CN117677699A - 用于治疗先兆子痫和其他血管生成病症的优化抗flt1寡核苷酸化合物 - Google Patents

用于治疗先兆子痫和其他血管生成病症的优化抗flt1寡核苷酸化合物 Download PDF

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Abstract

本公开涉及血管生成病症的新型靶标。还提供了新型寡核苷酸。还提供了使用新型寡核苷酸治疗血管生成病症(例如，先兆子痫)的方法。

Description

用于治疗先兆子痫和其他血管生成病症的优化抗FLT1寡核苷 酸化合物
相关申请
本申请要求2021年6月23日提交的美国临时专利申请序列号63/214,224的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
发明领域
本公开涉及用于治疗血管生成病症(例如，先兆子痫)的新型血管生成靶标和新型寡核苷酸化合物。
背景技术
先兆子痫(PE)是一种严重并逐渐致命的并发症，发生在全球5-8％的妊娠中并导致早产以及母亲和胎儿两者的发病率和死亡率增加。特征为高血压和蛋白尿的PE可以导致广泛的肾脏和肝脏损伤、溶血、血小板减少和死亡。
PE的母体症状主要是由高水平的胎盘分泌的可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFLT1)引起的，sFLT1既是该疾病的诊断标志物又是预后标志物。研究证明了sFLT1是用于治疗PE的可行治疗靶标。
之前的工作已经鉴定了靶向sFLT1主要同工型以降低妊娠小鼠和非人灵长类动物中的胎盘和循环sFLT1水平两者的siRNA(Turanov等人Nat Biotechnol.2018年11月19:10.1038/nbt.4297)。然而，仍然需要开发针对孕妇的治疗用途进行优化的siRNA。
发明内容
本发明部分基于优化寡核苷酸的发现，所述优化寡核苷酸靶向编码sFLT1蛋白而非全长FLT1(fl-FLT1)蛋白的mRNA同工型。本发明的新型寡核苷酸可以用于治疗PE、产后PE、子痫和/或HELLP综合征。本发明的新型寡核苷酸序列(例如，小干扰RNA (siRNA))已被工程化，以通过与fl-FLT1中不存在的一种或多种序列(例如，编码一种或多种sFLT1蛋白的mRNA的一个或多个内含子区域)结合来选择性降低sFLT1水平而不影响fl-FLT1。本文所述的新型优化寡核苷酸(例如，siRNA)可以使用全身(即，静脉内或皮下)递送至母亲而不递送至胎儿来优先递送至胎盘滋养层(导致过量sFLT1产生的细胞类型)。在某些实施方案中，本文所述的优化寡核苷酸保留高水平的沉默功效，同时胎盘组织积累增加、脱靶组织积累减少、siRNA降解减少、毒性减少且治疗指数更宽。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和20中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；并且(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补。
在另一方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和20中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含至少65％的2'-O-甲基修饰；(9)有义链5'端的位置4、6、8、10和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；并且(10)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在某些实施方案中，反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和20处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQ IDNO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链包含交替的2'-甲氧基-核糖核苷酸和2'-氟-核糖核苷酸；(3)反义链5'端的位置2和14处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(4)反义链3'端的位置1-2至1-7处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；并且(5)反义链的一部分与有义链的一部分互补。
在另一方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQ IDNO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链包含交替的2'-甲氧基-核糖核苷酸和2'-氟-核糖核苷酸；(3)反义链5'端的位置2和14处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(4)反义链3'端的位置1-2至1-7处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(5)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(6)有义链包含交替的2'-甲氧基-核糖核苷酸和2'-氟-核糖核苷酸；并且(7)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和18中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；并且(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补。
在另一方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和18中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含至少80％的2'-O-甲基修饰；(9)有义链5'端的位置7、9和11中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；并且(10)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在某些实施方案中，反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和18处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸。
在某些实施方案中，有义链5'端的位置7、9和11处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少70％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；并且(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补。
在另一方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少70％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含100％的2'-O-甲基修饰；并且(9)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在某些实施方案中，反义链5'端的位置2、4、5、6、8和14处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少75％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；并且(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补。
在另一方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少75％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含100％的2'-O-甲基修饰；并且(9)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少85％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；并且(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补。
在另一方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少85％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含100％的2'-O-甲基修饰；并且(9)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在某些实施方案中，反义链长度为20个核苷酸。在某些实施方案中，反义链长度为21个核苷酸。在某些实施方案中，反义链长度为22个核苷酸。
在某些实施方案中，有义链长度为15个核苷酸。在某些实施方案中，有义链长度为16个核苷酸。在某些实施方案中，有义链长度为18个核苷酸。在某些实施方案中，有义链长度为20个核苷酸。
在某些实施方案中，dsRNA包含15个碱基对至20个碱基对的双链区。在某些实施方案中，dsRNA包含15个碱基对的双链区。在某些实施方案中，dsRNA包含16个碱基对的双链区。在某些实施方案中，dsRNA包含18个碱基对的双链区。在某些实施方案中，dsRNA包含20个碱基对的双链区。
在某些实施方案中，dsRNA包含平末端。
在某些实施方案中，dsRNA包含至少一个单链核苷酸突出端。
在某些实施方案中，dsRNA包含约2个核苷酸至5个核苷酸的单链核苷酸突出端。
在某些实施方案中，dsRNA包含4-16个硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方案中，dsRNA包含8-13个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在某些实施方案中，有义链包含反义链和有义链之间的一个或多个核苷酸错配。
在某些实施方案中，反义链包含5'磷酸酯、5'-烷基膦酸酯、5'亚烷基膦酸酯或5'烯基膦酸酯。
在某些实施方案中，反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
在某些实施方案中，功能部分连接到有义链的3'末端。
在某些实施方案中，功能部分包含疏水部分。
在某些实施方案中，疏水部分选自由以下各项组成的组：脂肪酸、类固醇、开环类固醇、脂质、神经节苷脂、核苷类似物、内源性大麻素、维生素及其混合物。
在某些实施方案中，类固醇选自由胆固醇和石胆酸(LCA)组成的组。
在某些实施方案中，脂肪酸选自由二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳烯酸(DCA)组成的组。在一些实施方案中，脂肪酸为EPA。在一些实施方案中，脂肪酸为DHA。在一些实施方案中，脂肪酸为DCA。在一些实施方案中，脂肪酸为PC-DCA。
在某些实施方案中，维生素选自由胆碱、维生素A、维生素E、其衍生物和代谢物组成的组。
在某些实施方案中，功能部分通过接头与有义链连接。
在某些实施方案中，接头是可切割接头。
在某些实施方案中，可切割接头包含磷酸二酯键、二硫键、酸不稳定键或光可切割键。
在某些实施方案中，可切割接头包含具有磷酸二酯核苷酸间键的dTdT二核苷酸。
在某些实施方案中，酸不稳定键包括β-硫代丙酸酯键或羧二甲基马来酸酐(CDM)键。
在某些实施方案中，接头包含二价或三价接头。
在某些实施方案中，二价或三价接头选自由以下各项组成的组：
其中n为1、2、3、4或5。
在某些实施方案中，接头包含乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、酰胺、氨基甲酸酯或其组合。
在某些实施方案中，当接头是三价接头时，接头进一步连接磷酸二酯或磷酸二酯衍生物。
在某些实施方案中，接头还连接磷酸二酯或磷酸二酯衍生物。
在某些实施方案中，磷酸二酯或磷酸二酯衍生物选自由以下各项组成的组：
(Zc1)；
(Zc2)；
和
(Zc3)
(Zc4)
其中X是O、S或BH3。
在某些实施方案中，有义链3'端的位置1和2的核苷酸，以及反义链5'端的位置1和2的核苷酸，通过硫代磷酸酯键与相邻的核糖核苷酸连接。
在某些实施方案中，有互补性的区域与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少15、16、17或18个连续核苷酸互补。
在某些实施方案中，有互补性的区域与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2含有至多3个错配。
在某些实施方案中，有互补性的区域与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2完全互补。
在某些实施方案中，反义链包含5'UAAAUUUGGAGAUCCGA GAGA 3'的核酸序列或由其组成，并且有义链包含5'CGGAUCUCC AAAUUUA 3'的核酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，反义链包含5'UAUAAAUGGUAGCUAUG AUGA 3'的核酸序列或由其组成，并且有义链包含5'AUAGCUACC AUUUAUA 3'的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本公开提供了dsRNA分子的盐。在一些实施方案中，盐包括钠盐或钾盐。在一些实施方案中，盐包括药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，细胞或生物体中sFLT1蛋白的表达降低至少约20％。
在一个方面，本公开提供了一种治疗或控制PE、产后PE、子痫或HELLP综合征的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述dsRNA。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制PE的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述dsRNA。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制产后PE的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述dsRNA。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制子痫的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述dsRNA。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制HELLP综合征的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述dsRNA。
在某些实施方案中，静脉内施用或皮下施用药物组合物。
在某些实施方案中，受试者中的sFLT1蛋白表达降低至少约20％。
在一个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的PE、产后PE、子痫或HELLP综合征的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用上述dsRNA。
在一个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的血管生成病症的一种或多种症状的方法，所述方法包括向受试者施用上述dsRNA。
在某些实施方案中，血管生成病症选自由PE、产后PE、子痫和HELLP综合征组成的组。
在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含：包含第一有义链和第一反义链的第一dsRNA，其中第一反义链包含与SEQ ID NO:1基本上互补的具有互补性的区域，其中第一dsRNA包括上述dsRNA；包含第二有义链和第二反义链的第二dsRNA，其中第二反义链包含与SEQ ID NO:2基本上互补的具有互补性的区域，其中第二dsRNA包括上述dsRNA；和药学上可接受的载剂。
在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含：包含第一有义链和第一反义链的第一dsRNA，每条链具有5'端和3'端，其中第一反义链包含与SEQ ID NO:1基本上互补的具有互补性的区域；包含第二有义链和第二反义链的第二dsRNA，每条链具有5'端和3'端，其中第二反义链包含与SEQ ID NO:2基本上互补的具有互补性的区域；和药学上可接受的载剂，其中对于每个第一dsRNA和第二dsRNA：(1)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和20中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含至少65％的2'-O-甲基修饰；(9)有义链5'端的位置4、6、8、10和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；并且(10)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含(mU)#(fA)#(mA)(fA)(fU)(fU)(mU)(fG)(mG)(fA)(mG)(fA)(mU)(fC)#(mC)#(fG)#(mA)#(mG)#(mA)#(fG)#(mA)；并且(2)有义链包含(mC)#(mG)#(mG)(fA)(mU)(fC)(mU)(fC)(mC)(fA)(mA)(mA)(mU)(fU)#(mU)#(mA)，其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：反义链包含(mU)#(fA)#(mA)(fA)(fU)(fU)(mU)(fG)(mG)(fA)(mG)(fA)(mU)(fC)#(mC)#(fG)#(mA)#(mG)#(mA)#(fG)#(mA)，其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：有义链包含(mC)#(mG)#(mG)(fA)(mU)(fC)(mU)(fC)(mC)(fA)(mA)(mA)(mU)(fU)#(mU)#(mA)，其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含(mU)#(fA)#(mU)(fA)(fA)(fA)(mU)(fG)(mG)(fU)(mA)(fG)(mC)(fU)#(mA)#(fU)#(mG)#(mA)#(mU)#(fG)#(mA)；并且(2)有义链包含(mA)#(mU)#(mA)(fG)(mC)(fU)(mA)(fC)(mC)(fA)(mU)(mU)(mU)(fA)#(mU)#(mA)，其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：反义链包含(mU)#(fA)#(mU)(fA)(fA)(fA)(mU)(fG)(mG)(fU)(mA)(fG)(mC)(fU)#(mA)#(fU)#(mG)#(mA)#(mU)#(fG)#(mA)，其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：有义链包含(mA)#(mU)#(mA)(fG)(mC)(fU)(mA)(fC)(mC)(fA)(mU)(mU)(mU)(fA)#(mU)#(mA)，其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施方案中，反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
在一些实施方案中，dsRNA包含连接至有义链3'端的二十二烷酸(DCA)缀合物。
在一些实施方案中，DCA通过接头连接至有义链。
在一些实施方案中，接头是可切割接头。
在一些实施方案中，可切割接头包含磷酸二酯键、二硫键、酸不稳定键或光可切割键。
在一些实施方案中，可切割接头包含具有磷酸二酯核苷酸间键的dTdT二核苷酸。
在一些实施方案中，接头包括二价或三价接头。
在一些实施方案中，二价或三价接头选自由以下各项组成的组： 其中n为1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，当接头是三价接头时，所述接头进一步连接磷酸二酯或磷酸二酯衍生物。
在一些实施方案中，磷酸二酯或磷酸二酯衍生物选自由以下各项组成的组：
其中X是O、S或BH3。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含V(mU)#(fA)#(mA)(fA)(fU)(fU)(mU)(fG)(mG)(fA)(mG)(fA)(mU)(fC)#(mC)#(fG)#(mA)#(mG)#(mA)#(fG)#(mA)；并且(2)有义链包含(mC)#(mG)#(mG)(fA)(mU)(fC)(mU)(fC)(mC)(fA)(mA)(mA)(mU)(fU)#(mU)#(mA)(T)(T)-PCDCA，其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“T”对应于胸苷DNA核苷酸，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键，“V”对应于5'-乙烯基膦酸酯，并且“PCDCA”对应于通过磷酸酯接头的3'-C7-磷酸胆碱-二十二烷酸缀合物。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含V(mU)#(fA)#(mU)(fA)(fA)(fA)(mU)(fG)(mG)(fU)(mA)(fG)(mC)(fU)#(mA)#(fU)#(mG)#(mA)#(mU)#(fG)#(mA)；并且(2)有义链包含(mA)#(mU)#(mA)(fG)(mC)(fU)(mA)(fC)(mC)(fA)(mU)(mU)(mU)(fA)#(mU)#(mA)(T)(T)-PCDCA，其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“T”对应于胸苷DNA核苷酸，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键，“V”对应于5'-乙烯基膦酸酯，并且“PCDCA”对应于通过磷酸酯接头的3'-C7-磷酸胆碱-二十二烷酸缀合物。
在一些实施方案中，本公开提供了dsRNA分子的盐。在一些实施方案中，盐包括钠盐或钾盐。在一些实施方案中，盐包括药学上可接受的盐。
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)反义链包含式I或其盐：
并且
(2)有义链包含式II或其盐：
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)反义链包含式III或其盐：
并且
(2)有义链包含式IV或其盐：
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中反义链包含式I或其盐：
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中有义链包含式II或其盐：
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中反义链包含式III或其盐：
在一些方面，本公开提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中有义链包含式IV或其盐：
在一些实施方案中，盐包括药学上可接受的盐。在一些实施方案中，盐包括钠盐或钾盐。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制PE、产后PE、子痫或HELLP综合征的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述dsRNA。
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含：第一dsR NA，所述第一dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含V(mU)#(fA)#(mA)(fA)(fU)(fU)(mU)(fG)(m G)(fA)(mG)(fA)(mU)(fC)#(mC)#(fG)#(mA)#(mG)#(mA)#(fG)#(mA)；并且(2)有义链包含(mC)#(mG)#(mG)(fA)(mU)(fC)(mU)(fC)(mC)(fA)(mA)(mA)(mU)(fU)#(mU)#(mA)(T)(T)-PCDCA；以及第二dsRNA，所述第二dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含V(mU)#(fA)#(mU)(fA)(fA)(fA)(mU)(fG)(mG)(fU)(mA)(fG)(mC)(fU)#(mA)#(fU)#(mG)#(mA)#(mU)#(fG)#(mA)；并且(2)有义链包含(mA)#(mU)#(mA)(fG)(mC)(fU)(mA)(fC)(mC)(fA)(mU)(mU)(m U)(fA)#(mU)#(mA)(T)(T)-PCDCA，其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“T”对应于胸苷DNA核苷酸，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键，“V”对应于5'-乙烯基膦酸酯，并且“PCDCA”对应于通过磷酸酯接头的3'-C7-磷酸胆碱-二十二烷酸缀合物。
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含：第一dsRNA，所述第一dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)反义链包含式I或其盐：
/>
并且
(2)有义链包含式II或其盐：
以及
第二dsRNA，所述第二dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)反义链包含式III或其盐：
并且
(2)有义链包含式IV或其盐：
在一些实施方案中，盐包括药学上可接受的盐。在一些实施方案中，盐包括钠盐或钾盐。
在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制PE、产后PE、子痫或HELLP综合征的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述药物组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制PE的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述药物组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制产后PE的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述药物组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制子痫的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述药物组合物。在一些方面，本公开提供了一种治疗或控制HELLP综合征的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的上述药物组合物。
附图说明
根据结合附图进行的说明性实施方案的以下详细描述，本发明的上述和其他特征和优势将变得更加完全清楚明白。专利或申请文件包含至少一幅彩色绘图。专利局将根据请求和支付必要的费用提供本专利或专利申请出版物的彩色附图副本。
图1A至图1B描绘了几种富含2'OMe的siRNA化学修饰模式的沉默功效。图1A描绘了富含2'OMe的siRNA化学修饰模式的示意图。图1B描绘了靶向人flt1的siRNA的剂量响应曲线和汇总表。用所示浓度的siRNA处理HeLa细胞72小时。使用荧光素酶测定系统测量mRNA水平，并计算为未处理对照(C)的百分比。图1B的表-最大KD(％)-最高siRNA治疗剂量下靶mRNA敲低的最大百分比，IC50-半数最大抑制浓度，AUC-剂量响应曲线下面积，p值-显著性。
