JP4589794B2 - オステオポンチンｓｉＲＮＡ - Google Patents

Description

本発明は、オステオポンチンの発現抑制ためのｓｉＲＮＡに関するものである。

組織の構築には、細胞間の接着と同時に細胞―細胞外マトリックスとの接着が必要である。細胞―細胞外マトリックス間接着に関与する接着分子は、細胞骨格と細胞外を連結する役割を果たしており、細胞の分化、シグナル伝達に関与している。接着分子と細胞外マトリックスの接着機構を解析することにより、種々の疾患におけるメカニズムの解明、さらには治療につながることが期待されている。

細胞外マトリックスの一種であるオステオポンチン（ＯＰＮ）は、分子量約４１kDaの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質であり、分子中央部にはαｖ等のインテグリンとの接着に重要なＧＲＧＤＳ配列が存在し、その直後にはトロンビン開裂部位（Ｒ^１６８Ｓ^１６９）が存在する。また、ＧＲＧＤＳ配列直後に存在するＳＶＶＹＧＬＲ配列はα９β１、α４β１、α４β７という炎症に関与するインテグリンと結合する。

ＯＰＮは細胞接着、細胞遊走、一酸化窒素（ＮＯ）産生の制御、免疫系への関与など多彩な機能が報告されてきており、癌転移、リウマチ関節炎や多発性硬化症（ＥＡＥ）などの慢性炎症疾患、自己免疫疾患など多くの難治疾患病態と関与することが示されている。

特に、炎症性疾患に関しては、受容体からも推察されるように、直接的な関与が示唆されている。ＯＰＮの受容体であるα９インテグリンは好中球上に発現しており、α４インテグリンはリンパ球上に発現していることから、ＯＰＮ機能を抑制することにより好中球を初めとする白血球の遊走を抑制することが考えられ、抗炎症作用が期待されている。

事実、ＯＰＮ欠損マウスは、腫瘍、リウマチ関節炎、多発性硬化症（ＥＡＥ）、動脈硬化等の疾患に対し抵抗性を示すことが報告されている（非特許文献１〜４）。また、ＯＰＮに対する中和抗体を用いて、リウマチ関節炎が緩解した報告もある（特許文献３、非特許文献５）。

そこで、ＯＰＮ機能を阻害することにより、治療効果を期待することができると考え、新規分子特異的ノックダウン法であるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉：RNA interference）法の治療への応用を検討した。

ＲＮＡｉ法とは、短い干渉ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA））を用いて、それが導入された細胞において、それと同じ配列を持つ特定遺伝子の発現を遺伝子レベルですみやかに発現抑制する技術である（非特許文献６及び７）。ＯＰＮのｍＲＮＡ配列から、ターゲットとなる配列を複数選択し、そのｓｉＲＮＡを合成し、ＯＰＮをノックダウンさせることにより疾患治癒に結びつけようと考えた。

特許文献１には、オステオポンチンの部分をコードするＲＮＡのＩＬ−１βに関与する結合組織疾患の治療における使用が記載されている。しかし、ｓｉＲＮＡとしての使用については、何ら開示されていない。

特許文献２には、ＦＧＦＲ（線維芽細胞増殖因子レセプター：fibroblast growth factor receptors）のｓｉＲＮＡ及びＦＧＦＲがＯＰＮ遺伝子の発現を亢進していることが記載されている。しかし、ＯＰＮのｓｉＲＮＡについては、何らの開示も示唆もない。

特許文献３には、組換え抗オステオポンチン抗体及びそれを含む医薬が記載されている。しかし、ＯＰＮのｓｉＲＮＡについては、何らの開示も示唆もない。

また、二本鎖ＲＮＡをベクターを用いてインビトロで産生させ、これをＲＮａｓｅIII核酸分解酵素ファミリーの一つである、ｄｉｃｅｒを用いて切断した、ｓｉＲＮＡの集団からなる遺伝子操作用のキットが市販されている（ＳｕｐｅｒＳｉｌｅｎｃｉｎｇ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＳＰＰ１ ｓｉＲＮＡキット（Secreted phosphoprotein 1(osteopontin, bone sialoprotein I, early T-lymphocyte activation 1)）非特許文献８）。しかし、このキットは、遺伝子発現の研究のために、ｓｉＲＮＡを用いて特定遺伝子の発現を阻害するためのものであり、ｓｉＲＮＡの医薬用途については何ら開示されていない。また、上記製造方法によって得られたｓｉＲＮＡは、分子特異的ではない短いＲＮＡフラグメントをも含んでいることから、遺伝子ノックダウンの特異性が低いという欠点もあった。

