CN108064313B

CN108064313B - 用于抑制因子xii的基因表达的组合物和方法

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Publication number: CN108064313B
Application number: CN201680027422.5A
Authority: CN
Inventors: S·B·坎纳; D·L·路易斯; D·H·维基菲尔德; L·埃尔米达
Original assignee: Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Arrowhead Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-03-17
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2036-03-16
Also published as: JP2018509913A; CA2979703A1; AU2022203170A1; JP2023156455A; EP3271482A2; US20190359984A1; AU2016233364A1; WO2016149331A2; CN113493789A; MX2017011422A; US10308941B2; JP2021000102A; US9803205B2; TW201642874A; US10858658B2; CN108064313A; US20180023086A1; IL254518A0; EP3271482A4; US20160272978A1

Abstract

公开了用于通过RNA干扰机制抑制因子XII(F12)基因表达的RNA干扰(RNAi)引发剂。也公开了包含一种或多种F12 RNAi引发剂与一种或多种能够向肝细胞递送RNAi引发剂的赋形剂的药物组合物。向肝细胞体内递送F12 RNAi引发剂提供了对F12基因表达的抑制和对血管性水肿，包括遗传性血管性水肿(HAE)、静脉血栓栓塞(VTE)和与血管性水肿相关的疾病的治疗。

Description

用于抑制因子XII的基因表达的组合物和方法

背景技术

因子XII，一种主要在肝脏中表达并在血液中发现的丝氨酸蛋白酶，在内源性凝血途径和激肽-激肽释放酶系统中有双重功能。激肽-激肽释放酶系统在炎症、血压控制、凝血和疼痛中起作用。因子XII的活性形式(也称为FXII、FC12或哈格曼因子)同时切割凝血级联中的因子XI和激肽-激肽释放酶系统中的前激肽释放酶，分别产生活性形式的FXI和激肽释放酶。

完全失去F12的患者没有出血紊乱。另外，由于基因敲除缺少F12的小鼠被保护免于血栓形成(Renne等，JEM 2005，202∶271-281)。也在F12-抑制性抗体处理的小鼠、兔和灵长类中观察到F12消耗的血栓保护效果(Larsson等，ScienceTransMed，20146∶22ra17)。血栓栓塞事件的现有治疗靶向了凝血途径中下游的酶，这些酶对于通过形成纤维蛋白控制损伤相关的失血而言是关键的，并且因此，用这些试剂治疗对潜在的威胁生命的出血带来负面影响。

遗传性血管性水肿(HAE)是一种罕见的疾病，其特征是严重肿胀的重复发作。身体出现肿胀的最常见区域是四肢、脸、肠道和气道。发作可能是自发的或者可由物理伤口或应激诱导。喉(气道)水中可能是威胁生命的，因为其可能造成窒息致死。

大部分的HAE治疗选项是用于在发作时给予，聚焦于C1INH替代、抑制激肽释放酶、或通过缓激肽2受体信号传导。当前，唯一的长期预防性治疗是C1INH替代疗法。因为血栓形成(包括静脉血栓栓塞，VTE)和血管性水肿被认为通过它们相应途径的过度活化信号传导而发生，所以抑制F12基因表达可用于预防两种类型的病症。

发明内容

本文描述了用于抑制F12基因的体内表达的F12 RNA干扰(RNAi)引发剂及其组合物。本文所述的F12 RNAi引发剂可用于治疗由激肽-激肽释放酶和固有凝血途径的过度活化导致的疾病，如HAE和血栓形成。

本文描述了能够选择性并高效降低F12表达的因子XII(也称为因子12，F12或哈格曼因子)基因特异性RNA干扰(RNAi)引发剂分子(也称为RNAi剂，RNAi引发剂，或引发剂)。使用所述的F12 RNAi引发剂可用于治疗性处理与血管性水肿相关的疾病的方法，包括但不限于：遗传性血管性水肿(HAE)、获得性血管性水肿(AAE)、ACE抑制剂相关血管性水肿、变应性血管性水肿、非组胺能类出血性水肿(INAE)、特发性血管性水肿、栓塞形成、静脉血栓栓塞(VTE)、血栓性闭塞性疾病、围手术期静脉闭塞性疾病预防。使用所述的F12 RNAi引发剂还提供了治疗和预防静脉闭塞性疾病如深静脉血栓形成或肺栓塞，以及治疗或预防动脉血栓栓塞疾病的方法。这类方法包括向对象，例如，人或动物对象给予本文所述的F12 RNAi引发剂。

本文描述了用于抑制人F12基因表达的RNAi引发剂(F12 RNAi引发剂)。各RNAi引发剂包括至少正义链和反义链。正义链和反义链可以是互相部分、基本或完全互补的。本文所述的RNAi引发剂正义和反义链的长度各自可以是16-30个核苷酸。在一些实施方式中，正义和反义链的长度各自可以是17-26个核苷酸。正义和反义链的长度可以相同或不同。在一些实施方式中，正义和反义链的长度各自可以都是26个核苷酸。在其他实施方式中，正义链的长度是约23个核苷酸，而反义链的长度是约21个核苷酸。在一些实施方式中，正义和反义链的长度是17个核苷酸。本文所述的RNAi引发剂在递送至表达F12基因的细胞后，抑制F12基因在体外或体内的表达。

本文所述的F12 RNAi引发剂的正义链含有具有与F12 mRNA中的序列至少90％相同性的核苷酸序列。在一些实施方式中，具有与F12 mRNA中的序列至少90％相同性的核苷酸序列的长度是16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个核苷酸。本文所述的F12 RNAi引发剂的反义链含有具有与F12 mRNA中的序列至少90％互补性的核苷酸序列。在一些实施方式中，具有与F12 mRNA中的序列至少90％互补性的核苷酸序列的长度是16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个核苷酸。表1-3中提供了可用于F12 RNAi引发剂的F12 RNAi引发剂正义链和反义链的示例。

在一些实施方式中，使用本领域已知的任何寡核苷酸递送技术来将一种或多种F12 RNAi引发剂递送至靶细胞或组织。核酸递送方法包括，但不限于，通过脂质体中包封，通过离子透入法，或通过纳入其他载剂，如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米胶囊、和生物粘附微球、蛋白性载剂或DPC(参见，例如WO 2000/053722、WO 2008/0022309、WO 2011/104169、和WO 2012/083185，其各自通过引用纳入本文)。在一些实施方式中，F12RNAi引发剂共价连接至靶向基团。靶向基团可包括细胞受体配体，如半乳糖簇，包括包含N-乙酰基-半乳糖胺三聚体的半乳糖簇，或其疏水性基团，如胆甾醇。在一些实施方式中，通过体内递送化合物或载剂来提供F12RNAi引发剂。递送化合物或载剂可包括聚合物，如蜂毒肽样肽(MLP)递送聚合物或共聚物。在一些实施方式中，可将F12 RNAi引发剂共价连接至递送化合物或载剂。

根据是否需要局部或全身治疗和待治疗的区域，F12 RNAi引发剂或含有一种或多种F12 RNAi引发剂的药物组合物可通过多种方式给予。在一些实施方式中，给药是局部(例如，通过透皮贴片)、经肺(例如，通过粉末或气溶胶的吸入或吹气，包括通过喷雾器)；经气管；经鼻；表皮和透皮，口服或胃肠外。胃肠外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输液；真皮下，例如通过植入装置；或颅内，例如，通过实质内、鞘内或心室内给药。

除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。

从下文的详述和所附权利要求中能够很容易地了解本发明的其他特征和优点。

附图的简要说明

图1.图片显示：A.在给予2mg/kg RNAi引发剂和2mg/kg MLP递送聚合物之后野生型小鼠中的血清F12蛋白质水平，和B.在给予4mg/kg RNAi引发剂和4mg/kg MLP递送聚合物之后野生型小鼠中的血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至第1天和盐水对照。

图2.图片显示在以1：1重量/重量给予1、2、或4mg/kg F12RNAi引发剂和MLP递送聚合物之后野生型小鼠中的血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至第1天和盐水对照。

图3.图片显示在第1天单次皮下(SQ)给予1、3、或10mg/kg RNAi引发剂之后野生型小鼠中的血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至第1天和盐水对照。

图4.图片显示在第1、8和15天SQ给予1或2mg/kg RNAi引发剂之后野生型小鼠中的血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至第1天和盐水对照。

图5.图片显示在第1天以1∶1重量/重量给予单次2mg/kg RNAi引发剂和MLP递送聚合物之后猕猴的血清F12蛋白质水平。cF12水平被标准化至第1天。F12 RNAi引发剂AD01001显示在黑色圆圈中，F12 RNAi引发剂AD01520显示在灰色方块中。标准偏差显示为平均值上的误差线。

图6.图片显示在第1、29、57和85天以1∶1给予2mg/kg RNAi引发剂和MLP递送聚合物之后猕猴的血清F12蛋白质水平。cF12水平被标准化至第1天。F12 RNAi引发剂AD01001显示在黑色圆圈中，F12 RNAi引发剂AD01520显示在灰色方块中。标准偏差显示为平均值上的误差线。

图7.图片显示在第1、29、57、85和121天以1∶1给予4mg/kg F12 RNAi引发剂AD01520和MLP递送聚合物之后猕猴的血清F12蛋白质水平。cF12水平被标准化至第1天。cF12水平以灰色方块作图，aPPT显示为黑色圆圈。标准偏差显示为平均值上的误差线。

图8.图片显示在第1天单次皮下给予3mg/kg或10mpg的F12 RNAi引发剂AD02562之后猕猴中的血清F12蛋白质水平。cF12水平被标准化至第1天。3mg/kg剂量显示为灰色方块，10mg/kg剂量显示为黑色圆圈。标准偏差显示为平均值上的误差线。

图9.图片显示在用角叉菜胶注射前7天用盐水，或8mg/kg F12 RNAi引发剂AD01520和8mg/kgMLP递送聚合物处理的大鼠在角叉菜胶注射之后大鼠爪体积的变化。A.显示在处理的对比盐水动物中爪体积的变化。B.显示处理的对比盐水动物的敲减水平。

图10.图片显示：A.在氯化铁攻击前7天用盐水、或8mg/kg F12 RNAi引发剂AD01520和8mg/kg MLP递送聚合物处理的小鼠的氯化铁攻击后的出现堵塞的时间。在RNAi引发剂处理组中的所有动物在实验期间(30分钟，由虚线表示)没有出现堵塞。B.与用盐水处理的动物相比，用F12 RNAi引发剂AD01520和MLP递送聚合物处理的动物中的敲减。

图11.图片显示：A.用盐水、8mg/kg F7-靶向的RNAi引发剂和8mg/kg MLP递送聚合物、或8mg/kg F12 RNAi引发剂AD01520和8mg/kg MLP递送聚合物处理的小鼠的出血时间。B.F12蛋白质水平。C.F7蛋白质水平。

