JP2022542075A - 改良された治療濃度域をもつサポニン誘導体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、トリテルペンアグリコンと第1の糖鎖および/または第2の糖鎖とを含む、サポニンをベースとするサポニン誘導体であって、かつ:誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造と;および/または該第1の糖鎖であって、これにおいて該第1の糖鎖が、誘導体化されているカルボキシル基を含有する該第1の糖鎖と;および/または該第2の糖鎖であって、これにおいて該第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ基を含有する、該第2の糖鎖とを含む、該サポニン誘導体に関する。本発明はまた、本発明のサポニン誘導体を含む第1の医薬組成物にも関する。加えて、本発明は、本発明の該第1の医薬組成物と、抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つ以上を含む第2の医薬組成物とを含む、医薬組合せ剤に関する。本発明はまた、医薬としての使用のため、または癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病A、血友病B、アルファ-1アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、本発明の該第1の医薬組成物または該医薬組合せ剤にも関する。さらに本発明は、分子を細胞の外側から該細胞内へ移行させるための、インビトロまたはエクスビボの方法であって、該細胞を該分子とおよび本発明のサポニン誘導体と接触させることを含む、該方法に関する。
Description
本発明は、トリテルペンアグリコンと第1の糖鎖および/または第2の糖鎖とを含む、サポニンをベースとするサポニン誘導体であって、かつ:誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造と;および/または前記第1の糖鎖であって、これにおいて前記第1の糖鎖が、誘導体化されているカルボキシル基を含有する該第1の糖鎖と;および/または前記第2の糖鎖であって、これにおいて前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ基を含有する、該第2の糖鎖とを含む、該サポニン誘導体に関する。本発明はまた、本発明のサポニン誘導体を含む第1の医薬組成物にも関する。加えて、本発明は、本発明の第1の医薬組成物と、抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つ以上を含む第2の医薬組成物とを含む、医薬組合せ剤に関する。本発明はまた、医薬としての使用のため、または癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病A、血友病B、アルファ-1アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、本発明の前記第1の医薬組成物または前記医薬組合せ剤にも関する。さらに本発明は、分子を細胞の外側から前記細胞内へ移行させるための、インビトロまたはエクスビボの方法であって、前記細胞を前記分子および本発明のサポニン誘導体と接触させることを含む、該方法に関する。
標的化腫瘍療法は、癌細胞の増殖および生存に関与する特定の遺伝子およびタンパク質を標的とするための薬剤を使用する、癌療法である。免疫毒素は、標的化部分として抗体を含有する標的化された毒素であって、腫瘍特異抗原に対する抗体の特異性を併せもち、それにより目的とする作用点に毒素を向かわせることを可能にし、かつ抗体依存性細胞介在性の細胞毒性および補体依存性の細胞毒性などの細胞殺傷機構を付加的に導入し得ることから、非常に有望である。この効果を示すためには、毒素が、インターナリゼーション後にサイトゾル中へ放出される必要がある。主な欠点は、ペイロードを担持する標的部分がしばしば充分にインターナライズされず、インターナリゼーション後に表面へ直接リサイクルされるか、またはリソゾーム内で分解され、それにより細胞サイトゾル内へのペイロードの充分な送達が妨げられることである。腫瘍細胞のための毒性ペイロード濃度を確保するため、および不充分なサイトゾル進入を克服するためには、高い血清レベルの標的化毒素が必要であり、しばしば、特に免疫原性および血管漏出症候群を含む重い副作用を生じる結果となる。それ故、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)を用いて癌患者を治療する場合、充分に広い治療濃度域が尚重要である。
不充分なサイトゾル進入という欠点に対処するため、例えば、生合成経路の内在性細胞膜輸送複合体への毒素の方向転換、エンドソームの崩壊、エンドソーム膜の膜統合性の減衰、または細胞透過性ペプチドの使用に関連して、いくつかの戦略が開発された。
例えば、サポニンなどのグリコシル化されたトリテルペンは、腫瘍療法において、標的化された毒素のためのエンドソーム脱出促進剤、例えばリボソーム不活性化タンパク質(RIP)として作用することが見出された。サポニンの構造-活性関係の分析は、以下のコア構造要素の存在が、RIPの細胞毒性を強化するサポニンの能力にとり有益であるように見えることを示した(式(I)参照、X1=HまたはOH、およびX2=多糖部分):
- グルクロン酸を含有する、C-3における分岐型三糖
- C-4におけるアルデヒド
- C-28におけるカルボキシ基
- アセチル基を含有する少なくとも4つの糖部分からなる、C-28位に結合した多糖部分(R2)。
- グルクロン酸を含有する、C-3における分岐型三糖
- C-4におけるアルデヒド
- C-28におけるカルボキシ基
- アセチル基を含有する少なくとも4つの糖部分からなる、C-28位に結合した多糖部分(R2)。
特に、トリテルペノイドサポニン、SO1861(式II、時にはSPT001とも称される)は、腫瘍細胞標的化毒素のエンドソーム脱出を促進するための強力な分子として同定された。促進剤の機構については、二重効果が仮定され:第1に、エンドソーム脱出の直接的な増加が、結果としてカスパーゼ依存的なアポトーシスを生じ、それが、第2に、リソゾーム媒介性の細胞死経路と組合され、これらは、リソゾーム膜の破壊に続くカテプシンおよび他の加水分解酵素の放出の後にトリガーされる。
エンドソーム脱出促進剤としてのサポニンの適用は、これらのサポニンが赤血球膜を破裂する能力を有するという認識に基づく。しかしながら、まさに同時に、サポニンの細胞破裂活性は、かかるサポニンを用いて患者が治療される場合、副作用(のリスク)に寄与し、それにより治療指数の制限の観点からの最適治療域に影響を及ぼす。実際、かかるサポニンの毒性は、細胞外的および/または細胞内的に、抗腫瘍療法を必要とする患者に投与される際の、例えば最適の投与計画並びに投与の経路および頻度が考慮される場合の関心ごとである。
トリテルペンバックボーン、五環性C30テルペンスケルトン(サポゲニンまたはアグリコンとしても知られる)の構造、糖側鎖の数および長さ、並びにバックボーに結合された糖残基のタイプおよび結合変異体を含めて、サポニン自体の化学的組成の全ての特徴が、かかるサポニンの溶血指数および/または細胞毒性に寄与する。
サポニンは、細胞のエンドソームおよびサイトゾルが考慮される場合に、それ自体に標的特異性はなく、またサポニンは、同じ投与経路が考えられる場合であっても、予想通りにかつ最もしばしば、標的化毒素以外のカイネティクスで(ヒト)患者内に分布する。したがって、その必要がある患者に、例えばADCとサポニンとを含む治療的組合せ剤を適用した後、サポニン分子はあらゆる臓器中に見られ、特異性は標的化毒素によってのみ媒介されることが暗示される。サポニンの全身的分布には、標的細胞における特異的な蓄積と比較した場合、より高い濃度が好首尾の治療に必要である。したがって、適当な治療濃度域を達成するためには、修飾されたサポニンの毒性を、身体におけるサポニンの全身的適用の観点から、好首尾の適用のために充分に低くする必要がある。
それ故、例えばADCと一緒の、サポニンの同時投与が考慮される場合、治療指数を改善することが尚必要であり:ADCの細胞毒性効果の増強が考慮される場合、サポニンの細胞毒性をより良く制御(またはより良く:より低く)することと共に、同時に充分な効能を維持するために必要である。
驚いたことに本発明者らは、修飾サポニン、すなわち、
- サポニンのアグリコンのC-3において結合され、かつ修飾されたグルクロン酸を含有する、分岐型三糖部分;および/または
- サポニンのアグリコンのC-4における修飾されたアルデヒド;および/または
- サポニンのアグリコンのC-28位において結合された多糖部分であり、かつ、前記多糖部分中に修飾されたアセトキシ基を含有する、該多糖部分、
を有するサポニン誘導体が;
前記サポニン誘導体と接触された細胞の細胞生存率が考慮される場合に低減された毒性を有し、例えば毒素の細胞毒性またはBNA介在性遺伝子サイレンシングの増強が考慮される場合に(いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが:修飾サポニンの同様のまたは改善されたエンドソーム脱出促進活性に関連して)活性を有し、および/または非修飾サポニンの毒性、活性、および溶血活性と比較した場合に低減された溶血活性を有することを見出した。それにより本発明者らは、細胞毒性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとのIC50値間の比率が増加することから、および/または、サポニン溶血活性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとのIC50値間の比率が増加することから、改善された治療濃度域をもつサポニン誘導体を提供する。
- サポニンのアグリコンのC-3において結合され、かつ修飾されたグルクロン酸を含有する、分岐型三糖部分;および/または
- サポニンのアグリコンのC-4における修飾されたアルデヒド;および/または
- サポニンのアグリコンのC-28位において結合された多糖部分であり、かつ、前記多糖部分中に修飾されたアセトキシ基を含有する、該多糖部分、
を有するサポニン誘導体が;
前記サポニン誘導体と接触された細胞の細胞生存率が考慮される場合に低減された毒性を有し、例えば毒素の細胞毒性またはBNA介在性遺伝子サイレンシングの増強が考慮される場合に(いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが:修飾サポニンの同様のまたは改善されたエンドソーム脱出促進活性に関連して)活性を有し、および/または非修飾サポニンの毒性、活性、および溶血活性と比較した場合に低減された溶血活性を有することを見出した。それにより本発明者らは、細胞毒性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとのIC50値間の比率が増加することから、および/または、サポニン溶血活性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとのIC50値間の比率が増加することから、改善された治療濃度域をもつサポニン誘導体を提供する。
本発明の第1の態様は、トリテルペンアグリコンコア構造と、前記アグリコンコア構造に結合された、第1の糖鎖および第2の糖鎖の少なくとも1つとを含む、サポニンをベースとするサポニン誘導体であって、これにおいて:
i. 前記サポニン誘導体が、誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含むか;または
ii. 前記サポニン誘導体が、前記第1の糖鎖を含み、これにおいて、前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有するか:または
iii. 前記サポニン誘導体が、前記第2の糖鎖を含み、これにおいて、前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有するか;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含み;
ここで、前記第1の糖鎖および前記第2の糖鎖が、独立して、単糖、直鎖オリゴ糖、および分岐オリゴ糖から選択される、
該サポニン誘導体に関する。
i. 前記サポニン誘導体が、誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含むか;または
ii. 前記サポニン誘導体が、前記第1の糖鎖を含み、これにおいて、前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有するか:または
iii. 前記サポニン誘導体が、前記第2の糖鎖を含み、これにおいて、前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有するか;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含み;
ここで、前記第1の糖鎖および前記第2の糖鎖が、独立して、単糖、直鎖オリゴ糖、および分岐オリゴ糖から選択される、
該サポニン誘導体に関する。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が、モノデスモシド系トリテルペングリコシドまたはビスデスモシド系トリテルペングリコシド、より好ましくはビスデスモシド系トリテルペングリコシドである、本発明のサポニン誘導体である。
本発明の第2の態様は、本発明の前記サポニン誘導体と、任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤とを含む、第1の医薬組成物に関する。
本発明の第3の態様は、医薬組合せ剤であって:
・ 本発明の前記第1の医薬組成物と;および
・ 抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤を含む、第2の医薬組成物と
を含む、該医薬組合せ剤に関する。
・ 本発明の前記第1の医薬組成物と;および
・ 抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤を含む、第2の医薬組成物と
を含む、該医薬組合せ剤に関する。
本発明の第4の態様は、第3の医薬組成物であって、本発明の前記サポニン誘導体を含み、かつさらに:抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-核酸コンジュゲート、または受容体-リガンド-核酸コンジュゲートの任意の1つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤を含む、該第3の医薬組成物に関する。
本発明の第5の態様は、医薬としての使用のための、本発明の前記第1の医薬組成物、本発明の前記医薬組合せ剤、または本発明の前記第3の医薬組成物に関する。
本発明の第6の態様は、癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病A、血友病B、アルファ-1アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、本発明の前記第1の医薬組成物、本発明の前記医薬組合せ剤、または本発明の前記第3の医薬組成物に関する。
本発明の第7の態様は、分子を細胞の外側から前記細胞の内側へ、好ましくは前記細胞のサイトゾル中へ移行させるための、インビトロまたはエクスビボの方法であって:
a) 細胞を提供する工程と;
b) 工程a)において提供された前記細胞の内側に、前記細胞の外側から移行させるための分子を提供する工程と;
c) 本発明のサポニン誘導体を提供する工程と;
d) 工程a)の前記細胞を、インビトロまたはエクスビボにおいて、工程b)の前記分子および工程c)の前記サポニン誘導体と接触させ、それにより前記分子の前記細胞の外側から前記細胞内への移行を確立させる工程とを含む、該方法に関する。
a) 細胞を提供する工程と;
b) 工程a)において提供された前記細胞の内側に、前記細胞の外側から移行させるための分子を提供する工程と;
c) 本発明のサポニン誘導体を提供する工程と;
d) 工程a)の前記細胞を、インビトロまたはエクスビボにおいて、工程b)の前記分子および工程c)の前記サポニン誘導体と接触させ、それにより前記分子の前記細胞の外側から前記細胞内への移行を確立させる工程とを含む、該方法に関する。
定義
用語「サポニン」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、サポゲニンである親油性のアグリコンコアと結合した、1つ以上の親水性グリコン部分を含む、一群の両親媒性グリコシドを指す。サポニンは、天然産でもよく、または合成品(すなわち、非天然産)であってもよい。用語「サポニン」は、天然産サポニン、天然産サポニンの誘導体、並びに化学的および/またはバイオテクノロジー的な合成経路を介しデノボで合成されたサポニンを包含する。
用語「サポニン」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、サポゲニンである親油性のアグリコンコアと結合した、1つ以上の親水性グリコン部分を含む、一群の両親媒性グリコシドを指す。サポニンは、天然産でもよく、または合成品(すなわち、非天然産)であってもよい。用語「サポニン」は、天然産サポニン、天然産サポニンの誘導体、並びに化学的および/またはバイオテクノロジー的な合成経路を介しデノボで合成されたサポニンを包含する。
用語「修飾サポニン」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、修飾サポニンの提供のための化学修飾に供される前の非誘導体化サポニンにおいて、アルデヒド基、カルボキシル基、アセタート基、および/またはアセチル基のいずれかが既に存在した位置において、1つ以上の化学修飾を有するサポニン、すなわちサポニン誘導体を指す。例えば、修飾サポニンは、該修飾サポニンがベースとするサポニンにおける、アルデヒド基、カルボキシル基、アセタート基、および/またはアセチル基の任意の1つ以上の化学修飾により提供され、すなわち、該サポニンが提供され、そしてアルデヒド基、カルボキシル基、アセタート基、および/またはアセチル基のいずれかが化学修飾され、それにより修飾サポニンが提供される。例えば、修飾サポニンの提供のために修飾されるサポニンは、天然産サポニンである。典型的には修飾サポニンは合成サポニンであり、典型的には修飾サポニンは天然サポニンの修飾物であり、したがって天然サポニンに由来するが、しかし修飾サポニンが天然の対応物を有し得るかまたは有し得ない合成サポニンに由来することも可能ではある。典型的には、修飾サポニンは、天然の対応物をもたない、すなわち修飾サポニンは、例えば草または樹木によって自然に生成されることはない。
用語「アグリコンコア構造」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、それに結合された1つまたは2つの炭水化物アンテナまたは糖鎖(グリカン)をもたない、サポニンのアグリコンコアを指す。例えば、キラ酸は、SO1861、QS-7、およびQS21のアグリコンコア構造である。典型的には、サポニンのグリカンは、単糖またはオリゴ糖、例えば直鎖または分岐グリカンである。
用語「QS21」は、さらに特定しない限り、図41に示された構造式をもつ、QS21の異性体の任意の1つ、並びに図41に示された全ての異性体などの、2つ以上の混合物を指す。当業者には理解されるように、QS21を含む典型的な天然の抽出物は、QS21の様々な異性体の混合物を含むであろう。しかしながら、精製または(半)合成経路を介して、単一の異性体を単離し得る。
用語「糖鎖」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、グリカン、炭水化物アンテナ、単一の糖部分(単糖)、または複数の糖部分を含有する鎖(オリゴ糖、多糖)のいずれかを指す。糖鎖は、糖部分のみで構成されてもよく、或いはまた4E-メトキシケイ皮酸、4Z-メトキシケイ皮酸、および、例えばQS-21中に存在するような、
5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸の任意の1つなどの、さらなる部分を含んでもよい。
5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸の任意の1つなどの、さらなる部分を含んでもよい。
用語「化学的に修飾された」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、第2の化学基または第2の化学的部分を提供するようにする、第1の化学基または第1の化学的部分の化学修飾を指す。例は、カルボニル基の-(H)C-OH基への化学修飾、アセタート基のヒドロキシル基への化学修飾、そのアルデヒド基において化学反応によってN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)部分とコンジュゲートされたサポニンの提供などである。
用語「化学修飾されたアルデヒド基」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、サポニンのアルデヒド基が関与する、結果として新たな化学基による最初のアルデヒド基の置換を生じる化学反応によって得られた、化学反応生成物を指す。例として、サポニンの最初のアルデヒド基からの、-(H)C-OH基の形成がある。
用語「化学修飾されたカルボキシル基」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、サポニンのカルボキシル基、例えばグルクロン酸部分のカルボキシル基と、さらなる分子とが関与する、結果として新たな化学基による最初のカルボキシル基の置換を生じる化学反応によって得られた化学反応生成物を指す。例として、サポニンのグルクロン酸のカルボキシル基が関与する、サポニンと、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMPD)、N-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)、または1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)のいずれか1つとの間のコンジュゲートの形成がある。
糖鎖の名称という文脈における用語「Api/Xyl-」または「Api-またはXyl-」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、アピオース(Api)部分を含むか、またはキシロース(Xyl)部分を含む、いずれかの糖鎖を指す。
用語「修飾サポニンがベースとするサポニン」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、修飾サポニンを提供する目的で修飾されているサポニンを指す。典型的には、修飾サポニンがベースとするサポニンは、天然産サポニンであり、これが修飾サポニンの提供のための化学修飾に供される。
用語「サポニンをベースとする修飾サポニン」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、修飾サポニンが提供されるようにする化学修飾工程に供されているサポニンを指し、これにおいて、修飾サポニンがそれから調製されたサポニンは、典型的には天然産サポニンである。
用語「オリゴヌクレオチド」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、中でも、DNA、修飾DNA、RNA、mRNA、修飾RNA、単鎖分子または二本鎖分子として提供された、BNAなどの合成核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、短または低分子干渉RNA(siRNA;サイレンシングRNA)、アンチセンスDNA、アンチセンスRNAなどを含む、任意の天然または合成された一連の核酸を指す。
用語「抗体-薬物コンジュゲート」または「ADC」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、抗体、例えばIgG、Fab、scFv、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、1つまたは複数のVHドメイン、単一ドメイン抗体、VHH、ラクダ類のVHなどと、ヒト患者などの患者の細胞と接触された場合に治療効果を及ぼし得る任意の分子、例えば、医薬品有効成分、毒素、オリゴヌクレオチド、酵素、低分子薬剤化合物などとの、任意のコンジュゲートを指す。
用語「抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート」または「AOC」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、抗体、例えばIgG、Fab、scFv、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、1つまたは複数のVHドメイン、単一ドメイン抗体、VHH、ラクダ類のVHなどと、ヒト患者などの患者の細胞と接触された場合に治療効果を及ぼし得る任意のオリゴヌクレオチド分子、例えば、DNA、修飾DNA、RNA、mRNA、修飾RNA、単鎖分子または二本鎖分子として提供された、BNAなどの合成核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、短または低分子干渉RNA(siRNA;サイレンシングRNA)、アンチセンスDNA、アンチセンスRNAなどを包含する、核酸の天然または合成された一連の核酸から選択されるオリゴヌクレオチドとの、任意のコンジュゲートを指す。
用語「エフェクター分子」または「エフェクター部分」は、例えば、共有コンジュゲートの部分としてのエフェクター分子について言及する場合、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、標的分子:タンパク質、ペプチド、炭水化物、グリカンなどの糖、(リン)脂質、核酸、例えばDNA、RNA、酵素、の任意の1つ以上に選択的に結合することができ、かつ、かかる1つ以上の標的分子の生物活性を調節する分子を指す。エフェクター分子は、例えば、薬物分子などの低分子、タンパク質毒素などの毒素、BNAなどのオリゴヌクレオチド、ゼノ核酸またはsiRNA、酵素、ペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組合せの、任意の1つ以上から選択される分子である。したがって、例えば、エフェクター分子またはエフェクター部分は、標的分子:タンパク質、ペプチド、炭水化物、グリカンなどの糖、(リン)脂質、核酸、例えばDNA、RNA、酵素、の任意の1つ以上に選択的に結合することができ、かつ標的分子への結合に際し、かかる1つ以上の標的分子の生物活性を調節する、薬物分子などの低分子、タンパク質毒素などの毒素、BNAなどのオリゴヌクレオチド、ゼノ核酸またはsiRNA、酵素、ペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組合せの、任意の1つ以上から選択される分子または部分である。典型的には、エフェクター分子は、細胞、例えば哺乳類細胞、例えばヒト細胞の内側において、例えば前記細胞のサイトゾル中で、生物学的効果を及ぼすことができる。それ故、典型的なエフェクター分子は、薬物分子、プラスミドDNA、毒素、例えば抗体-薬物コンジュゲート(ADC)によって含まれる毒素、オリゴヌクレオチド、例えばsiRNA、BNA、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート(AOC)によって含まれる核酸である。例えば、エフェクター分子は、酵素活性、遺伝子発現、または細胞シグナリングを増加または減少させ得るリガンドとして、作用し得る分子である。
用語「HSP27」は、細胞におけるHSP27の発現をサイレンシングするBNA分子に関する。
用語「架橋型核酸」もしくは手短に言えば「BNA」、または「ロック核酸」もしくは手短に言えば「LNA」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、修飾されたRNAヌクレオチドを指す。BNAはまた、「束縛されたRNA分子」または「アクセス不能RNA分子」とも称される。BNAモノマーは、「固定された」C3’-endo糖パッカリングをもつ、五員、六員、またはさらに七員の架橋構造を含有し得る。架橋は、リボースの2’,4’-位置において合成的に取込まれ、2’,4’-BNAモノマーを生じる。BNAモノマーは、当該技術分野において既知の標準的なホスホロアミダイト化学を用いて、オリゴヌクレオチドポリマー構造内に取込まれ得る。BNAは、結合親和性及び安定性が増加した、構造的に堅いオリゴヌクレオチドである。
本明細書および特許請求の範囲における用語、第1、第2、第3などは、例えば、類似した要素、組成、組成物中の構成要素、または個別の方法工程の間を区別するために使用され、必ずしも順番または時系列順を記載するために使用されるものではない。この用語は、適当な状況下では交換可能であり、かつ本発明の実施形態は、他に特に指定しない限り、本明細書に記載または例示されたもの以外の順序で操作し得る。
本明細書に記載された実施形態は、他に特に指定しない限り、組合せてまた共同して操作し得る。
さらに、種々の実施形態は、「好ましい」または「例えば」または「例として」または「とりわけ」などと呼ばれていても、本発明の範囲を限定するものとしてよりもむしろ、本発明が実行され得る例示的な方法として解釈されるべきである。
特許請求の範囲において使用された用語「含む(comprising)」は、例えば、後段に列記された、要素または方法工程または組成物中の構成要素に限定されるものとして解釈されるべきではない;それは、他の要素または方法工程または組成物中の構成要素を除外しない。それは、述べられた特徴、整数、方法(工程)、または成分の存在を、表記された通りに特定するものとして解釈される必要はあるが、しかし1つ以上の他の特徴、整数、工程、または成分、またはそれらの群の存在また付加を排除するものではない。したがって、「工程AおよびBを含む方法」という表現の範囲は、工程AおよびBのみからなる方法に限定されるべきではなく、本発明に関してはむしろ、方法の工程の中でAおよびBが列挙されたに過ぎず、かつさらに特許請求の範囲は、これらの方法工程の同等物を含むものと解釈されるべきである。したがって、「成分AおよびBを含む組成物」という表現の範囲は、成分AおよびBのみからなる組成物に限定されるべきではなく、本発明に関してはむしろ、組成物の成分の中でAおよびBが列挙されたに過ぎず、かつさらに特許請求の範囲は、これらの成分の同等物を含むものと解釈されるべきである。
加えて、不定冠詞「1つ(a)」または「1つ(an)」による要素または成分への言及は、文脈が明らかに1つの、および唯一の要素または成分があることを要求しない限り、2つ以上の要素または成分が存在する可能性を排除しない。それ故不定冠詞「1つ(a)」または「1つ(an)」は、通常「少なくとも1つ」を意味する。
本発明は、特定の実施形態について記載されるが、しかし本発明はそれに制限されず、特許請求の範囲によってのみ制限される。
驚いたことに本発明者らは、修飾サポニン、すなわち、
- サポニンのアグリコンのC-3において結合され、かつ修飾されたグルクロン酸を含有する、分岐型三糖部分;および/または
- サポニンのアグリコンのC-4における修飾されたアルデヒド;および/または
- サポニンのアグリコンのC-28位において結合された多糖部分であり、かつ、前記多糖部分中に修飾されたアセトキシ基を含有する、該多糖部分、
を有するサポニン誘導体が;
前記サポニン誘導体と接触された細胞の細胞生存率が考慮される場合に低減された毒性を有し;修飾サポニンにおける前記の上述した基の1つまたは2つ(すなわち、アグリコンのアルデヒド基、前記アグリコンのC-3に結合された多糖鎖におけるグルクロン酸のカルボキシル基、およびアグリコンのC-28において結合された多糖鎖におけるアセチル基:の1つまたは2つ)が誘導体化される場合、例えば毒素の細胞毒性またはBNA介在性遺伝子サイレンシングの増強が考慮される場合に(いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが:修飾サポニンの類似のまたは改善されたエンドソーム脱出促進活性に関連して)活性を有し;および/または、非修飾のサポニンの毒性、活性、および溶血活性と比較した場合、低減された溶血活性を有することを見出した。それにより本発明者らは改善された治療濃度域をもつサポニン誘導体を提供するが、その理由は、該サポニン誘導体について、細胞毒性が天然産の対応物について測定された細胞毒性よりも低いこと、溶血活性がサポニン誘導体の天然産の対応物について測定された溶血活性よりも低いこと、また単一誘導体化サポニンについて、および二重誘導体化サポニンについて、細胞毒性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとの、IC50値間の比率が同様かまたは増加することから、および/または、サポニン溶血活性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとの、IC50値間の比率が同様かまたは増加することからである。例示的なサポニン誘導体の概要については、図1-14,および36-40と組合せて、表A2が参照され、また種々の細胞において測定された、細胞毒性、溶血活性、およびエンドソーム脱出促進活性(「活性」)の概要、並びに細胞毒性のIC50と活性のIC50との間の比率、および溶血活性のIC50と活性のIC50との間の比率の概要については、表A5および表A6が参照される。
- サポニンのアグリコンのC-3において結合され、かつ修飾されたグルクロン酸を含有する、分岐型三糖部分;および/または
- サポニンのアグリコンのC-4における修飾されたアルデヒド;および/または
- サポニンのアグリコンのC-28位において結合された多糖部分であり、かつ、前記多糖部分中に修飾されたアセトキシ基を含有する、該多糖部分、
を有するサポニン誘導体が;
前記サポニン誘導体と接触された細胞の細胞生存率が考慮される場合に低減された毒性を有し;修飾サポニンにおける前記の上述した基の1つまたは2つ(すなわち、アグリコンのアルデヒド基、前記アグリコンのC-3に結合された多糖鎖におけるグルクロン酸のカルボキシル基、およびアグリコンのC-28において結合された多糖鎖におけるアセチル基:の1つまたは2つ)が誘導体化される場合、例えば毒素の細胞毒性またはBNA介在性遺伝子サイレンシングの増強が考慮される場合に(いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが:修飾サポニンの類似のまたは改善されたエンドソーム脱出促進活性に関連して)活性を有し;および/または、非修飾のサポニンの毒性、活性、および溶血活性と比較した場合、低減された溶血活性を有することを見出した。それにより本発明者らは改善された治療濃度域をもつサポニン誘導体を提供するが、その理由は、該サポニン誘導体について、細胞毒性が天然産の対応物について測定された細胞毒性よりも低いこと、溶血活性がサポニン誘導体の天然産の対応物について測定された溶血活性よりも低いこと、また単一誘導体化サポニンについて、および二重誘導体化サポニンについて、細胞毒性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとの、IC50値間の比率が同様かまたは増加することから、および/または、サポニン溶血活性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとの、IC50値間の比率が同様かまたは増加することからである。例示的なサポニン誘導体の概要については、図1-14,および36-40と組合せて、表A2が参照され、また種々の細胞において測定された、細胞毒性、溶血活性、およびエンドソーム脱出促進活性(「活性」)の概要、並びに細胞毒性のIC50と活性のIC50との間の比率、および溶血活性のIC50と活性のIC50との間の比率の概要については、表A5および表A6が参照される。
本発明の第1の態様は、トリテルペンアグリコンコア構造(「アグリコンコア」とも称される)と、前記アグリコンコア構造に結合された、第1の糖鎖および第2の糖鎖の少なくとも1つとを含む、サポニンをベースとするサポニン誘導体であって、これにおいて:
