CN110859969B - 聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents
聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于眼底血管造影的聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂，所述造影剂是指树状大分子聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠PEI‑NHAc‑FS。本发明还公开了上述造影剂的制备方法及其在制备眼底血管造影剂中的应用。本发明成功构建聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠，在细胞及动物水平验证了PEI‑NHAc‑FS的安全性和有效性，为该纳米材料用于眼底血管造影提供了安全性的保障。相比于现有的造影剂，PEI‑NHAc‑FS具有细胞内吞率低，组织间的黏附更弱，视网膜显影清楚，眼底血管代谢更快等优点。本发明在完成视网膜眼底血管造影的同时，加快在眼内的代谢，降低传统造影剂的毒性、致敏性及滞留眼底的时间，减少副作用。
Description
技术领域
本发明涉及眼底血管造影技术领域，具体地说，是聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂 及其制备方法和应用。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是导致50岁以上老年人 中心视力下降，不可逆失明的最主要原因之一，目前全球约有2100万AMD患者。AMD根 据其有无新生血管分为干性和湿性两种类型。早期干性AMD表现为玻璃膜疣，对视力影 响不严重，发展到晚期，会出现地图样萎缩，盘状变性等，导致视力下降。而湿性AMD， 由于黄斑区脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的出现，导致黄斑区出血、 水肿，视力严重下降。目前，AMD的诊断方法包括：眼底照相、OCT、眼底血管造影技术，其中眼底血管造影技术在AMD疾病的诊断及观察治疗效果中发挥着重要的作用。典型的AMD临床上较容易诊断,但早期视网膜下新生血管及浆液性脱离很难发现，眼底血管造影技术能准确、清楚地显示视网膜下新生血管的位置、大小、形态。
眼底荧光血管造影技术是诊断眼底病和评价疗效的重要方法，临床上常用的眼底荧光 血管造影剂主要包括荧光素钠(Fluorescein sodium)与吲哚菁绿。荧光素眼底血管造影术 (fundus fluorescein angiography，FFA)是将荧光素钠从肘静脉注入，通过肘静脉进入循环 系统，由激光激发造影剂使眼底血管显影，视网膜血管受损部位显示异常荧光，可用于诊 断CNV等相关眼底疾病。虽然荧光素钠造影剂目前已经广泛应用于临床，但是仍有一定的 限制，例如：(1)仍有部分患者产生不良反应，如恶心、呕吐、皮疹、甚至导致过敏性休 克及死亡。这使得患者无法尽早得到诊断，延误了治疗时机。(2)荧光素钠分子可从脉络 膜毛细血管渗漏到血管外，因此荧光素钠血管造影法主要用于视网膜血管造影，例如糖尿 病视网膜病变、视网膜静脉或动脉堵塞、渗漏等，而用于脉络膜血管造影则效果不佳。因 此，合成一种低不良反应的安全有效的造影剂具有非常重要的意义。
树状大分子是一种高度支化的、合成性的、高度单分散的大分子。它具有非常精确的 核、内部空间和表面功能基团。它的分子量随着代数的增加而精确地增加，在代数增加至 第四代时，整个分子呈球形结构。树状大分子具有很好的水溶性和生物相容性，能够通过 肾脏从血液中清除，因而不需要其具备生物降解性。同时树状大分子具有去污作用，能够 减少荧光素钠渗透入组织和细胞内，从而减少荧光素钠的不良反应。聚乙烯亚胺是一种典 型的水溶性聚胺，结构上分为直链型聚乙烯亚胺(L-PEI)和支化聚乙烯亚胺(B-PEI)，分子链 上都拥有大量的胺基N原子，PEI大分子链上丰富的N原子使其具有很强的亲质子性。支 链状的PEI是一种超支化的聚合物，超支化PEI的支链中二级胺的每个分支平均出现3-35 个氮原子。这种分支分配可能会形成球形分子，因此内部可以形成一定体积的疏水空腔， 有助于对金属氧化物、金属纳米颗粒、疏水药物分子及其他小分子的有效包裹。同时超支 化PEI中氮原子的孤对电子能够有效配位金属离子，稳定金属离子，所以超支化PEI在基因转染、药物输送、分子影像等生物医学领域有着广泛的应用。
