる標準品の段階希釈液を調製することによって生成する。

マウス血漿中の脂質プロファイルの測定
マウス血漿中の総コレステロールレベルを測定するために、市販のＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｃｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ１２２１６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造業者の説明書に従って使用した。マウス血漿中のトリグリセリドレベルは、トリグリセリド定量キット（カタログ番号ＭＡＫ２６６，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造業者の説明書に従って使用して決定した。

ＡＬＴ及びＡＳＴ活性アッセイ
マウス血漿試料において、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性のアッセイを行って、肝細胞障害を検出した。２つの市販のキット、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性アッセイキット（カタログ番号ＭＡＫ０５５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ活性アッセイキット（カタログ番号ＭＡＫ０５２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造業者の説明書に従って使用した。

［結果］
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験結果

人工ｍｉＡＮＧ構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏサイレンシング有効性
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍｉＡＮＧ構築物のｍｉＡＮＧノックダウン有効性を評価するために、Ｈｕｈ－７細胞に、ＡＮＧ標的配列及び前記ｍｉＡＮＧ構築物をコードするウミシイタケルシフェラーゼレポーターをコトランスフェクトした。ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）遺伝子を同じレポーターベクターから発現させ、トランスフェクション効率を補正する内部対照として機能させた。最初のスクリーニングにおいて、Ｈｕｈ－７細胞に、それぞれ５０ｎｇ又は２５０ｎｇのｍｉＡＮＧ構築物、ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１、ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ２及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）、並びにそれぞれ５０ｎｇのＬｕｃＡＮＧ－Ａ又はＬｕｃＡＮＧ－Ｂをコトランスフェクトした。ＡＮＧＰＴＬ３エクソン１、３及び５を標的とするように設計されたｍｉＡＮＧ１－ｍｉＡＮＧ１４構築物から、ｍｉＡＮＧ１、ｍｉＡＮＧ２、ｍｉＡＮＧ３、ｍｉＡＮＧ６、ｍｉＡＮＧ８及びｍｉＡＮＧ１３は、２５～６５％の穏やかなルシフェラーゼノックダウンを誘導した。ｍｉＡＮＧ４、ｍｉＡＮＧ５、ｍｉＡＮＧ９、ｍｉＡＮＧ１０及びｍｉＡＮＧ１８（ＡＮＧＰＴＬ３エクソン６を標的とする）構築物は非常に有効であり、ＡＮＧＰＴＬ３ルシフェラーゼレポータープラスミドの７０％を超える阻害を誘導した（図３）。効力をさらに決定するために、いくつかのｍｉＡＮＧ構築物を力価実験のために選択した（４、５、９、１０、１３、及び１８）。構築物を、１０ｎｇのＡＮＧＰＴＬ３ルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、異なる濃度（１、１０、５０、又は２５０ｎｇ）のＨｕｈ－７細胞に、コトランスフェクトした（図４）。試験した最低ｍｉＲＮＡ濃度の１ｎｇ（ルシフェラーゼ：ｍｉＲＮＡの比率は１０：１）で、およそ２０％～４０％のノックダウンを誘発することができた。増加させたｍｉＲＮＡ濃度で測定したノックダウンは、１０ｎｇ ｍｉＲＮＡ（ルシフェラーゼ：ｍｉＲＮＡの比は１：１）でそれぞれ２０～７５％、５０ｎｇ ｍｉＲＮＡ（ルシフェラーゼ：ｍｉＲＮＡの比は１：５）で６０～９０％、２５０ｎｇ ｍｉＲＮＡ（ルシフェラーゼ：ｍｉＲＮＡの比は１：２５）で７０～９６％であった。最も強力な構築物は、ｍｉＡＮＧ５及びｍｉＡＮＧ４であった。ｍｉＡＮＧ５及びｍｉＡＮＧ４は、いずれも、ＡＮＧＰＴＬ３エクソン１の類似領域を標的とし、次いで、ｍｉＡＮＧ１８、ｍｉＡＮＧ１０、及びｍｉＡＮＧ１３を標的とした。ＡＮＧＰＴＬ３エクソン３及びエクソン５をそれぞれ標的とするｍｉＡＮＧ５並びにｍｉＡＮＧ１０及びｍｉＡＮＧ１３は、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、ＮＧＳ分析、バキュロウイルス生成及びＡＡＶ５産生の候補であった。ｍｉＡＮＧ１８は、そのＬＵＣノックダウンポテンシャルに基づいて強力な候補であったが、その特異性はヒト及びサル種に限定され、げっ歯類種に対してはないため、さらなる試験を行わなかった。

トランスフェクト細胞における内因性ＡＮＧＰＴＬ３発現の低下
細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ発現のノックダウンを試験するために、ｍｉＡＮＧ５、ｍｉＡＮＧ１０及びｍｉＡＮＧ１３の構築物を選択した。Ｈｕｈ－７細胞における内因性ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現のノックダウンは、トランスフェクト細胞のＲＴ－ＱＰＣＲによって確認した。２５０ｎｇのｍｉＲＮＡプラスミドのトランスフェクションは、ｍｉＡＮＧ５によりＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現の約６０％減少に至り、ｍｉＡＮＧ１０及びｍｉＡＮＧ１３により、それぞれ約５０％及び２０％のノックダウンに至った（図５のＡ）。４００ｎｇのｍｉＲＮＡプラスミドのトランスフェクションは、２５０ｎｇの構築物を使用したトランスフェクションと同様の結果を示した（図５のＢ）。

トランスフェクト細胞におけるｍｉＲＮＡの発現レベル（ＮＧＳデータ）
成熟ｍｉＲＮＡの発現レベルは、ｍｉＲＢａｓｅ及び目的のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列（配列番号６６、７１及び７４）を使用してアノテーションされた総リードの数に基づいて定量した。図６のＡ及びＢは、２５０ｎｇ又は４００ｎｇのｍｉＡＮＧ５をトランスフェクトしたＨｕｈ－７における上位５０位の最も発現されたｍｉＲＮＡの発現レベルを示した。ｍｉＡＮＧ５は、Ｈｕｈ－７において見出される２番目に豊富な成熟ｍｉＲＮＡであった。ｍｉＡＮＧ５の全てのプロセシング形態は、アノテーションされたリードの総数の３．７％（２５０ｎｇトランスフェクション）及び４．９％（４００ｎｇトランスフェクション）を占めた。ｍｉＡＮＧ５と同様に、ｍｉＡＮＧ１０は、トランスフェクトされたＨｕｈ－７において最も豊富なｍｉＲＮＡのうちの１つであり、２５０ｎｇのＤＮＡをトランスフェクトした場合に３番目に多く発現し、３．１％の発現レベルを示し（図７のＡ）、４００ｎｇのＤＮＡを使用した場合には２番目に多く発現し、４．７％の発現レベルに達した。（図７のＢ）。ｍｉＡＮＧ１３の存在量からの結果を図８のＡ及びＢに示す。ｍｉＡＮＧ１３の全てのプロセシング形態は、アノテーションされたリードの総数の０．７％（２５０ｎｇトランスフェクション）及び１％（４００ｎｇトランスフェクション）を占めた。両方の実験のセットにおいて、その結果から、トランスフェクトされたｍｉＲＮＡの発現レベルが内因性Ｈｕｈ－７ｍｉＲＮＡの発現レベルを超えておらず、より高いＤＮＡ濃度では、ｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇に対応することが示された。

細胞内でのトランスフェクション時のｍｉＡＮＧ構築物のプロセシング（ＮＧＳデータ）
ｍｉＲＮＡプロセシングもまた、配列番号６６、７１及び７４のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列へのリードのアラインメントによって調査した。アノテーションプロセスから得られた上位２０位の最も豊富な成熟形態を、図示のために検討し、１００％に設定した。参照配列とのミスマッチは許容されず、２％未満で表されるリードは示していない。Ｈｕｈ－７細胞におけるトランスフェクトされたｍｉＲＮＡプラスミド（２５０ｎｇ又は４００ｎｇ）の量とは独立して、最も存在量の多い形態の長さは、ｍｉＡＮＧ５に関して２４ｎｔであり（図９のＡ及びＢ）、ｍｉＡＮＧ１０に関しては２４ｎｔであり（図１０のＡ及びＢ）、ｍｉＡＮＧ１３に関しては２３ｎｔであった（図１１のＡ及びＢ）。参照配列との観察されたミスマッチは、アデニン又はチミン（ウラシル）が成熟ガイド配列に加えられた３’での配列改変にあった。全ての構築物について、これらのバリアントのいずれも、分析のために設定された２％を超える閾値に達しなかった。これは、様々な細胞株及び組織における３’末端編集イベントに関する以前に公表されたデータ（Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ｐ．ら、２００７）と合致する。しかしながら、モノウリジル化及びモノアデニル化の正確な役割は、さらに決定される必要がある。

細胞内でのＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ形質導入
得られたＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１０、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１が、パッケージ化された発現カセットを形質導入及び送達する能力を調べるために、Ｈｕｈ－７細胞を、１Ｅ＋０７（ｍｉＡＮＧ５及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲについてのみ試験）、１Ｅ＋０６及び１Ｅ＋０５ｇｃ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した（ｎ＝１）。ベクターＤＮＡは、ＱＰＣＲにより定量した。結果から、より高いＭＯＩで、検出されたベクターゲノムＤＮＡコピーの用量依存的増加が示された（表６）。

ｉｎ ｖｉｖｏ実験結果

ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰトランスジェニックマウスの肝臓におけるｍｉＡＮＧ５のプロセシング
ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を注射したマウスの肝臓試料（実験試料１１～１５、注射用量５ｅ１３ｇｃ／ｋｇ）において、成熟ｍｉＡＮＧ５形態の長さを調べた。ｍｉＲＮＡプロセシングを、配列番号６６のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列へのアラインメントによって分析した。アノテーションプロセスから得られた上位２０位の最も豊富な成熟形態を、図示の目的で検討し、１００％に設定した。参照配列との２つのミスマッチは許容された。２％未満で表されるリードは示していない。試料１２～１５において、参照配列との観察されたミスマッチは、アデニン又はチミン（ウラシル）が成熟ガイド配列に加えられた３’での配列改変において観察された（図２９Ｂ、２９Ｃ、２９Ｄ、及び２９Ｅ）。試料１１は、３’において、成熟ガイド配列にアデニン、チミン（ウラシル）、又はグアニンが加えられた、より大きな配列改変を示した（図２９Ａ）。成熟ｍｉＡＮＧ５の最も豊富な形態の長さは、試料１１（５’－ＴＡＧＣＡＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣ－３’）における２３ｎｔ、又は試料１２～１５における１つのヌクレオチドバリアントを有する２３ｎｔ（５’－ＴＡＧＣＡＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＴ－３’）である。

野生型マウスにおけるＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５ベクターのサイレンシング有効性
ｉｎ ｖｉｖｏでのｍｉＡＮＧ５の安全性及びサイレンシング有効性を調べるために、陰性対照として機能するｍｉＡＮＧ５及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１をコードするＡＡＶ５ベクターを生成した。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、１Ｅ＋１３ｇｃ／ｋｇの低用量、５Ｅ＋１３の中用量、及び２．５Ｅ＋１４ｇｃ／ｋｇの高用量（ｎ＝６）で、尾静脈にＩＶ注射した。ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１対照群は、２．５Ｅ＋１４ｇｃ／ｋｇの最高用量のみを投与した。

