KR20230044198A - 사포닌 및 단일-도메인 항체의 접합체, 상기 접합체를 포함하는 약학적 조성물, 이의 치료 용도 - Google Patents

사포닌 및 단일-도메인 항체의 접합체, 상기 접합체를 포함하는 약학적 조성물, 이의 치료 용도 Download PDF

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KR1020237002711A
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루벤 포스텔
가이 허먼스
헨드릭 푸치스
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사프렘 테크놀로지스 비.브이.
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Abstract

본 발명은 세포 외부로부터 상기 세포 내로 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 유형의 사포닌 또는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드 유형의 사포닌을 전달하기 위한 접합체로서, 상기 세포에 결합할 수 있으며 사포닌에 공유 결합되는 단일-도메인 항체를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 접합체를 포함하는 제1 약제학적 조성물 및 활성 약제학적 성분을 포함하는 제2 약제학적 조성물을 포함하는 약제학적 조성물 또는 본 발명의 접합체 및 활성 약제학적 성분을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제로 사용하거나 암, 자가면역 질환, 감염, 효소결핍증, 유전자 결손의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 약제학적 조합물 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 접합체의 적용을 포함하는, 분자를 세포 외부로부터 상기 세포 내부로 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명의 약제학적 조합물 또는 본 발명의 약제학적 조성물, 또는 본 발명의 접합체, 또는 이의 사용을 위한 설명서를 포함하는 부품 키트에 관한 것이다.

Description

사포닌 및 단일-도메인 항체의 접합체, 상기 접합체를 포함하는 약학적 조성물, 이의 치료 용도
본 발명은 세포 외부로부터 상기 세포 내로 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 유형의 사포닌 또는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드 유형의 사포닌을 전달하기 위한 접합체로서, 상기 세포에 결합할 수 있으며 사포닌에 공유 결합되는 단일-도메인 항체를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 접합체를 포함하는 제1 약제학적 조성물 및 활성 약제학적 성분을 포함하는 제2 약제학적 조성물을 포함하는 약제학적 조성물 또는 본 발명의 접합체 및 활성 약제학적 성분을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제로 사용하거나 암, 자가면역 질환, 감염, 효소결핍증, 유전자 결손의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명의 약제학적 조합물 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 접합체의 적용을 포함하는, 분자를 세포 외부로부터 상기 세포 내부로 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다. 최종적으로, 본 발명의 약제학적 조합물 또는 본 발명의 약제학적 조성물, 또는 본 발명의 접합체, 또는 이의 사용을 위한 설명서를 포함하는 부품 키트에 관한 것이다.
치료 생물학적 활성을 갖는 분자는 많은 경우 이론상, 이를 필요로 하는 인간 환자의 암과 같은 질환을 치료하는 데 효과적인 치료 약물로서 적용하기에 적합하다. 전형적인 예는 소분자 생물학적 활성 모이어티이다. 그러나, 전부는 아니지만 현재 임상에서 사용되는 많은 잠재적인 약물-유사 분자 및 치료제는 많은 단점 및 결점 중 적어도 하나를 겪고 있다. 인체에 투여될 때, 치료 활성 분자는 치료될 질환 또는 건강 문제의 근본적인 측면과 관련된 생물학적 활성뿐만 아니라 표적외(off-target) 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 표적외 효과는 바람직하지 않으며, 투여된 분자에 의한 건강 또는 심지어 생명을 위협하는 부작용을 유발할 위험이 있다. 이러한 부작용의 발생으로 인해 많은 약물-유사 화합물 및 치료 모이어티가 3상 임상 시험 또는 심지어 4상 임상 시험(시판후 추적관찰)을 통과하지 못한다. 따라서, 소분자 치료제와 같은 약물 분자의 제공에 대한 강한 요구가 있으며, 약물 분자의 치료 효과는 특히, 예를 들어 (1) 질환을 유발하는 생물학적 요인 또는 생물학적 과정에 대해 매우 특이적일 것, (2) 충분히 안전할 것, (3) 충분히 효능이 있을 것, (4) 비질환 세포에 대한 표적외 활성이 거의 또는 전혀 없이 질환 세포로 충분히 지향될 것, (5) 충분히 적시적인 작용 방식을 가질 것(예를 들어, 투여된 약물 분자가 특정 시간 프레임 내에 인간 환자의 표적 부위에 도달해야 하고 특정 시간 프레임 동안 표적 부위에 남아 있어야 함), 및/또는 (6) 환자의 체내에서 충분히 오래 지속되는 치료 활성을 가질 것을 요한다. 불행히도, 이미 오래 지속된 집중적인 연구에도 불구하고, 그리고 개별적으로 다루어진 직면한 어려움에 대한 여러 영역에서 이루어진 인상적인 진전에도 불구하고, 위에서 설명한 유익한 특성의 대부분 또는 전부를 가진 '이상적인' 치료제는 현재까지 환자에게 제공되고 있지 않다.
화학요법은 암 치료를 위한 가장 중요한 치료 옵션 중 하나이다. 그러나, 화학요법은 건강한 조직의 세포를 분열시키는 것에 비해 암세포에 대한 특이성이 높지 않기 때문에 많은 경우에 좁은 치료범위(therapeutic window)와 관련된다. 단일클론 항체의 발명은 정상 세포에 해를 가하지 않으면서 세포독성제를 암세포에 표적화 전달하는 메커니즘으로서 특이적 결합 특성을 이용할 수 있는 가능성을 제공하였다. 이는 세포독성 이펙터(페이로드 또는 탄두로도 알려짐)를 항체에 화학적으로 접합하여 항체-약물 접합체(ADC)를 생성함으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 접합되지 않은 형태에서 제한된 치료지수(유효 용량에 대해 독성 용량을 비교하는 비)를 갖는 엠탄신(DM1)과 같은 매우 강력한 페이로드가 사용된다. 캐사일라(Kadcycla)로도 알려진, 트라스투주맙에 대한 DM1의 접합(아도-트라스투주맙 엠탄신)은 원숭이에서 DM1의 허용 용량을 2배 이상 향상시킨다. 지난 수십 년 동안 치료용 ADC를 개발하기 위해 막대한 노력과 투자가 이루어졌다. 그러나, 기대되는 전임상 데이터에도 불구하고 ADC를 임상에 도입하는 것은 여전히 어려운 일이다. 임상용으로 승인된 최초의 ADC는 2000년, 재발성 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 젬투주맙 오조가미신(마일로타그(Mylotarg), CD33 표적화, Pfizer/Wyeth)이었다. 그러나 마일로타그는 안전성 프로필을 포함한 여러 가지 우려로 인해 미국 연방 의약품국(FDA)의 요청에 따라 시장에서 철수되었다. 마일로타그로 치료받은 환자는 기존 화학요법으로 치료받은 환자보다 사망률이 더 높은 것으로 나타났다. 마일로타그는 더 낮은 권장 용량, 화학요법과 병용되거나 자체적인 상이한 스케줄, 및 새로운 환자 집단을 사용하여 2017년에 다시 판매 허가를 받았다. 현재까지 5개의 ADC만이 임상용으로 승인되었으며, 그 사이에 약 55개 ADC의 임상 개발이 중단되었다. 그러나, 관심은 여전히 높으며 현재 거의 600건의 임상 시험에서 약 80개의 ADC가 여전히 임상 개발 중에 있다.
보통은 환자에게 허용되지 않는 독성 페이로드를 사용할 가능성에도 불구하고, 낮은 치료지수(독성 용량 대 유효 용량을 비교하는 비율)는 임상 개발에서 많은 ADC의 중단 원인이 되는 주요 문제이며, 이는 정상 세포에 대한 표적외 독성, 세포독성제에 대한 내성 발달, 및 순환계에서의 약물 조기 방출과 같은 여러 메커니즘에 의해 발생할 수 있다. ADC에 대한 FDA의 체계적 검토 결과, 대부분의 ADC의 독성 프로파일은 사용된 페이로드에 따라 분류될 수 있지만 사용된 항체에 따라 분류되지는 않는 것으로 나타났으며, 이는 독성이 페이로드의 조기 방출에 의해 대부분 결정됨을 시사한다. 중단된 약 55개의 ADC 중 적어도 23개는 치료지수가 좋지 않았기 때문인 것으로 추정된다. 예를 들어, 트라스투주맙 테시린 접합체(ADCT-502, HER-2 표적화, ADC 치료제)의 개발은 아마도 상당한 수준의 HER-2를 발현하는 폐 조직에서의 표적상(on-target), 조직외(off-tissue) 효과로 인해, 치료지수가 낮아 최근 중단되었다. 또한, 3상 시험 중인 여러 ADC가 1차 평가변수 누락으로 인해 중단되었다. 예를 들어, 새로 진단된 교모세포종 환자를 대상으로 시험된 데파툭시주맙 마포도틴 접합체(ABT-414, EGFR 표적화, AbbVie), 및 백금-내성 난소암 환자를 대상으로 시험된 미르베툭시맙 소라브탄신 접합체(IMGN853, 엽산 수용체 알파(FRα) 표적화, ImmunoGen)의 3상 시험은 생존 이점을 나타내지 않으며 최근 중단되었다. 일부 ADC의 임상적으로 사용되는 용량은 전체 항암 활성에 충분하지 않을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 예를 들어, 아도-트라스투주맙 엠탄신은 인간에서 3.6 mg/kg의 MTD를 갖는다. 유방암의 전임상 모델에서, 아도-트라스투주맙 엠탄신은 3 mg/kg 이상의 용량 수준에서 종양 퇴행을 유도했지만, 15 mg/kg에서 더 강력한 효능이 관찰되었다. 이는 임상적으로 투여된 용량에서 아도-트라스투주맙 엠탄신이 잠재적인 최대 항종양 효과를 나타내지 못할 수 있음을 시사한다.
ADC는 주로 항체, 페이로드와 같은 세포독성 모이어티, 및 링커로 구성된다. ADC의 각 구성요소를 대상으로, 기존 문제를 극복하기 위해 새로운 ADC의 설계 및 개발에서 몇 가지 새로운 전략이 제안되고 수행되었다. 예를 들어, 항체 구성요소에 대한 적절한 항원 표적의 식별 및 검증, 종양에서 높은 발현 수준을 갖고 정상 조직에서는 거의 또는 전혀 발현되지 않는 항원, 순환하는 ADC에 접근할 수 있도록 세포 표면에 존재하는 항원, 및 결합 후 ADC를 세포에 내재화할 수 있는 항원의 선택; 및 대안적 활성 메커니즘; 화학요법제를 세포 밖으로 운반할 수 있는 단백질에 의해 유도된 내성을 극복하고 ADC의 용해도 및 약물 대 항체 비(DAR)를 향상시키는 링커의 설계 및 최적화; 더 많은 페이로드의 포함에 의한 DAR 비의 향상, 항체 동질성 및 개발 가능성을 개선하기 위한 항체의 선택 및 최적화. ADC의 기술 개발과 더불어, 치료지수를 극대화하기 위한 새로운 임상 및 이행 전략이 또한 전개되고 있다(예를 들어, 분할 투약을 통한 투약 스케줄의 변경; 생체분포 연구의 수행; 환자 선택을 최적화하고, 반응 신호를 조기에 포착하고 반응의 기간과 깊이를 모니터링하고, 복합 연구에 정보를 제공하기 위한 바이오마커의 함유).
임상 잠재력이 있는 ADC의 예로는, 브렌툭시맙 베도틴, 이노투주맙 오조가미신, 목세투모맙 파수도톡스, 및 폴라투주맙 베도틴과 같은 ADC가 있으며, 이들은 림프성 악성종양 및 다발성 골수종에 대한 치료 옵션으로 평가된다. (악성) B-세포 상의 CD79b에 결합하는 폴라투주맙 베도틴, 및 CD22에 결합하는 피나투주맙 베도틴이 임상 시험에서 테스트되며, 각각의 ADC는 CD20에 결합하는 단일클론 항체인 병용투여 리툭시맙과 조합되었고 페이로드는 제공되지 않았다(B. Yu and D. Liu, Antibody-drug conjugates in clinical trials for lymphoid malignancies and multiple myeloma; Journal of Hematology & Oncology (2019) 12:94). 이러한 예와 같은 단일클론 항체의 조합은 앞서 언급한 ADC의 바람직한 특성의 대부분 또는 전부가 결합된 '마법의 탄환'에 도달하기 위한 또 다른 접근법 및 시도이다.
한편 지난 수십 년 동안 핵산 기반 치료제가 개발되고 있다. 치료용 핵산은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON), 및 짧은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA, 및 유전자 요법, RNA 간섭(RNAi)과 같은 접근법을 위한 DNA 및 RNA 압타머를 기반으로 할 수 있다. 그중 다수는 DNA 또는 RNA 발현을 억제하여 질환 관련 비정상 단백질의 발현을 방지함으로써 동일한 근본적 작용 기반을 공유한다. 가장 많은 임상 시험이 유전자 요법 분야에서 진행되고 있으며, 전 세계적으로 거의 2600건의 임상 시험이 진행 중이거나 완료되었지만 약 4%만이 3상에 진입한다. 그 다음에는 ASO를 사용한 임상 시험이 이어진다. ADC와 마찬가지로 많은 기술이 연구되고 있음에도 불구하고, 치료용 핵산은 임상 개발 동안 공통적으로 2가지 주요 문제(세포로의 전달 및 표적외 효과)를 갖는다. 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA), 포스포라미데이트 모폴리노 올리고머(PMO), 잠금 핵산(LNA), 및 가교 핵산(BNA)과 같은 ASO는 특정 표적 유전자, 특히 소분자 억제제 또는 중화 항체로 표적화하기 어려운 유전자를 억제하는 매력적인 전략으로서 연구되고 있다. 현재, 다양한 ASO의 효능이 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 근위축성 측색 경화증과 같은 많은 신경퇴행성 질환과 여러 암 단계에서 연구되고 있다. ASO를 잠재적 치료제로서 적용하려면 표적 세포 및 조직의 세포질 및/또는 핵에 이들을 전달하기 위한 안전하고 효과적인 방법이 필요하다. ASO의 임상적 유용성은 입증되었지만, 시험관내 및 생체내 둘 다에서 비효율적인 세포 흡수는 ASO의 효능을 제한하며 치료제 개발의 장벽이 되어 왔다. 세포 흡수는 용량의 2% 미만일 수 있고, 이는 효과적이고 지속적인 결과를 얻기에는 활성 부위에서 너무 낮은 ASO 농도를 초래한다. 이는 결과적으로 표적외 효과를 유도하는 투여 용량의 증가를 필요로 한다. 가장 흔한 부작용은 보체 캐스케이드의 활성화, 응고 캐스케이드의 억제, 및 면역계의 톨-유사 수용체 매개 자극이다.
화학요법제는 가장 일반적으로 소분자이지만, 이들의 효능은 낮은 용해도, 빠른 제거, 및 제한된 종양 노출뿐만 아니라 심각한 표적외 부차적 독성에 의해 제한된다. 폴리머-약물 접합체(PDC)와 같은 스캐폴드-소분자 약물 접합체는 캐리어 스캐폴드(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG))에 결합된 소분자 약물의 하나 이상의 분자를 포함하는, 약리학적 활성을 갖는 거대분자 구성체이다.
이러한 접합체 원리는 많은 관심을 끌었으며 수십 년 동안 연구되어 왔다. 전임상 또는 임상 개발 중인 소분자 약물의 접합체의 대부분은 종양 적응증을 위한 것이다. 그러나, 최근에 암과 관련이 없는 단 하나의 약물만이 2014년 비종양 적응증인 만성 통증 환자의 오피오이드 유도 변비에 대해 승인되었다(모반틱(Movantik), 오피오이드 길항제 날록손의 PEG 올리고머 접합체, AstraZeneca). 약물-스캐폴드 접합체의 적용을 인간 피험자의 치료로 이행하는 것은 지금까지 거의 임상적 성공을 거두지 못했다. 예를 들어, PK1(N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드(HPMA) 공중합체 독소루비신; Pharmacia, Pfizer 개발)은 뮤린 모델의 고형 종양과 백혈병 둘 다에서 뛰어난 항암 활성을 나타냈으며, 종양 적응증에 대해 임상 시험 중이었다. 인간에서 비특이적 독성의 유의한 감소 및 개선된 약동학을 입증했음에도 불구하고, 항암 효능의 개선은 환자에서 미미한 것으로 판명되었고, 결과적으로 PK1의 추가 개발은 중단되었다.
스캐폴드-소분자 약물 접합체의 실패는 적어도 부분적으로는 종양 부위에서의 부족한 축적에 기인한다. 예를 들어, 뮤린 모델에서 PK1은 건강한 조직(간, 신장, 폐, 비장, 및 심장)에서보다 종양에서 45~250배 더 높은 축적을 보인 반면, 임상 시험에서 종양에서의 축적은 소수의 하위 환자군에서만 관찰되었다.
앞서 언급한 문제에 대한 잠재적인 해결책은 리포솜과 같은, 약물 전달을 위한 나노입자 시스템의 적용이다. 리포솜은 인지질이 물에 분산될 때 자발적으로 형성되는 하나 이상의 인지질 이중층으로 구성된 구형 소포이다. 인지질의 양친매성 특성은 자기-조립, 유화, 및 습윤 특성을 제공하며, 이러한 성질은 새로운 약물 및 새로운 약물 전달 시스템의 설계에 사용될 수 있다. 리포솜 전달 시스템에서 캡슐화된 약물은 약물의 직접 투여에 비해, 약동학 및 약력학의 개선 및 제어, 조직 표적화 특성, 독성 감소, 및 약물 활성 강화와 같은 몇 가지 이점을 제공할 수 있다. 이러한 성공의 예로는 소분자 화학요법제 독소루비신의 리포솜 캡슐화 형태(Doxil: 독소루비신의 페길화 리포솜 캡슐화 형태; Myocet: 비페길화 리포솜 독소루비신)가 있으며, 이는 임상용으로 승인되었다.
따라서, 원하는 경우 비전신적 사용에 적용할 수 있으며 약물이 예를 들어 허용 가능한 안전성 프로파일, 약한 표적외 활성, 충분한 효능, 환자의 신체로부터 충분히 낮은 제거율, 충분히 넓은 치료범위 등을 갖는, 항종양 요법과 같은 약물 요법을 가능하게 하는 해결책의 발굴이 여전히 필요하다.
본 발명의 제1 양태는 적어도 하나의 사포닌에 직접적으로 또는 링커를 통해 공유 결합된 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 적어도 하나의 사포닌은 일반적으로 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 또는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드이다. 바람직하게는, 접합체는 세포 외부로부터 상기 세포 내로 사포닌을 전달하는데 적합한 것으로서, 접합체는 sdAb를 포함하고, sdAb는 상기 세포에 결합할 수 있고, 적어도 하나의 사포닌에 직접적으로 또는 링커를 통해 공유 결합되고, 적어도 하나의 사포닌은 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 또는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드이다.
본 발명의 제2 양태는,
- 본 발명의 접합체를 포함하고, 임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 제1 약제학적 조성물; 및
- 활성 약제학적 성분(API)을 포함하고, 임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 제2 약제학적 조성물
을 포함하는 약제학적 조합물에 관한 것이다. 제2 약제학적 조성물에 포함된 API는, 예를 들어, 약물 분자, mRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, EGF-다이안틴 또는 EGF-사포린과 같은 리간드-약물 접합체, 사포린, 다이안틴, 또는 BNA와 접합된 OKT9 단일클론 항-CD71 항체, 트라스투주맙, 또는 세툭시맙과 같은 항체-약물 접합체(ADC), 항체-BNA 접합체 또는 항체-siRNA 접합체와 같은 항체-올리고뉴클레오티드 접합체(AOC) 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 것과 같은 API(ADC 또는 AOC의 항체는 임의로 적어도 하나의 sdAb를 포함하거나 이로 구성되고, ADC 또는 AOC에 포함된 적어도 하나의 sdAb는 본 발명의 접합체의 sdAb와 상이하거나 동일함)이다. sdAb-사포닌 접합체의 sdAb가 세포 표면 상의 결합 부위에 결합하기 위한 결합 영역을 포함하는 것은 본 발명의 일부이다. sdAb는 세포에 결합할 수 있다. API가 리간드-약물 접합체, ADC 및 AOC 중 어느 하나인 경우, 리간드 또는 항체를 통해, 이러한 API는 sdAb와 사포닌의 접합체가 결합할 수 있는 세포와 동일한 세포에 결합할 수 있다. 따라서, sdAb-사포닌 접합체 및 API는 동일한 세포에 결합한다. 동일한 세포 상의 결합 부위는 사포닌-포함 접합체 및 API를 포함하는 리간드 또는 항체에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 일반적으로 동일한 세포의 결합 부위는 세포 표면 수용체와 같은 세포 표면 분자의 에피토프이다. 전형적인 세포 표면 수용체에는 CD71, EGFR, Her2, HIVgp41가 있다. 예를 들어, sdAb-사포닌 접합체에 포함된 sdAb는 수용체와 같은 제1 세포 표면 분자의 제1 에피토프에 결합하고 API는 동일한 제1 에피토프에 결합하거나 동일한 제1 세포 표면 분자 또는 동일한 세포 표면에 노출된 제2 세포 표면 분자의 제2 에피토프에 결합한다. 바람직한 API는 ADC 및 AOC이며, 이러한 ADC 또는 AOC는 바람직하게는 IgG와 같은 항체 또는 하나 이상의 VHH와 같은 sdAb를 포함한다.
본 발명의 제3 양태는,
- 본 발명의 접합체;
- 하나 이상의 API
를 포함하고,
임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제
를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적 조성물에 포함된 API는, 예를 들어, 약물 분자, mRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, ASO, EGF-다이안틴 또는 EGF-사포린과 같은 리간드-약물 접합체, 사포린, 다이안틴, 또는 BNA와 접합된 OKT9 단일클론 항-CD71 항체, 트라스투주맙, 또는 세툭시맙과 같은 ADC, 항체-BNA 접합체 또는 항체-siRNA 접합체와 같은 AOC로부터 선택되는 것과 같은 API(ADC 또는 AOC의 항체는 임의로 적어도 하나의 sdAb를 포함하거나 이로 구성되고, ADC 또는 AOC에 포함된 적어도 하나의 sdAb는 본 발명의 접합체의 sdAb와 상이하거나 동일함)이다. 즉, API가 세포 결합 모이어티, 도메인, 분자, 예컨대 세포 표면 분자(수용체)에 대한 리간드, 예컨대 예를 들어 EGF 또는 사이토카인, 또는 항체 또는 결합 도메인 또는 결합 단편, 예컨대 IgG, Fab, scFv, sdAb, 예컨대 Vh 도메인 또는 VHH를 포함하는 경우, 사포닌-포함 접합체 및 API는 동일한 세포에 결합할 수 있으며, 사포닌 포함 접합체는 sdAb를 통해 세포에 결합한다. 일반적으로, 접합체 및 API는 세포 표면에 노출된 수용체와 같은 동일한 세포 표면 분자에 결합하거나, 동일한 세포 상에 노출된 제1 및 제2 세포 표면 분자, 예를 들어 동일한 세포 상의 상이한 수용체인 제1 및 제2 세포 표면 분자에 결합한다. 바람직한 API는 ADC 및 AOC이며, 이러한 ADC 또는 AOC는 바람직하게는 IgG와 같은 항체 또는 하나 이상의 VHH와 같은 sdAb를 포함한다.
본 발명의 제4 양태는 제1 약제학적 조성물을 포함하고 제2 약제학적 조성물을 포함하는 본 발명의 약제학적 조합물, 또는 약제로 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태는, 암, 자가면역 질환, 바이러스 감염 등의 감염, 효소결핍증, 효소결핍증과 관련된 장애 또는 질환, 유전자 결손, 유전자 결손과 관련된 장애 또는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1 약제학적 조성물을 포함하고 제2 약제학적 조성물을 포함하는 본 발명의 약제학적 조합물, 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 치료는 사포닌-포함 접합체에 포함된 sdAb를 치료할 질환 또는 건강 상태와 관련된 표적 세포의 세포 표면에 존재하는 제1 세포 표면 분자에 결합시키는 것을 포함하고, 사포닌-포함 접합체와 API가 종양 세포와 같은 질환 관련 세포와 같은 동일한 세포에 결합할 수 있도록, 동일한 세포의 동일한 제1 세포 표면 분자에 결합하거나 제1 세포 표면 분자가 존재하는 동일한 세포에 존재하는 제2 세포 표면 분자에 결합하기 위한 리간드 또는 항체, 예컨대 IgG 또는 sdAb를 포함하는 API의 결합을 포함한다. 따라서, 사포닌 포함 접합체와 API의 조합은, 수용체와 같은 동일한 세포 표면 분자에 결합하거나, 상이하지만 동일한 세포에 존재하는 제1 수용체 및 제2 수용체와 같은 제1 및 제2 세포 표면 분자에 결합하여 동일한 세포로의 (동시) 결합을 위해 선택된다.
본 발명의 제6 양태는 분자를 세포 외부로부터 상기 세포 내부로, 바람직하게는 상기 세포의 세포질액에 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
a) 본 발명의 구현예에 따라, 본 발명의 접합체에 포함되는 sdAb에 대한 결합 부위를 표면에 발현하는 세포(바람직하게는 간 세포, 바이러스 감염 세포와 같은 비정상적인 세포, 자가면역 세포, 및 종양 세포로부터 선택됨)를 제공하는 단계;
b) 단계 a)에서 제공된 세포 내로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계(분자는 본 발명의 구현예의 API 중 임의의 하나 이상임);
c) 본 발명의 접합체를 제공하는 단계;
d) 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 접합체와 시험관내 또는 생체외 접촉시켜,
세포 외부로부터 상기 세포 내로, 바람직하게는 상기 세포의 세포질액 내로 분자를 전달하는 단계
를 포함하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다. API가 세포 표면 분자에 결합하기 위한 리간드 또는 항체를 포함하는 경우, 상기 세포 표면 분자는 사포닌-포함 접합체에 대한 결합 부위가 존재하는 동일한 세포에 존재하는 것으로 이해되어야 한다. 사포닌-포함 접합체 및 API는 동일한 세포에 결합한다. 표적 세포에 노출된 동일한 세포 표면 분자 또는 동일한 표적 세포에 노출된 두 개의 상이한 세포 표면 분자에, API에 포함된 분자(예를 들어, 이펙터 모이어티, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 예컨대 BNA 또는 (단백질) 독소)가 전달되어야 한다.
본 발명의 제7 양태는, 본 발명의 약제학적 조합물을 포함하고, 제1 약제학적 조성물을 포함하고 제2 약제학적 조성물을 포함하거나, 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하거나, 본 발명의 접합체를 포함하고, 임의로 본 발명에 따른 상기 약제학적 조합물의 사용 설명서, 또는 임의로 본 발명에 따른 상기 약제학적 조성물의 사용 설명서, 또는 임의로 본 발명에 따른 상기 접합체의 사용 설명서를 포함하는 부품 키트에 관한 것이다. 키트는 선택된 종양 세포와 같은 선택된 표적 세포의 제1 세포 표면 분자에 결합하기 위한 사포닌-포함 접합체를 포함하고, 예를 들어 리간드, 예컨대 EGF 또는 사이토카인, 또는 항체, 예컨대 IgG 또는 sdAb, 예컨대 ADC 또는 AOC를 포함하는 API를 포함하고, 리간드 또는 항체는 표적 세포에 존재하는 동일한 제1 세포 표면 분자에 결합할 수 있거나, 제1 세포 표면 분자가 존재하는 동일한 표적 세포에 존재하는 제2 세포 표면 분자에 결합할 수 있다.
정의
"단백질성"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 분자가 어느 정도 단백질의 물리화학적 특성을 갖는다는 의미에서 단백질과 유사한, 단백질의, 단백질과 관련된, 단백질을 포함하는, 단백질에 속하는, 단백질로 구성되는, 단백질과 비슷한, 또는 단백질인 분자를 의미한다. 예를 들어 '단백질성 분자'에서 사용되는 "단백질성"이라는 용어는 단백질과 유사하거나 단백질인 분자의 적어도 일부의 존재를 의미하며, '단백질'은 적어도 2개 잔기 길이의 아미노산 잔기의 사슬을 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질, 및 단백질 또는 단백질 도메인의 조립체를 포함한다. 단백질성 분자에서, 적어도 2개의 아미노산 잔기는 예를 들어 아미드 결합, 예컨대 펩티드 결합을 통해 연결된다. 단백질성 분자에서 아미노산 잔기는 천연 아미노산 잔기 및/또는 변형된 천연 아미노산 잔기와 같은 인공 아미노산 잔기이다. 바람직한 구현예에서, 단백질성 분자는 적어도 2개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 2 내지 약 2.000개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자이다. 일 구현예에서, 단백질성 분자는 2 내지 20개(펩티드에 전형적임) 아미노산을 포함하는 분자이다. 일 구현예에서, 단백질성 분자는 21 내지 1.000개(폴리펩티드, 단백질, 단백질 도메인, 예컨대, 항체, Fab, scFv, 수용체에 대한 리간드, 예컨대, EGF에 전형적임) 아미노산을 포함하는 분자이다. 바람직하게는, 아미노산 잔기는 (전형적으로) 펩티드 결합을 통해 연결된다. 본 발명에 따르면, 상기 아미노산 잔기는 (변형된) (비)천연 아미노산 잔기이거나 이를 포함한다.
예를 들어 공유 접합체의 일부로서 이펙터 분자를 언급할 때 "이펙터 분자" 또는 "이펙터 모이어티"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 예를 들어 다음의 표적 분자: 단백질, 펩티드, 탄수화물, 당류, 예컨대, 글리칸, (포스포)지질, 핵산, 예컨대, DNA, RNA, 효소 중 임의의 하나 이상에 선택적으로 결합할 수 있고 이러한 하나 이상의 표적 분자의 생물학적 활성을 조절하는 분자를 지칭한다. 본 발명의 접합체에서 이펙터 모이어티는 예를 들어 세포질액, 세포핵에서 효과를 발휘하고, 엔도솜 및/또는 리소좀에서 세포내로 전달되고/되거나, 엔도솜-리소좀 경로를 빠져나가거나 탈출한 후에 활성화된다. 이펙터 분자는 예를 들어 약물 분자와 같은 소분자, 단백질 독소와 같은 독소, BNA, 제노 핵산 또는 siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 효소, 펩티드, 단백질, 또는 이의 활성 단편 또는 활성 도메인, 또는 이들의 임의의 조합 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 분자이다. 따라서, 예를 들어, 이펙터 분자 또는 이펙터 모이어티는 약물 분자와 같은 소분자, 단백질 독소와 같은 독소, BNA, 제노 핵산 또는 siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 효소, 펩티드, 단백질, 또는 이들의 임의의 조합 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 분자 또는 모이어티로서, 다음의 표적 분자: 단백질, 펩티드, 탄수화물, 당류, 예컨대, 글리칸, (포스포)지질, 핵산, 예컨대, DNA, RNA, 효소 중 임의의 하나 이상에 선택적으로 결합할 수 있고 표적 분자에 결합시 이러한 하나 이상의 표적 분자의 생물학적 활성을 조절하는 분자 또는 모이어티이다. 예를 들어, 이펙터 모이어티는 독소 또는 이의 활성 독소 단편 또는 활성 독소 유도체 또는 이의 활성 독소 도메인이다. 전형적으로, 이펙터 분자는 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포와 같은 세포의 내부, 예컨대 상기 세포의 세포질액에서 생물학적 효과를 발휘할 수 있다. 따라서 본 발명의 이펙터 분자 또는 모이어티는 세포내 이펙터 분자 표적과의 상호작용에 의해 세포의 대사에 영향을 미치는 임의의 물질이며, 여기서 이펙터 분자 표적은 세포내이입 및 재순환 경로의 구획 및 소포의 내강을 제외하고 이러한 구획 및 소포의 막을 포함하는 세포 내부의 임의의 분자 또는 구조이다. 따라서 세포 내부의 상기 구조는 핵, 미토콘드리아, 엽록체, 소포체, 골지체, 기타 운반 소포, 원형질막의 내부 부분, 및 세포질액을 포함한다. 따라서 전형적인 이펙터 분자는 약물 분자, 효소, 플라스미드 DNA, 독소, 예컨대 항체-약물 접합체(ADC)에 포함된 독소, 올리고뉴클레오티드, 예컨대, siRNA, BNA, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체(AOC)에 포함된 핵산이다. 예를 들어, 이펙터 분자는 (세포내) 효소 활성, 유전자 발현, 또는 세포 신호전달을 증가 또는 감소시킬 수 있는 리간드로 작용할 수 있는 분자이다. 본 발명의 맥락에서, 이펙터 분자가 접합체의 일부인 경우 이펙터 분자 또는 이펙터 모이어티는 사포닌이 아니며, 세포 표면 분자 결합 분자, 예컨대 항체, 예컨대 sdAb가 아니다. 전형적으로, 접합체에 포함된 이펙터 모이어티는 세포질액 및/또는 세포핵에서 치료적(예를 들어, 독성, 효소, 억제, 유전자 침묵 등) 효과를 발휘한다. 전형적으로, 이펙터 모이어티는 엔도솜 및/또는 리소좀에서 세포내로 전달되고, 일반적으로 이펙터 모이어티는 엔도솜-리소좀 경로를 빠져나가거나 탈출한 후에 활성화된다.
"사포닌"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 사포게닌인 친유성 아글리콘 코어와 결합된 하나 이상의 친수성 글리콘 모이어티를 포함하는 양친매성 글리코시드의 그룹을 나타낸다. 사포닌은 천연 또는 합성(즉, 비천연)일 수 있다. "사포닌"이라는 용어는 천연 사포닌, 천연 사포닌의 기능적 유도체뿐만 아니라 화학적 및/또는 생명공학적 합성 경로를 통해 새롭게 합성된 사포닌을 포함한다. 사포닌은 사포게닌 또는 아글리콘이라고도 하는 펜타사이클릭 C30 테르펜 골격인 트리테르펜 백본을 갖는다. 본 발명의 맥락에서, 사포닌은, 예를 들어 접합체의 일부인 경우, 이펙터 분자 또는 이펙터 모이어티로 간주되지 않는다. 따라서, 사포닌을 포함하는 접합체에서, 사포닌은 이펙터 모이어티가 아니다.
"변형된 사포닌"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 변형된 사포닌의 제공을 위한 화학적 변형 처리 전에 비-유도체화된 사포닌에 알데히드기, 카복실기, 아세테이트기, 및/또는 아세틸기 중 임의의 것이 이전에 존재했던 위치에 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 사포닌, 즉 사포닌 기능적 유도체를 의미한다. 예를 들어, 변형된 사포닌은, 변형된 사포닌을 기반으로 하는 사포닌에서 알데히드기, 카복실기, 아세테이트기, 및/또는 아세틸기 중 어느 하나 이상의 화학적 변형에 의해 제공되는 것으로, 즉, 사포닌이 제공되고 알데히드기, 카복실기, 아세테이트기, 및/또는 아세틸기 중 임의의 것이 이와 함께 화학적으로 변형되어 변형된 사포닌을 제공한다. 예를 들어, 변형된 사포닌을 제공하기 위해 변형된 사포닌은 천연 사포닌이다. 전형적으로, 변형된 사포닌은 합성 사포닌이며, 전형적으로 변형된 사포닌은 천연 사포닌의 변형이므로 천연 사포닌으로부터 유래되지만, 천연 대응물을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있는 합성 사포닌으로부터 변형된 사포닌이 유래될 수도 있다. 전형적으로, 변형된 사포닌은 천연 대응물을 갖지 않는다. 즉, 변형된 사포닌은 예를 들어, 식물이나 나무에서 자연적으로 생성되지 않는다.
용어 "사포닌 유도체"("변형된 사포닌" 및 사포닌 기능적 유도체라고도 알려짐)는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 작용기의 산화, 작용기의 환원, 및/또는 다른 분자와의 공유 결합 형성("접합" 또는 "공유 접합"이라고도 지칭됨)과 같은 하나 이상의 화학적 변형에 의해 유도체화된 천연 사포닌에 해당하는 화합물을 의미한다. 바람직한 변형은 아글리콘 코어의 알데히드기; 당류 사슬의 카복실기 또는 당류 사슬의 아세톡시기의 유도체화를 포함한다. 전형적으로, 사포닌 유도체는 기능적 사포닌으로 천연 대응물을 갖지 않는다. 즉, 사포닌 유도체는 예를 들어, 식물이나 나무에서 자연적으로 생성되지 않는다. "사포닌 유도체"라는 용어는 천연 사포닌의 유도체화에 의해 수득된 유도체뿐만 아니라 하나 이상의 화학적 변형에 의해 유도체화된 천연 사포닌에 해당하는 화합물을 생성하는 화학적 및/또는 생명공학적 합성 경로를 통해 새롭게 합성된 유도체를 포함한다. "유도체"라는 용어는 사포닌과 관련하여 기능적 유도체로 이해되어야 한다. 사포닌 유도체와 관련하여 "기능적"은 사포닌 또는 사포닌 유도체와 함께 세포와 접촉하는 이펙터 분자의 엔도솜 탈출을 강화하는 사포닌 또는 사포닌 유도체의 능력 또는 활성으로 이해된다.
"아글리콘 코어 구조"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 하나 또는 두 개의 탄수화물 안테나 또는 당류 사슬(글리칸)이 결합되지 않은 사포닌의 아글리콘 코어를 지칭한다. 예를 들어, 퀼라산은 SO1861, QS-7, 및 QS21의 아글리콘 코어 구조이다. 전형적으로, 사포닌의 글리칸은 단당류 또는 올리고당류, 예컨대 선형 또는 분지형 글리칸이다.
"당류 사슬"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 글리칸, 탄수화물 안테나, 단일 당류 모이어티(단당류), 또는 복수의 당류 모이어티를 포함하는 사슬(올리고당, 다당류) 중 임의의 것을 나타낸다. 당류 사슬은 당류 모이어티로만 구성될 수 있거나, 또는 예를 들어 QS-21에 존재하는 것과 같은, 4E-메톡시신남산, 4Z-메톡시신남산, 및 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산 중 어느 하나와 같은 추가의 모이어티를 포함할 수도 있다.
"화학적으로 변형된"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 제2 화학기 또는 제2 화학 모이어티가 제공되도록 제1 화학 기 또는 제1 화학 모이어티의 화학적 변형을 지칭한다. 예를 들면 카보닐기를 - (H)C-OH 기로 화학적으로 변형하는 것, 아세테이트기를 하이드록실기로 화학적으로 변형하는 것, 화학 반응을 통해 알데히드기에서 N-ε-말레이미도카프로산 하이드라지드(EMCH) 모이어티와 접합된 사포닌을 제공하는 것 등이다.
"화학적으로 변형된 알데히드기"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 사포닌의 알데히드기를 포함하는 화학 반응에 의해 생성되어 처음의 알데히드기가 새로운 화학 기로 대체되는 화학 반응 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 사포닌의 처음의 알데히드기로부터 -(H)C-OH 기를 형성하는 것이다.
"화학적으로 변형된 카복실기"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 글루쿠론산 모이어티의 카복실기와 같은 사포닌의 카복실기와 추가 분자를 포함하는 화학 반응에 의해 생성되어 처음의 카복실기가 새로운 화학 기로 대체되는 화학 반응 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 사포닌과 사포닌의 글루쿠론산의 카복실기를 포함하는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD), N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM), 또는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드 헥사플루오로포스페이트(HATU) 중 어느 하나 사이의 접합체를 형성하는 것이다.
당류 사슬의 이름과 관련하여 "Api/Xyl-" 또는 "Api- 또는 Xyl-"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 아피오스(Api) 모이어티를 포함하거나 자일로스(Xyl) 모이어티를 포함하는 당류를 지칭한다.
"사포닌 기반의 변형된 사포닌"이라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 변형된 사포닌이 제공되도록 화학적 변형 단계를 거친 사포닌을 지칭하고, 변형된 사포닌의 원재료가 되는 사포닌은 일반적으로 천연 사포닌이다.
"올리고뉴클레오티드"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 특히, BNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON), 짧거나 작은 간섭 RNA(siRNA; 침묵 RNA), 안티센스 DNA, 안티센스 RNA 등과 같은, 단일가닥 분자 또는 이중가닥 분자로 제시되는, DNA, 변형된 DNA, RNA, mRNA, 변형된 RNA, 합성 핵산을 포괄하는 핵산의 임의의 천연 또는 합성 스트링을 나타낸다. 본원에서 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 또한 2개 이상 뉴클레오티드의 스트링을 의미한다. 즉, 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 짧은 올리고머이다. 예는 RNA 및 DNA, 및 임의의 변형된 RNA 또는 DNA, 예컨대 잠금 핵산(LNA) 또는 2'-O,4'-C-아미노에틸렌 또는 2'-O,4'-C-아미노메틸렌 가교 핵산(BNANC)으로도 알려진 가교 핵산(BNA)과 같은 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 핵산의 스트링이고, 여기서 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드이다.
"항체-약물 접합체" 또는 "ADC"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 항체(예컨대, IgG, Fab, scFv, 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 하나 이상의 VH 도메인, 단일-도메인 항체, VHH, 낙타과 VH 등)와, 인간 환자와 같은 대상체의 세포와 접촉시 치료 효과를 발휘할 수 있는 임의의 분자(예컨대, 활성 제약 성분, 독소, 올리고뉴클레오티드, 효소, 소분자 약물 화합물 등)의 임의의 접합체를 지칭한다.
"항체-올리고뉴클레오티드 접합체" 또는 "AOC"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 항체(예컨대, IgG, Fab, scFv, 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 하나 이상의 VH 도메인, 단일-도메인 항체, VHH, 낙타과 VH 등)와, 인간 환자와 같은 대상체의 세포와 접촉시 치료 효과를 발휘할 수 있는 임의의 올리고뉴클레오티드 분자(예컨대, BNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 짧거나 작은 간섭 RNA(siRNA; 침묵 RNA), 안티센스 DNA, 안티센스 RNA 등과 같은, 단일가닥 분자 또는 이중가닥 분자로 제시되는, DNA, 변형된 DNA, RNA, mRNA, 변형된 RNA, 합성 핵산을 포괄하는 핵산의 임의의 천연 또는 합성 스트링으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드)의 임의의 접합체를 지칭한다.
"가교 핵산" 또는 간단히 "BNA"(잠금 핵산(LNA) 또는 2'-O,4'-C-아미노에틸렌 또는 A 2'-O,4'-C-아미노메틸렌 가교 핵산(BNANC)으로도 알려짐)라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 변형된 RNA 뉴클레오티드를 나타낸다. BNA는 '제약된 RNA 분자' 또는 '접근할 수 없는 RNA 분자'라고도 한다. BNA 단량체는 "고정된" C3'-엔도 슈가 퍼커링이 있는 5원, 6원 또는 심지어 7원 가교 구조를 포함할 수 있다. 가교는 리보스의 2', 4'-위치에서 합성적으로 통합되어 2', 4'-BNA 단량체를 제공한다. BNA 단량체는 당업계에 공지된 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 올리고뉴클레오티드 중합체 구조에 혼입될 수 있다. BNA는 결합 친화력과 안정성이 증가된 구조적으로 단단한 올리고뉴클레오티드이다.
"단일 도메인 항체" 또는 간단히 "sdAb"라는 용어는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미한다. 본 발명의 접합체에서, 하나 초과의 sdAb가 존재할 수 있고, sdAb는 동일하거나(다가 및 단일특이적), 상이할 수 있다(다가 및/또는 예를 들어 다중파라토프, 이중파라토프, 다중특이적, 이중특이적). 또한, 2개 초과의 sdAb는 예를 들어 단일특이적 및 다가 sdAb와, 상이한 에피토프에 결합하는(예를 들어, 다중특이적 또는 이중파라토프) 적어도 하나의 추가 sdAb의 조합이다.
예를 들어 링커를 포함하는 항체-사포닌 접합체에서 사용되는 용어 'S'는 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포, 예컨대 인간 종양 세포의 엔도솜, 엔도리소좀, 및 리소좀에서, 따라서 약산성 조건(pH 6.6 미만, 예컨대 pH 4.0~5.5)에서 온전하게 유지되는 '안정한 링커'를 나타낸다.
예를 들어 링커를 포함하는 항체-사포닌 접합체에서 사용되는 용어 'L'은 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포, 예컨대 인간 종양 세포 엔도솜, 엔도리소좀, 및 리소좀의 약산성 조건(pH 6.6 미만, 예컨대 pH 4.0~5.5)에서 절단되는 '불안정한 링커'를 나타낸다.
설명 및 청구범위에서 제1, 제2, 제3 등의 용어는 예를 들어 구성 내의 유사한 요소, 조성, 구성성분, 또는 개별적인 방법 단계를 구별하는 데 사용되며, 반드시 순차적 순서 또는 연대순으로 설명하는 것은 아니다. 상기 용어들은 적절한 상황에서 상호교환 가능하며, 본 발명의 구현예는 달리 명시되지 않는 한, 본원에 설명되거나 예시된 것과 다른 순서로 작용할 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 구현예는 달리 명시되지 않는 한, 조합 및 합동적으로 작용할 수 있다.
또한, "바람직한" 또는 "예컨대" 또는 "예를 들어" 또는 "특히" 등으로 언급될지라도, 다양한 구현예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 본 발명이 구현될 수 있는 예시적인 방식으로 해석되어야 한다.
청구범위에서 사용되는 "포함하는"이라는 용어는 예를 들어 이후에 나열된 구성의 요소 또는 방법 단계 또는 구성성분으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 특정 구성의 다른 요소 또는 방법 단계 또는 구성성분을 배제하지 않는다. 이는 언급된 특징, 정수, (방법) 단계 또는 구성요소의 존재를 명시하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 구성요소, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 따라서, "단계 A 및 B를 포함하는 방법"이라는 표현의 범위는 단계 A 및 B로만 구성된 방법으로 제한되어서는 안 되며, 오히려 본 발명과 관련하여 방법의 열거된 단계가 A 및 B일 뿐이며, 또한 청구범위는 이러한 방법 단계의 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, "성분 A 및 B를 포함하는 조성물"이라는 표현의 범위는 성분 A 및 B로만 구성된 조성물로 제한되어서는 안 되며, 오히려 본 발명과 관련하여 조성물의 열거된 성분이 A 및 B일 뿐이며, 또한 청구범위는 이러한 성분의 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 단수 형태의 요소 또는 구성요소에 대한 언급은 문맥상 요소 또는 구성요소 중 유일한 한 가지만 존재함을 분명히 요구하지 않는 한, 요소 또는 구성요소 중 둘 이상이 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 단수 형태는 일반적으로 "적어도 하나"를 나타낸다.
