JP2017535552A - アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 - Google Patents

アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）遺伝子を標的化するＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤、およびＡＰＯＣ３の発現を阻害するための、かかるＲＮＡｉ剤の使用方法、およびＡＰＯＣ３関連障害、例えば高トリグリセリド血症を有する対象の治療方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０８０，９４１号明細書、および２０１５年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１３６，１５９号明細書の優先権の利益を主張する。前述の出願の各々の内容は全て、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は本明細書によって全体として参照により援用される。２０１５年１１月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、名称１２１３０１−０２５２０＿ＳＬ．ｔｘｔ、およびサイズ２１２，０８５バイトである。
アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）は超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）であり、リポタンパク質代謝の重要な調節因子である。ヒトでは、ＡＰＯＣ２は、１１番染色体の長腕上にＡＰＯＡ１およびＡＰＯＡ４遺伝子と共に遺伝子クラスターとして位置するＡＰＯＣ３遺伝子によってコードされる。ＡＰＯＣ３は、肝臓、およびそれより程度は少ないが腸において、小さい９９アミノ酸のタンパク質として発現する。小胞体で２０アミノ酸のシグナルペプチドが除去されると、７９アミノ酸の成熟ＡｐｏＣ３タンパク質が形成され、これは非グリコシル化型またはグリコシル化型アイソフォームとして存在し得る。
ＡＰＯＣ３の主な役割は、内皮結合型リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の非競合的阻害による脂肪分解の調節因子としての役割である。ＬＰＬは、トリアシルグリセロール（トリグリセリド）リッチなリポタンパク質（ＴＲＬ）中のトリアシルグリセロール類を加水分解して血漿中に脂肪酸を遊離させ、大きいトリアシルグリセロールリッチ粒子を小さいトリアシルグリセロール枯渇レムナントリポタンパク質に変える。ＡＰＯＣ３欠損者は低いＴＲＬレベルを有し、トリアシルグリセロール類の極めて効率的な脂肪分解を伴う。さらに、ＡＰＯＣ３遺伝子を遺伝的に欠失させたマウスもまた、低い血漿トリアシルグリセロールレベルおよび効率的なＴＲＬ異化を有することが示された。ＡＰＯＣ３はまた、肝臓で合成されるトリアシルグリセロールリパーゼおよびホスホリパーゼＡ１活性を有する脂肪分解酵素、肝性リパーゼ（ＨＬ）も阻害する。ＡＰＯＣ３のＨＬ阻害効果は、肝臓による脂肪分解およびＴＲＬレムナントの取込みをさらに低減する。ＡＰＯＣ３はまた、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の合成を刺激することも示されている。このＡＰＯＣ３効果に関連する根本的な機構は、プロテアソーム媒介性のＡＰＯＢ分解の阻害に関係している可能性があり、ＡＰＯＢ合成および分泌の増加、ならびにＶＬＤＬトリアシルグリセロールの合成の増加につながり得ると考えられる。したがってＡＰＯＣ３は、肝臓によるＶＬＤＬ産生量の調節において重要な役割を果たし得る。
細胞研究は、ＡＰＯＣ３が肝臓のリポタンパク質受容体に対するＴＲＬおよびレムナント結合を妨げ得ることを報告している。ＡＰＯＣ３は、ＡＰＯＢおよびＡＰＯＥを遮蔽するか、またはそれらのコンホメーションを変化させるかのいずれかにより、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に対するＡＰＯＢ媒介性およびＡｐｏＥ媒介性のリポタンパク質結合を消失させることができる。脂肪分解刺激受容体（ＬＳＲ）に対するカイロミクロンおよびＶＬＤＬ粒子の結合もまた、ＡＰＯＣ３によって有意に阻害される。
ＡＰＯＣ３レベルの増加は、高トリグリセリド血症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、すなわち高い（高（ｈｙｐｅｒ−））トリグリセリド血中濃度（血症（−ｅｍｉａ））の発症を引き起こす。トリグリセリドレベルの上昇は、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）、高血圧症および皮膚病変（黄色腫）を含めた種々の疾患と関連付けられる。極めて高いトリグリセリドレベルはまた、急性膵炎のリスクも増加させる。したがって、ＡＰＯＣ３代謝を調節することが、高トリグリセリド血症および関連疾患を管理するための重要な新規治療手法であり得る。
したがって、当該技術分野においては、高トリグリセリド血症などのアポリポタンパク質Ｃ３関連障害を治療するためのＡＰＯＣ３発現の調節因子が必要とされている。
本発明は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害または低減するｉＲＮＡ組成物を提供する。この遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象の体内にある細胞内にあり得る。
本発明はまた、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害または低減するｉＲＮＡ組成物を使用して、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の阻害または低減から利益を受け得る障害、例えば高トリグリセリド血症などのアポリポタンパク質Ｃ３関連疾患を有する対象を治療するための方法および療法も提供する。
一部の実施形態において、本発明は、細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
少なくとも一方の鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、および前記センス鎖は、３’末端に付加されたリガンドと共役している。
特定の態様において、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。一態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３に列挙される配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸塩、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’−メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’リン酸または５’リン酸模倣体を含むヌクレオチド、ビニルリン酸を含むヌクレオチド、アデノシン−グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ−異性体を含むヌクレオチド、２−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−５−リン酸を含むヌクレオチド、２’−デオキシチミジン−３’リン酸を含むヌクレオチド、２’−デオキシグアノシン−３’−リン酸を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。別の態様において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。さらに別の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。別の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。
一態様において、少なくとも一方の鎖が少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の態様において、少なくとも一方の鎖が少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
一部の実施形態では、本発明は、細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現の阻害能を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＡＰＯＣ３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
［式中：
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立して０〜６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはこれらの組み合わせである０〜２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾または非修飾のいずれかまたはこれらの組み合わせである０〜１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’（この各々は存在することもまたは存在しないこともある）は、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；
Ｎｂ上の修飾はＹ上の修飾と異なり、かつＮｂ’上の修飾はＹ’上の修飾と異なる］によって表され；および
センス鎖は少なくとも１つのリガンドと共役している。
さらなる実施形態において、ｉは０であり；ｊは０であり；ｉは１であり；ｊは１であり；ｉおよびｊは両方ともに０であり；またはｉおよびｊは両方ともに１である。別のさらなる実施形態において、ｋは０であり；ｌは０であり；ｋは１であり；ｌは１であり；ｋおよびｌは両方ともに０であり；またはｋおよびｌは両方ともに１である。別の態様において、ＹＹＹモチーフはセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。さらに別の態様において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１１、１２および１３位に存在する。
一実施形態において、Ｙ’は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロである。
一部の態様において、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
によって表される。
さらなる態様において、二本鎖領域は１５〜３０ヌクレオチド対長である。別の態様において、二本鎖領域は１７〜２３ヌクレオチド対長である。別の実施形態において、二本鎖領域は１７〜２５ヌクレオチド対長である。さらに別の実施形態において、二本鎖領域は２３〜２７ヌクレオチド対長である。さらなる態様において、二本鎖領域は１９〜２１ヌクレオチド対長である。さらに別の態様において、二本鎖領域は２１〜２３ヌクレオチド対長である。
一実施形態において、各鎖は１５〜３０ヌクレオチドを有する。さらなる実施形態において、各鎖は１９〜３０ヌクレオチドを有する。
一態様において、ヌクレオチド上の修飾は、表５、９、１０、１１Ｂ、１２、１３に列挙されるとおりの修飾、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
一部の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロ修飾である。
一部の実施形態において、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。さらなる実施形態において、リガンドは、
Figure 2017535552
 である。
一部の態様において、リガンドはセンス鎖の３’末端に付加されている。
特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図
Figure 2017535552
 ［式中、ＸはＯまたはＳである］に示されるとおりのリガンドと共役している。
一部の態様において、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む。さらなる態様において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は一方の鎖の３’末端にある。別のさらなる態様において、この鎖はアンチセンス鎖である。さらに別の態様において、この鎖はセンス鎖である。
一部の実施形態において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は一方の鎖の５’末端にある。さらなる態様において、この鎖はアンチセンス鎖である。別のさらなる態様において、この鎖はセンス鎖である。
特定の実施形態において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は一方の鎖の５’末端および３’末端の両方にある。一実施形態において、この鎖はアンチセンス鎖である。
一部の態様において、ＲＮＡｉ剤は６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらなる実施形態において、アンチセンス鎖は５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一部の実施形態において、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位にある塩基対はＡＵ塩基対である。
一部の態様において、Ｙヌクレオチドは２’−フルオロ修飾を含有する。さらなる態様において、Ｙ’ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含有する。
一部の実施形態において、センス鎖は合計２１ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は合計２３ヌクレオチドを有する。
一部の態様において、ＲＮＡｉ剤は、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂおよび１２のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される。
特定の実施形態において、本発明はまた、細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現の阻害能を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤も提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖は５’−ＧＣＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵ−３’（配列番号１３）を含み、かつアンチセンス鎖は５’−ＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣＡＡ−３’（配列番号１４）を含み、
センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
センス鎖は、３’末端に付加されたリガンドと共役し、および
リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
他の実施形態において、本発明はまた、細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現の阻害能を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤も提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖は５’−ＧＣＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵ−３’（配列番号１３）を含み、かつアンチセンス鎖は５’−ＵＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣＡＡ−３’（配列番号を含み１５）を含み、
センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
センス鎖は、３’末端に付加されたリガンドと共役し、および
リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
特定の実施形態において、本発明はまた、細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現の阻害能を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤も提供し、この二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖は５’−ＧＣＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＡ−３’（配列番号６５９）を含み、かつアンチセンス鎖は５’−ＵＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣＡＡ−３’（配列番号６７０）を含み、
センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
センス鎖は、３’末端に付加されたリガンドと共役し、および
リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。別の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。
さらなる態様において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸塩、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’−メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’リン酸または５’リン酸模倣体を含むヌクレオチド、ビニルリン酸を含むヌクレオチド、アデノシン−グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ−異性体を含むヌクレオチド、２−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−５−リン酸を含むヌクレオチド、２’−デオキシチミジン−３’リン酸を含むヌクレオチド、２’−デオキシグアノシン−３’−リン酸を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを１０個以下含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを９個以下含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを８個以下含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを７個以下含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを６個以下含む。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを５個以下含む。さらに別の実施形態において、センス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを４個以下含む。別の実施形態において、センス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを４個以下含む。別の実施形態において、センス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを３個以下含む。別の実施形態において、センス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを２個以下含む。別の態様において、アンチセンス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを６個以下含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを５個以下含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを４個以下含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを３個以下含む。さらに別の態様において、アンチセンス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを２個以下含む。
一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドに５’−リン酸または５’−リン酸模倣体をさらに含む。別の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドに５’−リン酸模倣体をさらに含む。具体的な実施形態において、５’−リン酸模倣体は５’−ビニルリン酸（５’−ＶＰ）である。
特定の態様において、リガンドは、
Figure 2017535552
 である。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図
Figure 2017535552
 ［式中、ＸはＯまたはＳである］に示されるとおりのリガンドと共役している。
一部の態様において、本発明は、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ配列を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の配列：
センス：５’ＧｆｓｃｓＵｆｕＡｆａＡｆａＧｆＧｆＧｆａＣｆａＧｆｕＡｆｕＵｆｃＵｆＬ９６ ３’（配列番号１６）
アンチセンス：５’ａｓＧｆｓａＡｆｕＡｆｃＵｆｇＵｆｃｃｃＵｆｕＵｆｕＡｆａＧｆｃｓＡｆｓａ ３’（配列番号１７）を含むＡＤ−５７５５３である。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の配列：
センス：５’ＧｆｓｃｓＵｆｕＡｆａＡｆａＧｆＧｆＧｆａＣｆａＧｆｕＡｆｕＵｆｃＵｆＬ９６ ３’（配列番号１８）
アンチセンス：５’ＶＰｕｓＧｆｓａＡｆｕＡｆｃＵｆｇＵｆｃｃｃＵｆｕＵｆｕＡｆａＧｆｃｓａｓａ ３’（配列番号１９）を含むＡＤ−６５６９６である。
さらに別の態様において、ＲＮＡｉ剤は、以下の配列：
センス：５’ｇｓｃｓｕｕａａＡｆａＧｆＧｆＧｆａｃａｇｕａｕｕｃａＬ９６ ３’（配列番号２０）
アンチセンス：５’ｕｓＧｆｓａａｕＡｆｃＵｆＧｆｕｃｃｃＵｆｕＵｆｕａａｇｃｓａｓａ ３’（配列番号２１）を含むＡＤ−６５７０３である。
さらに別の態様において、ＲＮＡｉ剤は、以下の配列：
センス：５’ｇｓｃｓｕｕａａＡｆａＧｆＧｆＧｆａｃａｇｕａｕｕｃａＬ９６ ３’（配列番号２２）
アンチセンス：５’ｕｓＧｆｓａａｕａｃｕｇｕｃｃｃＵｆｕｕｕａａｇｃｓａｓａ ３’（配列番号２３）を含むＡＤ−６５７０４である。
さらに別の態様において、ＲＮＡｉ剤は、以下の配列：
センス：５’ｃｓｃｓｃａａｕＡｆａＡｆＧｆＣｆｕｇｇａｃａａｇａａＬ９６ ３’（配列番号７１４）
アンチセンス：５’ｕｓＵｆｓｃｕｕＧｆｕＣｆＣｆａｇｃｕＵｆｕＡｆｕｕｇｇｇｓａｓｇ ３’（配列番号７１８）を含むＡＤ−６７２２１である。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の配列：
センス：５’ｇｓｃｓｕｕａａａａＧｆｇＧｆａｃａｇｕａｕｕｃａ ３’（配列番号７３８）
アンチセンス：５’ｓＧｆｓａａｕａｃｕｇｕｃＣｆｃＵｆｕｕｕａａｇｃｓａｓａ ３’（配列番号７４９）を含むＡＤ−６９５３５である。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の配列：
センス：５’ｇｓｃｓｕｕａａａａＧｆｇＧｆａｃａｇｕ（Ａｇｎ）ｕｕｃａ ３’（配列番号７４４）
アンチセンス：５’ｕｓＧｆｓａａｕａｃｕｇｕｃＣｆｃＵｆｕｕｕａａｇｃｓａｓａ ３’（配列番号７５５）を含むＡＤ−６９５４１である。
特定の実施形態において、本発明はまた、修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物も提供し、この薬剤は、細胞におけるＡＰＯＣ３の発現の阻害能を有し、かつ表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３のいずれか１つに列挙される配列の群から選択されるセンス配列と相補的な配列を含み、このポリヌクレオチドは約１４〜約３０ヌクレオチド長である。
一部の態様において、本発明はまた、本明細書に記載されるとおりの二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有するベクターも提供する。他の態様において、本発明はまた、本明細書に記載されるとおりの二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する細胞も提供する。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの二本鎖ＲＮＡｉ剤、または修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、またはベクターを含む医薬組成物に関する。
特定の態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は非緩衝液中に存在する。さらなる態様において、非緩衝液は生理食塩水または水である。他の態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は緩衝液中に存在する。さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む。具体的な実施形態において、緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
一実施形態において、本発明はまた、細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）発現を阻害する方法も提供し、この方法は、
（ａ）細胞を、本明細書に記載されるとおりの二本鎖ＲＮＡｉ剤、または修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、ベクター、または医薬組成物と接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で生じた細胞を、ＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって維持し、それによって細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するステップとを含む。
一態様において、細胞は対象の体内にある。さらなる態様において、対象はヒトまたはウサギである。一実施形態において、対象はＡＰＯＣ３関連疾患に罹患している。
一部の実施形態において、ＡＰＯＣ３発現は、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約１００％阻害される。
一部の態様において、本発明は、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）関連疾患を有する対象を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりの二本鎖ＲＮＡｉ剤、または修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、またはベクター、または医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって前記対象を治療するステップを含む。
一実施形態において、ＡＰＯＣ３関連疾患は高トリグリセリド血症である。別の実施形態において、ＡＰＯＣ３関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）、高血圧症、アテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）および膵炎からなる群から選択される。
一部の態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。さらなる態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。別の態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。さらに別の態様において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は皮下投与される。別の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は静脈内投与される。別の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は筋肉内投与される。
一部の態様において、ＲＮＡｉ剤は２用量以上で投与される。さらなる態様において、ＲＮＡｉ剤は、約１２時間に１回、約２４時間に１回、約４８時間に１回、約７２時間に１回、および約９６時間に１回からなる群から選択される間隔で投与される。
特定の実施形態において、本発明の方法は、対象に追加的な療法剤を投与するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、追加的な療法剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、フィブラート、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、抗血小板剤、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害薬、コレステロール吸収阻害薬、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害薬、コレステロールモジュレーター、胆汁酸モジュレーター、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、遺伝子ベース療法、複合血管保護剤、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害薬、アスピリンまたはアスピリン様化合物、ＩＢＡＴ阻害薬、スクアレンシンターゼ阻害薬、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−Ｉ阻害薬、または魚油からなる群から選択される。
指示される本発明のｉＲＮＡの０．１ｎＭまたは１０ｍＭの単回用量で処置した後のＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの相対量を示す棒グラフである。 ３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ用量のＧａｌＮａｃ共役ＡＤ−５７５５８で治療した野生型マウスにおいて５日目に計測されたＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの相対量を示す棒グラフである。 ＡＤ−５７５５３、ＡＤ−５７５４７およびＡＤ−５８９２４を注射した個々のＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡレベルの計測値を示す棒グラフである。 ＡＤ−５７５５３、ＡＤ−５７５４７およびＡＤ−５８９２４を注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡレベルの群平均を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射し、続いて１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−５７５５３を注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの相対量を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射し、続いて１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−５７５５３を注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの相対量の群平均を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて３ｍｇ／ｋｇ用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測された血清ＡＰＯＣ３タンパク質の２０日間の経時変化を示すグラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて３ｍｇ／ｋｇ用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測された血清ＡＰＯＣ３タンパク質の３０日間の経時変化を示すグラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて３ｍｇ／ｋｇ用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて１０日目に計測された血清ＡＰＯＣ３タンパク質の量を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて３ｍｇ／ｋｇ用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて２０日目に計測された血清ＡＰＯＣ３タンパク質の量を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて３ｍｇ／ｋｇ用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３タンパク質の量を示す経時変化である。 ＡＤ−５７５５３、ＡＤ−６５６９６、ＡＤ−６５６９９、ＡＤ−６５７０３およびＡＤ−６５７０４による複数用量試験に使用した投薬スケジュールＱ２Ｗ×４を示す概略図である。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて図１１に示す投薬スケジュールに従い投与した４回の０．３ｍｇ／ｋｇ用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３タンパク質の量を示す経時変化である。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて図１１に示す投薬スケジュールに従い投与した４回の１ｍｇ／ｋｇ用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３タンパク質の量を示す経時変化である。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて図１１に示す投薬スケジュールに従い投与した４回の３ｍｇ／ｋｇ用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３タンパク質の量を示す経時変化である。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて単回用量の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５７０４を注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて１４日目に計測されたＡＰＯＣ３タンパク質の相対量を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて図１１に示す投薬スケジュールに従い投与した、複数用量の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５７０４を注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて最終用量後２０日に計測されたＡＰＯＣ３タンパク質の相対量を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて１ｍｇ／ｋｇ用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３タンパク質の量を示す経時変化である。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて１ｍｇ／ｋｇ単回用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて１０日目に計測されたＡＰＯＣ３タンパク質の相対量を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて１ｍｇ／ｋｇ単回用量の指示される本発明のｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて２４日目に計測されたＡＰＯＣ３タンパク質の相対量を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて単回１ｍｇ／ｋｇ用量の指示されるｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて１４日目に計測された血清ＡＰＯＣ３タンパク質の相対量を示す棒グラフである。 １０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射し、続いて単回１ｍｇ／ｋｇ用量の指示されるｉＲＮＡを注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測された投与前レベルに対する０、１４、２８、および４２日目の血清ＡＰＯＣ３タンパク質の量を示すグラフである。 ８週間にわたるＡＤ−６５７０４の単回１ｍｇ／ｋｇ週用量（ＱＷ×８）後のカニクイザルにおいて１、８、１１、１５、２２、２９、３６、４３、５７、６４、および７１日目に計測された血清ＡＰＯＣ３タンパク質を−７日目における投与前と比べた量を示すグラフである。 ＡＤ−６５７０４の単回１ｍｇ／ｋｇ用量後のカニクイザルにおいて１、８、１１、１５、２２、２９、および３６日目に計測された血清ＡＰＯＣ３タンパク質を−７日目における投与前と比べた量を示すグラフである。 ５週間にわたるＡＤ−６５７０４の単回１ｍｇ／ｋｇ週用量（ｑ１ｗ×５）後のカニクイザルにおける６４日目の肝臓ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡを−７日目における投与前と比べた量、およびＡＤ−６５７０４の単回１ｍｇ／ｋｇ用量後のカニクイザルにおける１２日目の肝臓ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡを−７日目における投与前と比べた量を示すグラフである。 指示されるｉＲＮＡの単回１ｍｇ／ｋｇ用量後のカニクイザルにおいて１、８、１１、１５、２２、２９、および３６日目に計測された血清ＡＰＯＣ３タンパク質を−７日目における投与前と比べた量を示すグラフである。 指示されるｉＲＮＡの単回１ｍｇ／ｋｇ用量後のカニクイザルにおいて１２日目に計測された肝臓ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡを−７日目における投与前と比べた量を示す棒グラフである。 指示されるｉＲＮＡの単回１ｍｇ／ｋｇ用量および続く３６日目における同じ薬剤の単回皮下３ｍｇ／ｋｇ用量の投与後のカニクイザルにおいて１、８、１１、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７、６４、および７１日目に計測された血清ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡを−７日目における投与前と比べた量を示すグラフである。 １日目の指示されるｉＲＮＡの単回１ｍｇ／ｋｇ用量と、続く３６日目の同じｉＲＮＡ剤の単回３ｍｇ／ｋｇ用量後のカニクイザルにおいて１２日目に計測された肝臓ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡを−７日目における投与前と比べた量を示す棒グラフである。
本発明は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を低減または阻害するｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、および組成物を提供する。この遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象の体内にある細胞内にあり得る。
本発明はまた、ＡＰＯＣ３の発現の阻害または低減から利益を受け得る障害、例えば高トリグリセリド血症などのアポリポタンパク質Ｃ３関連疾患または障害を有する対象を、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害または低減するｉＲＮＡ組成物を使用して治療する方法も提供する。
本発明のｉＲＮＡは、約３０ヌクレオチド長以下、例えば、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２ヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域は、ＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。これらのｉＲＮＡを使用すると、細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡを標的化して分解することが可能になる。詳細には、極めて低い投薬量の本発明のｉＲＮＡがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を特異的かつ効率的に媒介することができ、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の有意な阻害をもたらし得る。本発明者らは、インビトロおよびインビボアッセイを使用して、ＡＰＯＣ３遺伝子を標的化するｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介し、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の有意な阻害およびＡＰＯＣ３タンパク質レベルの低下をもたらし得ることを実証している。本発明者らはまた、ＡＰＯＣ３遺伝子を標的化するｉＲＮＡが、アポリポタンパク質Ｃ３関連障害に伴う症状を低減し得る、例えばトリグリセリドレベルを低下させ得ることも実証している。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、高トリグリセリド血症などのアポリポタンパク質Ｃ３関連障害（ｄｉｓｏｅｒｄｅｒ）を有する対象の治療に有用である。
以下の詳細な説明は、ｉＲＮＡを含有する組成物をどのように作製および使用してＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するか、ならびにＡＰＯＣ３の発現の阻害および／または低減から利益を受け得る疾患および障害を有する対象を治療するための組成物、使用、および方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。これに加えて、パラメータの値または値範囲が列挙される場合は常に、列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図されることに留意すべきである。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として「因子（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの因子、または例えば複数の因子などの２つ以上の因子を意味する。
