KR20220038744A - 치료 윈도우가 개선된 사포닌 유도체 - Google Patents

치료 윈도우가 개선된 사포닌 유도체 Download PDF

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KR20220038744A
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루벤 포스텔
가이 허먼스
헨드릭 푸치스
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사프렘 테크놀로지스 비.브이.
샤리떼 우니베지테츠메디친 베를린
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Abstract

본 발명은 트리테르펜 아글리콘 및 제1 당류 사슬 및/또는 제2 당류 사슬을 포함하고, 유도체화된 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조물; 및/또는 유도체화된 카르복실기를 포함하는 제1 당류 사슬; 및/또는 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시기를 포함하는 제2 당류 사슬을 포함하는 사포닌 기반 사포닌 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 사포닌 유도체를 포함하는 제1 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 제1 약학 조성물 및 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 어느 하나 이상을 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는 약학 조합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한, 또는 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥소산뇨증, 혈우병 A, 혈우병 B, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증, 또는 자가 면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 제1 약학 조성물 또는 본 발명의 약학 조합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포를 분자와 접촉시키고, 본 발명의 사포닌 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 외부로부터 상기 세포 내부로 분자를 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.

Description

치료 윈도우가 개선된 사포닌 유도체
본 발명은 트리테르펜 아글리콘 및 제1 당류 사슬 및/또는 제2 당류 사슬을 포함하고, 유도체화된 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조물을 포함하는 사포닌에 기반한 사포닌 유도체에 관한 것이며; 그리고/또는 제1 당류 사슬은 유도체화된 카르복실기를 포함하며; 그리고/또는 제2 당류 사슬은 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시기를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 사포닌 유도체를 포함하는 제1 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 제1 약학 조성물 및 제2 약학 조성물로서 항체-독소 접합체, 수용체-리간드-독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 어느 하나 이상을 포함하는 제2 약학 조성물을 포함하는 약학 조합물(pharmaceutical combination)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증(hyperoxaluria), 혈우병 A, 혈우병 B, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증 또는 자가 면역 질환의 치료 또는 예방에 의약으로서 사용하기 위한, 또는 상기 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 제1 약학 조성물 또는 약학 조합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포를 본 발명의 분자 및 사포닌 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 외부에서 세포 내부로 분자를 전달하는 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 방법에 관한 것이다.
표적종양치료는 암세포의 성장과 생존에 관여하는 특정 유전자와 단백질을 표적으로 하는 약물을 사용하는 암 치료이다. 표적 모이어티로서 항체를 함유하는 표적 독소인 면역독소는, 종양 특이적 항원에 대한 항체의 특이성을 결합하여 목적으로 하는 작용 지점으로 독소를 채널링할 수 있고, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 및 보체-의존성 세포독성과 같은 세포 사멸 메커니즘을 추가로 도입할 수 있기 때문에 매우 유망하다. 그 효과를 나타내기 위해서는, 독소가 내재화 후 세포질로 방출되어야 한다. 주요 결점은 페이로드를 보유하는 표적화 모이어티가 종종 완전히 내재화되지 않고, 내재화 후 표면으로 직접 재순환되거나, 리소좀에서 분해되어, 페이로드가 세포 세포질로 충분히 전달되는 것을 방해한다는 것이다. 종양 세포에 대한 독성 페이로드 농도를 보장하고, 불충분한 세포질 진입을 극복하기 위해, 표적 독소의 높은 혈청 수준이 종종 요구되어, 특히 면역원성 및 혈관 누출 증후군을 포함하는 심각한 부작용을 초래한다. 따라서, 항체-약물 접합체(ADC)로 암 환자를 치료할 때 충분히 넓은 치료 윈도우가 우려 사항으로 남아 있다.
불충분한 세포질 진입의 결점에 대처하기 위해, 예를 들어 생합성 경로의 내인성 세포막 수송 복합체로 독소의 재지정, 엔도솜 파괴, 엔도솜 막의 막 완전성 약화, 또는 세포 침투성 펩티드의 사용과 관련된 몇 가지 전략이 개발되었다.
예를 들어, 사포닌과 같은 글리코실화된 트리테르펜은 종양 치료에서 리보솜 불활성화 단백질(RIP)과 같은 표적 독소에 대한 엔도솜 탈출 증강제로 작용하는 것으로 밝혀졌다. 사포닌의 구조적 활성 관계 분석은 다음과 같은 핵심 구조 요소의 존재가 사포닌이 RIP의 세포독성을 향상시키는 능력에 유익한 것으로 나타났다(화학식 (I) 참조, 여기서 X1 = H 또는 OH이고, X2 = 다당류 모이어티임):
- 글루쿠론산을 함유하는 C-3에서의 분지형 삼당류
- C-4에서의 알데히드
- C-28에서의 카르복시기
- 아세틸기를 함유하는 적어도 4개의 당 모이어티의 C-28 위치에 연결된 다당류 모이어티(R2).
Figure pct00001
화학식 (I)
특히, 트리테르페노이드 사포닌인 SO1861(화학식 II, 때때로 SPT001이라고도 함)은 종양 세포 표적 독소의 엔도솜 탈출을 향상시키는 강력한 분자로 확인되었다. 인핸서 메커니즘에 대한 이중 효과는 다음과 같이 추정된다. 첫째, 엔도솜 탈출의 직접적인 증가로 카스파제 의존적 세포자멸사가 일어나는 것, 둘째, 카텝신 및 기타 가수분해물의 방출 후에 촉발되는 리소솜 매개 세포 사멸 경로 후 리소좀 막의 파괴와 결합되는 것이다.
Figure pct00002
화학식 (II)
엔도솜 탈출 증강제로서 사포닌의 적용은 이러한 사포닌이 적혈구 막을 파열시키는 능력이 있다는 인식에 기초한다. 그러나, 동시에, 사포닌의 세포 파열 활성은 이러한 사포닌으로 대상자를 치료할 때 부작용(위험)에 기여하고, 이에 따라 치료 지수를 제한하는 관점에서 최적의 치료 윈도우에 영향을 미친다. 실제로, 항종양 요법을 필요로 하는 환자에게 투여될 때, 이러한 사포닌의 세포외 및/또는 세포내 독성은 예를 들어 최적의 투여 요법 및 투여 경로 및 빈도를 고려할 때 우려된다.
트리테르펜 골격의 구조, 펜타시클릭 C30 테르펜 골격(사포게닌 또는 아글리콘이라고도 함), 당류 측쇄의 수와 길이, 골격에 연결된 당 잔기의 유형 및 연결 변이체를 포함한 사포닌 자체의 화학적 조성의 모든 특성은 이러한 사포닌의 용혈 가능성 및/또는 세포독성에 기여한다.
사포닌은 세포의 엔도솜과 세포질을 고려할 때 그 자체로 표적 특이적이지 않으며, 사포닌은 예상대로 그리고 동일한 투여 경로가 고려될 수 있는 경우에도 가장 흔히 표적 독소와 다른 동역학을 가진 피험자에 분포된다. 따라서, 예를 들어 ADC 및 사포닌을 포함하는 치료 조합을 이를 필요로 하는 환자에게 적용 후, 사포닌 분자는 특이성이 표적화된 독소에 의해서만 매개된다는 것을 의미하는 모든 기관에서 발견될 수 있다. 전신의 사포닌 분포는 표적 세포의 특정 축적과 비교할 때 성공적인 치료를 위해 더 높은 농도를 필요로 한다. 따라서, 적절한 치료 윈도우를 얻기 위해, 체내에 사포닌이 전신적으로 적용된다는 관점에서 성공적인 적용을 위해서는 변형 사포닌의 독성이 충분히 낮아야 한다.
따라서, 사포닌을 예를 들어 ADC와 함께 병용 투여가 고려되는 경우, 치료 지수를 개선할 필요가 여전히 존재한다: ADC의 세포독성 효과의 강화가 고려되는 경우, 충분한 효능을 유지하면서 동시에 사포닌의 세포독성을 더 잘 제어(또는 더 우수하게: 더 낮게) 할 필요가 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 변형된 사포닌, 즉
- 사포닌의 아글리콘의 C-3에 결합되고, 변형된 글루쿠론산을 함유하는 분지된 삼당류 모이어티; 및/또는
- 사포닌의 아글리콘의 C-4에 변형된 알데히드; 및/또는
- 사포닌의 아글리콘의 C-28 위치에 결합되고, 상기 다당류 모이어티에 변형된 아세톡시기를 함유하는 다당류 모이어티
를 갖는, 사포닌 유도체가, 사포닌 유도체와 접촉된 세포의 세포 생존율이 고려될 경우, 감소된 독성을 가지며, 예를 들어 독소 세포독성 또는 BNA 매개 유전자 침묵의 강화가 고려될 경우, 활성을 가지며(어떤 이론에 구속되기를 원하지 않음: 변형된 사포닌의 유사하거나 개선된 엔도솜 탈출 증진 활성과 관련됨), 그리고/또는 비변형된 사포닌의 독성, 활성 및 용혈성과 비교할 경우, 감소된 용혈 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 이와 함께, 본 발명자들은 세포 독성에 대한 IC50 값과 예를 들어, 독소 강화 또는 유전자 침묵 사이의 비율이 증가하기 때문에, 그리고/또는 사포닌 용혈 활성에 대한 IC50 값과 예를 들어, 독소 강화 또는 유전자 침묵 사이의 비율이 증가하기 때문에, 개선된 치료 윈도우를 갖는 사포닌 유도체를 제공한다.
본 발명의 제1 견지는 트리테르펜 아글리콘 코어 구조물 및 아글리콘 코어 구조물에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 사포닌 기반 사포닌 유도체에 관한 것으로, 여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조물을 포함하거나; 또는
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하거나; 또는
iii. 사포닌 유도체는 제2 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제2 당류 사슬은 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시(Me(CO)O-)기를 포함하거나; 또는
iv. 사포닌 유도체는 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합, 바람직하게는 2개의 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합을 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 독립적으로 선택된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 또는 비데스모시드 트리테르펜 글리코시드, 보다 바람직하게는 비데스모시드 트리테르펜 글리코시드이다.
본 발명의 제2 견지는 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 임의로 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제1 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제3 견지는
Figure pct00003
본 발명의 제1 약학 조성물; 및
Figure pct00004
항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 그리고 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제2 약학 조성물
을 포함하는 약학 조합물에 관한 것이다.
본 발명의 제4 견지는 본 발명의 사포닌 유도체를 포함하고, 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-핵산 접합체 또는 수용체-리간드 - 핵산 접합체 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하며, 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제3 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제5 견지는 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 제1 약학 조성물, 본 발명의 약학 조합물 또는 본 발명의 제3 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제6 견지는 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, 혈우병 A, 혈우병 B, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증 또는 자가 면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 제1 약학 조성물, 본 발명의 약학 조합물 또는 본 발명의 제3 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제7 견지는 하기 단계를 포함하는, 세포 외부로부터 상기 세포의 내부, 바람직하게는 상기 세포의 세포질 내로 분자를 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다:
a) 세포를 제공하는 단계;
b) 세포 외부에서 단계 a)에 제공된 세포로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계;
c) 본 발명에 따른 사포닌 유도체를 제공하는 단계;
d) 시험관내 또는 생체외에서 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 사포닌 유도체와 접촉시켜, 세포 외부로부터 상기 세포의 내로 분자의 전달을 확립하는 단계.
정의
"사포닌(saponin)"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기에서 사포게닌인 친유성 아글리콘 코어와 결합된 하나 이상의 친수성 글리콘 모이어티를 포함하는 양친매성 글리코시드의 그룹을 나타낸다. 사포닌은 자연 발생 또는 합성(즉, 비자연 발생)일 수 있다. "사포닌"이라는 용어는 자연 발생 사포닌, 자연 발생 사포닌의 유도체 및 화학적 및/또는 생명공학적 합성 경로를 통해 새로 합성된 사포닌을 포함한다.
용어 "변형된 사포닌(modified saponin)"은 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서, 변형된 사포닌의 제공을 위해 화학적 변형을 받기 전에 비-유도체화된 사포닌에 알데히드기, 카르복실기, 아세테이트기 및/또는 아세틸기 중 어는 것이 이전에 존재하였던 위치에 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 사포닌, 즉 사포닌 유도체를 지칭한다. 예를 들어, 변형된 사포닌은 변형된 사포닌의 기반이 되는 사포닌에서 알데히드기, 카르복실기, 아세테이트기 및/또는 아세틸기 중 어느 하나 이상의 화학적 변형에 의해 제공된다. 즉, 사포닌이 제공되며, 알데히드기, 카르복실기, 아세테이트기 및/또는 아세틸기 중 어느 것이 이와 함께 화학적으로 변형되어 변형된 사포닌을 제공한다. 예를 들어, 변형된 사포닌의 제공을 위해 변형된 사포닌은 자연 발생 사포닌이다. 전형적으로, 변형된 사포닌은 합성 사포닌이고, 전형적으로 변형된 사포닌은 자연 사포닌의 변형이므로, 자연 사포닌에서 유래하며, 그럼에도 불구하고 변형된 사포닌은 또한 합성 사포닌으로부터 유래될 수 있으며, 이는 자연 대응물을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 전형적으로, 변형된 사포닌은 자연 대응물을 갖지 않는다. 즉, 변형된 사포닌은 예를 들어 식물이나 나무에 의해 자연적으로 생성되지 않는다.
"아글리콘 코어 구조물(aglycone core structure)"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 하나 또는 두 개의 탄수화물 안테나 또는 당류 사슬(글리칸)이 결합되지 않은 사포닌의 아글리콘 코어를 지칭한다. 예를 들어, 퀼라산은 SO1861, QS-7 및 QS21의 아글리콘 코어 구조물이다. 전형적으로, 사포닌의 글리칸은 선형 또는 분지형 글리칸과 같은 단당류 또는 올리고당류이다.
"QS21"이라는 용어는 추가로 명시되지 않는 한, 도 41에 나타낸 구조식을 갖는 QS21의 이성질체 중 임의의 하나 뿐만 아니라 도 41에 나타낸 모든 이성질체와 같은 둘 이상의 혼합물을 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, QS21을 포함하는 전형적인 자연 추출물은 QS21의 상이한 이성질체의 혼합물을 포함할 것이다. 그러나, 정제 또는 (반)합성 경로를 통해 단일 이성질체를 분리할 수 있다.
"당류 사슬(saccharide chain)"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 글리칸, 탄수화물 안테나, 단일 당류 모이어티(단당류) 또는 다중 당류 모이어티(올리고당, 다당류)를 포함하는 사슬 중 어느 것을 나타낸다. 당류 사슬은 당류 모이어티로만 구성될 수 있거나, 예를 들어 QS-21에 존재하는 것과 같은, 4E-메톡시신남산, 4Z-메톡시신남산 및 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산) 중 어느 하나와 같은 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
"화학적으로 변형된(chemically modified)"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 제2 화학 기 또는 제2 화학 모이어티가 제공되도록 제1 화학 기 또는 제1 화학 모이어티의 화학적 변형을 지칭한다. 예를 들면 카르보닐기를 -(H)C-OH 기로 화학적으로 변형하는 것, 아세테이트기를 히드록실기로 화학적으로 변형하는 것, 화학 반응을 통해 알데히드기에서 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH) 모이어티와 접합된 사포닌을 제공하는 것 등이다.
"화학적으로 변형된 알데히드기(chemically modified aldehyde group)"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 사포닌의 알데히드기를 포함하는 화학 반응에 의해 생성되어 처음의 알데히드기가 새로운 화학 기로 대체되는 화학 반응 생성물을 의미한다. 예를 들어, 사포닌의 처음의 알데히드기에서 -(H)C-OH 기를 형성하는 것이다.
"화학적으로 변형된 카르복실기(chemically modified carboxyl group)"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기와 같은 사포닌의 카르복실기와 추가 분자를 포함하는 화학 반응에 의해 생성되어 처음의 카르복실기가 새로운 화학 기로 대체되는 화학 반응 생성물을 의미한다. 예를 들어, 사포닌과 사포닌의 글루쿠론산의 카르복실기를 포함하는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD), N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM) 또는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU) 중 어느 하나 사이의 접합체를 형성하는 것이다.
당류 사슬의 명칭과 관련하여 "Api/Xyl-" 또는 "Api- 또는 Xyl-"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 아피오스(Api) 모이어티를 포함하거나 자일로스(Xyl) 모이어티를 포함하는 당류 사슬을 나타낸다.
"변형된 사포닌의 기반이 되는 사포닌(saponin on which the modified saponin is based)"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 변형된 사포닌을 제공하기 위해 변형된 사포닌을 의미한다. 전형적으로, 변형된 사포닌의 기반이 되는 사포닌은 자연 발생 사포닌이며, 이는 변형된 사포닌을 제공하기 위해 화학적 변형을 거친다.
"사포닌에 기반한 변형된 사포닌(modified saponin based on a saponin)"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 변형된 사포닌이 제공되도록 화학적 변형 단계를 거친 사포닌을 지칭하며, 여기서는 변형된 사포닌이 만들어진 사포닌은 전형적으로 자연 발생 사포닌이다.
"올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 다른 것들 중에서 특히 BNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 짧거나 작은 간섭 RNA(siRNA, 침묵 RNA), 안티센스 DNA, 안티센스 RNA 등과 같은 단일 가닥 분자 또는 이중 가닥 분자로 존재하는, DNA, 변형 DNA, RNA, mRNA, 변형 RNA, 합성 핵산을 포함하는 핵산들의 어느 자연 또는 합성 스트링을 지칭한다.
"항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)" 또는 "ADC"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 IgG, Fab, scFv, 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 하나 이상의 VH 도메인, 단일 도메인 항체, VHH, 낙타류 VH 등과 같은 항체, 및 활성 약학 성분, 독소, 올리고뉴클레오티드, 효소, 소분자 약물 화합물 등과 같이 인간 환자와 같은 피험자의 세포와 접촉했을 때 치료 효과를 발휘할 수 있는 임의의 분자의 임의의 접합체를 지칭한다.
용어 "항체-올리고뉴클레오티드 접합체(antibody-oligonucleotide conjugate)" 또는 "AOC"는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 IgG, Fab, scFv, 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 하나 이상의 VH 도메인, 단일 도메인 항체, VHH, 낙타류 VH 등과 같은 항체, 및 BNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 짧거나 작은 간섭 RNA(siRNA, 침묵 RNA), 안티센스 DNA, 안티센스 RNA 등과 같은 단일 가닥 분자 또는 이중 가닥 분자로 존재하는, DNA, 변형 DNA, RNA, mRNA, 변형 RNA, 합성 핵산을 포함하는 핵산들의 자연 또는 합성 스트링으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드와 같이, 인간 환자와 같은 피험자의 세포와 접촉했을 때 치료 효과를 발휘할 수 있는 임의의 올리고뉴클레오티드 분자의 임의의 접합체를 지칭한다.
"이펙터 분자(effector molecule)" 또는 "이펙터 모이어티(effector moiety)"라는 용어는 예를 들어 공유 접합체의 일부로서 이펙터 분자를 지칭하며, 이의 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 예를 들어 표적 분자들: 단백질, 펩티드, 탄수화물, 글리칸과 같은 당류, (인)지질, 핵산, 예를 들어 DNA, RNA, 효소 중 어느 하나 이상에 선택적으로 결합할 수 있으며, 이러한 하나 이상의 표적 분자(들)의 생물학적 활성을 조절할 수 있는 분자를 지칭한다. 이펙터 분자는 예를 들어 약물 분자와 같은 소분자, 단백질 독소와 같은 독소, BNA, 제노 핵산 또는 siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 효소, 펩티드, 단백질, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 분자이다. 따라서, 예를 들어, 이펙터 분자 또는 이펙터 모이어티는, 표적 분자들: 단백질, 펩티드, 탄수화물, 글리칸과 같은 당류, (인)지질, 핵산, 예를 들어 DNA, RNA, 효소 중 어느 하나 이상에 선택적으로 결합할 수 있으며, 표적 분자에 결합시 이러한 하나 이상의 표적 분자(들)의 생물학적 활성을 조절할 수 있는 약물 분자와 같은 소분자, 단백질 독소와 같은 독소, BNA, 제노 핵산 또는 siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 효소, 펩티드, 단백질, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 분자 또는 모이어티이다. 전형적으로, 이펙터 분자는 인간 세포와 같은 포유동물 세포와 같은 세포 내부, 예를 들어 상기 세포의 세포질 내에서 생물학적 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, 전형적인 이펙터 분자는 약물 분자, 플라스미드 DNA, 항체-약물 접합체(ADC)에 의해 포함된 독소와 같은 독소, siRNA, BNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체(AOC)에 의해 포함된 핵산이다. 예를 들어, 이펙터 분자는 (세포내) 효소 활성, 유전자 발현 또는 세포 신호 전달을 증가 또는 감소시킬 수 있는 리간드로 작용할 수 있는 분자이다.
용어 "HSP27"은 세포에서 HSP27의 발현을 침묵시키는 BNA 분자에 관한 것이다.
"연결된 핵산(bridged nucleic acid)" 또는 약어로 "BNA", 또는 "잠금 핵산(locked nucleic acid)" 또는 약어로 "LNA"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 여기서는 변형된 RNA 뉴클레오티드를 나타낸다. BNA는 '약학된 RNA 분자(constrained RNA molecule)' 또는 '접근할 수 없는 RNA 분자(inaccessible RNA molecule)'라고도 한다. BNA 단량체는 "고정(fixed)" C3'-엔도 슈가 퍼커링(puckering)이 있는 5원, 6원 또는 7원 연결 구조를 함유할 수 있다. 연결은 2', 4'-BNA 단량체를 제공하기 위해 리보오스의 2', 4'-위치에 합성적으로 편입된다. BNA 단량체는 당업계에 공지된 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 올리고뉴클레오티드 중합체 구조에 편입될 수 있다. BNA는 결합 친화도 및 안정성이 증가된 구조적으로 단단한 올리고뉴클레오티드이다.
설명 및 청구범위에서 용어 첫 번째, 두 번째, 세 번째 등은 예를 들어 구성의 유사한 요소, 구성, 구성 요소, 또는 별도의 방법 단계를 구별하는 데 사용되며, 반드시 순차적 또는 연대순으로 설명할 필요는 없다. 용어들은 적절한 상황에서 상호 교환 가능하며, 본 발명의 구현들은 달리 명시되지 않는 한, 여기에 설명되거나 예시된 것과 다른 순서로 실시될 수 있다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 구현들은 달리 명시되지 않는 한, 조합 및 협력하여 실시될 수 있다.
또한, "바람직한" 또는 "예를 들어"로 지칭되지만 다양한 구현들 또는 "예를 들어" 또는 "특히" 등은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 본 발명이 구현될 수 있는 예시적인 방식으로 해석되어야 한다.
