CN116234582A - GalNAc和皂苷的缀合物、包含所述缀合物和GalNAc-寡核苷酸缀合物的治疗性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与ASGPR的配体共价连接的皂苷，该配体包含至少一个GalNAc。本发明还涉及一种药物组合，该药物组合包含第一药物组合物和第二药物组合物，该第一药物组合物包含本发明的皂苷缀合物，该第二药物组合物包含效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和用于与细胞表面分子结合的结合分子的第三缀合物。另外，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的皂苷缀合物和该第二缀合物或该第三缀合物。此外，本发明涉及本发明的药物组合或药物组合物，其用作药物。本发明还涉及本发明的药物组合或药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因的疾病或健康问题中使用：apoB、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT和LDH，并且用于在治疗或预防以下中使用：癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR淀粉样变性、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、或自身免疫性疾病。最后，本发明涉及一种体外或离体方法，该方法用于将本发明的第二缀合物或第三缀合物从细胞外转移到所述细胞内。

Description

GalNAc和皂苷的缀合物、包含所述缀合物和GalNAc-寡核苷酸 缀合物的治疗性组合物
技术领域
本发明涉及一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与ASGPR的配体共价连接的皂苷，该配体包含至少一个GalNAc。本发明还涉及一种药物组合，该药物组合包含第一药物组合物和第二药物组合物，该第一药物组合物包含本发明的皂苷缀合物，该第二药物组合物包含效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和用于与细胞表面分子结合的结合分子的第三缀合物。另外，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的皂苷缀合物和该第二缀合物或该第三缀合物。此外，本发明涉及本发明的药物组合或药物组合物，其用作药物。本发明还涉及本发明的药物组合或药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因的疾病或健康问题中使用：apoB、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT和LDH，并且用于在治疗或预防以下中使用：癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR淀粉样变性、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、或自身免疫性疾病。最后，本发明涉及一种体外或离体方法，该方法用于将本发明的第二缀合物或第三缀合物从细胞外转移到所述细胞内。
背景技术
无论是在人中还是在病原体中，抑制蛋白质功能的能力都是新药发现不可或缺的一部分。传统的小分子药物以及抗体都强烈受限于可用靶标的子集。小分子主要与辅因子位点或递质位点结合，这些位点是设计用于容纳小分子的有效位点。抗体可以结合多种蛋白质，但通常限于细胞外靶标。
寡核苷酸疗法是相对年轻且快速发展的领域，其旨在通过直接操纵基因转录和翻译途径来克服小分子药物或抗体药物遇到的许多问题。寡核苷酸的效力和多功能性、特别是阻抑编码经典小分子药物“不可用药的”蛋白质的基因的前景，使其成为有吸引力的药物候选物。第一批寡核苷酸药物基于反义技术，由此，单链核酸分子将与其互补的mRNA靶标以序列特异性方式结合，从而触发核糖核酸酶H系统对双链体的降解。
1998年，Andrew Fire和Craig Mello发表了一篇开创性的论文，该论文将双链RNA(dsRNA)鉴定为秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)转录后基因沉默(PTGS)(他们将该现象称为RNA干扰(RNAi))的诱因。RNAi的发现解释了在植物和真菌中令人困惑的基因沉默观察结果，并引发了生物学的一场革命，最终表明非编码RNA是多细胞生物中基因表达的中心调节物。此后不久，发现了小的dsRNA(典型地15-30bp)可以在哺乳动物细胞中催化诱导RNAi沉默，而不会引发非特异性干扰素应答。通过小的dsRNA(如小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA))靶向RNAi途径与反义相比具有几个理论优势，其明显更高效(催化)并且对基因表达产生更长时间的抑制。这可以转化为更低的剂量和更低的成本以及更低频率的给药。较低的暴露也可以意味着较少的siRNA毒性问题。
然而，在siRNA到达其体内靶标之前，其面临着许多阻碍其通往RNA诱导沉默复合物(RISC)机器的途径的重大障碍。siRNA进入血流后，由于其小尺寸和高度阴离子特性，其容易被内源性核酸酶降解并被肾排泄。另外，在到达其靶细胞之前，siRNA必须穿过血管的紧密内皮连接，并通过细胞外基质扩散。由于siRNA具有大量的负电荷，其不容易与细胞膜结合或穿过细胞膜，并且一旦在细胞内，其必须从内体中逃逸以与其细胞内蛋白靶标相互作用。
因此，寡核苷酸(如siRNA)疗法的成功强烈依赖于将药物从细胞外有效地递送到胞质溶胶中。因此，许多注意力集中在开发改善寡核苷酸(如siRNA)递送的递送系统上。除了病毒递送外，用于增强siRNA(或其他寡核苷酸)向细胞递送的主要方法采用脂质体、细胞穿透肽(CPP)及它们的模拟物、或纳米颗粒(Gooding,Matt,等人.Chemical biology&drugdesign[化学生物学和药物设计]80.6(2012):787-809)。安全性问题(如插入诱变和免疫发生的可能性)被认为限制了病毒方法的未来。
脂质体是寡核苷酸(如siRNA)最常用的递送载体，其中将寡核苷酸包封在脂质双层内。脂质体寡核苷酸递送遇到了几个问题，如氧自由基介导的毒性(对于阳离子脂质体是典型的)、细胞毒性、对基因调节的影响和炎症应答。此外，使用脂质的体内递送似乎主要靶向肝脏和脾脏。
细胞穿透肽(CCP)也称为蛋白质转导结构域，是具有能够穿过细胞膜的特殊性质的短肽(长度通常<30个氨基酸残基)。通过与寡核苷酸共价连接或者通过与寡核苷酸形成非共价复合物，CPP可以增强寡核苷酸的细胞摄取。CPP介导的寡核苷酸递送领域极其复杂，因为它在单个药物中结合了寡核苷酸技术和肽技术两者(这两个领域还远未成熟)所带来的挑战。除了寡核苷酸相关的问题外，CPP遇到的典型挑战与肽链的体内稳定性(缺乏)相关，通常需要使用非天然肽衍生物，这些非天然肽衍生物合成复杂并且/或者表现出降低的细胞穿透活性。
尽管细胞递送增强，但克服内体的包埋是设计高效CPP和其他转运系统的主要挑战之一(Gooding等人)。
纳米颗粒和纳米载体是纳米级的寡核苷酸递送系统，典型地由聚合物、生物稳定剂以及与寡核苷酸复合的细胞靶向配体组成。已知一种示例性siRNA纳米载体系统的名称为siRNA动态聚缀合物。该系统基于与作为生物稳定剂的聚乙二醇(PEG)和肝细胞靶向配体连接的两亲性聚合物，其中siRNA通过二硫键与聚合物共价结合。靶向部分和PEG部分经由马来酰胺连接附接到聚合物上，形成带负电荷的纳米颗粒，不与血清蛋白结合。通过胞吞作用内化后，马来酰胺键在内体酸化时容易水解，暴露出聚合物的阳离子胺基团，并经由质子海绵作用诱导内体逃逸。还已知纳米载体为阳离子聚合物形式，如聚乙烯亚胺(PEI)(有时与环糊精组合)，其可与寡核苷酸(如siRNA)形成静电复合物，提供防止降解的保护并帮助内化。然而，膜破坏和细胞凋亡诱导导致的高浓度毒性可能限制阳离子聚合物作为治疗性递送剂的应用。除了纳米颗粒和纳米载体的复杂制备之外，它们的长期稳定性是商业上可行使用的主要障碍。
可以通过靶向载脂蛋白(ApoB)使用基因沉默疗法来减少导致心血管疾病的脂蛋白(如LDL、残粒脂蛋白和Lp(a))，该载脂蛋白在这些脂蛋白的产生或去除中具有重要作用。已经应用了基于反义寡核苷酸的方法和基于短干扰RNA的方法。临床研究已通过靶向apoB基因评估了这样的基因沉默疗法的功效。降低脂质的反义寡核苷酸和siRNA疗法的不良反应包括注射部位反应、流感样症状和血小板计数低。新一代的这些药物使用GalNAc缀合物更有效地将药物递送至肝细胞，从而降低药物在血浆中的水平，可能会解决不良反应。尽管这些递送系统中的一些可以实现改善的向细胞的寡核苷酸(如siRNA)递送，但是内体逃逸仍然是基于寡核苷酸的治疗剂(如基于RNAi的治疗剂)的应用的主要障碍。只有极小部分胞吞寡核苷酸逃逸到细胞质空间，其在细胞质空间中可以发挥其预期的功能，而绝大多数胞吞寡核苷酸仍然被困在胞吞区室中并且是无活性的。最近的文献表明被动siRNA逃逸率为<0.01％(Setten,Ryan L.等人.Nature Reviews Drug Discovery[自然评论药物发现]18.6(2019):421-446)。此外，已经证明细胞将寡核苷酸功能性地内化以产生靶作用(例如，敲低)的能力似乎不依赖于细胞内化大量寡核苷酸的程度。这些观察导致了分离的“生产性”和“非生产性”自由摄取途径的假设，尽管区分这些途径的分子机制仍不清楚(Setten,RyanL.,John J.Rossi和Si-ping Han.Nature Reviews Drug Discovery[自然评论药物发现]18.6(2019):421-446)。
总之，仍然迫切需要改善的寡核苷酸递送系统，其产生增加的效力(例如，靶标敲低)、更小的毒性和/或更小的脱靶效应，无论潜在的机制为何(改善的内体逃逸、增加的“生产性”途径摄取、或另一机制)。
一种新兴的策略需要使反义寡核苷酸(ASO)与受体配体缀合以增加寡核苷酸的效力和对选择的组织的分布。例如，三触角型N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)与寡核苷酸治疗剂的缀合在分离的肝细胞以及体内肝脏中产生的效力增加了10-30倍。在受损的糖蛋白上发现了GalNAc，这些糖蛋白从其悬垂的寡糖中失去了末端唾液酸残基。肝脏通过在肝细胞表面上以非常高的水平(105-106/细胞的数量级)表达三聚脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)将这些蛋白质从体循环中清除。ASGPR在中性pH下与GalNAc特异性结合，用于从血液中将循环大分子胞吞，并在酸性pH(约5-6)下释放GalNAc，用于早期内体中的负荷物卸载。然后将游离的ASGPR回收到细胞表面以供再次使用。目前临床试验中大约三分之一的RNAi药物是与靶向ASGPR的多价GalNAc配体缀合的单分子、化学修饰的RNAi触发物。合适的肝脏生理学、ASGPR的独特特性、GalNAc配体的无毒性质以及GalNAc-siRNA缀合物的简便性使其成为全身性RNAi递送至肝细胞的一种有吸引力的方法。
然而，仍然需要改善的递送系统，这些递送系统进一步增加ASGPR靶向的寡核苷酸系统(例如GalNAc-寡核苷酸缀合物)的效力、降低其毒性并且/或者降低其脱靶效应。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体共价连接的至少一个皂苷，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
本发明的第二方面涉及一种药物组合，该药物组合包含：
-第一药物组合物，该第一药物组合物包含本发明的皂苷缀合物并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂；以及
-第二药物组合物，该第二药物组合物包含效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
本发明的第三方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含：
-本发明的皂苷缀合物；
-效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
本发明的第四方面涉及本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其用作药物。
本发明的第五方面涉及本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：apoB、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT和LDH。
本发明的第六方面涉及一种体外或离体方法，该方法用于将本发明的第二缀合物或第三缀合物从细胞外转移到所述细胞内，优选地随后将本发明的第二缀合物或第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面上表达ASGPR并且当将该第三缀合物转移到该细胞中时该细胞表达细胞表面分子，其中该第三缀合物包含用于与所述细胞表面分子结合的结合分子，该细胞优选地选自肝细胞、病毒感染细胞和肿瘤细胞；
b)提供如本发明任一项所述的第二缀合物或第三缀合物用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供本发明的皂苷缀合物；
d)使步骤a)的细胞与步骤b)的第二缀合物或第三缀合物以及步骤c)的皂苷缀合物在体外或离体接触，从而实现将该第二缀合物或该第三缀合物从该细胞外转移到所述细胞中，并且优选地从而随后实现将该第二缀合物或该第三缀合物转移到所述细胞的胞质溶胶中，或者优选地从而随后实现将至少该第二缀合物或该第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中。
定义
术语“GalNAc”具有其常规科学含义并且此处是指N-乙酰半乳糖胺及其IUPAC名称：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-半乳糖。
术语“(GalNAc)3Tris”在例如基于siRNA的疗法领域中具有其常规的科学含义，并且此处是指包含三个GalNAc单元的部分，每个GalNAc单位分别与三(羟甲基)氨基甲烷(tris)(IUPAC名称：2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)的羟基基团优选地经由至少一个接头共价结合。(GalNAc)3Tris可以作为包含游离胺的分子存在，或者可以经由剩余的胺结合位点进一步官能化，例如形成本文所述的包含(GalNAc)3Tris部分的缀合物。
术语“寡核苷酸”具有其常规的科学含义并且此处是指两个或更多个核苷酸的串，即寡核苷酸是由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的短寡聚体。实例是RNA和DNA以及任何修饰的RNA或DNA，如包含核苷酸类似物的核酸串，如桥接核酸(BNA)，也称为锁核酸(LNA)或2'-O,4'-C-氨基乙烯或2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥接核酸(BNANC)，其中该核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
术语“RNAi介导的基因靶向”具有其常规的科学含义并且此处是指通过将靶向参与基因转录的mRNA的寡核苷酸(如小双链RNA分子)转移到细胞中来影响所述细胞中的基因发挥功能的体内、离体或体外方法：例如，小双链RNA分子能够高效地触发特定基因的RNAi沉默。
术语“桥接核酸”(或简称“BNA”)或“锁核酸”(或简称“LNA”)有其常规的科学含义并且此处是指修饰的RNA核苷酸。BNA也称为“受约束的RNA分子”或“不可接近的RNA分子”。BNA单体可以含有五元、六元或甚至七元桥接结构，具有“固定的”C3'-内糖褶皱。该桥是在核糖的2',4'-位置处经合成掺入，以提供2',4'-BNA单体。可以使用本领域已知的标准亚磷酰胺化学将BNA单体掺入到寡核苷酸聚合物结构中。BNA是具有增加的结合亲和力和稳定性的结构上刚性的寡核苷酸。
术语反义寡核苷酸具有其常规的科学含义并且在说明书中可以简称为“AON”或“ASO”。
术语“基于BNA的反义寡核苷酸”或简称“BNA-AON”具有其常规的科学含义并且此处是指反义核苷酸的串，其中至少一个所述核苷酸是BNA。
术语“朊”具有其常规的科学含义并且此处是指蛋白质样的分子，意指该分子在一定程度上具有蛋白质的物理化学性质特征、是蛋白质的、与蛋白质相关、含有蛋白质、属于蛋白质、由蛋白质组成、类似蛋白质、或是蛋白质。如在例如“朊分子”中所用，术语“朊”是指存在该分子的至少一部分，其类似于或是蛋白质，其中“蛋白质”应理解为包括长度为至少两个残基的氨基酸残基链，因此包括肽、多肽和蛋白质以及蛋白质或蛋白质结构域的组装。在朊分子中，至少两个氨基酸残基例如经由一个或多个酰胺键(如一个或多个肽键)连接。在朊分子中，氨基酸残基是天然氨基酸残基和/或人工氨基酸残基，如修饰的天然氨基酸残基。在优选的实施例中，朊分子是包含至少两个氨基酸残基(优选地两个至约2.000个氨基酸残基)的分子。在一个实施例中，朊分子是包含2至20个(对于肽是典型的)氨基酸的分子。在一个实施例中，朊分子是包含21至1.000个(对于以下是典型的：多肽、蛋白质、蛋白质结构域，如抗体、Fab、scFv、受体的配体，如EGF)氨基酸的分子。优选地，氨基酸残基(典型地)经由一个或多个肽键连接。根据本发明，所述氨基酸残基是(修饰的)(非)天然氨基酸残基或包含(修饰的)(非)天然氨基酸残基。
当涉及作为例如共价缀合物的一部分的效应分子时，术语“效应分子”或“效应子部分”具有其常规的科学含义并且此处是指可以与例如以下靶分子中的任一个或多个选择性结合并调节这样的一个或多个靶分子的生物活性的分子：蛋白质、肽、碳水化合物、糖类(如聚糖)、(磷)脂、核酸(如DNA、RNA)、酶。效应分子是例如选自以下中的任一个或多个的分子：小分子如药物分子、毒素如蛋白质毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质、或其任何组合。因此，例如，效应分子或效应子部分是选自以下中的任一个或多个的分子或部分：小分子如药物分子、毒素如蛋白质毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质、或其任何组合，该分子或部分可以与以下靶分子中的任一个或多个选择性结合：蛋白质、肽、碳水化合物、糖类(如聚糖)、(磷)脂、核酸(如DNA、RNA)、酶，并在与该靶分子结合后调节这样的一个或多个靶分子的生物活性。典型地，效应分子可以在细胞(如哺乳动物细胞，如人细胞)内、如在所述细胞的胞质溶胶中发挥生物学作用。因此，典型的效应分子是药物分子、质粒DNA、毒素(如由抗体-药物缀合物(ADC)所包含的毒素)、寡核苷酸(如siRNA、BNA)、由抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)包含的核酸。例如，效应分子是可以充当能够增加或减少(细胞内)酶活性、基因表达或细胞信号传导的配体的分子。
术语“健康问题”具有其常规的科学含义并且此处是指当与健康受试者的身体或其部分的状况相比时，受试者(如人患者)的身体、或其部分、器官、肌肉、静脉、动脉、皮肤、肢体、血液、细胞等的任何状况，从而妨碍该受试者的恰当的功能和/或健康，例如削弱人体的正常功能。
术语“GalNAc装饰的寡核苷酸药物”具有其常规的科学含义并且此处是指用于干扰基因转录的寡核苷酸，其中一个或多个GalNAc单元例如经由至少一个接头与寡核苷酸偶联。
术语“锁核酸”(简称“LNA”)具有其常规的科学含义并且此处是指含有一个或多个核苷酸构建块的寡核苷酸，其中另外的亚甲基桥以C3'-内构象(β-D-LNA)或C2'-内(α-L-LNA)构象固定核糖部分，如本领域已知的。
术语“桥接核酸NC”(简称“BNANC”)具有其常规的科学含义并且此处是指含有一个或多个核苷酸构建块的寡核苷酸，其中包含另外的2'-O,4'-C-氨基乙烯桥接核酸，在N原子处具有不同的取代(其中甲基基团是迄今最常用的)，如本领域已知的。
术语“化学修饰的、代谢稳定的siRNA”具有其常规的科学含义并且此处是指与由天然存在的核苷酸组成的RNA寡核苷酸相比包含化学修饰的siRNA分子，该化学修饰使得修饰的siRNA分子对代谢降解、消化、酶促裂解等更有抗性，即更稳定。
术语“皂苷”具有其常规的科学含义并且此处是指一组两亲性糖苷，这些两亲性糖苷包含一个或多个与亲脂性苷元核心(其为皂苷元)组合的亲水性糖基部分。皂苷可以是天然存在的或合成的(即，非天然存在的)。术语“皂苷”包括天然存在的皂苷、天然存在的皂苷的衍生物以及通过化学和/或生物技术合成途径从头合成的皂苷。
术语“皂苷衍生物”(也称为“修饰的皂苷”)具有其常规的科学含义并且此处是指与天然存在的皂苷对应的已通过一种或多种化学修饰衍生化的化合物，这些化学修饰如官能团的氧化、官能团的还原和/或与另一分子形成共价键。优选的修饰包括苷元核心的醛基的衍生化；糖链的羧基基团的衍生化或糖链的乙酰氧基基团的衍生化。典型地，皂苷衍生物不具有天然对应物，即皂苷衍生物不是由例如植物或树木天然产生的。术语“皂苷衍生物”包括通过天然存在的皂苷的衍生化获得的衍生物，以及通过化学和/或生物技术合成途径从头合成的衍生物，该合成产生与天然存在的皂苷对应的已通过一种或多种化学修饰衍生化的化合物。
术语“苷元核心结构”具有其常规的科学含义并且此处是指皂苷的苷元核心，其不具有与其结合的一个或两个碳水化合物天线或糖链(聚糖)。例如，皂皮酸是SO1861、QS-7、QS-21的苷元糖苷核心结构。
术语“糖链”具有其常规的科学含义并且此处是指以下中的任一种：聚糖、碳水化合物天线、单个糖部分(单糖)或包含多个糖部分的链(寡糖、多糖)。糖链可以仅由糖部分组成，或者还可以包含另外的部分，如以下中的任一种：4E-甲氧基肉桂酸、4Z-甲氧基肉桂酸、和5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸，例如像存在于QS-21中。
在糖链名称的上下文中，术语“Api/Xyl-”或“Api-或Xyl-”具有其常规的科学含义并且此处是指包含芹菜糖(Api)部分或包含木糖(Xyl)部分的糖链。
术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”具有其常规的科学含义并且此处是指抗体(如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个Vh结构域等)与任何分子的任何缀合物，当与受试者(如人患者)的细胞接触时，该分子可发挥治疗性作用，该分子如活性药物成分、毒素、寡核苷酸、酶、小分子药物化合物等。
术语“抗体-寡核苷酸缀合物”或“AOC”具有其常规的科学含义并且此处是指抗体(如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个Vh结构域等)与任何寡核苷酸分子的任何缀合物，当与受试者(如人患者)的细胞接触时，该寡核苷酸分子可发挥治疗性作用，该寡核苷酸分子如选自涵盖DNA、修饰的DNA、RNA、修饰的RNA、合成的核酸的天然或合成核酸串的寡核苷酸，其呈现为单链分子或双链分子，如BNA、等位基因特异性寡核苷酸、短或小干扰RNA(siRNA；沉默RNA)、反义DNA、反义RNA等。
术语“缀合物”具有其常规的科学含义并且此处是指与至少第二分子共价结合的至少第一分子，从而形成包含第一分子和第二分子或由第一分子和第二分子组成的共价偶联的组装。典型的缀合物是tris(GalNAc)3-siRNA、ADC、AOC和SO1861-EMCH(EMCH与皂苷的苷元糖苷核心结构的醛基连接)。
术语“部分”具有其常规的科学含义并且此处是指与另外的分子、接头、分子的组装等结合、连接、缀合，并从而形成较大的分子、缀合物、分子组装的一部分的分子。典型地，部分是与第二分子共价结合的第一分子，涉及最初存在于第一分子和第二分子上的一个或多个化学基团。例如，皂草毒蛋白是典型的效应分子。作为抗体-药物缀合物的一部分，皂草毒蛋白是ADC中的典型效应子部分。作为抗体-寡核苷酸缀合物的一部分，BNA或siRNA是AOC中的典型效应子部分。
如在如包含接头的抗体-皂苷缀合物或构建体中所用，术语“S”表示在内体和在胞质溶胶中保持完整的“稳定接头”。
如在如包含接头的抗体-皂苷缀合物或构建体中所用，术语“L”表示在内体中的微酸条件下切割的“不稳定接头”。
术语“部分”具有其常规的科学含义并且此处是指与另外的分子、接头、分子的组装等结合、连接、缀合，并从而形成较大的分子、缀合物、分子组装的一部分的分子。典型地，部分是与第二分子共价结合的第一分子，涉及最初存在于第一分子上和存在于第二分子上的一个或多个化学基团。例如，皂草毒蛋白是典型的分子，并且是效应分子的实例。作为抗体-药物缀合物的一部分，皂草毒蛋白是ADC中的典型效应子部分。作为抗体-寡核苷酸缀合物的一部分，BNA或siRNA是AOC中的典型效应子部分。
术语“DAR”通常代表药物抗体比率，并且是指给定的抗体药物缀合物(ADC)的制剂的平均药物和抗体比率，并且此处是指结合的SO1861部分或SPT001的量相对于缀合物分子的比率。
说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分例如相似要素、组合物、组合物中的成分、或分开的方法步骤，而不一定用于描述顺序或时间次序。除非另外说明，否则术语在适当的情况下是可互换的，并且本发明的实施例可以以本文所描述或展示的顺序外的其他顺序操作。
除非另外说明，否则本文所述的本发明的实施例可以组合和协同操作。
此外，尽管被称为“优选的”或“例如(e.g.或for example)”或“特别地”等，但各个实施例应被解释为可以实施本发明的示例性方式，而不是限制本发明的范围。
权利要求书中使用的术语“包含/包括(comprising)”不应被解释为限于例如其后列出的要素或方法步骤或组合物的成分；它不排除其他要素或方法步骤或某一组合物中的成分。它应被解释为明确说明存在提及的所述特征、整数、(方法)步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或组分、或其组的存在或添加。因此，“包含步骤A和B的方法”的表达的范围不应限于仅由步骤A和B组成的方法，而是相对于本发明，仅列举出该方法的步骤是A和B，并且权利要求应进一步解释为包括那些方法步骤的等同物。因此，“包含组分A和B的组合物”的表达的范围不应限于仅由组分A和B组成的组合物，而是相对于本发明，仅列举出该组合物的组分是A和B，并且权利要求应进一步解释为包括那些组分的等同物。
另外，不定冠词“一个/一种(a或an)”对要素或组分的提及不排除存在多于一个/种要素或组分的可能性，除非上下文明确要求存在一个/种并仅一个/种要素或组分。因此，不定冠词“一个/一种”通常意指“至少一个/一种”。
附图说明
图1：三价GalNAc的合成。
图2：SO1861-DBCO的合成。
图3：单价GalNAc-SO1861的合成。
图4：三价GalNAc-SO1861的合成。
图5：单价GalNAc-BNA的合成。
图6：三价GalNAc-BNA的合成。
图7：三价GalNAc-BNA的合成。
图8A和8B：三价GalNAc的合成。
图9A和9B：GalNAc-SO1861和三价GalNAc-SO1861对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的一般毒性(MTS)。图9B旁边显示的图例也适用于图9A。
图10A和10B：细胞杀伤测定(MTS)HepG2(A)和Huh7(B)细胞系。图10B旁边显示的图例也适用于图10A。
图11A和11B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。
图12A和12B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。图12B旁边显示的图例也适用于图12A。
图13A和13B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的细胞活力测定。图13B旁边显示的图例也适用于图13A。
图14A和14B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。图14B旁边显示的图例也适用于图14A。
图15A和15B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的细胞活力测定。图15B旁边显示的图例也适用于图15A。
图16A和16B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。图16B旁边显示的图例也适用于图16A。
图17A和17B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。图17B旁边显示的图例也适用于图17A。
图18：小鼠原代肝细胞中的ApoB RNA表达分析。
图19：C57BL/6J小鼠的肝组织中的ApoB RNA表达分析。
图20：C57BL/6J小鼠中的血清ApoB蛋白分析。注意，未报告1mg/kg ApoB编号02和0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号03+5mg/kg(GalNAc)3-SO861组在336小时时的分析值。
图21：C57BL/6J小鼠血清LDL-胆固醇(LDL-C)分析。