「含む」という用語は、本明細書では、「をはじめとするが、これに限定されるものではない」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
「または」という用語は、本明細書では、文脈上、明確に別の意味でない限り、「および／または」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
本明細書で使用されるとき、用語「ＡＰＯＣ３」は、アポリポタンパク質Ｃ３をコードする周知の遺伝子、ならびに当該技術分野においてＨＡＬＰ２またはＡＰＯＣＩＩＩとしても知られるそのタンパク質産物を指す。
用語「ＡＰＯＣ３」には、ヒトＡＰＯＣ３（そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：４５５７３２２（ＮＭ＿００００４０．１；配列番号１）を参照し得る）；マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＡＰＯＣ３（そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５４４４８９９５９（ＸＭ＿０５５７９７３０．１、配列番号３）を参照し得る）；マカカ・ムラタ（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＡＰＯＣ３（そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：２９７２６９２６０（ＸＭ＿００１０９０３１２．２；配列番号５）を参照し得る）；マウス（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））ＡＰＯＣ３（そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５７７０１９５５５（ＮＭ＿０２３１１４．４、配列番号７）を参照し得る）；ラット（ラッツス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ＡＰＯＣ３（そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：４０２５３４５４５（ＮＭ＿０１２５０１．２、配列番号９）を参照し得る）；およびウサギ（オリクトラグス・クニクルス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ））、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：６５５６０１４９８（ＸＭ＿００２７０８３７１．２、配列番号１１）が含まれる。
ＡＰＯＣ３ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、およびマカク属（Ｍａｃａｃａ）ゲノムプロジェクトウェブサイトなどで容易に利用可能である。
用語「ＡＰＯＣ３」は、本明細書で使用されるとき、ＡＰＯＣ３遺伝子の一塩基変異多型（ＳＮＰ）など、ＡＰＯＣ３遺伝子の天然に存在するＤＮＡ配列変異もまた指す。ＡＰＯＣ３ ＤＮＡ配列の例示的なＳＮＰは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰ／において利用可能なｄｂＳＮＰデータベースで参照し得る。ＡＰＯＣ３遺伝子内の配列変異の非限定的な例として、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６２（１２）：１０８２−１０８９（この内容は全て、参照により本明細書に援用される）に記載される２つの変異ｒｓ２８５４１１６およびｒｓ２８５４１１７が挙げられる。
本明細書の用法では、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡをはじめとする、ＡＰＯＣ３遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。一実施形態では、配列の標的部分は、ＡＰＯＣ３遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近辺における、ｉＲＮＡ指向切断のための基質としての役割を果たすのに、少なくとも十分長い。
標的配列は、例えば約１５〜３０ヌクレオチド長などの約９〜３６ヌクレオチド長であってもよい。例えば、標的配列は、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２ヌクレオチドなど、約１５〜３０ヌクレオチド長であり得る。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
本明細書の用法では、「配列を含む鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して、言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含む、オリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、通常、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される（例えば表３を参照されたい）。当業者は、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをその他の部分で置き換え得ることを十分承知している。制限を意図しない例として、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがってウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換え得る。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得て、標的ｍＲＮＡとＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に適する。
「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、本明細書定義で定義されるＲＮＡを含有して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じたＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。ｉＲＮＡは、例えば哺乳類対象などの対象内の細胞などの細胞内で、ＡＰＯＣ３発現を調節し、例えば阻害する。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えばＡＰＯＣ３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用する一本鎖ＲＮＡを含み、標的ＲＮＡの切断を誘導する。理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーがこれらのｄｓＲＮＡをプロセシングすると、特有の２塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡになる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。これらのｓｉＲＮＡは、次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖をほどき、相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様において本発明は、細胞内で生成される、かつＲＩＳＣ複合体の形成を促進して標的遺伝子、すなわちＡＰＯＣ３遺伝子のサイレンシングを生じさせる一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖）に関する。したがって、用語「ｓｉＲＮＡ」はまた、本明細書では、上記に記載したとおりのＲＮＡｉも指して使用される。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、細胞または生物体内に導入されて標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖ＲＮＡであってもよい。一本鎖ＲＮＡｉ剤はＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ、アルゴノート２に結合し、次にこれが標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは概して１５〜３０ヌクレオチドであり、化学修飾されている。一本鎖ＲＮＡの設計および試験については、米国特許第８，１０１，３４８号明細書およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３−８９４（その各々の内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に援用される）に記載されている。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれも、本明細書に記載されるとおりの一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３−８９４に記載される方法によって化学修飾されたものとして使用し得る。
別の実施形態において、本発明の組成物、使用、および方法において用いられる「ｉＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡであり、本明細書では、「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、「ＲＮＡｉ剤」、「ＲＮＡｉ」、または「ｄｓＲＮＡ」と称される。用語「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡ、すなわちＡＰＯＣ３遺伝子に対して「センス」および「アンチセンス」方向を有すると称される、２つの逆平行の、かつ実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明の一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機構を介した標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの分解を引き起こす。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大多数はリボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載されるとおり、各々または両方の鎖がまた、１つ以上の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得る；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドに実質的な修飾を含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合、および／または修飾核酸塩基を独立に有するヌクレオチドを指す。したがって、用語の修飾ヌクレオチドには、ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基に対する例えば官能基または原子の置換、付加または除去が包含される。本発明の薬剤中での使用に好適な修飾には、本明細書に開示される、または当該技術分野において公知のあらゆる種類の修飾が含まれる。いずれのかかる修飾も、ｓｉＲＮＡ型分子において用いられるとき、本明細書および特許請求の範囲の目的上「ＲＮＡｉ剤」に包含される。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた所望の標的ＲＮＡ特異的分解を可能にするあらゆる長さであってもよく、約９〜３６塩基対長さなどの範囲であってもよく、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対長さなどの約１５〜３０塩基対長さ、例えば約１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２塩基対長さなどである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、より大型のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大型の分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間が中断されていないヌクレオチド鎖によって結合される場合、結合ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得て；いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含み得る。
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は共有結合的に連結され得るが、必ずしもそうである必要はない。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なるヌクレオチド数を有してもよい。最大塩基対数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖中のヌクレオチド数から、二本鎖中に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤はｄｓＲＮＡであり、その各鎖が、標的ＲＮＡ配列、例えばＡＰＯＣ３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用する２０〜３０ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡの切断を誘導する。理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーがｄｓＲＮＡをプロセシングすると、特有の２塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡになる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。これらのｓｉＲＮＡは、次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖をほどき、相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えばｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びる、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得て；代案としては、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つ以上のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせの上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１〜１０ヌクレオチドを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１〜１０ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
「平滑末端化する」または「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の当該の末端に、対になっていないヌクレオチドがない、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」ＲＮＡｉ剤は、その全長にわたって二本鎖である、すなわち分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一端にヌクレオチドオーバーハングを有するか（すなわち、１つのオーバーハングと１つの平滑末端とを有する薬剤）、または両端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、例えばＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡなどの標的配列と実質的に相補的な領域を含む、ｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡ鎖を指す。本明細書の用法では、「領域相補性」という用語は、例えば本明細書で定義されるようなＡＰＯＣ３ヌクレオチド配列のような標的配列などの配列と実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、分子の内部または末端領域にミスマッチがあり得る。一般に、最も耐容されるミスマッチは、例えばｉＲＮＡの５’および／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド内などの末端領域にある。
「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む、ｉＲＮＡ鎖を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「切断領域」は、切断部位に直ちに隣接して位置する領域を指す。切断部位は、標的上で切断が起こる部位である。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位の両側の、かつそれに直ちに隣接した３塩基を含む。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位の両側の、かつそれに直ちに隣接した２塩基を含む。一部の実施形態において、切断部位はアンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１が結合する部位に特異的に存在し、切断領域はヌクレオチド１１、１２および１３を含む。
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解されるであろうように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を生成する能力を指す。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であり得て、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４の４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間と、それに続く洗浄が挙げられる（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件の組を判定することができる。
例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補配列は、片方または双方のヌクレオチド配列全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし本明細書で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは最大で３０塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、例えばＲＩＳＣ経路を通じた遺伝子発現の阻害などのそれらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、１つまたは複数であるが概して５、４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含み、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的では、なおも「完全に相補的」と称される。
「相補的」配列は、本明細書の用法ではまた、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間の、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列間の塩基整合に関して使用し得る。
本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えばＡＰＯＣ３をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えばポリヌクレオチドは、配列が、ＡＰＯＣ３をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的であれば、ＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
したがって、一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＡＰＯＣ３配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるセンス鎖ポリヌクレオチドおよび／またはアンチセンスポリヌクレオチドは標的ＡＰＯＣ３配列と実質的に相補的であり、配列番号１〜１２のいずれか１つのヌクレオチド配列の等価な領域とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列、または配列番号１〜１２のいずれか１つの断片を含む。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＡＰＯＣ３配列と相補的なアンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的なセンス鎖を含み、ここでこのセンス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号１〜１２のいずれか１つのヌクレオチド配列の等価な領域とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列、または配列番号１〜１２のいずれか１つの断片を含む。別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＡＰＯＣ３配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖を含み、配列番号１〜１２のいずれか１つのヌクレオチド配列の等価な領域とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列、または配列番号１〜１２のいずれか１つの断片を含む。
一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載されるように、片方または双方の鎖はまた、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドなどの１つまたは複数の非リボヌクレオチドも含み得る。さらに「ｉＲＮＡ」としては、化学修飾のあるリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾としては、本明細書で開示され、または当該技術分野で公知の全てのタイプの修飾が挙げられる。本明細書および特許請求の目的で、あらゆるこのような修飾は、ｉＲＮＡ分子における用法では「ｉＲＮＡ」に包含される。
本発明の一態様において、本発明の方法および組成物に使用される薬剤は、アンチセンス阻害機構によって標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンス核酸分子である。一本鎖アンチセンス核酸分子は標的ｍＲＮＡ内の配列と相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡとの塩基対合および翻訳機構の物理的な妨害によって化学量論的に翻訳を阻害し得る（Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７−３５５を参照）。一本鎖アンチセンス核酸分子は約１５〜約３０ヌクレオチド長であってもよく、標的配列と相補的な配列を有し得る。例えば、一本鎖アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか１つからの少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続ヌクレオチドである配列を含み得る。
本明細書の用法では、「対象」は、霊長類（ヒト、例えばサルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類など）、非霊長類（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラなど）をはじめとする哺乳類、または鳥類（例えばアヒルまたはガチョウ）などの動物である。一実施形態では、対象は、ＡＰＯＣ３発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を治療されまたは評価されるヒト；ＡＰＯＣ３発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状のリスクがあるヒト；ＡＰＯＣ３発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を有するヒト；および／または本明細書に記載されるようにＡＰＯＣ３発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を治療されるヒトなどのヒトである。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」または「治療」は、望ましくないまたは過剰なＡＰＯＣ３発現に関連する１つ以上の症状、例えば高トリグリセリド血症（または高トリグリセリドレベル）の、限定はされないが軽減または改善を含めた、有益なまたは所望の結果を指す。かかる症状には、例えば、皮膚症状（例えば、発疹性黄色腫）；眼異常（例えば、網膜脂血症）；肝脾腫（肝臓および脾臓の肥大）；神経症状；または膵炎の軽度のエピソードであり得る腹痛発作が含まれ得る。望ましくないまたは過剰なＡＰＯＣ３発現に関連する他の症状にはまた、高トリグリセリド血症によって引き起こされ得るか、それに関連し得るか、またはそれの結果であり得る疾患、障害または病態、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）、アテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、心血管疾患または膵炎の任意の症状も含まれ得る。「治療」はまた、治療がない場合に予想される生存と比較したときの生存の延長も意味し得る。
対象のＡＰＯＣ３レベルまたは疾患マーカもしくは症状の文脈で、用語「より低い」は、かかるレベルの統計学的に有意な低下を指す。この低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上であってもよく、好ましくはかかる障害を有しない個体の正常範囲内として認められているレベルまで下がる。
本明細書で使用されるとき、「予防」または「予防する」は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の低減によって治療または改善し得る疾患、障害またはその病態に関連して使用されるとき、対象がかかる疾患、障害、または病態に関連する症状、例えば高トリグリセリド血症などの望ましくないまたは過剰なＡＰＯＣ３発現の症状を発症する可能性の低減を指す。例えば高トリグリセリド血症を発症する可能性は、例えば、高トリグリセリド血症の１つ以上のリスク要因を有する個体が高トリグリセリド血症を発症しないか、あるいは同じリスク要因を有しかつ本明細書に記載されるとおりの治療を受けていない集団と比べて低い重症度で高トリグリセリド血症を発症するとき、低減される。疾患、障害または病態を発症しないこと、またはかかる疾患、障害または病態に関連する症状の発症が（例えば、当該の疾患または障害について臨床的に認められている尺度で少なくとも約１０％）低減されること、または症状の（例えば、数日、数週間、数ヵ月または数年の）遅延を呈することは、有効な予防と見なされる。
本明細書で使用されるとき、用語「アポリポタンパク質Ｃ３関連疾患」または「ＡＰＯＣ３関連疾患」は、望ましくないまたは過剰なＡＰＯＣ３発現によって引き起こされるか、またはそれに関連する疾患、障害または病態である。用語「ＡＰＯＣ３関連疾患」には、ＡＰＯＣ３発現の低減によって治療または改善し得る疾患、障害または病態が含まれる。用語「ＡＰＯＣ３関連疾患」には、高トリグリセリド血症、または高トリグリセリドレベルが含まれる。
高トリグリセリド血症の徴候があり得る対象、例えばヒト対象の血清中のトリグリセリドレベルについては、Ｏｈ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，７５（９）：１３６６−１３７１に記載されている。具体的には、高トリグリセリド血症は、「境界域高血清トリグリセリドレベル」（すなわち、１５０〜１９９ｍｇ／ｄＬまたは１．７０〜２．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）；「高血清トリグリセリドレベル」（すなわち、２００〜４９９ｍｇ／ｄＬまたは２．２６〜５．６４ｍｍｏｌ／Ｌ）；または「超高トリグリセリドレベル」（すなわち、５００ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上（または５．６５ｍｍｏｌ／Ｌまたはそれ以上）に関連し得る。
一実施形態において、ＡＰＯＣ３関連疾患は原発性高トリグリセリド血症である。「原発性トリグリセリド血症（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）」は、環境的または遺伝的原因によって生じる（例えば、明らかな基礎疾患の結果）。原発性高トリグリセリド血症として特徴付けられる例示的疾患としては、限定はされないが、家族性乳び血症（高リポタンパク血症Ｉ型）、原発性混合型高脂血症（５型）、家族性高トリグリセリド血症（高リポタンパク血症４型）、家族性複合型高リポタンパク血症（２Ｂ型）および家族性異常βリポタンパク血症（高リポタンパク血症３型）が挙げられる。
別の実施形態において、ＡＰＯＣ３関連疾患は続発性高トリグリセリド血症である。「続発性トリグリセリド血症」は、他の基礎的障害および病態によって引き起こされるか、またはそれに関連する。かかる障害および／または病態としては、例えば、肥満症、メタボリックシンドローム、糖尿病、脂肪肝、アルコール摂取、腎疾患、妊娠、非アルコール性脂肪肝障害、甲状腺機能低下症、パラプロテイン血症（マクログロブリン血症における高ガンマグロブリン血症、骨髄腫、リンパ腫およびリンパ性白血病など）、自己免疫障害（全身性エリテマトーデスなど）、薬剤の服用（リトナビルおよびロピナビルを含む抗レトロウイルス薬、およびクロザピンおよびオランザピンを含む抗精神病薬療法など）が挙げられる（Ｇ．Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｃａｎａｄｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｊｏｕｒｎａｌ，１７６（８）：１１１３−１１２０を参照のこと）。
高トリグリセリド血症の原因となり得る任意の障害（例えば、続発性高トリグリセリド血症）または高トリグリセリド血症の結果であり得る任意の障害（例えば、原発性または続発性高トリグリセリド血症）が、用語「ＡＰＯＣ３関連疾患」に包含される。ＡＰＯＣ３関連疾患の非限定的な例としては、代謝障害、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）；高血圧症；心血管障害、例えばアテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）；および膵炎、例えば急性膵炎が挙げられる。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。一実施形態において、このｉＲＮＡ剤は、ＡＰＯＣ３関連疾患、例えば高トリグリセリド血症を有する対象、例えばヒトなどの哺乳動物の体内にある細胞など、細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は約３０ヌクレオチド長以下（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド長以下）である。ＡＰＯＣ３遺伝子を発現する細胞と接触すると、このｉＲＮＡはＡＰＯＣ３遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、またはトリＡＰＯＣ３遺伝子）の発現を、例えばＰＣＲまたは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法によるか、または例えばウエスタンブロッティング法またはフローサイトメトリー法を用いた、免疫蛍光分析によるなどのタンパク質ベースの方法によってアッセイしたとき、少なくとも約１０％阻害する。
ｄｓＲＮＡは相補的な２本のＲＮＡ鎖を含み、それらはその中でｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補領域として含有され得る。
一般に、二本鎖構造は、例えば１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２塩基対長さなどの１５〜３０塩基対長さである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
同様に、標的配列の相補性領域は、例えば１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２ヌクレオチド長など１５〜３０ヌクレオチド長である。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１５〜約２０ヌクレオチド長、または約２５〜約３０ヌクレオチド長である。一般にｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質の役割を果たすのに十分長い。例えば約２１〜２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡが、ダイサーの基質の役割を果たしてもよいことは、当該技術分野で周知である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわちＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質となるのに十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。
当業者は、例えば約１０〜３６、１１〜３６、１２〜３６、１３〜３６、１４〜３６、１５〜３６、９〜３５、１０〜３５、１１〜３５、１２〜３５、１３〜３５、１４〜３５、１５〜３５、９〜３４、１０〜３４、１１〜３４、１２〜３４、１３〜３４、１４〜３４、１５〜３４、９〜３３、１０〜３３、１１〜３３、１２〜３３、１３〜３３、１４〜３３、１５〜３３、９〜３２、１０〜３２、１１〜３２、１２〜３２、１３〜３２、１４〜３２、１５〜３２、９〜３１、１０〜３１、１１〜３１、１２〜３１、１３〜３２、１４〜３１、１５〜３１、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２塩基対などの約９〜３６塩基対の二本鎖領域などの二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要機能部分であることもまた認識するであろう。したがって一実施形態では、それが例えば、所望のＲＮＡを切断に標的化する１５〜３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる範囲内で、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡでない。別の実施形態では、ＡＰＯＣ３発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大型のｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、例えば１、２、３、または４ヌクレオチドなどの１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端相当物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせ上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察されるように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるものなどの自動ＤＮＡ合成機を使用して、当該技術分野で公知の標準法によって合成し得る。
本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階法を使用して調製されてもよい。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別々に調製される。次に、構成要素鎖がアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機または双方を使用して調製し得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製し得る利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または双方を使用して調製し得る。
一態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列とアンチセンス配列とを含む。センス鎖および対応するアンチセンス鎖は、各々、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３のいずれか１つに提供される配列の群から選択される。この態様において、これらの２つの配列の一方は、これらの２つの配列の他方と相補的であり、これらの配列の一方は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現で生じるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで一方のオリゴヌクレオチドは、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３のいずれか１つにおけるセンス鎖として記載され、および第２のオリゴヌクレオチドは、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３のいずれか１つにおけるセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は単一のオリゴヌクレオチドに含まれる。
表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３の配列の一部は修飾配列および／または共役配列として記載されるが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば本発明のｄｓＲＮＡは、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３に示される配列のいずれか１つであって、修飾されていない、共役されていない、および／またはそこに記載されるものとは別様に修飾および／または共役されているものを含み得ることは理解されるであろう。
当業者は、例えば２１塩基対などの約２０〜２３塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかし他の当業者らは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造もまた、同様に効果的であり得ることを見出している。（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４−１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２−２２６）。上述の実施形態では、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２および１３のいずれか１つで提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最低限２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。片方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けている、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２および１３のいずれか１つの配列の１つを有するより短い二本鎖が、上で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。したがって表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２および１３のいずれか１つの配列の１つに由来する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチドの配列を有して、ＡＰＯＣ３遺伝子発現を阻害する能力が、完全長配列を含むｄｓＲＮＡと、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％の以下異なるｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが意図される。
さらに表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２および１３のいずれか１つで提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に対する感受性が高いＡＰＯＣ３転写物中の部位を同定する。したがって本発明は、これらの配列の１つ内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書の用法では、ｉＲＮＡが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＡＰＯＣ３遺伝子中の選択配列に隣接する領域からの追加的なヌクレオチド配列と連結する、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２および１３のいずれか１つで提供される配列の１つからの約１５個の連続ヌクレオチドを含む。
標的配列は、一般に約１５〜３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的例として２１個のヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えばコンピュータシミュレーションによるものをはじめとする）配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチもまた取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスは、同定された配列の系統的合成、および（本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知のアッセイを使用した）至適に機能する配列を同定する試験と相まって、ｉＲＮＡ剤で標的化した場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定し得る。したがって例えば表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２および１３のいずれか１つ中で同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、連続的に「ウィンドウを歩行させる」ことにより、同等またはより良い阻害特性がある配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。
さらにヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、これらの作成された配列を試験することにより、例えば表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２および１３のいずれか１つ中で同定される、あらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で考察されるその他の修飾によって、発現阻害物質として分子をさらに最適化する（例えば血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など）ことで、このような最適化配列を調節し得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばＡＰＯＣ３遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤鎖では、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心的な１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの有効性の検討は、特にＡＰＯＣ３遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に、重要である。
ＩＩＩ．発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未変性であり、例えば当該技術分野で公知であり本明細書に記載される、化学修飾および／または結合を含まない。別の実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの発明のｉＲＮＡのＲＮＡを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本発明の特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。本発明の他の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」本発明のｉＲＮＡは、全てではないが、大部分が修飾されており、非修飾ヌクレオチドを５、４、３、２、または１個以下含み得る。
本発明の一部の態様では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾されており、ｉＲＮＡ剤は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを１０個以下含む（例えば、９個以下の２’−フルオロ修飾、８個以下の２’−フルオロ修飾、７個以下の２’−フルオロ修飾、６個以下の２’−フルオロ修飾、５個以下の２’−フルオロ修飾、４個以下の２’−フルオロ修飾、５個以下の２’−フルオロ修飾、４個以下の２’−フルオロ修飾、３個以下の２’−フルオロ修飾、または２個以下の２’−フルオロ修飾を含む）。例えば、一部の実施形態において、センス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを４個以下含む（例えば、３個以下の２’−フルオロ修飾、または２個以下の２’−フルオロ修飾を含む）。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを６個以下含む（例えば、５個以下の２’−フルオロ修飾、４個以下の２’−フルオロ修飾、４個以下の２’−フルオロ修飾、または２個以下の２’−フルオロ修飾を含む）。本発明の他の態様では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾されており、ｉＲＮＡ剤は、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを１０個以下含む（例えば、９個以下の２’−フルオロ修飾、８個以下の２’−フルオロ修飾、７個以下の２’−フルオロ修飾、６個以下の２’−フルオロ修飾、５個以下の２’−フルオロ修飾、４個以下の２’−フルオロ修飾、５個以下の２’−フルオロ修飾、４個以下の２’−フルオロ修飾、３個以下の２’−フルオロ修飾、または２個以下の２’−フルオロ修飾を含む）。
本発明で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって、合成および／または修飾し得る。例えば修飾としては、例えば５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）または３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；糖修飾（例えば２’位または４’位における）または糖置換；リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。いくつかの実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’−５’結合、それらの２’−５’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’−５’から５’−３’、または２’−５’から５’−２’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。
上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；米国特許第５，６２５，０５０号明細書；米国特許第６，０２８，１８８号明細書；米国特許第６，１２４，４４５号明細書；米国特許第６，１６０，１０９号明細書；米国特許第６，１６９，１７０号明細書；米国特許第６，１７２，２０９号明細書；米国特許第６、２３９，２６５号明細書；米国特許第６，２７７，６０３号明細書；米国特許第６，３２６，１９９号明細書；米国特許第６，３４６，６１４号明細書；米国特許第６，４４４，４２３号明細書；米国特許第６，５３１，５９０号明細書；米国特許第６，５３４，６３９号明細書；米国特許第６，６０８，０３５号明細書；米国特許第６，６８３，１６７号明細書；米国特許第６，８５８，７１５号明細書；米国特許第６，８６７，２９４号明細書；米国特許第６，８７８，８０５号明細書；米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有するその他のものが挙げられる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
別の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡ中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の双方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中では、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに本発明のｉＲＮＡ中で使用するのに適するＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載される。
本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡ、および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［天然リン酸ジエステル主鎖は−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、またはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１〜約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしてもまた知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、すなわちアルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’−ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。
その他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、デオキシ−チミン（ｄＴ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよびシトシン；６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５−ハロ、具体的には５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン；８−アザグアニンおよび８−アザアデニン；７−デアザグアニンおよび７−ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８で開示されるもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンをはじめとする、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６および０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用する、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第５，７５０，６９２号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ以上の二環式糖部分を含むように修飾されていてもよい。「二環式糖」は、２つの原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を結び付ける架橋を含む糖部分を有し、それによって二環式の環系を形成するヌクレオシドである。特定の実施形態において、架橋は糖環の４’−炭素と２’−炭素とを結び付ける。したがって、一部の実施形態において本発明の薬剤は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロックド核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を結び付けるさらなる架橋を含む修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。換言すれば、ＬＮＡは、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’末端構造コンホメーションにおいてリボースを有効に「ロック」する。ｓｉＲＮＡにロックド核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、かつオフターゲット効果が低下することが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５−３１９３）。本発明のポリヌクレオチドに使用される二環式ヌクレオシドの例としては、限定なしに、４’および２’リボシル環原子間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’−２’架橋を含む１つ以上の二環式ヌクレオシドを含む。かかる４’−２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも称される）および４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（およびその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’［式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、または保護基である］（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照）；および４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられる。前述の各々の内容は全て、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製について教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許出願公開としては、限定はされないが、以下：米国特許第６，２６８，４９０号明細書；米国特許第６，５２５，１９１号明細書；米国特許第６，６７０，４６１号明細書；米国特許第６，７７０，７４８号明細書；米国特許第６，７９４，４９９号明細書；米国特許第６，９９８，４８４号明細書；米国特許第７，０５３，２０７号明細書；米国特許第７，０３４，１３３号明細書；米国特許第７，０８４，１２５号明細書；米国特許第７，３９９，８４５号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；米国特許第７，５６９，６８６号明細書；米国特許第７，７４１，４５７号明細書；米国特許第８，０２２，１９３号明細書；米国特許第８，０３０，４６７号明細書；米国特許第８，２７８，４２５号明細書；米国特許第８，２７８，４２６号明細書；米国特許第８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；および米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書（その各々の内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
前述の二環式ヌクレオシドのいずれも、例えばα−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノースを含む１つ以上の立体化学的糖配置を有するように調製することができる（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ以上の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾されてもよい。本明細書で使用されるとき、「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−０−２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において「Ｓ−ｃＥｔ」と称されるＳ配置である。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上の「配座固定ヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素またはリボースのＣ３および−Ｃ５’炭素を結び付けるリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮはリボース環を安定した配置に固定し、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増加させる。リンカーは、酸素を安定性および親和性に関して最適な位置に置くのに十分な長さであり、リボース環のパッカリングが少なくなる。
上述のＣＲＮの幾つかの調製について教示する代表的な文献としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；および国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレット（これらの各々の内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの１つ以上はまた、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドも含み得る。「ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド」は、非環式２’−３’−ｓｅｃｏ−ヌクレオチドであり、「アンロックド核酸」（「ＵＮＡ」）修飾とも称される。
ＵＮＡの調製について教示する代表的な米国公報としては、限定はされないが、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；米国特許第２０１３／００１１９２２号明細書；および米国特許第２０１１／０３１３０２０号明細書（これらの各々の内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−０−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３”−リン酸、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが挙げられる。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットにある。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、２０１２年１１月１６日に出願された国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレット（この内容は全て、参照により本明細書に援用される）に開示されるとおりの化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書および国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレットに示されるとおり、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に、特に切断部位またはその近傍へと３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを１つ以上導入することにより、優れた結果が得られ得る。一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、他の場合には完全に修飾されていてもよい。これらのモチーフの導入は、存在する場合には、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の修飾パターンを分断する。ＲＮＡｉ剤は、任意選択で、例えばセンス鎖上でＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと共役してもよい。得られるＲＮＡｉ剤は優れた遺伝子サイレンシング活性を呈する。
より具体的には、意外にも、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖の切断部位またはその近傍における３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを１つ以上有するように二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を完全に修飾すると、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が優位に増強されたことが見出されている。
したがって、本発明は、インビボで標的遺伝子（すなわち、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）遺伝子）の発現の阻害能を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。このＲＮＡｉ剤はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は１２〜３０ヌクレオチド長であってもよい。例えば、各鎖は、１４〜３０ヌクレオチド長、１７〜３０ヌクレオチド長、２５〜３０ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、または２１〜２３ヌクレオチド長であってもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には、本明細書では「ＲＮＡｉ剤」とも称される二重鎖の二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉ剤の二重鎖領域は１２〜３０ヌクレオチド対長であってもよい。例えば、二重鎖領域は、１４〜３０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２７〜３０ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長、または２１〜２３ヌクレオチド対長であり得る。別の例において、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド長から選択される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、一方または両方の鎖の３’末端、５’末端、または両方の末端に１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド長、例えば、２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、または１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長い結果、または同じ長さの２本の鎖がずれている結果であり得る。オーバーハングは標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、またはオーバーハングは標的とする遺伝子配列と相補的であり得るか、または別の配列であり得る。第１および第２の鎖はまた、例えばヘアピンを形成するように追加的な塩基によるか、または他の非塩基リンカーによってつなぎ合わされてもよい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域にあるヌクレオチドは、各々独立して、限定はされないが、２’−糖修飾、例えば、２−Ｆ、２’−Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組み合わせを含めた、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端のオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、またはオーバーハングは標的とする遺伝子配列と相補的であり得るか、または別の配列であり得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の５’−または３’−オーバーハングはリン酸化されていてもよい。一部の実施形態において、１つまたは複数のオーバーハング領域は、間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで２つのヌクレオチドは同じであっても、または異なってもよい。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態において、この３’−オーバーハングはアンチセンス鎖に存在する。一実施形態において、この３’−オーバーハングはセンス鎖に存在する。
ＲＮＡｉ剤は、単一のオーバーハングのみを含有してもよく、これにより、その全体的な安定性に影響が及ぶことなくＲＮＡｉの干渉活性を強化し得る。例えば、この一本鎖オーバーハングはセンス鎖の３’末端端部に位置しても、あるいはアンチセンス鎖の３’末端端部に位置してもよい。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置するか、またはその逆の、平滑末端を有してもよい。概して、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑末端である。理論によって拘束されることを望むものではないが、非対称であるアンチセンス鎖の５’末端の平滑末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングは、ＲＩＳＣプロセスにロードするガイド鎖に有利である。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は１９ヌクレオチド長の両端ブラントマー（ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、ここでセンス鎖は、５’末端から７、８、９位の３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｆ修飾のモチーフを少なくとも１つ含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｏ−メチル修飾のモチーフを少なくとも１つ含有する。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は２０ヌクレオチド長の両端ブラントマーであり、ここでセンス鎖は、５’末端から８、９、１０位の３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｆ修飾のモチーフを少なくとも１つ含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチド上の２’−Ｏ−メチル修飾のモチーフを少なくとも１つ含有する。
さらに別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は２１ヌクレオチド長の両端ブラントマーであり、ここでセンス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｆ修飾のモチーフを少なくとも１つ含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｏ−メチル修飾のモチーフを少なくとも１つ含有する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は２１ヌクレオチドセンス鎖および２３ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｆ修飾のモチーフを少なくとも１つ含有し；アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｏ−メチル修飾のモチーフを少なくとも１つ含有し、ここではＲＮＡｉ剤の一方の端部が平滑末端であり、他方の端部が２ヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、この２ヌクレオチドオーバーハングはアンチセンス鎖の３’末端にある。
２ヌクレオチドオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端３ヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があってもよく、ここでこの３ヌクレオチドのうちの２つはオーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドに隣接した対合ヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、さらに、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方の末端３ヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含めた、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のあらゆるヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基が、独立に、２’−Ｏ−メチルまたは３’−フルオロによって例えば交互モチーフで修飾される。任意選択で、ＲＮＡｉ剤はリガンド（好ましくはＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、ここでセンス鎖は２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端ヌクレオチド（１位）を始端として第１の鎖の１〜２３位が少なくとも８リボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドを始端として、センス鎖の１〜２３位と対合する位置に少なくとも８リボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成する；ここでアンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と対合せず、および最大６連続３’末端ヌクレオチドがセンス鎖と対合せず、それによって１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成する；アンチセンス鎖の５’末端は１０〜３０連続ヌクレオチドを含み、これらはセンス鎖と対合せず、それによって１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成する；センス鎖およびアンチセンス鎖が最大の相補性となるように整列したとき、少なくともセンス鎖５’末端および３’末端ヌクレオチドはアンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、それによってセンス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二重鎖の領域を形成する；およびアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長さの少なくとも１９リボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的であり、哺乳類細胞にこの二本鎖核酸が導入されたとき標的遺伝子発現を低減する；およびセンス鎖は、３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｆ修飾のモチーフを少なくとも１つ含有し、ここでこれらのモチーフの少なくとも１つは切断部位またはその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近傍の３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｏ−メチル修飾のモチーフを少なくとも１つ含有する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、ここでＲＮＡｉ剤は、２５ヌクレオチド以上２９ヌクレオチド以下の長さを有する第１の鎖と、５’末端から１１、１２、１３位の３連続ヌクレオチド上の３つの２’−Ｏ−メチル修飾のモチーフを少なくとも１つ有する３０ヌクレオチド以下の長さを有する第２の鎖とを含み；ここで第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端とは平滑末端を形成し、第２の鎖はその３’末端で第１の鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、二重鎖領域は少なくとも２５ヌクレオチド長であり、および第２の鎖は第２の鎖長さの少なくとも１９ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、哺乳類細胞にこのＲＮＡｉ剤が導入されたとき標的遺伝子発現を低減し、およびＲＮＡｉ剤のダイサー切断は第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それによって哺乳動物における標的遺伝子の発現を低減する。任意選択で、ＲＮＡｉ剤はリガンドをさらに含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを少なくとも１つ含有し、これらのモチーフのうちの１つはセンス鎖の切断部位に存在する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖もまた、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを少なくとも１つ含有することができ、ここでこれらのモチーフのうちの１つはアンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。
１７〜２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有するＲＮＡｉ剤について、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には５’末端から約１０、１１および１２位にある。したがって３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；または１３、１４、１５位に存在し得る（カウントはアンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドから始めるか、またはカウントはアンチセンス鎖の二重鎖領域内における５’末端から１番目の対合ヌクレオチドから始める）。アンチセンス鎖の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二重鎖領域の長さによっても変化し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位にある３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを少なくとも１つ含有し得る；およびアンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近傍の３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを少なくとも１つ有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の３つのヌクレオチドの１つのモチーフが少なくとも１ヌクレオチドのオーバーラップを有する、すなわち、センス鎖内のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つがアンチセンス鎖内のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列し得る。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチド、または３つ全てのヌクレオチドがオーバーラップしてもよい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを２つ以上含有し得る。第１のモチーフは鎖の切断部位またはその近傍に存在してもよく、他のモチーフはウィング修飾であり得る。用語「ウィング修飾」は、本明細書では、同じ鎖の切断部位またはその近傍にあるモチーフから隔てられている鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウィング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、あるいは少なくとも１ヌクレオチド以上隔てられているかのいずれかである。モチーフが互いに直ちに隣接している場合、モチーフの化学は互いに異なり、モチーフが１ヌクレオチド以上隔てられている場合、それらの化学は同じまたは異なってもよい。２つ以上のウィング修飾が存在してもよい。例えば、２つのウィング修飾が存在する場合、各ウィング修飾は、切断部位またはその近傍にある第１のモチーフに対して片側に存在し得るか、またはリードモチーフの両側に存在し得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを２つ以上含有してもよく、それらのモチーフのうちの少なくとも１つは鎖の切断部位またはその近傍に存在し得る。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖上に存在し得るウィング修飾と同様に整列して１つ以上のウィング修飾も含有し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両方の末端における最初の１つまたは２つの末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両方の末端にある二重鎖領域内の最初の１つまたは２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、各々、少なくとも１つのウィング修飾を含有する場合、それらのウィング修飾は二重鎖領域の同じ末端に位置して、１、２または３ヌクレオチドのオーバーラップを有し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、各々、少なくとも２つのウィング修飾を含有する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々１つの鎖からの２つの修飾が二重鎖領域の一方の末端に位置して、１、２または３ヌクレオチドのオーバーラップを有する；各々１つの鎖からの２つの修飾が二重鎖領域の他方の末端に位置して、１、２または３ヌクレオチドのオーバーラップを有する；２つの修飾１つの鎖がリードモチーフの両側に位置して、二重鎖領域に１、２または３ヌクレオチドのオーバーラップを有するように整列してもよい。
一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含めた、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のあらゆるヌクレオチドが修飾されていてもよい。各ヌクレオチドは、非結合リン酸酸素および／または結合リン酸酸素の１つ以上の一方または両方の１つ以上の改変；リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの改変；「デホスホ」リンカーによるリン酸部分の大規模置換；天然に存在する塩基の修飾または置換；およびリボースリン酸骨格の置換または修飾を含み得る同じまたは異なる修飾によって修飾されていてもよい。
核酸はサブユニットのポリマーであるため、修飾の多くが、核酸内で繰り返される位置に存在し、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾である。場合によっては、修飾は核酸内の対象位置の全てに存在し得るが、多くの場合にそうではない。例として、修飾は３’または５’末端位置にのみ存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５、または１０ヌクレオチドに存在するのみであってもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方に存在し得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域にのみ存在してもよく、またはＲＮＡの一本鎖領域にのみ存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置にあるホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端に存在するのみであってもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５、または１０ヌクレオチドに存在するのみであってもよく、または二本鎖および一本鎖領域、特に末端に存在してもよい。１つまたは複数の５’末端がリン酸化されてもよい。
例えば安定性を増強するため、オーバーハングに特定の塩基を含めるか、または一本鎖オーバーハング、例えば５’または３’オーバーハング、または両方に修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドサロゲートを含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合もある。一部の実施形態において、３’または５’オーバーハング内のこれらの塩基の全てまたは一部が、例えば本明細書に記載される修飾によって修飾されていてもよい。修飾には、当該技術分野において公知の修飾、例えば核酸塩基のリボ糖の代わりに修飾されたデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）または２’−Ｏ−メチルの使用によるリボース糖の２’位における修飾、およびリン酸基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾の使用が含まれ得る。オーバーハングは標的配列と相同である必要はない。
一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、または２’−フルオロで修飾される。鎖は２つ以上の修飾を含有し得る。一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。
センス鎖およびアンチセンス鎖上には、少なくとも２つの異なる修飾が典型的には存在する。それらの２つの修飾は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾などであってもよい。
一実施形態において、Ｎａおよび／またはＮｂは交互パターンの修飾を含む。用語「交互モチーフ」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の修飾を有するモチーフであって、各修飾が一方の鎖の交互のヌクレオチド上に存在するものを指す。交互ヌクレオチドは、１つおきに１つのヌクレオチドまたは３つおきに１つのヌクレオチド、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、ＢおよびＣの各々がヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ．．．」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ．．．」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ．．．」等であり得る。
交互モチーフに含まれる修飾のタイプは同じであっても、または異なってもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々がヌクレオチド上の１つのタイプの修飾を表す場合、交互パターン、すなわち１つおきのヌクレオチド上の修飾は同じであってもよく、但しセンス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、「ＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＣＡＣＡＣ．．．」、「ＢＤＢＤＢＤ．．．」または「ＣＤＣＤＣＤ．．．」など、交互モチーフ内で幾つか可能性のある修飾から選択され得る。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、センス鎖上の交互モチーフの修飾パターンがアンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対してシフトしたものを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾された基がアンチセンス鎖のヌクレオチドの別様に修飾された基に対応するようなもの、およびその逆であり得る。例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖においてセンス鎖がアンチセンス鎖と対合しているとき、二重鎖領域内においてセンス鎖の交互モチーフは鎖の５’−３’に「ＡＢＡＢＡＢ」で始まってもよく、アンチセンス鎖の交互モチーフは鎖の５’−３’に「ＢＡＢＡＢＡ」で始まってもよい。別の例として、二重鎖領域内においてセンス鎖の交互モチーフは鎖の５’−３’に「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で始まってもよく、アンチセンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｅｓｅ ｓｔｒａｎｄ）の交互モチーフは鎖の５’−３’に「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で始まってもよく、したがってセンス鎖とアンチセンス鎖との間に修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトがある。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖上に２’−Ｏ−メチル修飾と２’−Ｆ修飾との交互モチーフのパターンを含み、これは、最初はアンチセンス鎖上の２’−Ｏ−メチル修飾と２’−Ｆ修飾との交互モチーフのパターンに対して最初はシフトを有し、すなわち、センス鎖上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖上の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対になる、およびその逆である。センス鎖の１位は２’−Ｆ修飾で始まってもよく、およびアンチセンス鎖の１位は２’−Ｏ−メチル修飾で始まってもよい。
