CN116437965A - 皂苷、寡核苷酸和galnac的缀合物 - Google Patents

皂苷、寡核苷酸和galnac的缀合物 Download PDF

Info

Publication number
CN116437965A
CN116437965A CN202180070494.9A CN202180070494A CN116437965A CN 116437965 A CN116437965 A CN 116437965A CN 202180070494 A CN202180070494 A CN 202180070494A CN 116437965 A CN116437965 A CN 116437965A
Authority
CN
China
Prior art keywords
saponin
oligonucleotide
xyl
rha
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180070494.9A
Other languages
English (en)
Inventor
盖伊·赫尔曼斯
鲁本·波斯特尔
赫尔曼·范德兰格曼
马兹达克·阿萨迪亚比尔詹德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Saprami Technology Co ltd
Original Assignee
Saprami Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from NL2027405A external-priority patent/NL2027405B1/en
Priority claimed from PCT/NL2021/050384 external-priority patent/WO2021261992A1/en
Application filed by Saprami Technology Co ltd filed Critical Saprami Technology Co ltd
Priority claimed from PCT/NL2021/050549 external-priority patent/WO2022055351A1/en
Publication of CN116437965A publication Critical patent/CN116437965A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

本发明涉及缀合物，该缀合物包含共价连接至ASGPR的配体的皂苷并且包含共价连接至该皂苷和该ASGPR的配体的寡核苷酸，该配体包含至少一个GalNAc部分。此外，本发明涉及包含本发明的缀合物的药物组合物。此外，本发明涉及本发明的药物组合物，用作药物。本发明还涉及本发明的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及例如以下基因的疾病或健康问题中使用：apoB、HSP17、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT和LDH，并且用于在治疗或预防以下中使用：例如癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR淀粉样变性、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、或自身免疫性疾病。本发明还涉及一种用于生产本发明的寡核苷酸缀合物的方法。最后，本发明涉及一种体外或离体方法，该方法用于将本发明的缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内。

Description

皂苷、寡核苷酸和GALNAC的缀合物
技术领域
本发明涉及一种寡核苷酸缀合物，其包含与ASGPR的配体(ASGPR配体)共价连接的皂苷，并且进一步包含共价连接的寡核苷酸，即(皂苷、寡核苷酸、ASGPR配体)缀合物，其包含与ASGPR的配体共价连接的皂苷，所述配体包含至少一个GalNAc，其中皂苷-寡核苷酸-ASGPR配体缀合物进一步包含共价结合的寡核苷酸，例如siRNA或反义寡核苷酸(称为本发明的寡核苷酸缀合物)。此外，本发明涉及包含皂苷-寡核苷酸-ASGPR配体缀合物的本发明的药物组合物，用作药物。本发明还涉及本发明的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及例如以下基因的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，以及用于在治疗或预防以下中使用：例如癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、心血管疾病、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、α1-抗胰蛋白酶缺乏、β-地中海贫血或自身免疫性疾病。本发明还涉及一种用于生产本发明的寡核苷酸缀合物的方法。最后，本发明涉及一种体外或离体方法，该方法用于将本发明的皂苷-寡核苷酸-ASGPR配体缀合物(也称为本发明的寡核苷酸缀合物)从细胞的外部转移到所述细胞内。
背景技术
无论是在人中还是在病原体中，抑制蛋白质功能的能力都是新药发现不可或缺的一部分。传统的小分子药物以及抗体都强烈受限于可用靶标的子集。小分子主要与辅因子位点或递质位点结合，这些位点是设计用于容纳小分子的有效位点。抗体可以结合多种蛋白质，但通常限于细胞外靶标。
寡核苷酸疗法是相对年轻且快速发展的领域，其旨在通过直接操纵基因转录和翻译途径来克服小分子药物或抗体药物遇到的许多问题。寡核苷酸的效力和多功能性、特别是阻抑编码经典小分子药物“不可用药的”蛋白质的基因的前景，使其成为有吸引力的药物候选物。第一批寡核苷酸药物基于反义技术，由此，单链核酸分子将与其互补的mRNA靶标以序列特异性方式结合，从而触发核糖核酸酶H系统对双链体的降解。
1998年，Andrew Fire和Craig Mello发表了一篇开创性的论文，该论文将双链RNA(dsRNA)鉴定为秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)转录后基因沉默(PTGS)(他们将该现象称为RNA干扰(RNAi))的诱因。RNAi的发现解释了在植物和真菌中令人困惑的基因沉默观察结果，并引发了生物学的一场革命，最终表明非编码RNA是多细胞生物中基因表达的中心调节物。此后不久，发现了小的dsRNA(典型地15-30个碱基对(bp))可以在哺乳动物细胞中催化诱导RNAi沉默，而不会引发非特异性干扰素应答。通过小的dsRNA(如小干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA))靶向RNAi途径与反义相比具有几个理论优势，其明显更高效(催化)并且对基因表达产生更长时间的抑制。这可以转化为更低的剂量和更低的成本以及更低频率的给药。较低的暴露也可以意味着较少的siRNA毒性问题。
然而，在siRNA到达其体内靶标之前，其面临着许多阻碍其通往RNA诱导沉默复合物(RISC)机器的途径的重大障碍。siRNA进入血流后，由于其小尺寸和高度阴离子特性，其容易被内源性核酸酶降解并被肾排泄。另外，在到达其靶细胞之前，siRNA必须穿过血管的紧密内皮连接，并通过细胞外基质扩散。由于siRNA具有大量的负电荷，其不容易与细胞膜结合或穿过细胞膜，并且一旦在细胞内，其必须从内体中逃逸以与其细胞内蛋白靶标相互作用。
因此，寡核苷酸(如siRNA)疗法的成功极大地依赖于将药物从细胞的外部有效地递送到胞质溶胶中。因此，许多注意力集中在开发改善寡核苷酸(例如siRNA和反义寡核苷酸)递送的递送系统上。除了病毒递送外，用于增强siRNA(或其他寡核苷酸)向细胞递送的主要方法采用脂质体、细胞穿透肽(CPP)及它们的模拟物、或纳米颗粒(Gooding,Matt,等人.Chemical biology&drug design[化学生物学和药物设计]80.6(2012)：787-809)。安全性问题(如插入诱变和免疫发生的可能性)被认为限制了病毒方法的未来。
脂质体是寡核苷酸(如siRNA)最常用的递送载体，其中将寡核苷酸包封在脂质双层内。脂质体寡核苷酸递送遇到了几个问题，如氧自由基介导的毒性(对于阳离子脂质体是典型的)、细胞毒性、对基因调节的影响和炎症应答。此外，使用脂质的体内递送似乎主要靶向肝和脾脏。
细胞穿透肽(CCP)也称为蛋白质转导结构域，是具有能够穿过细胞膜的特殊性质的短肽(长度通常<30个氨基酸残基)。通过与寡核苷酸共价连接或者通过与寡核苷酸形成非共价复合物，CPP可以增强寡核苷酸的细胞摄取。CPP介导的寡核苷酸递送领域极其复杂，因为它在单个药物中结合了寡核苷酸技术和肽技术两者(这两个领域还远未成熟)所带来的挑战。除了寡核苷酸相关的问题外，CPP遇到的典型挑战与肽链的体内稳定性(缺乏)相关，通常需要使用非天然肽衍生物，这些非天然肽衍生物合成复杂并且/或者表现出降低的细胞穿透活性。
尽管细胞递送增强，但克服内体的包埋是设计高效CPP和其他转运系统的主要挑战之一(Gooding等人)。
纳米颗粒和纳米载体是纳米级的寡核苷酸递送系统，典型地由聚合物、生物稳定剂以及与寡核苷酸复合的细胞靶向配体组成。已知一种示例性siRNA纳米载体系统的名称为siRNA动态聚缀合物。该系统基于与作为生物稳定剂的聚乙二醇(PEG)和肝细胞靶向配体连接的两亲性聚合物，其中siRNA通过二硫键与聚合物共价结合。靶向部分和PEG部分经由马来酰胺连接附接到聚合物上，形成带负电荷的纳米颗粒，不与血清蛋白结合。通过胞吞作用内化后，马来酰胺键在内体酸化时容易水解，暴露出聚合物的阳离子胺基团，并经由质子海绵作用诱导内体逃逸。还已知纳米载体为阳离子聚合物形式，如聚乙烯亚胺(PEI)(有时与环糊精组合)，其可与寡核苷酸(如siRNA)形成静电复合物，提供防止降解的保护并帮助内化。然而，膜破坏和细胞凋亡诱导导致的高浓度毒性可能限制阳离子聚合物作为治疗性递送剂的应用。除了纳米颗粒和纳米载体的复杂制备之外，它们的长期稳定性是商业上可行使用的主要障碍。
寡核苷酸可用于通过一系列过程调节基因表达，包括RNAi、通过RNA酶H介导的切割进行的靶标降解、剪接调节、非编码RNA抑制、基因激活和程序化基因编辑。寡核苷酸是具有治疗或控制多种疾病潜力的核酸聚合物。尽管大多数寡核苷酸疗法都集中在基因沉默上，但其他策略也在探索中，包括剪接调节和基因激活，从而将可能的靶标范围扩大到传统药物模式通常无法达到的范围之外。
药物寡核苷酸的实例是单链反义寡核苷酸和双链短干扰RNA(siRNA)，它们具有相同的基本原理：寡核苷酸通过沃森-克里克碱基配对结合靶RNA，由此产生的双链指导靶信使RNA(mRNA)的降解。在细胞质中(在siRNA的情况下)或细胞核中(在反义寡核苷酸的情况下)，寡核苷酸可以调节同源RNA的表达。反义寡核苷酸(ASO)是小的(约18-30个核苷酸)合成单链核酸聚合物，具有多种化学性质，可用于通过多种机制调节基因表达。ASO可分为两大类：RNA酶H能力型(RNase H competent)和空间位阻型(steric block)。空间位阻型寡核苷酸是ASO，旨在以高亲和力结合靶转录物，但由于缺乏RNA酶H能力，因此不会诱导靶转录物降解。空间位阻型寡核苷酸可以掩盖靶转录物中的特定序列，从而干扰转录物RNA-RNA和/或RNA-蛋白质相互作用。siRNA分子是RNAi的效应分子，通常由特征性的19+2mer结构组成(即两个21-核苷酸RNA分子的双链体，具有19个互补碱基和末端2-核苷酸3’突出端)。siRNA的一条链(引导链或反义链)与靶转录物互补，而另一条链指定为过客链或有义链。siRNA的作用是引导作为RNA诱导沉默复合物(RISC)的一部分的Argonaute2蛋白(AGO2)到达互补的靶转录物。siRNA和靶转录物之间的完全互补导致引导链的靶相对位置10-11的切割(即切片活性)，由AGO2催化，导致基因沉默。siRNA方法包括Dicer底物siRNA、小的内部分段siRNA、自递送siRNA(不对称和疏水性)、单链siRNA和二价siRNA。空间位阻型ASO通过直接结合RISC复合物中的小RNA种类而竞争性地抑制miRNA。这种ASO被称为抗miRNA寡核苷酸、抗miR或antagomir。第一个进入临床试验的抗miRNA药物是miravirsen(SPC3649)，它是一种ASO，旨在通过靶向肝特异性miRNA miR-122来治疗慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染。其他类别的寡核苷酸疗法通过结合到前体mRNA上的剪接位点来调节RNA功能，这导致-例如-在肌肉萎缩症等疾病中含有突变的外显子的跳过。
用于临床应用的寡核苷酸的其他实例是微小RNA(miRNA)，它们是以下中涉及的内源性RNAi触发器，例如癌症、细胞周期进程、感染性疾病、免疫、糖尿病、代谢、肌生成和肌营养不良。嵌入长一级miRNA转录物中的MiRNA发夹依次被两种RNA酶III家族酶DICER1(Dicer)和DROSHA加工，这分别释放发夹然后切割环序列。将产生的双链RNA(类似于siRNA)加载到Argonaute蛋白(例如AGO2)中，并丢弃一条链以生成成熟的单链miRNA种类。与siRNA一样，miRNA将RISC引导至它们启动基因沉默的靶序列。与siRNA相比，miRNA通常以部分互补性结合，并通过切片独立机制诱导沉默。
治疗性寡核苷酸的长度通常为15至30个核苷酸并且旨在与编码疾病相关蛋白的信使RNA(mRNA)或调节性RNA的特定区域互补。肠胃外施用后，寡核苷酸进入细胞并与任何互补RNA结合。一旦寡核苷酸药物与其互补的mRNA或前体mRNA结合，就会发生一系列事件。结局部分地取决于靶向的序列的性质，并且包括通过以下破坏mRNA：酶促切割(这在mRNA发生突变并编码致病蛋白时很有帮助)，前体mRNA剪接模式的变化(这是当“默认”剪接模式产生致病产物时很有帮助)，或调节性RNA的功能的变化。
包含寡核苷酸的药物分子的实例是siRNA-GalNAc缀合物，其中siRNA部分靶向PCSK9酶。这种酶结合并降解低密度脂蛋白受体(当与低密度脂蛋白结合时)并且是治疗心血管疾病的靶标。另一个实例是包含针对在肝中表达的载脂蛋白(a)的反义寡核苷酸的GalNAc缀合物。基因DMD也是基于寡核苷酸的药物分子的靶标。Duchenne肌营养不良是由DMD(编码抗肌萎缩蛋白的基因)突变引起的致命疾病。脊髓性肌肉萎缩是一种常染色体隐性遗传病，由导致SMN1蛋白功能丧失的SMN1突变引起。基于寡核苷酸的疗法的靶标是基因SMN2。
使用序列驱动的切割机制来降低疾病相关mRNA及其蛋白质产物水平的寡核苷酸药物是例如米泊美生(mipomersen)和英克西兰(inclisiran)，它们使用切割机制来改变胆固醇分布。这两种药物各自靶向不同的基因产物，每种基因产物在高胆固醇血症中都很重要。由于每种寡核苷酸药物与靶标的杂交，每种机制中的共同因素是内源酶的激活，这导致靶mRNA在杂交位点被切割。米泊美生是一种单链寡核苷酸，其序列与编码载脂蛋白B(apoB)的RNA的一部分互补，载脂蛋白B是肝中产生的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的组分。当米泊美生与载脂蛋白B的前体mRNA杂交时，DNA-RNA异双链体的存在吸引并激活RNA酶H，后者切割异双链体中的mRNA。切割使载脂蛋白B mRNA失活，从而减少产生的载脂蛋白B的量。结果，从肝输出的极低密度脂蛋白胆固醇减少，最终，LDL胆固醇的循环水平降低。英克西兰诱导编码前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-科信9型(PCSK9)的mRNA的裂解，PCSK9是一种负调节LDL受体(LDLR)水平的酶。与没有这些变异的人相比，具有降低PCSK9活性的自然发生的遗传变异的人具有增加的LDLR水平，降低的LDL胆固醇水平和降低的心血管风险。英克西兰切割并使PCSK9 mRNA失活，这具有降低PCSK9水平的作用，并且因此增加LDLR水平和LDL胆固醇清除率，并降低LDL胆固醇的循环水平。英克西兰是一种双链小干扰RNA(siRNA)。英克西兰的一条RNA链与PCSK9mRNA的一部分互补。一旦英克西兰进入细胞，互补链(或引导链)就会被加载到RNA诱导沉默复合物(RISC)中，这是一种将链展示给细胞内环境的蛋白质复合物。一旦近乎完全互补的序列(在mRNA分子内)与引导链的一部分杂交，作为RISC一部分的酶就会切割mRNA。mRNA切割产物无法翻译，PCSK9蛋白水平因此降低。
触发RNA酶H介导和RISC介导的切割的基于寡核苷酸的药物(分别为inotersen和patisiran)正在用于治疗甲状腺素转运蛋白(TTR)淀粉样变性。在这种形式的淀粉样变性中，TTR中的突变会导致蛋白质产物的错误折叠，从而导致在包括外周神经元和心脏在内的多种组织中形成淀粉样蛋白沉积物。
FDA批准的靶向肝的寡核苷酸治疗剂有米泊美生(靶向基因apoB，用于治疗纯合子家族性高胆固醇血症)、去纤苷(肝静脉闭塞性疾病)、patisiran TTR(遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性、多发性神经病)、inotersenTTR(遗传性甲状腺素转运蛋白淀粉样变性，多发性神经病)和givosiran。Givosiran是一种用于治疗急性肝卟啉症的GalNAc缀合物；靶基因是ALAS1。临床开发中的靶向肝中的基因的寡核苷酸候选药物是例如靶向miR-122(丙型肝炎感染)的miravirsen、靶向miR-122(丙型肝炎感染)的RG-101、靶向乙型肝炎病毒HBsAg(乙型肝炎感染)的AB-729、靶向AAT(α1-抗胰蛋白酶缺乏)的ARO-AAT、靶向基因TMPRSS6(β-地中海贫血)的SLN124、靶向LDHA(原发性高草酸尿症)的DCR-PHXC和靶向CEBPA(肝细胞癌)的MTL-CEPBA。
尽管取得了相当大的进步，但仍存在两个主要障碍阻碍寡核苷酸疗法的广泛应用：药物安全和递送。事实证明，无法将寡核苷酸候选药物递送至表达疾病相关RNA的器官和细胞是成功开发寡核苷酸疗法的最大障碍。寡核苷酸比传统的小分子候选药物大得多。它们的大小加上高度阴离子的性质，使它们难以扩散穿过细胞膜到达细胞质和细胞核区室。寡核苷酸通常是大的亲水性聚阴离子(单链ASO约为4-10kDa，双链siRNA约为14kDa)，这些特性意味着它们不易穿过质膜。此外，当考虑到寡核苷酸在胞质溶胶和/或细胞核中的充分释放和递送时，当考虑到寡核苷酸在溶酶体降解之前从溶酶体内系统逃逸或通过胞吐作用再输出以便能够到达正确的细胞内作用位点时，出现了困难。目前的寡核苷酸细胞递送策略效率低下，导致药物从肾排泄或大部分药物被递送至不具有治疗意义的细胞和组织。尽管上述递送系统中的一些可以实现改善的向细胞的寡核苷酸(如siRNA)递送，但是内体逃逸仍然是基于寡核苷酸的治疗剂(如基于RNAi的治疗剂)的应用的主要障碍。只有极小部分胞吞寡核苷酸逃逸到细胞质空间，其在细胞质空间中可以发挥其预期的功能，而绝大多数胞吞寡核苷酸仍然被困在胞吞区室中并且是无活性的。最近的文献表明被动siRNA逃逸率为<0.01％(Setten,Ryan L.等人,Nature Reviews Drug Discovery[自然评论药物发现]18.6(2019)：421-446)。此外，已经证明细胞将寡核苷酸功能性地内化以产生靶作用(例如，敲低)的能力似乎不依赖于细胞内化大量寡核苷酸的程度。这些观察导致了分离的“生产性”和“非生产性”自由摄取途径的假设，尽管区分这些途径的分子机制仍不清楚(Setten,Ryan L.,John J.Rossi和Si-ping Han.Nature Reviews Drug Discovery[自然评论药物发现]18.6(2019)：421-446)。
总之，仍然迫切需要改善的寡核苷酸递送系统，其产生增加的效力(例如，靶标敲低)、更小的毒性和/或更小的脱靶效应，无论潜在的机制为何(改善的内体逃逸、增加的“生产性”途径摄取、或另一机制)。
一种新兴的策略需要使反义寡核苷酸(ASO)与受体配体缀合以增加寡核苷酸的效力和对选择的组织的分布。例如，三触角型N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)与寡核苷酸治疗剂的缀合在分离的肝细胞以及体内肝中产生的效力增加了10-30倍。在受损的糖蛋白上发现了GalNAc，这些糖蛋白从其悬垂的寡糖中失去了末端唾液酸残基。肝通过在肝细胞表面上以非常高的水平(105-106/细胞的数量级)表达三聚脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)将这些蛋白质从体循环中清除。ASGPR在中性pH下与GalNAc特异性结合，用于从血液中将循环大分子胞吞，并在酸性pH(约5-6)下释放GalNAc，用于早期内体中的负荷物卸载。然后将游离的ASGPR回收到细胞表面以供再次使用。目前临床试验中大约三分之一的RNAi药物是与靶向ASGPR的多价GalNAc配体缀合的单分子、化学修饰的RNAi触发物。合适的肝生理学、ASGPR的独特特性、GalNAc配体的无毒性质以及GalNAc-siRNA缀合物的简便性使其成为全身性RNAi递送至肝细胞的一种有吸引力的方法。
通过脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导的摄取将寡核苷酸治疗剂(寡核苷酸生物缀合物)靶向递送至肝细胞，缀合物与其相应的细胞表面受体蛋白之间的相互作用得以促进，导致随后通过受体介导的内吞作用进行内化。生物缀合物与细胞类型相关受体的相互作用从而能够靶向递送至特定组织或组织内的细胞类型。ASGPR结合并内化三触角N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，其与例如治疗性反义寡核苷酸缀合(这些寡核苷酸被内化，然后释放到细胞内，在那里它们可以与其同源前体信使RNA杂交(mRNA)并诱导RNA-DNA异双链体的切割)，或者例如与针对疾病相关基因的小干扰RNA(siRNA)缀合。从内体或溶酶体区室释放siRNA后，现在细胞质的siRNA可以加载到RNA诱导沉默复合物(RISC)中。然后加载的RISC可以扫描所有表达的RNA的序列互补性。当通过杂交检测到互补序列时，作为RISC一部分的酶会切割靶向的mRNA，从而减少疾病相关蛋白的表达。RNAi表示RNA干扰。这种受体介导的摄取允许低于未缀合寡核苷酸的治疗性递送所需的剂量。使用GalNAc缀合物可以将单链和双链寡核苷酸递送至肝细胞。例如，基于以下来开发治疗血友病A和血友病B等疾病的药物：寡核苷酸-GalNAc缀合物，以及siRNA-GalNAc缀合物英克西兰(其靶向基因PCSK9)和siRNA-GalNAc缀合物givosiran(其靶向基因ALAS1)。
尽管技术进步，实现有效的寡核苷酸递送仍然是一个主要的翻译限制。对于基于寡核苷酸的药物平台，使用了旨在改善寡核苷酸递送的方法，例如寡核苷酸的化学修饰、生物缀合和使用纳米载剂递送寡核苷酸，但递送挑战仍然需要改进。仍然需要改进的递送系统，这些递送系统进一步增加ASGPR靶向的寡核苷酸系统(例如GalNAc-寡核苷酸缀合物)的效力、降低其毒性并且/或者降低其脱靶效应。
发明内容
本发明的方面涉及一种寡核苷酸缀合物，该寡核苷酸缀合物包含至少一个皂苷，该至少一个皂苷共价连接至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，并且进一步共价连接至寡核苷酸，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
本发明的一个方面涉及药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸缀合物，以及任选的药学上可接受的赋形剂和/或任选的药学上可接受的稀释剂。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物，用作药物。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27和apoB，优选apoB，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27和apoB，优选apoB。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物，用于治疗或预防癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、心血管疾病、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、α1-抗胰蛋白酶缺乏、β地中海贫血或自身免疫性疾病。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物，用于治疗或预防癌症如子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌或肝细胞癌，以及高胆固醇血症等心血管疾病，优选高胆固醇血症。
本发明的一个方面涉及体外或离体方法，该方法用于将本发明的寡核苷酸缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选随后将本发明的寡核苷酸缀合物所包含的寡核苷酸转移到所述细胞的胞质溶胶中和/或细胞核中，该方法包括以下步骤：
a)提供在其表面表达ASGPR，优选ASGPR1的细胞，该细胞优选选自肝细胞、病毒感染的哺乳动物细胞和哺乳动物肿瘤细胞，其中优选所述细胞是人细胞；
b)提供本发明的寡核苷酸缀合物，用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)使步骤a)的细胞体外或离体地与步骤b)的寡核苷酸缀合物接触，优选在液体介质中，从而实现寡核苷酸缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，并且任选地并且优选地从而随后实现寡核苷酸缀合物包含的寡核苷酸转移到所述细胞的胞质溶胶和/或细胞核中。
本发明的方面涉及一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体共价连接的至少一个皂苷，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
本发明的方面涉及一种药物组合，该药物组合包含：
-第一药物组合物，该第一药物组合物包含本发明的皂苷缀合物并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂；及
-第二药物组合物，该第二药物组合物包含效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
本发明的方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含：
-本发明的皂苷缀合物；
-效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
本发明的一个方面涉及包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或涉及包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，用作药物。
本发明的一个方面涉及包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH。
本发明的方面涉及一种体外或离体方法，该方法用于将本发明的第二缀合物或第三缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选地随后将根据本发明的第二缀合物或第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面上表达ASGPR并且当将该第三缀合物转移到该细胞中时该细胞表达细胞表面分子，其中该第三缀合物包含用于与所述细胞表面分子结合的结合分子，该细胞优选地选自肝细胞、病毒感染细胞和肿瘤细胞；
b)提供如本发明任一项所述的第二缀合物或第三缀合物用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供本发明的皂苷缀合物；
d)使步骤a)的细胞与步骤b)的第二缀合物或第三缀合物以及步骤c)的皂苷缀合物在体外或离体接触，从而实现将该第二缀合物或该第三缀合物从所述细胞的外部转移到所述细胞中，并且优选地从而随后实现将该第二缀合物或该第三缀合物转移到所述细胞的胞质溶胶中，或者优选地从而随后实现将至少该第二缀合物或该第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中。
本发明的一个方面涉及提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供至少一个包含共价结合的第一接头的皂苷部分，其中该第一接头包含至少一个用于与第二接头上的第二反应基团或第七接头上的第七反应基团共价结合的第一反应基团；
(b)提供包含共价结合的第三接头的寡核苷酸，其中该第三接头包含用于与第四接头上的第四反应基团或第七接头上的第八反应基团共价结合的第三反应基团；
(c)提供至少一个包含共价结合的第五接头的GalNAc部分，其中该第五接头包含用于与第六接头上的第六反应基团或第七接头上的第九反应基团共价结合的第五反应基团；及
以下中的任何一个
(d1)通过在该第一反应基团和该第二反应基团之间形成共价键将该第一接头连接到该第二接头，通过在该第三反应基团和该第四反应基团之间形成共价键将该第三接头连接到该第四接头，通过在该第五反应基团和该第六反应基团之间形成共价键将该第五接头连接到该第六接头，并将该第二接头、第四接头和第六接头共价连接在一起，从而提供该寡核苷酸，
或
(d2)通过在该第一反应基团和该第七反应基团之间形成共价键将该第一接头连接到该第七接头，通过在该第三反应基团和该第八反应基团之间形成共价键将该第三接头连接到该第七接头，通过在该第五反应基团和该第九反应基团之间形成共价键将该第五接头连接到该第七接头，从而提供该寡核苷酸缀合物。
实施例是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中该第七接头是三官能接头，例如式(XXI)所示的三官能接头：
Figure BDA0004177963000000131
优选的是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中至少一个皂苷部分是1-16个皂苷部分，优选1-8个皂苷部分，例如1、4或8个皂苷部分。
优选的是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中皂苷是SO1861、SO1832、QS-21或其任何功能性衍生物，优选SO1861或SO1832。
优选的是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中一个或多个皂苷部分通过腙键或缩氨基脲键共价连接。
优选的是用于提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中至少一个GalNAc部分是1-4个GalNAc部分，优选1或3个GalNAc部分。
定义
术语“GalNAc”具有其常规科学含义并且此处是指N-乙酰半乳糖胺及其IUPAC名称：2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-半乳糖。
术语“(GalNAc)3Tris”在例如基于siRNA的疗法领域中具有其常规的科学含义，并且此处是指包含三个GalNAc单元的部分，每个GalNAc单位分别与三(羟甲基)氨基甲烷(tris)(IUPAC名称：2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇)的羟基基团优选地经由至少一个接头共价结合。(GalNAc)3Tris可以作为包含游离胺的分子存在，或者可以经由剩余的胺结合位点进一步官能化，例如形成本文所述的包含(GalNAc)3Tris部分的缀合物。
术语“寡核苷酸”具有其常规的科学含义并且此处是指两个或更多个核苷酸的串，即寡核苷酸是由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的短寡聚物。实例是RNA和DNA，以及任何经修饰的RNA或DNA，例如包含核苷酸类似物(例如桥接核酸(BNA)，也称为锁核酸(LNA)或2’-O,4’-C-氨基亚乙基或2’-O,4’-C-氨基亚甲基桥接核酸(BNANC))的一串核酸，其中核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
术语“RNAi介导的基因靶向”具有其常规的科学含义并且此处是指通过将靶向参与基因转录的mRNA的寡核苷酸(如小双链RNA分子)转移到细胞中来影响所述细胞中的基因发挥功能的体内、离体或体外方法：例如，小双链RNA分子能够高效地触发特定基因的RNAi沉默。
术语“桥接核酸”(或简称“BNA”)或“锁核酸”(或简称“LNA”)或2’-O,4'-C-氨基乙烯或2’-O,4'-C-氨基亚甲基桥接核酸(BNANC)具有其常规的科学含义并且此处是指修饰的RNA核苷酸。BNA也称为“受限RNA分子”或“不可接近的RNA分子”。BNA单体可以包含五元、六元或甚至七元桥接结构，其具有“固定”C3'-内糖折叠。该桥在核糖的2',4'-位置合成地并入，以提供2',4'-BNA单体。可以使用本领域已知的标准亚磷酰胺化学将BNA单体掺入到寡核苷酸聚合物结构中。BNA是具有增加的结合亲和力和稳定性的结构上刚性的寡核苷酸。
术语反义寡核苷酸具有其常规的科学含义并且在说明书中可以简称为“AON”或“ASO”。
术语“基于BNA的反义寡核苷酸”或简称“BNA-AON”具有其常规的科学含义并且此处是指反义核苷酸的串，其中至少一个所述核苷酸是BNA。
术语“朊”具有其常规的科学含义并且在此指的是蛋白样分子，意思是该分子在某种程度上具有蛋白的物理化学性质特征，具有蛋白，与蛋白相关，包含蛋白，属于蛋白，由蛋白组成，类似蛋白，或者是蛋白。在例如“朊分子”中使用的术语“朊”是指存在至少一部分类似于或者是蛋白的分子，其中“蛋白”应理解为包括至少两个残基长的氨基酸残基链，因此包括肽、多肽和蛋白以及蛋白或蛋白结构域的组合。在朊分子中，至少两个氨基酸残基例如经由一个或多个酰胺键(如一个或多个肽键)连接。在朊分子中，氨基酸残基是天然氨基酸残基和/或人工氨基酸残基，如修饰的天然氨基酸残基。在优选的实施例中，朊分子是包含至少两个氨基酸残基(优选地两个至约2.000个氨基酸残基)的分子。在一个实施例中，朊分子是包含2至20个(对于肽是典型的)氨基酸的分子。在一个实施例中，朊分子是包含21至1.000个(对于以下是典型的：多肽、蛋白质、蛋白质结构域，如抗体、Fab、scFv、受体的配体，如EGF)氨基酸的分子。优选地，氨基酸残基(典型地)经由一个或多个肽键连接。根据本发明，所述氨基酸残基是(修饰的)(非)天然氨基酸残基或包含(修饰的)(非)天然氨基酸残基。
当涉及作为例如共价缀合物的一部分的效应分子时，术语“效应分子”或“效应子部分”具有其常规的科学含义并且此处是指可以与例如以下靶分子中的任一个或多个选择性结合并调节这样的一个或多个靶分子的生物活性的分子：蛋白质、肽、碳水化合物、糖类(如聚糖)、(磷)脂、核酸(如DNA、RNA)、酶。效应分子是例如选自以下中的任一个或多个的分子：小分子如药物分子、毒素如蛋白质毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质、或其任何组合。因此，例如，效应分子或效应子部分是选自以下中的任一个或多个的分子或部分：小分子如药物分子、毒素如蛋白质毒素、寡核苷酸如BNA、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质、或其任何组合，该分子或部分可以与以下靶分子中的任一个或多个选择性结合：蛋白质、肽、碳水化合物、糖类(如聚糖)、(磷)脂、核酸(如DNA、RNA)、酶，并在与该靶分子结合后调节这样的一个或多个靶分子的生物活性。典型地，效应分子可以在细胞(如哺乳动物细胞，如人细胞)内、如在所述细胞的胞质溶胶中发挥生物学作用。因此，典型的效应分子是药物分子、质粒DNA、毒素(如由抗体-药物缀合物(ADC)所包含的毒素)、寡核苷酸(如siRNA、BNA)、由抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)包含的核酸。例如，效应分子是可以充当能够增加或减少(细胞内)酶活性、基因表达或细胞信号传导的配体的分子。
术语“健康问题”具有其常规的科学含义并且此处是指当与健康受试者的身体或其部分的状况相比时，受试者(如人患者)的身体、或其部分、器官、肌肉、静脉、动脉、皮肤、肢体、血液、细胞等的任何状况，从而妨碍该受试者的恰当的功能和/或健康，例如削弱人体的正常功能。
术语“GalNAc装饰的寡核苷酸药物”具有其常规的科学含义并且此处是指用于干扰基因转录的寡核苷酸，其中一个或多个GalNAc单元例如经由至少一个接头与寡核苷酸偶联。
术语“锁核酸”，简称“LNA”，是一种桥接核酸，具有其常规的科学含义并且此处是指含有一个或多个核苷酸构建块的寡核苷酸，其中另外的亚甲基桥以C3′-内构象(β-D-LNA)或C2′-内(α-L-LNA)构象固定核糖部分，如本领域已知的。
术语“BNA”是指BNANC或2′,4′-BNANC(2′-O,4'-氨基乙烯桥接核酸)并具有其常规的科学含义并且在本文中指的是一种寡核苷酸，它包含一个或多个具有六元桥接结构(其具有和N-O键联和(N-H)或(N-Me)残基)的核苷酸构建单元。
术语“化学修饰的、代谢稳定的siRNA”具有其常规的科学含义并且此处是指与由天然存在的核苷酸组成的RNA寡核苷酸相比包含化学修饰的siRNA分子，该化学修饰使得修饰的siRNA分子对代谢降解、消化、酶解等更有抗性，即更稳定。
术语“皂苷”具有其常规的科学含义并且此处是指一组两亲性糖苷，这些两亲性糖苷包含一个或多个与亲脂性苷元核心(其为皂苷元)组合的亲水性糖基部分。皂苷可以是天然存在的或合成的(即非天然存在的)。术语“皂苷”包括天然存在的皂苷、天然存在的皂苷的衍生物以及通过化学和/或生物技术合成途径从头合成的皂苷。
术语“皂苷衍生物”(也称为“修饰的皂苷”)具有其常规的科学含义并且此处是指与天然存在的皂苷对应的已通过一种或多种化学修饰衍生化的化合物，这些化学修饰如官能团的氧化、官能团的还原和/或与另一分子形成共价键。优选的修饰包括苷元核心的醛基团的衍生化；糖链的羧基基团的衍生化或糖链的乙酰氧基基团的衍生化。典型地，皂苷衍生物不具有天然对应物，即皂苷衍生物不是由例如植物或树木天然产生的。术语“皂苷衍生物”包括通过天然存在的皂苷的衍生化获得的衍生物，以及通过化学和/或生物技术合成途径从头合成的衍生物，该合成产生与天然存在的皂苷对应的已通过一种或多种化学修饰衍生化的化合物。
术语“苷元核心结构”具有其常规的科学含义并且此处是指皂苷的苷元核心，其不具有与其结合的一个或两个碳水化合物天线或糖链(聚糖)。例如，皂皮酸是SO1861、QS-7和QS-21的苷元糖苷核心结构。
术语“糖链”具有其常规的科学含义并且此处是指以下中的任一种：聚糖、碳水化合物天线、单个糖部分(单糖)或包含多个糖部分的链(寡糖、多糖)。糖链可以仅由糖部分组成，或者还可以包含另外的部分，如以下中的任一种：4E-甲氧基肉桂酸、4Z-甲氧基肉桂酸、和5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸，例如像存在于QS-21中。
糖链名称上下文中的术语“Api/Xyl-”或“Api-或Xyl-”具有其常规的科学含义并且此处是指包含芹菜糖(Api)部分或包含木糖(Xyl)部分的糖链。
术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”具有其常规的科学含义并且此处是指抗体(如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个Vh结构域等)与任何分子的任何缀合物，当与受试者(如人患者)的细胞接触时，该分子可发挥治疗性作用，该分子如活性药物成分、毒素、寡核苷酸、酶、小分子药物化合物等。
术语“抗体-寡核苷酸缀合物”或“AOC”具有其常规的科学含义并且此处是指抗体(如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个Vh结构域等)与任何寡核苷酸分子的任何缀合物，当与受试者(如人患者)的细胞接触时，该寡核苷酸分子可发挥治疗性作用，该寡核苷酸分子如选自涵盖DNA、修饰的DNA、RNA、修饰的RNA、合成的核酸的天然或合成核酸串的寡核苷酸，其呈现为单链分子或双链分子，如BNA、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、短或小干扰RNA(siRNA；沉默RNA)、反义DNA、反义RNA等。
术语“缀合物”具有其常规的科学含义并且此处是指与至少第二分子共价结合的至少第一分子，从而形成包含第一分子和第二分子或由第一分子和第二分子组成的共价偶联的组装。典型的缀合物是(GalNAc)3Tris-siRNA、ADC、AOC和SO1861-EMCH(EMCH与皂苷的苷元糖苷核心结构的醛基团连接)。
术语“部分”具有其常规的科学含义并且此处是指与另外的分子、接头、分子的组装等结合、连接、缀合，并从而形成较大的分子、缀合物、分子组装的一部分的分子。典型地，部分是与第二分子共价结合的第一分子，涉及最初存在于第一分子和第二分子上的一个或多个化学基团。例如，皂草毒蛋白是典型的效应分子。作为抗体-药物缀合物的一部分，皂草毒蛋白是ADC中的典型效应子部分。作为抗体-寡核苷酸缀合物的一部分，BNA或siRNA是AOC中的典型效应子部分。
如在如包含接头的抗体-皂苷缀合物或构建体中所用，术语‘S’表示在内体和在胞质溶胶中保持完整的‘稳定接头’。
如在如包含接头的抗体-皂苷缀合物或构建体中所用，术语‘L’表示在内体中的微酸条件下切割的‘不稳定接头’。
术语“部分”具有其常规的科学含义并且此处是指与另外的分子、接头、分子的组装等结合、连接、缀合，并从而形成较大的分子、缀合物、分子组装的一部分的分子。典型地，部分是与第二分子共价结合的第一分子，涉及最初存在于第一分子上和存在于第二分子上的一个或多个化学基团。例如，皂草毒蛋白是典型的分子，并且是效应分子的实例。作为抗体-药物缀合物的一部分，皂草毒蛋白是ADC中的典型效应子部分。作为抗体-寡核苷酸缀合物的一部分，BNA或siRNA是AOC中的典型效应子部分。
说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分例如相似要素、组合物、组合物中的成分、或分开的方法步骤，而不一定用于描述顺序或时间次序。除非另外说明，否则术语在适当的情况下是可互换的，并且本发明的实施例可以以本文所描述或展示的顺序外的其他顺序操作。
除非另外说明，否则本文所述的本发明的实施例可以组合和协同操作。
此外，尽管各种实施例被称为“优选的”或“例如”或“举例”或“特别地”等，但是这些实施例应被解释为可以实施本发明的示例性方式，而不是限制本发明的范围。
权利要求中使用的术语“包含”不应被解释为限于例如要素或方法步骤或其后列出的组合物的成分；它不排除其他要素或方法步骤或某一组合物中的成分。它应被解释为明确说明存在提及的所述特征、整数、(方法)步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或组分、或其组的存在或添加。因此，“包含步骤A和B的方法”的表达的范围不应限于仅由步骤A和B组成的方法，而是相对于本发明，仅列举出该方法的步骤是A和B，并且权利要求应进一步解释为包括那些方法步骤的等同物。因此，“包含组分A和B的组合物”的表达的范围不应限于仅由组分A和B组成的组合物，而是相对于本发明，仅列举出该组合物的组分是A和B，并且权利要求应进一步解释为包括那些组分的等同物。
另外，不定冠词“一个/一种(a或an)”对要素或组分的提及不排除存在多于一个/种要素或组分的可能性，除非上下文明确要求存在一个/种并仅一个/种要素或组分。因此，不定冠词“一个/一种”通常意指“至少一个/一种”。
术语“DAR”通常代表药物抗体比率，并且是指给定的抗体药物缀合物(ADC)的制剂的平均药物和抗体比率，并且此处是指结合的SO1861部分或SPT001或结合的负载(例如AON，例如ApoB BNA)的数目相对于缀合物分子的比率。
附图说明
图1A-C：三价GalNAc的合成。
图2A-B：SO1861-DBCO的合成。
图3：单价GalNAc-SO1861的合成。
图4：三价GalNAc-SO1861的合成。
图5A-C：单价GalNAc-BNA的合成。