中国专利文献CN104258422A公开了一种基于超支化聚乙烯亚胺分子的CT/MR双模态成像造影剂的制备方法，包括：(1)在超支化聚乙烯亚胺溶液中先加入EDC/NHS活化后 的mPEG-COOH溶液，再加入DOTA-NHS溶液，搅拌反应，得到功能化聚乙烯亚胺 PEI-mPEG-DOTA；(2)在PEI-mPEG-DOTA水溶液中加入HAuCl4溶液，并用NaBH4溶液 还原，然后加入Gd(NO3)3溶液继续搅拌，最后加入三乙胺和乙酸酐反应20-30h；(3)将步骤 (2)所得的溶液进行透析，冷冻干燥处理，即得CT/MR双模态成像造影剂。该发明采用价 廉易得的聚乙烯亚胺分子为载体，降低了材料的成本，所制备得到的CT/MR双模态成像造 影剂具有良好的生物相容性，在体外和体内都有良好的CT和MR成像效果。中国专利文献 CN103877597B公开了一种聚乙二醇化聚乙烯亚胺高分子磁共振成像造影剂及其制备方法： 首先修饰钆离子螯合剂DTPA于PEI表面，制备PEI-DPTA；其次聚乙二醇化修饰复合材料， 制备PEI-DTPA-mPEG；最后螯合钆离子制备PEI-DTPA(Gd III)-mPEG，并将PEI表面剩余 氨基乙酰化，该发明获得的聚乙二醇化聚乙烯亚胺高分子磁共振成像造影剂实现了小鼠的 体内MR血管。现有技术中，关于本发明的聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂，目前还未 见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种用于眼底血管造影的聚乙 烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂。
本发明的第二个目的是，提供一种用于眼底血管造影的聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造 影剂的制备方法。
本发明的第三个目的是，提供如上所述聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于眼底血管造影的聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂，所述造影剂是指树状大 分子聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠PEI-NHAc-FS，其制备方法如下：将荧光素钠与EDC.HCl反应20-50分钟，然后加入NHS搅拌1-5小时，在反应液中加入PEI，反应后得到PEI-NH2-FS， 对PEI-NH2-FS进行乙酰化处理，透析、干燥后得到PEI-NHAc-FS。
作为本发明的一个优选技术方案，所述荧光素钠与EDC.HCl摩尔比为1:5～15。
作为本发明的一个优选技术方案，所述荧光素钠与NHS摩尔比为1:5～15。
作为本发明的一个优选技术方案，所述PEI的分子量为25,000，荧光素钠与PEI的质 量比为1:10～30。
作为本发明的一个优选技术方案，所述制备方法如下：200mg荧光素钠与10摩尔当量 的EDC.HCl搅拌30分钟，然后和10摩尔当量的NHS再搅拌3小时，形成橙色溶液；在 上述橙色溶液中加入380mg PEI后搅拌3天，得到PEI-NH2-FS；加入1mL乙酸酐继续搅拌 24小时，透析、干燥后得到PEI-NHAc-FS。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于眼底血管造影的聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂的制备方法，包括如下步 骤：200mg荧光素钠与10摩尔当量的EDC.HCl搅拌30分钟，然后和10摩尔当量的NHS 再搅拌3小时，形成橙色溶液；在上述橙色溶液中加入380mg PEI后搅拌3天，得到 PEI-NH2-FS；加入1mL乙酸酐继续搅拌24小时，透析、干燥后得到PEI-NHAc-FS。