CN116814621A

CN116814621A - 一种抑制apoc3基因表达的rna抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN116814621A
Application number: CN202310655563.3A
Authority: CN
Inventors: 崔坤元; 卢雪琴
Original assignee: Kylonova Xiamen Biopharma Co Ltd
Current assignee: Kylonova Xiamen Biopharma Co Ltd
Priority date: 2022-08-05
Filing date: 2023-06-05
Publication date: 2023-09-29
Also published as: WO2024027809A1

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，RNA抑制剂包含正义链和反义链，正义链和反义链的链长各自独立地为15‑30个核苷酸，优选为19‑23个核苷酸，正义链和反义链之间至少有80％的碱基互补。RNA抑制剂还包括载体结构5’MVIP和3’MVIP。本申请还涉及包含抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂的药物组合物及其在心脑血管疾病的治疗与预防方面的应用。

Description

一种抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂及其应用。

背景技术

RNA抑制剂

RNA抑制剂(RNA干扰)于1998年，由安德鲁·法厄(Andrew Z.Fire)等在秀丽隐杆线虫中进行反义RNA抑制实验时发现，并将这一过程称为RNA抑制剂。这一发现被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。自此以后，以RNA抑制剂为作用机理的siRNA作为潜在的基因治疗药物得到人们广泛的关注，2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛(Craig C.Mello)由于在RNA抑制剂机制研究中的贡献获得诺贝尔生理或医学奖。RNA抑制剂是在许多生物中，包括动物、植物和真菌，都可由双链RNA(dsRNA)触发的，在RNA抑制剂过程中，一种称为“Dicer”的核酸内切酶将长链dsRNA切割或“切丁”成21～25个核苷酸长的小片段。这些小片段，被称为小干扰RNA(siRNA)，其中的反义链(Guide strand)被加载到Argonaute蛋白(AGO2)上。AGO2加载发生在RISC-loading复合物中，这是一个三元复合物，由Argonaute蛋白、Dicer和dsRNA结合蛋白(简称为TRBP)组成。在装载过程中，正义链(Passenger strand)链被AGO2裂解并排出。然后，AGO2使用反义链与包含完全互补序列的mRNA结合，然后催化这些mRNA的切割，致使mRNA分裂丧失翻译模板的作用，进而阻止相关蛋白质的合成。切割后，被切割的mRNA被释放，加载着反义链的RISC-loading复合物被循环用于另一轮的切割。

据统计，在人体内的疾病相关蛋白中，大约超过80％的蛋白质不能被目前常规的小分子药物以及生物大分子制剂所靶向，属于不可成药蛋白。旨在通过基因的表达、沉默等功能治疗疾病的基因治疗被业界认为是继化学小分子药物、生物大分子药物之后的第三代治疗药物，这种疗法在基因水平上实现对疾病的治疗，不受不可成药蛋白的制约。作为基因治疗中RNA抑制剂技术最主流的类型，RNA抑制剂技术是从mRNA的水平对疾病进行治疗，相比化学小分子药物及生物大分子药物在蛋白质水平的治疗具有更高的效率。利用RNA抑制剂技术，可以根据特定基因序列，设计出特异性高、抑制效果好的siRNA的正义链和反义链序列，通过固相合成这些单链序列，然后正义链与反义链在特定的退火缓冲液中按照碱基配对原则配对成siRNA，最后通过载体系统输送到体内相应靶点，降解目标mRNA，破坏目标mRNA作为翻译模板的功能，从而阻止相关蛋白的合成。

siRNA的递送系统

siRNA在血液和组织中不稳定，容易被核酸酶降解，为了提高siRNA的稳定性，可以通过对siRNA的正义链和/或反义链修饰，但这些化学修饰只提供有限的免受核酸酶降解的保护作用并且可能最终影响siRNA的活性。因此，还需要相应的传递系统来保障siRNA安全高效的穿过细胞膜。由于siRNA分子质量较大，且带有大量负电荷，而且具有高水溶解性，所以自身无法顺利穿越细胞膜到达细胞内。

脂质体基本结构是由亲水核和磷脂双分子层构成，具备类似生物膜的磷脂双分子层，拥有很高的生物相容性，所以脂质体一度成为最受欢迎、应用最广泛的siRNA载体。脂质体介导的siRNA递送主要将siRNA包裹到脂质体内，保护siRNA不被核酸酶降解，提高siRNA的通过细胞膜障碍的效率，从而促进细胞的吸收。例如阴离子脂质体、pH敏感性脂质体、免疫脂质体、膜融合脂质体(fusogenic liposome)和阳离子脂质等等，尽管取得了一定的进展，但脂质体本身容易引发炎症反应，给药前必须使用多种抗组胺和激素类如西利替嗪和地塞米松类等药物，以减少可能发生的急性炎症反应，因此在实际临床应用中并不适合所有治疗领域，尤其一些慢性疾病治疗领域，长期使用可能产生的积蓄毒性是潜在的安全隐患，因此需要一种更安全有效的载体系统来递送siRNA。

肝脏中去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，是肝细胞特异性表达的受体，是一种高效的内吞型受体。由于体内生理情况下各种糖蛋白在酶或酸水解唾液酸后，暴露出的次末端是半乳糖残基，所以ASGPR特异性结合的糖为半乳糖基，故又称半乳糖特异性受体。半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺等单糖和多糖分子都对ASGPR有高亲和性。ASGPR主要生理功能是介导血液中去唾液酸糖蛋白、脂蛋白等物质的清除，且与病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的发生发展有着密切联系。ASGPR这一特性的发现，对肝源性疾病的诊断及治疗起着重要作用(Ashwell G、Harford J，Carbohydrate specific Receptors of the Liver，AnnRev Biochem 1982 51:531-554)。结构中含有半乳糖或半乳糖胺及其衍生物的肝源性疾病治疗药物可以特异性地与ASGPR亲和，从而具有主动肝靶向性，不需要其它的载体系统来输送。

APOC3与心脑血管疾病

APOC3(apolipoprotein C-Ⅲ)为载脂蛋白C3的编码基因，全长约3.1kb，是由79个氨基酸残基构成的8.8kD的糖蛋白，主要在肝脏合成。APOC3具有抑制脂蛋白脂酶和肝脂酶活性的功能，干扰ApoE介导的富含甘油三酯(TG)的脂蛋白与肝脂酶的结合，影响脂质代谢的平衡，容易导致高甘油三酯血症。大量关联研究显示APOC3基因SstⅠ酶切位点多态性与高甘油三酯血症有关，因此也可能与高甘油三酯血症引起的其他心血管疾病有一定关联。

APOC3在富含甘油三酯的脂蛋白代谢中起关键作用。在正常人空腹血浆中主要与高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)(约70％)结合，而高甘油三酯血症患者血浆APOC3水平显著升高，其主要(约86％)与极低密度脂蛋白(VLDL)结合。

国内外研究表明血浆APOC3水平升高可引起高甘油三酯血症，血浆APOC3水平与血浆甘油三酯及极低密度脂蛋白中甘油三酯水平呈正相关。目前，已有大量文献报道APOC3基因功能与动脉冠状粥样硬化、Ⅱ型糖尿病、脑梗死等心脑血管疾病都有一定的相关性。

家族性高乳糜微粒血症(FCS)，又称脂蛋白脂肪酶缺乏症，是一种罕见的常染色体隐性遗传病，亦称原发性高脂蛋白血症Ⅰ型，需长期限制饮食中脂肪的含量。2012年11月之前，FCS并无特效药物可以针对其进行治疗。FCS的临床特征除了增高的甘油三酯外，还会导致反复发作的胰腺炎。2012年11月，欧盟委员会(EC)已批准了西方世界首个基因治疗药物Glybera，但是Glybera的价格非常昂贵。预计每名患者的花费将高达125万欧元(约合160万美元)。市场急需一种能够治疗FCS的特效药，APOC3是脂类代谢调节重要的调节剂，APOC3的功能丢失突变会抑制肝细胞清除富含甘油三酯的脂蛋白颗粒，导致血液中的TG水平和VLDL水平升高，以及HDL-c的水平降低。通过沉默APOC3的表达，来降低有害脂蛋白指标(即TG和VLDL水平)，提升“好”胆固醇HDL-c的水平。APOC3小干扰抑制剂正在被开发用于治疗高甘油三酯血症(HTG)、严重高甘油三酯血症(sHTG)和家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)。给予治疗乳糜微粒血症新的希望。

现有技术已能采用RNA干扰技术抑制APOC3基因表达，但是抑制效率和持续性仍然有待提高，市场需要一种具有更高抑制效率、持续作用更久的RNA抑制剂。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其通过特异性地干扰APOC3基因的mRNA，破坏其作为翻译模板的功能，阻止APOC3蛋白的表达，从而可以预防和/或治疗与APOC3基因介导的相关疾病。本发明的RNA抑制剂具有优秀的APOC3蛋白抑制表达效果，且作用时间持续久，具有很高的医药应用价值。

一方面，本发明提供了一种抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其中，RNA抑制剂由链长各自独立地为15-30个核苷酸的正义链和反义链通过碱基配对形成，其中所述链长各自独立地优选为19-23个核苷酸，并且所述正义链和反义链之间至少有80％的碱基互补。

在一些实施方案中，优选地，反义链选自a)以下序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：5’uugguggcgugcuucauguaatt 3’(SEQ ID NO.212),5’uaacccugcaugaagcugagatt 3’(SEQ IDNO.216),5’uuaacggugcuccaguagucutt 3’(SEQ ID NO.224),5’cagagaacuuguccuuaacggtt3’(SEQ ID NO.225),5’uauugaggucucaggcagccatt 3’(SEQ ID NO.241),5’ugaaguuggucugaccucaggtt 3’(SEQ ID NO.255),5’gcacugagaauacugucccuuuu 3’(SEQ IDNO.256),5’gcacugagaauacugucccuu3’(SEQ ID NO.459),5’acacugagaauacugucccua 3’(SEQ ID NO.461),5’ugaauacugucccuuuuaagc 3’(SEQ ID NO.465),5’cugagaauacugucccuuuua 3’(SEQ ID NO.471)，5’acugagaauacugucccuuua 3’(SEQ IDNO.472)，5’uaauacugucccuuuuaagcaa 3’(SEQ ID NO.438)，5’ugaggucucaggcagccacgg3’(SEQ ID NO.600)，5’uggauaggcagguggacuugg3’(SEQ ID NO.620),5’caggauggauaggcaggugga3’(SEQ ID NO.624)，5’gagcacugagaauacuguccc3’(SEQ IDNO.668),5’acacugagaauacugucgcuc3’(SEQ ID NO.687),5’acacugagaauacugucgcuu3’(SEQ ID NO.700),5’ucacugagaauacugucccuu 3’(SEQ ID NO.519)；

其中，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸，t＝胸苷酸。

需要说明的是：至少15个连续核苷酸各自独立地表示：连续15、16、17、18、19、20、21…等个核苷酸。相差不多于3个核苷酸各自独立地表示：1个、2个或3个不同核苷酸。需要说明的是：以下举例的正义链、反义链并非只能如本发明举例所示的组合方式组成RNA抑制剂。只要是可以互补配对形成双链，正义链、反义链均可以随意组合，不受实施例的限制。

在一些实施方案中，更优选地，正义链和反义链选自a)以下序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列；正义链和反义链的序列组合如下所示：

在本发明所述的RNA抑制剂中，正义链和/或反义链上的一个或多个核苷酸可以被修饰形成带修饰的核苷酸。

优选地，在本发明所述的RNA抑制剂中，正义链和/或反义链包含至少一个2’-修饰核苷酸，2’-修饰核苷酸包括：2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基核苷酸或2’-烷基核苷酸。

更优选地，在本发明所述的RNA抑制剂中，正义链和/或反义链包含至少一个2’-O-甲基核苷酸或2’-脱氧-2’-氟核苷酸。

优选地，在本发明所述的RNA抑制剂中，正义链和/或反义链的末端中至少有一个末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以被硫代。

在上述技术方案中，优选地，正义链和反义链选自a)以下序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：

其中，G＝2’-O-甲基鸟苷酸，A＝2’-O-甲基腺苷酸，U＝2’-O-甲基尿苷酸，C＝2’-O-甲基胞苷酸；fG＝2’-氟鸟苷酸，fA＝2’-氟腺苷酸，fU＝2’-氟尿苷酸，fC＝2’-氟胞苷酸，Gs＝2'-O-甲基-3’-硫代鸟苷酸，As＝2'-O-甲基-3'-硫代腺甘酸，Us＝2'-O-甲基-3'-硫代尿甘酸，Cs＝2'-O-甲基-3'-硫代胞苷酸，fGs＝2’-氟-3'-硫代鸟苷酸，fAs＝2’-氟-3'-硫代腺苷酸，fUs＝2’-氟-3'-硫代尿苷酸，fCs＝2’-氟-3'-硫代胞苷酸，T＝胸苷酸。

在技术方案中，优选地，RNA抑制剂或其药学上可接受的盐还含有载体结构，RNA抑制剂如式Ia、Ib或Ic所示：

其中，

载体结构包括5’MVIP和3’MVIP；

5’MVIP由转接点R₁、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，其通过转接点R₁与正义链5’端或反义链5’端连接，其结构如通式I所示：

(X-L)_n-B-D-R_I-

I

3’MVIP由转接点R₂、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，其通过转接点R₂与正义链3’端或反义链3’端连接，其结构如通式II所示：

(X-L)_m-B-D-R₂-

II

其中，

n和m各自独立地为0-4的任意整数，各自独立地优选为1-3的整数，且n+m＝2-6的整数，优选n+m＝2、3或4，更优选为4；

作为一种实施例，转接点R₁为如下所示的含有N、S或O的杂环或碳环结构：

或者，R₁为-NH(CH₂)_xCH₂O-，其中x为3-12的任意整数，优选为4-6的任意整数；

作为一种实施例，转接点R₂为如下所示的含有N、S或O的杂环或碳环结构：

或者，转接点R₂为-NH(CH₂)_x1CH(OH)(CH₂)_x2CH₂O-，其中x1为1-4的任意整数，x2为0-4的任意整数；

肝靶向特异性配体X在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同，其选自单糖及其衍生物，优选选自N-乙酰半乳糖胺及其衍生物，更优选地选自以下结构：

其中，作为一种实施例，W选自-OH、-NHCOOH和-NHCO(CH₂)_qCH₃中的一种或两种，其中q为0-4的整数；

作为一种实施例，支链L在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同，其选自如下结构中的一种或多种：

其中，r1是1-12的任意整数，r2为0-20的任意整数，Z为H、烷基或酰胺基，烷基如C₁-C₅烷基；

作为一种实施例，接头B在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同，其选自以下结构：

其中，A₁和A₂各自独立地是C、O、S、-NH-、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r为0-4的任意整数；

作为一种实施例，连接链D在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同，其选自以下结构：

其中，每个p各自独立地为1-20的任意整数；s为2-13的任意整数；Z₁和Z₂为相同或者不同的取代基团；

需要说明的是：以上结构均非穷举，只要是与本发明的序列连接的载体，无论公开或未公开的递送方式，靶向任何受体或是任何结构均在本发明的保护范围内。

已公开的运载方式包括：偶联载体递送方式，脂质包裹递送方式。偶联载体递送方式包括：胆固醇偶联、抗体偶联、叶酸偶联、GalNac偶联等；脂质包裹递送方式包括：脂质纳米粒(LNP)、多聚体纳米粒、细胞外囊泡等。

进一步优选地，在本发明所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐中，正义链5’端的载体结构为5’MVIP17，正义链3’端的载体结构为3’MVIP17，正义链5’MVIP和反义链3’MVIP的组合为5’MVIP01/3’MVIP01、5’MVIP01/3’MVIP17、5’MVIP17/3’MVIP01或5’MVIP09/3’MVIP09，或者所述正义链5’MVIP和正义链3’MVIP的组合5’MVIP01/3'MVIP09、5’MVIP09/3'MVIP01或5’MVIP01/3'MVIP01。

更进一步优选地，在本发明所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐中，所述RNA抑制剂选自Ky-12-DS23001、Ky-12-DS25001、Ky-12-DS25401、Ky-12-DS29701、Ky-12-DS29801、Ky-12-DS31701、Ky-12-DS31702、Ky-12-DS31703、Ky-12-DS31704、Ky-12-DS31705、Ky-12-DS31706、Ky-12-DS31707、Ky-12-DS31708、Ky-12-DS31709、Ky-12-DS31711、Ky-12-DS31712、Ky-12-DS31713、Ky-12-DS33001、Ky-12-DS33006、Kylo-12-DS1071、Kylo-12-DS1081、Kylo-12-DS1131、Kylo-12-DS1141、Kylo-12-DS1241、Kylo-12-DS1311、Kylo-12-DS1321、Kylo-12-DS5911、Kylo-12-DS2911、Kylo-12-DS2611、Kylo-12-DS2311、Kylo-12-DS3111和Kylo-12-DS5411中。