图6A-B：三价GalNAc-BNA的合成。
图7：三价GalNAc-BNA的合成。
图8A-G：三价GalNAc的合成。
图9A和9B：GalNAc-SO1861、SO1861-EMCH和三价GalNAc-SO1861对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的一般毒性(MTS)。图9B旁边显示的图例也适用于图9A。
图10A和10B：细胞杀伤测定(MTS)HepG2(A)和Huh7(B)细胞系。图10B旁边显示的图例也适用于图10A。
图11A和11B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。
图12A和12B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。图12B旁边显示的图例也适用于图12A。
图13A和13B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的细胞活力测定。图13B旁边显示的图例也适用于图13A。
图14A和14B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。图14B旁边显示的图例也适用于图14A。
图15A和15B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的细胞活力测定。图15B旁边显示的图例也适用于图15A。
图16A和16B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。图16B旁边显示的图例也适用于图16A。
图16C和16D：HepG2(C)和Huh7(D)细胞系的细胞活力测定。图16D旁边显示的图例也适用于图16C。
图17A和17B：对HepG2(A)和Huh7(B)细胞系的基因表达分析。图17B旁边显示的图例也适用于图17A。
图18A：使细胞与以下接触后原代人肝细胞的相对细胞活力(与设为100％的未处理的细胞(‘Untr’)相比)：一系列浓度的与SO1861缀合的三价GalNAc((GN)3-SPT)，与皂草毒蛋白缀合的10pM单克隆抗体抗CD71(CD71-SPRN)和一系列浓度的具有与苷元醛基团结合的EMCH的SO1861(SPT-EMCH)的组合，10pM CD71-SPRN和一系列浓度的(GN)3-SPT的组合，以及10pM CD71-SPRN和一系列浓度的与具有共价结合到其上的四个SO1861部分的树状突缀合的(GN)3的组合(DAR＝4，即比率(GN)3:树状突是1:1并且比例树状突:SO1861是1:4)((GN)3-dSPT4)。
图18B：在将细胞与以下接触后原代人肝细胞中的相对apoB表达(与未处理的细胞(‘Untr’)相比，未处理的细胞设置为100％)：一系列浓度的与靶向apoB mRNA的反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc((GalNAc)3-ApoB)，与皂苷SO1861((GalNAc)3-SPT001)缀合的300nM三价GalNAc和一系列浓度的(GalNAc)3-ApoB的组合，或与具有与其共价结合的四个SO1861部分(DAR＝4)的树状突缀合并与靶向apoB的反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc的缀合物((GalNAc)3-dSPT4-ApoB)。在整个描述和权利要求中，SO1861也称为“SPT001”和“dSPT”。
图19A和19B：使细胞与以下接触后原代人肝细胞(A)和Huh7肝细胞系(B)的细胞活力(两者均与设为100％的未处理的细胞(‘Untr’)相比)：一系列浓度的与SO1861缀合的三价GalNAc(三价GalNAc-SPT001)、与皂草毒蛋白缀合的10pM单克隆抗体抗CD71(CD71-皂草毒蛋白)和一系列浓度的共价缀合物三价GalNAc-SPT001的组合。
图19C：共价三价GalNAc-SPT001缀合物(对于皂苷SO1861，DAR＝1)的草图。草图中的‘S’是SPT001、SO1861。
图19D：抗CD71抗体-皂草毒蛋白缀合物(OKT-9)的草图，其中‘T’是与抗体重链共价连接的毒素皂草毒蛋白。
图19E：共价三价(GalNAc)3-dSPT4(或GN3-dSPT4)缀合物(对于皂苷SO1861，DAR＝4)的草图。草图中的‘S’是SPT001、SO1861；dSPT4描述了具有四个SO1861分子的树状突，如别处所述进行缀合。
图20A和20B：在将细胞与以下接触后在原代人肝细胞(A)和Huh7肝细胞系(B)中的相对apoB表达：一系列浓度的与用于沉默ApoB mRNA和ApoB蛋白表达，即靶向apoB的反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc(三价GalNAc-ApoBBNA)，与SO1861缀合的300nM三价GalNAc(三价GalNAc-SPT001)(关于结合的SPT001(皂苷SO1861)，DAR＝1)与一系列浓度的三价GalNAc-ApoB BNA的组合，或一系列浓度的具有与其共价结合的四个SO1861部分(DAR＝4)缀合的并且与用于沉默ApoB mRNA和ApoB蛋白表达，即靶向apoB的反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc(三价GalNAc-ApoBBNA-SPT001；这里四个SO1861分子利用单个树状突部分缀合到GalNAc/寡核苷酸缀合物上)。
图20C：共价三价GalNAc-ApoBBNA缀合物的草图。草图中的“A”是反义寡核苷酸ApoB(ApoBBNA)。
图20D：三价GalNAc-ApoBBNA-SPT001的草图。草图中的‘S’是SPT001，也称为SO1861；草图中的“E”是靶向apoB(ApoB BNA)的效应子部分反义寡核苷酸。
图20E：(GalNAc)3-dSPT4-ApoB的草图与树状突缀合，其中四个SO1861部分与树状突共价结合(DAR＝4)。草图中的‘S’是SPT001，也称为SO1861；草图中的“E”是靶向apoB(ApoB BNA)的效应子部分反义寡核苷酸。
图21A和B：在使细胞与以下接触的影响下，原代人肝细胞(A)和Huh7肝细胞系(B)中的绝对apoB蛋白表达：一系列浓度的三价GalNAc-ApoBBNA、300nM三价GalNAc-SPT001和一系列浓度的三价GalNAc-ApoBBNA的组合，或一系列浓度的三价GalNAc-ApoBBNA-SPT001；这里四个SO1861分子利用单个树状突部分缀合到GalNAc/寡核苷酸缀合物上(因此也命名为(GalNAc)3-dSPT4-ApoB)。
图22A-C：皂苷-寡核苷酸-ASGPR配体缀合物(即三价GalNAc-ApoB BNA-SPT001，也称为(GalNAc)3-SO1861-ApoB)的合成。
图23A：SO1861-OEG-NHS(SPT001-L-NHS，分子12，其中‘L’指不稳定的可切割接头)的合成。
图23B：树状突(SPT001)4-NH2(来自分子13和14的分子15)的合成。
图23C：树状突(SPT001)4-叠氮化物(来自分子15和18的分子19)的合成。
图23D-E：树状突(SPT001)4-三价GalNAc(来自分子19和23的分子24)的合成。
图24A-B：从分子27和分子28(三官能接头)合成DBCO-TCO-三价GalNAc(分子29)，其中分子27是由分子22、三价GalNAc-胺的甲酸盐和分子26(4-硝基苯基3-(乙酰基硫基)丙酸酯)之间的反应获得的GalNAc-硫代乙酸酯。
图24C：通过将甲基四嗪-L-ApoB BNA寡聚物(分子30)与DBCO-TCO-三价GalNAc(分子29)缀合，合成DBCO-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc(分子31)。
图24D：通过将分子31(DBCO-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc)和分子19(树状突(SPT001)4-叠氮化物)缀合，合成树状突(-L-SO1861)4-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc(分子34；‘三价GalNAc-ApoB BNA-SPT001缀合物’)。
图25：C57BL/6J小鼠的肝组织中的ApoB表达分析。
图26：C57BL/6J小鼠中的血清apoB蛋白分析。0.1mg/kg ApoB#02(196小时)、0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861(196小时和336小时)和0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861(196小时)的水平没有报道。
图27：C57BL/6J小鼠中血清LDL-胆固醇(LDL-C)分析。
图28：C57BL/6J小鼠中血清ALT分析。
图29A-C：对于ApoB#02缀合物而言对原代人肝细胞、HepG2和Huh7细胞的ApoB表达分析和细胞活力测定。
图30：对于ApoB#02缀合物而言对原代人肝细胞的ApoB表达分析和细胞活力测定
图31：C57BL/6J小鼠的肝组织中的ApoB表达分析。
图32：C57BL/6J小鼠中的血清ApoB蛋白分析。
图33：C57BL/6J小鼠中血清LDL-胆固醇(LDL-C)分析。
图34：C57BL/6J小鼠中血清ALT分析。
图35A-D：三官能接头-(L-腙-SO1861)-(L-BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成。
图36A-E：三官能接头-(树状突(-L-腙-SO1861)4)-(L-BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成。请注意，图36E的图包括两页，标记为图36E和图36E(续)，这两页一起显示分子21与分子19的缀合，从而形成缀合物分子22。
图37A-C：三官能接头-(树状突(-L-腙-SO1861)8)-(BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成。请注意，图37B的图包括两页，标记为图37B和图37B(续)，这两页一起显示分子24与分子18的缀合，从而形成缀合物分子25(中间体12)。请注意，图37C的图包括两页，标记为图37C和图37C(续)，这两页一起显示分子25与分子21的缀合，从而形成缀合物分子26。
图38A-C：三官能接头-(L-缩氨基脲-SO1861)-(BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成。
图39A-F：三官能接头-(树状突(L-缩氨基脲-SO1861)4)-(L-BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成。请注意，图39E的图包括两页，标记为图39E和图39E(续)，这两页一起显示分子40与分子20的缀合，从而形成缀合物中间体24。
图40A-D：三官能接头-(树状突(L-缩氨基脲-SO1861)8)-(L-BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成。请注意，图40A的图包括两页，标记为图40A和图40A(续)，这两页一起显示分子43与分子37的缀合，从而形成缀合物(分子44)中间体25。请注意，图40B的图包括两页，标记为图40B和图40B(续)，这两页一起显示分子44与分子18的缀合，从而形成缀合物分子45(中间体26)。请注意，图40C的图包括两页，标记为图40C和图40C(续)，这两页一起显示分子45与分子20的缀合，从而形成缀合物分子46(中间体27)。
图41：三价接头-(L-SPT001)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)合成
图42A-B：三价接头-(封闭的DBCO)-(L-BNA寡核苷酸)-(三价GalNAc)合成。
图43A-B：应用TFL(三官能接头)方法可获得的缀合物概述。通过将GalNAc、皂苷(此处为SO1861)和寡核苷酸(此处为BNA)共价缀合至三官能接头(A)的独立臂，合成本发明的寡核苷酸缀合物家族‘缀合物C1’的一般方案。根据(A)的一般方案合成的缀合物家族缀合物C1，其中指定选项R1用于缀合的皂苷，指定选项R2用于缀合的BNA(B)。图43A和B的图一起显示了三官能接头标记的分子4与靶向配体标记的分子41、效应子标记的分子12和增强子标记的分子3、19、25、28、40和45之一或用于对照的封闭剂标记的分子5、12a和50之一的缀合，由此形成具有如图43B所示的一般缀合物结构‘缀合物C1’的共轭物，其包含基团R1和基团R2，其中R1是缀合物C1下面描述的基团R1中的任何一个，缀合物C1中的R2是图43B中缀合物C1下面描述的基团R2中的任何一个。
具体实施方式
本发明将相对于特定实施例来说明，但本发明并不受限于此而只受权利要求限制。
本发明的第一方面涉及一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体共价连接的至少一个皂苷，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。本发明的方面涉及一种寡核苷酸缀合物，该寡核苷酸缀合物包含至少一个皂苷，该至少一个皂苷共价连接至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，并且进一步共价连接至寡核苷酸，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。通常，ASGPR是ASGPR1。三萜皂苷典型地是12,13-脱氢齐墩果烷类型三萜皂苷，例如属于在C-23位具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的三萜皂苷或双糖链三萜皂苷。优选的是12,13-脱氢齐墩果烷(优选在C-23位具有醛官能团)类型的单糖链或双糖链五环三萜皂苷。
出人意料地，当治疗性寡核苷酸在皂苷如SO1861(该皂苷与肝细胞特异性受体ASGPR1的配体共价缀合(如三价-GalNAc(GN3)(即包含三个GalNAc部分的缀合物)))的存在下与携带ASGPR的哺乳动物细胞如人细胞如人肝细胞接触时，当考虑与治疗性寡核苷酸靶向的靶基因相关的mRNA表达和/或蛋白质表达时，发明人确定基因沉默寡核苷酸(ASO，AON，siRNA，BNA)的效力增强了至少10倍，也就是说至少100倍或甚至超过1000倍。将治疗性寡核苷酸(例如siRNA或ASO，其涉及治疗癌症(例如通过沉默HSP27表达)或涉及治疗过高的血浆(LDL-)胆固醇水平(通过靶向apoB基因))与皂苷(例如作为与寡核苷酸分开的含GalNAc的缀合物提供，或者例如作为与ASGPR配体和寡核苷酸的缀合物共价连接的皂苷部分提供)组合拓宽了治疗性寡核苷酸的治疗窗口。当将靶细胞与跟ASGPR1的配体偶联的寡核苷酸接触时，与在没有(ASGPR1靶向性)皂苷存在下获得的基因沉默相比，在包含共价连接的皂苷的ASGPR1靶向配体存在下，在较低的寡核苷酸剂量下实现了有效的基因沉默(任何相关程度的沉默)。也就是说，当带有受体的细胞在体外或体内与本发明的寡核苷酸缀合物接触时，发明人建立了接近完全的(定义为至少95％或更高)RNA表达抑制。此外，发明人还实现了(接近)完全抑制蛋白质表达，例如，对于apoB蛋白质，随后导致(接近)完全清除血清中的LDL-胆固醇。当皂苷不是包含载荷和ASGPR1配体(例如GN3)的缀合物的一部分时，在本发明寡核苷酸缀合物的影响下，基因沉默的这种出人意料的强烈程度和功效是无法实现的。当评估mRNA表达和/或评估与靶基因相关的蛋白质表达时以及间接评估LDL-胆固醇水平时(因为LDL颗粒包含apoB蛋白(更具体地，apoB100蛋白)的一个拷贝，当细胞与本发明的寡核苷酸缀合物接触后，apoB表达被沉默)，将表达ASGPR1的靶(肝)细胞与本发明的含皂苷的缀合物接触后基因沉默的效力明显改善。当将靶细胞与相同剂量的与ASGPR1的配体偶联的寡核苷酸接触时，与在没有皂苷存在下获得的基因沉默功效相比，在含有共价连接的皂苷的ASGPR1靶向配体存在下，在固定的寡核苷酸剂量下获得了改善的基因沉默。发明人发现，与不存在皂苷缀合物时获得的功效相比，将治疗性寡核苷酸与ASGPR1配体如(GalNAc)3(也称为GN3或(GN)3)的缀合物和皂苷与ASGPR1配体如(GalNAc)3的缀合物组合，当该组合与携带ASGPR1的细胞如人肝细胞接触时导致基因沉默功效的出人意料地高改善。发明人还发现，与在GalNAc-寡核苷酸缀合物中不存在皂苷的情况下获得的功效相比，将皂苷共价偶联至治疗性寡核苷酸和ASGPR1的配体(例如(GalNAc)3)上，当该组合与携带ASGPR1的细胞(例如人肝细胞)接触时，导致基因沉默功效的出人意料的提高。
三萜苷型的皂苷具有刺激效应分子从靶细胞的外部递送至所述细胞内，并随后递送到所述细胞的胞质溶胶中的能力。皂苷促进例如受体介导的某些效应分子(如ADC中包含的蛋白质毒素)的摄取。作为ADC的一部分的毒素的胞吞作用在靶细胞的内体和/或溶酶体中递送毒素。不希望受任何理论的束缚，由本发明中应用的三萜皂苷刺激或介导ADC或至少毒素随后从内体或溶酶体外释放并进入细胞的胞质溶胶内。当以太低的毒素剂量使靶细胞与毒素接触而不能发挥细胞内作用时，毒素(如ADC的一部分)和游离皂苷的共同施用使得靶细胞与ADC和皂苷两者接触，这在不存在皂苷下与细胞接触时无效的相同毒素剂量下可导致高效的毒素介导的靶细胞杀伤。因此，在游离皂苷的影响下，毒素的效力得到提高。高效且充分的靶细胞杀伤所需的毒素剂量仍然可能伴随不期望的脱靶效应，例如当ADC靶向的肿瘤细胞受体不是真正的(排他性的)肿瘤细胞特异性受体时，也在例如健康细胞中、患者身体的其他地方、或在存在于靶细胞所在的相同器官中的细胞上表达。此外，所需的游离皂苷剂量需要达到足够程度的毒素激活(将毒素递送到靶细胞胞质溶胶中；介导中靶递送的皂苷阈值)可能处于诱导不良脱靶效应的水平。当考虑待用毒素治疗的靶(肿瘤)细胞时，由于游离皂苷是全身性地且非靶向地施用的，将向需要毒素治疗的患者施用相对高的皂苷剂量以达到靶细胞水平的局部皂苷剂量。此外，当游离皂苷与例如ADC共同施用时，遇到的另一个问题和缺点是难以在患者靶细胞中的正确时间和位置优化ADC+SPT001(游离皂苷)活性的同步化。发明人现在提供了一种单组分缀合物溶液，该溶液为该问题提供了一种解决方案。
诸位发明人现在惊奇地发现，当皂苷与靶细胞靶向部分如受体配体(例如EGF或细胞因子)、抗体、或其结合片段或结构域缀合时，增强毒素对肿瘤细胞的作用所需的皂苷剂量可降低10倍，或甚至降低约100至1000倍。对于肿瘤细胞，目前已知一系列细胞表面受体在这样的异常细胞的表面上特异性表达。发明人成功地将皂苷偶联至用于结合通常在肿瘤细胞上富集的受体的抗体和配体，例如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、等。这种靶向的皂苷缀合物确实能够增强，例如毒素在靶细胞内的细胞毒性作用，与游离形式，即不含肿瘤细胞靶向部分的相同皂苷所需的剂量相比，需要缀合物的有效剂量低至少10倍，例如100倍至1000倍。
发明人现在进一步发明了(靶向的)皂苷的靶细胞特异性递送和随后的胞吞作用对于非异常细胞或与例如癌症(肿瘤细胞)、自身免疫性疾病、病毒感染细胞等不相关的异常细胞也是可能的。也就是说，诸位发明人惊奇地发现，ASGPR为具有该受体的细胞(如肝细胞)提供了合适的靶受体，以供提供有ASGPR(特别是ASGPR1)的配体的皂苷进入(例如参见图3：与单个GalNAc部分缀合的皂苷SO1861(也称为‘SPT001’))。已知的配体如单价GalNAc和三价GalNAc(GN)3成功地与一个或多个(2，4，8等)皂苷分子偶联，提供包含ASGPR配体并包含至少一个皂苷部分(优选在位置C-23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型双糖链五环三萜皂苷)的皂苷缀合物。
使表达ASGPR(例如ASGPR1)的细胞(如肝细胞)与包含ASGPR的配体的皂苷缀合物接触(参见例如图4和图19C)令人惊讶地导致皂苷的摄取，如当用以下共靶向这样的细胞时明显的：例如包含基因沉默核酸和用于靶细胞表面分子(例如CD71、ASGPR)的结合分子的缀合物(导致靶细胞中改善的皂苷依赖性基因沉默)，或包含这样的用于靶细胞的结合分子和毒素的缀合物(导致皂苷依赖性细胞毒性)。将表达ASGPR例如ASGPR1的细胞例如肝细胞与包含ASGPR配体的皂苷缀合物接触，出人意料地导致皂苷的摄取，当此类细胞与此类皂苷缀合物接触时很明显，此类皂苷缀合物包含皂苷，ASGPR1的配体(例如GalNAc或(GN)3)，并且还包含用于沉默细胞中mRNA表达和/或沉默蛋白质表达的寡核苷酸(即本发明的寡核苷酸缀合物，其包含至少一个皂苷、ASGPR1的配体和寡核苷酸，它们共价连接在一起，例如通过三官能接头)。为皂苷提供ASGPR的配体导致在靶细胞中的效应，该效应由共同施用的效应分子如靶向的寡核苷酸或毒素(例如，与核酸或毒素偶联的抗CD71抗体或ASGPR配体)发挥，或者由也与皂苷和ASGPR1的配体偶联成本发明的寡核苷酸偶联物的寡核苷酸发挥(也参见图22A-C和图24D)。如果有的话，当靶细胞仅与效应分子(例如游离寡核苷酸或与例如三价GalNAc缀合的寡核苷酸)接触时，在没有靶向的皂苷情况下，这种效应明显在低得多的程度上。因此，当以下情况时本发明的皂苷缀合物和本发明的寡核苷酸缀合物改善了效应分子如寡核苷酸的效力：考虑在其表面包含ASGPR的靶细胞，并且这种靶细胞与本发明的皂苷-ASGPR配体和(靶向的)效应分子接触，或者与寡核苷酸缀合物(其包含皂苷、GalNAc(作为ASGPR1的配体)、寡核苷酸(作为效应子部分)，该皂苷用于增强效应子部分从内体和/或溶酶体向胞质溶胶和/或最终向靶细胞的细胞核的内体逃逸)接触。由此，效应分子的治疗窗得到改善：在相同剂量下，在皂苷缀合物的共同施用的影响下或在寡核苷酸缀合物的影响下具有更高的治疗效果；在皂苷缀合物的共同施用的影响下或在寡核苷酸缀合物(其中寡核苷酸是效应子部分)的影响下，在较低剂量下的类似治疗效果。诸位发明人还发现，当与皂苷未提供有ASGPR的配体时为达到类似作用所需的皂苷剂量相比时，为了在靶ASGPR表达细胞(如肝细胞)中达到一定水平的治疗性作用，需要的皂苷缀合物或寡核苷酸缀合物的剂量低至少10倍，例如约100倍至1000倍，该治疗性作用由共同施用的(靶向(ASGPR1)的)效应分子(如ASO、siRNA、BNA、毒素如蛋白质毒素)诱导，或由寡核苷酸缀合物中作为效应子部分被包含的寡核苷酸诱导。发明人还发现，当至少一个皂苷部分如SO1861部分或SO1832部分共价连接到包含至少一个GalNAc如三价GalNAc的寡核苷酸缀合物上时，在靶ASGPR表达细胞如肝细胞中，需要低至少10倍，例如约100倍至1000倍剂量的寡核苷酸来达到一定水平的治疗效果，所述治疗效果由施用给细胞的作为效应分子的((ASGPR1)靶向的)寡核苷酸如ASO、siRNA、BNA诱导。
因此，令人惊讶的是，诸位发明人现在提供了改善的治疗方法，这些治疗方法使用ASGPR作为靶受体用于皂苷介导的效应分子(例如治疗性寡核苷酸)在ASGPR表达细胞的胞质溶胶中的递送，导致效应分子以比不存在本发明的皂苷缀合物下或在寡核苷酸缀合物中没有共价连接的皂苷下可能的更低的剂量诱导类似的治疗性作用。因此，当考虑将效应分子递送到例如肝细胞的胞质溶胶或细胞核中时，本发明通过提供本发明的皂苷-ASGPR配体缀合物和通过提供本发明的寡核苷酸缀合物(例如在单一缀合物中共价连接在一起的皂苷、寡核苷酸、(GalNAc)3)而提供了皂苷刺激作用的改善的治疗用途。诸位发明人实现的优点尤其是：通过共同施用((ASGPR1)靶向的)效应分子与皂苷或通过施用寡核苷酸缀合物，所需的效应分子如寡核苷酸(siRNA或ASO)剂量更低，所述寡核苷酸缀合物包含：用于靶向ASGPR1的GalNAc部分，包含寡核苷酸(例如siRNA或ASO，用于沉默与选择的基因相关的mRNA表达和/或用于通过靶向选择的基因沉默蛋白质表达)并且包含至少一个皂苷(用于一旦寡核苷酸缀合物中的ASGPR1配体与细胞ASGPR1结合后寡核苷酸缀合物被内吞并且递送至携带ASGPR1的细胞如肝细胞的内体/溶酶体，刺激寡核苷酸的内体逃逸)；并且通过以下，所需的皂苷的剂量更低：提供作为ASGPR配体(例如三价GalNAc)的共价缀合物的皂苷，和一个或多个皂苷部分(本发明的皂苷缀合物)，和效应子部分，例如治疗性寡核苷酸(例如siRNA或ASO)(本发明的寡核苷酸缀合物)。令人惊讶的是，ASGPR的配体在皂苷缀合物和在靶向的效应分子缀合物中可以是相同的，在皂苷的刺激性影响下，在靶细胞中产生高效的效应分子介导的作用。也就是说，可以向靶细胞(如在其表面暴露ASGPR的肝细胞)共同施用皂苷缀合物和效应分子缀合物(两者均包含共价连接的ASGPR的配体，如三价GalNAc)，从而高效获得效应分子的期望的治疗性作用，同时两种缀合物靶向相同的受体并使用相同的胞吞作用路径进入细胞。这一令人惊讶的发现对肝细胞靶向疗法非常有益，这些疗法如涉及核酸(ASO、BNA、siRNA，仅列出几个)的胞质溶胶递送的疗法，因为肝细胞确实表达ASGPR，该ASGPR对肝细胞是特异性的(例如ASGPR1)，而实际上不存在特异性足以用于肝细胞靶向疗法的另外的肝细胞受体。
因此，本发明开辟了改善肝细胞定向疗法的新道路，其中对于其作用模式，效应分子如ASO和siRNA必须在细胞内递送并定位。作为本发明的皂苷缀合物提供的靶向的皂苷和本发明的寡核苷酸缀合物拓宽了这样的效应分子(寡核苷酸如siRNA、ASO)的治疗窗，并且同时，根据本发明，通过向皂苷提供肝细胞靶向结合分子，也改善了皂苷的治疗窗。因此，发明人实现了有效的寡核苷酸递送，从而为治疗性寡核苷酸领域中明显的主要翻译限制提供了解决方案。对于基于寡核苷酸的药物平台，发明人基于本发明的用于改善寡核苷酸递送的生物缀合提供导致改善寡核苷酸递送的解决方案。本发明的改善的递送系统导致寡核苷酸的效力增加，这可能有助于降低毒性和/或可能有助于减少ASGPR靶向寡核苷酸系统(例如GalNAc-寡核苷酸缀合物)的脱靶效应。
发明人设法合成了非朊性质的缀合物，其由两个或三个生物活性小分子构成，例如，当与基于抗体如IgG的(抗体-药物)缀合物中应用的抗体的分子大小(分子量)相比时，当考虑缀合物包含的两个或三个小分子中每一个的生物活性时，本发明的缀合物仍然具有生物活性：本发明的皂苷缀合物和本发明的寡核苷酸缀合物。本发明的缀合物相对较小，尽管在单个分子中共价缀合在一起的两个或三个小分子仍然能够发挥与每个小分子的性质相关的生物活性。也就是说，皂苷增强了被细胞摄取的寡核苷酸的内体和溶酶体逃逸。也就是说，携带ASGPR的细胞摄取本发明的包含皂苷缀合物和寡核苷酸缀合物的GalNAc。也就是说，当带有ASGPR的细胞与本发明的寡核苷酸缀合物接触时，基因沉默效应是明显的。当与包含寡核苷酸和GalNAc的缀合物共同施用至相同细胞时，本发明的包含皂苷和GalNAc的缀合物提供针对寡核苷酸的内体逃逸增强活性。皂苷和寡核苷酸都被这些细胞摄取，该摄取由GalNAc与靶细胞上的ASGPR结合介导。在内体/溶酶体中皂苷的影响下，以更高程度递送到胞质溶胶中的寡核苷酸发挥其细胞内生物活性，表现为寡核苷酸靶向的基因(例如靶向基因HSP27和apoB)的沉默。本发明的寡核苷酸缀合物提供针对寡核苷酸缀合物包含的寡核苷酸的内体逃逸增强活性。皂苷和寡核苷酸两者都作为本发明的寡核苷酸缀合物的一部分被那些细胞摄取，该摄取由GalNAc与靶细胞上的ASGPR的结合介导。在内体/溶酶体中皂苷的影响下，以更高程度递送到胞质溶胶中的寡核苷酸发挥其细胞内生物活性，表现为寡核苷酸靶向的基因(例如靶向基因HSP27和apoB)的沉默。因此，尽管相对较小的分子被缀合在一起形成单一缀合物，但至少一个皂苷(例如一个、四个、八个皂苷部分)、GalNAc部分或GalNAc部分的簇(例如(GN)3)和寡核苷酸中的每一个与当细胞与例如游离皂苷(例如，与在胞质溶胶中发挥其活性的分子组合)、GalNAc-寡核苷酸、游离寡核苷酸接触时测量的生物活性相比，仍然具有生物活性。虽然皂苷、GalNAc和寡核苷酸是相对较小的分子，但将这些分子缀合在一起并不妨碍它们的生物活性。
皂苷缀合物-介绍
本发明提供了皂苷和脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体的缀合物，在本文中称为“皂苷缀合物”。ASGPR配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。根据本发明的优选实施例，每个GalNAc部分经由与如式(I)中所指示的位置“1”上的氧的共价键，与ASGPR配体的剩余物结合，或者在ASGPR配体由单个GalNAc部分组成的情况下与皂苷部分结合：
Figure BDA0004177963000000301
如式(II)S中所示，ASGPR配体由优选地经由皂苷部分接头LS与皂苷部分S结合的单个GalNAc部分组成。
Figure BDA0004177963000000311
(II)S
ASGPR配体可以包含多于一个GalNAc部分，如2、3、4、5或6个GalNAc部分，优选地3或4个GalNAc部分，更优选地3个GalNAc部分。在这样的情况下，优选GalNAc部分各自分别经由位置“1”上的氧与中心桥接部分B共价结合，该中心桥接部分B优选地经由皂苷部分接头LS在GalNAc部分与皂苷部分之间有效地形成桥。GalNAc部分可以直接与桥接部分B结合，如式(III)S中所示：
Figure BDA0004177963000000312
(III)S
其中n是大于或等于2的整数，LS是皂苷部分接头，并且S是皂苷部分。更优选地，GalNAc部分经由GalNAc接头LGAL与桥接部分B结合，如式(IV)S中所示：
Figure BDA0004177963000000313
(IV)S
其中n是大于或等于2的整数，LS是皂苷部分接头，并且S是皂苷部分。虽然可以独立地选择每次出现的LGAL，但本领域技术人员将理解，在每次出现的LGAL表示相同的部分的情况下，皂苷缀合物的合成被简化。
皂苷缀合物-接头LS
皂苷部分接头LS表示适合用于使皂苷与如式(II)S中的GalNAc或与如式(III)S和(IV)S中的桥接部分B共价结合的任何化学部分。接头的特性和大小没有特别限制，并且使皂苷与如式(II)S中的GalNAc或与如式(III)S和(IV)S中的桥接部分B共价结合可以通过“常规的”化学官能团(例如酯键)以及通过典型地具有长链长度的“点击化学”型接头(产生包含例如多于10个或多于20个碳原子的接头ES)来实现。用于使分子彼此结合的合适的接头LS和相关的偶联反应描述于手册Hermanson,Greg T.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academic press[学术出版社],2013中。
如本领域技术人员将理解的，皂苷部分接头LS将典型地是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应(例如“点击化学”类型)的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合。该原理在具有式(II)S的化合物的以下反应方案中展示：
Figure BDA0004177963000000321
其中LS是皂苷部分接头，LS1是与GalNAc或与桥接部分B共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与皂苷部分共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且S是皂苷部分。
具有式(III)S的化合物的对应反应方案如下：
Figure BDA0004177963000000322
其中LS是皂苷部分接头，LS1是与GalNAc共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与皂苷部分共价结合的皂苷部分接头LS的前体，n是大于或等于2的整数，B是桥接部分，并且S是皂苷部分。
具有式(IV)S的化合物的对应反应方案如下：
Figure BDA0004177963000000323
其中LS是皂苷部分接头，LS1是与GalNAc共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与皂苷部分共价结合的皂苷部分接头LS的前体，n是大于或等于2的整数，B是桥接部分，S是皂苷部分并且LGAL是GalNAc接头。
皂苷部分接头LS可以是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，其中该偶联反应是例如叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格(Staudinger)反应、应变杂环亲电剂(如氮杂环丙烷、环氧化物、环状硫酸酯、氮丙啶(aziridinium)离子、镏化物离子)的亲核开环、非醛醇类型的羰基反应(如脲、硫脲、腙、肟醚、酰胺或芳香族杂环形成)或碳-碳双键的加成(如环氧化、氮杂环丙烷化、二羟基化、硫酰卤加成、亚硝酰卤化物加成或迈克尔加成)，优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环，更优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成或硫醇马来酰亚胺偶联。
根据本发明的一些实施例，皂苷部分接头LS包含缩氨基脲和/或腙和/或1,2,3-三唑，优选地腙和1，2，3-三唑或至少一个缩氨基脲。无论何时在本申请的接头的上下文中提及1,2,3-三唑，这优选地意指1H-1,2,3-三唑。
这样的腙是例如末端酰肼与含醛化合物(如含醛皂苷)之间的偶联的结果。该酰肼/醛偶联是生物缀合领域中已知的“点击”化学工具，并且例如描述于Hermanson,GregT.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academic press[学术出版社],2013中。这样的缩氨基脲是例如末端氨基脲与含醛化合物(如含醛皂苷)之间的偶联的结果。
这样的1,2,3-三唑是例如叠氮化物与含炔烃化合物之间的偶联的结果。该叠氮化物/炔烃偶联是生物缀合领域中通常已知的“点击”化学工具，并且例如描述于Hermanson,Greg T.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academic press[学术出版社],2013中。
因此，优选皂苷部分接头LS是第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第一前体LS1包含叠氮化物；该第二前体LS2与该皂苷部分共价结合，该第二前体LS2包含炔烃并且优选地包含由酰肼/醛与该皂苷部分的醛偶联产生的腙或优选地包含由氨基脲/醛与皂苷部分的醛偶联产生的缩氨基脲。
具有式(V)S的化合物中存在的前体LS1的结构的实施例是以下叠氮化物：
Figure BDA0004177963000000341
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示选自1、2和3的整数，更优选地a表示2。
具有式(VII)S或(VIII)S的化合物中存在的前体LS1的结构的实施例是以下叠氮化物：
Figure BDA0004177963000000342
其中c表示大于或等于0的整数，优选地c表示5-15范围内的整数，更优选地c表示9。
具有式(VI)S的化合物中存在的前体LS2的结构的实施例是以下腙：
Figure BDA0004177963000000343
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示2-6范围内的整数，更优选地a表示4，并且其中LS2a表示含炔烃部分。如本领域技术人员根据本披露所理解的，式(XIX)中所描述的腙由酰肼与皂苷部分的醛的反应产生。
LS2a优选地包含少于20个碳原子，更优选地LS2a表示根据式(XX)的部分：
Figure BDA0004177963000000351
因此，在一些实施例中，皂苷缀合物是如本文所述的具有式(II)S、(III)S或(IV)S的化合物，其中皂苷部分接头LS是具有式(V)S、(VII)S或(VIII)S的化合物与具有式(VI)S的化合物之间的偶联反应的结果，其中第一前体LS1是叠氮化物，例如具有式(XVII)或式(XVIII)的叠氮化物，并且其中第二前体LS2是包含含炔烃部分LS2a(例如，具有式(XX)的炔烃)和腙的具有式(XIX)的化合物，该腙由酰肼与皂苷部分的醛的反应产生。
皂苷缀合物-皂苷
本发明的方面涉及一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体共价连接的至少一个皂苷，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地三个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
本发明的方面涉及一种寡核苷酸缀合物，该寡核苷酸缀合物包含至少一个皂苷(优选1-32个，更优选1-16个，最优选1-8个皂苷部分，例如1、4或8个皂苷部分)，该至少一个皂苷共价连接至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地三个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，并且进一步共价连接至寡核苷酸，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。当在皂苷存在或不存在的情况下与靶细胞接触时评估分子如蛋白质毒素(如皂草毒蛋白，香石竹毒蛋白)或基因沉默寡核苷酸如HSP27 BNA的细胞内效应时，选择皂苷是因为其内体逃逸增强活性。对于在本发明的缀合物中应用的皂苷，通常，当毒素或寡核苷酸最初与皂苷在内体中共定位时，细胞的内体中皂苷的存在以至少10倍增加所述细胞的胞质溶胶中的生物活性(例如，基因沉默、毒性)，
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中皂苷是优选在皂苷的苷元核心结构的位置C-23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的五环三萜皂苷。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中皂苷是优选在皂苷的苷元核心结构的位置C-23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的单糖链或双糖链五环三萜皂苷。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷包含选自由以下组成的组的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸、
16α-羟基齐墩果酸、
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)、
16α,23-二羟基齐墩果酸、
丝石竹皂苷元、
皂皮酸、
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯、
洋地黄皂苷配基、
3，16，28-三羟基齐墩果烷-12-烯、
丝石竹酸、
及
其衍生物，
优选地，该皂苷包含选自皂皮酸和丝石竹皂苷元或其衍生物的苷元核心结构，更优选地，该皂苷苷元核心结构是皂皮酸或其衍生物。这样的优选的苷元(或其衍生物)包含如本文其他地方所述的C-23原子处的醛基团或其衍生物。不希望受任何理论的束缚，这样的醛基团有助于三萜苷型的皂苷的内体逃逸增强活性，这些皂苷包含选自C组(尤其是皂皮酸和丝石竹皂苷元)的苷元。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中至少一个皂苷包含第一糖链，该第一糖链与该至少一个皂苷的苷元核心结构的C3原子或C28原子结合，优选地与C3原子结合，和/或其中该至少一个皂苷包含第二糖链，该第二糖链与该至少一个皂苷的苷元核心结构的C28原子结合，优选地，该皂苷包含第一糖链和第二糖链。因此，当本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物所包含的皂苷具有两个聚糖(糖链)时，第一糖链结合在苷元核心结构的位置C3处，并且第二糖链结合在该苷元核心结构的位置C28处。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自A组：
GlcA-、
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-Ara-、
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-、
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、及
其衍生物，
或
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自B组：
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-；
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-；
Ara-；
Xyl-；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-，其中R1是4E-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-，其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-，其中R3是4E-甲氧基肉桂酸；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-，其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-，其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-，其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-，其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-，其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-，其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-，其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-，其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-，其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-；及
其衍生物，
或
·皂苷是双糖链三萜糖苷(双糖链三萜皂苷，优选五环皂苷，更优选12,13-脱氢齐墩果烷类型皂苷，优选在皂苷苷元核心结构的位置C-23具有醛官能团)包含选自与苷元核心结构结合的组A的第一糖链和包含与苷元核心结构结合的选自组B的第二糖链。
因此，当本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物所包含的皂苷具有两个聚糖(糖链)时，第一糖链结合在苷元核心结构的位置C3处，并且第二糖链结合在该苷元核心结构的位置C28处。