청구범위에 사용된 "포함하는"이라는 용어는 예를 들어 이후에 나열된 구성의 요소 또는 방법 단계 또는 구성 요소로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 특정 구성의 다른 요소나 방법 단계 또는 구성 요소를 배제하지 않는다. 언급된 특징, 정수, (방법) 단계 또는 구성요소의 존재를 명시하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 구성요소, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 따라서, "단계 A 및 B를 포함하는 방법"이라는 표현의 범위는 단계 A 및 B로만 구성된 방법으로 제한되어서는 안되며, 오히려 본 발명과 관련하여 방법의 열거된 단계는 A 및 B뿐이며, 또한 청구범위는 이러한 방법 단계의 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, "성분 A 및 B를 포함하는 조성물"이라는 표현의 범위는 성분 A 및 B로만 구성된 조성물로 제한되어서는 안되며, 오히려 본 발명과 관련하여 조성물의 열거된 성분은 A 및 B뿐이며, 또한 청구범위는 이들 구성요소의 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"에 의해 요소 또는 구성요소에 대한 언급은 문맥에서 단 하나의 존재가 있음을 분명히 요구하지 않는 한, 요소 또는 구성요소 중 하나 이상이 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
도 1: 분자 3A의 합성
도 2: 분자 6의 합성
도 3: 분자 8의 합성
도 4: 분자 9의 합성
도 5: 분자 10의 합성
도 6: 분자 11의 합성
도 7: 분자 12의 합성
도 8: 분자 14의 합성
도 9: 분자 15의 합성
도 10: 분자 16의 합성
도 11: 분자 18의 합성
도 12: 분자 19의 합성
도 13: 분자 20의 합성
도 14: 분자 21의 합성
도 15: 분자 6의 질량 크로마토그램
도 16: SO1861에서 시작하는 분자 6 합성의 질량 크로마토그램 세부 사항
도 17: 분자 6에서 시작하는 분자 9의 질량 크로마토그램의 세부 사항
도 18a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 5 pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 18b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 5pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 19a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 5 pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 19b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 5pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 20a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 5pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 20b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 5pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 21a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 21b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 22: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 측정된 사포닌 유도체의 용혈 활성
도 23a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 5pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 23b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 5pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 24a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 5pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 24b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 5pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도 존재하에서 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 25a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 25b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 26a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 26b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 27: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 측정된 사포닌 유도체의 용혈 활성
도 28: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 측정된 사포닌 유도체의 용혈 활성
도 29: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 측정된 사포닌 유도체의 용혈 활성
도 30a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 EGFR 발현 세포에 대한 5 pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 활성에 대한 IC50-곡선
도 30b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 EGFR 발현 세포에 대한 5 pM EGF-디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에서 사포닌 유도체의 활성에 대한 IC50-곡선
도 31a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 31b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 32: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 측정된 사포닌 유도체의 용혈 활성
도 33a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 5pM 세툭시맙-사포린 농도의 존재하에서 다양한 QS 사포닌 분획의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 33b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 5pM 세툭시맙-사포린 농도의 존재하에서 다양한 QS 사포닌 분획의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 34a: EGFR 발현 세포(HeLa)에 대한 QS 사포닌 분획의 독성에 대한 IC50-곡선
도 34b: EGFR 발현 세포(A431)에 대한 QS 사포닌 분획의 독성에 대한 IC50-곡선
도 35: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 측정된 QS 사포닌 분획의 용혈 활성
도 36: 분자 23의 합성
도 37: 분자 25의 합성
도 38: 분자 27의 합성
도 39: 분자 28의 합성
도 40a: 분자 29의 합성
도 40b: QS21-Ald-EMCH(분자 30)
도 40c: QS21-Glu-AMPD(분자 31)
도 40d: QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)(분자 32)
도 40e: QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(분자 33)
도 41: 4개의 QS-21 이성질체의 구조.
도 42: 임계 미셀 농도 측정: 단일 변형된 SO1861에 대한 ANS 형광 수율.
도 43: 임계 미셀 농도 측정: 이중 변형된 SO1861에 대한 ANS 형광 수율.
도 44: 임계 미셀 농도 측정: 삼중 변형된 SO1861에 대한 ANS 형광 수율.
도 45: 임계 미셀 농도 측정: QS 사포닌에 대한 ANS 형광 수율.
도 46: 임계 미셀 농도 측정: QS21에 대한 ANS 형광 수율.
도 47a: 임계 미셀 농도 측정: 변형된 QS21에 대한 ANS 형광 수율.
도 47b: 임계 미셀 농도 측정: 단일 변형된 QS21에 대한 ANS 형광 수율.
도 47c: 임계 미셀 농도 측정: 이중 변형된 QS21에 대한 ANS 형광 수율.
도 48: A431 세포에 대한 SO1861 또는 SO1861-EMCH + 10pM 세툭시맙-사포린의 세포 생존율 분석(MTS).
도 49: A431 세포에 대한 세툭시맙-디안틴 + 300 nM 및 4000 nM SO1861-EMCH의 세포 생존율 분석(MTS).
도 50: A431 세포에 대한 세툭시맙-사포린 + 300 nM 및 1500 nM SO1861 또는 4000 nM SO1861-EMCH의 세포 생존율 분석(MTS).
도 51: A431 세포에 대한 SO1861 또는 SO1861-EMCH + 10pM EGF디안틴의 세포 생존율 분석(MTS).
도 52a, b: A431 세포에 대한 EGF디안틴 + 10 nM, 300nM 및 1500 nM SO1861 또는 4829 nM SO1861-EMCH의 세포 생존율 분석(MTS).
도 53a, b: A431 세포에 대한 트라스투주맙-디안틴 또는 트라스투주맙-사포린 + 1500 nM SO1861 또는 4000 nM SO1861-EMCH의 세포 생존율 분석(MTS).
도 54: A431 세포에 대한 SO1861-EMCH + 100nM HSP27BNA, 100nM 세툭시맙-HSP27BNA의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 55: A431 세포에서 세툭시맙-HSP27BNA 접합체(DAR1.5 또는 DAR4) + 100nM SO1861-EMCH 또는 4000nM SO1861-EMCH의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 56: SK-BR-3 세포에 대한 트라스투주맙-HSP27BNA 접합체(DAR4.4) + 100 nM SO1861-EMCH 또는 4000 nM SO1861-EMCH의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 57a, b: A431 세포 및 A2058 세포에 대한 HSP27BNA + 4000 nM SO1861-EMCH의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 58: SK-BR-3 세포에 대한 HSP27BNA 또는 HSP27LNA + 4829 nM SO1861-EMCH의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 59: 분자 26의 합성.
도 60: EMCH 말레이미드기와 티올의 마이클 부가 반응의 일반 반응식(R = CH2-CH2-OH인 경우, 도 60은 SO1861-Ald-EMCH-차단(SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올)의 합성을 설명한다.).
도 61: (A) SO1861-Ald-EMCH 및 (B) SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼. (A) RP 모드: m/z 2124 Da([M+K]+, 사포닌-Ald-EMCH), m/z 2109 Da([M+K]+, SO1861-Ald-EMCH), m/z 2094 Da([M+Na]+, SO1861-EMCH). (B) RP 모드: m/z 2193 Da([M+K]+, 사포닌-Ald-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2185 Da([M+K]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2170 Da([M+Na]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올).
도 62: pH 3의 HCl 용액에서 가수분해 전(A) 및 후(B)의 SO1861-EMCH의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼
도 63. 비접합 사포닌-매개 엔도솜 탈출 및 표적 세포 사멸 향상. A) 1.5 pM EGF디안틴을 포함하거나 포함하지 않는 SO1861, SO1832, SO1862(SO1861의 이성질체) 또는 SO1904로 처리한 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존율 분석. B) EGF디안틴과 고정된 농도의 SO1861, SO1862(SO1861의 이성질체) 또는 SO1904로 처리된 eLa 세포(EGFR+)의 세포 생존율 분석. C) 1.5pM EGF디안틴이 있거나 없는 SO1861 또는 GE1741로 처리된 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존율 분석. D) 1.5pM EGF디안틴이 있거나 없는 다양한 QSmix(Quillaia Saponaria의 사포닌 혼합물)로 처리된 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존율 분석.
도 64. 비접합 SO1861 대 SO1861-Ald-EMCH 활성. 본 발명에 따른 EGFR 표적 안티센스 BNA 올리고 전달 및 암 세포에서의 유전자 침묵. A, B, C) 1.5pM EGF디안틴이 있거나 없는 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH로 처리된 A431(EGFR++), HeLa(EGFR+) 또는 A2058(EGFR-) 세포의 세포 생존율 분석. D, E) 1.5pM EGF디안틴이 있거나 없는 SO1861 또는 SO1861-L-N3(SO1861-N3 또는 SO1861-N3/아지드라고도 함)으로 처리된 A431(EGFR++) 또는 HeLa(EGFR+) 세포의 세포 생존율 분석.
도 65. 비접합 SO1861 대 SO1861-Ald-EMCH(불안정한 히드라존 결합) 대 SO1861-HATU(SO1861-(S)(안정) 및 SO1861-Glu-HATU라고도 함). EGF디안틴이 있거나 없는 SO1861, SO1861-Glu-HATU(SO1861-(S)(S=HATU)라고도 함) 및 SO1861-Ald-EMCH(SO1861 아글리콘 코어와 EMCH 링커 사이의 히드라존 결합은 불안정한 링커'라고도 함)로 처리된 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존율 분석.
본 발명은 특정 구현과 관련하여 설명될 것이지만, 본 발명은 이에 제한되지 않고 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
놀랍게도, 본 발명자들은 변형된 사포닌, 즉
- 사포닌의 아글리콘의 C-3에 결합되고, 변형된 글루쿠론산을 함유하는 분지된 삼당류 모이어티; 및/또는
- 사포닌의 아글리콘의 C-4에 변형된 알데히드; 및/또는
- 사포닌의 아글리콘의 C-28 위치에 결합되고, 상기 다당류 모이어티에 변형된 아세틸기를 함유하는 다당류 모이어티
를 갖는, 사포닌 유도체가, 사포닌 유도체와 접촉된 세포의 세포 생존율이 고려될 경우, 감소된 독성을 가지며, 만일 변형된 사포닌에서 상기 언급된 기들 중 하나 이상이 유도체화되는 경우(즉, 아글리콘의 알데히드기, 아글리콘의 C-3에 결합된 다당류 사슬의 글루쿠론산의 카르복실기, 및 아글리콘의 C-28에 결합된 다당류 사슬의 아세틸기 중 하나 또는 둘), 예를 들어 독소 세포독성 또는 BNA 매개 유전자 침묵의 강화가 고려될 경우, 활성을 가지며(어떤 이론에 구속되기를 원하지 않음: 변형된 사포닌의 유사하거나 개선된 엔도솜 탈출 증진 활성과 관련됨); 그리고/또는 비변형된 사포닌의 독성, 활성 및 용혈성과 비교할 경우, 감소된 용혈 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 이와 함께, 본 발명자들은 사포닌 유도체의 경우, 세포 독성이 자연 발생 대응물에 대해 측정된 세포 독성보다 낮고, 용혈 활성이 사포닌 유도체의 자연 발생 대응물에 대해 측정된 용혈 활성보다 낮고, 단일 유도체화된 사포닌과 이중 유도체화된 사포닌의 경우, 세포 독성에 대한 IC50 값과 예를 들어, 독소 강화 또는 유전자 침묵 사이의 비율이 유사하거나 증가하기 때문에, 그리고/또는 사포닌 용혈 활성에 대한 IC50 값과 예를 들어, 독소 강화 또는 유전자 침묵 사이의 비율이 유사하거나 증가하기 때문에, 개선된 치료 윈도우를 갖는 사포닌 유도체를 제공한다. 도 1-14 및 36-40과 함께 예시된 사포닌 유도체의 개요에 대해서는 표 A2를 참조하고, 세포독성, 용혈 활성 및 엔도솜 탈출 증진 활성('활성 '), 뿐만 아니라 다양한 세포에서 측정된, 세포독성에 대한 IC50과 활성에 대한 IC50 사이의 비율, 및 용혈 활성에 대한 IC50과 활성에 대한 IC50 사이의 비율에 대한 개요에 대해서는 표 A5 및 표A6을 참조바란다.
본 발명의 제1 견지는 트리테르펜 아글리콘 코어 구조물('아글리콘'으로도 지칭됨) 및 아글리콘 코어 구조물에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 사포닌 기반 사포닌 유도체에 관한 것으로, 여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조물을 포함하거나; 또는
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하거나; 또는
iii. 사포닌 유도체는 제2 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제2 당류 사슬은 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시(Me(CO)O-)기를 포함하거나; 또는
iv. 사포닌 유도체는 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합, 바람직하게는 2개의 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합을 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 독립적으로 선택된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 또는 비데스모시드 트리테르펜 글리코시드, 보다 바람직하게는 비데스모시드 트리테르펜 글리코시드이다.
놀랍게도, 사포닌의 아글리콘의 C-23에서 알데히드기, 아글리콘의 C-3에서 당류 모이어티의 카르복실기, 즉 글루쿠론산 모이어티, 및 사포닌의 아글리콘의 C-28에 결합된 (올리고-)당류 모이어티의 당류 단위의 아세틸기 중 어느 1개, 2개 또는 3개의 변형(유도체화)는 이러한 사포닌 유도체가 세포, 즉 다양한 유형의 세포와 접촉할 때 세포독성을 감소시킨다. 세포독성의 감소는 표 A2, 표 A3 및 도 1-14 및 36-40에 나열된 일련의 다양한 사포닌 유도체에 대해 본 발명자들에 의해 확립되었다. 따라서, 세포독성이 감소된 이러한 일련의 사포닌 유도체가 제공되는 것이 본 발명의 일부이며, 여기서 세포독성의 감소는 변형되지 않은 자연 발생 사포닌 대응물에 대해 측정된 세포독성에 상대적이다. 사포닌 유도체는 이러한 자연 발생 사포닌으로부터 형성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 사포닌 유도체는 SO1861 및 QS-21(아아이소폼)과 같이 자연에 존재하는 자연 발생 대응물과 비교할 때 1, 2 또는 3개의 유도체화를 포함한다. 세포독성의 감소가 고려될 때, 세포독성이 감소된 사포닌이 제공되어야 하는 경우, 위에 요약된 사포닌 분자의 부위에서 1, 2 또는 3개의 변형(유도체화)을 포함하는 사포닌 유도체가 동등하게 적합하다. 더욱이, 본 발명자들은, 놀랍게도 다양한 상이한 변형이 세포독성을 낮추고, 용혈 활성을 낮추고, 엔도솜 탈출 증진 활성을 충분히 보존하고 유지하는데 적합하다는 것을 확립하였다. 용혈 활성을 고려할 때, 세포 독성 감소와 유사하게, 사포닌에 표시된 화학 기 중 1, 2 또는 3개가 유도체화되면 용혈 활성이 감소한다. 이러한 유도는 표 A2, 표 A3 및 도 1-14 및 36-40에 설명된 유도체화와 같이 다양한 특성을 가질 수 있다. 히드록실기로의 환원에 의한 알데히드기의 유도체화만큼 작은 유도체화 및 AEM을 사용한 글루쿠론산의 카르복실기의 유도체화와 결합된 EMCH에 의한 알데히드기의 유도체화만큼 큰 유도체화 모두 세포독성 및 용혈 활성을 감소시킨다. 자연 발생 사포닌 대응물과 비교할 때 감소된 세포독성 측면에서 개선된 세포독성 및 감소된 용혈 활성 측면에서 개선된 용혈 활성을 갖는 사포닌 유도체를 제공하기 위해, 사포닌의 세 가지 화학 기 중 1, 2 또는 3개와 같이 어느 하나 이상이 다양한 크기 및/또는 다양한 화학적 특성을 갖는 다수의 다양한 화학 기에 의해 유도될 수 있다는 것은 명백하다.
어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 사포닌의 아글리콘의 C-3 원자에 있는 알데히드기는 사포닌의 비데스모시드 트리테르펜 글리코시드 유형의 엔도솜 탈출 증진 활성과 관련되고, 그리고/또는 기여하는 것으로 추정된다. 즉, 예를 들면, 시험관내 및 생체내 모두에서. 동일한 용량이 이러한 사포닌이 없는 동일한 세포에 접촉될 때의 이러한 독성과 비교하여, 이러한 사포닌의 존재하에 세포와 접촉할 때 (단백질) 독소의 증가된 독성을 나타내는 것으로 추정된다. 실제로, 본 발명자들은 글루쿠론산 단위에 유도체화된 카르복실기 및/또는 다당류 사슬에 유도체화된 아세틸기를 갖고 아글리콘에 유리 알데히드기를 포함하는 사포닌 유도체가 엔도솜 탈출 증진 활성을 갖는다는 것을 확립하였다. 이들 유도체는 용혈 활성을 감소시키고, 세포독성을 감소시킨다. 예를 들어, 분자 3A, 8, 11, 18, 19 및 28로서의 사포닌 유도체(표 A2, 표 A3, 표 A5, 표 A6, 도 1, 3, 6, 11, 12, 39)는 아글리콘 코어 내에 유리 비변형된 알데히드를 가지며, 실제로 항체가 결합하는 수용체를 발현하는 다양한 (종양) 세포와 접촉하는 항체-약물 접합체의 세포독성의 향상을 고려할 경우, 활성을 나타낸다. 따라서, 이러한 사포닌 유도체는 본 발명의 명백히 구상된 구현이다.
놀랍게도, 사포닌 유도체가 유리 알데히드기를 포함하지 않도록 아글리콘에 유도체화된 알데히드기를 갖는 사포닌 유도체도, 예를 들어, (종양) 세포에 ADC와 같은 리간드-독소 접합체의 형태로 이펙터 분자의 세포독성이 제공될 때, 특징적인 엔도솜 탈출 향상 활성을 여전히 나타내며, C-28에 있는 다당류 사슬의 아세틸기와 C-23에 있는 다당류 사슬의 카르복실기 중 아무 것도 유도체화되지 않거나 그 중 하나만 유도된다는 전제 조건이 있다. 예를 들어, 표 A2, 표 A3 및 도 2, 4, 5, 8, 9, 13, 38 및 40에서 분자 6, 9, 10, 14, 15, 20, 27 및 29로 표시된, 변형된 알데히드기를 갖고 추가 유도체화가 전혀 없거나 또는 단일의 추가 유도체화가 있는 사포닌 유도체는 아글리콘에서 유도체화된 알데히드기를 갖는 이러한 사포닌 유도체의 존재하에 종양 세포와 접촉하는 이펙터 분자의 세포독성 효과를 향상시키는 능력을 갖는다. 이들 모든 사포닌 유도체는 감소된 세포독성을 나타내고, 감소된 용혈 활성을 나타내므로, 본 발명의 명시적으로 예상되는 구현이다.
본 발명자들은 또한 특정 변형이 상응하는 비변형된 사포닌과 비교할 때 증가된 임계 미셀 농도(CMC)를 유도한다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 분자 2, 6, 8, 10, 15, 27 및 28로 표시된 사포닌 유도체, 바람직하게는 분자 2, 6, 8, 10 및 15로 표시된 사포닌 유도체는 상응하는 유도체화되지 않은 분자와 비교할 때 증가된 CMC를 가지므로, 본 발명의 명시적으로 예상되는 구현이다. 어떠한 이론에도 구속되지 않고, 증가된 CMC가 여러 가지 이유로 유리하다고 믿어진다. 예를 들어, 유리 분자는 일반적으로 미셀 구조로 정렬된 분자보다 접합 반응에 더 민감하기 때문에, 증가된 CMC는 후속 접합 반응에서 변형된 사포닌의 사용을 촉진할 수 있다. 또한, 사포닌 유도체가 생물학적 기능을 발휘해야 하는 경우(예: 생체 내 치료 또는 생체외 방법 또는 시험관내 방법), 예를 들어 사포닌 유도체를 그대로 사용하거나 또는 담체 또는 다른 개체(entity)로부터 절단된 후 원위치에서 방출되는 경우에도, 변형되지 않은 사포닌과 비교할 때 증가된 CMC는 유리 사포닌 분자가 이들 사포닌 유도체가 미셀 구조로 정렬된 경우보다 생물학적 표적과 상호작용하기 위해 더 쉽게 이용가능할 것이기 때문에 유리하다. 증가된 CMC는 또한 사포닌 유도체의 대규모 생산 및 농도를 촉진하는 데 유용할 수 있으며, 그 이유는 임계 미셀 농도를 초과(넘는)하는 농도에서 사포닌이 미셀을 형성하며, 이는 (예: 제조용 HPLC을 이용한) 분리를 방해하기 때문이다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 사포닌 유도체에 대해 관찰된 증가된 CMC는 증가된 세포독성 또는 용혈 활성과 연관되지 않았다. 예를 들어, de Groot et al.("Saponin interactions with model membrane systems-Langmuir monolayer studies, hemolysis and formation of ISCOMs"; Planta medica 82.18 (2016): 1496-1512.)의 표 2에 있는 데이터에서 볼 수 있듯이 CMC와 세포독성 사이의 관계는 예측할 수 없고 복잡하며, 이는 α-Hederin을 기준점으로 삼을 때, CMC의 증가가 (디지토닌의 경우와 같이) 일반적인 세포독성의 증가와 연관될 수 있지만 세포독성의 감소와 연관될 수도 있다(글리시리진 및 헤데라코사이드 C의 경우와 마찬가지로)는 것을 보여준다. 또한, 분자 2, 6, 10 및 15로 표시된 사포닌 유도체에 대해 증가된 CMC는 또한 상응하는 유리 사포닌과 비교하여 증가된 비율: IC50 용혈/IC50 활성과 연관되어, 이러한 사포닌 유도체가 특히 본 발명의 바람직한 구현이다.