具体实施方式

本文描述了用于抑制因子XII基因的表达的RNAi引发剂(本文称为F12 RNAi引发剂)。各F12 RNAi引发剂包括正义链和反义链。正义链和反义链是互相部分、基本或完全互补的。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂正义和反义链的长度独立地是16-30个核苷酸。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂正义和反义链的长度独立地是17-26个核苷酸。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂正义和反义链的长度独立地是17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个核苷酸。正义和反义链的长度可以相同或它们可以不同。在一些实施方式中，正义和反义链的长度各自是26个核苷酸。在其他实施方式中，正义链的长度是约23个核苷酸，而反义链的长度是约21个核苷酸。在其他实施方式中，正义和反义链的长度独立地是17-21个核苷酸。表1-3中提供了用于形成F12 RNAi引发剂分子的核苷酸序列的示例。

RNAi引发剂包括，但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、和切丁酶底物(dicer substrates)(美国专利第8084599、8349809和8513207号)。本文所述的RNAi引发剂在递送至表达F12基因的细胞后，通过RNA干扰(RNAi)的生物学过程，抑制或敲减F12基因在体外或体内的表达。

F12 RNAi引发剂包括正义链和反义链，其各自含有长度为16-23个核碱基的核心序列。反义链核心序列与F12 mRNA中存在的核苷酸序列(有时称为，例如，靶序列)100％(完美)互补或至少90％(基本)互补。正义链核心序列与反义链中的序列100％(完美)互补或至少90％(基本)互补，并且因此正义链核心序列与F12 mRNA中存在的核苷酸序列(靶序列)完美相同或至少90％相同。正义链核心序列可以与相应的反义核心序列的长度相同，或其可以是不同长度。在一些实施方式中，反义链核心序列的长度是17、18、19、20、21、22、或23个核苷酸。在一些实施方式中，正义链核心序列的长度是17、18、19、20、21、22、或23个核苷酸。

F12 RNAi引发剂正义和反义链通常退火以形成双链体。在互补双链体区域内，正义链核心序列与反义核心序列是至少90％互补或100％互补。在一些实施方式中，正义链核心序列含有与反义链核心序列的相应16、17、18、19、20、或21个核苷酸序列至少90％或100％互补的至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、或至少21个核苷酸的序列(即，F12RNAi引发剂的正义链和反义核心序列具有至少90％碱基配对或100％碱基配对的至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、或至少21个核苷酸的区域)。

正义链和/或反义链可任选地并独立地在核心序列的3′末端、5′末端、或者3′和5′末端处同时含有另外1、2、3、4、5、或6个核苷酸(延伸)。反义链其他核苷酸，如果存在，可以与或不与F12 mRNA中的相应序列互补。正义链其他核苷酸，如果存在，可以与或不与F12mRNA中的相应序列相同。反义链其他核苷酸，如果存在，可以与或不与正义链其他核苷酸(如果存在)互补。

如本文所用，延伸包括在正义链核心序列和/或反义链核心序列的5′和/或3′末端处的1、2、3、4、5、或6个核苷酸。正义链上的延伸核苷酸可以与或不与相应反义链中的核苷酸互补，该核苷酸是核心序列核苷酸或延伸核苷酸。相反，反义链上的延伸核苷酸可以与或不与相应正义链中的核苷酸互补，该核苷酸是核心序列核苷酸或延伸核苷酸。在一些实施方式中，RNAi引发剂的正义链和反义链都包含3′和5′延伸。在一些实施方式中，一个链的一个或多个3′延伸核苷酸与另一个链的一个或多个5′延伸核苷酸碱基配对。在其他实施方式中，一个链的一个或多个3′延伸核苷酸与另一个链的一个或多个5′延伸核苷酸碱基配对。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂具有反义链和正义链，该反义链具有3′延伸且该正义链具有5′延伸。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂分子包含具有长度为1、2、3、4、5、或6个核苷酸的3′延伸的反义链。在其他实施方式中，F12 RNAi引发剂分子包含具有长度为1、2、或3个核苷酸的3′延伸的反义链。在一些实施方式中，一个或多个反义链延伸核苷酸包含一个或多个尿嘧啶或胸腺嘧啶核苷酸，其与相应的F12 mRNA序列互补。在一些实施方式中，反义链延伸可以是，但不限于：uAu、uGu、udTsdT、usdTsdT、UfAu、Aua、Afsusa、UAU、uAfu、uau、udAu、uscu、usgu、uscsu、cAu、aUa、aua、u(invdA)u、cag、agu、gcg、caa、usasu、uAMTM、usTMsAM(各自以5′至3′列出，表2和3的符号相同)。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂分子包含具有长度为1、2、3、4、或5个核苷酸的5′延伸的反义链。在其他实施方式中，F12 RNAi引发剂分子包含具有长度为1或2个核苷酸的5′延伸的反义链。在一些实施方式中，一个或多个反义链延伸核苷酸包含一个或多个尿嘧啶或胸腺嘧啶核苷酸，其与相应的F12 mRNA序列互补。在其他实施方式中，反义链延伸包括或由以下组成：dA、dT、pdT、vpdT、或u，其中dA和dT分别表示脱氧腺苷和脱氧胸苷核苷酸，pdT表示具有5′磷酸的脱氧胸苷核苷酸，vpdT表示乙烯基膦酸脱氧胸苷核苷酸，并且u表示2′-OMe修饰的尿嘧啶核苷酸。反义链可具有任何上述的3′延伸与任何上述的5′反义链延伸的组合，如果存在。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂分子包含具有长度为1、2、3、4、或5个核苷酸的3′延伸的正义链。在一些实施方式中，一个或多个正义链延伸核苷酸包含腺苷、尿嘧啶或胸苷核苷酸、AT二核苷酸、或对应于F12mRNA序列中的核苷酸的核苷酸。在其他实施方式中，3′正义链延伸由以下组成：Af、invdA、invdT、A(invdT)、Af(invdT)、U(invdT)、Uf(invdT)、AfAbuAu、dTdT、或dTsdT，其中Af和Uf分别表示2′-氟腺苷和尿嘧啶核苷酸，invdA和invdT分别表示3′-3′连接的(反向)脱氧腺苷和脱氧胸苷核苷酸，Ab表示脱碱基核糖，u表示2′-OMe修饰的尿嘧啶核苷酸，dT表示脱氧胸苷核苷酸，sdT表示具有5′硫代磷酸酯的脱氧胸苷核苷酸，并且U和A表示尿嘧啶和腺苷核糖核苷酸。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂分子包含具有长度为1、2、3、4、5、或6个核苷酸的5′延伸的正义链。在一些实施方式中，一个或多个正义链延伸核苷酸包含一个或多个尿嘧啶或腺苷核苷酸，其对应于的F12 mRNA序列中的核苷酸。在一些实施方式中，正义链5′延伸可以是，但不限于：uAuAus、uAuAu、UAUUAGfs、UfaUfaA、uauaA、AUAUU、AfuAfuU、auauU、uaUfau、uAuA(U_UNA)、uauau、udAudAu、uuAga、uuAuu、uuGAu、uuaga、uAuga、aUaGas、uauaus、uAuaas、udAuau、adTaga、auaga、u(invdA)uau、gacau、ugaau、gcgau、uauga、uugga、auaga(各自以5′至3′列出，表2和3的符号相同)。正义链可具有3′延伸和/或5′延伸。

表1中提供了未修饰的F12RNAi引发剂正义链和反义链序列。注意在各行中，反义链不必与相应(互补)正义链一起显示。在F12RNAi引发剂形成中，表1中列出的各序列中的各核苷酸可以是修饰的核苷酸。

表1.未修饰的F12 RNAi引发剂反义链和正义链序列。

通过用正义链退火反义链来形成本文所述的F12 RNAi引发剂。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链包含表1和2中任意序列的核苷酸序列。在一些实施方式中，F12RNAi引发剂反义链包含表1和2中任意序列的核苷酸1-17、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21、2-21、1-22、2-22、1-23、2-23、1-24、2-24、1-25、2-25、1-26、或2-26的序列。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂正义链包含表1和3中任意序列的核苷酸序列。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂正义链包含表1和2中任意序列的核苷酸1-17、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21、2-21、1-22、2-22、1-23、2-23、1-24、2-24、1-25、2-25、1-26、或3-26的序列。

在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的正义和反义链含有相同数量的核苷酸。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的正义和反义链含有不同数量的核苷酸。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的正义链5′末端和反义链3′末端形成钝末端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的正义链3′末端和反义链5′末端形成钝末端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的2个末端形成钝末端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的2个末端都不是钝末端。如本文所述，钝末端是指双链引发剂分子的末端，其中2个退火的链的末端核苷酸互补(形成互补碱基对)。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的正义链5′末端和反义链3′末端形成散损末端(frayed end)。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的正义链3′末端和反义链5′末端形成散损末端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的2个末端形成散损末端。在一些实施方式中，本文所述的RNAi引发剂的2个末端都不是散损末端。如本文所用，散损末端是指双链引发剂分子的末端，其中2个退火的链的末端核苷酸成对(即，不形成突出端)，但不是互补的(即，形成非互补对)。如本文所用，突出端是在双链RNAi引发剂分子的一条链的末端处的一个或多个未配对核苷酸的延伸。未配对核苷酸可以在正义链或反义链上，产生3′或5′突出端。在一些实施方式中，RNAi引发剂分子含有：钝末端和散损末端，钝末端和5′突出末端，钝末端和3′突出末端，散损末端和5′突出末端，散损末端和3′突出末端，2个5′突出末端，2个3′突出末端，5′突出末端和3′突出末端，2个散损末端，或2个钝末端。

在一些实施方式中，F12RNAi引发剂含有一个或多个修饰的核苷酸。核苷酸碱基(或核碱基)是杂环嘧啶或嘌呤化合物，其是所有核酸的组分并且包括腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿嘧啶(U)。如本文所用，″G″、″g〞、″C″、″c″、″A″、″a″、″U″、″u″、和″T〞各自一般代表核碱基、核苷、核苷酸或核苷酸模拟物，其分别含有鸟苷、胞苷、腺苷、尿嘧啶和胸苷作为碱基。如本文所用，术语“核苷酸”可包括修饰的核苷酸或核苷酸模拟物、脱碱基位点、或替代部分。如本文中所用，“修饰的核苷酸”是核苷酸、脱氧核苷酸、核苷酸模型化合物、无碱基位点、或替代取代部分，而不是核糖核苷酸(2′-羟基核苷酸)。在一些实施方式中，修饰的核苷酸包含2′-修饰的核苷酸(即，核苷酸在五元糖环的2′位置具有除羟基外的基团)。修饰的核苷酸包括但不限于：2′-修饰的核苷酸，2′-O-甲基核苷酸(本文表示为核苷酸序列中的小写字母“n”)，2′-脱氧-2′-氟核苷酸(本文表示为Nf，本文也表示为2′-氟核苷酸)，2′-脱氧核苷酸(本文表示为dN)，2′-甲氧基乙基(2′-O-2-甲氧基乙基)核苷酸(本文表示为NM或2′-MOE)，2′-氨基核苷酸，2′-烷基核苷酸，3′至3′连接(反向)核苷酸(本文表示为invdN、invN、invn、invX)，包含非天然碱基的核苷酸，桥接核苷酸，肽核酸，2′，3′-开环核苷酸模拟物(未锁定核碱基类似物，本文表示为N_UNA或NUNA)，锁核苷酸(本文表示为N_LNA或NLNA)，3′-O-甲氧基(2′核苷酸间连接的)核苷酸(本文表示为3′-Omen)，2′-F-阿拉伯核苷酸(本文表示为NfANA或Nf_ANA)，吗啉代核苷酸，乙烯基膦酸脱氧核糖核苷酸(本文表示为vpdN)，乙烯基膦酸核苷酸，和脱碱基核苷酸(本文表示为X或Ab)。不需要对给定化合物的所有位置进行统一的修饰。相反地，可将多于一个的修饰并入单个F12 RNAi引发剂或者甚至是其单个核苷酸中。F12 RNAi引发剂正义链和反义链可以通过本领域已知的方法合成和/或修饰。在一个核苷酸处的修饰独立于其他核苷酸的修饰。