i. 前記サポニン誘導体が、誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含むか;または
ii. 前記サポニン誘導体が、前記第1の糖鎖を含み、これにおいて、前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有するか:または
iii. 前記サポニン誘導体が、前記第2の糖鎖を含み、これにおいて、前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有するか;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含み;
これにおいて、前記第1の糖鎖および前記第2の糖鎖が、独立して、単糖、直鎖オリゴ糖、および分岐オリゴ糖から選択される、
該サポニン誘導体に関する。
i. 前記サポニン誘導体が、誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含むか;または
ii. 前記サポニン誘導体が、前記第1の糖鎖を含み、これにおいて、前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有するか:または
iii. 前記サポニン誘導体が、前記第2の糖鎖を含み、これにおいて、前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有するか;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含み;
これにおいて、前記第1の糖鎖および前記第2の糖鎖が、独立して、単糖、直鎖オリゴ糖、および分岐オリゴ糖から選択される、
該サポニン誘導体に関する。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が、モノデスモシド系トリテルペングリコシドまたはビスデスモシド系トリテルペングリコシド、より好ましくはビスデスモシド系トリテルペングリコシドである、本発明のサポニン誘導体である。
驚いたことに、サポニンのアグリコンのC-23におけるアルデヒド基、アグリコンのC-3における糖部分、すなわちグルクロン酸部分におけるカルボキシル基、およびサポニンのアグリコンコアのC-28において結合された(オリゴ-)糖部分の糖単位におけるアセチル基の、任意の1つ、2つ、または3つの修飾(誘導体化)は、結果として、かかるサポニン誘導体が細胞、すなわち種々のタイプの細胞と接触された場合に細胞毒性を低減する。細胞毒性の低減は、本発明者らにより、表A2、表A3、並びに図1-14、および36-40に列記された一連の種々のサポニン誘導体について確証された。それ故、低減された細胞毒性をもつこれらの一連のサポニン誘導体が提供されることは、本発明の一部であって、ここで細胞毒性の低減とは、非修飾の天然産サポニンの対応物について測定されたような細胞毒性に比較したものである。サポニン誘導体は、かかる天然産サポニンから形成され得る。典型的には、本発明のサポニン誘導体は、自然界に存在するSO1861およびQS-21(異性体)などの、天然産の対応物に比較した場合、1つ、2つ、または3つの誘導体化を含む。細胞毒性の低減が考慮される場合、本明細書で上記に概説されたサポニン分子中の位置において1つ、2つ、または3つの修飾(誘導体化)を含むサポニン誘導体は、細胞毒性の低減されたサポニンが提供されるべき場合に、等しく好適である。さらに本発明者らは驚いたことに、多種多様な異なる修飾が、細胞毒性を低減すること、溶血活性を低減すること、および充分な程度のエンドソーム脱出促進活性を保持しかつ残すことに適していることを確証した。溶血活性が考慮される場合、細胞毒性の低下と同様に、サポニンの示された化学基の1つ、2つ、または3つが誘導体化される場合に、溶血活性は低減される。こうした誘導体化は、様々な性質のもの、例えば表A2、表A3、並びに図1-14、および36-40に概説されたものでよい。還元によるアルデヒド基のヒドロキシル基への誘導体化のように小さい誘導体化と、およびAEMによるグルクロン酸のカルボキシル基の誘導体化と組合された、EMCHによるアルデヒド基の誘導体化のように大きい誘導体化との双方の誘導体化が、細胞毒性および溶血活性を低減する。いずれも天然産のサポニン対応物に比較した場合に、低減された細胞毒性という点で改善された細胞毒性をもち、かつ低減された溶血活性という点で改善された溶血活性を持つサポニンを提供するために、サポニンの3つの化学基の任意の1つ以上、例えば1つ、2つ、または3つが、異なるサイズおよび/または異なる化学的性質をもつ幅広く様々な化学基によって誘導体化され得ることは明らかである。
何ら理論に束縛されることを望むものではないが、サポニンのアグリコンのC-3原子におけるアルデヒド基が、ビスデスモシド系トリテルペングリコシド型のサポニンのエンドソーム脱出促進活性、すなわち、例えば、インビトロおよびインビボの双方において、かかるサポニンの存在下に細胞と接触された場合の、かかるサポニンの不在下に同じ用量が同じ細胞と接触された場合のかかる毒素の毒性に比較して増大された(タンパク質)毒素の毒性、に関係および/または寄与することが推定される。実際、本発明者らは、グルクロン酸単位中に誘導体化されたカルボキシル基、および/または多糖鎖中に誘導体化されたアセチル基をもち、かつアグリコン中に遊離のアルデヒド基を含有するサポニン誘導体が、エンドソーム脱出促進活性をもつことを確証した。これらの誘導体は、低減された溶血活性および低減された細胞毒性を有する。例えば、分子3A、8、11、18、19、および28(表A2、表A3、表A5、表A6、図1、3、6、11、12、39)のようなサポニン誘導体は、アグリコンコア中に遊離の非修飾アルデヒド基を有しており、実際、抗体がそれに結合する受容体を発現している種々の(腫瘍)細胞と接触される、抗体-薬物コンジュゲートの細胞毒性の増強が考慮される場合に活性を示す。それ故これらのサポニン誘導体は、本発明の明らかに想定される実施形態である。
驚いたことに、アグリコン中に誘導体化されたアルデヒド基をもち、サポニン誘導体が遊離のアルデヒド基を含まないようにしたサポニン誘導体でも、リガンド-毒素コンジュゲート、例えばADCの形態で(腫瘍)細胞へ提供されたエフェクター分子の細胞毒性( )、かつ前提条件として、C-28における多糖鎖中のアセチル基およびC-23における多糖鎖中のカルボキシル基のうちのゼロ個または1個だけが誘導体化される場合、なお特徴的なエンドソーム脱出促進活性を示す。例えば、表A2、表A3、および図2、4、5、8、9、13、38,および40において分子6、9、10、14、15、20、27、および29として示された、修飾されたアルデヒド基をもち、かつゼロ個または単一のさらなる誘導体化をもつサポニン誘導体は、アグリコン中に誘導体化されたアルデヒド基をもつかかるサポニン誘導体の存在下に腫瘍細胞と接触される、エフェクター分子の細胞毒性を増強する能力をもつ。これらのサポニン誘導体は全て、低減された細胞毒性を示し、かつ低減された溶血活性を示し、かつそれ故に本発明の明らかに想定される実施形態である。
本発明者らはまた、ある修飾が、対応する非修飾のサポニンに比較した場合、増加された臨界ミセル濃度(CMC)をもたらすことも見出した。例えば、分子2、6、8、10、15、27、および28として示されたサポニン誘導体、好ましくは分子2、6、8、10、および15として示されたサポニン誘導体は、それらの対応する非誘導体化サポニンに比較した場合、増大されたCMCをもち、かつそれ故に本発明の明らかに想定される実施形態である。何ら理論に束縛されることを望むものではないが、増大されたCMCは、いくつかの理由で有利であると考えられる。例えば、遊離の分子は一般に、ミセル構造中に正しく並べられた分子よりもコンジュゲーション反応の影響を受けやすいことから、増大されたCMCはその後のコンジュゲーション反応における修飾サポニンの使用を促進し得る。さらに、サポニン誘導体が生物学的機能(例えば、インビボ治療、またはエクスビボ法、またはインビトロ法において)を及ぼす必要がある場合、例えば、サポニン誘導体がそのまま使用される場合、またはそれらが担体もしくは別の実体から切断された後にインシトゥで放出される場合でも、非修飾のサポニンに比較して増大されたCMCは有利であり、その理由は、遊離のサポニン分子が、これらのサポニン誘導体がミセル構造中に正しく並べられている場合よりも、その生物学的標的と相互作用するためにより容易に利用されやすいことからである。臨界ミセル濃度を超える(上回る)濃度においては、サポニンは単離(例えば、分取HPLCを用いた)を邪魔するミセルを形成することから、増大されたCMCはまた、サポニン誘導体の大量の生産および濃縮を促進するためにも有用であり得る。驚いたことに、本発明のサポニン誘導体については、観察された増大されたCMCは、増大された細胞毒性または溶血活性とは関係しない。CMCと細胞毒性との間の相互関係は、例えば、α-ヘデリン(Hederin)を基準点として、CMCは一般的な細胞毒性の増大と関係づけられ得る(ジギトニン(Digitonin)の場合と同様に)が、しかし細胞毒性の減少にも全く同様に関係づけられること(グリチルリチン(Glycyrrhizin)およびヘデラコシド(Hederacoside)Cの場合と同様に)を示す、Grootら(“Saponin interactions with model membrane systems-Langmuir monolayer studies,hemolysis and formation of ISCOMs(サポニンのモデル膜系との相互作用-ラングミュア単分子膜研究、溶血、およびISCOMの形成)”、「Planta medica」、2016年、第82巻、第18号、P.1496-1512)の表2のデータから分かるように、予測可能ではなくかつ複雑である。さらに、分子2、6、10、および15として示されたサポニン誘導体については、増大されたCMCはまた、対応する遊離のサポニンに比較して増大された比率:IC50溶血/IC50活性に関係づけられるため、これらのサポニン誘導体は本発明の特に好ましい実施形態である。
本発明者らはそれ故、細胞毒性が考慮される場合、および/または溶血活性が考慮される場合、および例えば毒素の増強、および/または対応する非誘導体化サポニンに比較して増大されたCMCが考慮される場合に、改善された治療濃度域をもつサポニン誘導体を提供する。本発明のかかるサポニン誘導体は、とりわけ、例えば癌の予防または治療のための、例えばADCまたはAOCを含む治療計画における適用のために適している。かかるサポニン誘導体の安全性は、細胞毒性および/または溶血活性が考慮される場合、とりわけ、かかるサポニン誘導体が、例えば、ADCを用いるかまたはAOCを用いる治療を要する患者に投与される場合に改善される。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて前記サポニン誘導体が、前記第1の糖鎖を含み、ここで、前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し、および/またはこれにおいて、前記サポニン誘導体が、前記第2の糖鎖を含み、これにおいて、前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基(本明細書ではまた誘導体化されたアセタート基とも称される)を含み、好ましくは、前記サポニン誘導体が、誘導体化されている前記第1の糖鎖と、誘導体化されている前記第2の糖鎖との双方を含み、より好ましくは、前記サポニン誘導体が、誘導体化されている前記第1の糖鎖と、誘導体化されている前記第2の糖鎖との双方を含み、かつ前記サポニン誘導体が、アルデヒド基または誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含み、最も好ましくは、前記サポニン誘導体が、誘導体化されている前記第1の糖鎖と、誘導体化されている前記第2の糖鎖との双方を含み、かつ前記サポニン誘導体が、アルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含む。同様に好ましいのは、天然産サポニンが考慮される場合、サポニン中のこれら3つの化学基の1つを未変更のまま残している、かかる誘導体化の2つの全ての他の可能な組合せである。さらに、サポニン中の化学基の1つ、2つ、または3つ、好ましくは1つまたは2つは、表A2および表A3に列記された誘導体化の任意の1つ以上によって誘導体化される。
一実施形態は、本発明によるサポニン誘導体であって、ここで、前記サポニン誘導体が:
2アルファ-ヒドロキシオレアノール酸;
16アルファ-ヒドロキシオレアノール酸;
ヘデラゲニン(23-ヒドロキシオレアノール酸);
16アルファ,23-ジヒドロキシオレアノール酸;
ギプソゲニン;
キラ酸;
プロトアエスシゲニン-21(2-メチルブタ-2-エノアート)-22-アセタート;
23-オキソ-バリングトゲノールC-21,22-ビス(2-メチルブタ-2-エノアート);
23-オキソ-バリングトゲノールC-21(2-メチルブタ-2-エノアート)-16,22-ジアセタート;
ジギトゲニン;
3,16,28-トリヒドロキシオレアナン-12-エン;
ギプソゲニン酸;
および
それらの誘導体、
からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、
好ましくは、前記サポニン誘導体が、キラ酸およびギプソゲニンまたはそれらの誘導体から選択されるアグリコンコア構造を含み、より好ましくは、前記サポニン誘導体アグリコンコア構造が、キラ酸またはその誘導体である。本発明者らは今、改善されたサポニン誘導体が、トリテルペングリコシド型のサポニンをベースとして、かかる誘導体と接触された細胞の、低減された細胞毒性および低下された溶血に関して提供され得ることを見出したことから、本発明者らによってテストされたようなエンドソーム脱出促進活性をもつ任意のサポニン、例えば前述の実施形態のアグリコンを有しかつ表A1に列記されたサポニンは、それ故基本的に改善可能である。毒素および例えばBNAの増強が考慮される場合、活性を充分に高い程度に保持しながら、毒性を低下させることおよび溶血活性を低下させることは、単独または例えばADCもしくはAOCと組合せたサポニン誘導体の治療濃度域の拡大が考慮される場合に、本発明者らによる重要な業績である。充分に高い用量の誘導体化されたサポニンが、例えば、それを必要とする癌患者のための腫瘍療法において適用可能である一方、サポニン誘導体によって及ぼされるかまたは誘導される、細胞毒性の副作用(のリスク)および望ましくない溶血活性(のリスク)は、天然のサポニンの対応物の適用に比較して低減される。本発明のサポニン誘導体の治療濃度域の改善は、例えば、細胞毒性または溶血活性のいずれかのIC50と、エンドソーム脱出促進活性のIC50との間の比率、並びに溶血活性、細胞毒性、および活性が列記されている表A5および表A6における例示的なサポニン誘導体について明らかである。
2アルファ-ヒドロキシオレアノール酸;
16アルファ-ヒドロキシオレアノール酸;
ヘデラゲニン(23-ヒドロキシオレアノール酸);
16アルファ,23-ジヒドロキシオレアノール酸;
ギプソゲニン;
キラ酸;
プロトアエスシゲニン-21(2-メチルブタ-2-エノアート)-22-アセタート;
23-オキソ-バリングトゲノールC-21,22-ビス(2-メチルブタ-2-エノアート);
23-オキソ-バリングトゲノールC-21(2-メチルブタ-2-エノアート)-16,22-ジアセタート;
ジギトゲニン;
3,16,28-トリヒドロキシオレアナン-12-エン;
ギプソゲニン酸;
および
それらの誘導体、
からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、
好ましくは、前記サポニン誘導体が、キラ酸およびギプソゲニンまたはそれらの誘導体から選択されるアグリコンコア構造を含み、より好ましくは、前記サポニン誘導体アグリコンコア構造が、キラ酸またはその誘導体である。本発明者らは今、改善されたサポニン誘導体が、トリテルペングリコシド型のサポニンをベースとして、かかる誘導体と接触された細胞の、低減された細胞毒性および低下された溶血に関して提供され得ることを見出したことから、本発明者らによってテストされたようなエンドソーム脱出促進活性をもつ任意のサポニン、例えば前述の実施形態のアグリコンを有しかつ表A1に列記されたサポニンは、それ故基本的に改善可能である。毒素および例えばBNAの増強が考慮される場合、活性を充分に高い程度に保持しながら、毒性を低下させることおよび溶血活性を低下させることは、単独または例えばADCもしくはAOCと組合せたサポニン誘導体の治療濃度域の拡大が考慮される場合に、本発明者らによる重要な業績である。充分に高い用量の誘導体化されたサポニンが、例えば、それを必要とする癌患者のための腫瘍療法において適用可能である一方、サポニン誘導体によって及ぼされるかまたは誘導される、細胞毒性の副作用(のリスク)および望ましくない溶血活性(のリスク)は、天然のサポニンの対応物の適用に比較して低減される。本発明のサポニン誘導体の治療濃度域の改善は、例えば、細胞毒性または溶血活性のいずれかのIC50と、エンドソーム脱出促進活性のIC50との間の比率、並びに溶血活性、細胞毒性、および活性が列記されている表A5および表A6における例示的なサポニン誘導体について明らかである。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて、前記サポニン誘導体が、キラ酸、ギプソゲニン、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、好ましくは、前記サポニン誘導体が、キラ酸、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、これにおいて、前記第1の糖鎖が、存在する場合、前記アグリコンコア構造のC3原子(「C-3原子」とも称される)またはC28原子(「C-28原子」とも称される)、好ましくはC3原子に結合され、および/またはこれにおいて、前記第2の糖鎖が、存在する場合、前記アグリコンコア構造のC28原子に結合される。好ましいのは、アグリコンに結合された双方の糖鎖を有するサポニンをベースとするサポニン誘導体であるが、しかし一般に、エンドソーム脱出促進活性を示す任意のいずれのサポニンも、より低い細胞毒性、より低い溶血活性、および充分に高いエンドソーム脱出促進活性をもつ、単一、二重、または三重、好ましくは一重または二重誘導体化されたサポニンを提供するための、本発明による誘導体化に適している。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて前記第1の糖鎖が、存在する場合、以下(リストS1)の:
GlcA-,
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-Ara-,
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-,
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,および
それらの誘導体から選択され、
および/または前記第2の糖鎖が、存在する場合、以下の(リストS2):
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-,
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-,
Ara-,
Xyl-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc- ここでR1は4E-メトキシケイ皮酸であり、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc- ここでR2は4Z-メトキシケイ皮酸であり、
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-di-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc- ここでR3は4E-メトキシケイ皮酸であり、
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
(Ara-またはXyl-)(1→3)-(Ara-またはXyl-)(1→4)-(Rha-またはFuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-またはFuc-)(1→4)]-(Rha-またはFuc-),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc- ここでR4は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc- ここでR5は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-di-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- ここでR6は5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- ここでR7は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- ここでR8は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- ここでR9は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- ここでR10は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- ここでR11は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- ここでR12は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-,および
それらの誘導体、から選択される。
GlcA-,
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-Ara-,
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-,
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,および
それらの誘導体から選択され、
および/または前記第2の糖鎖が、存在する場合、以下の(リストS2):
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-,
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-,
Ara-,
Xyl-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc- ここでR1は4E-メトキシケイ皮酸であり、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc- ここでR2は4Z-メトキシケイ皮酸であり、
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-di-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc- ここでR3は4E-メトキシケイ皮酸であり、
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
(Ara-またはXyl-)(1→3)-(Ara-またはXyl-)(1→4)-(Rha-またはFuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-またはFuc-)(1→4)]-(Rha-またはFuc-),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc- ここでR4は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc- ここでR5は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-di-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- ここでR6は5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- ここでR7は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- ここでR8は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- ここでR9は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- ここでR10は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- ここでR11は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- ここでR12は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-,および
それらの誘導体、から選択される。
典型的には、細胞がサポニンおよび毒素と接触されるとき、毒素の細胞毒性を増強するサポニンは、アグリコンに結合されたかかる単糖または多糖鎖の1つまたは2つを有する。好ましいのは、2つの糖鎖を含む誘導体化について選択されたサポニンである。エンドソーム脱出促進活性が充分に高い程度に保持されるべき場合に、かかるサポニンを、単一、二重、または三重誘導体化、好ましくは一重または二重誘導体化に供するために特に好ましいサポニンの概要は、表A1に提供される。当然ながら、かかるサポニンの構造変異体は、かかるサポニンが例えば毒素、BNAなどに対してエンドソーム脱出促進活性を示す場合には、本発明による誘導体化に等しく好適である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が、前記第1の糖鎖を含み、かつ前記第2の糖鎖を含み、ここで前記第1の糖鎖が、2つ以上の糖部分を含み、前記第2の糖鎖が、2つ以上の糖部分を含み、かつこれにおいて、前記アグリコンコア構造がキラ酸またはギプソゲニンであり、ここで:
i. 前記アグリコンコア構造のアルデヒド基が誘導体化されていること、
ii.前記第1の糖鎖が、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有すること:および
iii.前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有すること、
の1つ、2つ、または3つ、好ましくは1つまたは2つである、本発明のサポニン誘導体である。
i. 前記アグリコンコア構造のアルデヒド基が誘導体化されていること、
ii.前記第1の糖鎖が、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有すること:および
iii.前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有すること、
の1つ、2つ、または3つ、好ましくは1つまたは2つである、本発明のサポニン誘導体である。
以下の要約は、適当な誘導体化を例示する:
本発明によれば、サポニンは3つの誘導体化を含んでなお充分に高いエンドソーム脱出促進活性を示し得る。とりわけ、細胞毒性および/または溶血活性の低減が、細胞内でのエフェクター分子、例えば毒素またはBNAの効果および活性を、エフェクター分子および誘導体化されたサポニンと接触された腫瘍細胞において強化する能力の(潜在的なまたは見かけ上の)低減よりも大きい場合である。したがって、本発明はアグリコンのアルデヒド基が考慮される場合、存在する場合にはC-3における多糖中のグルクロン酸単位におけるカルボキシル基が考慮される場合、および存在する場合にはC-28における多糖鎖中のアセチル基が考慮される場合に、1つ、2つ、または3つの誘導体化を含む、誘導体化されたサポニンを提供する。好ましいのは、1つまたは2つの修飾を有するサポニン誘導体である。毒素およびBNAなどのエフェクター分子の、エンドソーム脱出を改善するために適するのは、例えば遊離のアルデヒド基をもち、かつ糖鎖中に1つまたは2つの誘導体化をもつサポニン誘導体である。先に述べた通り、誘導体化されたアルデヒド基を持つサポニン誘導体もまた、等しく好適である。誘導体化に際し、アグリコン中に遊離のアルデヒド基をもたないかかるサポニン誘導体は、なお充分かつ効率的なエンドソーム脱出促進活性を示す。何ら理論に束縛されることを望むものではないが、ヒト細胞などの(哺乳類)細胞のエンドソーム内およびリソゾーム内の酸性条件の結果として、アルデヒド基は、位置C-23において誘導体化されたアグリコンを持つサポニン誘導体を提供するためのサポニンのアルデヒド基に最初に結合した部分のpH駆動型の切断に際し、細胞の内側で再び形成され得る。エンドソームまたはリソゾーム内で再度形成され得る修飾されたアルデヒド基をもつサポニン誘導体の例は、ヒドラゾン結合を含むサポニン誘導体であり、該結合は、アルデヒドのカルボニル基と、例えば、アグリコンに結合された化学基中のヒドラジド部分、例えばN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)、またはマレイミド基に結合されてチオエーテル結合を形成するメルカプトエタノールをもつEMCHとの間に形成される。かかるサポニン誘導体の例は、図8および図9に提示され、かつ分子2および分子3として以下に表示される。
本発明のサポニン誘導体の一実施形態は、これにおいて前記サポニン誘導体が:キラヤ(Quillaja)樹皮サポニン、ジプサコシドB、サイコサポニンA、サイコサポニンD、マクラントイジンA、エスクレントシドA、フィトラッカゲニン、エシネート、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、アルファ-ヘデリン(Hederin)、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1,NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、SO1862、QS-7,QS1861,QS-7 api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21 A-apio、QS-21 A-xylo、QS-21 B-apio、QS-21 B-xylo、ベータ-エスシン(Aescin)、エスシンIa、茶種子(Teaseed)サポニンI、茶種子サポニンJ、アッサムサポニン(Assamsaponin)F、ジギトニン、プリムラ酸(Primula acid)1、およびAS64R、ならびにそれらの立体異性体およびそれらの組合せ、からなる群より選択されるサポニンの誘導体であり、好ましくは、前記サポニン誘導体が、QS-21誘導体、SO1861誘導体、SA1641誘導体、およびGE1741誘導体からなる群より選択され、さらに好ましくは、前記サポニン誘導体が、QS-21誘導体およびSO1861誘導体からなる群より選択され、最も好ましくは、前記サポニン誘導体が、SO1861誘導体である。これらのサポニンは、基本的に、本発明者らにより実証されたようなエンドソーム脱出促進活性を示すか、または、それらについてエンドソーム脱出促進活性が確立されているサポニンに構造的に非常に類似しているものである。これらのサポニンの構造は、表A1に要約されている。
本発明のサポニン誘導体の一実施形態は、これにおいて前記サポニン誘導体が、分子1:
[式中、
前記第1の糖鎖A1は、水素、単糖、または直鎖もしくは分岐オリゴ糖を表し、好ましくは、A1は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表し、より好ましくは、A1は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表しかつA1は、グルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部分からなり;
前記第2の糖鎖A2は、水素、単糖、または直鎖もしくは分岐オリゴ糖を表し、好ましくは、A2は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表し、より好ましくは、A2は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表しかつA2は、少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基、例えば1つ、2つ、3つ、または4つの、好ましくは1つのアセトキシ基を含有し、ここで、A1およびA2の少なくとも1つは水素ではなく、好ましくはA1およびA2の双方がオリゴ糖鎖であり;
かつRは、ギプソゲニン中の水素またはキラ酸中のヒドロキシルである]
によって表される、キラ酸サポニンまたはギプソゲニンサポニンの誘導体であり、
ここで、前記サポニン誘導体が、以下の誘導体化:
i. キラ酸またはギプソゲニンの位置C23におけるアルデヒド基が誘導体化されている;
ii. A1が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表しかつA1がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部からなる場合、A1のグルクロン酸部分のカルボキシル基が誘導体化されている;および
iii. A2が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を有する場合、A2の1つの糖部分または2つ以上の糖部分の、1つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が誘導体化されている、
の少なくとも1つが存在する分子1によって表されるサポニンに対応する。
前記第1の糖鎖A1は、水素、単糖、または直鎖もしくは分岐オリゴ糖を表し、好ましくは、A1は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表し、より好ましくは、A1は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表しかつA1は、グルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部分からなり;
前記第2の糖鎖A2は、水素、単糖、または直鎖もしくは分岐オリゴ糖を表し、好ましくは、A2は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表し、より好ましくは、A2は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表しかつA2は、少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基、例えば1つ、2つ、3つ、または4つの、好ましくは1つのアセトキシ基を含有し、ここで、A1およびA2の少なくとも1つは水素ではなく、好ましくはA1およびA2の双方がオリゴ糖鎖であり;
かつRは、ギプソゲニン中の水素またはキラ酸中のヒドロキシルである]
によって表される、キラ酸サポニンまたはギプソゲニンサポニンの誘導体であり、
ここで、前記サポニン誘導体が、以下の誘導体化:
i. キラ酸またはギプソゲニンの位置C23におけるアルデヒド基が誘導体化されている;
ii. A1が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表しかつA1がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部からなる場合、A1のグルクロン酸部分のカルボキシル基が誘導体化されている;および
iii. A2が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を有する場合、A2の1つの糖部分または2つ以上の糖部分の、1つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が誘導体化されている、
の少なくとも1つが存在する分子1によって表されるサポニンに対応する。
