KR20240034787A - 핵산, 이를 함유하는 조성물 및 접합체, 제조 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 아포지단백질 C3(APOC3) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA; 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 19개의 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역상보적이어서 이중 가닥 영역을 형성하고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 II는 APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA 내의 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 부분적으로 역상보적이며; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II의 3번째 내지 6번째 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 안정화 변형 뉴클레오타이드이다. siRNA 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체는 APOC3 유전자 발현과 관련된 질환 또는 장애를 효과적으로 치료 및/또는 예방할 수 있으며, 표적외 효과를 상당히 감소시킨다.
Description
본 개시내용은 표적외(off-target) 효과가 감소되면서 아포지단백질 C3(APOC3) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 핵산, 및 핵산을 포함하는 조성물 및 접합체에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 핵산, 조성물 및 접합체의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
고지혈증으로도 알려진 이상지질혈증은 지방 대사나 작용에 이상이 있어서 혈장 지질이 정상보다 높아지는 전신 질환으로 전 세계 환자들의 건강을 심각하게 위협하고 있다. 아포지단백질 C3(APOC3)은 지질 대사에 중요한 역할을 한다. APOC3 돌연변이 유전자를 보유한 사람의 혈액 순환 중 APOC3 발현은 일반인에 비해 46% 감소하고, 혈장 중 트리글리세라이드 수치는 39% 감소한다. 따라서 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용하여 유전자 수준에서 유전자 발현을 침묵시키고 APOC3를 차단하는 것은 의심할 여지 없이 APOC3와 관련된 이상지질혈증을 치료하는 이상적인 수단이다. 최근 APOC3 유전자의 약물로의 발현을 억제하기 위한 siRNA의 제조에 상당한 진전이 이루어졌다.
siRNA의 약제학적 연구에 있어서, 표적외 효과는 독성과 관련된 중요한 부작용 중 하나이다. 현재, 전임상 약제학적 연구에서 탁월한 약제학적 활성을 보인 많은 siRNA들은 표적외 효과에 의해 유발된 독성으로 인해 실제 약물 개발에 사용하기가 어렵다. 그러나 실제로 환자에게 적용되는 약물을 제조하는 데 사용될 것으로 예상되는 이상적인 siRNA는 표적외 효과에 의해 유발된 낮은 독성을 포함하여 독성이 낮아야 한다는 것은 의심할 여지가 없다. 따라서, 표적외 효과가 낮은 siRNA를 얻는 방법은 이 분야에서 계속해서 더 탐구되어야 한다.
표적외 효과를 상당히 감소시키면서 APOC3 유전자를 억제할 수 있는 siRNA를 개발하기 위해, 본 발명자들은 서열의 특정 위치에서 변형 뉴클레오타이드를 안정화시키는 siRNA가 해당 위치에서 변형 뉴클레오타이드를 안정화시키지 않는 siRNA에 비해 표적외 효과가 현저히 낮다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 더욱이, 서열의 특정 위치에 변형 뉴클레오타이드를 안정화시키는 특정 siRNA는 변형 뉴클레오타이드를 안정화시키지 않는 siRNA보다 현저히 낮은 표적외 효과를 나타내며, 또한 변형 뉴클레오타이드를 안정화시키지 않는 siRNA에 비해 APOC3 유전자 억제 활성이 상당히 감소되거나 비슷하지 않은 것으로 나타난다. 따라서 발명자들은 다음과 같은 발명을 하게 되었다.
일 양태에서, 본 개시내용은 siRNA를 제공하고, siRNA는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하며; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 모두 19개의 뉴클레오타이드로 구성되고, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내의 각각의 뉴클레오타이드는 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역상보적이어서 이중 가닥 영역을 형성하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 적어도 부분적으로 역상보적이며; 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA에서 길이가 19개의 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 서열이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 내지 6번째 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 안정화 변형 뉴클레오타이드이고; 안정화 변형 뉴클레오타이드는 리보스 2' 하이드록실 기가 안정화 변형 기로 치환된 뉴클레오타이드를 의미하며; 해당 위치의 뉴클레오타이드가 비변형 뉴클레오타이드인 siRNA와 비교하여, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하는 siRNA의 열안정성은 증가하고, 그리고 안정화 변형 기의 입체 장애는 2'-O-메틸의 입체 장애보다 크다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 본 개시내용에 의해 제공되는 siRNA 및 siRNA에 접합된 접합 그룹을 포함하는 siRNA 접합체를 제공하며, 접합 그룹은 링커 및 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹을 포함하고, siRNA, 링커 및 표적화 그룹은 공유적으로 또는 비공유적으로 순차적으로 연결되고; 각각의 표적화 그룹은 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA 수준과 연관된 질환 또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 수준과 연관된 질환 또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하고, 방법은 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 세포에서 APOC3 유전자의 발현 수준을 억제하는 방법을 제공하고, 방법은 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 유효 용량을 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
또한, 본 개시내용은 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 포함하는 키트를 제공한다.
참고에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
유익한 효과
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체는 안정성이 우수하고, 표적외 효과가 낮으며, APOC3 유전자 발현 억제 활성 및 혈중 지질 저하 효과가 우수하다. 세부사항은 다음과 같다.
첫째, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체는 시험관 내 또는 생체 내에서 표적외 효과 및/또는 표적외 효과로 인한 독성이 더 낮을 수 있다. 특히, 본 개시내용의 siRNA 접합체를 투여한 마우스는 참조 siRNA 접합체에 비해 현저히 낮은 혈액 생화학적 결과와 독성 면에서 분명한 이점을 보였다. 예를 들어, 본 개시내용의 siRNA 접합체를 100 mg/kg의 용량으로 투여한 마우스에서는, 혈액 생화학적 지표가 상당히 감소하였으며, 공시험(blank) 대조군과 비교하여 뚜렷한 이상은 없었다. 또한, 참조 siRNA 접합체와 비교하여, 본 개시내용의 siRNA 접합체를 투여한 마우스는 중간 정도 또는 중증의 염증 세포 침윤 및 괴사를 나타내지 않았으며, 조직병리에서 독성이 현저히 낮은 것으로 나타났다. 또 다른 예를 들면, 300 mg/kg의 고용량에서도, 공시험 대조군과 비교하여 혈청 ALT에는 유의한 차이가 없었다. 참조 접합체를 투여한 마우스 중에서 그리고 조직병리적 섹션에서 염증 세포 침윤을 보인 6마리와 비교하여, 본 개시내용의 접합체를 투여한 마우스 중 3마리만이 염증 세포 침윤을 보였으며, 이는 염증 세포 침윤을 보인 마우스의 수가 상당히 감소되었음을 나타낸다. 또 다른 예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 낮은 표적외 효과를 갖는다. 시험관 내 시체크(sicheck) 시스템에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 표적 서열에 대해 IC50 값이 4.50 pM 내지 11.3 pM으로 탁월한 표적 서열 억제 활성을 나타내었다. 한편, 테스트된 모든 siRNA 농도 범위에서 표적외 표적 서열 서열에 대한 억제율은 50% 미만으로 낮은 표적외 효과를 나타내었다. 또 다른 예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체를 3주 연속 300 mg/kg의 고용량으로 매주 투여한 마우스에서, 이들의 혈청 ALT 및 AST 농도는 공시험 대조군과 비슷하였다. 또한, 본 개시내용의 siRNA 접합체를 투여한 마우스의 병리적 섹션에서도 간 지방증 및 염증의 관점에서 공시험 대조군과 유사한 반응을 보였으며, 유의미한 이상이 없어 본 개시내용의 siRNA 접합체는 간독성이 매우 낮음을 나타낸다.
둘째, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체는 생체 내 및 시험관 내 실험에서 탁월한 APOC3 유전자 발현 조절 활성을 나타내었다. 또 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 접합체는 시험관 내 시체크 시스템에서 6.89 내지 8.55 pM의 IC50으로 매우 높은 표적 서열 억제 활성을 보여준다. 한편, siRNA 접합체는 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 참조 siRNA 접합체에 가까운 표적 서열 억제 활성을 갖는다. 또 다른 예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 접합체는 시험관 내 시체크 시스템에서 매우 높은 표적 서열 억제 활성을 갖는다. 0.01 nM의 낮은 농도에서, 표적 서열 발현 억제율은 적어도 38.92 nM이었고 최대 67.54%에 도달할 수 있었다. 0.1 nM의 농도에서, 표적 서열 발현 억제율은 84.73 내지 89.35%만큼 높을 수 있다. 한편, siRNA 접합체는 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않거나 표적 서열 억제 활성이 상당히 감소되지 않은 참조 siRNA 접합체와 유사한 표적 서열 억제 활성을 갖는다.
셋째, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체는 생체 내에서 더 우수한 혈중 지질 TG 감소 효과를 나타내었다. 예를 들어, 투여 후 상이한 시점에, 본 발명의 siRNA 접합체는 마우스 혈청 내 TG 및 CHO의 수준을 상당히 감소시킬 수 있으며, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않거나 상당히 감소된 혈중 지질 저하 효과가 없는 해당 참조 siRNA 접합체와 유사한 혈중 지질 저하 효과를 보여준다. 특히, 3 mg/kg의 용량에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 최대 50일의 투여 기간 동안 항상 매우 높은 혈중 지질 TG 저하 효과를 나타냈으며, 최고 억제율은 최대 90.2%에 이를 수 있다. 또 다른 예에서, 투여 후 상이한 시점에, 본 발명의 siRNA 접합체는 마우스 혈청 내 TG 및 CHO의 수준을 상당히 감소시킬 수 있으며, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 해당 참조 siRNA 접합체와 유사한 혈중 지질 저하 효과를 보여주었다. 특히, 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 용량에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 최대 50일의 투여 기간 동안 항상 매우 높은 혈중 지질 TG 저하 효과를 나타냈으며, 최고 억제율은 최대 92.0%에 이를 수 있다. 또 다른 예에서, 투여 후 상이한 시점에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체의 상이한 농도는 모두 마우스 혈청에서 TG 수준을 감소시킬 수 있다. 특히, 9 mg/kg의 용량에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 단 1회 투여 후 최대 64일 동안 50% 초과의 TG 수준 억제율을 유지할 수 있으며, 가장 높은 억제율은 최대 89.5%에 달해 탁월한 혈중 지질 억제 능력을 보여준다. 또 다른 예에서, 투여 후 상이한 시점에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 마우스 혈청 내 TG 및 CHO의 수준을 상당히 감소시킬 수 있다. 또한, 실험 43일 내내, 억제 효과는 항상 높게 유지되었다. 특히, 본 개시내용의 3 mg/kg 용량의 siRNA 접합체는 모두 마우스에서 탁월한 혈중 지질 억제 효과를 보여주었고, 최대 혈청 TG 억제율은 모두 88% 초과였고, 최대 혈청 CHO 억제율은 51.18% 내지 57.41%였다. 또 다른 예에서, 투여 후 상이한 시점에, 본 발명의 siRNA 접합체는 마우스 혈청 내 TG 및 CHO의 수준을 상당히 감소시킬 수 있으며, 실험 22일 내내 높은 억제 효과를 유지할 수 있다. 또한, 접합체는 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 해당 참조 siRNA 접합체와 유사한 혈중 지질 저하 효과를 보여주었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 siRNA, 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체는 표적외 효과 및 표적외 효과로 인한 독성 반응을 현저히 낮출 수 있으며, 또한 생체 내 및 시험관 내에서 APOC3 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있으며 간독성 반응 시 우수한 혈중 지질 저하 활성을 보여줄 수 있고, 따라서 상당히 더 높은 안전성을 가져서 양호한 적용 가능성을 나타내면서 APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA 수준과 관련된 질환 증상, 특히 이상지질혈증을 효과적으로 치료 및/또는 예방할 수 있다.
도 1a 및 1b는 본 개시내용의 siRNA 접합체 300 mg/kg 또는 PBS를 연속 3주 동안 매주 투여한 후 마우스 혈청 중 ALT 및 AST 농도를 나타내는 산점도이다.
도 2는 표적 서열과 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC를 함유하는 플라스미드를 공동 형질감염시킨 후 시험관 내 시체크(sicheck) 시스템에서 표적 서열의 상대적인 발현 수준을 나타내는 히스토그램이다.
도 3a 및 3b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 참조 siRNA 접합체 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 4a 및 4b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 참조 siRNA 접합체 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 5a 및 5b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 6은 상이한 농도의 본 개시내용의 siRNA 접합체 또는 PBS를 투여한 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 7a 및 7b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 8a 및 8b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 참조 siRNA 접합체 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 2는 표적 서열과 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC를 함유하는 플라스미드를 공동 형질감염시킨 후 시험관 내 시체크(sicheck) 시스템에서 표적 서열의 상대적인 발현 수준을 나타내는 히스토그램이다.
도 3a 및 3b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 참조 siRNA 접합체 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 4a 및 4b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 참조 siRNA 접합체 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 5a 및 5b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 6은 상이한 농도의 본 개시내용의 siRNA 접합체 또는 PBS를 투여한 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 7a 및 7b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
도 8a 및 8b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 참조 siRNA 접합체 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다.
본 개시내용의 특정 구현예가 아래에 상세히 기재된다. 본원에 기재된 특정 구현예는 본 개시내용을 제한하기보다는 단지 본 개시 내용을 예시하고 설명하기 위한 것임을 이해해야 한다.
본 개시내용에서, 달리 언급되지 않는 한, APOC3 mRNA 또는 "APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA"는, Genbank 등록 번호 NM_000040.3 하에 제시된 서열을 갖는 mRNA를 지칭하고, APOC3 유전자는 전술한 APOC3 mRNA를 전사하는 유전자를 지칭한다.
정의
상기 및 하기 본문에서, 달리 명시하지 않는 한, 대문자 C, G, U 및 A는 뉴클레오타이드의 염기 조성을 나타내고; 소문자 m은 왼쪽 문자 m에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; 소문자 f는 왼쪽 문자 f에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형 뉴클레오타이드임을 나타내고; 소문자 s는 왼쪽과 오른쪽의 문자 s에 인접한 2개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 기에 의해 연결되어 있음을 나타내고; P1은 오른쪽 P1에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형 뉴클레오타이드임을 나타낸다. 일부 구현예에서, P1은 특정 변형을 나타내는 VP, Ps 또는 P이고, 문자 조합 VP는 문자 조합 VP의 오른쪽에 인접한 뉴클레오타이드가 비닐포스페이트(5'-(E)-비닐포스포네이트, E-VP) 변형 뉴클레오타이드임을 나타내고, 문자 조합 Ps는 문자 조합 Ps의 오른쪽에 인접한 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오타이드임을 나타내고, 그리고 대문자 P는 문자 P의 오른쪽에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다.
상기 및 하기 본문에서, "플루오로 변형 뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 리보실 기의 2' 위치에 있는 하이드록시 기가 불소로 치환된 뉴클레오타이드를 지칭하고, "비-플루오로 변형 뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 리보실 기의 2' 위치에 있는 하이드록시 기가 비-불소기로 치환된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다. "뉴클레오타이드 유사체"는 핵산 내의 뉴클레오타이드를 대체할 수 있지만 아데닌 리보뉴클레오타이드, 구아닌 리보뉴클레오타이드, 시토신 리보뉴클레오타이드, 우라실 리보뉴클레오타이드, 또는 티민 데옥시리보뉴클레오타이드, 예를 들어, 이소뉴클레오타이드, 가교된 핵산 (요약해서 BNA) 또는 비환형 뉴클레오타이드와 다른 구조를 갖는 기를 지칭한다 "메톡시 변형 뉴클레오타이드"는 리보실 기의 2'-하이드록시 기가 메톡시 기로 치환된 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본 개시내용의 문맥에서, 표현 "상보적인" 및 "역상보적인"은 상호교환적으로 사용되고 당업자에게 잘 알려진 의미를 갖고, 즉, 이중 가닥 핵산 분자에서, 하나의 가닥의 염기는 다른 가닥의 염기와 상보적인 방식으로 짝을 이룬다. DNA에서, 퓨린 염기인 아데닌(A)은 항상 피리미딘 염기인 티민(T) (또는 RNA에서는 우라실(U))과 짝을 이루고, 퓨린 염기인 구아닌(C)은 항상 피리미딘 염기인 시토신(G)과 짝을 이룬다. 각 염기쌍은 퓨린과 피리미딘을 포함한다. 한 가닥의 아데닌이 항상 다른 가닥의 티민 (또는 우라실)과 쌍을 이루고 구아닌이 항상 시토신과 쌍을 이루는 경우, 2개의 가닥은 서로 상보적인 것으로 간주되며, 가닥의 서열은 상보적인 가닥의 서열로부터 유추될 수 있다. 따라서, 당업계에서 "불일치"란 이중 가닥 핵산에서 해당 위치의 염기가 상보적 방식으로 쌍을 이루지 않는 것을 의미한다.
상기 및 하기 본문에서, 달리 명시하지 않는 한, "실질적으로 역상보적"은 관련된 두 뉴클레오타이드 서열 세그먼트 사이에 3개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하고; "사실상 역상보적"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 세그먼트 사이에 1개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하며; "완전히 역상보적"은 2개의 뉴클레오타이드 서열 세그먼트 사이에 염기 불일치가 없음을 의미한다.
상기 및 하기 본문에서, 특히 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체의 제조 방법이 기재되는 경우, 달리 명시하지 않는 한, 뉴클레오사이드 모노머는 제조하고자 하는 siRNA 또는 siRNA 접합체 내의 뉴클레오타이드의 종류와 서열에 따라 포스포라미다이트 고상 합성에 사용된 변형 또는 비변형 RNA 포스포르아미다이트 (때때로 RNA 포스포르아미다이트는 뉴클레오타이드 포스포르아미다이트로도 알려져 있음)을 의미한다. 고상 포스포라미다이트 합성은 당업자에게 잘 알려진 RNA 합성에 사용되는 방법이다. 본 개시내용에 사용된 뉴클레오시드 모노머는 모두 상업적으로 입수 가능하다.
당업자는 하나 이상의 치환기를 함유하는 임의의 기에 대해 이들 기가 입체적으로 비실용적이고, 합성이 불가능하고/거나 본질적으로 불안정한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 도입하려는 의도가 아니라는 것을 이해할 것이다.
본원에 사용된 "알킬"은 지정된 수의 탄소 원자, 전형적으로 1 내지 20개의 탄소 원자, 예컨대 1 내지 10개의 탄소 원자, 예를 들어, 1 내지 8 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 분지쇄를 지칭한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자의 직쇄 및 분지쇄 알킬 기를 포함한다. 지정된 수의 탄소를 갖는 알킬 잔기에 대해 언급하는 경우, 해당 수의 탄소를 갖는 모든 분지쇄 및 직쇄 형태가 포괄되는 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들어 "부틸"은 n-부틸, sec-부틸, 이소부틸 및 tert-부틸을 포함하는 의미이고; "프로필"은 n-프로필 및 이소프로필을 포함한다. 알킬렌은 알킬의 하위 집합이며 알킬과 동일하지만 2개의 부착점이 있는 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 "알케닐"은 모 알킬 기의 인접한 탄소 원자로부터 수소 분자를 제거하여 얻은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 분지쇄 또는 직쇄 알킬 기를 지칭한다. 기는 이중 결합의 시스 또는 트랜스 배열일 수 있다. 전형적인 알케닐 기는 비닐; 프로페닐, 예컨대 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일 (알릴), 및 프로프-2-엔-2-일; 및 부테닐, 예컨대 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부트-1,3-디엔-1-일 및 부트-1,3-디엔-2-일을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 반면, 다른 구현예에서 알케닐 기는 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 알케닐렌은 알케닐의 하위 집합이며 알케닐과 동일하지만 2개의 부착점이 있는 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 "알키닐"은 모 알킬 기의 인접한 탄소 원자로부터 2개의 수소 분자를 제거하여 얻은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화 분지쇄 또는 직쇄 알킬 기를 지칭한다. 전형적인 알키닐 기는 에티닐; 프로피닐, 예컨대 프로프-1-인-1-일 및 프로프-2-인-1-일; 및 부티닐, 예컨대 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일 및 부트-3-인-1-일을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 반면, 다른 구현예에서 알키닐 기는 2 내지 10개, 2 내지 8개, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 알키닐렌은 알키닐의 하위 집합이며 알키닐과 동일하지만 2개의 부착점이 있는 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 "알콕시"는 산소 브릿지(bridge)에 의해 연결된 지정된 수의 탄소 원자의 알킬 기, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 펜틸옥시, 2-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, 네오펜틸옥시, 헥실옥시, 2-헥실옥시, 3-헥실옥시 및 3-메틸펜틸옥시를 지칭한다. 알콕시 기는 전형적으로 산소 브릿지로 연결된 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다.
본원에 사용된 "아릴"은 고리 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 방향족 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소 고리 시스템로부터 유래된 기를 지칭한다. 방향족 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소 고리 시스템은 수소와 탄소수 6 내지 18개의 탄소만을 함유하며, 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리는 완전히 불포화되고, 즉, 휘켈 이론(Huckel theory)에 따른 환형 비편재화된 (4n+2)π-전자 시스템이다. 아릴 기는 페닐, 플루오레닐 및 나프틸과 같은 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 알릴렌은 아릴의 하위 집합이며 알릴과 동일하지만 2개의 부착점이 있는 잔기를 지칭한다.
"헤테로아릴"은 3-원 내지 18-원 방향족 고리로부터 유래된 기를 지칭하며, 2 내지 17개의 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 함유한다. 본원에 사용된 바와 같이, 헤테로아릴 기는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리 시스템일 수 있으며, 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리는 완전히 불포화되고, 즉, 휘켈 이론에 따른 환형 비편재화된 (4n+2)π-전자 시스템이다. 헤테로아릴 기는 융합 또는 가교 고리 시스템을 포함하다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴 기의 헤테로원자는 산화된 헤테로원자이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 질소 원자가 헤테로아릴기에 포함된다. 일부 구현예에서, 헤테로아릴 기 내의 질소 원자 중 하나 이상은 사차화된 질소 원자이다. 헤테로아릴 그룹은 임의의 고리 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된다. 헤테로아릴 기의 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 아자사이클로헵타트리엔, 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈인돌릴, 1,3-벤조b이속사졸릴, 벤조푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조[d]티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조[b][1,4]디옥세피닐, 벤조[b][1,4]옥사지닐, 1,4-벤조디옥사닐, 벤조나프토푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥시닐, 벤조파이라닐, 벤조피라노닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐, 벤조티에노[3,2-d]피리미디닐, 벤조트리아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리디닐, 카바졸릴, 신놀리닐, 사이클로펜타[d]피리미디닐, 6,7-디하이드로-5H-사이클로펜타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6-디하이드로벤조[h]퀴나졸리닐, 5,6-디하이드로벤조[h]신놀리닐, 6,7-디하이드로-5H-벤조[6,7]사이클로헵타[1,2-c]피리다지닐, 디벤조푸라닐, 디벤조티에닐, 푸라닐, 푸라노닐, 푸로[3,2-c]피리디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[d]피리미디닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[d]피리다지닐, 5,6,7,8,9,10-헥사하이드로사이클로옥타[d]피리디닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 이소퀴놀릴, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 5,8-메타노-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 나프티리디닐, 1,6-나프티리디노닐, 옥사디아졸릴, 2-옥소아제피닐, 옥사졸릴, 옥시라닐, 5,6,6a,7,8,9,10,10a-옥타하이드로벤조[H]퀴나졸리닐, 1-페닐-1H-피롤릴, 펜아지닐, 페노티아지닐, 펜옥사지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피라졸로[3,4-d]피리미디닐, 피리디닐, 피리도[3,2-d]피리미디닐, 피리도[3,4-d]피리미디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸리닐, 5,6,7,8-테트라하이드로벤조[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 6,7,8,9-테트라하이드로-5H-사이클로헵타[4,5]티에노[2,3-d]피리미디닐, 5,6,7,8-테트라하이드로피리도[4,5-c]피리다지닐, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 트리아지닐, 티에노[2,3-d]피리미디닐, 티에노[3,2-d]피리미디닐, 티에노[2,3-c]피리디닐 및 티오페닐/티에닐.