"사포니넘 알범"이라는 용어는 일반적인 의미를 가지며, 본원에서는 집소필라 파니쿨라타(Gypsophila paniculata) 및 집소필라 아로스티(Gypsophila arostii)로부터의 사포닌, SA1657과, 주로 SA1641을 함유하는, Merck KGaA(Darmstadt, Germany)에서 생산한 사포닌 혼합물을 지칭한다.
"퀼라야 사포닌"이라는 용어는 일반적인 의미를 가지며, 본원에서는 퀼라야 사포나리아의 사포닌 분획, 따라서 주로 QS-18 및 QS-21을 함유하는, 다른 모든 QS 사포닌의 공급원을 지칭한다.
"QS-21" 또는 "QS21"은 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 QS-21 A-apio(약 63%), QS-21 A-xylo(약 32%), QS-21 B-apio(약 3.3%), 및 QS-21 B-xylo(약 1.7%)의 혼합물을 지칭한다.
유사하게, "QS-21A"는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 QS-21 A-apio(약 65%)와 QS-21 A-xylo(약 35%)의 혼합물을 지칭한다.
유사하게, "QS-21B"는 일반적인 과학적 의미를 가지며, 본원에서는 QS-21 B-apio(약 65%)와 QS-21 B-xylo(약 35%)의 혼합물을 지칭한다.
"Quil-A"라는 용어는 퀼라야 사포나리아의 상업적으로 이용 가능한 반정제 추출물을 지칭하며, 50개 초과의 별개의 사포닌을 다양한 양으로 함유하고, 그중 다수는 QS-7, QS-17, QS18, 및 QS-21에서 발견되는 C-3베타-OH 기에 트리테르펜-삼당류 하위구조 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-를 포함한다. Quil-A에서 발견되는 사포닌은 문헌[van Setten (1995), 표 2]에 열거되어 있다(Dirk C. van Setten, Gerrit van de Werken, Gijsbert Zomer and Gideon F. A. Kersten, Glycosyl Compositions and Structural Characteristics of the Potential Immuno-adjuvant Active Saponins in the Quillaja saponaria Molina Extract Quil A, RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY, VOL. 9,660-666 (1995)). Quil-A와 퀼라야 사포닌은 퀼라야 사포나리아의 사포닌 분획물이며, 둘 다 내용물이 크게 겹치는 다양한 사포닌을 함유하고 있다. 두 분획은 서로 다른 정제 절차에 의해 얻어지므로 특정 조성이 다르다.
용어 "QS1861" 및 용어 "QS1862"는 QS-7 및 QS-7 api를 지칭한다. QS1861은 1861 달톤의 분자량을 가지며, QS1862는 1862 달톤의 분자량을 갖는다. QS1862는 문헌[Fleck et al. (2019), 표 1, 28행]에 설명되어 있다(Juliane Deise Fleck, Andresa Heemann Betti, Francini Pereira da Silva, Eduardo Artur Troian, Cristina Olivaro, Fernando Ferreira and Simone Gasparin Verza, Saponins from Quillaja saponaria and Quillaja brasiliensis: Particular Chemical Characteristics and Biological Activities, Molecules 2019, 24, 171; doi:10.3390/molecules24010171). 설명된 구조는 QS-7의 api-변형 QS1862이다. 분자량은 1862이며, 이 질량은 글루쿠론산에 양성자를 포함하는 공식 질량이다. 중성 pH에서 이 분자는 탈양성자화된다. 음이온 모드의 질량분석법으로 측정할 때 측정된 질량은 1861 달톤이다.
도 1a: 표적화 2-구성요소 접근법(1 표적) . SO1861 및 독소(리보솜 비활성화 단백질)가 각각 개별적으로 표적 세포 내로의 전달 및 내재화를 위해 VHH 또는 항체(mAb)에 접합된다. 1) mAb-독소 및 VHH-SO1861이 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체 매개 세포내이입이 일어나고(수용체에 대한 접합체의 결합은 접합체/수용체 복합체의 내재화로 이어짐), 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하고, 4) 세포질로의 독소 방출이 일어나고, 세포 사멸을 유도한다.
도 1b: 표적화 2-구성요소 접근법(2 표적) . SO1861 및 독소(리보솜 비활성화 단백질)가 각각 개별적으로 표적 세포 내로의 전달 및 내재화를 위해 VHH 또는 항체(mAb)에 접합된다. 1) mAb-독소 및 VHH-SO1861이 해당 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체 매개 세포내이입이 일어나고(수용체에 대한 접합체의 결합은 접합체/수용체 복합체의 내재화로 이어짐), 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하고, 4) 세포질로의 독소 방출이 일어나고, 세포 사멸을 유도한다.
도 1c: 표적화 2-구성요소 접근법(2 표적) . SO1861 및 독소(리보솜 비활성화 단백질)가 각각 개별적으로 표적 세포 내로의 전달 및 내재화를 위해 VHH에 접합된다. 1) VHH1-독소 및 VHH2-SO1861이 해당 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체 매개 세포내이입이 일어나고(수용체에 대한 접합체의 결합은 접합체/수용체 복합체의 내재화로 이어짐), 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하고, 4) 세포질로의 독소 방출이 일어나고, 세포 사멸을 유도한다.
도 1d: 표적화 2-구성요소 접근법(2 표적) . SO1861 및 독소(리보솜 비활성화 단백질)가 각각 개별적으로 표적 세포 내로의 전달 및 내재화를 위해 VHH 또는 mAb에 접합된다. 1) VHH-독소 및 mAb-SO1861이 해당 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체 매개 세포내이입이 일어나고(수용체에 대한 접합체의 결합은 접합체/수용체 복합체의 내재화로 이어짐), 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하고, 4) 세포질로의 독소 방출이 일어나고, 세포 사멸을 유도한다.
도 1e: 표적화 2-구성요소 접근법(1 표적) . SO1861 및 독소(리보솜 비활성화 단백질)가 각각 개별적으로 표적 세포 내로의 전달 및 내재화를 위해 VHH 또는 항체(mAb)에 접합된다. 1) VHH-독소 및 mAb-SO1861이 세포 표면 수용체에 결합하고, 2) 두 접합체의 수용체 매개 세포내이입이 일어나고(수용체에 대한 접합체의 결합은 접합체/수용체 복합체의 내재화로 이어짐), 3) 낮은 엔도리소좀 pH 및 적절한 농도에서, SO1861이 활성화되어 엔도리소좀 탈출을 가능하게 하고, 4) 세포질로의 독소 방출이 일어나고, 세포 사멸을 유도한다.
도 2: SK-BR-3 세포(HER2++/CD71+)(도 2a) 및 MD-MB-468 세포(HER2-/CD71+)(도 2b) 상에서 VHH(HER2)-SO1861 (DAR1) + 50 pM 트라스투주맙-사포린(DAR4) 또는 10 pM CD71mab-사포린(DAR4)의 본 발명에 따른 병용 치료를 사용한 세포 사멸(MTS 분석).
도 3: SK-BR-3 세포(HER2++/CD71+)(도 3a) 및 MD-MB-468 세포(HER2-/CD71+)(도 3b) 상에서 트라스투주맙-사포린(DAR4) 또는 CD71-사포린(DAR4) + 900 nM HER2VHH-SO1861(DAR1)의 본 발명에 따른 병용 치료를 사용한 세포 사멸(MTS 분석).
도 4: SK-BR-3 세포(HER2++/CD71+)(도 4a) 및 MD-MB-468 세포(HER2-/CD71+)(도 4b) 상에서 VHH(HER2)-SO1861(DAR1) + 50 pM CD71VHH-다이안틴(DAR1)의 본 발명에 따른 병용 치료를 사용한 세포 사멸(MTS 분석).
도 5: SK-BR-3 세포(HER2++/CD71+)(도 5a) 및 MD-MB-468 세포(HER2-/CD71+)(도 5b) 상에서 CD71VHH-다이안틴(DAR1) + 900 nM HER2VHH-SO1861(DAR1)의 본 발명에 따른 병용 치료를 사용한 세포 사멸(MTS 분석).
도 6: A431 세포(EGFR+=/HER+/-/CD71+)(도 6a) 및 A2058 세포(EGFR-/HER+/-/CD71+)(도 6b) 상에서 CD71VHH-다이안틴(DAR1) + 세툭시맙-SO1861(DAR4) 또는 HER2VHH-다이안틴(DAR1) + 세툭시맙-SO1861(DAR4) 또는 EGFRVHH-다이안틴(DAR1) + 세툭시맙-SO1861(DAR4)의 본 발명에 따른 병용 치료를 사용한 세포 사멸(MTS 분석).
도 7: A431 세포(EGFR+=/HER+/-/CD71+)(도 7a) 및 MDA-MB-468 세포(HER2-/EGFR++/CD71+)(도 7b) 상에서 CD71VHH-다이안틴(DAR1) + 77 nM 세툭시맙-SO1861(DAR4) 또는 HER2VHH-다이안틴(DAR1) + 77 nM 세툭시맙-SO1861(DAR4) 또는 EGFRVHH-다이안틴(DAR1) + 77 nM 세툭시맙-SO1861(DAR4)의 본 발명에 따른 병용 치료를 사용한 세포 사멸(MTS 분석).
도 8: 1-표적 2-구성요소(EGFR 고발현). 치료적 조합에 의한 A431(EGFR+++) 및 CaSKi(EGFR++)에서의 EGFR 표적화 세포 사멸. 도 8a, 8b) 10 pM 세툭시맙-사포린의 고정 농도와 조합된 세툭시맙-SO1861 적정은 세툭시맙-사포린에 의한 세포 사멸을 유도하기 위해 비접합 SO1861에 비해 100~400배 감소된 농도의 접합 SO1861이 필요함을 보여준다. 도 8c, 8d) 278 nM 세툭시맙-SO1861과 조합된 세툭시맙-사포린 적정은 300 nM 비접합 SO1861 + 세툭시맙-사포린과 대조적으로 세포를 사멸시킨다. 1500 nM 비접합 SO1861 + 세툭시맙-사포린은, 두 세툭시맙 접합체가 동일한 EGFR 수용체에 대해 경쟁하므로 상기 치료적 조합에 비해 더 효율적이다. 두 세툭시맙 접합체의 동시 표적화 전달만이 접합체 단독에 의한 단독요법과 대조적으로 효율적인 세포 사멸을 유도한다. 비고: 도 8b에 표시된 범례는 도 8a의 그래프에도 관련된다. 비고: 도 8d에 표시된 범례는 도 8c의 그래프에도 관련된다.
도 9: 1-표적 2-구성요소(EGFR 무발현/저발현). 치료적 조합에 의한 HeLa(EGFR+) 및 A2058(EGFR-) 세포에서의 EGFR 표적화 세포 사멸. 도 9a, 9b) 10 pM 세툭시맙-사포린의 고정 농도와 조합된 세툭시맙-SO1861 적정은 세툭시맙-사포린에 의한 세포 사멸을 유도하지 않는다. 도 9c, 9d) 278 nM 세툭시맙-SO1861과 조합된 세툭시맙-사포린 적정은 세포 사멸을 유도할 수 없다. 낮은 EGFR 수용체 발현으로는 항체 매개 전달을 통해 충분한 SO1861이 전달되지 못하지만, 1500 nM의 비접합 SO1861은 세포 사멸을 유도한다. 비고: 도 9b에 표시된 범례는 도 9a의 그래프에도 관련된다. 비고: 도 9d에 표시된 범례는 도 9c의 그래프에도 관련된다.
도 10: 1-표적 2-구성요소(HER2 고발현). 치료적 조합에 의한 SKBR3(HER2+++) 세포에서의 HER2 표적화 세포 사멸. 도 10a) 673 pM 트라스투주맙-사포린의 고정 농도와 조합된 트라스투주맙-SO1861 적정은 트라스투주맙-사포린에 의한 세포 사멸을 유도하기 위해 비접합 SO1861에 비해 1000배 감소된 농도의 접합 SO1861이 필요함을 보여준다. 도 10b) 9,4 nM 트라스투주맙-SO1861과 조합된 트라스투주맙-사포린 적정은 10 nM 비접합 SO1861 + 트라스투주맙-사포린과 대조적으로 세포를 사멸시킨다. 1075 nM 비접합 SO1861 + 트라스투주맙-사포린은, 두 트라스투주맙 접합체가 동일한 HER2 수용체에 대해 경쟁하므로 상기 치료적 조합에 비해 더 효율적이다. 두 트라스투주맙 접합체의 동시 표적화 전달만이 접합체 단독에 의한 단독요법과 대조적으로 효율적인 세포 사멸을 유도한다. SPT001은 SO1861이다.
도 11: 1-표적 2-구성요소(HER2 무발현/저발현). 치료적 조합에 의한 JIMT1(HER2+) 및 A431(HER2+/-) 세포에서의 HER2 표적화 세포 사멸. 도 11a, 11b) 50 pM 트라스투주맙-사포린의 고정 농도와 조합된 트라스투주맙-SO1861 적정은 트라스투주맙-사포린에 의한 세포 사멸을 유도하지 않는다. 도 11c, 11d) 10 nM 트라스투주맙-SO1861과 조합된 트라스투주맙-사포린 적정은 세포 사멸을 유도할 수 없다. 낮은 HER2 수용체 발현으로는 항체 매개 전달을 통해 충분한 SO1861이 전달되지 못하지만, 1500 nM의 비접합 SO1861은 효율적인 세포 사멸을 유도한다. 비고: 도 11b에 표시된 범례는 도 11a의 그래프에도 관련된다. 비고: 도 11d에 표시된 범례는 도 11c의 그래프에도 관련된다. SPT001은 SO1861이다.
도 12: 2-표적 2-구성요소(EGFR 고 발현 및 HER2 저발현). 치료적 조합에 의한 A431(EGFR+++/HER2+/-) 및 Caski(EGFR++/HER2+/-) 세포에서의 EGFR/HER2 표적화 세포 사멸. 도 12a, 12b) 50 pM 트라스투주맙-사포린의 고정 농도와 조합된 세툭시맙-SO1861 적정은 트라스투주맙-사포린에 의한 세포 사멸을 유도하기 위해 비접합 SO1861에 비해 100배 감소된 농도의 접합 SO1861이 필요함을 보여준다. 도 12c, 12d) 278 nM 세툭시맙-SO1861과 조합된 트라스투주맙-사포린 적정은 300 nM 비접합 SO1861 + 트라스투주맙-사포린과 대조적으로 세포를 사멸시킨다. 1500 nM 비접합 SO1861 + 트라스투주맙-사포린은, 두 접합체가 동일한 수용체에 대해 경쟁하지 않으므로 치료적 조합, 278 nM 세툭시맙-SO1861 + 트라스투주맙-사포린과 비교하여 유사한 세포 사멸 효율을 갖는다. 두 접합체의 동시 표적화 전달만이 접합체 단독에 의한 단독요법과 대조적으로 효율적인 세포 사멸을 유도한다. 비고: 도 12b에 표시된 범례는 도 12a의 그래프에도 관련된다. 비고: 도 12d에 표시된 범례는 도 12c의 그래프에도 관련된다. SPT001은 SO1861이다.
도 13: 2-표적 2-구성요소(EGFR 저발현 및 HER2 무발현/저발현). 치료적 조합에 의한 HeLa(EGFR+/HER2+/-) 및 A2058(EGFR-/HER2+/-) 세포에서의 EGFR/HER2 표적화 세포 사멸. 도 13a, 13b) 50 pM 트라스투주맙-사포린의 고정 농도와 조합된 세툭시맙-SO1861 적정은 트라스투주맙-사포린에 의한 세포 사멸을 유도하지 않는다. 도 13c, 13d) 278 nM 세툭시맙-SO1861과 조합된 트라스투주맙-사포린 적정은 세포 사멸을 강화하지 않는 반면, 1500 nM의 비접합 SO1861은 효율적인 세포 사멸을 유도한다. 낮은 EGFR 수용체 발현으로는 항체 매개 전달을 통해 충분한 SO1861이 전달되지 못한다. 비고: 도 13b에 표시된 범례는 도 13a의 그래프에도 관련된다. 비고: 도 13d에 표시된 범례는 도 13c의 그래프에도 관련된다. SPT001은 SO1861이다.
도 14: 2-표적 2-구성요소(HER2 고발현 및 EGFR 저발현). 치료적 조합에 의한 SKBR3(HER2+++/EGFR+/-) 세포에서의 HER2 표적화 세포 사멸. 도 14a) 1.5 pM EGF-다이안틴의 고정 농도와 조합된 트라스투주맙-SO1861 적정은 EGF-다이안틴에 의한 세포 사멸을 유도하기 위해 비접합 SO1861에 비해 400배 감소된 농도의 접합 SO1861이 필요함을 보여준다. 도 14b) 9,4 nM 트라스투주맙-SO1861과 조합된 EGF-다이안틴 적정은 10 nM 비접합 SO1861 + EGF-다이안틴과 대조적으로 세포를 사멸시킬 수 있다. 1075 nM 비접합 SO1861 + EGF-다이안틴은, 두 접합체가 동일한 수용체에 대해 경쟁하지 않으므로 치료적 조합, 9,4 nM 트라스투주맙-SO1861 + EGF-다이안틴과 비교하여 유사한 세포 사멸 효율을 갖는다. 두 접합체의 동시 표적화 전달만이 접합체 단독에 의한 단독요법과 대조적으로 효율적인 세포 사멸을 유도한다. SPT001은 SO1861이다.
도 15: 2-표적 2-구성요소(HER2 저발현 및 EGFR 저발현 또는 고발현). 본 발명에 따른 치료적 조합에 의한 JIMT1(HER2+) 및 A431(HER2+/-) 세포에서의 HER2 표적화 세포 사멸. 도 15a, 15b) 5 pM 세툭시맙-사포린의 고정 농도와 조합된 트라스투주맙-SO1861 적정은 세툭시맙-사포린에 의한 세포 사멸을 유도하지 않는다. 도 15c, 15d) 10 nM 트라스투주맙-SO1861과 조합된 세툭시맙-사포린 적정은 세포 사멸을 유도할 수 없다. 낮은 HER2 수용체 발현으로는 항체 매개 전달을 통해 충분한 SO1861이 전달되지 못하지만, 1500 nM의 비접합 SO1861은 효율적인 세포 사멸을 유도한다. 세툭시맙-사포린의 전달에 대한 높은 EGFR 수용체 발현 수준(도 15d)조차도 트라스투주맙-SO1861의 존재시 효능을 변화시키지 못하며, 이는 너무 낮은 HER2 발현 수준이 세포 사멸 활성을 방해하는 요인이고, 이로 인해 표적 세포 내에서 SO1861이 엔도솜 탈출을 활성화하기에 불충분하게 됨을 나타낸다. 비고: 도 15b에 표시된 범례는 도 15a의 그래프에도 관련된다. 비고: 도 15d에 표시된 범례는 도 15c의 그래프에도 관련된다. SPT001은 SO1861이다.
도 16: 2-표적 2-구성요소 대 T-DM1. 높은 EGFR 발현 및 낮은 HER2 발현을 갖는 세포(A431)는 치료적 조합에 의해 효율적으로 사멸되지 않지만, T-DM1은 이러한 낮은 독소 농도에서 효과적이지 않다. T-DM1은 항체당 약 3.5개의 DM1 독소 분자를 운반하는 트라스투주맙-엠탄신(Kadcyla®)이다.
도 17a 내지 17e: 트라스투주맙(도 17a), 세툭시맙(도 17b) 또는 T-DM1(도 17c), 유리 독소 사포린(도 17d) 및 다이안틴(도 17d), 비세포 결합 IgG에 결합된 사포린(도 17d), 및 유리 사포닌 SO1861과 결합된 비세포 결합 IgG에 결합된 사포린(도 17e)이 표시된 세포주 SK-BR-3, JIMT-1, MDA-MB-468, A431, CaSki, HeLa, A2058, BT-474와 접촉하는 경우의 상대적 세포 생존력을 나타낸다. 비고: 도 17c에 표시된 범례는 도 17a 및 17b의 곡선에도 관련된다.
도 18: 1T2C 생체내 활성 . A431 종양 보유 마우스에서 50 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 + 25 mg/kg 세툭시맙-(-L-HSP27BNA)4의 1T2C 조합은 대조군과 비교하여 강한 종양 표적화 유전자 침묵을 나타낸다.
도 19: 1T2C 생체내 활성. PDX 종양 마우스 모델(높은 HER2 발현)에서 40 mg/kg 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 0.02/0.03 mg/kg 트라스투주맙-사포린의 1T2C 조합은 효과적인 종양 성장 억제를 나타낸다.
도 20: A431 종양 보유 모델에서 시험된 2T2 구성요소 시스템은 종양 퇴행을 나타낸다.
도 21: A431 종양 보유 모델에서 시험된 2T2 구성요소 시스템은 종양 퇴행 및 박멸을 나타낸다.
도 22: 2-표적 2-구성요소. 본 발명에 따른 치료적 조합에 의한 A431 세포(EGFR++/HER2+/-)(도 22a, 22c) 및 CaSKi 세포(EGFR++/HER2+/-)(도 22b, 22d)에서의 EGFR/HER2 표적화 세포 사멸. 도 22a, 22b) A431 세포에 대한 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 적정 + 고정 농도의 50 pM 트라스투주맙-사포린 및 대조군. 도 22c, 22d) Caski 세포에 대한 트라스투주맙-사포린 적정 + 고정 농도의 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 및 대조군. 도 22a, 22b에 대해 범례 및/또는 축은 동일하고, 도 22c 및 22d에 대해 범례는 동일하다.
도 23: 2-표적 2-구성요소. 본 발명에 따른 치료적 조합에 의한 HeLa 세포(EGFR+/-/HER2+/-)(도 23a, 23c) 및 A2058 세포(EGFR-/HER2+/-)(도 23b, 23d)에서의 EGFR/HER2 표적화 세포 사멸. 도 23a, 23b) HeLa 세포에 대한 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 적정 + 고정 농도의 50 pM 트라스투주맙-사포린 및 대조군. 도 23c, 23d) A2058 세포에 대한 트라스투주맙-사포린 적정 + 고정 농도의 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 및 대조군. 도 23c 및 23d에 대해 범례 및/또는 축은 동일하다.
도 24: 2-표적 2-구성요소. 본 발명에 따른 치료적 조합에 의한 SKBR3 세포(HER2++/EGFR+/-)(도 24a, 24b)에서의 HER2/EGFR 표적화 세포 사멸. 도 24a) SKBR3 세포에 대한 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 적정 + 고정 농도의 1.5 pM EGF-다이안틴 및 대조군. 도 24b) SKBR3 세포에 대한 EGF-다이안틴 적정 + 고정 농도의 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 대조군.
도 25: 2-표적 2-구성요소. 본 발명에 따른 치료적 조합에 의한 JIMT-1 세포(HER2+/-EGFR+/-)(도 25a, 25c) 및 MDA-MB-468 세포(HER2-/EGFR++)(도 25b, 25d)에서의 HER2/EGFR 표적화 세포 사멸. 도 25a, 25b) JIMT-1 세포에 대한 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 적정 + 고정 농도의 1.5 pM EGF-다이안틴 및 대조군. 도 25c, 25d) MDA-MB-468 세포에 대한 EGF-다이안틴 적정 + 고정 농도의 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 대조군. 도 25c 및 25d에 대해 범례 및/또는 축은 동일하다.
도 26: 2-표적 2-구성요소. 본 발명에 따른 치료적 조합에 의한 SKBR3 세포(HER2++/EGFR+/-)(도 26a, 26b)에서의 HER2/EGFR 표적화 세포 사멸. 도 26a) SKBR3 세포에 대한 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 적정 + 고정 농도의 10 pM 세툭시맙-사포린 및 대조군. 도 26b) SKBR3 세포에 대한 세툭시맙-사포린 적정 + 고정 농도의 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 대조군.
도 27: 2-표적 2-구성요소. 본 발명에 따른 치료적 조합에 의한 JIMT-1 세포(HER2+/-EGFR+/-)(도 27a, 27c) 및 MDA-MB-468 세포(HER2-/EGFR++)(도 27b, 27d)에서의 HER2/EGFR 표적화 세포 사멸. 도 27a, 27b) JIMT-1 세포에 대한 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 적정 + 고정 농도의 10 pM 세툭시맙-사포린 및 대조군. 도 27c, 27d) MDA-MB-468 세포에 대한 세툭시맙-사포린 적정 + 고정 농도의 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 대조군. 도 27a 및 27b에 대해 범례 및/또는 축은 동일하고, 도 27c 및 27d에 대해 범례는 동일하다.
도 28: A431 세포(EGFR++/HER+/-), A2058 세포(EGFR-/HER+/-), SK-BR-3 세포(EGFR+/HER2++), 및 MDA-MB-468 세포(EGFR++/HER2-)에 대한 세툭시맙-SO1861(DAR4) + 50 pM 2가 VHHEGFR-다이안틴(재조합 융합 단백질) 또는 트라스투주맙-SO1861(DAR4) + 50 pM 2가 VHHEGFR-다이안틴(재조합 융합 단백질)의 본 발명에 따른 병용 치료를 사용한 세포 사멸 (MTS) 분석.
생체활성 분자(예를 들어, 이펙터 분자)가 작동하려면, 분자가 예를 들어 세포 표면 외부의 혈청에서 또는 세포 또는 소기관 내부에서 표적과 결합해야 한다. 거의 모든 단백질 기반 표적화 독소의 활성 모이어티는 예를 들어 표적 조절 효과를 매개하기 위해 표적 세포의 세포질액에 진입해야 한다. 많은 집합체에서, (1) 표적화 모이어티가 제대로 내재화되지 않고 세포 외부에 결합된 상태로 남아 있거나, (2) 내재화 후 세포 표면으로 다시 재순환되거나, (3) 엔도리소좀에 운반되어 분해되기 때문에, 독소는 비효과적으로 남아 있게 된다. 이러한 근본적인 문제가 수십 년 동안 알려져 있었고 500개 초과의 표적화 독소가 지난 수십 년 동안 조사되었음에도 불구하고, 문제는 아직 해결되지 않았으며, 심각한 독성에 대한 경고 라벨이 있긴 하지만 몇 가지 항체 표적화 단백질 독소만 시장에 출시되었다. 목세투모맙 파수도톡스-tdfk(LUMOXITI®, AstraZeneca Pharmaceuticals LP)가 현재까지 FDA에 의해 재발성 또는 불응성 털세포 백혈병에 대해 승인되었다. 이러한 승인된 다른 ADC로는 Ontak의 엘존리스(Elzonri)s가 있다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 독소를 소포체 내 생합성 경로의 내인성 세포막 운반 복합체로 재지향시키는 접근법 및 엔도솜의 막 완전성을 방해하거나 약화시키는 기술, 즉 세포에서 세포내이입 경로를 구획하여 엔도솜 탈출을 촉진하는 기술을 포함하여 많은 전략이 설명되었다. 이는 리소소모트로픽 아민, 카복실 이오노포어, 칼슘 채널 길항제, 바이러스, 박테리아, 식물, 동물, 인간 및 합성 기원의 다양한 세포-투과 펩티드, 기타 유기 분자 및 광-유도 기술의 사용을 포함한다. 표적화 독소의 효능이 일반적으로 세포 배양물에서 백배 또는 천배, 예외적인 경우 백만배 초과 증가되었지만, 엔도솜 탈출 강화제를 다른 물질과 공동 투여해야 하는 요구 사항은 추가적인 부작용, 표적 특이성의 소실, 치료범위 결정의 어려움, 및 세포 유형 의존적 변화를 포함하여 새로운 문제를 수반한다.
물리화학적 기술을 포함한 모든 전략에는, 막과 어느 정도 직접적으로 상호작용하고 본질적으로 작은 화학 분자, 2차 대사산물, 펩티드, 및 단백질을 포함하는 강화제 분자가 필요하다. 이러한 모든 물질의 공통적인 특징은 그 자체가 표적 세포 특이적이지 않고 표적화 독소가 아닌 다른 동역학으로 분포한다는 것이다. 이는 현재 접근법의 주요 단점 중 하나이다.
본 발명의 첫 번째 목표는 ADC 및 AOC에 대한 개선된 강화제를 제공하는 것, 및 예를 들어 표적 세포 외부로부터 상기 세포 내로의 전달이 고려될 때, 또는 보다 구체적으로, 상기 표적 세포의 세포질액에서의 이펙터 분자의 전달이 고려될 때, 이펙터 분자의 유효한 양을 전달하기 위한 개선된 치료적 조합 또는 개선된 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 두 번째 목표는 예를 들어 표적 종양 세포에 대한, 이펙터 분자 및 리간드, 예컨대 EGF, 사이토카인, Her2 표적화 VHH 또는 IgG, EGFR 표적화 IgG 등, 또는 이의 활성 도메인, 활성 유도체, 또는 활성 단편, 바람직하게는 sdAb 또는 복수의 sdAb, 예컨대 하나 이상의 VHH를 포함하는 접합체로 치료될 질환을 앓고 있는 (인간) 환자를 치료하는 개선된 방법을 제공하는 것, 즉 표적 종양 세포의 세포질액에 전달될 이펙터 분자를 포함하는 ADC 또는 AOC의 치료범위를 개선하는 것이다.
본 발명의 목적은, 이펙터 분자에 대한 분자 표적을 포함하는 표적 세포 내로 전달되면 이펙터 분자의 생물학적 효과를 개선할 수 있는 분자를 포함하는 항암 요법, 치료 조성물, 또는 예를 들어 두가지 치료 조성물의 치료적 조합과 같은 요법에 사용하기 위한 이펙터 분자 강화 분자를 제공하는 것으로, 이를 필요로 하는 표적 세포 보유 (인간) 환자에게 투여되면 제공된 분자로 인해 이펙터 분자의 유효 용량에 도달하기 위해 현재 요구되는 용량보다 더 낮은 용량의 이펙터 분자에서 개선된 치료 효과 또는 충분한 효과를 경험한다. 이러한 방식으로, ADC 또는 AOC와 같은 접합체의 일부인 이펙터 분자와 같은 이러한 이펙터 분자의 치료 범위가 효과적으로 넓어진다.
상기 목적 중 적어도 하나는 본 발명의 접합체를 제공하여 달성된다.
본 발명은 특정 구현예와 관련하여 설명될 것이지만 본 발명은 이에 제한되지 않고 청구범위에 의해서만 제한된다. 본 발명이 여러 구현예의 관점에서 설명되었지만, 이의 대안, 수정, 치환, 및 등가물은 본 명세서를 읽고 도면과 그래프를 검토하면 당업자에게 명백해질 것으로 생각된다. 본 발명은 예시된 구현예에 어떠한 방식으로도 제한되지 않는다. 첨부된 청구범위에 의해 정의된 범위를 벗어나지 않고 변경이 이루어질 수 있다.
본 발명자들은 항체-약물 접합체 또는 항체-올리고뉴클레오티드 접합체와 같은 접합체가 이를 필요로 하는 동일한 대상체, 예컨대 인간 암 환자 또는 종양 보유 포유동물에게 적어도 하나의 공유 결합된 사포닌을 포함하는 제2 접합체가 투여되는 경우, 접합체의 치료범위가 증가함을 발명하고 규명하였다(예를 들어 표 A5~A7의 예 참조, ADC 또는 AOC와 결합할 때 항체, 예컨대 IgG 또는 VHH에 공유 결합된 사포닌의 효과에 대한 일련의 시험관내 및 생체내 종양 세포 모델 예에 대해 실시예 섹션에서, 예를 들어 VHH를 포함하는 접합체에 대해 도 2~5 참조 및 단일클론 항체(mAb)를 포함하는 접합체에 대해 도 5~16 및 18~27 참조). 사포닌은 IgG 또는 VHH와 같은 항체와 접합되고, 단백질 독소와 같은 이펙터 분자 또는 BNA와 같은 올리고뉴클레오티드는 IgG 또는 sdAb와 같은 이차 항체와 접합된다. 본 발명자들은 본 발명의 사포닌을, 세포 표면 분자에 결합하기 위한 리간드, 예컨대 항체, 예컨대 전장 온전한 IgG 또는 sdAb, 예컨대 VHH와 접합시키면, 세포 표면에 세포 표면 분자를 노출시키는 표적 세포의 세포 표면에서의 사포닌의 세포 특이적 전달, 및 세포 내부, 예컨대 세포 엔도솜, 엔도리소좀, 리소좀, 및 궁극적으로 세포의 세포질액에서의 사포닌의 후속 전달을 위한 접합체를 제공함을 최초로 규명하고 확정하였다. 이러한 세포 표적화 사포닌 접합체의 예는 예를 들어 하기 실시예 섹션에 설명된 바와 같이, 사포닌-VHH 접합체에 대한 도 2 내지 5, 및 도 5 내지 16 및 도 18 내지 27에 제공된다. 사포닌은 EGF, Her2 표적화 VHH 또는 IgG, EGFR 표적화 IgG, EGFR에 결합하는 서열번호 75로 표시된 아미노산 서열을 갖는 VHH 7D12, EGFR에 결합하는 서열번호 76으로 표시된 아미노산 서열을 갖는 VHH 9G8, EGFR에 결합하는 서열번호 74로 표시된 아미노산 서열을 갖는 공유 연결된 직렬형태의 이중파라토프성 VHH 7D12-9G8 등과 같은 리간드에 접합된다. 본 발명의 접합체 내 세포 표면 분자 결합 분자로서 sdAb 또는 전장 항체 또는 다른 면역글로불린(Ig) 포맷을 포함하는 본 발명의 접합체는, 바람직하게는 그리고 모든 예시적인 예에서, 공유적으로, 보다 바람직하게는 (절단 가능한) 링커를 통해 결합된 본 발명의 사포닌과 같은 적어도 하나의 글리코시드를 갖는다. 사포닌은 임의의 이론에 구애됨이 없이, 이펙터 모이어티의 활성이 요구되는 세포질액으로의 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 강화함으로써, 세포 표면 분자 표적화 분자(항체, sdAb), 즉 예를 들어 이펙터 분자와 IgG 또는 sdAb와 같은 항체의 제2 접합체에 공유 결합된 이펙터 모이어티의 효능을 증가시키는 것 같다. 이러한 방식으로 이미 ADC 또는 AOC의 통상적인 용량보다 낮은 용량의 이펙터 분자에서, 본 발명의 사포닌-포함 접합체의 특정 용량의 영향하에, 사포닌을 포함하는 접합체의 존재의 영향하에 치료 효과가 규명되어 사포닌을 표적 세포 근처로, 표적 세포로, 및/또는 표적 세포 내부로 가져온다. 표적 세포는 예를 들어 종양 세포 또는 자가면역 세포 또는 B-세포 질환 관련 B-세포 등과 같은 질환 세포이다. 이펙터 모이어티는 예를 들어 본 발명에 따른 ADC의 일부로서의 독소 또는 AOC의 일부로서의 안티센스 BNA와 같은 올리고뉴클레오티드이다. 제2 세포 표면 분자 표적화 분자는 예를 들어 본 발명의 접합체와 동일한 세포 표면 분자에 결합할 수 있고, 제2 접합체는 본 발명의 접합체와 동일한 세포 표면 분자 결합 분자의 카피를 포함한다. 대안적으로, 제2 접합체는 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체가 결합할 수 있는 세포 표면 분자와 상이한 세포 표면 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 세포 표면 분자 표적화 분자를 포함한다.
본 발명의 제1 양태는 세포 외부로부터 상기 세포 내로 사포닌을 전달하기 위한 접합체로서, 상기 세포에 결합할 수 있는 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함하고, sdAb는 임의로 직접 또는 임의로 링커를 통해 적어도 하나의 사포닌에 공유 결합되고, 적어도 하나의 사포닌은 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 또는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드인, 접합체에 관한 것이다. 본 발명의 접합체는 세포 외부, 바람직하게는 인간 세포와 같은 포유동물 세포로부터 상기 세포 내로, 접합체에 포함된 적어도 하나의 사포닌을 전달할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 표적 종양 세포 또는 표적 자가면역 세포이다.
접합체는 세포 외부에서 세포 내로 세포막을 통해 이동하여 세포 내로 사포닌을 전달할 수 있다. 일반적으로 접합체는 세포막에서 세포의 엔도솜 및/또는 리소좀으로 이동하여 엔도솜 및 리소좀 내로 사포닌을 전달한다. 일반적으로, 이러한 이동은 결합된 접합체가 있는 수용체의 세포내이입에 관여하는 수용체에 세포 표면 분자 결합 분자의 결합 시 접합체의 수용체 매개 세포내이입에 기인한다(접합체가 수용체에 결합한 후 접합체/수용체 복합체가 내재화됨). sdAb는 세포의 외부 표면에 노출된 결합 부위에 결합할 수 있고, 결합 부위는 일반적으로 단백질성 분자와 같은 세포 표면 분자, 바람직하게는 세포 표면 수용체에 존재한다. 접합체를 세포막을 통해 세포 내로 전달하는 것은 일반적으로 상기 세포 표면 수용체에 대한 결합에 대한 특이성을 갖는 sdAb를 통해 접합체를 세포 표면 수용체에 결합시킨 후, 접합체의 세포내이입을 통해 접합체의 사포닌이 세포 내로 전달되고 일반적으로 세포의 엔도솜에서 전달되도록 한다. 접합체는 세포 표면 분자에 결합하기 위한 단일 sdAb를 포함할 수 있거나 단일 유형의 세포 표면 분자에 결합하기 위해 2~10개 또는 3~6개의 sdAb와 같은 하나 초과의 sdAb를 포함할 수 있다.
일 구현예는 본 발명의 접합체로서, sdAb가 항체의 중쇄로부터 유래된, 바람직하게는 면역글로불린 G 기원의, 바람직하게는 인간 기원의 VH 도메인, 항체의 경쇄로부터 유래된, 바람직하게는 면역글로불린 G 기원의, 바람직하게는 인간 기원의 VL 도메인, 낙타과(Camelidae) 기원 또는 가변 중쇄 신규 항원 수용체(VNAR) 도메인과 같은 Ig-NAR 기원 등을 갖는 중쇄 단독 항체(HCAb)로부터 유래된 VHH 도메인이고, 바람직하게는 HCAb는 낙타과(Camelidae) 기원이고, 바람직하게는 sdAb는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 비쿠냐, 구아나코, 및 박트리아 낙타의 HCAb로부터 유래된 것과 같은 낙타과(Camelidae) 기원의 HCAb로부터 유래된 VHH 도메인(낙타과 VH)이다.
본 발명을 보다 상세히 설명하기 위해, 물질의 세포 흡수 과정 및 본 발명에서 사용되는 용어를 먼저 기술한다. 소포 발아(vesicle budding)에 의해 세포외 물질이 세포 내로 흡수되는 것을 세포내이입이라고 한다. 상기 소포 발아는 (1) 세포질액 단백질 클라트린에 의해 매개되는 수용체-의존성 리간드 흡수, (2) 콜레스테롤 결합 단백질 카베올린에 의해 매개되는 지질-뗏목(lipid-raft) 흡수, (3) 비특이적 체액 흡수(음세포작용), 또는 (4) 비특이적 입자 흡수(식세포작용)를 특징으로 한다. 세포내이입의 모든 유형은 세포내이입 경로라고 하는 소포 운반 및 물질 분류의 다음과 같은 세포 과정으로 진행된다. 세포내이입 경로는 복잡하여 완전히 이해되지는 않았다. 이전에는, 소기관이 새로이 형성되고 세포내이입 경로를 따라 다음 소기관으로 성숙하는 것으로 여겨졌다. 최근에는, 세포내이입 경로가 소포 수송에 의해 연결되는 안정적인 구획을 포함하는 것으로 가정한다. 구획은 세포의 특정 필수 기능 세트에 특화된 복잡하고 다기능적인 막 소기관이다. 소포는 구성이 보다 단순한 일시적인 소기관으로 간주되며, 기존 구획으로부터 발아하여 새롭게 형성하는 '막으로 둘러싸인 용기'로 정의된다. 구획과 달리, 소포는 생리학적으로 비가역적인 일련의 생화학적 변화인 성숙을 거칠 수 있다. 초기 엔도솜과 후기 엔도솜은 세포내이입 경로에서 안정적인 구획을 나타내는 반면, 1차 세포내이입 소포, 식포, 다중소포체(엔도솜 캐리어 소포라고도 함), 분비 과립, 및 심지어 리소좀은 소포를 나타낸다. 원형질막에서 가장 두드러지게는 클라트린 피막 홈(clathrin-coated pit)으로부터 발생하는 세포내이입 소포는 먼저 약 pH 6.5의 주요 분류 구획인 초기 엔도솜과 융합한다. 내재화된 피전달체와 막의 대부분은 재순환 소포(재순환 경로)를 통해 원형질막으로 다시 재순환된다. 분해되어야 하는 성분은 다중소포체를 통해 산성의 후기 엔도솜(pH 6 미만)으로 운반된다. 리소좀은 성숙한 리소좀 효소를 저장할 수 있고 필요할 때 이를 후기 엔도솜 구획에 전달할 수 있는 소포이다. 그 결과 생성된 소기관을 하이브리드 소기관 또는 엔도리소좀이라고 한다. 리소좀은 리소좀 재형성이라고 하는 과정에서 하이브리드 소기관에서 발아한다. 후기 엔도솜, 리소좀, 및 하이브리드 소기관은 매우 동적인 소기관이며, 이들간의 구별은 대개의 경우 어렵다. 세포내이입된 분자의 분해는 엔도리소좀 내부에서 발생한다. 엔도솜 탈출은 세포내이입 경로, 바람직하게는 클라트린 매개 세포내이입, 또는재순환 경로로부터 임의 종류의 구획 또는 소포의 내부 루멘으로부터의 물질이 세포질액으로 능동적 또는 수동적으로 방출되는 것이다. 따라서 엔도솜 탈출은 엔도솜, 엔도리소좀, 또는 리소좀(중간 및 하이브리드 소기관 포함)으로부터의 방출을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 세포질액에 유입된 후, 상기 물질은 핵과 같은 다른 세포 단위로 이동할 수 있다. 본 발명과 관련하여 글리코시드 분자(사포닌)는 특히 엔도솜 탈출을 촉진함으로써 이펙터 분자의 효과를 향상시킬 수 있는 화합물이다. 글리코시드 분자는 세포내이입 및 재순환 경로의 구획 및 소포의 막과 상호작용하여 이들을 상기 이펙터 분자에 대해 빠져나가기 쉽게 만들어 엔도솜 탈출을 증가시킨다.
"이펙터 분자의 효과 개선"이라는 용어는 사포닌이 바람직하게는 표적 결합을 가능하게 하거나 개선함으로써, 이펙터 분자의 기능적 효능(예를 들어, 독소 또는 약물의 치료지수; 생명공학적 과정에서 변형제의 대사 효능; 세포 배양 연구 실험에서 유전자의 형질감염 효능)을 증가시킴을 의미한다. 항원 특이적 면역 반응의 촉진, 연장, 또는 강화는 포함되지 않는 것이 바람직하다. 치료 효능은 더 낮은 투여량 및/또는 더 적은 부작용을 수반한 더 강한 치료 효과를 포함하나 이에 한정되지 않는다. "이펙터 분자의 효과 개선"은 또한 효과 부족 때문에 사용할 수 없었던(예를 들어, 이펙터 분자로 알려지지 않은) 이펙터 분자가 본 발명의 접합체와 조합하여 사용할 때 효과적이 되는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는, 이펙터 모이어티(예를 들어 ADC 또는 AOC의 일부로서) 및 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌의 조합에 기인할 수 있는 유익하거나 바람직한 임의의 다른 효과는 "개선된 효과"로 간주된다. 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌은 본 발명에 따른 ADC 또는 AOC와 같은 제2의 개별 접합체에 포함될 수 있는 이펙터 분자의 기능적 효능의 "강화제"이다.
본 발명에 이를 때까지, 예를 들어 사포닌과 같은 글리코시드에 의한 표적화 독소의 한 가지 주요 단점은 표적화 독소가 수용체 매개 세포내이입에 의해 내재화되는 반면(수용체에 대한 표적화 독소의 결합은 표적화 독소/수용체 복합체의 내재화로 이어짐), 글리코시드는 원형질막을 통해 수동적으로 확산되어 추측컨대 콜레스테롤과의 상호작용을 통해 엔도솜 막에 도달한다는 것이다. 원칙적으로, 글리코시드(예컨대 본 발명의 접합체 내 사포닌)는, 유리 비접합 형태인 경우, 임의의 세포에, 또한 비표적 세포(표적외 세포)에 진입할 수 있어, 표적 세포에서의 표적화 독소의 효과적 방출에 대해 비효율적인 강화제 이용가능성 및 비표적 세포에서의 부작용 가능성을 초래할 수 있다. 한 가지 주요 문제는 표적화 독소와 글리코시드의 진입이 서로 다른 동역학으로 진행되고 이러한 동역학이 세포(주)마다, 그리고 조직마다 달라, 두 물질(예를 들어 ADC, 유리 사포닌 포함)의 적용에 대한 정확한 시간차가 종양(세포(주))마다 크게 다를 수 있다는 것이다. 또한, 살아있는 유기체에서 이러한 물질의 유리, 흡수, 분포, 대사, 및 배설도 다르다. 또한, 비표적 세포에 의한 글리코시드의 a-특이적 흡수는 이러한 세포에서 원치 않는 효과를 유발할 수 있다. 이는 예를 들어 리소좀에 전달되었어야 하는 화합물의 세포질액 전달, 항원 제시의 방해 등일 수 있다. 글리코시드 및 표적화 약물의 비표적 투여도 약물 개발에서 문제가 될 수 있으며, 관련 당국(예를 들어, FDA 또는 EMA)의 판매 허가를 방해하거나 적어도 연기할 수 있다. 본 발명과 관련하여 표적화 독소 및 표적화 약물은 독소 또는 약물이 표적 세포(세포 표면 분자)의 막 결합 분자에 특이적으로 표적화됨을 의미한다(예를 들어, 막 수용체의 리간드에 결합되거나 표적 세포의 세포막 상의 구조(결합 부위, 에피토프)를 특이적으로 인식하는 항체(예컨대 sdAb)에 결합된 독소 또는 약물).