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂在制备眼底血管造影剂中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明将纳米材料引入视网膜血管造影，利用纳米材料自身的结构和性能优势，构 建聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠，减少荧光素钠内吞入细胞和渗透入组织的量，在保持造影 效果的同时，降低传统造影剂的毒性、致敏性及滞留眼底的时间。
2、细胞及动物实验表明，本发明的PEI-NHAc-FS对细胞无毒性，不会改变细胞组织形态，并且在细胞水平不影响血管形成，对大鼠的各脏器、视网膜结构均无明显破坏。证 明本发明的PEI-NHAc-FS是一种安全、无毒的造影剂。
3、细胞及动物实验表明，本发明的PEI-NHAc-FS相比较FS，细胞内吞率低，能够有效减少进入细胞内荧光物质的量，在保持造影效果的同时，降低传统造影剂的毒性、致敏性及滞留眼底的时间；减少组织吸附，减少副作用。
4、本发明将PEI-NH2-FS乙酰化制备得到PEI-NHAc-FS，减少了纳米材料表面氨基的 毒性作用。
附图说明
图1：(左)1H NMR分析(右)TGA分析(A:FS；B:PEI；C:PEI-NH2-FS；D:PEI-NHAc-FS)。
图2：UV-Vis分析(A:FS；B:PEI；C:PEI-NH2-FS；D:PEI-NHAc-FS)。
图3：(a-d)是0-10μmol/L FS和PEI-NHAc-FS处理ARPE19及HUVEC细胞12h和 24h后，对细胞活性的影响；(e)是0-10μmol/L FS和PEI-NHAc-FS作用ARPE-19及HUVEC 细胞24h后细胞形态变化；(f)是0、5、10μmol/L PEI-NHAc-FS对ARPE-19细胞和HUVEC 凋亡的影响；(g)是统计学分析。
图4：0、5、10μmol/L PEI-NHAc-FS对HUVEC细胞管腔形成能力的影响。
图5：(a)尾静脉注射1％PEI-NHAc-FS后第28天，各脏器(心、肝、脾、肾、脑、 肌肉)结构变化；(b)ERG观察视网膜功能变化。
图6：流式细胞仪(488nm氩离子激光)检测0-10μmol/L FS和PEI-NHAc-FS处理ARPE19细胞12h(a)和24h(c)后，细胞内荧光强度的变化，FITC-A值进行统计学分析(b、 d)；流式细胞仪(488nm氩离子激光)检测0-10μmol/L FS和PEI-NHAc-FS处理HUVEC细 胞12h(e)和24h(g)后，细胞内荧光强度的变化，FITC-A值进行统计学分析(f、h)；荧光显 微镜记录0-10μmol/L FS和PEI-NHAc-FS分别处理ARPE-19细胞(i)和HUVEC细胞(j)12h 和24h后细胞内荧光。
图7：眼底血管造影结果。
图8：1％FS和PEI-NHAc-FS尾静脉注射观察BN大鼠CNV病灶。
图9：1％FS和PEI-NHAc-FS尾静脉注射10min、20min、30min和60min眼底荧光切 片结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围；此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。下表为本发明所用到的实验材料的来源。
实施例1 PEI-NHAc-FS的制备及表征
1 PEI-NHAc-FS的制备
荧光素钠(200mg,1ml)与10摩尔当量的EDC·HCl搅拌30分钟，然后和10摩尔当量的NHS再搅拌3小时，形成橙色溶液。然后，在上述溶液中加入分子量25,000的PEI(380mg，5mL)后剧烈搅拌3天，从而得到PEI-NH2-FS。之后，将PEI-NH2-FS乙酰化。简而言之， 将超过PEI上剩余氨基五倍摩尔当量的乙酸酐(1mL)加入上述混合物中继续搅拌24小时， 之后将混合液彻底透析3天，并冷冻干燥后得到PEI-NHAc-FS。