图2A至图2B描绘了组织荧光图像和所述组织中的引导链积累。图2A描绘了肝脏、肾脏和胎盘组织中与各种功能部分缀合的Cy3标记的siRNA的组织荧光图像。图2B描绘了48小时后通过PNA杂交测定(n＝3)定量的引导链积累。p值描述了每种化合物和胆固醇缀合化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；**p<0.01；***p<0.001；未标记非显著性差异)。NOC-无缀合物，Chol-胆固醇，DCA-二十二烷酸，PC-DCA-磷酸胆碱-二十二烷酸，DHA-二十二碳六酸，PC-DHA-磷酸胆碱-二十二碳六酸，DIO-双支链寡核苷酸。
图3A至图3D描述了测试的siRNA的骨髓组织积累。对注射了Cy3标记的sFLT1_2283siRNA变体的CD-1小鼠的骨髓细胞进行FACS分析。图3A示出了用于量化图3B至图3D中骨髓中特定细胞群的Cy3强度的门控方案。图3B示出了注射siRNA变体后24h的骨髓嗜中性粒细胞的Cy3荧光强度的频率分布直方图(左)和Cy3中值荧光强度的条形图(右)。图3C示出了注射siRNA变体后24h的骨髓粒细胞的Cy3荧光强度的频率分布直方图(左)和Cy3中值荧光强度的条形图(右)。图3D示出了注射siRNA变体后24h的骨髓单核细胞的Cy3荧光强度的频率分布直方图(左)和Cy3中值荧光强度的条形图(右)。(n＝3，平均值±SD)p值描述化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；*p<0.05；未标记非显著性差异)。
图4A至图4F描绘了各种5'反义修饰对siRNA沉默功效的影响。在胚胎第13天(E)和E14，向妊娠CD-1小鼠注射20mg/kg的2283和2519siRNA变体的等摩尔混合物。图4A描绘了注射的siRNA化合物的化学模式和测试的5'部分的化学结构的示意图。图4B描绘了使用Quantigene 2.0RNA测定测量E18的胎盘中的sFlt1-i13 mRNA水平。将水平归一化至Flt1，并呈现为PBS对照的百分比(n＝5，平均值±SD)。图4C描绘了使用PNA杂交测定(n＝5)测量的E18的胎盘中siRNA积累量。p值描述了化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；**p<0.01；****p<0.0001；未标记非显著性差异)。图4D描绘了使用Quantigene 2.0RNA测定测量的E18的胎盘中的sFlt1-i13mRNA水平。将水平归一化至Flt1，并呈现为PBS对照的百分比(n＝6，平均值±SD)。图4E描绘了使用PNA杂交测定(n＝6)测量的E18的胎盘中siRNA积累量。p值描述了化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；**p<0.01；****p<0.0001；未标记非显著性差异。未配对t检验；#p<0.05；####p<0.0001)。图4F描绘了对照和经治疗的妊娠小鼠的平均小鼠幼仔数量、平均幼仔重量和平均胎盘重量。
图5描绘了优化的siRNA对血清细胞因子产生的影响。测量注射75mg/kg sFLT1_2283 siRNA变体后24h的CD-1小鼠的血清细胞因子水平(n＝3，平均值±SD)。p值描述了化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；未标记非显著性差异)。
图6描绘了示例性siRNA靶标sFLT1 2283或2519的示意图。
图7描绘了siRNA-2238和siRNA-2519沉默sFLT1-i13和sFLT1-e15a(分别)或两种siRNA的组合(siRNA-2238:siRNA-2519为1:1)的剂量响应曲线。在每个测试的siRNA浓度下测量sFLT1-i13和sFLT1-e15a mRNA表达水平以及sFLT1蛋白水平。
图8A至图8C描绘了在妊娠大鼠子宫胎盘灌注减少模型(RUPP)中进行的体内实验。图8A描绘了RUPP大鼠模型接受两种siRNA的组合(siRNA-2283(sFlt1-il3-靶向)和siRNA-2519(sFlt1-e15a-靶向)的1:1混合物)的治疗方案。图8B描绘了经治疗的大鼠和对照大鼠的母体血压和胎盘重量。图8C描绘了经治疗的大鼠和对照大鼠的胎儿吸收和胎儿重量。
图9描绘了优化的siRNA分子sFLT1 2283和sFLT1 2519的化学结构。
图10A至图10B描绘了优化的siRNA分子sFLT1 2283的化学结构。图10A描绘了反义链并且图10B描绘了有义链。
图11A至图11B描绘了优化的siRNA分子sFLT1 2519的化学结构。图11A描绘了反义链并且图11B描绘了有义链。
具体实施方式
提供了新型血管生成靶标(例如，PE靶序列，例如，sFlt1 mRNA的内含子序列)。还提供了选择性靶向编码血管生成靶标(例如，sFLT1蛋白)的mRNA内含子区域的新型siRNA。还提供了治疗血管生成病症(例如，PE、产后PE、子痫和/或HELLP)的方法。
通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学以及杂交相关使用的命名法是本领域众所周知且常用的那些。本文提供的方法和技术通常是根据本领域众所周知并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法进行的，除非另有说明。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常完成或如本文所述来进行。除非提供确切的定义，否则结合本文所描述的分析化学、合成有机化学和医药化学所使用的命名法和这些化学领域的实验室程序和技术为本领域熟知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果存在任何潜在的歧义，此处提供的定义优先于任何字典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。
为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。
“改变”意指如通过标准的本领域已知方法(诸如本文所述的那些方法)所检测的基因、mRNA或多肽的表达水平的变化(增加或减少)。如本文所用，增加或减少包括表达水平10％的变化、25％的变化、40％的变化和表达水平50％或更大的变化。在某些实施方案中，增加或减少是表达水平在约30％与约50％之间或在约30％与约40％之间的变化。“改变”还可以指示本发明的任何mRNA或多肽(例如，sFlt1(例如，sFlt1-i13短、sFlt1-i13长和/或sFlt1-i15a(也称为sFlt1-e15a)))的生物活性的变化(增加或减少)。sFlt-1的生物活性的实例包括PE或子痫的一种或多种临床症状。如本文所用，增加或减少包括生物活性10％的变化，优选地25％的变化，更优选地40％的变化，以及最优选地生物活性50％或更大的变化。在某些优选的实施方案中，增加或减少是表达水平在约30％与约50％之间或在约30％与约40％之间的变化。
本发明的某些实施方案涉及一种或多种血管生成病症的治疗。“血管生成病症的治疗”意指药物组合物中本发明的寡核苷酸(例如，siRNA)用于治疗涉及新生血管、血管生成(vasculogenesis)和/或血管形成(angiogenesis)的生理和病理过程的疾病的用途。因此，这些药物组合物可用于治疗需要抑制新生血管、血管生成或血管形成的疾病、疾患和病症，包括但不限于癌症肿瘤生长和转移、肿瘤、眼部新生血管(包括黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、缺血性视网膜病变、早产儿视网膜病变、脉络膜新生血管)、类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性哮喘、感染性休克、炎症性疾病、滑膜炎、骨和软骨破坏、血管翳生长、骨赘形成、骨髓炎、牛皮癣、肥胖、血管瘤、卡波西肉瘤、动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化斑块破裂)、子宫内膜异位症、疣、毛发过度生长、疤痕疙瘩、过敏性水肿、功能失调性子宫出血、卵泡囊肿、卵巢过度刺激、子宫内膜异位症、骨髓炎、炎症和感染过程(肝炎、肺炎、肾小球肾炎)、哮喘、鼻息肉、移植、肝再生、白质软化症、甲状腺炎、甲状腺肿大、淋巴增生性疾病、血液系统恶性肿瘤、血管畸形、先兆子痫、子痫和/或HELLP综合征。在一些实施方案中，疾病或病症是先兆子痫。在一些实施方案中，疾病或病症是产后先兆子痫。在一些实施方案中，疾病或病症是子痫。在一些实施方案中，疾病或病症是HELLP综合征。
“先兆子痫”(“PE”)意指多系统病症，其特征为高血压伴蛋白尿或水肿或两者，以及由于妊娠或近期妊娠的影响引起的肾小球功能障碍、脑水肿、肝水肿或凝血异常中的一种或多种。PE通常在妊娠第20周后发生。PE通常被定义为以下症状的某种组合：(1)妊娠20周后收缩压(BP)>140mmHg，舒张BP>90mmHg(通常测量两次，间隔4-168小时)，(2)新发蛋白尿(尿液分析通过试纸(dipstick)测得1+，24小时尿液收集中蛋白质>300mg，或蛋白质/肌酐比>v0.3的单一随机尿液样本)，以及(3)产后12周高血压和蛋白尿消退。
严重PE通常定义为(1)舒张BP>110mmHg(通常测量两次，间隔4-168小时)或(2)蛋白尿，其特征是24小时尿液收集中测量到3.5g或更多蛋白质或两份随机尿液样本通过试纸测得至少含有3+蛋白质。在PE中，高血压和蛋白尿通常会在7天内彼此同时发生。在严重PE中，严重高血压、严重蛋白尿和HELLP综合征(溶血、肝酶升高、血小板低)或子痫可能同时出现或一次仅出现一种症状。
有时，严重PE可能导致癫痫发作。这种严重形式的综合征称为“子痫”。子痫还可以包括多个器官或组织的功能障碍或损伤，诸如肝脏(例如，肝细胞损伤、门静脉周坏死)和中枢神经系统(例如，脑水肿和脑出血)。癫痫发作的病因被认为是继发于脑水肿和肾内小血管局灶性痉挛的发展。
“HELLP”综合征意指孕妇发生的一组症状，其特征是溶血、肝酶升高和血小板计数低。HELLP综合征被认为是PE的变体，但它可能是本身独立的实体。
在某些方面，PE包括产后PE。产后PE是一种罕见的疾患，其在女性分娩后不久出现高血压和尿液中蛋白质过多时发生。产后PE通常在分娩后48小时内发生。然而，产后PE有时会在分娩后六周时发生，这被称为晚期产后PE。产后PE和晚期产后PE的体征和症状通常与妊娠期间发生的PE相似，并且可以包括以下中的一种或任何组合：高血压(即，140/90mm Hg或更高；蛋白尿；严重头痛)；视力变化，包括暂时失明、视力模糊或光敏感；面部和四肢肿胀；上腹部疼痛，通常在右侧肋骨下方；恶心或呕吐；以及排尿减少；体重突然增加，通常每周超过2磅(0.9千克)。
“宫内生长迟缓(IUGR)”意指导致出生体重比胎儿胎龄的预测胎儿体重低10％的综合征。目前世界卫生组织低出生体重的标准是体重低于2,500克(5磅8盎司)或低于根据美国胎龄出生体重表(按种族、产次和婴儿性别)的胎龄的第10百分位数(Zhang和Bowes,Obstet.Gynecol.86:200-208,1995)。这些低出生体重婴儿也被称为“小于胎龄儿(SGA)”。PE是一种已知与IUGR或SGA相关的疾患。
本发明的某些实施方案涉及一种或多种肾脏病症的治疗。“肾脏病症的治疗”意指药物组合物中本发明的寡核苷酸(例如，siRNA)用于治疗与肾脏相关的疾病、疾患或病症的用途。与肾脏相关的疾病、疾患或病症包括但不限于慢性肾病(CKD)(1至5期，其中1期是最轻微的且通常几乎不引起症状，并且5期是严重疾病，如果不治疗，预期寿命很短(5期CKD通常称为终末期肾病、终末期肾衰竭或终末期肾病、慢性肾衰竭(chronic kidney failure)或慢性肾衰竭(chronic renal failure))和急性肾衰竭(ARF)(由失血的外伤、流向肾脏的血流量突然减少、脓毒症对肾脏造成的损害、尿流阻塞、某些药物或毒素造成的损害、妊娠并发症(例如，子痫、PE和/或HELLP综合征)等引起)。
本发明的某些实施方案涉及一种或多种肝脏病症的治疗。“肝脏病症的治疗”意指药物组合物中本发明的寡核苷酸(例如，siRNA)用于治疗与肝脏相关的疾病、疾患或病症的用途。与肝脏相关的疾病、疾患或病症包括但不限于片形吸虫病、肝炎(例如，病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、遗传性肝炎等)、酒精性肝病(包括酒精性脂肪肝病、酒精性肝炎和酒精性肝硬化)、非酒精性脂肪性肝病、脂肪性肝炎、非酒精性肝硬化、原发性肝癌(例如，肝细胞癌、胆管癌、血管肉瘤(angiosarcoma)、血管肉瘤(hemangiosarcoma)等)、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化、小叶中心坏死、布加综合征(Budd–Chiari syndrome)、血色素沉着病、Wilson病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、II型糖原累积病、转甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性、吉尔伯特综合征(Gilbert's syndrome)、胆道闭锁、α1抗胰蛋白酶缺乏症、阿拉基综合症(Alagille syndrome)、进行性家族性肝内胆汁淤积症等。
“治疗量”意指当施用于患有PE或子痫的患者时足以引起如本文所述的PE或子痫的症状定性或定量减少的量。“治疗量”还可以意指当施用于患有PE或子痫的患者或受试者时足以引起一种或多种sFLT1蛋白(例如，sFLT1-i13短、sFLT1-i13长和sFLT1-i15a中的一种或多种)的表达水平降低的量，如通过本文所述的一种或多种测定测量的。
“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物或其他动物，诸如牛、马、犬、羊、猫、鼠等。此定义包括妊娠、产后和非妊娠的哺乳动物。
“可溶性FLT1(sFLT1)”(也称为sVEGF-R1)意指具有sFLT1生物活性的FLT1受体的可溶性形式(例如，sFLT1-i13短、sFLT1-i13长和/或sFLT1-i15a(也称为sFLT1-e15a)。sFLT1多肽的生物活性可以使用任何标准方法测定，例如通过测定PE、产后PE、子痫和/或HELLP的一种或多种临床症状、通过测定sFLT1 mRNA和/或蛋白质水平、通过测定sFLT1与VEGF等结合。sFLT1蛋白缺乏FLT1受体的跨膜结构域和细胞质酪氨酸激酶结构域。sFLT1蛋白可以以高亲和力与VEGF和PlGF结合，但不能诱导增殖或血管形成，因此在功能上与FLT1和KDR受体不同。sFLT1最初是从人脐带内皮细胞中纯化的，并且后来证明是由体内滋养层细胞产生的。如本文所用，sFLT1包括任何sFLT1家族成员或同工型，例如，sFLT1-i13(例如，sFLT1-i13短和/或sFLT1-i13长(sFLT1_v1)、sFLT1-i15a(sFLT1_v2)、sFLT1-e15a、sFLT1_v3、sFLT1_v4等。
sFLT1-i13短同工型的序列为：
GTGAGCACTGCAACAAAAAGGCTGTTTTCTCTCGGATCTCC AAATTTAAAAGCACAAGGAATGATTGTACCACACAAAGTAATGT AAAACATTAAAGGACTCATTAAAAAGTAA(SEQ ID NO:5)。
sFLT1-i13长同工型的序列为：GAAGAAAGAAATTACAATCAGAGGTGAGCACTGCAACAAAAAGGCTGTTTTCTCTCGGATCTCCAAATTTAAAAGCACAAGGAATGATTGTACCACACAAAGTAATGTAAAACATTAAAGGACTCATTAA AAAGTAACAGTTGTCTCATATCATCTTGATTTATTGTCACTGTTGCTAACTTTCAGGCTCGGAGGAGATGCTCCTCCCAAAATGAGTTCGGAGATGATAGCAGTAATAATGAGACCCCCGGGCTCCAGCTCTGGGCCCCCCATTCAGGCCGAGGGGGCTGCTCCGGGGGGCCGACTTGGTGCACGTTTGGATTTGGAGGATCCCTGCACTGCCTTCTCTGTGTTTGTTGCTCTTGCTGTTTTCTCCTGCCTGATAAACAACAACTTGGGATGATCCTTTCCATTTTGATGCCAACCTCTTTTTATTTTTAAGCGGCGCCCTATAGT(SEQ ID NO:6)。
sFLT1-i15a(也称为sFLT1-e15a)同工型的序列为：AACTGTATACATCAACGTCACCATCGTCATCGTCATCATCACCATTGTCATCATCATCATCATCGTCATCATCATCATCATCATAGCTATCATCATTATCATCATCATCATCATCATCATCATAGCTACCATTTATTGAAAACTATTATGTGTCAACTTCAAAGAACTTATCCTTTAGTTGGAGAGCCAAGACAATCATAACAATAACAAATGGCCGGGCATGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGCAGGTGGATCATTTGAGGTCAGGAGTCCAAGACCAGCCTGACCAAGATGGTGAAATGCTGTCTCTATTAAAAATACAAAATTAGCCAGGCATGGTGGCTCATGCCTGTAATGCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGACAGGAGAATCACTTGAACCCAGGAGGCAGAGGTTGCAGGGAGCCGAGATCGTGTACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCGAAACTCCGTCTCAAAAAACAAATAAATAAATAAATAAATAAACAGACAAAATTCACTTTTTATTCTATTAAACTTAACATACATGCTAA(SEQ ID NO:7)。
sFLT1蛋白水平可以通过测量游离、结合(即，与生长因子结合)或总sFLT1(结合+游离)的量来测量。VEGF或PlGF水平通过测量游离PlGF或游离VEGF(即，未与sFLT1结合)的量来确定。一种示例性度量是[sFLT1/(VEGF+PlGF)]，也称为PE抗血管形成指数(PAAI)。
“先兆子痫抗血管形成指数(PAAI)”意指用作抗血管形成活性指标的sFLT1/VEGF+PlGF比。PAAI大于20被认为指示PE或PE风险。
“血管内皮生长因子(VEGF)”意指与美国专利号5,332,671；5,240,848；5,194,596；和Charnock-Jones等人(Biol.Reproduction,48:1120-1128,1993)中定义的生长因子同源并且具有VEGF生物活性的哺乳动物生长因子。VEGF作为糖基化同二聚体存在，并包括至少四种不同的选择性剪接异构体。天然VEGF的生物活性包括促进血管内皮细胞或脐静脉内皮细胞的选择性生长和诱导血管形成。如本文所用，VEGF包括任何VEGF家族成员或同工型(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165或VEGF121)。在某些实施方案中，VEGF是VEGF121或VEGF165同工型(Tischer等人,J.Biol.Chem.266,11947-11954,1991；Neufed等人Cancer Metastasis 15:153-158,1996)，其描述于美国专利号6,447,768；5,219,739；和5,194,596，通过引用特此并入。还包括VEGF的突变形式，诸如KDR选择性VEGF和Flt选择性VEGF，描述于Gille等人(J.Biol.Chem.276:3222-3230,2001)。VEGF包括人类形式并且可以包括VEGF的其他动物形式(例如小鼠、大鼠、狗、鸡等)。
“胎盘生长因子(PlGF)”意指与GenBank登录号P49763定义的蛋白质同源并且具有PlGF生物活性的哺乳动物生长因子。PlGF是属于VEGF家族的糖基化同二聚体，并且可以通过选择性剪接机制以两种不同的同工型存在。PlGF由胎盘中的细胞滋养层和合体滋养层表达，并且PlGF生物活性包括诱导内皮细胞特别是滋养层细胞的增殖、迁移和激活。
“滋养层”意指覆盖囊胚的中胚层细胞层，其侵蚀子宫粘膜并且胚胎通过其从母体接收营养。滋养层细胞有助于胎盘的形成。
术语“核苷”是指具有与核糖或脱氧核糖共价连接的嘌呤或嘧啶碱基的分子。示例性核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷和胸苷。其他示例性核苷包括肌苷、1-甲基肌苷、假尿苷、5,6-二氢尿苷、核胸苷、2N-甲基鸟苷和2,2N,N-二甲基鸟苷(也称为“稀有”核苷)。术语“核苷酸”是指具有以酯键连接到糖部分的一个或多个磷酸基团的核苷。示例性核苷酸包括核苷一磷酸、二磷酸和三磷酸。术语“多核苷酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，是指通过5'和3'碳原子之间的磷酸二酯键连接在一起的核苷酸聚合物。
术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸(例如，2、3、4、5、10、15、20、25、30或更多个核糖核苷酸)的聚合物。术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和RNA可以自然合成(例如，分别通过DNA复制或DNA转录)。RNA可以进行转录后修饰。DNA和RNA也可以化学合成。DNA和RNA可以是单链的(即，分别为ssRNA和ssDNA)或多链的(例如，双链，即分别为dsRNA和dsDNA)。“mRNA”或“信使RNA”是指定一条或多条多肽链的氨基酸序列的单链RNA。在蛋白质合成过程中，当核糖体与mRNA结合时，此信息被翻译。
如本文所用，术语“小干扰RNA”(“siRNA”)(在本领域中也称为“短干扰RNA”)是指包含约10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)的RNA(或RNA类似物)，它能够指导或介导RNA干扰。优选地，siRNA包含约15-30个核苷酸或核苷酸类似物，更优选地约16-25个核苷酸(或核苷酸类似物)，甚至更优选地约18-23个核苷酸(或核苷酸类似物)，且甚至更优选地约19-22个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如，19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)。术语“短”siRNA是指包含约21个核苷酸(或核苷酸类似物)，例如19、20、21或22个核苷酸的siRNA。术语“长”siRNA是指包含约24-25个核苷酸，例如23、24、25或26个核苷酸的siRNA。在一些情况下，短siRNA可以包括少于19个核苷酸，例如16、17或18个核苷酸，只要较短的siRNA保留介导RNAi的能力。同样，在一些情况下，长siRNA可以包括超过26个核苷酸，只要在没有进一步加工(例如酶促加工)至短siRNA的情况下，更长的siRNA保留介导RNAi的能力。
术语“核苷酸类似物”或“改变的核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指非标准核苷酸，包括非天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。示例性核苷酸类似物在任何位置被修饰以改变核苷酸的某些化学性质，但仍保留核苷酸类似物执行其预期功能的能力。可以衍生的核苷酸位置的实例包括：5位，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷、5-丙炔尿苷、5-丙烯基尿苷等；6位，例如6-(2-氨基)丙基尿苷；腺苷和/或鸟苷的8位，例如8-溴鸟苷、8-氯鸟苷、8-氟鸟苷等。核苷酸类似物还包括脱氮核苷酸，例如7-脱氮腺苷；O-和N-修饰的(例如，烷基化的，例如，N6-甲基腺苷，或如本领域中已知的)核苷酸；和其他杂环修饰的核苷酸类似物，诸如Herdewijn,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.,2000年8月10(4):297-310中描述的那些。
核苷酸类似物还可以包含对核苷酸糖部分的修饰。例如，2'OH-基团可以被选自H、OR、R、F、Cl、Br、I、SH、SR、NH2、NHR、NR2、COOR或OR的基团替代，其中R是取代或未取代的C1-C6烷基、烯基、炔基、芳基等。其他可能修饰包括美国专利号5,858,988和6,291,438中描述的那些。
核苷酸的磷酸基团也可以被修饰，例如，通过用硫取代磷酸基团的一个或多个氧(例如，硫代磷酸酯)，或通过进行其他取代，这允许核苷酸执行其预期功能，诸如描述于例如Eckstein,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2000年4月10(2):117-21，Rusckowski等人Antisense Nucleic Acid Drug Dev.2000年10月10(5):333-45，Stein,AntisenseNucleic Acid Drug Dev.2001年10月11(5):317-25，Vorobjev等人Antisense NucleicAcid Drug Dev.2001年4月11(2):77-85，以及美国专利号5,684,143。某些上述修饰(例如，磷酸基团修饰)优选地降低例如包含所述类似物的多核苷酸在体内或体外的水解速率。
术语“寡核苷酸”是指核苷酸和/或核苷酸类似物的短聚合物。术语“RNA类似物”是指与相应的未改变或未修饰的RNA相比具有至少一个改变或修饰的核苷酸，但保留与相应的未改变或未修饰的RNA相同或相似的性质或功能的多核苷酸(例如，化学合成的多核苷酸)。如上所述，寡核苷酸可以用键连接，与具有磷酸二酯键的RNA分子相比，这导致RNA类似物的水解速率较低。例如，类似物的核苷酸可以包含亚甲基二醇、乙二醇、氧甲硫基、氧乙硫基、氧羰基氧基、磷酰二胺、磷酰胺、和/或硫代磷酸酯键。优选的RNA类似物包括糖和/或骨架修饰的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。此类改变或修饰还可以包括添加非核苷酸材料，例如添加至RNA的末端或内部(在RNA的一个或多个核苷酸处)。RNA类似物只需要与天然RNA足够相似，以至于它具有介导RNA干扰的能力。
如本文所用，术语“RNA干扰”(“RNAi”)是指RNA的选择性细胞内降解。RNAi在细胞中自然发生以去除外源RNA(例如病毒RNA)。天然RNAi通过从游离dsRNA上切割下来的片段进行，这些片段将降解机制指导至其他相似的RNA序列。或者，RNAi可以由人工启动，例如，使靶基因的表达沉默。
具有“与靶mRNA序列充分互补以指导靶特异性RNA干扰(RNAi)”的链的RNAi剂，例如RNA沉默剂，意指所述链具有足以通过RNAi机制或过程触发靶mRNA破坏的序列。
本文中使用的术语“分离RNA”(例如，“分离siRNA”或“分离siRNA前体”)表示基本上没有通过重组技术产生时的其他细胞物质或培养介质，或基本上没有化学合成时的化学前体或其他化学品的RNA分子。
如本文所用，术语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组序列特异性调节机制(例如RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压制、共抑制和翻译抑制)，其导致相应蛋白质编码基因表达的抑制或“沉默”。已经在许多类型的生物体中观察到RNA沉默，包括植物、动物和真菌。
术语“区分性RNA沉默”是指RNA分子实质上抑制“第一”或“靶”多核苷酸序列的表达而不实质上抑制“第二”或“非靶”多核苷酸序列的表达的能力，例如，当两个多核苷酸序列存在于同一细胞中时。在某些实施方案中，靶多核苷酸序列对应于靶基因，而非靶多核苷酸序列对应于非靶基因。在某些实施方案中，靶多核苷酸序列对应于靶等位基因，而非靶多核苷酸序列对应于非靶等位基因。在某些实施方案中，靶多核苷酸序列是编码靶基因的调节区(例如启动子或增强子元件)的DNA序列。在其他实施方案中，靶多核苷酸序列是由靶基因编码的靶mRNA。
术语“体外”具有其本领域公认的含义，例如，涉及纯化的试剂或提取物，例如细胞提取物。术语“体内”也具有其本领域公认的含义，例如，涉及活细胞，例如永生化细胞、原代细胞、细胞系、和/或生物体内的细胞。
如本文所用，术语“转基因”是指任何核酸分子，其通过人为插入细胞中，并成为从细胞发育而来的生物体基因组的一部分。这种转基因可以包括与转基因生物部分或完全异源(即外源)的基因，或者可以代表与生物的内源基因同源的基因。术语“转基因”还意指一种核酸分子，其包括一种或多种选定的核酸序列例如DNA，所述序列编码将在转基因生物体例如动物中表达的一种或多种工程化RNA前体，所述序列与转基因动物部分或完全异源，即外源的，或与转基因动物的内源基因同源，但被设计成插入动物基因组中与天然基因不同的位置。转基因包括表达所选核酸序列所必需的一个或多个启动子和任何其他DNA例如内含子，所有这些DNA都可操作地连接到所选序列，并且可以包括增强子序列。
“涉及”疾病或病症的基因包括如下基因，所述基因的正常或异常表达或功能影响或导致疾病或病症或所述疾病或病症的至少一种症状。