不希望受任何理论的束缚，在苷元核心结构(此处也称为‘苷元’)中醛基团或其衍生物的存在有益于当这样的皂苷与(效应)分子共同定位于细胞中、所述细胞的内体中时，皂苷刺激并且/或者增强这些(效应)分子(例如寡核苷酸)的内体逃逸的能力。因此，本发明的皂苷缀合物或本发明的包含具有带醛基团的苷元的皂苷的寡核苷酸缀合物是优选的。在皂皮酸和丝石竹皂苷元中，醛基团位于苷元的C23原子处。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中皂苷选自由以下组成的组：皂树树皮皂苷、川续断皂苷B、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷甲、商陆皂苷甲、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶素、七叶素Ia、茶籽皂苷I、茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、毛地黄皂苷、报春花酸1和AS64R，其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SO1832、SO1832衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物。更优选地，皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物及其组合，更优选皂苷自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、SO1861及其组合，最优选皂苷是SO1861衍生物或SO1861，或SO1832衍生物或SO1832。皂苷的此类衍生物是内体逃逸增强衍生物，其程度与其非衍生化的天然对应物相同或相似。
当皂苷与(效应)分子(例如本发明的寡核苷酸缀合物所包含的寡核苷酸)共同定位在细胞内时，这样的三萜苷型的皂苷能够增强存在于细胞的内体(或溶酶体)中的这样的(效应)分子的内体逃逸。诸位发明人确立了当本发明的皂苷缀合物包含皂苷时或当本发明的寡核苷酸缀合物包含皂苷时，当使该皂苷与细胞接触时，这些皂苷的内体逃逸增强活性是至少约5倍更有效力，也就是说至少约10倍更有效力，如10-1000倍更有效力或约100-1000倍更有效力。当在比达到将(效应)分子(例如选自ASO或siRNA的寡核苷酸)从细胞的外部递送到内体中并最终递送到所述细胞的胞质溶胶中和/或细胞核中的相同程度所需的、本发明的皂苷缀合物所包含的或本发明的寡核苷酸缀合物所包含的相同皂苷的浓度高100-1000倍的皂苷浓度下使这样的细胞与(效应)分子和皂苷接触时，游离皂苷能够刺激(效应)分子在细胞的胞质溶胶中的递送。表A1中列出了展现出这样的内体逃逸增强活性的皂苷、以及与已经建立了增强(效应)分子的胞质溶胶递送能力的皂苷具有高度结构相似性的皂苷。与使相同的细胞与游离的、非靶向的皂苷(未提供用于与靶细胞的ASGPR结合的ASGPR的配体)接触相比，当皂苷是本发明的皂苷缀合物的一部分或本发明的寡核苷酸缀合物的一部分时，在ASGPR(例如ASGPR1)的配体(例如单个GalNAc部分或三个共价偶联的GalNAc部分的簇)与靶细胞(优选肝细胞)上的细胞表面结合位点结合后，在所述细胞上并且在胞吞作用后，将皂苷靶向递送到所述细胞的内体中的有效性(效力)因此高至少5-10倍，例如约100至1000倍。
通常，对于本发明的皂苷缀合物和本发明的寡核苷酸缀合物，一旦缀合物被携带ASGPR的细胞摄取并转运到内体中，则缀合物中共价结合的皂苷被从缀合物上切下(释放)。在内体中，化学条件和/或pH使得一个或多个皂苷和缀合物的其余部分之间的共价键被破坏并且皂苷以游离形式释放到内体中。优选的是，切下的皂苷具有其天然化学结构。例如，当皂苷的醛基团隐含在皂苷与GalNAc部分(通常通过接头)和/或寡核苷酸(通常通过接头)的共价偶联中时，优选地，从内体中的缀合物释放的皂苷再次包含在解偶联化学的影响下形成的该醛基团。不希望受任何理论的束缚，据信游离形式的皂苷(优选具有可自由接近的醛基团，优选在皂苷的苷元核心结构的位置C-23具有醛官能团)在内体中发挥最佳内体逃逸增强活性。例如，在细胞(如哺乳动物细胞，如人细胞，如肿瘤细胞、肝细胞)内体中酸性pH的影响下，皂苷例如从皂苷通过腙键或缩氨基脲键结合的缀合物切下。因此，优选地，在本发明的缀合物中，皂苷通过可切割的键共价结合，优选通过在细胞内体内部切割的可切割的共价键，例如由于内体中的酸性条件而被切割的键。
Figure BDA0004177963000000421
/>
Figure BDA0004177963000000431
/>
Figure BDA0004177963000000441
/>
Figure BDA0004177963000000451
/>
Figure BDA0004177963000000461
在实施例中，皂苷缀合物或寡核苷酸缀合物包含至少一个皂苷，其中该皂苷是衍生物，其中
i.该皂苷的苷元核心结构包含已衍生化的醛基团；
ii.该皂苷的糖链(优选地选自A组的糖链)包含已衍生化的羧基基团；
iii.该皂苷的糖链(优选地选自B组的糖链)包含已衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.存在衍生化(i)、(ii)和/或(iii)的任何组合。
苷元核心结构的醛基团的示例性衍生化(i)包括还原为醇，如伯醇；转化为腙(官能团)或缩氨基脲(官能团)；转化为半缩醛；转化为缩醛；氧化为羧基；转化为亚胺；转化为肟；转化为β-羟基酮；或转化为烯酮，优选地还原为醇，如伯醇；或转化为腙(官能团)或缩氨基脲(官能团)。一旦存在于摄取本发明的皂苷缀合物或寡核苷酸缀合物的细胞的内体中，本发明的缀合物的衍生化皂苷仍然发挥其内体逃逸增强活性。
在实施例中，皂苷是衍生物，其中苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基团：
-还原为醇，如伯醇；或
-转化为具有式RbHC＝NNHRa的腙；优选地转化为具有式RbHC＝NNH(CO)Ra的腙
其中Ra是包含少于20个碳原子、优选地少于10个碳原子的基团，并且Rb是皂苷的剩余物。优选地，Ra是N-烷基化马来酰亚胺。在特定的实施例中，醛基团已通过与以下反应转化为腙键：N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)、N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)、或N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)。
糖链的羧基基团的示例性衍生化(ii)包括：还原为醇，如伯醇；转化为酰胺；转化为酯；转化为胺，如伯胺或仲胺；或脱羧，优选地还原为醇，如伯醇；转化为酰胺；或转化为酯；更优选地转化为酰胺。
优选地，衍生化的羧基基团是葡糖醛酸部分的一部分，并且优选地糖链选自A组。
在实施例中，皂苷是衍生物，其中糖链(优选地选自A组的糖链)包含已通过以下衍生化的羧基基团(优选地葡糖醛酸部分的羧基基团)：
-还原为醇，如伯醇；
-转化为具有式RaNH(CO)Rb的酰胺；或
-转化为具有式RaO(CO)Rb的酯
其中Ra是包含少于20个碳原子、优选地少于10个碳原子的基团，并且Rb是皂苷的剩余物。优选地，Ra是N-烷基化马来酰亚胺或二醇。在特定的实施例中，羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化。
糖链的乙酰氧基基团的示例性衍生化(iii)包括：通过脱乙酰化转化为醇，如仲醇，任选地随后通过将所得的醇转化为醚；酯或酮；优选地通过脱乙酰化转化为醇，如仲醇。
优选地，衍生化的乙酰氧基基团是选自B组的糖链的一部分。
在实施例中，皂苷是衍生物，其中糖链(优选地选自B组的糖链)包含已通过以下衍生化的乙酰氧基基团：
-通过脱乙酰化转化为醇，如仲醇；或
-通过脱乙酰化转化为醇，如仲醇，随后将所得的醇转化为具有式RaORb的醚、具有式Ra(CO)ORb的酯、或具有式Ra(CO)Rb的酮
其中Ra是包含少于20个碳原子、优选地少于10个碳原子的基团，并且Rb是皂苷的剩余物。优选地，Ra是N-烷基化马来酰亚胺或二醇。
因此，在实施例中，皂苷是衍生物，其中：
i.苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基团：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化为腙键；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化为腙键；
ii.选择A组的糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化；
iii.选自B组的糖链包含乙酰氧基基团(Me(CO)O-)，该乙酰氧基基团已通过转化为羟基基团(HO-)而衍生化；或
iv.存在衍生化(i)、(ii)和/或(iii)的任何组合。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含含有已衍生化的醛基团的苷元核心结构；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自A组的糖链，该糖链包含已衍生化的羧基基团；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自B组的糖链，该糖链包含已衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂皮皂素、皂苷集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SO1832、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物、及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物。最优选皂苷自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、SO1861及其组合，甚至更优选皂苷是SO1861衍生物或SO1861，或SO1832衍生物或SO1832。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是根据本发明的皂皮酸皂苷或丝石竹皂苷元皂苷的皂苷衍生物，并由分子1表示：
Figure BDA0004177963000000491
Figure BDA0004177963000000501
其中
A1表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A1表示选自A组的糖链，更优选地A1表示选自A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成；
A2表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A2表示选自B组的糖链，更优选地A2表示选自B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团，如一个、两个、三个或四个乙酰氧基基团，
其中A1和A2中的至少一个不是氢，优选地A1和A2均为寡糖链；
并且R是丝石竹皂苷元中的氢或皂皮酸中的羟基；
其中该皂苷衍生物对应于该由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基团已被衍生化；
ii.当A1表示选自A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化；及
iii.当A2表示选自B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个(优选地全部)已被衍生化。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中A1表示选自A组的糖链并且包含葡糖醛酸部分或由其组成，并且其中A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，和/或其中A2表示选自B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团，并且其中A2的至少一个乙酰氧基基团已被衍生化。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中由分子1表示的皂苷是双糖链三萜皂苷。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷衍生物对应于由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基团已通过以下衍生化：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.当A1表示选自A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD(如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD)或皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；及
iii.当A2表示选自B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个(优选地全部)已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中A1是Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA并且/或者A2是Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc，优选地由分子1表示的皂苷是3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-葡糖醛酸吡喃基皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4OAc-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选地皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、SO1832、GE1741、SA1641和QS-21或其衍生物，最优选SO1861或其衍生物，或SO1832衍生物或SO1832。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基团：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD(如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD)或皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自B组的糖链，该糖链包含已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合；
优选地，该皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含已通过与EMCH反应转化成腙键而衍生化的醛基团，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化的醛基团，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；或
iii.该皂苷衍生物包含衍生化i.和ii.的组合。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含醛基团，并且其中该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中皂苷衍生物由分子2表示：
Figure BDA0004177963000000531
或其中该皂苷衍生物由分子3表示：
Figure BDA0004177963000000541
/>
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中至少一个皂苷和ASGPR的配体直接或经由至少一个接头共价连接。实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中该至少一个皂苷和该ASGPR的配体直接或经由至少一个接头共价连接，和/或其中该至少一个皂苷和该寡核苷酸直接或经由至少一个接头共价连接，和/或其中该ASGPR的配体和该寡核苷酸直接或经由至少一个接头共价连接，优选地，该至少一个皂苷、该ASGPR的配体和该寡核苷酸通过至少一个接头连接。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中GalNAc部分优选地经由皂苷接头Ls与皂苷S结合，如式(II)S中所表示：
Figure BDA0004177963000000542
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中GalNAc部分各自分别经由该GalNAc部分的位置“1”上的氧与中心桥接部分B共价结合，该中心桥接部分B优选地经由皂苷部分接头LS在该GalNAc部分与该皂苷部分之间有效地形成桥，如式(III)S中所示：
Figure BDA0004177963000000551
其中n是大于或等于2的整数，优选地n是3，LS是皂苷部分接头，并且S是该皂苷部分。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中GalNAc部分经由GalNAc接头LGAL与桥接部分B结合，如式(IV)S中所示：
Figure BDA0004177963000000552
其中n是大于或等于2的整数，优选地n是3，LS是皂苷部分接头，并且S是该皂苷部分。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷部分接头Ls表示适合用于使皂苷与如式(II)S中的GalNAc或与如式(III)S和(IV)S中的桥接部分B共价结合的任何化学部分。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷部分接头LS是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，其中LS1是与GalNAc或与该桥接部分B共价结合的皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与该皂苷部分共价结合的皂苷部分接头LS的前体。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷部分接头LS是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，其中该偶联反应选自由以下组成的组：叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环、非醛醇类型的羰基反应以及碳-碳双键的加成，优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环，更优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成或硫醇马来酰亚胺偶联。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中皂苷部分接头LS是第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第一前体LS1包含叠氮化物；该第二前体LS2与该皂苷部分共价结合，该第二前体LS2包含炔烃并且优选地包含由酰肼/醛与该皂苷部分的醛偶联产生的腙。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中前体LS1的结构是以下具有式(XVII)的叠氮化物：
Figure BDA0004177963000000561
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示选自1、2和3的整数，更优选地a表示2，或
其中该前体LS1的结构包含以下具有式(XVIII)的叠氮化物：
Figure BDA0004177963000000562
其中c表示大于或等于0的整数，优选地c表示5-15范围内的整数，更优选地c表示9。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中前体LS2的结构包含以下具有式(XIX)的腙：
Figure BDA0004177963000000563
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示2-6范围内的整数，更优选地a表示4，并且其中LS2a表示含炔烃部分。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中LS2a包含少于20个碳原子，优选地LS2a表示根据式(XX)的部分：
Figure BDA0004177963000000571
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中桥接部分是具有式(XV)的化合物：
Figure BDA0004177963000000572
其中该具有式(XV)的化合物的氧原子与GalNAc或该GalNAc接头LGAL结合，并且该具有式(XV)的化合物的氮原子与该皂苷部分接头LS结合。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中LGAL表示适合用于使GalNAc与桥接部分B共价结合的任何化学部分。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中LGAL包含2-25个碳原子、优选地7-15个碳原子、更优选地11个碳原子，并且其中LGAL包含至少一个、优选两个酰胺部分。
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中LGAL是根据式(XVI)的化合物：
Figure BDA0004177963000000573
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中至少一个GalNAc部分、至少一个皂苷和寡核苷酸通过三官能接头共价结合，优选GalNAc部分、皂苷和寡核苷酸中的每一个共价结合到三官能接头的单独臂上。本发明的优选寡核苷酸缀合物是寡核苷酸缀合物，其中至少一个GalNAc部分，优选三个GalNAc部分，至少一个皂苷，优选1-16个皂苷部分，更优选1-8个皂苷部分，例如1、4或8个皂苷部分和寡核苷酸通过三官能接头共价结合，优选地，一个或多个GalNAc部分、皂苷/皂苷部分和寡核苷酸中的每一个共价结合到三官能接头的单独臂上。适合并入本发明的寡核苷酸缀合物的三官能接头的实例是由式(XXI)表示的三官能接头：
Figure BDA0004177963000000581
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中三官能接头，例如由式(XXI)表示的三官能接头，通过接头的第一臂共价结合到一个或多个皂苷部分，优选1-16个皂苷部分，更优选1-8个皂苷部分，例如1、4或8个皂苷部分，通过接头的第二臂共价结合到至少一个GalNAc部分，优选1-4个GalNAc部分，更优选3个GalNAc部分，通过三官能接头的第三臂共价结合到寡核苷酸，优选AON，例如BNA或siRNA。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中ASGPR的配体是由分子I’表示的(GalNAc)3Tris：
Figure BDA0004177963000000591
或其中该ASGPR的配体是由分子II’表示的单GalNAc：
Figure BDA0004177963000000592
实施例是本发明的皂苷缀合物，其中至少一个皂苷经由由分子III’表示的接头与本发明的分子I’或分子II’共价结合：
Figure BDA0004177963000000593
其中分子III’的酰肼部分与该皂苷中的醛基团形成共价腙键，并且其中二苯并环辛炔基团与分子I’或分子II’的叠氮化物基团形成共价键。
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中至少一个皂苷通过至少一个可切割接头共价结合至ASGPR的配体，和/或其中至少一个皂苷通过至少一个可切割接头共价结合至寡核苷酸。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中至少一个皂苷与ASGPR的配体经由至少一个可切割接头共价结合。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中可切割接头在酸性条件、还原性条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键、和/或易被蛋白水解(例如由组织蛋白酶B进行的蛋白水解)的键、和/或在还原性条件下易于切割的键，如二硫键。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中可切割接头在酸性条件下(例如像存在于哺乳动物细胞(优选地人细胞)的内体和/或溶酶体中)经受体内切割，优选地该可切割接头在pH 4.0-6.5下、并且更优选地在pH≤5.5下经受体内切割。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中缀合物包含1、2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个皂苷部分，或其间的任何数目的皂苷部分，如7、9、12个皂苷部分，并且优选1、4或8个皂苷部分。优选皂苷SO1861或SO1832或其功能性衍生物，例如QS-21也是合适的皂苷或其功能性衍生物。
实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中缀合物包含1个皂苷部分。实施例是本发明的皂苷缀合物或本发明的寡核苷酸缀合物，其中缀合物包含4或8个皂苷部分。
当与寡核苷酸被不与寡核苷酸一起与皂苷共接触的细胞摄取时的活性相比时，本发明的缀合物以及本发明的皂苷缀合物和寡核苷酸缀合物的应用的许多好处之一是可以选择和筛选缀合物中适合实现改善的细胞内寡核苷酸活性(例如基因沉默活性)的皂苷部分的数量。发明人证明(参见实例部分)在本发明的缀合物中掺入单个皂苷部分已经足以实现如基因沉默所测量的改善的细胞内寡核苷酸活性。在进一步的实例中，证明通过例如在本发明的缀合物中包括4或8个皂苷部分进一步改善基因沉默。皂苷缀合物和寡核苷酸缀合物提供了将1-64或甚至更多个(如128个)皂苷部分偶联至一个或多个GalNAc部分(对于皂苷缀合物优选3个GalNAc部分)或偶联至一个或多个GalNAc部分和寡核苷酸(对于寡核苷酸缀合物)的自由度。如上所述，发明人出人意料地发现组合皂苷和GalNAc，或组合皂苷、GalNAc和寡核苷酸，不妨碍缀合物中任何组分的生物活性。此外，增加缀合物中皂苷部分的数量可以提高寡核苷酸活性。不希望受任何理论的束缚，皂苷部分数量的增加增加了皂苷一旦被细胞摄取并转移到内体中的内体逃逸增强活性。与皂苷一起存在于内体中的施用的寡核苷酸(作为寡核苷酸缀合物的一部分或作为GalNAc-寡核苷酸缀合物分开)由于皂苷介导的内体逃逸活性提高，更有效地从内体转移到胞质溶胶中，导致基因沉默活性增加。例如，在缀合物中掺入一个或多个皂苷部分的可能性允许在考虑用选定的寡核苷酸进行最佳基因沉默时定制缀合物设计。从内体转移到胞质溶胶的效率相对较低，例如效率为1％-2％的寡核苷酸受益于缀合物中单个皂苷部分的存在(寡核苷酸缀合物中的比率为1:1)，而从内体释放到胞质溶胶中的程度较低的寡核苷酸可以通过在缀合物中应用多于一个的单个皂苷部分，例如2-100个部分、2-64、2-34、2-16、4-12、4-8个部分而增加转移到胞质溶胶中。用于掺入多于一个皂苷部分的合适方法是例如将树状突掺入本发明的缀合物中，例如G2、G3或G4树状突，例如用于将4或8或16个皂苷部分一起结合在缀合物中。在实例部分中，对于包含单个皂苷部分、4个皂苷部分和8个皂苷部分的寡核苷酸缀合物而言，提供了改善的基因沉默的实例(在选定时间点的沉默程度，靶基因沉默的持续时间)。本发明人确定，与在不存在皂苷的情况下与寡核苷酸接触的细胞中的基因沉默相比，通过使细胞与本发明的寡核苷酸缀合物接触，在某一时间点的基因沉默程度得以改善，并且基因沉默的持续时间得以延长。
对于本发明的寡核苷酸缀合物，缀合物包含1或3个GalNAc部分，优选3个GalNAc部分是合适的(并且是优选的)。
根据本发明，皂苷通常是一个或多个SO1861或SO1832(也称为SO1831)部分，例如1-32个SO1861或SO1832部分，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个部分，更优选1、2、4、8、12或16个部分，最优选1、4或8个部分，例如1、4或8个SO1861或1、4或8个SO1832。发明人确定，当考虑内体中针对寡核苷酸(或蛋白质毒素)的内体逃逸增强活性时，SO1832与SO1861的活性大致相同。如上文所述，当考虑细胞与寡核苷酸接触时基因沉默的程度和持续时间时，皂苷部分的数量可以针对本发明的缀合物进行优化。对于本发明的寡核苷酸缀合物，这也适用于本发明的缀合物中的GalNAc部分的数量。通常，当本发明的缀合物包含1或3个GalNAc部分时，建立最佳基因沉默(程度和/或持续时间)。
皂苷SO1832由带有在C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-和在C-28-OH基团处的碳水化合物取代基Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-的皂皮酸苷元核心(另见表A1)组成。化学式为C82H128O45精确质量为1832,77道尔顿。SO1832的皂苷结构是根据分子(SO1832)：
Figure BDA0004177963000000621
本领域技术人员将理解，如果本发明的皂苷缀合物中所包含的皂苷是如本文所述的具有式(II)S、(III)S或(IV)S的化合物，其中皂苷部分接头LS是第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分共价结合，该第二前体LS2与皂苷部分共价结合，该第二前体LS2包含由酰肼/醛与皂苷部分的醛偶联产生的腙或包含由氨基脲/醛与皂苷部分的醛偶联产生的缩氨基脲官能团，如本文所述，这意指醛基团已被接头占据，使得合适的皂苷衍生物是其中皂苷通过(ii)如本文所述的糖链的羧基基团和/或(iii)如本文所述的糖链的乙酰氧基基团衍生化的这些皂苷衍生物。
效应分子缀合物-介绍
本发明的某些药物组合和某些药物组合物包含效应分子和脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体的第二缀合物，在本文中称为“效应分子缀合物”。当效应分子与效应分子缀合物的剩余物结合时，其在本文中被称为“效应子部分”。ASGPR配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分并且优选地包含三个GalNAc部分(GN)3。根据本发明的优选实施例，每个GalNAc部分经由与如式(I)中所指示的位置“1”上的氧的共价键，与ASGPR配体的剩余物结合，或者在ASGPR配体由单个GalNAc部分组成的情况下与效应子部分结合：
Figure BDA0004177963000000631
如式(II)E中所示，ASGPR配体由与效应子部分E结合的单个GalNAc部分组成，优选地经由效应子部分接头LE。
Figure BDA0004177963000000632
ASGPR配体可以包含多于一个GalNAc部分，如2、3、4、5或6个GalNAc部分，优选地3或4个GalNAc部分，最优选三个部分。在这样的情况下，优选GalNAc部分各自分别经由位置“1”上的氧与中心桥接部分B共价结合，该中心桥接部分B优选地经由效应子部分接头LE在GalNAc部分与效应子部分之间有效地形成桥。GalNAc部分可以直接与桥接部分B结合，如式(III)E中所示：
Figure BDA0004177963000000633
其中n是大于或等于2的整数，LE是效应子部分接头，并且E是效应子部分。更优选地，GalNAc部分经由GalNAc接头LGAL与桥接部分B结合，如式(IV)E中所示：
Figure BDA0004177963000000641
其中n是大于或等于2的整数，LE是效应子部分接头，并且E是效应子部分。虽然可以独立地选择每次出现的LGAL，但本领域技术人员将理解，在每次出现的LGAL表示相同的部分的情况下，缀合物的合成被简化。
效应分子缀合物-接头LE
效应子部分接头LE表示适合用于使效应子部分与如式(II)E中的GalNAc或与如式(III)E和(IV)E中的桥接部分B共价结合的任何化学部分。接头的特性和大小没有特别限制，并且使效应分子与如式(II)E中的GalNAc或与如式(III)E和(IV)E中的桥接部分B共价结合可以通过“常规的”化学官能团(例如醚键)以及通过典型地具有长链长度的“点击化学”型接头(产生包含例如多于10个或多于20个碳原子的接头EL)来实现。合适的效应子部分接头LE和相关的偶联反应描述于手册Hermanson,Greg T.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academic press[学术出版社],2013中。
如本领域技术人员将理解的，效应子部分接头LE将典型地是至少第一前体LE1与第二前体LE2之间的偶联反应(例如“点击化学”类型)的结果，该第一前体LE1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第二前体LE2与效应子部分共价结合。该原理在具有式(II)的化合物的以下反应方案中展示：
Figure BDA0004177963000000642
其中LE是效应子部分接头，LE1是与GalNAc共价结合的效应子部分接头LE的前体，并且LE2是与效应子部分共价结合的效应子部分接头LE的前体，并且E是效应子部分。
具有式(III)的化合物的对应反应方案如下：
Figure BDA0004177963000000651
其中LE是效应子部分接头，LE1是与GalNAc共价结合的效应子部分接头LE的前体，并且LE2是与效应子部分共价结合的效应子部分接头LE的前体，n是大于或等于2的整数，并且E是效应子部分。
具有式(IV)E的化合物的对应反应方案如下：
Figure BDA0004177963000000652
其中LE是效应子部分接头，LE1是与GalNAc共价结合的效应子部分接头LE的前体，并且LE2是与效应子部分共价结合的效应子部分接头LE的前体，n是大于或等于2的整数，E是效应子部分，并且LGAL是GalNAc接头并且B是桥接部分。
效应子部分接头LE可以是至少第一前体LE1与第二前体LE2之间的偶联反应的结果，该第一前体LE1与GalNAc或桥接部分共价结合，该第二前体LE2与效应子部分共价结合，其中该偶联反应是例如叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂(如氮杂环丙烷、环氧化物、环状硫酸酯、氮丙啶离子、镏化物离子)的亲核开环、非醛醇类型的羰基反应(如脲、硫脲、腙、肟醚、酰胺或芳香族杂环形成)或碳-碳双键的加成(如环氧化、氮杂环丙烷化、二羟基化、硫酰卤加成、亚硝酰卤化物加成或迈克尔加成)，优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环，更优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成或硫醇马来酰亚胺偶联。
根据本发明的一些实施例，效应子部分接头LE包含琥珀酰亚胺硫醚部分。这样的琥珀酰亚胺硫醚是例如N-取代的马来酰亚胺与含硫醇或巯基化合物之间的硫醇马来酰亚胺偶联的结果。该硫醇马来酰亚胺偶联是生物缀合领域中通常已知的“点击”化学工具，并且例如描述于Hermanson,Greg T.Bioconjugate techniques[生物缀合技术].Academicpress[学术出版社],2013第289页中。因此，优选效应子部分接头LE是第一前体LE1与第二前体LE2之间的偶联反应的结果，该第一前体LE1与GalNAc或桥接部分共价结合，该第一前体LE1包含N-取代的马来酰亚胺；该第二前体LE2与效应子部分共价结合，该第二前体LE2包含硫醇或其前体。合适的硫醇前体是二硫化物，其可经由还原成对应的硫醇而被(例如原位)切割。
存在于具有式(V)E、(VII)E或(VIII)E的化合物中的前体LE1的优选结构是以下末端N-取代的马来酰亚胺：
Figure BDA0004177963000000661
其中X表示适合用于使末端N-取代的马来酰亚胺与GalNAc或桥接部分B共价结合的任何接头。如本领域技术人员将理解的，X可以是第一部分与第二部分之间的偶联反应的结果，该第一部分与GalNAc或桥接部分共价结合，该第二部分与马来酰亚胺共价结合。X可以包含腙和/或1，2,3-三唑。无论何时在本申请的接头的上下文中提及1,2,3-三唑，这优选地意指1H-1,2,3-三唑。
存在于具有式(V)E、(VII)E或(VIII)E的化合物中的前体LE1的结构的实施例是以下末端N-取代的马来酰亚胺：
Figure BDA0004177963000000662
其中a和b各自独立地表示大于或等于0的整数，优选地a和b各自独立地表示选自0、1、2和3的整数，更优选地a和b表示2，并且其中LE1a表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地1,2,3-三唑，并且其中LE1b表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地腙；
Figure BDA0004177963000000663
Figure BDA0004177963000000671
其中b和c各自独立地表示大于或等于0的整数，优选地b表示选自0、1、2和3的整数并且c表示5-15范围内的整数，更优选地b表示2并且c表示9，其中LE1a表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地1,2,3-三唑，并且其中LE1b表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地腙；
及
Figure BDA0004177963000000672
其中c表示大于或等于0的整数，优选地c表示5-15范围内的整数，更优选地c表示9，其中LE1c表示腙和/或1,2,3-三唑、优选地1,2,3-三唑。
LE1a、LE1b和LE1c各自优选地包含少于20个碳原子，更优选地LE1a、LE1b和LE1c各自独立地表示根据式(XIII)、(XIV)或(XV)的部分，优选地LE1a是具有式(XIII)的1,2,3-三唑，LE1b是具有式(XIV)的腙，并且LE1c是具有式(XV)的1，2，3-三唑：
Figure BDA0004177963000000673
因此，在一些实施例中，效应分子缀合物是如本文所述的具有式(II)E、(III)E或(IV)E的化合物，其中效应子部分接头LE是具有式(V)E、(VII)E或(VIII)E的化合物与具有式(VI)E的化合物之间的偶联反应的结果，其中第一前体LE1是具有式(X)、(XI)或(XII)的末端N-取代的马来酰亚胺，其中LE1a是例如具有式(XIII)的1,2,3-三唑，LE1b是例如具有式(XIV)的腙，并且LE1c是例如具有式(XV)的1,2,3-三唑。
效应分子缀合物-效应子部分
本发明的方面涉及一种药物组合，该药物组合包含：
-第一药物组合物，该第一药物组合物包含本发明的皂苷缀合物并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂；及
-第二药物组合物，该第二药物组合物包含效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
本发明的方面涉及一种药物组合物，该药物组合物包含：
-本发明的皂苷缀合物；
-效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中该效应分子包含以下中的至少一个或由其组成：小分子(如药物分子)、毒素(如蛋白质毒素)、寡核苷酸(如AON，如BNA)、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质、或其任何组合，优选地，该效应分子是毒素、酶或寡核苷酸。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或是(GalNAc)3Tris，和/或其中该ASGPR的配体和效应分子经由共价键、优选经由至少一个接头缀合。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中效应分子是选自以下中的任一个或多个的寡核苷酸：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹形微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-O,4’-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA、以及基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中效应分子是选自以下中的任一个或多个的寡核苷酸：抗miRNA、BNA-AON或siRNA，如基于BNA的siRNA，该siRNA选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA、和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中效应分子是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够使以下基因中的任一种沉默的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)、HSP27、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/科信9型(PCSK9)、δ-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向异常miRNA的寡核苷酸。实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中效应分子是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够使以下基因中的任一种沉默的寡核苷酸：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，和/或是例如，当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向异常miRNA的寡核苷酸。优选的靶基因是HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA，更优选基因HPS27和apoB。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中效应分子是寡核苷酸，该寡核苷酸例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向参与以下蛋白质中的任一种的表达的mRNA：apoB、HSP27、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT和LDH，或例如当存在于哺乳动物细胞内时能够拮抗或恢复miRNA功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻抑onco-miR的表达。实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中效应分子是寡核苷酸，该寡核苷酸例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向参与以下蛋白质中的任一种的表达的mRNA：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，优选HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA，或例如当存在于哺乳动物细胞内时能够拮抗或恢复miRNA功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻抑onco-miR的表达。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中效应分子是或包含毒素，该毒素包含至少一种分子或由其组成，该分子选自以下中的任一种或多种：肽、蛋白质、酶(如脲酶和Cre重组酶)、朊毒素、核糖体失活蛋白、和/或细菌毒素、植物毒素，更优选地选自以下中的任一种或多种：病毒毒素，如凋亡蛋白；细菌毒素，如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，如α-八叠球菌素；植物毒素，包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，如香石竹毒蛋白例如香石竹毒蛋白-30或香石竹毒蛋白-32、皂草毒蛋白例如皂草毒蛋白-S3或皂草毒蛋白-S6、三角梅核糖体失活蛋白或三角梅核糖体失活蛋白的去免疫化衍生物去三角梅核糖体失活蛋白、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、蒴莲根毒素、蒴莲根毒素A链、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白、蒴莲根毒蛋白A链、槲寄生凝集素、槲寄生凝集素A链；或动物或人毒素，如青蛙核糖核酸酶、或来自人的颗粒酶B或血管生成蛋白，或其任何片段或衍生物；优选地，该蛋白质毒素是香石竹毒蛋白和/或皂草毒蛋白，和/或包含以下中的至少一种或由其组成：靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素，更优选地以下中的任一种或多种：恩美、帕舒托、美登木素生物碱衍生物DM1、美登木素生物碱衍生物DM4、单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE，维多汀)、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF，莫福汀)、卡奇霉素、N-乙酰基-γ-卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0004177963000000713