ベクターＤＮＡ測定は、誤注入された動物が存在しなかったこと、及びｇｃ数の増加が用量依存的であり、ｍｉＡＮＧ５低用量では平均４．７Ｅ＋４ｇｃ／μｇのＤＮＡ、ｍｉＡＮＧ５中用量では平均４．４Ｅ＋５ｇｃ／μｇのＤＮＡ、ｍｉＡＮＧ５及びｍｉＡＮＧ５－ＳＣＲの高用量ではそれぞれ３．１Ｅ＋６及び４．２Ｅ＋６ｇｃ／μｇのＤＮＡであったことを示した（図１２）。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５注射時のマウスＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ発現の減少には、明確な用量依存性パターンが存在する。高用量ではビヒクル注射群と比較して約７７％の最大減少に達し、中用量では６０％、低用量では２５％に達した（図１３）。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を注射した群は、ビヒクル群と比較して、Ａｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ発現の約４０％の増加を示したが、より高いＡＮＧＰＴＬ３血漿タンパク質レベルで反映されなかったため、アッセイのばらつきに起因することが示唆された。フォローアップ研究において、ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスに、より低用量（５Ｅ＋１３ｇｃ／ｋｇ対２．５Ｅ＋１４ｇｃ／ｋｇ）でｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を注射し、ビヒクル群と比較して、Ａｎｇｐｔｌ３発現レベルに差は観察されなかった。ベクターＤＮＡ及びｍＲＮＡの結果に従い、成熟ｍｉＡＮＧ５（２４ｎｔ又は２３ｎｔのバリアントＴ）の用量依存的な増加が、肝臓において検出され、ｍｉＡＮＧ５低用量で、平均約６±８分子／細胞、ｍｉＡＮＧ５中用量で約４７±３０分子／細胞、及びｍｉＡＮＧ５高用量で約２９９±１２５分子／細胞が計算された（ｍｉＡＮＧ５ ２４ｎｔ、図１４のＡ）。ｍｉＡＮＧ５低用量で平均約３±３分子／細胞、ｍｉＡＮＧ５中用量で約１２±７分子／細胞、及びｍｉＡＮＧ５高用量で約２２４±８６分子／細胞が計算された（ｍｉＡＮＧ５ ２３ｎｔバリアントＴ、図１４のＢ）。２３ｎｔバリアントＴは、マウス肝臓におけるｍｉＡＮＧ５の最も豊富な成熟形態であり、検出されるｍｉＡＮＧ５ ２４ｎｔ分子／細胞の数が多いのは、アッセイのバックグラウンドに起因する可能性が最も高い。ｍｉＡＮＧ５の発現は、マウスにおける循環ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の強力かつ用量依存的な低下を誘導した（図１５）。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の最大９０％ノックダウンが最高用量群において検出され、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの約５０％及び２５％のノックダウンが中用量群及び低用量群において検出された。ＡＬＴ及びＡＳＴを測定し、肝機能をモニタリングした。肝細胞細胞質内のＡＬＴの濃度は、ＡＳＴ及び他の全ての組織内のＡＬＴと同等であり、特にＡＬＴ活性がＡＳＴより著しく低い（Ｖｒｏｏｎ，ＤＨ．及びＩｓｒａｉｌｉ，Ｚ．、１９９０）。ＡＡＶ注射後２週目及び８週目のＡＳＴレベルは、ｍｉＲＮＡ発現マウス（ｍｉＡＮＧ又はｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１）において、ビヒクル注射マウスと比較して上昇しなかった。ＡＡＶ投与後４週目のＡＳＴでは、ビヒクル群と比較して、わずかに有意な増加が観察された（図１６）。同じ群の動物内でのＡＳＴ活性レベルが、ＡＳＴレベルと比較してより大きく広がっていることは、おそらくより高い生理学的変動に起因する。肝細胞損傷は、通常、ＡＳＴレベルの１０～２０倍の上昇をもたらす；したがって、観察された小さな上昇は、病理学的状態に関連したものではなかった（Ｖｒｏｏｎ，ＤＨ．及びＩｓｒａｉｌｉ，Ｚ．、１９９０）。マウスにおけるＡＡＶ注射後２週目及び８週目のＡＬＴの測定は、ビヒクル注射マウスと比較して有意な増加を示さなかった。注射されたｍｉＡＮＧ５高用量注射マウスでは、一過性の増加がわずか４週目に見出された（図１７）。ＡＡＶ投与後のマウスにおける肝細胞障害は、はるかに高いかつ持続的なＡＬＴレベルによって特徴づけられる（Ｂｏｒｅｌ，Ｆ．ら、２０１１）。このことは、病理学的ＡＬＴ上昇ではなく、アッセイ又はマウスの生理学的変動に関連している可能性が高いことを示唆する。注射後４週目において、ＴＣ及びＴＧレベルは、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を投与された最高用量群では、ビヒクル群と比較して有意に低く、ＴＣレベルのみでは、出血前測定と比較しても有意に低かった（図１８のＡ及びＢ）。

ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰトランスジェニックマウスにおけるＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１０ベクターのサイレンシングの有効性
ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスを使用して、ｍｉＡＮＧ５及びｍｉＡＮＧ１３の有効性を研究した。このマウスモデルは、ＨＤＬ／ＬＤＬ比の低下及び食事誘発性アテローム性動脈硬化に対する感受性の増加を含む脂質代謝に関してヒトの特性を有し、スタチン、フィブラート、ナイアシン、エゼチミブ及び抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体等の全ての登録された脂質低下薬に対してヒトと同様に応答する。高脂血症は、西洋型食事とコレステロール含有食事を使用することで誘発した。ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰ雌マウスに、５Ｅ＋１３のＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３又はＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を用いてＩＶ注射した（ｎ＝１５）。１６週目に、動物を屠殺し、続いて、肝臓におけるベクターゲノムコピー、Ａｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ発現、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質及びｍｉＡＮＧ５（２３ｎｔバリアントＴ成熟形態）レベルを決定した。体重、食物摂取、ＴＣ、ＴＧ、脂質プロファイル、血漿ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現及びＡＬＴ／ＡＳＴレベルを、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５－ＳＣＲ１については最大１６週間、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３については最大１２週間評価した。

等しいベクターｇｃ数が群内で検出され、それぞれＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５では平均１．３８Ｅ＋０５ｇｃ／μｇのＤＮＡ、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３では平均３．０１Ｅ＋０５ｇｃ／μｇのＤＮＡ、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５－ＳＣＲ１では平均１．４１Ｅ＋０５ｇｃ／μｇのＤＮＡであった（図１９）。部分的な投与を受け、全ての分析から除外された動物は少なく、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５群からのマウス３６及び４５、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３群からのマウス５１、５４及び６１、並びに＜３，０７Ｅ＋０３ｇｃ／μｇのＤＮＡを有するＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群のマウス２４であった。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を注射した群では、マウスＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ発現の約３０％の低下が認められたが、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１を注射したマウスでは、効果は認められなかった（図２０）。１６週目のＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ発現の軽度の減少は、１２週目及び１６週目のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現データと一致する。ｍｉＡＮＧ５の２４ｎｔの成熟形態を検出し、発現は平均１０５±６２分子／細胞であった（図２１のＡ）。また、２３ｎｔバリアントＴのｍｉＡＮＧ５の成熟形態も検出され、発現は平均１３±９分子／細胞であった（図２１のＢ）。２３ｎｔバリアントＴは、マウス肝臓におけるｍｉＡＮＧ５の最も豊富な成熟形態であり、検出されるｍｉＡＮＧ５ ２４ｎｔ分子／細胞の数が多いのは、アッセイのバックグラウンドに起因する可能性が最も高い。

結果は、研究の期間を通じて、ビヒクル群とＡＡＶ５注射群との間で、体重及び食物摂取に差がないことを示した（図２２のＡ及びＢ）。血漿総コレステロールは、ビヒクル群と比較した場合、４週目（約２５％）、６週目（約２９％）及び８週目（約２２％）のＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５投与により低下し、４週目（約２７％）、６週目（約２４％）、８週目（約２５％）、１０週目（約２４％）及び１４週目（約２０％）のＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１により低下した（図２３のＡ）。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５群の４週目の血漿ＴＧも、ＳＣＲ及びビヒクル群と比較して有意に低かった（最大約５８％）（図２３のＢ）。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３を受けた群は、一貫した効果を示さなかった。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３群の４週目（約２７％）、８週目（約２３％）、１０週目（約２６％）及び１２週目（約２７％）における血漿ＴＧレベルは、ビヒクル群と比較して有意に低下したが、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群と比較した場合は有意ではなかった。これは、８週目（約２０％）及び１６週目（約２９％）のＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５－ＳＣＲ１対照群におけるＴＧレベルが、ビヒクル群と比較して低下したことに起因する。リポタンパク質プロファイルデータは、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５群で観察された血漿総コレステロール及びＴＧの低下が（Ｖ）ＬＤＬ画分で生じたことを示した。（Ｖ）ＬＤＬ分画における減少は、４週目から１６週目まで観察された（図２４Ａ～２４Ｅ）。プールした血漿試料において、ＡＬＴ／ＡＳＴ肝毒性マーカーのレベルは正常範囲内であり、ＡＡＶの投与による肝臓関連障害は示唆されなかった（図２５のＡ及びＢ）。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、研究全体を通じて、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５注射ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスの血漿において有意に低かったが、一方で、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ１３注射マウスは、ＩＶ後８週目にわずか（約２０％）ではあるが有意な低下を示した（図２６）。ｍｉＡＮＧ５の最大サイレンシング効果は、８週目で、ビヒクル群及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１注射群と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現における約５４％の減少に達した。

ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰトランスジェニックマウスにおけるアテローム性動脈硬化の発症に対するＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５単独又はアトルバスタチンとの併用のサイレンシング有効性
本研究のねらいは、ＡＮＧＰＴＬ３の遺伝子サイレンシングを単独で又はアトルバスタチン投与との併用で誘導するＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５の、ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰにおけるアテローム性動脈硬化の発症に対する効果を検討することであった。高脂血症は、西洋型食事とコレステロール含有食事を使用することで誘発した。ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰ雌マウスに、ビヒクル溶液（ｎ＝２０）、１Ｅ＋１４ｇｃ／ｋｇのＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５（単独又はアトルバスタチンとの併用、１群あたりｎ＝１５）又はＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１（単独又はアトルバスタチンとの併用、１群あたりｎ＝１５）を静脈内注射した。１６週目に、動物を屠殺し、続いて、肝臓におけるベクターゲノムコピー、Ａｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ発現、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質及びｍｉＡＮＧ５（２３ｎｔバリアントＴ成熟形態）レベルを決定した。体重、食物摂取、ＴＣ、ＴＧ、脂質プロファイル、血漿ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現、及びＡＬＴ／ＡＳＴレベルを最大１６週まで評価した。１２週目（５匹のパイロットマウス）及び１６週目（１群あたり１５匹のマウス）に、大動脈根におけるアテローム性動脈硬化の測定（重症度及び病変部）を行った。

等しいベクターｇｃ数が群内で検出され、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１で平均４．２６Ｅ＋０５ｇｃ／μｇのＤＮＡ、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５中で５．５６Ｅ＋０５ｇｃ／μｇのＤＮＡ、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１＋アトルバスタチン中で４．２７Ｅ＋０５ｇｃ／μｇのＤＮＡ、及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５＋アトルバスタチン中で５．６５Ｅ＋０５ｇｃ／μｇのＤＮＡであった（図３０）。ベクターＤＮＡ測定は、（ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群に属する）マウス３１が、ＬＬＯＱ未満のｇｃ／μｇのＤＮＡを有する誤注入された動物である可能性が最も高いことを示した。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５にアトルバスタチンを注射した群では、マウスＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ発現の約３０％の低下が観察された（図３１）。同様に、ＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおける前回の研究で観察されたように、ビヒクルにおけるＡｎｇｐｌＴ３ ｍＲＮＡ発現及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ群は、非常に変動のあるレベルを示した。定量レベルのｍｉＡＮＧ５ ２３ｎｔバリアントＴは、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５注射群でのみ検出され、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を単独で、及びアトルバスタチンと組み合わせて投与した群で、それぞれ平均約８７及び約１０７分子／細胞であった（図３２）。