2 PEI-NHAc-FS的表征
为观察合成的纳米材料的特性，分别对FS、PEI、PEI-NH2-FS及PEI-NHAc-FS四种材料进行表征分析，主要包括：核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic ResonanceSpectroscopy,1H NMR)，ZETA电位(Zeta potential，ZP)，动态光散射(Dynamic LightScattering，DLS)，热 重分析(Thermogravimetic Analysis，TGA)和紫外-可见光吸收光谱(Ultraviolet-visible， UV-Vis)。分别对纳米材料PEI-NHAc-FS是否制备成功、电势、粒径、热重及紫外吸收光进 行表征。
3 PEI-NHAc-FS的表征结果
(1)电势及水动力学直径
表1 FS、PEI、PEI-NH2-FS及PEI-NHAc-FS的电势及水动力直径
(2)1H NMR、TGA及UV-Vis分析
结果如图1、2所示。
实施例2 PEI-NHAc-FS在细胞水平的安全性及有效性
1实验方法
1.1CCK8实验
取对数生长期的ARPE-19和HUVEC细胞，以104个/孔铺入96孔板，放入培养箱培养24h，待细胞贴壁。分别加入1-10μmol/L FS和PEI-NHAc-FS，孵育24h。换液，每孔加入 含10μL CCK-8的培养基110μL，37℃培养箱避光孵育2h。上机检测，选择450nm波长， 在多功能酶标仪上检测各孔OD值。
1.2流式细胞术检测凋亡
取对数生长期的ARPE-19和HUVEC细胞，以5×104个/孔铺入12孔板，放入培养箱培养24h，待细胞贴壁。分别加入1、5、10μmol/L FS和PEI-NHAc-FS，孵育24h。吸除 培养液，1×PBS洗2次，加入1×胰酶消化2min，加入培养基终止消化，收集各组细胞， 1000rmp离心5min，弃上清，PBS洗2次，再次离心，弃上清，每管加入50μL 1×Binding Buffer和2.5μLAPC Annexin V，室温避光15min，之后加入250μL 1×Binding Buffer和5μL PI，室温避光5min，上流式细胞仪检测。
1.3管腔形成实验
将35μL Matrigel基质胶均匀铺于96孔板，37℃培养箱孵育1h，使基质胶凝固，然后 将5、10μmol/L PEI-NHAc-FS预处理24h的HUVEC细胞重悬，以5×103个/孔铺入96孔 板，放入培养箱中孵育6h，显微镜下观察并采集图像。
1.4流式细胞仪检测细胞内荧光强度
将ARPE-19细胞和HUVECs分别在12孔板中以每孔105个密度培养。用含有不同浓度的FS和PEI-NHAc-FS(1、2.5、5、7.5、10μm)的新鲜培养基代替培养基，再孵育24h。 之后收集细胞于流式管中，并用1×PBS洗涤3次，用488nm氩离子激光流式细胞仪观察细 胞内荧光强度。
2实验结果
2.1细胞活性、形态和凋亡率
CCK8结果表明，0-10μmol/L FS和PEI-NHAc-FS在ARPE-19细胞及HUVEC细胞株 中均无毒性作用，从细胞水平证实其安全性，各组间差异无统计学意义(图3a-d)；0-10 μmol/L FS和PEI-NHAc-FS处理ARPE19细胞24h后，各组细胞大多呈扁平多角形或鹅卵 石样外观，胞内含少量色素颗粒，处理组无形态学改变；同法处理HUVEC细胞后，各组 细胞呈现为典型的鹅卵石样排列，边界清晰，无形态学改变，结果表明，PEI-NHAc-FS对 于细胞形态无影响(图3e)；流式细胞术结果表明，0-10μmol/L PEI-NHAc-FS不引起细胞凋 亡，从细胞水平证实其安全性，结果如图3f-g。
2.2血管形成能力
管腔形成实验结果发现，0、5、10μmol/L PEI-NHAc-FS分别处理HUVEC细胞24h 后，管腔形成能力没有影响，结果表明PEI-NHAc-FS作为一种造影剂在细胞水平不影响血 管形成(图4)。