另一方面，本发明还提供了上述RNA抑制剂或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或预防与APOC3水平升高相关的疾病的药物中的应用，与APOC3的水平升高相关的疾病包括肝源性疾病，其包括炎性、心脑血管和代谢疾病，其中，所述心脑血管疾病包括高脂血症、中风、动脉粥样硬化、血栓、冠心病、主动脉瓣狭窄、高甘油三酯血症(HTG)、严重高甘油三酯血症(sHTG)或家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)。

再一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括上述抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐和任选的药学上可接受的辅料，其中，所述药学上可接受的辅料可以为药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂，该药物组合物的剂型为口服剂、静脉注射剂或者皮下或肌内注射剂，优选为皮下注射剂。

又一方面，本发明还提供了一种治疗和/或预防与APOC3的水平升高相关的疾病、病症或综合征的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的包含抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐或者包括该RNA抑制剂其药学上可接受的盐和任选的药学上可接受的辅料的药物组合物。其中，向受试者施用方式(给药方式)包括口服、静脉注射、皮下或肌内注射、经直肠或腹膜内施加、雾化吸入。本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：

图1是本申请实施例9中RNA抑制剂干预后hAPOC3 Tg小鼠血清中hAPOC3平均水平示意图；

图2是本申请实施例10中RNA抑制剂干预后对APOC3 mRNA水平抑制效果示意图；

图3是本申请实施例11中RNA抑制剂干预后对HepG 2细胞中APOC3 mRNA水平抑制效果示意图；

图4是本申请实施例12中RNA抑制剂干预后对PHH细胞中APOC3 mRNA水平抑制效果示意图；

图5是本申请实施例13中RNA抑制剂干预后hAPOC3 Tg小鼠血清的平均hAPOC3水平示意图；

图6是本申请实施例13中RNA抑制剂干预后hAPOC3 Tg小鼠血清的平均TG水平示意图；

图7是本申请实施例14中RNA抑制剂干预后hAPOC3 Tg小鼠血清中hAPOC3抑制效果示意图；

图8是本申请实施例14中RNA抑制剂干预后hAPOC3 Tg小鼠血清中TC降低效果示意图；

图9是本申请实施例14中RNA抑制剂干预后hAPOC3 Tg小鼠血清中TG降低效果示意图；

图10是本申请实施例14中RNA抑制剂干预后hAPOC3 Tg小鼠小鼠血清中LDL-c降低效果示意图；

图11是本申请实施例15中RNA抑制剂干预后高脂食蟹猴血清中APOC3抑制效果示意图；

图12是本申请实施例15中RNA抑制剂干预后高脂食蟹猴血清中TG降低效果示意图；

图13是本申请实施例15中RNA抑制剂干预后高脂食蟹猴血清中HDL-c水平变化示意图；

图14是本申请实施例15中RNA抑制剂干预后高脂食蟹猴血清中LDL-c降低效果示意图；

图15是本申请实施例15中RNA抑制剂干预后高脂食蟹猴血清中TC降低效果示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，APOC3 mRNA序列的实例容易利用例如，GenBank、UniProt和OMIM这些公开的数据库取得。术语“APOC3”包括人类APOC3、食蟹猴APOC3、猕猴APOC3、小鼠APOC3、大鼠(褐家鼠)APOC3、兔(穴兔)APOC3等；只要是事实存在的具有APOC3基因的生物体，均在本发明限定的范围内。人类APOC3的mRNA序列可见于例如，GenBank NM_000040.3。食蟹猴APOC3，其氨基酸及其完全编码序列可以在例如GenBank登录号GI:544489959(XM_05579730.1)中找到；猕猴APOC3，其氨基酸及其完全编码序列可以在例如GenBank登录号GI:297269260(XM_001090312.2)中找到；小鼠APOC3，其氨基酸及其完全编码序列可以在例如GenBank登录号GI:577019555(NM_023114.4)中找到；大鼠(褐家鼠)APOC3的氨基酸及其完全编码序列可以在例如GenBank登录GI:402534545(NM_012501.2)中找到；和兔(穴兔)APOC3，GenBank登录号GI:655601498(XM_002708371.2)。

在本申请中，术语“iRNA”、“RNA抑制剂”、“iRNA剂”、“RNA干扰剂”可交换使用，通常指包含如本发明术语所定义的RNA的药剂，且其可通过RNA诱导沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录物的靶向切割。iRNA经由称为RNA干扰(RNA抑制剂)的过程指导mRNA的序列特异性降解。iRNA调控(例如，抑制)APOC3基因在细胞(例如，受试者如哺乳动物受试者中的细胞)中的表达。

在某些实施方式中，RNA抑制剂可为引入细胞或生物体中来抑制靶mRNA的单链siRNA(ssRNA抑制剂)。单链RNA抑制剂结合RISC内切核酸酶Argonaute 2，其然后切割靶mRNA。单链siRNA一般为15至30个核苷酸且经化学修饰。

在某些实施方式中，本申请所使用的“iRNA”是双链RNA，且本发明中称为“双链RNA抑制剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”指核糖核酸分子的复合物，其具有包含两个反向平行且基本上互补的核酸链的双链体结构，称为具有相对于靶RNA(即APOC3基因)的“正义”和“反义”取向。在本申请的一些实施方式中，双链RNA(dsRNA)通过转录后基因沉默机制(本发明中称为RNA干扰或RNA抑制剂)触发靶RNA(例如，mRNA)的降解。

双链体结构可为容许所需的靶RNA通过RISC途径的特异性降解的任何长度，且可在约19至36碱基对的长度范围内，例如，约19-30碱基对的长度，例如，约19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36碱基对的长度。上述范围与长度中间的范围与长度也包括为本申请的部分。在某些实施方式中，本申请的iRNA剂为各链包含15-23个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列(例如，APOC3基因)相互作用以指导靶RNA的切割。在某些实施方式中，本申请的iRNA为24-30个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列(例如，APOC3靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割。

通常，dsRNA分子的各链的大多数核苷酸为核糖核苷酸，但如本发明详细说明的，各链或两条链也可包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或修饰的核苷酸。此外，本说明书所用“iRNA”可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；iRNA可在多个核苷酸处包括实质修饰。本发明所用术语“修饰的核苷酸”意指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷酸间连接或修饰的核碱基，或其任何组合的核苷酸。因此，术语“修饰的核苷酸”涵盖对核苷酸间连接、糖部分或核碱基的例如官能团或原子的置换、添加或移除。适用于本申请药剂的修饰包括本发明所公开或本领域已知的所有类型的修饰。

在本申请中，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸或者其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、siRNA、miRNA、shRNA、RNA抑制剂试剂和引物。多核苷酸可以在一个或多个碱基、糖和/或磷酸酯处以本申请所述或本领域已知的任何各种修饰或取代进行修饰或取代。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分阻断。多聚核苷酸可以在聚合后修饰，例如通过与标记组分偶联。该术语可以是双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本申请作为多核苷酸的任何实施方式包括双链形式和已知或据预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。

在本申请中，术语“靶核酸”或“靶序列”通常指在APOC3基因转录期间所形成mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为主要转录产物的RNA加工产物的mRNA。序列的靶部分应至少足够长以作为在APOC3基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的该部分位置处或附近iRNA指导的切割的底物。在一个实施方式中，该靶序列在APOC3的蛋白质编码区内。靶序列可为约19-36个核苷酸的长度，例如，优选约19-30个核苷酸的长度。上述范围和长度中间的范围和长度也包括为本申请的部分。

在本申请中，术语“核苷酸序列”通常是指一连串或一定顺序的核碱基、核苷酸和/或核苷，无论是经修饰还是未修饰，使用标准核苷酸命名和本申请所述的经修饰的核苷酸的符号表用一连串字母描述。

在本申请中，术语“寡核苷酸”通常是指由多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关的结构变体或合成类似物)通过磷酸二酯键(或其相关的结构变体或合成类似物)连接组成的聚合物。因此，虽然术语“寡核苷酸”一般指其中核苷酸残基和它们之间的连接是天然产生的核苷酸聚合物，但应理解，该术语的范围也包括各种类似物，包括但不限于：肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核酸等。该分子的确切大小可取决于具体应用。寡核苷酸一般长度较短，通常约有10-30个核苷酸残基，但该术语也可指任何长度的分子，尽管术语“多核苷酸”或“核酸”一般用于较大的寡核苷酸。

在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个或多个未修饰的核糖核苷(RNA)和/或未修饰的脱氧核糖核苷(DNA)和/或一个或多个修饰核苷。术语“修饰寡核苷酸”通常意指包含至少一个修饰核苷和/或至少一个修饰的核苷间键联的寡核苷酸。

在本申请中，术语“修饰的核苷”通常意指与天然存在的RNA或DNA核苷相比包含至少一个化学修饰的核苷。修饰的核苷包含修饰的糖部分和/或修饰的核碱基。

在本申请中，术语“核碱基”通常意指杂环嘧啶或嘌呤化合物，它是所有核酸的组分且包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸可包括经修饰的核苷酸或核苷酸模拟物、无碱基位点(Ab或X)或替代物替代部分。如本申请所使用，“核碱基序列”通常意指不依赖于任何糖、键联或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。术语“未修饰的核碱基”或“天然存在的核碱基”通常意指RNA或DNA的天然存在的杂环核碱基：嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。“修饰的核碱基”通常意指并非天然存在的核碱基的任何核碱基。

“g”、“c”、“a”、“t”和“u”各自通常代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指经修饰的核苷酸，具体可以参考表1、2。本领域技术人员非常清楚鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶可以被其他部分替换，而不会显著改变包含带有这种替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于，包含i(肌苷酸)，也叫次黄嘌呤，可以与a、c、u进行碱基配对，有些情况下i也可与g配对，该现象称为摆动现象。因此，包含a、c或u的核苷酸可以在本申请内容中表征的dsRNA的核苷酸序列中被包含例如i的核苷酸替换。在另一种实施例中，寡核苷酸中任何地方的a和c可以分别替换为g和u，以形成与靶mRNA的g-u摆动碱基配对。含有此类置换部分的序列适用于本申请内容中的组成物和方法。

在本申请中，术语“糖部分”通常意指核苷的天然存在的糖部分或修饰的糖部分。术语“天然存在的糖部分”通常意指如在天然存在的RNA中发现的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中发现的脱氧呋喃核糖基。“修饰的糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。

在本申请中，术语“核苷间键联”通常意指寡核苷酸中相邻核苷之间的共价键联。“天然存在的核苷间键联”意指3’至5’磷酸二酯键联。“修饰的核苷间键联”意指除了天然存在的核苷间键联之外的任何核苷间键联。

在本申请中，术语“反义寡核苷酸”是指单链寡核苷酸分子，其具有与靶核酸(例如，目标基因组序列，mRNA前体，或mRNA分子)的相应片段互补的核碱基序列。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为12至30个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸是具有与靶核酸(如APOC3多核苷酸)序列互补的核苷酸序列的未经修饰或经修饰的核酸。

在本申请中，术语“反义链”通常是指RNA抑制剂(例如dsRNA)的包括与靶序列实质上互补的区域的链。在本发明中使用时，术语“互补性区域”通常指反义链上与本申请定义的序列(例如靶序列)实质上互补的区域。当互补性区域与靶序列不完全互补时，错配可以在分子的内部或末端区域。通常，最被容许的错配在末端区域，例如，在5’端和/或3’端的5、4、3或2个核苷酸内。

在本申请中，术语“正义链”(S)通常是指RNA抑制剂的这样一条链，所述链包括与作为在此定义的术语反义链的区域基本互补的区域。“正义”链有时被称为“有义”链，“过客”链或“反引导”链。借助它们的序列，反义链靶向所希望的mRNA，同时正义链靶向不同靶标。因此，如果反义链被掺入RISC中，则正确的靶标被靶向。正义链的掺入可以导致脱靶效应。这些脱靶效应可以通过在正义链上使用修饰或使用5’端帽加以限制。

在本申请中，术语“互补”当用于描述就第二核苷酸序列(如RNA抑制剂反义链)而言的第一核苷酸序列(如RNA抑制剂正义链或APOC3 mRNA)时是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交(形成碱基对氢键)并形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包括沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pairs)或非沃森-克里克碱基对，并且包括天然或经修饰的核苷酸或核苷酸模拟物，只要以上关于它们的杂交能力而言的需求得以实现。“互补”不必需在每个核苷上均具有核碱基互补性。相反，可以容忍一些错配。

在本申请中，术语“完全互补”通常意指第一多核苷酸的连续序列中的全部(100％)碱基将与第二多核苷酸的连续序列中的相同数目的碱基杂交。连续序列可以包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。如本申请所用，“部分互补”通常意指在杂交的核碱基序列对中，第一多核苷酸的连续序列中至少约70％的碱基将与第二多核苷酸的连续序列中相同数目的碱基杂交。如本申请所用，“基本上互补”通常意指在杂交的核碱基序列对中，第一多核苷酸的连续序列中至少约80％的碱基将与第二多核苷酸的连续序列中相同数目的碱基杂交。如本申请所用的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以就在RNA抑制剂的正义链与反义链之间或者在RNA抑制剂的反义链与APOC3 mRNA的序列之间的碱基匹配而言使用。序列同一性或互补性不依赖于修饰。为了测定同一性或互补性的目的，例如，A和fA与U(或T)互补并且与a同一。

在本申请中，术语“同源的”或“同源性”通常是指已经与参考核酸序列的相同核苷酸匹配的主题核酸序列的核苷酸的数量，通常通过序列分析程序(例如，Karlin和Altschul,1990,PNAS 87:2264-2268；Karlin和Altschul,1993,PNAS 90:5873-5877)，或通过目视检查确定。如本发明所使用的，术语“完全同源性”或“完全同源的”一般是指在参考序列和主题核酸序列之间的完全(100％)同源性或“同一性”。如本发明所使用的，术语“基本上同源的”或“基本上同源性”一般是指主题序列与参考序列中相同核苷酸位置的核苷酸共有至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的同源的核苷酸。

在本申请中，术语“配体”通常是指能够共价地或以其它化学方式与生物活性物质(如寡核苷酸)结合的任何化合物或分子。在某些实施方式中，配体能够与另一种化合物例如受体直接或间接地相互作用，与配体相互作用的受体可以存在于细胞表面上，或可替代地可以是细胞内和/或细胞间受体，配体与受体的相互作用可以导致生化反应，或可以仅仅是物理相互作用或结合。

在本申请中，术语“诱导”、“抑制”、“加强”、“升高”、“增加”、“减少”、“降低”等通常表示两个状态之间的定量差异。例如，“有效抑制APOC3的活性或表达的量”意指处理样品中APOC3的活性或表达的水平将低于未处理样品中APOC3活性或表达的水平。所述术语例如适用于表达水平和活性水平。术语“减少”和“降低”可互换使用并且通常表示小于原来的任何变化。“减少”和“降低”是相对的术语，需要在测量前和测量后间进行比较。“减少”和“降低”包括完全耗竭。

在某些实施方式中，术语“降低”可以通过本领域已知标准方法(诸如本申请中描述的那些)检测的，基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达水平/量与相应基因、基因产品例如蛋白质或生物标志物在第二样品中的表达水平/量相比约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或100％的总体降低。在某些实施方式中，术语“降低”指第一样品中基因或生物标志物的表达水平/量的降低，其中该降低是第二样品中相应基因或生物标志物的表达水平/量的至少约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、或0.01倍。在某些实施方式中，第一样品是自受试者获得的样品，而第二样品是参照样品。

在本申请中，术语“表达”通常意指基因最终产生蛋白质的过程。表达包括但不限于转录、转录后修饰(例如，剪接、聚腺苷酸化、添加5’-帽)以及翻译。

在本申请中，术语“药学上可接受的”通常是指不干扰活性成分生物学活性的有效性的一种或多种无毒物质。这类制剂通常可含有盐、赋形剂、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和任选的其它治疗剂。这类药学上可接受的制剂通常也可包含适合给予人的相容性固体或液体填料、稀释剂或包囊材料。用于医药时，盐应该是药学上可接受的盐，但可方便地使用非药学上可接受的盐来制备药学上可接受的盐，不能将它们排除在本申请范围以外。这类药理学和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、硼酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学上可接受的盐也可制备成碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。

在本申请中，术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”通常指包含包封药理活性分子(如核酸分子，例如，iRNA或iRNA从其转录的质粒)的纳米颗粒。所述iRNA可不含有配体或含有配体，如GalNAc衍生物。LNP描述于例如，中国专利号CN103189057B中，其完整内容以引用方式并入本文中。