如本文所用，术语“功能获得性突变”是指基因中的任何突变，其中由所述基因编码的蛋白质(即，突变蛋白质)获得通常不与所述蛋白质(即，野生型蛋白质)相关的功能，导致或促成疾病或病症。功能获得性突变可以是基因中一个或多个核苷酸的缺失、添加或取代，这导致编码的蛋白质的功能发生变化。在一个实施方案中，功能获得性突变改变突变蛋白质的功能(例如，引起产生一种或多种sFLT1蛋白)或引起与其他蛋白质的相互作用。在另一个实施方案中，功能获得性突变导致正常野生型蛋白质的减少或去除，例如，通过改变的突变蛋白质与所述正常野生型蛋白质的相互作用。
如本文所用，术语“靶基因”是其表达将被基本上抑制或“沉默”的基因。这种沉默可以通过RNA沉默来实现，例如通过切割靶基因的mRNA或靶基因的翻译抑制。术语“非靶基因”是其表达基本上不会被沉默的基因。在一个实施方案中，靶基因和非靶基因的多核苷酸序列(例如，由靶基因(sFLT1)和非靶基因(flFLT1)编码的mRNA)可以相差一个或多个核苷酸，例如，在内含子区域。在另一个实施方案中，靶基因和非靶基因可以因一种或多种多态性(例如，单核苷酸多态性或SNP)而不同。在另一个实施方案中，靶基因和非靶基因可以共享小于100％的序列同一性。在另一个实施方案中，非靶基因可以是靶基因的同源物(例如直向同源物或旁系同源物)。
“靶等位基因”是其表达将被选择性抑制或“沉默”的等位基因(例如，SNP等位基因)。这种沉默可以通过RNA沉默来实现，例如，通过siRNA切割靶基因或靶等位基因的mRNA。术语“非靶等位基因”是其表达基本上不被沉默的等位基因。在某些实施方案中，靶和非靶等位基因可以对应于相同的靶基因。在其他实施方案中，靶等位基因对应于或与靶基因相关，并且非靶等位基因对应于或与非靶基因相关。在一个实施方案中，靶和非靶等位基因的多核苷酸序列可以相差一个或多个核苷酸。在另一个实施方案中，靶和非靶等位基因可以通过一个或多个等位基因多态性(例如，一个或多个SNP)而不同。在另一个实施方案中，靶等位基因和非靶等位基因可以共享小于100％的序列同一性。
如本文所用，术语“多态性”是指当对来自不同来源或受试者(但来自相同有机体)的相同基因序列进行比较时，鉴定或检测到的基因序列中的变化(例如，一或多个缺失、插入或取代)。例如，当比较来自不同受试者的相同基因序列时，可以鉴定出多态性。这种多态性的鉴定在本领域中是常规的，所述方法相似于用于检测例如乳腺癌点突变的那些。例如，可以从从受试者的淋巴细胞中提取的DNA进行鉴定，然后使用针对所述多态性区域的特异性引物扩增多态性区域。或者，当比较同一基因的两个等位基因时，可以鉴定多态性。在特定实施方案中，多态性是单核苷酸多态性(SNP)。
生物体内相同基因的两个等位基因之间的序列变化在本文中称为“等位基因多态性”。在某些实施方案中，等位基因多态性对应于SNP等位基因。例如，等位基因多态性可以包含SNP的两个等位基因之间的单核苷酸变异。多态性可以在编码区内的核苷酸处，但由于遗传密码的简并性，编码的氨基酸序列没有变化。或者，多态性序列可以在特定位置编码不同的氨基酸，但氨基酸的变化不会影响蛋白质功能。多态性区域也可以在基因的非编码区域中找到。在示例性实施方案中，在基因的编码区或基因的非翻译区(例如，5'UTR或3'UTR)中发现多态性。
如本文所用，术语“等位基因频率”是个体群体中单个基因座处等位基因(例如，SNP等位基因)的相对频率的量度(例如，比例或百分比)。例如，如果个体群体在他们的每个体细胞中携带特定染色体基因座的n个基因座(以及占据所述基因座的基因)，那么等位基因的等位基因频率是在所述群体内，等位基因占据的基因座的分数或百分比。在特定实施方案中，等位基因(例如，SNP等位基因)的等位基因频率在样品群体中为至少10％(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％或更多)。
如本文所用，术语“样本群体”是指包括统计学上显著数量的个体的个体群体。例如，样本群体可以包括50、75、100、200、500、1000或更多个体。在特定实施方案中，样品群体可以包括个体，所述个体至少具有共同的疾病表型(例如，功能获得性病症)或突变(例如，功能获得性突变)。
如本文所用，术语“杂合性”是指群体中在特定基因座(例如，在SNP处)杂合(例如，含有两个或更多个不同等位基因)的个体的分数。可以使用本领域技术人员熟知的方法计算样本群体的杂合性。
短语“检查细胞或生物体中基因的功能”是指检查或研究由此产生的表达、活性、功能或表型。
如本文所用，术语“RNA沉默剂”是指能够抑制或“沉默”靶基因表达的RNA。在某些实施方案中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制来阻止mRNA分子的完全加工(例如，完全翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括小(<50b.p.)、非编码RNA分子，例如包含成对链的RNA双链体，以及可以从中生成这种小的非编码RNA的前体RNA。示例性的RNA沉默剂包括siRNA、miRNA、siRNA样双链体和双功能寡核苷酸，以及它们的前体。在一个实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译抑制。
如本文所用，术语“稀有核苷酸”是指不经常出现的天然存在的核苷酸，包括不经常出现的天然存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，例如不是鸟苷、腺苷、胞嘧啶或尿苷的天然存在的核糖核苷酸。稀有核苷酸的实例包括但不限于肌苷、1-甲基肌苷、假尿苷、5,6-二氢尿苷、核胸苷、2N-甲基鸟苷和2,2N,N二甲基鸟苷。
如工程化RNA前体或工程化核酸分子中的术语“工程化”表示前体或分子在自然界中不存在，因为前体或分子的全部或部分核酸序列由人产生或选择。一旦产生或选择所述序列，就可以通过细胞内的机制复制、翻译、转录或以其他方式处理所述序列。因此，在细胞内由包括工程化核酸分子的转基因产生的RNA前体是工程化RNA前体。
如本文所用，术语“微小RNA”(“miRNA”)在本领域中也称为“时序小RNA”(“stRNA”)，是指遗传编码(例如，通过病毒、哺乳动物或植物基因组)，并且能够指导或介导RNA沉默的小(10-50个核苷酸)RNA。“miRNA病症”应指以miRNA的异常表达或活性为特征的疾病或病症。
如本文所用，术语“双功能寡核苷酸”是指具有式T-L-μ的RNA沉默剂，其中T是mRNA靶向部分，L是连接部分，μ是miRNA募集部分。如本文所用，术语“mRNA靶向部分(mRNAtargeting moiety)”、“靶向部分(targeting moiety)”、“mRNA靶向部分(mRNAtargeting portion)”或“靶向部分(targeting portion)”是指双功能寡核苷酸的结构域、部分或区域，所述双功能寡核苷酸的结构域、部分或区域具有足够的大小和与选择或靶向用于沉默的mRNA部分或区域的足够互补性(即，所述部分具有足以捕获靶mRNA的序列)。如本文所用，术语“连接部分(linking moiety)”或“连接部分(linking portion)”是指共价连结或连接mRNA的RNA沉默剂的结构域、部分或区域。
如本文所用，术语RNA沉默剂例如siRNA或RNA沉默剂的“反义链”是指与靶向用于沉默的基因的mRNA的约10-50个核苷酸例如约15-30、16-25、18-23或19-22个核苷酸的部分基本上互补的链。反义链或第一链具有与所需靶mRNA序列充分互补以指导靶特异性沉默的序列，例如足以触发RNAi机制或过程(RNAi干扰)破坏所需靶mRNA的互补性或足以触发所需靶mRNA的翻译抑制的互补性。
RNA沉默剂例如siRNA或RNA沉默剂的术语“有义链”或“第二链”是指与反义链或第一链互补的链。反义链和有义链也可以称为第一链或第二链，所述第一链或第二链与靶序列具有互补性，并且相应的第二链或第一链与所述第一链或第二链具有互补性。miRNA双链体中间体或siRNA样双链体包含与靶向沉默的基因的mRNA的约10-50个核苷酸的部分具有足够互补性的miRNA链和具有足够互补性以与miRNA链形成双链体的miRNA*链。
如本文所用，术语“引导链”是指RNA沉默剂的链，例如siRNA双链体或siRNA序列的反义链，其进入RISC复合物并指导靶mRNA的切割。
如本文所用，术语“不对称”，如在RNA沉默剂的双链体区域(例如，shRNA的茎)的不对称中，是指RNA沉默剂末端之间(例如，在第一链或茎部分上的末端核苷酸与相对的第二链或茎部分上的末端核苷酸之间)的键强度或碱基配对强度的不平等，使得与互补链的5'端相比，双链体的一条链的5'端更频繁地处于瞬时未配对状态，例如，单链状态。这种结构差异决定了双链体的一条链优先掺入RISC复合物中。5'末端与互补链配对较不紧密的链将优先掺入RISC并介导RNAi。
如本文所用，术语“键强度”或“碱基对强度”是指寡核苷酸双链体(例如，siRNA双链体)的相对链上的核苷酸(或核苷酸类似物)对之间相互作用的强度，主要由于所述核苷酸(或核苷酸类似物)之间的氢键、范德华相互作用等。
如本文所用，如反义链的5'端中的“5'端”是指在反义链的5'末端处的5'末端核苷酸，例如1个至约5个核苷酸之间。如本文所用，如有义链的3'端中的“3'端”是指与互补反义链5'端的核苷酸互补的区域，例如1至约5个核苷酸之间的区域。
如本文所用，术语“去稳定化核苷酸”是指能够与第二核苷酸或核苷酸类似物形成碱基对的第一核苷酸或核苷酸类似物，使得所述碱基对的键强度低于常规碱基对(即，Watson-Crick碱基对)。在某些实施方案中，去稳定核苷酸能够与第二核苷酸形成错配碱基对。在其他实施方案中，去稳定核苷酸能够与第二核苷酸形成摆动碱基对。在其他实施方案中，去稳定核苷酸能够与第二核苷酸形成模糊碱基对。
如本文所用，术语“碱基对”是指寡核苷酸双链体(例如，由RNA沉默剂的链和靶mRNA序列形成的双链体)的相对链上的核苷酸(或核苷酸类似物)对之间的相互作用，主要是由于所述核苷酸(或核苷酸类似物)之间的氢键、范德华相互作用等。如本文所用，术语“键强度”或“碱基对强度”是指碱基对的强度。
如本文所用，术语“错配碱基对”是指由非互补或非Watson-Crick碱基对组成的碱基对，例如，非正常互补G:C、A:T或者A:U碱基对。如本文所用，术语“模糊碱基对”(也称为非区分碱基对)是指由通用核苷酸形成的碱基对。
如本文所用，术语“通用核苷酸”(也称为“中性核苷酸”)包括具有在形成碱基对时不显著区分互补多核苷酸上碱基的碱基(“通用碱基”或“中性碱基”)的那些核苷酸(例如，某些去稳定核苷酸)。通用核苷酸主要是疏水性分子，由于堆叠相互作用，它们可以有效地组装成反平行双链核酸(例如，双链DNA或RNA)。通用核苷酸的碱基部分通常包含含氮芳族杂环部分。
如本文所用，术语“足够的互补性”或“足够程度的互补性”意指RNA沉默剂具有足以相应地结合所需靶RNA并且触发靶mRNA的RNA沉默的序列(例如，在反义链、mRNA靶向部分或miRNA募集部分中)。
如本文所用，术语“翻译抑制”是指对mRNA翻译的选择性抑制。自然的翻译抑制通过从shRNA前体上切割下来的miRNA进行。RNAi和翻译抑制均由RISC介导。RNAi和翻译抑制都是自然发生的，或可以由人工启动，例如，使靶基因的表达沉默。
本发明的各种方法包括涉及将值、水平、特征、特性、性质等与在本文中可互换地称为“适当对照”的“合适对照”进行比较的步骤。“合适对照”或“适当对照”是本领域普通技术人员熟悉的用于比较目的的任何对照或标准。在一个实施方案中，“合适对照”或“适当对照”是在进行如本文所述RNAi方法之前确定的值、水平、特征、特性、性质等。例如，可以在将本发明的RNA沉默剂引入细胞或生物体之前确定转录速率、mRNA水平、翻译速率、蛋白质水平、生物活性、细胞特征或性质、基因型、表型等。在另一个实施方案中，“合适对照”或“适当对照”是在显示例如正常特征的细胞或生物体(例如对照或正常细胞或生物体)中确定的值、水平、特征、特性、性质等。在又一个实施方案中，“合适对照”或“适当对照”是预定义的值、水平、特征、特性、性质等。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料相似或等效的方法和材料可以在本发明的实践或测试中使用，但以下描述合适的方法和材料。本文引用的所有专利、专利申请和其他参考文献通过引用以其整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和示例仅是说明性的而不是旨在限制。
在一些实施方案中，本发明的RNA沉默剂被设计为靶向编码一种或多种sFLT1蛋白的mRNA分子中的内含子区域。
本发明靶向一种或多种sFLT1 mRNA及其相应的蛋白质。双链RNA(siRNA)的一条链与sFLT1 mRNA内的靶序列互补。将siRNA引入受试者或细胞后，siRNA部分解旋，以位点特异性方式结合到sFLT1 mRNA内的内含子靶区域，并激活mRNA核酸酶。这种核酸酶切割sFLT1mRNA，从而停止sFLT1蛋白的翻译。细胞去除部分消化的mRNA，从而阻止翻译，或者细胞消化部分翻译的蛋白质。在某些实施方案中，受试者或细胞中的sFLT1蛋白表达降低约30％至50％，或约30％至40％。
在本发明的实施方案中，本发明的RNA沉默剂能够靶向人flt1基因，其可以在位置2283(5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA3'(SEQ ID NO:1))或2519((5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2))处发现。
在以下小节中更详细地描述了本发明的各个方面。
I.siRNA设计
在一些实施方案中，siRNA设计如下。首先，选择靶基因(例如，flt1基因)的一部分，例如，一个或多个靶序列，例如，靶基因内含子区域的sFLT1-i13-2283、sFLT1-i15a-2519、sFLT1-i13-2318、sFLT1-i15a-2585中的一个或任何组合。在这些位点切割mRNA应消除相应可溶性蛋白质的翻译。基于靶序列设计有义链。优选地，所述部分(以及相应有义链)包含约30至35个核苷酸，例如，30、31、32、33、34或35个核苷酸。更优选地，所述部分(以及相应有义链)包含21、22或23个核苷酸。然而，本领域技术人员将理解，长度小于19个核苷酸或大于25个核苷酸的siRNA也可以起到介导RNAi的作用。因此，这种长度的siRNA也在本发明的范围内，只要它们保留介导RNAi的能力。更长的RNAi剂已被证明会在某些哺乳动物细胞中引发干扰素或PKR响应，这可能是不希望的。优选地，本发明的RNAi剂不引发PKR响应(即，具有足够短的长度)。然而，较长的RNAi试剂可能有用，例如，在不能生成PRK响应的细胞类型中，或在PKR响应已被替代方法下调或抑制的情况下。
设计有义链序列，使得靶序列基本上位于链的中间。在一些情况下，将靶序列移动到偏离中心的位置可以降低siRNA的切割效率。如果检测到野生型mRNA的关闭沉默，则可能需要使用此类组合物，即效率较低的组合物。
反义链通常与有义链长度相同并且包含互补核苷酸。在一个实施方案中，链是完全互补的，即，链在对齐或退火时是平端的。在另一个实施方案中，链对齐或退火使得生成1、2或3核苷酸突出端，即，有义链的3'端比反义链的5'端延伸远1、2或3个核苷酸和/或反义链的3'端比有义链的5'端延伸远1、2或3个核苷酸。突出端可以包含对应于靶基因序列(或其互补序列)的核苷酸(或由其组成)。或者，突出端可包含脱氧核糖核苷酸，例如dT，或核苷酸类似物，或其他合适的非核苷酸材料(或由其组成)。
为了促进反义链进入RISC(从而增加或提高靶标切割和沉默的效率)，有义链5'端和反义链3'端之间的碱基对强度可以改变，例如，减弱或减少，如在标题为“Methods andCompositions for Controlling Efficacy of RNA Silencing”的美国专利号7,459,547、7,772,203和7,732,593(2003年6月2日提交)和标题为“Methods and Compositions forEnhancing the Efficacy and Specificity of RNAi”的美国专利号8,309,704、7,750,144、8,304,530、8,329,892和8,309,705(2003年6月2日提交)中详细描述的，其内容通过引用整体并入。在本发明的这些方面的一个实施方案中，由于与在第一或反义链的3'端与第二或有义链的5'端之间的G:C碱基对相比，在第一或反义链的5'端与第二或有义链的3'端之间的G:C碱基对更少，因此碱基对强度较小。在另一个实施方案中，碱基对强度较低是由于第一或反义链的5'端与第二或有义链的3'端之间至少有一个错配碱基对。在某些示例性实施方案中，错配碱基对选自下组：G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C和U:U。在另一个实施方案中，碱基对强度由于在第一或反义链的5'端和第二或有义链的3'端之间的至少一个摆动碱基对例如G:U而较小。在另一个实施方案中，碱基对强度较低是由于至少一个碱基对包含稀有核苷酸，例如肌苷(I)。在某些示例性实施方案中，碱基对选自由以下各项组成的组：I:A、I:U和I:C。在又一个实施方案中，碱基对强度较低是由于至少一个碱基对包含修饰的核苷酸。在某些示例性实施方案中，修饰的核苷酸选自由2-氨基-G、2-氨基-A、2,6-二氨基-G和2,6-二氨基-A组成的组。
下面详细描述了适合靶向sFLT1靶序列的siRNA的设计。可以根据以上示例性教导针对在flt1基因中发现的任何其他靶序列设计siRNA。此外，所述技术适用于靶向任何其他靶序列，例如非致病靶序列。
为了验证siRNA破坏mRNA(例如，sFLT1 mRNA)的有效性，可以在基于果蝇的体外mRNA表达系统中将siRNA与cDNA(例如，Flt1cDNA)一起孵育。用32P放射性标记的新合成的mRNA(例如，Flt1mRNA)在琼脂糖凝胶上通过放射自显影检测到。切割的mRNA的存在表明mRNA核酸酶活性。合适的对照包括省略siRNA。或者，选择具有与所选siRNA相同的核苷酸组成，但与适当靶基因没有显著序列互补性的对照siRNA。这种阴性对照可以通过随机打乱所选siRNA的核苷酸序列来设计；可以进行同源性搜索以确保阴性对照与适当基因组中的任何其他基因缺乏同源性。此外，可以通过将一个或多个碱基错配引入序列来设计阴性对照siRNA。
选择导致最佳mRNA特异性和最大mRNA切割的siRNA-mRNA互补位点。
II.RNAi剂
本发明包括例如如上所述设计的siRNA分子。本发明的siRNA分子可以化学合成，或可以从DNA模板体外转录，或从例如shRNA体内转录，或通过使用重组人DICER酶，将体外转录的dsRNA模板切割成介导RNAi的20、21或23-bp双链体RNA的池。可以使用本领域已知的任何方法设计siRNA分子。
在一个方面，RNAi试剂不是干扰核糖核酸，例如如上所述的siRNA或shRNA，而是RNAi试剂可以编码干扰核糖核酸，例如如上所述的shRNA。换言之，RNAi试剂可以是干扰核糖核酸的转录模板。因此，本发明的RNAi剂还可以包括小发夹RNA(shRNA)，和工程化以表达shRNA的表达构建体。shRNA的转录起始于聚合酶III(PolIII)启动子，并被认为终止于4-5-胸腺嘧啶转录终止位点的第2位。表达后，shRNA被认为折叠成具有3'UU突出端的茎环结构；随后，这些shRNA的末端被加工，将shRNA转化为大约21-23个核苷酸的siRNA样分子(Brummelkamp等人，2002；Lee等人，2002，同上；Miyagishi等人，2002；Paddison等人，2002，同上；Paul等人，2002，同上；Sui等人，2002同上；Yu等人，2002，同上。有关shRNA设计和使用的更多信息可以在internet上的以下地址找到：katandin.c shl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI_Strategy.pdf和katandin.cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR_strategy1.pdf)。
本发明的表达构建体包括适用于适当表达系统的任何构建体，并且包括但不限于本领域已知的逆转录病毒载体、线性表达盒、质粒和病毒或病毒衍生的载体。此类表达构建体可以包括一种或多种诱导型启动子、RNAPol III启动子系统，诸如U6 snRNA启动子或H1RNA聚合酶III启动子，或本领域已知的其他启动子。构建体可以包括一条或两条siRNA链。表达两条链的表达构建体还可以包括连接两条链的环结构，或者每条链可以从同一构建体中的不同启动子分别转录。每条链也可以从单独的表达构建体转录。(Tuschl,T.,2002,同上)。
可以通过本领域已知的方法将合成的siRNA递送到细胞中，包括阳离子脂质体转染和电穿孔。为了获得对靶基因(即，flt1基因)的长期抑制并在某些情况下促进递送，可以在细胞内从重组DNA构建体中表达一种或多种siRNA。此类用于在细胞内从重组DNA构建体表达siRNA双链体以允许在细胞中长期抑制靶基因的方法是本领域已知的，包括哺乳动物Pol III启动子系统(例如，能够表达功能性双链siRNA的H1或U6/snRNA启动子系统(Tuschl，T.，2002，同上)；(Bagella等人，1998；Lee等人，2002，同上；Miyagishi等人，2002，同上；Paul等人，2002，同上；Yu等人，2002，同上；Sui等人，2002，同上)。RNAPol III的转录终止在DNA模板中四个连续的T残基的运行中发生，提供了一种在特定序列处结束siRNA转录物的机制。siRNA与靶基因序列在5'-3'和3'-5'方向互补，siRNA的两条链可以在同一个构建体中表达，也可以在不同的构建体中表达。由H1或U6snRNA启动子驱动并在细胞中表达的发夹siRNA可以抑制靶基因表达(Bagella等人，1998；Lee等人，2002，同上；Miyagishi等人，2002，同上；Paul等人，2002，同上；Yu等人，2002，同上；Sui等人，2002，同上)。当与表达T7 RNA聚合酶的载体共转染到细胞中时，含有T7启动子控制下的siRNA序列的构建体也产生功能性siRNA(Jacque等人，2002，同上)。单个构建体可以含有编码靶向同一基因或多个基因的siRNA的多个序列，诸如编码sFlt1的基因的多个区域，并且可以由例如单独的PolIII启动子位点驱动。
动物细胞表达被称为微RNA(miRNA)的一系列大约22个核苷酸的非编码RNA，其可以在动物发育过程中调节转录后或翻译水平的基因表达。miRNA的一个共同特征是它们都从大约70个核苷酸的前体RNA茎环中切除，可能是由一种RNA酶III型酶Dicer或其同源物切除的。通过用与靶mRNA互补的序列替换miRNA前体的茎序列，表达工程化前体的载体构建体可用于产生siRNA，以启动针对哺乳动物细胞中特定mRNA靶的RNAi(Zeng等人,2002，同上)。当由含有聚合酶III启动子的DNA载体表达时，微RNA设计的发夹可以使基因表达沉默(McManus等人，2002，同上)。在没有siRNA介导的基因沉默的情况下，靶向多态性的微小RNA也可用于阻断突变蛋白的翻译。此类应用在某些情况下可能很有用，例如，设计的siRNA导致野生型蛋白质的脱靶沉默。
病毒介导的递送机制也可用于通过siRNA的表达来诱导靶基因的特异性沉默，例如，通过在RNAPol II启动子转录控制下产生含有siRNA的重组腺病毒(Xia等人，2002，同上)。这些重组腺病毒感染HeLa细胞可以减少内源性靶基因的表达。将重组腺病毒载体注射到表达siRNA靶基因的转基因小鼠中导致体内靶基因表达降低。同上。在动物模型中，全胚胎电穿孔可以有效地将合成的siRNA输送到植入后的小鼠胚胎中(Calegari等人，2002)。在成年小鼠中，siRNA的有效递送可以通过“高压”递送技术实现，即通过尾静脉将大量含有siRNA的溶液快速(在5秒内)注射到动物体内(Liu等人，1999，同上；McCaffrey等人，2002，同上；Lewis等人，2002。纳米颗粒和脂质体也可用于将siRNA输送到动物体内。在某些示例性实施方案中，重组腺相关病毒(rAAV)及其相关载体可用于将一种或多种siRNA递送到细胞中，例如神经细胞(例如脑细胞)(美国专利申请2014/0296486、2010/0186103、2008/0269149、2006/0078542和2005/0220766)。
本发明的核酸组合物包括如本领域已知的未修饰的siRNA和修饰的siRNA，诸如交联的siRNA衍生物或具有连接到例如它们的3'或5'端的非核苷酸部分的衍生物。与相应的siRNA相比，以这种方式修饰siRNA衍生物可以改善所得siRNA衍生物的细胞吸收或增强细胞靶向活性，可用于追踪细胞中的siRNA衍生物，或与相应的siRNA相比，提高siRNA衍生物的稳定性。
如本文所述引入细胞或整个生物体中的工程化RNA前体将导致所需siRNA分子的产生。然后，这样的siRNA分子将与RNAi途径的内源性蛋白质成分结合，以结合并靶向特定的mRNA序列以进行切割和破坏。以这种方式，由工程化RNA前体生成的siRNA靶向的mRNA将从细胞或生物体中耗尽，导致细胞或生物体中由此mRNA编码的蛋白质浓度降低。RNA前体通常是单独编码dsRNA的一条链或编码RNA发夹环结构的整个核苷酸序列的核酸分子。
本发明的核酸组合物可以是未缀合的或可以缀合至另一部分诸如纳米颗粒，以增强组合物的性质，例如药代动力学参数，诸如吸收、功效、生物利用度和/或半衰期。缀合可以通过本领域已知的方法实现，例如，使用以下中的方法：Lambert等人,Drug Deliv.Rev.:47(1),99-112(2001)(描述了加载到聚氰基丙烯酸烷酯(PACA)纳米颗粒的核酸)；Fattal等人,J.Control Release 53(1-3):137-43(1998)(描述了与纳米颗粒结合的核酸)；Schwab等人,Ann.Oncol.5Suppl.4:55-8(1994)(描述了与嵌入剂、疏水基团、聚阳离子或PACA纳米颗粒连接的核酸)；以及Godard等人,Eur.J.Biochem.232(2):404-10(1995)(描述了与纳米颗粒连接的核酸)。
本发明的核酸分子也可以使用本领域已知的任何方法进行标记。例如，核酸组合物可以用荧光团标记，例如Cy3、荧光素或罗丹明。可以使用试剂盒进行标记，例如SILENCERTM siRNA标记试剂盒(Ambion)。此外，siRNA可以被放射性标记，例如，使用3H、32P或其他适当的同位素。
此外，因为据信RNAi通过至少一种单链RNA中间体进行，本领域技术人员将理解ss-siRNA(例如，ds-siRNA的反义链)也可以被设计(例如，用于化学合成)、生成(例如，酶促生成)或如本文所述表达(例如，从载体或质粒)和根据要求保护的方法来使用。此外，在无脊椎动物中，RNAi可以被充当RNAi的效应物的长dsRNA(例如，长度约100-1000个核苷酸，优选地约200-500，例如，长度为约250、300、350、400或450个核苷酸的dsRNA)有效触发。(Brondani等人,Proc Natl Acad Sci USA.2001年12月4；98(25):14428-33.Epub 2001年11月27)。
III.抗sFlt1 RNA沉默剂
本发明的特征在于抗sFlt1 RNA沉默剂(例如，siRNA和shRNA)、制备所述RNA沉默剂的方法，以及使用所述改进的RNA沉默剂(或其部分)来RNA沉默一种或多种sFLT1蛋白的方法(例如，研究和/或治疗方法)。RNA沉默剂包含反义链(或其部分)，其中反义链与杂合单核苷酸多态性具有足够的互补性以介导RNA介导的沉默机制(例如RNAi)。
a)抗sFlt1 siRNA分子的设计
本发明的siRNA分子是由有义链和互补反义链组成的双链体，所述反义链与sFLT1mRNA具有足够的互补性以介导RNAi。优选地，siRNA分子具有约10-50个或更多个核苷酸的长度，即每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。更优选地，siRNA分子在每条链中具有约16-30，例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，其中一条链与靶区域充分互补。优选地，将链对齐使得链末端有至少1、2或3个碱基不对齐(即，在相对链中不出现针对所述碱基的互补碱基)，这样当链退火时，在双链体的一端或两端会出现1、2或3个残基的突出端。优选地，siRNA分子具有约10-50个或更多个核苷酸的长度，即每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。更优选地，siRNA分子在每条链中具有约16-30，例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度，其中一条链与靶序列基本上互补，而另一条链与第一条链同一或基本上同一。
通常，可以通过使用本领域已知的任何方法来设计siRNA，例如，通过使用以下方案：
1.siRNA应该对靶序列(例如，靶序列)具有特异性。在一个实施方案中，靶序列存在于可溶性Flt1 mRNA中，但不存在于全长Flt mRNA中。在另一个实施方案中，靶序列存在于可溶性Flt1 mRNA和全长Flt mRNA中。在另一个实施方案中，靶序列存在于全长Flt mRNA中。第一条链应与靶序列互补，而另一条链与第一条链基本上互补。在一个实施方案中，靶序列在一个或多个可溶性Flt mRNA序列的内含子区域中编码。示例性靶序列对应于靶基因的一个或多个内含子区域。在这些位点切割mRNA应消除相应可溶性蛋白质的翻译而不消除全长蛋白质的翻译。flt基因其他区域的靶序列也适用于靶向。基于靶序列设计有义链。此外，具有较低G/C含量(35-55％)的siRNA可能比那些G/C含量高于55％的siRNA更有活性。因此，在一个实施方案中，本发明包括具有35-55％的G/C含量的核酸分子。