따라서 본 발명자들은 세포독성이 고려될 때 및/또는 용혈 활성이 고려될 때, 그리고 예를 들어 독소와 같은 강화작용이 고려되는 경우, 향상된 치료 윈도우를 가지며, 그리고/또는상응하는 유도체화되지 않은 사포닌과 비교하여 증가된 CMC를 갖는 사포닌 유도체를 제공한다. 본 발명의 이러한 사포닌 유도체는 특히 예를 들어 암의 예방 또는 치료를 위한 ADC 또는 AOC 등을 포함하는 치료 요법에 적용하기에 적합하다. 이러한 사포닌 유도체의 안전성은 세포독성 및/또는 용혈 활성을 고려할 때, 특히 이러한 사포닌 유도체가 예를 들어 ADC 또는 AOC를 이용한 치료가 필요한 환자에게 투여될 때 향상된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하고, 그리고/또는 여기서 사포닌 유도체는 제2 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제2 당류 사슬은 유도체화된 아세톡시(Me(CO)O-)기(여기서는 유도체화된 아세테이트기라고도 칭함)를 적어도 하나 포함하고, 바람직하게는 사포닌 유도체는 유도체화된 상기 제1 당류 사슬 및 유도체화된 상기 제2 당류 사슬 모두를 포함하고, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체는 유도체화된 상기 제1 당류 사슬 및 유도체화된 상기 제2 당류 사슬 모두를 포함하고, 상기 사포닌 유도체는 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조물을 포함한다. 자연 발생 사포닌을 고려할 때 사포닌의 이러한 세 가지 화학기 중 하나가 변경되지 않은 채로 두 가지 이러한 유도체화의 다른 모든 가능한 조합이 동등하게 바람직하다. 또한, 사포닌의 화학기 중 1개, 2개 또는 3개, 바람직하게는 1개 또는 2개가 표 A2 및 표 A3에 나열된 유도체화 중 임의의 하나 이상에 따라 유도체화된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 사포닌 유도체는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 아글리콘 코어 구조물을 포함하며,
2알파-히드록시 올레아놀산;
16알파-히드록시 올레아놀산;
헤데라게닌(23-히드록시 올레아놀산);
16알파,23-디히드록시 올레아놀산;
집소게닌;
퀼라산;
프로토에시게닌-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-22-아세테이트;
23-옥소-바링토게놀 C-21,22-비스(2-메틸부트-2-에노에이트);
23-옥소-바링토게놀 C-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-16,22-디아세테이트;
디지토게닌;
3,16,28-트리히드록시 올레아난-12-엔;
집소게닉산(gypsogenic acid),
및
이의 유도체,
바람직하게는 사포닌 유도체는 퀼라산 및 집소게닌 또는 이의 유도체로부터 선택된 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 더욱 바람직하게는 사포닌 유도체 아글리콘 코어 구조물은 퀼라산 또는 이의 유도체이다. 본 발명자들은 이제 트리테르펜 글리코시드 유형의 사포닌에 기초하여, 이러한 유도체와 접촉된 세포의 감소된 세포독성 및 더 낮은 용혈과 관련하여 개선된 사포닌 유도체가 제공될 수 있음을 발견했기 때문에, 기본적으로 본 발명자들에 의해 시험된 바와 같은 이러한 엔도솜 탈출 증진 활성을 갖는 임의의 사포닌, 예를 들어, 상기 구현의 아글리콘을 갖고 표 A1에 열거된 사포닌은 이에 따라 개선될 수 있다. 독소 및 예를 들어 BNA의 강화를 고려할 때 충분히 높은 정도로 활성을 보존하면서 독성을 낮추고 용혈 활성을 낮추는 것은, 사포닌 유도체 단독 또는 예를 들어 ADC 또는 AOC와의 조합의 치료 윈도우를 넓히는 것이 고려될 때 본 발명자들의 중요한 성과이다. 충분히 고용량의 유도체화된 사포닌을, 예를 들어, 이를 필요로 하는 암 환자에 대한 종양 요법에 적용할 수 있으며, 한편으로는 자연 사포닌 대응물의 적용과 비교할 때 사포닌 유도체에 의해 발휘되거나 유도되는 세포독성 부작용(위험) 및 바람직하지 않은 용혈 활성(위험)이 감소된다. 본 발명의 사포닌 유도체의 치료 윈도우의 개선은, 예를 들어, 표 A5 및 표 A6에 예시된 사포닌 유도체에 대해 명백하다: 세포독성 또는 용혈 활성에 대한 IC50과 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50 사이의 비가 나열되며, 뿐만 아니라 용혈 활성, 세포 독성 및 활성에 대한 것도 나열된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 사포닌 유도체는 퀼라산, 집소게닌 및 이들의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 바람직하게는 사포닌 유도체는 퀼라산 및 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된 아글리콘 코어 구조물을 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은 존재하는 경우 아글리콘 코어 구조물의 C3 원자('C-3' 원자로도 표시됨) 또는 C28 원자('C-28' 원자로도 표시됨)에 연결되며, 바람직하게는 C3 원자에 연결되며, 및/또는 존재하는 경우 제2 당류 사슬은 아글리콘 코어 구조물의 C28 원자에 연결된다. 아글리콘에 결합된 2개의 모든 당류 사슬을 갖는 사포닌을 기본으로 하는 사포닌 유도체가 바람직하지만, 일반적으로 더 낮은 세포독성, 더 낮은 용혈 활성 및 충분히 높은 엔도솜 탈출 증진 활성을 갖는, 단일, 이중 또는 삼중, 바람직하게는 단일 또는 이중 유도체화된 사포닌을 제공하기 위한 목적으로 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타내는 임의의 사포닌이 본 발명에 따른 유도체화에 적합하다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 존재하는 경우 제1 당류 사슬은 (목록 S1)에서 선택되며,
GlcA-,
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-Ara-,
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-,
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-, 및
이의 유도체,
및/또는 제2 당류 사슬이 존재한다면 (목록 S2)에서 선택된다:
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-,
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-,
Ara-,
Xyl-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc- 여기서, R1은 4E-메톡시신남산이고,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc- 여기서, R2는 4Z-메톡시신남산이고,
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-디-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc- 여기서, R3은 4E-메톡시신남산이고,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
(Ara- 또는 Xyl-)(1→3)-(Ara- 또는 Xyl-)(1→4)-(Rha- 또는 Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha- 또는 Fuc-)(1→4)]-(Rha- 또는 Fuc-),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc- 여기서, R4는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc- 여기서, R5는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc- ,
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-디-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- 여기서, R6은 5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- 여기서, R7은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- 여기서 R8은 5-O-[5-O-아라피-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- 여기서 R9는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- 여기서 R10은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- 여기서, R11은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- 여기서 R12는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산)
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-, 및
이의 유도체.
일반적으로 독소의 세포독성을 증진시키는 사포닌은 세포가 사포닌 및 독소와 접촉할 때 이러한 단당류 또는 다당류 사슬 중 1개 또는 2개가 아글리콘에 결합되어 있다. 2개의 당류 사슬을 포함하는 유도체화를 위해 선택된 사포닌이 바람직하다. 이러한 사포닌을 단일, 이중 또는 삼중 유도체화, 바람직하게는 엔도솜 탈출 증진 활성이 충분히 높은 정도로 보존되어야 하는 경우 단일 또는 이중 유도체화에 적용하기 위한 특히 바람직한 사포닌의 개요가 표 A1에 제공되어 있다. 물론, 그러한 사포닌이 예를 들어 독소, BNA 등에 대해 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타낸다면, 그러한 사포닌의 구조적 변이체는 본 발명에 따른 유도체화에 동등하게 적합하다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고 제2 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제1 당류 사슬은 하나 이상의 당류 모이어티를 포함하고 제2 당류 사슬은 하나 이상의 당류 모이어티를 포함하고, 그리고 여기서 아글리콘 코어 구조물은 퀼라산 또는 집소게닌이고, 여기서 하기 중 1, 2 또는 3, 바람직하게는 1 또는 2개가 존재한다:
i. 아글리콘 코어 구조물의 알데히드기가 유도체화되며,
ii. 제1 당류 사슬은 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하고,
iii. 제2 당류 사슬은 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시(Me(CO)O-)기를 포함한다.
다음 요약은 적절한 유도체화를 보여준다:
Figure pct00005
본 발명에 따르면, 사포닌은 3개의 유도체화를 포함할 수 있고, 여전히 충분히 높은 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타낼 수 있다. 특히 세포독성 및/또는 용혈 활성의 감소가, 이펙터 분자 및 유도체화된 사포닌과 접촉되는 종양 세포의 독소 또는 BNA와 같은, 세포 내부 이펙터 분자의 효과 및 활성을 강화하는 능력의 (잠재적 또는 명백한) 감소보다 클 때 그러하다. 따라서, 본 발명은 아글리콘의 알데히드기가 고려되는 경우, 존재한다면, C-3의 다당류에서 글루쿠론산 단위의 카르복실기가 고려되는 경우, 그리고 존재한다면, C-28에 있는 다당류 사슬의 아세틸기가 고려되는 경우, 단일, 2 또는 3개의 유도체화를 포함하는 유도체화된 사포닌을 제공한다. 1개 또는 2개의 변형을 갖는 사포닌 유도체가 바람직하다. 독소 또는 BNA와 같은 이펙터 분자의 엔도솜 탈출을 개선하는 데 적합한 것은, 예를 들어, 유리 알데히드기와 당류 사슬에 하나 또는 두 개의 유도체가 있는 사포닌 유도체이다. 앞서 기술한 바와 같이, 유도체화된 알데히드기를 갖는 사포닌 유도체도 동등하게 적합하다. 유도체화시 아글리콘에 유리 알데히드기를 갖지 않는 이러한 사포닌 유도체는 여전히 충분하고 효율적인 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타낸다. 어떠한 이론에도 구속되지 않고, 인간 세포와 같은 (포유류) 세포의 리소좀 및 엔도솜의 산성 조건의 결과로, C-23 위치에 유도체화된 아글리콘이 있는 사포닌 유도체를 제공하기 위해 처음에 사포닌의 알데히드기에 결합된 모이어티의 pH에 의해 유도된 절단시, 알데히드기가 다시 세포 내부에 형성될 수 있다. 엔도솜 또는 리소솜에서 다시 형성될 수 있는 변형된 알데히드기를 갖는 사포닌 유도체의 예는, 알데히드의 카보닐기와 예를 들어 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH), 또는 말레이미드기에 결합된 메르캅토에탄올과 함께 EMCH와 같은 아글리콘에 결합되어 티오-에테르 결합을 형성하는 화학기의 하이드라지드 모이어티 사이에 형성되는 히드라존 결합을 포함하는 사포닌 유도체이다. 이러한 사포닌 유도체의 예는 도 8 및 도 9에 제공되며, 본원에서 아래에 분자 2 및 분자 3으로 표시된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 퀼라자 껍질 사포닌, 딥사코시드 B, 사이코사포닌 A, 사이코사포닌 D, 마크란토이딘 A, 에스쿨렌토시드 A, 피토락카게닌, 아스시네이트, AS6.2, NP-005236, AMA-1, AMR, 알파-헤데린, NP-012672, NP-017777, NP-017778, NP-017774, NP-018110, NP-017772, NP-018109, NP-017888, NP-017889, NP-018108, SA1641, AE X55, NP-017674, NP-017810, AG1, NP-003881, NP-017676, NP-017677, NP-017706, NP-017705, NP-017773, NP-017775, SA1657, AG2, SO1861, GE1741, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, SO1904, SO1862, QS-7, QS1861, QS-7 api, QS1862, QS-17, QS-18, QS-21 A-apio, QS-21 A-xylo, QS-21 B-apio, QS-21 B-xylo, 베타-에스신(beta-Aescin), 에스신(Aescin) Ia, 티시드(Teaseed) 사포닌 I, 티시드사포닌 J, 아삼사포닌(Assamsaponin) F, 디지토닌(Digitonin), 프리물라산(Primula acid) 1 및 AS64R, 이의 입체이성질체 및 이의 조합으로 구성되는 사포닌 군으로부터 선택된 사포닌의 유도체이며, 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체, SO1861 유도체, SA1641 유도체 및 GE1741 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체 및 SO1861 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체이다. 이들 사포닌은 본질적으로 본 발명자들에 의해 확립된 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타내는 사포닌이거나, 엔도솜 탈출 증강 활성이 확립된 사포닌과 구조적으로 매우 유사한 것이다. 이러한 사포닌의 구조적 개요는 표 A1에 요약되어 있다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 상기 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 퀼라산 사포닌 또는 집소게닌 사포닌의 유도체이다:
Figure pct00006
(분자 1)
여기서
제1 당류 사슬 A1은 수소, 단당류 또는 선형 또는 분지형 올리고당류를 나타내고, 바람직하게는 A1은 본 발명의 특정 구현(목록 S1)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내고, 보다 바람직하게는 A1은 본 발명의 특정 구현(목록 S1)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내며 그리고 A1은 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되며;
제2 당류 사슬 A2는 수소, 단당류 또는 선형 또는 분지형 올리고당류를 나타내고, 바람직하게는 A2는 본 발명의 특정 구현(목록 S2)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내고, 더욱 바람직하게는 A2는 본 발명의 특정 구현(목록 S2)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내며, A2는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아세톡시기와 같은 적어도 하나의 아세톡시(Me(CO)O-)기, 바람직하게는 1개를 포함하고, 여기서 A1 및 A2 중 적어도 하나는 수소가 아니며, 바람직하게는 A1 및 A2 모두 올리고당 사슬이고;
R은 집소게닌 내의 수소 또는 퀼라산 내의 히드록실이고;
여기서 사포닌 유도체는 하기 유도체화 중 적어도 하나가 존재하는 분자 1로 표시되는 사포닌에 상응한다:
i. 퀼라산 또는 집소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드기가 유도체화되며;
ii. A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기는, A1이 본 발명의 특정 구현(목록 S1)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내고, A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되는 경우, 유도체화되며; 그리고
iii. A2의 하나의 당류 모이어티 또는 둘 이상의 당류 모이어티의 아세톡시기(들)의 하나 이상, 바람직하게는 모두는, A2가 본 발명의 특정 구현에 대해 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타내고(목록 S2), A2가 적어도 하나의 아세톡시기를 포함하는 경우, 유도체화된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 A1은 본 발명의 특정 구현(목록 S1)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내고, 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되며, 그리고 여기서 A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기는 유도체화되고, 그리고/또는 A2는 본 발명의 특정 구현(목록 S2)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내고, A2는 적어도 하나의 아세톡시기를 포함하고, 여기서 A2의 적어도 하나의 아세톡시기는 유도체화된다.
일 구현은 분자 1로 표시되는 사포닌이 비데스모시딕 트리테르펜 사포닌인 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 사포닌에 상응하며, 여기서 하기 유도체화 중 적어도 하나가 존재하고, 바람직하게는 하기 유도체화 중 1개 또는 2개가 존재하고, 보다 바람직하게는 1개가 존재한다:
i. 퀼라산 또는 집소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드기는
- 알코올로의 환원;
- 히드라존 결합으로의 변환, 바람직하게는 히드라지드와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환
에 의해 유도체화되며;
ii. A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기는, A1이 본 발명의 특정 구현(목록 S1)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내고, A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되는 경우, 아미드 결합으로의 변환에 의해, 바람직하게는 아민과의 반응을 통한 아미드 결합으로의 변환에 의해 유도체화되며; 그리고
iii. A2의 하나의 당류 모이어티 또는 둘 이상의 당류 모이어티의 아세톡시기(들)의 하나 이상, 바람직하게는 모두는, A2이 본 발명의 특정 구현(목록 S2)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내고, A2가 적어도 하나의 아세톡시기를 포함하는 경우, 탈아세틸화에 의한 히드록실기(HO-)로의 변환에 의해 유도체화된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 사포닌에 상응하며, 여기서 하기 유도체화 중 적어도 하나가 존재하고, 바람직하게는 하기 유도체화 중 1개 또는 2개가 존재하고, 보다 바람직하게는 1개가 존재한다:
i. 퀼라산 또는 집소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드기가
- 알코올로의 환원;
- N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 이로써 SO1861-Ald-EMCH 또는 QS-21-Ald-EMCH와 같은 사포닌-Ald-EMCH를 제공하고, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 유도체화됨;
- N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드(BMPH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 BMPH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨; 또는
- N-[κ-말레이미도운데칸산]히드라지드(KMUH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 KMUH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨
에 의해 유도체화되며;
ii. A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기는, A1이 본 발명의 특정 구현(목록 S1)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내고, A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되는 경우, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통한 아미드 결합으로의 변환에 의해 유도체화되어, 그 후 QS-21-Glu-AMPD 또는 SO1861-Glu-AMPD와 같은 사포닌-Glu-AMPD 또는 QS-21-Glu-AEM 또는 SO1861-Glu-AEM과 같은 사포닌-Glu-AEM을 제공하며; 그리고
iii. A2의 하나의 당류 모이어티 또는 2개 이상의 당류 모이어티의 아세톡시기(들)의 하나 이상, 바람직하게는 모두는, A2이 본 발명의 특정 구현(목록 S2)에 대해 상기 정의된 당류 사슬을 나타내는 경우, 탈아세틸화에 의한 히드록실기(HO-)로의 변환에 의해 유도체화된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 A1은 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA이며 및/또는 A2는 Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc이며, 바람직하게는 분자 1로 표시되는 사포닌은 3-O-베타-D-갈락토피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)]-베타-D-글루쿠로노피라노실 퀼라산 28-O-베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-자일로피라노실-(1→4)-알파-L-람노피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)-4OAc-베타-D-퀴노보피라노실-(1→4)]-베타-D-푸코피라노시드, 보다 바람직하게는 SO1861, GE1741, SA1641 및/또는 QS-21, 가장 바람직하게는 SO1861이다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 사포닌 유도체는 SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 퀼라자사포닌(Quillajasaponin), 사포니넘 알범(Saponinum album), QS-18, Quil-A, Gyp1, 글리코시드 A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, SO1862, SO1904, 이의 입체 이성질체 및 이의 조합의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체, GE1741 유도체, SA1641 유도체, QS-21 유도체 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체 또는 QS21 유도체이고, 가장 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체이다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 사포닌 유도체는 단일 유도체화를 포함하는 SO1861 유도체이고, 여기서 단일 유도체화는 예를 들어 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)를 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기에 결합하거나(도 59 참조) (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)를 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기에 결합하는 것에 의한 SO1861의 글루크론산 모이어티의 카르복실기의 변환이거나, 또는 여기서 사포닌 유도체는 분자 2로 표시되는 SO1861 유도체이며, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 퀼라산 아글리콘 코어 구조물의 표시된 위치 C23에 알데히드기를 포함하는 SO1861 유도체를 나타내거나:
Figure pct00007
(분자 2)
또는 여기서 사포닌 유도체는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 퀼라산 아글리콘 코어 구조물의 표시된 위치 C23에 알데히드기를 포함하는 SO1861 유도체를 나타내는, 분자 3으로 표시되는 SO1861 유도체이며, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 메르캅토에탄올로 유도체화되어, 그 후 티오-에테르 결합을 형성한다:
Figure pct00008
(분자 3)
분자 2로 표시되는 사포닌은 유리 설프히드릴기를 포함하는 추가 분자와의 접합 반응을 위한 전구체로서 적용하기에 적합하다. 분자 2로 표시되는 사포닌 유도체의 말레이미드기는 이러한 유리 설프히드릴기와 티오-에테르 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 분자 2의 사포닌 유도체는 유리 설프히드릴기를 갖는 시스테인과 같은 유리 설프히드릴기를 포함하는 펩티드 또는 단백질에 공유 커플링될 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 항체 또는 그의 결합 단편 또는 결합 도메인, 예를 들어 Fab, scFv, 단일 도메인 항체, 예를 들어 낙타류 VH와 같은 VHH이다. 예를 들어, 유리 설프히드릴기를 포함하는 항체와의 커플링 반응에서 분자 2의 사포닌 유도체의 적용은, 항체(또는 이의 결합 도메인 또는 단편)가 수용체, 예를 들어 종양 세포에 존재하는 수용체와 같은 표적 세포 표면 분자에 특이적 결합을 위한 항체인 경우, 사포닌을 세포로 그리고 세포 내부로 표적화된 운반을 위한 접합체를 제공한다. 바람직하게는, 사포닌 유도체는 예를 들어 HER2, EGFR, CD71과 같은 종양 세포 특이적 표면 분자에 결합할 수 있는 항체 또는 VHH에 커플링된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 사포닌 유도체는 단일 유도체화를 포함하는 SO1861 유도체가 아니라는 조건 하에, 여기서 단일 유도체화는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 반응에 의한 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 변환이거나, 또는 여기서 사포닌 유도체는 분자 2로 표시되는 SO1861 유도체이며, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 퀼라산 아글리콘 코어 구조물의 표시된 위치 C23에 알데히드기를 포함하는 SO1861 유도체를 나타낸다:
Figure pct00009
(분자 2)
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서,
i. 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 여기서 아글리콘 코어 구조물은
- 알코올로의 환원;
- N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨;
- N-[β-말레이미도프로피온산] 히드라지드(BMPH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 BMPH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨; 또는
- N-[κ-말레이미도운데칸산] 히드라지드(KMUH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서, KMUH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨
에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하며;
ii. 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하거나;
iii. 제2 당류 사슬은 탈아세틸화에 의해 히드록실기(HO-)로의 변환에 의해 유도체화된 아세톡시기(Me(CO)O-)를 포함하거나; 또는
iv. 사포닌 유도체는 2개 또는 3개의 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합, 바람직하게는 2개의 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합을 포함하며;
바람직하게는, 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물을 포함하며, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 EMCH와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하고, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 선택적으로 유도체화된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 알데히드기를 포함하고, 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하고, 이는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로의 변형에 의해 유도체화된 것이다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 아글리콘 코어 구조물의 알데히드기가 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화되고, 사포닌은 SO1861인 경우를 조건으로 하여, 글루쿠론산과 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나는 또한 유도체화되며, 그리고 사포닌이 SO1861이고, SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기가 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 반응에 의해 유도체화되는 경우를 조건으로 하여, 알데히드기와 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 변형된다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 사포닌 유도체의 아글리콘 코어 구조물의 알데히드기가 EMCH와의 반응을 통해 유도체화되고, 사포닌이 SO1861인 경우를 조건으로 하여, 글루쿠론산 및 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 유도체화되며, 그리고 사포닌이 SO1861이고, SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기가 결합된 HATU에 의해 유도체화되는 경우를 조건으로 하여, 알데히드기 및 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 유도체화된다.
본원에서 구현 D1로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가 SA1641이 아닌 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 환원성 아민화를 통한 것과 같은 변환에 의해 화학식 (A1)의 화합물과의 반응에 의해 아민으로 유도체화된 알데히드기를 포함한다:
Figure pct00010
(A1)
즉, 본원에서 구현 D1로 지칭되는 구현은 SA1641과 화학식 (A1)의 화합물 사이의 반응의 결과가 아닌 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다. 따라서, 구현 D1은 화학식 (A1)의 화합물에 대한 적어도 하나의 SA1641 분자의 환원성 아민화를 통한 커플링의 결과가 아님을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현 D2로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가 사포닌, 특히 SO1861이 아닌 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하며, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 선택적으로 티올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화되고, 그리고 여기서 다른 유도체화는 사포닌 상에 존재하지 않으며, 바람직하게는 사포닌 유도체가 사포닌, 특히 SO1861이 아닌 것을 특징으로 하고, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하고, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 선택적으로 티올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화된다.
본원에서 구현 D3으로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가 사포닌, 특히 SO1861이 아닌 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하고, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 하기 중 하나, 바람직하게는 모두로부터 선택된 티올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화되며:
Figure pct00011
메르캅토에탄올,
Figure pct00012
적어도 2-이미노티올란으로 유도체화된 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머,
Figure pct00013
시아닌-3과, 적어도 2-이미노티올란으로 추가로 유도체화된 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머의 접합체,
Figure pct00014
적어도 2-이미노티올란으로 유도체화된 G4 덴드론,
Figure pct00015
시아닌-3과, 적어도 2-이미노티올란으로 추가로 유도체화된 G4 덴드론의 접합체,
Figure pct00016
소 혈청 알부민(BSA), 및
Figure pct00017
서열 SESDDAMFCDAMDESDSK [SEQ ID NO: 1]를 갖는 펩티드
그리고 여기서 사포닌에는 다른 유도체화가 존재하지 않는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, "G4 덴드론(G4 dendron)"이라는 표현은 화학식 (A2)의 화합물을 의미하는 것으로 해석되어야 한다:
Figure pct00018
(A2)
본원에서 구현 D4로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가 사포닌, 특히 SO1861이 아닌 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 카르복실기는 선택적으로, 시아닌-3과, 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머의 추가로 유도체화된 접합체와의 반응에 의한 아미드로의 변환에 의해 유도체화되고, 그리고 여기서 다른 유도체화는 사포닌에 존재하지 않고, 바람직하게는 사포닌 유도체가 사포닌, 특히 SO1861이 아닌 것을 특징으로 하고, 여기서 카르복실기는 선택적으로 시아닌-3과, 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머의 추가로 유도체화된 접합체와의 반응에 의한 아미드로의 변환에 의해 유도체화된다.
본원에서 구현 D5로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가 사포닌, 특히 SO1861이 아닌 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 환원성 아민화를 통한 것과 같이, 시아닌-3과, 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머의 접합체와의 반응에 의한 아민으로의 변환에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하며, 그리고 여기서 다른 유도체화가 사포닌에 존재하지 않고, 바람직하게는 사포닌 유도체가 사포닌, 특히 SO1861이 아닌 것을 특징으로하며, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 환원성 아민화를 통한 것과 같이, 시아닌-3과, 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머의 접합체와의 반응에 의한 아민으로의 변환에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함한다.
