CN117264948B - 抑制血管紧张素原基因表达的RNAi抑制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的siRNA，包括正义链及反义链，所述正义链序列如AGCCCACAGAGUCUACCCAAU所示；所述反义链序列如AUUGGGUAGACUCUGUGGGCUCU所示。还提供了一种经过了修饰的、用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的siRNA，所述正义链序列如mAsmGsmCmCmCmAfCmAdGfAfGmUfCmUmAmCmCmCmAmAmU所示,所述反义链序列如mAsfUsmUmGfGmGm UfAmGfAmCdTmCfUmGfUmGmGmGmCmUsmCsmU所示，可用于制备抑制血管紧张素原(AGT)表达的药物。本发明公开的siRNA及其合适的修饰序列，不管在体外还是体内的生物活性都很好，有望于应用于临床上进行高血压的治疗。

Description

抑制血管紧张素原基因表达的RNAi抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及抑制血管紧张素原(AGT)基因表达的RNAi抑制剂及其应用。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默机制，它利用小的双链RNA分子以同源的方式指导基因沉默。RNAi介导的基因沉默已被广泛应用于活体靶标验证和机制研究。
小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)，是长度为19到25个左右的核苷酸的双链RNA，其招募一个RNA诱导的沉默复合体到靶mRNA，然后经历位点特异性的切割和降解，用于基因表达的沉默。siRNA通过使导致疾病的基因沉默来起作用，在治疗疾病的药物应用中具有巨大的潜力，可以作为各种系统性疾病的干扰RNA治疗剂。
由于人工制备的外源性siRNA可能会与内源性RNA竞争，并且外源性siRNA 还可能会引起“脱靶效应”从而导致非目的功能基因的表达沉默。可以设计针对目标靶点的高度特异性的19-25nt的siRNA，通过对核苷酸设计和化学修饰方面的改进能够降低寡核苷酸的免疫刺激，提高靶标的沉默能力并且降低脱靶效应。
高血压是一种慢性疾病，在全世界成年人中的患病率为26％。高血压是各种疾病、失调和病症的主要风险因素，如慢性肾病、中风、心肌梗塞、心力衰竭、动脉瘤、外周动脉疾病、心脏损伤和其他心血管相关疾病、失调病症。目前，市场上有许多降压药物主要针对肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)。
RAAS是调节血压、体液和电解质平衡的重要激素系统之一。血管紧张素原 (AGT)是一种血浆糖蛋白，是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的组成部分，主要由肝脏分泌，少量由肾、心、脑、脂肪组织和血管分泌。通过肾素和血管紧张素转换酶的连续蛋白分解作用，AGT被加工成活性的八肽血管紧张素II(Ang II)，作用于多种组织上的AngII受体，并介导血管收缩和醛固酮分泌等多种功能。AngII还刺激肾上腺皮质分泌激素醛固酮。醛固酮使肾脏增加对钠和水的重吸收,导致体内液体量增加,进而增加血压。
临床前研究已证实血浆AGT水平与血压调节相关，AGT水平的变化可导致血浆AngII水平的变化进而引起血压的变化；大鼠注射AGT可使血压升高，而AGT 抗体治疗可降低血压；AGT基因敲除小鼠的血压降低，而通过在小鼠中过表达 AGT基因则使血压升高。因此，调节AGT表达水平有望成为新的治疗高血压的方法。而随着RNA干扰(RNAi)技术的日渐成熟，寻找用于抑制血管紧张素原(AGT) 表达的双链核糖核酸(RNAi)抑制剂就成了寻找治疗高血压的重要治疗方式。
目前靶向血管紧张素原(Angiotensinogen，AGT)的寡核苷酸疗法比较成熟的是Alnylam的siRNA技术及IONIS的ASO技术。例如，US11015201B2中涉及了RNAi结构，其实现RNA诱导沉默复合体(RISC)-介导的血管紧张素原(AGT) 基因的RNA转录物的切割，并公开了大量的19-23碱基的siRNA序列靶向AGT。 IONIS WO2022109139A1专利也公布多条靶向AGT的ASO序列。
尽管Alnylam公开过非常多的靶向AGT siRNA序列，而目前真正进入了临床的只有US11015201B2专利中的序列AD-85481。通常，一个真正能应用于临床的肝脏靶向的siRNA药物至少克服3个技术平台的难题，包括序列、化学修饰、递送系统(GalNAc+linker)。
由于siRNA是带有负电荷的一种高度水溶性的大分子，自身很难通过带负电的细胞膜，即便进入细胞也很容易被核酸酶降解。外源性siRNA在血液和组织中不稳定，易被核酸酶降解。因此小核酸药物的修饰方法及递送系统十分重要。