2.siRNA的有义链是根据所选靶位点的序列设计的。优选地，有义链包含约19至25个核苷酸，例如19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。更优选地，有义链包含21、22或23个核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含16个核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含17个核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含18个核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含19个核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含20个核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含21个核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含22个核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含23个核苷酸。然而，本领域技术人员将理解，长度小于19个核苷酸或大于25个核苷酸的siRNA也可以起到介导RNAi的作用。因此，这种长度的siRNA也在本发明的范围内，只要它们保留介导RNAi的能力。更长的RNA沉默剂已被证明会在某些哺乳动物细胞中引发干扰素或蛋白激酶R(PKR)响应，这可能是不希望的。优选地，本发明的RNA沉默剂不引发PKR响应(即，具有足够短的长度)。然而，较长的RNA沉默剂可能有用，例如，在不能生成PRK响应的细胞类型中，或在PKR响应已被替代方法下调或抑制的情况下。
本发明的siRNA分子与靶序列具有足够的互补性，使得siRNA可以介导RNAi。一般来说，含有与靶基因的靶序列部分充分同一的核苷酸序列以实现RISC介导的靶基因切割的siRNA是优选的。因此，在一个优选的实施方案中，siRNA的有义链被设计成具有与靶标的一部分充分互补的序列。例如，有义链可以与靶位点具有100％的同一性。然而，不需要100％的同一性。有义链和靶RNA序列之间的大于80％的同一性，例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的同一性是优选的。本发明具有能够容忍某些序列变异以提高RNAi的效率和特异性的优点。在一个实施方案中，有义链与靶区域(诸如在可溶性flt1和全长flt1等位基因之间相差至少一个碱基对的靶区域，例如，包含功能获得性突变的靶区域)具有4、3、2、1或0个错配核苷酸，并且另一条链与第一链同一或基本上同一。此外，具有1个或2个核苷酸的小插入或缺失的siRNA序列也可能对介导RNAi有效。或者，具有核苷酸类似物取代或插入的siRNA序列可有效抑制。
序列同一性可以通过本领域已知的序列比较和比对算法来确定。为了确定两个核酸序列(或两个氨基酸序列)的百分比同一性，为了最佳比较目的比对序列(例如，可以在第一序列或第二序列中引入空位以实现最佳比对)。然后比较相应核苷酸(或氨基酸)位置的核苷酸(或氨基酸残基)。当第一个序列中的一个位置被与第二个序列中相应位置相同的残基占据时，则分子在此位置是同一的。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的同一位置数量的函数(即，％同源性＝同一位置的数量/位置总数x100)，任选择对引入的空位数量和/或引入的空位长度进行罚分。
可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定。在一个实施方案中，在具有足够同一性的所比对序列的特定部分上，但不是在具有低同一性程度的部分上产生比对(即，局部比对)。用于序列比较的局部比对算法的一个优选非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68的算法，修改于Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77中。这种算法被并入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLAST程序(2.0版)中。
在另一个实施方案中，通过引入适当的空位来优化比对并且在比对序列的长度上确定同一性百分比(即，空位比对)。为了获得有空位的比对以进行比较，可以使用GappedBLAST，如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所描述。在另一个实施方案中，通过引入适当的空位来优化比对并且在比对序列的整个长度上确定同一性百分比(即，全局比对)。用于序列全局比较的数学算法的一个优选非限制性实例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。这种算法被合并到ALIGN程序(2.0版)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120重量残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。
3.siRNA的反义链或引导链通常与有义链长度相同，并且包含互补核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链长于有义链。在一些实施方案中，反义链或引导链短于有义链。在一些实施方案中，反义链或引导链包含约19至25个核苷酸，例如19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链包含21、22或23个核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链包含16个核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链包含17个核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链包含18个核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链包含19个核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链包含20个核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链包含21个核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链包含22个核苷酸。在一些实施方案中，反义链或引导链包含23个核苷酸。
在一个实施方案中，引导链和有义链是完全互补的，即，链在对齐或退火时是平端的。在另一个实施方案中，siRNA的链可以以具有1至4个，例如2个核苷酸的3'突出端的方式配对。在一些实施方案中，3'突出端为1个核苷酸。在一些实施方案中，3'突出端为2个核苷酸。在一些实施方案中，3'突出端为3个核苷酸。在一些实施方案中，3'突出端为4个核苷酸。在一些实施方案中，3'突出端为5个核苷酸。突出端可以包含对应于靶基因序列(或其互补序列)的核苷酸(或由其组成)。或者，突出端可包含脱氧核糖核苷酸，例如dT，或核苷酸类似物，或其他合适的非核苷酸材料(或由其组成)。因此，在另一个实施方案中，核酸分子可以具有2个核苷酸的3'突出端，诸如TT。突出的核苷酸可以是RNA或DNA。如上所述，希望选择一个靶区域，其中突变:野生型错配是嘌呤:嘌呤错配。
4.使用本领域已知的任何方法，将潜在靶标与适当的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，并从考虑中排除与其他编码序列具有显著同源性的任何靶序列。用于此类序列同源性搜索的一种此类方法称为BLAST，可在国家生物技术信息中心网站获得。
5.选择一个或多个符合评估标准的序列。
有关siRNA的设计和使用的更多一般信息可以在The Max-Plank-Institut furBiophysikalishe Chemie网站上的“The siRNAUser Guide”中找到。
或者，siRNA可以在功能上定义为能够与靶序列杂交的核苷酸序列(或寡核苷酸序列)(例如，400mM NaCl、pH为6.4的40mM PIPES、1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时；然后洗涤)。其他优选的杂交条件包括70℃在1xSSC中或50℃在1xSSC，50％甲酰胺中的杂交，然后70℃在0.3xSSC中洗涤或70℃在4xSSC或50℃在4xSSC，50％甲酰胺中的杂交，然后67℃在1xSSC中洗涤。预计长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应比杂交体的解链温度(Tm)低5-10℃，其中Tm根据以下等式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基的数目)+4(G+C碱基的数目)。对于长度在18与49个碱基对之间的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log 10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数，并且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1xSSC的[Na+]＝0.165M)。用于多核苷酸杂交的严格性条件的其他实例提供于Sambrook,J.,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,第9和11章和Current Protocols in Molecular Biology,1995,F.M.Ausubel等人编,John Wiley&Sons,Inc.,第2.10和6.3-6.4节，所述文献通过引用并入本文。
阴性对照siRNA应与选定的siRNA具有相同的核苷酸组成，但与适当的基因组没有显著的序列互补性。这种阴性对照可以通过随机打乱所选siRNA的核苷酸序列来设计。可以进行同源性搜索以确保阴性对照与适当基因组中的任何其他基因缺乏同源性。此外，可以通过将一个或多个碱基错配引入序列来设计阴性对照siRNA。
6.为了验证siRNA破坏靶mRNA(例如，对应于可溶性FLT1的sFLT1 mRNA)的有效性，可以在基于果蝇的体外mRNA表达系统中将siRNA与靶cDNA(例如，flt1 cDNA)一起孵育。用32P放射性标记的新合成的靶mRNA(例如，sFlt1 mRNA)在琼脂糖凝胶上通过放射自显影检测到。切割的靶mRNA的存在表明mRNA核酸酶活性。合适的对照包括省略siRNA和使用非靶cDNA。或者，选择具有与所选siRNA相同的核苷酸组成，但与适当靶基因没有显著序列互补性的对照siRNA。这种阴性对照可以通过随机打乱所选siRNA的核苷酸序列来设计。可以进行同源性搜索以确保阴性对照与适当基因组中的任何其他基因缺乏同源性。此外，可以通过将一个或多个碱基错配引入序列来设计阴性对照siRNA。
可以设计抗sflt1 siRNA以靶向上文描述的任何靶序列。所述siRNA包含反义链，其与靶序列充分互补以介导靶序列的沉默。在某些实施方案中，RNA沉默剂是siRNA。
选择导致最佳mRNA特异性和最大mRNA切割的siRNA-mRNA互补位点。
b)siRNA样分子
本发明的siRNA样分子具有与sflt1 mRNA的靶序列“充分互补”的序列(即，具有具有序列的链)以通过RNAi或翻译抑制指导基因沉默。siRNA样分子与siRNA分子以相同方式设计，但有义链和靶RNA之间的序列同一性程度接近miRNA与其靶标之间观察到的序列同一性程度。一般来说，随着miRNA序列和相应靶基因序列之间序列同一性程度的降低，通过翻译抑制而不是RNAi介导转录后基因沉默的趋势会增加。因此，在另一个实施方案中，在需要通过靶基因的翻译抑制来进行转录后基因沉默的情况下，miRNA序列与靶基因序列具有部分互补性。在某些实施方案中，miRNA序列与分散在靶mRNA内(例如，在靶mRNA的3'-UTR内)的一个或多个短序列(互补性位点)具有部分互补性(Hutvagner和Zamore,Science,2002；Zeng等人,Mol.Cell,2002；Zeng等人,RNA,2003；Doench等人,Genes&Dev.,2003)。由于翻译抑制机制是合作的，因此在某些实施方案中可以靶向多个互补位点(例如，2、3、4、5或6个)。
siRNA样双链体介导RNAi或翻译抑制的能力可以通过靶基因序列和沉默剂的核苷酸序列之间的不同核苷酸在互补位点处的分布来预测。在一个实施方案中，在需要通过翻译抑制进行基因沉默的情况下，互补位点的中心部分存在至少一个不同一的核苷酸，使得由miRNA引导链和靶mRNA形成的双链体含有中心“凸起”(Doench J G等人,Genes&Dev.,2003)。在另一个实施方案中，引入了2、3、4、5或6个连续或不连续的不同核苷酸。可以选择不同一的核苷酸以使其形成摆动碱基对(例如，G:U)或不匹配的碱基对(G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C、U:U)。在进一步优选的实施方案中，“凸起”位于miRNA分子5'端的核苷酸位置12和13处。
c)短发夹RNA(shRNA)分子
在某些特征实施方案中，本发明提供了能够以增强的选择性介导sFlt1靶序列的RNA沉默的shRNA。与siRNA相比，shRNA模仿微小RNA(miRNA)的天然前体并进入基因沉默途径的顶端。出于这个原因，人们认为shRNA可以通过整个天然基因沉默途径更有效地介导基因沉默。
miRNA是大约22个核苷酸的非编码RNA，其可以在植物和动物发育过程中调节转录后或翻译水平的基因表达。miRNA的一个共同特征是它们都从被称为前miRNA的大约70个核苷酸的前体RNA茎环中切除，可能是由一种RNA酶III型酶Dicer或其同源物切除的。天然存在的miRNA前体(前miRNA)具有形成双链体茎的单链，所述双链体茎包括通常互补的两个部分，以及连接茎的两个部分的环。在典型的前miRNA中，茎包含一个或多个凸起，例如在茎的一部分中产生单个核苷酸“环”的额外核苷酸，和/或一个或多个未配对的核苷酸，它们在茎的两个部分相互杂交时产生空位。本发明的短发夹RNA或工程化RNA前体是基于这些天然存在的前miRNA的人工构建体，但其被工程化以递送所需的RNA沉默剂(例如，本发明的siRNA)。通过用与靶mRNA互补的序列替换前miRNA的茎序列，形成shRNA。shRNA通过细胞的整个基因沉默途径进行加工，从而有效地介导RNAi。
shRNA分子的必需元件包括第一部分和第二部分，它们具有足够的互补性以退火或杂交以形成双链体或双链茎部分。这两个部分不需要完全或完美地互补。第一和第二“茎”部分由具有序列的部分连接，所述序列的序列互补性不足以与shRNA的其他部分退火或杂交。后一部分被称为shRNA分子中的“环”部分。shRNA分子被加工以生成siRNA。shRNA还可以包括一个或多个凸起，即在茎的一部分中产生小核苷酸“环”(例如一、二或三核苷酸环)的额外核苷酸。茎部分可以是相同的长度，或者一个部分可以包括例如1-5个核苷酸的突出端。突出核苷酸可以包括例如尿嘧啶(U)，例如所有U。此类U尤其是由shRNA编码DNA中的胸苷(T)编码，它发出转录终止的信号。
在本发明的shRNA(或工程化的前体RNA)中，双链体茎的一部分是与sFlt1靶序列互补(或反义)的核酸序列。优选地，shRNA的茎部分的一条链与靶RNA(例如，mRNA)序列充分互补(例如，反义)以通过RNA干扰(RNAi)介导所述靶RNA的降解或切割。因此，工程化的RNA前体包括具有两个部分的双链体茎和连接两个茎部分的环。反义部分可以在茎的5'或3'端。shRNA的茎部分长度优选地为约15至约50个核苷酸。优选地，两个茎部分长度为约18或19至约21、22、23、24、25、30、35、37、38、39或40个或更多个核苷酸。在某些优选的实施方案中，茎部分的长度应为21个核苷酸或更大。当用于哺乳动物细胞时，茎部分的长度应小于约30个核苷酸，以避免引起干扰素途径等非特异性响应。在非哺乳动物细胞中，茎可以长于30个核苷酸。事实上，茎可以包括与靶mRNA互补的更大的部分(直到并包括整个mRNA)。事实上，茎部分可以包括与靶mRNA互补的更大的部分(直到并包括整个mRNA)。
双链体茎的两个部分必须充分互补才能杂交形成双链体茎。因此，这两个部分可以但是不需要完全或完美地互补。此外，两个茎部分可以具有相同的长度，或者一个部分可以包括1、2、3或4个核苷酸的突出端。突出核苷酸可以包括例如尿嘧啶(U)，例如所有U。shRNA或工程化RNA前体中的环可以通过修饰环序列以增加或减少配对核苷酸的数量，或用四环或其他环序列替换环序列的全部或部分来不同于天然的前miRNA序列。因此，shRNA或工程化RNA前体中的环长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9或更多个，例如15或20或更多个核苷酸。
shRNA或工程化RNA前体中的环可以通过修饰环序列以增加或减少配对核苷酸的数量，或用四环或其他环序列替换环序列的全部或部分来不同于天然的前miRNA序列。因此，shRNA中的环部分的长度可为约2至约20个核苷酸，即约2、3、4、5、6、7、8、9或更多，例如15或20或更多核苷酸长度。优选的环由“四环”序列组成或包含“四环”序列。示例性四环序列包括但不限于序列GNRA、GGGG和UUUU，其中N是任何核苷酸并且R是嘌呤核苷酸。
在某些实施方案中，本发明的shRNA包括上文所述的所需siRNA分子的序列。在其他实施方案中，shRNA的反义部分的序列可以基本上如上所述设计，或者通常通过从靶RNA(例如，sflt1 mRNA)中，例如，从翻译开始上游或下游的100至200或300个核苷酸的区域选择18、19、20、21个核苷酸或更长的序列来设计。一般来说，所述序列可以选自靶RNA(例如，mRNA)的任何部分，包括内含子区域、5'UTR(非翻译区)、编码序列或3'UTR，前提是所述部分远离功能获得性突变的位点。此序列可以任选地紧跟在包含两个相邻AA核苷酸的靶基因区域之后。核苷酸序列的最后两个核苷酸可以选择为UU。这21个左右的核苷酸序列用于产生shRNA中的双链体茎的一个部分。此序列可以例如酶促地替代野生型前miRNA序列的茎部分，或包含在合成的完整序列中。例如，可以合成DNA寡核苷酸，所述寡核苷酸编码整个茎环工程化RNA前体，或仅编码要插入前体双链体茎中的部分，并使用限制性内切酶，例如从野生型前miRNA来构建工程化RNA前体构建体。
在双链体茎中，工程化RNA前体包含希望在体内产生的siRNA或siRNA样双链体的21-22个左右的核苷酸序列。因此，工程化RNA前体的茎部分包括至少18或19个核苷酸对，对应于其表达将被降低或抑制的基因的外显子部分的序列。选择位于茎的此区域两侧的两个3'核苷酸，以便最大限度地从工程RNA前体产生siRNA，并最大限度地提高所得siRNA在体内和体外靶向相应mRNA以便进行翻译抑制或通过RNAi来破坏的功效。
在某些实施方案中，本发明的shRNA包括miRNA序列，任选末端修饰的miRNA序列，以增强进入RISC。miRNA序列可以与任何天然存在的miRNA的序列相似或同一(参见例如ThemiRNARegistry；Griffiths-Jones S,Nuc.Acids Res.,2004)。迄今为止，已鉴定出超过一千种天然miRNA，它们一起被认为包括约1％基因组中所有预测的基因。许多天然miRNA在前mRNA的内含子中聚集在一起，并且可以使用基于同源性的搜索(Pasquinelli等人，2000；Lagos-Quintana等人，2001；Lau等人，2001；Lee和Ambros，2001)或预测候选miRNA基因形成初级mRNA的茎环结构的能力的计算机算法(例如，MiRScan、MiRSeeker)在计算机上进行鉴定(Grad等人,Mol.Cell.,2003；Lim等人,Genes Dev.,2003；Lim等人,Science,2003；Lai EC等人,Genome Bio.,2003)。在线注册提供了所有已发表的miRNA序列的可搜索数据库(Sanger研究所网站上的miRNARegistry；Griffiths-Jones S，Nuc.Acids Res.,2004)。示例性的天然miRNA包括lin-4、let-7、miR-10、mirR-15、miR-16、miR-168、miR-175、miR-196及其同源物，以及来自人和某些模式生物的其他天然miRNA，所述模式生物包括黑腹果蝇、秀丽隐杆线虫、斑马鱼、拟南芥、小家鼠和褐家鼠，如国际PCT公开号WO 03/029459中所述。
天然存在的miRNA在体内由内源基因表达，并由Dicer或其他RNA酶从发夹或茎环前体(前miRNA或初级miRNA)加工而得(Lagos-Quintana等人,Science,2001；Lau等人,Science,2001；Lee和Ambros,Science,2001；Lagos-Quintana等人,Curr.Biol.,2002；Mourelatos等人,Genes Dev.,2002；Reinhart等人,Science,2002；Ambros等人,Curr.Biol.,2003；Brennecke等人,2003；Lagos-Quintana等人,RNA,2003；Lim等人,GenesDev.,2003；Lim等人,Science,2003)。miRNA可以作为双链体短暂存在于体内，但只有一条链被RISC复合物吸收以指导基因沉默。某些miRNA，例如植物miRNA，与其靶mRNA具有完美或接近完美的互补性，因此直接切割靶mRNA。其他miRNA与其靶mRNA不完全互补，因此直接翻译抑制靶mRNA。认为miRNA与其靶mRNA之间的互补程度决定了其作用机制。例如，miRNA与其靶mRNA之间的完美或接近完美的互补性预示着一种切割机制(Yekta等人，Science，2004)，而非完美的互补性预示着一种翻译抑制机制。在特定实施方案中，miRNA序列是天然存在的miRNA序列的序列，其异常表达或活性与miRNA病症相关。
d)双功能寡核苷酸系链
在其他实施方案中，本发明的RNA沉默剂包括可用于细胞间募集miRNA的双功能寡核苷酸系链。动物细胞表达一系列miRNA，即约22个核苷酸的非编码RNA，可在动物发育过程中调节转录后或翻译水平的基因表达。通过结合与RISC结合的miRNA并将其募集到靶mRNA，双功能寡核苷酸系链可以抑制涉及例如动脉硬化过程的基因的表达。与抑制特定基因的表达的现有技术相比，寡核苷酸系链的使用提供了几个优势。首先，本文所述的方法允许内源性分子(通常大量存在)miRNA来介导RNA沉默。因此，本文所述的方法消除了引入外源分子(例如，siRNA)以介导RNA沉默的需要。其次，可以使RNA沉默剂和特别地连接部分(例如，诸如2'-O-甲基寡核苷酸的寡核苷酸)稳定并且对核酸酶活性具有抗性。因此，本发明的系链可以设计用于直接递送，消除了对设计成在细胞内制造所需试剂的前体分子或质粒的间接递送(例如病毒)的需要。第三，系链及其各自的部分可以设计为符合特定的mRNA位点和特定的miRNA。设计可以是细胞和基因产品特异性的。第四，本文公开的方法使mRNA保持完整，允许本领域技术人员使用细胞自身的机制在短脉冲中阻断蛋白质合成。因此，这些RNA沉默方法是高度可调节的。
本发明的双功能寡核苷酸系链(“系链”)被设计成使得它们将miRNA(例如，内源性细胞miRNA)募集到靶mRNA上，从而诱导所关注的基因的调节。在优选的实施方案中，系链具有式T-L-μ，其中T是mRNA靶向部分，L是连接部分，并且μ是miRNA募集部分。任何一个或多个部分可以是双链的。然而，优选地，每个部分都是单链的。
系链内的部分可以排列或连接(在5'到3'方向)，如式T-L-μ所示(即，靶向部分的3'端连接到连接部分的5'端，并且连接部分的3'端连接到miRNA募集部分的5'端)。或者，所述部分可以如下排列或连接在系链中：μ-T-L(即，miRNA募集部分的3'端连接到连接部分的5'端，并且连接部分的3'端连接到靶向部分的5'端)。
如上所述，mRNA靶向部分能够捕获特定的靶mRNA。根据本发明，靶mRNA的表达是不期望的，因此，mRNA的翻译抑制是期望的。mRNA靶向部分的大小应足以有效结合靶mRNA。靶向部分的长度变化很大，部分取决于靶mRNA的长度以及靶mRNA和靶向部分之间的互补程度。在各种实施方案中，靶向部分小于约200、100、50、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6，或5个核苷酸长度。在特定实施方案中，靶向部分的长度为约15至约25个核苷酸。
如上所述，miRNA募集部分能够与miRNA结合。根据本发明，miRNA可以是任何能够抑制靶mRNA(例如，一个或多个sflt1 mRNA)的miRNA。据报道，哺乳动物具有250多种内源性miRNA(Lagos-Quintana等人(2002)Current Biol.12:735-739；Lagos-Quintana等人(2001)Science 294:858-862；以及Lim等人(2003)Science 299:1540)。在各种实施方案中，miRNA可以是任何本领域公认的miRNA。
连接部分是能够连接靶向部分从而维持靶向部分的活性的任何试剂。连接部分优选地是包含足够数量的核苷酸的寡核苷酸部分，使得靶向剂可以与它们各自的靶标充分相互作用。连接部分与细胞mRNA或miRNA序列几乎没有序列同源性或没有序列同源性。示例性连接部分包括一种或多种2'-O-甲基核苷酸，例如2'-β-甲基腺苷、2'-O-甲基胸苷、2'-O-甲基鸟苷或2'-O-甲基尿苷。
e)基因沉默寡核苷酸
在某些示例性实施方案中，可以使用基于寡核苷酸的化合物调节基因表达(即，sflt1基因表达)，所述化合物包含两个或更多个单链反义寡核苷酸，所述单链反义寡核苷酸通过它们的5'端连接，允许存在两个或更多个可接近的3'端以有效抑制或降低sflt1基因表达。这种连接的寡核苷酸也称为基因沉默寡核苷酸(GSO)。(参见，例如，转让给IderaPharmaceuticals,Inc.的US 8,431,544，出于所有目的通过引用将其全部并入本文。)
GSO 5'端的键独立于其他寡核苷酸键，并且可以直接通过5'、3'或2'羟基，或间接通过非核苷酸接头或核苷，所述核苷利用核苷的2'或3'羟基位置。键也可以利用5'末端核苷酸的功能化糖或核碱基。
GSO可以包含两个同一或不同的序列，在它们的5'-5'末端通过磷酸二酯、硫代磷酸酯或非核苷接头缀合。此类化合物可以包含15至27个核苷酸，这些核苷酸与所关注的mRNA靶标的特定部分互补，用于基因产物的反义下调。包含同一序列的GSO可以通过Watson-Crick氢键相互作用与特定的mRNA结合并抑制蛋白质表达。包含不同序列的GSO能够结合一个或多个mRNA靶标的两个或多个不同区域并抑制蛋白质表达。此类化合物由与靶mRNA互补的异核苷酸序列组成，并通过Watson-Crick氢键形成稳定的双链结构。在某些条件下，含有两个游离3'-末端(5'-5'反义连接)的GSO可能比那些含有单个游离3'-末端或没有游离3'-末端的GSO更有效地抑制基因表达。
在一些实施方案中，非核苷酸接头是式HO--(CH2)o--CH(OH)--(C H2)p--OH的甘油或甘油同源物，其中o和p独立地是整数1至约6、1至约4或1至约3。在一些其他实施方案中，非核苷酸接头是1,3-二氨基-2-羟基丙烷的衍生物。一些这样的衍生物具有分子式HO--(CH2)m--C(O)NH--CH2--CH(OH)--CH2--NHC(O)--(CH2)m--OH，其中m是0至约10、0至约6、2至约6或2至约4的整数。
一些非核苷酸接头允许连接两个以上的GSO组分。例如，非核苷酸接头甘油具有三个羟基，GSO组分可以共价连接到这些羟基上。因此，本发明的一些基于寡核苷酸的化合物包含连接到核苷酸或非核苷酸接头的两个或更多个寡核苷酸。根据本发明的此类寡核苷酸被称为“分支的”。
在某些实施方案中，GSO的长度至少为14个核苷酸。在某些示例性实施方案中，GSO的长度为15至40个核苷酸或20至30个核苷酸。因此，GSO的组分寡核苷酸可以独立地为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸长度。
这些寡核苷酸可以通过本领域公认的方法制备，诸如氨基磷酸酯或H-膦酸酯化学，其可以手动或通过自动合成仪进行。这些寡核苷酸也可以通过多种方式进行修饰，而不会损害它们与mRNA杂交的能力。此类修饰可以包括寡核苷酸的至少一个核苷酸间键，其为烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸羟基、乙酰胺酯、羧甲基酯，或在一个核苷酸的5'端和另一个核苷酸的3'端之间的这些和其他核苷酸间键的组合，其中5'核苷酸磷酸二酯键已被任意数量的化学基团取代。
IV.修饰的抗sFlt1 RNA沉默剂
在本发明的某些方面，如上文所述，本发明的RNA沉默剂(或其任何部分)可以被修饰，使得进一步提高此剂的活性。例如，本文中描述的RNA沉默剂可以用下文描述的任何修饰来修饰。修饰可以部分地用于进一步增强靶标区分、增强试剂的稳定性(例如，防止降解)、促进细胞吸收、提高靶标效率、提高结合(例如，与靶标的结合)的功效、提高患者对药物的耐受性，和/或减少毒性。
