JP7478121B2 - Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年４月２６日に出願された、米国仮特許出願第６１／６３８，９５２号明細書、２０１２年７月９日に出願された米国仮特許出願第６１／６６９，２４９号明細書、２０１２年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７３４，５７３号明細書、および２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願公開第１３／８３７，１２９号明細書の優先権を主張する。前述の各出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１は、セリンプロテイナーゼインヒビター（セルピン）スーパーファミリーのメンバーである。Ｓｅｒｐｉｎｃ１は、トロンビン、ならびにＸ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、およびＶＩＩ因子などの凝固系のその他の活性化セリンプロテアーゼを阻害し、したがって血液凝固カスケードを調節する、血漿プロテアーゼインヒビターである（例えば図１を参照されたい）。Ｓｅｒｐｉｎｃ１の抗凝固活性は、トロンビン：抗トロンビン（ＴＡＴ）複合体の形成を触媒する、ヘパリンおよびその他の関連グリコサミノグリカンの存在によって高められる。
遺伝性または後天性のいずれの出血障害も、血液凝固が不十分な病状である。例えば血友病は、血液凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）または凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）を制御する身体能力を損なう、一群の遺伝性出血障害である。血友病Ａは、機能性第ＶＩＩＩ凝固因子の欠如を伴う劣性Ｘ連鎖遺伝障害であり、血友病症例の８０％に相当する。血友病Ｂは、機能性第ＩＸ凝固因子の欠如を伴う劣性Ｘ連鎖遺伝障害である。それは、血友病症例のおよそ２０％を構成する。血友病Ｃは、機能性ＸＩ凝固因子の欠如を伴う常染色体性遺伝障害である。ヘテロ接合の個人もまた、出血増大を示すことから、血友病Ｃは完全に劣性でない。
現在のところ血友病の治療法はないが、それは例えば血友病Ａにおける第ＶＩＩＩ因子などの欠損している凝固因子の定期的輸液によって、制御し得る。しかし一部の血友病患者は、投与された代替因子に対する抗体（インヒビター）を生じ、したがって代替凝固因子では難治性になる。したがってこのような対象における出血は、適切に制御され得ない。
例えば第ＶＩＩＩ因子およびその他の凝固因子に対する高力価のインヒビターの発生は、血友病療法の最も深刻な合併症であり、出血の治療を非常に困難にする。目下、このような対象において出血を止める唯一のストラテジーは、第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）などの「バイパス剤」、および活性化組換えＶＩＩ因子（ｒＦＶＩＩａ）、血漿交換療法、継続的因子置換、および免疫寛容療法の使用であり、そのいずれも完全に有効でない。
したがって当該技術分野で、血友病などの出血障害を有する対象のための代案の治療薬に対する必要性がある。
本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらす、ｉＲＮＡ組成物を提供する。Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子は、例えばヒトなどの対象内の細胞などの細胞内にあってもよい。本発明はまた、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するための、および／またはＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の阻害または低下から利益を受ける、例えば血友病のような出血障害などの障害を有する対象を治療するための、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法および用途も提供する。
したがって一態様では、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。ｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、センス鎖は配列番号１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなり、アンチセンス鎖は配列番号５のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる。
別の態様では、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖は、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含んでなる相補性領域を含んでなる。
一実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、ＡＤ－５０４８７．１、ＡＤ－５０４７７．１、ＡＤ－５０４８３．１、ＡＤ－５０４７５．１、ＡＤ－５０４９５．１、ＡＤ－５０４７６．１、ＡＤ－５０４９９．１、ＡＤ－５０４７８．１、ＡＤ－５０４８９．１、ＡＤ－５０５０１．１、ＡＤ－５０５０７．１、ＡＤ－５０４８４．１、ＡＤ－５０５１５．１、ＡＤ－５０５４０．１、ＡＤ－５０５２８．１、ＡＤ－５０５４９．１、ＡＤ－５０５３９．１、ＡＤ－５０５３４．１、ＡＤ－５０５２７．１、ＡＤ－５０５１４．１、ＡＤ－５０５０９．１、ＡＤ－５０５２９．１、ＡＤ－５４９４４、ＡＤ－５６８１３、ＡＤ－５７２０５、ＡＤ－５７２１４、およびＡＤ－５７２１３からなる群から選択される配列、および表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つに列挙される配列のいずれか、またはこれらの配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含んでなる。本発明の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでなる。一実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含んでなるヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される。別の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基包含ヌクレオチドからなる群から選択される。
ｄｓＲＮＡの相補性領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、または１９ヌクレオチド長であってもよい。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの各鎖は、３０ヌクレオチド長以下である。
少なくとも１本のｄｓＲＮＡ鎖は、少なくとも１ヌクレオチドまたは少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなってもよい。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、リガンドをさらに含んでなる。一実施形態では、リガンドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共役する。
いくつかの実施形態では、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着するリガンドは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。特定の実施形態では、リガンドは、
である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図に示されるリガンドに共役する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図に示されるリガンドに共役し、式中、ＸはＯまたはＳである。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの相補性領域は、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つのアンチセンス配列の１つからなる。
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つの配列から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つの配列から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含んでなる。
別の態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡを含有する細胞を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、少なくとも１本のｄｓＲＮＡ鎖をコードするベクターを提供し、ｄｓＲＮＡはＳｅｒｐｉｎｃ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部との相補性領域を含んでなり、ｄｓＲＮＡは３０塩基対以下の長さであり、ｄｓＲＮＡはｍＲＮＡを切断標的とする。
相補性領域は、少なくとも１５ヌクレオチド長または１９～２１ヌクレオチド長であってもよい。
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１本のｄｓＲＮＡ鎖をコードするベクターを含んでなる細胞を提供し、ｄｓＲＮＡはＳｅｒｐｉｎｃ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部との相補性領域を含んでなり、ｄｓＲＮＡは３０塩基対以下の長さであり、ｄｓＲＮＡはｍＲＮＡを切断標的とする。
一態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡまたはベクターを含んでなる、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するための医薬組成物を提供する。
一実施形態では、医薬組成物は、ＭＣ３、ＳＮＡＬＰ、またはＸＴＣ製剤などの脂質製剤をさらに含んでなる。
別の態様では、本発明は、細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１発現を阻害する方法を提供する。方法は、細胞を本発明のｄｓＲＮＡまたはベクターに接触させて、生成された細胞をＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間保ち、それによって細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するステップを含む。
細胞は、例えば血友病などの出血障害に罹患しているヒト対象のような、ヒト対象などの対象内にあってもよい。
本発明の方法の一実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％阻害される。
別の態様では、本発明は、例えば血友病のような出血障害などの、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を受ける、障害を有する対象を治療する方法を提供する。方法は、本発明のｄｓＲＮＡまたはベクターの治療有効量を対象に投与し、それによって対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける、例えば血友病などの障害を有する対象中で、例えば出血などの少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。方法は、例えば本発明のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡまたはベクターの治療有効量を対象に投与し、それによってＳｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける障害を有する対象中で、少なくとも１つの症状を予防するステップを含む。
障害は、血友病などの出血障害であってもよい。
一実施形態では、対象へのｄｓＲＮＡの投与は、血液凝固の増大および／またはＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質の発現および／または蓄積の低下を引き起こす。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えばｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端で、リガンドに共役する。一実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約９．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇなどの約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えばｄｓＲＮＡは、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約５０ｍｇ／ｋｂ、約２～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１～約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４５ｍｇ／ｋｂ、約２～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１～約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４０ｍｇ／ｋｂ、約２～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約３０ｍｇ／ｋｂ、約２～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１～約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約２０ｍｇ／ｋｂ、約２～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象には、約０．５、０．６、０．７．０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えばリガンドに共役するｄｓＲＮＡは、週１回または月２回、対象に投与してもよい。
別の態様では、本発明は、対象中でＳｅｒｐｉｎｃ１発現を阻害する方法を提供する。方法は、本発明のｄｓＲＮＡまたはベクターの治療有効量を対象に投与し、それによって対象中でＳｅｒｐｉｎｃ１発現を阻害するステップを含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えばｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端で、リガンドに共役する。一実施形態では、リガンドはＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約９．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇなどの約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えばｄｓＲＮＡは、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約５０ｍｇ／ｋｂ、約２～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１～約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４５ｍｇ／ｋｂ、約２～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１～約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４０ｍｇ／ｋｂ、約２～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約３０ｍｇ／ｋｂ、約２～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１～約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約２０ｍｇ／ｋｂ、約２～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象には、約０．５、０．６、０．７．０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えばリガンドに共役するｄｓＲＮＡは、週１回または月２回、対象に投与してもよい。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法を実施するキットを提供する。一実施形態では、本発明は、細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するのに有効な量の二本鎖ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させることで、細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１発現を阻害する方法を実施するキットを提供する。キットは、ＲＮＡｉ剤および使用説明書および、任意選択的に、ＲＮＡｉ剤を対象に投与する手段を含んでなる。
血液凝固カスケードの概略図である。 示されるｉＲＮＡの単回投与に続く、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中のＳｅｒｐｉｎｃ１発現の阻害を示すグラフである。 示されるｉＲＮＡの単回投与に続く、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中のＳｅｒｐｉｎｃ１発現の阻害を示すグラフである。 示されるＡＤ－５０５０９またはＡＤ－１９５５のＬＮＰ製剤の単回投与に続く、ＣＤ－１マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質（Ｂ）発現の阻害を示すグラフである。 示されるＡＤ－５０５０９またはＡＤ－１９５５のＬＮＰ製剤の単回投与に続く、ＣＤ－１マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質（Ｂ）発現の阻害を示すグラフである。 １ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５０５０９またはＡＤ－１９５５のＬＮＰ製剤の単回投与に続く、ＣＤ－１マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質（Ｂ）発現の阻害持続期間を示すグラフである。 １ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５０５０９またはＡＤ－１９５５のＬＮＰ製剤の単回投与に続く、ＣＤ－１マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質（Ｂ）発現の阻害持続期間を示すグラフである。 １ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５０５０９またはＡＤ－１９５５のＬＮＰ製剤の単回投与に続く、ＣＤ１マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１活性およびＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現の阻害を示すグラフである。 示されるＧａｌＮＡｃ共役ｉＲＮＡの１０ｍｇ／ｋｇの単回投与に続く、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルのノックダウン百分率を示すグラフである。 ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４の５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、および７５ｍｇ／ｋｇの単回投与、および５×５ｍｇ／ｋｇの反復投与に続く、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現の阻害を示すグラフである。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現の阻害持続期間に対する、ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４の反復投与の効果を示すグラフである。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現の阻害持続期間に対する、ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４の反復投与の効果を示すグラフである。 ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４を投与されたＣ５７ＢＬ／６マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現のサイレンシング持続期間に対する、示される分割投薬計画の効果を示すグラフである。 ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４を投与されたＣ５７ＢＬ／６マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現のサイレンシング持続期間に対する、示される分割投薬計画の効果を示すグラフである。 示されるＧａｌＮＡｃ共役ｉＲＮＡの１０ｍｇ／ｋｇ（Ａ）または３ｍｇ／ｋｇ（Ｂ）の単回投与に続く、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルのノックダウン百分率を示すグラフである。 示されるＧａｌＮＡｃ共役ｉＲＮＡの１０ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの単回投与に続く、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルのノックダウン百分率を示すグラフである。 示されるＧａｌＮＡｃ共役ｉＲＮＡの１０ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの単回投与に続く、Ｓｅｒｐｉｎｃ１活性のノックダウン百分率を示すグラフである。 ＡＤ－５７２１３の単回投与に対する、用量効果応答を示すグラフである。 血友病Ａマウ中における、ＡＤ－５７２１３の１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの単回投与に続く、Ｓｅｒｐｉｎｃ１のサイレンシング持続期間を示すグラフである。 ＡＤ－５７２１３の３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および０．３ｍｇ／ｋｇの単回投与に続く、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡ発現の阻害を示すグラフである。 示されるＡＤ－５７２１３（Ａ）、ＡＤ－５７２０５（Ｂ）、およびＡＤ－５７２１４（Ｃ）の単回投与に続く、Ｓｅｒｐｉｎｃ１のサイレンシング持続期間を示すグラフである。 ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５７２１３を投与されたＣ５７ＢＬ／６マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現のサイレンシング持続期間に対する、示される分割投薬計画の効果を示すグラフである。 ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５７２１３を投与されたＣ５７ＢＬ／６マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現のサイレンシング持続期間に対する、示される分割投薬計画の効果を示すグラフである。 ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５７２１３を投与されたＣ５７ＢＬ／６マウス中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現のサイレンシング持続期間に対する、示される分割投薬計画の効果を示すグラフである。 非ヒト霊長類中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現の持続期間に対する、示される化合物の単回投与スクリーニング効果を示すグラフである。 非ヒト霊長類中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現の持続期間に対する、ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５７２１３の単回投与スクリーニング効果を示すグラフである。 非ヒト霊長類中のＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質発現の持続期間に対する、示される化合物の単回投与スクリーニング効果を示すグラフである。 非ヒト霊長類中の血清抗トロンビン（Ｓｅｒｐｉｎｃ１）レベルに対する、化合物ＡＤ－５７２１３の単回投与の効果を示すグラフである。 非ヒト霊長類中における、血清抗トロンビン（Ｓｅｒｐｉｎｃ１）レベルと、ピーク血漿トロンビンレベルの変化倍数との相関に対する、化合物ＡＤ－５７２１３のＡ）１ｍｇ／ｋｇ、Ｂ）３ｍｇ／ｋｇ、Ｃ）１０ｍｇ／ｋｇ、およびＤ）３０ｍｇ／ｋｇの単回投与の効果を示すグラフである。ピークトロンビンの変化倍数は、二次ｙ軸（灰色）上に描写され、相対的抗トロンビンレベルは、一次ｙ軸（黒）上に描写される。 相対的抗トロンビン（Ｓｅｒｐｉｎｃ１）サイレンシングの関数としてのピークトロンビン増大の変化倍数として、ＡＤ－５７２１３の効果を示すグラフである。 非ヒト霊長類中の血清抗トロンビンレベルに対する、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｓｉＲＮＡの多回投与（０．５ｍｇ／ｋｇ ｑｗ、１ｍｇ／ｋｇ ｑ２ｗ、１．５ｍｇ／ｋｇ ｑｗ、３ｍｇ／ｋｇ ｑ２ｗ）の効果を示すグラフである。データ点は群平均を表し、誤差棒は標準偏差を表す（Ｎ＝３）。（ｑｗ＝毎週；ｑ２ｗ＝隔週）。 非ヒト霊長類中のＳｅｒｐｉｎｃ１サイレンシングの累積効果を示すグラフである。 非ヒト霊長類中のＳｅｒｐｉｎｃ１サイレンシングの累積効果を示すグラフである。 微小血管レーザー損傷に続く血小板蓄積に対する、Ｓｅｒｐｉｎｃ１サイレンシングの効果を示すグラフである。グラフは、全ての被害的損傷からの中央値を示す。 微小血管レーザー損傷に続くフィブリン面積に対する、Ｓｅｒｐｉｎｃ１サイレンシングの効果を示すグラフである。グラフは、全ての被害的損傷からの中央値を示す。 脂質核酸粒子に調合された化合物ＡＤ－５７２１３の投与に続く、Ｓｅｒｐｉｎｃ１サイレンシングの持続期間を示すグラフである。 ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）セルピンペプチダーゼインヒビター、分岐群Ｃ（抗トロンビン）、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＣ１）（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。 アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）セルピンペプチダーゼインヒビター、分岐群Ｃ（抗トロンビン）、メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＣ２）（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。 ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）セリン（またはシステイン）ペプチダーゼインヒビター、分岐群Ｃ（抗トロンビン）、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎｃ１）（配列番号３）のヌクレオチド配列を示す。 ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）セルピンペプチダーゼインヒビター、分岐群Ｃ（抗トロンビン）、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎｃ１）（配列番号４）のヌクレオチド配列を示す。 配列番号１の逆相補体（配列番号５）を示す。 配列番号２の逆相補体（配列番号６）を示す。 配列番号３の逆相補体（配列番号７）を示す。 配列番号４の逆相補体（配列番号８）を示す。 例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドＲＦＧＦのアミノ酸配列（ｓｅｑｅｕｎｃｅ）（配列番号９）；例示的なＲＦＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号１０）；ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質のアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｉｃｄ）配列（配列番号１１）；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２）；および例示的なペプチドベースの切断可能連結基のアミノ酸配列を示す。 抗トロンビン低下が、試験管内で、第ＩＸ因子枯渇ヒト血漿中のトロンビン生成を増大させることを描写するグラフである。 抗トロンビン低下が、試験管内で、第ＩＸ因子枯渇ヒト血漿中のトロンビン生成を増大させることを描写するグラフである。
本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらす、ｉＲＮＡ組成物を提供する。Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子は、例えばヒトなどの対象内の細胞などの細胞内にあってもよい。本発明はまた、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するための、および／またはＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の阻害または低下から利益を受ける、例えば血友病などの出血障害のような障害を有する対象を治療するために、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法も提供する。本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の阻害または低下から利益を受ける、例えば血友病のような出血障害などの障害を有する対象中で、例えば出血などの少なくとも１つの症状を予防する方法をさらに提供する。
本発明のｉＲＮＡとしては、例えば１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長などの約３０ヌクレオチド以下の長さの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が挙げられ、その領域は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。これらのｉＲＮＡの使用は、哺乳類中のＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。特に、非常に低投与量のＳｅｒｐｉｎｃ１ ｉＲＮＡは、特異的かつ効率的にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得て、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の著しい阻害がもたらされる。本発明者らは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１を標的にするｉＲＮＡが、試験管内および生体内でＲＮＡｉを媒介して、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の顕著な阻害をもたら得しことを実証した。したがってこれらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、例えば血友病のような出血障害を有する対象などの、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質のレベルおよび／または活性の低下によって利益を受ける対象を治療するのに有用である。
以下の詳細な説明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡを含有する組成物を作成して利用する方法、ならびこの遺伝子の発現の阻害および／または低下から利益を受ける疾患および障害を有する対象を治療するための組成物、使用、および方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。これに加えて、パラメータの値または値範囲が列挙される場合は常に、列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図されることに留意すべきである。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として「因子（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの因子、または例えば複数の因子などの２つ以上の因子を意味する。
「含む」という用語は、本明細書では、「をはじめとするが、これに限定されるものではない」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
「または」という用語は、本明細書では、文脈上、明確に別の意味でない限り、「および／または」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