본 명세서에서 구현 D6으로 지칭되는 구현은, 사포닌 유도체가 독소, 마이크로 RNA, 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 바람직하게는 사포닌 유도체가 약학적 활성 물질, 예컨대 독소, 약물, 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체가 이펙터 분자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현 D7로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가
Figure pct00019
폴리에틸렌이민 및 폴리(아미도아민)과 같은 폴리- 또는 올리고(아민),
Figure pct00020
폴리에틸렌 글리콜,
Figure pct00021
폴리(락티드)와 같은 폴리- 또는 올리고(에스테르),
Figure pct00022
폴리(락탐),
Figure pct00023
폴리락티드-코-글리콜리드 공중합체,
Figure pct00024
시클로덱스트린 및 폴리덱스트로오스와 같은 다당류 또는 올리고당류,
Figure pct00025
단백질 및 펩티드와 같은 폴리- 또는 올리고(아미노산), 및
Figure pct00026
DNA, RNA, LNA(잠금 핵산) 및 PNA(펩티드 핵산)와 같은 핵산 및 이의 유사체
로 구성되는 군으로부터 선택된 중합체 또는 올리고머 구조를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며;
바람직하게는 사포닌 유도체가 중합체, 올리고머, 덴드리머, 덴드론화된 중합체 또는 덴드론화된 올리고머와 같은 구조적으로 정렬된 형성인 중합체 또는 올리고머 구조를 포함하지 않거나, 또는 하이드로겔, 마이크로겔, 나노겔, 안정화된 폴리머 미셀 또는 리포솜과 같은 조립된 중합체 구조인 것을 특징으로 하고, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체가 중합체 또는 올리고머 구조를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
본원에서 구현 D8로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가 함께 결합된 적어도 2개의 동일하거나 유사한 단위로부터 주로 또는 완전히 구성된 분자 구조를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현 D9로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가 SO1861과 N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로-[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드(HATU)의 반응 생성물인 화학식 (A3)의 화합물이 아닌 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며:
Figure pct00027
(A3),
바람직하게는 사포닌 유도체가 활성화된 에스테르가 아닌 것을 특징으로 한다. 도 59 참조.
본원에서 구현 D10으로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가 사포닌, 특히 SO1861이 아닌 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 카르복실기는 아미드 결합 또는 에스테르 결합으로의 변환에 의해 유도체화되며, 그리고 여기서 사포닌에 다른 유도체화가 존재하지 않으며, 바람직하게는 사포닌 유도체가 사포닌, 특히 SO1861이 아닌 것을 특징으로 하며, 여기서 카르복실기는 아미드 결합 또는 에스테르 결합으로의 변환에 의해 유도체화된다.
본원에서 구현 D11로 지칭되는 구현은 사포닌 유도체가 디안틴 모이어티를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현 D12로 지칭되는 바람직한 구현은 사포닌 유도체가 단일 사포닌 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현 D13으로 지칭되는 바람직한 구현은 사포닌 유도체가 2500 g/mol 미만, 바람직하게는 2300 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 2150 g/mol 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현 D14로 지칭되는 바람직한 구현은 사포닌 유도체화가 400 g/mol 미만, 바람직하게는 300 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 300 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 270 g/mol 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다. 사포닌 유도체화의 분자량은 아글리콘 코어와 1개(모노데스모시딕 사포닌의 경우) 또는 2개(비데스모시딕 사포닌의 경우) 글리콘(당) 사슬을 제외한 사포닌 유도체의 분자량에 해당한다. 당업자는 사포닌 유도체가 상응하는 유도체화된 사포닌보다 분자량이 더 낮은 경우(예를 들어, 탈아세틸화에 의해 유도체화된 SO1861에 상응하는 SO1861-Ac-OH의 경우와 같이), 사포닌 유도체화가 어떠한 분자량 증가도 가져오지 않아, 사포닌 유도체화가 구현 D14의 400g/mol 미만, 바람직하게는 300g/mol 미만, 더욱 바람직하게는 270g/mol 미만의 분자량을 갖는다는 요건을 준수한다는 것을 이해할 것이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 구현 D1-D14는 본원에서 설명된 다른 구현뿐만 아니라 서로 간에 결합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 구현에서 구현 D1-D14의 다음 조합이 제공된다:
Figure pct00028
D12 및 D1-D11, D13 중 하나 이상;
Figure pct00029
D13 및 D1-D12 중 하나 이상;
Figure pct00030
D12, D13 및 D1-D11 중 하나 이상;
Figure pct00031
D1, D2, D10 및 D12;
Figure pct00032
D1, D3, D7, D9 및 바람직하게는 D13; 또는
Figure pct00033
D3, D9, D12 및 D13.
구현 D1-D14의 이러한 조합은 예를 들어, 바람직하게는 구현 D14와 함께 본 발명에 따른 다른 구현과 다시 결합될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
특히 바람직한 구현은 구현 D3, D9, D12와, D13 및 D14 중 하나 또는 둘 모두의 조합에 상응한다. 다시 말해서, 특히 바람직한 구현은 사포닌 유도체가 단일 사포닌 모이어티를 포함하는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 2500 g/mol 미만, 바람직하게는 2300 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 2150g/mol 미만의 분자량을 가지며, 그리고 여기서 사포닌 유도체는
Figure pct00034
사포닌, 특히 SO1861이 아니며, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하며, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화되고, 그리고 여기서 바람직하게는 사포닌에 다른 유도체화가 존재하지 않으며; 그리고
Figure pct00035
SO1861과 N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로-[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥사이드의 반응 생성물인 활성화된 에스테르가 아니다.
본 발명의 제2 견지는 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제1 약학 조성물에 관한 것이다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하고, 다음을 추가로 포함하는 본 발명에 따른 제1 약학 조성물이다:
Figure pct00036
약학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 예컨대 암모늄, 칼슘, 구리, 철, 마그네슘, 망간, 포타슘, 소듐, 스트론튬 또는 아연 염과 같은 약학적으로 허용되는 무기 염, 바람직하게는 NaCl; 및/또는
Figure pct00037
포스페이트, 보레이트, 시트레이트, 카보네이트, 히스티딘, 락테이트, 트로메타민, 글루코네이트, 아스파르테이트, 글루타메이트, 타르타레이트, 숙시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 아세테이트 및/또는 케토글루타레이트 함유 완충 시스템과 같은 약학적으로 허용되는 완충 시스템.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 약학적으로 허용되는 희석제, 바람직하게는 물을 포함하는 본 발명에 따른 제1 약학 조성물로서, 여기서 조성물은 25℃의 온도에서 액체이고, 2 내지 2-11 범위 내, 바람직하게는 4-9의 범위 내, 보다 바람직하게는 6-8의 범위 내의 pH를 갖는다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 약학적으로 허용되는 희석제, 바람직하게는 물을 포함하는 본 발명에 따른 제1 약학 조성물로서, 여기서 조성물은 25℃의 온도에서 액체이고, 사포닌 유도체의 농도는 10-12 내지 1 mol/l의 범위 내, 바람직하게는 10-9 내지 0.1 mol/l의 범위 내, 더욱 바람직하게는 10-6 내지 0.1 mol/l의 범위 내이다.
전형적으로, 이러한 제1 약학 조성물은 예를 들어, ADC 또는 AOC와 조합하여 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 제1 약학 조성물은 ADC 또는 AOC의 투여를 필요로 하는 환자에게, ADC 또는 AOC가 투여되기 전에, ADC 또는 AOC와 함께, 또는 ADC 또는 AOC를 투여(직) 후에 그러한 ADC 또는 AOC 요법이 필요한 환자에게 투여된다. 예를 들어, 제1 약학 조성물은 ADC 또는 AOC를 포함하는 약학 조성물과 혼합되고, 수득된 혼합물의 적합한 투여량이 ADC 또는 AOC 요법이 필요한 환자에게 투여된다. 본 발명에 따르면, 제1 약학 조성물에 포함된 사포닌 유도체는, 사포닌 유도체와 ADC 또는 AOC가 종양 세포와 같은 표적 세포 내부에 공동 국재화될 때, 이러한 ADC 또는 AOC에 포함된 이펙터 분자의 효과 및 효능을 향상시킨다. 사포닌 유도체의 영향 하에, 이펙터 분자는 사포닌 유도체의 부재하에 동일한 세포를 동일한 투여량의 ADC 또는 AOC와 접촉하는 것과 비교하여, 표적 세포의 세포질 내로 더 높은 정도로 방출된다. 따라서, 이펙터 분자가 제1 약학 조성물의 사포닌 유도체와 함께 표적 세포 내부에 공동 국재화될 경우, 이펙터 분자를 포함하는 ADC 또는 AOC가 전달되는 세포 내부의 사포닌 유도체의 부재하에 동일한 효능을 달성하기 위해 필요한 투여량에 비해, 더 낮은 ADC 또는 AOC 투여량에서 유사한 효능을 얻을 수 있다.
일 구현은 사포닌 유도체가 분자 2:
Figure pct00038
(분자 2)
로 표시되는 사포닌 유도체이거나 또는 단일 유도체화를 포함하는 SO1861 유도체인 본 발명의 제1 약학 조성물이며, 여기서 단일 유도체화는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 반응에 의한 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 변형이거나, 또는 사포닌 유도체는 분자 3:
Figure pct00039
(분자 3)
으로 표시되는 사포닌 유도체이다.
본 발명의 제3 견지는
o 본 발명의 제1 약학 조성물; 및
o 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 그리고 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제2 약학 조성물
을 포함하는 약학 조합물에 관한 것이다.
본 발명의 제4 견지는 본 발명의 사포닌 유도체를 포함하고, 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-핵산 접합체 또는 수용체-리간드 - 핵산 접합체 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하며, 그리고 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제3 약학 조성물에 관한 것이다.
일 구현은 본 발명의 약학 조합물 또는 본 발명의 제3 약학 조성물로서, 여기서 제2 약학 조성물 또는 제3 약학 조성물은 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 어느 하나 이상을 포함하며, 여기서 약물은 예를 들어 사포린 및 디안틴과 같은 독소이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 아포리포단백질 B 또는 HSP27의 유전자 침묵을 위한 것과 같이 예를 들어 siRNA 또는 BNA이다.
일 구현은 본 발명의 약학 조합물 또는 본 발명의 제3 약학 조성물로서, 여기서 사포닌 유도체는 SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 퀼라자사포닌, 사포늄 알범, QS-18, Quil-A, Gyp1, 글리코시드 A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, SO1862, SO1904, 이의 입체이성질체 및 이들의 조합의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된 사포닌 유도체이며, 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체, GE1741 유도체, SA1641 유도체, QS-21 유도체, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체 또는 QS21 유도체이며, 보다 바람직하게는, 사포닌 유도체는 SO1861 유도체이고, 더욱 바람직하게는 분자 2 또는 분자 3으로 표시되는 사포닌 유도체이다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하고,
Figure pct00040
약학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 암모늄, 칼슘, 구리, 철, 마그네슘, 망간, 포타슘, 소듐, 스트론튬 또는 아연 염과 같은 약학적으로 허용되는 무기 염, 바람직하게는 NaCl; 및/또는
Figure pct00041
포스페이트, 보레이트, 시트레이트, 카보네이트, 히스티딘, 락테이트, 트로메타민, 글루코네이트, 아스파르테이트, 글루타메이트, 타르타레이트, 숙시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 아세테이트 및/또는 케토글루타레이트 함유 완충 시스템과 같은 약학적으로 허용되는 완충 시스템
을 추가로 포함하는 본 발명에 따른 제3 약학 조성물이다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 약학적으로 허용되는 희석제, 바람직하게는 물을 포함하는 본 발명에 따른 제3 약학 조성물로서, 여기서 조성물은 25℃의 온도에서 액체이고, 2 내지 11 범위 내, 바람직하게는 4-9의 범위 내, 보다 바람직하게는 6-8의 범위 내의 pH를 갖는다.
일 구현은 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 약학적으로 허용되는 희석제, 바람직하게는 물을 포함하는 본 발명에 따른 제3 약학 조성물로서, 여기서 조성물은 25℃의 온도에서 액체이고, 사포닌 유도체의 농도는 10-12 내지 1mol/l의 범위 내, 바람직하게는 10-9 내지 0.1mol/l의 범위 내, 보다 바람직하게는 10-6 내지 0.1mol/l의 범위 내이다.
본 발명의 제5 견지는 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 제1 약학 조성물, 본 발명의 약학 조합물, 또는 본 발명의 제3 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구현에서, 의약으로서 사용하기 위한 것으로, 사포닌 유도체가 SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, SO1861-L-N3 또는 SO1861-Glu-HATU를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성되는 본 발명의 제1 약학 조성물이 제공되거나, 사포닌 유도체가 SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, SO1861-L-N3 또는 SO1861-Glu-HATU를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성되는 본 발명의 약학 조합물이 제공되거나, 또는 사포닌이 유도체가 SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, SO1861-L-N3 또는 SO1861-Glu-HATU를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성되는 본 발명의 제3 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에서, 의약으로 사용하기 위한, 본원에 기재된 사포닌 유도체, 바람직하게는 SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, SO1861-L-N3 또는 SO1861-Glu-HATU가 제공된다.
본 발명의 제6 견지는 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥소산뇨증, 혈우병 A, 혈우병 B, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증, 또는 자가 면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 제1 약학 조성물, 본 발명의 약학 조합물, 또는 본 발명의 제3 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구현에서, 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥소산뇨증, 혈우병 A, 혈우병 B, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증, 또는 자가 면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것으로, 사포닌 유도체가 SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, SO1861-L-N3 또는 SO1861-Glu-HATU를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성되는 본 발명의 제1 약학 조성물이 제공되거나, 사포닌 유도체가 바람직하게는 SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, SO1861-L-N3 또는 SO1861-Glu-HATU를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성되는 본 발명의 약학 조합물이 제공되거나, 또는 사포닌이 유도체가 SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, SO1861-L-N3 또는 SO1861-Glu-HATU를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성되는 본 발명의 제3 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 제7 견지는
a) 세포를 제공하는 단계;
b) 세포 외부에서 단계 a)에 제공된 세포로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계;
c) 본 발명에 따른 사포닌 유도체를 제공하는 단계;
d) 시험관내 또는 생체외에서 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 사포닌 유도체와 접촉시켜, 세포 외부로부터 상기 세포 내로 분자의 전달을 확립하는 단계
를 포함하는, 세포 외부로부터 상기 세포 내부, 바람직하게는 상기 세포의 세포질 내로 분자를 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.
일 구현은 본 발명의 방법으로서, 여기서 세포는 T-세포, NK-세포, 종양 세포와 같은 인간 세포이며, 그리고/또는 여기서 단계 b)의 분자가 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 어느 하나이며, 여기서 약물은 예를 들어 독소이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 siRNA 또는 BNA이며, 그리고/또는 여기서 사포닌 유도체는 SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 퀼라자사포닌, 사포늄 알범, QS-18, Quil-A, Gyp1, 글리코시드 A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, SO1862, SO1904, 이의 입체이성질체 및 이들의 조합의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체, GE1741 유도체, SA1641 유도체, QS-21 유도체, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체 또는 QS21 유도체이며, 보다 바람직하게는, 사포닌 유도체는 SO1861 유도체이거나; 또는 여기서 사포닌 유도체는 단일 유도체화를 포함하는 SO1861 유도체이고, 여기서 단일 유도체화는, 예를 들어, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)를 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기에 결합하거나 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)를 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기에 결합하는 것에 의해, SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기가 아민과의 반응을 통해 결합된 아민으로의 변환이거나, 또는 여기서 사포닌 유도체는 분자 2로 표시되는 SO1861 유도체이고, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 퀼라산 글리콘 코어 구조물의 표시된 위치 C23에 알데히드기를 포함하는 SO1861 유도체를 나타내는 것이거나:
Figure pct00042
(분자 2)
또는 여기서 사포닌 유도체는 분자 3으로 표시되는 SO1861 유도체이며, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 퀼라산 아글리콘 코어 구조물의 표시된 위치 C23에 알데히드기를 포함하는 SO1861 유도체를 나타내며, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 메르캅토에탄올로 유도체화되어 티오-에테르 결합을 형성하는 것이거나:
Figure pct00043
(분자 3)
; 또는 사포닌 유도체는 사포닌 유도체가 단일 유도체화를 포함하는 SO1861 유도체가 아닌 것을 조건으로 하는 유도체이며, 여기서 단일 유도체화는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 반응에 의한 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 변형이거나, 또는 여기서 사포닌 유도체는 분자 2로 나타내는 SO1861 유도체이며, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 퀼라산 아글리콘 코어 구조물의 표시된 위치 C23에 알데히드기를 포함하는 SO1861 유도체를 나타내는 것이거나:
Figure pct00044
(분자 2)
; 또는 여기서 사포닌 유도체는 유도체로서 여기서,
i. 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 여기서 아글리콘 코어 구조물은
- 알코올로의 환원;
- N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨;
- N-[β-말레이미도프로피온산] 히드라지드(BMPH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 BMPH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨; 또는
- N-[κ-말레이미도운데칸산] 히드라지드(KMUH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서, KMUH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨
에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하며;
ii. 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하거나;
iii. 제2 당류 사슬은 탈아세틸화에 의해 히드록실기(HO-)로의 변환에 의해 유도체화된 아세톡시기(Me(CO)O-)를 포함하거나; 또는
iv. 사포닌 유도체는 2개 또는 3개의 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합, 바람직하게는 2개의 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합을 포함하며;
바람직하게는, 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물을 포함하며, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 EMCH와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하고, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합의 형성에 의해 선택적으로 유도체화되거나; 또는 여기서 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 알데히드기를 포함하고, 그리고 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하거나; 또는 여기서 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물의 알데히드기가 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화되고 사포닌이 SO1861인 유도체인 경우를 조건으로 하여, 글루쿠론산과 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 유도체화되는 유도체이며, 그리고 사포닌이 SO1861이고, SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기가 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 반응에 의해 유도체화되는 경우를 조건으로 하여, 알데히드기 및 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 변형되거나; 또는 여기서 사포닌은 사포닌 유도체의 아글리콘 코어 구조물의 알데히드기가 EMCH와의 반응을 통해 유도체화되고, 사포닌이 SO1861인 경우를 조건으로 하여, 글루쿠론산 및 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 유도체화되는 유도체이며, 그리고 사포닌이 SO1861이고 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기가 결합된 HATU에 의해 유도체화되는 경우를 조건으로 하여, 알데히드기와 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 유도체화된다.
특정 구현에서, 세포 외부로부터 상기 세포 내부로, 바람직하게는 본원에 기재된 상기 세포의 세포질 내로 분자를 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법이 제공되며, 여기서 사포닌 유도체는 SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, SO1861-L-N3 또는 SO1861-Glu-HATU를 포함하며, 바람직하게는 이로 구성된다.
본 발명이 여러 구현의 관점에서 설명되었지만, 그 대안, 변형, 순열 및 등가물은 명세서를 읽고 도면을 연구할 때 당업자에게 명백해질 것이라고 생각된다. 본 발명은 예시된 구현으로 어떤 식으로든 제한되지 않는다. 첨부된 청구범위에 의해 정의된 범위를 벗어나지 않고 변경이 이루어질 수 있다.
본 발명은 다수의 예시적인 구현을 참조하여 위에서 설명되었다. 변형이 가능하며, 첨부된 청구범위에 정의된 보호 범위에 포함된다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
실시예 및 예시적 구현
재료:
SO1861, SO1832, SO1862(이성질체) 및 SO1904는 사포나리아 오피시날리스 L(Saponaria officinalis L)에서 얻은 원료 식물 추출물에서 Analyticon Discovery GmbH에 의해 분리 및 정제되었다. QS21(순수), QS18(분획), QS17(분획), QS7(분획) QS21(분획)은 샌디에이고의 데저트 킹 인터내셔널에서 구입했다. 트라스투주맙(Trastuzumab)(Tras, Herceptin®, Roche), 세툭시맙(Cetuximab)(Cet, Erbitux®, Merck KGaA)은 약국에서 구입했다. EGF디안틴은 표준 절차에 따라 E. 콜라이(E.coli)에서 생산되었다. 세툭시맙-사포린 접합체는 Advanced Targeting Systems(San Diego, CA)에서 생산 및 구입했다. Tris(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, 98%, Sigma-Aldrich), 5,5-디디오비스(2-니트로벤조산)(DTNB, Ellman's 시약, 99%, Sigma-Aldrich), Zeba™ Spin Desalting Columns( 2mL, Thermo-Fisher), NuPAGE™ 4-12% Bis-Tris 단백질 젤(Thermo-Fisher), NuPAGE™ MES SDS Running Buffer(Thermo-Fisher), Novex™ Sharp 사전 염색된 단백질 표준물질(Thermo-Fisher), PageBlue™ 단백질 염색 용액(Thermo-Fischer), Pierce™ BCA 단백질 분석 키트(Thermo-Fisher), N-에틸말레이미드(NEM, 98%, Sigma-Aldrich), 1,4-디티오트레이톨(DTT, 98%, Sigma-Aldrich), Sephadex G25(GE Healthcare), Sephadex G50 M(GE Healthcare), Superdex 200P(GE Healthcare), 이소프로필 알코올(IPA, 99.6%, VWR), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Tris, 99%, Sigma-Aldrich), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드(Tris.HCL, Sigma-Aldrich), L-히스티딘(99%, Sigma-Aldrich), D-(+)-트레할로스 탈수화물(99%, Sigma-Aldrich), 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN 20, Sigma-Aldrich), Dulbecco의 인산염 완충 염수(DPBS, Thermo-Fisher), 구아니딘 하이드로클로라이드(99%, Sigma-Aldrich), 에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐염 디하이드레이트(EDTA-Na2, 99%, Sigma-Aldrich), 멸균 필터 0.2 μm 및 0.45 μm(Sartorius), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC, Thermo-Fisher), Vivaspin T4 및 T15 농축기(Sartorius), Superdex 200PG(GE Healthcare), Tetra(에틸렌 글리콜) 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (PEG4-SPDP, Thermo-Fisher), [O-(7-아자벤조트리아졸-1일)-N,N,N,N-테트라메틸우로늄-헥사플루오로포스페이트](HATU, 97%, Sigma-Aldrich), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 99%, Sigma-Aldrich), N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트염(AEM, 98%, Sigma-Aldrich), L-Cysteine(98.5%, Sigma-Aldrich), Ultrapure Lab Water Systems(MilliQ, Merck)로부터 새로 취한 탈이온수(DI), 니켈-니트릴로트리아세트산 아가로오스(Ni-NTA 아가로오스, Protino), 글리신(99.5%, VWR), 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산(Ellman's 시약, DTNB, 98%, Sigma-Aldrich), S-아세틸메르캅토숙시닉 무수물 플루오로세인(SAMSA 시약, Invitrogen) 소듐 비카보네이트(99.7%, Sigma-Aldrich), 소듐 카보네이트(99.9%, Sigma-Aldrich), Sephadex G-25 수지(GE Healthcare)가 있는 PD MiniTrap 탈염 컬럼, PD10 G25 탈염 컬럼(GE Healthcare), 0.5, 2, 5 및 10mL의 Zeba 스핀 탈염 컬럼(Thermo-Fisher), Vivaspin 원심 필터 T4 10kDa MWCO, T4 100kDa MWCO 및 T15(Sartorius), Biosep s3000 aSEC 컬럼(Phenomenex), Vivacell 한외여과 장치 10 및 30 kDa MWCO(Sartorius), Nalgene Rapid-Flow 필터(Thermo-Fisher).
약어
AEM: N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트염
AMPD: 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올
BOP: (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트
DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DMF: N,N-디메틸포름아미드
EMCH.TFA: N-(ε-말레이미도카프로산) 히드라지드, 트리플루오로아세트산염
HATU: 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트
Min: 분
NMM: 4-메틸모르폴린
r.t.: 체류 시간(retention time)
TCEP: 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드
Temp.: 온도
TFA: 트리플루오로아세트산
분석 방법
LC-MS 방법 1
장치: Waters IClass; Bin. Pump: UPIBSM, SM: SO가 있는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, 제품의 분자량에 따른 질량 범위 1500-2400 또는 2000-3000 범위 내에서 neg 또는 neg/pos; ELSD: 가스 압력 40psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃; 컬럼: Acquity C18, 50×2.1 mm, 1.7 μm 온도: 60℃, 유속: 0.6 mL/min,
제품의 극성에 따른 기울기:
At0 = 2% A, t5.0min = 50% A, t6.0min = 98% A
Bt0 = 2% A, t5.0min = 98% A, t6.0min = 98% A
사후 시간(Post time): 1.0분, 용리제 A: 아세토니트릴, 용리제 B: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트(pH=9.5).