다양한 하이드록시 보호기가 본 개시내용에 사용될 수 있다. 일반적으로 보호기는 화학적 작용기를 특정 반응 조건에 둔감하게 만들고 분자의 나머지를 실질적으로 손상시키지 않고 분자 내 해당 작용기에 추가 및 제거될 수 있다. 대표적인 하이드록실 보호기는 문헌[Beaucage 등, Tetrahedron 1992, 48, 2223-2311, 및 Greene 및 Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed, John Wiley & Sons, New York, 1991]에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다 일부 구현예에서, 보호기는 염기성 조건 하에서 안정하고 산성 조건 하에서 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 하이드록실 보호기의 비배타적 예는 디메톡시트리틸(DMT), 모노메톡시트리틸, 9-페닐옥산텐-9-일(Pixyl) 및 9-(p-메톡시페닐)크산트-9-일(Mox)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 하이드록실 보호기의 비배타적 예는 Tr(트리틸), MMTr(4-메톡시트리틸), DMTr(4,4'-디메톡시 트리틸) 및 TMTr(4,4',4"-트리메톡시트리틸)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물 또는 유대류와 같은 임의의 동물을 지칭한다. 본 개시내용의 대상체는 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 레수스 또는 다른 유형의 마카크), 마우스, 피그, 말, 당나귀, 암소, 토끼, 양, 랫트, 및 임의의 종의 가금류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "치료"는 치료적 이익을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유익하거나 원하는 결과를 얻는 수단을 지칭한다. "치료 이익"이라는 용어는 치료 중인 기저 장애를 퇴치하거나 개선하는 것을 의미한다. 더욱이, 기저 장애와 관련된 하나 이상의 생리학적 증상을 퇴치하거나 개선함으로써 치료적 이점이 얻어지며, 이로써 대상체가 여전히 기저 장애에 의해 고통받을 수 있더라도 대상체에서 개선이 관찰된다.
본원에 사용된 "예방"은 예방적 이익을 포함하되 이에 국한되지 않는 유익하거나 원하는 결과를 얻는 수단을 지칭한다. "예방적 이익"을 위해, 이중 가닥 siRNA, 약제학적 조성물 또는 siRNA 접합체는 비록 질환의 진단이 내려지지 않았을지라도, 특정 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체, 또는 보고된 질환의 하나 이상의 생리학적 증상이 있는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 siRNA
일 양태에서, 본 개시내용은 높은 APOC3 유전자 억제 활성 및 낮은 표적외 효과를 갖는 siRNA를 제공한다.
본 개시내용의 siRNA는 기본 구조 단위로 뉴클레오타이드 그룹을 함유한다. 뉴클레오타이드 그룹이 포스페이트 기, 리보실 기 및 염기를 함유한다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 본원에서는 자세히 설명하지 않는다.
본 개시내용의 siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 그리고 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 모두 19개의 뉴클레오타이드로 구성되고, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내의 각각의 뉴클레오타이드는 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역상보적이어서 이중 가닥 영역을 형성하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 적어도 부분적으로 역상보적이며; 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA에서 길이가 19개의 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 서열이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 2 내의 3번째 내지 6번째 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 안정화 변형 뉴클레오타이드이고; 안정화 변형 뉴클레오타이드는 리보스 2' 하이드록실 기가 안정화 변형 기로 치환된 뉴클레오타이드를 의미하며; 해당 위치의 뉴클레오타이드가 비변형 뉴클레오타이드인 siRNA와 비교하여, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하는 siRNA의 열안정성은 증가하고, 그리고 안정화 변형 기의 입체 장애는 2'-O-메틸의 입체 장애보다 크다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 또는 5번째 뉴클레오타이드는 안정화 변형 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 2개 이하의 뉴클레오타이드는 안정화 변형 뉴클레오타이드이다. 특정 위치에서 안정화 변형 뉴클레오타이드의 수를 제한함으로써, 본 개시내용의 siRNA는 약제학적 활성과 낮은 표적외 효과 사이의 최적의 균형을 달성할 수 있으며, 또한 탁월한 안정성을 갖는다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 및/또는 5번째 뉴클레오타이드(들)는 안정화 변형 뉴클레오타이드(들)이다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 뉴클레오타이드는 안정화 변형 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 5번째 뉴클레오타이드는 안정화 변형 뉴클레오타이드이다.
본 개시내용의 siRNA에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 제외한 뉴클레오타이드는 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아니다. 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 내지 6번째 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 안정화 변형 뉴클레오타이드이고, 서열이 또한 3번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 이외의 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하는 경우, siRNA의 표적 서열의 발현 수준을 조절하는 능력은 크게 영향을 받을 수 있다.
일부 구현예에서, "siRNA는 증가된 열안정성을 갖는다"는 siRNA의 용융 온도(Tm)가 증가된다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, "이중 가닥 siRNA는 증가된 열안정성을 갖는다"는 것은 siRNA의 Tm이 적어도 0.05℃ 증가된다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 표현은 0.1 내지 6℃의 증가를 의미한다. 일부 구현예에서, 표현은 0.5 내지 4℃의 Tm 증가를 의미한다. 이론적 설명에 의해 제한되지 않고, 특정 위치에 변형 뉴클레오타이드를 안정화시킴으로써, APOC3 유전자에 의해 발현된 mRNA에 결합하는 본 개시내용의 siRNA 내 안티센스 가닥의 능력은 실질적으로 영향을 받지 않는 반면, 표적외 표적 mRNA에 대한 결합이 상당히 감소되어 표적외 효과가 감소되거나 심지어 제거된다.
일부 구현예에서, 각각의 안정화 변형 기는 독립적으로 -X-R로 표시되는 구조를 갖고, 여기서 X는 O, NR', S 또는 SiR'2이고; R은 C2-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알킬, C6-C8 아릴 및 치환된 C6-C8 아릴 중 하나이고; 각각의 R'는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C6-C8 아릴 및 치환된 C6-C8 아릴 중 하나이고; 치환된 C2-C6 알킬, 치환 C6-C8 아릴 또는 치환 C1-C6 알킬은 C2-C6 알킬, C6-C8 아릴 또는 C1-C6 알킬 상의 하나 이상의 수소 원자가 치환기로 대체되어 형성된 기를 지칭하고, 그리고 치환기는 다음 치환기: C1-C3 알킬, C6-C8 아릴, C1-C3 알콕시, 할로겐, 옥소 및 설파닐리덴 중 하나 이상으로부터 선택된다. 본 개시내용은 구조에 맞는 모든 변형 기를 포괄하려는 것이 아니라, siRNA의 열안정성을 증가시킬 수 있는 안정화 변형 기만을 수반한다는 점에 유의해야 한다. 일부 구현예에서, 각각의 안정화 변형 기는 독립적으로 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-O-2-N-메틸아미노-2-옥소에틸, 2'-O-2-N,N-디메틸아미노에틸, 2'-O-3-아미노프로필 및 2'-O-2,4-디니트로페닐 중 하나로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 각각의 안정화 변형 기는 2'-O-메톡시에틸이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 안정화된 뉴클레오타이드를 갖는 siRNA는 다음의 제1, 제2, 또는 제3 siRNA일 수 있으며, 각각의 siRNA에 대해서는 이하에서 기재된다.
제1 siRNA
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 제1 siRNA이다. 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고; 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르다:
5'- CAAUAAAGCUGGACAAGAZ1 -3'(서열번호: 1);
5'- Z2UCUUGUCCAGCUUUAUUG -3'(서열번호: 2),
여기서 Z1은 A이고, Z2는 U이고;
더욱이, Z1은 A이고, Z2는 U이고, 뉴클레오타이드 서열 I은 위치 Z1에 상응하는 뉴클레오타이드 Z3을 함유하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 위치 Z2에 상응하는 뉴클레오타이드 Z4를 함유하고, 그리고 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이다. 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열이다. 각각의 U는 임의로 T로 대체될 수 있다. 본 명세서의 문맥에서, "위치에서..에 해당하는"은 뉴클레오타이드 서열의 동일한 말단부터 계산하여 뉴클레오타이드 서열 내의 동일한 위치에 있는 것을 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 I의 3' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드는 서열번호: 1에 제시된 제1 뉴클레오타이드에 해당하는 위치를 갖는 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I만을 함유하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 함유한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고/다르거나, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열번호: 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z4 위치의 차이를 포함하고, 그리고 Z4는 A, G 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z4 위치에서의 차이이고, Z4는 A, G 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z3은 Z4에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이는 siRNA의 표적 유전자 억제 능력을 크게 감소시키거나 siRNA의 표적외 효과를 증가시키지 않으며, 뉴클레오타이드 차이를 함유하는 이들 siRNA도 본 개시내용의 보호 범위 내에 속한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 뉴클레오타이드 서열 II에 대해 실질적으로 역상보적이거나, 사실상 역상보적이거나, 완전히 역상보적이고; 실질적으로 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하며; 사실상 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하며; 완전히 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 불일치가 없다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II의 2번째 내지 19번째 위치의 뉴클레오타이드는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 1번째 내지 18번째 위치의 뉴클레오타이드와 완전히 역상보적이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II는 뉴클레오타이드 서열 I과 완전히 역상보적이거나, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 뉴클레오타이드 서열 II 내의 2번째 뉴클레오타이드와 3' 말단에서 5' 말단 방향으로 뉴클레오타이드 서열 I 내의 2번째 뉴클레오타이드 사이에 염기 불일치가 있다. 염기 불일치를 포함함으로써, 본 개시내용의 siRNA의 표적 유전자 발현 억제 활성은 낮은 표적외 효과를 유지하면서 더욱 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열번호: 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열번호: 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열이다:
5'- CAAUAAAGCUGGACAAGAZ3 -3'(서열번호: 3);
5'- Z4UCUUGUCCAGCUUUAUUG -3'(서열번호: 4),
Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, Z3은 A이고 Z4는 U이다.
더욱이, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지며; 센스 가닥의 길이는 19 내지 23개의 뉴클레오타이드이고; 안티센스 가닥의 길이는 19 내지 26개의 뉴클레오타이드이므로, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA의 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 19/21, 21/23 또는 23/25이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 또한 뉴클레오타이드 서열 III을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 또한 뉴클레오타이드 서열 IV를 함유하고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 내의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나이고 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아니고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV의 길이는 각각 1 내지 4개의 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 뉴클레오타이드 서열 III는 길이가 같고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV 및 뉴클레오타이드 서열 III은 사실상 역상보적이거나 완전히 역상보적이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결된다. 또한, 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트와 사실상 역상보적이거나 완전 역상보적이며, 그리고 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 인접하고, 상기 뉴클레오타이드 서열 IV와 길이가 동일한 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 1개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 C이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 G이고; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기는 C이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 20/20이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 2개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CC이고, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GG이거나; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 조성은 CC이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 21/21이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 3개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UCC이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 GGA이거나; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 구성은 UCC이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 22/22이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 4개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CUCC이고, 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 GGAG이거나; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기 조성은 CUCC이고; 이때 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이 비율은 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역상보적이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 주어지면, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성이 결정된다.
제2 siRNA
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 제2 siRNA이다. 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 45에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고; 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 46에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르다:
5'- UUAAAAGGGACAGUAUUCZ5 -3'(서열번호: 45);
5'- Z6GAAUACUGUCCCUUUUAA -3'(서열번호: 46),
여기서 Z5는 U이고 Z6은 A이고;
더욱이, 뉴클레오타이드 서열 I은 위치 Z5에 상응하는 뉴클레오타이드 Z7을 함유하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 위치 Z6에 상응하는 뉴클레오타이드 Z8을 함유하고, 그리고 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이다. 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 45에 제시된 뉴클레오타이드 서열이다. 각각의 U는 임의로 T로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I만을 함유하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 함유한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 45에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고/다르거나, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 46에 제시된 뉴클레오타이드 서열는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열번호: 46에 제시된 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z8 위치의 차이를 포함하고, 그리고 Z8은 U, G 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z8 위치에서의 차이이고, Z8은 A, G 또는 C로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z7은 Z8에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이는 siRNA의 표적 유전자 억제 능력을 크게 감소시키거나 siRNA의 표적외 효과를 증가시키지 않으며, 뉴클레오타이드 차이를 함유하는 이들 siRNA도 본 개시내용의 보호 범위 내에 속한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 뉴클레오타이드 서열 II에 실질적으로 역상보적이거나, 사실상 역상보적이거나, 완전히 역상보적이며; 실질적으로 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하며; 실질적으로 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하며; 완전히 역상보적이라는 것은 두 뉴클레오타이드 서열 사이에 불일치가 없다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단으로의 방향에서, 뉴클레오타이드 서열 II의 2번째-19번째 위치에 있는 뉴클레오타이드는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 1번째 내지 18번째 위치에 있는 뉴클레오타이드와 완전히 역상보적이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II는 뉴클레오타이드 서열 I에 완전히 역상보적이거나, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 뉴클레오타이드 서열 II의 2번째 뉴클레오타이드와 2번째 뉴클레오타이드 사이에 염기 불일치가 존재한다. 뉴클레오타이드 서열 I의 3' 말단에서 5' 말단 방향으로. 염기 불일치를 포함함으로써, 본 개시내용의 siRNA의 표적 유전자 발현 억제 활성은 낮은 표적외 효과를 유지하면서 더욱 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열번호: 47에 제시된 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열번호: 48에 제시된 뉴클레오타이드 서열이다:
5'- UUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3'(서열번호: 47);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAA -3'(서열번호: 48),
Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, Z7은 U이고 Z8은 A이다.
더욱이, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지며; 센스 가닥의 길이는 19 내지 23개의 뉴클레오타이드이고; 안티센스 가닥의 길이는 19 내지 26개의 뉴클레오타이드이므로, 본 개시내용에 의해 제공하는 siRNA의 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 19/21, 21/23 또는 23/25이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 또한 뉴클레오타이드 서열 III을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 또한 뉴클레오타이드 서열 IV를 함유하고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 내의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나이고 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아니고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV의 길이는 각각 1 내지 4개의 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 뉴클레오타이드 서열 III는 길이가 같고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV 및 뉴클레오타이드 서열 III은 사실상 역상보적이거나 완전히 역상보적이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결된다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트와 사실상 역상보적이거나 완전 역상보적이며, 그리고 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 인접하고 APOC3 유전자에 의해 발현된 mRNA에서 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 1 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 C이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 G이고; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기는 C이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 20/20이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 2개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CGC이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GC이고; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 조성은 CGC이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 21/21이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 3개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UGC이고, 그리고 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 GCA이고; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 조성은 GCA이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 22/22이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 4개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UUGC이고, 그리고 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 GCAA이고; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기 조성은 GCAA이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역상보적이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성이 주어지면, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성이 결정된다.
제3 siRNA
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 제2 siRNA이다. 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 105에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고; 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 106에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르다:
5'- GGACAGUAUUCUCAGUGCZ9 -3'(서열번호: 105);
5'- Z10GCACUGAGAAUACUGUCC -3'(서열번호: 106),
여기서 Z9는 U이고 Z10은 A이고;
더욱이, 뉴클레오타이드 서열 I은 위치 Z9에 상응하는 뉴클레오타이드 Z11을 함유하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 위치 Z10에 상응하는 뉴클레오타이드 Z12를 함유하고, 그리고 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이다. 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 105에 제시된 뉴클레오타이드 서열이다. 각각의 U는 임의로 T로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I만을 함유하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II만을 함유한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 105에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고/다르거나, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 106에 제시된 뉴클레오타이드 서열는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열번호: 106에 제시된 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z12 위치의 차이를 포함하고, 그리고 Z12는 G, C 또는 U로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 차이는 Z12 위치에서의 차이이고, Z12는 G, C 또는 U로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Z11은 Z12에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이다. 이러한 뉴클레오타이드 차이는 siRNA의 표적 유전자 억제 능력을 크게 감소시키거나 siRNA의 표적외 효과를 증가시키지 않으며, 뉴클레오타이드 차이를 함유하는 이들 siRNA도 본 개시내용의 보호 범위 내에 속한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 뉴클레오타이드 서열 II에 대해 실질적으로 역상보적이거나, 사실상 역상보적이거나, 완전히 역상보적이고; 실질적으로 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하며; 사실상 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하며; 완전히 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 불일치가 없다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II의 2번째 내지 19번째 위치의 뉴클레오타이드는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 1번째 내지 18번째 위치의 뉴클레오타이드와 완전히 역상보적이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II는 뉴클레오타이드 서열 I과 완전히 역상보적이거나, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 뉴클레오타이드 서열 II 내의 2번째 뉴클레오타이드와 3' 말단에서 5' 말단 방향으로 뉴클레오타이드 서열 I 내의 2번째 뉴클레오타이드 사이에 염기 불일치가 있다. 염기 불일치를 포함함으로써, 본 개시내용의 siRNA의 표적 유전자 발현 억제 활성은 낮은 표적외 효과를 유지하면서 더욱 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I은 서열번호: 107에 제시된 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열번호: 108에 제시된 뉴클레오타이드 서열이다:
5'- GGACAGUAUUCUCAGUGCZ11 -3'(서열번호: 107);
5'- Z12GCACUGAGAAUACUGUCC -3'(서열번호: 108),
Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보적인 뉴클레오타이드인, siRNA. 일부 구현예에서, Z11은 U이고 Z12는 A이다.
더욱이, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 가지며; 센스 가닥의 길이는 19 내지 23개의 뉴클레오타이드이고; 안티센스 가닥의 길이는 19 내지 26개의 뉴클레오타이드이므로, 본 개시내용에 의해 제공하는 siRNA의 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 19/21, 21/23 또는 23/25이다.
일부 구현예에서, 센스 가닥은 또한 뉴클레오타이드 서열 III을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 또한 뉴클레오타이드 서열 IV를 함유하고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 내의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나이고 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아니고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV의 길이는 각각 1 내지 4개의 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 뉴클레오타이드 서열 III는 길이가 같고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV 및 뉴클레오타이드 서열 III은 사실상 역상보적이거나 완전히 역상보적이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결된다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열 IV는 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트와 사실상 역상보적이거나 완전 역상보적이며, 그리고 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 인접하고 APOC3 유전자에 의해 발현된 mRNA에서 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 1 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 C이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 G이고; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기는 C이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 20/20이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 2개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AG이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CU이고; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 조성은 AG이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 21/21이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 3개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AAG이고, 그리고 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 CUU이고; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 조성은 AAG이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 22/22이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV의 길이는 둘 다 4개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AAAG이고, 그리고 뉴클레오타이드 IV의 염기 조성은 CUUU이고; 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기 조성은 AAAG이고; 이때, 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 21/21이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV는 완전히 역상보적이다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기가 주어지면, 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기가 결정된다.
이하, 뉴클레오타이드 서열 V, siRNA의 뉴클레오타이드 변형 및 변형된 서열에 대한 설명은 본 개시내용의 전술한 siRNA, 예컨대 제1 siRNA, 제2 siRNA 또는 제3 siRNA에도 적용 가능하다. 즉, 구체적인 설명이 없는 경우, 이하의 siRNA 설명은 본 개시내용의 전술한 siRNA, 예컨대 제1 siRNA, 제2 siRNA 및 제3 siRNA를 하나하나씩 기재하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 특정 siRNA가 명시되지 않은 경우, "siRNA는 또한 뉴클레오타이드 서열 V를 함유한다"는 것은 "본 개시내용의 siRNA, 예컨대 제1 siRNA, 제2 siRNA 또는 제3 siRNA는 또한 뉴클레오타이드 서열 V를 함유한다"를 의미한다.
일부 구현예에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 상이한 길이를 가지며, 안티센스 가닥은 또한 뉴클레오타이드 서열 V를 함유하고 뉴클레오타이드 서열 V 내의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나이고 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아니고, 뉴클레오타이드 서열 V의 길이는 1 내지 3개의 뉴클레오타이드이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 V는 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결되어 안티센스 가닥의 3' 오버행을 구성한다. 따라서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA의 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 19/20, 19/21, 19/22, 20/21, 20/22, 20/23, 21/22, 21/23, 21/24, 22/23, 22/24, 22/25, 23/24, 23/25 또는 23/26일 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 V는 2 개의 뉴클레오타이드 길이이고, 따라서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA의 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 19/21, 21/23 또는 23/25일 수 있다.
뉴클레오타이드 서열 V 내의 각각의 뉴클레오타이드는 임의의 뉴클레오타이드일 수 있다. 합성의 편의와 비용 절감을 위해, 뉴클레오타이드 서열 V는 2개의 연속적인 티민 데옥시리보뉴클레오타이드(dTdT) 또는 2개의 연속적인 우라실 리보뉴클레오타이드(UU)이거나; 또는 표적 mRNA에 대한 siRNA 안티센스 가닥의 친화성을 향상시키기 위해, 뉴클레오타이드 서열 V는 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 대해 완전히 역상보적이다. 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트 또는 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 인접하고, APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 뉴클레오타이드 서열 V와 동일한 길이를 갖는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA의 안티센스 가닥에 대한 센스 가닥의 길이 비율은 19/21 또는 21/23이고, 이때 본 개시내용의 siRNA는 더 나은 mRNA 침묵화 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 제1 siRNA의 경우, 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기 조성은 CC이고; siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 6에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유한다:
5'- CAAUAAAGCUGGACAAGAZ3 -3'(서열번호: 5);
5'- Z4UCUUGUCCAGCUUUAUUGGG -3'(서열번호: 6),
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 7에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 8에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- CCCAAUAAAGCUGGACAAGAZ3 -3'(서열번호: 7);
5'- Z4UCUUGUCCAGCUUUAUUGGGAG -3'(서열번호: 8),
Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 9에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 10에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- CAAUAAAGCUGGACAAGAA -3'(서열번호: 9);
5'- UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGG -3'(서열번호: 10),
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 11에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 12에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- CCCAAUAAAGCUGGACAAGAA -3'(서열번호: 11);
5'- UUCUUGUCCAGCUUUAUUGGGAG -3'(서열번호: 12).
일부 구현예에서, 제2 siRNA의 경우, 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 45에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기 조성은 GC이다. siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 49에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 50에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- UUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3'(서열번호: 49);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAAGC -3'(서열번호: 50),
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 51에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 52에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- GCUUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3'(서열번호: 51);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA -3'(서열번호: 52),
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 49에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 149에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- UUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3'(서열번호: 49);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAAUU -3'(서열번호: 149),
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 51에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 150에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- GCUUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3'(서열번호: 51);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAAGCUU -3'(서열번호: 150),
Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 53에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 54에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- UUAAAAGGGACAGUAUUCU -3'(서열번호: 53);
5'- AGAAUACUGUCCCUUUUAAGC -3'(서열번호: 54),
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 55에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 55에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU -3'(서열번호: 55);
5'- AGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA -3'(서열번호: 56).