したがって、オステオポンチンの亢進に起因する疾患の処置のための医薬等として有用なＯＰＮのｓｉＲＮＡの開発が望まれていた。
特開平８−１９１６９３ 米国特許出願公開第２００３／０１４３６７６Ａ１号明細書 国際公開第２００３／０２７５１号パンフレット Nemoto H, Rittling SR, Yoshitake H, Furuya K, Amagasa T, Tsuji K, Nifuji A, Denhardt DT, Noda M. Osteopontin deficiency reduces experimental tumor cell metastasis to bone and soft tissues. J Bone Miner Res. 16:652-9, 2001. Yumoto K, Ishijima M, Rittling SR, Tsuji K, Tsuchiya Y, Kon S, Nifuji A, Uede T, Denhardt DT, Noda M. Osteopontin deficiency protects joints against destruction in anti-type II collagen antibody-induced arthritis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:4556-4561, 2002. Chabas D, Baranzini SE, Mitchell D, Bernard CC, Rittling SR, Denhardt DT, Sobel RA, Lock C, Karpuj M, Pedotti R, Heller R, Oksenberg JR, Steinman L. The influence of the proinflammatory cytokine, osteopontin, on autoimmune demyelinating disease.Science. 294:1731-5, 2001. Matsui Y, Rittling SR, Okamoto H, Inobe M, Jia N, Shimizu T, Akino M, Sugawara T, Morimoto J, Kimura C, Kon S, Denhardt D, Kitabatake A, Uede T. Osteopontin Deficiency Attenuates Atherosclerosis in Female Apolipoprotein E-Deficient Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23:1029-34, 2003. Yamamoto N, Sakai F, Kon S, Morimoto J, Kimura C, Yamazaki H, Okazaki I, Seki N, Fujii T, Uede T. Essential role of the cryptic epitope SLAYGLR within osteopontin in a murine model of rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 112:181-8, 2003. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391:806-11, 1998. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411:494-8, 2001. SuperArray社、SuperSilencing（登録商標）製品説明、［平成１６年３月２２日検索］。インターネット＜ＵＲＬ：http://www.superarray.com/sirnaqa.php＞

本発明の目的は、オステオポンチンのためのｓｉＲＮＡ、それを含む組成物及び医薬、及びオステオポンチンと相互作用する物質及び相互作用を阻害又は促進する物質をスクリーニングする方法を提供することである。

本発明者らは、鋭意研究を行ったところ、オステオポンチンの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡを見出し、本発明を完成させたものである。したがって、本発明は、下記を提供する。
１．配列番号１、配列番号７又は配列番号２１に示す配列からなるＤＮＡに対応するｍＲＮＡの、２０塩基〜３０塩基の連続した任意の部分ＲＮＡ配列からなるセンスＲＮＡ、該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ、若しくは該センス配列と該アンチセンス配列とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体であって、オステオポンチンの発現を抑制するＲＮＡ。
２．配列番号１に示す配列からなるＤＮＡに対応するｍＲＮＡのＡＡで始まる２１塩基のＲＮＡ配列であって、該ＤＮＡの配列番号２９８〜１１４０番から選ばれる連続した任意のＲＮＡ配列からなるセンスＲＮＡ、該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ、若しくは該センス配列と該アンチセンス配列とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体。
３．配列番号３、４、５若しくは６に示す配列からなるＲＮＡ、配列番号３、４、５若しくは６に示す配列と相補的な配列からなるＲＮＡ、若しくは配列番号３、４、５若しくは６に示す配列からなるＲＮＡと配列番号３、４、５若しくは６に示す配列と相補的な配列からなるＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体。
４．配列番号２８、２９若しくは３０に示す配列からなるＲＮＡ、配列番号２８、２９若しくは３０に示すと相補的な配列からなるＲＮＡ、若しくは配列番号２８、２９若しくは３０に示す配列からなるＲＮＡと配列番号２８、２９若しくは３０に示すと相補的な配列からなるＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体。
５．配列番号７に示す配列からなるＤＮＡに対応するｍＲＮＡのＡＡで始まる２１塩基のＲＮＡ配列であって、該ＤＮＡの配列番号２４１〜１０６５番から選ばれる連続した任意のＲＮＡ配列からなるセンスＲＮＡ、該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ、若しくは該センス配列と該アンチセンス配列とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体。
６．配列番号９、１０、１１若しくは１２に示す配列からなるＲＮＡ、配列番号９、１０、１１若しくは１２に示す配列と相補的な配列からなるＲＮＡ、若しくは配列番号９、１０、１１若しくは１２に示す配列からなるＲＮＡと配列番号９、１０、１１若しくは１２に示す配列と相補的な配列とからなるＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体。
７．配列番号２１に示す配列からなるＤＮＡに対応するｍＲＮＡのＡＡで始まる２１塩基のＲＮＡ配列であって、該ＤＮＡの配列番号１〜９５４番から選ばれる連続した任意のＲＮＡ配列からなるセンスＲＮＡ、該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ、若しくは該センス配列と該アンチセンス配列とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体。
８．配列番号２３、２４、２５、２６若しくは２７に示す配列からなるＲＮＡ、配列番号２３、２４、２５、２６若しくは２７に示す配列と相補的な配列からなるＲＮＡ、若しくは配列番号２３、２４、２５、２６若しくは２７に示す配列からなるＲＮＡと配列番号２３、２４、２５、２６若しくは２７に示す配列と相補的な配列からなるＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体。
９．上記１〜８の何れかに記載のＲＮＡを含む、オステオポンチンの発現を抑制するためのオステオポンチン発現抑制剤。
１０．上記１〜８の何れかに記載のＲＮＡを含む、オステオポンチンの発現を抑制するための組成物。
１１．上記１〜８の何れかに記載のＲＮＡを有効成分として含む医薬。
１２．オステオポンチンの発現を抑制するためのものである上記１１記載の医薬。
１３．上記１〜８の何れかに記載のＲＮＡを有効成分として含む、オステオポンチンの亢進に起因する疾患の処置のための医薬。
１４．上記オステオポンチンの亢進に起因する疾患が、腫瘍、肝炎、動脈硬化、多発性硬化症、関節炎、リウマチ及び／又は肺繊維症である、上記１３に記載の医薬。
１５．上記１〜８の何れかに記載のＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
１６．被験物質と上記１〜８の何れかに記載のＲＮＡとを接触させることを含む、オステオポンチンと相互作用する物質、又はオステオポンチン及びオステオポンチンと相互作用する物質の相互作用を促進又は阻害する物質をスクリーニングするための方法。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
先ず、本明細書で使用する略称について説明する。
Ａまたはａ：アデニン
Ｔまたはｔ：チミン
Ｕまたはｕ：ウラシル
Ｇまたはｇ：グアニン
Ｃまたはｃ：シトシン
ＲＮＡ：リボ核酸（通常、塩基としてＡ，Ｕ，Ｇ，Ｃを有するリボヌクレオチド単位から構成される。）
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸（通常、塩基としてＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃを有するデオキシリボヌクレオチド単位からなる。）
ＤＡＰＩ：４‘，６−ジアミノ−２−フェニルインドール
ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked immunosorbent assay
ＦＡＣＳ：蛍光活性化セルソーター
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＰＥ：フィコエリトリン（紅色の色素タンパク質）
Scr. RNA:スクランブルＲＮＡ。ｍＲＮＡ特異的なsiRNAとＧＣ含量を揃えた非特異的なＲＮＡ。
Scr. cont.：対象となるsiRNAのコントロールとして用いるScr. RNA
「オステオポンチン」とは、分泌性リン酸タンパク質１(secreted phospho protein 1)とも呼ばれ、配列番号２（マウス）、配列番号８（ヒト）又は配列番号２２（ラット）に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であり、骨のマトリックスに含まれる接着タンパク質の一種である。オステオポンチンは、インテグリンと結合するＲＧＤ配列を有し、破骨細胞と骨芽細胞の両方を骨組織周辺に接着させる作用を有する。また、オステオポンチンは、強く負に荷電しており、ヒドロキシアパタイトを沈着させ、骨のカルシウムを保持する作用を有する。以下、オステオポンチンをＯＰＮと略すこともある。