本明細書の用法では、「Ｓｅｒｐｉｎｃ１」は、細胞内で発現される特定のポリペプチドを指す。Ｓｅｒｐｉｎｃ１は、セルピンペプチダーゼインヒビター、分岐群Ｃ（抗トロンビン）、メンバー１；抗トロンビンＩＩＩ；ＡＴ３；抗トロンビン；およびヘパリン補助因子１としてもまた知られている。ヒトＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：２５４５８８０５９（ＮＭ＿０００４８８；配列番号１）にある。アカゲザルＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：１５７１６７１６９（ＮＭ＿００１１０４５８３；配列番号２）にある。マウスＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：２３７８７４２１６（ＮＭ＿０８０８４４；配列番号３）にある。ラットＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：５８８６５６２９（ＮＭ＿００１０１２０２７；配列番号４）にある。
「Ｓｅｒｐｉｎｃ１」という用語は、本明細書の用法では、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の一塩基多型などの、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の自然発生的ＤＮＡ配列多様性によって、細胞内で発現される特定のポリペプチドも指す。Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子内の多数のＳＮＰが同定されており、例えばＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰにある（例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐを参照されたい）。Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子内のＳＮＰの非限定的例は、ＮＣＢＩｄｂＳＮＰ受入番号ｒｓ６７７；ｒｓ５８７７；ｒｓ５８７８；ｒｓ５８７９；ｒｓ９４１９８８；ｒｓ９４１９８９；ｒｓ１７９９８７６；ｒｓ１９６３７７１１；ｒｓ２００８９４６；およびｒｓ２２２７５８６にある。
本明細書の用法では、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡをはじめとする、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。一実施形態（ｅｍｂｏｄｍｅｎｔ）では、配列の標的部分は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近辺における、ｉＲＮＡ指向切断のための基質としての役割を果たすのに、少なくとも十分長い。
標的配列は、例えば約１５～３０ヌクレオチド長などの約９～３６ヌクレオチド長であってもよい。例えば、標的配列は、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドなど、約１５～３０ヌクレオチド長であり得る。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
本明細書の用法では、「配列を含んでなる鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して、言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含んでなる、オリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、通常、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される（例えば表２を参照されたい）。当業者は、このような置換部分を有するヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをその他の部分で置き換え得ることを十分承知している。制限を意図しない例として、塩基としてイノシンを含んでなるヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがってウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換え得る。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得て、標的ｍＲＮＡとＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に適する。
「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、本明細書定義で定義されるＲＮＡを含有して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じたＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。ｉＲＮＡは、例えば哺乳類対象などの対象内の細胞などの細胞内で、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現を調節し、例えば阻害する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤としては、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１標的ｍＲＮＡ配列などの標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する一本鎖ＲＮＡが挙げられる。理論による拘束は望まないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡに分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセスして、特徴的な２塩基３’オーバーハングがある１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次にｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡとの結合に際して、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘発する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様では、本発明は、細胞内で生成されて、ＲＩＳＣ複合体形成を促進し、標的遺伝子、すなわちＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のサイレンシングをもたらす一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上述したようなＲＮＡｉに言及するために、本明細書で使用される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために、細胞または生物に導入された「一本鎖ｓｉＲＮＡ」であってもよい。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に１５～３０個のヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡのデザインおよび試験は、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第８，１０１，３４８号明細書、およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される。本明細書に記載されるあらゆるアンチセンスヌクレオチド配列は、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０；：８８３－８９４に記載される方法で化学的に修飾して、使用してもよい。
別の態様では、薬剤は、アンチセンス阻害機序によって標的を阻害する、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列と相補的である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡと塩基対を形成して翻訳機構を物理的に妨害することにより、化学量論的様式で翻訳を阻害し得る。Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７－３５５を参照されたい。代案としては、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、標的とハイブリダイズ（ｈｙｄｒｉｄｉｚｉｎｇ）して、ＲＮａｓｅＨ切断事象を通じて標的を切断することで、標的ｍＲＮＡを阻害する。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１５～約３０ヌクレオチド長であってもよく、標的配列と相補的な配列を有する。例えば一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つのアンチセンス配列のいずれか１つからの、少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチド配列を含んでなってもよい。
別の実施形態では、本発明の組成物、使用、および方法で使用される「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書で「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわちＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子に関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると言及される、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含んでなる、二本鎖構造を有するリボ核酸分子複合体を指す。本発明のいくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書でＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機序を通じて、例えばｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡ分解を引き起こす。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた所望の標的ＲＮＡ特異的分解を可能にするあらゆる長さであってもよく、約９～３６塩基対長さなどの範囲であってもよく、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対長さなどの約１５～３０塩基対長さ、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、より大型のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大型の分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間が中断されていないヌクレオチド鎖によって結合される場合、結合ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含んでなり得て；いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含んでなり得る。
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は共有結合的に連結され得るが、必ずしもそうである必要はない。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なるヌクレオチド数を有してもよい。最大塩基対数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖中のヌクレオチド数から、二本鎖中に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでなってもよい。
本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えばｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びる、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含んでなり得て；代案としては、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つ以上のヌクレオチドを含んでなり得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含んでなり得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせの上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
本明細書でｄｓＲＮＡに関して用いられる「平滑化された」または「平滑末端化された」という用語は、ｄｓＲＮＡの所与の末端に不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体がない、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。ｄｓＲＮＡ末端の片方または双方が、平滑化され得る。ｄｓＲＮＡの双方の末端が平滑化されている場合、ｄｓＲＮＡは平滑末端化されたと言われる。明確化のために言うと、「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、双方の末端が平滑化されたｄｓＲＮＡであり、すなわち分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖である。
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡなどの標的配列と実質的に相補的な領域を含む、ｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡ鎖を指す。本明細書の用法では、「領域相補性」という用語は、例えば本明細書で定義されるようなＳｅｒｐｉｎｃ１ヌクレオチド配列のような標的配列などの配列と実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、分子の内部または末端領域にミスマッチがあり得る。一般に、最も耐容されるミスマッチは、例えばｉＲＮＡの５’および／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド内などの末端領域にある。
「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む、ｉＲＮＡ鎖を指す。
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解されるであろうように、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を生成する能力を指す。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であり得て、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４の４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間と、それに続く洗浄が挙げられる（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件の組を判定することができる。
例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補配列は、片方または双方のヌクレオチド配列全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし本明細書で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは最大で３０塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、例えばＲＩＳＣ経路を通じた遺伝子発現の阻害などのそれらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、１つまたは複数であるが概して５、４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含んでなり、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含んでなるｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的では、なおも「完全に相補的」と称される。
「相補的」配列は、本明細書の用法ではまた、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間の、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列間の塩基整合に関して使用し得る。
本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えばＳｅｒｐｉｎｃ１をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えばポリヌクレオチドは、配列が、Ｓｅｒｐｉｎｃ１をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的であれば、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載されるように、片方または双方の鎖はまた、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドなどの１つまたは複数の非リボヌクレオチドも含み得る。さらに「ｉＲＮＡ」としては、化学修飾のあるリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾としては、本明細書で開示され、または当該技術分野で公知の全てのタイプの修飾が挙げられる。本明細書および特許請求の目的で、あらゆるこのような修飾は、ｉＲＮＡ分子における用法では「ｉＲＮＡ」に包含される。
「阻害する」という用語は、本明細書の用法では、「低下させる」、「サイレンシング」、「下方制御」、「抑制」、およびその他の類似した用語と同義的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。
「Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現を阻害する」という語句は、本明細書の用法では、あらゆるＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子（例えばマウスＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子、ラットＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子、サルＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子、またはヒトＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子など）、ならびにＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質をコードするＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の変種または変異体の発現の阻害を含む。
「Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の阻害」としては、例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の阻害などのＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の少なくとも部分的抑制などのＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のあらゆるレベルの阻害が挙げられる。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現は、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡレベル、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベル、または例えばトロンビン生成能力（ｐｏｒｔｅｎｔｉａｌ）尺度としてのトロンビン：抗トロンビン複合体レベル、出血時間、プロトロンビン時間（ＰＴ）、血小板数、および／または活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）などの、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現に伴うあらゆる変数のレベルに基づいて評価してもよい。阻害は、対照レベルと比較した、これらの変数の１つまたは複数の絶対または相対レベルの低下によって評価してもよい。対照レベルは、例えば投与前基線レベル、または未処置のまたは対照（例えば緩衝液のみの対照または非活性薬剤対照など）で処置された同様の対象、細胞、またはサンプルから測定されたレベルなどの当該技術分野で利用される、あらゆるタイプの対照レベルであってもよい。
一実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の少なくとも部分的抑制は、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、しかるべく処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現が阻害されるように処置されている、その中でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子が転写される第１の細胞または細胞群から単離され、またはその中に検出され得る、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの量の低下によって評価される。阻害の程度は、
を用いて表してもよい。
本明細書の用法では、ｄｓＲＮＡなどの「ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させる」という語句は、あらゆる可能な手段によって細胞を接触させるステップを含む。ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させることは、試験管内でｉＲＮＡに細胞を接触させる、または生体内でｉＲＮＡに細胞を接触させるステップを含む。接触は、直接または間接的に実施してもよい。したがって、例えば方法を実施する者が、ＲＮＡｉ剤を細胞と物理的に接触させてもよく、または代案としては、引き続いて細胞との接触が可能になり、または引き起こされる状況に、ＲＮＡｉ剤を置いてもよい。
試験管内における細胞の接触は、例えば細胞をＲＮＡｉ剤と共にインキュベートして実施してもよい。生体内における細胞の接触は、例えば細胞が位置する組織内にまたはその近辺にＲＮＡｉ剤を注入して実施してもよく、または接触させる細胞が位置する組織に引き続いて薬剤が到達するように、例えば血流または皮下空隙などの別の領域にＲＮＡｉ剤を注入して実施してもよい。例えばＲＮＡｉ剤は、例えば肝臓などの対象部位にＲＮＡｉ剤を誘導する、ＧａｌＮＡｃ３などのリガンドを含有し、および／またはそれと共役していてもよい。試験管内と生体内接触法の組み合わせもまた、可能である。例えば細胞を試験管内でＲＮＡｉ剤と接触させて、引き続いて対象に移植してもよい。
一実施形態では、細胞をｉＲＮＡに接触させるステップは、細胞内への取り込みまたは吸収を容易にし、またはそれをもたらすことで、「ｉＲＮＡを導入する」または「細胞に送達する」ステップを含む。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、助力を受けない拡散性または活性細胞過程を通じて、または助剤または装置によって生じ得る。ｉＲＮＡの細胞内への導入は、試験管内および／または生体内であってもよい。例えば生体内導入のために、ｉＲＮＡを組織部位に注射し、または全身投与し得る。生体内送達はまた、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，０３２，４０１号明細書および米国特許第５，６０７，６７７号明細書、および米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号明細書に記載されるものなどのβ－グルカン送達系によって実施し得る。細胞への生体外導入としては、電気穿孔およびリポフェクションなどの当該技術分野で公知の方法が挙げられる。さらなるアプローチは、本明細書で以下に記載され、および／または当該技術分野で公知である。
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、例えばｉＲＮＡなどの核酸分子またはそれからｉＲＮＡが転写されるプラスミドなどの薬理的活性分子を封入する脂質層を含んでなる、小胞である。ＬＮＰは、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第６，８５８，２２５号明細書、米国特許第６，８１５，４３２号明細書、米国特許第８，１５８，６０１号明細書、および米国特許第８，０５８，０６９号明細書に記載される。
「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定した核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡなどの核酸またはそれからｉＲＮＡが転写されるプラスミドを含んでなる、還元性水性内部を覆う、脂質の小胞である。ＳＮＡＬＰは、例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号明細書、米国特許出願公開第２００７０１３５３７２号明細書、および国際公開第２００９０８２８１７号パンフレットに記載される。「ＳＮＡＬＰ」製剤の例は、下述される。
本明細書の用法では、「対象」は、霊長類（ヒト、例えばサルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類など）、非霊長類（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラなど）をはじめとする哺乳類、または鳥類（例えばアヒルまたはガチョウ）などの動物である。一実施形態では、対象は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を治療されまたは評価されるヒト；Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状のリスクがあるヒト；Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を有するヒト；および／または本明細書に記載されるようにＳｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を治療されるヒトなどのヒトである。本明細書の用法では、「治療する」または「治療」という用語は、検出可能または検出不能を問わない、１つまたは複数の症状の緩和または改善、出血程度の低減、出血状態の安定化（すなわち悪化しない）、出血の改善または一時的緩和をはじめとするが、これに限定されるものではない、有益なまたは所望の結果を指す。「治療」はまた、治療不在下の予測生存期間と比較した生存期間の長期化も意味し得る。
「低下させる」とは、疾病マーカまたは症状の文脈で、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％以上であり得て、好ましくは、このような疾患がない個人の正常範囲内にあると一般に認められたレベルに低下する。
本明細書の用法では、Ｓｅｒｔｐｉｎｃ１遺伝子の発現低下から利益を受ける、疾患、障害またはその病状に関して使用される「予防」または「予防する」は、対象が例えば出血のような症状などの、このような疾患、障害、または病状に伴う症状を発症する可能性の低下を指す。出血を発症する可能性は、例えば１つまたは複数の出血危険因子を有する個人が出血を発症しない場合に、または同一危険因子を有して本明細書に記載される治療を受けない集団と比較して重症度のより低い出血を発症する場合に、低下される。疾患、障害または病状を発症しないこと、またはこのような疾患、障害または病状に伴う症状発症の減少（例えばその疾患または障害の臨床的に認められた尺度で少なくとも約１０％の）、または遅延した症状呈示の遅延（例えば数日間、数週間、数ヶ月または数年間）が、効果的予防と見なされる。
本明細書の用法では、「出血障害」という用語は、芳しくない血液凝固および／または過剰な出血をもたらす疾患または障害である。出血障害は、血友病またはフォン・ウィルブラント病などの遺伝性障害であってもよく、または例えば、播種性血管内凝固症候群、妊娠関連子癇、ビタミンＫ欠損、自己免疫障害、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、皮膚科学的障害（例えば乾癬、天疱瘡）、呼吸器疾患（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患）、例えばアスピリンやヘパリンやワルファリンなどの投薬の結果のアレルギー薬物反応、糖尿病、急性Ｂ型肝炎感染、急性Ｃ型肝炎感染、悪性病変または固形腫瘍（例えば前立腺、肺、結腸、膵臓、胃、胆管、頭頸部、子宮頸部、乳房、黒色腫、腎臓、および／または血液学的悪性病変）に関連する後天性疾患であってもよい。一実施形態では、遺伝性出血障害は、例えば血友病Ａ、Ｂ、またはＣなどの血友病である。一実施形態（ｅｍｂｏｄｍｅｎｔ）では、対象は、例えば血友病などの遺伝性出血障害を有し、代替凝固療法に対して、例えば同種抗体インヒビターなどのインヒビターを生じており、本明細書で「インヒビター対象」と称される。一実施形態では、インヒビター対象は、血友病Ａを有する。別の実施形態では、インヒビター対象は、血友病Ｂを有する。さらに別の実施形態では、インヒビター対象は、血友病Ｃを有する。
本明細書の用法では、「治療有効量」は、出血障害および出血を有する対象に投与されると、（例えば既存の疾患の、または１つまたは複数の疾患症状の低減、改善または維持によって）疾患の治療をもたらすのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤投与方法、疾患とその重症度、および治療される対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的体質、先行または併用治療薬のタイプ、もしあればその他の個人特性に応じて変動してもよい。
本明細書の用法では、「予防有効量」は、例えば出血障害を有して外科手術が予定されている対象などの、出血障害を有するが出血していない対象に投与されると、疾患の、または１つまたは複数の疾患症状を予防または改善するのに十分なｉＲＮＡの量を含むことが意図される。疾患の改善としては、疾患経過の減速、または後に発症する疾患の重症度の低下が挙げられる。「予防有効量」は、ｉＲＮＡ、薬剤投与方法、疾患リスクの程度、および治療される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的体質、先行または併用治療薬のタイプ、もしあればその他の個人特性に応じて変動してもよい。
「治療有効量」または「予防有効量」としてはまた、あらゆる治療薬に当てはまる妥当な利点／リスク比で、いくつかの所望の局所性または全身性効果を生じる、ＲＮＡｉ剤の量も挙げられる。本発明の方法で用いられるｉＲＮＡは、このような治療に当てはまる妥当な利点／リスク比を生じるのに十分な量で、投与されてもよい。
「薬学的に許容可能」という語句は、本明細書で、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答がなく、またはその他の問題または合併症が、妥当な利点／リスク比で釣り合う、ヒト対象および動物対象の組織との接触で使用するのに適する、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
本明細書の用法では、「薬理的に許容可能な担体」という語句は、液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば潤滑剤、滑石マグネシウム、カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）など）、または対象化合物を１つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分に運搬または輸送するのに関与する溶媒封入材料などの、薬理的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤のその他の成分と適合し、治療される対象に傷害性でないと言う意味で、「許容可能」でなくてはならない。薬理的に許容可能な担体の役割を果たし得る材料のいくつかの例としては、（１）乳糖、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースとその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）マグネシウム状態（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、および滑石などの平滑剤；（８）カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーンオイル、および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびエチルラウレートなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質非含有水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ、およびＬＤＬなどの血清成分；および（２２）医薬製剤で用いられるその他の無毒の適合性物質が挙げられる。