修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，如：5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基的衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫脲嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫脲嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-偶氮基鸟嘌呤和8-偶氮基腺嘌呤，7-去氮鸟嘌呤(7-deazaguanine)和7-去氮腺嘌呤(7-deazaadenine)以及3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。在一些实施方式中，20％或更少的修饰的核苷酸是2′-氟修饰的核苷酸。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂正义链在距离3′末端的11位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂正义链在距离3′末端的12位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂正义链在距离3′末端的13位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂正义链在距离3′末端的11、12和13位处含有至少2个2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂正义链在距离3′末端的11和12位，11和13位，或12和13位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂正义链在距离3′末端的11、12和13位处含有2′-F核苷酸。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的2位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的14位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的2和14位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂在距离正义链的3′末端的11、12和13位处和距离反义链的5′末端的2和14位处含有至少2个2′-F核苷酸。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的4位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的6位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的8位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的10位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12RNAi引发剂反义链在距离5′末端的12位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的4、6、8、10和12位处含有至少2个2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的4和6位，4和8位，4和10位，4和12位，6和8位，6和10位，6和12位，8和10位，8和12位，或10和12位处含有2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的4、6、8、10和12位处含有至少3个2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的4、6、8、10和12位处含有至少4个2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在距离5′末端的4、6、8、和10位，4、6、8、和12位，4、6、10、和12位，4、8、10、和12位或6、8、10、和12位处含有2′-F核苷酸。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链在2位和/或14位处含有2′-F核苷酸，并在距离5′末端的11、12和13位处含有3个2′-F核苷酸。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂在2位和/或14位处含有2′-F核苷酸，并且在距离反义链的5′末端的11、12和13位处含有1、2或3个2′-F核苷酸，并且在距离正义链的3′末端的11、12和13位处含有至少2个2′-F核苷酸。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂的一个或多个核苷酸通过不含磷酸的共价核苷间连接而连接。修饰的核苷间连接或主链包括，例如硫代磷酸酯、5′-硫代磷酸酯基团(本文表示为核苷酸前的小写“s”，如sN、sn、sNf、或sdN)、硫代磷酸盐、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯(包括3′-烯基磷酸酯和手性磷酸酯)、亚磷酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′连接的硼代磷酸酯、这些化合物2′-5′连接的类似物以及具有反向极性(invertedpolarity)的类似物，其中核苷单位的临近对以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接。也包括多种盐、混合的盐和无酸形式。在一些实施方式中，2′修饰可与修饰的核苷间连接组合。

修饰的核苷间连接或主链其中可缺少磷原子(即寡核苷)，其可通过短链烷基或环烷基糖间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间连接、或者一种或多种短链杂原子或杂环糖间连接而形成。这些修饰的连接或主链包括具有吗啉代连接(部分从核苷的糖基部分形成)的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含烯主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链和其他具有混合的N、O、S和CH₂组分的主链。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂可含有修饰的主链，即，F12 RNAi引发剂在2个核苷酸之间含有非标准连接。在一些实施方式中，修饰的主链含一个或多个硫代磷酸酯连接。例如，在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂的正义链可含有1、2、3、或4个硫代磷酸酯连接，F12 RNAi引发剂的反义链可含有1、2、3、或4个硫代磷酸酯连接，或者正义链和反义链都可独立地含有1、2、3、或4个硫代磷酸酯连接。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂正义链含有2个硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些实施方式中，2个硫代磷酸酯核苷酸间连接在距离正义链的3′末端的1-3位处的核苷酸之间。在一些实施方式中，2个硫代磷酸酯核苷酸间连接在距离正义链的5′末端的1-3、2-4、3-5、4-6、4-5、或6-8位处的核苷酸之间。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂反义链含有4个硫代磷酸酯核苷酸间连接。在一些实施方式中，2个硫代磷酸酯核苷酸间连接在距离正义链的5′末端的1-3位处的核苷酸之间并且在距离5′末端的19-21、20-22、21-23、22-24、23-25、或24-26位处的核苷酸之间。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂在正义链中含有2个硫代磷酸酯核苷酸间连接并且在反义链中含有4个硫代磷酸酯核苷酸间连接。

表2中提供了含有修饰的核苷酸的反义链的示例。表3中提供了含有修饰的核苷酸的正义链的示例。在表2和3中，使用以下符号来表示修饰的核苷酸、靶向基团和连接基团：

N ＝2′-OH(未修饰的)核糖核苷酸(大写字母，没有f或d指示)

n ＝2′-OMe修饰的核苷酸

Nf ＝2′-氟修饰的核苷酸

dN ＝2′-脱氧核苷酸

N_UNA ＝2′，3′-开环核苷酸模拟物(未锁定核碱基类似物)

N_LNA ＝锁核苷酸

Nf_ANA ＝2′-F-阿拉伯核苷酸

NM ＝2′-甲氧基乙基核苷酸

X ＝脱碱基核糖

R ＝核糖醇

(invdN) ＝反向脱氧核糖核苷酸(3′-3′连接的核苷酸)

(invX) ＝反向脱碱基核苷酸

(invn) ＝反向2′-OMe核苷酸

s ＝硫代磷酸酯连接的核苷酸

p ＝磷酸

vpdN ＝乙烯基膦酸脱氧核糖核苷酸

(3′OMen) ＝3′-OMe核苷酸

表2和3中列出了以下靶向基团和连接基团并且在下表4中进一步提供了它们的化学结构：(NAG3)、(C6-NAG3)、(C6-PEG4-NAG3)、(C6-C6-NAG3)、(C6-C12-NAG3)、(C11-NAG3)、(C11-palm-NAG3)、(C11-PEG3-NAG3)、(NAG4)、(NAG13)、(NAG14)、(NAG15)、(NAG16)、(NAG17)、(NAG18)、(NAG19)、(NAG20)、(NAG21)、(NAG23)、(Chol-TEG)、(TEG-Chol)、(Alk-C6)、(Alk-BC9-C6)、(Alk-C6-C6)、(C6-C6-Alk)、(Alk-C6-Ser)、(Ser-C6-Alk)、(Alk-NHCO-C6)、(Alk-NHCO-SS-C6)、(Alk-PEG4-C6)、(Alk-PEG5-C6)、(C6-PEG5-Alk)、(Alk-PEG13-C6)、(Alk-PEG5-Ser)、(Alk-PEG13-Ser)、(Alk-SS-C6)、(C6-SS-A1k-Me)、(Me-A1k-SS-C6)、(C6-SMPT-Alk)、(BCN)、(DBCO-TEG)、(C6-NH2)、(NH2-C6)、(NH2-C7)、(NH2-Ser)、(C3)、(C12)、(C6-SS-C6)、(Cy5-C6)、(降冰片烯-C6)、(降冰片烯-Ser)、(PAZ)、(Ser-NH2)、(Sp9)、(Sp18)、(精胺)、(十八烷酰)、(TetZ-C6)(NAG＝N-乙酰基-半乳糖胺)。

表2.修饰的F12 RNAi引发剂反义链序列。

表3.修饰的F12 RNAi引发剂正义链序列。

含有表1或3中所列的序列的正义链可与含有表1或2中所列的序列的任何反义链杂交，前提是2个序列具有连续16、17、18、19、20或21个核苷酸序列上至少90％互补性的区域；相应序列由表24中所示的双链体ID编号(Duplex ID No)所例示。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂由本文所示的任何双链体ID编号组成。在一些实施方式中，F12RNAi引发剂包含本文所示的任何双链体ID编号。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂包含本文所示的任何双链体ID编号的正义链和反义链核苷酸序列。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂包含本文所示的任何双链体ID编号的正义链和反义链核苷酸序列和靶向基团和/或连接基团，其中靶向基团和/或连接基团共价连接至正义链或反义链。在一些实施方式中，F12RNAi引发剂包含本文所示的任何双链体ID编号的正义链和反义链修饰的核苷酸序列。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂包含本文所示的任何双链体ID编号的正义链和反义链修饰的核苷酸序列和靶向基团和/或连接基团，其中靶向基团和/或连接基团共价连接至正义链或反义链。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂包含双链体ID编号AD00900、AD01001、AD01520、AD02639、AD02640、AD02023、AD02642、AD02708、AD02807、AD02822、AD02867、或AD02868。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂包含SEQ ID No.11、SEQ ID No.150、或SEQID No.177。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂包含SEQ ID No.374或SEQ ID No.379。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂还包括靶向基团、连接基团、递送聚合物和/或与正义链和/或反义链的3′和/或5′末端共价连接的其他非核苷酸基团。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂可包含靶向基团、连接基团、递送聚合物、或与正义链的3′和/或5′末端共价连接的其他非核苷酸基团。在一些实施方式中，靶向基团、连接基团、递送聚合物、或其他非核苷酸基团连接至F12 RNAi引发剂正义链的5′末端。在一些实施方式中，靶向基团、连接基团、和/或递送载剂通过接头/连接基团直接或剪接连接至引发剂。在一些实施方式中，靶向基团或递送载剂通过不稳定、可切割或可逆键或接头连接至引发剂。表4中提供了靶向基团和连接基团的示例。表4提供了具有与5′或3′末端连接的靶向基团或连接基团的F12RNAi引发剂正义链的几个实施方式。

靶向基团可提高其结合的偶联物或RNAi引发剂的药代动力学或生物分布特性以改良所述偶联物的细胞或组织特异分布和细胞特异摄取。在一些情况中，靶向基团与细胞或细胞受体的结合可引发内吞。靶向基团可以是单价、二价、三价、四价或更高的价位。代表性靶向基团包括，不限于，具有对细胞表面分子的亲和性的化合物，细胞受体配体，半抗原，抗体，单克隆抗体，抗体片段，具有对细胞表面分子的抗体模拟物。仅通过示例，多个配体可用于将药物和基因靶向细胞和特定细胞受体，包括但不限于，碳水化合物，聚糖，糖(包括，但不限于：半乳糖，半乳糖衍生物(例如，N-乙酰基-半乳糖胺)，甘露糖，和甘露糖衍生物)，维生素，叶酸，生物素，适体，和肽(包括，但不限于：含RGD的肽，胰岛素，EGF，和转铁蛋白)。在一些实施方式中，靶向基团可使用接头，如PEG接头或1、2或3个脱碱基和/或核糖醇基团连接至RNAi引发剂。