일부 구현예에서, 제3 siRNA의 경우, 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 105에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기 조성은 AG이다. siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 109에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 110에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- GGACAGUAUUCUCAGUGCZ11 -3'(서열번호: 109);
5'- Z12GCACUGAGAAUACUGUCCCU -3'(서열번호: 110),
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 111에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 112에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- AGGGACAGUAUUCUCAGUGCZ11 -3'(서열번호: 111);
5'- Z12GCACUGAGAAUACUGUCCCUUU -3'(서열번호: 112),
Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보적인 뉴클레오타이드인, siRNA.
일부 구현예에서, siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 113에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 114에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- GGACAGUAUUCUCAGUGCU -3'(서열번호: 113);
5'- AGCACUGAGAAUACUGUCCCU -3'(서열번호: 114),
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 115에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 116에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- AGGGACAGUAUUCUCAGUGCU -3'(서열번호: 115);
5'- AGCACUGAGAAUACUGUCCCUUU -3'(서열번호: 116).
위에서 언급한 바와 같이, 본 개시내용의 siRNA 내의 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 내의 뉴클레오타이드 중 일부 또는 전부는 변형 뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드 그룹에 대한 이러한 변형은 APOC3 유전자의 발현을 억제하는 본 개시내용의 siRNA 기능의 명백한 약화 또는 손실을 초래하지 않을 것이다.
본 개시내용의 문맥에서, "변형 뉴클레오타이드"라는 용어는 뉴클레오타이드의 리보실 기의 2' 위치에 있는 하이드록실 기를 다른 기로 대체하여 형성된 뉴클레오타이드 유사체 또는 뉴클레오타이드, 또는 염기가 변형 염기인 뉴클레오타이드를 지칭한다. 변형 뉴클레오타이드는 유전자 발현을 억제하는 siRNA 기능의 명백한 약화 또는 손실을 유발하지 않는다. 예를 들어, 문헌[J.K. Watts, G.F. Deleavey, 및 M.J. Damha, Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today, 2008, 13(19-20): 842-55]에 개시된 변형 뉴클레오타이드를 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 2번째, 6번째, 14번째 및 16번째 뉴클레오타이드가 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아닌 경우, 동일한 것은 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 모든 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 2번째, 6번째, 14번째 및 16번째 뉴클레오타이드가 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아닌 경우, 동일한 것은 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 II 내의 다른 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나이다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I 내의 7번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열 I 내의 모든 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I 내의 7번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 I 내의 다른 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나이다. 변형을 통해, 본 개시내용의 siRNA는 유전자 발현 조절 활성과 생체내 안정성 사이의 양호한 균형을 달성할 수 있다.
본 개시내용의 문맥에서, "플루오로 변형 뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 리보실 기의 2' 위치에 있는 하이드록실 기를 불소로 치환함으로써 형성된 뉴클레오타이드를 의미하며, 이는 화학식 (7)로 표시되는 구조를 갖는다. "비-플루오로 변형 뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 리보실 기의 2' 위치에 있는 하이드록실 기를 비-불소 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 각각의 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 리보실 기의 2' 위치에 있는 하이드록실 기를 비-불소 기로 치환함으로써 형성된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
리보실 기의 2' 위치에 있는 하이드록실 기가 비-불소 기로 치환된 뉴클레오타이드는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 뉴클레오타이드는 2'-알콕시 변형 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형 뉴클레오타이드, 2'-치환된 알킬 변형 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형 뉴클레오타이드, 2'-치환된 아미노 변형 뉴클레오타이드 및 2'-데옥시뉴클레오타이드부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 2'-알콕시 변형 뉴클레오타이드는 화학식 (8)으로 표시되는 메톡시 변형 뉴클레오타이드(2'-OMe)이다. 일부 구현예에서, 2'-아미노 변형 뉴클레오타이드(2'-NH2)는 화학식 (9)로 표시된다. 일부 구현예에서, 2'-데옥시뉴클레오타이드(DNA)는 화학식 (10)으로 표시된다:
"뉴클레오타이드 유사체"라는 단어는 핵산 내의 뉴클레오타이드를 치환할 수 있으나 아데닌 리보뉴클레오타이드, 구아닌 리보뉴클레오타이드, 시토신 리보뉴클레오타이드, 우라실 리보뉴클레오타이드, 또는 흉선 피리미딘 데옥시리보뉴클레오타이드와 구조적으로 다른 그룹을 지칭한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 이소뉴클레오타이드, 가교된 핵산(간단히 BNA) 또는 비환형 뉴클레오타이드일 수 있다.
BNA는 제한적이거나 접근할 수 없는 뉴클레오타이드를 지칭한다. BNA는 "고정된" C3'-엔도슈가(endosugar) 수축을 갖는 5-원, 6-원 또는 7-원 고리 브릿지(bridge) 구조를 함유할 수 있다. 전형적으로, 브릿지는 리보스의 2'- 및 4'-위치에 통합되어 2',4'-BNA 뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 구현예에서, BNA는 LNA, ENA, cET BNA 등일 수 있으며, 여기서 LNA는 화학식 (12)으로 표시되고, ENA는 화학식 (13)으로 표시되며, cET BNA는 화학식 (14)으로 표시된다:
비환형 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 당 고리가 열려 형성된 뉴클레오타이드의 유형이다. 일부 구현예에서, 비환형 뉴클레오타이드는 잠금 해제된 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)일 수 있으며, 여기서 UNA는 화학식 (15)로 표시되고, GNA는 화학식 (16)으로 표시된다:
화학화학식 (15) 및 화학식 (16)에서, R은 H, OH 또는 알콕시(O-알킬)로부터 선택된다.
이소뉴클레오타이드는 리보스 고리에 있는 뉴클레오타이드의 염기 위치가 바뀌어 형성된 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이소뉴클레오타이드는 화학식 (17) 또는 (18)로 표시되는 바와 같이, 리보스 고리의 1' 위치에서 2' 위치 또는 3' 위치로 염기가 이동하여 형성된 화합물일 수 있다.
화학식 (17)-(18)의 화합물에서, 염기는 A, U, G, C 또는 T와 같은 핵산 염기를 나타내고; R은 전술한 바와 같이 H, OH, F 또는 비-불소 기로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체는 이소뉴클레오타이드, LNA, ENA, cET, UNA 및 GNA 중 하나로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 각각의 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드는 메톡시 변형 뉴클레오타이드이다. 상기 및 하기 본문에서, 메톡시 변형 뉴클레오타이드는 리보실 기의 2'-하이드록실을 메톡시로 치환하여 형성된 뉴클레오타이드를 지칭한다.
상기 및 하기 본문에서, "플루오로 변형 뉴클레오타이드", "2'-불소 변형 뉴클레오타이드", "리보실 기의 2'-하이드록실 기가 불소로 치환된 뉴클레오타이드" 및 "2'-플루오로리보실 기를 갖는 뉴클레오타이드"는 동일한 의미를 가지며, 이들 모두는 뉴클레오타이드의 2'-하이드록실 기가 불소로 치환되어 형성되고 화학식 (7)로 표시되는 구조를 갖는 화합물을 의미하고; "메톡시 변형 뉴클레오타이드", "2'-메톡시 변형 뉴클레오타이드", "리보실 기의 2'-하이드록실 기가 메톡시로 치환된 뉴클레오타이드" 및 "2'-메톡시리보실 기를 갖는 뉴클레오타이드"는 동일한 의미를 가지며, 이들 모두는 뉴클레오타이드의 리보실 기의 2'-하이드록실기를 메톡시로 치환하여 형성되고 화학식 (8)로 표시되는 구조를 갖는 화합물을 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하는 siRNA는 다음 변형을 갖는 siRNA이다: 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 센스 가닥에서, 뉴클레오타이드 서열 I의 7번째, 8번째, 및 9번째 또는 5번째, 7번째, 8번째, 및 9번째 위치에 있는 뉴클레오타이드는 플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 그리고 센스 가닥 내의 나머지 위치에 있는 뉴클레오타이드는 메톡시 변형 뉴클레오타이드이고; 안티센스 가닥에서, 뉴클레오타이드 서열 II의 2번째, 6번째, 14번째, 16번째 또는 2번째, 6번째, 8번째, 9번째, 14번째, 16번째 위치에 있는 뉴클레오타이드는 플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 안티센스 가닥 내의 3번째 또는 5번째 위치에 있는 뉴클레오타이드는 안정화 변형 뉴클레오타이드이고, 그리고 안티센스 가닥 내의 나머지 위치에 있는 뉴클레오타이드는 메톡시 변형 뉴클레오타이드이다.
상기 변형된 siRNA는 비용이 낮을 뿐만 아니라, 혈액 중의 리보뉴클레아제가 siRNA를 절단하는 것을 어렵게 하여 siRNA의 안정성을 높이고 뉴클레아제 가수분해에 대한 저항성을 더욱 강하게 갖게 한다. 한편, 상기 변형은 siRNA의 억제 성능을 크게 감소시키지 않으면서 siRNA의 표적외 효과를 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA는 siAPOC3a1-M1, siAPOC3a1-M2, siAPOC3a2-M1, siAPOC3a2-M2, siAPOC3b1-M1, siAPOC3b1-M2, siAPOC3b2-M1, siAPOC3b2-M2, siAPOC3b3-M1, siAPOC3b3-M2, siAPOC3b4-M1, siAPOC3b4-M2, siAPOC3c1-M1, siAPOC3c1-M2, siAPOC3c2-M1, 및 siAPOC3c2-M2이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 중 적어도 하나의 단일 가닥의 인산염-당 백본에 있는 포스포에스테르 기의 적어도 일부는 변형된 기를 갖는 포스포에스테르 기이다. 일부 구현예에서, 변형된 기를 갖는 포스페이트 기는 포스페이트 기 내의 포스포디에스테르 결합에서 적어도 하나의 산소 원자를 황 원자로 치환함으로써 형성된 포스포로티오에이트 기이다. 일부 구현예에서, 변형된 기를 갖는 포스페이트 기는 화학식 (1)로 표시되는 구조를 갖는 포스포로티오에이트 기이다:
이러한 변형은 siRNA의 이중 가닥 구조를 안정화시키고 염기쌍의 높은 특이성과 높은 친화도를 유지할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA에서, 포스포로티오에이트 기 연결은 다음 위치 중 적어도 하나에 존재한다: 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단에 있는 제1과 제2 뉴클레오타이드 사이; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단에 있는 제2와 제3 뉴클레오타이드 사이; 또는 상기의 임의의 조합. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 기 연결은 센스 가닥의 5' 말단을 제외한 상기 위치 모두에 존재한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 기 연결은 센스 가닥의 3' 말단을 제외한 상기 위치 모두에 존재한다. 일부 구현예에서, 포스포로티오에이트 기 결합은 다음 위치 중 적어도 하나에 존재한다:
센스 가닥의 5' 말단에 있는 1번째 뉴클레오타이드 및 2번째 뉴클레오타이드 사이;
센스 가닥의 5' 말단에 있는 2번째 뉴클레오타이드 및 3번째 뉴클레오타이드 사이;
센스 가닥의 3' 말단에 있는 1번째 뉴클레오타이드 및 2번째 뉴클레오타이드 사이;
센스 가닥의 3' 말단에 있는 2번째 뉴클레오타이드 및 3번째 뉴클레오타이드 사이;
안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 1번째 뉴클레오타이드 및 2번째 뉴클레오타이드 사이;
안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 2번째 뉴클레오타이드 및 3번째 뉴클레오타이드 사이;
안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 1번째 뉴클레오타이드 및 2번째 뉴클레오타이드 사이; 및
안티센스 가닥의 3' 말단에 있는 2번째 뉴클레오타이드 및 3번째 뉴클레오타이드 사이.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA은 표 1a 내지 표 1c에 나열된 바와 같은 siAPOC3a1-M1S, siAPOC3a1-M2S, siAPOC3a2-M1S, siAPOC3a2-M2S, siAPOC3b1-M1S, siAPOC3b1-M2S, siAPOC3b2-M1S, siAPOC3b2-M2S, siAPOC3b3-M1S, siAPOC3b3-M2S, siAPOC3b4-M1S, siAPOC3b4-M2S, siAPOC3c1-M1S, siAPOC3c1-M2S, siAPOC3c2-M1S, 및 siAPOC3c2-M2S 중 하나이다.
일부 구현예에서, siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오타이드는 5'-포스페이트 유사체에 의해 변형된 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 뉴클레오타이드이다.
통상적으로 사용되는 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형 뉴클레오타이드는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 5'-포스페이트 뉴클레오타이드는 다음 구조를 가질 수 있다:
또 다른 예에서, 문헌[Anastasia Khvorova 및 Jonathan K. Watts, The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nature Biotechnology, 2017,35(3):238-48]은 다음의 4개의 5'-포스페이트 유사체 변형 뉴클레오타이드를 개시한다:
여기서 R은 H, OH, 메톡시, 불소로부터 선택되고; 염기는 A, U, C, G 또는 T로부터 선택된 핵산 염기를 나타낸다.
일부 구현예에서, 5'-포스페이트 뉴클레오타이드는 화학식 (2)로 표시되는 5'-포스페이트 변형 뉴클레오타이드를 함유하는 뉴클레오타이드이고, 5'-포스페이트 유사체 변형 뉴클레오타이드는 화학식 (3)으로 표시되는 비닐포스페이트 (5'-(E)-비닐포스포네이트, E-VP) 변형 뉴클레오타이드, 또는 화학식 (5)으로 표시되는 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA는 표 1a 내지 표 1c에 나열된 siAPOC3a1-M1P1, siAPOC3a1-M2P1, siAPOC3a2-M1P1, siAPOC3a2-M2P1, siAPOC3a1-M1SP1, siAPOC3a1-M2SP1, siAPOC3a2-M1SP1, siAPOC3a2-M2SP1, siAPOC3b1-M1P1, siAPOC3b1-M2P1, siAPOC3b2-M1P1, siAPOC3b2-M2P1, siAPOC3b1-M1SP1, siAPOC3b1-M2SP1, siAPOC3b2-M1SP1, siAPOC3b2-M2SP1, siAPOC3b3-M1P1, siAPOC3b3-M2P1, siAPOC3b4-M1P1, siAPOC3b4-M2P1, siAPOC3b3-M1SP1, siAPOC3b3-M2SP1, siAPOC3b4-M1SP1, siAPOC3b4-M2SP1, siAPOC3c1-M1P1, siAPOC3c1-M2P1, siAPOC3c2-M1P1, siAPOC3c2-M2P1, siAPOC3c1-M1SP1, siAPOC3c1-M2SP1, siAPOC3c2-M1SP1, 및 siAPOC3c2-M2SP1 중 하나이다.
본 개시내용의 발명자들은 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA가 혈장 및 리소좀 안정성을 현저히 향상시키고, 표적외 효과를 현저히 낮출 뿐만 아니라, 높은 유전자 억제 활성을 유지한다는 것을 예상치 못하게 발견하였다.
본 개시내용에서 제공되는 siRNA는 당해 분야의 기존의 siRNA 제조 방법(예컨대 고상 합성 및 액체상 합성 방법)을 통해 얻을 수 있다. 이들 중에서, 고상 합성은 맞춤형 서비스를 상용화하였다. 변형 뉴클레오타이드 그룹은 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오시드 모노머를 사용하여 본 개시내용의 siRNA에 도입될 수 있다. 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오시드 모노머를 제조하는 방법 및 변형 뉴클레오타이드 그룹을 siRNA에 도입하는 방법은 또한 당업자에게 잘 알려져 있다.
약제학적 조성물
본 개시내용은 전술한 siRNA를 활성 성분으로 함유하고 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 siRNA 투여 분야에서 일반적으로 사용되는 담체일 수 있으며, 그 예는 자성 나노입자 (예컨대 Fe3O4 또는 Fe2O3 기반의 나노입자), 탄소 나노튜브, 메조다공성 실리콘, 인산칼슘 나노입자, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 폴리(L-라이신) (PLL), 키토산, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP), 폴리(D&L-락트산/글리콜산)공중합체 (PLGA), 폴리(2-아미노에틸에틸렌 포스페이트) (PPEEA) 및 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트) (PDMAEMA) 뿐만 아니라 그의 유도체로 제한되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물에서, siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체의 함량에 대한 특별한 요건은 없다. 일부 구현예에서, siRNA 대 약제학적으로 허용되는 담체의 중량 비는 1:(1 내지 500)일 수 있고, 일부 구현예에서, 전술한 중량 비는 1:(1 내지 50)이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 다른 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 당업계에서 일상적으로 사용되는 다양한 제제 또는 화합물 중 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 다른 약제학적으로 허용되는 부형제는 pH 완충제, 보호제 및 삼투압 조절제 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
pH 완충액은 pH 값이 7.5 내지 8.5인 Tris 하이드로클로라이드 완충액 및/또는 pH 값이 5.5 내지 8.5인 인산염 완충액, 예를 들어 pH 값이 5.5 내지 8.5인 인산염 완충액일 수 있다.
보호제는 이노시톨, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 만노스, 말토스, 락토스 및 글루코오스 중 적어도 하나일 수 있다. 보호제의 함량은 약제학적 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 30 중량%일 수 있다.
삼투압 조절제는 염화나트륨 및/또는 염화칼륨일 수 있다. 삼투압 조절제의 함량은 약제학적 조성물의 삼투압을 200 내지 700 밀리오스몰/kg(mOsm/kg)으로 만든다. 원하는 삼투압에 따라, 당업자는 삼투압 조절제의 함량을 용이하게 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물로부터 제조된 제제의 용량은 투여 동안 상이한 투여 방법으로 인해 조정될 것이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사제와 같은 액상 제제일 수 있고; 이는 냉동 건조 분말 주사제일 수도 있으며, 투여 중에 액상 부형제와 혼합하여 액상 제제를 제조한다. 액상 제제는 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 투여에 사용될 수 있으나, 분무에 의해 폐에 투여할 수도 있고, 분무에 의해 폐를 통해 다른 장기(예컨대 간)에 투여할 수도 있고, 구강인두 흡입 또는 비강 투여를 통해 약제학적 조성물을 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 분무 투여용이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 리포솜 제형의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜 제형에 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체는 아민 함유 형질감염 화합물(이하, 유기 아민으로도 지칭됨), 헬퍼 지질 및/또는 PEG화 지질을 포함한다. 유기 아민, 헬퍼 지질 및 PEG화 지질은 중국 특허 출원 CN103380113A(전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 아민 함유 형질감염 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 유도체, 헬퍼 지질 및 PEG화 지질 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 중국 특허 출원 CN103380113A에 기재된 화학식 (201)로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다:
여기서:
X101 및 X102는 각각 독립적으로 O, S, N-A 또는 C-A이고, 여기서 A는 수소 또는 C1-C20 탄화수소 사슬이고;
Y101 및 Z101은 각각 독립적으로 C=O, C=S, S=O, CH-OH 또는 SO2이고;
R101, R102, R103, R104, R105, R106 및 R107은 각각 독립적으로 수소, 환형 또는 비환형, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 직쇄 지방족 그룹, 환형 또는 비환형, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 직쇄 헤테로지방족, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 직쇄 아실, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 직쇄 아릴, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 직쇄 헤테로아릴이고;
x는 1 내지 10의 정수이고;
n은 1 내지 3의 정수이고, m은 0 내지 20의 정수이고, p는 0 또는 1이고; m = p = 0인 경우, R102는 수소이고;
n 또는 m 중 적어도 하나가 2인 경우, 화학식 (201)의 R103과 질소는 화학식 (202) 또는 화학식 (203)으로 표시되는 구조를 형성한다:
화학식 (201)에서 g, e 및 f는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고, "HCC"는 탄화수소 사슬을 나타내고, 각각의 *N은 질소 원자를 나타낸다.
일부 구현예에서, R103은 폴리아민이다. 다른 구현예에서, R103은 케탈이다. 일부 구현예에서, 화학식 (201)의 R101 및 R102 각각은 독립적으로 임의의 치환 또는 비치환, 분지쇄 또는 직쇄 알킬 또는 알케닐이고, 알킬 또는 알케닐 기는 3 내지 약 20개의 탄소 원자, 예를 들어, 8 내지 약 18개의 탄소 원자, 및 0 내지 4개의 이중 결합, 예를 들어, 0 내지 2개의 이중 결합를 갖는다.
일부 구현예에서, n 및 m 각각이 독립적으로 1 또는 3의 값을 갖는 경우, R103은 화학식 (204) 내지 (213) 중 임의의 것일 수 있다:
화학식 (204) 내지 화학식 (213)에서, g, e 및 f는 각각 독립적으로 1 내지 6의 정수이고, 각각의 "HCC"는 탄화수소 사슬을 나타내고, 각각의 *는 화학식 (201)에서 R103의 질소 원자에 대한 가능한 부착점을 나타내고, 여기서 임의의 * 위치의 각각의 H는 치환되어 화학화학식 (201)의 질소 원자에 대한 연결을 달성할 수 있다.
화학식 (201)로 표시되는 화합물은 중국 특허 출원 CN103380113A의 설명에 따라 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 유기 아민은 화학식 (214)으로 표시되는 유기 아민 및/또는 화학식 (215)로 표시되는 유기 아민이다:
헬퍼 지질은 콜레스테롤, 콜레스테롤 유사체 및/또는 콜레스테롤 유도체이며;
PEG화 지질은 1,2-디팔미트아미드-sn-글리세롤-3-포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)]-2000이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물에서, 유기 아민, 헬퍼 지질 및 PEG화 지질 사이의 몰비는 (19.7 내지 80):(19.7 내지 80):(0.3 내지 50), 예컨대 (50 내지 70):(20 내지 40):(3 내지 20)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 전술한 아민 함유 형질감염 시약으로부터 형성된 약제학적 조성물의 입자는 약 30 nm 내지 약 200 nm, 전형적으로 약 40 nm 내지 약 135 nm의 평균 직경을 가지며; 더욱 전형적으로, 리포솜 입자의 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 120 nm, 약 50 nm 내지 약 100 nm, 약 60 nm 내지 약 90 nm 또는 약 70 nm 내지 약 90 nm이다. 예를 들어, 리포솜 입자의 평균 직경은 약 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 160 nm이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 및 아민 함유 형질감염 시약으로부터 형성된 약제학적 조성물에서, siRNA 대 모든 지질 (예컨대 유기 아민, 헬퍼 지질 및/또는 PEG화 지질)의 중량 비 (중량/중량 비)은 약 1:1 내지 약 1:50, 약 1:1 내지 약 1:30, 약 1:3 내지 약 1:20, 약 1:4 내지 약 1:18, 약 1:5 내지 약 1:17, 약 1:5 내지 약 1:15, 약 1:5 내지 약 1:12, 약 1:6 내지 약 1:12 또는 약 1:6 내지 약 1:10의 범위 내에 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 siRNA 대 모든 지질의 중량 비는 약 1:5, 1:6, 1:7. 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 또는 1:18이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 각 성분은 판매시 독립적으로 존재할 수 있고, 사용 시에는 액체 제형의 형태로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA와 전술한 약제학적으로 허용되는 담체로 형성된 약제학적 조성물은 공지된 다양한 방법에 따라 제조될 수 있으며, 기존의 siRNA를 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA로 치환하여 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 다음과 같이 제조될 수 있다:
유기 아민, 헬퍼 지질 및 PEG화 지질을 몰비에 따라 알코올에 현탁시키고 혼합하여 지질 용액을 얻고, 여기서 알코올의 양은 수득된 지질 용액의 총 질량 농도가 2 내지 25 mg/이 되도록 하는 것이고, 예를 들어, 8 내지 18 mg/mL일 수 있다. 알코올은 약제학적으로 허용되는 알코올, 예컨대 대략 실온에서 액체인 알코올, 예를 들어, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 벤질 알코올, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜 200, 폴리에틸렌 글리콜 300, 폴리에틸렌 글리콜 400 중 하나 이상로부터 선택되고, 예를 들어, 에탄올일 수 있다.