따라서, 강화제가 표적 세포의 세포내이입 경로의 산성 구획 내부에서 효과적인 농도로 이용될 수 있도록 하기 위해 그리고 독소와 시너지 효과를 나타내기 위해서는, 글리코시드(본 발명의 사포닌)를 이펙터 분자와 동일한 경로를 통해, 예를 들어 표적화 리간드를 통해 표적 세포로 지향시키는 것이 매우 유용하다. 따라서, 본 발명은 이펙터 분자와 엔도솜 탈출 강화제(즉, 본 발명의 사포닌) 둘 다를 표적화 리간드(결합 분자)를 통해 표적 세포의 세포내이입 경로의 산성 구획으로 재지향시키는 신규 접근법을 제공한다. 본 발명의 접합체의 사포닌을 포함하는 표적 리간드는 이펙터 분자를 포함하는 접합체에 포함된 표적화 리간드와 동일하거나 상이할 수 있다. 표적화 리간드가 상이한 경우, 두 표적화 리간드는, 상이하지만 종양 세포와 같은 동일한 표적 세포 상에 존재하는 제1 및 제2 세포 표면 분자에 결합하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 사포닌 모이어티를 포함하는 본 발명의 접합체는 EGFR 또는 CD71 또는 HER2에 결합할 수 있고, 예를 들어 이펙터 모이어티를 포함하는 제2 접합체는 EGFR 또는 CD71 또는 HER2에 결합할 수 있으며, 본 발명의 접합체와 제2 접합체는 동일한 세포 수용체 또는 상이한 세포 수용체에 결합한다.
본 발명자들은 세포 내부에서의 이펙터 분자의 효과가 고려될 때, 항체 또는 sdAb와 같은 표적화 리간드를 포함하는 제2 접합체의 일부인 이펙터 분자가, 본 발명의 접합체에 포함되는 사포닌의 영향하에 고효율로 세포 내부로 전달됨을 규명하였다. 놀랍게도, VHH와 같은 sdAb의 상대적으로 작은 크기에도 불구하고, 사포닌을 포함하고 이러한 sdAb를 포함하는 본 발명의 접합체의 세포 표면 수용체에 대한 결합은 접합체에 사포닌 및 sdAb(여기서 sdAb는 바람직하게는 VHH임)가 포함될 때 여전히 발생한다. 본 발명의 접합체를 형성하는, VHH와 같은 sdAb에 대한 사포닌의 결합은 세포 표면 분자에 결합하는 VHH의 능력이 고려될 때, 예를 들어 입체 장애를 일으키지 않는다. 즉, sdAb에 공유 결합된 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체의 부재하에, 예를 들어 종양 세포를 준최적 용량의 예를 들어 ADC 또는 AOC와 접촉시키면 세포내 이펙터 분자 활성이 발생하지 않는다(이펙터 분자의 생물학적 활성에 따라 표적 세포가 효율적으로 사멸되지 않음). 그러나, 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체, 및 ADC 또는 AOC와 표적 종양 세포를 접촉시키면, 효율적인 종양 세포 사멸이 달성된다.
본 발명의 접합체, 및 ADC 또는 AOC로 단일 세포 표면 분자를 표적화하거나, 본 발명의 접합체로 제1 세포 표면 분자를 표적화하고 ADC 또는 AOC로 제2 세포 표면 분자를 표적화함으로써(여기서 제1 및 제2 세포 표면 분자는 상이하고 동일한 표적 세포에 존재함), 세포 표면에 세포 표면 분자를 노출하는 표적 세포의 세포질액 및 그 내부에서, 본 발명의 접합체 내 sdAb와 같은 세포 표면 분자 표적화 항체에 결합된 사포닌의 전달 및 ADC 또는 AOC의 전달은, 예를 들어 본 발명의 사포닌을 포함하는 접합체와 동시에 세포를 접촉시키지 않는 일반적인 ADC로만, 따라서 세포 표적화 사포닌(본 발명의 접합체)의 존재 없이 세포에 접촉시키는 것과 비교하여 개선되고 더 특이적이다. 접합체의 세포 표면 분자 표적화 sdAb에 의한 표적화를 위해 선택된 비정상적인 세포는 이상적으로, 특히 환자의 (인접한) 건강한 세포가 고려될 때, 세포 표면 분자 표적화 분자가 높은 정도(즉, 예를 들어 건강한 세포와 같은 비표적 세포 상의 발현보다, 예를 들어 종양 세포 또는 자가면역 세포와 같은 표적 세포 상의 표적 세포 표면 분자의 상대적으로 더 높은 발현)로 결합할 수 있는 세포 표면 분자의 에피토프를 가지고 있거나/있고, 접합체의 세포 표면 분자 표적화 sdAb의 결합을 위한 표적 세포 표면 분자의 에피토프를 노출시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 접합체의 세포 표면 분자 표적화 sdAb에 의해 표적화된 세포 표면 분자는 건강한 세포에 비해 표적(질환, 종양) 세포에서 상대적으로 높게 그리고/또는 특이적으로 발현된다. 일 구현예는, 종양 세포 수용체와 같은 접합체의 세포 표면 분자 표적화 sdAb에 대한 표적 세포 표면 분자가, 건강한 (인접) 세포의 표면 상의 세포 표면 분자의 발현과 비교할 때 상대적으로 더 높은 정도로 또는 특이적으로 발현되는, 본 발명의 접합체이다. 따라서, 표적 세포 표면 분자의 에피토프는 이상적으로는 표적 질환 세포에 고유하고, 표적 세포의 표면에서 적어도 특이적으로 존재하고 노출된다. 본 발명의 접합체가 표적 세포 상의 세포 표면 분자의 에피토프에 결합한 후 접합체와 표적 세포 표면 분자의 복합체의 세포내이입이 뒤따른다(수용체(세포 표면 분자)에 대한 접합체의 결합은 접합체/수용체 복합체의 내재화로 이어짐). 접합체는 표적화되어서는 안 되는 건강한 세포와 비교할 때 표적 세포에서 고유하게 발현되거나 충분한 정도로 특이적으로 발현되는 세포 표면 분자와의 결합 상호작용을 통해서만 표적 세포에 진입할 수 있기 때문에, 본 발명의 접합체와 동일한 세포 표면 분자를 표적으로 하거나 본 발명의 접합체가 표적으로 하는 세포 표면 분자와 동일한 표적 세포에 존재하되 동일하지 않은 세포 표면 분자를 표적으로 하는 ADC 또는 AOC에 포함된 이펙터 모이어티 및 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌의 치료 활성량의 표적 세포 내 축적은 표적 세포 표면 분자의 발현 수준이 특정 최소 발현 역치를 초과하는 경우에만 가능하고 그런 경우에만 발생한다. 동시에, 제2 접합체의, 리간드, 예컨대 항체, 예컨대 sdAb를 표적화하는 세포 표면 분자에 결합된 이펙터 모이어티가 본 발명의 공유 결합 사포닌을 함유하는 접합체의 존재하에서만 세포내(예를 들어, 세포독성 또는 유전자 침묵) 활성을 발휘할 수 있다는 사실은 또한, 공유 결합된 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체가 존재하지 않는 ADC에 대한 세포의 노출과 비교할 때, 예를 들어 이펙터 모이어티에 의해 표적화되지 않아야 하고 영향을 받지 않아야 하는 건강한 세포 및 건강한 조직에 대한 이펙터 모이어티의 부정적이고 바람직하지 않은 부작용에 대한 안전장치를 제공한다. 즉, 본 발명의 접합체 및 ADC 또는 AOC와 같은 제2 접합체가 결합할 수 있는 노출된 세포 표면 분자의 충분히 낮은 발현 또는 심지어 부재는 이상적으로는, 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌의 영향하에 ADC 또는 AOC의 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 일으킬 정도의 양으로 본 발명의 접합체 및 이펙터 분자를 포함하는 제2 접합체가 (비표적) 건강한 세포에 유입되는 것을 허용하지 않는다. ADC 또는 AOC는, 본 발명의 접합체의 부재로 인한 사포닌의 부재하에 ADC 또는 AOC를 치료 요법에 적용했을 때와 비교하여, 본 발명의 접합체를포함하는 사포닌의 존재하에 더 낮은 용량으로 사용될 수 있으므로, 건강한 세포에서 ADC 또는 AOC가 낮은 수준으로 유입되면, 예를 들어 종양 세포 및 자가면역 세포와 같은 표적 질환 세포의 표적화 및 사멸이 고려될 때, 원치 않는 부작용의 발생 위험이 이미 더 낮다.
따라서, 접합체 내 sdAb를 포함하는 것은 IgG와 같은 항체 또는 이의 결합 단편 또는 결합 도메인을 포함하는 것과 비교하여 다양한 이점을 갖는다. 중요하게는, sdAb는 IgG에 존재하는 Fc 테일을 포함하지 않기 때문에, 접합체가 투여되는 숙주의 내피세포와 같은 세포 상의 Fc 수용체에 대한 접합체의 결합으로 인한 표적외 부작용에 대한 위험이 없다. 따라서, 본 발명의 접합체의 위험 프로파일은 사포닌을 포함하는 IgG 기반 접합체에 비해, 또는 Fc 테일 및 사포닌을 포함하는 접합체에 비해 개선된다. 또한, 본 발명의 접합체는 Fc 수용체에 의해 결합될 수 없으므로, 접합체는 목표로 하는 표적 세포 표면 분자와는 다른 세포 표면 수용체에 의한 접합체의 바람직하지 않은 포획이 적거나 없기 때문에, 전장 항체 기반 사포닌-포함 접합체로 동일한 이펙터 분자 활성에 도달하는 데 필요한 용량보다 낮은 용량에서 이미 효과적이다. 또한, 예를 들어 Fab, scFv, IgG에 비해 sdAb의 크기가 상대적으로 작기 때문에 조직 침투력이 향상되어, 치료가 필요한 환자에게 접합체를 투여했을 때 표적 세포에 도달하는 데 유리하다. 유사한 ADC 또는 AOC에서 Fc 테일을 포함하는 IgG와 같은 더 큰 항체 또는 이의 단편을 적용하는 것과 비교할 때, 본 발명의 접합체의 sdAb를 적용하는 것의 이러한 모든 이점은 예를 들어 ADC 또는 AOC에 포함될 때 및 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체와 함께 치료 요법에서 조합될 때 이펙터 분자에 대한 개선된 치료범위로 이어진다. 예를 들어, 본 발명의 사포닌을 포함하고 IgG를 기반으로 하며 동일한 이펙터 분자(ADC, AOC)와 조합된 접합체가 효과적이지 않거나 준최적으로만 효과적인 동일한 용량에서, sdAb 기반의 본 발명의 접합체와 조합된 ADC 또는 AOC는 이펙터 분자가 예를 들어 독소 또는 BNA일 때 표적 종양 세포의 경우 개선된 표적 세포 사멸을 달성할 수 있다. 본 발명의 양태에 따라, 사포닌이 dAb를 포함하는 접합체, 즉 본 발명의 접합체의 일부인 경우 더 낮은 용량의 이펙터 분자를 사용하여 환자를 치료하는 것이 이제 가능해져, 접합체를 포함하는 항체 기반 사포닌이 동일한 이펙터 분자를 포함하는 ADC 또는 AOC와 조합될 때 필요한 더 높은 용량과 비교하여, 표적 세포에서 동일하거나 개선된 이펙터 분자 매개 효과를 달성할 수 있다. 본 발명의 이러한 접합체를 더 낮은 용량으로 투여하면, 예를 들어 비표적 건강한 세포의 비특이적 진입에 의한 부작용의 발생에 대한 환자의 위험이 낮아진다. 이것은 예를 들어, 접합체에 포함된 sdAb에 의해 표적화되는 세포 표면 분자가 표적(종양) 세포에서 더 높은 정도로 발현되지만 이러한 표적 세포에서 고유하게 발현되지 않을 때 중요하다. 더 낮은 용량의 접합체는 비종양 건강한 세포와 같은 낮은 발현자에 대한 접합체의 결합 위험을 낮춘다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 접합체 내 공유 결합된 사포닌의 존재로 인해 본 발명의 접합체의 존재하에 ADC 및 AOC의 치료범위가 넓어짐을 확인하였다. 즉, 사포닌을 포함하는 접합체가 제공된(조합된) ADC 또는 AOC(즉, 본 발명의 접합체)가 표적 세포와 접촉하면, ADC 또는 AOC, 및 sdAb가 표적 세포의 표면에서 결합 파트너(ADC 또는 AOC에 의해 표적화되고 본 발명의 접합체의 sdAb에 의해 표적화되는 세포 표면 분자는 동일하거나 상이함)에 결합할 때, 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌도 제2 접합체(즉 ADC 또는 AOC)의 이펙터 분자와 함께 근접, 즉 표적 세포의 표면에 근접하게 된다. 세포 표면 분자, 즉 본 발명의 접합체에 포함된 sdAb에 대한 표적 및 ADC 또는 AOC 내 리간드 결합 분자에 대한 표적을 지닌 표적 세포가 본 발명의 접합체 및 ADC 또는 AOC와 접촉하는 경우, 이펙터 분자의 유효 용량 및 사포닌의 유효 용량은 둘 다, 표적 세포가 사포닌의 부재 또는 표적 세포가 유리(표적화되지 않은) 유리(비표적) 사포닌의 존재하에 ADC 또는 AOC와 접촉할 때보다 낮다. 표적화 사포닌이 본 발명의 접합체의 일부로서 존재하면 표적 세포에서의 이펙터 분자의 활성을 강화하여, 제2 접합체(즉 ADC 또는 AOC)의 치료범위 및 이와 함께 이펙터 분자의 치료범위가 넓어진다. 표적 세포가 ADC 또는 AOC와 함께 본 발명의 접합체와 접촉할 때 더 낮은 ADC 또는 AOC 용량에서, 충분한 이펙터 분자 효율이 달성된다. ADC 또는 AOC가 사포닌 또는 이의 기능적 유도체의 존재하에 표적 세포와 접촉할 때 유사한 효과가 본 발명자들에 의해 확인되었지만, 사포닌의 이펙터 분자 강화 활성이 고려될 때, 표적(종양) 세포에 대한 접합체의 표적화 결합을 위한 sdAb와 함께, 이펙터 분자 활성 강화 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체를 적용할 때 규명된 유효 용량과 비교하여, 100배 내지 1000배 더 높은 유리 사포닌(기능적 유도체) 농도에서 확인되었다. 따라서, 사포닌 또는 이의 기능적 유도체에 결합 분자(즉, 본 발명의 접합체에 포함된 sdAb)를 제공하고 또한 접합체를 이펙터 분자(즉, ADC 또는 AOC에 포함된 이펙터 분자)를 포함하는 제2 접합체와 결합하면, 본 발명의 접합체가 본 발명의 접합체의 sdAb를 결합하기 위한 세포 표면 분자를 발현하고 이의 표면에서 ADC 또는 AOC를 결합하기 위한 세포 표면 분자를 발현하는 표적 세포, 즉, sdAb에 대한 결합 표적 및 동일하거나 동일한 표적(종양) 세포에 노출되는 한 상이할 수 있는 ADC 또는 AOC에 대한 결합 표적과 접촉할 때, 개선된 이펙터 분자 활성 강화 효과를 가져온다. 표적화 사포닌은 표적 세포 내부로의 이펙터 분자의 전달, 및 상기 세포의 엔도솜 또는 리소좀으로부터, 이펙터 분자가 표적 결합 파트너에 결합해야 하고 생물학적 활성(예를 들어, 표적 세포가 종양 세포이고 이펙터 분자가 예를 들어 독소인 경우 세포 사멸)을 발휘해야 하는 곳인 세포질액으로의 전달에 있어 더 낮은 용량에서 이미 효과적이지만, 본 발명자들은 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체, 세포 표적화 모이어티(sdAb), 및 이펙터 분자(예를 들어 ADC에 대한 독소, 예를 들어 AON에 대한 BNA)를 포함하는 제2 접합체의 조합이 훨씬 더 효과적임을 발견하였다.
따라서, 본 발명자들은 동일한 표적 세포에서의 두 개의 접합체의 표적화 전달을 위한, 본 발명의 사포닌(기능적 유도체)를 포함하는 접합체와 이펙터 분자 및 sdAb와 같은 항체를 포함하는 제2 접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 이 약제학적 조성물은 본 발명의 접합체의 일부로서 공유 결합된 사포닌과 조합되어 적용되지 않은, 전장 항체 또는 이의 Fc 포함 구성체 기반의 현재 ADC와 비교할 때, 개선된 치료범위를 가지며, 이펙터 분자 기반 요법을 필요로 하는 환자에게 제2 접합체에 포함된 이펙터 분자의 유효 용량이 투여될 때의 부작용 유발 위험이 더 낮고, 본 발명의 접합체의 일부로서의 표적화 사포닌의 영향하에 표적 세포 내, 보다 구체적으로는 이러한 표적 세포의 세포질액 내로의 제2 접합체의 개선된 전달로 인한 개선된 이펙터 분자 활성을 갖는다. 본 발명의 접합체 단독 적용이 표적 세포의 엔도솜/엔도리소좀/리소좀으로 전달하기 위한 사포닌의 공급원으로서 바람직하긴 하지만, 본 발명의 이러한 접합체가 이펙터 분자 기반 요법을 필요로 하는 환자에게 ADC 또는 AOC와 조합하고, 임의로 유리 사포닌(기능적 유도체)의 용량과 함께 투여되는 것은 본 발명의 일부이다.
본 발명의 접합체에 적용하기에 적합한 사포닌의 예는 C-23 위치에 알데히드기를 갖는 12,13-데하이드로올레아난의 유형에 속하고 임의로 사포닌의 C-3베타-OH 기에 있는 탄수화물 치환기에 글루쿠론산기를 포함하는 모노데스모시드 또는 바이데스모시드 트리테르펜 사포닌이고, 바람직하게는 C-23 위치에 알데히드기를 갖는 12,13-데하이드로올레아난의 유형에 속하고 사포닌의 C-3베타-OH 기에 있는 탄수화물 치환기에 글루쿠론산기를 포함하는 바이-데스모시드 트리테르펜 사포닌이다. 본 발명에 따른 예시적인 사포닌은 하기 구조로 예시되고 사포닌 A로 표시되는 사포닌의 특징 중 하나, 여러 개, 또는 모두를 포함한다.
Figure pct00001
이 사포닌 그룹은 사포닌 및 이펙터 모이어티가 세포의 엔도솜에 존재할 때 이펙터 모이어티에 대한 엔도솜 탈출 강화 활성을 나타냈다. 전형적으로, 본 발명에 따른 접합체에 적용하기에 적합한 사포닌은 트리테르펜 백본의 구조가 펜타사이클릭 C30 테르펜 골격(사포게닌 또는 아글리콘이라고도 함)인 트리테르펜 백본을 갖는 사포닌이다. 표 A1은 적어도 하나의 sdAb, 예컨대 VHH 및 적어도 하나의 사포닌, 예컨대 1~16개의 사포닌 모이어티, 1~8개, 예컨대 2, 4, 또는 8개의 사포닌 모이어티를 포함하는 접합체의 합성에 적합한 사포닌을 열거하며, 사포닌은 예를 들어 SO1861 또는 QS-21, 바람직하게는 SO1861이다.
접합체 내 하나 이상의 sdAb는 낙타과 VH인 것이 바람직하다. 이러한 VH는 면역화 접근법을 사용하고/하거나 나이브 라이브러리 또는 상기 세포 외부로부터 상기 세포 내로 사포닌을 이동시키기 위해 선택된 세포의 외부 표면 상에 노출된 세포 표면 분자의 적어도 일부로 라마와 같은 낙타과 종의 면역화를 포함하는 면역화 전략을 사용하여 얻은 라이브러리로 파지 디스플레이 기술을 적용하여 용이하게 얻을 수 있다. 본 발명의 접합체에서 이러한 낙타과 VH를 적용하면, 이러한 결합 도메인이 상대적으로 안정하고 통상적인 면역글로불린 G 유형의 항체 또는 scFv, Fab와 같은 이의 공통 단편보다 작기 때문에 유익하며, 이는 일반적으로 예를 들어 인간 대상체에게 투여시 조직 침투의 개선을 보인다. 세포 표면 분자에 결합되면 세포내이입(수용체 매개 내재화)를 유도할 수 있는 임의의 sdAb가 본 발명의 접합체에서의 적용에 적합함이 이해될 것이다.
일 구현예는, 2개 이상의 sdAb를 포함하고; 적어도 하나의 사포닌에 공유 연결된 단일 제1 sdAb를 갖거나, 적어도 하나의 사포닌에 연결된 2개 이상의 sdAb를 갖거나, 2개 이상의 sdAb 모두가 적어도 하나의 사포닌에 연결된 것인 sdAb를 갖는, 본 발명의 접합체이다.
일 구현예는, 세포의 세포 표면 분자 상의 동일한 결합 부위에 결합할 수 있는 1~8개의 sdAb를 포함하고, 적어도 하나의 사포닌은 1~8개의 sdAb 중 단일 제1 sdAb에 연결되거나, 적어도 하나의 사포닌은 sdAb 중 2개 이상(존재하는 경우)에 연결되는, 본 발명의 접합체이다. 동일하고 세포 표면 상의 동일한 결합 부위에 결합할 수 있는 동일한 유형의 하나 초과의 sdAb가 본 발명의 접합체에서 함께 연결되는 것은 본 발명의 일부이다. 접합체 내 복수의 sdAb는 이러한 복수의 sdAb 중 하나 초과의 sdAb가 (동일한) 세포 표면에 존재하는 결합 부위에 동시에 결합할 수 있을 때 향상된 결합 친화도 및 결합력에 기여한다. 세포 표면에서의 이러한 다중 결합 이벤트는, 세포 표면의 결합 부위가 수용체에 결합된 접합체를 세포내이입할 수 있는 세포 표면 수용체의 일부일 때, 예를 들어 수용체 매개 세포내이입을 통해, 세포에 의한 접합체의 흡수를 촉진할 수 있다. 본 발명의 접합체가 표적 세포 상의 결합 부위에 결합하기 위한 하나 초과의 sdAb 카피를 포함하는 경우, 이들 sdAb의 단일 카피는 적어도 하나의 사포닌에 결합되거나 하나 초과의 sdAb 카피 또는 접합체에 포함된 모든 sdAb는 적어도 하나의 사포닌, 예컨대 접합체에 존재하는 하나 초과의 sdAb의 각각의 카피에 결합된 하나의 사포닌에 결합된다. 일 구현예는 단일 sdAb를 포함하고 이에 공유 결합된 단일 사포닌 또는 복수의 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체이다. 따라서 본 발명의 접합체는 일부 구현예에서 단일 sdAb 모이어티 및 단일 또는 복수의 사포닌 모이어티를 포함한다. 일 구현예는, 이중파라토프성인 2개 이상의 sdAb를 포함하는, 바람직하게는 이중파라토프성인 2개의 sdAb를 포함하는, 본 발명의 접합체이다. 이러한 이중파라토프성 직렬형태의 sdAb의 예는 서열번호 74로 표시된 아미노산 서열을 갖는 이중파라토프성 직렬형태의 sdAb이다. 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 2가 직렬형태의 sdAb는 EGFR에 결합한다. 서열번호 75로 표시된 아미노산 서열을 갖는 제1 sdAb, 7D12는 EGFR의 제1 에피토프에 결합하고, 서열번호 76으로 표시된 아미노산 서열을 갖는 제2 sdAb, 9G8은 EGFR의 제2 에피토프에 결합한다. 물론, sdAb 7D12 또는 sdAb 9G8은 또한, 단일 sdAb를 포함하는 본 발명의 접합체, 또는 7D12 및 9G8과는 다른 적어도 하나의 추가 sdAb(적어도 하나의 추가 sdAb는 EGFR에 결합하거나, EGFR이 노출되는 표면과 동일한 세포 표면에 존재하는 추가 세포 표면 분자에 결합함)를 포함하는 본 발명의 접합체에 적용하기에 적합하다.
일 구현예는, sdAb-사포닌 접합체가 적어도 하나의 사포닌 중 1~100개의 사포닌 모이어티, 바람직하게는 2~64개의 사포닌 모이어티, 보다 바람직하게는 4~32개의 사포닌 모이어티, 가장 바람직하게는 8~16개, 또는 그 사이의 임의의 수의 사포닌 모이어티를 포함하는, 본 발명의 접합체이다. 전형적으로, 본 발명의 sdAb-사포닌 접합체는 1, 2, 4, 8, 또는 16개의 사포닌 모이어티(사포닌 분자의 카피)를 포함한다. 예를 들어, 4개의 사포닌 분자가 G2 덴드론에 공유 연결되고, 덴드론-(사포닌)4 접합체(사포닌 접합체) 중 하나 이상, 예컨대 1개 또는 2개가 sdAb에 공유 연결된다. 예를 들어, 8개의 사포닌 분자가 G3 덴드론에 공유 연결되고, 덴드론-(사포닌)8 접합체(사포닌 접합체) 중 하나 이상, 예컨대 1개 또는 2개가 sdAb에 공유 연결된다. 일 구현예는, sdAb-사포닌 접합체가 하나 초과의 사포닌 모이어티를 포함하고, 사포닌 모이어티가 동일하거나 상이한, 본 발명의 접합체이다. 즉, 하나 초과의 사포닌이 본 발명의 sdAb-사포닌 접합체에서 sdAb에 공유 연결되는 경우, 이들 사포닌은 모두 동일한 사포닌의 카피이거나, 사포닌은 서로 다른 사포닌일 수 있다. sdAb에 결합된 사포닌이 동일한, 복수의 사포닌 모이어티를 포함하는 접합체가 바람직하다. 예를 들어, sdAb-사포닌 접합체에서 sdAb에 공유 연결된 2, 4, 8, 16개의 사포닌 분자, 예를 들어 2~16개의 SO1861 카피 또는 QS-21 카피, 바람직하게는 SO1861.
이펙터 분자에 대한 사포닌의 엔도솜 탈출 강화 효과의 적용이 고려될 때, 동기화는 마우스에 대한 성공적인 전달 전략과 인간에 대한 적용 사이의 연결 고리이다. 실제로, 본 발명자들은 일련의 생체내 마우스 종양 모델에서, 마우스에게 유리 사포닌의 용량 및 예를 들어 본 발명에 따른 사포닌을 포함하는 접합체가 존재하지 않는 ADC의 용량을 개별적으로 투여한 결과, 유리 사포닌이 있는 ADC로 처치되지 않은 대조군 동물과 비교하여, 종양 성장의 지연, 종양 퇴행, 종양 성장의 감소 및 둔화와 같은 어떠한 바람직한 항종양 활성도 나타나지 않음을 규명하였다. 또한 생체내 종양 모델에 대해 도 18~21 및 아래 실시예 섹션에 기술된 실시예 참조. 유리 사포닌은 다양한 투여 경로를 사용하여 투여되었고, ADC 투여 시점과 비교하여 유리 사포닌 투여 시점을 다양하게 사용하여 투여되었다(ADC 투여 전, 투여 중, 투여 후에 유리 사포닌 투여). 생체내 종양 모델에서 시험된 ADC는 세툭시맙-다이안틴(유리 SO1861 포함), 또는 트라스투주맙-사포린(유리 SO1861 포함)이었다. 유리 사포닌 용량을 변화시키는 것은 효과적인 항종양 활성을 제공하지 않았다． 언급된 ADC는 그 자체로는 종양 보유 동물에 어떠한 유익한 항종양 효과도 주지 않는 용량으로 투여되었다. 놀랍게도, 본 발명자들은 현재 인간 종양 세포를 사용하는 다양한 시험관내 포유동물 세포 기반 생물검정 및/또는 다양한 생체내 동물 종양 모델에서 유익한 항종양 활성이 ADC 또는 AOC와 조합된 본 발명에 따른 접합체로 세포 또는 동물을 처치함으로써 달성될 수 있음을 규명하였다. 본 발명의 접합체는 임의로 본 발명에 따른 스캐폴드(아래 참조; 하나 이상의 사포닌 모이어티가 공유 결합된 올리고머 또는 폴리머 구조를 포함하는 공유 사포닌 접합체와 같은 스캐폴드)를 포함한다. 스캐폴드는 예를 들어 절단 가능하거나 절단 가능하지 않은 연결을 통한 공유 결합 사포닌(예를 들어, SO1861, QS-21)과의 삼작용성 링커이며, 스캐폴드는 접합체의 세포 표면 분자 표적화 분자, 예컨대 세툭시맙, 트라스투주맙, OKT-9와 같은 단일클론 항체, 그러나 바람직하게는 VHH와 같은 sdAb에 공유 결합으로 연결되거나, 스캐폴드는 덴드론, 예를 들어 4개의 모이어티가 예컨대 4개의 사포닌 분자에 결합할 수 있는 G4-덴드론 G4-덴드론 또는 G5-덴드론, 또는 예를 들어 8개의 사포닌에 결합하는 덴드론과 같은 덴드론이고, 덴드론은 접합체의 세포 표면 분자 표적화 항체, 예컨대 sdAb에 (공유) 결합하는 화학기를 포함한다. 단백질성 독소에 의해 발휘되는 세포 독성이 고려될 때 또는 종양 세포에서의 유전자 침묵이 고려될 때 생체내 및/또는 시험관내 항종양 세포 활성을 나타내는, 본 발명에 따른 이들 스캐폴드 중 몇 가지를 예시하는 추가 구현예 및 실시예 섹션을 참조한다.
임의의 이론에 구애됨이 없이, 유리 사포닌과 함께 ADC로 종양 보유 동물을 처치할 때 관찰되는 실패를 고려하여, 표적 세포, 예를 들어 종양 세포 또는 자가면역 세포의 세포내이입 경로의 구획 또는 소포에서, 적어도 하나의 사포닌, 및 이펙터 모이어티, 바람직하게는 독소 또는 올리고뉴클레오티드, 둘 다의 존재를 동기화하는 것이 바람직하다. ADC 및 유리 사포닌을 사용하여, 생체내 시너지 효과를 얻기 위해, 후기 엔도솜에서 분자의 존재를 동기화하는 것은 본 발명자들의 시도에 따라 유익하게 얻을 수 없었다. 일 양태에서, 본 발명은 바람직하게는 이펙터 모이어티(예를 들어 ADC 또는 AOC)를 포함하는 접합체를 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체와 조합하는 것과 관련하여 적어도, 임의의 이론에 구애됨이 없이, 예를 들어 특히 단일의 절단 가능하고 유지 가능한 (공유) 결합에 사용될 수 있는 사포닌 내의 유일한 타당한 화학기가 엔도솜 탈출 활성에 필요하다는 문제를 해결한다. 예를 들어 본원에 예시된 본 발명의 사포닌의 현저한 엔도솜 탈출 강화제 효과가 10년 넘게 알려져 있었음에도, 면역 강화 보조 물질의 사용이 암시된 백신접종 요법에 사포닌을 적용하는 것 이외의 임상 연구에서 약제학적 활성 물질과 조합하여 사포닌이 사용된 적이 없었던 이유는 알려진 제한 사항일 가능성이 크다. 예를 들어, 본 발명의 접합체에, 예를 들어 여러 사포닌을 운반하는 스캐폴드의 맥락에서, 공유 결합 사포닌을 제공하는 것은 이러한 어려움을 적어도 부분적으로 해결한다. 놀랍게도, 이전에 사포닌을 보조 성분으로서 포함하는 백신접종 맥락에서 면역 강화 활성을 위해 적용되었던 사포닌은 이제 ADC 또는 AOC와 조합하여 사용할 때 시험관내 및 생체내 항종양 활성을 위해, 본 발명의 접합체 포함된 세포 표면 분자 표적화 항체, 예컨대 sdAb에 (공유) 결합시키기에도 적합하다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌이:
2알파-하이드록시 올레아놀산;
16알파-하이드록시 올레아놀산;
헤데라게닌(23-하이드록시 올레아놀산)
16알파,23-디하이드록시 올레아놀산;
집소게닌;
퀼라산;
프로토애시게닌-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-22-아세테이트;
23-옥소-바링토게놀 C-21,22-비스(2-메틸부트-2-에노에이트);
23-옥소-바링토게놀 C-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-16,22-디아세테이트;
디지토게닌;
3,16,28-트리하이드록시 올레아난-12-엔; 및
집소겐산
중 어느 하나로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하고,
바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 퀴라산 및 집소게닌으로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하고, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조는 퀼라산인, 본 발명의 접합체이다.
임의의 이론에 구애됨이 없이, 사포닌의 아글리콘 코어 구조(본원에서 '아글리콘'이라고도 함)에 알데히드기(또는 이의 유도체)가 존재하는 것은 사포닌이 본 발명에 따른, ADC 또는 AOC와 같은 제2 접합체의 일부로서 이펙터 분자와 함께 세포에서, 세포의 엔도솜 내에 공동 국재화될 때, 또는 엔도솜 내에서 유리 형태로 있을 때(예를 들어, 접합체가 표적 세포 엔도솜 또는 리소좀 내부로 전달되면 접합체에서 분리됨) 및 이펙터 분자를 보유하는 제2 접합체의 존재하에 세포에 노출될 때, 본 발명의 접합체에 포함된 이펙터 분자의 엔도솜 탈출을 자극 및/또는 강화하는 사포닌의 능력에 유익하다. 따라서, 알데히드기가 있는 아글리콘을 갖는 사포닌을 포함하는 본 발명의 접합체가 바람직하다. 퀼라산과 집소게닌에서 알데히드기는 아글리콘의 C23 원자에 있다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌은 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C3 원자 또는 C28 원자, 바람직하게는 C3 원자에 결합된 제1 당류 사슬을 포함하고/하거나, 적어도 하나의 사포닌은 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C28 원자에 결합된 제2 당류 사슬을 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 제1 및 제2 당류 사슬을 포함하는, 본 발명의 접합체이다. 따라서, 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌이 2개의 글리칸(당류 사슬)을 갖는 경우, 제1 당류 사슬은 아글리콘 코어 구조의 C3 위치에 결합되고 제2 당류 사슬은 아글리콘 코어 구조의 C28 위치에 결합된다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌이:
GlcA-,
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-Ara-,
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-,
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-, 및
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-
로부터 선택되는 제1 당류 사슬을 포함하고/하거나,
적어도 하나의 사포닌이
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-,
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-,
Ara-,
Xyl-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc- (R1은 4E-메톡시신남산임),
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc- (R2는 4Z-메톡시신남산임),
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-디-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc- (R3은 4E-메톡시신남산임),
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
(Ara- 또는 Xyl-)(1→3)-(Ara- 또는 Xyl-)(1→4)-(Rha- 또는 Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha- 또는 Fuc-)(1→4)]-(Rha- 또는 Fuc-),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc- (R4는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc- (R5는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-디-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- (R6은 5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- (R7은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- (R8은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- (R9는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- (R10은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- (R11은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- (R12는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임), 및
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-
로부터 선택되는 제2 당류 사슬을 포함하고,
바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 이러한 선택된 제1 당류 사슬 및 이러한 선택된 제2 당류 사슬을 포함하는, 본 발명의 접합체이다. 따라서, 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌이 2개의 글리칸(당류 사슬)을 갖는 경우, 제1 당류 사슬은 아글리콘 코어 구조의 C3 위치에 결합되고 제2 당류 사슬은 아글리콘 코어 구조의 C28 위치에 결합된다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌이 3-O-베타-D-갈락토피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)]-베타-D-글루쿠론피라노실 퀼라산 28-O-베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-자일로피라노실-(1→4)-알파-L-람노피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)-4OAc-베타-D-퀴노보피라노실-(1→4)]-베타-D-푸코피라노시드, 퀼라야(Quillaja) 수피 사포닌, 딥사코시드 B, 사이코사포닌 A, 사이코사포닌 D, 마크란토이딘 A, 에스쿨렌토시드 A, 피톨라카게닌, 에스시네이트, AS6.2, NP-005236, AMA-1, AMR, 알파-헤데린, NP-012672, NP-017777, NP-017778, NP-017774, NP-018110, NP-017772, NP-018109, NP-017888, NP-017889, NP-018108, SA1641, AE X55, NP-017674, NP-017810, AG1, NP-003881, NP-017676, NP-017677, NP-017706, NP-017705, NP-017773, NP-017775, SA1657, AG2, SO1861, SO1862, SO1904, GE1741, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, QS-7, QS1861, QS-7 api, QS1862, QS-17, QS-18, QS-21 A-apio, QS-21 A-xylo, QS-21 B-apio, QS-21 B-xylo, 베타-에스신(Aescin), 에스신 Ia, 티시드(Teaseed) 사포닌 I, 티시드 사포닌 J, 아삼사포닌(Assamsaponin) F, 디지토닌(Digitonin), 프리물라산(Primula acid) 1, 및 AS64R, 및/또는 이들의 기능적 유도체, 및/또는 이들의 입체이성질체, 및/또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고, 기능적 유도체는 임의로 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제2 당류 사슬에 아세틸기가 없고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 QS-21, GE1741, SA1641, 및 SO1861, 및/또는 이들의 기능적 유도체로부터 선택되고, 기능적 유도체는 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제2 당류 사슬에 아세틸기가 없는, 본 발명의 접합체이다. 적어도 하나의 사포닌이 3-O-베타-D-갈락토피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)]-베타-D-글루쿠론피라노실 퀼라산 28-O-베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-자일로피라노실-(1→4)-알파-L-람노피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)-4OAc-베타-D-퀴노보피라노실-(1→4)]-베타-D-푸코피라노시드, 퀼라야(Quillaja) 수피 사포닌, 딥사코시드 B, 사이코사포닌 A, 사이코사포닌 D, 마크란토이딘 A, 에스쿨렌토시드 A, 피톨라카게닌, 에스시네이트, AS6.2, NP-005236, AMA-1, AMR, 알파-헤데린, NP-012672, NP-017777, NP-017778, NP-017774, NP-018110, NP-017772, NP-018109, NP-017888, NP-017889, NP-018108, SA1641, AE X55, NP-017674, NP-017810, AG1, NP-003881, NP-017676, NP-017677, NP-017706, NP-017705, NP-017773, NP-017775, SA1657, AG2, SO1861, SO1862, SO1904, GE1741, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, QS-7, QS1861, QS-7 api, QS1862, QS-17, QS-18, QS-21 A-apio, QS-21 A-xylo, QS-21 B-apio, QS-21 B-xylo, 베타-에스신(Aescin), 에스신 Ia, 티시드(Teaseed) 사포닌 I, 티시드 사포닌 J, 아삼사포닌(Assamsaponin) F, 디지토닌(Digitonin), 프리물라산(Primula acid) 1, 및 AS64R로부터 선택되고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌이 QS-21, GE1741, SA1641, 및 SO1861, 및/또는 이들의 기능적 유도체(기능적 유도체는 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없음), 보다 바람직하게는 QS-21, SO1861로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 SO1861인, 본 발명의 사포닌-포함 접합체가 바람직하다. 전형적으로, 사포닌은 이펙터 분자(예컨대, ADC 또는 AOC의 이펙터 모이어티와 같은 부분)와 함께 선택된 세포와 접촉할 때 이펙터 분자에 대한 엔도솜 탈출 강화 활성에 대해 알려진, 표 A1로부터 선택되는 사포닌이다.
트리테르펜 글리코시드 유형의 이러한 사포닌은, 사포닌이 세포 내부에서 (이펙터) 분자와 공동 국재화될 때, 접합체에 포함된, 세포의 엔도솜(또는 리소좀)에 존재하는 이러한 (이펙터) 분자의 엔도솜 탈출을 강화시킬 수 있다. 본 발명자들은 사포닌이 본 발명의 접합체의 일부로서 세포와 접촉될 때 이들 사포닌의 엔도솜 탈출 강화 활성이 약 100 내지 1000배 더 강력하다는 것을 규명하였다. 유리 사포닌은 세포가 (이펙터) 분자, 및 사포닌과 접촉할 때, 세포 외부로부터 엔도솜 내부로, 최종적으로는 상기 세포의 세포질액에서 (이펙터) 분자의 동일한 정도의 전달을 달성하는 데 필요한, 본 발명의 접합체에 포함된 동일한 사포닌의 농도에 비해 100~1000배 더 높은 사포닌 농도에서 세포의 세포질액 내 (이펙터) 분자의 전달을 자극할 수 있다. 이러한 엔도솜 탈출 강화 활성을 나타내는 사포닌, 및 (이펙터) 분자의 세포질액 전달을 강화하는 능력이 규명된 사포닌과 높은 구조적 유사성을 갖는 사포닌을 표 A1에 열거하였다. 따라서, 사포닌이 본 발명의 접합체의 일부인 경우, 표적 세포 상의 세포 표면 결합 부위에 대한 sdAb의 결합시, 상기 세포 상에, 그리고 세포내이입 후 상기 세포의 엔도솜 내로 사포닌을 표적화 전달하는 것은, 동일한 세포를 표적 세포의 세포 표면 분자에 결합하기 위한 항체 또는 sdAb와 같은 결합 분자가 제공되지 않은 표적화되지 않은 유리 사포닌과 접촉시키는 것과 비교하여 약 100 내지 1000배 더 효과적이다. IgG 유형의 항체, 또는 이의 단편, 예컨대 Fab, scFv에 비해 본 발명의 접합체의 sdAb의 작은 크기는 sdAb의 결합을 위한 결합 부위를 노출하는 표적 세포에 의한 효율적인 흡수, 예를 들어 세포내이입에 의한 흡수에 기여한다. 전형적으로, 본 발명의 접합체 내 sdAb는 종양 세포 특이적 세포 표면 수용체와 같은, 표적 세포의 세포 표면 수용체에 결합할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 접합체는 예를 들어 세포 표면 수용체를 발현하는 종양 세포 내로의 세포내이입에 특히 적합하다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌이 SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 퀼라야사포닌, 사포니넘 알범(Saponinum album), QS-18, Quil-A, Gyp1, 집소시드 A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, SO1862, SO1904, 및/또는 이들의 입체이성질체, 및/또는 이들의 기능적 유도체, 및/또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고, 임의로 기능적 유도체는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제2 당류 사슬에 아세틸기가 없고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 SO1861, GE1741, SA1641, 및 QS-21로부터 선택되고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제2 당류 사슬에 아세틸기가 없는 이들의 기능적 유도체로부터 선택되는, 본 발명의 접합체이다. 일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌이 SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 퀼라야 사포닌, 사포니넘 알범, QS-18, Quil-A, Gyp1, 집소시드 A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, SO1862, SO1904로부터 선택되고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌이 SO1861, GE1741, SA1641, 및 QS-21로부터 선택되고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없는 이들의 기능적 유도체인, 본 발명의 사포닌-포함 접합체이다. 전형적으로, sdAb-사포닌 접합체에 포함된 적어도 하나의 사포닌은 표 A1로부터 선택된다. SO1861이 바람직하다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌은 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하고/하거나, 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티를 포함하는 제1 당류 사슬을 포함하고/하거나, 아세틸기를 포함하는 제2 당류 사슬을 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조, 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티를 포함하는 제1 당류 사슬, 및 아세틸기를 포함하는 제2 당류 사슬을 포함하고, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조, 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티를 포함하는 제1 당류 사슬, 아세틸기를 포함하는 제2 당류 사슬 중 하나 또는 둘을 포함하는, 본 발명의 접합체이다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌은 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조, 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티를 포함하는 제1 당류 사슬, 및 아세틸기를 포함하는 제2 당류 사슬을 포함하지 않는 사포닌 기능적 유도체인, 본 발명의 접합체이다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌은 링커, 바람직하게는 절단 가능한 링커를 통해 sdAb에 공유 결합되는, 본 발명의 접합체이다. 사포닌을 링커를 통해 sdAb에 결합시키면, sdAb에 대한 사포닌의 결합을 위한 결합 부위가 고려될 때 유연성을 제공한다. 또한, 이러한 링커는, sdAb가 세포 표면 분자 상의 결합 부위에 결합하는 능력을 유지하고, (이펙터) 분자와 함께, sdAb가 세포 표면 분자에 결합할 때 접합체가 표적으로 하는 세포의 엔도솜 또는 리소좀에 접합체가 공동 국재화되는 경우 사포닌이 a(n)(이펙터) 분자의 엔도솜 탈출을 강화하는 능력을 유지하도록, sdAb 및 사포닌 사이의 스페이서로 작용할 수 있다.
일 구현예는, 절단 가능한 링커가 산성 조건, 환원 조건, 효소 조건, 및/또는 광 유도 조건에서 절단될 수 있고, 바람직하게는 절단 가능한 링커가 산성 조건에서 절단될 수 있는 하이드라존 결합 및 하이드라지드 결합, 및/또는 단백질분해, 예를 들어 카텝신 B에 의한 단백질분해를 허용하는 결합, 및/또는 이황화 결합과 같은 환원 조건에서 절단되기 쉬운 결합으로부터 선택되는 절단 가능한 결합을 포함하는, 본 발명의 접합체이다.
