CN103649103A - 用于抑制载脂蛋白c-iii(apoc3)基因表达的组合物与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向APOC3基因的双链核糖核酸(dsRNA)、以及使用该dsRNA抑制APOC3表达的方法。

Description

用于抑制载脂蛋白C-III(APOC3)基因表达的组合物与方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月23日提交的美国临时申请号61/499,620的权益，将其通过引用以其全文特此结合。
序列表的引用
本申请包括一个序列表，其大小为X00,000字节，在201X年某月XX日创建，以文件名“11111US_序列表.txt”电子提交。该序列表通过引用结合。
发明领域
本发明涉及靶向APOC3基因的双链核糖核酸(dsRNA)、以及使用该dsRNA抑制APOC3表达的方法。
发明背景
在美国，30％的成人具有升高的＞150mg／dL的甘油三酯(TG)。具有严重的高甘油三酯血症(TG>500mg／dL)的成人的患病率是1.7％。目前的治疗包括生活方式改变(饮食、锻炼以及戒烟)、处方级别的鱼油、贝特以及烟酸。
ApoC3是一种分泌型肝蛋白，显示可以抑制将TG水解为游离脂肪酸的脂蛋白脂酶；抑制ApoE介导的通过LDLR和LRP以及受体不依赖性内吞作用对富含TG脂蛋白的肝摄取；并且促进肝VLDL分泌。人类APOC3基因中的至少一个突变已经与有利的脂类谱相关联。(Pollin TI(珀林TI)等人，2008)人类APOC3中的无效突变赋予一个有利的血浆脂类谱以及明显的心脏保护，Science(《科学》)322(5908)：1702-5)。
双链RNA分子(dsRNA)已经显示出以一种高度保守的调节机制(称为RNA干扰(RNAi))来阻断基因表达。WO99／32619(Fire(菲尔)等人)披露了至少25个核苷酸长度的dsRNA抑制秀丽线虫(C.elegans)中的基因表达的用途。dsRNA还显示出在其他有机体中降解靶标RNA，包括植物(参见，例如WO99/53050，Waterhouse(沃特豪斯)等人；以及WO99/61631，Heifetz(黑菲兹)等人)、果蝇(参见，例如Yang，D.(杨D)等人，Curr.Biol.(《生物学近况》)(2000)10：1191-1200)以及哺乳动物(参见，例如WO00／44895，Limmer(李默)；以及DE10100586.5，Kreutzer(克热特则)等人)。
发明概述
在此披露了一种用于抑制APOC3基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中该dsRNA包括一个正义链与一个反义链，该正义链与反义链每一者在长度上为30个或更少的核苷酸，其中该反义链包括在表1、2、6、7或10中的一个反义序列的至少15个连续核苷酸。在一个实施例中，该dsRNA包括一个由核苷酸序列SEQ IDNO：70组成的正义链以及一个由核苷酸序列SEQ ID NO：151(AD-45149.1UM)组成的反义链。在另一个实施例中，该正义链序列选自表1、2、6、7或10，并且该反义链选自表1、2、6、7或10。
在一些实施例中，该dsRNA的至少一个核苷酸是一种经修饰的核苷酸，例如，至少一个经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：2′-O-甲基修饰的核苷酸、包括5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸、以及连接至胆甾醇基衍生物或正十二烷酸双癸酰胺基团的末端核苷酸、2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包括非天然碱基的核苷酸。
在一些实施例中，至少一个链包括具有至少1个核苷酸的3’突出或每一链包括具有至少2个核苷酸的3’突出。
本发明的任何dsRNA可以进一步包括一种配体，例如一种轭合至该dsRNA的正义链的3’末端的配体。在一些实施例中，本发明的dsRNA进一步包括至少一个N-乙酰基-半乳糖胺。
另外，本发明提供了一种包括本发明的任何dsRNA的细胞；一种编码本发明的任何dsRNA的至少一个链的载体以及一种包括该载体的细胞。
本发明还包括包含本发明的任何dsRNA的、用于抑制APOC3基因的表达的药物组合物。该药物组合物可以包括一种脂类制剂，例如，一种包括MC3的脂类制剂。
本发明的另一个方面是一种用于抑制细胞中APOC3表达的方法，该方法包括：(a)使该细胞与本发明的APOC3dsRNA进行接触并且(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段时间，该时间足以获得APOC3基因的mRNA转录物的降解，由此抑制该细胞中的该APOC3基因的表达。在一些实施例中，APOC3表达被抑制至少30％。
本发明的一个另外的方面是一种治疗由APOC3表达介导的病症的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的APOC3dsRNA或本发明的药物组合物给予需要这种治疗的人类。该病症可以是例如升高的甘油三酯水平，例如，甘油三酯水平>150mg／dL或>500mg／dL。在一些实施例中，给药引起脂蛋白脂酶和／或肝脂酶活性的增加。将该dsRNA或该药物组合物以大约0.01mg／kg至大约10mg／kg或大约0.5mg／kg至大约50mg／kg的剂量给予。
附图说明
图1是一个显示在用靶向APOC3的siRNA(“siRNA#1”以及“siRNA#2”)进行治疗之后对小鼠中的靶标mRNA、甘油三酯(TG)以及总胆固醇水平的影响的图。
图2显示了GalNAc的结构。
图3显示了在3’末端经由磷酸酯键轭合至Chol-p-(GalNAc)3的siRNA的结构。
图4显示了轭合至LCO(GalNAc)3的siRNA的结构(一种(GalNAc)3-3’-石胆酸-油酰基siRNA轭合物)。
发明详细说明
本发明的一个或多个实施例的细节在以下说明中阐述。本发明的其他特征、目的以及优点将通过以下说明、附图以及权利要求书而清楚。
本发明提供了dsRNA、以及使用这些dsRNA来抑制其中该dsRNA靶向APOC3基因的细胞中或哺乳动物中的APOC3基因的表达的方法。本发明还提供了用于治疗哺乳动物中由APOC3基因表达引起的病理学病状以及疾病的组合物以及方法。APOC3dsRNA引导APOC3mRNA的序列特异性降解。
定义
为方便起见，在本说明书、实例以及所附权利要求书中使用的某些术语与短语的意义提供于下。如果在本说明书中的其他部分中的术语使用与在本部分提供的该术语的定义有明显偏差，应该以在本部分中的定义为准。
“G”、“C”、“A”以及“U”每一者通常分别代表包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。“T”以及“dT”在此可互换地使用并且指其中核碱基是胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，例如脱氧核糖胸腺嘧啶。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分。技术人员应很好地意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包括一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如，非限制性地，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明的核苷酸序列中被一种包含例如肌苷的核苷酸所置换。包含此类置换部分的序列是本发明的实施例。
“APOC3”指载脂蛋白C-III基因。根据NCBI NLM网站，载脂蛋白C-III是一种极低密度脂蛋白(VLDL)。APOC3抑制脂蛋白脂酶以及肝脂酶；认为它可以延迟富含甘油三酯的颗粒的分解代谢。在大鼠以及人类基因组中，APOAl、APOC3以及APOA4基因紧密相连。A-I与A-IV基因转录自相同链，而A-1与C-III基因是趋同转录的。apoC-III水平的增加引起高甘油三酯血症的发展。人类APOC3mRNA序列是GenBank登录号NM_000040.1，在此包括为SEQ ID NO：1。食蟹猴(cynomolgus monkey)(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))ANGPTL3mRNA序列是GenBank登录号X68359.1。
如在此所使用的，“靶标序列”指的是在APOC3基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
如在此所使用的，术语“含有序列的链”指的是含有由相当于使用标准核苷酸命名法描述的序列的核苷酸链的寡核苷酸。
如在此所使用的，除非另有陈述，术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，指的是含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链结构的能力，如本领域技术人员所理解。
例如，当在严格杂交条件下一个第一核苷酸序列与一个第二核苷酸序列杂交(例如退火)时，可以描述为这两序列互补。杂交条件包括用于退火和／或洗涤步骤的温度、离子强度、pH以及有机溶剂浓度。术语严格杂交条件指以下的条件：在此条件下，一个第一核苷酸序列将优先与其靶标序列(例如一个第二核苷酸序列)杂交，并且以较低程度与其他序列杂交或根本不与其杂交。严格杂交条件是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。通常，严格杂交条件在一个定义的离子强度和pH下被选择为低于该核苷酸序列的热熔点(Tm)大约5℃，。Tm是这些第一核苷酸序列的50％杂交至一种完全匹配的靶标序列的温度(在一个定义的离子强度和pH下)。对核酸杂交的广泛指导发现于例如Tijssen(提基森)(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridizationwith Nucleic Acid Probes part I，chap.2(生物化学与分子生物学实验室技术——核酸探针杂交第I部分，第2章)，“Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays(杂交原则和核酸探针分析策略综述)”，Elsevier，N.Y.(爱思唯尔出版公司，纽约)(“Tijssen(提基森)”)。
可以应用其他条件，比如可以在有机体中遇到的生理学相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用来确定两序列互补测试的最适条件集。
这包括：包括该第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包括该第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在该第一以及第二核苷酸序列全长上的碱基配对。此类序列在此可以称作相对于彼此“完全互补”。然而，在此在一个第一序列被称作相对于一个第二序列“基本上互补”的情况下，这两序列可以是完全互补的，或者它们可以在杂交时形成一个或多个，但是总体上不多于4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力。然而，在两寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出的情况下，此类突出不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如，出于在此描述的目的，以下这样一种dsRNA也可以称作“完全互补”：该dsRNA包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸以及一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸，其中该更长的寡核苷酸包括一个与该更短的寡核苷酸完全互补的21核苷酸序列。
如在此使用的，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和／或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G：U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsRNA的正义链与反义链之间，或dsRNA的反义链与靶标序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。
如在此使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸指与感兴趣的mRNA(例如，编码APOC3的mRNA)的一个连续部分(包括5’UTR，开放阅读框(ORF)或者3’UTR)基本互补的多核苷酸。例如，如果一个多核苷酸与编码APOC3的mRNA的一个非间断部分基本上互补，那么该序列则与APOC3mRNA的至少一部分互补。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链与一个靶标mRNA足够地互补以引起该靶标mRNA的切割。
如在此所使用的，术语“双链RNA”或“dsRNA”指的是核糖核酸分子的复合体，其具有双链结构，包括两条反向平行的、基本上互补的、如以上所定义的核酸链。总体上，每一链的大部分的核苷酸是核糖核苷酸，但是如在此详述的，两条链的每一者或两者还可以包括至少一个非核糖核苷酸，例如，一种脱氧核糖核苷酸和／或一种经修饰的核苷酸。另外，如在本说明书中所使用的，“dsRNA”可以包括对核糖核苷酸的化学修饰，这包括在多个核苷酸处的大量修饰并且包括在此披露的或本领域内已知的所有类型的修饰。如在siRNA类型的分子中所使用的任何此类修饰被“dsRNA”所囊括用于本说明书以及权利要求书的目的。
形成双链结构的两条链可以是一个更大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。在这两条链是一个更大分子的部分并且因此通过一条链的3’-末端与形成该双链结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链而连接的情况下，该连接的RNA链称作“发夹环”。在这两条链是通过除了一条链的3’-末端与形成该双链结构的对应另一条链的5’-末端之间的非间断核苷酸链以外的方式而共价连接的情况下，该连接结构称作“连接物(linker)”。这些RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去存在于该双链体中的任何突出。除了双链结构，一个dsRNA可以包括一个或多个核苷酸突出。术语“siRNA”还可以在此用作指代以上所述的dsRNA。
如在此使用的，“核苷酸突出”指：当dsRNA的一条链的3′-末端延伸超过另一条链的5′-末端(或反之亦然)时，从该dsRNA的双链结构突出的未配对的一个或多个核苷酸。“平端”或“平末端”意思是在该dsRNA的那个末端没有非配对的核苷酸，即，没有核苷酸突出。一个“平端的”dsRNA是一个在其全长上双链化的dsRNA，即，在该分子的任何一端都没有核苷酸突出。
术语“反义链”指的是dsRNA的链，该链包括基本上与一个靶标序列互补的区域。如在此所使用的，术语“互补性区域”指的是该反义链上基本上与一个序列互补的区域，例如如在此定义的一个靶标序列。在该互补性区域不与该靶标序列完全互补的情况下，错配在末端区域是最为可容忍的，并且如果出现错配，它们通常在末端的一个或多个区域，例如5’和／或3’末端的6、5、4、3、或2个核苷酸之内。
如在此所使用的术语“正义链”指的是含有与反义链区域基本上互补的区域的dsRNA链。
如在此所使用的，术语“核酸脂类颗粒”包括术语“SNALP”并且指包覆少量水性内部的脂类囊泡，该水性内部包括一种核酸，比如dsRNA或dsRNA从其转录的质粒。核酸脂类颗粒(例如SNALP)描述于美国专利申请公开号20060240093、20070135372以及2008年4月15日提交的USSN61／045,228中。这些申请通过引用特此结合。
当提及dsRNA时，“引入细胞内”意思是促进摄取或吸收进入该细胞，如本领域内的普通技术人员所理解的。dsRNA的吸收或摄取可以通过非辅助的扩散或积极的细胞过程，或通过辅助剂或仪器而发生。本术语的意义不限于体外细胞；dsRNA还可以被“引入细胞内”，其中该细胞是活有机体的部分。在这样的例子中，引入该细胞内将包括递送至该有机体。例如，对于体内递送而言，dsRNA可以被注射进入一个组织部位或全身性地给予。体外引入细胞内包括本领域内已知的方法，比如电穿孔以及脂质转染法。另外的方法描述于此或在本领域内是已知的。
当其涉及APOC3基因时，术语“沉默”、“抑制表达”、“下调表达”、“压制表达”等等在此是指至少部分地压制APOC3基因的表达，表示为：可从APOC3基因在其中转录的一个第一细胞或一组第一细胞(已经经过处理由此APOC3基因的表达被抑制)中分离的mRNA的量减少，这是与一个第二细胞或一组第二细胞(对照细胞)相比，其与该一个第一细胞或一组第一细胞基本上相同，除了未经受如此的处理。抑制程度通常如以下表示
Figure BPA0000181747700000081
可替代地，抑制程度能以与APOC3基因表达功能性相联系的一个参数的减少而给出，例如APOC3基因编码的由细胞分泌的蛋白的量，或展示某种表型(例如凋亡)的细胞的数目。原则上，APOC3基因沉默可以在(组成型地或通过基因组工程化)表达该靶标的任何细胞中通过任何合适的测定来确定。然而，当需要一个参考来确定一个给定的dsRNA是否在一定程度上抑制APOC3基因的表达并且因此被本发明所囊括时，在以下实例中提供的这些测定应该作为此参考。
例如，在一些例子中，通过在本发明中表征的双链寡核苷酸的给予，APOC3基因的表达被抑制至少大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实例中，通过在本发明中表征的双链寡核苷酸的给予，APOC3基因的表达被抑制至少大约60％、70％或80％。在一些实例中，通过在本发明中表征的双链寡核苷酸的给予，APOC3基因的表达被抑制至少大约85％、90％或95％。
如在APOC3表达的背景下在此所使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”以及类似术语指缓解或减轻由APOC3表达介导的病理学过程。在本发明的上下文中，在涉及以下在此所引用的任何其他病状的范围内(除了由APOC3表达介导的病理学过程)，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”以及等等意思是缓解或减轻至少一个与此病状相关联的症状，或意思是减缓或逆转这种病状的进程。
如在此所使用的，短语“有效量”指这样一个量，该量在治疗、预防或管理由APOC3表达介导的病理学过程或由APOC3表达介导的病理学过程的明显症状中提供一个治疗上的益处。有效的具体量可以容易地由普通医疗从业者来确定，并且可以根据本领域内已知的因素而变化，比如，例如由APOC3表达介导的病理学过程的类型、患者病史以及年龄、由APOC3表达介导的病理学过程的阶段、以及对抗由APOC3表达介导的病理学过程的试剂的给予。
如在此所使用的，“药物组合物”包括药理学有效量的dsRNA以及药学上可接受的载体。如在此所使用的，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简言之的“有效量”指有效产生预期的药理学、治疗或预防结果的RNA的量。例如，如果当一个与一种疾病或病症相关联的可测量的参数减少至少25％时，一个给定的临床治疗才被认为是有效的，那么一种用于该疾病或病症的治疗的药物的治疗的有效量是实现该参数至少减少25％所需要的一个量。例如，治疗有效量的靶向APOC3的dsRNA可以使APOC3血清水平降低至少25％。
术语“药学上可接受的载体”指用于一种治疗剂的给予的载体。此类载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇、及其组合。该术语特别地排除细胞培养基。对于口服给予的药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，比如惰性稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠以及碳酸钙、磷酸钠以及磷酸钙，以及乳糖，而玉米淀粉以及褐藻酸是合适的崩解剂。结合剂可以包括淀粉以及明胶，而润滑剂(如果存在的话)将通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果希望的话，可以将片剂用一种材料进行包衣，比如单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯，以延迟在胃肠道中的吸收。
如在此所使用的，“转化的细胞”是己引入可表达dsRNA分子的载体的细胞。
双链核糖核酸(dsRNA)
如在此更详细地描述，本发明提供了用于在细胞或哺乳动物中抑制APOC3基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其中该dsRNA包括一个具有互补性区域(该区域与在APOC3基因表达中形成的mRNA的至少一部分互补)的反义链，并且其中该互补性区域的长度小于30个核苷酸，通常长度是19-24个核苷酸，并且其中所述dsRNA在与表达所述APOC3基因的细胞相接触时抑制所述APOC3基因的表达至少30％，如通过例如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法、或通过基于蛋白的方法(例如通过蛋白质印迹(Western blot))所测定的。当通过如在以下实例中所描述的测定进行测量时，APOC3基因的表达可以减少至少30％。例如，在细胞培养物中(比如在Hep3B细胞中)的APOC3基因的表达可以通过测量APOC3mRNA的水平(例如通过bDNA或TaqMan测定)、或通过测量蛋白水平(比如通过ELISA测定)来进行测定。本发明的dsRNA可以进一步包括一个或多个单链的核苷酸突出。
该dsRNA可以通过如进一步在以下所讨论的、本领域内已知的标准方法来进行合成，例如，通过使用自动化的DNA合成仪，比如从例如Biosearch、AppliedBiosystems公司可商购的合成仪。该dsRNA包括两个RNA链，它们足够地互补以杂交形成一个双链结构。该dsRNA的一条链(反义链)包括一个互补性区域，该区域与一个靶标序列(衍生自在APOC3基因表达期间形成的mRNA的序列)基本上互补并且通常是完全互补，另一条链(正义链)包括一个区域，该区域与该反义链互补，这样使得这两条链当在合适的条件下进行组合时杂交并且形成一种双链结构。通常，该双链结构长度为在15与30之间或25与30之间，或18与25之间，或19与24之间，或19与21之间，或19、20或21个碱基对。在一个实施例中，该双链长度是19个碱基对。在另一个实施例中，该双链长度是21个碱基对。当两个不同的siRNA组合使用时，它们的双链长度可以是相同的或不同的。
本发明的dsRNA的每一链的长度通常为在15与30之间，或18与25之间，或18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在其他实施例中，每一链的长度是25-30个核苷酸。该双链的每一链可以是相同长度或不同长度。当两个不同的siRNA组合使用时，每一siRNA的每一链的长度可以是相同的或不同的。
本发明的dsRNA包括长于21-23个核苷酸的dsRNA，例如，足够长以被RNaseIII酶Dicer加工成为21-23碱基对siRNA的dsRNA，这样的siRNA然后被结合进入RISC。因此，本发明的dsRNA的长度可以是至少25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90个碱基对，或至少100个碱基对。
本发明的dsRNA可以包括具有一个或多个核苷酸的一个或多个单链突出。在一个实施例中，该dsRNA的至少一个末端具有1至4个核苷酸、通常是1或2个核苷酸的单链核苷酸突出。在另一个实施例中，该dsRNA的反义链在3’末端以及5’末端都具有超出正义链的1-10个核苷酸的突出。在另一个实施例中，该dsRNA的正义链在3’末端以及5’末端都具有超出反义链的1-10个核苷酸的突出。