본 개시내용에 의해 제공된 siRNA를 완충 식염수 용액에 용해시켜 siRNA 수용액을 얻는다. 완충 식염수 용액의 농도는 0.05 내지 0.5 M, 예를 들어, 0.1 내지 0.2 M이고; 완충 식염수 용액의 pH은 조정하고 4.0 내지 5.5, 예를 들어, 5.0 내지 5.2로 조정되고; 완충 식염수 용액의 양은 siRNA의 농도가 0.6 mg/mL를 초과하지 않도록 하고, 그 예는 0.2 내지 0.4 mg/mL이다. 완충 염은 가용성 아세테이트 및 가용성 시트레이트, 예를 들어, 아세트산나트륨 및/또는 아세트산칼륨 중 하나 이상으로부터 선택된다.
지질 용액과 siRNA 수용액을 혼합하고, 혼합된 생성물을 40 내지 60 ℃에서 적어도 2분, 예를 들어 5 내지 30분 동안 인큐베이션하여 인큐베이션된 리포좀 제제를 얻는다. 지질 용액 대 siRNA 수용액의 부피 비는 1:(2 내지 5), 예를 들어 1:4이다.
인큐베이션된 리포솜 제제를 농축 또는 희석하고 불순물을 제거하고, 제제를 멸균 처리하여 본 개시내용에 따른 약제학적 조성물을 얻는데, 물리적 및 화학적 매개변수는 pH 6.5 내지 8이고, 캡슐화 효율은 80% 이상이며, 입자 크기는 40 내지 200 nm이고, 다분산도 지수는 0.30 이하이고, 삼투압은 250 내지 400 mOsm/kg이다. 예를 들어, 물리적 및 화학적 매개변수는 pH 7.2 내지 7.6이고, 캡슐화 효율은 90% 이상이며, 입자 크기는 60 내지 100nm이고, 다분산도 지수는 0.20 이하이고, 삼투압은 300 내지 400 mOsm/kg이다.
농축 또는 희석은 불순물 제거 전, 후 또는 동시에 수행될 수 있다. 불순물을 제거하기 위해 기존의 다양한 방법을 사용할 수 있는데, 예를 들어 100K Da의 한외여과를 위해서는 접선 유동 시스템과 중공 섬유 컬럼을 사용할 수 있으며, 여기서 한외여과 교환 용액은 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)이다. 멸균은 기존의 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 0.22 μm 필터를 이용한 여과 멸균을 사용할 수 있다.
siRNA 접합체
본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 및 siRNA에 접합된 접합 그룹을 포함하는 siRNA 접합체를 제공한다. 일부 구현예에서, 접합 그룹은 링커 및 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹 및/또는 전달 보조 그룹을 포함하고, siRNA, 링커 및 표적화 그룹 또는 전달 보조 그룹은 공유적으로 또는 비공유적으로 순차적으로 연결되고; 각각의 표적화 그룹은 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드로부터 선택되고, 각각의 전달 보조 그룹은 전달 표적 장기 또는 조직에서 siRNA 접합체의 생체적합성을 증가시킬 수 있는 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 문맥에서, 달리 언급되지 않는 한, "접합"은 각각 특정 기능을 갖는 2개 이상의 화학적 모이어티가 서로 공유적으로 연결되어 있음을 의미하고; 따라서 "접합체"는 다양한 화학적 모이어티 사이의 공유 결합에 의해 형성된 화합물을 지칭한다. 또한, "siRNA 접합체"는 siRNA에 특정 기능을 갖는 하나 이상의 화학적 모이어티가 공유적으로 연결되어 형성된 화합물을 지칭한다. siRNA는 문맥에 따라 다중 siRNA 접합체 또는 특정 화학식으로 표시되는 siRNA 접합체의 일반적인 용어로 이해되어야 한다. 본 개시내용의 문맥에서, "접합 분자"는 반응을 통해 siRNA에 접합되어 궁극적으로 본 개시내용의 siRNA 접합체를 형성할 수 있는 특정 화합물로 이해되어야 한다.
일반적으로, 접합 그룹은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹 및 선택적으로 링커를 포함하고, siRNA, 링커 및 표적화 그룹은 순차적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 표적화 그룹의 수는 1 내지 6이다. 일부 구현예에서, 표적화 그룹의 수는 2 내지 4이다. siRNA 분자는 접합 그룹에 비공유적으로 또는 공유적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 접합 그룹에 공유적으로 접합될 수 있다. siRNA와 접합 그룹 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에, 안티센스 가닥의 5' 말단에, 또는 siRNA의 내부 서열에 있을 수도 있다. 일부 구현예에서, siRNA와 접합 그룹 사이의 접합 부위는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 있다.
일부 구현예에서, 접합 그룹은 포스페이트 기, 2'-위치 하이드록실 또는 뉴클레오타이드의 염기에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 접합 그룹은 3' 위치 하이드록실에 연결될 수 있으며, 이때 뉴클레오타이드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합 연결로 연결된다. 접합 그룹이 siRNA 사슬의 말단에 연결되는 경우, 접합 그룹은 일반적으로 뉴클레오타이드의 포스페이트 기에 연결된다. 접합 그룹이 siRNA의 내부 서열에 연결되는 경우, 접합 그룹은 일반적으로 리보스 당 고리나 염기에 연결된다. 다양한 연결 방법에 대해, 문헌[Muthiah Manoharan 등, siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleotides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7]을 참조한다.
표적화 그룹은 적절한 링커를 통해 siRNA 분자에 연결될 수 있으며, 당업자는 표적화 그룹의 특정 유형에 따라 적절한 링커를 선택할 수 있다. 이들 링커의 유형, 표적화 그룹 및 siRNA와의 연결 방법은 WO2015006740A2의 개시내용에서 찾아볼 수 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 표적화 그룹은 WO2009082607A2에 기재된 다양한 리간드와 같이 siRNA 투여 분야에서 일반적으로 사용되는 리간드일 수 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 표적화 그룹 중 적어도 하나 또는 각각은 APOC3 유전자를 발현하는 세포 표면의 수용체에 결합할 수 있는 리간드로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 표적화 그룹 중 적어도 하나 또는 각각은 포유류 간세포 표면의 수용체(ASGPR)에 결합할 수 있는 리간드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 각각의 표적화 그룹은 독립적으로 포유류 간세포 표면의 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드이다. 일부 구현예에서, 각각의 표적화 그룹은 독립적으로 아시알로당단백질 또는 당이다. 일부 구현예에서, 각각의 표적화 그룹은 독립적으로 아시알로당단백질, 예컨대 아시알로오로소뮤코이드 (ASOR) 또는 아시알로페투인 (ASF)이다. 일부 구현예에서, 각각의 표적화 그룹은 독립적으로 아시알로당단백질, 예컨대 아시알로오로소뮤코이드 (ASOR) 또는 아시알로페투인 (ASF). 일부 구현예에서, 각각의 표적화 그룹은 D-만노피라노스, L-만노피라노스, D-아라비노오스, D-자일로푸라노스, L-자일로푸라노스, D-글루코오스, L-글루코오스, D-갈락토스, L-갈락토스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코푸라노스, α-D-프룩토푸라노스, α-D-프룩토피라노스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노스, β-D-갈락토푸라노스, 글루코사민, 시알산, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-트리플루오로아세틸갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민, N-이소부티릴갈락토사민, 2-아미노-3-O-[(R)-1-카복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸아미노-L-글루코피라노스, 4,6-디데옥시-4-카복사미도-2,3-디-O-메틸-D-만노피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, N-글리콜로일-α-뉴라민산, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 2,3,4-트리-O-아세틸-1-티오-6-O-트리틸-α-D-글루코피라노시드 메틸 에스테르, 4-티오-β-D-갈락토피라노스, 3,4,6,7-테트라-O-아세틸-2-데옥시-1,5-디티오-α-D-글루코피라노시드 에틸 에스테르, 2,5-안하이드로-D-알로스 니트릴, 리보스, D-리보스, D-4-티오리보스, L-리보스, 및 L-4-티오리보스 중 하나로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 표적화 그룹 중 적어도 하나 또는 각각은 갈락토스 또는 N-아세틸갈락토사민이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체 내의 링커는 화학식 (301)로 표시되는 구조를 갖는다:
여기서 k는 1 내지 3의 정수이고;
LA는 화학식 (302)로 표시되는 아미드 결합을 함유하는 구조를 갖고, LB는 화학식 (303)으로 표시되는 N-아실피롤리딘을 함유하고, 카보닐 및 산소 원자를 함유하는 구조를 가지며, 그리고 LC는 하이드록시메틸아미노메탄, 디메틸롤아미노메탄 또는 트리스하이드록시메틸아미노메탄을 기반으로 하는 연결 기이다.
여기서 n302, q302 및 p302는 각각 독립적으로 2 내지 6의 정수이고, 선택적으로 n302, q302 및 p302는 각각 독립적으로 2 또는 3이고; 그리고 n303은 4 내지 16의 정수이고, 선택적으로 n303은 8 내지 12의 정수이다. 은 기가 공유적으로 연결된 지점을 나타낸다.
링커에서, 각 LA는 에테르 결합을 통해 표적화 그룹 중 하나와 연결되고, 에테르 결합을 형성하여 LC 부분에 있는 카보닐 기의 산소 원자를 통해 LC 부분에 연결된다. LB는 아미도 결합을 형성하여 화학식 (303)의 카보닐 기를 통해 LC 부분의 질소 원자에 연결되고, 포스포에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합을 형성하여 화학식 (303)의 산소 원자를 통해 siRNA에 연결된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 접합체는 화학식 (305)로 표시되는 구조를 갖는다:
여기서 Nu는 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체 내의 링커는 화학식 (306)로 표시되는 구조를 갖는다:
n306은 0 내지 3의 정수이고, 각각의 p306은 독립적으로 1 내지 6의 정수이며, 는 그룹이 공유 결합된 부위를 나타내고; 연결 기는 *로 표시된 산소 원자를 통해 표적화 그룹에 에테르 결합 연결을 형성한다. 연결 기는 siRNA와 #로 표시된 산소 원자 중 적어도 하나를 통해 포스포에스테르 결합 또는 포스포로티오에이트 결합을 형성하고, 나머지는 #으로 표시된 산소 원자를 통해 수소 원자와 연결되어 하이드록실을 형성하거나, C1-C3 알킬 기와 연결되어 C1-C3 알콕시 기를 형성한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 화학식 (307)로 표시되는 구조를 갖는다:
여기서 Nu는 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 화학식 (308)로 표시되는 구조를 갖는다:
여기서,
n1은 1 내지 3으로부터 선택되는 정수이고, n3은 0 내지 4로부터 선택되는 정수이고;
각각의 m1, m2 또는 m3은 독립적으로 2 내지 10으로부터 선택된 정수이고;
R10, R11, R12, R13, R14 또는 R15는 각각 독립적으로 H이거나, 다음의 기: C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬 및 C1-C10 알콕시로 구성된 그룹으로부터 선택되고;
R3은 화학식 A59로 표시되는 구조를 갖는다:
여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이고, Nu는 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA를 나타내고;
R2는 길이가 탄소 원자 1 내지 20개인 직쇄 알킬렌 기이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 다음 기: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌 및 C5-C10 헤테로아릴렌로 구성된 군에서 선택되는 임의의 하나 이상으로 교체되고; 그리고 R2는 선택적으로 다음 기: C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로겐 치환기, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), -NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)으로 구성된 군으로부터 임의의 하나 이상의 치환기를 가질 수 있고;
각각의 L1은 독립적으로 길이가 탄소 원자 1 내지 70개인 직쇄 알킬렌 기이고, 여기서 하나 이상의 탄소 원자는 선택적으로 다음 기: C(O), NH, O, S, CH=N, S(O)2, C2-C10 알케닐렌, C2-C10 알키닐렌, C6-C10 아릴렌, C3-C18 헤테로사이클릴렌 및 C5-C10 헤테로아릴렌로 구성된 군에서 선택되는 임의의 하나 이상으로 교체되고; 그리고 L1은 선택적으로 다음 기: C1-C10 알킬, C6-C10 아릴, C5-C10 헤테로아릴, C1-C10 할로알킬, -OC1-C10 알킬, -OC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-OH, -OC1-C10 할로알킬, -SC1-C10 알킬, -SC1-C10 알킬페닐, -C1-C10 알킬-SH, -SC1-C10 할로알킬, 할로겐 치환기, -OH, -SH, -NH2, -C1-C10 알킬-NH2, -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -NH(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬페닐), -NH(C1-C10 알킬페닐), 시아노, 니트로, -CO2H, -C(O)O(C1-C10 알킬), -CON(C1-C10 알킬)(C1-C10 알킬), -CONH(C1-C10 알킬), -CONH2, -NHC(O)(C1-C10 알킬), -NHC(O)(페닐), -N(C1-C10 알킬)C(O)(C1-C10 알킬), -N(C1-C10 알킬)C(O)(페닐), -C(O)C1-C10 알킬, -C(O)C1-C10 알킬페닐, -C(O)C1-C10 할로알킬, -OC(O)C1-C10 알킬, -SO2(C1-C10 알킬), -SO2(페닐), -SO2(C1-C10 할로알킬), -SO2NH2, -SO2NH(C1-C10 알킬), -SO2NH(페닐), -NHSO2(C1-C10 알킬), -NHSO2(페닐) 및 -NHSO2(C1-C10 할로알킬)으로 구성된 군으로부터 임의의 하나 이상의 치환기를 가질 수 있고;
는 그룹이 공유 결합된 부위를 나타내고;
M1은 표적화 그룹을 나타내며, 정의 및 선택 범위는 위와 동일하다. 일부 구현예에서, 각각의 M1은 포유류 간세포 표면의 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드 중 하나로부터 독립적으로 선택된다.
당업자는 L1이 편의상 직쇄 알킬 기로 정의되지만 선형 기가 아닐 수도 있거나 치환 및/또는 전술한 치환의 결과로 아민 또는 알케닐과 같은 상이한 명칭을 가질 수도 있음을 이해할 것이다. 본 개시내용의 목적을 위해, L1의 길이는 2개의 부착점을 연결하는 사슬 내 원자의 수이다. 이러한 목적을 위해, 헤테로사이클릴렌이나 헤테로아릴렌과 같은 직쇄형 알킬렌 기의 탄소 원자를 치환하여 얻은 고리를 하나의 원자로 간주한다.
M1이 포유류 간세포 표면의 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화성을 갖는 리간드인 경우, 일부 구현예에서, n1은 1 내지 3의 정수일 수 있고, n3은 0 내지 4의 정수일 수 있고, 이로써 접합체 내 M1 리간드의 수가 적어도 2가 되도록 한다. 일부 구현예에서, n1+ n3 ≥ 2이므로 M1 리간드의 수가 적어도 3이고 M1 리간드는 간 표면 아시알로당단백질 수용체에 더 쉽게 결합하며, 이는 결국 세포내이입에 의해 접합체가 세포 내로 진입되는 것을 촉진한다. 실험에 따르면 M1 리간드의 수가 3보다 크면, 간 표면의 아시알로당단백질 수용체에 대한 M1 리간드의 결합 용이성이 크게 증가하지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 합성의 용이성, 구조/공정 비용 및 전달 효율 및 다른 양태를 고려하여, 일부 구현예에서 n1은 1 내지 2의 정수이고, n3은 0 내지 1의 정수이며, n1 + n3은 2 내지 3이다.
일부 구현예에서, m1, m2 및 m3이 2 내지 10의 정수로부터 독립적으로 선택되는 경우, 다수의 M1 리간드 사이의 공간적 위치는 간 표면의 아시알로당단백질 수용체에 대한 M1 리간드의 결합에 적합할 수 있다. 본 개시내용에 의해 제공되는 접합체를 더 간단하게 제조하고, 더 쉽게 합성하고/하거나 비용을 절감하기 위해, 일부 구현예에서 m1, m2 및 m3은 각각 독립적으로 2 내지 5의 정수이고, 일부 구현예에서 m1 = m2 = m3.
R10, R11, R12, R13, R14 및 R15가 각각 독립적으로 H, C1-C10 알킬, C1-C10 할로알킬 및 C1-C10 알콕시 중 하나로부터 선택되는 경우, 본 개시내용의 목적은 본원에 개시된 접합체의 특성을 변경하지 않고도 달성될 수 있는 것을 당업자는 이해할 것이다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 각각 독립적으로 H, 메틸 및 에틸로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15는 모두 H이다.
본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 접합체에 따르면, R3은 화학식 A59로 표시되는 구조를 갖는 기이고, 여기서 E1은 OH, SH 또는 BH2이다. 제조를 위한 원료의 이용 가능성을 고려하여, 일부 구현예에서 E1은 OH 또는 SH이다.
일부 구현예에서, R2는 질소 함유 백본 상의 N 및 A59에 대한 연결을 달성하도록 선택된다. 본 개시내용의 문맥에서, "질소 함유 백본"은 R10, R11, R12, R13, R14, 및 R15에 연결된 탄소 원자가 N에 연결된 사슬 구조를 지칭한다. 따라서, R2는 A59 기를 질소 함유 백본의 N에 적절한 방식으로 연결할 수 있는 임의의 연결 기일 수 있다. 일부 구현예에서, 고상 합성 공정에 의해 본 개시내용의 siRNA 접합체를 제조하는 경우, R2 기는 질소 함유 백본 상의 N에 연결된 연결 부위 및 R3에서 P에 연결된 연결 부위를 모두 함유해야 한다. 일부 구현예에서, R2 기의 질소 함유 백본 상의 N에 연결된 부위는 N과 아미드 결합을 형성하고, R3 기 상의 P에 연결된 부위는 P와 포스포에스테르 결합을 형성한다. 일부 구현예에서, R2은 B5, B6, B5' 또는 B6'이다:
여기서 는 그룹이 공유 결합된 부위를 나타낸다.
q2의 값 범위는 1 내지 10의 정수일 수 있으며, 일부 구현예에서는 q2는 1 내지 5의 정수일 수 있다.
L1의 기능은 M1 리간드를 질소 함유 백본 상의 N에 연결하여 본 개시내용의 siRNA 접합체에 대한 표적화 기능을 제공하는 것이다. 일부 구현예에서, L1은 화학식 A1 내지 A26의 그룹 중 하나 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 연결 A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11 및 A13 중 하나 또는 둘 이상의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 연결 A1, A4, A8, A10 및 A11 중 적어도 2개의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, L1은 연결 A1, A8 및 A10 중 적어도 2개의 조합으로부터 선택된다.
및
일부 구현예에서, L1의 길이는 3 내지 25개 원자, 3 내지 20개 원자, 4 내지 15개 원자, 또는 5 내지 12개 원자일 수 있다. 일부 구현예에서, L1의 길이는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개의 원자이다.
일부 구현예에서 j1은 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서 j1은 3 내지 5의 정수이다. 일부 구현예에서 j2은 2 내지 10의 정수이고, 일부 구현예에서 j2는 3 내지 5의 정수이다. R'은 C1-C4 알킬이고, 일부 구현예에서 R'은 메틸, 에틸 및 이소프로필 중 하나이다. Ra는 A27, A28, A29, A30 및 A31 중 하나이고, 일부 구현예에서 Ra는 A27 또는 A28이다. Rb는 C1-C5 알킬이고, 일부 구현예에서 Rb는 메틸, 에틸, 이소프로필 및 부틸 중 하나이다. 일부 구현예에서, 화학식 A1 내지 A26의 j1, j2, R', Ra 및 Rb 각각은 질소 함유 백본 상의 N에 M1 리간드의 연결을 달성하고 M1 리간드 사이의 공간적 위치가 M1 리간드가 간 표면 아시알로당단백질 수용체에 결합하는 데 더 적합하도록 하기 위해 선택된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 화학식 (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) 또는 (422)로 표시되는 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, 화학식 A59의 P는 siRNA 서열의 임의의 가능한 위치에 연결될 수 있다. 예를 들어, 화학식 A59의 P는 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 A59의 P는 siRNA의 센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 화학식 A59의 P는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 화학식 A59의 P는 siRNA의 센스 가닥의 말단에 연결된다. 말단은 센스 가닥 또는 그 한쪽 말단의 안티센스 가닥에 있는 처음 4개의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 화학식 A59의 P는 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 화학식 A59의 P는 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단에 연결된다. siRNA의 센스 가닥의 위치에 연결되는 경우, 본 개시내용에서 제공하는 접합체가 세포 내로 들어간 후, 풀리면, siRNA의 별도의 안티센스 가닥이 풀려서 RNAi 메커니즘을 통해 목적 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
화학식 A59의 P는 siRNA의 뉴클레오타이드 상의 임의의 가능한 위치, 예를 들어 뉴클레오타이드의 5' 위치, 뉴클레오타이드의 2' 위치, 뉴클레오타이드의 3' 위치 또는 뉴클레오타이드의 염기에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 A59의 P는 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 siRNA 내 뉴클레오타이드의 2' 위치, 3' 위치 또는 5' 위치에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 A59의 P는 siRNA의 센스 가닥에서 3' 말단 뉴클레오타이드의 3' 하이드록실의 탈수소화 후에 형성된 산소 원자에 연결되거나, 화학식 A59의 P는 siRNA의 센스 가닥에 있는 하나의 뉴클레오타이드의 2'-하이드록실 내의 수소를 치환함으로써 뉴클레오타이드에 연결되거나, 또는 화학식 A59의 P는 siRNA의 센스 가닥에서 5'말단에 있는 뉴클레오타이드의 5'-하이드록실 내의 수소를 치환하여 뉴클레오타이드에 연결된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체에 함유된 siRNA는 예를 들어 표 1a, 1b 또는 1c에 나열된 임의의 siRNA일 수 있다. 이들 siRNA를 함유하는 siRNA 접합체는 APOC3 유전자 발현에 대해 낮은 표적외 효과와 높은 mRNA 억제 활성을 나타낸다.
대문자 C, G, U 및 A는 뉴클레오타이드의 염기 조성을 나타내고; 소문자 m은 왼쪽 문자 m에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; 소문자 f는 왼쪽 문자 f에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형 뉴클레오타이드임을 나타내고; 밑줄 친 대문자 S는 왼쪽 문자 S에 인접한 뉴클레오타이드가 안정화 변형 뉴클레오타이드임을 나타내고; 소문자 s는 문자 s의 왼쪽과 오른쪽에 있는 2개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 기에 의해 연결되어 있음을 나타내고; P1은 오른쪽 P1에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 유사체 변형 뉴클레오타이드임을 나타낸다. 일부 구현예에서, S는 moe와 같은 특정 안정화 변형을 나타내며, 여기서 밑줄 친 문자 조합 moe는 문자 조합 moe의 왼쪽에 인접한 뉴클레오타이드가 2'-O-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드를 갖는다는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, P1은 특정 변형을 나타내는 VP, Ps 또는 P이고, 문자 조합 VP는 문자 조합 VP의 오른쪽에 인접한 뉴클레오타이드가 비닐포스페이트(5'-(E)-비닐포스포네이트, E-VP) 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고, 문자 조합 Ps는 문자 조합 Ps의 오른쪽에 인접한 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 변형 뉴클레오타이드임을 나타내고, 그리고 대문자 P는 문자 P의 오른쪽에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다. 또한, 표 1a 내지 표 1c에 나열된 서열 중 각 U는 siRNA의 활성이나 표적외 효과에 큰 영향을 미치지 않으면서 임의로 T로 대체될 수 있다.