センス鎖および／またはアンチセンス鎖に対して３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを１つ以上導入すると、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に存在する当初の修飾パターンが分断される。センスおよび／またはアンチセンス鎖に対して３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフを１つ以上導入することによるセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の修飾パターンのこの分断は、意外にも、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を増強する。
一実施形態において、これらの鎖のいずれかに対して３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフが導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含有する配列の部分は「．．．ＮａＹＹＹＮｂ．．．」［式中、「Ｙ」は３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、および「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接したヌクレオチドに対する、Ｙの修飾と異なる修飾を表し、およびＮａおよびＮｂは同じまたは異なる修飾であってもよい］である。あるいは、ウィング修飾が存在するときＮａおよび／またはＮｂは存在しても、または存在しなくてもよい。
ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖または両方の鎖の、その鎖の任意の位置にある任意のヌクレオチド上に存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のあらゆるヌクレオチドに存在し得る；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在し得る；またはセンス鎖またはアンチセンス鎖は、両方ともにヌクレオチド間結合修飾を交互パターンで含有し得る。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンはアンチセンス鎖と同じであっても、または異なってもよく、センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンに対してシフトを有してもよい。一実施形態において、二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔａｎｄｅｄ）ＲＮＡｉ剤は６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含有し得る。ヌクレオチド間結合修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端対合ヌクレオチドと連結するために作製されてもよい。例えば、少なくとも２、３、４つ、または全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を介して連結されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドをオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合があってもよい。例えば、末端３つのヌクレオチドの間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があってもよく、これらの３つのヌクレオチドのうちの２つがオーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドがオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端３ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端にあってもよい。
一実施形態において、２ヌクレオチドオーバーハングはアンチセンス鎖の３’末端にあり、末端３ヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり、ここでこれらの３つのヌクレオチドのうちの２つはオーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端３ヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、二重鎖内に標的とのミスマッチ、またはこれらの組み合わせを含む。ミスマッチ（ｍｉｓｔｍａｔｃｈ）はオーバーハング領域または二重鎖領域に存在し得る。塩基対は、解離または融解を促進するそれらの傾向に基づき順位付けされ得る（例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーに関する、最も単純な手法は、個々の対塩基毎に対を調べることであるが、しかし次の隣接または同様の分析もまた用いることができる）。解離の促進の観点では：Ａ：ＵがＧ：Ｃより好ましく；Ｇ：ＵがＧ：Ｃより好ましく；およびＩ：ＣがＧ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば非カノニカルなまたはカノニカル以外の対合（本明細書の他の部分に記載されるとおり）はカノニカルな（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；およびユニバーサル塩基を含む対合はカノニカル対合より好ましい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ、及びミスマッチ対、例えば非カノニカルなまたはカノニカル以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合の群から独立して選択される、アンチセンス鎖の二重鎖領域内における５’末端から最初の１、２、３、４、または５塩基対のうちの少なくとも１つを含み、二重鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進する。
一実施形態において、アンチセンス鎖の二重鎖領域内における５’末端から１位にあるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の二重鎖領域内における５’末端から最初の１、２または３塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の二重鎖領域内における５’末端から最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
別の実施形態において、センス鎖の３’末端のヌクレオチドはデオキシチミン（ｄＴ）である。別の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドはデオキシチミン（ｄＴ）である。一実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端にデオキシチミンヌクレオチドの短い配列、例えば２つのｄＴヌクレオチドがある。
一実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉ）
［式中：
ｉおよびｊは、各々独立して０または１であり；
ｐおよびｑは、各々独立して０〜６であり；
各Ｎａは、独立して、０〜２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは、独立して、０〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ここでＮｂとＹとは同じ修飾を有さず；および
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、各々独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す］によって表され得る。好ましくはＹＹＹは全て２’−Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態において、Ｎａおよび／またはＮｂは交互パターンの修飾を含む。
一実施形態において、ＹＹＹモチーフはセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が１７〜２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有するとき、ＹＹＹモチーフはセンス鎖の切断部位またはそれに近接して存在し得る（例えば：６、７、８、７、８、９、８、９、１０、９、１０、１１、１０、１１，１２または１１、１２、１３位に存在し得る）（カウントは５’末端から１番目のヌクレオチドから始める；または任意選択で、カウントは二重鎖領域内における５’末端から１番目の対合ヌクレオチドから始める）。
一実施形態において、ｉは１であり、かつｊは０であるか、またはｉは０であり、かつｊは１であるか、またはｉおよびｊの両方が１である。したがってセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｃ）；または
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｄ）
によって表すことができる。
センス鎖が式（Ｉｂ）によって表されるとき、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｃ）として表されるとき、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
センス鎖が式（Ｉｄ）として表されるとき、各Ｎｂは、独立して、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、ＹおよびＺの各々は互いに同じであっても、または異なってもよい。
他の実施形態において、ｉは０であり、かつｊは０であり、およびセンス鎖は、式：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉａ）
によって表され得る。
センス鎖が式（Ｉａ）によって表されるとき、各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩ）
［式中：
ｋおよびｌは、各々独立して０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、各々独立して０〜６であり；
各Ｎａ’は、独立して、０〜２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は、独立して、０〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ここでＮｂ’およびＹ’は同じ修飾を有さず；および
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す］によって表され得る。
一実施形態において、Ｎａ’および／またはＮｂ’は交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフはアンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が１７〜２３ヌクレオチド長の二重鎖領域を有するとき、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフはアンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；または１３、１４、１５位に存在し得る（カウントは５’末端から１番目のヌクレオチドから始める；または任意選択で、カウントは二重鎖領域内における５’末端から１番目の対合ヌクレオチドから始める）。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは１１、１２、１３位に存在する。
一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは全てが２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態において、ｋは１であり、かつｌは０であるか、またはｋは０であり、かつｌは１であるか、またはｋおよびｌは両方ともに１である。
したがってアンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；または
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｄ）
によって表され得る。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｂ）によって表されるとき、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｃ）として表されるとき、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｄ）として表されるとき、各Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。
他の実施形態において、ｋは０であり、かつｌは０であり、アンチセンス鎖は、式：
５’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’３’（Ｉａ）
によって表され得る。
アンチセンス鎖が式（ＩＩａ）として表されるとき、各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は互いに同じであっても、または異なってもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−ヒドロキシル、または２’−フルオロで修飾されてもよい。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、詳細には、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１ｎｔであるとき鎖の９、１０および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含有してもよく（カウントは５’末端から１番目のヌクレオチドから始めるか、または任意選択で、カウントは二重鎖領域内における５’末端から１番目の対合ヌクレオチドから始める）；およびＹは２’−Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二重鎖領域の反対側の末端にウィング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含有し得る；およびＸＸＸおよびＺＺＺは、各々独立して２’−ＯＭｅ修飾または２’−Ｆ修飾を表す。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、鎖の１１、１２、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有してもよく（カウントは５’末端から１番目のヌクレオチドから始めるか、または任意選択で、カウントは二重鎖領域内における５’末端から１番目の対合ヌクレオチドから始める）；およびＹ’は２’−Ｏ−メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の反対側の末端にウィング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含有し得る；およびＸ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して２’−ＯＭｅ修飾または２’−Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
したがって、本発明の方法に使用されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含むことができ、各鎖が１４〜３０ヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二重鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
［式中：
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立して０〜６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、０〜２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、０〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑ（この各々は存在することもまたは存在しないこともある）は、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；および
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す］
によって表される。
一実施形態において、ｉは０であり、かつｊは０であるか；またはｉは１であり、かつｊは０であるか；またはｉは０であり、かつｊは１であるか；またはｉおよびｊは両方ともに０であるか；またはｉおよびｊは両方ともに１である。別の実施形態において、ｋは０であり、かつｌは０であるか；またはｋは１であり、かつｌは０であるか；ｋは０であり、かつｌは１であるか；またはｋおよびｌは両方ともに０であるか；またはｋおよびｌは両方ともに１である。
ＲＮＡｉ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的組み合わせとしては、以下の式が挙げられる：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表されるとき、各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）によって表されるとき、各Ｎｂは、独立して、１〜１０、１〜７、１〜５または１〜４個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）として表されるとき、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）として表されるとき、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ、Ｎｂ’の各々は、独立して、交互パターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）におけるＸ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じであっても、または異なってもよい。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｙヌクレオチドのうちの少なくとも１つがＹ’ヌクレオチドのうちの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｙヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＹヌクレオチドの３つ全てが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｚヌクレオチドのうちの少なくとも１つがＺ’ヌクレオチドのうちの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＺヌクレオチドの３つ全てが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）として表されるとき、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも１つがＸ’ヌクレオチドのうちの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＸヌクレオチドの３つ全てが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
一実施形態において、Ｙヌクレオチド上の修飾はＹ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾はＺ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、および／またはＸヌクレオチド上の修飾はＸ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾である。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０および少なくとも１つのｎｐ’がホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されている。さらに別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０および少なくとも１つのｎｐ’がホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに連結され、およびセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体（以下に記載される）と共役する。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０および少なくとも１つのｎｐ’がホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、およびセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と共役する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表されるとき、Ｎａ修飾は２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０および少なくとも１つのｎｐ’がホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、およびセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体と共役する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二重鎖を含有する多量体であり、この二重鎖はリンカーによって連結されている。リンカーは切断可能または非切断可能であり得る。任意選択で、多量体はリガンドをさらに含む。二重鎖の各々は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化し得る；または二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位にある同じ遺伝子を標的化し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される３、４、５、６つまたはそれ以上の二重鎖を含有する多量体であり、この二重鎖はリンカーによって連結されている。リンカーは切断可能または非切断可能であり得る。任意選択で、多量体はリガンドをさらに含む。二重鎖の各々は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化し得る；または二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位にある同じ遺伝子を標的化し得る。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端、および３’末端の一方または両方で互いに連結され、任意選択でリガンドと共役する。この薬剤の各々は、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的化し得る；またはこの薬剤の各々は、２つの異なる標的部位にある同じ遺伝子を標的化し得る。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含有する少数のヌクレオチド、例えば２’−フルオロ修飾を含む１０個またはそれ以下のヌクレオチドを含有し得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含む１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０個のヌクレオチドを含有し得る。具体的な実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含む１０個のヌクレオチド、例えば、センス鎖に２’−フルオロ修飾を含む４個のヌクレオチドおよびアンチセンス鎖に２’−フルオロ修飾を含む６個のヌクレオチドを含有する。別の具体的な実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含む６個のヌクレオチド、例えば、センス鎖に２’−フルオロ修飾を含む４個のヌクレオチドおよびアンチセンス鎖に２’−フルオロ修飾を含む２個のヌクレオチドを含有する。
他の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含有する極少数のヌクレオチド、例えば２’−フルオロ修飾を含有する２個またはそれ以下のヌクレオチドを含有し得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含む２、１または０個のヌクレオチドを含有し得る。具体的な実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含む２個のヌクレオチド、例えば、センス鎖に２−フルオロ修飾を含む０個のヌクレオチドおよびアンチセンス鎖に２’−フルオロ修飾を含む２個のヌクレオチドを含有し得る。
様々な文献が、本発明の方法において使用し得る多量体ＲＮＡｉ剤について記載している。かかる文献としては、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレット（これらの各々の内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
以下にさらに詳細に記載するとおり、ＲＮＡｉ剤との１つ以上の炭水化物部分の共役を含有するＲＮＡｉ剤が、ＲＮＡｉ剤の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに付加され得る。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を別の部分、例えば、炭水化物リガンドが付加される非炭水化物（好ましくは環状）担体に置き換えることができる。サブユニットのリボース糖がこのように置き換えられたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書ではリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称される。環状担体は炭素環系であってもよく、すなわち全ての環原子が炭素原子であるか、または複素環系であってもよく、すなわち１つ以上の環原子がヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であってもよい。環状担体は単環系であってもよく、または２つ以上の環を含有して、例えば縮合環であってもよい。環状担体は完全飽和環系であってもよく、または１つ以上の二重結合を含有してもよい。
リガンドは担体を介してポリヌクレオチドに付加され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは２つの「骨格結合点」と、（ｉｉ）少なくとも１つの「テザリング結合点」とを含む。「骨格結合点」は、本明細書で使用されるとき、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般的に、骨格、例えばリボ核酸のリン酸骨格、または修飾リン酸骨格、例えば硫黄含有骨格への担体の組み込みに利用可能な、かつそれに好適な結合を指す。「テザリング結合点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択の部分を結び付ける環状担体の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子とは異なる）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であり得る。任意選択で、選択の部分は介在するテザリングによって環状担体に結び付けられる。したがって、環状担体は多くの場合に官能基、例えばアミノ基を含み、または一般的には、構成環への別の化学物質、例えばリガンドの組み込みまたはテザリングに好適な結合を提供することになる。
ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドと共役してもよく、ここで担体は、環式基または非環式基であり得る；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
特定の具体的な実施形態において、本発明の方法に使用されるＲＮＡｉ剤は、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３のいずれか１つに列挙される薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤はリガンドをさらに含み得る。
ＩＶ．リガンド共役ｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、１つまたは複数のリガンド、部分または複合体を、ＲＮＡに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）などの脂質部分；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）；例えばベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）などのチオエーテル；例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）などの脂肪族鎖；例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
リガンドは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。
リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓｅａｍｉｎｅ）多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えば肝臓細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化因子、またはＮＦ−κＢ活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態調節因子（ＰＫ調節因子）を指す。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが、知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態中で、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチドは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への付加から誘導されるものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって、合成してもよい（下述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、または付着する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に、そして慣例的に、周知の固相合成技術を通じて生成されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）をはじめとする、いくつかの供給業者によって販売される。それに加えて、または代案として、当該技術分野で公知のこのような合成のためのその他のあらゆる手段を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのその他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた知られている。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチド、およびリガンド分子を保有する配列特異的結合ヌクレオシド中では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を保有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既にリガンド分子を保有するリガンド−ヌクレオチドまたはヌクレオシド−複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを保有する基本単位を使用して、適切なＤＮＡ合成機上で組み立ててもよい。
既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次にリガンド分子が結合部分と反応されて、リガンド共役オリゴヌクレオチドが生成する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されて、慣例的にオリゴヌクレオチド合成で使用される、標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。
Ａ．脂質複合体
１つの実施形態では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばナプロキセンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
例えば複合体の標的組織への結合を制御するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、または肝臓細胞などの標的細胞に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα−らせん剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５〜５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２４）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２５））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２６））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２７））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ−ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。細胞標的化目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ作用物質に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを使用し得る。
本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）としては、Ｄ−アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が挙げられる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にするその他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ−１またはＶＥＧＦを標的にする。
「細胞透過性ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα−らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα−デフェンシン、β−デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸（例えばＰＲ−３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物複合体
本発明の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含む。炭水化物共役ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）を有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）をそれぞれ有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、ＡＧＴ以上（例えばＡＧＴ、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類が挙げられる（例えばＡＧＴ、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。
一実施形態において、本発明の組成物および方法に使用される炭水化物共役体は単糖である。一実施形態において、単糖は、
Figure 2017535552
 などのＮ−アセチルガラクトサミンである。
別の実施形態において、本発明の組成物および方法に使用される炭水化物共役体は、
Figure 2017535552
Figure 2017535552
Figure 2017535552
Figure 2017535552
Figure 2017535552
 からなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態に使用される別の代表的な炭水化物共役体には、限定はされないが、
Figure 2017535552
 （式ＸＸＩＩＩ）［ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である］が含まれる。
一部の実施形態において、炭水化物共役体は、限定はされないが、ＰＫ調節剤および／または細胞透過ペプチドなど、上記に記載したとおりの１つ以上の追加的なリガンドをさらに含む。
本発明での使用に好適なさらなる炭水化物共役体としては、国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレット（これらの各々の内容は全て、参照により本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。
Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。
「リンカー」または「連結基」という用語は、例えば化合物の２つの部分に共有結合するなどの、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合、または酸素またはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）などであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含み、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環（式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一実施形態では、リンカーは、約１〜２４個の原子、２〜２４個の原子、３〜２４個の原子、４〜２４個の原子、５〜２４個の原子、６〜２４個の原子、６〜１８個の原子、７〜１８個の原子、７〜１７この原子、８〜１７個の原子、６〜１６個の原子、７〜１６個の原子、または、８〜１６個の原子である。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中において、または第２の標準状態下（例えば血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍より迅速に切断される。
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１〜７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍より迅速に切断される。
ｉ．酸化還元切断可能連結基
１つの実施形態では、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。１つの候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含む。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｉｉ．酸切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含む。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ−ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｖ．エステルベースの連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含む。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｖ．ペプチドベースの切断基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含む。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡはリンカーを介して炭水化物に共役する。本発明の組成物および方法のリンカーを含むｉＲＮＡ炭水化物共役体の非限定的な例としては、限定はされないが、
Figure 2017535552
Figure 2017535552
Figure 2017535552
 ［ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である］が挙げられる。
本発明の組成物および方法の特定の実施形態において、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩＩ）〜（ＸＸＸＶ）：
Figure 2017535552
 ［式中：
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、独立して存在毎に０〜２０を表し、かつ繰り返し単位は同じであってもまたは異なってもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各々独立して存在毎に、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、独立して存在毎に、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで１つ以上のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ”）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つ以上によって中断または終端されてもよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各々独立して存在毎に、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2017535552
 またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表し；すなわち、各々独立して存在毎に、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し；およびＲａはＨまたはアミノ酸側鎖である］のいずれかに示される構造の群から選択される二価または三価の分枝リンカーに共役する。三価共役ＧａｌＮＡｃ誘導体が、式（ＸＸＸＶ）
Figure 2017535552
 ［式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５ＣはＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す］のものなど、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤での使用に特に有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体に共役する適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上で列挙された構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８および５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書、米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
所与の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、前述の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物もまた含む。
「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａｓ）」は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがってＲＮａｓｅ Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡによって、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、そして必要ならば当該技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣例的に検出し得る。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的な共役結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合する分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体精製は、典型的に純粋な複合体を与える。
Ｖ．発明のｉＲＮＡの送達
例えばヒト対象（例えばＡＰＯＣ３関連疾患を有する対象などのそれを必要とする対象）などの対象内の細胞などの細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。例えば送達は、試験管内または生体内のどちらかで、細胞を本発明のｉＲＮＡに接触させることで実施してもよい。生体内送達はまた、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含む組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。代案としては、生体内送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、下でさらに考察される。
一般に、（試験管内または生体内で）核酸分子を送達するあらゆる方法が、本発明のｉＲＮＡで使用するために適応させ得る（例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。生体内送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために検討すべき要素としては、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織中の送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織内への直接注射または移植または製剤を局所投与するなどの局所投与によって最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被り得る、または作用物質を分解し得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２−１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．， ｅｔ ａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）、ＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０；Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１−５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）、および鼻腔内投与による肺への（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、生体内エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えばＫｉｍ ＳＨ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７−１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出）、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、“ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８月１６日オンライン先行発表；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
ＡＰＯＣ３遺伝子標的化ｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．国際公開第００／２２１１３号パンフレット；Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号パンフレット；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモータによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合良い制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにするあらゆる別の手段などであり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入し得る。１週間以上の期間にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的化する、ｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数脂質形質移入もまた、本発明により検討される。ベクターの宿主細胞への成功裏の導入は、様々な既知の方法を使用してモニタし得る。例えば一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光性マーカなど、レポーターによって示し得る。生体外における細胞への安定した形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定環境要素（例えば抗生物質および薬剤）耐性を提供するマーカを使用して、確実にし得る。
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、所望ならば、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の態様は、以下にさらに詳しく記載する。
ｉＲＮＡを送達するのに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織中のｉＲＮＡの発現に十分な調節因子（プロモータ、エンハンサーなど）を含む。調節因子は、構成的または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択し得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば循環グルコースレベル、またはホルモンなどの特定の生理学的制御因子に感受性の誘導性制御配列を使用して、正確に調節し得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳類におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適するこのような誘導性発現系としては、例えばエクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、適切な調節／プロモータ配列を選択できる。
ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用し得る。例えばレトロウイルスベクターを使用し得る（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を容易にする、１つまたは複数のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターに関してより詳しくは、例えば化学療法により高い耐性を示す幹細胞を生成するために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）にある。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例証するその他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）である。使用が検討されるレンチウイルスベクターとしては、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；米国特許第５，６６５，５５７号明細書；および米国特許第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられる。
アデノウイルもまた、本発明のｉＲＮＡの送達で使用するために検討される。アデノウイルは、例えば気道上皮に遺伝子を送達するために、特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルは気道上皮に天然で感染して、軽症の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系その他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルは、非分裂細胞に感染できる利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子療法のレビューを提示する。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）は、遺伝子をアカゲザルの気道上皮に移入するための、アデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルの使用のその他の事例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；およびＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）にある。本発明で取り上げるｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターもまた、本発明のｉＲＮＡを送達するために使用され得る（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモータ、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータのいずれかを有する、組換えＡＡＶベクターからの２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げるｄｓＲＮＡを発現するのに適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載される。
本発明のｉＲＮＡを送達するのに好適な別のウイルスベクターは、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニアなどのワクシニアウイルス、鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスなどのポックスウイルスである。
ウイルスベクターの親和性は、必要に応じて、その他のウイルスからの外被タンパク質またはその他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることで、または異なるウイルスからのカプシドタンパク質で置換することで、修飾し得る。例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質によって、レンチウイルスベクターをシュードタイピングし得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを遺伝子操作して、異なるカプシドタンパク質血清型を発現させることで、異なる細胞を標的化するようにできる；例えばその開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照されたい。
ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中のベクターを含み得て、またはその中に遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放マトリックスを含み得る。代案としては、例えばレトロウイルスベクターなどの完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞から無傷で生成され得る場合、医薬品は遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。
ＶＩ．本発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤も含む。一実施形態において、本明細書には、本明細書に記載されるとおりのｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物が提供される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害の治療に有用である。かかる医薬組成物は送達方法に基づき製剤化される。一例は、例えば皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）送達による、非経口送達を介した全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ注入によるなどの脳への注入による、脳実質への直接送達用に製剤化される組成物である。本発明の医薬組成物は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与され得る。一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、レシピエントの体重１キログラム当たり１日約０．００１〜約２００．０ミリグラムの範囲、概して体重１キログラム当たり１日約１〜５０ｍｇの範囲となり得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回用量当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与してもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象には、約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなど、単回治療量のｉＲＮＡが、例えば皮下または静脈内投与され得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
一部の実施形態において、対象には、用量約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなど、治療量のｉＲＮＡの複数用量が、例えば皮下または静脈内投与される。複数用量レジメン（ｒｅｇｉｍｉｎｅ）は、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、またはそれ以上にわたるなどの、治療量のｉＲＮＡの毎日の投与を含み得る。
他の実施形態において、対象には、用量約０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２２５、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、０．９７５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなど、治療量のｉＲＮＡの反復用量が、例えば皮下または静脈内投与される。反復用量レジメン（ｒｅｇｉｍｉｎｅ）は、隔日、３日毎、４日毎、週２回、週１回、隔週、または月１回など、治療量のｉＲＮＡの定期的な投与を含み得る。
特定の実施形態において、例えば、本発明の組成物が本明細書に記載されるとおりのｄｓＲＮＡと脂質とを含む場合、対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇなど、治療量のｉＲＮＡが投与され得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
本発明の特定の実施形態において、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤が修飾（例えば、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフ）、例えば、薬剤の切断部位またはその近傍にある１つのかかるモチーフ、６つのホスホロチオエート結合、およびリガンドを含む場合、かかる薬剤は、約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。前述の列挙された値の中間の値および範囲もまた本発明の一部であることが意図され、例えば、ＲＮＡｉ剤は、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜約０．４５ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与され得る。
例えば、ＲＮＡｉ剤、例えば、医薬組成物中のＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。前述の列挙された値の中間の値もまた、本発明の一部であることが意図される。
医薬組成物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１、２２、２３、２４、または約２５分の時間にわたるなど、所定の時間にわたる静脈内注入によって投与することができる。投与は、例えば、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月またはそれ以上にわたって毎週、隔週（すなわち２週間毎）など、定期的に繰り返されてもよい。初期治療レジメンの後、治療はより低頻度で投与することができる。例えば、３ヵ月間にわたる毎週または隔週の投与後、投与は月１回、６ヵ月間または１年間またはそれ以上にわたって繰り返すことができる。
医薬組成物は、毎日１回投与し得て、またはｉＲＮＡは、一日を通して適切な間隔で、２、３回以上の部分用量として投与し得て、または持続注入または放出制御製剤を通じた送達さえも使用して、投与し得る。その場合、各部分用量に含有されるｉＲＮＡは、１日あたり総用量を達成するために、対応してより少量でなくてはならない。投薬単位はまた、例えば数日間にわたってｉＲＮＡの徐放を提供する、従来型の徐放性製剤を使用して、数日間にわたる送達のために配合し得る。徐放性製剤は当該技術分野で周知であり、特に、本発明の作用物質で使用し得る、特定部位への作用物質送達のために有用である。この実施形態では、投薬単位は、相当する複数の１日量を含有する。
別の実施形態では、医薬組成物の単回投与は、引き続く用量が、３、４、または５日間以下の間隔で、または１、２、３、または４週間以下の間隔で投与されるように、長期にわたり得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、週１回投与される。本発明の別の実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、月２回投与される。
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、および存在するその他の疾患をはじめとするが、これに限定されるものではない、特定の要因が、対象を効果的に治療するのに要求される用量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに治療有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量および生体内半減期は、本明細書の他の箇所で記載されるように、従来の手順を使用して、または適切な動物モデルを使用した生体内試験に基づいて、推定し得る。
本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所（例えば経皮パッチによる）、例えばネブライザーをはじめとする、粉末または煙霧剤の吸入または吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；例えば埋め込みデバイスを通じた真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば肝臓の実質細胞）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましい可能性もある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されることができ、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成することができる。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１〜２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩）が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。
Ａ．膜様分子アセンブリーを含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法で使用されるｉＲＮＡは、例えばリポソームまたはミセルなどの膜様分子アセンブリー内の送達のために調合し得る。本明細書の用法では、「リポソーム」という用語は、例えば１つの二重層または複数の二重層などの、少なくとも１つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層のまたは多重膜小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、典型的にｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては含んでもよい。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するので、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、ｉＲＮＡを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではｉＲＮＡが標的ＲＮＡに特異的に結合し得て、ｉＲＮＡを媒介し得る。場合によっては、リポソームもまた特異的に標的化され、例えばｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
ｉＲＮＡ剤を含有するリポソームは、多様な方法によって調製し得る。一例では、リポソームの脂質成分は、脂質成分なしでミセルが形成されるように、洗剤に溶解される。例えば脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得て、非イオン性であってもよい。例示的な洗剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次にｉＲＮＡ剤調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基はｉＲＮＡ剤と相互作用して、ｉＲＮＡ剤周囲で凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって洗剤を除去し、ｉＲＮＡ剤のリポソーム調製物を得る。
必要ならば、例えば凝縮を助ける担体化合物を、制御された添加によって縮合反応中に添加し得る。例えば担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えばスペルミンまたはスペルミジン）であり得る。ｐＨもまた調節して、凝縮を支援し得る。
送達ビヒクルの構造的構成要素としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む、安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成する方法は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットにさらに記載される。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の１つまたは複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用される適切なサイズの脂質凝集体を調製する一般に使用される技術としては、超音波処理、および凍結解凍と押出の組み合わせが挙げられる（例えばＭａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小型（５０〜２００ｎｍ）で比較的均一な凝集体が所望される場合は、顕微溶液化を使用し得る（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、リポソーム内のＲＮＡｉ剤調製品の詰め込みに容易に適応される。
リポソームは、２つの大まかなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合してエンドソーム内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂して、それらの内容物を細胞質内へ放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、核酸と複合体を形成せず、むしろそれを封入する。核酸と脂質は、どちらも同様の荷電を持つため、複合体形成ではなく反発が起きる。それでもなおいくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養中で、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を細胞単層に送達するのに使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
試験管内および生体内でリポソームを細胞内に導入するその他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系が研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚真皮内へシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を容易にする上で、効果的であることを示唆した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
リポソームはまた、「立体的安定化」リポソームを含み、この用語は本明細書の用法では、１つまたは複数の特殊化された脂質を含むリポソームを指し、それは、リポソーム中に組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、改善された循環寿命をもたらす。立体的安定化リポソームの例は、その中で、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含み、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論による拘束も望まないが、当該技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的安定化リポソームでは、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の改善は、細網内皮系（ＲＥＳ：ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ）細胞への取り込み低下に由来するものと考えられる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳しく説明された。どちらもＡｌｌｅｎらに付与された、米国特許第４，８３７，０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリンと、（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含む、リポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍら）で開示される。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれ、ｉＲＮＡ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームには、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込み得て；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化されたｉＲＮＡ剤を代謝および分解から保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）を使用して、小型リポソームを形成し得て、それは核酸と自然発生的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合できる脂質−核酸複合体を形成し、ｉＲＮＡ剤送達をもたらす（ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの併用の説明については、例えばＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７および米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
ＡＤＯＴＭＡ類似体である１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ錯化小胞を形成し得る。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、生体組織培養細胞に、高アニオン性核酸を送達するための効果的薬剤であり、それは負に帯電したポリヌクレオチドと自然発生的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームを使用すれば、得られる複合体上の正味電荷もまた正である。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然発生的に付着して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞内に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合でなくエステルによって結合することで、ＤＯＴＭＡと異なる。
その他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、２つの脂質タイプの１つと共役するカルボキシスペルミンをはじめとする、多様な部分と共役しているものが挙げられ、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
別のカチオン性脂質複合体は、ＤＯＰＥと組み合わされてリポソームに調合されているコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による、脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥに共役させて生成されるリポポリリジンが、血清存在下における形質移入に効果的であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞系では、共役するカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的な形質移入を提供すると言われている。その他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適したその他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号パンフレットおよび国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載される。
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームはその他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収に関連した副作用の低下、所望標的における投与薬剤の蓄積増大、およびｉＲＮＡ剤を皮膚内に投与する能力が挙げられる。いくつかの実装では、リポソームは、ｉＲＮＡ剤を表皮細胞に送達するのに、また例えば皮膚内などの皮膚組織内へのｉＲＮＡ剤の浸透を高めるのに使用される。例えばリポソームは、局所的に塗布し得る。リポソームとして調合された治療薬の皮膚への局所送達が、実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０およびｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５６：２６７−２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照されたい）。
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムが研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮内に薬剤を送達するのに使用された。ｉＲＮＡ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能にし得る。このような変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい孔を通り抜けて、リポソームが浸透できるようにし得る。例えばトランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、通常は界面活性剤である表面エッジ活性化剤を、標準リポソーム組成物に添加して、作成し得る。ｉＲＮＡ剤を含むトランスファーソームは、皮膚内のケラチノサイトにｉＲＮＡ剤を送達するために、例えば感染によって皮下送達し得る。無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。さらに脂質特性のために、これらのトランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、自己最適化し（例えば皮膚孔の形状に適応する）、自己修復し得て、断片化することなく頻繁にそれらの標的に到達し得て、自己装填することが多い。
本発明を適用できるその他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，０８７号明細書、および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，５２８号明細書に記載される。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号明細書もまた、本発明を適用できる製剤を記載する。
トランスファーソームはなおも別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるために、小滴よりも小さい孔を通じて容易に浸透できる脂肪滴と説明され得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応でき、例えばそれらは自己最適化し（皮膚孔形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化することなくそれらの標的に到達し、自己装填することが多い。トランスファーソームを作成するために、通常は界面活性剤である表面縁活性化剤を標準リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に、効果的であることが示されている。
界面活性剤には、（マイクロエマルションをはじめとする）エマルションおよびリポソームなどの製剤における、幅広い応用がある。天然および合成双方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ）の使用による。親水性基（「ヘッド」としてもまた知られている）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬および美容製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も良く見られる構成員である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最も良く使用される構成員である。
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
医薬品、製剤中およびエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本発明の方法で使用されるｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供し得る。「ミセル」は、その中で、分子の疎水性部分が全て内側を向き、親水性部分が周囲の水性相に接したままであるように、両親媒性分子が球状構造に配列される、特定タイプの分子アセンブリーと、本明細書で定義される。環境が疎水性であれば、逆の配置が存在する。
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル調合物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩、およびミセル形成化合物の水溶液を混合して、調製してもよい。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレアート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンとその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に、またはその後に添加してもよい。混合ミセルは、成分を実質的にどのように混合しても形成するが、より小型のミセルを提供するためには、激しく混合される。
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する、第１のミセル組成物が調製される。次に第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩、および少なくとも１つのミセル形成化合物を混合して調製され、激しい混合を伴う残りのミセル形成化合物の添加がそれに続く。
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、調合物を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。代案としては、ミセル形成成分と共に、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを添加してもよい。グリセリンなどの等張剤もまた、混合ミセル組成物形成後に添加してもよい。
ミセル調合物を噴霧として送達するためには、調合物を煙霧剤計量分配装置に入れて、計量分配装置に噴霧剤を装填し得る。加圧下にある噴霧剤は、計量分配装置内で液体形態である。成分の比率は、水性相と噴霧剤相が１つになるように、すなわち１つの相になるように調節される。２つの相がある場合、例えば定量バルブを通じて内容物の一部を分散する前に、計量分配装置を振盪する必要がある。医薬品の分注用量は、定量バルブから精微噴霧で噴射される。
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２ーテトラフルオロエタン）を使用してもよい。
必須成分の特定濃度は、比較的簡単な実験法によって判定し得る。口腔を通じた吸収のためには、注射を通じた用量、または胃腸管を通じた投与の例えば少なくとも２倍または３倍に増大させることが、往々にして望ましい。
Ｂ．脂質粒子
本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、脂質製剤、例えばＬＮＰ、または他の核酸−脂質粒子中に完全に封入されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「ＬＮＰ」は、安定した核酸−脂質粒子を指す。ＬＮＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質共役体）を包含する。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長い循環寿命を呈し、かつ遠位部位（例えば、投与部位と物理的に隔たった部位）に蓄積するため、全身適用に極めて有用である。ＬＮＰとしては、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載のカプセル化縮合剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。本発明の粒子は、典型的に約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的に約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的に約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的に約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均径を有して、実質的に無毒である。これに加えて、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸−脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットで開示される。
一実施形態では脂質と薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲である。上記に引用した範囲の中間にある範囲も、本発明の一部と考えられる。
カチオン性脂質は、例えばＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約５０モル％または約４０モル％を構成し得る。