图22：C57BL/6J小鼠血清ALT分析。
图23：对原代人肝细胞的细胞活力测定(CTG)
图24：对原代人肝细胞的ApoB RNA表达分析及细胞活力测定
图25：(GalNAc)3-Ls-SO1861合成，中间体22、23。
图26：(GalNAc)3-Ls-SO1861合成，中间体24。
图27：(GalNAc)3-Ls-BNA合成，中间体25、26。
图28：(GalNAc)3-Ls-BNA合成。
图29A：使细胞与以下接触后原代人肝细胞的相对细胞活力(与设为100％的未处理的细胞“Untr”相比)：一系列浓度的与SO1861缀合的三价GalNAc((GN)3-SPT)、与皂草毒蛋白缀合的10pM单克隆抗体抗CD71(CD71-SPRN)和一系列浓度的具有与苷元醛基结合的EMCH的SO1861(SPT-EMCH)的组合、10pM CD71-SPRN和一系列浓度的(GN)3-SPT的组合、以及10pM CD71-SPRN和一系列浓度的与枝状物缀合的、具有共价结合到其上的四个SO1861部分(对于结合的SO1861，DAR＝4)的(GN)3的组合((GN)3-dSPT4)。
图29B：使细胞与以下接触后原代人肝细胞的相对ApoB基因表达(与设为100％的未处理的细胞“Untr”相比)：一系列浓度的与用于使ApoB mRNA和ApoB蛋白表达沉默的反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc((GalNAc)3-ApoB)、与SO1861缀合的300nM三价GalNAc((GalNAc)3-SPT001)和一系列浓度的(GalNAc)3-ApoB的组合。“Untr”是未处理的细胞，ApoB表达设为100％。
图30A和30B：使细胞与以下接触后原代人肝细胞(A)和肝细胞细胞系Huh7细胞(B)的细胞活力(两者均与设为100％的未处理的细胞“Untr”相比)：一系列浓度的与SO1861缀合的三价GalNAc(三价GalNAc-SPT001)、与皂草毒蛋白缀合的10pM单克隆抗体抗CD71(CD71-皂草毒蛋白)和一系列浓度的共价缀合物三价GalNAc-SPT001的组合。
图30C：共价三价GalNAc-SPT001缀合物(对于SO1861，DAR＝1)的草图。草图中的“S”是SPT001、SO1861。
图30D：抗CD71抗体-皂草毒蛋白缀合物(OKT-9)的草图，其中“T”是与抗体重链共价连接的毒素皂草毒蛋白。
图31A和31B：使细胞与以下接触后原代人肝细胞(A)和肝细胞细胞系Huh7细胞(B)的相对ApoB基因表达：一系列浓度的与用于使ApoB mRNA和ApoB蛋白表达沉默的反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc(三价GalNAc-ApoBBNA)、与SO1861缀合的300nM三价GalNAc(三价GalNAc-SPT001)(对于结合的SPT001(SO1861)，DAR＝1)和一系列浓度的三价GalNAc-ApoBBNA的组合。
图31C：共价三价GalNAc-ApoBBNA缀合物的草图。草图中的“A”是反义寡核苷酸ApoB(ApoBBNA)。
图32A和32B：在使细胞与以下接触的影响下，原代人肝细胞(A)和肝细胞细胞系Huh7细胞(B)的绝对ApoB蛋白表达：一系列浓度的三价GalNAc-ApoBBNA、300nM三价GalNAc-SPT001和一系列浓度的三价GalNAc-ApoBBNA的组合。
图33A：枝状物(SPT001)4-NH2(来自分子13和14的分子15)的合成。
图33B：枝状物(SPT001)4-叠氮化物(来自分子15和18的分子19)的合成。
图33C：枝状物(SPT001)4-三价GalNAc(来自分子19和23的分子24)的合成。
具体实施方式
本发明将相对于特定的实施例来描述，但本发明并不受限于此而只受权利要求书的限制。
本发明的第一方面涉及一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体共价连接的至少一个皂苷，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
三萜苷型的皂苷具有刺激效应分子从靶细胞外递送至所述细胞内，并随后递送到所述细胞的胞质溶胶中的能力。皂苷促进例如受体介导的某些效应分子(如ADC中包含的蛋白质毒素)的摄取。作为ADC的一部分的毒素的胞吞作用在靶细胞的内体和/或溶酶体中递送毒素。不希望受任何理论的束缚，三萜皂苷刺激或介导ADC或至少毒素随后从内体或溶酶体外释放并进入细胞的胞质溶胶内。当以太低的毒素剂量使靶细胞与毒素接触而不能发挥细胞内作用时，毒素(如ADC的一部分)和游离皂苷的共同施用使得靶细胞与ADC和皂苷两者接触，这在不存在皂苷下与细胞接触时无效的相同毒素剂量下可导致高效的毒素介导的靶细胞杀伤。因此，在皂苷的影响下，毒素的治疗窗得到改善。高效且充分的靶细胞杀伤所需的毒素剂量仍然可能伴随不期望的脱靶效应，例如当ADC靶向的肿瘤细胞受体不是真正的肿瘤细胞特异性受体时，尽管在例如健康细胞的表面处、患者身体的其他地方、或在存在于靶细胞所在的相同器官中的细胞上，其也以一定的较低程度表达。此外，达到足够程度的毒素激活(在靶细胞胞质溶胶中的毒素递送)所需的游离皂苷的所需剂量可能处于这样的水平，即皂苷介导的副作用的风险是明显的。当考虑待用毒素治疗的靶(肿瘤)细胞时，由于皂苷是全身性地且非靶向地施用的，将向需要毒素治疗的患者施用相对高的皂苷剂量以达到靶细胞水平的局部皂苷剂量。
诸位发明人现在惊奇地发现，当向皂苷提供靶细胞靶向部分如受体配体(例如EGF或细胞因子)、抗体、或其结合片段或结构域时，增强毒素对肿瘤细胞的作用所需的皂苷剂量可降低约100至1000倍。对于肿瘤细胞，目前已知一系列细胞表面受体在这样的异常细胞的表面上特异性表达。诸位发明人成功地使皂苷与用于与肿瘤细胞特异性受体结合的抗体和配体(如抗CD71抗体OKT-9、曲妥珠单抗、西妥昔单抗等)偶联。这样的靶向的皂苷缀合物确实能够在靶细胞内刺激例如毒素的细胞毒性作用，尽管与未提供肿瘤细胞靶向结合分子的游离形式的相同皂苷所需的剂量相比，皂苷剂量低100至1000倍。本发明的诸位发明人进一步发明了(靶向的)皂苷的靶细胞特异性递送和随后的胞吞作用对于非异常细胞或与例如癌症(肿瘤细胞)、自身免疫性疾病、病毒感染细胞等不相关的异常细胞也是可能的。也就是说，诸位发明人惊奇地发现，ASGPR为具有该受体的细胞(如肝细胞)提供了合适的入口，以供提供有ASGPR(特别是ASGPR1)的配体的皂苷进入。成功地将已知配体(如单价GalNAc和三价GalNAc)与一个或多个(2、4、8个等)皂苷分子偶联，这提供了包含ASGPR配体并包含至少一个皂苷部分的皂苷缀合物。
使表达ASGPR的细胞(如肝细胞)与包含ASGPR的配体的皂苷缀合物接触令人惊讶地导致皂苷的摄取，如当用以下共靶向这样的细胞时明显的：例如包含基因沉默核酸和用于靶细胞表面分子(例如CD71、ASGPR)的结合分子的缀合物(导致靶细胞中皂苷依赖性基因沉默)，或包含这样的用于靶细胞的结合分子和毒素的缀合物(导致皂苷依赖性细胞毒性)。提供具有ASGPR的配体的皂苷导致靶细胞中由共同施用的效应分子(如靶向的寡核苷酸或毒素(例如，与核酸或与毒素偶联的抗CD71抗体或ASGPR配体))发挥的作用。当使靶细胞仅与效应分子接触时，在不存在靶向的皂苷下，如果有的话，这样的作用的明显程度要低得多。因此，当考虑在其表面包含ASGPR的靶细胞并且使这样的靶细胞与本发明的皂苷-ASGPR配体和(靶向的)效应分子两者接触时，本发明的皂苷缀合物改善了效应分子的治疗功效。由此，效应分子的治疗窗得到改善：在共同施用皂苷缀合物的影响下，在相同剂量下具有更高的治疗性作用；或在共同施用皂苷缀合物的影响下，在更低剂量下产生类似的治疗性作用。诸位发明人还发现，当与皂苷未提供有ASGPR的配体时为达到类似作用所需的皂苷剂量相比时，为了在靶ASGPR表达细胞(如肝细胞)中达到一定水平的治疗性作用，需要的皂苷缀合物的剂量低约100倍至1000倍，该治疗性作用由共同施用的(靶向的)效应分子(如ASO、siRNA、BNA、毒素如蛋白质毒素)诱导。
因此，令人惊讶的是，诸位发明人现在提供了改善的治疗方法，这些治疗方法使用ASGPR作为靶受体用于皂苷介导的效应分子在ASGPR表达细胞的胞质溶胶中的递送，导致效应分子以比不存在本发明的皂苷缀合物下可能的更低的剂量诱导类似的治疗性作用。因此，本发明通过提供本发明的皂苷-ASGPR配体缀合物，在考虑将效应分子递送到例如肝细胞的胞质溶胶中时，提供了皂苷的刺激性作用的改善的治疗性用途。诸位发明人实现的优点尤其是：通过(靶向的)效应分子与皂苷的共同施用，所需的效应分子的剂量较低，以及通过提供作为ASGPR的配体(如三价GalNAc)的共价缀合物的皂苷和一个或多个皂苷部分，所需的皂苷的剂量较低。令人惊讶的是，ASGPR的配体在皂苷缀合物和在靶向的效应分子缀合物中可以是相同的，在皂苷的刺激性影响下，在靶细胞中产生高效的效应分子介导的作用。也就是说，可以向靶细胞(如在其表面暴露ASGPR的肝细胞)共同施用皂苷缀合物和效应分子缀合物(两者均包含共价连接的ASGPR的配体，如三价GalNAc)，从而高效获得效应分子的期望的治疗性作用，同时两种缀合物靶向相同的受体并使用相同的胞吞作用路径进入细胞。这一令人惊讶的发现对肝细胞靶向疗法非常有益，这些疗法如涉及核酸(ASO、BNA、siRNA，仅列出几个)的胞质溶胶递送的疗法，因为肝细胞确实表达ASGPR，该ASGPR对肝细胞是特异性的，而实际上不存在特异性足以用于肝细胞靶向疗法的另外的肝细胞受体。因此，本发明开辟了改善肝细胞定向疗法的新道路，其中对于其作用模式，效应分子必须在细胞内递送并定位。作为本发明的皂苷缀合物提供的靶向的皂苷拓宽了这样的效应分子的治疗窗，并且同时，根据本发明，通过向皂苷提供肝细胞靶向结合分子，也改善了皂苷的治疗窗。
皂苷缀合物-介绍
本发明提供了皂苷和脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体的缀合物，在本文中称为“皂苷缀合物”。ASGPR配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。根据本发明的优选实施例，每个GalNAc部分经由与如式(I)中所指示的位置“1”上的氧的共价键，与ASGPR配体的剩余物结合，或者在ASGPR配体由单个GalNAc部分组成的情况下与皂苷部分结合：
Figure BDA0004086040580000171
如式(II)S中所示，ASGPR配体由优选地经由皂苷部分接头LS与皂苷部分S结合的单个GalNAc部分组成。
Figure BDA0004086040580000172
ASGPR配体可以包含多于一个GalNAc部分，如2、3、4、5或6个GalNAc部分，优选地3或4个GalNAc部分。在这样的情况下，优选GalNAc部分各自分别经由位置“1”上的氧与中心桥接部分B共价结合，该中心桥接部分B优选地经由皂苷部分接头LS在GalNAc部分与皂苷部分之间有效地形成桥。GalNAc部分可以直接与桥接部分B结合，如式(III)S中所示：
Figure BDA0004086040580000181
其中n是大于或等于2的整数，LS是皂苷部分接头，并且S是皂苷部分。更优选地，GalNAc部分经由GalNAc接头LGAL与桥接部分B结合，如式(IV)S中所示：
Figure BDA0004086040580000182
其中n是大于或等于2的整数，LS是皂苷部分接头，并且S是皂苷部分。虽然可以独立地选择每次出现的LGAL，但本领域技术人员将理解，在每次出现的LGAL表示相同的部分的情况下，皂苷缀合物的合成被简化。
皂苷缀合物-接头LS
皂苷部分接头LS表示适合用于使皂苷与如式(II)S中的GalNAc或与如式(III)S和(IV)S中的桥接部分B共价结合的任何化学部分。接头的特性和大小没有特别限制，并且使皂苷与如式(II)S中的GalNAc或与如式(III)S和(IV)S中的桥接部分B共价结合可以通过“常规的”化学官能团(例如酯键)以及通过典型地具有长链长度的“点击化学”型接头(产生包含例如多于10个或多于20个碳原子的接头ES)来实现。用于使分子彼此结合的合适的接头LS和相关的偶联反应描述于手册Hermanson,Greg T.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academic press[学术出版社],2013中。
如本领域技术人员将理解的，皂苷部分接头LS将典型地是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应(例如“点击化学”类型)的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合。该原理在具有式(II)S的化合物的以下反应方案中展示：
Figure BDA0004086040580000191
其中LS是皂苷部分接头，LS1是与GalNAc或与桥接部分B共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与皂苷部分共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且S是皂苷部分。
具有式(III)S的化合物的对应反应方案如下：
Figure BDA0004086040580000192
其中LS是皂苷部分接头，LS1是与GalNAc共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与皂苷部分共价结合的皂苷部分接头LS的前体，n是大于或等于2的整数，B是桥接部分，并且S是皂苷部分。
具有式(IV)S的化合物的对应反应方案如下：
Figure BDA0004086040580000193
其中LS是皂苷部分接头，LS1是与GalNAc共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与皂苷部分共价结合的皂苷部分接头LS的前体，n是大于或等于2的整数，B是桥接部分，S是皂苷部分并且LGAL是GalNAc接头。
皂苷部分接头LS可以是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，其中该偶联反应是例如叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格(Staudinger)反应、应变杂环亲电剂(如氮杂环丙烷、环氧化物、环状硫酸酯、氮丙啶(aziridinium)离子、镏化物离子)的亲核开环、非醛醇类型的羰基反应(如脲、硫脲、腙、肟醚、酰胺或芳香族杂环形成)或碳-碳双键的加成(如环氧化、氮杂环丙烷化、二羟基化、硫酰卤加成、亚硝酰卤化物加成或迈克尔加成)，优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环，更优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成或硫醇马来酰亚胺偶联。
根据本发明的一些实施例，皂苷部分接头LS包含腙和/或1,2,3-三唑，优选地腙和1,2,3-三唑。无论何时在本申请的接头的上下文中提及1,2,3-三唑，这优选地意指1H-1,2,3-三唑。
这样的腙是例如末端酰肼与含醛化合物(如含醛皂苷)之间的偶联的结果。该酰肼/醛偶联是生物缀合领域中已知的“点击”化学工具，并且例如描述于Hermanson,GregT.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academic press[学术出版社],2013中。
这样的1,2,3-三唑是例如叠氮化物与含炔烃化合物之间的偶联的结果。该叠氮化物/炔烃偶联是生物缀合领域中通常已知的“点击”化学工具，并且例如描述于Hermanson,Greg T.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academic press[学术出版社],2013中。
因此，优选皂苷部分接头LS是第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第一前体LS1包含叠氮化物；该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，该第二前体LS2包含炔烃并且优选地包含由酰肼/醛与该皂苷部分的醛偶联产生的腙。
具有式(V)S的化合物中存在的前体LS1的结构的实施例是以下叠氮化物：
Figure BDA0004086040580000201
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示选自1、2和3的整数，更优选地a表示2。
具有式(VII)S或(VIII)S的化合物中存在的前体LS1的结构的实施例是以下叠氮化物：
Figure BDA0004086040580000211
其中c表示大于或等于0的整数，优选地c表示5-15范围内的整数，更优选地c表示9。
具有式(VI)S的化合物中存在的前体LS2的结构的实施例是以下腙：
Figure BDA0004086040580000212
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示2-6范围内的整数，更优选地a表示4，并且其中LS2a表示含炔烃部分。如本领域技术人员根据本披露所理解的，式(XIX)中所描述的腙由酰肼与皂苷部分的醛的反应产生。
LS2a优选地包含少于20个碳原子，更优选地LS2a表示根据式(XX)的部分：
Figure BDA0004086040580000213
因此，在一些实施例中，皂苷缀合物是如本文所述的具有式(II)S、(III)S或(IV)S的化合物，其中皂苷部分接头LS是具有式(V)S、(VII)S或(VIII)S的化合物与具有式(VI)S的化合物之间的偶联反应的结果，其中第一前体LS1是叠氮化物，例如具有式(XVII)或式(XVIII)的叠氮化物，并且其中第二前体LS2是包含含炔烃部分LS2a(例如，具有式(XX)的炔烃)和腙的具有式(XIX)的化合物，该腙由酰肼与皂苷部分的醛的反应产生。
皂苷缀合物-皂苷
本发明的方面涉及一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体共价连接的至少一个皂苷，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中该皂苷包含选自由以下组成的组的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸、
16α-羟基齐墩果酸、
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)、
16α,23-二羟基齐墩果酸、
丝石竹皂苷元、
皂皮酸、
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯、
洋地黄皂苷配基、
3,16,28-三羟基齐墩果烷-12-烯、
丝石竹酸、
以及
其衍生物，
优选地，该皂苷包含选自皂皮酸和丝石竹皂苷元或其衍生物的苷元核心结构，更优选地，该皂苷苷元核心结构是皂皮酸或其衍生物。这样的优选的苷元包含如本文其他地方所述的C-23原子处的醛基或其衍生物。不希望受任何理论的束缚，这样的醛基有助于三萜苷型的皂苷的内体逃逸增强活性，这些皂苷包含选自C组(尤其是皂皮酸和丝石竹皂苷元)的苷元。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中至少一个皂苷是单糖链三萜皂苷或双糖链三萜皂苷，该单糖链三萜皂苷或双糖链三萜皂苷属于在位置C-23处具有醛基的12,13-脱氢齐墩果烷类型并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸基团，优选地是双糖链三萜皂苷，该双糖链三萜皂苷属于在位置C-23处具有醛基的12,13-脱氢齐墩果烷类型并且在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸基团。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中至少一个皂苷包含第一糖链，该第一糖链与该至少一个皂苷的苷元核心结构的C3原子或C28原子结合，优选地与C3原子结合，和/或其中该至少一个皂苷包含第二糖链，该第二糖链与该至少一个皂苷的苷元核心结构的C28原子结合，优选地，该皂苷包含第一糖链和第二糖链。因此，当本发明的皂苷缀合物所包含的皂苷具有两个聚糖(糖链)时，第一糖链结合在苷元核心结构的位置C3处，并且第二糖链结合在该苷元核心结构的位置C28处。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中
·皂苷包含与苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自A组：
GlcA-
Glc-、
Gal-、
Rha-(1→2)-Ara-、
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-、
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、及
其衍生物，
或
·皂苷包含与苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自B组：
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-；
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-；
Ara-；
Xyl-；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-，其中R1是4E-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-，其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-，其中R3是4E-甲氧基肉桂酸；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-，其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-，其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-，其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-，其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-，其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-，其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-，其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-，其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-，其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-；及
其衍生物，
或
·皂苷是双糖链三萜苷，该双糖链三萜苷包含与苷元核心结构结合的选自A组的第一糖链并且包含与该苷元核心结构结合的选自B组的第二糖链。因此，当本发明的皂苷缀合物所包含的皂苷具有两个聚糖(糖链)时，第一糖链结合在苷元核心结构的位置C3处，并且第二糖链结合在该苷元核心结构的位置C28处。
不希望受任何理论的束缚，在苷元核心结构(此处也称为“苷元”)中醛基或其衍生物的存在有益于当这样的皂苷与(效应)分子共同定位于细胞中、所述细胞的内体中时，皂苷刺激并且/或者增强这些(效应)分子的内体逃逸的能力。因此，优选本发明的皂苷缀合物包含具有带有醛基的苷元的皂苷。在皂皮酸以及在丝石竹皂苷元中，醛基在苷元的C23原子处。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷选自由以下组成的组：皂树(Quillaja)树皮皂苷、川续断皂苷乙(dipsacoside B)、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷甲、商陆皂苷甲、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶素、七叶素Ia、茶籽皂苷I、茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、毛地黄皂苷、报春花酸1和AS64R、其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物。
当皂苷与(效应)分子共同定位在细胞内时，这样的三萜苷型的皂苷能够增强存在于细胞的内体(或溶酶体)中的这样的(效应)分子的内体逃逸。诸位发明人确立了当本发明的缀合物包含皂苷时，当使该皂苷与细胞接触时，这些皂苷的内体逃逸增强活性强约100至1000倍。当在比达到将(效应)分子从细胞外递送到内体中并最终递送到所述细胞的胞质溶胶中的相同程度所需的、本发明的皂苷缀合物所包含的相同皂苷的浓度高100-1000倍的皂苷浓度下使这样的细胞与(效应)分子和皂苷接触时，游离皂苷能够刺激(效应)分子在细胞的胞质溶胶中的递送。表A1中列出了展现出这样的内体逃逸增强活性的皂苷、以及与已经建立了增强(效应)分子的胞质溶胶递送能力的皂苷具有高度结构相似性的皂苷。与使相同的细胞与游离的、非靶向的皂苷(未提供用于与靶细胞的ASGPR结合的ASGPR的配体)接触相比，当皂苷是本发明的皂苷缀合物的一部分时，在ASGPR的配体与靶细胞上的细胞表面结合位点结合后，在所述细胞上并且在胞吞作用后，将皂苷靶向递送到所述细胞的内体中的有效性因此高约100至1000倍。
在实施例中，皂苷缀合物包含至少一个皂苷，其中该皂苷是衍生物，其中
i.该皂苷的苷元核心结构包含已衍生化的醛基；
ii.该皂苷的糖链(优选地选自A组的糖链)包含已衍生化的羧基基团；
iii.该皂苷的糖链(优选地选自B组的糖链)包含已衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.存在衍生化(i)、(ii)和/或(iii)的任何组合。
苷元核心结构的醛基的示例性衍生化(i)包括还原为醇，如伯醇；转化为腙；转化为半缩醛；转化为缩醛；氧化为羧基；转化为亚胺；转化为肟；转化为β-羟基酮；或转化为烯酮，优选地还原为醇，如伯醇；或转化为腙。
在实施例中，皂苷是衍生物，其中苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基：
-还原为醇，如伯醇；或
-转化为具有式RbHC＝NNHRa的腙；优选地转化为具有式RbHC＝NNH(CO)Ra的腙
其中Ra是包含少于20个碳原子、优选地少于10个碳原子的基团，并且Rb是皂苷的剩余物。优选地，Ra是N-烷基化马来酰亚胺。在特定的实施例中，醛基已通过与以下反应转化为腙键：N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)、N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)、或N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)。
糖链的羧基基团的示例性衍生化(ii)包括：还原为醇，如伯醇；转化为酰胺；转化为酯；转化为胺，如伯胺或仲胺；或脱羧，优选地还原为醇，如伯醇；转化为酰胺；或转化为酯；更优选地转化为酰胺。
优选地，衍生化的羧基基团是葡糖醛酸部分的一部分，并且优选地糖链选自A组。
在实施例中，皂苷是衍生物，其中糖链(优选地选自A组的糖链)包含已通过以下衍生化的羧基基团(优选地葡糖醛酸部分的羧基基团)：
-还原为醇，如伯醇；
-转化为具有式RaNH(CO)Rb的酰胺；或
-转化为具有式RaO(CO)Rb的酯
其中Ra是包含少于20个碳原子、优选地少于10个碳原子的基团，并且Rb是皂苷的剩余物。优选地，Ra是N-烷基化马来酰亚胺或二醇。在特定的实施例中，羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化。
糖链的乙酰氧基基团的示例性衍生化(iii)包括：通过脱乙酰化转化为醇，如仲醇，任选地随后通过将所得的醇转化为醚；酯或酮；优选地通过脱乙酰化转化为醇，如仲醇。
优选地，衍生化的乙酰氧基基团是选自B组的糖链的一部分。
在实施例中，皂苷是衍生物，其中糖链(优选地选自B组的糖链)包含已通过以下衍生化的乙酰氧基基团：
-通过脱乙酰化转化为醇，如仲醇；或
-通过脱乙酰化转化为醇，如仲醇，随后将所得的醇转化为具有式RaORb的醚、具有式Ra(CO)ORb的酯、或具有式Ra(CO)Rb的酮
其中Ra是包含少于20个碳原子、优选地少于10个碳原子的基团，并且Rb是皂苷的剩余物。优选地，Ra是N-烷基化马来酰亚胺或二醇。
因此，在实施例中，皂苷是衍生物，其中：
·苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键；
·选择A组的糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化；
·选自B组的糖链包含乙酰氧基基团(Me(CO)O-)，该乙酰氧基基团已通过转化为羟基基团(HO-)而衍生化；或