具有至少一个核苷酸的突出的dsRNA可以具有出乎预期的超出平末端相似物的优异抑制特性。在一些实施例中，具有仅一个核苷酸的突出的存在增强了该dsRNA的干扰活性，而不影响其整体稳定性。具有仅一个突出的dsRNA在体内以及在多种细胞、细胞培养基、血液以及血清中尤其显示出稳定性与有效性。通常，单链的突出位于反义链的3′-终末端，或者可替代地，位于正义链的3‘-终末端。该dsRNA还可以具有平末端，通常位于反义链的5’-末端。此类dsRNA可以具有改进的稳定性以及抑制活性，由此允许以低剂量，即每天低于5mg／kg受体体重来给予。通常，该dsRNA的反义链在3’末端具有核苷酸突出，并且5’末端是平端。在另一个实施例中，突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
在一个实施例中，APOC3基因是人类APOC3基因。在具体实施例中，该dsRNA的正义链是具有来自表1、2、6、7、11或12的正义序列的一者，并且该反义链是具有表1、2、6、7、11或12的反义序列的一者。在表1、2、6、7、11或12中提供的靶标序列中靶向其他地方的可替代的反义试剂可以使用该靶标序列以及侧翼APOC3序列来容易地进行确定。
熟练的技术人员将很好的意识到，具有20与23之间个碱基对(但是特别是21个碱基对)的双链结构的dsRNA被奉为是尤其有效地诱导RNA干扰(Elbashir(厄尔巴瑟)等人，EMBO2001，20：6877-6888)。然而，其他人已经发现更短或更长的dsRNA也可以有效。在以上描述的实施例中，由于在表1、2、6、7、11或12中提供的寡核苷酸序列的性质，在本发明中表征的dsRNA可以包括至少一条具有在此描述的长度的链。可以合理地预期，具有表1、2、6、7、11或12中的序列之一的、在一个末端或两个末端减去仅仅数个核苷酸的更短的dsRNA与以上描述的dsRNA相比可以类似地有效。因此，本发明考虑了以下这样的dsRNA：它们具有来自表1、2、6、7、11或12中的序列之一的至少15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的部分序列，并且与包括完全序列的一个dsRNA相比，它们在于此如下描述的测定中抑制APOC3基因表达的能力方面不同，抑制不超过5％、10％、15％、20％、25％、或30％。此外，在一个希望的APOC3靶标序列之内进行切割的dsRNA可以使用相应的APOC3反义序列以及一个互补正义序列来容易地进行制备。
另外，在表1、2、6、7、11或12中提供的dsRNA识别APOC3中一个易于经受基于RNAi切割的位点。按照这样，本发明进一步表征了在被本发明的试剂之一所靶向的序列之内进行靶向的dsRNA。如在此所使用的，如果一个第二dsRNA切割与一个第一dsRNA的反义链互补的mRNA之内的任何地方的信息，那么该第二dsRNA被描述为在该第一dsRNA的序列之内进行靶向。这样一个第二dsRNA将通常由以下组成：来自表1、2、6、7、11或12中提供的序列之一的至少15个连续核苷酸连同来自与APOC3基因中所选序列相连续的区域的另外的核苷酸序列。
可以常规地通过凝胶电泳并且如果必要的话联合本领域内已知的核酸杂交技术来检测该RNA靶标的切割。一个dsRNA的靶标mRNA上的切割位点可以通过本领域内的普通技术人员普遍已知的方法来确定，例如描述于Soutschek(索特克)等人，Nature(《自然》)；2004，432卷，173-178页中的5’-RACE方法(出于所有目的通过引用将其结合在此)。
本发明所表征的dsRNA可以包含一个或多个对于靶标序列的错配。在一个实施例中，本发明所表征的dsRNA包含的错配不多于3个。如果该dsRNA的反义链包含对于一个靶标序列的错配，则优选地是错配的区域不位于互补性区域的中心。如果该dsRNA的反义链包含对于该靶标序列的错配，则优选地是该错配被限于从任一末端起的5个核苷酸，例如距离互补性区域的5’或3’末端5、4、3、2或1个核苷酸处。例如，对于一个具有23个核苷酸的、与一个APOC3基因的一个区域互补的dsRNA链而言，该dsRNA通常在中心13个核苷酸之内不包含任何错配。在本发明中描述的方法可以用于确定一个包含对于靶标序列的错配的dsRNA是否在抑制APOC3基因的表达中有效。考虑具有错配的dsRNA在抑制APOC3基因表达方面的效率是重要的，尤其是如果APOC3基因中的互补性具体区域已知在群体内具有多态性序列变异。
在另一个方面，本发明是一种单链的反义寡核苷酸RNAi。反义寡核苷酸是一种单链的寡核苷酸，与靶标mRNA之内的一个序列互补。反义寡核苷酸能以化学计量的方式通过与该mRNA碱基配对并且物理性地阻碍翻译机器来抑制翻译，参见Dias，N.(蒂尔斯，N.)等人，(2002)Mol.Cancer Ther.(《分子癌症治疗学》)1：347-355。反义寡核苷酸还可以通过结合至该mRNA靶标并且促进mRNA靶标经由RNase-H的破坏来抑制靶标蛋白表达。单链的反义RNA分子可以是大约13至大约30个核苷酸长并且具有与一个靶标序列互补的序列。例如，该单链的反义RNA分子可以包括以下这样一个序列：该序列是来自表1、2、6、7或10的反义序列之一的至少大约13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸。
修饰
在再另一个实施例中，该dsRNA是经化学修饰的以增强稳定性。本发明所表征的核酸可以通过本领域内良好建立的方法来进行合成和／或修饰，比如描述于“Current protocols in nucleic acid chemistry(当前核酸化学方案)”，Beaucage，S.L.(比尤克居，S.L.)(编)，John Wiley&Sons，Inc.(约翰威利父子公司)，纽约，纽约州，美国中的那些，特此通过引用将其结合于此。在本发明中有用的dsRNA化合物的具体实例包括包含经修饰的骨架或非天然核苷间键的dsRNA。如在本说明书中所定义的，具有经修饰的骨架的dsRNA包括在该骨架中保留了磷原子的那些以及在该骨架中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如有时在本领域内所引用的，在其核苷间骨架中不具有磷原子的经修饰的dsRNA也可以被认为是寡核苷。
经修饰的dsRNA骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸三酯，以及具有正常3′-5′键、这些键的2′-5′连接类似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中相邻对的核苷单位以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′来连接的反向极性的那些硼烷磷酸酯。还可以包括不同盐、混合盐以及游离酸形式。
传授以上的含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；以及5,625,050，其每一者通过引用结合于此
其中不包括磷原子的经修饰的dsRNA骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子以及烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键的那些(部分地从一个核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲乙酰基(methylene formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架；含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的N、O、S和CH2组成部分的骨架。
传授以上的寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，其每一者通过引用结合于此。
在另一个合适的dsRNA模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即骨架)被新基团替代。保持碱基单元以与适当的核酸靶标化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，即已经显示具有优异的杂交特性的dsRNA模拟物，称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，dsRNA的糖骨架被含酰胺的骨架，尤其氨乙基甘氨酸骨架替代。这些核碱基得以保持并且直接或间接地结合至该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。传授PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；以及5,719,262，其每一者通过引用结合于此。PNA化合物的另外的传授可以发现于Nielsen(尼尔森)等人，Science(《科学》)，1991，254，1497-1500中。
本发明的其他实施例是以上参考的美国专利号5,489,677的具有硫代磷酸酯骨架的dsRNA和具有杂原子骨架的寡核苷，并且具体是--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--以及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然的磷酸二酯骨架由--O--P--O--CH2--代表]，以及以上参考的美国专利号5,602,240的酰胺骨架。还优选上述参考的美国专利号5,034,506的具有吗啉代骨架结构的dsRNA。
经修饰的dsRNA还可以含一个或多个经取代的糖部分。优选的dsRNA在2’位置包括下述之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。尤其优选的是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、以及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n与m是从1至大约10。其他优选的dsRNA在2’位置包括下述之一：C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、C1、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于提高dsRNA药代动力学特性的基团或用于提高dsRNA药效学特性的基团、以及其他具有类似特性的取代基。一个优选的修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O--CH2CH2OCH3，也称作2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin(马丁)等人，Helv.Chim.Acta(《瑞士化学学报》)，1995，78，486-504)，即，一个烷氧基-烷氧基基团。另一个优选的修饰包括如以下示例中阐述的2’-二甲基氨基氧乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，如在以下实例中所描述的也称作2′-DMAOE，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2′-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2，也如在以下实例中所描述的。
其他优选修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。类似的修饰也可以在dsRNA的其他位置完成，尤其是3’末端核苷酸上或在2’-5’连接的dsRNA中的糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5’位置。dsRNA还可以具有糖模拟物如替代呋喃戊糖的环丁基部分。传授此类经修饰糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；以及5,700,920，其中某些是与本申请共同拥有的，并且其每一者通过引用以其全文结合于此。
dsRNA还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰物或取代物。如在此所使用的，“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰核碱基包括但不局限于其他合成以及天然核碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基，8-氨基，8-氢硫基，8-硫烷基，8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基尤其是5-溴，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包括在美国专利号3,687,808中披露的那些、在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering(《聚合物科学与工程简明百科全书》)，第858-859页，Kroschwitz(克洛舍维奇)，J.L编著，John Wiley&Sons(约翰威利出版公司)，1990年中披露的那些、在Englisch(恩利施)等人，Angewandte Chemie(《应用化学》)，国际版，1991，30，613中披露的那些、以及在Sanghvi(赛格维)，Y.S.，第15章，DsRNA Research and Applications(《DsRNA研究与应用》)，第289-302页，Crooke(克鲁克)，S.T.和Lebleu(拉布列)，B.编著，CRC出版社，1993中披露的那些。这些核碱基中的某些对提高本发明的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已经表明5-甲基胞嘧啶取代基提高核酸双链体的稳定性0.6℃-1.2℃(Sanghvi，Y.S.(桑格威，Y.S.)，Crooke，S.T.(克鲁克，S.T.)以及Lebleu，B.(勒布鲁，B.)，Eds.，DsRNAResearch and Applications(《DsRNA研究与应用》)，CRC Press(CRC出版社)，Boca Raton(波卡拉顿)，1993，第276-278页)，并是示例性的碱基取代基，甚至更加特别地为当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰物组合时。
传授以上所提到的某些经修饰的核碱基和其他经修饰的核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于以上提到的美国专利号3,687,808，以及美国专利号4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；以及5,681,941，其每一者通过引用结合于此，以及美国专利号5,750,692，也通过引用结合于此。
轭合物
本发明的dsRNA的另一种修饰涉及将增强该dsRNA的活性、细胞分布或细胞吸收的一个或多个部分或轭合物化学连接至该dsRNA。此类部分包括但不限于脂类部分如胆固醇部分(Letsinger(乐欣格)等人，Proc.Natl.Acid.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，1989，86：6553-6556)，胆酸(Manoharan(马诺汗)等人，Biorg.Med.Chem.Let.(《生物有机化学与医药化学快报》)，1994，4：1053-1060)，硫醚如beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan(马诺汗)等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.(《纽约科学院年报》)，1992，660：306-309；Manoharan(马诺汗)等人，Biorg.Med.Chem.Let.(《生物有机化学与医药化学快报》)，1993，3：2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser(奥博汗瑟)等人，Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)，1992，20：533-538)，脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras(赛森-博和马拉)等人，EMBO J，1991，10：1111-1118；Kabanov(卡波诺)等人，FEBS Lett.，1990，259：327-330；Svinarchuk(斯伍那区克)等人，Biochimie(《生物化学》)，1993，75：49-54)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1,2-二-O-十六烧基-外消旋-甘油-3-H磷酸酯(Manoharan(马诺汗)等人，Tetrahedron Lett.(《四面体通讯》)，1995，36：3651-3654；Shea(舍阿)等人，Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)，1990，18：3777-3783)，聚胺或聚乙烯乙二醇链(Manoharan(马诺汗)等人，Nucleosides&Nucleotides(《核苷&核苷酸》)，1995，14：969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan(马诺汗)等人，Tetrahedron Lett.(《四面体通讯》)，1995，36：3651-3654)，十六烧基部分(Mishra(米莎)等人，Biochim.Biophys.Acta(《生物化学与生物物理学学报》)，1995，1264：229-237)，或十八胺或己胺-羰基羟胆固醇部分(Crooke(克鲁克)等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.(《药理学与实验治疗学杂志》)，1996，277：923-937)。
不需要给定化合物中的所有位置被均匀地修饰，并且事实上多于一种的上述修饰可并入单一化合物中或甚至一个dsRNA内的单一核苷处。本发明还包括作为嵌合体化合物的dsRNA化合物。杂本发明的上下文中，“嵌合体的”dsRNA化合物或“嵌合体”是以下这样的dsRNA化合物，尤其是dsRNA，它们包含两个或更多个化学上不同的区域，每者由至少一个单体单位构成，即，在dsRNA化合物的情况下的一种核苷酸。这些dsRNA典型地包含至少一个区域，其中该dsRNA经修饰以赋予该dsRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和／或增加的对于靶标核酸而言的结合亲和力。该dsRNA的一个另外的区域可以作为能够切割RNA：DNA或RNA：RNA杂交体的酶的底物。举例而言，RNase H是一种切割RNA：DNA双链体的RNA链的细胞内核酸酶。因此，RNase H的激活致使RNA靶标的切割，由此大大增强基因dsRNA对基因表达的抑制的效率。结果，当使用嵌合体dsRNA时，与硫代磷酸酯脱氧dsRNA杂交至相同靶标区域相比，使用较短的dsRNA通常可以获得可比较的结果。
在某些实例中，该dsRNA可以通过非配体基团来进行修饰。一些非配体分子已经被轭合至dsRNA以增强该dsRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类轭合的程序在科学文献中是可得的。这种非配体部分已经包括脂部分如胆固醇(Letsinger(乐欣格)等人，Proc.Natl.Acid.Sci.USA(《美国科学院院刊》)，1989，86：6553)，胆酸(Manoharan(马诺汗)等人，Biorg.Med.Chem.Let.(《生物有机化学与医药化学快报》)，1994，4：1053)，硫醚如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan(马诺汗)等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.(《纽约科学院年报》)，1992，660：306；Manoharan(马诺汗)等人，Biorg.Med.Chem.Let.(《生物有机化学与医药化学快报》)，1993，3：2765)，硫代胆固醇(Oberhauser(奥博汗瑟)等人，Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)，1992，20：533)，脂肪链如十二烷基二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras(赛森-博和马拉)等人，EMBO J，1991，10：111；Kabanov(卡波诺)等人，FEBS Lett.，1990，259：327；Svinarchuk(斯伍那区克)等人，Biochimie(《生物化学》)，1993，75：49)，磷脂如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙铵1，2-二-O-十六烧基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan(马诺汗)等人，Tetrahedron Lett.(《四面体通讯》)，1995，36：3651；Shea(舍阿)等人，Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)，1990，18：3777)，聚胺或聚乙烯乙二醇链(Manoharan(马诺汗)等人，Nucleosides & Nucleotides(《核苷&核苷酸》)，1995，14：969)或金刚烷乙酸(Manoharan(马诺汗)等人，Tetrahedron Lett.(《四面体通讯》)，1995，36：3651)，十六烧基部分(Mishra(米莎)等人，Biochim.Biophys.Acta(《生物化学与生物物理学学报》)，1995，1264：229)，或十八胺或己胺-羰基-羟胆固醇部分(Crooke(克鲁克)等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.(《药理学与实验治疗学杂志》)，1996，277：923)。传授此类dsRNA轭合物的制备的代表性美国专利已经列于以上。典型的轭合方案涉及在序列的一个或多个位置具有氨基连接物的dsRNA的合成。然后使用适当的偶联剂或活化剂使该氨基基团与被轭合的分子进行反应。该轭合反应可以使用仍旧结合至固体支撑体的dsRNA进行或者可以接下来切割溶液相中的dsRNA。通过HPLC纯化该dsRNA轭合物典型地给出纯轭合物。
将一种配体轭合至一个dsRNA可以增强其细胞吸收以及至特定组织的靶向或者被具体类型的细胞(比如肝细胞)的摄取。在某些实例中，将一种疏水配体轭合至dsRNA以促进细胞膜的直接渗透和／或肝细胞的摄取。可替代地，轭合至dsRNA的配体是用于受体介导的内吞作用的底物。这些方法已经用于促进反义寡核苷酸以及dsRNA剂的细胞渗透。例如，已经将胆固醇轭合至不同反义寡核苷酸，产生相比于其非轭合的类似物而言实质上更具活性的化合物。参见M.Manoharan(M.马诺汗)Antisense & Nucleic Acid Drug Development(《反义&核酸药物研发》)2002，12，103。已经被轭合至寡核苷酸的其他亲脂化合物包括1-芘丁酸、1，3-双-O-(十六烷基)甘油、以及薄荷醇。用于受体介导的内吞作用的配体的一个实例是叶酸。叶酸通过叶酸酯受体介导的内吞作用进入细胞。具有叶酸的dsRNA化合物通过叶酸酯受体介导的内吞作用会被有效地运输进入细胞。Li(李)与同事报道：将叶酸附接至寡核苷酸的3’-末端导致该寡核苷酸的细胞摄取增加8倍。Li，S.(李，S.)；Deshmukh，H.M.(德赫马克，H.M.)；Huang，L.(黄，L.)Pharm.Res.(《药物研究》)1998，15，1540。已经被轭合至寡核苷酸的其他配体包括聚乙二醇、碳水化合物簇、交联剂、卟啉轭合物、递送肽以及脂类比如胆固醇以及胆甾醇基胺。碳水化合物簇的实例包括Chol-p-(GalNAc)3(N-乙酰半乳糖胺胆固醇)以及LCO(GalNAc)3(N-乙酰半乳糖胺-3’-石胆酸-油酰基)。
碳水化合物轭合物