別の実施形態では、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを使用して、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を作成し得る。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照によって本明細書に援用する、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載される。
一実施形態では、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モル百分率）を含み、粒度６３．０±２０ｎｍのおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７である。
イオン性／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ），ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物をはじめとすることができるが、これに限定されるものではない、アニオン性脂質または中性脂質とすることもできる。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
粒子凝集を阻害する共役結合脂質は、例えば制限なしに、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）をはじめとする、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、またはその混合物であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えばＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子凝集を妨げる共役結合脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％または約２モル％であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（その内容を参照によって本明細書に援用する、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわちＬＮＰ０１粒子）を作成し得る。エタノール中の各原液は、次のように調製し得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次にＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６の原液を例えば４２：４８：１０のモル比で合わせ得る。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５〜４５％で最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように、（例えばｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）水性ｄｓＲＮＡと混合し得る。脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的に、混合に際して自然発生的に形成する。所望の粒度分布次第で、結果として生じるナノ粒子混合物は、例えばＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネートメンブラン（例えば１００ｎｍカットオフ）を通じて押出し得る。場合によっては、押出ステップは省き得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４など、約ｐＨ７のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で交換し得る。
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ＬＮＰ０１製剤が、例えば、国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレット（本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
さらなる例示的脂質−ｄｓＲＮＡ製剤を表１に記載する。
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ＳＮＡＬＰ（１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年４月１５日に出願された、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載される。
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、参照によって本明細書に援用する、２００９年１月２９日に出願された米国仮出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日に出願された米国仮出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日に出願された米国仮出願第号明細書；２００９年７月２４日に出願された米国仮出願第６１／２２８，３７３号明細書；２００９年９月３日に出願された米国仮出願第６１／２３９，６８６号明細書、および２０１０年１月２９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書に記載される。
ＭＣ３を含む製剤は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年６月１０日に出願された、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書に記載される。
ＡＬＮＹ−１００含有製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、２００９年１１月１０日に出願された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第０９／６３９３３号明細書に記載される。
Ｃ１２−２００含有製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書、および２０１０年５月５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書に記載される。
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えばナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ））、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載される。
非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含むことができ、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではないその他の適切な添加剤とを含有し得る。
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成され得る。肝臓がんなどの肝臓の障害を治療する場合、特に好ましいのは、肝臓を標的とする製剤である。
好都合には単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその双方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば生成物を整形することで調製される。
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合され得る。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
Ｃ．追加的な製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含む、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含む複数エマルションであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内に良く分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。
表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照されたい）。
エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
多岐にわたる非乳化材料もまたエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３〜５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしマイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製され得、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当該技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第 ７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは多くの場合、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成することができる。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に、特に有利となり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のｉＲＮＡ剤は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせをはじめとする、その他の方法によって製造してもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類され得る（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物エマルション．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１〜２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、およびそのモノ−およびジ−グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えばＴｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照されたい）。
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ：ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏ−２４，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｓｉｄａｔｅ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照されたい）。
本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。 適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばＫａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照されたい）。
本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えばＭｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本発明医薬およびその他の組成物に添加し得る。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏらに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｉＲＮＡＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２−ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとするその他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。
ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。
適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｖｉｉ．その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有することができ、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などなどの助剤と混合される。
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ｉＲＮＡ機序によって機能し、ＡＰＯＣ関連障害の治療に有用な１つまたは複数の薬剤を含む。このような薬剤の例としては、抗炎症剤、抗脂肪症薬、抗ウイルス、および／または抗線維症薬が挙げられるが、これに限定される（ｌｍｉｔｅｄ）ものではない。それに加えて、シリマリンなどの肝臓を保護するのに一般に使用されるその他の物質もまた、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用し得る。肝臓疾患の治療に有用なその他の薬剤としては、テルビブジンと、エンテカビルと、テラプレビルおよび例えばＴｕｎｇらに付与された米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１６７１１６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４４２１７号明細書；およびＨａｌｅらに付与された米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書で開示されたものなどのプロテアーゼインヒビターが挙げられる。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するための細胞培養物または実験動物中などで、標準薬学的手順によって判定し得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、最初に、治療有効用量を細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養中で判定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、上で考察されるそれらの投与に加えて、ＡＰＯＣ３発現によって媒介される病理過程の治療に効果的なその他の既知の作用物質と組み合わせて、投与し得る。いずれにしても処置を行う医師は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
ＶＩＩ．本発明の方法
本発明は、ＡＰＯＣ３関連疾患、障害、および／または病態（例えば、高トリグリセリド血症）を有するか、またはそれを発症し易い対象に対し、本発明のｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡを含むベクターを含む医薬組成物を投与するステップを含む治療および予防方法を提供する。
一態様において、本発明は、ＡＰＯＣ３発現の低減から利益を受け得る障害、例えば、高トリグリセリド血症および他のＡＰＯＣ−３関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）；高血圧症；心血管障害、例えばアテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）；および膵炎、例えば急性膵炎を有する対象を治療する方法を提供する。
本発明の治療方法（および使用）は、ＡＰＯＣ３遺伝子を標的化するｉＲＮＡ剤またはＡＰＯＣ３遺伝子を標的化するｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の治療有効量を対象、例えばヒトに投与し、それによってＡＰＯＣ３発現の低減から利益を受け得る障害を有する対象を治療するステップを含む。
一態様において、本発明は、ＡＰＯＣ３発現の低減から利益を受け得る障害、例えば、高トリグリセリド血症などのＡＰＯＣ３関連疾患、および高トリグリセリド血症によって引き起こされ得るか、それに関連し得るか、またはそれの結果であり得る他の疾患を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。後者の疾患としては、限定はされないが、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）、アテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、心血管疾患または膵炎が挙げられる。本方法は、本発明のｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ、またはベクターの治療有効量を対象に投与し、それによってＡＰＯＣ３発現の低減から利益を受け得る障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防するステップを含む。
別の態様において、本発明は、対象、例えばＡＰＯＣ３発現の低減および／または阻害から利益を受け得る対象を治療するための、本発明のｉＲＮＡ剤の治療有効量の使用を提供する。
さらなる態様において、本発明は、対象、例えばＡＰＯＣ３発現の低減および／または阻害から利益を受け得る対象、例えば、ＡＰＯＣ３発現の低減から利益を受け得る障害、例えば、高トリグリセリド血症などのＡＰＯＣ３関連疾患、および高トリグリセリド血症によって引き起こされ得るか、それに関連し得るか、またはそれの結果であり得る他の疾患を有する対象などを治療するための医薬の製造における、ＡＰＯＣ３遺伝子を標的化する本発明のｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡまたはＡＰＯＣ３遺伝子を標的化するｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。後者の疾患としては、限定はされないが、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）、アテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、心血管疾患または膵炎を挙げることができる。
別の態様において、本発明は、ＡＰＯＣ３発現の低減および／または阻害から利益を受け得る障害、例えば、ＡＰＯＣ３関連疾患、例えば高トリグリセリド血症および高トリグリセリド血症によって引き起こされ得るか、それに関連し得るか、またはそれの結果であり得る他の疾患に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための、本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。後者の疾患としては、限定はされないが、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）、アテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、心血管疾患または膵炎を挙げることができる。
さらなる態様において、本発明は、ＡＰＯＣ３発現の低減および／または阻害から利益を受け得る障害、例えば、ＡＰＯＣ３関連疾患、例えば、高トリグリセリド血症および高トリグリセリド血症によって引き起こされ得るか、それに関連し得るか、またはそれの結果であり得る他の疾患に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための医薬の製造における、本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。後者の疾患としては、限定はされないが、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）、アテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、心血管疾患または膵炎を挙げることができる。
一実施形態において、ＡＰＯＣ３を標的化するｉＲＮＡ剤は、ＡＰＯＣ３関連疾患を有する対象に対し、ｄｓＲＮＡ剤を対象に投与したとき対象の例えば細胞、組織、血液または他の組織もしくは体液中のＡＰＯＣ３レベルが少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％またはそれ以上低下するように投与される。
本発明の方法および使用は、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、または約８０時間などにわたって標的ＡＰＯＣ３遺伝子の発現が低下するように、本明細書に記載される組成物を投与するステップを含む。一実施形態において、標的ＡＰＯＣ３遺伝子の発現は、長時間、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７日間またはそれ以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、または約４週間またはそれ以上にわたって低下する。
本発明の方法および使用に係るｄｓＲＮＡの投与は、ＡＰＯＣ３関連疾患を有する患者におけるかかる疾患または障害の重症度、徴候、症状、および／またはマーカの低減をもたらし得る。これに関連して「低減」とは、かかるレベルの統計学的に有意な低下を意味する。低減は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％であり得る。
疾患の治療または予防の有効性は、例えば、疾患の進行、疾患の寛解、症状の重症度、疼痛の低下、クオリティ・オブ・ライフ、治療効果の持続に必要な医薬の用量、疾患マーカまたは治療下のもしくは予防の標的とされる所与の疾患に適切な任意の他の計測可能なパラメータのレベルを計測することにより評価し得る。かかるパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを計測することによって治療または予防の有効性をモニタすることは、十分に当業者の能力の範囲内にある。例えば、高トリグリセリド血症の治療の有効性は、例えば、血中トリグリセリドレベルの定期的なモニタリングによって評価し得る。後の読取りを最初の読取りと比較することにより、医師は治療が有効かどうかの指標を得る。かかるパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを計測することによって治療または予防の有効性をモニタすることは、十分に当業者の能力の範囲内にある。ＡＰＯＣ３を標的化するｉＲＮＡまたはその医薬組成物の投与に関して、ＡＰＯＣ３関連疾患「に対して有効」とは、臨床的に適切な方法での投与が、症状の改善、治癒、疾患の軽減、寿命の延長、クオリティ・オブ・ライフの改善、またはＡＰＯＣ３関連疾患および関連原因の治療に精通している医師らによって肯定的であると一般的に認められている他の効果など、有益な効果を少なくとも統計学的に有意な割合の患者にもたらすことを示す。
病態の１つまたは複数のパラメータに統計的に有意な改善がある場合、または処置がなければ予期される症状悪化または発症の欠如によって、治療または予防効果は明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化は、効果的な治療を示唆し得る。所与のｉＲＮＡ薬剤またはその薬剤の配合物の有効性はまた、当該技術分野で公知の所与の疾患のための実験動物モデルを使用して、判定し得る。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカまたは症状の統計的に有意な低下が観察される場合に、証明される。ＡＰＯＣ３関連疾患の好適な動物モデルには、例えば高トリグリセリド血症を有する任意の動物モデルが含まれる。かかる動物モデルとしては、例えば、ヒトアポリポタンパク質Ｃ２（ＡＰＯＣ２）遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭａｉｎｅのＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能な系統Ｂ６；ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ２）２Ｂｒｅｓ／ＪまたはＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ２）２Ｂｒｅｓ／Ｊのマウスなど）；ヒトアポリポタンパク質（ａｐｏｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｃ３（ＡＰＯＣ３）遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（系統Ｂ６；ＣＢＡ−Ｔｇ（ＡＰＯＣ３）３７０７Ｂｒｅｓ／Ｊのマウスなど、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能）；ホモ接合脂肪肝ジストロフィー（ｆｌｄ）マウス（系統Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ−Ｌｐｉｎ１ｆｌｄ−２Ｊ／Ｊのマウスなど、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能）；Ｓｅｃ６１ａ１Ｙ３４４Ｈと呼ばれるＥＮＵ誘導ミスセンス突然変異に関してホモ接合のマウス（系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｓｅｃ６１ａ１ｍ１Ｇｅｋ／Ｊのマウスなど、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能）；食餌誘発性肥満マウス（６０％ｋｃａｌ脂肪食を与えた系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのマウス、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能、または６０％ｋｃａｌ脂肪食を与えた系統Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃのマウス、Ｔａｃｏｎｉｃから入手可能）；および肝臓特異的ＴＢＧプロモータ下でヒトＡｐｏＣ３遺伝子を過剰発現するトランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウスまたは本明細書に記載されるとおりのトランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウスが挙げられる。
特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡまたはｉＲＮＡを含む製剤の有効性の試験に好適な実験動物モデルには、ウサギが含まれる。例示的ウサギモデルとしては、例えば、ワタナベ遺伝性高脂質血症（ＷＨＨＬ）ウサギが挙げられる。ＷＨＨＬウサギは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体の欠損に起因する高コレステロール血症の動物モデルである。ＷＨＨＬウサギの特徴およびＷＨＨＬウサギを使用して行われた研究の歴史が、例えば、Ｓｈｉｏｍｉ，Ｍ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｔ．，Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（２００９），２０７（１）：１−７（この内容は全て、本明細書によって参照により本明細書に援用される）によって記載されている。ＷＨＨＬウサギは、以下に示すとおりコレステロールおよびトリグリセリドレベルの増加を呈する：
Figure 2017535552
特定の実施形態では、ＷＨＨＬウサギがＡＰＯＣ３発現の阻害の研究に好ましい動物モデルであることもあり、なぜなら、ＷＨＨＬウサギは他の動物モデルと比べてよりヒトに近い脂質プロファイルを呈し、かつＡｐｏＣ３ノックダウンとトリグリセリドの低下との間の関係の理解に寄与し得るとともに、非ヒト霊長類が関与する研究のための用量決定について情報を与え得るためである。様々な動物種間での酵素およびリポタンパク質プロファイルの比較を以下の表２に提供する。
Figure 2017535552
本発明のｉＲＮＡまたはｉＲＮＡを含む製剤の有効性の試験に好適であり得る他の例示的ウサギモデルとしては、例えば、食餌誘発性肥満ウサギが挙げられる。食餌誘発性肥満ウサギについては、例えば、Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆａｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９７），２：２９８−３０８；Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６），２７１：Ｈ３７３−８；Ａｎｔｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．（２０００），１３：５５６−９；Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．（２００４），１８１：１８３−９１；およびＲｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９９），１９：２１７９−８８（これらの内容は全て、参照により本明細書に援用される）によって以前文献に記載されている。
対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、または約５０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、脂質とを含む特定の実施形態では、対象に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えばｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば本発明の組成物が、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、Ｎ−アセチルガラクトサミンとを含む別の実施形態では、対象に、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量などの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。一実施形態では、本発明の組成物が本明細書に記載のｄｓＲＮＡおよびＮ−アセチルガラクトサミンを含む場合、対象には、治療量の約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡが投与され得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
例えば、対象には、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
本発明の特定の実施形態において、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤が修飾（例えば、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフ）、例えば、薬剤の切断部位またはその近傍の１つのかかるモチーフ、６つのホスホロチオエート結合、およびリガンドを含む場合、かかる薬剤は、約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０８ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。前述の列挙された値の中間の値および範囲もまた本発明の一部であることが意図され、例えば、ＲＮＡｉ剤は、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜約０．４５ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与され得る。
例えば、ＲＮＡｉ剤、例えば医薬組成物中のＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。前述の列挙された値の中間の値もまた、本発明の一部であることが意図される。
ｉＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または約２５分間などにわたる静脈輸液によって投与し得る。投与は、例えば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月以上などにわたり、毎週、隔週（すなわち２週毎）で、定期的に繰り返してもよい。最初の治療計画の後に、治療は、より低い頻度で行い得る。例えば３ヶ月にわたる毎週または隔週の投与後、６ヶ月または１年以上にわたり月１回の投与を反復し得る。
ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿または他のコンパートメントにおけるＡＰＯＣ３レベルを少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％またはそれ以上低減し得る。
ｉＲＮＡの総用量の投与前に、５％輸液などのより少ない用量を患者に投与して、アレルギー反応などの悪影響についてモニタし得る。別の実施例では、サイトカイン（例えばＴＮＦ−αまたはＩＮＦ−α）レベル増大などの望まれない免疫賦活性効果について、患者をモニタし得る。
ＡＰＯＣ３発現に対する阻害効果のために、本発明に従った組成物またはそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高め得る。
本発明のｉＲＮＡは「ネイキッド」形態で投与されてもよく、ここでは修飾または非修飾ｉＲＮＡ剤が水性溶媒または好適な緩衝溶媒中に「遊離ｉＲＮＡ」として直接懸濁される。遊離ｉＲＮＡは医薬組成物の非存在下で投与される。遊離ｉＲＮＡは好適な緩衝液中にあってもよい。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一実施形態において、緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨおよび容量オスモル濃度は、対象への投与に好適となるように調整することができる。
あるいは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤など、医薬組成物として投与されてもよい。
ＡＰＯＣ３遺伝子発現の低減および／または阻害から利益を受け得る対象は、本明細書に記載されるとおりのＡＰＯＣ３関連疾患または障害を有する者である。
ＡＰＯＣ３遺伝子発現の低減および／または阻害から利益を受け得る対象の治療には、療法的および予防的治療が含まれる。
本発明はさらに、ＡＰＯＣ３発現の低減および／または阻害から利益を受け得る対象、例えば、ＡＰＯＣ３関連疾患を有する対象を治療するための、他の医薬品および／または他の治療法、例えば、既知の医薬品および／または既知の治療法、例えば、これらの疾患の治療に現在用いられているものと併用したｉＲＮＡ剤またはその医薬組成物の方法および使用を提供する。例えば、特定の実施形態では、ＡＰＯＣ３を標的化するｉＲＮＡが、例えば、ＡＰＯＣ３関連疾患の治療において有用な追加的な薬剤と併用して投与される。
追加的な療法剤の例としては、高トリグリセリド血症および高トリグリセリド血症によって引き起こされるか、それに関連するか、またはそれの結果である他の疾患を治療することが知られているものが挙げられる。例えば、本発明の特徴であるｉＲＮＡは、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬（例えば、スタチン）、フィブラート、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、抗血小板剤、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（例えば、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．のＣｏｚａａｒ（登録商標）などのロサルタンカリウム）、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害薬、コレステロール吸収阻害薬、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害薬、コレステロールモジュレーター、胆汁酸モジュレーター、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、遺伝子ベース療法、複合血管保護剤（例えば、ＡｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｓのＡＧＩ−１０６７）、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害薬、アスピリンまたはアスピリン様化合物、ＩＢＡＴ阻害薬（例えば、ＳｈｉｏｎｏｇｉのＳ−８９２１）、スクアレンシンターゼ阻害薬、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−Ｉ阻害薬、または魚油と共に投与することができる。例示的ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬としては、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒのＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）／Ｔａｈｏｒ／Ｓｏｒｔｉｓ／Ｔｏｒｖａｓｔ／Ｃａｒｄｙｌ）、プラバスタチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＰｒａｖａｃｈｏｌ、ＳａｎｋｙｏのＭｅｖａｌｏｔｉｎ／Ｓａｎａｐｒａｖ）、シンバスタチン（ＭｅｒｃｋのＺｏｃｏｒ（登録商標）／Ｓｉｎｖａｃｏｒ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＩｎｇｅｌｈｅｉｍのＤｅｎａｎ、ＢａｎｙｕのＬｉｐｏｖａｓ）、ロバスタチン（ＭｅｒｃｋのＭｅｖａｃｏｒ／Ｍｅｖｉｎａｃｏｒ、ＢｅｘａｌのＬｏｖａｓｔａｔｉｎａ、Ｃｅｐａ；Ｓｃｈｗａｒｚ ＰｈａｒｍａのＬｉｐｏｓｃｌｅｒ）、フルバスタチン（ＮｏｖａｒｔｉｓのＬｅｓｃｏｌ（登録商標）／Ｌｏｃｏｌ／Ｌｏｃｈｏｌ、ＦｕｊｉｓａｗａのＣｒａｎｏｃ、ＳｏｌｖａｙのＤｉｇａｒｉｌ）、セリバスタチン（ＢａｙｅｒのＬｉｐｏｂａｙ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＢａｙｃｏｌ）、ロスバスタチン（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＣｒｅｓｔｏｒ（登録商標））、およびピチバスタチン（ｐｉｔｉｖａｓｔａｔｉｎ）（イタバスタチン／リシバスタチン（ｒｉｓｉｖａｓｔａｔｉｎ））（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｗａ Ｋｏｇｙｏ、Ｓａｎｋｙｏ、およびＮｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられる。例示的フィブラート系薬としては、例えば、ベザフィブラート（例えば、ＲｏｃｈｅのＢｅｆｉｚａｌ（登録商標）／Ｃｅｄｕｒ（登録商標）／Ｂｅｚａｌｉｐ（登録商標）、ＫｉｓｓｅｉのＢｅｚａｔｏｌ）、クロフィブラート（例えば、ＷｙｅｔｈのＡｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（登録商標））、フェノフィブラート（例えば、ＦｏｕｒｎｉｅｒのＬｉｐｉｄｉｌ／Ｌｉｐａｎｔｉｌ、ＡｂｂｏｔｔのＴｒｉｃｏｒ（登録商標）、ＴａｋｅｄａのＬｉｐａｎｔｉｌ、ジェネリック薬）、ゲムフィブロジル（例えば、ＰｆｉｚｅｒのＬｏｐｉｄ／Ｌｉｐｕｒ）およびシプロフィブラート（Ｓａｎｏｆｉ−ＳｙｎｔｈｅｌａｂｏのＭｏｄａｌｉｍ（登録商標））が挙げられる。例示的胆汁酸捕捉剤としては、例えば、コレスチラミン（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＱｕｅｓｔｒａｎ（登録商標）およびＱｕｅｓｔｒａｎ Ｌｉｇｈｔ（商標））、コレスチポール（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａのＣｏｌｅｓｔｉｄ）、およびコレセベラム（Ｇｅｎｚｙｍｅ／ＳａｎｋｙｏのＷｅｌＣｈｏｌ（商標））が挙げられる。例示的ナイアシン療法としては、例えば、即効型製剤、例えば、ＡｖｅｎｔｉｓのＮｉｃｏｂｉｄ、Ｕｐｓｈｅｒ−ＳｍｉｔｈのＮｉａｃｏｒ、ＡｖｅｎｔｉｓのＮｉｃｏｌａｒ、およびＳａｎｗａｋａｇａｋｕのＰｅｒｙｃｉｔが挙げられる。ナイアシン徐放製剤としては、例えば、Ｋｏｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＮｉａｓｐａｎおよびＵｐｓｈｅｒ−ＳｍｉｔｈのＳＩｏ−Ｎｉａｃｉｎが挙げられる。例示的抗血小板剤としては、例えば、アスピリン（例えば、Ｂａｙｅｒのアスピリン）、クロピドグレル（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＰｌａｖｉｘ）、およびチクロピジン（例えば、Ｓａｎｏｆｉ−ＳｙｎｔｈｅｌａｂｏのＴｉｃｌｉｄおよびＤａｉｉｃｈｉのＰａｎａｌｄｉｎｅ）が挙げられる。ＡＰＯＣ３を標的化するｄｓＲＮＡとの併用で有用な他のアスピリン様化合物としては、例えば、Ａｓａｃａｒｄ（Ｐｈａｒｍａｃｉａの徐放性アスピリン）およびＰａｍｉｃｏｇｒｅｌ（Ｋａｎｅｂｏ／Ａｎｇｅｌｉｎｉ Ｒｉｃｅｒｃｈｅ／ＣＥＰＡ）が挙げられる。例示的アンジオテンシン変換酵素阻害薬としては、例えば、ラミプリル（例えば、ＡｖｅｎｔｉｓのＡｌｔａｃｅ）およびエナラプリル（例えば、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．のＶａｓｏｔｅｃ）が挙げられる。例示的アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣ ＡＴ）阻害薬としては、例えば、アバシミベ（Ｐｆｉｚｅｒ）、エフルシミベ（ＢｉｏＭｓｒｉｅｕｘ Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＣＳ−５０５（ＳａｎｋｙｏおよびＫｙｏｔｏ）、およびＳＭＰ−７９７（Ｓｕｍｉｔｏ）が挙げられる。例示的コレステロール吸収阻害薬としては、例えば、エゼチミブ（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｚｅｔｉａ（登録商標））およびＰａｍａｑｕｅｓｉｄｅ（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。例示的ＣＥＴＰ阻害薬としては、例えば、トルセトラピブ（ＣＰ−５２９４１４とも称される、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＪＴＴ−７０５（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、およびＣＥＴｉ−Ｉ（Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。例示的ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害薬としては、例えば、インプリタピド（Ｂａｙｅｒ）、Ｒ−１０３７５７（Ｊａｎｓｓｅｎ）、およびＣＰ−３４６０８６（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。他の例示的コレステロールモジュレーターとしては、例えば、ＮＯ−１８８６（Ｏｔｓｕｋａ／ＴＡＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＩ−１０２７（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＷＡＹ−１３５４３３（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）が挙げられる。