·存在衍生化(i)、(ii)和/或(iii)的任何组合。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含含有已衍生化的醛基的苷元核心结构；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自A组的糖链，该糖链包含已衍生化的羧基基团；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自B组的糖链，该糖链包含已衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂皮皂素、皂苷集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物、及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中该皂苷是根据本发明的皂皮酸皂苷或丝石竹皂苷元皂苷的皂苷衍生物，并由分子1表示：
Figure BDA0004086040580000301
其中
A1表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A1表示选自A组的糖链，更优选地A1表示选自A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成；
A2表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A2表示选自B组的糖链，更优选地A2表示选自B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团，如一个、两个、三个或四个乙酰氧基基团，
其中A1和A2中的至少一个不是氢，优选地A1和A2均为寡糖链；
并且R是丝石竹皂苷元中的氢或皂皮酸中的羟基；
其中该皂苷衍生物对应于由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基已被衍生化；
ii.当A1表示选自A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化；以及
iii.当A2表示选自B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个(优选地全部)已被衍生化。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中A1表示选自A组的糖链并且包含葡糖醛酸部分或由其组成，并且其中A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，和/或其中A2表示选自B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团，并且其中A2的至少一个乙酰氧基基团已被衍生化。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中由分子1表示的皂苷是双糖链三萜皂苷。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中该皂苷衍生物对应于由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基已通过以下衍生化：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.当A1表示选自A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD(如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD)或皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；以及
iii.当A2表示选自B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个(优选地全部)已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中A1是Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA并且/或者A2是Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc，优选地由分子1表示的皂苷是3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-葡糖醛酸吡喃基皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4OAc-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选地皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、GE1741、SA1641和QS-21、或其衍生物，最优选SO1861或其衍生物。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD(如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD)或皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自B组的糖链，该糖链包含已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合；
优选地，该皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含已通过与EMCH反应转化为腙键而衍生化的醛基，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化的醛基，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；或
iii.该皂苷衍生物包含衍生化i.和ii.的组合。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含醛基，并且其中该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷衍生物由分子2表示：
Figure BDA0004086040580000341
或其中该皂苷衍生物由分子3表示：
Figure BDA0004086040580000342
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中至少一个皂苷和ASGPR的配体直接或经由至少一个接头共价连接。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中GalNAc部分优选地经由皂苷接头Ls与皂苷S结合，如式(II)S中所表示：
Figure BDA0004086040580000351
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中GalNAc部分各自分别经由该GalNAc部分的位置“1”上的氧与中心桥接部分B共价结合，该中心桥接部分B优选地经由皂苷部分接头LS在该GalNAc部分与该皂苷部分之间有效地形成桥，如式(III)S中所示：
Figure BDA0004086040580000352
其中n是大于或等于2的整数，优选地n是3，LS是皂苷部分接头，并且S是该皂苷部分。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中GalNAc部分经由GalNAc接头LGAL与桥接部分B结合，如式(IV)S中所示：
Figure BDA0004086040580000353
其中n是大于或等于2的整数，优选地n是3，LS是皂苷部分接头，并且S是该皂苷部分。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷部分接头Ls表示适合用于使皂苷与如式(II)S中的GalNAc或与如式(III)S和(IV)S中的桥接部分B共价结合的任何化学部分。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷部分接头LS是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，其中LS1是与GalNAc或与该桥接部分B共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与该皂苷部分共价结合的皂苷部分接头LS的前体。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷部分接头LS是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，其中该偶联反应选自由以下组成的组：叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环、非醛醇类型的羰基反应以及碳-碳双键的加成，优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环，更优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成或硫醇马来酰亚胺偶联。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷部分接头LS是第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第一前体LS1包含叠氮化物；该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，该第二前体LS2包含炔烃并且优选地包含由酰肼/醛与该皂苷部分的醛偶联产生的腙。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中前体LS1的结构是以下具有式(XVII)的叠氮化物：
Figure BDA0004086040580000361
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示选自1、2和3的整数，更优选地a表示2，或
其中该前体LS1的结构包含以下具有式(XVIII)的叠氮化物：
Figure BDA0004086040580000371
其中c表示大于或等于0的整数，优选地c表示5-15范围内的整数，更优选地c表示9。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中前体LS2的结构包含以下具有式(XIX)的腙：
Figure BDA0004086040580000372
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示2-6范围内的整数，更优选地a表示4，并且其中LS2a表示含炔烃部分。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中LS2a包含少于20个碳原子，优选地LS2a表示根据式(XX)的部分：
Figure BDA0004086040580000373
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中桥接部分是具有式(XV)的化合物：
Figure BDA0004086040580000381
其中该具有式(XV)的化合物的氧原子与GalNAc或GalNAc接头LGAL结合，并且该具有式(XV)的化合物的氮原子与皂苷部分接头LS结合。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中LGAL表示适合用于使GalNAc与桥接部分B共价结合的任何化学部分。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中LGAL包含2-25个碳原子、优选地7-15个碳原子、更优选地11个碳原子，并且其中LGAL包含至少一个、优选两个酰胺部分。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中LGAL是根据式(XVI)的化合物：
Figure BDA0004086040580000382
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中ASGPR的配体是由分子I’表示的(GalNAc)3Tris：
Figure BDA0004086040580000383
或其中该ASGPR的配体是由分子II’表示的单GalNAc：
Figure BDA0004086040580000391
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中至少一个皂苷经由由分子III’表示的接头与本发明的分子I’或分子II’共价结合：
Figure BDA0004086040580000392
其中分子III’的酰肼部分与该皂苷中的醛基形成共价腙键，并且其中二苯并环辛炔基团与分子I’或分子II’的叠氮化物基团形成共价键。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中至少一个皂苷与ASGPR的配体经由至少一个可切割接头共价结合。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中可切割接头在酸性条件、还原性条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键、和/或易于蛋白水解(例如由组织蛋白酶B进行的蛋白水解)的键、和/或在还原性条件下易于切割的键，如二硫键。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中可切割接头在酸性条件下(例如像存在于哺乳动物细胞(优选地人细胞)的内体和/或溶酶体中)经受体内切割，优选地该可切割接头在pH 4.0-6.5下、并且更优选地在pH≤5.5下经受体内切割。
一个实施例是本发明的皂苷缀合物，其中缀合物包含1、2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个皂苷部分，或其间的任何数目的皂苷部分，如7、9、12个皂苷部分。
本领域技术人员将理解，如果本发明的皂苷缀合物中所包含的皂苷是如本文所述的具有式(II)S、(III)S或(IV)S的化合物，其中皂苷部分接头LS是第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，该第二前体LS2包含由酰肼/醛与皂苷部分的醛偶联产生的腙，如本文所述，这意指醛基已被接头占据，使得合适的皂苷衍生物是其中皂苷通过(ii)如本文所述的糖链的羧基基团和/或(iii)如本文所述的糖链的乙酰氧基基团衍生化的这些皂苷衍生物。
效应分子缀合物-介绍
本发明的某些药物组合和某些药物组合物包含效应分子和脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体的第二缀合物，在本文中称为“效应分子缀合物”。当效应分子与效应分子缀合物的剩余物结合时，其在本文中被称为“效应子部分”。ASGPR配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。根据本发明的优选实施例，每个GalNAc部分经由与如式(I)中所指示的位置“1”上的氧的共价键，与ASGPR配体的剩余物结合，或者在ASGPR配体由单个GalNAc部分组成的情况下与效应子部分结合：
Figure BDA0004086040580000401
如式(II)E中所示，ASGPR配体由与效应子部分E结合的单个GalNAc部分组成，优选地经由效应子部分接头LE。
Figure BDA0004086040580000402
ASGPR配体可以包含多于一个GalNAc部分，如2、3、4、5或6个GalNAc部分，优选地3或4个GalNAc部分。在这样的情况下，优选GalNAc部分各自分别经由位置“1”上的氧与中心桥接部分B共价结合，该中心桥接部分B优选地经由效应子部分接头LE在GalNAc部分与效应子部分之间有效地形成桥。GalNAc部分可以直接与桥接部分B结合，如式(III)E中所示：
Figure BDA0004086040580000411
其中n是大于或等于2的整数，LE是效应子部分接头，并且E是效应子部分。更优选地，GalNAc部分经由GalNAc接头LGAL与桥接部分B结合，如式(IV)E中所示：
Figure BDA0004086040580000412
其中n是大于或等于2的整数，LE是效应子部分接头，并且E是效应子部分。虽然可以独立地选择每次出现的LGAL，但本领域技术人员将理解，在每次出现的LGAL表示相同的部分的情况下，缀合物的合成被简化。
效应分子缀合物-接头LE
效应子部分接头LE表示适合用于使效应子部分与如式(II)E中的GalNAc或与如式(III)E和(IV)E中的桥接部分B共价结合的任何化学部分。接头的特性和大小没有特别限制，并且使效应分子与如式(II)E中的GalNAc或与如式(III)E和(IV)E中的桥接部分B共价结合可以通过“常规的”化学官能团(例如醚键)以及通过典型地具有长链长度的“点击化学”型接头(产生包含例如多于10个或多于20个碳原子的接头EL)来实现。合适的效应子部分接头LE和相关的偶联反应描述于手册Hermanson,Greg T.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academic press[学术出版社],2013中。
如本领域技术人员将理解的，效应子部分接头LE将典型地是至少第一前体LE1与第二前体LE2之间的偶联反应(例如“点击化学”类型)的结果，该第一前体LE1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LE2与效应子部分共价结合。该原理在具有式(II)的化合物的以下反应方案中展示：
Figure BDA0004086040580000421
其中LE是效应子部分接头，LE1是与GalNAc共价结合的效应子部分接头LE的前体，并且LE2是与效应子部分共价结合的效应子部分接头LE的前体，并且E是效应子部分。
具有式(III)的化合物的对应反应方案如下：
Figure BDA0004086040580000422
其中LE是效应子部分接头，LE1是与GalNAc共价结合的效应子部分接头LE的前体，并且LE2是与效应子部分共价结合的效应子部分接头LE的前体，n是大于或等于2的整数，并且E是效应子部分。
具有式(IV)E的化合物的对应反应方案如下：
Figure BDA0004086040580000423
其中LE是效应子部分接头，LE1是与GalNAc共价结合的效应子部分接头LE的前体，并且LE2是与效应子部分共价结合的效应子部分接头LE的前体，n是大于或等于2的整数，E是效应子部分，并且LGAL是GalNAc接头并且B是桥接部分。
效应子部分接头LE可以是至少第一前体LE1与第二前体LE2之间的偶联反应的结果，该第一前体LE1与GalNAc或桥接部分共价结合，该第二前体LE2与效应子部分共价结合，其中该偶联反应是例如叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂(如氮杂环丙烷、环氧化物、环状硫酸酯、氮丙啶离子、镏化物离子)的亲核开环、非醛醇类型的羰基反应(如脲、硫脲、腙、肟醚、酰胺或芳香族杂环形成)或碳-碳双键的加成(如环氧化、氮杂环丙烷化、二羟基化、硫酰卤加成、亚硝酰卤化物加成或迈克尔加成)，优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环，更优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成或硫醇马来酰亚胺偶联。
根据本发明的一些实施例，效应子部分接头LE包含琥珀酰亚胺硫醚部分。这样的琥珀酰亚胺硫醚是例如N-取代的马来酰亚胺与含硫醇或巯基化合物之间的硫醇马来酰亚胺偶联的结果。该硫醇马来酰亚胺偶联是生物缀合领域中通常已知的“点击”化学工具，并且例如描述于Hermanson,Greg T.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academicpress[学术出版社],2013第289页中。因此，优选效应子部分接头LE是第一前体LE1与第二前体LE2之间的偶联反应的结果，该第一前体LE1与GalNAc或桥接部分共价结合，该第一前体LE1包含N-取代的马来酰亚胺；该第二前体LE2与效应子部分共价结合，该第二前体LE2包含硫醇或其前体。合适的硫醇前体是二硫化物，其可经由还原成对应的硫醇而被(例如原位)切割。
存在于具有式(V)E、(VII)E或(VIII)E的化合物中的前体LE1的优选结构是以下末端N-取代的马来酰亚胺：
Figure BDA0004086040580000431
其中X表示适合用于使末端N-取代的马来酰亚胺与GalNAc或桥接部分B共价结合的任何接头。如本领域技术人员将理解的，X可以是第一部分与第二部分之间的偶联反应的结果，该第一部分与GalNAc或桥接部分共价结合，该第二部分与马来酰亚胺共价结合。X可以包含腙和/或1,2,3-三唑。无论何时在本申请的接头的上下文中提及1,2,3-三唑，这优选地意指1H-1,2,3-三唑。
存在于具有式(V)E、(VII)E或(VIII)E的化合物中的前体LE1的结构的实施例是以下末端N-取代的马来酰亚胺：
Figure BDA0004086040580000441
其中a和b各自独立地表示大于或等于0的整数，优选地a和b各自独立地表示选自0、1、2和3的整数，更优选地a和b表示2，并且其中LE1a表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地1,2,3-三唑，并且其中LE1b表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地腙；
Figure BDA0004086040580000442
其中b和c各自独立地表示大于或等于0的整数，优选地b表示选自0、1、2和3的整数并且c表示5-15范围内的整数，更优选地b表示2并且c表示9，其中LE1a表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地1,2,3-三唑，并且其中LE1b表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地腙；
以及
Figure BDA0004086040580000443
其中c表示大于或等于0的整数，优选地c表示5-15范围内的整数，更优选地c表示9，其中LE1c表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地1,2,3-三唑。
LE1a、LE1b和LE1c各自优选地包含少于20个碳原子，更优选地LE1a、LE1b和LE1c各自独立地表示根据式(XIII)、(XIV)或(XV)的部分，优选地LE1a是具有式(XIII)的1,2,3-三唑，LE1b是具有式(XIV)的腙，并且LE1c是具有式(XV)的1,2,3-三唑：
Figure BDA0004086040580000451
因此，在一些实施例中，效应分子缀合物是如本文所述的具有式(II)E、(III)E或(IV)E的化合物，其中效应子部分接头LE是具有式(V)E、(VII)E或(VIII)E的化合物与具有式(VI)E的化合物之间的偶联反应的结果，其中第一前体LE1是具有式(X)、(XI)或(XII)的末端N-取代的马来酰亚胺，其中LE1a是例如具有式(XIII)的1,2,3-三唑，LE1b是例如具有式(XIV)的腙，并且LE1c是例如具有式(XV)的1,2,3-三唑。
效应分子缀合物-效应子部分
本发明的方面涉及一种药物组合，该药物组合包含：
-第一药物组合物，该第一药物组合物包含本发明的皂苷缀合物并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂；以及
-第二药物组合物，该第二药物组合物包含效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
本发明的方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含：
-本发明的皂苷缀合物；
-效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中该效应分子包含以下中的至少一个或由其组成：小分子(如药物分子)、毒素(如蛋白质毒素)、寡核苷酸(如BNA)、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质、或其任何组合，优选地，该效应分子是毒素、酶或寡核苷酸。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或是(GalNAc)3Tris，和/或其中该ASGPR的配体和效应分子经由共价键、优选经由至少一个接头缀合。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中效应分子是选自以下中的任一个或多个的寡核苷酸：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹形微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-O,4’-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA、以及基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中效应分子是选自以下中的任一个或多个的寡核苷酸：抗miRNA、BNA-AON或siRNA，如基于BNA的siRNA，该siRNA选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA、和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中效应分子是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够使以下基因中的任一种沉默的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)、HSP27、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)、δ-氨基乙酰丙酸合成酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向异常miRNA的寡核苷酸。
尽管在实施用于预防的生活方式改变和药物治疗中取得了进展，但心血管疾病仍然是导致总寿命损失的重要原因[B.G.Nordestgaard等人,Advances in lipid-loweringtherapy through gene-silencing technologies[通过基因沉默技术的脂质降低疗法的进展],Nature Reviews-Cardiology[自然评论-心脏病学],V 15,2018年5月,第261-272页]。即使在最佳生活方式干预、抗高血压治疗、高剂量他汀类疗法之后以及在使用新类别的脂质降低疗法(如胆固醇吸收抑制剂依泽替米贝、PCSK9抑制剂依洛尤单抗和伯考赛珠单抗、降低脂质的贝特类药剂苯扎贝特、胆固醇酯转运蛋白抑制剂安塞曲匹和抗炎剂卡纳单抗)治疗后，仍有相当大的残余心血管疾病风险。开发中的疗法、特别是反义寡核苷酸抑制或基于小干扰RNA(siRNA)的方法采用通过mRNA降解的基因沉默技术。虽然小分子降脂剂经口服施用，但基因沉默药物通常经皮下注射。基因沉默技术抑制细胞核或细胞质内的基因表达以减少蛋白质的产生，导致以克的量计的血浆脂蛋白水平降低。配制反义寡核苷酸和siRNA的目的是在肝细胞内实现比血浆中高得多的浓度。基因沉默疗法靶向在血浆中和在细胞内的蛋白质。
LDL最有可能通过内膜胆固醇沉积导致动脉粥样硬化。心肌梗死(MI)或缺血性中风事件的先决条件是冠状动脉和其他动脉内动脉粥样硬化的发展。通过由血压梯度促进的LDL和残粒脂蛋白从血浆渗入到动脉内膜中发生动脉粥样硬化斑块起始。如果血浆中LDL和残粒脂蛋白的水平在延长的时间段内保持升高，则可能发生动脉粥样硬化斑块进展。内皮功能障碍导致这些脂蛋白流入内膜的通量增加，这可进一步增强动脉粥样硬化的进展。导致MI或缺血性中风的斑块破裂典型地发生在具有持续局部炎症并且无纤维帽的不稳定的动脉粥样硬化斑块部位。斑块破裂后，激活的血小板和纤维蛋白生成血栓，如果高水平的Lp(a)通过其与纤溶酶原的同源性抑制纤维蛋白溶解，则该血栓的大小可进一步进展。最后，血浆中LDL和残粒脂蛋白的大量减少可以通过减少斑块大小和局部炎症来稳定斑块。基因沉默技术利用了分子生物学的中心法则：DNA转录成mRNA以及mRNA翻译成蛋白质。如果已知基因的DNA序列影响导致心血管疾病的脂蛋白部分的水平，则可以合成单链RNA(反义寡核苷酸)或双链RNA(siRNA)，该单链RNA或双链RNA将与该基因的mRNA产物结合并使其失活，从而有效地关闭该基因或使该基因沉默。基于反义寡核苷酸或siRNA的基因沉默方法的一个挑战是潜在的脱靶或不良反应，通过优先将药物递送至肝细胞并从而使身体其余部分保持低的药物浓度，这些脱靶或不良反应被最小化。目前，向肝细胞选择性递送反义寡核苷酸或siRNA的最佳方式是将这些药物或它们的递送系统附接至N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分，这有助于经由脱唾液酸糖蛋白受体选择性地摄取到肝细胞中。这样的具有缀合的GalNAc部分的基因沉默药物将大幅提高药物效力、降低血浆中的药物水平并提供减少不良反应的希望。