在本发明的组合物与方法的一些实施例中，dsRNA寡核苷酸进一步包括一种碳水化合物。轭合碳水化合物的dsRNA对于核酸的体内递送以及适合于体内治疗用途的组合物而言是有利的，如在此所描述。如在此所使用的，“碳水化合物”指以下这样一种化合物，它是一种本身由具有至少6个碳原子的一个或多个单糖单位构成的碳水化合物(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子；或者它是一种具有以下这样的一个碳水化合物部分作为其一部分的化合物，该碳水化合物由具有至少六个碳原子的一个或多个单糖单位构成(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖以及包含从大约4、5、6、7、8或9个单糖单位的低聚糖)，以及多糖比如淀粉、糖原、纤维素以及多糖胶。具体的单糖包括C5以及以上的(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖以及三糖包括具有两个或三个单糖单位的糖(例如，C5、C6、C7或C8)。
在一个实施例中，用于在本发明的组合物以及方法中使用的碳水化合物轭合物是一种单糖。在一个实施例中，该单糖是一种N-乙酰半乳糖胺，比如
Figure BPA0000181747700000211
化学式I
在另一个实施例中，用于在本发明的组合物以及方法中使用的碳水化合物轭合物是选自下组，该组由以下各项组成：
Figure BPA0000181747700000221
Figure BPA0000181747700000231
Figure BPA0000181747700000241
Figure BPA0000181747700000251
用于在于此描述的实施例中使用的另一个代表性碳水化合物轭合物包括但不限于
Figure BPA0000181747700000262
当X或Y其中一者是寡核苷酸时，另一者是氢。
在一些实施例中，该碳水化合物轭合物进一步包括以上描述的一个或多个另外的配体，比如但不限于一种PK调制子和／或一种细胞渗透肽。
连接物
在一些实施例中，可以利用可切割的或不可切割的不同连接物将在此描述的轭合物或配体附接至本发明的dsRNA。
术语“连接物”或“连接基团”意为一种有机部分，它连接一个化合物的两个部分，例如，共价地附接一个化合物的两个部分。连接物典型地包括一种直接的键或一种原子比如氧或硫，一种单位比如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或者一种原子链，比如但不限于经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族的或经取代的脂肪族的。在一个实施例中，该连接物是在大约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子，7-17、8-17、6-16、7-17或8-16个原子之间。
一种可切割的连接基团在细胞外是足够稳定的，但它在进入靶标细胞时被切割以释放该连接物结合在一起的两个部分。在一个优选的实施例中，该可切割的连接基团在靶标细胞中或在一个第一参照条件(其可以例如被选择为模拟或代表细胞内条件)下的切割比在受试者的血液中或在一个第二参考条件下(其可以例如被选择为模拟或代表在该血液或血清中发现的条件)快至少大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少大约100倍。
可切割的连接基团易于受到切割因子(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。一般地，切割因子在细胞内比在血清或血液中更普遍或具有更高水平或活性。此类降解因子的实例包括：氧化还原因子，它们被选择用于具体底物或者无底物特异性，包括例如氧化或还原酶或者在细胞中出现的还原因子比如硫醇(它可以通过还原作用降解一种可氧化还原切割的连接基团)；酯酶；内涵体或可以创造酸性环境的因子，比如可以导致pH为5或更低的那些；可以通过作为一种广义酸起作用而水解或降解一种酸可切割的连接基团的酶，肽酶(它可以是底物特异性的)，以及磷酸酶。
一种可切割的连锁群，比如二硫键可以对pH敏感。人血清的pH是7.4，而平均的细胞内pH稍低，范围为大约7.1-7.3。内涵体具有一个更酸的pH，范围在5.5-6.0，并且溶酶体具有一个甚至更酸的pH，在5.0左右。一些连接物将具有可切割的连接基团，这些基团在一个优选的pH处被切割，由此将阳离子脂类从配体释放在细胞内，或释放进入所希望的细胞区室。
连接物可以包括一种可被特定酶切割的可切割连接基团。并入连接物的可切割连接基团的类型可以取决于有待被靶向的细胞。例如，肝靶向的配体可以通过一种包括酯基团的连接物而被连接至一种阳离子脂类。肝细胞富含酯酶，并且因此与不富含酯酶的细胞相比，该连接物将在肝细胞中被更有效地切割。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质以及睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(比如肝细胞与滑膜细胞)时，可以使用包含肽键的连接物。
总体上，一种候选的可切割连接基团的适合性可以通过测试降解因子(或条件)切割该候选的连接基团的能力来进行评估。还希望的是也测试该候选的可切割连接基团在血液中或当与其他非靶标组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定在一个第一条件与一个第二条件之间进行切割的相对敏感性，其中该第一条件被选择为指示在一个靶标细胞中的切割并且该第二条件被选择为指示在其他组织或生物流体(例如，血液或血清)中的切割。这些评估可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。有用的是在无细胞或培养条件下进行初始评估并且通过在整个动物中的进一步评估来进行确证。在优选的实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的切割比在血液或血清(或在被选择为模拟细胞外条件的体外条件下)中的切割快至少大约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大约100倍。
在一个实施例中，可切割的连接基团是一种氧化还原可切割的连接基团，其在还原或氧化时被切割。还原地可切割的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定一个候选的可切割连接基团是否是一种适合的“还原地可切割的连接基团”，或者例如是否适合于与一种特定的dsRNA部分以及特定的靶向剂一起使用，可以参考在此描述的方法。例如，可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或本领域内已知的使用还原剂的试剂进行孵育来对一个候选者进行评估，这模拟了会在细胞(例如靶标细胞)内观察到的切割速率。还可以在被选择为模拟血液或血清条件的条件下对这些候选者进行评估。在一个实施例中，候选化合物在血液中被切割最多大约10％。在其他实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)中的降解快至少大约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或大约100倍。可以在被选择为模拟细胞内介质的条件下，使用标准的酶动力学测定来确定候选化合物的切割速率，并且将其与被选择为模拟细胞外介质的条件下的速率相比较。
在另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于磷酸酯的可切割的连接基团。基于磷酸酯的可切割的连接基团通过降解或水解该磷酸酯基团的因子而被切割。一种在细胞中切割磷酸酯基团的因子的实例是酶，比如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。一个优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
在另一个实施例中，可切割连接物包括一种酸可切割的连接基团。酸可切割的连接基团是在酸性条件下被切割的一种连接基团。在优选的实施例中，酸可切割的连接基团在一个具有大约6.5或更低(例如，大约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的pH的酸性环境中被切割，或者被多种因子(比如可以作为一种广义酸起作用的酶)被切割。在细胞中，具体的低pH细胞器(比如内涵体或溶酶体)可以提供一个针对酸可切割的连接基团的切割环境。酸可切割的连接基团的实例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可切割的基团可以具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。一个优选的实施例是当附接至酯(烷氧基基团)的氧的碳是芳基基团、经取代的烷基基团或叔烷基基团(比如二甲基戊基或叔丁基)时。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
在另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于酯的可切割的连接基团。基于酯的可切割的连接基团通过酶(比如细胞中的酯酶与酰胺酶)而被切割。基于酯的可切割的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基以及亚炔基的酯。酸可切割的连接基团具有通式-C(O)O-、或-OC(O)-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
在又另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于肽的可切割的连接基团。基于肽的可切割的连接基团通过酶(比如细胞中的肽酶与蛋白酶)而被切割。基于肽的可切割的连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽，等等)以及多肽的肽键。基于肽的可切割的基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。该酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的特定类型的酰胺键。该基于肽的切割基团总体上限于在在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割的连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-(SEQ ID NO：13)，其中RA与RB是这两个邻接氨基酸的R基团。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
在一个实施例中，本发明的dsRNA通过一种连接物被轭合至一种碳水化合物。本发明的组合物与方法的具有连接物的dsRNA碳水化合物轭合物的非限制性实例包括但不限于，
Figure BPA0000181747700000301
Figure BPA0000181747700000321
当X或Y其中一者是寡核苷酸时，另一者是氢。
在本发明的组合物与方法的某些实施例中，配体是通过二价或三价分支连接物而附接的一个或多个GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)衍生物。
在一个实施例中，本发明的dsRNA被轭合至一种二价或三价分支连接物，其选自在化学式(XXXI)-(XXXIV)的任一个中显示的结构的组：
Figure BPA0000181747700000322
Figure BPA0000181747700000331
其中：各次出现的q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B以及q5C独立地代表0-20，并且其中该重复单位可以是相同或不同的；
各次出现的P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C各自独立地是：不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
各次出现的Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C独立地是：不存在、亚烷基、经取代的亚烷基其中一个或多个亚甲基可以被以下各项中的一个或多个所中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)；
各次出现的R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C各自独立地是：不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
Figure BPA0000181747700000332
Figure BPA0000181747700000333
或杂环基；
各次出现的L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B以及L5C代表配体，即，各自独立地代表：单糖(比如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、低聚糖或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价轭合的GalNAc衍生物对于与RNAi剂一起使用以抑制靶标基因的表达是特别有用的，比如具有化学式(XXXV)的那些：
Figure BPA0000181747700000341
其中L5A、L5B与L5C代表单糖，比如GalNAc衍生物。
合适的二价与三价分支连接物基团轭合的GalNAc衍生物的实例包括但不限于在以上引用为化学式II_VII、XI、X以及XIII的结构。
传授RNA轭合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，每一者的全部内容特此通过引用结合于此。
编码dsRNA的载体
在另一个方面，APOC3dsRNA分子是从插入RNA或RNA载体的转录单位表达(参见，例如，Couture，A(卡秋尔，A)等人，TIG.(1996)，12：5-10；Skillem，A.(思科勒尔，A)等人，国际PCT公开号WO00／22113，Conrad(卡雷德)，国际PCT公开号WO00／22114，以及Conrad(卡雷德)，美国专利号6,054,299)。这些转基因可以作为线性构建体、环形质粒或病毒载体而被引入，进而可以作为整合入宿主基因组的转基因而得以并入并遗传。该转基因还可以被构建以允许其作为染色体外的质粒进行遗传(Gassmann(噶斯曼)等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)(1995)92：1292)。
dsRNA的单个链可以通过在两个单独表达载体上的启动子进行转录，并且共转染进入靶标细胞。可替代地，该dsRNA的每一单个链可以通过两者都位于相同表达质粒上的启动子进行转录。在一个实施例中，dsRNA表达为被一种连接物多核苷酸序列连接的反向重复，由此该dsRNA具有茎环结构。
重组dsRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。表达dsRNA的病毒载体可以基于但不限于以下项进行构建：腺相关病毒(综述，参见Muzyczka(穆齐兹卡)等人，Curr.Topics Micro.Immunol.(《微生物免疫学当前话题》)(1992)158：97-129))；腺病毒(参加，例如，Berkner(贝克那)等人，BioTechniques(《生物技术》)(1998)6：616，Rosenfeld(罗森菲尔德)等人(1991，Science(《科学》)252：431-434)，以及Rosenfeld(罗森菲尔德)等人(1992)，Cell(《细胞》)68：143-155))；或者本领域内其他已知的甲病毒。逆转录病毒已经用于将多种基因引入许多不同的细胞类型，包括上皮细胞，体外和／或体内地(参见，例如Eglitis，(俄格李提思)等人，Science(《科学》)(1985)230：1395-1398；Danos(达诺斯)与Mulligan(穆丽干)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)(1998)85：6460-6464；Wilson(威尔森)等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)85：3014-3018；Armentano(阿门塔诺)等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)87：61416145；Huber(胡伯尔)等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)88：8039-8043；Ferry(费锐)等人，1991，Proc.NatI.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)88：8377-8381；Chowdhury(周博瑞)等人，1991，Science254：1802-1805；van Beusechem，(万碧右瑟科姆)等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：7640-19；Kay(凯)等人，1992，Human Gene Therapy(《人类基因治疗》)3：641-647；Dai(戴)等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)89：10892-10895；Hwu(胡)等人，1993，J.Immunol.(《免疫学杂志》)150：4104-4115；美国专利号4,868,116；美国专利号4,980,286；PCT申请WO89／07136；PCT申请WO89／02468；PCT申请WO89／05345；和PCT申请WO92／07573)。能够转导并且表达插入细胞基因组的基因的重组逆转录病毒载体可以通过将重组逆转录病毒基因组转染进入合适的包装细胞系(比如PA317以及Psi-CRIP)来产生(Comette(克米特)等人，1991，HumanGene Therapy(《人类基因治疗》)2：5-10；Cone(科恩)等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)81：6349)。重组腺病毒载体可用于感染易感宿主(例如大鼠、仓鼠、狗和黑猩猩)中的多种细胞和组织(Hsu(赫苏)等人，1992，J.Infectious Disease(《感染疾病杂志》)，166：769)，并且还具有不需要有丝分裂活性细胞进行感染的优点。
可以使用能够接受对有待表达的该(这些)dsRNA分子进行编码的序列的任何病毒载体，例如衍生自以下各项的载体：腺病毒(AV)；腺相关病毒(AAV)；逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒，等等。病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原来对这些载体假型化而进行修饰，或者适当时通过取代不同的病毒衣壳蛋白而进行修饰。
例如，在本发明中表征的慢病毒载体可以用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等等的表面蛋白进行假型化。在本发明中表征的AAV载体可以被制备为靶向不同细胞，这是通过对这些载体进行工程化以表达不同的衣壳蛋白血清型来达到。例如，在血清型2基因组上表达血清型2衣壳的AAV载体称为AAV2／2。在AAV2／2载体中的这种血清型2衣壳基因可以由血清型5衣壳基因替代以产生AAV2／5载体。用于构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术是在本领域的技艺之内；参见例如，Rabinowitz J E(罗宾诺威兹J E)等人(2002)，J Virol(《病毒学杂志》)76：791-801，将其全部披露通过引用结合于此。
适合于在本发明中使用的重组病毒载体的选择、用于将表达dsRNA的核酸序列插入载体的方法以及递送病毒载体至感兴趣细胞的方法都在本领域的技艺之内。参见，例如，Dornburg R(多恩伯格R)(1995)，Gene Therap.(《基因治疗》)2：301-310；Eglitis M A(俄格李提思)(1988)，Biotechniques(《生物技术》)6：608-614；Miller A D(米勒A D)(1990)，Hum Gene Therap.(《人类基因治疗》)1：5-14；Anderson W F(安德森A F)(1998)，Nature(《自然》)392：25-30；以及Rubinson D A(罗宾逊D A)等人，Nat.Genet.(《自然遗传学》)33：401-406，将其全部披露通过引用结合于此。
病毒载体可以衍生自AV以及AAV。在一个实施例中，在本发明中表征的dsRNA从重组AAV载体表达为两个单独的互补的单链RNA分子，该重组AAV载体具有例如U6或H1RNA启动子或者巨细胞病毒(CMV)启动子。
用于表达在本发明中表征的dsRNA的合适的AV载体、用于构建该重组AV载体的方法以及用于递送该载体进入靶标细胞的方法描述于Xia H(夏H)等人(2002)，Nat.Biotech.(《自然生物技术》)20：1006-1010中。
用于表达在本发明中表征的dsRNA的合适的AAV载体、用于构建该重组AV载体的方法以及用于递送该载体进入靶标细胞的方法描述于以下各项中：SamulskiR(萨穆尔斯基R)等人(1987)，J.Virol.(《病毒学杂志》)61：3096-3101；Fisher K J(费歇尔K J)等人(1996)，J.Virol(《病毒学杂志》)，70：520-532；Samulski R(萨穆尔斯基R)等人(1989)，J.Virol.(《病毒学杂志》)63：3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO94／13788；以及国际专利申请号WO93／24641，将其全部披露通过引用结合于此。
驱动dsRNA在本发明中表征的DNA质粒或病毒载体中表达的启动子可以是真核生物RNA聚合酶I(例如，核糖体RNA启动子)，RNA聚合酶II(例如，CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或Ul snRNA启动子)或通用RNA聚合酶III启动子(例如，U6snRNA或7SK RNA启动子)或原核生物启动子，例如T7启动子，其条件是该表达质粒还编码对于从T7启动子转录所需要的T7RNA聚合酶。该启动子还可以指导转基因表达至胰腺(参见，例如，the insulin regulatory sequence for pancreas(针对胰腺的胰岛素调节序列)(Bucchini(卜驰倪)等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)83：2511-2515))。
另外，转基因的表达可以被精确地调节，例如，通过使用一种可诱导的调节序列以及表达系统，比如一种对某些生理学上的调节因子敏感的调节序列，这些调节因子例如循环葡萄糖水平或激素(Docherty(多赫替)等人，1994，FASEB J.8：20-24)。适合于在细胞中或哺乳动物中控制转基因表达的此类可诱导的表达系统包括由以下项进行的调节：蜕皮激素、雌激素、黄体酮、四环素、二聚作用的化学诱导物、以及异丙基-β-D1-硫代半乳糖苷(EPTG)。本领域内的普通技术人员能够基于dsRNA转基因的预期用途来选择适当的调节／启动子序列。
通常，能够表达dsRNA分子的重组载体如以下所描述地被递送，并且存留在靶细胞内。可替代地，可以使用提供dsRNA分子的瞬时表达的病毒载体。必要时此类载体可以重复给予。一旦表达，这些dsRNA结合至靶标RNA并且调节其功能或表达。dsRNA表达载体的递送可以是系统性的，比如通过静脉内或肌内给予，通过给予至外移植自患者的靶标细胞、接着再引入该患者，或者通过允许引入所希望的靶标细胞的任何其他手段。
dsRNA表达DNA质粒典型地作为一种与阳离子脂类载体(例如，Oligofectamine)或基于非阳离子脂类的载体(例如，Transit-TKOTM)的复合体而转染进入靶标细胞。本发明还考虑了用于在一周或更长的时期内靶向一个单一APOC3基因的不同区域或多个APOC3基因的dsRNA介导的敲低的多脂类转染。成功地将载体引入宿主细胞可以使用多种已知的方法来监测。例如，瞬时转染可以使用一种报告物来进行信号化，比如荧光标记，比如绿色荧光蛋白(GFP)。稳定的对离体细胞的转染可以使用以下这样的标记来进行确保：这些标记为被转染的细胞提供了对特定环境因子(比如抗生素或药物)的抗性，比如潮霉素B抗性。