マウス、ヒト及びラットのオステオポンチン遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２、配列番号７及び８、並びに配列番号２１及び２２に示した。

本発明はオステオポンチン遺伝子に対応するｍＲＮＡの部分配列であって、２０塩基〜３０塩基の連続した任意のＲＮＡ配列からなるセンスＲＮＡ、該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ、若しくは該センス配列と該アンチセンス配列とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体であって、オステオポンチンの発現を抑制するｓｉＲＮＡに関する。
より具体的には本発明は、配列番号１に示す配列からなるマウスＤＮＡに対応するｍＲＮＡのＡＡで始まる２１塩基のＲＮＡ配列であって、該ＤＮＡの配列番号２９８〜１１４０番から選ばれる連続した任意のＲＮＡ配列からなるセンスＲＮＡ、配列番号７に示す配列からなるヒトＤＮＡに対応するｍＲＮＡのＡＡで始まる２１塩基のＲＮＡ配列であって、該ＤＮＡの配列番号２４１〜１０６５番から選ばれる連続した任意のＲＮＡ配列からなるセンスＲＮＡ、配列番号２１に示す配列からなるラットＤＮＡに対応するｍＲＮＡのＡＡで始まる２１塩基のＲＮＡ配列であって、該ＤＮＡの配列番号１〜９５４番から選ばれる連続した任意のＲＮＡ配列からなるセンスＲＮＡ、該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ、若しくは該センス配列と該アンチセンス配列とからなる二本鎖ＲＮＡ、又はそれらの誘導体に関する。
なお、ＯＰＮの発現を制御するｓｉＲＮＡは、通常ＯＰＮ遺伝子の開始コドンから７５塩基以上下流の最初の塩基配列ＡＡを見つけ、当該ＡＡを含む２１〜２３塩基、好ましくは２１塩基であって、ＧＣ含量が５０％前後の、ＯＰＮに対して特異的な配列を選択することによって得られる。特異的であるか否かは、例えばＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のBLAST-searchにかけることによって確認することができる。
また、本発明の他の具体的な態様としては、上記各ＤＮＡの翻訳領域に対応するｍＲＮＡの部分配列であって、ＧＣで始まる２５塩基の連続した任意のＲＮＡ配列からなるセンスＲＮＡと該センスＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡの誘導体であって、いわゆるステルス（商標）ＲＮＡｉの構造を有するｓｉＲＮＡが挙げられる（Stable plasma membrane levels of hCTR1 mediate cellular copper uptake. J Biol Chem. 2005 Mar 11;280(10):9635-9. Epub 2005 Jan 5. PMID: 15634665およびhttp://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/RNAi.shtml参照）。ステルス（商標）ＲＮＡｉは、上記の２１〜２３塩基のｓｉＲＮＡと同様にターゲット遺伝子を抑制し、かつ非特異的なインターフェロンストレス応答を抑制し、血清、細胞質中においても安定性が高いという特長を有する。

