JP2019213535A

JP2019213535A - アポリポタンパク質ｃ−ｉｉｉ（ａｐｏｃ３）の発現を阻害するための組成物及び方法

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Publication number: JP2019213535A
Application number: JP2019133527A
Authority: JP
Inventors: ブライアン・ベッテンコート; Bettencourt Brian; ケビン・フィッツジェラルド; Fitzgerald Kevin; スチュアート・ミルスタイン; Milstein Stuart; マルティン・マイアー; Martin Maier; クラウス・カリセ; Charisse Klaus; カラントッタティル・ラジーブ; Rajeev Kallanthottathil; サティア・クチマンチ; Kuchimanchi Satyanarayana; ムティア・マノハラン; Manoharan Muthiah; テュエン・グエン; Nguyen Tuyen
Original assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2019-12-19
Also published as: US20160333342A1; RU2631805C2; WO2012177947A3; EP2723756A4; AU2020277106A1; JP6236385B2; US20240110180A1; CN107201364A; KR102369777B1; US20140113957A1; CN112111492A; AU2019201470A1; EP2723756B1; KR20190114000A; MX344807B; JP2021072843A; MX2021015290A; AU2012272860A1; US9970006B2; EP3693464A2

Abstract

【課題】ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の提供。【解決手段】二重鎖リボ核酸であって、前記ｄｓＲＮＡが、特定のヌクレオチド配列からなるセンス鎖と、特定のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖とを含む、二重鎖リボ核酸であって、少なくとも１つのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される修飾ヌクレオチドであるｄｓＲＮＡ。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年６月２３日出願の米国特許仮出願第６１／４９９，６２０号明細書による利益を主張する。

配列リストの参照
本願は、２０１Ｘ年年月ＸＸに作製されたＸ００，０００バイトのサイズの１１１１１ＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名されたテキストファイルとして電子的に提出された配列リストを含む。配列リストは、参照により組み込まれる。

本発明は、ＡＰＯＣ３遺伝子を標的とする二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）と、このｄｓＲＮＡを使用してＡＰＯＣ３の発現を阻害する方法とに関する。

米国では、成人の３０％が、高いトリグリセリド（ＴＧ）＞１５０ｍｇ／ｄＬを有する。重篤な高トリグリセリド血症（ＴＧ＞５００ｍｇ／ｄＬ）を有する成人の有病率は、１．７％である。現在行われている処置としては、ライフスタイルの変更（食事、運動及び禁煙）、処方等級の魚油、フィブラート及びナイアシンが挙げられる。

ＡｐｏＣ３は、ＴＧを遊離脂肪酸に加水分解するリポタンパク質リパーゼを阻害し；ＬＤＬＲ及びＬＲＰ、並びに受容体非依存性エンドサイトーシスを介した、ＴＧに富んだリポタンパク質のＡｐｏＥ媒介による肝取り込みを阻害し；肝ＶＬＤＬ分泌を促進することが示されている、分泌された肝臓タンパク質である。ヒトＡＰＯＣ３遺伝子における少なくとも１つの突然変異は、好ましい脂質プロファイルに関連している（非特許文献１）。

二重鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知の高く保存された調節機構にて遺伝子発現を遮断することが示されている。特許文献１（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．）は、線虫内の遺伝子発現を阻害するための少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示している。ｄｓＲＮＡはまた、植物（例えば特許文献２、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｅｔａｌ．；及び特許文献３、Ｈｅｉｆｅｔｚｅｔａｌ．参照）、ショウジョウバエ（例えば非特許文献２参照）、及び哺乳動物（特許文献４、Ｌｉｍｍｅｒ；及び特許文献５、Ｋｒｅｕｔｚｅｒｅｔａｌ．参照）を含む他の生物内の標的ＲＮＡを分解することが示されている。

国際公開第９９／３２６１９号パンフレット国際公開第９９／５３０５０号パンフレット国際公開第９９／６１６３１号パンフレット国際公開第００／４４８９５号パンフレット独国特許第１０１００５８６．５号明細書

ＰｏｌｌｉｎＴＩｅｔａｌ．（２００８）ＡｎｕｌｌｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎＡＰＯＣ３ｃｏｎｆｅｒｓａｆａｖｏｒａｂｌｅｐｌａｓｍａｌｉｐｉｄｐｒｏｆｉｌｅａｎｄａｐｐａｒｅｎｔｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２２（５９０８）：１７０２−５Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００

本明細書は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を開示し、このｄｓＲＮＡは、各々３０以下のヌクレオチド長を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表１、２、６、７又は１０内のアンチセンス配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ヌクレオチド配列配列番号７０からなるセンス鎖と、ヌクレオチド配列配列番号１５１からなるアンチセンス鎖とを含む（ＡＤ−４５１４９．１ＵＭ）。別の実施形態では、センス鎖配列は、表１、２、６、７又は１０から選択され、アンチセンス鎖は、表１、２、６、７又は１０から選択される。

いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、例えば少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、及びヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含み、又は各鎖は、２ヌクレオチドに３’オーバーハングを含む。

本発明の任意のｄｓＲＮＡは、更にリガンド、例えばｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされているリガンドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、更に少なくとも１つのＮ−アセチル−ガラクトサミンを含む。

加えて、本発明は、本発明の任意のｄｓＲＮＡを含む細胞；本発明の任意のｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするベクター、及びこのベクターを含む細胞を提供する。

本発明には、本発明の任意のｄｓＲＮＡを含む、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物も含まれる。医薬組成物は、脂質製剤、例えばＭＣ３を含む脂質製剤を含んでもよい。

本発明の別の態様は、細胞内でのＡＰＯＣ３発現の阻害方法であり、該方法は：（ａ）細胞を本発明のＡＰＯＣ３ｄｓＲＮＡと接触させることと、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された細胞を十分な時間維持して、ＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得ることによって、細胞内でのＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＣ３発現は、少なくとも３０％阻害される。

本発明の更なる態様は、ＡＰＯＣ３発現により媒介される疾患の処置方法であり、該方法は、そのような処置を必要とするヒトに、治療的有効量の本発明のＡＰＯＣ３ｄｓＲＮＡ又は本発明の医薬組成物を投与することを含む。疾患は、例えば高いトリグリセリドレベル、例えばトリグリセリドレベル＞１５０ｍｇ／ｄＬ又は＞５００ｍｇ／ｄＬであってもよい。いくつかの実施形態では、この投与は、リポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性リパーゼ活性の増大をもたらす。ｄｓＲＮＡ又は医薬組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。

ＡＰＯＣ３を標的とするｓｉＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ＃１」及びｓｉＲＮＡ＃２」）による処置後の、マウスにおける標的ｍＲＮＡ、トリグリセリド（ＴＧ）及び総コレステロールレベル上の効果を示すグラフである。ＧａｌＮＡｃの構造を示す。３’末端におけるリン酸結合を介してＣｈｏｌ−ｐ−（ＧａｌＮＡｃ）３にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの構造を示す。ＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）３にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ（（ＧａｌＮＡｃ）３−３’−リトコール−オレオイルｓｉＲＮＡコンジュゲート）の構造を示す。

本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細を、下記の記載にて示す。本発明の他の特徴、目的及び利点は、明細書及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

本発明は、ｄｓＲＮＡと、細胞又は哺乳動物内のＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡの使用方法とを提供し、このｄｓＲＮＡは、ＡＰＯＣ３遺伝子を標的とする。本発明は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を原因とする哺乳動物の病的状態及び疾病を処置するための組成物及び方法も提供する。ＡＰＯＣ３ｄｓＲＮＡは、ＡＰＯＣ３ｍＲＮＡの配列特異的分解を導く。

定義
利便性のために、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲に使用される所定の用語及びフレーズの意味を、以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の使用と、このセクションに提供されるその定義との間に明らかな矛盾が存在する場合、このセクションの定義が優先するものとする。

「Ｇ」「Ｃ」「Ａ」及び「Ｕ」は各々、一般に、各々が塩基としてグアニン、シトシン、アデニン及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。「Ｔ」及び「ｄＴ」は本明細書にて交換可能に使用され、核酸塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシリボチミンを指す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「デオキシリボヌクレオチド」が、下記に更に詳細に記載するように、修飾ヌクレオチド又は代理の置換部分も指し得ることを理解するであろう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン及びウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対特性を実質的に変更することなく、他の部分と置換され得ることをよく認識している。例えば、非限定的に、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を為し得る。従って、ウラシル、グアニン又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列内で、例えばイノシンを含むヌクレオチドで置換されてもよい。そのような置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。

「ＡＰＯＣ３」は、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子を指す。ＮＣＢＩＮＬＭウェブサイトによれば、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩは、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）タンパク質である。ＡＰＯＣ３は、リポタンパク質リパーゼ及び肝性リパーゼを阻害し；トリグリセリドに富んだ粒子の異化反応を遅延させると考えられている。ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３及びＡＰＯＡ４遺伝子は、ラット及びヒトゲノムの両方に密接に関連している。Ａ−Ｉ及びＡ−ＩＶ遺伝子は同一の鎖から転写される一方、Ａ−１及びＣ−ＩＩＩ遺伝子は、収束的に転写される。ｐｏＣ−ＩＩＩレベルの上昇は、高トリグリセリド血症の発生を引き起こす。ヒトＡＰＯＣ３ｍＲＮＡ配列は、ジェンバンク受入番号ＮＭ＿００００４０．１であり、本明細書で配列番号１として含まれる。カニクイザル猿（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡ配列は、ジェンバンク受入番号Ｘ６８３５９．１である。

本明細書で使用される「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＡＰＯＣ３遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。

本明細書で使用される用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して指される配列によって記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。

本明細書で使用される用語「相補的な」は、特に指示されない限り、当業者により理解されるように、第一のヌクレオチド配列を第二のヌクレオチド配列との関連で記載する場合、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。

例えば、第一のヌクレオチド配列は、２つの配列が厳格なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ（例えば、アニール）する場合、第二のヌクレオチド配列に対して相補的であるとして記載され得る。ハイブリダイゼーション条件は、アニーリング及び／又は洗浄ステップのための温度、イオン強度、ｐＨ、及び有機溶媒濃度を含む。用語、厳格なハイブリダイゼーション条件は、該条件下で第一のヌクレオチド配列がその標的配列、例えば第二のヌクレオチド配列に優先的にハイブリダイズし、他の配列にはより低い程度でハイブリダイズし、又は全くハイブリダイズしない、条件を指す。厳格なハイブリダイゼーション条件は、配列依存的であり、異なる環境パラメータ下で異なる。一般に、厳格なハイブリダイゼーション条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでのヌクレオチド配列の熱融点（ｔｈｅｒｍａｌｍｅｌｔｉｎｇｐｏｉｎｔ）（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔ_ｍは、第一のヌクレオチド配列の５０％が、完全に一致する標的配列とハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度及びｐＨ下での）である。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、例えばＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓｐａｒｔＩ，ｃｈａｐ．２，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｐｒｏｂｅａｓｓａｙｓ，」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）に見出される。

内部で遭遇し得る、生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定できるであろう。

これは、第一のヌクレオチド配列及び第二のヌクレオチド配列の全長に亘って、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対して塩基対形成することを含む。そのような配列は、本明細書で互いに関連して「完全に相補的」と称され得る。しかしながら、第一の配列が、本明細書で第二の配列に関連して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的であってもよく、又は、それらの最終的な用途に最も関連した条件下でハイブリダイズする能力を残す一方で、ハイブリダイゼーション後に、１つ又は複数であるが、４つ、３つ又は２つを超えないミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション後に１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチと見なされないものとする。例えば、本明細書に記載する目的において、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な配列である２１ヌクレオチドの配列を含む場合、尚、「完全に相補的」と称され得る。

本明細書で使用される「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対、並びに／又は非天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み、又は該塩基対から完全に形成されてもよい。そのような非ワトソン−クリック塩基対には、非限定的に、Ｇ：Ｕゆらぎ又はＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対が挙げられる。

本明細書で、用語「相補的な」「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」は、それらの使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間で、一致する塩基に関連して使用され得る。

本明細書で使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に対して実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又は３’ＵＴＲを含む関心対象のｍＲＮＡ（例えば、ＡＰＯＣ３をコードするｍＲＮＡ）の連続部分に対して実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列がＡＰＯＣ３をコードするｍＲＮＡの非中断部分に対して実質的に相補的である場合、ＡＰＯＣ３ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。

一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡの切断をもたらすように、標的ｍＲＮＡに対して十分相補的である。

本明細書で使用される用語「二重鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」は、２つの逆平行の、かつ上記に定義したような実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有する、リボ核酸分子の複合体を指す。一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載するように、各々の又は両方の鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」は、多数のヌクレオチドにおける相当の修飾を含む、リボヌクレオチドに対する化学修飾を含んでもよく、また本明細書に開示する、又は当技術分野にて既知の、全タイプの修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子内で使用される任意のそのような修飾は、本明細書及び特許請求の範囲の目的において「ｄｓＲＮＡ」に包含される。

二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、又は別々のＲＮＡ分子であってもよい。２つの鎖が１つのより大きい分子の一部であり、従って二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と、対応する他方の鎖の５’末端との間でヌクレオチドの非中断鎖により接続されている場合、接続しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と称される。２つの鎖が、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と、対応する他方の鎖の５’末端との間でヌクレオチドの非中断鎖以外の手段により共有結合的に接続されている場合、接続している構造は、「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同一又は異なる数のヌクレオチドを有してもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖内のヌクレオチドから、二本鎖内に存在する任意のオーバーハングを減算した数である。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。用語「ｓｉＲＮＡ」も、上述したｄｓＲＮＡを指すのに使用し得る。

本明細書で使用される「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて延び、又はその逆の場合、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する不対ヌクレオチド又はヌクレオチドを指す。「平滑」又は「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡの末端に不対ヌクレオチドが存在しない、即ちヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端化」ｄｓＲＮＡは、その全長に亘って二重鎖である、即ち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。

用語「アンチセンス鎖」は、標的配列に対して実質的に相補的な領域を含む、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される用語「相補性の領域」は、配列、例えば標的配列に対して実質的に相補的な、本明細書に定義したアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が、標的配列に対して完全に相補的でない場合、ミスマッチは末端領域内で最も許容され、また存在する場合、一般に、終端領域、例えば５’及び／又は３’終端から６、５、４、３又は２ヌクレオチドの領域内である。

