KR20240103025A - 안지오텐시노겐(agt) 단백질의 발현을 저해하는 조성물 및 방법 - Google Patents

안지오텐시노겐(agt) 단백질의 발현을 저해하는 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

안지오텐시노겐(AGT) 단백질 발현을 저해하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 구체적으로, AGT 유전자 발현을 감소시키고 AGT-관련 질병 및 장애를 치료하는 데 사용될 수 있는 조성물 및 방법이 제공된다. 세포 및 대상에서 AGT 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있는 AGT dsRNA 시약, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 시약, AGT dsRNA 시약을 함유하는 조성물, 및 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 시약을 함유하는 조성물이 제공된다.

Description

안지오텐시노겐(AGT) 단백질의 발현을 저해하는 조성물 및 방법
본 발명의 실시형태 중 일부는 안지오텐시노겐(AGT) 단백질의 발현을 저해하는 데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS)은 혈압 조절에 중요한 역할을 한다. RAAS 캐스케이드(RAAS cascade)는 신장의 방사구체 세포(juxtaglomerular cell)에 의해 레닌을 순환기로 분비하면서 시작된다. 레닌 분비는 원위 세관에서의 Na+ 로딩, 베타-교감신경 자극 및/또는 신장 관류 감소를 비롯한 여러 인자에 의해 자극된다. 혈장 내 활성 레닌은 안지오텐시노겐(간에서 생성됨)을 안지오텐신 I로 분리하며, 이는 후속적으로 국소적으로 발현된 순환 중의 안지오텐신 전환 효소(ACE)에 의해 안지오텐신 II로 전환된다. RAAS에 대한 안지오텐신 II의 효과 대부분은 안지오텐신 II 1형 수용체(AT1R)와의 결합을 통해 발휘되어, 동맥 혈관 수축, Na+ 재흡수 또는 사구체 여과율의 조절 향상과 같은 관형 및 사구체 효과를 초래한다. 또한, Mg2+ 및 K+ 수준 뿐만 아니라 기타 자극(예를 들어, 코르티코트로핀(corticotropin), 항이뇨 호르몬, 카테콜아민, 엔도텔린(endothelin) 및 세로토닌(serotonin))과 함께, AT1R 자극은 알도스테론 방출을 초래하며, 이는 후속적으로 원위 세관에서 Na+ 및 K+의 배출을 촉진한다.
예를 들어, 과도한 안지오텐신 II 생산 및/또는 AT1R 자극을 초래하는 RAAS의 조절 장애는 고혈압을 야기하며, 이는 예를 들어 심장, 신장 및 동맥에서 산화 스트레스 증가, 염증 촉진, 비대(hypertrophy) 및 섬유증을 초래할 수 있으며, 예를 들어 좌심실 섬유증, 동맥 재형성(arterial remodeling) 및 사구체 경화증도 또한 초래할 수 있다.
고혈압은 선진국에서 가장 널리 퍼져 있는 관리 가능한 질병으로, 성인 인구의 20% 내지 50%에 영향을 미친다. 고혈압은 기대 수명 단축, 만성 신장 질병, 뇌졸중, 심근 경색, 심부전, 동맥류(예를 들어, 대동맥류), 말초 동맥 질병, 심장 손상(예를 들어, 심장 확장 또는 비대) 및 기타 심혈관-관련 질병, 장애 및/또는 병태와 같은 다양한 질병, 장애 및 병태의 주요 위험 인자이다. 또한, 고혈압은 뇌졸중 전체의 62% 및 심장 질병 전체의 49%를 차지하거나 구성하는 심혈관 유병률 및 사망률에 대한 중요한 위험 인자인 것으로 나타나 있다. 2017년에는 고혈압의 진단, 예방 및 치료에 대한 지침이 변경되어 고혈압-관련 질병 및 장애의 발병 위험성을 추가로 줄이기 위해 혈압 목표치를 더 낮게 규정하였다(예를 들어, 문헌[Reboussin et al., Systematic Review for the 2017ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 2017 Nov 7. pii: S0735-1097(17)41517-8. doi: 10.1016/j.jacc.2017.11.004]; 및 문헌[Whelton et al. (2017ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the Prevention, Detection, Evaluation, and Management of High Blood Pressure in Adults: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 2017 Nov 7. pii:S0735-1097(17)41519-1.doi:10.1016/j.jacc.2017.11.006] 참조).
고혈압 치료에 이용 가능한 항고혈압 약물이 많이 있음에도 불구하고, 개체의 2/3 이상에서는 하나의 항고혈압 약물로 병태를 조절할 수 없으며, 상이한 약물 종류로부터 선택되는 2개 이상의 항고혈압 약물이 필요하다. 이는 순응도 감소, 및 더 많은 약물 사용으로 인해 경험하게 되는 부작용 증가로 인해 제어된 혈압을 갖는 개체의 수를 추가로 감소시킨다.
따라서, 고혈압 및 기타 안지오텐시노겐-관련 질병의 치료를 위한 대체 요법 및 병용 요법이 당해 기술분야에서 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 양태에 따르면, 안지오텐시노겐(AGT) 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 시약이 제공되며, 이때 상기 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥 내의 2번 내지 18번 뉴클레오티드 위치는 AGT RNA 전사체에 대한 상보성 영역을 포함하며, 여기서 상보성 영역은 표 1 내지 표 4에 나열된 안티센스 서열 중 하나와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하고, 선택적으로 표적화 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, AGT RNA 전사체에 대한 상보성 영역은 표 1 내지 표 4에 나열된 안티센스 서열 중 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개, 16개, 17개, 18개 또는 19개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 적어도 서열 번호 519의 임의의 표적 영역에 실질적으로 상보적이고, 표 1 내지 표 4 중 하나에 제공된다. 일부 실시형태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호 519의 임의의 표적 영역에 완전히 상보적이고, 표 1 내지 표 4 중 하나에 제공된다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 표 1 내지 표 4에 나열된 센스 가닥 서열 중 임의의 하나를 포함하며, 이때 센스 가닥 서열은 적어도 dsRNA 제제 내의 안티센스 가닥 서열에 실질적으로 상보적이다. 특정 실시형태에서, dsRNA 제제는 표 1 내지 표 4에 나열된 센스 가닥 서열 중 임의의 것을 포함하며, 이때 센스 가닥 서열은 dsRNA 제제 내의 안티센스 가닥 서열에 완전히 상보적이다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 표 1 내지 표 4에 나열된 안티센스 가닥 서열 중 임의의 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 표 1 내지 표 4에서 듀플렉스 서열로서 나열된 서열 중 임의의 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 화학식 A와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 센스 가닥을 포함한다:
[화학식 A]
5'-Z1AGCUUGUUUGUGAAACZ2-3'
상기 식에서, Z1은 0개 내지 15개의 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열이고, Z2는 A, U, C, G 중 하나로부터 선택되거나 존재하지 않는다. 특정 실시형태에서, Z1은 1개 내지 4개의 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시형태에서, Z1은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시형태에서, Z2는 A이다. 특정 실시형태에서, Z1은 CACC 또는 GACC 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시형태에서, Z1 뉴클레오티드 서열은 하기 모티프 중 하나로부터 선택된다: C, AC, UC, GC, CC, ACC, UCC, GCC, CCC, GACC, AACC, UACC, CACC, CGACC, CCGACC, ACCGACC, AACCGACC, CAACCGACC, CCAACCGACC, UCCAACCGACC, UUCCAACCGACC, AUUCCAACCGACC, AAUUCCAACCGACC 또는 GAAUUCCAACCGACC. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 화학식 B와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 안티센스 가닥을 포함한다: 5'-Z3GUUUCACAAACAAGCUZ4-3'(여기서, Z3은 A, U, C, G 중 하나로부터 선택되거나 존재하지 않고, Z4는 0개 내지 15개의 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열임). 특정 실시형태에서, Z4는 1개 내지 4개의 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시형태에서, Z4는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다. 특정 실시형태에서, Z3은 U이다. 특정 실시형태에서, Z4 뉴클레오티드 서열은 GGUC 또는 GGUG 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, Z4 뉴클레오티드 서열은 하기 모티프 중 하나로부터 선택된다: G, GU, GC, GA, GG, GGU, GGA, GGC, GGG, GGUG, GGUC, GGUU, GGUA, GGUCG, GGUCGG, GGUCGGU, GGUCGGUU, GGUCGGUUG, GGUCGGUUGG, GGUCGGUUGGA, GGUCGGUUGGAA, GGUCGGUUGGAAU, GGUCGGUUGGAAUU 또는 GGUCGGUUGGAAUUC. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 본원에 기재된 바와 같이 화학식 A 및 화학식 B와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 뉴클레오티드 서열을 각각 포함하고, 선택적으로 표적화 리간드를 포함한다. 특정 실시형태에서, dsRNA 제제의 센스 가닥(A) 및 안티센스 가닥(B)은 각각 35개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시형태에서, Z1 및 Z4 뉴클레오티드 모티프는 완전히 또는 부분적으로 상보적이다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 화학식 A'와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 센스 가닥을 포함하고, 화학식 B'와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 안티센스 가닥을 포함한다:
[화학식 A']
5'-Z1'CAGCUUGUUUGUGAAACA-3'
[화학식 B']
5'-UGUUUCACAAACAAGCUGZ4'-3'
상기 식에서, Z1' 및 Z4'는 각각 독립적으로 0개 내지 13개의 뉴클레오티드 모티프를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, Z1' 및 Z4'는 각각 독립적으로 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드 모티프를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, Z1' 뉴클레오티드 서열은 하기 모티프 중 하나로부터 선택된다: A, U, G, C, AC, UC, GC, CC, GAC, AAC, UAC, CAC, CGAC, CCGAC, ACCGAC, AACCGAC, CAACCGAC 또는 GAAUUCCAACCGAC. Z4' 뉴클레오티드 서열은 하기 모티프 중 하나로부터 선택된다: U, C, A, G, GU, GA, GC, GG, GUG, GUC, GUU, GUA, GUCG, GUCGG, GUCGGU, GUCGGUU, GUCGGUUG 또는 GUCGGUUGGAAUUC.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서 안티센스 가닥은 하기에 나열된 안티센스 서열 중 하나와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다:
5'-UACUCAUUAGAAGAAAGGUG-3'(서열 번호 162);
5'-UCUUAGACCAAGGAGAAACGG-3'(서열 번호 163);
5'-UGUUUCACAAACAAGCUGGUC-3'(서열 번호 167);
5'-UGUUUCACAAACAAGCUGGUG-3'(서열 번호 523);
5'-UUCGGUUGGAAUUCUUUUUGC-3'(서열 번호 184);
5'-GUUUCACAAACAAGCUGG-3'(서열 번호 653).
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 이들 각각은 하기에 나열된 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다:
센스 가닥: 5'-CACCUUUUCUUCUAAUGAGUA-3'(서열 번호 65),
안티센스 가닥: 5'-UACUCAUUAGAAGAAAAGGUG-3'(서열 번호 162).
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 이들 각각은 하기에 나열된 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다:
센스 가닥: 5'-CCGUUUCUCCUUGGUCUAAGA-3'(서열 번호 66),
안티센스 가닥: 5'-UCUUAGACCAAGGAGAAACGG-3'(서열 번호 163).
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 이들 각각은 하기에 나열된 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다:
센스 가닥: 5'-GACCAGCUUGUUUGUGAAACA-3'(서열 번호 70),
안티센스 가닥: 5'-UGUUUCACAAACAAGCUGGUC-3'(서열 번호 167).
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 이들 각각은 하기에 나열된 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다:
센스 가닥: 5'-CACCAGCUUGUUUGUGAAACA-3'(서열 번호 522),
안티센스 가닥: 5'-UGUUUCACAAACAAGCUGGUG-3'(서열 번호 523).
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 이들 각각은 하기에 나열된 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다:
센스 가닥: 5'-GCAAAAAGAAUUCCAACCGAA-3'(서열 번호 87),
안티센스 가닥: 5'-UUCGGUUGGAAUUCUUUUUGC-3'(서열 번호 184).
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 이들 각각은 하기에 나열된 뉴클레오티드 서열 중 하나와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다:
센스 가닥: 5'-CCAGCUUGUUUGUGAAAC-3'(서열 번호 652),
안티센스 가닥: 5'-GUUUCACAAACAAGCUGG-3'(서열 번호 653).
일부 실시형태에서, dsRNA 제제 듀플렉스는 표 1의 AD00158-19-2, AD00158-19-1, AD00158-3, AD00158-1, AD00158-2, AD00158, AD00159, AD00159-1, AD00159-2, AD00159-19-1, AD00159-19-2, AD00163, AD00163-1, AD00163-2, AD00163-19-1, AD00163-19-2, AD00163-3, AD00300-1, AD00300-19-1 및 AD00300-19-2 중 임의의 하나의 듀플렉스로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제 듀플렉스는 표 1의 AV01227, AV01228, AV01229, AV01230, AV01231, AV01232, AV01233, AV01234, AV01235, AV01236, AV01237, AV01238, AV01239, AV01240, AV01241, AV01242, AV01243, AV01244, AV01245, AV01246, AV01247, AV01248, AV01249, AV01250, AV01251, AV01252, AV01253, AV01254, AV01255, AV01256, AV01257 또는 AV01711 중 임의의 하나의 듀플렉스로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2',3'-세코 뉴클레오티드 모사체, 잠금형 뉴클레오티드, 비잠금형 핵산(UNA) 뉴클레오티드, 글리콜 핵산(GNA) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드, 비염기성 뉴클레오티드, 리비톨, 역위형 뉴클레오티드, 역위형 비염기성 뉴클레오티드, 역위형 2'-OMe 뉴클레오티드, 역위형 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드 및 3'-OMe 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 또는 콜레스테롤 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 포스포라미데이트 또는 뉴클레오티드를 함유하는 비천연 염기에 연결된 말단 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이들 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제는 표적 유전자에 상응하는 mRNA의 적어도 일부와 상보적인 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 이때 dsRNA 제제는 화학식 C로 나타낸 안티센스 가닥, 및 화학식 D로 나타낸 센스 가닥을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
안티센스 가닥은 3'에서 5' 방향으로 나열된 화학식 C를 포함하고, 센스 가닥은 5'에서 3' 방향으로 나열된 화학식 D를 포함한다:
[화학식 C]
3'-(NL)nNM1NLNM2NLNFNLNM3NLNM4NLNM5NM6NLNM7NM8NLNFNL-5'
[화학식 D]
5'-(N'L)n'N'LN'LN'LN'N1N'N2N'N3N'N4N'FN'LN'N5N'N6N'LN'LN'L N'L N'LN'LN'L-3'.
상기 식에서, 각각의 NF는 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드를 나타낸다. NM1, NM2, NM3, NM4, NM5, NM6, NM7 및 NM8은 독립적으로 변형 또는 비변형 뉴클레오티드를 나타낸다. NM1, NM2, NM3, NM4, NM5, NM6, NM7 및 NM8 내에는 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드가 3개만 존재하거나, 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드가 1개만 존재한다. 각각의 NL은 독립적으로 변형 또는 비변형 뉴클레오티드를 나타내며, 이때 이러한 변형은 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드가 아니다. 각각의 N'F는 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드를 나타낸다. N'N1, N'N2, N'N3, N'N4, N'N5 및 N'N6은 독립적으로 변형 또는 비변형 뉴클레오티드를 나타낸다. N'N1, N'N2, N'N3, N'N4, N'N5 및 N'N6 내에는 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드가 2개만 존재한다. 각각의 N'L은 독립적으로 변형 또는 비변형 뉴클레오티드를 나타내며, 이때 이러한 변형은 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드가 아니다. 각각의 n 및 n'는 독립적으로 0 내지 7의 정수일 수 있다.
특정 실시형태에서, dsRNA 제제에서 화학식 C로 나타낸 안티센스 가닥의 2번, 7번, 12번, 14번 및 16 번 위치(5' 단부에 첫 번째 쌍을 이루는 뉴클레오티드부터 계산됨)에 있는 뉴클레오티드는 2'-플루오르-변형 뉴클레오티드이고; 화학식 D로 나타낸 센스 가닥의 9번, 11번 및 13번 위치(3' 단부에 첫 번째 쌍을 이루는 뉴클레오티드부터 계산됨)에 있는 뉴클레오티드는 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 화학식 C로 나타낸 안티센스 가닥의 NM2번, NM3번, NM6번 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드이고, 화학식 D로 나타낸 센스 가닥의 N'N3번, N'N5번 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-플루오로-변형 뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 가이드 가닥의 5' 단부에 E-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에서, 센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다.
특정 실시형태에서, 센스 및 안티센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 변형 센스 가닥은 표 2 내지 표 4에 나열된 변형 센스 가닥 서열이다. 일부 실시형태에서, 변형 안티센스 가닥은 표 2 내지 표 4에 나열된 변형 안티센스 가닥 서열이다.
특정 실시형태에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적이거나 실질적으로 상보적이고, 상보성 영역은 16개 내지 23개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 상보성 영역은 19개 내지 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시형태에서, 상보성 영역은 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시형태에서, 각각의 가닥의 길이는 뉴클레오티드 40개 이하이다. 일부 실시형태에서, 각각의 가닥은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 각각의 가닥은 25개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 각각의 가닥은 23개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, 각각의 가닥은 4개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시형태에서, dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하고, 하나 이상의 표적화기(targeting group) 또는 연결기를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 표적화기 또는 연결기는 센스 가닥에 접합되어 있다. 일부 실시형태에서, 표적화기 또는 연결기는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화기는 하기 구조를 갖는다:
, 또는
특정 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-단부에 접합된 표적화기를 포함한다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 센스 가닥의 3'-단부에 접합된 표적화기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 가닥은 3'-단부에 역위형 비염기성 잔기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥은 3' 및/또는 5' 단부에 1개 또는 2개의 역위형 비염기성 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 2개의 평활 단부(blunt end)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드 길이의 3' 돌출부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드 길이의 3' 돌출부를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 개방형 핵산(UNA) 올리고머에 관한 것이다. 비잠금형 핵산(UNA)은 리보오스 고리의 C2' 및 C3' 원자 사이의 결합이 절단된 RNA의 비환형 유사체이다. UNA의 혼입은 내약성이 좋은 것으로 나타나며, 일부 경우에 심지어 siRNA 유전자 침묵(gene silencing) 활성을 향상시키는 것으로 나타나 있다(문헌[Meghan A. et al. "Locked vs. unlocked nucleic acids (LNA vs. UNA): contrasting structures work towards common therapeutic goals". Chem. Soc. Rev., 2011, 40 , 5680-5689]).
UNA는 열에 불안정한 변형이며, 리보뉴클레오티드를 UNA로 대체하면 염기쌍 형성 강도 및 듀플렉스 안정성이 감소할 것이다. siRNA 안티센스 가닥의 시드 영역(seed region)에 UNA를 전략적으로 배치하면 마이크로RNA(miRNA)에 의해 매개되는 유전자 침묵 기작에서 오프-타겟 활성(off-target activity)을 감소시킬 수 있다. miRNA는 주로 안티센스 시드 영역(5' 단부에서 2번 내지 8번 위치)과 유전자 억제를 위한 표적 mRNA 사이의 염기쌍 형성을 통해 표적 유전자를 인식한다. 각각의 miRNA는 수많은 유전자를 조절할 수 있는 잠재력을 갖고 있다. RNA-유도 침묵 복합체(RISC)에 의해 로딩된 siRNA 안티센스 가닥은 miRNA-매개 기작을 통해 원치 않은 수많은 유전자를 잠재적으로 조절할 수도 있다. 따라서, UNA와 같은 열에 불안정한 뉴클레오티드를 siRNA의 시드 영역에 부가하면 표적 외 활성을 감소시킬 수 있다(문헌[Lam JK, Chow MY, Zhang Y, Leung SW. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Sep 15;4(9):e252. doi: 10.1038/mtna.2015.23. PMID: 26372022; PMCID: PMC4877448.]). 특히, 이 같은 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 RNA 올리고뉴클레오티드의 복합체는 시드 영역 내에 적어도 하나의 UNA 뉴클레오티드 단량체를 함유한다(문헌[Narendra Vaish et al. "Improved specificity of gene silencing by siRNAs containing unlocked nucleobase analog". Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 5 1823-1832]).
본 기술적 해결방법에 따라 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 RNA 올리고뉴클레오티드의 복합체에 UNA를 혼입하는 잠재적 이점은 하기를 포함하지만. 이에 제한되지는 않는다:
1. 오프-타겟 활성 감소. siRNA 시드 영역에 UNA를 부가하면 시드 영역의 염기쌍 형성 강도가 감소하여 마이크로-RNA 기작에 의해 야기되는 잠재적인 오프-타겟 활성을 감소시킬 것이다.
2. siRNA 활성 측면에서 UNA에 대한 양호한 내약성. 일부 경우에 UNA는 활성 증가를 초래할 수 있다.
본 기술적 해결방법에서 사용될 수 있는 예시적인 UNA 단량체는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 표 2 내지 표 4의 듀플렉스인 AD00158-19-2, AD00158-19-1, AD00158-3, AD00158-1, AD00158-2, AD00158, AD00159, AD00159-1, AD00159-2, AD00159-19-1, AD00159-19-2, AD00163, AD00163-1, AD00163-2, AD00163-19-1, AD00163-19-2, AD00163-3, AD00300-1, AD00300-19-1 및 AD00300-19-2 중 임의의 하나로부터 선택되는 변형 듀플렉스이다.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 표 2 내지 표 4의 듀플렉스인 AV01227, AV01228, AV01229, AV01230, AV01231, AV01232, AV01233, AV01234, AV01235, AV01236, AV01237, AV01238, AV01239, AV01240, AV01241, AV01242, AV01243, AV01244, AV01245, AV01246, AV01247, AV01248, AV01249, AV01250, AV01251, AV01252, AV01253, AV01254, AV01255, AV01256 및 AV01257 중 임의의 것으로부터 선택되는 변형 듀플렉스이다.
본 발명의 하나의 양태에 따르면, 본 발명의 전술한 dsRNA 제제 양태의 임의의 실시형태를 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 키트, 용기, 팩, 디스펜서, 사전 충전형 주사기 또는 바이알에 포장된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 피하 또는 정맥 내(IV) 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 전술한 dsRNA 제제 양태의 임의의 실시형태를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유류 세포, 선택적으로 인간세포이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 세포에서 AGT 유전자의 발현을 저해하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 (i) 본 발명의 전술한 dsRNA 제제 또는 전술한 조성물의 임의의 실시형태를 유효량으로 포함하는 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이 방법은 (ii) 제조된 세포를 AGT 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 달성하기에 충분한 시간 동안 유지하여 세포 내에서 AGT 유전자의 발현을 저해하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 개체 내에 있고, dsRNA 제제는 개체에게 피하 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포는 개체 내에 있고, dsRNA 제제는 개체에게 IV 투여에 의해 투여된다. 특정 실시형태에서, 이 방법은 개체에게 dsRNA 제제를 투여한 후 AGT 유전자의 저해를 평가하는 단계를 추가로 포함하며, 이때 이러한 평가 수단은 (i) 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리학적 특징을 결정하는 것, 및 (ii) 결정된 생리학적 특징을 AGT-연관 질병 또는 병태의 치료 전 기준선 생리학적 특징 및/또는 AGT-연관 질병 또는 병태의 대조군 생리학적 특징과 비교하는 것을 포함하며, 이때 비교는 개체에서의 AGT 유전자 발현의 저해 유무를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 결정된 생리학적 특징은 혈중 AGT 수준이다. 일부 실시형태에서, 결정된 생리학적 특징은 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 및 평균 동맥압(MAPR)을 비롯한 혈압이다. 혈중 AGT 수준의 감소 및/또는 혈압 감소는 개체에서의 AGT 유전자 발현의 감소를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 개체에서 AGT 유전자의 발현을 저해하기 위한 방법이 제공되며, 이때 이 방법은 개체에게 상술한 dsRNA 제제 양태의 실시형태 또는 상술한 조성물의 실시형태를 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 개체에게 피하 투여된다. 특정 실시형태에서, dsRNA 제제는 개체에게 IV 투여에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 dsRNA 제제의 투여 이후 AGT 유전자의 저해를 평가하는 단계를 추가로 포함하며, 이때 평가 수단은 (i) 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리학적 특징을 결정하는 것; (ii) 결정된 생리학적 특징을 AGT-연관 질병 또는 병태의 치료 전 기준선 생리학적 특징 및/또는 AGT-연관 질병 또는 병태의 대조군 생리학적 특징과 비교하는 것을 포함하며, 이때 비교는 개체에서의 AGT 유전자 발현의 저해 유무를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 결정된 생리학적 특징은 혈중 AGT 수준이고; 일부 실시형태에서, 결정된 생리학적 특징은 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 및 평균 동맥압(MAPR)을 비롯한 혈압이다. 혈중 AGT 수준의 감소 및/또는 혈압 감소는 개체에서의 AGT 유전자 발현의 감소를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, AGT 단백질과 연관된 질병 또는 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 이때 이 방법은 AGT 유전자 발현을 저해하기 위해 개체에게 본 발명의 상술한 dsRNA 제제 양태 또는 본 발명의 상술한 조성물의 임의의 실시형태를 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, AGT-연관 장애는 고혈압, 높은 혈압, 경계선 고혈압, 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 고립성 수축기 또는 이완기 고혈압, 임신-관련 고혈압, 당뇨성 고혈압, 저항성 고혈압, 치료 불응성 고혈압, 발작성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 골드블랫 고혈압(Goldblatt's hypertension), 안구 고혈압, 녹내장, 폐 고혈압, 문맥 고혈압, 전신성 정맥 고혈압, 수축기 고혈압, 불안정 고혈압; 고혈압성 심장 질병, 고혈압성 신장병증, 죽상경화증, 동맥 경화증, 혈관병, 당뇨성 신장병증 변성, 당뇨성 망막증, 만성 심부전, 심근병증, 당뇨성 심근병증, 사구체 경화증, 대동맥 협착증, 대동맥류, 심실 섬유증, 심부전, 심근 경색, 협심증, 뇌졸중, 신장 질병, 신부전, 전신성 경화증, 자궁 내 성장 지연(IUGR) 및 태아 성장 제한으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 개체에게 추가적인 치료 용법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료 용법은 AGT-연관 질병 또는 병태의 치료를 포함한다. 특정 실시형태에서, 추가적인 치료 용법은 개체에게 본 발명의 하나 이상의 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것; 개체에게 비-AGT dsRNA 치료제를 투여하는 것; 및 개체에서 행동 변화를 초래하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-AGT dsRNA 치료제는 하기 중 하나이다: 이뇨제, 안지오텐신 전환 효소(ACE) 저해제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 베타-차단제, 혈관 확장제, 칼슘 채널 차단제, 알도스테론 길항제, α2-작용제, 레닌 저해제, α-차단제, 말초 작용 아드레날린 작용제, 선택적 D1 수용체 부분 작용제, 비선택적 알파-아드레날린성 길항제, 합성 스테로이드성 항염류코르티코이드(steroidal antimineralocorticoid) 또는 상기 중 임의의 것의 조합과 같은 추가적인 치료제, 및 제제의 조합으로서 제형화된 고혈압 치료제.
일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 개체에게 피하 투여된다. 특정 실시형태에서, dsRNA 제제는 개체에게 IV 투여에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 개체에서 투여된 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 효능을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 개체에서의 치료 효능의 결정 수단은 (i) 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리학적 특징을 결정하는 것; (ii) 결정된 생리학적 특징을 AGT-연관 질병 또는 병태와 연관시키는 것을 포함하며, 이때 비교는 개체에게 투여된 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 효능의 존재, 부재 및 그 수준 중 하나 이상을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 결정된 생리학적 특징은 혈중 AGT 수준이고; 일부 실시형태에서 결정된 생리학적 특징은 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 및 평균 동맥압(MAPR)을 비롯한 혈압이다. 혈중 AGT 수준의 감소 및/또는 혈압 감소는 개체에게 투여된 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 효능의 존재를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 개체에서의 AGT 단백질의 치료 전 기준선 수준과 비교할 때 개체에서 AGT 단백질의 수준을 감소시키는 방법이 제공되며, 이때 이 방법은 AGT 유전자의 발현 수준을 감소시키기 위해 개체에게 본 발명의 상술한 dsRNA 제제 양태의 임의의 실시형태 또는 본 발명의 상술한 조성물의 임의의 실시형태를 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 개체에게 피하 투여되거나 IV에 의해 투여된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 개체에서의 AGT-연관 질병 또는 병태의 치료 전 기준선 생리학적 특징과 비교할 때 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 생리학적 특징을 변경하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 생리학적 특징을 변경하기 위해 개체에게 본 발명의 상술한 dsRNA 제제 양태의 임의의 실시형태 또는 본 발명의 상술한 dsRNA 제제 양태의 임의의 실시형태를 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, dsRNA 제제는 개체에게 피하 투여되거나 IV에 의해 투여된다. 특정 실시형태에서, 생리학적 특징은 혈중 AGT 수준이고; 일부 실시형태에서 결정된 생리학적 특징은 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 및 평균 동맥압(MAPR)을 비롯한 혈압이다.
