JP2022104985A - アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用 - Google Patents

アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）遺伝子を標的とするＲＮＡｉ薬、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ薬、ＡＧＴの発現を阻害するためのかかるＲＮＡｉ薬の使用法、ならびに、ＡＧＴ関連障害、例えば、高血圧を有する対象の処置法を提供する。【解決手段】細胞内でのＡＧＴの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、ここで、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖とアンチセンス鎖は実質的に全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、そしてセンス鎖は、３’末端で結合しているリガンド（例えば、二価のリンカー又は三価の分枝状リンカーを介して結合している１個又はそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体）と複合体を形成している、二本鎖ＲＮＡｉ薬、ならびに、他の高血圧治療薬との併用療法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月２２日出願の米国仮特許出願第６２／００１，７３１号、および２０１４年９月９日出願の米国仮特許出願第６２／０４７９７８号に基づいて優先権を主張している。上記の各出願の内容全体は、引用により本明細書中に包含される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が引用により本明細書中に包含される配列表を含む。２０１５年５月１８日に作成されたＡＳＣＩＩコピーを、１２１３０１－０１３２０＿ＳＬ．ｔｘｔと言い、サイズは３１８，６８８バイトである。
発明の背景
レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系（ＲＡＡＳ）は、血圧の調節に重要な役割を果たしている。ＲＡＡＳカスケードは、腎臓の傍糸球体細胞によるレニンの循環系への放出により始まる。レニン分泌は、遠位尿細管でのＮａ＋の再吸収、β－交感神経刺激、および／または低下した腎臓灌流を含む、幾つかの要因によって刺激される。血漿中の活性型レニンは、アンジオテンシノーゲン（肝臓で産生される）を切断してアンジオテンシンＩにし、その後、それは循環して、局所的に発現されたアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によりアンジオテンシンＩＩに変換される。ＲＡＡＳにおけるアンジオテンシンＩＩの作用のほとんどは、アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（ＡＴ１Ｒ）へのその結合によって発揮され、増加したＮａ＋再吸収または糸球体濾過比の調節などの、動脈血管収縮作用、尿細管作用および糸球体作用をもたらす。加えて、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、カテコールアミン、エンドセリン、セロトニン、ならびにＭｇ２＋およびＫ＋濃度のような他の刺激と共に、ＡＴ１Ｒ刺激は、アルドステロンの放出を誘導し、順に、腎臓の遠位尿細管におけるＮａ＋およびＫ＋の排出を促進する。
例えば、過剰のアンジオテンシンＩＩ産生および／またはＡＴ１Ｒ刺激をもたらす、ＲＡＡＳの調節不全は、結果として、例えば、心臓、腎臓お予備動脈における酸化ストレスの増加、炎症の促進、肥大および線維症をもたらし得る高血圧をもたらし、そして、例えば、左心室線維症、動脈リモデリング、および糸球体硬化症をもたらす。
高血圧は、先進国の中で最も高い有病率であり、コントロール可能な疾患であり、成人集団の２０から５０％が罹患している。それは、平均寿命の短縮、慢性腎疾患、卒中、心筋梗塞、心不全、動脈瘤（例えば、大動脈瘤）、末梢動脈疾患、心不全（例えば、心肥大（heart enlargement or hypertrophy）および他の心血管関連疾患、障害および／または病状のような、種々の疾患、障害および病状の主な危険因子である。加えて、高血圧は、心血管罹病率の重要な危険因子であることが示されており、卒中の全症例の６２％および心疾患の全症例の４９％を占めるか、またはそれに貢献する死亡原因である。
高血圧を処置するための利用可能な降圧薬が多数あるにも関わらず、対象の３分の２以上は、１つの降圧薬で制御されず、異なる薬剤クラスから選択される２つ以上の抗高血圧剤を必要とする。これはさらに、コンプライアンスおよび副作用が薬剤の増加に伴って増えるため、制御された血圧を有する対象者数を減少させる。
従って、当技術分野において、アンジオテンシノーゲン関連疾患を有する対象のための別の療法および併用療法が必要とされている。
発明の概要
本発明は、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が介在する切断に影響するｉＲＮＡ組成物を提供する。ＡＧＴ遺伝子は、細胞内、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内に存在し得る。
本発明はまた、ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するための、ＲＮＡ転写産物のＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が介在するＡＧＴ遺伝子の切断作用を有するｉＲＮＡ組成物を用いて、ＡＧＴ遺伝子の発現の阻害または低下により利点を有し得る障害、例えば、高血圧などのアンジオテンシノーゲン関連疾患を有する対象を処置するための方法および療法を提供する。
従って、一面において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、ここで、該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして該アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、ここで、該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、そして該センス鎖は、３’末端で結合しているリガンドと複合体を形成している、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬を提供する。一態様において、該センス鎖の全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
別の面において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、ここで、該センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２８０１－２１０１；８０３－８４３；８３４－８５９；８０３－８５９；８０３－８７５；８３４－８７５；８４７－８７５；１２４７－１２７１；１５６６－１６２４；１５７０－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２１；２０３５－２１４４；２０７０－２１４４；２０７０－２１０３；２２０１－２２２３；２２２７－２３６０；２２２７－２３０４；２２９０－２３１８；２３０４－２３５０；２３０４－２３２６；２３２０－２３４２；２３３３－２３６０；２３３３－２３５８；４８５－５０３；５１７－５３５；５６０－５７８；６３５－６５３；８０３－８２１；８１４－８３２；８２２－８４０；８２５－８４３；８３４－８５２；８３７－８５５；８４１－８５９；８５５－８７３；９６７－９８５；１２４７－１２６５；１２４８－１２６６；１２４９－１２６７；１２５１－１２６９；１２５３－１２７１；１５６６－１５８４；１５７０－１５８８；１５７２－１５９０；１５７４－１５９２；１５８４－１６０２；１５８７－１６０５；１５９１－１６０９；１５９２－１６１０；１５９５－１６１３；１６０１－１６１９；１６０２－１６２０；１６０５－１６２３；１７２９－１７４７；１７３８－１７５６；１７３９－１７５７；１７４１－１７６９；１７６７－１７８５；１８１０－１８２８；１８２７－１８４５；１８８０－１９８９；１８９２－１９１４；１８９４－１９１４；１８９４－２０１２；２０３５－２０５３；２０４６－２０６４；２０５７－２０７５；２０７０－２０８８；２０７２－２０９０；２０７８－２０９６；２０７８－２１０７；２０７８－２０１１；２０８０－２０９８；２０８１－２０９９；２０８１－２１０４；２０８１－２０１１；２０８２－２１００；２０８４－２１０２；２０８４－２０１１；２０９０－２１０８；２１００－２１１８；２１１１－２１２９；２１２４－２１４２；２１２５－２１４３；２１６７－２１８５；２１７９－２１９７；２２０１－２２１９；２２０２－２２２０；２２０３－２２２１；２２０４－２２２２；２２２７－２２４５；２２３０－２２４８；２２３４－２２５２；２２４４－２２６４；２２５５－２２７３；２２６６－２２８４；２２６８－２２８６；２２７０－２２８８；２２７９－２２９７；２２８１－２２９９；２２８３－２３０１；２２８４－２３０２；２２８５－２３０３；２２８６－２３０４；２２８８－２３０６；２２９０－２３０８；２２９１－２３０９；２２９１－２３１１；２２９１－２３１８；２２９１－２３１５；２２９２－２３１０；２２９４－２３１２；２２９６－２３１４；２２９９－２３１７；２３０４－２３２２；２３０４－２３２９；２３０６－２３２４；２３０７－２３２５；２３０９－２３２７；２３０９－２３２９；２３０９－２３４２；２３０９－２３５０；２３０９－２３５８；２３１４－２３３２；２３１６－２３３４；２３１７－２３３５；２３２０－２３３８；２３２１－２３３９；２３２３－２３４１；２３２５－２３４３；２３２６－２３４４；２３２８－２３４６；２３２９－２３４７；２３３１－２３４９；２３３３－２３５１；２３３４－２３５２；２３３５－２３５３；２３３９－２３５７；２３４０－２３５８；または、２３４１－２３５９と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖が、センス鎖における少なくとも１５個の連続ヌクレオチドに実質的に相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置にて該ヌクレオチドと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、二本鎖ＲＮＡｉ薬を提供する。任意の態様において、センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。他の態様において、アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。さらに他の態様において、両鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。一態様において、該センス鎖の全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。一態様において、センス鎖は、３’末端で結合しているリガンドと複合体を形成している。一態様において、該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２８０１－２１０１と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、センス鎖における少なくとも１５個の連続ヌクレオチドに実質的に相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置にて該ヌクレオチドと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
一面において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、ここで、該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド８０３－８４３；８３４－８５９；８０３－８５９；１２４７－１２７１；１５６６－１６２４；１５７０－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２１；２０３５－２１４４；２０７０－２１４４；２０７０－２１０３；２２０１－２２２３；２２２７－２３６０；２２２７－２３０４；２２９０－２３１８；２３０４－２３５０；２３０４－２３２６；２３２０－２３４２；２３３３－２３６０；２３３３－２３５８；４８５－５０３；５１７－５３５；５６０－５７８；６３５－６５３；８０３－８２１；８１４－８３２；８２２－８４０；８２５－８４３；８３４－８５２；８３７－８５５；８４１－８５９；８５５－８７３；９６７－９８５；１２４７－１２６５；１２４８－１２６６；１２４９－１２６７；１２５１－１２６９；１２５３－１２７１；１５６６－１５８４；１５７０－１５８８；１５７２－１５９０；１５７４－１５９２；１５８４－１６０２；１５８７－１６０５；１５９１－１６０９；１５９２－１６１０；１５９５－１６１３；１６０１－１６１９；１６０２－１６２０；１６０５－１６２３；１７２９－１７４７；１７３８－１７５６；１７３９－１７５７；１７４１－１７６９；１７６７－１７８５；１８１０－１８２８；１８２７－１８４５；１８８０－１９８９；１８９４－２０１２；２０３５－２０５３；２０４６－２０６４；２０５７－２０７５；２０７０－２０８８；２０７２－２０９０；２０７８－２０９６；２０８０－２０９８；２０８１－２０９９；２０８２－２１００；２０８４－２１０２；２０９０－２１０８；２１００－２１１８；２１１１－２１２９；２１２４－２１４２；２１２５－２１４３；２１６７－２１８５；２１７９－２１９７；２２０１－２２１９；２２０２－２２２０；２２０３－２２２１；２２０４－２２２２；２２２７－２２４５；２２３０－２２４８；２２３４－２２５２；２２４４－２２６４；２２５５－２２７３；２２６６－２２８４；２２６８－２２８６；２２７０－２２８８；２２７９－２２９７；２２８１－２２９９；２２８３－２３０１；２２８４－２３０２；２２８５－２３０３；２２８６－２３０４；２２８８－２３０６；２２９０－２３０８；２２９１－２３０９；２２９２－２３１０；２２９４－２３１２；２２９６－２３１４；２２９９－２３１７；２３０４－２３２２；２３０６－２３２４；２３０７－２３２５；２３０９－２３２７；２３１４－２３３２；２３１６－２３３４；２３１７－２３３５；２３２０－２３３８；２３２１－２３３９；２３２３－２３４１；２３２５－２３４３；２３２６－２３４４；２３２８－２３４６；２３２９－２３４７；２３３１－２３４９；２３３３－２３５１；２３３４－２３５２；２３３５－２３５３；２３３９－２３５７；２３４０－２３５８；または、２３４１－２３５９と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして該アンチセンス鎖が、センス鎖における少なくとも１５個の連続ヌクレオチドに実質的に相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置にて該ヌクレオチドと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬を提供する。任意の態様において、センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。他の態様において、アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。さらに他の態様において、両鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。一態様において、センス鎖は、３’末端で結合しているリガンドと複合体を形成している。
一態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表３、４、７、８、１１、１３および１５の何れかの表に列記されるアンチセンス配列の何れか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、相補性の領域を含む。例えば、任意の態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖(duplex)ＡＤ－５２４３３．１、ＡＤ－５２４３８．１、ＡＤ－５２４３９．１、ＡＤ－５２４４５．１、ＡＤ－５２４４９．１、ＡＤ－５２４５１．１、ＡＤ－５２４５６．１、ＡＤ－５２４５７．１、ＡＤ－５２４６２．１、ＡＤ－５２４６３．１、ＡＤ－５２４６９．１、ＡＤ－５２４７４．１、ＡＤ－５５９７６．１、ＡＤ－５５９７８．１、ＡＤ－５５９７９．１、ＡＤ－５５９８０．１、ＡＤ－５５９８１．１、ＡＤ－５５９８２．１、ＡＤ－５５９８３．１、ＡＤ－５５９８４．１、ＡＤ－５５９８７．１、ＡＤ－５５９８８．１、ＡＤ－５５９８９．１、ＡＤ－５５９９０．１、ＡＤ－５５９９１．１、ＡＤ－５５９９４．１、ＡＤ－５５９９５．１、ＡＤ－５５９９６．１、ＡＤ－５５９９９．１、ＡＤ－５６０００．１、ＡＤ－５６００１．１、ＡＤ－５６００２．１、ＡＤ－５６００３．１、ＡＤ－５６００６．１、ＡＤ－５６００７．１、ＡＤ－５６００８．１、ＡＤ－５６００９．１、ＡＤ－５６０１１．１、ＡＤ－５６０１２．１、ＡＤ－５６０１３．１、ＡＤ－５６０１６．１、ＡＤ－５６０１７．１、ＡＤ－５６０１９．１、ＡＤ－５６０２０．１、ＡＤ－５６０２１．１、ＡＤ－５６０２２．１、ＡＤ－５６０２４．１、ＡＤ－５６０２６．１、ＡＤ－５６０２７．１、ＡＤ－５６０２９．１、ＡＤ－５６０３０．１、ＡＤ－５６０３１．１、ＡＤ－５６０３２．１、ＡＤ－５６０３５．１、ＡＤ－５６０３９．１、ＡＤ－５６０４１．１、ＡＤ－５６０４３．１、ＡＤ－５６０４４．１、ＡＤ－５６０４７．１、ＡＤ－５６０４８．１、ＡＤ－５６０５１．１、ＡＤ－５６０５３．１、ＡＤ－５６０５４．１、ＡＤ－５６０５９．１、ＡＤ－５６０６２．１、ＡＤ－５６０６５．１、ＡＤ－５６０６６．１、ＡＤ－６０７７０．１、ＡＤ－６０７７１．１、ＡＤ－６０７７６．１、ＡＤ－６０７７７．１、ＡＤ－６０７７８．１、ＡＤ－６０７７９．１、ＡＤ－６０７８０．１、ＡＤ－６０７８１．１、ＡＤ－６０７８３．１、ＡＤ－６０７８４．１、ＡＤ－６０７８５．１、ＡＤ－６０７８８．１、ＡＤ－６０７８９．１、ＡＤ－６０７９１．１、ＡＤ－６０７９３．１、ＡＤ－６０７９５．１、ＡＤ－６０７９８．１、ＡＤ－６０８０１．１、ＡＤ－６７９０３．１、ＡＤ－６７９０６．１、ＡＤ－６７９２３．１、ＡＤ－６７９２４．１、ＡＤ－６７９２５．１、ＡＤ－６７９２６．１、ＡＤ－６７９３５．１、ＡＤ－６７９６５．１、ＡＤ－６７９９４．１、ＡＤ－６７９９５．１、ＡＤ－６７９９６．１、ＡＤ－６８０１７．１、ＡＤ－６８０２２．１、ＡＤ－６８０３５．１、ＡＤ－６８０３６．１、ＡＤ－６８０３７．１、ＡＤ－６８０８４．２、ＡＤ－６８０８５．２、ＡＤ－６８０８６．２、ＡＤ－６８０８７．２、ＡＤ－６８０９０．２、ＡＤ－６８０９１．２、ＡＤ－６８０９２．２、ＡＤ－６８０９３．２、ＡＤ－６８１１６．１、ＡＤ－６８１１７．１、ＡＤ－６８１１８．１、ＡＤ－６８１２４．１、ＡＤ－６８１２５．１、またはＡＤ－６８１２６．１のアンチセンス配列の何れか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、相補性の領域を含む。任意の態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖ＡＤ－５２４３３．１、ＡＤ－５２４３８．１、ＡＤ－５２４３９．１、ＡＤ－５２４４５．１、ＡＤ－５２４４９．１、ＡＤ－５２４５１．１、ＡＤ－５２４５６．１、ＡＤ－５２４５７．１、ＡＤ－５２４６２．１、ＡＤ－５２４６３．１、ＡＤ－５２４６９．１、ＡＤ－５２４７４．１、ＡＤ－５５９７６．１、ＡＤ－５５９７８．１、ＡＤ－５５９７９．１、ＡＤ－５５９８０．１、ＡＤ－５５９８１．１、ＡＤ－５５９８２．１、ＡＤ－５５９８３．１、ＡＤ－５５９８４．１、ＡＤ－５５９８７．１、ＡＤ－５５９８８．１、ＡＤ－５５９８９．１、ＡＤ－５５９９０．１、ＡＤ－５５９９１．１、ＡＤ－５５９９４．１、ＡＤ－５５９９５．１、ＡＤ－５５９９６．１、ＡＤ－５５９９９．１、ＡＤ－５６０００．１、ＡＤ－５６００１．１、ＡＤ－５６００２．１、ＡＤ－５６００３．１、ＡＤ－５６００６．１、ＡＤ－５６００７．１、ＡＤ－５６００８．１、ＡＤ－５６００９．１、ＡＤ－５６０１１．１、ＡＤ－５６０１２．１、ＡＤ－５６０１３．１、ＡＤ－５６０１６．１、ＡＤ－５６０１７．１、ＡＤ－５６０１９．１、ＡＤ－５６０２０．１、ＡＤ－５６０２１．１、ＡＤ－５６０２２．１、ＡＤ－５６０２４．１、ＡＤ－５６０２６．１、ＡＤ－５６０２７．１、ＡＤ－５６０２９．１、ＡＤ－５６０３０．１、ＡＤ－５６０３１．１、ＡＤ－５６０３２．１、ＡＤ－５６０３５．１、ＡＤ－５６０３９．１、ＡＤ－５６０４１．１、ＡＤ－５６０４３．１、ＡＤ－５６０４４．１、ＡＤ－５６０４７．１、ＡＤ－５６０４８．１、ＡＤ－５６０５１．１、ＡＤ－５６０５３．１、ＡＤ－５６０５４．１、ＡＤ－５６０５９．１、ＡＤ－５６０６２．１、ＡＤ－５６０６５．１、ＡＤ－５６０６６．１、ＡＤ－６０７７０．１、ＡＤ－６０７７１．１、ＡＤ－６０７７６．１、ＡＤ－６０７７７．１、ＡＤ－６０７７８．１、ＡＤ－６０７７９．１、ＡＤ－６０７８０．１、ＡＤ－６０７８１．１、ＡＤ－６０７８３．１、ＡＤ－６０７８４．１、ＡＤ－６０７８５．１、ＡＤ－６０７８８．１、ＡＤ－６０７８９．１、ＡＤ－６０７９１．１、ＡＤ－６０７９３．１、ＡＤ－６０７９５．１、ＡＤ－６０７９８．１、ＡＤ－６０８０１．１、ＡＤ－６７９０３．１、ＡＤ－６７９０６．１、ＡＤ－６７９２３．１、ＡＤ－６７９２４．１、ＡＤ－６７９２５．１、ＡＤ－６７９２６．１、ＡＤ－６７９３５．１、ＡＤ－６７９６５．１、ＡＤ－６７９９４．１、ＡＤ－６７９９５．１、ＡＤ－６７９９６．１、ＡＤ－６８０１７．１、ＡＤ－６８０２２．１、ＡＤ－６８０３５．１、ＡＤ－６８０３６．１、ＡＤ－６８０３７．１、ＡＤ－６８０８４．２、ＡＤ－６８０８５．２、ＡＤ－６８０８６．２、ＡＤ－６８０８７．２、ＡＤ－６８０９０．２、ＡＤ－６８０９１．２、ＡＤ－６８０９２．２、ＡＤ－６８０９３．２、ＡＤ－６８１１６．１、ＡＤ－６８１１７．１、ＡＤ－６８１１８．１、ＡＤ－６８１２４．１、ＡＤ－６８１２５．１、またはＡＤ－６８１２６．１の何れか１つ相補性の領域の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、相補性の領域を含む。
一態様において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－６７３２７のアンチセンスヌクレオチド配列（５’－ＡＵＵＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＧＡＧＡＣＵ－３’；配列番号５３７）と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続する非修飾ヌクレオチドを含む、相補性の領域を含む。別の態様において、相補性の領域は、ＡＤ－６７３２７のアンチセンス非修飾ヌクレオチド配列からなる（５’－ＡＵＵＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＧＡＧＡＣＵ－３’；配列番号５３７）。一態様において、ｄｓＲＮＡは、ヌクレオチド配列 ５’－ＵＣＵＣＣＣＡＣＣＵＵＵＵＣＵＵＣＵＡＡＵ－３’（配列番号４９９）からなるセンス鎖、およびヌクレオチド配列 ５’－ＵＵＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＧＡＧＡＣＵ－３’（配列番号５３７）からなるアンチセンス鎖を含む。一態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、ＡＤ－６７３２７の修飾ヌクレオチド配列を含む（５’－ｕｓｃｓｕｃｃｃＡｆｃＣｆＵｆＵｆｕｕｃｕｕｃｕａａｕ－３’；配列番号１０３７および５’－ａｓＵｆｓｕａｇＡｆａｇａａａａｇＧｆｕＧｆｇｇａｇａｓｃｓｕ－３’；配列番号１０３８）。
ある態様において、修飾ヌクレオチド（複数可）は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリルエステル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基（bisdecylamide group）と結合する末端ヌクレオチドからなる群より独立して選択される。さらなる態様において、修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド(locked nucleotide)、非ロックドヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチル（constrained ethyl）ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群より選択される。
二本鎖ＲＮＡｉ薬の別の態様において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の態様において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
別の面において、本発明は、細胞におけるアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができるＲＮＡｉ薬、例えば、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、
Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成している。］
で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬を提供する。
一態様において、ｉは０であり、ｊは０であるか；ｉは１であり、ｊは１であるか；ｉおよびｊの両方が０であるか；または、ｉおよびｊの両方が１である。別の態様において、ｋは０であり、ｌは０であるか；ｋは１であり、ｌは１であるか；ｋおよびｌの両方が０であるか；または、ｋおよびｌの両方が１である。
一態様において、ＸＸＸは、Ｘ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、そしてＺＺＺは、Ｚ’Ｚ’Ｚ’に相補的である。
一態様において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位に、またはその近位に生じる。
別の態様において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１１位、１２位および１３位に生じる。
一態様において、Ｙ’は２’－Ｏ－メチルである。
一態様において、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩａ）で表される。
別の態様において、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｂ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩｂ）
［式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、１－５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。］
で表される。
さらに別の態様において、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｃ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩｃ）
［式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、１－５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。］
で表される。
さらなる態様において、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｄ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩｄ）
［式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、１－５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は、独立して、２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。］
で表される。
一態様において、二本鎖領域は、１５－３０ヌクレオチド対の長さである。別の態様において、二本鎖領域は、１７－２３ヌクレオチド対の長さである。さらに別の態様において、二本鎖領域は、１７－２５ヌクレオチド対の長さである。さらなる態様において、二本鎖領域は、２３－２７ヌクレオチド対の長さである。別の態様において、二本鎖領域は、１９－２１ヌクレオチド対の長さである。別の態様において、二本鎖領域は、１９－２３ヌクレオチド対の長さである。別の態様において、二本鎖領域は、２１－２３ヌクレオチド対の長さである。さらに別の態様において、各鎖は、１５－３０個のヌクレオチドを有する。さらに別の態様において、各鎖は、１９－３０個のヌクレオチドを有する。
一態様において、ヌクレオチドにおける修飾は、ＬＮＡ、ＵＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびそれらの組合せからなる群より選択される。別の態様において、ヌクレオチドにおける修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾である。
一態様において、リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。別の態様において、リガンドは、
Figure 2022104985000001
である。
一態様において、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合している。
別の態様において、ＲＮＡｉ薬は、以下：
Figure 2022104985000002
［式中、Ｘは、ＯまたはＳである。］
で示されるリガンドと複合体を形成している。特定の態様において、ＸはＯである。
一態様において、本発明の薬剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む。
さらなる態様において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の３’末端にある。別の態様において、該鎖はアンチセンス鎖である。別の態様において、該鎖はセンス鎖である。
一態様において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の５’末端にある。別の態様において、該鎖はアンチセンス鎖である。さらなる態様において、該鎖はセンス鎖である。
一態様において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の５’末端および３’末端の両方にある。別の態様において、該鎖はアンチセンス鎖である。
別の態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、６－８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらなる態様において、アンチセンス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、そしてセンス鎖は、該センス鎖の５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一態様において、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１つの位置の塩基対は、ＡＵ塩基対である。別の態様において、Ｙヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を含む。さらなる態様において、Ｙ’ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。
一態様において、ｐ’＞０である。別の態様において、ｐ’＝２である。さらなる態様において、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０、およびｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに相補的である。さらなる態様において、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０、およびｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに相補的でない。
一態様において、センス鎖は、合計２１個のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計２３個のヌクレオチドを有する。
別の態様において、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されている。さらなる態様において、全てのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されている。
別の態様において、ＲＮＡｉ薬は、表３、４、７、８、１１、１３および１５の何れかに列記されるＲＮＡｉ薬の群から選択される。
一面において、本発明は、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬を提供する。二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして、該アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群より選択される修飾を含み、該センス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群より選択される修飾を含み、該アンチセンス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、そして、該センス鎖は、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して３’末端に結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と複合体を形成している。
一態様において、該センス鎖の全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、修飾を含む。
別の面において、本発明は、細胞内でのＡＧＴ（アンジオテンシノーゲン）の発現を阻害することができるＲＮＡｉ薬、例えば、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成している。］
で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬を提供する。
さらに別の面において、本発明は、細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができるＲＮＡｉ薬、例えば、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ｐ、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成している。］
で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬を提供する。
さらなる面において、本発明は、細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができるＲＮＡｉ薬、例えば、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ薬）であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、ここで、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ｐ、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成しており、ここで該リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。］
で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬を提供する。
別の面において、本発明は、細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができるＲＮＡｉ薬、例えば、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、ここで、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ｐ、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成しており、ここで該リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。］
で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬を提供する。
さらに別の面において、本発明は、細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができるＲＮＡｉ薬、例えば，二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、ここで、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩａ）
［式中、各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ｐ、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
該センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、そして
該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成しており、ここで該リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。］
で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬を提供する。
別の面において、本発明は、表３、４、７、８、１１、１３および１５のうち何れか１つに列記されるＲＮＡｉ薬を含む二本鎖ＲＮＡｉ薬を提供する。
別の面において、本発明は、修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド薬を含む組成物であって、該医薬が、細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができ、表３、４、７、８、１１、１３および１５の何れか１つに列記される配列群より選択されるセンス配列に相補的な配列を含み、該ポリヌクレオチドが、約１４から約３０ヌクレオチド長である、組成物を提供する。
本発明はまた、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ薬を含む、細胞、ベクター、宿主細胞および医薬組成物を提供する。
一態様において、細胞は二本鎖ＲＮＡｉ薬を含む。
ある態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬または修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド薬を含む組成物は、医薬組成物を用いて投与される。
一態様において、本発明の医薬組成物は、液体製剤、例えばＸＴＣまたはＭＣ３を含む。
好ましい態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、溶液で投与される。ある態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、非緩衝液で投与される。別の態様において、非緩衝液は、生理食塩水または水である。別の態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、緩衝液と共に投与される。さらに別の態様において、緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、プロラミン、炭酸緩衝液、またはリン酸緩衝液、あるいはこれらの任意の組合せを含む。ある態様において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
別の面において、本発明は、細胞でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害する方法を提供する。該方法には、細胞と二本鎖ＲＮＡｉ薬、医薬組成物、修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド薬を含む組成物またはＲＮＡｉ薬を含むベクターとを接触させること、およびそうして製造された細胞をＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるのに十分な時間維持して、細胞でのＡＧＴ遺伝子の発現を阻害することが含まれる。
一態様において、細胞は対象内に存在する。さらなる態様において、対象はヒトである。さらなる態様において、対象はアンジオテンシノーゲン関連疾患に罹患している。
一態様において、ＡＧＴ発現は、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約１００％阻害される。
一態様において、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２８０１－２１０１；８０３－８４３；８３４－８５９；８０３－８５９；８０３－８７５；８３４－８７５；８４７－８７５；１２４７－１２７１；１５６６－１６２４；１５７０－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２１；２０３５－２１４４；２０７０－２１４４；２０７０－２１０３；２２０１－２２２３；２２２７－２３６０；２２２７－２３０４；２２９０－２３１８；２３０４－２３５０；２３０４－２３２６；２３２０－２３４２；２３３３－２３６０；２３３３－２３５８；４８５－５０３；５１７－５３５；５６０－５７８；６３５－６５３；８０３－８２１；８１４－８３２；８２２－８４０；８２５－８４３；８３４－８５２；８３７－８５５；８４１－８５９；８５５－８７３；９６７－９８５；１２４７－１２６５；１２４８－１２６６；１２４９－１２６７；１２５１－１２６９；１２５３－１２７１；１５６６－１５８４；１５７０－１５８８；１５７２－１５９０；１５７４－１５９２；１５８４－１６０２；１５８７－１６０５；１５９１－１６０９；１５９２－１６１０；１５９５－１６１３；１６０１－１６１９；１６０２－１６２０；１６０５－１６２３；１７２９－１７４７；１７３８－１７５６；１７３９－１７５７；１７４１－１７６９；１７６７－１７８５；１８１０－１８２８；１８２７－１８４５；１８８０－１９８９；１８９２－１９１４；１８９４－１９１４；１８９４－２０１２；２０３５－２０５３；２０４６－２０６４；２０５７－２０７５；２０７０－２０８８；２０７２－２０９０；２０７８－２０９６；２０７８－２１０７；２０７８－２０１１；２０８０－２０９８；２０８１－２０９９；２０８１－２１０４；２０８１－２０１１；２０８２－２１００；２０８４－２１０２；２０８４－２０１１；２０９０－２１０８；２１００－２１１８；２１１１－２１２９；２１２４－２１４２；２１２５－２１４３；２１６７－２１８５；２１７９－２１９７；２２０１－２２１９；２２０２－２２２０；２２０３－２２２１；２２０４－２２２２；２２２７－２２４５；２２３０－２２４８；２２３４－２２５２；２２４４－２２６４；２２５５－２２７３；２２６６－２２８４；２２６８－２２８６；２２７０－２２８８；２２７９－２２９７；２２８１－２２９９；２２８３－２３０１；２２８４－２３０２；２２８５－２３０３；２２８６－２３０４；２２８８－２３０６；２２９０－２３０８；２２９１－２３０９；２２９１－２３１１；２２９１－２３１８；２２９１－２３１５；２２９２－２３１０；２２９４－２３１２；２２９６－２３１４；２２９９－２３１７；２３０４－２３２２；２３０４－２３２９；２３０６－２３２４；２３０７－２３２５；２３０９－２３２７；２３０９－２３２９；２３０９－２３４２；２３０９－２３５０；２３０９－２３５８；２３１４－２３３２；２３１６－２３３４；２３１７－２３３５；２３２０－２３３８；２３２１－２３３９；２３２３－２３４１；２３２５－２３４３；２３２６－２３４４；２３２８－２３４６；２３２９－２３４７；２３３１－２３４９；２３３３－２３５１；２３３４－２３５２；２３３５－２３５３；２３３９－２３５７；２３４０－２３５８；または、２３４１－２３５９と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
別の面において、本発明は、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）関連障害を有する対象の処置法であって、治療的有効量の二本鎖ＲＮＡｉ薬、修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド薬を含む組成物、または二本鎖ＲＮＡｉ薬を含む医薬組成物を該対象に投与して、該対象を処置することを含む、処置法を提供する。
別の面において、本発明は、治療的有効量の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ薬）を対象に皮下投与することを含む、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）関連障害を有する対象の処置法であって、ここで、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして該アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群より選択される修飾を含み、該アンチセンス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群より選択される修飾を含み、該センス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、そして、該センス鎖は、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して３’末端に結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と複合体を形成する、処置法を提供する。
一態様において、センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む。
別の面において、本発明は、治療的有効量の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ薬）を対象に投与することを含む、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）関連障害を有する対象の処置法であって、ここで、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２８０１－２１０１；８０３－８４３；８３４－８５９；８０３－８５９；８０３－８７５；８３４－８７５；８４７－８７５；１２４７－１２７１；１５６６－１６２４；１５７０－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２１；２０３５－２１４４；２０７０－２１４４；２０７０－２１０３；２２０１－２２２３；２２２７－２３６０；２２２７－２３０４；２２９０－２３１８；２３０４－２３５０；２３０４－２３２６；２３２０－２３４２；２３３３－２３６０；２３３３－２３５８；４８５－５０３；５１７－５３５；５６０－５７８；６３５－６５３；８０３－８２１；８１４－８３２；８２２－８４０；８２５－８４３；８３４－８５２；８３７－８５５；８４１－８５９；８５５－８７３；９６７－９８５；１２４７－１２６５；１２４８－１２６６；１２４９－１２６７；１２５１－１２６９；１２５３－１２７１；１５６６－１５８４；１５７０－１５８８；１５７２－１５９０；１５７４－１５９２；１５８４－１６０２；１５８７－１６０５；１５９１－１６０９；１５９２－１６１０；１５９５－１６１３；１６０１－１６１９；１６０２－１６２０；１６０５－１６２３；１７２９－１７４７；１７３８－１７５６；１７３９－１７５７；１７４１－１７６９；１７６７－１７８５；１８１０－１８２８；１８２７－１８４５；１８８０－１９８９；１８９２－１９１４；１８９４－１９１４；１８９４－２０１２；２０３５－２０５３；２０４６－２０６４；２０５７－２０７５；２０７０－２０８８；２０７２－２０９０；２０７８－２０９６；２０７８－２１０７；２０７８－２０１１；２０８０－２０９８；２０８１－２０９９；２０８１－２１０４；２０８１－２０１１；２０８２－２１００；２０８４－２１０２；２０８４－２０１１；２０９０－２１０８；２１００－２１１８；２１１１－２１２９；２１２４－２１４２；２１２５－２１４３；２１６７－２１８５；２１７９－２１９７；２２０１－２２１９；２２０２－２２２０；２２０３－２２２１；２２０４－２２２２；２２２７－２２４５；２２３０－２２４８；２２３４－２２５２；２２４４－２２６４；２２５５－２２７３；２２６６－２２８４；２２６８－２２８６；２２７０－２２８８；２２７９－２２９７；２２８１－２２９９；２２８３－２３０１；２２８４－２３０２；２２８５－２３０３；２２８６－２３０４；２２８８－２３０６；２２９０－２３０８；２２９１－２３０９；２２９１－２３１１；２２９１－２３１８；２２９１－２３１５；２２９２－２３１０；２２９４－２３１２；２２９６－２３１４；２２９９－２３１７；２３０４－２３２２；２３０４－２３２９；２３０６－２３２４；２３０７－２３２５；２３０９－２３２７；２３０９－２３２９；２３０９－２３４２；２３０９－２３５０；２３０９－２３５８；２３１４－２３３２；２３１６－２３３４；２３１７－２３３５；２３２０－２３３８；２３２１－２３３９；２３２３－２３４１；２３２５－２３４３；２３２６－２３４４；２３２８－２３４６；２３２９－２３４７；２３３１－２３４９；２３３３－２３５１；２３３４－２３５２；２３３５－２３５３；２３３９－２３５７；２３４０－２３５８；または、２３４１－２３５９と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして該アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖がセンス鎖の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドに実質的に相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置に該ヌクレオチドと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、処置法を提供する。任意の態様において、センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。他の態様において、アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。さらに他の態様において、両鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。一態様において、センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。一態様において、センス鎖は、３’末端で結合しているリガンドと複合体を形成している。
別の面において、本発明は、治療的有効量の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ薬）を対象に投与することを含む、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）関連障害を有する対象の処置法であって、ここで、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド８０３－８４３；８３４－８５９；８０３－８５９；１２４７－１２７１；１５６６－１６２４；１５７０－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２１；２０３５－２１４４；２０７０－２１４４；２０７０－２１０３；２２０１－２２２３；２２２７－２３６０；２２２７－２３０４；２２９０－２３１８；２３０４－２３５０；２３０４－２３２６；２３２０－２３４２；２３３３－２３６０；２３３３－２３５８；４８５－５０３；５１７－５３５；５６０－５７８；６３５－６５３；８０３－８２１；８１４－８３２；８２２－８４０；８２５－８４３；８３４－８５２；８３７－８５５；８４１－８５９；８５５－８７３；９６７－９８５；１２４７－１２６５；１２４８－１２６６；１２４９－１２６７；１２５１－１２６９；１２５３－１２７１；１５６６－１５８４；１５７０－１５８８；１５７２－１５９０；１５７４－１５９２；１５８４－１６０２；１５８７－１６０５；１５９１－１６０９；１５９２－１６１０；１５９５－１６１３；１６０１－１６１９；１６０２－１６２０；１６０５－１６２３；１７２９－１７４７；１７３８－１７５６；１７３９－１７５７；１７４１－１７６９；１７６７－１７８５；１８１０－１８２８；１８２７－１８４５；１８８０－１９８９；１８９４－２０１２；２０３５－２０５３；２０４６－２０６４；２０５７－２０７５；２０７０－２０８８；２０７２－２０９０；２０７８－２０９６；２０８０－２０９８；２０８１－２０９９；２０８２－２１００；２０８４－２１０２；２０９０－２１０８；２１００－２１１８；２１１１－２１２９；２１２４－２１４２；２１２５－２１４３；２１６７－２１８５；２１７９－２１９７；２２０１－２２１９；２２０２－２２２０；２２０３－２２２１；２２０４－２２２２；２２２７－２２４５；２２３０－２２４８；２２３４－２２５２；２２４４－２２６４；２２５５－２２７３；２２６６－２２８４；２２６８－２２８６；２２７０－２２８８；２２７９－２２９７；２２８１－２２９９；２２８３－２３０１；２２８４－２３０２；２２８５－２３０３；２２８６－２３０４；２２８８－２３０６；２２９０－２３０８；２２９１－２３０９；２２９２－２３１０；２２９４－２３１２；２２９６－２３１４；２２９９－２３１７；２３０４－２３２２；２３０６－２３２４；２３０７－２３２５；２３０９－２３２７；２３１４－２３３２；２３１６－２３３４；２３１７－２３３５；２３２０－２３３８；２３２１－２３３９；２３２３－２３４１；２３２５－２３４３；２３２６－２３４４；２３２８－２３４６；２３２９－２３４７；２３３１－２３４９；２３３３－２３５１；２３３４－２３５２；２３３５－２３５３；２３３９－２３５７；２３４０－２３５８；または、２３４１－２３５９と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして該アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖がセンス鎖の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドに実質的に相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置に該ヌクレオチドと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む、処置法を提供する。任意の態様において、センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。他の態様において、アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。さらに他の態様において、両鎖の実質的に全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。一態様において、センス鎖は、３’末端で結合しているリガンドと複合体を形成している。
一態様において、対象はヒトである。
一態様において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は、高血圧、境界域高血圧、原発性高血圧、二次性高血圧、高血圧緊急症、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心内膜線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、レニン腫症候群（reninoma）、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺／副甲状腺疾患、心不全、心筋梗塞、狭心症、卒中、真性糖尿病、腎疾患、腎不全、全身性硬化症、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、ならびに胎児発育不全からなる群より選択される。
別の態様において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は、高血圧、高血圧性心疾患、高血圧性腎症、妊娠関連高血圧、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、慢性腎臓病、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心内膜線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺／副甲状腺疾患、心不全、心筋梗塞、卒中、真性糖尿病、腎不全、ならびに全身性硬化症からなる群より選択される。
一態様において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は、妊娠関連高血圧（例えば、妊娠高血圧症候群、子癇前症、および子癇）であり、本発明のｉＲＮＡの対象への投与は、母体の血圧の低下；母体のアルブミン尿の減少；子宮胎盤単位重量の増加；胎児体重の増加；胎児の脳の：肝臓比の正常化；母体の肝臓におけるＡＧＴ ｍＲＮＡ発現の減少および胎盤でのｈＡＧＴ ｍＲＮＡ発現の有意な減少なし；全体の胎盤サイズの増加；絨毛胎盤のサイズの増加；胎盤の栄養海綿体サイズの有意な変化なし；母体の腎臓におけるｓＦＬＴ１：ＰＬＧＦ ｍＲＮＡ発現の比の低下；血清ｓＦＬＴ１：ＰＬＧＦレベルの比の低下；および／または、ＡＴ１に対するアゴニスト自己抗体のレベルの低下をもたらす。
一態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、体重１ｋｇ当たり、約０．０１ｍｇから約１０ｍｇまたは約０．５ｍｇから約５０ｍｇの用量で投与される。好ましい態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、体重１ｋｇ当たり、約１０ｍｇ、約３０ｍｇ、または約３．０ｍｇの用量で投与される。一態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、体重１ｋｇ当たり、約１０ｍｇの用量で投与される。一態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、体重１ｋｇ当たり、約０．５ｍｇの用量で週に２回投与される。別の態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、体重１ｋｇ当たり、約１０ｍｇの用量で隔週で投与される。別の態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、体重１ｋｇ当たり、約０．５－１．０ｍｇの用量で週に１回投与される。別の態様において、ＲＮＡｉ薬は、およそ週に１回、月に１回、２か月に１回または四半期に１回（すなわち、３カ月に１回）、体重１ｋｇ当たり、約０．１ｍｇから約５．０ｍｇの用量で投与される。
一態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、皮下または静脈内に投与される。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、２以上の用量で投与される。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、約７２時間毎および約９６時間毎に１回投与からなる群より選択される間隔で投与される。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は週に２回投与される。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は隔週で投与される。
任意の態様において、ＲＮＡｉ薬は、月に１回投与される。
任意の態様において、ＲＮＡｉ薬は２か月に１回投与される。
任意の態様において、ＲＮＡｉ薬は、四半期に１回（すなわち、３カ月に１回）投与される。
さらに別の態様において、該方法は、対象にさらなる治療剤を投与することをさらに含む。ある態様において、さらなる治療剤は、利尿剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、β遮断薬、血管拡張薬、カルシウムチャンネル遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、α２－アゴニスト、レニン阻害剤、α遮断薬、末梢作用型アドレナリン作動薬、選択的Ｄ１受容体部分アゴニスト、非選択的アルファ－アドレナリンアンタゴニスト、合成したステロイド性の抗ミネラルコルチコイド薬、または上記の何れかの組合せ、および併用剤として製剤された高血圧治療薬からなる群より選択される。