本明細書の用法では、「サンプル」という用語は、対象から単離された同様の体液、細胞、または組織の採取物、ならびに対象内に存在する体液、細胞、または組織を含む。生体液の例としては、血液、血清および漿液（ｓｅｒｏｓａｌ ｆｌｕｉｄｓ）、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織サンプルとしては、組織、臓器または局在性領域からのサンプルが挙げられる。例えばサンプルは、特定の臓器、臓器の部分、または体液またはこれらの臓器内の細胞に由来してもよい。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば肝臓全体または肝臓の特定部分、または例えば肝実質細胞などの肝臓の特定タイプの細胞）に由来してもよい。いくつかの実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取された血液または血漿を指す。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本明細書に記載されるのは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡである。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、例えば遺伝性出血障害などの出血障害を有するヒトのような、哺乳類などの対象内の細胞などの細胞内で、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約３０ヌクレオチド以下の長さ（例えば約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド以下の長さ）である。Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を発現する細胞との接触に際して、ｉＲＮＡは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子（例えばヒト、霊長類、非霊長類、または鳥類Ｓｅｒｔｐｉｎｃ１遺伝子）の発現を、例えばＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法による、または例えばウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などのタンパク質ベースの方法によるアッセイで、少なくとも約１０％阻害する。
ｄｓＲＮＡは相補的な２本のＲＮＡ鎖を含み、それらはその中でｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補領域として含有され得る。
一般に、二本鎖構造は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどの１５～３０塩基対長さである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
同様に、標的配列の相補性領域は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長など１５～３０ヌクレオチド長である。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１５～約２０ヌクレオチド長、または約２５～約３０ヌクレオチド長である。一般にｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質の役割を果たすのに十分長い。例えば約２１～２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡが、ダイサーの基質の役割を果たしてもよいことは、当該技術分野で周知である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわちＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質となるのに十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。
当業者は、例えば約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対などの約９～３６塩基対の二本鎖領域などの二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要機能部分であることもまた認識するであろう。したがって一実施形態では、それが例えば、所望のＲＮＡを切断に標的化する１５～３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる範囲内で、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡでない。別の実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大型のｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、例えば１、２、３、または４ヌクレオチドなどの１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端相当物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含んでなり得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせ上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察されるように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるものなどの自動ＤＮＡ合成機を使用して、当該技術分野で公知の標準法によって合成し得る。
本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階法を使用して調製されてもよい。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別々に調製される。次に、構成要素鎖がアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機または双方を使用して調製し得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製し得る利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または双方を使用して調製し得る。
一態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列の少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。センス鎖は、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つで提供される配列群から選択され、センス鎖に対応するアンチセンス鎖は、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つの配列群から選択される。この態様では、２配列の一方は２配列の他方に相補的であり、配列の１つは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現中に生じるｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。したがってこの態様では、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、１つのオリゴヌクレオチドは、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つのセンス鎖と説明され、第２のオリゴヌクレオチドは、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つのセンス鎖に対応するアンチセンス鎖と説明される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチド上に含有される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、単一オリゴヌクレオチド上に含有される。
表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１の配列の一部は、修飾および／または共役配列と説明されるが、例えば本発明のｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未修飾、非共役、および／または説明されるものとは異なって修飾されおよび／または共役している、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１に記載される配列のいずれか１つを含んでなってもよいものと理解される。
当業者は、例えば２１塩基対などの約２０～２３塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７－６８８８）。しかし他の当業者らは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造もまた、同様に効果的であり得ることを見出している。（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上述の実施形態では、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つで提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最低限２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。片方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けている、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つの配列の１つを有するより短い二本鎖が、上で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。したがって表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つの配列の１つに由来する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチドの配列を有して、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害する能力が、完全長配列を含んでなるｄｓＲＮＡと、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％の以下異なるｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが意図される。
さらに表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０、および２１のいずれか１つで提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に対する感受性が高いＳｅｒｐｉｎｃ１転写物中の部位を同定する。したがって本発明は、これらの配列の１つ内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書の用法では、ｉＲＮＡが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子中の選択配列に隣接する領域からの追加的なヌクレオチド配列と連結する、表３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０および２１のいずれか１つで提供される配列の１つからの約１５個の連続ヌクレオチドを含む。
標的配列は、一般に約１５～３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的例として２１個のヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えばコンピュータシミュレーションによるものをはじめとする）配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチもまた取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスは、同定された配列の系統的合成、および（本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知のアッセイを使用した）至適に機能する配列を同定する試験と相まって、ｉＲＮＡ剤で標的化した場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定し得る。したがって例えば表２、３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０および２１のいずれか１つ中で同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、連続的に「ウィンドウを歩行させる」ことにより、同等またはより良い阻害特性がある配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。
さらにヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、これらの作成された配列を試験することにより、例えば表２、３、４、８、１１、１２、１４、１５、２０および２１のいずれか１つ中で同定される、あらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で考察されるその他の修飾によって、発現阻害物質として分子をさらに最適化する（例えば血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など）ことで、このような最適化配列を調節し得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤鎖では、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心的な１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。ＳＥＲＰＩＮＣ１遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの有効性の検討は、特にＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に、重要である。
ＩＩＩ．発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未変性であり、例えば当該技術分野で公知であり本明細書に記載される、化学修飾および／または結合を含まない。別の実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの発明のｉＲＮＡのＲＮＡを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本発明で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって、合成および／または修飾し得る。例えば修飾としては、例えば５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）または３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；糖修飾（例えば２’位または４’位における）または糖置換；リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。いくつかの実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’－５’結合、それらの２’－５’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。
上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；米国特許第５，６２５，０５０号明細書；米国特許第６，０２８，１８８号明細書；米国特許第６，１２４，４４５号明細書；米国特許第６，１６０，１０９号明細書；米国特許第６，１６９，１７０号明細書；米国特許第６，１７２，２０９号明細書；米国特許第６、２３９，２６５号明細書；米国特許第６，２７７，６０３号明細書；米国特許第６，３２６，１９９号明細書；米国特許第６，３４６，６１４号明細書；米国特許第６，４４４，４２３号明細書；米国特許第６，５３１，５９０号明細書；米国特許第６，５３４，６３９号明細書；米国特許第６，６０８，０３５号明細書；米国特許第６，６８３，１６７号明細書；米国特許第６，８５８，７１５号明細書；米国特許第６，８６７，２９４号明細書；米国特許第６，８７８，８０５号明細書；米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有するその他のものが挙げられる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
別の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡ中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の双方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中では、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに本発明のｉＲＮＡ中で使用するのに適するＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載される。
本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡ、および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［天然リン酸ジエステル主鎖は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの１つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、またはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１～約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしてもまた知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわちアルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’－ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および、２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。
その他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン；５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニルウラシルおよびシトシン；６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）；４－チオウラシル；８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５－ハロ、具体的には５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン；８－アザグアニンおよび８－アザアデニン；７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８で開示されるもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンをはじめとする、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、およびＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用する、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第５，７５０，６９２号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含むように修飾され得る。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、その中でリボース部分は、２’および４’炭素を結合する追加の架橋を含んでなる。この構造は、リボースを３’－エンド立体構造内に効果的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の追加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増大させ、非特異的効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；米国特許第６，６７０，４６１号明細書；米国特許第６，７９４，４９９号明細書；米国特許第６，９９８，４８４号明細書；米国特許第７，０５３，２０７号明細書；米国特許第７，０８４，１２５号明細書；および米国特許第７，３９９，８４５号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－リン酸、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが挙げられる。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットにある。
ＩＶ．リガンド共役ｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、１つまたは複数のリガンド、部分または複合体を、ＲＮＡに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３－６５５６）などの脂質部分；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３－１０６０）；例えばベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０：５３３－５３８）などのチオエーテル；例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９－５４）などの脂肪族鎖；例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７－３７８３）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９－９７３）；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９－２３７）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３－９３７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
リガンドは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。
リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓｅａｍｉｎｅ）多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えば肝臓細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化因子、またはＮＦ－κＢ活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態調節因子（ＰＫ調節因子）を指す。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含んでなるオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが、知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含んでなる、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態中で、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチドは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への付加から誘導されるものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって、合成してもよい（下述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、または付着する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に、そして慣例的に、周知の固相合成技術を通じて生成されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）をはじめとする、いくつかの供給業者によって販売される。それに加えて、または代案として、当該技術分野で公知のこのような合成のためのその他のあらゆる手段を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのその他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた知られている。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチド、およびリガンド分子を保有する配列特異的結合ヌクレオシド中では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を保有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既にリガンド分子を保有するリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシド－複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを保有する基本単位を使用して、適切なＤＮＡ合成機上で組み立ててもよい。
既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次にリガンド分子が結合部分と反応されて、リガンド共役オリゴヌクレオチドが生成する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されて、慣例的にオリゴヌクレオチド合成で使用される、標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。
Ａ．脂質複合体
１つの実施形態では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばナプロキセンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
例えば複合体の標的組織への結合を制御するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、または肝臓細胞などの標的細胞に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα－らせん剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５～５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号９）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１０））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１１））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１２））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ－ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。細胞標的化目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ作用物質に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを使用し得る。
本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）としては、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が挙げられる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にするその他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的にする。
「細胞透過性ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ－３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸（例えばＰＲ－３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物複合体
本発明の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含んでなる。炭水化物共役ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）を有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）をそれぞれ有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、Ｃ５以上（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類が挙げられる（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は単糖である。一実施形態では、単糖は、
などのＮ－アセチルガラクトサミンである。
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は、

からなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態で使用される別の代表的な炭水化物複合体としては、
（式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、炭水化物複合体は、ＰＫ調節因子および／または細胞透過性ペプチドなどであるが、これに限定されるものではない、上述の１つまたは複数の追加的なリガンドをさらに含んでなる。
Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。
「リンカー」または「連結基」という用語は、例えば化合物の２つの部分に共有結合するなどの、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合、または酸素またはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）などであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含んでなり、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環（式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一実施形態では、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４個の原子、３～２４個の原子、４～２４個の原子、５～２４個の原子、６～２４個の原子、６～１８個の原子、７～１８個の原子、７～１７この原子、８～１７個の原子、６～１６個の原子、７～１６個の原子、または、８～１６個の原子である。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中において、または第２の標準状態下（例えば血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍より迅速に切断される。
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１～７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍より迅速に切断される。
ｉ．酸化還元切断可能連結基
１つの実施形態では、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。１つの候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含んでなる。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｉｉ．酸切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含んでなる。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｖ．エステルベースの連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含んでなる。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｖ．ペプチドベースの切断基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含んでなる。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物と共役する。本発明の組成物および方法のリンカーと共役するｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例としては、
（式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する１つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、
式（ＸＸＸＩ）～（ＸＸＸＩＶ）、
（式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、０～２０の各出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なり得て；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つまたは複数によって中断または終結され得て；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表し；すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）のいずれかで示される構造群から選択される、二価または三価の分枝リンカーと共役する。三価の共役ＧａｌＮＡｃ誘導体は、