서열에 대한 설명
AD00051 내지 AD00122-19-2, AD00163-3, AV01227 내지 AVAV01257 및 AV01711 듀플렉스는 표 1에 나타나 있으며, 이들의 센스 가닥 서열이 나타나 있다.
AD00051 내지 AD00122-19-2, AD00163-3, AV01227 내지 AVAV01257 및 AV01711 듀플렉스는 표 1에 나타나 있으며, 이들의 안티센스 가닥 서열이 나타나 있다.
서열 번호 519는 인간 안지오텐시노겐(AGT) mRNA이다[NCBI 참조 서열: NM_001384479.1]:
GAAGAAGCTGCCGTTGTTCTGGGTACTACAGCAGAAGGGTATGCGGAAGCGAGCACCCCAGTCTGAGATGGCTCCTGCCGGTGTGAGCCTGAGGGCCACCATCCTCTGCCTCCTGGCCTGGGCTGGCCTGGCTGCAGGTGACCGGGTGTACATACACCCCTTCCACCTCGTCATCCACAATGAGAGTACCTGTGAGCAGCTGGCAAAGGCCAATGCCGGGAAGCCCAAAGACCCCACCTTCATACCTGCTCCAATTCAGGCCAAGACATCCCCTGTGGATGAAAAGGCCCTACAGGACCAGCTGGTGCTAGTCGCTGCAAAACTTGACACCGAAGACAAGTTGAGGGCCGCAATGGTCGGGATGCTGGCCAACTTCTTGGGCTTCCGTATATATGGCATGCACAGTGAGCTATGGGGCGTGGTCCATGGGGCCACCGTCCTCTCCCCAACGGCTGTCTTTGGCACCCTGGCCTCTCTCTATCTGGGAGCCTTGGACCACACAGCTGACAGGCTACAGGCAATCCTGGGTGTTCCTTGGAAGGACAAGAACTGCACCTCCCGGCTGGATGCGCACAAGGTCCTGTCTGCCCTGCAGGCTGTACAGGGCCTGCTAGTGGCCCAGGGCAGGGCTGATAGCCAGGCCCAGCTGCTGCTGTCCACGGTGGTGGGCGTGTTCACAGCCCCAGGCCTGCACCTGAAGCAGCCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCTATACCCCTGTGGTCCTCCCACGCTCTCTGGACTTCACAGAACTGGATGTTGCTGCTGAGAAGATTGACAGGTTCATGCAGGCTGTGACAGGATGGAAGACTGGCTGCTCCCTGATGGGAGCCAGTGTGGACAGCACCCTGGCTTTCAACACCTACGTCCACTTCCAAGGGAAGATGAAGGGCTTCTCCCTGCTGGCCGAGCCCCAGGAGTTCTGGGTGGACAACAGCACCTCAGTGTCTGTTCCCATGCTCTCTGGCATGGGCACCTTCCAGCACTGGAGTGACATCCAGGACAACTTCTCGGTGACTCAAGTGCCCTTCACTGAGAGCGCCTGCCTGCTGCTGATCCAGCCTCACTATGCCTCTGACCTGGACAAGGTGGAGGGTCTCACTTTCCAGCAAAACTCCCTCAACTGGATGAAGAAACTATCTCCCCGGACCATCCACCTGACCATGCCCCAACTGGTGCTGCAAGGATCTTATGACCTGCAGGACCTGCTCGCCCAGGCTGAGCTGCCCGCCATTCTGCACACCGAGCTGAACCTGCAAAAATTGAGCAATGACCGCATCAGGGTGGGGGAGGTGCTGAACAGCATTTTTTTTGAGCTTGAAGCGGATGAGAGAGAGCCCACAGAGTCTACCCAACAGCTTAACAAGCCTGAGGTCTTGGAGGTGACCCTGAACCGCCCATTCCTGTTTGCTGTGTATGATCAAAGCGCCACTGCCCTGCACTTCCTGGGCCGCGTGGCCAACCCGCTGAGCACAGCATGAGGCCAGGGCCCCAGAACACAGTGCCTGGCAAGGCCTCTGCCCCTGGCCTTTGAGGCAAAGGCCAGCAGCAGATAACAACCCCGGACAAATCAGCGATGTGTCACCCCCAGTCTCCCACCTTTTCTTCTAATGAGTCGACTTTGAGCTGGAAAGCAGCCGTTTCTCCTTGGTCTAAGTGTGCTGCATGGAGTGAGCAGTAGAAGCCTGCAGCGGCACAAATGCACCTCCCAGTTTGCTGGGTTTATTTTAGAGAATGGGGGTGGGGAGGCAAGAACCAGTGTTTAGCGCGGGACTACTGTTCCAAAAAGAATTCCAACCGACCAGCTTGTTTGTGAAACAAAAAAGTGTTCCCTTTTCAAGTTGAGAACAAAAATTGGGTTTTAAAATTAAAGTATACATTTTTGCATTGCCTTCGGTTTGTTATTTAGTGTCTTGAATGTAAGAACATGACCTCCGTGTAGTGTCTGTAATACCTTAGTTTTTTCCACAGATGCTTGTGATTTTTGACAACAATACGTGAAAGATGCAAGCACCTGAATTTCTGTTTGAATGCGGAACCATAGCTGGTTATTTCTCCCTTGTGTTAGTAATAAACGTCTTGCCACAATAAGCCTCCAAAAA.
서열 번호 520은 마우스 안지오텐시노겐(AGT) mRNA이다[NCBI 참조 서열: NM_007428.4]:
ATGACTCCCACGGGGGCAGGCCTGAAGGCCACCATCTTCTGCATCTTGACCTGGGTCAGCCTGACGGCTGGGGACCGCGTATACATCCACCCCTTCCATCTCCTTTACCACAACAAGAGCACCTGCGCCCAGCTGGAGAACCCCAGTGTGGAGACACTCCCAGAGTCAACGTTCGAGCCTGTGCCCATTCAGGCCAAGACCTCCCCTGTGAATGAGAAGACCCTGCATGATCAGCTCGTGCTGGCCGCCGAGAAGCTAGAGGATGAGGACCGGAAGCGGGCTGCCCAGGTCGCAATGATCGCCAACTTCGTGGGCTTCCGCATGTACAAGATGCTGAATGAGGCAGGAAGTGGGGCCAGTGGGGCCATCCTCTCACCACCAGCTCTCTTTGGCACCCTGGTCTCTTTCTACCTTGGATCCTTAGATCCCACGGCCAGCCAGCTGCAGACGCTGCTGGATGTCCCTGTGAAGGAGGGAGACTGCACCTCCCGACTAGATGGACACAAGGTCCTCGCTGCCCTGCGGGCCATTCAGGGCTTGCTGGTCACCCAGGGTGGGAGCAGCAGCCAGACACCCCTGCTACAGTCCATTGTGGTGGGGCTCTTCACTGCTCCAGGCTTTCGTCTAAAGCACTCATTTGTTCAGAGCCTGGCTCTCTTTACCCCTGCCCTCTTCCCACGCTCTCTGGATTTATCCACTGACCCAGTTCTTGCCACTGAGAAAATCAACAGGTTCATAAAGGCTGTGACAGGGTGGAAGATGAACTTGCCACTGGAGGGGGTCAGTACAGACAGCACCCTACTTTTCAACACCTACGTTCACTTCCAAGGAACGATGAGAGGTTTCTCTCAGCTGCCTGGAGTCCATGAATTCTGGGTGGACAACAGCATCTCGGTGTCTGTGCCCATGATCTCCGGCACTGGCAACTTCCAGCACTGGAGTGACACCCAGAACAACTTCTCCGTGACGTGCGTGCCCCTAGGTGAGAGAGCCACCCTGCTGCTCATCCAGCCCCACTGCACCTCAGATCTCGACAGGGTGGAGGCCCTCATCTTCCGGAACGACCTCCTGACTTGGATAGAGAACCCGCCTCCTCGGGCCATCCGCCTGACTCTGCCCCAGCTGGAAATCCGAGGATCCTACAATCTGCAGGACCTGCTGGCTGAGGACAAGCTGCCCACCCTTTTGGGTGCGGAGGCAAATCTGAACAACATTGGTGACACCAACCCCCGAGTGGGAGAGGTTCTCAATAGCATCCTCCTCGAACTCAAAGCAGGAGAGGAGGAACAGCCGACCACGTCTGTCCAGCAGCCTGGCTCACCGGAGGCACTGGATGTGACCCTGAGCAGCCCCTTCCTGTTCGCCATCTACGAGCAGGACTCAGGCACGCTGCACTTTCTGGGCAGAGTGAATAACCCCCAGAGTGTGGTGTGA.
서열 번호 521은 시노몰구스 원숭이 안지오텐시노겐(AGT) mRNA이다[NCBI 참조 서열: NM_001283634.1]:
ATGCAGAAGCGAGCACCCCAGTCCGAGATGGCTCCTGCCAGCGTGAGCCTGAGGGCCACCATCCTCTGCCTCCTGGCCTGGGCTGGCCTGGCCACAGGTGACCGGGTGTACATACACCCCTTCCACCTCGTCATCCACAATGAGAGTACCTGTGAGCAGCTGGCAAAGGCCGATGCTGGGAAGCCCAAAGATCCCACCTTCACACCTGTTCCGATACAGGCCAAGACGTCTCCTGTGGATGAAAAGGCCCTGCAGGACCAGCTAGTGCTGGTTGCCGCAAAACTCGACACCGAGGACAAGTTGAGAGCCGCGATGGTCGGGATGCTGGCCAACTTCTTGGGCTTCCGTATATATGGCATGCACAGTGAGCTATGGGGCGTGGTCCATGGGGCCACCATCCTCTCCCCAACGGCTGTCTTTGGCACCCTGGCCTCTCTCTACCTGGGAGCGTTGGACCACACAGCCGACAGGCTACAGGCAATCCTGGGCGTCCCTTGGAAGGACAAGAACTGCACCTCCCGGCTGGATGCGCACAAGGTCCTCTCTGCCCTGCAGGCTGTACAGGGCCTGCTGGTGGCCCAGGGCAGGGCTGACGGCCAGTCCCAGCTGCTGTTGTCCACAGTGGTGGGTCTCTTCACAGCCCCAGATCTGCACCTGAAGCAGCCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCTATGCCCCTGTGGTCCTCCCACGCTCTCTGGACTTCACAGACCTGGAAGTCGCTGCTGAGAAGATTGACAGGTTCATGCAGGCTGTGACAGGATGGAAGATTAGCAGCCCCCTGACGGGAGCCAGTGCGGACAGCACCCTGGTTTTCAACACCTACGTCCATTTCCAAGGGAAGATGAGGGACTTCTTCCTGCTGGCTGAGCCCCAGGAGTTCTGGGTGGACAACAGCACCTCAGTGTCTGTCCCCATGCTGTCTGGCGTGGGCACCTTCCAGCACTGGAGCGACGCCCAGGACAACTTCTCAGTGACTCAAGTGCCCTTTACTGAGAGCGCCTGCTTGCTGCTGATTCAGCCTCACTACGCCTCTGACCTGGACAAGGTGGAGGGTCTCACTTTCCAGCAAAACTCCCTCAACTGGATGAAGAAACTGTCTCCCCGGGCCATCCACCTGACCATGCCCCGACTGGTGCTGCGAGGATCTTATGACCTGCAGGACCTGCTTGCCCAGGCTGAGCTGCCCGCCATTCTGGGCACCGAGCTGAACCTGCAAAAATTGAGCAATGACAACCTCAGGGTGGGGAAGGTGCTGAACAGCATTCTTTTTGAACTCGAAGCGGATGAGAGAGAGCCCACAGAGTCTACCCGACAGCTGAACAGGCCTGAGTTCTTGGAGGTGACCCTGGACCGCCCATTCCTGTTTGCTGTGTATGATCAAAGTGCCACTGCCCTGCACTTCCTGGGCCGTGTGGCCAACCCGCTGAGCCCAGCATGA.
표 2에 나타나 있는 서열에서, 화학적 변형은 다음과 같이 표시된다: 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오포스페이트: *.
표 3에 나타나 있는 서열에서, 생체 내 연구에서 사용된 전달 분자는 각각의 센스 가닥의 3' 단부에서 "GLO-0"로 표시된다. 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오포스페이트: *; 비잠금형 핵산: UNA(참고: AD00052, AD00113-AD00260: UNA 없음; AD00282-AD00301: UNA 버전)로서 표시된다.
표 4에 나타나 있는 서열에서, 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오포스페이트: *; Invab = 역위형 비염기성로서 표시된다.
도 1은 2 ㎎/㎏의 AD00158-1, AD00158-2, AD00163-1, AD00159-1 및 AD00300-1의 각각 투여 이후 시노몰구스 원숭이에서의 혈청 AGT 단백질 수준을 보여주는 그래프이고;
도 2는 10 ㎎/㎏의 AD00163-3의 투여 이후 시노몰구스 원숭이에서의 혈청 AGT 단백질 수준을 보여주는 그래프이고;
도 3은 10 ㎎/㎏의 AD00163-3의 투여 이후 시노몰구스 원숭이에서의 혈청 SBP의 변화를 보여주는 그래프이고;
도 4는 10 ㎎/㎏의 AD00163-3의 투여 이후 시노몰구스 원숭이의 평균 혈압(MBP)을 보여주는 그래프이고;
도 5는 10 ㎎/㎏의 AD00163-3의 투여 이후 시노몰구스 원숭이에서의 이완기 혈압(DBP)을 보여주는 그래프이다.
본 발명의 일부 실시형태는 이중 가닥(ds) RNAi 제제를 예로 들 수 있지만 이에 제한되지 않는, 안지오텐시노겐(AGT) 유전자의 발현을 저해할 수 있는 RNAi 제제를 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태는 또한 AGT RNAi 제제를 포함하는 조성물, 및 이 조성물을 사용하는 방법을 포함한다. 본원에 개시된 AGT RNAi 제제는 세포로의 전달(간세포로의 전달을 포함함)을 위한 전달 화합물에 부착될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적어도 하나의 dsAGT 제제 및 전달 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 전달 화합물은 GalNAc-함유 전달 화합물이다. 세포로 전달된 AGT RNAi 제제는 AGT 유전자 발현을 저해할 수 있어서 세포에서 유전자의 AGT 단백질 생성물의 활성을 감소시킨다. 본 발명의 dsRNAi 제제는 AGT-연관 질병 및 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 이 같은 dsRNAi 제제는, 예를 들어 표 1에 나타나 있는 듀플렉스인 AD00051 내지 AD00122-19-2를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바람직한 dsRNAi 제제는, 예를 들어 AD00158, AD00163, AD00159, AD00290, AD00300 또는 AD00122 듀플렉스를 포함한다. 기타 실시형태에서, 바람직한 dsRNAi 제제는, 예를 들어 AD00158-1, AD00158-2, AD00163-1, AD00163-3, AD00159-1 또는 AD00300-1을 포함한다. 일부 기타 실시형태에서, 이 같은 dsRNAi 제제는 AD00158, AD00163, AD00163-3, AD00159, AD00290, AD00300 또는 AD00122 듀플렉스의 변이체와 같은 듀플렉스 변이체를 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 세포 또는 개체에서 AGT 발현을 감소시키면 세포 또는 개체에서 각각 AGT 발현과 연관된 질병 또는 병태가 치료된다. AGT 활성을 감소시킴으로써 치료될 수 있는 질병 및 병태의 비제한적인 예로는 고혈압, 높은 혈압, 경계선 고혈압, 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 고립성 수축기 또는 이완기 고혈압, 임신성 고혈압, 당뇨성 고혈압, 저항성 고혈압, 치료 불응성 고혈압, 발작성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 골드블랫 고혈압, 안구 고혈압, 녹내장, 폐 고혈압, 문맥 고혈압, 전신성 정맥 고혈압, 수축기 고혈압, 불안정 고혈압, 고혈압성 심장 질병, 고혈압성 신장병증, 죽상경화증, 동맥 경화증, 혈관 질병, 당뇨성 신장병증, 당뇨성 망막증, 만성 심부전, 심근병증, 당뇨성 심근병증, 사구체 경화증, 대동맥 협착증, 대동맥류, 심실 섬유증, 심부전, 심근 경색, 협심증, 뇌졸중, 신장 질병, 신부전, 전신성 경화증, 자궁 내 성장 지연(IUGR) 및 태아 성장 제한이 있다.
AGT 유전자 발현에 의해 야기되거나 조절되는 질병 및 병태를 치료하기 위한 조성물 및 방법 뿐만 아니라, AGT 유전자 발현을 저해하기 위해 AGT 단일 가닥(ssRNA) 및 이중 가닥(dsRNA) 제제를 포함하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법이 하기에 기재되어 있다. "RNAi"란 용어는 또한 당해 기술분야에 알려져 있으며, "siRNA"로서 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "RNAi"란 용어는 RNA를 포함하고, RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 경로를 통해 RNA 전사체의 표적화된 개열을 매개하는 제제를 지칭한다. 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, RNAi 표적 영역은 유전자 전사 동안에 형성된 RNA 분자의 뉴클레오티드 서열(메신저 RNA(mRNA)를 포함함)의 인접한 부분을 지칭하며, 이는 일차 전사 생성물의 RNA 가공 생성물이다. 서열의 표적 일부는 적어도 이러한 일부 또는 그 주변에서 RNAi-지시 개열(RNAi-directed cleavage)을 위한 기질로서 작용하기에 충분히 길어야 할 것이다. 표적 서열은 8개 내지 30개의 뉴클레오티드 길이(경계값 포함), 10개 내지 30개의 뉴클레오티드 길이(경계값 포함), 12개 내지 25개의 뉴클레오티드 길이(경계값 포함), 15개 내지 23개의 뉴클레오티드 길이(경계값 포함), 16개 내지 23개의 뉴클레오티드 길이(경계값 포함) 또는 18개 내지 23개의 뉴클레오티드 길이(경계값 포함)이며, 이는 각각의 명시된 범위 내의 보다 짧은 모든 길이를 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 표적 서열은 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 26개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시형태에서, 표적 서열은 9개 내지 26개 사이의 뉴클레오티드 길이(경계값 포함)이며, 이는 이들 사이의 모든 하위 범위 및 정수를 포함한다. 예를 들어, 제한하려는 의도는 아니지만, 본 발명의 특정 실시형태에서 표적 서열은 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 뉴클레오티드 길이이며, AGT 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 완전히 또는 적어도 실질적으로 상보적이다. 본 발명의 일부 양태는 하나 이상의 AGT dsRNA 제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 AGT RNAi는 AGT 단백질의 발현을 저해한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "dsRNA 제제"는 표적 mRNA 전사체를 분해하거나 이의 번역을 억제할 수 있는 RNA 또는 RNA-유사(예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 포함하는 조성물을 지칭한다. 특정 이론에 결부되기를 원하지는 않지만, 본 발명의 dsRNA 제제는 RNA 간섭 기작을 통해 작용하거나(즉, 포유류 세포의 RNA 간섭 경로 기계(RNA-유도 침묵 복합체 또는 RISC)와의 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도하거나), 임의의 대체 기작(들) 또는 경로(들)를 통해 작동할 수 있다. 식물, 무척추동물 및 척추동물 세포에서 유전자를 침묵시키기 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 개시내용이 본원에서 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15: 485]; 문헌[Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363]; 문헌[Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309]; 및 문헌[Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188)] 참조). 당해 기술분야에 알려져 있는 유전자 침묵 수단은 AGT 발현의 저해를 달성하기 위해 본원에 제공된 개시내용과 함께 사용될 수 있다.
본원에 개시된 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 이루어져 있고, 짧은 간섭 RNA(siRNA), RNAi 제제, 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 다이서 기질(dicer substrate)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 표적화된 mRNA와 적어도 부분적으로 상보적이고, 표적 유전자 발현을 저해하기 위해 다양한 길이의 dsRNA 듀플렉스 구조가 사용할 수 있는 것으로 당해 기술분야에서 이해된다. 예를 들어, 19개, 20개, 21개, 22개 및 23개의 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA는 RNA 간섭을 효과적으로 유도하는 것으로 알려져 있다(문헌[Elbashir et al., EMBO 2001, 20: 6877-6888]). 또한, 보다 짧거나 보다 긴 RNA 듀플렉스 구조도 또한 RNA 간섭을 유도하는 데 효과적이라는 것이 당해 기술분야에 알려져 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서 AGT dsRNA는 적어도 21개의 nt 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있거나, 듀플렉스는 표 1 내지 표 4에 나열된 서열 중 하나에 기초하여 1개, 2개 또는 3개의 nt 또는 심지어 보다 짧은 길이를 뺀 길이를 가질 수 있다. 표 1 내지 표 4 각각에 나열된 dsRNA와 비교하여 한쪽 또는 양쪽 단부에서 4개의 뉴클레오티드를 감소시키는 것이 또한 효과적일 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 표 1 내지 표 4의 하나 이상의 서열로부터 적어도 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 인접한 뉴클레오티드의 부분 서열을 가질 수 있으며, 전체 서열을 포함하는 dsRNA(여기서 "부모" 서열로도 지칭됨)에 의해 생성된 저해 수준과 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 30% 이상으로 AGT 유전자 발현을 저해하는 이들 능력이 상이하지 않을 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법의 특정 실시형태는 조성물 내에 단일 가닥 RNA를 포함하고/하거나, 개체에게 단일 가닥 RNA를 투여한다. 예를 들어, 표 1 내지 표 4 중 임의의 것에 나열된 안티센스 가닥은 개체에게 투여되는 경우에 개체에서 AGT 폴리펩티드 활성 및/또는 AGT 유전자의 발현을 감소시키는 조성물로서 또는 그 내부에 사용될 수 있다. 표 1 내지 표 4에는 일부 AGT dsRNA 제제의 안티센스 및 센스 가닥 코어 스트레치 염기 서열이 나타나 있다. 본 발명의 특정 조성물에 포함될 수 있고/있거나 본 발명의 특정 방법으로 투여될 수 있는 단일 가닥 안티센스 분자는 본원에서 "단일 가닥 안티센스 제제" 또는 "안티센스 폴리뉴클레오티드 제제"로서 지칭된다. 특정 조성물에 포함될 수 있고/있거나 본 발명의 특정 방법으로 투여될 수 있는 단일 가닥 센스 분자는 본원에서 "단일 가닥 센스 제제" 또는 "센스 폴리뉴클레오티드 제제"로서 지칭된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "염기 서열"이란 용어는 화학적 변형 또는 전달 화합물이 없는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 표 1에 나타나 있는 센스 가닥은 표 3의 상응하는 염기 서열에 상응하지만; 표 3의 상응하는 서열은 각각의 화학적 변형 및 전달 화합물을 나타낸다. 본원에 개시된 서열에는 식별자(identifier)가 할당될 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 센스 서열은 "센스 가닥 SS#"으로 식별될 수 있고; 단일 가닥 안티센스 서열은 "안티센스 가닥 AS#"으로 식별될 수 있고; 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 듀플렉스는 "듀플렉스 AD#"으로 식별될 수 있다.
표 1에는 센스 및 안티센스 가닥이 포함되며, 표 1의 동일한 행에 센스 및 안티센스 가닥에 의해 형성된 듀플렉스의 식별 번호가 제공된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 안티센스 서열은 이의 첫 번째 위치에 핵염기(u) 또는 핵염기(a)를 함유한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 안티센스 서열은 이의 첫 번째 위치에 핵염기(u)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "매칭 위치(matching position)"란 용어는 어떤 의미에서 2개의 가닥이 듀플렉스로서 작용하는 경우 서로 "쌍"을 형성하는 각각의 가닥 내의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 21개 핵염기의 센스 가닥 및 21개 핵염기의 안티센스 가닥에서, 센스 가닥의 1번 위치의 핵염기는 안티센스 가닥의 21번 위치의 핵염기와 "매칭 위치"에 있다. 다른 비제한적인 예에서, 23개 핵염기의 센스 가닥 및 23개 핵염기의 안티센스 가닥에서, 센스 가닥의 2번 위치의 핵염기는 안티센스 가닥의 22번 위치와 매칭 위치에 있다. 다른 비제한적인 예에서, 18개 핵염기의 센스 가닥 및 18개 핵염기의 안티센스 가닥에서, 센스 가닥의 1번 위치의 핵염기는 안티센스 가닥의 18번 위치의 핵염기와 매칭 위치에 있고, 센스 가닥의 4번 위치의 핵염기는 안티센스 가닥의 15번 위치의 핵염기와 매칭 위치에 있다. 당업자라면 듀플렉스의 센스 및 안티센스 가닥과 쌍을 이룬 가닥 사이의 매칭 위치를 식별하는 방법을 이해할 것이다.
표 1의 마지막 열은 동일한 표의 행에 센스 및 안티센스 서열을 포함하는 듀플렉스의 듀플렉스 AD#/AV#를 나타낸다. 예를 들어, 표 1에는 상응하는 센스 및 안티센스 가닥 서열을 포함하는, "듀플렉스 AD#AD00051"로 지정된 듀플렉스가 개시되어 있다. 따라서, 표 1의 각각의 행은 동일한 행에 나타나 있는 센스 및 안티센스 서열을 각각 포함하는 본 발명의 듀플렉스를 식별하며, 각각의 듀플렉스에 지정된 식별자는 열의 행 끝에 나타나 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 1에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNAi 제제가 개체에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 개체에게 투여된 RNAi 제제는 표 1에 나열된 염기 서열 중 적어도 하나를 포함하고 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개의 서열 변형을 포함하는 듀플렉스를 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 1에 나타나 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 RNAi 제제를 전달 분자에 연결하는 단계가 추가로 포함되며, 이의 비제한적인 예는 GalNAc를 포함하는 전달 화합물이다.
[표 1]
표 2에는 본 발명의 특정 화학적으로 변형된 AGT RNAi 제제의 안티센스 및 센스 가닥 서열이 나타나 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 2에 나타나 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 제제는 세포 및/또는 개체에게 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 2에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 제제는 개체에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 개체에게 투여된 RNAi 제제는 표 2의 제1 열에 언급된 듀플렉스를 포함하고, 표 2의 동일한 행의 제3 및 제6 행에 각각 나타나 있는 센스 및 안티센스 가닥 서열의 서열 변형을 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 2에 나타나 있는 서열은 RNAi 제제를 개체의 세포 및/또는 조직에 전달할 수 있는 화합물에 연결(본원에서는 "접합"으로도 지칭됨)될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에 유용한 전달 화합물의 비제한적인 예로는 GalNAc-함유 화합물이 있다. 표 2에서, 제1 열은 표 1에 상응하는 염기 서열의 듀플렉스 AD# 또는 AV#를 나타낸다. 듀플렉스의 AD#에 의해 식별된 염기 서열에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥에 포함된 염기 서열이 나타나 있을 뿐만 아니라, 특정한 화학적 변형도 표 2의 동일한 행에 나타나 있다. 예를 들어, 표 1의 제1 행에는 단일 가닥 센스 및 안티센스 염기 서열이 나타나 있으며, 이들은 함께 듀플렉스 AD# AD00051로 식별되는 듀플렉스를 형성하는 반면; 표 2에 나열된 듀플렉스 AD# AD00051에서, 듀플렉스로서 이는 AD00051-SS 및 AD00051-AS의 염기 서열을 포함하고, 제3 및 제6 열 각각에 나타나 있는 센스 및 안티센스 서열 내에 화학적 변형을 포함한다. 표 2의 제2 열에서 "센스 가닥 SS#"은 동일한 행의 제3 열에 나타나 있는 센스 서열(변형을 포함함)에 지정된 식별자이다. 표 2의 제5 열에서 "안티센스 가닥 AS#"은 제6 열에 나타나 있는 안티센스 서열(변형을 포함함)에 지정된 식별자이다.