N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)是一种高效的递送技术，完美避免了脂质体递送系统的缺点，能够做到直接递送以及靶向递送，避免了脂质分子的免疫原性，同时又增加了安全性。肝脏中去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，是肝细胞特异性表达的异源低聚物的内吞型受体，能特异性地识别并结合GalNAc。寡核苷酸结合GalNAc通过与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的相互作用进入到细胞内形成内涵体，从而将足够数量的siRNA带入细胞内，诱导选择性RNA沉默反应，是肝细胞特异性递送的首选方法。但尽管如此，什么样的siRNA，进行怎么样的修饰，需要什么样的递送系统，在体外活性效果好，在体内是否具有很好的效果，都是未知数且不可预测，这些综合在一起提高了siRNA药物的筛选难度。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种体内和体外效果都很好的、用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的siRNA及其应用。
本发明的第一个方面，提供了一种用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的 siRNA，包括正义链及反义链，所述正义链序列如AGCCCACAGAGUCUACCCAAU所示，所述反义链序列如AUUGGGUAGACUCUGUGGGCUCU所示。
本发明的第二个方面，提供了上述siRNA在制备抑制血管紧张素原(AGT)表达的生物制剂或者药物制剂中的应用。
本发明的第三个方面，提供了一种经过了用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的修饰siRNA，所述正义链序列如 mAsmGsmCmCmCmAfCmAdGfAfGmUfCmUmAmCmCmCmAmAmU所示，所述反义链序列如mAsfUsmUmGfGmGmUfAmGfAmCdTmCfUmGfUmGmGmGmCmUsmCsmU所示，其中，mG为2’ -O-甲基鸟苷酸，mA为2’-O-甲基腺苷酸，mU为2’-O-甲基尿苷酸，mC为2’ -O-甲基胞苷酸；fG为2’-氟鸟苷酸，fA为2’-氟腺苷酸，fU为2’-氟尿苷酸，fC为2’-氟胞苷酸；Gs为2'-O-甲基-3’-硫代鸟苷酸，As为2'-O-甲基 -3'-硫代腺苷酸，Us为2'-O-甲基-3'-硫代尿苷酸，Cs为2'-O-甲基-3'-硫代胞苷酸；dG为2’-脱氧鸟苷酸、dT为2’-脱氧胸苷酸。
本发明的第四个方面，提供了上述修饰siRNA在制备抑制血管紧张素原(AGT) 表达的生物制剂或者药物制剂中的应用。
在其中一个实施例中，上述生物制剂或者药物是用于预防或者治疗高血压。
本发明的第五个方面，提供了用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的药物制剂，包括上述siRNA或修饰的siRNA，以及与siRNA连接的配体，所述配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在其中一些实施例中，所述配体的结构如下：
在其中一些实施例中，所述配体与siRNA的正义链的3’端连接方式如下：
本发明的第六个方面，是提供所述药物制剂在制备预防和治疗高血压的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本申请的发明人经过对siRNA的研究，并通过大量的实验，筛选到一条能够用于抑制血管紧张素原(AGT)表达的siRNA，并在此基础上，进行了合适的修饰以提高靶标的沉默能力，其中，获得的BBD-1003.14序列在体内和体外都具有很好的抑制血管紧张素原(AGT)表达生物活性，有望应用于临床上进行高血压的治疗。
附图说明
图1为实施例2中BBD-1003.14、BBD-1004.7siRNA单剂量1nM对比实验结果示意图。
图2为实施例2中BBD-1003.14与BBD-1003.15siRNA的活性对比实验结果示意图。
图3为实施例3中BBD-1003.14、BBD-1004.7siRNA单剂量1nM在小鼠原代肝细胞中采用脂质体转染方法的对比实验结果示意图。
图4为实施例4中BBD-1003.14、BBD-1004.7siRNA单剂量1nM在小鼠原代肝细胞中采用GalNAc递送自由摄取方法的对比实验结果示意图。
图5为实施例6中BBD-1003.14-GalNAc、BBD-1004.7-GalNAc在表达hAGT的小鼠血清中的hAGT单剂量筛选试验结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/ 或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