(PBD)二聚体、苯并二氮杂/>
Figure BDA0004177963000000712
CC-1065类似物、多卡米星、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、微管溶素、吲哚啉并苯并二氮杂/>
Figure BDA0004177963000000714
AZ13599185、念珠藻素、根瘤菌素、氨甲蝶呤、蒽环素、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依喜替康、截短形式的铜绿假单胞菌外毒素(PE38)、多卡米星衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、剪接抑制素、泰兰斯他汀、奥佐米星、特司林、安伯他汀269和索星、或其衍生物。
缀合物-桥接部分B
存在于本文所述的具有式(III)S或(IV)S的皂苷缀合物中和具有式如(III)E或(IV)E的效应分子缀合物中的桥接部分B表示适合用于共价结合2个或更多个、优选地3个或4个、更优选地3个GalNAc部分和皂苷部分接头LS或效应子部分接头LE的任何部分。
根据优选的实施例，桥接部分B是具有式(XV)的化合物：
Figure BDA0004177963000000711
其中具有式(XV)的化合物的氧原子与GalNAc(对应于具有式(III)S或(III)E的化合物)或与GalNAc接头LGAL(对应于具有式(IV)S或(IV)E的化合物)结合，并且具有式(XV)的化合物的氮原子与皂苷部分接头LS或效应子部分接头LE结合。
本领域技术人员将理解，具有式(III)S、(III)E、(IV)S或(IV)E的这些化合物(其中桥接部分B是具有式(XV)的化合物)对应于其中ASGPR配体由(GalNAc)3Tris组成的效应分子缀合物。
缀合物-接头LGAL
GalNAc接头LGAL表示适合用于使GalNAc与如式(IV)S或(IV)E中的桥接部分共价结合的任何化学部分。接头的特性和大小没有特别限制。
根据实施例，GalNAc接头LGAL各自包含2-25个碳原子、优选地7-15个碳原子、更优选地11个碳原子。优选地GalNAc接头LGAL包含至少一个、优选地两个酰胺部分。特别优选的GalNAc接头LGAL是根据式(XVI)的化合物：
Figure BDA0004177963000000721
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子是细胞表面分子的配体或包含用于细胞表面分子的结合位点的抗体或其包含该结合位点的至少一个结构域或片段。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中第三缀合物是以下中的任一种或多种：抗体-毒素缀合物、受体-配体-毒素缀合物、抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-核酸缀合物或受体-配体-核酸缀合物。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子能够与以下细胞表面分子中的任一种结合：CD71、CD63、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，优选地以下中的任一种：HER2、CD71、ASGPR和EGFR，更优选地CD71。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，其中第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子是或包含以下中的任一种：抗体，优选地单克隆抗体如人单克隆抗体、IgG、包含以下或由以下组成的分子：单结构域抗体、至少一个VHH结构域、优选地骆驼VH、可变重链新抗原受体(VNAR)结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2和Fcab片段。
本发明的一个方面涉及包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或涉及包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，用作药物。本发明的一个方面涉及本发明的寡核苷酸缀合物，用作药物。
本发明的一个方面涉及包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：apoB、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT和LDH。本发明的一个方面涉及包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，优选HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA，更优选HSP27、apoB。
实施例是包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合或包含本发明的皂苷缀合物的本发明的药物组合物，或包含本发明的皂苷缀合物的药物组合或包含以下的皂苷缀合物的药物组合物用于本发明的用途，用于在治疗或预防以下中使用：癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、心血管疾病、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、α1-抗胰蛋白酶缺乏、β-地中海贫血、或自身免疫性疾病。
实施例是包含本发明皂苷缀合物的药物组合用于本发明的用途或包含本发明皂苷缀合物的药物组合物用于本发明的用途或包含本发明寡核苷酸缀合物的药物组合物，其中皂苷是皂苷衍生物，优选根据本发明的QS-21衍生物或SO1861衍生物或SO1832衍生物。
本发明的方面涉及一种体外或离体方法，该方法用于将本发明的第二缀合物或第三缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选地随后将根据本发明的第二缀合物或第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面上表达ASGPR并且当将该第三缀合物转移到该细胞中时该细胞表达细胞表面分子，其中该第三缀合物包含用于与所述细胞表面分子结合的结合分子，该细胞优选地选自肝细胞、病毒感染细胞和肿瘤细胞；
b)提供如本发明的第二缀合物或第三缀合物用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供本发明的皂苷缀合物；
d)使步骤a)的细胞与步骤b)的第二缀合物或第三缀合物以及步骤c)的皂苷缀合物在体外或离体接触，从而实现将该第二缀合物或该第三缀合物从所述细胞的外部转移到所述细胞中，并且优选地从而随后实现将该第二缀合物或该第三缀合物转移到所述细胞的胞质溶胶中，或者优选地从而随后实现将至少该第二缀合物或该第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中。
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸是BNA、异种核酸、siRNA、反义寡核苷酸中的任一种。
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸选自以下中的任何一种或多种：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹形微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2′-O,4’-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA、以及基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸选自以下中的任何一种或多种：抗miRNA、BNA-AON或siRNA，如基于BNA的siRNA，该siRNA选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA、和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时沉默以下基因中任何一个的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)、HSP27、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/科信9型(PCSK9)、TMPRSS6、δ-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向异常miRNA的寡核苷酸。优选地，基因是以下基因中的任何一个：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA，用于表达蛋白HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1的、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时沉默以下基因中任何一个的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)和HSP27。
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：apoB、HSP27、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，或例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时能够拮抗或恢复miRNA功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻抑onco-miR的表达。优选地，蛋白质是选自以下的肝蛋白质：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
实施例是本发明的寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：apoB和HSP27。
本发明的一个方面涉及提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供至少一个包含共价结合的第一接头的皂苷部分，其中该第一接头包含至少一个用于与第二接头上的第二反应基团或第七接头上的第七反应基团共价结合的第一反应基团；
(b)提供包含共价结合的第三接头的寡核苷酸，其中该第三接头包含用于与第四接头上的第四反应基团或第七接头上的第八反应基团共价结合的第三反应基团；
(c)提供至少一个包含共价结合的第五接头的GalNAc部分，其中该第五接头包含用于与第六接头上的第六反应基团或第七接头上的第九反应基团共价结合的第五反应基团；及
以下中的任何一个
(d1)通过在该第一反应基团和该第二反应基团之间形成共价键将该第一接头连接到该第二接头，通过在该第三反应基团和该第四反应基团之间形成共价键将该第三接头连接到该第四接头，通过在该第五反应基团和该第六反应基团之间形成共价键将该第五接头连接到该第六接头，并将该第二接头、第四接头和第六接头共价连接在一起，从而提供该寡核苷酸，
或
(d2)通过在该第一反应基团和该第七反应基团之间形成共价键将该第一接头连接到该第七接头，通过在该第三反应基团和该第八反应基团之间形成共价键将该第三接头连接到该第七接头，通过在该第五反应基团和该第九反应基团之间形成共价键将该第五接头连接到该第七接头，从而提供该寡核苷酸缀合物。
实施例是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中该第七接头是三官能接头，例如式(XXI)所示的三官能接头：
Figure BDA0004177963000000771
优选的是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中至少一个皂苷部分是1-16个皂苷部分，优选1-8个皂苷部分，例如1、4或8个皂苷部分。
优选的是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中皂苷是SO1861、SO1832、QS-21或其任何功能性衍生物，优选SO1861或SO1832。
优选的是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中一个或多个皂苷部分通过腙键或缩氨基脲键共价连接。
优选的是用于提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中至少一个GalNAc部分是1-4个GalNAc部分，优选1或3个GalNAc部分。
本发明的一个方面涉及药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸缀合物，以及任选的药学上可接受的赋形剂和/或任选的药学上可接受的稀释剂。
本发明的一个方面涉及用作药物的药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸缀合物，以及任选的药学上可接受的赋形剂和/或任选的药学上可接受的稀释剂。本发明的一个方面涉及本发明的寡核苷酸缀合物，用作药物。
本发明的一个方面涉及药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸缀合物和任选的药学上可接受的赋形剂和/或任选的药学上可接受的稀释剂或涉及本发明的寡核苷酸缀合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH。例如，该疾病是与肿瘤细胞中HSP27的(过度)表达相关的癌症。将包含用于使HSP27基因沉默的寡核苷酸的本发明的寡核苷酸缀合物施用于患有肿瘤生长与HSP27的(过)表达相关的肿瘤的患者，导致HSP27基因的沉默并由此使肿瘤生长停止。例如，与apoB表达相关的健康问题是与人受试者血液中LDL-胆固醇水平升高相关的健康问题，例如处于动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症风险中的患者，和/或患有所述动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症的患者。向所述人受试者或患者施用包含用于沉默apoB基因的寡核苷酸的本发明的寡核苷酸导致抑制或降低apoB表达并且因此降低LDL(-胆固醇)，因为apoB是LDL颗粒的蛋白质组分。循环LDL水平降低与循环LDL-胆固醇减少相关，并由此降低了LDL-胆固醇相关的健康风险和疾病症状风险，这在患有动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症的患者或在高于正常血液水平的LDL-胆固醇的影响下处于发生动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症的风险中的受试者中是明显的。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物或涉及本发明的寡核苷酸缀合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
实施例是用于根据本发明的用途的药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸缀合物，或者是用于根据本发明的用途的本发明的寡核苷酸缀合物，其中所述用途是治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题：HSP27和apoB，优选apoB，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27和apoB，优选apoB。
实施例是用于根据本发明的用途的药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸缀合物，或者是用于根据本发明的用途的本发明的寡核苷酸缀合物，其中所述用途是治疗或预防以下：癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、或自身免疫性疾病。
实施例是用于根据本发明的用途的药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸缀合物，或者是用于根据本发明的用途的本发明的寡核苷酸缀合物，其中所述用途是治疗或预防癌症如子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌和高胆固醇血症，优选高胆固醇血症中。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物，或涉及本发明的寡核苷酸缀合物，用于治疗或预防癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、心血管疾病、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、α1-抗胰蛋白酶缺乏、β地中海贫血或自身免疫性疾病。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物，或涉及本发明的寡核苷酸缀合物，用于治疗或预防癌症如子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌或肝细胞癌，和/或心血管疾病如动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症，优选动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症。
例如，该疾病是与肿瘤细胞中HSP27的(过度)表达相关的癌症。将包含用于使HSP27基因沉默的寡核苷酸的本发明的寡核苷酸缀合物施用于患有肿瘤生长与HSP27的(过)表达相关的肿瘤的患者，导致HSP27基因的沉默并由此使肿瘤生长停止。例如，与apoB表达相关的健康问题是与人受试者血液中LDL-胆固醇水平升高相关的健康问题，例如处于动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症风险中的患者，和/或患有所述动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症的患者。向所述人受试者或患者施用包含用于沉默apoB基因的寡核苷酸的本发明的寡核苷酸导致抑制或降低apoB表达并且因此降低LDL(-胆固醇)，因为apoB是LDL颗粒的蛋白质组分。循环LDL水平降低与循环LDL-胆固醇减少相关，并由此降低了LDL-胆固醇相关的健康风险和疾病症状风险，这在患有动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症的患者或在高于正常血液水平的LDL-胆固醇的影响下处于发生动脉粥样硬化和/或高胆固醇血症的风险中的受试者中是明显的。
本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物或涉及本发明的寡核苷酸缀合物，用于降低受试者的LDL-胆固醇。本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物或涉及本发明的寡核苷酸缀合物，用于降低人受试者血液中的LDL-胆固醇浓度的方法中。本发明的一个方面涉及包含本发明的寡核苷酸缀合物的药物组合物或涉及本发明的寡核苷酸缀合物，用于治疗或预防心血管疾病的方法中。通常，治疗或预防是在患有心血管疾病的人患者中或在有患心血管疾病风险的人受试者中进行的。通常，与正常LDL-胆固醇水平范围的上限相比，心血管疾病与升高的LDL-胆固醇血液水平有关。
本发明的一个方面涉及体外或离体方法，该方法用于将本发明的寡核苷酸缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选随后将本发明的寡核苷酸缀合物所包含的寡核苷酸转移到所述细胞的胞质溶胶中和/或细胞核中，该方法包括以下步骤：
a)提供在其表面表达ASGPR，优选ASGPR1的细胞，该细胞优选选自肝细胞、病毒感染的哺乳动物细胞和哺乳动物肿瘤细胞，其中优选所述细胞是人细胞；
b)提供本发明的寡核苷酸缀合物，用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)使步骤a)的细胞体外或离体地与步骤b)的寡核苷酸缀合物接触，优选在液体介质中，从而实现寡核苷酸缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，并且任选地并且优选地从而随后实现寡核苷酸缀合物包含的寡核苷酸转移到所述细胞的胞质溶胶和/或细胞核中。
出人意料的是，发明人发现基于皂苷的皂苷衍生物，该皂苷包含三萜苷元核心结构和第一糖链‘R1’和第二糖链‘R2’中的至少一个(如本文所定义，连接至苷元核心结构，优选皂皮酸)，其中皂苷衍生物包含含有醛基团的苷元核心结构，其中该醛基团转化为根据式(I1)的缩氨基脲官能团)：
Figure BDA0004177963000000811
其中R1和R2独立地选自氢、单糖、直链寡糖和支链寡糖，
X＝O、P或S，以及
Y＝NR3R4，其中R3和R4独立代表H，未取代的C1-C10直链、支链或环状烷基，未取代的C2-C10直链、支链或环状烯基或未取代的C2-C10直链或支链炔基，或共价结合的接头，优选R3和R4之一为H；或
Figure BDA0004177963000000812
其中n和m各自为独立地选自1、2或3的整数，
Z＝CH2、O、S、P或NR5，并且
其中R5表示H，未取代的C1-C10直链、支链或环烷基，未取代的C2-C10直链、支链或环烯基，未取代的C2-C10直链或支链炔基，或共价结合的接头，或根据式(II1)a的马来酰亚胺部分：
Figure BDA0004177963000000813
或根据式(II1)b的叠氮化物部分
Figure BDA0004177963000000821
其中o是选自0-10、优选2-7、更优选4-6的整数，
当考虑与皂苷衍生物接触的细胞的细胞活力时具有降低的毒性；当考虑例如毒素细胞毒性或BNA介导的基因沉默的增强时具有活性(不希望受任何理论的约束：涉及修饰的皂苷的类似或改善的内体逃逸增强活性)，如果醛官能团被转化为根据式(I1)的缩氨基脲官能团；和/或与未修饰的皂苷的毒性、活性和溶血活性相比具有降低的溶血活性。也就是说，皂苷衍生物具有以下中的至少一项，优选至三，更优选全部三项：
(i)当考虑与皂苷衍生物接触的细胞的细胞活力时具有降低的毒性；
(ii)当考虑例如BNA介导的基因沉默的增强时具有增强的活性(不希望受任何理论的约束：涉及修饰的皂苷的类似或改善的内体逃逸增强活性)，如果醛官能团被转化为根据式(I1)的缩氨基脲官能团；和/或
(iii)降低的溶血活性，
这是与皂苷衍生物所基于的未修饰皂苷的毒性、活性和溶血活性相比。由此，诸位发明人提供了具有改善的治疗窗的皂苷衍生物，因为对于皂苷衍生物，细胞毒性低于对其天然存在的对应物确定的细胞毒性，溶血活性低于对皂苷衍生物的天然存在的对应物确定的溶血活性，细胞毒性的IC50值与例如毒素增强的IC50值或基因沉默的IC50值之间的比率相似或增加，和/或因为皂苷溶血活性的IC50值与例如毒素增强的IC50值或基因沉默的IC50值之间的比率相似或增加。术语“内体逃逸增强活性”可以缩写为“活性”。
此外，发明人通过将此类细胞与基于包含缩氨基脲官能团的皂苷衍生物的皂苷缀合物以及抗体-蛋白毒素缀合物等ADC接触，从而出人意料地建立了(肿瘤)细胞杀伤，尽管由皂苷缀合物包含的细胞表面分子结合分子(例如抗体)靶向的细胞表面受体的中至低表达和/或尽管由ADC靶向的细胞表面受体的中至低表达。皂苷衍生物和皂苷缀合物包含缩氨基脲官能团。例如，在比较实例中，当包含相同细胞表面分子结合分子(例如抗体)但包含腙官能团(＝N-N(H)-C(O)-)而不是缩氨基脲官能团的皂苷缀合物与细胞接触时，不能建立这种细胞杀伤或仅在较低程度上建立这种细胞杀伤。因此，当考虑效应子部分如ADC或AOC所包含的效应子部分的激活或增强时，本发明人提供了更有效的皂苷衍生物和皂苷缀合物。
此外，发明人已经发现，与本领域已知的包含腙官能团(＝N-N(H)-C(O)-)的皂苷衍生物相比，在酸性条件下(所述酸性条件是哺乳动物细胞的内体和/或溶酶体中存在的条件)，包含缩氨基脲官能团的皂苷衍生物相对包含“游离”醛官能团的相应天然皂苷水解更快且量更高。这具有以下益处：与所需量的包含例如腙官能团(＝N-N(H)-C(O)-)的皂苷衍生物相比，应施用给需要增强例如ADC或AOC或基因沉默寡核苷酸(例如与一个或多个GalNAc部分偶联的BNA)的患者较低量的本发明皂苷衍生物，以获得相同量的包含“游离”醛的天然皂苷，从而充当靶向的毒素或靶向的寡核苷酸的内体逃逸增强剂。不希望受任何理论的束缚，当与从包含例如腙官能团的皂苷衍生物中释放包含醛官能团的皂苷相比时，从包含缩氨基脲官能团的皂苷衍生物中更快和更有效地释放包含醛官能团的皂苷是发明人确定的包含包含缩氨基脲官能团的皂苷衍生物的皂苷缀合物(例如包含皂苷、寡核苷酸和细胞表面受体配体如一至三个GalNAc部分(用于靶向表达ASGPR的(肝)细胞)的缀合物)的活性改善的基础，其中所述活性是通过内体逃逸增强对靶细胞的胞质溶胶或细胞核内的效应子部分活性如基因沉默寡核苷酸的增强。
出人意料的是，皂苷苷元C-23处的醛基团转化(衍生化)为根据式(I1)的缩氨基脲官能团，导致当此类皂苷衍生物与细胞(即各种类型的细胞)接触时细胞毒性降低。因此以下是有益的：提供具有降低的细胞毒性的这些系列的皂苷衍生物，其中细胞毒性的降低是相对于未修饰的天然存在的皂苷对应物所测定的细胞毒性而言的。皂苷衍生物可以由此类天然存在的皂苷形成，例如SO1861、同等活性的SO1832和QS-21(同种型)，优选由SO1861或SO1832形成。当考虑降低细胞毒性时，当要提供具有降低的细胞毒性的皂苷时，包含缩氨基脲官能团的皂苷衍生物同样适用。
因此，当考虑细胞毒性和/或溶血活性时，并且当考虑与相应的未充分发挥作用的皂苷相比(例如基因沉默性)寡核苷酸的增强时，发明人提供了具有改进的治疗窗的皂苷衍生物。这种包含缩氨基脲官能团的皂苷衍生物例如特别适用于涉及GalNAc-寡核苷酸缀合物的治疗方案中，所述GalNAc-寡核苷酸缀合物与所述皂苷衍生物组合或者所述缀合物是本发明的寡核苷酸缀合物，所述本发明的寡核苷酸缀合物包含共价连接的皂苷以及GalNAc部分和寡核苷酸，用于预防或治疗有需要的(人)受试者中健康受试者的例如癌症、高胆固醇血症、心血管疾病或LDL-胆固醇水平高于正常水平的升高。当考虑细胞毒性和/或溶血活性时，特别是当将这类皂苷衍生物施用给需要例如用ADC或用AOC或用包含至少一个GalNAc部分并包含寡核苷酸(例如用于沉默基因如HSP27和apoB的BNA)的缀合物治疗的患者时，或当包含缩氨基脲官能团的皂苷衍生物是本发明的寡核苷酸缀合物的一部分时，这类皂苷衍生物的安全性得到改善。
实施例是包含一个皂苷部分的本发明的寡核苷酸缀合物。本发明的一个方面涉及根据分子(EE)的寡核苷酸缀合物：
Figure BDA0004177963000000841
，其中分子(EE)是通过以下的共价缀合得到的共价缀合产物：根据式(XXI)的三官能接头：
Figure BDA0004177963000000851
/>
与
(1)根据分子(AA)的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000000852
，其中
Figure BDA0004177963000000853
代表根据式(SM)的皂苷部分：
Figure BDA0004177963000000861
，其中R1和R2独立地选自氢、单糖、直链寡糖和支链寡糖，并且其中根据式(SM)的皂苷部分基于在位置C-23包含醛基团的皂苷，
以及与
(2)根据分子(FF)的GalNAc缀合物：
Figure BDA0004177963000000862
，其中
Figure BDA0004177963000000863
代表根据分子(DD)的三-GalNAc缀合物：
Figure BDA0004177963000000871
以及与
(3)根据分子(GG)的提供有接头的寡核苷酸：
Figure BDA0004177963000000872
，其中分子(GG)表示接头(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰胺)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺和根据分子(HH)的寡核苷酸-接头分子之间的缀合反应的缀合产物：
Figure BDA0004177963000000873
当考虑皂苷部分的核内体逃逸增强活性时，根据本发明的分子(EE)的此类寡核苷酸缀合物显示出出人意料的改善的效力。据认为，功效的改善与皂苷从缀合物中的解偶联(释放)改善有关，这种解偶联是通过在细胞(所述细胞已经通过缀合物与ASGPR结合介导而摄取了缀合物)内体中的弱酸性pH的影响下切割缩氨基脲官能团实现的。因此，与应用相似的缀合物(尽管没有共价连接的皂苷部分)相比，增强了寡核苷酸的内体逃逸并且增强了寡核苷酸在胞质溶胶和/或核中的(基因沉默)活性。
实施例是包含四个皂苷部分的本发明的寡核苷酸缀合物。本发明的一个方面涉及根据分子(PP)的寡核苷酸缀合物：
Figure BDA0004177963000000881
，其中分子(PP)是通过以下的共价缀合得到的共价缀合产物：根据分子(LL)的皂苷-GalNAc缀合物：
Figure BDA0004177963000000891
与根据分子(GG)的提供有接头的寡核苷酸：
Figure BDA0004177963000000892
，其中分子(GG)表示接头(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰胺)-N-(4-(6-甲基-1，2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺和根据分子(HH)的寡核苷酸-接头分子之间的缀合反应的缀合产物：
Figure BDA0004177963000000901
，其中分子(LL)是通过以下的共价缀合得到的共价缀合产物：根据分子(JJ)的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000000902
与三官能接头和根据分子(MM)的GalNAc的缀合物：
Figure BDA0004177963000000911
，其中分子(JJ)是N,N′-((9S,19S)-14-(6-氨基己酰基)-1-巯基-9-(3-巯基丙酰胺基)-3,10,18-三氧代-4,11,14,17-四氮杂二十三烷-19,23-二基)双(3-巯基丙酰胺)与以下进行缀合的缀合产物：首先与根据式(KK)的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000000912
，其中
Figure BDA0004177963000000913
代表根据式(SM)的皂苷部分：
Figure BDA0004177963000000921
，其中R1和R2独立地选自根据本发明的氢、单糖、直链寡糖和支链寡糖，并且其中根据式(SM)的皂苷部分基于根据本发明的任何一个皂苷在位置C-23包含醛基团的皂苷，并且例如列于表A1中，如QS-21、SO1861、SO1832，
然后与2,5-二氧代吡咯烷-1-基-1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯，
，并且其中分子(MM)是以下的缀合物：根据式(XXI)的三官能接头：
Figure BDA0004177963000000922
和根据分子(NN)的GalNAc缀合物：
Figure BDA0004177963000000931
，其中
Figure BDA0004177963000000932
代表根据分子(DD)的三-GalNAc缀合物：
Figure BDA0004177963000000933
实施例是包含八个皂苷部分的本发明的寡核苷酸缀合物。本发明的一个方面涉及根据分子(SS)的寡核苷酸缀合物：
Figure BDA0004177963000000941
，其中分子(SS)是通过以下的共价缀合得到的共价缀合产物：根据分子(RR)的皂苷-GalNAc缀合物：
Figure BDA0004177963000000951
与根据分子(GG)的提供有接头的寡核苷酸：
Figure BDA0004177963000000952
，其中分子(GG)表示接头(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰胺)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺和根据分子(HH)的寡核苷酸-接头分子之间的缀合反应的缀合产物：
Figure BDA0004177963000000961
，其中分子(RR)是通过以下的共价缀合得到的共价缀合产物：根据分子(QQ)的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000000962
与三官能接头和根据分子(MM)的GalNAc的缀合物：
Figure BDA0004177963000000971
，其中分子(QQ)是(2S)-N-[(1S)-1-{[2-(6-氨基-N-{2-[(2S)-2,6-双[(2S)-2,6-双(3-硫烷基丙酰胺基)己酰胺基]己酰胺基]乙基}己酰胺基)乙基]氨基甲酰基}-5-[(2S)-2,6-双(3-硫烷基丙酰胺基)己酰胺基]戊基]-2，6-双(3-硫烷基丙酰胺基)己酰胺甲酸酯与以下进行缀合的缀合产物：
(a)首先与根据分子(KK)的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000000972
，其中
Figure BDA0004177963000000973
代表根据式(SM)的皂苷部分：
Figure BDA0004177963000000981
，其中R1和R2独立地选自根据本发明的氢、单糖、直链寡糖和支链寡糖，并且其中根据式(SM)的皂苷部分基于根据本发明的任何一个皂苷在位置C-23包含醛基团的皂苷，并且例如列于表A1中，如QS-21、SO1861、SO1832，
以及随后
(b)与2,5-二氧代吡咯烷-1-基-1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯。
，并且其中分子(MM)是以下的缀合物：根据式(XXI)的三官能接头：
Figure BDA0004177963000000982
和根据分子(NN)的GalNAc缀合物：
Figure BDA0004177963000000991
，其中
Figure BDA0004177963000000992
代表根据分子(DD)的三-GalNAc缀合物：
Figure BDA0004177963000000993
/>
实施例是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸缀合物基于根据上文所列和表A1中任一皂苷的皂苷。
优选的是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸缀合物基于选自SO1861、SO1832和QS-21的皂苷，优选SO1861和SO1832，更优选SO1861或SO1832。当皂苷为SO1861时，根据分子(VII)a的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000001001
与寡核苷酸和至少一个GalNAc部分缀合，以提供本发明的寡核苷酸缀合物。
还优选的是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其中缩氨基脲官能团在酸性条件下在体内经历水解，所述酸性条件是存在于哺乳动物细胞，优选人细胞的内体和/或溶酶体中，优选pH 4.0-6.5，更优选pH≤5.5。
实施例是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其包含寡核苷酸，其中寡核苷酸是AON，例如BNA、异种核酸、siRNA中的任一种。
实施例是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其包含寡核苷酸，其中寡核苷酸选自以下中的任何一个或多个：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹形微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2′-O,4’-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA、以及基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
实施例是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其包含寡核苷酸，其中寡核苷酸选自以下中的任何一个或多个：抗miRNA、BNA-AON或siRNA，如基于BNA的siRNA，该siRNA选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA、和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
实施例是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其包含寡核苷酸，其中寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时沉默以下基因中任何一个的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)、HSP27、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/科信9型(PCSK9)、TMPRSS6、δ-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向异常miRNA的寡核苷酸。
实施例是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其包含寡核苷酸，其中寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时沉默以下基因中任何一个的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)和HSP27。
实施例是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其包含寡核苷酸，其中寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：apoB、HSP27、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，或例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时能够拮抗或恢复miRNA功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻抑onco-miR的表达。
实施例是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其包含寡核苷酸，其中寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
实施例是根据本发明和根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，其包含寡核苷酸，其中寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：apoB和HSP27。
本发明的一个方面涉及第二药物组合物，其包含本发明的且根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，以及任选的药学上可接受的赋形剂和/或任选的药学上可接受的稀释剂。
本发明的一个方面涉及本发明的第二药物组合物或本发明的且根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，用作药物。
本发明的一个方面涉及本发明的第二药物组合物或本发明的且根据分子(EE)、(PP)和(SS)中的任一个的寡核苷酸缀合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH。
本发明的一个方面涉及本发明的第二药物组合物或本发明的且根据分子(EE)、(PP)和(SS)中的任一个的寡核苷酸缀合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
实施例是本发明的第二药物组合物或本发明的且根据分子(EE)、(PP)和(SS)中的任一个的寡核苷酸缀合物，用于如上所述的用途，其中所述用途用于治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题：HSP27和apoB，优选apoB，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27和apoB，优选apoB。
实施例是本发明的第二药物组合物或本发明的且根据分子(EE)、(PP)和(SS)中的任一个的寡核苷酸缀合物，用于如上所述的用途，用于治疗或预防癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、心血管疾病、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、α1-抗胰蛋白酶缺乏、β地中海贫血或自身免疫性疾病。