一実施形態は、A1が、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表しかつグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部からなり、かつこれにおいて、A1のグルクロン酸部分のカルボキシル基が誘導体化されており、および/または、A2が、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を含有し、かつこれにおいて、A2の少なくとも1つのアセトキシ基が誘導体化されている、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、分子1によって表される前記サポニンが、ビスデスモシド系トリテルペンサポニンである、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて、前記サポニン誘導体が分子1によって表されるサポニンに対応し、ここで、以下の誘導体化:
i. 前記キラ酸またはギプソゲニンの位置C23における前記アルデヒド基が、
- アルコールへの還元;
- 好ましくはヒドラジドとの反応を介した、ヒドラゾン結合への変換、
によって誘導体化されている;
ii. A1が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表しかつA1がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部分からなる場合、A1のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基がアミド結合への変換により、好ましくはアミンとの反応を介して誘導体化されている;および
iii. A2が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を有する場合、A2の1つの糖部分または2つ以上の糖部分の、1つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されている、
の少なくとも1つが存在し、好ましくは1つまたは2つが存在し、より好ましくは1つが存在する、該サポニン誘導体である。
i. 前記キラ酸またはギプソゲニンの位置C23における前記アルデヒド基が、
- アルコールへの還元;
- 好ましくはヒドラジドとの反応を介した、ヒドラゾン結合への変換、
によって誘導体化されている;
ii. A1が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表しかつA1がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部分からなる場合、A1のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基がアミド結合への変換により、好ましくはアミンとの反応を介して誘導体化されている;および
iii. A2が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を有する場合、A2の1つの糖部分または2つ以上の糖部分の、1つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されている、
の少なくとも1つが存在し、好ましくは1つまたは2つが存在し、より好ましくは1つが存在する、該サポニン誘導体である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が分子1によって表されるサポニンに対応し、これにおいて、以下の誘導体化:
i. キラ酸またはギプソゲニンの位置C23におけるアルデヒド基が、
- アルコールへの還元;
- N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、それにより、サポニン-Ald-EMCH、例えばSO1861-Ald-EMCHまたはQS-21-Ald-EMCHを提供し、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
- N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド(BMPH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、これにおいてBMPHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;または
- N-[κ-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド(KMUH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、これにおいてKMUHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
によって誘導体化される;
ii. A1が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表しかつA1がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部分からなる場合、A1のグルクロン酸部分のカルボキシル基が、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMPD)またはN-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化され、それにより、サポニン-Glu-AMPD、例えばQS-21-Glu-AMPDもしくはSO1861-Glu-AMPD、またはサポニン-Glu-AEM、例えばQS-21-Glu-AEMもしくはSO1861-Glu-AEMを提供する;および
iii. A2が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を有する場合、A2の1つの糖部分または2つ以上の糖部分の、1つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されている、
の少なくとも1つが存在し、好ましくは1つまたは2つが存在し、より好ましくは1つが存在する、本発明のサポニン誘導体である。
i. キラ酸またはギプソゲニンの位置C23におけるアルデヒド基が、
- アルコールへの還元;
- N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、それにより、サポニン-Ald-EMCH、例えばSO1861-Ald-EMCHまたはQS-21-Ald-EMCHを提供し、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
- N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド(BMPH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、これにおいてBMPHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;または
- N-[κ-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド(KMUH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、これにおいてKMUHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
によって誘導体化される;
ii. A1が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS1)を表しかつA1がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部分からなる場合、A1のグルクロン酸部分のカルボキシル基が、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMPD)またはN-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化され、それにより、サポニン-Glu-AMPD、例えばQS-21-Glu-AMPDもしくはSO1861-Glu-AMPD、またはサポニン-Glu-AEM、例えばQS-21-Glu-AEMもしくはSO1861-Glu-AEMを提供する;および
iii. A2が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖(リストS2)を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を有する場合、A2の1つの糖部分または2つ以上の糖部分の、1つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されている、
の少なくとも1つが存在し、好ましくは1つまたは2つが存在し、より好ましくは1つが存在する、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、 が、Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcAであり、および/またはA2が、Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fucであり、好ましくは、分子1によって表される前記サポニンが、3-O-ベータ-D-ガラクトピラノシル-(1→2)-[ベータ-D-キシロピラノシル-(1→3)]-ベータ-D-グルクロノピラノシルキラ酸-28-O-ベータ-D-グルコピラノシル-(1→3)-ベータ-D-キシロピラノシル-(1→4)-アルファ-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[ベータ-D-キシロピラノシル-(1→3)-4OAc-ベータ-D-キノボピラノシル-(1→4)]-ベータ-D-フコピラノシドであり、より好ましくはSO1861、GE1741、SA1641および/またはQS-21、最も好ましくはSO1861である、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が:SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21 A-api、QS-21 A-xyl、QS-21B、QS-21 B-api、QS-21 B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、キラヤサポニン(Quillajasaponin)、サポニナム・アルバム(Saponinum album)、QS-18、Quil-A、Gyp1、ギプソシドA、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904の誘導体、それらの立体異性体およびそれらの組合せからなる群より選択され、好ましくは、前記サポニン誘導体が、SO1861誘導体、GE1741誘導体、SA1641誘導体、QS-21誘導体、およびそれらの組合せからなる群より選択され、より好ましくは、前記サポニン誘導体が、SO1861誘導体またはQS-21誘導体であり、最も好ましくは、サポニン誘導体がSO1861誘導体である、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が単一誘導体化を含むSO1861誘導体であり、ここで前記単一誘導体化が、例えば、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)の、SO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基への結合によるか(図59参照)、または(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(BOP)の、SO1861のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基への結合による、SO1861のグルクロン酸の前記カルボキシル基の変換であり、或いはこれにおいて前記サポニン誘導体が;N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置C23にアルデヒド基を含有する;分子2によって表されるSO1861誘導体であり:
或いはこれにおいて、前記サポニン誘導体が;N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置C23にアルデヒド基を含有するSO1861誘導体であって、ここでEMCHのマレイミド基がメルカプトエタノールによって誘導体化され、それによりチオエーテル結合を生じる該誘導体を表す;分子3によって表される、本発明のサポニン誘導体である:
分子2によって表されるサポニン誘導体は、遊離のスルフヒドリル基を含有するさらなる分子とのコンジュゲーション反応のための前駆体としての適用に適する。分子2として示されたサポニン誘導体のマレイミド基は、遊離のスルフヒドリル基などとチオエーテル結合を形成し得る。例えば、分子2のサポニン誘導体は、遊離のスルフヒドリル基をもつシステインなどの遊離のスルフヒドリル基を含有する、ペプチドまたはタンパク質に共有結合され得る。かかるタンパク質は、例えば抗体または、その結合フラグメントもしくは結合ドメイン、例えばFab、scFv、単一ドメイン抗体、例えばVHH、例えばラクダ類VHなどである。例えば、遊離のスルフヒドリル基をもつ抗体とのカップリング反応における、分子2のサポニン誘導体の適用は、抗体(または結合ドメインもしくはそのフラグメント)が、例えば腫瘍細胞上に存在する受容体などの、標的細胞表面分子への特異的結合のための抗体である場合、細胞および細胞内部へのサポニンの標的化送達のためのコンジュゲートを提供する。好ましくは、サポニン誘導体は、例えばHER2、EGFR、CD71といった受容体などの腫瘍細胞特異表面分子への結合が可能な、抗体またはVHHへ結合される。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が単一誘導体化を含むSO1861誘導体ではないという前提条件付きであり、これにおいて前記単一誘導体化が、1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)の、SO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基との反応による、SO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基の変換であり、或いはこれにおいて前記サポニン誘導体が;N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化された、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置C23においてアルデヒド基を含有するSO1861誘導体を表す;分子2によって表される、本発明のサポニン誘導体である:
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて、
i.前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、
- アルコールへの還元;
- N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
- N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド(BMPH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでBMPHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;または
- N-[κ-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド(KMUH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでKMUHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し;
ii. 前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMPD)またはN-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し;かつ
iii. 前記第2の糖鎖が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されているアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有し;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の2つまたは3つの任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含み;
好ましくは、前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、EMCHとの反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、EMCHのマレイミド基が、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される。
i.前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、
- アルコールへの還元;
- N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
- N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド(BMPH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでBMPHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;または
- N-[κ-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド(KMUH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでKMUHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し;
ii. 前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMPD)またはN-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し;かつ
iii. 前記第2の糖鎖が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されているアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有し;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の2つまたは3つの任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含み;
好ましくは、前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、EMCHとの反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、EMCHのマレイミド基が、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される。
一実施形態は、前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、アルデヒド基を含有し、かつここで、前記第1の糖鎖がカルボキシル基、好ましくは、N-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換によって誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有する、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、前記アグリコンコア構造中の前記アルデヒド基がN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラジド結合への変換によって誘導体化され、かつ前記サポニンがSO1861である場合には、前記グルクロン酸および前記アセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがSO1861でありかつSO1861の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基が1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)とSO1861の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基との反応によって誘導体化される場合には、前記アルデヒド基および前記アセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きである、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体の前記アグリコンコア構造中の前記アルデヒド基がEMCHとの反応を介して誘導体化され、かつ前記サポニンがSO1861である場合には、前記グルクロン酸および前記アセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがSO1861でありかつSO1861の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基が、結合したHATUにより誘導体化される場合には、前記アルデヒド基および前記アセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きである、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書において実施例D1と称された一実施形態は、前記サポニン誘導体がSA1641ではないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体であり、これにおいて、前記アグリコンコア構造が変換によって、例えば式(A1)の化合物との反応によるアミンへの還元的アミノ化によって、誘導体化されているアルデヒド基を含有する:
すなわち、本明細書において実施形態D1と称された一実施形態は、それが、SA1641と式(A1)の化合物との間の反応の結果ではないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。したがって、実施形態D1は、それが、少なくとも1つのSA1641分子の、式(A1)の化合物に対する還元的アミノ化によるカップリングの結果ではないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書において実施形態D2と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造がN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でチオ-ルとのチオエーテル結合の形成により誘導体化され、かつここで該サポニンには何ら他の誘導体化が存在しないことを特徴とし、好ましくは、サポニン誘導体がサポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造がN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でチオ-ルとのチオエーテル結合の形成により誘導体化されることを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD3と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造が、N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここでEMCHのマレイミド基が:
・ メルカプトエタノール、
・ 少なくとも2-イミノチオランによって誘導体化されているエチレンジアミンコアを有するポリ(アミドアミン)デンドリマー、
・ シアニン-3と、少なくとも2-イミノチオランによってさらに誘導体化されているエチレンジアミンコアを有するポリ(アミドアミン)デンドリマーとのコンジュゲート、
・ 少なくとも2-イミノチオランによって誘導体化されているG4デンドロン、
・ シアニン-5と、少なくとも2-イミノチオランによってさらに誘導体化されているG4デンドロンとのコンジュゲート、
・ ウシ血清アルブミン(BSA)、および
・ 配列SESDDAMFCDAMDESDSK[配列番号:1]をもつペプチド、
の1つ、好ましくは全てから選択されるチオールとの、チオエーテル結合の形成により誘導体化され、かつこれにおいて、他の誘導体化が該サポニンに存在しないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。当業者には理解されるように、「G4デンドロン」という表現は、式(A2)の化合物を意味するものと解釈されるべきである:
・ メルカプトエタノール、
・ 少なくとも2-イミノチオランによって誘導体化されているエチレンジアミンコアを有するポリ(アミドアミン)デンドリマー、
・ シアニン-3と、少なくとも2-イミノチオランによってさらに誘導体化されているエチレンジアミンコアを有するポリ(アミドアミン)デンドリマーとのコンジュゲート、
・ 少なくとも2-イミノチオランによって誘導体化されているG4デンドロン、
・ シアニン-5と、少なくとも2-イミノチオランによってさらに誘導体化されているG4デンドロンとのコンジュゲート、
・ ウシ血清アルブミン(BSA)、および
・ 配列SESDDAMFCDAMDESDSK[配列番号:1]をもつペプチド、
の1つ、好ましくは全てから選択されるチオールとの、チオエーテル結合の形成により誘導体化され、かつこれにおいて、他の誘導体化が該サポニンに存在しないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。当業者には理解されるように、「G4デンドロン」という表現は、式(A2)の化合物を意味するものと解釈されるべきである:
本明細書においてD4と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、カルボキシル基が、シアニン-3とエチレンジアミンコアを有するポリ(アミドアミン)デンドリマーとからなる任意でさらに誘導体化されたコンジュゲートとの反応による、アミドへの変換によって誘導体化されており、かつこれにおいて、何ら他の誘導体化が該サポニンに存在しないことを特徴とし、好ましくは、サポニン誘導体がサポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、カルボキシル基が、シアニン-3とエチレンジアミンコアを有するポリ(アミドアミン)デンドリマーとからなる任意でさらに誘導体化されたコンジュゲートとの反応による、アミドへの変換によって誘導体化されている、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD5と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造が、シアニン-3およびエチレンジアミンコアを有するポリ(アミドアミン)デンドリマーからなるコンジュゲートとの反応による、アミンへの還元的アミノ化などの変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含み、かつこれにおいて、何ら他の誘導体化が該サポニンに存在しないことを特徴とし、好ましくは、サポニン誘導体がサポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造が、シアニン-3およびエチレンジアミンコアを有するポリ(アミドアミン)デンドリマーからなるコンジュゲートとの反応による、アミンへの還元的アミノ化などの変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含むことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD6と称された一実施形態は、サポニン誘導体が毒素、マイクロRNA、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まないこと、好ましくは、サポニン誘導体が薬学的に活性のある物質、例えば毒素、薬物、ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドを含まないことを特徴とし、より好ましくは、サポニン誘導体がエフェクター分子を含まないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD7と称された一実施形態は、サポニン誘導体が:
・ ポリ-またはオリゴ(アミン)、例えばポリエチレンイミンおよびポリ(アミドアミン)、
・ ポリエチレングリコール、
・ ポリ-またはオリゴ(エステル)、例えばポリ(ラクチド)、
・ ポリ(ラクタム)、
・ ポリラクチド-co-グリコリド共重合体、
・ 多-またはオリゴ糖、例えばシクロデキストリンおよびポリデキストロース、
・ ポリ-またはオリゴ(アミノ酸)、例えばタンパク質およびペプチド、および
・ 核酸およびそれらの類似体、例えばDNA、RNA、LNA(ロック核酸)、およびPNA(ペプチド核酸);
からなる群より選択されるポリマーまたはオリゴマー構造を含まないことを特徴とし、
好ましくは、サポニン誘導体が、ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、デンドロナイズドポリマー、またはデンドロナイズドオリゴマーといった、構造的に規則正しい形態であるポリマーまたはオリゴマー構造を含まないか、またはそれが、ヒドロゲル、ミクロゲル、ナノゲル、安定化された重合体ミセル、またはリポソームといった、集合したポリマー構造であることを特徴とし、より好ましくは、サポニン誘導体がポリマーまたはオリゴマー構造を含まないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
・ ポリ-またはオリゴ(アミン)、例えばポリエチレンイミンおよびポリ(アミドアミン)、
・ ポリエチレングリコール、
・ ポリ-またはオリゴ(エステル)、例えばポリ(ラクチド)、
・ ポリ(ラクタム)、
・ ポリラクチド-co-グリコリド共重合体、
・ 多-またはオリゴ糖、例えばシクロデキストリンおよびポリデキストロース、
・ ポリ-またはオリゴ(アミノ酸)、例えばタンパク質およびペプチド、および
・ 核酸およびそれらの類似体、例えばDNA、RNA、LNA(ロック核酸)、およびPNA(ペプチド核酸);
からなる群より選択されるポリマーまたはオリゴマー構造を含まないことを特徴とし、
好ましくは、サポニン誘導体が、ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、デンドロナイズドポリマー、またはデンドロナイズドオリゴマーといった、構造的に規則正しい形態であるポリマーまたはオリゴマー構造を含まないか、またはそれが、ヒドロゲル、ミクロゲル、ナノゲル、安定化された重合体ミセル、またはリポソームといった、集合したポリマー構造であることを特徴とし、より好ましくは、サポニン誘導体がポリマーまたはオリゴマー構造を含まないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD8と称された一実施形態は、サポニン誘導体が、一緒に結合された少なくとも2つの等しいかまたは同様の単位から、主としてまたは完全に構築された分子構造を含まないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD9と称された一実施形態は、サポニン誘導体が、SO1861とN-[(ジメチルアミノ)-1H-1,2,3-トリアゾロ-[4,5-b]ピリジン-1-イルメチレン]-N-メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファート N-オキシド(HATU)との反応生成物である、式(A3)の化合物ではないことを特徴とし:
好ましくは、該サポニン誘導体が活性化されたエステルではないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。図59参照。
本明細書においてD10と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、カルボキシル基がアミド結合またはエステル結合への変換により誘導体化されており、かつこれにおいて、サポニンには何ら他の誘導体化が存在しないことを特徴とし、好ましくは、サポニン誘導体がサポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、カルボキシル基がアミド結合またはエステル結合への変換により誘導体化されていることを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD11と称された一実施形態は、サポニン誘導体がジアンチン部分を含まないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD12と称された好ましい一実施形態は、サポニン誘導体が単一のサポニン部分を含むことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD13と称された、好ましい一実施形態は、前記サポニン誘導体が2500g/mol未満、好ましくは2300g/mol未満、より好ましくは2150g/mol未満の分子量を有することを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてD14と称された、1つの好ましい実施形態は、サポニン誘導体が400g/mol未満、好ましくは300g/mol未満、より好ましくは270g/mol未満の分子量を有することを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。サポニン誘導体の分子量は、アグリコンコアと1つ(モノデスモシド系サポニンについて)または2つ(ビスデスモシド系サポニンについて)のグリコン(糖)鎖を除いたサポニン誘導体の分子量に相当する。当業者は、サポニン誘導体がその対応する非誘導体化サポニン(例えば、脱アセチル化により誘導体化されたSO1861に相当する、SO1861-Ac-OHの場合のように)よりも低い分子量をもつ場合、サポニン誘導体化は分子量に何ら増加をもたらすことはなく、それ故、サポニン誘導体化が実施形態D14の、400g/mol未満、好ましくは300g/mol未満、より好ましくは270g/mol未満の分子量をもつことという要求に適合することを理解するであろう。
当業者には理解されるように、実施形態D1-D14は、互いの中で、並びに本出願において記載された別の実施形態と組合されてよい。例えば、本発明の実施形態においては、実施形態D1-D14の以下の組合せが提供される:
・ D12、およびD1-D11、D13の1つ以上;
・ D13、およびD1-D12の1つ以上;
・ D12、D13、およびD1-D11の1つ以上;
・ D1、D2、D10、およびD12;
・ D1、D3、D7、D9、および好ましくはD13;または
・ D3、D9、D12、およびD13.
・ D12、およびD1-D11、D13の1つ以上;
・ D13、およびD1-D12の1つ以上;
・ D12、D13、およびD1-D11の1つ以上;
・ D1、D2、D10、およびD12;
・ D1、D3、D7、D9、および好ましくはD13;または
・ D3、D9、D12、およびD13.