在某些实施方案中，提供了具有以下特性中的一种或任何组合的siRNA化合物：(1)完全化学稳定(即，没有未修饰的2'-OH残基)；(2)不对称性；(3)11-16碱基对双链体；(4)化学修饰核苷酸的交替模式(例如，2'-氟和2'-甲氧基修饰)或富含2'-甲氧基的模式(反义链中超过50％的2'-甲氧基和有义链中超过65％的2'-甲氧基)；以及(5)5-8个碱基的单链、完全硫代磷酸化的尾部。在不同的实施方案中，硫代磷酸酯修饰的数量在总共6至17个之间变化。
具有上文和本文所述的结构特性的本发明的某些化合物可以被称为“hsiRNA-ASP”(特征为先进的稳定模式的疏水修饰的小干扰RNA)。此外，这种hsiRNA-ASP模式显示出在大脑、脊髓、肝脏、胎盘、肾脏、脾脏和其他几个组织中的分布显著改善，使其可用于治疗介入。
在肝脏中，hsiRNA-ASP特异性递送至内皮细胞和kupper细胞，而不是肝细胞，使得这种化学修饰模式与GalNac缀合物互补而不是竞争技术。
本发明的化合物可以在以下方面和实施方案中进行描述。
在第一方面，本文提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQ IDNO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和20中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含至少65％的2'-O-甲基修饰；(9)有义链5'端的位置4、6、8、10和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；并且(10)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在本公开第一方面的一个实施方案中，反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和20处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸，并且有义链5'端的位置4、6、8、10和14处的核苷酸不是2'-甲氧基核糖核苷酸。
在本公开第一方面的一个实施方案中，反义链长度为21个核苷酸，并且有义链长度为16个核苷酸。
在本公开第一方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAAAUUUGGAGAUCCGAGAGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'CGGAUCUCCAAAUUUA 3'的核酸序列。
在本公开第一方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAUAAAUGGUAGCUAUGAUGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'AUAGCUACCAUUUAUA 3'的核酸序列。
在本公开第一方面的一个实施方案中，反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
在第二方面，本文提供了一种双链RNA(dsRNA)，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQ ID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链包含交替的2'-甲氧基-核糖核苷酸和2'-氟-核糖核苷酸；(3)反义链5'端的位置2和14处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(4)反义链3'端的位置1-2至1-7处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(5)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(6)有义链包含交替的2'-甲氧基-核糖核苷酸和2'-氟-核糖核苷酸；并且(7)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在本公开第二方面的一个实施方案中，反义链长度为21个核苷酸，并且有义链长度为16个核苷酸。
在本公开第二方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAAAUUUGGAGAUCCGAGAGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'CGGAUCUCCAAAUUUA 3'的核酸序列。
在本公开第二方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAUAAAUGGUAGCUAUGAUGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'AUAGCUACCAUUUAUA 3'的核酸序列。
在本公开第二方面的一个实施方案中，反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
在第三方面，本文提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQ IDNO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和18中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含至少80％的2'-O-甲基修饰；(9)有义链5'端的位置7、9和11中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；并且(10)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在本公开第三方面的一个实施方案中，反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和18处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸，并且有义链5'端的位置7、9和11处的核苷酸不是2'-甲氧基核糖核苷酸。
在本公开第三方面的一个实施方案中，反义链长度为21个核苷酸，并且有义链长度为16个核苷酸。
在本公开第三方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAAAUUUGGAGAUCCGAGAGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'CGGAUCUCCAAAUUUA 3'的核酸序列。
在本公开第三方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAUAAAUGGUAGCUAUGAUGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'AUAGCUACCAUUUAUA 3'的核酸序列。
在本公开第三方面的一个实施方案中，反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
在第四方面，本文提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQ IDNO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少70％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6、8和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含100％的2'-O-甲基修饰；并且(9)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在本公开第四方面的一个实施方案中，反义链5'端的位置2、4、5、6、8和14处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸。
在本公开第四方面的一个实施方案中，反义链长度为21个核苷酸，并且有义链长度为16个核苷酸。
在本公开第四方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAAAUUUGGAGAUCCGAGAGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'CGGAUCUCCAAAUUUA 3'的核酸序列。
在本公开第四方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAUAAAUGGUAGCUAUGAUGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'AUAGCUACCAUUUAUA 3'的核酸序列。
在本公开第四方面的一个实施方案中，反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
在第五方面，本文提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQ IDNO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少75％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2、4、5、6和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含100％的2'-O-甲基修饰；并且(9)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在本公开第五方面的一个实施方案中，反义链5'端的位置2、4、5、6和14处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸。
在本公开第五方面的一个实施方案中，反义链长度为21个核苷酸，并且有义链长度为16个核苷酸。
在本公开第五方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAAAUUUGGAGAUCCGAGAGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'CGGAUCUCCAAAUUUA 3'的核酸序列。
在本公开第五方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAUAAAUGGUAGCUAUGAUGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'AUAGCUACCAUUUAUA 3'的核酸序列。
在本公开第五方面的一个实施方案中，反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
在第六方面，本文提供了一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：(1)反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQ IDNO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；(2)反义链长度为至少20个核苷酸；(3)反义链包含至少85％的2'-O-甲基修饰；(4)反义链5'端的位置2和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；(5)反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；(6)反义链的一部分与有义链的一部分互补；(7)有义链长度为至少15个核苷酸；(8)有义链包含100％的2'-O-甲基修饰；并且(9)有义链5'端的位置1-2处的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
在本公开第六方面的一个实施方案中，反义链5'端的位置2和14处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸。
在本公开第六方面的一个实施方案中，反义链长度为21个核苷酸，并且有义链长度为16个核苷酸。
在本公开第六方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAAAUUUGGAGAUCCGAGAGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'CGGAUCUCCAAAUUUA 3'的核酸序列。
在本公开第六方面的一个实施方案中，反义链包含5'UAUAAAUGGUAGCUAUGAUGA 3'的核酸序列，并且有义链包含5'AUAGCUACCAUUUAUA 3'的核酸序列。
在本公开第六方面的一个实施方案中，反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
在本公开的第一至第六方面中任一个的实施方案中，有义链的3'端通过C7氨基接头和dTdT可切割接头连接至PC-DCA(磷酸胆碱-二十二烷酸)。
1)增强靶识别的修饰
在某些实施方案中，本发明的RNA沉默剂可以用不稳定核苷酸取代，以增强单核苷酸靶标鉴别(参见2007年1月25日提交的美国申请序列号11/698,689和2006年1月25日提交的美国临时申请号60/762,225，两者均通过引用并入本文)。这种修饰可能足以消除RNA沉默剂对非靶mRNA(例如野生型mRNA)的特异性，而不会明显影响RNA沉默剂对靶mRNA(例如功能获得性突变体mRNA)的特异性。
在优选的实施方案中，本发明的RNA沉默剂通过在其反义链中引入至少一种通用核苷酸来修饰。通用核苷酸包含能够与四种常规核苷酸碱基(例如A、G、C、U)中的任何一种进行碱基配对的碱基部分。通用核苷酸是优选的，因为它对RNA双链体或由RNA沉默剂的引导链和靶mRNA形成的双链体的稳定性具有相对较小的影响。示例性的通用核苷酸包括具有肌苷碱基部分或肌苷类似物碱基部分的那些，所述肌苷碱基部分或肌苷类似物碱基部分选自由以下各项组成的组：脱氧肌苷(例如2'-脱氧肌苷)、7-脱氮杂-2'-脱氧肌苷、2'-氮杂-2'-脱氧肌苷、PNA-肌苷、吗啉代-肌苷、LNA-肌苷、氨基磷酸酯-肌苷、2'-O-甲氧基乙基-肌苷和2'-OMe-肌苷。在特别优选的实施方案中，通用核苷酸是肌苷残基或其天然存在的类似物。
在某些实施方案中，本发明的RNA沉默剂通过在距特异性决定核苷酸(即，识别疾病相关多态性的核苷酸)5个核苷酸内引入至少一个不稳定核苷酸来修饰。例如，去稳定化核苷酸可以在距特异性决定核苷酸5、4、3、2或1个核苷酸以内的位置引入。在示例性实施方案中，去稳定核苷酸在距特异性决定核苷酸3个核苷酸的位置处引入(即，使得在去稳定核苷酸和特异性决定核苷酸之间存在2个稳定核苷酸)。在具有两条链或链部分的RNA沉默剂(例如siRNA和shRNA)中，去稳定化核苷酸可被引入不包含特异性决定核苷酸的链或链部分中。在优选的实施方案中，去稳定核苷酸被引入含有特异性决定核苷酸的相同链或链部分中。
2)提高疗效和特异性的修饰
在某些实施方案中，根据不对称设计规则，可以改变本发明的RNA沉默剂以促进增强介导RNAi的功效和特异性(参见美国专利号8,309,704、7,750,144、8,304,530、8,329,892和8,309,705)。这种改变有利于siRNA(例如，使用本发明的方法设计的siRNA或由shRNA产生的siRNA)的反义链进入RISC，有利于有义链，使得反义链优先引导靶mRNA的切割或翻译抑制，从而增加或提高靶切割和沉默的效率。优选地，通过相对于所述RNA沉默剂的反义链3'端(AS 3')和有义链5'端(S'5)之间的键强度或碱基对强度，降低RNA沉默剂的反义链5'端(AS 5')和有义链3'端(S 3')之间的碱基对强度来增强RNA沉默剂的不对称性。
在一个实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称性，是的与第一或反义链的3'端与有义链部分的5'端之间相比，在第一或反义链的5'端与有义链部分的3'端之间存在较少G:C碱基对。在另一个实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称性，使得在第一链或反义链的5'端与有义链部分的3'端之间存在至少一个错配碱基对。优选地，错配碱基对选自由以下各项组成的组：G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C和U:U。在另一个实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称性，使得在第一链或反义链的5'端和有义链部分的3'端之间存在至少一个摆动碱基对，例如，G:U。在另一个实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称性，使得存在至少一个包含稀有核苷酸(例如肌苷(I))的碱基对。优选地，碱基对选自由以下各项组成的组：I:A、I:U和I:C。在又一个实施方案中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称性，使得存在至少一个包含修饰的核苷酸的碱基对。在优选的实施方案中，修饰的核苷酸选自由2-氨基-G、2-氨基-A、2,6-二氨基-G和2,6-二氨基-A组成的组。
3)具有增强稳定性的RNA沉默剂
本发明的RNA沉默剂可以被修饰以提高在血清或细胞培养生长培养基中的稳定性。为了增强稳定性，可以稳定3'-残基以防止降解，例如，可以选择它们使得它们由嘌呤核苷酸组成，特别是腺苷或鸟苷核苷酸。或者，用修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，例如用2'-脱氧胸苷取代尿苷是可以接受的，并且不影响RNA干扰的效率。
在一个优选地方面，本发明的特征在于包括第一和第二链的RNA沉默剂，其中第二链和/或第一链通过用修饰的核苷酸取代内部核苷酸来修饰，使得与相应的未修饰的RNA沉默剂相比，增强了体内稳定性。如本文所定义，“内部”核苷酸是存在于除核酸分子、多核苷酸或寡核苷酸的5'端或3'端之外的任何位置的核苷酸。内部核苷酸可以在单链分子内或在双链体或双链分子的链内。在一个实施方案中，有义链和/或反义链通过取代至少一个内部核苷酸来修饰。在另一个实施方案中，有义链和/或反义链通过至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个内部核苷酸的取代来修饰。在另一个实施方案中，有义链和/或反义链通过取代至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的内部核苷酸来修饰。在又一个实施方案中，有义链和/或反义链通过取代所有内部核苷酸来修饰。
在一些实施方案中，有义链通过取代至少50％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少55％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少60％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少65％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少70％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少75％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少80％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少85％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少90％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少95％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少96％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少97％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少98％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代至少99％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，有义链通过取代100％的内部核苷酸来修饰。
在一些实施方案中，反义链通过取代至少50％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少55％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少60％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少65％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少70％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少75％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少80％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少85％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少90％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少95％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少96％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少97％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少98％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代至少99％的内部核苷酸来修饰。在一些实施方案中，反义链通过取代100％的内部核苷酸来修饰。
在本发明的优选实施方案中，RNA沉默剂可以含有至少一种修饰的核苷酸类似物。一种或多种核苷酸类似物可以位于靶特异性沉默活性(例如，RNAi介导活性或翻译抑制活性)基本上不受影响的位置，例如，在siRNA分子的5'端和/或3'端的区域中。特别地，可以通过掺入修饰的核苷酸类似物来稳定末端。
示例性核苷酸类似物包括糖和/或骨架修饰的核糖核苷酸(即包括对磷酸糖骨架的修饰)。例如，可以修饰天然RNA的磷酸二酯键以包括氮或硫杂原子中的至少一种。在示例性的骨架修饰的核糖核苷酸中，连接到相邻核糖核苷酸的磷酸酯基团被修饰的基团(例如硫代磷酸酯基团)替代。在示例性的糖修饰的核糖核苷酸中，2'-OH-基团可被选自H、OR、R、卤代基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或ON的基团代替，其中R为C1-C6烷基、烯基或炔基并且卤代基为F、Cl、Br或I。
在特定实施方案中，修饰是2'-氟、2'-氨基和/或2'-硫修饰。特别优选的修饰包括2'-氟-胞苷、2'-氟-尿苷、2'-氟-腺苷、2'-氟-鸟苷、2'-氨基-胞苷、2'-氨基-尿苷、2'-氨基-腺苷、2'-氨基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、4-硫代-尿苷，和/或5-氨基-烯丙基-尿苷。在特定实施方案中，2'-氟核糖核苷酸是每个尿苷和胞苷。其他示例性修饰包括5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖-胸苷、2-氨基嘌呤、2'-氨基-丁酰基-芘-尿苷、5-氟-胞苷和5-氟尿苷。2'-脱氧核苷酸和2'-Ome核苷酸也可以用于本发明的修饰的RNA沉默剂。其他修饰残基包括脱氧无碱基、肌苷、N3-甲基-尿苷、N6,N6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核糖核苷和利巴韦林。在特别优选的实施方案中，2'部分是甲基，使得连接部分是2'-O-甲基寡核苷酸。
在一个示例性实施方案中，本发明的RNA沉默剂包含锁核酸(LNA)。LNA包含抗核酸酶活性(高度稳定)并具有对mRNA的单核苷酸区分的糖修饰核苷酸(Elmen等人,NucleicAcids Res.,(2005),33(1):439-447；Braasch等人(2003)Biochemistry 42:7967-7975，Petersen等人(2003)Trends Biotechnol 21:74-81)。这些分子具有2'-O,4'-C-乙烯桥连的核酸，并具有可能的修饰，例如2'-脱氧-2”-氟尿苷。此外，LNA通过将糖部分限制在3'-内构象中来增加寡核苷酸的特异性，从而预先组织核苷酸以进行碱基配对，并将寡核苷酸的解链温度提高多达10℃/碱基。
在另一个示例性实施方案中，本发明的RNA沉默剂包括肽核酸(PNA)。PNA包含修饰的核苷酸，其中核苷酸的糖磷酸酯部分被中性2-氨基乙基甘氨酸部分替换，所述部分能够形成聚酰胺骨架，其对核酸酶消化具有高度抗性，并赋予分子提高的结合特异性(Nielsen等人,Science,(2001),254:1497-1500)。
还优选的是核碱基修饰的核糖核苷酸，即含有至少一种非天然存在的核碱基而不是天然存在的核碱基的核糖核苷酸。可以修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。示例性修饰的核碱基包括但不限于5-位处修饰的尿苷和/或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；8位处修饰的腺苷和/或鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；O-烷基化核苷酸和N-烷基化核苷酸，例如，N6-甲基腺苷是合适的。应当注意，上述修饰可以组合。
在其他实施方案中，可以使用交联来改变RNA沉默剂的药代动力学，例如，增加体内的半衰期。因此，本发明包括具有两条互补核酸链的RNA沉默剂，其中两条链是交联的。本发明还包括与另一部分(例如，非核酸部分诸如肽)、有机化合物(例如，染料)或类似物缀合或未缀合(例如，在其3'末端处)的RNA沉默剂。与相应的siRNA相比，以这种方式修饰siRNA衍生物可以改善所得siRNA衍生物的细胞吸收或增强细胞靶向活性，可用于追踪细胞中的siRNA衍生物，或与相应的siRNA相比，提高siRNA衍生物的稳定性。
其他示例性修饰包括：(a)2'修饰，例如，在有义链或反义链中的U上提供2'OMe部分，尤其是在有义链上，和/或有义链或反义链中的U上提供2'F部分，尤其是在有义链上，和/或在3'突出端中提供2'OMe部分，例如在3'末端(3'末端意指在分子的3'原子处或在最3'部分，例如，最3'P或2'位置，如上下文所指示)，和/或2'F部分；(b)磷酸酯骨架中骨架的修饰，例如用S替换0，例如在U或A或两者上，特别是在反义链上提供硫代磷酸酯修饰；例如，用S替换P；(c)用C5氨基接头替换U；(d)用G替换A(序列变化优选地位于有义链上而不是反义链上)；以及(d)在2'、6'、7'或8'位处的修饰。示例性实施方案是其中一种或多种这些修饰存在于有义链但不存在于反义链上的那些，或其中反义链具有较少此类修饰的实施方案。其他示例性修饰包括在3'突出端例如在3'末端使用甲基化P；2'修饰，例如提供2'OMe部分和例如用S替换P的骨架的修饰，例如提供硫代磷酸酯修饰，或在3'突出端，例如在3'末端使用甲基化P的组合；用3'烷基修饰；在3'突出端，例如在3'末端用脱碱基吡咯烷酮进行修饰；用萘普生、布洛芬或其他抑制3'末端处的降解的部分进行修饰。
重度修饰的RNA沉默剂
在某些实施方案中，RNA沉默剂包含至少80％的化学修饰核苷酸。在某些实施方案中，RNA沉默剂被完全化学修饰，即100％的核苷酸被化学修饰。
在某些实施方案中，RNA沉默剂富含2'-O-甲基，即包含大于50％的2'-O-甲基含量。在某些实施方案中，RNA沉默剂包含至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％2'-O-甲基核苷酸含量。在某些实施方案中，RNA沉默剂包含至少约70％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，RNA沉默剂包含约70％与约90％之间的2'-O-甲基核苷酸修饰。