本発明で相補的な配列からなるＲＮＡとは、所定の塩基配列を有するＲＮＡに対して、Ａ：ＵおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、ｍＲＮＡの配列に対応する配列を有する鎖を意味するものである。ＤＮＡの相補的二本鎖のうち、タンパク質をコードしている鎖、すなわち、ｍＲＮＡと同一の配列を有する鎖がセンス鎖であり、センス鎖と塩基配列が相補的な関係にある配列を有する鎖がアンチセンス鎖である。

本発明で誘導体とは、例えば、本発明のＲＮＡの安定性を向上させるために、３’側にｄＴを数個、好ましくは２〜４個、より好ましくは２又は３個、最も好ましくは２個付加させた、３’オーバーハング型誘導体である。なお、ｄＴの代わりにＵを付加させても良い。

また、本発明で誘導体とは、例えば、本発明のＲＮＡの安定性を向上させるために、５’側にリン酸を付加させた誘導体である。

また、本発明で誘導体とは、いわゆるタンデムタイプのｓｉＲＮＡ発現ベクターに組み込むための、２つのプロモーター、例えばＵ６プロモーター、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを結合させた誘導体である。具体的には、Ｕ６プロモーター、センスＲＮＡ、５個のＴ、Ｕ６プロモーター、アンチセンスＲＮＡ、５個のＴを結合させた誘導体が挙げられる。

また、本発明で誘導体とは、いわゆるステムループタイプのｓｉＲＮＡ発現ベクターに組み込み、ショートヘアピンＲＮＡを介して、ｓｉＲＮＡを産生するための、プロモーター、例えばＵ６プロモーター、センスＲＮＡ、ループ配列及びアンチセンスＲＮＡを結合させた誘導体である。具体的には、Ｕ６プロモーター、センスＲＮＡ、ループ配列、例えば、ｇｔｇｔｇｃｔｇｔｃｃ、アンチセンスＲＮＡを結合させた誘導体が挙げられる。
また、本発明で誘導体とは、ステルス（商標）ＲＮＡｉ構造を有する誘導体である。

ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）とは、２０〜３０ｂｐ、好ましくは２１〜２３bp、２５ｂｐまたは２７ｂｐからなる二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ干渉（RNA interference: RNAi）を誘導することができる二本鎖ＲＮＡをいう。また、ＲＮＡ干渉とは、二本鎖ＲＮＡにより、そのＲＮＡと相同的な配列を有する遺伝子の発現が抑制される現象をいう。

ＲＮＡｉは、特定配列を有する遺伝子を破壊することができることから、遺伝子機能の解析や特定遺伝子の発現抑制に有用である。また、細胞への導入量が少量の割に比較的長時間効果が持続するという特徴を有する。

本発明のｓｉＲＮＡは、常法によって合成することができ、市販のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４型で行うことができる。

本発明のＲＮＡは、そのままか又は凍結乾燥させて、オステオポンチンの機序解明のための試薬として用いることができる。

本発明のＲＮＡ又はその誘導体は、そのままもしくは公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。

ｓｉＲＮＡベクターは、常法にしたがって調製することができる。タンデムタイプの場合は、ＰＣＲによってセンス、アンチセンス配列を含むプライマーによりプロモーター部分を増幅し、増幅断片を制限酵素で切断後、ベクターのプロモーター、例えばＵ６プロモーターの下流に挿入する。ステムループの場合、センス−ループ−アンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドを合成アニールさせ、ベクターのプロモーター、例えばＵ６プロモーターの下流に挿入する。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。なお、実施例においてｍＯＰＮはマウス・オステオポンチンを、ｈＯＰＮはヒト・オステオポンチンを、そしてｒＯＰＮはラット・オステオポンチンそれぞれ示す。

（１）オリゴヌクレオチドの調製
４種のリボヌクレオシド３’−ホスホロアミダイト（ＧＬＥＮリサーチ）を用いて、ＤＮＡ自動合成機（Applied Biosystem Model３９４A）で配列番号３、４、５、６、９、１０、１１、１２、２３、２４、２５、２６及び２７に示す各配列の各オリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ断片）を合成した。各ＲＮＡ断片を１μmolスケールで合成した。合成終了後、合成したオリゴヌクレオチドが結合したＣＰＧ（Controlled Pore Glass）を濃アンモニア水：エタノール（３：１v／v）混液で室温２時間処理してオリゴリボヌクレオチドをＣＰＧ樹脂から切り出し、更に５５℃で１６時間加温した。
マウスＯＰＮについて、RNAi designer（http://www.invitrogen.co.jp/primers/rnaidesign/）を用いて決定した配列である、配列番号２８、２９若しくは３０に示す配列について、invitorgenの示す方法にしたがって、ステルス（商標）ＲＮＡｉを調製した（Stable plasma membrane levels of hCTR1 mediate cellular copper uptake. J Biol Chem. 2005 Mar 11;280(10):9635-9. Epub 2005 Jan 5. PMID: 15634665およびhttp://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/RNAi.shtml参照）。