일 구현예는, 절단 가능한 링커는 예를 들어 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포의 엔도솜 및/또는 리소좀에 존재하는 것과 같은 산성 조건에서 생체내 절단될 수 있고, 바람직하게는 절단 가능한 링커는 pH 4.0~6.5에서, 보다 바람직하게는 pH 5.5 이하에서 생체내 절단될 수 있는, 본 발명의 접합체이다. 엔도솜 및 리소좀의 명백한 조건에서 절단 가능한 이러한 절단 가능한 링커는 본 발명의 접합체의 나머지로부터 사포닌의 절단시 엔도솜 또는 리소좀 내부의 유리 사포닌의 전달을 촉진한다. 이러한 방식으로, 본 발명의 접합체는 표적 세포 상의 세포 표면 분자에 대한 sdAb의 특이적 결합시 사포닌의 세포 표적화 전달의 이점과, 세포 내부, 즉 엔도솜(또는 리소좀) 내부의 유리 사포닌의 존재의 이점을 조합하며, 이는 (이펙터) 분자가 엔도솜(또는 리소좀) 밖으로 그리고 표적 세포의 세포질액으로 전달되는 것을 자극 및/또는 촉진하는 유리 사포닌의 능력에 기여한다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌은 올리고머 분자 또는 폴리머 분자를 포함하는 공유 사포닌 접합체의 일부로서 sdAb에 공유 결합되고, 올리고머 분자 또는 폴리머 분자는 적어도 하나의 사포닌에 공유 결합되고 sdAb에 공유 결합되는, 본 발명의 접합체이다. 일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌이, 사포닌이 공유 결합된 올리고머 분자 또는 폴리머 분자를 포함하는 공유 사포닌 접합체의 일부이고, sdAb가 또한 사포닌이 결합된 것과 동일한 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 공유 결합된, 본 발명의 접합체이다. 따라서, 올리고머 분자 또는 폴리머 분자는 하나 이상의 공유 결합된 사포닌 모이어티를 포함하고, sdAb에 공유 결합된다. 사포닌과 sdAb는 폴리머 분자 또는 올리고머 분자를 통해 서로 공유 결합된다. 올리고머 분자 또는 폴리머 분자는 sdAb 및 사포닌을 함께 연결하여, 본 발명의 사포닌-포함 접합체를 제공한다. 올리고머 또는 폴리머 분자에 결합된 사포닌의 이러한 공유 사포닌 접합체는 바람직하게는 (절단 가능한) 링커를 통해, 단일 결합을 통해, sdAb에 결합할 수 있는 복수의 사포닌 모이어티에 대한 캐리어(스캐폴드, 담체) 역할을 한다. 공유 사포닌 접합체는 임의의 선택된 수의 공유 결합된 사포닌 모이어티, 예컨대 1~200개의 사포닌 모이어티를 가질 수 있기 때문에, 이들 사포닌을 공유 연결하기 위한 결합 부위를 포함하는 선택된 올리고머 또는 폴리머 구조의 유형과 관련하여, 이러한 공유 사포닌 접합체의 적용은 본 발명의 sdAb-사포닌 접합체 내 사포닌 모이어티의 수가 고려될 때 자유를 제공한다. 예를 들어, 선택된 이펙터 분자의 세포질액 전달을 위해, 본 발명의 sdAb-사포닌 접합체에 존재하는 사포닌의 수는, 공유 사포닌 접합체가 본 발명의 sdAb-사포닌 접합체의 일부인 경우, 및 이펙터 분자가 생물학적 활성을 발휘해야 하는 표적 세포의 엔도솜 또는 리소좀에서 sdAb-사포닌 접합체와 공동 국재화되는 경우, 이펙터 분자의 세포질액 전달을 자극하기에 충분한 다수의 사포닌 모이어티를 공유 사포닌 접합체에 제공함으로써 조정될 수 있다.
일 구현예는 공유 사포닌 접합체 중 1~8개 또는 공유 사포닌 접합체 중 2~4개가 sdAb에 공유 결합된, 본 발명의 접합체이다. 일 구현예는, 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자가 덴드론, 예컨대 G2 덴드론, G3 덴드론, G4 덴드론, 또는 G5 덴드론이고, 1~32개의 사포닌 모이어티, 바람직하게는 2, 3, 4개(예를 들어, G2 덴드론), 5, 6, 8개(예를 들어, G3 덴드론), 10, 16개(예를 들어, G4 덴드론), 32개(예를 들어, G5 덴드론)의 사포닌 모이어티, 또는 그 사이의 임의의 수의 사포닌 모이어티, 예컨대 7, 9, 12개의 사포닌 모이어티가 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 공유 결합된, 본 발명의 sdAb-사포닌 접합체이다.
일 구현예는, 사포닌을 포함하는 올리고머 분자 또는 폴리머 분자 중 1~8개가 sdAb에 공유 결합된, 본 발명의 사포닌-포함 접합체이다.
일 구현예는, 사포닌을 포함하는 올리고머 분자 또는 폴리머 분자 중 2~4개가 sdAb에 공유 결합된, 본 발명의 사포닌-포함 접합체이다.
일 구현예는, 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자가 덴드론인, 본 발명의 사포닌-포함 접합체이다. 생물학적으로 충분히 비활성 또는 불활성, 바람직하게는 생물학적으로 비활성 또는 불활성인 올리고머 분자 또는 폴리머 분자, 예컨대 덴드론 또는 폴리에틸렌 글리콜이 바람직하다.
일 구현예는, 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자가, 각각 4, 8, 16, 또는 32개의 사포닌 모이어티를 공유 결합하기 위한 4, 8, 16, 및 32개의 결합 부위를 갖는 G2 덴드론, G3 덴드론, G4 덴드론, 또는 G5 덴드론인, 본 발명의 사포닌-포함 접합체이다.
일 구현예는, 1~32개의 사포닌 모이어티, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32개의 사포닌 모이어티, 또는 그 사이의 임의의 수의 사포닌 모이어티, 예컨대 7, 9, 12개의 사포닌 모이어티가 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 공유 결합된, 본 발명의 사포닌-포함 접합체이다.
바람직하게는, 공유 사포닌 접합체 중 1개 또는 2개가 본 발명의 sdAb-사포닌 접합체에서 단일 sdAb에 결합된다. 여러 목적을 위해, 접합체에 포함된 단일 sdAb에 대한 단일 사포닌의 결합 또는 단일 공유 사포닌 접합체의 결합은 표적 세포 및 상기 세포의 세포질액으로의 이펙터 분자 전달의 효율적인 자극에 충분하다. 전형적으로, 4, 8, 또는 16개의 사포닌이 본 발명의 접합체에 포함되며, 예컨대 본 발명의 접합체에서 sdAb에 결합된 단일 공유 사포닌 접합체에 4 또는 8개의 사포닌이 포함된다. 전형적으로, 본 발명의 이러한 접합체는 사포닌 또는 복수의 사포닌 또는 공유 사포닌 접합체가 결합된 단일 sdAb를 포함하고, 바람직하게는, 단일 사포닌 또는 단일 공유 사포닌 접합체이다. sdAb-사포닌 접합체와 관련하여 "sdAb-사포닌"은 적어도 하나의 사포닌 분자 및 적어도 하나의 sdAb의 접합체를 지칭하며 단일 sdAb 및 단일 사포닌 분자를 포함하는 본 발명의 접합체로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 접합체는 1개 또는 2개의 sdAb, 예컨대 VHH, 및 1~32개의 사포닌 분자, 예컨대 2, 4, 8, 16개의 사포닌 분자를 포함하거나 이로 구성된다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌이 바람직하게는 링커(예컨대 절단가능한 링커)를 통해, 이민 결합, 하이드라존 결합, 하이드라지드 결합, 옥심 결합, 1,3-디옥솔란 결합, 이황화 결합, 티오-에테르 결합, 아미드 결합, 펩티드 결합, 또는 에스테르 결합 중 임의의 하나 이상을 통해 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 공유 결합되는, 본 발명의 접합체이다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌은 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C23 위치에 알데히드 작용기, 및 임의로 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C3베타-OH 기에 제1 당류 사슬의 글루쿠론산 작용기를 포함하고, 알데히드 작용기는 sdAb에 대한 직접 공유 결합에 관여하거나 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 대한 공유 결합에 관여하고/하거나, 존재하는 경우, 글루쿠론산 작용기는 sdAb에 대한 직접 공유 결합에 관여하거나 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 대한 적어도 하나의 사포닌의 공유 결합에 관여하고, 적어도 하나의 사포닌의 결합은 직접적인 공유 결합을 통해 또는 링커(절단가능한 링커 또는 안정한 링커인 링커)를 통해 이루어지는, 본 발명의 접합체이다. 여기서, '안정한'은 사포닌과 sdAb 사이의 결합, 또는 사포닌과 올리고머 또는 폴리머 구조 사이의 결합을 나타내며, 이러한 결합은 세포 내부의 산성 조건, 특히 이러한 세포의 엔도솜 또는 리소좀의 산성 조건에서 온전하게(절단되지 않고) 유지된다. 또한, 이러한 안정한 결합은 예를 들어 공유 사포닌 접합체를 포함하는 본 발명의 접합체가 투여되는 인간 대상체의 순환기 및 기관에서 온전하게(즉, 절단되지 않고) 유지된다. 대조적으로, sdAb에 대한, 또는 올리고머 구조 또는 폴리머 구조에 대한 사포닌의 결합과 관련하여 절단 가능한 링커는 인간 세포, 예를 들어 종양 세포와 같은 포유동물 세포의 엔도솜 및 리소좀 내부의 명백한 산성 조건에서 절단되는 결합을 나타내는 반면, 이러한 절단 가능한 링커는 예를 들어 본 발명의 접합체가 투여되는 인간 대상체의 순환기 또는 기관, 즉 세포 외부에 이러한 절단 가능한 결합을 포함하는 접합체가 존재할 때 온전하게(절단되지 않고) 유지된다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C23 위치에 있는 알데히드 작용기는 링커, 바람직하게는 절단가능한 링커, 보다 바람직하게는 N-ε-말레이미도카프로산 하이드라지드(EMCH) 링커에 공유 결합되고, 링커는 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자의 설프하이드릴기, 예컨대 시스테인의 설프하이드릴기에 티오-에테르 결합을 통해 공유 결합되는, 본 발명의 접합체이다. 사포닌의 아글리콘의 알데히드기에 대한 EMCH 링커의 결합은 하이드라존 결합을 형성시킨다. 이러한 하이드라존 결합은 엔도솜 및 리소좀 내부의 산성 조건에서 절단 가능한 결합의 전형적인 예이다. 본 발명의 접합체의 sdAb, 또는 공유 사포닌 접합체(이러한 공유 사포닌 접합체는 본 발명의 접합체 내 sdAb에 결합됨)의 올리고머 구조 또는 폴리머 구조에 결합된 사포닌은, 접합체의 sdAb가 결합할 수 있는 세포 표면 분자를 노출하는 표적 세포의 엔도솜 또는 리소좀에 전달되면 본 발명의 접합체로부터 방출될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 접합체에서 sdAb에 결합된 사포닌은 세포 외부로부터 엔도솜(또는 리소좀) 내로 전달되고, 엔도솜(또는 리소좀)에서 사포닌은 pH에 의한 하이드라존 결합의 절단시 접합체로부터 방출된다. 엔도솜(또는 리소좀)에서, 유리 사포닌은 엔도솜(또는 리소좀)에 공동 국재화된 이펙터 분자의 세포질액으로의 전달이 고려될 때 자극 활성을 발휘할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은 사포닌의 경우 사포닌이 엔도솜 또는 리소좀에서 유리 형태로 존재한다는 것이 사포닌의 엔도솜 탈출 강화 활성에 대한 전제 조건이 아님을 규명하였다. 또한, 예를 들어 본 발명의 접합체 또는 예를 들어 항체와 사포닌의 접합체에 의해 포함된 사포닌은 접합체의 일부로서의 이펙터 분자 및 사포닌이 동일한 표적 세포와 접촉되면, 표적 세포의 엔도솜/리소좀에서 세포질액으로의 이펙터 분자의 전달을 강화한다.
일 구현예는, 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C3베타-OH 기에 있는 제1 당류 사슬의 글루쿠론산 작용기는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU) 링커와 같은 링커에 공유 결합되고, 링커는 sdAb에 직접 아미드 결합을 통해 공유 결합되거나 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자의 아민기, 예컨대 라이신 또는 단백질 N-말단의 아민기에 아미드 결합을 통해 공유 결합되는, 본 발명의 접합체이다. HATU 링커가 사포닌 및 sdAb에 결합될 때, 사포닌은 예를 들어 sdAb의 N-말단에 결합되거나, sdAb에 존재하는 라이신의 아민기에 결합된다.
일 구현예는, 공유 사포닌 접합체의 폴리머 분자 또는 올리고머 분자는 sdAb에, 바람직하게는 공유 사포닌 접합체의 폴리머 분자 또는 올리고머 분자 상의 클릭 화학기를 포함하는 sdAb의 아미노산 잔기에 결합하고, 클릭 화학기는 바람직하게는 테트라진, 아지드, 알켄, 알킨, 또는 이들 기의 환형 유도체로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 클릭 화학기는 아지드인, 본 발명의 접합체이다.
일 구현예는, 공유 사포닌 접합체의 폴리머 분자 또는 올리고머 분자는 선형 폴리머, 분지형 폴리머, 및/또는 환형 폴리머, 올리고머, 덴드리머, 덴드론, 덴드론화된 폴리머, 덴드론화된 올리고머, DNA, 폴리펩티드, 폴리라이신, 폴리에틸렌 글리콜, 올리고에틸렌 글리콜(OEG), 예컨대 OEG3, OEG4, 및 OEG5로부터 선택되는 폴리머 구조 및/또는 올리고머 구조, 또는 이들 폴리머 구조 및/또는 올리고머 구조의 어셈블리를 포함하고, 어셈블리는 바람직하게는 공유 가교에 의해 구축되고, 바람직하게는 공유 사포닌 접합체의 폴리머 분자 또는 올리고머 분자는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머와 같은 덴드론인, 본 발명의 접합체이다. 일 구현예는, 공유 사포닌 접합체의 폴리머 분자 또는 올리고머 분자가 덴드리머, 덴드론, 덴드론화된 폴리머, 덴드론화된 올리고머, DNA, 예를 들어 2~200개 핵산, 폴리-에틸렌 글리콜, 올리고-에틸렌 글리콜(OEG), 예컨대 OEG3, OEG4, 및 OEG5로부터 선택되는 폴리머 구조 및/또는 올리고머 구조를 포함하는, 본 발명의 접합체이다. 올리고머 분자 또는 폴리머 분자는 고유한 생물학적 활성이 없는 것에 대해 선택된다. 전형적으로, 선택된 올리고머 분자 또는 폴리머 분자는 이러한 올리고머 분자 또는 폴리머 분자를 포함하는 본 발명의 사포닌-포함 접합체가 인간 대상체에게 투여되는 경우 인간 대상체에서 건강상의 위험을 초래할 수 있거나 초래할, 또는 부작용을 초래할 수 있거나 초래할 생물학적 활성이 고려될 때 불활성 분자이다. 본 발명의 접합체에 혼입될 선택된 사포닌의 수에 따라, 올리고머 구조 또는 폴리머 구조의 유형 및 크기 또는 길이가 선택된다. 즉, 본 발명의 접합체의 형성을 위한, sdAb에 결합될 사포닌의 수는, 원하는 수의 사포닌을 결합시키기에 충분한 양의 결합 부위를 가져 본 발명의 접합체를 제공하기 위한, sdAb에 결합될 선택된 수의 사포닌 모이어티를 갖는 공유 사포닌 접합체를 제공하는, 적합한 올리고머 또는 폴리머 구조의 선택을 결정할 수 있다. 예를 들어, OEG의 길이 또는 덴드론 또는 폴리-라이신 분자의 크기는 이러한 올리고머 또는 폴리머 구조에 공유 연결될 수 있는 사포닌의 최대 수를 결정한다.
따라서 본 발명에 따른 접합체는 적어도 하나의 사포닌을 포함한다. 이와 관련하여 "적어도 하나"는 접합체가 하나의 사포닌 분자를 포함하지만 몇 개(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)의 사포닌 또는 다수(예를 들어, 10개, 20개, 또는 100개)의 사포닌을 포함할 수도 있음을 의미한다. 적용에 따라, 접합체는 공유 결합된 사포닌을 갖는 공유 결합 스캐폴드(공유 사포닌 접합체)를 포함할 수 있으며, 스캐폴드는 정의된 수의 사포닌을 포함하도록 설계될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 접합체는 임의의 수가 아닌 정의된 수 또는 범위의 사포닌을 포함한다. 이는 판매 허가와 관련하여 의약품 개발에 특히 유리하다. 이와 관련하여 정의된 수는 접합체가 바람직하게는 이전에 정의된 수의 사포닌을 포함함을 의미한다. 예를 들어, 이는 사포닌이 (공유적으로) 부착할 수 있는 특정 수의 모이어티를 갖는 폴리머 구조를 포함하는 스캐폴드를 설계함으로써 달성된다. 이상적인 상황에서, 이러한 모이어티는 모두 사포닌에 결합되고 스캐폴드는 이전에 정의된 수의 사포닌을 포함한다. 사용자가 필요에 따라 최적의 수를 쉽게 테스트할 수 있도록, 예를 들어 2, 4, 8, 16, 32, 64개 등의 사포닌을 포함하는 표준 스캐폴드 세트를 제공하는 것이 예상된다. 일 구현예는, 예를 들어 비이상적 상황에서 폴리머 구조에 존재하는 모든 모이어티가 사포닌에 결합하지는 않으므로 사포닌이 정의된 범위로 존재하는, 본 발명의 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)를 포함하는 본 발명의 접합체이다. 이러한 범위는 예를 들어 스캐폴드당 2~4개의 사포닌 분자, 스캐폴드당 3~6개의 사포닌 분자, 스캐폴드당 4~8개의 사포닌 분자, 스캐폴드당 6~8개의 사포닌 분자, 스캐폴드당 6~12개의 사포닌 분자 등일 수 있다. 이러한 경우, 범위가 2~4로 정의된 경우 본 발명에 따른 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)를 포함하는 접합체는 따라서 2, 3, 또는 4개의 사포닌을 포함한다.
스캐폴드는 기본적으로 스캐폴드에 공유 결합된 사포닌의 유형과 독립적이며, 스캐폴드는 후속적으로(순서대로) 본 발명의 접합체에 공유 결합된다. 따라서, 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)를 포함하는 본 발명의 접합체는 플랫폼 기술을 위한 기본 산물이다. 적어도 하나의 공유 결합된 사포닌은 본 발명에 따른 ADC 또는 AOC와 같은 제2 접합체에 포함된 세포 표면 분자 표적화 리간드, 예컨대 항체, 예컨대 sdAb에 결합된 이펙터 모이어티의 세포내 전달을 매개하기 때문에, 본 발명에 따른 스캐폴드 기술은 ADC 또는 AOC를 사포닌 및 sdAb를 포함하는 본 발명의 접합체와 조합하여 사포닌에 의한 제어된 세포내 이펙터 모이어티 전달을 매개하는 시스템이다. 스캐폴드는 sdAb의 단일의 정의된 위치에서, 접합체에 포함된 세포 표면 분자 표적화 sdAb 및 사포닌에 연결될 수 있는 최적화되고 기능적으로 활성인 단위를 제공한다.
일 구현예는, 폴리머 또는 올리고머 구조의 단량체 수가 정확히 정의된 수 또는 범위인, 본 발명에 따른 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)를 포함하는 본 발명의 접합체이다. 바람직하게는, 폴리머 또는 올리고머 구조는 선형, 분지형, 또는 환형 폴리머, 올리고머, 덴드리머, 덴드론(예를 들어, 각각 4, 8, 16, 또는 32개의 사포닌 모이어티의 최대 공유 결합을 위한 G2, G3, G4, 또는 G5 덴드론 중 임의의 것), 덴드론화된 폴리머, 덴드론화된 올리고머, 또는 이들 구조의 순전한 또는 혼합된 어셈블리로서 나타나는, 폴리(아민), 예를 들어 폴리에틸렌이민 및 폴리(아미도아민)과 같은 구조, 또는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(에스테르), 예컨대 폴리(락티드), 폴리(락탐), 폴리락티드-코-글리콜리드 공중합체, 폴리(덱스트린)과 같은 구조, 또는 펩티드 또는 단백질, 또는 천연 및/또는 인공 폴리아미노산과 같은 구조, 예를 들어 폴리-라이신, DNA 중합체, 예컨대 2~100개 뉴클레오티드를 포함하는 DNA, 예를 들어 2~200개 뉴클레오티드를 포함하는 안정화된 RNA 중합체 또는 PNA(펩티드 핵산) 중합체를 포함한다. 바람직하게는, 폴리머 또는 올리고머 구조는 생체적합성이며, 생체적합성이란 폴리머 또는 올리고머 구조가 유기체에서 실질적인 급성 또는 만성 독성을 나타내지 않고, 그대로 배설되거나 신체의 대사에 의해 배설 가능한 화합물 및/또는 생리학적 화합물로 완전히 분해될 수 있음을 의미한다. 어셈블리는 공유 가교 또는 비공유 결합 및/또는 인력에 의해 구축될 수 있다. 따라서 어셈블리는 나노겔, 마이크로겔, 또는 하이드로겔을 형성할 수 있거나, 무기 나노입자, 콜로이드, 리포솜, 콜레스테롤 및/또는 인지질을 포함하는 미셀 또는 입자 유사 구조와 같은 캐리어에 부착될 수 있다. 상기 폴리머 또는 올리고머 구조는 바람직하게는 글리코시드 분자(및/또는 캐리어 분자, 예컨대 리간드, 단일클론 항체 또는 이의 단편, 예컨대 sdAb(여기서 sdAb는 본 발명에 따라 바람직함))의 결합을 위한 정확히 정의된 수 또는 범위의 결합 모이어티(화학기)를 갖는다. 폴리머 또는 올리고머 구조 내 결합 모이어티(화학기)의 정확히 정의된 수 또는 범위의 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 (약) 100%가 본 발명에 따른 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)에서 글리코시드 분자(본 발명의 사포닌)에 의해 점유된다.
바람직하게는, 덴드론은 결절점(focal point)이라고 하는 나무 원점에 화학적으로 주소지정할 수 있는 단일의 기를 갖는 분지형의 명확히 정의된 나무 형상(tree-like) 중합체이다. 덴드리머는 결절점에서 2개 이상의 덴드론이 연결된 것이다. 덴드론화된 폴리머는 하나 이상의 덴드론의 결절점이 폴리머에 연결된 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 스캐폴드가 제공되며, 폴리머 또는 올리고머 구조는 선형, 분지형, 또는 환형 폴리머, 올리고머, 덴드리머, 덴드론, 덴드론화된 폴리머, 덴드론화된 올리고머, 또는 이들 구조의 순전한 또는 혼합된 어셈블리를 포함하고, 어셈블리는 공유 가교 또는 비공유 인력에 의해 구축될 수 있고 나노겔, 마이크로겔, 또는 하이드로겔을 형성할 수 있으며, 바람직하게는, 폴리머는 폴리(아민)의 유도체, 예를 들어 폴리에틸렌이민 및 폴리(아미도아민), 및 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(에스테르), 예컨대 폴리(락티드), 폴리(락탐), 폴리락티드-코-글리콜리드 공중합체, 및 폴리(덱스트린)과 같은 구조, 및 천연 및/또는 인공 폴리아미노산과 같은 구조, 예컨대 폴리-라이신, 또는 펩티드 또는 단백질 또는 DNA 중합체, 예컨대 2~100개 뉴클레오티드를 포함하는 DNA, 예를 들어 2~200개 뉴클레오티드를 포함하는 안정화된 RNA 중합체 또는 PNA(펩티드 핵산) 중합체이다. 바람직하게는, 폴리머 또는 올리고머 구조는 생체적합성이다.
일 구현예는, sdAb는 단일 sdAb이거나 2개 이상, 바람직하게는 2개의 sdAb이고, sdAb는 세포의 종양 세포 표면 분자, 바람직하게는 종양 세포 표면 수용체, 예컨대 종양 세포 특이적 수용체, 보다 바람직하게는 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린, 신데칸-1, 혈관 인테그린 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 엽산 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, 전립선 특이 막항원(PSMA), CanAg, 인테그린-알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토(Cripto), CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, 에프린A4, MUC-1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA-4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, c-Met(HGFR), EGFR1, RANKL, ADAMTS5, CD16, CXCR7(ACKR3), 글루코코르티코이드-유도 TNFR 관련 단백질(GITR) 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 (표적) 세포의 수용체, 가장 바람직하게는 HER2, c-Met, VEGFR2, CXCR7, CD71, 및 EGFR1로부터 선택되는 세포의 수용체에 결합할 수 있는, 본 발명의 접합체이다.
이러한 세포 표면 분자는 일반적으로 종양 세포 특이성을 가진 종양 세포에 적어도 어느 정도 존재한다. 종양 세포 특이성은 이들 수용체를 본 발명의 접합체에 적합한 표적이 되도록 하고, 따라서 접합체 내 sdAb는 이러한 세포 표면 수용체에 결합할 수 있다. 종양 세포는, 일반적으로 항체 또는 이의 결합 단편 또는 도메인과 같은 결합 분자를 표적화하는 종양 세포 수용체를 포함하고, 표적 종양 세포 내부, 보다 구체적으로 상기 종양 세포의 세포질에서 전달될 이펙터 분자를 포함하는 접합체에 표적화된다. 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌은 세포, 예컨대 본 발명의 접합체에 포함된 sdAb에 의해 표적화된 (종양) 세포의 세포질액에서, 이펙터 분자의 방출 및 전달을 자극할 수 있기 때문에, sdAb에 대한 표적(종양) 세포 표면 분자로서, 예를 들어 ADC 및 AOC에 대한 표적으로 작용하기에 적합한 것으로 알려진 세포 표면 수용체를 선택하는 것이 특히 적합하다. 본 발명의 접합체는 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌과 함께 ADC 또는 AOC의 일부인 이펙터 분자의 동시 전달에 적합하다. 본 발명의 접합체를 사용한 종양 세포 특이적 수용체의 표적화는 접합체의 일부로서의 사포닌의 표적 세포 엔도솜 및/또는 리소좀 내로의 세포내이입 및 전달을 촉진한다. 또한 종양 세포가 ADC 또는 AOC와 접촉될 때, 이러한 ADC 또는 AOC에 포함된 이펙터 분자는 엔도솜 또는 리소좀 내로 공동 전달되고, 사포닌의 영향하에, 이펙터 분자는 이어서 표적 세포의 세포질액으로 전달된다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 접합체의 일부로서 표적화 사포닌의 적용은, sdAb 또는 전체 항체와 같은 세포 표적화 모이어티가 없는 유리 사포닌의 적용과 비교하여, 이펙터 분자의 생물학적 활성이 고려될 때, 사포닌의 자극 효과를 약 100배 내지 1000배 강화시킨다. 본 발명의 접합체에서 낙타과 VH와 같은 작은 sdAb의 적용은, 항체 기반 ADC에서 일반적으로 관찰되는 제거율과 비교할 때, 접합체가 투여된 인간 대상체의 순환기 및 신체로부터 본 발명의 접합체가 제거되는 것을 방지하거나 늦춘다. 또한, sdAb의 크기가 상대적으로 작기 때문에, 예를 들어 사포닌에 결합하는 항체의 더 큰 크기와 비교하여, 연결 단백질 도메인의 존재로 인한 표적 세포 내부의 사포닌 활성의 제한 또는 방해에 대한 위험이 제한된다. 일반적으로, 사포닌에 연결된 분자의 크기가 작을수록, 결합 분자, 예를 들어 VHH와 같은 항체 도메인의 존재로 인한 세포 내부의 사포닌 활성에 대한 간섭 위험이 적어진다. 또한, sdAb의 상대적으로 작은 크기는 종양 조직과 같은 조직에서의 빠른 분포로 이어져, 예를 들어 ADC, OAC에 일반적으로 적용되는 상대적으로 큰 크기의 IgG와 비교하여, 표적 세포 도달의 개선, 및 이와 함께 표적 세포에 대한 결합(의 정도)의 개선을 가능하게 한다. 본 발명의 접합체에 sdAb를 적용(예를 들어 ADC 및 AOC에서 sdAb를 적용하는 경우에도 적용됨)하는 많은 이점 중 하나는 예를 들어 IgG 유형의 일반적인 항체에 공통적인 Fc 테일이 없다는 것이다. 본 발명의 접합체 내 sdAb에 Fc 테일이 없으면, 접합체가 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 때, Fcγ-수용체 활성화와 관련된 바람직하지 않은 부작용과 같은 Fcγ-수용체 매개 표적외 효과의 발생이 방지된다. Fc 테일이 없으면, 예를 들어 항체 기반 ADC가 투여되는 환자의 세포에 Fc가 결합함으로써 발생하는 부작용의 위험이 제거된다. 본 발명의 접합체는 Fc 매개의 바람직하지 않은 부작용에 대한 이러한 위험을 갖지 않는 반면, 본 발명자들은 이제 이러한 접합체가, 종양 세포가 ADC(상대적으로 낮은 용량; 또한 실시예 섹션 참조) 및 본 발명의 접합체(상대적으로 낮은 용량; 또한 실시예 섹션 참조) 모두와 접촉할 때, ADC에 포함된 이펙터 분자의 강화에 매우 효율적이고 효과적임을 보여준다.
일 구현예는, 적어도 sdAb가 단일 sdAb이거나 2개 이상, 바람직하게는 2개의 sdAb이고, sdAb가 항-CD71 sdAb, 항-HER2 sdAb, 항-CD20 sdAb, 항-CA125 sdAb, 항-EpCAM(17-1A) sdAb, 항-EGFR sdAb, 항-CD30 sdAb, 항-CD33 sdAb, 항-혈관 인테그린 알파-v 베타-3 sdAb, 항-CD52 sdAb, 항-CD22 sdAb, 항-CEA sdAb, 항-CD44v6 sdAb, 항-FAP sdAb, 항-CD19 sdAb, 항-CanAg sdAb, 항-CD56 sdAb, 항-CD38 sdAb, 항-CA6 sdAb, 항-IGF-1R sdAb, 항-인테그린 sdAb, 항-신데칸-1 sdAb, 항-CD79b, 항-c-Met sdAb, 항-EGFR1 sdAb, 항-VEGFR2 sdAb, 항-CXCR7 sdAb로부터 선택되고, sdAb가 바람직하게는 VHH, 보다 바람직하게는 낙타과 VH인, 본 발명의 접합체이다. 종양 세포 특이적 수용체, 특히 Her2, CD71, 및 EGFR에 결합할 수 있는 항체로부터 유래하는 sdAb가 바람직하다.
일 구현예는, 접합체는 HER2, CD71, 또는 EGFR에 결합할 수 있는 sdAb를 포함하고, sdAb는 바람직하게는 VHH, 보다 바람직하게는 낙타과 VH인, 본 발명의 접합체이다. 본 발명자들은 이들 종양 세포 특이적 수용체가 본 발명의 접합체에 의해 효율적이고 효과적으로 표적화될 수 있음을 규명하였다. 예를 들어, 항-HER2 VHH, 항-CD71 VHH, 및 항-EGFR VHH는 본 발명에 따른 적어도 하나의 사포닌 또는 적어도 하나의 공유 사포닌 접합체에 결합하기에 적합하다.
일 구현예는, 접합체는 클론 11A4, 클론 18C3, 클론 22G12, 클론 Q17, 클론 Q17-C-태그에 의해 생성된 sdAb로부터 선택되는 HER2에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-EGFR Q86-C-태그에 의해 생성된, EGFR에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-CD71 Q52-C-태그에 의해 생성된, CD71에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-HIVgp41 Q8-C-태그에 의해 생성된, HIVgp41에 결합하기 위한 sdAb; 또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 및 31 중 어느 하나의 cDNA에 의해 암호화된 sdAb; 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36 내지 72의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 중 어느 하나를 포함하고, 임의로 접합체는 알부민에 결합하기 위한 sdAb, 예컨대 서열번호 33, 34, 및 35의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함하는, 본 발명의 접합체이다. 일 구현예는, 접합체가 클론 11A4, 클론 18C3, 클론 22G12, 클론 Q17, 또는 클론 Q17-C-태그에 의해 생성된 sdAb로부터 선택되는 HER2에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-EGFR Q86-C-태그에 의해 생성된, EGFR에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-CD71 Q52-C-태그에 의해 생성된, CD71에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-HIVgp41 Q8-C-태그에 의해 생성된, HIVgp41에 결합하기 위한 sdAb; 또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 및 31 중 어느 하나의 cDNA에 의해 암호화된 sdAb; 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36 내지 72의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 중 어느 하나, 또는 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 이중파라토프성 직렬형태의 sdAb 7D12 및 9G8, 또는 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 7D12, 또는 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 9G8을 포함하고, 임의로 접합체가 알부민에 결합하기 위한 sdAb, 예컨대 서열번호 33, 34, 및 35의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함하는, 본 발명의 접합체이다. 예를 들어, 사포닌 및 적어도 하나의 VHH의 접합체는 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 직렬형태의 이중파라토프성 sdAb를 포함하거나, 7D12의 하나 이상의 카피 및/또는 9G8의 하나 이상의 카피를 포함한다. 본 발명의 접합체에 혼입되기에 적합한 VHH는 예를 들어 단일 도메인 항체 데이터베이스(Wilton, E.E. et al. (2018)), 특허 출원 US20160251440(항-CD123, 항-CEACAM), US9683045(항-c-Met), US20090252681(항-EGFR, 항-IGF-1R), US9969805(항-HER2), US20190023796A1(항-HER3), 문헌[Kijanka et al. (2013)](항-HER2), 및 문헌[Mercier et al. (2019)](항-HER2)에서 확인된다. 일련의 적합한 VHH의 아미노산 서열 및/또는 cDNA 서열은 또한 종양 세포 특이적 수용체에 결합할 수 있는 능력을 고려하여, 서열번호 1~32 및 36~72로서, 항-HER2, 항-HER3, 항-CD123, 항-CEACAM, 항-c-Met, 항-EGFR, 항-IGF-1R, 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-CD19, 항-HER1, 및 항-VGFR2에 대해 아래에 제공되어 있다.
일 구현예는, 접합체는 분자 I의 일반 구조로 표시되고:
(분자 I)
sdAb1 (-L1-Su1)n -[ L2a-((-sdAb2)m1 (-L3-Su2)p)q1 … L2i-((-sdAb9)m2 (-L4-Su3)p)q2]-(L5-sdAb10r (-L6-Su4)t)v,
여기서, sdAb1, sdAb2 … sdAb9, sdAb10은 sdAb1, sdAb2, sdAb3, sdAb4, sdAb5, sdAb6, sdAb7, sdAb8, sdAb9, 및 sdAb10이고, 이들 sbAb는 동일한 sdAb(의 카피)이고;
S는 적어도 하나의 사포닌 모이어티이고;
L1, L3, L4, 및 L6은 각각 독립적으로, 적어도 하나의 사포닌을 sdAb에 연결하는 공유 결합 또는 공유 링커이고, 이러한 링커는 동일하거나 상이하고;
L2a 내지 L2i, 및 L5는 각각 독립적으로, 하나 초과의 sdAb가 존재하는 경우 2개의 연속 sdAb를 연결하는 공유 결합 또는 공유 링커이고, 이러한 링커는 동일하거나 상이하고;
n은 0~4로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
m1, m2는 각각 독립적으로 0~10으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m1 및/또는 m2는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이고(m1 또는 m2가 1보다 큰 경우, 연속 sdAb는 바람직하게는 링커를 통해 공유 연결됨);
p는 0~4로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 p는 1, 2, 3, 또는 4이고;
q1, q2는 각각 독립적으로 0~10으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q1 및/또는 q2는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이고;
r은 0~10으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 r은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9이고;
t는 0~4로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 t는 1, 2, 3, 또는 4이고;
u1, u2, u3, u4는 각각 독립적으로 0~100으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 u1, u2, u3, 및/또는 u4는 0, 1, 2, 4, 16, 32, 또는 64이고, 바람직하게는 u1, u2, u3, 및 u4는 동일하고;
v는 0 또는 1인, 본 발명의 접합체이다.
일 구현예는, L1 및 L2a는 링커, u1은 0 초과, n은 0 초과, m1은 1~9 중 임의의 수, p는 0, q1은 1, m2는 0, u2는 0, u3은 0, q2는 0, v는 0, r은 0, u4는 0, t는 0이거나, 또는 L1, L2a, L5, 및 L6은 링커, u1은 0, n은 0, m1은 1~9 중 임의의 수, u2는 0, p는 0, q1은 1, m2는 0, u3은 0, p는 0, q2는 0, r은 1, u4는 1 초과, t는 1 초과, v는 1인, 본 발명의 접합체이다.
본 발명의 제2 양태는,
- 본 발명의 접합체를 포함하고, 임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 제1 약제학적 조성물; 및
- 약물 분자, mRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, EGF-다이안틴 또는 EGF-사포린과 같은 리간드-약물 접합체, 사포린, 다이안틴, 또는 BNA와 접합된 OKT9 단일클론 항-CD71 항체, 트라스투주맙, 또는 세툭시맙과 같은 항체-약물 접합체(ADC), 항체-올리고뉴클레오티드 접합체(AOC)와 같은 리간드-올리고뉴클레오티드 접합체, 예컨대 항체-BNA 접합체 또는 항체-siRNA 접합체 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 것과 같은 활성 약제학적 성분(API)(ADC 또는 AOC의 항체는 임의로 적어도 하나의 sdAb를 포함하거나 이로 구성되고, ADC 또는 AOC에 포함된 적어도 하나의 sdAb는 본 발명의 접합체의 sdAb와 상이하거나 동일함)을 포함하고, 임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 제2 약제학적 조성물을 포함하는 약제학적 조합물에 관한 것이다. 바람직한 API는 ADC 및 AOC이며, 이러한 ADC 또는 AOC는 바람직하게는 IgG와 같은 항체 또는 하나 이상의 VHH와 같은 sdAb를 포함한다.
본 발명의 추가 양태는,
- 본 발명의 접합체;
- 하나 이상의 활성 약제학적 성분(API)
을 포함하고
임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제
를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적 조성물에 포함된 API 또는 복수의 API는, 예를 들어, 약물 분자, mRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, ASO, EGF-다이안틴 또는 EGF-사포린과 같은 리간드-약물 접합체, 사포린, 다이안틴, 또는 BNA와 접합된 OKT9 단일클론 항-CD71 항체 중 하나, 트라스투주맙, 또는 세툭시맙과 같은 ADC, AOC와 같은 리간드 올리고뉴클레오티드 접합체, 예컨대 항체-BNA 접합체 또는 항체-siRNA 접합체로부터 선택되는 것과 같은 API(ADC 또는 AOC의 항체는 임의로 적어도 하나의 sdAb를 포함하거나 이로 구성되고, ADC 또는 AOC에 포함된 적어도 하나의 sdAb는 본 발명의 접합체의 sdAb와 상이하거나 동일함)이다. 바람직한 API는 ADC 및 AOC이며, 이러한 ADC 또는 AOC는 바람직하게는 IgG와 같은 항체 또는 하나 이상의 VHH와 같은 sdAb를 포함한다.
일 구현예는, 본 발명의 접합체 및 이펙터 분자를 포함하는 ADC 또는 AOC와 같은 제2 접합체의 일부로서 하나 이상의 API를 포함하는 약제학적 조성물로서, 적어도 하나의 이펙터 분자가 보다 바람직하게는 아폽틴과 같은 바이러스 독소; 박테리아 독소, 예컨대 시가(Shiga) 독소, 시가-유사 독소, 녹농균 외독소(PE) 또는 PE의 외독소 A, 전장 또는 절단된 디프테리아 독소(DT), 콜레라 독소; 알파-사르신과 같은 진균 독소; 리보솜 비활성화 단백질 및 2형 리보솜 비활성화 단백질의 A 사슬, 예컨대 다이안틴, 예를 들어 다이안틴-30 또는 다이안틴-32, 사포린, 예를 들어 사포린-S3 또는 사포린-S6, 부가닌 또는 부가닌의 탈면역 유도체 데부가닌, 시가-유사 독소 A, 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 리신, 리신 A 사슬, 모데신, 모데신 A 사슬, 아브린, 아브린 A 사슬, 볼켄신, 볼켄신 A 사슬, 비스쿠민, 비스쿠민 A 사슬을 포함하는 식물 독소; 또는 동물 또는 인간 독소, 예컨대 개구리 RNase, 그랜자임 B, 또는 인간 안지오게닌, 또는 이들의 임의의 독성 단편 또는 독성 유도체 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는, 우레아제 및 Cre-재조합효소, 단백질성 독소, 리보솜 비활성화 단백질, 단백질 독소, 박테리아 독소, 식물 독소 중 적어도 하나를 포함하거나, 또는 이로 구성되고, 바람직하게는 단백질 독소가 다이안틴 및/또는 사포린인, 약제학적 조성물이다.
일반적으로, ADC 또는 AOC는 본원에서 상기 열거된 종양 세포 수용체 중 임의의 하나, 즉 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린, 신데칸-1, 혈관 인테그린 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 엽산 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, 전립선 특이 막항원(PSMA), CanAg, 인테그린-알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토(Cripto), CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, 에프린A4, MUC-1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA-4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, c-Met(HGFR), EGFR1, RANKL, ADAMTS5, CD16, CXCR7(ACKR3), 글루코코르티코이드-유도 TNFR 관련 단백질(GITR), 바람직하게는 HER2, c-Met, VEGFR2, CXCR7, CD71, 및 EGFR1로부터 선택되는 것에 결합하기 위한 항체를 포함한다. 이러한 항체의 예로는 세툭시맙, 트라스투주맙, OKT-9이 있다. ADC 또는 AOC는 본 발명의 접합체에서 sdAb에 의해 표적화된 것과 동일한 세포 표면 분자를 표적화 하거나, ADC 또는 AOC는 본 발명의 접합체에서 표적화된 세포 표면 분자와 상이한 제2 세포 표면 분자를 표적화 할 수 있으므로, ADC 또는 AOC는, 클론 11A4, 클론 18C3, 클론 22G12, 클론 Q17, 또는 클론 Q17-C-태그에 의해 생성된 sdAb로부터 선택되는 HER2에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-EGFR Q86-C-태그에 의해 생성된, EGFR에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-CD71 Q52-C-태그에 의해 생성된, CD71에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-HIVgp41 Q8-C-태그에 의해 생성된, HIVgp41에 결합하기 위한 sdAb; 또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 및 31 중 어느 하나의 cDNA에 의해 암호화된 sdAb; 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36 내지 72의 아미노산 서열을 갖는 sdAb로부터 선택되는 sdAb를 포함할 수 있다. ADC 또는 AOC는, 클론 11A4, 클론 18C3, 클론 22G12, 클론 Q17, 또는 클론 Q17-C-태그에 의해 생성된 sdAb로부터 선택되는 HER2에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-EGFR Q86-C-태그에 의해 생성된, EGFR에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-CD71 Q52-C-태그에 의해 생성된, CD71에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-HIVgp41 Q8-C-태그에 의해 생성된, HIVgp41에 결합하기 위한 sdAb; 또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 및 31 중 어느 하나의 cDNA에 의해 암호화된 sdAb; 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36 내지 72의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 중 어느 하나, 또는 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 이중파라토프성 직렬형태의 sdAb, 또는 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 2개의 sdAb 중 하나로부터 선택되는 sdAb를 포함하고, 임의로 접합체는 알부민에 결합하기 위한 sdAb, 예컨대 서열번호 33, 34, 및 35의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 ADC 또는 AOC에 혼입되기에 적합한 VHH는 예를 들어 단일 도메인 항체 데이터베이스(Wilton, E.E. et al. (2018)), 특허 출원 US20160251440(항-CD123, 항-CEACAM), US9683045(항-c-Met), US20090252681(항-EGFR, 항-IGF-1R), US9969805(항-HER2), US20190023796A1(항-HER3), 문헌[Kijanka et al. (2013)](항-HER2), 및 문헌[Mercier et al. (2019)](항-HER2)에서 확인된다. 일련의 적합한 VHH의 아미노산 서열 및/또는 cDNA 서열은 또한 종양 세포 특이적 수용체에 결합할 수 있는 능력을 고려하여, 서열번호 1~32 및 36~72로서, 항-HER2, 항-HER3, 항-CD123, 항-CEACAM, 항-c-Met, 항-EGFR, 항-IGF-1R, 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-CD19, 항-HER1, 및 항-VGFR2에 대해 아래에 제공되어 있다. 본 발명에 따른 ADC 또는 AOC에 혼입하기에 적합한 이러한 VHH의 예로는 예를 들어 항-HER2 VHH, 항-CD71 VHH, 항-EGFR VHH가 있고, 이러한 VHH는 예를 들어 BNA, siRNA, 독소, 예컨대 단백질 독소, 예컨대 다이안틴 및 사포린에 결합될 수 있다. 예를 들어, 도 5 내지 7의 예시적인 구현예 참조.
본 발명에 ADC 또는 AOC의 일부로서 유용한 이펙터 모이어티는 바람직하게는 후기 엔도솜 탈출에 의존해 효과를 발휘한다. 예를 들어 슈도모나스 외독소와 같은 일부 이펙터 분자는 "후기 엔도솜 단계" 이전에 다른 소기관으로 경로가 변경되고, 따라서 일반적으로는 본 발명에 따른 접합체와 조합하기 위한 ADC에의 혼입으로부터 이익을 얻지 못할 것이다. 그러나, 이러한 독소는, 예를 들어 경로 재지정을 담당하는 신호 펩티드를 제거함으로써, 본 발명에 사용하기에 적합해질 수 있다. 특히, 독성이 강하고 세포를 사멸시키기 위해 엔도솜을 탈출하는 데 단 하나의 분자만 필요한 독소는 덜 강력하도록 변형될 수 있다. 적어도 2개, 보다 바람직하게는 적어도 5개, 보다 바람직하게는 적어도 10개, 보다 바람직하게는 적어도 20개, 보다 바람직하게는 적어도 50개, 가장 바람직하게는 적어도 100개의 독소 분자가 엔도솜 탈출(및 세포질액 진입)을 거치면 세포를 사멸시키는 독소를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되거나 본 발명의 약제학적 조합물에 포함되는 본 발명의 제2 접합체는 공유 접합된 기능화된 스캐폴드, 즉 결합된 이펙터 모이어티/모이어티들을 포함하는 스캐폴드를 종양 세포 또는 자가면역 세포와 같은 표적 세포에 표적화하기 위한 공유 결합된 이펙터 모이어티 또는 모이어티들을 포함하는, 올리고머 또는 폴리머 분자 또는 삼작용성 링커와 같은 스캐폴드를 포함하는 것이 더 바람직하다. 또한, 표적외 독성을 감소시키기 위해, 세포막 비투과성 소분자 독소가 세포막 투과성 독소보다 선호되는 이펙터 분자이다.