LC-MS 방법 2, 2
장치: Waters IClass; Bin. Pump: UPIBSM, SM: SO가 있는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, 제품의 분자량에 따른 질량 범위: pos/neg 100-800 또는 neg 2000-3000; ELSD: 가스 압력 40psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃; 컬럼: Waters XSelectTM CSH C18, 50×2.1mm, 2.5μm, 온도: 25℃, 유속: 0.5mL/min, 기울기: t0min = 5% A, t2.0min = 98% A, t2.7min = 98% A, 사후 시간: 0.3분, 용리제 A: 아세토니트릴, 용리제 B: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트(pH = 9.5).
LC-MS 방법 3
장치: Waters IClass; Bin. Pump: UPIBSM, SM: SO가 있는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, 제품의 분자량에 따른 질량 범위 pos/neg 105-800, 500-1200 또는 1500-2500; ELSD: 가스 압력 40psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃; 컬럼: Waters XSelectTM CSH C18, 50×2.1mm, 2.5μm, 온도: 40℃, 유속: 0.5mL/min, 기울기: t0min = 5% A, t2.0min = 98% A, t2.7min = 98% A, 사후 시간: 0.3분, 용리제 A: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산, 용리제 B: 물 중 0.1% 포름산.
LC-MS 방법 4
장치: Waters IClass; Bin. Pump: UPIBSM, SM: SO가 있는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, 제품의 분자량에 따른 질량 범위: pos/neg 100-800 또는 neg 2000-3000; ELSD: 가스 압력 40psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃ 컬럼: Waters Acquity Shield RP18, 50×2.1mm, 1.7μm, 온도: 25℃, 유속: 0.5mL/min, 기울기: t0min = 5% A, t2.0분 = 98% A, t2.7분 = 98% A, 사후 시간: 0.3분, 용리제 A: 아세토니트릴, 용리제 B: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트(pH = 9.5).
제조 방법
제조용 MP-LC 방법 1,
기기 유형: Reveleris™ prep MPLC; 컬럼: Waters XSelectTM CSH C18(145×25 mm, 10 μm); 유속: 40mL/분; 컬럼 온도: 실온; 용리제 A: 물 중 10mM 암모늄 비카보네이트 pH = 9.0); 용리제 B: 물 중 99% 아세토니트릴 + 1% 10mM 암모늄 비카보네이트; 기울기:
At0min = 5% B, t1min = 5% B, t2min = 10% B, t17min = 50% B, t18min = 100% B, t23min = 100% B
Bt0min = 5% B, t1min = 5% B, t2min = 20% B, t17min = 60% B, t18min = 100% B, t23min = 100% B
; 검출 UV: 210, 235, 254 nm 및 ELSD.
제조용 MP-LC 방법 2
기기 유형: Reveleris™ prep MPLC; 칼럼: 페노메넥스 LUNA C18(3) (150×25 mm, 10 μm); 유속: 40mL/min; 컬럼 온도: 실온; 용리제 A: 물 중 0.1%(v/v) 포름산, 용리제 B: 아세토니트릴 중 0.1%(v/v) 포름산; 기울기:
At0min = 5% B, t1min = 5% B, t2min = 20% B, t17min = 60% B, t18min = 100% B, t23min = 100% B
Bt0min = 2% B, t1min = 2% B, t2min = 2% B, t17min = 30% B, t18min = 100% B, t23min = 100% B
Ct0min = 5% B, t1min = 5% B, t2min = 10% B, t17min = 50% B, t18min = 100% B, t23min = 100% B
Dt0min = 5% B, t1min = 5% B, t2min = 5% B, t17min = 40% B, t18min = 100% B, t23min = 100% B
; 검출 UV: 210, 235, 254 nm 및 ELSD.
제조용 LC-MS 방법 3
MS 기기 유형: Agilent Technologies G6130B Quadrupole; HPLC 기기 유형: Agilent Technologies 1290 제조용 LC; 컬럼: Waters XSelectTM CSH(C18, 150×19mm, 10μm); 유속: 25ml/min; 컬럼 온도: 실온; 용리제 A: 100% 아세토니트릴; 용리제 B: 물 pH=9.0 중 10mM 암모늄 비카보네이트; 기울기:
At0 = 20% A, t2.5min = 20% A, t11min = 60% A, t13min = 100% A, t17min = 100% A
Bt0 = 5% A, t2.5min = 5% A, t11min = 40% A, t13min = 100% A, t17min = 100% A
; 검출: DAD(210nm); 검출: MSD(ESI pos/neg) 질량 범위: 100 - 800; DAD 기반 분획 수집.
제조용 LC-MS 방법 4
MS 기기 유형: Agilent Technologies G6130B Quadrupole; HPLC 기기 유형: Agilent Technologies 1290 제조용 LC; 컬럼: Waters XBridge Protein(C4, 150x19mm, 10μm); 유속: 25ml/min; 컬럼 온도: 실온; 용리제 A: 100% 아세토니트릴; 용리제 B: 물 pH=9.0 중 10mM 암모늄 비카보네이트; 기울기:
At0 = 2% A, t2.5min = 2% A, t11min = 30% A, t13min = 100% A, t17min = 100% A
Bt0 = 10% A, t2.5min = 10% A, t11min = 50% A, t13min = 100% A, t17min = 100% A
Ct0 = 5% A, t2.5min = 5% A, t11min = 40% A, t13min = 100% A, t17min = 100% A
; 검출: DAD(210nm); 검출: MSD(ESI pos/neg) 질량 범위: 100 - 800; DAD 기반 분획 수집
플래시 크로마토그래피
Grace Reveleris X2® C-815 플래시; 용매 전달 시스템: 자동 프라이밍 기능이 있는 3-피스톤 펌프, 단일 실행에서 최대 4개의 용매가 있는 4개의 독립 채널, 용매가 고갈되면 라인 자동 전환; 최대 펌프 유속 250mL/min; 최대 압력 50bar(725psi); 검출: UV 200-400 nm, 최대 4개의 UV 신호 조합 및 전체 UV 범위 스캔, ELSD; 컬럼 크기: 기기에서 4-330g, 루어(luer) 유형, 750g ~ 3000g(옵션 홀더 포함).
실시예 1: 사포닌 유도체 합성
다음의 변형된 SO1861 사포닌, 즉 사포닌 유도체는 표 A2에 요약된 바와 같이 자연 발생 SO1861을 기반으로 합성되었다.
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
SO1861 유도체의 합성에 대한 하기 설명을 참조하며, 표 A2 및 도면을 참조한다.
SO1861-Ald-EMCH(분자 2 )의 합성; 도 60, 도 61a 참조
사포나리아 오피시날리스 L(Saponaria officinalis L)의 SO1861(59mg, 31.7μmol) 및 EMCH(301mg, 888μmol)를 교반기가 있는 둥근 플라스크에 넣고, 13mL 메탄올에 용해했다. TFA(400μL, cat.)를 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 RCT B 자기 교반기(IKA Labortechnik)에서 800rpm 및 실온에서 3시간 동안 교반했다. 3시간 동안 교반한 후, 혼합물을 MilliQ 물 또는 PBS로 희석하고, 1kDa의 MWCO를 함유한 재생 셀룰로오스 멤브레인 튜브(Spectra/Por 7)를 사용하여 MilliQ 물 또는 PBS로 24시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후, 용액을 동결건조하여 백색 분말을 얻었다. 수율 62.4mg(95%). 건조된 분취량(aliquots)은 1H NMR 및 MALDI-TOF-MS를 통해 특성화를 위해 추가로 사용되었다.
1H NMR (400 MHz, methanol-D 4) (SO1861): δ = 0.50-5.50 (m, 사포닌 트리테르페노이드 및 당 골격 양성자), 9.43(1H, s, 사포닌의 알데히드 양성자, Ha).
1H NMR (400 MHz, methanol-D 4) (SO1861-Ald-EMCH, PBS 워크업): δ = 0.50-5.50(m, 사포닌 트리테르페노이드 및 당 골격 양성자), 6.79(2H, s, 말레이미드 양성자, Hc), 7.62-7.68(1H, m, 히드라존 양성자, Hb).
MALDI-TOF-MS (RP 모드): m/z 2124 Da ([M+K]+, 사포닌-EMCH), m/z 2109 Da ([M+K]+, SO1861-ALD-EMCH), m/z 2094 Da ([M+Na]+, SO1861-ALD-EMCH). 도 61a 참조.
MALDI-TOF-MS(RN 모드): m/z 2275 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2244 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2222 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2178 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2144 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2122 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2092 Da([MH]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2070 Da([MH]-, SO1861-ALD-EMCH), 2038 Da([MH]-, SO1832-EMCH), 1936 Da([MH]-, SO1730-EMCH), 1861 Da([MH]-, SO1861). SO1861-ALD-EMCH는 분자 2(화학식: C93H143N3O48, 정확한 질량: 2069.88)로 표시된다:
Figure pct00052
(분자 2)
히드라존 결합의 pH 의존적 가수분해를 테스트하기 위해, SO1861-Ald-EMCH를 pH 3의 HCl 용액에 용해시키고, MALDI-TOF-MS 스펙트럼을 두 개의 다른 시점에서 기록했다(도 62). 도 62a와 62b에서 볼 수 있듯이, SO1861-Ald-EMCH에 해당하는 m/z 2070 Da에서 분명한 피크의 감소 경향은 도 61b에서 볼 수 있다. SO1861은 가수분해 중에 생성되기 때문에, m/z 1861 Da에서 피크의 증가가 기록되었으며, 이는 m/z 2070 Da에서 감소하는 경향을 동반하였다. 이러한 결과는 히드라존 결합이 가수분해에 반응하고, SO1861에 부착되더라도 절단된다는 것을 보여준다.
SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올의 합성(분자 3 ; SO1861-Ald-EMCH-차단); 도 60 및 도 61b 참조
SO1861-Ald-EMCH의 말레이미드기는 pH 6.5-7.5 범위에서 수행될 때 티올과 빠르고 특이적인 마이클 부가 반응을 수행한다.
SO1861-Ald-EMCH(0.1mg, 48nmol)에 200μL 메르캅토에탄올(18mg, 230μmol)을 첨가하고, 용액을 ThermoMixer C(Eppendorf)에서 800rpm 및 실온에서 1시간 동안 진탕했다. 1시간 동안 진탕한 후, 용액을 메탄올로 희석하고, 1kDa의 MWCO를 함유한 재생 셀룰로오스 멤브레인 튜브(Spectra/Por 7)를 사용하여 메탄올에 대해 4시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올이 제공되었고(분자 3), 분취량을 꺼내 MALDI-TOF-MS를 통해 분석했다.
MALDI-TOF-MS(RP 모드): m/z 2193 Da([M+K]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2185 Da([M+K]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2170 Da([M+Na]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올). 도 61b 참조. SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올은 분자 3(화학식: C95H149N3O49S, 정확한 질량: 2147.90)으로 표시된다.
Figure pct00053
(분자 3)
SO1861-Glu-AMPD(분자 3A )의 합성; 도 1 참조
SO1861(28.8mg, 0.015mmol), AMPD(8.11mg, 0.077mmol) 및 HATU(17.6mg, 0.046mmol)를 DMF(1.00mL) 및 NMM(8.48μL, 0.077mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC로 처리하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조시켰다. 다음으로, 제조용 LC-MS를 사용하여 생성물을 재정제하였다.3 생성물에 상응하는 분획을 즉시 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(20.2mg, 67%)을 백색의 솜털 같은 고체로 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 93% (화학식: C87H139NO47, 정확한 질량: 1949,85.
LRMS(m/z):1949[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.451B
SO1861-Ald-OH(분자 6 )의 합성; 도 2 참조
SO1861(20.0mg, 10.7μmol)을 메탄올(1.00mL)에 용해시켰다. 다음으로, 소듐 보로하이드리드(4.06 mg, 0.107 mmol; NaBH4)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 물(0.50mL)로 희석하고, 제조용 MP-LC에 적용했다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결하고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(15.9mg, 79%)을 백색의 솜털 같은 고체로 수득하였다. LC-MS 기준 순도 97%(화학식: C83H132O46, 정확한 질량: 1864,80)이다.
LRMS(m/z):1865[M-1]1-(도 15 및 16 참조)
LC-MS r.t.(min):1.951B
SO1861-Ac-OH(분자 8 )의 합성; 도 3 참조
SO1861(9.30mg, 4.99μmol)에 물(0.25mL) 및 메탄올(0.25mL) 중 소듐 히드록시드(2.00mg, 0.050mmol) 용액을 첨가했다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(8.86mg, 97%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 97%(화학식: C81H128O45, 정확한 질량: 1820,77).
LRMS(m/z):1820[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.831B
SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(분자 9 )의 합성; 도 4 참조
SO1861-Ald-OH(9.37mg, 5.02μmol), AMPD(2.64mg, 0.025mmol) 및 BOP(6.66mg, 0.015mmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(5.52μL, 0.050mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC로 처리하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(6.32mg, 64%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 95% (화학식: C87H141NO47, 정확한 질량: 1951,87).
LRMS(m/z):1952[M-1]1-(도 17 참조)
LC-MS r.t.(min):2.451B
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(분자 10 )의 합성; 도 5 참조
SO1861-Ald-OH(26.8mg, 0.014mmol)에 물(0.50mL) 및 메탄올(0.50mL) 중 소듐 히드록시드(5.74mg, 0.144mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC로 처리하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(24.2mg, 92%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 98%. (화학식: C81H130O45, 정확한 질량: 1822,79)
LRMS(m/z):1822[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.811B
SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(분자 11 )의 합성; 도 6 참조
SO1861-Ac-OH(14.3mg, 7.84μmol), AMPD(4.12mg, 0.039mmol) 및 BOP(10.4mg, 0.024mmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(8.62μL, 0.078mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC로 처리하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조시켰다. 다음으로, 생성물을 제1 제조용 MP-LC를 사용하여 정제하고2, 이어서 제조용 LC-MS를 사용하여 정제하였다.3 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(9.47mg, 63%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 98%(화학식: C85H137NO46, 정확한 질량: 1907,84).
LRMS(m/z):1908[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.311B
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(분자 12 )의 합성; 도 7 참조
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.57mg, 4.70μmol), AMPD(42.58mg, 0.025mmol) 및 BOP(6.57mg, 0.015mmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(5.17μL, 0.047mmol)의 혼합물에 용해하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC로 처리하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고. 밤새 동결건조시켰다. 다음으로, 정제용 MP-LC를 다시 사용하여 생성물을 정제하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조시켜 표제 화합물(7.21 mg, 80%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 97.8% 화학식: C85H139NO46, 정확한 질량: 1909,86)
LRMS(m/z):1910[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.211B
SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)(분자 14 )의 합성; 도 8 참조
SO1861-Glu-AMPD(10.6mg, 5.43μmol) 및 EMCH.TFA(9.22mg, 0.027mmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 0.50mL)에 용해했다. 다음으로, TFA(1.66μL, 0.022mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.1 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조시켰다. 다음으로, 생성물을 제조용 LC-MS를 사용하여 정제하였다.3 생성물에 상응하는 분획을 함께 모았다. 생성된 용액을 포름산을 사용하여 중화하고, 동결하고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(2.61 mg, 22%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 95%(화학식: C97H152N4O49, 정확한 질량: 2156,95).
LRMS(m/z): 2156[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.641B
SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)(분자 15 )의 합성; 도 9 참조
SO1861-Ac-OH(9.05mg, 4.97μmol) 및 EMCH.TFA(8.43mg, 0.025mmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 0.50mL)에 용해시켰다. 다음으로, TFA(1.52μL, 0.022mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.1 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(6.58 mg, 65%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 97%(화학식: C91H141N3O47, 정확한 질량: 2027,87).
LRMS(m/z): 2028[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 1.961B
SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(분자 16 )의 합성; 도 10 참조
SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(6.00mg, 3.14μmol) 및 EMCH.TFA(5.33mg, 0.016mmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 0.50mL)에 용해시켰다. 다음으로, TFA(0.96μL, 0.013mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.1 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조시켰다. 다음으로, 생성물을 제조용 LC-MS를 사용하여 정제하였다.3 생성물에 상응하는 분획을 함께 모았다. 생성된 용액을 포름산을 사용하여 중화하고, 동결 및 밤새 동결건조하여 표제 화합물(1.04 mg, 16%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 94%(화학식: C95H150N4O48, 정확한 질량: 2114,94).
LRMS(m/z): 2115[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.551B
SO1861-Glu-AEM(분자 18 )의 합성; 도 11 참조
SO1861(10.4mg, 5.58μmol), AEM(7.10mg, 0.028mmol) 및 HATU(6.36mg, 0.017mmol)를 DMF(1.00mL) 및 NMM(6.13μL, 0.056mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조시켜 표제 화합물(7.82 mg, 71%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 95%(화학식: C89H136N2O47, 정확한 질량: 1984,83).
LRMS(m/z): 1985[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.621B
SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)(분자 19 )의 합성; 도 12 참조
SO1861-Ac-OH(9.02mg, 4.95μmol), AEM(7.10mg, 0.028mmol) 및 HATU(5.65mg, 0.015mmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(5.44μL, 0.050mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC로 처리하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조시켜 표제 화합물(7.16 mg, 74%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 96%(화학식: C87H134N2O46, 정확한 질량: 1942,82).
LRMS(m/z): 1944[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.471B
SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)(분자 20 )의 합성; 도 13 참조
SO1861-Ald-OH(9.38mg, 5.03μmol), AEM(6.39mg, 0.025mmol) 및 HATU(5.73mg, 0.015mmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(5.53μL, 0.050mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(8.63 mg, 86%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 95%(화학식: C89H138N2O47, 정확한 질량: 1986,85).
LRMS(m/z): 1987[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.621B
SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)(분자 21 )의 합성; 도 14 참조
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.92mg, 4.89μmol), AEM(6.54mg, 0.026mmol) 및 HATU(5.65mg, 0.015mmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(5.38μL, 0.049mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC로 처리하였다.2 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(8.92 mg, 94%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 = 97%(화학식: C87H136N2O46, 정확한 질량: 1944,84).
LRMS(m/z): 1944[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.461B
SO1861-L-N 3 (분자 23 )의 합성; 도 36 참조
화학식: C94H151N5O50, 정확한 질량: 2149,94
SO1861-L-NHS(분자 25 )의 합성; 도 37 참조
SO1861-L-N3(7.71mg, 3.58μmol) 및 DBCO-NHS(2.88mg, 7.17μmol)를 건조 DMF(0.50mL)에 용해했다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 디에틸 에테르(40mL)에 적가하였다. 원심분리(7800RPM, 5분) 후 상층액을 따라내고, 펠렛을 디에틸 에테르(20mL)에 재현탁하고 다시 원심분리했다. 상청액을 따라낸 후, 잔류물을 물/아세토니트릴(3:1, v/v, 3 mL)에 용해시키고, 생성된 용액을 직접 동결하고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(8.81 mg, 96%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 얻었다. LC-MS 기준 순도 84%. 14%의 가수분해된 NHS 에스테르를 함유한다(화학식: C117H169N7O55, 정확한 질량: 2552,06).
LRMS(m/z): 2551 [M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.76/2.782(이성질체로 인한 이중 피크)
SO1861-Glu-HATU(분자 26 )의 합성; 도 59 참조
SO1861-Glu-HATU를 생성하기 위해 SO1861의 카르복실기는 펩티드 결합 화학에 사용되는 시약을 통해 활성화되어 활성 에스테르, 즉 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)가 생성되었다. 생성된 SO1861의 활성 에스테르는 도 59에 나와 있다.
다음과 같은 변형된 QS-21 사포닌, 즉 사포닌 유도체는 자연 발생 QS-21을 기반으로 합성되었다.
Figure pct00054
Figure pct00055
QS21-Ald-OH(분자 27 )의 합성; 도 38 참조
QS21(9.41mg, 4.73μmol)을 메탄올(0.50mL)에 용해했다. 다음으로, 소듐 보로하이드리드(1.79 mg, 0.047 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 물(0.50mL)로 희석하고, 제조용 MP-LC에 적용하였다.2A 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(4.68mg, 50%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 99%(정확한 질량: 1990, 4개의 이성질체: Api/Xyl(2:1)).
LRMS(m/z): 1990 [M-1]1-
LC-MS r.t. (min): 1.25/2.311B(이중 피크, 17/83 UV-영역 %, QS21이 혼합물이기 때문에)
QS21-Glu-AEM(분자 28 )의 합성; 도 39 참조
QS-21(2.42mg, 1.22μmol, 도 41), AEM(1.68mg, 6.61μmol) 및 HATU(1.48mg, 3.89μmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(1.34μL, 0.012mmol)의 혼합물에 용해했다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 예비 MP-LC에 적용하였다.2A 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(1.80 mg, 70%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 92%(정확한 질량: 2110, 4개의 이성질체: Api/Xyl(2:1)).
LRMS(m/z): 2110 [M-1]1-
LC-MS r.t. (min): 2.84/2.931B(이중 피크, 10/90 UV 영역 %, QS21이 혼합물이기 때문에)
QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)(분자 29 )의 합성; 도 40a 참조
QS-21-Ald-OH(1.92mg, 0.964μmol), AEM(1.29mg, 5.08μmol) 및 HATU(1.10mg, 2.89μmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(1.06μL, 9.64μmol)의 혼합물에 용해했다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.2A 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(1.46 mg, 72%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 92%(정확한 질량: 2112, 4개의 이성질체: Api/Xyl(2:1)).
LRMS(m/z): 2112 [M-1]1-
LC-MS r.t. (min): 2.83/2.921B(이중 피크, 7/93 UV-영역 %, QS21이 혼합물이기 때문에)
QS21-Ald-EMCH(도 40b; 분자 30 )의 합성
QS21(4.82mg, 2.42μmol) 및 EMCH.TFA(4.11mg, 0.012mmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 0.25mL)에 용해했다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.2A 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조시켰다. 다음으로, 생성물을 제조용 MP-LC를 사용하여 재정제하였다.2A 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조시켜 표제 화합물(2.78 mg, 52%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 96%.
LRMS(m/z): 2196[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.441B(QS21이 혼합물이기 때문에 다중 피크)
QS21-Glu-AMPD(도 40c; 분자 31)의 합성
QS21(4.89mg, 2.46μmol), AMPD(1.29mg, 0.012mmol) 및 BOP(3.26mg, 7.37μmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(2.70μL, 0.025mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.2A 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(3.76 mg, 74%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 94%.
LRMS(m/z): 2076[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.781B(QS21이 혼합물이기 때문에 다중 피크)
QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)(도 40d; 분자 32 )의 합성
QS21-Glu(2.47mg, 1.19μmol) 및 EMCH.TFA(2.02mg, 5.95μmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 100μL)에 용해했다. 다음으로, TFA(0.36μL, 4.76μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.2A 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(2.25 mg, 83%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 95%.