在本申请中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，还通常包括预防疾病的发作，减缓或逆转疾病的进展，预防或减缓与疾病相关的一种或多种症状的发作，减少和/或减轻与疾病相关的一种或多种症状，降低疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度和/或持续时间和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度的进一步增加，预防、减少或逆转由疾病引起的任何生理损伤，以及通常对正在治疗的患者有益的任何药理学作用。本申请的RNA抑制剂或药物组合物形成可行的治疗剂不需要实现完全治愈或根除疾病的任何症状或表现。如在相关领域中所认识到的，用作治疗剂的药物可降低给定疾病状态的严重程度，但不需要消除疾病的每种表现才能被认为是有用治疗剂。类似地，预防性施用的治疗构成可行的预防剂不需要完全有效地预防病症的发作。简单地在受试者中减少疾病的影响(例如，通过减少其症状的数量或严重程度，或通过提高另一种治疗的有效性，或通过产生另一种有益效果)，或减少疾病发生或恶化的可能性就足够了。

在本申请中，术语“疾病”或“病症”可以互换使用，通常是指受试者与正常状态的任意偏离，例如身体或某些器官的状态的任何变化，妨碍或扰乱了功能的履行，和/或在患病或与其接触的人中引起症状例如不适、机能障碍、痛苦或甚至死亡。疾病或病症还可以称为失调、不适、小病、疾病、紊乱、疾病、生病和身体不适。

本申请中，术语“施用”通常是指通过任意引入或递送途径将本申请药物制剂引入受试者的身体中。可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与所述药物接触的任何方法。所述施用可以包括而不限于静脉内、动脉内、鼻内、腹内、肌内、皮下透皮或口服。每日剂量可以划分成一个、两个或更多个合适形式的剂量以在某个时间段期间的一个、两个或更多个时间施用。

在本申请中，术语“接触”通常是指两种两个或更多个不同类型的物质以任何顺序、任何方式以及任何时长接触在一起。接触可以发生在体内(in vivo)、间接体内(exvivo)或体外(in vitro)。在某些实施方式中，可以是指使本申请的RNA抑制剂或组合物直接接触细胞或组织。在另一些实施方式中，该术语是指使本申请的RNA抑制剂或组合物间接接触细胞或组织。例如，本申请的方法包括其中受试者接触本申请的RNA抑制剂或组合物，然后RNA抑制剂或组合物通过扩散或本领域已知的任何其他主动运输或被动运输过程(化合物通过该过程在体内循环)接触细胞或组织的方法。

在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”通常是指当单独或与另一种治疗剂组合给有疾病发展或疾病复发的风险的受试者施用时抑制疾病的发展或复发的药物量。可以使用本领域技术人员已知的多种方法对治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力进行评估，比如在处于临床试验期间的人类受试者中、在动物模型系统中预测对人类的功效、或者通过在体外测定中测定药剂的活性。在某些实施方式中，“有效量”是指产生预期药理学、治疗性或预防性结果的RNA抑制剂的量。

在本申请中，术语“受试者”通常是指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病的人或非人动物(包括哺乳动物)，诸如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(家禽如鸡和鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。人受试者包括胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包括动物疾病模型。

在本申请中，术语“包括”、“包含”、“具有”、“可以”、“含有”及其变体通常旨在是开放式过渡性短语、术语或词语，其不排除额外行为或结构的可能性。术语“由……组成”通常表示不能存在别的组分(或同样地，特征、整数、步骤等)。

在本申请中，术语“约”通常意指大约、在......的附近、粗略地、或左右。当术语“约”当用于指涉数值范围时，截值或特定数值用于指示所载明的数值可与该列举数值有多达10％的差异。因此，术语“约”可用于涵盖自特定值±10％或更少的变异、±5％或更少的变异、±1％或更少的变异、±0.5％或更少的变异、或±0.1％或更少的变异。

应理解，数字或一系列数字之前的术语“至少”包括与该术语“至少”相邻的数字，及逻辑上包括在内的所有后续数字或整数，即“大于等于”。例如，核酸分子中的核苷酸数目必需为整数。例如，“至少15个核苷酸”意指15、16、17、18、19、20、21或更多个核苷酸；“至少16个核苷酸”意指16、17、18、19、20、21或更多个核苷酸；“至少17个核苷酸”意指17、18、19、20、21或更多个核苷酸；以此类推，当“至少”出现在一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可修饰该系列或范围中每一个数字。

应理解本发明中采用的“不多于”指与该数值相邻且逻辑上较低的值或整数，即“小于等于”，如从上下文逻辑而言，至零。例如，具有“不多于3个核苷酸”指具有3、2或1个核苷酸。当“不多于”出现在一系列数字或范围之前时，应理解，“不多于”可修饰该系列或范围内每个数字。本发明所采用范围同时包括上限与下限。

发明详述

一方面，本发明提供了一种抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐。

在某些的实施方式中，所述RNA抑制剂包括用于抑制在细胞中，如受试者(例如，哺乳动物，如易于发生APOC3相关障碍例如高脂血症的人)的细胞中，APOC3基因的表达的单链寡核苷酸或双链核糖核酸(dsRNA)分子。其中，该dsRNA包括反义链，其具有与在APOC3基因的表达中所形成mRNA的至少一部分互补的互补区。该互补区为约15-30个核苷酸长度(例如，约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16或15个核苷酸长度)。

dsRNA包括两个RNA链，其可在dsRNA使用的条件下互补并杂交形成双链体结构(互补区)。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区。靶序列可源自APOC3基因表达期间形成mRNA的序列。另一条链(正义链)包括与反义链互补的区域，使得在合适条件下组合时，两条链可杂交并形成双链体结构。通常，双链体结构的长度为15至30个碱基对。类似地，与靶序列的互补区的长度为15至30个核苷酸。

在某些实施方式中，dsRNA为约19至约23个核苷酸长度，或约24至约30个核苷酸长度。通常，dsRNA的长度足以用作Dicer酶的底物。例如，本领域公知，长度大于约21-23个核苷酸的dsRNA可用作Dicer的底物。本领域技术人员也了解，被靶向切割的RNA的区域通常为较大RNA分子(通常mRNA分子)的部分。靶的“一部分”为mRNA靶的连续核苷酸，其长度足以允许其为RNA抑制剂指导切割(即经由RISC途径的切割)的底物。

本领域技术人员也应理解，双链体区为dsRNA的主要功能部分，例如，约19至约30碱基对的双链体区，例如，约19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20碱基对。因此在一个实施方式中，为了达到成为靶向所需RNA进行切割的功能性双链体(例如，15-30碱基对)的程度，具有超过30碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子的复合物为dsRNA。

在本发明的一个方面中，本申请的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其包含反义链，其中所述反义链包含至少15个与选自APOC3 mRNA NM_000040.3(SEQ ID NO.1：ctgctcagttcatccctagaggcagctgctccaggaacagaggtgccatgcagccccgggtactccttgttgttgccctcctggcgctcctggcctctgcccgagcttcagaggccgaggatgcctcccttctcagcttcatgcagggttacatgaagcacgccaccaagaccgccaaggatgcactgagcagcgtgcaggagtcccaggtggcccagcaggccaggggctgggtgaccgatggcttcagttccctgaaagactactggagcaccgttaaggacaagttctctgagttctgggatttggaccctgaggtcagaccaacttcagccgtggctgcctgagacctcaataccccaagtccacctgcctatccatcctgcgagctccttgggtcctgcaatctccagggctgcccctgtaggttgcttaaaagggacagtattctcagtgctctcctaccccacctcatgcctggcccccctccaggcatgctggcctcccaataaagctggacaagaagctgctatga)相应位置的核苷酸基本上互补的连续核苷酸或与其相差不超过3个核苷酸的序列。

在某些实施方式中，所述反义链和正义链形成的双链体结构(互补区)，所述互补区包括至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述RNA抑制剂的正义链与表1中的靶序列具有基本上同源性。

表1RNA抑制剂的靶序列

其中，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，c＝胞苷酸，t＝胸苷酸。

在某些实施方式中，所述RNA抑制剂的正义链与表1中的靶序列具有基本上同源性，其选自a)表2中的序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：

表2RNA抑制剂的正义链序列

其中，g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸。

在某些实施方式中，所述RNA抑制剂的反义链选自a)以下序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，或c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：

表3RNA抑制剂的反义链序列

其中g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸。

在一些筛选实施方案中，所述RNA抑制剂选自a)表2中的正义链和表3中的反义链的组合，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：

在某些实施方式中，所述RNA抑制剂选自：a)表5中的序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，或c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：

表5RNA抑制剂

在一些实施方案中，所述RNA抑制剂可以通过本领域技术人员所熟知的细胞转染方式或脂质体-核酸纳米颗粒的方式加药到细胞系中进行序列筛选。专利US9233971B2，US9080186B2，CN102985548B和CN103189057B有关脂质化合物及脂质体-核酸纳米颗粒制备的方法全文引入本说明书。

在一些实施方案中，其中所述的脂质化合物中的两性脂质优选大环脂类化合物D1C1、T1C1、T1C6、T4C4、B2C1、B2C6、B2C7和M10C1。

本领域技术人员公知，具有约19至23碱基对，例如，21碱基对的双链体结构的dsRNA已经被认为能特别有效地诱导RNA干扰(Elbashir等人，EMBO 2001，20：6877-6888)。然而，其他人已发现更短或更长的RNA双链体结构也有效(Chu和Rana(2007)RNA14：1714-1719；Kim等人(2005)Nat Biotech 23：222-226)。可以合理地预期，本领域技术人员可以根据表1-3和5中的一个序列在一端或两端减去或增加几个核苷酸设计成新的序列，这样的序列和本发明的序列相比可以类似地有效。因此，包含与表1-3和5中所示序列具有相同的至少15、16、17、18、19、20、21个连续核苷酸的序列，都应该在本发明的保护范围之内。至少15个连续核酸是指：15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多个连续核苷酸的序列且在抑制APOC3基因表达的能力方面与本发明的序列的抑制效果相差不超过约5、10、15、20、25或30％的序列均包括在本申请保护范围内。

本申请所述dsRNA可进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端，例如，1、2、3或4个核苷酸。核苷酸突出端可包含核苷酸/核苷类似物或其组成，包括脱氧核苷酸/核苷。该突出端可在正义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可存在于dsRNA的反义或正义链的5’端、3’端或两端。该突出端可由一条链长于另一条链所造成，或由相同长度的两条链交错造成。该突出端可与靶mRNA形成错配或其可与所靶向的基因序列互补或可为另一个序列。

dsRNA也可以只含有单一突出端，其可以增强RNA抑制剂的干扰活性，而不影响其整体稳定性。例如，单链突出端可以位于正义链的3’端，或可选地，在反义链的3’端。RNA抑制剂还可以具有平端，位于反义链的5’端(或正义链的3’端)，反之亦然。通常，RNA抑制剂的反义链在3’端具有核苷酸突出端，而5’端是平端。

在某些实施方式中，突出端存在于正义链、反义链或两条链的3’端。在某些实施方式中，此3’-突出端存在于反义链中。在某些实施方式中，此3’-突出端存在于正义链中。

在某些实施方式中，所述dsRNA是21个核苷酸长的双端平端体。

在某些实施方式中，所述dsRNA具有21个核苷酸长度，且正义链和反义链在3’端均具有2个核苷酸的突出端。

在某些实施方式中，所述dsRNA的正义链具有19个核苷酸长度，反义链具有21个核苷酸长度，且反义链在3’端具有2个核苷酸的突出端。

在某些实施方式中，所述dsRNA的正义链具有21个核苷酸长度，反义链具有23个核苷酸长度，且反义链在3’端具有2个核苷酸的突出端。

为了增强本申请所述的RNA抑制剂在体内的稳定性，在不影响其活性甚至增强其活性的情况下，可以对上述RNA抑制剂的正义链和反义链进行修饰，其中的核苷酸可以有修饰基团，可以整条链或者部分修饰。在某些实施方式中，所述正义链和/或反义链上的一个或多个核苷酸被修饰以形成修饰的核苷酸。

在某些实施方式中，本申请的RNA抑制剂(例如，dsRNA)的RNA未修饰，且不包含例如，本领域已知及本发明所述的化学修饰或偶联。在其他实施方式中，本申请的RNA抑制剂(例如，dsRNA)的RNA经化学修饰以加强稳定性或其他有利特性。本申请的其他实施方式中，本申请的RNA抑制剂的所有核苷酸或基本上所有核苷酸被修饰，即RNA抑制剂的链存在不超过5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。

如本申请所述的核酸可采用本领域上公知的方法合成和/或修饰，如那些描述于“Current protocols in nucleic acid chemistry”，Beaucage，S.L.等人(编辑)，JohnWiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA中的，其以引用方式并入本发明中。修饰包括例如，末端修饰，例如，5’端修饰(磷酸化、偶联、反向连接)或3’端修饰(偶联、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如，使用稳定化碱基、失稳碱基或用与扩异展的伴体库碱基配对的碱基替代、移除碱基(无碱基核苷酸)或偶联碱基；糖修饰(例如，2’-位或4’-位)或糖的替代；或主链修饰，包括磷酸二酯连接的修饰或替换。在本申请提供的RNA抑制剂中，所述RNA抑制剂的正义链和反义链均不需要均匀修饰，可在其单个核苷酸中掺入一种或一种以上的修饰。

在某些实施方式中，所述修饰的核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、核苷酸模拟物、脱碱基核苷酸、2’-修饰核苷酸、3’至3’连接(倒置)核苷酸、含非天然碱基的核苷酸、桥接核苷酸、肽核酸(PNA)、解锁的核碱基类似物、锁定核苷酸、3’-O-甲氧基(2’核苷间连接)核苷酸、2’-F-阿拉伯糖核苷酸、5’-Me/2’-氟带核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、含乙烯基膦酸酯的核苷酸和含环丙基膦酸酯的核苷酸。

在某些实施方式中，所述2’-修饰核苷酸包括2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基核苷酸和2’-烷基核苷酸。

在某些实施方案中，所述正义链5’端开始的奇数位的核苷酸糖基2’位部分或全部是氟。

在某些实施方案中，所述正义链至少有3个或4个核苷酸的糖基2’位是氟。

在某些实施方案中，所述反义链5’端开始的偶数位的核苷酸糖基2’位部分或全部是氟。

在某些实施方案中，所述反义链至少有2个或4个核苷酸的糖基2’位是氟。

在某些实施方式中，所述反义链5’端开始的第2、4、6、8、14、16位核苷酸糖基2’位至少一个是氟。例如，所述反义链5’端开始的第2、4、6、8、14、16位核苷酸糖基2’位均是氟。

在某些实施方式中，所述反义链除了5’端开始的第2、4、6、8、14、16位核苷酸之外，其余的核苷酸糖基的2’位至少一个是甲氧基。

在某些实施方式中，所述正义链5’端开始的第9、10、11位核苷酸糖基2’位至少一个是氟。例如，所述正义链5’端开始的第9、10、11位核苷酸糖基2’位均是氟。

在某些实施方式中，所述正义链除了5’端开始的第9、10、11位核苷酸之外，其余的核苷酸糖基的2’位的至少一个是甲氧基。

在某些实施方式中，所述正义链除了5’端开始的第7、9、10、11位核苷酸之外，其余的核苷酸糖基的2’位的至少一个是甲氧基。

例如，所述正义链和/或反义链的部分或全部核苷酸糖基2’位的-OH可以被取代，其中，所述取代基团为氟或甲氧基，优选从正义链5’端开始的第9、10、11位的核苷酸糖基2’位是氟且从反义链的5’端开始的第2、4、6、8、14、16、18、20位核苷酸2’位是氟，其余的核苷酸糖基2’位均是甲氧基，或优选从正义链5’端开始的第5、7、8、9位的核苷酸2’位是氟且从反义链的5’端开始的第7、12、14位核苷酸糖基2’位是氟，其余的核苷酸糖基2’位均是甲氧基。

在一些实施方式中，所述正义链和/或反义链的核苷酸之间存在至少两个连续的硫代磷酸酯键。

在一些实施方式中，所述正义链末端和/或反义链末端至少有一端的3个连续的核苷酸之间存在至少两个连续的硫代磷酸酯键。

例如，所述正义链和反义链的5’端和3’端的3个连续的核苷酸之间存在至少两个连续的硫代磷酸酯键。

又例如，从正义链5’端开始的第9、10、11位的核苷酸糖基2’位是氟且从反义链的5’端开始的第2、4、6、8、14、16、18、20位核苷酸糖基2’位是氟，其余的核苷酸糖基2’位均是甲氧基，并且所述正义链和反义链的5’端和3’端的3个连续的核苷酸之间存在至少两个连续的硫代磷酸酯键。