本明細書で使用される用語「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。

本明細書で使用される用語「核酸脂質粒子」は、用語「ＳＮＡＬＰ」を含み、ｄｓＲＮＡ、又は、そこからｄｓＲＮＡが転写されるプラスミドなどの核酸を含む、縮小された（ｒｅｄｕｃｅｄ）水性内部を被覆する脂質のベシクルを指す。核酸脂質粒子、例えばＳＮＡＬＰは、例えば米国特許出願公開第２００６０２４００９３号明細書、同第２００７０１３５３７２号明細書、及び２００８年４月１５日出願の米国特許出願第６１／０４５，２２８号明細書に記載されている。これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

「細胞内に導入する」は、ｄｓＲＮＡを指す場合、当業者により理解されるように、細胞内への取り込み又は吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収又は取り込みは、援助のない拡散プロセス若しくは活性細胞プロセスを介して生じ、又は補助剤若しくはデバイスにより生じ得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず；ｄｓＲＮＡは細胞が生きた生物の一部である場合でも「細胞内に導入」され得る。そのような場合、細胞内への導入は、生物への送達を含むであろう。例えば、インビボでの送達のために、ｄｓＲＮＡは組織部位内に注射されてもよく、又は全身投与されてもよい。インビトロでの細胞内への導入は、電気穿孔及びリポフェクションなどの、当技術分野にて既知の方法を含む。更なる手法は、本明細書に記載され、又は当技術分野にて既知である。

用語「サイレンス」「発現を阻害する」「の発現を下方調節する」「の発現を抑制する」などは、本明細書でそれらがＡＰＯＣ３遺伝子を指す限り、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指し、この抑制は、第一の細胞又は細胞の群と実質的に同一であるが処理されていない第二の細胞又は細胞の群（対照細胞）と比較した、ＡＰＯＣ３遺伝子が転写され、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現が阻害されるように処理された第一の細胞又は細胞の群から単離され得るｍＲＮＡの量の低下により明らかになる。阻害度は、通常、
の点から表される。

代替的に、阻害度は、ＡＰＯＣ３遺伝子発現に機能的に関連付けられるパラメータの低下、例えば、細胞により分泌される、ＡＰＯＣ３遺伝子によりコードされるタンパク質の量、又は所定の表現型、例えばアポトーシスを呈する細胞の数の低下で与えられ得る。原則として、ＡＰＯＣ３遺伝子サイレンシングは、構成的に又は遺伝子操作によって標的を発現している任意の細胞内で、任意の適切なアッセイによって決定され得る。しかしながら、所定のｄｓＲＮＡが、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を所定の程度阻害し、従って本発明に包含されるか否かを決定するために参照が必要である場合、下記の実施例に提供するアッセイは、そのような参照の役割を果たすであろう。

例えば、所定の場合、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現は、本発明を特徴付ける二重鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＣ３遺伝子は、本発明を特徴付ける二重鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、又は８０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＣ３遺伝子は、本発明を特徴付ける二重鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、又は９５％抑制される。

ＡＰＯＣ３発現の文脈において本明細書で使用される用語「処置する」、「処置」などは、ＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程の軽減又は緩和を指す。本発明の文脈において、本明細書にて下記に引用される他の病状（ＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程以外の）のいずれかに関係する限り、用語「処置する」、「処置」などは、そのような病状に関連した少なくとも１つの症状を軽減若しくは緩和し、又は、そのような病状の進行を遅延若しくは逆転させることを意味する。

本明細書で使用されるフレーズ「有効量」は、ＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程、又は、ＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程の明らかな症状の処置、予防又は管理において治療的利益を提供する量を指す。有効な特定の量は、通常の医師により容易に決定されることができ、例えばＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程のタイプ、患者の病歴及び年齢、ＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程の段階、及び、ＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程に抵抗する他の薬剤の投与などの、当技術分野にて既知の因子に応じて変動し得る。

本明細書で使用される「医薬組成物」は、薬理学的に有効な量のｄｓＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含む。本明細書で使用される「薬理学的に有効な量」、「治療的有効量」又は単に「有効量」は、意図される薬理学的、治療的又は予防的結果を生じるのに有効なＲＮＡの量を指す。例えば、疾病又は疾患に関連した測定可能なパラメータにおいて少なくとも２５％の低下が存在する場合に所定の医療処置が有効である場合、その疾病又は疾患の処置のための治療的有効量の薬物は、そのパラメータにおいて少なくとも２５％の低下を達成するのに必要な量である。例えば、治療的有効量の、ＡＰＯＣ３を標的とするｄｓＲＮＡは、ＡＰＯＣ３血清レベルを少なくとも２５％低下し得る。

用語「薬学的に許容され得る担体」は、治療薬を投与するための担体を指す。そのような担体には、非限定的に生理食塩水、緩衝生理食塩水、右旋糖、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。用語は、特に、細胞培地を除外する。経口投与される薬物の場合、薬学的に許容され得る担体には、非限定的に、不活性希釈剤、錠剤崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、風味剤、着色剤及び保存剤などの薬学的に許容され得る賦形剤が挙げられる。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウム及びカルシウム、リン酸ナトリウム及びカルシウム、並びに乳糖が挙げられる一方、トウモロコシ澱粉及びアルギン酸は好適な錠剤崩壊剤である。結合剤には澱粉及びゼラチンが挙げられる一方、潤滑剤は、存在する場合、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであろう。所望の場合、錠剤はモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの材料で被覆されて、胃腸管内での吸収を遅延させてもよい。

本明細書で使用される「形質転換された細胞」は、内部にベクターが導入されている細胞であり、該ベクターからｄｓＲＮＡ分子が発現され得る。

二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
本明細書により詳細に記載するように、本発明は、細胞又は哺乳動物内でＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、ｄｓＲＮＡは、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的な相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含み、また相補性の領域が、３０ヌクレオチド長未満であり、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、また前記ｄｓＲＮＡが、前記ＡＰＯＣ３遺伝子を発現する細胞と接触した後、例えばＰＣＲ若しくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法、又はウェスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法でアッセイして、前記ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を少なくとも３０％阻害する。ＡＰＯＣ３遺伝子の発現は、下記の実施例に記載したアッセイにより測定した際、少なくとも３０％低下し得る。例えば、例えばＨｅｐ３Ｂ細胞など細胞培養物内でのＡＰＯＣ３遺伝子の発現は、例えばｂＤＮＡ若しくはＴａｑＭａｎアッセイによりＡＰＯＣ３ｍＲＮＡレベルを測定することにより、又は例えばＥＬＩＳＡアッセイによりタンパク質レベルを測定することにより、アッセイすることができる。本発明のｄｓＲＮＡは、更に１つ又は複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。

ｄｓＲＮＡは、下記に更に述べるように、当技術分野にて既知の標準的な方法により、例えば、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているような自動ＤＮＡ合成機を使用することにより合成することができる。ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分相補的な２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現中に形成されたｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に対して実質的に相補的な、及び一般に完全に相補的な相補性の領域を含み、他の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対して相補的な領域を含み、従って２つの鎖は、好適な条件下で組み合わされた際、ハイブリダイズし二本鎖構造を形成する。一般に、二本鎖構造は、１５〜３０、又は２５〜３０、又は１８〜２５、又は１９〜２４、又は１９〜２１、又は１９、２０、又は２１塩基対の長さを有する。一実施形態において、二本鎖は、１９塩基対の長さを有する。別の実施形態では、二本鎖は、２１塩基対の長さを有する。２つの異なるｓｉＲＮＡが組み合わせで使用される場合、二本鎖の長さは、同一でも又は異なっていてもよい。

本発明のｄｓＲＮＡの各鎖は、一般に、１５〜３０、又は１８〜２５、又は１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、鎖の各々は、２５〜３０ヌクレオチド長である。二本鎖の各鎖は、同一の長さ又は異なる長さを有してもよい。２つの異なるｓｉＲＮＡが組み合わせで使用される場合、各ｓｉＲＮＡの各鎖の長さは、同一でも又は異なっていてもよい。

本発明のｄｓＲＮＡは、２１〜２３ヌクレオチド長を超えるｄｓＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｅＩＩＩ酵素ダイサーにより２１〜２３塩基対ｓｉＲＮＡに処理されるのに十分な長さのｄｓＲＮＡを含み、該ｓｉＲＮＡは次にＲＩＳＣ内に組み込まれる。従って、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は少なくとも１００塩基対の長さを有し得る。

本発明のｄｓＲＮＡは、１つ又は複数のヌクレオチドからなる１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを含んでもよい。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１〜４、一般に、１又は２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、センス鎖を超える３’末端及び５’末端において各々１〜１０ヌクレオチドオーバーハングを有する。更なる実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖を超える３’末端及び５’末端において各々１〜１０ヌクレオチドオーバーハングを有する。

少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、平滑末端化対応物と比較して予想外に優れた阻害特性を有し得る。いくつかの実施形態では、１つのみのヌクレオチドオーバーハングの存在は、全体の安定性に影響を与えることなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強化する。１つのみのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、インビボで、また多様な細胞、細胞培地、血液、及び血清中で、特に安定かつ有効であることが証明されている。一般に、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端に位置し、又は、代替的に、センス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、一般に、アンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端も有し得る。そのようなｄｓＲＮＡは、改善された安定性及び阻害活性を有し得るため、低い投与量での投与、即ち１日当たり、レシピエントの体重当たり、５ｍｇ／ｋｇ未満での投与を可能にする。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドの１つ又は複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。

一実施形態において、ＡＰＯＣ３遺伝子は、ヒトＡＰＯＣ３遺伝子である。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、表１、２、６、７、１１又は１２のセンス配列のうちの１つであり、アンチセンス鎖は、表１、２、６、７、１１又は１２のアンチセンス配列のうちの１つである。表１、２、６、７、１１又は１２に提供する標的配列の他の箇所を標的とする代替的なアンチセンス剤は、標的配列及び隣接のＡＰＯＣ３配列を使用して容易に決定することができる。

当業者は、２０と２３との間、詳細には２１塩基対に二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に効果的であると認められていることをよく認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，ＥＭＢＯ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、より短い又はより長いｄｓＲＮＡも有効であり得ることを見出している者がいる。上述した実施形態では、表１、２、６、７、１１又は１２に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質によって、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡは、本明細書に記載された少なくとも１つの鎖長を含んでもよい。表１、２、６、７、１１又は１２の配列のうちの１つから一方又は両方の末端上の数個のみのヌクレオチドを引いた配列を有する、より短いｄｓＲＮＡは、上述したｄｓＲＮＡと比較して、同様に効果的であり得ることが合理的に予想され得る。従って、表１、２、６、７、１１又は１２の配列のうちの１つからの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれを超える数の連続ヌクレオチドの部分的配列を有するｄｓＲＮＡと、本明細書にて下記に記載するアッセイにおいて、完全配列を含むｄｓＲＮＡの５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害である、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するそれらの能力における差異とは、本発明により予想される。更に、所望のＡＰＯＣ３標的配列内を切断するｄｓＲＮＡは、対応するＡＰＯＣ３アンチセンス配列及び相補的なセンス配列を使用して容易に作製することができる。

加えて、表１、２、６、７、１１又は１２に提供するｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉベースの切断を受けやすいＡＰＯＣ３内の部位を識別する。従って、本発明は更に、本発明の薬剤のうちの１つにより標的とされる配列内を標的とするｄｓＲＮＡにより特徴付けられる。本明細書で使用されるように、第二のｄｓＲＮＡは、第二のｄｓＲＮＡが、第一のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に対して相補的なｍＲＮＡ内のいずれかの箇所のメッセージを切断する場合、第一のｄｓＲＮＡの配列内を標的とすると言われる。そのような第二のｄｓＲＮＡは、一般に、表１、２、６、７、１１又は１２に提供する配列のうちの１つからの少なくとも１５連続ヌクレオチドからなり、該ヌクレオチドは、ＡＰＯＣ３遺伝子内の選択された配列に連続する領域から取られた更なるヌクレオチド配列に連結されるであろう。

ＲＮＡ標的の切断は、当技術分野にて既知のゲル電気泳動、及び必要であれば、関連した核酸ハイブリダイゼーション技術により日常的に検出することができる。ｄｓＲＮＡの標的ｍＲＮＡ上の切断部位は、一般に、当業者に既知の方法、例えばＳｏｕｔｓｃｈｅｋｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ；２００４，Ｖｏｌ．４３２，ｐｐ．１７３−１７８（全目的において参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている５’−ＲＡＣＥ法を用いて決定することができる。

本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡは、標的配列に対する１つ又は複数のミスマッチを含んでもよい。一実施形態において、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含む。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチの範囲は、相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチは、いずれの末端からも５ヌクレオチドに制限され、例えば相補性の領域の５’又は３’末端のいずれかから５、４、３、２、又は１ヌクレオチドに制限されることが好ましい。例えば、ＡＰＯＣ３遺伝子の一領域に対して相補的な２３ヌクレオチドｄｓＲＮＡ鎖の場合、ｄｓＲＮＡは一般に、中心の１３ヌクレオチド内にいずれのミスマッチも含まない。本発明中に記載される方法を用いて、標的配列にミスマッチを含むｄｓＲＮＡが、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するのに有効であるか否かを決定することができる。ミスマッチを有するｄｓＲＮＡの、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の阻害における効力を考慮することは重要であり、特に、ＡＰＯＣ３遺伝子内の特定の相補性領域が、集団内で多形配列変形（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有することが既知である場合に重要である。

別の一態様において、本発明は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドＲＮＡｉである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ内の配列に対して相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに対して塩基対形成し、翻訳機構を物理的に妨害する化学量論的方法で翻訳を阻害することができる。Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ．ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ．１：３４７−３５５を参照されたい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的に結合し、ＲＮＡｅ−Ｈを介したｍＲＮＡ標的破壊を促進することによっても標的タンパク質発現を阻害することができる。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１３〜約３０ヌクレオチド長であってもよく、標的配列に対して相補的な配列を有する。例えば、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、表１、２、６、７又は１０のアンチセンス配列のうちの１つからの、少なくとも約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれを超える数の連続ヌクレオチドである配列を含んでもよい。