式（ＸＸＸＶ）、
（式中、
Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）などの標的遺伝子の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体に共役する適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上で列挙された構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８および５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書、米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
所与の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、前述の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物もまた含む。
「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａｓ）」は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがってＲＮａｓｅ Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡによって、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、そして必要ならば当該技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣例的に検出し得る。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的な共役結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合する分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体精製は、典型的に純粋な複合体を与える。
ＩＶ．発明のｉＲＮＡの送達
例えばヒト対象（例えば出血障害を有する対象などのそれを必要とする対象）などの対象内の細胞などの細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。例えば送達は、試験管内または生体内のどちらかで、細胞を本発明のｉＲＮＡに接触させることで実施してもよい。生体内送達はまた、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含んでなる組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。代案としては、生体内送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、下でさらに考察される。
一般に、（試験管内または生体内で）核酸分子を送達するあらゆる方法が、本発明のｉＲＮＡで使用するために適応させ得る（例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。生体内送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために検討すべき要素としては、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織中の送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織内への直接注射または移植または製剤を局所投与するなどの局所投与によって最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被り得る、または作用物質を分解し得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２－１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．， ｅｔ ａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０－２１６）、ＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７－２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３－３５０；Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５－５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）、および鼻腔内投与による肺への（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６－４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７－１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０－５５）局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、生体内エンド－およびエキソ－ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５－１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えばＫｉｍ ＳＨ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出）、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、“ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８月１６日オンライン先行発表；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子標的化ｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．国際公開第００／２２１１３号パンフレット；Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号パンフレット；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモータによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合良い制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにするあらゆる別の手段などであり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入し得る。１週間以上の期間にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的化する、ｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数脂質形質移入もまた、本発明により検討される。ベクターの宿主細胞への成功裏の導入は、様々な既知の方法を使用してモニターし得る。例えば一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光性マーカなど、レポーターによって示し得る。生体外における細胞への安定した形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定環境要素（例えば抗生物質および薬剤）耐性を提供するマーカを使用して、確実にし得る。
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、所望ならば、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の態様は、以下にさらに詳しく記載する。
ｉＲＮＡを送達するのに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織中のｉＲＮＡの発現に十分な調節因子（プロモータ、エンハンサーなど）を含む。調節因子は、構成的または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択し得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば循環グルコースレベル、またはホルモンなどの特定の生理学的制御因子に感受性の誘導性制御配列を使用して、正確に調節し得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０－２４）。細胞または哺乳類におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適するこのような誘導性発現系としては、例えばエクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、適切な調節／プロモータ配列を選択できる。
ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用し得る。例えばレトロウイルスベクターを使用し得る（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１－５９９（１９９３）を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を容易にする、１つまたは複数のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターに関してより詳しくは、例えば化学療法により高い耐性を示す幹細胞を生成するために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１－３０２（１９９４）にある。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例証するその他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４－６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７－１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９－１４１（１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０－１１４（１９９３）である。使用が検討されるレンチウイルスベクターとしては、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；米国特許第５，６６５，５５７号明細書；および米国特許第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられる。
アデノウイルもまた、本発明のｉＲＮＡの送達で使用するために検討される。アデノウイルは、例えば気道上皮に遺伝子を送達するために、特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルは気道上皮に天然で感染して、軽症の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系その他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルは、非分裂細胞に感染できる利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９－５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子療法のレビューを提示する。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３－１０（１９９４）は、遺伝子をアカゲザルの気道上皮に移入するための、アデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルの使用のその他の事例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１－４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３－１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５－２３４（１９９３）；国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；およびＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５－７８３（１９９５）にある。本発明で取り上げるｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６－１０１０に記載される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターもまた、本発明のｉＲＮＡを送達するために使用され得る（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９－３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモータ、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータのいずれかを有する、組換えＡＡＶベクターからの２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げるｄｓＲＮＡを発現するのに適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６－３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０－５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載される。
本発明のｉＲＮＡを送達するのに好適な別のウイルスベクターは、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニアなどのワクシニアウイルス、鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスなどのポックスウイルスである。
ウイルスベクターの親和性は、必要に応じて、その他のウイルスからの外被タンパク質またはその他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることで、または異なるウイルスからのカプシドタンパク質で置換することで、修飾し得る。例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質によって、レンチウイルスベクターをシュードタイピングし得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを遺伝子操作して、異なるカプシドタンパク質血清型を発現させることで、異なる細胞を標的化するようにできる；例えばその開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１－８０１を参照されたい。
ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中のベクターを含み得て、またはその中に遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放マトリックスを含み得る。代案としては、例えばレトロウイルスベクターなどの完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞から無傷で生成され得る場合、医薬品は遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。
Ｖ．発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤もまた含む。一実施形態では、本発明で提供されるのは、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物である。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、例えば出血障害などのＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現または活性に関連する、疾患または障害を治療するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて調合される。一実施例は、例えば静脈内（ＩＶ）送達による、非経口送達を通じた、全身投与のために調合される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ輸液などの脳内点滴による、脳実質内への直接送達のために調合される組成物である。本発明の医薬組成物は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するのに十分な投与量で投与してもよい。一般に、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、１日あたり受容者の体重１キログラムあたり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、一般に１日あたり体重１キログラムあたり約１～５０ｍｇの範囲である。例えばｄｓＲＮＡは、単回投与あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇで投与し得る。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与してもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約５０ｍｇ／ｋｂ、約２～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１～約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４５ｍｇ／ｋｂ、約２～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１～約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４０ｍｇ／ｋｂ、約２～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約３０ｍｇ／ｋｂ、約２～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１～約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約２０ｍｇ／ｋｂ、約２～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えばｄｓＲＮＡは、約０．．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約５０ｍｇ／ｋｂ、約２～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１～約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４５ｍｇ／ｋｂ、約２～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１～約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４０ｍｇ／ｋｂ、約２～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約３０ｍｇ／ｋｂ、約２～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１～約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約２０ｍｇ／ｋｂ、約２～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象には、約０．５、０．６、０．７．０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
医薬組成物は、毎日１回投与し得て、またはｉＲＮＡは、一日を通して適切な間隔で、２、３回以上の部分用量として投与し得て、または持続注入または放出制御製剤を通じた送達さえも使用して、投与し得る。その場合、各部分用量に含有されるｉＲＮＡは、１日あたり総用量を達成するために、対応してより少量でなくてはならない。投薬単位はまた、例えば数日間にわたってｉＲＮＡの徐放を提供する、従来型の徐放性製剤を使用して、数日間にわたる送達のために配合し得る。徐放性製剤は当該技術分野で周知であり、特に、本発明の作用物質で使用し得る、特定部位への作用物質送達のために有用である。この実施形態では、投薬単位は、相当する複数の１日量を含有する。
別の実施形態では、医薬組成物の単回投与は、引き続く用量が、３、４、または５日間以下の間隔で、または１、２、３、または４週間以下の間隔で投与されるように、長期にわたり得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、週１回投与される。本発明の別の実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、月２回投与される。
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、および存在するその他の疾患をはじめとするが、これに限定されるものではない、特定の要因が、対象を効果的に治療するのに要求される用量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに治療有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量および生体内半減期は、本明細書の他の箇所で記載されるように、従来の手順を使用して、または適切な動物モデルを使用した生体内試験に基づいて、推定し得る。
マウス遺伝学における進歩は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける出血障害などの、様々なヒト疾患研究のためのいくつかのマウスモデルを作り出した。このようなモデルは、ｉＲＮＡの生体内試験のために、ならびに治療有効用量を判定するために、使用し得る。例えば、Ｂｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １０３：１２３３－１２３８、Ｂｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １０：１１９－２１、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ９０：３９６２－６、Ｋｕｎｄｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２：１６８－７４、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９４：１１５６３－６、および Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０４：１７３３に記載されるものなどの凝固因子遺伝子ノックアウトを有するマウスのような、血友病Ａマウスモデルおよび血友病（Ｈｅｍｏｈｐｈｉｌｉａ）Ｂマウスモデルなどの適切なマウスモデルが当該技術分野で公知である。
本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所（例えば経皮パッチによる）、例えばネブライザーをはじめとする、粉末または煙霧剤の吸入または吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；例えば埋め込みデバイスを通じた真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。ｉＲＮＡは、肝臓（例えば肝臓の実質細胞）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましい可能性もある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されることができ、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成することができる。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩）が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。
Ａ．膜様分子アセンブリーを含んでなるｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法で使用されるｉＲＮＡは、例えばリポソームまたはミセルなどの膜様分子アセンブリー内の送達のために調合し得る。本明細書の用法では、「リポソーム」という用語は、例えば１つの二重層または複数の二重層などの、少なくとも１つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層のまたは多重膜小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、典型的にｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては含んでもよい。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するので、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、ｉＲＮＡを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではｉＲＮＡが標的ＲＮＡに特異的に結合し得て、ＲＮＡｉを媒介し得る。場合によっては、リポソームもまた特異的に標的化され、例えばｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
ＲＮＡｉ剤を含有するリポソームは、多様な方法によって調製し得る。一例では、リポソームの脂質成分は、脂質成分なしでミセルが形成されるように、洗剤に溶解される。例えば脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得て、非イオン性であってもよい。例示的な洗剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次にＲＮＡｉ剤調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基はＲＮＡｉ剤と相互作用して、ＲＮＡｉ剤周囲で凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって洗剤を除去し、ＲＮＡｉ剤のリポソーム調製物を得る。
必要ならば、例えば凝縮を助ける担体化合物を、制御された添加によって縮合反応中に添加し得る。例えば担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えばスペルミンまたはスペルミジン）であり得る。ｐＨもまた調節して、凝縮を支援し得る。
送達ビヒクルの構造的構成要素としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む、安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成する方法は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットにさらに記載される。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の１つまたは複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用される適切なサイズの脂質凝集体を調製する一般に使用される技術としては、超音波処理、および凍結解凍と押出の組み合わせが挙げられる（例えばＭａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小型（５０～２００ｎｍ）で比較的均一な凝集体が所望される場合は、顕微溶液化を使用し得る（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、リポソーム内のＲＮＡｉ剤調製品の詰め込みに容易に適応される。
リポソームは、２つの大まかなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合してエンドソーム内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂して、それらの内容物を細胞質内へ放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０－９８５）。
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、核酸と複合体を形成せず、むしろそれを封入する。核酸と脂質は、どちらも同様の荷電を持つため、複合体形成ではなく反発が起きる。それでもなおいくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養中で、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を細胞単層に送達するのに使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９－２７４）。
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
試験管内および生体内でリポソームを細胞内に導入するその他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含んでなる系が研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含んでなる非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚真皮内へシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を容易にする上で、効果的であることを示唆した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
リポソームはまた、「立体的安定化」リポソームを含み、この用語は本明細書の用法では、１つまたは複数の特殊化された脂質を含んでなるリポソームを指し、それは、リポソーム中に組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、改善された循環寿命をもたらす。立体的安定化リポソームの例は、その中で、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含んでなり、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論による拘束も望まないが、当該技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的安定化リポソームでは、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の改善は、細網内皮系（ＲＥＳ：ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ）細胞への取り込み低下に由来するものと考えられる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つまたは複数の糖脂質を含んでなる様々なリポソームが、当該技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳しく説明された。どちらもＡｌｌｅｎらに付与された、米国特許第４，８３７，０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリンと、（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含んでなる、リポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含んでなるリポソームを開示する。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含んでなるリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍら）で開示される。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれ、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームには、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込み得て；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化されたＲＮＡｉ剤を代謝および分解から保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）を使用して、小型リポソームを形成し得て、それは核酸と自然発生的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合できる脂質－核酸複合体を形成し、ＲＮＡｉ剤送達をもたらす（ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの併用の説明については、例えばＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７および米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
ＡＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ錯化小胞を形成し得る。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、生体組織培養細胞に、高アニオン性核酸を送達するための効果的薬剤であり、それは負に帯電したポリヌクレオチドと自然発生的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含んでなる。十分に正に帯電したリポソームを使用すれば、得られる複合体上の正味電荷もまた正である。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然発生的に付着して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞内に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合でなくエステルによって結合することで、ＤＯＴＭＡと異なる。
その他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、２つの脂質タイプの１つと共役するカルボキシスペルミンをはじめとする、多様な部分と共役しているものが挙げられ、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
別のカチオン性脂質複合体は、ＤＯＰＥと組み合わされてリポソームに調合されているコレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）による、脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥに共役させて生成されるリポポリリジンが、血清存在下における形質移入に効果的であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞系では、共役するカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的な形質移入を提供すると言われている。その他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適したその他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号パンフレットおよび国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載される。
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームはその他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収に関連した副作用の低下、所望標的における投与薬剤の蓄積増大、およびＲＮＡｉ剤を皮膚内に投与する能力が挙げられる。いくつかの実装では、リポソームは、ＲＮＡｉ剤を表皮細胞に送達するのに、また例えば皮膚内などの皮膚組織内へのＲＮＡｉ剤の浸透を高めるのに使用される。例えばリポソームは、局所的に塗布し得る。リポソームとして調合された治療薬の皮膚への局所送達が、実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５－４１０およびｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２－５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５，１９８７を参照されたい）。
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含んでなるシステムが研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含んでなる非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮内に薬剤を送達するのに使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能にし得る。このような変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい孔を通り抜けて、リポソームが浸透できるようにし得る。例えばトランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、通常は界面活性剤である表面エッジ活性化剤を、標準リポソーム組成物に添加して、作成し得る。ＲＮＡｉ剤を含むトランスファーソームは、皮膚内のケラチノサイトにＲＮＡｉ剤を送達するために、例えば感染によって皮下送達し得る。無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。さらに脂質特性のために、これらのトランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、自己最適化し（例えば皮膚孔の形状に適応する）、自己修復し得て、断片化することなく頻繁にそれらの標的に到達し得て、自己装填することが多い。
本発明を適用できるその他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，０８７号明細書、および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，５２８号明細書に記載される。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号明細書もまた、本発明を適用できる製剤を記載する。
トランスファーソームはなおも別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるために、小滴よりも小さい孔を通じて容易に浸透できる脂肪滴と説明され得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応でき、例えばそれらは自己最適化し（皮膚孔形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化することなくそれらの標的に到達し、自己装填することが多い。トランスファーソームを作成するために、通常は界面活性剤である表面縁活性化剤を標準リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に、効果的であることが示されている。
界面活性剤には、（マイクロエマルションをはじめとする）エマルションおよびリポソームなどの製剤における、幅広い応用がある。天然および合成双方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ）の使用による。親水性基（「ヘッド」としてもまた知られている）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬および美容製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も良く見られる構成員である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最も良く使用される構成員である。
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
医薬品、製剤中およびエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本発明の方法で使用されるｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供し得る。「ミセル」は、その中で、分子の疎水性部分が全て内側を向き、親水性部分が周囲の水性相に接したままであるように、両親媒性分子が球状構造に配列される、特定タイプの分子アセンブリーと、本明細書で定義される。環境が疎水性であれば、逆の配置が存在する。
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル調合物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩、およびミセル形成化合物の水溶液を混合して、調製してもよい。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレアート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンとその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に、またはその後に添加してもよい。混合ミセルは、成分を実質的にどのように混合しても形成するが、より小型のミセルを提供するためには、激しく混合される。
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する、第１のミセル組成物が調製される。次に第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩、および少なくとも１つのミセル形成化合物を混合して調製され、激しい混合を伴う残りのミセル形成化合物の添加がそれに続く。
フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、調合物を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。代案としては、ミセル形成成分と共に、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを添加してもよい。グリセリンなどの等張剤もまた、混合ミセル組成物形成後に添加してもよい。
ミセル調合物を噴霧として送達するためには、調合物を煙霧剤計量分配装置に入れて、計量分配装置に噴霧剤を装填し得る。加圧下にある噴霧剤は、計量分配装置内で液体形態である。成分の比率は、水性相と噴霧剤相が１つになるように、すなわち１つの相になるように調節される。２つの相がある場合、例えば定量バルブを通じて内容物の一部を分散する前に、計量分配装置を振盪する必要がある。医薬品の分注用量は、定量バルブから精微噴霧で噴射される。
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２ーテトラフルオロエタン）を使用してもよい。
必須成分の特定濃度は、比較的簡単な実験法によって判定し得る。口腔を通じた吸収のためには、注射を通じた用量、または胃腸管を通じた投与の例えば少なくとも２倍または３倍に増大させることが、往々にして望ましい。
Ｂ．脂質粒子
例えば本発明のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、例えばＬＮＰなどの脂質製剤中で完全にカプセル化して、例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、またはその他の核酸－脂質粒子を形成してもよい。
本明細書の用法では、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰをはじめとする、安定核酸－脂質粒子を指す。本明細書の用法では、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含んでなる核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えばＰＥＧ脂質複合体）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射に続いて長期循環寿命を示し、遠位部位（例えば部位投与から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身的用途のために極めて有用である。ＳＰＬＰとしては、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載のカプセル化縮合剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。本発明の粒子は、典型的に約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的に約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的に約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的に約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均径を有して、実質的に無毒である。これに加えて、本発明の核酸－脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸－脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットで開示される。
一実施形態では脂質と薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲である。上記に引用した範囲の中間にある範囲も、本発明の一部と考えられる。
カチオン性脂質は、例えばＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％または約４０モル％を構成し得る。
別の実施形態では、化合物２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランを使用して、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を作成し得る。２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、参照によって本明細書に援用する、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載される。
一実施形態では、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モル百分率）を含み、粒度６３．０±２０ｎｍのおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７である。
イオン性／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ），ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物をはじめとすることができるが、これに限定されるものではない、アニオン性脂質または中性脂質とすることもできる。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
粒子凝集を阻害する共役結合脂質は、例えば制限なしに、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）をはじめとする、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質、またはその混合物であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、例えばＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子凝集を妨げる共役結合脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％～約２０モル％または約２モル％であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（その内容を参照によって本明細書に援用する、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわちＬＮＰ０１粒子）を作成し得る。エタノール中の各原液は、次のように調製し得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次にＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６の原液を例えば４２：４８：１０のモル比で合わせ得る。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５～４５％で最終酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００ｍＭになるように、（例えばｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）水性ｄｓＲＮＡと混合し得る。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的に、混合に際して自然発生的に形成する。所望の粒度分布次第で、結果として生じるナノ粒子混合物は、例えばＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネートメンブラン（例えば１００ｎｍカットオフ）を通じて押出し得る。場合によっては、押出ステップは省き得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４など、約ｐＨ７のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で交換し得る。
ＬＮＰ０１製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載される。
追加的な例示的脂質ｄｓＲＮＡ製剤は、表１に記載される。
ＳＮＡＬＰ（１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含んでなる製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年４月１５日に出願された、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載される。
ＸＴＣを含んでなる製剤は、例えば、参照によって本明細書に援用する、２００９年１月２９日に出願された米国仮出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日に出願された米国仮出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日に出願された米国仮出願第号明細書；２００９年７月２４日に出願された米国仮出願第６１／２２８，３７３号明細書；２００９年９月３日に出願された米国仮出願第６１／２３９，６８６号明細書、および２０１０年１月２９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書に記載される。
ＭＣ３を含んでなる製剤は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年６月１０日に出願された、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書に記載される。
ＡＬＮＹ－１００含有製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、２００９年１１月１０日に出願された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第０９／６３９３３号明細書に記載される。
Ｃ１２－２００含有製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書、および２０１０年５月５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書に記載される。
イオン性／カチオン性脂質の合成
例えば本発明の核酸－脂質粒子で使用されるカチオン性脂質などの化合物のいずれもが、実施例でより詳細に記載される方法をはじめとする、既知の有機合成技術によって調製され得る。特に断りのない限り、全ての置換基は、以下に定義するとおりである。
「アルキル」は、１～２４個の炭素原子を含有する、直鎖または分枝、非環式または環式、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシルなどが挙げられ；他方、飽和分枝アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ；他方、不飽和環式アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。
アルケニルは、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義されるようなアルキルを意味する。アルケニルには、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓの双方の異性体が含まれる。代表的な直鎖および分枝アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニルなどが挙げられる。
「アルキニル」は、隣接する炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する、上で定義されるようなあらゆるアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分枝アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－メチル－１ブチニルなどが挙げられる。
「アシル」は、以下に定義するとおり、炭素が結合点でオキソ基によって置換される、あらゆるアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば－Ｃ（＝Ｏ）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および－Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。
「複素環」は、下の複素環のいずれかがベンゼン環に融合する二環をはじめとする、窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される１または２個のヘテロ原子を含有する、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかの５～７員環単環、または７～１０員環二環、複素環を意味し、窒素およびイオウヘテロ原子は任意選択で酸化されていることができ、窒素ヘテロ原子は任意選択で四級化され得る。複素環は、あらゆるヘテロ原子または炭素原子を介して付着し得る。複素環としては、以下に定義されるヘテロアリールが挙げられる。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプルイミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
「置換されていてもいなくてもよいアルキル」、「置換されていてもいなくてもよいアルケニル」、「置換されていてもいなくてもよいアルキニル」、「置換されていてもいなくてもよいアシル」、および「置換されていてもいなくてもよい複素環」という用語は、置換される場合、少なくとも１つの水素原子が置換基で置換されていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置き換えられる。この点において、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、－ＣＮ、－ＯＲｘ、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ ，－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ、および－ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられ、ｎは０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは同一であるかまたは異なり、独立して水素、アルキルまたは複素環であり、前記アルキルおよび複素環置換基のそれぞれは、１つまたは複数のオキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲｘ、複素環、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ ，－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ、および－ＳＯｎＮＲｘＲｙによってさらに置換され得る。
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、保護基の使用を要し得る。保護基の手順は、当業者に良く知られている（例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照されたい）。簡単に述べると、本発明の文脈では、保護基は、官能基の望まれない反応性を低下させまたは排除する、あらゆる基である。保護基は官能基に付加されて、特定の反応中にその反応性をマスクし、次に除去されて元の官能基を曝露し得る。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望まれない反応性を低下させまたは排除する、あらゆる基である。保護基は、当該技術分野で周知の技術を使用して、付加して除去し得る。
式Ａの合成
いくつかの実施形態では、本発明の核酸脂質粒子は、式Ａ、
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立してそれぞれ置換されていてもいなくてもよい、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、Ｒ３およびＲ４は、独立して低級アルキルであり、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって置換されていてもいなくてもよい複素環を形成し得る）のカチオン性脂質を使用して調合される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）である。一般に、上の式Ａの脂質は、特に断りのない限り全ての置換基が上で定義されるとおりである、以下の反応スキーム１または２によって作成され得る。
Ｒ１およびＲ２が独立して、それぞれ置換されていてもいなくてもよい、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、Ｒ３およびＲ４が独立して低級アルキルであり、またはＲ３およびＲ４が一緒になって、置換されていてもいなくてもよい複素環を形成し得る、脂質Ａは、スキーム１に従って調製され得る。ケトン１および臭化物２は購入され、または当業者に知られている方法に従って調製され得る。１と２の反応は、ケタール３をもたらす。ケタール３をアミン４で処理して、式Ａの脂質を得る。式Ａの脂質は、式５（式中、Ｘは、ハロゲン、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などから選択されるアニオン対イオンであるの有機塩によって、対応するアンモニウム塩に変換し得る。
代案としては、ケトン１出発原料は、スキーム２に従って調製され得る。グリニャール試薬６およびシアン化物７は購入され、または当業者に知られている方法に従って調製され得る。６と７の反応は、ケトン１をもたらす。ケトン１の対応する式Ａの脂質への変換は、スキーム１に記載されるとおりである。
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（すなわち（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸）の調製は、次のとおりであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－オール（０．５３ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を希塩酸で、続いて希釈水性炭酸水素ナトリウムで洗浄した。無水硫酸マグネシウム上で有機画分を乾燥させ、濾過して、回転蒸発器上で溶媒を除去した。１～５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を使用して、残留物をシリカゲルカラム（２０ｇ）に通過させた。精製産物を含有する画分を合わせて溶媒を除去し、無色の油（０．５４ｇ）を得た。
ＡＬＮＹ－１００の合成
以下のスキーム３を使用して、ケタール５１９［ＡＬＮＹ－１００］の合成を実施した。
５１５の合成
ニ頚ＲＢＦ（１Ｌ）内の撹拌される２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２モル）懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６モル）の溶液を０ ０Ｃにおいて窒素雰囲気下で緩慢に添加した。添加完了後、反応混合物を室温に加温し、次に加熱して４時間還流した、反応の進捗は、ＴＬＣによってモニターした。反応完了（ＴＬＣによる）後、混合物を０ ０Ｃに冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液の注意深い添加によってクエンチした。反応混合物を室温で４時間撹拌し、濾過した。残留物をＴＨＦで良く洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃ＨＣｌで希釈して、室温で２０分間撹拌した。揮発度（ｖｏｌａｔｉｌｉｔｉｅｓ）を真空下で揮散して、５１５の塩酸塩を白色固体として得た。収量：７．１２ｇ １Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（ｂｒｏａｄ，２Ｈ），５．６８（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｍ，１Ｈ），２．６６－２．６０（ｍ，２Ｈ），２．５０－２．４５（ｍ，５Ｈ）．
５１６の合成
２５０ｍＬニ頚ＲＢＦ内の１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌される溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９モル）を添加して、窒素雰囲気下で０ ０Ｃに冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のＮ－（ベンジルオキシ－カルボニルオキシ）－スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７モル）の緩慢な添加後、反応混合物が室温に暖まるまで放置した。反応完了後（ＴＬＣによる２～３時間）、混合物を１ＮのＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。次に無水Ｎａ２ＳＯ４上で有機層を乾燥し、溶媒を蒸発させて粗製物を得て、それをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、５１６を粘着性塊として得た。収量：１１ｇ（８９％）．１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６－７．２７（ｍ，５Ｈ），５．６９（ｓ，２Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｂｒ．，１Ｈ）２．７４（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｍ，２Ｈ），２．３０－２．２５（ｍ，２Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］－２３２．３（９６．９４％）．
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成
室温において、５００ｍＬ一頚ＲＢＦ内で、シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４モル）を２２０ｍＬアセトンと水（１０：１）の溶液中に溶解し、それにＮ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２モル）を添加し、ｔｅｒｔ－ブタノール中の４．２ｍＬの７．６％ＯｓＯ４（０．２７５ｇ、０．００１０８モル）溶液がそれに続いた。反応完了後（約３時間）、固体Ｎａ２ＳＯ３の添加によって混合物をクエンチし、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈して、水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）、最後に鹹水（１×５０ｍＬ）が続いた。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、真空中で溶媒を除去した。粗製物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製からジアステレオマー混合物を得て、それを予備ＨＰＬＣによって分離した。収量：－６ｇ粗製
５１７Ａ－ピーク－１（白色固体）、５．１３ｇ（９６％）．１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９－７．３１（ｍ，５Ｈ），５．０４（ｓ，２Ｈ），４．７８－４．７３（ｍ，１Ｈ），４．４８－４．４７（ｄ，２Ｈ），３．９４－３．９３（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），１．７２－１．６７（ｍ，４Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ－［Ｍ＋Ｈ］－２６６．３，［Ｍ＋ＮＨ４＋］－２８３．５存在，ＨＰＬＣ－９７．８６％．立体化学はＸ線によって確認された。
５１８の合成
化合物５０５の合成について記載されるものと類似の手順を使用して、化合物５１８を無色の油として得た（１．２ｇ、４１％）。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５－７．３３（ｍ，４Ｈ），７．３０－７．２７（ｍ，１Ｈ），５．３７－５．２７（ｍ，８Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．５８－４．５７（ｍ，２Ｈ），２．７８－２．７４（ｍ，７Ｈ），２．０６－２．００（ｍ，８Ｈ），１．９６－１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．３７－１．２５（ｂｒ ｍ，３６Ｈ），０．８７（ｍ，６Ｈ）．ＨＰＬＣ－９８．６５％．
化合物５１９の合成の基本手順
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１ｅｑ）溶液をＴＨＦ中のＬＡＨ（１Ｍ，２ｅｑ）氷冷溶液に、滴下して添加した。添加完了後、混合物を４０℃で０．５時間加熱し、次に氷浴上で再度冷却した。混合物を飽和水性Ｎａ２ＳＯ４によって注意深く加水分解し、次にセライトを通して濾過して油に濃縮した。カラムクロマトグラフィーから、純粋な５１９を無色の油として得た（１．３ｇ、６８％）。１３Ｃ ＮＭＲ＝１３０．２，１３０．１（ｘ２），１２７．９（ｘ３），１１２．３，７９．３，６４．４，４４．７，３８．３，３５．４，３１．５，２９．９（ｘ２），２９．７，２９．６（ｘ２），２９．５（ｘ３），２９．３（ｘ２），２７．２（ｘ３），２５．６，２４．５，２３．３，２２６，１４．１；エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２（Ｍ＋Ｈ）＋の分子量、計算値６５４．６、測定値６５４．６．