在一些实施方式中，所述正义链的部分核苷酸2’位是氟或甲氧基，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以被硫代。从正义链5’端开始的第5、7、8、9位或者第3、5、7、9、11、13、15的核苷酸2’位是氟，其余的核苷酸2’位是甲氧基，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以被硫代。

在一些实施方式中，所述正义链的部分核苷酸2’位是氟或甲氧基，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以被硫代。从正义链5’端开始的第9、10、11位或者第3、5、7、9、11、13、15和/或17的核苷酸2’位是氟，其余的核苷酸2’位是甲氧基，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以被硫代。

在一些筛选实施方案中，正义链和反义链的3’端可以分别悬挂两个tt，所述RNA抑制剂的正义链和反义链选自a)表6中序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：

表6RNA抑制剂

其中g＝鸟苷酸，a＝腺苷酸，u＝尿苷酸，c＝胞苷酸，t＝胸苷酸。

在一些实施方案中，所述正义链的部分核苷酸2’位是氟，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以硫代。

在一些实施方案中，RNA抑制剂中的正义链优先选自下列表6-1和表6-2中的正义链序列。

表6-1正义链的修饰序列

表6-2正义链的修饰序列

其中，G＝2’-O-甲基鸟苷酸，A＝2’-O-甲基腺苷酸，U＝2’-O-甲基尿苷酸，C＝2’-O-甲基胞苷酸；fG＝2’-氟鸟苷酸，fA＝2’-氟腺苷酸，fU＝2’-氟尿苷酸，fC＝2’-氟胞苷酸，Gs＝2'-O-甲基-3’-硫代鸟苷酸，As＝2'-O-甲基-3'-硫代腺甘酸，Us＝2'-O-甲基-3'-硫代尿甘酸，Cs＝2'-O-甲基-3'-硫代胞苷酸，fGs＝2’-氟-3'-硫代鸟苷酸，fAs＝2’-氟-3'-硫代腺苷酸，fUs＝2’-氟-3'-硫代尿苷酸，fCs＝2’-氟-3'-硫代胞苷酸，T＝胸苷酸，Ts＝3'-硫代胸苷酸。

在某些实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂的正义链选自：a)表6-1和表6-2中的序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，或c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列。

在一些实施方案中，所述反义链的部分核苷酸2’位是氟，且所述反义链的末端至少有3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以硫代，所述RNA抑制剂中的反义链优先选自a)表7-1和表7-2中的序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，或c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：

表7-1反义链的修饰序列

表7-2反义链的修饰序列

其中，G＝2’-O-甲基鸟苷酸，A＝2’-O-甲基腺苷酸，U＝2’-O-甲基尿苷酸，C＝2’-O-甲基胞苷酸，fG＝2’-氟鸟苷酸，fA＝2’-氟腺苷酸，fU＝2’-氟尿苷酸，fC＝2’-氟胞苷酸，Gs＝2'-O-甲基-3’-硫代鸟苷酸，As＝2'-O-甲基-3'-硫代腺甘酸，Us＝2'-O-甲基-3'-硫代尿甘酸，Cs＝2'-O-甲基-3'-硫代胞苷酸，fGs＝2'-氟-3’-硫代鸟苷酸，fAs＝2'-氟-3'-硫代腺甘酸，fUs＝2'-氟-3'-硫代尿甘酸，fCs＝2'-氟-3'-硫代胞苷酸，T＝胸苷酸。

在某些实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂的反义链选自：a)表7-1和表7-2中的序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列。

在某些实施方案中，所述RNA抑制剂中正义链与反义链选自下表8。

表8序列被修饰的RNA抑制剂

在某些实施方式中，通过在载体中引入靶组织受体的配体，以改变RNA抑制剂的分布、靶向或稳定性。例如，与不存在配体的物种相比，专属性的配体可以提供针对所选靶(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室、身体组织、器官或区域))的增强的亲和力。

配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、茁霉多糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如合成的聚氨基酸。

配体也可以包括靶向基团，例如与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。在某些实施方式中，该配体为多价半乳糖，例如，N-乙酰基-半乳糖胺。

本发明所述的RNA抑制剂所包含的正义链和反义链可以通过固相合成的公知技术方便且常规地制备。可另外地或替代地使用本领域中已知的用于这类合成的任何其他方法，如液相合成或发酵。使用相似的技术来制备其他寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)也是已知的。

在某些实施方式中，除了可商购以及寡核苷酸合成中常规使用的标准核苷亚磷酰胺单体以及非标准核苷亚磷酰胺单体之外，本申请的寡核苷酸或连接的核苷酸可以通过自动合成仪使用衍生自载体-核苷亚磷酰胺单体的亚磷酰胺法合成。

在某些实施方式中，本发明所述配体缀合的方式通过载体结构偶联于反义链的5’端和/或3’端，和/或正义链的5’端和/或3’端。

例如，所述载体结构可以偶联于正义链的5’端和/或3’端；或所述载体结构可以偶联于反义链的5’端，且所述载体结构偶联于正义链的3’端；或所述载体结构可以偶联于反义链的3’端，且所述载体结构偶联于正义链的5’端。

在某些实施方式中，所述载体结构包括5’MVIP和3’MVIP，其中，所述5’MVIP偶联在所述正义链和/或反义链5’端，所述3’MVIP偶联在所述反义链和/或正义链3’端，所述5’MVIP的结构如式I所示，所述3’MVIP结构如式II所示，

(X-L)_n-B-D-R_I-，

I

(X-L)_m-B-D-R₂-，

II

其中，

X为肝靶向特异性配体；

L为支链；

B为接头；

D为连接链；

R₁和R₂为转接点；

所述5’MVIP通过转接点R₁与正义链5’端或反义链5’端连接，所述3’MVIP通过转接点R₂与正义链3’端或反义链3’端连接，n和m各自独立地为0-4的任意整数，且n+m＝2-6的整数，优选n+m＝2、3或4，更优选为4。

在某些实施方式中，所述R₁或R₂与所述正义链或反义链的连接通过磷酸酯或经修饰的磷酸酯，R₁或R₂优选地通过磷酸酯或硫代磷酸酯与所述正义链或反义链相连接。

在某些实施方式中，m或n可以为0，即不存在3’MVIP或5’MVIP。

在某些实施方案中，当n＝0(即不存在5’MVIP)时，所述3’MVIP的结构可以为：

在某些实施方案中，当n＝1时，所述3’MVIP的结构可以为：

在某些实施方案中，当n＝2时，所述3’MVIP的结构可以为：

在某些实施方案中，当n＝3时，所述3’MVIP的结构可以为：

在某些实施方案中，当n＝4时，所述3’MVIP的结构可以为：

在某些实施方案中，所述的n是指同时放在所述RNA抑制剂的正义链和反义链5’端5'MVIP中n之和，所述的m是指同时放在所述RNA抑制剂的正义链和反义链3’端3'MVIP中m之和。

在某些实施方案中，所述R₁和R₂结构中带有-NH-、-S-和/或-O-，R₁和R₂通过结构中-NH-、-S-或-O-分别与连接链D以及正义链和/或反义链5’端和3’端相连，R₁和R₂相同或不相同。

在某些实施方案中，所述R₁和R₂是任选直链，或带有酰胺基、羧基或烷基类支链的直链或者环状结构，所述环状结构包括饱和或不饱和的脂肪族碳环基，或者含有硫、氧或氮原子的五元或六元杂环基或芳香烃基。

在某些实施方案中，所述R₁和/或R₂为-E₁(CH₂)_xCH₂E₂-，其中x为3-12的任意整数，基团E₁和E₂可以分别为-NH-、-S-或-O-。

在某些实施方案中，所述R₁和/或R₂为-E₁(CH₂)_x1CH(OH)(CH₂)_x2E₂-，其中x1或x2各自独立地为3-10的任意整数，E₁和E₂可以分别为-NH-、-S-或-O-。

在某些实施方案中，所述R₁为如下所示的含有N、S或O的杂环或碳环结构：

在某些实施方式中，所述转接点R₁为-NH(CH₂)_xCH₂O-，其中x为3-12的任意整数，优选为4-6的任意整数，可以通过以下两种亚磷酰胺单体的方式引入。

i.R₁结构中的一个-O-或-S-用于R₁亚磷酰胺单体的合成，通过固相合成的方法接入RNA抑制剂正义链或反义链的5’端。结构中-NH-、-S-或-O-用于与5'MVIP中的连接链D连接，从而在RNA抑制剂中的正义链或反义链的5’端引入肝靶向特异性配体X。引入到RNA抑制剂正义链或反义链5’端的单体示例性结构如下：

在某些实施方案中，优选以下结构：

ii.R₁结构中的一个-NH-、-S-或-O-先与连接链D连接，另外一个-NH-、-S-或-O-用于5'MVIP亚磷酰胺单体的合成中与亚磷酰胺成酯，正义链或反义链5’MVIP亚磷酰胺单体结构示例如下：

在某些实施方案中，正义链或反义链5’MVIP亚磷酰胺单体优选以下结构：

当通式中n为1-4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的单体化合物，借助上述的单体化合物，肝靶向特异性配体X通过固相合成被引入到正义链或反义链5’端。

在某些实施方案中，所述转接点R₁为-NH(CH₂)_xCH₂O-，其中x可以是3-12的任意整数，优选为4-6的任意整数。

在某些实施方案中，5'MVIP亚磷酰胺单体结构选自如下结构中：

在某些实施方式中，所述转接点R₂为如下所示的含有N、S或O的杂环或碳环结构：

在某些实施方式中，所述转接点R₂为-NH(CH₂)_x1CH(OH)(CH₂)_x2CH₂O-，其中x1为1-4的任意整数，x2为0-4的任意整数。

本申请所述的转接点R₂是通过丁二酸酐与R₂结构中-NH-、-S-或-O-成酯或酰胺的同时，又与空白Solid Support中-NH-进行偶联，形成3'MVIP solid spport，再通过亚磷酰胺固相合成法，将3’MVIP引入到正义链或反义链的3’端。

在某些实施方案中，所述转接点R₂结构中的杂环为吡咯环或哌啶环，其通过环中的氮杂原子与3'MVIP的连接链D连接，引入3'MVIP solid spport示例性结构如下：

当通式中m为1-4时，上述的单体中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的Solid Support。

在某些实施方案中，所述转接点R₂为-B₄(CH₂)_x1CH(OH)(CH₂)_x2CH₂B₅-，其中x1为1-4的任意整数，x2为0-4的任意整数，B₄和B₅分别为-NH-、-S-或-O-，引入3’MVIP solid spport示例性结构如下：

在某些实施方案中，R₂为-NHCH₂CH(OH)CH₂O-，引入3’MVIP solid spport示例性结构如下：

在某些实施方案中，3’MVIP solid support结构如下：

在某些实施方式中，所述肝靶向特异性配体X选自用于增强肝细胞对RNA抑制剂的摄取的结构，可以是脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多胺及肽模拟结构。在本申请提供的RNA抑制剂中，引入所述RNA抑制剂正义链或反义链末端的肝靶向特异性配体X可以相同，也可以不同，例如在特性上，有些可以是增强肝靶向性，有些可以是所述RNA抑制剂在体内药代动力学的调节结构，有些可以是具有体内溶解活性的结构。在某些实施方案中，所述肝靶向特异性配体X选自以下结构中的一种或多种单糖及其衍生物。

在某些实施方式中，所述单糖选自以下结构中的一种或多种：甘露糖、半乳糖、D-阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、木糖、葡糖胺、核糖。所述单糖衍生物选自甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、葡萄糖衍生物、核糖衍生物以及其他衍生物。

在某些实施方式中，所述肝靶向特异性配体X选自半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺及其衍生物，其结构通式如下：

其中，W₁为氢或羟基保护基，可以相同也可以不同；W为-OH、-NHCOOH或-NHCO(CH₂)_qCH₃，其中q为0-4的整数；W₂为-NH-、O、S或C。

在某些实施方式中，所述肝靶向特异性配体X为N-乙酰半乳糖胺及其衍生物。

在某些实施方式中，所述肝靶向特异性配体X选自以下结构：

其中，W选自-OH、-NHCOOH或-NHCO(CH₂)_qCH₃中的一种或两种，其中q为0-4的整数。

在某些实施方案中，所述肝靶向特异性配体X在同一个5'MVIP或3'MVIP结构中可以相同，也可以不同。

在某些实施方案中，5'MVIP与3'MVIP彼此之间的X可以相同，也可以不同。

在某些实施方式中，所述支链L是含有-NH-、-C(＝O)-、-O-、-S-、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、C₄-C₁₀脂肪族碳环基、苯基或者这些基团的组合的C₄-C₁₈碳链。

在某些实施方式中，所述支链L还带有羟乙基或羧酸类的侧链。

在某些实施方式中，所述支链L为含有酰胺基或六元脂肪族碳环基的C₇-C₁₈碳链。

在某些实施方式中，所述支链L选自如下结构中的一种或多种：

其中，r1是1-12的任意整数，r2为0-20的任意整数，Z为H、烷基或酰胺基，所述烷基如C₁-C₅烷基。

在某些实施方式中，所述接头B的结构与能引入的X的数量有关，所述接头B中含-NH-、C、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基，当n或m为1时，其为一条直链，当n或m为2、3或4时，其分叉的次数分别为2、3或4。

在某些实施方式中，所述接头B选自以下结构：

其中，A₁和A₂各自独立地是C、O、S、-NH-、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r为0-4的整数。

在某些实施方式中，所述接头B选自以下结构：

其中，r为0-4的任意整数。

在某些实施方式中，所述接头B选自以下结构：

在某些实施方式中，所述连接链D是含有-NH-、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、芳香烃基、C₄-C₁₀脂肪族碳环基、含1-3个氮的五元或六元杂环基或者这些基团的组合的C₃-C₁₈碳链。

在某些实施方式中，所述连接链D还带有羟甲基、甲基叔丁基、甲基苯酚基、C₅-C₆脂肪环基的侧链。

在某些实施方式中，所述连接链D为含有两个C＝O、六元脂肪族碳环基或苯基的C₃-C₁₀碳链。

在某些实施方式中，所述连接链D为含两个C＝O的C₃-C₁₀碳链。

在某些实施方式中，所述连接链D选自以下结构：

其中，每个p各自独立地为1-20的任意整数；s为2-13的整数；Z₁和Z₂为相同或者不同的取代基团，如C₃-C₁₀烷基。

在某些实施方式中，所述连接链D选自以下结构：

在某些实施方式中，所述5’MVIP结构中的(X-L)_n-B-D-和3’MVIP结构中的(X-L)_m-B-D-选自以下结构中的一种或多种：

在某些实施方式中，所述X、L、B及D在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同。

在某些实施方案中，所述5’MVIP结构中的(X-L)_n-B-D-选自表9所示的结构：

表9 5’MVIP的(X-L)_n-B-D-结构

在某些实施方案中，5’MVIP也可以不存在，这时候m可以为2-4的任意整数。

在某些实施方案中，所述3’MVIP结构中的(X-L)_m-B-D-选自表10中所示的结构：

表10 3’MVIP的(X-L)_m-B-D-结构

在某些实施方案中，所述载体结构5’MVIP中的(X-L)_n-B-D-与R₁的组合如表11所示。

表11 5’MVIP中(X-L)_n-B-D-与R₁的组合

在某些实施方案中，3’MVIP可以不存在，这时候n可以是2-4的任意整数。

在某些实施方案中，所述载体结构3’MVIP中的(X-L)_m-B-D-与R₂组合如表12所示。

表12 3’MVIP的(X-L)_m-B-D-与R₂组合

在某些实施方式中，所述5’MVIP选自表11中5’MVIP01至5’MVIP22中的任一个或多个。

在某些实施方式中，所述3’MVIP选自表12中3’MVIP01至3’MVIP27中的任一个或多个。

在某些实施方式中，表11中的5’MVIP与表12中的3’MVIP任一个存在组合的可能性，其中n+m＝2、3、4、5或6。

在一些实施方案中，所述RNA抑制剂中的正义链可以选自下列表13中的序列。

表13与5’MVIP09偶联的正义链

正义链代码	正义链序列5'→3'
		S19301	5'MVIP09-GsAsGCfACfCfGfUUAAGGACAAGsUsU
S19401	5'MVIP09-GsCsACfCGfUfUfAAGGACAAGUUsCsU
		S19501	5'MVIP09-UsUsACAUGAfAfGfCACGCCACCsAsA
S19601	5'MVIP09-UsCsUCAGCUfUfCfAUGCAGGGUsUsA
		S19701	5'MVIP09-GsCsUUfCAfGfUfUCCCUGAAAGAsCsU
S19801	5'MVIP09-UsUsCCfCUfGfAfAAGACUACUGGsAsG
		S19901	5'MVIP09-AsGsACUACUfGfGfAGCACCGUUsAsA
S20001	5'MVIP09-CsCsGUUAAGfGfAfCAAGUUCUCsUsG
		S20101	5'MVIP09-CsUsGCfCCfCfUfGUAGGUUGCUUsAsA
S20201	5'MVIP09-CsAsGUfAUfUfCfUCAGUGCUCUCsCsU
		S20301	5'MVIP09-UsGsGCUGCCfUfGfAGACCUCAAsUsA
S20401	5'MVIP09-GsAsGCfUCfCfUfUGGGUCCUGCAsAsU
		S20501	5'MVIP09-CsCsUGAGGUfCfAfGACCAACUUsCsA
S20601	5'MVIP09-AsAsGGGACAfGfUfAUUCUCAGUsGsC