在某些实施方案中，RNA沉默剂是包含反义链和有义链的dsRNA。在一些实施方案中，反义链包含至少约50％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含大于约50％的2'-O-甲基核苷酸修饰(例如，51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％的2'-O-甲基核苷酸修饰)。在一些实施方案中，反义链包含大于50％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含大于60％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约50％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约55％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约60％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约65％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约70％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约75％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约80％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约85％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约90％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约95％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约99％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约100％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含至少约70％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，反义链包含约70％与约90％之间的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含约70％至约90％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含约50％至约100％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含约50％至约90％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含约50％至约80％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含约50％至约75％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含约50％至约70％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含约50％至约65％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含约50％至约60％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，反义链包含约50％至约55％的2'-O-甲基核苷酸修饰。
在一些实施方案中，有义链包含至少约60％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含大于60％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，有义链包含至少约70％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约60％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约65％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约70％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约75％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约80％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约85％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约90％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约99％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约100％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，有义链包含约70％与约90％之间的2'-O-甲基核苷酸修饰。在某些实施方案中，有义链包含100％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约70％至约90％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约60％至约100％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约60％至约95％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约60％至约90％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约60％至约85％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约60％至约80％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约60％至约75％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约60％至约70％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约65％至约90％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约65％至约85％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约65％至约80％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约65％至约75％的2'-O-甲基核苷酸修饰。在一些实施方案中，有义链包含约65％至约70％的2'-O-甲基核苷酸修饰。
富含2'-O-甲基的RNA沉默剂和特定的化学修饰模式进一步描述于美国专利号11,279,930B2和US2021/0115442A1，每一个都通过引用并入本文。
核苷酸间键修饰
在某些实施方案中，至少一个核苷酸间键、亚基间键或核苷酸骨架在RNA沉默剂中被修饰。在某些实施方案中，RNA沉默剂中的所有核苷酸间键都被修饰。在某些实施方案中，修饰的核苷酸间键包含硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方案中，RNA沉默剂包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方案中，RNA沉默剂包含4-16个硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方案中，RNA沉默剂包含8-13个硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方案中，RNA沉默剂是包含反义链和有义链的dsRNA，各自包含5'末端和3'末端。在某些实施方案中，有义链5'端的位置1和2的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键连接到相邻的核糖核苷酸。在某些实施方案中，来自有义链3'末端的位置1和2的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键与相邻的核糖核苷酸连接。在某些实施方案中，来自反义链5'末端的位置1和2的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键与相邻的核糖核苷酸连接。在某些实施方案中，来自反义链3'末端的位置1-2至1-8的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键与相邻的核糖核苷酸连接。在某些实施方案中，来自反义链3'末端的位置1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7或1-8的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键与相邻的核糖核苷酸连接。在某些实施方案中，来自反义链3'末端的位置1-2至1-7的核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键与相邻的核糖核苷酸连接。
4)增强分子吸收的修饰
在其他实施方案中，RNA沉默剂可以用化学部分修饰，例如以增强靶细胞(例如，神经元细胞)的细胞吸收。因此，本发明包括与另一部分(例如，非核酸部分诸如肽)、有机化合物(例如，染料)或类似物缀合或未缀合(例如，在其3'末端处)的RNA沉默剂。缀合可以通过本领域已知的方法实现，例如，使用以下中的方法：Lambert等人,Drug Deliv.Rev.:47(1),99-112(2001)(描述了加载到聚氰基丙烯酸烷酯(PACA)纳米颗粒的核酸)；Fattal等人,J.Control Release53(1-3):137-43(1998)(描述了与纳米颗粒结合的核酸)；Schwab等人,Ann.Oncol.5Suppl.4:55-8(1994)(描述了与嵌入剂、疏水基团、聚阳离子或PACA纳米颗粒连接的核酸)；以及Godard等人,Eur.J.Biochem.232(2):404-10(1995)(描述了与纳米颗粒连接的核酸)。
在特定实施方案中，本发明的RNA沉默剂与亲脂部分缀合。在一个实施方案中，亲脂部分是包括阳离子基团的配体。在另一个实施方案中，亲脂部分连接至siRNA的一条或两条链。在一个示例性实施方案中，亲脂部分连接到siRNA有义链的一端。在另一个示例性实施方案中，亲脂部分连接到有义链的3'端。在某些实施方案中，亲脂部分选自由以下各项组成的组：胆固醇、维生素E、维生素K、维生素A、叶酸或阳离子染料(例如，Cy3)。在一个示例性实施方案中，亲脂部分是胆固醇。其他亲脂性部分包括胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或吩恶嗪。
5)栓系配体
其他实体可以与本发明的RNA沉默剂栓系。例如，配体栓系至RNA沉默剂以改善稳定性、与靶核酸的杂交热力学、靶向特定组织或细胞类型或细胞渗透性，例如通过内吞作用依赖性或非依赖性机制。配体和相关修饰也可以增加序列特异性，从而减少异位靶向。栓系配体可包括一种或多种可用作嵌入剂的修饰碱基或糖。这些优选地位于内部区域，诸如在RNA沉默剂/靶双链体的凸起中。嵌入剂可以是芳族化合物，例如多环芳族化合物或杂环芳族化合物。多环嵌入剂可以具有堆叠能力，并且可以包括具有2、3或4个稠环的系统。本文所述的通用碱基可以包含在配体上。在一个实施方案中，配体可以包括一个切割基团，其有助于通过切割靶核酸来抑制靶基因。切割基团可以是例如博来霉素(例如，博来霉素-A5、博来霉素-A2或博来霉素-B2)、芘、菲咯啉(例如，O-菲咯啉)、聚胺、三肽(例如，lys-tyr-lys三肽)，或金属离子螯合基团。金属离子螯合基团可以包括例如Lu(III)或EU(III)大环络合物、Zn(II)2,9-二甲基菲咯啉衍生物、Cu(II)三联吡啶或吖啶，它们可以促进游离金属离子(如Lu(III))在凸起部位选择性切割靶RNA。在一些实施方案中，肽配体可以与RNA沉默剂栓系以促进靶RNA的切割，例如在凸起区域。例如，1,8-二甲基-1,3,6,8,10,13-六氮杂环十四烷(cyclam)可以与肽(例如通过氨基酸衍生物)缀合以促进靶RNA切割。栓系配体可以是氨基糖苷配体，其可以使RNA沉默剂具有改进的杂交特性或改进的序列特异性。示例性氨基糖苷类包括糖基化聚赖氨酸、半乳糖基化聚赖氨酸、新霉素B、妥布霉素、卡那霉素A和氨基糖苷类的吖啶缀合物，例如新-N-吖啶、新-S-吖啶、新-C-吖啶、Tobra-N-吖啶和KanaA-N-吖啶。使用吖啶类似物可以增加序列特异性。例如，与DNA相比，新霉素B对RNA的亲和力高，但序列特异性低。吖啶类似物新-5-吖啶对HIV Rev响应元件(RRE)的亲和力增加。在一些实施方案中，氨基糖苷配体的胍类似物(胍基糖苷)被栓系至RNA沉默剂。在胍基糖苷中，氨基酸上的胺基被胍基交换。胍类似物的附接可以增强RNA沉默剂的细胞渗透性。栓系配体可以是聚精氨酸肽、类肽或拟肽，其可以增强寡核苷酸试剂的细胞吸收。
示例性配体通过介入系链直接或间接地与配体缀合的载剂(优选地共价)偶联。在示例性实施方案中，配体通过介入系链连接至载剂。在示例性实施方案中，配体改变其所掺入的RNA沉默剂的分布、靶向或寿命。在示例性实施方案中，例如与没有这种配体的物种相比，配体提供对选定靶标(例如，分子、细胞或细胞类型、隔室(例如，细胞或器官隔室)、组织、器官或身体区域)的增强的亲和力。
示例性配体可以改善转运、杂交和特异性性质，并且还可以改善所得天然或修饰的RNA沉默剂或包含本文所述单体和/或天然或修饰的核糖核苷酸的任何组合的聚合物分子的核酸酶抗性。配体一般可以包括治疗性修饰剂，例如用于增强吸收；诊断化合物或报告基团，例如，用于监测分布；交联剂；核酸酶抗性赋予部分；和天然或不寻常的核碱基。一般实例包括亲脂性物质、脂质、类固醇(例如，乌发醇、海柯皂苷元、薯蓣皂苷元)、萜烯(例如，三萜，例如菝葜皂苷元、无羁萜、表无羁萜醇衍生的石胆酸)、维生素(例如，叶酸、维生素A、生物素、吡哆醛)、碳水化合物、蛋白质、蛋白质结合剂、整合素靶向分子、聚阳离子、肽、多胺和肽模拟物。配体可以包括天然存在的物质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、甲壳素、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；氨基酸或脂质。配体也可以是重组或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸是聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、拟肽聚胺、树枝状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可以包括结合特定细胞类型诸如胎盘细胞、肾细胞和/或肝细胞的靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、二膦酸酯、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如，吖啶和取代的吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、Sapphyrin)、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪、菲咯啉、芘)、lys-tyr-lys三肽、氨基糖苷类、胍氨基糖苷、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子例如胆固醇(及其硫代类似物)、胆酸、胆烷酸、石胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、甘油(例如，酯(例如，单、双或三脂肪酸酯，例如，C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20脂肪酸)及其醚类，例如C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基；例如，1,3-双-O(十六烷基)甘油、1,3-双-O(十八烷基)甘油)、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、硬脂酸(例如，二硬脂酸甘油酯)、油酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰)石胆酸、O3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩恶嗪)和肽缀合物(例如，触足肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记、酶、半抗原(例如，生物素)，转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、萘普生、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对共配体具有特定亲和力的分子，或抗体例如与特定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体。配体还可能包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类物质，例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。
配体可以是可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝、和/或中间丝来增加RNA沉默剂吸收至细胞中的物质，例如药物。所述药物可以是例如分类群、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑、japlakinolide、拉春库林A(latrunculinA)、鬼笔环肽、swinholide A、茚满新碱(indanocine)或myoservin。例如，配体可以通过激活炎症响应来增加RNA沉默剂吸收至细胞中。具有这种作用的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素1β或γ干扰素。在一个方面，配体是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物分布至靶组织。例如，靶组织可以是胎盘、肾脏或肝脏。其他可以结合HSA的分子也可以用作配体。例如，可以使用奈普洛辛或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可用于调节与血清蛋白例如HSA的结合。基于脂质的配体可用于调节例如控制缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA结合更强的脂质或基于脂质的配体将不太可能靶向胎盘、肝脏和/或肾脏，因此不太可能从体内清除。与HSA结合较弱的脂质或基于脂质的配体可以用于将缀合物靶向胎盘、肝脏和/或肾脏。靶向胎盘细胞、肝细胞和/或肾细胞的其他部分也可以用于代替或补充基于脂质的配体。
在另一个方面，配体是被靶细胞例如增殖细胞吸收的部分，例如维生素。这些尤其可用于治疗以不希望的细胞(例如，恶性或非恶性类型的细胞，例如癌细胞)增殖为特征的病症。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或癌细胞吸收的其他维生素或营养素。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
在另一个方面，配体是细胞渗透剂，优选地是螺旋细胞渗透剂。优选地，剂是两亲性的。示例性试剂是肽，例如tat或触足。如果试剂是肽，它可以被修饰，包括肽模拟物、转化体、非肽或假肽键，以及使用D-氨基酸。螺旋剂优选地是α-螺旋剂，其优选地具有亲脂相和疏脂相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(本文也称为寡肽模拟物)是能够折叠成相似于天然肽的确定的三维结构的分子。肽和肽模拟物与寡核苷酸试剂的连接可以影响RNA沉默剂的药代动力学分布，例如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟部分可以是约5-50个氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。肽部分可以是L-肽或D-肽。在另一个备选方案中，肽部分可以包括疏水膜易位序列(MTS)。肽或肽模拟物可由DNA的随机序列编码，例如从噬菌体展示文库或单珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等人，Nature 354:82-84,1991)。在示例性实施方案中，通过掺入的单体单元与RNA沉默剂栓系的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度范围可以从约5个氨基酸到约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，例如以增加稳定性或直接构象特性。
在某些实施方案中，功能部分连接到本发明的RNA沉默剂的5'端和/或3'端。在某些实施方案中，功能部分连接到本发明的RNA沉默剂的反义链的5'端和/或3'端。在某些实施方案中，功能部分连接到本发明的RNA沉默剂的有义链的5'端和/或3'端。在某些实施方案中，功能部分连接到本发明的RNA沉默剂的有义链的3'端。
在某些实施方案中，功能部分通过接头与RNA沉默剂连接。在某些实施方案中，功能部分通过接头与反义链和/或有义链连接。在某些实施方案中，功能部分通过接头与有义链的3'端连接。在某些实施方案中，接头包含二价或三价接头。在某些实施方案中，接头包含乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、酰胺、氨基甲酸酯或其组合。在某些实施方案中，二价或三价接头选自：
其中n为1、2、3、4或5。
在某些实施方案中，接头还包含磷酸二酯或磷酸二酯衍生物。在某些实施方案中，磷酸二酯或磷酸二酯衍生物选自由以下各项组成的组：
其中X是O、S或BH3。
本公开的各种功能部分以及将它们与RNA沉默剂缀合的方法在WO2017/030973A1和WO2018/031933A2中进一步详细地描述，所述文献通过引用并入本文。
在某些实施方案中，接头是可切割接头。
在某些实施方案中，可切割接头包含磷酸二酯键、二硫键、酸不稳定键或光可切割键。
在某些实施方案中，可切割接头包含具有磷酸二酯核苷酸间键的dTdT二核苷酸。
在某些实施方案中，酸不稳定键包括β-硫代丙酸酯键或羧二甲基马来酸酐(CDM)键。
在某些实施方案中，具有C7氨基接头的功能性部分PC-DCA由以下表示：
其中“siRNA”对应于有义链的3'端。
V.引入核酸、载体和宿主细胞的方法
本发明的RNA沉默剂可以直接引入细胞(例如，神经细胞)中(即，细胞内)；或细胞外引入空腔、间质空间、生物体循环中、口服引入，或可以通过将细胞或生物体浸入含有核酸的溶液中而引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊液是可以引入核酸的部位。
可以使用本领域已知的核酸递送方法引入本发明的RNA沉默剂，包括注射含有核酸的溶液、用被核酸覆盖的粒子轰击、将细胞或生物体浸泡在核酸溶液中，或在核酸存在下对细胞膜进行电穿孔。可以使用本领域已知的用于将核酸引入细胞的其他方法，例如脂质介导的载剂转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染，例如磷酸钙等。可以将核酸与执行以下活性中的一种或多种的其他组分一起引入：增强细胞对核酸的吸收或以其他方式增加对靶基因的抑制。
引入核酸的物理方法包括注射含有RNA的溶液，用被RNA覆盖的粒子轰击，将细胞或生物体浸泡在RNA溶液中，或在RNA存在下对细胞膜进行电穿孔。包装到病毒颗粒中的病毒构建体将实现将表达构建体有效引入细胞和转录由表达构建体编码的RNA。可以使用本领域已知的用于将核酸引入细胞的其他方法，例如脂质介导的载剂转运、化学介导的转运例如磷酸钙等。因此，可以将RNA与执行以下活性中的一种或多种的组分一起引入：增强细胞对RNA的吸收、抑制单链退火、稳定单链或以其他方式增加对靶基因的抑制。
RNA可以直接引入细胞中(即，细胞内)；或细胞外引入空腔、间质空间、生物体循环中、口服引入，或可以通过将细胞或生物体浸入含有RNA的溶液中而引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊液是可以引入RNA的部位。
具有靶基因的细胞可以来自种系或体细胞、全能或多能、分裂或非分裂、实质或上皮、永生化或转化等。细胞可以是干细胞或分化细胞。分化的细胞类型包括脂肪细胞、成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、血细胞、巨核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、白细胞、粒细胞、角质形成细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、肝细胞和内分泌或外分泌腺细胞。
根据特定的靶基因和递送的双链RNA材料的剂量，此过程可能会导致靶基因部分或完全丧失功能。至少在50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多的靶细胞中减少或损失基因表达是示例性的。基因表达的抑制是指来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物水平的缺失(或可观察到的降低)。特异性是指抑制靶基因而不对细胞的其他基因产生明显影响的能力。抑制的后果可以通过检查细胞或生物体的外在特性(如下面的实施例中所示)或通过生化技术(例如RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern杂交、逆转录、使用微阵列的基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、其他免疫测定和荧光激活细胞分选(FACS))来确认。
对于细胞系或整个生物体中的RNA介导的抑制，基因表达可通过使用其蛋白质产物易于测定的报告基因或药物抗性基因方便地测定。此类报告基因包括乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡萄糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)及其衍生物。有多种任选择的标记物可赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦丝菌素、嘌呤霉素和四环素的抗性。根据测定，基因表达量的定量允许人们与未根据本发明处理的细胞相比，确定大于10％、33％、50％、90％、95％或99％的抑制程度。较低剂量的注射材料和RNAi试剂给药后的较长时间可能会导致较小部分的细胞受到抑制(例如，至少10％、20％、50％、75％、90％或95％的靶细胞)。细胞中基因表达的量化可能在靶mRNA的积累或靶蛋白的翻译水平上显示出相似的抑制量。例如，抑制效率可以通过评估细胞中基因产物的量来确定；mRNA可以用具有用于抑制性双链RNA的区域之外的核苷酸序列的杂交探针检测，或者翻译的多肽可以用针对所述区域的多肽序列产生的抗体检测。
可以以允许每个细胞递送至少一个拷贝的量引入RNA。更高剂量(例如，每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)的材料可以产生更有效的抑制作用；较低剂量也可能对特定应用有用。
在一个示例性方面，测试本发明的RNAi剂(例如，靶向flt1内含子靶序列的siRNA)在细胞中(特别是在胎盘细胞(例如，迷路细胞、滋养层(例如，合体滋养层和/或细胞滋养层))、间充质细胞、间充质来源的巨噬细胞(Hofbauer细胞)、成纤维细胞、胎儿血管细胞(例如，平滑肌细胞、血管周围细胞(周细胞)和内皮细胞))、肝细胞和/或肾细胞)特异性降解突变体mRNA(例如，sflt1 mRNA和/或产生sFlt1蛋白)的能力的功效。其他可容易转染的细胞也适用于基于细胞的验证分析，例如滋养层细胞、HeLa细胞或COS细胞。用人野生型或突变cDNA(例如，人野生型或分泌flt1 cDNA)转染细胞。共转染标准siRNA、修饰的siRNA或能够从U环mRNA产生siRNA的载体。测量靶mRNA(例如，sflt1 mRNA)和/或靶蛋白(例如，sFlt1蛋白)的选择性减少。可以将靶mRNA或蛋白质的减少与不存在RNAi剂或存在不靶向sFlt1mRNA的RNAi剂的情况下靶mRNA或蛋白质的水平进行比较。出于比较目的，可以分析外源引入的mRNA或蛋白质(或内源mRNA或蛋白质)。当使用已知对标准转染技术有一定抵抗力的神经元细胞时，可能需要通过被动吸收引入RNAi试剂(例如，siRNA)。