図１は、治療介入の標的にされてきた、レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系（ＲＡＡＳ）における種々の時点の表示を含む該系の模式図である（Zaman, et al. (2002) Nat Rev Drug Disc 1:621より出展）。 図２Ａは、ＡＤ－６０７７１の投与後の、妊娠したトランスジェニックラットの平均動脈血圧の低下を示すグラフである。図２Ｂは、ＡＤ－６０７７１の投与後の、妊娠したトランスジェニックラットの血清アルブミンの低下を示すグラフである。 図３Ａは、ＡＤ－６０７７１の母体投与後に胎児に現れる改善を証明する、ＡＤ－６０７７１の母体投与後に増加した子宮胎盤単位重量を示すグラフである。図３Ｂは、ＡＤ－６０７７１の母体投与後に胎児に現れる改善を証明する、ＡＤ－６０７７１の母体投与後の胎児の体重増加を示すグラフである。図３Ｃは、ＡＤ－６０７７１の母体投与後に胎児に現れる改善を証明する、ＡＤ－６０７７１の母体投与後の胎児の脳：肝臓比の正常化を示すグラフである。 図４Ａは、ｉＲＮＡが胎盤関門を通過していないことを証明する、ＡＤ－６０７７１の投与後の母体の肝臓におけるｈＡＧＴ ｍＲＮＡの減少を示すグラフである。図４Ｂは、ｉＲＮＡが胎盤関門を通過していないことを証明する、胎盤におけるｈＡＧＴ ｍＲＮＡの有意な減少がないことを示すグラフである。 図５は、母体の肝臓、胎盤および胎児の肝臓のＡＤ－６０７７１への組織暴露を示すグラフである。 図６Ａは、サイトケラチンを免疫組織化学染色した妊娠中の野生型ラットの胎盤である。図６Ｂは、サイトケラチンを免疫組織化学染色した処理の妊娠中のＰＥラットの胎盤である。図６Ｃは、サイトケラチンを免疫組織化学染色した、ＡＤ－６０７７１を投与した妊娠中のＰＥラットの胎盤である。 図６Ｄは、ＡＤ－６０７７１を投与した妊娠中のＰＥラットおよび未処理の妊娠中のＰＥラットの、子宮間膜の三角部(mesometrial triangle)の大きさを示すグラフである。図６Ｅは、ＡＤ－６０７７１を投与した妊娠中のＰＥラットおよび未処理の妊娠中のＰＥラットの、栄養海綿体の大きさを示すグラフである。図６Ｆは、ＡＤ－６０７７１を投与した妊娠中のＰＥラットおよび未処理の妊娠中のＰＥラットの、胎盤の大きさを示すグラフである。図６Ｇは、ＡＤ－６０７７１を投与した妊娠中のＰＥラットおよび未処理の妊娠中のＰＥラットの、ラビリンス（labyrinth）の大きさを示すグラフである。 図７Ａは、ＡＤ－６０７７１の投与後の、母体の腎臓における抗血管形成因子ｓＦＬＴ１のｍＲＮＡ量の減少を示すグラフである。図７Ｂは、ＡＤ－６０７７１の投与後の、母体の腎臓における血管新生因子ＰＬＧＦのｍＲＮＡ量の減少を示すグラフである。図７Ｃは、ＡＤ－６０７７１の母体投与後の、胎盤における抗血管形成因子ｓＦＬＴ１のｍＲＮＡ量の減少を示すグラフである。図７Ｄは、ＡＤ－６０７７１の母体投与後の、胎盤における血管新生因子ＰＬＧＦのｍＲＮＡ量の減少を示すグラフである。 図８は、対照ＰＥラットおよび妊娠中のＰＥラットから単離されたＡＴ１－ＡＡの、新生仔ラットの心筋細胞の自発的な拍動速度への影響により評価されるように、ＡＤ－６０７７１を投与したＰＥラットにおけるＡＴ１－ＡＡレベルの低下を示すグラフである。 図９Ａは、妊娠していないＰＥラットおよび妊娠中の対照Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットと比較した、ＡＤ－６０７７１を投与した妊娠中のＰＥラットにおける血清アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ２－１０）レベルの低下を示すグラフである。図９Ｂは、妊娠していないＰＥラットおよび妊娠中の対照Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットと比較した、ＡＤ－６０７７１を投与した妊娠中のＰＥラットにおける血清ヒトＡＧＴ（ｈＡＧＴ）レベルおよびラットＡＧＴ（ｒＡＧＴ）レベルの低下を示すグラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）遺伝子のＲＮＡ転写物の、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が介在する切断を行う、ｉＲＮＡ組成物を提供する。遺伝子は細胞内、例えば、ヒトのような対象内の細胞内に存在していてよい。
本発明はまた、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が介在するＡＧＴ遺伝子のＲＮＡ転写物の切断を起こすｉＲＮＡ組成物を用いる、ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害または低下させることにより利点を有し得る障害、例えば、高血圧または妊娠関連高血圧のようなアンジオテンシノーゲン関連疾患を有する対象の処置法を提供する。
本発明のｉＲＮＡには、約３０ヌクレオチド長またはそれ未満、例えば、１５－３０、１５－２９、１５－２８、１５－２７、１５－２６、１５－２５、１５－２４、１５－２３、１５－２２、１５－２１、１５－２０、１５－１９、１５－１８、１５－１７、１８－３０、１８－２９、１８－２８、１８－２７、１８－２６、１８－２５、１８－２４、１８－２３、１８－２２、１８－２１、１８－２０、１９－３０、１９－２９、１９－２８、１９－２７、１９－２６、１９－２５、１９－２４、１９－２３、１９－２２、１９－２１、１９－２０、２０－３０、２０－２９、２０－２８、２０－２７、２０－２６、２０－２５、２０－２４，２０－２３、２０－２２、２０－２１、２１－３０、２１－２９、２１－２８、２１－２７、２１－２６、２１－２５、２１－２４、２１－２３、または２１－２２ヌクレオチド長の領域（領域は、ＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である）を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が含まれる。任意の態様において、本発明のｉＲＮＡには、ＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である少なくとも１９個の連続ヌクレオチドの領域を有する、より長い、例えば６６ヌクレオチド長まで、例えば、３６－６６、２６－３６、２５－３６、３１－６０、２２－４３、２７－５３ヌクレオチド長であり得るＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が含まれる。これらのより長いアンチセンス鎖を有するｉＲＮＡには、２０－６０ヌクレオチド長の第二のＲＮＡ鎖（センス鎖）であって、ここでセンス鎖およびアンチセンス鎖が１８－３０個の連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する、ＲＮＡ鎖（センス鎖）が含まれる。これらのｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における対応する遺伝子（ＡＧＴ遺伝子）のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。特に、本発明のｉＲＮＡの非常に低い投与量は、特異的かつ効率的にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して、対応する遺伝子（ＡＧＴ遺伝子）の発現を顕著に阻害することができる。インビトロアッセイおよびインビボアッセイを用いて、本発明者らは、アンジオテンシノーゲン遺伝子を標的とするｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを媒介して、ＡＧＴの発現の顕著な阻害をもたらし、ならびに妊娠関連高血圧（例えば、妊娠高血圧症候群、子癇前症、および子癇）などのアンジオテンシノーゲン関連疾患に関連する症状を軽減させ得ることを証明した。従って、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、高血圧などのアンジオテンシノーゲン関連疾患を有する対象を処置するのに有用である。
以下の詳細な説明は、アンジオテンシノーゲン遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを含む組成物の製造法および使用法、ならびにＡＧＴの発現を阻害および／または低下することで利点を有し得る疾患および障害を有する対象の処置のための組成物、使用および方法もまた、記載されている。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るようにするため、特定の用語を初めに定義する。加えて、パラメーターの値または範囲が記載されているときは、記載された値の中間の値および範囲も本発明の一部であることが意図されることが意図されていることが特記されるべきである。
単数形の「１つの“ａ”」および「１つの“ａｎ”」は、本明細書中、該用語の文法上の目的語の１つまたは２以上（すなわち、少なくとも１つ）を意味するために用いられる。例えば、「１つの要素“ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ”」は、１つの要素または２つ以上の要素、例えば複数の要素を意味する。
用語“～を含む(including)”は、本明細書中、語句“～を含むが、これらに限定されない(including but not limited to)”を意味し、それと互換的に使用される。
用語“または”は、本明細書中、他に明確にこれと異なる記載がなされない限り、用語“および／または”を意味し、これと互換的に使用される。
用語“約”は、本明細書中、当技術分野で許容される一般的範囲内を意味するために使用される。用語“ＡＧＴ”と互換的に使用される本明細書で用いる“アンジオテンシノーゲン”は、周知の遺伝子およびポリペプチドを意味し、セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー８；アルファ－１アンチプロテイナーゼ；アンチトリプシン；ＳＥＲＰＩＮＡ８；アンジオテンシンＩ；セルピンＡ８；アンジオテンシンＩＩ；アルファ－１アンチプロテイナーゼアンジオテンシノーゲン；アンチトリプシン；プレ－アンジオテンシノーゲン２；ＡＮＨＵ；セリンプロテイナーゼ阻害剤；および、システインプロテイナーゼ阻害剤としても当技術分野で知られている。
用語“ＡＧＴ”は、ヒトＡＧＴ（そのアミノ酸およびその完全なコーディング配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１８８５９５６５８（ＮＭ＿００００２９．３；配列番号１）に見いだされ得る）；カニクイザルＡＧＴ（そのアミノ酸およびその完全なコーディング配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：９００７５３９１（ＡＢ１７０３１３．１：配列番号３）に見いだされ得る）；マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＡＧＴ（そのアミノ酸およびその完全なコーディング配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１１３４６１９９７（ＮＭ＿００７４２８．３；配列番号５）に見いだされ得る）；および、ラットＡＧＴ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＡＧＴ（そのアミノ酸およびその完全なコーディング配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５１０３６６７２（ＮＭ＿１３４４３２；配列番号７）に見いだされ得る）を含む。
ＡＧＴ ｍＲＮＡ配列のさらなる例としては、公に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、およびＭａｃａｃａマカカゲノムプロジェクトのｗｅｂサイトを用いて容易に利用可能である。
本明細書で用いる用語“ＡＧＴ”は、ＡＧＴ遺伝子の天然に生じるＤＮＡ配列変異体、例えばＡＧＴ遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）もまた意味する。代表的なＳＮＰは、利用可能なｄｂＳＮＰデータベース中（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｒｅｆ．ｃｇｉ－ｇｅｎｅＩｄ＝１８３）に見出すことができる。ＡＧＴ遺伝子内の配列変異の非限定的な例には、例えば、米国特許第５，５８９，５８４号（その内容全体を引用により本明細書中に包含される）に記載されたものが含まれる。例えば、ＡＧＴ遺伝子内の配列の変異は、位置－５３２（転写開始部位と比較して）でのＣ→Ｔ；位置－３８６でのＧ→Ａ；位置－２１８でのＧ→Ａ；位置－１８でのＣ→Ｔ；位置－６および－１０でのＧ→ＡおよびＡ→Ｃ；位置＋１０でのＣ→Ｔ（非翻訳）；位置＋５２１でのＣ→Ｔ（Ｔ１７４Ｍ）；位置＋５９７でのＴ→Ｃ（Ｐ１９９Ｐ）；位置＋７０４でのＴ→Ｃ（Ｍ２３５Ｔ；例えば、Reference SNP (refSNP) Cluster Report：ｒｓ６９９、www.ncbi.nlm.nih.gov/SNPで利用可能、も参照のこと）；位置＋７４３でのＡ→Ｇ（Ｙ２４８Ｃ）；位置＋８１３でのＣ→Ｔ（Ｎ２７１Ｎ）；位置＋１０１７でのＧ→Ａ（Ｌ３３９Ｌ）；位置＋１０７５でのＣ→Ａ（Ｌ３５９Ｍ）；および／または、位置＋１１６２でのＧ→Ａ（Ｖ３８８Ｍ）が含まれ得る。
本明細書で用いる“標的配列”は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＡＧＴ遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を意味する。一態様において、配列の標的部分は、ＡＧＴ遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近位のｉＲＮＡ指向性切断のための基質として作用するのに少なくとも十分な長さであり得る。
標的配列は、約９－３６ヌクレオチド長、例えば、約１５－３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は、約１５－３０ヌクレオチド長、１５－２９、１５－２８、１５－２７、１５－２６、１５－２５、１５－２４、１５－２３、１５－２２、１５－２１、１５－２０、１５－１９、１５－１８、１５－１７、１８－３０、１８－２９、１８－２８、１８－２７、１８－２６、１８－２５、１８－２４、１８－２３、１８－２２、１８－２１、１８－２０、１９－３０、１９－２９、１９－２８、１９－２７、１９－２６、１９－２５、１９－２４、１９－２３、１９－２２、１９－２１、１９－２０、２０－３０、２０－２９、２０－２８、２０－２７、２０－２６、２０－２５、２０－２４，２０－２３、２０－２２、２０－２１、２１－３０、２１－２９、２１－２８、２１－２７、２１－２６、２１－２５、２１－２４、２１－２３、または２１－２２ヌクレオチド長であり得る。上記の範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であると考えられる。
本明細書で用いる用語“配列を含む鎖”は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して参照される配列によって記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
“Ｇ”、“Ｃ”、“Ａ”、“Ｔ”および“Ｕ”はそれぞれ一般的に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルをそれぞれ含むヌクレオチドを表す。しかしながら、用語“リボヌクレオチド”または“ヌクレオチド”は、以下に詳述されるように、修飾ヌクレオチド、または代理置換部分（surrogate replacement moiety）も意味し得ることが理解されよう（例えば、表２参照）。当業者は、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく他の部分で置換され得ることを十分認識している。例えば、限定するものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成し得る。従って、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドは、例えば、イノシンを含むヌクレオチドにより、本発明のｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列を置換されていてよい。別の例では、オリゴヌクレオチド中のどこかのアデニンおよびシトシンは、標的ｍＲＮＡとＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成するために、それぞれグアニンおよびウラシルで置換されていてよい。そのような置換部分を含む配列は、本発明の組成物および方法に好適である。
本明細書中互換的に使用される用語“ｉＲＮＡ”、“ＲＮＡｉ薬”、“ｉＲＮＡ薬”、“ＲＮＡ干渉薬”は、その用語が本明細書で定義されるＲＮＡを含む薬剤であり、それは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写産物の標的化切断を仲介する。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知の方法を介してｍＲＮＡの配列特異的分解をもたらす。ｉＲＮＡは、例えば、細胞、例えば、哺乳動物対象のような対象内の細胞においてＡＧＴの発現を調節、例えば阻害する。
一態様において、本発明のＲＮＡｉ薬は、標的ＲＮＡの切断を行うために、標的ＲＮＡ配列と相互作用する一本鎖ＲＮＡ、例えば、ＡＧＴ標的ｍＲＮＡ配列を含む。理論はともかく、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解されると考えられている（Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485）。Ｄｉｃｅｒ（リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素）は、ｄｓＲＮＡを処理して、特徴的な２個の塩基の３’オーバーハングを有する１９－２３塩基対の短い干渉ＲＮＡとする（Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363）。その後、ｓｉＲＮＡは、１つまたはそれ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を解くＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309）。適当な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘導する（Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188）。従って、一面において、本発明は、細胞内で生成された一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関係し、それは、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進して、標的遺伝子、すなわちＡＧＴ遺伝子のサイレンシングを促進する。従って、用語“ｓｉＲＮＡ”はまた、本明細書中、上記のＲＮＡｉを意味するためにも使用される。
任意の態様において、ＲＮＡｉ薬は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または生物に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｉ）であり得る。一本鎖ＲＮＡｉ薬は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ、アルゴノート２に結合し、その後、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般的に、１５－３０ヌクレオチドであり、化学修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計および試験は、米国特許第８，１０１，３４８号およびLima et al., (2012) Cell 150:883-894（その内容全体は、引用により本明細書中に包含される）に記載されている。本明細書に記載のアンチセンスヌクレオチド配列のいずれかは、本明細書に記載のように、またはLima et al., (2012) Cell 150:883-894に記載の方法により化学修飾されて、一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用することができる。
別の態様において、本発明の組成物、使用および方法に使用するための“ｉＲＮＡ”は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書中、“二本鎖ＲＮＡｉ薬”、“二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子”、“ｄｓＲＮＡ薬”または“ｄｓＲＮＡ”と記載される。用語“ｄｓＲＮＡ”は、標的ＲＮＡ、すなわち、ＡＧＴ遺伝子に対して“センス”および“アンチセンス”配向を有すると言われる、２つの逆平行のかつ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を意味する。本発明のある態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書中、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと言われる、転写後の遺伝子サイレンシング機序を介して、標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの分解を誘発する。
一般的に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書に詳述するように、各鎖または両方の鎖は、１つまたはそれ以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。加えて、本明細書で用いるように、“ＲＮＡｉ薬”は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでよく、ＲＮＡｉ薬は、複数のヌクレオチドでの実質的な修飾を含んでいてよい。本明細書で用いる用語“修飾ヌクレオチド”は、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間結合、および／または修飾された核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。従って、修飾ヌクレオチドなる用語は、例えば、官能基もしくは原子、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基の、置換、付加または除去を含む。本発明の薬剤に使用するのに適する修飾には、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の全ての修飾のタイプが含まれる。ｓｉＲＮＡ型分子に使用されるかかる修飾は全て、本明細書および特許請求の範囲の目的に関して、“ＲＮＡｉ薬”に包含される。
ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであってよいが、本明細書に詳述するように、各鎖または両方の鎖は、１つまたはそれ以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。加えて、本明細書で用いるように、“ＲＮＡｉ薬”は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでよく、ＲＮＡｉ薬は、複数のヌクレオチドでの実質的な修飾を含んでいてよい。本明細書で用いる用語“修飾ヌクレオチド”は、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間結合、および／または修飾された核酸塩基を有するヌクレオチドを意味する。従って、修飾ヌクレオチドなる用語は、例えば、官能基もしくは原子、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基の、置換、付加または除去を含む。本発明の薬剤に使用するのに適する修飾には、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の全ての修飾のタイプが含まれる。ｓｉＲＮＡ型分子に使用されるかかる修飾は全て、本明細書および特許請求の範囲の目的に関して、“ＲＮＡｉ薬”に包含される。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介して所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであってよく、約９から３６塩基対の長さの範囲、例えば、約１５から３０塩基対の長さ、例えば、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６塩基対の長さ、例えば約１５－３０、１５－２９、１５－２８、１５－２７、１５－２６、１５－２５、１５－２４、１５－２３、１５－２２、１５－２１、１５－２０、１５－１９、１５－１８、１５－１７、１８－３０、１８－２９、１８－２８、１８－２７、１８－２６、１８－２５、１８－２４、１８－２３、１８－２２、１８－２１、１８－２０、１９－３０、１９－２９、１９－２８、１９－２７、１９－２６、１９－２５、１９－２４、１９－２３、１９－２２、１９－２１、１９－２０、２０－３０、２０－２９、２０－２８、２０－２７、２０－２６、２０－２５、２０－２４，２０－２３、２０－２２、２０－２１、２１－３０、２１－２９、２１－２８、２１－２７、２１－２６、２１－２５、２１－２４、２１－２３または２１－２２塩基対の長さの範囲であってよい。上記の範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であると考えられる。
二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であり得るか、またはそれらは、別個のＲＮＡ分子であり得る。２つの鎖が１つのより大きな分子の部分であり、従って、一方の鎖の３’末端と、二本鎖構造を形成する対応する他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されていない鎖により連結されているとき、連結ＲＮＡ鎖は、“ヘアピンループ”と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含んでいてよい。ある態様において、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含んでいてよい。
ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が別個のＲＮＡ分子からなる場合、それらの分子は必要ないが、共有結合的に連結され得る。該２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、二本鎖構造を形成する対応する他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されていない鎖以外の手段により共有結合的に結合されている場合、結合構造は、“リンカー”と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖におけるヌクレオチド数から二本鎖中に存在する任意のオーバーハングを減算したものである。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
任意の態様において、本発明のＲＮＡｉ薬はｄｓＲＮＡであり、その各鎖は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＡＧＴ遺伝子と相互作用する１９－２３ヌクレオチドを含み、理論はともかく、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485）。Ｄｉｃｅｒ（リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素）は、ｄｓＲＮＡを処理して、特徴的な２個の塩基の３’オーバーハングを有する１９－２３塩基対の短い干渉ＲＮＡとする（Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363）。その後、ｓｉＲＮＡは、１つまたはそれ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を解くＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309）。適当な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘導する（Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188）。
一態様において、本発明のＲＮＡｉ薬は、標的ＲＮＡ配列、例えばＡＧＴ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断をもたらす、２４－３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。理論はともかく、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485）。Ｄｉｃｅｒ（リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素）は、ｄｓＲＮＡを処理して、特徴的な２個の塩基の３’オーバーハングを有する１９－２３塩基対の短い干渉ＲＮＡとする（Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363）。その後、ｓｉＲＮＡは、１つまたはそれ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を解くＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309）。適当な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘導する（Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188）。
本明細書で用いる用語“ヌクレオチドオーバーハング”は、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを意味する。例えば、ｄｓＲＮＡの１つの鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びる、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含んでいてよい。あるいは、該オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチドまたはそれ以上を含んでいてよい。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドを含む、ヌクレオチド／ヌクレオシド類縁体を含んでいてよい。オーバーハング（複数可）は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその任意の組合せ上にあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチド（複数可）は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
一態様において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、例えば、３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。一態様において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、例えば、３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。任意の態様において、センス鎖またはアンチセンス鎖または双方の鎖上のオーバーハングは、１０ヌクレオチド以上の長さ、例えば、１－３０ヌクレオチド、２－３０ヌクレオチド、１０－３０ヌクレオチドまたは１０－１５ヌクレオチド長を含み得る。任意の態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上にある。任意の態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端に存在する。任意の態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端に存在する。任意の態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上に存在する。任意の態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端に存在する。任意の態様において、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端に存在する。任意の態様において、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
“平滑化された(Blunt)”または“平滑末端(blunt end)”は、二本鎖ＲＮＡｉ薬の末端に不対ヌクレオチドが存在しないこと、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。“平滑末端化された(blunt ended)”ＲＮＡｉ薬は、その全長に亘って二本鎖であるｄｓＲＮＡであって、すなわち、分子の何れかの末端にヌクレオチドオーバーハングがない。本発明のＲＮＡｉ薬には、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ薬（すなわち、一方の末端はオーバーハング、もう一方の末端は平滑である薬剤）または両方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ薬が含まれる。
用語“アンチセンス鎖”または“ガイド鎖”は、例えばＡＧＴｍＲＮＡなどの標的配列と実質的に相補的である領域を含む、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの鎖を意味する。本明細書で用いる用語“相補性の領域”は、標的配列、本明細書で定義する通り、例えばＡＧＴヌクレオチド配列などの標的配列などの配列と実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を意味する。相補性の領域が標的配列に完全に相補的でない場合、分子の内部または末端領域にミスマッチがあり得る。一般的に、最も耐容されるミスマッチは、例えばｉＲＮＡの５’末端および／または３’末端の５、４、３または２ヌクレオチド内などの末端領域にある。
本明細書で用いる用語“センス鎖”または“パッセンジャー鎖”は、該用語が本明細書で定義される通り、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ鎖を意味する。
本明細書で用いる用語“切断領域”は、切断部位にすぐ隣接して配置されている領域を意味する。切断部位とは、切断が起こる標的上の部位である。ある態様において、切断領域は、切断部位の一方の末端で、切断部位にすぐ隣接する３塩基を含む。ある態様において、切断領域は、切断部位の一方の末端で、切断部位にすぐ隣接する２塩基を含む。ある態様において、切断部位は、具体的には、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合される部位に生じ、切断領域はヌクレオチド１１、１２および１３を含む。
本明細書で用いる用語“相補的”は、他に別の記載がされない限り、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解され得るように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を形成する能力を意味する。そのような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であってよく、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２－１６時間、その後、洗浄することが含まれ得る（例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと）。生物内で生じ得る生理的条件などのその他の条件が、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件の組み合わせを決定することができる。
例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補配列は、一方または両方のヌクレオチド配列全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書で互いに“完全に相補的”と称され得る。しかしながら、本明細書中、第１の配列が第２の配列に関して“実質的に相補的”と言われる場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは３０塩基対までの二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、例えばＲＩＳＣ経路を介する遺伝子発現の阻害などのそれらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、１つまたは複数であるが、一般的に５、４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、ハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドが設計される場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含み、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的では、なおも“完全に相補的”と記載され得る。
本明細書で用いる“相補的”配列は、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン－クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン－クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されない。
本明細書中、用語“相補的”、“完全に相補的”および“実質的に相補的”は、それらが使用される文脈から理解され得るように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の、またはｉＲＮＡ薬のアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに関して使用され得る
本明細書で用いるように、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の“少なくとも一部に実質的に相補的”なポリヌクレオチドとは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡ）の連続部分と実質的に相補的なポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、該配列が、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的であれば、ＡＧＴ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
従って、ある態様において、本明細書に記載のアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＡＧＴ配列に完全に相補的である。他の態様において、本明細書に記載のアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＡＧＴ配列と実質的に相補的であり、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１のフラグメントに等価な領域に、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば約８５％、約９０％、または約９５％相補的な、連続ヌクレオチド配列を含む。
一態様において、本発明のＲＮＡｉ薬は、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドと実質的に相補的なセンス鎖を含み、そして標的ＡＧＴ配列に相補的であり、センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２のフラグメントに等価な領域に、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的な、例えば約８５％、約９０％、または約９５％相補的な、連続ヌクレオチド配列を含む。
一般的に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載されるように、一方または両方の鎖は、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドなどの１つまたは複数の非リボヌクレオチドも含んでいてよい。さらに、“ｉＲＮＡ”としては、化学修飾を有するリボヌクレオチドが含まれる。このような修飾としては、本明細書に記載され、または当該技術分野で公知の、全てのタイプの修飾が含まれ得る。ｉＲＮＡ分子において使用される、任意のこのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的に関し“ｉＲＮＡ”に包含される。
本発明の一面において、本発明の方法および組成物に使用するための薬剤は、アンチセンス阻害機序により標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに対する塩基対形成により化学量論的な方法で、および物理的に翻訳機構を妨害して、翻訳を阻害し得る（Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355を参照のこと）。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１５から約３０ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な配列を有していてよい。例えば、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、本明細書に記載のアンチセンス配列のいずれか１つから少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上連続するヌクレオチドである配列を含んでいてよい。
本明細書で用いる用語“阻害する”は、“低下する”、“サイレンシング”、“下方制御”、“抑制”、およびその他の同様の用語と互換的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。
本明細書で用いる語句“ＡＧＴの発現を阻害する”には、任意のＡＧＴ遺伝子（例えば、マウスＡＧＴ遺伝子、ラットＡＧＴ遺伝子、サルＡＧＴ遺伝子、またはヒトＡＧＴ遺伝子）、ならびにＡＧＴタンパク質をコードするＡＧＴ遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害が含まれる。
“ＡＧＴ遺伝子の発現の阻害”には、少なくとも約２０％の阻害などのＡＧＴ遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制などＡＧＴ遺伝子の任意のレベルの阻害が含まれる。任意の態様において、阻害は、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の阻害である。
ＡＧＴ遺伝子の発現は、例えば、ＡＧＴ ｍＲＮＡレベルまたはＡＧＴタンパク質レベルなどの、ＡＧＴ遺伝子発現に関連する任意の可変レベルに基づいて評価され得る。阻害は、対照レベルと比較した、これらの変数の１つまたは複数の絶対または相対レベルの低下によって評価され得る。対照レベルは、例えば投与前ベースラインレベル、または未処置のもしくは対照（例えば、緩衝液のみの対照または非活性薬剤対照など）で処置された同様の対象、細胞またはサンプルから測定されたレベルなどの、当該技術分野で利用される任意のタイプの対照レベルであってもよい。
一態様において、ＡＧＴ遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制は、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、そこでＡＧＴ遺伝子が転写され、ＡＧＴ遺伝子の発現が阻害されるように処理されている、第１の細胞または細胞群から単離され、またはその中に検出され得る、ＡＧＴ ｍＲＮＡの量の低下によって評価される。阻害の程度は、以下を用いて表され得る。
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本明細書で用いる語句、ｄｓＲＮＡなどの“ＲＮＡｉ薬に細胞を接触させる”には、あらゆる可能な手段によって細胞を接触させることが含まれる。ＲＮＡｉ薬に細胞を接触させることは、インビトロで細胞をｉＲＮＡと接触させる、またはインビボで細胞をｉＲＮＡと接触させることを含む。接触は、直接または間接的に行われ得る。従って、例えば、方法を実施する個人が、ＲＮＡｉ薬を細胞と物理的に接触させてもよく、あるいは、後に細胞との接触が可能になるか、または引き起こされる状況に、ＲＮＡｉ薬を置いてもよい。
インビトロでの細胞の接触は、例えば細胞をＲＮＡｉ薬と共にインキュベートして実施してもよい。インビボでの細胞の接触は、例えば細胞が位置する組織内にまたはその近辺にＲＮＡｉ薬を注射して実施してもよく、または例えば、後に接触させる細胞が位置する組織にＲＮＡｉ薬が到達するように、血流または皮下空隙などの別の領域に該薬剤を注射して実施してもよい。例えばＲＮＡｉ薬は、例えば肝臓などの目的の部位にＲＮＡｉ薬を誘導するＧａｌＮＡｃ３などのリガンドを含有し、および／またはそれと共役していてもよい。インビトロおよびインビボでの接触法の組み合わせもまた、可能である。例えば、細胞をインビトロでＲＮＡｉ薬と接触させて、その後対象に移植してもよい。
一態様において、細胞をｉＲＮＡと接触させることは、細胞内への取り込みまたは吸収を容易にし、またはそれを可能にすることで、“ｉＲＮＡを導入する”または“ｉＲＮＡを細胞に送達する”ことを含む。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、助力を受けない拡散または能動的細胞過程を通じて、または助剤もしくは装置によって生じ得る。ｉＲＮＡの細胞内への導入は、インビトロおよび／またはインビボであり得る。例えば、インビボ導入のために、ｉＲＮＡを組織部位に注射し、または全身投与し得る。インビボ送達はまた、米国特許第５，０３２，４０１号および同第５，６０７，６７７号および米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号（それらの内容全体は、引用により本明細書中に包含される）に記載されるようなβ－グルカン送達系によって実施され得る。細胞へのインビトロ導入としては、電気穿孔およびリポフェクションなどの当該技術分野で公知の方法が含まれる。さらなる方法は、本明細書で以下に記載され、および／または当該技術分野で公知である。
用語“脂質ナノ粒子”または“ＬＮＰ”は、例えばｉＲＮＡまたはｉＲＮＡがそれから転写されるプラスミドなどの核酸分子のような薬学的に活性な分子を封入する脂質層を含むビークルである。ＬＮＰは、例えば、米国特許第６，８５８，２２５号、同第６，８１５，４３２号、同第８，１５８，６０１号、および同第８，０５８，０６９号（その内容全体は、引用により本明細書中に包含される）に記載されている。
本明細書で用いる“対象”は、霊長動物（ヒト、非ヒト霊長動物、例えばサルおよびチンパンジーなど）、非霊長動物（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラなど）を含む哺乳類、または鳥類（例えばアヒルまたはガチョウ）などの動物である。一態様では、対象は、ＡＧＴ発現低下により利益を受ける、疾患、障害または病状を処置され、またはそれを評価されるヒト；ＡＧＴ発現低下により利益を受ける、疾患、障害または病状のリスクがあるヒト；ＡＧＴ発現低下により利益を受ける、疾患、障害または病状を有するヒト；および／または、本明細書に記載されるようにＡＧＴ発現低下により利益を受ける、疾患、障害または病状を処置されるヒトなどのヒトである。
本明細書で用いる用語“処置する”または“処置”は、検出可能または検出不可能を問わない、望ましくないＡＧＴ発現と関連する１つまたは複数の症状、例えば、アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体活性化（ＡＴ１Ｒ）（例えば、高血圧、慢性腎臓病、卒中、心筋梗塞、心不全、動脈瘤、末梢動脈疾患、心疾患、増加した酸化ストレス、例えば、増加したスーパーオキシドの生成、炎症、血管収縮、ナトリウムおよび水の貯留、カリウムおよびマグネシウム欠乏、レニン分泌抑制（renin suppression）、筋肥大および平滑筋肥大、増加したコラーゲン合成、血管の刺激、心筋および腎線維症、心臓の増加した収縮速度および収縮力、変更された心拍数、例えば、増加した不整脈、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ１）の刺激、交感神経系の活性化、および増加したエンドセリン分泌）、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）または胎児発育不全を含むが、これに限定されない、妊娠関連高血圧の症状（例えば、子癇前症および子癇）、悪性高血圧と関係する症状、高アルドステロン症に関連する症状の緩和または改善；望ましくないＡＴ１Ｒ活性化の程度の低下；慢性ＡＴ１Ｒ活性化の状態の安定化（すなわち、悪化しない）；望ましくないＡＴ１Ｒ活性化の改善または緩和（例えば、高血圧、慢性腎臓病、卒中、心筋梗塞、心不全、動脈瘤、末梢動脈疾患、心疾患、増加した酸化ストレス、例えば、増加したスーパーオキシド生成、炎症、血管収縮、ナトリウムおよび水の貯留、カリウムおよびマグネシウム欠乏、レニン分泌抑制、筋肥大および平滑筋肥大、増加したコラーゲン合成、血管の刺激、心筋および腎線維症、心臓の増加した収縮速度および収縮力、変更された心拍数、例えば、増加した不整脈、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ１）の刺激、交感神経系の活性化、および増加したエンドセリン分泌）を含むが、これに限定されるものではない、有益なまたは所望の結果を意味する。“処置”はまた、未処置での予測される生存期間と比較した生存期間の長期化も意味し得る。
用語“より低い”とは、対象におけるＡＧＴレベルまたは疾患マーカーおよび症状の文脈で、そのようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上であり得て、好ましくは、かかる障害がない個体の正常範囲内にあると認められたレベルに低下する。
本明細書で用いる“予防”または“予防する”は、ＡＧＴ遺伝子の発現低下から利益を受ける、疾患、障害またはその病状に関して使用されるとき、対象が、例えば高血圧、慢性腎臓病、卒中、心筋梗塞、心不全、動脈瘤、末梢動脈疾患、心疾患、増加した酸化ストレス、例えば、増加したスーパーオキシドの生成、炎症、血管収縮、ナトリウムおよび水の貯留、カリウムおよびマグネシウム欠乏、レニン分泌抑制（renin suppression）、筋肥大および平滑筋肥大、増加したコラーゲン合成、血管の刺激、心筋および腎線維症、心臓の増加した収縮速度および収縮力、変更された心拍数、例えば、増加した不整脈、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ１）の刺激、交感神経系の活性化、および増加したエンドセリン分泌のような望ましくないＡＴ１Ｒ活性化の症状などの、このような疾患、障害または病状に関連する症状を発症する可能性の低下を意味する。例えば、高血圧を発症する可能性は、例えば、１つまたは複数の高血圧危険因子を有する個体が高血圧を発症しない場合に、または同一危険因子を有して本明細書に記載される処置を受けない集団と比較して重症度のより低い高血圧を発症する場合に、低下される。疾患、障害または病状を発症しないこと、またはこのような疾患、障害または病状に関連する症状の発症の低下（例えば、その疾患または障害の臨床的に認められた尺度で少なくとも約１０％の低下）、または遅延した症状呈示（例えば、数日間、数週間、数ヶ月または数年間）が、効果的予防と考えられる。
本明細書で用いる用語“アンジオテンシノーゲン関連疾患”または“ＡＧＴ関連疾患”は、レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系（ＲＡＡＳ）の活性化により引き起こされるか、またはそれと関連する疾患または障害、またはＲＡＡＳ活性化に応答するか、それにより進行する疾患、障害または症状である。用語“アンジオテンシノーゲン関連疾患”には、ＡＧＴ発現低下により利益を受ける疾患、障害または病状が含まれる。そのような疾患は、一般的に、高血圧と関連している。アンジオテンシノーゲン関連疾患の非限定的な例には、高血圧、例えば、境界域高血圧（高血圧前症としても公知）、原発性高血圧（本態性高血圧または特発性高血圧としても公知）、二次性高血圧（非本態性高血圧としても公知）、高血圧緊急症（悪性高血圧としても公知）、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧（例えば、子癇前症、子癇および出産後の子癇前症）、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧（腎性高血圧としても公知）、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害（末梢血管疾患を含む）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心室線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、レニン腫症候群（reninoma）、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺／副甲状腺疾患、心不全（例えば、左心室収縮機能障害）、心筋梗塞、狭心症、卒中、真性糖尿病（例えば、糖尿病性腎症）、腎疾患、例えば、要すれば妊娠に関連する慢性腎臓病または糖尿病性腎症、腎不全、例えば、慢性腎不全、認知機能障害（例えば、アルツハイマー）、および全身性硬化症（例えば、強皮症腎クリーゼ）が含まれる。任意の態様において、ＡＧＴ関連疾患には、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）または胎児発育不全が含まれる。
２回以上の来院中に好適に測定される着座血圧測定値の平均に基づいて、正常血圧を有する対象は、約９０－１１９ｍｍＨｇ（約１２－１５．９ｋＰａ（ｋＮ／ｍ２））の収縮期血圧および約６０－７９ｍｍＨｇ（約８．０－１０．５ｋＰａ（ｋＮ／ｍ２））の拡張期血圧を有する者であり、高血圧前症を有する対象は、約１２０－１３９ｍｍＨｇ（約１６．１－１８．５ｋＰａ（ｋＮ／ｍ２））の収縮期血圧および約６０－７９ｍｍＨｇ（約８．０－１０．５ｋＰａ（ｋＮ／ｍ２））の拡張期血圧を有する者であり、高血圧（例えば、ステージＩの高血圧）を有する対象は、約１４０－１５９ｍｍＨｇ（約１８．７－２１．２ｋＰａ（ｋＮ／ｍ２））の収縮期血圧および約９０－９９ｍｍＨｇ（約１２．０－１３．２ｋＰａ（ｋＮ／ｍ２））の拡張期血圧を有する者であり、そして高血圧（例えば、ステージＩＩの高血圧）を有する対象は、約≧１６０ｍｍＨｇ（約≧２１．３ｋＰａ（ｋＮ／ｍ２））の収縮期血圧および約≧１００ｍｍＨｇ（約≧１３．３ｋＰａ（ｋＮ／ｍ２））の拡張期血圧を有する者である。１型または２型糖尿病または腎疾患と共に１３０／８０ｍｍＨｇ以上の血圧を有する対象は、高血圧を有すると考えられる。
一態様において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は原発性高血圧である。“原発性高血圧”は、環境および遺伝子的原因の結果（例えば、明らかな基礎疾患原因のない結果）である。
一態様において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は二次性高血圧である。“二次性高血圧”は、腎臓、血管および内分泌原因、例えば、実質性腎疾患（例えば、多嚢胞性腎、糸球体または間質性疾患）、腎血管疾患（例えば、腎動脈狭窄、線維筋性異形成）、内分泌障害（例えば、副腎皮質ステロイドまたはミネラルコルチコイド過剰、褐色細胞腫、甲状腺機能亢進症または甲状腺機能低下症、成長ホルモン過剰、副甲状腺機能亢進症）、大動脈狭窄症、または経口避妊薬の使用を含む複数の病因であり得る、識別可能な基礎疾患を有している。
一態様において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は高血圧緊急症であり、例えば、悪性高血圧および進行性高血圧である。“進行性高血圧”は、１またはそれ以上の末端臓器への直接的な損傷を含む重度の血圧の上昇（すなわち、収縮期１８０ｍｍＨｇまたは拡張期１１０ｍｍＨｇと同じか、またはそれ以上）である。血圧は、さらなる臓器の損傷を防ぐために直ぐに下げられなければならない。“悪性高血圧”は、１またはそれ以上の末端臓器および乳頭浮腫への直接的な損傷を含む重度の血圧の上昇（すなわち、収縮期１８０ｍｍＨｇまたは拡張期１１０ｍｍＨｇと同じか、またはそれ以上）である。血圧は、さらなる臓器の損傷を防ぐために直ぐに下げられなければならない。制御されない血圧に起因する神経末端器官の損傷は、高血圧性脳症、脳血管障害／脳梗塞；くも膜下出血、および／または頭蓋内出血を含み得る。心血管末端器官の損傷は、心筋虚血／梗塞、急性左室機能不全、急性肺浮腫、および／または大動脈解離を含み得る。他の器官系もまた、急性腎不全／機能不全、網膜症、子癇、または微小血管症性溶血性貧血につながり得る、制御されない高血圧の影響を受け得る。
一態様において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は高血圧急迫症である。“高血圧急迫症”は、１または複数の器官への直接的損傷のない、重度の血圧の上昇（すなわち、収縮期１８０ｍｍＨｇまたは拡張期１１０ｍｍＨｇと同じか、またはそれ以上）である。血圧は、数時間以内に安全に下げられる。
一態様において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は、妊娠関連高血圧、例えば、妊娠性慢性高血圧、妊娠高血圧症、子癇前症、子癇、慢性高血圧に加えて子癇前症、ＨＥＬＬＰ症候群、および妊娠性高血圧（妊娠の一過性高血圧、妊娠の後半で識別された慢性高血圧ｔ、および妊娠高血圧症候群（ＰＩＨ）としても公知）である。“妊娠性慢性高血圧”を有する対象は、妊娠前または妊娠２０週より前に１４０／９０ｍｍＨｇを超える血圧を有する者である。“妊娠高血圧症”または“妊娠高血圧症候群”は、子癇前症の他の特徴なしに妊娠後期（＞妊娠２０週）に発症する高血圧と、その後の出産後の血圧の正常化を意味する。“軽度の子癇前症”は、妊娠２０週前に正常血圧であった女性における、末端器官損傷の形跡なしに、少なくとも６時間の間隔で、２回起こる高血圧（血圧≧１４０／９０ｍｍＨｇ）の存在として定義される。本態性高血圧の既往歴を有する対象において、子癇前症は、収縮期血圧が３０ｍｍＨｇ増加するか、または拡張期血圧が１５ｍｍＨｇ増加した場合に、診断される。“重度の子癇前症”は、子癇前症の存在下で以下の症状または兆候の１つの存在として定義される；少なくとも６時間の間隔で２回起こる、１６０ｍｍＨｇもしくはそれ以上の収縮期血圧、または１１０ｍｍＨｇもしくはそれ以上の拡張期血圧；２４時間収集で５ｇ以上の尿タンパクまたは少なくとも４時間の間隔で収集した２つの無作為の尿サンプルにおける３＋以上、肺浮腫もしくはチアノーゼ、尿量減少（２４時間で＜４００ｍＬ）、永続的な頭痛、心窩部痛および／または肝機能障害、血小板減少症、羊水過少、胎児発育不全ｈ、または胎盤早期剥離。“子癇”は、子癇前症の女性における他の原因に起因し得ない発作のように定義される。“ＨＥＬＬＰ症候群”（浮腫－タンパク尿－Ｂ型妊娠高血圧症としても公知）は、妊娠した対象における、溶血、肝酵素の上昇、および低血小板レベルである。
一態様において、アンジオテンシノーゲン関連疾患は治療抵抗性高血圧である。“抵抗性高血圧”は、そのうちの１つがチアジド利尿剤である異なるクラスの３つの降圧剤の同時使用にもかかわらず、目標（例えば、１４０／９０ｍｍＨｇ）を超えたままの血圧である。血圧が４種またはそれ以上の薬剤を用いて制御されている対象も、治療抵抗性高血圧を有すると考えられる。
本明細書で用いる“治療的有効量”は、アンジオテンシノーゲン関連疾患を有する対象に投与されると、（例えば、既存の疾患の、または１つまたは複数の疾患症状の低減、寛解または維持によって）疾患の治療をもたらすのに十分なＲＮＡｉ薬の量を含むことが意図される。“治療的有効量”は、ＲＮＡｉ薬、薬剤投与方法、疾患とその重症度、および治療される対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的体質、先行するまたは併用の治療薬の種類、もしあれば、その他の個人的特性に応じて変動してもよい。
本明細書で用いる“予防的有効量”は、アンジオテンシノーゲン関連疾患を有する対象に投与されると、アンジオテンシノーゲン関連疾患、病気にかかりやすい対象、すなわち、１つまたはそれ以上の要因、例えば年齢、体重、妊娠により一般集団に比べて疾患により罹患しやすい対象における、疾患または該疾患の１もしくはそれ以上の症状の余郷または改善をもたらすのに十分なｉＲＮＡの量を含むことが意図される。疾患の改善には、疾患の経過の遅延またはより遅く発症した疾患の重症度の低下が含まれる。“予防的有効量”は、ｉＲＮＡ、薬剤投与方法、疾患リスクの程度、および治療される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的体質、先行するまたは併用の治療薬の種類、もしあれば、その他の個人的特性に応じて変動してもよい。