以下实施例中，GalNAc载体及连接siRNA后的结构如下：
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实验例1 siRNA的合成
在北京擎科生物科技有限公司12通道合成仪上，使用固相寡核苷酸合成方案进行0.2-1μmol的寡核苷酸合成，含GalNAc的siRNA需要在偶联GalNAc的CPG预填充柱上进行合成。在合成的寡核苷酸中加入氨解试剂(1：1的30％甲胺 -氨水溶液)，并在60℃下孵育30分钟，将寡核苷酸与固相载体分离使寡核苷酸游离下来。然后在乙醇：氯化钠(300：1)溶液中沉淀粗制寡核苷酸，高速离心弃去上清液，重复两遍获得粗制寡核苷酸，并将沉淀重悬于DEPC水中。通过离子配对HPLC方法对粗制寡核苷酸进行纯化，将收集到的产物在真空离心干燥器中干燥至粉末状。用DEPC水溶解纯化后得到的产物，并通过TOF LC-MS进行分析。测定寡核苷酸浓度，计算等摩尔量的正义链、反义链所需体积，将等摩尔量的正义链、反义链混合均匀，通过95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温的退火方法制备双链。
表1：未修饰siRNA的正义链和反义链序列，其中G为鸟苷酸，A为腺苷酸，U 为尿苷酸，C为胞苷酸。范围是指基因(NM_000029.3)中的位置。UM AD-85481 为US11015201B2专利中序列，UM AD-67327为CN106574268B专利中序列，用于阳性比对序列，其中UM代表未修饰的siRNA序列。
实验例2在Hep3B细胞中采用脂质体转染方法进行siRNA体外筛选
细胞培养和96孔板转染：在Hep3B细胞中进行体外实验，采用MEM (BasalMedia,REF.L130KJ)+10％FBS+1X青霉素链霉素(Gibco,Cat.15070-063) +1X非必需氨基酸(cellcook,Cat.CM1008L)培养基，细胞平铺面积达80％时用胰蛋白酶消化，并用细胞计数器进行计数，同时在96孔板中将2ul的siRNA 与68ul的Opti-MEM和INTERFERin(Polyplustransfection,REF.409-10)混合并置于室温孵育10分钟，然后每孔加入125ul的Hep3B细胞完全培养基(含有7000个细胞)，将96孔板放于37℃，5％CO2的培养箱中孵育24小时。
未修饰的siRNA以0.3nM和/或0.1nM最终浓度进行筛选试验。
96孔板RNA提取、反转：使用Dynabeads mRNA DIRECT试剂盒(Ambion, Cat.61021)提取96孔板细胞mRNA，将96孔板中细胞吸走，用1xPBS清洗一次，每孔加入100ul细胞裂解液，再加入20ul beads,在振荡器上震荡5分钟后，将 96孔板置于磁铁上计时1分钟后，吸走孔内裂解液，每孔加入100ul的清洗缓冲液A，吹打后置于磁铁上1分钟后，吸走清洗缓冲液A，重复用缓冲液A洗一次，然后用清洗缓冲液B将beads吹起，转移到新的96孔板，置于磁铁1分钟，吸走清洗缓冲液B，再用缓冲液B将beads吹起转移到反转录使用的96孔板中，同时将反转试剂配好，反转试剂使用的是高容量cDNA反转试剂盒(applied biosystems,Cat.4368813),反转录试剂的体系是20ul,将反转录使用的96孔板置于磁铁上1分钟后，吸走清洗缓冲液B，每孔加入20ul的反转试剂，用封板膜封板后在PCR仪上进行25℃孵育10分钟，然后37℃孵育两小时后85℃，5 分钟。
实时荧光定量PCR：反转结束后将96孔板置于磁铁上直到beads都吸附在底部，吸走反转试剂，将配好的QPCR体系(10ul的TaqMan Fast Advanced Master Mix,人的AGT引物和探针各0.5ul,人的GAPDH引物和探针0.5ul，8ul的无核酶水)，加入到96孔板中，封板膜封板，在StepOnePlus的实时PCR系统(applied biosystems)上进行PCR。
采用ΔΔCt方法分析数据，并采用1nM阴性对照序列转染的细胞进行测试标准化。
阴性对照序列为：CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT(SEQ ID NO.27)UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT(SEQ ID NO.28)。
其中dT为2’-脱氧胸腺嘧啶，G为鸟苷酸，A为腺苷酸，U为尿苷酸，C为胞苷酸。
表2为Hep3B细胞中未修饰siRNA的筛选结果
所得实验结果显示，表1中的siRNA在0.3nM或0.1nM下对Hep3B细胞中 AGT的表达产生了不同程度的抑制，其中BBD-1003和BBD-1004对AGT的抑制活性比较高，与参考AD-85481活性相似。