在某些实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂的正义链与表13中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸，或与表13中序列具有相同的至少15、16、17、18、19、20、21个连续核苷酸的序列。

在某些实施方案中，所述RNA抑制剂中的反义链可以选自下列表14中的序列。

表14与3’MVIP09偶联的反义链

反义链代码	反义链序列5'→3'
		AS19301	AsAsCUUGfUCCUUfAAfCGGUGCsUsC-3'MVIP09
AS19401	AsGsAACUfUGUCCfUUfAACGGUsGsC-3'MVIP09
		AS19501	UsfUsGfGUfGGfCGUGCUfUCfAUGUsAsA-3'MVIP09
AS19601	UsfAsAfCCfCUfGCAUGAfAGfCUGAsGsA-3'MVIP09
		AS19701	AsGsUCUUfUCAGGfGAfACUGAAsGsC-3'MVIP09
AS19801	CsUsCCAGfUAGUCfUUfUCAGGGsAsA-3'MVIP09
		AS19901	UsfUsAfACfGGfUGCUCCfAGfUAGUsCsU-3'MVIP09
AS20001	CsfAsGfAGfAAfCUUGUCfCUfUAACsGsG-3'MVIP09
		AS20101	UsUsAAGCfAACCUfACfAGGGGCsAsG-3'MVIP09
AS20201	AsGsGAGAfGCACUfGAfGAAUACsUsG-3'MVIP09
		AS20301	UsfAsUfUGfAGfGUCUCAfGGfCAGCsCsA-3'MVIP09
AS20401	AsUsUGCAfGGACCfCAfAGGAGCsUsC-3'MVIP09
		AS20501	UsfGsAfAGfUUfGGUCUGfACfCUCAsGsG-3'MVIP09
AS20601	GsfCsAfCUfGAfGAAUACfUGfUCCCUUsUsU-3'MVIP09

在某些实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂的反义链与表14中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸，或与表14中序列具有相同的至少15、16、17、18、19、20、21个连续核苷酸的序列。

在一些体内试验实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂选自表15中的序列。

表15含5’MVIP09/3’MVIP09组合的RNA抑制剂

RNA抑制剂	正义链代码	反义链代码
			Kylo-12-DS1041	S19301	AS19301
Kylo-12-DS1051	S19401	AS19401
			Kylo-12-DS1071	S19501	AS19501
Kylo-12-DS1081	S19601	AS19601
			Kylo-12-DS1091	S19701	AS19701
Kylo-12-DS1111	S19801	AS19801
			Kylo-12-DS1131	S19901	AS19901
Kylo-12-DS1141	S20001	AS20001
			Kylo-12-DS1181	S20101	AS20101
Kylo-12-DS1221	S20201	AS20201
			Kylo-12-DS1241	S20301	AS20301
Kylo-12-DS1261	S20401	AS20401
			Kylo-12-DS1311	S20501	AS20501
Kylo-12-DS1321	S20601	AS20601

在某些实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂的正义链和反义链与表15中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸，或与表15中序列具有相同的至少15、16、17、18、19、20、21个连续核苷酸的序列。

需要说明的是：表13、14、15的组合方式都不是穷举，本发明的序列可以连接任何结构的MVIP，且不限制连接位点和连接数量。连接位点不受限制是指：可以是连接在5’端也可以连接在3’端，也可以不连接在端部。连接数量不受限制是指：可以是连接一个或多个，数量不受限制。

在某些实施方案中，所述RNA抑制剂的反义链UsfAsAfCCfCUfGCAUGAfAGfCUGAsGsA(SEQ ID NO:382)的5’端和/或3'端与不同结构的5'MVIP和/或3'MVIP连接，所述反义链及其载体结构选自下表16：

表16 5'MVIP和/或3'MVIP偶联的反义链

在某些实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂的反义链与表16中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸，或与表16中序列具有相同的至少15、16、17、18、19、20、21个连续核苷酸的序列。

在某些实施方案中，与表16中5'MVIP和/或3'MVIP偶联的反义链可以是表7-1和表7-2中的序列与5'MVIP和/或3'MVIP偶联得到。

在某些实施方案中，所述RNA抑制剂的正义链UsCsUCAGCUfUfCfAUGCAGGGUsUsA(SEQ ID NO:412)的5’端和/或3'端与不同结构的5'MVIP和/或3'MVIP连接，所述正义链及其载体结构选自下表17：

表17 5'MVIP和/或3'MVIP偶联的正义链

在某些实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂的正义链与表17中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸，或与表17中序列具有相同的至少15、16、17、18、19、20、21个连续核苷酸的序列。

在某些实施方案中，所述RNA抑制剂的反义链AsfCsAfCUfGAfGAAUACfUGfUCfGCsfUsC(SEQ ID NO:970)的5’端和/或3'端与不同结构的5'MVIP和/或3'MVIP连接，所述反义链及其载体结构选自下表18：

表18 5'MVIP和/或3'MVIP偶联的反义链

在某些实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂的反义链与表18中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸，与表18中序列具有相同的至少15、16、17、18、19、20、21个连续核苷酸的序列。

需要说明的是，表18的组合方式都不是穷举，本发明的序列可以连接任何结构的MVIP，且不限制连接位点和连接数量。连接位点不受限制是指：可以是连接在5’端也可以连接在3’端，也可以不连接在端部。连接数量不受限制是指：可以是连接一个或多个，数量不受限制。

在某些实施方案中，所述RNA抑制剂的正义链GsAsGCGACAfGfUfAUUCUCAGUsGsU(SEQ ID NO:1033)的5’端和/或3'端与不同结构的5'MVIP和/或3'MVIP连接，所述正义链及其载体结构选自下表19：

表19 5'MVIP和/或3'MVIP偶联的正义链

在一些实施方式中，本申请所述的RNA抑制剂的正义链与表19中的各序列相差一个、两个或三个核苷酸，或与表19中序列具有相同的至少15、16、17、18、19、20、21个连续核苷酸的序列。

需要说明的是，表19的组合方式都不是穷举，本发明的序列可以连接任何结构的MVIP，且不限制连接位点和连接数量。连接位点不受限制是指：可以是连接在5’端也可以连接在3’端，也可以不连接在端部。连接数量不受限制是指：可以是连接一个或多个，数量不受限制。

在某些实施方案中，所述RNA抑制剂的反义链可以是以上举例的反义链的序列与任意的5'MVIP和/或3'MVIP偶联得到。

在某些实施方案中，所述RNA抑制剂的正义链可以是以上举例的正义链的序列与任意的5'MVIP和/或3'MVIP偶联得到。

在某些实施方案中，本申请保护范围内的序列可以在任何位置连接任何结构任何数量的5'MVIP或3'MVIP形成RNA抑制剂，这些RNA抑制剂均在本发明的保护范围内，均受本发明的启示。

中国专利CN113171371B中详细考察了5'MVIP和/或3'MVIP结构中X、L、B、D、R₁和R₂不同对RNA抑制剂活性效果影响，该专利全文通过引入的方式全部并入本发明书，当X、L、B、D、R₁和R₂之一不同时，相应的5'MVIP和/或3'MVIP中其它部分与5’MVIP09/3’MVIP09的相同。

当X分别为半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺及其衍生物时，在本发明提供的RNA抑制剂中，优选N-乙酰半乳糖胺及其衍生物作为肝靶向特异性配体：

L的长短对RNA抑制剂的作用效果影响较大，L链不能太短也不能太长；当含有-NH-、C＝O、O、S、酰胺基、磷酰基、硫代磷酰基、脂肪族碳环基如环己烷或者这些基团的组合时，或者在同一个5'MVIP、3'MVIP结构中或5'MVIP与3'MVIP彼此L结构不同、在碳链长为C7-C18这个范围，所得RNA抑制剂的活性相差不大。

除接头B结构改变外，而X、L、D及R₁/R₂与组合5’MVIP09/3’MVIP09中的一致时，接头B中通式中的A₁和A₂各自独立地是C、O、S、-NH-、羰基、酰胺基、磷酰基或硫代磷酰基，r为0-4的任意整数，并且接头B在5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同时，所得RNA抑制剂活性相差不大。

在MVIP结构及RNA抑制剂相同的情况下，不同的连接链D会对RNA抑制剂活性有影响，其中D1、D2、D4的效果接近且优于D3。

不同的转接点R₁会对RNA抑制剂活性有影响，其中R1-1作为转接点的所得的RNA抑制剂活性最好。

R₁代码	R₁结构
		R1-1	-NH(CH₂)₆O-
R1-2	-O(CH₂)₆O-
		R1-3	-S(CH₂)₆O-
R1-4	-NH(CH₂)₈ O-
		R1-5	-NH(CH₂)₅CH(CH₂CH₃)O-
R1-6	-S(CH₂)₄CH(CH₃)O-

不同的转接点R₂会对RNA抑制剂活性有影响，其中R2-1作为转接点时RNA抑制剂最佳。

在某些实施方案中，本发明所述的RNA抑制剂中的n+m分别为2、3、4、5和6。5’MVIP和/或3’MVIP偶联的位置包括反义链的5’端和/或3’端、正义链的5’端和/或3’端、反义链的5’端和正义链的3’端、正义链的5’端和反义链的3’端。由反义链和正义链碱基配对退火，其中n+m＝2、3、4、5和6，如表20所示：

表20 5’MVIP和3’MVIP与正义链和/或反义链偶联位置

在一些实施方式中，n和m各自独立地为0-4的任意整数，各自独立地优选为1-3的整数，且n+m＝2-6的整数，优选n+m＝2、3或4，更优选为4。

在某些实施方式中，所述5'MVIP和/或3'MVIP偶联的正义链和反义链选自下表21：

表21 5'MVIP和/或3'MVIP偶联的正义链和反义链

在一些实施方式中，所述RNA抑制剂选自表22-1、表22-2，其中的正义链和/或反义链与表22-1和表22-2中的各序列相差1个、2个或3个核苷酸，或与表22-1、表22-2中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列：

表22-1 RNA抑制剂

表22-2RNA抑制剂

在某些实施方案中，本申请所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐优选以钠盐、三乙胺盐或其它可药用盐的形式制备或合成。

在某些实施方案中，所述RNA抑制剂或其药学上可接受的盐更优选为其钠盐或三乙胺盐。

本申请还提供了一种包含上述RNA抑制剂或其药学上可接受的盐的药物组合物。

在一个实施方式中，本发明还提供了一种包含上述RNA抑制剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的药用辅料的药物组合物。包含RNA抑制剂的药物组合物可用于预防和/或治疗与含APOC3的水平升高相关的疾病，例如，肝源性疾病、炎性、心脑血管和代谢疾病，其中，心脑血管疾病包括高脂血症、中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、主动脉瓣狭窄、高甘油三酯血症(HTG)、严重高甘油三酯血症(sHTG)或家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)。这类药物组合物依据递送模式配制。一个实例方案为配制用于以肠胃外递送全身性施用的组合物，例如，皮下(SC)、肌内(IM)或静脉内(IV)递送。本申请的药物组合物可以足以抑制APOC3基因表达的剂量施用。

药学上可接受的“辅料”或“赋形剂”是用于递送一种或多种核酸至动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他药学上惰性的媒介物。赋形剂可为液体或固体，并根据计划的施用方式进行选择，以在与核酸及给定药物组合物中的其他组分组合时提供所需的体积、稠度等。RNA抑制剂可以靶向特定组织(例如，肝细胞)的方式递送。

在某些实施方式中，所述药物组合物，其还进一步包含递送媒介物(如纳米颗粒、树状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)。

在某些实施方式中，所述递送媒介物包括脂质体。

在某些实施方式中，所述递送媒介物包括纳米脂质，其能够与核酸分子形成脂质体-核酸纳米颗粒。

在某些实施方式中，所述递送媒介物包括两性脂质化合物M10C1。

本发明提供的药物组合物包括(但不限于)溶液、乳液和包含脂质体的制剂。这些组合物可由多种组分产生，包括(但不限于)预形成液体、自乳化固体和自乳化半固体。制剂包括靶向肝脏的那些。可以单位剂型方便地存在的本申请药物制剂可依据制药业公知的常规技术制备。这类技术包括将活性成分与药用辅料或赋形剂结合的步骤。

用途

另一方面，本申请进一步提供了一种减少细胞或组织中APOC3 mRNA或蛋白质表达的方法，其包括使细胞或组织与有效量的前述的抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，和/或前述的药物组合物接触。

适合使用本申请方法处理的细胞可为任何表达APOC3基因的细胞，例如，肝脏细胞、脑细胞、胆囊细胞、心脏细胞或肾脏细胞，但优选为肝脏细胞。适合用于本申请方法的细胞可为哺乳动物细胞，当与表达APOC3基因的细胞接触时，RNA抑制剂抑制APOC3基因(例如，人类、灵长类、非灵长类或大鼠APOC3基因)的表达至少约50％，例如可通过PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法，或由基于蛋白质的方法，如免疫荧光分析法，蛋白质印迹法或流式细胞分析技术测定的。

在某些实施方式中，所述组织是肝脏组织。

本发明所用术语“抑制”可与“减少”、“降低”、“沉默”、“下调”、“压制”及其他类似术语交换使用，且包括任何抑制水平。APOC3基因的表达可依据与APOC3基因表达相关的任何变量的水平或水平变化来评价，例如，APOC3 mRNA水平或APOC3蛋白水平。这一水平可在单个细胞中或细胞群中(包括例如，源自受试者的样品)中分析。可通过与APOC3表达相关的一种或多种变量与对照水平比较的绝对或相对水平的下降来评价抑制。对照水平可为本领域上采用的任何类型的对照水平，例如，给药前基线水平或从未处理或接受对照(如例如，仅缓冲剂对照或无活性剂对照)处理的类似受试者、细胞或样本测得的水平。

APOC3基因表达的抑制可通过其中APOC3基因被转录且已处理(例如，通过一个或多个细胞与本申请的RNA抑制剂接触，或通过施用本申请的RNA抑制剂于其中存在该细胞的受试者)使得抑制APOC3基因表达的第一细胞或细胞群(这类细胞可例如存在于源自受试者的样品中)表达的mRNA量与基本上与该第一细胞或细胞群相同但未如此处理的第二细胞或细胞群(未用RNA抑制剂处理或未用靶向目的基因的RNA抑制剂处理的对照细胞)相比的降低来表现。在优选的实施方式中，抑制通过实施例2提供的方法使用siRNA合适的浓度在高表达APOC3的细胞系中评价，并将被干预细胞中的mRNA水平表示为非干预对照细胞中mRNA水平的百分比。

在其他实施方式中，APOC3基因表达的抑制可通过功能上与APOC3基因表达相关的参数的降低来评价，例如，受试者血液或血清中的APOC3蛋白水平。APOC3基因沉默可在任何表达APOC3的细胞(内源性或来自表达构建体的外源性)中且通过本领域已知的任何分析法测定。

APOC3蛋白质表达的抑制可由细胞或细胞群或受试者样品表达的APOC3蛋白水平(例如，源自受试者的血液样品中的蛋白质水平)的降低来表现。如上所述，对于mRNA抑制的评价，处理细胞或细胞群的蛋白质表达水平的抑制可类似地表示为对照细胞或细胞群的蛋白质水平的百分比，或受试者样品(例如，血液或其衍生的血清)中的蛋白质水平的变化。

可用于评价APOC3基因抑制的对照组细胞、细胞群或受试者样品包括未与本申请RNA抑制剂接触的细胞、细胞群或受试者样品。例如，对照细胞、细胞群或受试者样品可源自于用RNA抑制剂治疗前的单个受试者(例如，人类或动物受试者)或适当匹配的群体对照。

细胞或细胞群表达的APOC3 mRNA水平可采用本领域已知用于评价mRNA表达的任何方法测定。例如，qRT-PCR，评价基因表达的降低。可通过本领域中已知的任何方法，例如，ELISA，评价蛋白质产生的降低。在某些实施方式中，穿刺肝脏活检样品用作监测APOC3基因或蛋白质表达降低的组织材料。其他实施方式中，血液样品用作监测APOC3蛋白质表达降低的受试者样品。