바람직하게는, 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌에 의해 이펙터 모이어티 효과가 강화되는, 본 발명의 접합체와의 조합을 위한 ADC 또는 AOC에 포함된 이펙터 모이어티는 세포내이입시 제 2접합체(즉 ADC, AOC)로부터 분리된다(예를 들어, 제2 접합체의 세포 표면 분자 표적화 모이어티로서 제2 접합체에 존재하는 sdAb와 같은 항체로부터 분리된다). 이는 예를 들어 산성, 환원성, 효소적, 또는 광-유도 조건에서 끊어지는 절단 가능한 결합에 의해 달성될 수 있다.
본 발명자들은 종양 세포와 접촉하는, 공유 결합된 안티센스 BNA, 예컨대 BNA(HSP27)가 제공되고, 동일하거나 상이한 종양 세포 표적 단일클론 항체 또는 sdAb와 결합되고, 공유 결합된 사포닌(즉 본 발명의 접합체)이 제공된 sdAb 또는 종양 세포 표적화 단일클론 항체(세포 표적 리간드(즉, 제2 접합체)에 결합된(절단 가능한 결합을 통해) BNA 및 항체(예를 들어, 본 발명의 접합체 내 sdAb)에 결합된(절단가능한 결합을 통해) 사포닌 둘 다)는 대조군과 비교하여, 그리고 사포닌(SO1861)을 포함하는 본 발명의 접합체가 없는 BNA를 보유하는 AOC와 비교하여, 종양에서 생체내 HSP27을 침묵시킬 수 있음을 보여준다. ADC를 본 발명의 사포닌을 포함하는 접합체와 함께 투여하거나, 항체-BNA 접합체와 같은 항체-올리고뉴클레오티드 접합체를 본 발명의 사포닌을 포함하는 접합체와 함께 투여함으로써, 동일한 용량에서, 본 발명의 접합체의 부재하에 ADC 또는 AOC만으로는 나타나지 않는 항종양 세포 활성을 ADC 또는 AOC에 부여한다. 안티센스 BNA(HSP27)는 문헌[Zhang et al. (2011)]에 따른 올리고핵산 서열을 갖는 BNA였다(Y Zhang, Z Qu, S Kim, V Shi, B Liao1, P Kraft, R Bandaru, Y Wu, LM Greenberger and ID Horak, Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection, Gene Therapy (2011) 18, 326-333). 주목할 만한 것은, 발명자들이 아는 한, BNA는 유리 핵산으로서의 적용을 위해 설계된다는 것이다. 본 발명자들은 이제 유전자 침묵 활성이 시험관내 유지되는 방식으로, 보다 중요하게는 종양 보유 동물의 종양 세포에서 생체내 유지되는 방식으로, 안티센스 BNA가 리간드 또는 항체, 예컨대 mAb 또는 sdAb, 예컨대 VHH와 함께 (비)절단성 링커를 통해 공유 결합될 수 있음을 최초로 입증하였다. BNA 기반 AOC를 제공하는 이 접근법은 이를 필요로 하는 인간 (암)환자에게 표적화 BNA를 투여하는 새로운 방법을 열어준다.
본 발명의 접합체 내 sdAb 및 ADC 또는 AOC 내 항체 또는 sdAb가 상이한 종양 세포 특이적 수용체와 같은 상이한 세포 표면 분자를 표적화할 때, ADC 또는 AOC에 포함된 이펙터 분자 및 본 발명의 접합체에 포함된 사포닌이 공동 전달되어야 하는 표적 세포의 표면에 2개의 상이한 표적이 모두 존재함이 이해될 것이다. 본 발명의 ADC 또는 AOC 및 본 발명의 접합체가 상이한 (종양) 세포 수용체를 표적화할 때, ADC 또는 AOC 및 본 발명의 접합체의 용량이 표적 세포를 포함하는 상이한 세포 유형의 혼합물과 접촉하는 경우, 예를 들어 ADC 또는 AOC 및 본 발명의 접합체의 조합이 이를 필요로 하는 환자에게 (공동) 투여되는 경우, 이점은 예를 들어 표면에 두 개의 세포 표면 분자 중 하나를 갖는 세포에 대한, 예를 들어 표적외 효과의 위험이 감소하는 것이다. 본 발명의 접합체 형태의 표적화된 사포닌의 부재하에, ADC 또는 AOC가 표적 세포에 결합할 때, 이러한 표적 세포 내부로 이펙터 분자의 치료적 유효량을 전달하기에는 너무 낮은 용량의 ADC 또는 AOC를 투여함으로써 이에따라, ADC 또는 AOC가 결합할 수 있는 세포 표면 분자를 발현할 수 있지만 본 발명의 접합체 내 sdAb에 대한 표적을 발현하지 않는 세포의 유입은 ADC를 고려할 때 예를 들어 세포독성 효과를 유발하지 않을 것이다. ADC 또는 AOC의 결합 및 본 발명의 접합체의 결합(동일한 세포 표면에서)을 위한 두 수용체를 모두 보유하는 표적 세포에서만 이펙터 분자의 용량은, 두 수용체를 모두 발현하는 상기 표적 세포 내부에 공동-국재화하는 사포닌의 영향하에 엔도솜 탈출이 일어나면, 상기 세포의 세포질액에서 생물학적 효과를 발휘하기에 충분할 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 접합체에 포함된 sdAb 및 ADC 또는 AOC는 동일한 종양 세포 특이적 수용체와 같은 동일한 세포 표면 분자를 표적화 한다. 이러한 방식으로, 단 하나의 종양 세포 특이적 수용체의 존재가 이러한 단일 유형의 표적 수용체를 보유하는 표적 세포 내부로 ADC 또는 AOC 및 본 발명의 접합체 모두의 공동 전달을 가능하게 한다. 단일 세포 특이적 표면 분자, 예컨대 종양 세포 특이적 수용체, 예를 들어 HER2, EGFR, CD71을 사용하여 표적 세포 내로의 이러한 공동 전달의 이점은 본 발명의 접합체 및 ADC 또는 AOC에 의해 이러한 표적 종양 세포의 특이적 표적화에 충분히 특이적인 단일 수용체만을 발현하는 종양 세포를 표적화하는 것이 가능하다는 것이다. 이러한 단일 특이적 수용체를 사용하면 종양 세포 내부로 표적화된 사포닌 및 표적화된 이펙터 분자를 공동 전달하는 것이 가능하므로 치료가 어려운 종양 세포에 유효량의 이펙터 분자가 효과적으로 여전히 제공될 수 있도록 할 수 있다.
일 구현예는, ADC 또는 AOC의 항체는 VHH, 바람직하게는 낙타과 VH이거나 이를 포함하는, 본 발명의 약제학적 조합물 또는 본 발명의 약제학적 조성물이다.
일 구현예는, 본 발명의 접합체는 HER2, CD71, 또는 EGFR에 결합할 수 있는 sdAb를 포함하고/하거나, 하나 이상의 활성 약제학적 성분은 HER2, CD71, 또는 EGFR에 결합할 수 있는 sdAb를 포함하고/하거나, ADC는 다이안틴 또는 사포린을 포함하는, 본 발명의 약제학적 조합물 또는 본 발명의 약제학적 조성물이다.
본 발명의 제4 양태는 제1 약제학적 조성물을 포함하고 제2 약제학적 조성물을 포함하는 본 발명의 약제학적 조합물, 또는 약제로 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태는, 암, 자가면역 질환, 바이러스 감염 등의 감염, 효소결핍증, 효소결핍증과 관련된 장애 또는 질환, 유전자 결손, 유전자 결손과 관련된 장애 또는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1 약제학적 조성물을 포함하고 제2 약제학적 조성물을 포함하는 본 발명의 약제학적 조합물, 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 어떤 종양 세포 사멸도 일으키지 않는 ADC의 용량이 ADC가 본 발명의 접합체의 존재하에 종양 세포와 접촉할 때에는 효율적인 종양 세포 사멸에 충분하다는 것을 발견하였다. 예는 도 2 내지 4에 제공된다. 예를 들어, OKT-9-사포린과 같은 ADC 항-CD71-독소의 용량은 종양 세포와 접촉할 때 종양 세포에 독성 효과를 발휘하지 않는다. 그러나, ADC가 본 발명의 접합체와 함께 공동 투여될 때, 효율적인 종양 세포 사멸이 달성된다. 본 발명의 접합체는 예를 들어 항-HER2 VHH - SO1861, 항-CD71 VHH - SO1861, 항-EGFR VHH - SO1861이다. ADC는 예를 들어 HER2, CD71, 또는 EGFR에 결합할 수 있는 항체 또는 VHH를 포함하는 ADC이고, 예를 들어 ADC는 다이안틴 또는 사포린과 같은 단백질 독소를 포함한다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 접합체를 적용함으로써, 표적 세포 내에서, ADC 또는 AOC에 포함된 이펙터 분자의 효율적인 생물학적 활성을 달성하는 데 필요한 사포닌 용량은, ADC 또는 AOC가 유리 사포닌과 함께 표적 세포에 공동 투여될 때 필요한 유리 사포닌의 용량과 비교하여, 사포닌을 포함하는 접합체가 ADC 또는 AOC와 함께 표적 세포에 공동 투여될 때 약 100 내지 1000배 더 낮다. 이와 함께, 본 발명의 접합체는, 이를 필요로 하는 환자에게 표적화 사포닌의 부재하에 투여되면 종양 세포에서 효과적이지 않을 ADC 또는 AOC의 용량에서 ADC 또는 AOC를 강화하고, 또한 이와 함께, 본 발명의 접합체는 상대적으로 낮은 용량에서, 즉 종양 세포 표적화 sdAb가 제공되지 않은 유리 사포닌이 이펙터 분자 강화에 충분히 효과적이지 않은 용량에서, ADC 또는 AOC의 이펙터 분자의 강화가 고려될 때 이미 충분히 효과적이다. 조합하여, 본 발명자들은 ADC 또는 AOC가 본 발명의 접합체의 존재하에 환자에게 공동 투여시 더 낮은 용량에서 이미 효과적이므로, 치료 유효량의 ADC 또는 AOC를 사용하여 치료를 필요로 하는 인간 환자를 치료하는 개선된 방법을 제공한다. 본 발명의 접합체의 많은 이점 중 하나는 접합체의 sdAb 부분에 Fc 테일이 없다는 점이다. Fc 테일이 없으면, Fc 수용체를 보유하는 표적외 환자 세포에 대한 접합체의 원치 않는 결합(이러한 결합은 많은 통상적인 ADC, AOC에서 나타나는 것과 같이 이러한 Fc 테일이 존재할 경우 부작용을 초래할 수 있음)이 방지된다. Fc 테일을 포함하는 항체 기반 ADC 및 AOC는 Fc 수용체에 대한 이러한 IgG 기반 ADC, AOC의 바람직하지 않은 결합으로 인해 효능이 감소된다. Fc 수용체 결합의 결과로 인해, 이러한 IgG 기반 ADC 및 AOC의 유효 용량이 낮아진다. 이와 함께, Fc 테일의 부재는 이와 관련하여 몇 가지 이점을 제공한다. Fc 수용체에 대한 접합체의 표적외 및 바람직하지 않은 결합은 발생할 수 없다. 이와 함께, 본 발명의 접합체는 IgG 기반 접합체에서 나타나는 단점인 Fc 수용체로 인한 접합체 '손실'이 없기 때문에, 엔도솜 내에서 본 발명의 접합체의 표적 수용체 매개 세포내이입 및 전달이 고려될 때, 더 낮은 유효 용량을 갖는다. 결과적으로, 본 발명의 접합체의 치료범위는 sdAb가 Fc 테일을 포함하는 통상적인 IgG로 대체되었을 때 달성되었을 치료범위보다 넓다.
본 발명의 제6 양태는 분자를 세포 외부로부터 상기 세포 내부로, 바람직하게는 상기 세포의 세포질액에 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
a) 본 발명의 접합체에 포함되는 sdAb에 대한 결합 부위를 표면에 발현하는 세포(바람직하게는 간 세포, 바이러스 감염 세포와 같은 비정상적인 세포, 자가면역 세포, 및 종양 세포로부터 선택됨)를 제공하는 단계;
b) 단계 a)에서 제공된 세포 내로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계(분자는 본 발명의 구현예의 API 중 임의의 하나 이상임);
c) 본 발명의 접합체를 제공하는 단계;
d) 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 접합체와 시험관내 또는 생체외 접촉시켜,
세포 외부로부터 상기 세포 내로, 바람직하게는 상기 세포의 세포질액 내로 분자를 전달하는 단계
를 포함하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 특히 본 발명의 사포닌의 엔도솜 탈출 메커니즘과 관련된 경우, 본원에서 "엔도솜" 또는 "엔도솜 탈출"이라는 단어가 사용될 때마다, 이는 각각 엔도리소좀 및 리소좀, 및 엔도리소좀 및 리소좀으로부터의 탈출도 포함한다. 세포질액에 유입된 후, 상기 물질은 핵과 같은 다른 세포 단위로 이동할 수 있다.
공식적인 용어로, 글리코시드는 당 그룹이 글리코시드 결합을 통해 다른 그룹에 아노머 탄소를 통해 결합된 임의의 분자이다. 본 발명과 관련하여 사포닌과 같은 글리코시드 분자는 임의의 이론에 구애됨이 없이, 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 촉진함으로써 이펙터 모이어티의 효과를 더 강화할 수 있는 분자이다. 임의의 이론에 구애됨이 없이, 글리코시드 분자(본원 및 청구범위에 예시된 것과 같은 본 발명의 사포닌)는 세포내이입 및 재순환 경로의 구획 및 소포의 막과 상호작용하여 이들을 상기 이펙터 모이어티에 대해 빠져나가기 쉽게 만들어 엔도솜 탈출을 증가시킨다. "스캐폴드가 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 증가시킬 수 있다"라는 말은 sdAb와 같은 세포 표면 분자 표적화 항체에 링커를 통해 또는 직접 또는 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)의 폴리머 또는 올리고머 구조를 통해 결합된 적어도 하나의 사포닌(글리코시드 분자)이, 두 분자가 엔도솜, 예를 들어 후기 엔도솜 내에 있을 때, 임의로 그리고 바람직하게는, 적어도 하나의 사포닌이 예를 들어 적어도 하나의 글리코시드(사포닌)와 접합체 사이의(예를 들어, 스캐폴드의 폴리머 또는 올리고머 구조 및/또는 링커를 통한) 절단 가능한 결합의 절단에 의해, 본 발명의 접합체로부터, 예컨대 상기 접합체에 포함된 링커 또는 폴리머 또는 올리고머 구조로부터 방출된 후, 이펙터 모이어티의 엔도솜 탈출을 강화할 수 있음을 의미한다. 임의로 링커 또는 스캐폴드를 통한 본 발명에 따른 적어도 하나의 사포닌과 본 발명의 접합체의 세포 표면 분자 표적화 sdAb 사이의 결합이 "안정한 결합"일 수 있지만, 그것이 이러한 결합이 예를 들어 효소에 의해 엔도솜 내에서 절단될 수 없음을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 사포닌은, 임의로 링커 또는 스캐폴드의 올리고머 또는 폴리머 구조의 일부와 함께, 남은 링커 단편 또는 올리고머 또는 폴리머 구조로부터 절단될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제가 (단백질성) 링커 또는 단백질성 폴리머 구조, 예를 들어 알부민을 절단함으로써 적어도 하나의 사포닌이 방출될 수 있다. 그러나, 글리코시드 분자(바람직하게는 사포닌)가 활성 형태로, 바람직하게는 임의로 링커 및/또는 올리고머 또는 폴리머 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)를 통해 본 발명의 접합체의 세포 표면 분자 표적화 sdAb에 결합(되도록 준비)되기 전의 원래의 형태로 방출되어, 글리코시드(사포닌)가 이러한 절단 후 천연 구조를 갖거나, 글리코시드(사포닌)가 이러한 절단 후 결합된 화학기 또는 링커(의 일부)를 갖는 한편, 글리코시드 생물학적 활성(사포닌 생물학적 활성), 예를 들어 동일한 엔도솜 또는 리소좀에 존재하는 이펙터 모이어티에 대한 엔도솜/리소좀 탈출 강화 활성이, 임의로 링커 및/또는 본 발명의 스캐폴드를 포함하는, 글리코시드(사포닌)와 sdAb와 같은 세포 표면 분자 표적화 항체 사이의 결합의 상기 절단시 유지되거나 복원되는 것이 바람직하다. 본 발명과 관련하여, 예를 들어 사포닌과 접합체 내 세포 표면 분자 표적화 sdAb의 아미노산 잔기, 링커, 폴리머 또는 올리고머 구조(스캐폴드의 구조, 본 발명의 공유 사포닌 접합체라고도 함), 리간드, (단일클론) 면역글로불린 또는 이의 결합 도메인 또는 단편, 및/또는 이펙터(이펙터 모이어티, 이펙터 분자) 사이의 결합에 대한 "안정한"이라는 용어는 결합이 쉽게 끊어지지 않거나, 적어도 예를 들어 pH 차이, 염 농도, 또는 UV 광, 환원 조건에 의해 쉽게 끊어지지 않도록 설계되었음을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 예를 들어 사포닌과 세포 표면 분자 표적화 sdAb, 링커, 아미노산 잔기, 공유 사포닌 접합체의 폴리머 또는 올리고머 구조, 리간드, 항체, 및/또는 이펙터 사이의 결합에 대한 "절단 가능한"이라는 용어는 결합이 예를 들어 pH 차이, 염 농도, 환원 조건 등에 의해 쉽게 끊어지도록 설계되었음을 의미한다. 당업자는 이러한 절단 가능한 결합 및 이를 준비하는 방법을 잘 알고 있다.
본 발명 이전에 ADC 및 AOC를 시장에 도입하는 데 있어 주요 장애물 중 하나는 좁은 치료범위였다: ADC 또는 AOC의 치료적 유효 용량은 (허용되지 않는) 부작용을 동반하여, ADC를 이용한 환자의 치료에 있어 개발 및 영향을 방해한다. 본 발명의 접합체(즉 ADC 또는 AOC와 조합된, sdAb-사포닌 접합체)를 적용함으로써, 하나 이상의 글리코시드 분자(사포닌)를, 페이로드 운반 ADC와 함께 또는 본 발명에 따른 BNA와 같은 올리고뉴클레오티드와 접합된 (단일클론) 항체(sdAb)와 함께, (표적) 세포로 유도하는 것이 이제 가능해졌다. 특히, 이전에는 ADC 또는 AOC 또는 페이로드와 (단백질성) 세포 표면 분자 표적화 분자의 임의의 다른 접합체의 이펙터 모이어티, 및 동시에 이펙터 모이어티당 (미리 정의된, 제어 가능한) 특정 수 또는 범위의 글리코시드 분자(사포닌)를 예컨대 세포의 세포내이입 경로를 통해, 세포의 세포질액으로 특이적으로 유도할 수 없었다. 전술한 바와 같이, ADC 또는 AOC 및 본 발명의 접합체는 동일한 세포 표면 분자를 표적화할 수 있거나 상이한 세포 표면 분자를 표적화할 수 있고, 여기서 두 개의 상이한 세포 표면 분자는 종양 세포 또는 자가 면역 세포와 같은 동일한 표적 세포의 표면에서 발현된다.
본 발명에 의해 제공되는 해결책은 본 발명의 접합체의 세포 표면 분자 표적화 분자, 즉 sdAb에 대한 적어도 하나의 사포닌의 공유 결합을 포함한다. 본 발명에 의해 제공되는 추가 해결책은 올리고머 또는 폴리머 스캐폴드를 사용하여 글리코시드 분자(사포닌)을 (먼저) 중합하는 단계, 및 본 발명의 접합체에 포함된 세포 표면 분자 표적화 분자에 공유 결합 사포닌의 클러스터를 제공하여, 예를 들어 세포내이입 후, 사포닌의 작용 방식이 요구되는 세포내 부위에서 하나 이상의 사포닌의 재단량체화를 가능하게 하는 단계를 포함한다. 이 문맥에서 "중합"은 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)를 형성하기 위해 링커를 통해, 또는 직접 또는 폴리머 또는 올리고머 구조를 통해 sdAb에 사포닌 분자를 가역적 및/또는 비가역적으로 다중 접합시키거나, 또는 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)를 형성하기 위해 (변형된) 사포닌을 가역적 및/또는 비가역적으로 다중 접합시켜 폴리머 또는 올리고머 구조를 형성하는 것을 의미한다. 이 문맥에서 "재단량체화"는 예를 들어 세포내이입 후, 접합체로부터, 또는 접합체의 세포 표면 분자 표적화 sdAb에 사포닌을 연결하는 링커로부터, 또는 스캐폴드로부터 사포닌이 절단되는 것, 및 결합되지 않은 사포닌의 (천연) 화학적 상태를 회복하는 것을 의미하며, 결합되지 않은 사포닌은 추가 화학기, 예컨대 사포닌을 링커, 접합체의 아미노산 잔기, 또는 스캐폴드에 연결하기 위한 화학기, 및/또는 알데히드기 또는 카복실산기와 같은 사포닌의 화학기에 결합된 (화학적) 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 사포닌의 복잡한 화학으로 인해, 예를 들어 스캐폴드 또는 다른 연결 링커에서의 사포닌의 '중합' 및 예를 들어 세포내이입 후, 세포 내와 같은 원하는 위치에서의 '재단량체화'는 어려운 과제였다. 특히, 접합체에 대한 공유 결합을 위한 공유 연결된 글리코시드, 예를 들어 트리테르페노이드 사포닌을 포함하는 스캐폴드 및 링커를 제공하기 위해 사용되는 화학 반응(글리코시드의 중합)은 일반적으로 물이 없는 유기 용매에서 일어나지만, 사포닌 및 예를 들어 결합된 사포닌을 함유하기 위한 스캐폴드로서 적용되는 생체적합성 폴리머는 수용성 분자이다. 변형되지 않은 사포닌의 화학적 성질은 그 자체로 중합을 더욱 방해하였으며, 복수의 사포닌을 sdAb에 (직접) 결합시키는 또 다른 가능한 해결책은 sdAb가 일반적으로 충분한 결합 부위를 제공하지 않는다는 점과, 결합 생성물이 상당히 이질적이 되고/되거나 생물학적 활성 분자, 예컨대 사포닌 및 sdAb를 함께 결합시키면 이러한 사포닌-포함 접합체에서 두 분자가 함께 결합될 때 세포 표면 분자에 결합하는 사포닌의 활성 및/또는 sdAb의 능력에 영향을 미치고 방해할 위험이 있다는 점 때문에, 그다지 유망하지 않은 것으로 추정되었다. 본 발명의 구현예는 이러한 단점 중 적어도 하나를 해결한다.
본 발명의 제7 양태는, 본 발명의 약제학적 조합물을 포함하고, 제1 약제학적 조성물을 포함하고 제2 약제학적 조성물을 포함하거나, 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하거나, 본 발명의 접합체를 포함하고, 임의로 본 발명에 따른 상기 약제학적 조합물의 사용 설명서, 또는 임의로 본 발명에 따른 상기 약제학적 조성물의 사용 설명서, 또는 임의로 본 발명에 따른 상기 접합체의 사용 설명서를 포함하는 부품 키트에 관한 것이다.
사포닌을 포함하고, 하나 이상의 (절단 가능한) 링커 및/또는 임의로 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)를 추가로 포함하거나 포함하지 않는 본 발명의 접합체가 산성 환경을 방해하고 적어도 하나의 글리코시드(사포닌)의 엔도솜 탈출 기능을 억제할 수 있는지 여부는 실시예 섹션에 기재된 바와 같은, 당업계에 알려진 분석으로 쉽게 결정될 수 있다. 억제는 "50% 세포 사멸을 유도하는 데 필요한 글리코시드(본 발명의 사포닌)의 양의 배수 증가"로 기술된다. 스캐폴드 또는 본 발명의 접합체는 클로로퀸을 양성 대조군으로 사용할 때 관찰되는 50% 세포 사멸을 얻는 데 필요한 글리코시드 분자(사포닌)의 증가 이상의 증가를 초래하지 않는 것이 바람직하다. 대안적으로 그리고 바람직하게는, 사포닌을 포함하고, 하나 이상의 (절단 가능한) 링커 및/또는 임의로 스캐폴드를 추가로 포함하거나 포함하지 않는 접합체는 50% 세포 사멸을 유도하는 데 글리코시드 분자의 4배 이상의 증가를 초래하지 않고, 보다 바람직하게는 2배 이상의 증가를 초래하지 않는다. 배수 증가는 분석에서 측정되어야 하며, 양성 대조군인 클로로퀸은 50% 세포 사멸을 관찰하는 데 글리코시드 양, 바람직하게는 사포닌 양의 2배 증가를 유도하고, 사포닌은 본 발명(이전 구현예)의 사포닌 중 임의의 하나 이상이다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 접합체에 포함된 적어도 하나의 사포닌은 적어도 본 발명에서 정의된 바와 같은 현재 및 새로운 이펙터 모이어티의 효능을 증가시킨다. 잠재적인 부작용은 효능 저하 없이, ADC 또는 AOC와 같은 제2 접합체에 포함된 이펙터 모이어티의 투여량을 낮춤으로써 감소될 것이다. 따라서, 본 발명은 약제에 사용하거나 약제로 사용하기 위한 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 본 발명의 일 양태는 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 접합체를 포함한다.
본 발명의 접합체에 포함된 엔도솜 탈출 강화제, 즉 본 발명의 사포닌에 대해 다음과 같은 여러 바람직한 특징을 나타낼 수 있다: (1) 바람직하게는 독성이 없고 면역 반응을 일으키지 않음, (2) 바람직하게는 표적외 세포로의 이펙터 모이어티의 세포질액 흡수를 매개하지 않음, (3) 작용 부위에서의 존재가 바람직하게는 이펙터 모이어티의 존재와 동기화됨, (4) 바람직하게는 생분해성이거나 배설 가능함, 및 (5) 바람직하게는 엔도솜 탈출 강화제가 결합되는 이펙터 분자의 생물학적 활성과 무관한 유기체의 생물학적 과정을 실질적으로 방해하지 않음(예를 들어, 호르몬과의 상호작용). 전술한 기준을 적어도 어느 정도 충족하는 본 발명의 사포닌의 예는 바이데스모시드 트리테르펜, 바람직하게는 바이데스모시드 트리테르펜 사포닌, 예컨대 SO1861, SA1641, QS-21, GE1741, 및 명세서 전반에 걸쳐, 표 A1에 열거된 바와 같은 본 발명에 따른 추가 사포닌이다.
또한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 접합체의 용도가 제공된다. 특히 항암제, 및 특히 전형적인 화학요법제는 부작용이 심한 것으로 알려져 있다. 제2 접합체, 예컨대 ADC 또는 AOC에 포함된 약제학적 활성 물질 및 본 발명의 접합체 분자에 포함된 사포닌을 둘 다 표적화하고 시간적 및 공간적으로 동기화했다는 점에서, 본 발명에 따른 접합체는 특히 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제로서 또는 약제의 구성성분으로서 사용하기에 특히 가치가 있으며, 여기서 약제는 ADC, AOC, 또는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 BNA 또는 siRNA, 및 본 발명의 접합체를 포함하는 단일 조성물이거나, ADC, AOC, 또는 올리고뉴클레오티드, 예컨대 BNA 또는 siRNA를 포함하는 제1 약제학적 조성물, 및 본 발명의 접합체를 포함하는 제2 약제학적 조성물의 치료적 조합물이다. 따라서 본 발명은 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 후천성 또는 유전성 장애, 특히 단일유전자 결손 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 접합체를 제공한다. 따라서 접합체는 종양 세포 또는 자가면역 세포와 같은 비정상적인 표적 세포에서 접합체를 표적화하기 위한 적어도 하나의 사포닌 및 sdAb를 포함하고, 본 발명의 접합체는 적어도 하나의 이펙터 모이어티, 예컨대 BNA 또는 ADC 또는 AOC와 조합된다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 본 발명에 따른 접합체에 관한 것으로, 여기서 접합체는 암 또는 자가 면역 질환의 치료 방법에 사용하기 위한, 공유 결합된 사포닌 및 세포 표면 분자 결합 항체, 예컨대 sdAb를 포함하고, 해당 방법은 이를 필요로 하는 암 환자와 같은 대상체에게 이펙터 분자를 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 이펙터 분자는 그 자체로 또는 ADC 또는 AOC의 일부로서 제공된다.
약제에서 본 발명의 접합체의 추가 적용은 불충분한 양 또는 불충분한 기능성으로 효소를 생성하는 표적 세포에서 세포내 효소의 대체를 위한 방법에서의 용도이다. 본 발명의 접합체는 예를 들어 표적 세포내 효소의 대체를 위한, 분자 또는 대체될 효소 또는 유전자 요법용 올리고뉴클레오티드를 포함하는 추가 접합체와 조합되어 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 발생되는 질환은 유전적이거나 후천적일 수 있다. 대부분의 경우 대증적 치료만이 가능하며, 다수의 희귀 질환의 경우, 불충분한 치료 옵션으로 인해 해당 환자의 수명이 단축된다. 이러한 질환의 예는 아미노산 페닐알라닌의 대사 감소를 초래하는 선천적 대사 이상인 페닐케톤뇨증이다. 이 질환은 간 효소 페닐알라닌 하이드록실라제에 대한 유전자의 돌연변이를 특징으로 한다. 페닐케톤뇨증은 현재까지 완치가 불가능하다. 발병률은 약 1:10,000이며, 알려진 가장 높은 발병률은 터키에서의 1:2,600이다. 본 발명의 접합체에 포함된 세포 표면 분자 표적화 항체, 바람직하게는 결합된 사포닌 및 sdAb 및 페닐알라닌 하이드록실라제와 같은 항체와 같은 동일하거나 상이한 세포 표면 결합 분자를 포함하는 제2 접합체 또는 페닐알라닌 하이드록실라제를 암호화하는 결합된 폴리뉴클레오티드가 있는 sdAb와 같은 항체와 같은 동일하거나 상이한 세포 표면 결합 분자를 포함하는 제2 접합체를 갖는 VHH와 같은 sdAb는 본 발명의 접합체 및 본 발명에 따른 제2 접합체 내 적합한 특정 항체 또는 sdAb를 사용하여 간세포를 표적화하고 간세포에서 결손 효소를 대체하는 데 사용될 수 있다. 이는 대체 요법 또는 유전자 요법을 위한, 본 발명에 따라 결합된 사포닌 및 해당 예에서 이펙터 분자를 포함하는 제2 접합체, 예컨대 본 발명에 따라 결합된 효소 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 접합체의 용도의 한 예이다. 바람직한 구현예에서, 유전자 요법 또는 대체 요법의 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 접합체는 세포 표면 결합 분자 및 효소 또는 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 접합체와 조합되어 제공된다.
본 발명의 접합체를 사용하여, 2-구성요소, 비바이러스성 임상 적용가능한 유전자 전달 기술을 설계하고 제조하는 것이 이제 가능해졌다. 예를 들어, 본 발명의 접합체는 비바이러스 기반 접합체 조합 유전자 전달 기술의 개발을 가능하게 하여 더 낮은 치료 용량으로 치료 효능을 향상시킴으로써 환자의 건강을 개선한다. 본 발명의 접합체는, 특히 (종양, 자가면역) 세포 표면 특이적 분자에 결합하기 위한 공유 결합된 세포 표면 분자 표적화 항체, 예컨대 단일클론 항체 또는 sdAb를 포함할 경우, 및 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 BNA와 같은 이펙터 모이어티를 포함하는 제2 접합체와 조합되는 경우, 유전자 전달 분야의 오랜 주요 병목현상, 즉 엔도솜 막을 가로질러 세포질액/뉴클레오졸로 유전자 치료제를 효율적이고 안전하며 비용 효율적으로 전달하는 것을 극복할 수 있게 한다. 실제로 유전자 요법은 광범위한 질환에 대한 미래의 첨단 요법을 위한 가장 유망한 치료 옵션 중 하나이다. 성공적인 유전자 전달은 표적 세포의 인식뿐만 아니라 유전자의 세포질액 및 뉴클레오졸 흡수를 필요로 한다. 비바이러스 유전자 요법 분야의 주요 문제 중 하나는 환자 치료용으로 사용하기에는 유전 물질의 전달이 비효율적이고 전달 안전성이 충분하지 않다는 것이다.
따라서, 리간드 또는 바람직하게는 항체(이의 단편, 도메인, 바람직하게는 sdAb)와 같은 세포 표적화 세포 표면 분자 표적화 분자를 포함하고, 안티센스 BNA와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 접합체를 포함하는 제2 접합체, 예컨대 AOC 또는 sdAb와 조합된 본 발명의 접합체를 적용할 때, 본 발명자들은 이제 유전자 전달 분야의 오랜 주요 병목현상, 즉 엔도솜 막을 가로질러 세포질액/뉴클레오졸로 유전자 치료제 안전하게 전달하는 것을 극복할 수 있도록 하였다. 본 발명의 접합체는 모든 알려진 유전 제제를 사용한 임의의 주소지정 가능한 세포 유형의 표적화하고 이후 유전자의 효율적인 세포질 전달을 가능하게 하도록 설계됨으로써, 유전 장애에 국한되지 않고 암 치료에도 보다 나은 환자 치료를 보장하므로 대규모 환자 그룹에 중요한 기술을 나타낸다. 본 발명의 접합체를 기반으로 한 기술은 엔도솜 탈출 강화제(EEE), 예컨대 본원에 예시된 바와 같은 사포닌, 및 본 발명에 따른 구현예의 사포닌, 세포 표면 분자 표적화 분자, 예컨대 표적화 리간드 또는 (단일클론) (종양 세포 특이적) 항체, 또는 이의 단편, 또는 바람직하게는 VHH와 같은 sdAb에 대한, 캐리어로 작용하는 폴리머 또는 올리고머 스캐폴드(본 발명의 공유 사포닌 접합체)를 포함할 수 있다. 이어서 제2 접합체는 수용체 리간드와 같은 제2 세포 표면 분자 결합 분자, sdAb와 같은 항체, 및 이펙터 모이어티(본원에서는 LNA 또는 BNA와 같은 이펙터 유전자)를 포함한다. 예를 들어 세포 표적화 항체(단편) 또는 sdAb, 및 BNA와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 접합체의 사용은 임의의 종류의 생물학적 거대분자를 세포질액 및 핵으로 운반할 잠재력을 가지고 있다. 새로운 표적화 리간드, sdAb, 및 단일클론 (인간, 인간화) 항체의 개발은 전 세계 수많은 연구 그룹과 회사에서 지속적으로 연구되고 있다. 암세포와 같은 질환 세포의 세포질액 내 전달을 목적으로 하는 올리고뉴클레오티드에 대해서도 마찬가지이다. 따라서 본 발명의 접합체는 또한, 현재 및 향후의 표적화 sdAb 및 항체가 클릭 화학기에 의해 사용될 수 있는 분자 도구로서 제공되어, 맞춤형 약물 적용과 조직 및 세포 표적화 기술 분야의 향후 개발을 가능하게 하고, 이에 따라 본 발명에 따른 제2 접합체는 또한, 현재 및 향후의 치료용 올리고뉴클레오티드(및 단백질 독소와 같은 페이로드)가 예를 들어 클릭 화학기에 의해 sdAb에 연결될 수 있거나 연결되는 분자 도구로서 제공되어, 맞춤형 약물 적용과 조직 및 세포 표적화 기술 분야의 향후 개발을 가능하게 한다. 본 발명의 접합체는 항체 및 리간드를 세포 표면 분자 표적화 분자로서 포함할 수 있지만, sdAb가 바람직하다. 유전자 치료제의 전 세계 시장은 빠르게 성장하고 있으며, 암, 심혈관 질환, 파킨슨병, 알츠하이머, HIV, 및 많은 희귀(단일유전) 질환과 같은 광범위한 질환 영역에 대한 잠재적 치료법을 다루고 있다. 현재의 바이러스 벡터 기반 유전자 치료 기술은 안전성, 제조 물류, 및 이와 관련된 높은 비용과 같은 중요한 문제를 안고 있다. 본 발명의 접합체는, 전달될 유전자 및 세포 표면 표적화 분자, 예컨대 항체, 예컨대 sdAb를 포함하는 제2 접합체와 조합될 때, 현재의 바이러스 유전자 전달 기술에 대한 대안을 나타내는 기술 플랫폼에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 접합체는 암, 심혈관 질환, 파킨슨병, 알츠하이머병, HIV 감염, 및 많은 희귀(단일유전) 질환과 같은 질환에 대한 비바이러스 유전자 치료법을 개발하기 위한 접근법을 구현하는 데 적합하다. 본 발명의 접합체는 표적화 안티센스 BNA 기반과 같은 비바이러스 벡터 기반 유전자 치료제를 만들어 항체-약물 접합체(ADC) 및 올리고뉴클레오티드 기반 치료제 분야를 변화시키기 위한 새로운 치료법을 개발하는 데 적합하다. 본 발명의 접합체, 특히 sdAb와 같은 항체 및 사포닌을 포함하는 공유 접합체, 및 항체와 같은 세포 표면 분자 결합 분자 및 BNA와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 접합체와의 결합의 적용은 본 발명으로 인해 가능해진 많은 유익한 접근법 중 하나이다. 예를 들어, 본 발명의 접합체의 사용은 이제 포유동물 세포의 세포내이입 경로 이용을 가능하게 한다. 세포내이입이 치료제의 전달에 이용되고, 본 발명의 접합체는 예를 들어 제2 접합체에 포함된 siRNA의 개선된 흡수 및 엔도솜 탈출에 기여한다. 본 발명의 접합체는 예를 들어 페이로드, 올리고뉴클레오티드에 대한 전달 강화제로 작용하는 소분자와 함께 적합하게 사용된다. 이와 함께, 본 발명의 사포닌을 함유하고 공유 결합된 세포 표적화 모이어티, 예컨대 리간드 및 바람직하게는 항체(도메인 또는 단편, 바람직하게는는 VHH)를 함유하는 본 발명의 접합체와 조합하여, 공유 결합된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 BNA, 및 공유 결합된 세포 표적화 모이어티, 예컨대 리간드 및 바람직하게는 항체(도메인 또는 단편, 바람직하게는 VHH)를 함유하는 본 발명의 제2 접합체는, 사포닌을 포함하는 이러한 본 발명의 접합체가 BNA와 같은 유전자 산물, 및 (단일클론) 항체 또는 sdAb와 같은 (종양) 세포 표적화 모이어티를 포함하는 제2접합체와 조합되므로, 유리 비표적 사포닌을 포함하는 2가지 구성요소로서의 적용과 이에 따른 복잡한 치료 승인 및 임상 적용가능성과 관련하여 현재의 엔도솜 탈출 강화제 및 유전자 치료제에서 나타나는 현재의 문제에 대한 해결책을 제공한다. 따라서 본 발명은 엔도솜 탈출 강화제(예를 들어, 본 발명의 구현예 및 제공된 실시예의 글리코시드) 및 표적화 리간드 또는 항체(예를 들어, 본 발명의 구현예에 따른 것 및 아래 실시예 섹션에 예시된 sdAb)가 본 발명의 접합체에 포함되고, 유전자 치료제(BNA와 같은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 제2 접합체 및 본 발명의 접합체에 포함되는 동일하거나 상이한 세포 표면 표적화 분자와 같은 제2 세포 표면 분자 표적화 분자(제2 세포 표면 분자 표적화 분자는 본 발명의 접합체의 세포 표면 분자 표적화 분자와 동일하거나 상이한 세포 표면 분자에 결합함)와 조합되는, 비바이러스 유전자 전달 기술을 제공한다. 따라서 본 발명의 이러한 접합체는 광범위한 질환과 대규모 환자 그룹을 위한 현재 및 향후의 거대분자 약물에 대한 치료 기회를 제공한다. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 및 적어도 하나의 특이적 세포 표적화 모이어티, 예컨대 면역글로불린 또는 sdAb을 포함하는 제2 접합체와 조합된, 적어도 하나의 사포닌, 및 적어도 하나의 특이적 세포 표적화 모이어티, 예컨대 면역글로불린 또는 sdAb를 포함하는 본 발명의 이러한 접합체의 적용으로, 비세포 표면 분자 표적화된 유리 엔도솜 탈출 강화제(예를 들어, 세포 표면 분자 결합 항체와 접합되지 않은 사포닌) 및 유전자 치료제를 개별적으로 적용하는 현재의 방법에서 두 화합물이 상호작용 부위에 동시에 존재함을 보장하지 않는 명백한 문제가 해결된다. 이 문제는 이제 핵산을 포함하는 제2 접합체와 조합된 본 발명의 접합체를 사용함으로써 극복되며, 본 발명의 접합체 및 제2 접합체 둘 모두 세포 표면 분자 표적화 분자, 예컨대 항체, 예컨대 sdAb를 포함한다. 즉, 본 발명의 접합체와 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 접합체의 이러한 조합은 두 화합물, 즉 사포닌 및 BNA와 같은 유전자 산물의 (시간적 및 공간적) 동기화가 증가된 비바이러스 유전자 전달 기술을 제공한다.
유전자 요법은 낭포성 섬유증, 무도병, 헌팅턴병, 또는 혈우병과 같은 이전에 치료할 수 없었던 유전성 질환에 도움이 될 수 있다. 그러나, 현재 일부 문제가 해결되지 않았다. 예를 들어, 치료 유전자는 신체의 특정 표적 세포에 정확하게 도달해야 한다. 한편, 치료 유전자는 표적 세포에 흡수되어야 하지만, 치료 유전자가 파괴되어서는 안 된다. 현재의 유전자 치료 접근법은 바이러스를 유전자 전달체로서 사용한다. 그러나, 이러한 절차는 상당한 위험을 수반하며 다른 생체분자의 도입으로 이어질 수 없다. 일 구현예는, 유전자가 제2 접합체에 캐리어 분자로서 포함될 때 이러한 유전자의 전달을 가능하게 할 뿐만 아니라, 표적 세포에 도입될 다른 치료 생체분자의 전달도 가능하게 하는 플랫폼 기술을 사용하기 위한 (식물 유래) 글리코시드(예를 들어, 본 발명의 사포닌 중 어느 하나)를 포함하는 본 발명의 접합체이다. 따라서, 본 발명의 접합체는 낭포성 섬유증, 무도병, 헌팅턴병, 또는 혈우병에 대한 핵산 기반 치료법을 개발하는 데 사용된다. 이와 함께, 본 발명의 접합체를 사용하여, 낭포성 섬유증, 헌팅턴병, 및 혈우병 환자를 포함한 유전 질환 환자의 건강을 개선하기 위한 새로운 유전자 치료 전력이 가능하다. 본 발명의 일부로서, 세포 표면 분자 결합 분자 및 유전자 치료제를 포함하는 제2 접합체와의 조합을 위해, 본 발명의 단일 접합체에 포함된, 식물 유래 엔도솜 탈출 강화제(글리코시드, 즉 본 발명의 사포닌) 및 표적 리간드(즉, sdAb)를 결합한 비바이러스 유전자 전달 기술이 개발된다. 본 발명의 접합체를 기반으로 한 비바이러스 유전자 요법은 현재 이용 가능한 전략에 비해 유전자를 포함하는 제2 접합체의 더 낮은 투여량으로 약 40배 증가된 전달 효율을 나타낸다. 이와 함께, 본 발명의 접합체는 낭포성 섬유증 환자에서와 같은 결손 유전자의 복구 또는 대체, 및 예를 들어 암세포를 파괴하기 위한 특정 유전자의 표적화 전달과 같은 임상 적용에 사용하기 위한 것이다. 사실, 본 발명의 접합체는 낭포성 섬유증, 헌팅턴병, 및 혈우병과 같은 현재 치료가 불가능한, 유전적 결손에 의해 유발된 질환에 대한 치료 요법에 적용하기에 적합하다. 본 발명의 접합체를 사용하는 유전자 요법은 현재의 두 가지 문제를 극복하는 데 도움이 된다. 첫째, 신체의 특정 표적 세포에 치료 유전자를 포함하는 제2 접합체를 전달하는 것이 본 발명의 접합체로 가능하고; 둘째, 치료 유전자가 이러한 세포 내부로 진입하지만, 표적 세포(본 발명의 접합체)에 결합하기 위한 사포닌 및 표적화 모이어티, 예컨대 항체 또는 sdAb의 존재 및 표적 세포에 결합하기 위한 올리고뉴클레오티드 생성물 및 표적화 모이어티, 예컨대 항체 또는 sdAb의 존재로 인해, 파괴되지 않는다.
본 발명은 또한, 암을 치료하는 방법으로서, 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 약제를 이를 필요로 하는 환자에게 ADC 또는 AOC와 조합하여 투여하는 단계, 바람직하게는 유효 용량의 상기 약제를 이를 필요로 하는 환자, 바람직하게는 인간 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
투여에 적합한 형태에 관한 고려사항은 당업계에 알려져 있으며, 독성 효과, 용해도, 투여 경로, 및 활성 유지를 포함한다. 예를 들어, 혈류에 주사되는 약리학적 조성물은 가용성이어야 한다.
적합한 투약 형태는 부분적으로 용도 또는 진입 경로(예를 들어, 경피 또는 주사)에 따라 다르다. 이러한 투약 형태는 표적 세포가 다세포 숙주에 존재하는지 여부에 상관없이 화합물이 표적 세포에 도달할 수 있도록 해야 한다. 기타 요인은 당업계에 알려져 있으며, 화합물 또는 조성물의 효과 발휘를 지연시키는 독성 및 투약 형태와 같은 고려사항을 포함한다.