接下来我们对BBD-1003和BBD-1004的序列进行修饰，以提高其体内的稳定性及活性。
表3描述了BBD-1003和BBD-1004siRNA修饰正义链序列，其中，mG为2’-O- 甲基鸟苷酸，mA为2’-O-甲基腺苷酸，mU为2’-O-甲基尿苷酸，mC为2’-O- 甲基胞苷酸；fG为2’-氟鸟苷酸，fA为2’-氟腺苷酸，fU为2’-氟尿苷酸， fC为2’-氟胞苷酸；Gs为2'-O-甲基-3’-硫代鸟苷酸，As为2'-O-甲基-3'- 硫代腺苷酸，Us为2'-O-甲基-3'-硫代尿苷酸，Cs为2'-O-甲基-3'-硫代胞苷酸；dA为2'-脱氧腺苷酸，dC为2'-脱氧胞苷酸，dG为2'-脱氧鸟苷酸，dT为 2'-脱氧胸苷酸。
表4描述了BBD-1003和BBD-1004siRNA修饰反义链序列，其中，mG为2’-O- 甲基鸟苷酸，mA为2’-O-甲基腺苷酸，mU为2’-O-甲基尿苷酸，mC为2’-O- 甲基胞苷酸；fG为2’-氟鸟苷酸，fA为2’-氟腺苷酸，fU为2’-氟尿苷酸， fC为2’-氟胞苷酸；Gs为2'-O-甲基-3’-硫代鸟苷酸，As为2'-O-甲基-3'- 硫代腺苷酸，Us为2'-O-甲基-3'-硫代尿苷酸，Cs为2'-O-甲基-3'-硫代胞苷酸；dA为2'-脱氧腺苷酸，dC为2'-脱氧胞苷酸，dG为2'-脱氧鸟苷酸，dT为 2'-脱氧胸苷酸；Tgna为胸苷-二醇核酸(GNA)S-异构体，Ggna为鸟苷-二醇核酸(GNA)。
表5描述了修饰siRNA双链序列
表6为Hep3B细胞中修饰siRNA双链单剂量筛选实验结果
参见图1，修饰BBD-1003和BBD-1004siRNA单剂量1nM对比数据，证明了在 hep3B细胞中，通过脂质体递送的BBD-1003.14、BBD-1004.7修饰序列，比 AD-85481活性好，其中BBD-1003.14跟AD-67327的活性相似。同时我们也发现，即使同一条序列，不同的修饰方法，活性差异也非常大。
由表一可知，虽然UM AD-85481(未修饰)的序列活性跟BBD-1003和BBD-1004 (未修饰)相似，但通过我们设计的修饰方法，可让修饰后的BBD-1003、BBD-1004 活性提高更多，从而导致BBD-1003.14和BBD-1004.7比修饰后的AD-85481活性更高。
表7描述了Hep3B细胞中AD-85481、BBD-1003.14和BBD-1004.7抑制AGT表达的IC50，BBD-1003.14的IC50是AD-85481的2.4倍，进一步证明了通过我们的修饰方法，可以更好地提高序列的活性。
双链体名称 IC50(nM)
AD-85481 0.121
BBD-1003.14 0.050
BBD-1004.7 0.083
为了进一步验证修饰方法对序列活性的影响，我们采用AD-85481的修饰方法对BBD-1003进行修饰(BBD-1003.15)，如图2所示，在hep3B细胞中，BBD-1003.14 的修饰活性比BBD-1003.15的活性高很多，说明即使相同序列，不同的修饰方法，序列的活性也是不同的。
实验例3在表达hAGT基因的小鼠原代肝细胞中采用脂质体转染方法进行siRNA 体外筛选
将hAGT(人AGT)基因整合到肝靶向的AVV8表达载体，制备病毒【VectorBuilder，货号：AAV8LP(VB210615-1452kmc)-C】后感染小鼠，获得稳定表达hAGT的转基因小鼠。
小鼠原代肝细胞提取：通过下腔静脉灌注法，用Collagenase type IV胶原酶(sigma，C5138)消化提取小鼠肝细胞。经70um组织细胞滤网(BIOLOGIX， 15-1070)过滤，Percoll分离液(GE，17-0891-09)分离去除死细胞，得到活性良好的小鼠原代肝细胞，重悬于DMEM培养基(BasalMedia,REF.L110KJ) +10％FBS+1X青霉素链霉素(Gibco,Cat.15070-063)中，用Scepter自动细胞计数仪(Millipore，#PHCC00000)测定细胞密度。
96孔板转染：在小鼠原代肝细胞中进行体外实验，在96孔板中分别将2ul 的siRNA与68ul的Opti-MEM和INTERFERin(Polyplus transfection,REF.409-10)混合并置于室温孵育10分钟(自由摄取方式siRNA 则无需添加INTERFERin)，然后每孔加入125ul的小鼠原代肝细胞完全培养基。将96孔板放于37℃，5％CO2的培养箱中孵育24小时。
修饰的siRNA以1nM最终浓度进行单剂量筛选试验。