APOC3特异性dsRNA分子还可以插入载体并且用作人类患者的基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部给予(参见美国专利5,328,470)或通过定向性注射(参见例如Chen(陈)等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)91：3054-3057)被递送至一个受试者。该基因治疗载体的药物制品可以包括在一种可接受的稀释剂中的该基因治疗载体，或者可以包括一种缓释基质，该基因递送媒介物被嵌入其中。可替代地，当该完全的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产出的情况下，该药物制品可以包括产出该基因递送系统的一个或多个细胞。
包含dsRNA的药物组合物
在一个实施例中，本发明提供了包含如在此所描述的dsRNA以及一种药学上可接受的载体的药物组合物。包含该dsRNA的药物组合物对于治疗与APOC3基因表达或活性相关联的疾病或病症(比如由APOC3表达介导的病理学过程)而言是有用的。此类药物组合物基于递送模式而进行配制。
在此表征的药物组合物以足以抑制APOC3基因表达的剂量给予。
通常，dsRNA的适当剂量为每天每公斤接受者体重0.01到200.0mg，通常在每天每公斤体重1到50mg范围内。
可以将以下治疗量的dsRNA给予受试者：比如大约0.01mg／kg、0.02mg／kg、0.03mg／kg、0.04mg／kg、0.05mg／kg、0.06mg／kg、0.07mg／kg、0.08mg／kg、0.09mg／kg、0.1mg／kg、0.15mg／kg、0.2mg／kg、0.25mg／kg、0.3mg／kg、0.35mg／kg、0.4mg／kg、0.45mg／kg、0.5mg／kg、0.55mg／kg、0.6mg／kg、0.65mg／kg、0.7mg／kg、0.75mg／kg、0.8mg／kg、0.85mg／kg、0.9mg／kg、0.95mg／kg、1.0mg／kg、1.1mg／kg、1.2mg／kg、1.3mg／kg、1.4mg/kg、1.5mg／kg、1.6mg／kg、1.7mg／kg、1.8mg／kg、1.9mg／kg、2.0mg／kg、2.1mg／kg、2.2mg／kg、2.3mg／kg、2.4mg／kg、2.5mg／kg dsRNA、2.6mg／kg dsRNA、2.7mg／kg dsRNA、2.8mg／kg dsRNA、2.9mg／kgdsRNA、3.0mg／kg dsRNA、3.1mg／kg dsRNA、3.2mg／kgdsRNA、3.3mg／kg dsRNA、3.4mg／kg dsRNA、3.5mg／kg dsRNA、3.6mg／kg dsRNA、3.7mg／kg dsRNA、3.8mg／kg dsRNA、3.9mg／kg dsRNA、4.0mg／kg dsRNA、4.1mg／kg dsRNA、4.2mg／kg dsRNA、4.3mg／kg dsRNA、4.4mg／kg dsRNA、4.5mg／kg dsRNA、4.6mg／kg dsRNA、4.7mg／kg dsRNA、4.8mg／kg dsRNA、4.9mg／kg dsRNA、5.0mg／kg dsRNA、5.1mg／kg dsRNA、5.2mg／kg dsRNA、5.3mg／kg dsRNA、5.4mg／kg dsRNA、5.5mg／kg dsRNA、5.6mg／kg dsRNA、5.7mg／kg dsRNA、5.8mg／kg dsRNA、5.9mg／kg dsRNA、6.0mg／kg dsRNA、6.1mg／kg dsRNA、6.2mg／kg dsRNA、6.3mg／kg dsRNA、6.4mg／kg dsRNA、6.5mg／kg dsRNA、6.6mg／kg dsRNA、6.7mg／kg dsRNA、6.8mg／kg dsRNA、6.9mg／kg dsRNA、7.0mg／kg dsRNA、7.1mg／kg dsRNA、7.2mg／kgdsRNA、7.3mg／kg dsRNA、7.4mg／kg dsRNA、7.5mg／kg dsRNA、7.6mg／kg dsRNA、7.7mg／kg dsRNA、7.8mg／kg dsRNA、7.9mg／kg dsRNA、8.0mg／kg dsRNA、8.1mg／kg dsRNA、8.2mg／kg dsRNA、8.3mg／kg dsRNA、8.4mg／kg dsRNA、8.5mg／kg dsRNA、8.6mg／kg dsRNA、8.7mg／kg dsRNA、8.8mg／kg dsRNA、8.9mg／kg dsRNA、9.0mg／kg dsRNA、9.1mg／kg dsRNA、9.2mg／kg dsRNA、9.3mg／kg dsRNA、9.4mg／kg dsRNA、9.5mg／kg dsRNA、9.6mg／kg dsRNA、9.7mg／kg dsRNA、9.8mg／kg dsRNA、9.9mg／kg dsRNA、9.0mg／kg dsRNA、10mg／kgdsRNA、15mg／kg dsRNA、20mg／kg dsRNA、25mg／kg dsRNA、30mg／kgdsRNA、35mg／kg dsRNA、40mg／kg dsRNA、45mg／kg dsRNA、或者大约50mg／kgdsRNA。对于这些引用的值而言的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
可以将该药物组合物一日给予一次，或者可以将该dsRNA在一天内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或者甚至可以通过控释制剂使用连续输注或递送而给予。在那种情况下，包含在每一亚剂量中的dsRNA必须相应地较小以达到每日总剂量。该剂量单位还可以被配成用于数天的递送，例如使用常规的缓释制剂，它们在一个数天的时期内提供该dsRNA的持续释放。缓释制剂在本领域内是熟知的并且对于在特定部位递送试剂是特别有用的，由此可以与本发明的试剂使用。在这一实施例中，该剂量单位包含相应的多个每日剂量。
单剂量对APOC3水平的影响是长期的，这样以不超过3、4或5天的间隔，或以不超过1、2、3或4周的间隔，或以不超过5、6、7、8、9或10周的间隔施用后续剂量。
本领域技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括(但不局限于)疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和／或年龄、以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗一个受试者可以包括单一治疗或者一系列治疗。本发明所囊括的单个dsRNA的有效剂量的评估以及体内半衰期的评估可以使用常规的方法论来进行，或者基于使用适当动物模型的体内测试来进行，如在此的其他地方所描述的。
在小鼠遗传学方面的进展已经产生了许多用于研究人类不同疾病的小鼠模型，比如由APOC3表达介导的病理学过程。此类模型被用于dsRNA的体内测试，以及用于确定治疗上的有效剂量。合适的小鼠模型是例如包含表达人类APOC3的质粒的小鼠。另外的合适的小鼠模型是携带一种表达人类APOC3的转基因的转基因小鼠。
获得自细胞培养测定与动物研究的数据可以在配制一系列的用于在人类中使用的剂量方面使用。在本发明中表征的组合物的剂量总体上处在一个循环浓度范围内，该范围包括具有很小或没有毒性的ED50。该剂量可以取决于所采用的剂型以及利用的给药途径而在此范围内变化。对于任何在本发明表征的方法中使用的化合物，该治疗上有效的剂量可以从细胞培养测定来进行初始估计。在动物模型中可以将一个剂量配制为达到该化合物的循环血浆浓度范围，或者当适当时，一个靶标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到该多肽的一个降低的浓度)，该范围包括如在细胞培养中确定的IC50(即，测试化合物实现症状的半最大抑制时的浓度)。这种信息可以用于更准确地确定人类中有用的剂量。可以测量血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱。
在本发明中表征的dsRNA可以与在治疗由靶标基因表达介导的病理学过程方面有效的其他已知试剂联合给予。在任何事件中，给药医师可以基于使用本领域内已知的或在此描述的标准的疗效测量而观察到的结果来调整dsRNA给予的量和时间安排。
给予
本发明还包括药物组合物和制剂，它们包括本发明表征的dsRNA化合物。取决于希望局部还是系统性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的(包括口腔与舌下)；肺的；例如通过粉末或气溶剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的以及经皮的、经口的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；或颅内的，例如实质内的、鞘内的或心室内的给予。
该dsRNA能以靶向一个特定组织的方式进行递送。
用于局部给予的药物组合物以及制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等等可以是必要的或希望的。包衣的避孕套、手套等等也可以是有用的。合适的局部制剂包括其中本发明表征的dsRNA是与一种局部递送试剂相混合的那些，该局部递送试剂比如脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂以及表面活性剂。合适的脂类与脂质体包括中性的(例如，二油酰基磷脂酰基DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷酯酰胆碱)、阴离子的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)以及阳离子的(例如，二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP以及二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明表征的dsRNA可以包囊化在脂质体中或可以形成与脂质体尤其是阳离子脂质体的复合物。可替代地，dsRNA可以复合至脂类，尤其是阳离子脂类。合适的脂肪酸与酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或C1-10烷基酯(例如，异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部制剂详细描述于美国专利号6,747,014中，将其通过引用结合于此。
脂质体制剂
除了已经被研究过并且用于药物的配制的微乳剂之外，还存在许多有组织的表面活性剂结构。这些包括单分子层、微粒、双分子层以及囊泡。囊泡(比如脂质体)由于其特异性以及它们从药物递送方面所提供的作用持续时间而引起人们很大兴趣。如在本发明中所使用的，术语“脂质体”意为一种由以球形双分子层或双分子层排列的两亲性分子脂类构成的囊泡。
脂质体是单层的或多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。该水性部分包含有待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够融合至细胞壁的优势。非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与细胞壁融合，但是可以被体内巨噬细胞摄取。
为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂类囊泡必须在合适的经皮梯度的影响下穿过一系列的细孔，每一孔具有小于50nm的直径。因此，希望的是使用高度可变形并且能够穿过这些细孔的脂质体。
脂质体的另外的优势包括：获得自天然磷脂类的脂质体是生物相容性的以及生物可降解的；脂质体可以合并广泛范围的水以及脂类可溶性药物；脂质体可以保护包囊化的药物在其内部区室内免于受到代谢与降解(罗索夫，in PharmaceuticalDosage Forms(Rosoff，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，245页)。在制备脂质体制剂方面的重要的考虑是脂类表面电荷、囊泡大小以及这些脂质体的水性体积。
脂质体对于将活性成分转移以及递送至作用部位是有用的。因为脂质体膜在结构上类似于生物膜，所以当脂质体被应用至一个组织时，这些脂质体开始与这些细胞膜合并，并且随着脂质体的合并和细胞进程，这些脂质体的内容物被排空进入该细胞，在这里活性剂可以起作用。
脂质体制剂已经作为许多药品的递送的模型成为广泛研究的焦点。越来越多的证据表明，对于局部给予而言，脂质体呈现超出其他制剂的一些优势。这些优势包括：减少的与所给予药物的高系统性吸收相关的副作用、在希望的靶标处所给予药物的增加的积累、以及将广泛种类的药物(亲水的与疏水的两者)给予进入皮肤的能力。
一些报告已经详述了脂质体递送试剂(包括高分子量的DNA)进入皮肤的能力。已经将包括镇痛药、抗体、激素以及高分子量DNA的化合物给予至皮肤。大多数的应用导致靶向上表皮
脂质体有两个广泛的类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的DNA分子相互作用而形成一种稳定的复合体。该带正电荷的DNA/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化在内涵体中。由于该内涵体中的酸性pH，这些脂质体破裂，释放其内容物进入细胞质(Wang(王)等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.(《生物化学与生物物理学研究通讯》)，1987，147，980-985)。
pH敏感的或带负电荷的脂质体捕获DNA而不是与其形成复合体。由于该DNA与该脂类是带类似的电荷，所以形成排斥而不是复合。虽然如此，一些DNA被捕获在这些脂质体的水性内部中。pH敏感的脂质体已经用于将编码胸苷激酶基因的DNA递送至培养中的细胞单层。在靶标细胞内检测到外源基因的表达(Zhou(周)等人，Journal of Controlled Release(《控释杂志》)，1992，19，269-274)。
脂质体组合物的一个主要类型包括磷脂，除了天然衍生的磷脂酰胆碱。例如中性脂质体组合物可以形成自二肉豆蔻酰磷酸卵磷酯(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。阴离子脂质体组合物通常可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，而阴离子融合脂质体主要形成自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。另一类型的脂质体组合物形成自磷酸卵磷酯(PC)，比如像大豆PC，蛋PC。另一个类型形成自磷脂和／或磷酸卵磷酯和／或胆固醇的混合物。
一些研究已经评价了脂质体药物制剂至皮肤的局部递送。将包含干扰素的脂质体应用至天竺鼠皮肤导致皮肤疱疹溃疡的减少，而通过其他手段的干扰素递送(例如，作为溶液或作为乳剂)是无效的(Weiner(维纳)等人，Journal of DrugTargeting(《药物靶向杂志》)，1992，2，405-410)。此外，另外的研究测试了作为脂质体制剂的一部分而给予的干扰素与使用水性系统而给予的干扰素的疗效，并且总结出该脂质体制剂优于水性给予(du Plessis(杜普利斯)等人，AntiviralResearch(《抗病毒研究》)，1992，18，259-265)。
非离子型脂质体系统也已经得以检验并确定了它们在递送药物至皮肤方面的实用性，特别是包括非离子型表面活性剂以及胆固醇的系统。包括NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯／胆固醇／聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯／胆固醇／聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体制剂用于将环孢霉素A递送入小鼠皮肤的真皮。结果表明此类非离子型脂质体系统在促进环孢霉素A沉积进入皮肤的不同层之内方面是有效的(Hu(胡)等人，S.T.P.Pharma.Sci.(《S.T.P.药物科学》)，1994，4，6，466)。
脂质体还包括“立体化学稳定的”脂质体，这个术语如在此使用的指包括一种或多种专门化脂类的脂质体，当并入脂质体中时这些脂类导致相对于缺少此类专门化脂类的脂质体而言的增加的循环寿命。立体化学稳定的脂质体的实例是以下那些：在其中该脂质体的形成囊泡的脂类部分中的一部分(A)包括一种或多种糖脂，比如单唾液酸神经节苷酯GM1，或者(B)是用一种或多种亲水聚合物衍生，比如聚乙二醇(PEG)部分。虽然不希望受任何具体理论束缚，但是本领域认为，至少对于包含神经节苷酯、鞘磷脂或PEG-衍生脂类的立体化学稳定的脂质体而言，这些立体化学稳定的脂质体的增加的循环半寿期是由于进入网状内皮系统(RES)细胞的减少的摄取(Allen(阿勒)等人，FEBS Letters，1987，223，42；Wu(吴)等人，Cancer Research(《癌症研究》)，1993，53，3765)。
包括一种或多种糖脂的不同脂质体在本领域内是已知的。Papahadjopoulos(帕帕哈都久珀罗斯)等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.(《纽约科学院年报》)，1987，507，64)报道了单唾液酸神经节苷酯GM1、硫酸半乳糖脑苷脂以及磷脂酰肌醇改进脂质体的血液半衰期的能力。这些发现由Gabizon(噶碧佐)等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(《美国科学院院刊》)，1988，85，6949)详细描述。美国专利号4,837,028以及WO88／04924(都归于Allen(阿勒)等人)披露了包括以下项的脂质体：(1)鞘磷脂以及(2)神经节苷脂GM1或半乳糖脑苷脂硫酸酯。美国专利号5,543,152(Webb(韦伯)等人)披露了包括鞘磷脂的脂质体。包括1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体披露于WO97／13499(Lim(利姆)等人)中。
含有由一种或多种亲水性聚合物衍生化的脂质的许多脂质体及其制备方法是本领域已知的。Sunamoto(熊本)等人(Bull.Chem.Soc.Jpn.(《日本化学学会公报》)，1980，53，2778)披露了包括非离子型去污剂2C1215G(其包含PEG部分)的脂质体。Illum(艾鲁姆)等人(FEBS Lett.，1984，167，79)提到，用聚合二醇对聚苯乙烯颗粒进行亲水包衣导致血液半衰期的显著增加。通过附接聚烯烃基二醇(例如，PEG)的羧基基团而修饰的合成磷脂由Sears(斯尔斯)(美国专利号4,426,330以及4,534,899)描述。Klibanov(克里巴农伍)等人(FEBS Lett.，1990,268,235)描述了这样的实验，这些实验证实了包括用PEG或PEG硬脂酸酯衍生化的磷脂酰乙醇胺(PE)的脂质体具有显著增加的血液循环半衰期。Blume(布鲁姆)等人(Biochimica et Biophysica Acta(《生物化学与生物物理学报》)，1990，1029，91)将这样的观察延伸到了其他的PEG-衍生的磷脂，例如DSPE-PEG，形成自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)以及PEG的组合。在其外表面具有共价键合的PEG部分的脂质体描述于Fisher(费歇尔)的欧洲专利号EP0445131B1以及WO90／04384中。含有1-20摩尔百分数的PEG衍生化的PE的脂质体组合物以及其使用方法描述于Woodle(吴德尔)等人(美国专利号5,013,556与5,356,633)与Martin(马丁)等人(美国专利号5,213,804与欧洲专利号EP0496813B1)中。包括一些其他的脂类-聚合物轭合物的脂质体披露于WO91／05545与美国专利号5,225,212(都归于Martin(马丁)等人)与WO94／20073(Zalipsky(扎利平斯基)等人)中。包括PEG修饰的神经酰胺脂类的脂质体描述于WO96／10391(Choi(佐伊)等人)中。美国专利号5,540,935(Miyazaki(宫崎)等人)以及美国专利号5,556,948(Tagawa(田川)等人)描述了包含PEG的脂质体，它们可以进一步被官能部分在其表面进行衍生化。
一些包括核酸的脂质体在本领域内是已知的。Thierry(切瑞)等人的WO96／40062披露了用于将高分子量核酸包囊在脂质体中的方法。Tagawa(田川)等人的美国专利号5,264,221披露了蛋白键合的脂质体并且称此类脂质体的内容物可以包括dsRNA。Rahman(拉哈曼)等人的美国专利号5,665,710描述了将寡聚脱氧核苷酸包囊在脂质体中的某些方法。Love(拉乌)等人的WO97／04787披露了包括靶向raf基因的dsRNA的脂质体。
传递体是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂类聚集物，它们是用于药物递送媒介物的引人注目的候选者。传递体可以描述为脂滴，其是高度可变形从而它们能够容易地穿过比该脂滴更小的孔。传递体能适应在其中使用它们的环境，例如它们是自优化性的(能适应皮肤中孔的形状)、自我修复性的、频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。为了制备传递体，可能的是将表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)添加至一种标准的脂质体组合物。传递体已经被用于递送血清白蛋白至皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已经显示与包含血清白蛋白的溶液的皮下注射同样有效。
表面活性剂在制剂(比如乳剂(包括微乳剂)以及脂质体)中有广泛应用。对许多不同类型的表面活性剂(天然的与合成的)的特性进行分类与评级的最普通的方法是通过亲水／亲油平衡值(HLB)的使用。亲水基团(也称作“头”)的性质提供了用于对在制剂中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用的手段(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms(列赫尔，《药物剂型》)，MarcelDekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，1988，285页)。
如果该表面活性剂分子没有离子化，它被分类为一种非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂在药物与化妆品产品方面有方法应用并且能够在广泛的pH范围使用。总体上，取决于它们的结构它们的HLB值范围为从2至大约18。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，比如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子型烷醇酰胺以及醚(比如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化／丙氧基化嵌段聚合物)也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是该非离子型表面活性剂类别中最常用的成员。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带负电荷，则该表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧化物(比如皂)、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯(比如烷基硫酸酯以及乙氧基化的烷基硫酸酯)、磺酸酯(比如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯以及磺基琥珀酸酯)、以及磷酸酯。该阴离子型表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯以及皂类。
如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐以及乙氧基化胺。这些季铵盐是这一类别的最常用的成员。