例示的胆汁酸モジュレーターとしては、例えば、ＨＢＳ−１０７（Ｈｉｓａｍｉｔｓｕ／Ｂａｎｙｕ）、Ｂｔｇ−５１１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）、ＢＡＲＩ−１４５３（Ａｖｅｎｔｉｓ）、Ｓ−８９２１（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）、ＳＤ−５６１３（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＡＺＤ−７８０６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる。例示的ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬としては、例えば、テサグリタザル（ＡＺ−２４２）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ネトグリタゾン（ＭＣＣ−５５５）（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ／Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＧＷ−４０９５４４（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｎｉａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＷ−５０１５１６（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＬＹ−９２９（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ−４６５６０８（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ−５１８６７４（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、およびＭＫ−７６７（ＭｅｒｃｋおよびＫｙｏｒｉｎ）が挙げられる。例示的遺伝子ベースの療法薬としては、例えば、ＡｄＧＷＥＧＦ １２１．１０（ＧｅｎＶｅｃ）、ＡｐｏＡｌ（ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ／Ｇｒｏｕｐｅ Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）、ＥＧ−００４（Ｔｒｉｎａｍ）（Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびＡＴＰ結合カセットトランスポーター−Ａｌ（ＡＢＣＡ１）（ＣＶ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｉｎｃｙｔｅ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｘｅｎｏｎ）が挙げられる。例示的糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害薬としては、例えば、ロキシフィバン（ＤＭＰ７５４とも称される、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ガントフィバン（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ／Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ）、およびクロマフィバン（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。例示的スクアレンシンターゼ阻害薬としては、例えば、ＢＭＳ−１８８４９４１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＣＰ−２１０１７２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ−２９５６９７（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ−２９４８３８（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＴＡＫ−４７５（Ｔａｋｅｄａ）が挙げられる。例示的ＭＣＰ−Ｉ阻害薬としては、例えば、ＲＳ−５０４３９３（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。抗アテローム硬化剤ＢＯ−６５３（Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびニコチン酸誘導体Ｎｙｃｌｉｎ（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌｓ）もまた、本発明の特徴であるｄｓＲＮＡと併用して投与するのに適切である。ＡＰＯＣ３を標的化するｄｓＲＮＡと共に投与するのに好適な例示的併用療法薬としては、例えば、アドビコール（ａｄｖｉｃｏｒ）（Ｋｏｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのナイアシン／ロバスタチン）、アムロジピン／アトルバスタチン（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびエゼチミブ／シンバスタチン（例えば、Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによるＶｙｔｏｒｉｎ（登録商標）１０／１０、１０／２０、１０／４０、および１０／８０錠）が挙げられる。高トリグリセリド血症の治療用の、ＡＰＯＣ３を標的化するｄｓＲＮＡと併用して投与するのに好適な薬剤としては、例えば、ロバスタチン、ナイアシンＡｌｔｏｐｒｅｖ（登録商標）徐放錠（Ａｎｄｒｘ Ｌａｂｓ）、ロバスタチンＣａｄｕｅｔ（登録商標）錠（Ｐｆｉｚｅｒ）、ベシル酸アムロジピン、アトルバスタチンカルシウムＣｒｅｓｔｏｒ（登録商標）錠（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロスバスタチンカルシウムＬｅｓｃｏｌ（登録商標）カプセル（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムＬｅｓｃｏｌ（登録商標）（Ｒｅｌｉａｎｔ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）錠（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）、アトルバスタチンカルシウムＬｏｆｉｂｒａ（登録商標）カプセル（Ｇａｔｅ）、Ｎｉａｓｐａｎ徐放錠（Ｋｏｓ）、ナイアシンＰｒａｖａｃｈｏｌ錠（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、プラバスタチンナトリウムＴｒｉＣｏｒ（登録商標）錠（Ａｂｂｏｔｔ）、フェノフィブラートＶｙｔｏｒｉｎ（登録商標）１０／１０錠（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エゼチミブ、シンバスタチンＷｅｌＣｈｏｌ（商標）錠（Ｓａｎｋｙｏ）、塩酸コレセベラムＺｅｔｉａ（登録商標）錠（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、エゼチミブＺｅｔｉａ（登録商標）錠（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびエゼチミブＺｏｃｏｒ（登録商標）錠（Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、エゼチミブ／シンバスタチンの組み合わせ（例えば、Ｖｙｔｏｒｉｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））と併用して投与される。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤が患者に投与され、次に追加的な療法剤が患者に投与される（またはその逆）。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤と追加的な療法剤とは同時に投与される。
ｉＲＮＡ剤および追加的な療法剤および／または治療は、同時におよび／または同じ組み合わせで、例えば非経口的に投与されてもよく、または追加的な療法剤は、別個の組成物の一部として、または別個の時点で、および／または当該技術分野において公知のまたは本明細書に記載される別の方法によって投与することができる。
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡ剤および／または本発明のｉＲＮＡ剤を含有する組成物を使用して細胞におけるＡＰＯＣ３発現を低減および／または阻害する方法も提供する。他の態様において、本発明は、細胞におけるＡＰＯＣ３発現の低減および／または阻害に使用される本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明のｉＲＮＡを含む組成物を提供する。さらに他の態様において、細胞におけるＡＰＯＣ３発現を低減および／または阻害する医薬を製造するための、本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明のｉＲＮＡを含む組成物の使用が提供される。
本方法および使用は、細胞を、本発明のｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡと接触させるステップと、ＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって細胞を維持し、それによって細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するステップとを含む。
遺伝子発現の低減は、当該技術分野において公知の任意の方法によって評価することができる。例えば、ＡＰＯＣ３の発現の低減は、当業者にとってルーチンの方法、例えば、ノーザンブロッティング、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＡＰＯＣ３のｍＲＮＡ発現レベルを決定し、当業者にとってルーチンの方法、例えば、ウエスタンブロッティング、免疫学的技法、フローサイトメトリー法、ＥＬＩＳＡを用いてＡＰＯＣ３のタンパク質レベルを決定し、および／またはＡＰＯＣ３の生物学的活性を決定することによって決定し得る。
本発明の方法および使用において、細胞はインビトロまたはインビボで接触させてもよく、すなわち細胞は対象の体内にあり得る。
本発明の方法を用いた治療に好適な細胞は、ＡＰＯＣ３遺伝子を発現する任意の細胞であり得る。本発明の方法および使用における使用に好適な細胞は、哺乳類細胞、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（雌ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、またはスイギュウ細胞など）、トリ細胞（例えば、アヒル細胞またはガチョウ細胞）、またはクジラ細胞であり得る。一実施形態において、細胞はヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。
ＡＰＯＣ３発現は、細胞において少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％阻害され得る。
本発明のインビボ方法および使用は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与するステップを含むことができ、ここでｉＲＮＡは、治療する哺乳動物のＡＰＯＣ３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。治療する生物がヒトである場合、本組成物は、限定はされないが、皮下、静脈内、経口、腹腔内、または非経口経路、例えば、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内およびくも膜下腔内）、筋肉内、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、直腸、および局所（頬側および舌下を含む）投与を含めた、当該技術分野において公知の任意の手段により投与することができる。特定の実施形態において、本組成物は皮下または静脈内注入または注射によって投与される。
一部の実施形態において、投与はデポー注射を介する。デポー注射は、ｉＲＮＡを長期間にわたって一貫した形で放出し得る。したがって、デポー注射は、所望の効果、例えば所望のＡＰＯＣ３阻害、または療法的もしくは予防的効果を得るために必要な投与頻度を減らすことができる。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度も提供し得る。デポー注射は皮下注射または筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態において、デポー注射は皮下注射である。
一部の実施形態において、投与はポンプを介する。ポンプは外部ポンプまたは外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態において、ポンプは皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態において、ポンプは輸液ポンプである。輸液ポンプは、静脈内、皮下、動脈内、または硬膜外注入に用いられ得る。好ましい実施形態において、輸液ポンプは皮下注入ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、ｉＲＮＡを肝臓に送達する外科的に埋め込まれたポンプである。
投与方法は、局所治療か、それとも全身治療が所望されるかに基づき、および治療範囲に基づき選択し得る。投与経路および部位は、標的化が増強されるように選択し得る。
一態様において、本発明はまた、哺乳動物、例えばヒトにおけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。本発明はまた、哺乳動物におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現の阻害に使用するための、哺乳動物の細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子を標的化するｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物も提供する。別の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための医薬の製造における、哺乳動物の細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子を標的化するｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの使用を提供する。
本方法および使用は、哺乳動物、例えばヒトに対し、哺乳動物の細胞におけるＡＰＯＣ３遺伝子を標的化するｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物を投与するステップと、ＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって哺乳動物を維持し、それによって哺乳動物におけるＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するステップとを含む。
遺伝子発現の低減は、ｉＲＮＡを投与した対象の末梢血試料において、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば本明細書に記載されるｑＲＴ−ＰＣＲによって評価することができる。タンパク質産生の低減は、当該技術分野において公知の任意の方法、および本明細書に記載される方法、例えばＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングによって評価することができる。一実施形態では、穿刺肝生検試料が、ＡＰＯＣ３遺伝子および／またはタンパク質発現の低減をモニタするための組織材料として働く。別の実施形態では、血液試料が、ＡＰＯＣ３遺伝子および／またはタンパク質発現の低減をモニタするための組織材料として働く。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤投与後のＲＩＳＣの媒介によるインビボ標的切断の確認は、５’−ＲＡＣＥまたは当該技術分野において公知のとおりのプロトコルの修正版の実施によって行われる（Ｌａｓｈａｍ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３８（３）ｐ−ｅ１９）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−４）。
本発明は以下の例によってさらに例示され、これらの例は限定するものと解釈されてはならない。本出願全体を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容全体、ならびに図および配列表は、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
材料および方法
本実施例では、以下の材料および方法を使用した。
試薬の供給元
試薬の供給元が本明細書に具体的に示されない場合、かかる試薬は、任意の分子生物学試薬供給業者から分子生物学における適用の品質／純度基準で入手することができる。
ｓｉＲＮＡ合成
Ｍｅｒｍａｄｅ １９２シンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）において、固体支持体媒介ホスホラミダイト化学を用いてＡＰＯＣ３ ｓｉＲＮＡ配列を１μｍｏｌ規模で合成した。固体支持体は、カスタムＧａｌＮＡｃリガンドを負荷したコントロールド・ポア・グラス（５００Å）またはユニバーサル固体支持体（ＡＭ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）であった。補助合成試薬、２’−Ｆおよび２’−Ｏ−メチルＲＮＡおよびデオキシホスホラミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）およびＨｏｎｇｅｎｅ（Ｃｈｉｎａ）から入手した。対応するホスホラミダイトを用いて２’Ｆ、２’−Ｏ−メチル、ＧＮＡ（グリコール核酸）、５’リン酸および脱塩基修飾を導入した。３’ＧａｌＮＡｃ共役一本鎖の合成は、ＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ支持体で実施した。アンチセンス一本鎖の合成には、カスタムＣＰＧユニバーサル固体支持体を使用した。全てのホスホラミダイト（アセトニトリル中１００ｍＭ）のカップリング時間は、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）をアクチベーター（アセトニトリル中０．６Ｍ）として用いて５分であった。無水アセトニトリル／ピリジン（１：１ｖ／ｖ）中５０ｍＭ溶液の３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡから入手した）を使用して、ホスホロチオエート結合を作成した。酸化時間は３分であった。配列は全て、ＤＭＴ基を最終的に除去して合成した（「ＤＭＴオフ」）。
初めに、「ＴＯＦＦＥＥ−６ＰＳ」モチーフを使用してインビトロスクリーニングアッセイ用のＡＰＯＣ３配列を合成した。ＴＯＦＦＥＥ−６ＰＳ設計では、３’末端にＧａｌＮＡｃリガンド、５’末端に２つのホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）ならびに９、１０および１１位に２’Ｆヌクレオチドのトリプレットがある２１ヌクレオチド長のセンス鎖が作製される。ＴＯＦＦＥＥ−６ＰＳ設計におけるアンチセンス配列は２３ヌクレオチド長であり；１１、１２および１３位に２’−ＯＭｅヌクレオチドの３ヌクレオチドトリプレットを含有し、３’末端および５’末端のそれぞれに２つのホスホロチオエートを有する。
固相合成の完了後、オリゴリボヌクレオチドを固体支持体から切断し、密閉した９６ディープウェルプレートにおいて２００μＬメチルアミン水溶液試薬を６０℃で２０分間使用して脱保護した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護されている２’リボ残基（２’−ＯＨ）を含有する配列について、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミン三フッ化水素酸塩）試薬を使用して第２の脱保護ステップを実施した。このメチルアミン脱保護溶液に、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および３００μｌ ＴＥＡ．３ＨＦ試薬を添加し、溶液を６０℃でさらに２０分間インキュベートした。切断および脱保護ステップが終了したところで合成プレートを室温に至らせ、１ｍＬのアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｔｉｌｅ）：エタノール混合物（９：１）を添加することによって沈殿させた。プレートを−８０℃で２時間冷却し、マルチチャンネルピペットを用いて上清（ｓｕｐｅｒａｎａｔａｎｔ）を慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液に再懸濁し、Ａ９０５オートサンプラーおよびＦｒａｃ ９５０フラクションコレクターを備えたＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで５ｍＬ ＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩した。脱塩した試料を９６ウェルプレートに収集した。各配列からの試料をＬＣ−ＭＳによって分析してアイデンティティを確認し、ＵＶ（２６０ｎｍ）で定量化し、およびＩＥＸクロマトグラフィーによって選択の試料セットの純度を決定した。
Ｔｅｃａｎ液体ハンドリングロボットでＡＰＯＣ３一本鎖のアニーリングを実施した。９６ウェルプレートにおいてセンスおよびアンチセンス一本鎖の等モル混合物を合わせ、アニールした。相補的な一本鎖を合わせた後、９６ウェルプレートをしっかりと密閉し、１００℃のオーブンで１０分間加熱し、２〜３時間の時間をかけてゆっくりと室温に至らせた。各二重鎖の濃度は１×ＰＢＳ中１０μＭに標準化し、次にインビトロスクリーニングアッセイにかけた。
細胞培養および９６ウェルトランスフェクション
１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）を補足したＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中５％ＣＯ２の雰囲気下３７℃でＨｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をほぼコンフルエンスになるまで成長させた後、トリプシン処理によってプレートから剥がした。トランスフェクションは、９６ウェルプレートにウェル当たり１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）をウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に添加することによって行い、室温で１５分間インキュベートした。次に、約２×１０４個のＨｅｐ３Ｂ細胞を含有する８０μｌの抗生物質不含完全成長培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。ＲＮＡ精製に先立ち細胞を２４時間または１２０時間のいずれかにわたってインキュベートした。１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二重鎖濃度で単回用量実験を実施し、８つの６倍希釈にわたる１０ｎＭ〜３６ｆＭの最終二重鎖濃度の用量範囲にわたって反応実験を行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；パーツ番号６１０−１２）を使用した全ＲＮＡ単離
細胞を収集して１５０μｌの溶解／結合緩衝液に溶解し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して、８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、処理全体にわたり同一であった）。１０μｌの磁性ビーズと、８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに入れて、１分間混合した。磁性スタンドを使用して磁性ビーズを捕捉し、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解細胞を残留ビーズに入れて、５分間混合した。上清を除去した後、磁性ビーズを１５０μｌの洗浄液緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉して、上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉して上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉して上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加して、５℃で７０分間混合した。ビーズを磁石上に５分間捕捉した。４０μｌの上清を除去して、別の９６ウェルプレートに入れた。
ＡＢＩハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成
反応当たり２μｌ １０×緩衝液、０．８μｌ ２５×ｄＮＴＰ、２μｌランダムプライマー、１μｌ逆転写酵素、１μｌ ＲＮアーゼ阻害薬および３．２μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを１０μｌの全ＲＮＡに添加した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、以下のステップ：２５℃１０分、３７℃１２０分、８５℃５秒、４℃保持によってｃＤＮＡを作成した。
リアルタイムＰＣＲ
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）内のウェル当たり０．５μｌ ＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌ ＡｐｏＣ３ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号Ｈｓ００１６３６４４＿ｍ１）および５μｌ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに、２μｌのｃＤＮＡを添加した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）でΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。概要の表に特に注記しない限り、各二重鎖は２つの独立したトランスフェクションで試験し、各トランスフェクションはデュプリケートでアッセイした。
相対変化倍数を計算するため、ΔΔＣｔ法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭ ＡＤ−１９５５をトランスフェクトした細胞またはモックトランスフェクト細胞で実施したアッセイに対して正規化した。ＸＬＦｉｔを使用して４パラメータフィットモデルを用いてＩＣ５０を計算し、ＡＤ−１９５５をトランスフェクトした細胞またはナイーブ細胞に対して正規化した。
ＡＤ−１９５５のセンス配列およびアンチセンス配列は以下である：
センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号２８）
アンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号２９）
Figure 2017535552
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実施例１．ｉＲＮＡ合成
ＡＰＯＣ３を標的化するｉＲＮＡ剤の初期セットの作成
ヒトＡＰＯＣ３、「アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ」（ヒト：ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００００４０．１）、ならびにｔｏｘ種ＡＰＯＣ３オルソログ（カニクイザル：ＸＭ＿００５５７９７３０；アカゲザル、ＸＭ＿００１０９０３１２．２；マウス：ＮＭ＿０２３１１４；ラット、ＮＭ＿０１２５０１）を標的化する一組のｉＲＮＡを、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ヒトＡＰＯＣ３ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは５３３塩基の長さを有する。この一組のｓｉＲＮＡ設計の理論的根拠および方法は、以下のとおりである：４７位〜５３３位の可能性のあるあらゆる１９ｍｅｒ ｉＲＮＡの予想有効性を、多数の脊椎動物遺伝子を標的化する２０，０００個超の異なるｉＲＮＡ設計からのｍＲＮＡノックダウンを直接測定して導き出した線形モデルで決定した。ヒト、カニクイザルおよびアカゲザルの間で完全なまたはほぼ完全なマッチを有するＡＰＯＣ３ ｓｉＲＮＡのサブセットを設計した。マウスおよびラットＡＰＯＣ３オルソログと完全なまたはほぼ完全なマッチを有するさらなるサブセットを設計した。ｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを総当たり検索で使用して、ｓｉＲＮＡと標的種トランスクリプトームにおける可能性のあるあらゆるアラインメントとの間のミスマッチの数および位置を測定した。シード領域のミスマッチ（ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの２〜９位として定義される）、またｉＲＮＡの切断部位（ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０〜１１位として定義される）には、追加の重みを加えた。ミスマッチの相対的な重みは、シードミスマッチ、切断部位、およびアンチセンス１９位までの他の位置について２．８；１．２：１であった。１番目の位置のミスマッチは無視した。各鎖について、各重み付きミスマッチの値を合計することにより、特異性スコアを計算した。ヒトおよびカニクイザルにおけるアンチセンススコアが＞＝３．０であり、かつ予想有効性が＞＝ＡＰＯＣ３転写物の７０％ノックダウンであったｓｉＲＮＡを優先して選択した。
上記に記載したとおり設計した配列を有する一連のｉＲＮＡ二重鎖を合成し、上記に記載した技法を用いてセンス鎖の３末端で三価ＧａｌＮＡｃと共役した。これらの二重鎖の配列を表４Ａおよび４Ｂに示す。これらの同じ配列であって、様々なヌクレオチド修飾を有するものもまた合成し、三価ＧａｌＮＡｃと共役した。修飾二重鎖の配列は表５に示す。
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実施例２．ｓｉＲＮＡ配列のインビトロ試験
表６は、選択された修飾ＡＰＯＣ３ ｉＲＮＡを使用したＨｅｐ３Ｂ細胞における単回用量スクリーンの結果を示す。データは、ＡＤ−１９５５非標的化対照をトランスフェクトした細胞中に残存するＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡに対するｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞中に残存するＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡの割合として表す。
Figure 2017535552
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表７は、指示されるカニクイザル／ヒト交差反応性修飾ＡＰＯＣ３ ｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞の用量反応を示す。指示されるＩＣ５０値は、未処理細胞に対するＩＣ５０値を表す。ＡＰＯＣ３ ｉＲＮＡの単回用量スクリーンの結果（１０ｎＭ平均値青色バーおよび０．１ｎＭ平均値赤色バー）を図１に示す。このスクリーンの結果に基づき、さらなるインビボ試験に３つのｉＲＮＡ（ＡＤ−５７５５３．１、ＡＤ−５７５４７．１およびＡＤ−５８９２４．１）を選択した。
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実施例３．野生型マウスにおけるＡＤ−５７５５８ ｓｉＲＮＡ配列のインビボ試験
野生型マウスにおいて、げっ歯類特異的ＡＤ−５７５５８−ＧａｌＮＡｃ３配列を、ＡＰＯＣ３の発現を阻害し、かつ血清脂質を低減するその能力に関して試験した。ＡＤ−５７５５８−ＧａｌＮＡｃ３を単回用量として３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇで皮下（ｃｕｂｓｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与し、ＰＢＳを陰性対照として使用した。投与５日後にＲＴ−ＰＣＲによってＡＰＯＣ３の発現を計測した。図２に示す結果は、ＡＤ−５７５５８−ＧａｌＮＡｃ３がＡＰＯＣ３の発現を約６０％（３ｍｇ／ｋｇ用量について）、約８０％（１０ｍｇ／ｋｇ用量について）および約８５％（３０ｍｇ／ｋｇ用量について）低減可能であることを示している。
実施例４．ＡＰＯＣ３過剰発現マウスモデルの作成および特徴付け
げっ歯類ＡＰＯＣ３遺伝子と交差反応しない化合物でインビボでのＡｐｏＣ３ ＧａｌＮＡｃ共役リード発見を可能にするため、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓におけるヒトＡＰＯＣ３遺伝子の過剰発現系を用いた。肝臓特異的ＴＢＧプロモータ下でヒトＡＰＯＣ３を発現する、アデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）キャプシド形成ＡＡＶ２ベクターゲノムを作成した。ＡＡＶ形質導入マウスにおけるヒトＡｐｏＣ３の高い持続的な発現に必要なウイルスゲノムコピー（ＧＣ）数および時間を含め、最適条件を同定するため、モデルの特徴付け研究を実施した。
マウス当たり１０１１個のゲノムコピーのＡＡＶ２ベクターの投与を用いてさらなる試験を実施した。ｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶベクターの投与後１．５週間、６．５週間、８週間および１６週間に、ＡＡＶ−ｈＡｐｏＣ３マウスの肝臓におけるＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲによって計測した。ＲＴ−ＰＣＲの結果は（データは示さず）、１０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーの投与後１０日以内にマウスにおいてヒトＡＰＯＣ３遺伝子の高い発現レベルが達成され、少なくとも６ヵ月間持続し、動物間のばらつきはほとんどなかったことを示している。
実施例５．ＡＰＯＣ３過剰発現マウスモデルにおける可能性のあるリードｉＲＮＡの試験
特徴付けの後、ＡＰＯＣ３過剰発現のＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスモデル系を使用して、インビトロでの効力に基づき同定されたＡＤ−５７５５３、ＡＤ−５７５４７およびＡＤ−５８９２４のインビボスクリーニングを行った。単回高用量スクリーン実験については、１０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスに単回１０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−５７５５３、ＡＤ−５７５４７およびＡＤ−５８９２４またはＰＢＳ（対照として）を投与し、続いてＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡを計測した。結果は図３および図４に提供する。具体的には、図３は、ＡＤ−５７５５３、ＡＤ−５７５４７およびＡＤ−５８９２４またはＰＢＳを注射した個々のＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡレベルを示し、一方、図４はｍＲＮＡ群平均を示す。データは、ＡＰＯＣ３発現の阻害にＡＤ−５７５５３が最も有効であることを示している。
用量反応および複数用量試験におけるさらなるインビボ試験にＡＤ−５７５５３を選択した。用量反応実験については、１０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスに、１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ用量を毎週、４週間にわたって投与し、続いてＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡレベルを計測した。結果は図５および図６に提供する。具体的には、図５は、ＡＤ−５７５５３を注射した個々のＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて計測されたＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡレベルを示し、一方、図６はｍＲＮＡ群平均を示す。これらのデータは、ＡＤ−５７５５３の用量増加に伴うＡＰＯＣ３ ｍＲＮＡ発現の阻害の増加を示している。
実施例６．ＡＤ−５７５５３に基づくさらなるＲＮＡ配列の作成およびインビボ試験
ｉＲＮＡ化学のＳＡＲ最適化の初回ラウンドから、ＡＤ−５７５５３リード配列に基づき、２’Ｆ、２’ＯＭｅおよび５’Ｐ修飾における変化を導入することによって１０個のさらなるｉＲＮＡ配列を作成した。さらなるｉＲＮＡを以下の表８および表９に提供する。
Figure 2017535552
Figure 2017535552
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ＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにおいて、これらのさらなる配列を、ＡＰＯＣ３タンパク質の発現を阻害するそれらの能力に関して試験した。具体的には、１０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスに単回用量の３ｍｇ／ｋｇの指示される修飾ｉＲＮＡを投与し、投与後５、１０および２０日目に、得られた循環中血清ＡＰＯＣ３タンパク質レベルを計測した。図７Ａは、試験した各ｉＲＮＡ配列について計測した血清ＡＰＯＣ３タンパク質レベルの２０日目までの経時変化を提供し、図７Ｂは、６つの選択されたｉＲＮＡ配列に関する血清ＡＰＯＣ３タンパク質レベルの３０日目までの経時変化を提供する。図８および図９は、試験した各ｉＲＮＡ配列のそれぞれ１０日目および２０日目のデータを表す。これらのデータは、ＡＤ−６５７０４など、最も活性の高いｉＲＮＡ配列が、１０日目および２０日目に血清ＡＰＯＣ３タンパク質の約８０％のノックダウンを達成可能であることを示している。
実施例７．ＡＰＯＣ３過剰発現マウスモデルにおける新規リードｉＲＮＡの試験
ＡＤ−５７５５３、ＡＤ−６５６９６、ＡＤ−６５７０３およびＡＤ−６５７０４をフォローオン研究に選択し、フッ素含有量およびビニルリン酸がインビボでＡＰＯＣ３タンパク質の発現を阻害するｉＲＮＡ剤の能力に及ぼす効果を試験した。上記の表９は、ＡＤ−５７５５３、ＡＤ−６５６９６、ＡＤ−６５７０３およびＡＤ−６５７０４の修飾配列を示し、以下の表１０は、各鎖に存在する修飾の簡単な説明を含む。
Figure 2017535552
ＡＰＯＣ３過剰発現のＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスモデル系において、ｉＲＮＡがインビボでヒトＡＰＯＣ３タンパク質の発現を阻害する能力を試験した。単回用量スクリーン研究については、１０１１個のＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスに単回３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−５７５５３、ＡＤ−６５６９６、ＡＤ−６５７０３およびＡＤ−６５７０４またはＰＢＳ（対照として）を投与し、投与後０、３、１０、２０、３０、４１、５５および７０日目に投与前と比べたＡＰＯＣ３タンパク質レベルを計測した。図１０は、試験した４つ全てのｉＲＮＡのデータを提供する。図１０のデータは、２’Ｆ含有量が低いｉＲＮＡ（ＡＤ−６５７０３およびＡＤ−６５７０４）が、ＡＰＯＣ３の約８０％のノックダウンを３０日間にわたって維持可能であることを示している。データはまた、単回３ｍｇ／ｋｇ用量後にＡＰＯＣ３レベルが対照（ＰＢＳ）群で観察されるレベルに戻るのに５５〜７０日かかることも実証している。
用量反応および複数用量試験におけるさらなるインビボ試験にＡＤ−５７５５３、ＡＤ−６５６９６、ＡＤ−６５６９９、ＡＤ−６５７０３およびＡＤ−６５７０４を使用した。用量反応実験については、１０１１個のＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスが、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの各ｉＲＮＡの皮下用量を４回受けた（Ｑ２Ｗ×４投薬スケジュール）。０、７、１４、２１、３５、４９、６２および７７日目に動物を出血させて、ＡＰＯＣ３の量を評価した。この実験に用いた投薬スケジュールを図１１に概略的に図示する。
０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ用量についての経時変化をそれぞれ図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃに示す。図１２Ａ〜図１２Ｃのデータは、０．３ｍｇ／ｋｇ用量で、試験したｉＲＮＡの各々がＡＰＯＣ３タンパク質の発現を投与前計測値の５０％まで阻害可能であることを実証している。これらのデータはまた、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ用量で、２’Ｆ修飾を含有しないＡＤ−６５６９９が試験した他のｉＲＮＡと比べてＡＰＯＣ３の発現を阻害する有効性が低いことも実証している。これらのデータはさらに、３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−５７５５３、ＡＤ−６５６９６、ＡＤ−６５７０３およびＡＤ−６５７０４を動物に投与した後に最大９４％の相対ＡＰＯＣ３レベルの低下が達成されることを示している。ＡＰＯＣ３レベルのこのノックダウンは最終用量後少なくとも３週間持続する。試験したｉＲＮＡのうちの２つ、ＡＤ−６５６９６およびＡＤ−６５７０４は、最終用量後少なくとも５週間にわたってＡＰＯＣ３タンパク質の約８０％の阻害を維持することが可能であった。
ＡＰＯＣ３過剰発現のＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスモデル系を使用した単回用量タイトレーション研究において、選択されたリード配列のうちの１つ、センス鎖およびアンチセンス鎖上に６つの２’Ｆ修飾を含有するＡＤ−６５７０４を試験した。用量スクリーン実験については、１０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスに、単回用量の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５７０４またはＰＢＳ（対照として）を投与し、１４日後に投与前と比べたＡＰＯＣ３タンパク質レベルを計測した。図１３に提供する結果は、ＡＰＯＣ３発現の８０％阻害を達成するのに有効な用量（ＥＤ８０）が約３ｍｇ／ｋｇであり、一方、ＡＰＯＣ３発現の４０％阻害を達成するのに有効な用量（ＥＤ４０）が１ｍｇ／ｋｇであることを示している。