实施例是本发明的第二药物组合物或本发明的且根据分子(EE)、(PP)和(SS)中的任一个的寡核苷酸缀合物，用于如上所述的用途，其中所述用途是在治疗或预防癌症如子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌或肝细胞癌，和/或高胆固醇血症等心血管疾病，优选高胆固醇血症中。
本发明的一个方面涉及本发明的第二药物组合物或本发明的且根据分子(EE)、(PP)和(SS)中任一个的寡核苷酸缀合物，用于降低受试者体内的LDL-胆固醇。
尽管已经根据几个实施例描述了本发明，但是可以预期，对于本领域普通技术人员而言，通过阅读说明书和研究附图，其替代、修改、排列和等同物将变得显而易见。本发明不以任何方式受限于所展示的实施例。可以在不偏离所附权利要求书限定的范围的情况下作出改变。
实施例
1.一种皂苷缀合物，该皂苷缀合物包含与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体共价连接的至少一个皂苷，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
2.如实施例1所述的皂苷缀合物，其中该皂苷包含选自由以下组成的组的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸、
16α-羟基齐墩果酸、
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)、
16α,23-二羟基齐墩果酸、
丝石竹皂苷元、
皂皮酸、
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯、
洋地黄皂苷配基、
3,16,28-三羟基齐墩果烷-12-烯、
丝石竹酸、
及
其衍生物，
优选地，该皂苷包含选自皂皮酸和丝石竹皂苷元或其衍生物的苷元核心结构，更优选地，该皂苷苷元核心结构是皂皮酸或其衍生物。
3.如实施例1或2所述的皂苷缀合物，其中
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自A组：
GlcA-、
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-Ara-、
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-、
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、及
其衍生物，
或
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自B组：
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-；
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-；
Ara-；
Xyl-；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-，其中R1是4E-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-，其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-，其中R3是4E-甲氧基肉桂酸；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-，其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-，其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-，其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-，其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-，其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-，其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-，其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-，其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-，其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-；及
其衍生物，
或
·该皂苷是双糖链三萜苷，该双糖链三萜苷包含与该苷元核心结构结合的选自A组的第一糖链并且包含与该苷元核心结构结合的选自B组的第二糖链。
4.如实施例1-3中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷选自由以下组成的组：皂树树皮皂苷、川续断皂苷乙、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷甲、商陆皂苷甲、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶素、七叶素Ia、茶籽皂苷I、茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、毛地黄皂苷、报春花酸1和AS64R、其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物。
5.如实施例3或4所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含含有已衍生化的醛基团的苷元核心结构；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例3中定义的A组的糖链，该糖链包含已衍生化的羧基基团；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例3中定义的B组的糖链，该糖链包含已衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合。
6.如实施例1-5中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是以下中的任何一个或多个：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂皮皂素、皂苷集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物、及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物。
7.如实施例1-6任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是如实施例2所述的皂皮酸皂苷或丝石竹皂苷元皂苷的皂苷衍生物，并由分子1表示：
Figure BDA0004177963000001091
其中
A1表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A1表示选自如实施例3所定义的A组的糖链，更优选地A1表示选自如实施例3所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成；
A2表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A2表示选自如实施例3所定义的B组的糖链，更优选地A2表示选自如实施例3所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团，如一个、两个、三个或四个乙酰氧基基团，
其中A1和A2中的至少一个不是氢，优选地A1和A2均为寡糖链；
并且R是丝石竹皂苷元中的氢或皂皮酸中的羟基；
其中该皂苷衍生物对应于该由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基团已被衍生化；
ii.当A1表示选自如实施例3所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化；及
iii.当A2表示选自如实施例3所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个、优选地全部已被衍生化。
8.如实施例7所述的皂苷缀合物，其中A1表示选自如实施例3中所定义的A组的糖链并且包含葡糖醛酸部分或由其组成，并且其中A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，和/或其中A2表示选自如实施例3中所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团，并且其中A2的至少一个乙酰氧基基团已被衍生化。
9.如实施例7或8所述的皂苷缀合物，其中该由分子1表示的皂苷是双糖链三萜皂苷。
10.如实施例7-9中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷衍生物对应于该由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基团已通过以下衍生化：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.当A1表示选自如实施例3所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD、或皂苷-Glu-AEM如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM；及
iii.当A2表示选自如实施例3所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个、优选地全部已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化。
11.如实施例7-10中任一项所述的皂苷缀合物，其中A1是Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA并且/或者A2是Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc，优选地由分子1表示的皂苷是3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-葡糖醛酸吡喃基皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4OAc-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选地皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、GE1741、SA1641和QS-21、或其衍生物，最优选SO1861或其衍生物。
12.如实施例5-11中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基团：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例3中所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD(如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD)或皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例3中所定义的B组的糖链，该糖链包含已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合；
优选地，该皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含已通过与EMCH反应转化成腙键而衍生化的醛基团，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化。
13.如实施例12所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化的醛基团，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例3中所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；或
iii.该皂苷衍生物包含衍生化i.和ii.的组合。
14.如实施例12所述的皂苷缀合物，其中皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含醛基团，并且其中该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例3中所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化。
15.如实施例1-12中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷是分子2表示的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000001131
/>
或其中该皂苷是由分子3表示的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000001132
16.如实施例1-15中任一项所述的皂苷缀合物，其中至少一个皂苷和ASGPR的配体直接或经由至少一个接头共价连接。
17.如实施例1-16中任一项所述的皂苷缀合物，其中该GalNAc部分优选地经由皂苷接头Ls与该皂苷S结合，如式(II)S中所示：
Figure BDA0004177963000001141
18.如实施例1-16中任一项所述的皂苷缀合物，其中该GalNAc部分各自分别经由该GalNAc部分的位置“1”上的氧与中心桥接部分B共价结合，该中心桥接部分B优选地经由皂苷部分接头LS在该GalNAc部分与该皂苷部分之间有效地形成桥，如式(III)S中所示：
Figure BDA0004177963000001142
其中n是大于或等于2的整数，优选地n是3，LS是皂苷部分接头，并且S是该皂苷部分。
19.如实施例18所述的皂苷缀合物，其中GalNAc部分经由GalNAc接头LGAL与桥接部分B结合，如式(IV)S中所示：
Figure BDA0004177963000001143
其中n是大于或等于2的整数，优选地n是3，LS是皂苷部分接头，并且S是该皂苷部分。
20.如实施例17-19中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷部分接头Ls表示适合用于使皂苷与如式(II)S中的GalNAc或与如式(III)S和(IV)S中的桥接部分B共价结合的任何化学部分。
21.如实施例17-20中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷部分接头LS是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或该桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与该皂苷部分共价结合，其中LS1是与GalNAc或与该桥接部分B共价结合的该皂苷部分接头LS的前体，并且LS2是与该皂苷部分共价结合的该皂苷部分接头LS的前体。
22.如实施例17-21中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷部分接头LS是至少第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或该桥接部分B共价结合，该第二前体LS2与该皂苷部分共价结合，其中该偶联反应选自由以下组成的组：叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环、非醛醇类型的羰基反应以及碳-碳双键的加成，优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成、硫醇马来酰亚胺偶联、施陶丁格反应、应变杂环亲电剂的亲核开环，更优选地其中该偶联反应是叠氮化物-炔烃环加成或硫醇马来酰亚胺偶联。
23.如实施例17-22中任一项所述的皂苷缀合物，其中该皂苷部分接头LS是第一前体LS1与第二前体LS2之间的偶联反应的结果，该第一前体LS1与GalNAc或桥接部分B共价结合，该第一前体LS1包含叠氮化物；该第二前体LS2与该皂苷部分共价结合，该第二前体LS2包含炔烃并且优选地包含由酰肼/醛与该皂苷部分的醛偶联产生的腙。
24.如实施例21-23中任一项所述的皂苷缀合物，其中该前体LS1的结构是以下具有式(XVII)的叠氮化物：
Figure BDA0004177963000001151
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示选自1、2和3的整数，更优选地a表示2，或
其中该前体LS1的结构包含以下具有式(XVIII)的叠氮化物：
Figure BDA0004177963000001161
其中c表示大于或等于0的整数，优选地c表示5-15范围内的整数，更优选地c表示9。
25.如实施例21-24中任一项所述的皂苷缀合物，其中该前体LS2的结构包含以下具有式(XIX)的腙：
Figure BDA0004177963000001162
其中a表示大于或等于0的整数，优选地a表示2-6范围内的整数，更优选地a表示4，并且其中LS2a表示含炔烃部分。
26.如实施例25所述的皂苷缀合物，其中LS2a包含少于20个碳原子，优选地LS2a表示根据式(XX)的部分：
Figure BDA0004177963000001163
27.如实施例18-26中任一项所述的皂苷缀合物，其中该桥接部分是式(XV)的化合物：
Figure BDA0004177963000001171
其中该具有式(XV)的化合物的氧原子与GalNAc或该GalNAc接头LGAL结合，并且该具有式(XV)的化合物的氮原子与该皂苷部分接头LS结合。
28.如实施例19-27中任一项所述的皂苷缀合物，其中LGAL表示适合用于使GalNAc与桥接部分B共价结合的任何化学部分。
29.如实施例19-28中任一项所述的皂苷缀合物，其中LGAL包含2-25个碳原子、优选地7-15个碳原子、更优选地11个碳原子，并且其中LGAL包含至少一个、优选两个酰胺部分。
30.如实施例19-29中任一项所述的皂苷缀合物，其中LGAL是根据式(XVI)的化合物：
Figure BDA0004177963000001172
31.如实施例17-30中任一项所述的皂苷缀合物，其中ASGPR的配体是由分子I’表示的(GalNAc)3Tris：
Figure BDA0004177963000001181
或其中该ASGPR的配体是由分子II’表示的单GalNAc：
Figure BDA0004177963000001182
32.如实施例1-31中任一项所述的皂苷缀合物，其中至少一个皂苷经由由分子III’表示的接头与实施例31的分子I’或分子II’共价结合：
Figure BDA0004177963000001183
其中分子III’的酰肼部分与该皂苷中的醛基团形成共价腙键，并且其中二苯并环辛炔基团与分子I’或分子II’的叠氮化物基团形成共价键。
33.如实施例1-32中任一项所述的皂苷缀合物，其中该至少一个皂苷与ASGPR的配体经由至少一个可切割接头共价结合。
34.如实施例33所述的皂苷缀合物，其中该可切割接头在酸性条件、还原条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地，该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键，和/或易被蛋白水解的键，例如被组织蛋白酶B进行蛋白水解的键，和/或在还原条件下易被切割的键，例如二硫键。
35.如实施例33或34所述的皂苷缀合物，其中该可切割接头在酸性条件下，例如像存在于哺乳动物细胞、优选地人细胞的内体和/或溶酶体中的酸性条件下经受体内切割，优选地该可切割接头在pH 4.0-6.5下、并且更优选地在pH≤5.5下经受体内切割。
36.如实施例1-35中任一项所述的皂苷缀合物，其中缀合物包含1、2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个皂苷部分，或其间的任何数目的皂苷部分，如7、9、12个皂苷部分。
37.一种药物组合，该药物组合包含：
-第一药物组合物，该第一药物组合物包含如实施例1-36中任一项所述的皂苷缀合物并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂；及
-第二药物组合物，该第二药物组合物包含效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
38.一种药物组合物，该药物组合物包含：
-如实施例1-36中任一项所述的皂苷缀合物；
-效应分子和ASGPR的配体的第二缀合物、或效应分子和结合分子的第三缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂，其中该ASGPR的配体优选地包含至少一个GalNAc部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，该结合分子包含用于细胞表面分子的结合位点。
39.如实施例37所述的药物组合或如实施例38所述的药物组合物，其中该效应分子包含以下中的至少一个或由其组成：小分子(如药物分子)、毒素(如蛋白质毒素)、寡核苷酸(如AON，如BNA)、异种核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质、或其任何组合，优选地，该效应分子是毒素、酶或寡核苷酸。
40.如实施例37或39所述的药物组合，或如实施例38或39所述的药物组合物，其中该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或是(GalNAc)3Tris，和/或其中该ASGPR的配体和该效应分子经由共价键、优选经由至少一个接头缀合。
41.如实施例37或39-40中任一项所述的药物组合或如实施例38-40中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是选自以下中的任何一个或多个的寡核苷酸：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹形微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2′-O,4’-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA、以及基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
42.如实施例37或39-41中任一项所述的药物组合或如实施例38-41中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是选自以下中的任何一个或多个的寡核苷酸：抗miRNA、BNA-AON或siRNA，如基于BNA的siRNA，该siRNA选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA、和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
43.如实施例37或39-42中任一项所述的药物组合或如实施例38-42中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够使以下基因中的任一种沉默的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)、HSP27、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/科信9型(PCSK9)、δ-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向异常miRNA的寡核苷酸。
44.如实施例37或39-43中任一项所述的药物组合或如实施例38-43中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是寡核苷酸，该寡核苷酸例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向参与以下蛋白质中的任一种的表达的mRNA：apoB、HSP27、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT和LDH，或例如当存在于哺乳动物细胞内时能够拮抗或恢复miRNA功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻抑onco-miR的表达。
45.如实施例37或39-44中任一项所述的药物组合或如实施例38-44中任一项所述的药物组合物，其中该效应分子是或包含毒素，该毒素包含至少一种分子或由其组成，该分子选自以下中的任一种或多种：肽、蛋白质、酶(如脲酶和Cre重组酶)、朊毒素、核糖体失活蛋白、和/或细菌毒素、植物毒素，更优选地选自以下中的任一种或多种：病毒毒素，如凋亡蛋白；细菌毒素，如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，如α-八叠球菌素；植物毒素，包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，如香石竹毒蛋白例如香石竹毒蛋白-30或香石竹毒蛋白-32、皂草毒蛋白例如皂草毒蛋白-S3或皂草毒蛋白-S6、三角梅核糖体失活蛋白或三角梅核糖体失活蛋白的去免疫化衍生物去三角梅核糖体失活蛋白、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、蒴莲根毒素、蒴莲根毒素A链、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白、蒴莲根毒蛋白A链、槲寄生凝集素、槲寄生凝集素A链；或动物或人毒素，如青蛙核糖核酸酶、或来自人的颗粒酶B或血管生成蛋白，或其任何片段或衍生物；优选地，该蛋白质毒素是香石竹毒蛋白和/或皂草毒蛋白，和/或包含以下中的至少一种或由其组成：靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素，更优选地以下中的任一种或多种：恩美、帕舒托、美登木素生物碱衍生物DM1、美登木素生物碱衍生物DM4、单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE，维多汀)、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF，莫福汀)、卡奇霉素、N-乙酰基-γ-卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0004177963000001211
(PBD)二聚体、苯并二氮杂/>
Figure BDA0004177963000001212
CC-1065类似物、多卡米星、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、微管溶素、吲哚啉并苯并二氮杂/>
Figure BDA0004177963000001213
AZ13599185、念珠藻素、根瘤菌素、氨甲蝶呤、蒽环素、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依喜替康、截短形式的铜绿假单胞菌外毒素(PE38)、多卡米星衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、剪接抑制素、泰兰斯他汀、奥佐米星、特司林、安伯他汀269和索星、或其衍生物。/>
46.如实施例37或39-45中任一项所述的药物组合或如实施例38-45中任一项所述的药物组合物，其中该第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子是细胞表面分子的配体或包含用于细胞表面分子的结合位点的抗体或其包含该结合位点的至少一个结构域或片段。
47.如实施例37或39-46中任一项所述的药物组合或如实施例38-46中任一项所述的药物组合物，其中该第三缀合物是以下中的任何一种或多种：抗体-毒素缀合物、受体-配体-毒素缀合物、抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-核酸缀合物或受体-配体-核酸缀合物。
48.如实施例37或39-47中任一项所述的药物组合或如实施例38-47中任一项所述的药物组合物，其中该第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子能够与以下细胞表面分子中的任一种结合：CD71、CD63、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、黏结蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2、脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，优选地以下中的任一种：HER2、CD71、ASGPR和EGFR，更优选地CD71。
49.如实施例37或39-48中任一项所述的药物组合或如实施例38-48中任一项所述的药物组合物，其中该第三缀合物所包含的含有用于细胞表面分子的结合位点的结合分子是或包含以下中的任一种：抗体，优选地单克隆抗体如人单克隆抗体、IgG、包含以下或由以下组成的分子：单结构域抗体、至少一个VHH结构域、优选地骆驼VH、可变重链新抗原受体(VNAR)结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2和Fcab片段。
50.如实施例37、39-49中任一项所述的药物组合或如实施例38-49中任一项所述的药物组合物，其用作药物。
51.如实施例37、39-49中任一项所述的药物组合或如实施例38-49中任一项所述的药物组合物，其用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：apoB、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT和LDH。
52.如实施例37、39-49中任一项所述的药物组合或如实施例38-49中任一项所述的药物组合物、或用于如实施例51所述使用的药物组合或药物组合物，其用于在治疗或预防以下中使用：癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、或自身免疫性疾病。
53.用于如实施例51或52所述使用的药物组合或用于如实施例51或52所述使用的药物组合物，其中该皂苷为皂苷衍生物，优选为如实施例4-15任一项所述的QS-21衍生物或SO1861衍生物。
54.一种体外或离体方法，该方法用于将如实施例37-48中任一项所述的第二缀合物或第三缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选地随后将如实施例37-48中任一项所述的第二缀合物或第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中，该方法包括以下步骤：
a)提供细胞，该细胞在其表面上表达ASGPR并且当将该第三缀合物转移到该细胞中时该细胞表达细胞表面分子，其中该第三缀合物包含用于与所述细胞表面分子结合的结合分子，该细胞优选地选自肝细胞、病毒感染细胞和肿瘤细胞；
b)提供如实施例37-48中任一项所述的第二缀合物或第三缀合物用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)提供如实施例1-36中任一项所述的皂苷缀合物；
d)使步骤a)的细胞与步骤b)的第二缀合物或第三缀合物以及步骤c)的皂苷缀合物在体外或离体接触，从而实现将该第二缀合物或该第三缀合物从所述细胞的外部转移到所述细胞中，并且优选地从而随后实现将该第二缀合物或该第三缀合物转移到所述细胞的胞质溶胶中，或者优选地从而随后实现将至少该第二缀合物或该第三缀合物所包含的效应分子转移到所述细胞的胞质溶胶中。
实施例
I.一种寡核苷酸缀合物，该寡核苷酸缀合物包含至少一个皂苷，该至少一个皂苷共价连接至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，并且进一步共价连接至寡核苷酸，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
II.如实施例I所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是优选在皂苷的苷元核心结构的位置C-23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的五环三萜皂苷。
III.如实施例I或II所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是优选在皂苷的苷元核心结构的位置C-23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的单糖链或双糖链五环三萜皂苷。
IV.如实施例I-III中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷包含选自由以下组成的组的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸、
16α-羟基齐墩果酸、
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)、
16α，23-二羟基齐墩果酸、
丝石竹皂苷元、
皂皮酸、
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯、
洋地黄皂苷配基、
3,16,28-三羟基齐墩果烷-12-烯、
丝石竹酸、
及
其衍生物，
优选地，该皂苷包含选自皂皮酸和丝石竹皂苷元或其衍生物的苷元核心结构，更优选地，该皂苷苷元核心结构是皂皮酸或其衍生物。
V.如实施例I-IV中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自A组：
GlcA-、
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-Ara-、
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-、
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、及
其衍生物，
或
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自B组：
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-；
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-；
Ara-；
Xyl-；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-，其中R1是4E-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-，其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-，其中R3是4E-甲氧基肉桂酸；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-，其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-，其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-，其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-，其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-，其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-，其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-，其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-，其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-，其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-；及
其衍生物，
或
·该皂苷是双糖链三萜苷，该双糖链三萜苷包含与该苷元核心结构结合的选自A组的第一糖链并且包含与该苷元核心结构结合的选自B组的第二糖链。
VI.如实施例I-V中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷选自由以下组成的组：皂树树皮皂苷、川续断皂苷B、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷甲、商陆皂苷甲、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶素、七叶素Ia、茶籽皂苷I、茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、毛地黄皂苷、报春花酸1和AS64R、其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、SO1861及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物或SO1861。
VII.如实施例V或VI所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含含有已衍生化的醛基团的苷元核心结构；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例V中定义的A组的糖链，该糖链包含已衍生化的羧基基团；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例V中定义的B组的糖链，该糖链包含已衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合。
VIII.如实施例I-VII中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是以下中的任何一个或多个：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂皮皂素、皂苷集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物、及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、SO1861及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物或SO1861。
IX.如实施例I-VIII中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是如实施例IV所述的皂皮酸皂苷或丝石竹皂苷元皂苷的皂苷衍生物，并由分子1表示：
Figure BDA0004177963000001291
其中
A1表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A1表示选自如实施例V所定义的A组的糖链，更优选地A1表示选自如实施例V所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成；
A2表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A2表示选自如实施例V所定义的B组的糖链，更优选地A2表示选自如实施例V所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团，如一个、两个、三个或四个乙酰氧基基团，
其中A1和A2中的至少一个不是氢，优选地A1和A2均为寡糖链；
并且R是丝石竹皂苷元中的氢或皂皮酸中的羟基；
其中该皂苷衍生物对应于该由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基团已被衍生化；
ii.当A1表示选自如实施例V所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化；及
iii.当A2表示选自如实施例V所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个、优选地全部已被衍生化。
X.如实施例IX所述的寡核苷酸缀合物，其中A1表示选自如实施例V中所定义的A组的糖链并且包含葡糖醛酸部分或由其组成，并且其中A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，和/或其中A2表示选自如实施例V中所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团，并且其中A2的至少一个乙酰氧基基团已被衍生化。
XI如实施例IX或X所述的寡核苷酸缀合物，其中该由分子1表示的皂苷是双糖链三萜皂苷。
XII.如实施例IX-XI中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷衍生物对应于该由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基团已通过以下衍生化：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.当A1表示选自如实施例V所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD、或皂苷-Glu-AEM如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM；及
iii.当A2表示选自如实施例V所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个、优选地全部已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化。
XIII.如实施例IX-XII中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中A1是Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA并且/或者A2是Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc，优选地由分子1表示的皂苷是3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-葡糖醛酸吡喃基皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4OAc-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选地皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、GE1741、SA1641和QS-21、或其衍生物，最优选SO1861或其衍生物。