如果该表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，该表面活性剂被分类为两性型。两性型表面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基胺、N-烷基甜菜碱以及磷脂。
药物产品、制剂以及乳剂中表面活性剂的使用已有综述(Rieger，inPharmaceutical Dosage Forms(列赫尔，《药物剂型》)，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，1988，285页)。
核酸脂类颗粒
在一个实施例中，本发明表征的APOC3dsRNA被完全包囊在脂类制剂中，从而例如形成一种SPLP、pSPLP、SNALP或其他核酸-脂类颗粒。如在此使用的，术语“SNALP”指一种稳定的核酸-脂类颗粒，包括SPLP。如在此使用的，术语“SPLP”指一种核酸-脂类颗粒，其包括包囊在脂类囊泡中的质粒DNA。SNALP与SPLP典型地包含一种阳离子脂类、一种非阳离子脂类以及一种阻止该颗粒聚集的脂类(例如，一种PEG-脂类轭合物)。SNALP与SPLP对于合成应用是极其有用的，因为它们展示出在静脉内(i.v.)注射之后延长的循环寿命并且在远端部位积累(例如身体在与给予部位分开的部位)。SPLP包括“pSPLP”，pSPLP包括一种包囊化的缩合剂-核酸复合体，如在PCT公开号WO00／03683中所提出的。本发明的颗粒典型地具有大约50nm至大约150nh，更典型地是大约60nh至大约130nm，更典型地是大约70nh至大约110nm，最典型地是大约70nm至大约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。另外，当出现在本发明的核酸-脂类颗粒中时，这些核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂类颗粒以及它们的制备方法披露于例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；以及PCT公开号WO96／40964中。
在一个实施例中，脂类与药物的比率(质量／质量比率)(例如，脂类与dsRNA的比率)将处于从大约1∶1至大约50∶1，从大约1∶1至大约25∶1，从大约3∶1至大约15∶1，从大约4∶1至大约10∶1，从大约5∶1至大约9∶1，或大约6∶1至大约9∶1的范围内。在一些实施例中，脂类与dsRNA的比率可以是大约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、或11∶1。
总体上，脂类-核酸颗粒被悬浮在一种缓冲液(例如，PBS)中以用于给予。在一个实施例中，脂类配制的siRNA的pH是在6.8与7.8之间，例如7.3或7.4。重量摩尔渗透压浓度可以是例如在250mOsm／kg与350mOsm／kg之间，例如大约300，例如，298、299、300、301、302、303、304、或305。
阳离子脂类可以是例如，N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2，3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2，3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、1，2-二亚油基氧基(DiLinoleyloxy)-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基(Dilinolenyloxy)-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1，2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1，2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1，2-二亚油基酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1，2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油基酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TMA.C1)、1，2-二亚油基酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TAP.C1)、1，2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N，N-二亚油基氨基)-1，2-丙二醇(DLinAP)、3-(N，N-二油烯基氨基)-1，2-丙二醇(DOAP)、1，2-二亚油基氧代-3-(2-N，N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR，5s，6aS)-N，N-二甲基-2，2-二((9Z，12Z)-十八-9，12-二烯)四氢-3aH-环戊[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-胺(ALN100)、(6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七-6,9，28，31-四-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1，1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基月桂基)氨基)乙基)(2-羟基月桂基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(C12-200或Tech G1)，或其混合物。该阳离子脂类可以占该颗粒中存在的总脂类的从大约20mol％至大约50mol％或大约40mol％。
非阳离子脂类可以是一种阴离子脂类或一种中性脂类，包括但不限于：二硬脂酰磷酸卵磷酯(DSPC)、二油酰基磷酸卵磷酯(DOPC)、二棕榈酰磷酸卵磷酯(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷酸卵磷酯(POPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇，或其混合物。非阳离子脂类(如果包括胆固醇的话)可以占该颗粒中存在的总脂类的从大约5mol％至大约90mol％，大约10mol％，或大约58mol％。
抑制颗粒聚集的轭合脂类可以是例如一种聚乙二醇(PEG)-脂类，其包括但不限于PEG-PEG-(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)，或其混合物。PEG-DAA轭合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕榈基氧基丙基(Cl6)、或PEG-二硬脂酰氧基丙基(C18)。PEG轭合物的其他实例包括PEG-cDMA(N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰基]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、mPEG2000-DMG(mPEG-二肉豆蔻基甘油(具有平均分子量2，000)以及PEG-C-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨甲酰基)]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)。阻止颗粒聚集的轭合脂类可以占该颗粒中存在的总脂类的从0mol％至大约20mol％，或者大约1.0mol％、1.1mol％、1.2mol％、.13mol％、1.4mol％、1.5mol％、1.6mol％、1.7mol％、1.8mol％、1.9mol％、或2mol％。
在一些实施例中，核酸-脂类颗粒进一步包括胆固醇，该胆固醇例如占该颗粒中存在的总脂类的大约10mol％到大约60mol％或大约48mol％。
在一个实施例中，化合物2，2-二亚油基(Dilinoleyl)-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环可以用于制备脂类-siRNA纳米颗粒。2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61／107,998中，将其通过引用结合于此。
例如，该脂类-siRNA颗粒可以包括40％2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环∶10％DSPC∶40％胆固醇∶10％PEG-C-DOMG(摩尔百分数)，颗粒大小在63.0±20nm，并且具有0.027siRNA/脂类比率。
在仍另一个实施例中，1，1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基月桂基)氨基)乙基)(2-羟基月桂基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(Tech G1)可以用于制备脂类-siRNA颗粒。例如，该dsRNA可以被配制在一种脂类制剂中，该脂类制剂包括Tech-G1、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇以及mPEG2000-DMG，摩尔比率是50∶10∶38.5∶1.5，总脂类与siRNA的比率是7∶1(wt∶wt)。
在一个实施例中，脂类样物质(lipidoid)ND98·4HCl(MW1487)、胆固醇(Sigma-Aldrich公司)、以及PEG-神经酰胺C16(Avanti Polar Lipids公司)可以用于制备脂类-siRNA纳米颗粒(即，LNP01颗粒)。LNP01制剂描述于国际申请公开号WO2008／042973中，将其通过引用特此结合。
另外的示例性制剂描述于表A中。
表A
Figure BPA0000181747700000511
Figure BPA0000181747700000521
包含SNALP(1，2-二亚麻基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的制剂描述于2009年4与15日提交的国际公开号WO2009／127060中，通过引用将其结合于此。
包括XTC的制剂描述于例如以下各项中：2009年1月29日提交的美国临时序列号61／148,366；2009年3月2日提交的美国临时序列号61／156,851；2009年6月10日提交的美国临时序列号；2009年7月24日提交的美国临时序列号61／228,373；2009年9月3日提交的美国临时序列号61／239,686，以及2010年1月29日提交的国际申请号PCT／US2010／022614，将其通过引用特此结合。
包括MC3的制剂描述于例如以下各项中：2009年9月22日提交的美国临时序列号61／244,834，2009年6月10日提交的美国临时序列号61／185,800，以及2010年6月10日提交的国际申请号PCT／US10／28224，将其通过引用特此结合。
包括ALNY-100的制剂描述于例如以下中：2009年11月10日提交的国际专利申请号PCT／US09／63933，将其通过引用特此结合。
包括C12-200的制剂描述于例如以下各项中：2009年5月5日提交的美国临时序列号61／175,770以及2010年5月5日提交的国际申请号PCT／US10／33777，将其通过引用特此结合。
通过标准或非挤出方法制备的制剂可以按类似的方式来表征。例如，制剂典型地通过视觉检查来进行表征。它们应该是发白的半透明溶液，无聚集物或沉淀。脂类纳米颗粒的颗粒大小与颗粒大小分布可以使用例如Malvern Zetasizer NanoZS(Malvern公司，USA)通过光散射来进行测量。颗粒应该是大约20-300nm，比如40-100nm大小。颗粒大小分布应该是单峰。制剂中的总siRNA浓度以及捕获的片段是使用染料排除测定来评估。可以将配制的siRNA的样品在一种制剂扰乱性表面活性剂(例如，0.5％Triton-X100)的存在或不存在下与RNA结合染料(比如Ribogreen(Molecular Probes公司))一起孵育。该配制品中的总siRNA可以通过来自包含该表面活性剂的样品的信号相对于标准曲线来确定。该捕获的片段是通过将“游离”siRNA内含物(如通过在表面活性剂不存在下的信号所测量的)从该总siRNA内含物中减去来确定。捕获的siRNA的百分数典型地是>85％。对于SNALP制剂而言，颗粒大小是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nh、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、以及至少120nm。合适的范围典型地是大约至少50nm至大约至少110nm、大约至少60nm至大约至少100nm、或大约至少80nm至大约至少90nm。
用于口服给予的组合物与制剂包括粉末或颗粒剂、微粒剂、纳米颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或迷你片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是希望的。在一些实施例中，口服制剂是以下那些：在其中本发明所表征的dsRNA与一种或多种穿透促进剂表面活性剂以及螯合剂结合地给予。合适的表面活性剂包括脂肪酸和／或其酯或盐、胆汁酸和／或其盐。合适的胆汁酸／盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)以及乌索脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘油胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠以及甘油二氢梭链孢酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、一种酰基肉毒碱、一种酰基胆碱、或一种甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。在一些实施例中，穿透促进剂的组合(例如脂肪酸／盐)是与胆汁酸／盐组合使用。一个示例性的组合是月桂酸、羊蜡酸以及UDCA的钠盐。另外的穿透促进剂包括聚氧乙烯-9-月桂基酯、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明表征的dsRNA可以口服递送，以包括喷雾干燥颗粒的颗粒剂的形式递送，或者复合成微颗粒或纳米颗粒。dsRNA复合剂包括聚-氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸脂；聚烷基丙烯酸酯、聚氧杂环丁烷(polyoxethanes)、聚烷基氰基丙烯酸脂；阳离子化的明胶剂、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)与淀粉；聚烷基氰基丙烯酸脂；DEAE-衍生的聚亚胺、支链淀粉、纤维素与淀粉。合适的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如p-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-异丁烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白与DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻朊酸盐、以及聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制剂以及它们的制备详述于美国专利6,887,906、美国公开号20030027780以及美国专利号6,747,014中，将其各自通过引用结合于此。
用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内给药的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂及其他适当的添加剂，例如但不限于：穿透促进剂、载体化合物及其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体制剂。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。特别优选的是当治疗肝脏病症(比如肝癌)时靶向肝脏的制剂。
本发明的药物制剂(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该(这些)药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些制剂是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。
本发明的组合物可以被配制为许多可能的剂型中的任一者，这些剂型比如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂以及灌肠剂。本发明的组合物还可以被配制为在水性或非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和／或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
乳剂
本发明的组合物可以被制备或配制为乳剂。乳剂典型地是一种液体以液滴形式(通常直径超过0.1μm)分散在另一种中的非均匀系统(Idson，in PharmaceuticalDosage Forms(Idson，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，199页；Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms(Rosoff，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，245页；Block in Pharmaceutical Dosage Forms(Block《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷2，335页；Higuchi(希古契)等人，inRemington′s Pharmaceutical Sciences(在《雷明顿氏药物科学》中)，MackPublishing Co.(麦克出版公司)，Easton(伊斯顿)，Pa.，1985，301页)。乳剂通常是双相的系统，其包含互不混溶的两个彼此紧密混合并分散的液相。通常，乳剂可以为油包水(w／o)或水包油(o／w)两种。当水相作为微小液滴细碎并分散到本体油相中时，所产生的组合物被称为油包水(w／o)乳剂。可替代地，当油相作为微小液滴细碎并分散到本体水相中时，所产生的组合物被称为水包油(o／w)乳剂。除了分散相和活性药物外，乳剂还可以含其他组分，活性药物可以作为在水相、油相中的溶液，或者其自身作为独立相。如果需要，也可以存在药物赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂还可以为包括多于两种相的多重乳剂，比如像油包水包油(o／w／o)和水包油包水(w／o／w)乳剂的情况。此类复合制剂通常提供某些简单的二元乳剂所不具有的优势。当多重乳剂中的o／w乳剂的各油滴还包有小水滴时，该多重乳剂形成w／o／w乳剂。同样地，在油连续相中稳定化的水滴中包封油滴的系统，构成o／w／o乳剂。
乳剂具有较小或没有热力学稳定性的特征。通常，乳剂的分散相或不连续相很好地分散在外相或连续相中并通过乳化剂或制剂的粘性保持这种形式。在乳剂状软膏基料或膏剂的情况下，乳剂的每个相都可以为半固体或固体。其他稳定乳剂的方式需要使用乳化剂，这些乳化剂可以合并进入到乳剂的任意相中。乳化剂可以宽泛地分成四种类型：合成的表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基料和细分散的固体(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms(Idson，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，MarcelDekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，199页)。
已经发现合成的表面活性剂，也即表面活性试剂，在乳剂配制中有广泛应用，并且已经在文献中进行了综述(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms(列赫尔，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，285页)；Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms(Idson，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，1988，卷1，199页)。表面活性剂典型地是两亲性分子，并且包括亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水和疏水性的比值定义为亲水／亲油平衡值(HLB)，它是制剂制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂可以根据亲水基团的性质被分成不同的类型：非离子型、阴离子型、阳离子型和两性型(Rieger，in Pharmaceutical Dosage Forms(列赫尔，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，285页)。
乳剂制剂中使用的自然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯树胶。吸收基料具有亲水特性，所以它们能够吸收水以形成w／o乳剂并仍然保持它们的半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水凡士林。精细分散的固体也已经被用做优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合和在粘性制品中使用。它们包括极性无机固体(如重金属氢氧化物)，不溶胀的粘土(如膨润土、绿坡缕石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱石、胶状硅酸铝和胶状硅酸镁铝)，色素和非极性固体(如碳或三硬脂酸甘油酯)。
在乳剂制剂中还包括多种非乳化材料，它们对乳剂的特性有帮助。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block，in Pharmaceutical Dosage Forms(Block，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，335页；Idson，in PharmaceuticalDosage Forms(Idson，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，199页)。
亲水胶体或水状胶体包括天然存在的树胶和合成的聚合物如多糖(如阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、角叉菜聚糖、瓜耳胶、刺梧桐树胶和皇蓍胶)，纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(如卡波姆胶、纤维素醚和羰基乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或膨胀形成胶状溶液，这些胶状溶液通过在分散相小滴的周围形成强的界面膜并通过增强外相的粘度来稳定乳剂。
由于乳剂通常包含一些可以容易地支持微生物生长的成份如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以这些制剂通常含有防腐剂。乳剂制剂中通常使用的防腐剂包括甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也将抗氧剂加入到乳剂制剂中，以预防制剂的变质。所使用的抗氧化剂可以为自由基清除剂如生育酚、五倍子酸烷基酯、丁基化的羟基茴香醚，丁基化的羟基甲苯，或还原剂如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，以及抗氧化剂协同剂如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