另一方面，本申请进一步提供了前述的抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，或前述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病或病症或者降低疾病或病症的风险。

在某些实施方式中，所述疾病或病症包括与APOC3相关的疾病或病症。

在某些实施方式中，所述疾病或病症选自动脉粥样硬化、血管病变、心肌梗塞、心绞痛、中风、肾疾病、肾衰竭、肥胖、葡萄糖耐受不良、2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)和代谢综合征中。

又一方面，本申请进一步还提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的前述的抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，和/或前述的药物组合物。

本申请的体内方法可包括对受试者施用包含RNA抑制剂的组合物，其中该RNA抑制剂包括与接受施用RNA抑制剂的哺乳动物的APOC3基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。组合物可采用本领域已知的任何方式施用，包括(但不限于)：经口、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如，脑室内、脑实质内和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、经鼻、直肠和局部(包括颊内及舌下)施用。在某些实施方式中，药物组合物通过静脉内输注或注射施用。在某些实施方式中，组合物通过皮下注射施用。在某些实施方式中，该组合物通过肌内注射施用。

本申请的RNA抑制剂还可作为“游离RNA抑制剂”施用。游离RNA抑制剂是在没有药物组合物的存在下施用。裸RNA抑制剂可在合适缓冲液中。缓冲液可包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个实施方式中，缓冲液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调整包含RNA抑制剂的缓冲液的pH和渗透压，以便适合施用于受试者。

或者，本申请的RNA抑制剂可作为药物组合物施用，如脂质体制剂。

本申请的药物组合物可以足以抑制APOC3基因表达的剂量施用。在一些实施例中，本申请的RNA抑制剂的合适剂量在每天每千克接受试者体重约0.001至约1000.0mg的范围内；在一些实施例中，本申请的RNA抑制剂的合适剂量在每天每千克体重约1至50mg的范围内；在一些实施例中，本申请的RNA抑制剂的合适剂量在约0.1mg/kg至约10.0mg/kg的范围内，例如约0.3mg/kg至约3.0mg/kg的范围内。

在一个实施方式中，该方法包括施用本发明所述的药物组合物，使得降低靶APOC3基因表达，如每剂约1、2、3、4、5、6、1-6、1-3或3-6个月。在某些实施方式中，该组合物每3-6个月施用一次。

在某些实施方式中，在初始治疗方案后，以较少的频率施用治疗。重复剂量方案可包括规律地施用治疗量的RNA抑制剂，如每月1次至每年1次。在某些实施方式中，RNA抑制剂约每月1次至约每3个月1次施用，或约每3个月1次至约每6个月1次施用。

在初始治疗方案后，可以较低的频率施用治疗。可依据疾病严重性确定治疗持续时间。

在其他实施方式中，单一剂量的药物组合物可以为长效的，使得剂量以不超过1、2、3或4个月的间隔施用。在本申请的一些实施方式中，本申请的药物组合物的单一剂量约每月施用一次。在本申请的其他实施方式中，本申请药物组合物的单一剂量按季(即约每3个月)施用。在本申请的其他实施方式中，本申请药物组合物的单一剂量每年施用2次(即约每6个月一次)。

本领域技术人员应理解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量和施用时间，包括(但不限于)：受试者中存在的突变、之前的治疗、受试者的一般健康或年龄和存在的其他疾病。此外，按照需要以预防和/或治疗有效量的药物组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。

在某些实施方式中，其进一步包括测定来自所述受试者的样品中的APOC3水平。

例如，其进一步包括测定来自所述受试者血液样品、血清样品或尿液样品中的APOC3水平。

在某些实施方式中，该方法进一步包括对所述受试者施用用于治疗高脂血症的另外的治疗剂。

例如，该另外的治疗剂可以选自他汀类药物，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等；胆固醇吸收抑制剂如依折麦布；PCSK9抑制剂。

另一方面，本申请进一步提供了一种细胞，其包含前述的抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐。

再一方面，本申请进一步提供了一种药盒，其包含前述的抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，或者前所述的药物组合物。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的RNA抑制剂、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

说明：

DMSO的中文名称为二甲基亚砜；

DMF的中文名称为N,N-二甲基甲酰胺；

HOBt的中文名称为1-羟基苯并三氮唑；

HBTU的中文名称为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯；

DIPEA(DIEA)的中文名称为N,N-二异丙基乙胺；

DCM的中文名称为二氯甲烷；

DMAP的中文名称为4-二甲氨基吡啶；

DMT-CL的中文名称为4,4'-二甲氧基三苯基氯甲烷；

MEOH的中文名称为甲醇；

TBTU的中文名称为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；

的名称为固相载体，如大孔氨甲基树脂(Resin)。

实施例1RNA抑制剂的合成

未偶联载体结构的正义链和反义链是利用标准的固相亚磷酰胺法，使用固相合成仪合成的。正义链与对应的反义链互补退火制备得到RNA抑制剂。

固相亚磷酰胺法基本步骤包括：

1)脱保护：脱掉起始单体Solid Support羟基保护基(DMTr)；

2)偶联：加上第一个亚磷酰胺单体，通过3’至5’方向发生偶联反应；

3)氧化：将所得的核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯(即三价磷氧化成五价磷)；

4)封闭：将前步骤失败核苷酸序列5’-OH加冒封死，使其不再进一步参与反应；重复上述步骤，直至最后一个亚磷酰胺单体的接入；然后用甲胺水溶液和氨水裂解SolidSupport与起始单体之间酯键，并将所得核苷酸序列上的各个碱基与磷酸上的保护基脱掉；经HPLC分离纯化后，过滤除菌，冻干得到相应的正义链或反义链。

RNA抑制剂的合成工艺描述：

将正义链和反义链冻干粉分别复溶、等摩尔混合，加入注射用水适量，投入适量的TRIS缓冲溶液。轻晃约1～2min，使溶液混合均匀。将水浴锅升温至92℃～95℃。将上述反应液置水浴锅中加热3min～5min,轻晃使溶液受热均匀。自然冷却至室温。得到无色或微黄色透明液体，取样送检，测浓度。

实施例2-1RNA抑制剂体外抑制APOC3基因表达试验1

本实施例的RNA抑制剂(DS52～DS102)由实施例1所述的方法制备得到。将RNA抑制剂水溶液和DOTMA的有机溶液混合形成不溶于水的沉淀，沉淀分离干燥后溶于氯仿，进一步和其他脂质氯仿溶液混合，其他脂质包括M10C1和PEG600-胆固醇。混合物真空离心蒸发干燥过夜，得到纳米脂质包裹的RNA抑制剂，其中DOTMA、M10C1和PEG600-胆固醇与RNA抑制剂的重量配比为1～1.6，1.5～2.5和2.5～3.5。

用含10％胎牛血清的DMEM配制相应浓度的纳米脂质包裹的RNA抑制剂样品溶液。以10⁵细胞密度接种HepG 2细胞，10％胎牛血清DMEM培养基，37℃，5％CO₂，培养24h后，加10nM的样品干预，孵育72h后，收集细胞样品，往收集完毕的细胞样品中加入1mL Ezol裂解液，漩涡震荡混匀。加入0.2mL三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置1分钟。4℃，12,000xg离心15min。将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的100％乙醇。吸取全部样品，加入带有2mL收集管的mini-spin离心柱。8,000×g，室温离心15s，弃尽流穿液。将剩余的样品转移至离心柱，重复上一步骤。往离心柱中加入700μL WB，轻盖盖子，8,000×g，室温离心15s，弃尽流穿液，重复上一步骤，用500μL WB洗涤离心柱两次。通过qRT-PCR测定APOC3 mRNA水平。与未干预的HepG 2细胞上清对比，标定样品干预组的APOC3 mRNA相对表达水平。

数据分析ΔΔCt法(Ct差值比较法)：

看家基因GAPDH在所有细胞中均表达，其产物是维持细胞生存所必须，且在细胞中的表达量或基因组的拷贝数恒定，受环境影响小，因此引用GAPDH作为内参基因。qRT-PCR后，内参的CT值同时会被记录，被称为Ct(GAPDH)，样品的CT值，被称为Ct(样品)。

ΔCt(样品)＝Ct(样品)-Ct(GAPDH)

ΔCt(对照)＝Ct(对照)-Ct(GAPDH)

ΔΔCt＝ΔCt(样品)-ΔCt(对照)

基因的相对表达水平＝2＾-ΔΔCt

所得试验结果见下表23。

表23RNA抑制剂干预后HepG2细胞中APOC3 mRNA的水平

所得试验结果显示，由表6中RNA抑制剂，在不同浓度下对HepG2细胞中APOC3 mRNA表达水平呈现出不同程度的抑制效果，其中DS52-58、DS60、DS62-64、DS66-75、DS77-87和DS90-98以及DS100-102对HepG2细胞中APOC3 mRNA表达水平的抑制效果显著。

实施例2-2RNA抑制剂体外抑制APOC3基因表达试验2

本实施例的RNA抑制剂的序列选自表5，由实施例1所述方法制备得到。将RNA抑制剂接种HepG2细胞到96孔细胞板，铺板同时将siRNA化合物用转染试剂转染进入细胞，siRNA测试浓度点为1nM和0.1nM，在37℃，5％ CO₂培养箱中过夜培养，平行测定3复孔。同时设置对照组。

qPCR检测靶标基因mRNA表达水平:转染48h后，提取RNA，靶标cDNA将通过qPCR进行检测，同时检测GAPDH cDNA作为内部对照进行平行检测。在384孔中加入8μL配置好的qPCR反应液和2μL样本cDNA。qPCR反应程序为：95℃加热10min，然后进入循环模式，95℃加热15sec，随后60℃1min，共40个循环。与未干预的HepG 2细胞上清对比，标定样品干预组的APOC3 mRNA的相对表达水平，三次测验取APOC3相对表达水平平均值。1nM和0.1nM所得试验结果见下表24和表25。

表24RNA抑制剂体外抑制APOC3基因效果(1nM)

表25RNA抑制剂体外抑制APOC3基因效果(0.1nM)

优选出RNA抑制剂Ky-12-DS230、Ky-12-DS250、Ky-12-DS254、Ky-12-DS297、Ky-12-DS298、Ky-12-DS317、Ky-12-DS330作EC₅₀值研究，实验结果如表26。

表26EC₅₀值

实施例3RNA抑制剂体外抑制APOC3基因表达试验2

本实施例的序列选自表8。正义链和反义链序列中进行糖基2’位甲氧基化或氟代修饰，正义链和反义链修饰后的序列分别见表6-1和表7-1。选取表6-1和表7-1中对应的序列退火合成RNA抑制剂。

取按实施例1所述的方法制备得到的RNA抑制剂。将RNA抑制剂转染进入HepG 2细胞，考察RNA抑制剂在浓度1.0nM下对细胞的干预效果，通过qRT-PCR测定APOC3 mRNA水平。与未干预的HepG 2细胞上清对比，标定样品干预组的APOC3 mRNA相对表达水平。所得试验结果见表27。

表27RNA抑制剂干预后HepG2细胞中APOC3 mRNA的水平

优选出RNA抑制剂：DS104-105、DS107-109、DS111、DS113-114、DS118、DS122、DS124、DS127、DS131和DS132作进一步的活性研究。

实施例4RNA抑制剂体外抑制APOC3基因表达试验3

本实施例的序列选自表8。正义链和反义链序列中进行糖基2’位甲氧基化或氟代修饰，正义链和反义链修饰后的序列分别见表6-1和表7-1。表6-1和表7-1中对应的序列退火合成RNA抑制剂。考察RNA抑制剂在低浓度0.1nM下对细胞中APOC3干预效果。取按实施例1所述的方法制备得到的RNA抑制剂。将RNA抑制剂转染进入HepG 2细胞，通过qRT-PCR测定APOC3 mRNA水平。与未干预的HepG 2细胞上清对比，标定样品干预组的APOC3 mRNA相对表达量。所得试验结果见表28。

表28

结果：进一步优选出DS107、DS108、DS113、DS114、DS124、DS131和DS132进入下一步EC₅₀检测。

实施例5 RNA抑制剂体外抑制APOC3基因表达试验

本实施例检测DS107、DS108、DS113、DS114、DS124、DS131和DS132的EC₅₀值。

将RNA抑制剂转染进入HepG 2细胞，考察RNA抑制剂在浓度10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM和0.01nM下对细胞中APOC3基因干预效果，通过qRT-PCR测定APOC3mRNA水平，计算EC₅₀，所得试验结果见表29。

表29 RNA抑制剂EC₅₀值

RNA抑制剂	Absolute EC₅₀(nM)
		DS107	0.035
DS108	<0.01
		DS113	<0.01
DS114	0.029
		DS124	0.042
DS131	0.018
		DS132	0.019

优选出DS107、DS108、DS113、DS114、DS124、DS131和DS132进入下一步与5’MVIP/3’MVIP连接。

实施例6 5’MVIP和3’MVIP化合物的合成

当本申请的RNA抑制剂的正义链或反义链的3’端偶联有载体结构3'MVIP时，3'MVIP的solid support作为固相合成的起始单体。当本申请的RNA抑制剂的正义链或反义链的5’端偶联有载体结构5'MVIP时，5’MVIP亚磷酰胺单体作为固相合成的最后一个单体。

当本申请的RNA抑制剂的正义链或反义链的3’端偶联有3'MVIP时，3'MVIP的solidsupport作为固相合成的起始单体，3’MVIP的solid spport通式如下：

m为1-4时，通式中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的3’MVIP的SolidSupport。

例如，当m为1时，所得的Solid Support作为RNA抑制剂

Kylo-12-DS134～Kylo-12-DS136、Kylo-12-DS142、Kylo-12-DS145、Kylo-12-DS146、Kylo-12-DS157、Kylo-12-DS158的正义链和Kylo-12-DS131～Kylo-12-DS133、Kylo-12-DS139、Kylo-12-DS140、Kylo-12-DS149、Kylo-12-DS150及本发明所述的其他RNA抑制剂中反义链固相合成的起始单体；

当m为2时，所得的Solid Support作为RNA抑制剂Kylo-12-DS141、Kylo-12-DS143、Kylo-12-DS144、Kylo-12-DS154～Kylo-12-DS156、Kylo-12-DS166、Kylo-12-DS169、Kylo-12-DS170的正义链和Kylo-12-DS1081、Kylo-12-DS137、Kylo-12-DS138、Kylo-12-DS151～Kylo-12-DS153、Kylo-12-DS163、Kylo-12-DS164及本发明所述的其他RNA抑制剂中的反义链的固相合成起始单体；

当m为3时，所得的Solid Support作为RNA抑制剂Kylo-12-DS159、Kylo-12-DS160、Kylo-12-DS165、Kylo-12-DS167、Kylo-12-DS168、Kylo-12-DS174、Kylo-12-DS175的正义链和Kylo-12-DS147、Kylo-12-DS148、Kylo-12-DS161、Kylo-12-DS162、Kylo-12-DS171、Kylo-12-DS172及本发明所述的其他RNA抑制剂中的反义链固相合成起始单体。

当本申请的RNA抑制剂的正义链或反义链的5'端有5’MVIP时，5’MVIP亚磷酰胺单体是作为正义链或反义链固相合成的最后一个亚磷酰胺单体。5’MVIP亚磷酰胺单体通式如下：

n为1-4时，通式中接头B部分分别支化1至4次，以获得对应的5’MVIP亚磷酰胺单体。

例如，当n为1时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为RNA抑制剂Kylo-12-DS131～Kylo-12-DS134、Kylo-12-DS137、Kylo-12-DS138、Kylo-12-DS141、Kylo-12-DS147和Kylo-12-DS148及本发明所述的其他RNA抑制剂中的正义链和Kylo-12-DS135、Kylo-12-DS136、Kylo-12-DS143、Kylo-12-DS144、Kylo-12-DS159、Kylo-12-DS160及本发明所述的其他RNA抑制剂中的反义链固相合成的最后一个单体；

当n等于2时，所得的5’MVIP亚磷酰胺单体作为Kylo-12-DS1081、Kylo-12-DS139、Kylo-12-DS140、Kylo-12-DS142、Kylo-12-DS151～Kylo-12-DS154、Kylo-12-DS161、Kylo-12-DS162、Kylo-12-DS165及本发明所述的其他RNA抑制剂中的正义链和Kylo-12-DS145、Kylo-12-DS146、Kylo-12-DS155、Kylo-12-DS156、Kylo-12-DS167、Kylo-12-DS168及本发明所述的其他RNA抑制剂中的反义链固相合成的最后一个单体。