在II期和III期试验中评估了降低脂质的基因沉默疗法。除了使载脂蛋白B基因沉默外，在几种脂蛋白途径中具有活性的基因ANGPTL3、APOC3、LPA和PCSK9也是基因沉默疗法的靶标。脂蛋白基因沉默疗法的实例是米泊美生(Mipomersen)，它是与编码apoB蛋白的mRNA序列直接结合的反义寡核苷酸，该apoB蛋白是LDL、残粒脂蛋白和Lp(a)上携带的主要蛋白质。
本发明的一部分是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中效应分子是寡核苷酸(优选地siRNA，如基于BNA的siRNA)、或反义寡核苷酸(如基于BNA的反义寡核苷酸，例如基于2'-O,4’-氨基乙烯桥接核酸的AON)，优选地当存在于哺乳动物细胞内时其能够使基因载脂蛋白B(apoB)沉默。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中效应分子是寡核苷酸，该寡核苷酸例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向参与以下蛋白质中的任一种的表达的mRNA：apoB、HSP27、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT和LDH，或例如当存在于哺乳动物细胞内时能够拮抗或恢复miRNA功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻抑onco-miR的表达。
本发明的一部分是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中效应分子是寡核苷酸(优选地siRNA，如基于BNA的siRNA)、或反义寡核苷酸(如基于BNA的反义寡核苷酸，例如基于2'-O,4’-氨基乙烯桥接核酸的AON)，优选地当存在于哺乳动物细胞内时其能够靶向参与蛋白质apoB的表达的mRNA。也就是说，包含效应子部分的缀合物所包含的寡核苷酸与apoB mRNA的结合导致蛋白质载脂蛋白B的表达沉默。
诸位发明人现在令人惊讶地通过用BNA-AON与ASGPR的配体(此处为三GalNAc)和皂苷的缀合物的组合治疗建立了改善且有效的apoB基因沉默。已知皂苷(此处以SO1861作为实例)具有促进例如经由受体介导的细胞摄取进入内体的分子的内体逃逸的活性。在用包含GalNAc的AON缀合物和包含GalNAc的皂苷缀合物的治疗性组合治疗后，apoB的基因沉默导致表达ApoB蛋白的mRNA水平降低、血浆ApoB水平降低，并导致LDL血浆水平降低。在单次施用所述两种缀合物的组合后72小时，并且甚至在超过10天后(例如，在14天后)，基因沉默作用明显。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中效应分子是或包含毒素，该毒素包含至少一种分子或由其组成，该分子选自以下中的任一种或多种：肽、蛋白质、酶(如脲酶和Cre重组酶)、朊毒素、核糖体失活蛋白、和/或细菌毒素、植物毒素，更优选地选自以下中的任一种或多种：病毒毒素，如凋亡蛋白；细菌毒素，如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，如α-八叠球菌素；植物毒素，包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，如香石竹毒蛋白(例如香石竹毒蛋白-30或香石竹毒蛋白-32)、皂草毒蛋白(例如皂草毒蛋白-S3或皂草毒蛋白-S6)、三角梅核糖体失活蛋白或三角梅核糖体失活蛋白的去免疫化衍生物去三角梅核糖体失活蛋白、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、蒴莲根毒素、蒴莲根毒素A链、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白、蒴莲根毒蛋白A链、槲寄生凝集素、槲寄生凝集素A链；或动物或人毒素，如青蛙核糖核酸酶、或来自人的颗粒酶B或血管生成蛋白，或其任何片段或衍生物；优选地，蛋白质毒素是香石竹毒蛋白和/或皂草毒蛋白，和/或包含以下中的至少一种或由其组成：靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素，更优选地以下中的任一种或多种：恩美、帕舒托、美登木素生物碱衍生物DM1、美登木素生物碱衍生物DM4、单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE，维多汀(vedotin))、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF，莫福汀(mafodotin))、卡奇霉素、N-乙酰基-γ-卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0004086040580000491
(PBD)二聚体、苯并二氮杂/>
Figure BDA0004086040580000492
CC-1065类似物、多卡米星、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、微管溶素(tubulysin)、吲哚啉并苯并二氮杂/>
Figure BDA0004086040580000502
AZ13599185、念珠藻素、根瘤菌素、氨甲蝶呤、蒽环素、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依喜替康、截短形式的铜绿假单胞菌外毒素(PE38)、多卡米星衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、剪接抑制素(spliceostatin)、泰兰斯他汀、奥佐米星、特司林、安伯他汀(Amberstatin)269和索星(soravtansine)、或其衍生物。
缀合物-桥接部分B
存在于本文所述的具有式(III)S或(IV)S的皂苷缀合物中和具有式如(III)E或(IV)E的效应分子缀合物中的桥接部分B表示适合用于共价结合2个或更多个、优选地3个或4个、更优选地3个GalNAc部分和皂苷部分接头LS或效应子部分接头LE的任何部分。
根据优选的实施例，桥接部分B是具有式(XV)的化合物：
Figure BDA0004086040580000501
其中具有式(XV)的化合物的氧原子与GalNAc(对应于具有式(III)S或(III)E的化合物)或与GalNAc接头LGAL(对应于具有式(IV)S或(IV)E的化合物)结合，并且具有式(XV)的化合物的氮原子与皂苷部分接头LS或效应子部分接头LE结合。
本领域技术人员将理解，具有式(III)S、(III)E、(IV)S或(IV)E的这些化合物(其中桥接部分B是具有式(XV)的化合物)对应于其中ASGPR配体由(GalNAc)3Tris组成的效应分子缀合物。
缀合物-接头LGAL
GalNAc接头LGAL表示适合用于使GalNAc与如式(IV)S或(IV)E中的桥接部分共价结合的任何化学部分。接头的特性和大小没有特别限制。
根据实施例，GalNAc接头LGAL各自包含2-25个碳原子、优选地7-15个碳原子、更优选地11个碳原子。优选地GalNAc接头LGAL包含至少一个、优选地两个酰胺部分。特别优选的GalNAc接头LGAL是根据式(XVI)的化合物：
Figure BDA0004086040580000511
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子是细胞表面分子的配体或包含用于细胞表面分子的结合位点的抗体或其包含该结合位点的至少一个结构域或片段。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中第三缀合物是以下中的任一种或多种：抗体-毒素缀合物、受体-配体-毒素缀合物、抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-核酸缀合物或受体-配体-核酸缀合物。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子能够与以下细胞表面分子中的任一种结合：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，优选地以下中的任一种：HER2、CD71、ASGPR和EGFR，更优选地CD71。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其中第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子是或包含以下中的任一种：抗体，优选地单克隆抗体如人单克隆抗体、IgG、包含以下或由以下组成的分子：单结构域抗体、至少一个VHH结构域、优选地骆驼VH、可变重链新抗原受体(VNAR)结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2和Fcab片段。
本发明的方面涉及本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其用作药物。
本发明的方面涉及本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：apoB、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT和LDH。
本发明的一部分是本发明的药物组合或本发明的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及基因apoB的疾病或健康问题中使用。apoB基因的表达产物是作为LDL、残粒脂蛋白和Lp(a)的一部分存在的脂蛋白载脂蛋白B(ApoB)。典型地，该疾病是心血管疾病，典型地与涉及以下中的一种或多种的动脉粥样硬化斑块的堆积和存在相关：包含ApoB的LDL、Lp(a)和残粒脂蛋白。诸位发明人现在令人惊讶地通过用BNA-AON与ASGPR的配体(此处为三GalNAc)和皂苷的缀合物的组合治疗建立了改善且有效的apoB基因沉默。已知皂苷(此处以SO1861作为实例)具有促进例如经由受体介导的细胞摄取进入内体的分子的内体逃逸的活性。在用包含GalNAc的AON缀合物和包含GalNAc的皂苷缀合物的治疗性组合治疗后，apoB的基因沉默导致表达ApoB蛋白的mRNA水平降低、血浆ApoB蛋白水平降低，并导致LDL血浆水平降低。在单次施用所述两种缀合物的组合后72小时，并且甚至在超过10天后(例如，在14天后)，基因沉默作用明显。
一个实施例是本发明的药物组合或本发明的药物组合物、或用于本发明的药物组合或药物组合物，其用于在治疗或预防以下中使用：癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、或自身免疫性疾病。
一个实施例是用于本发明的药物组合或用于本发明的药物组合物，其中皂苷是皂苷衍生物、优选地根据本发明的QS-21衍生物或SO1861衍生物。
本发明的方面涉及一种体外或离体方法，该方法用于将本发明的第二缀合物或第三缀合物从细胞外转移到所述细胞内，优选地随后将根据本发明的第二缀合物或第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面上表达ASGPR并且当将该第三缀合物转移到该细胞中时该细胞表达细胞表面分子，其中该第三缀合物包含用于与所述细胞表面分子结合的结合分子，该细胞优选地选自肝细胞、病毒感染细胞和肿瘤细胞；
b)提供如本发明的第二缀合物或第三缀合物用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供本发明的皂苷缀合物；
d)使步骤a)的细胞与步骤b)的第二缀合物或第三缀合物以及步骤c)的皂苷缀合物在体外或离体接触，从而实现将该第二缀合物或该第三缀合物从该细胞外转移到所述细胞中，并且优选地从而随后实现将该第二缀合物或该第三缀合物转移到所述细胞的胞质溶胶中，或者优选地从而随后实现将至少该第二缀合物或该第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中。
尽管已经根据几个实施例描述了本发明，但是可以预期，对于本领域普通技术人员而言，通过阅读说明书和研究附图，其替代、修改、排列和等同物将变得显而易见。本发明不以任何方式受限于所展示的实施例。可以在不偏离所附权利要求书限定的范围的情况下作出改变。
上面已经参考多个示例性实施例描述了本发明。修改是可能的，并且包括在所附权利要求书所限定的保护范围内。本发明由以下实例进一步说明，这些实例不应被解释为以任何方式限制本发明。
实例和示例性实施例
实例1.CD71-皂草毒蛋白+4000nM三价GalNAc-L-SO1861
三价GalNAc是识别肝细胞上的ASGPR1受体并与其结合的靶向配体。产生了三价GalNAc(图1和图8)并且使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合(不稳定，方式与如图2和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似，其中SPT001与SO1861同义)，对于结合的SO1861(三价GalNAc-SO1861)，DAR为1。SO1861-EMCH是指如下SO1861，其中醛基通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化，从而提供SO1861-Ald-EMCH。如图1和图8中所描述的“三价GalNAc”是适合用于与效应分子或与皂苷偶联的典型(GalNAc)3Tris缀合物。作为对照，也使SO1861-EMCH与单价GalNAc缀合(不稳定)(图3)，对于结合的SO1861(GalNAc-SO1861)，DAR为1。将HepG2(ASGPR1+；CD71+，表A3)和Huh7(ASGPR1+/-；CD71+，表A3)细胞在存在和不存在10pM CD71-皂草毒蛋白(与蛋白质毒素皂草毒蛋白缀合的靶向CD71的单克隆抗体OKT-9)的情况下用浓度范围的三价GalNAc-L-SO1861((GalNAc)3-SO1861)和GalNAc-L-SO1861(GalNAc-SO1861)处理。在不存在CD71-皂草毒蛋白的情况下的细胞处理表明，作为单个化合物的三价GalNAc-L-SO1861((GalNAc)3-SO1861)(或三价GalNAc)在高达15000nM下没有毒性(图9)。
将HepG2和Huh7细胞也用浓度范围的CD71-皂草毒蛋白与1000nM或4000nM的固定浓度的三价GalNAc-SO1861的组合处理(对于结合的SO1861，DAR＝1)。确定了ASGPR1/CD71表达细胞(HepG2和Huh7)的靶向的蛋白质毒素介导的细胞杀伤。这揭示了在两种细胞系中低浓度的CD71-皂草毒蛋白的强细胞杀伤(IC50＝1pM)，而等同浓度的CD71-皂草毒蛋白(CD71-SPRN)、CD71-皂草毒蛋白+1000nM三价GalNAc((GalNAc)3)或CD71-皂草毒蛋白+4000nM三价GalNAc((GalNAc)3-SPT)仅能在高浓度的CD71-皂草毒蛋白下在两种细胞中诱导细胞杀伤(IC50＝100pM)(图10)。
所有这些都表明三价GalNAc-SO1861((GalNAc)3-SPT)与低浓度的CD71-皂草毒蛋白(CD71-SPRN)的组合在ASGPR1/CD71表达细胞中有效地诱导细胞杀伤。因此，三价GalNAc-SO1861在ASGPR1表达细胞中有效地诱导蛋白质毒素的内体逃逸。
实例2三价GalNAc-L/S-BNA+SO1861-EMCH
使HSP27BNA与三价GalNAc缀合(图6-7)，并用浓度范围的三价GalNAc-L-HSP27BNA(不稳定缀合，图6)或三价GalNAc-S-HSP27BNA(稳定缀合，图7)与4000nM的固定浓度的SO1861-EMCH的组合处理HepG2(ASGPR1+)细胞或Huh7(ASPGR1+/-)。确定了HepG2和Huh7细胞中的HSP27基因沉默。只有与4000nM SO1861-EMCH组合，才在以下情况下在HepG2和Huh7两种细胞中观察到有效的基因沉默：低浓度的三价GalNAc-L-HSP27BNA(也称为(GalNAc)3-L-HSP27)(HepG2：IC50＝0.1nM；Huh7：IC50＝3nM)或三价GalNAc-S-HSP27BNA(也称为(GalNAc)3-S-HSP27)(HepG2：IC50＝0.1nM；Huh7：IC50＝3nM)，而等同浓度的三价GalNAc-L-HSP27BNA(HepG2/Huh7：IC50>2000nM)或三价GalNAc-S-HSP27BNA(HepG2/Huh7：IC50>2000nM)在HepG2和Huh7细胞系中没有显示出基因沉默活性(图11)。
接下来，以类似的方式(图6-7)使ApoBBNA与三价GalNAc缀合，并用以下处理HepG2(ASGPR1+)细胞或Huh7(ASPGR1+/-)：浓度范围的三价GalNAc-L-ApoBBNA(也称为(GalNAc)3-L-ApoB)(不稳定缀合，图6、图12、图13)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(也称为(GalNAc)3-S-ApoB)(稳定缀合，图7、图14、图15)或三价GalNAc-L-ApoB加扰BNA(也称为(GalNAc)3-L-ApoB(加扰))或三价GalNAc-S-ApoB加扰BNA(也称为(GalNAc)3-L-ApoB(加扰))(其中加扰的ApoBBNA是不与ApoB mRNA结合的反义加扰寡聚体序列；脱靶对照BNA)与4000nM的固定浓度的SO1861-EMCH(也称为SPT-EMCH)的组合。确定了HepG2(ASGPR1+)细胞或Huh7(ASPGR1+/-)中的ApoB基因沉默。只有与4000nM SO1861-EMCH组合，才在以下情况下在HepG2细胞中观察到有效的基因沉默：低浓度的三价GalNAc-L-ApoBBNA(IC50＝10nM)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(IC50＝10nM)，而等同浓度的三价GalNAc-L-ApoBBNA(IC50>2000nM)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(IC50>2000nM)在HepG2细胞中没有显示出基因沉默活性(图12、图14)。这些处理没有影响两种细胞系的活力(图13、图15)。“L”是指“不稳定”接头，其表明接头在细胞中(即在如内体和溶酶体中明显的pH下)被切割。相比之下，“S”是指“稳定”接头，其表明接头在细胞中(即在如内体和溶酶体中明显的pH下)不被切割。因此，包含在形成缀合物或由缀合物所包含的任何两个分子之间的不稳定键的缀合物将在不稳定接头中的位置处被切割，从而使两个连接的或结合的分子解离。一个实例是在如在哺乳动物细胞(如人细胞)的内体和溶酶体中明显的酸性条件下腙键的切割。
所有这些都表明SO1861-EMCH可以增强三价GalNAc-L-BNA或三价GalNAc-S-BNA的内体逃逸和对两个独立的基因靶标的靶基因沉默。与Huh7细胞相比，HepG2细胞中的基因沉默更高效，这表明在细胞的质膜处的更高水平的ASGPR1表达有助于增加GalNAc-BNA缀合物的摄取。
实例3三价GalNAc-L/S-BNA+三价GalNAc-L-SO1861
使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合(不稳定，方式与如图2和图4中针对未衍生化的SO1861(也称为SPT001)所述的类似)，对于结合的SO1861(称为三价GalNAc-SO1861、或(GalNAc)3-SO1861、或(GN)3-SPT)，DAR＝1。用以下处理HepG2(ASGPR1+)细胞或Huh7(ASPGR1+/-)细胞：浓度范围的三价GalNAc-L-ApoBBNA(不稳定缀合，图16)、三价GalNAc-S-ApoBBNA(稳定缀合(图17))或加扰的脱靶对照缀合物(三价GalNAc-L-ApoB加扰BNA或三价GalNAc-S-ApoB加扰BNA)与4000nM的固定浓度的三价GalNAc-L-SO1861的组合(对于结合的SO1861，DAR＝1)。确定了HepG2(ASGPR1+)细胞和Huh7(ASPGR1+/-)细胞的ApoB基因沉默。只有与4000nM的三价GalNAc-L-SO1861((GN)3-SPT)组合，才在以下情况下在HepG2细胞(ASGPR1+)中观察到有效的基因沉默：低浓度的三价GalNAc-L-ApoBBNA(IC50＝50nM)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(IC50＝50nM)。两种组合处理在Huh7细胞(ASGPR1+/-)中显示出降低的有效基因沉默(三价GalNAc-L-ApoBBNA：IC50＝700nM；三价GalNAc-S-ApoBBNA：IC50＝700nM)。等同浓度的三价GalNAc-L-ApoBBNA(HepG2/Huh7：IC50>1000nM)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(HepG2/Huh7：IC50>1000nM)在HepG2和Huh7细胞系中没有显示出基因沉默活性，4000nM的三价GalNAc-L-SO1861也没有诱导/增强加扰的三价GalNAc-L-ApoB加扰BNA+(HepG2/Huh7：IC50>1000nM)或加扰的三价GalNAc-S-ApoB加扰BNA(HepG2/Huh7：IC50>1000nM)的基因沉默(图16)。T
所有这些都表明与三价GalNAc-L-SO1861((GN)3-SPT)组合时，极低浓度的三价GalNAc-L-HSP27BNA或三价GalNAc-S-HSP27BNA在ASGPR1表达细胞中有效地诱导基因沉默，并且在具有较高ASGPR1表达的细胞中再次见到较强的作用。
实例4(GalNAc)3-BNA(GalNAc)3-SO1861在原代小鼠肝细胞中的效力
使(GalNAc)3与具有SO1861-EMCH的接头(“Ls”)缀合，揭示了(GalNAc)3-SO1861，对于结合的SO1861，DAR＝1(图25、26)。接下来，使靶向鼠ApoB序列的BNA(更特别地，ApoB编号02BNANC、或ApoB编号02或硫醇13-ApoB BNA)与接头(“Ls”)缀合，从而揭示出(GalNAc)3-ApoB编号02，对于结合的SO1861，DAR＝1(图27、28)。
用浓度范围的单独ApoB编号02BNA、或(GalNAc)3-ApoB编号02、或(GalNAc)3-ApoB编号02+2000nM SO1861-EMCH、或(GalNAc)3-ApoB编号02+250nM(GalNAc)3-SO1861处理原代小鼠肝细胞，并在72小时孵育后通过qPCR确定ApoB RNA表达(图18)。只有与2000nMSO1861-EMCH组合或与250nM(GalNAc)3-SO1861组合，才在低浓度的(GalNAc)3-ApoB编号02BNA下观察到有效的ApoB mRNA表达下调(即，基因表达抑制)；与2000nM SO1861-EMCH组合时IC50大约为0.03nM并且与250nM(GalNAc)3-SO1861组合时IC50大约为0.2nM。用单独的ApoBBNA编号02处理时ApoB RNA下调的效力降低大约100-667倍(ApoB编号02：IC50＝20nM)，而(GalNAc)3-ApoB编号02(IC50为大约2nM)，效力降低大约10-67倍。
这表明只有与(GalNAc)3-SO1861或SO1861-EMCH组合，极低浓度的(GalNAc)3-ApoB编号02BNA才在鼠原代肝细胞中有效地诱导ApoB RNA下调(即，基因沉默)。
实例5(GalNAc)3-BNA+(GalNAc)3-SO1861在C57BL/6J小鼠中的体内功效
将C57BL/6J小鼠如所描述的治疗并根据表A5给药。如图25-28中所述产生本研究中使用的缀合物(GalNAc)3-ApoB编号02和(GalNAc)3-SO1861。记录临床观察并分析功效和耐受性的不同生物标志物。
如图19所示，在24小时后，与媒介物给药组(n＝5只动物)相比，用0.1mg/kg ApoB编号02BNA(ApoB编号02)治疗的动物中的ApoB RNA水平(即基因表达)没有显著降低，并且用1mg/kg或2mg/kg ApoB编号02BNA给药的组中ApoB RNA水平分别降低了大约15％和21％(所有n＝3只动物/组)。同样地，在24小时后，与媒介物对照相比，剂量为1mg/kg的(GalNAc)3-ApoB编号02(对应于0.58mg/kg ApoB编号02BNA)使ApoB表达降低了大约53％(n＝3只动物)，而与媒介物相比，单独的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02没有显示出显著的降低(n＝3)。相比之下，与媒介物相比，当0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861共同施用时，ApoB表达在24小时后已容易地降低了大约69％(n＝2只动物)；而当与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861共同施用时，0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02仍然显示出16％的小幅降低(n＝2只动物)。在72小时后，与媒介物(n＝5只动物)相比，施用的最高剂量的ApoB编号02BNA(2mg/kg)显示出39％的最大降低(n＝3只动物)，而1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02导致ApoB表达降低68％(n＝3只动物)。再次，相比之下，当与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861共同施用时，剂量低10倍的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02导致ApoB表达水平甚至降低82％(n＝3只动物)，而单独的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02仅显示出12％的降低(n＝3只动物)。作用是持久的，并且在336小时后，对于2mg/kg ApoB编号2BNA，ApoB表达水平降低30％(n＝2只动物)，并且对于1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02，ApoB表达水平降低25％。有效载荷减少10倍的共同施用组(即，0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861)仍然显示出25％的降低，并因此构成了基于ApoB表达降低的施用的有效载荷降低的10倍改善。
如图20所示，ApoB RNA下调(在图19中显示)良好地转化为ApoB蛋白水平。在24小时后，与对照(n＝14只动物)相比，对于1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02(n＝8只动物)并且同样也对于低10倍的(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861(即，0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861)(n＝8只动物)的共同施用组，ApoB蛋白水平最显著地降低了大约50％。在72小时后，与媒介物对照相比，尽管所有治疗组都显示出ApoB蛋白的减少，但仅当将0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861共同施用时才观察到最显著的作用，其导致ApoB降低大约90％(n＝5只动物)。在给药后72小时后，当与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861(n＝4只动物)共同施用时，即使0.01mg/kg的(GalNAc)3-ApoB编号02也使ApoB蛋白降低大约25％，而单独的剂量高10倍的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02使ApoB蛋白降低了35％(n＝5只动物)。同样地，作用是持久的，并且在336小时时，对于所有分析的治疗组仍可观察到ApoB蛋白降低(所有n＝2只动物/组；未分析1mg/kgApoB编号02和0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO861组在336小时时的样品)。同样在此处，1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02以及剂量低10倍的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861的共同施用组显示出类似的持久性(在336小时后，ApoB蛋白降低23％)。