乳剂制剂通过皮肤的、经口的和肠胃外途径的应用和它们的生产方法已经在文献(Idson，in Pharmaceutical Dosage Forms(Idson，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，199页)中综述。因为配制简单并且在吸收和生物利用率方面的功效，口服递送的乳剂制剂已经被广泛使用(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms(Rosoff，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，245页；Idson，in Pharmaceutical DosageForms(Idson，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，199页)。基于矿物油的缓泻药、油溶性的维生素和高脂肪营养制品属于经常作为o／w乳剂口服给予的物质。
在本发明的一个实施例中，dsRNA与核酸的组合物是配制成微乳剂。微乳剂可以定义为水、油和两亲物的系统，它是单一的光学各向同性的和热力学稳定的液体溶液(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms(Rosoff，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，MarcelDekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，245页)。典型地，微乳剂是通过如下方法制备的系统：首先将油分散到表面活性剂水溶液中，然后加入足量的通常为中等链长度的醇的第四组分而形成透明系统。因此，微乳剂也被描述成由表面活性分子的界面膜稳定化的两种不能混合的液体的热力学稳定的各向同性的澄清分散系(Leung(朗)与Shah(纱)，在：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems(药物的受控释放：聚合物和聚集体系统)，Rosoff，M.(罗索夫，M.)，Ed.，1989，VCH Publishers(VCH出版公司)，纽约，第185-215页)。通常微乳剂通过包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解液的三至五种组分的组合来制备。微乳剂是为油包水(w／o)还是水包油(o／w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子的极性头部和羟基尾的结构和几何包装(Schott(斯科特)，in Remington′s Pharmaceutical Sciences(在《雷明顿氏药物科学》中)，Mack Publishing Co.(麦克出版公司)，Easton(伊斯顿)，Pa.，1985，p.271)。
利用相图的现象学方法已经广泛地得以研究，并且已经产生关于本领域技术人员如何制备微乳剂的全面知识(Rosoff，in Pharmaceutical Dosage Forms(Rosoff，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，245页；Block，in Pharmaceutical Dosage Forms(Block，《药物剂型》)，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)与Banker(斑克)(编著)，1988，MarcelDekker，Inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，335页)。与常规乳剂相比，微乳剂提供的优点是能将非水溶性药物溶解到自发形成的热力学稳定的液滴的制剂中。
在微乳剂的制备中使用的表面活性剂包括但不限于单独的或与助表面活性剂组合使用的离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、一又二分之一油酸十甘油酯(SO750)(decaglycerol sequioleate)、十油酸十甘油酯(DAO750)。该助表面活性剂通常是短链醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通过渗透到表面活性剂膜中并由此在表面活性剂分子间产生空余空间来产生无序膜从而提高界面流动性。然而，微乳剂可以不用助表面活性剂进行制备，并且无醇的自乳化微乳剂系统是本领域已知的。典型地，水相可以是(但不限于)水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、和乙乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如多种材料，比如Captex300、Captex355、Capmul MCM、脂肪酸酯，中等链(C8-C12)的单、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolized glyceride)，饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
从药物溶解和增强的药物吸收方面看，微乳剂是特别令人感兴趣的。已经提议使用基于脂类的微乳剂(o／w和w／o两者)以增强包含肽的药物的口服生物利用度(Constantinides等人，Pharmaceutical Research(《药物研究》)，1994，ll，1385-1390；Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.(《实验与临床药理学的方法与发现》)，1993，13，205)。微乳剂具有以下优势：改进药物溶解度，保护药物不受酶的水解，由于表面活性剂导致的膜流动性和渗透性的改变可能增强药物的吸收，易于制备，容易以固体剂型口服给予，改进临床效能以及降低毒性(Constantinides等人，Pharmaceutical Research(《药物研究》)，1994，11，1385；Ho(侯)等人，J.Pharm.Sci.(《药物科学杂志》)，1996，85，138-143)。通常，微乳剂的成份在环境温度下混合在一起时，它们可以自然形成微乳剂。当配制热不稳定的药物、肽或dsRNA时，这可能是特别有利的。在化妆品和药物应用领域，微乳剂在活性组分的经皮递送中也是有效的。期望的是本发明的微乳剂组合物和制剂将会有利于提高dsRNA和核酸从胃肠道的全身吸收，并改进dsRNA和核酸的局部的细胞摄取。
本发明的微乳剂还可以包含其他成份和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol和穿透促进剂，以改进制剂的特性并增强本发明的dsRNA和核酸的吸收。本发明的微乳剂中使用的穿透促进剂可以分成归于五大类中的一种：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(Lee(李)等人.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1991，p.92)。每个类型都已经在以上进行了讨论。
穿透促进剂
在一个实施例中，本发明使用了各种穿透促进剂以实现核酸特别是dsRNA至动物皮肤的有效递送。多数药物以离子化和非离子化的形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或亲脂的药物易于穿过细胞膜。已经发现，如果用穿透促进剂处理要穿过的膜，甚至连非亲脂药物都可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜外，穿透促进剂还增强亲脂药物的渗透性。
穿透促进剂可以分成归于5大类中的一种，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(Lee(李)等人.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1991，p.92)。在下面对每类以上提及的穿透促进剂都详细进行了阐述。
表面活性剂：在本发明的上下文中，表面活性剂(或“表面活性试剂”)为化学实体，当其溶解在水溶液中时，它能降低该溶液的表面张力或者水溶液和另一种液体之间的界面张力，结果是dsRNA通过粘膜的吸收得到增强。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些穿透促进剂还包括例如月桂醇硫酸钠、聚氧乙烯基-9-月桂基醚和聚氧乙烯基-20-鲸蜡基醚(Lee(李)等人.，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1991，p.92)；以及全氟化学乳剂如FC-43(Takahashi(高松)等人，J.Pharm.Pharmacol.(《药物药理学杂志》)，1988，40，252)。
脂肪酸：作为穿透促进剂的各种脂肪酸和它们的衍生物包括，例如油酸、月桂酸、羊蜡酸(正癸酸)、肉豆蘧酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸酯(1-单油酰-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、羊脂酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱，它们的C1-10烷基酯(如甲基、异丙基和叔丁基)，和它们的甘油单酯和甘油二酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(Lee(李)等人.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1991，p.92；Muranishi(村西)，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1990，7，1-33；El Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.(《药物药理学》)，1992，44，651-654)。
胆汁盐：胆汁的生理作用包括促进脂类和脂可溶性维生素的分散和吸收(Brunton(布鲁顿)，Chapter38in：Goodman&Gilman′s The PharmacologicalBasis of Therapeutics(古德曼&吉尔曼的《治疗的药理学基础》第38章)，第9版，Hardman(哈德曼)等人编著.，McGraw-Hill(麦格劳希尔)，纽约，1996，934-935页)。各种天然胆汁盐和它们的合成衍生物作为穿透促进剂起作用。因此术语“胆汁盐”包括胆汁中天然存在的任意成分和它们的任意合成衍生物。合适的胆汁盐包括例如胆酸(或其药学上可接受的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘油胆酸(甘油胆酸钠)、甘油脱氧胆酸(甘油脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、乌索脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠(STDHF)、甘油二氢梭链孢酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(Lee(李)等人.，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1991，92页；Swinyard(斯文亚德)，Chapter39In：Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿氏药物科学》第19章)，第18版，Gennaro，编著，Mack Publishing Co.(麦克出版公司)，Easton(伊斯顿)，Pa.，1990，第782-783页；Muranishi(村西)，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1990，7，1-33；Yamamoto(山本)等人，J.Pharm.Exp.Ther.(《实验与临床药物杂志》)，1992，263，25；Yamashita(山本)等人，J.Pharm.Sci.(《药物科学杂志》)，1990，79，579-583)。
螯合剂：所使用的与本发明有关的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的dsRNA的吸收得到加强。关于它们在本发明中作为穿透促进剂的应用，因为多数特征化的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化并且因此可以被螯合剂抑制，螯合剂还具有充当DNase抑制剂的附加优势(Jarrett(加热特)，J.Chromatogr.(《色谱学杂志》)，1993，618，315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(酯)(如水杨酸钠、5-甲氧水杨酸酯和高香草酸酯)、胶原质的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(Lee(李)等人.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1991，p.92；Muranishi(村西)，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1990，7，1-33；Buur(布尔)等人，J.Control Rel.，1990，14，43-51)。
非螯合的非表面活性剂：如在此所使用的，非螯合的非表面活性剂穿透促进化合物可以定义为这样的化合物，它们显示具有不显著的螯合剂或表面活性剂的活性，但是仍可促进dsRNA穿过消化道粘膜的吸收(Muranishi(村西)，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1990，7，1-33)。这类的穿透促进剂包括例如不饱和环脲、1-烷基烷酮衍生物和1-烯基氮杂环烷酮衍生物(Lee(李)等人.，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems(《治疗性药物载体系统锐评》)，1991，第92页)；以非甾体抗炎剂如双氯芬酸钠、引哚美辛和苯丁唑啉(Yamashit(山下)等人，J.Pharm.Pharmacol.(《药物药理学》)，1987，39，621-626)。
载体
本发明的某些组合物还向制剂中引入了载体化合物。如在此所使用的，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但却在体内过程中被认为是核酸，能例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共同给予(典型的是后一种物质过量)可以引起肝、肾或其他循环外脏器中回收的核酸的量大幅度减少，推测原因是载体化合物和核酸之间竞争共有受体。例如，当与聚次黄嘌呤核苷酸、葡聚糖硫酸酯、聚胞嘧啶核苷酸或4-乙酰胺基-4’异氰硫基-芪-2,2′-二磺酸共同给予时，部分地硫代磷酸酯的dsRNA在肝组织中的回收可以减少(Miyao(宫尾)等人，DsRNA Res.Dev.(《DsRNA研究与研发》)，1995，5，115-121；Takakura(高仓)等人，DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev.(《DsRNA&核酸药物研发》)，1996，6，177-183)。
赋形剂
与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是用于向动物递送一种或多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其他任意药学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体，当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考意欲的给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于结合剂(如预胶凝的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟基丙基甲基纤维素等)；填料(如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶状二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金属盐、还原的植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(如淀粉、淀粉乙醇酸钠等)；和湿润剂(如月桂基硫酸钠等)。
适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。适当的药学上可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部给予核酸的制剂可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包含缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
其他组分
本发明的组合物另外可以包含其他本领域熟知用量的在药物组合物中常用的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包含另外的、可相容的药学上有活性的物质如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包含对本发明的组合物的各种剂型的物理配制有用的其他物质，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入此类物质时，它们不应当过度干扰本发明的组合物的成份的生物活性。可以将这些制剂进行灭菌并且如果希望的话与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、盐混合，用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、芳香物质和／或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该制剂中的一种或多种核酸发生有害的相互作用。
水性悬浮液可以包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和／或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
在一些实施例中，本发明所表征的药物组合物包括(a)一种或多种dsRNA化合物和(b)一种或多种通过一种非RNAi机制起作用的抗细胞因子生物制剂。此类生物制剂的实例包括靶向IL1β(例如，阿那白滞素)、IL6(塔西单抗)、或TNF(依那西普、英利昔单抗、阿达木单抗(adlimumab)、或赛妥珠单抗)的生物制剂。
此类化合物的毒性与治疗效果可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体的致死剂量)以及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以被表示为比率LD50／ED50。优选那些表现出高的治疗指数的化合物。
获得自细胞培养测定与动物研究的数据可以在配制一系列的用于在人类中使用的剂量方面使用。在本发明中表征的组合物的剂量总体上处在一个循环浓度范围内，该范围包括具有很小或没有毒性的ED50。该剂量可以取决于所采用的剂型以及利用的给予途径而在该范围内变化。对于任何在本发明表征的方法中使用的化合物，该治疗上有效的剂量可以从细胞培养测定来进行初始估计。在动物模型中可以将一个剂量配制为达到该化合物的循环血浆浓度范围，或者当适当时，一个靶标序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到该多肽的一个降低的浓度)，该范围包括如在细胞培养中确定的IC50(即，测试化合物实现症状的半最大抑制时的浓度)。这种信息可以用于更准确地确定人类中有用的剂量。可以测量血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱。
除了给予它们之外，如在此所讨论的，还可以将在本发明中表征的dsRNA与在治疗由APOC3表达介导的病理学过程方面有效的其他已知试剂联合给予。在任何事件中，给药医师可以基于使用本领域内已知的或在此描述的标准的疗效测量而观察到的结果来调整dsRNA给予的量和时间安排。
抑制APOC3基因表达的方法
本发明还提供了使用本发明的dsRNA和／或包含本发明的iRNA的组合物来减少和／或抑制细胞中的APOC3表达的方法。这些方法包括：将该细胞与本发明的dsRNA进行接触并且维持该细胞一段时间，该时间足以获得APOC3基因的mRNA转录物的降解，由此抑制该细胞中的该APOC3基因的表达。基因表达的减少可以通过本领域内已知的任何方法来进行评估。例如，APOC3的表达的减少可以通过如下进行确定：使用对本领域内的普通技术人员而言常规的方法(RNA印迹法、qRT-PCR)来确定APOC3的mRNA表达水平，使用对本领域内的普通技术人员而言常规的方法(蛋白质印迹法、免疫技术)来确定APOC3的蛋白水平，和／或确定APOC3的生物活性，比如对与甘油三酯水平相关联的一种或多种分子(例如，脂蛋白脂酶(LPL)和／或肝酯酶)的影响、或者在体内的背景下甘油三酯其自身水平。
在本发明的方法中，该细胞可以在体外或体内被接触，即，该细胞可以在一个受试者体内。
适合于使用本发明的方法的治疗的细胞可以是任何表达APOC3基因的细胞。适合于在本发明的方法中使用的细胞可以是哺乳动物细胞，例如，灵长类细胞(比如人类细胞或非人类灵长类细胞，例如，猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类细胞(比如母牛细胞、猪细胞、骆驼细胞、美洲驼细胞、马细胞、山羊细胞、兔细胞、绵羊细胞、仓鼠、豚鼠细胞、猫细胞、狗细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、狮子细胞、老虎细胞、熊细胞、或水牛细胞)、鸟细胞(例如，鸭细胞或鹅细胞)、或鲸细胞。在一个实施例中，该细胞是人类细胞，例如，人类肝细胞。
APOC3表达在该细胞中被抑制至少大约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或大约100％。
本发明的体内方法可以包括将包含dsRNA的组合物给予受试者，其中该dsRNA包括与有待治疗的哺乳动物的APOC3基因的RNA转录物的至少一部分互补的一个核苷酸序列。当有待治疗的有机体是哺乳动物(比如人类)时，该组合物可以通过本领域内已知的任何手段进行给予，这些手段包括但不限于经口、腹膜内、或肠胃外途径(包括颅内(例如，心室内、实质内、鞘内)、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气溶剂)、经鼻、直肠以及局部(包括口腔与舌下)给予)。在某些实施例中，这些组合物是通过静脉输注或注射或皮下注射进行给予。
在一些实施例中，该给予是经由积存注射。积存注射可以在一个延长的时期以连贯的方式释放该dsRNA。因此，积存注射可以减少获得所希望的效果而需要的给药的频率，例如所希望的APOC3的抑制、或疗效或预防效果。积存注射还可以提供更连贯的血清浓度。积存注射包括皮下注射或肌内注射。在优选的实施例中，该积存注射是皮下注射。
在一些实施例中，该给予是经由一个泵。该泵可以是外部泵或手术植入的泵。在某些实施例中，该泵是一个皮下植入的渗透泵。在其他实施例中，该泵是一个输注泵。输注泵可以用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选的实施例中，该输注泵是一个皮下输注泵。在其他实施例中，该泵是一个手术植入泵，其递送该dsRNA至肝。
给予的模式取决于是希望局部治疗还是系统性治疗并且基于有待治疗的区域来进行选择。给予的途径与部位可以被选择为增强靶向。