結果は、研究期間を通じて、ビヒクル群とＡＡＶ５注射群との間で、体重及び食物摂取に差がないことを示した（図３３のＡ及びＢ）。

ビヒクル群で測定された血漿総コレステロールレベルは、研究中、約１５～１８ｍｍｏｌ／Ｌ（群１）であり、ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群では約１５～１９ｍｍｏｌ／Ｌであった（群２）。したがって、ビヒクルとスクランブル対照群との間で、いずれの時点でも血漿総コレステロールレベルに差がなかった（図３４のＡ）。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみを投与した動物（群３）は、投与開始後の全ての週において、ビヒクル対照群及びスクランブル対照群の両方と比較して、血漿総コレステロールレベルが低下していた。ＡＡＶ５の注射後の血漿総コレステロールの試料ポイントあたりの平均減少率は、ビヒクル対照群と比較して－４３％であり、スクランブルｍｉＲＮＡ対照群と比較して－４８％であった。コレステロール曝露に基づくと、研究１６週目までの血漿コレステロールの平均低下は、ビヒクル対照群及びスクランブル対照群と比較して、それぞれ－４１％及び－４６％であった（図３４のＡ）。スクランブルｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１及びアトルバスタチンを投与した動物（群４）は、ビヒクル対照群と比較して、血漿総コレステロールレベルの低下を、研究の６週目（－２１％）及び１０週目（－２７％）に示した。スクランブル対照と比較して、血漿総コレステロールレベルは、研究の４週目から１６週目まで低下した。研究の８週目から１６週目までで、血漿総コレステロールの減少は、≧－２５％であった（図３４のＡ）。アトルバスタチンとの併用でＡＡＶ５－ｍＡＮＧ５を投与した動物（群５）は、投与開始後の全ての週において、ビヒクル対照群及びスクランブル対照群の両方と比較して、血漿総コレステロールレベルが低下していた。ＡＡＶ５の注射後の血漿総コレステロールの試料ポイントあたりの平均減少は、ビヒクル対照群と比較して－６１％、スクランブルｍｉＲＮＡ対照群と比較して－６４％、アトルバスタチン投与群と比較して－５３％、及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみを投与した群と比較して－３２％であった（図３４のＡ）。コレステロール曝露に基づくと、研究の１６週目までの血漿コレステロールの平均低下は、ビヒクル対照群及びスクランブル対照群と比較してそれぞれ－５８％及び－６１％であった。ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１の投与と比較して、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びアトルバスタチンの投与は、投与開始後の全ての週において血漿総コレステロールレベルを低下させた。コレステロール曝露に基づくと、１６週目までの血漿コレステロールの平均低下は－５０％であった。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみの投与と比較して、併用投与は、個々の時点のいずれにおいても、血漿総コレステロールレベルに統計的に有意な影響を与えなかったが、６週目、１４週目及び１６週目に有意差に向かう傾向が見出され、コレステロール曝露は統計的に有意な減少（－２９％）を示した（図３４のＢ）。

ビヒクル対照群（群１）は、研究中に約４～８ｍｍｏｌ／Ｌの血漿トリグリセリドレベル及び約５～８ｍｍｏｌ／ＬのｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群（群２）レベルを示した。したがって、いずれの時点においても、ビヒクル群及びスクランブル対照群との間で血漿トリグリセリドレベルに差がなかった（図３５のＡ）。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみを投与した動物（群３）は、ビヒクル対照群及びスクランブル対照群と比較して、それぞれ研究の２週目から１２週目及び１４週目まで、血漿トリグリセリドレベルが低下した。ＡＡＶ５注射後の血漿トリグリセリド中の試料ポイントあたりの平均減少は、ビヒクル対照群と比較して－６０％であり、スクランブルｍｉＲＮＡ対照群と比較して－６１％であった。トリグリセリド曝露に基づくと、１６週目までの血漿トリグリセリドの平均減少は、ビヒクル対照群及びスクランブル対照群と比較して、それぞれ－５４％及び－５８％であった（図３５のＡ）。スクランブルｍｉＲＮＡ及びアトルバスタチンを投与した動物（群４）は、両方の対照と比較して、血漿トリグリセリドレベルに差を示さなかった。アトルバスタチンと併用してＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を投与した動物（群５）は、ビヒクル群及びスクランブル対照群と比較して、それぞれ研究の２週目から１２週目及び１４週目まで血漿トリグリセリドレベルが低下した。ＡＡＶ５注射後の血漿総トリグリセリドの試料ポイントあたりの平均減少は、ビヒクル対照群と比較して－５７％、スクランブルｍｉＲＮＡ対照群と比較して－５９％、及びアトルバスタチン投与群と比較して－６０％であった（図３５のＡ）。トリグリセリド曝露に基づくと、１６週目までの血漿トリグリセリドの平均減少は、ビヒクル対照群及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１と比較してそれぞれ－５１％及び－５５％であった。スクランブルｍｉＲＮＡ及びアトルバスタチンの投与と比較して、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びアトルバスタチンの投与は、投与開始後の全ての週において、血漿トリグリセリドレベルを低下させた。コレステロール曝露に基づくと、１６週目までの血漿トリグリセリドの平均減少率は－５６％であった。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみの投与と比較して、併用投与は、いずれの試験時点でも血漿トリグリセリドレベルに影響を及ぼさなかった（図３５のＢ）。

リポタンパク質測定（コレステロール及びリン脂質）は、研究の０、４、８、及び１２週目の群ごとのプールされた血漿試料（図３６及び３７）及び研究の１６週目の個々の試料（図３８）で実施した。分画３～８をＶＬＤＬ、分画９～１６をＩＤＬ／ＬＤＬ、及び分画１７～２４をＨＤＬとする。この分析のための統計は行わなかった。リポタンパク質プロファイルは、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみ（群３）及びＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５とアトルバスタチンとの併用（群５）の注射がコレステロール低下効果を有し、ＶＬＤＬ－コレステロール及びＬＤＬ－コレステロールを低下させるが、ＨＤＬ－コレステロールには効果がないようにみえることを確認する。

ＡＮＧＰＴＬ３血漿タンパク質は、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみを注射したＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウスにおいて、ビヒクル群及びｍｉＲＮＡスクランブル群と比較して、１６週間の研究全体を通して有意に低下した（ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１と比較して、４週目で約７８％低下；図３９）。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びアトルバスタチンを投与した動物は、研究全体の間に有意なＡＮＧＰＴＬ３血漿タンパク質低下を示し（ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１と比較して、４週目で約８３％低下）、ｍｉＡＮＧ５のみを注射したマウスと比較して、血漿タンパク質低下に対する追加的効果は観察されなかった。ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群では、ビヒクル対照群と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３血漿タンパク質レベルに有意な差は観察されなかった。ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１及びアトルバスタチンを投与した群において、ＡＮＧＰＴＬ３血漿タンパク質レベルの有意な低下は、１２週目にのみ観察された（図３９）。

マウス肝臓において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルは、ビヒクル（約２１％低下）及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１対照群（約１７％低下）と比較して、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１及びアトルバスタチン群で有意に低下した。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルは、ビヒクル（約２７％低下）及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１対照群（約２４％低下）と比較して、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びアトルバスタチンを注射したマウスの肝臓においても有意に低下した。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみを投与した群では、有意なＡＮＧＰＴＬ３タンパク質低下は観察されなかった（図４０）。

４つの異なる時点（研究４、８、１２及び１６週目）における３０匹のＡＰＯＥ＊３－Ｌｅｉｄｅｎ．ＣＥＴＰマウス（６匹のマウス／群）において、ＡＬＴ及びＡＳＴパラメータを分析した（図４０のＡ及びＢ）。測定されたレベルは、これらの変化が一時点でのみ観察された場合、投与期間に関して明らかな傾向のない状況で、又は統計的有意性が達成されなかった場合に、生物学的に関連性はないと考えられた。加えて、選択された組織の顕微鏡検査は、いずれの群についても顕微鏡的な変化において何らの差異も明らかにしなかった。

ビヒクル対照群（群１）及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群（群２）において、それぞれ１８４及び２０６×１０３μｍ２の平均総病変面積が見られた。マウス２（群１に属する）では、６８５×１０３μｍ２の総病変面積が見られ、これに基づいて、マウス２のデータは、さらなる統計解析から除外した。ＡＡＶ５－ｍＡＮＧ５のみを投与した動物（群３）は、ビヒクル対照群（－５３％）及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群（－５８％）と比較して、総病変が減少していた。ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１及びアトルバスタチンを投与した動物（群４）は、ビヒクル対照群（－４６％）及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群（－５２％）と比較して総病変が減少したが、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみを投与した群（＋１５％）との比較では減少していなかった。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５をアトルバスタチンと組み合わせて投与した動物（群５）は、ビヒクル対照群（－８４％）及びｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群（－８６％）と比較して、総病変が減少した。ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１及びアトルバスタチン又はＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみを投与した動物と比較して、総病変面積のそれぞれ－７０％及び－６６％の減少が見られた（図４１）。

ビヒクル対照群（群１）と比較して、アトルバスタチンとの併用でＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を投与したマウス（群５）は、大動脈根において非疾患の、正常であるセグメントの割合が高い（図４２のＡ）。ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群（群２）と比較して、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を投与したマウス、アトルバスタチンを投与したマウス、又はそれらの組合せは、大動脈根部において非疾患の又は正常であるセグメントの割合が高い。加えて、アトルバスタチンとの併用によるＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５の投与（群５）も、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５又はアトルバスタチンのみの投与と比較した場合に、非疾患のセグメントが保たれていた（図４２のＡ）。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５の単独又はアトルバスタチンと組み合わせた投与は、両方の対照群と比較した場合、重度のＩＶ型及びＶ型病変の発生の低減と関連付けられた。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５及びアトルバスタチンの投与は、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５又はアトルバスタチンによる単独投与と比較して、重度のＩＶ型及びＶ型病変の発生のさらなる低減をもたらした（図４２のＡ）。

ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５のみを投与した動物（群３）は、ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１群と比較して病変数が減少した。ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５をアトルバスタチンと併用した投与（群５）は、両方の対照群と比較して、及び両方の単独投与群と比較して、病変数のさらなる減少をもたらした（図４２のＢ）。

オートファジーを誘導するための化合物の効果、ＡＡＶビヒクルの形質導入効率
１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを補足したＤＭＥＭ培地１ｍｌ中の１ウェルあたり１００万個のＨｕｈ７細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２で増殖させた培養液から調製した。細胞を６つのウェルプレートに播種し、さらに１ｍＬの新鮮な培地を補充した。ｏ／ｎインキュベーション後、細胞を１×ＤＰＢＳで洗浄し、その後、オートファジーを活性化又は阻害する必要がある細胞を、ＤＭＥＭと共に１００ｎＭ／ｍＬの濃度のラパマイシン（活性化剤）又はバフィロマイシン（阻害剤）との混合物で２時間の前処理を行った。細胞を、１ｍＬの培地、及び適用可能な場合は５０００ｇｃ／細胞の濃度のＡＡＶ５、及び１：６４の用量の２０％イントラリピッド（Ｓｉｇｍａ Ｉ１４１）中で、以下の条件で処理した。処理：ａ）未処理＋ＡＡＶ５、ｂ）活性化物質、ｃ）阻害剤、ｄ）イントラリピッド＋ＡＡＶ５、５）イントラリピッド＋阻害剤＋ＡＡＶ５、ｅ）イントラリピッド＋活性化物質＋ＡＡＶ５、ｆ）活性化物質＋ＡＡＶ５、ｇ）阻害剤＋ＡＡＶ５。全ての処理は、生物学的三連で行った。細胞を４時間インキュベートした後、回収し、その後、ＤＮＡ又はＲＮＡを、それぞれＺｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号Ｄ４０７４のｑｕｉｃｋ ＤＮＡキット及びＰｒｏｍｅｇａ ＲＮＡミニプレップシステムカタログ番号Ｚ６０１０を使用して単離した。合計で２５ｎｇのＤＮＡを、ヒト第ＩＸ因子についての特異的プライマー、ＬＣ３（オートファゴソームマーカー）及びハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨを用いてｑＰＣＲ反応（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｏＴａＱ）に使用した。反応を実行し、ＡＢＩ７５００システムで分析した。

ｑＰＣＲプライマー：
ＧＡＰＤＨ
Ｆ：ＡＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧ
Ｒ：ＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴ
ヒト第ＩＸ因子
Ｆ：ＣＡＡＧＴＡＴＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＴ
Ｒ：ＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡ
ＬＣ３
Ｆ：ＣＧＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴ
Ｒ：ＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＣＧＡＡＴＧＴＣＴＣ