溶媒を留去し、残渣に１mlの１Ｍ ＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド）／ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液を加え、３７℃で１６時間攪拌した。これに５mlの０.１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート水溶液（ｐＨ７.０）を加えた後、Ｃ１８（ウォーターズ社製）オープンカラムクロマトグラフィーを行なった（カラムサイズ１.５×１２cm：５−４０％アセトニトリル、５０mMトリエチルアンモニウムビカルボネート水溶液の両溶媒を用いた濃度勾配により溶出した）。約３０％濃度のアセトニトリルで溶出される末端リボヌクレオチド５’位の保護基であるジメトキシトリチルの発色を有するフラクションを集め、これに５mlの０.０１Ｎ塩酸を加え、１５分間攪拌した。０.１Ｎアンモニア水で中和し、水層を酢酸エチルで洗浄し、溶媒留去後、滅菌水１mlに溶解した。この画分中のオリゴリボヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで分取後、さらにイオン交換ＨＰＬＣで分取し、精製した。得られたオリゴヌクレオチドを後述の実験に供した。

逆相およびイオン交換ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった：
逆相ＨＰＬＣ
カラム：μ−ボンダスフィアー（Ｃ−１８）カラム、Ф３.９ｘ１５０mm（ウォーターズ社製）
溶媒：Ａ溶液 ５％ アセトニトリル／０.１Ｍ ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７.０）；
Ｂ溶液 ２５％ アセトニトリル／０.１Ｍ ＴＥＡＡ（ｐＨ７.０）。
イオン交換ＨＰＬＣ
カラム：TSKgel DEAE ２SWカラム、４.６×２５０mm、東ソー（株）製
溶媒：Ａ溶液 ２０％ アセトニトリル；
Ｂ溶液 ２０％ アセトニトリルを含む２Ｍ ギ酸アンモニウム。

（２）ＯＰＮｓｉＲＮＡの生物学的作用
〔方法〕
＜培養細胞へのＯＰＮ ｓｉＲＮＡ導入方法＞
上記の通り合成された各ＲＮＡ断片をＯＰＮ ｓｉＲＮＡとして、Lipofectamine 2000（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いるリポフェクション法により、２４穴プレート中で増殖させた対数増殖期の培養細胞に導入した。

Ｆ−１２培地５０μLにリポフェクタミン２０００を２μLを加え、５分間放置した。別のチューブで、Ｆ−１２培地５０μLに各ｓｉＲＮＡ ０．８μgを加えた。両チューブの内容物を混ぜ、２０分放置し、ｓｉＲＮＡ−リポフェクタミン２０００複合体を調製した。細胞をＦ−１２培地で洗浄後、Ｆ−１２培地５００μLを加え、さらにｓｉＲＮＡ−リポフェクタミン複合体を加え、これを２４時間培養した。次いで、上清を回収し、細胞ペレットを、ＴＮＥバッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８、１．０％ ＮＰ−４０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ）を用いて可溶化させた。ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）にて上清及び細胞ペレット可溶化物におけるＯＰＮ発現量を定量した。

＜ＥＬＩＳＡ及びＲＴ−ＰＣＲ＞
ヒトＯＰＮ及びマウスＯＰＮのｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果をＥＬＩＳＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法）及びリアルタイムＰＣＲ法を用いて検討した。
ヒトＯＰＮ、マウスＯＰＮのＥＬＩＳＡを用いた解析には、ヒトオステオポンチン測定キット及びマウスオステオポンチン測定キット（共に免疫生物研究所製）を使用した。
ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲには以下のプライマーを用いた。リアルタイムＰＣＲは、LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I（Roche Diagnostics、Mannheim、Germany）により作製したサンプルを用いて行った。定量は、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）を標準とした標準比（Normalized Ratio）で行った。
また、ラットＯＰＮのｓｉＲＮＡ及びマウスＯＰＮ stealth（商標）ＲＮＡのノックダウン効果を、上記と同様にＥＬＩＳＡを用いて解析した。

使用したプライマー
mOPN-forward: 5'-TCAAAGTCTAGGAGTTTCCAG-3'
mOPN-reverse: 5'-TTAGTTGACCTCAGAAGATGA-3'
hOPN-forward: 5'-CCATGAGAATTGCAGTGATTT-3'
hOPN-reverse: 5'-TTAATTGACCTCAGAAGATGC-3'
G3PDH-forward: 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
G3PDH-reverse: 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
β-actin-forward: 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'
β-actin-reverse: 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'

＜肝炎マウス作製＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、Vector laboratories, Burlingame, CA）を尾静脈投与し（２００μg／マウス）、肝炎モデルを作出した。ＣｏｎＡ投与２４時間後に、肝臓を摘出し、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＧＰＴ）測定、ＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色、ＲＮＡ抽出を行った。