標準法または押出のない方法のいずれかによって調製された製剤は、同様の様式で特性解析し得る。例えば製剤は、典型的に外観検査によって特徴付けられる。それらは凝集体または沈降物を含まない、白みがかった半透明溶液であるべきである。脂質－ナノ粒子の粒度および粒度分布は、例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を使用して、光散乱によって測定し得る。粒度は、４０～１００ｎｍなど、約２０～３００ｎｍであるべきである。粒度分布は、単峰型分布であるべきである。製剤ならびに封入画分中の総ｄｓＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを使用して推定された。調合されたｄｓＲＮＡのサンプルを例えば０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００などの配合破壊性界面活性剤の存在または不在下で、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合色素と共にインキュベートし得る。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準曲線と比較して、界面活性剤含有サンプルからのシグナルによって判定し得る。封入画分は、総ｄｓＲＮＡ含量から、「遊離」ｄｓＲＮＡ含量（界面活性剤不在下のシグナルにより測定される）を減じて求められる。封入ｄｓＲＮＡ百分率は、典型的に＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤では、粒度は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は、典型的に、少なくとも約５０ｎｍから少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍから少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍから少なくとも約９０ｎｍである。
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えばナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ））、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載される。
非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含むことができ、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではないその他の適切な添加剤とを含有し得る。
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成され得る。肝臓がんなどの肝臓の障害を治療する場合、特に好ましいのは、肝臓を標的とする製剤である。
好都合には単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその双方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば生成物を整形することで調製される。
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合され得る。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
Ｃ．追加的な製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含んでなる、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含んでなる複数エマルションであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内に良く分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。
表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含んでなる。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照されたい）。
エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
多岐にわたる非乳化材料もまたエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３～５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしマイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製され得、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当該技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８－Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５－１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第 ７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８－１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは多くの場合、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成することができる。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に、特に有利となり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のＲＮＡｉ剤は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせをはじめとする、その他の方法によって製造してもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類され得る（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ－４３などのペルフルオロ化合物エマルション．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１～２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、およびそのモノ－およびジ－グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えばＴｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１－６５４を参照されたい）。
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４－９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ：ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏ－２４，２５－ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｓｉｄａｔｅ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２－７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９－５８３を参照されたい）。
本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５－３３９）。 適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトン（エナミン）のＮ－アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばＫａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３－５１を参照されたい）。
本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えばＭｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１－６２６）が挙げられる。
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本発明医薬およびその他の組成物に添加し得る。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏらに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２－ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとするその他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。
ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４－アセトアミド－４’－イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５－１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７－１８３。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。
適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｖｉｉ．その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有することができ、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などなどの助剤と混合される。
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能し、出血障害の治療に有用な１つまたは複数の薬剤を含む。このような薬剤の例としては、抗炎症剤、抗脂肪症薬、抗ウイルス、および／または抗線維症薬が挙げられるが、これに限定される（ｌｍｉｔｅｄ）ものではない。それに加えて、シリマリンなどの肝臓を保護するのに一般に使用されるその他の物質もまた、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用し得る。肝臓疾患の治療に有用なその他の薬剤としては、テルビブジンと、エンテカビルと、テラプレビルおよび例えばＴｕｎｇらに付与された米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１６７１１６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４４２１７号明細書；およびＨａｌｅらに付与された米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書で開示されたものなどのプロテアーゼインヒビターが挙げられる。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するための細胞培養物または実験動物中などで、標準薬学的手順によって判定し得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、最初に、治療有効用量を細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養中で判定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、上で考察されるそれらの投与に加えて、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現によって媒介される病理過程の治療に効果的なその他の既知の作用物質と組み合わせて、投与し得る。いずれにしても処置を行う医師は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
ＶＩ．発明の方法
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡ、および／または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を使用して、細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１発現を低下させおよび／または阻害する方法も提供する。その他の態様では、本発明は、細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１発現を低下させおよび／または阻害するのに使用される、本発明のｉＲＮＡ、および／または本発明のｉＲＮＡを含んでなる組成物を提供する。なおも別の態様では、細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１発現を低下させおよび／または阻害する薬剤を製造（ｍａｎｕｆａｃｔｕｉｒｅ）するための、本発明のｉＲＮＡ、および／または本発明のｉＲＮＡを含んでなる組成物の使用が提供される。
方法および使用は、細胞を例えば本発明のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡに接触させて、細胞をＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間保ち、それによって細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するステップを含む。
遺伝子発現の低下は、当該技術分野で公知のあらゆる方法によって評価し得る。例えばＳｅｒｐｉｎｃ１発現の低下は、例えばノーザンブロット法やｑＲＴ－ＰＣＲなどの当業者には通例の方法を使用してＳｅｒｐｉｎｃ１のｍＲＮＡ発現レベルを測定することで、ウエスタンブロット法や免疫学的技術などの当業者には通例の方法を使用してＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルを測定することで、および／または細胞の血液凝固機序（または生体内状況における血液凝固それ自体）と関係する１つまたは複数の分子に影響を及ぼすＳｅｒｐｉｎｃ１の生物学的活性を測定することで、判定してもよい。
本発明の方法および使用では、細胞は、試験管内または生体内で接触させてもよく、すなわち細胞は対象内にあってもよい。
本発明の方法を使用した治療に適する細胞は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を発現するあらゆる細胞であってもよい。本発明の方法および使用で使用するのに適した細胞は、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞または例えばサル細胞またはチンパンジー細胞などの非ヒト霊長類細胞など）、非霊長類細胞（ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、またはバッファロー細胞など）などの哺乳類細胞、鳥類細胞（例えばアヒル細胞またはガチョウ細胞）、またはクジラ細胞であってもよい。一実施形態では、細胞は、例えばヒト肝細胞などのヒト細胞である。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現は、細胞中で、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または約１００％阻害されてもよい。
本発明の生体内における方法および使用は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与するステップを含んでもよく、ｉＲＮＡは、治療される哺乳類のＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。ヒトなどの哺乳類などの生物が治療される場合、組成物は、経口；腹腔内；または頭蓋内（例えば心室内、実質内、およびクモ膜下腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（煙霧剤）、経鼻、直腸をはじめとする非経口経路、および局所（バッカルおよび舌下をはじめとする）投与をはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の任意の手段によって投与し得る。特定の実施形態では、組成物は、静脈輸液または注射によって投与される。
いくつかの実施形態では、投与は、蓄積注射による。蓄積注射は、長期にわたり、一貫性を持ってｉＲＮＡを放出してもよい。したがって蓄積注射は、例えば所望のＳｅｒｐｉｎｃ１阻害、または治療的または予防的効果などの所望の効果を得るのに、必要な投薬頻度を低下させてもよい。蓄積注射はまた、より一貫した血清濃度を提供してもよい。蓄積注射としては、皮下注射または筋肉内注射が挙げられる。好ましい実施形態では、蓄積注射は皮下注射である。
いくつかの実施形態では、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ、または外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態では、ポンプは、皮下移植浸透圧ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、点滴ポンプである。点滴ポンプは、静脈内、皮下、動脈、または硬膜外輸液のために使用してもよい。好ましい実施形態では、点滴ポンプは、皮下点滴ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、ｉＲＮＡを肝臓に送達する、外科的に埋め込まれたポンプである。
投与様式は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに基づいて、および治療領域に基づいて、選択されてもよい。投与経路および部位は、標的化を向上させるように選択してもよい。
一態様では、本発明はまた、例えばヒトなどの哺乳類中で、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害する方法も提供する。本発明はまた、哺乳類中でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するのに使用される、例えば哺乳類細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含んでなる組成物も提供する。別の態様では、本発明は、哺乳類中でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害する薬剤を製造するための、例えば哺乳類細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの使用を提供する。
方法および使用は、例えば哺乳類細胞内でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含んでなる組成物を、例えばヒトなどの哺乳類に投与して、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得て、それによって哺乳類中でＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現を阻害するに十分な時間にわたり、哺乳類を保つステップを含む。
遺伝子発現の低下は、技術分野で公知のあらゆる方法によって、そして例えばｑＲＴ－ＰＣＲなどの本明細書に記載される方法によって、評価し得る。タンパク質産生の低下は、技術分野で公知のあらゆる方法によって、そして例えばＥＬＩＳＡなどの本明細書に記載される方法によって、評価し得る。一実施形態では、穿刺肝臓生検サンプルが、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子および／またはタンパク質発現の低下をモニターするための組織材料の役割を果たす。別の実施形態では、血液サンプルが、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子および／またはタンパク質発現の低下をモニターするための組織材料の役割を果たす。別の実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の阻害は、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１経路中で遺伝子の発現および／または活性を判定することで、間接的にモニターされる（例えば図１を参照されたい）。例えばＸａ因子の活性をモニターして、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の阻害を判定してもよい。例えば血液または肝臓サンプルなどのサンプル中の抗トロンビンレベル、血餅形成、および／または内因性トロンビン生成能もまた、評価してもよい。適切なアッセイは、下の実施例セクションにさらに記載される。
本発明は、例えば血友病などのＳｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける障害を有する対象を治療する方法をさらに提供する。本発明の治療法（および使用）は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的にするｉＲＮＡ、またはＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的にするｉＲＮＡを含んでなる医薬組成物の治療有効量を、例えばヒトである対象に投与して、それによってＳｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける障害を有する対象を治療するステップを含む。
一態様では、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける障害を有する対象中で、少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。方法は、例えば本発明のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡまたはベクターの治療有効量を対象に投与し、それによってＳｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける障害を有する対象中で、少なくとも１つの症状を予防するステップを含む。例えば本発明は、例えば血友病などのＳｅｒｐｉｎｃ１発現低下から利益を受ける障害に罹患している対象において、出血を予防する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１発現の低下および／または阻害から利益を受ける対象などの対象を治療するための、本発明のｉＲＮＡの治療有効量の使用を提供する。ｉＲＮＡとしては、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的にするｉＲＮＡ、またはＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的にするｉＲＮＡを含んでなる医薬組成物が挙げられる。
さらに別の態様では、本発明は、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１発現の低下および／または阻害から利益を受ける対象などの対象を治療するための薬剤の製造における、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的にする本発明のｉＲＮＡ、またはＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的にするｉＲＮＡを含んでなる医薬組成物の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、例えば血友病のような出血障害などのＳｅｒｐｉｎｃ１発現の低下および／または阻害から利益を受ける障害に罹患している対象において、少なくとも１つの症状を予防するための、例えば本発明のｄｓＲＮＡであるｉＲＮＡの使用を提供する。
さらなる態様では、本発明は、例えば血友病のような出血障害などのＳｅｒｐｉｎｃ１発現の低下および／または阻害から利益を受ける障害に罹患している対象において、少なくとも１つの症状を予防するための薬剤の製造における本発明のｉＲＮＡの使用を提供する。本発明のｉＲＮＡは、「裸の」または「遊離ｉＲＮＡ」形態で投与してもよい。裸のｉＲＮＡは、医薬組成物不在下で投与される。裸のｉＲＮＡは、適切な緩衝溶液中にあってもよい。緩衝溶液は、酢酸エステル、クエン酸塩、プロラミン、炭酸、またはリン酸、またはそれらのあらゆる組み合わせを含んでなってもよい。一実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝溶液のｐＨおよびモル浸透圧濃度は、対象への投与に適するように調節し得る。
代案としては、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与してもよい。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の低下および／または阻害から利益を受ける対象は、例えば本明細書に記載される遺伝性出血障害または後天性出血障害などの出血障害を有する対象である。一実施形態では、遺伝性出血障害を有する対象は、例えば血友病Ａ、Ｂ、またはＣなどの血友病に罹患している。一実施形態（ｅｍｂｏｄｍｅｎｔ）では、例えば血友病などの遺伝性出血障害を有する対象は、インヒビター対象である。一実施形態では、インヒビター対象は、血友病Ａを有する。別の実施形態（ｅｍｂｏｄｍｅｎｔ）では、インヒビター対象は、血友病Ｂを有する。さらに別の実施形態では、インヒビター対象は、血友病Ｃを有する。Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の低下および／または阻害から利益を受ける対象の治療としては、治療処置（例えば対象が出血している（特発性出血または外傷の結果としての出血）および血餅形成できないなどのオンデマンド）、および予防処置（例えば対象は出血していないおよび／または外科手術を受ける予定である）が挙げられる。
本発明は、例えばこれらの障害を治療するために目下用いられているもののような、既知の医薬品および／または既知の治療法などのその他の医薬品および／またはその他の治療法と組み合わせて、例えば出血障害を有する対象などのＳｅｒｐｉｎｃ１発現の低下および／または阻害から利益を受ける対象を治療するための、ｉＲＮＡまたはその医薬組成物の使用のための方法および使用をさらに提供する。例えば特定の実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎｃ１を標的にするｉＲＮＡは、本明細書の他の箇所で記載されるように、例えば出血障害を治療するのに有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば出血障害を有する対象などのＳｅｒｐｉｎｃ１発現の低下（ｒｅｄｕｃｔｏｎ）から利益を受ける対象を治療するのに適した追加的な治療薬および治療法としては、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）；組換えＦＶＩＩａ；組換えＦＩＸ；ＦＸＩ濃縮物；不活性化ウイルス、ｖＷＦ含有ＦＶＩＩＩ濃縮物；ステロイドまたは静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）およびシクロホスファミドと共に、高用量のＦＶＩＩＩまたはＦＩＸを含んでもよい脱感作療法；抗線維素溶解療法ありまたはなしの免疫抑制およびＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの点滴と併用される血漿交換療法；免疫抑制療法（例えばシクロホスファミド、プレドニゾン、および／または抗ＣＤ２０）ありまたはなしの免疫寛容誘導（ＩＴＩ）；酢酸デスモプレッシン［ＤＤＡＶＰ］；アミノカプロン酸およびトラネキサム酸などの抗線維素溶解薬；活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）；抗血友病薬；コルチコステロイド；免疫抑制剤；およびエストロゲンが挙げられる。ｉＲＮＡおよび追加的な治療薬および／または治療法は、例えば非経口的に同時におよび／または同じ組み合わせで投与してもよく、または追加的な治療薬は、別の組成物の一部として、または別の時点で、および／または当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、別の方法によって投与し得る。
一実施形態では、方法および使用は、標的Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現が、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、または約８０時間などにわたって低下するように、本明細書で取り上げる組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、標的Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現は、例えば約１週間、２週間、３週間、または約４週間以上など、少なくとも約２、３、４、５、６、７日間以上などの長期間にわたって低下する。
好ましくは、本明細書で取り上げる方法、使用、および組成物で有用なｉＲＮＡは、標的Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の（一次またはプロセシングされた）ＲＮＡを特異的に標的とする。これらの遺伝子の発現を阻害するための、ｉＲＮＡを使用した組成物、使用、および方法は、本明細書に記載されるように調製して実施し得る。
本発明の方法および使用に従ったｄｓＲＮＡの投与は、出血障害がある患者中で、このような疾患または障害の重症度、徴候、症状、および／またはマーカの低下をもたらしてもよい。「低下」とは、この文脈で、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％であり得る。
疾患の治療または予防の効能は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、出血発生頻度、疼痛減少、生活の質、治療効果維持に必要な薬剤用量、疾病マーカレベルまたは治療されるまたは予防目標である、所与の疾患に適した、あらゆるその他の測定可能パラメータレベルを測定することで評価し得る。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することで、治療または予防有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば出血障害治療の効能は、例えばトロンビン：抗トロンビンレベルを周期的にモニターすることで、評価してもよい。最初の読み取りと後からの読み取りの比較は、治療が効果的かどうかの指標を医師に提供する。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することで、治療または予防有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。Ｓｅｒｐｉｎｃ１を標的にするｉＲＮＡまたはその医薬組成物投与との関連で，出血障害「に対して効果的」とは、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも統計学的に有意な割合の患者に、症状改善、治癒、疾患低減、延命、生活の質改善、または出血障害および関連原因の治療に精通している医者によって、好ましいと一般に認められているその他の効果などの有益な効果をもたらすことを意味する。
病態の１つまたは複数のパラメータに統計的に有意な改善がある場合、または処置がなければ予期される症状悪化または発症の欠如によって、治療または予防効果は明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化は、効果的な治療を示唆し得る。所与のｉＲＮＡ薬剤またはその薬剤の配合物の有効性はまた、当該技術分野で公知の所与の疾患のための実験動物モデルを使用して、判定し得る。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカまたは症状の統計的に有意な低下が観察される場合に、証明される。
代案としては、効能は、一例としてＣｈｉｌｄ－Ｐｕｇｈスコア（時にＣｈｉｌｄ－Ｔｕｒｃｏｔｔｅ－Ｐｕｇｈスコアとも）などの、臨床的に認められた疾患重症度評価尺度に基づく、診断当業者による判定で、疾患重症度の低下によって評価され得る。例えば適切な尺度を使用して評価された、疾患重症度の低下をもたらすあらゆる好ましい変化は、本明細書に記載されるｉＲＮＡまたはｉＲＮＡ調合物を使用した適切な治療を示す。