当業者には、実施形態D1-D14のこれらの組合せが、再度本発明の別の実施形態、例えば、および好ましくは、実施形態D14と組合され得ることが理解されよう。
特に好ましい実施形態は、実施形態D3、D9、D12、および、D13とD14の一方または双方の組合せに対応する。言い換えれば、特に好ましい実施形態は、前記サポニン誘導体が単一のサポニン誘導体を含み、これにおいて前記サポニン誘導体が2500g/mol未満、好ましくは2300g/mol未満、より好ましくは2150g/mol未満の分子量を有し、かつこれにおいて、前記サポニン誘導体が、
・ サポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、前記アグリコンコア構造がN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されたアルデヒド基を含有し、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノ-ルとのチオエーテル結合の形成により誘導体化され、かつこれにおいて、好ましくは前記サポニンには何ら他の誘導体化が存在せず;かつ
・ SO1861とN-[(ジメチルアミノ)-1H-1,2,3-トリアゾロ-[4,5-b]ピリジン-1-イルメチレン]N-メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファート N-オキシド(HATU)との反応生成物である活性化されたエステルではない、
本発明のサポニン誘導体である。
・ サポニン、特にSO1861ではなく、これにおいて、前記アグリコンコア構造がN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されたアルデヒド基を含有し、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノ-ルとのチオエーテル結合の形成により誘導体化され、かつこれにおいて、好ましくは前記サポニンには何ら他の誘導体化が存在せず;かつ
・ SO1861とN-[(ジメチルアミノ)-1H-1,2,3-トリアゾロ-[4,5-b]ピリジン-1-イルメチレン]N-メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファート N-オキシド(HATU)との反応生成物である活性化されたエステルではない、
本発明のサポニン誘導体である。
本発明の第2の態様は、本発明の前記サポニン誘導体と、任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤とを含む、第1の医薬組成物に関する。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体、好ましくは薬学的に許容される希釈剤を含み、かつさらに:
・ 薬学的に許容される塩、好ましくは薬学的に許容される無機塩、例えばアンモニウム、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、ストロンチウム、または亜鉛塩、好ましくはNaCl;および/または
・ 薬学的に許容される緩衝系、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、トロメタミン、グルコン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、および/またはケトグルタール酸塩含有緩衝系、
を含む、前記第1の医薬組成物である。
・ 薬学的に許容される塩、好ましくは薬学的に許容される無機塩、例えばアンモニウム、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、ストロンチウム、または亜鉛塩、好ましくはNaCl;および/または
・ 薬学的に許容される緩衝系、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、トロメタミン、グルコン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、および/またはケトグルタール酸塩含有緩衝系、
を含む、前記第1の医薬組成物である。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体と、薬学的に許容される希釈剤、好ましくは水とを含む本発明の第1の医薬組成物であって、これにおいて、前記組成物が25℃の温度において液体であり、かつ2-11の範囲内、好ましくは4-9の範囲内、より好ましくは6-8の範囲内のpHを有する。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体と、薬学的に許容される希釈剤、好ましくは水とを含む本発明の第1の医薬組成物であって、これにおいて、前記組成物が25℃の温度において液体であり、かつこれにおいて前記サポニン誘導体の濃度が10-12から1mol/lの範囲内、好ましくは10-9から0.1mol/lの範囲内、より好ましくは10-6から0.1mol/lの範囲内である。
典型的には、かかる第1の医薬組成物は、例えばADCまたはAOCと組合せた使用に適する。例えば、第1の医薬組成物は、ADCまたはAOCの投与を必要とする患者に対し、ADCまたはAOCが投与される前に、ADCまたはAOCと一緒に、或いはADCまたはAOCの投与の(直)後に、かかるADCまたはAOC療法を必要とする該患者に投与される。例えば、第1の医薬組成物はADCまたはAOCを含む医薬組成物と混合され、そして得られた混合物の適当な用量が、ADCまたはAOC療法を必要とする該患者に投与される。本発明によれば、第1の医薬組成物によって含まれたサポニン誘導体は、サポニン誘導体とADCまたはAOCとが腫瘍細胞のような標的細胞の内側に共存する場合、かかるADCまたはAOCによって含まれるエフェクター分子の効能および効力を増強する。サポニン誘導体の影響下では、サポニン誘導体の不在下で同じ細胞がサポニン同じ用量のADCまたはAOCと接触された場合に比較して、より高い程度までエフェクター分子が標的細胞のサイトゾル中に放出される。それ故、エフェクター分子が第1の医薬組成物のサポニン誘導体と一緒に標的細胞の内側に共存する場合、エフェクター分子を含むADCまたはAOCが送達される細胞の内側においてサポニン誘導体の不在下で同じ効能を達成するのに必要な用量に比較して、より低いADCまたはAOC用量において同様の効能が得られる。
一実施形態は、本発明の第1の医薬組成物であり、これにおいて、前記サポニン誘導体が分子2によって表される前記サポニン誘導体であるか:
または単一誘導体化を含むSO1861誘導体であり、ここで前記単一誘導体化は、SO1861の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基の、1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)と、SO1861の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基との反応による変換であり、或いは前記サポニン誘導体が分子3によって表されるサポニン誘導体である:
本発明の第3の態様は、
・ 本発明の前記第1の医薬組成物と;および
・ 抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤を含む、第2の医薬組成物と、
を含む医薬組合せ剤に関する。
・ 本発明の前記第1の医薬組成物と;および
・ 抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤を含む、第2の医薬組成物と、
を含む医薬組合せ剤に関する。
本発明の第4の態様は、本発明の前記サポニン誘導体を含み、かつさらに:抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-核酸コンジュゲート、または受容体-リガンド-核酸コンジュゲートの任意の1つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤を含む、第3の医薬組成物に関する。
一実施形態は、本発明の前記医薬組合せ剤または前記第3の医薬組成物であって、これにおいて、前記第2の医薬組成物または前記第3の医薬組成物が、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つ以上を含み、ここで、前記薬物は、例えばサポリンおよびジアンチンといった毒素であり、かつここで、前記オリゴヌクレオチドは、例えばsiRNA、BNA,例えばアポリポタンパク質BまたはHSP27の遺伝子サイレンシングである。
一実施形態は、本発明の前記医薬組合せ剤または前記第3の医薬組成物であって、これにおいて、前記サポニン誘導体は:SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21 A-api、QS-21 A-xyl、QS-21B、QS-21 B-api、QS-21 B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、キラヤサポニン、サポニナム・アルバム、QS-18、Quil-A、Gyp1、ギプソシド A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、の誘導体、それらの立体異性体およびそれらの組合せからなる群より選択されるサポニン誘導体であり、好ましくは、前記サポニン誘導体は、SO1861誘導体、GE1741誘導体、SA1641誘導体、QS-21誘導体、およびそれらの組合せからなる群より選択され、より好ましくは、前記サポニン誘導体は、SO1861誘導体またはQS-21誘導体であり、より好ましくは、前記サポニン誘導体はSO1861誘導体であり、なおより好ましいのは、分子2または分子3によって表される前記サポニン誘導体である。
一実施形態は、本発明の第3の医薬組成物であって、本発明のサポニン誘導体、好ましくは薬学的に許容される希釈剤を含み、かつさらに:
・ 薬学的に許容される塩、好ましくは薬学的に許容される無機塩、例えばアンモニウム、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、ストロンチウム、または亜鉛塩、好ましくはNaCl;および/または
・ 薬学的に許容される緩衝系、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、トロメタミン、グルコン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、および/またはケトグルタール酸塩含有緩衝系、
を含む、該医薬組成物である。
・ 薬学的に許容される塩、好ましくは薬学的に許容される無機塩、例えばアンモニウム、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、ストロンチウム、または亜鉛塩、好ましくはNaCl;および/または
・ 薬学的に許容される緩衝系、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、トロメタミン、グルコン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、および/またはケトグルタール酸塩含有緩衝系、
を含む、該医薬組成物である。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体と、薬学的に許容される希釈剤、好ましくは水とを含む本発明の第3の医薬組成物であり、これにおいて、該組成物は25℃の温度において液体であり、かつ2-11の範囲内、好ましくは4-9の範囲内、より好ましくは6-8の範囲内のpHを有する。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体と、薬学的に許容される希釈剤、好ましくは水とを含む本発明の第3の医薬組成物であって、これにおいて、前記組成物は25℃の温度において液体であり、かつこれにおいて、前記サポニン誘導体の濃度は10-12から1mol/lの範囲内、好ましくは10-9から0.1mol/lの範囲内、より好ましくは10-6から0.1mol/lの範囲内である。
本発明の第5の態様は、医薬としての使用のための、本発明の前記第1の医薬組成物、本発明の前記医薬組合せ剤、または本発明の前記第3の医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、医薬としての使用のための、前記サポニン誘導体がSO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール、SO1861-L-N3、またはSO1861-Glu-HATUを含み、好ましくはそれらからなる、前記第1の医薬組成物;前記サポニン誘導体がSO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール、SO1861-L-N3、またはSO1861-Glu-HATUを含み、好ましくはそれらからなる、本発明の前記医薬組合せ剤;または前記サポニン誘導体がSO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール、SO1861-L-N3、またはSO1861-Glu-HATUを含み、好ましくはそれらからなる、本発明の前記第3の医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様においては、医薬としての使用のための、本明細書に記載されたような前記サポニン誘導体、好ましくはSO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール、SO1861-L-N3、またはSO1861-Glu-HATUが提供される。
本発明の第6の態様は、癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病A、血友病B、アルファ-1アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、本発明の前記第1の医薬組成物、本発明の前記医薬組合せ剤、または本発明の前記第3の医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病A、血友病B、アルファ-1アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、前記サポニン誘導体がSO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール、SO1861-L-N3、またはSO1861-Glu-HATUを含み、好ましくはそれらからなる、前記第1の医薬組成物;前記サポニン誘導体がSO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール、SO1861-L-N3、またはSO1861-Glu-HATUを含み、好ましくはそれらからなる、本発明の前記医薬組合せ剤;または前記サポニン誘導体がSO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール、SO1861-L-N3、またはSO1861-Glu-HATUを含み、好ましくはそれらからなる、本発明の前記第3の医薬組成物が提供される。
本発明の第7の態様は、分子を細胞の外側から前記細胞の内側へ、好ましくは前記細胞のサイトゾル中へ移行させるための、インビトロまたはエクスビボの方法であって:
a) 細胞を提供する工程と;
b) 工程a)において提供された前記細胞の内側に、前記細胞の外側から移行させるための分子を提供する工程と;
c) 本発明のサポニン誘導体を提供する工程と;
d) 工程a)の前記細胞を、インビトロまたはエクスビボにおいて、工程b)の前記分子および工程c)の前記サポニン誘導体と接触させ、それにより前記分子の前記細胞の外側から前記細胞内への移行を確立させる工程とを含む、該方法に関する。
a) 細胞を提供する工程と;
b) 工程a)において提供された前記細胞の内側に、前記細胞の外側から移行させるための分子を提供する工程と;
c) 本発明のサポニン誘導体を提供する工程と;
d) 工程a)の前記細胞を、インビトロまたはエクスビボにおいて、工程b)の前記分子および工程c)の前記サポニン誘導体と接触させ、それにより前記分子の前記細胞の外側から前記細胞内への移行を確立させる工程とを含む、該方法に関する。
一実施形態は、本発明の方法であって、これにおいて前記細胞が、ヒト細胞、例えばT-細胞、NK-細胞、腫瘍細胞であり、および/またはこれにおいて、工程b)の前記分子が:抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つであり、ここで、前記薬物が、例えば毒素であり、かつこれにおいて、前記オリゴヌクレオチドが、例えばsiRNA、BNAであり、および/または前記サポニン誘導体が:SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21 A-api、QS-21 A-xyl、QS-21B、QS-21 B-api、QS-21 B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、キラヤサポニン、サポニナム・アルバム、QS-18、Quil-A、Gyp1、ギプソシド A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、の誘導体、それらの立体異性体およびそれらの組合せからなる群より選択され、好ましくは、前記サポニン誘導体が、SO1861誘導体、GE1741誘導体、SA1641誘導体、QS-21誘導体、およびそれらの組合せからなる群より選択され、より好ましくは、前記サポニン誘導体が、SO1861誘導体またはQS-21誘導体であり、最も好ましくは、サポニン誘導体はSO1861誘導体であり;或いはこれにおいて、前記サポニン誘導体が単一誘導体化を含むSO1861誘導体であり、ここで前記単一誘導体化は、SO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基の、アミンとの反応を介したアミドへの変換であり、例えば、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)を、SO1861のグルクロン酸のカルボキシル基へ結合することによるか、または(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(BOP)を、SO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基へ結合することによるものであり、或いはこれにおいて前記サポニン誘導体は;N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置C23においてアルデヒド基を含有する;分子2によって表されるSO1861誘導体であり:
或いはこれにおいて、前記サポニン誘導体は;N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置C23においてアルデヒド基を含有するSO1861誘導体であって、ここでEMCHのマレイミド基がメルカプトエタノールによって誘導体化され、それによりチオエーテル結合を生じる該誘導体を表す;分子3によって表されるSO1861誘導体であり:
;或いは、前記サポニン誘導体は、単一誘導体化を含むSO1861誘導体ではないという前提条件つきであり、ここで、前記単一誘導体化とは、1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)の、SO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基との反応による、SO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基の変換であり、或いはこれにおいて、前記サポニン誘導体は;N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、キラ酸アグリコンコア構造の示した位置C23においてアルデヒド基を含有する;分子2によって表されるSO1861誘導体であり:
;或いはここで、前記サポニン誘導体が、誘導体であって、これにおいて、
i.前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、
- アルコールへの還元;
- N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
- N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド(BMPH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでBMPHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;または
- N-[κ-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド(KMUH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでKMUHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し;
ii. 前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMPD)またはN-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し;かつ
iii. 前記第2の糖鎖が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されている、アセトキシ基(Me(CO)O-)を含み;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の2つまたは3つの任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含む、該誘導体であり;
好ましくは、前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造は、EMCHとの反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化され;或いはここで、該サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、アルデヒド基を含有し、かつここで、前記第1の糖鎖がカルボキシル基、好ましくは、N-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換によって誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し;或いはここで、前記サポニン誘導体は、アグリコンコア構造中のアルデヒド基がN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラジド結合への変換によって誘導体化され、かつ前記サポニンがSO1861である場合には、グルクロン酸およびアセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きの、および前記サポニンがSO1861でありかつSO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基が1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)とSO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基との反応によって誘導体化される場合には、アルデヒド基およびアセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きの、誘導体であり;或いはここで、前記サポニンが、サポニン誘導体のアグリコンコア構造中のアルデヒド基がEMCHとの反応を介して誘導体化されかつ前記サポニンがSO1861である場合には、グルクロン酸およびアセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがSO1861でありかつSO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基が、結合したHATUにより誘導体化される場合には、アルデヒド基およびアセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きの誘導体である、該方法である。
i.前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、
- アルコールへの還元;
- N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
- N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド(BMPH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでBMPHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;または
- N-[κ-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド(KMUH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでKMUHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し;
ii. 前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMPD)またはN-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し;かつ
iii. 前記第2の糖鎖が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されている、アセトキシ基(Me(CO)O-)を含み;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の2つまたは3つの任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含む、該誘導体であり;
好ましくは、前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造は、EMCHとの反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化され;或いはここで、該サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、アルデヒド基を含有し、かつここで、前記第1の糖鎖がカルボキシル基、好ましくは、N-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換によって誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し;或いはここで、前記サポニン誘導体は、アグリコンコア構造中のアルデヒド基がN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラジド結合への変換によって誘導体化され、かつ前記サポニンがSO1861である場合には、グルクロン酸およびアセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きの、および前記サポニンがSO1861でありかつSO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基が1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)とSO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基との反応によって誘導体化される場合には、アルデヒド基およびアセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きの、誘導体であり;或いはここで、前記サポニンが、サポニン誘導体のアグリコンコア構造中のアルデヒド基がEMCHとの反応を介して誘導体化されかつ前記サポニンがSO1861である場合には、グルクロン酸およびアセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがSO1861でありかつSO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基が、結合したHATUにより誘導体化される場合には、アルデヒド基およびアセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きの誘導体である、該方法である。
特定の実施形態においては、分子を細胞の外側から前記細胞の内側へ、好ましくは、本明細書に記載の前記細胞のサイトゾル中へ、移行させるためのインビトロまたはエクスビボの方法が提供され、これにおいて、前記サポニン誘導体は、SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール、SO1861-L-N3、またはSO1861-Glu-HATUを含み、好ましくはそれらからなる。
本発明は、いくつかの実施形態に関して記載されてきたが、当業者には、明細書を読むにあたり、かつ図面を調べるにあたり、それらの代替え物、変更形態、置換物、および同等物が明らかとなることが意図される。本発明は例示される実施形態にいかなる方法においても制限されない。変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される範囲から離れることなく行われ得る。
本発明は、いくつかの例示的な実施形態を参照して記載されてきた。変更形態は可能であり、かつ添付の特許請求の範囲において定義された保護の範囲内に含まれる。本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、それらはいかなる方法においても本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。
実施例および例示的な実施形態
材料:
SO1861、SO1832、SO1862(異性体)、およびSO1904は、サポナリア・オフィキナリス(Saponaria officinalis L)から得られた未加工の植物抽出物から、Analyticon Discovery GmbHにより単離および精製された。QS21(純粋)、QS18(分画)、QS17(分画)、QS7(分画)、QS21(分画)は、Desert King International、Sandiegoから購入し、トラスツズマブ(Tras、Herceptin(登録商標)、Roche)、セツキシマブ(Cet、Erbitux(登録商標)、Merck KGaA)は、薬局から購入した。EGFジアンチンは、大腸菌(E.coli)より、標準的な手法によって製造された。セツキシマブ-サポニンコンジュゲートは、Advanced Targeting System(San Diego、CA)より製造および購入された。トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP、98%、Sigma-Aldrich)、5,5-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB、エルマン試薬、99%、Sigma-Aldrich)、Zeba(商標)スピン脱塩カラム(2mL、Thermo-Fisher)、NuPAGE(商標)4-12% ビス-トリス プロテインゲル(Bis-Tris Protein Gels)(Thermo-Fisher)、NuPAGE(商標)MES SDS ランニングバッファー(Running Buffer)(Thermo-Fisher)、Novex(商標)シャーププレステインドプロテインスタンダード(Sharp Pre-stained Protein Standard)(Thermo-Fisher)、PageBlue(商標)タンパク質染色液(Protein Staining Solution)(Thermo-Fisher)、Pierce(商標)BCA タンパク質アッセイキット(Protein Assay Kit)(Thermo-Fisher)、N-エチルマレイミド(NEM、98%、Sigma-Aldrich)、1,4-ジチオスレイトール(DTT、98%、Sigma-Aldrich)、セファデックス(Sephadex)G25(GE Healthcare)、セファデックスG50M(GE Healthcare)、スーパーデックス(Superdex)200P(GE Healthcare)、イソプロピルアルコール(IPA、99.6%、VWR)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris、99%、Sigma-Aldrich)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris.HCl、Sigma-Aldrich)、L-ヒスチジン(99%、Sigma-Aldrich)、D-(+)-トレハロース二水和物(99%、Sigma-Aldrich)、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート(TWEEN20、Sigma-Aldrich)、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、Thermo-Fisher)、グアニジン塩酸塩(99%、Sigma-Aldrich)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA-Na2、99%、Sigma-Aldrich)、濾過滅菌フィルター0.2μmおよび0.45μm(Sartorius)、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC、Thermo-Fisher)、ビバスピン(Vivaspin)T4およびT15濃縮器(Sartorius)、スーパーデックス(Superdex)200PG(GE Healthcare)、テトラ(エチレングリコール)スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(PEG4-SPDP、Thermo-Fisher)、[O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N,N-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロホスファート](HATU、97%、Sigma-Aldrich)、ジメチルスルフォキシド(DMSO、99%、Sigma-Aldrich)、N-(2-アミノエチル)マレイミドトリフルオロ酢酸塩(AEM、98%、Sigma-Aldrich)、L-システイン(98.5%、Sigma-Aldrich)、脱イオン水(DI)はUltrapure Lab Water Systems(MilliQ、Merck)から新たに採取した、ニッケル-ニトリロ三酢酸アガロース(Ni-NTAアガロース、Protino)、グリシン(99.5%、VWR)、5,5-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸(エルマン試薬、DTNB、98%、Sigma-Aldrich)、S-アセチルメルカプトコハク酸無水物フルオレセイン(SAMSA試薬、Invitrogen) 重炭酸ナトリウム(99.7%、Sigma-Aldrich)、炭酸ナトリウム(99.9%、Sigma-Aldrich)、セファデックスG-25樹脂を用いたPD MiniTrap脱塩カラム(GE Healthcare)、PD10 G25脱塩カラム(GE Healthcare)、0.5、2、5、および10mLのZeba Spin脱塩カラム(Thermo-Fisher)、Vivaspin遠心式フィルターT4 10kDa MWCO、T4 100kDa MWCO、およびT15(Sartorius)、Biosep s3000 aSECカラム(Phenomenex)、Vivacell限外濾過ユニット10および30kDa MWCO(Sartorius)、Nalgene Rapid-Flowフィルター(Thermo-Fisher)。
材料:
SO1861、SO1832、SO1862(異性体)、およびSO1904は、サポナリア・オフィキナリス(Saponaria officinalis L)から得られた未加工の植物抽出物から、Analyticon Discovery GmbHにより単離および精製された。QS21(純粋)、QS18(分画)、QS17(分画)、QS7(分画)、QS21(分画)は、Desert King International、Sandiegoから購入し、トラスツズマブ(Tras、Herceptin(登録商標)、Roche)、セツキシマブ(Cet、Erbitux(登録商標)、Merck KGaA)は、薬局から購入した。EGFジアンチンは、大腸菌(E.coli)より、標準的な手法によって製造された。セツキシマブ-サポニンコンジュゲートは、Advanced Targeting System(San Diego、CA)より製造および購入された。トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP、98%、Sigma-Aldrich)、5,5-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB、エルマン試薬、99%、Sigma-Aldrich)、Zeba(商標)スピン脱塩カラム(2mL、Thermo-Fisher)、NuPAGE(商標)4-12% ビス-トリス プロテインゲル(Bis-Tris Protein Gels)(Thermo-Fisher)、NuPAGE(商標)MES SDS ランニングバッファー(Running Buffer)(Thermo-Fisher)、Novex(商標)シャーププレステインドプロテインスタンダード(Sharp Pre-stained Protein Standard)(Thermo-Fisher)、PageBlue(商標)タンパク質染色液(Protein Staining Solution)(Thermo-Fisher)、Pierce(商標)BCA タンパク質アッセイキット(Protein Assay Kit)(Thermo-Fisher)、N-エチルマレイミド(NEM、98%、Sigma-Aldrich)、1,4-ジチオスレイトール(DTT、98%、Sigma-Aldrich)、セファデックス(Sephadex)G25(GE Healthcare)、セファデックスG50M(GE Healthcare)、スーパーデックス(Superdex)200P(GE Healthcare)、イソプロピルアルコール(IPA、99.6%、VWR)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris、99%、Sigma-Aldrich)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris.HCl、Sigma-Aldrich)、L-ヒスチジン(99%、Sigma-Aldrich)、D-(+)-トレハロース二水和物(99%、Sigma-Aldrich)、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート(TWEEN20、Sigma-Aldrich)、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、Thermo-Fisher)、グアニジン塩酸塩(99%、Sigma-Aldrich)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA-Na2、99%、Sigma-Aldrich)、濾過滅菌フィルター0.2μmおよび0.45μm(Sartorius)、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC、Thermo-Fisher)、ビバスピン(Vivaspin)T4およびT15濃縮器(Sartorius)、スーパーデックス(Superdex)200PG(GE Healthcare)、テトラ(エチレングリコール)スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(PEG4-SPDP、Thermo-Fisher)、[O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N,N-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロホスファート](HATU、97%、Sigma-Aldrich)、ジメチルスルフォキシド(DMSO、99%、Sigma-Aldrich)、N-(2-アミノエチル)マレイミドトリフルオロ酢酸塩(AEM、98%、Sigma-Aldrich)、L-システイン(98.5%、Sigma-Aldrich)、脱イオン水(DI)はUltrapure Lab Water Systems(MilliQ、Merck)から新たに採取した、ニッケル-ニトリロ三酢酸アガロース(Ni-NTAアガロース、Protino)、グリシン(99.5%、VWR)、5,5-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸(エルマン試薬、DTNB、98%、Sigma-Aldrich)、S-アセチルメルカプトコハク酸無水物フルオレセイン(SAMSA試薬、Invitrogen) 重炭酸ナトリウム(99.7%、Sigma-Aldrich)、炭酸ナトリウム(99.9%、Sigma-Aldrich)、セファデックスG-25樹脂を用いたPD MiniTrap脱塩カラム(GE Healthcare)、PD10 G25脱塩カラム(GE Healthcare)、0.5、2、5、および10mLのZeba Spin脱塩カラム(Thermo-Fisher)、Vivaspin遠心式フィルターT4 10kDa MWCO、T4 100kDa MWCO、およびT15(Sartorius)、Biosep s3000 aSECカラム(Phenomenex)、Vivacell限外濾過ユニット10および30kDa MWCO(Sartorius)、Nalgene Rapid-Flowフィルター(Thermo-Fisher)。