LRMS(m/z):2283[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.881B(QS21이 혼합물이기 때문에 다중 피크)
QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(도 40e; 분자 33 )의 합성
QS21-(Ald-OH)(4.90mg, 2.46μmol), AMPD(1.29mg, 0.012mmol) 및 BOP(3.26mg, 7.37μmol)를 DMF(0.50mL) 및 NMM(2.70μL, 0.025mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1분 동안 진탕하고, 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 반응 혼합물을 제조용 MP-LC에 적용하였다.2A 생성물에 상응하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결시키고, 밤새 동결건조하여 표제 화합물(2.16 mg, 42%)을 백색의 솜털 같은 고체로서 수득하였다. LC-MS 기준 순도 96%.
LRMS(m/z): 2077[M-1]1-
LC-MS r.t.(min): 2.771B(QS21이 혼합물이기 때문에 다중 피크)
실시예 2: 사포닌 유도체의 활성 - 예비 연구
본원에 기재된 사포닌 변형은 엔도솜 탈출(변형된 사포닌 또는 엔도솜 내부의 접합체로부터 유리된 사포닌)을 향상시키는 사포닌의 능력을 실질적으로 방해하지 않는 것으로 밝혀졌다. 실험 결과는 하기 표 Ex2에 요약되어 있다.
화학적으로 변형된 사포닌 SO1861은 세포 기반 생물학적 분석에서 반응성을 나타내었으며, 상대적인 세포 생존율을 판독했다. HeLa 세포를 72시간 동안 인큐베이션하고 72시간 인큐베이션 전후에 다음 구성물 및 세포 생존율을 평가했다. 실험에서 세포는 1.5 pM 디안틴-EGF 접합체에 노출되었다. 음성 대조군은 디안틴-EGF 없이 완충 비히클 및 10 마이크로그램/ml 사포닌과 함께 배양된 세포였다. 세포 생존율은 사포닌과 EGF-디안틴이 모두 생략된 대조군에 대해 100%로 설정되었다. 양성 대조군은 10 마이크로그램/ml의 변형되지 않은 사포닌 SO1861 + 디안틴-EGF였다. 72시간 후 세포 생존율은 본질적으로 0%였다. 화학적으로 변형된 사포닌 변이체의 경우, 10 마이크로그램/ml 사포닌을 1.5pM 디안틴-EGF와 조합하여 테스트했다. SO1861-Ald-EMCH는 10 마이크로그램/ml에서 세포 생존율을 감소시켰다.
이러한 데이터는 사포닌이 엔도솜 탈출 향상 활성을 잃지 않고 유리 알데히드기 또는 유리 카르보닐기에서 변형될 수 있음을 입증한다.
Figure pct00056
실시예 3: 사포닌 유도체의 활성 - 상세한 연구
다양한 사포닌들(예: SO1861, QS-21)을 리간드 독소 융합체(예: EGF-디안틴) 또는 항체-단백질 독소 접합체와 조합하여 '유리(free)' 비접합 분자로 세포에 공동 투여하였으며, 이는 표적 발현 세포의 세포 사멸 활성을 증가시켰다.
본 발명자들은 분자 내의 다양한 위치에서 SO1861(사포나리아 오피시날리스의 뿌리 추출물로부터 분리 및 정제됨) 및 QS21(퀼라자 사포나리아에서 분리 및 정제됨; Desert King)을 화학적으로 변형하여(단일, 이중 또는 삼중 변형) 표 A2 및 A3에 요약된 일련의 사포닌 유도체를 제공하였다. 사포닌 유도체는 1) EGFR 발현 세포(HeLa 및 A431)에 대한 리간드 독소(변형된 SO1861/QS21 적정 + 5 pM EGF디안틴)의 엔도솜 탈출 향상 활성; 2) HeLa 및 A431에 대한 고유 세포 독성(변형된 SO1861/QS21 적정); 및 3) 인간 적혈구 용혈 활성(인간 적혈구에 대한 변형된 SO1861/QS21 적정)에 대해 시험되었다.
엔도솜 탈출 향상 활성을 측정하기 위해, 변형된 SO1861을 EGFR 발현 세포(HeLa 및 A431)에 대한 비효과적인 고정 농도의 5pM EGF-디안틴 존재하에 적정하였다(도 18a-b 및 19a-b 참조). 또한, 엔도솜 탈출 향상 활성은 비효과적인 고정 농도의 5 pm EGF-디안틴 존재하에서 적정된 사포닌 유도체에 대해서도 측정되었다(SO1861과 SO1861-Ald-EMCH 및 SO1861-Ald-EMCH-차단-의 비교는 도 23a-b 참조 및 SO1861과 SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH), SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD) 및 SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)의 비교는 도 24a-b 참조). 이것은 SO1861과 비교하여 단일 변형을 가진 변형된 사포닌이 다음 농도에서 활성을 나타냄을 보여주었다: HeLa에서의 SO1861-Ald-OH: IC50 = 600 nM 및 A431: IC50 = 600 nM, HeLa에서의 SO1861-Glu-AMPD: IC50 = 600 nM 및 A431: IC50 = 600 nM, HeLa에서의 SO1861-Ac-OH: IC50 = 1000 nM 및 A431: IC50 = 800 nM, HeLa에서의 SO1861-Glu-AEM: IC50 = 1500 nM 및 A431: IC50 = 2000 nM 및 HeLa에서의 SO1861-Ald-EMCH: IC50 = 2000 nM. 그리고 이중 변형은 다음 IC50 값을 갖는 활성을 나타냈다: HeLa에서의 SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD): IC50 = 3000 nM 및 A431: IC50 = 3000nM, HeLa의 SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD): IC50 = 4000nM 및 A431: IC50 = 4000nM, HeLa에서의 SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH): IC50 = 4000nM 및 A431: IC50 = 5000nM, HeLa에서의 SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH): IC50 = 8000nM 및 A431: IC50 = 4000nM, HeLa에서의 SO1861-(AldAc-EMCH)-(Ac-OH): IC50 = 8000 nM 및 A431: IC50 = 10.000 nM, HeLa에서의 SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH): IC50 = 40.000 nM 및 A431: IC50 = 20.000nM. 시험된 삼중 변형은 현재 농도에서 활성을 나타내지 않았다. 변형되지 않은 SO1861 대조군으로 다음 IC50 값이 HeLa에서 얻어졌다: IC50 = 100nM 및 A431에서: IC50 = 200nM. 변형된 QS21의 엔도솜 탈출 향상은 EGFR 발현 세포에서 비효과적인 고정 농도의 5pM EGF-디안틴의 존재하에 사포닌 유도체를 적정함으로써 측정하였다(도 30a 및 30b 참조). 이것은 변형되지 않은 QS21과 비교하여 다음 변형된 QS21이 다음 농도에서 활성을 나타냄을 보여주었다. HeLa에서의 QS21: IC50 = 200nM 및 A431: IC50 = 200nM, HeLa에서의 QS21-Ald-OH: IC50 = 600nM 및 A431: IC50 = 600 nM, HeLa에서의 QS21-Glu-AEM: IC50 = 600 nM 및 A431: IC50 = 700 nM, HeLa의 QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM): IC50 = 1500 nM 및 A4330: IC50 = 3000nM. 결론적으로, 변형되지 않은 SO1861 및 QS21은 모두 HeLa 및 A431 세포에서 IC50 = 200nM에서 효과적이었다. 단일 SO1861/QS21 변형(SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-차단, SO1861-Glu-AMPD, SO1861-Ald-OH, SO1861-Ac-OH, SO1861-Glu-AEM, QS21-Ald-OH, QS21-Glu-AEM)은 HeLa 또는 A431에서 IC50 = 600 nM - 2000 nM에서 활성을 보인 반면(표 A5 및 표 A6) 이중 SO1861/QS21 변형은 Hela 또는 A531 세포에서 IC50 = 1500-40.000 nM에서 활성을 나타냈다(표 A5 및 표 A6). SO1861의 삼중 변형의 경우 최대 20.000nM까지 활성이 관찰되지 않았다.
언급한 바와 같이, 엔도솜 탈출 향상 활성을 측정하기 위해, SO1861 유도체, QS21 유도체 및 이들의 유도체화되지 않은 대응물을 EGFR 발현 세포(HeLa 및 A431)에서 5 pM EGF디안틴의 비효과적인 고정 농도의 존재하에 적정하였다. 이것은 비유도체화된 SO1861 및 비유도체화된 QS21 및 QS21 유도체 QS21-Glu-AMPD가 HeLa 및 A431 세포에서 IC50 = 200 nM에서 효과적임을 밝혀냈다. 단일 SO1861/QS21 변형(SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH(차단)(SO1861-Ald-EMCH(메르캅토에탄올), SO1861-Glu-AMPD, SO1861-(Ald-OH), SO1861-Ac-OH, SO1861-Glu-AEM, QS21-Ald-EMCH, QS21-(Ald-OH), QS21-Glu-AEM)은 HeLa 또는 A431에서 IC50 = 600 nM - 2000 nM에서 활성을 보였으며(표 A5 및 A6), 반명에 SO1861 변형 및 이중 QS21 변형은 Hela 또는 A431 세포에서 IC50 = 1500-40.000 nM에서 활성을 나타냈다(표 A5 및 A6). SO1861의 삼중 변형의 경우 최대 20.000 nM까지 활성이 관찰되지 않았다.
독성 측정을 위해 변형된 SO1861을 HeLa 세포(도 20a 및 21a 참조) 및 A431 세포(도 20b 및 21b 참조)에서 적정했다. 도 25a 및 25b는 SO1861, SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH 차단에 대한 독성 테스트의 세부 사항을 보여주고, 도 26a 및 26b는 SO1861, SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH), SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD) 및 SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)에 대한 세부 사항을 보여준다. 이것은 HeLa 세포에서 변형되지 않은 SO1861이 가장 강한 고유 독성: IC50 = 2000 nM을 나타내는 반면에 HeLa 세포에서 단일 변형 SO1861-Ac는 IC50 = 10.000 nM에서 독성을 나타내는 것으로 나타났다. 다른 모든 SO1861-유도체의 경우 HeLa 세포에서의 고유 독성(IC50)은 20.000nM보다 높았다. A431 세포에서 변형되지 않은 SO1861의 독성은 IC50: 1000 nM에서 관찰되는 반면에 단일 변형 SO1861-Ac-OH, SO1861-Ald-OH, SO1861-Glu-AMPD, SO1861-Ald-EMCH는 각각 IC50 = 2000 nM, IC50 = 7000nM, IC50 = 20.000nM 및 IC50 = 30.000nM에서 독성을 나타낸다. 변형된 QS21의 독성 측정을 위해, 사포닌 유도체는 HeLa 세포(도 31a 참조) 및 A431 세포(도 31b)에서 적정되었다. 이것은 독성을 QS21이 HeLa 세포에서 IC50 = 6000 nM 및 A431 세포에서 IC50 = 3000 nM, QS21-Ald-OH가 HeLa 세포에서 IC50 = 20.000 nM 및 A431 세포에서 IC50 = 20.000 nM, QS21-Glu-AEM가 HeLa 세포에서 IC50 = >100.000 nM 및 A431 세포에서 IC50 = > 100.000 nM, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)가 HeLa 세포에서 IC50 = >100.000 nM 및 A431 세포에서 IC50 = > 100.000 nM을 나타내는 것으로 나타났다. SO1861 또는 QS21 이중 변형 및 SO1861 삼중 변형의 경우 최대 100.000nM까지 독성이 관찰되지 않았다. 언급한 바와 같이, 변형되지 않거나 변형된 SO1861 또는 QS21은 HeLa 및 A431 세포에서 적정되었다. 이것은 변형되지 않은 SO1861이 IC50 = 1000 nM(HeLa) 및 IC50 = 2000 nM(A431)에서 독성을 나타내는 반면 QS21은 IC50 = 6000 nM(HeLa)(IC50 = 3000 nM(A431)에서 독성을 나타내었으며, QS21-Glu-AMPD는 IC50 = 9000 nM(HeLa) 및 IC50 = 5000 nM(A431)에서 독성을 나타냈다(표 A5 및 A6). HeLa 세포에서 단일 SO1861 변형 및 단일 QS21 변형의 경우, SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH(차단), SO1861-(Ald-OH), SO1861-Glu-AEM, QS21-Ald-EMCH, QS21-Glu-AEM은 최대 100.000nM까지 독성을 나타내지 않은 반면, SO1861-Glu-AMPD, SO1861-Ac-OH, QS21-(Ald-OH)는 각각 IC50 = 20.000 nM, IC50 = 10.000 nM, IC50 = 20.000 nM에서 독성을 나타내었다(표 A5 및 A6). A431 세포에서 SO1861-Glu-AEM 및 QS21-Glu-AEM은 최대 100.000nM까지 독성을 나타내지 않은 반면, SO1861-Ald-EMCH(IC50 = 30.000 nM), SO1861-Ald-EMCH(차단)(IC50 = 30.000 nM), SO1861-(Ald-OH)(IC50 = 7000 nM), SO1861-Ac-OH(IC50 = 2000 nM), SO1861-Glu-AMPD(IC50 = 20.000 nM), QS21-Ald-EMCH(IC50 = 30.000 nM), QS21-(Ald-OH)(IC50 = 20.000 nM)의 경우 독성이 관찰될 수 있었다(표 A5 및 A6). SO1861 이중 변형 또는 QS21 이중 변형 및 SO1861 삼중 변형의 경우 최대 100.000nM까지 독성이 관찰되지 않았다(표 A5 및 A6).
또한, 비변형 및 변형 SO1861의 용혈 활성은 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 측정되었다(도 22, 도 27, 도 28 및 도 32 참조). 이것은 변형되지 않은 SO1861이 IC50 = 8000 nM에서 활성을 나타내고, 변형되지 않은 QS21이 IC50 = 3000 nM에서 활성을 나타내는 것을 보여주었다. 단일 변형 SO1861-Ald-EMCH는 최대 1.000.000nM까지 용혈 활성을 나타내지 않은 반면 인간 적혈구의 용혈 활성은 SO1861-Ald-EMCH 차단(IC50 = 300.000nM), SO1861-Ald-OH(IC50 = 30.000 nM), SO1861-Ac-OH(IC50 = 20.000 nM), SO1861-Glu-AMPD(IC50 = 20.000 nM), SO1861-Glu-AEM(IC50 = 30.000 nM) QS21-Ald-OH(IC50 = 20.000 nM), 및 QS21-Glu-AEM(IC50 = 10.000 nM)에 대해 관찰될 수 있었다(표 A5 및 표 A6). SO1861 또는 QS21 이중 변형의 경우 SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD), SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH), SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH) 및 QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)에 대해 용혈 활성(최대 1.000.000nM)이 관찰되지 않았으나, 반면에 SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50 = 100.000), SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(IC50 = 200.000), SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(IC50= 140.000), SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)(IC50= 100.000)에 대해 용혈 활성이 관찰되었다. SO1861 삼중 변형 중 어느 것도 최대 100.000nM까지 용혈이 관찰될 수 없었다. 용혈 분석은 변형되지 않은 SO1861의 경우 IC50 = 8000 nM에서 그리고 변형되지 않은 Q21의 경우 IC50 = 3000 nM에서 그리고 변형된 QS21-Glu-AMPD의 경우 IC50 = 3000nM에서 용혈 활성을 나타냈다. 단일 변형 SO1861-Ald-EMCH는 최대 1.000.000nM까지 용혈 활성을 나타내지 않은 반면, 인간 적혈구의 용혈 활성은 SO1861-Ald-EMCH(차단)(IC50 = 300.000nM), SO1861-(Ald-OH)(IC50 = 30.000 nM), SO1861-Ac-OH(IC50 = 20.000 nM), SO1861-Glu-AMPD(IC50 = 20.000 nM), SO1861-Glu-AEM(IC50 = 30.000 nM), QS21-Ald-EMCH(IC50 = 30.000 nM), QS21-(Ald-OH)(IC50 = 20.000 nM), 및 QS21-Glu-AEM(IC50 = 10.000 nM)에 대해 관찰될 수 있었다(표 A5 및 A6). SO1861 이중 변형 또는 QS21 이중 변형의 경우 SO1861-Ald-EMCH-(Glu-AMPD), SO1861-(Ac-OH)-EMCH, SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-Ald-EMCH-(Glu-AMPD) 및 QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)에 대해 용혈 활성이 관찰되지 않았으나, 반면 용혈 활성은 SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50 = 100.000 nM), SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(IC50 = 200.000 nM), SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(IC50 = 140.000 nM), SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AEM)(IC50 = 100.000 nM) 및 QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50 = 40.000 nM)에 대해 관찰되었다(표 A5 및 A6). SO1861 삼중 변형 중 어느 것도 최대 100.000nM까지 용혈을 관찰할 수 없었다(표 A5 및 A6).
다양한 QS 사포닌 분획의 엔도솜 탈출 향상 활성(HeLa 및 A431 세포에 대한 사포닌 + 5 pM 세툭시맙-사포린의 적정, 도 33a-b 참조), 독성(HeLa 및 A431 세포에 대한 사포닌 적정, 도 34a-b 참조) 및 용혈 활성(인간 적혈구 세포에 대한 사포닌의 적정, 도 32 및 도 35 참조)을 시험하였다. 이것은 QS21(분획), QS17(분획), QS18(분획)이 HeLa 세포 및 A431 세포에서 200 nM에서 활성을 보인 반면 QS7(분획)은 IC50 = 6000 nM(HeLa) 및 10.000 nM(A431)에서 활성을 나타냄을 보여주었다. 독성 검출 과정에서 HeLa 세포와 A431 세포에서 QS21(분획), QS17(분획), QS18(분획)은 HeLa 세포 및 A431 세포에서 IC50 = 3000 nM에서 독성을 나타낸 반면, QS7(분획)은 IC50 = 20.0000 nM에서 독성을 나타내는 것으로 나타났다. 다음으로, 용혈 분석이 수행되었으며, 이는 QS21(분획)의 경우 IC50 = 3000 nM에서, QS17(분획), QS18(분획)의 경우 IC50 = 5000 nM에서 용혈 활성을 나타낸 반면, QS7(분획)의 경우 최대 20.000nM까지 용혈 활성이 검출될 수 없는 것으로 나타났다(도 35).
다양한 SO 사포닌들(SO1862(이성질체), SO1832, SO1904)의 용혈 활성을 시험했을 뿐만 아니라 항체-SO1861 접합체(세툭시맙-SO1861(DAR4), 트라스투주맙-SO1861(DAR4))의 용혈 활성을 시험하였다. 이는 SO1862(이성질체, SO1832, SO1904)의 용혈 활성이 SO1861(IC50 = 10.000 nM)과 비교할만한 정도임을 보여주었다(도 29). 세툭시맙-SO1861(DAR4) 접합체는 최대 60.000 nM까지 용혈 활성을 나타내지 않은 반면, 트라스투주맙-SO1861(DAR4))은 60.000nM부터 계속 초기 용혈 활성을 나타냈다(IC50 = 200.000 nM)(도 29).
SO1861, SO1861-Ald-EMCH 및 SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올(SO1861-Ald-EMCH-차단)의 세포 독성, 용혈 활성 및 엔도솜 탈출 향상 활성을 비교할 때, 후자의 두 가지는 유사하거나 본질적으로 동일한 세포 독성, 용혈 활성 및 엔도솜 탈출 향상 활성 생체 분석에서의 활성이었으며, 후자의 두 가지는 SO1861보다 세포 독성이 적고 용혈 활성이 적었다. 또한 표 A5 및 표 A6 참조.
세포 생존율 분석
세포 생존율은 제조업체의 지침에 따라 수행된 MTS-분석에 의해 측정되었다(CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). MTS 용액을 10% FBS(PAN-Biotech GmbH)가 보충된 페놀 레드(PAN-Biotech GmbH)가 없는 DMEM에서 20x 희석했다. 세포를 웰당 200μL PBS로 1회 세척한 후, 웰당 100μL 희석된 MTS 용액을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 대략 20-30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, Thermo Scientific Multiskan FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific)에서 492 nm에서의 광학 밀도를 측정했다. 정량화를 위해 처리되지 않은 웰의 배경 보정된 신호를 처리된 웰의 배경 보정된 신호로 나누어 처리되지 않은/처리된 세포의 비율을 계산하기 전에 '배지(medium) 단독' 웰의 배경 신호를 다른 모든 웰에서 차감했다.
FACS 분석
세포를 10cm 디쉬에 500,000 c/플레이트에서 10% 송아지 태아 혈청(PAN-Biotech GmbH) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(PAN-Biotech GmbH)이 보충된 DMEM(PAN-Biotech GmbH)에 접종하고, 90%의 컨플루언시에 도달할 때까지 48시간 동안 인큐베이션(5% CO2, 37℃)했다. 다음으로, 세포를 각 세포에 대해 트립신 처리하였다(TryplE Express, Gibco Thermo Scientific). 0.75 x 106 세포를 15mL 팔콘 튜브로 옮기고, 원심분리했다(1,400rpm, 3분). 세포 펠렛을 잠긴 채로 상층액을 버렸다. 볼텍스 쉐이커에서 팔콘 튜브를 부드럽게 두드려 펠릿을 해리하고, 세포를 4mL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 무함유, 2% FBS)로 세척했다. 세척 후, 세포를 3mL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 무함유, 2% FBS)에 재현탁하고, 3개의 둥근 바닥 FACS 튜브(1mL/튜브)에 균등하게 나누었다. 세포를 다시 원심분리하고, 200μL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 무함유, 2% FBS) 또는 200μL 항체 용액에 재현탁하여; 195 μL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 무함유, 2% FBS)에 5 μL 항체를 함유하도록 하였다. APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl FC(#400122, Biolegend)를 아이소토프 대조군으로 사용하였고, APC 항-인간 EGFR(#352906, Biolegend)을 사용하였다. 시료를 튜브 롤러 믹서에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 무함유, 2% FBS)로 3회 세척하고, PBS 중 2% PFA 용액을 사용하여 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, FACS 분석을 위해 250-350 μL 차가운 PBS에 재현탁했다. 시료는 BD FACSCanto II 유세포 분석 시스템(BD Biosciences) 및 FlowJo 소프트웨어로 분석되었다. FACS 분석 결과는 표 A4에 요약되어 있다.
Figure pct00057
용혈 분석
적혈구(RBC)는 Ficoll 기울기를 사용하여 버피 코트에서 분리되었다. 얻어진 RBC 펠릿(~4-5 ml)을 50 ml DPBS(Ca2+/Mg2+ 무함유, PAN-Biotech GmbH)로 2회 세척했다. RT에서 800xg, 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화했다. RBC를 계수하고, 총 세포 수를 기준으로 DPBS(Ca2+/Mg2+ 무힘유)에서 500.000.000 c/ml로 재현탁했다.
사포닌 희석액은 1.11x 최종 강도에서 DPBS(Ca2+/Mg2+, PAN-Biotech GmbH 함유)에서 제조되었다. 양성 용해 대조군을 위해 0.02% Triton-X100 용액을 DPBS+/+에서 준비했다. 모든 화합물 용액 중 135μl가 96웰 V-바닥 플레이트에 분주되었다. 이에 15μl RBC 현탁액을 첨가하고m 짧게 혼합했다(10초 - 600rpm). 플레이트를 실온에서 30분 동안 부드럽게 교반하면서 인큐베이션하였다. 그 후 플레이트를 800xg에서 10분 동안 회전시켜, RBC를 펠렛화하고, 100-120 μl 상청액을 표준 96 wp(96 웰 플레이트)로 옮겼다. 이어서, Thermo Scientific Multiskan FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific)에서 405 nm에서의 OD를 측정했다. 정량화를 위해 처리되지 않은 웰의 배경 보정된 신호를 0.02% Triton-X100 웰(x 100)의 배경 보정된 신호로 나누어, 용혈 퍼센트를 0.02% Triton-X100과 비교하여 계산하기 전에, 'DPBS+/+ 단독' 웰의 배경 신호를 다른 모든 웰에서 차감했다.