脂質異常性ＮＨＰにおける血漿脂質レベルに対するＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５の効果
大型動物におけるＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５の有効性及び安全性を評価するために、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を脂質異常性カニクイザルマカクにＩＶ注射した。ＮＨＰは、試験試料の投与前に、１６７日間にわたって高カロリー食を受けた。総コレステロール及びトリグリセリドレベルは、高カロリー食のために、全ての動物において上昇した。しかしながら、各動物の食事に対する応答は非常に変動が大きかった。投与前に、シンバスタチンに対する応答を調べるために動物にシンバスタチンを投与し、その後、洗浄期間を設けた。３匹の動物にビヒクル（製剤緩衝液）を投与し、５匹の動物に１Ｅ＋１４ｇｃ／ｋｇの用量のＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５を静脈内投与した。研究の目的は、ＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５によるＡＮＧＰＴＬ３のサイレンシングの安全性、及びシンバスタチンとの同時投与における血漿脂質プロファイルへの影響を調べることであった。トリグリセリド、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、及び総コレステロールのレベルに関する結果は、高カロリー食事に応答して、動物におけるレベルの変動が大きいことを示した（図４３－１及び４３－２）。シンバスタチン投与は、単独で、またＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５との併用で、脂質マーカーに対する（追加的）効果を示さなかった。したがって、シンバスタチン投与を含む投与前及び投与後９０日間の脂質マーカーレベルを使用して、ＴＧ、ＴＣ、ＬＤＬ－Ｃ及びＨＤＬ－Ｃにおけるベースラインレベルの変化を計算した（図４４）。変動性にもかかわらず、トリグリセリド、総コレステロール、及びＬＤＬ－ＣについてのＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５投与ＮＨＰにおいて、投与９０日後に減少が示されるようであった（図４５）。しかしながら、この結論は変動が大きいため慎重に導き出した。脂質異常性ＮＨＰへのシンバスタチン及び／又はＡＡＶ５－ｍｉＡＮＧ５の投与は、一部の動物においてＡＬＴ／ＡＳＴの一過性の増加をもたらした。これは、スタチン及び／又はＡＡＶ媒介性遺伝子療法に対して予測される応答である（図４５）。標的分析（例えば、ｍｉＲＮＡ及びＡＮＧＰＴＬ３）において、組織病理学及び他の追加的脂質マーカーを測定する。

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［配列］
配列番号１ ＮＡ配列ヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子
AATGACAAACTGAAAAAATCTATTGTTTGTTATATATATAACAAAGAATTAGTATCCACAATATGTAAATAATTCCTAAAATTAGTCAGAAAGAGACAAACTTAAAAAGAGGGTAACAAGGAGGGGAGCAAATTATGTACATAACCAGATGATTCGCAAAGACGGCAACAGAGATGGCCAGCAAAACAAACTAGATATATACTTGTCTATTAGATTTATCAACATTTTTTGCCTTTTTCATTAAAAGCATTTGTAAAAGGATATAGGAAAAGAGGAACTCTCATATACTCCTGGCAGGGATGTAAATTGGTACAACCCTTTTGAAGGACAATCTGACAAAAGCAATCGTAAGTTACAAGTCAACATCTATGAATGTATATGAAAATATTTATATACATACATCACCACCATAAAAGCATTTTCTATACATACTGTTTATAATTAGAAAATTGGAAACAAATGATTAAAAGGGGGCTGATTAAATTAAGGTTCATCTATATAACAGGATTATGCAGCTATTAAAAAGGACGTGGTAACTCTATAGACATTCATAGGAAAATAAATTTTAAAATACTAAGATCCTGAATGATATATATATCATGAGCTATTATACATAACAAGATCCCACTTGTGTTATAAAAAATTATGTTTAGTCATTCAAAGGGTCTGGTATGATAGACCCAAAATGTTAATAGAGTCGAGATTTTTATTTTTTATAGGTTTTTGAAATACCTGAATTTTCACAATAAGTACTTTGCACATTAAAAATCTTAGCTGGGCATGGTGGCTCACGCTTGTAATCCCAGCACTCTGGGAGGCCAAGGTAGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGTCTGGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCAGGCTTGGTTGGGGGTGCCTGTAATTCCAGATACTCGGGAAGCTGAGACAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGGGGAAGTTGCAGTGAGCTGAGATCACGACGCTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAAGAGCAAAACTCCGTCTCAAAAATAAATAAAGAAAAAATCTTTACATGTCCAAAGATACGGCTGTTCAACTAAAAAATATATATGTATAAAACTTAACATGTTAATAGTGAACACACAAAACAGTAAGATAGATAAAATTATTCCTTCAAAGCTCACTTAACCTCTGGATCTACACTGTCCAAAAAGACGGTCTAATGAGACAATTGAGCACTTGATAGGTGAGTGGTTCTAACTGAGATATGTTCTCAGTATAAAACATACAATAGGATCTTCCTATACAACATTAATTAAAAAACAAACTATTGTAGTTAAAAAGGAAAAAATTAGAGATACTATGTAAAAAAGAGCCAAAATACCTTGTATTTTATTTGAAAGACATATCTCCATAAGATTACACAACCTCGTGTAGGATAAAGGACTTTGCTTTGCTTGGAATTTAAACAATTTAGGCTCTTAAATGTCCTAAAATTCTCTGTAGCTAAGAAATTTTTATATTGGTTCCTAGGAACTAGGAATCCTTAAATTAGGCCCTACATTTGCTTACAAGTTTATTTTCCTTGGCATAAAATTTTTTAGTTTTTACATTACTGGTTATATTTGATCAGGGTTCTATTTAAATAGGCACAAGTTCAAGCAAAGATCAGATTCTGCTTTTAGCAGTGTGTACTCAGACAGGAAGTATTAAAAGGCAGGCAGAAAATCCTTTATAAAATTACTACTTTCAATGCATTTTCCCACGTTGAAATGCTTCTGCAGTTTATAATTAGGCAAATTACTTTAATTATAATCAATAATGCTGTTCAAATTACTATAAGAATTATACAGATATTTATACCAAGAGACAATATACTAGAAACCAAGACTACGTGACCATTACCTCTACTCTGTCAGTGTTATTTGTGAGAAATTGCACAAATTTTGCAAAAAGTGTTAGTATCCTACTACAGTAGGATATAATATAGAAGGAAATAATTTCATAAAGCCTGTCTTTGGTACTAGTGCTCAGTTACTTTCATTAACTAAAAAAGGGGCTACTCTTCAAATTCCCTTCTCTAAAAAGAATGTACTATATCAAAAGGGGGTAAACACTACTACGTATACATTCTGCACTTAGAAATCCCTATATGTTGATTTTATCATTCTCTTATTCAATAAATATTGTTTCTACAATGTGTAAGGCATTACTGTACTAAAGCATTATAAGGAATATAAGTTAAAAACACATACAAATCTTGCCAATCAACAGCTTATAGTGTAATAGGGGAGAGAAGCTGGCCCATCTATATTCTCCCTCAACTAGCAAGTGGATGAAATATCAGGGTCAATAGTTATAAGCCACAAAAGCTGACAGCTTAATTAAGAGAAGTTTTGAAATATGTATTTCATGACCAATAATTACAACTGTAACTTTTCTATTTAAAGAAGGAGAAAATTTGAATTTCTTCTCTAGCTCAACATACACTTCTATAATTCCATTACATGAACCAGAGTAAAGGGTAAGATGGAAATGAAGAATATTTTCTTACCCTTTTGTGGTTCTATATTGGACACTTAAAAATCATACACAACCTAATCAAAAGATGTAATTCTTTAAAAAGGTACGAGACCAAAATTCAGAAAATCTAGACTATAACAAAATTTCTCAATTTACATTATCTTAATATGCAATTAATTTTCACCAGTAAAATACTATAGTATGGGTACAAATGCATTGATTAGTTCTAATTACAAAAATGGCTAATATATAATACTGTGTAGTGTTTATGATACATCAGATAATGTTCTAAGTGCTCTGAAAATATAAACTTTTAATCTTTTATACGACCCTATAAAATAGGTGTTATTCTCACTGGAGAGATGAGAAAACAGGGGTTCAGAGATGTGAAGTAATTTGACCAAAGGTCACAAAGCTGAAGAATATGAAATCCGGGATTCTGATTCAGGCAGTCTTATTCCAGAATCATGCTCTTAACCACTATGGAATACTGCCTCTACTGTAACTATTATACCCAAAACCCTTAATCCTAAGTCATCAAAAGGAAGAGCCTCTATTTTACACAATGAAGAGGCATTTCTAAGAATAGAAATTTAGGGACGAGCACAGTGGCTTACTCCTTTAATATCAGCACTTTGAGAGGCTGATATGGGAGGTTCACTTGAAGTCAGGAGTTCAAGGTCAGCTTGGGCAACATAGTGAAACACAGTCTCTACAAAATATTTAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCATGCATCTATAGTCTCAGCTACTTGGGAGACAGAGGGAGGAGGCTTGCTCGAGCCCAGGAGTTCGTGGCTATAGTGAGCTATGATCATGCCACTGCACTCCAGCCTGGACAACAGAGCAAGACCCTGTCTCTAAAAAAGAAAAGAAATTTGGAAATGGTTTATTTTGTATTAACAATTTATAATTTACACTGAAATTTATTATGATAAAACTTTTCCCTGTGTTAAAAAGCTATTAACTTTATGAAAAATTTCTTTTAGGTAAGGTTGATTATATATACCCACACACATACACAGGTTAAAAGTTAGTTTCATGTGACATAATAACTAGCATTTTGAGCACTACCTGTTTGCCCAGCACTGTTCTAAGTGCTCTACATGTATTATTGTTAAATTATCATAACACTATGAATTATGTACTATAATTACCCCAGCTTTACAGATGAGGAGACTAATCCATGGGGAGGTTAAGTAACTTGTCCAAGGCCAGACAGCTAGAGCCGGCTTTTGGACCCACACCACAGTCTGACTCCAGCACCCATATTCTTAACAATTTCACCATATTAATATGTCAAGATTAAGCAGTTTTAAAGGATGCTATTTTCTCACAAATTTCTTAATATGAACACTCAATAAGAATAATCACTAATATAAGCATTTAGTATTTTTTTAACACTAAGTTGGAAGCATAGTGGAACATTTATTTTTAGAAATATTATTAATTGGCTGGGCTCACGCTTGTAATCGGCTGGGCTCATGCCTGTAAATTTTGGGAGGCCAAGGTAAAAGAATTGCTTGAGCCCAGTATTTCCAGACCAGCATGGGCAATACATTAAGACATCATCTTTAAAAAAAAAATGTTATTAATCTCCTCTTTTTGTTAAATGTATATTATCAAAATTGTTACTAAGCTAACAAACTTCAGAAAAACTTATGATGGGCAAGCTGCTTGTGACATTGAAGGTATTTAAGATTCAATTCTAGTTTGGTCCTAGATGACCACATATCCATTGTTCCTTCAACGAGCACATGGTAAAGAGCCTAGAACACAGAGACACAGAACACAGTGGAGAAAAGGGAGTGAAATGTCTTTAATGACACTTACTATATATGGGATTTTGTGACAATATACAAGGATGGTTAAGACATATAAGGTGATGCAAAAAAACATATTAACAATTATAGTGACAAAAAATGAGGAGCATATAATTATACATTGATTTATACAGAGTACCAGAGGAACACAGCATTGAGAGCCGTAACACCACCTGAGGGAGTGGAGAAAGGCTTCAGAGAGAAAGTGTTTTTTGGAATGGATCACTGTTTCCAAAAGAACTAAAGTACAGTTTGAGAAATGCATACTTAATTCATTACTTTTTTCCCCTCAACTTTAATAATAAATTTACCCAACAAAAAAGTTTATTTTTGACTTGTAAATCTCTTAAAATCATAAAAAAGTAAAATTAGCTTTTAAAAACAGGTAGTCACCATAGCATTGAATGTGTAGTTTATAATACAGCAAAGTTAAATACAATTTCAAATTACCTATTAAGTTAGTTGCTCATTTCTTTGATTTCATTTAGCATTGATCTAACTCAATGTGGAAGAAGGTTACATTCGTGCAAGTTAACACGGCTTAATGATTAACTATGTTCACCTACCAACCTTACCTTTTCTGGGCAAATATTGGTATATATAGAGTTAAGAAGTCTAGGTCTGC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ACGTTTTACATATCAATTAATTGGAAGTTAAAAGGACCAGGAAACTCAGACATACAGTATACATTTTAAAATTTCAATTATTTAAATATAATATATAGAATGTATGGCTTATAATGAATTAGTTAACTCAATGCAAATTATTCTATTTTGATTACAAATAGTAAAATAAGCAAGATAAAATAACAGATGTTTAAAATCCAAAAAGCACATACAAAAATCCATGAATGATGTCTAAGTACTCACTTATAAAGTAGAAGACATTCATTATTATATCAAATTTTTAAATGCTCAGTACTATTTGACCATTTAAAAATTTTGTATTCAAACTACCAGTGAAAGCCCTACCTAGAAGGTATACTCAGTGATAAGTTTTGTAGCTCCAAATCTTCTAATAGTGAGTGTAACCCCAAAATAAAAGGCTGACAGGTAAGTCGAGAATACTCACTTAATTCTGGTAAGAAAGCAACCCATTTGTACTTGTATTTACCAGCAATCCTTAAAATGAAGCTTCCTACTAACTCAATAGCAATAAGACAATAGTGAATGTTTAATGAAAACAGTATTTTATAAATACTTTAATAAAAAGGATTGTGATGAAGAACAATCTATTTATATTTGTTATTTGTTTTTAATTCCAATAAAAATAATTTTTAAAATTACAGAAAAAAGTTATTAAGAACCATGCTTTTAAATTTAAAATGATTTTTTAAATTTATTCCTGTCTTTTTCTACAAAGAAAGCATACATTAAGCAAATACCAAAGGCCAGGTTTACATTTGAAGAAAGTGACATTATTATTACTCAAGTCTCTAGGAATACTTAACACATCTCTTGACTGTATATGGATGTTAATAAATAGCTGACAGTAAAGTTTATCCATATAAAGACTTGCAAATATTCCTCTACCAATGACGAGACTTTAAAATATCTATAATAATGTAACACATTTCACTGGTGAAACATGTCTTGTCATATGCATTATAGAAAGGATAATCAGACTTTCAGTTATATTAATATTTTTAACATTTTTGTGCACATAGCTATCTTCAATAAAATTGTTTTAAAAGGTATTATTTTAAGATACACTAAAATGATCAAGGGATTCAAGACTAAACAACTCAATTAGTTGCACCAATAAAAAACACTTAAAAAAACTGTCAGTGTCCAACCTGTACTTAATAACTCACAGATTTTTAAAACTTTTCTTTTCAGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTATGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGTATCTTTTTCTGATACCAATACTTTATTTTCATATCTTCAAAGTATCTTCCCACATTATTAGCTATTATCTGCAATGACAACTTTTAAAAATCCGAATCCCAAATAAGCGTTTTCTCTCTAGACGAAAACCTCTTAACTATAATGAAAGTGTTCATTCTAGTTCAATCAGGTATTTTACCTCTAATCTTCCTCAGATTTTCTATTTTTTGGTAGTGTATAGATTATTTATACAGATTATTTAAAATTGGGACTTATACAGATTATTTAAAACTGGGATACATGCATCTAAAACACTGTAATATTTATAAGAAAGGAAGATAAACTTACGGGGAAATACAGTAACAGTAACTACATACGAGTCTGTACCCATTAAATTGCATATCTATCTCCTTTAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCAAAATCTAAGCCAGAGAGGAGAAGAGGATTATCTTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTTGATCCATCCAACAGATTCAGAAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAAATTTAAAAGGCAATAATTTAAACATTAACCTCATTCCAAGTTAATGTGGTCTAATAATCTGGTATTAAATCCTTAAGAGAAAGCTTGAGAAATAGATTTTTTTTATCTTAAAGTCACTGTCTATTTAAGATTAAACATACAATCACATAACCTTAAAGAATACCGTTTACATTTCTCAATCAAAATTCTTATAATACTATTTGTTTTAAATTTTGTGATGTGGGAATCAATTTTAGATGGTCACAATCTAGATTATAATCAATAGGTGAACTTATTAAATAACTTTTCTAAATAAAAAATTTAGAGACTTTTATTTTAAAAGGCATCATATGAGCTAATATCACAACTTTCCCAGTTTAAAAAACTAGTACTCTTGTTAAAACTCTAAACTTGACTAAATACAGAGGACTGGTAATTGTACAGTTCTTAAATGTTGTAGTATTAATTTCAAAACTAAAAATCGTCAGCACAGAGTATGTGTAAAAATCTGTAATACAAATTTTTAAACTGATGCTTCATTTTGCTACAAAATAATTTGGAGTAAATGTTTGATATGATTTATTTATGAAACCTAATGAAGCAGAATTAAATACTGTATTAAAATAAGTTCGCTGTCTTTAAACAAATGGAGATGACTACTAAGTCACATTGACTTTAACATGAGGTATCACTATACCTTATTTGTTAAAATATATACTGTATACATTTTATATATTTTAACACTTAATACTATGAAAACAAATAATTGTAAAGGAATCTTGTCAGATTACAGTAAGAATGAACATATTTGTGGCATCGAGTTAAAGTTTATATTTCCCCTAAATATGCTGTGATTCTAATACATTCGTGTAGGTTTTCAAGTAGAAATAAACCTCGTAACAAGTTACTGAACGTTTAAACAGCCTGACAAGCATGTATATATGTTTAAAATTCAATAAACAAAGACCCAGTCCCTAAATTATAGAAATTTAAATTATTCTTGCATGTTTATCGACATCACAACAGATCCCTAAATCCCTAAATCCCTAAAGATTAGATACAAATTTTTTACCACAGTATCACTTGTCAGAATTTATTTTTAAATATGATTTTTTAAAACTGCCAGTAAGAAATTTTAAATTAAACCCATTTGTTAAAGGATATAGTGCCCAAGTTATATGGTGACCTACCTTTGTCAATACTTAGCATTATGTATTTCAAATTATCCAATATACATGTCATATATATTTTTATATGTCACATATATAAAAGATATGTATGATCTATGTGAATCCTAAGTAAATATTTTGTTCCAGAAAAGTACAAAATAATAAAGGTAAAAATAATCTATAATTTTCAGGACCACAGACTAAGCTGTCGAAATTAACGCTGATTTTTTTAGGGCCAGAATACCAAAATGGCTCCTCTCTTCCCCCAAAATTGGACAATTTCAAATGCAAAATAATTCATTATTTAATATATGAGTTGCTTCCTCTATTTGGTTTCCTTAAAAAAAAAAAAAACTCTCATAGGACATGTTTCATTTTGTTCCTTTCAGGAGTAGTAAATTAGACGTTTTCCCCATATAAAGCTTTTTTCTACCAGAAAGATACTTCTGGTAGAAGAAGAGAAAGGAGCTCTTTATGGTTCACACGACTGTCTCCTGTCCTAACTACTTTGCTTAAAGTGCTCAAATTCCATCACTACTCACAGTTGTCTAATCTAAGTCTAATCCCCTTTGATCTCTCAGACTACCTTCCCTTTTATCTCTCTACTACTTAATAATAAGAATATCTTTTTTTCAAACTTGACCTTCATTTTGCTTTCACAATACTATACTCTCCATGGATTATCCCTTATCTGAATCCATCTTTATAACCCTATTCCTTTCTCATATTTAGTACTGTGGGCCAATGGACAACCTTCAATCATCTTTTCTACACTGACCCTCAGACATTCTATCTGCTCTCACGGACTCCTTTATTTACCATGAATAAAGTTCCAAAATCTACATATTCATCCCAAGTCTCTTTCCAGTTCCCCTTCTTACATTGCCTATTTGCCATTTCTCCCTTCAATACCCTATACTTCACTCAAATTCAACATACCAAAAATAAAAGGCCAGGCACGGTGGCTCACACCTGTAATCCCAGGACTTTGGGAGGCTGAGGCAGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTCTGACCAGCCTGACCAATATGGTGAAACCCCGTCTCTACCTAAAATACAAAAATTAGCCAGGCGTGGTGGCATGTGCCTACAGTCCCAGCTACTCAAGAGGCTGAGACAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCACACCAATGCACTGGGTGACAGAACAAGACTGACTCAAAAAAAAATAAATAACAAATTCCCCAGCCCCTTACTGCTACTGCTATCCCTTTCTACCCACCTTTCCCTCCTTTATACTCTTTCACACCATCTTCCTCACTTCTTTATATCCATTAATATGACCAGCATGTTCCCAGTCACAGAAGCCTGGAACCCGGAAGACATCTCTGGCTTTTCACTCAACTTTGTAAACTACCTCTTTTGTATCATAAGCCACCAAGTTCAATACAATCTTCTCTTGAAACGTCTCTTAATCTTATAAGCTTTCTTCCCCAAAGACTGTCTTTAACTTCAGTGCTAGATTATATAAGT