対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、または約５０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、脂質とを含んでなる特定の実施形態では、対象に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約９．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えばｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、Ｎ－アセチルガラクトサミンとを含んでなる別の実施形態では、対象に、約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１～約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約５０ｍｇ／ｋｂ、約２～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０～約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１～約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４５ｍｇ／ｋｂ、約２～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０～約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１～約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約４０ｍｇ／ｋｂ、約２～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０～約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１～約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約３０ｍｇ／ｋｂ、約２～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３～約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４～約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０～約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１～約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５～約２０ｍｇ／ｋｂ、約２～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３～約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４～約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０～約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５～約２０ｍｇ／ｋｇの用量などの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。一実施形態では、本発明の組成物が本明細書に記載のｄｓＲＮＡおよびＮ－アセチルガラクトサミンを含む場合、対象には、治療量の約１０～約３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡが投与され得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象には、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
ｉＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、または約２５分間などにわたる静脈輸液によって投与し得る。投与は、例えば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月以上などにわたり、毎週、隔週（すなわち２週毎）で、定期的に繰り返してもよい。最初の治療計画の後に、治療は、より低い頻度で行い得る。例えば３ヶ月にわたる毎週または隔週の投与後、６ヶ月または１年以上にわたり月１回の投与を反復し得る。
一実施形態では、本発明は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇの累積週間用量で、化合物ＡＤ－５７２１３を前記対象に皮下投与することで、例えば血友病などの出血障害に罹患している対象を治療する方法を提供する。
一実施形態では、方法は、約０．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に皮下投与するステップを含んでもよい。例えば一実施形態では、方法は、毎週約０．５ｍｇ／ｋｇとして、０．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。別の一実施形態では、方法は、隔週１ｍｇ／ｋｇとして、０．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。
別の実施形態では、方法は、約１．５ｍｇ／ｋｇの累積週用量を対象に皮下投与するステップを含んでもよい。例えば一実施形態では、方法は、毎週約１．５ｍｇ／ｋｇとして、１．５．ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。別の一実施形態では、方法は、隔週３ｍｇ／ｋｇとして、１．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。
別の実施形態では、方法は、約２ｍｇ／ｋｇの累積週用量を対象に皮下投与するステップを含んでもよい。例えば一実施形態では、方法は、毎週約２ｍｇ／ｋｇとして、２ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。別の一実施形態では、方法は、隔週４ｍｇ／ｋｇとして、２ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。
なおも別の実施形態では、方法は、約３ｍｇ／ｋｇの累積週用量を対象に皮下投与するステップを含んでもよい。例えば一実施形態では、方法は、毎週約３ｍｇ／ｋｇとして、３ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。別の一実施形態では、方法は、隔週６ｍｇ／ｋｇとして、３ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。
別の実施形態では、本発明は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇの累積週間用量で化合物ＡＤ－５７２１３を対象に皮下投与することで、対象において、例えば血友病などの出血障害の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。
一実施形態では、方法は、約０．５ｍｇ／ｋｇの累積週用量を対象に皮下投与するステップを含んでもよい。例えば一実施形態では、方法は、毎週約０．５ｍｇ／ｋｇとして、０．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。別の一実施形態では、方法は、隔週１ｍｇ／ｋｇとして、０．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。
別の実施形態では、方法は、約１．５ｍｇ／ｋｇの累積週用量を対象に皮下投与するステップを含んでもよい。例えば一実施形態では、方法は、毎週約１．５ｍｇ／ｋｇとして、１．５．ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。別の一実施形態では、方法は、隔週３ｍｇ／ｋｇとして、１．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。
別の実施形態では、方法は、約２ｍｇ／ｋｇの累積週用量を対象に皮下投与するステップを含んでもよい。例えば一実施形態では、方法は、毎週約２ｍｇ／ｋｇとして、２ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。別の一実施形態では、方法は、隔週４ｍｇ／ｋｇとして、２ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。
なおも別の実施形態では、方法は、約３ｍｇ／ｋｇの累積週用量を対象に皮下投与するステップを含んでもよい。例えば一実施形態では、方法は、毎週約３ｍｇ／ｋｇとして、３ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。別の一実施形態では、方法は、隔週６ｍｇ／ｋｇとして、３ｍｇ／ｋｇの累積週間用量を対象に投与するステップを含んでもよい。
ｉＲＮＡ投与は、例えば患者の細胞、組織、血液、尿またはその他のコンパートメント中で、Ｓｅｒｐｉｎｃ１レベルを少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または少なくとも約９９％以上低下させ得る。
一実施形態では、治療および／または予防的方法としては、対象に、例えば患者の細胞、組織、血液、尿またはその他のコンパートメント中のＳｅｒｐｉｎｃ１レベルを、少なくとも約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、６９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、または約８０％阻害低下させる（ｉｎｈｉｂｉｔ ｒｅｄｕｃｅ）のに十分な用量で、化合物ＡＤ－５７２１３を皮下投与することが挙げられる。
ｉＲＮＡの総用量の投与前に、５％輸液反応などのより少ない用量を患者に投与して、アレルギー反応などの悪影響についてモニターし得る。別の実施例では、サイトカイン（例えばＴＮＦ－αまたはＩＮＦ－α）レベル増大などの望まれない免疫賦活性効果について、患者をモニターし得る。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現に対する阻害効果のために、本発明に従った組成物またはそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高め得る。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似したまたは同等の方法および材料を、本発明で取り上げるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験で使用し得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照によって援用する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。
実施例１：ｉＲＮＡ合成
試薬供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示さない場合、このような試薬は、分子生物学用途の品質／純度規格の分子生物学用試薬のあらゆる供給業者から得られてもよい。
転写物
ｓｉＲＮＡデザインを実施して、ＮＣＢＩ遺伝子データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）でアノテートされたヒト、アカゲザル（アカゲザル（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）、イヌ、マウス、およびラットＳＥＲＰＩＮＣ１転写物を標的にするｓｉＲＮＡを同定した。デザインは、ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑコレクションからの以下の転写物を使用した：Ｈｕｍａｎ－ＮＭ＿０００４８８．２、ＮＭ＿０００４８８．３；Ｒｈｅｓｕｓ－ＮＭ＿００１１０４５８３．１；Ｄｏｇ－ＸＭ＿８５６４１４．１；Ｍｏｕｓｅ－ＮＭ＿０８０８４４．４；Ｒａｔ－ＮＭ＿００１０１２０２７．１。高度な霊長類／イヌ類／齧歯類配列多様性のために、ｓｉＲＮＡ二本鎖は、二本鎖整合ヒトおよびアカゲザル転写物のみ；ヒト、アカゲザル、およびイヌ転写物のみ；ヒト、アカゲザル，マウス、およびラット転写物のみ；およびマウスおよびラット転写物のみを含有するバッチをはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの別個のバッチでデザインされた。全てのｓｉＲＮＡ二本鎖は、各デザインバッチ（上記）で考察された、列挙されたヒト転写物およびその他の種の転写物と１００％の同一性を共有するようにデザインされた。
ｓｉＲＮＡデザイン、特異性、および効能予測
全ての可能な１９量体の予測された特異性は、各配列から予測された。次に７ヌクレオチドよりも長い反復を欠いている、候補１９量体を選択した。これらの８７４の候補ヒト／アカゲザル、６７ヒト／アカゲザル／イヌ、１０３ヒト／アカゲザル／マウス／ラット、および５６９マウス／ラットｓｉＲＮＡを、ｐｙｔｈｏｎスクリプト「ＢｒｕｔｅＦｏｒｃｅ．ｐｙ」中で実装される網羅的な「総当たり攻撃」アルゴリズムを使用する、適切なトランスクリプトーム（ヒト、アカゲザル、イヌ、マウス、またはラットＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿およびＸＭ＿ｒｅｃｏｒｄｓセットと定義される）に対する包括的検索で使用した。次にスクリプトは、転写物オリゴアラインメントを構文解析し、ｓｉＲＮＡとあらゆる可能な「オフターゲット」転写物とのミスマッチの配置および数に基づいて、スコアを作成した。オフターゲットスコアを重み付けして、分子の５’末端から２～９位で、ｓｉＲＮＡの「シード」領域内の違いを強調した。
総当たり攻撃検索からの各オリゴ転写物対には、個々のミスマッチスコアを加算することでミスマッチスコアが与えられ；２～９位のミスマッチは２．８と見なされ、１０～１１位の切断部位のミスマッチは１．２と見なされ、領域１２～１９のミスマッチは１．０と見なされた。さらに３つの異なる、各オリゴのシード由来六量体に由来する七量体および八量体の発生頻度を比較することで、オフターゲット予測を実施した。５’開始点に対する２～７位からの六量体を使用して、２つの七量体および１つの八量体を作成した。「七量体１」は、六量体に３’－Ａを付加して作成し；七量体２は、六量体に５’－Ａを付加して作成し；八量体は、六量体の５’および３’末端の双方にＡを付加して作成した。ヒト、アカゲザル、マウス、またはラット３’ＵＴＲｏｍｅ（ＮＣＢＩのＲｅｆｓｅｑデータベースからのトランスクリプトームの部分配列と定義され、コード領域末端「ＣＤＳ」は明確に画定されている）中の八量体および七量体の発生頻度は、事前に計算された。八量体発生頻度は、八量体頻度範囲からの中央値を使用して、七量体発生頻度について正規化した。次に（（３×正規化八量体数）＋（２×七量体２数）＋（１×七量体１数））の合計を計算することで、「ｍｉｒＳｅｅｄＳｃｏｒｅ」を計算した。
計算スコアに従って、双方のｓｉＲＮＡ鎖を特異性カテゴリーに割り当てた。３を超えるスコアは高度に特異的であり、３に等しいスコアは特異的であり、２．２～２．８のスコアは中程度に特異的であると認定された。アンチセンス鎖の特異性によって二本鎖をソートして、アンチセンスオリゴが１位のＧＣを欠き、１３位と１４位双方のＧを欠き、シード領域に３つ以上のＵまたはＡを有する二本鎖を選択した。
ｓｉＲＮＡ配列選択
合計６６のセンスおよび６６のアンチセンス由来ヒト／アカゲザル、６のセンスおよび６のアンチセンス由来ヒト／アカゲザル／マウス、１２のヒト／アカゲザル／マウス／ラット、および２１のセンスおよび２１のアンチセンス由来マウス／ラットｓｉＲＮＡオリゴが合成され、二本鎖に形成された。Ｓｅｐｉｎｃ１センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧は、表３および４で示される。
ｓｉＲＮＡ合成
Ｉ．一般的小規模および中規模ＲＮＡ合成手順
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、標準固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルに従って、市販されるウリジンの５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－ｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホラミダイトモノマー、４－Ｎ－アセチルシチジン、６－Ｎ－ベンゾイルアデノシン、および２－Ｎ－イソブチリルグアノシン、そして対応する２’－Ｏ－メチルおよび２’－フルオロホスホラミダイトを使用して、０．２～５００μｍｏｌの規模で合成した。アミダイト溶液は、０．１～０．１５Ｍの濃度で調製し、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（アセトニトリル中の０．２５～０．６Ｍ）を活性化剤として使用した。酸化段階のために、合成中に、ルチジン：アセトニトリル（１：１）（ｖ；ｖ）中の０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、またはピリジン中の０．１Ｍ ３－（ジメチルアミノメチレン）アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）を使用して、ホスホロチオエート主鎖の修飾を導入した。合成完了後、配列を固体担体から切断し、メチルアミンとそれに続くトリエチルアミン・３ＨＦを使用して脱保護し、存在するあらゆる２’－Ｏ－ｔ－ブチルジメチルシリル保護基を除去した。
５～５００μｍｏｌ規模の完全２’修飾配列（２’－フルオロおよび／または２’－Ｏ－メチルまたはそれらの組み合わせ）の合成では、３５℃で１６時間または５５℃で５．５時間のいずれかで、３：１（ｖ／ｖ）エタノールおよび濃縮（２８～３２％）水性アンモニアを使用して、オリゴヌクレオチドを脱保護した（ｗｈｅｒｅ ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）。アンモニア脱保護に先だって、固体担体上で２０分間、アセトニトリル中の０．５Ｍピペリジンで、オリゴヌクレオチドを処理した（ｗｈｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ）。ＬＣ－ＭＳおよびアニオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）によって、粗製オリゴヌクレオチドを分析した。２０ｍＭのリン酸、１０％～１５％ＡＣＮ、ｐＨ＝８．５（緩衝液Ａ）、および２０ｍＭのリン酸、１０％～１５％ＡＣＮ、１ＭのＮａＢｒ、ｐＨ＝８．５（緩衝液Ｂ）を使用して、ＩＥＸ ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチド精製を実施した。分析ＨＰＬＣによって、画分を純度について分析した。適切な純度の生成物含有画分を貯留し、脱塩に先だって回転蒸発器上で濃縮した。サイズ排除クロマトグラフィーによってサンプルを脱塩し、凍結乾燥した。１×ＰＢＳ緩衝液中で、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖をアニールして、対応するｓｉＲＮＡ二本鎖を調製した。
小規模（０．２～１μｍｏｌ）では、９６ウェル構成のＭｅｒＭａｄｅ １９２合成機上で合成を実施した。完全２’－修飾配列（２’－フルオロおよび／または２’－Ｏ－メチルまたはそれらの組み合わせ）の場合は、室温で３０～６０分間のメチルアミンと、それに続く６０℃で３０分間のインキュベーションを使用して、または室温で３０～６０分間の３：１（ｖ／ｖ）エタノールおよび濃縮（２８～３２％）水性アンモニアと、それに続く４０℃で１．５時間のインキュベーションを使用して、オリゴヌクレオチドを脱保護した（ｗｈｅｒｅ ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）。次に粗製オリゴヌクレオチドをアセトニトリル：アセトン（９：１）溶液中で沈殿させて、遠心分離によって単離し、上清を傾斜法で除去した。粗製オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、ＬＣ－ＭＳおよびアニオン交換ＨＰＬＣによって分析した。５ｍＬ ＨｉＴｒａｐセファデックスＧ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の９６深型ウェルプレート内で、粗製オリゴヌクレオチド配列を脱塩した。各ウェル内に、個々の配列に対応する約１．５ｍＬのサンプルを収集した。ＬＣ－ＭＳおよびアニオン交換クロマトグラフィーによって、これらの精製脱塩オリゴヌクレオチドを分析した。Ｔｅｃａｎロボット上で、等モル量のセンスおよびアンチセンス配列をアニーリングして、二本鎖を調製した。１×ＰＢＳ緩衝液中で、二本鎖の濃度を１０μＭに調節した。
ＩＩ．生体内分析のためのＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド合成のための４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護一級水酸基を保有するＹ型リンカーと、係留を通じて付着するＧａｌＮＡｃリガンドとが事前装填された固体担体を使用して、０．２～５００μｍｏｌの規模で、ＧａｌＮＡｃリガンドと３’末端で共役するオリゴヌクレオチドを合成した。
５～５００μｍｏｌ規模でのＧａｌＮＡｃ複合体合成では、以下の修正を加えて、上のＲＮＡ合成プロトコルに従った。ポリスチレンベースの合成担体では、合成中のＤＭＴ切断のために、トルエン中の５％ジクロロ酢酸を使用した。担体からの切断および脱保護は、上述のように実施した。ホスホロチオエートに富む配列（通常は５個を超えるホスホロチオエート（ｐｈｏｒｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ））は、最後の５’－ＤＭＴ基を除去することなく（「ＤＭＴ－ｏｎ」）合成し、上述したような切断および脱保護後に、水中の５０ｍＭの酢酸アンモニウム（緩衝液Ａ）と、８０％アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｉｒｉｌｅ）中の５０ｍＭの酢酸アンモニウム（緩衝液Ｂ）とを使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製した。分析ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ－ＭＳによって、画分を純度について分析した。適切な純度の生成物含有画分を貯留し、回転蒸発器上で濃縮した。水中の２０％～２５％酢酸を使用して、完了するまで、ＤＭＴ基を除去した。サイズ排除クロマトグラフィーによってサンプルを脱塩し、凍結乾燥した。１×ＰＢＳ緩衝液中で、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖をアニールして、対応するｓｉＲＮＡ二本鎖を調製した。
複数のホスホロチオエート結合がある配列を含むＧａｌＮＡｃ複合体（０．２～１μｍｏｌ）の小規模合成では、ＭｅｒＭａｄｅプラットフォーム上のＲＮＡまたは完全な２’－Ｆ／２’－ＯＭｅ含有配列の合成のための上述のプロトコルを適用した。合成は、ＧａｌＮＡｃ官能化制御孔ガラス担体を含有する、事前充填カラム上で実施した。
実施例２：試験管内スクリーニング
細胞培養および形質移入
３７℃および５％ＣＯ２雰囲気内で、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）が添加されたイーグル最少必須培地（ＡＴＣＣ）中で、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をコンフルエンス近くまで培養した後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。マウス交差反応性二本鎖では、形質移入前の１時間以内にマウス初代培養肝細胞（ＰＭＨ）を新鮮に単離して、初代培養肝細胞培養液中で培養した。９６ウェルプレートの個々のウェル内で、各５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に、ウェルあたり１４．８μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；カタログ番号１３７７８－１５０）を添加することで、Ｈｅｐ３ＢとＰＭＨ双方の形質移入を実施した。次に混合物を室温で１５分間インキュベートした。次に約２×１０４個のＨｅｐ３Ｂ細胞を含有する、抗生物質を含まない８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞をＲＮＡ精製に先だって、２４時間培養した。１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で単回投与実験を実施し、１０ｎＭ～１２８ｐＭの範囲にわたる８×５倍連続希釈を使用して、用量応答実験を実施した（図２Ａおよび２Ｂを参照されたい）。
自由取り込み形質移入
９６ウェルプレートの各ウェル内で、９５μｌのＩｎ Ｖｉｔｒｏ Ｇｒｏ ＣＰ培地（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－Ｃｅｌｓｉｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）に再懸濁した４×１０４の新鮮に解凍された冷凍保存カニクイザル肝実質細胞に、ＰＢＳ中の５μｌの各ＧａｌＮａｃ共役ｓｉＲＮＡを合わせた。混合物を３７℃および５％ＣＯ２雰囲気内で、約２４時間培養した。ｓｉＲＮＡは、１００ｎＭ、１０ｎＭ、および０．１ｎＭの最終濃度で、有効自由取り込みアッセイのために試験した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；パーツ番号６１０－１２）を使用した全ＲＮＡ単離
細胞を収集して１５０μｌの溶解／結合緩衝液に溶解し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して、８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、処理全体にわたり同一であった）。１０μｌの磁性ビーズと、８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに入れて、１分間混合した。磁性スタンドを使用して磁性ビーズを捕捉し、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解細胞を残留ビーズに入れて、５分間混合した。上清を除去した後、磁性ビーズを１５０μｌの洗浄液緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉して、上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉して上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉して上清を除去した。最後に、ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加して、５℃で７０分間混合した。ビーズを磁石上に５分間捕捉した。４０μｌの上清を除去して、別の９６ウェルプレートに入れた。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用したｃＤＮＡ合成（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号４３６８８１３）
反応あたり、２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰｓ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅインヒビター、および３．２μｌのＨ２Ｏのマスター混合物を１０μｌの全ＲＮＡに付加した。ｃＤＮＡは、以下のステップを通じて、Ｂｉｏ－ＲａｄＣ－１０００またはＳ－１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して作成した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、および４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ
３８４ウェルプレートのウェルあたり、０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、ヒト細胞では０．５μｌのヒトＳＥＲＰＩＮＣ１ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号Ｈｓ００８９２７５８＿ｍ１）またはマウス細胞では０．５μｌのマウスＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０８３１３）、０．５μｌのマウスＳＥＲＰＩＮＣ１ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号Ｍｍ００４４６５７３＿ｍ１）；および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に、２μｌのｃＤＮＡを添加した。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを使用して、ＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内で、リアルタイムＰＣＲを実施した。各二本鎖は、２つの独立した形質移入で試験され、要約表で特に断りのない限り、各形質移入は複製でアッセイされた。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡレベルの相対的倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ－１９５５で形質移入された細胞または模擬形質移入細胞で実施したアッセイに、正規化した。ＸＬＦｉｔを使用した４パラメータ適合モデルを使用して、ＩＣ５０を計算し、同一投与範囲にわたってＡＤ－１９５５で形質移入された細胞に、またはそれ自身の最低用量に正規化した。表５は、示されるｉＲＮＡで形質移入されたＨｅｐ３Ｂ細胞およびＰＭＨ細胞における、単回投与スクリーニングの結果を示す。表６は、示されるｉＲＮＡのＨｅｐ３ＢおよびＰＭＨ細胞への形質移入の用量応答結果を示す。
ＡＤ－１９５５のセンスおよびアンチセンス配列は、次の通り：
センスｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ－（配列番号１３）
アンチセンスＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ－（配列番号１４）。
ｓｉＲＮＡの一部はまた、２’－ＯＭｅ修飾によって合成され、リポフェクタミン調合物中のこれらのｓｉＲＮＡの二本鎖を使用して、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を形質移入した。修飾二本鎖の単回投与スクリーニング結果は、表７で示される。
実施例３～４：リード最適化および生体内試験
表８は、リード最適化および生体内送達のために、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として（すなわちＭＣ３と共に）調合された、またはＧａｌＮＡｃに共役された、Ｓｅｒｐｉｎｃ１を標的にする二本鎖ｓｉＲＮＡ配列の詳細な一覧である。
実施例３：ＬＮＰ媒介ｓｉＲＮＡ送達
上述の試験管内単回投与とＩＣ５０結果に基づいて、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤のために、修飾ＡＤ－５０５０９を選択した。ＡＤ－５０５０９のＬＮＰ媒介送達の有効用量を判定するために、ＡＤ－５０５０９ ｓｉＲＮＡのＬＮＰ製剤（ＡＦ－０１１）の単回投与を０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、または１．０ｍｇ／ｋｇで、ＣＤ１マウスに静脈内注射した。動物を４８時間後に殺処分し（ｓａｃｒｉｆｉｃｉｅｄ）、本明細書に記載されるようにして、ＧＡＰＤＨと比較したＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡレベル、およびＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルを測定した。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、約０．１ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０で、ＡＦ－０１１－ＡＤ－５０５０９による８５％の最大Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡサイレンシングが達成され（図３Ａ）、約０．０５ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０で、９０％の最大Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質サイレンシングが達成された（図３Ｂ）。
ＡＤ－５０５０９ ｓｉＲＮＡ（Ａｆ－０１１－５０５０９）ＬＮＰ製剤のサイレンシング持続期間は、ＣＤ１マウス中で、ｓｉＲＮＡの単回１ｍｇ／ｋｇ静脈内注射に続いて判定した。動物を投与の１、２、３、７、１４、２１、または２８日後に殺処分して、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの相対レベルおよびＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質のレベルを測定した。図４Ａは、Ａｆ－０１１調合ＡＤ－５０５０９が、投与の２４時間以内に約９０％のＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡサイレンシングを達成し、投与の約２週間後に、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの相対量におよそ５０％の回復があったたことを実証する。図４Ｂは、Ａｆ－０１１に処方されたＡＤ－５０５０９が、投与の約７２時間以内に約９０％のＳｅｒｐｉｎｃ１ タンパク質ｍＲＮＡサイレンシングを達成し、投与の約２週間後に、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質の相対量におよそ５０％の回復があったたことを実証する。Ｓｅｒｐｉｎｃ１活性はまた、ＣＤ１マウス中で、ＬＮＰに処方されたＡＤ－５０５０９ｓｉＲＮＡの単回１ｍｇ／ｋｇ静脈内注射に続いて、市販のキット（Ａｎｉａｒａ）を使用して、Ｘａ因子活性を測定することでも判定された。動物を投与の１、２、３、７、１４、２１、または２８日後に殺処分して、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質の相対活性レベルおよび相対Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルを測定した。図４Ｃは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルとＳｅｒｐｉｎｃ１活性レベルの間に、良好な相関があることを示す。
実施例４：ＧａｌＮＡｃ共役ｓｉＲＮＡ
４４本の修飾Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖を、センス鎖の３’末端で三価のＧＡＬＮＡｃと共役させた。これらの二本鎖を、カニクイザル肝実質細胞中における、共役二本鎖の単回投与自由取り込み効率について、アッセイした。表９は、これらのアッセイ結果を示す。
これらの二本鎖はまた、自由取り込みおよび形質移入アッセイで、用量応答についてもアッセイされた。
表１０は、自由取り込みおよび形質移入の双方について、これらのアッセイ結果および二本鎖の順位を示す。最高のＩＣ５０がある５本の二本鎖は淡灰色で網掛けされ、最低の５本の二本鎖は濃灰色で網掛けされる。二本鎖のＩＣ５０順位は、ＧａｌＮＡｃ複合体の自由取り込みおよび形質移入媒介取り込みの間で、良好に保たれた。
実施例５：ＡＤ－５４９４４最適化