在一些实施方式中，表3中所列的任何F12 RNAi引发剂，其含有3′或5′靶向基团或连接基团，可替代地不含3′或5′靶向基团或连接基团，或者可含有不同的3′或5′靶向基团或连接基团，其包括但不限于，表4中所示的那些。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂可包括疏水性基团，如胆甾醇或靶向基团(例如，半乳糖簇)。

在一些实施方式中，靶向基团可包括或由疏水性基团组成。在一些实施方式中，疏水性基团含有至少20个碳原子。疏水基团可以是烃类(例如，仅包含碳和氢原子)。然而，维持疏水性的取代或杂原子，例如，氟，是允许的。可用作靶向基团的疏水性基团包括，但不限于，烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基(其各可为线性、分支或环形)、胆甾醇、胆甾醇衍生物、固醇、类固醇和类固醇衍生物。合适的疏水性基团的示例包括但不限于：胆甾醇、胆甾醇基(cholestery1)衍生物、二胆甾醇、生育酚、二生育酚、二癸基、双十二烷基、双十八烷基、双十二烷基、双十八烷基、类异戊二烯、和胆酰胺(choleamide)。

在一些实施方式中，靶向基团可包括或由一种或多种半乳糖衍生物或半乳糖簇组成。如本文所用，术语半乳糖衍生物包括半乳糖和对去唾液酸糖蛋白受体的亲和性等于或超过半乳糖的半乳糖衍生物。半乳糖衍生物包括，但不限于：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、和N-异丁酰基-半乳糖胺(参见，例如，Iobst，S.T.和Drickamer，K.J.B.C.1996，271，6686)。可用于体内靶向寡核苷酸和其他分子至肝脏的半乳糖衍生物和半乳糖簇是本领域所熟知的(参见，例如，Baenziger和Fiete，1980，Cell，22，611-620；Connolly等，1982，J.Biol.Chem.，257，939-945)。

本文中所用的半乳糖簇包含具有2-4个末端半乳糖衍生物的分子。末端半乳糖衍生物通过其C-1碳来结合分子。

在一些实施方式中，半乳糖簇是半乳糖衍生物三聚体、三触角型半乳糖衍生物、三价半乳糖衍生物。在一些实施方式中，半乳糖簇包括N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)。在一些实施方式中，半乳糖簇包括三价N-乙酰基-半乳糖胺。

如本文所用，半乳糖衍生物三聚体含有3个半乳糖衍生物，各自连接至中央分支点。半乳糖衍生物可通过糖的C-1碳结合至中央分支点。在一些实施方式中，半乳糖衍生物通过接头或间隔子连接至分支点。在一些实施方式中，接头或间隔子是柔性亲水性间隔子，如PEG基团(参见，例如，美国专利号5885968；Biessen等，J.Med.Chem.1995卷39第1538-1546页)。分支点可以是任何小分子，其允许所述三种半乳糖衍生物结合，还允许所述分支点结合RNAi引发剂。分支点基团的示例是二-赖氨酸或二-谷氨酸。分支点与RNAi引发剂的结合可通过接头或间隔子发生。

在一些实施方式中，描述了用于向体内肝细胞递送F12 RNAi引发剂的药物组合物。这类药物组合物可包括，例如，与半乳糖簇偶联的F12 RNAi引发剂。在一些实施方式中，半乳糖簇包括半乳糖衍生物三聚体，其可以是，例如，N-乙酰基-半乳糖胺三聚体。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂包含与引发剂偶联的连接基团。连接基团促进了引发剂与靶向基团或递送聚合物的共价连接。连接基团可连接至RNAi引发剂正义链或反义链的3′或5′末端。在一些实施方式中，连接基团连接至RNAi引发剂正义链。在一些实施方式中，连接基团偶联至RNAi引发剂正义链的5′或3′末端。在一些实施方式中，连接基团偶联至RNAi引发剂正义链的5′末端。连接基团的示例，包括或由以下组成，但不限于：Alk-SMPT-C6，Alk-SS-C6，DBCO-TEG，Me-Alk-SS-C6，和C6-SS-Alk-Me，反应性基团入伯胺和炔烃、烷基、脱碱基核糖、核糖醇和/或PEG基团。

接头或连接基团是2个原子之间的连接，其通过一个或多个共价键连接一个化学基团(如RNAi试剂)或感兴趣区段至另一个化学基团(如靶向基团或递送聚合物)或感兴趣区段。不稳定连接含有不稳定键。连接可任选地包括增加两种相连原子之间距离的间隔子。间隔子还可增加连接的灵活性和/或长度。间隔子可包括，但不限于，烷基，烯基，炔基，芳基，芳烷基，芳烯基，和芳炔基；其各自可含有一个或多个杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸和糖。间隔基团为本领域熟知，前述列表不意在限制本发明的范围。

靶向基团和连接基团包括或由以下组成，但不限于，由表4所示的结构表示的化合物。在所示的靶向基团和连接基团中的一些中，显示了RNAi引发剂并且由引发剂、RNA、R、或者R1或R2表示(即，引发剂、RNA或R1或R2各自包含RNAi引发剂)。在一些实施方式中，RNAi引发剂直接连接至靶向基团或连接基团。在其他实施方式中，RNAi引发剂通过接头连接至靶向基团或连接基团。例如，对于(Alk-C6-Ser)、(Alk-PEG5-Ser)、和(Alk-PEG13-Ser)，R1和R2之一包含RNAi引发剂并且其他可以是氢。对于接头(C3)、(C12)、(Sp9)、(Sp18)、(精胺)、(C6-SS-C6)，R1或R2之一包含RNAi引发剂并且其他可以是氢、反应性基团、靶向基团、连接基团、烷基或取代的烷基。

表4.结构表示，vpdT，靶向基团和连接基团。

在一些实施方式中，可使用递送载剂来向细胞或组织递送RNAi引发剂。递送载剂是改善RNAi引发剂向细胞或组织递送的化合物。递送载剂可包括，或由以下组成，但不限于：聚合物，如两亲性聚合物，膜活性聚合物，肽，蜂毒肽，蜂毒肽样肽，脂质，或可逆修饰的聚合物或肽。

如本文所用，术语“序列”或“核苷酸序列”是指一系列或顺序的核碱基或核苷酸，使用标准核苷酸命名和本文所述的修饰的核苷酸的键的一序列字母描述。

如本文所用，并且除非另外说明，术语“互补”在用于相对于第二核苷酸序列(例如RNAi引发剂反义链)描述第一核苷酸序列(例如，RNAi引发剂正义链或F12 mRNA)时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交(形成碱基对氢键)并形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包括沃森-克里克碱基对或非沃森-克里克碱基对并且包括天然或修饰的核苷酸或核苷酸模拟物，只要满足关于它们杂交能力的上述要求。“完美”或“完全互补”表示第一多核苷酸的连续序列中的全部碱基(100％)将与第二多核苷酸的连续序列中相同数量的碱基杂交。连续序列可包括第一或第二多核苷酸序列的全部或部分。如本文所用，“部分互补”表示在核碱基序列的杂交对中，第一多核苷酸的连续序列中至少70％的碱基将与第二多核苷酸的连续序列中相同数量的碱基杂交。如本文所用，“基本互补”表示在核碱基序列的杂交对中，第一多核苷酸的连续序列中至少85％的碱基将与第二多核苷酸的连续序列中相同数量的碱基杂交。本文所用术语“互补”、“完全互补”和“基本互补”可相对于RNAi引发剂的正义链和反义链之间，或RNAi引发剂的反义链和F12 mRNA的序列之间的碱基配对使用。

序列相同性或互补性独立于修饰。出于确定相同性或互补性的目的，例如，a和Af与U(或T)互补并且与A相同。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂可用于治疗具有可能获益于降低或抑制F12的表达的疾病或病症的对象。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂可用于配制用于治疗对象中可能获益于降低或抑制F12的表达的疾病或病症的组合物。例如，对象可给予治疗有效量的任意一种或多种本文所述的F12 RNAi引发剂或组合物。该对象还可被称为患者，并且可以是人或动物患者。所述的F12 RNAi引发剂可用于提供治疗性治疗疾病的方法。这类方法一般包括向对象给予本文所述的F12 RNAi引发剂。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂可用于抑制，例如，对象中，细胞、细胞群、或组织中的F12表达。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂可用于配制用于抑制，例如，对象中，细胞、细胞群、或组织中的F12表达的组合物。在一些实施方式中，向对象给予治疗有效量的一种类型(或几种不同类型)的F12 RNAi引发剂，从而抑制对象中F12的表达(例如，有效抑制对象中F12的表达的量)。

本文所用的术语“沉默”、“降低”、“抑制”、“下调”或“敲减基因表达”，当指代F12基因时，表示与还没有经这样处理的第二细胞、细胞群或组织相比，或与给予F12 RNAi引发剂之前的相同细胞、细胞群或组织相比，当用转录的F12 RNAi引发剂处理该细胞、细胞群、或组织时，基因表达降低，如由从基因转录的RNA的水平或从细胞、细胞群、或组织(其中F12基因被转录)翻译的多肽、蛋白质或蛋白质亚基的水平测量。

在一些实施方式中，本文所述的F12 RNAi引发剂用于治疗具有可能获益于降低或抑制F12的表达的疾病或病症的对象。治疗可能获益于降低和/或抑制F12基因表达的对象包括治疗性和/或预防性治疗。代表性的疾病是与血管性水肿相关的那些，包括但不限于：遗传性血管性水肿(HAE)，获得性血管性水肿(AAE)，包括但不限于ACE抑制剂相关血管性水肿，变应性血管性水肿，非组胺能类出血性水肿(INAE)，特发性血管性水肿，栓塞形成，静脉血栓栓塞(VTE)，血栓性闭塞性疾病，包括但不限于围手术期静脉闭塞性疾病预防，治疗和预防静脉闭塞性疾病如深静脉血栓形成或肺栓塞，和治疗或预防动脉血栓栓塞疾病。

在一些实施方式中，考虑包含至少一种所述的F12 RNAi引发剂的药物组合物。这些药物组合物用于抑制细胞、组织或生物体中F12基因的表达。在一些实施方式中，本文所述的药物组合物用于治疗具有会获益于降低或抑制F12的表达的疾病或病症的对象。在一些实施方式中，本文所述的药物组合物用于治疗处于发生疾病或病症的风险中的对象，所述疾病或病症从降低或抑制F12的表达中获益。会获益于降低或抑制F12表达的疾病和/或病症可选自以下：血管性水肿、HAE、AAE、变应性血管性水肿、INAE、特发性血管性水肿、栓塞形成、VTE、血栓性闭塞性疾病、静脉闭塞性疾病、和动脉血栓栓塞疾病。在一些实施方式中，对象是哺乳动物，包括但不限于，人患者。在一些实施方式中，该方法包括向待治疗的哺乳动物给予包含本文所述的F12 RNAi引发剂分子的组合物。上述药物组合物也可包括一种或多种药学上可接受的赋形剂(包括载剂、运载体、稀释剂、和/或递送聚合物)。