[표 2]
표 3에는 본 발명의 특정 화학적으로 변형된 AGT RNAi 제제의 안티센스 및 센스 가닥 서열이 나타나 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 3에 나타나 있는 RNAi 제제는 세포 및/또는 개체에게 투여된다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 제제는 개체에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 개체에게 투여된 RNAi 제제는 표 3의 제1 열에서 식별된 듀플렉스를 포함하고, 표 3의 동일한 행의 제3 및 제6 열에서 센스 및 안티센스 가닥 서열 각각에 나타나 있는 서열 변형 및/또는 전달 화합물을 포함한다. 이 서열은 본원의 다른 부분에 기재된 특정 생체 내 시험 연구에 사용되었다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 3에 나타나 있는 서열은 전달 용 화합물에 연결(본원에서 "접합"으로도 지칭됨)될 수 있으며, 이의 비제한적인 예는 GalNAc-함유 화합물이다. 즉, "GLX-n"으로서 식별된 전달 화합물은 표 3의 제3 열의 센스 가닥 상에 존재한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "GLX"는 "GLS" 또는 "GLO" 전달 화합물("X"는 "S" 또는 "O"일 수 있음)을 의미하도록 사용되고, GLX-n은 합성 과정 동안 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 3'- 또는 5-단부에 연결될 수 있는 임의의 GLS 및 GLO일 수 있다. 비제한적인 예로서, GLX-13 및 GLX-14는 합성 과정 동안 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 3'-단부에 연결될 수 있고, GLX-5 및 GLX-15는 합성 과정 동안 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 5'-단부에 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에서 사용되고 표 3에 나타나 있는 바와 같이, "GLX-n"은 부착된 GalNAc-함유 화합물을 나타내기 위해 사용되고, GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6, GLS-7, GLS-8, GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1. GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15 및 GLO-16 화합물 중 임의의 것이다. 일부 구현예에서, GLO-0는, 전문이 본원에서 인용되는 문헌[Jayaprakash, et al., (2014) J. Am. Chem. Soc., 136, 16958]에 기재된 결찰(ligation)용으로 유용한 GalNAc-함유 화합물을 예로 들 수 있지만 이에 제한되지 않는, 선행 기술분야에서 결찰용으로 이용 가능한 것으로 기재되어 있는 GalNAc-함유 화합물을 나타낸다. 일부 구현예에서, 당업자라면 GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6 중 하나, GLS-7, GLS-8, GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1, GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15 및 GLO-16을 포함하지만 이에 제한되지 않는 전달 화합물이 부착된 본 발명의 dsRNA 화합물을 제조 및 사용할 수 있을 것이다. 이들 각각의 구조는 본원의 다른 부분에 제공된다. 표 3의 제1 열에는 상기 표의 이러한 행에 센스 및 안티센스 서열로 할당된 듀플렉스의 듀플렉스 AD#이 제공된다. 예를 들어, 듀플렉스 AD# AD00052는 AD00052-SS 센스 가닥 및 AD00052-AS 안티센스 가닥으로 구성된 듀플렉스이다. 표 3의 각각의 행에는 하나의 센스 가닥 및 하나의 안티센스 가닥이 제공되고, 표시된 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성된 듀플렉스가 개시되어 있다. 표 3의 제2 열에서 "센스 가닥 SS#"은 동일한 행의 제3 열에 나타나 있는 센스 서열(변형을 포함함)에 지정된 식별자이다. 표 3의 제5 열에서 "안티센스 가닥 AS#"은 제6 열에 나타나 있는 안티센스 서열(변형을 포함함)에 지정된 식별자이다. 특정 연결된 GalNAc-함유 GLO 화합물에 대한 식별자는 GLO-0으로서 나타나 있으며, GLO-0으로서 나타나 있는 화합물 대신 다른 GLO-n 또는 GLS-n 화합물이 치환될 수 있고, 얻어진 화합물이 또한 본 발명의 방법 및/또는 조성물의 실시형태에 포함된다는 것이 이해될 것이다.
표 3에는 생체 내 시험에 사용되는 화학적으로 변형된 AGT RNAi 제제의 안티센스 및 센스 가닥 서열이 제공된다. 모든 서열은 5'에서 3'로 나타나 있다. 이들 서열은 본원의 다른 부분에 기재된 생체 내 시험 연구 중 일부에서 사용되었다. 생체 내 연구에 사용된 전달 분자는 각각의 센스 가닥의 3' 단부에 "GLO-0"으로 표시된다. 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오포스페이트: *; 비잠금형 핵산: UNA(참고: AD00052, AD00113-AD00260: UNA 없음, AD00282-AD00301: UNA 버전)로서 표시된다.
[표 3]
표 4에는 본 발명의 특정 화학적으로 변형된 AGT RNAi 제제의 안티센스 및 센스 가닥 서열이 나타나 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 4로 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 제제가 개체에게 투여된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 개체에게 투여된 RNAi 제제는 표 4의 제1 열의 행에서 식별된 듀플렉스를 포함하고, 표 4의 제3 및 제6 열의 동일한 행에서 센스 및 안티센스 가닥 서열에 나타나 있는 서열 변형 및/또는 전달 화합물을 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 표 4에 나타나 있는 서열은 개체의 세포 및/또는 조직에 RNAi 제제를 전달할 수 있는 화합물에 연결될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에 유용한 전달 화합물의 비제한적인 예로는 GalNAc-함유 화합물이 있다. 표 4에서, "GLX-n"이란 용어는 나타나 있는 센스 가닥에 GalNAc를 함유하는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, "GLO-0" 및 "GLS-5"란 용어는 각각 센스 가닥에 부착된 상이한 GalNAc-함유 화합물을 나타낸다. GLO-0로서 나타나 있는 화합물은 다른 GLO-n 또는 GLS-n 화합물에 의해 치환될 수 있고, 얻어진 화합물이 또한 본 발명의 방법 및/또는 조성물의 실시형태에 포함된다는 것이 이해될 것이다. 유사하게, GLS-5로서 나타나 있는 화합물은 또한 다른 GLS-n 또는 GLO-n 화합물에 의해 치환될 수 있고, 얻어진 화합물은 본 발명의 방법 및/또는 조성물의 실시형태에 포함될 수 있다. 표 4에서, 부착된 GalNAC-함유 화합물을 나타내기 위해 사용된 화합물 GLX-n은 GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6, GLS-7, GLS-8. GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1, GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15 및 GLO-16 화합물이며, 이들 각각의 구조는 본원의 다른 부분에 제공된다. 표 4의 제1 열은 표 3에 나타나 있는 듀플렉스에 상응하는 듀플렉스 AD#을 나타낸다. 듀플렉스 AD#은 표 3에 상응한 듀플렉스 서열을 식별하며, 이는 표 4의 센스, 안티센스 및 듀플렉스 서열이 표 3에서의 동일한 듀플렉스 AD#을 갖는 염기 서열과 동일하지만, 표 4의 서열 및 듀플렉스는 표 3에 나타나 있는 상응하는 서열 및 듀플렉스와 비교하여 상이한 화학적 변형 및/또는 전달 화합물을 갖는다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 표 4에 나타나 있는 바와 같이, AD00113-1-SS 및 AD00113-1-AS 서열 및 이들의 듀플렉스 AD#AD00113-1은 각각 표 3에 나타나 있는 AD00113-SS(센스), AD00113-AS(안티센스) 및 이중 가닥 AD#AD00113과 동일한 염기 서열을 갖지만, 각각의 표에 표시된 바와 같이 화학적 변형 및/또는 전달 화합물을 갖는다. 표 4의 제1 열은 듀플렉스 AD# 번호를 식별하고; 각각의 행에서 번호로 식별되는 듀플렉스는 동일한 행의 제3 및 제6 열에 각각 나타나 있는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 변형을 포함하며, 각각은 센스 가닥의 3'- 또는 5'-단부에 부착된 GLO- 또는 GLS-전달 화합물을 갖는다.
표 4에는 화학적으로 변형된 AGT RNAi 제제의 안티센스 및 센스 가닥 서열이 제공된다. 이들 서열은 본원의 다른 부분에 기재된 특정 생체 내 연구에 사용되었다. 모든 서열은 5'에서 3'로 나타나 있다. 화학적 변형은 대문자: 2'-플루오로; 소문자: 2'-OMe; 티오포스페이트: *; Invab = 역위형 비염기성으로서 표시된다.
[표 4]
미스매치
특히 미스매치가 dsRNA의 말단 영역 내에 있으면 dsRNA의 효능에 내약성이 있는 것으로 당업자에게 알려져 있다. 워블 염기쌍(wobble base pair) G:U 및 A:C을 갖는 것과 같은 특정 미스매치는 내약성이 보다 양호하다(문헌[Du et al., A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites. Nucleic Acids Res. 2005 Mar 21; 33(5): 1671-7. Doi: 10.1093/nar/gki312. Nucleic Acids Res. 2005; 33(11): 3698]). 본 발명의 방법 및 화합물의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 AGT 표적 서열에 대한 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제는 미스매치를 함유하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제는 1개 이하의 미스매치를 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제는 2개 이하의 미스매치를 함유한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제는 3개 이하의 미스매치를 함유한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 상보성 영역의 중심에 위치하지 않는 AGT 표적 서열에 대한 미스매치를 함유한다. 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 상보성 영역의 5' 또는 3' 단부 중 하나 또는 둘 모두에서 마지막 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 뉴클레오티드 내에 위치한 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 미스매치를 함유한다. 본원에 기재된 방법 및/또는 당해 기술분야에 알려져 있는 방법은, AGT 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 AGT dsRNA 제제가 AGT 유전자의 발현을 저해하는 데 효과적인지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
상보성
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한, 제1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, AGT dsRNA 제제 센스 가닥 또는 표적화된 AGT mRNA)과 제2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, AGT dsRNA 제제 안티센스 가닥 또는 단일 가닥 안티센스 폴리뉴클레오티드)의 관계를 설명하기 위해 사용되는 경우의 "상보성/상보적"이란 용어는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 혼성화하고[포유류 생리학적 조건(또는 시험관 내의 유사한 조건) 하에 염기쌍 사이의 수소 결합을 형성하고], 특정 조건 하에 이중 나선 또는 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 지칭한다. 생물체 내에서 직면할 수 있는 생리적으로 관련이 있는 조건과 같은 기타 조건이 또한 적용될 수 있다. 당업자라면 혼성화된 뉴클레오티드의 최종 용도에 기초하여 2개의 서열에 대한 상보성 시험에 가장 적합한 조건 세트를 결정할 수 있을 것이다. 상보적인 서열은 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pair) 또는 비-왓슨-크릭 염기쌍을 포함하며, 적어도 상기의 혼성화 요건이 충족되는 정도로 천연 또는 변형 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 모사체를 포함한다. 서열 동일성 또는 상보성은 변형과 무관하다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 AGT dsRNA 내의 상보적 서열은, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 1개 또는 둘 모두의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기쌍 형성을 포함한다. 이 같은 서열은 본원에서 서로에 대해 "완전히 상보적"인 것으로 지칭될 수 있다. 2개의 올리고뉴클레오티드가 혼성화 시에 하나 이상의 단일 가닥 돌출부를 형성하도록 설계된 실시형태에서, 이 같은 돌출부는 상보성에 기초하여 결정된 미스매치인 것으로 간주되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 19개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 하나의 올리고뉴클레오티드 및 20개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 AGT dsRNA 제제(여기서, 보다 긴 올리고뉴클레오티드는 보다 짧은 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적인 19개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 포함함)는, 본원에 기재된 목적에 따라 "완전히 상보적"인 것으로 지칭될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "완전히 상보적"이란 제1 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 모든(100%) 염기가 제2 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 동일한 개수의 염기와 혼성화될 것임을 의미한다. 인접한 서열은 제1 또는 제2 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 상보적"이란 용어는 핵염기 서열의 혼성 쌍(hybrid pair)에서 제1 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 염기의 (전부는 아니지만) 적어도 약 85%가 제2 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 동일한 개수의 염기와 혼성화될 것임을 의미한다. 2개의 서열이 혼성화되는 경우에 하나 이상의 미스매칭된 염기쌍, 예를 들어 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 미스매칭된 염기쌍을 함유하면, "실질적으로 상보적"이란 용어는 이의 최종 용도, 예를 들어 RISC 경로를 통한 AGT 유전자의 발현 저해와 가장 관련이 높은 조건 하에 혼성화되는 능력을 유지하면서 제1 서열에 의해 제2 서열에 대해 형성된 최대 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기쌍(bp)으로 이루어진 듀플렉스를 참고하여 사용될 수 있다. 본원에서 "부분적으로 상보적"이란 용어는 제1 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 염기의 (전부는 아니지만) 적어도 75%가 제2 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 동일한 개수의 염기와 혼성화될 핵염기 서열의 혼성화된 쌍을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, "부분적으로 상보적"이란 제1 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열 내의 염기의 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 제2 폴리뉴클레오티드의 인접한 서열의 동일한 개수의 염기와 혼성화될 것임을 의미한다.
본원에서 "상보적", "완전히 상보적", "실질적으로 상보적" 및 "부분적으로 상보적"이란 용어는 AGT dsRNA 제제의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, AGT dsRNA 제제의 안티센스 가닥과 표적 AGT mRNA의 서열 사이, 또는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 AGT mRNA의 서열 사이의 염기 매칭을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. "AGT dsRNA 제제의 안티센스 가닥"이란 용어는 "ANG 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제"의 동일한 서열을 지칭할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열을 지칭하는 경우의 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적 동일성"이란 용어는 핵산 서열이 참조 서열 대비 적어도 약 85% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 서열 동일성의 백분율은 비교 윈도우(comparison window) 상에서 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정된다. 백분율은 서열 둘 모두에서 동일한 핵산 염기가 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭된 위치의 개수를 산출하고, 매칭된 위치의 개수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 수득함으로써 계산된다. 본원에 개시된 발명은 본원에 개시된 것과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들어, 표 1 내지 표 5). 일부 실시형태에서, 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 서열(예를 들어, 표 1 내지 표 4)과 동일하거나, 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "서열을 포함하는 가닥"이란 용어는 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 언급된 서열로 기재된 뉴클레오티드의 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA"이란 용어는 표적 AGT RNA에 대해 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로 지칭되는 2개의 역평행의 실질적으로 또는 완전히 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 혼성화된 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNAi 분자 복합체를 포함하는 서열을 지칭한다. 듀플렉스 영역은 RISC 경로에 의해 표적 AGT RNA의 특이적 분해를 가능케 하는 임의의 목적하는 길이일 수 있지만, 전형적으로 9개 내지 30개의 염기쌍 길이, 예를 들어 15개 내지 30개의 염기쌍 길이이다. 염기쌍이 9개와 30개 사이인 듀플렉스를 고려할 때, 듀플렉스는 이러한 범위 내의 임의의 길이, 예를 들어 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 염기쌍, 또는 그 사이의 하위 범위일 수 있으며, 여기서 하위 범위는 15개 내지 30개의 염기쌍, 15개 내지 26개의 염기쌍; 15개 내지 23개의 염기쌍, 15개 내지 22개의 염기쌍, 15개 내지 21개의 염기쌍, 15개 내지 20개의 염기쌍, 15개 내지 19개의 염기쌍, 15개 내지 18개의 염기쌍, 15개 내지 17개의 염기쌍, 18개 내지 30개의 염기쌍, 18개 내지 26개의 염기쌍, 18개 내지 23개의 염기쌍, 18개 내지 22개의 염기쌍, 18개 내지 21개의 염기쌍, 18개 내지 20개의 염기쌍, 19개 내지 30개의 염기쌍, 19개 내지 26개의 염기쌍, 19개 내지 23개의 염기쌍, 19개 내지 22개의 염기쌍, 19개 내지 21개의 염기쌍, 19개 내지 20개의 염기쌍, 20개 내지 30개의 염기쌍, 20개 내지 26개의 염기쌍, 20개 내지 25개의 염기쌍, 20개 내지 24개의 염기쌍, 20개 내지 23개의 염기쌍, 20개 내지 22개의 염기쌍, 20개 내지 21개의 염기쌍, 21개 내지 30개의 염기쌍, 21개 내지 26개의 염기쌍, 21개 내지 25개의 염기쌍, 21개 내지 24개의 염기쌍, 21개 내지 23개의 염기쌍 또는 21개 내지 22개의 염기쌍을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다이서 및 유사한 효소를 이용한 가공에 의해 세포에서 생성된 AGT dsRNA 제제는 전형적으로 19개 내지 22개의 염기쌍 길이 범위이다. AGT dsDNA 제제의 듀플렉스 영역의 하나의 가닥은 표적 AGT RNA의 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥은 적어도 하나의 자기 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로부터 유래할 수 있거나, 2개 이상의 별도 RNA 분자로부터 형성될 수 있다. 듀플렉스 영역이 단일 분자로부터 형성되는 경우, 분자는 뉴클레오티드의 단일 가닥 사슬(본원에서 "헤어핀 루프"로도 지칭됨)의 3'-단부의 하나의 가닥과 상응하는 5'-단부의 다른 가닥 사이에 형성된 듀플렉스 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 헤어핀 구성은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 쌍 형성되지 않은 뉴클레오티드를 포함한다. AGT dsRNA 제제의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 별도 RNA 분자로 구성되는 경우, 이들 분자는 반드시 공유 연결될 필요는 없지만, 공유 결합될 수도 있다. 2개의 가닥이 헤어핀 루프가 아닌 다른 수단에 의해 공유 결합되는 경우, 연결 구조를 "링커"로서 지칭된다. 또한, "siRNA"란 용어는 본원에 기재된 바와 같은 dsRNA 제제를 지칭하기 위해 사용된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 dsRNA 제제의 하나 말단 또는 양 말단 모두에 쌍 형성되지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 갖는 센스 및 안티센스 서열을 포함할 수 있다. 쌍 형성되지 않은 뉴클레오티드가 없는 단부는 "평활 단부"로서 지칭되며, 어떠한 뉴클레오티드 돌출부도 없다. dsRNA 제제의 양 말단 모두가 평활하면, dsRNA는 "평활 단부를 갖는" 것으로 언급된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, dsRNA 제제의 제1 단부가 평활하고, 일부 실시형태에서 dsRNA 제제의 제2 단부가 평활하며, 본 발명의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA 제제의 양 단부 모두가 평활하다.
본 발명의 dsRNA 제제의 일부 실시형태에서, dsRNA는 1개 또는 2개의 평활 단부를 갖지 않는다. 이 경우, dsRNA 제제의 가닥의 단부에는 적어도 하나의 쌍 형성되지 않은 뉴클레오티드가 존재한다. 예를 들어, dsRNA의 하나의 가닥의 3'-단부가 다른 하나의 가닥의 5'-단부를 넘어 확장되거나, 그 반대인 경우, 뉴클레오티드 돌출부가 존재한다. dsRNA는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 갖는 돌출부를 함유할 수 있다. 뉴클레오티드 돌출부는 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서 뉴클레오티드 돌출부는 dsRNA 제제의 센스 가닥 상에, dsRNA 제제의 안티센스 가닥 상에, 또는 dsRNA 제제의 양 단부에 존재하고, 돌출부의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5' 단부, 3' 단부 또는 양 단부 상에 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 돌출부 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트로 교체된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"이란 용어는 AGT 표적 서열에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 AGT dsRNA 제제의 가닥을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "센스 가닥" 또는 "패신저 가닥(passenger strand)"이란 용어는 AGT dsRNA 제제의 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 함유하는 AGT dsRNA 제제의 가닥을 지칭한다.
변형
본 발명의 일부 실시형태에서, AGT RNAi 제제의 RNA는 안정성 및/또는 하나 이상의 기타 유익한 특성의 향상을 얻기 위해 화학적으로 변형된다. 본 발명의 특정 실시형태에서 핵산은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있으며, 예를 들어 본원에서 참고로 포함되는 문헌["Current protocols in Nucleic Acid Chemistry", Beaucage, SL et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]을 참고한다. 본 발명의 AGT dsRNA 제제의 특정 실시형태에서 존재할 수 있는 변형은, 예를 들어 (a) 5' 단부 변형(인산화, 접합, 역위형 연결 등), 3' 단부 변형(접합, DNA 뉴클레오티드, 역위형 연결 등)과 같은 말단 변형; (b) 염기 변형, 예를 들어 안정화 염기, 불안정화 염기 또는 확장형 파트너 풀(expanded partner pool)과 쌍 형성한 염기를 이용한 교체, 염기(비염기성 뉴클레오티드) 결실 또는 염기 접합; (c) 당 변형(예를 들어, 2' 위치 또는 4' 위치) 또는 당의 치환; 및 (d) 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 교체를 포함하는 골격 변형을 포함한다. 본 발명의 AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및 AGT 센스 폴리뉴클레오티드의 특정 실시형태에 유용한 RNA 화합물의 구체적인 예로는 변형 골격을 포함하거나 천연 뉴클레오시드간 연결이 없는 RNA를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 비제한적인 예로서, 골격 변형을 갖는 RNA는 골격 내에 인 원자를 갖지 않을 수 있다. 뉴클레오시드간 골격 내에 인 원자를 갖지 않는 RNA는 올리고뉴클레오시드로서 지칭될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 변형 RNA는 뉴클레오시드간 골격 내에 인 원자를 갖는다.
"RNA 분자" 또는 "RNA" 또는 "리보핵산 분자"란 용어는 자연에서 발현 또는 발견되는 RNA 분자뿐만 아니라, 본원에 기재되거나 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같이 하나 이상의 리보뉴클레오티드/리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 RNA의 유사체 및 유도체도 포함한다는 것이 이해될 것이다. "리보뉴클레오시드" 및 "리보뉴클레오티드"란 용어는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. RNA 분자는 (예를 들어, 하기에 기술된 것과 같이) 핵염기 구조 또는 리보오스-인산 골격 구조가 변형될 수 있고, 리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 함유하는 분자는 듀플렉스를 형성하는 능력을 유지해야 한다. 비제한적인 예로서, RNA 분자는 또한 2'-O-메틸 변형 뉴클레오시드, 5' 포스포로티오에이트기를 함유하는 뉴클레오시드, 콜레스테릴 유도체 또는 도데카노산 비스데실아마이드기에 연결된 말단 뉴클레오시드, 잠긴형 뉴클레오시드, 비염기성 뉴클레오시드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오시드, 2'-아미노 변형 뉴클레오시드, 2'-알킬 변형 뉴클레오시드, 모폴리노 뉴클레오시드, 포스포라미데이트 또는 뉴클레오시드를 함유하는 비-천연 염기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 적어도 하나의 변형 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, RNA 분자는 하기 개수의 변형 리보뉴클레오시드, 즉 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개의 변형 리보뉴클레오시드, 또는 AGT dsRNA 제제 분자의 리보뉴클레오시드의 최대 전체 길이까지 포함한다. 이 같은 RNA 분자 내의 복수의 변형 리보뉴클레오시드 각각에 대해 변형이 동일할 필요는 없다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 독립적으로 선택된 변형 뉴클레오티드 및/또는 비-포스포디에스테르 결합으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 변형 뉴클레오티드, 비-포스포디에스테르 결합 등과 같은 선택된 요소를 지칭하기 위해 사용되는 경우 "독립적으로 선택된"이란 용어는 2개 이상의 선택된 요소가 서로 동일할 수 있지만, 반드시 동일할 필요는 없다는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "뉴클레오티드 염기", "뉴클레오티드" 또는 "핵염기"는 모든 핵산의 표준 구성성분이며, 뉴클레오티드를 형성하는 염기, 즉 아데닌(a), 구아닌(g), 시토신(c), 티민(t) 및 우라실(u)을 포함하는 헤테로환형 피리미딘 또는 푸린 화합물이다. 핵염기는, 제한하려는 의도는 아니지만 범용 염기, 소수성 염기, 비특이적(promiscuous) 염기, 크기-확장형 염기 및 불소화된 염기를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"란 용어는 본원에서 비변형 뉴클레오티드, 변형 뉴클레오티드, 또는 대체 모이어티를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 당업자라면 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 이 같은 교체 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 형성 특성을 유의하게 변경하지 않으면서 기타 모이어티로 교체될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
하나의 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 고려되는 변형 RNA는 목적하는 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 가지며, RISC 경로를 통해 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하거나 매개하는 펩티드 핵산(PNA)이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AGT RNA 간섭제(interfering agent)는 표적 AGT RNA 서열과 상호 작용하여 표적 AGT RNA의 개열을 지시하는 단일 가닥 RNA를 포함한다.
변형 RNA 골격은, 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트(3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함함), 포스피네이트, 포스포라미데이트(3'-아미노포스포라미데이트 및 아미노알킬 포스포라미데이트를 포함함), 티오포스포라미데이트, 티오알킬포스포네이트, 티오알킬포스포트리에스테르 및 보라노포스페이트(정상적인 3'-5' 연결 뿐만 아니라, 이들의 2'-5' 연결 유사체, 및 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2' 형식으로 연결된, 반전된 극성을 갖는 것들)를 포함할 수 있다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태가 또한 포함된다. 인-함유 결합을 제조하기 위한 방법은 당해 기술분야에서 일상적으로 실시되며, 이 같은 방법은 본 발명의 특정 변형 AGT dsRNA 제제, 특정 변형 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 특정 변형 AGT 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
내부에 인 원자를 함유하지 않는 변형 RNA 골격은 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로환형 뉴클레오시드간 연결로 형성되는 구조를 갖는다. 이들은 모르폴리노 결합(뉴클레오시드의 당 일부로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 골격; 실록산 골격; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 골격; 메틸아세틸 및 티오메틸아세틸 골격; 메틸렌 메트아세틸 및 티오메틸아세틸 골격; 알켄-함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 N, O, S 및 CH2 성분이 혼합된 기타 부분을 포함한다. 인 원자를 함유하지 않는 변형 RNA 골격을 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 일상적으로 실시되며, 이 같은 방법은 본 발명의 특정 변형 AGT dsRNA 제제, 특정 변형 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 특정 변형 AGT 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, RNA 모방체는 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 연결(즉, 골격) 대신에 신규한 기를 사용하는 것을 예를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는, AGT dsRNA, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드 내에 포함된다. 이 같은 실시형태에서, 염기 단위는 적절한 AGT 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 이 같은 하나의 올리고머성 화합물은 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 나타나 있는 RNA 모방체로서, 펩티드 핵산(PNA)으로서 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 골격은 아미드-함유 골격, 구체적으로 아미노에틸글리신 골격에 의해 교체된다. 핵염기가 보유되며, 골격의 아미드 일부의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. RNA 모방체를 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 일상적으로 실시되며, 이 같은 방법은 본 발명의 특정 변형 AGT dsRNA 제제를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태는 포스포로티오에이트 골격을 갖는 RNA 및 헤테로원자 골격을 갖는 올리고뉴클레오시드를 포함하며, 특히 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 골격으로서 알려져 있음], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2----[여기서, 네이티브 포스포디에스테르 골격은 --O--P--O--CH2--로서 나타냄]를 포함한다. 포스포로티오에이트 골격을 갖는 RNA 및 헤테로원자 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 방법은 당해 기술분야에서 일상적으로 실시되며, 이 같은 방법은 본 발명의 특정 변형 AGT dsRNA 제제, 특정 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 특정 AGT 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 변형 RNA는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 본 발명의 AGT dsRNA, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O--, S-- 또는 N-알킬; O--, S-- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬(여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 미치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 적합한 예시적인 변형으로는 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2(여기서, n 및 m은 1 내지 약 10임)를 들 수 있다. 기타 실시형태에서, dsRNA는 2' 위치에 하기 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 개열기(RNA cleaving group), 리포터기, 인터칼레이터(intercalator), AGT dsRNA 제제의 약동학적 특성을 개선시키기 위해 사용되는 기 또는 AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선시키기 위해 사용되는 기, 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환기. 일부 실시형태에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3; 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려져 있음)(문헌[Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78: 486-504]), 즉 알콕시-알콕시기를 포함한다. 다른 예시적인 변형은 2'-디메틸아미노에톡시에톡시, 즉 이하 실시예에서 기재된 바와 같은 O(CH2)2ON(CH3)2 기(2'-DMAOE로도 알려져 있음), 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(당해 기술분야에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려져 있음), 즉 2'-O--CH2-O--CH2--N(CH2)2이다. 기재된 바와 같은 변형 RNA를 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 일상적으로 실시되며, 이 같은 방법은 본 발명의 특정 변형 AGT dsRNA 제제를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
기타 변형으로는 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드, AGT 센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드의 RNA 상의 기타 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상 또는 2'-5' 연결된 AGT dsRNA, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드 내의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 유사한 변형이 이루어질 수 있다. AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 기재된 바와 같은 변형 RNA를 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 일상적으로 실시되며, 이 같은 방법은 본 발명의 특정 변형 AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드는 핵염기(당해 기술분야에서 흔히 "염기"로서 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "미변형된" 또는 "천연" 핵염기는 푸린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C), 및 우라실(U)을 포함한다. 변형 핵염기는 기타 합성 및 천연 핵염기, 예를 들어 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토산 피리미딘, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐우라실 및 시토신, 6-아조우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신; 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-아자구아닌 및 7-아자아데닌 뿐만 아니라, 3-아자구아닌 및 3-아자아데닌을 포함한다. 본 발명의 AGT dsRNA 제제의 특정 실시형태에 포함될 수 있는 추가적인 핵염기는 당해 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. Ed. Wiley-VCH, 2008]; 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859], 문헌[Kroschwitz, J. L, Ed. John Wiley & Sons, 1990], 문헌[English et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613], 문헌[Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302] 및 문헌[Crooke, ST and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]을 참고한다. 본원에 기재된 바와 같은 핵염기 변형 및/또는 치환을 포함하는 dsRNA, AGT 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 가닥 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 일상적으로 실시되며, 이 같은 방법은 본 발명의 특정 변형 AGT dsRNA 제제, AGT 센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드의 특정 실시형태는 하나 이상의 잠금형 핵산(LNA)을 포함하도록 변형된 RNA를 포함한다. 잠금형 핵산은 2' 및 4' 탄소를 연결시키는 추가적인 가교(bridge)를 포함하는 변형 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드이다. 이러한 구조는 리보오스를 3'-엔도 구조 형태로 효과적으로 "잠근다". 본 발명의 AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드에 잠금형 핵산을 첨가하면 혈청 내 안정성을 증가시키고 오프-타겟 효과를 줄일 수 있다(문헌[Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1): 439-447]; 문헌[Mook, O R. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3): 833-843]; 문헌[Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12): 3185-3193]). 잠금형 핵산을 포함하는 dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 일상적으로 실시되며, 이 같은 방법은 본 발명의 특정 변형 AGT dsRNA 제제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 AGT dsRNA 화합물, 센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 특정 실시형태는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하며, 이때 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2',3'-세코 뉴클레오티드 모사체, 잠금형 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드 및 3'-Ome 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 함유하는 뉴클레오티드, 또는 콜레스테롤 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 포스포라미데이트 또는 뉴클레오티드를 함유하는 비천연 염기에 연결된 말단 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 화합물은 안티센스 가닥(본원에서 가이드 가닥으로도 지칭됨)의 5' 단부에 E-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 함유한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드는 AGT dsRNA 화합물, 센스 폴리뉴클레오티드의 3' 및 5' 단부 및/또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 포함되며, 이때 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드는 비염기성 뉴클레오티드, 리비톨, 역위형 뉴클레오티드, 역위형 비염기성 뉴클레오티드, 역위형 2'-OMe 뉴클레오티드 및 역위형 2'-데옥시뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 단부에 비염기성 또는 역위형 비염기성 뉴클레오티드를 포함시키면 안정성을 향상시킬 수 있다는 것이 당업자에게 알려져 있다(문헌[Czauderna et al. Structural variations and stabilizing modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2003; 31(11): 2705-2716. doi:10.1093/nar/gkg393]).