配列番号２ ＮＡ配列ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ
AGAAGAAAACAGTTCCACGTTGCTTGAAATTGAAAATCAAGATAAAAATGTTCACAATTAAGCTCCTTCTTTTTATTGTTCCTCTAGTTATTTCCTCCAGAATTGATCAAGACAATTCATCATTTGATTCTCTATCTCCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACGAAGGGCCAAATTAATGACATATTTCAAAAACTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCTATCGCTGCAAACCAGTGAAATCAAAGAAGAAGAAAAGGAACTGAGAAGAACTACATATAAACTACAAGTCAAAAATGAAGAGGTAAAGAATATGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAAGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAAAAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAACTAACTTAATTCAAAATCAACCTGAAACTCCAGAACACCCAGAAGTAACTTCACTTAAAACTTTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATCAAAGACCTTCTCCAGACCGTGGAAGACCAATATAAACAATTAAACCAACAGCATAGTCAAATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAAGGACTAGTATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCTATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGTTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGAATGTACCACCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCATGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTATATCAGGTAGTCCATGGACATTAATTCAACATCGAATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTTGGGAGGCTTGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTATGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAACTGTCCAGAGGGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAGCAAAATCTAAGCCAGAGAGGAGAAGAGGATTATCTTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTTGATCCATCCAACAGATTCAGAAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAAATTTAAAAGGCAATAATTTAAACATTAACCTCATTCCAAGTTAATGTGGTCTAATAATCTGGTATTAAATCCTTAAGAGAAAGCTTGAGAAATAGATTTTTTTTATCTTAAAGTCACTGTCTATTTAAGATTAAACATACAATCACATAACCTTAAAGAATACCGTTTACATTTCTCAATCAAAATTCTTATAATACTATTTGTTTTAAATTTTGTGATGTGGGAATCAATTTTAGATGGTCACAATCTAGATTATAATCAATAGGTGAACTTATTAAATAACTTTTCTAAATAAAAAATTTAGAGACTTTTATTTTAAAAGGCATCATATGAGCTAATATCACAACTTTCCCAGTTTAAAAAACTAGTACTCTTGTTAAAACTCTAAACTTGACTAAATACAGAGGACTGGTAATTGTACAGTTCTTAAATGTTGTAGTATTAATTTCAAAACTAAAAATCGTCAGCACAGAGTATGTGTAAAAATCTGTAATACAAATTTTTAAACTGATGCTTCATTTTGCTACAAAATAATTTGGAGTAAATGTTTGATATGATTTATTTATGAAACCTAATGAAGCAGAATTAAATACTGTATTAAAATAAGTTCGCTGTCTTTAAACAAATGGAGATGACTACTAAGTCACATTGACTTTAACATGAGGTATCACTATACCTTATTTGTTAAAATATATACTGTATACATTTTATATATTTTAACACTTAATACTATGAAAACAAATAATTGTAAAGGAATCTTGTCAGATTACAGTAAGAATGAACATATTTGTGGCATCGAGTTAAAGTTTATATTTCCCCTAAATATGCTGTGATTCTAATACATTCGTGTAGGTTTTCAAGTAGAAATAAACCTCGTAACAAGTTACTGAACGTTTAAACAGCCTGACAAGCATGTATATATGTTTAAAATTCAATAAACAAAGACCCAGTCCCTAAATTATAGAAATTTAAATTATTCTTGCATGTTTATCGACATCACAACAGATCCCTAAATCCCTAAATCCCTAAAGATTAGATACAAATTTTTTACCACAGTATCACTTGTCAGAATTTATTTTTAAATATGATTTTTTAAAACTGCCAGTAAGAAATTTTAAATTAAACCCATTTGTTAAAGGATATAGTGCCCAAGTTATATGGTGACCTACCTTTGTCAATACTTAGCATTATGTATTTCAAATTATCCAATATACATGTCATATATATTTTTATATGTCACATATATAAAAGATATGTATGATCTATGTGAATCCTAAGTAAATATTTTGTTCCAGAAAAGTACAAAATAATAAAGGTAAAAATAATCTATAATTTTCAGGACCACAGACTAAGCTGTCGAAATTAACGCTGATTTTTTTAGGGCCAGAATACCAAAATGGCTCCTCTCTTCCCCCAAAATTGGACAATTTCAAATGCAAAATAATTCATTATTTAATATATGAGTTGCTTCCTCTATTTGGTTTCC