如图21所示，观察到的ApoB蛋白下调(在图20中显示)良好地转化为LDL-胆固醇(LDL-C)水平。在24小时后，与媒介物(n＝6只动物)相比，用0.1、1或2mg/kg ApoB编号02BNA治疗的动物(n＝3只动物/组)中的LDL-C水平没有显著降低。与媒介物和ApoB编号02BNA组相比，剂量为1mg/kg的靶向的(GalNAc)3-ApoB编号02已在24小时内将LDL-C降低至平均2.7mg/dl(n＝3只动物)，即降低了53％。已观察到当与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861共同施用时，剂量低10倍的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02在24小时内已将LDL-C同样降低至平均2.7mg/dl(n＝3只动物)，即降低了53％，而0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861的组的变异太大，无法得出结论(n＝2只动物)。在72小时后，与媒介物(n＝6只动物)相比，最高剂量的ApoB编号02BNA(2mg/kg)显示出LDL-C降低了50％(n＝3只动物)，同时1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02的情况为降低了72％(n＝3只动物)，并且剂量低10倍的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861的情况为甚至降低了78％(n＝3只动物)；而0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861的情况则降低了13％(n＝2只动物)。作用是持久的，并且在336小时后，对于2mg/kg ApoB编号02BNA，LDL-C水平降低了40％，并且对于1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02和对于0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861的共同施用组，LDL-C水平降低了48％，显示出基于LDL-C降低的施用的有效载荷的10倍改善。
总之，这表明只有与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861组合，极低浓度的三价GalNAc ApoB编号02BNA((GalNAc)3-ApoB编号02BNA)才在C57BL/6J小鼠的肝脏中有效地诱导ApoB RNA下调(即基因沉默)以及所有功效的“下游”生物标志物(如ApoB蛋白和LDL-胆固醇)。
实例5(GalNAc)3-BNA+(GalNAc)3-SO1861在C57BL/6J小鼠中的体内耐受性
如图25-28中所述产生本研究中使用的缀合物(GalNAc)3-ApoB编号02和(GalNAc)3-SO1861。
在研究过程期间，如表A5中所述的所有治疗、剂量和剂量方案都具有良好的耐受性，并且未显示出治疗特定的不良反应发现或任何指示缀合物不耐受的特定临床观察。治疗组小鼠增加的体重与接受媒介物的小鼠相当。确定了血清ALT水平，并且结果在图22中显示。在研究时间段期间，媒介物小鼠的ALT水平的范围为平均47至61U/L/组(对于媒介物，n＝6只动物)。不同剂量组中的ALT水平在不同时间点瞬时增加，有时每只动物变异/组大，没有显示出特定的化合物或剂量关系(所有组在24小时和72小时分别为n＝3，除了0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861外(其中两个时间点均为n＝2))。值得注意的是，在336小时后，所有给药组的ALT水平都回到基线并与媒介物对照相当(所有组均为n＝2)。
总之，这表明ApoB编号02、(GalNAc)3-ApoB编号02、和(GalNAc)3-SO1861(单独或与(GalNAc)3-ApoB编号02组合)在所应用的剂量和剂量方案中具有良好的耐受性，并且特别地，(GalNAc)3-SO1861与(GalNAc)3-ApoB编号02的共同施用在C57BL/6J小鼠模型中没有即时的耐受性问题，同时显示出高效力。
实例6.(GalNAc)3-SO1861+10pM CD71-皂草毒蛋白以及(GalNAc)3-BNA+250nM(GalNAc)3-SO1861
使SO1861-EMCH与三价GalNAc((GalNAc)3)缀合(不稳定，方式与如图2和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似)，对于结合的SO1861(称为(GalNAc)3-SO1861)，DAR＝1。SO1861-EMCH是指如下SO1861，其中醛基通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化，从而提供SO1861-Ald-EMCH。如图1和图8中所描述的“三价GalNAc”是适合用于与效应分子或与皂苷偶联的典型(GalNAc)3Tris缀合物。在存在和不存在10pM(非有效浓度)CD71-皂草毒蛋白(与蛋白质毒素皂草毒蛋白缀合的靶向CD71的单克隆抗体OKT-9)的情况下，用浓度范围的SO1861(未衍生化)或(GalNAc)3-SO1861处理原代人肝细胞(图23)。这揭示了CD71-皂草毒蛋白介导的原代人肝细胞的高效细胞杀伤在SO1861 IC50＝200nM时是有效的，而靶向的(GalNAc)3-SO1861在低得多的浓度(SO1861 IC50＝10nM)下已经有效(图23)。所有这些都揭示，为了显示出增强的效力，ASGPR1受体介导的、缀合的酸敏感的可切割(EMCH)SO1861的递送所需要的SO1861的量减少。
接下来，使ApoB BNA(SEQ ID NO:2)与三价GalNAc((GalNAc)3)缀合以产生(GalNAc)3-ApoBBNA(图6)，并与2000nM SO1861-EMCH或250nM(GalNAc)3-SO1861组合在原代人肝细胞上测试对ApoB RNA表达的调节(图24A)以及细胞活力(图24B)。这揭示了单独的(GalNAc)3-ApoBBNA不能高效地降低ApoB RNA表达(IC50>1000nM)(图24A)，并且未观察到对细胞活力的作用(图24B)。然而，(GalNAc)3-ApoBBNA+2000nM SO1861-EMCH高度有效，并且在低浓度的(GalNAc)3-ApoBBNA下显示出ApoB RNA表达的强烈下调(IC50＝8nM；图24A)并在IC50＝600nM时观察到细胞活力降低(图24B)。(GalNAc)3-ApoBBNA+250nM(GalNAc)3-SO1861也在低浓度的(GalNAc)3-ApoBBNA下显示出ApoB RNA的强烈下调(IC50＝15nM；图24A)而不显著影响细胞活力(图24B)。有趣的是，在(GalNAc)3-ApoBBNA+250nM(GalNAc)3-SO1861组合中，超过100nM(GalNAc)3-ApoBBNA时，观察到(GalNAc)3缀合物竞争结合ASGPR1受体，从而限制了两种缀合物进入细胞的最佳浓度，从而使ApoB RNA下调回复。
实例7.CD71-皂草毒蛋白+系列浓度的三价GalNAc-L-SO1861、三价GalNAc-(L-SO1861)4、SO1861-EMCH
产生了三价GalNAc(图1和图8)并且使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合(不稳定，方式与如图2和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似，其中SPT和SPT001与SO1861同义)，对于结合的SO1861(三价GalNAc-SO1861；(GN)3-SPT)，DAR＝1，或者通过使SO1861-EMCH首先与枝状物(三价GalNAc-枝状物(SO1861)4；(GN)3-dSPT4；图33C)偶联，DAR为4。再次，SO1861-EMCH是指如下SO1861，其中醛基通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化，从而提供SO1861-Ald-EMCH。如图1和图8中所描述的“三价GalNAc”是适合用于与效应分子或与皂苷偶联的典型(GalNAc)3Tris缀合物。作为对照，也使SO1861-EMCH与单价GalNAc缀合(不稳定)(图3)，对于结合的SO1861，DAR＝1，或者对于结合的SO1861(使用枝状物)，DAR＝4(GalNAc-SO1861和GalNAc-(SO1861)4)。原代肝细胞以高密度表达受体——允许靶向。在存在10pM CD71-皂草毒蛋白(与蛋白质毒素皂草毒蛋白缀合的靶向CD71的单克隆抗体OKT-9)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-L-SO1861、SO1861-EMCH、三价GalNAc-(SO1861)4处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1+)。在不存在CD71-皂草毒蛋白的情况下进行的细胞处理表明作为单个化合物的三价GalNAc-L-SO1861在高达至少1.000nM下没有毒性(图29A；相对细胞活力)。与用抗CD71 MoAb-皂草毒蛋白(CD71-SPRN)和SO1861-EMCH(SPT-EMCH)的组合处理的细胞的细胞活力相比，用抗CD71MoAb-皂草毒蛋白(“MoAb”＝单克隆抗体)和与SO1861缀合的GalNAc(对于结合的SO1861，DAR＝1，或者对于结合的SO1861，DAR＝4)的组合处理的细胞的细胞活力低约100倍(图29A)。
所有这些都表明三价GalNAc-SO1861和三价GalNAc-(SO1861)4与低浓度的CD71-皂草毒蛋白的组合在ASGPR1/CD71表达细胞中有效地诱导细胞杀伤。因此，三价GalNAc-SO1861在ASGPR1表达细胞中有效地诱导蛋白质毒素的内体逃逸。因此，SPT001和GalNAc靶向的SPT001(对于结合的SO1861，DAR＝1)两者都增加了工业标准GalNAc靶向的ASO的效力；当考虑肝细胞的细胞活力时，SO1861-EMCH约为10倍，并且(GN)3-SPT和(GN)3-dSPT4均为约100倍。
实例8.与ApoB反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc+三价GalNAc-L-SO1861
产生了三价GalNAc(图1和图8)并且使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合(不稳定，方式与如图2和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似，其中SPT和SPT001与SO1861同义)，DAR为1(三价GalNAc-SO1861；(GalNAc)3-SPT001；图30C)。再次，SO1861-EMCH是指如下SO1861，其中醛基通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化，从而提供SO1861-Ald-EMCH。此外，制备了与ApoB反义BNA寡核苷酸ApoBBNA(SEQ ID NO:2)和包含四个共价偶联的SO1861-EMCH的枝状物两者偶联的三价GalNAc的共价缀合物。关于制备缀合物的概述，也参见下文的“三价GalNAc-SO1861和GalNAc-SO1861的合成(图2、4)”部分和“三价GalNAc-BNA寡聚体的合成(图6、7)”部分和“三价GalNAc-S-ApoB(或HSP27)BNA寡聚体的合成”部分和“三价GalNAc-L-ApoB(或HSP27)BNA寡聚体的合成”部分以及“枝状物(-L-SO1861)4-三价GalNAc的合成”部分。
在存在或不存在300nM三价GalNAc-SO1861((GalNAc)3-SPT001)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-ApoBBNA((GalNAc)3-ApoB)处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1+)(图29B)。不存在(GalNAc)3-SPT001的情况下的细胞处理表明，与仅用(GalNAc)3-ApoB处理的细胞中的ApoB基因表达相比，三价GalNAc-L-SO1861在原代肝细胞中高度有效地降低ApoB基因表达(图29B)。
所有这些都表明三价GalNAc-SO1861与(GalNAc)3-ApoB的组合在ASGPR1表达细胞中有效地诱导ApoB基因表达的沉默。因此，三价GalNAc-SO1861在ASGPR1表达细胞中有效地诱导BNA的内体逃逸。
实例9.在存在固定剂量的OKT-9抗CD71单克隆抗体的情况下，与SO1861缀合的三价GalNAc、或一系列浓度的缀合物三价GalNAc-(L-SO1861)
产生了三价GalNAc(图1和图8)并且使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合(不稳定，方式与如图2和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似，其中SPT和SPT001与SO1861同义)，对于结合的SO1861(三价GalNAc-SO1861；(GalNAc)3-SPT001；图30C)，DAR＝1。再次，SO1861-EMCH是指如下SO1861，其中醛基通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化，从而提供SO1861-Ald-EMCH。关于制备缀合物的概述，也参见下文的“三价GalNAc-SO1861和GalNAc-SO1861的合成(图2、4)”部分。
在存在或不存在10pM CD71-皂草毒蛋白(与蛋白质毒素皂草毒蛋白缀合的靶向CD71的单克隆抗体OKT-9；图30D)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-SO1861(三价GalNAc-SPT001)处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1+)和细胞系Huh7的肝细胞(ASGPR1+/-)。在不存在CD71-皂草毒蛋白的情况下进行的细胞处理表明作为单个化合物的三价GalNAc-L-SO1861在高达至少1.000nM下没有毒性(图30A、30B；相对细胞活力)。与用相同剂量的抗CD71 MoAb-皂草毒蛋白(CD71-皂草毒蛋白)和相同剂量的三价GalNAc-SPT001的组合处理的Huh7细胞的细胞活力相比，用抗CD71 MoAb-皂草毒蛋白和与SO1861缀合的低nM剂量的GalNAc(对于结合的SO1861，DAR＝1；三价GalNAc-SPT001)的组合处理的细胞的细胞活力高度有效地杀伤原代肝细胞(图30A和30B)。
所有这些都表明低剂量的三价GalNAc-SO1861与低浓度的CD71-皂草毒蛋白的组合在ASGPR1表达细胞中有效地诱导细胞杀伤。因此，三价GalNAc-SO1861在ASGPR1表达细胞中有效地诱导蛋白质毒素的内体逃逸。因此，低nM的三价GalNAc-SPT001在原代肝细胞中增强了低pM CD71MoAb-皂草毒蛋白的细胞质递送；并且缺乏ASGPR1表达的肝细胞在低nM浓度的三价GalNAc-SPT001下没有应答。
实例10.与ApoB反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc+三价GalNAc-L-SO1861
如实例8中所述，产生三价GalNAc并且使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合，对于结合的SO1861，DAR＝1(三价GalNAc-SO1861；(GalNAc)3-SPT001；图30C)。另外，制备了三价GalNAc和ApoB反义BNA寡核苷酸ApoBBNA(SEQ ID NO:2)的缀合物(图31C)。关于制备缀合物的概述，也参见下文的“三价GalNAc-SO1861和GalNAc-SO1861的合成(图2、4)”部分和“三价GalNAc-BNA寡聚体的合成(图6、7)”部分和“三价GalNAc-S-ApoB(或HSP27)BNA寡聚体的合成”和“三价GalNAc-L-ApoB(或HSP27)BNA寡聚体的合成”部分和“枝状物(-L-SO1861)4-三价GalNAc和枝状物(-L-SO1861)8-三价GalNAc的合成”部分以及“枝状物(-L-SO1861)4-三价GalNAc的合成”。
在存在或不存在300nM三价GalNAc-SO1861(三价GalNAc-SPT001)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-ApoBBNA(三价GalNAc-ApoBBNA)处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1+)和细胞系Huh7的肝细胞(ASGPR1+/-)(图31A和31B)。不存在三价GalNAc-SPT001的情况下的细胞处理表明，与仅用三价GalNAc-ApoBBNA处理的原代肝细胞中的ApoB mRNA表达相比，三价GalNAc-SPT001在原代肝细胞中高度有效地(效力高约100倍)降低ApoB mRNA表达(图31A)。三价GalNAc-ApoBBNA、或三价GalNAc-ApoBBNA和三价GalNAc-SPT001的组合均未在这些肝细胞中诱导ApoB mRNA表达的降低。
所有这些都表明三价GalNAc-SPT001与三价GalNAc-ApoBBNA的组合在ASGPR1表达细胞中有效地诱导ApoB mRNA表达的沉默。因此，三价GalNAc-SPT001在ASGPR1表达细胞中有效地诱导BNA的内体逃逸。
在存在或不存在300nM三价GalNAc-SO1861(三价GalNAc-SPT001)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-ApoBBNA(三价GalNAc-ApoBBNA)处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1+)和细胞系Huh7的肝细胞(ASGPR1+/-)(图32A和32B)，并且评估并比较ApoB蛋白表达。不存在三价GalNAc-SPT001的情况下的细胞处理表明，与仅用三价GalNAc-ApoBBNA处理的原代肝细胞中的ApoB蛋白表达相比，三价GalNAc-SPT001在原代肝细胞中高度有效地(效力高超过1000倍)降低ApoB蛋白表达(图32A)。三价GalNAc-ApoBBNA、或三价GalNAc-ApoBBNA和三价GalNAc-SPT001的组合均未在这些肝细胞中诱导ApoB蛋白表达的降低(图32B)。
所有这些都表明三价GalNAc-SPT001与三价GalNAc-ApoBBNA的组合在ASGPR1表达细胞中有效地诱导ApoB蛋白表达的沉默。因此，三价GalNAc-SPT001在ASGPR1表达细胞中有效地诱导BNA的内体逃逸。因此，低nM三价GalNAc-ApoBBNA+三价GalNAc-SPT001可在原代肝细胞中增强ApoBBNA的内体逃逸和细胞质递送，导致ApoB mRNA沉默；低nM三价GalNAc-ApoBBNA+三价GalNAc-SPT001可在原代肝细胞中增强ApoBBNA的内体逃逸和细胞质递送，导致ApoB蛋白衰减；当考虑ApoB表达时，具有低ASGPR1表达的细胞对疗法没有应答。
材料与方法
缩写
AEM N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐
AMPD 2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇
BOP (苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
EDCI.HCl 3-((乙基亚氨基)亚甲基氨基)-N,N-二甲基丙-1-铵氯化物
EMCH.TFA N-(ε-马来酰亚胺基己酸)酰肼，三氟乙酸盐
HATU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
min 分钟
NMM 4-甲基吗啉
r.t. 保留时间
TCEP 三(2-羧基乙基)膦盐酸盐
Temp 温度
TFA 三氟乙酸
分析方法
LC-MS方法1
设备：Waters IClass；二元(Bin.)泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：
neg或neg/pos在1500-2400或2000-3000范围内；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：Acquity C18，50×2.1mm，1.7μm温度：60℃，流速：0.6mL/min，取决于产物的极性的线性梯度：
At0＝2％A，t5.0min＝50％A，t6.0min＝98％A
Bt0＝2％A，t5.0min＝98％A，t6.0min＝98％A
后运行时间：1.0min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
LC-MS方法2
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：pos/neg 100-800或neg 2000-3000；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：Waters XSelectTM CSH C18，50×2.1mm，2.5μm，温度：25℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％A，t2.0min＝98％A，t2.7min＝98％A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
LC-MS方法3
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于pos/neg产物105-800、500-1200或1500-2500的分子量；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：Waters XSelectTM CSHC18，50×2.1mm，2.5μm，温度：40℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％A，t2.0min＝98％A，t2.7min＝98％A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：在乙腈中的0.1％甲酸，洗脱剂B：在水中的0.1％甲酸。
LC-MS方法4
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：pos/neg 100-800或neg 2000-3000；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃，柱：Waters Acquity Shield RP18，50×2.1mm，1.7μm，温度：25℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％A，t2.0min＝98％A，t2.7min＝98％A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
LC-MS方法5
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围：pos/neg 1500-2500；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：Waters XSelectTM CSH C18，50×2.1mm，2.5μm，温度：25℃，流速：0.6mL/min，梯度：t0min＝5％A，t1.3min＝98％A，t1.7min＝98％A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
制备型方法
制备型MP-LC方法1
仪器类型：RevelerisTM制备型MPLC；柱：Waters XSelectTM CSH C18(145×25mm，10μm)；流速：40mL/min；柱温：室温；洗脱剂A：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.0)；洗脱剂B：99％乙腈+在水中的1％10mM碳酸氢铵；梯度：
At0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝10％B，t17min＝50％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B
At0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝20％B，t17min＝60％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B
；检测UV：210、235、254nm和ELSD。
制备型MP-LC方法2
仪器类型：RevelerisTM制备型MPLC；柱：Phenomenex LUNAC18(3)(150×25mm，10μm)；流速：40mL/min；柱温：室温；洗脱剂A：在水中的0.1％(v/v)甲酸，洗脱剂B：在乙腈中的0.1％(v/v)甲酸；梯度：
At0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝20％B，t17min＝60％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B
Bt0min＝2％B，t1min＝2％B，t2min＝2％B，t17min＝30％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B
Ct0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝10％B，t17min＝50％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B
Dt0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝5％B，t17min＝40％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B
；检测UV：210、235、254nm和ELSD。
制备型LC-MS方法3
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B Quadrupole；HPLC仪器类型：Agilent Technologies 1290制备型LC；柱：Waters XSelectTM CSH(C18，150×19mm，10μm)；流速：25ml/min；柱温：室温；洗脱剂A：100％乙腈；洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵，pH＝9.0；梯度：
At0＝20％A，t2.5min＝20％A，t11min＝60％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A
Bt0＝5％A，t2.5min＝5％A，t11min＝40％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A
；检测：DAD(210nm)；检测：MSD(ESI pos/neg)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集。
制备型LC-MS方法4
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B Quadrupole；HPLC仪器类型：Agilent Technologies 1290制备型LC；柱：Waters XBridge Protein(C4，150×19mm，10μm)；流速：25ml/min；柱温：室温；洗脱剂A：100％乙腈；洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵，pH＝9.0；梯度：
At0＝2％A，t2.5min＝2％A，t11min＝30％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A
Bt0＝10％A，t2.5min＝10％A，t11min＝50％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A
Ct0＝5％A，t2.5min＝5％A，t11min＝40％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A
；检测：DAD(210nm)；检测：MSD(ESI pos/neg)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集
制备型LC-MS方法1.