2.3不同浓度PEI-NHAc-FS在细胞水平观察有效性
0-10μmol/L FS和PEI-NHAc-FS处理ARPE19和HUVEC细胞12h和24h后，分别用 流式细胞仪(488nm氩离子激光)和荧光显微镜检测进入细胞内的荧光材料的强度，结果发 现(图6)，PEI修饰后的荧光素钠在两株细胞内的荧光强度明显减弱，PEI-NHAc-FS能够 有效减少进入细胞内荧光物质的量，差异有统计学意义(p<0.05)。
实施例3 PEI-NHAc-FS在动物水平的安全性及有效性
1实验方法
1.1激光诱导BN大鼠CNV模型的建立
BN雄性大鼠(8-10周，质量180±20g)，采用1％戊巴比妥钠40mg/mg腹腔内注射麻醉，复方托吡卡胺散瞳，爱尔卡因表面麻醉，暴露右眼，手持盖玻片作为接触镜，距视盘 等2支视网膜血管间激光光凝，共计6-8个点，采用激光(532nm，360mW，0.1s，50μm) 建立大鼠CNV模型，以光凝后有气泡产生或轻度出血为准。激光过程中注意避开眼底血管， 避免严重的眼底出血。
1.2石蜡切片制作
上述6只BN大鼠分为2组，对照组(尾静脉注射生理盐水，n＝3)、PEI-NHAc-FS组(尾静脉注射1％PEI-NHAc-FS 0.15mL，n＝3)，尾静脉注射后第28天摘取眼球及全身各 脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉)，4％多聚甲醛固定24h。以眼球为例，取出固定眼 球，流水冲洗，常温下将眼球及各脏器依次置入低浓度到高浓度梯度乙醇进行脱水，过程 如下：50％、70％、80％、90％、95％乙醇各1h；无水乙醇30-45min，二甲苯30min，之 后置入二甲苯中进行透明。将标本依次浸入二甲苯石蜡混合液(二甲苯：软蜡＝1:1)10min； 融化的纯石蜡(52-54℃)50min，(56-58％)1h。将已浸蜡的组织放入包埋器包埋，待其完全 冷凝变硬后保存。使用石蜡切片机进行切片，眼球以垂直于角膜中央到视神经根连线方向 为轴，由前向后切片，切片厚度5μm。将蜡片在温水展平，裱于载玻片上，置37℃恒温箱 内烘干待用。
1.3HE染色
取上述切片放入60℃烤箱内30min，切片分别置于二甲苯I、Ⅱ各10min脱蜡；切片依 次经过100％、95％、85％、75％乙醇下行至去离子水水合各5min。苏木素染色3min；流水冲洗5min；1％盐酸酒精分化后流水冲洗5min；伊红染色1min；上行梯度乙醇脱水， 二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并采集图像。
1.4视网膜电图(ERG)
采用视觉电生理检测系统记录F-ERG，刺激器为全野刺激器，记录电极为金箔环状角 膜电极，参考电极和接地电极分别为不锈钢针状电极，各电极阻抗小于5Ω。F-ERG记录采用大鼠双眼同时记录法。F-ERG记录前大鼠暗适应12h，1％戊巴比妥钠40mg/kg腹腔内 注射，速眠新注射液肌肉注射0.1mL，盐酸丙美卡因点双眼表面麻醉，暗红光下安放电极， 记录电极分别置于双眼角膜，局部用生理盐水保持角膜湿润，参考电极分别刺入大鼠眉弓 正中皮下，接地电极置于尾部，打开电生理软件(康华瑞明视觉电生理系统)，在9通道模 式下刺激采集波形，每次刺激间隔3min。
1.5眼底血管造影技术
取BN雄性大鼠(6-8周，质量180±20g)1％戊巴比妥钠40mg/kg腹腔内注射，麻醉后复方托吡卡胺散瞳，分别对大鼠进行无赤光下及自发荧光下的眼底照相。分别于尾静脉注射不同浓度梯度：0.5％、1％、5％的FS及PEI-NHAc-FS，动态观察造影至显影减弱。
2实验结果
2.1动物水平验证PEI-NHAc-FS的安全性
BN大鼠尾静脉注射1％PEI-NHAc-FS 0.15ml后28天，HE染色结果发现，与对照组相比，大鼠各脏器(心、肝、脾、肾、脑、肌肉)结构无明显破坏(图5a)；ERG结果表 明，与对照组相比，大鼠a波、b波的振幅无明显差异，表明视网膜功能没有受损(图5b)。
2.2不同浓度PEI-NHAc-FS在动物水平行眼底血管造影的有效性