在一个方面，本发明还提供了用于抑制哺乳动物中APOC3基因表达的方法。这些方法包括将包括靶向该哺乳动物的细胞中的APOC3基因的dsRNA的组合物给予该哺乳动物并且维持该哺乳动物一段时间，该时间足以获得该APOC3基因的mRNA转录物的降解，由此抑制该APOC3基因在该细胞中的表达。基因表达的减少可以通过本领域内任何已知的方法或通过在此描述的方法(例如qRT-PCR)来进行评估。蛋白产物的减少可以通过本领域内任何已知的方法或通过在此描述的方法(例如ELISA)来进行评估。在一个实施例中，穿刺肝脏活组织检查样品作为组织材料用于监测APOC3基因和／或蛋白表达的减少。在其他实施例中，APOC3基因的表达的抑制间接地通过例如确定APOC3途径中的基因的表达和／或活性来进行监测。例如，脂蛋白脂酶(LPL)或肝酯酶的活性可以被监测以确定APOC3基因的表达的抑制。还可以测量样品(例如血液或肝样品)中的甘油三酯水平。APOC3基因的抑制还可以通过观察对升高的甘油三酯水平的临床表现的影响来进行监测，例如对过早慢性心脏病(CHD)、出疹性黄瘤、肝脾大以及胰腺炎的影响。合适的测定在以下实例部分进行进一步描述。
本发明进一步提供了治疗有需要的受试者的方法。本发明的这些治疗方法包括：将本发明的dsRNA给予受试者，例如以一个治疗有效量的靶向APOC3基因的dsRNA或包括靶向APOC3基因的dsRNA的药物组合物给予，将会受益于APOC3表达的减少和／或抑制的受试者。
可以将本发明的dsRNA以“裸”形式或作为“游离dsRNA”进行给予。裸dsRNA是在药物组合物不存在下进行给予。该裸dsRNA可以处在合适的缓冲液中。该缓冲液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任意组合。在一个实施例中，该缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以将包含该dsRNA的缓冲液的pH与体积摩尔渗透压浓度进行调节，使得它适合于给予受试者。另外的缓冲液描述于上。
可替代地，可以将本发明的dsRNA作为药物组合物进行给予，比如dsRNA脂质体制剂。另外的脂质体制剂描述于此。
受益于APOC3基因表达的减少和／或抑制的受试者可以是具有升高的甘油三酯水平(例如，TG>150mg／dL)的那些或者具有严重高甘油三酯血症(例如，TG>500mg/dL)的那些。在一个实施例中，受试者带有具有功能获得性突变的APOC3基因变体。在其他实施例中，该患者具有混合的HTG(V型)减少的LPL活性和／或家族性HTG(IV)失活的LPL突变和／或组合的增加的ApoB-100水平。在另一个实施例中，该受试者具有失控的伴有急性胰腺炎的高甘油三酯血症，或者该患者是一个正在治疗的HIV患者，或者该受试者具有高脂肪饮食(餐后高甘油三酯血症)、或代谢综合征、或化合物治疗(类视黄醇治疗)、或胰岛素抗性。对将会受益于APOC3基因表达的减少和／或抑制的受试者的治疗包括治疗性与预防性治疗。
本发明进一步提供了用于使用RNA或其药物组合物的方法，例如用于治疗将会受益于APOC3表达的减少和／或抑制的受试者，该受试者例如是具有升高的甘油三酯水平的受试者，这些方法与其他药物制剂和／或其他治疗方法组合使用，例如与已知的药物制剂和／或已知的治疗方法(比如像目前采用以治疗升高的甘油三酯水平的那些)组合使用。例如，在某些实施例中，将靶向APOC3的dsRNA与例如在治疗升高的甘油三酯水平中有用的试剂组合地给予。例如，适合于治疗将会受益于APOC3表达的减少的受试者(例如一个具有升高的甘油三酯水平的受试者)的合适的另外的治疗剂和治疗方法包括生活方式与饮食改变、处方级别的鱼油、贝特(fibrates)、盐酸、ApoC3反义、CETP抑制剂、胆汁酸多价螯合剂、烟酸、HMG CoA还原酶抑制剂、吉非贝齐(Gemfibrozil)、非诺贝特(Fenofibrate)、胆固醇吸收抑制剂、新霉素、ω-3脂肪酸、等等。可以将该dsRNA以及另外的治疗试剂和／或治疗在相同时间和／或在相同组合中进行给予，例如非肠胃地，或者可以将该另外的治疗试剂作为一种单独组合物的部分或在单独的时间和／或通过本领域内已知的或在此描述的另一种方法进行给予。
在一个实施例中，该方法包括将在此表征的组合物进行给予，这样使得靶标APOC3基因的表达被降低持续大约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、或24小时或28、32、或36小时。在一个实施例中，靶标APOC3基因的表达被降低持续一个延长的持续期，例如至少大约两天、三天、四天或更长，例如大约一周、两周、三周或四周或更长。
根据本发明的方法给予dsRNA可以导致具有升高的甘油三酯水平的患者的此类疾病或病症的严重性、体征、症状、和／或标记减少。在上下文中“减少”意为此水平的统计学上的显著减少。该减少可以是例如至少大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或大约100％。
疾病治疗或预防的效果可以通过测量以下项来进行评估：疾病进程、疾病缓和、症状严重性、生活质量、维持治疗效果所需要的药剂的剂量、疾病标记的水平或其他任何适合于正在治疗或靶向预防的一种给定疾病的其他可测量参数。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测治疗或预防效果，这是在本领域内的普通技术人员的能力范围之内。例如，升高的甘油三酯水平的治疗的效果可以通过例如血清甘油三酯水平的周期性测量来进行评估。稍后数据与初始数据的比较为医师提供了该治疗是否有效的指示。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来检测治疗或预防效果，这在本领域内的普通技术人员的能力范围之内。关于给予靶向APOC3的dsRNA或其药物组合物，“有效抵抗”升高的甘油三酯水平表明以临床上适当的方式进行给予会对至少统计学上显著量的病人产生有益效果，比如改善的症状、治愈、疾病减少、生命延长、生活质量改善、或被熟悉升高甘油三酯水平及相关原因的医生大体上认可为是积极的其他影响。
当在疾病状态的一个或多个参数方面存在统计学上显著的改善的时候，或者通过使得不能恶化或发展否则可以被预期的症状，治疗或预防效果是明显的。作为一个实例，在疾病的可测量参数方面的至少10％，并且优选是至少20％、30％、40％、50％或更多的有利改变，可以指示有效治疗。给定的dsRNA药物或该药物的制剂的效果还可以使用如在本领域内已知的用于该给定疾病的实验动物模型来进行判定。当使用实验动物模型时，当观察到统计学上显著的标记或症状减少时治疗效果是明显的。
可替代地，该效果可以基于临床上接受的疾病严重性分级量表(比如一个实例，肝功能评分(Child-Pugh score)，有时称作肝功能分级评分(Child-Turcotte-Pugh score))，通过如诊断领域内的普通技术人员所确定的疾病严重性的减少来进行测量。产生例如使用合适的量表而测量的疾病严重性的减轻的任何积极的改变代表使用如在此描述的dsRNA或dsRNA制剂的足够的治疗。
可以给予受试者治疗量的dsRNA，比如大约0.01mg／kg、0.02mg／kg、0.03mg／kg、0.04mg／kg、0.05mg／kg、0.06mg／kg、0.07mg／kg、0.08mg／kg、0.09mg／kg、0.1mg／kg、0.15mg／kg、0.2mg／kg、0.25mg／kg、0.3mg／kg、0.35mg/kg、0.4mg／kg、0.45mg／kg、0.5mg／kg、0.55mg／kg、0.6mg／kg、0.65mg／kg、0.7mg／kg、0.75mg／kg、0.8mg／kg、0.85mg／kg、0.9mg／kg、0.95mg／kg、1.0mg／kg、1.1mg／kg、1.2mg／kg、1.3mg／kg、1.4mg／kg、1.5mg／kg、1.6mg／kg、1.7mg／kg、1.8mg／kg、1.9mg／kg、2.0mg／kg、2.1mg／kg、2.2mg／kg、2.3mg／kg、2.4mg／kg、2.5mg／kg dsRNA、2.6mg／kg dsRNA、2.7mg／kg dsRNA、2.8mg／kg dsRNA、2.9mg／kg dsRNA、3.0mg／kg dsRNA、3.1mg／kg dsRNA、3.2mg／kg dsRNA、3.3mg／kg dsRNA、3.4mg／kg dsRNA、3.5mg／kg dsRNA、3.6mg／kg dsRNA、3.7mg／kg dsRNA、3.8mg／kg dsRNA、3.9mg／kg dsRNA、4.0mg／kg dsRNA、4.1mg／kg dsRNA、4.2mg／kgdsRNA、4.3mg／kg dsRNA、4.4mg／kg dsRNA、4.5mg／kg dsRNA、4.6mg／kg dsRNA、4.7mg／kg dsRNA、4.8mg／kg dsRNA、4.9mg／kg dsRNA、5.0mg／kg dsRNA、5.1mg／kg dsRNA、5.2mg／kg dsRNA、5.3mg／kg dsRNA、5.4mg／kg dsRNA、5.5mg／kg dsRNA、5.6mg／kg dsRNA、5.7mg／kg dsRNA、5.8mg／kg dsRNA、5.9mg／kg dsRNA、6.0mg／kg dsRNA、6.1mg／kg dsRNA、6.2mg／kg dsRNA、6.3mg／kg dsRNA、6.4mg／kg dsRNA、6.5mg／kg dsRNA、6.6mg／kg dsRNA、6.7mg／kg dsRNA、6.8mg／kg dsRNA、6.9mg／kg dsRNA、7.0mg／kg dsRNA、7.1mg／kg dsRNA、7.2mg／kg dsRNA、7.3mg／kg dsRNA、7.4mg／kg dsRNA、7.5mg／kg dsRNA、7.6mg／kg dsRNA、7.7mg／kg dsRNA、7.8mg／kg dsRNA、7.9mg／kg dsRNA、8.0mg／kg dsRNA、8.1mg／kg dsRNA、8.2mg／kg dsRNA、8.3mg／kg dsRNA、8.4mg／kg dsRNA、8.5mg/kg dsRNA、8.6mg／kg dsRNA、8.7mg/kg dsRNA、8.8mg／kg dsRNA、8.9mg／kg dsRNA、9.0mg／kg dsRNA、9.1mg／kg dsRNA、9.2mg／kg dsRNA、9.3mg／kg dsRNA、9.4mg／kg dsRNA、9.5mg／kg dsRNA、9.6mg／kg dsRNA、9.7mg/kg dsRNA、9.8mg/kg dsRNA、9.9mg／kg dsRNA、9.0mg／kg dsRNA、10mg／kgdsRNA、15mg／kgdsRNA、20mg／kgdsRNA、25mg／kgdsRNA、30mg／kgdsRNA、35mg／kg dsRNA、40mg／kg dsRNA、45mg／kg dsRNA、或大约50mg／kgdsRNA。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在某些实施例中，例如，当本发明的组合物包括如在此描述的dsRNA以及脂类时，可以给予受试者治疗量的dsRNA，比如大约0.01mg／kg至大约5mg／kg、大约0.01mg／kg至大约10mg／kg、大约0.05mg／kg至大约5mg／kg、大约0.05mg／kg至大约10mg／kg、大约0.1mg／kg至大约5mg／kg、大约0.1mg／kg至大约10mg／kg、大约0.2mg／kg至大约5mg／kg、大约0.2mg／kg至大约10mg／kg、大约0.3mg／kg至大约5mg／kg、大约0.3mg／kg至大约10mg／kg、大约0.4mg／kg至大约5mg／kg、大约0.4mg／kg至大约10mg／kg、大约0.5mg／kg至大约5mg／kg、大约0.5mg/kg至大约10mg／kg、大约1mg／kg至大约5mg／kg、大约1mg／kg至大约10mg／kg、大约1.5mg／kg至大约5mg／kg、大约1.5mg／kg至大约10mg／kg、大约2mg／kg至大约2.5mg／kg、大约2mg／kg至大约10mg／kg、大约3mg／kg至大约5mg／kg、大约3mg／kg至大约10mg／kg、大约3.5mg／kg至大约5mg／kg、大约4mg／kg至大约5mg／kg、大约4.5mg／kg至大约5mg／kg、大约4mg／kg至大约10mg／kg、大约4.5mg／kg至大约10mg／kg、大约5mg／kg至大约10mg／kg、大约5.5mg／kg至大约10mg／kg、大约6mg／kg至大约10mg／kg、大约6.5mg／kg至大约10mg／kg、大约7mg／kg至大约10mg／kg、大约7.5mg／kg至大约10mg／kg、大约8mg／kg至大约10mg／kg、大约8.5mg／kg至大约10mg／kg、大约9mg/kg至大约10mg／kg、或大约9.5mg／kg至大约10mg／kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如，可以按以下剂量给予dsRNA：大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或大约10mg／kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
在其他实施例中，例如，当本发明的组合物包括如在此描述的dsRNA以及N-乙酰半乳糖胺时，可以给予受试者治疗量的dsRNA，比如一个以下的剂量：大约0.1至大约50mg／kg、大约0.25至大约50mg／kg、大约0.5至大约50mg／kg、大约0.75至大约50mg／kg、大约1至大约50mg／mg、大约1.5至大约50mg／kb、大约2至大约50mg／kg、大约2.5至大约50mg／kg、大约3至大约50mg／kg、大约3.5至大约50mg／kg、大约4至大约50mg／kg、大约4.5至大约50mg／kg、大约5至大约50mg／kg、大约7.5至大约50mg／kg、大约10至大约50mg／kg、大约15至大约50mg／kg、大约20至大约50mg／kg、大约20至大约50mg／kg、大约25至大约50mg／kg、大约25至大约50mg／kg、大约30至大约50mg／kg、大约35至大约50mg／kg、大约40至大约50mg／kg、大约45至大约50mg／kg、大约0.1至大约45mg／kg、大约0.25至大约45mg／kg、大约0.5至大约45mg／kg、大约0.75至大约45mg／kg、大约1至大约45mg／mg、大约1.5至大约45mg／kb、大约2至大约45mg／kg、大约2.5至大约45mg／kg、大约3至大约45mg／kg、大约3.5至大约45mg／kg、大约4至大约45mg／kg、大约4.5至大约45mg／kg、大约5至大约45mg／kg、大约7.5至大约45mg／kg、大约10至大约45mg／kg、大约15至大约45mg／kg、大约20至大约45mg／kg、大约20至大约45mg／kg、大约25至大约45mg／kg、大约25至大约45mg／kg、大约30至大约45mg／kg、大约35至大约45mg／kg、大约40至大约45mg／kg、大约0.1至大约40mg／kg、大约0.25至大约40mg／kg、大约0.5至大约40mg／kg、大约0.75至大约40mg／kg、大约1至大约40mg／mg、大约1.5至大约40mg／kb、大约2至大约40rg／kg、大约2.5至大约40mg／kg、大约3至大约40mg／kg、大约3.5至大约40mg／kg、大约4至大约40mg／kg、大约4.5至大约40mg／kg、大约5至大约40mg／kg、大约7.5至大约40mg／kg、大约10至大约40mg／kg、大约15至大约40mg／kg、大约20至大约40mg／kg、大约20至大约40mg／kg、大约25至大约40mg／kg、大约25至大约40mg／kg、大约30至大约40mg／kg、大约35至大约40mg／kg、大约0.1至大约30mg／kg、大约0.25至大约30mg／kg、大约0.5至大约30mg／kg、大约0.75至大约30mg／kg、大约1至大约30mg／mg、大约1.5至大约30mg／kb、大约2至大约30mg／kg、大约2.5至大约30mg／kg、大约3至大约30mg／kg、大约3.5至大约30mg／kg、大约4至大约30mg／kg、大约4.5至大约30mg／kg、大约5至大约30mg／kg、大约7.5至大约30mg／kg、大约10至大约30mg／kg、大约15至大约30mg／kg、大约20至大约30mg／kg、大约20至大约30mg／kg、大约25至大约30mg／kg、大约0.1至大约20mg／kg、大约0.25至大约20mg／kg、大约0.5至大约20mg／kg、大约0.75至大约20mg／kg、大约1至大约20mg／mg、大约1.5至大约20mg／kb、大约2至大约20mg／kg、大约2.5至大约20mg／kg、大约3至大约20mg／kg、大约3.5至大约20mg／kg、大约4至大约20mg／kg、大约4.5至大约20mg／kg、大约5至大约20mg／kg、大约7.5至大约20mg／kg、大约10至大约20mg／kg、或大约15至大约20mg／kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
例如，可以给予受试者治疗量的dsRNA：比如大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或大约50mg／kg。这些引用值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。
可以通过静脉输注经一个时期来给予该dsRNA，比如经5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或大约25分钟的时期。该给予可以例如在一个常规基础上(比如双周地(即，每两周))重复持续一个月、两个月、三个月、四个月或更长。在初始治疗方案之后，可以将这些治疗以一个频繁度更低的基础来进行给予。例如，在双周给予持续三个月后，给予可以按每个月重复一次，持续六个月或一年或更长。该dsRNA的给予可以减少患者的细胞、组织、血液、尿或其他区室的APOC3水平至少大约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、39％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少大约99％或更多。
在给予全剂量的dsRNA之前，可以给予患者较小的剂量，比如5％输注反应，并且监测不良影响，比如过敏反应。在另一个实例中，针对不想要的免疫刺激作用(比如增加的细胞因子(例如，TNF-α或INF-α)水平)对该患者进行监测。
由于对APOC3表达的抑制作用，本发明组合物或由其制备的药物组合物可以提高生命质量。
除非另外限定，在此所用的所有技术术语和科学术语均与本发明所属领域一个普通技术人员普遍理解的具有相同的含义。虽然类似或等同于在此所述的那些的方法和材料可用于本发明表征的dsRNA与方法的实践或测试，在下文仍描述了适合的方法和材料。所有出版物、专利申请、专利以及其他在此提及的参考文献均通过引用其全文结合在此。在矛盾的情况下，本发明说明书，包括定义，将占据主导。此外，材料、方法和实例仅是示例性的而非旨在是限制性的。
实例
实例1.dsRNA合成
试剂来源
当本文没有专门给出试剂来源时，这种试剂可以从分子生物学试剂的任何供应商获得，其质量／纯度标准符合分子生物学应用。
siRNA合成
使用Expedite8909合成仪(Applied Biosystems(应用生物系统公司)，Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德国)以及可控多孔玻璃(CPG，
Figure BPA0000181747700000751
Proligo Biochemie GmbH，Hamburg(汉堡)，德国)作为固体支撑，以1μmole的规模通过固相合成来产生单链RNA。RNA与包含2′-O-甲基核苷酸的RNA通过固相合成来产生，分别采用相应的亚磷酰胺以及2′-O-甲基亚磷酰胺(Proligo BiochemieGmbH，Hamburg(汉堡)，德国)。使用标准的核苷亚磷酰胺化学方法，在寡核苷酸链的序列内的所选位点上并入这些构建单元，所述化学方法利如描述于Current protocols in nucleic acid chemistry(《核酸化学流行方案》)，Beaucage，S.L.(比尤克居，S.L.)等人(Edrs.)，John Wiley&Sons，Inc.(约翰威利出版社)，纽约，纽约州，美国。通过用Beaucage试剂(Chruachem Ltd公司，Glasgow(格拉斯哥)，UK)的乙腈溶液(1％)替换碘氧化剂溶液来引入硫代磷酸酯键。其他辅助试剂来自Mallinckrodt Baker公司(Griesheim，德国)。
根据已经建立的程序，通过阴离子交换HPLC进行粗寡核糖核苷酸的去保护和纯化。使用光谱光度计(DU640B，Beckman Coulter GmbH，Unterschleiβheim，德国)，通过在260nm波长处的各个RNA溶液的UV吸收率确定得率和浓度。以如下方法产生双链RNA：在退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH6.8；100mM氯化钠)中混合等摩尔的互补链溶液，在85℃-90℃水浴中加热3分钟并经3-4小时冷却到室温。退火的RNA溶液储存在-20℃备用。
以下使用标准命名，并且特别表B中的缩写来表示核酸序列。
表B：缩写
缩写 核苷酸
A 腺苷-3′-磷酸酯
C 胞苷-3′-磷酸酯
G 鸟苷-3′-磷酸酯
U 尿苷-3′-磷酸酯
N 任何核苷酸(G、A、C、或T)
a 2′-O-甲基腺苷-3′-磷酸酯
c 2′-O-甲基胞苷-3′-磷酸酯
g 2′-O-甲基鸟苷-3′-磷酸酯
u 2′-O-甲基尿苷-3′-磷酸酯
T，dT 2′-脱氧胸苷-3′-磷酸酯
缩写 核苷酸
sT；sdT 2’-脱氧-胸苷-5’磷酸酯-硫代磷酸酯
实例2：APOC3siRNA设计
转录物
进行siRNA设计以鉴别对NCBI基因库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中注释的所有的人类与食蟹猴(cynomolgus monkey，Macaca fascicularis；此后称为“cyno”)APOC3转录物进行靶向的siRNA。设计使用了以下来自NCBI：人类-NM_000040.1；cyno-X68359.1的转录物。所有的与所列的人类和cyno转录物具有100％一致性的siRNA双链体被设计。
siRNA设计、特异性以及效果预测
这些siRNA是基于预测的特异性、预测的效果以及GC含量而被选择。
从每一序列预测所有可能的19mers的预测特异性。然后对缺少长于7核苷酸的重复的候选19mers进行选择。在针对人类转录组(定义为人类NCBI Refseq组中的NM_与XM_记录的组)的全面搜索中使用这171个候选siRNA。
基于该siRNA与任何潜在的‘脱靶’转录物之间的任何数目的错配的位置计算出一个分数，并且将衍生自每一寡核苷酸的3个不同的、种子(该分子的5′末端的位置2-9)衍生六聚体的七聚体以及八聚体的频率进行比较。两种siRNA链被指定为根据计算分数的特异性分类：得分高于3为高特异性的、等于3为特异性的，并且在2.2与2.8之间为中等特异性的。我们通过该反义链的特异性进行分类。然后我们选择这样的双链体：其反义寡核苷酸具有总体低于70％的GC含量，在第一个位置无GC，并且不与小鼠APOC3转录物NM_023114.3匹配。
siRNA序列选择
共计合成27条正义和27条反义衍生的siRNA寡核苷酸并形成双链体。
实例3.APOC3siRNA合成
修饰的与未修饰的ApoC3序列的合成
在MerMade192合成仪上以1或0.2umol的规模合成APOC3平铺序列(APOC3tiled sequence)。
利用未修饰的、2’-O-甲基或2’-氟化学修饰进行单链与双链体的制备。基于这些单链中的化学修饰的性质对合成条件进行适当修改。
合成、切割与去保护：
APOC3序列的合成(未修饰的、2’-O-甲基或2’-氟)使用了利用亚磷酰胺化学作用的固体支撑的寡核苷酸合成。
在96孔板中以1或2um的规模进行以上序列的合成。未修饰的或修饰的(2-O-甲基或2’-氟代)亚酰胺(amidite)溶液被制备为0.1M浓度，并且乙基硫代四唑(0.6M于乙腈中)被用作激活剂。
在96孔板中进行合成序列的切割与去保护，在第一步骤使用氨水或甲胺水溶液并且在第二步骤使用氟化物试剂。使用丙酮∶乙醇(80∶20)混合物对粗制序列进行沉淀并且将沉淀物重悬浮在0.2M乙酸钠缓冲液中以将这些粗制单链转化为其钠盐。将来自每一序列的样品通过LC-MS进行分析以确证一致性、UV用于定量并且通过IEX色谱确定纯度。
纯化与脱盐：