XIV.如实施例VII-XIII中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基团：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例V中所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD(如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD)或皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例V中所定义的B组的糖链，该糖链包含已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合；
优选地，该皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含已通过与EMCH反应转化成腙键而衍生化的醛基团，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化。
XV.如实施例XIV所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
a)该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化的醛基团，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH；
b)该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例V中所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AEM(如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM)；或
c)该皂苷衍生物包含衍生化i.和ii.的组合。
XVI.如实施例XIV所述的寡核苷酸缀合物，其中皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含醛基团，并且其中该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如实施例V中所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化。
XVII.如实施例I-XIV中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是分子2表示的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000001331
或其中该皂苷是由分子3表示的皂苷衍生物：
Figure BDA0004177963000001341
XVIII.如实施例I-XVII中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该至少一个皂苷和该ASGPR的配体直接或经由至少一个接头共价连接，和/或其中该至少一个皂苷和该寡核苷酸直接或经由至少一个接头共价连接，和/或其中该ASGPR的配体和该寡核苷酸直接或经由至少一个接头共价连接，优选地，该至少一个皂苷、该ASGPR的配体和该寡核苷酸通过至少一个接头连接。
XIX.如实施例I-XVIII中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该至少一个GalNAc部分、至少一个皂苷和寡核苷酸通过三官能接头共价结合，优选GalNAc部分、皂苷和寡核苷酸中的每一个共价结合到三官能接头的单独臂上。
XX.如实施例I-XIX中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中ASGPR的配体是由分子I’表示的(GalNAc)3Tris：
Figure BDA0004177963000001351
或其中该ASGPR的配体是由分子II’表示的单GalNAc：
Figure BDA0004177963000001352
XXI.如实施例I-XX中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该至少一个皂苷通过至少一个可切割接头共价结合至ASGPR的配体，和/或其中至少一个皂苷通过至少一个可切割接头共价结合至寡核苷酸。
XXII.如实施例XIX所述的寡核苷酸缀合物，其中该至少一个皂苷通过至少一个可切割接头共价结合至该三官能接头的臂上。
XXIII.如实施例XXI或XXII所述的寡核苷酸缀合物，其中该可切割接头在酸性条件、还原条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地，该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键，和/或易被蛋白水解的键，例如被组织蛋白酶B进行蛋白水解的键，和/或在还原条件下易被切割的键，例如二硫键。
XXIV.如实施例XXI-XXIII中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该可切割接头在酸性条件下，例如像存在于哺乳动物细胞、优选地人细胞的内体和/或溶酶体中的酸性条件下经受体内切割，优选地该可切割接头在pH 4.0-6.5下、并且更优选地在pH≤5.5下经受体内切割。
XXV.如实施例I-XXIV中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该缀合物包含1、2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个皂苷部分，或其间的任何数目的皂苷部分，如7、9、12个皂苷部分。
XXVI.如实施例I-XXIV中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸缀合物包含1个皂苷部分。
XXVII.如实施例I-XXVI中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是BNA、异种核酸、siRNA、反义寡核苷酸中的任一种。
XXVIII.如实施例I-XXVI中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸选自以下中的任何一个或多个：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹形微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-O,4’-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA、以及基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
XXIX.如实施例I-XXVI中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸选自以下中的任何一个或多个：抗miRNA、BNA-AON或siRNA，如基于BNA的siRNA，该siRNA选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA、和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
XXX.如实施例I-XXIX中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时沉默以下基因中任何一个的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)、HSP27、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/科信9型(PCSK9)、δ-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向异常miRNA的寡核苷酸。
XXXI.如实施例I-XXIX中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时沉默以下基因中任何一个的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)和HSP27。
XXXII.如实施例I-XXXI中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：apoB、HSP27、TTR、PCSK9、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT和LDH，或例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时能够拮抗或恢复miRNA功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻抑onco-miR的表达。
XXXIII.如权利要求I-XXXI中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
XXXIV.如实施例I-XXXII中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：apoB和HSP27。
XXXV.一种药物组合物，其包含如实施例I-XXXIV中任一项所述的寡核苷酸缀合物，以及任选的药学可接受的赋形剂和/或任选的药学可接受的稀释剂。
XXXVI.如实施例XXXV所述的药物组合物，用作药物。
XXXVII.如权利要求XXXV所述的药物组合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH。
XXXVIII.如权利要求XXXV所述的药物组合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
XXXIX.用于如权利要求XXXVI或XXXVII所述使用的药物组合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一种或多种的疾病或健康问题中使用：HSP27和apoB，优选apoB，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27和apoB，优选apoB。
XL.用于权利要求XXXVI-XXXIX中任一项所述使用的药物组合物，用于治疗或预防癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、心血管疾病、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、α1-抗胰蛋白酶缺乏、β地中海贫血或自身免疫性疾病。
XLI.用于如权利要求XXXVI-XXXIX中任一项所述使用的药物组合物，用于治疗或预防癌症如子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌或肝细胞癌，以及高胆固醇血症等心血管疾病，优选高胆固醇血症。
XLII.一种体外或离体方法，用于将如实施例I-XXXIV中任一项所述的寡核苷酸缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选随后将如实施例I-XXXIV中任一项所述的寡核苷酸缀合物所包含的寡核苷酸转移到所述细胞的胞质溶胶中和/或细胞核中，该方法包括以下步骤：
a)提供在其表面表达ASGPR，优选ASGPR1的细胞，该细胞优选选自肝细胞、病毒感染的哺乳动物细胞和哺乳动物肿瘤细胞，其中优选所述细胞是人细胞；
b)提供如实施例I-XXXIV中任一项所述的寡核苷酸缀合物，用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)使步骤a)的细胞体外或离体地与步骤b)的寡核苷酸缀合物接触，优选在液体介质中，从而实现寡核苷酸缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，并且任选地并且优选地从而随后实现寡核苷酸缀合物包含的寡核苷酸转移到所述细胞的胞质溶胶和/或细胞核中。
本发明的一个方面涉及提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供至少一个包含共价结合的第一接头的皂苷部分，其中该第一接头包含至少一个用于与第二接头上的第二反应基团或第七接头上的第七反应基团共价结合的第一反应基团；
(b)提供包含共价结合的第三接头的寡核苷酸，其中该第三接头包含用于与第四接头上的第四反应基团或第七接头上的第八反应基团共价结合的第三反应基团；
(c)提供至少一个包含共价结合的第五接头的GalNAc部分，其中该第五接头包含用于与第六接头上的第六反应基团或第七接头上的第九反应基团共价结合的第五反应基团；及
以下中的任何一个
(d1)通过在该第一反应基团和该第二反应基团之间形成共价键将该第一接头连接到该第二接头，通过在该第三反应基团和该第四反应基团之间形成共价键将该第三接头连接到该第四接头，通过在该第五反应基团和该第六反应基团之间形成共价键将该第五接头连接到该第六接头，并将该第二接头、第四接头和第六接头共价连接在一起，从而提供该寡核苷酸，
或
(d2)通过在该第一反应基团和该第七反应基团之间形成共价键将该第一接头连接到该第七接头，通过在该第三反应基团和该第八反应基团之间形成共价键将该第三接头连接到该第七接头，通过在该第五反应基团和该第九反应基团之间形成共价键将该第五接头连接到该第七接头，从而提供该寡核苷酸缀合物。
实施例是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中该第七接头是三官能接头，例如式(XXI)所示的三官能接头：
Figure BDA0004177963000001401
优选的是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中至少一个皂苷部分是1-16个皂苷部分，优选1-8个皂苷部分，例如1、4或8个皂苷部分。
优选的是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中皂苷是SO1861、SO1832、QS-21或其任何功能性衍生物，优选SO1861或SO1832。
优选的是提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中一个或多个皂苷部分通过腙键或缩氨基脲键共价连接。
优选的是用于提供本发明的寡核苷酸缀合物的方法，其中至少一个GalNAc部分是1-4个GalNAc部分，优选1或3个GalNAc部分。
上面已经参考多个示例性实施例描述了本发明。修改是可能的，并且包括在所附权利要求书所限定的保护范围内。本发明由以下实例进一步说明，这些实例不应被解释为以任何方式限制本发明。
实例和示例性实施例
实例1.CD71-皂草毒蛋白+4000nM三价GalNAc-L-SO1861
三价GalNAc是识别肝细胞上的ASGPR1受体并与其结合的靶向配体。产生了三价GalNAc(图1A-C和图8A-G)并且使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合(不稳定，方式与如图2A-B和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似，其中SPT001与SO1861同义)，DAR为1，(三价GalNAc-SO1861)。SO1861-EMCH是指如下SO1861，其中醛基团通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化，从而提供SO1861-Ald-EMCH。如图1A-C和8A-G中所描述的‘三价GalNAc’是适合用于与效应分子或与皂苷偶联的典型(GalNAc)3Tris缀合物。作为对照，也使SO1861-EMCH与单价GalNAc缀合(不稳定)(图3)，DAR为1，(GalNAc-SO1861)。将HepG2(ASGPR1+；CD71+，表A3)和Huh7(ASGPR1+/-；CD71+，表A3)细胞在存在和不存在10pMCD71-皂草毒蛋白(与蛋白质毒素皂草毒蛋白缀合的靶向CD71的单克隆抗体克隆OKT-9)的情况下用浓度范围的三价GalNAc-L-SO1861和GalNAc-L-SO1861处理。在不存在CD71-皂草毒蛋白的情况下的细胞处理表明，作为单个化合物的三价-GalNAc-L-SO1861(或三价GalNAc)在高达15000nM下没有毒性(图9)。
将HepG2和Huh7细胞也用浓度范围的CD71-皂草毒蛋白与1000nM或4000nM的固定浓度的三价GalNAc-SO1861的组合处理(DAR1)。确定了ASGPR1/CD71表达细胞(HepG2和Huh7)的靶向的蛋白质毒素介导的细胞杀伤。这表明两种细胞系在低浓度CD71-皂草毒蛋白(IC50＝1pM)下具有很强的细胞杀伤力，而等效浓度的CD71-皂草毒蛋白、CD71-皂草毒蛋白+1000nM三价-GalNAc或CD71-皂草毒蛋白+4000nM三价-GalNAc可以仅在两种细胞系中以高浓度CD71-皂草毒蛋白(IC50＝100pM)诱导细胞杀伤(图10)。
所有这些都表明三价GalNAc-SO1861与低浓度的CD71-皂草毒蛋白的组合在ASGPR1/CD71表达细胞中有效地诱导细胞杀伤。因此，三价GalNAc-SO1861在ASGPR1表达细胞中有效地诱导蛋白质毒素的内体逃逸。
实例1A.CD71-皂草毒蛋白+系列浓度的三价GalNAc-L-SO1861、三价GalNAc-(L-SO1861)4、SO1861-EMCH
产生了三价GalNAc(图1A-C和图8A-G)并且使SO1861-EMCH与三价-GalNAc缀合(不稳定，方式与如图2A-B和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似，其中SPT和SPT001与皂苷SO1861同义)(DAR 1)(三价-GalNAc-SO1861；(GN)3-SPT))，或以DAR 4通过首先将SO1861-EMCH偶联到树状突(三价-GalNAc-树状突(SO1861)4；(GN)3-dSPT4；图23D-E)。再次，SO1861-EMCH是指如下SO1861，其中醛基团通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化，从而提供SO1861-Ald-EMCH。如图1A-C和图8A-G中所描述的‘三价GalNAc’是适合用于与效应分子或与皂苷偶联的典型(GalNAc)3Tris缀合物。作为对照，也使SO1861-EMCH与单价GalNAc缀合(不稳定)(图3)，其中以DAR 1或者以DAR 4(使用树状突)(GalNAc-SO1861和GalNAc-(SO1861)4)。在存在10pM CD71-皂草毒蛋白(与蛋白质毒素皂草毒蛋白缀合的靶向CD71的单克隆抗体OKT-9)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-L-SO1861、SO1861-EMCH或(GN)3-dSPT4处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1高)。在不存在CD71-皂草毒蛋白的情况下进行的细胞处理表明作为单个化合物的三价GalNAc-L-SO1861在高达至少1.000nM下没有毒性(图18A；相对细胞活力)。与用抗CD71 MoAb-皂草毒蛋白(CD71-SPRN)和SO1861-EMCH(SPT-EMCH)的组合处理的细胞的细胞活力相比，用抗CD71MoAb-皂草毒蛋白(“MoAb”＝单克隆抗体)和与SO1861缀合的三价GalNAc(DAR 1或者DAR 4)的组合处理的细胞的细胞活力低约100倍(图18A)。
所有这些都表明三价GalNAc-SO1861和三价GalNAc-(SO1861)4与低浓度的CD71-皂草毒蛋白的组合在ASGPR1/CD71表达细胞中有效地诱导细胞杀伤。因此，三价GalNAc-SO1861在ASGPR1表达细胞中有效地诱导蛋白质毒素的内体逃逸。因此，SPT001和GalNAc靶向的SPT001(DAR1)两者都增加了工业标准GalNAc靶向的ASO的效力；当考虑肝细胞的细胞活力时，SO1861-EMCH约为10倍，并且(GN)3-SPT和(GN)3-dSPT4均为约100倍。
实例1B.与ApoB反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc+三价GalNAc-L-SO1861，或一系列浓度的缀合的三价GalNAc-(L-SO1861)-ApoB反义寡核苷酸(皂苷-寡核苷酸-ASGPR配体缀合物；图22A-C)
产生了三价GalNAc(图1A-C和图8A-G)并且使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合(不稳定，方式与如图2A-B和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似，其中SPT和SPT001与皂苷SO1861同义)，DAR为1，(三价GalNAc-SO1861；(GalNAc)3-SPT001)；图19C)。再次，SO1861-EMCH是指如下SO1861，其中醛基团通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化，从而提供SO1861-Ald-EMCH。此外，制备了与ApoB反义BNA寡核苷酸ApoBBNA(SEQ ID NO:2)和包含四个共价偶联的SO1861-EMCH的树状突两者偶联的三价GalNAc的共价缀合物(图20E)。关于制备缀合物的概述，也参见以下‘三价GalNAc-SO1861和GalNAc-SO1861的合成(图2A-B、4)’部分以及‘三价GalNAc-BNA寡聚物的合成(图5A-B；图6A-B，图7)’部分以及“三价GalNAc-S-ApoB(或HSP27)BNA寡聚物的合成”和“三价GalNAc-L-ApoB(或HSP27)BNA寡聚物的合成”部分以及‘树状突(-L-SO1861)4-三价GalNAc和树状突(-L-SO1861)8-三价GalNAc的合成’和‘树状突(-L-SO1861)4-三价GalNAc的合成’和‘树状突(-L-SO1861)4-L-BNA寡聚物-三价GalNAc和树状突(-L-SO1861)8-L-BNA寡聚物-三价GalNAc的合成’部分以及‘树状突(-L-SO1861)4-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc的合成’部分。
在存在或不存在300nM三价GalNAc-SO1861((GalNAc)3-SPT001)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-ApoBBNA((GalNAc)3-ApoB)处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1高)(图18B)。比较不存在和存在(GalNAc)3-SPT001时的细胞处理表明，与仅用(GalNAc)3-ApoB处理的细胞中的apoB基因表达相比，三价-GalNAc-L-SO1861在提高ASO的效力以减少原代肝细胞中的apoB基因表达方面非常有效(图18B)。
所有这些都表明三价GalNAc-SO1861与(GalNAc)3-ApoB的组合在ASGPR1表达细胞中有效地诱导apoB基因表达的沉默。因此，三价GalNAc-SO1861在ASGPR1表达细胞中有效地诱导BNA的内体逃逸。
此外，原代肝细胞与一系列浓度的皂苷-寡核苷酸-ASGPR配体缀合物接触，即与SO1861(DAR为4)和ApoB BNA(SEQ ID NO.2)缀合的三价GalNAc((GalNAc)3-dSPT4-ApoB；图24D)，并评估apoB基因表达(图18B和图20A)。(GalNAc)3-dSPT4-ApoB的apoB基因沉默效力比缺乏共价连接的皂苷的(GalNAc)3-ApoB缀合物高约100倍。
实例1C.在存在固定剂量的OKT-9抗CD71单克隆抗体的情况下，与SO1861缀合的三价GalNAc、或一系列浓度的缀合物三价GalNAc-(L-SO1861)
产生了三价GalNAc(图1A-B和图8A-G)并且使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合(不稳定，方式与如图2A-B和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似，其中SPT和SPT001与皂苷SO1861同义)，DAR为1，(三价GalNAc-SO1861；(GalNAc)3-SPT001)；图19C)。再次，SO1861-EMCH是指如下SO1861，其中醛基团通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化，从而提供SO1861-Ald-EMCH。关于制备缀合物的概述，也参见下文的‘三价GalNAc-SO1861和GalNAc-SO1861的合成(图2A-B，图4)’部分。
在存在或不存在10pM CD71-皂草毒蛋白(与蛋白质毒素皂草毒蛋白缀合的靶向CD71的单克隆抗体OKT-9；图19D)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-SO1861(三价GalNAc-SPT001)处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1高)和Huh7肝细胞系(ASGPR1+/-表达)。在不存在CD71-皂草毒蛋白的情况下进行的细胞处理表明作为单个化合物的三价GalNAc-SO1861在高达至少1000nM下没有毒性(图19A、19B；相对细胞活力)。与用相同剂量的抗CD71 MoAb-皂草毒蛋白(CD71-皂草毒蛋白)和相同剂量的三价GalNAc-SPT001的组合处理的Huh7细胞的细胞活力相比，用抗CD71 MoAb-皂草毒蛋白和与SO1861缀合的低nM剂量的三价GalNAc(DAR 1；三价GalNAc-SPT001)的组合处理的细胞的细胞活力高度有效地杀伤原代肝细胞(图19A和19B)。
所有这些都表明低剂量的三价GalNAc-SO1861与低浓度的CD71-皂草毒蛋白的组合在ASGPR1表达细胞中有效地诱导细胞杀伤。因此，三价GalNAc-SO1861在ASGPR1表达细胞中有效地诱导蛋白质毒素的内体逃逸。因此，低nM三价GalNAc-SPT001增强原代肝细胞中低pM ADC抗CD71 MoAb-皂草毒蛋白的细胞质递送；具有低ASGPR1表达的肝细胞系(Huh7)在低nM浓度的三价GalNAc-SPT001下没有反应。
实例1D.与ApoB反义寡核苷酸缀合的三价GalNAc+三价GalNAc-L-SO1861，或一系列浓度的缀合的三价GalNAc-(L-SO1861)-ApoB反义寡核苷酸(皂苷-寡核苷酸-ASGPR配体缀合物；图22A-C，三价GalNAc-ApoBBNA-SPT001)
如实例1B中所述，产生三价GalNAc并且使SO1861-EMCH与三价GalNAc缀合，DAR 1(三价GalNAc-SO1861；(GalNAc)3-SPT001；图19C)。此外，制备了与ApoB反义BNA寡核苷酸ApoBBNA(SEQ ID NO：2)和SO1861-EMCH两者偶联的三价GalNAc的共价缀合物(图20D)。另外，制备了三价GalNAc和ApoB反义BNA寡核苷酸ApoBBNA(SEQ ID NO：2)的缀合物(图20C)。关于制备缀合物的概述，也参见以下‘三价GalNAc-SO1861和GalNAc-SO1861的合成(图2A-B、图4)’部分以及‘三价GalNAc-BNA寡聚物的合成(图5A、5B；图6A-B，图7)’部分以及“三价GalNAc-S-ApoB(或HSP27)BNA寡聚物的合成”和“三价GalNAc-L-ApoB(或HSP27)BNA寡聚物的合成”部分以及‘树状突(-L-SO1861)4-三价GalNAc和树状突(-L-SO1861)8-三价GalNAc的合成’和‘树状突(-L-SO1861)4-三价GalNAc的合成’和‘树状突(-L-SO1861)4-L-BNA寡聚物-三价GalNAc和树状突(-L-SO1861)8-L-BNA寡聚物-三价GalNAc的合成’部分以及‘树状突(-L-SO1861)4-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc的合成’部分(图19E；图20E；图23、图24)。
在存在或不存在300nM三价GalNAc-SO1861(三价GalNAc-SPT001)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-ApoBBNA(三价GalNAc-ApoBBNA)处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1高)和Huh7肝细胞系(低ASGPR1表达)(图20A和20B)。不存在三价GalNAc-SPT001的情况下的细胞处理表明，与仅用三价GalNAc-ApoBBNA处理的原代肝细胞中的apoB mRNA表达相比，三价GalNAc-SPT001在原代肝细胞中高度有效地(效力高约100倍)降低apoB mRNA表达(图20A)。由于Huh7细胞表达非常低水平的ASGPR1，三价GalNAc-ApoBBNA、或三价GalNAc-ApoBBNA和三价GalNAc-SPT001的组合均未在这些肝细胞中诱导apoB mRNA表达的降低。
所有这些都表明三价GalNAc-SPT001与三价GalNAc-ApoBBNA的组合在ASGPR1表达细胞中有效地诱导apoB mRNA表达的沉默。因此，三价GalNAc-SPT001在ASGPR1表达细胞中有效地诱导BNA的内体逃逸。
此外，将原代肝细胞和细胞系Huh7的肝细胞与一系列浓度的皂苷-寡核苷酸-ASGPR配体缀合物(即与SO1861缀合的三价GalNAc(DAR为4，在具有四个SO1861分子的树状突中)和ApoB BNA(SEQ ID NO.2)((GalNAc)3-dSPT4-ApoB(图20E)，或三价GalNAc-ApoBBNA-树状突(SO1861)4))接触，并评估apoB mRNA表达(图20A和B)。(GalNAc)3-dSPT4-ApoB的apoB mRNA表达沉默效力比缺乏共价连接的皂苷的三价GalNAc-ApoBBNA缀合物高约100倍。
在存在或不存在300nM三价GalNAc-SO1861(三价GalNAc-SPT001)的情况下，用浓度范围的三价GalNAc-ApoBBNA(三价GalNAc-ApoBBNA)处理高度表达ASGPR1的原代肝细胞(ASGPR1高)和Huh7肝细胞系(低ASGPR1表达)(图21A和B)，并且评估并比较apoB蛋白表达。不存在三价GalNAc-SPT001的情况下的细胞处理表明，与仅用三价GalNAc-ApoBBNA处理的原代肝细胞中的apoB蛋白表达相比，三价GalNAc-SPT001在原代肝细胞中高度有效地(效力高超过1000倍)降低apoB蛋白表达(图21A)。由于Huh7细胞表达非常低水平的ASGPR1，三价GalNAc-ApoBBNA、或三价GalNAc-ApoBBNA和三价GalNAc-SPT001的组合均未在这些肝细胞中诱导显著降低apoB蛋白表达(图21B)。
所有这些都表明三价GalNAc-SPT001与三价GalNAc-ApoBBNA的组合在ASGPR1高表达细胞中有效地诱导apoB蛋白表达的沉默。因此，三价GalNAc-SPT001在ASGPR1高表达细胞中有效地诱导BNA的内体逃逸。
因此，低nM三价GalNAc-ApoBBNA+三价GalNAc-SPT001可在原代肝细胞中增强ApoBBNA的内体逃逸和细胞质递送，导致apoB mRNA沉默；低nM(GalNAc)3-dSPT4-ApoB可在原代肝细胞中增强ApoBBNA的内体逃逸和细胞质递送，导致apoB mRNA沉默；ASGPR1表达非常低的肝细胞对这两种疗法均无反应；低nM三价GalNAc-ApoBBNA+三价GalNAc-SPT001可在原代肝细胞中增强ApoBBNA的内体逃逸和细胞质递送，导致apoB蛋白衰减；低nM(GalNAc)3-dSPT4-ApoB可在原代肝细胞中增强ApoBBNA的内体逃逸和细胞质递送，导致apoB蛋白衰减；当考虑apoB表达时，具有非常低ASGPR1表达的细胞对这两种疗法均无反应。
实例2三价GalNAc-L/S-BNA+SO1861-EMCH
使HSP27BNA与三价GalNAc缀合(图5A、B、图6、图7)，并用浓度范围的三价GalNAc-L-HSP27BNA(不稳定缀合，图5A-B，图6A-B)或三价GalNAc-S-HSP27BNA(稳定缀合，图7)与4000nM的固定浓度的SO1861-EMCH的组合处理HepG2(ASGPR1+)细胞或Huh7(ASGPR1+/-)。确定了HepG2和Huh7细胞中的HSP27基因沉默。只有与4000nM SO1861-EMCH组合，才在以下情况下在HEPG2和Huh7细胞中观察到有效的基因沉默：低浓度的三价-GalNAc-L-HSP27BNA(HepG2：IC50＝0.1nM；Huh7:IC50＝3nM)或三价-GalNAc-S-HSP27BNA(HepG2:IC50＝0.1nM；Huh7:IC50＝3nM)，而等同浓度的三价-GalNAc-L-HSP27BNA(HepG2/Huh7:IC50>2000nM)或三价-GalNAc-S-HSP27BNA(HepG2/Huh7:IC50>2000nM)在HepG2和Huh7细胞系中没有显示出基因沉默活性(图11)。
接下来，以类似的方式(图5A-B、图6A-B、图7)使ApoBBNA与三价GalNAc缀合，并用以下处理HepG2(ASGPR1+)细胞或Huh7(ASGPR1+/-)：浓度范围的三价GalNAc-L-ApoBBNA(不稳定缀合，图5A-B；图6A-B，图12，图13)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(稳定缀合，图7、图14、图15)或三价GalNAc-L-ApoB加扰BNA或三价GalNAc-S-ApoB加扰BNA(其中加扰的ApoBBNA是不与apoB mRNA结合的反义加扰寡核苷酸序列；脱靶对照BNA)与4000nM的固定浓度的SO1861-EMCH的组合。确定了HepG2(ASGPR1+)细胞或Huh7(ASGPR1+/-)中的ApoB基因沉默。只有与4000nM SO1861-EMCH组合，才在以下情况下在HepG2细胞中观察到有效的基因沉默：低浓度的三价GalNAc-L-ApoBBNA(IC50＝10nM)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(IC50＝10nM)，而等同浓度的三价GalNAc-L-ApoBBNA(IC50>2000nM)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(IC50>2000nM)在HepG2细胞中没有显示出基因沉默活性(图12、图14)。这些处理没有影响这些细胞系的活力(图13、图15)。‘L’是指‘不稳定的’接头，其表明接头在细胞中(即在如内体和溶酶体中明显的pH下)被切割。相比之下，‘S’是指‘稳定的’接头，其表明接头在细胞中(即在如内体和溶酶体中明显的pH下)不被切割。因此，包含在形成缀合物或由缀合物所包含的任何两个分子之间的不稳定键的缀合物将在不稳定接头中的位置处被切割，从而使两个连接的或结合的分子解离。一个实例是在如在哺乳动物细胞(如人细胞)的内体和溶酶体中明显的酸性条件下腙键的切割。
所有这些都表明SO1861-EMCH可以增强三价GalNAc-L-BNA或三价GalNAc-S-BNA的内体逃逸和对两个独立的基因靶标的靶基因沉默。与Huh7细胞相比，HepG2细胞中的基因沉默更高效，这表明在细胞的质膜处的更高水平的ASGPR1表达有助于增加GalNAc-BNA缀合物的摄取。
实例3三价GalNAc-L/S-BNA+三价GalNAc-L-SO1861
使SO1861-EMCH(也称为SPT)与三价GalNAc((GalNAc)3或(GN)3)缀合(不稳定，方式与如图2A-B和图4中针对未衍生化的SO1861所述的类似)，DAR 1，(三价-GalNAc-SO1861)。用以下处理HepG2(ASGPR1+)细胞或Huh7(ASGPR1+/-)细胞：浓度范围的三价GalNAc-L-ApoBBNA(不稳定缀合，图16，图17)、三价GalNAc-S-ApoBBNA(稳定缀合(图16，图17))或加扰(Scr.)的脱靶对照缀合物(三价GalNAc-L-ApoB加扰BNA或三价GalNAc-S-ApoB加扰BNA)与4000nM的固定浓度的三价GalNAc-L-SO1861的组合(DAR1)。确定了HepG2(ASGPR1+)细胞和Huh7(ASGPR1+/-)细胞中的ApoB基因沉默。只有与4000nM的三价GalNAc-L-SO1861组合，才在以下情况下在HepG2细胞(ASGPR1+)中观察到有效的基因沉默：低浓度的三价GalNAc-L-ApoBBNA(IC50＝50nM)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(IC50＝50nM)。两种组合处理在Huh7细胞(ASGPR1+/-)中显示出降低的有效基因沉默(三价GalNAc-L-ApoBBNA：IC50＝700nM；三价GalNAc-S-ApoBBNA：IC50＝700nM)。等同浓度的三价GalNAc-L-ApoBBNA(HepG2/Huh7：IC50>1000nM)或三价GalNAc-S-ApoBBNA(HepG2/Huh7：IC50>1000nM)在HepG2和Huh7细胞系中没有显示出基因沉默活性，4000nM的三价GalNAc-L-SO1861也没有诱导/增强加扰的三价GalNAc-L-ApoB加扰BNA+(HepG2/Huh7：IC50>1000nM)或加扰的三价GalNAc-S-ApoB加扰BNA(HepG2/Huh7：IC50>1000nM)的基因沉默(图16，图17)。这些处理没有影响这些细胞系的活力(图16C、D)。
所有这些都表明与三价GalNAc-L-SO1861组合时，极低浓度的三价GalNAc-L-HSP27BNA或三价GalNAc-S-HSP27BNA在ASGPR1表达细胞中有效地诱导基因沉默，并且在具有较高ASGPR1表达的细胞中再次见到较强的作用。
材料与方法
缩写
AEM N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐
AMPD 2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇
BOP(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
EDCI.HCl 3-((乙基亚氨基)亚甲基氨基)-N,N-二甲基丙-1-铵氯化物
EMCH.TFA N-(ε-马来酰亚胺基己酸)酰肼，三氟乙酸盐
HATU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
min分钟
NMM 4-甲基吗啉
r.t.保留时间
TCEP三(2-羧基乙基)膦盐酸盐
Temp温度
TFA三氟乙酸
分析方法
LC-MS方法1
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：
1500-2400或2000-3000范围内的阴或阴/阳；ELSD：气体压力40psi，漂移管temp：50℃；柱：Acquity C18，50×2.1mm，1.7μm温度：60℃，流速：0.6mL/min，取决于产物的极性的线性梯度：
At0＝2％ A，t5.0min＝50％ A，t6.0min＝98％ A
Bt0＝2％ A，t5.0min＝98％ A，t6.0min＝98％ A
后运行时间：1.0min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
LC-MS方法2
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：阳/阴100-800或阴2000-3000；ELSD：气体压力40psi，漂移管temp：50℃；柱：Waters XSelectTM CSH C18，50×2.1mm，2.5μm，温度：25℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％ A，t2.0min＝98％ A，t2.7min＝98％ A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
LC-MS方法3
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量阳/阴105-800、500-1200或1500-2500；ELSD：气体压力40psi，漂移管temp：50℃；柱：Waters XSelectTM CSHC18，50×2.1mm，2.5μm，温度：40℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％ A，t2.0min＝98％ A，t2.7min＝98％ A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：在乙腈中的0.1％甲酸，洗脱剂B：在水中的0.1％甲酸。
LC-MS方法4
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：阳/阴100-800或阴2000-3000；ELSD：气体压力40psi，漂移管temp：50℃，柱：Waters Acquity Shield RP18，50×2.1mm，1.7μm，温度：25℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％ A，t2.0min＝98％ A，t2.7min＝98％ A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
制备型方法
制备型MP-LC方法1
仪器类型：RevelerisTM制备型MPLC；柱：Waters XSelectTM CSH C18(145×25mm，10μm)；流速：40mL/min；柱温：室温；洗脱剂A：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.0)；洗脱剂B：99％乙腈+在水中的1％10mM碳酸氢铵；梯度：
At0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝10％ B，t17min＝50％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
At0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝20％ B，t17min＝60％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
；检测UV：210、235、254nm和ELSD。
制备型MP-LC方法2
仪器类型：RevelerisTM制备型MPLC；柱：Phenomenex LUNA C18(3)(150×25mm，10μm)；流速：40mL/min；柱温：室温；洗脱剂A：在水中的0.1％(v/v)甲酸，洗脱剂B：在乙腈中的0.1％(v/v)甲酸；梯度：
At0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝20％ B，t17min＝60％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
Bt0min＝2％ B，t1min＝2％ B，t2min＝2％ B，t17min＝30％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
Ct0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝10％ B，t17min＝50％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
Dt0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝5％ B，t17min＝40％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