본 발명의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA 화합물 및 안티센스 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하며, 이때 상기 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드는 비잠금형 핵산(UNA) 뉴클레오티드 및/또는 글리콜 핵산(GNA) 뉴클레오티드를 포함한다. UNA 및 GNA가 siRNA 화합물의 오프-타겟 프로파일을 유의하게 개선시킬 수 있는 열적으로 불안정한 화학적 변형이라는 것이 당업자에게 알려져 있다(문헌[Janas, et al., Selection of GalNAc-conjugated siRNAs with limited off-target-driven rat hepatotoxicity. Nat Commun 2018; 9(1): 723. doi:10.1038/s41467-018-02989-4]; 문헌[Laursen et al., Utilization of unlocked nucleic acid (UNA) to enhance siRNA performance in vitro and in vivo. Mol BioSyst. 2010; 6:862-70]).
본 발명의 AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드의 특정 실시형태의 RNA에 포함될 수 있는 다른 변형은 AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 각각 향상시키는 RNA에 화학적으로 연결된 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 접합체를 포함한다. 향상될 수 있는 특징의 비제한적인 예로는 AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드 활성, 세포 분포, AGT dsRNA 제제의 전달, AGT dsRNA 제제의 약동학적 특성 및 AGT dsRNA 제제의 세포 섭취가 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 하나 이상의 표적화기 또는 연결기를 포함하며, 이는 본 발명의 특정 실시형태에서 센스 가닥에 접합된다. 표적화기의 비제한적인 예는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)을 포함하는 화합물이다. "표적화제", "연결제", "표적화 화합물" 및 "표적화 리간드"란 용어는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-단부에 접합된 표적화 화합물을 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 센스 가닥의 3'-단부에 접합된 표적화 화합물을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 GalNAc-함유 표적화기를 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 센스 가닥의 3'-단부 및 5'-단부 중 하나 또는 둘 모두에 접합된 표적화 화합물을 포함하지 않는다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-단부 및 3'-단부중 하나 또는 둘 모두에 접합된 GalNAc-함유 표적화 화합물을 포함하지 않는다.
추가적인 표적화제 및 연결제는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 본 발명의 특정 실시형태에 유용한 표적화제 및 연결제는 지질 모이어티, 예를 들어 콜레스테롤 모이어티(문헌[Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556]), 콜산(문헌[Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4: 1053-1060]), 티오에테르, 예를 들어 베릴-S-트리틸티올(문헌[Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660: 306-309]; 문헌[Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3: 2765-2770]), 티오콜레스테롤(문헌[Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533-538]), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌[Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10: 1111-1118]; 문헌[Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259: 327-330]; 문헌[Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75: 49-54]), 인지질, 예를 들어 2-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세롤-3-포스포네이트(문헌[Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654]; 문헌[Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777-3783]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(문헌[Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969-973]) 또는 아다만탄 아세트산(문헌[Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651-3654]), 팔미토일 모이어티(문헌[Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229-237]) 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(문헌[Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923-937])를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다
AGT dsRNA 제제, AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 AGT 센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 특정 실시형태는 AGT dsRNA 제제의 분포, 표적화 특성 등을 변경하는 리간드를 포함할 수 있다. 본 발명의 AGT dsRNA 제제를 포함하는 조성물의 일부 실시형태에서, 예를 들어 리간드는 이 같은 리간드가 존재하지 않는 종과 비교하여 선택된 표적(예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획(예를 들어, 세포 또는 기관 구획), 조직, 기관 또는 신체 부위)에 대한 친화도를 증가시킨다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법에 유용한 리간드는 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA), 저밀도 지질단백질(LDL) 또는 글로불린), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 아밀로펙틴, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산) 또는 지질과 같은 자연 발생 물질일 수 있다. 또한, 리간드는 합성 중합체(예를 들어, 합성 폴리아미노산 또는 폴리아민)과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예로는 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-공-글리콜산) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 또는 폴리포스파진이 있다. 폴리아민의 예로는 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidine), 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도모방체 폴리아민, 수지상 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염 또는 α-나선형 펩티드를 들 수 있다.
본 발명의 조성물 및/또는 방법에 포함된 리간드는 표적화기를 포함할 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어 신장 세포 또는 간세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체가 있다. 표적화기는 티로트로핀(thyrotropin), 멜라노겐(melanogen), 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 엽산, 비타민 B12, 비타민 A, 비오틴 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체일 수 있다.
리간드의 기타 예로는 염료, 인터칼레이터(예를 들어, 아크리딘), 가교 결합제(예를 들어, 소랄렌(psoralen), 미토마이신 C(mitomycin C)), 포르피린(TPPC4, 텍사피린(texaphyrin), 사피린(sapphyrin)), 다환형 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세린, 제라닐옥시헥실, 헥사데실글리세롤, 보르네올(borneol), 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레일)리토콜산, O3-(올레일)콜산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진 및 펩티드 접합체(예를 들어, 안테나페디아(antennapedia) 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사선 표지 마커, 효소, 합텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 증강제(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터(imidazole cluster), 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP 또는 AP를 들 수 있다.
본 발명의 조성물 및/또는 방법에 포함되는 리간드는 단백질, 예를 들어 당단백질 또는 펩티드(예를 들어, 공동 리간드(co-ligand)에 특정 친화도를 갖는 분자) 또는 항체(예를 들어, 암 세포, 내피 세포, 심근 세포 또는 골 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체)일 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 실시형태에 유용한 리간드는 호르몬 또는 호르몬 수용체일 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 실시형태에 유용한 리간드는 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조 효소, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스 또는 다가 푸코오스일 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 실시형태에 유용한 리간드는, 예를 들어 세포의 세포 골격을 파괴함으로써(예를 들어, 세포의 미세소관, 미세 필라멘트, 및/또는 중간체 필라멘트를 파괴함으로써) 세포 내로의 AGT dsRNA 제제의 업데이트(update)를 증가시키는 물질일 수 있다. 이 같은 제제의 비제한적인 예로는 탁손(taxon), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 사이토칼라신(cytochalasin), 노코다졸(nocodazole), 자스플라키놀리드(jasplakinolide), 라투룬쿨린 A(latrunculin A), 팔로이딘(phalloidin), 스윈홀라이드 A(swinholide A), 인다노신(indanocine) 및 마이오세르빈(myoservin)이 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제에 연결된 리간드는 약동학(PK) 조절제로서 기능을 한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 PK 조절제의 예로는 친유성 제제, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민, 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 다아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센(naproxen), 이부프로펜(ibuprofen), 비타민 E, 비오틴, 및 혈청 단백질에 결합하는 압타머(aptamer) 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 많은 포스포로티오에이트 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드도 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 골격 내 다수의 포스포로티오에이트 연결을 함유하는 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 약 5개의 염기, 10개의 염기, 15개의 염기 또는 20개의 염기의 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 조성물 및/또는 방법에서 리간드로서 사용될 수 있다.
AGT dsRNA 제제 조성물
본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 조성물 내에 있다. 본 발명의 조성물은 하나 이상의 AGT dsRNA 제제 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 전달제, 표적화제, 검출 가능한 표지 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에 따라 유용할 수 있는 표적화제의 비제한적인 예로는 본 발명의 AGT dsRNA 제제를 치료될 세포로 및/또는 세포 내로 유도하는 제제가 있다. 표적화제의 선택은 AGT-연관 질병 또는 병태의 특징 및 표적 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 비제한적인 예에서, 본 발명의 일부 실시형태에서 AGT dsRNA 제제를 간세포로 및/또는 간세포 내로 표적화하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 치료제는 전달제만을 갖는 AGT dsRNA 제제를 포함하며, 이때 이 같은 전달제는 임의의 추가적인 연결 요소 없이 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 일부 양태에서 AGT dsRNA 제제는 GalNAc를 포함하는 전달 화합물에 연결될 수 있으며, 이때 이는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물 내에 포함되어 AGT dsRNA 제제에 연결된 임의의 검출 가능한 표지 또는 표적화제 등의 부재 하에 세포 또는 개체에 투여된다.
본 발명의 AGT dsRNA 제제가 하나 이상의 전달제, 표적화제, 표지제 등과 함께 및/또는 이에 연결되어 투여되는 경우, 당업자라면 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적절한 제제를 이해하고, 이를 선택 및 사용할 수 있을 것이다. 표지제는 세포 및 조직에서 AGT dsRNA 제제의 위치를 결정하기 위해 본 발명의 특정 방법에서 사용될 수 있으며, 본 발명의 방법에서 투여된 AGT dsRNA 제제를 포함하는 치료용 조성물의 세포, 조직, 또는 기관 위치를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 효소 표지, 염료, 방사선 표지 등과 같은 표지 시약을 부착 및 사용하기 위한 수단은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 표지제는 AGT dsRNA 제제에 포함된 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 모두에 연결된다는 것이 이해될 것이다.
AGT dsRNA 제제 및 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 전달
본 발명의 방법의 특정 실시형태는 세포 내로의 AGT dsRNA 제제의 전달을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "전달"이란 용어는 세포 섭취 또는 흡수를 촉진시키고 이에 영향을 미치는 것을 의미한다. AGT dsRNA 제제의 흡수 또는 섭취는 독립적인 확산 또는 활성 세포 과정에 의해 발생할 수 있거나, 본 발명의 AGT dsRNA 제제와 연관될 수 있는 전달제, 표적화제 등의 사용을 통해 발생할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 전달 방식은 AGT dsRNA 제제가 조직 부위 내에 주사되거나 전신 투여되는 생체 내 전달을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 전달제에 연결되어 있다.
AGT dsRNA 제제를 세포, 조직 및/또는 개체로 전달하기 위해 사용될 수 있는 방법의 비제한적인 예로는 AGT dsRNA-GalNAc 접합체, SAMiRNA 기술, LNP 기반 전달 방법 및 네이키드 RNA 전달(naked RNA delivery)을 들 수 있다. 이들 및 기타 전달 방법은 치료용 RNAi 제제를 전달하여 다양한 질병 및 병태를 치료하기 위해 당해 기술분야에서 성공적으로 사용되고 있으며, 이때 질병 및 병태는 간 질병, 급성 간헐성 포르피린증(acute intermittent porphyria; AIP), 혈우병, 폐 섬유증 등을 예로 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 다양한 전달 방법의 세부사항은, 전문이 본원에서 참고로 포함되는 문헌[Nikam, R. R. & K. R. Gore (2018) Nucleic Acid Ther, 28 (4), 209-224 Aug 2018]; 문헌[Springer A. D. & S. F. Dowdy (2018) Nucleic Acid Ther. Jun 1; 28(3): 109-118]; 문헌[Lee, K. et al., (2018) Arch Pharm Res, 41(9), 867-874]; 및 문헌[Nair, J. K. et al., (2014) J. Am. Chem. Soc. 136:16958-16961]과 같은 공개물에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태는 AGT dsRNA 제제를 세포, 조직 및/또는 개체로 전달하기 위한 지질 나노입자(LNP)의 사용을 포함한다. LNP는 치료용 AGT dsRNA 제제를 비롯한 AGT dsRNA 제제의 생체 내 전달을 위해 흔히 사용된다. LNP 또는 기타 전달제를 사용하는 것의 한 가지 이점은, LNP 또는 기타 전달제를 사용하여 개체로 전달되는 경우 AGT RNA 제제의 안정성이 증가한다는 것이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, LNP는 본 발명의 하나 이상의 AGT RNAi 분자가 로딩된 양이온성 LNP를 포함한다. AGT RNAi 분자(들)를 포함하는 LNP가 개체에게 투여되고, LNP 및 이에 부착된 AGT RNAi 분자는 세포내이입(endocytosis)을 통해 세포에 흡수되고, 이들의 존재로 인해 RNAi 유발 분자(RNAi trigger molecule)가 방출되어 RNAi를 매개한다.
본 발명의 AGT dsRNA 제제를 세포, 조직 및/또는 개체로 전달하기 위해 본 발명의 실시형태에서 사용될 수 있는 전달제의 다른 비제한적인 예는 본 발명의 AGT dsRNA 제제에 연결되어 AGT dsRNA 제제를 세포, 조직, 및/또는 개체로 전달하는 GalNAc를 포함하는 제제이다. 본 발명의 방법 및 조성물의 특정 실시형태에서 사용될 수 있는 특정한 기타 GalNAc-함유 전달제의 예는 PCT 공개공보 WO2020191183A1에 개시되어 있다. AGT dsRNA 제제를 세포로 전달하기 위해 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 GalNAc 표적화 리간드의 비제한적인 예는 표적화 리간드 클러스터이다. 여기에 제안된 표적화 리간드 클러스터의 예로는 포스포디에스테르 연결(GLO)을 갖는 GalNAc 리간드 및 포스포로티오에이트 연결(GLS)을 갖는 GalNAc 리간드가 있다. 본원에서 "GLX-n"란 용어는 부착된 GalNAC-함유 화합물이 GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6, GLS-7, GLS-8, GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1, GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15 및 GLO-16 화합물(각각의 구조는 하기에 나타나 있는 바와 같음) 중 하나인 것을 의미하도록 사용될 수 있다. 하기 도면에서, 본 발명의 GalNAc 표적화 리간드 및 RNAi 제제의 연결 위치는 각각의 표적화 리간드의 가장 우측 상에 있다. 본 발명의 임의의 RNAi 및 dsRNA 분자는 GLS-1, GLS-2, GLS-3, GLS-4, GLS-5, GLS-6, GLS-7, GLS-8, GLS-9, GLS-10, GLS-11, GLS-12, GLS-13, GLS-14, GLS-15, GLS-16, GLO-1, GLO-2, GLO-3, GLO-4, GLO-5, GLO-6, GLO-7, GLO-8, GLO-9, GLO-10, GLO-11, GLO-12, GLO-13, GLO-14, GLO-15 및 GLO-16에 연결될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 하기는 GLO-1 내지 GLO-16 및 GLS-1 내지 GLS-16의 구조이다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 생체 내 전달은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된 미국 특허 제5,032,401호 및 제5,607,677호 및 미국 공개공보 제2005/0281781호에 기재된 것과 같은 베타-글루칸 전달 시스템에 의한 것일 수도 있다. 또한, AGT RNAi 제제는 전기천공 및 리포펙션(lipofection)과 같은 당해 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 시험관 내에서 세포 내에 도입될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA는 표적화제 없이 전달된다. 이들 RNA는 "네이키드" RNA 분자로서 전달될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 AGT dsRNA는 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태(예를 들어, 고혈압)을 치료하기 위해 RNAi 제제를 포함하지만 표적화제(예를 들어, GalNAc 표적화 화합물)는 포함하지 않는 약학 조성물로 개체에게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 특정 전달 양식 이외에, 기타 RNAi 전달 양식이 본원에 기재된 AGT RNAi 작용제 및 치료 방법의 실시형태, 예를 들어 본원에 기재된 것 및 당해 기술분야에서 사용된 것과 함께 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 AGT dsRNA 제제는 세포 및/또는 개체에서 AGT 폴리펩티드의 수준 및 활성을 감소시키는 데 효과적인 양 및 방식으로 개체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 AGT dsRNA 제제는 AGT 발현 및 활성과 연관된 질병 또는 병태를 치료하기 위해 세포 및/또는 개체에 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 개체에서 AGT 발현과 연관된 질병 또는 병태를 완화시키기 위해 이 같은 치료가 필요한 개체에게 하나 이상의 AGT dsRNA 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 시험관 내, 생체 외 및 생체 내 세포 중 하나 이상에서 AGT 발현 및/또는 활성을 감소시키기 위해 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 세포 내의 AGT 폴리펩티드의 수준 및 이에 따른 이의 활성은 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 세포 내로 전달(예를 들어, 도입)함으로써 감소된다. 표적화제 및 방법은 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 특정 세포 유형, 세포 아형, 기관 또는 개체 내의 공간 영역 및/또는 세포 내 세포하 영역으로 전달할 수 있게 하기 위해 사용될 수 있다. AGT dsRNA 제제는 본 발명의 특정 방법에서 단독으로 투여되거나, 하나 이상의 추가적인 AGT dsRNA 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상 독립적으로 선택된 AGT dsRNA 제제가 개체에게 투여된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 AGT-관련 질병 또는 병태를 치료하기 위한 하나 이상의 추가적인 치료 용법과 조합하여 AGT-관련 질병 또는 병태를 치료하기 위해 개체에게 투여된다. 추가적인 치료 용법의 비제한적인 예로는 본 발명의 하나 이상의 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드의 투여, 비-AGT dsRNA 치료제의 투여 및 행동 수정(behavioral modification)이 있다. 추가적인 치료 용법은 본 발명의 AGT dsRNA 제제의 투여 전, 투여와 동시 및 투여 후 중 하나 이상의 시점에 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "동시"는, 0시(time zero)로부터 5분 이내, 0시로부터 10분 이내, 0시로부터 30분 이내, 0시로부터 45분 이내, 및 0시로부터 60분 이내임을 의미하는 것으로 이해될 것이며, 여기서 "0시"는 본 발명의 AGT dsRNA 제제가 개체에게 투여되는 시간이다. 비-AGT dsRNA 치료제의 비제한적인 예로는 추가적인 치료제, 예를 들어 이뇨제, 안지오텐신-전환 효소(ACE) 저해제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 베타-차단제, 혈관 확장제, 칼슘 채널 차단제, 알도스테론 길항제, 알파-2 작용제, 레닌 저해제, 알파-차단제, 말초 작용 아드레날린 작용제, 선택적 D1 수용체 부분 작용제, 비선택적 알파-아드레날린성 길항제, 합성, 스테로이드성 항염류코르티코이드 또는 상기 중 임의의 것의 조합, 및 약학적 조합으로 제형화된 고혈압 치료제가 있다. 행동 수정의 비제한적인 예로는 식이 용법, 상담 및 운동 용법이 있다. 이들 및 기타 치료제 및 행동 수정은 당해 기술분야에 알려져 있고, 개체에서 AGT 질병 또는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있으며, 또한 AGT 질병 또는 병태를 치료하기 위해 본 발명의 하나 이상의 AGT dsRNA 제제와 조합하여 개체에게 투여될 수 있다. AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하기 위해 세포 또는 개체에게 투여되는 본 발명의 AGT dsRNA 제제는 하나 이상의 기타 치료제 또는 유효 성분과 상승적 방식으로 작용하여 하나 이상의 치료제 또는 유효 성분의 효능을 증대시킬 수 있고/있거나 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하는 데 있어 AGT dsRNA 제제의 효능을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 AGT dsRNA 제제의 투여를 포함하며, 이때 AGT dsRNA 제제는 AGT-연관 질병 또는 병태의 발병 이전 및/또는 AGT-연관 질병 또는 병태가 존재하는 경우(질병 또는 병태의 초기, 중기 및 후기 단계를 포함함)에 사용될 수 있고, 임의의 이들 단계 이전 또는 이후에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 이전에 AGT-연관 질병 또는 병태에 대해 치료를 받은 적이 있는 개체를 하나 이상의 기타 치료제 및/또는 치료용 유효 성분으로 치료할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 기타 치료제 및/또는 유효 성분은 개체의 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하는 데 성공하지 못했고/못했거나, 최소한으로 성공했고/했거나, 더 이상 성공하지 못하였다.
벡터-암호화된 dsRNA
본 발명의 특정 실시형태에서, 벡터는 AGT dsRNA 제제를 세포 내로 전달하기 위해 사용될 수 있다. AGT dsRNA 제제 전사 단위는 DNA 또는 RNA 벡터 내에 포함될 수 있다. 서열을 세포 및/또는 개체 내로 전달하기 위한 이 같은 이식 유전자-암호화 벡터의 제조 및 사용은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간 또는 그 이상의 시간, 또는 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 또는 그 이상의 주간 동안 AGT dsRNA의 일시적 발현을 초래하는 벡터가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일시적 발현의 길이는 선택된 특정 벡터 구조체 및 표적 세포 및/또는 조직을 예를 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는 인자에 기반을 둔 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이 같은 이식 유전자는 선형 구조체, 원형 플라스미드, 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있으며, 이는 통합 또는 비통합 벡터일 수 있다. 또한, 이식 유전자는 염색체 외 플라스미드로서 유전되도록 구성될 수 있다(문헌[Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292]).
AGT dsRNA 제제의 하나 이상의 단일 가닥은 발현 벡터 상의 프로모터로부터 전사될 수 있다. 예를 들어, dsRNA를 생성하기 위해 2개의 별도 가닥이 발현되어야 하는 경우, 2개의 별도 발현 벡터는 형질 감염 또는 감염과 같은 수단을 사용하여 세포 내에 동시 도입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제의 각각의 개별 가닥은 동일한 발현 벡터 상에 포함된 프로모터로부터 전사될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA 제제는 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 역위형 반복 폴리뉴클레오티드로서 발현되어 AGT dsRNA 제제가 스템 및 루프 구조를 갖도록 한다.
RNA 발현 벡터의 비제한적인 예로는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 있다. 본 발명의 실시형태에 유용한 발현 벡터는 진핵 세포와 양립 가능할 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당해 기술분야에서 일상적으로 사용되며, 많은 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있다. AGT dsRNA 발현 벡터의 전달은 정맥 또는 근육 내 투여에 의해, 개체로부터 제거된 후 개체에 재도입된 표적 세포에 대한 투여에 의해, 또는 목적하는 표적 세포의 도입을 가능케 하는 임의의 수단에 의해 전신적일 수 있다.
방법의 실시형태에 포함될 수 있는 바이러스 벡터 시스템은 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스 벡터, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노-연관 바이러스 벡터; (d) 단순 헤르페스 바이러스 벡터; (e) SV40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 유두종 바이러스 벡터; (h) 피코르나바이러스 벡터; (i) 오르토폭스바이러스 벡터(예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터) 또는 조류 폭스바이러스 벡터(예를 들어, 카나리아 또는 가금류 폭스바이러스 벡터)와 같은 폭스바이러스 벡터; (j) 협력자 의존성 또는 가틀리스(gutless) 아데노바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. AGT dsRNA 제제의 재조합 발현을 위한 구조체는 구성적 또는 조절/유도성 발현을 제공하도록 선택될 수 있는 프로모터, 인핸서 등과 같은 조절 요소를 함유할 수 있다. 바이러스 벡터 시스템 및 프로모터 및 인핸서 등의 사용은 당해 기술분야에서 일상적이며, 본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태는 AGT dsRNA 제제를 세포 내로 전달하기 위한 바이러스 벡터의 사용을 포함한다. 다수의 아데노바이러스-기반 전달 시스템은, 예를 들어 폐, 간, 중추 신경계, 내피 세포 및 근육으로의 전달을 위해 당해 기술분야에서 일상적으로 사용된다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예로는 AAV 벡터, 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스), 변형 바이러스 안카라(MVA), NYVAC 또는 조류 폭스바이러스(예를 들어, 가금류 또는 카나리아 폭스바이러스)가 있다.
본 발명의 특정 실시형태는 벡터를 사용하여 AGT dsRNA 제제를 세포 내로 전달하는 방법을 포함하고, 이 같은 벡터는 유전자 전달 벡터가 포매된 서방형 매트릭스를 포함할 수는 있지만 반드시 포함하는 것은 아닌 약학적으로 허용 가능한 벡터 내에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, AGT dsRNA를 전달하기 위한 벡터는 재조합 세포에 의해 생산될 수 있으며, 본 발명의 약학 조성물은 AGT dsRNA 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
AGT dsRNA 또는 ssRNA 제제를 함유하는 약학 조성물
본 발명의 특정 실시형태는 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학 조성물의 용도를 포함한다. AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 함유하는 약학 조성물은 세포에서 AGT 유전자 발현 및 AGT 활성을 감소시키기 위해 본 발명의 방법에서 사용될 수 있고, AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이 같은 약학 조성물은 전달 방식에 기초하여 제형화될 수 있다. 전달 방식을 위한 제형의 비제한적인 예로는 피하 전달을 위해 제형화된 조성물, 비경구 전달에 의한 전신 투여를 위해 제형화된 조성물, 정맥 내(IV) 전달을 위해 제형화된 조성물, 경막 내 전달을 위해 제형화된 조성물, 및 뇌로의 직접 전달을 위해 제형화된 조성물 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물은 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 세포 내로 전달하기 위해 하나 이상의 수단, 예를 들어 국소(예를 들어, 경피 패치에 의해), 폐, 예를 들어 네뷸라이저를 통한 투여를 비롯하여 분말 또는 에어로졸의 흡입(inhalation) 또는 흡인(insufflation)에 의한; 기관 내, 비강 내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구 수단을 사용하여 투여될 수 있다. 비경구 투여로는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내 또는 근육 내 주사 또는 주입; 피하, 예를 들어 이식 장치에 의한 투여; 또는 두개 내, 예를 들어 뇌실질 내(intraparenchymal), 경막 내 또는 심실 내 투여를 들 수 있다. AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 또한 표적 조직에 직접, 예를 들어 간에 직접, 신장에 직접 등으로 전달될 수 있다. 세포로 "AGT dsRNA 제제를 전달하는 것" 또는 "AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달하는 것"은 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 각각 전달하고, 세포에서 직접 AGT dsRNA 제제를 발현하는 것 뿐만 아니라, 세포로 전달된 암호화 벡터로부터 AGT dsRNA 제제를 발현하는 것을 포함하거나, AGT dsRNA 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 세포에 존재하도록 하는 임의의 적합한 수단을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 저해용 RNA를 전달하기 위한 제형 및 수단의 제조 및 사용은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며 일상적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "약학 조성물"은 본 발명의 약리학적 유효량의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. "약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는 치료제를 투여하기 위해 사용되는 담체를 지칭한다. 이 같은 담체로는 식염수, 완충 식염수, 글루코오스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 용어는 구체적으로 세포 배양 배지를 제외한다. 경구 투여된 약물의 경우, 약학적으로 허용 가능한 담체로는 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제와 같은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 불활성 희석제로는 탄산나트륨 및 탄산칼슘, 인산나트륨 및 인산칼슘, 락토오스를 들 수 있는 반면, 옥수수 전분 및 알긴산이 적합한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있는 반면, 윤활제는 존재하는 경우 일반적으로 스테아린산마그네슘, 스테아르산 또는 활석이다. 필요한 경우, 위장관에서 흡수를 지연시키기 위해 정제를 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질로 코팅할 수 있다. 약학적 제형에 포함되는 제제는 하기에 추가로 기재되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약리학적 유효량", "치료적 유효량" 및 "유효량"과 같은 용어는 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 주어진 임상 치료가 질병 또는 장애와 연관된 측정 가능한 매개변수를 적어도 10% 감소시키는 경우에 효과적인 것으로 간주되면, 이러한 질병 또는 병태를 치료하기 위해 사용되는 약물의 치료적 유효량은 이러한 매개변수를 적어도 10% 감소시키기 위해 필요한 양이다. 예를 들어, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 치료적 유효량은 AGT 폴리펩티드 수준을 적어도 10% 감소시킬 수 있다. 약학 조성물은 표 1에 나타나 있는 AD00051 내지 AD00122-19-2, AD00163-3, AV01227 내지 AVAV01257 및 AV01711과 같은 듀플렉스를 포함하는 dsRNAi 제제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바람직한 dsRNAi 제제는, 예를 들어 AD00158, AD00163, AD00159, AD00290, AD00300 또는 AD00122 듀플렉스를 포함한다. 기타 실시형태에서, 바람직한 dsRNAi 제제는, 예를 들어 AD00158-1, AD00158-2, AD00163-1, AD00159-1 또는 AD00300-1을 포함한다. 일부 기타 실시형태에서, 이 같은 dsRNAi 제제는 듀플렉스 변이체, 예를 들어 AD00158, AD00163, AD00163-3, AD00159, AD00290, AD00300 또는 AD00122 듀플렉스의 변이체를 포함한다.