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B Quadrupole；HPLC仪器类型：Agilent Technologies 1290制备型LC；柱：Waters XBridge Protein(C4，150×19mm，10μm)；流速：25ml/min；柱温：室温；洗脱剂A：100％乙腈；洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵，pH＝9.0；梯度：
At0＝2％A，t2.5min＝2％A，t11min＝30％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A
Bt0＝10％A，t2.5min＝10％A，t11min＝50％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A
；检测：DAD(210nm)；检测：MSD(ESI pos/neg)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集
制备型MP-LC方法1.
仪器类型：RevelerisTM制备型MPLC；柱：Phenomenex LUNAC18(3)(150×25mm，10μm)；流速：40mL/min；柱温：室温；洗脱剂A：在水中的0.1％(v/v)甲酸，洗脱剂B：在乙腈中的0.1％(v/v)甲酸；梯度：
At0min＝2％B，t1min＝2％B，t2min＝2％B，t17min＝30％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B
Bt0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝5％B，t17min＝40％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B
Ct0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝10％B，t17min＝50％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B
；检测UV：210、235、254nm和ELSD。
快速色谱法
Grace Reveleris
Figure BDA0004086040580000691
C-815快速；溶剂递送系统：具有自动启动功能的3活塞泵，4个独立通道，一次运行最多4种溶剂，当溶剂耗尽时自动切换管路；最大泵流速250mL/min；最大压力50巴(725psi)；检测：UV 200-400nm，多达4个UV信号的组合和整个UV范围的扫描，ELSD；柱大小：在仪器上为4-330g，鲁尔型，750g至3000g，带可选支架。
SO1861-EMCH的合成(SO1861-EMCH也称为SO1861-Ald-EMCH)
向SO1861(121mg，0.065mmol)和EMCH.TFA(110mg，0.325mmol)中添加甲醇(特干的，3.00mL)和TFA(0.020mL，0.260mmol)。在室温下搅拌反应混合物。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(120mg，90％)。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z)：2069[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.084
SO1861-EMCH-巯基乙醇(SO1861-EMCH(阻断))
向SO1861-EMCH(0.1mg，48nmol)中添加200μL巯基乙醇(18mg，230μmol)，并将溶液在ThermoMixer C(艾本德公司(Eppendorf))上在800rpm和室温下振荡1h。在振荡1h后，将溶液用甲醇稀释并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por 7)对甲醇彻底透析4h。透析后，取出等分试样并经由MALDI-TOF-MS进行分析。
MALDI-TOF-MS(RP模式)：m/z 2193Da([M+K]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)，m/z2185Da([M+K]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)，m/z 2170Da([M+Na]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)。
三价GalNAc-叠氮化物的合成
中间体1：
1-叠氮基-17,17-双((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯
向3,3'-((2-氨基-2-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))二丙酸二叔丁酯(1.27g，2.51mmol)中添加3-叠氮基(peg4)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(977mg，2.51mol)在DMF(10mL)中的溶液。接下来，添加DIPEA(657μL，3.77mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将所得溶液用0.5N硫酸氢钾溶液(2×100mL)和盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中蒸发。将残余物通过快速色谱法(DCM-在DCM中的10％甲醇(v/v)梯度100:0升至0:100)纯化以得到呈无色油状物的标题化合物(1.27g，65％)。基于LC-MS的纯度为100％(ELSD)。
LRMS(m/z)：780[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：2.102
中间体2：
1-叠氮基-17,17-双((2-羧基乙氧基)甲基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酸
向1-叠氮基-17,17-双((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯(1.27g，1.63mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加TFA(5.0mL，65mmol)。将反应混合物在室温下搅拌。在1.5小时后，将反应混合物在真空中蒸发，与甲苯(3×10mL)和DCM(3×10mL)共蒸发以得到呈无色油状物的粗标题产物。
LRMS(m/z)：611[M+1]1+
中间体3：
(10-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-10-(13,13-二甲基-5,11-二氧代-2,12-二氧杂-6,10-二氮杂十四烷基)-5,15-二氧代-8,12-二氧杂-4,16-二氮杂十九烷-1,19-二基)二氨基甲酸二叔丁酯
将1-叠氮基-17,17-双((2-羧基乙氧基)甲基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酸(997mg，1.63mmol)、Oxyma Pure(1.04g，7.35mmol)和EDCI.HCl(1.17g，6.12mmol)溶解于DMF(10.0mL)中。接下来，添加DIPEA(1.99mL，11.4mmol)，随后直接添加N-BOC-1,3-丙二胺(1.07g，6.12mmol)在DMF(10.0mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将所得溶液用0.5N硫酸氢钾溶液(100mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2×100mL)和盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中蒸发。将残余物通过快速色谱法(DCM-在DCM中的10％甲醇(v/v)梯度0:100升至100:0，保持在100:0直到洗脱出产物)纯化以得到呈淡黄色粘性油状物的标题化合物(1.16g，66％)。LC-MS 99％(ELSD)。
LRMS(m/z)：1080[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：1.513
中间体4：
3,3'-((2-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))双(N-(3-氨基丙基)丙酰胺)三(2,2,2-三氟乙酸酯)的合成
向(10-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-10-(13,13-二甲基-5,11-二氧代-2,12-二氧杂-6,10-二氮杂十四烷基)-5,15-二氧代-8,12-二氧杂-4,16-二氮杂十九烷-1,19-二基)二氨基甲酸二叔丁酯(1.16g，1.08mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加TFA(10mL，131mmol)。将反应混合物在室温下搅拌。在2小时后，将反应混合物在真空中蒸发，与甲苯(3×10mL)和DCM(3×10mL)共蒸发以得到呈淡黄色粘性油状物的粗标题产物。
LRMS(m/z)：260[M+3]3+，390[M+2]2+，780[M+1]1+，
中间体5：
(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯
将5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸(根据J.Am.Chem Soc.[美国化学会志],2014,136,16958-16961获得，3.00g，6.70mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(926mg，8.05mmol)溶解于DCM(50mL)中。接下来，添加EDCI.HCl(1.54g，8.05mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(82mg，0.67mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用DCM稀释，并将所得溶液用0.5N硫酸氢钾溶液(150mL)、饱和碳酸氢钠溶液(150mL)和盐水(150mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中蒸发以得到呈白色泡沫的标题化合物(3.60g，99％)。基于LC-MS的纯度为99％(ELSD)。
LRMS(m/z)：545[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：1.073
中间体6：
[(3R,6R)-3,4-双(乙酰基氧基)-6-{4-[(3-{3-[2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-3-(2-{[3-(5-{[(2R,5R)-4,5-双(乙酰基氧基)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-3-乙酰胺基氧杂环己-2-基]氧基}戊酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[(2-{[3-(5-{[(2R,5R)-4,5-双(乙酰基氧基)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-3-乙酰胺基氧杂环己-2-基]氧基}戊酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙氧基)甲基]丙氧基]丙酰胺基}丙基)氨基甲酰基]丁氧基}-5-乙酰胺基氧杂环己-2-基]甲基乙酸酯
将3,3'-((2-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))双(N-(3-氨基丙基)丙酰胺)三(2,2,2-三氟乙酸酯)(1.21g，1.08mmol)溶解于DMF(10mL)和DIPEA(1.69mL，9.70mmol)的混合物中。接下来，添加(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯(2.20g，4.04mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过周末。接下来，将反应混合物在真空中蒸发并将残余物通过快速色谱法(DCM-在DCM中的30％甲醇(v/v)梯度0:100升至100:0)纯化以得到呈淡黄色泡沫的标题化合物(1.84g，83％)。LC-MS 95％(ELSD)。
LRMS(m/z)：2068[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：1.183
中间体7：
三价GalNAc-叠氮化物
将[(3R,6R)-3,4-双(乙酰基氧基)-6-{4-[(3-{3-[2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-3-(2-{[3-(5-{[(2R,5R)-4,5-双(乙酰基氧基)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-3-乙酰胺基氧杂环己-2-基]氧基}戊酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[(2-{[3-(5-{[(2R,5R)-4,5-双(乙酰基氧基)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-3-乙酰胺基氧杂环己-2-基]氧基}戊酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙氧基)甲基]丙氧基]丙酰胺基}丙基)氨基甲酰基]丁氧基}-5-乙酰胺基氧杂环己-2-基]甲基乙酸酯(300mg，0.145mmol)溶解于三乙胺(2.00mL，14.4mmol)、甲醇(2.00mL)和水(2.00mL)的混合物中，并将反应混合物在室温下搅拌。在2小时后，在真空中蒸发反应混合物。将残余物通过制备型MP-LC纯化。将对应于产物的2B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(164mg，67％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z)：1688[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.991A
三价GalNAc-SO1861和GalNAc-SO1861的合成(图2、4)
中间体8：
SO1861-NH2
将SO1861-叠氮化物(6.89mg，3.20μmol)溶解于32mM碳酸钾(150μL，4.80μmol)和乙腈(150μL)的混合物中。之后直接添加在THF中的1.0M三甲基膦溶液(32μL，32μmol)，并将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(5.30mg，78％)。基于LC-MS的纯度为94％。
LRMS(m/z)：1062[M-2]2-
LC-MS r.t.(min)：2.511B
中间体9：
SO1861-DBCO
向SO1861-胺(48.6mg，22.9μmol)和DBCO-NHS(13.0mg，32.4μmol)中添加DIPEA(5.98μL，34.3μmol)和DMF(2.0mL)的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在4小时后，将反应混合物用50mM碳酸氢钠(1.00mL，50μmol)的溶液稀释。将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(16.9mg，31％)。基于LC-MS的纯度为94％。
LRMS(m/z)：2412[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.451B
SO1861-L-三价GalNAc的合成
将SO1861-DBCO(7.50mg，3.11μmol)和三价GalNAc-叠氮化物(5.31mg，3.14μmol)溶解于水/乙腈(2:1，v/v，0.90mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的3B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(9.60mg，75％)。基于LC-MS的纯度为99％。
LRMS(m/z)：2050[M-2]2-
LC-MS r.t.(min)：2.041B
SO1861-L-GalNAc的合成
将SO1861-DBCO(1.75mg，0.73μmol)和GalNAc-PEG3-叠氮化物(0.82mg，2.18μmol)溶解于水/乙腈(1:1，v/v，1.00mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的3B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(1.63mg，81％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z)：2790[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.151B
三价GalNAc-BNA寡聚体的合成(图6、7)
中间体10：
4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-N-[2-(2-{2-[2-({4-[(E)-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)已酰胺基]亚氨基}甲基]苯基}甲酰胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基]-4-氧代丁酰胺
将4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-N-{2-[2-(2-{2-[(4-甲酰基苯基)甲酰胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}-4-氧代丁酰胺(25.0mg，40.9μmol)和EMCH.TFA(20.8mg，61.3μmol)溶解于甲醇(特干的，2.00mL)中。接下来，添加TFA(9.39μL，123μmol)。将反应混合物振荡1min并在室内静置过夜。使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(16.2mg，48％)。基于LC-MS的纯度为91％。
LRMS(m/z)：410.2[M+2]2+
LC-MS r.t.(min)：1.412
中间体11：
三价GalNAc-L-马来酰亚胺
将三价GalNAc-叠氮化物(20.3mg，12.0μmol)和4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-N-[2-(2-{2-[2-({4-[(E)-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)已酰胺基]亚氨基}甲基]苯基}甲酰胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基]-4-氧代丁酰胺(11.8mg，14.4μmol)溶解于水/乙腈(2:1，v/v，0.90mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的2C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(25.6mg，85％)。基于LC-MS的纯度为88％。
LRMS(m/z)：2101[M-405]1-，2304[M-202]1-，2507[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.901B(异构体引起的双峰)
中间体12：
三价GalNAc-S-马来酰亚胺
将三价GalNAc-叠氮化物(20.3mg，12.0μmol)和DBCO-马来酰亚胺(10.3mg，24.0μmol)溶解于水/乙腈(2:1，v/v，0.90mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的2D级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(22.2mg，87％)。基于LC-MS的纯度为85％。含有10％的水解马来酰亚胺。
LRMS(m/z)：2115[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.601B(异构体引起的双峰)
三价GalNAc-S-ApoB(或HSP27)BNA寡聚体的合成
向ApoB BNA寡聚体二硫化物(5.00mg，0.686μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)稀释，并将所得溶液直接添加到三价GalNAc-S-马来酰亚胺(3.02mg，1.43μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(6.75mg，定量)。基于LC-MS的纯度为94％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2318[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：1.651A
三价GalNAc-S-ApoB(或HSP27)加扰的BNA寡聚体的合成
向ApoB加扰的BNA寡聚体二硫化物(5.00mg，0.688μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)稀释，并将所得溶液直接添加到三价GalNAc-S-马来酰亚胺(3.09mg，1.46μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(5.91mg，93％)。基于LC-MS的纯度为88％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2311[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：1.601A
三价GalNAc-L-ApoB(或HSP27)BNA寡聚体的合成
向ApoB BNA寡聚体二硫化物(5.00mg，0.686μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)稀释，并将所得溶液直接添加到三价GalNAc-L-马来酰亚胺(3.63mg，1.45μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(6.68mg，定量)。基于LC-MS的纯度为99％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2416[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：1.971A
三价GalNAc-L-ApoB(或HSP27)加扰的BNA寡聚体的合成
向ApoB加扰的BNA寡聚体二硫化物(5.00mg，0.688μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)稀释，并将所得溶液直接添加到三价GalNAc-L-马来酰亚胺(3.68mg，1.47μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(4.71mg，71％)。基于LC-MS的纯度为96％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2409[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：1.931A
枝状物(-L-SO1861)4-三价GalNAc和枝状物(-L-SO1861)8-三价GalNAc的合成
中间体13：
三价GalNAc-胺甲酸盐
将三价GalNAc-叠氮化物(36.5mg，21.6μmol)溶解于碳酸钾(5.97mg，43.2μmol)在水(1.00mL)和乙腈(1.00mL)中的溶液中。接下来，添加在THF中的1.0M三甲基膦溶液(216μL，216μmol)，并将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在45min后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于水/乙腈(9:1，v/v，1mL)中。使所得溶液直接经受制备型MP-LC。将对应于产物的2B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(36.1mg，98％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z)：1662[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.621A
中间体14：
三价GalNAc-DBCO
将三价GalNAc-胺甲酸盐(17.4mg，10.2μmol)和DBCO-NHS(6.14mg，15.3μmol)溶解于NMM(2.24μL，20.3μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于水/乙腈(8:2，v/v，1mL)中。使所得溶液直接经受制备型MP-LC。将对应于产物的2C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(14.2mg，72％)。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z)：1950[M-1]1
LC-MS r.t.(min)：1.861B
中间体15：
枝状物(-L-SO1861)8-叠氮化物
将枝状物(-L-SO1861)8-胺(19.6mg，1.08μmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(4.17mg，10.8μmol)溶解于DMF(1.50mL)中。接下来，添加DIPEA(1.87μL，10.8μmol)，并将混合物振荡1min并在室温下静置过夜。使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(11.7mg，59％)。基于LC-MS的纯度为92％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2316[M-8]8-，2647[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：4.291A
枝状物(-L-SO1861)4-三价GalNAc的合成
将枝状物(-L-SO1861)4-叠氮化物(2.50mg，0.266μmol)和三价GalNAc-DBCO(1.56mg，0.799μmol)溶解于水/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.74mg，91％)。基于LC-MS的纯度为86％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2832[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：4.071A
枝状物(-L-SO1861)8-三价GalNAc的合成
将枝状物(-L-SO1861)8-叠氮化物(2.50mg，0.135μmol)和三价GalNAc-DBCO(0.79mg，0.405μmol)溶解于水/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.03mg，74％)。基于LC-MS的纯度为100％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2559[M-8]8-，2925[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：4.181A
枝状物(-L-SO1861)4-L-BNA寡聚体-三价GalNAc和枝状物(-L-SO1861)8-L-BNA寡聚体-三价GalNAc的合成
中间体16：
三价GalNAc-硫代乙酸酯
将三价GalNAc-胺甲酸盐(18.7mg，11.0μmol)和4-硝基苯基3-(乙酰基硫代)丙酸酯(5.90mg，21.9μmol)溶解于NMM(2.41μL，21.9μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于在水中的0.1％甲酸和在乙腈中的0.1％甲酸(9:1，v/v，1mL)的混合物中。使所得溶液直接经受制备型MP-LC。将对应于产物的2B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(13.0mg，66％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z)：1749[M-43]1-，1792[M-1]1
LC-MS r.t.(min)：1.241B
中间体17：
DBCO-TCO-三价GalNAc
将三价GalNAc-硫代乙酸酯(13.0mg，7.25μmol)溶解于甲醇(0.50mL)中。接下来，添加1M的氢氧化钠溶液(7.98μL，7.98μmol)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，将反应混合物添加到新鲜制备的三功能性接头(Ls-t)(即，是皂苷部分接头Ls的实例)(7.39mg，6.13μmol)在20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，2.00mL)中的溶液中。
三功能性接头具有IUPAC名称：5,8,11,18,21,24,27-七氧杂-2,14,30-三氮杂三十烷酸,14-[16-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-13,16-二氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十六碳-1-基]-33-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-15,31-二氧代-,(1R,4E)-4-环辛烯-1-基酯。三功能性接头具有以下式(XXI)：
Figure BDA0004086040580000811
将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的2A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(3.83mg，21％)。基于LC-MS的纯度为89％。
LRMS(m/z)：2409[M-546]1-，2955[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.661B
中间体18：
甲基四嗪-L-ApoB BNA寡聚体
向ApoB BNA寡聚体二硫化物(5.00mg，0.686μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵(1.50mL)稀释，并将所得混合物直接添加到(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(1.36mg，1.73μmol)在乙腈(0.5mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，将反应混合物冷冻并冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的粗标题产物。向粗产物中添加20mM碳酸氢铵的溶液(1.50mL)，并将所得悬浮液经0.45μm注射器过滤器过滤。将滤液冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的标题产物(5.44mg，定量)。基于LC-MS的纯度为90％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2648[M-3]3-