[표 A1]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 및 예시적인 구현예
실시예 1. V HH -SO1861 + mAb-사포린(1T2C 및 2T2C)
1-표적 2-구성요소 시스템(1T2C)은 VHH 및 mAb가 동일한 세포 표면 수용체를 인식하고 이에 결합하는, VHH-SO1861 및 mAb-단백질 독소의 병용 치료제이다(도 1a). 2-표적 2-구성요소 시스템(2T2C)은 VHH가 mAb와 다른 세포 표면 수용체를 인식하고 이에 결합하는, VHH-SO1861 및 mAb-단백질 독소의 병용 치료제이다(도 1b). SO1861-EMCH를 말단 시스테인 잔기(Cys)를 통해 항HER2VHH에 (불안정) 접합시켰다(DAR 1, HER2VHH-SO1861). HER2VHH-SO1861을 고정 농도의 10 pM CD71mab-사포린(단백질 독소, 사포린에 접합된 CD71 단일클론 항체, DAR4) 또는 50 pM 트라스투주맙-사포린(단백질 독소, 사포린에 접합된 트라스투주맙, DAR4)에서 적정하였다. SK-BR-3(HER2++ /CD71+) 및 MDA-MB-468(HER2-/CD71+)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 10 pM CD71mab-사포린 또는 50 pM 트라스투주맙-사포린과의 두 조합의 경우 SK-BR-3에서 저농도의 HER2VHH-SO1861에서 강화된 세포 사멸을 나타냈다(IC50 = 300 nM; 도 2a). 동등한 농도의 HER2VHH-SO1861 단독은 높은 농도에서 세포 사멸을 유도한 반면(IC50 = 4.000 nM), 동등한 농도의 HER2VHH, HER2VHH + CD71mab-사포린, 또는 HER2VHH + 트라스투주맙-사포린은 세포 사멸 활성을 유도할 수 없었다(IC50 > 5000 nM; 도 2a). MDA-MB-468(HER2-/CD71+)에서, HER2VHH-SO1861 + 10 pM CD71mab-사포린의 조합은 높은 농도에서 세포 사멸 활성을 나타낸 반면(IC50 = 2.000 nM; 도 2b), HER2VHH-SO1861 + 50 pM 트라스투주맙-사포린의 조합은 훨씬 더 높은 농도에서 세포 사멸 활성을 나타냈다(IC50 > 5.000 nM; 도 2b). 동등한 농도의 HER2VHH, HER2VHH + CD71mab-사포린, 또는 HER2VHH + 트라스투주맙-사포린은 MDA-MB-468 세포에서 세포 사멸 활성을 유도할 수 없었다(IC50 >5.000 nM; 도 2b).
이 모든 것은 HER2 표적화 VHH에 대한 SO1861-EMCH의 접합이 (동일하거나 상이한 세포 표면 수용체를 표적화하는) 표적화 단백질 독소의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 강화하여, HER2 발현 세포의 세포 사멸을 유발함을 보여준다.
다음으로, 트라스투주맙-사포린 또는 CD71mab-사포린을 고정 농도의 900 nM HER2VHH-SO1861에서 적정하고, SK-BR-3(HER2++ /CD71+) 및 MDA-MB-468(HER2-/CD71+)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도의 트라스투주맙-사포린 또는 CD71mab-사포린과 조합된 900 nM HER2VHH-SO1861이 이미 SK-BR-3의 효율적인 세포 사멸을 유도했음을 나타낸 반면(IC50 = 0,0001 pM; 도 3a), CD71mab-사포린 + 900 nM HER2VHH 또는 트라스투주맙-사포린 + 900 nM HER2VHH는 높은 농도에서만 세포 사멸을 유도할 수 있었다(각각 IC50 = 50 pM; IC50 = 400 pM; 도 3). MDA-MB-468 세포(HER2-/CD71+)에서, CD71mab-사포린 + 900 nM HER2VHH-SO1861은 IC50 = 0,01 pM에서 세포 사멸을 나타낸 반면, 트라스투주맙-사포린 + 900 nM HER2VHH-SO1861은 IC50 = 2.000 pM에서 활성을 나타냈다. 트라스투주맙-사포린 + 900 nM HER2VHH 또는 CD71mab-사포린 + 900 nM HER2VHH는 각각 IC50 > 10.000 pM 및 IC50 = 20 pM에서만 세포 사멸을 나타냈다(도 3b). 이 모든 것은 상대적으로 낮은 농도의 트라스투주맙-사포린 또는 CD71mab-사포린이 HER2++ /CD71+ 발현 세포에서 상대적으로 낮은 농도의 HER2VHH-SO1861(DAR1)과 조합하여 효과적이며 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 2. V HH -SO1861 + V HH -다이안틴(2T2C)
2-표적 2-구성요소 시스템(2T2C)은 각각의 VHH가 다른 세포 표면 수용체를 인식하는, VHH1-SO1861 및 VHH2-단백질 독소의 병용 치료제이다(도 1c). SO1861-EMCH를 HER2 표적화 VHH의 말단 시스테인 잔기에 접합시켜 HER2VHH-SO1861(DAR1)을 생성하였다. HER2VHH-SO1861을 고정 농도의 50 pM CD71VHH-다이안틴에서 적정하고, SK-BR-3(HER2++ /CD71+) 및 MDA-MB-468(HER2-/CD71+)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 상대적으로 낮은 농도의 VHHHER2-L-SO1861에서 강화된 세포 사멸을 나타냈다(SK-BR-3: IC50 = 300 nM; 도 4a). 동등한 농도의 HER2VHH-SO1861 단독은 높은 농도에서 세포 사멸을 유도한 반면(IC50 = 4.000 nM), 동등한 농도의 HER2VHH, HER2VHH + 50 pM CD71VHH-다이안틴은 세포 사멸을 유도할 수 없었다(IC50 > 5.000 nM; 도 4a). MDA-MB-468(HER2-/CD71+)에서, HER2VHH-SO1861 + 50 pM CD71VHH-다이안틴의 조합은 더 높은 농도에서 세포 사멸 활성을 나타낸 반면(IC50 = 600 nM; 도 4b), 동등한 농도의 HER2VHH, HER2VHH-SO1861, 또는 HER2VHH + 50 pM CD71VHH-다이안틴은 세포 사멸 활성을 유도할 수 없었다(IC50 > 5.000 nM; 도 4b).
다음으로, CD71VHH-다이안틴을 고정 농도의 900 nM HER2VHH-SO1861에서 적정하고, SK-BR-3(HER2++ /CD71+) 및 MDA-MB-468(HER2-/CD71+)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도의 CD71VHH-다이안틴과 조합된 900 nM HER2VHH-SO1861이 SK-BR-3의 효율적인 세포 사멸을 유도했음을 나타낸 반면(IC50 = 0,05 pM; 도 5a), CD71VHH다이안틴 또는 CD71VHH-다이안틴 + 900 nM HER2VHH는 높은 농도에서만 세포 사멸을 유도할 수 있었다(IC50 > 10.000 pM; 도 5a). 뿐만 아니라, CD71VHH-다이안틴을 고정 농도의 77 nM 트라스투주맙-SO1861(DAR4)에서도 적정하였고, 이는 또한 SK-BR-3(HER2++ /CD71+) 세포에서 세포 사멸 활성의 강력한 향상을 나타냈다(IC50 < 0,0001 pM). MDA-MB-468 세포(HER2-/CD71+)에서, CD71VHH-다이안틴 + 900 nM HER2VHH-SO1861은 훨씬 더 높은 농도에서만 세포 사멸을 나타낸 반면(IC50 = 10 pM, 도 5b), CD71VHH-다이안틴, CD71VHH-다이안틴 + 900 nM HER2VHH, 또는 CD71VHH-다이안틴 + 트라스투주맙-SO1861(DAR4)은 IC50 = 2.000 pM에서만 세포 사멸을 나타냈다(도 5b).
이 모든 것은 상대적으로 낮은 농도의 CD71 CD71-다이안틴이 HER2/CD71 고발현 세포에서 저농도의 VHHHER2-SO1861 접합체와 조합하여 효과적이며 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.
MDA-MB-468 세포(HER2-/CD71+)에서 본 발명에 따른 조합은 어떤 세포 사멸 활성도 나타내지 않았다. 이는 충분한 수용체 발현이 없는 경우, 단백질 독소의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 유도하는 데 효과적인 세포내 전달 SO1861 농도(역치)에 도달하지 못한다는 것을 보여준다.
실시예 3. V HH -다이안틴 + mAb-SO1861(1T2C 및 2T2C)
1-표적 2-구성요소 시스템(1T2C)은 mAb 및 VHH가 동일한 세포 표면 수용체를 인식하고 이에 결합하는, mAb-SO1861 및 VHH-단백질 독소의 병용 치료제이다(도 1e). 2-표적 2-구성요소 시스템(2T2C)은 또한 mAb 및 VHH가 다른 세포 표면 수용체를 인식하는, mAb-SO1861 및 VHH-단백질 독소의 병용 치료제이다(도 1d).
다이안틴-C(말단 시스테인을 갖는 다이안틴)을 HER2 표적화 VHH, CD71 표적화 VHH, 또는 EGFR 표적화 VHH의 말단 시스테인 잔기에 접합시켜 HER2VHH-다이안틴(DAR1), CD71VHH-다이안틴(DAR1), 및 EGFRVHH-다이안틴(DAR1)을 생성하였다.
CD71VHH-다이안틴, HER2VHH-다이안틴, 또는 EGFRVHH-다이안틴을 고정 농도의 세툭시맙-SO1861(DAR4)에서 적정하고, A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+) 및 A2058(EGFR-/HER2+/-/CD71+)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 77 nM 세툭시맙-SO1861과 조합된 매우 낮은 농도의 CD71VHH-다이안틴이 A431 세포의 효율적인 세포 사멸을 유도했음을 나타낸 반면(IC50 < 0,0001 pM; 도 6a), CD71VHH-다이안틴 단독은 IC50 = 2000 pM에서 활성을 나타냈다. 다른 두 조합 EGFRVHH-다이안틴 + 77 nM 세툭시맙-SO1861 및 HER2VHH-다이안틴 + 77 nM 세툭시맙-SO1861은 각각 IC50 = 20 pM 및 IC50 = 50 pM에서 효율적인 세포 사멸을 나타낸 반면, EGFRVHH-다이안틴 또는 HER2VHH-다이안틴 단독은 A431 세포에서 효율적인 세포 사멸을 유도할 수 없었다(IC50 > 10.000 pM; 도 6a). A2058 세포(EGFR-/HER2+/-/CD71+)에서, CD71VHH-다이안틴 및 CD71VHH-다이안틴 + 77 nM 세툭시맙-SO1861은 각각 IC50 = 3.000 pM 및 IC50 = 1.000 pM에서 세포 사멸 활성을 보인 반면, 다른 모든 치료제 또는 조합은 A2058 세포에서 IC50 = 10.000 pM VHH-독소까지 세포 사멸을 나타내지 않았다(도 6b).
이는 세툭시맙-SO1861(DAR4)이 3가지 상이한 VHH-다이안틴 접합체의 엔도솜 탈출을 효율적으로 유도하여 A431 세포에서 강화된 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.
다음으로, CD71VHH-다이안틴, HER2VHH-다이안틴, 또는 EGFRVHH-다이안틴을 고정 농도의 트라스투주맙-SO1861(DAR4)에서 적정하고, SK-BR-3(HER2++/EGFR=/CD71+) 및 MDA-MB-468 세포(HER2-/EGFR++/CD71+)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 77 nM 트라스투주맙-SO1861과 조합된 매우 낮은 농도의 CD71VHH-다이안틴이 SK-BR-3 세포의 효율적인 세포 사멸을 유도했음을 나타낸 반면(IC50 < 0,0001 pM; 도 7a), CD71VHH-다이안틴 단독은 IC50 = 10.000 pM에서 활성을 나타냈다. 다른 두 조합 EGFRVHH-다이안틴 + 77 nM 트라스투주맙-SO1861 및 HER2VHH-다이안틴 + 77 nM 트라스투주맙-SO1861은 각각 IC50 = 400 pM 및 IC50 = 6 pM에서 효율적인 세포 사멸을 나타낸 반면, EGFRVHH-다이안틴 또는 HER2VHH-다이안틴 단독은 SK-BR-3 세포에서 효율적인 세포 사멸을 유도할 수 없었다(IC50 > 10.000 pM; 도 7a). MDA-MB-468 세포(HER2-/EGFR++/CD71+)에서, CD71VHH-다이안틴 및 CD71VHH-다이안틴 + 77 nM 세툭시맙-SO1861은 각각 IC50 = 3000 및 IC50 = 2000 pM에서 세포 사멸 활성을 보인 반면, 다른 모든 치료제 또는 조합은 MDA-MB-468 세포에서 IC50 = 10.000 pM VHH-다이안틴까지 세포 사멸을 나타내지 않았다(도 7b). 이는 트라스투주맙-SO1861(DAR4)이 3가지 상이한 VHH-다이안틴 접합체의 엔도솜 탈출을 효율적으로 유도하여 SK-BR-3 세포에서 강화된 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.
물질 및 방법
물질
SO1861은 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis)에서 얻은 원시 식물 추출물로부터 Analyticon Discovery GmbH에 의해 분리 및 정제되었다. VHH는 QVQ(Utrecht, Netherlands)에서 구입하였다(HER2VHH: 클론명: Q17c; CD71VHH: 클론명: Q52c EGFRVHH: 클론명: Q86c). 트라스투주맙(Tras, Herceptin®, Roche), 세툭시맙(Cet, Erbitux®, Merck KGaA)은 약국(Charite, Berlin)에서 구입하였다. CD71 단일클론 항체는 BioCell(Okt9, #BE0023)에서 구입하였다. 맞춤형 트라스투주맙-사포린 및 항CD71mab-사포린 접합체는 Advanced Targeting Systems(San Diego, CA)에서 생산된 것을 구입하였다. 다이안틴-Cys(Dia-Cys, 단일 C-말단 시스테인을 갖는 다이안틴 돌연변이)는 Proteogenix(프랑스)에서 생산되었다.
트리스(2-카복시에틸)포스핀 염산염(TCEP, 98%, Sigma-Aldrich), 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB, Ellman 시약, 99%, Sigma-Aldrich), Zeba™ 스핀 탈염 컬럼(2 mL, Thermo-Fisher), NuPAGE™ 4~12% 비스-트리스 단백질 겔(Thermo-Fisher), NuPAGE™ MES SDS 러닝 버퍼(Thermo-Fisher), Novex™ 샤프 사전염색 단백질 표준물질(Thermo-Fisher), PageBlue™ 단백질 염색액(Thermo-Fischer), Pierce™ BCA 단백질 분석 키트(Thermo-Fisher), N-에틸말레이미드(NEM, 98%, Sigma-Aldrich), 1,4-디티오트레이톨(DTT, 98%, Sigma-Aldrich), Sephadex G25(GE Healthcare), Sephadex G50 M(GE Healthcare), Superdex 200P(GE Healthcare), 이소프로필 알코올(IPA, 99.6%, VWR), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris, 99%, Sigma-Aldrich), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염(Tris.HCL, Sigma-Aldrich), L-히스티딘(99%, Sigma-Aldrich), D-(+)-트레할로스 디하이드레이트(99%, Sigma-Aldrich), 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN 20, Sigma-Aldrich), Dulbecco 인산염 완충 식염수(DPBS, Thermo-Fisher), 구아니딘 염산염(99%, Sigma-Aldrich), 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨염 이수화물(EDTA-Na2, 99%, Sigma-Aldrich), 멸균 필터 0.2 μm 및 0.45 μm(Sartorius), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(SMCC, Thermo-Fisher), Vivaspin T4 및 T15 농축기(Sartorius), Superdex 200PG(GE Healthcare), 테트라(에틸렌 글리콜) 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP, Thermo-Fisher), HSP27 BNA 디설파이드 올리고뉴클레오티드(Biosynthesis), [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸우로늄-헥사플루오르포스파트](HATU, 97%, Sigma-Aldrich), 디메틸 설폭사이드(DMSO, 99%, Sigma-Aldrich), N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트 염(AEM, 98%, Sigma-Aldrich), L-시스테인(98.5%, Sigma-Aldrich), 탈이온수(DI)는 Ultrapure Lab Water Systems(MilliQ, Merck)에서 새로 준비, 니켈-니트릴로트리아세트산 아가로스(Ni-NTA agarose, Protino), 글리신(99.5%, VWR), 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산)(Ellman 시약, DTNB, 98%, Sigma-Aldrich), S-아세틸머캅토석신산 무수물 플루오레세인(SAMSA 시약, Invitrogen), 중탄산나트륨(99.7%, Sigma-Aldrich), 탄산나트륨(99.9%, Sigma-Aldrich), Sephadex G-25 수지를 포함한 PD MiniTrap 탈염 컬럼(GE Healthcare), PD10 G25 탈염 컬럼(GE Healthcare), 0.5, 2, 5, 및 10 mL의 Zeba 스핀 탈염 컬럼(Thermo-Fisher), Vivaspin 원심분리 필터 T4 10 kDa MWCO, T4 100 kDa MWCO, 및 T15(Sartorius), Biosep s3000 aSEC 컬럼(Phenomenex), Vivacell 한외여과 유닛 10 및 30 kDa MWCO(Sartorius), Nalgene Rapid-Flow 필터(Thermo-Fisher).
방법
SO1861-EMCH 합성
SO1861(121 mg, 0.065 mmol) 및 EMCH.TFA(110 mg, 0.325 mmol)에 메탄올(추가 건조, 3.00 mL) 및 TFA(0.020 mL, 0.260 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 분취용 MP-LC.1에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결하고 밤새 동결건조하여 표제 화합물(120 mg, 90%)을 백색 솜털형 고체로 얻었다. LC-MS 기반 순도 96%.
LRMS (m/z): 2069 [M-1]1-
LC-MS r.t. (min): 1.084
세포 생존력 분석
처리 후 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 제조사의 지침(CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)에 따라 수행된 MTS 분석으로 세포 생존력을 측정하였다. 간략하게, MTS 용액을 10% FBS가 보충된 페놀 레드(PAN-Biotech GmbH)가 없는 DMEM에서 20배 희석하였다. 세포를 200 μL/PBS 웰로 1회 세척한 후 웰당 100 μL의 희석된 MTS 용액을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 약 20~30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 Thermo Scientific Multiskan FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific)에서 492 nm에서의 OD를 측정했다. 정량화를 위해 '배지 단독' 웰의 백그라운드 신호를 다른 모든 웰에서 뺀 후, 처리 웰의 백그라운드 보정된 신호를 비처리 웰의 백그라운드 보정된 신호로 나누어(x 100), 처리/비처리 세포의 세포 생존력 백분율을 계산하였다.
FACS 분석
10 cm 디쉬에서 500,000 c/플레이트로, 세포를 10% 우태아 혈청(PAN-Biotech GmbH) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(PAN-Biotech GmbH)이 보충된 DMEM(PAN-Biotech GmbH)에 시딩하고, 90% 컨플루언시에 도달할 때까지 48시간 동안 인큐베이션하였다(5% CO2, 37℃). 이어서, 세포를 트립신 처리하여(TryplE Express, Gibco Thermo Scientific) 단일 세포로 만들었다. 0.75 x 106개 세포를 15 mL 팔콘 튜브로 옮기고 원심분리하였다(1,400 rpm, 3분). 세포 펠릿을 침수시킨 채로 상청액을 버렸다. 볼텍스 쉐이커에서 팔콘 튜브를 가볍게 태핑하여 펠릿을 분리하고 세포를 4 mL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)로 세척하였다. 세척 후 세포를 3 mL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)에 재현탁시키고, 3개의 둥근 바닥 FACS 튜브에 균등하게 분배하였다(1 mL/튜브). 세포를 다시 원심분리하고 200 μL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS) 또는 200 μL의 항체 용액(195 μL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)에 5 μL의 항체를 함유)에 재현탁시켰다. APC 마우스 IgG1, κ APC 항-인간 EGFR(#352906, Biolegend)을 사용하여 EGFR 수용체를 염색하였다. PE 항-인간 HER2 APC 항-인간 CD340(erbB2/HER-2)(#324408 Biolegend)을 사용하여 HER2 수용체를 염색하고, PE 마우스 IgG2a, κ 이소형 Ctrl FC(#400212, Biolegend)를 매칭 이소형 대조군으로 사용하였다. PE 항-인간 CD71(#334106, Biolegend)을 사용하여 CD71 수용체를 염색하고, PE 마우스 IgG2a, κ 이소형 Ctrl FC(#400212, Biolegend)를 매칭 이소형 대조군으로 사용하였다. 튜브 롤러 믹서에서 샘플을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)로 3회 세척하고, PBS 중 2% PFA 용액을 사용하여 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 FACS 분석을 위해 250~350 μL의 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 샘플을 BD FACSCanto II 유세포 분석 시스템(BD Biosciences) 및 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 다양한 세포에 대한 EGFR, HER2, 및 CD71의 세포 표면 발현 분석 결과를 표 A2에 요약하였다.
[표 A2]
Figure pct00006
V HH -SO1861의 접합에 대한 절차
VHH의 분취량에 새로 제조한 TCEP 용액(10.0 mg/ml)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 롤러 믹싱으로 20℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 생성된 VHH-SH를 zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 TBS pH 7.5로 정제하였다. 생성된 VHH-SH에 새로 제조한 SPT-EMCH 용액을 첨가하고 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 20℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, VHH-SO1861 혼합물의 분취량을 제거하고 Ellman 분석으로 특성화하여 SO1861 혼입을 확인하였다. DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 × 35 cm Superdex 200PG 컬럼으로 접합체를 정제하여 정제된 VHH-SO1861을 얻었다. 분취량을 0.2 μm로 여과하고, 농축하고 1.0 mg/ml로 정규화하여 VHH-SO1861을 수득하였다.
V HH -다이안틴의 접합에 대한 절차
다이안틴-Cys를 vivaspin T15 10 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 한외여과로 농축하고 TBS pH 7.5로 버퍼 교환하였다. 농축된 다이안틴-Cys에 새로 제조한 TCEP 용액(10.0 mg/ml)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 롤러 믹싱으로 20℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 생성된 다이안틴-SH를 zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 겔 여과로 정제한 다음, vivaspin T15 10 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 TBS pH 7.5로 원심분리-세척 사이클을 반복하였다. 생성된 다이안틴-SH를 새로 제조한 DTME 용액(10 mg/ml)과 DMSO에서 반응시키고, 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 20℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 이후, zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 TBS pH 7.5로 정제한 후 다이안틴-DTME를 얻었다. 다이안틴-DTME는 접합될 때까지 20℃에서 보관되었다. 동시에, VHH의 분취량을 vivaspin T15 10 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 한외여과로 농축하고 TBS pH 7.5로 버퍼 교환하였다. 농축된 VHH에 새로 제조한 TCEP 용액(10.0 mg/ml)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 롤러 믹싱으로 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 생성된 VHH를 zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 겔 여과로 정제한 다음, vivaspin T4 5 KDa MWCO 원심분리 필터를 사용하여 TBS pH 7.5로 원심분리-세척 사이클을 반복하였다. 생성된 VHH-SH의 분취량을 다이안틴-DTME와 반응시키고, 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 20℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 반응 혼합물을 vivaspin T4 10 KDa MWCO 원심분리 튜브를 사용하여 농축하고, DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 × 35 cm Superdex 200PG 컬럼을 사용하여 겔 여과로 정제하였다.
항체-(L-SO1861) 4
트라스투주맙, 세툭시맙을 이하 "Ab"로 지칭한다. Ab를 Michael 유형 티올-엔 접합 반응을 통해 사포닌 SO1861-EMCH에 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 DAR로 접합시켰다. SO1861-EMCH 분자는 구조와 말레이미드 기능 사이에 불안정한(L) 하이드라존 결합을 얻어 사포닌과 Ab 사이에 불안정한 결합이 생성된다. 절차를 트라스투주맙-(L-SO1861)4에 대해 예시적으로 설명한다.
세툭시맙의 용액(40 mg, 8.0 ml)에 Tris 농축액(127 mg/ml, 1.05 M), Tris.HCl 농축액(623 mg/ml, 3.95 M), 및 EDTA-Na2 농축액(95 mg/ml, 0.26 M)을 각각 10 μl/ml씩 첨가하여 50 mM TBS, 2.5 mM EDTA 버퍼 pH 7.5를 얻었다.
네 부분(각각 9.73 mg, 4.864 mg/ml, 65 nmol)으로 나눈 세툭시맙에 새로 제조한 TCEP 용액(0.5~2.0 mg/ml, 1.15~7.02 몰당량, 75~455 nmol)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 롤러 믹싱으로 20℃에서 300분 동안 인큐베이션하였다. (SO1861-EMCH의 첨가 전) 인큐베이션 후, 약 1 mg(0.210 ml) 분취량의 Ab-SH를 각 혼합물로부터 제거하고, zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 TBS pH 7.5로 정제하였다. 이들 분취량을 UV-vis 분석 및 Ellman 분석으로 특성화하였다(티올 대 Ab 비 = 각각 2.0, 4.2, 5.9, 및 6.8). 각각의 벌크 Ab-SH에 새로 제조한 SO1861-EMCH 용액(2 mg/ml, '티올'당 1.3 당량, 0.15~0.61 μmol, 0.16~0.63 ml)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 20℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 접합 반응 외에, 탈염된 Ab-SH(0.25 mg, 1.67 nmol)의 두 분취량을 각각 양성 및 음성 대조군으로서, NEM('티올'당 1.3 몰당량, 4.3~17.4 nmol, 0.25 mg/ml 용액 2.2~8.7 μl) 또는 TBS pH 7.5 버퍼(2.2~8.7 μl)와 20℃에서 120분 동안 반응시켰다. (NEM의 첨가 전) 인큐베이션 후, 0.200 ml 분취량의 Ab - SO1861-EMCH 혼합물을 제거하고, zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 TBS pH 7.5로 정제하였다. 이 분취량을 UV-vis로 특성화하고 양성 및 음성 대조군과 함께 Ellman 분석으로 특성화하여 SO1861-EMCH 혼입을 얻었다. 벌크 Ab - SO1861-EMCH 혼합물에 새로 제조한 NEM 용액(2.5 mg/ml, 2.5~10 몰당량, 0.15~0.58 μmol)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을, DPBS pH 7.5로 용리하는 zeba 스핀 탈염 컬럼으로 정제하여 정제된 세툭시맙 - (L-SO1861) 접합체를 얻었다. 생성물을 2.5 mg/ml로 정규화하고 0.2 μm로 여과한 후, 생물학적 평가를 위해 분배하였다. 트라스투주맙-L-SO1861 접합체에 대한 반응 조건 및 결과와 세툭시맙-L-SO1861 접합체에 대한 반응 조건 및 결과를 표 A3과 표 A4에 요약하였다.
[표 A3]
Figure pct00007
[표 A4]
Figure pct00008
단백질 독소 또는 사포닌에 공유 결합된 항체 및 수용체 리간드에 관한 다수의 구현예에 대한 요약
mAb: 트라스투주맙(HER2) 또는 세툭시맙(EGFR)
리간드: EGF
단백질 독소: 리보솜 비활성화 단백질, 사포린 또는 다이안틴
리간드와 사포닌의 엔도솜 탈출 강화 접합체:
mAb-SO1861 엔도솜 탈출 강화 접합체
Figure pct00009
절단 가능한 하이드라존 링커 포함
Figure pct00010
트라스투주맙-SO1861 DAR 4.0
Figure pct00011
세툭시맙-SO1861 DAR 3.7;
시험관내 또는 생체내 시험 모델에서 조합된 리간드와 사포닌의 엔도솜 탈출 강화 접합체:
mAb/리간드-단백질 독소 접합체
Figure pct00012
절단 가능하지 않은 화학적 링커를 포함하거나 재조합 융합 단백질임
Figure pct00013
트라스투주맙-사포린 DAR 3.0
Figure pct00014
세툭시맙-사포린 DAR 2.6
Figure pct00015
트라스투주맙-다이안틴 DAR 1.0
Figure pct00016
EGF-다이안틴(융합 단백질) DAR 1.0
Figure pct00017
IgG-사포린 DAR 2.2
실시예 4 내지 9의 경우:
물질:
트라스투주맙 및 세툭시맙은 약국(Charite, Berlin)에서 구입하였다. SO1861은 사포나리아 오피시날리스 L(Saponaria officinalis L)에서 얻은 원시 식물 추출물로부터 Analyticon Discovery GmbH에 의해 분리 및 정제되었다.
방법
SO1861-EMCH 합성
SO1861은 사포나리아 오피시날리스 L(Analyticon Discovery GmbH)에서 유래되었으며, 당업계에 알려진 통상적인 단계에 따라 EMCH에 결합되었다.
항체에 대한 SO1861의 접합
트라스투주맙-SO1861 및 세툭시맙-SO1861의 맞춤형 생산은 FleetBioprocessing(UK)에서 수행하였다. SO1861-EMCH은 항체의 시스테인에 접합되었다.
트라스투주맙 및 세툭시맙에 대한 사포린의 접합
맞춤형 트라스투주맙-사포린 및 세툭시맙-사포린 접합체는 Advanced Targeting Systems(San Diego, CA)에서 생산된 것을 구입하였다. IgG-사포린 및 사포린은 Advanced Targeting Systems에서 구입하였다.
FACS 분석
FACS 분석은 BD FACSCanto II에서 수행하였고, 데이터는 FlowJo V10 소프트웨어로 분석하였으며, FACS 항체는 다음과 같다: 1) 이소형: APC 마우스 IgG1, κ 이소형 Ctrl(FC)(400122, Biolegend). EGFR: APC 항-인간 EGFR(352906, Biolegend) HER2: APC 항-인간 CD340(erbB2/HER-2)(324408, Biolegend).
다이안틴 생성
다이안틴은 박테리아 배양물에서 발현되었고, 단백질은 당업계에 알려진 통상적인 세포 배양 및 단백질 정제 단계에 따라 정제되었다.
다이안틴에 대한 항체의 접합
항체와 다이안틴의 접합은 당업계에 알려진 일반적인 절차에 따랐다.
세포 배양
세포는 10% 우태아 혈청(FBS)(PAN-Biotech GmbH)이 보충된 DMEM(PAN-Biotech GmbH)에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다.
세포 생존력 분석
세포를 100 μL/웰의 5.000~10.000 c/w로 96웰 플레이트에 시딩하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 10x 농축 처리-믹스 샘플을 PBS에서 준비했으며, 여기에는 항체-접합 SO1861(즉, 본 발명의 '결합 분자' 또는 '엔도솜 탈출 강화 접합체') 및 표적화 독소(즉, '결합 분자')가 둘 다 10x 최종 농도로 포함되어 있다. 세포 배양 플레이트에서 배지를 제거하고 180 μL 배양 배지로 교체한 다음, 20 μL 처리-믹스/웰을 첨가하였다. 대조를 위해, 상응하는 농도의 항체-접합 SO1861만, 항체만, SO1861만, 표적화 독소만, 또는 비히클 대조군으로서 화합물이 없는 PBS를 함유한 10x 처리-믹스 샘플을 준비하였다. 엔도솜 산성화 억제제(클로로퀸(Sigma Aldrich) 또는 바필로마이신 A1(Enzo Life Sciences))가 사용된 경우, 처리 1단계의 세포 배양 배지를 1 μM 클로로퀸 또는 0.2 μM 바필로마이신 A1이 포함된 180μL 배지로 교체하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 10x 처리-믹스 샘플을 첨가하였다. 나머지 인큐베이션 및 처리 단계는 당업계에 알려진 표준 절차에 따라 수행하였다.
처리 후 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 제조사의 지침(CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)에 따라 수행된 MTS 분석으로 세포 생존력을 측정하였다. 간략하게, MTS 용액을 10% FBS(PAN-Biotech GmbH)가 보충된 페놀 레드(PAN-Biotech GmbH)가 없는 DMEM에서 20배 희석하였다. 세포를 웰당 200 μL PBS로 1회 세척한 후 웰당 100 μL의 희석된 MTS 용액을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 약 20~30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 Thermo Scientific Multiskan FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific)에서 492 nm에서의 광학 밀도를 측정했다. 정량화를 위해 '배지 단독' 웰의 백그라운드 신호를 다른 모든 웰에서 뺀 후, 비처리 웰의 백그라운드 보정된 신호를 처리 웰의 백그라운드 보정된 신호로 나누어, 비처리/처리 세포의 비를 계산하였다.
결과
실시예 4. 1 표적 2-구성요소 시스템
1-표적 2-구성요소 시스템은 mAb1-단백질 독소 및 mAb1-SO1861의 병용 치료제인 반면(도 1a, 1e 참조), 2-표적 2-구성요소 시스템은 mAb1-단백질 독소 및 mAb2-SO1861 또는 mAb2-단백질 독소 + mAb1-SO1861의 조합이다(도 1b 내지 1d).
세툭시맙-SO1861(사포닌 분자, SO1861에 접합된, EGFR을 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체; 엔도솜 탈출 강화 접합체)을 고정 농도의 10 pM 세툭시맙-사포린(단백질 독소, 사포린에 접합된, EGFR을 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체)에서 적정하고(농도 SO1861에서 계산), EGFR 고발현 세포에 대한 세포 사멸을 측정하였다. EGFR 고발현 세포(A431또는 CaSKi)는 10 pM 세툭시맙-사포린이 고농도의 비표적화 비접합 SO1861과 조합된 경우 효율적인 세포 사멸을 나타냈다(A431: [SO1861] IC50 = 600 nM 및 Caski: [SO1861] IC50 = 700 nM; 도 8a, 8b; 표 A6). 그러나, 세툭시맙-사포린이 세툭시맙-SO1861과 조합된 경우, 강력한 세포 사멸은 이미 저농도의 SO1861에서 유도되었다(A431: [SO1861] IC50 = 5 nM 및 Caski [SO1861] IC50 = 8 nM; 도 8a, 8b ; 표 A6). 이는 표적화 접합 SO1861이 비표적화 비접합 SO1861에 비해 엔도솜 탈출 유도에 더 효과적임을 보여준다. 다음으로, 세툭시맙-사포린을 고정 농도의 300 nM 세툭시맙-SO1861에서 적정하고, EGFR 발현 세포에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. EGFR 고발현 세포(A431 또는 CaSKi)는 비표적화 비접합 300 nM SO1861과 조합된 고농도의 세툭시맙-사포린에서만 세포 사멸을 나타내는 반면(A431: [독소] IC50 = 40 pM; CaSki: [독소] IC50 = 40 pM; 도 8c, 8d; 표 A7), 저농도의 세툭시맙-사포린과 조합된 300 nM 세툭시맙-SO1861은 이미 효율적인 세포 사멸을 유도했다(A431: [독소] IC50 = 0.4 pM; CaSKi: [독소] IC50 = 2 pM; 도 8c 및 8d; 표 A7). 최고 세포 사멸 효율은 고농도의 비표적화 비접합 SO1861(1500 nM)이 저농도의 세툭시맙-사포린과 조합된 경우에 달성된다(A431: [독소] IC50 = 0,03 pM; CaSki: [독소] IC50 = 0,02 pM; 도 8c, 8d; 표 A7). 이 모든 것은 세툭시맙에 접합되었을 때, 상대적으로 낮은 농도의 SO1861이 상대적으로 낮은 농도의 세툭시맙-사포린과 조합하여 EGFR 고발현 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있음을 보여준다. 저농도의 세툭시맙-사포린과 조합된 고농도(1500 nM)의 비표적화 비접합 SO1861은, 1-표적 2-구성요소 시스템에서 두 접합체가 동일한 EGFR 수용체에 대해 경쟁하여, SO1861이 세포에 진입하는 데 수용체 경쟁이 어떤 역할을 하지 않기 때문에 여전히 가장 효과적이다. 수용체 경쟁 원리는 75 nM의 세툭시맙의 부재(A431: [독소] IC50 = 40 pM; Caski: [독소] IC50 = 40 pM) 또는 존재(A431: [독소] IC50 = 1000 pM; Caski: IC50 = 1000 pM; 도 8c, 8d) 하에 세툭시맙-독소 적정 치료에서도 명확하게 나타난다.
다음으로, 세툭시맙-SO1861을 고정 농도의 10 pM 세툭시맙-사포린에서 적정하고(농도 SO1861에서 계산), EGFR 저발현/무발현 세포에 대한 세포 사멸을 측정하였다. EGFR 저발현 세포(HeLa)는 10 pM 세툭시맙-사포린이 고농도의 비표적화 비접합 SO1861과 조합된 경우에만 세포 사멸을 나타낸 반면, EGFR을 발현하지 않는 A2058 세포(A2058)는 전혀 감수성이 없었다(HeLa: [SO1861] IC50 = 1000 nM; A2058: [SO1861] IC50 > 1000 nM; 도 9a, 9b; 표 A6). 10 pM 세툭시맙-사포린과 증가하는 농도의 세툭시맙-SO1861의 조합은 두 세포주에서 어떤 유의한 세포 사멸도 유도하지 않았다(HeLa: [SO1861] IC50 = 1000 nM; A2058: [SO1861] IC50 > 1000 nM; 도 9a, 9b; 표 A6). 이는 충분한 수용체 발현이 없는 경우, 엔도솜 단백질 독소 탈출 및 독소 매개 세포 사멸을 유도하는 데 효과적인 세포내 SO1861 농도(역치)에 도달하지 못한다는 것을 보여준다. 다음으로, 세툭시맙-사포린을 고정 농도의 300 nM 세툭시맙-SO1861에서 적정하고, EGFR 저발현/무발현 세포에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. EGFR 저발현 세포(HeLa)는 278 nM 세툭시맙-SO1861 또는 300 nM 비접합 SO1861과 조합된 매우 높은 농도의 세툭시맙-사포린에서만 세포 사멸을 나타내는 반면, A2058 세포(EGFR)는 시험된 어떤 농도에서도 감수성이 없다(HeLa: [독소] IC50 = 60 pM; A2058: [독소] IC50 > 10.000 pM; 도 9c, 9d; 표 A7). EGFR 저발현 세포(HeLa)에서 저농도의 세툭시맙-사포린과 조합된 고농도의 비접합 SO1861(1500 nM)은 효율적인 세포 사멸을 나타내는 반면, A2058 세포에서는 비표적화 1500 nM SO1861과 조합된 매우 높은 농도의 세툭시맙-사포린에서만 a-특이적 세포 사멸이 유도된다(Hela: [독소] IC50 = 0,03 pM; A2058: [독소] IC50 = 20 pM; 도 9c, 9d; 표 A6). 이 모든 것은 EGFR 수용체 저발현 또는 무발현 세포가 세포 내에서 충분한 SO1861 및 독소의 진입을 용이하게 하는 충분한 EGFR 수용체의 부족으로 인해 세툭시맙-SO1861 + 세툭시맙-사포린의 조합에 큰 영향을 받지 않음을 보여준다.
트라스투주맙-SO1861(사포닌 분자, SO1861에 접합된, HER2를 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체; 본 발명에 따른 엔도솜 탈출 강화 접합체)을 고정 농도의 50 pM 트라스투주맙-사포린(단백질 독소, 사포린에 접합된, HER2를 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체)에서 적정하고(농도 SO1861에서 계산), HER2 고발현 세포에 대한 세포 사멸을 측정하였다. HER2 고발현 세포(SKBR3)는 50 pM 트라스투주맙-사포린이 고농도의 비표적화 비접합 SO1861과 조합된 경우 효율적인 세포 사멸을 나타냈다(SKBR3; 도 10a, 10b; 표 A6). 그러나, 트라스투주맙-사포린이 트라스투주맙-SO1861과 조합된 경우, 강력한 세포 사멸은 이미 저농도의 SO1861에서 유도되었다(SKBR3; 도 10a, 10b; 표 A6). 이는 표적화 접합 SO1861이 비표적화 비접합 SO1861에 비해 엔도솜 탈출 유도에 더 효과적임을 보여준다. 다음으로, 트라스투주맙-사포린을 고정 농도의 50 nM 트라스투주맙-SO1861에서 적정하고, HER2 발현 세포에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. HER2 고발현 세포(SKBR3 또는 BT474)는 비표적화 비접합 10 nM SO1861과 조합된 고농도의 트라스투주맙-사포린에서만 세포 사멸을 나타내는 반면(표 A7), 저농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 10 nM 트라스투주맙-SO1861은 이미 효율적인 세포 사멸을 유도했다(표 A7). 최고 세포 사멸 효율은 고농도의 비표적화 비접합 SO1861(1500 nM)이 저농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 경우에 달성된다(표 A7). 이 모든 것은 트라스투주맙에 접합되었을 때, 저농도의 SO1861이 상대적으로 낮은 농도의 트라스투주맙-사포린과 조합하여 HER2 고발현 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있음을 보여준다. 저농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 고농도(1500 nM)의 비표적화 비접합 SO1861은, 1-표적 2-구성요소 시스템에서 두 접합체가 동일한 EGFR 수용체에 대해 경쟁하여, SO1861이 세포에 진입하는 데 수용체 경쟁이 어떤 역할을 하지 않기 때문에 여전히 가장 효과적이다. 수용체 경쟁 원리는 2,5 nM 트라스투주맙(SKBR3: [독소] IC50 = 1000 nM)의 부재 또는 존재하에 트라스투주맙-독소 적정 치료에서도 명확하게 나타난다.
다음으로, 트라스투주맙-SO1861을 고정 농도의 50 pM 트라스투주맙-사포린에서 적정하고(농도 SO1861에서 계산), EGFR 저발현/무발현 세포에 대한 세포 사멸을 측정하였다. EGFR 저발현 세포(JIMT1; A431)는 50 pM 트라스투주맙-사포린이 고농도의 비표적화 비접합 SO1861과 조합된 경우에만 세포 사멸을 나타냈다(JIMT1: [SO1861] IC50 > 1000 nM; A431: [SO1861] IC50 > 1000 nM; 도 11a, 11b; 표 A6). 50 pM 트라스투주맙-사포린과 증가하는 농도의 트라스투주맙-SO1861의 조합은 두 세포주에서 어떤 유의한 세포 사멸도 유도하지 않았다(JIMT1: [SO1861] IC50 > 1000 nM; A431: [SO1861] IC50 > 1000 nM; 도 11a, 11b; 표 A6). 이는 충분한 수용체 발현이 없는 경우, 엔도솜 단백질 독소 탈출 및 독소 매개 세포 사멸을 유도하는 데 효과적인 세포내 SO1861 농도(역치)에 도달하지 못한다는 것을 보여준다. 다음으로, 트라스투주맙-사포린을 고정 농도의 10 nM 트라스투주맙-SO1861에서 적정하고, HER2 저발현/무발현 세포에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. HER2 저발현 세포(JIMT1; A431)는 10 nM 트라스투주맙-SO1861과 조합하여 고농도의 트라스투주맙-사포린에서 유의한 세포 사멸을 나타내지 않는다(JIMT-1: [독소] IC50 > 10.000 pM; A431: [독소] IC50 > 10.000 pM; 도 11c, 11d; 표 A7). HER2 저발현 세포에서 저농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 고농도의 비접합 SO1861(1500 nM)는 효율적인 세포 사멸을 나타낸다(JIMT1: [독소] IC50 = 0,1 pM; A431: [독소] IC50 = 0,8 pM; 도 11c, 11d; 표 A5). 이 모든 것은 HER2 수용체 저발현 세포가 세포 내에서 충분한 SO1861 및 독소의 진입을 용이하게 하는 충분한 HER2 수용체의 부족으로 인해 트라스투주맙-SO1861 + 트라스투주맙-사포린의 조합에 큰 영향을 받지 않음을 보여준다.
실시예 5. 2 표적 2-구성요소 시스템
세툭시맙-SO1861을 고정 농도의 50 pM 트라스투주맙-사포린에서 적정하고(농도 SO1861에서 계산) EGFR 고발현/HER2 저발현 세포에 대한 세포 사멸을 측정하였다. A431 및 CaSki 세포는 50 pM 트라스투주맙-사포린이 고농도의 비표적화 비접합 SO1861과 조합된 경우 효율적인 세포 사멸을 나타냈다(A431 및 Caski: [SO1861] IC50 = 1000 nM; 도 12a, 12b; 표 A6). 그러나, 트라스투주맙-사포린이 세툭시맙-SO1861과 조합된 경우, 강력한 세포 사멸은 이미 저농도의 SO1861에서 유도되었다(A431: [SO1861] IC50 = 12 nM 및 Caski [SO1861] IC50 = 40 nM; 도 12a, 12b; 표 A6). 이는 표적화 접합 SO1861이 비표적화 비접합 SO1861에 비해 엔도솜 탈출 유도에 더 효과적임을 보여준다. 다음으로, 트라스투주맙-사포린을 고정 농도의 300 nM 세툭시맙-SO1861에서 적정하고, EGFR 고발현/HER2 저발현 세포(A431 및 CaSki)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 비표적화 비접합 300 nM SO1861과 조합된 고농도의 트라스투주맙-사포린에서는 효과적인 세포 사멸이 관찰되지 않은 반면(A431 및 Caski: [독소] IC50 > 10.000 pM; 도 12c, 12d; 표 A7), 저농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 300 nM 세툭시맙-SO1861은 이미 효율적인 세포 사멸을 유도했다(A431: [독소] IC50 = 3 pM; Caski: [독소] IC50 = 1 pM; 도 12c 및 12d; 표 A7). A431 세포에서, 고농도(1500 nM)의 비표적화 비접합 SO1861이 저농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 경우, 유사한 세포 사멸 효율이 달성된다(A431: [독소] IC50 = 1 pM; 도 12c 참조; 표 A7). Caski 세포에서, 이들 세포에서의 EGFR 발현이 A431에 비해 현저히 낮고 따라서 SO1861의 Caski 세포로의 표적화 전달이 덜 충분하기 때문에 반응은 세툭시맙-SO1861과 트라스투주맙-사포린의 조합에 비해 약간 더 강했다(Caski: [독소] IC50 = 0,2 pM; 도 12d 참조; 표 A7). 이 모든 것은 세툭시맙에 접합되었을 때, 저농도의 SO1861이 상대적으로 낮은 농도의 트라스투주맙-사포린과 조합하여 EGFR 고발현 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있음을 보여준다. 저농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 고농도(1500 nM)의 비표적화 비접합 SO1861은, 2-표적 2-구성요소 시스템에서 두 접합체가 EGFR을 통한 SO1861 및 HER2 수용체를 통한 독소와 같이 서로 다른 수용체를 통해 전달되어, SO1861이 세포에 진입하는 데 수용체 경쟁이 어떤 역할을 하지 않기 때문에 유사한 활성을 갖는다.