유효량
일부 양태에서, 본 발명의 방법은 세포를 유효량의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 접촉시켜 접촉한 세포에서 AGT 유전자 발현을 감소시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법의 특정 실시형태는 개체에게 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 개체에서 AGT 유전자 발현을 감소시키고 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다. AGT의 발현을 감소시키고/시키거나 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료할 목적으로 사용되는 "유효량"은 목적하는 생물학적 효과를 구현하는 데 필요하거나 충분한 양이다. 예를 들어, AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하기 위한 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 (i) 질병 또는 병태의 진행을 늦추거나 중단하거나; (ii) 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 반전, 감소 또는 제거하는 데 필요한 양일 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 유효량은 AGT-연관 질병 또는 병태의 치료를 필요로 하는 개체에 투여되는 경우에 질병 또는 병태를 예방 및/또는 치료하는 치료 반응을 초래하는 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양이다. 본 발명의 일부 양태에 따르면, 유효량은 AGT-연관 질병 또는 병태에 대한 다른 치료와 조합 또는 동시 투여되는 경우에 질병 또는 병태를 예방 및/또는 치료하는 치료 반응을 초래하는 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 이용하여 개체를 치료하는 생물학적 효과는 AGT-연관 질병 또는 병태로 인해 야기된 증상의 개선 및/또는 완전 제거일 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 생물학적 효과는, 예를 들어 개체가 AGT-연관 질병 또는 병태가 없다는 것을 나타내는 진단 시험에 의해 입증되는 바와 같이, AGT-연관 질병 또는 병태가 완전히 사라지는 것이다. 검출 가능한 생리학적 증상의 비제한적인 예로는 본 발명의 제제 투여 후 개체의 간에서의 지질 축적의 감소를 들 수 있다. AGT-연관 질병 또는 병태의 상태를 평가하는, 당해 기술분야에 알려져 있는 기타 수단은 본 발명의 제제 및/또는 방법이 AGT-연관 질병 또는 병태에 미치는 효과를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하는 수준까지 AGT 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 대조 개체군 대비 시험 개체군에 대한 맹검 연구에서 유효 투여량이 확립된 임상 시험에서 전형적으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 유효량은 질병 또는 병태를 앓고 있는 세포, 조직 및/또는 개체에서의 AGT-연관 질병 또는 병태의 감소와 같은 목적하는 반응을 초래하는 양이다. 따라서, AGT 폴리펩티드 활성을 감소시킴으로써 치료 가능한 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하기 위한 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 투여된 경우에 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 투여 없이 세포, 조직 및/또는 개체에 존재할 수 있는 양 미만까지 개체에서 AGT 폴리펩티드 활성의 양을 감소시키는 양일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제에 노출되지 않거나 이를 투여하지 않은 세포, 조직 및/또는 개체에 존재하는 AGT 폴리펩티드 활성 및/또는 AGT 유전자 발현 수준은 "대조군" 양으로서 지칭된다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 개체에 대한 대조군 양은 개체에 대한 치료 전 양이며, 즉 AGT 제제의 투여 이전의 개체에서의 수준은 개체의 대조군 수준일 수 있으며, 개체에 대한 siRNA 투여 이후 개체에서의 AGT 폴리펩티드 활성 및/또는 AGT 유전자 발현 수준과의 비교를 위해 사용될 수 있다. AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하는 경우, 목적하는 반응은 세포, 조직 및/또는 개체에서 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 감소 또는 제거하는 것일 수 있다. 감소 또는 제거는 일시적일 수 있거나 영구적일 수 있다. AGT 폴리펩티드 활성, AGT 유전자 발현, 증상 평가, 임상 시험 등을 결정하는 방법을 사용하여 AGT-연관 질병 또는 병태의 상태를 모니터링할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 일부 양태에서, AGT-연관 질병 또는 병태의 치료에 대한 목적하는 반응은 질병 또는 병태의 발병을 지연시키거나 심지어 발병을 예방하는 것이다.
또한, AGT 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 화합물의 유효량은 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 투여가 세포 또는 개체에 미치는 생리적 효과, 예를 들어 투여 후 AGT-연관 질병 또는 병태의 감소를 평가함으로써 결정될 수 있다. 개체에서의 검정 및/또는 증상 모니터링은 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제(본 발명의 약학적 화합물로 투여될 수 있음)의 효능을 결정하고, 치료에 대한 반응이 존재하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 당해 기술분야에 알려져 있는 하나 이상의 혈압 검사이다. 다른 비제한적인 예는, 개체를 본 발명의 AGT dsRNA 제제로 치료하기 전과 후에 당해 기술분야에 알려져 있는 하나 이상의 혈압 검사가 개체의 AGT-연관 장애의 상태를 결정하기 위해 사용될 수 있다는 것이다. 다른 비제한적인 예에서, 혈압 수준을 낮추기 위해 당해 기술분야에 알려져 있는 하나 이상의 검사는 개체에서 AGT-연관 질병의 상태를 결정하기 위해 사용된다. 이러한 예에서, 질병은 고혈압을 포함하며, 이 검사는 본 발명의 AGT dsRNA 제제로 개체를 치료하기 전과 후에 개체에서 혈압 수준의 감소를 결정하기 위해 사용된다.
본 발명의 일부 실시형태는 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 하나 이상의 "생리학적 특징"을 평가 및/또는 모니터링함으로써 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하기 위해 개체에게 투여되는 본 발명의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효능을 결정하는 방법을 포함한다. AGT-연관 질병 또는 병태의 생리학적 특징의 비제한적인 예로는 개체에서의 혈청 AGT 수준, 평균 혈압 및 이완기 혈압이 있다. 이 같은 생리학적 특징을 결정하기 위한 표준 방법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 혈액 검사, 영상 연구, 신체 검사 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
개체에 투여된 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양은 적어도 부분적으로 개체에 의해 결정된 질병 및/또는 병태 상태 및/또는 생리적 특징에 기초하여 수정될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 치료량은 AGT-dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양을 증가 또는 감소시키기 위해, 예를 들어 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 투여되는 조성물을 변경함으로써, 투여 경로를 변경함으로써, 투여 시기 등을 변경함으로써 변경될 수 있다. AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 치료 중인 특정 병태, 치료 개체의 나이 및 의학적 상태; 병태의 중증도, 치료 기간, 동시 치료의 특성(존재하는 경우), 특정 투여 경로, 및 보건 의료인의 지식 및 전문성 내의 기타 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 유효량은 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 AGT 폴리펩티드 활성 및/또는 AGT 유전자 발현의 목적하는 수준에 따라 달라질 수 있다. 당업자라면 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 특정한 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량을 과도한 실험 없이도 경험적으로 결정할 수 있다. 본원에 제공된 교시와 함께, 본 발명의 다양한 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 중에서 선택하고, 효능, 상대적 생체 이용률, 환자 체중, 유해 부작용의 심각성 및 바람직한 투여 방식과 같은 인자를 평가함으로써, 특정 개체를 효과적으로 치료하는 데 효과적인 예방적 또는 치료적 치료 용법을 고안하는 것이 가능하다. 본 발명의 실시형태에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 유효량은 세포와 접촉하는 경우에 세포에서 목적하는 생물학적 효과를 생성하는 양일 수 있다.
AGT 유전자 침묵은 AGT를 발현하는 임의의 세포에서 구성적으로 수행되거나 게놈 공학에 의해 수행될 수 있고, 임의의 적절한 검정에 의해 결정될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT 유전자 발현은 본 발명의 AGT dsRNA 제제를 투여함으로써 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT 유전자 발현은 본 발명의 AGT dsRNA 제제를 투여함으로써 5% 내지 10%, 5% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 75%, 25% 내지 75%, 25% 내지 100% 또는 50% 내지 100% 감소된다.
투약
AGT dsRNA 제제 및 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 약학 조성물 내에서 AGT 유전자의 발현을 저해하기에 충분한 용량으로 전달된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 투여량은 투여 대상의 체중의 킬로그램 당 1일 0.01 내지 200.0 ㎎이며, 전형적으로 1일 1 내지 50 ㎎/㎏ 체중, 5 내지 40 ㎎/㎏ 체중, 10 내지 30 ㎎/㎏ 체중, 1 내지 20 ㎎/㎏ 체중, 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중, 또는 4 내지 15 ㎎/㎏ 체중(경계값 포함)이다. 예를 들어, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 각각의 단일 투여는 약 0.01 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 0.2 ㎎/㎏, 0.3 ㎎/㎏, 0.4 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 1.1 ㎎/㎏, 1.2 ㎎/㎏, 1.3 ㎎/㎏, 1.4 ㎎/㎏, 1.5 ㎎/㎏, 1.6 ㎎/㎏, 1.7 ㎎/㎏, 1.8 ㎎/㎏, 1.9 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 2.1 ㎎/㎏, 2.2 ㎎/㎏, 2.3 ㎎/㎏, 2.4 ㎎/㎏, 2.5 ㎎/㎏, 2.6 ㎎/㎏, 2.7 ㎎/㎏, 2.8 ㎎/㎏, 2.9 ㎎/㎏, 3.0 ㎎/㎏, 3.1 ㎎/㎏, 3.2 ㎎/㎏, 3.3 ㎎/㎏, 3.4 ㎎/㎏, 3.5 ㎎/㎏, 3.6 ㎎/㎏, 3.7 ㎎/㎏, 3.8 ㎎/㎏, 3.9 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏, 4.1 ㎎/㎏, 4.2 ㎎/㎏, 4.3 ㎎/㎏, 4.4 ㎎/㎏, 4.5 ㎎/㎏, 4.6 ㎎/㎏, 4.7 ㎎/㎏, 4.8 ㎎/㎏, 4.9 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 5.1 ㎎/㎏, 5.2 ㎎/㎏, 5.3 ㎎/㎏, 5.4 ㎎/㎏, 5.5 ㎎/㎏, 5.6 ㎎/㎏, 5.7 ㎎/㎏, 5.8 ㎎/㎏, 5.9 ㎎/㎏, 6 ㎎/㎏, 6.1 ㎎/㎏, 6.2 ㎎/㎏, 6.3 ㎎/㎏, 6.4 ㎎/㎏, 6.5 ㎎/㎏, 6.6 ㎎/㎏, 6.7 ㎎/㎏, 6.8 ㎎/㎏, 6.9 ㎎/㎏, 7 ㎎/㎏, 7.1 ㎎/㎏, 7.2 ㎎/㎏, 7.3 ㎎/㎏, 7.4 ㎎/㎏, 7.5 ㎎/㎏, 7.6 ㎎/㎏, 7.7 ㎎/㎏, 7.8 ㎎/㎏, 7.9 ㎎/㎏, 8 ㎎/㎏, 8.1 ㎎/㎏, 8.2 ㎎/㎏, 8.3 ㎎/㎏, 8.4 ㎎/㎏, 8.5 ㎎/㎏, 8.6 ㎎/㎏, 8.7 ㎎/㎏, 8.8 ㎎/㎏, 8.9 ㎎/㎏, 9 ㎎/㎏, 9.1 ㎎/㎏, 9.2 ㎎/㎏, 9.3 ㎎/㎏, 9.4 ㎎/㎏, 9.5 ㎎/㎏, 9.6 ㎎/㎏, 9.7 ㎎/㎏, 9.8 ㎎/㎏, 9.9 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 11 ㎎/㎏, 12 ㎎/㎏, 13 ㎎/㎏, 14 ㎎/㎏, 15 ㎎/㎏, 16 ㎎/㎏, 17 ㎎/㎏, 18 ㎎/㎏, 19 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 21 ㎎/㎏, 22 ㎎/㎏, 23 ㎎/㎏, 24 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏, 26 ㎎/㎏, 27 ㎎/㎏, 28 ㎎/㎏, 29 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 31 ㎎/㎏, 32 ㎎/㎏, 33 ㎎/㎏, 34 ㎎/㎏, 35 ㎎/㎏, 36 ㎎/㎏, 37 ㎎/㎏, 38 ㎎/㎏, 39 ㎎/㎏, 40 ㎎/㎏, 41 ㎎/㎏, 42 ㎎/㎏, 43 ㎎/㎏, 44 ㎎/㎏, 45 ㎎/㎏, 46 ㎎/㎏, 47 ㎎/㎏, 48 ㎎/㎏, 49 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏ 체중 범위의 투여량으로 투여된다.
다양한 인자는 본 발명의 AGT dsRNA 제제의 복용량 및 전달 시기를 결정하는 경우에 고려될 수 있다. 전달된 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 절대량은 동시 치료, 투여 횟수, 및 연령, 신체 상태, 크기 및 체중을 비롯한 개별 개체 매개변수를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 이들 인자는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 일상적인 실험에 의해 해결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 최대 투여량, 즉 건전한 의학적 판단에 따른 최고의 안전 용량이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 개체에게 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 이상의 투여량으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우, 약학적 화합물(예를 들어, AGT dsRNA 제제를 포함하거나 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함함)의 투여량은 개체에게 적어도 1일, 격일로, 매주, 격주로, 매월 등으로 투여될 수 있다. 투여량은 1일 1회 또는 1회 초과, 예를 들어 24시간 동안 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 1일 1회 투여될 수 있거나; AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 하루 내내 적절한 간격으로 2회, 3회 또는 그 이상의 하위 투여량으로 투여될 수 있거나, 심지어 제어 방출 제형을 통한 연속 주입 또는 전달을 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 매일 1회 이상, 매주 1회 이상, 매월 1회 이상, 또는 매년 1회 이상 투여된다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법은 약학적 화합물을 단독으로, 하나 이상의 기타 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 조합하여, 및/또는 AGT-연관 질병 또는 병태를 앓고 있는 개체에게 투여된 기타 약물 요법 또는 치료 활동 또는 용법과 조합하여 투여하는 단계를 포함한다. 약학적 화합물은 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 약학 조성물은 멸균될 수 있고, AGT 폴리펩티드의 활성을 개체에 대한 투여에 적합한 중량 또는 부피 단위로 목적하는 반응을 생성하기에 충분한 수준까지 감소시키는 양으로 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함한다. AGT 단백질 활성을 감소시키기 위해 개체에게 투여된 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는 약학 조성물의 복용량은 다양한 매개변수, 특히 사용된 투여 방식 및 개체의 상태에 따라 선택될 수 있다. 기타 인자로는 필요한 치료 기간을 들 수 있다. 초기 투여량에서의 개체의 반응이 불충분하면, 환자가 견딜 수 있는 한 더 높은 투여량이 투여될 수 있다(또는, 투여량은 보다 국부적인 상이한 전달 경로를 통해 효과적으로 증가될 수 있음).
치료
본원에서 사용된 바와 같이, AGT 유전자의 발현 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 질병, 장애 또는 이의 병태를 지칭하기 위해 사용되는 경우 "예방" 또는 "예방하다"란 용어는, 개체가 이 같은 질병, 장애 또는 병태와 연관된 증상, 예를 들어 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS)의 활성화에 의해 야기되거나 이와 연관된 증상(예를 들어, 고혈압)이 발생할 가능성이 적다는 것을 의미한다. 이 같은 상황에서, 고혈압이 발생할 가능성이 감소된다: 예를 들어, 개인이 고혈압에 대한 하나 이상의 위험 인자를 갖고 있지만 고혈압이 발생하지 않거나 덜 중증인 고혈압만이 발생한 경우, 질병, 장애 또는 병태가 발생하지 않는 경우, 또는 이 같은 질병, 장애 또는 병태와 연관된 증상의 발생이 본원에 기재된 바와 같이 치료를 받지 않거나 증상의 발현이 지연된, 동일한 위험 인자를 갖는 개체군 대비 (예를 들어, 수일, 수주, 수개월 또는 수년) 감소하는 경우(예를 들어, 임상 환경에서 질병 또는 병태에 대한 척도에서의 적어도 10% 감소), 예방은 효과적인 것으로 간주된다.
2회 이상의 방문 동안 올바르게 측정된 앉은 자세에서의 혈압 판독치의 평균에 기초하여, 정상 혈압의 개체는 약 90 내지 119 mmHg(약 12 내지 15.9 ㎪(kN/㎡))의 수축기 혈압 및 약 60 내지 79 mmHg(약 8.0 내지 10.5 ㎪(kN/㎡))의 이완기 혈압을 갖는다. 고혈압 전단계의 개체는 약 120 내지 139 mmHg(약 16.1 내지 18.5 ㎪(kN/㎡))의 수축기 혈압 및 약 60 내지 79 mmHg(약 8.0-10.5 ㎪(kN/㎡))의 이완기 혈압을 갖고; 고혈압(예를 들어, I기 고혈압)을 갖는 개체는 약 140 내지 159 mmHg(약 18.7 내지 21.2 ㎪(kN/㎡))의 수축기 혈압 및 약 90 내지 99 mmHg(약 12.0 내지 13.2 ㎪(kN/㎡))의 이완기 혈압을 갖고; 고혈압(예를 들어, II기 고혈압)을 갖는 개체는 약 160 mmHg 이상(약 21.3 ㎪(kN/㎡) 이상)의 수축기 혈압 및 약 100 mmHg 이상(약 13.3 ㎪(kN/㎡) 이상)의 이완기 혈압을 갖는다.
특정 실시형태에서, 안지오텐시노겐-관련 질병은 본태성 고혈압이다. "본태성 고혈압"은 환경 또는 유전 인자의 결과(예를 들어, 명백하고 근본적인 의학적 원인의 결과)이다.
특정 실시형태에서, 안지오텐시노겐-관련 질병은 이차성 고혈압이다. "이차성 고혈압"은 식별 가능한 기저 병태를 갖고, 신장, 혈관 및 내분비 원인을 포함한 다양한 병인, 예를 들어 신실질 질병(예를 들어, 다낭성 신장 질병, 사구체 또는 간질 질병), 신장 혈관 질환(예를 들어, 신장 동맥 협착증, 섬유근성 이형성증), 내분비 장애(예를 들어, 아드레노코르티코이드(adrenocorticoid) 또는 미네랄로코르티코이드(mineralocorticoid) 과량, 크롬친화 세포종(pheochromocytoma), 갑상선 기능 항진증 또는 갑상선 기능 저하증, 성장 호르몬 과량, 부갑상선 기능 항진증), 대동맥 협착 또는 경구 피임약의 사용을 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 안지오텐시노겐-관련 질병은 악성 고혈압 및 가속성 고혈압과 같은 고혈압 응급증이다. "가속성 고혈압"은 하나 이상의 종말 기관(end organ)의 직접적인 손상을 수반하는 혈압의 심각한 상승(즉, 180 mmHg 이상의 수축기 혈압 또는 110 mmHg 이상의 이완기 혈압)을 지칭한다. 추가의 장기 손상을 방지하기 위해 혈압을 즉시 낮추어야 한다. "악성 고혈압"은 하나 이상의 종말 기관에 대한 직접적인 손상 및 유두부종(papilledema)을 동반하는 심각하게 상승된 혈압(즉, 180 mmHg 이상의 수축기 혈압 또는 110 mmHg 이상의 이완기 혈압)을 지칭한다. 추가의 장기 손상을 방지하기 위해 혈압을 즉시 낮추어야 한다. 제어되지 않는 혈압으로 인한 신경 종말 기관의 손상은 고혈압성 뇌병증, 뇌혈관 발작/뇌경색, 지주막하 출혈 및/또는 두개 내 출혈을 포함할 수 있다. 심혈관 종말 기관의 손상은 심근 허혈/경색, 급성 좌심실 기능장애, 급성 폐부종 및/또는 대동맥 박리를 포함할 수 있다. 또한, 기타 기관계는 조절되지 않는 고혈압의 영향을 받을 수 있으며, 이는 급성 신부전/부전증, 망막병증, 자간증 또는 미세혈관병 용혈성 빈혈(microangiopathic hemolytic anemia)을 초래할 수 있다.
특정 실시형태에서, 안지오텐시노겐-관련 질병은 급성 고혈압이다. "급성 고혈압"은 하나 이상의 기관에 대한 직접적인 손상이 없는 혈압의 심각한 상승(즉, 180 mmHg 이상의 수축기 혈압 또는 110 mmHg 이상의 이완기 혈압)을 지칭한다. 혈압은 수 시간 이내에 안전하게 저하될 수 있다.
특정 실시형태에서, 안지오텐시노겐-관련 질병은 만성 임신성 고혈압, 임신성 고혈압, 전자간증, 자간증, 만성 고혈압과 겹친 전자간증, HELLP 증후군 및 임신-유도 고혈압(일과성 임신성 고혈압, 임신 후반기에 발견되는 만성 고혈압 및 임신-유도 고혈압(PIH)으로도 지칭됨)과 같은 임신-관련 고혈압이다. 만성 임신성 고혈압을 갖는 개체는 혈압이 임신 전 또는 임신 20주 전에 140/90 mmHg를 초과하는 개체이다. "임신성 고혈압" 또는 "임신-유도 고혈압"은 전자간증의 임의의 기타 특징 없이 임신 말기(20주 초과의 임신)에 발생하고, 출산 이후에 정상으로 되돌아가는 고혈압을 지칭한다. "경증 전자간증"은 임신 20주 이전의 정상 혈압의 여성에서 적어도 6시간의 간격으로 고혈압(140/90 mmHg 이상의 혈압)이 발생하지만 종말 기관 손상의 증거는 없는 2회 에피소드로서 정의된다. 기존의 본태성 고혈압을 갖는 개체에서, 수축기 혈압이 30 mmHg 증가하거나 이완기 혈압이 15 mmHg 증가하면 전자간증으로 진단된다. "중증 전자간증"은 전자간증의 하기 징후 또는 증상 중 하나가 존재하는 것으로 정의된다: 적어도 6시간 간격으로 160 mmHg 이상의 수축기 혈압 또는 110 mmHg 이상의 이완기 혈압의 2회 에피소드; 24시간 동안 수집된 5 g 이상의 단백뇨 또는 적어도 4시간 간격으로 수집된 2개의 무작위 소변 샘플에서 3+ 초과의 단백뇨; 폐부종 또는 청색증; 핍뇨증(oliguria; 24시간 이내에 400 ㎖ 미만); 지속적인 두통, 상복부 통증 및/또는 간 기능 장애; 혈소판 감소증(thrombocytopenia), 양수 과소증(oligohydramnios), 태아 성장 감소 또는 태반 조기 박리(placental abruption). "자간증"은 전자간증이 있는 여성에게서 기타 원인으로 기인할 수 없는 발작으로서 정의된다. "HELLP 증후군"(부종-단백뇨-고혈압 임신증 B형으로도 알려져 있음)은 임신한 개체의 용혈, 간 효소 수치 상승 및 혈소판 수치 감소를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 안지오텐시노겐-관련 질병은 저항성 고혈압이다. "저항성 고혈압"은 3개의 상이한 종류의 항고혈압 약물(이들 중 하나는 티아지드(thiazide) 이뇨제임)의 동시 사용에도 불구하고 목표치(예를 들어, 140/90 mmHg)보다 높게 유지되는 혈압을 지칭한다. 4개 이상의 약으로 혈압을 조절한 개체는 또한 저항성 고혈압을 갖는 것으로 간주된다.
AGT 폴리펩티드의 수준 및/또는 활성의 감소가 질병 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 AGT 관련 질환 및 병태는 AGT 발현을 저해하기 위해 본 발명의 방법 및 AGT dsRNA 제제를 사용하여 치료될 수 있다. 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 및 본 발명의 치료 방법으로 치료될 수 있는 질병 및 병태의 예로는 고혈압 질병, 고혈압, 경계선 고혈압, 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 고립성 수축기 또는 이완기 고혈압, 임신-연관 고혈압, 당뇨성 고혈압, 저항성 고혈압, 치료 불응성 고혈압, 발작성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 골드블랫 고혈압, 안구 고혈압, 녹내장, 폐 고혈압, 문맥 고혈압, 전신성 정맥 고혈압, 수축기 고혈압, 불안정 고혈압, 고혈압성 심장 질병, 고혈압성 신장병증, 죽상경화증, 동맥 경화증, 혈관 질병, 당뇨성 신장병증, 당뇨성 망막증, 만성 심부전, 심근병증, 당뇨성 심근병증, 사구체 경화증, 대동맥 협착증, 대동맥류, 심실 섬유증, 심부전, 심근 경색, 협심증, 뇌졸중, 신장 질병, 신부전, 전신성 경화증, 자궁 내 성장 지연(IUGR) 및 태아 성장 제한을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이 같은 질병 및 병태는 본원에서 "AGT-연관 질병 및 병태" 및 "AGT에 의해 야기 및/또는 조절되는 질병 및 병태"로서 지칭될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 AGT-연관 질병 또는 병태의 진단 이전 또는 이후에 개체에게 1회 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 개체는 AGT-연관 질병 또는 병태를 앓고 있거나 발생할 위험성이 있다. AGT-연관 질병 또는 병태가 발생할 위험성이 있는 개체는 AGT-연관 질병 또는 병태가 발생할 대조군 위험성과 비교하여 AGT-연관 질병 또는 병태가 발생할 가능성이 증가한 개체이다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 위험성 수준은 대조군 위험성 수준과 비교하여 통계적으로 유의하다. 위험성이 있는 개체는, 예를 들어 개체를 기존의 질병 또는 유전적 기형이 없는 대조군 개체보다 AGT-연관 질병 또는 병태가 발생하기 보다 쉽게 만드는 기존의 질병 및/또는 유전적 기형을 갖는 개체이거나 개체일 수 있는 개체; AGT-연관 질병 또는 병태의 가족 및/또는 개인 이력을 갖는 개체; 및 이전에 AGT-연관 질병 또는 병태에 대해 치료를 받은 적이 있는 개체를 포함할 수 있다. 개체를 AGT-연관 질병 또는 병태에 보다 취약하게 만드는 기존의 질병 및/또는 유전적 기형은 존재하는 경우 AGT-연관 질병 또는 병태의 보다 높은 발생 가능성과 연관이 있는 것으로 이전에 결정된 질병 또는 유전적 기형일 수 있다는 것이 이해될 것이다.
AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 개별 개체의 의학적 상태에 기초하여 개체에게 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 개체에게 제공되는 건강 관리는 개체에서 수득된 샘플에서 측정된 AGT 수준을 평가할 수 있고, 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여함으로써 개체의 AGT 수준을 감소시키는 것이 바람직하다는 것을 결정할 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 혈액 또는 혈청 샘플과 같은 생물학적 샘플은 개체로부터 수득될 수 있으며, 개체의 AGT 수준은 샘플에서 결정될 수 있다. 개체에게 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여하고, 투여 이후에 개체로부터 혈액 또는 혈청 샘플을 수득하고, 샘플을 사용하여 AGT 수준을 결정하고, 그 결과를 개체의 투여 전(이전) 샘플과 비교한다. 투여 전 수준과 비교하여 후속 샘플에서의 개체의 AGT 수준의 감소는 개체의 AGT 수준을 감소시키는 데 있어 투여된 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효능을 나타낸다. 하나의 비제한적인 예에서, 개체가 본원에 개시된 같은 AGT-연관 장애로 진단받지 않은 경우에도 혈압은 AGT-연관 장애의 생리학적 특성으로 간주될 수 있다. 의료 제공자는 본 발명의 투여된 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효능의 척도로서 개체의 혈압 변화를 모니터링할 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시형태는 개체에서의 AGT-연관 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리학적 특징의 변화에 대한 평가에 적어도 부분적으로 기초하여 개체에게 본 발명의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여하는 것을 포함하는 치료를 수정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시형태에서, 개체에게 투여된 본 발명의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효과를 결정하고, 개체에게 후속적으로 투여된 본 발명의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양을 조절하는 데 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 본 발명의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 개체에게 투여되고, 개체의 혈압은 투여 이후에 결정되고, 결정된 수준에 적어도 부분적으로 기초하여 개체의 혈압을 낮추거나 추가로 낮추는 것과 같은 투여된 제제의 생리학적 효과를 향상시키기 위해 더 많은 양의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 필요한지 여부가 결정된다. 다른 비제한적인 예에서, 본 발명의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 개체에게 투여되고, 개체의 혈압은 투여 이후에 결정되고, 결정된 수준에 적어도 부분적으로 기초하여 보다 적은 양의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여하는 것이 예상된다.
따라서, 본 발명의 일부 실시형태는 개체에게 후속적으로 투여된 본 발명의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 양을 조정하기 위해 개체의 선행 치료에서 얻은 하나 이상의 생리학적 특징의 변화를 평가하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태는 AGT-연관 질병 또는 병태의 생리학적 특징을 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상의 횟수로 결정하는 단계; 본 발명의 투여된 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 효능을 평가 및/또는 모니터링하는 단계; 및 선택적으로 결정된 결과를 사용하여 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하기 위한 본 발명의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 복용량, 투여 용법 및 투여 빈도 중 하나 이상을 조절하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, 개체에게 본 발명의 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 유효량으로 투여한 목적하는 결과는 개체에 대해 결정된 이전 혈압과 비교하여 개체의 혈압이 감소한 것이거나, 정상 혈압 범위 내의 혈압이다.
본원에서 사용된 바와 같이, AGT-연관 질병 또는 병태를 참고하여 사용하는 경우 "치료", "치료적" 또는 "치료된"이란 용어는 개체가 AGT-연관 질병 또는 병태가 발생할 가능성을 감소시키는 예방적 치료를 지칭할 수 있으며, 또한 개체에서 AGT 폴리펩티드 활성을 감소시키기 위한 용법의 부재 하의 개체와 비교할 때 AGT-연관 질병 또는 병태의 수준을 제거 또는 감소시키고/시키거나, AGT-연관 질병 또는 병태가 보다 심해지는 것을 예방하고/하거나, 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 진행을 지연시키기 위해 개체에 AGT-연관 질병 또는 병태가 발생한 이후의 치료를 지칭할 수 있다.
본 발명의 제제, 조성물 및 방법의 특정 실시형태는 AGT 유전자 발현을 저해하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, AGT 유전자의 발현과 관련하여 "억제하다", "침묵시키다", "감소시키다", "하향 조절하다" 및 "녹다운(knockdown)시키다"라는 용어는, 예를 들어 하기 중 하나로 AGT 유전자의 발현을 변경하는 것을 지칭한다: 유전자로부터 전사된 RNA의 수준, 발현된 AGT의 활성 수준, 및 AGT 유전자가 전사된 세포, 세포 그룹, 조직, 기관 또는 개체에서 mRNA로부터 번역된 AGT 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 하위 단위의 수준은, AGT 유전자로부터 전사된 RNA의 대조군 수준, 발현된 AGT의 활성 수준 또는 mRNA로부터 번역된 AGT의 수준과 각각 비교할 때 세포, 세포 그룹, 조직, 기관 또는 개체가 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제에 노출(예를 들어, 이들로 치료)되는 경우에 감소된다. 일부 실시형태에서, 대조군 수준은 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제에 노출(예를 들어, 이들로 치료)되지 않은 세포, 조직, 기관 또는 개체에서의 수준이다.
투여 방법
AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 다양한 투여 경로가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 특정한 전달 방식의 선택은 적어도 부분적으로 치료 중인 특정 상태 및 치료 효능에 필요한 복용량에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 의학적으로 허용 가능한 임의의 투여 방식을 사용하여 실시될 수 있으며, 이는 임상적으로 허용 불가능한 부작용을 야기하지 않으면서 AGT-연관 질병 또는 병태에 대한 효과적인 치료 수준을 생성하는 임의의 방식을 의미한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 경구, 장내, 점막, 피하 및/또는 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다. "비경구"란 용어는 피하, 정맥 내, 경막 내, 근육 내, 복강 내 및 흉골 내 주사 또는 주입 기법을 포함한다. 기타 경로는 비강(예를 들어, 위비강관(gastronasal tube)을 통해), 경피, 질, 직장, 설하 및 흡입을 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 전달 경로는 경막 내, 뇌실 내 또는 두 개 내를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 서방형 매트릭스에 배치될 수 있고, 매트릭스를 개체에 배치함으로써 투여될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 특정 세포 또는 소기관을 표적화하는 전달제로 코팅된 나노입자를 사용하여 개체의 세포로 전달될 수 있다. 다양한 전달 방식, 방법 및 시약은 당해 기술분야에 알려져 있다. 전달 방법 및 전달제의 비제한적인 예는 본원의 다른 부분에서 제공된다. 본 발명의 일부 양태에서, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제에 관한 "전달"이란 용어는 하나 이상의 "네이키드" AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 서열을 세포 또는 개체로 전달하는 것을 지칭할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, "전달"은 형질 감염에 의해 세포 또는 개체에게 투여하는 것, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 포함하는 세포를 개체로 전달하는 것, 또는 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 암호화는 벡터를 세포 및/또는 개체로 전달하는 것 등을 의미한다. 형질 감염을 이용한 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 전달은 벡터를 세포 및/또는 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 방법에서, 하나 이상의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 제제의 형태로 또는 약학적으로 허용 가능한 용액으로 투여될 수 있으며, 이는 전형적으로 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 보조제 및 선택적으로 기타 치료 성분을 약학적으로 허용 가능한 농도로 함유할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 동시 투여를 위한 다른 치료제와 함께 제형화될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 전형적으로, 약학적 조성물은 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 약학적으로 허용 가능한 담체는 유효 성분의 생물학적 활성의 유효성(예를 들어, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제가 세포 또는 개체에서 AGT 유전자 발현을 저해하는 능력)을 방해하지 않는 무독성 물질을 지칭한다. 치료용으로 dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여 및 전달하는 다양한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 및 당해 기술분야에 알려져 있는 기타 물질을 포함한다. 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 미국 특허 제5,211,657호에 기재되어 있으며, 기타 담체는 당업자에게 알려져 있다. 이 같은 제제는 일반적으로 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체 및 선택적으로 기타 치료제를 함유할 수 있다. 의약으로 사용되는 경우, 염은 약학적으로 허용 가능해야 하지만, 약학적으로 허용 불가능한 염도 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하기 위해 편리하게 사용될 수 있고, 본 발명의 범주에서 제외되지 않는다. 이 같은 약리학적 및 약학적으로 허용 가능한 염으로는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등과 같은 산으로부터 제조된 염을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 약학적으로 허용 가능한 염은 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로서 제조될 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태는 하나 이상의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 조직에 직접 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화합물이 투여되는 조직은 AGT-연관 질병 또는 병태가 존재하거나 발생할 가능성이 있는 조직이며, 이의 비제한적인 예는 간 또는 신장이다. 직접적인 조직 약물 전달은 직접 주사 또는 기타 수단에 의해 구현될 수 있다. 경구 전달된 많은 화합물은 자연적으로 간 및 신장 내로 들어가고 이를 통과하며, 본 발명의 치료 방법의 일부 실시형태는 개체에게 하나 이상의 AGT dsRNA 제제를 경구 투여하는 단계를 포함한다. AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 단독으로 또는 기타 치료제와 조합하여 1회 투여될 수 있거나, 다수회 투여될 수 있다. 다수회 투여되는 경우, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제한하려는 의도는 아니지만, 최초(또는 처음 여러 번) 투여는 피하로 투여될 수 있고, 1회 이상의 추가적인 투여는 경구 및/또는 전신 투여일 수 있다.
AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전신 투여하는 것이 바람직한 본 발명의 실시형태에 있어서, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사 가능한 제제는 보존제가 첨가되거나 첨가되지 않은 앰플 또는 다수회 용량 용기와 같은 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. AGT dsRNA 제제 제형(약학 조성물로도 알려져 있음)는 유성 또는 수성 담체 중 현탁액, 용액 또는 유화액의 형태를 취할 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형으로는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 들 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 담체로는 물, 알코올성 용액/수용액, 유화액 또는 현탁액(식염수 및 완충 매질을 포함함)을 들 수 있다. 비경구 담체로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스 용액, 덱스트로오스 및 염화나트륨 용액, 젖산화 링거액 또는 고정유를 들 수 있다. 정맥 내 부형제로는 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예를 들어, 링거 덱스트로오스 용액에 기반을 둔 보충제) 등을 들 수 있다. 항균제, 산화 방지제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제도 존재할 수 있다. 정맥 내 투여와 같은 기타 투여 형태는 투여량 저하를 초래할 것이다. 초기 투여량에서 개체의 반응이 부적절할 경우, 환자 순응도(tolerance)가 허용하는 정도로 더 높은 투여량을 투여할 수 있다(또는, 보다 국소화된 상이한 전달 경로를 통해 투여량을 효과적으로 증가시킬 수 있음). 하나 이상의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 적절한 전신 또는 국소 수준을 구현하고 AGT 단백질 활성의 적절한 감소를 구현하기 위해 필요에 따라 1일 다중 투여량을 사용할 수 있다.
기타 실시형태에서, 본 발명의 방법은 생체 적합성 마이크로입자, 나노입자, 또는 개체와 같은 투여 대상에게 이식하기에 적합한 임플란트와 같은 전달 담체의 사용을 포함한다. 이러한 방법에 따라 사용될 수 있는 예시적인 생분해성 임플란트는 생물학적 거대분자를 포함시키기 위한 생체 적합성의 생분해성 매트릭스가 기재되어 있는 PCT 공개공보 WO 95/24929(본원에서 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
비생분해성 및 생분해성 중합체 매트릭스 둘 모두는 하나 이상의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 개체로 전달하기 위해 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 매트릭스는 생분해성일 수 있다. 매트릭스 중합체는 천연 또는 합성 중합체일 수 있다. 중합체는 방출이 요구되는 기간, 전형적으로 대략 수 시간 내지 1년 이상을 기준으로 선택될 수 있다. 전형적으로, 수 시간 내지 3 내지 12개월 범위의 기간에 걸친 방출은 가능하다. 중합체는 선택적으로 하이드로겔 형태이며, 이는 물에서 이의 중량의 약 90%까지 흡수할 수 있으며, 선택적으로 다가 이온 또는 기타 중합체와 추가로 가교 결합된다.
전형적으로, AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제는 본 발명의 일부 실시형태에서 생분해성 임플란트를 사용하여 확산에 의해 또는 중합체 매트릭스의 분해에 의해 전달될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적인 합성 중합체는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 생분해성 중합체 및 비생분해성 중합체는 당해 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 생체 침식성 하이드로겔(문헌[H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587])과 같은 생체 접착성 중합체는 또한 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하기 위한 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 기타 적합한 전달 시스템은 정시 방출, 지연 방출 또는 서방형 전달 시스템을 포함할 수 있다. 이 같은 시스템은 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 반복 투여를 방지하여 개체 및 의료 전문가의 편의성을 개선시킬 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 이용 가능하며, 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,075,109호, 제4,452,775호, 제4,675,189호, 제5,736,152호, 제3,854,480호, 제5,133,974호 및 제5,407,686호 참조). 또한, 펌프-기반 하드웨어 전달 시스템이 이용 가능하며, 이들 중 일부는 이식용으로도 적합하다.
장기 서방형 임플란트의 사용은 개체의 예방적 치료에 적합할 수 있고, 재발성 AGT-연관 질병 또는 병태가 발생할 위험성이 있는 개체에게 적합할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 장기 방출은 적어도 최고 10일, 20일, 30일, 60일, 90일, 6개월, 1년 또는 그 이상 동안 치료 수준의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 전달하도록 구성 및 배열된 임플란트를 지칭한다. 장기 서방형 임플란트는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 상기에 기재된 방출 시스템 중 일부를 포함한다.
AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제의 치료용 제형은 목적하는 순도를 갖는 분자 또는 화합물을 선택적인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제[Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition (2006)]와 동결 건조된 제형 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 저장용으로 제조되고 사용될 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이의 이용된 투여량 및 농도가 투여 대상에게 비독성인 것으로, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화 방지제; 보존제(예를 들어, 스테아릴디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부탄올 및 벤질 알코올, 또는 메틸 또는 프로필파라벤과 같은 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예를 들어, 아연-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
세포, 개체 및 대조군
본 발명의 방법은 세포, 조직, 기관 및/또는 개체와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 개체는 인간 또는 척추 포유류이며, 여기서 척추 포유류는 인간 또는 개, 고양이, 말, 소, 염소, 마우스, 래트 및 영장류(예를 들어, 원숭이)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는. 따라서, 본 발명은 인간 및 비인간 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 개체는 농장 동물, 동물원 동물, 가축 또는 비-가축 동물일 수 있고, 본 발명의 방법은 수의학적 예방 및 치료 용법에 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 개체는 인간이고, 본 발명의 방법은 인간 예방 및 치료 용법에 사용될 수 있다.
본 발명이 적용될 수 있는 개체의 비제한적인 예는 목적하는 것보다 높은 AGT 발현 및/또는 활성("상승된 AGT 발현 수준"으로도 지칭됨)과 연관된 질병 또는 병태로 진단받거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나, 이를 앓을 위험성이 있는 개체이다. 목적하는 것보다 높은 수준의 AGT 발현 및/또는 활성과 연관된 질병 및 병태의 비제한적인 예는 본원의 다른 부분에 기재되어 있다. 본 발명의 방법은 치료 시에 이러한 질병 또는 병태를 앓고 있는 것으로 진단받은 개체, 목적하는 것보다 높은 AGT 발현 및/또는 활성과 연관된 개체, 또는 목적하는 것보다 높은 수준의 AGT 발현 및/또는 활성과 연관된 질병 또는 병태에 대한 위험성이 있는 것으로 간주되는 개체에게 적용될 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 목적하는 것보다 높은 수준의 AGT 발현 및/또는 활성과 연관된 질병 또는 병태는 급성 질병 또는 병태이고; 본 발명의 특정 양태에서 목적하는 것보다 높은 수준의 AGT 발현 및/또는 활성과 연관된 질병 또는 병태는 만성 질병 또는 병태이다.
비제한적인 예에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제는 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 고혈압 응급증(예를 들어, 악성 고혈압 및 가속성 고혈압, 급성 고혈압, 임신-관련 고혈압 및 저항성 고혈압을 포함하는 고혈압으로 진단받은 환자에게 투여된다. 본 발명의 방법은 치료 시에 질병 또는 병태를 갖는 것으로 진단받았던 개체, 또는 질병 또는 병태가 발생할 위험성이 있거나 질병 또는 병태가 발생 중인 것으로 간주되는 개체에게 적용될 수 있다.
다른 비제한적인 예에서, 본 발명의 AGT dsRNA 제제는 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS)의 활성화에 의해 유발되거나 이와 연관된 질병 또는 장애, 또는 RAAS가 비활성화된 질병 또는 장애에 반응하는 이의 증상 또는 진행을 치료하기 위해 투여된다. "안지오텐시노겐-관련 질병"이란 용어는 AGT의 발현 감소로부터 이익을 얻는 질환, 장애 또는 병태를 포함한다. 이 같은 질병은 전형적으로 높은 혈압과 연관이 있다. 안지오텐시노겐-관련 질병의 비제한적인 예로는 고혈압, 예를 들어 경계선 고혈압(고혈압 전단계로도 알려져 있음), 본태성 고혈압(본태성 고혈압 또는 특발성 고혈압으로도 알려져 있음), 이차성 고혈압(비-특발성 고혈압으로도 지칭됨), 고립성 수축기 또는 이완기 고혈압, 임신-관련 고혈압(자아(ego), 전자간증, 자간증 및 임신 중독증(postpartum preeclampsia)), 당뇨성 고혈압, 저항성 고혈압, 치료 불응성 고혈압, 발작성 고혈압, 신혈관성 고혈압(신장성 고혈압으로도 지칭됨), 골드블랫 고혈압, 안구 고혈압, 녹내장, 폐 고혈압, 문맥 고혈압, 전신성 정맥 고혈압, 수축기 고혈압, 불안정 고혈압, 고혈압성 심장 질병, 고혈압성 신장병증, 죽상경화증, 동맥 경화증, 혈관 질병(말초 혈관 질병을 포함함), 당뇨성 신장병증, 당뇨성 망막증, 만성 심부전, 심근병증, 당뇨성 심근병증, 사구체 경화증, 대동맥 협착, 대동맥류, 심실 섬유증, 수면 무호흡증, 심부전(예를 들어, 좌심실 수축기 기능장애), 심근 경색, 협심증, 뇌졸중, 신장 질병(예를 들어, 만성 신장 질병 또는 당뇨성 신장병증, 선택적으로 임신 상황에서 발생), 신부전(예를 들어, 만성 신부전), 인지 장애(예를 들어, 알츠하이머병) 및 전신성 경화증(예를 들어, 경피성 신발증(scleroderma renal crisis))을 들 수 잇다. 특정 실시형태에서, AGT-연관 장애는 자궁 내 성장 지연(IUGR) 또는 태아 성장 제한을 포함한다.
본 발명의 방법이 적용될 수 있는 세포는 시험관 내, 생체 내, 및 생체 외 세포인 세포를 포함한다. 세포는 개체, 배양물 및/또는 현탁액 내에 있을 수 있거나, 기타 적합한 상태 또는 조건에 있을 수 있다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 세포는 간세포(liver cell, hepatocyte), 심장 세포, 췌장 세포, 심혈관 세포, 신장 세포 또는 기타 유형의 척추동물 세포(인간 및 비인간 포유류 세포를 포함함)일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 세포는 병든 세포인 것으로 알려지지 않은 건강한 정상 세포이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 간세포, 심장 세포, 췌장 세포, 심혈관 세포 및/또는 신장 세포에 적용된다. 본 발명의 특정 양태에서, 대조군 세포는 정상 세포이지만, 질병 또는 병태를 갖는 세포는 또한 특정 환경, 예를 들어 질병 또는 병태를 갖는 치료된 세포의 결과를 질병 또는 병태를 갖는 치료되지 않은 세포와 비교하는 경우에 대조군 세포로서 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, AGT 폴리펩티드 활성의 수준을 측정하고, AGT 폴리펩티드 활성의 대조군 수준과 비교할 수 있다. 대조군은 다양한 형태를 취할 수 있는 소정의 값일 수 있다. 이는 중앙값 또는 평균과 같은 단일 절단값(cutoff value)일 수 있다. 이는, 예를 들어 정상 수준의 AGT 폴리펩티드 및/또는 AGT 폴리펩티드 활성을 갖는 그룹 및 AGT 폴리펩티드의 수준 및/또는 AGT 폴리펩티드 활성이 증가된 그룹 내에서 비교 그룹에 기초하여 확립될 수 있다. 비교 그룹의 다른 비제한적인 예는 AGT-연관 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 진단을 갖는 개체군 대 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 진단을 갖지 않는 개체군일 수 있거나, 본 발명의 siRNA 치료가 투여된 개체의 그룹 대 본 발명의 siRNA 치료가 투여되지 않은 개체의 그룹일 수 있다. 전형적으로, 대조군은 겉보기에 건강한 정상 개인 또는 적절한 연령대의 겉보기에 건강한 세포에 기반을 둘 수 있다. 소정의 값 이외에, 본 발명에 따른 대조군은 실험 재료와 병행하여 시험된 재료의 샘플일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예로는 대조군 개체군 유래 샘플 또는 실험 샘플과 병행하여 시험하기 위한 제조로 생산되는 대조군 샘플을 들 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 대조군은 본 발명의 AGT dsRNA 제제에 노출되지 않았거나 이를 이용하여 치료되지 않은 세포 또는 개체를 포함할 수 있으며, 이 경우 AGT 폴리펩티드의 대조군 수준 및/또는 AGT 폴리펩티드 활성의 대조군 수준은 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제에 노출된 세포 또는 개체에서의 AGT 폴리펩티드의 수준 및/또는 AGT 폴리펩티드 활성의 수준과 비교될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 대조군 수준은 상이한 시점에 동일한 개체에 대해 결정된 AGT 폴리펩티드 수준이 비교되는 개체에 대해 결정된 AGT 폴리펩티드 수준일 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, AGT 수준은 본 발명의 AGT 치료를 받지 않은 개체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 결정된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플이다. 개체에서 수득된 샘플에서 결정된 AGT 폴리펩티드 수준은 개체에 대한 기준선 또는 대조군 값으로서 역할을 할 수 있다. 본 발명의 치료 방법에서 개체에게 AGT dsRNA 제제를 1회 이상 투여한 후, 하나 이상의 추가적인 혈청 샘플을 개체로부터 수득할 수 있고, 후속적인 하나 이상의 샘플 내의 AGT 폴리펩티드 수준을 개체의 대조군/기준선 수준과 비교할 수 있다. 이 같은 비교는 개체에서의 AGT-연관 질병 또는 병태의 발병, 진행 또는 퇴행을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 개체에게 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여한 후 동일한 개체로부터 수득된 수준보다 더 높은 개체로부터 수득된 기준선 샘플 내의 AGT 폴리펩티드의 수준은 AGT-연관 질병 또는 병태의 퇴행을 나타내며, AGT-연관 질병 또는 병태를 치료할 때 본 발명의 투여된 AGT dsRNA 제제의 효능을 나타낸다.
본 발명의 특정 양태에서, 개체에 결정된 AGT 폴리펩티드의 수준 및/또는 AGT 폴리펩티드 활성 수준 중 하나 이상은 동일한 개체에서 AGT 폴리펩티드 및/또는 AGT 활성 수준에 대한 추후 비교를 위한 대조군 값으로서 작용할 수 있어서 개체에서 "기준선" AGT 폴리펩티드 활성으로부터의 변화에 대한 평가를 가능케 할 수 있다. 따라서, 초기 수준이 개체에 대한 대조군 수준으로서 사용되는 경우, 초기 AGT 폴리펩티드 수준 및/또는 초기 AGT 폴리펩티드 활성 수준은 개체에서 AGT 폴리펩티드의 수준 및/또는 AGT 폴리펩티드 활성을 감소시키기 위한 본 발명의 방법 및 화합물의 능력을 나타내고/내거나 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 본 발명의 AGT dsRNA 제제 및/또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 개체에게 투여할 수 있다. 이 같은 dsRNAi 제제는, 예를 들어 표 1에 나타나 있는 AD00051 내지 AD00122-19-2, AD00163-3, AV01227 내지 AVAV01257 및 AV01711 듀플렉스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바람직한 dsRNAi 제제는, 예를 들어 AD00158, AD00163, AD00163-3, AD00159, AD00290, AD00300 또는 AD00122 듀플렉스를 포함한다. 기타 실시형태에서, 바람직한 dsRNAi 제제는, 예를 들어 AD00158-1, AD00158-2, AD00163-1, AD00159-1 또는 AD00300-1을 포함한다. 일부 기타 실시형태에서, 이 같은 dsRNAi 제제는 듀플렉스 변이체, 예를 들어 AD00158, AD00163, AD00163-3, AD00159, AD00290, AD00300 또는 AD00122 듀플렉스의 변이체를 포함한다. 본 발명의 투여 및 치료 효능은 이전 시점에 개체로부터 수득된 혈청 샘플 내의 AGT 폴리펩티드의 투여 전 수준, 또는 비-노출 대조군 수준(예를 들어, 대조군 혈청 샘플 내 AGT 폴리펩티드의 수준)과 비교하여 평가될 수 있다. 투여하고 치료하는 경우, 개체로부터 수득된 혈청 샘플 내 AGT 폴리펩티드의 수준은 적어도 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 감소된다. AGT 폴리펩티드의 수준 및 AGT 폴리펩티드의 활성 수준 둘 모두는 AGT 유전자의 발현 수준과 관련이 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 방법의 특정 실시형태는 AGT 유전자 발현을 저해하여 개체에서 AGT 폴리펩티드의 수준을 감소시키고 AGT 폴리펩티드의 활성 수준을 감소시키는 데 효과적인 양으로 본 발명의 AGT dsRNA 및/또는 AGT 안티센스 제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태는 하나 이상의 개체로부터 수득된 하나 이상의 생물학적 샘플에서 AGT 폴리펩티드의 존재, 부재 및/또는 양(본원에서 수준으로도 지칭됨)을 결정하는 것을 포함한다. 이러한 결정은 본 발명의 치료 방법의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 이전에 본 발명의 AGT dsRNA 제제 및/또는 AGT 안티센스 제제의 투여로 치료받은 개체로부터 수득된 생물학적 샘플 내에서 AGT 폴리펩티드의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이전 시점에 개체로부터 얻은 혈청 샘플 내 AGT 폴리펩티드의 투여 전 수준과 비교하거나 비-노출 대조군 수준(예를 들어, 대조군 혈청 샘플 내의 AGT 폴리펩티드 수준)과 비교하여 투여 및 치료 이후 혈청 샘플 내 AGT 폴리펩티드의 수준의 적어도 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 감소는 개체에게 제공된 치료 효능의 수준을 나타낸다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 개체에 대해 결정된 AGT-연관 질병 또는 병태의 생리학적 특징은 대조군 결과로서 사용될 수 있고, 상이한 시간에 동일한 개체의 생리학적 특징을 결정한 결과는 대조군 결과와 비교된다. 하나의 비제한적인 예에서, 혈압(및/또는 AGT 질병 또는 병태의 기타 생리학적 특징)은 본 발명의 AGT 치료를 전혀 투여받은 적이 없는 개체로부터 측정되며, 이는 개체에 대한 기준선 또는 대조군 값으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 방법에서 개체에게 AGT dsRNA 제제를 1회 이상 투여한 후, 혈압을 측정하고 개체의 대조군/기준선 수준과 각각 비교한다. 이 같은 비교는 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 발병, 진행 또는 퇴행을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 개체에게 본 발명의 AGT dsRNA 제제 또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 투여한 후 동일한 개체로부터 측정된 혈압보다 더 높은 개체로부터 수득된 기준선 혈압은 AGT-연관 질병 또는 장애의 퇴행을 나타내고, AGT-연관 질병 또는 병태를 치료할 때 본 발명의 AGT dsRNA 제제의 투여 효능을 입증한 것이다.
본 발명의 일부 양태에서, AGT-연관 질병 또는 장애의 하나 이상의 생리학적 특성에 대해 개체에 대해 결정된 값은 동일한 개체의 생리학적 특성의 추후 비교를 위한 대조군 값으로서 역할을 하여 개체의 "기준선" 생리학적 특징의 변화에 대한 평가를 가능케 할 수 있다. 따라서, 개인에서 초기 생리학적 프로파일을 수득하고, 이러한 개체에 대해 대조군으로서 측정된 초기 생리학적 프로파일을 측정하고, 본 발명의 방법 및 화합물을 사용하여 개인에서 AGT 폴리펩티드의 수준 및/또는 AGT 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 효과를 보여주고/주거나 결정하는 것이 가능하다. 본 발명의 방법을 사용하여 본 발명의 AGT dsRNA 제제 및/또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 개체에게 AGT 질병 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 투여 및 치료 효능은 AGT 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리학적 특징의 변화를 결정함으로써 평가될 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 개체의 혈압은 이전 시점에 개체로부터 수득된 혈압과 비교할 때 또는 비-노출 대조군 혈압과 비교하는 경우 개체의 혈압이 정상 범위 내에 있을 때까지 적어도 0.5 mmHg, 1 mmHg, 2 mmHg, 3 mmHg, 4 mmHg, 5 mmHg, 6 mmHg, 7 mmHg, 8 mmHg, 9 mmHg, 10 mmHg, 11 mmHg, 12 mmHg, 13 mmHg, 14 mmHg, 15 mmHg, 16 mmHg, 17 mmHg, 18 mmHg, 19 mmHg, 20 mmHg 또는 그 이상 감소된다.