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
실시예 4: 사포닌 유도체의 임계 미셀 농도(CMC)
재료 및 방법
사포나리아 오피시날리스(SO)(표 A7) 및 퀼라자 사포나리아(QS)(표 A8 및 표 A9)에서 유래된 사포닌의 임계 미셀 농도(CMC)는 DeVendittis 등(A fluorimetric method for the estimation of the critical micelle concentration of surfactants, Analytical Biochemistry, Volume 115, Issue 2, August 1981, Pages 278-286)의 방법에 의해 다음과 같이 측정되었다:
정제수(MQ) 또는 PBS(Dulbecco의 PBS +/+)에서 8-아닐리노나프탈렌-1-설폰산(ANS)의 방출 스펙트럼은 CMC 위 및 아래 범위를 포함하기 위해 1~1400μM 범위의 사포닌 건조 중량 농도에서 측정되었다. CMC 위에서는 형광 염료가 미셀로 분할되기 때문에, ANS의 형광 수율이 증가하고, 최대 방출 파장이 감소한다. 형광 수율은 355 nm의 여기 파장 및 460 nm의 방출 파장에서 Fluoroskan Ascent FL(Thermo Scientific)에서 기록되었다. 75.86μM의 농도에서 6μg의 ANS가 시료 및 측정당 사용되었다.
결과
SO1861 사포닌
알데히드(Ald), 글루쿠론산(Glu) 작용기의 화학적 변형 및 아세틸기(Ac)의 제거는 각 사포닌의 미셀 특성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 도 42에 나타난 바와 같이, SO1861 사포닌에서의 각 작용기의 단일 변형(mono-modification)은 얻어진 ANS의 상대적 형광값의 기울기로 나타나는 미셀 형성능에 유의한 영향을 미쳤다. 글루쿠론산에서의 변형(SO1861-Glu-AMPD, SO1861-Glu-AEM)은 분명히 더 가파른 경사를 초래하였으며(도 42), 이는 185μM의 고유 SO1861에 대해 얻어진 바와 같이 보다 낮은 CMC 값을 형성하였다. SO1861-Ald-EMCH-차단 시료에 대해서 유사한 관찰이 얻어졌다. 그러나, 알데히드 및 아세틸기에서의 변형(SO1861-Ald-OH, SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ac-OH)은 현저히 더 평평한 기울기를 초래했고(도 42), 이는 고유 SO1861에 대해 보다 높은 CMC 값을 형성하였다. SO1861-Ald-EMCH 시료는 얻어진 기울기가 거의 평평하고 최대 800μM 농도에서도 CMC를 측정할 수 없었기 때문에 특히 흥미로웠다.
SO1861 사포닌의 이중 변형(도 43) 및 삼중 변형(도 44)에 대해 변형 부위와 관련하여 유사한 관찰이 얻어졌다. 글루쿠론산에서의 변형(SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD), SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH), SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH), SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD))은 더 가파른 ANS 형광 수율 기울기를 가져왔고, 따라서 더 낮은 CMC 값을 형성한 반면에 알데히드 및 아세틸 위치에 대한 변형(SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH), SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH))은 평평한 ANS 형광 수율 기울기로 일으켰으며, 따라서 고유 SO1861에 대해 증가된 CMC 값을 형성하였다(표 A7).
삼중 변형된 사포닌들 SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH) 및 SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD) 비교하면, SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)에서 글루쿠론산에서의 변형은 각 ANS 형광 수율의 더 평평한 기울기를 초래한 반면에 SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)에서 글루쿠론산에서의 변형은 고유 SO1861에 대해 각각의 ANS 형광 수율의 더 가파른 기울기를 형성하였다(도 44). 이러한 결과는 CMC가 고려되는 경우, 알데히드 및/또는 아세톡시 위치에서의 변형의 중요성을 나타낸다. 왜냐하면 Glu-변형된 유도체(유리 사포닌보다 더 낮은 CMC를 가짐)에서도, 상기 알데히드 및/또는 아세톡시 변형이 CMC를 증가할 수 있으며, 이는 CMC가 고려될 경우, 적어도 부분적으로 Glu-변형의 부정적인 영향을 완화시키기 때문이다.
Figure pct00062
QS 사포닌
퀼라자 사포나리아(QS)에서 유래된 사포닌에 대해 QS7, QS17, QS18, QS21 Frac 및 QS21 SP CMC 값이 측정되었으며, 이는 표 A8에 표시된다. 도 45에 도시된 바와 같이, 예상된 QS 사포닌의 ANS 형광 수율의 기울기는 유도된 CMC 값에 상응한다. 얻어진 CMC 값은 49μM의 가장 높은 CMC 값에서 QS21 SP를 시작으로 QS-17, QS-18 및 QS-21 Frac에 비해 감소하는 경향을 나타내며, 모두 약 70μM에서 유사한 CMC를 나타낸다. 마지막으로, QS-7의 경우 230μM의 CMC 값을 얻었다.
정제수(MQ) 및 PBS에서 측정된 QS21 SP의 ANS 형광 수율을 비교할 때, 정제수(MQ)에서의 기울기는 약간 더 가파르게 되어 정제수에서 약간 더 높은 CMC 값이 예상된다(도 46, 표 A9).
단일 변형된 QS21 사포닌 QS21-Ald-EMCH(분자 30; 도 40b), QS21-Glu-AEM, QS21-(Ald-OH) 및 QS21-Glu-AMPD(도 47a, 도 47b)의 경우, 단지 글루쿠론산에 대한 AMPD 변형(QS21-Glu-AMPD, 도 47b)이 고유 QS21에 대해 ANS 형광 수율의 보다 가파른 기울기를 초래하여, 40μM의 더 낮은 CMC 값을 초래했다(표 A9). 글루쿠론산(QS21-Glu-AEM) 및 알데히드 위치(QS21-(Ald-OH), QS21-Ald-EMCH) 모두에서 다른 모든 QS21 단일 변형은 고유 QS21보다 더 평평한 ANS 형광 수율 기울기를 초래했다(도 47b).
사포나리아 오피시날리스 사포닌 SO1861에 대한 이중 변형에 대한 발견과 유사하게, 또한 QS21 사포닌의 AldGlu 변형(QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), 도 40e, 분자 33, 도 47c)은 고유 QS21에 대해 ANS 형광 수율의 보다 가파른 기울기를 초래하여 39 μM의 더 낮은 CMC 값을 초래했다(표 A9). 글루쿠론산 및 알데히드 위치 둘 다에서 다른 모든 QS21 이중-변형(QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-Ald-EMCH-(Glu-AEM), 도 47c)은 고유 QS21보다 더 평평한 ANS 형광 수율을 초래했다.
Figure pct00063
Figure pct00064
실시예 5: SO1861 및 SO1861-Ald-EMCH의 엔도솜 탈출 향상 활성
SO1861 및 SO1861-Ald-EMCH(예를 들어 도 48-58에서 SO1861-EMCH라고도 함)는 표적 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 향상시키는 능력에 대해 시험되었다. 이를 위해 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH를 EGFR 발현 세포(A431)에 대한 10pM 세툭시맙-사포린(DAR4과 함께 단백질 독소, 사포린에 접합된 세툭시맙)의 고정 농도로 적정하였다. 이것은 SO1861(IC50 = 800 nM) 및 SO1861-Ald-EMCH(IC50 = 2000 nM)가 10 pM 세툭시맙-사포린과 조합하여 A431 세포의 효율적인 세포 사멸을 유도하는 반면 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH 단독은 어떠한 세포 사멸 활성도 나타내지 않음을 보여주었다(도 48).
다음으로, 세툭시맙-디안틴 또는 세툭시맙-사포린을 다양한 고정 농도의 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH에서 적정하였다. 이것은 4000 nM SO1861-Ald-EMCH, 4829 nM SO1861-Ald-EMCH 또는 1500 nM SO1861의 존재하에서 낮은 pM 농도의 세툭시맙-디안틴(IC50 = 1 pM, 도 49) 또는 세툭시맙-사포린(IC50 = 0.5 pM, 도 50)으로 효율적인 세포 사멸을 나타냈다. 이 세포 사멸 효과는 300nM SO1861 또는 300nM SO1861-Ald-EMCH에서는 관찰되지 않았다(도 49 및 50).
다음으로, SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH를 EGFR 발현 세포(A431)에서 10 pM EGF디안틴(EGFR 표적화 융합 단백질 독소)의 고정 농도로 적정하였다. 이것은 SO1861(IC50 = 800 nM) 및 SO1861-Ald-EMCH(IC50 = 2000 nM)가 10 pM EGF디안틴과 조합하여 A431 세포의 효율적인 세포 사멸을 유도하는 반면 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH 단독으로는 세포 사멸 활성을 나타내지 않음을 보여주었다(도 51).
다음으로, EGF디안틴은 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH의 다양한 고정 농도에서 적정되었다. 이것은 4829 nM SO1861-Ald-EMCH 또는 1500 nM SO1861의 존재하에 낮은 pM 농도의 EGF디안틴(IC50 = 0.1 pM, 도 52)으로 효율적인 세포 사멸을 나타냈다. 이 세포 사멸 효과는 10nM SO1861 또는 300nM SO1861에서는 관찰되지 않았다(도 52).
다음으로, 트라스투주맙-디안틴 또는 트라스투주맙-사포린(DAR4과 함께 단백질 독소, 사포린에 접합된 트라스투주맙)을 HER2 발현 세포(SK-BR-3)에 대해 1500 nM SO1861 또는 4000 nM SO1861-Ald-EMCH의 고정 농도에서 적정하였다. 이것은 1500 nM SO1861 또는 4000 nM SO1861-Ald-EMCH의 존재하에서 낮은 pM 농도의 트라스투주맙-디안틴(IC50 = 0,1 pM) 또는 트라스투주맙-사포린(IC50 = 0,1 pM)으로 효율적인 세포 사멸을 나타냈다(도 53).
도 48-53에 요약된 이러한 모든 결과는 SO1861-Ald-EMCH가 표적 단백질 독소의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 효율적으로 향상시켜, 표적 단백질 독소의 유효 농도를 nM 범위에서 낮은 pM 범위로 현저히 감소시킨다는 것을 보여준다.
SO1861-Ald-EMCH는 HSP27 mRNA에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드(BNA, 브릿지된 핵산)의 엔도솜 탈출을 향상시키는 능력에 대해 테스트되었다. 이를 위해 SO1861-Ald-EMCH를 EGFR/HER2 발현 세포(A431)에 대해 100 nM HSP27BNA, 100 nM 세툭시맙-HSP27BNA(DAR4와 함께 HSP27BNA에 접합된 세툭시맙) 또는 100 nM 트라스투주맙-HSP27BNA(DAR4와 함께 HSP27BNA에 접합된 트라스투주맙)의 고정 농도에 적정하였다. 이것은 A431 세포에서 100 nM HSP27BNA, 100 nM 세툭시맙-HSP27BNA(도 54) 또는 100 nM 트라스투주맙-HSP27BNA과의 조합에서 효율적인 HSP27 유전자 침묵 세포를 유도한다는 것을 보여주었다(표시되지 않음). SO1861-Ald-EMCH 단독으로는 HSP27 유전자 침묵 활성을 나타내지 않았다(도 54).
다음으로, 세툭시맙-HSP27BNA(DAR1.5 또는 DAR4), 트라스투주맙-HSP27BNA(DAR4.4)를 EGFR(A431) 또는 HER2(SK-BR-3) 발현 세포에서 SO1861-Ald-EMCH의 다양한 고정 농도에서 적정하였다. 이는 4000 nM SO1861-Ald-EMCH의 존재하에 낮은 nM 농도의 세툭시맙-HSP27BNA(IC50 = 0.5 nM, 도 55)를 갖는 A431 세포에서 효율적인 HSP27 유전자 침묵을 나타내는 반면, 세툭시맙-HSP27BNA 단독 또는 세툭시맙-HSP27BNA + 100 nM SO1861-Ald-EMCH는 매우 높은 농도(IC50 > 100 nM, 도 550)에서 유전자 침묵 활성을 나타내지 않았거나 약간의 활성만 나타내었다. SKBR-3 세포에서, 4000 nM SO1861-Ald-EMCH의 존재하에 트라스투주맙-HSP27BNA(IC50 = 0.5 nM, 도 56)는 효율적인 HSP27 유전자 억제 활성을 보인 반면, 트라스투주맙-HSP27BNA 단독 또는 트라스투주맙-HSP27BNA + 100 nM SO1861-Ald-EMCH는 단지 약간의 유전자 침묵 활성을 보였다(IC50 > 100 nM; 도 56).
다음으로, 다양한 세포주에서 비표적 HSP27BNA를 SO1861-Ald-EMCH의 고정 농도로 적정하였다. 이것은 of 4000 nM 또는 4829 nM SO1861-Ald-EMCH의 존재하에서 낮은 nM 농도의 HSP27BNA(IC50(SK-BR3) = 2 nM; IC50(A431) = 10 nM; IC50(A2058) = 10 nM)로 A431, A2058 및 SK-BR-3 세포에서 효과적인 HSP27 유전자 침묵을 나타낸 반면(도 57 및 58), HSP27BNA 단독은 훨씬 더 높은 농도(IC50(SK-BR3) = 300 nM; IC50(A431) = 1000 nM; IC50 (A2058) > 1000nM)에서 유전자 침묵을 유도한 것으로 나타났다(도 57 및 58). HSP27BNA의 활성(SO1861-Ald-EMCH 포함하고 이를 포함하지 않은 경우)을 HSP27LNA(LNA, 락킹된 핵산) 활성과 비교했을 때, 본 발명자들은 엔도솜 탈출/유전자 침묵 향상 인자가 대등하지만, HSP27BNA에 비해 더 높은 HSP27LNA 농도에서 관찰하였다(도 58).
이 모든 것은 SO1861-Ald-EMCH가 표적화된 안티센스 BNA 올리고 및 표적화되지 않은 BNA/LNA 올리고의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 효율적으로 향상시켜, 표적 및 비표적 안티센스 올리고의 유효 농도를 μM 범위에서 낮은 nM 범위로 현저히 감소시킨다는 것을 보여준다.
재료
트라스투주맙(Tras, Herceptin®, Roche), 세툭시맙(Cet, Erbitux®, Merck KGaA). 디안틴-cys는 프랑스 Proteogenix에서 생산하여 구매하였고, EGF디안틴은 표준 절차에 따라 이. 콜라이(E.coli)에서 생산되었다. 세툭시맙-사포린 및 트라스투주맙-사포린 접합체는 Advanced Targeting Systems(San Diego, CA)에서 생산 및 구입했다.
방법
플래시 크로마토그래피
Grace Reveleris X2® C-815 플래시; 용매 전달 시스템: 자동 프라이밍 기능이 있는 3-피스톤 펌프, 단일 실행에서 최대 4개의 용매가 있는 4개의 독립 채널, 용매가 고갈되면 라인 자동 전환; 최대 펌프 유속 250mL/min; 최대 압력 50bar(725psi); 검출: UV 200-400 nm, 최대 4개의 UV 신호 조합 및 전체 UV 범위 스캔, ELSD; 컬럼 크기: 기기에서 4-330g, 루어 유형, 750g 내지 최대 3000g(옵션 홀더 포함).
HSP27BNA 올리고 서열
Zhang et al.(2011)[Y Zhang, Z Qu, S Kim, V Shi, B Liao1, P Kraft, R Bandaru, Y Wu, LM Greenberger and ID Horak, Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection, Gene Therapy (2011) 18, 326-333])([SEQ-ID NO: 2])에 따른 HSP27 BNA 올리고(5'-GGCacagccagtgGCG-3')를 Bio-Synthesis Inc.(Lewisville, Texas)에서 5'-티올 C6 링커와 함께 또는 5'-티올 C6 링커 없이 주문하였다. HSP27 LNA oliogo(5'-ggcacagccagtggcg-3')([SEQ-ID NO: 3])를 Bio-Synthesis Inc.(텍사스 루이스빌)에서 주문하였다.
RNA 분리 및 유전자 발현 분석
세포로부터 RNA를 분리하고 표준 프로토콜(Biorad)에 따라 분석했다. 사용된 qPCR 프라이머는 표 A10에 나와 있다.
Figure pct00065
트라투주맙-사포린 및 세툭시맙-사포린 합성
맞춤형 mAb-사포린 접합체는 Advanced Targeting Systems(San Diego, CA)에서 생산 및 구매되었다.
트라스투주맙-디안틴 및 세툭시맙-디안틴 합성
디안틴-Cys(17.0ml, ~9.6mg)를 vivaspin T15 필터 튜브(3,000g, 20℃, 10분)를 사용하여 한외여과에 의해 농축했다. 생성된 3.25 ml 분취량을 TBS pH 7.5로 용리하는 zeba 10ml 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과하였다.
트라스투주맙(mAb) 또는 세툭시맙(mAb)(0.30ml, ~10mg)을 DPBS pH 7.5로 10mg/ml로 희석하고, DPBS pH 7.5로 용리하는 zeba 5ml 스핀 컬럼을 통해 탈염하고, 2.50mg/ml로 정규화했다. mAb의 분취량에 DMSO에서 새로 제조된 SMCC 용액(1.00mg/ml, 4.20몰 당량, 13.9 × 10-5mmol)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음, 롤러-믹싱과 함께 20℃에서 60분 동안 인큐베이션했다. 그 후, DPBS pH 7.5에서 새로 제조된 글리신 용액(2.0mg/ml, 5.0몰 당량, 69.5 x 10-5mmol)의 분취량을 첨가하여 반응을 켄칭했다. mAb-SMCC(4.27mg, 2.80 x 10-5mmol, 1.514mg/ml)는 TBS pH 7.5로 용리되는 zeba 10ml 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과 후 얻었다.
디안틴-Cys(7.54 mg, 25.3 × 10-5 mmol, 2.258 mg/ml)에 TBS pH 7.5에서 새로 제조된 TCEP 용액(1.00 mg/ml, 0.5 mole 당량, 12.6 × 10-5 mmol)의 분취량을 첨가하고, 그 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음, 롤러-믹싱과 함께 20℃에서 60분 동안 인큐베이션했다. 그 후, TBS pH 7.5로 용리되는 zeba 10ml 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과하여 디안틴-SH(6.0 mg, 20.2 × 10-5 mmol, 1.722 mg/ml, 디안틴:SH = 1.1)를 얻었다.
벌크 mAb-SMCC에 디안틴-SH의 분취량(7.20몰 당량)을 첨가하고, 그 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음, 20℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 약 16시간 후, TBS pH 7.5에서 새로 제조된 NEM 용액(2.50mg/ml, 5.0몰 당량, 101 x 10-5mmol)의 분취량을 첨가하여 반응을 켄칭했다. 반응 혼합물을 0.45㎛로 여과한 다음, vivaspin T15 필터 튜브(3,000g, 20℃, 15분)를 사용한 한외여과에 의해 <2 ml로 농축시켰다. 접합체는 DPBS pH 7.5로 용리되는 1.6 x 35 cm Superdex 200PG 컬럼을 사용하는 겔 여과에 의해 정제되었다.
항체-(L-HSP27 BNA) n [HSP27 BNA 디설피드에 대한]
DAR4와 함께 PEG4-SPDP를 통한 트라스투주맙-(L-HSP27)4, 세툭시맙-(L-HSP27)4 합성 및 DAR2와 함께 PEG4-SPDP를 통한 세툭시맙-(L-HSP27)2 합성
트라스투주맙, 세툭시맙은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab는 Ab와 HSP27 BNA 사이에 불안정한(L) 디설피드 결합을 형성하는 테트라(에틸렌 글리콜) 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP) 링커를 통해 HSP27 BNA 디설피드에 접합되었다. 절차는 트라스투주맙-(L-HSP27 BNA)4에 대해 예시적으로 설명된다.
HSP27 BNA 디설피드 올리고(2.7mg, 470nmol, 6.10mg/ml)를 TCEP(10몰 당량, 4.7μmol, 1.34mg, 50mg/ml)와 20℃에서 롤러 믹싱과 함께 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 올리고-SH를 TBS pH 7.5로 용리되는 PD10 G25 탈염 컬럼으로 정제하고, 즉시 사용하였다. 올리고-SH를 얻었다(2.48 mg, 90%, 1.24 mg/ml, SH 대 올리고 비율 = 0.8)
트라스투주맙(1.5mg, 10.3nmol, 2.50mg/ml)을 DMSO(1mg/ml)에서 새로 제조된 PEG4-SPDP 용액(6.81몰 당량, 70.1nmol, 39㎍)의 분취량과 20℃에서 60분 동안 롤러 혼합과 함께 반응시켰다. 그 후, 반응을 글리신(TBS pH 7.5에서 새로 제조된 2 mg/ml 용액 15.1 ㎕)으로 켄칭한 다음, TBS pH 7.5로 용리하는 zeba 탈염 컬럼을 통해 탈염하였다. 생성된 Tras-S-PEG4-SPDP의 분취량을 꺼내어, UV-Vis 분석으로 테스트했다. SPDP 혼입은 TCEP를 사용하여 피리디일-2-티온(PDT)을 유리시키고, 343 nm에서 UV-vis 분석(SPDP 대 Ab 비율: 4)을 사용하여 측정했다. 나머지 Tras-(S-PEG4-SPDP)4는 새로 제조된 HSP27 올리고뉴클레오티드(올리고-SH)의 분취량(8 mole 당량, 82.4 nmol, 1.24 mg/ml)과 반응하고, 롤러 혼합과 함께 20℃에서 밤새 인큐베이션했다. 17시간 후, 접합체를 UV-vis 분석으로 분석하여 343 nm에서 피리디일-2-티온(PDT)의 치환에 의한 HSP27의 혼입을 확인하였다. 조 접합체를 DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 × 33 cm Sephadex G50 컬럼을 사용하여 정제했다. 생성된 트라스투주맙-(L-HSP27)4를 단일 분획으로 얻었다. 수율: n.d.. 순도: 96%, HSP27 BNA 대 Ab 비율 = 4.4
실시예 6 - 사포닌의 엔도솜 탈출 향상 활성
이전에는 다양한 사포닌(SO1861, SA1642)의 효능이 리간드 독소 융합체(예: EGF디안틴) 또는 항체-단백질 독소 접합체와 결합하여 '유리(free)' 비접합 분자로서 세포에 공동 투여되어, 표적 발현 세포의 세포 사멸 활성이 향상되었다. 여기에서, 사포나이라 오피시날리스의 뿌리 추출물에서 분리된 세 가지 다른 사포닌 분자(SO1861, SO1862(SO1861의 이성질체), SO1832 및 SO1904)를 HeLa(EGFR+) 세포에 대해 1.5 pM EGF디안틴의 비유효 고정 농도의 존재 및 부재하에 적정하였다. 이는 EGF디안틴이 없는 처리와 비교하여 시험된 모든 사포닌 변이체(IC50 = 300 nM; 도 63a)에 대한 세포 사멸 활성의 강력한 향상을 나타내었다. 다음으로, EGF디안틴은 고정된 농도의 사포닌(~1000 nM)으로 적정되었으며, 이는 낮은 pM 농도의 EGF디안틴(IC50 = 0.4 pM; 도 63b)에서 강력한 표적 세포 사멸 향상이 사용된 모든 사포닌들 SO1861, SO1862(SO1861의 이성질체), SO1832 및 SO1904에 대해 관찰되었다. EGF-디안틴 단독은 매우 높은 농도(IC50 = 10.000 pM)에서만 세포 사멸을 유도할 수 있다. 이것은 이러한 특정 유형의 사포닌 모두가 이용가능한 단지 매우 적은 양의 표적 독소로 엔도솜 탈출을 효율적으로 유도하는 고유한 능력을 가지고 있음을 보여준다.