본 개시내용의 siRNA 접합체의 제조
siRNA 접합체는 선행 기술에 상세히 기재된 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어 WO2015006740A2에는 다양한 siRNA 접합체의 제조 방법이 자세히 기재되어 있다. 본 개시내용의 siRNA 접합체는 또한 당업자에게 널리 공지된 수단에 의해 얻을 수 있다 예를 들어, 화학식 (305)로 표시되는 구조의 제조 방법은 WO2014025805A1에 기재되어 있고, 화학식 (307)로 표시되는 구조의 제조 방법은 문헌[Rajeev 등, ChemBioChem 2015, 16, 903-908]에 기재되어 있다. 중국 특허 출원 CN110959011A에는 또한 화학식 (308)로 표시되는 siRNA 접합체를 제조하는 방법이 상세히 개시되어 있다. 문서의 내용은 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
본 개시내용의 siRNA 접합체는 또한 다른 약제학적으로 허용되는 보조제와 조합하여 사용될 수도 있다. 보조제는 당업계에서 일반적으로 사용되는 다양한 제제 또는 화합물 중 하나 이상일 수 있다. 자세한 내용은 본 개시내용의 약제학적 조성물에 대한 설명을 참조하기 바란다.
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및 siRNA 접합체의 용도
일부 구현예에서, 본 개시내용은 또한 APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA 수준과 연관된 질환 또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의, 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 수준과 연관된 질환 또는 증상은 이상지질혈증이다. 일부 구현예에서, 이상지질혈증은 고콜레스테롤혈증, 고중성지질혈증 또는 죽상동맥경화증이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 수준과 연관된 질환 또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하고, 방법은 본 개시내용의 siRNA 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 수준과 연관된 질환 또는 증상은 이상지질혈증이다. 일부 구현예에서, 이상지질혈증은 고콜레스테롤혈증, 고중성지질혈증 또는 죽상동맥경화증이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 또한 세포에서 APOC3 유전자의 발현 수준을 억제하는 방법을 제공하고, 방법은 본 개시내용의 siRNA, 및/또는 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 유효 용량을 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
본 개시내용에 의해 제공된 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 세포 내 특정 유전자의 발현에 의해 유발되는 병리적 병태 또는 질환을 예방 및/또는 치료하는 목적은 유전자 발현을 조절하는 메커니즘에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체는 병리적 병태 또는 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있고, 본원에 기재된 병리적 병태 또는 질환의 예방 및/또는 치료용 약제를 제조하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "투여/투여하다"라는 용어는 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 대상체에 배치하기 위해 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 적어도 일부를 원하는 부위에 위치시켜 원하는 효과를 발생시키는 방법 또는 접근 방식을 지칭한다. 본 개시내용의 방법에 적합한 투여 경로에는 국소 투여 및 전신 투여가 포함된다. 일반적으로, 국소 투여는 대상체의 전신에 비해 특정 부위에 더 많은 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 전달하는 반면, 전신 투여는 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA를 실질적으로 대상체의 전신에 전달하게 한다. 본 개시내용이 간 세포에서 특정 유전자의 발현에 의해 유발되는 병리적 병태 또는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 수단을 제공하려는 의도인 것을 고려하면, 수단은 구현예에서 간에 약제를 전달할 수 있는 투여 방식이다.
대상체에 대한 투여는 경구 또는 비경구 경로, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 경피, 기도 (에어로졸), 폐, 비강, 직장, 및 국부 (협측 및 설하 포함) 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 경로에 의해 이루어질 수 있다. 투여 빈도는 매일, 매주, 2주마다, 3주마다, 매월 또는 매년 1회 이상일 수 있다.
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체의 용량은 당업계에서 통상적인 용량일 수 있으며, 용량은 다양한 매개변수, 특히 대상체의 연령, 체중 및 성별에 기초할 수 있다. 독성과 효능은 LD50(집단의 50%가 사망하게 하는 용량) 및 ED50(정량적 반응의 관점에서 최대 반응 강도의 50%를 일으킬 수 있는 용량, 및 정성적 반응 의 관점에서 테스트 대상체의 50%가 양성 반응을 보일 수 있는 용량) 결정과 같은 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 인간에게 사용하기 위한 용량 범위는 세포 배양 검정 및 동물 연구에서 얻은 데이터를 기반으로 유래될 수 있다.
본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를, 예를 들어, C57BL/6J, 또는 C3H/HeNCrlVr 마우스(수컷 또는 암컷, 6 내지 12주령, 체중 18 내지 25g)에게 투여하는 경우, 투여는 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체 내 siRNA의 양을 기준으로 하고, siRNA 및 약제학적으로 허용되는 접합된 분자로 형성된 siRNA 접합체의 경우, siRNA의 양은 0.001 내지 100 mg/kg 체중일 수 있다. 일부 구현예에서, 양은 0.01 내지 50 mg/kg 체중이다. 추가 구현예에서, 양은 0.05 내지 20 mg/kg 체중이다. 또 다른 추가 구현예에서, 양은 0.1 내지 15 mg/kg 체중이다. 더욱 추가 구현예에서, 양은 0.1 내지 10 mg/kg 체중이다. 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 투여하는 경우 용량이 바람직할 수 있다.
또한, 본 개시내용의 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 특정 유전자의 발현이 이상적으로 발현되는 세포에 도입함으로써, 유전자 발현 조절의 메커니즘을 통해 세포 내에서 특정 유전자의 발현을 억제하는 목적도 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 간세포이다. 일부 구현예에서, 간세포는 Hep3B, HepG2 및 Huh7과 같은 간종양 세포주로부터 선택된 세포, 또는 단리된 일차 간세포일 수 있고, 일부 구현예에서, 세포는 일차 간세포이다.
본 개시내용에서 제공하는 방법을 사용하여 세포 내 특정 유전자의 발현을 억제하는 경우, 제공된 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체 내의 siRNA의 양은 원하는 효과에 따라 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제공된 siRNA 접합체 내의 siRNA의 양은 표적 유전자의 발현을 감소시키고 세포외 농도가 표적 세포 표면 1 pM 내지 1 μM, 또는 0.01 nM 내지 100 nM, 또는 0.05 nM 내지 50 nM 또는 내지 약 5 nM이 되기에 충분하다. 이러한 국소 농도를 달성하는 데 필요한 양은 전달 방법, 전달 부위, 전달 부위 및 표적 세포 또는 조직 사이의 세포층 수, 전달 범위(국소 또는 전신 전달) 등을 포함한 다양한 인자에 따라 달라진다. 전달 부위의 농도는 표적 세포 또는 조직 표면의 농도보다 상당히 높을 수 있다.
키트
본 개시내용은 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 siRNA 접합체를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 키트는 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 접합체를 하나의 용기에 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 약제학적으로 허용되는 부형제를 제공하는 용기를 수용할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 안정제 또는 보존제와 같은 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 접합체가 제공되는 용기 이외의 용기에 적어도 하나의 추가 치료제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 siRNA, 약제학적 조성물 및/또는 접합체를 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제 또는 다른 성분(있는 경우)과 혼합하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 키트에 있어서, siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제 및 약제학적 조성물 및/또는 접합체, 및/또는 약제학적으로 허용되는 보조제는 어떠한 형태, 예를 들어, 액체 형태, 건조 형태 또는 동결건조된 형태로도 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제 및 약제학적 조성물 및/또는 접합체 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 보조제는 실질적으로 순수하고/하거나 멸균된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 키트에는 멸균수가 제공될 수 있다.
다음 실시예는 본 개시내용을 추가로 예시할 것이지만, 본 개시내용은 이에 의해 제한되지 않는다.
실시예
달리 명시되지 않는 한, 하기 실시예에 사용된 시약 및 배지는 모두 시판되고 있으며, 사용된 핵산 전기영동, 실시간 PCR 등의 조작은 모두 문헌[Molecular Cloning (Cold Spring Harbor LBboratory Press (1989))]에 기록된 방법을 참조하여 수행하였다.
제조예 1.37. 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 접합체의 합성
CN110959011A의 제조예 1에 기재된 제조 방법에 따라, 표 2의 다음의 접합체 1 내지 7을 제조하였고, 유일한 차이점은 각 siRNA 접합체에 함유된 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥이 표 2에서 나타나 있다는 것이다. 핵산 서열에 대해, 표 2에서 접합체 1 내지 접합체 7로 지정된 siRNA의 핵산 서열에 따라, siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥을 합성하였다. 초순수(Milli-Q 초순수 기기, 저항률 18.2 MΩ*cm(25℃))를 사용하여 각 siRNA 접합체를 0.2 mg/mL 농도(siRNA에 기반함)로 희석한 다음, 액체 크로마토그래피-질량 분광분석 기기(LC-MS, Waters Inc.에서 구입, 모델: LCT Premier)을 분자량 측정에 사용하였다. 발견된 값은 계산된 값과 일치하여, 합성된 접합체 1 내지 7이 목적으로 설계된 이중 가닥 핵산 서열을 가지고 있음을 나타낸다. siRNA 접합체는 화학식 (403)으로 표시되는 구조를 가지며, siRNA 접합체에 함유된 siRNA는 표 2의 접합체 1 내지 7에 해당하는 siRNA 서열을 갖는다. 예를 들어, 접합체 5의 분자량(mw)에 대해, 센스 가닥 이론값: 7581.42; 측정값: 7581.22; 안티센스 가닥 이론값: 6948.55; 측정값: 6948.72. 측정값은 이론값과 일치하고, 이는 접합체가 화학식 (403)으로 표시되는 구조를 가지며, 접합체는 표 2의 접합체 5에 해당하는 siRNA 서열을 가지고 있음을 나타낸다.
대문자 C, G, U, A, 및 T는 뉴클레오타이드의 염기 조성을 나타내고; 소문자 m은 왼쪽 문자 m에 인접한 뉴클레오타이드가 메톡시 변형된 뉴클레오타이드임을 나타내고; 소문자 f는 왼쪽 문자 f에 인접한 뉴클레오타이드가 플루오로 변형 뉴클레오타이드임을 나타내고; 밑줄 친 문자 조합 moe는 왼쪽의 문자 조합 moe에 인접한 뉴클레오타이드가 리보스 2'-O-메톡시에틸 변형 뉴클레오타이드임을 나타내고; 소문자 s는 문자 s의 왼쪽과 오른쪽에 있는 2개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 기에 의해 연결되어 있음을 나타내고; P는 오른쪽 문자 P에 인접한 뉴클레오타이드가 5'-포스페이트 뉴클레오타이드임을 나타낸다.
비교 제조예 1 내지 3. 참조 siRNA 접합체의 합성
CN110959011A의 제조예 1에 기재된 제조 방법에 따라, 표 2의 참조 접합체 1 내지 3으로 지정된 다음의 참조 접합체를 제조하였고, 유일한 차이점은 각 참조 siRNA 접합체에 함유된 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥이 표 2에서 나타나 있다는 것이다. 표 2의 참조 접합체 1 내지 3으로 지정된 siRNA의 핵산 서열에 따라, siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥을 합성하였다. 초순수(Milli-Q 초순수 기기, 저항률 18.2 MΩ*cm(25℃))를 사용하여 각 참조 siRNA 접합체를 0.2 mg/mL 농도(siRNA에 기반함)로 희석한 다음, 액체 크로마토그래피-질량 분광분석 기기(LC-MS, Waters Inc.에서 구입, 모델: LCT Premier)을 분자량 측정에 사용하였다. 발견된 값은 계산된 값과 일치하여, 합성된 참조 접합체 1 내지 1이 목적으로 설계된 이중 가닥 핵산 서열을 가지고 있음을 나타낸다. 참조 siRNA 접합체는 화학식 (403)으로 표시되는 구조를 가지며, 함유된 siRNA는 표 2의 참조 접합체 1 내지 3에 해당하는 siRNA 서열을 갖는다. 이러한 siRNA 서열은 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지않는다.
비교 제조예 4. 참조 siRNA NC의 합성
WO2019105418(A1)의 제조예 1에 기재된 방법에 따라, 하기 참조 siRNA NC를 고상 합성 방법으로 합성하였으며, 유일한 차이점은 DEPC 물을 사용하여 서열번호: 161에 제시된된 등몰 상보적 센스 가닥과 서열번호: 162에 제시된 안티센스 가닥을 용해시킨 후, 어닐링하여 참조 siRNA NC를 얻었다는 것이다:
제조예 8 내지 14. 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA의 합성
WO2019105418(A1)의 제조예 1에 기재된 방법에 따라, 표 2에 나열된 siRNA 서열을 고상 합성법으로 합성하였으며, 유일한 차이점은 DEPC 물을 사용하여 표 2의 등몰 상보적 센스 가닥과 안티센스 가닥을 용해시킨다는 것이다. 어닐링 후, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA1-siRNA7을 얻었으며, 이들의 서열을 표 2에 나타낸다.
비교 제조예 4 내지 10
참조 siRNA-참조 siRNA7을 제조예 8 내지 14와 동일한 방법으로 제조하였다.
실험예 1. 마우스에서 siRNA 접합체의 독성 효과
접합체 1, 접합체 2 및 참조 접합체 1을 PBS에 용해시켜 10 mg/mL 용액(siRNA 접합체에 기반함)을 얻었다. ICR 마우스(반은 수컷, 반은 암컷, 체중 18 내지 22g, 5 내지 6주령, SiPeiFu Inc.에서 구입)를 무작위로 6마리(반은 수컷, 반은 암컷)의 그룹으로 나누고 번호를 매겼다. 목 뒤쪽에 피하 주사하는 방식으로, 시험군으로 siRNA 접합체 용액을 각 마우스에 10 mL/kg의 투여 용량으로 투여하였다. 또한, 공시험 대조군으로 각 마우스군에 PBS를 10 mL/kg의 투여 용량으로 투여하였다.
투여 시점을 1일로 하여, 8일째에 시험군과 공시험 대조군의 각 마우스를 안와 채혈하였다. 혈액 부피는 0.6mL였다. 혈액을 37℃에서 60분간 인큐베이션한 다음, 3000rpm에서 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 농도는 PM1P000/3 자동 혈청 생화학적 분석기(SABA, 이탈리아)를 통해 추가로 검출되었다. 결과는 표 1에 나타나 있다.
또한, 8일째 채혈 후, 마우스를 희생시켜 절개하고, 10% 중성 완충 포르말린 고정액에 보존하고, 병리적 섹션을 만들었다. 병리적 섹션에서 간 지방증 및 염증의 중증도를 평가하고 등급화하였다.
표 1에서, % 및 앞의 수치는 마우스 혈청 내 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 농도와 공시험 대조군의 혈청 내 농도 사이의 차이 및 공시험 대조군의 혈청 내 농도의 백분율을 나타낸다. 예를 들어, 표 1에서 420%는 참조 접합체 1을 100 mg/Kg으로 투여한 마우스에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제의 농도가 공시험 대조군의 농도보다 420% 더 높았음을 의미한다.
표 1의 결과에 따르면, 공시험 대조군과 비교하여, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 참조 접합체 1을 투여한 마우스는 혈액 생화학적 지표에 상당한 변화를 보였고: ALT 농도는 420% 증가하였고, AST 농도는 126% 증가하였다. 본 개시내용의 siRNA 접합체 1 또는 2를 투여한 마우스에서, ALT 농도가 각각 116%, 118% 증가에 그쳤고, AST 농도는 32% 증가에 그쳐 혈액 생화학적 지표가 현저히 감소한 것으로 나타났다.
병리적 섹션의 결과는 공시험 대조군과 비교하여, 안정화 변형 뉴클레오티드를 함유하지 않는 참조 접합체 1을 투여한 6마리의 마우스 중 1마리가 중등도의 간 염증 반응을 보인 것으로 나타났고, 이는 특히 간 소엽에서 소량의 확산성 염증 세포 침윤이 확인되었으며, 간 동양혈관에서 섬유아세포의 확산 증식이 확인되었다. 3마리의 마우스는 경미한 간 염증 반응, 국소 간 소엽의 염증 세포의 초점 침윤, 및 점상 괴사가 있는 1마리의 동물의 개별 간세포에서 국소 간 소엽의 염증 괴사를 가졌다. 그러나, 본 개시내용의 접합체 1을 투여한 마우스 중에서, 2마리의 마우스만이 경미한 간세포 염증 반응을 나타내어, 소량의 염증 세포 침윤을 보였으며, 중간 정도 또는 더 심각한 염증 반응 및 괴사는 발견되지 않았다. 본 개시내용의 접합체 2를 투여한 마우스 중에서, 단 한 마리의 마우스만이 경미한 간세포 염증 반응을 나타냈고, 중등도 이상의 염증 반응 및 괴사는 발견되지 않았다. 접합체 1 및 2는 참조 접합체 1보다 상당히 낮은 독성을 나타내었다.
상기 결과는 참조 접합체와 비교하여, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 표적외 효과에 의해 유발된 간독성을 효과적으로 감소시킬 수 있으므로, 뛰어난 개발 전망을 가지고 있는 이상지질혈증 관련 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 약제 제조에 있어 훨씬 더 높은 안전성을 나타낼 수 있음을 보여준다.
실험예 2. 마우스에서 siRNA 접합체의 독성 효과
접합체 6, 접합체 7 및 참조 접합체 3을 각각 PBS에 용해시켜 10 mg/mL 용액 및 30 mg/mL 용액(siRNA 접합체에 기반함)을 얻었다. ICR 마우스(반은 수컷, 반은 암컷, 체중 18 내지 22g, 5 내지 6주령, SiPeiFu Inc.에서 구입)를 무작위로 그룹으로 나누고 번호를 매겼다. 각 농도의 각 접합체에 대해, 동물을 2-주 그룹과 4-주 그룹으로 나누었으며, 각 그룹에는 6마리의 마우스(반은 수컷, 반은 암컷)가 있었다. 목 뒤쪽에 피하 주사하는 방식으로, 시험군으로 siRNA 접합체 용액을 각 마우스에 10 mL/kg의 투여 용량으로 투여하였다. 또한, 2-주 군과 4-주 군의 공시험 대조군으로 PBS를 두 군의 마우스 각각에게 10 mL/kg의 투여 용량으로 투여하였다.
투여 시점을 1일로 하여, 15일 후, 2-주 군에서 300 mg/kg의 접합체를 투여한 6마리 마우스를 희생시켜 절개하고 10% 중성 완충 포르말린 고정 용액에 보존하고, 병리적 섹션을 만들었다. 시험군의 4-주 군과 공시험 대조군의 6마리 마우스를 각각 29일차에 안와 채혈하였다. 채혈 부피는 0.6 mL였으며, 수집된 혈액을 37℃에서 60분간 인큐베이션한 다음, 3000rpm에서 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 농도는 PM1P000/3 자동 혈청 생화학적 분석기(SABA, 이탈리아)를 통해 추가로 검출되었고, 공시험 대조군의 농도와 비교되었으며 그 결과는 표 2에 나타낸다. 병리적 섹션에서 염증 세포 침윤 및 간세포 괴사의 중증도를 평가하고 등급화하고 비교하였다.
표 2에서, F는 암컷 마우스, 및 % 및 앞의 수치가 마우스 혈청 내 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 농도와 공시험 대조군의 혈청 내 농도 사이의 차이 및 공시험 대조군의 혈청 내 농도의 백분율을 나타냄을 나타낸다. 예를 들어, 표 2에서 F: 212%는 참조 접합체 3을 300 mg/Kg으로 투여한 암컷 마우스에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제의 농도가 공시험 대조군의 농도보다 212% 더 높았음을 의미한다.
표 2의 결과에 따르면, 공시험 대조군과 비교하여, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 참조 접합체 3을 투여한 마우스는 혈액 생화학적 지표에 상당한 변화를 보였다. 300 mg/Kg의 고용량에서, 암컷 마우스의 ALT 및 AST 농도는 각각 212% 및 36% 증가하였다. 동일한 용량에서, 본 개시내용의 접합체 7을 투여한 암컷 마우스의 ALT 및 AST 농도는 각각 130% 및 32% 증가하였다. 참조 접합체 3과 비교하여, ALT의 농도가 크게 감소하였다. 본 개시내용의 접합체 6을 투여한 마우스에서는 ALT 및 AST 농도의 증가가 발견되지 않았으며, 혈액 생화학적 지표의 변화 정도는 참조 접합체 3에 비해 상당히 감소하였다.
병리적 섹션의 결과는 공시험 대조군과 비교하여, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 참조 접합체 3을 투여한 마우스가 유의한 간 염증을 보였으며, 6마리 마우스 모두 염증 세포 침윤을 나타냄을 보여주었다. 반면, 접합체 6을 투여한 마우스 중 3마리만이 염증 세포 침윤을 보여주었다. 접합체 7을 투여한 마우스 중 3마리만이 염증 세포 침윤을 보여주었다. 참조 접합체와 비교하여, 본 개시내용의 접합체를 투여한 후 염증 세포 침윤을 겪는 마우스의 수가 상당히 감소하였다.
상기 결과는 참조 접합체와 비교하여, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 표적외 효과에 의해 유발된 간독성을 효과적으로 감소시킬 수 있으므로, 뛰어난 개발 전망을 가지고 있는 이상지질혈증 관련 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 약제 제조에 있어 훨씬 더 높은 안전성을 나타낼 수 있음을 보여준다.
실험예 3. 마우스에서 siRNA 접합체의 독성 효과
실험예 2의 방법에 따라, siRNA 접합체의 마우스 독성 효과를 검증하였으며, 유일한 차이점은 접합체 3과 참조 접합체 2를 사용하여 실험을 수행하였고, 각 접합체를 각각 PBS에 용해시켜 10mg/mL 용액(siRNA 접합체에 기반함)을 얻는다는 것이다. 2-주 군과 4-주 군(표 19에서 D15 군과 D29 군으로 표시)에는 각각 3마리의 마우스가 있었고, 모두 수컷이었다. 즉, 마우스에서 접합체 13 및 참조 접합체 2의 독성 효과를 100mg/kg의 용량에서 테스트하였다.
표 3에서, % 및 앞의 수치는 마우스 혈청 내 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 농도와 공시험 대조군의 혈청 내 농도 사이의 차이 및 공시험 대조군의 혈청 내 농도의 백분율을 나타낸다.
표 3의 결과에 따르면, 공시험 대조군과 비교하여, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 참조 접합체 2를 투여한 마우스는 혈액 생화학적 지표에 상당한 변화를 보였다. 투여 후 15일째에, 혈청 중 ALT 및 AST 농도는 각각 71% 및 54% 증가하였고, 투여 후 29일째에, 혈청 중 ALT 및 AST 농도는 각각 118% 및 94% 증가하였다. 그러나 동일한 용량의 접합체 3을 투여한 마우스 내의 혈청 ALT 및 AST 농도의 증가가 관찰되지 않았다. 본 개시내용의 접합체 3은 혈액 생화학적 지표가 상당히 낮은 것으로 나타났다.