본 발명의 일부 실시형태는 하기 방법을 사용하여 AGT-연관 질병 또는 병태의 생리학적 특성의 존재, 부재 및/또는 변화를 결정하는 것을 포함하며, 이때 이 방법은 (1) 개체의 혈압을 측정하는 단계; (2) 한 명 이상의 개체로부터 수득된 하나 이상의 생물학적 샘플의 생리학적 특성을 평가하는 단계; 또는 (3) 개체의 신체 검사 단계를 예로 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 결정은 본 발명의 치료 방법의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
키트
본 발명의 방법에서 사용된 하나 이상의 AGT dsRNA 제제 및/또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 및 이들에 대한 설명서를 포함하는 키트는 본 발명의 범주 내에 있다. 본 발명의 키트는 AGT-연관 질병 또는 병태를 치료하는 데 유용한 AGT dsRNA 제제, AGT 센스 폴리뉴클레오티드 및 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나 이상의 AGT dsRNA 제제, AGT 센스 폴리뉴클레오티드 및 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제를 함유하는 키트는 본 발명의 치료 방법에 사용하기 위해 제조될 수 있다. 본 발명의 키트의 성분은 수성 매질 또는 동결 건조된 형태로 포장될 수 있다. 본 발명의 키트는 그 내부에 하나 이상의 용기 수단 또는 일련의 용기 수단(예를 들어, 시험관, 바이알, 플라스크, 병, 주사기 등)을 담기 위해 분할된 담체를 포함할 수 있다. 제1 용기 수단 또는 일련의 용기 수단은 AGT dsRNA 제제 및/또는 AGT 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드 제제와 같은 하나 이상의 화합물을 함유할 수 있다. 제2 용기 수단 또는 일련의 용기 수단은 표적화제, 표지제 또는 전달제 등을 함유할 수 있으며, 이는 본 발명의 치료 방법의 실시형태에서 투여될 AGT dsRNA 및/또는 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드의 일부로서 그 내부에 포함될 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 일반적으로 서면 형식으로 제공되며, 키트에 의해 구현된 치료를 수행하고 이러한 치료에 기반을 둔 결정을 내리기 위한 지침을 제공할 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 구체적인 예 및 실시를 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범주를 제한하기 위한 것은 아니다. 본 발명이 다양한 조성물 및 방법에 적용 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1. RNAi 제제의 합성
상기 표 2 내지 표 4에 나타나 있는 AGT RNAi 제제 듀플렉스를 하기 일반 절차에 따라 합성하였다:
siRNA 센스 및 안티센스 가닥 서열을 포스포라미다이트 화학을 기반으로 하는 잘 확립된 고체상 합성 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드 합성기 상에서 합성하였다. 탈보호 단계, 축합 단계, 캡핑 단계, 및 각 뉴클레오티드의 첨가를 위한 산화 또는 황화 단계의 4단계 주기를 통해 올리고뉴클레오티드 사슬 증식을 달성하였다. 조절 공극 유리(CPG, 1,000 Å)로 만들어진 고체 지지체 상에서 합성을 수행하였다. 단량체 포스포르아미다이트는 상업적 공급원에서 구입하였다. GalNAc 리간드 클러스터(비제한적인 예로서 GLPA1 및 GLPA2)를 갖는 포스포라미다이트를 본원의 실시예 2 및 실시예 3의 절차에 따라 합성하였다. 시험관 내 스크리닝에 사용된 siRNA(표 2)의 경우, 합성을 2 μmol 규모로 수행하였다. 생체내 시험을 위한 siRNA(표 3 및 표 4)의 경우, 합성을 5 μmol 이상의 규모로 수행하였다. GalNAc 리간드(비제한적인 예로서 GLO-0)가 센스 가닥의 3'-단부에 부착된 경우, GalNAc 리간드가 부착된 CPG 고체 지지체를 사용하였다. GalNAc 리간드(비제한적인 예로서 GLS-1 또는 GLS-2)가 센스 가닥의 5'-단부에 부착된 경우, GalNAc 포스포라미다이트(비제한적인 예로서 GLPA1 또는 GLPA2)를 최종 커플링 반응에 사용하였다. 3% 디클로로메탄 중의 트리클로로아세트산(TCA)을 4,4'-디메톡시트리틸 보호기(DMT)의 탈보호용으로 사용하였다. 5-에틸티오-1H-테트라졸을 활성화제로서 사용하였다. THF/Py/H2O 중의 I2 및 피리딘/MeCN 중의 페닐아세틸 디설파이드(PADS)를 각각 산화 및 황화 반응에 사용하였다. 최종 고체상 합성 단계 이후, 고체 지지체-결합형 올리고머를 개열하고, 보호기를 1:1 부피의 40 중량의 메틸아민 수용액 및 28% 수산화암모늄 용액으로 처리하여 제거하였다. 시험관 내 스크리닝을 위한 siRNA를 합성하기 위해, 미정제 혼합물을 농축하였다. 잔류 고체를 1.0 M NaOAc 중에 용해하고, 빙냉된 EtOH를 첨가하여 단일 가닥 생성물을 나트륨 염으로서 침전시켰으며, 이를 추가 정제 없이 어닐링(annealing)에 사용하였다. 생체 내 시험를 위한 siRNA를 합성하기 위해, 미정제 단일 가닥 생성물을 이온쌍 형성 역상 HPLC(IP-RP-HPLC)에 의해 추가로 정제하였다. IP-RP-HPLC로부터 정제된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 1.0 M NaOAc에 용해하고 빙냉된 EtOH를 첨가하여 침전시킴으로써 나트륨 염으로 전환하였다. 센스 및 안티센스 가닥 올리고뉴클레오타이드를 물에서 등몰 상보성에 의해 어닐링하여 이중 가닥 siRNA 생성물을 형성하였으며, 이를 동결 건조하여 솜털 모양의 백색 고체를 수득하였다.
실시예 2. 중간체-A 및 중간체-B의 제조
하기 반응식 1에 나타나 있는 바와 같이, 시중에 판매 중인 갈락토사민 펜타아세테이트를 디클로로메탄(DCM) 중의 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(TMSOTf)로 처리하여 중간체-A를 합성하였다. 이에 이어서 Cbz-보호된 2-(2-아미노에톡시)에탄-1-올을 이용한 글리코실화를 수행하여 화합물 II를 얻었다. Cbz 보호기를 수소화에 의해 제거하여 트리플루오로아세테이트(TFA) 염으로서 중간체-A를 수득하였다. Cbz-보호된 2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에탄-1-올이 출발 물질로서 역할을 한다는 점을 제외하고, 중간체 B를 동일한 반응식에 기초하여 합성하였다.
[반응식 1]
100 ㎖의 1,2-디클로로에탄(DCE) 중의 화합물 I(20.0 g, 51.4 mmol)의 용액에 TMSOTf(17.1 g, 77.2 mmol)를 첨가하였다. 얻어진 반응 용액을 60℃에서 2시간 동안 교반한 후, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. Cbz-보호된 2-(2-아미노에톡시)에탄-1-올(13.5 g, 56.5 mmol)을 DCE(100 ㎖) 중에 용해하고, 4 Å 분말 분자체(10 g) 상에서 건조하고, N2 분위기 하에 0℃에서 상술한 반응 용액에 적가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 N2 분위기 하에 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 포화 NaHCO3(200 ㎖), 물(200 ㎖) 및 포화 염수(200 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 미정제 생성물을 얻었으며, 이를 2-메틸테트라히드로푸란/헵탄(5/3, v/v, 1.80 ℓ)으로 2시간 동안 분쇄하였다. 얻어진 혼합물을 여과하고, 건조하여 백색 고체로서 화합물 II(15.0 g, 수율: 50.3%)를 수득하였다.
10% Pd/C(1.50 g)를 아르곤으로 퍼징된 건식 수소화 플라스크에 조심스럽게 첨가한 후, 10 ㎖의 테트라히드로푸란(THF)을 첨가하고, 이어서 THF(300 ㎖) 중의 화합물 II(15.0 g, 26.4 mmol) 및 TFA(트리플루오로아세트산, 3.00 g, 26.4 mmol)의 용액을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 탈기하고, H2로 3회 퍼징하고, H2(45 psi) 분위기 하에 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 박층 크로마토그래피(TLC, 용매: DCM:MeOH = 10:1)에 따르면 화합물 II이 완전히 소비되는 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 무수 DCM(500 ㎖) 중에 용해하고 농축하였다. 이러한 과정을 3회 반복하여 포말형 백색 고체로서 중간체-A(14.0 g, 수율: 96.5%)를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz DMSO-d 6 ): δ ppm 7.90 (d, J = 9.29 Hz, 1 H), 7.78 (br s, 3 H), 5.23 (d, J = 3.26 Hz, 1 H), 4.98 (dd, J = 11.29, 3.26 Hz, 1 H), 4.56 (d, J = 8.53 Hz, 1 H), 3.98-4.07 (m, 3 H), 3.79-3.93 (m, 2 H), 3.55-3.66 (m, 5 H), 2.98 (br d, J = 4.77 Hz, 2 H), 2.11 (s, 3 H), 2.00 (s, 3 H), 1.90 (s, 3 H), 1.76 (s, 3 H).
중간체-A의 합성과 유사한 절차를 사용하여 중간체-B를 합성하였다. 1H NMR (400 MHz DMSO-d 6 ): δ ppm 7.90 (br d, J = 9.03 Hz, 4 H), 5.21 (d, J = 3.51 Hz, 1 H), 4.97 (dd, J = 11.1 Hz, 1 H), 4.54 (d, J = 8.53 Hz, 1 H), 3.98-4.06 (m, 3 H), 3.88 (dt, J = 10.9 Hz, 1 H), 3.76-3.83 (m, 1 H), 3.49-3.61 (m, 9 H), 2.97 (br s, 2 H), 2.10 (s, 3 H), 1.99 (s, 3 H), 1.88 (s, 3 H), 1.78 (s, 3 H). C20H34N2O11에 대해 계산된 질량: 478.22; 실측치: 479.3 (M+H+).
실시예 3. GalNAc 리간드 클러스터 포스포라미다이트 GLPA1, GLPA2 및 GLPA15의 합성
하기 반응식 2에 따라 GLPAl 및 GLPA2를 합성하였다. 벤질-보호된 프로판-1,3-디아민을 출발 물질로 하여 tert-부틸 2-브로모아세테이트로 알킬화하면 트리에스테르 화합물 I이 얻어졌다. 수소화에 의해 벤질 보호기를 제거하면 이차 아민 화합물 II가 얻어졌다. 아미드를 6-하이드록시카프로산과 커플링시켜 화합물 III을 얻었다. 이어서, 디옥산 중의 HCl로 처리 시에 tert-부틸 보호기가 제거되어 삼산 화합물 IV를 수득하였다. 삼산 화합물 IV와 중간체-A 또는 중간체-B 사이의 아미드 커플링을 수행하여 화합물 Va 또는 화합물 Vb를 얻었다. 화합물 Va 또는 화합물 Vb를 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로라이드포스포라미다이트 및 촉매량의 1H-테트라졸로 인산화하여 포스포라미다이트 GLPA1 또는 GLPA2를 합성하였다.
[반응식 2]
디메틸포름아미드(DMF, 100 ㎖) 중의 N-벤질-1,3-프로판디아민(5.00 g, 30.4 mmol)에 tert-부틸 2-브로모아세테이트(23.7 g, 121 mmol)를 첨가한 후, 디이소프로필에틸아민(DIEA, 23.61 g, 182 mmol)을 적가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 25℃ 내지 30℃에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS에 따르면 N-벤질-1,3-프로판디아민이 완전히 소비되는 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 H2O(500 ㎖)로 희석하고, EtOAc(500 ㎖ × 2)로 추출하였다. 모은 유기물을 포화 염수(1 ℓ)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 미정제 생성물을 수득하였으며, 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(구배: 20:1 내지 5:1의 석유 에테르:에틸 아세테이트)에 의해 정제하였다. 화합물 I을 무색 오일(12.1 g, 수율: 78.4%)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 7.26-7.40 (m, 5 H), 3.79 (s, 2 H), 3.43 (s, 4 H), 3.21 (s, 2 H), 2.72 (dt, J = 16.9, 7.34 Hz, 4 H), 1.70 (quin, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.44-1.50 (m, 27 H).
건조된 수소화 병을 아르곤으로 3회 퍼징하였다. Pd/C(200 ㎎, 10%)를 첨가한 후, MeOH(5 ㎖)를 첨가하고, 이어서 MeOH(5 ㎖) 중의 화합물 I (1.00 g, 1.97 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 진공 하에서 탈기하고, H2로 재충전하였다. 이러한 과정을 3회 반복하였다. 혼합물을 H2 분위기(15 psi) 하에 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. LCMS에 따르면 화합물 I이 완전히 소비된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 N2 분위기 하에 감압 하에 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 농축하여 황색 오일로서 화합물 II(655 ㎎, 수율: 79.7%)를 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 3.44 (s, 4 H), 3.31 (s, 2 H), 2.78 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 2.68 (t, J = 6.9 Hz, 2 H), 1.88 (br s, 1 H), 1.69 (quin, J = 7.03 Hz, 2 H), 1.44-1.50 (s, 27 H).
DMF(6 ㎖) 중의 화합물 II(655 ㎎, 1.57 mmol), 6-하이드록시카프로산(249 ㎎, 1.89 mmol), DIEA(1.02 g, 7.86 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDCI, 904 ㎎, 4.72 mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 637 ㎎, 4.72 mmol)의 혼합물을 탈기하고, N2로 3회 퍼징한 후, N2 분위기 하에 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS에 따르면 목적하는 생성물이 나타났다. 반응 혼합물을 H2O(10 ㎖)로 희석하고, 20 ㎖의 EtOAc(10 ㎖ × 2)로 추출하였다. 유기물을 모으고, 포화 염수(20 ㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 생성물을 수득하였으며, 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(구배: 5:1 내지 1:1의 석유 에테르:에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 황색 오일로서 화합물 III(650 ㎎, 수율: 77.8%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 3.90-3.95 (s, 2 H), 3.63 (t, J = 6.40 Hz, 2 H), 3.38-3.45 (m, 6 H), 2.72 (t, J = 6.65 Hz, 2 H), 2.40 (t, J = 7.28 Hz, 2 H), 1.55-1.75 (m, 8 H), 1.44 (s, 27 H). C27H50N2O8에 대해 계산된 질량: 530.36; 실측치: 531.3 (M+H+).
HCl/디옥산(2 M, 55 ㎖) 중의 화합물 III(5.5 g, 10.3 mmol)의 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS에 따르면 화합물 III이 완전히 소비되는 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 여과하고, EtOAc(50 ㎖)로 세척하고, 감압 하에 건조하여 미정제 생성물을 수득하였다. 이를 CH3CN(50 ㎖) 중에 용해하고, 휘발성 물질을 진공 하에 제거하였다. 이러한 과정을 3회 반복하여 백색 고체로서 화합물 IV(2.05 g, 수율: 54.5%)를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, D2O): δ ppm 4.21 (s, 1 H), 4.07 (d, J = 4.5 Hz, 4 H), 3.99 (s, 1 H), 3.45-3.52 (m, 3 H), 3.42 (t, J = 6.5 Hz, 1 H), 3.32-3.38 (m, 1 H), 3.24-3.31 (m, 1 H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 2.24 (t, J = 7.4 Hz, 1 H), 1.99 (dt, J = 15.5, 7.53 Hz, 1 H), 1.85-1.94 (m, 1 H), 1.85-1.94 (m, 1 H), 1.39-1.56 (m, 4 H), 1.19-1.31 (m, 2 H).
화합물 IV(500 ㎎, 1.05 mmol), 중간체-A(2.02 g, 3.67 mmol), DIEA(813 ㎎, 6.30 mmol), EDCI(704 ㎎, 3.67 mmol) 및 DMF(10 ㎖) 중의 HOBt(496 ㎎, 3.67 mmol)의 혼합물을 탈기하고, N2로 3회 퍼징한 후, 혼합물을 N2 분위기 하에 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS에 따르면 목적하는 생성물이 나타났다. 반응 혼합물을 H2O(10 ㎖)를 첨가하여 켄칭하고, DCM(10 ㎖ × 2)으로 추출하였다. 모은 유기물을 10% 시트르산(20 ㎖)으로 추출하였다. 수성상을 포화 NaHCO3 용액으로 중화시키고, DCM(10 ㎖ × 2)로 다시 추출하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 백색 고체로서 화합물 Va(570 ㎎, 0.281 mmol, 수율: 26.8%)를 수득하였다. 1H NMR: (400 MHz, CDCl3) ppm δ 7.84-8.12 (m, 3 H), 6.85-7.15 (m, 2 H), 6.66-6.81 (m, 1 H), 5.36 (br d, J = 2.7 Hz, 3 H), 5.11-5.27 (m, 3 H), 4.63-4.85 (m, 3 H), 3.90-4.25 (m, 18 H), 3.37-3.75 (m, 28 H), 3.15-3.28 (m, 4 H), 2.64 (br d, J = 6.53 Hz, 2 H), 2.30-2.46 (m, 2 H), 2.13-2.18 (m, 9 H), 2.05 (s, 9 H), 1.94-2.03 (m, 18 H), 1.68 (br s, 2 H), 1.45 (br s, 2 H), 1.12 (br t, J = 7.0 Hz, 2 H).
무수 DCM(5 ㎖) 중의 화합물 Va(260 ㎎, 0.161 mmol)의 용액에 디이소프로필암모늄 테트라졸리드(30.3 ㎎, 0.177 mmol)를 첨가한 후, 3-비스(디이소프로필아미노)포스파닐옥시프로판니트릴(194 ㎎, 0.645 mmol)을 N2 하에 주위 온도에서 적가하였다. 반응 혼합물을 20℃ 내지 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS에 따르면 화합물 Va가 완전히 소비되는 것으로 나타났다. -20℃까지 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 0℃에서 염수/포화 NaHCO3(1:1, 5 ㎖)의 교반 용액에 첨가하였다. 1분 동안 교반한 후, DCM(5 ㎖)을 첨가하였으며, 계층화가 나타났다. 유기층을 염수/포화 수성 NaHCO3 용액(1:1, 5 ㎖)으로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 대략 1 ㎖의 부피까지 농축하였다. 잔류 용액을 교반하면서 20 ㎖의 메틸 tert-부틸 에테르(MTBE)에 적가하였다. 이로 인해 백색 고체가 침전되었다. 혼합물을 원심분리하고, 고체를 수집하였다. 고체를 1 ㎖의 DCM 중에 다시 용해하고, MTBE(20 ㎖)를 첨가하여 침전시켰다. 고체를 원심분리에 의해 다시 단리하고, 수집된 고체를 무수 CH3CN 중에 용해하고, 휘발성 물질을 제거하였다. 이러는 과정을 2회 이상 반복하여 백색 고체로서 GalNAc 리간드 포스포라미다이트 화합물 GLPA1(153 ㎎, 84.4 μmol)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): ppm δ 7.71-8.06 (m, 2 H), 6.60-7.06 (m, 3 H), 5.37 (br d, J = 3.0 Hz, 3 H), 5.18-5.32 (m, 3 H), 4.70-4.86 (m, 3 H), 3.92-4.25 (m, 18 H), 3.42-3.85 (m, 30 H), 3.25 (m, 4 H), 2.59-2.75 (m, 4 H), 2.27-2.44 (m, 2 H), 2.15-2.20 (s, 9 H) 2.07 (s, 9 H), 1.96-2.03 (m, 18 H), 1.65 (br s, 4 H), 1.44 (br d, J = 7.28 Hz, 2 H), 1.14-1.24 (m, 12 H). 31P NMR (CDCl3): ppm δ 147.15.
중간체-B를 사용하였다는 것을 제외하고 동일한 절차를 이용하여 GalNAc 리간드 포스포라미다이트 화합물 GLPA2를 합성하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): ppm δ 7.94-8.18 (m, 1 H), 7.69 (br s, 1 H), 6.66-7.10 (m, 3 H), 5.35 (d, J = 3.5 Hz, 3 H), 5.07-5.25 (m, 3 H), 4.76-4.86 (m, 3 H), 4.01-4.31 (m, 10 H), 3.91-4.01 (m, 8 H), 3.74-3.86 (m, 4 H), 3.52-3.71 (m, 30 H), 3.42-3.50 (m, 6 H), 3.15-3.25 (m, 4 H), 2.52-2.70 (m, 4 H), 2.22-2.45 (m, 2 H), 2.15-2.22 (s, 9 H), 2.06 (s, 9 H), 1.95-2.03 (m, 18 H), 1.77 (br s, 2 H), 1.58-1.66 (m, 4 H), 1.40 (m, 2 H), 1.08-1.24 (m, 12 H). 31P NMR (CDCl3): ppm δ 147.12.
하기 반응식 3을 따라서 GLPA15를 제조하였다.
Figure pct00078
디클로로메탄(2.75 L) 중의 중간체 화합물 II(275 g, 660 mmol, 1.00 당량)의 용액에 트리에틸아민(133 g, 1.32 mol, 2.00 당량)을 첨가한 후, Cbz-Cl(169 g, 990 mmol, 1.50 당량)을 적가하였다. 반응 용액을 25℃에서 2시간 동안 교반하였으며, 그 결과 LCMS에 따르면 화합물 II가 완전히 전환된 것으로 나타났다. 반응 용액을 포화 NaHCO3(800 ㎖) 용액 및 포화 염수(500 ㎖)로 순차적으로 세척하고, 유기상을 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 여과에 의해 건조제를 제거한 후, 여과액을 농축 건조하였다. 미정제 생성물에 칼럼 크로마토그래피(SiO2, PE/EA = 100/1 내지 5/1)를 적용하여 무색 오일로서 화합물 5(290 g, 527 mmol, 수율: 75.7%)를 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d 6 중 400 MHz): δ ppm 7.23-7.40 (m, 5 H), 5.00-5.12 (m, 2 H), 3.86-3.95 (m, 2 H), 3.23-3.39 (m, 6 H), 2.55-2.67 (m, 2 H), 1.56-1.64 (m, 2 H), 1.31-1.46 (m, 27 H). MS (ESI) [M+H]+ m/z: 551.6.
화합물 5(145 g, 263 mmol, 1.00 당량)에 HCOOH(2.9 ℓ)를 첨가하고, 용액을 60℃에서 12시간 동안 교반하였으며, 그 결과 LCMS에 따르면 화합물 5가 완전히 전환된 것으로 나타났다. 1.5 ℓ의 톨루엔 및 1.5 ℓ의 아세토니트릴을 반응 용액에 첨가하였으며, 이를 감압 하에 약 500 ㎖까지 농축하였다. 이어서, 톨루엔/아세토니트릴(1:1, 약 750 ㎖)을 첨가한 후, 약 500 ㎖까지 농축하였다. 이에 이어 아세토니트릴(약 1000 ㎖)을 첨가한 후, 농축 건조하였다. 미정제 생성물을 700 ㎖의 아세토니트릴로 60℃에서 2시간 동안 분쇄한 후, 여과하였다. 고체를 모으고, 건조하여 백색 고체인 화합물 6(105 g, 정량적)을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d 6 중 400 MHz): δ ppm 7.26-7.40 (m, 5 H), 5.02-5.10 (m, 2 H), 3.89-4.00 (m, 2 H), 3.36-3.45 (m, 4 H), 3.24-3.34 (m, 2 H), 2.59-2.72 (m, 2 H), 1.40 (s, 2 H). MS (ESI) [M+H]+ m/z: 383.0.
화합물 6(100 g, 261 mmol) 및 중간체-A(502 g, 915. mmol, 3.50 당량)의 DMF(1.0 ℓ) 용액에 TBTU(327 g, 1.02 mol, 3.90 당량) 및 트리에틸아민(212 g, 2.09 mol, 8.00 당량)을 첨가하였다. 반응을 25℃에서 1시간 동안 수행하였으며, 그 결과 LCMS에 따르면 화합물 6이 완전히 전환된 것으로 나타났다. 반응 용액을 4,000 ㎖의 물에 첨가하고, 메틸 tert-부틸 에테르(2,000 ㎖, 2회)로 추출하여 불순물을 제거하였다. 잔류 수성상을 디클로로메탄(3000 ㎖, 2회)으로 추출하였다. 디클로로메탄 상을 10% 시트르산 수용액(2회 세척에 걸쳐 2,000 ㎖ 분할), 포화 NaHCO3(2회 세척에 걸쳐 2.0 ℓ 분할) 및 포화 염수(2.0 ℓ)로 연속적으로 세척한 후, 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 여과액을 여과하고, 감압 하에 농축하여 백색 고체인 화합물 8(260 g, 159 mmol, 수율: 60.9%)을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d 6 중 400 MHz): δ ppm 7.99-8.08 (m, 2 H), 7.93 (br d, J = 5.50 Hz, 1 H), 7.79-7.86 (m, 3 H), 7.26-7.39 (m, 5 H), 5.22 (d, J = 3.13 Hz, 3 H), 4.95-5.08 (m, 5 H), 4.54 (br d, J = 8.38 Hz, 3 H), 4.03 (s, 9 H), 3.81-3.93 (m, 5 H), 3.76 (br d, J = 4.88 Hz, 3 H), 3.44-3.62 (m, 10 H), 3.34-3.43 (m, 6 H), 3.24 (br d, J = 6.13 Hz, 7 H), 3.02-3.09 (m, 4 H), 2.40-2.47 (m, 2 H), 2.10 (s, 9 H), 1.99 (s, 9 H), 1.89 (s, 9 H), 1.77 (s, 9 H), 1.57-1.68 (m, 2 H). MS (ESI) [M+H]+ m/z: 816.4.
2 ℓ 수소화 케틀(hydrogenation kettle)을 아르곤으로 불활성시킨 후, 건조 Pd/C(9g)를 조심스럽게 첨가하고, 이어서 MeOH(50 ㎖)를 첨가하여 Pd/C에 가습하였다. 다음으로, MeOH(850 ㎖) 중의 화합물 8(90 g, 55.1 mmol, 1.00 당량) 및 트리플루오로아세트산(6.29 g, 55.1 mmol, 1.00 당량)의 용액을 아르곤 분위기 하에 천천히 첨가하였다. H2를 3회 첨가하여 혼합물을 탈기/치환하여 수소 분위기를 제공하고, 25℃에서 10시간 동안 교반하였다. LCMS에 따르면 화합물 8이 완전히 전환된 것으로 나타났다. Pd/C를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 감압 하에 농축하여 화합물 9(80 g, 수율: 90.2%)를 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d 6 중 400 MHz): δ ppm 9.12 (br s, 2 H), 8.50 (br t, J = 5.19 Hz, 1 H), 8.10 (br t, J = 5.50 Hz, 2 H), 7.85-7.91 (m, 3 H), 5.22 (d, J = 3.25 Hz, 3 H), 4.95-5.01 (m, 3 H), 4.52-4.58 (m, 3 H), 4.03 (s, 9 H), 3.84-3.93 (m, 3 H), 3.75-3.83 (m, 3 H), 3.39-3.61 (m, 16 H), 3.23-3.32 (m, 6 H), 3.15-3.18 (m, 3 H), 2.97-3.05 (m, 2 H), 2.54-2.61 (m, 2 H), 2.10 (s, 9 H), 2.00 (s, 9 H), 1.89 (s, 9 H), 1.77-1.80 (m, 9 H), 1.70-1.76 (m, 2 H). MS (ESI) [M+H]+ m/z: 749.3.