；检测UV：210、235、254nm和ELSD。
制备型LC-MS方法3
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B Quadrupole；HPLC仪器类型：Agilent Technologies 1290制备型LC；柱：Waters XSelectTM CSH(C18，150×19mm，10μm)；流速：25ml/min；柱温：室温；洗脱剂A：100％乙腈；洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵，pH＝9.0；梯度：
At0＝20％ A，t2.5min＝20％ A，t11min＝60％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
Bt0＝5％ A，t2.5min＝5％ A，t11min＝40％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
；检测：DAD(210nm)；检测：MSD(ESI pos/neg)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集。
制备型LC-MS方法4
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B Quadrupole；HPLC仪器类型：Agilent Technologies 1290制备型LC；柱：Waters XBridge Protein(C4，150×19mm，10μm)；流速：25ml/min；柱温：室温；洗脱剂A：100％乙腈；洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵，pH＝9.0；梯度：
At0＝2％ A，t2.5min＝2％ A，t11min＝30％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
Bt0＝10％ A，t2.5min＝10％ A，t11min＝50％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
Ct0＝5％ A，t2.5min＝5％ A，t11min＝40％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
；检测：DAD(210nm)；检测：MSD(ESI pos/neg)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集
快速色谱法
Grace Reveleris
Figure BDA0004177963000001521
C-815快速；溶剂递送系统：具有自动启动功能的3活塞泵，4个独立通道，一次运行最多4种溶剂，当溶剂耗尽时自动切换管路；最大泵流速250mL/min；最大压力50巴(725psi)；检测：UV 200-400nm，多达4个UV信号的组合和整个UV范围的扫描，ELSD；柱尺寸：在仪器上为4-330g，鲁尔型，750g至3000g，带可选支架。
SO1861-EMCH的合成(SO1861-EMCH也称为SO1861-Ald-EMCH和SPT-EMCH)
向SO1861(121mg，0.065mmol)和EMCH.TFA(110mg，0.325mmol)中添加甲醇(特干的，3.00mL)和TFA(0.020mL，0.260mmol)。在室温下搅拌反应混合物。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(120mg，90％)。基于LC-MS的纯度为96％。
三价GalNAc-叠氮化物的合成
中间体1：
1-叠氮基-17,17-双((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯
向3,3′-((2-氨基-2-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))二丙酸二叔丁酯(1.27g，2.51mmol)中添加3-叠氮基(peg4)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(977mg，2.51mol)在DMF(10mL)中的溶液。接下来，添加DIPEA(657μL，3.77mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将所得溶液用0.5N硫酸氢钾溶液(2×100mL)和盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中蒸发。将残余物通过快速色谱法(DCM-在DCM中的10％甲醇(v/v)梯度100:0升至0:100)纯化以得到呈无色油状物的标题化合物(1.27g，65％)。基于LC-MS的纯度为100％(ELSD)。
LRMS(m/z)：780[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：2.102
中间体2：
1-叠氮基-17,17-双((2-羧基乙氧基)甲基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酸
向1-叠氮基-17,17-双((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)甲基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酸叔丁酯(1.27g，1.63mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液中添加TFA(5.0mL，65mmol)。将反应混合物在室温下搅拌。在1.5小时后，将反应混合物在真空中蒸发，与甲苯(3×10mL)和DCM(3×10mL)共蒸发以得到呈无色油状物的粗标题产物。
LRMS(m/z)：611[M+1]1+
中间体3：
(10-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-10-(13,13-二甲基-5,11-二氧代-2,12-二氧杂-6,10-二氮杂十四烷基)-5,15-二氧代-8,12-二氧杂-4,16-二氮杂十九烷-1,19-二基)二氨基甲酸二叔丁酯
将1-叠氮基-17,17-双((2-羧基乙氧基)甲基)-15-氧代-3,6,9,12,19-五氧杂-16-氮杂二十二烷-22-酸(997mg，1.63mmol)、Oxyma Pure(1.04g，7.35mmol)和EDCI.HCl(1.17g，6.12mmol)溶解于DMF(10.0mL)中。接下来，添加DIPEA(1.99mL，11.4mmol)，随后直接添加N-BOC-1,3-丙二胺(1.07g，6.12mmol)在DMF(10.0mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于乙酸乙酯(100mL)中。将所得溶液用0.5N硫酸氢钾溶液(100mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2×100mL)和盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中蒸发。将残余物通过快速色谱法(DCM-在DCM中的10％甲醇(v/v)梯度0:100升至100:0，保持在100:0直到洗脱出产物)纯化以得到呈淡黄色粘性油状物的标题化合物(1.16g，66％)。LC-MS 99％(ELSD)。
LRMS(m/z)：1080[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：1.513
中间体4：
3,3′-((2-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))双(N-(3-氨基丙基)丙酰胺)三(2,2,2-三氟乙酸酯)的合成
向(10-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-10-(13,13-二甲基-5,11-二氧代-2,12-二氧杂-6,10-二氮杂十四烷基)-5,15-二氧代-8,12-二氧杂-4,16-二氮杂十九烷-1,19-二基)二氨基甲酸二叔丁酯(1.16g，1.08mmol)在DCM(10mL)中的溶液中添加TFA(10mL，131mmol)。将反应混合物在室温下搅拌。在2小时后，将反应混合物在真空中蒸发，与甲苯(3×10mL)和DCM(3×10mL)共蒸发以得到呈淡黄色粘性油状物的粗标题产物。
LRMS(m/z)：260[M+3]3+，390[M+2]2+，780[M+1]1+，
中间体5：
(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯
将5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)戊酸(根据J.Am.Chem Soc.[美国化学会志],2014,136，16958-16961获得，3.00g，6.70mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(926mg，8.05mmol)溶解于DCM(50mL)中。接下来，添加EDCI.HCl(1.54g，8.05mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(82mg，0.67mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用DCM稀释，并将所得溶液用0.5N硫酸氢钾溶液(150mL)、饱和碳酸氢钠溶液(150mL)和盐水(150mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中蒸发以得到呈白色泡沫的标题化合物(3.60g，99％)。基于LC-MS的纯度为99％(ELSD)。
LRMS(m/z)：545[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：1.073
中间体6：
[(3R，6R)-3,4-双(乙酰基氧基)-6-{4-[(3-{3-[2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-3-(2-{[3-(5-{[(2R,5R)-4,5-双(乙酰基氧基)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-3-乙酰胺基氧杂环己-2-基]氧基}戊酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[(2-{[3-(5-{[(2R,5R)-4,5-双(乙酰基氧基)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-3-乙酰胺基氧杂环己-2-基]氧基}戊酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙氧基)甲基]丙氧基]丙酰胺基}丙基)氨基甲酰基]丁氧基}-5-乙酰胺基氧杂环己-2-基]甲基乙酸酯
将3,3′-((2-((3-((3-氨基丙基)氨基)-3-氧代丙氧基)甲基)-2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)丙烷-1,3-二基)双(氧基))双(N-(3-氨基丙基)丙酰胺)三(2,2,2-三氟乙酸酯)(1.21g，1.08mmol)溶解于DMF(10mL)和DIPEA(1.69mL，9.70mmol)的混合物中。接下来，添加(2R,3R,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((5-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-5-氧代戊基)氧基)四氢-2H-吡喃-3,4-二基二乙酸酯(2.20g，4.04mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过周末。接下来，将反应混合物在真空中蒸发并将残余物通过快速色谱法(DCM-在DCM中的30％甲醇(v/v)梯度0:100升至100:0)纯化以得到呈淡黄色泡沫的标题化合物(1.84g，83％)。LC-MS 95％(ELSD)。
LRMS(m/z)：2068[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：1.183
中间体7：
三价GalNAc-叠氮化物
将[(3R,6R)-3,4-双(乙酰基氧基)-6-{4-[(3-{3-[2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)-3-(2-{[3-(5-{[(2R,5R)-4,5-双(乙酰基氧基)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-3-乙酰胺基氧杂环己-2-基]氧基}戊酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙氧基)-2-[(2-{[3-(5-{[(2R,5R)-4,5-双(乙酰基氧基)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-3-乙酰胺基氧杂环己-2-基]氧基}戊酰胺基)丙基]氨基甲酰基}乙氧基)甲基]丙氧基]丙酰胺基}丙基)氨基甲酰基]丁氧基}-5-乙酰胺基氧杂环己-2-基]甲基乙酸酯(300mg，0.145mmol)溶解于三乙胺(2.00mL，14.4mmol)、甲醇(2.00mL)和水(2.00mL)的混合物中，并将反应混合物在室温下搅拌。在2小时后，在真空中蒸发反应混合物。将残余物通过制备型MP-LC纯化。将对应于产物的2B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(164mg，67％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z)：1688[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.991A
三价GalNAc-SO1861和GalNAc-SO1861的合成(图2，图4)
中间体8：
SO1861-NH2
将SO1861-叠氮化物(6.89mg，3.20μmol)溶解于32mM碳酸钾(150μL，4.80μmol)和乙腈(150μL)的混合物中。之后直接添加在THF中的1.0M三甲基膦溶液(32μL，32μmol)，并将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(5.30mg，78％)。基于LC-MS的纯度为94％。
LRMS(m/z)：1062[M-2]2-
LC-MS r.t.(min)：2.511B
中间体9：
SO1861-DBCO
向SO1861-胺(48.6mg，22.9μmol)和DBCO-NHS(13.0mg，32.4μmol)中添加DIPEA(5.98μL，34.3μmol)和DMF(2.0mL)的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在4小时后，将反应混合物用50mM碳酸氢钠(1.00mL，50μmol)的溶液稀释。将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(16.9mg，31％)。基于LC-MS的纯度为94％。
LRMS(m/z)：2412[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.451B
SO1861-L-三价GalNAc的合成
将SO1861-DBCO(7.50mg，3.11μmol)和三价GalNAc-叠氮化物(5.31mg，3.14μmol)溶解于水/乙腈(2:1，v/v，0.90mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的3B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(9.60mg，75％)。基于LC-MS的纯度为99％。
LRMS(m/z)：2050[M-2]2-
LC-MS r.t.(min)：2.041B
SO1861-L-GalNAc的合成
将SO1861-DBCO(1.75mg，0.73μmol)和GalNAc-PEG3-叠氮化物(0.82mg，2.18μmol)溶解于水/乙腈(1:1，v/v，1.00mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的3B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(1.63mg，81％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z)：2790[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.151B
三价GalNAc-BNA寡聚物的合成(图6、7)
中间体10：
4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-N-[2-(2-{2-[2-({4-[(E)-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)已酰胺基]亚氨基}甲基]苯基}甲酰胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基]-4-氧代丁酰胺
将4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-N-{2-[2-(2-{2-[(4-甲酰基苯基)甲酰胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基}-4-氧代丁酰胺(25.0mg，40.9μmol)和EMCH.TFA(20.8mg，61.3μmol)溶解于甲醇(特干的，2.00mL)中。接下来，添加TFA(9.39μL，123μmol)。将反应混合物振荡1min并在室内静置过夜。使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(16.2mg，48％)。基于LC-MS的纯度为91％。
LRMS(m/z)：410.2[M+2]2+
LC-MS r.t.(min)：1.412
中间体11：
三价GalNAc-L-马来酰亚胺
将三价GalNAc-叠氮化物(20.3mg，12.0μmol)和4-{2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-己烯-10-炔-2-基}-N-[2-(2-{2-[2-({4-[(E)-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)已酰胺基]亚氨基}甲基]苯基}甲酰胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基]-4-氧代丁酰胺(11.8mg，14.4μmol)溶解于水/乙腈(2:1，v/v，0.90mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的2C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(25.6mg，85％)。基于LC-MS的纯度为88％。
LRMS(m/z)：2101[M-405]1-，2304[M-202]1-，2507[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.901B(异构体引起的双峰)
中间体12：
三价GalNAc-S-马来酰亚胺
将三价GalNAc-叠氮化物(20.3mg，12.0μmol)和DBCO-马来酰亚胺(10.3mg，24.0μmol)溶解于水/乙腈(2:1，v/v，0.90mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的2D级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(22.2mg，87％)。基于LC-MS的纯度为85％。含有10％的水解马来酰亚胺。
LRMS(m/z)：2115[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.601B(异构体引起的双峰)
三价GalNAc-S-ApoB(或HSP27)BNA寡聚物的合成
向ApoB BNA寡聚物二硫化物(5.00mg，0.686μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵/乙腈(3：1，v/v，1.00mL)稀释，并将所得溶液直接添加到三价GalNAc-S-马来酰亚胺(3.02mg，1.43μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(6.75mg，定量)。基于LC-MS的纯度为94％(非常宽的峰)。ApoB BNA序列参见SEQ ID NO：2。
LRMS(m/z)：2318[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：1.651A
三价GalNAc-S-ApoB(或HSP27)加扰的BNA寡聚物的合成
向ApoB加扰的BNA寡聚物二硫化物(5.00mg，0.688μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵/乙腈(3：1，v/v，1.00mL)稀释，并将所得溶液直接添加到三价GalNAc-S-马来酰亚胺(3.09mg，1.46μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(5.91mg，93％)。基于LC-MS的纯度为88％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2311[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：1.601A
三价GalNAc-L-ApoB(或HSP27)BNA寡聚物的合成
向ApoB BNA寡聚物二硫化物(5.00mg，0.686μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵/乙腈(3：1，v/v，1.00mL)稀释，并将所得溶液直接添加到三价GalNAc-L-马来酰亚胺(3.63mg，1.45μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(6.68mg，定量)。基于LC-MS的纯度为99％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2416[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：1.971A
三价GalNAc-L-ApoB(或HSP27)加扰的BNA寡聚物的合成
向ApoB加扰的BNA寡聚物二硫化物(5.00mg，0.688μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵/乙腈(3：1，v/v，1.00mL)稀释，并将所得溶液直接添加到三价GalNAc-L-马来酰亚胺(3.68mg，1.47μmol)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(4.71mg，71％)。基于LC-MS的纯度为96％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2409[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：1.931A
树状突(-L-SO1861)4-三价GalNAc(图23D-E)和树状突(-L-SO1861)8-三价GalNAc的合成
中间体13：
三价GalNAc-胺甲酸盐
将三价GalNAc-叠氮化物(36.5mg，21.6μmol)溶解于碳酸钾(5.97mg，43.2μmol)在水(1.00mL)和乙腈(1.00mL)中的溶液中。接下来，添加在THF中的1.0M三甲基膦溶液(216μL，216μmol)，并将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在45min后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于水/乙腈(9：1，v/v，1mL)中。使所得溶液直接经受制备型MP-LC。将对应于产物的2B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(36.1mg，98％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z)：1662[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.621A
中间体14：
三价GalNAc-DBCO
将三价GalNAc-胺甲酸盐(17.4mg，10.2μmol)和DBCO-NHS(6.14mg，15.3μmol)溶解于NMM(2.24μL，20.3μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于水/乙腈(8:2，v/v，1mL)中。使所得溶液直接经受制备型MP-LC。将对应于产物的2C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(14.2mg，72％)。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z)：1950[M-1]1
LC-MS r.t.(min)：1.861B
中间体15：
树状突(-L-SO1861)8-叠氮化物
将树状突(-L-SO1861)8-胺(19.6mg，1.08μmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(4.17mg，10.8μmol)溶解于DMF(1.50mL)中。接下来，添加DIPEA(1.87μL，10.8μmol)，并将混合物振荡1min并在室温下静置过夜。使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(11.7mg，59％)。基于LC-MS的纯度为92％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2316[M-8]8-，2647[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：4.291A
树状突(-L-SO1861)4-三价GalNAc的合成
将树状突(-L-SO1861)4-叠氮化物(2.50mg，0.266μmol)和三价GalNAc-DBCO(1.56mg，0.799μmol)溶解于水/乙腈(3：1，v/v，1.00mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.74mg，91％)。基于LC-MS的纯度为86％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2832[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：4.071A
树状突(-L-SO1861)8-三价GalNAc的合成
将树状突(-L-SO1861)8-叠氮化物(2.50mg，0.135μmol)和三价GalNAc-DBCO(0.79mg，0.405μmol)溶解于水/乙腈(3：1，v/v，1.00mL)的混合物中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.03mg，74％)。基于LC-MS的纯度为100％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2559[M-8]8-，2925[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：4.181A
树状突(-L-SO1861)4-L-BNA寡聚物-三价GalNAc和树状突(-L-SO1861)8-L-BNA寡聚物-三价GalNAc的合成
中间体16：
三价GalNAc-硫代乙酸酯
将三价GalNAc-胺甲酸盐(18.7mg，11.0μmol)和4-硝基苯基3-(乙酰基硫代)丙酸酯(5.90mg，21.9μmol)溶解于NMM(2.41μL，21.9μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于在水中的0.1％甲酸和在乙腈中的0.1％甲酸(9:1，v/v，1mL)的混合物中。使所得溶液直接经受制备型MP-LC。将对应于产物的2B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(13.0mg，66％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z)：1749[M-43]1-，1792[M-1]1
LC-MS r.t.(min)：1.241B
中间体17：
DBCO-TCO-三价GalNAc
将三价GalNAc-硫代乙酸酯(13.0mg，7.25μmol)溶解于甲醇(0.50mL)中。接下来，添加1M的氢氧化钠溶液(7.98μL，7.98μmol)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，将反应混合物添加到新鲜制备的三官能接头(Ls-t)(即，是皂苷部分接头Ls的实例)(7.39mg，6.13μmol)在20mM碳酸氢铵/乙腈(3：1，v/v，2.00mL)中的溶液中。
三官能接头具有IUPAC名称：5,8,11,18,21,24,27-七氧杂-2,14,30-三氮杂三十烷酸,14-[16-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-13,16-二氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十六碳-1-基]-33-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-15,31-二氧代-,(1R,4E)-4-环辛烯-1-基酯。三官能接头具有以下式(XXI)：
Figure BDA0004177963000001631
将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的2A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(3.83mg，21％)。基于LC-MS的纯度为89％。
LRMS(m/z)：2409[M-546]1-，2955[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.661B
中间体18：
甲基四嗪-L-ApoB BNA寡聚物
向ApoB BNA寡聚物二硫化物(5.00mg，0.686μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵(1.50mL)稀释，并将所得混合物直接添加到(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(1.36mg，1.73μmol)在乙腈(0.5mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，将反应混合物冷冻并冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的粗标题产物。向粗产物中添加20mM碳酸氢铵的溶液(1.50mL)，并将所得悬浮液经0.45μm注射器过滤器过滤。将滤液冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的标题产物(5.44mg，定量)。基于LC-MS的纯度为90％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2648[M-3]3-
LC-MS r.t.(min)：0.624
中间体19：
甲基四嗪-L-ApoB加扰的BNA寡聚物
向ApoB加扰的BNA寡聚物二硫化物(5.00mg，0.688μmol)中添加具有2.5mM TCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵(1.50mL)稀释，并将所得混合物直接添加到(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1，2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3，6，9，12-四氧杂十五烷-15-酰胺(1.34mg，1.70μmol)在乙腈(0.5mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，将反应混合物冷冻并冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的粗标题产物。向粗产物中添加20mM碳酸氢铵的溶液(1.50mL)，并将所得悬浮液经0.45μm注射器过滤器过滤。将滤液冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的标题产物(5.48mg，定量)。基于LC-MS的纯度为84％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2639[M-3]3-
LC-MS r.t.(min)：0.584
中间体20：
DBCO-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc
向甲基四嗪-L-ApoB BNA寡聚物(5.44mg，0.684μmol)和DBCO-TCO-三价GalNAc(2.03mg，0.687μmol)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3：1，v/v，1.00mL)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.87mg，39％)。LC-MS显示具有正确m/z值的多个宽峰。
LRMS(m/z)：2175[M-5]5-,2718[M-6]4-
LC-MS r.t.(min)：2.60-3.001A
中间体21：
DBCO-L-ApoB加扰的BNA寡聚物-三价GalNAc
向甲基四嗪-L-ApoB加扰的BNA寡聚物(5.48mg，0.692μmol)和DBCO-TCO-三价GalNAc(1.80mg，0.609μmol)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3：1，v/v，1.00mL)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.15mg，33％)。LC-MS显示具有正确m/z值的多个宽峰。
LRMS(m/z)：2169[M-5]5-,2711[M-6]4-
LC-MS r.t.(min)：2.58-3.201A
树状突(-L-SO1861)4-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc(分子34，图24D)的合成
向DBCO-L-ApoB BNA寡聚物三价GalNAc(1.49mg，0.137μmol；分子31，图24C)和树状突(-L-SO1861)4-叠氮化物(1.33mg，0.142μmol；分子19，图23D；树状突(-L-SO1861)4-叠氮化物是在树状突(SPT001)4-NH2(分子15，图23C)上合成，其中该胺树状突用叠氮基-PEG4-NHS酯(分子18)在DMF中用DIPEA作为碱处理)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3：1，v/v，0.5mL)使得树状突(-L-SO1861)4-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc(分子34；‘三价GalNAc-ApoBBNA-SPT001缀合物’)被合成(图24D)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(0.96mg，35％)。基于LC-MS的纯度为93％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2025[M-10]10-，2250[M-9]9-，2532[M-8]8-，2893[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：3.681A
通过将甲基四嗪-L-ApoB BNA寡聚物(分子30)与DBCO-TCO-三价GalNAc(分子29)缀合，合成DBCO-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc(分子31)(图24A-B和24C)，其中DBCO-TCO-三价GalNAc(分子29)是用分子27和分子28(三官能接头)合成的，其中分子27是从分子22、三价GalNAc-胺的甲酸盐和分子26(4-硝基苯基3-(乙酰基硫代)丙酸酯)之间的反应获得的GalNAc-硫代乙酸酯(图24A-B)。
ApoB BNA、三价GalNAc和SPT001(它是皂苷SO1861)使用三官能接头缀合成单个共价缀合物(图24D)。
使用与合成树状突(-L-SO1861)4-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc(分子34；‘三价GalNAc-ApoB BNA-SPT001缀合物’)类似的方法，合成了一种缀合物用于对照测试目的，其中ApoB BNA被替换为具有加扰ApoB核酸序列的BNA。
使用与合成树状突(-L-SO1861)4-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc(分子34；‘三价GalNAc-ApoB BNA-SPT001缀合物’)类似的方法，合成了缀合物树状突(-L-SO1861)8-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc，其中ApoB BNA寡核苷酸是用于沉默mRNA/蛋白质表达的ApoBBNA，或者是具有加扰ApoB核酸序列的BNA。
SO1861-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc合成(三价GalNAc-ApoB BNA-SPT001缀合物，图22A-C)
参考图22A-C，使用具有以下分子结构的三价接头TFL，合成了包含三价GalNAc、皂苷SO1861和ApoB BNA的缀合物：
Figure BDA0004177963000001671
形成缀合物SO1861-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc合成(三价GalNAc-ApoB BNA-SPT001缀合物)。
树状突(-L-SO1861)8-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc合成
向DBCO-L-ApoB BNA寡聚物-三价GalNAc(1.38mg，0.127μmol)和树状突(-L-SO1861)8-叠氮化物(2.51mg，0.135μmol)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3：1，v/v，0.5mL)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在4小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(0.75mg，20％)。基于LC-MS的纯度为99％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2099[M-14]14-，2261[M-13]13-，2450[M-12]12-，2672[M-11]11-，2940[M-10]10-
LC-MS r.t.(min)：3.901A
树状突(-L-SO1861)4-L-ApoB加扰BNA寡聚物-三价GalNAc合成
向DBCO-L-ApoB加扰BNA寡聚物-三价GalNAc(1.09mg，0.100μmol)和树状突(-L-SO1861)4-叠氮化物(0.96mg，0.102μmol)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，0.5mL)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(0.45mg，22％)。LC-MS显示具有正确m/z值的多个宽峰。
LRMS(m/z)：2023[M-10]10-，2248[M-9]9-，2528[M-8]8-，2890[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：3.60-4.001A
抗CD71-皂草毒蛋白的合成
从高级靶向系统公司(Advanced Targeting Systems)(加利福利亚州圣地亚哥)生产并购买定制CD71mab-皂草毒蛋白缀合物。CD71单克隆抗体购自InVivoMab，抗人CD71(OKT-9)，BioXCell公司。
HSP27BNA、ApoB和ApoB加扰寡聚物序列
HSP27(5'-GGCacagccagtgGCG-3')[SEQ ID NO:1](修改自Zhang等人(2011)[YZhang,Z Qu,S Kim,V Shi,B Liao1,P Kraft,R Bandaru,Y Wu,LM Greenberger和IDHorak,Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid(LNA)-basedantisense oligonucleotides without transfection[使用基于锁核酸(LNA)的反义寡核苷酸在没有转染的情况下下调癌症靶标],Gene Therapy[基因疗法](2011)18,326-333]的反义BNA(HSP27)为BNA(NC)，其具有寡聚物核酸序列5'-GGCacagccagtgGCG-3')、ApoB(5’-GCCTCagtctgcttcGCACC-3’)[SEQ ID NO:2]和ApoB加扰(5’-GGCCTctctacaccgCTCGT-3’)[SEQID NO:3]BNA寡聚物订购自生物合成公司(Bio-Synthesis Inc.)(刘易斯维尔市(Lewisville)，德克萨斯州(Texas))，含有5'-硫醇C6接头。
人原代肝细胞处理
将冷冻保存的原代人肝细胞(细胞生物技术有限公司(Cytes BiotechnologiesS.L.)，西班牙)在肝细胞解冻培养基(细胞生物技术有限公司，西班牙)中解冻。将细胞重悬于肝细胞铺板培养基(细胞生物技术有限公司，西班牙)中。将细胞接种到胶原I包被的板上，对于48或96孔板(Greiner BioOne公司)，密度为215.600个细胞/孔或66.600个细胞/孔。在开始处理前将细胞在37℃下预培养4-6小时，以允许细胞附接至细胞培养板。用315μl或108μl维持培养基(细胞生物技术有限公司，西班牙)替代铺板培养基，之后添加来自在PBS中的10倍浓缩储备溶液的缀合物。将板在37℃下孵育72小时，将其收获用于基因表达和细胞活力分析。
从人细胞培养物进行RNA分离和基因表达分析
根据标准方案(伯乐公司(Biorad))分离并分析来自细胞的RNA。使用的qPCR引物在表A2中指示。