“治療的有効量”または“予防的有効量”にはまた、あらゆる治療薬に当てはまる妥当な利点／リスク比で、いくつかの所望の局所性または全身性効果を生じる、ＲＮＡｉ薬の量も含まれる。本発明の方法で用いられるｉＲＮＡは、このような治療に当てはまる妥当な利点／リスク比を生じるのに十分な量で、投与されてもよい
語句“薬学的に許容される”は、本明細書中、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答がなく、またはその他の問題もしくは合併症が、妥当な利点／リスク比で釣り合う、ヒト対象および動物対象の組織との接触で使用するのに適する、化合物、材料、組成物、および／または剤形を意味するために用いられる。
本明細書で用いる語句“薬学的に許容される担体”は、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、滑石マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）など）、または目的化合物を１つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分に運搬または輸送するのに関与する溶媒封入材料などの、薬理的に許容される材料、組成物またはビークルを意味する。各担体は、製剤のその他の成分と適合し、処置される対象に有害でないと言う意味で、“許容される”はずである。薬学的に許容される担体として作用し得る材料のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースとその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどの平滑剤；（８）カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーンオイルおよび大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびエチルラウレートなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質非含有水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ、およびＬＤＬなどの血清成分；および（２２）医薬製剤で用いられるその他の無毒の適合性物質が含まれる。
本明細書で用いる用語“サンプル”は、対象から単離された同様の体液、細胞または組織の採取物、ならびに対象内に存在する体液、細胞、または組織を含む。生体液の例としては、血液、血清および漿液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織サンプルとしては、組織、臓器または局在性領域からのサンプルが挙げられる。例えば、サンプルは、特定の臓器、臓器の部分もしくは体液またはこれらの臓器内の細胞に由来してもよい。任意の態様において、サンプルは、肝臓（例えば、肝臓全体または肝臓の特定部分、または例えば肝細胞などの肝臓の特定タイプの細胞）に由来してもよい。ある態様において、“対象に由来するサンプル”は、対象から採取された血液または血漿を意味する。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、ＡＧＴ遺伝子発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。一態様において、ｉＲＮＡ薬は、アンジオテンシノーゲン関連疾患、例えば、高血圧を有するヒトのような、哺乳動物などの対象内の細胞などの細胞内で、ＡＧＴ遺伝子発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＡＧＴ遺伝子発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約３０ヌクレオチド以下の長さ（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９または１８ヌクレオチド以下の長さ）である。ＡＧＴ遺伝子を発現する細胞との接触に際して、ｉＲＮＡは、ＡＧＴ遺伝子（例えばヒト、霊長動物、非霊長動物、または鳥類のＡＧＴ遺伝子）の発現を、例えばＰＣＲまたは分枝状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法による、または例えばウェスタンブロッティングまたはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などのタンパク質ベースの方法によるアッセイで、少なくとも約１０％阻害する。
ｄｓＲＮＡは、相補的な２本のＲＮＡ鎖を含み、それらはｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、ＡＧＴ遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、好適な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補性配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補性領域としても含有され得る。
一般的に、二本鎖構造は、１５から３０塩基対の長さ、例えば、１５－２９、１５－２８、１５－２７、１５－２６、１５－２５、１５－２４、１５－２３、１５－２２、１５－２１、１５－２０、１５－１９、１５－１８、１５－１７、１８－３０、１８－２９、１８－２８、１８－２７、１８－２６、１８－２５、１８－２４、１８－２３、１８－２２、１８－２１、１８－２０、１９－３０、１９－２９、１９－２８、１９－２７、１９－２６、１９－２５、１９－２４、１９－２３、１９－２２、１９－２１、１９－２０、２０－３０、２０－２９、２０－２８、２０－２７、２０－２６、２０－２５、２０－２４，２０－２３、２０－２２、２０－２１、２１－３０、２１－２９、２１－２８、２１－２７、２１－２６、２１－２５、２１－２４、２１－２３または２１－２２塩基対の長さである。上記の範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
同様に、標的配列に相補的な領域は、１５から３０ヌクレオチド長、例えば、１５－２９、１５－２８、１５－２７、１５－２６、１５－２５、１５－２４、１５－２３、１５－２２、１５－２１、１５－２０、１５－１９、１５－１８、１５－１７、１８－３０、１８－２９、１８－２８、１８－２７、１８－２６、１８－２５、１８－２４、１８－２３、１８－２２、１８－２１、１８－２０、１９－３０、１９－２９、１９－２８、１９－２７、１９－２６、１９－２５、１９－２４、１９－２３、１９－２２、１９－２１、１９－２０、２０－３０、２０－２９、２０－２８、２０－２７、２０－２６、２０－２５、２０－２４，２０－２３、２０－２２、２０－２１、２１－３０、２１－２９、２１－２８、２１－２７、２１－２６、２１－２５、２１－２４、２１－２３または２１－２２ヌクレオチド長である。上記の範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
ある態様において、ｄｓＲＮＡは、約１５から約２０ヌクレオチド長、約２５から約３０ヌクレオチド長、または約１５から約２３ヌクレオチド長である。一般的に、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素の基質として作用するのに十分な長さである。例えば、約２１～２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡが、Ｄｉｃｅの基質として作用し得ることは、当該技術分野で周知である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大きなＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の“部分”は、ＲＮＡｉ指向性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を介した切断）の基質となるのに十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。
当業者は、例えば、約９から３６塩基対の二本鎖領域、例えば、約１０－３６、１１－３６、１２－３６、１３－３６、１４－３６、１５－３６、９－３５、１０－３５、１１－３５、１２－３５、１３－３５、１４－３５、１５－３５、９－３４、１０－３４、１１－３４、１２－３４、１３－３４、１４－３４、１５－３４、９－３３、１０－３３、１１－３３、１２－３３、１３－３３、１４－３３、１５－３３、９－３２、１０－３２、１１－３２、１２－３２、１３－３２、１４－３２、１５－３２、９－３１、１０－３１、１１－３１、１２－３１、１３－３２、１４－３１、１５－３１、１５－３０、１５－２９、１５－２８、１５－２７、１５－２６、１５－２５、１５－２４、１５－２３、１５－２２、１５－２１、１５－２０、１５－１９、１５－１８、１５－１７、１８－３０、１８－２９、１８－２８、１８－２７、１８－２６、１８－２５、１８－２４、１８－２３、１８－２２、１８－２１、１８－２０、１９－３０、１９－２９、１９－２８、１９－２７、１９－２６、１９－２５、１９－２４、１９－２３、１９－２２、１９－２１、１９－２０、２０－３０、２０－２９、２０－２８、２０－２７、２０－２６、２０－２５、２０－２４，２０－２３、２０－２２、２０－２１、２１－３０、２１－２９、２１－２８、２１－２７、２１－２６、２１－２５、２１－２４、２１－２３、または２１－２２塩基対の二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要機能部分であることもまた認識する。従って、一態様において、それが例えば、所望のＲＮＡを切断に標的化する１５～３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる範囲内で、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。従って、当業者は、一態様において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識し得る。別の態様において、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡでない。別の態様において、ＡＧＴ発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ薬は、より大きなｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で産生されない。
本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、例えば１、２、３、または４ヌクレオチドなどの１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端相当物と比較して、予期しない優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドを含む、ヌクレオチド／ヌクレオシド類縁体を含み得るか、またはそれからなる。オーバーハング(複数可)は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその任意の組合せ上にあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチド(複数可)は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。本明細書に記載のように、最大３０ヌクレオチド長まで伸長したオーバーハングもまた、本発明の種々の態様において意図される。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察されるように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ(登録商標)，Ｉｎｃ．から市販されるものなどの自動化ＤＮＡ合成機を使用して、当該技術分野で公知の標準法によって合成され得る。
本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階法を使用して調製されてもよい。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖を、別々に調製する。次に、各鎖をアニーリングする。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖を、溶液相もしくは固相有機合成または両方を使用して調製することができる。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製し得る利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相もしくは固相有機合成または両方を使用して調製することができる。
一面において、本発明のｄｓＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列の少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。センス鎖は、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つで提供される配列群から選択され、センス鎖に対応するアンチセンス鎖は、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つの配列群から選択される。この面では、２配列の一方は２配列の他方に相補的であり、配列の１つは、ＡＧＴ遺伝子発現中に生じるｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。従って、この面では、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、１つのオリゴヌクレオチドは、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つのセンス鎖として説明され、第２のオリゴヌクレオチドは、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つのセンス鎖に対応するアンチセンス鎖として説明される。一態様において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチド上に含まれる。別の態様において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、単一オリゴヌクレオチド上に含まれる。
表３、４、７、８、１１、１３および１５の配列の一部は、修飾および／または共役配列と説明されるが、例えば、本発明のｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未修飾、非共役、および／または本明細書に記載のものとは異なって修飾され、および／または共役している、表３、４、７、８、１１、１３および１５に記載される配列のいずれか１つを含んでいてよいものと理解される。
別の面において、アンジオテンシノーゲンの発現を阻害するための本発明の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり、ここで、センス鎖は、表３、４、７、８、１１、１３および１５のセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、表３、４、７、８、１１、１３および１５の対応するアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む。
当業者は、例えば２１塩基対などの約２０～２３塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888）。しかしながら、他の当業者らは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造もまた、同様に効果的であり得ることを見出している（Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226）。上記の態様では、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つで提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最小で２１ヌクレオチド長の少なくとも１つの鎖を含み得る。片方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが欠失している、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つの配列の１つを有するより短い二本鎖が、上記の通り、ｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。従って、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つの配列の１つに由来する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連続ヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡであって、ＡＧＴ遺伝子発現を阻害する能力が、完全長配列を含むｄｓＲＮＡと、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下異なるｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが意図される。
さらに、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つで提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ介在切断に対する感受性が高いＡＧＴ転写物中の部位(複数可)を同定する。従って、本発明は、ｉＲＮＡこれらの部位の１つの内部を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書で用いるｉＲＮＡは、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＡＧＴ遺伝子中の選択配列に隣接する領域からのさらなるヌクレオチド配列と連結する、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つで提供される配列の１つからの約１５の連続ヌクレオチドを含む。
標的配列は、一般的に、約１５～３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所定の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書に記載の種々のソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所定の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所定のサイズの“ウィンドウ”または“マスク”（非限定的例として、２１ヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えば、コンピュータ上を含む）配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、実験的アプローチもまた取り得る。配列“ウィンドウ”を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に移動することで、選択された任意の所定の標的サイズについて完全な可能な配列セットが同定されるまで、次の可能性のある標的配列が同定され得る。このプロセスは、同定された配列の体系的合成、および（本明細書に記載されアッセイ法または当該技術分野で公知のアッセイ法を用いる）至適に機能する配列を同定する試験と相まって、ｉＲＮＡ薬で標的化した場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を介するＲＮＡ配列を同定し得る。従って、例えば表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つ中で同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所定の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、漸進的に“ウィンドウを移動させる”ことにより、同等またはより良好な阻害特性を有する配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。
さらに、ヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡの上流または下流に、よりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを移動させることで、これらの作成された配列を試験することにより、例えば表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つ中で同定される、任意の配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合も、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加または変更、または当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載のその他の修飾によって、発現阻害剤として分子をさらに最適化すること（例えば、血清安定性または循環半減期の増大、熱安定性の増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増大、エンドソームからの放出増大など）で、このような最適化配列を調節し得る。
本明細書に記載のｉＲＮＡは、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一態様において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばＡＧＴ遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドのｉＲＮＡ薬の鎖は、一般的に、中心の１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載の方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＡＧＴ遺伝子の発現阻害に効果があるかどうかを決定することができる。ＡＧＴ遺伝子の発現阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの有効性の検討は、とりわけＡＧＴ遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に、重要である。
ＩＩＩ．本発明の修飾ｉＲＮＡ
一態様において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、未変性であり、例えば当技術分野で公知であり本明細書に記載される、化学修飾および／または結合を含まない。別の態様において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本発明の任意の態様において、本発明のｉＲＮＡの実質的に全てのヌクレオチドは修飾されている。本発明の他の態様において、本発明のｉＲＮＡの全てのヌクレオチドは、本発明の修飾ｉＲＮＡであり、“実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている”は、大部分であるが、完全に修飾されておらず、５、４、３、２または１以下の未修飾ヌクレオチドを含み得る。
本発明で特記する核酸は、“Current protocols in nucleic Acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, NY, USA（引用により本明細書中に包含される）に記載されるものなどの、当該術分野で確立された方法によって合成および／または修飾され得る。修飾には、例えば、５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）または３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；例えば、安定化塩基での、不安定化塩基での、またはパートナーの伸長レパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；糖修飾（例えば２’位または４’位における）または糖置換；および／または、リン酸ジエステル結合の修飾または置換を含む、主鎖修飾が含まれる。本明細書に記載される態様で有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾された主鎖を含むＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾された主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると考えられる。ある態様において、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有し得る。
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含むホスホラミデート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’－５’結合、それらの２’－５’連結類縁体を有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸形態もまた包含される。
上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９５号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３１６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；同第６，０２８，１８８号；同第６，１２４，４４５号；同第６，１６０，１０９号；同第６，１６９，１７０号；同第６，１７２，２０９号；同第６、２３９，２６５号；同第６，２７７，６０３号；同第６，３２６，１９９号；同第６，３４６，６１４号；同第６，４４４，４２３号；同第６，５３１，５９０号；同第６，５３４，６３９号；同第６，６０８，０３５号；同第６，６８３，１６７号；同第６，８５８，７１５号；同第６，８６７，２９４号；同第６，８７８，８０５号；同第７，０１５，３１５号；同第７，０４１，８１６号；同第７，２７３，９３３号；同第７，３２１，０２９号；および米国特許ＲＥ３９４６４（それらの内容全体は、引用により本明細書中に包含される）が挙げられるが、これらに限定されない。
リン原子を含まない修飾されたＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらには、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を混合して有するその他のものが含まれる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および、同第５，６７７，４３９号（それらの内容全体は、引用により本明細書中に包含される）が挙げられるが、これらに限定されない。
他の態様において、好適なＲＮＡ模倣体は、ｉＲＮＡでの使用が検討され、そこで、糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しい基に置換されている。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する、代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号（それらの内容全体は、引用により本明細書中に包含される）が挙げられるが、これに限定されない。さらに本発明のｉＲＮＡ中で使用するのに適するＰＮＡ化合物は、例えばNielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に記載される。
本発明で記載のいくつかの態様は、ホスホロチオエート主鎖を有するＲＮＡ、および特に、上記の米国特許第５，４８９，６７７号の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主査として公知］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［式中、転園ホスホジエステル主鎖は、－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］であるヘテロ原子主鎖を有する、および上記の米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖を有する、オリゴヌクレオシドを含む。ある態様において、本明細書に記載のＲＮＡは、上記の米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書に記載のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの１つを含み得て、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、またはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２、（式中、ｎおよびｍは１から約１０である）が挙げられる。他の態様において、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基(cleaving group)、レポーター基、インターカレーター、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。ある態様において、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）、すなわちアルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’－ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および、２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２を含む。さらなる例示的修飾には、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド、（これらの３つのファミリーのＲおよびＳ異性体の両方）；２’－アルコキシアルキル；および、２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が含まれる。
他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が含まれる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも可能である。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号（特定のものは本出願と発明者が共通である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体は、引用により本明細書に包含される。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当技術分野では単に“塩基”と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書で用いる“未修飾”または“天然”核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン；５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニルウラシルおよびシトシン；６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）；４－チオウラシル；８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５－ハロ、具体的には５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン；８－アザグアニンおよび８－アザアデニン；７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの；Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008で開示されるもの；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley ＆ Sons, 1990で開示されるもの；Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613によって開示されるもの；およびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらには、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン類、６－アザピリミジン類、ならびにＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリン類が含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、例示的な塩基置換であり、なおもより特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、上記の米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第６，０１５，８８６号；同第６，１４７，２００号；同第６，１６６，１９７号；同第６，２２２，０２５号；同第６，２３５，８８７号；同第６，３８０，３６８号；同第６，５２８，６４０号；同第６，６３９，０６２；６，６１７，４３８号；同第７，０４５，６１０号；同第７，４２７，６７２号；および、同第７，４９５，０８８号（その内容全体は、それぞれ引用によって本明細書中に包含される）が含まれるが、これらに限定されない。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むようにも修飾され得る。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、その中でリボース部分は、２’および４’炭素を結合する追加の架橋を含んでなる。この構造は、リボースを３’－エンド立体構造内に効果的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の追加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増大させ、非特異的効果（オフターゲット作用）を低下させることが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＵＮＡ（非ロックド核酸）ヌクレオチドである１つまたは複数の単量体を含む。ＵＮＡは、糖の結合のいずれかが除かれて、ロックされていない“糖”残基を形成する、ロックされていない非環状構造の核酸である。一例として、ＵＮＡは、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合（すなわち、Ｃ１’とＣ４’炭素の間の共有炭素－酸素－炭素結合）が除かれた単量体も包含する。別の例において、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’とＣ３’炭素との間の共有炭素－炭素結合）が除かれている（引用により本明細書中に包含される、Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) および Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照のこと）。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数の二環式糖部分を含むようにも修飾され得る。“二環式糖”とは、２つの原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。“二環式ヌクレオシド”（“ＢＮＡ”）は、糖環の２個の炭素原子を結合する架橋を含んでなり、それによって二環式環系を形成する糖部分を有するヌクレオシドである。任意の態様において、架橋は、糖環の４’－炭素と２’－炭素とを結合する。従って、ある態様において、本発明の薬剤は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、その中でリボース部分は、２’および４’炭素を結合する追加の架橋を含んでなる。言い換えると、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、リボースを３’－エンド立体構造内に効果的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の追加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増大させ、非特異的効果（オフターゲット作用）を低下させることが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。本発明のポリヌクレオチドに使用するための二環式ヌクレオシドの例には、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが含まれるが、これに限定されない。任意の態様において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド薬には、４’から２’架橋を含む１つまたは複数の二環式ヌクレオシドが含まれる。かかる４’から２’架橋された二環式ヌクレオシドの例としては、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（“拘束（constrained）エチル”または“ｃＥｔ”とも言う）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類縁体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照のこと）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類縁体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照のこと）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類縁体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照のこと）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号を参照のこと）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、または保護基である）（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照のこと）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照のこと）；および、４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類縁体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。上記のそれぞれの内容全体は、引用により本明細書中に包含される。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許出願公開としては、以下の米国特許第６，２６８，４９０号；同第６，５２５，１９１号；同第６，６７０，４６１号；同第６，７７０，７４８号；同第６，７９４，４９９号；同第６，９９８，４８４号；同第７，０５３，２０７号；同第７，０３４，１３３号；同第７，０８４，１２５号；同第７，３９９，８４５号；同第７，４２７，６７２号；同第７，５６９，６８６号；同第７，７４１，４５７号；同第８，０２２，１９３号；同第８，０３０，４６７号；同第８，２７８，４２５号；同第８，２７８，４２６号；同第８，２７８，２８３号；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号；および、米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号（それぞれの内容全体は、引用により本明細書中に包含される）が含まれるが、これに限定されない。
上記の二環式ヌクレオシドのいずれかは、例えば、α－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む、１つまたは複数の糖の立体化学的配置を有するように調製され得る（ＷＯ９９／１４２２６を参照のこと）。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書で用いる“拘束エチルヌクレオチド”または“ｃＥｔ”は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックされた核酸である。一態様において、Ｓ立体配座にある拘束エチルヌクレオチドは、本明細書中、“Ｓ－ｃＥｔ”と言う。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つまたは複数の“立体配座的に制限されたヌクレオチド”（“ＣＲＮ”）を含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素またはリボースのＣ３および－Ｃ５’炭素を連結するリンカーを有するヌクレオチド類縁体である。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体構造にロックし、ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションの親和性を高める。リンカーは、安定性および親和性に最適な位置に酸素を配置して、リボース環のパッカリングを減らすのに十分な長さである。
上記のＣＲＮの任意の調製を教示する代表的な刊行物には、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号；およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３６８６８（それぞれの内容全体は、引用により本明細書中に包含される）が含まれるが、これに限定されない。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの１つまたはそれ以上はまた、ヒドロキシメチル置換されたヌクレオチドを含み得る。“ヒドロキシメチル置換されたヌクレオチド”は、非環式２’－３’－セコ－ヌクレオチドであり、“非ロックド核酸”（“ＵＮＡ”）修飾とも称される。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国刊行物には、米国特許第８，３１４，２２７号；および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号；同第２０１３／００１１９２２号；および同第２０１１／０３１３０２０号（それぞれの内容全体は、引用により本明細書中に包含される）が含まれるが、これに限定されない。
ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが含まれ得る。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号に見いだされ得る。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾には、ＲＮＡｉ薬のアンチセンス鎖上の、５’リン酸または５’リン酸模倣物、例えば、５’－末端リン酸またはリン酸模倣物が含まれる。好適なリン酸模倣物は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号（そのよう全体の内容は、引用により本明細書中に包含される）に開示される。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の任意の面において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ薬には、例えば、２０１１年１１月１８日出願の米国仮特許出願第６１／５６１，７１０８、または２０１２年１１月１６日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１（それぞれの全体の内容は、引用により本明細書中に包含される）に開示された化学修飾を有する薬剤が含まれる。
本明細書および仮出願番号６１／５６１，７１０またはＰＣＴ出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１に示される通り、優れた結果は、ＲＮＡｉ薬のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖中の３つの連続するヌクレオチド上に、特に切断部位またはその近位に、３つの同一の修飾の１つまたは複数のモチーフを導入することにより得られ得る。ある態様において、ＲＮＡｉ薬のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、他の方法で完全に修飾されてもよい。これらのモチーフの導入は、存在する場合に、センスおよび／またはアンチセンス鎖の修飾パターンを中断する。ＲＮＡｉ薬は、必要に応じて、例えば、センス鎖上のＧａｌＮＡｃ誘導リガンドと複合体を形成していてよい。得られたＲＮＡｉ薬は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
より具体的には、驚くべきことに、二本鎖ＲＮＡｉ薬のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ＲＮＡｉ薬の少なくとも１つの鎖の切断部位またはその近位に３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つまたは複数のモチーフを有するように完全に修飾されたとき、ＲＮＡｉ薬の遺伝子サイレンシング活性が優位に増強されたことが発見されている。
従って、本発明は、標的遺伝子（すなわち、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）遺伝子）のインビボでの発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ薬を提供する。ＲＮＡｉ薬は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ薬の各鎖は、１２－３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４－３０ヌクレオチド長、１７－３０ヌクレオチド長、２５－３０ヌクレオチド長、２７－３０ヌクレオチド長、１７－２３ヌクレオチド長、１７－２１ヌクレオチド長、１７－１９ヌクレオチド長、１９－２５ヌクレオチド長、１９－２３ヌクレオチド長、１９－２１ヌクレオチド長、２１－２５ヌクレオチド長、または２１－２３ヌクレオチド長の間の長さであり得る。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、一般的に、本明細書中、“ＲＮＡｉ薬”とも記載される、二本鎖ＲＮＡ（“ｄｓＲＮＡ”）を形成している。ＲＮＡｉ薬の二本鎖領域は、１２－３０ヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、二本鎖領域は、１４－３０ヌクレオチド対の長さ、１７－３０ヌクレオチド対の長さ、２７－３０ヌクレオチド対の長さ、１７－２３ヌクレオチド対の長さ、１７－２１ヌクレオチド対の長さ、１７－１９ヌクレオチド対の長さ、１９－２５ヌクレオチド対の長さ、１９－２３ヌクレオチド対の長さ、１９－２１ヌクレオチド対の長さ、２１－２５ヌクレオチド対の長さ、または２１－２３ヌクレオチド対の長さの間であり得る。別の例において、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７ヌクレオチド長から選択される。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、一方または両方の鎖の３’末端、５’末端、または両末端に、１つまたは複数のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含んでいてよい。オーバーハングは、１－６ヌクレオチド長、例えば２－６ヌクレオチド長、１－５ヌクレオチド長、２－５ヌクレオチド長、１－４ヌクレオチド長、２－４ヌクレオチド長、１－３ヌクレオチド長、２－３ヌクレオチド長、または１－２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長くなるか、または互い違いに配置された同じ長さの２本の鎖をもたらし得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成することができるか、あるいは標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、または別の配列であり得る。本明細書に記載の通り、３０ヌクレオチド長までの伸長されたオーバーハングはまた、本発明の種々の態様において企図される。第一および第二の鎖はまた、例えば、ヘアピンを形成するための追加の塩基により、または他の非塩基リンカーにより、連結され得る。
一態様において、ＲＮＡｉ薬のオーバーハング領域中のヌクレオチドは、それぞれ独立して、修飾または非修飾ヌクレオチドであってよく、それらには、２’－糖修飾、例えば２－Ｆ、２’－Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの任意の組合せが含まれるが、これに限定されない。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれか端オーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、またはそれは標的とされる遺遺伝子配列に相補的であり得るか、または別の配列であり得る。
ＲＮＡｉ薬のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の５’－または３’－オーバーハングは、リン酸化されていてよい。ある態様において、オーバーハング領域（複数可）は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで、２つのヌクレオチドは、同一または異なっていてよい。一態様において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端に存在する。一態様において、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。一態様において、この３’－オーバーハングは、センス鎖中に存在する。
ＲＮＡｉ薬は、その全体的な安定性に影響を与えることなく、ＲＮＡｉの干渉活性を強力にし得る、単一のオーバーハングのみを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端に、あるいは、アンチセンス鎖の３’末端に位置していてよい。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（または、センス鎖の３’末端）またはその逆に位置する平滑末端を有していてもよい。一般的に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑末端である。理論にとらわれることなく、アンチセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングにおける非対称平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスにローディングされるガイド鎖を好む。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、両端が平滑の１９ヌクレオチド長の鎖であり、ここで、センス鎖は、５’末端からの位置７、８、９に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端からの位置１１、１２、１３に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
別の態様において、ＲＮＡｉ薬は、両端が平滑の２０ヌクレオチド長の鎖であり、ここで、センス鎖は、５’末端からの位置８、９、１０に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端からの位置１１、１２、１３に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
さらに別の態様において、ＲＮＡｉ薬は、両端が平滑の２１ヌクレオチド長の鎖であり、ここで、センス鎖は、５’末端からの位置９、１０、１１に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端からの位置１１、１２、１３に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、２１ヌクレオチドのセンス鎖および２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、５’末端からの位置９、１０、１１に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端からの位置１１、１２、１３に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、該ＲＮＡｉ薬の一方の末端は平滑であるが、他方の末端は、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。
２ヌクレオチドのオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端にあるとき、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してよく、ここで、３つのヌクレオチドのうち２つは、オーバーハングヌクレオチドであり、そして３番目のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の対になったヌクレオチドである。一態様において、ＲＮＡｉ薬はさらに、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方の末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。一態様において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含むＲＮＡｉ薬のセンス鎖およびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドでる。一態様において、各残基は、独立して、例えば、交互モチーフにおいて、２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロで修飾されている。要すれば、ＲＮＡｉ薬は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、２５－３０ヌクレオチド残基長であり、ここで、第一鎖の５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して位置１から２３は、少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６－６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の位置１から２３と対になって二本鎖を形成する位置に少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；ここで、アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対になっておらず、６個までの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対になっておらず、それ故に、１－６個のヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここで、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対になっていない１０－３０個の連続するヌクレオチドを含み、それ故に、１０－３０個のヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで、少なくともセンス鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖が最大相補性のために整列されたとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それ故に、センス鎖とアンチセンス鎖の間に実質的に二本鎖領域を形成し；そして、アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、標的遺伝子発現を低減させるアンチセンス鎖の長さの少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分相補的であり；そして、センス鎖は、３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、少なくとも１つのモチーフは、切断部位またはその近位に生じる。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近位に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで、ＲＮＡｉ薬は、少なくとも２５ヌクレオチド長の、最大で２９ヌクレオチド長の第一鎖、ならびに５’末端からの位置１１、１２、１３に３つの連続するヌクレオチド上の３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを有する、最大で３０ヌクレオチド長の第二鎖を含み；ここで、第一鎖の３’末端および第二鎖の５’末端は平滑末端を形成し、第二鎖は、第一の鎖よりも、その３’末端で１－４ヌクレオチド長く、ここで、二本鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長の領域であり、第二鎖は、ＲＮＡｉ薬が哺乳動物細胞に導入されるとき、標的遺伝子発現を低減させる第二鎖の長さの少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分相補的であり、ここで、ＲＮＡｉ薬のｄｉｃｅｒ切断は、優先的に、第二鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを生じ、それ故に、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。要すれば、ＲＮＡｉ薬は、リガンドをさらに含む。
一態様において、ＲＮＡｉ薬のセンス鎖は、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、該モチーフの１つは、センス鎖中の切断部位で生じる。
一態様において、ＲＮＡｉ薬のアンチセンス鎖はまた、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいてよく、ここで、該モチーフの１つは、アンチセンス鎖中の切断部位またはその近位に生じる。
１７－２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するＲＮＡｉ薬について、アンチセンス鎖の切断部位は、一般的に、５’末端から１０、１１および１２の位置の周りである。従って、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から最初のヌクレオチドから数えて、またはアンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の最初の対になったヌクレオチドから開始して数えて、アンチセンス鎖の９、１０、１１の位置；１０、１１、１２の位置；１１、１２、１３の位置；１２、１３、１４の位置；または、１３、１４、１５の位置に生じ得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二本鎖領域の長さに応じて変更されてよい。
ＲＮＡｉ薬のセンス鎖は、鎖の切断部位に３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいてよく；そして、アンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近位に３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを有していてよい。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するとき、該センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーラップを有するように、すなわち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つと塩基対を形成するように、整列させることができる。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してよいか、または３つすべてのヌクレオチドが重複してもよい。