이 테스트를 확장하기 위해, 다른 출처의 사포닌을 분석했다. 집소필라 엘레간스(Gypsophila elegans) M.Bieb의 뿌리 추출물에서 정제된 사포닌(GE1741)을 1.5pM EGF디안틴의 존재 및 부재하에 HeLa 세포에서 적정하고, 정제된 SO1861과 비교했다. GE1741은 또한 EGF디안틴 유도 HeLa 세포 사멸을 향상시키지만, SO1861에 비해 약간 낮은 효능을 보이며(GE1741 IC50 = 800 nM; 도 63c), 또한 더 높은 일반 독성을 나타낸다(EGF디안틴 부재하에 IC50 = 5.000 nM, 도 63c). 퀼라자 사포나리아 사포닌(QSmix 1-3)의 다른 부분적으로 정제된 혼합물을 HeLa 세포에 1.5pM EGF디안틴과 함께 공동 투여한 유사한 테스트에서 3개 중 2개(QSmix 1 및 QSmix 3)에서 SO1861과 유사한 활성이 나타났다(IC50 QSmix/QSmix3 = 300nM, 도 63d). QSmix(2)는 1.5pM EGF디안틴 유도 세포 사멸을 향상시키는 데 덜 효율적이지만(IC50 = 2000nM; 도 63d), 일반적인 독성은 관찰되지 않는다. 이것은 QS 추출물에서도 표적 리간드 독소 EGF디안틴의 엔도솜 탈출을 효율적으로 유도하는 특정 유형의 사포닌을 사용할 수 있음을 보여준다. 따라서, 퀼라자 사포나리아 사포닌들, GE1741, SO1861, SO1862, SO1832 및 SO1904와 같은 이 실시예에서 설명된 사포닌들은 본 발명에 따라 유도체화하기에 특히 매력적인 사포닌들이다.
실시예 7 - 사포닌 및 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 향상 활성
불안정/산 민감성 유도체화(Ald-EMCH 또는 SO1861-L-N3(SO1861-N3 및 SO1861-아지드 또는 SO1861-N3/아지드라고도 함)는 알데히드기를 통해 SO1861에 적용되어 SO1861-Ald-EMCH 또는 SO1861-L-N3를 생성한다. SO1861-Ald-EMCH의 활성을 확인하기 위해, 상기 분자를 EGFR 발현(A431, HeLa) 및 비발현 세포(A2058)에 대한 고정된 비효과적(1.5pM) EGF디안틴 농도의 존재 및 부재하에 적정하였다. 세 가지 세포주 모두에서 SO1861 단독은 강력한 세포 생존율 감소를 보인 반면, 단일 화합물로서의 SO1861-Ald-EMCH는 최대 25.000 nM까지 독성을 나타내지 않았다(도 64a-c). SO1861-Ald-EMCH를 1.5 pM EGF디안틴과 조합한 경우, EGFR+ A431 및 HeLa 세포에서 강력한 표적 특이적 세포 생존율 감소가 관찰되나(IC50 = 3.000 nM; 도 64a,b), 이에 반해 EGFR- A2058 세포는 전혀 영향을 받지 않는다(도 64c). 유사한 결과가 SO1861-L-N3에 대해 관찰되었다. 1.5 pM EGF디안틴과 함께 공동 투여된 SO1861-L-N3도 A431 및 HeLa 세포에서 효율적인 세포 사멸을 나타내자(IC50 = 3.000 nM), EGF디안틴이 없으면 10.000 nM을 넘는 경우에 일반적인 독성이 관찰된다(도 64d, 64e).
HATU는 SO1861의 카르복실산기를 통해 SO1861에 접합되어 SO1861-HATU 및 SO1861-Glu-HATU라고도 하는 SO1861-(S)를 생성한다. 활성을 측정하기 위해, 다양한 농도의 SO1861-(S)를 1.5pM EGF디안틴과 함께 공동 투여하고, EGFR 발현 HeLa 세포에서 세포 사멸 활성을 테스트했다. SO1861-(S)는 SO1861과 유사한 활성을 보여 카르복실산기에 대한 접합이 SO1861-Ald-EMCH에서 관찰된 것과 유사하게 상기 분자의 엔도솜 탈출 향상 효능에 영향을 미치지 않음을 나타낸다(도 65).
SEQUENCE LISTING <110> Sapreme Technologies B.V. Charite- Universitatsmedizin Berlin <120> SAPONIN DERIVATIVES WITH IMPROVED THERAPEUTIC WINDOW <130> P6092645PCT <150> NL2025904 <151> 2020 06 24 <150> NL2023568 <151> 2019 07 25 <150> PCT/EP2019/084210 <151> 2019 12 09 <150> PCT/EP2019/084290 <151> 2019 12 09 <150> PCT/EP2019/084292 <151> 2019 12 09 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Customized peptide <400> 1 Ser Glu Ser Asp Asp Ala Met Phe Cys Asp Ala Met Asp Glu Ser Asp 1 5 10 15 Ser Lys <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP27 BNA oligo <400> 2 ggcacagcca gtggcg 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP27 LNA oligo <400> 3 ggcacagcca gtggcg 16 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP27 Primer Forward <400> 4 gcagtccaac gagatcacca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP27 Primer Reverse <400> 5 taaggcttta cttggcggca 20

Claims (30)

  1. 트리테르펜 아글리콘 코어 구조물 및 아글리콘 코어 구조물에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 사포닌 기반 사포닌 유도체로서, 여기서:
    i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조물을 포함하거나; 또는
    ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하거나; 또는
    iii. 사포닌 유도체는 제2 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제2 당류 사슬은 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시(Me(CO)O-)기를 포함하거나; 또는
    iv. 사포닌 유도체는 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합, 바람직하게는 2개의 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합을 포함하며;
    여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 독립적으로 선택되는, 사포닌 유도체.
  2. 제1항에 있어서,
    사포닌 유도체가 모노데스모시딕 트리테르펜 글리코시드 또는 비데스모시딕 트리테르펜 글리코시드, 보다 바람직하게는 비데스모시딕 트리테르펜 글리코시드인, 사포닌 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하고, 그리고/또는 여기서 사포닌 유도체는 제2 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제2 당류 사슬은 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시(Me(CO)O-)기를 포함하고,
    바람직하게는 사포닌 유도체는 유도체화된 상기 제1 당류 사슬 및 유도체화된 상기 제2 당류 사슬 모두를 포함하고,
    보다 바람직하게는, 사포닌 유도체는 유도체화된 상기 제1 당류 사슬 및 유도체화된 상기 제2 당류 사슬 모두를 포함하고, 상기 사포닌 유도체는 알데히드기 또는 유도체화된 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조물을 포함하고,
    가장 바람직하게는, 사포닌 유도체는 유도체화된 상기 제1 당류 사슬과 유도체화된 상기 제2 당류 사슬 모두를 포함하고, 상기 사포닌 유도체는 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조물을 포함하는, 사포닌 유도체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포닌 유도체는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 아글리콘 코어 구조물을 포함하며,
    2알파-히드록시 올레아놀산;
    16알파-히드록시 올레아놀산;
    헤데라게닌(23-히드록시 올레아놀산);
    16알파,23-디히드록시 올레아놀산;
    집소게닌;
    퀼라산;
    프로토에시게닌(protoaescigenin)-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-22-아세테이트;
    23-옥소-바링토게놀 C-21,22-비스(2-메틸부트-2-에노에이트);
    23-옥소-바링토게놀 C-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-16,22-디아세테이트;
    디지토게닌;
    3,16,28-트리히드록시 올레아난-12-엔;
    집소게닉산(gypsogenic acid),
    및
    이의 유도체,
    바람직하게는 상기 사포닌 유도체는 퀼라산 및 집소게닌 또는 이의 유도체로부터 선택된 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 더욱 바람직하게는 사포닌 유도체 아글리콘 코어 구조물은 퀼라산 또는 이의 유도체인, 사포닌 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포닌 유도체는 퀼라산, 집소게닌 및 이들의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 바람직하게는 사포닌 유도체는 퀼라산 및 이의 유도체로 구성되는 군으로부터 선택된 아글리콘 코어 구조물을 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은, 존재하는 경우, 아글리콘 코어 구조물의 C3 원자 또는 C28 원자에 연결되며, 바람직하게는 상기 C3 원자에 연결되며, 및/또는 제2 당류 사슬은, 존재하는 경우, 아글리콘 코어 구조물의 C28 원자에 연결되는, 사포닌 유도체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 당류 사슬은 존재하는 경우,
    GlcA-,
    Glc-,
    Gal-,
    Rha-(1→2)-Ara-,
    Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-,
    Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-,
    Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
    Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
    Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-,
    Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-, 및
    이의 유도체
    로부터 선택되며,
    및/또는 제2 당류 사슬이 존재하는 경우,
    Glc-,
    Gal-,
    Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-,
    Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-,
    Ara-,
    Xyl-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc- 여기서, R1은 4E-메톡시신남산이고,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc- 여기서, R2는 4Z-메톡시신남산이고,
    Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-디-OAc-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc- 여기서, R3은 4E-메톡시신남산이고,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
    (Ara- 또는 Xyl-)(1→3)-(Ara- 또는 Xyl-)(1→4)-(Rha- 또는 Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha- 또는 Fuc-)(1→4)]-(Rha- 또는 Fuc-),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc- 여기서, R4는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc- 여기서, R5는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc- ,
    6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-디-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- 여기서, R6은 5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- 여기서, R7은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- 여기서 R8은 5-O-[5-O-아라피-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- 여기서 R9는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- 여기서 R10은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- 여기서, R11은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- 여기서 R12는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디히드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디히드록시-6-메틸-옥탄산)
    Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-, 및
    이의 유도체
    로부터 선택되는, 사포닌 유도체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고, 제2 당류 사슬을 포함하고, 여기서 제1 당류 사슬은 하나 이상의 당류 모이어티를 포함하고, 제2 당류 사슬은 하나 이상의 당류 모이어티를 포함하고, 그리고 여기서 아글리콘 코어 구조물은 퀼라산 또는 집소게닌이고, 여기서 하기 중 1, 2 또는 3개, 바람직하게는 1 또는 2개가 존재하는, 사포닌 유도체.
    i. 아글리콘 코어 구조물의 알데히드기가 유도체화되며,
    ii. 제1 당류 사슬은 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하고, 그리고
    iii. 제2 당류 사슬은 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시(Me(CO)O-)기를 포함한다.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포닌 유도체는 퀼라자(Quillaja) 껍질 사포닌, 딥사코시드 B, 사이코사포닌 A, 사이코사포닌 D, 마크란토이딘 A, 에스쿨렌토시드 A, 피토락카게닌, 아스시네이트, AS6.2, NP-005236, AMA-1, AMR, 알파-헤데린, NP-012672, NP-017777, NP-017778, NP-017774, NP-018110, NP-017772, NP-018109, NP-017888, NP-017889, NP-018108, SA1641, AE X55, NP-017674, NP-017810, AG1, NP-003881, NP-017676, NP-017677, NP-017706, NP-017705, NP-017773, NP-017775, SA1657, AG2, SO1861, GE1741, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, SO1904, SO1862, QS-7, QS1861, QS-7 api, QS1862, QS-17, QS-18, QS-21 A-apio, QS-21 A-xylo, QS-21 B-apio, QS-21 B-xylo, 베타-에스신(beta-Aescin), 에스신(Aescin) Ia, 티시드(Teaseed) 사포닌 I, 티시드사포닌 J, 아삼사포닌(Assamsaponin) F, 디지토닌(Digitonin), 프리물라산(Primula acid) 1 및 AS64R, 이의 입체이성질체 및 이의 조합으로 구성되는 사포닌 군으로부터 선택된 사포닌의 유도체이며, 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체, SO1861 유도체, SA1641 유도체 및 GE1741 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체 및 SO1861 유도체로 구성되는 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체인, 사포닌 유도체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 제4항의 퀼라산 사포닌 또는 집소게닌 사포닌의 유도체인, 사포닌 유도체.
    Figure pct00066

    (분자 1)
    여기서
    제1 당류 사슬 A1은 수소, 단당류 또는 선형 또는 분지형 올리고당류를 나타내고, 바람직하게는 A1은 제6항에 정의된 당류 사슬을 나타내고, 보다 바람직하게는 A1은 제6항에 정의된 당류 사슬을 나타내며, 그리고 A1은 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되며;
    제2 당류 사슬 A2는 수소, 단당류 또는 선형 또는 분지형 올리고당류를 나타내고, 바람직하게는 A2는 제6항 정의된 당류 사슬을 나타내고, 더욱 바람직하게는 A2는 제6항에 정의된 당류 사슬을 나타내며, A2는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아세톡시기와 같은 적어도 하나의 아세톡시(Me(CO)O-)기를 포함하고, 여기서 A1 및 A2 중 적어도 하나는 수소가 아니며, 바람직하게는 A1 및 A2 모두 올리고당 사슬이고;
    R은 집소게닌 내의 수소 또는 퀼라산 내의 히드록실이고;
    여기서 사포닌 유도체는 하기 유도체화 중 적어도 하나가 존재하는 분자 1로 표시되는 사포닌에 상응한다:
    i. 퀼라산 또는 집소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드기가 유도체화되며;
    ii. A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기는, A1이 제6항에 정의된 당류 사슬을 나타내고, A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되는 경우, 유도체화되며; 그리고
    iii. A2의 하나의 당류 모이어티 또는 둘 이상의 당류 모이어티의 아세톡시기(들)의 하나 이상, 바람직하게는 모두는, A2이 제6항에 정의된 당류 사슬을 나타내고, A2가 적어도 하나의 아세톡시기를 포함하는 경우, 유도체화된다.
  10. 제9항에 있어서,
    A1은 제6항에 정의된 당류 사슬을 나타내고, 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되며, 그리고 여기서 A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기는 유도체화되고, 그리고/또는 A2는 제6항에 정의된 당류 사슬을 나타내고, A2는 적어도 하나의 아세톡시기를 포함하고, 여기서 A2의 적어도 하나의 아세톡시기는 유도체화된, 사포닌 유도체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    분자 1로 표시되는 사포닌이 비데스모시딕 트리테르펜 사포닌인, 사포닌 유도체.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 사포닌에 상응하며, 여기서 하기 유도체화 중 적어도 하나가 존재하고, 바람직하게는 하기 유도체화 중 1개 또는 2개가 존재하는, 사포닌 유도체.
    i. 퀼라산 또는 집소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드기가
    - 알코올로의 환원;
    - N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 이로써 SO1861-Ald-EMCH 또는 QS-21-Ald-EMCH와 같은 사포닌-Ald-EMCH를 제공하고, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨;
    - N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드(BMPH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 BMPH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨; 또는
    - N-[κ-말레이미도운데칸산]히드라지드(KMUH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 KMUH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨
    에 의해 유도체화되며;
    ii. A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기는, A1이 제6항에 정의된 당류 사슬을 나타내고, A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되는 경우, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통한 아미드 결합으로의 변환에 의해 유도체화되어, 그 후 QS-21-Glu-AMPD 또는 SO1861-Glu-AMPD와 같은 사포닌-Glu-AMPD 또는 QS-21-Glu-AEM 또는 SO1861-Glu-AEM과 같은 사포닌-Glu-AEM을 제공하며; 그리고
    iii. A2의 하나의 당류 모이어티 또는 2개 이상의 당류 모이어티의 아세톡시기(들)의 하나 이상, 바람직하게는 모두는, A2가 제6항에 정의된 당류 사슬을 나타내는 경우, 탈아세틸화에 의한 히드록실기(HO-)로의 변환에 의해 유도체화된다.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    A1은 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA이며 및/또는 A2는 Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc이며, 바람직하게는 분자 1로 표시되는 사포닌은 3-O-베타-D-갈락토피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)]-베타-D-글루쿠로노피라노실 퀼라산 28-O-베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-자일로피라노실-(1→4)-알파-L-람노피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)-4OAc-베타-D-퀴노보피라노실-(1→4)]-베타-D-푸코피라노시드, 보다 바람직하게는 SO1861, GE1741, SA1641 및/또는 QS-21, 가장 바람직하게는 SO1861인, 사포닌 유도체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포닌 유도체는 SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 퀼라자사포닌(Quillajasaponin), 사포니넘 알범(Saponinum album), QS-18, Quil-A, Gyp1, 글리코시드 A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, SO1862, SO1904, 이의 입체 이성질체 및 이의 조합의 유도체들로 구성되는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체, GE1741 유도체, SA1641 유도체, QS-21 유도체 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체 또는 QS21 유도체이고, 가장 바람직하게는 사포닌 유도체는 SO1861 유도체인, 사포닌 유도체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포닌 유도체는 단일 유도체화를 포함하는 SO1861 유도체이고, 여기서 단일 유도체화는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)를 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기에 결합하거나 또는 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)를 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기에 결합하는 것에 의한 SO1861의 글루크론산 모이어티의 카르복실기의 변환이거나, 또는 여기서 사포닌 유도체는 분자 2로 표시되는 SO1861 유도체이며, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 퀼라산 아글리콘 코어 구조물의 표시된 위치 C23에 알데히드기를 포함하는 SO1861 유도체를 나타내거나:
    Figure pct00067

    (분자 2)
    또는 여기서 사포닌 유도체는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 퀼라산 아글리콘 코어 구조물의 표시된 위치 C23에 알데히드기를 포함하는 SO1861 유도체를 나타내는, 분자 3으로 표시되는 SO1861 유도체이며, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 메르캅토에탄올로 유도체화되어, 그 후 티오에테르 결합을 형성하는, 사포닌 유도체.
    Figure pct00068

    (분자 3)
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포닌 유도체는 단일 유도체화를 포함하는 SO1861 유도체가 아니라는 조건 하에, 여기서 단일 유도체화는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 반응에 의한 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 변환이거나, 또는 여기서 사포닌 유도체는 분자 2로 표시되는 SO1861 유도체이며, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 퀼라산 아글리콘 코어 구조물의 표시된 위치 C23에 알데히드기를 포함하는 SO1861 유도체를 나타내는, 사포닌 유도체.
    Figure pct00069

    (분자 2)
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    i. 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 여기서 아글리콘 코어 구조물은
    - 알코올로의 환원;
    - N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨;
    - N-[β-말레이미도프로피온산] 히드라지드(BMPH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서 BMPH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨; 또는
    - N-[κ-말레이미도운데칸산] 히드라지드(KMUH)와의 반응을 통한 히드라존 결합으로의 변환, 여기서, KMUH의 말레이미드기는 선택적으로 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합의 형성에 의해 유도체화됨
    에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하며;
    ii. 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하거나;
    iii. 제2 당류 사슬은 탈아세틸화에 의해 히드록실기(HO-)로의 변환에 의해 유도체화된 아세톡시기(Me(CO)O-)를 포함하거나; 또는
    iv. 사포닌 유도체는 2개 또는 3개의 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합, 바람직하게는 2개의 유도체화 i., ii. 및 iii.의 어느 조합을 포함하며;
    바람직하게는, 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물을 포함하며, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 EMCH와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 알데히드기를 포함하고, 여기서 EMCH의 말레이미드기는 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합의 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는, 사포닌 유도체.
  18. 제17항에 있어서,
    사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조물을 포함하고, 여기서 아글리콘 코어 구조물은 알데히드기를 포함하고, 그리고 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실기, 바람직하게는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로의 변환에 의해 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기를 포함하는, 사포닌 유도체.
  19. 제17항에 있어서,
    아글리콘 코어 구조물의 알데히드기가 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로의 변환에 의해 유도체화되고, 사포닌이 SO1861인 유도체인 경우를 조건으로 하여, 글루쿠론산과 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 유도체화되며, 그리고 사포닌이 SO1861이고, SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기가 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 반응에 의해 유도체화되는 경우를 조건으로 하여, 알데히드기 및 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 변형되는, 사포닌 유도체.
  20. 제19항에 있어서,
    사포닌 유도체의 아글리콘 코어 구조물의 알데히드기가 EMCH와의 반응을 통해 유도체화되고, 사포닌이 SO1861인 경우를 조건으로 하여, 글루쿠론산 및 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 유도체화되며, 그리고 사포닌이 SO1861이고 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기가 결합된 HATU에 의해 유도체화되는 경우를 조건으로 하여, 알데히기와 아세톡시기(Me(CO)O-) 중 적어도 하나가 또한 유도체화되는, 사포닌 유도체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 사포닌 유도체 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제1 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    사포닌 유도체가 분자 2:
    Figure pct00070

    (분자 2)
    로 표시되는 사포닌 유도체이거나 또는 단일 유도체화를 포함하는 SO1861 유도체로서, 여기서 단일 유도체화는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 반응에 의한 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실기의 변형이거나, 또는 사포닌 유도체가 분자 3:
    Figure pct00071

    (분자 3)
    으로 표시되는 사포닌 유도체인, 제1 약학 조성물.
  23. Figure pct00072
    제21항 또는 제22항의 제1 약학 조성물; 및
    Figure pct00073
    항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 어느 하나 이상을 포함하며, 그리고 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제2 약학 조성물
    을 포함하는 약학 조합물.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 사포닌 유도체를 포함하며, 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-핵산 접합체 또는 수용체-리간드 - 핵산 접합체 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하며, 그리고 선택적으로 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 희석제를 포함하는, 제3 약학 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    약학 조합물 또는 제3 약학 조성물은 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 어느 하나 이상을 포함하며, 여기서 약물은 예를 들어 사포린 및 디안틴과 같은 독소이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 아포리포단백질 B 또는 HSP27의 유전자 침묵을 위한 것과 같이 예를 들어 siRNA 또는 BNA인, 약학 조합물 또는 제3 약학 조성물.
  26. 제23항 또는 제25항, 또는 제24항 또는 제25항에 있어서,
    사포닌 유도체는 제14항에 따른 사포닌 유도체, 바람직하게는 분자 2 또는 분자 3으로 표현되는 사포닌 유도체인, 약학 조합물 또는 제3 약학 조성물.
  27. 의약으로서 사용하기 위한, 제21항 또는 제22항의 제1 약학 조성물, 제23항 또는 제25항 내지 제26항 중 어느 한 항의 약학 조합물 또는 제24항 내지 제25항 중 어느 한 항의 제3 약학 조성물.
  28. 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥소산뇨증, 혈우병 A, 혈우병 B, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴 매개 아밀로이드증, 또는 자가 면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제21항 또는 제22항의 제1 약학 조성물, 제23항 또는 제25항 내지 제26항 중 어느 한 항의 약학 조합물 또는 제24항 내지 제25항 중 어느 한 항의 제3 약학 조성물.
  29. a) 세포를 제공하는 단계;
    b) 세포 외부에서 단계 a)에 제공된 세포로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계;
    c) 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 사포닌 유도체를 제공하는 단계;
    d) 시험관내 또는 생체외에서 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 사포닌 유도체와 접촉시켜, 그 후 세포 외부로부터 상기 세포 내로 분자의 전달을 확립하는 단계
    를 포함하는, 세포 외부로부터 상기 세포 내부, 바람직하게는 상기 세포의 세포질 내로 분자를 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    세포는 T-세포, NK-세포, 종양 세포와 같은 인간 세포이며, 그리고/또는 여기서 사포닌 유도체는 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항의 사포닌 유도체이며, 그리고/또는 여기서 단계 b)의 분자가 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 어느 하나이며, 여기서 약물은 예를 들어 독소이고, 그리고 여기서 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 siRNA 또는 BNA인, 시험관내 또는 생체외 방법.
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