VI.治疗方法
本发明提供了治疗处于全部或部分由分泌的Flt1蛋白引起的疾病或病症风险(或易感)的受试者的预防和治疗方法。在一个实施方案中，疾病或病症是肝脏疾病或病症。在另一个实施方案中，疾病或病症是肾脏疾病或病症。在一个实施方案中，疾病或病症是胎盘疾病或病症。在一个实施方案中，疾病或病症是与妊娠相关的疾病或病症。在一个优选的实施方案中，疾病或病症是与可溶性Flt1蛋白表达相关的病症，并且其中可溶性Flt1蛋白表达扩增导致PE、产后PE、子痫和/或HELLP的临床表现在一些实施方案中，疾病或病症是PE。在一些实施方案中，疾病或病症是产后PE。在一些实施方案中，疾病或病症是子痫。在一些实施方案中，疾病或病症是HELLP。
如本文所用，“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”定义为向患者应用或施用治疗剂(例如，RNA剂或载体或编码它们的转基因)，或向来自患有疾病或病症、疾病或病症的症状或具有对疾病或病症的易感性的患者的分离组织或细胞系应用或施用治疗剂，目的是治愈、医治、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善或影响疾病或病症、疾病或病症的症状或对疾病的易感性。
在一个方面，本发明提供了一种用于通过向受试者施用治疗剂(例如，RNAi剂或载体或编码它们的转基因)，在受试者中预防如上所述的疾病或病症的方法。可以通过例如本文所述的任何诊断或预后测定或其组合来鉴定处于疾病风险中的受试者。预防剂的施用可以在疾病或病症的特征性症状表现之前发生，从而预防疾病或病症，或者延迟其进展。
本发明的另一方面涉及治疗性地治疗受试者的方法，即改变疾病或病症的症状的发作。在示例性实施方案中，本发明的调节方法包括使表达功能获得性突变体的细胞与对基因(例如，SEQ ID NO:1或2或其任何组合)内的一个或多个靶序列具有特异性的治疗剂(例如，RNAi剂或载体或编码其的转基因)接触，使得实现对基因的序列特异性干扰。这些方法可以在体外进行(例如，通过用试剂培养细胞)，或者，在体内(例如，通过向受试者施用试剂)。
关于预防性和治疗性治疗方法，可以基于从药物基因组学领域获得的知识来具体定制或修改此类治疗。如本文所用，“药物基因组学”是指将基因组学技术(诸如基因测序、统计遗传学和基因表达分析)应用于临床开发和市场上的药物。更具体地，此术语是指患者的基因如何决定他或她对药物的响应的研究(例如，患者的“药物响应表型”或“药物响应基因型”)。因此，本发明的另一个方面提供了根据个体的药物响应基因型用本发明的靶基因分子或靶基因调节剂定制个体的预防性或治疗性治疗的方法。药物基因组学允许临床医生或医师针对最能从治疗中受益的患者进行预防性或治疗性治疗，并避免治疗会经历有毒药物相关副作用的患者。
治疗剂可以在适当的动物模型中进行测试。例如，如本文所述的RNAi剂(或表达载体或编码其的转基因)可以用于动物模型中以确定用所述剂治疗的功效、毒性或副作用。或者，可以在动物模型中使用治疗剂以确定此类剂的作用机制。例如，可以在动物模型中使用剂来确定用此类剂治疗的功效、毒性或副作用。或者，可以在动物模型中使用剂以确定此类剂的作用机制。
含有本发明的RNA沉默剂的药物组合物可以施用于任何诊断为患有妊娠、肝脏和/或肾脏相关病症诸如PE和/或子痫或有风险患上妊娠、肝脏和/或肾脏相关病症诸如PE和/或子痫的患者。在一个实施方式中，患者被诊断为患有PE和/或子痫，并且患者在其他方面总体健康状况良好。例如，患者未患绝症，并且患者在诊断后可能存活至少2、3、5年或更多年。患者可以在诊断后立即接受治疗，或者可以推迟治疗，直到患者经历更使人衰弱的症状，诸如两种或更多种PE症状或者一种或更多种子痫症状。在另一个实施方案中，患者尚未达到疾病的晚期。
可以以有效治疗或预防肝脏、肾脏或妊娠相关疾病或病症(例如，PE、产后PE、子痫和/或HELLP)的剂量将RNA沉默剂直接递送至器官(例如，直接递送至胎盘、肝脏和/或肾脏)。
RNA沉默剂组合物的浓度是足以有效治疗或预防病症或调节人生理状况的量。施用的RNA沉默剂的浓度或量将取决于针对剂和施用方法(例如，鼻腔、口腔或肺部)确定的参数。
VI.药物组合物和施用方法
本发明涉及上述试剂用于如下所述的预防性和/或治疗性治疗的用途。因此，本发明的调节剂(例如，RNAi剂)可以掺入适合施用的药物组合物中。此类组合物通常包含核酸分子、蛋白质、抗体或调节化合物和药学上可接受的载剂。如本文所用，短语“药学上可接受的载剂”旨在包括可与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药学活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，预期将其用于组合物中。补充性有效化合物也可并入组合物中。
包含本文提供的RNAi剂(例如，dsRNA)的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐。因此，例如，本公开还涉及RNAi剂的药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐和其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施方案中，本公开提供了RNAi剂(例如，dsRNA)的盐。在一些实施方案中，本公开提供了dsRNA剂的盐。在一些实施方案中，本公开提供了siRNA剂的盐。在一些实施方案中，盐是钠盐。在一些实施方案中，盐是钾盐。在一些实施方案中，盐是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，RNAi剂的盐是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，dsRNA剂的盐是药学上可接受的盐。在一些实施方案中，siRNA剂的盐是药学上可接受的盐。
本发明的药物组合物被配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外施用，例如静脉内(IV)、皮内、皮下(SC或SQ)、腹膜内、肌内、口服(例如，吸入)、透皮(局部)和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲液诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的剂诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)调节。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(当为水溶性时)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且流动性应该达到易于注射的程度。它在制造和储存条件下必须稳定，并且必须防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。适当的流动性可以例如通过使用包衣诸如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现防止微生物的作用。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射组合物的吸收。
无菌注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与上文列举的成分中的一种或组合(根据需要)掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基本的分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载剂。它们可以封装在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可以与赋形剂结合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可以使用用作漱口剂的流体载剂来制备，其中将流体载剂中的化合物口服施用并漱口并咳出或吞咽。药学相容的粘合剂，和/或辅助材料可以包括为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任何以下成分或相似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖；崩解剂诸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂诸如胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；或调味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂。
对于通过吸入施用，化合物以来自压力容器或分配器的气溶胶喷雾形式递送，所述压力容器或分配器含有合适的推进剂，例如，气体诸如二氧化碳，或雾化吸入剂。
全身施用也可以通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮施用，在制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用，活性化合物被配制成如本领域公知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
化合物还可以制备成栓剂的形式(例如，用常规栓剂基质诸如可可脂和其他甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂。
还可以使用本领域已知的方法通过转染或感染来施用RNA沉默剂，包括但不限于描述于McCaffrey等人(2002),Nature,418(6893),38-9(流体动力转染)；Xia等人(2002),Nature Biotechnol.,20(10),1006-10(病毒介导的递送)；或Putnam(1996),Am.J.HealthSyst.Pharm.53(2),151-160(勘误表在Am.J.Health Syst.Pharm.53(3),325(1996))中的方法。
还可以通过任何适合于施用核酸剂(诸如DNA疫苗)的方法来施用RNA沉默剂。这些方法包括基因枪、生物注射器和皮肤贴片以及无针方法诸如美国专利号6,194,389中公开的微粒DNA疫苗技术，和如美国专利号6,168,587中公开的使用粉末形式疫苗的哺乳动物透皮无针疫苗接种。此外，鼻内给药是可能的，如特别在Hamajima等人(1998),Clin.Immunol.Immunopathol.,88(2),205-10.Liposomes中所述(例如，如在美国专利号6,472,375中所述)，并且也可以使用微胶囊。也可以使用可生物降解的可靶向微粒递送系统(例如，如美国专利号6,471,996中所述)。
在一个实施方案中，用将防止化合物从体内快速消除的载剂制备活性化合物，诸如包含植入物和微囊化递送系统的控释制剂。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制物的方法对本领域技术人员将是显而易见的。这些材料也可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括具有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载剂。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述。
为了便于施用和剂量的均匀性，将口服或肠胃外组合物配制为剂量单位形式是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的药物载剂。本发明的剂量单位形式的规格由以下决定并直接取决于以下：活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，以及混合此类活性化合物用于治疗个体的领域固有的限制。
此类化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序(例如，用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％治疗有效的剂量))来确定。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为LD50/ED50的比。优选表现出大治疗指数的化合物。尽管可以使用表现出毒副作用的化合物，但应注意设计将此类化合物靶向受影响组织位点的递送系统，以最小化对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人的一系列剂量。此类化合物的剂量优选地位于包括具有几乎没有或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可以在此范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。对于本发明的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中配制剂量以达到包括如在细胞培养物中确定的EC50(即，实现半最大响应的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更准确地确定人的可用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱法来测量。
药物组合物可以与任选的施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
递送途径可取决于患者的病症。在某些示例性实施方案中，可以通过IV或SC施用向诊断患有PE、产后PE、子痫和/或HELLP的受试者施用本发明的抗sFlt1 RNA沉默剂。除了本发明的RNA沉默剂之外，可以向患者施用第二疗法，例如姑息疗法和/或疾病特异性疗法。二级疗法可以是例如对症治疗(例如，用于缓解症状)、保护性治疗(例如，用于减缓或停止疾病进展)或恢复性治疗(例如，用于逆转疾病过程)。对于治疗PE、产后PE、子痫和/或HELLP，例如，对症疗法还可以包括药物阿替洛尔、肼屈嗪、拉贝洛尔、硫酸镁、甲基多巴、尼卡地平、硝苯地平、硝普钠等。
一般来说，本发明的RNA沉默剂可以通过任何合适的方法施用。如本文所用，局部递送可以指将RNA沉默剂直接应用至身体的任何表面，包括眼睛、粘膜、体腔表面或任何内表面。用于局部施用的制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、喷雾剂和液体。常规的药物载剂、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或期望的。局部施用还可以用作将RNA沉默剂选择性递送至受试者的表皮或真皮，或其特定层，或下层组织的手段。
用于肠胃外施用的制剂可以包括无菌水性溶液，其还可以含有缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。脑室内注射可以通过脑室内导管来促进，例如，连接到储存器。对于静脉内使用，应控制溶质的总浓度以使制剂等渗。
如本文所用，短语“立体化学异构形式”、“立体形式”、“立体异构体(stereoisoform)”、“立体异构体(stereoisomer)”等是指由通过相同的键序列结合的相同原子组成但具有不可互换的不同三维结构的不同化合物。在本公开的一些实施方案中，包含RNAi剂(例如，dsRNA)的药物组合物可以是或包含RNAi剂的单个立体化学异构形式的纯制剂。在一些实施方案中，药物组合物可以是或包含RNAi剂的两种或更多种立体化学异构形式的混合物。
VII.试剂盒
在某些其他方面，本发明提供了试剂盒，其包括合适的容器，所述容器含有RNA沉默剂(例如，双链RNA沉默剂或sRNA剂(例如，前体，例如较大的RNA沉默剂，其可以被加工成sRNA剂；或编码RNA沉默剂(例如，双链RNA沉默剂或sRNA剂)的DNA，或其前体))的药物制剂。在某些实施方案中，药物制剂的各个组分可以提供在一个容器中。或者，可能需要在两个或更多个容器中分别提供药物制剂的组分，例如，一个容器用于RNA沉默剂制剂，以及至少另一个容器用于载剂化合物。试剂盒可以以多种不同的配置来包装，诸如在单个盒子中的一个或多个容器。例如，可以根据试剂盒提供的说明书来组合不同的组分。可以根据本文所述的方法组合组分，例如以制备和施用药物组合物。试剂盒还可以包括递送装置。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本文所公开的实施方案的范围的情况下，可以使用合适的等效物对本文所述的方法进行其他合适的修改和调适，这将是显而易见的。现已详细描述某些实施方案，通过参考以下实施例将使实施方案得到更清楚的理解，包括所述实施例仅为说明目的而不旨在限制本发明。
实施例
实施例1.先兆子痫(PE)的背景和重要性
来自流行病学和实验研究的压倒性证据已表明，PE是由母亲血流中Flt1基因(VEGFR1)的“可溶性诱饵”蛋白(可溶性FLT1(sFLT1))水平升高引起的(Young,B.C.,Levine,R.J.和Karumanchi,S.A.Pathogenesis of preeclampsia.Annual review ofpathology 5,173-192(2010)；Maynard,S.E.等人Excess placental soluble fms-liketyrosine kinase 1(sFlt1)may contribute to endothelial dysfunction,hypertension,and proteinuria in preeclampsia.The Journal of clinicalinvestigation 111,649-658(2003)；Levine,R.J.等人Circulating angiogenic factorsand the risk of preeclampsia.The New England journal of medicine 350,672-683(2004)；Heydarian,M.等人Novel splice variants of sFlt1 are upregulated inpreeclampsia.Placenta 30,250-255(2009))。FLT1是主要在胎盘中表达的受体酪氨酸激酶(RTK)。RTK调节的一般机制是产生充当整个信号传导通路的主要负调节因子的截短的、分泌形式的受体。这种可溶性诱饵的配体螯合抑制了全长受体的细胞内信号传导，从而使系统对配体浓度不敏感(Vorlova,S.等人Induction of antagonistic soluble decoyreceptor tyrosine kinases by intronic polyA activation.Molecular cell 43,927-939(2011))。在FLT1的情况下，可溶性诱饵由截短的mRNA表达，所述mRNA是通过编码fl-FLT1跨膜(TM)和激酶结构域的外显子上游的两个内含子(i13和i15)内的聚腺苷酸化生成的。
在哺乳动物中，FLT1主要在胎盘中表达，其中人胎盘Flt1 mRNA水平是其他成人组织中观察到的那些水平高10-100倍(Cerdeira,A.S.和Karumanchi,S.A.Angiogenicfactors in preeclampsia and related disorders.Cold Spring Harbor perspectivesin medicine 2(2012))。尽管全长同工型在非妊娠成年人的所有组织中占主导地位(同上)，但胎盘表达以三种截短的同工型为主，即sFlt1-i13短、sFlt1-i13长和sFlt1-i15a，所有这些均编码sFLT1蛋白。在啮齿类动物中也观察到胎盘中高Flt1和其他非妊娠成人组织中低表达的这种相同模式。然而，由于啮齿类动物缺乏内含子14聚腺苷酸化位点，它们仅表达单一可溶性诱饵形式：sFlt1-i13。在PE中，全长(fl-Flt1)Flt1 mRNA和截短的Flt1 mRNA均在胎盘中的积聚水平高于正常妊娠时的水平，其中截短的同工型甚至更为明显。这些mRNA水平的变化可能解释了PE期间母体血流中sFLT1蛋白的显著增加。
siRNA治疗PE的适用性
先前的工作证明了基于siRNA的治疗对于治疗PE的适用性(美国专利号9,862,952，通过引用并入本文)。
实施例2.靶向sFLT1的siRNA的优化
对先前描述的siRNA进行优化，以增强沉默，同时促进胎盘组织积累、最小化siRNA降解并降低毒性。通过引入富含2'-OMe的支架以增强稳定性，并引入PC-DCA缀合有义链以增强胎盘递送来进行优化。与先前开发的化学物质相比，优化的siRNA显示出更高的积累、功效和安全性。
2'OMe含量优化
如图1A所示，siRNA的反义链和有义链中采用了不同量的2'OMe修饰。如图1B所示，产生靶向位置2283处的人flt1基因(5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA 3'(SEQ ID NO:1))的siRNA的剂量响应结果(n＝3，平均值±SD)。还测试了靶向位置2519(5'CATCATAGCTACCATTTATT3'(SEQ ID NO:2))的siRNA，得到相似的结果。用所示浓度的siRNA处理HeLa细胞72小时。使用荧光素酶测定系统测量mRNA水平，并将其计算为未处理对照(C)的百分比。图1B的表-最大KD(％)-最高siRNA治疗剂量下靶mRNA敲低的最大百分比，IC50-半数最大抑制浓度，AUC-剂量响应曲线下面积，p值-显著性。结果表明，siRNA中2'OMe修饰量的增加不会显著降低所述siRNA的沉默功效。2'OMe修饰的毒性低于2'F修饰。因此，富含2'OMe的siRNA可能更适合治疗用途。
有义链缀合物优化
siRNA缀合物在将siRNA导向适当的组织和细胞方面发挥重要作用。如图2A所示，Cy3标记的siRNA与各种功能部分缀合，并通过组织荧光成像监测肝脏、肾脏和胎盘组织递送。在这项研究中，妊娠CD1小鼠被注射了20mg/kg Cy3标记的siRNA变体。用Leica DMi8倒置倾斜显微镜进行组织荧光成像。10倍平铺阵列图像。比例尺＝2mm。所有图像均在同一的激光强度下获取。如图2B所示，48小时后通过PNA杂交测定(n＝3)定量引导链积累。p值描述了每种化合物和胆固醇缀合化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；**p<0.01；***p<0.001；未标记非显著性差异)。NOC-无缀合物，Chol-胆固醇，DCA-二十二烷酸，PC-DCA-磷酸胆碱-二十二烷酸，DHA-二十二碳六酸，PC-DHA-磷酸胆碱-二十二碳六酸，DIO-双支链寡核苷酸。结果表明，PC-DCA siRNA缀合物表现出增强的胎盘积累。
进一步表征PC-DCA siRNA缀合物，显示出骨髓中的积累减少。对注射了Cy3标记的sFLT1_2283 siRNA变体的CD-1小鼠的骨髓细胞进行FACS分析。图3A示出了用于量化图3B至图3D中骨髓中特定细胞群的Cy3强度的门控方案。图3B示出了注射siRNA变体后24h的骨髓嗜中性粒细胞的Cy3荧光强度的频率分布直方图(左)和Cy3中值荧光强度的条形图(右)。图3C示出了注射siRNA变体后24h的骨髓粒细胞的Cy3荧光强度的频率分布直方图(左)和Cy3中值荧光强度的条形图(右)。图3D示出了注射siRNA变体后24h的骨髓单核细胞的Cy3荧光强度的频率分布直方图(左)和Cy3中值荧光强度的条形图(右)。(n＝3，平均值±SD)p值描述化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；*p<0.05；未标记非显著性差异)。结果证明PC-DCA缀合的siRNA在骨髓单核细胞、粒细胞和嗜中性粒细胞中显示出较低的积累，表明PC-DCA缀合物可用于胎盘递送，且脱靶积累最少。
反义链5'端优化
反义链可能容易受到5'核酸外切酶的作用。因此，用修饰来保护5'端以减少降解是有利的。通过测试三种不同反义5'端修饰(5'乙烯基膦酸酯(VP)、5’硫代磷酸酯(PS)和5'-羟基(OH))的效果进一步优化siRNA。siRNA化学修饰模式的示意图。
在胚胎第13天(E)和E14，向妊娠CD-1小鼠注射20mg/kg的2283和2519siRNA变体的等摩尔混合物。图4A描绘了注射的siRNA化合物的化学模式和测试的5'部分的化学结构的示意图。如图4B所示，使用Quantigene 2.0RNA测定测量E18的胎盘中的sflt1-i13 mRNA水平。将水平归一化至Flt1，并呈现为PBS对照的百分比(n＝5，平均值±SD)。
5'部分、2'修饰模式和缀合物的优化导致组织积累和体内功效增加。如图4C所示，使用PNA杂交测定(n＝5)测量E18的胎盘中siRNA积累量。p值描述了化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；**p<0.01；****p<0.0001；未标记非显著性差异)。如图4D所示，使用Quantigene 2.0 RNA测定测量E18的胎盘中的sflt1-i13 mRNA水平。将水平归一化至Flt1，并呈现为PBS对照的百分比(n＝6，平均值±SD)。如图4E所示，使用PNA杂交测定(n＝6)测量E18的胎盘中siRNA积累量。p值描述了化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；**p<0.01；****p<0.0001；未标记非显著性差异。未配对t检验；#p<0.05；####p<0.0001)。如图4F所示，对照小鼠和经治疗的妊娠小鼠之间的平均小鼠幼仔数量、平均幼仔重量和平均胎盘重量大致相同，表明2283 siRNA和2519 siRNA的混合物不会对这些指标产生负面影响。
血清细胞因子产生减少
测试了优化的siRNA对血清细胞因子产生的影响。生成优化的siRNA以部分降低毒性并扩大治疗指数。血清细胞因子产生的减少将证明毒性降低和更广泛的治疗指数。
如图5所示，测量注射75mg/kg sFLT1_2283 siRNA变体后24h的CD-1小鼠的血清细胞因子水平(n＝3，平均值±SD)。p值描述了化合物之间的统计显著性差异(单向ANOVA；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；未标记非显著性差异)。测量了大量白介素、集落刺激因子和趋化因子水平，并发现相比于第一代siRNA，第二代优化siRNA的所述水平更低。更广泛的治疗指数意指siRNA可以以高浓度给药，而不会有出现毒性问题的风险。这可能导致施用频率降低和/或sFLT-1的更好沉默。
实施例2的总体结果显示，当与第一代siRNA相比时，靶向sFlt-12283和2519靶位点的优化的siRNA具有相似的沉默功效，具有优异的胎盘组织积累、减少的脱靶组织积累、减少的降解，减少的毒性，和更广泛的治疗指数。
用于评价先导化合物的分析系统。
目前为止开发的测定和模型如下。
原位组织分布的荧光显微术评价
合成了具有Cy3或Cy5.5(较低自发荧光)染料的hsiRNA变体，所述染料通过不可降解的接头附接到有义(随从)链的5'端。该化合物是生物稳定的，在24小时内未检测到Cy3裂解。将与其互补引导链杂交(从而形成双链hsiRNA)的荧光有义链施用至动物，并在也用DAPI或/和细胞类型选择性抗体染色的4μm组织切片中检查寡核苷酸分布模式。平行切片可以用标准组织学标记染色，从而实现详细的组织学作图。由于hsiRNA已经进行了重度疏水性修饰，因此染料添加对整体疏水性几乎没有影响，并因此对寡核苷酸分布的影响也很小。该测定允许快速评价组织和细胞类型分布，并补充有用于直接引导链检测的基于PNA的定量测定。
用于组织裂解物中定量引导链检测的PNA杂交
为了能够直接定量组织中完整的引导链，开发并实施了一种新型测定，其中引导链与完全互补的Cy3标记的PNA(肽核酸)寡核苷酸杂交，并将相应的双链体与过量的单链PNA通过HPLC分离。由于PNA不带电荷并且与引导链的结合极其紧密，因此它竞争胜过hsiRNA有义链和任何内源靶序列两者。Cy3-PNA:引导杂交体的荧光检测提供了组织裂解物中引导链丰度的直接量度。与HPLC自动进样器结合，该测定能够在一夜之间对数百个样品进行引导链定量。所述测定还高度灵敏，检测限小于10fmol/g，并且含有全长、部分降解、5'-磷酸化和5'-去磷酸化引导链的杂交体都可以在HPLC迹线中定量为单独的峰或肩。由于该测定可以检测标记和未标记的化合物两者，因此其可以直接过渡到未来的CRO进行临床样品分析。
用于直接检测细胞和组织中的Flt1 mRNA变体的 (Affymetrix)测 定
是一种高度灵敏的基于96孔的测定，其中通过信号放大直接从组织和/或细胞裂解物中直接检测mRNA。通过将这种直接检测分析与192孔自动TissueLyser连接起来，开发了能够处理每只动物的数十个样品的高通量版本。因此，在许多动物中同时生成了有关靶基因和管家基因表达的定量数据。在初步研究中，n＝8足以以80％的置信度检测sFlt1 mRNA同工型表达的40％调节。bDNA测定描述于Coles等人Nucleic Acid Ther.(2015)11月23日.PMID:26595721。