一態様において、ＲＮＡｉ薬のセンス鎖は、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の２以上のモチーフを含んでいてよい。第一のモチーフは、鎖の切断部位またはその近位に生じ、他のモチーフは、ウイング修飾であり得る。用語“ウイング修飾”は、本明細書中、同一鎖の切断部位またはその近位でモチーフから分離される鎖の別の部分で生じるモチーフを意味する。ウイング修飾は、第一のモチーフに隣接しているか、または少なくとも１つまたはそれ以上のヌクレオチドにより分離されている。該モチーフが互いに直接隣接しているとき、該モチーフの化学的性質は互いに異なり、該モチーフが１つまたはそれ以上のヌクレオチドにより分離されているとき、その化学的性質は同じかまたは異なっていてよい。２個またはそれ以上のウイング修飾が存在してよい。例えば、２個のウイング修飾が存在するとき、各ウイング修飾は、切断部位またはその近位にある、またはリードモチーフのいずれかの側にある、第一モチーフに関して一方の端で起こり得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ薬のアンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近位に生じるモチーフの少なくとも１つと共に、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の２以上のモチーフを含んでいてよい。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖上に存在してよいウイング修飾と同様のアライメントないに１つまたは複数のウイング修飾を含み得る。
一態様において、ＲＮＡｉ薬のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は、一般的に、鎖の３’末端、５’末端または両端に最初の１つまたは２つの末端ヌクレオチドを含まない。
別の態様において、ＲＮＡｉ薬のセンス鎖またはアンチセンス鎖のウイング修飾は、一般的に、鎖の３’末端、５’末端または両端に二本鎖領域内の最初の１つまたは２つの対になったヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ薬のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウイング修飾を含むとき、該ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に存在してよく、１個、２個または３個のヌクレオチドの重複を有していてよい。
ＲＮＡｉ薬のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウイング修飾を含むとき、該センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つの鎖からの各２つの修飾が、１個、２個または３個のヌクレオチドの重複を有する二本鎖領域の一方の末端にあるように；１つの鎖からの各２つの修飾が、１個、２個または３個のヌクレオチドの重複を有する二本鎖領域の他方の末端にあるように；１つの鎖からの２つの修飾が、二本鎖領域中の１個、２個または３個のヌクレオチドの重複を有するリードモチーフの各側にあるように、整列（アライン）されてよい。
一態様において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ薬のセンス鎖およびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、修飾されていてよい。各ヌクレオチドは、同じかまたは異なる修飾で修飾されていてよく、それには、非結合リン酸酸素の一方または両方、および／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の、１つまたはそれ以上の改変；リボース糖の構成成分、例えば、リボース糖の２’－ヒドロキシルの改変；リン酸部分の“脱ホスホ”リンカーでの大規模な置換；天然に存在する塩基の修飾または置換；ならびに、リボース－リン酸骨格の置換または修飾が含まれ得る。
核酸をサブユニットのポリマーであるとして、修飾の多くは、核酸内で反復される位置、例えば、塩基の修飾、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏに生じる。ある場合において、修飾は、核酸内の対象位置の全てで生じ得るが、多くの場合、そうはならない。一例として、修飾は、３’末端または５’末端位置でのみ、末端領域でのみ、例えば、鎖の末端ヌクレオチドまたは最後の２、３、４、５または１０ヌクレオチド中の位置で生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方で起こり得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内でのみ、またはＲＮＡの一本鎖領域内でのみ起こり得る。例えば、非結合Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみ起こり得る、末端領域でのみ起こり得る、例えば、鎖の末端ヌクレオチドまたは最後の２、３、４、５または１０ヌクレオチド中の位置で起こり得る、または二本鎖および一本鎖領域の、特に末端で起こり得る。５’末端または末端をリン酸化し得る。
例えば、安定性を高めるために、一本鎖オーバーハングに、例えば、５’または３’オーバーハング、あるいは両方に、オーバーハング中に特定の塩基を含めること、あるいは修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド代用物を含めることが可能である。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましいことがある。ある態様において、３’または５’オーバーハング中の塩基の全てまたはいくつかは、例えば本明細書に記載の修飾で修飾されていてよい。修飾には、例えば、当技術分野で公知の修飾を有するリボース糖の２’位置での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチル修飾の使用、およびリン酸基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾が含まれ得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾されている。鎖は、２以上の修飾を含み得る。一態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾されている。
少なくとも２個の異なる修飾が、一般的に、センス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。これらの２個の修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾などであってよい。
一態様において、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。本明細書で用いる用語“交互(alternating)モチーフ”は、１つまたは複数の修飾を有するモチーフを意味し、各修飾は、一方の鎖の交互ヌクレオチドに生じる。交互ヌクレオチドは、他のヌクレオチド毎に１個または３個のヌクレオチド毎に１個、または同様のパターンを意味し得る。例えば、Ａ、ＢおよびＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１タイプの修飾を示す場合、交互モチーフは、“ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…”、“ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…”、“ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…”、“ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…”、“ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…”または“ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…”などであり得る。
交互モチーフに含まれる修飾のタイプは、同じかまたは異なっていてよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチドの修飾の１タイプを示す場合、交互パターン、すなわち、他のヌクレオチド毎の修飾は、同じであってよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖のそれぞれは、“ＡＢＡＢＡＢ…”、“ＡＣＡＣＡＣ…”、“ＢＤＢＤＢＤ…”または“ＣＤＣＤＣＤ…”などのような交互モチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
一態様において、本発明のＲＮＡｉ薬は、アンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに相対的にセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンがシフトされるものを含む。シフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応するように、またはその逆のようにしてもよい。例えば、センス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖中のアンチセンス鎖と対になるとき、センス鎖中の交互モチーフは、鎖の５’－３’から“ＡＢＡＢＡＢ”で始まり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’－３’から“ＢＡＢＡＢＡ”で始まってよい。別の例として、センス鎖中の交互モチーフは、鎖の５’－３’から“ＡＡＢＢＡＡＢＢ”で始まり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’－３’から“ＢＢＡＡＢＢＡＡ”で始まってよく、そのため、センス鎖とアンチセンス鎖の間の修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトが存在することになる。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、最初にセンス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾および２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンが最初にアンチセンス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾および２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンに対するシフトを有するものを含み、すなわち、センス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖上の２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対形成する、そしてその逆もある。センス鎖の位置１は２’－Ｆ修飾で始まり、アンチセンス鎖の位置１は、２’－Ｏ－メチル修飾で始まってよい。
センス鎖および／またはアンチセンス鎖への３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つまたはそれ以上のモチーフの導入は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖および／またはアンチセンス鎖の、該センス鎖および／またはアンチセンス鎖のへの３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つまたはそれ以上のモチーフの導入による修飾パターンのこの中断は、驚くべきことに、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を増強させる。
一態様において、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフがいずれかの鎖に導入されるとき、該モチーフの次のヌクレオチドの修飾は、該モチーフの修飾とは異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、“…ＮａＹＹＹＮｂ…”（式中、“Ｙ”は、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、“Ｎａ”および“Ｎｂ”は、Ｙの修飾とは異なるモチーフ“ＹＹＹ”の次のヌクレオチドの修飾を表し、そして、ＮａおよびＮｂは、同じかまたは異なる修飾であってよい）である。あるいは、Ｎａおよび／またはＮｂは、ウイング修飾が存在するとき、存在するか、または不存在であってよい。
ＲＮＡｉ薬は、少なくとも１つのホスホロチオエート間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエート間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖または両方の鎖に、該鎖のいずれかの位置で、いずれかのヌクレオチドに起こり得る。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のヌクレオチド毎に起こり得る；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上に代替パターンで起こり得る；または、センス鎖またはアンチセンス鎖は、代替パターンで両方のヌクレオチド間結合修飾を含み得る。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の代替パターンは、アンチセンス鎖と同じかまたは異なっていてよく、センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の代替パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の代替パターンと比べてシフトしていてよい。一態様において、二本鎖ＲＮＡｉ薬は、６－８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一態様において、アンチセンス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、３’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一態様において、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域中にホスホロチオエート間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２個のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対になったヌクレオチドと結合させてもよい。例えば、少なくとも２、３、４個、または全てのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエート間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を介して結合してよく、要すれば、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドの次の対になったヌクレオチドと連結する、さらなるホスホロチオエート間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在してよい。例えば、末端の３個のヌクレオチド間に少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してよく、ここで、３個のヌクレオチドのうち２個はオーバーハングヌクレオチドであり、３個目は、オーバーハングヌクレオチドの次の対になったヌクレオチドである。これらの末端の３個のヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、および／またはセンス鎖の５’末端に存在してよい。
一態様において、２個のヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３個のヌクレオチド間に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、ここで、３個のヌクレオチドのうち２個は、オーバーハングヌクレオチドであり、３個目のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の対になったヌクレオチドである。要すれば、ＲＮＡｉ薬は、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方に、末端の３個のヌクレオチド間の２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有していてよい。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、標的とのミスマッチ（複数可）、二本鎖内のミスマッチ（複数可）、またはその組合せを含み得る。ミスマッチは、オーバーハング領域または二本鎖領域中で起こり得る。塩基対は、解離または融解を促進するそれらの傾向に基づいてランク付けされ得る（例えば、特定のペアリングの会合または解離の自由エネルギーについて、最も簡単な方法は、隣同士または同じ分析も使用できるが、個々の対毎に該対を調べることである）。解離を促進するという点では：Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕは、Ｇ：Ｃより好ましく；そして、Ｉ：Ｃは、Ｇ：Ｃ（Ｉ＝イノシン）より好ましい。ミスマッチ、例えば、非標準的または標準的以外の対形成（本明細書の他の箇所に記載）は、標準的な対（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対形成は、標準的な対形成よりも好ましい。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択される、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２、３、４または５塩基対の少なくとも１つ、ならびにミスマッチ対、例えば、非標準的対形成または標準的対形成もしくはユニバーサル塩基を含む対形成以外の対形成を含み、二本鎖の５’末端でのアンチセンス鎖の解離を促進する。
一態様において、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の位置１のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群より選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からのｅ二本鎖領域内の最初の１、２または３塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の塩基対はＡＵ塩基対である。
別の態様において、センス鎖の３’末端のヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。別の態様において、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。一態様において、デオキシ－チミンヌクレオチドの短い配列、例えば、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端上の２個のｄＴヌクレオチドが存在する。
一態様において、センス鎖配列は、式（Ｉ）で示され得る：
５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
（Ｉ）
式中：
ｉおよびｊは、それぞれ独立して、０または１であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、０－６であり；
Ｎａは、それぞれ独立して、０－２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列であり、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み；
Ｎｂは、それぞれ独立して、０－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列であり；
ｎｐおよびｎｑは、それぞれ独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し；
ここで、ＮｂおよびＹは、同じ修飾を有さず；そして
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、それぞれ独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを示す。好ましくは、ＹＹＹは、全て２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一態様において、Ｎａおよび／またはＮｂは、代替パターンの修飾を含む。
一態様において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近位に生じる。例えば、ＲＮＡｉ薬が、１７－２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するとき、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近位に、５’末端から、位置１のヌクレオチドから数えて、または、要すれば、５’末端から、二本鎖領域内の位置１の対になったヌクレオチドから数えて、（例えば：位置６、７、８；７、８、９；８、９、１０；９、１０、１１；１０、１１、１２または１１、１２、１３に）生じ得る。
一態様において、ｉは１であり、ｊは０であるか、またはｉは０であり、ｊは１であるか、またはｉおよびｊの両方が１である。従って、センス鎖は以下の式で表すことができる：
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉｂ）；
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉｃ）；または
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉｄ）。
センス鎖が式（Ｉｂ）で表されるとき、Ｎｂは、０－１０、０－７、０－５、０－４、０－２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。Ｎａはそれぞれ独立して、２－２０、２－１５、または２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し得る。
センス鎖が式（Ｉｃ）で表されるとき、Ｎｂは、０－１０、０－７、０－１０、０－７、０－５、０－４、０－２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。Ｎａは、それぞれ独立して、２－２０、２－１５、または２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し得る。
センス鎖が式（Ｉｄ）で表されるとき、Ｎｂは、それぞれ独立して、０－１０、０－７、０－５、０－４、０－２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。Ｎａは、それぞれ独立して、２－２０、２－１５、または２－１０この修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し得る。
Ｘ、ＹおよびＺはそれぞれ、互いに同じかまたは異なっていてよい。
他の態様において、ｉは０であり、ｊは０であり、センス鎖は以下の式で表される：
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－ Ｎａ－ｎｑ ３’ （Ｉａ）。
センス鎖が式（Ｉａ）で表されるとき、Ｎａは、それぞれ独立して、２－２０、２－１５、または２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し得る。
一態様において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）で表され得る：
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’ ３’ （ＩＩ）
式中：
ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり；
Ｎａ’は、それぞれ独立して、０－２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み；
Ｎｂ’は、それぞれ独立して、０－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し；
ｎｐ’およびｎｑ’は、それぞれ独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し；
ここで、Ｎｂ’およびＹ’は、同じ修飾を有さず；そして
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを示す。
一態様において、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、代替パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近位に生じる。例えば、ＲＮＡｉ薬が、１７－２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するとき、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端から、位置１のヌクレオチドから数えて、または、要すれば、５’末端から、二本鎖領域内の位置１の対になったヌクレオチドから数えて、アンチセンス鎖の位置９、１０、１１；１０、１１、１２；１１、１２、１３；１２、１３、１４；または１３、１４、１５に生じ得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、位置１１、１２、１３に生じる。
一態様において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは全て２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一態様において、ｋは１であり、ｌは０であるか、またはｋは０であり、ｌは１であるか、またはｋおよびｌの両方が１である。
従って、アンチセンス鎖は以下の式で表され得る：
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’ ３’ （ＩＩｂ）；
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’ ３’ （ＩＩｃ）；ｏｒ
５’ ｎｑ’－Ｎａ’－ Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－ Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’ ３’ （ＩＩｄ）。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｂ）で表されるとき、Ｎｂ ’は、０－１０、０－７、０－１０、０－７、０－５、０－４、０－２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。Ｎａ’は、それぞれ独立して、２－２０、２－１５、または２－１０この修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｃ）で表されるとき、Ｎｂ’は、０－１０、０－７、０－１０、０－７、０－５、０－４、０－２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。Ｎａ’は、それぞれ独立して、２－２０、２－１５または２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｄ）で表されるとき、Ｎｂ’は、それぞれ独立して、０－１０、０－７、０－１０、０－７、０－５、０－４、０－２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。Ｎａ’は、それぞれ独立して、２－２０、２－１５または２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。
他の態様において、ｋは０であり、ｌは０であり、アンチセンス鎖は以下の式で表され得る：
５’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－ Ｎａ’－ｎｑ’ ３’ （Ｉａ）。
アンチセンス鎖が式（ＩＩａ）で表されるとき、Ｎａ’は、それぞれ独立して、２－２０、２－１５または２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はそれぞれ、互いに同じかまたは異なっていてよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾されていてよい。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチドは、それぞれ独立して、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はそれぞれ、特に、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を示し得る。
一態様において、ＲＮＡｉ薬のセンス鎖は、二本鎖領域が２１塩基であるとき、５’末端から、位置１のヌクレオチドから数えて、または、要すれば、５’末端から、二本鎖領域内の位置１の対になったヌクレオチドから数えて、鎖の位置９、１０および１１に生じるＹＹＹモチーフを含んでいてよく、ここで、Ｙは２’－Ｆ修飾である。センス鎖は、二本鎖領域の反対の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含んでいてよく、ここで、ＸＸＸおよびＺＺＺは、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を示す。
一態様において、アンチセンス鎖は、５’末端から、位置１のヌクレオチドから数えて、または、要すれば、５’末端から、二本鎖領域内の位置１の対になったヌクレオチドから数えて、鎖の位置１１、１２、１３に生じるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでいてよく、ここで、Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を示す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含んでいてよく、ここで、Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を示す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｄ）のいずれかで示されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）のいずれか１つで示されるアンチセンス鎖と共に二本鎖を形成する。
従って、本発明の方法において使用するためのＲＮＡｉ薬は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでいてよく、各鎖は１４から３０ヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、以下の式（ＩＩＩ）で表される：
センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
アンチセンス：３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ ’－ｎｑ ’ ５’
（ＩＩＩ）
式中：
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり；
ＮａおよびＮａ ’は、それぞれ独立して、０－２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み；
ＮｂおよびＮｂ ’は、それぞれ独立して、０－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し；
ここで、ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’およびｎｑは（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）、それぞれ独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し；そして
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを示す。
一態様において、ｉは０であり、ｊは０であるか；または、ｉは１であり、ｊは０であるか；または、ｉは０であり、ｊは１であるか；またはｉおよびｊの両方は０であるか；またはｉおよびｊの両方は１である。別の態様において、ｋは０であり、ｌは０であるか；または、ｋは１であり、ｌは０であるか；ｋは０であり、ｌは１であるか；または、ｋおよびｌの両方は０であるか；または、ｋおよびｌの両方は１である。
ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の組み合わせの例には、以下の式が含まれる：
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’ｎｑ ’ ５’ (IIIa)
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ ’ｎｑ ’ ５’ (IIIb)
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’－ｎｑ ’ ５’ (IIIc)
５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’
３’ ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ ’ ５’ (IIId)。
ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩａ）で示されるとき、Ｎａは、それぞれ独立して、２－２０、２－１５または２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。
ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩｂ）で示されるとき、Ｎｂは、それぞれ独立して、１－１０、１－７、１－５または１－４個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。Ｎａは、それぞれ独立して、２－２０、２－１５または２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。
ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩｃ）で示されるとき、Ｎｂ、Ｎｂ’は、それぞれ独立して、０－１０、０－７、０－１０、０－７、０－５、０－４、０－２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。Ｎａは、それぞれ独立して、２－２０、２－１５、または２－１０修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。
ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩｄ）で示されるとき、Ｎｂ、Ｎｂ’は、それぞれ独立して、０－１０、０－７、０－１０、０－７、０－５、０－４、０－２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。Ｎａ、Ｎａ ’は、それぞれ独立して、２－２０、２－１５、または２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示す。Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂおよびＮｂ ’は、それぞれ独立して、代替パターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）中のＸ、ＹおよびＺはそれぞれ、互いに同じであるか、または異なっていてよい。
ＲＮＡｉ薬が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で示されるとき、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つはＹ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成してよい。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成するか；または、Ｙヌクレオチドの３つすべては、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）で表されるとき、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成してよい。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成するか；または、３つすべてのＺヌクレオチドは全て、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）で表されるとき、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成してよい。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成するか；または、３つ全てのＸヌクレオチドは全て、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
一態様において、Ｙヌクレオチドの修飾は、Ｙ’ヌクレオチドの修飾とは異なり、Ｚヌクレオチドの修飾は、Ｚ’ヌクレオチドの修飾とは異なり、および／またはＸヌクレオチドの修飾は、Ｘ’ヌクレオチドの修飾とは異なる。
一態様において、ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩｄ）で表されるとき、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾である。別の態様において、ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩｄ）で表されるとき、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、そして少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合している。さらに別の態様において、ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩｄ）で表されるとき、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、そして少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、かつセンス鎖は、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と複合体を形成している（下記）。別の態様において、ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩｄ）で表されるとき、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、そして少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、そしてセンス鎖は、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と複合体を形成している。
一態様において、ＲＮＡｉ薬が式（ＩＩＩａ）で表されるとき、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、そして少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、そしてセンス鎖は、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して１つまたはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と複合体を形成している。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、ここで、該二本鎖はリンカーにより連結されている。リンカーは、切断可能であるか、または切断不可能である。要すれば、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とし得るか；または、二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位にて同じ遺伝子を標的とし得る。
一態様において、ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される、3つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、ここで、該二本鎖は、リンカーにより連結されている。リンカーは、切断可能であるか、または切断不可能である。要すれば、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とし得るか；または、二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位にて同じ遺伝子を標的とし得る。
一態様において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される２つのＲＮＡｉ薬は、５’末端および３’末端の一方または両方の端部で互いに結合しており、要すればリガンドと複合体を形成している。各薬剤は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とし得るか；または、各薬剤は、２つの異なる標的部位にて同じ遺伝子を標的とし得る。
種々の文献が、本発明の方法に使用することができる多量体ＲＮＡｉ薬を記載している。かかる文献としては、ＷＯ２００７／０９１２６９、米国特許第７８５８７６９号、ＷＯ２０１０／１４１５１１、ＷＯ２００７／１１７６８６、ＷＯ２００９／０１４８８７およびＷＯ２０１１／０３１５２０（それらの内容全体は、引用により本明細書中に包含される）が挙げられる。
以下により詳しく記載するように、ＲＮＡｉ薬に１つまたは複数の炭水化物部分を結合させて含むＲＮＡｉ薬は、該ＲＮＡｉ薬の１つまたは複数の特性を最適化することができる。多くの場合に、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ薬の修飾サブユニットに結合され得る。例えば、ｄｓＲＮＡ薬の１つまたはそれ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合された非炭水化物（好ましくは、環状）担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書中、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と言う。環状担体は、炭素環式環系であってよく、すなわち、全ての環原子が炭素原子であるか、またはヘテロ環式環系であってよく、すなわち、１個または複数の環原子がヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であってよい。環状担体は、単環式環系であってよいか、または２つもしくは複数の環を含んでいてよく、例えば縮合環であってよい。環状担体は、完全に飽和した環系であってよく、またはそれは、１つまたは複数の二重結合を含んでいてよい。
リガンドは、担体を仲介してポリヌクレオチドに結合されていてよい。担体は、（ｉ）少なくとも１つの“骨格結合点”、好ましくは、２個の“骨格結合点”、および（ｉｉ）少なくとも１つの“テザリング（tethering）結合点”を含む。本明細書で用いる“骨格結合点”は、官能基、例えばヒドロキシル基を意味するか、または一般的に、骨格への担体の組み込み利用可能な結合、およびそれに適するもの、例えば、リボ核酸の、リン酸エステル、または修飾リン酸、例えば、硫黄含有骨格を意味する。ある態様において、“テザリング結合点”（ＴＡＰ）は、選択された部分を結合する、環状担体、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子とは異なる）の構成環原子を意味する。該部分は、例えば、炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖類であり得る。要すれば、選択された部分は、環状担体に介在テザーによって連結されている。従って、環状担体は、官能基、例えばアミノ基を含むことが多いか、または一般的に、構成環への別の化合物、例えば、リガンドの組み込みまたはテザリングに適する結合を提供する。
ＲＮＡｉ薬は、担体を介してリガンドに連結されてよく、ここで、担体は、環状基または非環式基であってよい。好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択される。好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
任意の特定の態様において、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ薬は、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つに記載の薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンドをさらに含んでいてよい。
ＩＶ．リガンド共役ｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、１つまたは複数のリガンド、部分または複合体を、ＲＮＡに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556) などの脂質部分；コール酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060）；チオエーテル、例えばベリル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）；脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）；例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654;Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides ＆ Nucleotide, 1995, 14:969-973)；またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654）；パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）が挙げられるが、これに限定されない。
一態様において、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ薬の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい態様において、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または臓器内区画などの区画、身体の組織または臓器または領域などの選択された標的に対する改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーのような、組み換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例にはポリアミノ酸が含まれ、それは、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンである。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαヘリカルペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、例えば、腎細胞などの特定の細胞タイプに結合するターゲティング基(targeting group)、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体を含み得る。ターゲティング基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋リンカー（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えば肝臓細胞などの特定の細胞タイプに結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼアクティベーター、またはＮＦ－κＢのアクティベーターであり得る。
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ薬の取り込みを増大させることができる薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
ある態様において、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態学的モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターとしては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類縁体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。多数のホスホロチオエート結合を含んでなるオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが知られており、従って、例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含んでなる、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される態様において、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチドは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への結合から誘導されるものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって、合成されてもよい（下記）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有して合成されたリガンド、またはそれに結合する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に、そして常套的に、周知の固相合成技術により作製されてもよい。このような合成のための装置は、Applied Biosystems (Foster City, Calif.)を含む、いくつかの供給業者によって販売される。それに加えて、または代案として、当技術分野で公知のこのような合成のためのその他のあらゆる手段を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのその他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた知られている。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチド、およびリガンド分子を含有する配列特異的結合ヌクレオシドにおいて、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を含有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既にリガンド分子を保有するリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシド－複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを含有する構成要素を利用して、好適なＤＮＡ合成機上で組み立ててよい。
既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成は一般的に完了し、次にリガンド分子を結合部分と反応させて、リガンド共役オリゴヌクレオチドを形成する。ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されており、常套的にオリゴヌクレオチド合成で使用される、標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。
Ａ．脂質複合体
一態様において、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子もまた、リガンドとして使用できる。例えばナプロキセンまたはアスピリンが使用できる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解抵抗性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用できる。
例えば複合体の標的組織への結合を制御するなど、脂質ベースのリガンドを阻害のために使用できる。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に複合体を標的化するのに使用できる。
好ましい態様において、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
別の好ましい態様において、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎臓細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用できる。
別の面において、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞により取り込まれるビタミンなどの部分である。これらは、例えば癌細胞などの悪性または非悪性型などの望ましくない細胞増殖によって特徴付けられる障害を処置するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、または肝臓細胞などの標的細胞により取り込まれるその他のビタミン類または栄養素が挙げられる。また、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
Ｂ．細胞透過剤
別の面において、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはヘリカル（helical）細胞透過剤である。好ましくは、該薬剤は両親媒性である。例示的な薬剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。該薬剤がペプチドであるとき、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード－ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸の使用を含む、修飾を受け得る。ヘリカル剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有するα－ヘリカル剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも言う）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ薬への結合は、細胞認識および吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長などであり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。あるいは、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号９）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類縁体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１０））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む、多数の極性分子を輸送し得る“送達”ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１１））およびショウジョウバエ・アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１２））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ－ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991）。細胞標的化の目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ薬に結合されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下記の構造修飾のいずれかを使用できる。
本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織(複数可)への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体としては、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が含まれ得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とするその他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的にする。
“細胞透過性ペプチド”は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－ヘリカル直鎖ペプチド（例えばＬＬ－３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つもしくは２つの主要アミノ酸のみを含有するペプチド（例えばＰＲ－３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分（bipartite）両親媒性ペプチドであり得る（Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003）。
Ｃ．炭水化物複合体
本発明の組成物および方法のいくつかの態様において、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含んでなる。炭水化物共役ｉＲＮＡは、本明細書に記載の通り、核酸ならびにインビボ治療用途に適する組成物のインビボ送達に有利である。本明細書で用いる“炭水化物”は、各炭素原子に結合する酸素、窒素または硫黄原子を含む少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）を有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物自体；または、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子を含む少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）をそれぞれ有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を意味する。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、ＡＧＴおよび上記（例えば、ＡＧＴ、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）が挙げられる。
一態様において、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は単糖である。一態様において、単糖は、式ＩＩ
Figure 2022104985000004
で示されるような、Ｎ－アセチルガラクトサミンである。
別の態様において、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は、以下からなる群より選択される。
Figure 2022104985000005
Figure 2022104985000006
Figure 2022104985000007
Figure 2022104985000008
Figure 2022104985000009
Figure 2022104985000010
本明細書に記載される態様で使用するための別の代表的な炭水化物複合体としては、
Figure 2022104985000011
（式ＸＸＩＩＩ）
（式中、ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）
が挙げられるが、これに限定されない。