＜肝炎治癒作用＞
上記肝炎モデルにｓｉＲＮＡ５０μg（３００μl（図８−１）又は５００μl（ハイドロダイナミクス法：図８−２））をマウスに尾静脈投与した。
ｓｉＲＮＡを、ＣｏｎＡ投与２４時間前、１６時間前及び同時の３回投与した。コントロールとして、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を上記と同条件で投与した（図８−１、図８−２）。

＜癌転移抑制作用／マトリゲルアッセイ＞
癌浸潤能のインビトロアッセイは、マトリゲルインベージョンチャンバー（BD Biosciences, Bedford, MA）を用いて行った。マウスルイス肺癌細胞又はＨＴ１０８０（ヒト線維肉腫細胞）（２．５×１０^４細胞／ウェル）をチャンバー上層に接種し、下層には、５％ ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含む培地を加え、２２時間培養した。綿棒にてフィルター上層をこすり、上層部に残るマトリゲルや非浸潤細胞を取り去った。フィルター下層の浸潤した細胞をメタノールで固定し、ギムザで染色し、蒸留水で洗浄した。

〔実験結果〕
＜培養細胞におけるノックダウン効果＞
ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡのｍＯＰＮに対するＲＮＡｉ効果を、ｍＯＰＮ遺伝子をＣＨＯ細胞に高発現させたトランスフェクタントであるｍＯＰＮ／ＣＨＯ細胞に種々のｓｉＲＮＡを導入することにより解析した。ＲＮＡｉ効果の確認は、ｍＯＰＮに対するＥＬＩＳＡとＲＴ−ＰＣＲによって行った。ＥＬＩＳＡは、ｓｉＲＮＡ導入後の細胞可溶化物をサンプルとして用いた。その結果、ｍ−ｓｉＲＮＡ−１、ｍ−ｓｉＲＮＡ−５、ｍ−ｓｉＲＮＡ−７及びｍ−ｓｉＲＮＡ−１６の全てのｓｉＲＮＡについて、ｍＯＰＮのノックダウン効果が認められた（図３）。

同様にｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡのｈＯＰＮに対するＲＮＡｉ効果を、ｈＯＰＮ／ＣＨＯ細胞を用いて解析した。その結果、ｈ−ｓｉＲＮＡ−４及びｈ−ｓｉＲＮＡ−６において、ｈＯＰＮのノックダウン効果が認められた（図４）。

本発明のｓｉＲＮＡが、内在性ＯＰＮ発現をも抑制するかどうかを、マウス悪性メラノーマ細胞株である、Ｂ１６−ＢＬ６細胞を用いて解析した。細胞可溶化物をサンプルとして使用した結果、ｍ−ｓｉＲＮＡ−５及びｍ−ｓｉＲＮＡ−１６によって内在性ＯＰＮ発現の抑制効果が認められた（図５）。

次に、ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果持続期間について検討した。図６に示すようにｍＯＰＮ／ＣＨＯ細胞に遺伝子導入後、２４時間後に上清と細胞３／４を回収した。残りの細胞１／４をさらに培養し、２４時間後に培地を交換し、さらに２４時間後に、培養上清及び細胞３／４を回収した。残りの細胞１／４をさらに培養し、同様な操作を繰り返し、上清及び細胞の回収を２週間行った。培養上清と細胞可溶化物におけるＯＰＮの発現量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。その結果、約１週間後においても、全てのｓｉＲＮＡにおいて、ノックダウン効果が認められた（図７）。

＜ＯＰＮｓｉＲＡＮの治療効果＞
次に、ＯＰＮ ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉ医薬への可能性について検討するため、肝炎についてＯＰＮ機能抑制による治療効果を試験した。治癒効果検討方法の概略を図８−１及び図８−２に示した。すなわち、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）２００μgをＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈内投与することによって肝炎誘発モデルを作製した。ｓｉＲＮＡをＣｏｎＡ投与２４時間前、１６時間前、同時の３回、それぞれ５０μgを尾静脈内に投与した。肝炎の評価は、ＣｏｎＡ投与２４時間後の血清ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）値と肝臓組織のＨＥ染色にて行った。ＯＰＮのＲＮＡｉ効果は、ＲＴ−ＰＣＲとリアルタイムＰＣＲによって評価した（図８−１）。
さらに、図８−２に示すプロトコールで、肝炎治療実験を行った。５群で実験を行った。すなわち、１群：ｓｉＲＮＡの代わりにＰＢＳとＣｏｎＡの代わりにＰＢＳ、２群：Ｓｃｒ ｓｉＲＮＡとＣｏｎＡの代わりにＰＢＳ、３群：ＯＰＮ ｓｉＲＮＡ−５とＣｏｎＡの代わりにＰＢＳ、４群：ＯＰＮ ｓｉＲＮＡ−５とＣｏｎＡ、５群：Ｓｃｒ ｓｉＲＮＡとＣｏｎＡ。ＣｏｎＡ肝炎マウスに対してＯＰＮ ｓｉＲＮＡを投与した４群では有意にＡＬＴの減少が見られた（図１５）。

肝臓におけるＯＰＮノックダウン効果をＲＴ−ＰＣＲによって検討した。その結果、ｓｉＲＮＡ処理群では、コントロール群と比較して低いＯＰＮ発現が見られた。一方、血清ＡＬＴ値は、ＯＰＮ抑制が認められた個体において、低値傾向が見られた（図９）。