修飾
更なる別の実施形態では、ｄｓＲＮＡを化学的に修飾して、安定性を向上させてもよい。本発明を特徴付ける核酸は、参照により本明細書に組み込まれる「Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，」Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔａｌ．（Ｅｄｓ．），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような、当技術分野にてよく確立された方法により合成及び／又は修飾することができる。本発明に有用なｄｓＲＮＡ化合物の特定の例は、修飾バックボーンを含む又は天然ヌクレオシド間結合を有さないＲＮＡを含む。本明細書に定義されるように、修飾バックボーンを有するｄｓＲＮＡは、バックボーン内にリン原子を保持するものと、バックボーン内にリン原子を有さないものとを含む。本明細書の目的において、及び、当技術分野にて時折言及されるように、それらのヌクレオシド間バックボーン内にリン原子を有さない修飾ｄｓＲＮＡも、オリゴヌクレオシドであると見なされてもよい。

修飾ｄｓＲＮＡバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、及び、隣接するヌクレオシド単位の対が、３’−５’〜５’−３’又は２’−５’ 〜５’−２’に結合する、反転極性を有するもの）が挙げられる。様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、非限定的に米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；及び米国特許第５，６２５，０５０号明細書が挙げられ、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

内部にリン原子を含まない修飾ｄｓＲＮＡバックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホンバックボーン；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネート及びスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２構成要素部分を有するその他、が挙げられる。

上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許第には、非限定的に米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５号明細書；米国特許第５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；及び米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

他の好適なｄｓＲＮＡ模倣物において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、即ちバックボーンの両方は、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。卓越したハイブリダイゼーション特性を有することが示されている１つのそのようなオリゴマー化合物、ｄｓＲＮＡ模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ｄｓＲＮＡの糖バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンで置換されている。酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許第には、非限定的に米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；及び米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。

本発明の別の実施形態は、ホスホロチオエートバックボーンを有するｄｓＲＮＡ、並びに上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号明細書のヘテロ原子バックボーン、特に−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩバックボーンとして既知］、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−及び−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−［ここで天然のホスホジエステルバックボーンは、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−と表される］及び上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミドバックボーンを有するオリゴヌクレオシドである。上記に参照した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノバックボーン構造を有するｄｓＲＮＡも好ましい。

修飾ｄｓＲＮＡは、１つ又は複数の置換された糖部分も含み得る。好ましいｄｓＲＮＡは、以下のうちの１つを２’位に含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２、（ｎ及びｍは、１〜約１０である）が特に好ましい。他の好ましいｄｓＲＮＡは、以下のうちの１つを２’位に含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｄｓＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、又はｄｓＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、及び同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても既知）（Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、即ち、アルコキシ−アルコキシ基が挙げられる。更なる好ましい修飾には、本明細書の下記の実施例に記載するような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、２’−ＤＭＡＯＥとしても既知のＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、及び、本明細書の下記の実施例に記載するような２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても既知）、即ち、２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_２）_２が挙げられる。

他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。またｄｓＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、又は２’−５’結合ｄｓＲＮＡ内及び５’末端ヌクレオチドの５’位に、同様の変更を行うことができる。またＤｓＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣物を有し得る。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、非限定的に米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；及び米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらの所定のものは、所有者が本願と共通であり、またこれらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ｄｓＲＮＡは、核酸塩基（当技術分野にて多くの場合、単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシ及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−ダアザアデニン（ｄａａｚａｇｕａｎｉｎ）、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されているもの、ＴｈｅＣｏｎｃｉｓｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａＯｆＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅＡｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ．８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈｅｔａｌ．，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅ，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，ＹＳ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，ＤｓＲＮＡＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものを含む。これらの核酸塩基の所定のものは、本発明を特徴付けるオリゴマー化合物の結合親和性の増大に特に有用である。それらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃、増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＤｓＲＮＡＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、更に特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた際に、例示的な塩基置換である。

上記した修飾核酸塩基及び他の修飾核酸塩基の所定の調製を教示する代表的な米国特許には、非限定的に米国特許第３，６８７，８０８号明細書、並びに米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１号明細書，米国特許第５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；及び米国特許第５，６８１，９４１号明細書が挙げられ、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれ、また同様に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，６９２号明細書が挙げられる。

コンジュゲート
本発明のｄｓＲＮＡの他の修飾は、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させる１つ又は複数の部分又はコンジュゲートをｄｓＲＮＡに化学的に結合することを含む。そのような部分には、非限定的にコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えばベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）、脂肪鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ，１９９１，１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９〜２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）などの脂質部分が挙げられる。

所定の化合物中の全位置を均一に修飾する必要はなく、事実上、前述した修飾のうちの２つ以上を単一の化合物に組み込んでもよく、又は更にはｄｓＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込んでもよい。本発明は、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も含む。本発明の文脈において「キメラ」ｄｓＲＮＡ化合物又は「キメラ」は、特に２つ以上の化学的に異なる領域を含むｄｓＲＮＡであるｄｓＲＮＡ化合であり、該領域の各々が少なくとも１つのモノマー単位、即ちｄｓＲＮＡ化合物の場合、ヌクレオチドから構成されている。これらのｄｓＲＮＡは、典型的には、少なくとも１つの領域を含み、該領域においてｄｓＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大、及び／又は、標的核酸に対する結合親和性の増大を、ｄｓＲＮＡに対して付与するように修飾されている。ｄｓＲＮＡの更なる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮＡｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮＡｅＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のｄｓＲＮＡ阻害の効率が多大に向上する。その結果、キメラｄｓＲＮＡを使用した場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｄｓＲＮＡを用いて、多くの場合、同様の結果を得ることができる。

所定の場合、ｄｓＲＮＡは、非リガンド基により修飾されてもよい。多数の非リガンド分子がｄｓＲＮＡにコンジュゲートされて、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させており、そのようなコンジュゲーションを行うための手順は、科学文献にて入手可能である。そのような非リガンド部分は、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）などの脂質部分を含んでいる。そのようなｄｓＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記に列挙されている。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の１つ又は複数の位置にアミノリンカーを支持するｄｓＲＮＡを合成することを含む。次いで、適切なカップリング試薬又は活性化試薬を使用して、コンジュゲートされる分子とアミノ基とを反応させる。コンジュゲーション反応は、固相担体に尚結合しているｄｓＲＮＡを用いて、又は、溶液相中でｄｓＲＮＡを切断した後のいずれかに行うことができる。一般に、ｄｓＲＮＡコンジュゲートのＨＰＬＣによる精製は、純粋なコンジュゲートを与える。

リガンドをｄｓＲＮＡにコンジュゲートすることにより、その細胞吸収と、特定の組織に対するターゲティング、又は肝細胞などの特定タイプの細胞による取り込みとが向上し得る。所定の場合、疎水性リガンドがｄｓＲＮＡにコンジュゲートされて、細胞膜の直接透過、及び又は肝細胞全域での取り込みを促進する。代替的に、ｄｓＲＮＡにコンジュゲートされるリガンドは、受容体媒介によるエンドサイトーシスの基質である。これらの手法を用いることにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｄｓＲＮＡ剤の細胞透過が促進されている。例えば、コレステロールが様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされて、それらの非コンジュゲート類似体と比較して実質的により活性な化合物をもたらしている。Ｍ．ＭａｎｏｈａｒａｎＡｎｔｉｓｅｎｓｅ＆ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２００２，１２，１０３を参照されたい。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他の親油性化合物には、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロール及びメントールが挙げられる。受容体媒介によるエンドサイトーシスのためのリガンドの一例は、葉酸である。葉酸は、葉酸−受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞に進入する。葉酸を支持するｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸−受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞内に効率的に輸送されるであろう。Ｌｉ及び共働者は、オリゴヌクレオチドの３’終端に葉酸を結合することによって、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みが８倍増大したことを報告している。Ｌｉ，Ｓ．；Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ｈ．Ｍ．；Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８，１５，１５４０。オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている他のリガンドには、ポリエチレングリコール、カルボキシレートクラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、送達ペプチド、並びにコレステロール及びコレステリルアミンなどの脂質が挙げられる。カルボキシレートクラスターの例には、Ｃｈｏｌ−ｐ−（ＧａｌＮＡｃ）_３（Ｎ−アセチルガラクトサミンコレステロール）及びＬＣＯ（ＧａｌＮＡｃ）_３（Ｎ−アセチルガラクトサミン−３’−リトコール−オレオイルが挙げられる。

炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物及び方法のいくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは更に炭水化物を含む。炭水化物コンジュゲートｄｓＲＮＡは、本明細書に記載するように、インビボでの核酸の送達に有利であり、また組成物は、インビボでの治療的使用に好適である。本明細書で使用される「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状又は環状であってもよい）を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物；又はその一部として、１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物部分を有し、該単糖単位の各々が少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状又は環状であってもよい）を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物には、糖（単糖、二糖、三糖、及び、約４、５、６、７、８、又は９単糖単位を含むオリゴ糖）、並びに澱粉、グリコーゲン、セルロース及び多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖には、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）の糖が挙げられ；二及び三糖には、２つ又は３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７又はＣ８）を有する糖が挙げられる。

一実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用される炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態において、単糖は、
などのＮ−アセチルガラクトサミンである。

別の実施形態では、本発明の組成物及び方法に使用される炭水化物コンジュゲートは：
からなる群から選択される。

本明細書に記載する実施形態に使用される代表的な他の炭水化物コンジュゲートには、非限定的に、
が挙げられる。

Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドの場合、他方は水素である。

いくつかの実施形態において、炭水化物コンジュゲートは更に、非限定的にＰＫ修飾因子及び／又は細胞透過ペプチドなどの、上述したような１つ又は複数の更なるリガンドを含む。

リンカー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載したコンジュゲート又はリガンドは、切断可能又は非切断可能であってもよい様々なリンカーを用いて、本発明のｄｓＲＮＡに結合されてもよい。

用語「リンカー」又は「結合基」は、化合物の２つの部分を接続し、例えば化合物の２つの部分を共有結合させる有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合、又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＳＯ_２ＮＨなどの単位、又は、非限定的に置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）アリール（１つ又は複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアリール、置換又は非置換のヘテロ環状により中断又は終結されてもよい）などの原子の鎖を含み；ここでＲ８は、水素、アシル、脂肪族又は置換された脂肪族である。一実施形態において、リンカーは、約１〜２４個の原子、２〜２４、３〜２４、４〜２４、５〜２４、６〜２４、６〜１８、７〜１８、８〜１８個の原子、７〜１７、８〜１７、６〜１６、７〜１７、又は８〜１６個の原子からなる。

切断可能な結合基は、細胞の外部では十分安定であるが、標的細胞内に入った後、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を解放するものである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、標的細胞内又は第一の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下で、対象の血液中又は第二の参照条件（例えば、血液又は血清に見出される条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下の少なくとも約１０倍、２０、倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又はそれを超える、又は少なくとも約１００倍速く切断される。

結合可能な結合基は、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に敏感である。一般に、切断剤は、血清又は血液中と比較して細胞内部に広く存在し、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。そのような分解剤の例には：例えば細胞内に存在する酸化若しくは還元酵素、又は、還元により酸化還元切断可能な結合基を分解できる、メルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質用に選択され又は基質特異性を有さない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を形成可能な、例えば５以下のｐＨをもたらす薬剤；一般的な酸として作用することにより、酸切断可能な結合基を加水分解又は分解できる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。

ジスルフィド結合などの切断可能な結合基は、ｐＨに敏感であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４である一方、平均細胞内ｐＨは、僅かに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは５．５〜６．０の範囲内のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、ほぼ５．０の、更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有することによって、細胞内部でリガンドから陽イオン性脂質を放出し、又は細胞の所望の区画内へ放出するであろう。

リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な結合基を含んでもよい。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、陽イオン性脂質に結合されてもよい。肝細胞はエステラーゼに富んでいるため、このリンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞タイプ内と比較して、肝細胞内でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富んだ他の細胞タイプには、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。

ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞などの、ペプチダーゼに富んだ細胞タイプを標的とする際に使用することができる。

一般に、切断可能な候補結合基の適切性は、分解剤（又は分解条件）の候補結合基を切断する能力を試験することにより評価することができる。血液中、又は他の非標的組織との接触の際に、切断可能な候補結合基が切断に抵抗する能力を試験することも望ましいであろう。それ故、第一の条件と第二の条件との間の、切断に対する相対的な感受性を決定することができ、第一の条件は標的細胞内での切断を示すよう選択され、第二の条件は他の組織内又は生体液、例えば血液又は血清中での切断を示すよう選択される。この評価は、無細胞系内、細胞内、細胞培養物中、器官内若しくは組織培養物中、又は全動物内で行うことができる。無細胞又は培養物条件内で最初の評価を行い、動物内での更なる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く切断される。

一実施形態において、切断可能な結合基は、還元又は酸化後に切断される酸化還元切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能な候補結合基が好適な「還元的に切断可能な結合基」であるか、又は例えば特定のｄｓＲＮＡ部分及び特定のターゲティング剤との使用に好適であるかを決定するために、本明細書に記載した方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、又は当技術分野にて既知の試薬を使用した他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察されるであろう切断の速度を模倣する。候補は血液又は血清条件を模倣するよう選択された条件下でも評価し得る。その１つにおいて、候補化合物は、血液中で多くて約１０％切断される。別の実施形態では、有用な候補化合物は、血液中（又は、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。

別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な結合基を含む。リン酸ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの結合基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能な結合基を含む。酸切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０、又はそれ未満）のｐＨを有する酸性環境内で、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの、特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能な結合基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例には、非限定的にヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は−ＯＣ（Ｏ）を有してもよい。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはｔ−ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な結合基を含む。エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミラーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例には、非限定的にアルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な結合基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

更なる別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基の例は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−（配列番号１３）を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。

一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物とコンジュゲートされる。本発明の組成物及び方法のリンカーとコンジュゲートするｄｓＲＮＡ炭水化物の非限定的な例には、
が挙げられる。

Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドのとき、他方は水素である。

本発明の組成物及び方法の所定の実施形態において、リガンドは、二価又は三価の分枝状リンカーを介して結合した１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体である。

一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩ）〜（ＸＸＸＩＶ）のいずれかに示す構造の群から選択される二価又は三価の分枝状リンカーにコンジュゲートされる：