병리적 섹션 결과, 공시험 대조군과 비교하여, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않은 참조 접합체 2를 투여한 마우스 중에서, 1마리의 마우스에서 심각한 간세포 변성이 나타났으며, 특히 간세포 부종이 광범위하게 나타났으며 세포질은 느슨하고 염색된 액포 변성이 일부 간 세포에 발생했고, 세포질에 작고 둥근 액포가 보였다. 두 마리의 마우스는 중등도의 간세포 변성을 보였으며, 특히 많은 간세포의 세포질이 느슨하고 염색되었으며, 일부 간세포에서 액포 변성이 발생했으며, 세포질에 작고 둥근 액포가 보였다. 본 개시내용의 siRNA 접합체 3을 투여받은 마우스 중에서, 3마리는 경미한 간세포 변성을 나타냈으며, 세포질 희박화를 겪는 간세포의 수가 더 적었다. 간세포 변성 정도는 조직병리학적으로 상당히 감소되었으며, 참조 접합체에 비해 상당히 낮은 독성을 나타내었다.
상기 결과는 참조 접합체와 비교하여, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 표적외 효과에 의해 유발된 간독성을 효과적으로 감소시킬 수 있으므로, 뛰어난 개발 전망을 가지고 있는 이상지질혈증 관련 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 약제 제조에 있어 훨씬 더 높은 안전성을 나타낼 수 있음을 보여준다.
실험예 4. 마우스에서 siRNA 접합체의 독성 효과
접합체 3과 접합체 5를 각각 PBS에 용해시켜 30 mg/mL 용액을 얻었다(siRNA 접합체에 기반함). ICR 마우스(반은 수컷, 반은 암컷, 체중 18 내지 22g, 5 내지 6주령, SiPeiFu Inc.에서 구입)를 무작위로 10마리(반은 수컷, 반은 암컷)의 그룹으로 나누고 번호를 매겼다. 목 뒤쪽에 피하 주사하는 방식으로, 시험군으로 siRNA 접합체 용액을 각 마우스에 10 mL/kg의 투여 용량으로 투여하였다. 또한, 공시험 대조군으로 각 마우스군에 PBS를 10 mL/kg의 투여 용량으로 투여하였다.
첫 번째 투여 시점을 1일로 하여, 8일째와 15일째에 각 마우스에 반복 투여하였으며, 사용된 siRNA 접합체 용액(또는 PBS)의 농도 및 투여 용량은 첫 번째 투여와 동일하였다. 시험군과 공시험 대조군의 각 마우스는 16일째에 안와 채혈을 거쳤다. 채혈 부피는 0.6 mL였으며, 수집된 혈액을 37℃에서 60분간 인큐베이션한 다음, 3000rpm에서 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 농도는 PM1P000/3 자동 혈청 생화학적 분석기(SABA, 이탈리아)를 통해 추가로 검출되었다. 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타낸다.
도 1a 및 1b는 본 개시내용의 siRNA 접합체 300 mg/kg 또는 PBS를 연속 3주 동안 매주 투여한 후 마우스 혈청 중 ALT 및 AST 농도를 나타내는 산점도이다. 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이, 공시험 대조군과 비교하여, 본 개시내용의 접합체 투여 후, 혈청 ALT 및 AST 농도는 공시험 대조군과 비슷한 수준을 나타내어, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 간독성이 매우 낮다.
또한, 채혈 후, 마우스를 희생시켜 절개하고, 10% 중성 완충 포르말린 고정액에 보존하고, 병리적 섹션을 만들었다. 상대적인 비교가 이루어졌다. 병리적 섹션에서는 본 개시내용의 siRNA 접합체 3 또는 접합체 5를 투여한 마우스가 상당한 이상 없이 간 지방증 및 염증의 관점에서 공시험 대조군과 유사한 반응을 보였다. 이는 또한 본 개시내용의 siRNA 접합체가 매우 낮은 간독성을 가짐을 나타낸다.
상기 결과는 본 개시내용의 siRNA 접합체는 표적외 효과에 의해 유발된 간독성을 효과적으로 감소시킬 수 있으므로, 뛰어난 개발 전망을 가지고 있는 이상지질혈증 관련 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 약제 제조에 있어 훨씬 더 높은 안전성을 나타낼 수 있음을 보여준다.
실험예 5. 시험관 내 시체크 시스템에서 siRNA 접합체의 억제 활성
본 실험예에서, 시험관 내 시체크 시스템을 이용하여 접합체 1, 접합체 2, 접합체 3, 접합체 4, 접합체 6, 접합체 7, 참조 접합체 1, 참조 접합체 2, 참조 접합체 3 또는 참조 siRNA NC(시험관 내 시체크 시스템의 표적 서열에 대한 것)의 억제 활성을 검출하였다.
[1] 검출 플라스미드의 구축
psiCHECKTM-2(PromegaTM) 플라스미드를 이용하여 검출 플라스미드를 구축하였고, 플라스미드에는 표적 서열 1, 즉 siRNA 표적 서열이 함유되어 있었다. 테스트하려는 siRNA 접합체의 표적 서열 1은 다음과 같다:
표적 서열 1은 테스트된 siRNA가 표적으로 하는 인간 APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 뉴클레오타이드 서열이므로, 표적 서열 1에 대한 각 siRNA 접합체의 억제 효과는 테스트된 siRNA 접합체의 APOC3 유전자 발현을 억제하는 능력을 반영할 수 있다. 표적 서열 1과 이의 상보적 서열을 psiCHECKTM-2 플라스미드의 Xho I/Not I 부위에 클로닝하였다.
[2] 형질감염
HEK293A 세포(Nanjing CoBioer Biosciences Co., Ltd.에서 구입)를 5% CO2/95% 공기가 들어 있는 인큐베이터에서 20% 우태 혈청(FBS, Hyclone Inc.)과 0.2 부피%의 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, Invitrogen Inc.)이 보충된 DMEM 완전 배지 (Hyclone Inc.)에서 37℃에서 배양하였다.
HEK293A 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 8Х103개의 세포로 시딩하였다. 16시간 후 세포 성장 밀도가 70 내지 80%에 도달하면, H-DMEM 완전 배지를 웰에서 흡인하고 80 μL의 Opti-MEM 배지(GIBCO Inc.)를 각 웰에 추가로 1.5시간 동안 첨가하였다.
DEPC 물을 사용하여 검출 플라스미드를 200ng/μL 검출 플라스미드 작업 용액으로 희석하였고; DEPC 물을 사용하여 다음 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC 각각을 세 가지 상이한 농도(siRNA에 기반함): 10nM, 3nM 및 1nM를 갖는 세 가지 종류의 siRNA 접합체 작업 용액 또는 참조 siRNA NC 작업 용액으로 제조하였다. 사용된 siRNA 접합체는 제조된 접합체 1, 접합체 2, 접합체 3, 접합체 4, 접합체 6, 접합체 7, 참조 접합체 1, 참조 접합체 2 및 참조 접합체 3였다.
각각의 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC에 대해, 1A1-1A3 용액을 제조하였고, 각 1A1-1A3 용액은 1 μL의 세 가지 농도의 siRNA 접합체 작업 용액 또는 참조 siRNA NC 작업 용액, 0.05 μL의 검출 플라스미드 작업 용액 (10 ng의 검출 플라스미드 함유) 및 10 μL의 Opti-MEM 배지를 함유하였다.
1B 용액을 제조하였고, 각 1B 용액은 0.2 μL의 LipofectamineTM 2000과 10 μL의 Opti-MEM 배지를 함유하였다.
1C 용액을 제조하였고, 각 1C 용액은 0.05 μL의 검출 플라스미드 작업 용액 (10 ng의 검출 플라스미드 함유) 및 10 μL의 Opti-MEM 배지를 함유하였다.
1B 용액의 분취량을 각 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC의 1A1-1A3 용액의 생성된 분취량과 혼합하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션하여 각 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC에 대한 형질감염 복합체 1X1-1X3을 얻었다.
1B 용액의 분취량을 1C 용액의 분취량과 혼합하고 각각 실온에서 20분 동안 인큐베이션하여 블랭크 형질감염 복합체 1X4를 얻었다.
각각의 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC에 대한 형질감염 복합체 1X1-1X3을 각각 20 μL/웰의 양으로 배양 웰에 첨가하고 균일하게 혼합하여 각 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC에 대한 형질감염 복합체를 약 0.1 nM, 0.03 nM 및 0.01 nM(siRNA에 기반함)의 최종 농도로 얻었다. 각 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC에 대한 형질감염 복합체 1X1-1X3을 각각 3개의 배양 웰에 형질감염시켜 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC를 함유하는 공동 형질감염 혼합물을 얻었고, 이를 시험군으로 지정하였다.
각각의 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC에 대해, 형질감염 복합체 1X4를 또 다른 3개의 배양 웰에 20 μL/웰의 양으로 첨가하여 siRNA가 없는 형질감염 혼합물을 얻었고, 이를 공시험 대조군으로 지정하였다.
siRNA가 있는 공동 형질감염 혼합물과 siRNA가 없는 공동 형질감염 혼합물을 각각 배양 웰에 4시간 동안 형질감염시키고, 20% FBS를 함유한 100 μL의 H-DMEM 완전 배지를 각 웰에 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 CO2 인큐베이터에 넣고 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다.
[3] 검출
배양 웰 내의 배양 배지를 흡인하고, 150 μL의 Dual-Glo® 루시퍼라제 시약 및 H-DMEM 혼합 용액 (부피 비 1:1)을 각 웰에 첨가하고 균일하게 잘 혼합한 후 실온에서10분 동안 인큐베이션하고; 120 μL의 혼합 용액을 96-웰 마이크로플레이트에 옮기고, 96-웰 마이크로플레이트 상의 각 배양 웰에서 반딧불이의 화학발광 값(Fir)을 Synergy II 다기능 마이크로플레이트 판독기(BioTek사)를 사용하여 판독하고; 60 μL의 Dual-Glo® Stop & Glo® 시약을 다시 96-웰 마이크로플레이트의 모든 웰에 첨가하고 완전히 균일하게 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고; Fir 판독 배열에 따라 96-웰 마이크로플레이트의 각 배양 웰에서 레닐라의 화학적 발광 값(Ren)을 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다.
96-웰 마이크로플레이트 상의 각 웰의 발광비 = Ren / Fir를 계산하였고, 각 시험군의 발광비 (시험) 또는 각 대조군의 비(대조군)를 3개 배양 웰의 비의 평균값이고; 대조군의 발광비를 기준으로, 각 시험군의 발광비를 정규화하여 레닐라 리포터 유전자의 상대적인 발현 수준을 나타내는 비율 (시험)/비율(대조군)의 비율 R, 즉, 잔류 활성을 얻었다. 표적 서열 1에 대한 각 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC의 억제율 = (1 - R) Х 100%.
표적 서열 1에 대한 각 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC의 억제 효과를 도 2에 나타낸다. 도 2는 시험할 표적 서열 1 및 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC를 함유하는 플라스미드를 이용한 공동 형질감염 후 시험관 내 시체크 시스템에서 표적 서열 1의 상대적인 발현 수준을 보여주는 막대형 챠트이다. 또한, 표적 서열 1에 대한 siRNA 접합체 또는 참조 siRNA NC의 발현 억제율을 표 3에 요약한다.
도 2 및 표 4의 결과에 따르면, 본 개시내용에 의해 제공된 siRNA 접합체는 시험관 내 시체크 시스템에서 매우 높은 표적 서열 억제 활성을 갖는다. 0.01 nM의 낮은 농도에서, 표적 서열 1 발현 억제율은 적어도 38.92 nM이었고 최대 67.54%에 도달할 수 있었다. 0.1 nM의 농도에서, 표적 서열 1 발현 억제율은 적어도 84.73%이었고 최대 89.35%에 도달할 수 있었다. 한편, siRNA 접합체는 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 참조 접합체 1, 참조 접합체 2 또는 참조 접합체 3과 유사한 표적 서열 억제 활성을 갖는다.
실험예 6. 시험관 내 시체크 시스템에서 siRNA 접합체의 억제 활성
본 실험예에서, 시험관 내 시체크 시스템을 이용하여 접합체 6, 접합체 7 또는 참조 접합체 3의 억제 활성을 검출하였다.
문헌[Kumico Ui-Tei 등, Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution: modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect. Nucleic Acids Research, 2008.36(7), 2136-2151]에 기재된 방법에 따라, 검출 플라스미드를 구축하고, HEK293A 세포를 검출 플라스미드 및 접합체로 공동 형질감염시켜 시험하였다. siRNA의 표적 서열 억제 활성은 이중 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현 수준에 의해 반영되었다. 구체적인 단계는 다음과 같다:
[1] 검출 플라스미드의 구축
psiCHECKTM-2(PromegaTM) 플라스미드를 이용하여 검출 플라스미드를 구축하였고, 플라스미드에는 표적 서열 2, 즉 siRNA 접합체 표적 서열이 함유되어 있었다. 테스트하려는 siRNA 접합체의 표적 서열 2는 다음과 같다:
표적 서열 2는 시험된 siRNA 접합체의 안티센스 가닥에 완전히 상보적인 서열이므로, 표적 서열 2에 대한 각 siRNA 접합체의 억제 효과는 시험된 siRNA 접합체가 표적 유전자 발현을 억제하는 능력을 반영할 수 있다. 표적 서열 2와 이의 상보적 서열을 psiCHECKTM-2 플라스미드의 Xho I/Not I 부위에 클로닝하였다.
[2] 형질감염
HEK293A 세포(Nanjing CoBioer Biosciences Co., Ltd.에서 구입)를 5% CO2/95% 공기가 들어 있는 인큐베이터에서 20% 우태 혈청(FBS, Hyclone Inc.)과 0.2 부피%의 페니실린-스트렙토마이신 디아바디 (Gibco, Invitrogen Inc.)이 보충된 DMEM 완전 배지 (Hyclone Inc.)에서 37℃에서 배양하였다.
HEK293A 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 8Х103개의 세포로 시딩하였다. 16시간 후 세포 성장 밀도가 70 내지 80%에 도달하면, H-DMEM 완전 배지를 웰에서 흡인하고 80 μL의 Opti-MEM 배지(GIBCO Inc.)를 각 웰에 추가로 1.5시간 동안 첨가하였다.
검출 플라스미드를 DEPC 물과 함께 200ng/μL 검출 플라스미드 작업 용액으로 희석하였고; 표 4의 각 siRNA 접합체를 DEPC 물과 함께 다음 11가지 상이한 농도: 1.00 μM, 0.330 μM, 0.110 μM, 0.0370 μM, 0.0123 μM, 0.00412 μM, 0.00137 μM, 0.000457 μM, 0.000152 μM, 0.0000508 μM, 및 0.0000169 μM (siRNA 접합체 내의 siRNA의 양을 기반으로 함)의 siRNA 접합체 작업 용액으로 제형화하였다. 사용된 siRNA 접합체는 각각 전술한 바와 같이 제조된 접합체 6, 접합체 7 및 참조 접합체 3이었다.
각 siRNA 접합체에 대해, 2A1 내지 2A11 용액을 제조하였고, 각 2A1 내지 2A11 용액은 각각 1 μL의 11가지 농도의 siRNA 작업 용액, 0.05 μL의 검출 플라스미드 작업 용액 (10 ng의 검출 플라스미드 함유) 및 10 μL의 Opti-MEM 배지를 순차적으로 함유하였다.
2B 용액을 제조하였고, 각 2B 용액은 0.2 μL의 LipofectamineTM 2000과 10 μL의 Opti-MEM 배지를 함유하였다.
2C 용액을 제조하였고, 각 2C 용액은 0.05 μL의 검출 플라스미드 작업 용액 (10 ng의 검출 플라스미드 함유) 및 10 μL의 Opti-MEM 배지를 함유하였다.
2B 용액의 분취량을 각 siRNA 접합체에 대한 생성된 2A1 내지 2A11 용액의 분취량과 혼합하고 각각 실온에서 20분 동안 인큐베이션하여 각 siRNA 접합체에 대한 형질감염 복합체 2X1-2X11을 얻었다.
2B 용액의 분취량을 2C 용액의 분취량과 혼합하고 각각 실온에서 20분 동안 인큐베이션하여 형질감염 복합체 2X12를 얻었다.
배양 웰에서, 각 siRNA에 대한 형질감염 복합체 2X1-2X11을 각각 첨가하고, 20 μL/웰의 양으로 균일하게 혼합하여 각 siRNA에 대한 형질감염 복합체를 약 0.01 μM, 0.0033 μM, 0.0011 μM, 0.00037 μM, 0.000123 μM, 0.0000412 μM, 0.0000137 μM, 0.00000457 μM, 0.00000152 μM, 0.000000508 μM 및 0.000000169 μM (siRNA 접합체 내의 siRNA의 양을 기반으로 함)의 최종 농도로 얻었다. 각 siRNA 접합체에 대한 형질감염 복합체 2X1-2X11을 각각 3개의 배양 웰에 형질감염시켜 siRNA 접합체를 함유하는 공동 형질감염 혼합물을 얻었고, 이를 시험군으로 지정하였다.
각각의 siRNA 접합체에 대해, 형질감염 복합체 2X12를 또 다른 3개의 배양 웰에 20 μL/웰의 양으로 첨가하여 siRNA 접합체가 없는 형질감염 혼합물을 얻었고, 이를 공시험 대조군으로 지정하였다.
siRNA 접합체가 있는 공동 형질감염 혼합물과 siRNA 접합체가 없는 공동 형질감염 혼합물을 각각 배양 웰에 4시간 동안 형질감염시키고, 20% FBS를 함유한 100 μL의 H-DMEM 완전 배지를 각 웰에 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 CO2 인큐베이터에 넣고 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다.
[3] 검출
배양 웰 내의 배양 배지를 흡인하고, 150 μL의 Dual-Glo® 루시퍼라제 시약 및 H-DMEM 혼합 용액 (부피 비 1:1)을 각 웰에 첨가하고 균일하게 잘 혼합한 후 실온에서10분 동안 인큐베이션하고; 120 μL의 혼합 용액을 96-웰 마이크로플레이트에 옮기고, 96-웰 마이크로플레이트 상의 각 배양 웰에서 반딧불이의 화학발광 값(Fir)을 Synergy II 다기능 마이크로플레이트 판독기(BioTek사)를 사용하여 판독하고; 60 μL의 Dual-Glo® Stop & Glo® 시약을 다시 96-웰 마이크로플레이트의 모든 웰에 첨가하고 완전히 균일하게 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고; Fir 판독 배열에 따라 96-웰 마이크로플레이트의 각 배양 웰에서 레닐라의 화학적 발광 값(Ren)을 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다.
96-웰 마이크로플레이트 상의 각 웰의 발광비 = Ren / Fir를 계산하였고, 각 시험군의 발광비 (시험) 또는 각 대조군의 비(대조군)를 3개 배양 웰의 비의 평균값이고; 대조군의 발광비를 기준으로, 각 시험군의 발광비를 정규화하여 레닐라 리포터 유전자의 상대적인 발현 수준을 나타내는 비율 (시험)/비율(대조군)의 비율 R, 즉, 잔류 활성을 얻었다. 표적 서열에 대한 siRNA의 억제율 = (1 - R) Х 100%.
테스트할 상이한 농도의 siRNA로 형질감염된 HEK293A 세포에서 레닐라의 상대적 잔류 활성에 따라, 로그(억제제) 대 반응의 용량-효과 곡선 - 가변 기울기(4개 매개변수)를 Graphpad 5.0 소프트웨어의 비선형 회귀 분석 기능을 사용하여 피팅하였다.
피팅된 용량-효과 곡선에 해당하는 함수에 따라, 테스트할 siRNA가 표적으로 삼은 표적 서열의 IC50 값을 계산했으며 그 함수는 다음과 같다:
여기서:
Y는 레닐라의 상대적 잔류 활성인 비율 R이고,
X는 형질감염 siRNA 농도의 로그 값이고,
Bot은 정상 상태 기간의 하단에 있는 Y 값이고;
Top은 정상 상태 기간의 상단에 있는 Y 값이고, 그리고
X'는 Y가 하단과 상단 사이의 중간에 있을 때 해당 X 값이고 HillSlope는 X'에서 곡선의 기울기이다.
용량-효과 곡선과 해당 함수로부터, Y = 50%일 때 해당 X50 값을 결정하였고, 각 siRNA의 IC50 값은 IC50 = 10^X50(nM)으로 계산하였으며, IC50 값은 표 5에 요약한다.
표 5의 결과에 따르면, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 시험관 내 시체크 시스템에서 IC50이 6.89-8.55 pM으로 매우 높은 표적 서열 억제 활성을 나타낸다. 한편, siRNA 접합체는 동일한 서열을 함유하지만 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않는 참조 접합체 3과 유사한 표적 서열 억제 활성을 갖는다.
실험예 7. 시험관 내 시체크 시스템에서 siRNA 접합체의 억제 활성
시험관 내 시체크 시스템에서 접합체 3 및 접합체 6의 표적외 서열 억제 활성을 실험예 6의 방법에 따라 검출하였다. 유일한 차이점은 테스트된 siRNA 접합체 대신 접합체 3 또는 접합체 6이 테스트되었다는 것이다. 접합체 6의 경우, 사용된 표적 서열은 표적 서열 2이거나, 표적 서열 2 대신에 아래에 나타낸 표적 3-5를 사용하였다. 접합체 3의 경우, 사용된 표적 서열은 표적 서열 2이거나, 각각 표적 서열 2 대신에 아래에 나타낸 표적 6-8를 사용하였다.
이들 중에서, 표적 서열 2는 접합체 3과 접합체 6의 siRNA의 안티센스 가닥과 완전히 상보적인 서열을 함유하므로, 표적 서열 2에 대한 접합체 3 또는 6의 억제 효과는 접합체 3 또는 6의 ApoC3 mRNA 억제 활성을 반영할 수 있다. 표적 서열 3은 접합체 6의 siRNA의 안티센스 가닥에 부분적으로 상보적인 서열을 함유하고, 표적 서열 4는 접합체 6의 siRNA의 센스 가닥에 완전히 상보적인 서열을 함유하고, 표적 서열 5는 접합체 6의 siRNA의 센스 가닥에 부분적으로 상보적인 서열을 함유한다. 따라서, 표적 서열 3, 4 또는 5에 대한 접합체 6의 억제 효과는 표적외 효과의 정도를 반영할 수 있다. 즉, 억제 효과가 높을수록 접합체 6이 표적외일 가능성이 더 높다. 유사하게, 표적 서열 6은 접합체 3의 siRNA의 안티센스 가닥에 부분적으로 상보적인 서열을 함유하고, 표적 서열 7은 접합체 3의 siRNA의 센스 가닥에 완전히 상보적인 서열을 함유하고, 표적 서열 8은 접합체 3의 siRNA의 센스 가닥에 부분적으로 상보적인 서열을 함유한다. 따라서, 표적 서열 6, 7 또는 8에 대한 접합체 3의 억제 효과는 표적외 효과의 정도를 반영할 수 있다. 즉, 억제 효과가 높을수록 접합체 3이 표적외일 가능성이 더 높다.
그 결과, 시험관 내 시체크 시스템에서, 표적 서열 2에 대한 접합체 6의 억제 IC50은 11.3 pM이었으며, 표적 서열 3, 4 또는 5에 대한 억제율은 테스트한 모든 siRNA의 농도 범위 내에서 50% 미만이고, 즉 이들 중 어느 것도 표적외였다. 표적 서열 2에 대한 접합체 3의 억제 IC50은 4.50 pM이었으며, 표적 서열 6, 7 또는 8에 대한 억제율은 테스트한 모든 siRNA의 농도 범위 내에서 50% 미만이고, 즉 어느 것도 표적외였다.