上の実施例４に記載されるように、ＡＤ－５４９４４は、自由取り込みおよび形質移入アッセイの双方による判定で、最も活性が高いＧａｌＮＡｃ共役ｓｉＲＮＡ二本鎖の１つであり、したがってさらなる最適化および生体内試験のために選択された。
同一ＡＤ－５４９４４親配列をベースとして２９種の化合物を調製し、１０ｍｇ／ｋｇの単回投与を使用して、生体内効能についてスクリーニングした。動物（Ｃ５７ＢＬ／６）は、０日目に皮下注射して、３日目に殺処分した。血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定し、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡレベルは、動物からの肝臓サンプルを使用して、ＱＲＴ－ＰＣＲによって測定した。表１１および１２は、二本鎖の配列、そしてＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベル百分率のＰＢＳからのノックダウンとしてのこれらの二本鎖の単回投与スクリーニング結果を示す。図５は、Ｓｅｒｐｉｎｃｅ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルのＰＢＳからのノックダウン百分率として、単回投与スクリーニング結果を示す。
ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４の生体内用量応答は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝５）に単回皮下投与することで判定された。ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４はまた、５ｍｇ／ｋｇの反復１日量で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝５）に５日間にわたり皮下投与した。投与の７２時間後に動物を殺処分して、上述したように、肝臓および血清サンプル中でＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質および活性レベルを測定した。
図６に示されるように、ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４の単回皮下投与は、約１０ｍｇ／ｋｇのタンパク質ＥＣ５０をもたらし、毎日５×５ｍｇ／ｋｇの反復投与は、約７５％のタンパク質サイレンシングをもたらした。
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４の追加的な反復投与もまた、８週間にわたり実施して、サイレンシングの効能と持続期間を判定した。図７Ａおよび７Ｂは、これらの試験結果を示す。
実施例６：ＡＤ－５４９４４の分割投薬の用量持続期間
化合物ＡＤ－５４９４４によるＳｅｒｐｉｎｃ１発現および活性ノックダウンをさらに評価するために、分割投薬実験を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４を皮下投与して、週３回のＡＤ－５４９４４の１／３用量の効果を，週１回のＡＤ－５４９４４の完全濃縮用量の効果と比較した。研究デザインの概要は、表１３に示される。血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルは、０、３、７、１０、１４、１７、２１、２４、２９、３１、および３５日目に測定した。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルの投与前レベルからのノックダウン百分率としての、週１回の分割投薬スクリーニングの結果は、図８で示され、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルの投与前レベルからのノックダウン百分率としての、週３回投薬のスクリーニングの結果は、図９で示される。結果は、双方の群でＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５４９４４に用量応答効果があり、３０ｍｇ／ｋｇで週１回投与、および１０ｍｇ／ｋｇで週３回投与の双方が、Ｓｅｒｐｉｎｃ１の長期サイレンシングをもたらすことを実証する。
実施例７：ＡＤ－５４９４４のさらなる最適化
ＡＤ－５４９４４の効能をさらに改善するために、ＡＤ－５４９４４親配列をベースとして追加的な化合物を調製した。一般に修飾としては、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）結合、Ｃ１６（ヘキサデシル）修飾、５’末端キャップ、および２’メチルの付加が挙げられる。３ｍｇ／ｍｇの単回投与および１０ｍｇ／ｋｇの単回投与の双方を使用して、新しい化合物を生体内効能についてスクリーニングした。動物（Ｃ５７ＢＬ／６）は、０日目に皮下注射して、３日目に殺処分した。血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。ＥＬＩＳＡアッセイは、Ａｂｃａｍから購入された抗トロンビンＩＩＩマウスＥＬＩＳＡキットを使用して実施した。簡単に述べると、血清を希釈（例えば約１：１０，０００）して、製造会社の使用説明に従って使用した。プレートは、アッセイの終了時に４５０ｎｍで読み取った。
表１４は、二本鎖の配列と、そしてＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベル百分率のＰＢＳからのノックダウンとしてのこれらの二本鎖の単回投与スクリーニング結果を示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルのＰＢＳからのノックダウン百分率としての単回投与スクリーニング結果を示す。表１４および図１０から分かるように、化合物ＡＤ－５６８１３は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルのノックダウンレベルに基づいて、新しいリードとして出現した。
化合物の活性を保つ（ｍａｉｎａｔｉａｎｅｄ）化合物の安定性に要する最少化学修飾を判定するために、その中で２’－メトキシエチルおよびホスホロチオエート結合数が低下している、ＡＤ－５６８１３親配列をベースとして、さらなる化合物を調製した。３ｍｇ／ｍｇの単回投与および１０ｍｇ／ｋｇの単回投与の双方を使用して、新しい化合物を生体内効能についてスクリーニングした。動物（Ｃ５７ＢＬ／６）は、０日目に皮下注射して、３日目に殺処分した。Ｓｅｒｐｉｎｃ１（ＡＴ３）活性および血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。ＥＬＩＳＡアッセイは、上述したように実施した。Ｓｅｒｐｉｎｃ１活性は、ＢＩＯＰＨＥＮ（抗Ｘａ因子）活性試験キットを使用して測定した。簡単に述べると、血清サンプルを約１：２０～約１：６０に希釈し、製造会社の使用説明に従って処理した。プレートは、アッセイの終了時に４５０ｎｍで読み取った。
新たに調製された二本鎖の配列、そしてＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルのＰＢＳからのノックダウン百分率としてのこれらの二本鎖の単回投与スクリーニングの結果は、表１５で示される。図１１は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルのＰＢＳからのノックダウン百分率としての単回投与スクリーニング結果を示し、図１２は、ＰＢＳからのＳｅｒｐｉｎｃ１活性のノックダウン百分率としての単回投与スクリーニング結果を示す。
表１５ならびに図１１および１２から分かるように、化合物に対する修飾数は劇的に低下されたが、化合物ＡＤ－５７２１３は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現および活性のノックダウンを維持し、したがって、新しいリードとして出現した。１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５７２１３の単回投与は、ＥＤ９０をもたらし、３ｍｇ／ｋｇの単回投与は、ＥＤ５０をもたらした。
実施例８：血友病マウスにおけるＳｅｒｐｉｎｃ１ノックダウン
標的とされる第ＶＩＩＩ因子の欠失を有して、血友病Ａ表現型を再現するオスおよびメスマウス（Ｃ５７ＢＬ／６／１２９ハイブリッド）、および対照または野生型（Ｃ５７ＢＬ／６メス）マウスに、ＧａｌＮＡｃに共役した化合物ＡＤ－５７２１３の単回投与を３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇで０日目に皮下注射し、 動物を３日目に殺処分して、Ｓｅｒｐｉｎｃ１活性を上述したように測定した。図１３は、ＡＤ－５７２１３の単回投与が、Ｓｅｒｐｉｎｃ１活性を効果的にノックダウンするだけでなく、ＡＤ－５７２１３に対する用量応答があることを示す。
血友病状況におけるトロンビン生成に対する抗トロンビン低下の影響を調べるために、 第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および抗トロンビン（Ａｎｔｈｉｔｈｒｏｍｂｉｎ）（ＡＴ）枯渇ヒト血漿に対して、トロンビン生成試験を実施した。（ＦＩＸ枯渇は、血友病Ｂ表現型を再現する）。引き続いて血漿サンプルに、様々なレベル（１ＩＵ／ｍｌ＝１００％）でＡＴを戻し入れて、異なるレベルの抗トロンビン（０～１００％）があるＦＩＸ枯渇血漿サンプルを作り出した。対照血漿は、二重枯渇血漿に、１ＩＵ／ｍｌ抗トロンビンおよび５μｇ／ｍｌＦＩＸ（１００％）を戻し入れて作成された。図３１Ａは、ＦＩＸおよびＡＴ枯渇ヒト血漿中におけるトロンビン生成を描写する（組織因子＝５ｐＭ）。図３１Ｂは、ＦＩＸおよびＡＴ枯渇ヒト血漿中におけるピークトロンビンｉを描写する（組織因子＝５ｐＭ）。これらの数値で示されるように、抗トロンビン低下は、試験管内で、第ＩＸ因子枯渇ヒト血漿中におけるトロンビン生成を増大させる。
実施例９：ＡＤ－５７２１３の用量持続期間
血友病Ａマウス（Ｂ６；１２９Ｓ４－Ｆ８ｔｍ１／Ｋａｚ／Ｊ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）における、抗トロンビンサイレンシング持続期間を評価するために、ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５７２１３の単回投与に続いて、マウスに化合物ＡＤ－５７２１４、ＡＤ－５７２０５、またはＡＤ－５７２１３またはＰＢＳを皮下注射した。全血を眼窩後方採取して、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡレベルおよびＳｅｒｐｉｎｃ１活性についてアッセイした。３、７、１０、１４、１７、２１、２８、および３６日目における、Ｓｅｒｐｉｎｃ１活性のＰＢＳからのノックダウン百分率としての、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇで投与された化合物ＡＤ－５７２１３の単回投与スクリーニング結果は、図１４に描写される。図１６は、３、７、１０、１４、１７、２１、および２５日目における、Ｓｅｒｐｉｎｃ１活性のＰＢＳからのノックダウン百分率としての、図に示される用量で投与された化合物ＡＤ－５７２１３、ＡＤ－５７２０５、およびＡＤ－５７２１４の単回投与スクリーニング結果を示す。
０日目に、３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇの用量でＡＤ－５７２１３、またはＰＢＳを皮下注射した血友病Ａマウス（Ｂ６；１２９Ｓ４－Ｆ８ｔｍ１／Ｋａｚ／Ｊ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）中で、肝臓ｍＲＮＡ、血清中ＡＴ抗原、およびＡＴ活性を評価した。動物は、上述したように注射の３日後に殺処分した。図１５は、ＡＤ－５７２１３について、３日目における、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡレベルのＰＢＳからのノックダウン百分率としての、Ｓｅｒｐｉｎｃ１抗原レベルのＰＢＳからのノックダウンの百分率としての、およびＳｅｒｐｉｎｃ１活性のＰＢＳからのノックダウン百分率としての、単回投与スクリーニング結果を示す。
図１４～１６によって証明されるように、化合物ＡＤ－５７２１３の投与は、ＨＡマウスにおいて、７日目に１ｍｇ／ｋｇ未満の単回投与ＥＤ５０で、Ｓｅｒｐｉｎｃ１の強力な用量依存的抑制をもたらす。Ｓｅｒｐｉｎｃ１抑制は持続して、達成された最大の抗トロンビン抑制レベルと相関する。１ｍｇ／ｋｇの単回投与が、約１５日間にわたり維持される５０％の抑制をもたらした一方で、１０ｍｇ／ｋｇの用量は、２８日間にわたり維持される８０％を超える抑制をもたらした。
実施例１０：ＡＤ－５７２１３の分割投薬の用量持続期間
化合物ＡＤ－５７２１３によるＳｅｒｐｉｎｃ１発現および活性ノックダウンをさらに評価するために、分割投薬実験を実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＧａｌＮＡｃ共役ＡＤ－５７２１３を皮下投与して、週３回のＡＤ－５７２１３の１／３用量の効果を，週１回のＡＤ－５７２１３の完全濃縮用量の効果と比較した。研究デザインの概要は、表１６に示される。血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルが測定された。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルのＰＢＳからのノックダウン百分率としての週１回（ｑ１ｗ）投薬の結果は、図１７で示され、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルのＰＢＳからのノックダウン百分率としての週３回（ｔ．ｉ．ｗ．）投薬の結果は、図１８で示される。
図１７および１８に示されるように、反復投薬は、化合物ＡＤ－５７２１３は、いくつかの相加効果がある、用量依存的な持続性応答をもたらした。３ｍｇ／ｋｇを投与された動物は、２回の毎週投与後に、＞９５％ノックダウンのほぼ最下点レベルに達したのに対し、より低い２種の用量群は、３回の毎週投与後に、最下点に達し（１．５ｍｇ／ｋｇでは約９０％ノックダウン，０．７５ｍｇ／ｋｇでは約８０％）。
異なる群における異なる投薬計画をさらに試験するために、同一週間用量を分割して週３回投与し、例えば１．５ｍｇ／ｋｇ ｑ１ｗを０．５ｍｇ／ｋｇ ｔｉｗと比較した。図１９に示されるように、累積週間用量は、同一ノックダウンレベルを与えた。例えば、１．５ｍｇ／ｋｇ（ｑ１ｗ）で達成されたＳｅｒｐｉｎｃ１レベルは、週３回投与される０．５ｍｇ／ｋｇで達成されたＳｅｒｐｉｎｃ１レベルと同等であった。
実施例１１：Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｓｉＲＮＡの非ヒト霊長類投薬
化合物ＡＤ－５７２１３を表１７で概説されるように、非ヒト霊長類中の効能について、試験した。血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルは、１４、８、４日前に、１日目は投薬４時間後に、そして２、４、８、１１、１５、２２、２９、３７、４４、５１、および５８日後に測定した。
図２０は、投薬前Ｓｅｒｐｉｎｃ１レベルと比較した相対血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１レベルの群平均としての、試験した全ての化合物について、単回投与スクリーニング結果を示し、試験した全てのｉＲＮＡが、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルを効果的にノックダウンすることを実証する。
図２１は、投薬前Ｓｅｒｐｉｎｃ１レベルと比較した相対血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１レベルの群平均としての、化合物ＡＤ－５７２１３の単回投与スクリーニング結果を示す。
図２２は、８日目における、投薬前Ｓｅｒｐｉｎｃ１レベルと比較した相対血清Ｓｅｒｐｉｎｃレベルの群平均としての、試験した全化合物の単回投与スクリーニング結果を示す。
全体的には、結果は、非ヒト霊長類において、ＡＤ－５７２１３による、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルの用量依存的ノックダウンがあり、ＡＤ－５７２１３およびＡＤ－５７２０５の双方が、親化合物ＡＤ－５２４４４よりも改善された効力を示すことを実証する。
実施例１２：治療的Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｓｉＲＮＡの非ヒト霊長類投薬
化合物ＡＤ－５７２１３を非ヒト霊長類中の効能について試験した。カニクイザルに、下の表１８で概説されるように化合物ＡＤ－５７２１３を投与した。ＡＤ－５７２１３の投与後、様々な時点で血漿を採取して、ＥＬＩＳＡによって抗トロンビンタンパク質（Ｓｅｒｐｉｎｃ１）レベルについて分析した。
図２３は、３回の投与前測定値の平均と比較した相対血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１レベルの群平均としての、化合物ＡＤ－５７２１３の単回投与スクリーニング結果を示す。結果は、それぞれ１、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇでの、約５０、７０、８０および＞９０％のサイレンシングによって、用量依存的Ｓｅｒｐｉｎｃ１サイレンシングを実証する。データ点は群平均を表し、誤差棒は標準偏差を表す。
図２４Ａ～Ｄは、化合物ＡＤ５７２１３のＡ）１ｍｇ／ｋｇ、Ｂ）３ｍｇ／ｋｇ、Ｃ）１０ｍｇ／ｋｇ、およびＤ）３０ｍｇ／ｋｇの単回投与における、相対血清Ｓｅｒｐｉｎｃ１レベルと、ピーク血漿トロンビンレベルの変化倍数との間の相関を示す。Ｓｅｒｐｉｎｃ１レベルは、３回の投与前測定値の平均と比較して表される。トロンビン生成曲線は、Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅを使用して、様々な時点で採取され血漿サンプルから作成した（組織因子＝１ｐＭ）。ピークトロンビンの変化倍数は、各動物について、２回の投与前測定値の平均ピークトロンビン値と比較して計算された。データ点は群平均を表し、誤差棒は標準偏差を表す。図２５は、相対的Ｓｅｒｐｉｎｃ１サイレンシングの関数として、ピークトロンビン増大の倍数変化の統合された散布図を示す。
動物にはまた、３回の毎週３０ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５７２１３用量も投与して、動物から採取された血液サンプル中で、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質およびｍＲＮＡレベルを測定した。これらの試験結果を図２６Ａ（出血前レベルと比較したＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベル）および２６Ｂ（ＧＡＰＤＨと比較したＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡレベル）に提示する。
全体的には、結果は、非ヒト霊長類において、化合物ＡＤ－５７２１３によるＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベルの持続する量依存的阻害があり、それは、トロンビン生成に最大で４倍の増大をもたらすことを実証する。
実施例１３：非ヒト霊長類投薬におけるＳｅｒｐｉｎｃ１ ｓｉＲＮＡの反復投与
反復投与プロトコルによって、非ヒト霊長類において、化合物ＡＤ－５７２１３を効能について試験し、化合物の累積効果を評価した。カニクイザルに、２ヶ月間にわたる０．５ｍｇ／ｋｇｑ１ｗ；１ｍｇ／ｋｇ ｑ２ｗ（隔週）、および６週間にわたる１．５ｍｇ／ｋｇｑ１ｗ；３ｍｇ／ｋｇ ｑ２ｗで、化合物ＡＤ－５７２１３を投与した。図２７で図示されるように、血清を様々な時点で採取し、ＥＬＩＳＡによって抗トロンビンタンパク質レベル（ＳｅｒｐｉｎＣ１）について分析した。抗トロンビンレベルは、３回の投与前測定の平均と比較して表された。
０．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量の最初の２つの用量群では、５週間後にＡＴレベルの８０％低下が得られた。１．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量の後者の２群では、＞９５％の最大ノックダウンが得られた。図２７Ａは、後者の２群からのデータを示す。３ｍｇ／ｋｇの用量を投与した動物を５４日目に安楽死させ、１．５ｍｇ／ｋｇ ｑ１ｗの用量を投与した動物には、３６日目に追加的な６回目の週間用量を投与して、ベースラインレベルの回復をモニターした。図２７Ｂは、０．５ｍｇ／ｋｇの累積週間用量後のＡＴレベルを示す。
データは、全ての投薬計画で、用量依存性抗トロンビンサイレンシングが観察され、２５日目までに、抑制の定常状態レベルが達成されたことを実証する。
実施例１４：血友病マウスへの化合物ＡＤ－５７２１３投与に続く止血の矯正
血友病動物は、トロンビン生成能が低く、安定した血餅を形成できない。これらの動物中の抗トロンビンタンパク質の低下は、止血の再バランスと内在性トロンビン生成能の増大を助けて、血餅形成ができるようにするはずである。生体内画像診断を伴う微小血管レーザー傷害モデルにおいて、血友病Ａおよび血友病Ｂマウス中で、この仮説を試験した。マウスに化合物ＡＤ－５７２１３を注射して、処置後１０日目に傷害を誘発した。傷害部位の血小板およびフィブリン蓄積を視覚化し、記録して定量化した。図２８Ａは、レーザー外科手術後の経時的な血小板蓄積（ａｃｃｕｌｕｌａｔｉｏｎ）中央値を示し、図２８Ｂは、レーザー外科手術後の経時的な全ての被害的損傷からのフィブリン値の中央値を示す。図２８Ａおよび２８Ｂによって実証されるように、１ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇで注射された化合物ＡＤ－５７２１３は、損傷の１００％で、血餅形成に至る血小板およびフィブリン沈着をもたらした。表１９は、ＨＡおよびＨＢ動物を用いた別個の２回の実験からの結果を要約する。
実施例１５：ＡＤ－５７２１３ＬＮＰ製剤の生体内効能
化合物ＡＤ－５５０２９（非結合）およびＡＤ－５７２１３（ＧａｌＮＡｃに共役する）を脂質核酸粒子（Ａｆ－１１）に調合し、これらのＬＮＰ調合化合物を０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、および０．３ｍｇ／ｋｇ用量で野生型動物に投与した。対照として、ルシフェラーゼ（ＡＦ１１－１９５５）を使用した。
どちらの化合物も、０．３ｍｇ／ｋｇで＞９５％のノックダウンをもたらしたが、ＡＦ１１－５７２１３ではレベルが１５日間維持されたのに対し、ＡＦ１１－５５０２９では８日間維持された（図２９を参照されたい）。作用持続期間における２種の化合物間の同様の違いは、より低い用量でも観察された。
実施例１６：追加的なｓｉＲＮＡのデザイン、合成、および試験管内スクリーニング
ｓｉＲＮＡデザイン
ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００４８８．３に記載されるヒトＳＥＲＰＩＮＣ１ ｍＲＮＡ配列を使用して、センスおよびアンチセンス鎖の双方が１９ヌクレオチド長のＳｉＲＮＡ二本鎖をデザインした。１５９９ヌクレオチド転写物全体にわたって７ヌクレオチドより長い反復を含有しない、１５８１本の二本鎖を最初に同定した。次に、各二本鎖位置でヌクレオチド対を評価する線形モデル、およびスクリーニングで使用される用量および細胞系に従って、１５８１本の全ての二本鎖を予測効能について点数化した。二本鎖はまた、カスタム総当たりアルゴリズムを使用してヒトＲｅｆＳｅｑコレクション中の全ての転写物に対して整合させ、ＳＥＲＰＩＮＣ１以外の転写物に対するミスマッチ（鎖あたり）の最小数について点数化した。次に以下のスキームに従って、合成およびスクリーニングする二本鎖を１５８１本から選択した。転写物の５’末端から開始して、各１０±２ヌクレオチド「ウィンドウ」内で、
１）最大予測効能を有し、
２）ＳＥＲＰＩＮＣ１以外の全ての転写物に対する、少なくとも１つのミスマッチを双方の鎖に有し、
３）その他の二本鎖セットの一部として、既に合成およびスクリーニングされていない
二本鎖を選択した。
所与のウィンドウ内で全ての基準を満たす二本鎖が同定され得れば、そのウィンドウをスキップした。これらの基準を満たす１６４本の二本鎖が、同定された。
Ｓｅｐｉｎｃ１センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧は、表２０および２１で示される。
細胞培養および形質移入
３７℃および５％ＣＯ２雰囲気内で、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）が添加されたイーグル最少必須培地（ＡＴＣＣ）中で、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をコンフルエンス近くまで培養した後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。９６ウェルプレートの個々のウェル内で、各４μｌの１６４本のｓｉＲＮＡ二本鎖に、ウェルあたり１４．８μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；カタログ番号１３７７８－１５０）を添加することで、形質移入を実施した。次に混合物を室温で１５分間インキュベートした。次に約２．５×１０４個のＨｅｐＧ２細胞を含有する、抗生物質を含まない８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞をＲＮＡ精製に先だって、２４時間培養した。実験は２０ｎＭで実施され、未感作細胞と、ＡＤ－１９５５で形質移入された細胞と、陰性対照としてのルシフェラーゼを標的にするｓｉＲＮＡとが含まれた。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；パーツ番号６１０－１２）を使用した全ＲＮＡ単離
細胞を収集して１５０μｌの溶解／結合緩衝液に溶解し、次にプラットフォーム振盪機上で、７００ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は処理全体にわたり同一であった）。１０マイクロリットルの磁性ビーズと８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに入れて、１分間混合した。磁性スタンドを使用して磁性ビーズを捕捉し、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解細胞を残留ビーズに入れて、５分間混合した。上清を除去した後、磁性ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄して、１分間混合した。ビーズを再度捕捉して、上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉して上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉して上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加して、５℃で７０分間混合した。ビーズを磁石上に５分間捕捉した。単離ＲＮＡを含有する（ｃｏｎｔａｉｎｇ）４０μｌの上清を取り出して、別の９６ウェルプレートに入れた。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用したｃＤＮＡ合成（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号４３６８８１３）
反応あたり、２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．２μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを１０μｌの全ＲＮＡに添加した。ｃＤＮＡは、以下のステップを通じて、Ｂｉｏ－ＲａｄＣ－１０００またはＳ－１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して作成した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号０４８８７３０１００１）中のウェルあたり、０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌヒトＳＥＲＰＩＮＣ１ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号Ｈｓ００８９２７５８＿ｍ１）、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に、２μｌのｃＤＮＡを添加した。ＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）内で、リアルタイムＰＣＲを実施した。
相対的倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、２０ｎＭのＡＤ－１９５５で形質移入された細胞で実施したアッセイに正規化した。
表２２は、ＨｅｐＧ２における、示されるｉＲＮＡの単回投与スクリーニング結果を示す。

Claims (26)

  1. センス鎖、アンチセンス鎖、およびリガンドを含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子であって、ここで前記センス鎖のヌクレオチド配列が、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）からなり、かつ前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列が、配列５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）からなり、ａ、ｇ、ｃおよびｕがそれぞれ２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆがそれぞれ２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；およびｓがホスホロチオエート結合であり、リガンドが概略図
    ここでＸはＯである、
    で示されるように前記センス鎖の３’末端に共役される、ｄｓＲＮＡ分子。
  2. ｄｓＲＮＡ分子が遊離酸の形態である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  3. ｄｓＲＮＡ分子が塩の形態である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  4. 請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子を含む医薬組成物。
  5. リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. インヒビターを有するか、またはインヒビターを有しない血友病Ａまたは血友病Ｂの患者における出血症状の頻度の予防または減少させるための予防における使用のための、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子を含む、医薬組成物。
  7. リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 出血を予防する、請求項６または７に記載の医薬組成物。
  9. 前記患者がインヒビターを有する血友病Ａ患者である、請求項６－８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. 前記患者がインヒビターを有しない血友病Ａ患者である、請求項６－８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 前記患者がインヒビターを有する血友病Ｂ患者である、請求項６－８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 前記患者がインヒビターを有しない血友病Ｂ患者である、請求項６－８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. インヒビターを有するか、またはインヒビターを有しない血友病Ａまたは血友病Ｂの患者における出血症状の頻度の予防または減少させるための予防のための医薬の製造における、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子の使用。
  14. 前記医薬がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む、請求項１３に記載の使用。
  15. 前記医薬が出血を予防する、請求項１３または１４に記載の使用。
  16. 前記患者がインヒビターを有する血友病Ａ患者である、請求項１３－１５のいずれか一項に記載の使用。
  17. 前記患者がインヒビターを有しない血友病Ａ患者である、請求項１３－１５のいずれか一項に記載の使用。
  18. 前記患者がインヒビターを有する血友病Ｂ患者である、請求項１３－１５のいずれか一項に記載の使用。
  19. 前記患者がインヒビターを有しない血友病Ｂ患者である、請求項１３－１５のいずれか一項に記載の使用。
  20. インヒビターを有するか、またはインヒビターを有しない血友病Ａまたは血友病Ｂの患者における出血症状の頻度の予防または減少させるための予防における使用のための、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  21. 前記ｄｓＲＮＡ分子がリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）にある、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  22. 前記ｄｓＲＮＡ分子が出血を予防する、請求項２０または２１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  23. 前記患者がインヒビターを有する血友病Ａ患者である、請求項２０－２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  24. 前記患者がインヒビターを有しない血友病Ａ患者である、請求項２０－２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  25. 前記患者がインヒビターを有する血友病Ｂ患者である、請求項２０－２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  26. 前記患者がインヒビターを有しない血友病Ｂ患者である、請求項２０－２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子。
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