화합물 9(270 g, 168 mmol, 1.00 당량) 및 글루타르산 무수물(28.6 g, 252 mmol, 1.50 당량)의 디클로로메탄(2.7 ℓ) 용액에 트리에틸아민(67.8 g, 672 mmol, 4.00 당량)을 첨가하고, 용액을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS에 따르면 화합물 9가 화합물 11로 완전히 전환된 것으로 나타났다. 4-하이드록시피페리딘(42.4 g, 420 mmol, 2.50 당량) 및 TBTU(107 g, 335 mmol, 2.00 당량)를 반응 용액에 첨가하고, 교반은 25℃에서 1시간 동안 계속하였다. LCMS에 따르면 화합물 11이 완전히 전환된 것으로 나타났다. 포화 NH4Cl(3.0 ℓ)을 천천히 첨가하여 반응을 켄칭하고, 층을 분리하였으며, 수성상을 디클로로메탄(2 × 1000 ㎖)으로 추출하고, 이전 유기상과 함께 모았다. 모은 유기상을 포화 NaHCO3(수용액)과 포화 염수(3.0 ℓ)의 1:1 혼합물로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하였다. 미정제 생성물을 1.5 ℓ의 디클로로메탄 중에 용해하고, 메틸 tert-부틸 에테르(7.5 ℓ)에 적가하였다. 적가 동안에 반투명한 백색 침전물이 서서히 형성하였다. 침전물을 진공 하에 여과하고, 고체를 수집하고, 진공 하에 건조하여 백색 고체로서 화합물 13(207 g, 수율: 72.8%)을 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d 6 중 400 MHz): δ ppm 8.05 (br d, J = 2.00 Hz, 2 H), 7.82 (br d, J = 7.38 Hz, 3 H), 5.21 (br s, 3 H), 4.98 (br d, J = 10.26 Hz, 3 H), 4.72 (br s, 1 H), 4.54 (br d, J = 7.88 Hz, 3 H), 4.03 (br s, 9 H), 3.74-3.94 (m, 9 H), 3.45-3.71 (m, 12 H), 3.40 (br s, 6 H), 3.24 (br s, 7 H), 3.07 (br d, J = 14.13 Hz, 5 H), 2.91-3.01 (m, 1 H), 2.24-2.44 (m, 5 H), 2.20 (br s, 1 H), 2.10 (s, 9 H), 1.96-2.04 (m, 9 H), 1.89 (br s, 9 H), 1.74-1.81 (m, 9 H), 1.51-1.73 (m, 6 H), 1.07-1.36 (m, 3 H). MS (ESI) [M+H]+ m/z: 848.0.
디클로로메탄(2.0 ℓ) 중의 화합물 13(200 g, 118 mmol, 1.00 당량) 및 테트라졸 디이소프로필암모늄(8.08 g, 47.2 mmol, 0.40 당량)의 용액에 3-비스(디이소프로필아미노)포스파닐옥시프로판니트릴(53.3 g, 177 mmol, 1.50 당량)을 첨가하였다. 반응 용액을 40℃에서 2시간 동안 교반하였으며, 그 결과 LCMS에 따르면 화합물 13이 완전히 전환된 것으로 나타났다. 반응 용액을 포화 NaHCO3과 포화 염수(2.0 ℓ)의 1:1 혼합물로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 여과액을 농축한 후 수득된 미정제 생성물을 디클로로메탄(1.2 ℓ) 중에 용해하고, 교반된 메틸 tert-부틸 에테르(6.0 ℓ)에 적가하였다. 현탁액을 여과하고, 필터 케이크를 tert-부틸 에테르로 세정하였다. 고체를 수집하고, 진공 하에 건조하였다. 생성물을 디클로로메탄(1.0 ℓ) 중에 용해하고, 농축 건조하였다. 이러한 작업을 4회 반복하여 잔류 tert-부틸 에테르를 제거하고, GLPA15(164 g, 수율: 73.3%)를 수득하였다. 1H NMR (DMSO-d 6 중 400 MHz): δ ppm 8.05 (br d, J = 6.50 Hz, 2 H), 7.81 (br d, J = 9.01 Hz, 3 H), 5.22 (d, J = 3.25 Hz, 3 H), 4.98 (dd, J = 11.26, 3.25 Hz, 3 H), 4.55 (br d, J = 8.50 Hz, 3 H), 4.03 (s, 9 H), 3.64-3.97 (m, 12 H), 3.55-3.63 (m, 6 H), 3.50 (br s, 5 H), 3.40 (br d, J = 6.13 Hz, 6 H), 3.17-3.30 (m, 9 H), 3.07 (br d, J = 14.26 Hz, 4 H), 2.76 (t, J = 5.82 Hz, 2 H), 2.18-2.47 (m, 6 H), 2.10 (s, 9 H), 1.99 (s, 9 H), 1.89 (s, 9 H), 1.78 (s, 9 H), 1.52-1.74 (m, 6 H), 1.12-1.19 (m, 12 H). 31P NMR (DMSO-d 6 ): ppm δ 145.25. MS (ESI) [M+H]+ m/z: 1895.7.
일부 연구에서, GalNAc를 포함하는 표적화기(본원에서 GalNAc 전달 화합물로도 지칭됨)를 센스 가닥의 5'-단부에 부착시키기 위한 방법들이 제공되며, 이는 GalNAc 포스포라미다이트(GLPA1)를 센스 가닥의 5'-단부에 부착시키기 위해 올리고뉴클레오티드 사슬 연장(즉, 센스 가닥의 5'-단부에 대한 뉴클레오티드의 부가)에서 사용된 것과 같은 합성 방법을 사용하여 고체상 합성의 최종 커플링 단계에서 GalNAc 포스포라미다이트(GLPA1)의 사용을 수반한다.
일부 연구에서, GalNAc-함유 표적화기를 센스 가닥의 3'-단부에 부착시키는 방법은 GLO-n-함유 고체 지지체(CPG)의 사용을 포함한다. 일부 연구에서, GalNAc-함유 표적화기를 센스 가닥의 3'-단부에 부착시키는 방법은, 에스테르 결합을 통해 GalNAc 표적화기를 CPG 고체 지지체에 연결하는 단계, 및 이에 따라 생성된 GalNAc 표적화기가 부착된 CPG를 센스 가닥의 합성 중에 사용하여 센스 가닥의 3'-단부에 GalNAc 표적화기를 부착하는 단계를 포함한다. 마찬가지로, 기타 GalNAc 포스포라미다이트 화합물(GLPAn)은 본원의 방법 또는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법과 유사한 방법을 이용함으로써 합리적으로 상응하는 중간체의 사용 이후에 수득될 수 있고, 표적화기로서 siRNA 듀플렉스의 적절한 위치에 결합될 수 있다.
실시예 4. AGT siRNA 듀플렉스의 시험관 내 스크리닝
Hep3B 세포를 트립신 처리하고, 적절한 밀도로 조절한 후, 96-웰 플레이트에 접종하였다. 접종과 동시에 제조사의 권장 사항에 따라 리포펙타민 RNAiMax(Invitrogen-13778-150)를 사용하여 시험 siRNA 또는 대조군 siRNA를 이용하여 세포를 형질 감염시켰다. siRNA는 2개의 농도(0.2 nM 내지 1.0 nM)에서 3회 시험한 반면, 대조군 siRNA는 4.6 pM 내지 10 nM에서 순차적으로 3배 희석하여 8개의 농도에서 3회 시험하였다.
형질 감염 24시간 후, 배지를 제거하고, 세포를 RNA 추출을 위해 수확하였다. TRIzolTM 시약(Invitrogen-15596018)을 사용하여 설명서에 따라 총 RNA를 추출하였다.
cDNA를 PrimeScriptTM RT 시약 키트 및 gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa-RR047A)를 사용하여 설명서에 따라 합성하였다. AGT cDNA를 qPCR에 의해 검출하였다. GAPDH cDNA를 내부 대조군과 동시에 검출하였다. PCR을 하기와 같이 수행하였다: 95℃에서 30초, 이어서 95℃에서 10초 및 60℃에서 30초의 40회 사이클.
데이터 분석
각각의 샘플에서의 AGT 유전자의 발현은 비교용 Ct(ΔΔCt) 방법을 사용하여 상대적 정량(RQ)에 의해 결정되었고; 이러한 방법은 표적 유전자와 하우스키핑 유전자(GAPDH) 사이의 Ct 차이(ΔCt)를 측정한다.
방정식은 하기에 나열되어 있다:
ΔCT = 표적 유전자의 평균 Ct - GAPDH의 평균 Ct
ΔΔCT = ΔCT(샘플) - ΔCT(무작위 대조군 또는 리포펙타민 RNAiMax 대조군)
표적 유전자 mRNA의 상대적 정량 = 2(-ΔΔCT)
저해율(%) = (대조군의 상대적 정량 - 샘플의 상대적 정량)/대조군의 상대적 정량 × 100%.
[표 5]
실시예 5. AGT siRNA 듀플렉스의 생체 내 시험
AGT siRNA의 생체 내 활성을 평가하기 위해, 인간 AGT 유전자를 암호화하는 AAV로 감염된 마우스를 사용하였다(그룹 당 4마리의 마우스). siRNA 투여 14일 전, 인간 AGT 유전자를 암호화하는 아데노-연관 바이러스 8(AAV8) 벡터의 1 × 1011개의 바이러스 입자를 정맥 주사에 의해 암컷 C57BL/6J 마우스에 감염시켰다. 0일째 날, 마우스에 AGT siRNA 제제 또는 PBS를 2.5 ㎎/㎏ 또는 3 ㎎/㎏의 단일 투여량으로 피하 주사하였다. 혈액 샘플을 0일째 날, siRNA 투여 이전 및 7일째 날 종료 시점에 수집하였다. 인간 AGT 단백질 농도를 제조사의 권장 프로토콜(IBL America, Human Angiotensinogen ELISA 키트)에 따라 ELISA 검정에 의해 측정하였다. 마우스 간 내의 인간 AGT mRNA 수준(qPCR에 의해 결정됨) 또는 혈장 샘플 내의 인간 AGT 단백질 수준을 7일째 날에 siRNA 처리군과 PBS 처리군 사이에서 비교함으로써 녹다운 백분율을 계산하였다. 결과는 표 6 내지 표 9에 나타나 있다.
[표 6]
[표 7]
[표 8]
[표 9]
실시예 6. AGT siRNA 듀플렉스의 생체 내 시험
AGT siRNA의 생체 내 활성을 평가하기 위해, 총 15마리의 수컷 시노몰구스 원숭이(13세 내지 22세, 7 ㎏ 내지 9 ㎏의 체중)를 본 연구에 모집하였다. 동물을 무작위로 각각 3마리씩 5개 그룹으로 나누고, 각각의 동물에 2 ㎎/㎏의 시험 물질을 피하 주사하였으며, 이때 사용된 시험 물질은 표 4에 나타나 있는 화합물(AD00158-1, AD00158-2, AD00163-1, AD00159-1, AD00300-1)에 상응한다.
하룻밤 동안 금식한 후, -14일(투여 전), -7일(투여 전), 1일(투여 전) 및 투여 후 8일, 15일, 22일, 29일, 43일, 57일, 64일, 71일, 78일, 85일 및 92일째 날에 혈액을 수집하였다. 이어서, 수집된 혈액 샘플을 실온에서 30분 이상 방치하여 응고시킨 후, 4℃에서 10분 동안 350 rpm으로 원심분리하였다. 수집된 혈청(대략 1.0 ㎖)을 사전 표지된 2개의 폴리프로필렌 스크류 캡 바이알(0.5 ㎖/바이알, 하나는 ELISA 검정용이고, 다른 하나는 추후 사용됨) 내로 옮기고, 시험이 있을 때까지 -80℃ 냉동고에 저장하였다.
혈청 내 AGT 단백질 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 1일째 날에 원숭이의 혈장에서의 AGT 수준과 비교하여 남아 있는 비율은 도 1에 나타나 있다.
실시예 7. AGT siRNA 듀플렉스의 시험관 내 스크리닝
실시예 4의 방법에 따라 시험관 내 연구를 수행하였으며, 실험 결과는 표 10에 나타나 있다.
[표 10]
실시예 8. AAV 마우스 모델에서의 AD00163-3의 생체 내 시험:
적응 기간 후, 12마리의 암컷 C57BL/6J 마우스를 체중에 따라 무작위로 2개의 그룹, 즉 모델(용매) 그룹 및 AD00163-3(1 ㎎/㎏) 그룹으로 나누었다. 1일째 날에 각각의 마우스의 꼬리 정맥에 1 × 1011 vg의 AAV-AGT 바이러스를 주입하여 동물 당 100 ㎕의 부피로 주입함으로써 동물 모델을 확립하였다. 15일째 날에, 각각의 그룹 내의 마우스에 PBS 또는 표 4의 AD00163-3을 피하 주사에 의해 제공하여 5 mL/kg의 부피로 투여하였다. 15일째 날 투여 이전에 각각의 마우스로부터 턱밑 정맥을 통해 혈액을 수집하고, 혈청 시료를 원심분리 이후에 수집하였다. 22일째 날에, 모든 마우스를 CO2를 사용하여 희생시키고, 심장 천자를 통해 전혈을 수집하고, 혈청 샘플을 원심분리 이후에 수집하였다. 인간 AGT 단백질 농도를 제조자의 권장 프로토콜(IBL America, Human Angiotensinogen ELISA 키트)에 따라 ELISA 검정에 의해 측정하였다. 마우스 혈장 샘플 내의 인간-유래 AGT 단백질 수준을 7일째 날(투여 후)에 siRNA 처리군과 PBS 처리군 사이에서 비교함으로써 녹다운 백분율을 계산하였다. 데이터에 따르면 AD00163-3(1 ㎎/㎏) 처리는 마우스 혈청 내의 인간 AGT 단백질의 발현을 91%로 유의하게 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 9. 시노몰구스 원숭이의 자발성 고혈압 모델에서의 AD00163-3의 시험
혈압이 상승한 10마리의 시노몰구스 원숭이를 무작위로 2개의 그룹(각 그룹당 5마리의 원숭이)으로 나누어 식염수 또는 표 4의 AD00163-3을 10 ㎎/㎏ 투여하였다. 혈액 샘플을 -6일 및 -2일째 날(투여 전) 및 2일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일째 날(투여 후)에 수집하였다. 혈청 AGT 농도를 제조업자의 권장 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 측정하였고, 혈압을 꼬리 커프 장치(tail cuff device)를 사용하여 측정하였다. 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 혈청 AGT 감소(투여 후 35일째 날에 98% 감소)와 동시에 10 ㎎/㎏의 AD00163-3의 단일 피하 투여량은 투여 후 35일째 날에 SBP에서의 28 mmHg의 유의한 감소(SBP는 147 mmHg의 기준선에서 119 mmHg로 감소함)를 초래하는 반면, 동일한 기간 동안 대조군에서는 SBP에서 유의한 변화가 없었다(SBP는 144 mmHg의 기준선에서 145 mmHg로 증가함). 평균 및 이완기(MBP 및 DBP) 혈압에서의 유의한 감소는 도 4 및 도 5에 각각 나타나 있는 바와 같이 관찰되었다.
등가물
본 발명의 여러 실시형태가 본원에 기재 및 예시되어 있지만, 당업자라면 본원에 기재된 기능을 수행하고/하거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 기타 수단 및/또는 구조를 사용할 수 있고, 이들 변경 및/또는 변형 각각은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 보다 일반적으로, 당업자라면 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것이며, 실제 파라미터, 치수, 재료 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 특정 응용에 따라 달라질 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 당업자라면 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 단지 일상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상술한 실시형태는 단지 예로서만 제시된 것이며, 첨부된 청구범위 및 이들의 등가물의 범주 내에서 본 발명은 구체적으로 설명 및 청구된 바와는 다르게 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 본원에 기재된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이 같은 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는다면, 이 같은 2개 이상의 특징, 시스템, 물품, 재료 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 발명의 범주 내에 또한 포함된다.
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Claims (74)

  1. 안지오텐시노겐(AGT)의 발현을 저해하는 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서, 상기 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥 내 2번 내지 18번 뉴클레오티드 위치는 AGT RNA 전사체에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 상보성 영역은 표 1 내지 표 4 중 하나에 나열된 안티센스 서열 중 하나와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하고, 선택적으로 표적화 리간드를 포함하는, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AGT RNA 전사체에 대한 상보성 영역은 표 1 내지 표 4 중 하나에 나열된 안티센스 서열 중 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개, 16개, 17개, 18개 또는 19개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 dsRNA의 안티센스 가닥은 적어도 서열 번호 519 내의 임의의 표적 영역에 실질적으로 상보적이고, 표 1 내지 표 4 중 임의의 하나에 제공되는 것인 dsRNA 제제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 dsRNA의 안티센스 가닥은 서열 번호 519 내의 임의의 표적 영역에 완전히 상보적이고, 표 1 내지 표 4 중 임의의 하나에 제공되는 것인 dsRNA 제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 표 1 내지 표 4 중 임의의 하나에 기재된 센스 가닥 서열을 포함하며, 이때 상기 센스 가닥 서열은 적어도 상기 dsRNA 제제 내의 상기 안티센스 가닥 서열에 실질적으로 상보적인 것인 dsRNA 제제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 표 1 내지 표 4 중 임의의 하나에 기재된 센스 가닥 서열을 포함하며, 이때 상기 센스 가닥 서열은 상기 dsRNA 제제 내의 상기 안티센스 가닥 서열에 완전히 상보적인 것인 dsRNA 제제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 표 1 내지 표 4 중 임의의 하나에 나열된 안티센스 가닥 서열을 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 표 1 내지 표 4 중 임의의 하나에 듀플렉스 서열로서 나열된 서열을 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  9. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  10. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥 내의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드인 것인 dsRNA 제제.
  11. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로뉴클레오티드, 2'-데옥시뉴클레오티드, 2'3'-세코 뉴클레오티드 모사체(2'3'-seco nucleotide mimic), 잠금형 뉴클레오티드(locked nucleotide), 비잠금형 핵산(unlocked nucleic acid, UNA) 뉴클레오티드, 글리콜 핵산(GNA) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드, 비염기성 뉴클레오티드, 리비톨(ribitol), 역위형 뉴클레오티드, 역위형 비염기성 뉴클레오티드, 역위형 2'-OMe 뉴클레오티드, 역위형 2'-데옥시뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드 및 3'-OMe 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 또는 콜레스테롤 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 포스포라미데이트 또는 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기에 연결된 말단 뉴클레오티드를 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, E-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 가이드 가닥의 5' 단부에 포함되는 것인 dsRNA 제제.
  13. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결(phosphorothioate internucleoside linkage)을 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  14. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  15. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  16. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  17. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  18. 제1항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥의 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드인 것인 dsRNA 제제.
  19. 제1항에 있어서, 상기 변형 센스 가닥은 표 2 내지 표 4 중 하나에 나열된 변형 센스 가닥 서열인 것인 dsRNA 제제.
  20. 제1항에 있어서, 상기 변형 안티센스 가닥은 표 2 내지 표 4 중 하나에 나열된 변형 안티센스 가닥 서열인 것인 dsRNA 제제.
  21. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥에 상보적 또는 실질적으로 상보적이고, 상기 상보성 영역은 16개 내지 23개의 뉴클레오티드 길이인 것인 dsRNA 제제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 상보성 영역은 19개 내지 21개의 뉴클레오티드 길이인 것인 dsRNA 제제.
  23. 제1항에 있어서, 각각의 가닥은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이인 것인 dsRNA 제제.
  24. 제1항에 있어서, 각각의 가닥은 25개 이하의 뉴클레오티드 길이인 것인 dsRNA 제제.
  25. 제1항에 있어서, 각각의 가닥은 23개 이하의 뉴클레오티드 길이인 것인 dsRNA 제제.
  26. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함하고, 하나 이상의 표적화기(targeting group) 또는 연결기를 추가로 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  27. 제26항에 있어서, 상기 하나 이상의 표적화기 또는 연결기는 상기 센스 가닥에 접합되는 것인 dsRNA 제제.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 표적화기(들) 또는 연결기(들)는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)을 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 각각의 표적화기는 하기 구조를 갖는 것인 dsRNA 제제:
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  30. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 상기 센스 가닥의 5'-단부에 접합된 표적화기를 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  31. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 상기 센스 가닥의 3'-단부에 접합된 표적화기를 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  32. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 3'-단부에 역위형 비염기성 잔기를 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  33. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥은 3' 또는/및 5' 단부에 1개 또는 2개의 역위형 비염기성 잔기를 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  34. 제1항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 2개의 평활 단부(blunt end)를 갖는 것인 dsRNA 제제.
  35. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 3' 돌출부를 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  36. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드의 3' 돌출부를 포함하는 것인 dsRNA 제제.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 치료제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 키트, 용기, 팩, 디스펜서, 사전 충전형 주사기 또는 바이알에 포장되는 것인 조성물.
  41. 제37항에 있어서, 상기 조성물은 피하 투여용으로 제형화되거나, 정맥 내(IV) 투여용으로 제형화되는 것인 조성물.
  42. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 dsRNA 제제를 포함하는 세포.
  43. 제42항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포, 선택적으로 인간세포인 것인 세포.
  44. 세포에서 AGT 유전자 발현을 저해하는 방법으로서,
    (i) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 유효량으로 포함하는 세포를 제조하는 단계를 포함하는, 세포에서 AGT 유전자 발현을 저해하는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    (ii) 제44항의 (i)에서 제조된 세포를 상기 AGT 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 달성하기에 충분한 시간 동안 유지하여 상기 세포 내에서 상기 AGT 유전자의 발현을 저해하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 세포는 개체 내에 있고, 상기 dsRNA 제제는 상기 개체에게 피하 투여되는 것인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 세포는 개체 내에 있고, 상기 dsRNA 제제는 상기 개체에게 IV 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 개체에게 상기 dsRNA 제제를 투여한 후 상기 AGT 유전자의 저해를 평가하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 평가 수단은,
    (i) 상기 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리학적 특징을 결정하는 것, 및
    (ii) 상기 결정된 생리학적 특징을 상기 AGT-연관 질병 또는 병태의 치료 전 기준선 생리학적 특징 및/또는 상기 AGT-연관 질병 또는 병태의 대조군 생리학적 특징과 비교하는 것을 포함하며,
    이때 상기 비교는 상기 개체에서의 상기 AGT 유전자 발현의 저해의 존재 또는 부재 중 하나 이상을 나타내는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 결정된 생리학적 특징은 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 고혈압 응급증(예를 들어, 악성 고혈압 및 가속성 고혈압), 급성 고혈압, 임신-관련 고혈압 및 저항성 고혈압을 포함하는 고혈압인 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 개체의 혈압 감소는 상기 개체에서의 AGT 유전자의 발현 감소를 나타내는 것인 방법.
  51. 개체에서 AGT 유전자의 발현을 저해하는 방법으로서,
    상기 개체에게 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 AGT 유전자의 발현을 저해하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 상기 개체에게 피하 투여되는 것인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 상기 개체에게 IV 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에게 상기 dsRNA 제제를 투여한 후 상기 AGT 유전자의 저해를 평가하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 평가 수단은,
    (i) 상기 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리학적 특징을 결정하는 것, 및
    (ii) 상기 결정된 생리학적 특징(들)을 상기 AGT-연관 질병 또는 병태의 치료 전 기준선 생리학적 특징 및/또는 상기 AGT-연관 질병 또는 병태의 대조군 생리학적 특징과 비교하는 것을 포함하며,
    이때 상기 비교는 상기 개체에서 상기 AGT 유전자 발현의 저해의 존재 또는 부재 중 하나 이상을 나타내는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 결정된 생리학적 특징은 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 고혈압 응급증(예를 들어, 악성 고혈압 및 가속성 고혈압), 급성 고혈압, 임신-관련 고혈압 및 저항성 고혈압을 포함하는 고혈압인 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 개체의 혈압 감소는 상기 개체에서의 AGT 유전자의 발현 감소를 나타내는 것인 방법.
  57. AGT 단백질과 연관된 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    AGT 유전자 발현을 저해하기 위해 개체에게 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, AGT 단백질과 연관된 질병 또는 병태를 치료하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 질병 또는 병태는 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS)의 활성화 또는 상기 RAAS의 활성화에 따른 이의 증상 또는 진행에 의해 야기되거나 이와 연관이 있으며, 이때 상기 질병 또는 병태는 고혈압 질병, 고혈압, 경계선 고혈압, 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 분리성 고혈압, 수축기 또는 이완기 고혈압, 임신-관련 고혈압, 당뇨성 고혈압, 저항성 고혈압, 치료 불응성 고혈압, 발작성 고혈압, 신혈관성 고혈압, 골드블랫 고혈압(Goldblatt hypertension), 안구 고혈압, 녹내장, 폐 고혈압, 문맥 고혈압, 전신성 정맥 고혈압, 수축기 고혈압, 불안정 고혈압, 고혈압성 심장 질병, 고혈압성 신장병증, 죽상경화증, 동맥 경화증, 혈관병, 당뇨성 신장병증, 당뇨성 망막증, 만성 심부전, 심근병증, 당뇨성 심근병증, 사구체 경화증, 대동맥 협착증, 대동맥류, 심실 섬유증, 심부전, 심근 경색, 협심증, 뇌졸중, 신장 질병, 신부전, 전신성 경화증, 자궁 내 성장 지연(IUGR) 및 태아 성장 제한 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고혈압과 통상 연관이 있는 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 개체에게 추가적인 치료 용법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 추가적인 치료 용법은 상기 개체에 대한 본 발명의 하나 이상의 AGT 안티센스 폴리뉴클레오티드의 투여, 상기 개체에 대한 비-AGT dsRNA 치료제의 투여, 및 상기 개체에 대한 행동 수정(behavioral modification)을 포함하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 비-AGT dsRNA 치료제는 이뇨제, 안지오텐신 전환 효소(ACE) 저해제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 베타-차단제, 혈관 확장제, 칼슘 채널 차단제, 알도스테론 길항제, 알파-2 작용제, 레닌 저해제, 알파-차단제, 말초 작용 아드레날린 작용제, 선택적 D1 수용체 부분 작용제, 비선택적 알파-아드레날린성 길항제, 합성 스테로이드성 항염류코르티코이드(steroidal antimineralocorticoid) 또는 상기 중 임의의 것의 조합과 같은 추가적인 치료제, 및 제제의 조합으로서 제형화된 고혈압 치료제 중 하나 이상인 것인 방법.
  62. 제57항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 상기 개체에게 피하 투여되는 것인 방법.
  63. 제57항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 상기 개체에게 IV 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에서 상기 투여된 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 효능을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 개체에서의 치료 효능의 결정 수단은,
    (i) 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 하나 이상의 생리학적 특징을 결정하는 것, 및
    (ii) 상기 결정된 생리학적 특징(들)을 상기 AGT-연관 질병 또는 병태의 치료 전 기준선 생리학적 특징과 비교하는 것을 포함하며,
    이때 상기 비교는 상기 개체에게 투여된 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의효능의 존재, 부재 및 그 수준 중 하나 이상을 나타내는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 결정된 생리학적 특징은 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 고혈압 응급증(예를 들어, 악성 고혈압 및 가속성 고혈압), 급성 고혈압, 임신-관련 고혈압 및 저항성 고혈압을 포함하는 고혈압인 것인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 개체의 혈압 감소는 상기 개체에 대한 상기 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제의 투여 효능의 존재를 나타내는 것인 방법.
  68. 개체에서의 AGT 단백질의 치료 전 기준선 수준과 비교할 때 상기 개체에서 AGT 단백질의 수준을 감소시키는 방법으로서,
    AGT 유전자의 발현 수준을 감소시키기 위해 상기 개체에게 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 AGT 단백질의 수준을 감소시키는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 상기 개체에게 피하 투여되거나 IV에 의해 투여되는 것인 방법.
  70. 개체에서의 AGT-연관 질병 또는 병태의 치료 전 기준선 생리학적 특징과 비교할 때 상기 개체에서 상기 AGT-연관 질병 또는 병태의 생리학적 특징을 변경하는 방법으로서,
    상기 개체에서 AGT-연관 질병 또는 병태의 생리학적 특징을 변경하기 위해 상기 개체에게 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제 또는 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, AGT-연관 질병 또는 병태의 생리학적 특징을 변경하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 dsRNA 제제는 상기 개체에게 피하 투여되거나 IV에 의해 투여되는 것인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 생리학적 특징은 본태성 고혈압, 이차성 고혈압, 고혈압 응급증(예를 들어, 악성 고혈압 및 가속성 고혈압), 급성 고혈압, 임신-관련 고혈압 및 저항성 고혈압을 포함하는 고혈압인 것인 방법.
  73. 제1항에 있어서, 화학식 A와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 센스 가닥을 포함하는 것인 dsRNA 제제:
    [화학식 A]
    5'-Z1AGCUUGUUUGUGAAACZ2-3'
    (상기 식에서, Z1은 0개 내지 15개의 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열이고, Z2는 A, U, C, G 중 하나로부터 선택되거나 존재하지 않음).
  74. 제1항에 있어서, 화학식 B와 0개, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 상이한 안티센스 가닥을 포함하는 것인 dsRNA 제제:
    [화학식 B]
    5'-Z3GUUUCACAAACAAGCUZ4-3'
    (상기 식에서, Z3은 A, U, C, G 중 하나로부터 선택되거나 존재하지 않고, Z4는 0개 내지 15개의 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 뉴클레오티드 서열임).
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