BN大鼠尾静脉分别注射不同浓度的FS和PEI-NHAc-FS后，分别行眼底血管造影检查。 0.5％FS和PEI-NHAc-FS注射后，由于浓度低仅能显影视网膜主干血管，无法观察视网膜 小血管(图7)。提高浓度至1％FS和PEI-NHAc-FS，结果发现，FS和PEI-NHAc-FS都能 够清晰显影视网膜的主干和小血管，因此能够很好的用于视网膜血管成像，同时，注射后 30min能够使患者的眼底情况得到判断，但1％FS注射后1h仍然会在血管内检测到较强的 荧光，而PEI-NHAc-FS在30min开始在眼内逐渐代谢，代谢时间和速度较FS组明显加快 (图7)。继续提高浓度至5％FS和PEI-NHAc-FS，显影同样清晰且PEI-NHAc-FS组从眼 内代谢更快(图7)。
激光建立BN大鼠CNV模型后，1％FS和PEI-NHAc-FS分别尾静脉注射，结果发现， 眼底CNV病灶均显示高荧光，PEI-NHAc-FS能够有效显影CNV病灶部位，起到有效的诊 断作用，同时，与FS组相比，PEI-NHAc-FS从30min开始，逐渐从眼底血管开始代谢， 能够在发挥造影诊断作用的同时，比原先造影剂更快地从眼内代谢(图8)。
为了观察1％FS和PEI-NHAc-FS尾静脉注射后在眼底组织间地分布情况，分别注射后 10min、20min、30min和60min处死后，摘取大鼠眼球行冰冻切片，荧光显微镜下观察。 结果表明，FS能够黏附在视网膜各层结果，而PEI-NHAc-FS能够减少这种黏附作用，在发 挥眼底血管造影作用的同时，减少组织黏附，加快眼底血管中的代谢(图9)。
本发明成功构建聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠(PEI-NHAc-FS)，通过细胞及动物水平验 证了PEI-NHAc-FS的安全性，为该纳米材料用于眼底血管造影提供了安全性的保障。目前 临床上应用的眼底血管造影，如荧光素钠，部分患者静脉注射造影剂时产生不良反应，如 恶心、呕吐、皮疹、甚至导致过敏性休克及死亡。这些患者无法完成造影检查，不能明确 诊断，进行后续治疗。相比于现有的造影剂，PEI-NHAc-FS具有细胞内吞率低，组织间的黏附更弱，视网膜显影清楚，眼底血管代谢更快等优点，因此，PEI-NHAc-FS能够在完成 视网膜眼底血管造影的同时，加快在眼内的代谢，减少原先药物的副作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员， 在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本 发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠造影剂在制备眼底血管造影剂中的应用，所述造影剂是指树状大分子聚乙烯亚胺修饰的荧光素钠PEI-NHAc-FS，其制备方法如下：将荧光素钠与EDC.HCl反应20-50分钟，然后加入NHS搅拌1-5小时，在反应液中加入PEI，反应后得到PEI-NH2-FS，对PEI-NH2-FS进行乙酰化处理，透析、干燥后得到PEI-NHAc-FS。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光素钠与EDC.HCl摩尔比为1:5～15。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光素钠与NHS摩尔比为1:5～15。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PEI的分子量为25,000，荧光素钠与PEI的质量比为1:10～30。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，制备方法如下：200mg荧光素钠与10摩尔当量的EDC.HCl搅拌30分钟，然后和10摩尔当量的NHS再搅拌3小时，形成橙色溶液；在上述橙色溶液中加入380mg PEI后搅拌3天，得到PEI-NH2-FS；加入1mL乙酸酐继续搅拌24小时，透析、干燥后得到PEI-NHAc-FS。
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