如本文所述，“药物组合物”包括药学有效量的至少一种RNAi引发剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂。药理学上可接受的赋形剂(赋形剂)是除活性药物组分(PAI，治疗产品，例如RNAi引发剂)以外的物质，其已经适当地进行了安全性评价，且有意地包含于药物递送系统。赋形剂以预期的剂量不促进或不意图促进治疗效果。赋形剂可起到以下作用：a)在制造中在药物递送系统的加工中起辅助作用；b)保护、支持或提高API的稳定性、生物利用率或患者接受度；c)在产品的鉴定中起协助作用；和/或d)在储藏或使用中提高API的递送的整体安全性、有效性中的任何其他特性。药学上可接受的赋形剂可以是或不是惰性物质。

赋形剂包括但不限于：吸收促进剂、防粘剂、防泡剂、抗氧化剂、粘合剂、粘合剂、缓冲剂、载剂、包衣剂、色素、递送促进剂、葡糖聚糖、葡萄糖、稀释剂、崩解剂、乳化剂、膨胀剂、填料、香味剂、助流剂、保湿剂、润滑剂、油、聚合物、防腐剂、盐水、盐、溶剂、糖、悬浮剂、持续释放基质、甜味剂、增稠剂、等张剂、载剂、防水剂、和润湿剂。

药物组合物可包含其他另外的在药物组合物中通常使用的成分。其它这类组分可包括但不限于：止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂、或抗炎剂(例如抗组胺药、苯海拉明等)。也考虑到表达或包括本文定义的RNAi引发剂的细胞、组织或分离的器官可以被用作“药物组合物”。如本文所述，“药理学有效量”、“治疗上有效量”或简单的“有效量”是指产生预期的药理学、治疗或预防性结果的RNAi引发剂的量。

在其他实施方式中，F12 RNAi引发剂用于治疗、预防或控制与以下疾病相关的临床表现：血管性水肿、遗传性血管性水肿(HAE)，获得性血管性水肿(AAE)，变应性血管性水肿，非组胺能类出血性水肿(INAE)，特发性血管性水肿，栓塞形成，静脉血栓栓塞(VTE)，血栓性闭塞性疾病，静脉闭塞性疾病预防，和动脉血栓栓塞疾病。所述方法包括给予需要这种治疗、预防或管理的对象治疗或预防有效量的一种或多种本文所述的F12 RNAi引发剂。在一些实施方式中，对象是哺乳动物，包括但不限于，人患者。在一些实施方式中，该方法包括向待治疗的哺乳动物给予包含本文所述的F12 RNAi引发剂分子的组合物。

在一些实施方式中，所述的F12 RNAi引发剂和使用这种F12 RNAi引发剂的方法用于治疗或预防具有会获益于降低或抑制F12表达的疾病或病症的对象中的至少一种症状。向该对象给予治疗有效量的任何一种或多种所述的RNAi引发剂，从而治疗该症状。向该对象给予预防有效量的任何一种或多种所述的RNAi引发剂，从而预防至少一种症状。

在一些实施方式中，给予所述的F12 RNAi引发剂的对象中F12的基因表达水平和/或mRNA水平相对于给予F12 RNAi引发剂之前的对象或未接受F12 RNAi引发剂的对象降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或98％。对象中的基因表达水平和/或mRNA水平可在对象的细胞、细胞群、和/或组织中降低。在一些实施方式中，给予所述的F12 RNAi引发剂的对象中F12的蛋白质水平相对于给予F12 RNAi引发剂之前的对象或未接受F12 RNAi引发剂的对象已降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或98％。对象中的蛋白质水平可在对象的细胞、细胞群、组织、血液、和/或其他流体中降低。可通过本领域已知的任何方法来评价基因表达、mRNA、或蛋白质水平的降低。F12 mRNA水平和/或蛋白质水平的降低或减少在本文中统称为F12的降低或减少或者抑制或降低F12的表达。

所述的F12 RNAi引发剂可与第二治疗组合，其包括但不限于：第二RNAi引发剂或其他RNAi试剂，小分子药物，抗体，抗体片段，和/或疫苗。

所述的RNAi引发剂和包含本文所述的F12 RNAi引发剂的药物组合物可被包装或包含于试剂盒、容器、包或分配器。F12 RNAi引发剂可被包装于预填充注射器或瓶。

当指代RNAi引发剂时，“引入细胞”表示功能性递送RNAi引发剂到细胞中。功能性递送表示所述RNAi引发剂递送到细胞并预期具有生物学活性，(例如，基因表达的序列特异性抑制)。

给药途径是RNAi引发剂与身体接触的途径。通常，用于治疗对象的药物和核酸给予方法为本领域熟知，且可用于给予本文所述的组合物。本文所述的化合物可通过任意合适的途径在根据特定途径适当调整的制备物中给予。因此，可通过注射(例如，静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内注射)给予本文所述化合物。

在一些实施方式中，本文所述的F12 RNAi引发剂分子或组合物可使用本领域抑制的寡核苷酸递送技术递送至细胞、细胞群、组织或对象。一般而言，本领域公认的递送核酸分子(体外或体内)的任何合适方法可适用于本文所述的F12 RNAi引发剂。例如，递送可以是通过局部给药(例如，直接注射、植入、或局部给予)，全身给药，或皮下，静脉内，口服，腹膜内，或胃肠外途径，包括颅内(例如，心室内，实质内和鞘内)，肌肉内，透皮，气道(气溶胶)，鼻，直肠，或局部(包括口颊和舌下)给药。在某些实施方式中，通过皮下或静脉内输注或注射给予组合物。

在一些实施方式中，RNAi引发剂可与脂质、纳米颗粒、聚合物、胶粒、DPC或本领域可用的其他递送系统组合。RNAi引发剂也可化学偶联至靶向基团，脂质(包括，但不限于，胆甾醇和胆甾醇基衍生物)，纳米颗粒，聚合物，脂质体，胶粒，DPC(参见，例如，WO 2000/053722，WO 2008/0022309，WO 2011/104169，和WO 2012/083185，其各自通过引用纳入本文)，或本领域可用的其他递送系统。

在一些实施方式中，RNAi引发剂可偶联至递送聚合物。在一些实施方式中，递送聚合物是可逆掩蔽/修饰的两亲性膜活性聚胺。

在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂-靶向基团偶联物可与蜂毒肽样肽(MLP)递送肽(例如，活性赋形剂)共同给予。共同给予表示将F12 RNAi引发剂和递送肽给予对象，从而两者同时存在于该对象内。F12 RNAi引发剂-靶向基团偶联物和所述递送肽可被同时给予或其可被依次递送。对于同时给药，F12RNAi引发剂-靶向基团偶联物和递送肽可在给药之前混合。对于依次给药，F12 RNAi引发剂基团部分偶联物或递送肽可先给予。

在一些实施方式中，描述了用于向体内肝细胞递送F12 RNAi引发剂的药物组合物。这类药物组合物可包括或由以下组成：a)与含有至少20个碳原子的疏水性基团，如胆甾醇偶联的F12 RNAi引发剂(RNAi引发剂-偶联物)和b)MLP递送聚合物。所述MLP递送聚合物和所述RNAi引发剂-偶联物可分开合成并可在单独容器或单一容器中提供。在一些实施方式中，F12 RNAi引发剂不与递送肽偶联。

本文所用的蜂毒肽样肽(MLP)是一种小两亲性膜活性肽，包含衍生自天然产生的蜜蜂毒肽，蜂毒肽的约23至约32个氨基酸，如WO 2012/083185中所述。天然产生的蜂毒肽含有26个氨基酸，在氨基末端主要是疏水性的并且在羧基末端主要是亲水性的(阳离子型)。在一些实施方式中，本文所述的MLP分离自生物来源。在其它实施方式中，MLP是合成的。可通过化学过程来配制或制备MLP合成聚合物。本文使用的MLP包括天然产生的蜂毒肽家族的多种蜜蜂毒液肽，所述蜂毒肽家族可在以下物种的毒液中找到：小蜜蜂(Apis florea)、西方蜜蜂(Apis mellifera)、大蜜蜂(Apis dorsata)、大胡蜂(Vespa magnifica)、墨胸胡蜂(Vespa velutina)、马蜂属HQL-2001(Polistes sp.HQL-2001)、和亚非马蜂(Polisteshebraeus)。本文使用的MLP还包括氨基酸序列与天然产生的蜂毒肽相同或类似的合成肽。MLP氨基酸序列的示例包括表5中提供的那些。在一些实施方式中，MLP包括：Leu-Ile-Gly-Ala-Ile-Leu-Lys-Val-Leu-AleThr-Gly-Leu-ProThr-Leu-IleSer-Trp-Ile-Lys-Asn-Lys-Arg-Lys-Gln(SEQ ID 2234)。

表5.MLP肽序列。

dMe1＝具有D-型氨基酸的蜂毒肽

Nle＝正亮氨酸

MLP的膜活性可被可逆掩蔽以产生MLP递送聚合物。可通过可逆连接掩蔽剂至MLP的伯胺来实现掩蔽。

MLP递送聚合物可包括通过肽上的伯胺与含去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)配体的掩蔽剂的反应可逆修饰的MLP，其中可逆修饰可以是生理上不稳定的，如WO 2012/083185所述。在一些实施方式中，掩蔽剂包括中性亲水性分布的烷基马来酸酐：

其中R1包括不带电荷的去唾液酸糖蛋白受体配体。在一些实施方式中，烷基是甲基或乙基。取代的烷基马来酸酐的示例是2-丙酸-3-烷基马来酸酐衍生物。中性亲水性2-丙酸-3-烷基马来酸酐衍生物可通过将中性亲水性基团通过2-丙酸-3-烷基马来酸酐-羧基连接至2-丙酸-3-烷基马来酸酐来形成：

其中R1包括中性ASGPr配体并且n＝0或1。在一些实施方式中，ASGPr配体可通过短PEG接头连接至酸酐。

ASGPr配体通过对ASGPr的亲和性提供靶向功能。ASGPr配体含有对ASGPr有亲和性的糖，包括但不限于：半乳糖，N-乙酰基-半乳糖胺和半乳糖衍生物。本领域熟知半乳糖衍生物对ASGPr有亲和性。

在一些实施方式中，公开了组合物，其包含：

N-T和MLP-(L-M)_x，

其中N是F12 RNAi引发剂，T包括具有20个或更多个碳原子的疏水性基团，如胆甾醇，MLP是蜂毒肽样肽，并且M含有通过生理上不稳定的可逆马来酰胺酸连接L共价连接至MLP的ASGPr配体。x是超过1的整数。更具体地，x的值比群体MLP上伯胺的数量的80％、90％或95％大。本文所用的MLP-(L-M)_x可被称为MLP递送聚合物(例如，赋形剂)。在一些实施方式中，可在相同容器中提供F12 RNAi引发剂-胆甾醇偶联物和MLP递送聚合物。在其他实施方式中，可在分开的容器中提供F12 RNAi引发剂-胆甾醇偶联物和MLP递送聚合物。F12RNAi引发剂-胆甾醇偶联物和MLP递送聚合物可在给予之前合并，共同给予，或依次给予。