式中：ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃは、各存在に関して独立して０〜２０を表し、反復単位は、同一又は異なっていてもよく；
Ｐ^２Ａ、Ｐ^２Ｂ、Ｐ^３Ａ、Ｐ^３Ｂ、Ｐ^４Ａ、Ｐ^４Ｂ、Ｐ^５Ａ、Ｐ^５Ｂ、Ｐ^５Ｃ、Ｔ^２Ａ、Ｔ^２Ｂ、Ｔ^３Ａ、Ｔ^３Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^４Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^５Ｂ、Ｔ^５Ｃは、各々、各存在に関して独立して不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＮＨ又はＣＨ_２Ｏであり；
Ｑ^２Ａ、Ｑ^２Ｂ、Ｑ^３Ａ、Ｑ^３Ｂ、Ｑ^４Ａ、Ｑ^４Ｂ、Ｑ^５Ａ、Ｑ^５Ｂ、Ｑ^５Ｃは、各存在に関して独立して不在、アルキレン、置換されたアルキレンであり、ここで１つ又は複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ_２、Ｎ（Ｒ^Ｎ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）のうちの１つ又は複数により中断又は終結されてもよく；
Ｒ^２Ａ、Ｒ^２Ｂ、Ｒ^３Ａ、Ｒ^３Ｂ、Ｒ^４Ａ、Ｒ^４Ｂ、Ｒ^５Ａ、Ｒ^５Ｂ、Ｒ^５Ｃは、各々、各存在に関して独立して不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒ^ａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒ^ａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
又はヘテロシクリルであり；
Ｌ^２Ａ、Ｌ^２Ｂ、Ｌ^３Ａ、Ｌ^３Ｂ、Ｌ^４Ａ、Ｌ^４Ｂ、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５Ｂ及びＬ^５Ｃは、リガンドを表し；即ち、各々、各存在に関して独立して単糖（ＧａｌＮＡｃなどの）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり；Ｒ^ａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。式（ＸＸＸＶ）のものなどの、三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、ＲＮＡｉ剤と共に使用されて、標的遺伝子の発現を阻害するのに特に有用である：
式ＸＸＸＶ
式中、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５Ｂ及びＬ^５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。

ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価の分枝状リンカー基の例には、非限定的に、式ＩＩ＿ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、及びＸＩＩＩとして上記に引用した構造が挙げられる。

ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な特許には、非限定的に米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７，５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書，米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３，５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８及び５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書；米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられ、これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

ｄｓＲＮＡをコードするベクター
別の態様において、ＡＰＯＣ３ｄｓＲＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター内に挿入された転写単位から発現される（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔａｌ．，国際ＰＣＴ公開第００／２２１１３号パンフレット、Ｃｏｎｒａｄ，国際ＰＣＴ公開第００／２２１１４号パンフレット、及びＣｏｎｒａｄ，米国特許第６，０５４，２９９号明細書参照）。これらの導入遺伝子は、直鎖状コンストラクト、円形プラスミド、又はウィルスベクターとして導入されてもよく、これらは、宿主ゲノムに統合された導入遺伝子として組み込まれ及び遺伝され得る。導入遺伝子はまた、染色体外プラスミドとして遺伝されることが可能であるよう構成され得る（Ｇａｓｓｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。

ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２つの別個の発現ベクター上のプロモーターにより転写され、標的細胞内にコトランスフェクトされてもよい。代替的に、ｄｓＲＮＡの個々の鎖の各々は、両方ともが同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターにより転写されてもよい。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステム及びループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列により連結された反転反復として発現される。

組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミド又はウィルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウィルスベクターは、アデノ関連ウィルス（概説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＴｏｐｉｃｓＭｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９））；アデノウィルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１−４３４）及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄｅｔａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５５）を参照されたい）；又はαウィルス、並びに当技術分野にて既知のその他に基づいて構成され得る。レトロウィルスは、インビトロ及び／又はインビボで、上皮細胞を含む多数の異なる細胞タイプ内へ多様な遺伝子を導入するのに使用されている（例えばＥｇｌｉｔｉｓ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓａｎｄＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏｅｔａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１６１４５；Ｈｕｂｅｒｅｔａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙｅｔａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙｅｔａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎＢｅｕｓｅｃｈｅｍ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０−１９；Ｋａｙｅｔａｌ．，１９９２，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：６４１−６４７；Ｄａｉｅｔａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号明細書；米国特許第４，９８０，２８６号明細書；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０７１３６号パンフレット；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０２４６８号パンフレット；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０５３４５号パンフレット；及びＰＣＴ出願国際公開第９２／０７５７３号パンフレット参照）。細胞のゲノム内に挿入される遺伝子を形質導入及び発現可能な組換えレトロウィルスベクターは、組換えレトロウィルスゲノムをＰＡ３１７及びＰｓｉ−ＣＲＩＰなどの好適なパッケージング細胞ラインにトランスフェクトすることにより生成することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅｅｔａｌ．，１９９１，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２：５−１０；Ｃｏｎｅｅｔａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６３４９）。組換えアデノウィルスベクターは、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ及びチンパンジー）内の非常に様々な細胞及び組織を感染させるのに使用することができ（Ｈｓｕｅｔａｌ．，１９９２，Ｊ．ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、また、感染のために有糸分裂的に活性な細胞を必要としない利点も有する。

発現されるべきｄｓＲＮＡ分子のコード配列を受容可能な任意のウィルスベクター、例えばアデノウィルス（ＡＶ）；アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）；レトロウィルス（例えば、レンチウィルス（ＬＶ）、ラブドウィルス、ハツカネズミ白血病ウィルス）；ヘルペスウィルスなどに由来するベクターを使用することができる。ウィルスベクターの向性は、適宜、ベクターをエンベロープタンパク質若しくは他のウィルスからの他の表面抗原でシュードタイピングすることにより、又は異なるウィルスカプシドタンパク質で置き換えることにより変更することができる。

例えば、本発明を特徴付けるレンチウィルスベクターは、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質でシュードタイピングされてもよい。本発明を特徴付けるＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することによって、異なる細胞を標的とするよう作製され得る。例えば、血清型２ゲノム上に血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれている。ＡＡＶ２／２ベクター内のこの血清型２カプシド遺伝子は、血清型５カプシド遺伝子により置換されてＡＡＶ２／５ベクターを生成し得る。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構成するための技術は、当業者の技能の範疇にある；例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚＪＥｅｔａｌ．（２００２），ＪＶｉｒｏｌ７６：７９１−８０１を参照されたい。

本発明で使用するのに好適な組換えウィルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡを発現する核酸配列をベクター内に挿入する方法、及びウィルスベクターを関心対象の細胞に送達する方法は、当業者の技能の範疇にある。例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるＤｏｒｎｂｕｒｇＲ（１９９５），ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；ＥｇｌｉｔｉｓＭＡ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６０８−６１４；ＭｉｌｌｅｒＡＤ（１９９０），ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ．１：５−１４；ＡｎｄｅｒｓｏｎＷＦ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ３９２：２５−３０；及びＲｕｂｉｎｓｏｎＤＡｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照されたい。

ウィルスベクターは、ＡＶ及びＡＡＶに由来してもよい。一実施形態において、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡは、例えばＵ６若しくはＨ１ＲＮＡプロモーター、又はサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現される。

本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡを発現するための好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構成する方法、及びベクターを標的細胞に送達する方法は、ＸｉａＨｅｔａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。

本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡを発現するための好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構成する方法、及びベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｕｌｓｋｉＲｅｔａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；ＦｉｓｈｅｒＫＪｅｔａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；ＳａｍｕｌｓｋｉＲｅｔａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際特許出願第９４／１３７８８号パンフレット；及び国際特許出願第９３／２４６４１号パンフレットに記載されている。

本発明を特徴付けるＤＮＡプラスミド又はウィルスベクターのいずれか内でｄｓＲＮＡ発現を推進するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーター又はアクチンプロモーター又はＵ１ｓｎＲＮＡプロモーター）若しくは一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６ｓｎＲＮＡ又は７ＳＫＲＮＡプロモーター）又は原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドがＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ＲＮＡポリメラーゼもコードすることを条件として、Ｔ７プロモーターであってもよい。プロモーターは膵臓に導入遺伝子発現を導くこともできる（例えば、膵臓のためのインスリン制御配列（Ｂｕｃｃｈｉｎｉｅｔａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：２５１１−２５１５）参照）。

加えて、導入遺伝子の発現は、例えば、所定の生理学的調節因子、例えば循環ブドウ糖レベル又はホルモンに感受性の調節配列などの誘導性調節配列及び発現系を使用することにより、正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙｅｔａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢＪ．８：２０−２４）。細胞内又は哺乳動物内で導入遺伝子発現を制御するのに好適な、そのような誘導性発現系は、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導因子、及びイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節を含む。当業者は、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の意図される使用に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することが可能であろう。

一般に、ｄｓＲＮＡ分子を発現可能な組換えベクターは、下記に記載するように送達され、標的細胞内に留まる。代替的に、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウィルスベクターを使用してもよい。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与されてもよい。発現後、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡに結合し、その機能又は発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内若しくは筋内投与などによる全身、又は患者から外植された標的細胞に投与した後、患者に再導入することにより、又は所望の標的細胞内へ導入可能な任意の他の手段によるものであってもよい。

ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には、陽イオン性脂質担体（例えば、オリゴフェクトアミン）又は非陽イオン性脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞内にトランスフェクトされる。１週間以上に亘る単一のＡＰＯＣ３遺伝子又は多数のＡＰＯＣ３遺伝子の異なる領域を標的とする、ｄｓＲＮＡ媒介によるノックダウンのための多数の脂質トランスフェクションも、本発明により期待される。宿主細胞内へのベクター導入の成功は、既知の様々な方法を用いて監視することができる。例えば、一過性トランスフェクションは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光マーカーなどのレポーターを用いて示すことができる。エクスビボでの細胞の安定なトランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞に、例えばハイグロマイシンＢ耐性などの、特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬物）に対する耐性を提供するマーカーを使用して確実にすることができる。

ＡＰＯＣ３特異的ｄｓＲＮＡ分子は、ベクター内に挿入され、ヒト患者用の遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局部投与（米国特許第５，３２８，４７０号明細書参照）又は定位注射（例えばＣｈｅｎｅｔａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７参照）により対象に送達されてもよい。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含んでもよく、又は内部に遺伝子送達ビヒクルが組み込まれた遅延放出マトリックスを含んでもよい。代替的に、組換え細胞から完全遺伝子送達ベクター、例えばレトロウィルスベクターが無傷で生成され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達系を生成する１つ又は複数の細胞を含み得る。

ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載したｄｓＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程などの、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現又は活性に関連した疾病又は疾患の処置に有用である。そのような医薬組成物は、送達モードに基づいて処方される。

本発明を特徴付ける医薬組成物は、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。

一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量は、１日当たり、レシピエントのキログラム体重当たり０．０１〜２００．０ミリグラムの範囲内、一般に、１日当たり、キログラム体重当たり１〜５０ｍｇの範囲内であろう。

対象は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、又は約５０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡなどの治療量のｄｓＲＮＡを投与されてもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。

医薬組成物は、一日１回投与されてもよく、又はｄｓＲＮＡは、１日を通して適切な間隔で、２、３以上のサブ用量として投与され、又は更には、連続注入若しくは徐放製剤を介した送達を用いて投与されてもよい。その場合、各サブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは、総一日投与量を達成するように、対応してより少量である必要がある。投与単位はまた、例えば数日間の期間に亘る持続放出を提供する従来の持続放出製剤を使用して、数日間に亘る送達用に配合されてもよい。持続放出製剤は当技術分野にて周知であり、薬剤を特定の部位に送達するのに特に有用であるため、本発明の薬剤と共に使用することができる。この実施形態では、投与単位は、一日用量の対応する倍数を含む。

ＡＰＯＣ３レベルに対する単一用量の効果は持続性であるため、次の用量は、３、４、若しくは５日間以下の間隔で、又は１、２、３、若しくは４週間以下の間隔で、又は５、６、７、８、９、若しくは１０週間以下の間隔で投与される。

当業者は、非限定的に疾病又は疾患の重篤さ、以前の処置、対象の全体的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾病を含む所定の因子が対象を効果的に処置するのに必要な投与量及び時間に影響し得ることを認識するであろう。更に、治療的有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置又は一連の処置を含み得る。本発明により包含される個々のｄｓＲＮＡに関する有効な投与量、及びインビボでの半減期は、従来の方法論を用いて、又は、本明細書の他の箇所に記載されるような適切な動物モデルを使用したインビボでの試験に基づいて概算することができる。

マウス遺伝学における進歩は、例えばＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程などの様々なヒト疾病の試験用の多数のマウスモデルを生み出した。そのようなモデルは、ｄｓＲＮＡのインビボでの試験、及び治療的有効用量を決定するために使用される。好適なマウスモデルは、ヒトＡＰＯＣ３を発現するプラスミドを含むマウスである。別の好適なマウスモデルは、ヒトＡＰＯＣ３を発現する導入遺伝子を保有する遺伝子導入マウスである。

細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量範囲を定めるのに使用され得る。本発明を特徴付ける組成物の投与量は、毒性を殆ど又は全く有さない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明を特徴付ける方法で使用される任意の化合物の場合、治療的有効用量は当初、細胞培養アッセイから概算されてもよい。用量は、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、又は適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように、動物モデル内で定められてもよい。そのような情報を使用して、ヒト内での有用な用量を正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。

本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子発現により媒介される病理過程の処置に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの場合でも、投与する医師は、当技術分野にて既知の又は本明細書に記載される効力の標準的な尺度を用いて観察された結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量及びタイミングを調整することができる。

投与
本発明は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡ化合物を含有する医薬組成物及び製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局部又は全身処置のどちらが所望されるか、及び、処置されるべき範囲に応じて、多数の方法で投与され得る。投与は、局所（頬内及び舌下を含む）、経肺、例えば噴霧器を含む、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送により；気管内、鼻腔内、上皮及び経皮、経口又は非経口であってもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋内注射若しくは注入；又は頭蓋内、例えば実質内、くも膜下腔内若しくは脳室内投与が挙げられる。

ｄｓＲＮＡは、特定の組織を標的とする方法で送達され得る。

局所投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、噴霧剤、液剤及び散剤が挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であり、又は所望され得る。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤などの局所送達薬剤との混合物であるものを含む。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及び陽イオン性（例えば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本発明を特徴付けるＤｓＲＮＡは、リポソーム中に封入されてもよく、又はリポソームに対して、特に陽イオン性リポソームに対して錯体を形成してもよい。代替的に、ｄｓＲＮＡは、脂質に対して、特に陽イオン性脂質に対して錯体化されてもよい。好適な脂肪酸及びエステルには、非限定的にアラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１〜１０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容され得る塩が挙げられる。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されている。