略号
AEM:N-(2-アミノエチル)マレイミドトリフルオロ酢酸塩
AMPD:2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール
BOP:(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
DIPEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMF:N,N-ジメチルホルムアミド
EMCH.TFA:N-(ε-マレイミドカプロン酸)ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩
HATU:1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート
Min:分
NMM:4-メチルモルホリン
r、t:保持時間
TCEP:トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩
Temp:温度
TFA:トリフルオロ酢酸
AEM:N-(2-アミノエチル)マレイミドトリフルオロ酢酸塩
AMPD:2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール
BOP:(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
DIPEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMF:N,N-ジメチルホルムアミド
EMCH.TFA:N-(ε-マレイミドカプロン酸)ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩
HATU:1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート
Min:分
NMM:4-メチルモルホリン
r、t:保持時間
TCEP:トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩
Temp:温度
TFA:トリフルオロ酢酸
分析法
LC-MS方法1
装置:Waters IClass;Bin.Pump:UPIBSM、SM:SOを備えたUPISMFTN;UPCMA,PDA:UPPDATC、210-320nm、SQD:ACQ-SQD2 ESI、生成物の分子量に応じた質量範囲 negまたはneg/pos 1500-2400または2000-3000の範囲内;ELSD:ガス圧40psi、ドリフトチューブ温度:50℃;カラム:Acquity C18,50x2.1mm、1.7μm 温度:60℃、流量:0.6mL/min、
生成物の極性に応じた勾配:
At0=2%A、t5.0min=50%A、t6.0min=98%A
Bt0=2%A、t5.0min=98%A、t6.0min=98%A
ポストタイム:1.0min;溶離液A;アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム(pH=9.5)。
LC-MS方法1
装置:Waters IClass;Bin.Pump:UPIBSM、SM:SOを備えたUPISMFTN;UPCMA,PDA:UPPDATC、210-320nm、SQD:ACQ-SQD2 ESI、生成物の分子量に応じた質量範囲 negまたはneg/pos 1500-2400または2000-3000の範囲内;ELSD:ガス圧40psi、ドリフトチューブ温度:50℃;カラム:Acquity C18,50x2.1mm、1.7μm 温度:60℃、流量:0.6mL/min、
生成物の極性に応じた勾配:
At0=2%A、t5.0min=50%A、t6.0min=98%A
Bt0=2%A、t5.0min=98%A、t6.0min=98%A
ポストタイム:1.0min;溶離液A;アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム(pH=9.5)。
LC-MS方法2,2
装置:Waters IClass;Bin.Pump:UPIBSM、SM:SOを備えたUPISMFTN;UPCMA,PDA:UPPDATC、210-320nm、SQD:ACQ-SQD2 ESI、生成物の分子量に応じた質量範囲;pos/neg 100-800またはneg 2000-3000;ELSD:ガス圧40psi、ドリフトチューブ温度:50℃;カラム:Waters XSelect(商標)CSH C18、50x2.1mm、2.5μm 温度:25℃、流量:0.5mL/min、勾配:t0min=5%A、t2.0min=98%A、t2.7min=98%A、ポストタイム:0.3min;溶離液A;アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム(pH=9.5)。
装置:Waters IClass;Bin.Pump:UPIBSM、SM:SOを備えたUPISMFTN;UPCMA,PDA:UPPDATC、210-320nm、SQD:ACQ-SQD2 ESI、生成物の分子量に応じた質量範囲;pos/neg 100-800またはneg 2000-3000;ELSD:ガス圧40psi、ドリフトチューブ温度:50℃;カラム:Waters XSelect(商標)CSH C18、50x2.1mm、2.5μm 温度:25℃、流量:0.5mL/min、勾配:t0min=5%A、t2.0min=98%A、t2.7min=98%A、ポストタイム:0.3min;溶離液A;アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム(pH=9.5)。
LC-MS方法3
装置:Waters IClass;Bin.Pump:UPIBSM、SM:SOを備えたUPISMFTN;UPCMA,PDA:UPPDATC、210-320nm、SQD:ACQ-SQD2 ESI、生成物の分子量に応じた質量範囲 pos/neg 105-800、500-1200または1500-2500;ELSD:ガス圧40psi、ドリフトチューブ温度:50℃;カラム:Waters XSelect(商標)CSH C18、50x2.1mm、2.5μm 温度:40℃、流量:0.5mL/min、勾配:t0min=5%A、t2.0min=98%A、t2.7min=98%A、ポストタイム:0.3min;溶離液A;アセトニトリル中の0.1%ギ酸;溶離液B;水中の0.1%ギ酸。
装置:Waters IClass;Bin.Pump:UPIBSM、SM:SOを備えたUPISMFTN;UPCMA,PDA:UPPDATC、210-320nm、SQD:ACQ-SQD2 ESI、生成物の分子量に応じた質量範囲 pos/neg 105-800、500-1200または1500-2500;ELSD:ガス圧40psi、ドリフトチューブ温度:50℃;カラム:Waters XSelect(商標)CSH C18、50x2.1mm、2.5μm 温度:40℃、流量:0.5mL/min、勾配:t0min=5%A、t2.0min=98%A、t2.7min=98%A、ポストタイム:0.3min;溶離液A;アセトニトリル中の0.1%ギ酸;溶離液B;水中の0.1%ギ酸。
LC-MS方法4
装置:Waters IClass;Bin.Pump:UPIBSM、SM:SOを備えたUPISMFTN;UPCMA,PDA:UPPDATC、210-320nm、SQD:ACQ-SQD2 ESI、生成物の分子量に応じた質量範囲;pos/neg 100-800またはneg 2000-3000;ELSD:ガス圧40psi、ドリフトチューブ温度:50℃;カラム:Waters Acquity Shield RP18、50x2.1mm、1.7μm 温度:25℃、流量:0.5mL/min、勾配:t0min=5%A、t2.0min=98%A、t2.7min=98%A、ポストタイム:0.3min;溶離液A;アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム(pH=9.5)。
装置:Waters IClass;Bin.Pump:UPIBSM、SM:SOを備えたUPISMFTN;UPCMA,PDA:UPPDATC、210-320nm、SQD:ACQ-SQD2 ESI、生成物の分子量に応じた質量範囲;pos/neg 100-800またはneg 2000-3000;ELSD:ガス圧40psi、ドリフトチューブ温度:50℃;カラム:Waters Acquity Shield RP18、50x2.1mm、1.7μm 温度:25℃、流量:0.5mL/min、勾配:t0min=5%A、t2.0min=98%A、t2.7min=98%A、ポストタイム:0.3min;溶離液A;アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム(pH=9.5)。
分取法
分取MP-LC方法1
装置型:Reveleris(商標)prep MPLC;カラム:Waters XSelect(商標)CSH C18(145x25mm、10μm);流量:40mL/min;カラム温度:室温;溶離液A;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム(pH=9.0);溶離液B;99%アセトニトリル+水中の1%の10mM 炭酸水素アンモニウム;勾配:
At0min=5%B、t1min=5%B、t2min=10%B、t17min=50%B、t18min=100%B、t23min=100%B
Bt0min=5%B、t1min=5%B、t2min=20%B、t17min=60%B、t18min=100%B、t23min=100%B;
検出UV:210、235、254nmおよびELSD。
分取MP-LC方法1
装置型:Reveleris(商標)prep MPLC;カラム:Waters XSelect(商標)CSH C18(145x25mm、10μm);流量:40mL/min;カラム温度:室温;溶離液A;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム(pH=9.0);溶離液B;99%アセトニトリル+水中の1%の10mM 炭酸水素アンモニウム;勾配:
At0min=5%B、t1min=5%B、t2min=10%B、t17min=50%B、t18min=100%B、t23min=100%B
Bt0min=5%B、t1min=5%B、t2min=20%B、t17min=60%B、t18min=100%B、t23min=100%B;
検出UV:210、235、254nmおよびELSD。
分取MP-LC方法2
装置型:Reveleris(商標)prep MPLC;カラム:Phenomenex LUNA C18(3)(150x25mm、10μm);流量:40mL/min;カラム温度:室温;溶離液A;水中の0.1%(v/v)ギ酸;溶離液B;アセトニトリル中の0.1%(v/v)ギ酸;勾配:
At0min=5%B、t1min=5%B、t2min=20%B、t17min=60%B、t18min=100%B、t23min=100%B
Bt0min=2%B、t1min=2%B、t2min=2%B、t17min=30%B、t18min=100%B、t23min=100%B
Ct0min=5%B、t1min=5%B、t2min=10%B、t17min=50%B、t18min=100%B、t23min=100%B
Dt0min=5%B、t1min=5%B、t2min=5%B、t17min=40%B、t18min=100%B、t23min=100%B
;検出UV:210、235、254nmおよびELSD。
装置型:Reveleris(商標)prep MPLC;カラム:Phenomenex LUNA C18(3)(150x25mm、10μm);流量:40mL/min;カラム温度:室温;溶離液A;水中の0.1%(v/v)ギ酸;溶離液B;アセトニトリル中の0.1%(v/v)ギ酸;勾配:
At0min=5%B、t1min=5%B、t2min=20%B、t17min=60%B、t18min=100%B、t23min=100%B
Bt0min=2%B、t1min=2%B、t2min=2%B、t17min=30%B、t18min=100%B、t23min=100%B
Ct0min=5%B、t1min=5%B、t2min=10%B、t17min=50%B、t18min=100%B、t23min=100%B
Dt0min=5%B、t1min=5%B、t2min=5%B、t17min=40%B、t18min=100%B、t23min=100%B
;検出UV:210、235、254nmおよびELSD。
分取LC-MS方法3
MS装置型:Agilent Technologies G6130B Quadrupole;HPLC装置型:Agilent Technologies 1290分取LC;カラム:Waters XSelect(商標)CSH(C18、150x19mm、10μm);流量:25ml/min;カラム温度:室温;溶離液A;100%アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム pH=9.0;勾配:
At0=20%A、t2.5min=20%A、t11min=60%A、t13min=100%A、t17min=100%A、
Bt0=5%A、t2.5min=5%A、t11min=40%A、t13min=100%A、t17min=100%A
;検出:DAD(210nm);検出:MSD(ESI pos/neg)質量範囲:100-800;DADに基づく分画収集。
MS装置型:Agilent Technologies G6130B Quadrupole;HPLC装置型:Agilent Technologies 1290分取LC;カラム:Waters XSelect(商標)CSH(C18、150x19mm、10μm);流量:25ml/min;カラム温度:室温;溶離液A;100%アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム pH=9.0;勾配:
At0=20%A、t2.5min=20%A、t11min=60%A、t13min=100%A、t17min=100%A、
Bt0=5%A、t2.5min=5%A、t11min=40%A、t13min=100%A、t17min=100%A
;検出:DAD(210nm);検出:MSD(ESI pos/neg)質量範囲:100-800;DADに基づく分画収集。
分取LC-MS方法4
MS装置型:Agilent Technologies G6130B Quadrupole;HPLC装置型:Agilent Technologies 1290分取LC;カラム:Waters XBridge Protein(C4、150x19mm、10μm);流量:25ml/min;カラム温度:室温;溶離液A;100%アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム pH=9.0;勾配:
At0=2%A、t2.5min=2%A、t11min=30%A、t13min=100%A、t17min=100%A
Bt0=10%A、t2.5min=10%A、t11min=50%A、t13min=100%A、t17min=100%A
Ct0=5%A、t2.5min=5%A、t11min=40%A、t13min=100%A、t17min=100%A
;検出:DAD(210nm);検出:MSD(ESI pos/neg)質量範囲:100-800;DADに基づく分画収集
MS装置型:Agilent Technologies G6130B Quadrupole;HPLC装置型:Agilent Technologies 1290分取LC;カラム:Waters XBridge Protein(C4、150x19mm、10μm);流量:25ml/min;カラム温度:室温;溶離液A;100%アセトニトリル;溶離液B;水中の10mM 炭酸水素アンモニウム pH=9.0;勾配:
At0=2%A、t2.5min=2%A、t11min=30%A、t13min=100%A、t17min=100%A
Bt0=10%A、t2.5min=10%A、t11min=50%A、t13min=100%A、t17min=100%A
Ct0=5%A、t2.5min=5%A、t11min=40%A、t13min=100%A、t17min=100%A
;検出:DAD(210nm);検出:MSD(ESI pos/neg)質量範囲:100-800;DADに基づく分画収集
フラッシュクロマトグラフィー
Grace Reveleris X2(登録商標)C-815Flash;溶媒送達システム:オートプライミングを備えた3-ピストンポンプ、単回のランで4つまでの溶媒を用いた4つの独立したチャンネル、溶媒枯渇時のオートスイッチライン;最大ポンプ流量率250mL/min;最大圧 50bar(725psi);検出:UV200-400nm、4つまでのUVシグナルと全UV範囲のスキャンの組合せ、ELSD;カラムサイズ:装置上で4-330g、ルアー型、750gから3000gまで、オプションのホルダー付き。
Grace Reveleris X2(登録商標)C-815Flash;溶媒送達システム:オートプライミングを備えた3-ピストンポンプ、単回のランで4つまでの溶媒を用いた4つの独立したチャンネル、溶媒枯渇時のオートスイッチライン;最大ポンプ流量率250mL/min;最大圧 50bar(725psi);検出:UV200-400nm、4つまでのUVシグナルと全UV範囲のスキャンの組合せ、ELSD;カラムサイズ:装置上で4-330g、ルアー型、750gから3000gまで、オプションのホルダー付き。
実施例1:サポニン誘導体の合成
以下の修飾されたSO1861サポニン、すなわちサポニン誘導体は、表A2に要約されるように、天然産SO1861をベースとして合成された:
以下の修飾されたSO1861サポニン、すなわちサポニン誘導体は、表A2に要約されるように、天然産SO1861をベースとして合成された:
以下のSO1861誘導体の合成の記載については、表A2および図面が参照される。
SO1861-Ald-EMCH(分子2)の合成;図60、図61A参照
サポナリア・オフィキナリス由来のSO1861(59mg、31.7μmol)およびEMCH(301mg、888μmol)を、スターラーを備えた丸型フラスコに入れ、13mLのメタノール中に溶解した。TFA(400μL、cat.)を溶液に添加し、反応混合物をRCT Bマグネチックスタラー(IKA Labortechnik)上で、室温にて800rpmで3時間攪拌した。3時間の攪拌後、混合物をMilliQ水またはPBSのいずれかで希釈し、MWCO 1kDaの再生セルロース膜チューブ(Spectra/Por7)を用いて、MilliQ水またはPBSのいずれかに対し、24時間にわたり充分に透析した。透析後、溶液を凍結乾燥して白色粉末を得た。収率62.4mg(95%)。乾燥したアリコートをさらに、1H NMRおよびMALDI-TOF-MSによるキャラクタリゼーションに使用した。
サポナリア・オフィキナリス由来のSO1861(59mg、31.7μmol)およびEMCH(301mg、888μmol)を、スターラーを備えた丸型フラスコに入れ、13mLのメタノール中に溶解した。TFA(400μL、cat.)を溶液に添加し、反応混合物をRCT Bマグネチックスタラー(IKA Labortechnik)上で、室温にて800rpmで3時間攪拌した。3時間の攪拌後、混合物をMilliQ水またはPBSのいずれかで希釈し、MWCO 1kDaの再生セルロース膜チューブ(Spectra/Por7)を用いて、MilliQ水またはPBSのいずれかに対し、24時間にわたり充分に透析した。透析後、溶液を凍結乾燥して白色粉末を得た。収率62.4mg(95%)。乾燥したアリコートをさらに、1H NMRおよびMALDI-TOF-MSによるキャラクタリゼーションに使用した。
1H NMR(400MHz,メタノール-D4)(SO1861):δ=0.50-5.50(m,サポニン トリテルペノイドおよび糖バックボーンプロトン),9.43(1H,s,サポニンのアルデヒドプロトン,Ha)。
1H NMR(400MHz,メタノール-D4)(SO1861-Ald-EMCH,PBSワークアップ):δ=0.50-5.50(m,サポニン トリテルペノイドおよび糖バックボーンプロトン),6.79(2 H,s,マレイミド プロトン,Hc),7.62-7.68(1H,m,ヒドラゾン プロトン,Hb)。
MALDI-TOF-MS(RPモード):m/z 2124 Da([M+K]+,サポニン-EMCH),m/z 2109 Da([M+K]+,SO1861-ALD-EMCH),m/z 2094 Da([M+Na]+,SO1861-ALD-EMCH)。図61A参照。
MALDI-TOF-MS(RN mode):m/z 2275 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2244 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2222 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2178 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2144 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2122 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2092 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2070 Da([M-H]-,SO1861-ALD-EMCH),2038 Da([M-H]-,SO1832-EMCH),1936 Da([M-H]-,SO1730-EMCH),1861 Da([M-H]-,SO1861)。SO1861-ALD-EMCHは分子2(化学式:C93H143N3O48,精密質量:2069.88)によって表される:
1H NMR(400MHz,メタノール-D4)(SO1861-Ald-EMCH,PBSワークアップ):δ=0.50-5.50(m,サポニン トリテルペノイドおよび糖バックボーンプロトン),6.79(2 H,s,マレイミド プロトン,Hc),7.62-7.68(1H,m,ヒドラゾン プロトン,Hb)。
MALDI-TOF-MS(RPモード):m/z 2124 Da([M+K]+,サポニン-EMCH),m/z 2109 Da([M+K]+,SO1861-ALD-EMCH),m/z 2094 Da([M+Na]+,SO1861-ALD-EMCH)。図61A参照。
MALDI-TOF-MS(RN mode):m/z 2275 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2244 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2222 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2178 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2144 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2122 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2092 Da([M-H]-,サポニンEMCHコンジュゲート),2070 Da([M-H]-,SO1861-ALD-EMCH),2038 Da([M-H]-,SO1832-EMCH),1936 Da([M-H]-,SO1730-EMCH),1861 Da([M-H]-,SO1861)。SO1861-ALD-EMCHは分子2(化学式:C93H143N3O48,精密質量:2069.88)によって表される:
ヒドラゾン結合のpH依存性加水分解を検査するため、SO1861-Ald-EMCHをHCl溶液中にpH3において溶解し、MALDI-TOF-MSスペクトルを2つの異なる時点において記録した(図62)。図62Aおよび62Bに示したように、SO1861-Ald-EMCHの相当するm/z2070のピークの明らかな減少傾向が、図61Bにおいて見られる。SO1861は加水分解中に生成されることから、m/z2070Daの減少傾向を伴ったm/z1861Daにおけるピークの上昇が記録された。これらの結果は、ヒドラゾン結合が加水分解に対し感受性であり、それがSO1861に結合されている場合でも切断されることを示している。
SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール(分子3;ブロックSO1861-Ald-EMCH)の合成;図60、図61B参照
SO1861-Ald-EMCHのマレイミド基は、6.5-7.5のpH範囲において実施された場合、チオールと、迅速かつ特異的なマイケル付加を行う。
SO1861-Ald-EMCH(0.1mg、48nmol)に対し、200μLのメルカプトエタノール(18mg、230μmol)を添加し、溶液をThermoMixer C(Eppendorf)上で、室温にて800rpmで1時間振とうした。1時間の振とう後、溶液をメタノールで希釈し、MWCO 1kDaの再生セルロース膜チューブ(Spactra/Por7)を用いて、メタノールに対し、4時間にわたり充分に透析した。透析後、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノールが与えられ(分子3)、アリコートを採取して、MALDI-TOF-MSによって分析した。
SO1861-Ald-EMCHのマレイミド基は、6.5-7.5のpH範囲において実施された場合、チオールと、迅速かつ特異的なマイケル付加を行う。
SO1861-Ald-EMCH(0.1mg、48nmol)に対し、200μLのメルカプトエタノール(18mg、230μmol)を添加し、溶液をThermoMixer C(Eppendorf)上で、室温にて800rpmで1時間振とうした。1時間の振とう後、溶液をメタノールで希釈し、MWCO 1kDaの再生セルロース膜チューブ(Spactra/Por7)を用いて、メタノールに対し、4時間にわたり充分に透析した。透析後、SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノールが与えられ(分子3)、アリコートを採取して、MALDI-TOF-MSによって分析した。
MALDI-TOF-MS(RPモード):m/z 2193 Da([M+K]+,SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール),m/z 2185 Da([M+K]+,SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール),m/z 2170 Da([M+Na]+,SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール)。図61B参照。SO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノールは分子3(化学式:C95H149N3O49S、精密質量:2147.90)によって表される:
SO1861-Glu-AMPD(分子3A)の合成;図1参照
SO1861(28.8mg、0.015mmol)、AMPD(8.11mg、0.077mmol)、およびHATU(17.6mg、0.046mmol)を、DMF(1.00mL)およびNMM(8.48μL、0.077mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に、生成物を分取LC-MS3を用いることにより再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(20.2mg、67%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=93%(化学式:C87H139NO47、精密質量:1949,85)
LRMS(m/z):1949[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.451B
SO1861(28.8mg、0.015mmol)、AMPD(8.11mg、0.077mmol)、およびHATU(17.6mg、0.046mmol)を、DMF(1.00mL)およびNMM(8.48μL、0.077mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に、生成物を分取LC-MS3を用いることにより再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(20.2mg、67%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=93%(化学式:C87H139NO47、精密質量:1949,85)
LRMS(m/z):1949[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.451B
SO1861-Ald-OH(分子6)の合成;図2参照
SO1861(20.0mg、10.7μmol)を、メタノール(1.00mL)中に溶解した。次に、水素化ホウ素ナトリウム(4.06mg、0.107mmol;NaBH4)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。30分後、反応混合物を水(0.50mL)で希釈し、分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(15.9mg、79%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度97%(化学式:C83H132O46、精密質量:1864,80)
LRMS(m/z):1865[M-1]1-(図15および16参照)
LC-MS r.t.(min):1.951B
SO1861(20.0mg、10.7μmol)を、メタノール(1.00mL)中に溶解した。次に、水素化ホウ素ナトリウム(4.06mg、0.107mmol;NaBH4)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。30分後、反応混合物を水(0.50mL)で希釈し、分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(15.9mg、79%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度97%(化学式:C83H132O46、精密質量:1864,80)
LRMS(m/z):1865[M-1]1-(図15および16参照)
LC-MS r.t.(min):1.951B
SO1861-Ac-OH(分子8)の合成;図3参照
SO1861(9.30mg、4.99μmol)に対し、水(0.25mL)中の水酸化ナトリウム(2.00mg、0.050mmol)の溶液およびメタノール(0.25mL)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(8.86mg、97%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=97%(化学式:C81H128O45、精密質量:1820,77)
LRMS(m/z):1820[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.831B
SO1861(9.30mg、4.99μmol)に対し、水(0.25mL)中の水酸化ナトリウム(2.00mg、0.050mmol)の溶液およびメタノール(0.25mL)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(8.86mg、97%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=97%(化学式:C81H128O45、精密質量:1820,77)
LRMS(m/z):1820[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.831B
SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(分子9)の合成;図4参照
SO1861-Ald-OH(9.37mg、5.02μmol、AMPD(2.64mg、0.025mmol)、およびBOP(6.66mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.52μL、0.050mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(6.32mg、64%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=95%(化学式:C87H141NO47、精密質量:1951,87)
LRMS(m/z):1952[M-1]1-(図17参照)
LC-MS r.t.(min):2.451B
SO1861-Ald-OH(9.37mg、5.02μmol、AMPD(2.64mg、0.025mmol)、およびBOP(6.66mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.52μL、0.050mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(6.32mg、64%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=95%(化学式:C87H141NO47、精密質量:1951,87)
LRMS(m/z):1952[M-1]1-(図17参照)
LC-MS r.t.(min):2.451B
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(分子10)の合成;図5参照
SO1861-Ald-OH(26.8mg、0.014mm)に対し、水(0.50mL)中の水酸化ナトリウム(5.74mg、0.144mmol)の溶液およびメタノール(0.50mL)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(24.2mg、92%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=98%(化学式:C81H130O45、精密質量:1822,79)
LRMS(m/z):1822[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.811B
SO1861-Ald-OH(26.8mg、0.014mm)に対し、水(0.50mL)中の水酸化ナトリウム(5.74mg、0.144mmol)の溶液およびメタノール(0.50mL)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(24.2mg、92%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=98%(化学式:C81H130O45、精密質量:1822,79)
LRMS(m/z):1822[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.811B
SO1861-(Ac-OH)(Glu-AMPD)(分子11)の合成;図6参照
SO1861-Ac-OH(14.3mg、7.84μmol)、AMPD(4.12mg、0.039mmol)、およびBOP(10.4mg、0.024mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(8.62μL、0.078mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、最初の分取MP-LC2を、次いで分取MP-LC3を用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(9.47mg、63%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=98%(化学式:C85H137NO46、精密質量:1907,84)
LRMS(m/z):1908[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.311B
SO1861-Ac-OH(14.3mg、7.84μmol)、AMPD(4.12mg、0.039mmol)、およびBOP(10.4mg、0.024mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(8.62μL、0.078mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、最初の分取MP-LC2を、次いで分取MP-LC3を用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(9.47mg、63%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=98%(化学式:C85H137NO46、精密質量:1907,84)
LRMS(m/z):1908[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.311B
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(Glu-AMPD)(分子12)の合成;図7参照
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.57mg、4.70μmol)、AMPD(42.58mg、0.025mmol)、およびBOP(6.57mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.17μL、0.047mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、再び分取MP-LC2を用いて精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(7.21mg、80%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=97.8%(化学式:C85H139NO46、精密質量:1909,86)
LRMS(m/z):1910[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.211B
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.57mg、4.70μmol)、AMPD(42.58mg、0.025mmol)、およびBOP(6.57mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.17μL、0.047mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、再び分取MP-LC2を用いて精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(7.21mg、80%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=97.8%(化学式:C85H139NO46、精密質量:1909,86)
LRMS(m/z):1910[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.211B
SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)(分子14)の合成;図8参照
SO1861-Glu-AMPD(10.6mg、5.43μmol)およびEMCH.TFA(9.22mg、0.027mmol)を、メタノール(超脱水、0.50mL)中に溶解した。次に、TFA(1.66μL、0.022mmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC1に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、分取MP-LC3を用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールした。得られた溶液を、ギ酸を用いて中和し、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(2.61mg、22%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=95%(化学式:C97H152N4O49、精密質量:2156,95)。
LRMS(m/z):2156[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.641B
SO1861-Glu-AMPD(10.6mg、5.43μmol)およびEMCH.TFA(9.22mg、0.027mmol)を、メタノール(超脱水、0.50mL)中に溶解した。次に、TFA(1.66μL、0.022mmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC1に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、分取MP-LC3を用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールした。得られた溶液を、ギ酸を用いて中和し、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(2.61mg、22%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=95%(化学式:C97H152N4O49、精密質量:2156,95)。