考虑了包括至少一种本文所述的RNAi引发剂的细胞、组织、和非人生物体。通过本领域可用的任何手段向细胞、组织、或非人生物体递送RNAi引发剂来制备该细胞、组织、或非人生物体。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于，人细胞。该细胞、组织、或非人生物体可用于研究或用作研究工具(例如，药物测试或诊断)。

上述提供的实施方式和项目现在用下面的非限制性实施例说明。

实施例

实施例1.RNAi引发剂合成。

A)合成。在用于寡核苷酸合成的固相上按照亚磷酰胺技术来合成RNAi引发剂分子。根据规模，使用MerMade96E(生物自动化公司(Bioautomation))或MerMade12(生物自动化公司)。在可控多孔玻璃(CPG，

或

，来自美国宾夕法尼亚州阿斯顿的引物合成公司(Prime Synthesis))制成的固体支持物上进行合成。所有DNA、2′-修饰的RNA、和UNA亚磷酰胺购自赛默飞世尔科学公司(Thermo Fisher Scientific)(美国威斯康辛州密尔沃基)。具体地，使用下面的2′-O-甲基亚磷酰胺：(5′-O-二甲氧基三苯甲基-N⁶-(苯甲酰基)-2′-O-甲基-腺苷-′-O-(2-氰基乙基_N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-N⁴-(乙酰基)-2′-O-甲基-胞苷-3′-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、(5′-O-二甲氧基-三苯甲基-N²-(异丁酰基)-2′-O-甲基-鸟苷-3′-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺和5′-O-二甲氧基-三苯甲基-2′-O-甲基-尿苷-3′-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2′-脱氧-2′-氟-亚磷酰胺携带与2′-O-甲基RNA酰胺相同的保护基团。使用以下UNA亚磷酰胺：5′-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-苯甲酰基-2′，3′-开环-腺苷，2′-苯甲酰基-3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺，5′-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-乙酰基-2′，3′-开环-胞嘧啶，2′-苯甲酰基-3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺，5′-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-N-异丁酰基-2′，3′-开环-鸟苷，2′-苯甲酰基-3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺，和5′-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′，3′-开环-鸟苷，2′-苯甲酰基-3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺。所有的酰胺溶于无水乙腈(50mM)中并且加入分子筛(

)。为了在寡聚物的5′-末端处引入TEG-胆甾醇，采用来自格兰研究公司(Glen Research)(美国弗吉尼亚州斯特林)的1-二甲氧基三苯甲基氧基-3-O-(N-胆甾醇基-3-氨基丙基)-三乙二醇-甘油-2-O-(2-氰基乙基)-(N，N，-二异丙基)-亚磷酰胺。在对于合成的环没有任意修饰下引入5′-修饰。使用5-苄基硫-1H-四唑(BTT，在乙腈中250mM)作为活化剂溶液。偶联时间为10分子(RNA)，180秒(胆甾醇)，90秒(2′OMe和UNA)，和60秒(2′F和DNA)。为了引入亚磷酰胺连接，采用无水乙腈中100mM的3-苯基1，2，4-二噻唑啉-5-酮(POS，获自美国马萨诸塞州莱姆斯特的PolyOrg公司(PolyOrg，Inc.))溶液。具体序列参见表1-3。

B.支持物上结合的低聚体的切割和去保护。在固相合成结束后，在30℃下用1∶1体积的水肿40重量％甲基胺溶液和28％氢氧化铵溶液(奥德里奇公司)处理干燥的固体支持物2小时。蒸发溶液并在水中重建固体残留物(见下文)。

C.纯化。通过使用Waters XBridge BEH300C4 5u制备柱和ShimadzuLC-8系统的反相HPLC来纯化粗含胆甾醇寡聚物。缓冲液A是100mM TEAA，pH 7.5并含有5％乙腈，并且缓冲液B是100mM TEAA并含有95％乙腈。记录260nm处的UV痕迹。合适的组分然后在使用填充有SephadexG-25介质的GE Healthcare XK 16/40柱的尺寸排阻HPLC上运行，运行缓冲液是100mM碳酸氢铵，pH 6.7和20％乙腈。通过使用TKSgel SuperQ-5PW13u柱和Shimadzu LC-8系统的阴离子交换HPLC来纯化其他粗寡聚物。缓冲液A是20mM Tris，5mM EDTA，pH 9.0并含有20％乙腈并且缓冲液B与缓冲液A相同，除了添加1.5M氯化钠。记录260nm处的UV痕迹。收集合适的组分，然后在尺寸排阻HPLC上运行，如针对含胆甾醇的寡聚物所述。

D.退火。通过在0.2×PBS(磷酸盐缓冲盐水，1×，康宁(Corning)，Cellgro)中混合等摩尔的溶液(正义和反义)来混合互补链以形成RNAi引发剂。将该溶液置于70℃的热混合器中，加热至95℃，在95℃保持5分钟，并缓慢冷却至室温。一些RNAi引发剂被冻干并储存在-15至-25℃。通过测量0.2×PBS中UV-Vis光谱仪上的溶液吸收来确定双链体浓度。在260nm处的溶液吸收然后乘以转化因子和稀释因子来确定双链体浓度。除非另外说明，所有转化因子是0.037mg/(mL·cm)。对于一些实验，从实验确定的消光系数来计算转化因子。

实施例2.蜂毒肽样肽(MLP)递送聚合物。

A)蜂毒肽样肽(MLP)合成。使用本领域标准的肽合成技术来制备所有MLP。不依赖于L或D型，所述MLP序列可以是反向的(retro)。

B)CDM-NAG(N-乙酰基半乳糖胺)合成向50mL二氯甲烷中的CDM(300mg，0.16mmol)溶液中加入草酰氯(2g，10重量当量)和二甲基甲酰胺(5μL)。反应过夜进行，之后通过旋转蒸发去除过量的草酰氯和二氯甲烷以产生CDM酸酰氯。酸酰氯溶解在1mL的二氯甲烷中。在该溶液中加入1.1摩尔当量(氨基乙氧基)乙氧基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷(即氨基二乙氧基-乙基NAG)和10mL二氯甲烷中的吡啶(200μL，1.5当量)。然后搅拌1.5小时。然后移除溶剂，将得到的固体溶于5mL水中并用0.1％TFA水/乙腈梯度通过反相HPLC纯化。

CDM

R1包含中性ASGPr配体。在一些实施方式中，掩蔽剂不带电荷。

CDM-NAG

n是1-10的整数。如上所述，PEG间隔子可位于酐基和ASGPr配体之间。在一些实施方式中，PEG间隔子含1～10个乙烯单元。或者，可在酐和N-乙酰基-半乳糖胺(NAG)之间使用烷基间隔子。

CDM-NAG(烷基间隔子)

n是0-6的整数。

可在酐和N-乙酰基-半乳糖胺之间使用其他间隔子或接头。在一些实施方式中，间隔子或接头是亲水性的，并且是中性或不带电荷的。

C)形成MLP递送聚合物(即，掩蔽)。MLP与CDM-NAG掩蔽剂反应以产生MLP递送聚合物。MLP组分首先在水性HEPES(钠盐，GMP级，约430mg/mL)中溶解至8.5mg/mL的终浓度。MLP溶液然后冷却至4℃，并且通过UV分光光度法检查外观(澄清至淡黄色溶液，没有可见颗粒)和浓度。CDM-NAG以约75mg/mL的终浓度溶于4℃的水中。溶液通过UV分光光度法检查外观(澄清至淡黄色溶液，没有可见颗粒)和浓度。溶液中的MLP与溶液中的CDM-NAG以5∶1(w/w)的CDM-NAG与MLP的比例混合。搅拌下，CDM-NAG溶液的添加速率为0.3L/分钟。在所有CDM-NAG溶液已被添加到MLP溶液中之后，搅拌混合物30分钟。为了使MLP递送聚合物稳定，通过添加1M水性氢氧化钠将pH增加至9.0±0.2。未取代的马来酸酐掩蔽剂与肽的反应产生具有以下结构的化合物：

其中R是MLP并且R1包含ASGPr配体(例如，NAG)。

使用对剩余游离胺的三硝基苯磺酸(TNBS)试验来确定MLP被CDM-NAG充分遮蔽，少于10％的MLP总量仍未修饰。

通过对10mM，pH 9.2碳酸盐缓冲液进行渗滤以去除过量的CDM-NAG来纯化MLP递送聚合物。渗滤过程使每个体积的掩蔽的MLP反应溶液交换约10个体积的碳酸盐缓冲液并保持在2-8℃。

组分	量(标称)
		MLP	30g/L
CDM-NAG<sup>a</sup>	25g/L
		碳酸钠	0.3g/L
碳酸氢钠	0.6g/L
		水	1000g/L

^a-假定五(5)个CDM-NAG部分/MLP

MLP递送聚合物进一步用葡聚糖配制至10％w/v并在2-8℃储存。228mg MLP递送聚合物，500mg 1kDa葡聚糖，1.59mg Na₂CO₃，2.94mg NaHCO₃。对于一些实验，在使用前冻干该溶液。

D)注射溶液。通过用MLP递送聚合物混合RNAi引发剂来形成注射溶液。将冻干的MLP递送聚合物溶解在水中并与RNAi引发剂混合。该溶液然后用生理盐水稀释至正确注射浓度。

实施例3.F12 RNAi引发剂的体外筛选。

A)人细胞背景。通过计算机分析鉴定为人、非人灵长类和小鼠交叉反应性的候选序列被体外筛选为化学修饰的规范siRNA。32个计算机鉴定的潜在F12 RNAi引发剂以规范siRNA形式合成并体外筛选功效。出于筛选目的，人F12 cDNA序列(登录号NM_000505)被合成并克隆(DNA 2.0，加利福尼亚州门洛帕克)到基于市售报告物的筛选质粒，psiCHECK2(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega))中，其生成海肾荧光素酶/F12融合mRNA。对于siRNA在人背景中的功效，Hep3B细胞，一种人肝细胞癌细胞系以约10,000个细胞/孔在96孔板中接种。32个F12 siRNA中的每一个在两种浓度(1nM和0.1nM)下与25ng F12-psiCHECK2质粒DNA/孔和0.2μL LipoFectamine 2000/孔共转染。通过测量标准化至组成型表达的萤火虫荧光素酶(也存在于psiCHECK2质粒上，使用双荧光素酶报告物试验(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司))水平的海肾荧光素酶水平来确定基因敲减。