リポソーム製剤
マイクロエマルションの他に、試験され、かつ薬物の製剤に使用されている多数の構築された界面活性剤構造が存在する。それらには、単層、ミセル、二重層及びベシクルが挙げられる。リポソームなどのベシクルは、それらが薬物送達の観点から提供する、それらの作用の特異性及び遅延に起因して多大な興味を引いてきた。本発明で使用される用語「リポソーム」は、球状の二重層に配置された両親媒性脂質から構成されるベシクルを意味する。

リポソームは、親油性材料から形成された膜と水性内部とを有するユニラメラ又はマルチラメラベシクルである。水性部分は、送達されるべき組成物を含む。陽イオン性リポソームは、細胞壁に融合する利点を所有する。非陽イオン性リポソームは、細胞壁と十分融合できないが、インビボでマクロファージにより取り上げられる。

無傷哺乳動物皮膚を交差するために、脂質ベシクルは、好適な経皮勾配の影響下で、各々直径５０ｎｍ未満の一連の細孔内を通過する必要がある。従って、高度に変形可能であり、そのような細孔内を通過できるリポソームを使用することが望ましい。

リポソームの更なる利点には、以下が挙げられる；天然リン脂質から得られたリポソームは、生体適合性かつ生分解性である；リポソームは、広い範囲の水溶性及び脂溶性薬物を組み込むことができる；リポソームは、それらの内部区画内の封入薬物を、代謝及び分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、ベシクルサイズ、及びリポソームの水性容積である。

リポソームは、活性成分を作用部位へ移動及び送達するのに有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているため、リポソームが組織に適用された際、リポソームは細胞膜との同化を開始し、リポソームと細胞との同化が進行するにつれて、リポソーム内容物が、活性薬剤が作用し得る細胞内に放出される。

リポソーム製剤は、多数の薬物用の送達モードとして広範な研究が結集されている。局所投与において、リポソームは他の製剤を超える数個の利点を有することが益々実証されている。そのような利点には、投与薬物の高い全身吸収に関連した副作用の低下、所望の標的における投与薬物の蓄積の増大、並びに、親水性及び疎水性の両方の非常に多様な薬物の皮膚内への投与の可能性が挙げられる。

数個の報告では、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚内へ送達する、リポソームの能力が詳細に説明されている。鎮痛薬、抗体、ホルモン及び高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。適用の大部分は、上面表皮のターゲティングをもたらした。

リポソームは、２つの大きなクラスに分かれる。陽イオン性リポソームは、負に帯電された分子と相互作用して安定な複合体を形成する正に帯電されたリポソームである。正に帯電されたＤＮＡ／リポソーム複合体は負に帯電された細胞表面に結合し、エンドソーム内に移行される。エンドソーム内の酸性ｐＨによって、リポソームが破裂され、それらの内容物を細胞質内に放出する（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。

ｐＨ感受性かつ負に帯電されたリポソームは、ＤＮＡと複合するのではなく、ＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡ及び脂質の両方は同様に帯電されるため、複合体形成ではなく反発が起こる。にも係わらず、いくつかのＤＮＡはこれらのリポソームの水性内部内に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養物中の細胞単層に送達するよう使用されている。標的細胞内で外来遺伝子の発現が検出された（Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９〜２７４）。

リポソーム組成物の主要な一タイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。陰イオン性リポソーム組成物は一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方、陰イオン性膜融合リポソームは、主としてジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。他のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣ、及び卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。他のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。

数個の試験は、リポソーム薬物製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含むリポソームのモルモット皮膚への適用により、皮膚ヘルペス疼痛の低下がもたらされたが、他の手段（例えば、溶液として又はエマルションとして）を介したインターフェロンの送達は無効であった（Ｗｅｉｎｅｒｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。更に、更なる研究により、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの効力が、水性系を使用したインターフェロンの投与に対して試験され、リポソーム製剤は水性投与よりも優れていることが結論付けられた（ｄｕＰｌｅｓｓｉｓｅｔａｌ．，ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９〜２６５）。

非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系も試験されて、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性が決定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮に送達した。結果はそのような非イオン性リポソーム系が皮膚の異なる層中へのシクロスポリン−Ａの堆積を促進するのに有効であることを示した（Ｈｕｅｔａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。

リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、本明細書で使用されるこの用語は、１つ又は複数の特定化脂質を含むリポソームを指し、該特定化脂質は、リポソームに組み込まれた際、そのような特定化脂質を欠いたリポソームと比較して増強された循環寿命をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１などの１つ又は複数の糖脂質を含むもの、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ又は複数の親水性ポリマーにより誘導体化されているものである。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ−誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの低下に由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。

１つ又は複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野にて既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、リポソームの血中半減期を改善するモノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールの能力を報告している。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎｅｔａｌ．により詳説されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）。両方ともＡｌｌｅｎｅｔａｌ．に付与された米国特許第４，８３７，０２８号明細書及び国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧ_Ｍ１又は硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂｅｔａｌ．）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍｅｔａｌ．）に開示されている。

１つ又は複数の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多数のリポソーム、及びその調製方法は、当技術分野にて既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏｅｔａｌ．（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む、非イオン性洗剤、２Ｃ_{１２１５Ｇ}を含むリポソームを記載している。Ｉｌｌｕｍｅｔａｌ．（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリスチレン粒子を高分子グリコールで親水性被覆することにより、有意に増強された血液半減期がもたらされることに注目した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基を結合することによる合成リン脂質修飾は、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号明細書及び米国特許第４，５３４，８９９号明細書）により記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖｅｔａｌ．（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧ又はＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期を有意に増大させることを示す実験を記載している。Ｂｌｕｍｅｅｔａｌ．（ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、そのような観察事項を他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組み合わせから形成されたＤＳＰＥ−ＰＥＧに拡大適用した。それらの外側表面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒに付与された欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号明細書及び国際公開第９０／０４３８４号パンフレットに記載されている。１〜２０モルパーセントのＰＥＧによるＰＥ誘導体化を含むリポソーム組成物、及びその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅｅｔａｌ．（米国特許第５，０１３，５５６号明細書及び米国特許第５，３５６，６３３号明細書）及びＭａｒｔｉｎｅｔａｌ．（米国特許第５，２１３，８０４号明細書及び欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号明細書）により記載されている。多数の他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが国際公開第９１／０５５４５号パンフレット及び米国特許第５，２２５，２１２号明細書（両方ともＭａｒｔｉｎｅｔａｌ．に付与）及び国際公開第９４／２００７３号パンフレット（Ｚａｌｉｐｓｋｙｅｔａｌ．）に記載され、ＰＥＧ−修飾セラミド脂質を含むリポソームが国際公開第９６／１０３９１号パンフレット（Ｃｈｏｉｅｔａｌ）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号明細書（Ｍｉｙａｚａｋｉｅｔａｌ．）及び米国特許第５，５５６，９４８号明細書（Ｔａｇａｗａｅｔａｌ．）は、それらの表面上の官能基部分で更に誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記載している。

核酸を含む多数のリポソームが当技術分野にて既知である。Ｔｈｉｅｒｒｙｅｔａｌ．に付与された国際公開第９６／４００６２号パンフレットは、リポソーム中に高分子量核酸をカプセル化する方法を開示している。Ｔａｇａｗａｅｔａｌ．に付与された米国特許第５，２６４，２２１号明細書は、タンパク質−結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ることを主張している。Ｒａｈｍａｎｅｔａｌ．に付与された米国特許第５，６６５，７１０号明細書は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する所定の方法を記載している。Ｌｏｖｅｅｔａｌ．に付与された国際公開第９７／０４７８７号パンフレットは、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。

トランスファーソームは、リポソームの更なる別の一タイプであり、薬物送達ビヒクルの候補として魅力的な、高く変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、脂質小滴として記載されてもよく、この脂質小滴は、高く変形可能であるため、小滴よりも小さい孔内を容易に透過することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば自己最適性（皮膚内の孔の形状に適応する）であり、自己修復性であり、しばしば細分化することなくそれらの標的に到達し、また多くの場合、自己負荷性である。トランスファーソームを作製するためには、通常は界面活性剤である表面縁部活性化因子を標準的なリポソーム組成物に加えることが可能である。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するのに使用されている。トランスファーソーム媒介による血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。

界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソームなどの製剤に広い用途を見出している。天然及び合成の両方の多数の異なるタイプの界面活性剤を分類及び順位付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部」としても既知）の性質は、製剤中に使用される異なる界面活性剤を類別する最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。

界面活性剤分子がイオン化されていない場合、この界面活性剤は非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬及び美容製品に広い用途を見出し、広い範囲のｐＨ値に亘って使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル、及びエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミド、及び、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどのエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も人気のあるメンバーである。

界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に負電荷を保有する場合、この界面活性剤は陰イオン性に分類される。陰イオン性界面活性剤には、せっけんなどのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルスルフェート及びエトキシル化アルキルスルフェートなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、並びにホスフェートが挙げられる。陰イオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキルスルフェート及びせっけんである。

界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に正電荷を保有する場合、この界面活性剤は陽イオン性に分類される。陽イオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、最も使用されているこのクラスのメンバーである。

界面活性剤分子が正又は負電荷のいずれかを保有する能力を有する場合、この界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドが挙げられる。

薬物製品、製剤及びエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。

核酸脂質粒子
一実施形態において、本発明を特徴付けるＡＰＯＣ３ｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全に封入されて、例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸−脂質粒子を形成する。本明細書で使用される用語「ＳＮＡＬＰ」は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸−脂質粒子を指す。本明細書で使用される用語「ＳＰＬＰ」は、脂質ベシクル内に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、典型的には、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、及び粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含む。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に延長された循環寿命を有し、かつ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）に蓄積するため、全身適用に極めて有用である。ＳＰＬＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、ｐＳＰＬＰは、ＰＣＴ公開第国際公開第００／０３６８３号パンフレットに示されているように、封入された縮合剤−核酸複合体を含む。本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均粒径を有し、かつ実質的に無毒である。加えて、核酸は、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、水性溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸−脂質粒子、及びそれらの調製方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；及びＰＣＴ公開国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。

一実施形態において、脂質対薬物の比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡの比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、又は約６：１〜約９：１の範囲内であろう。いくつかの実施形態では、脂質対ｄｓＲＮＡの比は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、又は１１：１であってもよい。

一般に、脂質−核酸粒子は、投与用に緩衝液、例えばＰＢＳ中に懸濁される。一実施形態において、脂質処方ｄｓｉＲＮＡのｐＨは、６．８〜７．８、例えば７．３又は７．４である。浸透圧は、例えば２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えばおよそ３００、例えば２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４又は３０５であってもよい。

陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、又は３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）又はその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｃ１２−２００又はＴｅｃｈＧ１）、又はこれらの混合物であってもよい。陽イオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％からなり得る。

非陽イオン性脂質は、非限定的にジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ）エタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はこれらの混合物を含む陰イオン性脂質又は中性脂質であってもよい。非陽イオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、又は約５８ｍｏｌ％であってもよい。

粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、非限定的にＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であってもよい。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ_２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ_４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１_６）、又はＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ_１８）であってもよい。ＰＥＧコンジュゲートの他の例には、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシル（ｏｘｌ）プロピル−３−アミン）、ｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（ｍＰＥＧ−ジミリスチル（ｄｉｍｙｒｙｓｔｙｌ）グリセロール（平均分子量２，０００を有する）及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシル（ｏｘｌ）プロピル−３−アミン）が挙げられる。粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する全脂質の０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、又は約１．０、１．１．、１．２、．１３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９若しくは２ｍｏｌ％であってもよい。

いくつかの実施形態において、核酸−脂質粒子は更に、粒子中に存在する全脂質の例えば約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％又は約４８ｍｏｌ％のコレステロールを含む。

一実施形態において、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランは、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子の調製に使用することができる。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照により本明細書に組み込まれる、２００８年１０月２３日出願の米国特許仮出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載されている。

例えば、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含んでもよく、粒子サイズは、６３．０±２０ｎｍであり、０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質比である。

尚別の実施形態では、化合物１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（ＴｅｃｈＧ１）は、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子の調製に使用することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、５０：１０：３８．５：１．５のモル比のＴｅｃｈ−Ｇ１、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール及びｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧを含み、全脂質対ｓｉＲＮＡの比が７：１（ｗｔ：ｗｔ）の脂質製剤に処方されることができる。

一実施形態において、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＥＧ−セラミドＣ１６（ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ）は、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子（即ち、ＬＮＰ０１粒子）の調製に使用することができる。ＬＮＰ０１製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載されている。

追加の例示的な製剤は、表Ａに記載されている。

ＳＮＡＬＰ（１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年４月１５日出願の国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載されている。

ＸＴＣを含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１月２９日出願の米国特許仮出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日出願の米国特許仮出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日出願の米国特許仮出願第号明細書；２００９年７月２４日出願の米国特許仮出願第６１／２２８，３７３号明細書２００９年９月３日出願米国特許仮出願第６１／２３９，６８６号明細書、及び２０１０年１月２９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書に記載されている。

ＭＣ３を含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年９月２２日出願の米国特許仮出願第６１／２４４，８３４号明細書、２００９年６月１０日出願の米国特許仮出願第６１／１８５，８００号明細書、及び２０１０年６月１０日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／２８２２４号明細書に記載されている。

ＡＬＮＹ−１００を含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１１月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号明細書に記載されている。

Ｃ１２−２００を含む製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年５月５日出願の米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号明細書及び２０１０年５月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書に記載されている。

標準的な又は押し出しフリー（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ）方法のいずれかにより調製された製剤は、同様の方法で特徴付けることができる。例えば、製剤は典型的には視認検査により特徴付けられる。製剤は凝集体又は沈殿物を含まない白みがかった半透明溶液である筈である。脂質−ナノ粒子の粒子サイズ及び粒子サイズ分布は、例えば、ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を使用した光散乱により測定することができる。粒子は、そのサイズが約２０〜３００ｎｍ、例えば４０〜１００ｎｍである必要がある。粒子サイズ分布は、単峰形である必要がある。製剤中の総ｓｉＲＮＡ濃度、及び捕捉された割合は、色素排除アッセイを用いて概算される。処方されたｓｉＲＮＡのサンプルは、製剤崩壊界面活性剤、例えば０．５％トリトン−Ｘ１００の存在又は不在下、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合染料と共にインキュベートされてもよい。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、標準的な曲線に対する界面活性剤を含むサンプルからの信号により決定され得る。捕捉された割合は、総ｓｉＲＮＡ含有量から「遊離」ｓｉＲＮＡ含有量（界面活性剤の不在下で信号により測定した）を減算することにより決定される。捕捉されたｓｉＲＮＡのパーセントは、典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤の場合、粒子サイズは、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、及び少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、又は少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。