肝臓のＨＥ染色を行った。ＯＰＮ ｓｉＲＮＡを投与していない個体は、肝臓に広範な壊死が観察された。一方、ＯＰＮ ｓｉＲＮＡを投与した個体は、肝臓内壊死が抑制されていた（図１０）。

ＯＰＮの発現量を定量化するために、リアルタイムＰＣＲを行った。その際、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）の発現量を用いて標準化を行った。ＯＰＮ発現量とＡＬＴ値との相関を調べた結果、ＯＰＮ量とＡＬＴ値に強い相関が見られた（図１１）。

次に、癌転移のインビトロアッセイであるマトリゲル法を用いて、ＯＰＮ ｓｉＲＮＡによる癌転移抑制能を調べた。ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡ、ｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡの転移抑制能を調べるためにマウスルイス肺癌細胞 と ＨＴ１０８０（Human Fibrosarcoma cells）細胞をそれぞれ用いた。

まず、ｍＯＰＮ、ｈＯＰＮのノックダウン効果をそれぞれのＯＰＮ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて検討した。その結果、ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡでは、ｍ−ｓｉＲＮＡ−５及びｍ−ｓｉＲＮＡ−１６の両方においてＯＰＮのノックダウン効果が見られ、ｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡでは、ｈ−ｓｉＲＮＡ−６においてノックダウン効果が観察された（図１２）。Ｃ８、Ｃ９は、ＧＣ含量が一致するコントロールｓｉＲＮＡを対照として使用しており、ｍ−ｓｉＲＮＡ−５とｈ−ｓｉＲＮＡ−４のコントロールはＣ８、ｍ−ｓｉＲＮＡ−１６とｈ−ｓｉＲＮＡ−６のコントロールとしてＣ９を利用した。

転移能の評価は、マトリゲル膜の裏側に浸潤した細胞を観測することにより検討した。ｓｉＲＮＡを導入した細胞の浸潤能は、コントロールと比較して少ないことが分かった（図１３、１４）。特に、ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡでは、ｍ−ｓｉＲＮＡ−５が、ｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡではｈ−ｓｉＲＮＡ−６が強い浸潤抑制能を有していることが分かった（図１３、１４）。グラフは、浸潤している細胞を計測することにより定量化して、ＯＰＮ ｓｉＲＮＡによる浸潤抑制効果を確認した結果を示す。

その結果、ｓｉＲＮＡを導入した細胞の浸潤能は、コントロールと比較して明らかに抑制された（図１２）。特に、ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡでは、ｍ−ｓｉＲＮＡ−５が、また、ｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡではｈ−ｓｉＲＮＡ−６がマトリゲルに対する細胞の浸潤を抑制し、これらが、強い浸潤抑制能を有していることが分かった（図１３、図１４）。
以上により、ＯＰＮノックダウン効果と浸潤抑制とが相関している結果を得ることができた。

＜ｓｉＲＮＡのターゲット免疫細胞の同定＞
肝炎発症には、ＮＫＴ細胞から分泌されるＯＰＮが重要ということは既に報告されている（Diao H, Kon S, Iwabuchi K, Kimura C, Morimoto J, Ito D, Segawa T, Maeda M, Hamuro J, Nakayama T, Taniguchi M, Yagita H, Van Kaer L, Onoe K, Denhardt D, Rittling S, Uede T. Osteopontin as a mediator of NKT cell function in T cell-mediated liver diseases. Immunity. 2004 Oct;21(4):539-50.）。以上のことから、ＯＰＮ ｓｉＲＮＡの静脈内投与による肝炎治療効果は、ＮＫＴ細胞から分泌されるＯＰＮをＯＰＮ ｓｉＲＮＡが抑制していると推察された。そこで、蛍光ｓｉＲＮＡをマウス尾静脈に投与し、肝臓内の白血球のｓｉＲＮＡの取り込みをＦＡＣＳを用いて解析したところ、ＮＫＴ細胞画分にｓｉＲＮＡが取り込まれている結果を得ることができた。