当n等于3时，所得的带3个肝靶向特异性配体X的5’MVIP亚磷酰胺单体可作为Kylo-12-DS149、Kylo-12-DS150、Kylo-12-DS163、Kylo-12-DS164、Kylo-12-DS166、Kylo-12-DS171～Kylo-12-DS173及本发明所述的其他RNA抑制剂中的正义链和Kylo-12-DS157、Kylo-12-DS158、Kylo-12-DS169、Kylo-12-DS170、Kylo-12-DS174、Kylo-12-DS175及本说明书提及的其他RNA抑制剂中的反义链固相合成的最后一个单体。

以上仅示例性列举出一些RNA抑制剂，本发明中所述的但未列举出来的RNA抑制剂都适用于这个规则，即当本申请的RNA抑制剂的正义链或反义链的3’端偶联有载体结构3'MVIP时，3'MVIP的solid support作为固相合成的起始单体。当本申请的RNA抑制剂的正义链或反义链的5’端偶联有载体结构5'MVIP时，5’MVIP亚磷酰胺单体作为固相合成的最后一个单体。

所述的这些RNA抑制剂的正义链和反义链在进行亚磷酰胺固相合成之前，需要先化学合成相应的3’MVIP Solid Support和5’MVIP亚磷酰胺单体。

本实施例仅示例性提供了本发明所述的RNA抑制剂的几种3’MVIP Solid Support和5’MVIP亚磷酰胺单体化学合成过程，本领域技术人员可以容易的合成没有列举出来的其他的3’MVIP Solid Support和5’MVIP亚磷酰胺单体，合成工艺过程描述如下：

4.1 3’MVIP的Solid Support的合成

4.1.1 3'MVIP09的Solid Support的合成

合成过程描述：

4.1.1.1ERC-01-c1的合成

称取2-氨基-1,3-丙二醇(5.0g，54.9mmol)加入DMSO 50mL，氢氧化钠溶液(1g/mL)5mL，降温到0℃，滴加丙烯酸叔丁酯(20mL，137.8mol)2小时加完，室温反应48h，加石油醚(100mL)，饱和食盐水洗2次，有机层干燥。过层析柱(洗脱液：乙酸乙酯:石油醚＝25％-75％)，上柱加0.05％的三乙胺，得无色油状物6.2g。

4.1.1.2ERC-01-c2的合成

称取ERC-01-c1(6.2g，17.9mmol)，加二氯甲烷50mL，碳酸钠溶液(25％)23mL，室温滴加氯甲酸苄酯(8.2mL，57.4mmol)，2小时滴加完，室温反应过夜，饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，过层析柱(乙酸乙酯:石油醚＝5％-30％)得油状物4.0g。

4.1.1.3ERC-01-c3的合成

取ERC-01-c2(4.0g，8.3mmol)加甲酸12mL，室温反应过夜，减压蒸干溶剂，得产品2.8g。4.1.1.4ERCd-01-c1的合成

将化合物ERC-01-c3(1.11g，3.0mmol)和dlSANC-c4(3.6g，8.04mmol)加到DMF(60mL)中，然后加入HOBt(2.24g)和HBTU(3.36g)，然后缓慢加入DIEA(4.16mL)。反应液室温下搅拌反应3小时。然后加入水，水层用二氯甲烷萃取(2x10mL)。合并有机层，然后依次用饱和碳酸氢钠(80mL)、水(2x60 mL)、饱和食盐水(60mL)洗。用无水硫酸钠干燥，减压蒸干，用硅胶柱层析纯化(洗脱液：3-15％MeOH in DCM)。得淡黄色固3.24g。

4.1.1.5ERCd-01-c2的合成

ERCd-01-c1(3.24g，2.6mmol)用甲醇(60mL)溶解，加入10％钯碳(0.3g)，乙酸(2.0mL)。然后常压下加氢，反应过夜。反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸干，得油状物ERCd-01-c2 2.9g。

4.1.1.6 3’MVIP09-c1的合成

向反应瓶内依次加入SANCd-01-c0(0.824g，1.5mmol)和ERCd-01-c2(1.09g，1.0mmol)，再加入10mL的DCM，搅拌溶解，再依次加入TBTU(0.963g)和DIPEA(0.517g)，反应过夜，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和食盐水洗涤，干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得产品1.3g。

4.1.1.7 3’MVIP09-c2的合成

向反应瓶内依次加入3’MVIP09-c1(1.62g，1μmol)和10mL的DCM，室温搅拌溶解，再依次加入DMAP(0.366g)和丁二酸酐(0.2g，3μmol)，室温搅拌反应，TLC分析，反应合格浓缩掉DCM，加水，用DCM萃取，有机相再用饱和食盐水洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，最后过硅胶柱进行纯化，得到产品为1.55g。

4.1.1.8 3’MVIP09的Solid Support合成

向反应瓶内依次加入3’MVIP09-c2(0.86g，0.5μmol)和10mL DMF，溶解，再依次加入HBTU(0.19g)、DIPEA(0.194g)和大孔氨甲基树脂(2.0g)，摇床24h，过滤，树脂用10％甲醇/DCM洗涤，再用25％醋酸/吡啶进行封端，取代度150μmol/g。

4.1.2 3'MVIP17的Solid Support的合成

4.1.2.1SANC-01-c1的合成

合成步骤参照4.1.1.1.ERC-01-c1的合成。4.1.2.2SANC-01-c2的合成

合成步骤参照4.1.1.2.ERC-01-c2的合成。4.1.2.3SANC-01-c3的合成

合成步骤参照4.1.1.3.ERC-01-c3的合成。4.1.2.4SANCd-01-c1的合成

合成步骤参照4.1.1.4.ERCd-01-c1的合成。4.1.2.5SANCd-01-c2的合成

合成步骤参照4.1.1.5.ERCd-01-c2的合成。

4.1.2.6 3’MVIP17-c1的合成

合成步骤参照4.1.1.6.3’MVIP09-c1的合成，合成得到3’MVIP17-c1。4.1.2.7 3’MVIP17-c2的合成

合成步骤参照4.1.1.7.3’MVIP09-c2的合成。

4.1.2.8 3’MVIP17的Solid Support合成

合成步骤参照4.1.1.8 3’MVIP09的Solid Support合成。4.1.3 3'MVIP01的SolidSupport的合成：

合成过程描述：

4.1.3.1 3’MVIP01-c1的合成

合成步骤参照4.1.1.6.3’MVIP09-c1的合成。4.1.3.2 3’MVIP01-c2的合成

合成步骤参照5.1.1.7.3’MVIP09-c2的合成。

4.1.3.3 3’MVIP01的Solid Support合成

合成步骤参照4.1.1.8.3’MVIP09的Solid Support合成。

4.2.5’MVIP亚磷酰胺单体的合成

4.2.1 5’MVIP09亚磷酰胺单体的合成：

4.2.1.1 5’MVIP09-ERCd-PFP-c1的合成

称量ERCd-01-c2(2.18g，2.0mmol)溶于DMF(50mL)，加戊二酸单苄酯(0.53g，2.4mmol)、DIPEA(0.78g)与TBTU(0.84g)，室温搅拌过夜，加水淬灭(50mL)，DCM(30mL*3)萃取，10％柠檬酸(50mL*3)、饱和碳酸氢钠50mL和吡啶100mL洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸，过柱纯化得产品5’MVIP09-ERCd-PFP-c1(2.15g)。

4.2.1.2 5’MVIP09-ERCd-PFP-c2的合成

称量5’MVIP09-ERCd-PFP-c1(2.15g，1.66mmol)和10％钯碳(0.21g)，加甲醇(50mL)，室温搅拌加氢过夜，反应结束后硅藻土过滤钯碳，旋蒸得5’MVIP09-ERCd-PFP-c2粗品(1.9g)。

4.2.1.3 5’MVIP09-ERCd-PFP的合成

称量5’MVIP09-ERCd-PFP-c2粗品(1.9g，1.58mmol)溶于DCM(60mL)，加DIPEA(1.33g)，冷却，加三氟乙酸五氟苯酚酯(2.21g，7.9mmol)，室温搅拌反应2h后旋蒸，再溶于DCM(60mL)，饱和碳酸氢钠(30mL*3)、10％柠檬酸(30mL*1)、饱和食盐水(50mL*1)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸得5’MVIP09-ERCd-PFP粗品(2.35g)，抽干后无纯化直接用于下一步反应。

4.2.1.4 5’MVIP09亚磷酰胺单体-c1的合成

5’MVIP09-ERCd-PFP粗品(2.35g，1.58mmol)溶于DCM(60mL)，加DIPEA(0.82g，6.32mmol)、6-氨基-1-己醇(0.37g，3.16mmol)，室温搅拌反应过夜。加10％柠檬酸(30mL)，DCM(30mL*3)萃取，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤、旋蒸，过柱纯化得产品5’MVIP09单体-c1(1.73g)。

4.2.1.5 5’MVIP09亚磷酰胺单体

称量5’MVIP09亚磷酰胺单体-c1(1.3g，1.0mmol)溶于乙腈(30mL)，加入二异丙胺三氮唑(0.22g)，冰浴下滴加双-(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(0.36g，1.2mmol)，室温反应4h，HPLC中控，反应合格后，浓缩过柱纯化得到产品5’MVIP09单体(1.2g)。

4.2.2 5'MVIP01亚磷酰胺单体的合成：

5'MVIP01的亚磷酰胺单体称量YICd-01-c2(1.12g，2.0mmol)，剩余操作参照4.2.1.1.～4.2.1.5。

实施例7 5’MVIP09/3’MVIP 09偶联不同的siRNA的RNA抑制剂的合成

反义链及其载体结构合成描述：用氩气吹扫试剂瓶至少2min。向试剂瓶中依次加入亚磷酰胺单体和乙腈，拧紧瓶盖后，震荡直至目测固体全溶。然后加入3A分子筛，静置8h以上待用。用氩气吹扫试剂瓶至少2min。向试剂瓶中依次加入氢化黄原素和干燥的吡啶，拧紧瓶盖后，震荡直至目测固体全溶，暂存待用。确认在室温20～30℃环境条件下进行以下操作：称取3’MVIP载体,加入到试剂瓶中，再加入乙腈，震荡混合均匀。将载体转移至合成柱内，并用乙腈将试剂瓶中残余的载体淋洗转移至合成柱内。淋洗完毕后加乙腈充满合成柱，记录使用乙腈的用量。按仪器操作安装固定合成柱。

将上述配制的单体溶液、CAP A、CAP B、氧化剂、硫代试剂、活化剂、脱帽剂以及乙腈，连接至AKTA PILOT100对应的管路，确保管路插入试剂瓶底。

合成方法设置完毕后，仪器各项工作准备就绪，点击运行，开始合成。在线观察记录每个detritylation峰面积。在合成过程中根据脱保护试剂实际使用量，进行补加操作。

合成结束后，氩气吹扫合成柱≥2h，按操作规程卸载合成柱。向合成柱内固相载体转移至反应瓶，加入甲胺水溶液和氨水，将反应瓶放入摇床中，35℃，2-3小时。将溶液过滤至圆底烧瓶中，再使用50％乙醇水溶液洗涤残留固相，再次过滤与之前滤液合并，将圆底烧瓶连接旋转蒸发仪，设置水温50℃蒸至无馏出，向圆底烧瓶内加入乙醇，混匀，再次蒸至无馏出，重复操作至瓶底出现白色粉末。将得到的白色粉末配制成溶液，使用反向层析柱进行纯化，取样检测OD260、纯度。将纯化的反义链溶液分装于西林瓶中冻干备用，并将产品密封储存于-20℃冰箱中。

正义链及其载体结构的合成操作同反义链及其载体结构的合成操作，其中装柱的载体为Universal载体。所得中间体加DIPEA配制成溶液，加入5’MVIP亚磷酰胺单体，混匀，将反应瓶放入摇床中，35℃，2-3小时。

RNA抑制剂的合成退火工艺描述：

取正义链及其载体结构，取反义链及其载体结构，1:1等摩尔混合在反应瓶中，水浴95℃5分钟后，关闭水浴锅电源，使其自然降温至40℃以下。向双链溶液中加入3M醋酸钠水溶液，混合均匀后，再加入适量体积的无水乙醇，混合均匀，将反应液放入-20℃冰箱内45min。冷冻高速离心机设置4℃预制冷，温度达到后，放入双链溶液，启动离心机。取出离心后的双链溶液，去除上清液，加入超纯水使固体完全溶解，取样检测OD260、纯度，可得到表14中的RNA抑制剂，将纯化的成品溶液分装于西林瓶中冻干备用，并将产品密封储存于-20℃冰箱中。

实施例8-1应用PHH评价含有5’MVIP09/3’MVIP09结构的RNA抑制剂活性研究

应用原代人肝细胞(Primary Human hepatocytes，简称PHH)评价表15中RNA抑制剂体外活性。复苏冻存的PHH，将细胞密度调整到6×10⁵个细胞每毫升。从稀释板取配制好的RNA抑制剂加入96孔细胞培养板中(10μL/孔)，并加90μL/孔细胞到96孔板中，每孔终体积为100μL。RNA抑制剂按照200nM起始，依次10倍稀释，共3个浓度点，3复孔，加好后置于5％CO₂、37℃培养箱箱中培养48小时。提取细胞内RNA，然后将RNA反转录为cDNA。利用qPCR检测目的基因cDNA。GAPDH作为内参基因，qPCR在384孔板中进行。qPCR反应程序为：95℃10分钟；然后在95℃15秒，60℃1分钟40个循环。检测APOC3 mRNA相对表达水平。试验结果见表31。

表31RNA抑制剂干预后APOC3 mRNA相对表达水平

本实施例验证了5’MVIP09/3’MVIP09载体组合可以实现siRNA的自我递送。

实施例8-2应用PHH评价带5’MVIP/3’MVIP的RNA抑制剂活性

本实施例应用原代人肝细胞评估表22-1中带修饰的RNA抑制剂体外活性。复苏冻存的PHH，将细胞密度调整到6×10⁵个细胞每毫升。从稀释板取配制好的RNA抑制剂加入96孔细胞培养板中(10μL/孔)，并加90μL/孔细胞到96孔板中，每孔终体积为100μL。RNA抑制剂共2个浓度点：200nM和20nM，3复孔，加好后置于5％ CO₂、37℃培养箱箱中培养48小时。提取细胞内RNA，然后将RNA反转录为cDNA。利用qPCR检测目的基因cDNA。GAPDH作为内参基因，qPCR在384孔板中进行。qPCR反应程序为：95℃10分钟；然后在95℃15秒，60℃1分钟40个循环。检测APOC3 mRNA相对表达水平。所得试验结果见下表32。

表32APOC3 mRNA相对表达水平

试验结果显示，修饰的正义链5’端的载体结构为5’MVIP17，修饰的正义链3’端的载体结构为3’MVIP17，修饰的正义链和反义链偶联载体5’MVIP/3’MVIP的组合5’MVIP01/3’MVIP01、5’MVIP01/3’MVIP17、5’MVIP17/3’MVIP01或5’MVIP09/3’MVIP09，或者所述正义链5’MVIP和正义链3’MVIP的组合5’MVIP01/3'MVIP09、5’MVIP09/3'MVIP01或5’MVIP01/3'MVIP01形成的RNA抑制剂可以自由摄取进入PHH细胞，并呈现出对PHH细胞中的APOC3 mRNA显著的抑制作用。

实施例9不同结构5’MVIP和3’MVIP偶联同一种siRNA对RNA抑制剂的活性影响研究

分别挑选出反义链和正义链，按照实施例7所述的方法配对退火合成RNA抑制剂(见表22-2)。考察5'MVIP和/或3'MVIP结构中X、L、B、D、R₁或R₂不同时，对RNA抑制剂活性效果影响。取适龄的APOC3 Tg小鼠模型做实验评估。在Day0分别通过皮下注射给药3mg/kg。在给药后第14天(Day14)取血，分离血清，用ELISA方法测定血清中APOC3水平，试验结果见表33及图1。

表33 APOC3 Tg小鼠血清中APOC3平均水平(归一化)

RNA抑制剂	RNA抑制剂干预后APOC3平均水平
		生理盐水组	1.000
Kylo-12-DS131	0.331
		Kylo-12-DS141	0.312
Kylo-12-DS142	0.291
		Kylo-12-DS147	0.138
Kylo-12-DS148	0.136
		Kylo-12-DS149	0.101
Kylo-12-DS150	0.127
		Kylo-12-DS1081	0.179
Kylo-12-DS151	0.193
		Kylo-12-DS152	0.184
Kylo-12-DS153	0.100
		Kylo-12-DS154	0.134
Kylo-12-DS155	0.199
		Kylo-12-DS156	0.142
Kylo-12-DS157	0.178
		Kylo-12-DS158	0.211
Kylo-12-DS159	0.243
		Kylo-12-DS160	0.191