表6.人/非人灵长类/小鼠交叉反应性RNAi引发剂在人背景中的功效筛选结果，如双荧光素酶报告物试验所确定。

B)小鼠原代细胞背景。筛选相同的32个siRNA在小鼠背景中的功效。小鼠原代肝细胞冷藏获得或预接种在96孔板(北卡罗来纳州研究三角园的TRL研究公司(TRL Research))中。siRNA在两个浓度，1nM和0.1nM下用0.6μL/孔的Lipofectamine RNAiMax(纽约州格兰德岛的生命技术公司(Life Technologies))转染4小时，之后提供新鲜培养基。在24小时后，裂解细胞用于使用TaqMan基因表达细胞-至-CT试剂盒(生命技术公司)的基因表达分析。使用小鼠特异性TaqMan基因表达试验(生命技术公司)，通过qRT-PCR确定F12相对于内源性对照β-肌动蛋白的表达。

表7.人/非人灵长类/小鼠交叉反应性RNAi引发剂在小鼠背景中的功效筛选结果，如qRT-PCR和比较CT分析所确定。

C)EC₅₀计算。进一步评价6个候选RNAi引发剂。使用与上述A)中相同的细胞和转染条件来生成10-点EC₅₀曲线，siRNA浓度范围为150fM至3nM。这6个F12 RNAi引发剂中的每一个被进一步修饰并合成为相应的含UNA的RNAi引发剂。所有修饰的RNAi引发剂通过体外敲减分析通过3-浓度分析(0.02，0.2和2nM)和10-点EC₅₀测定来检查。

表8.所示RNAi引发剂的人背景中的EC₅₀值(nM)。

D)人/非人灵长类特异性RNAi引发剂。通过计算机分析鉴定为人和非人灵长类，但非小鼠交叉反应性的其他序列在人背景中另外筛选。前12个序列用前述过程筛选，对6个最有活性的RNAi引发剂进行完全10-点剂量响应曲线和EC₅₀测定。

表9.人/非人灵长类特异性RNAi引发剂的功效筛选和EC₅₀值(nM)。

实施例4.RNAi引发剂在野生型小鼠或大鼠中的功效的体内分析。

A)给药和样品收集。为了评价F12 RNAi引发剂的体内功效，使用野生型小鼠或大鼠。通过静脉内(IV)或皮下(SQ)注射来给予RNAi引发剂。在第1天使用MLP递送聚合物向小鼠或大鼠给予胆甾醇靶向的RNAi引发剂。各啮齿动物接受尾静脉中静脉内(IV)注射200-250μL的含RNAi引发剂+MLP递送聚合物(大多数情况下，1∶1w/w RNAi引发剂：MLP递送聚合物)的剂。在与靶向聚合物偶联之后，通过IV或SQ注射向小鼠给予含炔烃的RNAi引发剂。含半乳糖簇的RNAi引发剂最通常SQ给予，但也可与MLP递送聚合物组合给予。可能时，基线(预处理)样品取自在第7天之间注射前和第1天注射的小鼠。从第4天、第8天、和每周直至第71天从小鼠取得注射前血清样品。在一些小鼠中，在所示的天收获肝组织用于RNA分离。

B)因子12血清蛋白质水平。通过使用针对mF12的ELISA(分子创新公司(MolecularInnovations))或内部开发的mF12

(帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))测试来自小鼠的血清来监测血清中的F12蛋白(mF12)水平直至表达水平回到基线。对于具有基线样品的动物，各动物在相对时间点的mF12水平除以该动物中的处理前表达水平来确定“标准化至处理前”的表达比率。在特定时间点处的表达然后通过将单个动物的“标准化至处理前天(normalized to day pre-treatment)”的比率除以盐水对照组中全部小鼠的平均“标准化至处理前天”的比率来标准化至盐水对照组。这产生了标准化至对照组的各时间点的表达。对于没有基线样品的样品，在特定采血日期的表达被标准化至同一日期盐水对照组的平均值。对于所有研究，以标准偏差给出实验误差。

实施例5.体内筛选F12 RNAi引发剂和F12敲减的时程。通过IV(胆甾醇偶联的RNAi引发剂和递送聚合物)或皮下(SQ)(半乳糖-簇-偶联的RNAi引发剂)对野生型小鼠给药，并且如上所述监测mF12水平。检测的各RNAi引发剂的mF12的最大敲减(最低点)示于表10。最低点在第4-22天之间。显示了测试的选择RNAi引发剂的RNAi引发剂给予之后随实验时间的相对血清mF12水平(参见表11、12、13、14、15和16，图1)。在给予所有测试的RNAi引发剂之后获得超过98％的F12血清蛋白质水平降低，AD0090显示最大的敲减持续时间(在第36天超过87％敲减)。RD10694，一种已知的小鼠因子VII(mF7)RNAi引发剂序列，用作这些实验中的对照RNAi引发剂(表10)。

表10.静脉内给予所示的F12 RNAi引发剂和MLP(递送聚合物)或皮下给予所示的F12 RNAi引发剂(无递送聚合物)之后小鼠中的相对血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至处理前和盐水对照。(F12 RNAi引发剂双链体编号与正义链和反义链编号)

表11.在给予mg/kg RNAi引发剂和8mg/kg MLP递送聚合物之后野生型小鼠中的血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至处理前和盐水对照。

表12.给予2mg/kg规范的或含UNA的RNAi引发剂和2mg/kg MLP递送聚合物之后C57/B6小鼠中的血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至处理前和盐水对照。

表13.给予0.5mg/kg修饰的F12 RNAi引发剂和2mg/kg MLP递送聚合物之后C57/B6小鼠中的相对血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至处理前和盐水对照。

表14.给予0.5mg/kg修饰的F12 RNAi引发剂和2mg/kg MLP递送聚合物之后C57/B6小鼠中的相对血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至处理前和盐水对照。

表15.给予0.5mg/kg修饰的F12 RNAi引发剂和2mg/kg MLP递送聚合物之后C57/B6小鼠中的相对血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至处理前和盐水对照。

表16.给予0.5mg/kg修饰的F12 RNAi引发剂和2mg/kg MLP递送聚合物之后C57/B6小鼠中的相对血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至处理前和盐水对照。

实施例6.选择F12 RNAi引发剂的体内剂量响应和F12敲减的时程。为了进一步表征选择RNAi引发剂的体内活性，在单次实验中检查多剂量水平的活性。对于用MLP递送聚合物(IV)的研究，给予的RNAi引发剂的量和递送聚合物的量都被调整，使得剂量比率改变。如上所述监测给药和mF12水平。显示了给予RNAi引发剂之后随实验时间的相对血清mF12水平(参见表17和18，图2和3)。

实施例7.选择F12 RNAi引发剂的体内多剂量研究和F12敲减的时程。挑选选择引发剂来使用多剂量给药方案进行检验。最常用的给药方案是每周三次剂量并且如上所述监测mF12水平。这种多剂量给药方案最常用于SQ-递送的引发剂。图4中显示了给予RNAi引发剂之后随时间的相对血清mF12水平。

表17.给予0.5、1、或2mg/kg含UNA的RNAi引发剂和2mg/kg MLP递送聚合物之后C57/B6小鼠中的血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至处理前和盐水对照。

表18.给予2或4mg/kg剂量的AD01001 RNAi引发剂和1、2、4或8mg/kg的MLP递送聚合物之后小鼠中的相对血清F12蛋白质水平。F12水平被标准化至处理前和盐水对照。

实施例8.肝F12 mRNA水平。在安乐死时，小鼠肝脏的部分或全部被转移至合适体积的TRI试剂RT(俄亥俄州辛辛那提的分子研究中心公司(Molecular Research Center，Inc.))。按照生产商的推荐方案分离总RNA。简言之，用组织匀浆器处理TRI试剂RT中的肝脏切片持续约30秒。将1mL匀浆添加到50μL的4-溴苯甲醚，混合，并通过离心分离相。去除0.25-0.5mL的水相，用异丙醇沉淀，并离心。所得团块用75％乙醇洗涤并在0.3-0.7mL无核酸酶的水中悬浮。

使用High Capacity cDNA逆转录试剂盒(纽约州格兰德岛的生命技术公司)来逆转录总RNA(约500ng)。cDNA然后1∶5稀释并且使用5′外切核酸酶化学与市售的针对小鼠因子12的FAM-标记的试验(试验编号Mm00491349m1，生命技术公司)，针对小鼠β-肌动蛋白的VIC-标记的内源性对照试验(生命技术公司)和VeriQuest主混合物(加利福尼亚州圣克拉拉的昂飞公司(Affymetrix))进行多重RT-qPCR。使用相对定量的比较CT方法来分析基因表达数据(Livak和Schmittgen，2001)(表19和20)。

表19.1∶1给予规范的或含UNA的RNAi引发剂和MLP递送聚合物之后小鼠中的相对血清F12蛋白质水平。血清mF12水平被标准化至第1天和盐水对照。

表20.1∶1重量/重量给予规范的或含UNA的RNAi引发剂和MLP递送聚合物之后小鼠中的肝F12 mRNA水平。相对于小鼠β-肌动蛋白mRNA水平表示F12 mRNA水平。

实施例9.检验在用F12 RNAi引发剂处理之后F12降低的药效(PD)-大鼠中角叉菜胶诱导的爪水肿(CPE)。为了测试降低F12水平导致对激肽释放酶/激肽系统的影响，我们测试了用F12 RNAi引发剂预处理对大鼠中的炎症模型(CPE)的影响。由λ角叉菜胶诱导的炎症由包括缓激肽的多种介质诱导。野生型大鼠给予单一IV剂量的8mg/kg RNAi引发剂(AD01520)和8mg/kg MLP递送聚合物，或盐水。在7天后，将角叉菜胶注射到盐水或RNAi-引发剂处理的大鼠的裸爪中，并且在6小时中测量爪体积。爪体积随时间的变化绘于图9。盐水和F12 RNAi引发剂处理的组之间的爪体积变化的差异是统计学显著的(p＜0.0001)，并且与用激肽释放酶靶向的抗体的处理所看到的那些相似(Kenniston JA等，2014)，表明通过激肽释放酶/激肽系统的信号传导减少。

实施例10.检验在用F12 RNAi引发剂处理之后F12减少的药效(PD)-氯化铁攻击。对F12敲减的生理响应的临床相关指示物是由氯化铁处理诱导的血栓栓塞模型。如上所述，在氯化铁(FeCl₃)攻击前7天向野生型小鼠给予胆甾醇偶联的规范RNAi引发剂。在FeCl₃攻击之前，测量了F12水平。用4mg/kg AD01520和4mg/kg MLP递送聚合物处理导致血清中超过99％的mF12蛋白质敲减。由颈动脉(CA)暴露于氯化铁来诱导血栓并且通过血流探针测量的血流堵塞时间持续达30分钟。所有用F12 RNAi引发剂和MLP递送聚合物处理的小鼠在实验的时间段期间没有堵塞(图10)。

实施例11.检验在用F12 RNAi引发剂处理之后F12减少的药效(PD)-出血风险。一些抗凝血剂治疗的潜在风险是增加的出血事件的风险。因子VII(F7)靶向的RNAi引发剂用作阳性出血对照，因为已知F7是外部凝血途径的关键组分。