経口投与用の組成物及び製剤には、散剤又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、縣濁剤、又は水若しくは非水性媒体中の液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、薬袋、錠剤又は小型錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤は、所望される場合がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡが、１種又は複数種の透過促進剤界面活性剤及びキレート剤と共に投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸及び／若しくはエステル又はその塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはモノグリセリド、ジグリセリド、又はこれらの薬学的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明を特徴付けるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子、又はマイクロ若しくはナノ粒子を形成するために錯体化されたものを含む顆粒形態で経口的に送達されてもよい。ｄｓＲＮＡ錯体化剤には、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース及び澱粉が挙げられる。好適な錯体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノ（ｃｙｎａｏ）アクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤、及びそれらの製剤は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書及び米国特許第６，７４７，０１４号明細書に記載されている。

非経口、実質内（脳内へ）、くも膜下腔内、脳室内又は肝内投与用の組成物及び製剤には、無菌水性溶液を挙げることができ、該無菌水性溶液は、緩衝液、希釈剤、並びに、非限定的に浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容され得る担体又は賦形剤などの他の好適な添加剤も含み得る。

本発明の医薬組成物は、非限定的に、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、非限定的に予め形成された液剤、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体を含む多様な構成成分から生成されてもよい。肝癌腫などの肝疾患を処置する際、肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。

単位剤形にて都合よく存在し得る本発明の医薬製剤は、医薬産業にて周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体又は賦形剤と関連させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体又は微粉化固体担体又は両方と均一かつ親密に関連させた後、必要であれば、製品を成形することにより調製される。

本発明の組成物は、非限定的に錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬、及び浣腸などの多数の可能な剤形のいずれかに処方されてもよい。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液として処方されてもよい。水性縣濁液は、更に、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。縣濁液はまた、安定剤を含んでもよい。

エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製及び処方されてもよい。エマルションは、典型的には１つの液体が通常直径０．１μｍを超える小滴の形態で他の液体に分散された不均一系である（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５；ＢｌｏｃｋｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，ｉｎＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。エマルションは、多くの場合、互いに親密に混合され及び分散された２つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。代替的に、油相が微小液滴として塊の水性相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて追加の構成成分を含んでもよく、該構成成分は、水性相、油相中の溶液として、又はそれ自体が別個の相として存在してもよい。必要に応じてエマルション中に乳化剤、安定剤、染料、及び抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３つ以上の相からなる多エマルションであってもよい。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油小滴が小さい水小滴を囲い込むする多エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。

エマルションは、熱力学的安定性を殆ど又は全く有さないことにより特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散又は不連続相は、外部又は連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段、又は製剤の粘度を介してこの形態に維持される。エマルションの相のいずれかは、エマルション型軟膏ベース及びクリームの場合のように半固体又は固体であってもよい。エマルションを安定化させる他の手段には、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用が含まれる。乳化剤は、広くは４つのカテゴリーに分類され得る：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収ベース、及び微細に分散した固体（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。

表面活性剤としても既知の合成界面活性剤は、エマルションの調製に広い用途を見出しており、文献にて概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性及び疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤を類別し及び製剤の調製において界面活性剤を選択する際の価値のあるツールである。界面活性剤は、親水性基：非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両性の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２８５）。

エマルション製剤中に使用される、天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸収ベースは、無水ラノリン及び親水性ワセリンのように、水を取り入れてｗ／ｏエマルションを形成するが、尚それらの半固体稠度を維持する親水性特性を所有する。微粉化固体は、特に界面活性剤の組み合わせ中、及び粘稠な製剤中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤粘土、顔料、及び炭素などの非極性固体又はトリステアリン酸グリセリルが挙げられる。

非常に多様な非乳化材料もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。それらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。

親水性コロイド又は親水コロイドには、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グァーガム、カラヤガム、及びトラガカント）などの天然に存在するゴム及び合成ポリマー、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中に分散し又は水中で膨潤して、分散相の小滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することにより、また、外部相の粘度を増大させることにより、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。

エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多数の成分を含むため、これらの製剤は、多くの場合、保存剤を組み込んでいる。製剤に含まれる、通常使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も、通常、エマルション製剤に加えられて、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの遊離基スカベンジャー、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、並びにクエン酸、酒石酸及びレシチンなどの抗酸化剤共力剤であってもよい。

エマルション製剤の皮膚、経口、及び非経口経路を介した適用、並びにそれらの製造方法は、文献に概説されている（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。経口送達用のエマルション製剤は、調製の容易さと、吸収及びバイオアベイラビリティの観点からの効力とに起因して非常に広く使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．１９９）。鉱油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養製剤は、通常、ｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料のうちに入る。

本発明の一実施形態において、ｄｓＲＮＡ及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして処方される。マイクロエマルションは、単一の、光学的に等方性かつ熱力学的に安定な液体溶液である水、油及び両親媒性物質の系として定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散した後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間の鎖長のアルコールを加えて透明系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている２つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な、等方的に透明な分散物として記載されている（ＬｅｕｎｇａｎｄＳｈａｈ，ｉｎ：ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅｏｆＤｒｕｇｓ：ＰｏｌｙｍｅｒｓａｎｄＡｇｇｒｅｇａｔｅＳｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．１８５−２１５）。マイクロエマルションは通常、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤及び電解質を含む３〜５つの構成成分の組み合わせを用いて調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）タイプ又は水中油（ｏ／ｗ）タイプのいずれのものであるかは、使用される油及び界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｐａｃｋｉｎｇ）とに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。

相図を利用する現象的手法は広範に研究されており、当業者はマイクロエマルションを処方する方法の包括的な知識を得ている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．３３５）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成する熱力学的に安定な小滴の製剤中で水不溶性薬物を可溶化する利点を提供する。

マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤には、単独で又は補助界面活性剤との組み合わせで、非限定的に、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）デカグリセロール（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。通常、エタノール、１−プロパノール、及び１−ブタノールなどの短鎖アルコールである補助界面活性剤は、界面活性剤フィルム中に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成された空隙空間によって不規則フィルムを形成することにより、界面流動性を増大させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用することなく調製されることができ、アルコールフリー自己乳化型マイクロエマルション系は、当技術分野にて既知である。水性相は、典型的には、非限定的に水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体であってもよい。油相は、非限定的にＣａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、ＣａｐｍｕｌＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油などの材料を含んでもよい。

マイクロエマルションは、薬物可溶化及び薬物吸収向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティの向上に提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルションは、薬物可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤誘導による膜流動性及び透過性の変更に起因する薬物吸収の可能な向上、調製の容易さ、固体剤形を超える経口投与の容易さ、臨床的効能の改善、及び毒性の低下の利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓｅｔａｌ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３。多くの場合、マイクロエマルションは、マイクロエマルションの構成成分が周囲温度で一緒にされた際に自発的に形成され得る。このことは、易熱性薬物、ペプチド又はｄｓＲＮＡを処方する際に特に有利であり得る。マイクロエマルションはまた美容及び医薬用途の両方において活性構成成分の経費送達に有効である。本発明のマイクロエマルション組成物及び製剤が胃腸管からのｄｓＲＮＡ及び核酸の全身吸収の増大、並びにｄｓＲＮＡ及び核酸の局部細胞取り込みの改善を促進することが期待される。

本発明のマイクロエマルションはまた、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、及び透過促進剤などの追加の構成成分及び添加剤を含んで、製剤の特性を改善し、かつ本発明のｄｓＲＮＡ及び核酸の吸収を向上させてもよい。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリーの１つに属するものとして分類されてもよい−−界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート化非界面活性剤（Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々は、上記に論じられている。

浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、様々な浸透促進剤を使用して、核酸、特にｄｓＲＮＡの動物の皮膚への効率的な送達を達成する。殆どの薬物は、溶液中でイオン化及び非イオン化形態の両方にある。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性薬物のみが、細胞膜を容易に交差する。交差される細胞膜が透過促進剤で処理された場合、非親油性薬物さえも該膜を交差し得ることが発見されている。加えて、細胞膜を横切る非親油性薬物の分散を補助するために、浸透促進剤は親油性薬物の浸透性も向上させる。

浸透促進剤は、５つの広いカテゴリーの１つ、即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート化非界面活性剤の１つに属するものとして分類され得る（Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。上述したクラスの透過促進剤の各々は、下記により詳細に記載される。

界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（又は「表面−活性剤」）は、水性溶液中に溶解された際、溶液の表面張力又は水性溶液と他の液体との間の界面張力を低下させ、その結果、粘膜を通したｄｓＲＮＡの吸収を向上させる、化学的実体である。胆汁酸塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；並びにＦＣ−４３などのペルフルオロケミカルエマルション。Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。

脂肪酸：浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸及びそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロペンタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ_１〜１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、並びにそれらのモノ−及びジ−グリセリド（即ち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレートなど）（Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；ＥｌＨａｒｉｒｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）が挙げられる。

胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割は、脂質及び脂肪可溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を含む（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ３８ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈＥｄ．，Ｈａｒｄｍａｎｅｔａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。様々な天然胆汁酸塩、及びそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。それ故、用語「胆汁酸塩」には、天然に存在する胆汁の任意の構成成分、及びそれらの任意の合成誘導体が含まれる。好適な胆汁酸塩には、例えば、コール酸（又はその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ３９Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐｐ．７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。

キレート化剤：発明に関連して使用されるキレート化剤は、金属イオンと錯体を形成して、溶液から該金属イオンを除去し、その結果、粘膜を通したｄｓＲＮＡの吸収を向上させる化合物として定義することができる。本発明でのそれらの浸透促進剤としての使用に関連して、キレート化剤は、ＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、それ故、キレート化剤により阻害されることによって最も高く特徴付けられるように、ＤＮａｓｅ阻害剤としての役割も果たす利点を加えている（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート化剤には、非限定的にエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩及びホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。

非キレート化非界面活性剤：本明細書で使用される非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化剤又は界面活性剤としての僅かな活性を示すが、それにも係わらず、消化粘膜を通したｄｓＲＮＡの吸収を向上させる化合物として定義され得る（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；並びにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド系抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。

担体
本発明の所定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込んでいる。本明細書で使用される「担体化合物」又は「担体」は、不活性（即ち、生物学的活性ｐｅｒｓｅを所有しない）であり得るが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解し、又は循環からの核酸の除去を促進することによる、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボでのプロセスによって、核酸であると認識される核酸又はその類似体を指すことができる。核酸及び担体化合物の共投与、典型的には過剰な後者の物質による共投与により、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓又は他の循環外リザーバ（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中で回収される核酸の量が実質的に低下し得る。例えば、肝組織内での部分的ホスホロチオエートの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸塩、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃａｃｉｄ）又は４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与された際、低下され得る（Ｍｉｙａｏｅｔａｌ．，ＤｓＲＮＡＲｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａｅｔａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。

賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、動物に１つ又は複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体又は固体であってもよく、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸及び医薬組成物の他の所定の構成成分と組み合わされた際に、所望の嵩、稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、非限定的に、結合剤（例えば、α化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、乳糖及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；錠剤崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。

核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤も本発明の組成物の処方に使用され得る。薬学的に許容され得る好適な担体には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

核酸の局所投与用の製剤には、アルコールなどの通常の溶媒中の無菌及び非無菌水性溶液、非水性溶液、又は液体若しくは固体油ベース中の核酸溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤も含み得る。核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤を使用し得る。

薬学的に許容され得る好適な賦形剤には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

他の構成成分
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬剤などの更なる、適合可能な、医薬的に活性な材料を含有してもよく、又は、染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有してもよい。しかしながら、それらの材料は、加えられた際、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望の場合、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料及び／又は芳香性物質などと混合される。

水性縣濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。縣濁液は、安定剤も含み得る。

いくつかの実施形態において、本発明を特徴付ける医薬組成物は、（ａ）１つ又は複数のｄｓＲＮＡ化合物、及び（ｂ）非ＲＮＡｉ機構により機能する１つ又は複数の抗−サイトカイン生物製剤を含有してもよい。そのような生物製剤の例には、ＩＬ１β（例えば、アナキンラ）、ＩＬ６（トシリズマブ）、又はＴＮＦ（エタネルセプト、インフリキシマブ、アドリムマブ（ａｄｌｉｍｕｍａｂ）、又はセルトリズマブ）を標的とする生物製剤が挙げられる。

このような化合物の毒性及び治療的効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための標準的な医薬手順により、細胞培養物又は実験動物内で決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現することができる。高い治療指数を有する化合物が好ましい。

細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを使用して、ヒトで使用するための一連の投与量を処方することができる。本発明を特徴付ける組成物の投与量は、一般に、毒性が殆ど又は全くない、ＥＤ５０を含む一連の循環濃度内に存在する。投与量は、使用される剤形と利用される投与経路とに応じて、この範囲内で変動し得る。本発明を特徴付ける方法に使用される任意の化合物において、治療的有効用量は、当初、細胞培養アッセイにより概算され得る。用量は、細胞培養物中で測定して、ＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、又は、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。

上記に述べたそれらの投与に加えて、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡは、ＡＰＯＣ３発現により媒介される病理過程の処置に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの場合でも、投与する医師は、観察された結果に基づいて、当技術分野にて既知の又は本明細書に記載される標準的な効力の尺度を使用して、ｄｓＲＮＡの量及び投与時間を調整することができる。

ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための方法
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ、及び／又は本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を使用して、細胞内でのＡＰＯＣ３発現を低減及び／又は阻害する方法も提供する。本方法は、細胞を本発明のｄｓＲＮＡと接触させることと、細胞を十分な時間維持してＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得ることによって、細胞内でのＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害することと、を含む。遺伝子発現の低下は、当技術分野にて既知の任意の方法により評価することができる。例えば、ＡＰＯＣ３の発現の低下は、当業者に日常的な方法、例えばノーザンブロッティング、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＡＰＯＣ３のｍＲＮＡ発現レベルを決定することにより、ウェスタンブロッティング、免疫学的技術などの当業者に日常的な方法を用いてＡＰＯＣ３のタンパク質レベルを決定することにより、並びに／又は、トリグリセリドレベルに関連した１つ又は複数の分子、例えばリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）及び／若しくは肝性リパーゼに影響を与えることなどの、ＡＰＯＣ３の生物学的活性を測定することにより、又はインビ環境内でトリグリセリドレベル自体を測定することにより決定することができる。