LRMS(m/z):2156[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.641B
SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)(分子15)の合成;図9参照
SO1861-Ac-OH(9.05mg、4.97μmol)およびEMCH.TFA(8.43mg、0.025mmol)を、メタノール(超脱水、0.50mL)中に溶解した。次に、TFA(1.52μL、0.022mmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC1に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(6.58mg、65%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=97%(化学式:C91H141N3O47、精密質量:2027,87)。
LRMS(m/z):2028[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.961B
SO1861-Ac-OH(9.05mg、4.97μmol)およびEMCH.TFA(8.43mg、0.025mmol)を、メタノール(超脱水、0.50mL)中に溶解した。次に、TFA(1.52μL、0.022mmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC1に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(6.58mg、65%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=97%(化学式:C91H141N3O47、精密質量:2027,87)。
LRMS(m/z):2028[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.961B
SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(分子16)の合成;図10参照
SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(6.00mg、3.14μmol)およびEMCH.TFA(5.33mg、0.016mmol)を、メタノール(超脱水、0.50mL)中に溶解した。次に、TFA(0.96μL、0.013mmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC1に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、分取MP-LC3を用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールした。得られた溶液を、ギ酸を用いて中和し、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(1.04mg、16%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=94%(化学式:C95H150N4O48、精密質量:2114,94)
LRMS(m/z):2115[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.551B
SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(6.00mg、3.14μmol)およびEMCH.TFA(5.33mg、0.016mmol)を、メタノール(超脱水、0.50mL)中に溶解した。次に、TFA(0.96μL、0.013mmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC1に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、分取MP-LC3を用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールした。得られた溶液を、ギ酸を用いて中和し、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(1.04mg、16%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=94%(化学式:C95H150N4O48、精密質量:2114,94)
LRMS(m/z):2115[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.551B
SO1861-Glu-AEM(分子18)の合成;図11参照
SO1861(10.4mg、5.58μmol)、AEM(7.10mg、0.028mmol)、およびHATU(6.36mg、0.017mmol)を、DMF(1.00mL)およびNMM(6.13μL、0.056mmol)の混合物中に溶解した。
反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(7.82mg、71%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=95%(化学式:C89H136N2O47、精密質量:1984,83)。
LRMS(m/z):1985[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.621B
SO1861(10.4mg、5.58μmol)、AEM(7.10mg、0.028mmol)、およびHATU(6.36mg、0.017mmol)を、DMF(1.00mL)およびNMM(6.13μL、0.056mmol)の混合物中に溶解した。
反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(7.82mg、71%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=95%(化学式:C89H136N2O47、精密質量:1984,83)。
LRMS(m/z):1985[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.621B
SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)(分子19)の合成;図12参照
SO1861-Ac-OH(9.02mg、4.95μmol)、AEM(7.10mg、0.028mmol)、およびHATU(5.65mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.44μL、0.050mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(7.16mg、74%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=96%(化学式:C87H134N2O46、精密質量:1942,82)。
LRMS(m/z):1944[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.471B
SO1861-Ac-OH(9.02mg、4.95μmol)、AEM(7.10mg、0.028mmol)、およびHATU(5.65mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.44μL、0.050mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(7.16mg、74%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=96%(化学式:C87H134N2O46、精密質量:1942,82)。
LRMS(m/z):1944[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.471B
SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)(分子20)の合成;図13参照
SO1861-Ald-OH(9.38mg、5.03μmol)、AEM(6.39mg、0.025mmol)、およびHATU(5.73mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.53μL、0.050mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(8.63mg、86%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=95%(化学式:C89H138N2O47、精密質量:1986,85)。
LRMS(m/z):1987[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.621B
SO1861-Ald-OH(9.38mg、5.03μmol)、AEM(6.39mg、0.025mmol)、およびHATU(5.73mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.53μL、0.050mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(8.63mg、86%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=95%(化学式:C89H138N2O47、精密質量:1986,85)。
LRMS(m/z):1987[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.621B
SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)(分子21)の合成;図14参照
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.92mg、4.89μmol)、AEM(6.54mg、0.026mmol)、およびHATU(5.65mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.38μL、0.049mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(8.92mg、94%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=97%(化学式:C87H136N2O46、精密質量:1944,84)。
LRMS(m/z):1944[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.461B
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.92mg、4.89μmol)、AEM(6.54mg、0.026mmol)、およびHATU(5.65mg、0.015mmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(5.38μL、0.049mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(8.92mg、94%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=97%(化学式:C87H136N2O46、精密質量:1944,84)。
LRMS(m/z):1944[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.461B
SO1861-L-N3(分子23)の合成;図36参照
化学式:C94H151N5O50、精密質量:2149,94
化学式:C94H151N5O50、精密質量:2149,94
SO1861-L-NHS(分子25)の合成;図37参照
SO1861-L-N3(7.71mg、3.58μmol)およびDBCO-NHS(2.88mg、7.17μmol)を、脱水DMF(0.50mL)中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。30分後、反応混合物をジエチルエーテル(40mL)に対し滴下添加した。遠心分離(7800RPM、5min)の後、上清をデカンテートし、ペレットをジエチルエーテル(20mL)中に再懸濁して、再度遠心分離した。上清をデカンテートした後、残渣を水/アセトニトリル(3:1、v/v、3mL)中に溶解し、得られた溶液を直ちに凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(8.81mg、96%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=84%。14%の加水分解されたNHSを含有(化学式:C117H169N7O55、精密質量:2552,06)。
LRMS(m/z):2551[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.76/2.782(異性体による二重ピーク)
SO1861-L-N3(7.71mg、3.58μmol)およびDBCO-NHS(2.88mg、7.17μmol)を、脱水DMF(0.50mL)中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。30分後、反応混合物をジエチルエーテル(40mL)に対し滴下添加した。遠心分離(7800RPM、5min)の後、上清をデカンテートし、ペレットをジエチルエーテル(20mL)中に再懸濁して、再度遠心分離した。上清をデカンテートした後、残渣を水/アセトニトリル(3:1、v/v、3mL)中に溶解し、得られた溶液を直ちに凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(8.81mg、96%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度=84%。14%の加水分解されたNHSを含有(化学式:C117H169N7O55、精密質量:2552,06)。
LRMS(m/z):2551[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.76/2.782(異性体による二重ピーク)
SO1861-Glu-HATU(分子26)の合成;図59参照
SO1861-Glu-HATUを生成するためには、SO1861のカルボキシル基が、ペプチドカップリング化学において活性エステルを生じるべく使用される試薬、すなわち、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)、によって活性化される。得られたSO1861の活性エステルは、図59に示される。
SO1861-Glu-HATUを生成するためには、SO1861のカルボキシル基が、ペプチドカップリング化学において活性エステルを生じるべく使用される試薬、すなわち、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)、によって活性化される。得られたSO1861の活性エステルは、図59に示される。
以下の修飾されたQS-21サポニン、すなわちサポニン誘導体は、天然産QS-21をベースとして合成された:
QS21-Ald-OH(分子27)の合成;図38参照
QS21(9.41mg、4.73μmol)を、メタノール(0.50mL)中に溶解した。次に、水素化ホウ素ナトリウム(1.79mg、0.047mmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。30分後、反応混合物を水(0.50mL)で希釈し、分取MP-LC.2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(4.68mg、50%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度99%(精密質量:1990,4異性体:Api/Xyl(2:1))。
LRMS(m/z):1990 [M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.25/2.311B(二重ピーク,17/83 UV-面積%,混合物であるQS21に起因)
QS21(9.41mg、4.73μmol)を、メタノール(0.50mL)中に溶解した。次に、水素化ホウ素ナトリウム(1.79mg、0.047mmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。30分後、反応混合物を水(0.50mL)で希釈し、分取MP-LC.2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(4.68mg、50%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度99%(精密質量:1990,4異性体:Api/Xyl(2:1))。
LRMS(m/z):1990 [M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.25/2.311B(二重ピーク,17/83 UV-面積%,混合物であるQS21に起因)
QS21-Glu-AEM(分子28)の合成;図39参照
QS-21(2.42mg、1.22μmol;図41)、AEM(1.68mg、6.61μmol)、およびHATU(1.48mg、3.89μmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(1.34μL、0.012mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(1.80mg、70%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度92%(精密質量:2110,4異性体:Api/Xyl(2:1))。
LRMS(m/z):2110[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.84/2.931B(二重ピーク,10/90 UV-面積% 混合物であるQS21に起因)
QS-21(2.42mg、1.22μmol;図41)、AEM(1.68mg、6.61μmol)、およびHATU(1.48mg、3.89μmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(1.34μL、0.012mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(1.80mg、70%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度92%(精密質量:2110,4異性体:Api/Xyl(2:1))。
LRMS(m/z):2110[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.84/2.931B(二重ピーク,10/90 UV-面積% 混合物であるQS21に起因)
QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)(分子29)の合成;図40A参照
QS-21-Ald-OH(1.92mg、0.964μmol)、AEM(1.29mg、5.08μmol)、およびHATU(1.10mg、2.89μmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(1.06μL、9.64μmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(1.46mg、72%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度92%(精密質量:2112,4異性体:Api/Xyl(2:1))。
LRMS(m/z):2112[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.83/2.921B(二重ピーク,7/93 UV-面積% 混合物であるQS21に起因)
QS-21-Ald-OH(1.92mg、0.964μmol)、AEM(1.29mg、5.08μmol)、およびHATU(1.10mg、2.89μmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(1.06μL、9.64μmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温で静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(1.46mg、72%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度92%(精密質量:2112,4異性体:Api/Xyl(2:1))。
LRMS(m/z):2112[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.83/2.921B(二重ピーク,7/93 UV-面積% 混合物であるQS21に起因)
QS21-Ald-EMCH(図40B、分子30)の合成
QS21(4.82mg、2.42μmol)およびEMCH.TFA(4.11mg、0.012mmol)を、メタノール(超脱水、0.25mL)中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、分取MP-LC2Aを用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(2.78mg、52%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度96%。
LRMS(m/z):2196[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.441B(混合物であるQS21に起因する多重ピーク)
QS21(4.82mg、2.42μmol)およびEMCH.TFA(4.11mg、0.012mmol)を、メタノール(超脱水、0.25mL)中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、分取MP-LC2Aを用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(2.78mg、52%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度96%。
LRMS(m/z):2196[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.441B(混合物であるQS21に起因する多重ピーク)
QS21-Glu-AMPD(図40C;分子31)の合成
QS21(4.89mg、2.46μmol)、AMPD(1.29mg、0.012mmol)、およびBOP(3.26mg、7.37μmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(2.70μL、0.025mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(3.76mg、74%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度94%。
LRMS(m/z):2076[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.781B(混合物であるQS21に起因する多重ピーク)
QS21(4.89mg、2.46μmol)、AMPD(1.29mg、0.012mmol)、およびBOP(3.26mg、7.37μmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(2.70μL、0.025mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(3.76mg、74%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度94%。
LRMS(m/z):2076[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.781B(混合物であるQS21に起因する多重ピーク)
QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)(図40D;分子32)の合成
QS21-Glu(2.47mg、1.19μmol)およびEMCH.TFA(2.02mg、5.95μmol)を、メタノール(超脱水、100μL)中に溶解した。次に、TFA(0.36μL、4.76μmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(2.25mg、83%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度95%。
LRMS(m/z):2283[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.881B(混合物であるQS21に起因する多重ピーク)
QS21-Glu(2.47mg、1.19μmol)およびEMCH.TFA(2.02mg、5.95μmol)を、メタノール(超脱水、100μL)中に溶解した。次に、TFA(0.36μL、4.76μmol)を添加した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。2時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(2.25mg、83%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度95%。
LRMS(m/z):2283[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.881B(混合物であるQS21に起因する多重ピーク)
QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(図40E;分子33)の合成
QS21-(Ald-OH)(4.90mg、2.46μmol)、AMPD(1.29mg、0.012mmol)、およびBOP(3.26mg、7.37μmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(2.70μL、0.025mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(2.16mg、42%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度96%。
LRMS(m/z):2077[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.771B(混合物であるQS21に起因する多重ピーク)
QS21-(Ald-OH)(4.90mg、2.46μmol)、AMPD(1.29mg、0.012mmol)、およびBOP(3.26mg、7.37μmol)を、DMF(0.50mL)およびNMM(2.70μL、0.025mmol)の混合物中に溶解した。反応混合物を1分間振とうし、室温に静置した。1時間後、反応混合物を分取MP-LC2Aに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物(2.16mg、42%)を白色のふわふわした固体として得た。LC-MSに基づく純度96%。
LRMS(m/z):2077[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):2.771B(混合物であるQS21に起因する多重ピーク)
実施例2:サポニン誘導体の活性-予備実験
本明細書に記載されたサポニン修飾は、エンドソーム脱出を促進するサポニンの能力を実質的に妨害しないことが判明した(エンドソームの内側でコンジュゲートから解放された修飾サポニンまたはサポニン)。実験の結果は、以下の表Ex2に要約される。
本明細書に記載されたサポニン修飾は、エンドソーム脱出を促進するサポニンの能力を実質的に妨害しないことが判明した(エンドソームの内側でコンジュゲートから解放された修飾サポニンまたはサポニン)。実験の結果は、以下の表Ex2に要約される。
化学修飾されたサポニンSO1861は、細胞ベースのバイオアッセイにおいて、読取り値としての相対細胞生存率によって反応性を示した。HeLa細胞を、以下の構成で72時間インキュベートし、72時間のインキュベーションの前後における細胞生存率を評価した。実験では、細胞を1.5pMのジアンチン-EGFコンジュゲートに暴露した。ネガティブコントロールは、ジアンチン-EGFなしで、バッファビヒクルおよび10マイクログラム/mlサポニンとインキュベートした細胞であった。細胞生存率は、サポニンおよびEGF-ジアンチンの双方が除外されたコントロールについて100%に設定した。ポジティブコントロールは、10マイクログラム/mlの非修飾サポニンSO1861+ジアンチン-EGFであった。72時間後の細胞生存率は、基本的に0%であった。化学修飾されたサポニン変異体については、10マイクログラム/mlサポニンを1.5pMのジアンチン-EGFと組合せて検査した。SO1861-Ald-EMCHは、10マイクログラム/mlにおいて細胞生存率を低減した。
これらのデータは、サポニンが、遊離のアルデヒド基において、または遊離のカルボニル基において、エンドソーム脱出促進活性を失うことなく修飾され得ることを証明する。
実施例3:サポニン誘導体の活性-詳細な研究
種々のサポニン(例えば、SO1861、QS-21)を、細胞に対し、「遊離の」非コンジュゲート分子として、標的発現細胞の増強された殺細胞活性を生じる結果となる、リガンド毒物融合物(例えば、EGF-ジアンチン)または抗体-タンパク質毒素コンジュゲートと組合せて同時投与した。
種々のサポニン(例えば、SO1861、QS-21)を、細胞に対し、「遊離の」非コンジュゲート分子として、標的発現細胞の増強された殺細胞活性を生じる結果となる、リガンド毒物融合物(例えば、EGF-ジアンチン)または抗体-タンパク質毒素コンジュゲートと組合せて同時投与した。
本発明者らは、SO1861(サポナリア・オフィキナリスの根の抽出物から単離および精製された)およびQS21(キラヤ・サポナリアから単離および精製された;Desert King)を、分子内の種々の位置において化学修飾し(単一、二重、または三重修飾)、それにより表A2およびA3に概説したような一連のサポニン誘導体を提供した。サポニン誘導体を、1)EGFR発現細胞(HeLaおよびA431)でのリガンド毒素(修飾SO1861/QS21タイトレーション+5pM EGFジアンチン)のエンドソーム脱出促進活性について;2)HeLaおよびA431に対する内在的細胞毒性(修飾SO1861/QS21タイトレーション)について;および3)ヒト赤血球溶血活性(ヒト赤血球に対する修飾SO1861/QS21タイトレーション)について検査した。
エンドソーム脱出促進活性を測定するため、修飾SO1861を、EGFR発現細胞(HeLaおよびA431)において、非有効的な定濃度の5pM EGF-ジアンチンの存在下でタイトレーションした(図18A-B、および19A-B参照)。さらに、エンドソーム脱出促進活性はまた、非有効的な定濃度の5pm EGF-ジアンチンの存在下でタイトレーションされたサポニン誘導体についても測定された(SO1861とSO1861-Ald-EMCHおよびブロックSO1861-Ald-EMCHとの比較には、図23A-Bを、SO1861とSO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)、およびSO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)との比較には、図24A-Bを参照)。これは、単一修飾をもつ修飾サポニンが、SO1861に比較して、以下の濃度:SO1861-Ald-OHでは、HeLaで:IC50=600nMおよびA431:IC50=600nM、SO1861-Glu-AMPDでは、HeLaで:IC50=600nMおよびA431:IC50=600nM、SO1861-Ac-OHでは、HeLaで:IC50=1000nMおよびA431:IC50=800nM、SO1861-Glu-AEMでは、HeLaで:IC50=1500nMおよびA431:IC50=2000nM、およびSO1861-Ald-EMCHでは、HeLaで:IC50=2000nMおよびA431:IC50=2000nM、で活性を示したこと、並びに二重修飾体が、以下のIC50値:SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)では、HeLaで:IC50=3000nMおよびA431:IC50=3000nM、SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)では、HeLaで:IC50=4000nMおよびA431:IC50=4000nM、SO1861-(Ald-OH)(Ac-OH)では、HeLaで:IC50=4000nMおよびA431:IC50=5000nM、SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)では、HeLaで:IC50=8000nMおよびA431:IC50=4000nM、SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)では、HeLaで:IC50=8000nMおよびA431:IC50=10,000nM、SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)では、HeLaで:IC50=40,000nMおよびA431:IC50=20,000nM、で活性を示したことを表している。検査した三重修飾体は、この濃度では何ら活性を示さなかった。非修飾SO1861コントロールでは、以下のIC50値:HeLaで:IC50=100nM、およびA431で:IC50=200nM、が観察された。修飾QS21のエンドソーム脱出促進は、サポニン誘導体を、EGFR発現細胞において、非有効的な定濃度の5pM EGF-ジアンチンの存在下でタイトレーションすることにより測定した(図30A、および30B)。これは、以下の修飾QS21が、非修飾QS21に比較して、以下の濃度:QS21では、HeLaで:IC50=200nMおよびA431:IC50=200nM、QS21-Ald-OHでは、HeLaで:IC50=600nMおよびA431:IC50=600nM、QS21-Glu-AEMでは、HeLaで:IC50=600nMおよびA431:IC50=700nM、QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)では、HeLaで:IC50=1500nMおよびA431:IC50=3000nM、において活性を示したことを表す。結論として、修飾されていない、SO1861およびQS21の双方は、HeLaおよびA431細胞において、IC50=200nMで有効であった。単一SO1861/QS21修飾体(SO1861-Ald-EMCH、ブロックSO1861-Ald-EMCH、SO1861-Glu-AMPD、SO1861-Ald-OH、SO1861-Ac-OH、SO1861-Glu-AEM、QS21-Ald-OH、QS21-Glu-AEM)は、HeLaまたはA431において、IC50=600nM-2000nMで活性を示した(表A5およびA6)のに対し、二重SO1861/QS21修飾体は、HeLaまたはA431細胞において、IC50=1500nM-40,00nMで活性を示した(表A5およびA6)。SO1861の三重修飾体については、20,000nMまで何ら活性は観察できなかった。
上述の通り、エンドソーム脱出促進活性を測定するために、SO1861誘導体、QS21誘導体、およびそれらの非誘導体化対応物を、EGFR発現細胞(HeLaおよびA431)において、非有効的な定濃度の5pM EGF-ジアンチンの存在下でタイトレーションした。これは、非誘導体化SO1861および非誘導体化QS21、およびQS21誘導体であるQS21-Glu-AMPDが、HeLaおよびA431細胞において、IC50=200nMで有効であったことを表す。単一SO1861/QS21修飾体(SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH(ブロック)(SO1861-Ald-EMCH(メルカプトエタノール)、SO1861-Glu-AMPD、SO1861-(Ald-OH)、SO1861-Ac-OH、SO1861-Glu-AEM、QS21-Ald-EMCH、QS21-(Ald-OH)、QS21-Glu-AEM)は、HeLaまたはA431において、IC50=600nM-2000nMで活性を示した(表A5およびA6)のに対し、二重SO1861修飾体および二重QS21修飾体は、HeLaまたはA431において、IC50=1500nM-40,000nMで活性を示した(表A5およびA6)。SO1861の三重修飾体については、20,000nMまで何ら活性は観察できなかった。
毒性測定には、修飾SO1861を、HeLa細胞(図20Aおよび21A参照)およびA431細胞(図20Bおよび21B参照)においてタイトレーションした。図25Aおよび25Bは、SO1861、SO1861-Ald-EMCH、ブロックSO1861-Ald-EMCHについての毒性試験の詳細を描き、図26Aおよび26Bは、SO1861、SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)、およびSO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)についての詳細を示す。これは、非修飾SO1861が、HeLa細胞に対し、最も強い内在的毒性:IC50=2000nMを示すのに対し、単一修飾体SO1861-Acが、HeLa細胞に対し、IC50=10,000nMで毒性を示すことを表す。他の全てのSO1861誘導体では、HeLa細胞に対する内在的毒性(IC50)は、20,000nMより高かった。A431細胞では、非修飾SO1861の毒性は、IC50:1000nMで観察されたのに対し、単一修飾体SO1861-Ac-OH、SO1861-Ald-OH、SO1861-Glu-AMPD、SO1861-Ald-EMCHは、(受容可能な)IC50=2000nM、IC50=7000nM、IC50=20,000nM、およびIC50=30,000nMで毒性を示す。修飾QS21の毒性測定には、サポニン誘導体を、HeLa細胞(図31A)およびA431細胞(図31B参照)においてタイトレーションした。これは、QS21が、HeLa細胞で:IC50=6000nMおよびA431細胞:IC50=3000nM、QS21-Ald-OHが、HeLa細胞で:IC50=20,000nMおよびA431細胞:IC50=20,000nM、QS21-Glu-AEMが、HeLa細胞で:IC50=>100,000nMおよびA431細胞:IC50=>100,000nM、QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)が、HeLa細胞で:IC50=>100,000nMおよびA431細胞:IC50=>100,000nM、の毒性を示すことを表す。SO1861またはQS21の二重修飾体、およびSO1861三重修飾体では、100,000nMまで何ら毒性は観察できなかった。上述の通り、修飾されないかまたは修飾された、SO1861またはQS21を、HeLaおよびA431細胞についてタイトレーションした。これは、非修飾SO1861がIC50=1000nM(HeLa)およびIC50=2000nM(A431)で毒性を示したのに対し、QS21がIC50=6000nM(HeLa)(IC50=3000nM(A431)で毒性を示し、かつQS21-Glu-AMPDが、IC50=9000nM(HeLa)およびIC50=5000nM(A431)で毒性を示したことを表す(表A5およびA6)。HeLa細胞での単一SO1861修飾体および単一QS21修飾体については、SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH(ブロック)、SO1861-(Ald-OH)、SO1861-Glu-AEM、QS21-Ald-EMCH、QS21-Glu-AEMは、100,000nMまで何ら毒性を示さなかったのに対し、SO1861-Glu-AMPD、SO1861-Ac-OH、QS21-(Ald-OH)は、それぞれIC50=20,000nM、IC50=10,000nM、IC50=20,000nMで毒性を示した(表A5およびA6)。A431細胞においては、SO1861-Glu-AEMおよびQS21-Glu-AEMは、100,000nMまで何ら毒性を示さなかったのに対し、毒性は、SO1861-Ald-EMCH(IC50=30,000nM)、SO1861-Ald-EMCH(ブロック)(IC50=30,000nM)、SO1861-(Ald-OH)(IC50=7000nM)、SO1861-Ac-OH(IC50=2000nM)、SO1861-Glu-AMPD(IC50=20,000nM)、QS21-Ald-EMCH(IC50=30,000nM)、QS21-(Ald-OH)(IC50=20,000nM)について観察できた(表A5およびA6)。SO1861二重修飾体またはQS21二重修飾体、およびSO1861三重修飾体については、100,000nMまで何ら毒性は観察できなかった(表A5およびA6)。