在攻击前7天，给予野生型小鼠单一IV剂量的8mg/kg AD01520与8mg/kg MLP递送聚合物，或8mg/kg F7引发剂与8mg/kg MLP递送聚合物。进行对尾静脉的横向切割，并且监测凝血时间达到15分钟。在盐水和AD01520处理的小鼠之间出血时间没有显著差异(图11)。

实施例12.在F12 RNAi引发剂分子递送与MLP递送聚合物之后，在非人灵长类中的因子12(F12)敲减。MLP递送聚合物和RNAi引发剂被制备并在药学上可接受的缓冲液中合并，如上所述。在第1天，2只猕猴(食蟹猴)灵长类(雄性，分别是5.0kg和8.15kg)被共注射2mg/kg RNAi引发剂(AD01001)和2mg/kg MLP递送聚合物。对于每次注射，使用22-25号静脉留置针将RNAi引发剂+MLP递送聚合物(2mg/kg)注射到隐静脉中。在所示的时间点(表21-23所示)，抽出血液样品并分析F12水平、凝结参数和毒性标记物。从股静脉收集血液并且灵长类在全部血液收集前禁食过夜。在自动化学分析仪上进行对血液尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸酐、和活化的部分血栓栓塞时间(aPTT)的血液测试。通过使用针对人F12的ELISA(分子创新公司)测试从猴获得的血清来监测血清中的F12蛋白质水平直至F12表达水平回到基线。为了标准化，将各动物在相应时间点处的F12水平除以该动物中的处理前表达水平(本例中在第1天)以确定“标准化至第1天”的表达比率。也可通过活化的部分血栓栓塞时间(aPTT)的延长来观察F12敲减的功能读数。对于处理，没有观察到凝血酶原时间上的变化。

在第15天观察到F12的显著敲减，平均最大敲减为92.5％。在2只动物中都观察到aPTT的增加，在第15天和第22天相对出血前的值有50-56％的最大增加，虽然aPTT没有超过“正常”值。在处理的动物中没有观察到剂量相关毒性。

表21.在给予2mg/kg AD01001和2mg/kg MLP递送聚合物之后猕猴(食蟹猴)灵长类的血清F12蛋白质水平。mF12水平被标准化至给药前。

表22.在给予2mg/kg AD01001和2mg/kg MLP递送聚合物之后猕猴(食蟹猴)灵长类的活化的部分血栓栓塞时间(秒)。

表23.在给予2mg/kg AD01001和2mg/kg MLP递送聚合物之后猕猴(食蟹猴)灵长类的尿素氮、肌酸酐、丙氨酸转氨酶、和天冬氨酸转氨酶水平。

实施例13.在F12 RNAi引发剂分子递送之后，在非人灵长类中的因子12(F12)敲减。MLP递送聚合物和RNAi引发剂被制备并在药学上可接受的缓冲液中合并，如上所述。在第1天，2只猕猴(食蟹猴)灵长类被共注射2mg/kg AD01001和2mg/kg MLP递送聚合物，或2mg/kg AD01520和2mg/kg MLP递送聚合物，如上所述。抽出血液样品并分析F12水平、凝结参数和毒性标记物。从股静脉收集血液并且灵长类在全部血液收集前禁食过夜。在自动化学分析仪上进行对血液尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸酐、和活化的部分血栓栓塞时间(aPTT)的血液测试。通过使用针对人F12的ELISA(分子创新公司)测试从猴获得的血清来监测血清中的F12蛋白质水平直至F12表达水平回到基线。为了标准化，将各动物在相应时间点处的F12水平除以该动物中的处理前表达水平(本例中在第1天)以确定“标准化至第1天的表达比率。”也可通过活化的部分血栓栓塞时间(aPTT)的延长来观察F12敲减的功能读数。对于处理，没有观察到凝血酶原时间(PT)上的变化。

在第15天观察到F12的显著敲减，平均最大敲减为89％(图5)。在2只动物中都观察到aPTT的增加，在第15天和第22天相对出血前的值有约70％-80％的最大增加，虽然aPTT没有超过“正常”值。在处理的动物中没有观察到剂量相关毒性。

实施例14.在F12 RNAi引发剂分子递送之后，在非人灵长类中的因子12(F12)敲减。MLP递送聚合物和RNAi引发剂被制备并在药学上可接受的缓冲液中合并，如上所述。在第1、29、57、85天，2只猕猴(食蟹猴)灵长类被共注射2mg/kg AD01001和2mg/kg MLP递送聚合物，或2mg/kg AD01520和2mg/kg MLP递送聚合物，如上所述。抽出血液样品并分析F12水平、凝结参数和毒性标记物。从股静脉收集血液并且灵长类在全部血液收集前禁食过夜。在自动化学分析仪上进行对血液尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸酐、以及凝血酶原时间(PT)和活化的部分血栓栓塞时间(aPTT)的血液测试。通过使用针对人F12的ELISA(分子创新公司)测试从猴获得的血清来监测血清中的F12蛋白质水平直至F12表达水平回到基线。为了标准化，将各动物在相应时间点处的F12水平除以该动物中的处理前表达水平(本例中在第1天)以确定“标准化至第1天”的表达比率。也可通过活化的部分血栓栓塞时间(aPTT)的延长来观察F12敲减的功能读数。对于处理，没有观察到凝血酶原时间上的变化。

在第15天观察到具有85-93％，并且在后续剂量观察到具有95-98％的平均最大敲减的F12的显著敲减(图6)。与F12水平在最低点时观察到的出血前的值相比，在2只动物中均观察到最大增加的aPPT增加(图7)。实验时间期间，在处理的动物中没有观察到剂量相关的毒性或PT增加。

实施例15.在F12 RNAi引发剂分子递送之后，在非人灵长类中的因子12(F12)敲减。RNAi引发剂经制备并在药学上可接受的缓冲液中合并，如上所述，用于皮下(SQ)注射。在第1天，2只猕猴(食蟹猴)灵长类被皮下注射3mg/kg AD02562或10mg/kg AD02562。抽出血液样品并分析F12水平、凝结参数和毒性标记物，如前所述。

在第22天和第29天之间观察到F12的敲减，对于3mg/kg剂量有60％的平均最大敲减，并且对于10mg/kg剂量有84％的平均最大敲减(图8)。实验时间期间，在处理的动物中没有观察到剂量相关的毒性或PT增加。

实施例16.F12 RNAi引发剂双链体的示例。

表24.由双链体编号与相应的正义链和反义链鉴定的F12 RNAi引发剂。

其它实施方式：应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。

Claims

1.一种用于抑制因子XII(F12)基因的表达的RNA干扰(RNAi)引发剂，其中所述RNAi引发剂包含正义链和反义链，并且其中所述反义链包含SEQ ID NO：1417的核苷酸2-19(5′至3′)(GGUCUUUCACUUUCUUGG)，所述正义链与所述反义链互补，并且其中所述反义链的至少1个核苷酸是修饰的核苷酸。

2.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述至少一个修饰的核苷酸是2′-O-甲基核苷酸、2′-氟核苷酸、2′-脱氧核苷酸、2′，3′-开环核苷酸模拟物、锁定核苷酸、2′-F-阿拉伯核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、脱碱基核糖、核糖醇、反向核苷酸、反向脱碱基核苷酸、反向2′-OMe核苷酸、反向2′-脱氧核苷酸、2′-氨基-修饰的核苷酸、2′-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸脱氧核糖核苷酸、或3′-OMe核苷酸。

3.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述正义链在距离3′末端的11、12、和/或13位处是2′-F修饰的核苷酸。

4.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述反义链在距离5′末端的2位处是2′-F修饰的核苷酸。

5.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述反义链在距离5′末端的14位处是2′-F修饰的核苷酸。

6.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述反义链在距离5′末端的4、6、8、10、和12位处是2′-F修饰的核苷酸。

7.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述RNAi引发剂包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间连接。

8.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述正义链包含一个或两个硫代磷酸酯核苷酸间连接。

9.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述反义链包含1个、2个、3个或4个硫代磷酸酯核苷酸间连接。

10.如权利要求1所述的RNAi引发剂，还包含与所述正义链偶联的靶向基团。

11.如权利要求10所述的RNAi引发剂分子，其中所述靶向基团包含胆甾醇基或胆甾醇基衍生物。

12.如权利要求10所述的RNAi引发剂，其中靶向基团包含去唾液酸糖蛋白受体配体。

13.如权利要求12所述的RNAi引发剂，其中所述去唾液酸糖蛋白受体配体包含半乳糖簇。

14.如权利要求13所述的RNAi引发剂，其中所述半乳糖簇包含N-乙酰基-半乳糖胺三聚体。

15.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述RNAi引发剂包含双链体结构，所述双链体结构包含SEQ ID NO：693的反义链和SEQ ID NO：1064的正义链，或SEQ ID NO：791的反义链和SEQ ID NO：1146的正义链，或SEQ ID NO：461的反义链和SEQ ID NO：986的正义链，或SEQ ID NO：604的反义链和SEQ ID NO：986的正义链，或SEQ ID NO：772的反义链和SEQ IDNO：1211的正义链，或SEQ ID NO：791的反义链和SEQ ID NO：1228的正义链，或SEQ ID NO：791的反义链和SEQ ID NO：1229的正义链，或SEQ ID NO：791的反义链和SEQ ID NO：1232的正义链，或SEQ ID NO：827的反义链和SEQ ID NO：1232的正义链，或SEQ ID NO：791的反义链和SEQ ID NO：1296的正义链，或SEQ ID NO：830的反义链和SEQ ID NO：1359的正义链，或SEQ ID NO：791的反义链和SEQ ID NO：1363的正义链，或SEQ ID NO：791的反义链和SEQ IDNO：1364的正义链。

16.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述反义链包含SEQ ID No：177、SEQ ID No：150、或SEQ ID No：11的核苷酸序列。

17.如权利要求1所述的RNAi引发剂，其中所述正义链包含SEQ ID No：1385、SEQ IDNo：374或SEQ ID No：379的核苷酸序列。

18.一种组合物，其包含：如权利要求1所述的RNA干扰(RNAi)引发剂分子，和至少一种药学上可接受的赋形剂。

19.如权利要求18所述的组合物，其中所述至少一种药学上可接受的赋形剂包含递送聚合物。

20.如权利要求19所述的组合物，其中所述递送聚合物包含蜂毒肽样肽。

21.如权利要求18所述的组合物，还包含第二治疗剂。

22.如权利要求18所述的组合物，其中所述组合物被包装到试剂盒、容器、包、分配器、预填充注射器、或瓶中。

23.如权利要求18所述的组合物，其中所述组合物经胃肠外给予。

24.如权利要求1所述的RNAi引发剂在制备用于抑制细胞中因子XII基因表达的方法的药物中的用途。

25.如权利要求18所述的组合物在制备用于治疗血管性水肿的药物中的用途，所述血管性水肿包括遗传性血管性水肿和静脉血栓栓塞，所述治疗包括给予需要这种治疗的患者权利要求18所述的组合物。