따라서, 시험관 내 시체크 시스템에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 IC50 값이 4.50 pM 내지 11.3 pM으로 탁월한 표적 서열 표적외 억제 활성을 나타내었다. 한편, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 표적외 효과가 낮다.
실험예 8. 시험관 내 시체크 시스템에서 siRNA 접합체의 억제 활성
실험예 6의 방법에 따라, 시험관 내 시체크 시스템에서 접합체 5의 억제 활성을 테스트하고, 유일한 차이는 테스트된 siRNA 접합체 대신 접합체 5를 테스트하였다는 것이다. 그 결과, 접합체 5는 시험관 내 시체크 시스템에서 IC50이 49.8 pM으로 높은 표적 서열 억제 활성을 나타내었다.
실험예 9. siRNA 접합체의 마우스의 혈중 지질의 저하 효과 (생체 내)
혈청 TG 함량이 > 2 mmol/L인 인간 APOC3 형질전환 마우스 Tg(APOC3)3707Bres(미국 Jackson Laboratory에서 구입)를 선택하고 무작위로 6개의 그룹으로 나누었는데, 그 중 반은 수컷이고 반은 암컷이었다. 접합체 6, 참조 접합체 3 및 PBS 공시험 대조군을 각각의 마우스 그룹에 투여하였다. 모든 동물은 체중에 따라 투여되었으며 단일 피하 주사로 투여되었다. 각 siRNA 접합체의 용량(siRNA 양 기준)은 3 mg/kg 마우스 체중이었고, 투여 용량은 5 mL/kg였다. 각 siRNA 접합체는 PBS 수용액에 제공되고, 투여 용량 및 부피에 따라 접합체가 제조되어야 하는 농도를 계산하였다. 다른 그룹의 각 마우스에는 5 mL/kg 용량의 1X PBS를 투여하여 공시험 대조군으로 사용하였다.
투여 시점을 1일로 하여, 1일째, 9일째 및 15일째에 마우스의 안와 정맥총에서 매회 100μL씩 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 실온에서 30분간 방치한 다음, 3000rpm에서 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 그 다음 PM1P000/3 자동 혈청 생화학 분석기(SABA, 이탈리아)를 사용하여 혈청 내 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세리드(TG)의 함량을 검출하였다.
표준화된 혈중 지질 수준 = (투여 후 시험군의 혈중 지질 함량/투여 전 시험군의 혈중 지질 함량) Х 100%.
혈중 지질 수준의 억제율 = (1 - 투여 후 시험군의 혈중 지질 함량/투여 전 시험군의 혈중 지질 함량) Х 100%.
혈중 지질은 총 콜레스테롤(CHO) 또는 트리글리세라이드(TG)을 지칭한다.
도 3a 및 3b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 참조 siRNA 접합체 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다. 추가로, 이들 시점에서의 혈청 TG 억제율 및 혈청 CHO 억제율은 표 6A 및 표 6B에 요약된다:
도 3a 및 3b와 표 6A 및 6B의 결과에 따르면, 투여 후 상이한 시점에서, 접합체 6은 마우스 혈청 중 TG 및 CHO 수준을 상당히 감소시킬 수 있으며, 안정화 변형 뉴클레오티드를 함유하지 않은 상응하는 참조 접합체 3과 비교하여 11% 이하 감소하는 혈중 지질 수준 저하 효과를 보여주었다.
실험예 10. siRNA 접합체의 마우스의 혈중 지질의 저하 효과 (생체 내)
본 개시내용의 접합체 7이 마우스의 혈중 지질 감소에 미치는 영향을 실험예 9의 방법을 사용하여 검사하였다. 유일한 차이점은 접합체 7, 참조 접합체 3 및 PBS 공시험 대조군을 각각의 마우스 그룹에 투여하는 것이었다. 모든 동물은 체중에 따라 투여되었으며 단일 피하 주사로 투여되었다. 각 siRNA 접합체의 용량(siRNA 양 기준)은 3 mg/kg 및 1 mg/kg 마우스 체중이었고, 투여 용량은 5 mL/kg였다. 투여 시점을 1일로 하여, 1, 9, 15, 22, 29, 36 및 50일째에 마우스의 안와 정맥총에서 매회 100μL씩 혈액을 채취하였다.
도 4a 및 4b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 참조 siRNA 접합체 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다. 추가로, 이들 시점에서의 혈청 TG 억제율 및 혈청 CHO 억제율은 표 7A 및 표 7B에 요약된다:
도 4a 및 4b 및 표 7A 및 7B의 결과에 따르면, 투여 후 상이한 시점에서, 접합체 7은 마우스 혈청 중 TG 및 CHO 수준을 상당히 감소시킬 수 있으며, 안정화 변형 뉴클레오티드를 함유하지 않은 해당 참조 접합체 3과 동일하거나 훨씬 더 나은 혈중 지질 수준 저하 효과를 보여주었다. 특히, 3 mg/kg의 용량에서, 접합체 7은 최대 50일의 투여 기간 동안 항상 매우 높은 혈중 지질 TG 저하 효과를 나타내었고, 최고 억제율은 최대 90.2%에 이를 수 있다.
실험예 11. siRNA 접합체의 마우스의 혈중 지질의 저하 효과 (생체 내)
실험예 9의 방법에 따라, siRNA 접합체의 마우스에서의 혈중 지질 저하 효과를 테스트하였고, 유일한 차이는 사용된 siRNA 접합체가 결합체 3 또는 결합체 4라는 것이었다. 결과는 도 9a 및 9b에 보여진다.
도 9a 및 9b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다. 추가로, 이들 시점에서의 혈청 TG 억제율 및 혈청 CHO 억제율은 표 8A 및 표 8B에 요약된다:
도 5a, 도 5b 및 표 8A 및 8B의 결과는 투여 후 상이한 시점에서 접합체 3 및 접합체 4가 마우스 혈청 중 TG 및 CHO의 수준을 상당히 감소시킬 수 있음을 보여준다. 특히, 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 용량에서, 접합체 4는 최대 50일의 투여 기간 동안 항상 매우 높은 혈중 지질 TG 저하 효과를 나타내었고, 최고 억제율은 92.0%에 이를 수 있다.
실험예 12. siRNA 접합체의 마우스의 혈중 지질의 저하 효과 (생체 내)
실험예 9의 방법에 따라, 마우스에서 siRNA 접합체의 혈중 지질 저하 효과가 확인되었으며, 유일한 차이는 사용된 siRNA 접합체가 접합체 3이라는 것이었고, 각 siRNA 접합체(siRNA를 기반으로 함)의 용량은 9 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.1 mg/kg 또는 0.05 mg/kg 마우스 체중이었고, 투여 용량은 5mL/kg이었다. 각 siRNA 접합체는 PBS 수용액에 제공되고, 투여 용량 및 부피에 따라 접합체가 제조되어야 하는 농도를 계산하였다. 투여 시점을 1일째로 기록하였고, 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57 및 64일째에 마우스의 안와 정맥총에서 혈액을 채취하여 혈청 내 TG 수준을 검출하였다. 결과는 도 6에 보여진다.
도 6은 상이한 농도의 본 개시내용의 상이한 농도의 접합체 3 또는 PBS를 투여한 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다. 추가로, 이들 시점에서의 혈청 TG 억제율은 표 9에 요약된다:
도 6 및 표 9의 결과는 투여 후 상이한 시점에서 상이한 농도의 접합체 3이 모두 마우스 혈청에서 TG 수준을 감소시킬 수 있음을 보여준다. 특히, 9 mg/kg의 용량에서, 본 개시내용의 siRNA 접합체는 단 1회 투여 후 최대 64일 동안 50% 초과의 TG 수준 억제율을 유지할 수 있으며, 억제율은 최대 89.5%에 달해 탁월한 혈중 지질 억제 능력을 보여준다.
실험예 13. siRNA 접합체의 마우스의 혈중 지질의 저하 효과 (생체 내)
혈청 TG 함량이 > 2 mmol/L인 인간 APOC3 형질전환 마우스 Tg(APOC3)3707Bres(미국 Jackson Laboratory에서 구입)를 선택하고 무작위로 8개의 그룹으로 나누었는데, 그 중 반은 수컷이고 반은 암컷이었다. 접합체 3, 참조 접합체 5 및 PBS 공시험 대조군을 각각의 마우스 그룹에 투여하였다. 모든 동물은 체중에 따라 투여되었으며 단일 피하 주사로 투여되었다. 각 siRNA 접합체의 용량(siRNA 양 기준)은 3 mg/kg 및 1 mg/kg 마우스 체중이었고, 투여 용량은 5 mL/kg였다. 각 siRNA 접합체는 PBS 수용액에 제공되고, 투여 용량 및 부피에 따라 접합체가 제조되어야 하는 농도를 계산하였다. 다른 그룹의 각 마우스에는 5 mL/kg 용량의 1X PBS를 투여하여 공시험 대조군으로 사용하였다.
투여 시점을 1일로 기록하였고, 8, 15, 22, 29, 36, 및 43일째에 마우스의 안와 정맥총에서 매회 100μL씩 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 실온에서 30분간 방치한 다음, 3000rpm에서 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 그 다음 PM1P000/3 자동 혈청 생화학 분석기(SABA, 이탈리아)를 사용하여 혈청 내 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세리드(TG)의 함량을 검출하였다.
표준화된 혈중 지질 수준 = (투여 후 시험군의 혈중 지질 함량/투여 전 시험군의 혈중 지질 함량) Х 100%.
혈중 지질 수준의 억제율 = (1 - 투여 후 시험군의 혈중 지질 함량/투여 전 시험군의 혈중 지질 함량) Х 100%.
혈중 지질은 총 콜레스테롤(CHO) 또는 트리글리세라이드(TG)을 지칭한다.
도 7a 및 7b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다. 추가로, 본 개시내용의 siRNA 접합체 투여 후 이러한 시점에서의 혈청 TG 억제율 및 혈청 CHO 억제율은 표 10A 및 표 10B에 요약된다:
도 7a, 도 7b 및 표 10A 및 10B의 결과에 따라, 투여 후 상이한 시점에서, 3 및 접합체 5는 마우스 혈청 중 TG 및 CHO의 수준을 상당히 감소시킬 수 있다. 또한, 실험 43일 내에, 억제 효과는 항상 높게 유지되었다. 특히, 3mg/kg의 용량에서, 접합체 3 및 접합체 5 모두 마우스에서 탁월한 혈중 지질 억제 효과를 보여주었고, 최대 혈청 TG 억제율은 모두 88% 초과였고, 최대 혈청 CHO 억제율은 각각 51.18% 및 57.41%였다. 상기 결과는 본 개시내용의 siRNA 접합체가 장기간에 걸쳐 혈중 지질 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여주며, 이상지질혈증 관련 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어 탁월한 개발 전망을 보여준다.
실험예 14. siRNA 접합체의 마우스의 혈중 지질의 저하 효과 (생체 내)
혈청 TG 함량이 > 2 mmol/L인 인간 APOC3 형질전환 마우스 Tg(APOC3)3707Bres(미국 Jackson Laboratory에서 구입)를 선택하고 무작위로 6개의 그룹으로 나누었는데, 그 중 반은 수컷이고 반은 암컷이었다. 접합체 1, 접합체 2, 참조 접합체 1 및 PBS 공시험 대조군을 각각의 마우스 그룹에 투여하였다. 모든 동물은 체중에 따라 투여되었으며 단일 피하 주사로 투여되었다. 각 siRNA 접합체의 용량(siRNA 양 기준)은 3 mg/kg 및 1 mg/kg 마우스 체중이었고, 투여 용량은 5 mL/kg였다. 각 siRNA 접합체는 PBS 수용액에 제공되고, 투여 용량 및 부피에 따라 접합체가 제조되어야 하는 농도를 계산하였다. 다른 그룹의 각 마우스에는 5 mL/kg 용량의 1X PBS를 투여하여 공시험 대조군으로 사용하였다.
투여 시점을 1일로 기록하였고, 1, 8, 15 및 22일째에 마우스의 안와 정맥총에서 매회 100μL씩 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 실온에서 30분간 방치한 다음, 3000rpm에서 4℃에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 그 다음 PM1P000/3 자동 혈청 생화학 분석기(SABA, 이탈리아)를 사용하여 혈청 내 총 콜레스테롤(CHO) 및 트리글리세리드(TG)의 함량을 검출하였다.
표준화된 혈중 지질 수준 = (투여 후 시험군의 혈중 지질 함량/투여 전 시험군의 혈중 지질 함량) Х 100%.
혈중 지질 수준의 억제율 = (1 - 투여 후 시험군의 혈중 지질 함량/투여 전 시험군의 혈중 지질 함량) Х 100%.
혈중 지질은 총 콜레스테롤(CHO) 또는 트리글리세라이드(TG)을 지칭한다.
도 8a 및 8b는 본 개시내용의 siRNA 접합체, 참조 siRNA 접합체 또는 PBS 투여 후 시간 경과에 따른 혈청 TG 또는 혈청 CHO 수준의 변화를 보여주는 선 그래프이다. 추가로, 본 개시내용의 siRNA 접합체 투여 후 이러한 시점에서의 혈청 TG 억제율 및 혈청 CHO 억제율은 표 11A 및 표 11B에 요약된다:
도 8a, 도 8b 및 표 11A 및 11B의 결과는 투여 후 상이한 시점에, 접합체 1 및 접합체 2는 마우스 혈청 내 TG 및 CHO의 수준을 상당히 감소시킬 수 있으며, 실험 22일 내내 높은 억제 효과를 유지할 수 있다. 또한, 접합체는 안정화 변형 뉴클레오타이드를 함유하지 않은 상응하는 참조 접합체 1과 유사한 혈중 지질 수준 저하 효과를 보여주었다.
특히, 3mg/kg의 용량에서, 접합체 1 및 접합체 2 모두 마우스에서 탁월한 혈중 지질 억제 효과를 보여주었고, 최대 혈청 TG 억제율은 모두 92% 초과였고, 최대 혈청 CHO 억제율은 각각 57.5% 및 54.9%였다. 상기 결과는 본 개시내용의 siRNA 접합체가 장기간에 걸쳐 혈중 지질 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여주며, 이상지질혈증 관련 질환 또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어 탁월한 개발 전망을 보여준다.
실험예 15. 이중가닥 용융 온도 Tm의 측정
제조된 siRNA1-siRNA7과 참조 siRNA1-참조 siRNA7을 각각 1X PBS 완충액을 사용하여 0.02 mg/mL 용액으로 만들어 시험 샘플 용액으로 하였다. 열 프로그램이 장착된 Agilent cary300 UV 분광광도계의 10mm 경로 길이 석영 큐벳에 테스트 용액을 추가하였다. 260 nm의 파장에서 온도-흡광도 곡선이 기록되었으며, 여기서 가열 속도는 0.5℃/min이고 온도는 20.0℃에서 95℃로 상승하였다. 이중 가닥 용융 온도 Tm은 분광광도계 매뉴얼에 따라 온도-흡광도 곡선의 1차 도함수를 계산하여 얻었다. Tm 값은 표 12에 나타나 있다:
참조 siRNA1-참조 siRNA7은 siRNA1-siRNA7과 동일한 염기서열을 가지나, siRNA1-siRNA7에서 안정화 변형 뉴클레오타이드가 있는 위치에 임의의 변형 뉴클레오타이드가 없는 siRNA이다:
Δ Tm 값(테스트할 siRNA) = Tm(siRNA) - Tm(참조 siRNA).
표 12의 결과에 따르면, 동일한 위치에 비변형 뉴클레오티드가 존재하는 경우와 비교하면, 안정화 변형 뉴클레오티드를 포함하는 본 개시내용의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 및 그의 접합체는 더 높은 이중 가닥 용융 온도를 갖는다. 이중 가닥 용융 온도는 적어도 1.33℃ 증가했으며, 여기서 siRNA1은 참조 siRNA에 비해 2.91℃로 가장 많이 증가하였다.
위에서 본 개시내용의 일부 구현예를 상세히 기재했지만, 본 개시내용은 구현예의 특정 세부 사항에 제한되지 않는다. 본 개시내용의 기술적 사상의 범위 내에서, 본 개시내용의 기술적 해결책은 다양하고 간단한 변형이 가능하다. 이러한 단순한 변형은 모두 본 개시내용의 보호 범위에 속한다.
또한, 위의 일부 구현예에 기재된 다양한 특정 기술적 특징은 특징이 서로 모순되지 않는 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 불필요한 반복을 피하기 위해, 이러한 조합은 별도로 예시되지 않을 것이다.
또한, 본 개시내용의 사상을 침해하지 않는 한, 본 개시내용의 다양한 구현은 임의로 조합될 수 있으며, 이 역시 본 개시내용에 개시된 내용으로 간주되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> SUZHOU RIBO LIFE SCIENCE CO., LTD.
<120> NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING SAME, AND
PREPARATION METHOD AND USE
<130> ESP1V232235ZX-KR
<150> 202110807464.3
<151> 2021-07-16
<160> 177
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is Z1, and Z1 is A
<400> 1
caauaaagcu ggacaagan 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z2, and Z2 is U
<400> 2
nucuugucca gcuuuauug 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is Z3, and Z3 is selected from A, U, G or C
<400> 3
caauaaagcu ggacaagan 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z4, Z4 is a nucleotide complementary to Z3, and Z3 is
selected from A, U, G or C
<400> 4
nucuugucca gcuuuauug 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is Z3, and Z3 is selected from A, U, G or C
<400> 5
caauaaagcu ggacaagan 19
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z4, Z4 is a nucleotide complementary to Z3, and Z3 is
selected from A, U, G or C
<400> 6
nucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is Z3, and Z3 is selected from A, U, G or C
<400> 7
cccaauaaag cuggacaaga n 21
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z4, Z4 is a nucleotide complementary to Z3, and Z3 is
selected from A, U, G or C
<400> 8
nucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 9
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 10
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 11
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 12
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 13
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 14
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 15
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 16
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 17
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 18
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 18
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 19
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 20
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 20
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 21
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 22
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 23
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 24
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 25
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 26
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 26
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 27
cccaauaaag cuggacaaga a 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 28
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 29
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 30
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 31
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 32
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 33
cccaauaaag cuggacaaga a 21
<210> 34
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 34
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 35
cccaauaaag cuggacaaga a 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 36
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
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<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 37
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 38
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 39
caauaaagcu ggacaagaa 19
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 40
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
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cccaauaaag cuggacaaga a 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 42
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> siRNA
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cccaauaaag cuggacaaga a 21
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 44
uucuugucca gcuuuauugg gag 23
<210> 45
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is Z5, and Z5 is U
<400> 45
uuaaaaggga caguauucn 19
<210> 46
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z6, and Z6 is A
<400> 46
ngaauacugu cccuuuuaa 19
<210> 47
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is Z7, and Z7 is selected from A, U, G or C
<400> 47
uuaaaaggga caguauucn 19
<210> 48
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z8, Z8 is a nucleotide complementary to Z7, and Z7 is
selected from A, U, G or C
<400> 48
ngaauacugu cccuuuuaa 19
<210> 49
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is Z7, and Z7 is selected from A, U, G or C
<400> 49
uuaaaaggga caguauucn 19
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z8, Z8 is a nucleotide complementary to Z7, and Z7 is
selected from A, U, G or C
<400> 50
ngaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is Z7, and Z7 is selected from A, U, G or C
<400> 51
gcuuaaaagg gacaguauuc n 21
<210> 52
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z8, Z8 is a nucleotide complementary to Z7, and Z7 is
selected from A, U, G or C
<400> 52
ngaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 53
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 53
uuaaaaggga caguauucu 19
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 54
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 55
gcuuaaaagg gacaguauuc u 21
<210> 56
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 56
agaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 57
uuaaaaggga caguauucu 19
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 58
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 59
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 59
uuaaaaggga caguauucu 19
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 60
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 61
gcuuaaaagg gacaguauuc u 21
<210> 62
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 62
agaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 63
gcuuaaaagg gacaguauuc u 21
<210> 64
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 64
agaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 65
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 65
uuaaaaggga caguauucu 19
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 66
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 67
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 67
uuaaaaggga caguauucu 19
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 68
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 69
gcuuaaaagg gacaguauuc u 21
<210> 70
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 70
agaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 71
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 71
gcuuaaaagg gacaguauuc u 21
<210> 72
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 72
agaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 73
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 73
uuaaaaggga caguauucu 19
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 74
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 75
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 75
uuaaaaggga caguauucu 19
<210> 76
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 76
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 77
gcuuaaaagg gacaguauuc u 21
<210> 78
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 78
agaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 79
gcuuaaaagg gacaguauuc u 21
<210> 80
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 80
agaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 81
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 81
uuaaaaggga caguauucu 19
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 82
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 83
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 83
uuaaaaggga caguauucu 19
<210> 84
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 84
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 85
gcuuaaaagg gacaguauuc u 21
<210> 86
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 86
agaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 87
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 87
gcuuaaaagg gacaguauuc u 21
<210> 88
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 88
agaauacugu cccuuuuaag caa 23
<210> 89
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 89
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 90
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 90
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 91
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 91
agaauacugu cccuuuuaag cuu 23
<210> 92
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 92
agaauacugu cccuuuuaag cuu 23
<210> 93
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 93
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 94
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 95
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 95
agaauacugu cccuuuuaag cuu 23
<210> 96
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 96
agaauacugu cccuuuuaag cuu 23
<210> 97
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 97
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 98
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 99
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 99
agaauacugu cccuuuuaag cuu 23
<210> 100
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 100
agaauacugu cccuuuuaag cuu 23
<210> 101
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 101
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 102
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 103
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 103
agaauacugu cccuuuuaag cuu 23
<210> 104
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 104
agaauacugu cccuuuuaag cuu 23
<210> 105
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is Z9, and Z9 is U
<400> 105
ggacaguauu cucagugcn 19
<210> 106
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z10, and Z10 is A
<400> 106
ngcacugaga auacugucc 19
<210> 107
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is Z11, and Z11 is selected from A, U, G or C
<400> 107
ggacaguauu cucagugcn 19
<210> 108
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z12, Z12 is a nucleotide complementary to Z11, and Z11 is
selected from A, U, G or C
<400> 108
ngcacugaga auacugucc 19
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is Z11, and Z11 is selected from A, U, G or C
<400> 109
ggacaguauu cucagugcn 19
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z12, Z12 is a nucleotide complementary to Z11, and Z11 is
selected from A, U, G or C
<400> 110
ngcacugaga auacuguccc u 21
<210> 111
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is Z11, and Z11 is selected from A, U, G or C
<400> 111
agggacagua uucucagugc n 21
<210> 112
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z12, Z12 is a nucleotide complementary to Z11, and Z11 is
selected from A, U, G or C
<400> 112
ngcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 113
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 113
ggacaguauu cucagugcu 19
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 114
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 115
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 115
agggacagua uucucagugc u 21
<210> 116
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 116
agcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 117
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 117
ggacaguauu cucagugcu 19
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 118
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 119
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 119
ggacaguauu cucagugcu 19
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 120
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 121
agggacagua uucucagugc u 21
<210> 122
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 122
agcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 123
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 123
agggacagua uucucagugc u 21
<210> 124
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 124
agcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 125
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 125
ggacaguauu cucagugcu 19
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 126
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 127
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 127
ggacaguauu cucagugcu 19
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 128
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 129
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 129
agggacagua uucucagugc u 21
<210> 130
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 130
agcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 131
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 131
agggacagua uucucagugc u 21
<210> 132
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 132
agcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 133
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 133
ggacaguauu cucagugcu 19
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 134
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 135
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 135
ggacaguauu cucagugcu 19
<210> 136
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 136
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 137
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 137
agggacagua uucucagugc u 21
<210> 138
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 138
agcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 139
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 139
agggacagua uucucagugc u 21
<210> 140
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 140
agcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 141
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 141
ggacaguauu cucagugcu 19
<210> 142
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 142
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 143
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 143
ggacaguauu cucagugcu 19
<210> 144
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 144
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 145
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 145
agggacagua uucucagugc u 21
<210> 146
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 146
agcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 147
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 147
agggacagua uucucagugc u 21
<210> 148
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 148
agcacugaga auacuguccc uuu 23
<210> 149
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z8, Z8 is a nucleotide complementary to Z7, and Z7 is
selected from A, U, G or C
<400> 149
ngaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 150
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is Z8, Z8 is a nucleotide complementary to Z7, and Z7 is
selected from A, U, G or C
<400> 150
ngaauacugu cccuuuuaag cuu 23
<210> 151
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 151
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 152
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 152
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 153
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 153
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 154
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 154
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 155
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 155
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 156
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 156
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 157
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 157
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 158
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 158
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 159
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 159
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 160
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 160
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 161
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 161
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 162
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 162
acgugacacg uucggagaac u 21
<210> 163
<211> 532
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence 1
<400> 163
tgctcagttc atccctagag gcagctgctc caggaacaga ggtgccatgc agccccgggt 60
actccttgtt gttgccctcc tggcgctcct ggcctctgcc cgagcttcag aggccgagga 120
tgcctccctt ctcagcttca tgcagggtta catgaagcac gccaccaaga ccgccaagga 180
tgcactgagc agcgtgcagg agtcccaggt ggcccagcag gccaggggct gggtgaccga 240
tggcttcagt tccctgaaag actactggag caccgttaag gacaagttct ctgagttctg 300
ggatttggac cctgaggtca gaccaacttc agccgtggct gcctgagacc tcaatacccc 360
aagtccacct gcctatccat cctgcgagct ccttgggtcc tgcaatctcc agggctgccc 420
ctgtaggttg cttaaaaggg acagtattct cagtgctctc ctaccccacc tcatgcctgg 480
cccccctcca ggcatgctgg cctcccaata aagctggaca agaagctgct at 532
<210> 164
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence 2
<400> 164
ttgcttaaaa gggacagtat tctcagtgct ctcctacc 38
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence 3
<400> 165
taggcccctt tcaagtattc t 21
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence 4
<400> 166
agaatactgt cccttttaag c 21
<210> 167
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence 5
<400> 167
ctccgcagtg aaattttaag c 21
<210> 168
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence 6
<400> 168
ctttcactgc ggatcagtgc t 21
<210> 169
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence 7
<400> 169
agcactgaga atactgtccc t 21
<210> 170
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target sequence 8
<400> 170
ctacagtctc cgcctgtccc t 21
<210> 171
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 171
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 172
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 172
uucuugucca gcuuuauugg g 21
<210> 173
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 173
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 174
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 174
agaauacugu cccuuuuaag c 21
<210> 175
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 175
agaauacugu cccuuuuaau u 21
<210> 176
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 176
agcacugaga auacuguccc u 21
<210> 177
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 177
agcacugaga auacuguccc u 21
Claims (51)
- siRNA로서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 I을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오타이드 서열 II를 포함하며; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 모두 19개의 뉴클레오타이드로 구성되고, 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II 내의 각각의 뉴클레오타이드는 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 I 및 뉴클레오타이드 서열 II는 적어도 부분적으로 역상보적이어서 이중 가닥 영역을 형성하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 적어도 부분적으로 역상보적이며; 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 아포지단백질 C3 유전자에 의해 발현되는 mRNA에서 길이가 19개의 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 서열이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 내지 6번째 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 안정화 변형 뉴클레오타이드이고; 안정화 변형 뉴클레오타이드는 2' 위치의 리보스 하이드록실 기가 안정화 변형 기로 치환된 뉴클레오타이드를 의미하며; 해당 위치의 뉴클레오타이드가 비변형 뉴클레오타이드인 siRNA와 비교하여, 안정화 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 siRNA는 증가된 열안정성을 가지며, 그리고 안정화 변형 기의 입체 장애는 2'-O-메틸의 입체 장애보다 큰 것인, siRNA.