ある態様において、炭水化物複合体は、ＰＫモジュレーターおよび／または細胞透過性ペプチドなどであるが、これに限定されない、上記の１つまたは複数の追加リガンドをさらに含んでなる。
本発明の使用に適するさらなる炭水化物複合体（およびリンカー）としては、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１７９６２０およびＷＯ２０１４／１７９６２７(その内容全体は、引用により本明細書中に包含される)に記載のものが挙げられる。
Ｄ．リンカー
ある態様において、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不可能であり得る、種々のリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合され得る。
用語“リンカー”または“連結基”という用語は、例えば化合物の２つの部分に共有結合するなどの、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、一般的に、直接結合、または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（alkylhererocyclylalkynyl）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどであるが、これらに限定されない原子鎖を含んでなり、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロ環（ここで、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一態様において、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４個の原子、３～２４個の原子、４～２４個の原子、５～２４個の原子、６～２４個の原子、６～１８個の原子、７～１８個の原子、７～１７この原子、８～１７個の原子、６～１６個の原子、７～１６個の原子、または、８～１６個の原子である。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定であるが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい態様において、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中においてよりも、または第２の標準状態下（例えば血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍より迅速に切断される。
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般的に、切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルもしくは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る物質；一般的な酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対して感受性であり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはそれよりわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞内のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝臓細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝臓細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富む他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝臓細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富む細胞型を標的化する際に使用され得る。
一般的に、切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性物質（または条件）の能力を試験することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた試験することもまた望ましい。従って、第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液もしくは血清などの生体液中での切断を示すように選択される場合、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を決定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい態様において、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍より迅速に切断される。
ｉ．酸化還元切断可能連結基
一態様において、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能連結基候補が、好適な“還元的切断可能連結基”か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的化物質と共に使用するのに適するかどうかを決定するために、当業者は、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。１つの候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。他の態様において、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して決定され得る。
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能連結基
別の態様において、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含んでなる。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい態様は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい態様は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を用いて評価し得る。
ｉｉｉ．酸切断可能連結基
別の態様において、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含んでなる。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい態様において、酸切断可能連結基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）のｐＨの酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい態様は、炭素がエステルの酸素に結合する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｖ．エステルベースの連結基
別の態様において、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含んでなる。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｖ．ペプチドベースの切断基
さらに別の態様において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含んでなる。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般的に、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価し得る。
一態様において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物と共役する。本発明の組成物および方法のリンカーと共役するｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例としては、以下
Figure 2022104985000012
Figure 2022104985000013
（式中、ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）
が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の組成物および方法の任意の態様において、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して結合する１つまたは複数の“ＧａｌＮＡｃ”（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、以下の式（ＸＸＸＩＩ）～（ＸＸＸＶ）、
Figure 2022104985000014
 （式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、それぞれ０～２０の出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なってよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つまたは複数によって中断または終結されてよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
Figure 2022104985000015
 または、ヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表し；すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり；そして、Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）のいずれかで示される構造群より選択される、二価または三価の分枝リンカーと共役する。三価の共役ＧａｌＮＡｃ誘導体は、式（ＸＸＸＶ）、
Figure 2022104985000016
 （式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）
などの標的遺伝子の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体に共役する適切な二価および三価の分枝状リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上記の構造が挙げられるが、これらに限定されない。
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号；同第６，２９４，６６４号；同第６，３２０，０１７号；同第６，５７６，７５２号；同第６，７８３，９３１号；同第６，９００，２９７号；同第７，０３７，６４６号；同第８，１０６，０２２（それぞれの内容全体は、引用により本明細書中に包含される）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
所定の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、上記の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物もまた含む。
“キメラ”ｉＲＮＡ化合物または“キメラ(chimeras)”は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、一般的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるようにＲＮＡが修飾される、少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡによって、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、そして必要ならば当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、常套的に検出し得る。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、多数の非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053）、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオールなどのチオエーテル（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111;Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327;Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49）、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネートなどのリン脂質（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651;Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides ＆ Nucleotides, 1995, 14:969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。一般的な共役結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適当なカップリング剤または活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合する分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡの切断に続いて実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体の精製は、一般的に純粋な複合体を与える。
Ｖ．本発明のｉＲＮＡの送達
例えば、ヒト対象（例えば、アンジオテン関連疾患または状態を有する対象などの、それを必要とする対象）などの対象内の細胞などの細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。例えば、送達は、インビトロまたはインビボのどちらかで、細胞を本発明のｉＲＮＡに接触させることで実施してもよい。インビボ送達はまた、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含んでなる組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。あるいは、インビボ送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、以下でさらに考察される。
一般に、（インビトロまたはインビボで）核酸分子を送達するあらゆる方法が、本発明のｉＲＮＡで使用するために適応され得る（例えば、その内容全体を引用により本明細書に包含させる、Akhtar S.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144および国際公開ＷＯ９４／０２５９５を参照のこと）。インビボ送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために検討すべき要素としては、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織中の送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織内への直接注射または移植、あるいは製剤を局所投与するなどの局所投与によって最小化し得る。処置部位への局所投与は、物質の局所濃度を最大化し；そうしなければ物質によって害を被り得るか、または物質を分解し得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し；ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（Tolentino, MJ., et al(2004)Retina 24:132-138）、およびマウスにおける網膜下注射による（Reich, SJ., et al(2003)Mol.Vis.9 :210-216）ＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を阻止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（Pille, J., et al(2005)Mol.Ther.11:267-274）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長することができた（Kim, WJ., et al(2006)Mol.Ther.14: 343-350; Li, S., et al(2007)Mol.Ther.15:515-523）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya, Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602）、および鼻腔内投与による肺への（Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55）局所送達の成功が示されている。疾患を治療するためにｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、あるいは薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、インビボでエンド－およびエキソ－ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている（McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015）。別の態様において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えば、Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照のこと）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに阻止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205（引用によりその全体を本明細書中に包含される）を参照のこと）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN., et al (2003), 前出）、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、“固体核酸脂質顆粒（solid nucleicacid lipidparticles）”（Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114）、カルジオリピン（Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328;Pal, A., et al(2005)Int J.Oncol.26:1087-1091）、ポリエチレンイミン（Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487）、およびポリアミドアミン（（Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804）が挙げられる。ある態様において、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、米国特許第７，４２７，６０５号（その内容全体を引用により本明細書中に包含させる）に見いだされる。
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
ＡＧＴ遺伝子を標的化するｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al.、国際公開ＷＯ００／２２１１３；Ｃｏｎｒａｄ、国際公開ＷＯ００／２２１１４；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型によって変わり、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入され得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモーターから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを作製する場合、（例えばトランスフェクションまたは感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。あるいは、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一態様において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般的に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載のｉＲＮＡ発現のための組み換えコンストラクトを作製し得る。真核細胞発現ベクターは当技術分野で周知であり、多くの商業的供給元から入手できる。一般的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合よい制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、または患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにする任意の他の手段などであり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞にトランスフェクトし得る。１週間以上の期間にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的化する、ｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数脂質トランスフェクションもまた、本発明により検討される。ベクターの宿主細胞への成功裏の導入は、種々の既知の方法を使用して観測し得る。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光性マーカーなど、レポーターによって示し得る。エクスビボにおける細胞への安定したトランスフェクションは、トランスフェクト細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定環境要素（例えば、抗生物質および薬剤）耐性を提供するマーカを使用して、確実にし得る。
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むが、これに限定されない、レトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、要すれば、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、コンストラクトは、例えばＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモーター、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の面は、以下にさらに詳しく記載する。
ｉＲＮＡを送達するのに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織中のｉＲＮＡの発現に十分な調節因子（プロモーター、エンハンサーなど）を含む。調節因子は、構成的または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択し得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば循環グルコースレベル、またはホルモンなどの特定の生理学的制御因子に感受性の誘導性制御配列を使用して、正確に調節し得る（Docherty et al., 1994, FASEB J.8:20-24）。細胞または哺乳動物におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適するこのような誘導性発現系としては、例えばエクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、好適な調節配列／プロモーター配列を選択できる。
ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用し得る。例えばレトロウイルスベクターを使用し得る（Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を容易にする、１つまたは複数のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターに関してより詳しくは、例えば化学療法により高い耐性を示す幹細胞を作製するために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)に見いだされる。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例証するその他の文献は、Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); および、 Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)である。使用が検討されるレンチウイルスベクターとしては、例えば引用により本明細書に包含される、米国特許第６，１４３，５２０号；同第５，６６５，５５７号；および同第５，９８１，２７６号に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられる。
アデノウイルもまた、本発明のｉＲＮＡの送達で使用するために検討される。アデノウイルは、例えば呼吸上皮(Respiratory epithelium)に遺伝子を送達するために、特に魅力的なビークルである。アデノウイルは呼吸上皮に天然で感染して、軽症の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系その他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できる利点を有する。Kozarsky and Wilson, Current Opinion in遺伝子tics and Development 3:499-503 (1993)は、アデノウイルスベースの遺伝子療法のレビューを提示する。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)は、遺伝子をアカゲザルの呼吸上皮に移入するための、アデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用のその他の例は、Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); PCT公開WO94/12649;および、Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995)に見いだされる。本発明で取り上げるｉＲＮＡを発現するための好適なＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010に記載される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターもまた、本発明のｉＲＮＡを送達するために使用できる（Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); 米国特許第5,436,146号）。一態様において、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する、組み換えＡＡＶベクターからの２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げるｄｓＲＮＡを発現するのに好適なＡＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；同第５，１３９，９４１号；国際公開ＷＯ９４／１３７８８；および、国際公開ＷＯ９３／２４６４１（その開示全体は、引用により本明細書中に包含される）に記載される。
本発明のｉＲＮＡを送達するのに好適な別のウイルスベクターは、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニアなどのワクシニアウイルス、鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスなどのポックスウイルスである。
ウイルスベクターの指向性（tropism）は、必要に応じて、その他のウイルスからのエンベロープタンパク質またはその他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることで、または異なるウイルスからのカプシドタンパク質で置換することで、修飾し得る。例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質によって、レンチウイルスベクターをシュードタイピングし得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを遺伝子操作して、異なるカプシドタンパク質血清型を発現させることで、異なる細胞を標的化するようにできる；例えばRabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801（その開示内容全体は引用により本明細書中に包含される）を参照のこと。
ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中のベクターを含み得て、またはその中に遺伝子送達ビークルが包埋される徐放マトリックスを含み得る。あるいは、例えばレトロウイルスベクターなどの完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞から無傷で作製され得る場合、該医薬品は遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。
ＶＩ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤もまた含む。一態様において、本発明で提供されるのは、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＡＧＴ遺伝子の発現または活性に関連する、疾患または障害を治療するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤される。一例としては、例えば皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）送達による、非経腸送達による、全身投与のために製剤される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ輸液などの脳内点滴による、脳実質内への直接送達のために調合される組成物である。本発明の医薬組成物は、ＡＧＴ遺伝子発現を阻害するのに十分な投与量で投与してもよい。一般的に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、１日あたり受容者の体重１キログラムあたり、約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、一般的に１日あたり体重１キログラムあたり、約１～５０ｍｇの範囲である。例えばｄｓＲＮＡは、単回投与あたり、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載の値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
別の態様において、ｄｓＲＮＡは、約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約４から約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約４から約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約３から約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約４から約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１から約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約１から約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約２から約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約３から約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約４から約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５から約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。記載された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
別の態様において、ｄｓＲＮＡは、約０．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約４から約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約４から約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約３から約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約４から約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約１から約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約２から約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約３から約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約４から約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５から約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一態様において、ｄｓＲＮＡは、約１０ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象は、例えば、皮下または静脈内に、約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇのようなｉＲＮＡの単回治療量を投与され得る。記載された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
ある態様において、対象は、例えば、皮下または静脈内に、約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇのような、ｉＲＮＡの複数回治療量を投与される。複数用量レジメンは、ｉＲＮＡの治療量を毎日、例えば２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、またはそれ以上投与することを含み得る。
他の態様において、対象は、例えば、皮下または静脈内に、約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇのような、ｉＲＮＡの反復治療用量を投与される。反復用量レジメンは、１日おきに、３日に１回、４日に１回、週２回、週１回、隔週、または月１回のように定期的にｉＲＮＡ治療量を投与することを含み得る。任意の態様において、ｉＲＮＡは、約１月に１回から約四半期に１回（すなわち、約３月に１回）投与される。
初期治療レジメン後、処置剤は、より少ない頻度で投与することができる。
任意の態様において、例えば、本発明の組成物が、本明細書に記載のｄｓＲＮＡおよび脂質を含むとき、対象は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、または約９．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇのようなｉＲＮＡの治療量を投与され得る。記載された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
本発明の任意の態様において、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ薬が、修飾（例えば、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つまたは複数のモチーフ）（薬剤の切断部位またはその近位にそのようなモチーフを含むものを含む）、６個のホスホロチオエート結合、およびリガンドを含むとき、かかる薬剤は、約０．０１から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇから約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図され、例えば、ＲＮＡｉ薬は、約０．０１５ｍｇ／ｋｇから約０．４５ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与され得る。
例えばＲＮＡｉ薬、例えば医薬組成物中のＲＮＡｉ薬は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
医薬組成物は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、または約２５分間以上のような時間をかけて静脈内に投与され得る。投与は、例えば、１か月、２か月、３か月、４か月またはそれ以上の期間、週１回、隔週（すなわち、２週間に１回）、定期的に繰り返してもよい。初期治療レジメン後、処置剤は、より少ない頻度で投与することができる。例えば、３か月間、週１回または２週間に１回の投与後、投与を、６か月間または１年以上の期間、月に１回繰り返してよい。
医薬組成物は、皮下投与により投与されてよい。
医薬組成物は、毎日１回投与し得て、またはｉＲＮＡは、一日を通して適当な間隔で、２回、３回またはそれ以上の部分用量として投与し得て、または持続注入もしくは放出制御製剤を通じた送達さえも使用して、投与し得る。その場合、各部分用量に含有されるｉＲＮＡは、１日あたり総用量を達成するために、対応してより少量でなくてはならない。投与量単位はまた、例えば数日間にわたってｉＲＮＡの徐放を提供する、従来型の徐放性製剤を使用して、数日間にわたる送達のために配合し得る。徐放性製剤は当技術分野で周知であり、特に、本発明の薬剤を使用し得る、特定部位への該薬剤送達のために有用である。この態様では、投与量単位は、相当する複数の１日量を含有する。より高用量を最初に投与し（すなわち、負荷用量）、その後により低用量を持続期間で投与してよい。
他の態様において、医薬組成物の単回投与は、引き続く用量が、３、４、または５日間以下の間隔で、または１、２、３、または４週間以下の間隔で投与されるように、長期にわたり続いてよい。本発明のいくつかの態様では、本発明の医薬組成物の単回用量は、週１回投与される。本発明の他の態様では、本発明の医薬組成物の単回用量は、月２回投与される。任意の態様において、ｉＲＮＡは、約１か月に１回から約四半期に１回（すなわち、約３カ月に１回）投与される。
医薬組成物は、例えば、肥満により血圧が上昇中の、または高レベルのＡＧＴの原因が存在する時期、例えば、妊娠高血圧中の対象に、無期限に投与される。
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全般的な健康状態および／または年齢、および存在するその他の疾患を含むが、これに限定されない、特定の要因が、対象を効果的に治療するのに要求される投与量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の組成物による対象の処置は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量およびインビボ半減期は、本明細書の他の箇所で記載されるように、従来の手順を使用して、または適当な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて、行い得る。
本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所投与（例えば経皮パッチによる）、例えばネブライザーを含む、粉剤またはエアロゾル剤の吸入または吹き入れ(insufflation)による経肺投与；気管内投与、鼻腔内投与、経上皮および経皮投与、経口投与または非経腸投与であってもよい。非経腸投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；例えば埋め込みデバイスを通じた真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましいこともある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。好適な局所製剤としては、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和されるものが挙げられる。好適な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（distearolyphosphatidyl）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されるか、またはそれと、特にカチオン性リポソームと複合体形成することができる。あるいは、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。好適な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１－２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩）が挙げられるが、これに限定されない。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号（引用により本明細書中に包含される）に詳述される。
Ａ．膜様分子アセンブリーを含んでなるｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法で使用されるｉＲＮＡは、例えばリポソームまたはミセルなどの膜様分子アセンブリー内の送達のために製剤し得る。本明細書で用いる用語“リポソーム”は、例えば１つの二重層または複数の二重層などの、少なくとも１つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層膜小胞および多重膜小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、一般的にｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては含んでもよい。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するため、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進むにつれて、ｉＲＮＡを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではｉＲＮＡが標的ＲＮＡに特異的に結合し得て、ｉＲＮＡを媒介し得る。場合によっては、リポソームもまた特異的に標的化され、例えばｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
ｉＲＮＡ薬を含有するリポソームは、種々の方法によって調製し得る。一例では、リポソームの脂質成分は、脂質成分とミセルが形成されるように、洗浄剤に溶解される。例えば脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗浄剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得て、非イオン性であってもよい。例示的な洗浄剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次にｉＲＮＡ薬調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基はｉＲＮＡ薬と相互作用して、ｉＲＮＡ薬の周囲で凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって洗浄剤を除去し、ｉＲＮＡ薬のリポソーム調製物を得る。
必要ならば、例えば凝縮を助ける担体化合物を、制御された添加によって縮合反応中に添加し得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）であり得る。ｐＨも調節することができ、凝縮を補助し得る。
送達ビークルの構造的構成要素としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む、安定したポリヌクレオチド送達ビークルを作製する方法は、例えばＷＯ９６／３７１９４（その内容全体を引用により本明細書中に包含する）にさらに記載される。リポソーム形成は、Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987;米国特許第4,897,355号;米国特許第5,171,678号;Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965;Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979;Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978;Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984;Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983;および、Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984に記載される例示的な方法の１つまたは複数の面も含み得る。送達ビークルとして使用される好適なサイズの脂質凝集体を調製する一般に使用される技術としては、超音波処理、および凍結解凍と押出の組み合わせが挙げられる（例えば、Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986を参照のこと）。一貫して小型（５０～２００ｎｍ）で比較的均一な凝集体が所望される場合は、顕微溶液化（microfluidization）を使用し得る(Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984)。これらの方法は、リポソーム内のｉＲＮＡ薬調製物の包埋に容易に適応される。
リポソームは、２つの大まかなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合してエンドソーム内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂して、それらの内容物を細胞質内へ放出する(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985)。
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、核酸と複合体を形成せず、むしろそれを封入する。核酸と脂質は、どちらも同様の荷電を持つため、複合体形成ではなく反発が起きる。それでもなおいくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養中で、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を細胞単層に送達するのに使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞内で検出された(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274)。
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば、中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
インビトロおよびインビボでリポソームを細胞内に導入するその他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号；同第５，１７１，６７８号；国際公開ＷＯ９４／００５６９号；国際公開ＷＯ９３／２４６４０号；国際公開ＷＯ９１／１６０２４号；Felgner,J.Biol.Chem.269:2550,1994;Nabel,Proc.Natl.Acad.Sci.90:11307,1993;Nabel,Human Gene Ther.3:649,1992;Gershon,Biochem.32:7143,1993;および、Strauss EMBO J.11:417,1992が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含んでなる系が研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が試験されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含んでなる非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚の真皮内へシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を容易にする上で、効果的であることを示唆した（Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466）。
リポソームはまた、“立体的安定化”リポソームを含み、本明細書で用いるこの用語は、１つまたは複数の特殊化された脂質を含んでなるリポソームを意味し、それは、リポソーム中に組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、増強された循環寿命をもたらす。立体的安定化リポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含んでなり、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論にとらわれることなく、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的安定化リポソームでは、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の延長は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込み低下に由来するものと考えられる（Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42;Wu et al., 癌 Research, 1993, 53, 3765）。
１つまたは複数の糖脂質を含んでなる種々のリポソームが、当技術分野で公知である。Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告している。これらの知見は、Gabizon ら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)によって詳しく説明された。どちらもＡｌｌｅｎらに付与された、米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４は、（１）スフィンゴミエリン、および（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含んでなる、リポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号(Webbら)は、スフィンゴミエリンを含んでなるリポソームを開示する。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含んでなるリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９（Limら）に開示される。
一態様において、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合できないが、インビボでマクロファージに取り込まれ、ｉＲＮＡ薬をマクロファージに送達するのに使用され得る。
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームには、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込むことができ；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化されたｉＲＮＡ薬を代謝および分解から保護することができる(Rosoff, in “Pharmaceutical Dosage Forms,” Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245)。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズおよび液量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、小型リポソームを形成し得て、それは核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合できる脂質－核酸複合体を形成し、ｉＲＮＡ薬送達をもたらす（ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの併用の説明については、例えばFelgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987および米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと）。
ＤＯＴＭＡ類縁体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ錯化小胞を形成することができる。リポフェクチン（商標）（Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.）は、生体組織培養細胞に、高アニオン性核酸を送達するための効果的薬剤であり、それは負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含んでなる。十分に正に帯電したリポソームを使用するとき、得られる複合体上の正味電荷もまた正である。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然発生的に付着して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞内に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販されているカチオン性脂質、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（“ＤＯＴＡＰ”）（Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana）は、オレオイル部分がエーテル結合でなくエステルによって結合することで、ＤＯＴＭＡと異なる。
その他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、２つの脂質タイプの１つと共役するカルボキシスペルミンを含む、多様な部分と共役しているものが挙げられ、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（“ＤＯＧＳ”）（Transfectam（商標）, Promega, Madison, Wisconsin）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（“ＤＰＰＥＳ”）などの化合物が挙げられる（例えば米国特許第５，１７１，６７８号を参照のこと）。
別のカチオン性脂質複合体は、ＤＯＰＥと組み合わされてリポソームに製剤されているコレステロール（“ＤＣ－Ｃｈｏｌ”）による、脂質の誘導体化を含む（Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991を参照のこと）。ポリリジンをＤＯＰＥに共役させて生成されるリポポリリジンが、血清存在下における形質移入に効果的であると報告されている（Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991）。特定の細胞系では、共役するカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的な形質移入を提供すると言われている。その他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Vical, La Jolla, California）、およびリポフェクトアミン（ＤＯＳＰＡ）（Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適したその他のカチオン性脂質は、ＷＯ９８／３９３５９およびＷＯ９６／３７１９４に記載される。
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームはその他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収に関連した副作用の低下、所望の標的における投与薬剤の蓄積増大、およびｉＲＮＡ薬を皮膚内に投与する可能性が挙げられる。いくつかの実施において、リポソームは、ｉＲＮＡ薬を上皮細胞に送達するのに、また例えば皮膚内などの皮膚組織内へのｉＲＮＡ薬の浸透を高めるのに使用される。例えばリポソームは、局所的に塗布し得る。リポソームとして製剤された薬剤の皮膚への局所送達が、実証されている（例えば、Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265;Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988;Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987;Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987;Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983;Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987を参照のこと）。
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含んでなるシステムが研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が決定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含んでなる非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮内に薬剤を送達するのに使用された。ｉＲＮＡ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に作製され得る。このような変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい孔を通り抜けて、リポソームが浸透できるようにし得る。例えばトランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、通常は界面活性剤である表面エッジアクティベーターを、標準リポソーム組成物に添加して、作製し得る。ｉＲＮＡ薬を含むトランスファーソームは、皮膚内のケラチノサイトにｉＲＮＡ薬を送達するために、例えば感染によって皮下送達し得る。無傷の哺哺乳動物皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。さらに脂質特性のために、これらのトランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、自己最適化し（例えば皮膚孔の形状に適応する）、自己修復し得て、断片化することなく頻繁にそれらの標的に到達し得て、自己装填することが多い。
本発明を適用できるその他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１１号；２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号；２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，０８７号、および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，５２８号に記載される。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号もまた、本発明を適用できる製剤を記載する。