配列番号８５ ＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーター配列
GGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGTAAGT

配列番号８０ Ｑ１プロモーター配列
AAGCAAATAT TTGTGGTTAT GGATTAACTC GAACTGTTTG CCCACTCTATTTGCCCGGCGCCCTTTGGAC CTTTTGCAAT CCTGGAGCAA ACAGCAAACACGGACTTAGC CCCTGTTTGC TCCTCCGATAACTGGGGTGA CCTTGGTTAATATTCACCAG CAGCCTCGGG CATATAAAAC AGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCA ATCACCACCA AGCCTGGAAT AACTGCAGCC ACC

配列番号８１ Ｑ１－プライムプロモーター配列
AAGCAAATAT TTGTGGTTAT GGATTAACTC GAACTGTTTG CCCACTCTAT TTGCCCGGCGCCCTTTGGAC CTTTTGCAAT CCTGGAGCAA ACAGCAAACA CGACTCAGAT CCCAGCCAGT GGACTTAGCC CCTGTTTGCTCCTCCGATAA CTGGGGTGAC CTTGGTTAAT ATTCACCAGC AGCCTCCCCC GTTGCCCCTC TGGGGCATATAAAACAGGGG CAAGGCACAG ACTCATAGCA GAGCAATCAC CACCAAGCCT GGAATAACTG CAGCCACC

配列番号８２ Ｃ１４プロモーター配列
TTAATATTTAACATCCTAGCACAGCTTCACTTCCAGGTATGACCTTTGAACCTCTTCTAGAAGGGTAATTATTAACCTAGCTAGGTATGACCTTCGAACCTCTTCTAGAAGTGAAGCTGGGCATATAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATTACCACCAAGCCTGGAATAGCTGCAGCCACC

配列番号８３ Ｃ１６プロモーター配列
GGTTAATAATTACCCTTCTAGGATTGAGTCACTTCTAGAAGCTGGACTTTGGACTCATCCTAGAAGTCACTTCCTCTTTTTTACCTAGAAGAGGTTCAAAGGTCATACCTAGCATAGCTTCACTTCTAGAAGGGTAATTATTAACCGGGCATATAAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATCACCACCAGGCCTGGAATAACTGCAGCCACC

配列番号８４ プロモーター配列
AAGCAAATATTTGTGGTTATGGATTAACTCGAACTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCGGCGCCCTTTGGACCTTTTGCAATCCTGGAGCAAACAGCAAACACGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCATGAGCGGAAGTGGGTCTCAACCACTATAAATCCTCTCTGTGCCCGTCCGGAGCTGGTGAGGACAGCCACC

配列番号８５ プロモーター配列
TAAAGCAAATATTTGTGGTTATGGATTAACTCGAACTTCTAGAAGCTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCATCCTAGGTAGGCGCCCTTTGGACCTTTTGCAATCCTGGCTTCTAGAAGAGCAAACAGCAAACACATCCTAGGTAGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCAT

配列番号８６ プロモーター配列
AAGCAAATATTTGTGGTTATGGATTAACTCGAACTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCGGCGCCCTTTGGACCTTTTGCAATCCTGGAGCAAACAGCAAACACGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCGGGCATATAAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATCACCACCAAGCCTGGAATAACTGCAGCCACC

配列番号８７ プロモーター配列
AAGCAAATATTTGTGGTTATGGATTAACTCGAACTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCGGCGCCCTTTGGACCTTTTGCAATCCTGGAGCAAACAGCAAACACGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGGGCATATAAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATCACCACCAAGCCTGGAATAACTGCAGCCACC

配列番号８８ ＳＶ４０ポリＡ配列
TGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAA

配列番号８９ マカカ・ファスシクラリス、ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＭ＿００５５４３１８５．２、予測：マカカ・ファスシクラリス アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、ｍＲＮＡ
TACAATTTCAAATTACCTATTAAGTTAGTTGCTCATTTCTTTGATTTCATTTAGCATTGATGTAACTCAATGTGGAAGAAGGTTACATTCGTGCAAGTTAACATGGCTTAATGATTAACTATATTCACCTGCCAACCTTGCCTTTTCTGTGGCAAATATTGGTATATATAGAGTTAAGAAGTCTAGGTCTGCTTCCAGAAGAACACAGTTCCACGCTGCTTGAAATTGAAAATCAGGATAAAAATGTTCACAATTAAGCTCCTTCTTTTTATTGTTCCTCTAGTTATTTCCTCCAGAATTGACCAAGACAATTCATCATTTGATTCTGTATCTCCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTTCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCCATAAGACTAAGGGCCAAATTAATGACATATTTCAAAAACTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCTATCACTGCAAACCAGTGAAATCAAAGAAGAAGAAAAGGAACTGAGAAGAACTACATATAAACTACAAGTCAAAAATGAAGAGGTAAAGAATATGTCACTTGAACTCAACTCAAAACTTGAAAGCCTCCTAGAAGAAAAAATTCTACTTCAACAAAAAGTGAAATATTTAGAAGAGCAACTAACTAACTTAATTCAAAATCAACCTGCAACTCCAGAACATCCAGAAGTAACTTCACTTAAAAGTTTTGTAGAAAAACAAGATAATAGCATCAAAGACCTTCTCCAGACTGTGGAAGAACAATATAAGCAATTAAACCAACAGCATAGTCAAATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAATGACTAATATTCAAGAACCCACAGAAATTTCTCTATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGCTGAATGAAATAAGAAATGTAAAACATGATGGCATTCCTGCTGATTGTACCACCATTTACAATAGAGGTGAACATATAAGTGGCACGTATGCCATCAGACCCAGCAACTCTCAAGTTTTTCATGTCTACTGTGATGTTGTATCAGGTAGTCCATGGACATTAATTCAACATCGAATAGATGGATCACAAAACTTCAATGAAACGTGGGAGAACTACAAATATGGTTTCGGGAGGCTTGATGGAGAATTCTGGTTGGGCCTAGAGAAGATATACTCCATAGTGAAGCAATCTAATTACGTTTTACGAATTGAGTTGGAAGACTGGAAAGACAACAAACATTATATTGAATATTCTTTTTACTTGGGAAATCACGAAACCAACTATACGCTACATGTAGTTAAGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGGAAAACAAAGATTTGGTGTTTTCTACTTGGGATCACAAAGCAAAAGGACACTTCAGCTGTCCAGAGAGTTATTCAGGAGGCTGGTGGTGGCATGATGAGTGTGGAGAAAACAACCTAAATGGTAAATATAACAAACCAAGAACAAAATCTAAGCCAGAGCGGAGAAGAGGATTATCCTGGAAGTCTCAAAATGGAAGGTTATACTCTATAAAATCAACCAAAATGTTGATCCATCCAACAGATTCAGAAAGCTTTGAATGAACTGAGGCAAATTTAAAAGGCAATAAATTAAACATTAAACTCATTCCAAGTTAATGTGGTTTAATAATCTGGTATTAAATCCTTAAGAGAAGGCTTGAGAAATAGATTTTTTTATCTTAAAGTCACTGTCAATTTAAGATTAAACATACAATCACATAACCTTAAAGAATACCATTTACATTTCTCAATCAAAATTCTTACAACACTATTTGTTTTATATTTTGTGATGTGGGAATCAATTTTAGATGGTCGCAATCTAAATTATAATCAACAGGTGAACTTACTAAATAACTTTTCTAAATAAAAAACTTAGAGACTTTAATTTTAAAAGTCATCATATGAGCTAATATCACAATTTTCCCAGTTTAAAAAACTAGTTTTCTTGTTAAAACTCTAAACTTGACTAAATAAAGAGGACTGATAATTATACAGTTCTTAAATTTGTTGTAATATTAATTTCAAAACTAAAAATTGTCAGCACAGAGTATGTGTAAAAATCTGTAATATAAATTTTTAAACTGATGCCTCATTTTGCTACAAAATAATCTGGAGTAAATTTTTGATAGGATTTATTTATGAAACCTAATGAAGCAGGATTAAATACTGTATTAAAATAGGTTCGCTGTCTTTTAAACAAATGGAGATGATGATTACTAAGTCACATTGACTTTAATATGAGGTATCACTATACCTTAACATATTTGTTAAAACGTATACTGTATACATTTTGTGTATTTTAATACTTAATACTATGAAAACAAGTAATTGTAAACGTATCTTGTCAGATTACAATAGGAATGAACATATTGGTGACATCGAGTTAAAGTTTATATTTCCCCTAAATATGCTGCGATTCCAATATATTCATGTAGGTTTTCAAGCAGAAATAAACCTTGTAACAAGTTACTGACTAAACAGCCTGACAAGTATGTATATATGTTTAAAATTCAATAAATAAAGACCCAGTCTTCTAAATTATAAAAATTTAAATTAGTCTTGCACAAATTAAATTATTCATCACAAAAGATGTATTGTTATTTTTAAGTCATTTAAGCCCTAAATCCCTAAAGATTAGATATAAATTTTTTTTGCCAGAGTATAAATTGTCAGAATTTATTTTTAAATATATTTTTTAAAACTACCAGTAAGAAATTTTAAATTAAACCCATTTGTTAAAGGATATAGTGCCCAAGTTATACGGTGACCTACCTTTGTCAATATTTAGCATTATGTATTTCAAATTATCCAATATACATGTCATATATATTTTTATATGTTGCATATATAAAAGATATACACGATTTATGTGAATCCTATGTAAATATTTTGTTCCAGAAAAGTACAAAATAATAAAGGTAAAAATAATCCA