加えて、非修飾および修飾SO1861の溶血活性を、ヒト赤血球溶血アッセイによって測定した(図22、図27、図28、および図32参照)。これは、非修飾SO1861がIC50=8000nMで、および非修飾QS21がIC50=3000nMで、活性を示したことを表す。単一修飾体SO1861-Ald-EMCHは、1,000,000nMまで何ら溶血活性を示さなかったのに対し、ヒト赤血球の溶血活性は、SO1861-Ald-EMCH(ブロック)(IC50=300,000nM)、SO1861-Ald-OH(IC50=30,000nM)、SO1861-Ac-OH(IC50=20,000nM)、SO1861-Glu-AMPD(IC50=20,000nM)、SO1861-Glu-AEM(IC50=30,000nM)、QS21-Ald-OH(IC50=20,000nM)、QS21-Glu-AEM(IC50=10,000nM)について観察できた(表A5およびA6)。SO1861およびQS21二重修飾体については、SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)、SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)、およびQS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)では何ら溶血活性が(1,000,000nMまで)観察されなかったのに対し、溶血活性は、SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50=100,000)、SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(IC50=200,000)、SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(IC50=140,000)、SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)(IC50=100,000)では観察された。何らのSO1861三重修飾体についても、100,000nMまで溶血は観察できなかった。溶血アッセイは、非修飾SO1861についてはIC50=8000nMで、および非修飾QS21についてはIC50=3000nMで、また修飾QS21-Glu-AMPDについてはIC50=3000nMで、溶血活性を示した。単一修飾体SO1861-Ald-EMCHは、1,000,000nMまで何ら溶血活性を示さなかったのに対し、ヒト赤血球の溶血活性は、SO1861-Ald-EMCH(ブロック)(IC50=300,000nM)、SO1861-(Ald-OH)(IC50=30,000nM)、SO1861-Ac-OH(IC50=20,000nM)、SO1861-Glu-AMPD(IC50=20,000nM)、SO1861-Glu-AEM(IC50=30,000nM)QS21-Ald-EMCH(IC50=30,000nM)、QS21(Ald-OH)(IC50=20,000nM)、およびQS21-Glu-AEM(IC50=10,000nM)で観察できた(表A5およびA6)。SO1861二重修飾体またはQS21二重修飾体については、SO1861-Ald-EMCH-(Glu-AMPD)、SO1861-(Ac-OH)-EMCH、SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AEM)、QS21-Ald-EMCH-(Glu-AMPD)、およびQS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)については何らの溶血活性も(1,000,000nMまで)観察されなかったのに対し、溶血活性は、SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50=100,000nM)、SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(IC50=200,000nM)、SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(IC50=140,000nM)、SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AEM)(IC50=100,000nM)、およびQS21-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(IC50=40,000nM)について観察された(表A5およびA6)。SO1861三重修飾体では100,000nMまで何ら溶血活性は観察できなかった(表A5およびA6)。
様々なQSサポニン分画の、エンドソーム脱出促進活性(HeLaおよびA431細胞でのサポニン+5pM セツキシマブ-サポリンのタイトレーション、図33A-B参照)、毒性(HeLaおよびA431細胞でのサポニンのタイトレーション、図34A-B参照)および溶血活性(ヒト赤血球でのサポニンのタイトレーション、図32および35参照)を検査した。これは、QS21(分画)、QS17(分画)、QS18(分画)が、HeLa細胞およびA431細胞において、200nMで活性を示したのに対し、QS7(分画)は、IC50=6000nM(HeLa)および10,000nM(A431)で活性を示したことを表した。毒性の測定を通じて、QS21(分画)、QS17(分画)、QS18(分画)が、HeLa細胞およびA431細胞において、IC50=10,000nMで毒性を示したことが観察されたとき、一方でQS7(分画)は、IC50=20,000nMで毒性を示した(図34)。次に、溶血アッセイを行い、これは、IC50=3000nMでのQS21(分画)、IC50=5000nMでのQS17(分画)、QS18(分画)の溶血活性を示したのに対し、QS7(分画)では、20,000nMまで何ら溶血活性は検出できなかったことを示した(図35)。
種々のSOサポニン(SO1862(異性体)、SO1832,SO1904)、並びに抗体-SO1861コンジュゲート(セツキシマブ-SO1861(DAR4)、トラスツズマブ-SO1861(DAR4))の溶血活性を検査した。これは、SO1862(異性体、SO1832,SO1904の溶血活性が、SO1861(IC50=10,000nM)に匹敵していたことを示した(図29)。セツキシマブ-SO1861(DAR4)は、60,000nMまで何ら溶血活性を示さなかったのに対し、トラスツズマブ-SO1861(DAR4)は、最初の溶血活性を60,000nM以降に示した(IC50=200,000nM)(図29)。
SO1861、SO1861-Ald-EMCH、およびSO1861-Ald-EMCH-メルカプトエタノール(ブロックSO1861-Ald-EMCH)の、細胞毒性、溶血活性、およびエンドソーム脱出促進活性を比較した場合、後者2つは同様にまたは基本的に等しく細胞毒性であり、溶血活性があり、かつエンドソーム脱出促進活性バイオアッセイにおいて活性があり、かつ後者2つはSO1861よりも細胞毒性が低くかつ溶血活性が低かった。また表A5およびA6も参照。
細胞生存率アッセイ
細胞生存率は、MTSアッセイにより、製造業者の指示に従って実施した(CellTiter96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega)。MTS溶液を、10%FBS(PAN-Biotech GmbH)を補足した、フェノールレッドなしのDMEM(PAN-Biotech GmbH)中で20xに希釈した。細胞を、ウェル当たり200μLのPBSで1回洗浄し、その後、ウェル当たり100μLの希釈MTS溶液を添加した。プレートを、37℃で約20-30分間インキュベートした。続いて、492nmにおける光学密度を、Thermo Scientific Multiskan FCプレートリーダー(Thermo Scientific)で測定した。定量化には、「培地のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを、他の全てのウェルから引き算し、その後に、無処理ウェルのバックグラウンド補正シグナルを、処理ウェルの補正されたバックグラウンドシグナルで割ることにより、無処理/処理細胞の比率を算出した。
細胞生存率は、MTSアッセイにより、製造業者の指示に従って実施した(CellTiter96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega)。MTS溶液を、10%FBS(PAN-Biotech GmbH)を補足した、フェノールレッドなしのDMEM(PAN-Biotech GmbH)中で20xに希釈した。細胞を、ウェル当たり200μLのPBSで1回洗浄し、その後、ウェル当たり100μLの希釈MTS溶液を添加した。プレートを、37℃で約20-30分間インキュベートした。続いて、492nmにおける光学密度を、Thermo Scientific Multiskan FCプレートリーダー(Thermo Scientific)で測定した。定量化には、「培地のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを、他の全てのウェルから引き算し、その後に、無処理ウェルのバックグラウンド補正シグナルを、処理ウェルの補正されたバックグラウンドシグナルで割ることにより、無処理/処理細胞の比率を算出した。
FACS分析
細胞を、10% ウシ胎児血清(PAN-Biotech GmbH)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(PAN-Biotech GmbH)を補足したDMEM(PAN-Biotech GmbH)中で、10cmディッシュにおいて500,000c/プレートで播種し、集密度90%が達成されるまで48時間インキュベートした(5%CO2、37℃)。次に、細胞をトリプシン処理(TrypIE Express,Gibco Thermo Scientific)して単一細胞とした。0.75x106細胞を15mLのファルコンチューブに移して遠心分離した(1,400rpm、3min)。上清を捨てる一方、細胞ペレットは水中に沈んだままにした。ペレットをボルテックスシェイカー上でファルコンチューブを穏やかにタップすることにより溶解し、細胞を4mLの冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)で洗浄した。洗浄後、細胞を3mLの冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)中に再懸濁し、3つの丸底FACSチューブに等しく分割した(1mL/チューブ)。細胞を再度遠心分離し、200μLの冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)または200μLの抗体溶液;195μLの冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)中に5μLの抗体を含有する、の中に再度懸濁した。APCマウスIgG1、κアイソタイプCtrl FC(#400122、Biolegend)を、アイソタイプコントロールとして使用し、APC抗ヒトEGFR(#352906、Biolegend)を使用した。試料を、チューブローラーミキサー上で、4℃で30分間インキュベートした。その後、細胞を冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)で3回洗浄し、PBS中の2%PFA溶液を用いて、室温で20分間固定した。細胞を、冷PBSで2回洗浄し、FACS分析用には250-350μLの冷PBS中に再懸濁した。試料をBD FACSCanto IIフローサイトメトリーシステム(BD Biosciences)およびFlowJoソフトウェアを用いて分析した。FACS分析の結果は、表A4に要約される。
細胞を、10% ウシ胎児血清(PAN-Biotech GmbH)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(PAN-Biotech GmbH)を補足したDMEM(PAN-Biotech GmbH)中で、10cmディッシュにおいて500,000c/プレートで播種し、集密度90%が達成されるまで48時間インキュベートした(5%CO2、37℃)。次に、細胞をトリプシン処理(TrypIE Express,Gibco Thermo Scientific)して単一細胞とした。0.75x106細胞を15mLのファルコンチューブに移して遠心分離した(1,400rpm、3min)。上清を捨てる一方、細胞ペレットは水中に沈んだままにした。ペレットをボルテックスシェイカー上でファルコンチューブを穏やかにタップすることにより溶解し、細胞を4mLの冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)で洗浄した。洗浄後、細胞を3mLの冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)中に再懸濁し、3つの丸底FACSチューブに等しく分割した(1mL/チューブ)。細胞を再度遠心分離し、200μLの冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)または200μLの抗体溶液;195μLの冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)中に5μLの抗体を含有する、の中に再度懸濁した。APCマウスIgG1、κアイソタイプCtrl FC(#400122、Biolegend)を、アイソタイプコントロールとして使用し、APC抗ヒトEGFR(#352906、Biolegend)を使用した。試料を、チューブローラーミキサー上で、4℃で30分間インキュベートした。その後、細胞を冷PBS(Mg2+およびCa2+フリー、2%FBS)で3回洗浄し、PBS中の2%PFA溶液を用いて、室温で20分間固定した。細胞を、冷PBSで2回洗浄し、FACS分析用には250-350μLの冷PBS中に再懸濁した。試料をBD FACSCanto IIフローサイトメトリーシステム(BD Biosciences)およびFlowJoソフトウェアを用いて分析した。FACS分析の結果は、表A4に要約される。
溶血アッセイ
赤血球(RBC)を、フィコール(Ficoll)勾配を用いてバフィーコートから分離した。得られたRBCペレット(~4-5ml)を、50mlのDPBS(Ca2+/Mg2+無し、PAN-Biotech GmbH)で2回洗浄した。細胞を、室温で800xg、10分間の遠心分離によりペレット化した。RBCをカウントし、全細胞カウントに基づき、DPBS(Ca2+/Mg2+無し)中に500,000,000c/mlで再懸濁した。
赤血球(RBC)を、フィコール(Ficoll)勾配を用いてバフィーコートから分離した。得られたRBCペレット(~4-5ml)を、50mlのDPBS(Ca2+/Mg2+無し、PAN-Biotech GmbH)で2回洗浄した。細胞を、室温で800xg、10分間の遠心分離によりペレット化した。RBCをカウントし、全細胞カウントに基づき、DPBS(Ca2+/Mg2+無し)中に500,000,000c/mlで再懸濁した。
サポニン希釈物を、DPBS(Ca2+/Mg2+有り、PAN-Biotech GmbH)中で、1.11x最終強度において調製した。ポジティブリシスコントロールには、0.02%トリトン(Triton)-X100溶液を、DPBS+/+中に調製した。全ての化合物溶液の135μlを、96ウェルV底プレートのウェル当たりに分注した。これに、15μlのRBC懸濁液を添加し、短時間混合した(10秒-600rpm)。プレートを、穏やかに攪拌しながら室温で30分間インキュベートした。その後、プレートを800xgで10分間回転してRBCをペレット化し、100-120μlの上清を、標準的な96wp(96ウェルプレート)に移した。続いて、405nmにおけるODを、Thermo Scientific Muliskan FCプレートリーダー(Thermo Scientific)で測定した。定量化には、「DPBS+/+のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを、他の全てのウェルから引き算し、その後に、処理ウェルのバックグラウンド補正シグナルを、0.02%トリトン-X100ウェルの補正されたバックグラウンドシグナルで割ることにより、0.02%トリトン-X100と比較する溶血のパーセントを算出した(x100)。
実施例4:サポニン誘導体の臨界ミセル濃度(CMC)
材料および方法
サポナリア・オフィキナリス(Saponaria officinalis)(SO)由来(表A7)およびキラヤ・サポナリア(Quillaja Saponaria)(QS)由来(表A8および表A9)のサポニン誘導体の臨界ミセル濃度(CMC)を、DeVendittisらの方法(A fluorimetric method for the estimation of the critical micelle concentration of surfactants(界面活性剤の臨界ミセル濃度の推定のための蛍光測定法)、「Analytical Biochemistry」、1981年8月、第115巻、第2号、P.278-286)により、以下のように測定した:
材料および方法
サポナリア・オフィキナリス(Saponaria officinalis)(SO)由来(表A7)およびキラヤ・サポナリア(Quillaja Saponaria)(QS)由来(表A8および表A9)のサポニン誘導体の臨界ミセル濃度(CMC)を、DeVendittisらの方法(A fluorimetric method for the estimation of the critical micelle concentration of surfactants(界面活性剤の臨界ミセル濃度の推定のための蛍光測定法)、「Analytical Biochemistry」、1981年8月、第115巻、第2号、P.278-286)により、以下のように測定した:
精製水(MQ)またはPBS(Dulbecco’s PBS+/+)のいずれかにおける8-アニリノナフタレン-1-スルホン酸(ANS)の発光スペクトルを、CMCの下および上の範囲をカバーするための1から1400μMの範囲のサポニンの乾燥重量濃度において測定した。CMCより上では、ミセル内への蛍光色素のポジショニングに起因して、ANSの蛍光収率は増加し、かつ極大発光の波長は減少する。蛍光収率は、Fluoroskan Ascent FL(Thermo Scientific)で、355nmの励起波長、および460nmの発光波長において記録した。試料および測定当たり、6μg、濃度75.86μMのANSを用いた。
結果
SO1861サポニン
官能基アルデヒド(Ald)、グルクロン酸(Glu)における化学修飾、およびアセチル基(Ac)の除去は、個々のサポニンのミセル特性に対し、強い影響を示した。図42に示したように、SO1861サポニン上の個々の官能基の単一修飾は、得られたANSの相対蛍光値のスロープにおいて表されるミセル形成能に有意に影響を及ぼした。グルクロン酸に対する修飾(SO1861-Glu-AMPD、SO1861-Glu-AEM)は明らかに、より急勾配のスロープを生じる結果となり(図42)、天然のSO1861について得られた185μMのようにより低いCMCが得られた。同様の観察が、ブロックSO1861-Ald-EMCH試料について得られている。しかしながらアルデヒドおよびアセチル基の修飾(SO1861-Ald-OH、SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ac-OH)は、有意により平坦なスロープを生じる結果となり(図42)、天然のSO1861についてよりも高いCMC値をもたらした。SO1861-Ald-EMCH試料は、得られたスロープがほぼ平坦であり、かつ800μMまでの濃度でも何らCMCが測定できなかったことから、特に興味深かった。
SO1861サポニン
官能基アルデヒド(Ald)、グルクロン酸(Glu)における化学修飾、およびアセチル基(Ac)の除去は、個々のサポニンのミセル特性に対し、強い影響を示した。図42に示したように、SO1861サポニン上の個々の官能基の単一修飾は、得られたANSの相対蛍光値のスロープにおいて表されるミセル形成能に有意に影響を及ぼした。グルクロン酸に対する修飾(SO1861-Glu-AMPD、SO1861-Glu-AEM)は明らかに、より急勾配のスロープを生じる結果となり(図42)、天然のSO1861について得られた185μMのようにより低いCMCが得られた。同様の観察が、ブロックSO1861-Ald-EMCH試料について得られている。しかしながらアルデヒドおよびアセチル基の修飾(SO1861-Ald-OH、SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ac-OH)は、有意により平坦なスロープを生じる結果となり(図42)、天然のSO1861についてよりも高いCMC値をもたらした。SO1861-Ald-EMCH試料は、得られたスロープがほぼ平坦であり、かつ800μMまでの濃度でも何らCMCが測定できなかったことから、特に興味深かった。
修飾の位置に関する同様の観察が、SO1861サポニンの二重修飾(図43)および三重修飾(図44)について得られている。グルクロン酸に対する修飾(SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)、SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)、SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)、SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD))は、結果としてより急勾配のANS蛍光収率スロープを、およびそれ故により低いCMC値を生じる一方、アルデヒドおよびアセチル位置に対する修飾(SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH))は、平坦なANS蛍光収率スロープを、およびそれ故天然のSO1861に対して増大されたCMC値をもたらした(表A7)。
三重修飾サポニンSO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)およびSO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)を比較した場合、SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)におけるグルクロン酸に対する修飾は、結果として個別のANS蛍光収率のより平坦なスロープを生じたのに対し、SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)におけるグルクロン酸に対する修飾は、結果として個別のANS蛍光収率の、天然のSO1861についてよりも急勾配なスロープを生じた(図44)。これらの結果は、CMCが考慮される場合に、Glu-修飾誘導体(遊離のサポニンよりも低いCMCをもつ)であっても、前記アルデヒドおよび/またはアセトキシ修飾が、Glu-修飾のネガティブな効果を少なくとも部分的に軽減して、CMCを増大し得ることから、CMCが考慮される場合のアルデヒドおよび/またはアセトキシ位置における修飾の重要性を示している。
QSサポニン
キラヤ・サポナリア由来のサポニン(QS)、QS7、QS17、QS18、QS21 Frac、およびQS21 SPについて、CMC値が測定されており、それらは表A8に示されている。図45に示される通り、個々のQSサポニンのANS蛍光収率のスロープは、導き出されたCMC値と一致する。得られたCMC値は、49μMという最も高いCMC値のQS21 SPから出発して、すべて70μM周辺の類似したCMC値を示す、QS-17、QS-18、QS-21 Fracに向かって減少する傾向を示す。最終的には、QS-7について、CMC値230μMが得られた。
キラヤ・サポナリア由来のサポニン(QS)、QS7、QS17、QS18、QS21 Frac、およびQS21 SPについて、CMC値が測定されており、それらは表A8に示されている。図45に示される通り、個々のQSサポニンのANS蛍光収率のスロープは、導き出されたCMC値と一致する。得られたCMC値は、49μMという最も高いCMC値のQS21 SPから出発して、すべて70μM周辺の類似したCMC値を示す、QS-17、QS-18、QS-21 Fracに向かって減少する傾向を示す。最終的には、QS-7について、CMC値230μMが得られた。
精製水(MQ)およびPBS中で測定されたQS21 SPのANS蛍光収率を比較した場合、精製水(MQ)中のスロープは、わずかにより急勾配であり、精製水中ではわずかに高い予想CMC値をもたらす(図46、表A9)。
単一修飾QS21サポニンQS21-Ald-EMCH(分子30;図40B)、QS21-Glu-AEM、QS21-(Ald-OH)、およびQS21-Glu-AMPD(図47A、図47B)では、グルクロン酸に対するAMPD修飾(QS21-Glu-AMPD、図47B)のみが、結果として40μMというより低いCMC値を生じる天然のQS21に対し、より急勾配のANS蛍光収率のスロープをもたらした(表A9)。グルクロン酸(QS21-Glu-AEM)およびアルデヒド位置(QS21-(Ald-OH)、QS21-Ald-EMCH)の双方における、他の全てのQS21単一修飾は、結果として天然のQS21よりも平坦なANS蛍光収率スロープを生じた(図47B)。
サポナリア・オフィキナリスサポニンSO1861に対する二重修飾についての知見と同様に、QS21サポニンのAldGlu修飾(QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)、図40E、分子33,図47C)もまた、結果として39μMというより低いCMC値を生じる天然のQS21に対し、より急勾配のANS蛍光収率のスロープをもたらした(表A9)。グルクロン酸およびアルデヒド位置の双方における、他の全てのQS21二重修飾体(QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)、QS21-Ald-EMCH-(Glu-AEM)、図47C)は、結果として天然のQS21よりも平坦なANS蛍光収率を生じた。
実施例5:SO1861およびSO1861-Ald-EMCHのエンドソーム脱出促進活性
SO1861およびSO1861-Ald-EMCH(またSO1861-EMCHとも称される、例えば図48-58)を、標的化されたタンパク質毒素のエンドソーム脱出を促進するそれらの能力について検査した。このため、SO1861またはSO1861-Ald-EMCHを、EGFR発現細胞(A431)について、定濃度の10pM セツキシマブ-サポリン(DAR4で、タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたセツキシマブ)に対しタイトレーションした。これは、SO1861(IC50=800nM)およびSO1861-Ald-EMCH(IC50=2000nM)が、10pM セツキシマブ-サポリンとの組合せにおいて、A431細胞の有効な殺細胞を誘発したのに対し、SO1861またはSO1861-Ald-EMCH単独では、何ら殺細胞活性を示さないことを表した(図48)。
SO1861およびSO1861-Ald-EMCH(またSO1861-EMCHとも称される、例えば図48-58)を、標的化されたタンパク質毒素のエンドソーム脱出を促進するそれらの能力について検査した。このため、SO1861またはSO1861-Ald-EMCHを、EGFR発現細胞(A431)について、定濃度の10pM セツキシマブ-サポリン(DAR4で、タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたセツキシマブ)に対しタイトレーションした。これは、SO1861(IC50=800nM)およびSO1861-Ald-EMCH(IC50=2000nM)が、10pM セツキシマブ-サポリンとの組合せにおいて、A431細胞の有効な殺細胞を誘発したのに対し、SO1861またはSO1861-Ald-EMCH単独では、何ら殺細胞活性を示さないことを表した(図48)。
次に、セツキシマブ-ジアンチンまたはセツキシマブ-サポリンを、種々の定濃度のSO1861またはSO1861-Ald-EMCHについてタイトレーションした。これは、4000nM SO1861-Ald-EMCH、4829nM SO1861-Ald-EMCH、または1500nM SO1861の存在下での、低いpM濃度のセツキシマブ-ジアンチン(IC50=1pM、図49)またはセツキシマブ-サポリン(IC50=0,5pM、図50)による効率的な細胞殺傷を示した。この細胞殺傷効果は、300nM SO1861または300nM SO1861-Ald-EMCHでは観察されなかった(図49および50)。
次に、SO1861またはSO1861-Ald-EMCHを、EGFR発現細胞(A431)について、定濃度の10pM EGFジアンチン(EGFR標的化融合タンパク質毒素)に対してタイトレーションした。これは、SO1861(IC50=800nM)およびSO1861-Ald-EMCH(IC50=2000nM)が、10pMのEGFジアンチンとの組合せにおいて、A431細胞の効率的な細胞殺傷を誘発するのに対し、SO1861またはSO1861-Ald-EMCH単独では、何ら細胞殺傷活性を示さなかったことを表す(図51)。
次に、EGFジアンチンを、種々の定濃度のSO1861またはSO1861-Ald-EMCHに対してタイトレーションした。これは、4829nM SO1861-Ald-EMCH、または1500nM SO1861の存在下での、低いpM濃度のEGFジアンチン(IC50=0,1pM、図52)による効率的な細胞殺傷を示した。この細胞殺傷効果は、10nM SO1861または300nM SO1861では観察されなかった(図52)。
次に、トラスツズマブ-ジアンチンまたトラスツズマブ-サポリン(DAR4で、タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたトラスツズマブ)を、HER2発現細胞(SK-BR-3)について、定濃度の1500nM SO1861または4000nM SO1861-Ald-EMCHに対してタイトレーションした。これは、1500nM SO1861、または4000nM SO1861-Ald-EMCHの存在下での、低いpM濃度のトラスツズマブ-ジアンチン(IC50=0,1pM)またはトラスツズマブ-サポリン(IC50=0,1pM)による、効率的な細胞殺傷を示した(図53)。
図48-53に概説されたこれらすべての結果は、SO1861-Ald-EMCHが、標的化タンパク質毒のエンドソーム脱出および細胞質送達を効率的に促進し、それにより標的化タンパク質毒素の有効濃度を、nMレンジからpMレンジへ有意に低減することを示している。
SO1861-Ald-EMCHを、HSP27mRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(BNA、架橋型核酸)の、エンドソーム脱出を促進する能力について検査した。このため、SO1861-Ald-EMCHを、EGFR/HER2発現細胞(A431)について、定濃度の100nM HSP27BNA、100nM セツキシマブ-HSP27BNA(DAR4で、HSP27BNAにコンジュゲートされたセツキシマブ)、または100nM トラスツズマブHSP27BNA(DAR4で、HSP27BNAにコンジュゲートされたトラスツズマブ)に対してタイトレーションした。これは、SO1861-Ald-EMCH(IC50=700nM)が、A431細胞において、100nM HSP27BNA、100nM セツキシマブ-HSP27BNA(図54)、または100nM トラスツズマブHSP27BNAとの組合せにおいて、効率的なHSP27遺伝子サイレンシング細胞を誘発することを示した(示されず)。SO1861-Ald-EMCH単独では、何らHSP27遺伝子サイレンシング活性は示されなかった(図54)。
次に、セツキシマブ-HSP27BNA(DAR1.5またはDAR4)、トラスツズマブHSP27BNA(DAR4.4)を、EGFR(A431)またはHER2(SK-BR-3)発現細胞において、種々の定濃度のSO1861-Ald-EMCHについてタイトレーションした。これは、A431細胞における、低いnM濃度のセツキシマブ-HSP27BNA(IC50=0,5nM、図55)の、4000nM SO1861-Ald-EMCHの存在下での効率的なHSP27遺伝子サイレンシングを示したのに対し、セツキシマブ-HSP27BNA単独、またはセツキシマブ-HSP27BNA+100nM SO1861-Ald-EMCHでは、何ら遺伝子サイレンシング活性を示さないか、または非常に高い濃度においてわずかな活性を示すに過ぎなかった(IC50>100nM;図550)。SKBR-3細胞では、トラスツズマブHSP27BNA(IC50=0,5nM、図56)が、4000nM SO1861-Ald-EMCHの存在下で効率的なHSP27遺伝子サイレンシング活性を示したのに対し、トラスツズマブ-HSP27BNA単独、またはトラスツズマブHSP27BNA+100nM SO1861-Ald-EMCHは、わずかな遺伝子サイレンシング活性を示すに過ぎなかった(IC50>100nM;図56)。
次に、非標的化HSP27BNAを、種々の細胞系において、定濃度のSO1861-Ald-EMCHについてタイトレーションした。これは、A431、A2058、およびSK-BR-3細胞における、4000nMまたは4829nMのSO1861-Ald-EMCHの存在下での、低いnM濃度のHSP27BNA(IC50(SK-BR3)=2nM;IC50(A431)=10nM;IC50(A2058)=10nM)による効率的なHSP27遺伝子サイレンシングを示したのに対し(図57および58)、HSP27BNA単独は、はるかに高い濃度において遺伝子サイレンシングを誘発した(IC50(SK-BR3)=300nM;IC50(A431)=1000nM;IC50(A2058)>1000nM)(図57および58)。HSP27BNAのこの活性(SO1861-Ald-EMCHの有り無しで)を、HSP27LNA(LNA、ロック核酸)活性と比較した場合、本発明者らは、エンドソーム脱出/遺伝子サイレンシング促進係数は同程度であるが、しかしHSP27BNAに比較してより高いHSP27LNA濃度においてであることを観察した(図58)。
このことは全て、SO1861-Ald-EMCHが、標的化されたアンチセンスBNAオリゴ並びに非標的化BNA/LNAオリゴの、エンドソーム脱出および細胞質送達を効率的に促進すること、それにより、標的化および非標的化アンチセンスオリゴの有効濃度を、μMレンジから低いnMレンジへ有意に低減することを示している。
材料
トラスツズマブ(Tras、Herceptin(登録商標)、Roche)、セツキシマブ(Cet、Erbitux(登録商標)、Merck KGaA)。ジアンチン-cysは、Proteogenix、Franceから製造および購入し、EGFジアンチンは、大腸菌(E.coli)から、標準的な手順により製造した。セツキシマブ-サポリンおよびトラスツズマブ-サポリンコンジュゲートは、Advanced Targeting Systems(San Diego、CA)から製造および購入した。
トラスツズマブ(Tras、Herceptin(登録商標)、Roche)、セツキシマブ(Cet、Erbitux(登録商標)、Merck KGaA)。ジアンチン-cysは、Proteogenix、Franceから製造および購入し、EGFジアンチンは、大腸菌(E.coli)から、標準的な手順により製造した。セツキシマブ-サポリンおよびトラスツズマブ-サポリンコンジュゲートは、Advanced Targeting Systems(San Diego、CA)から製造および購入した。
方法
フラッシュクロマトグラフィー
Grace Reveleris X2(登録商標)C-815 Flash;溶媒送達システム:オートプライミングを備えた3-ピストンポンプ、単回のランで4つまでの溶媒を用いた4つの独立したチャンネル、溶媒枯渇時のオートスイッチライン;最大ポンプ流量率250mL/min;最大圧 50bar(725psi);検出:UV200-400nm、4つまでのUVシグナルおよび全UV範囲のスキャンの組合せ、ELSD;カラムサイズ:装置上で4-330g、ルアー型、750gから3000gまで、オプションのホルダー付き。
フラッシュクロマトグラフィー
Grace Reveleris X2(登録商標)C-815 Flash;溶媒送達システム:オートプライミングを備えた3-ピストンポンプ、単回のランで4つまでの溶媒を用いた4つの独立したチャンネル、溶媒枯渇時のオートスイッチライン;最大ポンプ流量率250mL/min;最大圧 50bar(725psi);検出:UV200-400nm、4つまでのUVシグナルおよび全UV範囲のスキャンの組合せ、ELSD;カラムサイズ:装置上で4-330g、ルアー型、750gから3000gまで、オプションのホルダー付き。
HSP27BNAオリゴ配列
Zhangら(2011)[Y Zhang、Z Qu、S Kim、V Shi、B Liao 1、P Kraft、R Bandaru、Y Wu、LM GreenbergerおよびID Horak“Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid(LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection(トランスフェクション無しでロック核酸(LNA)ベースのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた癌標的のダウンモジュレーション)”「Gene Therapy」、2011年、第18巻、P.326-333])によるHSP27 BNAオリゴ(5’-GGCacagccagtgGCG-3’)([配列番号:2])は、Bio-Synthesis Inc.(Lewisville,Texas)において、5’-チオールC6リンカーの有り無しでオーダーした。HSP27 LNAオリゴ(5’-ggcacagccagtggcg-3’)([配列番号:3])は、Bio-Synthesis Inc.(Lewisville,Texas)においてオーダーした。
Zhangら(2011)[Y Zhang、Z Qu、S Kim、V Shi、B Liao 1、P Kraft、R Bandaru、Y Wu、LM GreenbergerおよびID Horak“Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid(LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection(トランスフェクション無しでロック核酸(LNA)ベースのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた癌標的のダウンモジュレーション)”「Gene Therapy」、2011年、第18巻、P.326-333])によるHSP27 BNAオリゴ(5’-GGCacagccagtgGCG-3’)([配列番号:2])は、Bio-Synthesis Inc.(Lewisville,Texas)において、5’-チオールC6リンカーの有り無しでオーダーした。HSP27 LNAオリゴ(5’-ggcacagccagtggcg-3’)([配列番号:3])は、Bio-Synthesis Inc.(Lewisville,Texas)においてオーダーした。
RNA単離および遺伝子発現分析
細胞由来のRNAは、標準的なプロトコール(Biorad)に従って単離および分析した。使用されたqPCRプライマーを、表A10に示す。
細胞由来のRNAは、標準的なプロトコール(Biorad)に従って単離および分析した。使用されたqPCRプライマーを、表A10に示す。
トラスツズマブ-サポリンおよびセツキシマブ-サポリン合成
カスタムmAB-サポリンコンジュゲートは、Advanced Targeting Systems(San Diego,CA)より製造および購入された。
カスタムmAB-サポリンコンジュゲートは、Advanced Targeting Systems(San Diego,CA)より製造および購入された。
トラスツズマブ-ジアンチンおよびセツキシマブ-ジアンチン合成
ジアンチン-Cys(17.0ml、~9.6mg)は、限外濾過により、Vivaspin T15フィルターチューブ(3,000g、20℃、10分間)を用いて濃縮した。得られた3.25mlのアリコートを、TBS pH7.5で溶出するzeba 10mlスピンカラムを用いてゲル濾過した。
ジアンチン-Cys(17.0ml、~9.6mg)は、限外濾過により、Vivaspin T15フィルターチューブ(3,000g、20℃、10分間)を用いて濃縮した。得られた3.25mlのアリコートを、TBS pH7.5で溶出するzeba 10mlスピンカラムを用いてゲル濾過した。
トラスツズマブ(mAB)またはセツキシマブ(mAB)(0.30ml、~10mg)を、DPBS pH7.5で10mg/mlに希釈し、DPBS pH7.5で溶出するzeba 5mlスピンカラムを通して脱塩し、2.50mg/mlにノーマライズした。mAbのアリコートに対し、DMSO中に新たに調製されたSMCC溶液のアリコート(1.00mg/ml、4.20モル当量、13.9x10-5mmol)を添加し、混合物を短時間ボルテックスし、次いでローラーミキシングを用いて20℃で60分間インキュベートした。その後、反応を、DPBS pH7.5中に新たに調製されたグリシン溶液のアリコート(2.0mg/ml、5.0モル当量、69.5x10-5mmol)の添加によりクエンチした。TBS pH7.5で溶出するzeba 10mlスピンカラムを用いたゲル濾過の後、mAb-SMCC(4.27mg、2.80x10-5mmol、1.514mg/ml)が得られた。
ジアンチン-Cys(7.54mg、25.3x10-5mmol、2.258mg/ml)に対し、TBS pH7.5中に新たに調製されたTCEP溶液のアリコート(1.00mg/ml、0.5モル当量、12.6x10-5mmol)を添加し、混合物を短時間ボルテックスし、次いでローラーミキシングを用いて20℃で60分間インキュベートした。その後、TBS pH7.5で溶出するzeba 10mlスピンカラムを用いたゲル濾過により、ジアンチン-SH(6.0mg、20.2x10-5mmol、1.722mg/ml、ジアンチン:SH=1:1)が得られた。