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７またはＣｙ５で蛍光標識してあるコントロールｓｉＲＮＡ （Qiagen）を使用して、ＯＰＮ ｓｉＲＮＡを投与した際の肝炎治療に関わる免疫細胞の同定を試みた。まず、それぞれの蛍光ｓｉＲＮＡの遺伝子導入効率を検討するため、ｍＯＰＮ／ＣＨＯ細胞に遺伝子導入し、ＦＡＣＳ解析した。その結果、それぞれの蛍光ｓｉＲＮＡは９０％以上の導入効率を得ることができた（図１６、１７）。
次にそれぞれの蛍光ｓｉＲＮＡの細胞内局在を蛍光顕微鏡を用いて検討した。ＤＡＰＩは核染色に用いた。その結果、核周囲の細胞質にｓｉＲＮＡが局在することが分かり（図１６、１７）、これは報告と一致する（http://www1.qiagen.com/JP/geneXpression/NewsLetter/PDF/1027994_GExClubNL_5J.pdf）。Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡを図２０に示す方法にてマウスに導入し、肝臓内における免疫細胞のｓｉＲＮＡのターゲット細胞同定を行った。ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体とＦＩＴＣ標識抗ＴＣＲβ抗体にて展開し、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞画分中の蛍光ｓｉＲＮＡをＦＬ４にて検出した。
その結果、ｓｉＲＮＡは、特にＮＫＴ細胞とＴ細胞に多く取り込まれていることが分かった。すなわち、ＯＰＮ ｓｉＲＮＡの肝炎治療効果は、ＮＫＴ細胞とＴ細胞が発現するＯＰＮをノックダウンすることにより得られていることが示唆された（図２１、２２）。
＜ラットＯＰＮ ｓｉＲＮＡによるノックダウン効果とステルスｓｉＲＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるマウスＯＰＮ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果＞
上記と同様の方法によって、ラットＯＰＮ ｓｉＲＮＡによるノックダウン効果とStealth（商標）ｓｉＲＮＡ（invitrogen）によるマウスＯＰＮ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果も確認された（図２３〜２５）。

マウスＯＰＮ ｓｉＲＮＡのターゲット配列とその位置。 ヒトＯＰＮ ｓｉＲＮＡのターゲット配列とその位置。 ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果（マウスＯＰＮを遺伝子導入したｍＯＰＮ／ＣＨＯ細胞を用いた。Scr contは、哺乳動物の細胞にはないことが確認されているｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡのネガティブコントロールとして使用した。ＲＩＳＣはRNA-induced silencing complexを示す。）。ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡ は、ｍＯＰＮタンパク質発現を抑制した。 ｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果（ヒトＯＰＮを遺伝子導入したｈＯＰＮ／ＣＨＯ細胞を用いている。Scr cont、ＲＩＳＣは図３と同義である）。ｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡ はｈＯＰＮタンパク質発現を抑制した。 内在性ＯＰＮに対するｓｉＲＮＡのノックダウン効果（細胞はマウス悪性メラノーマ細胞であるＢ１６−ＢＬ６細胞株を用いている。Scr cont、ＲＩＳＣは図３と同義である）。ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡ は内在性ｍＯＰＮの発現を抑制した。 ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果持続時間解析実験のスケジュール。 ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果持続時間（Lipo. cont.は、ｓｉＲＮＡを加えないでLipofectamine 2000を用いて遺伝子導入を行った結果である。Nega cont.は、遺伝子導入処理等を一切行わないで通常に培養していた状態である）。 肝炎誘発とｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡ による肝炎治療実験プロトコール。 肝炎誘発とｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡ による肝炎治療実験プロトコール。 ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡによる肝臓中ＯＰＮのノックダウン効果とＡＬＴ値。 ＯＰＮ ｓｉＲＮＡ投与による肝臓ＨＥ染色像 肝炎悪性度とＯＰＮ ｍＲＮＡ量の相関 癌細胞に対するＯＰＮ ｓｉＲＮＡ のノックダウン効果。 ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡ による癌細胞浸潤抑制効果。ｍＯＰＮ ｓｉＲＮＡは肺癌細胞の浸潤を抑制した。 ｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡによる癌細胞浸潤抑制効果。ｈＯＰＮ ｓｉＲＮＡはヒト線維肉腫の浸潤を抑制した。 ＯＰＮ ｓｉＲＮＡ投与による肝炎治療効果（血清ＡＬＴ値）。 蛍光ｓｉＲＮＡ（Ｃｙ５）を用いたＦＡＣＳ。 蛍光ｓｉＲＮＡ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）を用いたＦＡＣＳ。 ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５の細胞内局在。 ｓｉＲＮＡ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の細胞内局在。 ｓｉＲＮＡの肝臓内リンパ球導入プロトコール。 肝臓内リンパ球のＦＡＣＳによる分離・検出。 ｓｉＲＮＡの肝臓内リンパ球への導入。 ラットＯＰＮ ｓｉＲＮＡのターゲット配列とその位置。 ラットＯＰＮ ｓｉＲＮＡのノックダウン効果。ｒＯＰＮ ｓｉＲＮＡはｒＯＰＮタンパク質発現を抑制した（ＲＩＳＣは図３と、Lipo. Cont.は図７のLipo. cont.と同義である）。 ｍＯＰＮ Ｓｔｅａｌｔｈ（商標）ＲＮＡｉのターゲット配列とそのノックダウン効果。ｍＯＰＮ Ｓｔｅａｌｔｈ（商標）ＲＮＡｉはｍＯＰＮ タンパク質発現を抑制した。

Claims (4)

1. 配列番号３、４、５、６、２８、２９若しくは３０に示す配列からなるＲＮＡと配列番号３、４、５、６、２８、２９若しくは３０に示す配列と相補的な配列からなるＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ。
2. 請求項１に記載のＲＮＡを含む、オステオポンチンの発現を抑制するためのオステオポンチン発現抑制剤。
3. 請求項２に記載のＲＮＡを含む、医薬組成物。
4. 配列番号３、４、５若しくは６に示す配列からなるＲＮＡと配列番号３、４、５若しくは６に示す配列と相補的な配列からなるＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを有効成分として含む肝炎の処置のための医薬。