配列番号９０ ＮＡ配列マウスＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ
ACAGGAGGGAGAAGTTCCAAATTGCTTAAAATTGAATAATTGAGACAAAAAATGCACACAATTAAATTATTCCTTTTTGTTGTTCCTTTAGTAATTGCATCCAGAGTGGATCCAGACCTTTCATCATTTGATTCTGCACCTTCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCGAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTCATGGACTTAAAGATTTTGTCCATAAGACTAAGGGACAAATTAACGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGACCTATCACTTCGAACCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAACTACATCTACACTACAAGTTAAAAACGAGGAGGTGAAGAACATGTCAGTAGAACTGAACTCAAAGCTTGAGAGTCTGCTGGAAGAGAAGACAGCCCTTCAACACAAGGTCAGGGCTTTGGAGGAGCAGCTAACCAACTTAATTCTAAGCCCAGCTGGGGCTCAGGAGCACCCAGAAGTAACATCACTCAAAAGTTTTGTAGAACAGCAAGACAACAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAGTATAAACAATTAAGTCAACAGCACATGCAGATAAAAGAAATAGAAAAGCAGCTCAGAAAGACTGGTATTCAAGAACCCTCAGAAAATTCTCTTTCTTCTAAATCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCCCTCTTCAACTGAACGAAACAGAAAATACAGAACAAGATGACCTTCCTGCCGACTGCTCTGCCGTTTATAACAGAGGCGAACATACAAGTGGCGTGTACACTATTAAACCAAGAAACTCCCAAGGGTTTAATGTCTACTGTGATACCCAATCAGGCAGTCCATGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGCTCACAGGACTTCAACGAAACATGGGAAAACTACGAAAAGGGCTTTGGGAGGCTCGATGGAGAATTTTGGTTGGGCCTAGAGAAGATCTATGCTATAGTCCAACAGTCTAACTACATTTTACGACTCGAGCTACAAGACTGGAAAGACAGCAAGCACTACGTTGAATACTCCTTTCACCTGGGCAGTCACGAAACCAACTACACGCTACATGTGGCTGAGATTGCTGGCAATATCCCTGGGGCCCTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTCTACATGGAATCACAGAGCAAAGGGACAGCTCTACTGTCCAGAAAGTTACTCAGGTGGCTGGTGGTGGAATGACATATGTGGAGAAAACAACCTAAATGGAAAATACAACAAACCCAGAACCAAATCCAGACCAGAGAGAAGAAGAGGGATCTACTGGAGACCTCAGAGCAGAAAGCTCTATGCTATCAAATCATCCAAAATGATGCTCCAGCCCACCACCTAAGAAGCTTCAACTGAACTGAGACAAAATAAAAGATCAATAAATTAAATATTAAAGTCCTCCCGATCACTGTAGTAATCTGGTATTAAAATTTTAATGGAAAGCTTGAGAATTGAATTTCAATTAGGTTTAAACTCATTGTTAAGATCAGATATCACCGAATCAACGTAAACAAAATTTATCTTTTTCAATC

配列番号９１ ＮＡ配列ラットＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ
GACGTTCCAAATTGCTTGAAATTGAATAATTGAAACAAAAATGCACACAATTAAGCTGCTCCTTTTTGTTGTTCCTCTAGTAATTTCGTCCAGAGTTGATCCAGACCTTTCGCCATTTGATTCTGTACCGTCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTGGATGATGTCAAAATTTTAGCCAATGGCCTCCTGCAGCTGGGTCATGGTCTTAAAGATTTTGTCCATAAGACAAAGGGACAAATTAATGACATATTTCAGAAGCTCAACATATTTGATCAGTGTTTTTATGACCTATCACTTCAAACCAATGAAATCAAAGAAGAGGAAAAGGAGCTAAGAAGAACCACATCTAAACTACAAGTTAAAAACGAAGAGGTGAAGAATATGTCACTTGAACTGAACTCAAAGCTTGAAAGTCTACTGGAGGAGAAGATGGCGCTCCAACACAGAGTCAGGGCTTTGGAGGAACAGCTGACCAGCTTGGTTCAGAACCCGCCTGGGGCTCGGGAGCACCCAGAGGTAACGTCACTTAAAAGTTTTGTAGAACAGCAAGATAACAGCATAAGAGAACTCCTCCAGAGTGTGGAAGAACAATATAAACAACTAAGTCAACAGCACATTCAGATAAAAGAAATAGAAAATCAGCTCAGAAAGACTGGCATTCAAGAACCCACTGAAAATTCTCTTTATTCTAAACCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCCCTCTTCATCTGAAGGAAGCAAAAAATATAGAACAAGATGATCTGCCTGCTGACTGCTCTGCCATTTATAACAGAGGTGAACATACAAGTGGCGTGTATACTATTAGACCAAGCAGCTCTCAAGTGTTTAATGTCTACTGTGACACCCAATCAGGCACTCCACGGACATTAATTCAACACCGGAAAGATGGCTCTCAAAACTTCAACCAAACGTGGGAAAACTACGAAAAGGGTTTTGGGAGGCTTGATGGTAAAGTGATTTCCTTGCATCACTCACTTATCTGTTGATTTAATAGTATTAGTTGGGTGTGTTGACACAGGCCTGAGACCATAGCGCTTTTGGGCAAGGGGGGAGGAGGAGCAGCAGGTGAATTGAAAGTTCAAGACCAGTCTGGGCCACACATTGATACTCCTTCTCGACATTAAGAATTATAAATTAAGCAGCAATTATAAAATGGGCTGTGGAAATGTAACAATAAGCAAAAGCAGACCCCAGTCTTCATAAAACTGATTGGTAAATATTATCCATGATAGCAACTGCAATGATCTCATTGTACTTATCACTACTGCATGCCTGCAGTATGCTTGTTGAAACTTAATTCTATAGTTCATGGTTATCATAAGTCTTATTAAGGAACATAGTATACGCCATTGGCTCTAGTGAGGGGCCATGCTACAAATGAGCTGCAAAGATAGCAGTATAGAGCTCTTTCAGTGATATCCTAAGCACAACGTAACACAGGTGAAATGGGCTGGAGGCACAGTTGTGGTGGAACACGCGGCCAGCAGGACACTGGGACTGATCCCCAGCAGCACAAAGAAAGTGATAGGAACACAGAGCGAGAGTTAGAAGGGACAGGGTCACCGTCAGAGATACGGTGTCTAACTCCTGCAACCCTACCTGTAATTATTCCATATTATAAACATATACTATATAACTGTGGGTCTCTGCATGTTCTAGAATATGAATTCTATTTGATTGTAAAACAAAACTATAAAAATAAGTAAAAAAATAAAAAATAAACAGATACTTAAAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

配列番号９２ ＮＡ配列ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ１ガイド
GTAGTTCTATTAGCGCTTACTA

配列番号９３ ＮＡ配列ｍｉＡＮＧ－ＳＣＲ２ガイド
ATGGATCGAGTCTCGTTATATA

配列番号９４ ＨＣＲ－ｈＡＡＴプロモーター配列
GGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGTAAGT

配列番号９５ ＮＡ配列ＬｕｃＡＮＧ－Ａ
TTCTCTATCTCCAGAGCCAAAATCAAGATTTGCTATGTTAGACGATGTAAGACATATTTCAAAAACTCAACATATTTGATCAGTCTTTTTATGATCTATCTCTATCTTCCAAGCCAAGAGCACCAAGAACTACTCCCTTTCTTCAGTTGAATGTTATATCAGGTAGTCCATGGACATTAATTCAACATCGAATAGATGGA

配列番号９６ ＮＡ配列ＬｕｃＡＮＧ－Ｂ
TACGCTACATCTAGTTGCGATTACTGGCAATGTCCCCAATGCAATCCCGG

配列番号９７ ＮＡ ｈＡＡＴ－ｐｒｉ－ｍｉＡＮＧ５カセット
GGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGTAAGTCTCTGGAGCCTGACAAGGAGGACAGGAGAGATGCTGCAAGCCCAAGAAGCTCTCTGCTCAGCCTGTCACAACCTACTGACTGCCAGGGCACTTGGGAATGGCAAGGTAGCAAATCTTGATTTTGGCTCCAAAATCAAGATTTGCTCTCTTGCTATACCCAGAAAACGTGCCAGGAAGAGAACTCAGGACCCTGAAGCAGACTACTGGAAGGGAGACTCCAGCTCAAACAAGGCAGGGGTGGGGGCGTGGGATTGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAA

配列番号９８ ｈＡＡＴのウイルスベクターゲノム－ｐｒｉ－ｍｉＡＮＧ５
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACGTGAATTACGTCATAGGGTTAGGGAGGTCAGATCTGAGCTCCATGGCGCGCCGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGTAAGTCTCTGGAGCCTGACAAGGAGGACAGGAGAGATGCTGCAAGCCCAAGAAGCTCTCTGCTCAGCCTGTCACAACCTACTGACTGCCAGGGCACTTGGGAATGGCAAGGTAGCAAATCTTGATTTTGGCTCCAAAATCAAGATTTGCTCTCTTGCTATACCCAGAAAACGTGCCAGGAAGAGAACTCAGGACCCTGAAGCAGACTACTGGAAGGGAGACTCCAGCTCAAACAAGGCAGGGGTGGGGGCGTGGGATTGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCGGCCGCAGATCTGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA

配列番号９９ ＶＰ３ ＡＡＶ５構築物（ハイブリッドＶＰ１）３０
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL

配列番号１００ ベクターゲノム定量のためのプライマーフォワード
GGGAGGTGTGGGAGGTTT

配列番号１０１ ベクターゲノム定量のためのプライマーリバース
AATGATTAACCCGCCATGCT

配列番号１０２ ベクターゲノム定量のためのプローブ
[FAM] ACT TAT CTA CAG ATC TGC GGC CGC T [TAMRA]

配列番号１０３ ＡＣＴＢ定量のためのプライマーフォワード
AGGTGCACAGTAGGTCTGAACAGA

配列番号１０４ ＡＣＴＢ定量のためのプライマーリバース
TGCAAAGAACACGGCTAAGTGT

配列番号１０５ 逆転写ｍｉＡＮＧ５ ２４ｎｔプライマーの標的配列
TAGCAAATCTTGATTTTGGCTCCA

配列番号１０６ プローブ２４ｎｔ ｍｉＡＮＧ５の設計のための標的配列
[FAM] TAGCAAATCTTGATTTTGGCTCCA [NFQ]

配列番号１０７ ｍｉＡＮＧ５ ２４ｎｔの定量のための合成ＲＮＡオリゴ
rUrArGrCrArArArUrCrUrUrGrArUrUrUrUrGrGrCrUrCrCrA

配列番号１０８ プロモーター配列
TAAAGCAAATATTTGTGGTTATGGATTAACTCGAACTTCTAGAAGCTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCATCCTAGGTAGGCGCCCTTTGGACCTTTTGCAATCCTGGCTTCTAGAAGAGCAAACAGCAAACACATCCTAGGTAGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCATGCTAGCCTCGAGGATATCAGATCTGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATCGCCACC

配列番号１０９ プロモーター配列
TAAAGCAAATATTTGTGGTTATGGATTAACTCGAACTTCTAGAAGCTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCATCCTAGGTAGGCGCCCTTTGGACCTTTTGCAATCCTGGCTTCTAGAAGAGCAAACAGCAAACACATCCTAGGTAGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCATGCTAGCCTCGAGGATATCAGATCTTCATCTATTTCCTGCCCACATCTGGTATAAAAGGAGGCAGTGGCCCACAGAGGAGCACAGCTGTGCCACC

配列番号１１０ プロモーター配列
TTAATATTTAACATCCTAGCACAGCTTCACTTCCAGGTATGACCTTTGAACCTCTTCTAGAAGGGTAATTATTAACCTAGCTAGGTATGACCTTCGAACCTCTTCTAGAAGTGAAGCTGGGCATATAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATTACCACCAAGCCTGGAATAGCTGCAGCCACC

配列番号１１１ プロモーター配列
GGTTAATAATTACCCTTCTAGGATTGAGTCACTTCTAGAAGCTGGACTTTGGACTCATCCTAGAAGTCACTTCCTCTTTTTTACCTAGAAGAGGTTCAAAGGTCATACCTAGCATAGCTTCACTTCTAGAAGGGTAATTATTAACCGGGCATATAAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATCACCACCAGGCCTGGAATAACTGCAGCCACC

配列番号１１２ プロモーター配列
CATAGCTTCACTTCTAGAAGAGGTCAGGGTGACCTGGGCCTACCTAGCTAGGTTAATAATTACCCTTCTAGAAGTGACTCAATCCTAGAAGCCGGAAGTGGCATCCTAGAAGAGGTTCAAAGGTCATACCTAGGTAAAAAAGAGGAAGTGACTTCTAGGATAAGGAAGTACTTCTAGAAGTACTTCCTTATCCTAGCATAGCTTCACTTCTAGAAGAGGTTCAAAGGTCATACCTAGGTATGACCTTTGAACCTCTTCTANAAGTTAATATTTAACATCCTAGAAGGGTAATTATTAACCTAGCAAGGCTGACTACACGAGCACATATCAGCGCGTCGACGATATCAGACCTGGGCATATAAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATCACCACCAAGCCTGGAATAACTGCAGCCACCATGG