トランスファーソームはなおも別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビークルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるために、小滴よりも小さい孔を通じて容易に浸透できる脂肪滴と説明され得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応でき、例えばそれらは自己最適化し（皮膚孔形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化することなくそれらの標的に到達し、自己装填することが多い。トランスファーソームを作製するために、通常は界面活性剤である表面縁アクティベーターを標準リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム仲介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に、効果的であることが示されている。
界面活性剤には、（マイクロエマルジョンを含む）エマルジョンおよびリポソームなどの製剤における、幅広い適用がある。天然および合成双方の多数の異なる界面活性剤タイプの特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による。親水性基（“ヘッド”としても公知）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬および美容製品における幅広い用途があり、広いｐＨ値範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最もよく見られる構成成分である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成成分は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最もよく使用される構成成分である。
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
医薬品、製剤中およびエマルジョン中の界面活性剤の使用は、概説されている（Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285）。
本発明の方法で使用されるｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供し得る。“ミセル”は、その中で、分子の疎水性部分が全て内側を向き、親水性部分が周囲の水性相に接したままであるように、両親媒性分子が球状構造に配列される、特定タイプの分子アセンブリーと、本明細書で定義される。環境が疎水性であれば、逆の配置が存在する。
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩、およびミセル形成化合物の水溶液を混合して、調製してもよい。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレアート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンとその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類縁体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類縁体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に、またはその後に、添加してもよい。混合ミセルは、成分を実質的にどのように混合しても形成するが、より小型のミセルを提供するためには、激しく混合される。
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する、第１のミセル組成物が調製される。次に第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩、および少なくとも１つのミセル形成化合物を混合して調製され、その後に、激しい混合を伴う残りのミセル形成化合物の添加が続く。
フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。あるいは、ミセル形成成分と共に、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを添加してもよい。グリセリンなどの等張剤もまた、混合ミセル組成物形成後に添加してもよい。
ミセル製剤を噴霧として送達するためには、該製剤をエアロゾル分配装置に入れて、分配装置に噴射剤を装填し得る。加圧下にある噴霧剤は、分配装置内で液体形態である。成分の比率は、水性相と噴射剤相が１つになるように、すなわち１つの相になるように調節される。２つの相がある場合、例えば定量バルブを通じて内容物の一部を分散する前に、分配装置を振とうする必要がある。医薬品の分注用量は、定量バルブから精微噴霧で噴射される。
噴射剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルが挙げられる。任意の態様において、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２ーテトラフルオロエタン）を使用してもよい。
必須成分の特定濃度は、比較的簡単な実験法によって決定され得る。口腔を通じた吸収のためには、注射を通じた用量、または胃腸管を通じた投与の、例えば少なくとも２倍または３倍に増大させることが、望ましいことが多い。
Ｂ．脂質粒子
例えば本発明のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、例えばＬＮＰなどの脂質製剤中で完全にカプセル化して、またはその他の核酸－脂質粒子を形成してもよい。
本明細書で用いる用語“ＬＮＰ”は、安定核酸－脂質粒子を意味する。ＬＮＰは、一般的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えばＰＥＧ脂質複合体）を含有する。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長期循環寿命を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身的用途のために極めて有用である。ＬＮＰとしては、国際公開第００／０３６８３号に記載のカプセル化縮合剤－核酸複合体を含む“ｐＳＰＬＰ”が挙げられる。本発明の粒子は、一般的に約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より一般的に約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より一般的に約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も一般的に約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均径を有して、実質的に無毒である。これに加えて、本発明の核酸－脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸－脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号；および国際公開第９６／４０９６４号で開示される。
一態様において、脂質と薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲である。上記の範囲の中間にある範囲も、本発明の一部と考えられる。
カチオン性脂質は、例えばＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ（Dilinoleyoxy）－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ（Dilinoleyoxy）－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（propanedio）（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはその類縁体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％または約４０モル％を構成し得る。
別の態様において、化合物２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランを使用して、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を作成し得る。２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、引用によって本明細書に包含させる、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号に記載される。
一態様において、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モル百分率）を含み、粒度６３．０±２０ｎｍおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７である。
イオン性／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ），ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物を含むが、これに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質とすることもできる。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
粒子の凝集を阻害する複合型脂質（conjugated lipid）は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）を含むが、これに限定されない、ＰＥＧ－脂質、またはその混合物であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、例えばＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子の凝集を妨げる複合型脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％～約２０モル％または約２モル％であり得る。
ある態様において、核酸－脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
一態様において、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号（引用により本明細書中に包含させる）を参照のこと）、コレステロール（Sigma-Aldrich）、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６（Avanti Polar Lipids）を使用して、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわちＬＮＰ０１粒子）を作製し得る。エタノール中の各原液は、次のように調製し得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次にＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６の原液を、例えば４２：４８：１０のモル比で合わせ得る。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５～４５％で最終酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００ｍＭになるように、（例えばｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）水性ｄｓＲＮＡと混合し得る。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、一般的に、混合に際して自然発生的に形成する。所望の粒度分布に依存して、結果として生じるナノ粒子混合物は、例えばＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Northern Lipids,Inc）などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネートメンブラン（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通じて押出し得る。ある場合において、押出ステップは省かれ得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば透析またはタンジェンシャルフロー濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４など、約ｐＨ７のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で交換し得る。
Figure 2022104985000017
ＬＮＰ０１製剤は、例えば引用により本明細書中に包含させる、ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載される。
さらなる例示的脂質ｄｓＲＮＡ製剤は、表１に記載される。
Figure 2022104985000018
Figure 2022104985000019
Figure 2022104985000020
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジアルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ－ＤＭＧ：ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（Ｃ１４－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１４）（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ－ＤＳＧ：ＰＥＧ－ジスチリルグリセロール（Ｃ１８－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１８）（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ－ｃＤＭＡ：ＰＥＧ－カルバモイル－１，２－ジミリスチルオキシプロピルアミン（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＳＮＡＬＰ（ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含んでなる製剤は、２００９年４月１５日に出願された国際公開ＷＯ２００９／１２７０６０号（引用により本明細書中に包含させる）に記載される。
ＸＴＣを含んでなる製剤は、例えば、２００９年１月２９日に出願された米国仮出願第６１／１４８，３６６号；２００９年３月２日に出願された米国仮出願第６１／１５６，８５１号；２００９年６月１０日に出願された米国仮出願第 号；２００９年７月２４日に出願された米国仮出願第６１／２２８，３７３号；２００９年９月３日に出願された米国仮出願第６１／２３９，６８６号、および２０１０年１月２９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号（それらは、引用により本明細書中に包含される）に記載される。
ＭＣ３を含んでなる製剤は、例えば、２０１０年６月１０日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号に記載される（その内容全体を引用により本明細書中に包含させる）。
ＡＬＮＹ－１００を含む製剤は、例えば、２００９年１１月１０日に出願された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第０９／６３９３３号（引用により本明細書中に包含させる）に記載される。
Ｃ１２－２００を含有する製剤は、２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号、および２０１０年５月５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号（それらは、引用により本明細書中に包含される）に記載される。
イオン性／カチオン性脂質の合成
例えば本発明の核酸－脂質粒子で使用されるカチオン性脂質などの化合物のいずれもが、実施例でより詳細に記載される方法を含む、既知の有機合成技術によって調製され得る。他に特記しない限り、全ての置換基は、以下に定義するとおりである。
“アルキル”は、１～２４個の炭素原子を含有する、直鎖または分枝状、非環式または環式、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシルなどが挙げられ；他方、飽和分枝状アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ；他方、不飽和環式アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。
“アルケニル”は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義されるようなアルキルを意味する。アルケニルには、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分枝状アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニルなどが挙げられる。
“アルキニル”は、隣接する炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する、上で定義されるようなあらゆるアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分枝状アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－メチル－１ブチニルなどが挙げられる。
“アシル”は、以下に定義するとおり、炭素が結合点でオキソ基によって置換される、あらゆるアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば－Ｃ（＝Ｏ）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および－Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。
“ヘテロ環”は、下のヘテロ環のいずれかがベンゼン環に融合する二環を含む、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１または２個のヘテロ原子を含有する、飽和、不飽和または芳香族のいずれかの５～７員の単環、または７～１０員の二環、ヘテロ環式環を意味し、ここで、窒素および硫黄ヘテロ原子は所望により酸化されていてよく、窒素ヘテロ原子は所望により四級化されていてよい。ヘテロ環は、あらゆるヘテロ原子または炭素原子を介して付着し得る。ヘテロ環としては、以下に定義されるヘテロアリールが挙げられる。ヘテロ環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（piperidinyl）、ピペリジニル（piperizynyl）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプルイミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる
用語“置換されていてもよいアルキル”、“置換されていてもよいアルケニル”、“置換されていてもよいアルキニル”、“置換されていてもよいアシル”および“置換されていてもよいヘテロ環”は、置換されるとき、少なくとも１つの水素原子が置換基で置換されていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置換される。この点において、置換基としては、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、－ＣＮ、－ＯＲｘ、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ，－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ、および－ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられ、式中、ｎは０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは同じかまたは異なり、独立して水素、アルキルまたはヘテロ環であり、該アルキルおよびヘテロ環置換基のそれぞれは、１つまたは複数のオキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲｘ、ヘテロ環、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ、および－ＳＯｎＮＲｘＲｙによってさらに置換されていてよい。
“ハロゲン”は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
ある態様において、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の手順は、当業者に周知である（例えばProtective Groups in 有機合成, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999を参照のこと）。要約すれば、本発明の文脈では、保護基は、官能基の望ましくない反応性を低下させまたは排除する、任意の基である。保護基は官能基に付加されて、特定の反応中にその反応性をマスクし、その後、除去されて元の官能基を曝露し得る。いくつかの態様では、“アルコール保護基”が使用される。“アルコール保護基”は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低下させまたは排除する、任意の基である。保護基は、当技術分野で周知の技術を使用して、付加され、そして除去され得る。
式Ａの合成
ある態様において、本発明の核酸脂質粒子は、式Ａ、
Figure 2022104985000021
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、それぞれ置換されていてもよい、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、Ｒ３およびＲ４は、独立して、低級アルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は、一体となって、置換されていてもよいヘテロ環式環を形成し得る）のカチオン性脂質を使用して製剤される。ある態様において、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）である。一般に、上の式Ａの脂質は、他に特記しない限り、全ての置換基が上で定義されるとおりである、以下の反応スキーム１または２によって作成され得る。
Figure 2022104985000022
脂質Ａ（式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、それぞれ置換されていてもよい、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、Ｒ３およびＲ４は独立して低級アルキルであり、またはＲ３およびＲ４は一体となって、置換されていてもよいヘテロ環を形成し得る）は、スキーム１に従って調製され得る。ケトン１および臭化物２は購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製し得る。１と２の反応により、ケタール３が得られる。ケタール３をアミン４で処理して、式Ａの脂質を得る。式Ａの脂質は、式５（式中、Ｘは、ハロゲン、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などから選択されるアニオン対イオンである）の有機塩によって、対応するアンモニウム塩に変換し得る。
Figure 2022104985000023
あるいは、ケトン１出発物質は、スキーム２に従って調製され得る。グリニャール試薬６およびシアン化物７は購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製され得る。６と７の反応は、ケトン１をもたらす。ケトン１の対応する式Ａの脂質への変換は、スキーム１に記載されるとおりである。
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（すなわち（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸）の調製は、次のとおりであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－オール（０．５３ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を希塩酸で洗浄し、続いて希釈炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。無水硫酸マグネシウム上で有機画分を乾燥させ、濾過して、回転蒸発器上で溶媒を除去した。１～５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を用いて、残留物をシリカゲルカラム（２０ｇ）に通過させた。精製産物を含有する画分を合わせて溶媒を除去し、無色の油状物（０．５４ｇ）を得た。
ＡＬＮＹ－１００の合成
以下のスキーム３を用いて、ケタール５１９［ＡＬＮＹ－１００］の合成を実施した。
Figure 2022104985000024
５１５の合成
ニ口ＲＢＦ（１Ｌ）内の、２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）の溶液を０ ０℃において窒素雰囲気下でゆっくり添加した。添加完了後、反応混合物を室温に加温し、次に４時間加熱還流した、反応の進捗は、ＴＬＣによってモニターした。反応完了（ＴＬＣによる）後、混合物を０ ０℃に冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液の慎重な添加によってクエンチした。反応混合物を室温で４時間撹拌し、濾過した。残渣をＴＨＦでよく洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃ＨＣｌで希釈して、室温で２０分間撹拌した。揮発性（ｖｏｌａｔｉｌｉｔｉｅｓ）を真空下で取り除き、５１５の塩酸塩を白色固体として得た。収量：７．１２ｇ １Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（ｂｒｏａｄ、２Ｈ）、５．６８（ｓ、２Ｈ）、３．７４（ｍ、１Ｈ）、２．６６－２．６０（ｍ、２Ｈ）、２．５０－２．４５（ｍ、５Ｈ）。
５１６の合成
２５０ｍＬのニ口ＲＢＦ中、１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）を添加して、窒素雰囲気下で０ ０℃に冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中、Ｎ－（ベンジルオキシ－カルボニルオキシ）－スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）をゆっくり添加後、反応混合物が室温に暖まるまで放置した。反応完了後（ＴＬＣにより、２～３時間後）、混合物を１Ｎ ＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４上で有機層を乾燥させ、溶媒を蒸発させて粗製物を得て、それをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、５１６を粘着性塊として得た。収量：１１ｇ（８９％）．１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６－７．２７（ｍ、５Ｈ）、５．６９（ｓ、２Ｈ）、５．１２（ｓ、２Ｈ）、４．９６（ｂｒ．、１Ｈ）、２．７４（ｓ、３Ｈ）、２．６０（ｍ、２Ｈ）、２．３０－２．２５（ｍ、２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］－２３２．３（９６．９４％）．
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成
室温において、５００ｍＬの１口ＲＢＦ中、シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を２２０ｍＬのアセトンおよび水（１０：１）の溶液中に溶解し、それにＮ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）を添加し、次いでｔｅｒｔ－ブタノール中の４．２ｍＬの７．６％ＯｓＯ４（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）溶液を添加した。反応完了後（約３時間後）、固体Ｎａ２ＳＯ３の添加によって混合物をクエンチし、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈して、水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、次いで飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）、最後に塩水（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、真空中で溶媒を除去した。粗製物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製からジアステレオマー混合物を得て、それを予備ＨＰＬＣによって分離した。収量：－６ｇ粗製。
５１７Ａ－ピーク－１（白色固体）、５．１３ｇ（９６％）。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９－７．３１（ｍ，５Ｈ），５．０４（ｓ，２Ｈ），４．７８－４．７３（ｍ，１Ｈ），４．４８－４．４７（ｄ，２Ｈ），３．９４－３．９３（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），１．７２－１．６７（ｍ，４Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ－［Ｍ＋Ｈ］－２６６．３，［Ｍ＋ＮＨ４＋］－２８３．５存在、ＨＰＬＣ－９７．８６％。立体化学はＸ線によって確認した。
５１８の合成
化合物５０５の合成について記載されるものと類似の方法を用いて、化合物５１８を無色の油状物として得た（１．２ｇ、４１％）。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５－７．３３（ｍ，４Ｈ），７．３０－７．２７（ｍ，１Ｈ），５．３７－５．２７（ｍ，８Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．５８－４．５７（ｍ，２Ｈ），２．７８－２．７４（ｍ，７Ｈ），２．０６－２．００（ｍ，８Ｈ），１．９６－１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．３７－１．２５（ｂｒ ｍ，３６Ｈ），０．８７（ｍ，６Ｈ）．ＨＰＬＣ－９８．６５％。
化合物５１９の合成の基本手順
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）溶液をＴＨＦ中のＬＡＨ（１Ｍ，２当量）氷冷溶液に、滴下した。添加完了後、混合物を４０℃で０．５時間加熱し、次に氷浴上で再度冷却した。混合物を飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液によって注意深く加水分解し、次にセライトを通して濾過して油状物に濃縮した。カラムクロマトグラフィーから、純粋な５１９を無色の油状物として得た（１．３ｇ、６８％）。１３Ｃ ＮＭＲ δ＝１３０．２，１３０．１（ｘ２），１２７．９（ｘ３），１１２．３，７９．３，６４．４，４４．７，３８．３，３５．４，３１．５，２９．９（ｘ２），２９．７，２９．６（ｘ２），２９．５（ｘ３），２９．３（ｘ２），２７．２（ｘ３），２５．６，２４．５，２３．３，２２６，１４．１；エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２（Ｍ＋Ｈ）＋の分子量、計算値６５４．６、測定値６５４．６。
標準法または押出のない方法のいずれかによって調製された製剤は、同様の方法で特徴付けることができる。例えば製剤は、典型的に外観検査によって特徴付けられる。それらは凝集体または沈降物を含まない、白みがかった半透明溶液であるべきである。脂質－ナノ粒子の粒度および粒度分布は、例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を使用して、光散乱によって測定し得る。粒度は、例えば４０～１００ｎｍなどの、約２０～３００ｎｍであるべきである。粒度分布は、単峰型分布であるべきである。製剤ならびに封入画分中の総ｄｓＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを使用して推定された。製剤されたｄｓＲＮＡのサンプルを、例えば０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００などの製剤破壊性界面活性剤の存在または不在下で、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Molecular Probes）などのＲＮＡ結合色素と共にインキュベートし得る。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準曲線と比較して、界面活性剤含有サンプルからのシグナルによって決定され得る。封入画分は、総ｄｓＲＮＡ含量から、“遊離”ｄｓＲＮＡ含量（界面活性剤不在下のシグナルにより測定される）を減じて決定される。封入ｄｓＲＮＡ割合は、典型的に＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤では、粒度は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、一般的に、少なくとも約５０ｎｍから少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍから少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍから少なくとも約９０ｎｍである。
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい可能性がある。ある態様において、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるｄｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。好適な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容される塩（例えばナトリウム）が挙げられる。ある態様において、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としてはさらに、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む、顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロ粒子またはナノ粒子を形成してもよい。ｄｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（pollulan）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。好適な複合化剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸）、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号（それらは各々、引用により本明細書中に包含される）に詳細に記載される。
非経腸、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は、滅菌水溶液を含んでいてよく、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、ならびに浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容される担体または賦形剤などを含むが、これに限定されない、その他の好適な添加剤とを含有し得る。
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が挙げられるが、これに限定されない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含むが、これに限定されない、種々の成分から生成され得る。肝臓がんなどの肝臓の障害を治療する場合、特に好ましいのは、肝臓を標的とする製剤である。
好都合には単位投与量形態で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその両方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば、生成物を整形することで調製される。
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されない、多数の可能な投与量形態のいずれかに製剤され得る。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として製剤され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定化剤もまた含有し得る。
Ｃ．追加的な製剤
ｉ．エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製し製剤され得る。エマルジョンは、一般的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１種の不均一液体である（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照のこと）。エマルジョンは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含んでなる、二相性システムであることが多い。一般的に、エマルジョンは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンと称される。あるいは、油性相がバルク水相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョンと称される。エマルジョンは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、さらなる成分を含有し得る。乳化剤、安定化剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルジョン中に存在し得る。医薬品エマルジョンはまた、例えば油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンなどの場合、３つ以上の相を含んでなる複数エマルジョンであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルジョンが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンを提供する。
エマルジョンは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。エマルジョンの分散または不連続相は、頻繁に、外部または連続相内によく分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルジョン様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルジョン相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョン相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えばAnsel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照のこと）。
表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルジョン製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えばAnsel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199）を参照のこと）。界面活性剤は、一般的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含んでなる。界面活性剤の親水性と疎水性の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上で有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えばAnsel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285を参照のこと）。
エマルジョン製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルジョンを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
多岐にわたる非乳化材料もまたエマルジョン製剤に含まれて、エマルジョンの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤および抗酸化剤が挙げられる（Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルジョンを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルジョンは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いため、これらの製剤には防腐剤が組み込まれることが多い。エマルジョン製剤に含まれる一般に使用される防腐剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルジョン製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；ならびに、クエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口、および非経腸経路を通じたエマルジョン製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照のこと）。経口送達のためのエマルジョン製剤は、製剤の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの観点からの効率のために、幅広く使用されている（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照のこと）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルジョンとして経口投与されている材料の一つである。
ｉｉ．マイクロエマルジョン
本発明の一態様において、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照のこと）。一般的に、マイクロエマルジョンは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。従って、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215）。マイクロエマルジョンは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む、３～５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルジョンが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（Schott, in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271）。
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルジョンの製剤法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335を参照のこと）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルジョンの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されない。通常、エタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしながら、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤の使用なしに調製され得、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルジョン系は、当技術分野で公知である。水性相は、一般的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されない。油性相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８－Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８－Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されない。
マイクロエマルジョンは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）が、ペプチドを含む薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205を参照のこと）。マイクロエマルジョンは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体投与量形態に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143を参照のこと）。マイクロエマルジョンは多くの場合、それらの成分を環境温度で共に合わせた場合に、自然発生的に形成することができる。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを製剤する場合に、特に有利となり得る。マイクロエマルジョンは、美容および医薬用途の両方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
本発明のマイクロエマルジョンは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などのさらなる成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本発明のマイクロエマルジョン中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。これらの各クラスについては、上に記載した。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のｉＲＮＡ薬は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせを含む、その他の方法によって製造してもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一態様において、本発明は、種々の浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の両方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属するとして分類され得る（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照のこと）。上記の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明する。
界面活性剤（または“表面活性剤”）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照のこと）；およびＦＣ－４３などのペルフルオロ化合物エマルジョン．Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252）が挙げられる。
浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１～２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、およびそのモノ－およびジ－グリセリド（すなわちオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる。（例えば、Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654を参照のこと）。
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman ＆ Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935を参照のこと）。種々の天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。従って、用語“胆汁酸塩”は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。好適な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583を参照のこと）。
本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、ＤＮａｓｅ阻害剤の役割も果たすというさらなる利点を有する（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339）。好適なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（homovanilate））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトン（エナミン）のＮ－アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されない。（例えば、Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51を参照のこと）。
本明細書で用いる、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えば、Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug 担体 Systems, 1990, 7, 1-33を参照のこと）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）が挙げられる。
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本発明の医薬およびその他の組成物に添加し得る。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（Junichiらの、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Lolloらの、国際公開第９７／３０７３１号）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Invitroge(商標)； Carlsbad, CA）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ＭＡＸ（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ２０００ ＣＤ（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、ｉＲＮＡＭＡＸ（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Invitroge(商標)；Carlsbad, CA）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２形質移入試薬（Roche;Grenzacherstrasse, Switzerland）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ形質移入試薬(Grenzacherstrasse, Switzerland）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ形質移入試薬（Grenzacherstrasse, Switzerland）、またはＦｕｇｅｎｅ（Grenzacherstrasse, Switzerland）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）試薬（Promega（登録商標）; Madison, WI）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）形質移入試薬（Promega（登録商標）; Madison, WI）、Ｔｆｘ（商標）－２０試薬（Promega（登録商標）; Madison, WI）、Ｔｆｘ（商標）－５０試薬（Promega（登録商標）; Madison, WI）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（OZ Biosciences; Marseille, France）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（OZ Biosciences; Marseille, France）、ＴｒａｎｓＰａｓｓ（商標）Ｄ１形質移入試薬（New England Biolabs(商標); Ipswich, MA, USA）、ＬｙｏＶｅ(商標)／ＬｉｐｏＧｅｎ(商標)（Invitroge(商標)；San Diego, CA, USA）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ形質移入試薬（Genlantis(商標); San Diego, CA, USA）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ(登録商標) 形質移入試薬（Genlantis(商標); San Diego, CA, USA）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ(登録商標)形質移入試薬（Genlantis(商標); San Diego, CA, USA）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ(登録商標)２形質移入試薬（Genlantis(商標); San Diego, CA, USA）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬（Genlantis(商標); San Diego, CA, USA）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ(登録商標) 形質移入試薬（Genlantis(商標); San Diego, CA, USA）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ(商標) 形質移入試薬（Genlantis(商標); San Diego, CA, USA ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Bioline(商標); Taunton, MA, USA）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Biolin(商標); Taunton, MA, USA）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（B-Bridge International(商標); Mountain View, CA, USA）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（B-Bridge International(商標); Mountain View, CA, USA）、またはＨｉＦｅｃｔ(商標)（B-Bridge International(商標), Mountain View, CA, USA）などが挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２－ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンを含む、その他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。
ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、また製剤中に担体化合物が組み込まれる。本明細書で用いる“担体化合物”または“担体”は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させる、インビボ過程によって核酸と認識される、核酸またはその類縁体を意味し得る。核酸および担体化合物の、一般的に、後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵器で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）酸または４－アセトアミド－４’－イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA ＆ Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、“薬学的担体”または“賦形剤”は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤または任意の他の薬理学的に不活性なビークルである。賦形剤は液体または固体であり得て、核酸および所定の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望のバルク、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式をもとに選択される。一般的な薬学的担体としては、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸と有害反応しない、非経腸投与に適する、薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤し得る。好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸の局所投与のための製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の好適な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、非経腸投与に適する、薬学的に許容される有機または無機賦形剤を使用し得る。
好適な薬学的に許容される賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン（viscous paraffin）、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｖｉｉ．その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。従って、例えば組成物は、例えば、痒み止め（antipruritics）、収斂剤（astringent）、局所麻酔薬または抗炎症剤などのさらなる適合性の薬理的に活性な材料を含有することができ、または染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、濃化剤、および安定化剤などの本発明の組成物の種々の剤形を物理的に製剤する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸(複数可)と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、香味料および／または芳香族物質などの助剤と混合される。
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