다음으로, 세툭시맙-SO1861을 고정 농도의 50 pM 트라스투주맙-사포린에서 적정하고(농도 SO1861에서 계산), EGFR/HER2 저발현/무발현 세포에 대한 세포 사멸을 측정하였다. EGFR/HER2 저발현 세포는 50 pM 트라스투주맙-사포린이 고농도의 비표적화 비접합 SO1861과 조합된 경우에만 세포 사멸을 나타냈다(HeLa: [SO1861] IC50 > 1000 nM; A2058: [SO1861] IC50 > 1000 nM; 도 13a, 13b; 표 A6). 50 pM 트라스투주맙-사포린과 증가하는 농도의 세툭시맙-SO1861의 조합은 두 세포주에서 고농도의 세툭시맙-SO1861에서만 유의한 세포 사멸을 나타냈다(HeLa: [SO1861] IC50 > 1000 nM; A2058: [SO1861] IC50 > 1000 nM; 도 13a, 13b; 표 A6). 이는 충분한 수용체 발현이 없는 경우, 엔도솜 단백질 독소 탈출 및 독소 매개 세포 사멸을 유도하는 데 효과적인 세포내 SO1861 농도(역치)에 도달하지 못한다는 것을 보여준다. 다음으로, 트라스투주맙-사포린을 고정 농도의 세툭시맙-SO1861에서 적정하고, EGFR/HER2 저발현/무발현 세포에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. EGFR/HER2 저발현/무발현 세포(HeLa 및 A2058)는 278 nM 세툭시맙-SO1861과 조합된 고농도의 트라스투주맙-사포린에서 유의한 세포 사멸을 나타내지 않는다(HeLa: [독소] IC50 > 10.000 pM; A2058: [독소] IC50 > 10.000 pM; 도 13c, 13d; 표 A7). 저농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 고농도의 비접합 SO1861(1500 nM)은 효율적인 세포 사멸을 나타낸다(HeLa: [독소] IC50 = 0,4 pM; A2058: [독소] IC50 = 0,5 pM; 도 13c, 13d; 표 A5). 이 모든 것은 EGFR 저발현/무발현/HER2 저발현 세포가 세포 내에서 독소의 효율적인 세포질 전달을 보장하기에 충분한 SO1861의 진입을 용이하게 하는 충분한 EGFR 수용체의 부족으로 인해 세툭시맙-SO1861 + 트라스투주맙-사포린의 조합에 큰 영향을 받지 않음을 보여준다.
다음으로, 트라스투주맙-SO1861을 고정 농도의 1.5 pM EGF-다이안틴에서 적정하고(농도 SO1861에서 계산), HER2 고발현/EGFR 저발현 세포에 대한 세포 사멸을 측정하였다. SKBR3는 1.5 pM EGF-다이안틴이 고농도의 비표적화 비접합 SO1861과 조합된 경우 효율적인 세포 사멸을 나타냈다(SKBR3: [SO1861] IC50 = 800 nM; 도 14a; 표 A6). 그러나, EGF-다이안틴이 트라스투주맙-SO1861과 조합된 경우, 강력한 세포 사멸은 이미 저농도의 접합된 SO1861에서 유도되었다(SKBR3: [SO1861] IC50 = 2 nM; 도 14a; 표 A5). 이는 표적화 접합 SO1861이 비표적화 비접합 SO1861에 비해 엔도솜 탈출 유도에 더 효과적임을 보여준다. 다음으로, EGF-다이안틴을 고정 농도의 트라스투주맙-SO1861에서 적정하고, SKBR3에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 비표적화 비접합 10 nM SO1861과 조합된 고농도의 EGF-다이안틴에서는 효과적인 세포 사멸이 관찰되지 않은 반면(SKBR3(도시) 및 BT474(미도시): [독소] IC50 > 10.000 pM; 도 14b; 표 A7), 저농도의 EGF-다이안틴과 조합된 9.4 nM 트라스투주맙-SO1861은 이미 효율적인 세포 사멸을 유도했다(SKBR3: [독소] IC50 = 3 pM(도시); BT474: [독소] IC50 = 1 pM(미도시); 도 14b; 표 A7). 고농도(1075 nM)의 비표적화 비접합 SO1861이 저농도의 EGF-다이안틴과 조합된 경우, 유사한 세포 사멸 효율이 달성된다(도 14b; 표 A7). 이 모든 것은 트라스투주맙에 접합되었을 때, 저농도의 SO1861이 상대적으로 낮은 농도의 EGF-다이안틴과 조합하여 HER2 고발현 세포를 효율적으로 사멸시킬 수 있음을 보여준다. 저농도의 EGF-다이안틴과 조합된 고농도(1500 nM)의 비표적화 비접합 SO1861은, 2-표적 2-구성요소 시스템에서 두 접합체가 HER2를 통한 SO1861 및 EGFR 수용체를 통한 독소와 같이 서로 다른 수용체를 통해 전달되어, SO1861이 세포에 진입하는 데 수용체 경쟁이 어떤 역할을 하지 않기 때문에 유사한 활성을 갖는다.
다음으로, 트라스투주맙-SO1861을 고정 농도의 5 pM 세툭시맙-사포린에서 적정하고(농도 SO1861에서 계산), HER2 저발현, EGFR 저발현/고발현 세포에 대한 세포 사멸을 측정하였으며, 5 pM 세툭시맙-사포린이 고농도의 비표적화 비접합 SO1861과 조합된 경우 세포 사멸을 나타냈다(JIMT-1: [SO1861] IC50 > 1000 nM; A431: [SO1861] IC50 > 1000 nM; 도 15a, 22b; 표 A6). 5 pM 세툭시맙-사포린과 증가하는 농도의 트라스투주맙-SO1861의 조합은 두 세포주에서 고농도의 세툭시맙-SO1861에서만 세포 사멸을 나타냈다(JIMT-1: [SO1861] IC50 > 1000 nM; A431: [SO1861] IC50 > 1000 nM; 도 15a, 15b; 표 A6). 이는 충분한 수용체 발현이 없는 경우, 엔도솜 단백질 독소 탈출 및 독소 매개 세포 사멸을 유도하는 데 효과적인 세포내 SO1861 농도(역치)에 도달하지 못한다는 것을 보여준다. 다음으로, 세툭시맙-사포린을 고정 농도의 트라스투주맙-SO1861에서 적정하고, JIMT-1 및 A431에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 세포 사멸은 10 nM 트라스투주맙-SO1861과 조합된 고농도의 세툭시맙-사포린에서만 관찰되었다(JIMT-1: [독소] IC50 > 90 pM; A431: [독소] IC50 > 20 pM; 도 15c, 15d; 표 A7). 저농도의 세툭시맙-사포린과 조합된 고농도의 비접합 SO1861(1500 nM)은 효율적인 세포 사멸을 나타낸다(JIMT-1: [독소] IC50 = 0,02 pM; A431: [독소] IC50 = 0,03 pM; 도 15c, 15d; 표 A5). 이 모든 것은 HER2 저발현, EGFR 저발현/고발현 세포가 세포 내에서 독소의 효율적인 세포질 전달을 보장하기에 충분한 SO1861의 진입을 용이하게 하는 충분한 HER2 수용체의 부족으로 인해 트라스투주맙-SO1861 + 세툭시맙-사포린의 조합에 큰 영향을 받지 않음을 보여준다. 트라스투주맙-SO1861을 통한 SO1861의 흡수를 촉진할 수 있는 HER2 수용체의 부족으로 인해 SO1861의 역치에 도달하지 않았기 때문에, A431 세포에서 매우 높은 EGFR 발현조차도 세툭시맙-사포린에 의한 효율적인 세포 사멸을 유발하지 않았다.
실시예 6.
2-표적 2-구성요소 시스템은 매우 낮은 표적 발현을 갖는 세포의 세포 사멸을 유발한다. A431 세포에서 T-DM1은 나노몰 농도에서 세포를 사멸시키는 반면, 표적화 2-구성요소 시스템은 피코몰 농도에서 세포를 효율적으로 사멸시킨다(독소 농도 약 7000배 감소)(도 16).
실시예 7. 작용 기전
SPT001(식물 유래 사포닌, SO1861)은 낮은 엔도솜 pH에서만 활성화되기 때문에, 엔도솜 산성화가 차단되면 표적화 2-구성요소 시스템은 활성화되지 않는다.
실시예 8
엔도솜 산성화 억제제는 엔도솜의 산성화가 차단될 때 SO1861 기능이 감소됨을 나타내며 표적화 2-구성요소 시스템 활성을 차단한다.
실시예 9
도 17a 내지 17e는 트라스투주맙(도 17a), 세툭시맙(도 17b) 또는 T-DM1(도 17c), 유리 독소 사포린(도 17d) 및 다이안틴(도 17d), 비세포 결합 IgG에 결합된 사포린(도 17d), 및 유리 사포닌 SO1861과 결합된 비세포 결합 IgG에 결합된 사포린(도 17e)이 표시된 세포주 SK-BR-3, JIMT-1, MDA-MB-468, A431, CaSki, HeLa, A2058, BT-474와 접촉하는 경우의 상대적 세포 생존력을 나타낸다.
트라스투주맙 및 세툭시맙은 대부분의 세포주에 노출될 때 세포 생존력에 영향을 미치지 않거나 거의 미치지 않으며, 트라스투주맙이 비교적 높은 용량으로 SK-BR-3 세포에 노출될 때 세포 생존력에 약간의 영향을 미치고, 세툭시맙이 비교적 높은 용량으로 MDA-MB-468 세포에 노출될 때 약간의 영향을 미친다.
TDM-1 또는 아도-트라스투주맙 엠탄신은 이전에 허셉틴(화학명: 트라스투주맙) 및 탁산 화학요법으로 치료받은 적이 있는 HER2-양성 전이성 유방암; 허셉틴 및 탁산 화학요법을 사용한 신보강(수술 전) 치료 후 잔여 질환이 발견된 경우 수술 후의 초기 병기 HER2-양성 유방암을 치료하기 위해 미국 식품의약국에서 승인한 표적 치료제이다. TDM-1은 허셉틴과 화학요법제 엠탄신의 조합이다. 도 17c는 TDM-1이 모든 시험 세포주에 대해 세포 생존력을 감소시킴을 보여준다.
유리 독소 사포린 및 다이안틴 및 시험된 세포주 상의 어떤 세포 표면 분자에 대해서도 친화성이 없는 대조군 IgG에 결합된 독소 사포린은 최대 10000 pM까지, 시험된 독소의 광범위한 농도에 걸쳐 세포 생존력에 영향을 미치지 않거나 거의 미치지 않는다.
독소 사포린이 비세포 결합 IgG에 결합된 경우, 접합체와 유리 사포닌 SO1861의 조합은 상대적 세포 생존력의 IgG-사포린 용량 의존적 감소를 유발한다(도 17e).
[표 A5]
Figure pct00018
[표 A6]
Figure pct00019
[표 A7]
Figure pct00020
실시예 10 - ADC와 조합된 본 발명의 접합체를 사용한 포유류 종양 보유 동물의 처치에 따른 생존 및 종양 퇴행
암컷 Balb/c 누드 마우스에 인간 A431 종양 세포 현탁액을 피하 주사하였다. 마우스의 피부 아래에서, 이종이식 동물 종양 모델의 인간 표피 암종이 발생했다. 종양 세포 주입 후, 이종이식 종양을 약 170~180 mm3의 크기로 성장시켰다. A431 종양 세포는 높은 EGFR 발현자, 중간 CD71 발현자, 낮은 HER2 발현자의 특징을 가지고 있다.
표 6A에 대조군 마우스 및 종양 보유 마우스의 처치 결과가 제시되어 있다. 이종이식 종양의 세포 표면 수용체인 인간 Her2/neu, 인간 EGFR, 또는 인간 CD71에 대한 표시된 항체로 종양 보유 마우스를 처치하였다. 세툭시맙을 사포닌 SO1861과 공유 접합시켰다. SO1861에 먼저, 카보닐(알데히드 또는 케톤, 여기서는 사포닌의 C-23 위치에 있는 알데히드의 카보닐)에 설프하이드릴(항체의 환원된 시스테인)을 공유 접합시키기 위한 말레이미드-하이드라지드 가교제인 링커 EMCH(N-ε-말레이미도카프로산 하이드라지드)를 제공하였다. 사포닌-EMCH를 세툭시맙의 환원된 시스테인에 공유 결합시켜, EMCH와 시스테인 측쇄 사이에 공유 티오-에테르 결합을 형성하였다. 트라스투주맙-사포린(공유 접합체) 및 항-CD71 mAb(OKT-9, IgG) - 사포린(공유 접합체) ADC를 사용한 처치의 시작 후 시간 경과에 따른 종양 부피를 측정하여 마우스에서 ADC의 종양 공격 효능을 시험하였다. ADC의 용량은 종양 모델에서 준최적이었다. 즉, 이전 실험으로부터, ADC의 이러한 준최적 용량에서는 종양 퇴행 또는 종양 성장 억제가 관찰되지 않는 것으로 규명되었다.
[표 6A]
Figure pct00021
이들 결과는 종양 보유 마우스의 ADC 단독 처치가 고려될 때 비효과적인 용량(종양 성장, 마우스의 사망을 막을 수 없음(안락사))의 ADC와, 사포닌, 즉 SO1861에 공유 결합된 종양 세포 특이적 수용체 표적화 항체로 이루어진 본 발명의 접합체의 병용 요법(공유 접합체는 암을 앓는 마우스에게 단독 투여시 비효과적인 용량(종양 성장, 마우스의 사망을 막을 수 없음(안락사))으로 투여됨)이 처치된 동물의 종양 퇴행 및 연장된 생존(실험 기간 초과)으로 나타나는 효율적이고 효과적인 치료 요법을 제공함을 보여준다. 따라서, 단독 투여시 항종양 활성이 없는 본 발명의 공유 결합 사포닌-포함 접합체와 조합된 ADC의 준최적 용량은 암 환자에게 효과적인 치료 옵션을 제공한다(상대적으로 낮은 용량의 ADC가 효과적임). 더 낮은 용량의 ADC는 부작용 위험이 더 적거나, 심지어 부작용이 전혀 없음을 보장한다. 또한, ADC의 효능이 고려될 때 사포닌 함유 접합체의 자극 효과는, 본 실시예에서 나타난 바와 같이 병용 요법 환경에서 ADC 효능이 개선되기 때문에, 이전에 종양 환자 치료와 관련하여 효능이 부족한 것으로 입증된 ADC가 새로운 관심과 가치를 얻을 수 있음을 보여준다. 이는 인간 임상 환경에서 이전에 연구되었지만 추가 임상 연구에서 철회된 일부 ADC에 대한 당업계에 알려진 ADC와 관련된다. 특히, 관찰된 효능 부족 및/또는 허용할 수 없는 부작용의 발생으로 인해 임상 개발이 종료된 ADC는 시험된 세툭시맙-사포닌과 같은 공유 결합 사포닌-포함 접합체와 조합될 때 암 환자에 대해 새로운 가치를 얻을 수 있는 ADC이다.
실시예 11 - 엔도솜/리소좀 탈출 강화 활성을 갖는, QS-21을 포함하는 퀼라야 사포나리아의 사포닌 혼합물
도식 Q는 일련의 QS-21 사포닌의 일반적인 분자 구조를 나타낸다(부분적으로 문헌[Conrado Pedebos, Laercio Pol-Fachin, Ramon Pons, Cilaine V. Teixeira Hugo Verli, Atomic Model and Micelle Dynamics of QS-21 Saponin, Molecules 2014, 19, 3744-3760]에서 발췌; 4가지 동형, 표시된 각각의 글리칸은 R 기로서 결합될 수 있음). 퀼라야 사포나리아로부터 얻은 수용성 사포닌 혼합물(Sigma-Aldrich, 제품번호 S4521; Roth, 품목번호 6857; InvivoGen, 제품 'Quil-A')을, 혼합물에 존재하는 적어도 하나의 개별 사포닌의 엔도솜/리소좀 탈출 강화 특성에 기초하여(예컨대, QS-21), 또는 혼합물에 포함된 2종 이상의 사포닌의 조합에 기초하여(예컨대, QS-21 및 QS-7), 본 발명의 엔도솜/리소좀 탈출 강화 접합체, 조성물, 및 조합에 적용할 수 있다.
본 발명자들은 2,5 μg/ml 용량의 퀼라야 사포나리아로부터의 사포닌 혼합물이 세포-기반 생물검정에서 포유동물 종양 세포로 시험된 바와 같이 다이안틴의 엔도솜 탈출을 강화시킬 수 있음을 입증하였다. 세포에 노출된 이펙터 분자는 리간드 EGF에 공유 결합된 다이안틴(EGF-다이안틴)이었다. 시험된 세포는 유리 사포닌에 대한 종양 세포주 HeLa, 및 세툭시맙에 공유 결합될 때 사포닌을 시험하기 위한 A431, MDA-MB-468, CaSki, 및 A2058이었다.
(도식 Q)
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 12
1-표적 2-구성요소 시스템(1T2C)은 도 1a, 1e에 도시된 바와 같은, mAb1-단백질 독소 및 mAb1-SO1861의 병용 치료제이다. 세툭시맙(인간 EGFR을 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체)에 SO1861-EMCH를 시스테인 잔기(Cys)를 통해 접합시키고 HSP27BNA oligo를 라이신 잔기를 통해 접합시켜(둘 다 DAR 4), 2개의 접합체, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 및 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4를 생성하였다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4(복강내 투여, (i.p.)) 및 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4(정맥내 투여, (i.v.))의 조합을 EGFR 종양 표적화 유전자 침묵 활성에 대해 A431 이종이식 마우스 종양 모델에서 시험하였다. 종양 크기가 약 150 mm3에 도달한 12일째에 투약을 시작하고, 첫 투약 72시간 후에 종양 샘플을 수집하고, 대조군 유전자 mRNA 발현 수준(기준 유전자)과 비교하여 HSP27 유전자 발현에 대해 분석하였다. 이는 50 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 + 25 mg/kg 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4의 1회 투약이 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 또는 세툭시맙-(Lys-L-HSP27BNA)4 단독요법의 단회 투약과 비교하여 A431 종양에서 HSP27 유전자 발현을 50% 감소시켰음을 보여주였다(도 18). 비히클 대조군 종양과 비교하여, 40%의 HSP27 유전자 침묵 감소가 관찰되었다. 이것은 1T2C 발명에 따른 세툭시맙-접합 SO1861 + 세툭시맙-접합 HSP27BNA oligo의 조합이 고형 종양 세포의 세포질에서 치료용 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효율적인 표적화 전달을 유도함으로써, 생체내 종양 표적화 유전자 침묵을 유도함을 보여주며 이를 가능하게 한다.
다음으로, SO1861-EMCH를 시스테인 잔기(Cys)를 통해 트라스투주맙(인간 HER2를 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체)에 접합시켜(DAR 4), 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4를 생성하였다. 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 트라스투주맙-사포린(트라스투주맙 단백질 독소 접합체)의 조합을 HER2 발현 수준이 높고 트라스투주맙 단독요법에 내성이 있는 마우스 종양 모델(환자 유래 이종이식 종양 모델, PDX)에서 시험하였다. 40 mg/kg 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4(복강내 투여, (i.p.)) + 0.03(1, 8일째)/ 0.02(15, 22, 30, 36, 43일째) mg/kg 트라스투주맙-사포린(정맥내 투여, (i.v.))의 1T2C 발명에 따른 조합은 비히클 대조군 및 40 mg/kg 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 또는 0.03/0.02 mg/kg 트라스투주맙-사포린 단독요법과 비교하여 강력한 종양 성장 억제를 나타냈다(도 19). 뿐만 아니라, 더 낮은 용량 조합(40 mg/kg 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 0.01 mg/kg 트라스투주맙-사포린)으로 처치된 종양 보유 마우스에서 종양 성장 억제 활성은 관찰되지 않았다(도 26). 이것은 트라스투주맙 접합 SO1861 + 트라스투주맙 접합 단백질 독소의 1T2C 조합이 고형 종양 세포의 세포질에서 치료용 단백질 독소의 효율적인 표적화 전달을 유도함으로써, 생체내 종양 세포 사멸 및 종양 성장 억제를 유도함을 보여주며 이를 가능하게 한다.
실시예 13. 2-표적 2-구성요소 시스템(생체내)
2-표적 2-구성요소 시스템(2T2C)은 mAb1-SO1861 및 mAb2-단백질 독소의 병용 치료제이다(도 1b 내지 1d). SO1861-EMCH를 시스테인 잔기(Cys)를 통해 세툭시맙(인간 EGFR을 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체)에 접합시켜(DAR 4), 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4를 생성하였다. 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 및 트라스투주맙-사포린 또는 CD71mab-사포린의 조합을 도 1b 내지 1d에 도시된 바와 같은 EGFR 종양 표적화 세포 사멸에 대해 A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+) 이종이식 '누드' 마우스 종양 모델에서 시험하였다. 치료 효능을 결정하기 위해 용량 증량을 수행하였다(9일째: 0.3 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.1 mg/kg CD71mab-사포린 + 5 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861) 4 ; 14, 18일째: 0.1 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.05 mg/kg CD71mab-사포린 + 5 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861) 4 ; 21일째: 0.05 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.05 mg/kg CD71mab-사포린 + 15 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861) 4 ; 28일째: 0.02 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.02 mg/kg CD71mab-사포린 + 15 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861) 4 트라스투주맙-사포린/세툭시맙-SO1861. 대조군은 각각 동일한 투약 계획에 따랐고, 세툭시맙(i.v.)만 처치일마다 25 mg/kg 투약). 32일째(세로 파선), 35일째, 및 39일째, 본 발명자들은 25 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4(복강내 주사(i.p.) + 0.02 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.02 CD71mab-사포린(정맥내 투여, (i.v.))의 2T2C 발명에 따른 조합을 시작하였으며, 이는 비히클 대조군, 25 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4 또는 0.02 mg/kg 트라스투주맙-사포린/CD71mab-사포린 단독요법과 비교하여 두 2T2C 조합 그룹의 경우 강력한 종양 퇴행을 나타냈다(도 20). 2T2C 시스템은 EGFR에 대해 임상적으로 사용되는 단일클론 항체인 세툭시맙을 능가한다. 다음으로, 본 발명자들은 동일한 실험을 수행했지만, 이후 시험은 25 mg/kg 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)4(복강내 주사(i.p.) + 0.03 mg/kg 트라스투주맙-사포린 또는 0.03 CD71mab-사포린(정맥내 투여, (i.v.)) 처치로 시작하였다(9일째 및 14일째에 투약하고 이후 매주 1회 투약). 본 발명에 따른 2T2C 시스템은 모든 마우스에서 종양 퇴행을 나타냈고, 심지어 두 2T2C 그룹의 1마리 마우스에서는 완전한 종양 박멸(종양 부피 = 0 mm3)을 나타냈다(도 21). 또한 여기서 대조군은 종양 부피가 크게 증가한 것으로 나타난 반면, 이 A431 마우스 모델에 대한 양성 대조군인 세툭시맙은 종양 성장 억제만 보였고 퇴행은 없었다(도 21). 이것은 세툭시맙 접합 SO1861 + 트라스투주맙 접합 단백질 독소 또는 CD71mab 접합 단백질 독소의 2T2C 시스템이 종양 보유 마우스의 고형 종양의 세포질에서 치료용 단백질 독소의 생체내 매우 효율적인 표적화 전달을 유도함으로써, 일부 마우스에서는 완전한 종양 박멸을 유도하고 다른 마우스에서는 큰 크기의 종양(2000 mm3)에서도 강력한 종양 퇴행을 유도함을 보여주며 이를 가능하게 한다.
실시예 14. 2-표적 2-구성요소 시스템(시험관내)
결과
2-표적 2-구성요소 시스템(2T2C)은 mAb1-SO1861 및 mAb2-단백질 독소의 병용 치료제이다(도 1b 내지 1d). SO1861-EMCH를 시스테인 잔기(Cys)를 통해 세툭시맙(인간 EGFR을 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체)에 접합시켜, DAR 3,7(세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7)을 생성하였다). 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7을 고정 농도의 50 pM 트라스투주맙-사포린(단백질 독소, 사포린에 접합된 트라스투주맙)에서 적정하고, 도 1b 내지 1d에 도시된 바와 같은 EGFR/HER2 발현 세포(A431, EGFR++/HER2+/-; CaSKi, EGFR+/HER2+/-)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도의 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7에서 강력한 세포 사멸을 나타낸 반면(A431: IC50 = 3 nM 및 CaSKi IC50 = 10 nM; 도 22a, 22b), 동등한 농도의 세툭시맙, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 또는 세툭시맙 + 50 pM 트라스투주맙-사포린은 EGFR/HER2 발현 세포에서 어떤 세포 사멸 활성도 유도할 수 없었다. 이는 상대적으로 낮은 농도의 세툭시맙-SO1861 접합체가 (비효과적 농도의) 트라스투주맙 접합 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 강화함으로써, EGFR 고발현/HER2 저발현 세포의 효율적인 세포 사멸을 유도함을 보여준다.
다음으로, 트라스투주맙-사포린을 고정 농도의 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7에서 적정하고, EGFR/HER2 발현 세포에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도의 트라스투주맙-사포린과 조합된 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7이 EGFR/HER2 발현 세포에서 이미 효율적인 세포 사멸을 유도했음을 나타낸 반면(A431: IC50 = 5 pM; 및 CaSKi: IC50 = 1 pM; 도 22c 및 22d), 트라스투주맙-사포린 단독 또는 트라스투주맙-사포린 + 75 nM 세툭시맙은 두 세포주에서 유의한 세포 사멸 활성을 나타내지 않았다(IC50 > 10.000 pM)(도 22c, 22d). 이 모든 것은 상대적으로 낮은 농도의 트라스투주맙-사포린이 EGFR 고발현/HER2 저발현 세포에서 저농도의 세툭시맙-SO1861 접합체와 조합하여 효과적이며 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.
다음으로, 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7을 고정 농도의 50 pM 트라스투주맙-사포린에서 적정하고, 도 1b 내지 1d에 도시된 바와 같은 HeLa(EGFR+/-/HER2+/-) 또는 A2058(EGFR-/HER2+/-)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 두 HeLa(EGFR+/-/HER2+/-) 및 A2058(EGFR-/HER2+/-) 세포는 저농도의 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 + 50 pM 트라스투주맙-사포린에서 세포 사멸을 나타내지 않는다(HeLa: IC50 = 400 nM; A2058: IC50 > 400 nM; 도 23a, 23b). 이는 충분한 수용체 발현이 없는 경우, 단백질 독소의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 유도하는 데 효과적인 세포내 전달 SO1861 농도(역치)에 도달하지 못한다는 것을 보여준다. 다음으로, 트라스투주맙-사포린을 고정 농도의 75 nM 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7에서 적정하고, HeLa(EGFR+/-/HER2+/-) 또는 A2058(EGFR-/HER2+/-)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 두 HeLa(EGFR+/-/HER2+/-) 및 A2058(EGFR-/HER2+/-) 세포는 세포 사멸 활성을 나타내지 않았다(HeLa: IC50 > 10.000 pM; A2058: IC50 > 10.000 pM; 도 23c, 23d). 이 모든 것은 EGFR 수용체 저발현 또는 무발현 세포가 세포의 세포질 내 독소의 엔도솜 탈출을 보장하기에 충분한 SO1861(역치)의 항체 매개 전달을 용이하게 하는 충분한 EGFR 수용체의 부족으로 인해 세툭시맙-(Cys-L-SO1861)3,7 + 트라스투주맙-사포린의 조합에 큰 영향을 받지 않음을 보여준다.
다음으로, SO1861-EMCH를 시스테인 잔기(Cys)를 통해 트라스투주맙(인간 HER2를 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체)에 접합시켜, DAR 4(트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4)를 생성하였다. 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4를 고정 농도의 1.5 pM EGF-다이안틴(EGFR 표적화 리간드 독소 융합 단백질)에서 적정하고, HER2/EGFR 발현 세포(SK-BR-3: HER2++/EGFR+/-)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도의 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 1.5 pM EGF-다이안틴에서 강력한 세포 사멸을 나타낸 반면(SK-BR-3: IC50 = 1 nM; 도 24a), 동등한 농도의 트라스투주맙, 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 또는 트라스투주맙 + 1.5 pM EGF-다이안틴은 HER2++/EGFR+/- 발현 세포에서 어떤 세포 사멸 활성도 유도할 수 없었다. 이는 트라스투주맙 접합 SO1861이 (비효과적 농도의) EGF 융합 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 강화함으로써, HER2 고발현/EGFR 저발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 보여준다.
다음으로, EGF-다이안틴을 고정 농도의 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4에서 적정하고, SK-BR-3(HER2++/EGFR+/-) 발현 세포에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도의 EGF-다이안틴과 조합된 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4가 HER2/EGFR 발현 세포에서 이미 효율적인 세포 사멸을 유도했음을 나타낸 반면(SK-BR-3: IC50 = 1 pM)(도 24b), EGF-다이안틴 단독 또는 EGF-다이안틴 + 2.5 nM 트라스투주맙은 세포 사멸 활성을 나타내지 않았다(IC50 > 10.000 pM)(도 24b). 이 모든 것은 상대적으로 낮은 농도의 EGF-다이안틴이 HER2 고발현/EGFR 저발현 세포에서 저농도의 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4와 조합해서만 효과적이고 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.
다음으로, 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4를 고정 농도의 1.5 pM EGF-다이안틴에서 적정하고, JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-) 또는 MDA-MB-468(HER2-/EGFR++)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 두 세포주는 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 1.5 pM EGF-다이안틴의 어떤 조합에 대해서도 감수성이 없었다(JIMT-1: IC50 > 1000 nM; MDA-MB-468: IC50 > 1000 nM; 도 25a, 25b). 이는 충분한 HER2 수용체 발현이 없는 경우, 단백질 독소의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 유도하는 데 효과적인 세포내 전달 SO1861 농도(역치)에 도달하지 못한다는 것을 보여준다.
다음으로, EGF-다이안틴을 고정 농도의 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4에서 적정하고, JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-) 또는 MDA-MB-468(HER2-/EGFR++)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 두 세포주는 2,5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4의 존재 또는 부재하에 고농도의 EGF-다이안틴에서 세포 사멸을 나타냈다(JIMT-1: IC50 = 10.000 pM; MDA-MB-468: IC50 = 200 pM; 도 25c, 25d).
이 모든 것은 HER2 수용체 저발현 또는 무발현 세포가 세포의 세포질 내 독소의 엔도솜 탈출을 보장하기에 충분한 SO1861(역치)의 항체 매개 전달을 용이하게 하는 충분한 HER2 수용체의 부족으로 인해 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)3,7 + 1.5 pM EGF-다이안틴의 조합에 큰 영향을 받지 않음을 보여준다.
다음으로, SO1861-EMCH를 시스테인 잔기(Cys)를 통해 트라스투주맙(인간 HER2를 인식하고 이에 결합하는 단일클론 항체)에 접합시켜, DAR 4(트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4)를 생성하였다. 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4를 고정 농도의 5 pM 세툭시맙-사포린(EGFR 표적화 항체-단백질 독소 접합체)에서 적정하고, 도 1b 내지 1d에 도시된 바와 같은 HER2/EGFR 발현 세포(SK-BR-3: HER2++/EGFR+/-)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도의 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 5 pM 세툭시맙-사포린에서 강력한 세포 사멸을 나타낸 반면(SK-BR-3: IC50 = 1 nM; 도 26a), 동등한 농도의 트라스투주맙, 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4, 또는 트라스투주맙 + 5 pM 세툭시맙-사포린은 HER2++/EGFR+/- 발현 세포에서 어떤 세포 사멸 활성도 유도할 수 없었다. 이는 트라스투주맙 접합 SO1861이 (비효과적 농도의) 세툭시맙 접합 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 효율적으로 강화함으로써, HER2++/EGFR+/- 발현 세포의 세포 사멸을 유도함을 보여준다.
다음으로, 세툭시맙-사포린을 고정 농도의 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 및 75 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4에서 적정하고, HER2/EGFR 발현 세포(SK-BR-3: HER2++/EGFR+/-)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 저농도의 세툭시맙-사포린과 조합된 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4가 SK-BR-3 세포에서 이미 효율적인 세포 사멸을 유도했음을 나타낸 반면(SK-BR-3: IC50 = 1 pM; 도 26b), 세툭시맙-사포린 단독 또는 세툭시맙-사포린 + 2.5 nM 트라스투주맙은 고농도의 트라스투주맙-사포린에서만 세포 사멸을 나타냈다(SK-BR-3: IC50 > 4000 pM; 도 26b). 이 모든 것은 상대적으로 낮은 농도의 세툭시맙-사포린이 HER2++/EGFR+/- 발현 세포에서 저농도의 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4와 조합해서만 효과적이고 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.
다음으로, 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4를 고정 농도의 5 pM 세툭시맙-사포린에서 적정하고, JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-) 및 MDA-MB-468(HER2-/EGFR++) 세포에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 두 세포주는 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 5 pM 세툭시맙-사포린의 조합에 대해 감수성이 없었다(JIMT-1: IC50 > 1000 nM; MDA-MB-468: IC50 > 1000 nM; 도 27a, 27b). 이는 충분한 HER2 수용체 발현이 없는 경우, 단백질 독소의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 유도하는 데 효과적인 세포내 전달 SO1861 농도(역치)에 도달하지 못한다는 것을 보여준다.
다음으로, 세툭시맙-사포린을 고정 농도의 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4에서 적정하고, JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-) 및 MDA-MB-468(HER2-/EGFR++) 세포에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 두 세포주는 2.5 nM 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4의 존재 또는 부재하에 유사한 농도의 세툭시맙-사포린에서 세포 사멸을 나타냈다(JIMT-1: IC50 = 80 pM; MDA-MB-468: IC50 = 100 pM; 도 27c, 27d).
이 모든 것은 HER2 수용체 저발현 또는 무발현 세포가 세포의 세포질 내 독소의 엔도솜 탈출을 보장하기에 충분한 SO1861(역치)의 항체 매개 전달을 용이하게 하는 충분한 HER2 수용체의 부족으로 인해 트라스투주맙-(Cys-L-SO1861)4 + 세툭시맙-사포린의 조합에 큰 영향을 받지 않음을 보여준다.
실시예 14. 2가 VHHEGFR-다이안틴 + mAb-SO1861(1T2C 및 2T2C)
결과
1-표적 2-구성요소 시스템(1T2C)은 mAb 및 VHH가 동일한 세포 표면 수용체를 인식하고 이에 결합하는, mAb-SO1861 및 VHH-단백질 독소의 병용 치료제이다(도 1e). 2-표적 2-구성요소 시스템(2T2C)은 또한 mAb 및 VHH가 다른 세포 표면 수용체를 인식하는, mAb-SO1861 및 VHH-단백질 독소의 병용 치료제이다(도 1d).
2가 VHH-EGFR-다이안틴(서열번호 73)을 서열번호 74로 표시된 아미노산 서열을 가진 2가 VHHEGFR을 포함하는 재조합 융합 단백질로서 생성하였다. 세툭시맙-SO1861(DAR4)을 고정(비효과적) 농도의 50 pM 2가 VHHEGFR-다이안틴에서 적정하고, A431(EGFR++/HER2+/-), MDA-MB-468(EGFR++/HER2+/-), SK-BR-3(HER2++/EGFR+), 및 A2058(EGFR-/HER2+/-)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 50 pM 2가 VHHEGFR-다이안틴과 조합된 매우 낮은 농도의 세툭시맙-SO1861이 MDA-MB-468 세포(IC50 = 0,5 nM; 도 28) 및 A431 (EGFR++) 세포(IC50 = 4 nM, 도 28)에서 효율적인 세포 사멸을 유도했음을 나타낸 반면, SK-BR-3 또는 A2058 세포(EGFR 저발현 또는 무발현)에서, 활성은 매우 높은 농도의 세툭시맙-SO1861에서만 감지되었다(IC50 > 100 nM; 도 28).
이는 저농도의 세툭시맙-SO1861(DAR4)이 EGFR 고발현 세포에서만 2가 VHH-EGFR-다이안틴 융합 단백질의 엔도솜 탈출을 효율적으로 유도함으로써, 강화된 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.
다음으로, 트라스투주맙-SO1861(DAR4)을 고정(비효과적) 농도의 50 pM 2가 VHH-EGFR-다이안틴에서 적정하고, SK-BR-3 (HER2++/EGFR=), A431 (EGFR++/HER2+/-), A2058 (EGFR-/HER2+/-), 및 MDA-MB-468 세포(HER2-/EGFR++)에 대한 표적화 단백질 독소 매개 세포 사멸을 측정하였다. 이는 50 pM 2가 VHH-EGFR-다이안틴과 조합된 매우 낮은 농도의 트라스투주맙-SO1861이 SK-BR-3 세포에서 효율적인 세포 사멸을 유도했음을 나타낸 반면(IC50 = 0,3 nM, 도 28), 이 조합은, 낮은 수준의 HER2를 발현하거나(A431, A2058) HER2 발현이 결여된(MDA-MB-468), A431(HER2 저발현), A2058(HER2 저발현), 및 MDA-MB-468(HER2 무발현) 세포에서 매우 높은 농도의 트라스투주맙-SO1861에서만 세포 사멸 활성을 나타냈다(IC50 > 100 nM; 도 28). 이는 저농도의 트라스투주맙-SO1861(DAR4)이 HER2 고발현 세포에서만 2가 VHHEGFR-다이안틴의 엔도솜 탈출을 효율적으로 유도함으로써, 강화된 세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여준다.
물질 및 방법
물질
SO1861은 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis)에서 얻은 원시 식물 추출물로부터 Analyticon Discovery GmbH에 의해 분리 및 정제되었다. 트라스투주맙(Tras, Herceptin®, Roche), 세툭시맙(Cet, Erbitux®, Merck KGaA)은 약국(Charite, Berlin)에서 구입하였다. 2가 VHHEGFR-다이안틴 융합은 표준 절차(GenScript)에 따라 E.coli에서 재조합 단백질로서 생성하였고, 서열번호 74로 표시된 아미노산 서열을 갖는다.
트리스(2-카복시에틸)포스핀 염산염(TCEP, 98%, Sigma-Aldrich), 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB, Ellman 시약, 99%, Sigma-Aldrich), Zeba™ 스핀 탈염 컬럼(2 mL, Thermo-Fisher), NuPAGE™ 4~12% 비스-트리스 단백질 겔(Thermo-Fisher), NuPAGE™ MES SDS 러닝 버퍼(Thermo-Fisher), Novex™ 샤프 사전염색 단백질 표준물질(Thermo-Fisher), PageBlue™ 단백질 염색액(Thermo-Fischer), Pierce™ BCA 단백질 분석 키트(Thermo-Fisher), N-에틸말레이미드(NEM, 98%, Sigma-Aldrich), 1,4-디티오트레이톨(DTT, 98%, Sigma-Aldrich), Sephadex G25(GE Healthcare), Sephadex G50 M(GE Healthcare), Superdex 200P(GE Healthcare), 이소프로필 알코올(IPA, 99.6%, VWR), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris, 99%, Sigma-Aldrich), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염(Tris.HCL, Sigma-Aldrich), L-히스티딘(99%, Sigma-Aldrich), D-(+)-트레할로스 디하이드레이트(99%, Sigma-Aldrich), 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN 20, Sigma-Aldrich), Dulbecco 인산염 완충 식염수(DPBS, Thermo-Fisher), 구아니딘 염산염(99%, Sigma-Aldrich), 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨염 이수화물(EDTA-Na2, 99%, Sigma-Aldrich), 멸균 필터 0.2 μm 및 0.45 μm(Sartorius), Vivaspin T4 및 T15 농축기(Sartorius), Superdex 200PG(GE Healthcare), 테트라(에틸렌 글리콜), 디메틸 설폭사이드(DMSO, 99%, Sigma-Aldrich), N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트 염(AEM, 98%, Sigma-Aldrich), L-시스테인(98.5%, Sigma-Aldrich), 탈이온수(DI)는 Ultrapure Lab Water Systems(MilliQ, Merck)에서 새로 준비, 니켈-니트릴로트리아세트산 아가로스(Ni-NTA agarose, Protino), 글리신(99.5%, VWR), 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산)(Ellman 시약, DTNB, 98%, Sigma-Aldrich), S-아세틸머캅토석신산 무수물 플루오레세인(SAMSA 시약, Invitrogen), 중탄산나트륨(99.7%, Sigma-Aldrich), 탄산나트륨(99.9%, Sigma-Aldrich), Sephadex G-25 수지를 포함한 PD MiniTrap 탈염 컬럼(GE Healthcare), PD10 G25 탈염 컬럼(GE Healthcare), 0.5, 2, 5, 및 10 mL의 Zeba 스핀 탈염 컬럼(Thermo-Fisher), Vivaspin 원심분리 필터 T4 10 kDa MWCO, T4 100 kDa MWCO, 및 T15(Sartorius), Biosep s3000 aSEC 컬럼(Phenomenex), Vivacell 한외여과 유닛 10 및 30 kDa MWCO(Sartorius), Nalgene Rapid-Flow 필터(Thermo-Fisher).
방법
세포 생존력 분석
처리 후 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 제조사의 지침(CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)에 따라 수행된 MTS 분석으로 세포 생존력을 측정하였다. 간략하게, MTS 용액을 10% FBS가 보충된 페놀 레드(PAN-Biotech GmbH)가 없는 DMEM에서 20배 희석하였다. 세포를 200 μL/PBS 웰로 1회 세척한 후 웰당 100 μL의 희석된 MTS 용액을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 약 20~30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 Thermo Scientific Multiskan FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific)에서 492 nm에서의 OD를 측정했다. 정량화를 위해 '배지 단독' 웰의 백그라운드 신호를 다른 모든 웰에서 뺀 후, 처리 웰의 백그라운드 보정된 신호를 비처리 웰의 백그라운드 보정된 신호로 나누어(x 100), 처리/비처리 세포의 세포 생존력 백분율을 계산하였다.
FACS 분석
10 cm 디쉬에서 500,000 c/플레이트로, 세포를 10% 우태아 혈청(PAN-Biotech GmbH) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(PAN-Biotech GmbH)이 보충된 DMEM(PAN-Biotech GmbH)에 시딩하고, 90% 컨플루언시에 도달할 때까지 48시간 동안 인큐베이션하였다(5% CO2, 37℃). 이어서, 세포를 트립신 처리하여(TryplE Express, Gibco Thermo Scientific) 단일 세포로 만들었다. 0.75 x 106개 세포를 15 mL 팔콘 튜브로 옮기고 원심분리하였다(1,400 rpm, 3분). 세포 펠릿을 침수시킨 채로 상청액을 버렸다. 볼텍스 쉐이커에서 팔콘 튜브를 가볍게 태핑하여 펠릿을 분리하고 세포를 4 mL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)로 세척하였다. 세척 후 세포를 3 mL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)에 재현탁시키고, 3개의 둥근 바닥 FACS 튜브에 균등하게 분배하였다(1 mL/튜브). 세포를 다시 원심분리하고 200 μL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS) 또는 200 μL의 항체 용액(195 μL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)에 5 μL의 항체를 함유)에 재현탁시켰다. APC 마우스 IgG1, κ APC 항-인간 EGFR(#352906, Biolegend)을 사용하여 EGFR 수용체를 염색하였다. PE 항-인간 HER2 APC 항-인간 CD340(erbB2/HER-2)(#324408 Biolegend)을 사용하여 HER2 수용체를 염색하고, PE 마우스 IgG2a, κ 이소형 Ctrl FC(#400212, Biolegend)를 매칭 이소형 대조군으로 사용하였다. PE 항-인간 CD71(#334106, Biolegend)을 사용하여 CD71 수용체를 염색하고, PE 마우스 IgG2a, κ 이소형 Ctrl FC(#400212, Biolegend)를 매칭 이소형 대조군으로 사용하였다. 튜브 롤러 믹서에서 샘플을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)로 3회 세척하고, PBS 중 2% PFA 용액을 사용하여 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 FACS 분석을 위해 250~350 μL의 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 샘플을 BD FACSCanto II 유세포 분석 시스템(BD Biosciences) 및 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 결과는 표 A2를 참조.
SO1861-EMCH 합성
SO1861(121 mg, 0.065 mmol) 및 EMCH.TFA(110 mg, 0.325 mmol)에 메탄올(추가 건조, 3.00 mL) 및 TFA(0.020 mL, 0.260 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1.5시간 후, 반응 혼합물을 분취용 MP-LC.1에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획을 즉시 함께 모으고, 동결하고 밤새 동결건조하여 표제 화합물(120 mg, 90%)을 백색 솜털형 고체로 얻었다. LC-MS 기반 순도 96%.
LRMS (m/z): 2069 [M-1]1-
LC-MS r.t. (min): 1.084
항체-(L-SO1861) 4
트라스투주맙, 세툭시맙을 이하 "Ab"로 지칭한다. Ab를 Michael 유형 티올-엔 접합 반응을 통해 사포닌 SO18161-EMCH에 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 DAR로 접합시켰다. SO1861-EMCH 분자는 구조와 말레이미드 기능 사이에 불안정한(L) 하이드라존 결합을 얻어 사포닌과 Ab 사이에 불안정한 결합이 생성된다. 절차를 트라스투주맙-(L-SO1861)4에 대해 예시적으로 설명한다.
세툭시맙의 용액(40 mg, 8.0 ml)에 Tris 농축액(127 mg/ml, 1.05 M), Tris.HCl 농축액(623 mg/ml, 3.95 M), 및 EDTA-Na2 농축액(95 mg/ml, 0.26 M)을 각각 10 μl/ml씩 첨가하여 50 mM TBS, 2.5 mM EDTA 버퍼 pH 7.5를 얻었다.