用于检测条件培养基和血液中的sFLT1蛋白的ELISA(#MVR100，R&D系统)
这种基于96孔的测定每个样品仅需要10μL的生物液体。该测定已针对体外和体内研究进行了多年优化。它具有临床兼容性，并且允许在不处死动物的情况下评价循环sFLT1蛋白水平，并且对于非人类灵长类动物研究特别有用。
正常小鼠妊娠模型
sFlt1-i13变体在小鼠妊娠期间表达，其中i13水平从第14-19天呈指数增加。sFLT1-i13-2283化合物与i13小鼠变体之间的完美同源性允许在这种简单的啮齿动物模型中研究功效和安全性两者。
先兆子痫模型
如下文进一步描述的，使用先兆子痫的胎盘缺血和缺氧模型的子宫灌注压降低(RUPP)模型。
狒狒野生型妊娠模型
sFlt1-i15a变体在妊娠期间的啮齿动物中不表达，因此将使用ELISA(一种非侵入性测定)作为功效读数在野生型妊娠狒狒中评价整体组合功效和安全性。
实施例3.在体外和在先兆子痫的RUPP大鼠模型中的靶向sFlt-1的优化siRNA
使用人细胞系在体外和在先兆子痫的RUPP大鼠模型中测试靶向sFlt-1的优化siRNA。本实施例中使用了以下siRNA：
图例：m＝2'-O-甲基；f＝2'-氟；T＝胸苷；#＝硫代磷酸酯；V＝5'-乙烯基膦酸酯；PCDCA＝通过磷酸酯接头的3'-C7-磷酸胆碱-二十二烷酸缀合物。
图9、图10A-图10B和图11A-图11B描绘了优化的sFlt-1靶向siRNA (sFLT-2283和sFLT-2519)。
在人WM-115细胞系中测试了优化的siRNA，以分析siRNA-2283和siRNA-2519沉默其靶标的能力。单独或以1:1的比率组合测试siRNA-2283(靶向sFLT1-i13)和siRNA-2519(靶向sFLT1-e15a)。如图7所示，单独的每种siRNA都能够沉默其靶sFLT1 mRNA同工型并降低总sFLT1蛋白水平，而组合表现出甚至更大程度的个体同工型沉默和总蛋白减少。
在先兆子痫的RUPP(妊娠大鼠子宫胎盘灌注减少模型)大鼠模型中组合测试了相同的siRNA。RUPP手术引起胎盘局部缺血，并且其是充分表征的先兆子痫模型。RUPP大鼠显示出先兆子痫的标志性症状，包括母体平均动脉血压(MAP)升高和肾小球滤过率(GFR)降低，伴有sFLT1水平升高。
为了在RUPP模型中评价靶向sFlt1的优化siRNA，在妊娠第13天和14天的给大鼠皮下注射10mg/体重kg的组合siRNA疗法(sFLT1siRNA：(siRNA-2283(sFLT1-i13-靶向)和siRNA-2519(sFLT1-e15a-靶向)的1:1混合物)或PBS对照(参见图8A)。
为了生成RUPP模型，在妊娠第14天，通过手术将银夹放置在妊娠Sprague Dawley大鼠子宫中的腹主动脉和卵巢动脉周围。假手术(腹部切口和缝合而不放置夹子)用作对照。
在妊娠第19天采集血液和组织并分析妊娠生物指标。在妊娠第19天测量清醒大鼠的血压，然后用异氟烷麻醉动物，以收集血液用于测量sFLT-1，并收集组织用于组织学分析。
进行了以下测定：
●母体血压测量：妊娠第18天，植入颈动脉导管用于测量第19天的清醒动脉血压和心率。
●胎儿和胎盘重量：在妊娠第19天，在临终处死时，测量胎儿和胎盘重量。计算每只大鼠的总胎儿和胎盘重量和平均胎儿和胎盘重量。
●胎儿吸收：目视确定被母体吸收的胎儿数量。
如图8B所示，组合疗法RUPP组中的母体血压降低，使血压达到对照水平(假手术)。此外，使用组合疗法的RUPP组中的胎盘重量得以保留(图8B)。如通过胎儿吸收和胎儿重量测量(如图8C所示)，没有对胎儿产生不利影响，并且胎儿生长有改善的趋势。
等效方案
本公开可以通过其他特定形式来实施而不会脱离其精神或基本特性。因此，上述实施方案应在所有方面均被视为说明性的，而非是对本发明的限制。本公开的范围因此由所附权利要求而非由前面的描述来指示，且因而在权利要求的含义和等效范围内的所有变化被涵盖在权利要求中。

Claims (81)

1.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA3'(SEQ ID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；
(2)所述反义链长度为至少20个核苷酸；
(3)所述反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；
(4)所述反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和20中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；
(5)所述反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；
(6)所述反义链的一部分与所述有义链的一部分互补；
(7)所述有义链长度为至少15个核苷酸；
(8)所述有义链包含至少65％的2'-O-甲基修饰；
(9)所述有义链5'端的位置4、6、8、10和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；并且
(10)所述有义链5'端的位置1-2处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
2.一种双链RNA(dsRNA)，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA3'(SEQ ID NO:1)或5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；
(2)所述反义链包含交替的2'-甲氧基-核糖核苷酸和2'-氟-核糖核苷酸；
(3)所述反义链5'端的位置2和14处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；
(4)所述反义链3'端的位置1-2至1-7处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；
(5)所述反义链的一部分与所述有义链的一部分互补；
(6)所述有义链包含交替的2'-甲氧基-核糖核苷酸和2'-氟-核糖核苷酸；并且
(7)所述有义链5'端的位置1-2处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
3.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA3'(SEQ ID NO:1)或
5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；
(2)所述反义链长度为至少20个核苷酸；
(3)所述反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；
(4)所述反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和18中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；
(5)所述反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；
(6)所述反义链的一部分与所述有义链的一部分互补；
(7)所述有义链长度为至少15个核苷酸；
(8)所述有义链包含至少80％的2'-O-甲基修饰；
(9)所述有义链5'端的位置7、9和11中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；并且
(10)所述有义链5'端的位置1-2处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
4.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA3'(SEQ ID NO:1)或
5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；
(2)所述反义链长度为至少20个核苷酸；
(3)所述反义链包含至少70％的2'-O-甲基修饰；
(4)所述反义链5'端的位置2、4、5、6、8和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；
(5)所述反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；
(6)所述反义链的一部分与所述有义链的一部分互补；
(7)所述有义链长度为至少15个核苷酸；
(8)所述有义链包含100％的2'-O-甲基修饰；并且
(9)所述有义链5'端的位置1-2处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
5.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA3'(SEQ ID NO:1)或
5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；
(2)所述反义链长度为至少20个核苷酸；
(3)所述反义链包含至少75％的2'-O-甲基修饰；
(4)所述反义链5'端的位置2、4、5、6和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；
(5)所述反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；
(6)所述反义链的一部分与所述有义链的一部分互补；
(7)所述有义链长度为至少15个核苷酸；
(8)所述有义链包含100％的2'-O-甲基修饰；并且
(9)所述有义链5'端的位置1-2处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
6.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含与5'CTCTCGGATCTCCAAATTTA3'(SEQ ID NO:1)或
5'CATCATAGCTACCATTTATT 3'(SEQ ID NO:2)的核酸序列基本上互补的序列；
(2)所述反义链长度为至少20个核苷酸；
(3)所述反义链包含至少85％的2'-O-甲基修饰；
(4)所述反义链5'端的位置2和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；
(5)所述反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；
(6)所述反义链的一部分与所述有义链的一部分互补；
(7)所述有义链长度为至少15个核苷酸；
(8)所述有义链包含100％的2'-O-甲基修饰；并且
(9)所述有义链5'端的位置1-2处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
7.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其中所述反义链长度为20个核苷酸。
8.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其中所述反义链长度为21个核苷酸。
9.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其中所述反义链长度为22个核苷酸。
10.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链长度为15个核苷酸。
11.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链长度为16个核苷酸。
12.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链长度为18个核苷酸。
13.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链长度为20个核苷酸。
14.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其包含15个碱基对至20个碱基对的双链区域。
15.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其包含15个碱基对的双链区域。
16.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其包含16个碱基对的双链区域。
17.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其包含18个碱基对的双链区域。
18.如权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其包含20个碱基对的双链区域。
19.如权利要求1-18中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含平末端。
20.如权利要求1-19中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个单链核苷酸突出端。
21.如权利要求20所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含约2个核苷酸至5个核苷酸的单链核苷酸突出端。
22.如权利要求1-21中任一项所述的dsRNA，其包含4-16个硫代磷酸酯核苷酸间键。
23.如权利要求1-21中任一项所述的dsRNA，其包含8-13个硫代磷酸酯核苷酸间键。
24.如权利要求1-23中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链包含所述反义链和所述有义链之间的一个或多个核苷酸错配。
25.如权利要求1-24中任一项所述的dsRNA，其中所述反义链包含5'磷酸酯、5'-烷基膦酸酯、5'亚烷基膦酸酯或5'烯基膦酸酯。
26.如权利要求25所述的dsRNA，其中所述反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
27.如权利要求1-26中任一项所述的dsRNA，其中功能部分连接到所述有义链的3'端。
28.如权利要求27所述的dsRNA，其中所述功能部分包括疏水部分。
29.如权利要求28所述的dsRNA，其中所述疏水部分选自由以下各项组成的组：脂肪酸、类固醇、开环类固醇、脂质、神经节苷脂、核苷类似物、内源性大麻素、维生素及其混合物。
30.如权利要求29所述的dsRNA，其中所述类固醇选自由胆固醇和石胆酸(LCA)组成的组。
31.如权利要求29所述的dsRNA，其中所述脂肪酸选自由二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十二烷酸(DCA)组成的组。
32.如权利要求29所述的dsRNA，其中所述维生素选自由胆碱、维生素A、维生素E及其衍生物和代谢物组成的组。
33.如权利要求27-32中任一项所述的dsRNA，其中所述功能部分通过接头连接至所述有义链。
34.如权利要求33所述的dsRNA，其中所述接头是可切割接头。
35.如权利要求34所述的dsRNA，其中所述可切割接头包含磷酸二酯键、二硫键、酸不稳定键或光可切割键。
36.如权利要求34或35所述的dsRNA，其中所述可切割接头包含具有磷酸二酯核苷酸间键的dTdT二核苷酸。
37.如权利要求35所述的dsRNA，其中所述酸不稳定键包括β-硫代丙酸酯键或羧二甲基马来酸酐(CDM)键。
38.如权利要求33-37中任一项所述的dsRNA，其中所述接头包括二价或三价接头。
39.如权利要求38所述的dsRNA，其中所述二价或三价接头选自由以下各项组成的组：
其中n为1、2、3、4或5。
40.如权利要求33-39中任一项所述的dsRNA，其中所述接头包含乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、酰胺、氨基甲酸酯或其组合。
41.如权利要求38-40中任一项所述的dsRNA，其中当所述接头为三价接头时，所述接头进一步连接磷酸二酯或磷酸二酯衍生物。
42.如权利要求41所述的dsRNA，其中所述磷酸二酯或磷酸二酯衍生物选自由以下各项组成的组：
其中X是O、S或BH3。
43.如权利要求1-42中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链3'端的位置1和2处的核苷酸，以及所述反义链5'端的位置1和2处的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻的核糖核苷酸连接。
44.如权利要求1-43中任一项所述的dsRNA，其中所述有互补性的区域与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少15、16、17或18个连续核苷酸互补。
45.如权利要求1-43中任一项所述的dsRNA，其中所述有互补性的区域含有与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的不超过3个错配。
46.如权利要求1-43中任一项所述的dsRNA，其中所述有互补性的区域与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2完全互补。
47.如权利要求1-46中任一项所述的dsRNA，其中所述反义链包含5'UAAAUUUGGAGAUCCGAGAGA3'的核酸序列，并且所述有义链包含5'CGGAUCUCCAAAUUUA3'的核酸序列。
48.如权利要求1-46中任一项所述的dsRNA，其中所述反义链包含5'UAUAAAUGGUAGCUAUGAUGA3'的核酸序列，并且所述有义链包含5'AUAGCUACCAUUUAUA3'的核酸序列。
49.如权利要求1-46中任一项所述的dsRNA，其中细胞或生物体中sFLT1蛋白的表达降低至少约20％。
50.一种治疗或控制PE、产后PE、子痫和/或HELLP综合征的方法，所述方法包括向需要此类治疗或控制的受试者施用治疗有效量的如权利要求1-48中任一项所述的dsRNA。
51.如权利要求50所述的方法，其中静脉内施用或皮下施用所述药物组合物。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述受试者中的sFLT1蛋白表达降低至少约20％。
53.一种治疗有需要的受试者的PE、产后PE、子痫或HELLP综合征的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-48中任一项所述的dsRNA。
54.一种治疗有需要的受试者的血管生成病症的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-48中任一项所述的dsRNA。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述血管生成病症选自由PE、产后PE、子痫和HELLP综合征组成的组。
56.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
包含第一有义链和第一反义链的第一dsRNA，其中所述第一反义链包含与SEQ ID NO:1基本上互补的具有互补性的区域，其中所述第一dsRNA包括如权利要求1-46中任一项所述的dsRNA；
包含第二有义链和第二反义链的第二dsRNA，其中所述第二反义链包含与SEQ ID NO:2基本上互补的具有互补性的区域，其中所述第二dsRNA包括如权利要求1-46中任一项所述的dsRNA；和
药学上可接受的载剂。
57.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
包含第一有义链和第一反义链的第一dsRNA，每条链具有5'端和3'端，其中所述第一反义链包含与SEQ ID NO:1基本上互补的具有互补性的区域；
包含第二有义链和第二反义链的第二dsRNA，每条链具有5'端和3'端，其中所述第二反义链包含与SEQ ID NO:2基本上互补的具有互补性的区域；和
药学上可接受的载剂，其中对于所述第一dsRNA和所述第二dsRNA中的每一项：
(1)所述反义链长度为至少20个核苷酸；
(3)所述反义链包含至少50％的2'-O-甲基修饰；
(4)所述反义链5'端的位置2、4、5、6、8、10、12、14、16和20中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；
(5)所述反义链3'端的位置1-2至1-8处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接；
(6)所述反义链的一部分与所述有义链的一部分互补；
(7)所述有义链长度为至少15个核苷酸；
(8)所述有义链包含至少65％的2'-O-甲基修饰；
(9)所述有义链5'端的位置4、6、8、10和14中的任一个或多个处的核苷酸不是2'-甲氧基-核糖核苷酸；并且
(10)所述有义链5'端的位置1-2处的核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键相互连接。
58.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含(mU)#(fA)#(mA)(fA)(fU)(fU)(mU)(fG)(mG)(fA)(mG)(fA)(mU)(fC)#(mC)#(fG)#(mA)#(mG)#(mA)#(fG)#(mA)；并且
(2)所述有义链包含(mC)#(mG)#(mG)(fA)(mU)(fC)(mU)(fC)(mC)(fA)(mA)(mA)(mU)(fU)#(mU)#(mA)，
其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键。
59.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含(mU)#(fA)#(mU)(fA)(fA)(fA)(mU)(fG)(mG)(fU)(mA)(fG)(mC)(fU)#(mA)#(fU)#(mG)#(mA)#(mU)#(fG)#(mA)；并且
(2)所述有义链包含(mA)#(mU)#(mA)(fG)(mC)(fU)(mA)(fC)(mC)(fA)(mU)(mU)(mU)(fA)#(mU)#(mA)，
其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键。
60.如权利要求58或59所述的dsRNA，其中所述反义链包含5'乙烯基膦酸酯。
61.如权利要求58-60中任一项所述的dsRNA，其包含连接至所述有义链3'端的二十二烷酸(DCA)缀合物。
62.如权利要求61所述的dsRNA，其中所述DCA通过接头连接至所述有义链。
63.如权利要求62所述的dsRNA，其中所述接头是可切割接头。
64.如权利要求63所述的dsRNA，其中所述可切割接头包含磷酸二酯键、二硫键、酸不稳定键或光可切割键。
65.如权利要求63或64所述的dsRNA，其中所述可切割接头包含具有磷酸二酯核苷酸间键的dTdT二核苷酸。
66.如权利要求62-65中任一项所述的dsRNA，其中所述接头包括二价或三价接头。
67.如权利要求66所述的dsRNA，其中所述二价或三价接头选自由以下各项组成的组：
其中n为1、2、3、4或5。
68.如权利要求62-67中任一项所述的dsRNA，其中当所述接头为三价接头时，所述接头进一步连接磷酸二酯或磷酸二酯衍生物。
69.如权利要求68所述的dsRNA，其中所述磷酸二酯或磷酸二酯衍生物选自由以下各项组成的组：
其中X是O、S或BH3。
70.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含V(mU)#(fA)#(mA)(fA)(fU)(fU)(mU)(fG)(mG)(fA)(mG)(fA)(mU)(fC)#(mC)#(fG)#(mA)#(mG)#(mA)#(fG)#(mA)；并且
(2)所述有义链包含(mC)#(mG)#(mG)(fA)(mU)(fC)(mU)(fC)(mC)(fA)(mA)(mA)(mU)(fU)#(mU)#(mA)(T)(T)-PCDCA，
其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“T”对应于胸苷DNA核苷酸，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键，“V”对应于5'-乙烯基膦酸酯，并且“PCDCA”对应于通过磷酸酯接头的3'-C7-磷酸胆碱-二十二烷酸缀合物。
71.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含V(mU)#(fA)#(mU)(fA)(fA)(fA)(mU)(fG)(mG)(fU)(mA)(fG)(mC)(fU)#(mA)#(fU)#(mG)#(mA)#(mU)#(fG)#(mA)；并且
(2)所述有义链包含(mA)#(mU)#(mA)(fG)(mC)(fU)(mA)(fC)(mC)(fA)(mU)(mU)(mU)(fA)#(mU)#(mA)(T)(T)-PCDCA，
其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“T”对应于胸苷DNA核苷酸，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键，“V”对应于5'-乙烯基膦酸酯，并且“PCDCA”对应于通过磷酸酯接头的3'-C7-磷酸胆碱-二十二烷酸缀合物。
72.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含式I或其盐：
并且
(2)所述有义链包含式II或其盐：
73.一种双链RNA(dsRNA)分子，所述dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含式III或其盐：
或其盐；并且
(2)所述有义链包含式IV或其盐：
74.如权利要求72或73所述的dsRNA，其中所述盐包括钠盐或钾盐。
75.一种治疗或控制PE、产后PE、子痫和/或HELLP综合征的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的如权利要求58-74中任一项所述的dsRNA。
76.一种治疗有需要的受试者的血管生成病症的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求58-74中任一项所述的dsRNA。
77.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
第一dsRNA，所述第一dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含V(mU)#(fA)#(mA)(fA)(fU)(fU)(mU)(fG)(mG)(fA)(mG)(fA)(mU)(fC)#(mC)#(fG)#(mA)#(mG)#(mA)#(fG)#(mA)；并且
(2)所述有义链包含(mC)#(mG)#(mG)(fA)(mU)(fC)(mU)(fC)(mC)(fA)(mA)(mA)(mU)(fU)#(mU)#(mA)(T)(T)-PCDCA；和
第二dsRNA，所述第二dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含V(mU)#(fA)#(mU)(fA)(fA)(fA)(mU)(fG)(mG)(fU)(mA)(fG)(mC)(fU)#(mA)#(fU)#(mG)#(mA)#(mU)#(fG)#(mA)；并且
(2)所述有义链包含(mA)#(mU)#(mA)(fG)(mC)(fU)(mA)(fC)(mC)(fA)(mU)(mU)(mU)(fA)#(mU)#(mA)(T)(T)-PCDCA，
其中“m”对应于2'-O-甲基修饰，“f”对应于2'-氟修饰，“T”对应于胸苷DNA核苷酸，“#”对应于硫代磷酸酯核苷酸间键，“V”对应于5'-乙烯基膦酸酯，并且“PCDCA”对应于通过磷酸酯接头的3'-C7-磷酸胆碱-二十二烷酸缀合物。
78.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
第一dsRNA，所述第一dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含式I或其盐：
/>
并且
(2)所述有义链包含式II或其盐：
以及
第二dsRNA，所述第二dsRNA包含反义链和有义链，每条链具有5'端和3'端，其中：
(1)所述反义链包含式III或其盐：
并且
(2)所述有义链包含式IV或其盐：
79.如权利要求78所述的药物组合物，其中所述盐包括钠盐或钾盐。
80.一种治疗或控制PE、产后PE、子痫和/或HELLP综合征的方法，所述方法包括向需要这种治疗或控制的受试者施用治疗有效量的如权利要求77或78所述的药物组合物。
81.一种治疗有需要的受试者的血管生成病症的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求77或78所述的药物组合物。
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