96孔板RNA提取、反转：使用Dynabeads mRNA DIRECT试剂盒(Ambion, Cat.61021)提取96孔板细胞mRNA，将96孔板中细胞吸走，用1XPBS清洗一次，每孔加入100ul细胞裂解液，再加入20ul beads,在振荡器上震荡5分钟后，将96孔板置于磁铁上计时1分钟后，吸走孔内裂解液，每孔加入100ul的清洗缓冲液A，吹打后置于磁铁上1分钟后，吸走清洗缓冲液A，重复用缓冲液A洗一次，然后用清洗缓冲液B将beads吹起，转移到新的96孔板，置于磁铁1分钟，吸走清洗缓冲液B，再用缓冲液B将beads吹起转移到反转录使用的96孔板中，同时将反转试剂配好，反转试剂使用的是高容量cDNA反转试剂盒(applied biosystems,Cat.4368813),反转录试剂的体系是20ul,将反转录使用的96孔板置于磁铁上1分钟后，吸走清洗缓冲液B，每孔加入20ul的反转试剂，用封板膜封板后在PCR仪上进行25℃孵育10分钟，然后37℃孵育两小时后85℃，5 分钟。
实时荧光定量PCR：反转结束后将96孔板置于磁铁上直到beads都吸附在底部，吸走反转试剂，将配好的QPCR体系(10ul的TaqMan Fast Advanced Master Mix,人的AGT引物和探针各0.5ul,人的GAPDH引物和探针0.5ul，8ul的无核酶水)，加入到96孔板中，封板膜封板，在StepOnePlus的实时PCR系统(applied biosystems)上进行PCR。采用ΔΔCt方法分析数据，并采用1nM AD-1955转染的细胞进行测试标准化。
图3为修饰BBD-1003.14和BBD-1004.7siRNA单剂量1nM的实验结果，证明了在小鼠原代肝细胞中，通过脂质体递送的1003.14和1004.7修饰序列，抑制hAGT基因表达的活性比US11015201B2专利中AD-85481及CN 106574268 B 专利中AD-67327都要好。
实验例4在表达hAGT基因的小鼠原代肝细胞中采用GalNAc递送自由摄取方法进行siRNA体外筛选
如实验例3，提取表达hAGT基因的小鼠原代肝细胞，将连有GalNAc的siRNA 加入原代肝细胞中，孵育24h，提取RNA后，通过QPCR的方法检测剩余hAGT的量。采用ΔΔCt方法分析数据，并采用1nM AD-1955转染的细胞进行测试标准化。
图4描述了修饰BBD-1003.14-GalNAc和BBD-1004.7-GalNAc siRNA单剂量 1nM对比数据，证明了在小鼠原代肝细胞中，通过GalNAc载体递送BBD-1003.14 和BBD-1004.7修饰序列，抑制AGT基因表达的活性比US11015201B2专利中 AD-85481及CN 106574268 B专利中AD-67327都要好。
实验例5
在表达hAGT基因的小鼠原代肝细胞中进行siRNA对细胞活力筛选，用于评估siRNA的安全性。
96孔板转染：将小鼠原代肝细胞稀释成每毫升含44,000个细胞的溶液，以每孔 90微升加入96孔培养板中。将96孔板置于37℃、5％CO2培养箱中，待细胞培养24小时后，加入不同浓度的siRNA(通过INTERFERin转染)后，继续培养 72小时。
细胞活力测定：修饰的siRNA以1uM起始浓度，4倍稀释，8个浓度点进行细胞活力筛选试验。
使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit(Promega，#G7573) 测定ATP的含量来评估细胞生长抑制。用多功能微孔板检测仪(BioTek SynergyH1)检测记录萤光信号。使用Graphpad prism7软件处理数据，通过S 形剂量-反应曲线拟合计算IC50值。
表8描述了通过脂质体递送BBD-1003.14和BBD-1004.7，验证其对小鼠原代肝细胞活力影响，从结果中得出，BBD-1003.14和BBD-1004.7对小鼠细胞活性没有明显影响，安全性良好。
实施例6动物实验：表达hAGT的小鼠血清中的hAGT单剂量筛选试验(1mg/kg)
1.腺病毒整合hAGT
通过1x1011个超纯化重组AAV8病毒颗粒【VectorBuilder，货号：AAV8LP(VB210615-1452kmc)-C】感染小鼠，获得稳定表达hAGT的转基因小鼠。 100ul病毒加入5.9mLPBS中，每只小鼠静脉注射200ul病毒稀释液。
2.实验分组给药
小鼠注射病毒14天后，断尾取血，室温静置30分钟，1000×g离心10 分钟，取上清血清，分装冻存于-80度冰箱。血清样品稀释1000倍，通过Human Angiotensinogen/AGT/SerpinA8 ELISA Kit(联科生物，货号：EK1202–96) 检测小鼠血清中hAGT的表达。以hAGT表达量为基准，将小鼠平均分组，每组 3只。siRNA用PBS溶解，浓度调整为0.2mg/kg，小鼠按1mg/kg剂量皮下注射 siRNA溶液。
3.ELISA检测
siRNA注射9及18天后，断尾取少量血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，稀释1000倍后ELISA检测hAGT表达量。
实验结果见图5：不同序列通过L05或GalNAc递送进体内后抑制AGT表达水平。其中BC为不给药组，血清中AGT含量一直维持较高水平。
AD-67327-GalNAc在1mg/kg，第9天时可少量降解AGT,在第18天时，血浆中AGT表达水平开始回升。