本発明の方法では、細胞はインビトロで又はインビボで接触されてもよく、即ち細胞は対象内にあってもよい。

本発明の方法を用いた処置に好適な細胞は、ＡＰＯＣ３遺伝子を発現する任意の細胞であり得る。本発明の方法での使用に好適な細胞は、哺乳動物細胞、例えば霊長類細胞（ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞、例えば猿細胞又はチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（雌牛細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、又は水牛細胞など）、鳥細胞（例えば、アヒル細胞又はガチョウ細胞）、又はクジラ細胞であり得る。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。

ＡＰＯＣ３発現は、細胞内で少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は約１００％阻害される。

本発明のインビボ方法は、ｄｓＲＮＡを含有する組成物を対象に投与することを含んでもよく、ｄｓＲＮＡは、処置されるべき哺乳動物のＡＰＯＣ３遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。処置されるべき生物がヒトなどの哺乳動物の場合、組成物は、非限定的に経口、腹腔内、又は、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内及びくも膜下腔内）、静脈内、筋内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、直腸、及び局所（頬内及び舌下を含む）投与を含む非経口経路を含む、当技術分野にて既知の任意の手段により投与することができる。所定の実施形態では、組成物は、静脈内注入若しくは注射又は皮下注射により投与される。

いくつかの実施形態において、投与は、デポー注射による。デポー注射は、長時間に亘ってｄｓＲＮＡを一貫して放出することができる。それ故、デポー注射は、所望の効果、例えばＡＰＯＣ３の所望の阻害、又は治療的若しくは予防的効果を得るのに必要な投与の頻度を低減し得る。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供することができる。デポー注射は、皮下注射又は筋内注射を含み得る。好ましい実施形態では、デポー注射は、皮下注射である。

いくつかの実施形態において、投与はポンプによる。ポンプは、外部ポンプ又は手術により埋め込まれたポンプであってもよい。所定の実施形態では、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈内、又は硬膜外注入用に使用することができる。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、ｄｓＲＮＡを肝臓に送達する、手術により埋め込まれたポンプである。

投与モードは、局部又は全身処置のいずれが所望されるかに基づいて、また処置されるべき範囲に基づいて選択され得る。投与の経路及び部位は、ターゲティングを向上させるように選択され得る。

一態様において、本発明は、哺乳動物内でＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本方法は、哺乳動物の細胞内のＡＰＯＣ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含有する組成物を哺乳動物に投与することと、哺乳動物を十分な時間維持してＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得ることによって、細胞内でのＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害することと、を含む。遺伝子発現の低下は、当技術分野にて既知の任意の方法により、及び本明細書に記載する方法、例えばｑＲＴ−ＰＣＲにより評価することができる。タンパク質産生の低下は、当技術分野にて既知の任意の方法により、及び本明細書に記載する方法、例えばＥＬＩＳＡにより評価することができる。一実施形態において、穿刺肝生検サンプルは、ＡＰＯＣ３遺伝子及び／又はタンパク質発現の低下を監視するための組織材料としての役割を果たす。別の実施形態では、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の阻害は、例えば、ＡＰＯＣ３経路における遺伝子の発現及び／又は活性を測定することにより間接的に監視される。例えば、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）又は肝性リパーゼの活性を監視して、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現の阻害を決定することができる。サンプル、例えば血液又は肝臓サンプル中のトリグリセリドレベルも測定し得る。ＡＰＯＣ３阻害の阻害はまた、高いトリグリセリドレベルの臨床症状に対する効果、例えば早期慢性心疾患（ｐｒｅｍａｔｕｒｅｃｈｒｏｎｉｃｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＨＤ）、発疹性黄色腫、肝脾腫、及び膵炎に対する効果を観察することによって監視され得る。好適なアッセイは、更に下記の実施例部分に記載される。

本発明は更に、それを必要とする対象の処置方法を提供する。本発明の処置方法は、本発明のｄｓＲＮＡを対象、例えばＡＰＯＣ３発現の低減及び／又は阻害から利益を受けるであろう対象に、治療的有効量の、ＡＰＯＣ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ、又は、ＡＰＯＣ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物を投与することを含む。

本発明のｄｓＲＮＡは、「裸」形態で、又は「遊離ｄｓＲＮＡ」として投与されてもよい。裸ｄｓＲＮＡは、医薬組成物の不在下で投与される。裸ｄｓＲＮＡは、好適な緩衝溶液中にあってもよい。緩衝溶液には、酢酸、クエン酸、プロラミン、炭酸、若しくはリン酸、又はこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。一実施形態において、緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ｄｓＲＮＡを含む緩衝溶液のｐＨ及びモル浸透圧濃度は、対象への投与に好適であるように調整され得る。更なる緩衝液は、下記に記載される。

代替的に、本発明のｄｓＲＮＡは、例えばｄｓＲＮＡリポソーム製剤として、医薬組成物として投与されてもよい。更なるリポソーム製剤は、本明細書に記載されている。

ＡＰＯＣ３遺伝子発現の低減及び／又は阻害から利益を受けるであろう対象は、高いトリグリセリドレベル、例えばＴＧ＞１５０ｍｇ／ｄＬを有するもの、又は重篤な高トリグリセリド血症、例えばＴＧ＞５００ｍｇ／ｄＬを有するものである。一実施形態において、対象は、機能獲得型の突然変異を伴うＡＰＯＣ３遺伝子変異体を有する。別の実施形態では、患者は、混合型ＨＴＧ（タイプＶ）低下ＬＰＬ活性、及び／又は家族性ＨＴＧ（ＩＶ）不活性化ＬＰＬ突然変異、及び／又は家族性複合型のＡｐｏＢ−１００レベルの増大を有する。別の実施形態では、対象は、急性膵炎を伴う非管理の高トリグリセリド血症を有し、又は対象は治療中のＨＩＶ患者であり、又は対象は高脂肪食（食後高トリグリセリド血症）、若しくはメタボリック症候群、若しくは化合物処置（レチノイド療法）、若しくはインスリン抵抗性を有する。ＡＰＯＣ３遺伝子発現の低減及び／又は阻害から利益を受けるであろう対象の処置は、治療的及び予防的処置を含む。

本発明は更に、他の医薬及び／又は他の治療的方法、例えば、例えば高いトリグリセリドレベルの処置に現在使用されているものなどの既知の医薬及び／又は既知の治療的方法と組み合わせた、例えば、ＡＰＯＣ３発現の低減及び／又は阻害から利益を受けるであろう対象、例えば高いトリグリセリドレベルを有する対象の処置のためのｄｓＲＮＡ又はその医薬組成物の使用方法を提供する。例えば、所定の実施形態では、ＡＰＯＣ３を標的とするｄｓＲＮＡは、高いトリグリセリドレベルの処置に有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＡＰＯＣ３発現の低減から利益を得るであろう対象、例えば高いトリグリセリドレベルを有する対象の処置に好適な更なる治療及び治療的方法には、ライフスタイル及び食事の変更、処方等級の魚油、フィブラート、ナイアシン、ＡｐｏＣ３アンチセンス、ＣＥＴＰ阻害剤、胆汁酸捕捉剤、ニコチン酸、ＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害剤、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、コレステロール吸収阻害剤、ネオマイシン、ω３脂肪酸などが挙げられる。ｄｓＲＮＡ並びに更なる治療薬及び／又は処置は、同時に及び／若しくは同じ組み合わせ中で、例えば非経口的に投与されてもよく、又は更なる治療薬は、別個の組成物の一部として、若しくは別々の時間に、及び／若しくは当技術分野にて既知の若しくは本明細書に記載する他の方法で投与されてもよい。

一実施形態において、本方法は、標的ＡＰＯＣ３遺伝子の発現が約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８若しくは２４時間、又は２８、３２若しくは３６時間の間低下されるように、本明細書を特徴付ける組成物を投与することを含む。一実施形態において、標的ＡＰＯＣ３遺伝子の発現は、長い継続時間、例えば少なくとも約２日間、３日間、４日間、又はそれより長く、例えば約１週間、２週間、３週間、４週間、又はそれより長い間低下される。

本発明の方法によるｄｓＲＮＡの投与は、高いトリグリセリドレベルを有する患者において、そのような疾病又は疾患の重篤さ、徴候、症状、及び／又はマーカーの低下をもたらし得る。この文脈にて「低下」は、それらのレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は約１００％であってもよい。

処置の効力又は疾病の予防は、例えば疾病の進行、疾病の寛解、症状の重篤さ、生活の質、処置効果を持続させるのに必要な薬物の用量、疾病マーカーのレベル、又は、処置されている若しくは予防にターゲティングされる所定の疾病に適切な、測定可能な任意の他のパラメータを測定することにより評価することができる。それらのパラメータの任意の１つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することにより処置又は予防の効力を監視することは、当業者の技能の範疇にある。例えば、高いトリグリセリドレベルの処置の効力は、例えば、血清トリグリセリドレベルの定期的測定により評価することができる。後の読み取り値を初期の読み取り値と比較することにより、医師は処置が有効であるか否かの指示を提供される。そのようなパラメータの任意の１つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することにより、処置又は予防の効力を監視することは、当業者の能力の範疇にある。ＡＰＯＣ３を標的とするｄｓＲＮＡ又はその医薬組成物の投与に関連して、高いトリグリセリドレベルに「対して有効」とは、臨床的に適切な方法での投与が、少なくとも患者の統計的に有意な割合にて、症状の改善、治癒、疾病の低減、延命、生活の質の改善、又は一般に、高いトリグリセリドレベル及び関連した原因に精通した医者によって正として認識される他の効果などの有益な効果をもたらすことを示す。

処置又は予防の効果は、疾病状態の１つ又は複数のパラメータの統計的に有意な改善が存在した場合、又は悪化若しくはさもなくば予想されていた症状が発生しないことにより明らかである。一例として、疾病の測定可能なパラメータの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれを上回る好ましい変化は、有効な処置を示し得る。ｄｓＲＮＡ薬物、又はその薬物の所定の製剤に関する効力も、当技術分野にて既知のように、所定の疾病に関して実験動物モデルを使用して判断することができる。実験動物モデルを使用する際、処置の効力は、マーカー又は症状において統計的に有意な低下が観察された場合に証明される。

代替的に、効力は、一例を挙げればＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア（時折、Ｃｈｉｌｄ−Ｔｕｒｃｏｔｔｅ−Ｐｕｇｈスコア）などの、臨床的に許容される疾病の重篤さの評価尺度に基づいて診断の当業者により決定された疾病の重篤さの低減により測定することができる。適切な尺度を使用して測定された、例えば疾病の重篤さの減少をもたらす任意の正の変化は、本明細書に記載したｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ製剤を使用した十分な処置を表す。

対象に、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡ又は約５０ｍｇ／ｋｇｄｓＲＮＡなどの治療量のｄｓＲＮＡを投与してもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。

所定の実施形態では、例えば、本発明の組成物が本明細書に記載したｄｓＲＮＡと脂質とを含有する場合、対象に約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｄｓＲＮＡを投与してもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。

例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。

別の実施形態では、例えば本発明の組成物が本明細書に記載したｄｓＲＮＡとＮ−アセチルガラクトサミンとを含有する場合、対象に、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量などの治療量のｄｓＲＮＡを投与してもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。

例えば、対象に、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｄｓＲＮＡを投与してもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。

ｄｓＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は約２５分間など、ある時間に亘る静脈内注入により投与されてもよい。投与は、例えば、定期的に、例えば隔週（即ち、２週間毎）で１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間又はそれより長い間、繰り返されてもよい。初期処置計画の後、処置はより少ない頻度で投与されてもよい。例えば、隔週で３ヶ月の投与後、投与は１ヶ月に１回で６ヶ月間、又は１年間、又はそれより長い間繰り返されてもよい。ｄｓＲＮＡの投与は、例えば細胞、組織、血液、尿又は患者の他の区画内のＡＰＯＣ３レベルを、少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は少なくとも約９９％、又はそれを上回って低下させ得る。

ｄｓＲＮＡの完全用量を投与する前に、より少ない用量を患者に投与し（例えば５％注入反応）、アレルギー反応などの有害効果を監視してもよい。別の例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α又はＩＮＦ−α）レベルの増大などの望まれない免疫賦活効果に関して患者を観察してもよい。

ＡＰＯＣ３発現に対する阻害効果により、本発明による組成物又は該組成物から調製した医薬組成物は、生活の質を向上させることができる。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により通常に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載したものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡ及び方法の実践又は試験に使用できるが、好適な方法及び材料は下記に記載されている。本明細書に言及した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。

実施例１ｄｓＲＮＡ合成
試薬供給源
本明細書に試薬供給源が特に与えられていない場合、それらの試薬は、分子生物学における任意の供給業者から、分子生物学での用途の品質／純度基準で得ることができる。

ｓｉＲＮＡ合成
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＡｐｐｌｅｒａＤｅｕｔｓｃｈｌａｎｄＧｍｂＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び固相担体として多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ，５００Å，ＰｒｏｌｉｇｏＢｉｏｃｈｅｍｉｅＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した固相合成により、一本鎖ＲＮＡを、１μｍモルのスケールで生成した。ＲＮＡと、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むＲＮＡとを、各々、対応するホスホロアミダイト及び２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイトを使用して、固相合成により生成した（ＰｒｏｌｉｇｏＢｉｏｃｈｅｍｉｅＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。これらの基本単位を、Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔａｌ．（Ｅｄｒｓ．），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような標準的なヌクレオシドホスホロアミダイト化学を用いてオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に組み込んだ。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液をアセトニトリル中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（ＣｈｒｕａｃｈｅｍＬｔｄ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）の溶液（１％）で置き換えることにより導入した。更なる補助試薬は、ＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔＢａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。