ある態様において、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ｉＲＮＡ機序によって機能し、溶血性障害の治療に有用な１つまたは複数の薬剤を含む。このような薬剤の例としては、抗炎症剤、抗脂肪症薬、抗ウイルス剤、および／または抗線維症薬が挙げられるが、これらに限定されない。それに加えて、シリマリンなどの肝臓を保護するのに一般に使用されるその他の物質もまた、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用し得る。肝臓疾患の治療に有用なその他の薬剤としては、テルビブジンと、エンテカビルと、テラプレビルおよび例えばTungらの米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号、米国特許出願公開第２００４／０１６７１１６号、および米国特許出願公開第２００３／０１４４２１７号；およびＨａｌｅらの、米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号で開示されたものなどのプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための細胞培養物または実験動物中などで、標準薬学的手順によって決定し得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与量範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる投与量形態および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で取り上げる方法で使用される任意の化合物について、最初に、治療的有効用量を細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養中で決定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）を含む、化合物の、または適当な場合には、標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、上記で考察されるそれらの投与に加えて、ＡＧＴ発現によって媒介される病理過程の治療に効果的なその他の既知の作用物質と組み合わせて、投与され得る。いずれにしても処置を行う医師は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
ＶＩＩ．発明の方法
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物、または本発明のｉＲＮＡを含むベクターを、ＡＧＴ関連疾患、障害、および／または病状（例えば、高血圧）を有するか、またはそれをを発症し易い対象に投与することを含む、治療法および予防法を提供する。
一面において、本発明は、ＡＧＴ発現の低下により利点を有し得る障害、例えば、ＡＧＴ関連疾患、例えば高血圧、例えば、境界域高血圧（高血圧前症としても公知）、原発性高血圧（本態性高血圧または特発性高血圧としても公知）、二次性高血圧（非本態性高血圧としても公知）、高血圧緊急症（悪性高血圧としても公知）、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧（例えば、子癇前症、子癇および出産後の子癇前症）、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧（腎性高血圧としても公知）、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害（末梢血管疾患を含む）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心室線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、レニン腫症候群（reninoma）、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺／副甲状腺疾患、心不全（例えば、左心室収縮機能障害）、心筋梗塞、狭心症、卒中、真性糖尿病（例えば、糖尿病性腎症）、腎疾患、例えば、要すれば妊娠に関連する慢性腎臓病または糖尿病性腎症、腎不全、例えば、慢性腎不全、認知機能障害（例えば、アルツハイマー）、および全身性硬化症（例えば、強皮症腎クリーゼ）を有する対象の処置法を提供する。任意の態様において、ＡＧＴ関連疾患には、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）または胎児発育不全が含まれる。本発明の処置法（および使用）は、対象、例えばヒトに、治療的有効量の、ＡＧＴ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ薬またはＡＧＴ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ薬を含む医薬組成物を投与して、それによりＡＧＴ発現の低下により利点を有し得る障害を有する対象を処置することを含む。
一面において、本発明は、ＡＧＴ発現の低下により利点を有し得る障害を有する対象における少なくとも１つの症状、例えば、ＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧、例えば、境界域高血圧（高血圧前症としても公知）、原発性高血圧（本態性高血圧または特発性高血圧としても公知）、二次性高血圧（非本態性高血圧としても公知）、高血圧緊急症（悪性高血圧としても公知）、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧（例えば、子癇前症、子癇および出産後の子癇前症）、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧（腎性高血圧としても公知）、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害（末梢血管疾患を含む）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心室線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、レニン腫症候群（reninoma）、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺／副甲状腺疾患、心不全（例えば、左心室収縮機能障害）、心筋梗塞、狭心症、卒中、真性糖尿病（例えば、糖尿病性腎症）、腎疾患、例えば、要すれば妊娠に関連する慢性腎臓病または糖尿病性腎症、腎不全、例えば、慢性腎不全、認知機能障害（例えば、アルツハイマー）、および全身性硬化症（例えば、強皮症腎クリーゼ）を阻止する方法を提供する。任意の態様において、ＡＧＴ関連疾患には、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）または胎児発育不全が含まれる。この方法は、対象に、治療的有効量の、本発明のｉＲＮＡ薬、例えばｄｓＲＮＡ、またはベクターを投与して、それによりＡＧＴ発現の低下により利点を有し得る障害を有する対象における少なくとも１つの症状を阻止することを含む。
別の面において、本発明は、対象、例えば、ＡＧＴ発現の低下および／または阻害により利点を有し得る障害を有する対象の処置のための、治療的有効量の本発明のｉＲＮＡ薬の使用を提供する。
さらなる面において、本発明は、対象、例えば、ＡＧＴ発現の低下により利点を有し得る障害、例えば、ＡＧＴ関連疾患、例えば高血圧、例えば、境界域高血圧（高血圧前症としても公知）、原発性高血圧（本態性高血圧または特発性高血圧としても公知）、二次性高血圧（非本態性高血圧としても公知）、高血圧緊急症（悪性高血圧としても公知）、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧（例えば、子癇前症、子癇および出産後の子癇前症）、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧（腎性高血圧としても公知）、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害（末梢血管疾患を含む）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心室線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、レニン腫症候群（reninoma）、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺／副甲状腺疾患、心不全（例えば、左心室収縮機能障害）、心筋梗塞、狭心症、卒中、真性糖尿病（例えば、糖尿病性腎症）、腎疾患、例えば、要すれば妊娠に関連する慢性腎臓病または糖尿病性腎症、腎不全、例えば、慢性腎不全、認知機能障害（例えば、アルツハイマー）、および全身性硬化症（例えば、強皮症腎クリーゼ）などを有する対象などの、ＡＧＴ発現の低下および／または阻害により利点を有し得る障害を有する対象を処置するための医薬の製造における、ＡＧＴ遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ薬、例えば、ｄｓＲＮＡ、またはＡＧＴ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ薬を含む医薬組成物の使用を提供する。任意の態様において、ＡＧＴ関連疾患は、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）または胎児発育不全を含む。
別の面において、本発明は、ＡＧＴ発現の低下および／または阻害により利点を有し得る障害、例えばＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧、例えば、境界域高血圧（高血圧前症としても公知）、原発性高血圧（本態性高血圧または特発性高血圧としても公知）、二次性高血圧（非本態性高血圧としても公知）、高血圧緊急症（悪性高血圧としても公知）、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧（例えば、子癇前症、子癇および出産後の子癇前症）、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧（腎性高血圧としても公知）、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害（末梢血管疾患を含む）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心室線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、レニン腫症候群（reninoma）、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺／副甲状腺疾患、心不全（例えば、左心室収縮機能障害）、心筋梗塞、狭心症、卒中、真性糖尿病（例えば、糖尿病性腎症）、腎疾患、例えば、要すれば妊娠に関連する慢性腎臓病または糖尿病性腎症、腎不全、例えば、慢性腎不全、認知機能障害（例えば、アルツハイマー）、および全身性硬化症（例えば、強皮症腎クリーゼ）などを有する対象における少なくとも１つの症状を阻止するための、本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。任意の態様において、ＡＧＴ関連疾患は、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）または胎児発育不全を含む。
さらなる面において、本発明は、ＡＧＴ発現の低下および／または阻害により利点を有し得る障害、例えばＡＧＴ関連疾患、例えば、高血圧、例えば、境界域高血圧（高血圧前症としても公知）、原発性高血圧（本態性高血圧または特発性高血圧としても公知）、二次性高血圧（非本態性高血圧としても公知）、高血圧緊急症（悪性高血圧としても公知）、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧（例えば、子癇前症、子癇および出産後の子癇前症）、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧（腎性高血圧としても公知）、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害（末梢血管疾患を含む）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心室線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、レニン腫症候群（reninoma）、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺／副甲状腺疾患、心不全（例えば、左心室収縮機能障害）、心筋梗塞、狭心症、卒中、真性糖尿病（例えば、糖尿病性腎症）、腎疾患、例えば、要すれば妊娠に関連する慢性腎臓病または糖尿病性腎症、腎不全、例えば、慢性腎不全、認知機能障害（例えば、アルツハイマー）、および全身性硬化症（例えば、強皮症腎クリーゼ）などを有する対象における少なくとも１つの症状の阻止のための医薬の製造における、本発明のｉＲＮＡ薬の使用を提供する。任意の態様において、ＡＧＴ関連疾患は、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）または胎児発育不全を含む。
一態様において、ＡＧＴを標的とするｉＲＮＡ薬は、該ｄｓＲＮＡ薬をＡＧＴ関連疾患を有する対象に投与するとき、例えば、対象の細胞、組織、血液またはその他の組織または体液中のＡＧＴレベルを、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％以上低下させるように、該対象に投与される。好ましい態様において、ＡＧＴレベルは少なくとも２０％低下される。
本発明の方法および使用は、標的ＡＧＴ遺伝子の発現が、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、または約８０時間に亘って低下するように、本明細書に記載の組成物を投与することを含む。一態様において、標的ＡＧＴ遺伝子の発現は、少なくとも約２、３、４、５、６、７日間以上、例えば約１週間、２週間、３週間、または約４週間以上などの長期間にわたって低下する。
本発明の方法および使用に従うｄｓＲＮＡの投与は、ＡＧＴ関連疾患を有する対象において、このような疾患または障害の重症度、徴候、症状および／またはマーカーの低下をもたらしてもよい。“低下”とは、この文脈中、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％であり得る。好ましい態様において、ＡＧＴレベルは少なくとも２０％低下される。
疾患の治療または予防の効能は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、疼痛減少、生活の質、治療効果維持に必要な薬剤用量、疾病マーカレベルまたは治療されるもしくは予防目標である所定の疾患に適する任意の他の測定可能パラメータレベルを測定することで評価し得る。このようなパラメーターのいずれか１つ、またはパラメーターの任意の組み合わせを測定することで、治療または予防有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば異脂肪血症高血圧治療の効能は、例えば血圧を周期的にモニターすることで、評価してもよい。最初の読み取りと後の読み取りの比較は、治療が効果的かどうかの指標を医師に提供する。このようなパラメーターのいずれか１つ、またはパラメーターの任意の組み合わせを測定することで、治療または予防有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＡＧＴを標的にするｉＲＮＡまたはその医薬組成物の投与との関連で、ＡＧＴ関連疾患“に対して効果的”とは、臨床的に適当な様式での投与が、少なくとも統計学的に有意な割合の患者に、症状改善、治癒、疾患低減、延命、生活の質の改善、またはＡＧＴ関連疾患および関連原因の治療に精通している医者によって、好ましいと一般に認められているその他の効果などの有益な効果をもたらすことを意味する。
病態の１つまたは複数のパラメーターに統計的に有意な改善がある場合、または処置がなければ予期される症状悪化または発症の欠如によって、治療または予防効果は明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメーターの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化は、効果的な治療を示唆し得る。所定のｉＲＮＡ薬またはその薬剤の製剤の有効性はまた、当技術分野で公知の所定の疾患のための実験動物モデルを使用して、判定し得る。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカーまたは症状の統計的に有意な低下が観察される場合に、証明される。アンジオテンシノーゲン関連疾患、例えば、高血圧の好適な動物モデルには、例えば、高血圧の遺伝的モデル、例えば、ＢＰＨ／２マウス、高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）、ダール塩感受性ラット（ＤＳ）、腎臓内レニンが抑制されたＴＧＲ（ｍＲＥＮ２）２７トランスジェニックラット、および境界線高血圧ラット（ＢＨＲ）、高血圧症の実験的に誘発モデル、例えば、腎性高血圧の実験的に誘発モデル、腎臓誘発性実験的高血圧のゴールドブラットモデル、腎臓亜全摘モデル、およびアンジオテンシンＩＩ誘導性高血圧（例えば、Dornal and Silva (2011) J Biosci 36:731を参照のこと）が含まれる。好適な妊娠関連高血圧の動物モデルには、例えば、遺伝的モデル、例えば、境界高血圧マウス（例えば、ＢＰＨ／５マウス）、ヒトレニンをコードする導入遺伝子およびヒトアンジオテンシノーゲンをコードする導入遺伝子を担持するラットおよび／またはマウス、ならびに実験的に誘導されたモデル、例えば、ｓＦｌｔ－１注入モデル、ＡＴ１－ＡＡ－誘導モデル、子宮内灌流圧低下（ＲＵＰＰ）モデル（例えば、McCarthy, et al. (2011) 胎盤 32:413-419を参照のこと）が含まれる。
対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、または約５０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。上記の値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
任意の態様において、例えば本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、脂質とを含んでなる場合、対象に、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、または約９．５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。上記の値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。上記の値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
他の態様において、例えば本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、Ｎ－アセチルガラクトサミンとを含んでなる場合、対象に、約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０から約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５から約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約４から約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５から約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０から約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約４から約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０から約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５から約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約３から約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約４から約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０から約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５から約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１から約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約１から約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約２から約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約３から約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約４から約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５から約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０から約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５から約２０ｍｇ／ｋｇの用量などの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。一態様において、本発明の組成物が本明細書に記載のｄｓＲＮＡおよびＮ－アセチルガラクトサミンを含む場合、対象には、約１０～約３０ｍｇ／ｋｇの治療量のｄｓＲＮＡが投与され得る。上記の値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象には、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。上記の値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
本発明の任意の態様において、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ薬が修飾（例えば、３つの連続するヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つまたはそれ以上のモチーフ）を有して、該薬剤の切断部位またはその近位にそのようなモチーフ、６個のホスホロチオエート結合およびリガンドを含む場合、このような薬剤は、約０．０１から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０４から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇから約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５から約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．０８ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．０７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。上記の値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図され、例えば、ＲＮＡｉ薬は、約０．０１５ｍｇ／ｋｇから約０．４５ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与され得る。
例えば、ＲＮＡｉ薬、例えば、医薬組成物中のＲＮＡｉ薬は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。上記の値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
ｉＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、または約２５分間などにわたる静脈内投与によって投与され得る。投与は、例えば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月以上などにわたり、毎週、隔週（すなわち２週毎）で、定期的に繰り返してもよい。最初の治療レジメンの後に、治療は、より低頻度で行われ得る。例えば３ヶ月にわたる毎週または隔週の投与後、６ヶ月または１年以上にわたり月１回の投与を反復し得る。
ｉＲＮＡ投与は、例えば患者の細胞、組織、血液、尿またはその他のコンパートメント中で、ＡＧＴレベルを少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％以上低下させ得る。
ｉＲＮＡの総用量の投与前に、５％輸液などのより少ない用量を患者に投与して、アレルギー反応などの悪影響についてモニターし得る。他の例では、サイトカイン（例えばＴＮＦ－αまたはＩＮＦ－α）レベルの増大などの望まれない免疫賦活性効果について、患者をモニターし得る。
ＡＧＴ発現に対する阻害効果のために、本発明に従った組成物またはそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高め得る。
本発明のｉＲＮＡは、“裸の（naked）”の形態で投与してもよく、ここで、修飾または非修飾ｉＲＮＡ薬は、“遊離ｉＲＮＡ”として、水溶液または好適な緩衝溶媒中に直接懸濁される。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の不存在下で投与される。遊離ｉＲＮＡは、好適な緩衝溶液中にあってもよい。緩衝液は、酢酸エステル、クエン酸塩、プロラミン、炭酸、またはリン酸、またはそれらの任意の組み合わせを含んでなってもよい。一態様において、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝溶液のｐＨおよびモル浸透圧濃度は、対象への投与に適するように調節され得る。
あるいは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与してもよい。
ＡＧＴ遺伝子発現の低下および／または阻害により利点を有し得る対象は、本明細書に記載のＡＧＴ関連疾患または障害を有する者である。
ＡＧＴ遺伝子発現の低下および／または阻害により利点を有し得る対象の処置は、治療的および予防的処置を含む。
本発明は、ＡＧＴ遺伝子発現の低下および／または阻害により利点を有し得る対象、例えばＡＧＴ関連疾患を有する対象を治療するための、ｉＲＮＡ薬またはその医薬組成物の、他の医薬品および／または他の治療法、例えば、これらの障害の処置のために現在しようされるものなどの公知の医薬品および／または公知の治療法と組み合わせた、方法および使用をさらに提供する。例えば、任意の態様において、ＡＧＴを標的とするｉＲＮＡは、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるＡＧＴ関連疾患の処置に有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＡＧＴ発現の低下により利点を有し得る対象、例えばＡＧＴ関連疾患を有する対象を治療するのに適する追加の治療薬および治療法には、血管形成術、大動脈腎動脈バイパス、腎除神経、経皮経管腎血管形成術（ＰＴＲＡ）およびステント留置術、外科的血行再建術、カテーテルベースの腎交感神経除神経、ならびに褐色細胞腫またはレニン腫症候群（reninoma）の外科的除去、副腎摘出、利尿剤、例えば、チアジド系利尿剤、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、クロルタリドン、メトラゾン、およびインダパミド、カリウム保持性利尿薬、例えばトリアムテレンおよびアミロライド、ループ利尿薬、例えばフロセミド、トルセミド、エタクリン酸、およびブメタニド；アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、例えば、ホシノプリル、カプトプリル、ラミプリル、エナラプリル、リシノプリルおよびキナプリル；アンジオテンシンII受容体拮抗薬（アンジオテンシン受容体遮断薬としても公知）、例えばロサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、エプロサルタンおよびアジルサルタン；β遮断薬、例えばβ－１選択的β遮断薬、例えばアテノロール、メトプロロール、プロプラノロール、ビソプロロールおよびチモロール、アルファ１受容体β遮断薬、例えばラベタロール、エスモロールおよびカルベジロール、内因性交感神経刺激性β遮断薬、例えばアセブトロールおよびピンドロール；血管拡張薬、例えばヒドララジン、ミノキシジル、ニトロプルシドナトリウムおよびニトログリセリン；カルシウムチャネル遮断薬、例えばニフェジピン、クレビジピン、アムロジピン、フェロジピン、ジルチアゼム、ニカルジピンおよびベラパミル；アルドステロン拮抗薬、例えば、選択的アルドステロン拮抗薬、例えばエプレレノンおよびスピロノラクトン；α２－アゴニスト、例えば中枢性α２－アゴニスト、例えばメチルドパ、クロニジン、およびグアンファシン、レニン阻害剤、例えば、アリスキレン；α遮断薬、例えばプラゾシン、テラゾシンおよびドキサゾシン；末梢作用アドレナリン作動剤、例えばレセルピン；選択的Ｄ１受容体部分アゴ二スト、例えばフェノルドパムメシル酸；非選択的αアドレナリン作動性アンタゴニスト、例えばフェントラミン；合成ステロイド系アンチミネラルコルチコイド（antimineralocorticoid）剤、例えば、スピロノラクトン、または上記のいずれかの組み合わせ；および、薬剤の組み合わせとして製剤された治療剤、例えば、アムロジピン／ベナゼプリル（Lotrel）、アムロジピン／オルメサルタン（Azor）、アムロジピン／テルミサルタン（Twynsta）、アムロジピン／バルサルタン（Exforge）、アムロジピン／バルサルタン／ヒドロクロロチアジド（Exforge HCT）、アムロジピン／アリスキレン（Tekamlo）、アムロジピン／アリスキレン／ヒドロクロロチアジド（Amturnide）、オルメサルタン／アムロジピン／ヒドロクロロチアジド（Tribenzor）、トランドラプリル／ベラパミル（Tarka）、ベナゼプリル／ヒドロクロロチアジド（Lotensin HCT）、カプトプリル／ヒドロクロロチアジド（Capozide）、エナラプリル／ヒドロクロロチアジド（Vaseretic）、フォシノプリル／ヒドロクロロチアジド、リシノプリル／ヒドロクロロチアジド（Prinzide、Zestoretic）、モエキシプリル／ヒドロクロロチアジド（Uniretic）、キナプリル／ヒドロクロロチアジド（Accuretic）、カンデサルタン／ヒドロクロロチアジド（Atacand HCT）、エプロサルタン／ヒドロクロロチアジド（Teveten HCT）、イルベサルタン／ヒドロクロロチアジド（Avalide）、ロサルタン／ヒドロクロロチアジド（Hyzaar）、オルメサルタン／ヒドロクロロチアジド（Benicar HCT）、テルミサルタン／ヒドロクロロチアジド（Micardis HCT）、バルサルタン／ヒドロクロロチアジド（Diovan HCT）、アテノロール／クロルタリドン（Tenoretic）、ビソプロロール／ヒドロクロロチアジド（ZIAC）、メトプロロール／ヒドロクロロチアジド（Lopressor HCT）、ナドロール／ベンドロフルメサイアザイド（Corzide）、プロプラノロール／ヒドロクロロチアジド、アリスキレン／ヒドロクロロチアジド（Tekturna HCT）、クロニジン／クロルタリドン（Clorpres）、スピロノラクトン／ヒドロクロロチアジド（Aldactazide）、トリアムテレン／ヒドロクロロチアジド（Dyazide、Maxzide）、メチルドパ／ヒドロクロロチアジド、およびアミロライド／ヒドロクロロチアジド、またはＡＧＴ関連疾患の処置のための他の治療剤による治療が含まれる。
ｉＲＮＡ薬および追加の治療薬および／または処置剤は、同時におよび／または同一の組み合わせで、例えば、非経腸的に投与することができるか、またはさらなる治療剤は、別個の組成物の一部として、または別々の時間におよび／または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の他の方法によって投与することができる。
本発明はまた、細胞内のＡＧＴ発現を低下および／または阻害するために、本発明のｉＲＮＡ薬および／または本発明のｉＲＮＡ薬を含む組成物を使用する方法を提供する。他の面において、本発明は、細胞内でのＡＧＴ発現を低下および／または阻害するのに使用するための、本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明のｉＲＮＡを含む組成物を提供する。さらに他の面において、細胞内でのＡＧＴ発現を低下および／または阻害するための医薬の製造のための、本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明のｉＲＮＡを含む組成物の使用を提供する。
方法および使用には、細胞を、本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡと接触させ、ＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間、該細胞を維持し、それにより細胞内でのＡＧＴ遺伝子の発現を阻害することが含まれる。
遺伝子発現の低下は、遺伝子発現の減少は、当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。例えば、ＡＧＴ発現の低下は、当業者の常套法、例えば、ノーザンブロット法、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＡＧＴのｍＲＮＡ発現レベルを測定することにより、または当業者の常套法、例えばウェスタンブロッティング、免疫学的技術、フローサイトメトリー法、ＥＬＩＳＡを用いてＡＧＴのタンパク質レベルを決定することにより、および／またはＡＧＴの生物学的活性を測定することにより、決定することができる
。
本発明の方法および使用において、細胞は、インビトロまたはインビボで接触させることができる、すなわち、細胞は、対象内であってもよい。
本発明の方法を用いる処置に好適な細胞は、ＡＧＴ遺伝子を発現する任意の細胞であり得る。本発明の方法および使用における使用に適する細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長動物細胞（ヒト細胞または非ヒト霊長動物細胞、例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞など）、非霊長動物細胞（ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞として、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオンセル、トラ細胞、クマ細胞、または水牛細胞など）、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞またはガチョウ細胞など）、またはクジラ細胞であり得る。一態様において、細胞はヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。
ＡＧＴ発現は、細胞中、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％阻害され得る。好ましい態様において、ＡＧＴレベルは、少なくとも２０％低下される。
本発明のインビボ方法および使用は、ｉＲＮＡを含む組成物を対象に投与することを含んでいてよく、ここで、ｉＲＮＡは、処置すべき哺乳動物のＡＧＴ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む。処置すべき生物がヒトである場合、組成物は、頭蓋内（例えば、脳内、脳実質内および髄腔内）、筋肉内、経皮、気道（エアロゾル）、鼻腔、直腸、および局所（頬および舌下を含む）投与を含む、皮下、静脈内、経口、腹腔内、または非経腸投与を含むが、これらに限定されない、公知の何らかの手段で投与できる。任意の態様において、組成物は、皮下または静脈内注入または注射によって投与される。
ある態様において、投与は、デポー注射により行われる。デポー注射は、長時間にわたって一定した方法でｉＲＮＡを放出することができる。従って、デポー注射は、所望の効果、例えば、ＡＧＴの所望の阻害、または治療もしくは予防効果を得るために必要な投薬頻度を減少させることができる。デポー注射は、より一定の血清濃度を提供することができる。デポー注射は、皮下注射または筋肉内注射を含み得る。好ましい態様において、デポー注射は、皮下注射である。
ある態様において、投与はポンプを介して行われる。ポンプは、外部ポンプまたは外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。任意の態様において、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の態様において、ポンプは、輸液ポンプである。輸液ポンプは、静脈内、皮下、動脈または硬膜外注入のために使用できる。好ましい態様において、輸液ポンプは、皮下注入ポンプである。他の態様において、ポンプは、肝臓へｉＲＮＡを送達する外科的に埋め込まれたポンプである。
より高用量が、最初に投与され（すなわち、負荷用量）、続いてより低用量が持続期間のために投与されてよい。
投与方法は、局所処置または全身処置が望ましいかどうか、および治療すべき領域に基づいて選択することができる。投与経路および部位は、標的化を増強するために選択され得る。
一面において、本発明はまた、哺乳動物、例えばヒトにおいて、ＡＧＴ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物においてＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するのに使用するための、哺乳動物細胞中でＡＧＴ遺伝子を標的とする、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物を提供する。別の面において、本発明は、哺乳動物においてＡＧＴ遺伝子の発現を阻害するための医薬の製造における、哺乳動物細胞中でＡＧＴ遺伝子を標的とする、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。
該方法および使用には、哺乳動物、例えばヒトに、哺乳動物細胞中でＡＧＴ遺伝子を標的とする、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物を投与し、そしてＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間、哺乳動物を維持し、それにより哺乳動物におけるＡＧＴ遺伝子の発現を阻害することが含まれる。
遺伝子発現の低下は、本明細書に記載の、当技術分野で公知の任意の方法、例えばｑＲＴ－ＰＣＲにより、ｉＲＮＡを投与した対象の末梢血サンプルにおいて評価できる。タンパク質産生の減少は、当技術分野で公知の任意の方法および本明細書に記載の方法、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティング法により、評価できる。一態様において、肝生検サンプルは、ＡＧＴ遺伝子および／またはタンパク質発現の減少を観察するための組織材料としての役割を果たす。別の態様において、血液サンプルは、ＡＧＴ遺伝子および／またはタンパク質発現の減少を観察するための組織材料としての役割を果たす。
一態様において、ｉＲＮＡ薬投与後のインビボでの標的のＲＩＳＣが介在する切断の確認は、５’－ＲＡＣＥまたは当技術分野で公知のプロトコルの改善法により行われる（Lasham A et al., (2010) Nucleic Acid Res., 38 (3) p-e19) (Zimmermann et al. (2006) Nature 441: 111-4）。
本発明は、以下の実施例によりさらに説明され、それらは本発明を限定するものと意図されるべきではない。本明細書で言及される、全ての文献、特許および特許出願の内容全体、ならびに図面および配列表は、引用により本明細書中に包含される。
実施例
実施例１．ｉＲＮＡ合成
試薬供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示されていない場合、そのような試薬は、分子生物学用途の品質／純度規格の分子生物学用試薬の如何なる供給業者から調達されてもよい。
転写物
ｓｉＲＮＡデザインを実施して、ＮＣＢＩ遺伝子データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）でアノテートされた(annotated)ヒト(Homo sapiens)、アカゲザル（カニクイザル；以下、“ｃｙｎｏ”と記載）、マウス(Mus musculus)、およびラット(Rattus norvegicus)のＡＧＴ転写物を標的とするｓｉＲＮＡを同定した。デザインは、ＮＣＢＩからの以下の転写物を使用した：ヒト－ＮＭ＿００００２９．３；サル－ＡＢ１７０３１３．１；マウス－ＮＭ＿００７４２８．３。アカゲザル転写物は、肝臓由来のｃＤＮＡライブラリーから得られた配列を用いて伸長された。高度な霊長動物／齧歯動物配列多様性のために、ｓｉＲＮＡ二本鎖は、二本鎖整合ヒトおよびサル転写物のみ、およびマウス転写物のみ、を含有するバッチを含むが、これに限定されない、いくつかの別個のバッチでデザインされた。全てのｓｉＲＮＡ二本鎖は、各デザインバッチで考察された、列挙されたヒト転写物およびその他の種の転写物と１００％の同一性を共有するようにデザインされた。
ｓｉＲＮＡデザイン、特異性、および効能予測
全ての可能な１９量体（ｍｅｒ）の予測された特異性は、各配列から予測された。次に、７ヌクレオチドよりも長い反復を欠く、候補１９量体を選択した。これらの７０６の候補ヒト／サルｓｉＲＮＡおよび１８１５のマウスｓｉＲＮＡを、ｐｙｔｈｏｎスクリプト‘ＢｒｕｔｅＦｏｒｃｅ．ｐｙ’中で実装される網羅的な“総当たり攻撃”アルゴリズムを使用する、好適なトランスクリプトーム（ヒト、サルまたはマウスＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿およびＸＭ＿ｒｅｃｏｒｄｓセットと定義される）に対する包括的検索で使用した。次にスクリプトは、転写物－オリゴアライメントを解析し、ｓｉＲＮＡとあらゆる可能な“オフターゲット”転写物とのミスマッチの配置および数に基づいて、スコアを作成した。オフターゲットスコアを重み付けして、分子の５’末端から２～９位で、ｓｉＲＮＡの“シード”領域内の違いを強調した。総当たり攻撃検索からの各オリゴ転写物対には、個々のミスマッチスコアを加算することでミスマッチスコアが与えられ；２～９位のミスマッチは２．８と見なされ、１０～１１位の切断部位のミスマッチは１．２と見なされ、領域１２～１９のミスマッチは１．０と見なされた。さらに、３つの異なる各オリゴのシード由来六量体に由来する七量体および八量体の発生頻度を比較することで、オフターゲット予測を実施した。５’開始点に対する２～７位からの六量体を使用して、２つの七量体および１つの八量体を作成した。“七量体１”は、六量体に３’－Ａを付加して作製し；“七量体２”は、六量体に５’－Ａを付加して作製し；“八量体”は、六量体の５’および３’末端の両方にＡを付加して作製した。ヒト、サルまたはマウス３’ＵＴＲｏｍｅ（ＮＣＢＩのＲｅｆｓｅｑデータベースからのトランスクリプトームの部分配列と定義され、コード領域末端‘ＣＤＳ’は明確に画定されている）中の八量体および七量体の発生頻度は、予め計算された。八量体発生頻度は、八量体頻度範囲からの中央値を使用して、七量体発生頻度について正規化した。次に（（３×正規化八量体数）＋（２×七量体２数）＋（１×七量体１数））の合計を計算することで、“ｍｉｒＳｅｅｄＳｃｏｒｅ”を計算した。
計算スコアに従って、双方のｓｉＲＮＡ鎖を特異性カテゴリーに割り当てた。３を超えるスコアは高度に特異的であり、３に等しいスコアは特異的であり、２．２～２．８のスコアは中程度に特異的であると認定された。二本鎖を、アンチセンス鎖の特異性によって分類した。アンチセンスオリゴが１位のＧＣを欠き、１３位と１４位双方のＧを欠き、シード領域に３つ以上のＵまたはＡを有する（高度に予測される効果を有する二本鎖の特徴）ヒト／サルセットおよびマウスセットからの二本鎖を選択した。
それぞれセンスおよびアンチセンス鎖上の２１および２３ヌクレオチド長の、候補ＧａｌＮＡｃと複合体形成した二本鎖を、アンチセンス１９量体を３’方向にのさらに４ヌクレオチド伸長することによりデザインした（標的転写物との完全な相補性を維持する）。センス鎖は、アンチセンス２３量体の最初の２１ヌクレオチドの逆相補体として特定された。二本鎖は、全ての２３ヌクレオチドのすべての選択された種の転写産物への完全一致を維持して選択された。
ｓｉＲＮＡ配列選択
合計１１７のセンスおよび１１７のアンチセンス由来ヒト／サルｓｉＲＮＡ１９量体オリゴ、および４２のセンスおよび４２のアンチセンス由来マウスｓｉＲＮＡ１９量体オリゴを合成し、ＧａｌＮＡｃと複合体形成した二本鎖を形成した。合計３８のセンスおよび３８のアンチセンス由来ヒト／サル２１／２３量体オリゴおよび合計２６のマウス２１／２３量体オリゴを合成し、ＧａｌＮＡｃと複合体形成した二本鎖を形成した。
修飾されていない１９量体のＡＧＴセンス鎖およびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表３に示す。
修飾された１９量体のＡＧＴセンス鎖およびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表４に示す。
修飾されていない２１／２３量体のＡＧＴセンス鎖およびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表７に示す。
修飾された２１／２３量体のＡＧＴセンス鎖およびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表８に示す。
修飾されていない１９量体のＡＧＴセンス鎖およびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表１１に示す。
修飾されていない２１／２３量体のＡＧＴセンス鎖およびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表１３に示す。
修飾された２１／２３量体のＡＧＴセンス鎖およびアンチセンス鎖配列の詳細なリストを表１５に示す。
ｓｉＲＮＡ合成
ｂ．一般的小規模および中規模ＲＮＡ合成手順
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、標準固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルに従って、市販の、ウリジンの５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－Ｏ－ｔ－ブチルジメチルシリル－３’－Ｏ－（２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）ホスホラミダイトモノマー、４－Ｎ－アセチルシチジン、６－Ｎ－ベンゾイルアデノシンおよび２－Ｎ－イソブチリルグアノシン、および対応する２’－Ｏ－メチルおよび２’－フルオロホスホラミダイトを使用して、０．２～５００μｍｏｌの規模で合成した。アミダイト溶液を、０．１～０．１５Ｍ濃度で調製し、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（アセトニトリル中の０．２５～０．６Ｍ）をアクティベーターとして使用した。酸化工程のために、合成中に、ルチジン：アセトニトリル（１：１）（ｖ；ｖ）中の０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、またはピリジン中の０．１Ｍ ３－（ジメチルアミノメチレン）アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）を使用して、ホスホロチオエート主鎖の修飾を導入した。合成完了後、配列を固体支持体から切断し、メチルアミンとそれに続くトリエチルアミン・３ＨＦを使用して脱保護し、存在する全ての２’－Ｏ－ｔ－ブチルジメチルシリル保護基を除去した。
５～５００μｍｏｌ規模の完全２’修飾配列（２’－フルオロおよび／または２’－Ｏ－メチルまたはそれらの組み合わせ）の合成のために、３５℃にて１６時間または５５℃にて５．５時間のいずれかで、３：１（ｖ／ｖ）エタノールおよび濃縮（２８～３２％）水性アンモニアを使用して、オリゴヌクレオチドを脱保護した。アンモニア脱保護に先だって、固体支持体上で２０分間、アセトニトリル中の０．５Ｍピペリジンで、オリゴヌクレオチドを処理した。ＬＣ－ＭＳおよびアニオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）によって、粗製オリゴヌクレオチドを分析した。２０ｍＭのリン酸、１０％～１５％ＡＣＮ、ｐＨ＝８．５（緩衝液Ａ）、および２０ｍＭのリン酸、１０％～１５％ＡＣＮ、１ＭのＮａＢｒ、ｐＨ＝８．５（緩衝液Ｂ）を使用して、ＩＥＸ ＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチド精製を実施した。分析ＨＰＬＣによって、画分を純度について分析した。好適な純度の生成物含有画分を貯留し、脱塩に先だって回転蒸発器上で濃縮した。サイズ排除クロマトグラフィーによってサンプルを脱塩し、凍結乾燥した。１×ＰＢＳ緩衝液中で、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖をアニーリングして、対応するｓｉＲＮＡ二本鎖を調製した。
小規模（０．２～１μｍｏｌ）では、９６ウェル構成のＭｅｒＭａｄｅ １９２合成機上で合成を実施した。完全２’－修飾配列（２’－フルオロおよび／または２’－Ｏ－メチルまたはそれらの組み合わせ）の場合は、室温で３０～６０分間のメチルアミンと、それに続く６０℃で３０分間のインキュベーションを使用して、または室温で３０～６０分間の３：１（ｖ／ｖ）エタノールおよび濃縮（２８～３２％）水性アンモニアと、それに続く４０℃で１．５時間のインキュベーションを使用して、オリゴヌクレオチドを脱保護した。次に、粗製オリゴヌクレオチドをアセトニトリル：アセトン（９：１）溶液中で沈殿させて、遠心分離によって単離し、上清を傾斜法で除去した。粗製オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、ＬＣ－ＭＳおよびアニオン交換ＨＰＬＣによって分析した。５ｍＬ ＨｉＴｒａｐセファデックスＧ２５カラム（GE Healthcare）上の９６深型ウェルプレート内で、粗製オリゴヌクレオチド配列を脱塩した。各ウェル内に、個々の配列に対応する約１．５ｍＬのサンプルを収集した。ＬＣ－ＭＳおよびアニオン交換クロマトグラフィーによって、これらの精製脱塩オリゴヌクレオチドを分析した。Ｔｅｃａｎロボット上で、等モル量のセンスおよびアンチセンス配列をアニーリングして、二本鎖を調製した。１×ＰＢＳ緩衝液中で、二本鎖の濃度を１０μＭに調節した。
インビボ分析のためのＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド合成のための４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護一級ヒドロキシ基を保有するＹ型リンカーと、係留を通じて付着するＧａｌＮＡｃリガンドとが、予め装填された固体支持体を使用して、０．２～５００μｍｏｌの規模で、ＧａｌＮＡｃリガンドと３’末端で複合体形成するオリゴヌクレオチドを合成した。
５～５００μｍｏｌ規模でのＧａｌＮＡｃ複合体合成では、以下の修正を加えて、上のＲＮＡ合成プロトコルに従った。ポリスチレンベースの合成支持体では、合成中のＤＭＴ切断のために、トルエン中の５％ジクロロ酢酸を使用した。支持体からの切断および脱保護は、上記のように実施した。ホスホロチオエートに富む配列（通常は５個を超えるホスホロチオエート）は、最後の５’－ＤＭＴ基を除去することなく（“ＤＭＴ－ｏｎ”）合成し、上述したような切断および脱保護後に、水中の５０ｍＭの酢酸アンモニウム（緩衝液Ａ）と、８０％アセトニトリル中の５０ｍＭの酢酸アンモニウム（緩衝液Ｂ）とを使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製した。分析ＨＰＬＣおよび／またはＬＣ－ＭＳによって、画分を純度について分析した。適切な純度の生成物含有画分を貯留し、回転蒸発器上で濃縮した。水中の２０％～２５％酢酸を使用して、完了するまで、ＤＭＴ基を除去した。サイズ排除クロマトグラフィーによってサンプルを脱塩し、凍結乾燥した。１×ＰＢＳ緩衝液中で、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖をアニーリングして、対応するｓｉＲＮＡ二本鎖を調製した。
複数のホスホロチオエート結合を有する配列を含むＧａｌＮＡｃ複合体（０．２～１μｍｏｌ）の小規模合成では、ＭｅｒＭａｄｅプラットフォーム上のＲＮＡまたは完全な２’－Ｆ／２’－ＯＭｅ含有配列の合成のための上記のプロトコルを適用した。合成は、ＧａｌＮＡｃ官能化制御細孔性ガラス支持体を含有する、事前充填カラム上で実施した。
実施例２．ｓｉＲＮＡ二本鎖のインビトロスクリーニング
細胞培養および９６ウェル形質移入
３７℃および５％ＣＯ２雰囲気下で、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシンおよびグルタミン（ＡＴＣＣ）が添加されたイーグルの最少必須培地（ＡＴＣＣ）中で、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をコンフルエント近くまで培養した後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。細胞を洗浄し、０．１２５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。トランスフェクション中、細胞を、１ウェル当たり約２０，０００細胞で９６ウェルプレートに播種した。
９６ウェルプレートの個々のウェル内の各５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に、１ウェルあたり１４．８μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Invitroge(商標)、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；カタログ番号１３７７８－１５０）を添加することで、トランスフェクションを実施した。次に混合物を室温で２０分間インキュベートした。次に適当な数の細胞を含有する、抗生物質を含まない８０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を、ＲＮＡ精製に先だって、２４時間インキュベートした。
単回投与試験を、１０ｎＭおよび０．０１ｎＭの終濃度の二本鎖で行った。用量応答試験を、１０、１．６７、０．２８、０．０４６、０．００７７、０．００１３、０．０００２１、０．００００３６ｎＭの終濃度の二本鎖で行った。
細胞培養およびトランスフェクション
３７℃で５％ＣＯ２雰囲気下で、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシンおよびグルタミン（ＡＴＣＣ（登録商標））が添加されたイーグルの最少必須培地（ＡＴＣＣ（登録商標）中で、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をコンフルエント近くまで培養した後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。細胞を洗浄し、０．１２５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。トランスフェクション中、細胞を、１ウェル当たり約５，０００細胞細胞で３８４ウェルプレートに播種した。
９６ウェルプレートの個々のウェル内の各５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に、１ウェルあたり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Invitroge(商標)、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；カタログ番号１３７７８－１５０）を添加することで、トランスフェクションを実施した。次に混合物を室温で２０分間インキュベートした。次に適当な数の細胞を含有する、抗生物質を含まない４０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を、ＲＮＡ精製に先だって、２４時間インキュベートした。
単回投与試験を、１０ｎＭおよび０．０１ｎＭの終濃度の二本鎖で行った。用量応答試験を、１０、１．６７、０．２８、０．０４６、０．００７７、０．００１３、０．０００２１、０．００００３６ｎＭの終濃度の二本鎖で行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Invitroge(商標)、パーツ番号：６１０－１２）を用いた全ＲＮＡ単離－９６ウェル単離
細胞を収集して１５０μｌの溶解／結合緩衝液に溶解し、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを用いて、８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は処理全体にわたり同一であった）。１０マイクロリットルの磁性ビーズと８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに入れて、１分間混合した。磁性スタンドを使用して磁性ビーズを捕捉し、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解細胞を残留ビーズに入れて、５分間混合した。上清を除去した後、磁性ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄して、１分間混合した。ビーズを再度捕捉して、上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉して上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉して上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加して、７０℃で５分間混合した。ビーズを磁石上に５分間捕捉した。４０μｌの上清を取り出して、別の９６ウェルプレートに入れた。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems, Foster City, CA、カタログ番号４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
反応あたり、２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．２μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを、１０μｌの全ＲＮＡに添加した。ｃＤＮＡは、以下の工程により、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ－１０００またはＳ－１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して作製した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Invitroge(商標)、パーツ番号：６１０－１２）を用いた全ＲＮＡ単離－３８４ウェル抽出
細胞を５０μｌの溶解／結合緩衝液に溶解した。磁性ビーズ（Dynabeads）を溶解／結合緩衝液で洗浄し、それに再懸濁した。次いで、１ウェル当たり、２μｌのDynabeadsを含む２５μｌの溶解／結合緩衝液を添加した。Vibratranslator (UnionScientific)の“７”で１０分間プレートを振盪後、自動プレート洗浄システムを利用した（Biostackerを備えるBiotek EL406、および磁性捕捉プレート）。次いで、プレートを９６ウェルでの方法に記載のものと同様の方法で洗浄した：緩衝液Ａ（９０μｌ）で２回洗浄、緩衝液Ｂ（９０μｌ）で１回洗浄、そして緩衝液Ｃ（１００μｌ）で２回洗浄。最後の洗浄液をプレートから除去し、ｃＤＮＡ合成を直ちに開始した。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems, Foster City, CA、カタログ番号４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成－３８４ウェル合成
反応あたり、２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、および１３．２μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを、抽出したＲＮＡおよび磁性ビーズのみを含む３８４ウェルプレート（総容量２０μｌ）のウェルに添加した。ｃＤＮＡは、２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、そして８５℃で８分間のインキュベーションにより作製した。
リアルタイムＰＣＲ：
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号０４８８７３０１００１）の１ウェルあたり、０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのヒトＡＧＴ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号Ｈｓ００１７４８５４ｍ１）、２μＬの核酸不含有水および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号０４８８７３０１００１）を含むマスター混合物に、２μｌのｃＤＮＡを添加した。ｑＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲ機（Ｒｏｃｈｅ）で行った。相対的な変化倍を計算するために、ΔΔＣｔ法を用いてデータを分析し、１０ｎＭ ＡＤ－１９５５またはモックでトランスフェクトした細胞を用いて実施したアッセイに対して標準化を行った。ＩＣ５０値を、ＸＬＦｉｔを用いて４パラメーターフィットモデルを用いて計算し、ＡＤ－１９５５またはモックでトランスフェクトした細胞に対して標準化を行った。