バルクmAb-SMCCに対し、ジアンチン-SHのアリコート(7.20モル当量)を添加し、混合物を短時間ボルテックスし、次いで20℃で一晩インキュベートした。約16時間後、TBS pH7.5中に新たに調製されたNEM溶液のアリコート(2.50mg/ml、5.0モル当量、101x10-5mmol)の添加により、反応をクエンチした。反応混合物を、0.45μmに対して濾過し、次いで限外濾過により、Vivaspin T15フィルターチューブ(3,000g、20℃、15分間)を用いて、<2mlに濃縮した。コンジュゲートを、DPBS pH7.5で溶出する1.6x35cmのSuperdex 200PGカラムを用いたゲル濾過により精製した。
抗体-(L-HSP27 BNA)n[HSP27 BNAジスルフィド上で]
DAR4でのPEG4-SPDPを介した、トラスツズマブ-(L-HSP27)4、セツキシマブ-(L-HSP27)4合成、およびDAR2でのPEG4-SPDPを介した、セツキシマブ-(L-HSP27)2合成
トラスツズマブおよびセツキシマブは、以降「Ab」と称される。Abは、AbとHSP27 BNAとの間に不安定な(L)ジスルフィド結合を形成するテトラ(エチレングリコール)スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(PEG4-SPDP)リンカーを介して、HSP27 BNAジスルフィドにコンジュゲートされた。手順を、例示的にトラスツズマブ-(L-HSP27 BNA)4について記載する:
DAR4でのPEG4-SPDPを介した、トラスツズマブ-(L-HSP27)4、セツキシマブ-(L-HSP27)4合成、およびDAR2でのPEG4-SPDPを介した、セツキシマブ-(L-HSP27)2合成
トラスツズマブおよびセツキシマブは、以降「Ab」と称される。Abは、AbとHSP27 BNAとの間に不安定な(L)ジスルフィド結合を形成するテトラ(エチレングリコール)スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート(PEG4-SPDP)リンカーを介して、HSP27 BNAジスルフィドにコンジュゲートされた。手順を、例示的にトラスツズマブ-(L-HSP27 BNA)4について記載する:
HSP27 BNAジスルフィドオリゴ(2.7mg、470nmol、6.10mg/ml)を、TCEP(10モル当量、4.7μmol、1.34mg、50mg/ml)と、ローラーミキシングを用いて20℃で30分間反応させた。その後、オリゴ-SHを、TBS pH7.5中に溶出するPD10 G25脱塩カラムによって精製して、速やかに使用した。オリゴ-SHが得られた(2.48mg、90%、1.24mg/ml、SH対オリゴ比=0.8)。
トラスツズマブ(1.5mg、10.3nmol、2.50mg/ml)を、DMSO(1mg/ml)中に新たに調製されたPEG4-SPDP溶液のアリコート(6.81モル当量、70.1nmol、39μg)と、ローラーミキシングを用いて20℃で60分間反応させた。その後、反応をグリシン(TBS pH7.5中に新たに調製された2mg/mlの溶液の15.1μl)でクエンチし、次いでzeba脱塩カラムにより、TBS pH7.5で溶出して脱塩した。得られたTras-S-PEG4-SPDPのアリコートを採取して、UV-Vis分析により検査した。SPDPの取込みは、TCEPを用いてピリジル-2-チオン(PDT)を遊離させ、そして343nmにおけるUV-Vis分析によって測定した(SPDP対Ab比:4)。残りのTras-(S-PEG4-SPDP)4を、新たに調製されたHSP27オリゴヌクレオチド(オリゴ-SH)のアリコート(8モル当量、82.4nmol、1.24mg/ml)と反応させ、ローラーミキシングを用いて20℃で一晩インキュベートした。17時間後、コンジュゲートをUV-Vis分析によって分析し、ピリジル-2-チオン(PDT)の置換によるHSP27の取込みを、343nmにおいて確認した。粗コンジュゲートを、DPBS pH7.5で溶出する1.6x33cmのSephadex G50カラムを用いて精製した。結果として生じたトラスツズマブ-(L-HSP27)4を、単一の分画として得た。収率:n.d. 純度:96%、HSP27 BNA対Ab比=4.4
実施例6-サポニンのエンドソーム脱出促進活性
先には、種々のサポニン(SO1861、SA1642)の効能が、「遊離の」非コンジュゲート分子として、リガンド毒素融合物(例えば、EGFジアンチン)または抗体-タンパク質毒素コンジュゲートと組合せて細胞に同時投与され、標的発現細胞の細胞殺傷活性を促進する結果を生じている。ここでは、サポナリア・オフィキナリスの根の抽出物から単離された3つの異なるサポニン分子(SO1861、SO1862(SO1861の異性体)、SO1832、およびSO1904)を、HeLa(EGFR+)細胞について、非有効定濃度の1.5pM EGFジアンチンの有り無しでタイトレーションした。これは、全ての検査されたサポニン変異体について、EGFジアンチン無しの処理に比較して、細胞殺傷活性の強い促進を示した(IC50=300nM;図63A)。次に、EGFジアンチンを、定濃度のサポニン(~1000nM)を用いてタイトレーションし、これは、全ての使用したサポニンSO1861、SO1862(SO1861の異性体)、SO1832、およびSO1904について観察された、EGFジアンチンの低いpM濃度における強い標的化細胞殺傷促進を示した(IC50=0.4pM;図63B)。EGF-ジアンチン単独では、非常に高い濃度において細胞殺傷を誘発し得たにすぎない(IC50=10.000pM)。これは、これらの特定のタイプのサポニンが全て、非常に少量の利用可能な標的化毒素を用いるだけで、効率的にエンドソーム脱出を誘発する内在的な能力を持つことを示している。
先には、種々のサポニン(SO1861、SA1642)の効能が、「遊離の」非コンジュゲート分子として、リガンド毒素融合物(例えば、EGFジアンチン)または抗体-タンパク質毒素コンジュゲートと組合せて細胞に同時投与され、標的発現細胞の細胞殺傷活性を促進する結果を生じている。ここでは、サポナリア・オフィキナリスの根の抽出物から単離された3つの異なるサポニン分子(SO1861、SO1862(SO1861の異性体)、SO1832、およびSO1904)を、HeLa(EGFR+)細胞について、非有効定濃度の1.5pM EGFジアンチンの有り無しでタイトレーションした。これは、全ての検査されたサポニン変異体について、EGFジアンチン無しの処理に比較して、細胞殺傷活性の強い促進を示した(IC50=300nM;図63A)。次に、EGFジアンチンを、定濃度のサポニン(~1000nM)を用いてタイトレーションし、これは、全ての使用したサポニンSO1861、SO1862(SO1861の異性体)、SO1832、およびSO1904について観察された、EGFジアンチンの低いpM濃度における強い標的化細胞殺傷促進を示した(IC50=0.4pM;図63B)。EGF-ジアンチン単独では、非常に高い濃度において細胞殺傷を誘発し得たにすぎない(IC50=10.000pM)。これは、これらの特定のタイプのサポニンが全て、非常に少量の利用可能な標的化毒素を用いるだけで、効率的にエンドソーム脱出を誘発する内在的な能力を持つことを示している。
この検査を拡張するため、他の供給源に由来するサポニンを分析した。カスミソウ(Gypsophila elegans M.Bieb)の根の抽出物から精製されたサポニン(GE1741)を、HeLa細胞について、1.5pM EGFジアンチンの有り無しでタイトレーションし、精製されたSO1861と比較した。GE1741もまた、EGFジアンチン誘発性のHeLa細胞殺傷を促進するが、しかしSO1861に比較してやや低い効率を示し(GE1741 IC50=800nM、図63C)、またより高い一般毒性を示した(EGFジアンチン無しでIC50=5,000nM、図63C)。同様の検査においては、キラヤ・サポナリアの異なる部分精製されたサポニンの混合物(QSmix1-3)が、HeLa細胞に対し、1.5pM EGFジアンチンと同時投与され、3つのうち2つ(QSmix1およびQSmix3)について、SO1861と同様の活性が示された(IC50 QSmix/QSmix3=300nM;図63D)。QSmix(2)は、1.5pM EGFジアンチン誘発性の細胞殺傷の促進においては効率がより低いが(IC50=2000nM;図63D)、しかしながら、何ら一般毒性は観察されない。これは、QS抽出物においても、特定のタイプのサポニンが利用可能であって、標的化リガンド毒素EGFジアンチンのエンドソーム脱出を効率的に誘発することを示す。したがって、本実施例において記載されたサポニン、例えばキラヤ・サポナリアサポニン、GE1741、SO1861、SO1862、SO1832、およびSO1904は、本発明によって誘導体化するために特に魅力的なサポ二ンである。
実施例7:サポニンおよびサポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性
不安定/酸感受性誘導体(Ald-EMCHまたはSO1861-L-N3(またSO1861-N3およびSO1861-アジドまたはSO1861-N3/アジドとも称される)を、アルデヒド基を介してSO1861に適用して、SO1861-Ald-EMCHまたはSO1861-L-N3を生成した。SO1861-Ald-EMCHの活性を確認するため、EGFR発現(A431,HeLa)および非発現細胞(A2058)について、固定非有効濃度(1.5pM)のEGFジアンチンの有り無しで、この分子をタイトレーションした。3つの全ての細胞系において、SO1861単独では強い細胞生存率減少が示されたのに対し、単一化合物としてのSO1861-Ald-EMCHは、25,000nMまで何ら毒性を示さなかった(図64A-C)。SO1861-Ald-EMCHを1.5pM EGFジアンチンと組合せた場合、EGFR+A431およびHeLa細胞において、強い標的特異な細胞生存率減少が観察される(IC50=3,000nM、図64A、B)のに対し、EGFR--A2058細胞は、全く影響を受けない(図64C)。同様の結果が、SO1861-L-N3について得られた。1.5pM EGFジアンチンと同時投与されたSO1861-L-N3もまた、A431およびHeLa細胞に対し、効率的な殺細胞を示す(IC50=3,000nM)が、しかしEGFジアンチン無しでは、一般毒性は10,000nMより上において観察される(図64D、64E)。
不安定/酸感受性誘導体(Ald-EMCHまたはSO1861-L-N3(またSO1861-N3およびSO1861-アジドまたはSO1861-N3/アジドとも称される)を、アルデヒド基を介してSO1861に適用して、SO1861-Ald-EMCHまたはSO1861-L-N3を生成した。SO1861-Ald-EMCHの活性を確認するため、EGFR発現(A431,HeLa)および非発現細胞(A2058)について、固定非有効濃度(1.5pM)のEGFジアンチンの有り無しで、この分子をタイトレーションした。3つの全ての細胞系において、SO1861単独では強い細胞生存率減少が示されたのに対し、単一化合物としてのSO1861-Ald-EMCHは、25,000nMまで何ら毒性を示さなかった(図64A-C)。SO1861-Ald-EMCHを1.5pM EGFジアンチンと組合せた場合、EGFR+A431およびHeLa細胞において、強い標的特異な細胞生存率減少が観察される(IC50=3,000nM、図64A、B)のに対し、EGFR--A2058細胞は、全く影響を受けない(図64C)。同様の結果が、SO1861-L-N3について得られた。1.5pM EGFジアンチンと同時投与されたSO1861-L-N3もまた、A431およびHeLa細胞に対し、効率的な殺細胞を示す(IC50=3,000nM)が、しかしEGFジアンチン無しでは、一般毒性は10,000nMより上において観察される(図64D、64E)。
HATUを、SO1861のカルボン酸基を介してSO1861にコンジュゲートし、SO1861-HATUまたはSO1861-Glu-HATUとも称される、SO1861-(S)を生成した。活性を測定するため、EGFR発現HeLa細胞において、様々な濃度のSO1861-(S)を1.5p MEGFジアンチンと同時投与し、細胞殺傷活性について検査した。SO1861-(S)は、SO1861と同様の活性を示し、SO1861-Ald-EMCHについて観察されたものと同様に、カルボン酸基へのコンジュゲーションが何らこの分子のエンドソーム脱出促進活性に影響を及ぼさないことを示している(図65)。
Claims (30)
- トリテルペンアグリコンコア構造と、前記アグリコンコア構造に結合された、第1の糖鎖および第2の糖鎖の少なくとも1つとを含む、サポニンをベースとするサポニン誘導体であって、これにおいて:
i. 前記サポニン誘導体が、誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含むか;または
ii. 前記サポニン誘導体が、前記第1の糖鎖を含み、これにおいて、前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有するか:または
iii. 前記サポニン誘導体が、前記第2の糖鎖を含み、これにおいて、前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有するか;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含み;
ここで、前記第1の糖鎖および前記第2の糖鎖が、独立して、単糖、直鎖オリゴ糖、および分岐オリゴ糖から選択される、
サポニン誘導体。 - 前記サポニン誘導体が、モノデスモシジックトリテルペングリコシドまたはビデスモシジックトリテルペングリコシド、より好ましくはビデスモシジックトリテルペングリコシドである、請求項1に記載のサポニン誘導体。
- 前記サポニン誘導体が、前記第1の糖鎖を含み、ここで、前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し、および/またはこれにおいて、前記サポニン誘導体が、前記第2の糖鎖を含み、これにおいて、前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基を含み、
好ましくは、前記サポニン誘導体が、誘導体化されている前記第1の糖鎖と、誘導体化されている前記第2の糖鎖との双方を含み、
より好ましくは、前記サポニン誘導体が、誘導体化されている前記第1の糖鎖と、誘導体化されている前記第2の糖鎖との双方を含み、かつ前記サポニン誘導体が、アルデヒド基または誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含み、
最も好ましくは、前記サポニン誘導体が、誘導体化されている前記第1の糖鎖と、誘導体化されている前記第2の糖鎖との双方を含み、かつ前記サポニン誘導体が、アルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含む、請求項1または2に記載のサポニン誘導体。 - 前記サポニン誘導体が:
2アルファ-ヒドロキシオレアノール酸;
16アルファ-ヒドロキシオレアノール酸;
ヘデラゲニン(23-ヒドロキシオレアノール酸);
16アルファ,23-ジヒドロキシオレアノール酸;
ギプソゲニン;
キラ酸;
プロトアエスシゲニン-21(2-メチルブタ-2-エノアート)-22-アセタート;
23-オキソ-バリングトゲノールC-21,22-ビス(2-メチルブタ-2-エノアート);
23-オキソ-バリングトゲノールC-21(2-メチルブタ-2-エノアート)-16,22-ジアセタート;
ジギトゲニン;
3,16,28-トリヒドロキシオレアナン-12-エン;
ギプソゲニン酸;
および
それらの誘導体、
からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、
好ましくは、前記サポニン誘導体が、キラ酸およびギプソゲニンまたはそれらの誘導体から選択されるアグリコンコア構造を含み、より好ましくは、前記サポニン誘導体アグリコンコア構造が、キラ酸またはその誘導体である、請求項1~3のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。 - 前記サポニン誘導体が、キラ酸、ギプソゲニン、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、好ましくは、前記サポニン誘導体が、キラ酸、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、これにおいて、前記第1の糖鎖が、存在する場合、前記アグリコンコア構造のC3原子またはC28原子に結合され、好ましくは前記C3原子に結合され、および/またはこれにおいて、前記第2の糖鎖が、存在する場合、前記アグリコンコア構造の前記C28原子に結合される、請求項1~4のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。
- 前記第1の糖鎖が、存在する場合:
GlcA-,
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-Ara-,
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-,
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、および
それらの誘導体、から選択され、
および/または前記第2の糖鎖が、存在する場合:
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-,
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-,
Ara-,
Xyl-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc- ここでR1は4E-メトキシケイ皮酸であり、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc- ここでR2は4Z-メトキシケイ皮酸であり、
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-di-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc- ここでR3は4E-メトキシケイ皮酸であり、
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
(Ara-またはXyl-)(1→3)-(Ara-またはXyl-)(1→4)-(Rha-またはFuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-またはFuc-)(1→4)]-(Rha-またはFuc-),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc- ここでR4は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc- ここでR5は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-di-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- ここでR6は5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- ここでR7は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- ここでR8は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- ここでR9は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- ここでR10は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- ここでR11は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり、
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- ここでR12は5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタノイル]-3,5-ジヒドロキシ-6-メチル-オクタン酸)であり
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-,および
それらの誘導体、から選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。 - 前記サポニン誘導体が、前記第1の糖鎖を含み、かつ前記第2の糖鎖を含み、ここで前記第1の糖鎖が、1を超える糖部分を含み、前記第2の糖鎖が、1を超える糖鎖部分を含み、かつこれにおいて、前記アグリコンコア構造がキラ酸またはギプソゲニンであり、ここで:
i. 前記アグリコンコア構造のアルデヒド基が誘導体化されていること、
ii.前記第1の糖鎖が、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有すること:および
iii.前記第2の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有すること、
の1つ、2つ、または3つ、好ましくは1つまたは2つである、請求項1~6のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。 - 前記サポニン誘導体が:キラヤ(Quillaja)樹皮サポニン、ジプサコシドB、サイコサポニンA、サイコサポニンD、マクラントイジンA、エスクレントシドA、フィトラッカゲニン、エシネート、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、アルファ-ヘデリン(Hederin)、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1,NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、SO1862、QS-7,QS1861,QS-7 api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21 A-apio、QS-21 A-xylo、QS-21 B-apio、QS-21 B-xylo、ベータ-エスシン(Aescin)、エスシンIa、茶種子(Teaseed)サポニンI、茶種子サポニンJ、アッサムサポニン(Assamsaponin)F、ジギトニン、プリムラ酸(Primula acid)1、およびAS64R、それらの立体異性体およびそれらの組合せ、からなる群より選択されるサポニンの誘導体であり、好ましくは、前記サポニン誘導体が、QS-21誘導体、SO1861誘導体、SA1641誘導体、およびGE1741誘導体からなる群より選択され、さらに好ましくは、前記サポニン誘導体が、QS-21誘導体およびSO1861誘導体からなる群より選択され、最も好ましくは、前記サポニン誘導体が、SO1861誘導体である、請求項1~7のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。
- 前記サポニン誘導体が、分子1:
前記第1の糖鎖A1は、水素、単糖、または直鎖もしくは分岐オリゴ糖を表し、好ましくは、A1は、請求項6に定義されたような糖鎖を表し、より好ましくは、A1は、請求項6に定義されたような糖鎖を表しかつA1は、グルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部からなり;
前記第2の糖鎖A2は、水素、単糖、または直鎖もしくは分岐オリゴ糖を表し、好ましくは、A2は、請求項6に定義されたような糖鎖を表し、より好ましくは、A2は、請求項6に定義されたような糖鎖を表しかつA2は、少なくとも1つのアセトキシ(Me(CO)O-)基、例えば1つ、2つ、3つ、または4つのアセトキシ基を含有し、ここで、A1およびA2の少なくとも1つは水素ではなく、好ましくはA1およびA2の双方がオリゴ糖鎖であり;
かつRは、ギプソゲニン中の水素またはキラ酸中のヒドロキシルである]
によって表される、請求項4に記載のキラ酸サポニンまたはギプソゲニンサポニンの誘導体であり、ここで、前記サポニン誘導体が、以下の誘導体化:
i. キラ酸またはギプソゲニンの位置C23におけるアルデヒド基が誘導体化されている;
ii. A1が請求項6に定義されたような糖鎖を表しかつA1がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部からなる場合、A1のグルクロン酸部分のカルボキシル基が誘導体化されている;および
iii. A2が請求項6に定義されたような糖鎖を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を有する場合、A2の1つの糖部分または2つ以上の糖部分の、1つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が誘導体化されている、
の少なくとも1つが存在する分子1によって表される前記サポニンに対応する、請求項1~8のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。 - A1が、請求項6に定義されたような糖鎖を表しかつグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部からなり、かつこれにおいて、A1のグルクロン酸部分のカルボキシル基が誘導体化されており、および/または、A2が、請求項6に定義されたような糖鎖を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を含有し、かつこれにおいて、A2の少なくとも1つのアセトキシ基が誘導体化されている、請求項9に記載のサポニン誘導体。
- 分子1によって表される前記サポニンが、ビスデスモシド系トリテルペンサポニンである、請求項9または10に記載のサポニン誘導体。
- 前記サポニン誘導体が分子1によって表される前記サポニンに対応し、これにおいて、以下の誘導体化:
i. 前記キラ酸またはギプソゲニンの位置C23におけるアルデヒド基が、以下によって誘導体化される;
- アルコールへの還元;
- N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、それにより、サポニン-Ald-EMCH、例えばSO1861-Ald-EMCHまたはQS-21-Ald-EMCHを提供し、ここで、前記EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
- N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド(BMPH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、これにおいて前記BMPHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;または
- N-[κ-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド(KMUH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、これにおいて前記KMUHの前記マレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
ii. A1が請求項6に定義されたような糖鎖を表しかつA1がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部からなる場合、A1のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基が、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMPD)またはN-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化され、それにより、サポニン-Glu-AMPD、例えばQS-21-Glu-AMPDもしくはSO1861-Glu-AMPD、またはサポニン-Glu-AEM、例えばQS-21-Glu-AEMもしくはSO1861-Glu-AEMを提供する;および
iii. A2が請求項6に定義されたような糖鎖を表しかつA2が少なくとも1つのアセトキシ基を有する場合、A2の1つの糖部分または2つ以上の糖部分の、1つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されている、
の少なくとも1つが存在し、好ましくは1つまたは2つが存在する、請求項9~11のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。 - A1が、
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcAであり、および/またはA2が、Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fucであり、好ましくは、分子1によって表される前記サポニンが、3-O-ベータ-D-ガラクトピラノシル-(1→2)-[ベータ-D-キシロピラノシル-(1→3)]-ベータ-D-グルクロノピラノシルキラ酸-28-O-ベータ-D-グルコピラノシル-(1→3)-ベータ-D-キシロピラノシル-(1→4)-アルファ-L-ラムノピラノシル-(1→2)-[ベータ-D-キシロピラノシル-(1→3)-4OAc-ベータ-D-キノボピラノシル-(1→4)]-ベータ-D-フコピラノシドであり、より好ましくは SO1861、GE1741、SA1641および/またはQS-21、最も好ましくはSO1861である、請求項9~12のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。 - 前記サポニン誘導体が:SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21 A-api、QS-21 A-xyl、QS-21B、QS-21 B-api、QS-21 B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、キラヤサポニン(Quillajasaponin)、サポニナム・アルバム(Saponinum album)、QS-18、Quil-A、Gyp1、ギプソシドA、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、の誘導体、それらの立体異性体およびそれらの組合せからなる群より選択され、好ましくは、前記サポニン誘導体が、SO1861誘導体、GE1741誘導体、SA1641誘導体、QS-21誘導体、およびそれらの組合せからなる群より選択され、より好ましくは、前記サポニン誘導体が、SO1861誘導体またはQS-21誘導体であり、最も好ましくは、サポニン誘導体がSO1861誘導体である、請求項1~13のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。
- 前記サポニン誘導体が単一誘導体化を含むSO1861誘導体であり、ここで前記単一誘導体化が、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)の、SO1861のグルクロン酸部分のカルボキシル基への結合によるか、または(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(BOP)の、SO1861のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基への結合による、SO1861の前記グルクロン酸の前記カルボキシル基の変換であり、或いはこれにおいて前記サポニン誘導体が;N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置C23にアルデヒド基を含有するSO1861誘導体を表す;分子2によって表されるSO1861誘導体であり:
- 前記サポニン誘導体が単一誘導体化を含むSO1861誘導体ではないという前提条件付きであり、これにおいて、前記単一誘導体化が、1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)の、SO1861のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基との反応による、SO1861の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基の変換であり、或いはこれにおいて、前記サポニン誘導体が;N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化された、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置C23においてアルデヒド基を含有するSO1861誘導体を表す;分子2によって表される、請求項1~14のいずれか1項に記載のサポニン誘導体:
- i.前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、以下によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し;
- アルコールへの還元;
- N-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、ここで、前記EMCHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
- N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド(BMPH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここで前記BMPHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;または
- N-[κ-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド(KMUH)との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここで前記KMUHのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される;
ii. 前記第1の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール(AMPD)またはN-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し;かつ
iii. 前記第2の糖鎖が、脱アセチル化によるヒドロキシル基(HO-)への変換によって誘導体化されているアセトキシ(Me(CO)O-)基を含有し;または
iv. 前記サポニン誘導体が、誘導体化i.ii.およびiii.の2つまたは3つの任意の組合せ、好ましくは誘導体化i.ii.およびiii.の2つの任意の組合せを含み;
好ましくは、前記サポニン誘導体がアグリコン構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、EMCHとの反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、前記EMCHの前記マレイミド基が、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される、請求項1~16のいずれか1項に記載のサポニン誘導体。 - 前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、アルデヒド基を含有し、かつここで、前記第1の糖鎖がカルボキシル基、好ましくは、N-(2-アミノエチル)マレイミド(AEM)との反応を介したアミド結合への変換によって誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有する、請求項17に記載のサポニン誘導体。
- 前記アグリコンコア構造中の前記アルデヒド基がN-ε-マレイミドカプロン酸ヒドラジド(EMCH)との反応を介したヒドラジド結合への変換によって誘導体化され、かつ前記サポニンがSO1861である場合には、前記グルクロン酸および前記アセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがSO1861でありかつSO1861の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基が1-[ビス-(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU)とSO1861の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基との反応によって誘導体化される場合には、前記アルデヒド基および前記アセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた修飾されるという条件付きである、請求項17に記載のサポニン誘導体。
- 前記サポニン誘導体の前記アグリコンコア構造中の前記アルデヒド基がEMCHとの反応を介して誘導体化され、かつ前記サポニンがSO1861である場合には、前記グルクロン酸および前記アセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがSO1861でありかつSO1861の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基が、結合したHATUにより誘導体化される場合には、前記アルデヒド基および前記アセトキシ基(Me(CO)O-)のうちの少なくとも1つもまた誘導体化されるという条件付きである、請求項19に記載のサポニン誘導体。
- 請求項1~20のいずれか1項に記載の前記サポニン誘導体と、任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤とを含む、第1の医薬組成物。
- ・ 請求項21または22に記載の前記第1の医薬組成物と、
・ 抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤を含む、第2の医薬組成物と、
を含む医薬組合せ剤。 - 請求項1~20のいずれか1項に記載の前記サポニン誘導体を含み、かつさらに:抗体-毒素コンジュゲート、受容体-リガンド-毒素コンジュゲート、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-核酸コンジュゲート、または受容体-リガンド-核酸コンジュゲートの任意の1つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および/または希釈剤を含む、第3の医薬組成物。
- 前記第2の医薬組成物または前記第3の医薬組成物が、抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つ以上を含み、ここで、前記薬物が、例えばサポリンおよびジアンチンといった毒素であり、かつここで、前記オリゴヌクレオチドが、例えばアポリポタンパク質BまたはHSP27の遺伝子サイレンシングのための例えばsiRNAまたはBNAである、請求項23に記載の医薬組合せ剤または請求項24に記載の第3の医薬組成物。
- 前記サポニン誘導体が、請求項14に記載のサポニン誘導体、好ましくは分子2または分子3によって表される前記サポニン誘導体である、請求項23もしくは請求項25に記載の医薬組合せ剤、または請求項24もしくは25に記載の第3の医薬組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項21または22に記載の第1の医薬組成物、請求項23または25-26のいずれか1項に記載の医薬組合せ剤、または請求項24-25のいずれか1項に記載の第3の医薬組成物。
- 癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病A、血友病B、アルファ-1アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、請求項21または22に記載の第1の医薬組成物、請求項23または25-26のいずれか1項に記載の医薬組合せ剤、または請求項24-25のいずれか1項に記載の第3の医薬組成物。
- 分子を細胞の外側から前記細胞の内側へ、好ましくは前記細胞のサイトゾル中へ移行させるための、インビトロまたはエクスビボの方法であって:
a) 細胞を提供する工程と;
b) 工程a)において提供された前記細胞の内側に、前記細胞の外側から移行させるための前記分子を提供する工程と;
c) 請求項1~20のいずれか1項に記載のサポニン誘導体を提供する工程と;
d) 工程a)の前記細胞を、インビトロまたはエクスビボにおいて、工程b)の前記分子および工程c)の前記サポニン誘導体と接触させ、それにより前記分子の前記細胞の外側から前記細胞内への移行を確立させる工程とを含む、方法。 - 前記細胞が、ヒト細胞、例えばT-細胞、NK-細胞、腫瘍細胞であり、および/またはこれにおいて前記サポニン誘導体が、請求項13~20のいずれか1項に記載のサポニン誘導体であり、および/またはこれにおいて、工程b)の前記分子が:抗体-薬物コンジュゲート、受容体-リガンド-薬物コンジュゲート、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体-リガンド-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の1つであり、ここで、前記薬物が、例えば毒素であり、かつこれにおいて、前記オリゴヌクレオチドが、例えばsiRNAまたはBNAである、請求項29記載の方法。
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