LC-MS r.t.(min)：0.624
中间体19：
甲基四嗪-L-ApoB加扰的BNA寡聚体
向ApoB加扰的BNA寡聚体二硫化物(5.00mg，0.688μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵(1.50mL)稀释，并将所得混合物直接添加到(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(1.34mg，1.70μmol)在乙腈(0.5mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，将反应混合物冷冻并冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的粗标题产物。向粗产物中添加20mM碳酸氢铵的溶液(1.50mL)，并将所得悬浮液经0.45μm注射器过滤器过滤。将滤液冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的标题产物(5.48mg，定量)。基于LC-MS的纯度为84％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2639[M-3]3-
LC-MS r.t.(min)：0.584
中间体20：
DBCO-L-ApoB BNA寡聚体-三价GalNAc
向甲基四嗪-L-ApoB BNA寡聚体(5.44mg，0.684μmol)和DBCO-TCO-三价GalNAc(2.03mg，0.687μmol)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.87mg，39％)。LC-MS显示具有正确m/z值的多个宽峰。
LRMS(m/z)：2175[M-5]5-，2718[M-6]4-
LC-MS r.t.(min)：2.60-3.001A
中间体21：
DBCO-L-ApoB加扰的BNA寡聚体-三价GalNAc
向甲基四嗪-L-ApoB加扰的BNA寡聚体(5.48mg，0.692μmol)和DBCO-TCO-三价GalNAc(1.80mg，0.609μmol)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.15mg，33％)。LC-MS显示具有正确m/z值的多个宽峰。
LRMS(m/z)：2169[M-5]5-，2711[M-6]4-
LC-MS r.t.(min)：2.58-3.201A
三价接头-L-SPT001-(阻断的TCO)-三价GalNAc的合成
中间体22(图25)
三价GalNAc-硫醇
将三价GalNAc-硫代乙酸酯(16.2mg，9.02μmol)溶解于甲醇(500μL)中。接下来，添加1.00M的氢氧化钠(11.0μL，11.0μmol)溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(13.1mg，83％)。基于LC-MS的纯度为98％。
LRMS(m/z)：1748[M-H]1-
LC-MS r.t.(min)：1.781A
中间体23：(图25)
DBCO-TCO-三价GalNAc
将三功能性接头(15.0mg，12.4μmol)溶解于乙腈(0.50mL)中。接下来，添加20mM碳酸氢铵的溶液(1.50mL)并将所得溶液直接转移到三价GalNAc-硫醇(22.7mg，13.0μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，将反应混合物冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的粗标题产物。基于LC-MS的纯度为84％。
LRMS(m/z)：2409[M-546]1-，2955[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.631B
中间体24(图26)：
N-(2-羟基乙基)-2-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)乙酰胺
向甲基四嗪-NHS酯(30.0mg，91.7μmol)在DMF(1.00mL)中的溶液中添加乙醇胺(11.1μL，0.184mmol)和三乙胺(25.5μL，0.183mmol)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈紫色固体的标题化合物(19.2mg，77％)。基于LC-MS的纯度为89％。
LRMS(m/z)：274[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：0.852
三价接头-L-SPT001-(阻断的TCO)-三价GalNAc
将DBCO-TCO-三价GalNAc(36.8mg，12.5μmol)在DMF(2.0mL)中的溶液中添加到SO1861-L-叠氮化物(26.8mg，12.5μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，添加N-(2-羟基乙基)-2-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)乙酰胺(4.08mg，14.9μmol)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(37.3mg，56％)。基于LC-MS的纯度为96％(区域异构体引起的双峰)。
LRMS(m/z)：2676[M-2]2-
LC-MS r.t.(min)：2.231B
三价接头-(阻断的DBCO)-BNA寡聚体-三价GalNAc的合成
中间体25(图27)：
甲基四嗪-BNA寡聚体
向硫醇-13-ApoB BNA寡聚体二硫化物(20mg，4.17μmol)中添加具有5.0mM TCEP(2.00mL，10.0μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，4×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵(3.00mL)稀释，并将所得混合物直接添加到(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(7.22mg，9.16μmol)在乙腈(1.0mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，将反应混合物冷冻并冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的粗标题产物。向粗产物中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(2:1，v/v，2.00mL)，并使所得溶液经受制备型LC-MS。将对应于产物的1A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的标题化合物(20.3mg，89％)。基于LC-MS的纯度为93％(宽峰)。
LRMS(m/z)：1817[M-3]3-
LC-MS r.t.(min)：0.593
中间体26(图27)：
(阻断的DBCO)-TCO-三价GalNAc
将1-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-11-醇(2.17mg，9.88μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液添加到DBCO-TCO-三价GalNAc(14.6mg，4.94μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(10.00mg，64％)。基于LC-MS的纯度为98％。
LRMS(m/z)：1750[片段]
LC-MS r.t.(min)：2.331B
三价接头-(阻断的DBCO)-BNA寡聚体-三价GalNAc
将(阻断的DBCO)-TCO-三价GalNAc(10.0mg，3.15μmol)和甲基四嗪-BNA寡聚体(10.0mg，1.83μmol)溶解于20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，将反应混合物冷冻并冻干过夜。将粗产物溶解于20mM碳酸氢铵(1mL)中，并使所得溶液直接经受制备型LC-MS。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(11.3mg，72％)。基于LC-MS的纯度为95％(区域异构体引起的多个(宽)峰)。
LRMS(m/z)：2149[M-4]4-，2866[M-3]3-
LC-MS r.t.(min)：2.921A
枝状物(-L-SO1861)4-胺(分子15)
将N,N'-((9S,19S)-14-(6-氨基己酰基)-1-巯基-9-(3-巯基丙酰胺基)-3,10,18-三氧代-4,11,14,17-四氮杂二十三烷-19,23-二基)双(3-巯基丙酰胺)甲酸酯(2.73mg，3.13μmol)溶解于20mM NH4HCO3与0.5mM TCEP/乙腈(3:1，v/v，3.00mL)的混合物中。接下来，添加SO1861-EMCH(29.2mg，0.014mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的3B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(12.3mg，43％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z)：1517[M-6]6-，1821[M-5]5-，2276[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：4.395A
枝状物(-L-SO1861)4-三价GalNAc(图33A-33C)和枝状物(-L-SO1861)8-三价GalNAc的合成
枝状物(-L-SO1861)4-叠氮化物(分子19)
基于枝状物(SPT001)4-NH2(分子15，图33B)合成枝状物(-L-SO1861)4-叠氮化物，其中以DIPEA作为碱用在DMF中的叠氮基-PEG4-NHS酯(分子18)处理该胺枝状物。
三价GalNAc-胺甲酸盐(图33C中的分子22)
将三价GalNAc-叠氮化物(36.5mg，21.6μmol，在图33C中的分子21)溶解于碳酸钾(5.97mg，43.2μmol)在水(1.00mL)和乙腈(1.00mL)中的溶液中。接下来，添加在THF中的1.0M三甲基膦溶液(216μL，216μmol)，并将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在45min后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于水/乙腈(9:1，v/v，1mL)中。使所得溶液直接经受制备型MP-LC。将对应于产物的2B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(36.1mg，98％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z)：1662[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.621A
三价GalNAc-DBCO(图33C中的分子23)
将三价GalNAc-胺甲酸盐(17.4mg，10.2μmol；分子22)和DBCO-NHS(6.14mg，15.3μmol；图33C中的分子10)溶解于NMM(2.24μL，20.3μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于水/乙腈(8:2，v/v，1mL)中。使所得溶液直接经受制备型MP-LC。将对应于产物的2C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(14.2mg，72％)。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z)：1950[M-1]1
LC-MS r.t.(min)：1.861B
枝状物(-L-SO1861)8-叠氮化物
将枝状物(-L-SO1861)8-胺(19.6mg，1.08μmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(4.17mg，10.8μmol)溶解于DMF(1.50mL)中。接下来，添加DIPEA(1.87μL，10.8μmol)，并将混合物振荡1min并在室温下静置过夜。使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(11.7mg，59％)。基于LC-MS的纯度为92％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2316[M-8]8-2647[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：4.291A
枝状物(-L-SO1861)4-三价GalNAc(图33C中的分子24)的合成
将枝状物(-L-SO1861)4-叠氮化物(2.50mg，0.266μmol；合成描述于图33A-33C中，图33C中的分子19)和三价GalNAc-DBCO(1.56mg，0.799μmol；图33C中的分子23)溶解于水/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.74mg，91％)。基于LC-MS的纯度为86％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2832[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：4.071A
枝状物(-L-SO1861)8-三价GalNAc的合成
将枝状物(-L-SO1861)8-叠氮化物(2.50mg，0.135μmol)和三价GalNAc-DBCO(0.79mg，0.405μmol；图33C中的分子23)溶解于水/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.03mg，74％)。基于LC-MS的纯度为100％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2559[M-8]8-，2925[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：4.181A
抗CD71-皂草毒蛋白的合成
从高级靶向系统公司(Advanced Targeting Systems)(加利福利亚州圣地亚哥)生产并购买定制CD71mab-皂草毒蛋白缀合物。CD71单克隆抗体购自InVivoMab，抗人CD71(OKT-9)，BioXCell公司。
HSP27BNA、ApoB和ApoB加扰、以及ApoB编号02寡聚体序列
HSP27(5'-GGCacagccagtgGCG-3')[SEQ ID NO:1](根据Zhang等人(2011)[YZhang,Z Qu,S Kim,V Shi,B Liao1,P Kraft,R Bandaru,Y Wu,LM Greenberger和IDHorak,Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid(LNA)-basedantisense oligonucleotides without transfection[使用基于锁核酸(LNA)的反义寡核苷酸在没有转染的情况下下调癌症靶标],Gene Therapy[基因疗法](2011)18,326-333]的反义BNA(HSP27)为BNA、更特别地BNANC，其具有寡聚体核酸序列5'-GGCacagccagtgGCG-3’)、ApoB(5'-GCCTCagtctgcttcGCACC-3')[SEQ ID NO:2]和ApoB加扰(5'-GGCCTctctacaccgCTCGT-3')[SEQ ID NO:3]、以及鼠和人序列相容的ApoB编号02(5′-GCattggtatTCA-3′)[SEQ ID NO:12]BNANC寡聚体订购自生物合成公司(Bio-SynthesisInc)(刘易斯维尔市(Lewisville)，德克萨斯州(Texas))，含有5'-硫醇C6接头，其中BNA碱基大写，并且骨架为完全硫代磷酸酯。
从人细胞培养物进行RNA分离和基因表达分析
根据标准方案(伯乐公司(Biorad))分离并分析来自细胞的RNA。使用的qPCR引物在表A2中指示。
表A2.qPCR中使用的引物在下面显示：
基因 引物 序列(5′-3′)
HSP27 正向 GCAGTCCAACGAGATCACCA[SEQ ID NO:4]
反向 TAAGGCTTTACTTGGCGGCA[SEQ ID NO:5]
ApoB 正向 AGGGTCCGGGAATCTGATGA[SEQ ID NO:6]
反向 TGGGCACGTTGTCTTTCAGAG[SEQ ID NO:7]
HBMS 正向 CACCCACACACAGCCTACTT[SEQ ID NO:8]
反向 GTACCCACGCGAATCACTCT[SEQ ID NO:9]
GUSB 正向 GAAAATACGTGGTTGGAGAGCT[SEQ ID NO:10]
反向 CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA[SEQ ID NO:11]
细胞活力测定(MTS)
在处理后，将细胞在37℃下孵育72小时，然后通过根据制造商的说明(CellTiter
Figure BDA0004086040580000891
单溶液细胞增殖测定，普洛麦格公司(Promega))进行的MTS测定确定细胞活力。简言之，将MTS溶液在DMEM中稀释20倍，该DMEM不含补充有10％FBS的苯酚红(PAN-Biotech GmbH公司)。每孔用200μL PBS洗涤细胞一次，然后每孔添加100μL稀释的MTS溶液。将平板在37℃下孵育大约20-30分钟。随后，在赛默科技公司(Thermo Scientific)的Multiskan FC板读取器(赛默科技公司)上测量492nm处的OD。为了定量，将“仅培养基”孔的背景信号从所有其他孔中减去，然后通过将经处理的孔的背景校正信号除以未处理的孔的背景校正信号(x100)计算经处理/未处理细胞的细胞活力百分比。
细胞活力测定(CTG)
在处理后，将细胞在37℃下孵育72小时，然后根据制造商的说明(
Figure BDA0004086040580000892
2.0细胞活力测定，普洛麦格公司)通过CTG测定确定细胞活力。简言之，首先将细胞板平衡至室温持续30分钟。接下来，向含有120μL处理培养基的每个孔中添加120μL CTG溶液。将板短暂混合(10秒，600rpm)并在室温下避光孵育大约10分钟。随后，在Spectramax ID5板读取器(分子仪器公司(Molecular Devices))上测量发光信号。为了定量，将“仅培养基”孔的背景信号从所有其他孔中减去，然后通过将经处理的孔的背景校正信号除以未处理的孔的背景校正信号(x100)计算经处理/未处理细胞的细胞活力百分比。
FACS分析
对于每种细胞系，将细胞以适当的密度接种在T75烧瓶中的补充有10％胎牛血清(PAN-Biotech GmbH公司)和1％青霉素/链霉素(PAN-Biotech GmbH公司)的DMEM(PAN-Biotech GmbH公司)中并孵育72-96小时(5％CO2，37℃)，直到达到90％的汇合。接下来，将细胞胰蛋白酶化(TryplE Express，吉布科赛默科技公司(Gibco Thermo Scientific))成单个细胞、转移至15mL falcon管并离心(1,400rpm，3min)。弃去上清液，同时将细胞沉淀浸没。将500.000个细胞转移至圆底FACS管并用3mL冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％FBS)洗涤。将细胞以1800rpm、4℃离心3min并重悬于200μL冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％FBS)或200μL抗体溶液(在195μL冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％FBS)中含有5μL抗体)中。将转铁蛋白受体使用PE抗人CD71(编号334106，生物传奇公司(Biolegend))染色，使用PE小鼠IgG2a、κ同种型对照FC(编号400212，生物传奇公司)作为其匹配的同种型对照。将ASGPR1受体使用PE抗人ASGPR1(编号130-122-963，美天旎公司(Miltenyi))染色并使用PE小鼠IgG1、同种型对照(编号130-113-762，美天旎公司)作为其匹配的同种型对照。将样品在4℃下孵育30min。之后用冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％FBS)将细胞洗涤2次，并在室温下使用在DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％FBS)中的2％PFA溶液固定20min。将细胞用冷DPBS洗涤1次并重悬于1000μL冷DPBS中用于FACS分析。使用希森美康公司(Sysmex)的Cube 8流式细胞仪系统(希森美康公司)和FCS Express 7研究版软件分析样品。FACS分析的结果总结在表A3中。
表A3.HepG2和Huh7细胞的ASPGR1和CD71的细胞膜受体表达水平
Figure BDA0004086040580000901
小鼠原代肝细胞处理
将冷冻保存的原代小鼠肝细胞(PRIMACYT细胞培养技术有限公司(PRIMACYT CellCulture Technology GmbH)，德国)在肝细胞解冻培养基(HTM，PRIMACYT细胞培养技术有限公司，德国)中解冻，并用肝细胞洗涤培养基(HWM，PRIMACYT细胞培养技术有限公司，德国)洗涤1次。将细胞以大约0.275x106个细胞/ml的密度重悬于肝细胞铺板培养基(HPM Cryo，PRIMACYT细胞培养技术有限公司，德国)中。将细胞接种到胶原I包被的板上，对于48或96孔板(Greiner BioOne公司)，密度为88.000个细胞/孔或26.400个细胞/孔。在开始处理前将细胞在37℃下预培养4-6小时，以允许细胞附接至细胞培养板。用315μl或108μl测定培养基(MHM，PRIMACYT细胞培养技术有限公司，德国)替代铺板培养基，之后添加来自在PBS中的10倍浓缩储备溶液的缀合物。将板在37℃下孵育72小时，将其收获用于基因表达和细胞活力分析。
人原代肝细胞处理
将冷冻保存的原代人肝细胞(细胞生物技术有限公司(Cytes BiotechnologiesS.L.)，西班牙)在肝细胞解冻培养基(细胞生物技术有限公司，西班牙)中解冻。将细胞重悬于肝细胞铺板培养基(细胞生物技术有限公司，西班牙)中。将细胞接种到胶原I包被的板上，对于48或96孔板(Greiner BioOne公司)，密度为215.600个细胞/孔或66.600个细胞/孔。在开始处理前将细胞在37℃下预培养4-6小时，以允许细胞附接至细胞培养板。用315μl或108μl维持培养基(细胞生物技术有限公司，西班牙)替代铺板培养基，之后添加来自在PBS中的10倍浓缩储备溶液的缀合物。将板在37℃下孵育72小时，将其收获用于基因表达和细胞活力分析。
从原代小鼠和人肝细胞进行RNA分离及基因表达分析
根据制造商的说明，使用TRI
Figure BDA0004086040580000911
溶液(赛默科技公司)从细胞分离RNA。使用标准方案使用iScriptTM cDNA合成试剂盒(伯乐公司)转化成cDNA。使用定量实时PCR测定(qRT-PCR)，使用iTaqTM通用/>
Figure BDA0004086040580000912
Green超混合物(伯乐公司)和Light Cycler 480(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，罗特克莱兹市(Rotkreuz)，瑞士)，用表A4中列出的特定DNA引物确定ApoB表达水平和特定肝细胞管家基因的水平。通过ΔCt方法进行分析以确定相对于2种肝细胞特异性管家对照mRNA的ApoB表达。每个分析反应以一式三份进行。
表A4.小鼠原代肝细胞的qPCR分析中使用的引物
ApoB编号02 正向 GCTAACACTAAGAACCAGAAGATC[SEQ ID NO:13]
反向 TGTCCGTCTAAGGATCCTGC[SEQ ID NO:14]
Mm PPIA 正向 GCGGCAGGTCCATCTACG[SEQ ID NO:15]
反向 GCCATCCAGCCATTCAGTC[SEQ ID NO:16]
Mm SDHA 正向 GAGGAAGCACACCCTCTCAT[SEQ ID NO:17]
反向 GGAGCGGATAGCAGGAGGTA[SEQ ID NO:18]
C57BL/6J模型中三价GalNAc-缀合物的体内耐受性和功效
·剂量施用和生命期。对治疗组每组8只C57BL/6J雄性小鼠以及媒介物对照组每组14只C57BL/6J雄性小鼠(到达大约6-7周和给药大约8-9周)给药。将根据表A5在PBS中配制的化合物或单独的PBS(媒介物)以5ml/kg在尾静脉中(静脉内，iv)给药，剂量体积与个体体重对应。在适用的情况下，在三价GalNAc-ApoB缀合物之后立即将三价GalNAc-SO1861-EMCH以5ml/kg在尾静脉(iv)中共同施用。每周对动物进行称重，并在前48小时内每天进行2-3次临床观察，并在此后每天至少进行一次，直到研究结束。
·血清、肝脏和肾组织的采样。在给药前(给药之前)以及给药后24小时、72小时、196小时和336小时对血液采样，并使用标准程序从采集的血液中产生血清用于生物标志物分析。在24小时和72小时的给药后时间点，将3只动物/时间点/治疗组和媒介物对照组中的6只动物处死以采集末端出血以及肝脏、肾脏和肠系膜淋巴结组织用于进一步分析。在336小时研究结束时，将剩余的2只动物(对照组中为4只)/组处死。将一半的肝脏和一个肾脏冷冻并用于组织RNA分析。
表A5.三价GalNAc-缀合物的体内耐受性和功效的实验设计
Figure BDA0004086040580000921
Figure BDA0004086040580000931
肝组织中的生物标志物RNA分析
根据制造商的说明，使用
Figure BDA0004086040580000933
试剂(赛默科技公司)从冷冻的肝组织中分离mRNA。使用iScriptTM cDNA合成试剂盒(伯乐公司)转化成cDNA。使用定量实时PCR测定(qRT-PCR)，使用iTaqTM通用/>
Figure BDA0004086040580000932
Green超混合物(伯乐公司)和Light Cycler 480(罗氏诊断公司，罗特克莱兹市，瑞士)，用表A5中列出的特定DNA引物确定ApoB表达水平和特定肝脏管家基因的水平。通过ΔCt方法进行分析以确定相对于2种肝脏特异性管家对照mRNA的ApoB表达。每个分析反应以一式三份进行。
表A6.肝脏组织的qPCR分析中使用的引物
ApoB编号02 正向 GCTAACACTAAGAACCAGAAGATC[SEQ ID NO:13]
反向 TGTCCGTCTAAGGATCCTGC[SEQ ID NO:14]
Mm RSP17 正向 GTGCGAGGAGATCGCCATTA[SEQ ID NO:19]
反向 ATCCGCTTCATCAGATGCGT[SEQ ID NO:20]
Mm SDHA 正向 GAGGAAGCACACCCTCTCAT[SEQ ID NO:17]
反向 GGAGCGGATAGCAGGAGGTA[SEQ ID NO:18]
生物标志物分析ApoB蛋白
根据制造商的说明，使用ApoB ELISA(ab230932，艾博抗公司(Abcam)，剑桥市(Cambridge)，英国)确定小鼠血清中的ApoB蛋白水平。注意，未分析1mg/kg ApoB编号02和0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB编号03+5mg/kg(GalNAc)3-SO861组在336小时时的样品。
生物标志物分析胆固醇
分别使用来自贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)的LDL-胆固醇特异性两步AU480测定试剂盒，根据制造商的说明用光度测量来测量小鼠血清中的LDL-胆固醇。
生物标志物分析胆固醇
使用来自贝克曼库尔特公司的AU480测定试剂盒(光度测量)，根据制造商的说明测量血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平。
序列表
<110> 萨普雷米科技有限公司（Sapreme Technologies B.V.）
<120> GalNAc和皂苷的缀合物、包含所述缀合物和GalNAc-寡核苷酸缀合物的治疗性组合物
<130> P6093957PCT
<150> NL 2025899
<151> 2020-06-24
<160> 20
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义BNA（HSP27）寡聚体核酸序列
<400> 1
ggcacagcca gtggcg 16
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> APOB BNA寡聚体
<400> 2
gcctcagtct gcttcgcacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> APOB加扰的BNA寡聚体
<400> 3
ggcctctcta caccgctcgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSP27引物正向序列
<400> 4
gcagtccaac gagatcacca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HSP27引物反向序列
<400> 5
taaggcttta cttggcggca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ApoB引物正向序列
<400> 6
agggtccggg aatctgatga 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ApoB引物反向序列
<400> 7
tgggcacgtt gtctttcaga g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBMS引物正向序列
<400> 8
cacccacaca cagcctactt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HBMS引物反向序列
<400> 9
gtacccacgc gaatcactct 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GUSB引物正向序列
<400> 10
gaaaatacgt ggttggagag ct 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GUSB引物反向序列
<400> 11
ccgagtgaag atcccctttt ta 22
<210> 12
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ApoB编号02
<400> 12
gcattggtat tca 13
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ApoB编号02正向引物
<400> 13
gctaacacta agaaccagaa gatc 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ApoB编号02反向引物
<400> 14
tgtccgtcta aggatcctgc 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mm PPIA正向引物
<400> 15
gcggcaggtc catctacg 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mm PPIA反向引物
<400> 16
gccatccagc cattcagtc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mm SDHA正向引物
<400> 17