备注：归一化是将动物在时间点的TG水平分别除于该只动物Day0天的TG水平，得到一个比率A1，将对照组动物的时间点的TG平均水平除于对照组Day0的TG平均水平，得到一个比率A2。A1除于A2即得归一化后的血中平均TG水平。实验结果显示，5’MVIP/3’MVIP组合中n+m＝4的RNA抑制剂的整体活性稍高于n+m＝3的组合。

实施例10考察5’端或3’端核苷酸不同对RNA抑制剂活性影响

将RNA抑制剂转染进入HepG 2细胞，通过qRT-PCR测定APOC3 mRNA水平。与未干预的HepG 2细胞上清对比，标定样品干预组的APOC3 mRNA相对百分率。试验结果见表34和图2：

表34RNA抑制剂干预后APOC3 mRNA的抑制率

研究结果显示，RNA抑制剂的正义链和反义链5’端或3’端可以承受1个、2个或甚至3个核苷酸不同，RNA抑制剂的活性不受显著影响。

实施例11考察核苷酸糖基2’位上不同的修饰对RNA抑制剂活性影响

考察从正义链的5’端开始不同位置上的核苷酸糖基的2’位氟修饰，从反义链的5’端开始的不同位置的核苷酸糖基的2’位氟修饰，对RNA抑制剂活性的影响。

将RNA抑制剂转染进入HepG 2细胞，通过qRT-PCR测定APOC3 mRNA水平。与未干预的HepG 2细胞上清对比，标定样品干预组的APOC3 mRNA的平均表达水平，并计算抑制率，结果见表35和图3：

表35 RNA抑制剂干预后APOC3 mRNA的抑制率

根据实验结果，修饰方式具有序列的特异性，从正义链的5’端开始的5、7、8、9的核苷酸糖基的2’位氟修饰，从反义链的5’端开始的7、14、16的核苷酸糖基的2’位氟修饰效果比较理想的是DS231、DS261、DS281和DS311。

DS541和DS551具有同一序列,从正义链的5’端开始的5、7、8、9的核苷酸糖基的2’位氟修饰，从反义链的5’端开始的7、14、16的核苷酸糖基的2’位氟修饰或从正义链的5’端开始的3、5、7、8、9、11、13、15的核苷酸糖基的2’位氟修饰，从反义链的5’端开始的2、4、6、8、14、16的核苷酸糖基的2’位氟修饰，RNA抑制剂维持良好活性。

DS571从正义链的5’端开始的3、5、7、8、9、11、13、15的核苷酸糖基的2’位氟修饰，从反义链的5’端开始的2、4、6、8、14、16的核苷酸糖基的2’位氟修饰效果比较理想。

DS591从正义链的5’端开始的9、10、11的核苷酸糖基的2’位氟修饰，从反义链的5’端开始的2、4、6、8、14、16的核苷酸糖基的2’位氟修饰效果比较理想。

实施例12应用PHH筛选评估5’MVIP09/3’MVIP09组合对RNA抑制剂递送效果

应用原代人肝细胞评价表36中RNA抑制剂体外活性。复苏冻存的PHH，将细胞密度调整到6×10⁵个细胞每毫升。从稀释板取配制好的RNA抑制剂加入96孔细胞培养板中(10μL/孔)，并加90μL/孔细胞到96孔板中，每孔终体积为100μL。RNA抑制剂按照500nM起始，依次10倍稀释，共3个浓度点，3复孔，加好后置于5％ CO₂、37℃培养箱箱中培养48小时。提取细胞内RNA，然后将RNA反转录为cDNA。利用qPCR检测目的基因cDNA。GAPDH作为内参基因，qPCR在384孔板中进行。qPCR反应程序为：95℃10分钟；然后在95℃15秒，60℃1分钟40个循环。检测APOC3 mRNA相对表达水平，并计算抑制率，结果见表36和图4。

表36RNA抑制剂干预后APOC3 mRNA的抑制率

试验结果显示，修饰的正义链和反义链偶联载体5’MVIP09/3’MVIP09形成的RNA抑制剂可以自由摄取进入PHH细胞，对PHH细胞中的APOC3 mRNA发挥抑制作用，且呈现明显的剂效作用。

实施例13应用转基因小鼠模型评估RNA抑制剂的活性

考察表36中的RNA抑制剂在体内的活性。取适龄的APOC3 Tg小鼠模型做实验评估。在d0分别通过皮下注射给药3mg/kg。在给药后d8、15、22、29、35和42天采血，测TG和APOC3水平。RNA抑制剂干预后，归一化后的血清中平均APOC3水平结果见表37及图5。

表37归一化后的血清中平均APOC3水平

RNA抑制剂	d0	d8	d15	d22	d29	d35	d42
								生理盐水组	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000
Kylo-12-DS2311	1.000	0.219	0.161	0.234	0.199	0.267	0.299
								Kylo-12-DS2611	1.000	0.209	0.178	0.157	0.246	0.278	0.300
Kylo-12-DS2911	1.000	0.159	0.169	0.210	0.269	0.250	0.289
								Kylo-12-DS5911	1.000	0.189	0.193	0.225	0.253	0.320	0.35

备注：归一化是将动物在时间点的APOC3水平分别除于该只动物d0天的水平，得到一个比率A1，将对照组动物的时间点的平均水平除于对照组d0的平均水平，得到一个比率A2。A1除于A2即得归一化后的血清中平均APOC3水平。

RNA抑制剂干预后，归一化后的血清中平均TG水平结果见表38及图6：

表38归一化后的血清中平均TG水平

RNA抑制剂	d0	d8	d15	d22	d29	d35	d42
								生理盐水组	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000
Kylo-12-DS2311	1.000	0.356	0.307	0.389	0.394	0.450	0.560
								Kylo-12-DS2611	1.000	0.289	0.297	0.322	0.398	0.411	0.460
Kylo-12-DS2911	1.000	0.199	0.213	0.278	0.321	0.345	0.384
								Kylo-12-DS5911	1.000	0.201	0.267	0.293	0.307	0.323	0.360

备注：归一化是将动物在时间点的TG水平分别除于该只动物d0天的水平，得到一个比率A1，将对照组动物的时间点的平均水平除于对照组d0的平均水平，得到一个比率A2。A1除于A2即得归一化后的血清中平均TG水平。

实施例14应用转基因小鼠模型评估RNA抑制剂的活性

考察表22-1中的RNA抑制剂在体内的活性。取适龄的hAPOC3 Tg小鼠模型做实验评估，6-8周龄雄性hAPOC3 Tg小鼠55只，给药组(Ky-12-DS23001、Ky-12-DS25001、Ky-12-DS25401、Ky-12-DS29701、Ky-12-DS29801、Ky-12-DS31705、Ky-12-DS33001和Ky-12-DS31701)和生理盐水组，小鼠适应性饲养2-3天后，禁食采血分离血清检测hAPOC3蛋白、TG、TC和LDL-c水平，根据TG指标随机分组，每组5只。给药当天定义为Day0，其中，Ky-12-DS31701考察3个剂量组，在Day0分别皮下注射给药1mg/kg、3mg/kg和6mg/kg，其他组分别通过皮下注射给药3mg/kg。在给药后Day7、14、21、28、35、42、49、56、63、70和77天采血，测hAPOC3、TC、TG和LDL-c水平，将所测结果归一化(计算方法参见实施例13)，归一化后的hAPOC3、TC、TG和LDL-c干扰效果见图7、图8、图9和图10。

试验结果显示，本实施例考察的这些RNA抑制剂对hAPOC3 Tg小鼠血清中的hAPOC3表达及TC、TG和LDL-c水平都有不同程度的影响，其中对hAPOC3的表达和TG水平影响显著，且持续性好。3mg/kg剂量下：至Day35，Ky-12-DS25401对TG水平的降低率可高达89.89％，至Day77，各RNA抑制剂对TG水平的降低率仍维持在50％上。本实施例也考察了RNA抑制剂Ky-12-DS31701对hAPOC3表达及TC﹑TG和LDL-c水平影响的剂效关系，试验结果显示该RNA抑制剂对TG水平的影响呈现显著的剂效关系，至Day 14，1mg/kg，3mg/kg和6mg/kg可分别使TG水平下降84.21％﹑88.98％和95.06％。

实施例15应用食蟹猴模型评估RNA抑制剂的活性

高脂食蟹猴，雄性，15只，每组3只，给药组(Ky-12-DS31701、Ky-12-DS31712、Ky-12-DS31711和Ky-12-DS33001)和生理盐水组，适应性喂养2周后，按TG水平随机分组，分组当天进行皮下给药，4mg/kg。于以下时间点采集隐静脉或头静脉血液：第0天(Day 0)以及给药后的Day7、14、21、28、35、42、49、56和63。测APOC3、TC、TG、HDL-c和LDL-c水平，将所测结果归一化，归一化后的APOC3、TG、HDL-c、LDL-c和TC干扰效果见图11、图12、图13、图14和图15。。在Day28和Day 63，分别对Ky-12-DS31701给药组的食蟹猴进行额外的肝脏活检，提取肝脏组织，通过RT-qPCR测量食蟹猴肝脏中的APOC3 mRNA水平，将检测结果进行归一化。

试验结果显示，RNA抑制剂Ky-12-DS31701、Ky-12-DS31712、Ky-12-DS31711、Ky-12-DS33001对食蟹猴血清中的APOC3表达都有显著的抑制效果，其中Ky-12-DS31701和Ky-12-DS33001使TG水平分别达到84.01％和81.15％的降低率，TC和LDL-c水平都有不同程度的降低，HDL-c水平显著上升。上述化合物对APOC3表达和TG水平抑制效果显著，且持续性好，其中Ky-12-DS31701对TG的降低水平，至Day63仍旧可达到75.48％。在Day28和Day 63，分别对Ky-12-DS31701给药组的食蟹猴进行肝脏活检，提取肝脏组织，通过RT-qPCR测量食蟹猴肝脏中的APOC3 mRNA水平，将检测结果进行归一化，归一化计算方法参见实施例13。所得试验结果显示，Ky-12-DS31701对食蟹猴APOC3 mRNA水平的抑制率分别为91.65％和87.23％,个体最高抑制率达95％。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种抑制APOC3基因表达的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述RNA抑制剂由链长各自独立地为15-30个核苷酸的正义链和反义链通过碱基配对形成，其中所述链长各自独立地优选为19-23个核苷酸，并且所述正义链和反义链之间至少有80％的碱基互补。

2.根据权利要求1所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述反义链选自a)以下序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：5’uugguggcgugcuucauguaatt 3’(SEQ IDNO.212),5’uaacccugcaugaagcugagatt 3’(SEQ ID NO.216),5’uuaacggugcuccaguagucutt3’(SEQ ID NO.224),5’cagagaacuuguccuuaacggtt 3’(SEQ ID NO.225),5’uauugaggucucaggcagccatt 3’(SEQ ID NO.241),5’ugaaguuggucugaccucaggtt 3’(SEQ IDNO.255),5’gcacugagaauacugucccuuuu 3’(SEQ ID NO.256),5’gcacugagaauacugucccuu3’(SEQ ID NO.459),5’acacugagaauacugucccua 3’(SEQ ID NO.461),5’ugaauacugucccuuuuaagc 3’(SEQ ID NO.465),5’cugagaauacugucccuuuua 3’(SEQ IDNO.471)，5’acugagaauacugucccuuua 3’(SEQ ID NO.472)，5’uaauacugucccuuuuaagcaa 3’(SEQ ID NO.438)，5’ugaggucucaggcagccacgg3’(SEQ ID NO.600)，5’uggauaggcagguggacuugg3’(SEQ ID NO.620),5’caggauggauaggcaggugga3’(SEQ IDNO.624)，5’gagcacugagaauacuguccc3’(SEQ ID NO.668),5’acacugagaauacugucgcuc3’(SEQ ID NO.687),5’acacugagaauacugucgcuu3’(SEQ ID NO.700),5’ucacugagaauacugucccuu 3’(SEQ ID NO.519)；

3.根据权利要求1所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述正义链和反义链选自a)以下序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列；所述正义链和反义链的序列组合如下所示：

4.根据权利要求1所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述正义链和/或反义链包含至少一个2’-修饰核苷酸，所述2’-修饰核苷酸包括：2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基核苷酸或2’-烷基核苷酸。

5.根据权利要求4所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述正义链和/或反义链包含至少一个2’-O-甲基核苷酸或2’-脱氧-2’-氟核苷酸。

6.根据权利要求5所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述正义链和/或反义链的末端中至少有一个末端的3个相邻核苷酸之间的磷酸酯键可以被硫代。

7.根据权利要求5所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的正义链和反义链选自a)以下序列，b)与a)中的序列具有相同的至少连续15个核苷酸的序列，和c)与a)和b)中的序列相差不多于3个核苷酸的序列：

8.根据权利要求1-7中任一项所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述RNA抑制剂还含有载体结构，其结构如式Ia、Ib或Ic所示：

其中，

所述载体结构包括5’MVIP和3’MVIP；

所述5’MVIP由转接点R₁、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，其通过转接点R₁与正义链5’端或反义链5’端连接，其结构如通式I所示：

(X-L)_n-B-D-R₁-

I

所述3’MVIP由转接点R₂、连接链D、接头B、支链L和肝靶向特异性配体X组成，其通过转接点R₂与正义链3’端或反义链3’端连接，其结构如通式II所示：

(X-L)_m-B-D-R₂-

II

其中，

所述转接点R₁为如下所示的含有N、S或O的杂环或碳环结构：

或者，所述R₁为-NH(CH₂)_xCH₂O-，其中x为3-12的任意整数，优选为4-6的任意整数；

所述转接点R₂为如下所示的含有N、S或O的杂环或碳环结构：

或者，所述转接点R₂为-NH(CH₂)_x1CH(OH)(CH₂)_x2CH₂O-，其中x1为1-4的任意整数，x2为0-4的任意整数；

所述肝靶向特异性配体X在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同，其选自单糖及其衍生物，优选为为N-乙酰半乳糖胺及其衍生物，更优选地选自以下结构：

其中，W选自-OH、-NHCOOH和-NHCO(CH₂)_qCH₃中的一种或两种，其中q为0-4的整数；

所述支链L在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同，其选自如下结构中的一种或多种：

其中，r1是1-12的任意整数，r2为0-20的任意整数，Z为H、烷基或酰胺基，所述烷基如C₁-C₅烷基；

所述接头B在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同，其选自以下结构：

所述连接链D在5’MVIP与3’MVIP各自的内部或5’MVIP与3’MVIP之间相同或不同，其选自以下结构：

其中，每个p各自独立地为1-20的任意整数；s为2-13的任意整数；Z₁和Z₂为相同或者不同的取代基团。

9.根据权利要求8所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述5’MVIP为如下所示的5’MVIP01、5’MVIP09或5’MVIP17，所述3’MVIP为如下所示的3’MVIP01、3’MVIP09或3’MVIP17：

10.根据权利要求9所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述正义链5’端的载体结构为5’MVIP17，所述正义链3’端的载体结构为3’MVIP17，所述正义链5’MVIP和反义链3’MVIP的组合为5’MVIP01/3’MVIP01、5’MVIP01/3’MVIP17、5’MVIP17/3’MVIP01或5’MVIP09/3’MVIP09，或者所述正义链5’MVIP和正义链3’MVIP的组合5’MVIP01/3'MVIP09、5’MVIP09/3'MVIP01或5’MVIP01/3'MVIP01。

11.根据权利要求9所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述RNA抑制剂选自Ky-12-DS23001、Ky-12-DS25001、Ky-12-DS25401、Ky-12-DS29701、Ky-12-DS29801、Ky-12-DS31701、Ky-12-DS31702、Ky-12-DS31703、Ky-12-DS31704、Ky-12-DS31705、Ky-12-DS31706、Ky-12-DS31707、Ky-12-DS31708、Ky-12-DS31709、Ky-12-DS31711、Ky-12-DS31712、Ky-12-DS31713、Ky-12-DS33001、Ky-12-DS33006、Kylo-12-DS1071、Kylo-12-DS1081、Kylo-12-DS1131、Kylo-12-DS1141、Kylo-12-DS1241、Kylo-12-DS1311、Kylo-12-DS1321、Kylo-12-DS5911、Kylo-12-DS2911、Kylo-12-DS2611、Kylo-12-DS2311、Kylo-12-DS3111和Kylo-12-DS5411中。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的RNA抑制剂或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或/和预防与含APOC3的水平升高相关的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述与含APOC3的水平升高相关的疾病包括肝源性疾病，其包括炎性、心脑血管和代谢疾病，其中，所述心脑血管疾病包括高脂血症、中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病、主动脉瓣狭窄、高甘油三酯血症(HTG)、严重高甘油三酯血症(sHTG)或家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)。

13.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物包括权利要求1-11中任一项所述的APOC3抑制剂或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的辅料，所述药物组合物为口服剂、静脉注射剂或者皮下或肌内注射剂，优选为皮下注射剂。