用量タイトレーション実験については、１０１１個のＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスにＡＤ−６５７０４を０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。各用量レベルについて、隔週で１回、合計４用量を投与した（Ｑ２Ｗ×４投与）。図１４は、最終用量後２０日に計測した、投与前と比べたＡＰＯＣ３タンパク質の量を示す。これらのデータは、ＡＰＯＣ３発現の９０％阻害を達成するのに有効な用量（ＥＤ９０）が≦３ｍｇ／ｋｇであり；ＡＰＯＣ３発現の７０％阻害を達成するのに有効な用量（ＥＤ７０）が１ｍｇ／ｋｇであり；およびＡＰＯＣ３発現の５０％阻害を達成するのに有効な用量（ＥＤ５０）が０．３ｍｇ／ｋｇであることを示している。
この例で提供される結果（図１０〜図１４）は、低フッ素含有量のｉＲＮＡ（ＡＤ−６５７０３およびＡＤ−６５７０４）が、単回３ｍｇ／ｋｇ用量として投与したとき、少なくとも３０日間にわたって持続するＡＰＯＣ３の約８０％のノックダウンを達成することを実証している（図１０を参照）。２週間毎に３ｍｇ／ｋｇ用量を４回投与すると、ＡＰＯＣ３レベルの最大９４％の低下が達成され、９０％超のノックダウンが少なくとも３週間持続する（図１２Ｃを参照）。
超低フッ素含有量のｉＲＮＡ（ＡＤ−６５６９８）の結果は、このｉＲＮＡが、２週間毎に投与する３ｍｇ／ｋｇの４用量で最大８３％のノックダウンを達成可能であり、７５％のノックダウンが最終用量後３週間持続することを示している（図１２Ｃを参照）。フッ素不含のｉＲＮＡ（ＡＤ−６５６９９）の結果は、３ｍｇ／ｋｇの単回用量で、このｉＲＮＡが極めて短期間のノックダウンを達成可能であることを示している。２週間毎に投与する４回の３ｍｇ／ｋｇ用量は、ノックダウンを最大５０％まで増加させることができ、ＡＰＯＣ３レベルは最終用量の投与後２週間以内にベースラインに戻る（図１２Ｃを参照）。
アンチセンス鎖の５’にＶＰを付加すると、ｉＲＮＡがＡＰＯＣ３発現を阻害する能力のブーストがもたらされる。これは、ＶＰを有しない親ｉＲＮＡ ＡＤ−５７５５３で観察される約８０％のノックダウンと比較したときの、ＶＰ含有ＡＤ−６５６９６の単回３ｍｇ／ｋｇ用量後に観察される９４％のＡＰＯＣ３ノックダウンから明らかである（図１０を参照のこと）。ＡＤ−６５６９６による複数用量実験は、３ｍｇ／ｋｇでＡＰＯＣ３の最大９９％のノックダウン、１ｍｇ／ｋｇで約８０％のノックダウンおよび０．３ｍｇ／ｋｇ用量で５０％超のノックダウンをもたらした（図１２Ａ〜図１２Ｃを参照）。
実施例８．ウサギＡＰＯＣ３と交差反応するｉＲＮＡの同定
表７に示すｉＲＮＡ剤を、ウサギＡＰＯＣ３と交差反応するそれらの能力に関して分析した。ウサギＡＰＯＣ３とのミスマッチの数に基づき、ＡＤ−５８９１１、ＡＤ−５８９２４、ＡＤ−５８９２２およびＡＤ−５８９１６がウサギＡＰＯＣ３と交差反応性を有することが決定された。
４つのウサギ交差反応性配列を、センス鎖およびアンチセンス鎖に合計１０個の２’Ｆ修飾を含有するように修飾して、ｉＲＮＡ ＡＤ−６７２２１、ＡＤ−６７２２２、ＡＤ−６７２２３、およびＡＤ−６７２２４を得た。ＡＤ−６７２２１、ＡＤ−６７２２２、ＡＤ−６７２２３、およびＡＤ−６７２２４の非修飾配列および修飾配列は、それぞれ以下の表１１Ａおよび表１１Ｂに提供する。
Figure 2017535552
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ＡＰＯＣ３過剰発現のＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスモデル系を使用した単回投与試験においてこれらのｉＲＮＡを試験した。１０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスに、単回用量の１ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５７０４、ＡＤ−６７２２１、ＡＤ−６７２２２、ＡＤ−６７２２３、ＡＤ−６７２２４、またはＰＢＳ（対照として）を投与し、投与後１４日目および２６日目の投与前と比べたＡＰＯＣ３タンパク質レベルを計測した。図１５に提供される結果は、１４日目に、１ｍｇ／ｋｇではｉＲＮＡ ＡＤ−６７２２２およびＡＤ−６７２２４が活性でなく、ＡＤ−６７２２３はＡＰＯＣ３タンパク質の３０％阻害を示し、およびＡＤ−６７２２１はＡＤ−６５７０４と同等で、１ｍｇ／ｋｇ用量でＡＰＯＣ３タンパク質の約４０％阻害であったことを示している。１４日目においてＡＰＯＣ３タンパク質の当初のサイレンシングはＡＤ−６５７０４とＡＤ−６７２２１との間で同様であるが、２６日目の活性レベルはＡＤ−６５７０４がＡＤ−６７２２１よりも持続的である（それぞれＡＰＯＣ３タンパク質の４６％および３３％阻害を達成する）ことを示している。
実施例９．ビニルリン酸修飾の効果の試験
この研究の目的は、アンチセンス鎖上のビニルリン酸（ＶＰ）および２’Ｆ修飾がＡＰＯＣ３発現を阻害するｉＲＮＡの能力に及ぼす効果を試験することであった。本研究に用いたｉＲＮＡを以下の表１２に要約する。
Figure 2017535552
ｉＲＮＡ剤ＡＤ−６５６９８およびＡＤ−６６２３９は同じセンス鎖を有するが、アンチセンス鎖は異なる。同様に、二重鎖ＡＤ−６５７０１およびＡＤ−６６２４０は同じセンス鎖を有するが、アンチセンス鎖は異なる。ｉＲＮＡ剤ＡＤ−６５７０４およびＡＤ−６６２４１は同じセンス鎖を含有するが、アンチセンス鎖は異なる。ＡＤ−６５６９８、ＡＤ−６５７０１およびＡＤ−６５７０４のアンチセンス鎖は同じであり、ホスホロチオエートを含有する４つのヌクレオチドと、２’−フルオロ修飾を含有する２つのヌクレオチドとを含有する。ＡＤ−６６２３９、ＡＤ−６６２４０およびＡＤ−６６２４１のアンチセンス鎖は同じであり、ホスホロチオエートを含有する４つのヌクレオチドと、２’−フルオロ修飾を含有する９つのヌクレオチドと、アンチセンス鎖の５’末端に１つのビニルリン酸とを含有する。
１０１１個のＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを予め注射したＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスに単回１ｍｇ／ｋｇ用量の表１１に列挙される各ｉＲＮＡまたはＰＢＳ（対照として）を投与し、投与後１０日目および２４日目に、投与前と比べたＡＰＯＣ３タンパク質レベルを計測した。１０日目のデータを図１６Ａに示し、２４日目のデータを図１６Ｂに示す。
これらの結果は、アンチセンス鎖上のＶＰ修飾とセンス鎖の低フッ素含有量との混合適合が活性の同程度のブーストをもたらしたが、しかしながら、センス鎖とＶＰ修飾を有しないアンチセンス鎖との対合と比べて持続期間を改善することはできなかったことを実証している。
実施例１０．ＡＤ−６５７０４ベースのさらなるｉＲＮＡ配列のインビボ試験
ＡＤ−６５７０４化学のＳＡＲ最適化により、１０個のさらなるｉＲＮＡ配列が生じた（表１３）。
ＡＰＯＣ３過剰発現のＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスモデル系を使用した単回投与試験においてこれらのｉＲＮＡを試験した。簡潔に言えば、ＡＰＯＣ３−ＡＡＶマウスに１０１１個のｈＡＰＯＣ３ ＡＡＶゲノムコピーを注射した２週間後、マウス（ｎ＝３）に単回１ｍｇ／ｋｇ用量のｉＲＮＡ剤またはＰＢＳ（対照として）を皮下投与した。投与後１４、２８、および４２日目に、投与前レベルと比べた血清ＡＰＯＣ３タンパク質レベルをＥＬＩＳＡアッセイによって計測した。図１７Ａおよび図１７Ｂに提供する結果は、１４日目に、試験したｉＲＮＡの全てが１ｍｇ／ｋｇで活性であったことを示している。
Figure 2017535552
実施例１１．非ヒト霊長類におけるｉＲＮＡ剤のインビボ試験
実施例１０に記載する結果に基づき、３つのｉＲＮＡ剤、ＡＤ−６５７０４、ＡＤ−６９５３５およびＡＤ−６９５４１を、非ヒト霊長類（ｐｒｉｍｔａｅｓ）における評価に選択した。
カニクイザルで単回および複数用量実験を実施した。一つの実験セットでは、未処置雄カニクイザル（ｎ＝３）に１日目に単回週用量の１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６５７０４を皮下投与し、または未処置雄カニクイザル（ｎ＝３）に１、８、１５、２２、２９、３６、４３、および５０日目に週１回１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６５７０４を皮下投与した。−７、−１、１、８、１１、１５、２２、２９、３６、４３、５７、６４、および７１日目に血清を採取した。カニクイザルＡｐｏＣ３タンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。−７、１２、３０、および６４日目に肝生検を実施し、ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルを決定した。単回投与試験の結果は図１８Ａおよび図１８Ｂに図示し、１ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５７０４の週１回投与が総血清ＡｐｏＣ３の＞８０％の低下および総ＡｐｏＣ３タンパク質の最大５０％の低下（図１８Ｂ）を達成することを実証している。これらのデータはまた、１ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５７０４の週１回投与が、投与前レベルと比較したとき６０％の肝臓ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡの低下を達成することも実証している。図１８Ｃに図示されるとおり、１ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５７０４の週１回投与はＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルを投与前レベルと比べて９５％低下させる。
別の実験セットでは、未処置雄カニクイザル（ｎ＝３）に１日目に単回週用量の１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６５７０４、ＡＤ−６９５３５、またはＡＤ−６９５４１を皮下投与した。−７、−１、１、８、１１、１５、２２、２９、および３６日目に血清を採取した。カニクイザルＡｐｏＣ３タンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。−７、１２、３０、および６４日目に肝生検を実施し、ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルを決定した。これらのデータは、試験した３つ全てのｉＲＮＡ剤の単回１ｍｇ／ｋｇ用量がＡｐｏＣ３タンパク質レベルをベースラインレベルの約５０％に低下させる（ＥＤ５０ タンパク質＝約１ｍｇ／ｋｇ）ことを実証している（図１９Ａ）。図１９Ｂに示されるとおり、単回１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６５７０４がＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡを投与前レベルと比べて６０％低下させ、ＡＤ−６９５３５がＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡを投与前レベルと比べて６８％低下させ、およびＡＤ−６９５４１がＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡを投与前レベルと比べて６４％低下させる（ＥＤ５０ｍＲＮＡ＜１ｍｇ／ｋｇ）。
カニクイザルにおいてＡＤ−６５７０４、ＡＤ−６９５３５、およびＡＤ−６９５４１でさらなる複数用量試験を実施した。未処置雄カニクイザルに１日目に単回１ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６５７０４、ＡＤ−６９５３５、またはＡＤ−６９５４１を皮下投与し、続いて３６日目に単回皮下３ｍｇ／ｋｇ用量の同じ薬剤を投与した。Ｎ＝３／群。−７、−１、１、８、１１、１５、２２、２９、３６、４３、５０、５７、６４、および７１日目に血清を採取した。カニクイザルＡｐｏＣ３タンパク質のレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。−７、１２、３０、および６４日目に肝生検を実施し、ＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルを決定した。図２０Ａは、３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６５７０４またはＡＤ−６９５３５の投与がＡｐｏＣ３タンパク質レベルを投与前レベルと比べて約７０％低下させる（ＥＤ７０ タンパク質＝約３ｍｇ／ｋｇ）ことを実証しており、および図２０Ｂは、３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６５７０４の投与後６４日目にＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルが投与前レベルと比べて８１％低下し、３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６９５３５の投与後６４日目にＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルが投与前レベルと比べて８８％低下し、および３ｍｇ／ｋｇ用量のＡＤ−６９５４１の投与後６４日目にＡｐｏＣ３ ｍＲＮＡレベルが投与前レベルと比べて８４％低下する（ＥＤ８０ｍＲＮＡ≦３ｍｇ／ｋｇ）ことを実証している。
均等物
当業者は、本明細書に記載される具体的な実施形態および方法の多くの均等物を認識し、または常法の域を越えない実験を用いて確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (99)

  1. 細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
    少なくとも一方の鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、および
    前記センス鎖が、３’末端に付加されたリガンドと共役している、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  2. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、および１２、１３に列挙される配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  3. 前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸塩、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’−メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’リン酸または５’リン酸模倣体を含むヌクレオチド、ビニルリン酸を含むヌクレオチド、アデノシン−グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ−異性体を含むヌクレオチド、２−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−５−リン酸を含むヌクレオチド、２’−デオキシチミジン−３’リン酸を含むヌクレオチド、２’−デオキシグアノシン−３’−リン酸を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  4. 前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  5. 前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  6. 前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  7. 前記センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  8. 前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  9. 前記センス鎖のヌクレオチドの全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  10. 少なくとも一方の鎖が少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  11. 少なくとも一方の鎖が少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  12. 細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現の阻害能を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、ＡＰＯＣ３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
    ［式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立して０または１であり；
    ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立して０〜６であり；
    各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾または非修飾のいずれかである０〜２５ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾または非修飾のいずれかである０〜１０ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’（この各々は存在することもまたは存在しないこともある）は、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；
    Ｎｂ上の修飾はＹ上の修飾と異なり、かつＮｂ’上の修飾はＹ’上の修飾と異なる］によって表され；および
    前記センス鎖は少なくとも１つのリガンドと共役している、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  13. ｉが０であり；ｊが０であり；ｉが１であり；ｊが１であり；ｉおよびｊが両方ともに０であり；またはｉおよびｊが両方ともに１である、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  14. ｋが０であり；ｌが０であり；ｋが１であり；ｌが１であり；ｋおよびｌが両方ともに０であり；またはｋおよびｌが両方ともに１である、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  15. 前記ＹＹＹモチーフが前記センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  16. 前記Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、前記アンチセンス鎖の５’末端から１１、１２および１３位に存在する、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  17. 前記Ｙ’が２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロである、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  18. 式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩａ）：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
    によって表される、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  19. 前記二本鎖領域が１５〜３０ヌクレオチド対長である、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  20. 前記二本鎖領域が１７〜２３ヌクレオチド対長である、請求項１９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  21. 前記二本鎖領域が１７〜２５ヌクレオチド対長である、請求項１９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  22. 前記二本鎖領域が２３〜２７ヌクレオチド対長である、請求項１９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  23. 前記二本鎖領域が１９〜２１ヌクレオチド対長である、請求項１９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  24. 前記二本鎖領域が２１〜２３ヌクレオチド対長である、請求項１９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  25. 各鎖が１５〜３０ヌクレオチドを有する、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  26. 各鎖が１９〜３０ヌクレオチドを有する、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  27. 前記ヌクレオチド上の修飾が、表５、９、１０、１１Ｂ、１２、および１３に列挙するとおりの修飾、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  28. 前記ヌクレオチド上の前記修飾が２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロ修飾である、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  29. 前記リガンドが、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  30. 前記リガンドが、
    Figure 2017535552
     である、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  31. 前記リガンドが前記センス鎖の３’末端に付加されている、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  32. 以下の概略図
    Figure 2017535552
     ［式中、ＸはＯまたはＳである］に示されるとおりのリガンドと共役している、請求項３１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  33. 少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  34. 前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の３’末端にある、請求項３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  35. 前記鎖が前記アンチセンス鎖である、請求項３４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  36. 前記鎖が前記センス鎖である、請求項３４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  37. 前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の５’末端にある、請求項３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  38. 前記鎖が前記アンチセンス鎖である、請求項３７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  39. 前記鎖が前記センス鎖である、請求項３７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  40. 前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の５’末端および３’末端の両方にある、請求項３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  41. 前記鎖が前記アンチセンス鎖である、請求項４０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  42. ６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  43. 前記アンチセンス鎖が５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、前記センス鎖が５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項４２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ。
  44. 前記二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位にある塩基対がＡＵ塩基対である、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  45. 前記Ｙヌクレオチドが２’−フルオロ修飾を含有する、請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  46. 前記Ｙ’ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾を含有する、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  47. 前記センス鎖が合計２１ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が合計２３ヌクレオチドを有する、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  48. 表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される、請求項１または１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  49. 細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現の阻害能を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖は５’−ＧＣＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵ−３’（配列番号１３）を含み、かつ前記アンチセンス鎖は５’−ＡＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣＡＡ−３’（配列番号１４）を含み、
    前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
    前記センス鎖は、３’末端に付加されたリガンドと共役し、および
    前記リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  50. 細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現の阻害能を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖は５’−ＧＣＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＵ−３’（配列番号１３）を含み、かつ前記アンチセンス鎖は５’−ＵＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣＡＡ−３’（配列番号１５）を含み、
    前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
    前記センス鎖は、３’末端に付加されたリガンドと共役し、および
    前記リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  51. 細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）の発現の阻害能を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖は５’−ＧＣＵＵＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＵＡＵＵＣＡ−３’（配列番号６５９）を含み、かつ前記アンチセンス鎖は５’−ＵＧＡＡＵＡＣＵＧＵＣＣＣＵＵＵＵＡＡＧＣＡＡ−３’（配列番号６７０）を含み、
    前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
    前記センス鎖は、３’末端に付加されたリガンドと共役し、および
    前記リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  52. 前記センス鎖のヌクレオチドの全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  53. 前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸塩、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’−メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’リン酸または５’リン酸模倣体を含むヌクレオチド、ビニルリン酸を含むヌクレオチド、アデノシン−グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ−異性体を含むヌクレオチド、２−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−５−リン酸を含むヌクレオチド、２’−デオキシチミジン−３’リン酸を含むヌクレオチド、２’−デオキシグアノシン−３’−リン酸を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  54. ２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを１０個以下含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  55. ２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを６個以下含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  56. 前記センス鎖が、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを４個以下含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  57. 前記アンチセンス鎖が、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを６個以下含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  58. 前記アンチセンス鎖が、２’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを２個以下含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  59. 前記アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドに５’−リン酸または５’−リン酸模倣体をさらに含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  60. 前記アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドに５’−リン酸模倣体をさらに含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  61. 前記５’−リン酸模倣体が５’−ビニルリン酸（５’−ＶＰ）である、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  62. 前記リガンドが、
    Figure 2017535552
     である、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  63. 以下の概略図
    Figure 2017535552
     ［式中、ＸはＯまたはＳである］に示されるとおりのリガンドと共役する、請求項６２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  64. 表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ配列を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  65. 以下の配列：
    センス：５’ＧｆｓｃｓＵｆｕＡｆａＡｆａＧｆＧｆＧｆａＣｆａＧｆｕＡｆｕＵｆｃＵｆＬ９６ ３’（配列番号１６）
    アンチセンス：５’ａｓＧｆｓａＡｆｕＡｆｃＵｆｇＵｆｃｃｃＵｆｕＵｆｕＡｆａＧｆｃｓＡｆｓａ ３’（配列番号１７）
    を含むＡＤ−５７５５３である、請求項６４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  66. 以下の配列：
    センス：５’ＧｆｓｃｓＵｆｕＡｆａＡｆａＧｆＧｆＧｆａＣｆａＧｆｕＡｆｕＵｆｃＵｆＬ９６ ３’（配列番号１８）
    アンチセンス：５’ＶＰｕｓＧｆｓａＡｆｕＡｆｃＵｆｇＵｆｃｃｃＵｆｕＵｆｕＡｆａＧｆｃｓａｓａ ３’（配列番号１９）
    を含むＡＤ−６５６９６である、請求項６４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  67. 以下の配列：
    センス：５’ｇｓｃｓｕｕａａＡｆａＧｆＧｆＧｆａｃａｇｕａｕｕｃａＬ９６ ３’（配列番号２０）
    アンチセンス：５’ｕｓＧｆｓａａｕＡｆｃＵｆＧｆｕｃｃｃＵｆｕＵｆｕａａｇｃｓａｓａ ３’（配列番号２１）
    を含むＡＤ−６５７０３である、請求項６４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  68. 以下の配列：
    センス：５’ｇｓｃｓｕｕａａＡｆａＧｆＧｆＧｆａｃａｇｕａｕｕｃａＬ９６ ３’（配列番号２２）
    アンチセンス：５’ｕｓＧｆｓａａｕａｃｕｇｕｃｃｃＵｆｕｕｕａａｇｃｓａｓａ ３’（配列番号２３）
    を含むＡＤ−６５７０４である、請求項６４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  69. 以下の配列：
    センス：５’ｃｓｃｓｃａａｕＡｆａＡｆＧｆＣｆｕｇｇａｃａａｇａａＬ９６ ３’（配列番号７１４）
    アンチセンス：５’ｕｓＵｆｓｃｕｕＧｆｕＣｆＣｆａｇｃｕＵｆｕＡｆｕｕｇｇｇｓａｓｇ ３’（配列番号７１８）
    を含むＡＤ−６７２２１である、請求項６４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  70. 以下の配列：
    センス：５’ｇｓｃｓｕｕａａａａＧｆｇＧｆａｃａｇｕａｕｕｃａ ３’（配列番号７３８）
    アンチセンス：５’ｓＧｆｓａａｕａｃｕｇｕｃＣｆｃＵｆｕｕｕａａｇｃｓａｓａ ３’（配列番号７４９）
    を含むＡＤ−６９５３５である、請求項６４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  71. 以下の配列：
    センス：５’ｇｓｃｓｕｕａａａａＧｆｇＧｆａｃａｇｕ（Ａｇｎ）ｕｕｃａ ３’（配列番号７４４）
    アンチセンス：５’ｕｓＧｆｓａａｕａｃｕｇｕｃＣｆｃＵｆｕｕｕａａｇｃｓａｓａ ３’（配列番号７５５）
    を含むＡＤ−６９５４１である、請求項６４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  72. 修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物であり、前記薬剤が、細胞におけるＡＰＯＣ３の発現の阻害能を有し、かつ表４Ａ、４Ｂ、５、８、９、１０、１１Ａ、１１Ｂ、１２、および１３のいずれか１つに列挙される配列の群から選択されるセンス配列と相補的な配列を含み、前記ポリヌクレオチドが約１４〜約３０ヌクレオチド長である、組成物。
  73. 請求項１、１２、および４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有するベクター。
  74. 請求項１、１２、および４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する細胞。
  75. 請求項１、１２、および４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または請求項７２に記載の修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、または請求項７３に記載のベクターを含む医薬組成物。
  76. 二本鎖ＲＮＡｉ剤が非緩衝液中に存在する、請求項７５に記載の医薬組成物。
  77. 前記非緩衝液が生理食塩水または水である、請求項７６に記載の医薬組成物。
  78. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が緩衝液中に存在する、請求項７６に記載の医薬組成物。
  79. 前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７８に記載の医薬組成物。
  80. 前記緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項７９に記載の医薬組成物。
  81. 細胞におけるアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）発現を阻害する方法であって、
    （ａ）前記細胞を、請求項１、１２、および４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または請求項７２に記載の修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、請求項７３に記載のベクター、または請求項７５〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させるステップ；および
    （ｂ）ステップ（ａ）で生じた前記細胞を、ＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって維持し、それによって前記細胞における前記ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するステップ
    を含む方法。
  82. 前記細胞が対象の体内にある、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記対象がヒトまたはウサギである、請求項７２に記載の方法。
  84. 前記対象がＡＰＯＣ３関連疾患に罹患している、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記ＡＰＯＣ３発現が、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約１００％阻害される、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）関連疾患を有する対象を治療する方法であって、請求項１、１２、および４９〜５１のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または請求項７２に記載の修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、または請求項７３に記載のベクター、または請求項７５〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象を治療するステップを含む、方法。
  87. 前記ＡＰＯＣ３関連疾患が高トリグリセリド血症である、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ＡＰＯＣ３関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、２型真性糖尿病（インスリン抵抗性）、高血圧症、アテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）および膵炎からなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
  89. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８２に記載の方法。
  90. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８９に記載の方法。
  92. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８９に記載の方法。
  93. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が皮下投与される、請求項８２に記載の方法。
  94. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が静脈内投与される、請求項８２に記載の方法。
  95. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が筋肉内投与される、請求項８２に記載の方法。
  96. 前記ＲＮＡｉ剤が２用量以上で投与される、請求項８２に記載の方法。
  97. 前記ＲＮＡｉ剤が、約１２時間に１回、約２４時間に１回、約４８時間に１回、約７２時間に１回、および約９６時間に１回からなる群から選択される間隔で投与される、請求項９５に記載の方法。
  98. 前記対象に追加的な療法剤を投与するステップをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
  99. 前記追加的な療法剤が、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、フィブラート、胆汁酸捕捉剤、ナイアシン、抗血小板剤、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害薬、コレステロール吸収阻害薬、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害薬、コレステロールモジュレーター、胆汁酸モジュレーター、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動薬、遺伝子ベース療法、複合血管保護剤、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害薬、アスピリンまたはアスピリン様化合物、ＩＢＡＴ阻害薬、スクアレンシンターゼ阻害薬、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−Ｉ阻害薬、または魚油からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
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