配列番号１１３ プロモーター配列
TTTCTCTGGCCTAACTGGCCGGTACCGTCGACTGTGCTCGGACCTGTAGATGCTAGTCTAGAAGAGGTTCAAAGGTCATACCTAGGATAAGGAAGTACTTCTAGGTAGGCCCAGGTCACCCTGACCTCTTCTAGGATAAGGAAGTACTTCTAGAAGAGGTCAGGGTGACCTGGGCCTACCTAGAAGTACTTCCTTATCCTAGGTATGACCTTTGAACCTCTTCTAGACTAGCATCTACAGGTCCGAGCACAGTCGACGGTACCGGCCAGTTAGGCCAGAGAAATGTTCTGNCACCTG

配列番号１１４ プロモーター配列
TAGTAGGGCAAAGGTCACTTCTAGAAGCCGGAAGTGGCATCCTAGAAGTGACTCAATCCTAGAAGAGGTCAGGGTGACCTGGGCCTACCTAGAAGTGACTCAATCCTAGGATGTTAAATATTAACTTCTAGTAGCAAGGCTGACTACACGAGCACATATCAACGCGTCGACGATATCAGATCTGGGCATATAAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATCACCACCAAGCCTGGAATAACTGCAGCCACCATGG

配列番号１１５ 配列番号９４の誘導体
AAGCAAATATTTGTGGTTATGGATTAACTCGAACTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCGGCGCCCTTTGGACCTTTTGCAATCCTGGAGCAAACAGCAAACACGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGGGCATATAAAACAGGGGCAAGGCACAGACTCATAGCAGAGCAATCACCACCAAGCCTGGAATAACTGCAGCCACC

配列番号１２４ 改変ｍｉＲ－４５１をコードする核酸配列
CTCTGGAGCCTGACAAGGAGGACAGGAGAGATGCTGCAAGCCCAAGAAGCTCTCTGCTCAGCCTGTCACAACCTACTGACTGCCAGGGCACTTGGGAATGGCAAGGTAGCAAATCTTGATTTTGGCTCCAAAATCAAGATTTGCTCTCTTGCTATACCCAGAAAACGTGCCAGGAAGAGAACTCAGGACCCTGAAGCAGACTACTGGAAGGGAGACTCCAGCTCAAACAAGGCAGGGGTGGGGGCGTGGGAT

配列番号１２５ 逆転写ｍｉＡＮＧ５ ２３ｎｔバリアントＴプライマーのための標的配列
TAGCAAATCTTGATTTTGGCTCT

配列番号１２６ プローブｍｉＡＮＧ５ ２３ｎｔバリアントＴ設計のための標的配列
TAGCAAATCTTGATTTTGGCTCT

配列番号１２７ ｍｉＡＮＧ５ ２３ｎｔバリアントＴ定量のための合成ＲＮＡオリゴ
rUrArGrCrArArArUrCrUrUrGrArUrUrUrUrGrGrCrUrCrU

前記核酸は、上述のように、前記ＲＮＡ分子へ転写することができる。前記ＲＮＡ分子は、上述のように、前記「オフターゲット」問題を阻害及び／又はさらに低減するために、本発明において有用である。好ましくは、上述のように、前記ＲＮＡヘアピンは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はロングヘアピンＲＮＡ（ｌｈＲＮＡ）である。より好ましくは、上述のように、ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ－４５１を含む。さらに好ましくは、前記ＲＮＡ分子は、改変ｍｉＲ－４５１をコードする核酸配列である配列番号１１６からコードされている。配列番号１１６などの核酸配列又は前記ｍｉＲ－４５１をコードする配列は、ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルなどの遺伝子治療ビヒクルで構成されるベクターに含められて標的臓器に送達されるのに好適である。さらに、前記核酸配列によってコードされている前記ＲＮＡ分子を使用することによる前記「オフターゲット」問題は低減する及び／又は阻害される。これにより、前記核酸は、上述のようなニーズを満たす。

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ分子」という用語は、ヘアピン、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を指す。前記ヘアピンは、好ましくは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はロングヘアピンＲＮＡ（ｌｈＲＮＡ）である。より好ましくは、前記ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ－４５１、又は配列番号１１６によってコードされているＲＮＡ分子である。

本明細書で記載される場合、「ＲＮＡ分子をコードする核酸配列」という用語は、ヘアピン、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのＲＮＡ分子をコードする核酸配列を指す。好ましくは、前記核酸配列は、ｍｉＲ４５１骨格に基づくマイクロＲＮＡをコードする。好ましくは、前記核酸配列は、配列番号１１６を含む。前記ＲＮＡ分子は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を低減させる及び／又はノックダウンするのに使用することができる。

任意選択で、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルは、前記ＤＮＡ発現カセットを含み、前記ＤＮＡ発現カセットは、ＲＮＡ分子をコードする配列番号１１６を含むか、又は前記ＤＮＡ発現カセットは、ｍｉＲ－４５１をコードし、前記ＲＮＡ分子は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写物を標的化、切断及び／又はノックダウンすることができ、前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２／５ハイブリッドキャプシドタンパク質配列によって、又はＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列によってコードされている。

マウス及びサル肝臓におけるベクターＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｍｉＡＮＧ５の定量
ＤＮｅａｓｙ（登録商標）血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を、供給業者のプロトコルに従って使用して、肝臓由来のＤＮＡを抽出する。ベクターゲノムコピーを、「細胞からのベクターＤＮＡの単離及び定量」の項に記載のとおりに定量する。肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルは、「内因性Ｈｕｈ－７ ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡノックダウンの測定」の項で先に記載しているように決定する。ｍｉＡＮＧ５を定量化するために、２４ｎｔ（プライマー標的配列、配列番号１０５）又は２３ｎｔ（バリアントＴ）処理されたｍｉＡＮＧ５（プライマー標的配列、配列番号１１７）に特異的な逆転写プライマーを有するＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、肝臓由来のＲＮＡを逆転写する。２つのカスタムＴａｑＭａｎ ＱＰＣＲ低分子ＲＮＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を実施して、２４ｎｔ（アッセイＩＤ ＣＴＦＶＫＺＴ、ラックＩＤ、配列番号１０６）又は２３ｎｔ（バリアントＴ）の長さ（アッセイＩＤ ＣＴＧＺＦＪＰ、配列番号１１８）の最も豊富なｍｉＡＮＧ５種を測定する。合成ＲＮＡオリゴの連続希釈を標準として使用して、肝臓試料あたりのｍｉＡＮＧ５の２４ｎｔ（配列番号１０７）又は２３ｎｔ（バリアントＴ；配列番号１１９）分子／細胞の量を計算する（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

配列番号１１６ 改変ｍｉＲ－４５１をコードする核酸配列
CTCTGGAGCCTGACAAGGAGGACAGGAGAGATGCTGCAAGCCCAAGAAGCTCTCTGCTCAGCCTGTCACAACCTACTGACTGCCAGGGCACTTGGGAATGGCAAGGTAGCAAATCTTGATTTTGGCTCCAAAATCAAGATTTGCTCTCTTGCTATACCCAGAAAACGTGCCAGGAAGAGAACTCAGGACCCTGAAGCAGACTACTGGAAGGGAGACTCCAGCTCAAACAAGGCAGGGGTGGGGGCGTGGGAT

配列番号１１７ 逆転写ｍｉＡＮＧ５ ２３ｎｔバリアントＴプライマーのための標的配列
TAGCAAATCTTGATTTTGGCTCT

配列番号１１８ プローブｍｉＡＮＧ５ ２３ｎｔバリアントＴ設計のための標的配列
TAGCAAATCTTGATTTTGGCTCT

配列番号１１９ ｍｉＡＮＧ５ ２３ｎｔバリアントＴ定量のための合成ＲＮＡオリゴ
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Claims (33)

1. ＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む核酸であって、前記ＲＮＡ分子が第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を含み、前記第１のＲＮＡ配列が、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子によってコードされているＲＮＡに含まれる標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的な配列を含み、前記標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的な前記配列が少なくとも１９個のヌクレオチドを有し、前記ＲＮＡ分子がヘアピン、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、核酸。
2. 前記ヘアピンが、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又はロングヘアピンＲＮＡ（ｌｈＲＮＡ）である、請求項１に記載の核酸。
3. 前記ＲＮＡ分子がｍｉＲ４５１を含む、請求項１又は２に記載の核酸。
4. 前記標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的な前記配列が、少なくとも１５個のヌクレオチドを有し、好ましくは少なくとも２２個のヌクレオチドを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸。
5. 前記標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的な前記配列が、最大３０個のヌクレオチドを有し、好ましくは最大２８個のヌクレオチドを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸。
6. 前記標的ＲＮＡ配列が、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれる少なくとも１つのエクソンの一部によってコードされているＲＮＡ配列を含み、好ましくは、前記エクソンが、エクソン１、エクソン３、エクソン５、又はエクソン６である、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸。
7. 前記標的ＲＮＡ配列が、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれる前記少なくとも１つのエクソンの一部によってコードされているＲＮＡ配列を含み、前記エクソンは、エクソン１、エクソン５、又はエクソン６である、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸。
8. 前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に含まれる前記少なくとも１つのエクソンの一部が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸。
9. 前記標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的な前記配列が、配列番号８～２５からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸。
10. 前記標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的な前記配列が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２０、及び配列番号２５、好ましくは配列番号１２からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸。
11. ＤＮＡ分子である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸。
12. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸を含むＤＮＡ発現カセットであって、プロモーター、ポリＡテールをさらに含み、２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接している、ＤＮＡ発現カセット。
13. 前記プロモーターが肝臓特異的プロモーターを含む、請求項１１又は１２に記載のＤＮＡ発現カセット。
14. 請求項１２又は１３に記載のＤＮＡ発現カセットが含まれる、ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル。
15. 前記ＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルのキャプシドが、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質配列を含む、請求項１４に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル。
16. 請求項１４又は１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルを含む、組成物。
17. 血漿中のコレステロールレベル、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベル及び／又はアテローム性動脈硬化病変を低減させる及び／又は阻害する少なくとも１つの分子をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記アテローム性動脈硬化病変が、重度のアテローム性動脈硬化病変を含む、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記少なくとも１つの分子が、スタチンのうちの少なくとも１つを含む、請求項１７又は１８に記載の組成物。
20. 前記少なくとも１つの分子が、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチンからなる群より選択される、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組成物。
21. 前記少なくとも１つの分子が、アトルバスタチン及び／又はシンバスタチンを含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 医薬としての使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
23. ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされている転写物を減少させる及び／又はノックダウンする医薬としての使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記医薬が、血漿中のコレステロールレベル、リン脂質レベル、アテローム性動脈硬化病変、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、総コレステロール（ＴＣ）レベル及び／又は低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルを低下させる及び／又は阻害する、請求項２２又は２３に記載の使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
25. 前記アテローム性動脈硬化病変が、初期、軽度、及び／又は重度のアテローム性動脈硬化病変を含む、請求項２４に記載の使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
26. 前記医薬が、血漿中のコレステロールレベル、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベル及び／又はアテローム性動脈硬化病変をさらに低減させる及び／又は阻害する少なくとも１つの分子をさらに含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
27. 前記アテローム性動脈硬化病変が、重度のアテローム性動脈硬化病変を含む、請求項２６に記載の使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
28. 前記少なくとも１つの分子が、スタチンのうち少なくとも１つを含む、請求項２６又は２７に記載の使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
29. 前記少なくとも１つの分子が、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチンからなる群から選択される、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
30. 前記少なくとも１つの分子が、アトルバスタチン及び／又はシンバスタチンを含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
31. 前記医薬が、脂質及び／又はリポタンパク質代謝障害の治療及び／又は予防のために使用される、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
32. 前記医薬が、脂質異常症の治療及び／又は予防のために使用される、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１４若しくは１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクル又は請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
33. 請求項１４又は１５に記載のＡＡＶ遺伝子治療ビヒクルと、スタチンを含む組成物とを含む、パーツのキット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）。

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