ＡＤ－１９５５のセンスおよびアンチセンス配列は、以下の通りである：
センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ （配列番号１３）
アンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ （配列番号１４）。
表５は、示された１９量体のＡＧＴ ｉＲＮＡを、９６ウェル法を用いてトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞における単一用量スクリーニングの結果を示す。データは、未処理細胞と比較して、残ったｍＲＮＡの割合として表される。
表６は、示された１９量体のＡＧＴ ｉＲＮＡを、９６ウェル法を用いてトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞の用量応答を示す。示されたＩＣ５０値は、未処理細胞と比較したＩＣ５０値を表す。
表９は、示された２１／２３量体の複合体ＡＧＴ ｉＲＮＡを、３８４ウェル法を用いてトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞における単一用量スクリーニングの結果を示す。データは、未処理細胞と比較して、残ったｍＲＮＡの割合として表される。
表１０は、示された２１／２３量体の複合体ＡＧＴ ｉＲＮＡを、３８４ウェル法を用いてトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞の用量応答を示す。示されたＩＣ５０値は、未処理細胞と比較したＩＣ５０値を表す。
表１２は、示された１９量体のＡＧＴ ｉＲＮＡを、９６ウェル法を用いてトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞における単一用量スクリーニングの結果を示す。データは、未処理細胞と比較して、残ったｍＲＮＡの割合として表される。
表１４は、ｈＡＧＴを発現するＡＡＶベクターを感染させたマウスにおける、示された２１／２３量体の複合体ＡＧＴ ｉＲＮＡを用いたｈＡＧＴノックダウンの単回投与、用量応答スクリーニングの結果を示す。
表１６は、ｈＡＧＴを発現するＡＡＶベクターを感染させたマウスにおける、示された２１／２３量体の複合体ＡＧＴ ｉＲＮＡを用いたｈＡＧＴノックダウンの単回投与、用量応答スクリーニングの結果を示す。
Figure 2022104985000025

Figure 2022104985000026
Figure 2022104985000027
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実施例２．インビボでのＡＧＴサイレンシング－子癇前症後遺症の改善
完全なゲノムのヒトＡＧＴ遺伝子を保持するトランスジェニック雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（例えば、［ＴＧＲ（ｈＡＧＴ）Ｌ１６２３］（例えば、Bohlender J, et al. (1996) Hypertension 27: 535－540 および Bohlender J, et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11: 2056－2061を参照のこと））に、遠隔測定により血圧を測定する装置を外科的に移植した。移植術からの回復後、これらのラットを、全ゲノムヒトＲＥＮ遺伝子を保持するトランスジェニック雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（例えば、［ＴＧＲ（ｈＲＥＮ）Ｌ１０Ｊ］（例えば、Bohlender J, et al. (1997) Hypertension 29: 428－434 および Bohlender J, et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11: 2056－2061を参照のこと））と交配させた。この交雑のメス子孫（本明細書中、“ＰＥラット”という）は、子癇前症のモデルであり、アルブミン尿および子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）を発症し、そして妊娠１３日目辺りに始まる血圧スパイクを有している（例えば、図２Ａ参照）。
妊娠中のＰＥラットの下位集団への、１０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを標的とするｈＡＧＴ（ＡＤ－６０７７１）の投与を、妊娠３日目に開始した。妊娠ＰＥラットの第２の下位集団を未処理対照とした。投薬を、妊娠１５日目まで３日毎に継続した。該ラットを妊娠１９日目に屠殺し、血液および組織サンプルを母親ラットおよび胎仔から採取した。
母体血圧を、遠隔で血圧を測定するために外科的に移植された装置により、試験中、測定した。図２Ａは、ＡＤ－６０７７１の投与後に、母体の平均動脈血圧が顕著に低下したことを示す。加えて、血清アルブミンのＥＬＩＳＡ分析により決定されるように、母体のアルブミン尿は、ＡＤ－６０７７１の投与後に顕著に低下した（図２Ｂ）。これらの２つの状態は、子癇前症の特徴である。低下した血圧は、疾患に関連する心血管事象を減少させ、一方、低下したアルブミン尿は、改善された腎機能の指標である。
子癇前症はまた、おそらく不十分な血液循環に関連する、縮小した胎盤サイズと関連している。この状態の結果、胎仔の成長が損なわれる。しかし、母体へのＡＤ－６０７７１の投与後、子宮胎盤単位重量（図３Ａ）および胎仔重量（図３Ｂ）が増加し、そして胎仔の脳：肝臓比（図３Ｃ）が正常化し、それらは全て、より正常な胎盤および胎仔発達の指標である。
母体の肝臓および胎盤における、ｈＡＧＴのｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析により決定される通り、母体の肝臓では、ｈＡＧＴの有意なサイレンシングがあるが（図４Ａ）、胎盤では有意なサイレンシングはない（図４Ｂ）ことが示された。このことは、胎盤へのｉＲＮＡの浸透の欠如を示している。
さらに、４つの母体肝臓サンプル、４つの胎盤サンプル、および８つの胎仔肝臓サンプルの分析は、胎仔肝臓のｉＲＮＡへの暴露は、組織１ｇ当たり、約１．２ｎｇのｓｉＲＮＡ（検出限界以下、組織１ｇ当たり、１．３ｎｇのｓｉＲＮＡ）であり、母体肝臓のｉＲＮＡへの暴露は、胎盤のｉＲＮＡへの暴露よりも約２６５倍高かった（図５）ことを示した。組織暴露は、既報の通り（例えば、Landesman, Y., et al. (2010) Silence 1:16を参照のこと）、ステムループｑＰＣＲにより決定した。
従って、ｈＡＧＴを標的とするｉＲＮＡでの母体の処理は、ＡＣＥ阻害剤などの小分子レニン－アンジオテンシン阻害剤、およびアンジオテンシン受容体遮断薬（これらの化合物は、胎盤を通過し、胎仔毒性がある）での母体処理よりも優れている。
胎盤は胎仔への栄養素のための導管として働き、胎仔から老廃物を排せつする導管として作用するため、その組成は重要である。従って、胎盤の病理を評価した（すなわち、サイトケラチンを免疫組織化学的に染色した組織切片の面積を測定することにより）。図６は、胎盤（子宮間膜の三角部；図６Ｄ）および栄養海綿体（分化した栄養芽細胞の前駆体である細胞の均一な層；図６Ｅ）の母体部分は、ＡＤ－６０７７１の投与により変化しないが、全体の胎盤サイズは増加した（図６Ｂ、６Ｃおよび６Ｆならびに図６Ａ参照）ことを示す。特に、胎仔と母体の血液との間の栄養素の交換部分であるラビリンスのサイズは、母体のＡＤ－６０７７１での処理により増大した（図６Ｇ）。
アンジオテンシンによって調節される、抗血管形成可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－１（ｓＦＬＴ１）および血管新生胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）は、子癇前症において重要な役割を果たし、それらは、胎盤から母体の血流へ放出されて、内皮機能不全を引き起こす。ｓＦｌｔ－１は、主に胎盤から母体の血流中に放出され、内皮機能不全を引き起こす。ＰＬＧＦは、胎盤由来であり、血管形成を促進する。ｓＦｌｔ－１：ＰＬＧＦの比は診断に用いられ、より高いｓＦｌｔ－１：ＰＬＧＦ比は、より重度の疾患に関連する。
ＲＴ－ｑＰＣＲ分析によるｓＦＬＴ１およびＰＬＧＦのｍＲＮＡ発現の評価は、ｓＦＬＴ１およびＰＬＧＦの両方のレベルが、ＡＤ－６０７７１の母体投与後に、母体の腎臓で有意に低下したが（それぞれ、図７Ａおよび７Ｂ）、胎盤では変化しないままであった（それぞれ、図７Ｃおよび７Ｄ）ことを実証した。しかしながら、ｓＦｌｔ－１は、母体の腎臓においてＰＬＧＦよりも大幅に減少したため、血清中のｓＦｌｔ－１：ＰＬＧＦ比を向上させることができた。
アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩ（ＡＴ１）に対するアゴニスト自己抗体は、子癇前症の女性(メス)で同定されている。妊娠中のげっ歯動物をＡＴ１自己抗体に暴露するとき、子癇前症様症候群を発症する。ＡＴ１の活性化は、血管収縮作用ならびにアルドステロン分泌およびｓＦｌｔ－１産生に関連するため、ＡＴ１自己抗体の減少は、子癇前症の表現型を軽減することが期待される。従って、ＡＴ１受容体に対するアゴニスト自己抗体（ＡＴ１－ＡＡ）の産生レベルは、バイオクロマトグラフィーおよびその後の単離された抗体のバイオアッセイによっても評価できる。ＡＴ１－ＡＡレベルは、既報の通り、単離され、精製されたＡＴ１－ＡＡ抗体の、新生ラットの心筋細胞の自発的な拍動速度に対する影響を評価することにより測定した（例えば、Dechend, et al. (2005) Hypertension 45:742－746）。図８は、妊娠中のＰＥラットへのＡＤ－６０７７１の投与後にＡＴ１－ＡＡレベルの有意な減少があったことを示している。
実施例３．子癇前症のトランスジェニックラットモデルにおけるインビボでのＡＧＴサイレンシング
ＡＤ－６０７７１二本鎖を、実施例２に記載した妊娠中のＰＥラットにおけるｈＡＧＴ発現のサイレンシングの能力について試験した。妊娠中のＰＥラットの下位集団への、１０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを標的とするｈＡＧＴ（ＡＤ－６０７７１）の投与を、妊娠３日目に開始した。肝臓および血液を妊娠２１日目に採取し、ｈＡＧＴおよびｒＡＧＴタンパク質およびｍＲＮＡのレベルをアッセイし、未処理の、妊娠中のトランスジェニックラット、妊娠中のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットおよび妊娠していないＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット中に存在するｈＡＧＴおよびｒＡＧＴタンパク質およびｍＲＮＡのレベルと比較した。これらのアッセイ結果を図９Ａおよび９Ｂに示し、対照の妊娠中のＰＥラットと比較して、ＡＤ－６０７７１で処理した妊娠中のＰＥラットにおいて、循環ＡＴ２の８０％の低下および循環ｈＡＴ１の９５％の低下があったことが実証されている。ラットＡＴ２の約４５％の減少もまた、対照の妊娠中のＰＥラットと比較して、ＡＤ－６０７７１で処理した妊娠中のＰＥラットで観察された。肝臓ＡＧＴ ｍＲＮＡの９５％サイレンシングが、対照の妊娠中のＰＥラットと比較して、ＡＤ－６０７７１で処理した妊娠中のＰＥラットで観察された。図９Ａおよび９Ｂはまた、妊娠中のＰＥラットへのＡＤ－６０７７１の投与後に、ＡＴ１およびＡＴ２の血清レベルの大幅な減少があったことも実証している。
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実施例４：ｈＡＧＴを発現するマウスにおけるインビボでのＡＧＴサイレンシング
一連の試験を、強力な肝向性(liver tropism)を有するＡＡＶ８発現ベクターからヒトＡＧＴ（ｈＡＧＴ）を発現するマウスにおける、ｈＡＧＴを標的とするノックダウンを評価するために行った。まとめると、マウスに、構成的プロモーターの制御下にｈＡＧＴのための発現構築物を含む、１×１０１１のＡＡＶ８粒子を感染させた。感染の２週間後、マウスに、３．０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇのｈＡＧＴを標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＤ－６７３２７．２またはＡＤ－６７３３５．２）、または対照としてＰＢＳ（１群当たり、ｎ＝４）を単回投与した。これらの試験で評価される薬剤のヌクレオチド配列を表１３に示す。
Figure 2022104985000065
薬剤投与後、０日目、３日目、７日目および１４日目に、採血し、ｈＡＧＴの前採血レベルに対するｈＡＧＴ ｍＲＮＡ発現のレベルを決定するために、血清を調製した。これらの試験結果を表１４に示す。
Figure 2022104985000066
実施例５：ｈＡＧＴを発現するマウスにおけるインビボでのＡＧＴサイレンシング
一連の試験を、強力な肝向性(liver tropism)を有するＡＡＶ８発現ベクターからヒトＡＧＴ（ｈＡＧＴ）を発現するマウスにおける、ｈＡＧＴを標的とするノックダウンを評価するために行った。まとめると、マウスに、構成的プロモーターの制御下にｈＡＧＴのための発現構築物を含む、１×１０１１のＡＡＶ８粒子を感染させた。ＡＡＶ８ウイルスでの感染の２週間後、マウスに、１ｍｇ／ｋｇのｈＡＧＴを標的とするｓｉＲＮＡ、または対照としてＰＢＳ（１群当たり、ｎ＝３）を単回投与した。これらの試験で評価される二本鎖のヌクレオチド配列を表１５に示す。
Figure 2022104985000067
薬剤投与の７日後、採血し、ｈＡＧＴの前採血レベルに対するｈＡＧＴ ｍＲＮＡ発現のレベルを決定するために、血清を調製した。これらの試験結果を表１６に示す。
Figure 2022104985000068
均等物
当業者は、本明細書に記載の特定の態様および方法に対する多くの均等物を認識するか、または常套的な実験のみを用いて確認することが可能である。そのような均等物は、本明細書に添付する特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。

Claims (101)

  1. 細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、ここで、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして該アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、
    該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり、そして
    該センス鎖は、３’末端で結合しているリガンドと複合体を形成している、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  2. 細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、ここで、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２８０１－２１０１；８０３－８４３；８３４－８５９；８０３－８５９；８０３－８７５；８３４－８７５；８４７－８７５；１２４７－１２７１；１５６６－１６２４；１５７０－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２１；２０３５－２１４４；２０７０－２１４４；２０７０－２１０３；２２０１－２２２３；２２２７－２３６０；２２２７－２３０４；２２９０－２３１８；２３０４－２３５０；２３０４－２３２６；２３２０－２３４２；２３３３－２３６０；２３３３－２３５８；４８５－５０３；５１７－５３５；５６０－５７８；６３５－６５３；８０３－８２１；８１４－８３２；８２２－８４０；８２５－８４３；８３４－８５２；８３７－８５５；８４１－８５９；８５５－８７３；９６７－９８５；１２４７－１２６５；１２４８－１２６６；１２４９－１２６７；１２５１－１２６９；１２５３－１２７１；１５６６－１５８４；１５７０－１５８８；１５７２－１５９０；１５７４－１５９２；１５８４－１６０２；１５８７－１６０５；１５９１－１６０９；１５９２－１６１０；１５９５－１６１３；１６０１－１６１９；１６０２－１６２０；１６０５－１６２３；１７２９－１７４７；１７３８－１７５６；１７３９－１７５７；１７４１－１７６９；１７６７－１７８５；１８１０－１８２８；１８２７－１８４５；１８８０－１９８９；１８９２－１９１４；１８９４－１９１４；１８９４－２０１２；２０３５－２０５３；２０４６－２０６４；２０５７－２０７５；２０７０－２０８８；２０７２－２０９０；２０７８－２０９６；２０７８－２１０７；２０７８－２０１１；２０８０－２０９８；２０８１－２０９９；２０８１－２１０４；２０８１－２０１１；２０８２－２１００；２０８４－２１０２；２０８４－２０１１；２０９０－２１０８；２１００－２１１８；２１１１－２１２９；２１２４－２１４２；２１２５－２１４３；２１６７－２１８５；２１７９－２１９７；２２０１－２２１９；２２０２－２２２０；２２０３－２２２１；２２０４－２２２２；２２２７－２２４５；２２３０－２２４８；２２３４－２２５２；２２４４－２２６４；２２５５－２２７３；２２６６－２２８４；２２６８－２２８６；２２７０－２２８８；２２７９－２２９７；２２８１－２２９９；２２８３－２３０１；２２８４－２３０２；２２８５－２３０３；２２８６－２３０４；２２８８－２３０６；２２９０－２３０８；２２９１－２３０９；２２９１－２３１１；２２９１－２３１８；２２９１－２３１５；２２９２－２３１０；２２９４－２３１２；２２９６－２３１４；２２９９－２３１７；２３０４－２３２２；２３０４－２３２９；２３０６－２３２４；２３０７－２３２５；２３０９－２３２７；２３０９－２３２９；２３０９－２３４２；２３０９－２３５０；２３０９－２３５８；２３１４－２３３２；２３１６－２３３４；２３１７－２３３５；２３２０－２３３８；２３２１－２３３９；２３２３－２３４１；２３２５－２３４３；２３２６－２３４４；２３２８－２３４６；２３２９－２３４７；２３３１－２３４９；２３３３－２３５１；２３３４－２３５２；２３３５－２３５３；２３３９－２３５７；２３４０－２３５８；または、２３４１－２３５９と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置にて該ヌクレオチドと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして
    該アンチセンス鎖は、センス鎖に実質的に相補的である、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  3. 該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるか、該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるか、または該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  4. 該センス鎖が、３’末端で結合しているリガンドと複合体を形成している、請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  5. 該センス鎖の全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項１から４のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  6. 該センス鎖および該アンチセンス鎖が、表３、４、７、８、１１、１３および１５のうち何れか１つに列記される配列の何れか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む相補的な領域を含む、請求項１から４のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  7. 該修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非ロックドヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリルエステル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１および３から６のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  8. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１から７のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  9. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１から７のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  10. 細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することのできる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、ここで、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
    ［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
    ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
    各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、
    Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
    該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成している。］
    で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  11. ｉが０であり、ｊが０であるか、ｉが１であり、ｊが１であるか、ｉおよびｊの両方が０であるか、またはｉおよびｊの両方が１である、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  12. ｋが０であり、ｌが０であるか、ｋが１であり、ｌが１であるか、ｋおよびｌの両方が０であるか、またはｋおよびｌの両方が１である、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  13. ＸＸＸがＸ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹがＹ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、そしてＺＺＺがＺ’Ｚ’Ｚ’に相補的である、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  14. ＹＹＹモチーフが、センス鎖の切断部位に、またはその近位に生じる、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  15. Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、アンチセンス鎖の５’末端から１１位、１２位および１３位に生じる、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  16. Ｙ’が２’－Ｏ－メチルである、請求項１５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  17. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩａ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩａ）で表される、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  18. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｂ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩｂ）
    ［式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、１－５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。］
    で表される、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  19. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｃ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩｃ）
    ［式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、１－５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。］
    で表される、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  20. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｄ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩｄ）
    ［式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、１－５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は、独立して、２－１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。］
    で表される、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  21. 二本鎖領域が１５－３０ヌクレオチド対の長さである、請求項１から４のいずれかまたは請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  22. 二本鎖領域が、１７－２３ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  23. 二本鎖領域が、１７－２５ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  24. 二本鎖領域が、２３－２７ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  25. 二本鎖領域が、１９－２１ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  26. 二本鎖領域が、２１－２３ヌクレオチド対の長さである、請求項２１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  27. 各鎖が１５－３０個のヌクレオチドを有する、請求項１から４および１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  28. 各鎖が１９－３０個のヌクレオチドを有する、請求項１から４および１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  29. ヌクレオチドにおける修飾が、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  30. ヌクレオチドにおける修飾が、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾である、請求項２９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  31. リガンドが、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１、４および１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  32. リガンドが、
    Figure 2022104985000069
     である、請求項１、４および１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  33. リガンドがセンス鎖の３’末端に結合している、請求項１、４および１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  34. ＲＮＡｉ薬が、以下：
    Figure 2022104985000070
     ［式中、Ｘは、ＯまたはＳである。］
    で示されるリガンドと複合体を形成している、請求項３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  35. ＲＮＡｉ薬が、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルヌクレオチドまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項１から４および１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  36. 該ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の３’末端にある、請求項３５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  37. 該鎖がアンチセンス鎖である、請求項３６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  38. 該鎖がセンス鎖である、請求項３６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  39. 該ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の５’末端にある、請求項３５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  40. 該鎖がアンチセンス鎖である、請求項３９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  41. 該鎖がセンス鎖である、請求項３９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  42. 該ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の５’末端および３’末端の両方にある、請求項３５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  43. 該鎖がアンチセンス鎖である、請求項４２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  44. 該ＲＮＡｉ薬が、６－８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項３５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  45. 該アンチセンス鎖が、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、そして該センス鎖が、５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項４４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  46. アンチセンス鎖の５’末端の１つの位置の塩基対がＡＵ塩基対である、請求項１から４および１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  47. Ｙヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾を含む、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  48. Ｙ’ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  49. ｐ’＞０である、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  50. ｐ’＝２である、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  51. ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０、そしてｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに相補的である、請求項５０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  52. ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０、そしてｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに相補的でない、請求項５０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  53. センス鎖が合計２１個のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が、合計２３個のヌクレオチドを有する、請求項５０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  54. 少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されている、請求項４９から５３のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  55. 全てのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されている、請求項５４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  56. 該ＲＮＡｉ薬が、表３、４、７、８、１１、１３および１５のいずれか１つに列記されたＲＮＡｉ薬の群より選択される、請求項１から４および１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  57. アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、
    該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    ここで、該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして該アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、
    該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群より選択される修飾を含み、
    該センス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群より選択される修飾を含み、
    該アンチセンス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、そして
    該センス鎖は、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して３’末端に結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と複合体を形成している、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  58. センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２８０１－２１０１；８０３－８４３；８３４－８５９；８０３－８５９；８０３－８７５；８３４－８７５；８４７－８７５；１２４７－１２７１；１５６６－１６２４；１５７０－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２１；２０３５－２１４４；２０７０－２１４４；２０７０－２１０３；２２０１－２２２３；２２２７－２３６０；２２２７－２３０４；２２９０－２３１８；２３０４－２３５０；２３０４－２３２６；２３２０－２３４２；２３３３－２３６０；２３３３－２３５８；４８５－５０３；５１７－５３５；５６０－５７８；６３５－６５３；８０３－８２１；８１４－８３２；８２２－８４０；８２５－８４３；８３４－８５２；８３７－８５５；８４１－８５９；８５５－８７３；９６７－９８５；１２４７－１２６５；１２４８－１２６６；１２４９－１２６７；１２５１－１２６９；１２５３－１２７１；１５６６－１５８４；１５７０－１５８８；１５７２－１５９０；１５７４－１５９２；１５８４－１６０２；１５８７－１６０５；１５９１－１６０９；１５９２－１６１０；１５９５－１６１３；１６０１－１６１９；１６０２－１６２０；１６０５－１６２３；１７２９－１７４７；１７３８－１７５６；１７３９－１７５７；１７４１－１７６９；１７６７－１７８５；１８１０－１８２８；１８２７－１８４５；１８８０－１９８９；１８９２－１９１４；１８９４－１９１４；１８９４－２０１２；２０３５－２０５３；２０４６－２０６４；２０５７－２０７５；２０７０－２０８８；２０７２－２０９０；２０７８－２０９６；２０７８－２１０７；２０７８－２０１１；２０８０－２０９８；２０８１－２０９９；２０８１－２１０４；２０８１－２０１１；２０８２－２１００；２０８４－２１０２；２０８４－２０１１；２０９０－２１０８；２１００－２１１８；２１１１－２１２９；２１２４－２１４２；２１２５－２１４３；２１６７－２１８５；２１７９－２１９７；２２０１－２２１９；２２０２－２２２０；２２０３－２２２１；２２０４－２２２２；２２２７－２２４５；２２３０－２２４８；２２３４－２２５２；２２４４－２２６４；２２５５－２２７３；２２６６－２２８４；２２６８－２２８６；２２７０－２２８８；２２７９－２２９７；２２８１－２２９９；２２８３－２３０１；２２８４－２３０２；２２８５－２３０３；２２８６－２３０４；２２８８－２３０６；２２９０－２３０８；２２９１－２３０９；２２９１－２３１１；２２９１－２３１８；２２９１－２３１５；２２９２－２３１０；２２９４－２３１２；２２９６－２３１４；２２９９－２３１７；２３０４－２３２２；２３０４－２３２９；２３０６－２３２４；２３０７－２３２５；２３０９－２３２７；２３０９－２３２９；２３０９－２３４２；２３０９－２３５０；２３０９－２３５８；２３１４－２３３２；２３１６－２３３４；２３１７－２３３５；２３２０－２３３８；２３２１－２３３９；２３２３－２３４１；２３２５－２３４３；２３２６－２３４４；２３２８－２３４６；２３２９－２３４７；２３３１－２３４９；２３３３－２３５１；２３３４－２３５２；２３３５－２３５３；２３３９－２３５７；２３４０－２３５８；または、２３４１－２３５９と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置にて該ヌクレオチドと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして
    該アンチセンス鎖は、センス鎖に実質的に相補的である、請求項５７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  59. 該センス鎖の全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む、請求項５７または５８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  60. 細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
    ［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
    ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
    各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
    Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
    該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成している。］
    で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  61. 細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
    ［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
    ｐ、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
    各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
    Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
    該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成している。］
    で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  62. 細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
    ［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
    ｐ、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
    各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
    Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
    該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成しており、ここで該リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。］
    で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  63. 細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩ）
    ［式中、ｉ、ｊ、ｋおよびｌは、それぞれ独立して、０または１であり、
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
    ｐ、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
    各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
    Ｎｂにおける修飾は、Ｙにおける修飾とは異なり、Ｎｂ’における修飾は、Ｙ’における修飾とは異なり、そして
    該センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、
    該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成しており、ここで該リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。］
    で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  64. 細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）の発現を阻害することができる二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＧＴをコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は、約１４から約３０ヌクレオチド長であり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ ３’
    アンチセンス：３’ ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’ ５’（ＩＩＩａ）
    ［式中、各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’（それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい）は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
    ｐ、ｑおよびｑ’は、それぞれ独立して、０－６であり、
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
    各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、０－２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
    ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドにおける３個の同一の修飾の１つのモチーフを表し、該修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
    該センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、
    該センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成しており、ここで該リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。］
    で表される、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  65. センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬であって、該センス鎖および該アンチセンス鎖が、表３、４、７、８、１１、１３および１５のうち何れか１つに列記される配列の何れか１つからなる群より選択される配列を含む、二本鎖ＲＮＡｉ薬。
  66. 修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド薬を含む組成物であって、該医薬が、細胞内でのＡＧＴの発現を阻害することができ、そして表３、４、７、８、１１、１３および１５の何れか１つに列記される配列群より選択されるセンス配列に相補的な配列を含み、該ポリヌクレオチドが、約１４から約３０ヌクレオチド長である、組成物。
  67. 請求項２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬を含む、ベクター。
  68. 請求項１－４、１０、５７、５８および６０－６５のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬を含む、細胞。
  69. 請求項１－４、１０、５７、５８および６０－６５のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬を含む医薬組成物、または請求項６６に記載の修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド薬を含む組成物、または請求項６７に記載のベクター
  70. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が非緩衝液で投与される、請求項６９に記載の医薬組成物。
  71. 該非緩衝液が生理食塩水または水である、請求項７０に記載の医薬組成物。
  72. 該二本鎖ＲＮＡｉ薬が緩衝液と共に投与される、請求項６９に記載の医薬組成物。
  73. 該緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、プロラミン、炭酸緩衝液、またはリン酸緩衝液、あるいはこれらの任意の組合せを含む、請求項７２に記載の医薬組成物。
  74. 該緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項７３に記載の医薬組成物。
  75. 細胞内でのアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）発現を阻害する方法であって、
    （ａ）細胞を、請求項１－４、１０、５７、５８および６０－６５のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬、または請求項６６に記載の修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド薬を含む組成物、請求項６７に記載のベクター、または請求項６９－７４のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させること；そして
    （ｂ）工程（ａ）で製造された細胞を、ＡＧＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるのに十分な時間維持して、細胞内でのＡＧＴ遺伝子の発現を阻害すること
    を含む、方法。
  76. 該細胞が対象内に存在する、請求項７５に記載の方法。
  77. 対象がヒトである、請求項７６に記載の方法。
  78. 対象がアンジオテンシノーゲン関連疾患に罹患している、請求項７７に記載の方法。
  79. ＡＧＴ発現が、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約１００％阻害される、請求項７５から７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 治療的有効量の、請求項１－４、１０、５７、５８および６０－６５のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬、または請求項６６に記載の修飾されたアンチセンスポリヌクレオチド薬を含む組成物、請求項６７に記載のベクター、または請求項６９－７４のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与し、該対象を処置することを含む、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）関連障害を有する対象の処置法。
  81. 治療的有効量の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬を対象に皮下投与し、それにより対象を処置することを含む、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）関連障害を有する対象の処置法であって、
    ここで、該二本鎖ＲＮＡｉ薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    該センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして該アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、
    該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群より選択される修飾を含み、
    該アンチセンス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群より選択される修飾を含み、
    該センス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、そして
    該センス鎖は、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して３’末端に結合している１個またはそれ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と複合体を形成する、
    方法。
  82. 該センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２８０１－２１０１；８０３－８４３；８３４－８５９；８０３－８５９；８０３－８７５；８３４－８７５；８４７－８７５；１２４７－１２７１；１５６６－１６２４；１５７０－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２４；１５８４－１６２１；２０３５－２１４４；２０７０－２１４４；２０７０－２１０３；２２０１－２２２３；２２２７－２３６０；２２２７－２３０４；２２９０－２３１８；２３０４－２３５０；２３０４－２３２６；２３２０－２３４２；２３３３－２３６０；２３３３－２３５８；４８５－５０３；５１７－５３５；５６０－５７８；６３５－６５３；８０３－８２１；８１４－８３２；８２２－８４０；８２５－８４３；８３４－８５２；８３７－８５５；８４１－８５９；８５５－８７３；９６７－９８５；１２４７－１２６５；１２４８－１２６６；１２４９－１２６７；１２５１－１２６９；１２５３－１２７１；１５６６－１５８４；１５７０－１５８８；１５７２－１５９０；１５７４－１５９２；１５８４－１６０２；１５８７－１６０５；１５９１－１６０９；１５９２－１６１０；１５９５－１６１３；１６０１－１６１９；１６０２－１６２０；１６０５－１６２３；１７２９－１７４７；１７３８－１７５６；１７３９－１７５７；１７４１－１７６９；１７６７－１７８５；１８１０－１８２８；１８２７－１８４５；１８８０－１９８９；１８９２－１９１４；１８９４－１９１４；１８９４－２０１２；２０３５－２０５３；２０４６－２０６４；２０５７－２０７５；２０７０－２０８８；２０７２－２０９０；２０７８－２０９６；２０７８－２１０７；２０７８－２０１１；２０８０－２０９８；２０８１－２０９９；２０８１－２１０４；２０８１－２０１１；２０８２－２１００；２０８４－２１０２；２０８４－２０１１；２０９０－２１０８；２１００－２１１８；２１１１－２１２９；２１２４－２１４２；２１２５－２１４３；２１６７－２１８５；２１７９－２１９７；２２０１－２２１９；２２０２－２２２０；２２０３－２２２１；２２０４－２２２２；２２２７－２２４５；２２３０－２２４８；２２３４－２２５２；２２４４－２２６４；２２５５－２２７３；２２６６－２２８４；２２６８－２２８６；２２７０－２２８８；２２７９－２２９７；２２８１－２２９９；２２８３－２３０１；２２８４－２３０２；２２８５－２３０３；２２８６－２３０４；２２８８－２３０６；２２９０－２３０８；２２９１－２３０９；２２９１－２３１１；２２９１－２３１８；２２９１－２３１５；２２９２－２３１０；２２９４－２３１２；２２９６－２３１４；２２９９－２３１７；２３０４－２３２２；２３０４－２３２９；２３０６－２３２４；２３０７－２３２５；２３０９－２３２７；２３０９－２３２９；２３０９－２３４２；２３０９－２３５０；２３０９－２３５８；２３１４－２３３２；２３１６－２３３４；２３１７－２３３５；２３２０－２３３８；２３２１－２３３９；２３２３－２３４１；２３２５－２３４３；２３２６－２３４４；２３２８－２３４６；２３２９－２３４７；２３３１－２３４９；２３３３－２３５１；２３３４－２３５２；２３３５－２３５３；２３３９－２３５７；２３４０－２３５８；または、２３４１－２３５９と３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして該アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列の対応する位置にて該ヌクレオチドと３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含み、そして
    該アンチセンス鎖が、センス鎖に実質的に相補的である、請求項８１に記載の方法。
  83. 該センス鎖の全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む、請求項８１または８２に記載の方法。
  84. 対象がヒトである、請求項８１－８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. アンジオテンシノーゲン関連疾患が、高血圧、境界域高血圧、原発性高血圧、二次性高血圧、高血圧緊急症、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧；高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心内膜線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、レニン腫症候群（reninoma）、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺／副甲状腺疾患、心不全、心筋梗塞、狭心症、卒中、真性糖尿病、腎疾患、腎不全、全身性硬化症、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、ならびに胎児発育不全からなる群より選択される、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。
  86. アンジオテンシノーゲン関連疾患が妊娠関連高血圧である、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。
  87. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから約１０ｍｇまたは約０．５ｍｇから約５０ｍｇの用量で投与される、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。
  88. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が、体重１ｋｇ当たり、約１０ｍｇから約３０ｍｇの用量で投与される、請求項８７に記載の方法。
  89. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が、体重１ｋｇ当たり、約３ｍｇの用量で投与される、請求項８７に記載の方法。
  90. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が、体重１ｋｇ当たり、約１０ｍｇの用量で投与される、請求項８７に記載の方法。
  91. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が、体重１ｋｇ当たり、約０．５ｍｇの用量で週に２回投与される、請求項８７に記載の方法。
  92. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が、体重１ｋｇ当たり、約１０ｍｇの用量で隔週投与される、請求項８７に記載の方法。
  93. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が、体重１ｋｇ当たり、約０．５－１ｍｇの用量で週に１回投与される、請求項８７に記載の方法。
  94. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が皮下投与される、請求項８７に記載の方法。
  95. 二本鎖ＲＮＡｉ薬が静脈内投与される、請求項８７に記載の方法。
  96. 該ＲＮＡｉ薬が２以上の用量で投与される、請求項８７に記載の方法。
  97. 該ＲＮＡｉ薬が、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、約７２時間毎および約９６時間毎に１回投与からなる群より選択される間隔で投与される、請求項９６に記載の方法。
  98. 該ＲＮＡｉ薬が週に２回投与される、請求項９６に記載の方法。
  99. 該ＲＮＡｉ薬が隔週で投与される、請求項９６に記載の方法。
  100. 対象にさらなる治療剤を投与することを含む、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。
  101. さらなる治療剤が、利尿剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、β遮断薬、血管拡張薬、カルシウムチャンネル遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、α２－アゴニスト、レニン阻害剤、α遮断薬、末梢作用型アドレナリン作動薬、選択的Ｄ１受容体部分アゴニスト、非選択的α－アドレナリンアンタゴニスト、合成したステロイド性の抗ミネラルコルチコイド薬、または上記の何れかの組合せ、および併用剤として製剤された高血圧治療薬からなる群より選択される、請求項１００に記載の方法。
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