AD-85481-GalNAc在1mg/kg，第9天时显著降低AGT表达，第18天时，血浆中AGT表达几乎全部被抑制。
BBD-1003.14-GalNAc在1mg/kg，第9天时显著降低AGT表达，第18天时，血浆中AGT表达几乎全部被抑制，活性跟临床上药物AD-85481-GalNAc活性相当，远高于AD-67327-GalNAc。
BBD-1004.7-GalNAc在1mg/kg，第9天时显著降低AGT表达，第18天时，血浆中AGT表达水平开始回升，活性比AD-85481-GalNAc差，说明体外活性较好的，进入体内后活性不一定好。
本研究根据早先积累的经验，再经过反复的实验，以及对比验证，最终我们选择了正义链序列如mAsmGsmCmCmCmAfCmAdGfAfGmUfCmUmAmCmCmCmAmAmU所示，所述反义链序列如mAsfUsmUmGfGmGmUfAmGfAmCdTmCfUmGfUmGmGmGmCmUsmCsmU所示的siRNA，通过正义链3’端和GalNAc相连，有望应用于临床上，抑制细胞中血管紧张素原表达，以治疗高血压。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州必贝特医药股份有限公司
<120> 抑制血管紧张素原基因表达的RNAi抑制剂及其应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gucauccaca augagaguac a 21
<210> 2
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uguacucuca uuguggauga cga 23
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ucucccaccu uuucuucuaa u 21
<210> 4
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
auuagaagaa aaggugggag acu 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
augagaguac cugugagcag c 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcugcucaca gguacucuca uug 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uccacaauga gaguaccugu g 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacagguacu cucauugugg aug 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcccacaga gucuacccaa u 21
<210> 10
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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auuggguaga cucugugggc ucu 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaaacuugac accgaagaca a 21
<210> 12
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uugucuucgg ugucaaguuu ugc 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uagucgcugc aaaacuugac a 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ugucaaguuu ugcagcgacu agc 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agucgcugca aaacuugaca c 21
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<212> RNA
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gugucaaguu uugcagcgac uag 23
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gucgcugcaa aacuugacac c 21
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<212> RNA