- 제1항에 있어서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 또는 5번째 뉴클레오타이드는 안정화 변형 뉴클레오타이드인, siRNA.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 3번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 2개 이하의 뉴클레오타이드는 안정화 변형 뉴클레오타이드인, siRNA.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 열안정성의 증가는 siRNA의 Tm의 증가를 지칭하며, Tm은 siRNA의 이중 가닥 용융 온도인, siRNA.
- 제4항에 있어서, siRNA의 열안정성의 증가는 siRNA의 Tm이 적어도 0.05℃ 증가함을 지칭하는, siRNA.
- 제4항에 있어서, siRNA의 열안정성의 증가는 siRNA의 Tm이 0.1 내지 6℃ 증가함을 지칭하는, siRNA.
- 제4항에 있어서, siRNA의 열안정성의 증가는 siRNA의 Tm이 0.5 내지 4℃ 증가함을 지칭하는, siRNA.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 안정화 변형 기는 독립적으로 -X-R로 표시되는 구조를 갖고, 여기서 X는 O, NR', S 또는 SiR'2이고; R은 C2-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알킬, C6-C8 아릴 및 치환된 C6-C8 아릴 중 하나이고; 각각의 R'는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C6-C8 아릴 및 치환된 C6-C8 아릴 중 하나이고; 치환된 C2-C6 알킬, 치환 C6-C8 아릴 또는 치환 C1-C6 알킬은 C2-C6 알킬, C6-C8 아릴 또는 C1-C6 알킬 상의 하나 이상의 수소 원자가 치환기로 대체되어 형성된 기를 지칭하고, 그리고 치환기는 다음 치환기: C1-C3 알킬, C6-C8 아릴, C1-C3 알콕시, 할로겐, 옥소 및 설파닐리덴 중 하나 이상으로부터 선택되는, siRNA.
- 제8항에 있어서, 각각의 안정화 변형 기는 독립적으로 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-O-2-N-메틸아미노-2-옥소에틸, 2'-O-2-N,N-디메틸아미노에틸, 2'-O-3-아미노프로필 및 2'-O-2,4-디니트로페닐 중 하나로부터 선택되는, siRNA.
- 제9항에 있어서, 각각의 안정화 변형 기는 2'-O-메톡시에틸인, siRNA.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고; 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고
5'- CAAUAAAGCUGGACAAGAZ1 -3' (서열번호: 1);
5'- Z2UCUUGUCCAGCUUUAUUG -3' (서열번호: 2),
여기서 Z1은 A이고, Z2는 U이고, 뉴클레오타이드 서열 I은 위치 Z1에 상응하는 뉴클레오타이드 Z3을 함유하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 위치 Z2에 상응하는 뉴클레오타이드 Z4를 함유하고, 그리고 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고;
또는 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 45에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고; 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 46에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고
5'- UUAAAAGGGACAGUAUUCZ5 -3' (서열번호: 45);
5'- Z6GAAUACUGUCCCUUUUAA -3' (서열번호: 46),
여기서 Z5는 U이고, Z6은 A이고, 뉴클레오타이드 서열 I은 위치 Z5에 상응하는 뉴클레오타이드 Z7을 함유하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 위치 Z6에 상응하는 뉴클레오타이드 Z8을 함유하고, 그리고 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고;
또는 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 105에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고; 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 106에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고
5'- GGACAGUAUUCUCAGUGCZ9 -3' (서열번호: 105);
5'- Z10GCACUGAGAAUACUGUCC -3' (서열번호: 106),
여기서 Z9는 U이고, Z10은 A이고, 뉴클레오타이드 서열 I은 위치 Z9에 상응하는 뉴클레오타이드 Z11을 함유하고, 뉴클레오타이드 서열 II는 위치 Z10에 상응하는 뉴클레오타이드 Z12를 함유하고, 그리고 Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드인, siRNA. - 제11항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열이거나; 또는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 45에 제시된 뉴클레오타이드 서열이거나; 또는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 105에 제시된 뉴클레오타이드 서열인, siRNA.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고/다르거나, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고;
뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 45에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고/다르거나, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 46에 제시된 뉴클레오타이드 서열는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고;
뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 105에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고/다르거나, 뉴클레오타이드 서열 II 및 서열번호: 106에 제시된 뉴클레오타이드 서열는 1개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다른 것인, siRNA. - 제13항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 II와 서열번호: 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z4 위치의 차이를 포함하고, 그리고 Z4는 A, G 또는 C로부터 선택되고;
또는 뉴클레오타이드 서열 II와 서열번호: 46에 제시된 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z8 위치의 차이를 포함하고, 그리고 Z8은 G, C 또는 U로부터 선택되고;
또는 뉴클레오타이드 서열 II와 서열번호: 106에 제시된 뉴클레오타이드 서열 사이의 뉴클레오타이드 차이는 Z12 위치의 차이를 포함하고, 그리고 Z12는 G, C 또는 U로부터 선택되는, siRNA. - 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Z3은 Z4에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이거나; 또는 Z5는 Z6에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이거나; 또는 Z8은 Z7에 대해 상보적인 뉴클레오타이드인, siRNA.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 II는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 대해 실질적으로 역상보적이거나, 사실상 역상보적이거나, 완전히 역상보적이고; 실질적으로 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 3개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하며; 사실상 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 1개 이하의 염기 불일치가 있음을 의미하며; 완전히 역상보적이라는 것은 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이에 불일치가 없다는 것을 의미하는, siRNA.
- 제16항에 있어서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II의 2번째 내지 19번째 위치의 뉴클레오타이드는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 1번째 내지 18번째 위치의 뉴클레오타이드와 완전히 역상보적인, siRNA.
- 제17항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 II는 뉴클레오타이드 서열 I과 완전히 역상보적이거나, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 뉴클레오타이드 서열 II 내의 제2 뉴클레오타이드와 3' 말단에서 5' 말단 방향으로 뉴클레오타이드 서열 I 내의 제2 뉴클레오타이드 사이에 염기 불일치가 있는, siRNA.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 동일하거나 상이한 길이를 갖고; 센스 가닥의 길이는 19 내지 23개의 뉴클레오타이드이고; 안티센스 가닥의 길이는 19 내지 26개의 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 I은 서열번호: 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열이고; 뉴클레오타이드 서열 II는 서열번호: 4에 제시된 뉴클레오타이드 서열이고
5'- CAAUAAAGCUGGACAAGAZ3 -3' (서열번호: 3);
5'- Z4UCUUGUCCAGCUUUAUUG -3' (서열번호: 4),
Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이고;
또는 뉴클레오타이드 서열 I은 서열번호: 47에 제시된 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열번호: 48에 제시된 뉴클레오타이드 서열이고
5'- UUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3' (서열번호: 47);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAA -3' (서열번호: 48),
Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이고;
또는 뉴클레오타이드 서열 I은 서열번호: 107에 제시된 뉴클레오타이드 서열이고, 뉴클레오타이드 서열 II는 서열번호: 108에 제시된 뉴클레오타이드 서열이고
5'- GGACAGUAUUCUCAGUGCZ11 -3' (서열번호: 107);
5'- Z12GCACUGAGAAUACUGUCC -3' (서열번호: 108),
Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보적인 뉴클레오타이드인, siRNA. - 제19항에 있어서, Z3은 A이고, Z4는 U이거나; 또는 Z7은 U이고 Z8은 A이거나; 또는 Z11은 U이고 Z12는 A인, siRNA.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 2번째, 6번째, 14번째 및 16번째 뉴클레오타이드가 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아닌 경우, 동일한 것은 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드인, siRNA.
- 제21항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 모든 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II의 모든 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 II 내의 2번째, 6번째, 14번째, 16번째 뉴클레오타이드가 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아닌 경우에, 동일한 것은 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 II 내의 다른 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나인, siRNA.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I 내의 7번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드인, siRNA.
- 제23항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 내의 모든 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I 내의 7번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드인, siRNA.
- 제24항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 내의 모든 뉴클레오타이드는 변형 뉴클레오타이드이고; 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 I 내의 7번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 I 내의 다른 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나인, siRNA.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 또한 뉴클레오타이드 서열 III을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 또한 뉴클레오타이드 서열 IV를 함유하고; 뉴클레오타이드 서열 III 및 뉴클레오타이드 서열 IV 내의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나이고 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아니고; 뉴클레오타이드 서열 III의 길이는 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드이고; 뉴클레오타이드 서열 IV 및 뉴클레오타이드 서열 III는 길이가 같고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV 및 뉴클레오타이드 서열 III은 사실상 역상보적이거나 완전히 역상보적이고; 뉴클레오타이드 서열 III은 뉴클레오타이드 서열 I의 5' 말단에 연결되고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV는 뉴클레오타이드 서열 II의 3' 말단에 연결되고; 뉴클레오타이드 서열 IV는제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 대해 사실상 역상보적이거나 완전히 역상보적이고, 그리고 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 인접하고, APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA 내의 뉴클레오타이드 서열 IV와 동일한 길이를 갖는 뉴클레오타이드 서열을 지칭하는, siRNA.
- 제26항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 1개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 C이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 G이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 2개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CC이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GG이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 3개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UCC이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GGA이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 4개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 CUCC이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GGAG인, siRNA.
- 제27항에 있어서, 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 길이는 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드이고, 염기 조성은 각각 C, CC, UCC 또는 CUCC인, siRNA.
- 제26항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 45에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 1개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 C이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 G이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 2개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 GC이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GC이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 3개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UGC이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GCA이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 4개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 UUGC이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 GCAA인, siRNA.
- 제29항에 있어서, 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 길이는 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드이고, 염기 조성은 각각 C, GC, GCA 또는 GCAA인, siRNA.
- 제26항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 I 및 서열번호: 105에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 길이가 동일하고 3개 이하의 뉴클레오타이드만큼 다르고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 1개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기는 G이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기는 C이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 2개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AG이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CU이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 3개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AAG이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CUU이거나; 또는 뉴클레오타이드 서열 III 및 IV 둘 다는 길이가 4개의 뉴클레오타이드이고, 뉴클레오타이드 서열 III의 염기 조성은 AAAG이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 IV의 염기 조성은 CUUU인, siRNA.
- 제31항에 있어서, 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 길이는 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드이고, 염기 조성은 각각 G, AG, AAG 또는 AAAG인, siRNA.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA는 또한 올리고뉴클레오타이드 서열 V를 함유하고, 올리고뉴클레오타이드 서열 V 내의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드 중 하나이고 안정화 변형 뉴클레오타이드가 아니고, 뉴클레오타이드 서열 V의 길이는 1 내지 3개의 뉴클레오타이드이고, 그리고 뉴클레오타이드 서열 V는 안티센스 가닥의 3' 말단에 연결되어 안티센스 가닥의 3' 오버행을 구성하는, siRNA.
- 제33항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열 V의 길이는 2개의 뉴클레오타이드이고, 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 뉴클레오타이드 서열 V는 2개의 연속된 티민 데옥시리보뉴클레오타이드, 2개의 연속된 우라실 리보뉴클레오타이드이거나, 또는 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트와 완전히 역상보적이며; 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트 또는 제2 뉴클레오타이드 서열 세그먼트에 인접하고, APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA 내의 뉴클레오타이드 서열 V와 동일한 길이를 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는, siRNA.
- 제34항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖고 그리고 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기 조성은 CC이거나; 또는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 45에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 그리고 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기 조성은 GC이거나; 또는 제1 뉴클레오타이드 서열 세그먼트는 서열번호: 105에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 가지며, 그리고 제3 뉴클레오타이드 서열 세그먼트의 염기 조성은 AG인, siRNA.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 5에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 6에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- CAAUAAAGCUGGACAAGAZ3 -3' (서열번호: 5);
5'- Z4UCUUGUCCAGCUUUAUUGGG -3' (서열번호: 6),
Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이고;
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 7에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 siRNA의 안티센스 가닥은 서열번호: 8에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- CCCAAUAAAGCUGGACAAGAZ3 -3' (서열번호: 7);
5'-Z4UCUUGUCCAGCUUUAUUGGGAG-3' (서열번호: 8), 여기서 Z4는 안티센스 가닥의 5' 말단의 제1 뉴클레오타이드이고, Z3은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z4는 Z3에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이고;
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 49에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 50에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- UUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3' (서열번호: 49);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAAGC -3' (서열번호: 50),
Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이고;
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 51에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 52에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- GCUUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3' (서열번호: 51);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA -3' (서열번호: 52),
Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이고;
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 49에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 149에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- UUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3' (서열번호: 49);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAAUU -3' (서열번호: 149),
Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이고;
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 51에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 150에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- GCUUAAAAGGGACAGUAUUCZ7 -3' (서열번호: 51);
5'- Z8GAAUACUGUCCCUUUUAAGCUU -3' (서열번호: 150),
Z8은 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z7은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z8은 Z7에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이고;
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 109에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 110에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- GGACAGUAUUCUCAGUGCZ11 -3' (서열번호: 109);
5'- Z12GCACUGAGAAUACUGUCCCU -3' (서열번호: 110),
Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보적인 뉴클레오타이드이고;
또는 siRNA의 센스 가닥은 서열번호: 111에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 그리고 안티센스 가닥은 서열번호: 112에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하고
5'- AGGGACAGUAUUCUCAGUGCZ11 -3' (서열번호: 111);
5'- Z12GCACUGAGAAUACUGUCCCUUU -3' (서열번호: 112),
Z12는 안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 제1 뉴클레오타이드이고, Z11은 A, U, G 또는 C로부터 선택되고, Z12는 Z11에 대해 상보적인 뉴클레오타이드인, siRNA. - 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 리보실 기의 2' 위치에 있는 하이드록실 기를 비-불소 기로 대체함으로써 형성된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 중 하나로부터 독립적으로 선택되는, siRNA.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 비-플루오로 변형 뉴클레오타이드는 메톡시 변형 뉴클레오타이드이고, 메톡시 변형 뉴클레오타이드는 리보실 기의 2'-하이드록실을 메톡시로 대체함으로써 형성된 뉴클레오타이드인, siRNA.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA는 siAPOC3a1-M1, siAPOC3a1-M2, siAPOC3a2-M1, siAPOC3a2-M2, siAPOC3b1-M1, siAPOC3b1-M2, siAPOC3b2-M1, siAPOC3b2-M2, siAPOC3b3-M1, siAPOC3b3-M2, siAPOC3b4-M1, siAPOC3b4-M2, siAPOC3c1-M1, siAPOC3c1-M2, siAPOC3c2-M1, 및 siAPOC3c2-M2 중 하나인, siRNA.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 중 적어도 하나의 단일 가닥의 인산염-당 백본 내의 적어도 하나의 포스페이트 기는 변형 기를 갖는 포스페이트 기이고, 변형 기를 갖는 포스페이트 기는 다음 위치로 구성된 군 중 적어도 하나에 존재하는, siRNA:
센스 가닥의 5' 말단에 있는 1번째 뉴클레오타이드 및 2번째 뉴클레오타이드 사이;
센스 가닥의 5' 말단에 있는 2번째 뉴클레오타이드 및 3번째 뉴클레오타이드 사이;
센스 가닥의 3' 말단에 있는 1번째 뉴클레오타이드 및 2번째 뉴클레오타이드 사이;
센스 가닥의 3' 말단에 있는 2번째 뉴클레오타이드 및 3번째 뉴클레오타이드 사이;
안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 1번째 뉴클레오타이드 및 2번째 뉴클레오타이드 사이;
안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 2번째 뉴클레오타이드 및 3번째 뉴클레오타이드 사이;
안티센스 가닥의 5' 말단에 있는 1번째 뉴클레오타이드 및 2번째 뉴클레오타이드 사이; 및
안티센스 가닥의 3' 말단에 있는 2번째 뉴클레오타이드 및 3번째 뉴클레오타이드 사이. - 제40항에 있어서, siRNA는 siAPOC3a1-M1S, siAPOC3a1-M2S, siAPOC3a2-M1S, siAPOC3a2-M2S, siAPOC3b1-M1S, siAPOC3b1-M2S, siAPOC3b2-M1S, siAPOC3b2-M2S, siAPOC3b3-M1S, siAPOC3b3-M2S, siAPOC3b4-M1S, siAPOC3b4-M2S, siAPOC3c1-M1S, siAPOC3c1-M2S, siAPOC3c2-M1S, 및 siAPOC3c2-M2S 중 하나인, siRNA.
- 제1항 내지 제38항 및 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오타이드는 5'-포스페이트 유사체에 의해 변형된 뉴클레오타이드 또는 5'-포스페이트 뉴클레오타이드인, siRNA.
- 제42항에 있어서, siRNA는 ssiAPOC3a1-M1P1, siAPOC3a1-M2P1, siAPOC3a2-M1P1, siAPOC3a2-M2P1, siAPOC3a1-M1SP1, siAPOC3a1-M2SP1, siAPOC3a2-M1SP1, siAPOC3a2-M2SP1, siAPOC3b1-M1P1, siAPOC3b1-M2P1, siAPOC3b2-M1P1, siAPOC3b2-M2P1, siAPOC3b1-M1SP1, siAPOC3b1-M2SP1, siAPOC3b2-M1SP1, siAPOC3b2-M2SP1, siAPOC3b3-M1P1, siAPOC3b3-M2P1, siAPOC3b4-M1P1, siAPOC3b4-M2P1, siAPOC3b3-M1SP1, siAPOC3b3-M2SP1, siAPOC3b4-M1SP1, siAPOC3b4-M2SP1, siAPOC3c1-M1P1, siAPOC3c1-M2P1, siAPOC3c2-M1P1, siAPOC3c2-M2P1, siAPOC3c1-M1SP1, siAPOC3c1-M2SP1, siAPOC3c2-M1SP1, 및 siAPOC3c2-M2SP1 중 하나인, siRNA.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
- siRNA 접합체로서, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및 siRNA에 접합된 접합 그룹을 포함하고, 접합 그룹은 링커 및 약제학적으로 허용되는 표적화 그룹을 포함하고, siRNA, 링커 및 표적화 그룹은 공유적으로 또는 비공유적으로 순차적으로 연결되고; 각각의 표적화 그룹은 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드로부터 선택되는, siRNA 접합체.
- APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA 수준과 연관된 질환 또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제44항에 따른 약제학적 조성물 및/또는 제45항에 따른 siRNA 접합체의 용도.
- 제46항에 있어서, APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 수준과 연관된 질환 또는 증상은 이상지질혈증인, 용도.
- APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 수준과 관련된 질환 또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제44항에 따른 약제학적 조성물 및/또는 제45항에 따른 siRNA 접합체를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 제48항에 있어서, APOC3 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 수준과 연관된 질환 또는 증상은 이상지질혈증인, 방법.
- 세포 내에서 APOC3 유전자의 발현 수준을 억제하는 방법으로서, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제44항에 따른 약제학적 조성물 및/또는 제45항에 따른 siRNA 접합체의 유효 용량을 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 키트로서, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 및/또는 제44항에 따른 약제학적 조성물 및/또는 제45항에 따른 siRNA 접합체를 포함하는, 키트.
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