沉淀APOC3平铺序列并使用葡聚糖凝胶柱在AKTA纯化系统上(AKTAPurifier system)进行纯化。该过程在环境温度下运行。样品注射与收集在96孔板(孔深1.8mL)中进行。在洗脱液中收集到对应于全长度序列的一个单一峰。将脱盐的APOC3序列针对浓度(通过在A260处的UV测量)以及纯度(通过离子交换HPLC)进行分析。然后将这些互补单链以1∶1化学计量比率进行组合以形成siRNA双链体。
表1与2提供了第一组的未修饰与修饰序列。
实例4.APOC3siRNA体外筛选
细胞培养和转染：
将Hep3B细胞(ATCC公司，Manassas(马纳萨斯)，弗吉尼亚州)在37℃在5％CO2的气氛中在RPMI(ATCC公司)(补充有10％FBS，链霉素以及谷氨酰胺)中培养接近融合，然后通过胰酶消化从该板释放。转染通过以下进行：将14.8μl的Opti-MEM加每孔0.2μl的Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen公司，Carlsbad CA.cat#13778-150)与每孔5μl的siRNA双链体添加至96孔板并且在室温孵育15分钟。然后将包含～2×104Hep3B细胞的抗生素的80μl的完全培养基添加至该siRNA混合物。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时或120小时。在10nM与0.1nM最终双链体浓度进行单一剂量实验，并且在10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005、0.00001nM最终双链体浓度进行剂量反应实验。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(Invitrogen公司，部件#：610-12)的 总RNA分离：
收获细胞并且在150μl裂解／结合缓冲液中进行裂解，然后使用EppendorfThermomixer在850rpm混合5分钟，混合速度在整个过程中相同。将十微升磁珠与80μl裂解／结合缓冲液混合物添加至圆底板中并且混合1分钟。使用磁性表座捕获磁珠并且将该上清液除去而不扰动这些珠子。使用磁性表座捕获磁珠并且将该上清液除去而不扰动这些珠子。在除去上清液后，将磁珠用150μl清洗缓冲液A(Wash Buffer A)清洗2次并且混合1分钟。珠子再次被捕获并且去除上清液。然后将珠子用150μl清洗缓冲液B(Wash Buffer B)进行清洗并且除上清液。然后将珠子用150μl洗脱缓冲液(Elution Buffer)进行清洗、捕获并且除上清液。允许珠子干燥持续2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液并且在70℃混合5分钟。用磁体捕获珠子持续5分钟。去除40μl的上清液并且添加至另一96孔板中。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems(应用生物系统公 司))，Foster City(福斯特城)，加利福尼亚州，Cat#4368813)的cDNA合成：
将母混合物(每一反应：2μl10×缓冲液、0.8μl25×dNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μl R Nase抑制剂以及3.2μl H2O)添加至10μl总RNA中。使用Bio-Rad C-1000或S-1000热循环仪(Hercules公司，CA)通过以下步骤产生cDNA：25℃l0min、37℃120min、85℃5sec、4℃保持。实时PCR：
将2μl的cDNA添加至母混合物中，该母混合物在一个384孔50板(Roche(罗氏公司)cat#04887301001)中每一孔包含0.5μl GAPDH TaqMan探针(AppliedBiosystems(应用生物系统公司)Cat#4326317E)、0.5μl ApoC3TaqMan探针(Applied Biosystems(应用生物系统公司)cat#Hs00163644_ml)以及5μlLightcycler480探针母混合物(Roche(罗氏公司)Cat#04887301001)。实时PCR在ABI7900HT实时PCR系统(Applied Biosystems(应用生物系统公司))上使用ΔΔCt(RQ)测定而完成。将每一双链体在两个独立的转染中进行测试并且每一转染以一式两份进行测定，除非在总结表中另外指出。
为了计算相对倍数，使用ΔΔCt方法分析实时数据，并且将这些数据归一化为利用以下这样的细胞而进行的测定：这些细胞是转染了10nM AD-1955的细胞，或是模拟转染的细胞。使用4参数拟合模型使用XLFit计算IC50，并且将IC50归一化为在相同剂量范围内或至其自身最低剂量转染了AD-1955的细胞或原初细胞(
Figure BPA0000181747700000791
cell)。
生存力筛选
在3天、5天时在HeLa以及Hep3B细胞中测量细胞生存力，接着用100、10、1、0.1、0.01以及0.0001nM siRNA进行转染。将细胞在96孔板中以每个孔中10,000个细胞的密度进行铺板。每一siRNA以一式三份进行分析并且将数据平均化。靶向PLK1与AD-19200的siRNA被包括作为生存力损失的阳性对照，而AD-1955作为阴性对照。PLK1与AD-19200导致剂量依赖性的生存力损失。为了测量生存力，在3、5天之后将20ul的CellTiter Blue(Promega公司)添加至该96孔板的每一孔并且在37℃孵育2小时。然后将板在560Ex／590Em在分光光度计(Molecular Devices(分子仪器公司))中进行读数。将生存力表达为来自三个重复转染+／-标准差的光单位的平均值。在一些情况中，通过首先将这三个重复转染进行平均化并且然后将其归一化为获得自最低剂量(0.001nM)的值来评估相对生存力。
这些结果提供在表3、4和5中。
实例5：在小鼠中的APOC3体内测试
将靶向APOC3的siRNA给予至小鼠，野生型(5.0mg／kg)与转基因高脂血症模型SREBPtg／LDLR-/-KO小鼠(1.0mg／kg)。在给予后两天将小鼠处死并且确定肝靶标mRNA、血清甘油三酸酯以及血清总胆固醇水平。使用了包含MC3的LNp11制剂。
野生型小鼠的结果显示在图1中。给予靶向APOC3的siRNA导致野生型小鼠中mRNA水平的敲低，甘油三酯降低50％，并且总胆固醇降低。给予靶向APOC3的siRNA导致高脂血症模型小鼠中甘油三酯降低80％，数据未显示。这些结果显示APOC3是基于siRNA治疗高甘油三酯血症(包括冠心病冠状动脉硬化性心脏病(CAD)以及胰腺炎)的有效靶标。
实例6：修饰的靶向APOC3的siRNA的合成与筛选(第二组)
另外的如表6与表7所描述的修饰的APOC3siRNA使用以上描述的方法进行合成。UMdTdsdT修饰模式是对每一链添加dT-硫代磷酸酯-dT。DECAF修饰模式如下：正义链——在所有嘧啶上的2’O-甲基，dTsdT／dTdT突出；反义链——在种子区域(位置2-9)中在双核苷酸基序UU／UA／UG中的任何两个位点处修饰‘U’加上在最后3个核苷酸上(位置17-19)的2’O-甲基加上在位置10-16中的每一‘U’上的2'O-甲基；dTsdT／dTdT突出。FOME修饰模式如下：正义链——2’F(5’第一碱基)然后与2’OMe交替，反义链——2’OMe(5’第一碱基)，然后与2'F交替。
如上描述地对在Hep3b细胞中的如表6与表7所描述的siRNA进行测定。这些结果显示在表8中。
实例7：修饰的靶向APOC3的siRNA的合成与筛选(第三组)
另外的如表9与表10所描述的修饰的APOC3siRNA使用以上描述的方法进行合成。如以上所述地对在Hep3b细胞中的该siRNA进行测定。这些结果显示在表11中。
表1.ApoC3siRNA(第一组)：未修饰的序列
Figure BPA0000181747700000801
Figure BPA0000181747700000811
表2.ApoC3修饰的siRNA(第一组)序列
小写字母核苷酸(g、a、u、c)是2’-O-甲基核苷酸；Nf(例如，Gf、Af、Uf、Cf)是2’-氟核苷酸；s是硫代磷酸酯键。
Figure BPA0000181747700000821
Figure BPA0000181747700000831
Figure BPA0000181747700000841
表3：ApoC3修饰的siRNA(第一组)单一剂量筛选
双链体ID 10nM 0.1nM
AD-24548.1 0.06 0.38
AD-24549.1 0.17 0.39
AD-24550.1 0.38 0.67
AD-24551.1 1.08 1.02
AD-24552.1 0.98 0.97
AD-24553.1 0.51 0.63
AD-24554.1 0.63 0.78
AD-24555.1 0.06 0.29
AD-24556.1 0.17 0.72
AD-24557.1 0.81 0.93
AD-24558.1 0.90 0.75
AD-24559.1 0.88 0.94
AD-24560.1 0.75 0.85
AD-24561.1 0.40 0.77
AD-24562.1 0.07 0.39
AD-24563.1 0.55 0.91
AD-24564.1 0.70 1.00
AD-24565.1 0.67 1.00
AD-24566.1 0.97 1.01
AD-24567.1 0.89 0.92
AD-24568.1 0.95 0.85
AD-24569.1 0.68 0.88
AD-24570.1 0.74 0.77
AD-24571.1 0.22 0.60
AD-24572.1 0.92 0.91
AD-24573.1 0.65 0.76
AD-24574.1 0.70 0.80
AD-24575.1 0.63 0.94
AD-24576.1 0.05 0.31
AD-24577.1 0.90 0.98
AD-45078.1 0.38 0.78
AD-45084.1 0.60 0.92
AD-45090.1 0.97 0.86
AD-45096.1 0.47 0.82
AD-45101.1 1.01 1.30
AD-45102.1 0.05 0.22
AD-45107.1 0.87 1.06
AD-45108.1 0.02 0.12
AD-45113.1 0.97 1.04
AD-45114.1 0.37 0.77
AD-45119.1 0.91 0.87
AD-45120.1 0.03 0.08
AD-45121.1 0.93 0.94
AD-45122.1 0.92 0.97
AD-45123.1 0.15 0.41
AD-45124.1 0.03 0.07
AD-45125.1 0.16 0.55
AD-45126.1 0.03 0.08
AD-45127.1 0.58 0.75
AD-45128.1 0.97 0.96
AD-45129.1 0.20 0.47
AD-45130.1 0.05 0.12
AD-45131.1 0.24 0.64
AD-45132.1 0.30 0.52
AD-45133.1 0.03 0.10
AD-45135.1 0.02 0.08
AD-45136.1 0.04 0.10
AD-45137.1 0.02 0.19
AD-45138.1 0.86 1.04
AD-45139.1 1.19 1.13
AD-45140.1 0.07 0.33
AD-45141.1 0.03 0.07
AD-45143.1 0.73 0.94
AD-45144.1 0.45 0.95
AD-45145.1 0.04 0.13
AD-45146.1 0.06 0.21
AD-45147.1 0.20 0.49
AD-45148.1 0.80 0.94
AD-45149.1 0.03 0.07
AD-45150.1 0.09 0.28
AD-45151.1 0.03 0.05
AD-45152.1 0.04 0.13
AD-45153.1 0.92 1.02
AD-45154.1 0.14 0.29
AD-45155.1 0.60 0.68
AD-45157.1 0.13 0.29
AD-45158.1 0.37 0.78
AD-45159.1 0.12 0.53
AD-45160.1 0.03 0.11
AD-45161.1 0.59 0.54
AD-45162.1 0.02 0.06
表4.ApoC3修饰的siRNA(第一组)IC50数据
双链体名称 IC5024hr(nM) IC50120hr(nM)
AD-24555 0.038 0.091
AD-24562 0.025 0.106
AD-24576 0.037 0.059
AD-45102.1 0.012 0.022
AD-45108.1 0.014 0.246
AD-45120.1 0.011 0.02
AD-45124.1 0.013 0.264
AD-45126.1 0.025 0.098
AD-45129.1 0.023 0.046
AD-45133.1 0.014 0.015
AD-45135.1 0.008 0.064
AD-45136.1 0.008 0.053
AD-45137.1 0.010 0.077
AD-45141.1 0.007 0.063
AD-45145.1 0.013 0.113
AD-45146.1 0.031 0.316
AD-45149.1 0.011 0.091
AD-45151.1 0.006 0.009
AD-45152.1 0.011 0.051
AD-45160.1 0.019 0.162
AD-45162.1 0.008 0.013
表5.ApoC3修饰的siRNA(第一组)生存力
生存力数据表达为相对于用最低siRNA剂量(0.0001nM)治疗的细胞而言的生存力分数。1=100％生存，0=100％致死
Figure BPA0000181747700000861
Figure BPA0000181747700000871
Figure BPA0000181747700000881
Figure BPA0000181747700000891
表6：ApoC3siRNA(第二组)未修饰的序列以及修饰的siRNA的双链体名称
Figure BPA0000181747700000892
Figure BPA0000181747700000901
表7：ApoC3修饰的siRNA(第二组)序列
Figure BPA0000181747700000902
Figure BPA0000181747700000911
表8：细胞中ApoC3修饰的siRNA(第二组)的活性
双链体名称 10nM 0.1nM 10nM SD 0.1nM SD
AD-46822.1 0.15 0.31 0.00 0.00
AD-47334.1 0.41 0.82 0.12 0.10
AD-47361.1 0.89 1.00 0.19 0.03
AD-46825.1 0.13 0.26 0.01 0.01
AD-47338.1 0.38 0.73 0.12 0.12
AD-47365.1 0.74 0.93 0.01 0.07
AD-46828.1 0.15 0.57 0.00 0.04
AD-47342.1 0.38 0.91 0.26 0.06
AD-47369.1 1.10 1.26 0.18 0.29
AD-46831.1 0.01 0.37 0.00 0.05
AD-47346.1 0.57 0.95 0.17 0.08
AD-47373.1 0.80 1.06 0.06 0.15
AD-46811.1 0.03 0.31 0.01 0.04
AD-47349.1 0.03 0.29 0.02 0.18
AD-47376.1 0.38 0.95 0.15 0.01
AD-46815.1 0.06 0.37 0.00 0.00
AD-47352.1 0.04 0.35 0.04 0.23
AD-47379.1 0.81 1.03 0.12 0.05
AD-46818.1 0.03 0.26 0.00 0.03
AD-47355.1 0.23 0.60 0.14 0.08
AD-47382.1 0.40 0.81 0.11 0.09
AD-46820.1 0.03 0.38 0.00 0.02
AD-47358.1 0.05 0.45 0.03 0.31
AD-47385.1 0.53 0.84 0.12 0.19
AD-46823.1 0.02 0.22 0.00 0.04
AD-47335.1 0.15 0.70 0.05 0.00
AD-47362.1 0.66 1.07 0.01 0.09
AD-46826.1 0.02 0.18 0.00 0.02
AD-47339.1 0.19 0.62 0.12 0.04
AD-47366.1 0.60 0.82 0.02 0.09
AD-46829.1 0.02 0.22 0.01 0.01
AD-47347.1 0.16 0.66 0.14 0.11
AD-47374.1 0.90 1.15 0.03 0.03
AD-46832.1 0.09 0.56 0.02 0.01
AD-47353.1 0.21 0.65 0.04 0.02
AD-47380.1 0.66 1.02 0.07 0.02
AD-46812.1 0.01 0.10 0.00 0.00
AD-47356.1 0.02 0.13 0.01 0.13
AD-47383.1 0.03 0.21 0.02 0.10
AD-46816.1 0.04 0.53 0.00 0.01
AD-47336.1 0.10 0.37 0.06 0.14
AD-47363.1 0.54 0.88 0.03 0.14
AD-46819.1 0.06 0.49 0.01 0.02
AD-47340.1 0.20 0.72 0.18 0.21
AD-47367.1 0.99 1.10 0.17 0.07
AD-46821.1 0.19 0.67 0.01 0.01
AD-47344.1 0.48 0.90 0.16 0.06
AD-47371.1 1.01 0.92 0.14 0.12
AD-46824.1 0.02 0.21 0.00 0.02
AD-47348.1 0.19 0.66 0.20 0.24
AD-47375.1 0.83 0.94 0.06 0.00
AD-46827.1 0.05 0.54 0.01 0.06
AD-47354.1 0.23 0.79 0.15 0.19
AD-46830.1 0.64 1.01 0.03 0.00
AD-47360.1 0.76 1.22 0.09 0.22
AD-47387.1 0.90 0.84 0.04 0.09
AD-46833.1 0.06 0.46 0.01 0.05
AD47337.1 0.05 0.23 0.03 0.16
AD-47364.1 0.52 0.79 0.10 0.02
AD-46813.1 0.02 0.27 0.00 0.01
AD-47341.1 0.04 0.17 0.02 0.11
AD-47368.1 0.46 0.56 0.02 0.13
AD-46817.1 0.10 0.29 0.01 0.04
AD-47345.1 0.27 0.58 0.17 0.19
AD-47372.1 0.34 0.44 0.17 0.04
AD-47343.1 0.21 0.66 0.15 0.18
AD-47350.1 0.12 0.58 0.05 0.31
AD-47359.1 0.82 1.04 0.10 0.18
AD-47386.1 0.88 1.28 0.15 0.21
AD-47351.1 0.48 1.01 0.18 0.14
AD-47378.1 1.10 1.08 0.09 0.03
AD-47357.1 0.09 0.28 0.02 0.25
AD-47357.1 0.09 0.28 0.02 0.25
表9：ApoC3siRNA(第三组)双链体名称以及修饰的siRNA的修饰模式
Figure BPA0000181747700000931
Figure BPA0000181747700000941
Figure BPA0000181747700000951
表10：ApoC3修饰的siRNA(第三组)序列
Figure BPA0000181747700000961
Figure BPA0000181747700000971
Figure BPA0000181747700000981
表11：细胞中ApoC3修饰的siRNA(第三组)的活性
Figure BPA0000181747700000982
Figure BPA0000181747700000991
Figure BPA0000181747700001001
Figure BPA0000181747700001011
SEQ ID NO：1
NCBI参考序列：NM_000040.1，人类载脂蛋白C-III(APOC3)，mRNA
Figure BPA0000181747700001012

Claims (24)

1.一种用于抑制APOC3基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中该dsRNA包括一个正义链与一个反义链，该正义链与反义链每一者在长度上为30个或更少的核苷酸，其中该反义链包括在表1、2、6、7或10中的一个反义序列的至少15个连续核苷酸。
2.一种用于抑制APOC3基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中该dsRNA包括一个由核苷酸序列SEQ ID NO：70组成的正义链以及一个由核苷酸序列SEQ ID NO：151(AD-45149.1UM)组成的反义链。
3.如权利要求1所述的dsRNA，其中该正义链序列选自表1、2、6、7或10，并且该反义链选自表1、2、6、7或10。
4.如权利要求1或2所述的dsRNA，其中该dsRNA的至少一个核苷酸是经修饰的核苷酸。
5.如权利要求4所述的dsRNA，其中该经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：2′-O-甲基修饰的核苷酸、包括5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸、以及连接至胆甾醇基衍生物或正十二烷酸双癸酰胺基团的末端核苷酸。
6.如权利要求4所述的dsRNA，其中该经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包括非天然碱基的核苷酸。
7.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，其中至少一个链包括具有至少1个核苷酸的3’突出。
8.如权利要求1或2所述的dsRNA，其中每一链包括具有至少2个核苷酸的3’突出。
9.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，进一步包括一种配体。
10.如权利要求9所述的dsRNA，其中该配体轭合至该dsRNA的正义链的3’末端。
11.如以上权利要求中任一项所述的dsRNA，进一步包括至少一个N-乙酰基-半乳糖胺。
12.一种细胞，包括如以上权利要求中任一项所述的dsRNA。
13.一种载体，编码如以上权利要求中任一项所述的dsRNA的至少一个链。
14.一种细胞，包括如权利要求13所述的载体。
15.一种包括如以上权利要求中任一项所述的dsRNA的、用于抑制APOC3基因的表达的药物组合物。
16.如权利要求15所述的药物组合物，包括一种脂类制剂。
17.如权利要求15所述的药物组合物，包括一种脂类制剂，该脂类制剂包括MC3。
18.抑制一种细胞中APOC3表达的一种方法，该方法包括：
(a)使该细胞与如以上权利要求中任一项所述的dsRNA进行接触；并且
(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段时间，该时间足以获得APOC3基因的mRNA转录物的降解，由此抑制该细胞中的该APOC3基因的表达。
19.如权利要求18所述的方法，其中该APOC3表达被抑制至少30％。
20.一种治疗由APOC3表达介导的病症的方法，该方法包括将治疗有效量的如权利要求1或2或11所述的APOC3dsRNA或如权利要求15、16或17所述的药物组合给予需要这种治疗的人类。
21.如权利要求20所述的方法，其中该病症是升高的甘油三酯水平。
22.如权利要求20所述的方法，其中该病症是甘油三酯水平>150mg／dL或＞500mg／dL。
23.如权利要求20所述的方法，其中给药引起脂蛋白脂酶和／或肝脂酶活性的增加。
24.如权利要求20所述的方法，其中将该dsRNA或该药物组合物以大约0.01mg／kg至大约10mg／kg或大约0.5mg／kg至大约50mg／kg的剂量给予。
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