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ggugucaagu uuugcagcga cua 23
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<212> RNA
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ucgcugcaaa acuugacacc g 21
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<212> RNA
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cggugucaag uuuugcagcg acu 23
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aaaacuugac accgaagaca a 21
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<212> RNA
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uugucuucgg ugucaaguuu ugc 23
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<212> RNA
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aacuugacac cgaagacaag u 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acuugucuuc ggugucaagu uuu 23
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uucaacaccu acguccacuu c 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaaguggacg uagguguuga aag 23
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cuuacgcuga guacuucga 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ucgaaguacu cagcguaag 19

Claims (9)

1.一种用于抑制细胞中血管紧张素原表达的siRNA，包括正义链及反义链，其特征在于，所述正义链序列如AGCCCACAGAGUCUACCCAAU所示，所述反义链序列如AUUGGGUAGACUCUGUGGGCUCU所示。
2.权利要求1所述的siRNA在制备用于抑制血管紧张素原表达的生物制剂或者药物制剂中的应用。
3.用于抑制血管紧张素原表达的修饰siRNA，包括正义链及反义链，其特征在于，所述正义链序列如mAsmGsmCmCmCmAfCmAdGfAfGmUfCmUmAmCmCmCmAmAmU所示，所述反义链序列如mAsfUsmUmGfGmGmUfAmGfAmCdTmCfUmGfUmGmGmGmCmUsmCsmU所示，其中，mG为2’-O-甲基鸟苷酸，mA为2’-O-甲基腺苷酸，mU为2’-O-甲基尿苷酸，mC为2’-O-甲基胞苷酸；fG为2’-氟鸟苷酸，fA为2’-氟腺苷酸，fU为2’-氟尿苷酸，fC为2’-氟胞苷酸；Gs为2'-O-甲基-3’-硫代鸟苷酸，As为2'-O-甲基-3'-硫代腺苷酸，Us为2'-O-甲基-3'-硫代尿苷酸，Cs为2'-O-甲基-3'-硫代胞苷酸；dG为2’-脱氧鸟苷酸、dT为2’-脱氧胸苷酸。
4.权利要求3所述的修饰siRNA在制备用于抑制血管紧张素原表达的生物制剂或者药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生物制剂或者药物制剂是预防或者治疗高血压的药物。
6.用于抑制血管紧张素原表达的生物制剂或者药物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述siRNA或权利要求3所述的修饰siRNA，以及与siRNA连接的配体，所述配体为N-乙酰基半乳糖胺衍生物。
7.根据权利要求6所述的用于抑制血管紧张素原表达的生物制剂或者药物制剂，其特征在于，所述配体的结构如下：
8.根据权利要求6-7任一项所述的用于抑制血管紧张素原表达的生物制剂或者药物，其特征在于，所述配体与siRNA的正义链的3’端连接。
9.权利要求6-8任一项所述生物制剂或者药物制剂在制备预防和治疗高血压的药物中的应用。
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