네 부분(각각 9.73 mg, 4.864 mg/ml, 65 nmol)으로 나눈 세툭시맙에 새로 제조한 TCEP 용액(0.5~2.0 mg/ml, 1.15~7.02 몰당량, 75~455 nmol)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 롤러 믹싱으로 20℃에서 300분 동안 인큐베이션하였다. (SO1861-EMCH의 첨가 전) 인큐베이션 후, 약 1 mg(0.210 ml) 분취량의 Ab-SH를 각 혼합물로부터 제거하고, zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 TBS pH 7.5로 정제하였다. 이들 분취량을 UV-vis 분석 및 Ellman 분석으로 특성화하였다(티올 대 Ab 비 = 각각 2.0, 4.2, 5.9, 및 6.8). 각각의 벌크 Ab-SH에 새로 제조한 SO1861-EMCH 용액(2 mg/ml, '티올'당 1.3 당량, 0.15~0.61 μmol, 0.16~0.63 ml)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을 짧게 볼텍싱한 후, 20℃에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 접합 반응 외에, 탈염된 Ab-SH(0.25 mg, 1.67 nmol)의 두 분취량을 각각 양성 및 음성 대조군으로서, NEM('티올'당 1.3 몰당량, 4.3~17.4 nmol, 0.25 mg/ml 용액 2.2~8.7 μl) 또는 TBS pH 7.5 버퍼(2.2~8.7 μl)와 20℃에서 120분 동안 반응시켰다. (NEM의 첨가 전) 인큐베이션 후, 0.200 ml 분취량의 Ab - SO1861-EMCH 혼합물을 제거하고, zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 TBS pH 7.5로 정제하였다. 이 분취량을 UV-vis로 특성화하고 양성 및 음성 대조군과 함께 Ellman 분석으로 특성화하여 SO1861-EMCH 혼입을 얻었다. 벌크 Ab - SO1861-EMCH 혼합물에 새로 제조한 NEM 용액(2.5 mg/ml, 2.5~10 몰당량, 0.15~0.58 μmol)의 분취량을 첨가하고, 혼합물을, DPBS pH 7.5로 용리하는 zeba 스핀 탈염 컬럼으로 정제하여 정제된 세툭시맙 - (L-SO1861) 접합체를 얻었다. 생성물을 2.5 mg/ml로 정규화하고 0.2 μm로 여과한 후, 생물학적 평가를 위해 분배하였다. 표 A3 및 표 A4 참조.
참고문헌
Figure pct00027
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서열번호
서열번호 1: 낙타과 유래 항-HER2 sdAb 2Rb17c의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
gaagttcagctgcaggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtttcatcttctctaacgacgcgatgacctgggttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatgggtttcttctatcaactggtctggtacccacaccaactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaacgtaccctgtacctgcagatgaactctctgaaagacgaagacaccgcgctgtactactgcgttaccggttacggtgttaccaaaaccccgaccggtcagggtacccaggttaccgtttcttctcaccaccaccaccaccactctccgtctaccccgccgaccccgtctccgtctaccccgccgtgc
서열번호 2: 낙타과 유래 항-HER2 sdAb 2Rb17c의 아미노산 서열
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서열번호 3: 단봉낙타 유래 항-HER2 sdAb NB2의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
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서열번호 4: 단봉낙타 유래 항-HER2 sdAb NB2의 아미노산 서열
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서열번호 5: 합성 구성체, 항-HER2 sdAb pcNB2의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
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서열번호 6: 합성 구성체, 항-HER2 sdAb pcNB2의 아미노산 서열
MEVQLVEKGGGRVQAGGSLRLRCAASGITFSINTMGWYRQAPGKQRELVALISSIGDTYYADSVKGRFRIRRDNAKNTVYLRMRRLKPEDTAVYYCKRFRTAAQGTDYWGQGTRVTVSKHHHHHH
서열번호 7: 낙타과 유래 항-HER1 sdAb 7D12의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
gcggcgcaggttaaactggaagaatctggtggtggttctgttcagaccggtggttctctgcgtctgacctgcgcggcgtctggtcgtacctctcgttcttacggtatgggttggttccgtcaggcgccgggtaaagaacgtgaattcgtttctggtatctcttggcgtggtgactctaccggttacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaaaacaccgttgacctgcagatgaactctctgaaaccggaagacaccgcgatctactactgcgcggcggcggcgggttctgcgtggtacggtaccctgtacgaatacgactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttct
서열번호 8: 낙타과 유래 항-HER1 sdAb 7D12의 아미노산 서열
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서열번호 9: 낙타과 유래 항-HER1 sdAb 9G8의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
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서열번호 10: 낙타과 유래 항-HER1 sdAb 9G8의 아미노산 서열
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVVAINWSSGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGYQINSGNYNFKDYEYDYWGQGTQVTVSS
서열번호 11: 합성 구성체, 항-VGFR2 sdAb NTV1의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
atggcgcaggttcagctgctggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggttactctgttatcaacgacttcatgacctgggttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatgggtttcttctatctctgttgcggacggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaactctaaaaacaccctgtacctgcagatgaactctctgcgtgcggaagacaccgcggtttactactgcgcggcgcgtgttggtggtcgtgacctgggttggccgtacgaactggactactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttct
서열번호 12: 합성 구성체, 항-VGFR2 sdAb NTV1의 아미노산 서열
MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSVINDFMTWVRQAPGKGLEWVSSISVADGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARVGGRDLGWPYELDYWGQGTLVTVSS
서열번호 13: 합성 구성체, 항-VGFR2 sdAb NTV2의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
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서열번호 14: 합성 구성체, 항-VGFR2 sdAb NTV2의 아미노산 서열
MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITNKTMAWVRQAPGKGLEWVSSIGSSSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRKGNRLGPAALRSWGQGTLVTVSS
서열번호 15: 합성 구성체, 항-VGFR2 sdAb NTV3의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
atggcgcaggttcagctgctggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtgttcgtgttaactacaaatctatgtcttgggttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatgggtttctaccatcacctctcgtaacggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaactctaaaaacaccctgtacctgcagatgaactctctgcgtgcggaagacaccgcggtttactactgcgcgaccggtcgtgcgcaccacgcgccggttcgttactggggtcagggtaccctggttaccgtttcttct
서열번호 16: 합성 구성체, 항-VGFR2 sdAb NTV3의 아미노산 서열
MAQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVRVNYKSMSWVRQAPGKGLEWVSTITSRNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGRAHHAPVRYWGQGTLVTVSS
서열번호 17: 합성 구성체, 항-VGFR2 sdAb NTV4의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
atggcgcaggttcagctgctggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtgttaccatcaccgacgaagacatgacccgtgttcgtcaggcgccgggtaaaggtctggaatgggtttcttctatcctgaacaccggtggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaactctaaaaacaccctgtacctgcagatgaactctctgcgtgcggaagacaccgcggtttactactgcgcggcggttcacgaaaaagcggcggacatgaacttctggggtcagggtaccctggttaccgtttcttct
서열번호 18: 합성 구성체, 항-VGFR2 sdAb NTV4의 아미노산 서열
AQVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVTITDEDMTRVRQAPGKGLEWVSSILNTGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVHEKAADMNFWGQGTLVTVSS
서열번호 19: 박트리아 낙타 유래 항-인간 CD19 sdAb SRB-85의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
gaagttcagctgctggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgttcttgcgaagcgtctggtttcaacgcgatgacctctatcgactcttggaccgacgcggttaaaggttgggttcgtcagccgccgggtaaaggtctggaatgggtttctcgtttcgcgatctctcaggacaacgcgaaaaacaccgtttacctgcagatgaactctctgaaaccggaagacaccgcgatgtactactgcgcgctgtctaaatgctacacccgtgtttacgactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttctggt
서열번호 20: 박트리아 낙타 유래 항-인간 CD19 sdAb SRB-85의 아미노산 서열
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서열번호 21: 박트리아 낙타 유래 항-인간 CD19 sdAb SRB-37의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
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서열번호 22: 박트리아 낙타 유래 항-인간 CD19 sdAb SRB-37의 아미노산 서열
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서열번호 23: 단봉낙타 유래 항-CTLA-4 sdAb NB16의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
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서열번호 24: 단봉낙타 유래 항-CTLA-4 sdAb NB16의 아미노산 서열
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서열번호 25: 단봉낙타 유래 항-CTLA-4 sdAb NB36의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
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서열번호 26: 단봉낙타 유래 항-CTLA-4 sdAb NB36의 아미노산 서열
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서열번호 27: 단봉낙타 유래 항-CTLA-4 sdAb NB91의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
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서열번호 28: 단봉낙타 유래 항-CTLA-4 sdAb NB91의 아미노산 서열
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서열번호 29: 단봉낙타 유래 항-인간 PD-L1 sdAb A1의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
Caggttcagctgcaggaatctggtggtggtctggttcagccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtttcaccctggactactacgcgatcggttggttccgtcaggcgccgggtaaagaacgtgaaggtgtttcttgcatctcttcttctgacggttctacctactacgcggactctgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaaaacaccgtttacctgcagatgtcttctctgaaaccggaagacaccgcggtttactactgcggtatctctggttcttgcctgctggaagactacggtatggactactggggtaaaggtacccaggttaccgtttcttct
서열번호 30: 단봉낙타 유래 항-인간 PD-L1 sdAb A1의 아미노산 서열
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서열번호 31: 단봉낙타 유래 항-인간 PD-L1 sdAb B1의 DNA 서열을 암호화하는 아미노산
caggttcagctgcaggaatctggtggtggtctggttcacccgggtggttctctgcgtctgtcttgcgcggcgtctggtttctctctggacaactacgcgatcggttggttccgtcaggcgccgggtaaagaacgtgaaggtgtttcttgcatctcttctggttctgaaggtcgtcgttactacgcggacttcgttaaaggtcgtttcaccatctctcgtgacaacgcgaaaaacaccgcgttcctgcagatgaactctctgaaaccggaagacaccgcggactactactgcgcgaccgttggtttctgctcttctcagtacggtatggaattcgttggtgactactggggtcagggtacccaggttaccgtttcttct
서열번호 32: 단봉낙타 유래 항-인간 PD-L1 sdAb B1의 아미노산 서열
QVQLQESGGGLVHPGGSLRLSCAASGFSLDNYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSGSEGRRYYADFVKGRFTISRDNAKNTAFLQMNSLKPEDTADYYCATVGFCSSQYGMEFVGDYWGQGTQVTVSS
서열번호 33: 항-마우스 혈청 알부민 sdAb MSA21의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTFSRFGMTWVRQAPGKGVEWVSGISSLGDSTLYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLNPGGQGTQVTVSS
서열번호 34: 항-인간 혈청 알부민 sdAb Alb-1의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
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서열번호 35: 항-인간 혈청 알부민 sdAb Alb23(인간화, 최적화된 Alb1)의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
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서열번호 36: 항-EGFR VHH 7A5의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 37: 항-EGFR VHH 7D12의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 38: 항-EGFR VHH 7C12의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 39: 항-인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 VHH 4B11의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 40: 항-인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 VHH 3G7의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 41: 항-인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 VHH 2C7의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 42: 항-인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 VHH 1C7의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSRTANAWFRQAPGKEREFVATITWNSGTTRYADSVKGRFFISKDSAKNTIYLEMNSLEPEDTAVYYCAATAAAVITPTRGYYNYWGQGTQVTVSS
서열번호 43: 항-CEACAM VHH NbCEA5의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 44: 항-CEACAM VHH CEA5의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 45: 항-CD123 VHH 57A07의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 46: 항-CD123 VHH 57B04의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 47: 항-CD123 VHH 51D09의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 48: 항-CD123 VHH 55C05의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 49: 항-CD123 VHH 50F07의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 50: 항-CD123 VHH 55F03의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
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서열번호 51: 항-CD123 VHH 55A01의 아미노산 서열(유기체: 인공; 재조합 펩티드)
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTTSGRALNMYVMGWFRQAPGNEREFVAATSSSGGSTSYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAAYRCAASPYVSTPTMNILEEYRYWGLGTQVTVSS
서열번호 52: 항-c-MET VHH 04E09의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFILDYYAIGWFRQAPGKEREGVLCIDASDDITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCATPIGLSSSCLLEYDYDYWGQGTLVTVSS
서열번호 53: 항-c-MET VHH 06B08의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTISRYTMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGDNTNYADSVKGRFTISRPNTKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAADYRSGSYYQASEWTRPSGYDYWGQGTLVTVSS
서열번호 54: 항-c-MET VHH 06C12의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
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서열번호 55: 항-c-MET VHH 06F10의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
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서열번호 56: 항-Her3 VHH 21F6의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTYYLNAMGWFRQGPGKDREFVAAIDWSDGNKDYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADTPPWGPMIYIESYDSWGQGTLVTVSS
서열번호 57: 항-Her3 VHH 4C7의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
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서열번호 58: 항-Her3 VHH 17B5의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIGGLNAMAWYRQAPGKERELVAGIFGVGSTRYADSVKGRFTISRDIAKNTVFLQMNSLNSEDTAVYYCRMSSVTRGSSDYWGQGTQVTVSS
서열번호 59: 항-Her3 VHH 18G11의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTLFKINAMGWYRQAPGKRRELVALITSSDTTDYAESVEGRFTISRDNTWNAVYLQMNSLKPEDTAVYYCHSDHYSMGVPEKRVIMYGQGTQVTVSS
서열번호 60: 항-Her3 VHH 34C7의 아미노산 서열(유기체: 인공 서열)
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서열번호 61: 항-Her2 VHH 47D5의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 62: 항-Her2 VHH 2D3의 아미노산 서열(유기체: 라마)
EVQLVESGGSLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMSWVRQVPGKGLEWVSSINWSGTHTDYADSVKGRFTISRNNANNTLYLQMNSLKSEDTAVYYCAKNWRDAGTTWFEKSGSAGQGTQVTVSS
서열번호 63: 항-Her2 VHH 5F7의 아미노산 서열(유기체: 라마)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSINTMGWYRQAPGKQRELVALISSIGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKRFRTAAQGTDYWGQGTQVTVSS
서열번호 64: 항-Her2 VHH 13D11의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 65: 항-Her2 VHH 2B4의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 66: 항-Her2 VHH 2G2의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 67: 항-Her2 VHH 13G11의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 68: 항-Her2 VHH 12E33의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 69: 항-Her2 VHH 13F21의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 70: 항-Her2 VHH 11A101의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 71: 항-Her2 VHH 11A22의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 72: 항-Her2 VHH 12D44의 아미노산 서열(유기체: 라마)
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서열번호 73: 2가 VHHEGFR-다이안틴-Cys의 아미노산 서열
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서열번호 74: 2가 VHHEGFR-Cys의 아미노산 서열
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서열번호 75: VHH 7D12의 아미노산 서열
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서열번호 76: VHH 9G8의 아미노산 서열
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SEQUENCE LISTING <110> Sapreme Technologies B.V. Charite- Universitatsmedizin Berlin <120> CONJUGATE OF SAPONIN AND SINGLE-DOMAIN ANTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAID CONJUGATE, THERAPEUTIC USE THEREOF <130> P6093952PCT1 <150> NL 2025898 <151> 2020-06-24 <150> PCT/EP2020/069341 <151> 2020-07-09 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 414 <212> DNA <213> Camelus dromedarius <400> 1 gaagttcagc tgcaggaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60 tcttgcgcgg cgtctggttt catcttctct aacgacgcga tgacctgggt tcgtcaggcg 120 ccgggtaaag gtctggaatg ggtttcttct atcaactggt ctggtaccca caccaactac 180 gcggactctg ttaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgaca acgcgaaacg taccctgtac 240 ctgcagatga actctctgaa agacgaagac accgcgctgt actactgcgt taccggttac 300 ggtgttacca aaaccccgac cggtcagggt acccaggtta ccgtttcttc tcaccaccac 360 caccaccact ctccgtctac cccgccgacc ccgtctccgt ctaccccgcc gtgc 414 <210> 2 <211> 138 <212> PRT <213> Camelus dromedarius <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser 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Ser Trp Thr Asp Ala Val Lys Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Phe Ala Ile Ser Gln Asp Asn Ala 50 55 60 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 65 70 75 80 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Cys Tyr Thr Arg Val Tyr Asp 85 90 95 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 100 105 <210> 21 <211> 312 <212> DNA <213> Camelus bactrianus <400> 21 gaagttcagc tgcaggaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60 tcttgcgcgg cgtctggttt catctacatg gttggtatca aaaccgaacg tgacggtgtt 120 aaaggttggg ttcgtcaggc gccgggtaaa ggtctggaat ggctgtctcg tttcaccatc 180 ccgcgtgaca acgcgaaaaa caccctgtac ctgcagatga acaacctgaa atctgaagac 240 accgcgctgt actactgcgc gaccgaagaa aacgactggg gtcagggtac ccaggttacc 300 gtttcttctg gt 312 <210> 22 <211> 103 <212> PRT <213> Camelus bactrianus <400> 22 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Tyr Met Val Gly 20 25 30 Ile Lys Thr 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<210> 28 <211> 117 <212> PRT <213> Camelus dromedarius <400> 28 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Lys Tyr Thr Ser Cys Met Gly 20 25 30 Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val Ala His Ile 35 40 45 Asp Ser Gly Pro Arg Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 50 55 60 Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Ser 65 70 75 80 Thr Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro 85 90 95 Met Tyr Ser Gly Ser Cys Asn Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 366 <212> DNA <213> Camelus dromedarius <400> 29 caggttcagc tgcaggaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60 tcttgcgcgg cgtctggttt caccctggac tactacgcga tcggttggtt ccgtcaggcg 120 ccgggtaaag aacgtgaagg tgtttcttgc atctcttctt ctgacggttc tacctactac 180 gcggactctg ttaaaggtcg tttcaccatc tctcgtgaca acgcgaaaaa caccgtttac 240 ctgcagatgt cttctctgaa accggaagac accgcggttt actactgcgg tatctctggt 300 tcttgcctgc tggaagacta cggtatggac tactggggta aaggtaccca ggttaccgtt 360 tcttct 366 <210> 30 <211> 122 <212> PRT <213> Camelus dromedarius <400> 30 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Ile Ser Gly Ser Cys Leu Leu Glu Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 378 <212> DNA <213> Camelus dromedarius <400> 31 caggttcagc tgcaggaatc tggtggtggt ctggttcacc cgggtggttc tctgcgtctg 60 tcttgcgcgg cgtctggttt ctctctggac aactacgcga tcggttggtt ccgtcaggcg 120 ccgggtaaag aacgtgaagg tgtttcttgc atctcttctg gttctgaagg tcgtcgttac 180 tacgcggact tcgttaaagg tcgtttcacc atctctcgtg acaacgcgaa aaacaccgcg 240 ttcctgcaga tgaactctct gaaaccggaa gacaccgcgg actactactg cgcgaccgtt 300 ggtttctgct cttctcagta cggtatggaa ttcgttggtg actactgggg tcagggtacc 360 caggttaccg tttcttct 378 <210> 32 <211> 126 <212> PRT <213> Camelus dromedarius <400> 32 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Gly Ser Glu Gly Arg Arg Tyr Tyr Ala Asp Phe 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala 65 70 75 80 Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Thr Val Gly Phe Cys Ser Ser Gln Tyr Gly Met Glu Phe Val 100 105 110 Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 33 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino-acid sequence of Anti-mouse serum albumin dsAb MSA21 <400> 33 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino-acid sequence of Anti-human serum albumin dsAb Alb-1 <400> 34 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys 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VHH 7A5 <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Arg Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Gly Trp Gly Gly Leu Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Ser Ser Thr Arg Thr Val Ile Tyr Thr Leu Pro Arg Met Tyr 100 105 110 Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 37 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino-acid sequence of Anti-EGFR VHH 7D12 <400> 37 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 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Anti-CD123 VHH 50F07 <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Arg Ile Ser Ala Gly Thr Ala Phe Trp Leu Trp Ser Asp Tyr Glu 100 105 110 Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino-acid sequence of Anti-CD123 VHH 55F03 <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Tyr Trp Ser Asn Gly Lys Thr Gln Tyr Thr Asp 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Ser Phe Leu Asp Gln Ile Arg Asn Asn Val Arg Asp Thr Ser 290 295 300 Leu Ile Tyr Gly Gly Thr Asp Val Ala Val Ile Gly Ala Pro Ser Thr 305 310 315 320 Thr Asp Lys Phe Leu Arg Leu Asn Phe Gln Gly Pro Arg Gly Thr Val 325 330 335 Ser Leu Gly Leu Arg Arg Glu Asn Leu Tyr Val Val Ala Tyr Leu Ala 340 345 350 Met Asp Asn Ala Asn Val Asn Arg Ala Tyr Tyr Phe Lys Asn Gln Ile 355 360 365 Thr Ser Ala Glu Leu Thr Ala Leu Phe Pro Glu Val Val Val Ala Asn 370 375 380 Gln Lys Gln Leu Glu Tyr Gly Glu Asp Tyr Gln Ala Ile Glu Lys Asn 385 390 395 400 Ala Lys Ile Thr Thr Gly Asp Gln Ser Arg Lys Glu Leu Gly Leu Gly 405 410 415 Ile Asn Leu Leu Ile Thr Met Ile Asp Gly Val Asn Lys Lys Val Arg 420 425 430 Val Val Lys Asp Glu Ala Arg Phe Leu Leu Ile Ala Ile Gln Met Thr 435 440 445 Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Gln Asn Leu Val Thr Lys Asn 450 455 460 Phe Pro Asn Lys Phe Asp Ser Glu Asn Lys Val Ile Gln Phe Gln Val 465 470 475 480 Ser Trp Ser Lys Ile Ser Thr Ala Ile Phe Gly Asp Cys Lys Asn Gly 485 490 495 Val Phe Asn Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe Gly Lys Val Arg Gln Ala 500 505 510 Lys Asp Leu Gln Met Gly Leu Leu Lys Tyr Leu Gly Arg Pro Lys Gly 515 520 525 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Arg Trp Cys Cys Pro Gly 530 535 540 Cys Cys Lys Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His 545 550 555 560 His His His His His Arg Trp Cys Cys Pro Gly Cys Cys Lys Thr Phe 565 570 575 <210> 74 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bivalent VHHEGFR-Cys <400> 74 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Glu Arg Glu Phe Val Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr 180 185 190 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 195 200 205 Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn 225 230 235 240 Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 245 250 255 Val Thr Val Ser Ser His His His His His His His His His His His 260 265 270 Arg Trp Cys Cys Pro Gly Cys Cys Lys Thr Phe 275 280 <210> 75 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH 7D12 <400> 75 Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr Glu Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH 9G8 <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Val Ala Ile Asn Trp Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Tyr Gln Ile Asn Ser Gly Asn Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr 100 105 110 Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

Claims (39)

  1. 세포 외부로부터 상기 세포 내로 사포닌을 전달하기 위한 접합체로서, 직접 또는 링커를 통해 적어도 하나의 사포닌에 공유 결합되고 상기 세포에 결합할 수 있는 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함하고, 적어도 하나의 사포닌은 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 또는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드인, 접합체.
  2. 제1항에 있어서, sdAb는, 항체의 중쇄로부터 유래된, 바람직하게는 면역글로불린 G 기원의, 바람직하게는 인간 기원의 VH 도메인, 항체의 경쇄로부터 유래된, 바람직하게는 면역글로불린 G 기원의, 바람직하게는 인간 기원의 VL 도메인, 낙타과(Camelidae) 기원 또는 가변 중쇄 신규 항원 수용체(VNAR) 도메인과 같은 Ig-NAR 기원 등을 갖는 중쇄 단독 항체(HCAb)로부터 유래된 VHH 도메인이고, 바람직하게는 HCAb는 낙타과(Camelidae) 기원이고, 바람직하게는 sdAb는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 비쿠냐, 구아나코, 및 박트리아 낙타의 HCAb로부터 유래된 것과 같은 낙타과(Camelidae) 기원의 HCAb로부터 유래된 VHH 도메인(낙타과 VH)인, 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개 이상의 sdAb를 포함하고; 적어도 하나의 사포닌에 공유 연결된 단일 제1 sdAb를 갖거나, 적어도 하나의 사포닌에 연결된 2개 이상의 sdAb를 갖거나, 2개 이상의 sdAb 모두가 적어도 하나의 사포닌에 연결된 것인 sdAb를 갖는, 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, sdAb는 동일한 sdAb인 2개 이상의 sdAb, 바람직하게는 2~8개의 sdAb, 보다 바람직하게는 2~4개의 sdAb를 포함하는, 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 세포 표면 분자 상의 동일한 결합 부위에 결합할 수 있는 1~8개의 sdAb를 포함하고, 적어도 하나의 사포닌은 1~8개의 sdAb 중 단일 제1 sdAb에 연결되거나, 적어도 하나의 사포닌은 sdAb 중 2개 이상(존재하는 경우)에 연결되는, 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이중파라토프성인 2개 이상의 sdAb를 포함하는, 바람직하게는 이중파라토프성인 2개의 sdAb를 포함하는, 접합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 적어도 하나의 사포닌 중 1~100개의 사포닌 모이어티, 바람직하게는 2~64개의 사포닌 모이어티, 보다 바람직하게는 4~32개의 사포닌 모이어티, 가장 바람직하게는 8~16개, 또는 그 사이의 임의의 수의 사포닌 모이어티를 포함하는, 접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은,
    2알파-하이드록시 올레아놀산;
    16알파-하이드록시 올레아놀산;
    헤데라게닌(23-하이드록시 올레아놀산)
    16알파,23-디하이드록시 올레아놀산;
    집소게닌;
    퀼라산;
    프로토애시게닌-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-22-아세테이트;
    23-옥소-바링토게놀 C-21,22-비스(2-메틸부트-2-에노에이트);
    23-옥소-바링토게놀 C-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-16,22-디아세테이트;
    디지토게닌;
    3,16,28-트리하이드록시 올레아난-12-엔; 및
    집소겐산
    중 어느 하나로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하고,
    바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 퀴라산 및 집소게닌으로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하고, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조는 퀼라산인, 접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C3 원자 또는 C28 원자, 바람직하게는 C3 원자에 결합된 제1 당류 사슬을 포함하고/하거나, 적어도 하나의 사포닌은 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C28 원자에 결합된 제2 당류 사슬을 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 제1 및 제2 당류 사슬을 포함하는, 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은
    GlcA-,
    Glc-,
    Gal-,
    Rha-(1→2)-Ara-,
    Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-,
    Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-,
    Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
    Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
    Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-,
    Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-, 및
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-
    로부터 선택되는 제1 당류 사슬을 포함하고/하거나,
    적어도 하나의 사포닌은
    Glc-,
    Gal-,
    Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-,
    Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-,
    Ara-,
    Xyl-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc- (R1은 4E-메톡시신남산임),
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc- (R2는 4Z-메톡시신남산임),
    Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-디-OAc-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc- (R3은 4E-메톡시신남산임),
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
    (Ara- 또는 Xyl-)(1→3)-(Ara- 또는 Xyl-)(1→4)-(Rha- 또는 Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha- 또는 Fuc-)(1→4)]-(Rha- 또는 Fuc-),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc- (R4는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc- (R5는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
    6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-,
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-디-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- (R6은 5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- (R7은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- (R8은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- (R9는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- (R10은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- (R11은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- (R12는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산임), 및
    Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-
    로부터 선택되는 제2 당류 사슬을 포함하고,
    바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 이러한 선택된 제1 당류 사슬 및 이러한 선택된 제2 당류 사슬을 포함하는, 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은 3-O-베타-D-갈락토피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)]-베타-D-글루쿠론피라노실 퀼라산 28-O-베타-D-글루코피라노실-(1→3)-베타-D-자일로피라노실-(1→4)-알파-L-람노피라노실-(1→2)-[베타-D-자일로피라노실-(1→3)-4OAc-베타-D-퀴노보피라노실-(1→4)]-베타-D-푸코피라노시드, 퀼라야(Quillaja) 수피 사포닌, 딥사코시드 B, 사이코사포닌 A, 사이코사포닌 D, 마크란토이딘 A, 에스쿨렌토시드 A, 피톨라카게닌, 에스시네이트, AS6.2, NP-005236, AMA-1, AMR, 알파-헤데린, NP-012672, NP-017777, NP-017778, NP-017774, NP-018110, NP-017772, NP-018109, NP-017888, NP-017889, NP-018108, SA1641, AE X55, NP-017674, NP-017810, AG1, NP-003881, NP-017676, NP-017677, NP-017706, NP-017705, NP-017773, NP-017775, SA1657, AG2, SO1861, SO1862, SO1904, GE1741, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, QS-7, QS1861, QS-7 api, QS1862, QS-17, QS-18, QS-21 A-apio, QS-21 A-xylo, QS-21 B-apio, QS-21 B-xylo, 베타-에스신(Aescin), 에스신 Ia, 티시드(Teaseed) 사포닌 I, 티시드 사포닌 J, 아삼사포닌(Assamsaponin) F, 디지토닌(Digitonin), 프리물라산(Primula acid) 1, 및 AS64R, 및/또는 이들의 기능적 유도체, 및/또는 이들의 입체이성질체, 및/또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고, 기능적 유도체는 임의로 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제2 당류 사슬에 아세틸기가 없고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 QS-21, GE1741, SA1641, 및 SO1861, 및/또는 이들의 기능적 유도체로부터 선택되고, 기능적 유도체는 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제2 당류 사슬에 아세틸기가 없는, 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은 SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 퀼라야사포닌, 사포니넘 알범(Saponinum album), QS-18, Quil-A, Gyp1, 집소시드 A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, SO1862, SO1904, 및/또는 이들의 입체이성질체, 및/또는 이들의 기능적 유도체, 및/또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되고, 임의로 기능적 유도체는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제2 당류 사슬에 아세틸기가 없고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 SO1861, GE1741, SA1641, 및 QS-21로부터 선택되고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조에 알데히드기가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제1 당류 사슬에 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티가 없고/없거나, 적어도 하나의 사포닌의 제2 당류 사슬에 아세틸기가 없는 이들의 기능적 유도체로부터 선택되는, 접합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하고/하거나, 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티를 포함하는 제1 당류 사슬을 포함하고/하거나, 아세틸기를 포함하는 제2 당류 사슬을 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조, 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티를 포함하는 제1 당류 사슬, 및 아세틸기를 포함하는 제2 당류 사슬을 포함하고, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 사포닌은 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조, 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티를 포함하는 제1 당류 사슬, 아세틸기를 포함하는 제2 당류 사슬 중 하나 또는 둘을 포함하는, 접합체.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은 알데히드기를 포함하는 아글리콘 코어 구조, 카복실기를 포함하는 글루쿠론산 모이어티를 포함하는 제1 당류 사슬, 및 아세틸기를 포함하는 제2 당류 사슬을 포함하지 않는 사포닌 기능적 유도체인, 접합체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은 링커, 바람직하게는 절단 가능한 링커를 통해 sdAb에 공유 결합되는, 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 절단 가능한 링커는 산성 조건, 환원 조건, 효소 조건, 및/또는 광 유도 조건에서 절단될 수 있고, 바람직하게는 절단 가능한 링커는 산성 조건에서 절단될 수 있는 하이드라존 결합 및 하이드라지드 결합, 및/또는 단백질분해, 예를 들어 카텝신 B에 의한 단백질분해를 허용하는 결합, 및/또는 이황화 결합과 같은 환원 조건에서 절단되기 쉬운 결합으로부터 선택되는 절단 가능한 결합을 포함하는, 접합체.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 절단 가능한 링커는 예를 들어 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포의 엔도솜 및/또는 리소좀에 존재하는 것과 같은 산성 조건에서 생체내 절단될 수 있고, 바람직하게는 절단 가능한 링커는 pH 4.0~6.5에서, 보다 바람직하게는 pH 5.5 이하에서 생체내 절단될 수 있는, 접합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌이, 사포닌이 공유 결합된 올리고머 분자 또는 폴리머 분자를 포함하는 공유 사포닌 접합체의 일부이고, sdAb가 또한 사포닌이 결합된 것과 동일한 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 공유 결합된, 접합체.
  19. 제18항에 있어서, 사포닌을 포함하는 올리고머 분자 또는 폴리머 분자 중 1~8개, 또는 사포닌을 포함하는 올리고머 분자 또는 폴리머 분자 중 2~4개가 sdAb에 공유 결합되고, 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자는 임의로, 각각 4, 8, 16, 또는 32개의 사포닌 모이어티를 공유 결합하기 위한 4, 8, 16, 및 32개의 결합 부위를 갖는 G2 덴드론, G3 덴드론, G4 덴드론, 또는 G5 덴드론과 같은 덴드론이고, 1~32개의 사포닌 모이어티, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32개의 사포닌 모이어티, 또는 그 사이의 임의의 수의 사포닌 모이어티, 예컨대 7, 9, 12개의 사포닌 모이어티가 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 공유 결합된, 접합체.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은 바람직하게는 링커를 통해, 이민 결합, 하이드라존 결합, 하이드라지드 결합, 옥심 결합, 1,3-디옥솔란 결합, 이황화 결합, 티오-에테르 결합, 아미드 결합, 펩티드 결합, 또는 에스테르 결합 중 임의의 하나 이상을 통해 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 공유 결합되는, 접합체.
  21. 제20항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌은 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C23 위치에 알데히드 작용기, 및 임의로 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C3베타-OH 기에 제1 당류 사슬의 글루쿠론산 작용기를 포함하고, 알데히드 작용기는 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 대한 공유 결합에 관여하고/하거나, 존재하는 경우, 글루쿠론산 작용기는 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자에 대한 적어도 하나의 사포닌의 공유 결합에 관여하고, 적어도 하나의 사포닌의 결합은 직접적인 공유 결합을 통해 또는 링커를 통해 이루어지는, 접합체.
  22. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C23 위치에 있는 알데히드 작용기는 링커, 바람직하게는 N-ε-말레이미도카프로산 하이드라지드(EMCH) 링커에 공유 결합되고, 링커는 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자의 설프하이드릴기, 예컨대 시스테인의 설프하이드릴기에 티오-에테르 결합을 통해 공유 결합되는, 접합체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 적어도 하나의 사포닌의 아글리콘 코어 구조의 C3베타-OH 기에 있는 제1 당류 사슬의 글루쿠론산 작용기는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU) 링커와 같은 링커에 공유 결합되고, 링커는 공유 사포닌 접합체의 올리고머 분자 또는 폴리머 분자의 아민기, 예컨대 라이신 또는 단백질 N-말단의 아민기에 아미드 결합을 통해 공유 결합되는, 접합체.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 사포닌 접합체의 폴리머 분자 또는 올리고머 분자는 sdAb에, 바람직하게는 공유 사포닌 접합체의 폴리머 분자 또는 올리고머 분자 상의 클릭 화학기를 포함하는 sdAb의 아미노산 잔기에 결합하고, 클릭 화학기는 바람직하게는 테트라진, 아지드, 알켄, 알킨, 또는 이들 기의 환형 유도체로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 클릭 화학기는 아지드인, 접합체.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 사포닌 접합체의 폴리머 분자 또는 올리고머 분자는 선형 폴리머, 분지형 폴리머, 및/또는 환형 폴리머, 올리고머, 덴드리머, 덴드론, 덴드론화된 폴리머, 덴드론화된 올리고머, DNA, 폴리펩티드, 폴리라이신, 폴리에틸렌 글리콜, 올리고에틸렌 글리콜(OEG), 예컨대 OEG3, OEG4, 및 OEG5로부터 선택되는 폴리머 구조 및/또는 올리고머 구조, 또는 이들 폴리머 구조 및/또는 올리고머 구조의 어셈블리를 포함하고, 어셈블리는 바람직하게는 공유 가교에 의해 구축되고, 바람직하게는 공유 사포닌 접합체의 폴리머 분자 또는 올리고머 분자는 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머와 같은 덴드론인, 접합체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, sdAb는 단일 sdAb이거나 2개 이상, 바람직하게는 2개의 sdAb이고, sdAb는 세포의 종양 세포 표면 분자, 바람직하게는 종양 세포 표면 수용체, 예컨대 종양 세포 특이적 수용체, 보다 바람직하게는 CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, 인테그린, 신데칸-1, 혈관 인테그린 알파-V 베타-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, 엽산 수용체 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L 수용체, 전립선 특이 막항원(PSMA), CanAg, 인테그린-알파V, CA6, CD33, 메소텔린, 크립토(Cripto), CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, 에프린A4, MUC-1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA-4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, c-Met(HGFR), EGFR1, RANKL, ADAMTS5, CD16, CXCR7(ACKR3), 글루코코르티코이드-유도 TNFR 관련 단백질(GITR) 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 세포의 수용체, 가장 바람직하게는 HER2, c-Met, VEGFR2, CXCR7, CD71, 및 EGFR1로부터 선택되는 세포의 수용체에 결합할 수 있는, 접합체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, sdAb는 단일 sdAb이거나 2개 이상, 바람직하게는 2개의 sdAb이고, sdAb는 항-CD71 sdAb, 항-HER2 sdAb, 항-CD20 sdAb, 항-CA125 sdAb, 항-EpCAM(17-1A) sdAb, 항-EGFR sdAb, 항-CD30 sdAb, 항-CD33 sdAb, 항-혈관 인테그린 알파-v 베타-3 sdAb, 항-CD52 sdAb, 항-CD22 sdAb, 항-CEA sdAb, 항-CD44v6 sdAb, 항-FAP sdAb, 항-CD19 sdAb, 항-CanAg sdAb, 항-CD56 sdAb, 항-CD38 sdAb, 항-CA6 sdAb, 항-IGF-1R sdAb, 항-인테그린 sdAb, 항-신데칸-1 sdAb, 항-CD79b, 항-c-Met sdAb, 항-EGFR1 sdAb, 항-VEGFR2 sdAb, 항-CXCR7 sdAb로부터 선택되고, sdAb는 바람직하게는 VHH, 보다 바람직하게는 낙타과 VH인, 접합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체는 HER2, CD71, 또는 EGFR에 결합할 수 있는 sdAb를 포함하고, sdAb는 바람직하게는 VHH, 보다 바람직하게는 낙타과 VH인, 접합체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체는 클론 11A4, 클론 18C3, 클론 22G12, 클론 Q17, 또는 클론 Q17-C-태그에 의해 생성된 sdAb로부터 선택되는 HER2에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-EGFR Q86-C-태그에 의해 생성된, EGFR에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-CD71 Q52-C-태그에 의해 생성된, CD71에 결합하기 위한 sdAb; 또는 클론 항-HIVgp41 Q8-C-태그에 의해 생성된, HIVgp41에 결합하기 위한 sdAb; 또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 및 31 중 어느 하나의 cDNA에 의해 암호화된 sdAb; 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 36 내지 72의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 중 어느 하나, 또는 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 7D12 및 9G8의 이중파라토프성 직렬형태(tandem), 또는 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 7D12, 또는 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 9G8을 포함하고, 임의로 접합체는 알부민에 결합하기 위한 sdAb, 예컨대 서열번호 33, 34, 및 35의 아미노산 서열을 갖는 sdAb 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함하는, 접합체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체는 분자 I의 일반 구조로 표시되고:
    (분자 I)
    sdAb1 (-L1-Su1)n -[ L2a-((-sdAb2)m1 (-L3-Su2)p)q1 … L2i-((-sdAb9)m2 (-L4-Su3)p)q2]-(L5-sdAb10r (-L6-Su4)t)v,
    여기서, sdAb1, sdAb2 … sdAb9, sdAb10은 sdAb1, sdAb2, sdAb3, sdAb4, sdAb5, sdAb6, sdAb7, sdAb8, sdAb9, 및 sdAb10이고, 이들 sbAb는 동일한 sdAb이고;
    S는 적어도 하나의 사포닌 모이어티이고;
    L1, L3, L4, 및 L6은 각각 독립적으로, 적어도 하나의 사포닌을 sdAb에 연결하는 공유 결합 또는 공유 링커이고, 이러한 링커는 동일하거나 상이하고;
    L2a 내지 L2i, 및 L5는 각각 독립적으로, 하나 초과의 sdAb가 존재하는 경우 2개의 연속 sdAb를 연결하는 공유 결합 또는 공유 링커이고, 이러한 링커는 동일하거나 상이하고;
    n은 0~4로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
    m1, m2는 각각 독립적으로 0~10으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 m1 및/또는 m2는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이고(m1 또는 m2가 1보다 큰 경우, 연속 sdAb는 바람직하게는 링커를 통해 공유 연결됨);
    p는 0~4로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 p는 1, 2, 3, 또는 4이고;
    q1, q2는 각각 독립적으로 0~10으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 q1 및/또는 q2는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이고;
    r은 0~10으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 r은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9이고;
    t는 0~4로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 t는 1, 2, 3, 또는 4이고;
    u1, u2, u3, u4는 각각 독립적으로 0~100으로부터 선택되는 정수이고, 바람직하게는 u1, u2, u3, 및/또는 u4는 0, 1, 2, 4, 16, 32, 또는 64이고, 바람직하게는 u1, u2, u3, 및 u4는 동일하고;
    v는 0 또는 1인, 접합체.
  31. 제30항에 있어서, L1 및 L2a는 링커, u1은 0 초과, n은 0 초과, m1은 1~9 중 임의의 수, p는 0, q1은 1, m2는 0, u2는 0, u3은 0, q2는 0, v는 0, r은 0, u4는 0, t는 0이거나, 또는 L1, L2a, L5, 및 L6은 링커, u1은 0, n은 0, m1은 1~9 중 임의의 수, u2는 0, p는 0, q1은 1, m2는 0, u3은 0, p는 0, q2는 0, r은 1, u4는 1 초과, t는 1 초과, v는 1인, 접합체.
  32. 약제학적 조합물로서,
    - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하고, 임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 제1 약제학적 조성물; 및
    - 약물 분자, mRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, EGF-다이안틴 또는 EGF-사포린과 같은 리간드-약물 접합체, 사포린, 다이안틴, 또는 BNA와 접합된 OKT9 단일클론 항-CD71 항체, 트라스투주맙, 또는 세툭시맙과 같은 항체-약물 접합체(ADC), 항체-올리고뉴클레오티드 접합체(AOC)와 같은 리간드-올리고뉴클레오티드 접합체, 예컨대 항체-BNA 접합체 또는 항체-siRNA 접합체 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 것과 같은 활성 약제학적 성분(ADC 또는 AOC의 항체는 임의로 적어도 하나의 sdAb를 포함하거나 이로 구성되고, ADC 또는 AOC에 포함된 적어도 하나의 sdAb는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 접합체의 sdAb와 상이하거나 동일함)을 포함하고, 임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제를 포함하는 제2 약제학적 조성물
    을 포함하는 약제학적 조합물.
  33. 약제학적 조성물로서,
    - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 접합체;
    - 약물 분자, mRNA와 같은 올리고뉴클레오티드, ASO, EGF-다이안틴 또는 EGF-사포린과 같은 리간드-약물 접합체, 사포린, 다이안틴, 또는 BNA와 접합된 OKT9 단일클론 항-CD71 항체, 트라스투주맙, 또는 세툭시맙과 같은 ADC, AOC와 같은 리간드-올리고뉴클레오티드 접합체, 예컨대 항체-BNA 접합체 또는 항체-siRNA 접합체로부터 선택되는 것과 같은 하나 이상의 활성 약제학적 성분(ADC 또는 AOC의 항체는 임의로 적어도 하나의 sdAb를 포함하거나 이로 구성되고, ADC 또는 AOC에 포함된 적어도 하나의 sdAb는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 접합체의 sdAb와 상이하거나 동일함); 및
    임의로 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 희석제
    를 포함하는 약제학적 조성물.
  34. 제32항의 약제학적 조합물 또는 제33항의 약제학적 조성물에 있어서, ADC 또는 AOC의 항체는 VHH, 바람직하게는 낙타과 VH이거나 이를 포함하는, 약제학적 조합물 또는 약제학적 조성물.
  35. 제32항 또는 제34항의 약제학적 조합물 또는 제33항 또는 제34항의 약제학적 조성물에 있어서, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 접합체는 HER2, CD71, 또는 EGFR에 결합할 수 있는 sdAb를 포함하고/하거나, 하나 이상의 활성 약제학적 성분은 HER2, CD71, 또는 EGFR에 결합할 수 있는 sdAb를 포함하고/하거나, ADC는 다이안틴 또는 사포린을 포함하는, 약제학적 조합물 또는 약제학적 조성물.
  36. 약제로 사용하기 위한 제32항, 제34항, 또는 제35항 중 어느 한 항의 약제학적 조합물 또는 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  37. 암, 자가면역 질환, 바이러스 감염 등의 감염, 효소결핍증, 효소결핍증과 관련된 장애 또는 질환, 유전자 결손, 유전자 결손과 관련된 장애 또는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제32항, 제34항, 또는 제35항 중 어느 한 항의 약제학적 조합물 또는 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  38. 분자를 세포 외부로부터 상기 세포 내부로, 바람직하게는 상기 세포의 세포질액에 전달하기 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 sdAb에 대한 결합 부위를 표면에 발현하는 세포(바람직하게는 간 세포, 바이러스 감염 세포와 같은 비정상적인 세포, 자가면역 세포, 및 종양 세포로부터 선택됨)를 제공하는 단계;
    b) 단계 a)에서 제공된 세포 내로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계(분자는 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항의 활성 약제학적 성분 중 임의의 하나 이상임);
    c) 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 접합체를 제공하는 단계;
    d) 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 접합체와 시험관내 또는 생체외 접촉시켜, 세포 외부로부터 상기 세포 내로, 바람직하게는 상기 세포의 세포질액 내로 분자를 전달하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  39. 제32항, 제34항, 또는 제35항 중 어느 한 항의 약제학적 조합물 또는 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물, 또는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 접합체, 및 제32항 또는 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 상기 약제학적 조합물의 사용, 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 상기 약제학적 조성물의 사용, 또는 제38항에 따른 접합체의 사용을 위한 설명서를 포함하는 부품 키트.
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