gaggaagcac accctctcat 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mm SDHA反向引物
<400> 18
ggagcggata gcaggaggta 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mm RSP17正向引物
<400> 19
gtgcgaggag atcgccatta 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Mm RSP17反向引物
<400> 20
atccgcttca tcagatgcgt 20

Claims (57)

1.一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体共价连接的至少一个皂苷，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
2.如权利要求1所述的皂苷缀合物，其中该皂苷包含选自由以下组成的组的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸、
16α-羟基齐墩果酸、
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)、
16α,23-二羟基齐墩果酸、
丝石竹皂苷元、
皂皮酸、
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯、
洋地黄皂苷配基、
3,16,28-三羟基齐墩果烷-12-烯、
丝石竹酸、
及
其衍生物，
优选地，该皂苷包含选自皂皮酸和丝石竹皂苷元或其衍生物的苷元核心结构，更优选地，该皂苷苷元核心结构是皂皮酸或其衍生物。
3.如权利要求1或2所述的皂苷缀合物，其中
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自A组：
GlcA-、
Glc-、
Gal-、
Rha-(1→2)-Ara-、
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-、
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、及
其衍生物，
或
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自B组：
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-；
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-；
Ara-；
Xyl-；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-，其中R1是4E-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-，其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-，其中R3是4E-甲氧基肉桂酸；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-，其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-，其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-，其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-，其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-，其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-，其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-，其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-，其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-，其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-；及
其衍生物，
或
·该皂苷是双糖链三萜苷，该双糖链三萜苷包含与该苷元核心结构结合的选自A组的第一糖链并且包含与该苷元核心结构结合的选自B组的第二糖链。
4.如权利要求1-3中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷选自由以下组成的组：皂树树皮皂苷、川续断皂苷乙、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷甲、商陆皂苷甲、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶素、七叶素Ia、茶籽皂苷I、茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、毛地黄皂苷、报春花酸1和AS64R、其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物。
5.如权利要求3或4所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含含有已衍生化的醛基的苷元核心结构；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求3所定义的A组的糖链，该糖链包含已衍生化的羧基基团；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求3所定义的B组的糖链，该糖链包含已衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂皮皂素、皂苷集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物、及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是如权利要求2所述的皂皮酸皂苷或丝石竹皂苷元皂苷的皂苷衍生物，并由分子1表示：
Figure FDA0004086040560000061
其中
A1表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A1表示选自如权利要求3所定义的A组的糖链，更优选地A1表示选自如权利要求3所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成；
A2表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A2表示选自如权利要求3所定义的B组的糖链，更优选地A2表示选自如权利要求3所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团，如一个、两个、三个或四个乙酰氧基基团，
其中A1和A2中的至少一个不是氢，优选地A1和A2均为寡糖链；
并且R是丝石竹皂苷元中的氢或皂皮酸中的羟基；
其中该皂苷衍生物对应于该由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基已被衍生化；
ii.当A1表示选自如权利要求3所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化；及
iii.当A2表示选自如权利要求3所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个、优选地全部已被衍生化。
8.如权利要求7所述的皂苷缀合物，其中A1表示选自如权利要求3所定义的A组的糖链并且包含葡糖醛酸部分或由其组成，并且其中A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，和/或其中A2表示选自如权利要求3所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团，并且其中A2的至少一个乙酰氧基基团已被衍生化。
9.如权利要求7或8所述的皂苷缀合物，其中该由分子1表示的皂苷是双糖链三萜皂苷。
10.如权利要求7-9中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷衍生物对应于该由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基已通过以下衍生化：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷
-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.当A1表示选自如权利要求3所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD、或皂苷-Glu-AEM如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM；及
iii.当A2表示选自如权利要求3所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个、优选地全部已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化。
11.如权利要求7-10中任一项所述的皂苷缀合物，其中A1是Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA并且/或者A2是Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc，优选地该由分子1表示的皂苷是3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-葡糖醛酸吡喃基皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4OAc-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选地该皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、GE1741、SA1641和QS-21、或其衍生物，最优选SO1861或其衍生物。
12.如权利要求5-11中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求3所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD、或皂苷-Glu-AEM如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求3所定义的B组的糖链，该糖链包含已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合；
优选地，该皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含已通过与EMCH反应转化为腙键而衍生化的醛基，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化。
13.如权利要求12所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化的醛基，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求3所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AEM，如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM；或
iii.该皂苷衍生物包含衍生化i.和ii.的组合。
14.如权利要求12所述的皂苷缀合物，其中该皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含醛基并且其中该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求3所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化。
15.如权利要求1-12中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是由分子2表示的皂苷衍生物：
Figure FDA0004086040560000101
或其中该皂苷是由分子3表示的皂苷衍生物：
Figure FDA0004086040560000111
16.如权利要求1-15中任一项所述的皂苷缀合物，其中该至少一个皂苷和该ASGPR的配体直接或经由至少一个接头共价连接。
17.如权利要求1-16中任一项所述的皂苷缀合物，其中该GalNAc部分优选地经由皂苷接头Ls与该皂苷S结合，如式(II)S中所示：
Figure FDA0004086040560000112
18.如权利要求1-16中任一项所述的皂苷缀合物，其中该GalNAc部分各自分别经由该GalNAc部分的位置“1”上的氧与中心桥接部分B共价结合，该中心桥接部分B优选地经由皂苷部分接头LS在该GalNAc部分与该皂苷部分之间有效地形成桥，如式(III)S中所示：
Figure FDA0004086040560000121
其中n是大于或等于2的整数，优选地n是3，LS是皂苷部分接头，并且S是该皂苷部分。
19.如权利要求18所述的皂苷缀合物，其中该GalNAc部分经由GalNAc接头LGAL与该桥接部分B结合，如式(IV)S中所示：
Figure FDA0004086040560000122
其中n是大于或等于2的整数，优选地n是3，LS是皂苷部分接头，并且S是该皂苷部分。
20.如权利要求17-19中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷部分接头Ls表示适合用于使皂苷与如式(II)S中的GalNAc或与如式(III)S和(IV)S中的该桥接部分B共价结合的任何化学部分。
21.如权利要求17-20中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷部分接头LS是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或该桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与该皂苷部分共价结合，其中LS1是与GalNAc或与该桥接部分B共价结合的该皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与该皂苷部分共价结合的该皂苷部分接头LS的前体。
22.如权利要求17-21中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷部分接头LS是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或该桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与该皂苷部分共价结合，其中该偶联反应选自由以下组成的组：叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环、非醛醇类型的羰基反应以及碳-碳双键的加成，优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环，更优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成或硫醇马来酰亚胺偶联。
23.如权利要求17-22中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷部分接头LS是第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或该桥接部分B共价结合，该第一前体LS1包含叠氮化物；该第二前体LS2与该皂苷部分共价结合，该第二前体LS2包含炔烃并且优选地包含由酰肼/醛与该皂苷部分的醛偶联产生的腙。
24.如权利要求21-23中任一项所述的皂苷缀合物，其中该前体LS1的结构是以下具有式(XVII)的叠氮化物：
Figure FDA0004086040560000131
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示选自1、2和3的整数，更优选地a表示2，或
其中该前体LS1的结构包含以下具有式(XVIII)的叠氮化物：
Figure FDA0004086040560000132
其中c表示大于或等于0的整数，优选地c表示5-15范围内的整数，更优选地c表示9。
25.如权利要求21-24中任一项所述的皂苷缀合物，其中该前体LS2的结构包含以下具有式(XIX)的腙：
Figure FDA0004086040560000141
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示2-6范围内的整数，更优选地a表示4，并且其中LS2a表示含炔烃部分。
26.如权利要求25所述的皂苷缀合物，其中LS2a包含少于20个碳原子，优选地LS2a表示根据式(XX)的部分：
Figure FDA0004086040560000142
27.如权利要求18-26中任一项所述的皂苷缀合物，其中该桥接部分是具有式(XV)的化合物：
Figure FDA0004086040560000143
其中该具有式(XV)的化合物的氧原子与GalNAc或该GalNAc接头LGAL结合，并且该具有式(XV)的化合物的氮原子与该皂苷部分接头LS结合。
28.如权利要求19-27中任一项所述的皂苷缀合物，其中LGAL表示适合用于使GalNAc与该桥接部分B共价结合的任何化学部分。
29.如权利要求19-28中任一项所述的皂苷缀合物，其中LGAL包含2-25个碳原子、优选地7-15个碳原子、更优选地11个碳原子，并且其中LGAL包含至少一个、优选两个酰胺部分。
30.如权利要求19-29中任一项所述的皂苷缀合物，其中LGAL是根据式(XVI)的化合物：
Figure FDA0004086040560000151
31.如权利要求17-30中任一项所述的皂苷缀合物，其中该ASGPR的配体是由分子I’表示的(GalNAc)3Tris：
Figure FDA0004086040560000152
或其中该ASGPR的配体是由分子II’表示的单GalNAc：
Figure FDA0004086040560000161
32.如权利要求1-31中任一项所述的皂苷缀合物，其中该至少一个皂苷经由由分子III’表示的接头与如权利要求31所述的分子I’或分子II’共价结合：
Figure FDA0004086040560000162
其中分子III’的酰肼部分与该皂苷中的醛基形成共价腙键，并且其中二苯并环辛炔基团与分子I’或分子II’的叠氮化物基团形成共价键。
33.如权利要求1-32中任一项所述的皂苷缀合物，其中该至少一个皂苷与该ASGPR的配体经由至少一个可切割接头共价结合。
34.如权利要求33所述的皂苷缀合物，其中该可切割接头在酸性条件、还原性条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键，和/或易于蛋白水解、例如由组织蛋白酶B进行的蛋白水解的键，和/或在还原性条件下易于切割的键，如二硫键。
35.如权利要求33或34所述的皂苷缀合物，其中该可切割接头在酸性条件下，例如像存在于哺乳动物细胞、优选地人细胞的内体和/或溶酶体中经受体内切割，优选地该可切割接头在pH 4.0-6.5下、并且更优选地在pH≤5.5下经受体内切割。
36.如权利要求1-35中任一项所述的皂苷缀合物，其中该缀合物包含1、2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个皂苷部分，或其间的任何数目的皂苷部分，如7、9、12个皂苷部分。
37.一种药物组合，该药物组合包含：
-第一药物组合物，该第一药物组合物包含如权利要求1-36中任一项所述的皂苷缀合物并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂；及
-第二药物组合物，该第二药物组合物包含效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
38.一种药物组合物，该药物组合物包含：
-如权利要求1-36中任一项所述的皂苷缀合物；
-效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
39.如权利要求37所述的药物组合或如权利要求38所述的药物组合物，其中该效应分子包含以下中的至少一个或由其组成：小分子如药物分子、毒素如蛋白质毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质、或其任何组合，优选地，该效应分子是毒素、酶或寡核苷酸。
40.如权利要求37或39所述的药物组合或如权利要求38或39所述的药物组合物，其中该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或是(GalNAc)3Tris，和/或其中该ASGPR的配体和该效应分子经由共价键、优选经由至少一个接头缀合。
41.如权利要求37或39-40中任一项所述的药物组合或如权利要求38-40中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是选自以下中的任一个或多个的寡核苷酸：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹形微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-O,4’-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA、以及基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
42.如权利要求37或39-41中任一项所述的药物组合或如权利要求38-41中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是选自以下中的任一个或多个的寡核苷酸：抗miRNA、BNA-AON或siRNA，如基于BNA的siRNA，该siRNA选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA、和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
43.如权利要求37或39-42中任一项所述的药物组合或如权利要求38-42中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够使以下基因中的任一种沉默的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)、HSP27、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)、δ-氨基乙酰丙酸合成酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向异常miRNA的寡核苷酸。
44.如权利要求37或39-43中任一项所述的药物组合或如权利要求38-43中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是寡核苷酸、优选地siRNA如基于BNA的siRNA，或反义寡核苷酸如基于BNA的反义寡核苷酸，例如基于2'-O,4’-氨基乙烯桥接核酸的AON，优选地当存在于哺乳动物细胞内时其能够使基因载脂蛋白B(apoB)沉默。
45.如权利要求37或39-44中任一项所述的药物组合或如权利要求38-44中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是寡核苷酸，该寡核苷酸例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向参与以下蛋白质中的任一种的表达的mRNA：apoB、HSP27、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT和LDH，或例如当存在于哺乳动物细胞内时能够拮抗或恢复miRNA功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻抑onco-miR的表达。
46.如权利要求37或39-45中任一项所述的药物组合或如权利要求38-45中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是寡核苷酸、优选地siRNA如基于BNA的siRNA，或反义寡核苷酸如基于BNA的反义寡核苷酸，例如基于2'-O,4’-氨基乙烯桥接核酸的AON，优选地当存在于哺乳动物细胞内时其能够靶向参与蛋白质apoB的表达的mRNA。
47.如权利要求37或39-46中任一项所述的药物组合或如权利要求38-46中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是或包含毒素，该毒素包含至少一种分子或由其组成，该分子选自以下中的任一种或多种：肽、蛋白质、酶如脲酶和Cre重组酶、朊毒素、核糖体失活蛋白、和/或细菌毒素、植物毒素，更优选地选自以下中的任一种或多种：病毒毒素，如凋亡蛋白；细菌毒素，如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，如α-八叠球菌素；植物毒素，包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，如香石竹毒蛋白，例如香石竹毒蛋白-30或香石竹毒蛋白-32；皂草毒蛋白，例如皂草毒蛋白-S3或皂草毒蛋白-S6；三角梅核糖体失活蛋白或三角梅核糖体失活蛋白的去免疫化衍生物去三角梅核糖体失活蛋白、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、蒴莲根毒素、蒴莲根毒素A链、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白、蒴莲根毒蛋白A链、槲寄生凝集素、槲寄生凝集素A链；或动物或人毒素，如青蛙核糖核酸酶、或来自人的颗粒酶B或血管生成蛋白，或其任何片段或衍生物；优选地，该蛋白质毒素是香石竹毒蛋白和/或皂草毒蛋白，和/或包含以下中的至少一种或由其组成：靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素，更优选地以下中的任一种或多种：恩美、帕舒托、美登木素生物碱衍生物DM1、美登木素生物碱衍生物DM4、单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE，维多汀)、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF，莫福汀)、卡奇霉素、N-乙酰基-γ-卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0004086040560000201
(PBD)二聚体、苯并二氮杂/>
Figure FDA0004086040560000202
、CC-1065类似物、多卡米星、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、微管溶素、吲哚啉并苯并二氮杂/>
Figure FDA0004086040560000203
、AZ13599185、念珠藻素、根瘤菌素、氨甲蝶呤、蒽环素、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依喜替康、截短形式的铜绿假单胞菌外毒素(PE38)、多卡米星衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、剪接抑制素、泰兰斯他汀、奥佐米星、特司林、安伯他汀269和索星、或其衍生物。
48.如权利要求37或39-47中任一项所述的药物组合或如权利要求38-47中任一项所述的药物组合物，其中该第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子是细胞表面分子的配体或包含用于细胞表面分子的结合位点的抗体或其包含该结合位点的至少一个结构域或片段。
49.如权利要求37或39-48中任一项所述的药物组合或如权利要求38-48中任一项所述的药物组合物，其中该第三缀合物是以下中的任一个或多个：抗体-毒素缀合物、受体-配体-毒素缀合物、抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-核酸缀合物或受体-配体-核酸缀合物。
50.如权利要求37或39-49中任一项所述的药物组合或如权利要求38-49中任一项所述的药物组合物，其中该第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子能够与以下细胞表面分子中的任一种结合：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，优选地以下中的任一种：HER2、CD71、ASGPR和EGFR，更优选地CD71。
51.如权利要求37或39-50中任一项所述的药物组合或如权利要求38-50中任一项所述的药物组合物，其中该第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子是或包含以下中的任一种：抗体，优选地单克隆抗体如人单克隆抗体、IgG、包含以下或由以下组成的分子：单结构域抗体、至少一个VHH结构域、优选地骆驼VH、可变重链新抗原受体(VNAR)结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2和Fcab片段。
52.如权利要求37、39-51中任一项所述的药物组合或如权利要求38-51中任一项所述的药物组合物，其用作药物。
53.如权利要求37、39-51中任一项所述的药物组合或如权利要求38-51中任一项所述的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：apoB、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT和LDH。
54.如权利要求37、39-51或53中任一项所述的药物组合或如权利要求38-51或53中任一项所述的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及基因apoB的疾病或健康问题中使用。
55.如权利要求37、39-51中任一项所述的药物组合或如权利要求38-51中任一项所述的药物组合物、或用于如权利要求53所述使用的药物组合或药物组合物，其用于在治疗或预防以下中使用：癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、或自身免疫性疾病。
56.用于如权利要求53、54或55所述使用的药物组合或用于如权利要求53、54或55所述使用的药物组合物，其中该皂苷是皂苷衍生物、优选地如权利要求4-15中任一项所述的QS-21衍生物或SO1861衍生物。
57.一种体外或离体方法，该方法用于将如权利要求37-51中任一项所述的第二缀合物或第三缀合物从细胞外转移到所述细胞内，优选地随后将如权利要求37-51中任一项所述的第二缀合物或第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面上表达ASGPR并且当将该第三缀合物转移到该细胞中时该细胞表达细胞表面分子，其中该第三缀合物包含用于与所述细胞表面分子结合的结合分子，该细胞优选地选自肝细胞、病毒感染细胞和肿瘤细胞；
b)提供如权利要求37-51中任一项所述的第二缀合物或第三缀合物用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供如权利要求1-36中任一项所述的皂苷缀合物；
d)使步骤a)的细胞与步骤b)的第二缀合物或第三缀合物以及步骤c)的皂苷缀合物在体外或离体接触，从而实现将该第二缀合物或该第三缀合物从该细胞外转移到所述细胞中，并且优选地从而随后实现将该第二缀合物或该第三缀合物转移到所述细胞的胞质溶胶中，或者优选地从而随后实现将至少该第二缀合物或该第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中。
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