確立された手順に従って、陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護及び精製を行った。収率及び濃度は、分光光度計（ＤＵ６４０Ｂ，ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、波長２６０ｎｍにおける各ＲＮＡ溶液のＵＶ吸収により決定した。アニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）中で相補的な鎖の等モル溶液を混合し、水浴内にて８５〜９０℃で３分間加熱し、３〜４時間に亘って室温で冷却することにより二重鎖ＲＮＡを生成した。アニールしたＲＮＡ溶液を、使用まで−２０℃で保管した。

標準的な命名法、詳細には表Ｂの略語を使用して、核酸配列を下記に表す。

実施例２：ＡＰＯＣ３ｓｉＲＮＡ設計
転写産物
ｓｉＲＮＡ設計を行って、ＮＣＢＩ遺伝子データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）に注釈が付けられている全てのヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；以下「ｃｙｎｏ」）ＡＰＯＣ３転写産物を標的とするｓｉＲＮＡを同定した。設計は、ＮＣＢＩからの下記の転写産物を使用した：ヒト−ＮＭ＿００００４０．１；ｃｙｎｏ−Ｘ６８３５９．１。リストされているヒト及びｃｙｎｏ転写産物と１００％同一性を共有する全ｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した。

ｓｉＲＮＡ設計、特異性及び効力の予測
ｓｉＲＮＡを、予測される特異性、予測される効力、及びＧＣ含有量に基づいて選択した。

全ての可能な１９ｍｅｒｓの予測される特異性を、各配列から予測した。次いで、７ヌクレオチドよりも長い反復を欠いた候補１９ｍｅｒｓを選択した。これらの１７１候補ｓｉＲＮＡを、ヒトトランスクリプトーム（ヒトＮＣＢＩＲｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿及びＸＭ＿レコードのセットとして定義される）に対する包括的検索に使用した。

ｓｉＲＮＡと任意の潜在的な「オフ標的」転写産物との間のミスマッチの位置及び数に基づいてスコアを計算し、各オリゴの３つの異なるシード（分子の５’末端から２〜９位）由来の六量体由来の七量体及び八量体の頻度を比較した。計算したスコアに従って、両方のｓｉＲＮＡ鎖を特異性のカテゴリーに割り当てた：３を超えるスコアは高く特異的、３と等しいスコアは特異的、２．２〜２．８のスコアはやや特異的として認定した。本発明者らは、アンチセンス鎖の特異性により選別した。次いで、本発明者らは、そのアンチセンスオリゴが７０％未満の総ＧＣ含有量を有し、第一の位置にてＧＣを欠き、マウスＡＰＯＣ３転写産物ＮＭ＿０２３１１４．３と一致しなかった二本鎖を選択した。

ｓｉＲＮＡ配列選択
合計で２７のセンス及び２７のアンチセンスに由来するｓｉＲＮＡオリゴを合成し、二本鎖に形成した。

実施例３ＡＰＯＣ３ｓｉＲＮＡ合成
修飾及び非修飾ＡｐｏＣ３配列の合成
ＡＰＯＣ３タイル配列を１又は０．２ｕｍｏｌスケールのいずれかにてＭｅｒＭａｄｅ１９２合成機上で合成した。

非修飾、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ化学修飾のいずれかを用いて一本鎖及び二本鎖を作製した。合成条件は、一本鎖内の化学的修飾の性質に基づいて、適切に変更された。

合成、切断及び脱保護：
ＡＰＯＣ３配列（非修飾、２−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ）の合成は、ホスホロアミダイト化学を使用した固相担体オリゴヌクレオチド合成を用いた。

上記の配列の合成は、９６ウェルプレート内にて１又は０．２ｕｍスケールで行った。非修飾及び修飾（２−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ）アミダイト溶液を０．１Ｍ濃度で調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性化因子として使用した。

合成した配列を切断し、９６ウェルプレート内で脱保護した。第一のステップで水性アンモニア又は水性メチルアミンのいずれかを使用し、第二のステップでフッ化物試薬を使用した。アセトン：エタノール（８０：２０）ミックスを使用して粗配列を沈殿させ、ペレットを０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中で再懸濁して、粗の一本鎖をそれらのナトリウム塩に変換した。各配列からのサンプルをＬＣ−ＭＳにより分析して、同一性を確認し、ＵＶにより定量化し、ＩＥＸクロマトグラフィーにより純度を決定した。

精製及び脱塩：
ＡＰＯＣ３タイル配列を沈殿させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを使用してＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒシステム上で精製した。このプロセスは、周囲温度で行った。サンプル注入及び収集は、９６ウェル（深さ１．８ｍＬのウェル）プレート内で行った。完全長配列に対応する単一ピークを、溶離液中に収集した。脱塩ＡＰＯＣ３配列の濃度（Ａ２６０でのＵＶ測定により）及び純度（イオン交換ＨＰＬＣにより）を分析した。次いで、相補的な一本鎖を１：１の化学量論比で組み合わせてｓｉＲＮＡ二本鎖を形成した。

表１及び２は、非修飾配列及び修飾配列の第一の組を提供する。

実施例４ＡＰＯＣ３ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
細胞培養物及びトランスフェクション：
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を５％ＣＯ_２の雰囲気下、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン及びグルタミン（ＡＴＣＣ）で補充したＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中、３７℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によりプレートから解放した。ウェル当たり１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０を、９６ウェルプレート内に、ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによりトランスフェクションを行い、室温で１５分間インキュベートした。次いで、抗生物質を有さない、〜２×１０^４Ｈｅｐ３Ｂ細胞を含む８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡ精製に先だって細胞を２４又は１２０時間のいずれかでインキュベートした。１０ｎＭ及び０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で単一用量実験を行い、１０、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、０．００００１ｎＭの最終二本鎖濃度で用量応答実験を行った。

ＤＹＮＡＢＥＡＤＳｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ＃：６１０−１２）を使用した総ＲＮＡ単離：
細胞を回収し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液中に溶解した後、エッペンドルフサーモミキサーを使用して、８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、プロセス全体において同一であった）。１０マイクロリットルの磁気粒及び８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、１分間混合した。磁気スタンドを使用して磁気粒を捕捉し、粒を乱すことなく上清を除去した。上清の除去後、溶解した細胞を残りの粒に加え、５分間混合した。上清の除去後、磁気粒を１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。粒を再度捕捉し、上清を除去した。次いで、粒を１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に粒を１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。粒を２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を加え、７０℃で５分間混合した。粒を磁石上で５分間捕捉した。４０μｌの上清を除去し、他の９６ウェルプレートに加えた。

ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ＃４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成：
反応当たり２μｌの１０Ｘ緩衝液、０．８μｌの２５ＸｄＮＴＰｓ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮＡｅ阻害剤及び３．２μｌのＨ２Ｏからなるマスターミックスを、１０μｌの総ＲＮＡに加えた。Ｂｉｏ−ＲａｄＣ−１０００又はＳ−１０００サーモサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、以下のステップを介してｃＤＮＡを生成した：２５℃ １０分間、３７℃ １２０分間、８５℃ ５秒間、４℃保持。

リアルタイムＰＣＲ：
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェル５０プレート（Ｒｏｃｈｅｃａｔ＃０４８８７３０１００１）内にて、ウェル当たり０．５μｌのＧＡＰＤＨＴａｑＭａｎプローブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＣａｔ＃４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのＡｐｏＣ３ＴａｑＭａｎプローブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓｃａｔ＃Ｈｓ００１６３６４４＿ｍ１）及び５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０プローブマスターミックス（ＲｏｃｈｅＣａｔ＃０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに加えた。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いて、ＡＢＩ７９００ＨＴＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内でリアルタイムＰＣＲを行った。概略表内に特に記さない限り、各二本鎖を２つの独立トランスフェクションにて試験し、各トランスフェクションを二回アッセイした。

相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞、又は疑似トランスフェクト細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。ＸＬＦｉｔを用いて４パラメータ適合モデルを使用してＩＣ５０を計算し、ＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞、又は天然の細胞に対して、同じ用量範囲に亘って正規化し、又はそれ自体の最低用量に対して正規化した。

生存率スクリーニング
ＨｅＬａ及びＨｅｐ３Ｂ細胞における細胞生存率を、１００、１０、１、０．１、０．０１及び０．０００１ｎＭのｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションから３、５日後に測定した。細胞を９６ウェルプレート内でウェル当たり１０，０００細胞の密度で播種した。各ｓｉＲＮＡを３回アッセイし、データを平均した。ＰＬＫ１及びＡＤ−１９２００を標的とするｓｉＲＮＡを生存率の損失に関する正の対照として、ＡＤ−１９５５を負の対照として含めた。ＰＬＫ１及びＡＤ−１９２００は、生存率の用量依存性損失をもたらす。生存率を測定するために、３、５、日後に９６ウェルプレートの各ウェルに２０ｕｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＢｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、プレートを分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）内にて５６０Ｅｘ／５９０Ｅｍで読み取った。生存率を３回の反復トランスフェクションからの光単位の平均値＋／−標準偏差として表した。場合により、相対的な生存率は、最初に３回の反復トランスフェクションを平均した後、最低用量（０．００１ｎＭ）から得られた値に対して正規化することにより評価した。

結果を表３、４及び５に提供する。

実施例５：マウスにおけるＡＰＯＣ３のインビボ試験
ＡＰＯＣ３を標的とするｓｉＲＮＡを、野生型（５．０ｍｇ／ｋｇ）及び遺伝子導入高脂血症モデルＳＲＥＢＰｔｇ／ＬＤＬＲ−／−ＫＯマウス（１．０ｍｇ／ｋｇ）の両方のマウスに投与した。投与から２日後にマウスを犠牲にし、肝標的ｍＲＮＡ、血清トリグリセリド、及び血清総コレステロールレベルを測定した。ＭＣ３を含むＬＮｐ１１製剤を使用した。

野生型マウスに関する結果を図１に示す。ＡＰＯＣ３を標的とするｓｉＲＮＡの投与は、野生型マウスにおいて、ｍＲＮＡレベルのノックダウン、トリグリセリドの５０％低下、及び総コレステロールの低下をもたらした。ＡＰＯＣ３を標的とするｓｉＲＮＡの投与は、高脂血症モデルマウスにおいてトリグリセリドの８０％低下をもたらした。データは示されていない。この結果は、ＡＰＯＣ３が冠動脈心疾患（ＣＡＤ）及び膵炎を含む高トリグリセリド血症のｓｉＲＮＡベースの処置の確認された標的であることを示す。

実施例６：ＡＰＯＣ３を標的とする修飾ｓｉＲＮＡの合成及びスクリーニング（第二の組）
追加の修飾ＡＰＯＣ３ｓｉＲＮＡを、上述した方法を用いて、表６及び表７に記載したように合成した。ＵＭｄＴｄｓｄＴ修飾パターンは、ｄＴ−ホスホロチオエート−ｄＴを各鎖に付加することである。ＤＥＣＡＦ修飾パターンは、以下の通りである：センス鎖−全ピリミジン上に２’Ｏ−メチル、ｄＴｓｄＴ／ｄＴｄＴオーバーハング；アンチセンス鎖−シード領域（２〜９位）内のジヌクレオチドモチーフＵＵ／ＵＡ／ＵＧ内の任意の２つの部位における「Ｕ」を修飾＋最終３ヌクレオチド（１７〜１９位）上に２’Ｏ−メチル＋１０〜１６位の全部の「Ｕ」上に２’Ｏ−メチル；ｄＴｓｄＴ／ｄＴｄＴオーバーハング。ＦＯＭＥ修飾パターンは、以下の通りである：センス鎖−２’Ｆ（５’第一の塩基）次いで２’ＯＭｅと交互、アンチセンス鎖−２’ＯＭｅ（５’第一の塩基）、次いで２’Ｆと交互。

表６及び表７に記載したｓｉＲＮＡを、上述したようにＨｅｐ３ｂ細胞においてアッセイした。結果を表８に示す。

実施例７：ＡＰＯＣ３を標的とする修飾ｓｉＲＮＡの合成及びスクリーニング（第三の組）
追加の修飾ＡＰＯＣ３ｓｉＲＮＡを、上述した方法を用いて、表９及び表１０に記載したように合成した。ｓｉＲＮＡを、上述したようにＨｅｐ３ｂ細胞においてアッセイした。結果を表１１に示す。

配列番号１
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００００４０．１、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）、ｍＲＮＡ

Claims

ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、各々３０ヌクレオチド長以下のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表１、２、６、７又は１０内のアンチセンス配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための二重鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、ヌクレオチド配列配列番号７０からなるセンス鎖と、ヌクレオチド配列配列番号１５１からなるアンチセンス鎖とを含む、二重鎖リボ核酸（ＡＤ−４５１４９．１ＵＭ）。
前記センス鎖配列が、表１、２、６、７又は１０から選択され、前記アンチセンス鎖が、表１、２、６、７又は１０から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
前記ｄｓＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
前記修飾ヌクレオチドが：２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
前記修飾ヌクレオチドが：２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、及びヌクレオチドを含む非天然塩基からなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
少なくとも１つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
各鎖が、２ヌクレオチドに３’オーバーハングを含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
更にリガンドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされている、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ。
更に少なくとも１つのＮ−アセチル−ガラクトサミンを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするベクター。
請求項１３に記載のベクターを含む細胞。
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含有する、ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
脂質製剤を含有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
ＭＣ３を含む脂質製剤を含有する、請求項１５に記載の医薬組成物。
細胞内でのＡＰＯＣ３発現の阻害方法であって：
（ａ）前記細胞を請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡと接触させることと；
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された前記細胞を十分な時間維持して、ＡＰＯＣ３遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得ることによって、前記細胞内での前記ＡＰＯＣ３遺伝子の発現を阻害することと、を含む、方法。
前記ＡＰＯＣ３発現が少なくとも３０％阻害される、請求項１８に記載の方法。
ＡＰＯＣ３発現により媒介される疾患の処置方法であって、そのような処置を必要とするヒトに、治療的有効量の請求項１、２、若しくは１１のいずれか一項に記載のＡＰＯＣ３ｄｓＲＮＡ、又は請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
前記疾患が高いトリグリセリドレベルである、請求項２０に記載の方法。
前記疾患がトリグリセリドレベル＞１５０ｍｇ／ｄＬ又は＞５００ｍｇ／ｄＬである、請求項２０に記載の方法。
投与がリポタンパク質リパーゼ及び／又は肝性リパーゼ活性の増大をもたらす、請求項２０に記載の方法。
前記ｄｓＲＮＡ又は前記医薬組成物が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量にて投与される、請求項２０に記載の方法。