表A2.qPCR中使用的引物在下面显示：
Figure BDA0004177963000001681
Figure BDA0004177963000001691
细胞活力测定(MTS)
在处理后，将细胞在37℃下孵育72小时，然后通过根据制造商的说明(CellTiter
Figure BDA0004177963000001692
AQueous单溶液细胞增殖测定，普洛麦格公司(Promega))进行的MTS测定确定细胞活力。简言之，将MTS溶液在DMEM中稀释20倍，该DMEM不含补充有10％ FBS的苯酚红(PAN-Biotech GmbH公司)。每孔用200μL PBS洗涤细胞一次，然后每孔添加100μL稀释的MTS溶液。将板在37℃下孵育约20-30分钟。随后，在赛默飞世尔科技公司Multiskan FC平板读数器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))上测量492nm处的OD。为了定量，将“仅培养基”孔的背景信号从所有其他孔中减去，然后通过将经处理的孔的背景校正信号除以未处理的孔的背景校正信号(x 100)计算经处理/未处理细胞的细胞活力百分比。
FACS分析
对于每种细胞系，将细胞以适当的密度接种在T75烧瓶中的补充有10％胎牛血清(PAN-Biotech GmbH公司)和1％青霉素/链霉素(PAN-Biotech GmbH公司)的DMEM(PAN-Biotech GmbH公司)中并孵育72-96小时(5％ CO2，37℃)，直到达到90％的汇合。接下来，将细胞胰蛋白酶化(TryplE Express，吉布科赛默科技公司(Gibco Thermo Scientific))成单个细胞、转移至15mL falcon管并离心(1,400rpm，3min)。弃去上清液，同时将细胞沉淀浸没。将500.000个细胞转移至圆底FACS管并用3mL冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)洗涤。将细胞以1800rpm、4℃离心3min并重悬于200μL冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)或200μL抗体溶液(含有在195μL冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)中的5μL抗体)中。将转铁蛋白受体使用PE抗人CD71(编号334106，生物传奇公司(Biolegend))染色，使用PE小鼠IgG2a、κ同种型对照FC(编号400212，生物传奇公司)作为其匹配的同种型对照。将ASGPR1受体使用PE抗人ASGPR1(编号130-122-963，美天旎公司(Miltenyi))染色并使用PE小鼠IgG1、同种型对照(编号130-113-762，美天旎公司)作为其匹配的同种型对照。将样品在4℃下孵育30min。之后用冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)将细胞洗涤2次，并在室温下使用在DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)中的2％ PFA溶液固定20min。用冷DPBS洗涤细胞1次并重悬于1000μL冷DPBS中用于FACS分析。使用希森美康公司(Sysmex)的Cube 8流式细胞仪系统(希森美康公司)和FCSExpress 7研究版软件分析样品。FACS分析的结果总结在表A3中。
表A3.HepG2和Huh7细胞的ASGPR1和CD71的细胞膜受体表达水平
Figure BDA0004177963000001701
实例4
材料与方法
缩写
AEM N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐
AMPD 2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇
BOP(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DTME二硫代双马来酰亚胺乙烷
DTT二硫代苏糖醇
EDCI.HCl 3-((乙基亚氨基)亚甲基氨基)-N,N-二甲基丙-1-铵氯化物
EDTA乙二胺四乙酸
EMCH.TFA N-(ε-马来酰亚胺基己酸)酰肼，三氟乙酸盐
HATU 1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
min分钟
NMM 4-甲基吗啉
r.t.保留时间
SEC尺寸排阻色谱法
TBEU(三(羟基甲基)氨基甲烷)-硼酸盐-EDTA-脲
TCEP三(2-羧基乙基)膦盐酸盐
Temp温度
TFA三氟乙酸
TFL三官能接头
分析方法
LC-MS方法1
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：
1500-2400或2000-3000范围内的阴或阴/阳；ELSD：气体压力40psi，漂移管temp：50℃；柱：Acquity C18，50×2.1mm，1.7μm温度：60℃，流速：0.6mL/min，取决于产物的极性的线性梯度：
At0＝2％ A，t5.0min＝50％ A，t6.0min＝98％ A
Bt0＝2％ A，t5.0min＝98％ A，t6.0min＝98％ A
后运行时间：1.0min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
LC-MS方法2
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：阳/阴100-800或阴2000-3000；ELSD：气体压力40psi，漂移管temp：50℃；柱：Waters XSelectTM CSH C18，50×2.1mm，2.5μm，温度：25℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％ A，t2.0min＝98％ A，t2.7min＝98％ A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
LC-MS方法3
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量阳/阴105-800、500-1200或1500-2500；ELSD：气体压力40psi，漂移管temp：50℃；柱：Waters XSelectTM CSHC18，50×2.1mm，2.5μm，温度：40℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％ A，t2.0min＝98％ A，t2.7min＝98％ A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：在乙腈中的0.1％甲酸，洗脱剂B：在水中的0.1％甲酸。
LC-MS方法4
设备：Waters IClass；二元泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：阳/阴100-800或阴2000-3000；ELSD：气体压力40psi，漂移管temp：50℃，柱：Waters Acquity Shield RP18，50×2.1mm，1.7μm，温度：25℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％ A，t2.0min＝98％ A，t2.7min＝98％ A，后运行时间：0.3min，洗脱剂A：乙腈，洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.5)。
制备型方法
制备型MP-LC方法1
仪器类型：RevelerisTM制备型MPLC；柱：Waters XSelectTM CSH C18(145×25mm，10μm)；流速：40mL/min；柱温：室温；洗脱剂A：在水中的10mM碳酸氢铵(pH＝9.0)；洗脱剂B：99％乙腈+在水中的1％10mM碳酸氢铵；梯度：
At0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝10％ B，t17min＝50％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
At0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝20％ B，t17min＝60％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
；检测UV：210、235、254nm和ELSD。
制备型MP-LC方法2
仪器类型：RevelerisTM制备型MPLC；柱：Phenomenex LUNA C18(3)(150×25mm，10μm)；流速：40mL/min；柱温：室温；洗脱剂A：在水中的0.1％(v/v)甲酸，洗脱剂B：在乙腈中的0.1％(v/v)甲酸；梯度：
At0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝20％ B，t17min＝60％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
Bt0min＝2％ B，t1min＝2％ B，t2min＝2％ B，t17min＝30％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
Ct0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝10％ B，t17min＝50％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
Dt0min＝5％ B，t1min＝5％ B，t2min＝5％ B，t17min＝40％ B，t18min＝100％ B，t23min＝100％ B
；检测UV：210、235、254nm和ELSD。
制备型LC-MS方法3
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B Quadrupole；HPLC仪器类型：Agilent Technologies 1290制备型LC；柱：Waters XSelectTM CSH(C18，150×19mm，10μm)；流速：25ml/min；柱温：室温；洗脱剂A：100％乙腈；洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵，pH＝9.0；梯度：
At0＝20％ A，t2.5min＝20％ A，t11min＝60％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
Bt0＝5％ A，t2.5min＝5％ A，t11min＝40％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
；检测：DAD(210nm)；检测：MSD(ESI pos/neg)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集。
制备型LC-MS方法4
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B Quadrupole；HPLC仪器类型：Agilent Technologies 1290制备型LC；柱：Waters XBridge Protein(C4，150×19mm，10μm)；流速：25ml/min；柱温：室温；洗脱剂A：100％乙腈；洗脱剂B：在水中的10mM碳酸氢铵，pH＝9.0；梯度：
At0＝2％ A，t2.5min＝2％ A，t11min＝30％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
Bt0＝10％ A，t2.5min＝10％ A，t11min＝50％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
Ct0＝5％ A，t2.5min＝5％ A，t11min＝40％ A，t13min＝100％ A，t17min＝100％ A
；检测：DAD(210nm)；检测：MSD(ESI pos/neg)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集
快速色谱法
Grace Reveleris
Figure BDA0004177963000001741
C-815快速；溶剂递送系统：具有自动启动功能的3活塞泵，4个独立通道，一次运行最多4种溶剂，当溶剂耗尽时自动切换管路；最大泵流速250mL/min；最大压力50巴(725psi)；检测：UV 200-400nm，多达4个UV信号的组合和整个UV范围的扫描，ELSD；柱尺寸：在仪器上为4-330g，鲁尔型，750g至3000g，带可选支架。
UV-可见分光光度法
使用Thermo Nanodrop 2000光谱仪和以下质量ε280值((mg/ml)-1cm-1)测定蛋白质浓度；使用153,000M-1cm-1的摩尔ε260值确定寡聚物浓度。
使用Perkin Elmerλ25分光光度计和TNB的文献摩尔ε412值14150M-1cm-1进行Ellman分析。对于SAMSA-荧光素，使用实验确定的摩尔ε495＝58,700M-1cm-1和Rz280:495＝0.428。
SEC
使用Akta纯化器10系统和Biosep SEC-s3000柱通过SEC分析缀合物，用DPBS:IPA(85:15)洗脱。缀合物纯度通过缀合物峰相对于杂质/聚集体形式的积分来确定。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
使用4-12％bis-tris凝胶和MES作为运行缓冲液(200V，约40分钟)，在热变性非还原和还原条件下，通过SDS-PAGE针对蛋白阶梯分析天然蛋白和缀合物。将样品制备成0.5mg/ml，包含LDS样品缓冲液和作为稀释剂的MOPS运行缓冲液。对于还原样品，添加DTT至最终浓度为50mM。样品在90-95℃下热处理2分钟，并向每个孔中添加5μg(10μl)。蛋白阶梯(10μl)未经预处理即被加载。用1×LDS样品缓冲液(10μl)填充空孔。凝胶运行后，用DI水(100ml)伴随振荡(15分钟，200rpm)洗涤三次。通过将凝胶与PAGEBlue蛋白染色剂(30ml)进行摇床孵育(60分钟，200rpm)来进行考马斯染色。除去过量的染色溶液，将凝胶用DI水(100ml)漂洗两次，并用DI水(100ml)脱色(60分钟，200rpm)。使用ImageJ对所得凝胶进行成像和处理(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes ofHealth),贝塞斯达,马里兰州,美国)。
TBEU-PAGE
在热变性非还原和还原条件下，使用15％ TBE-脲凝胶和TBE作为运行缓冲液(180V，约60分钟)，通过TBEU-PAGE针对寡聚物阶梯分析天然蛋白、缀合物和BNA标准品。样品制备至0.5mg/ml，BNA标准品制备至20μg/ml，均包含TBE脲样品缓冲液和作为稀释剂的纯化H2O。样品和标准品在70℃下热处理3分钟，并向每个孔中添加10μl，相当于每个泳道5μg蛋白和缀合物样品以及0.2μg BNA。在TE pH 7.5(2μl)中重构至0.1μg/条带/ml的寡聚物阶梯未经预处理即被加载。凝胶运行后，用新鲜制备的溴化乙锭溶液(1μg/ml)染色，同时振荡(40分钟，200rpm)。所得凝胶通过UV落射照明(254nm)进行可视化，使用ImageJ进行成像和处理(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes ofHealth),贝塞斯达,马里兰州,美国)。
MALDI-TOF-MS
在MALDI质谱仪(Bruker Ultrafex III)上记录MALDI-TOF光谱。通常，使用超级DHB(99％，Fluka)或芥子酸(SA，99％，西格玛-奥尔德里奇公司)作为溶解在乙腈(MADLI-TOF-MS测试，西格玛公司)/0.1％ TFA(7:3v/v)中的基质，通过干滴法将纳摩尔至微摩尔范围内的溶解在MilliQ水中的样品点在靶(MTP 384靶板抛光钢T F，Bruker Daltons公司)上。PepMix(肽校准标准品，Bruker Daltons公司)或ProteMass(蛋白质校准标准品，西格玛-奥尔德里奇公司)用作校准标准品。
三官能接头-(L-腙-SO1861)-(L-BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成(图35)
三官能接头(TFL)具有IUPAC名称：5,8,11,18,21,24,27-七氧杂-2,14,30-三氮杂三十烷酸,14-[16-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-13,16-二氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十六碳-1-基]-33-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-15，31-二氧代-,(1R，4E)-4-环辛烯-1-基酯。三官能接头具有以下式(XXI)：
Figure BDA0004177963000001761
中间体1：
SO1861-L-腙-叠氮化物(分子3)
向SO1861(60mg，0.032mmol，分子1)和1-叠氮基-3，6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰肼(39.3mg，0.129mmol，分子2)中加入甲醇(特干，1.00mL)和TFA(9.86μl，0.129mmol)，并且将反应混合物振荡1分钟，并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC。1将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(58.4mg，84％)。基于LC-MS的纯度为99％。
LRMS(m/z)：2150[M-H]1-
LC-MS r.t.(min)：1.103B
中间体2：
三官能接头-(L-腙-SO1861)-(TCO)-(马来酰亚胺)(分子5)
将TFL-(DBCO)-(TCO)-(马来酰亚胺)(15mg，12.5μmol，分子4)在DMF(2.0mL)中的溶液添加到SO1861-L-腙-叠氮化物(26.8mg，12.5μmol，分子3)。将反应混合物振荡30分钟，并在室温下静置。30分钟后，将反应混合物进行制备型MP-LC。1C将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(31.4mg，75％)。基于LC-MS的纯度为96％。
MS(m/z)：3354[M-H]1-
中间体3：
三价GalNAc-硫代乙酸酯(分子8)
将三价GalNAc-胺甲酸盐(18.7mg，11.0μmol，分子6)和4-硝基苯基3-(乙酰基硫代)丙酸酯(5.90mg，21.9μmol，分子7)溶解于NMM(2.41μL，21.9μmol)在DMF(0.50mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于在水中的0.1％甲酸和在乙腈中的0.1％甲酸(9:1，v/v，1mL)的混合物中。使所得溶液直接经受制备型MP-LC。将对应于产物的2B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(13.0mg，66％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z)：1749[M-43]1-，1792[M-H]1
LC-MS r.t.(min)：1.241B
中间体4：
三官能接头-(L-SO1861)-(TCO)-(三价GalNAc)(分子9)
将三价GalNAc-硫代乙酸酯(13.0mg，7.25μmol，分子8)溶解于甲醇(0.50mL)中。接下来，添加1M的氢氧化钠溶液(7.98μL，7.98μmol)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。30分钟后，将反应混合物添加到新制备的TFL-(DBCO)-(TCO)-(马来酰亚胺)(20.6mg，6.13μmol，分子5)在20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，2.00mL)中的溶液中。
将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的2A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(3.83mg，21％)。基于LC-MS的纯度为89％。
MS(m/z)：5106[M+H]+
中间体5：
甲基四嗪-L-ApoB BNA寡聚物(分子12)
向ApoB#02BNA寡聚物二硫化物(3.3mg，0.686μmol，分子10)中添加具有2.5mMTCEP(1.00mL，2.5μmol)的20mM碳酸氢铵的溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，通过使用分子量截止值为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000×g持续30min，2×0.50mL)。接下来，将残余物溶液用具有2.5mM TCEP(0.50mL)的20mM碳酸氢铵的溶液洗涤两次，每次都在上述相同条件下过滤。如接下来的，将残余物溶液用20mM碳酸氢铵(1.50mL)稀释，并将所得混合物直接添加到(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(1.36mg，1.73μmol，分子11)在乙腈(0.5mL)中的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，将反应混合物冷冻并冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的粗标题产物。向粗产物中添加20mM碳酸氢铵的溶液(1.50mL)，并将所得悬浮液经0.45μm注射器过滤器过滤。将滤液冻干过夜以得到呈粉红色蓬松固体的标题产物(3.4mg，89％)。基于LC-MS的纯度为90％。
MS(m/z)：5579[M+Na]+
三官能接头-(L-腙-SO1861)-(L-BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(分子13)
将TFL-(L-腙-SO1861)-(TCO)-(三价GalNAc)(16.1mg，3.15μmol，分子9)和甲基四嗪-BNA寡聚物(10.2mg，1.83μmol，分子12)溶解在20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，将反应混合物冷冻并冻干过夜。将粗产物溶解于20mM碳酸氢铵(1mL)中，并使所得溶液直接经受制备型LC-MS。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(27.2mg，81％)。基于LC-MS的纯度为91％。
MS(m/z)：10660[M+H]+
使用与合成三官能接头-(L-腙-SO1861)-(L-BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(分子13)类似的方法；可以合成一种缀合物用于对照测试目的(分子13a)，其中ApoB BNA被替换为具有加扰ApoB核酸序列的BNA(分子12a)。
三官能接头-(树状突(L-腙-SO1861)4)-(L-BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成(图36)
中间体6：
SO1861-EMCH(分子15)
向SO1861(121mg，0.065mmol，分子1)和EMCH.TFA(110mg，0.325mmol，分子14)中添加甲醇(特干的，3.00mL)和TFA(0.020mL，0.260mmol)。在室温下搅拌反应混合物。1.5小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC。1将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(120mg，90％)。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z)：2069[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：1.084
中间体7：
树状突(-L-SO1861)4-胺(分子17)
将N,N′-((9S,19S)-14-(6-氨基己酰基)-1-巯基-9-(3-巯基丙酰胺基)-3,10,18-三氧代-4,11,14,17-四氮杂二十三烷-19,23-二基)双(3-巯基丙酰胺)甲酸酯(2.73mg，3.13μmol，分子16)溶解于20mM NH4HCO3与0.5mM TCEP/乙腈(3:1，v/v，3.00mL)的混合物中。接下来，添加SO1861-EMCH(29.2mg，0.014mmol，分子15)并且将反应混合物在室温下搅拌。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的3B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(12.3mg，43％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z)：1517[M-6]6-，1821[M-5]5-，2276[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：4.395A
中间体8
树状突(-L-SO1861)4-叠氮化物(分子19)
将树状突(SO1861)4-胺(6.81mg，0.748μmol，分子17)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(2.90mg，7.48μmol，分子18)溶解在DMF(1.00mL)中。接下来，添加DIPEA(1.302μL，7.48μmol)，将混合物振荡1分钟，并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS。3C将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(5.86mg，84％)。基于LC-MS的纯度为90％。
LRMS(m/z)：2344[M-4]4-
LC-MS r.t.(min)：4.785B
中间体9：
三官能接头(DBCO)-(TCO)-(三价GalNAc)(分子20)
将三价GalNAc-硫代乙酸酯(13.0mg，7.25μmol，分子8)溶解于甲醇(0.50mL)中。接下来，添加1M的氢氧化钠溶液(7.98μL，7.98μmol)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。30分钟后，将反应混合物添加到新制备的三官能接头(7.39mg，6.13μmol，分子4)在20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，2.00mL)中的溶液中。将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的2A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(3.83mg，21％)。基于LC-MS的纯度为89％。
LRMS(m/z)：2409[M-546]1-，2955[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.661B
中间体10：
三官能接头(DBCO)-(L-ApoB BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(分子21)
向甲基四嗪-L-ApoB BNA寡聚物(5.82mg，0.684μmol，分子12)和TFL-(DBCO)-(TCO)-(三价GalNAc)(2.03mg，0.687μmol，分子20)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(3.73mg，64％)。LC-MS显示具有正确m/z值的多个宽峰。
MS(m/z)：8511[M+H]+
三官能接头(树状突(-L-腙-SO1861)4)-(L-ApoB BNA寡聚物)-(三价GalNAc合成)(分子22)
向TFL-(DBCO)-(L-ApoB BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(1.16mg，0.137μmol；分子21)和树状突(-L-SO1861)4-叠氮化物(1.39mg，0.142μmol；分子19)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，0.5mL)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(1.36mg，54％)。基于LC-MS的纯度为92％(非常宽的峰)。
MS(m/z)：18336[M+H]+
使用与合成三官能接头(树状突(-L-腙-SO1861)4)-(L-ApoB BNA寡聚物)-(三价GalNAc合成)(分子22)类似的方法；可以合成一种缀合物用于对照测试目的(分子22a)，其中ApoB BNA被替换为具有加扰ApoB核酸序列的BNA(分子12a)。
三官能接头-(树状突(L-腙-SO1861)8)-(BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成(图37)
中间体11：
树状突(-L-SO1861)8-胺(分子24)
将(2S)-N-[(1S)-1-{[2-(6-氨基-N-{2-[(2S)-2,6-双[(2S)-2,6-双(3-硫烷基丙酰胺基)己酰胺基]己酰胺基]乙基}己酰胺基)乙基]氨基甲酰基}-5-[(2S)-2,6-双(3-硫烷基丙酰胺基)己酰胺基]戊基]-2,6-双(3-硫烷基丙酰胺基)己酰胺甲酸酯(0.52mg，0.299μmol，分子23)和SO1861-EMCH(29.2mg，0.014mmol，分子15)溶解在20mM NH4HCO3和0.5mMTCEP/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的混合物中并且将所得混合物振荡1min并在室温下静置。30分钟后，添加TCEP(0.30mg，1.05μmol)并将反应混合物振荡1分钟。接下来使混合物直接经受制备型LC-MS。将对应于产物的3B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(2.17mg，40％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z)：2282[M-8]8-，2607[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：4.415A
中间体12：
树状突(-L-SO1861)8-叠氮化物(分子25)
将树状突(-L-SO1861)8-胺(19.6mg，1.08μmol，分子24)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(4.17mg，10.8μmol，分子18)溶解在DMF(1.50mL)中。接下来，添加DIPEA(1.87μL，10.8μmol)，并将混合物振荡1min并在室温下静置过夜。使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(11.7mg，59％)。基于LC-MS的纯度为92％(非常宽的峰)。
LRMS(m/z)：2316[M-8]8-，2647[M-7]7-
LC-MS r.t.(min)：4.291A
三官能接头(树状突(-L-腙-SO1861)8)-(L-ApoB BNA寡聚物)-(三价GalNAc合成)(分子26)
向TFL-(DBCO)-(L-ApoB BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(1.16mg，0.137μmol；分子21)和树状突(-L-SO1861)8-叠氮化物(2.72mg，0.142μmol；分子25)中添加20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，0.5mL)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的4B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(1.6mg，42％)。基于LC-MS的纯度为93％(非常宽的峰)。
MS(m/z)：27655[M+H]+
使用与合成三官能接头(树状突(-L-腙-SO1861)8)-(L-ApoB BNA寡聚物)-(三价GalNAc合成)(分子26)类似的方法；可以合成一种缀合物用于对照测试目的(分子26a)，其中ApoB BNA被替换为具有加扰ApoB核酸序列的BNA(分子12a)。
三官能接头-(L-缩氨基脲-SO1861)-(BNA寡聚物)-(三价-GalNAc合成)(图38)
中间体13：
SO1861-L-缩氨基脲-叠氮化物(分子28)
向SO1861(60mg，0.032mmol，分子1)和4-(6-叠氮基己酰基)哌嗪-1-碳酰肼(36.5mg，0.129mmol，分子27)中加入甲醇(特干，1.00mL)和TFA(9.86μl，0.129mmol)，并且将反应混合物振荡1分钟，并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC。1将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(30mg，44％)。基于LC-MS的纯度为99％。
MS(m/z)：2126[M-1]1-
中间体14：
三官能接头-(L-缩氨基脲-SO1861)-(TCO)-(马来酰亚胺)(分子29)
将TFL-(DBCO)-(TCO)-(马来酰亚胺)(15mg，12.5μmol，分子4)在DMF(2.0mL)中的溶液添加到SO1861-L-叠氮化物(26.6mg，12.5μmol，分子28)。将反应混合物振荡30分钟，并在室温下静置。30分钟后，将反应混合物进行制备型MP-LC。1C将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(27.5mg，66％)。基于LC-MS的纯度为96％。
MS(m/z)：3331[M-1]1-
中间体15：
三官能接头-(L-缩氨基脲-SO1861)-(TCO)-(三价GalNAc)(分子30)
将三价GalNAc-硫代乙酸酯(13.0mg，7.25μmol，分子8)溶解于甲醇(0.50mL)中。接下来，添加1M的氢氧化钠溶液(7.98μL，7.98μmol)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。30分钟后，将反应混合物添加到新制备的TFL-(L-缩氨基脲-SO1861)-(TCO)-(马来酰亚胺)(20.4mg，6.13μmol，分子29)在20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，2.00mL)中的溶液中。
将所得混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的2A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(16.7mg，54％)。基于LC-MS的纯度为94％。
MS(m/z)：5081[M-1]1-
三官能接头-(L-缩氨基脲-SO1861)-(L-BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(分子31)
将TFL-(L-缩氨基脲-SO1861)-(TCO)-(三价GalNAc)(16mg，3.15μmol，分子30)和甲基四嗪-BNA寡聚物(10.2mg，1.83μmol，分子12)溶解在20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，将反应混合物冷冻并冻干过夜。将粗产物溶解于20mM碳酸氢铵(1mL)中，并使所得溶液直接经受制备型LC-MS。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(11.3mg，59％)。基于LC-MS的纯度为92％。
MS(m/z)：10638[M+H]+
使用与合成三官能接头-(L-缩氨基脲-SO1861)-(L-BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(分子31)类似的方法；可以合成一种缀合物用于对照测试目的(分子31a)，其中ApoB BNA被替换为具有加扰ApoB核酸序列的BNA(分子12a)
三官能接头-树状突(L-缩氨基脲-SO1861)4-(L-BNA寡聚物)-(三价-GalNAc)合成(图39)
中间体16：
苄基4-(2-(叔丁氧基羰基)肼-1-羰基)哌嗪-1-甲酸酯(分子33)
在0℃下向光气在甲苯中的搅拌溶液(20％，w/w，15.8mL，30.0mmol)中缓慢(10分钟)添加1-Cbz-哌嗪(1.93mL，10.0mmol，分子1)在二氯甲烷(25mL)和DIPEA(3.83mL，22.0mmol)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌。30分钟后，将反应混合物真空蒸发并与二氯甲烷(2×50mL)共蒸发。接下来，将残余物溶解于二氯甲烷(100mL)中并将所得溶液在0℃下搅拌。添加Boc肼(2.33mL，15.0mmol)在二氯甲烷(20mL)和DiPEA(3.83mL，22.0mL)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，并且将所得溶液用0.5N硫酸氢钾溶液(2×100mL)和盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中蒸发。将残余物通过快速色谱纯化(首先通过乙酸乙酯-庚烷梯度，5:95(v/v)上升至100％乙酸乙酯，然后用10％甲醇的DCM溶液(v/v)冲洗)得到呈白色固体的标题化合物(2.42g，64％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z)：279/323/401[M-99/M-55/M+23]1+
LC-MS r.t.(min)：1.271
中间体17：
叔丁基2-(哌嗪-1-羰基)肼-1-甲酸酯(分子34)
向苄基4-(2-(叔丁氧基羰基)肼-1-羰基)哌嗪-1-甲酸酯(2.42g，6.39mmol，分子33)中添加甲醇(50mL)。加热混合物以获得澄清溶液。接下来，添加钯(10％炭钯，50％用水润湿，1.50g)并通过使用气球在氢气氛下搅拌所得混合物。1小时后，将反应混合物经硅藻土过滤，将滤液真空蒸发得到呈白色固体的标题产物(1.56g，定量)。
LRMS(m/z)：189/245[M-55/M+1]1+
中间体18：
叔丁基2-(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-羰基)肼-1-甲酸酯(分子36)
将6-马来酰亚胺己酸(810mg，3.84mmol，分子35)、叔丁基2-(哌嗪-1-羰基)肼-1-甲酸酯(781mg，3.20mmol，分子34)，EDCI.HCl(735mg，3.84mmol)和Oxyma Pure(591mg，4.16mmol)溶解在二氯甲烷(25mL)和DIPEA(835μL，4.80mmol)的混合物中，并将反应混合物在室温下搅拌。2小时后，将反应混合物在真空中蒸发并且将残余物溶解于乙酸乙酯(50mL)中。将所得溶液用0.5N硫酸氢钾溶液(50mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2×50mL)和盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中蒸发。将残余物通过快速色谱法(DCM-在DCM中的10％甲醇(v/v)梯度100:0升至40:60)纯化以得到呈白色固体的标题化合物(634mg，45％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z)：338/382/460[M-99/M-55/M+23]1+
LC-MS r.t.(min)：1.021
中间体19：
S01861-SC-Mal(分子37)
将叔丁基2-(4-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)哌嗪-1-羰基)肼-1-甲酸酯(25.0mg，57.1μmol，分子36)溶解在二氯甲烷(500μL)和TFA(500μL)的混合物中，并在室温下搅拌反应混合物。30分钟后，将反应混合物真空蒸发并与二氯甲烷(3×5mL)和甲醇(5mL)共蒸发。将残余物和SO1861(21.3mg，11.4μmol，分子1)溶解在甲醇(超干燥，1.00mL)中，将所得混合物振荡1分钟并在室温下静置。4小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC。2将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(13.7mg，55％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z)：2181[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.133
中间体20：
树状突(L-缩氨基脲-SO1861)4-胺(分子39)
将N，N'-((9S，19S)-14-(6-氨基己酰基)-1-巯基-9-(3-巯基丙酰胺基)-3，10,18-三氧代-4,11,14,17-四氮杂二十三烷-19,23-二基)双(3-巯基丙酰胺)甲酸酯(2.73mg，3.13μmol，分子38)溶解于1M NaOH和MeOH(1:1，v/v，3.00mL)的混合物中并且搅拌30分钟。接下来，添加溶解在THF中的5mL三甲基膦(9.5mg，125μmol)，并将混合物搅拌30分钟。接下来，添加溶解在20mM NH4HCO3和乙腈(3:1，v/v，3.00mL)中的SO1861-SC-Mal(30.54mg，0.014mmol，分子37)，并将反应混合物在室温下搅拌。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的3B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(19mg，64％)。基于LC-MS的纯度为95％。
MS(m/z)：9553[M+H]+
中间体21：
树状突(-L-SO1861)4-叠氮化物(分子40)
将树状突(L-缩氨基脲-SO1861)4-胺(7.1mg，0.748μmol，分子39)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(2.90mg，7.48μmol，分子18)溶解在DMF(1.00mL)中。接下来，添加DIPEA(1.302μL，7.48μmol)，将混合物振荡1分钟，并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS。3C将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(6.4mg，87％)。基于LC-MS的纯度为93％。
MS(m/z)：9826[M+H]+
中间体22
三价GalNAc-硫醇(分子41)
将三价GalNAc-硫代乙酸酯(16.2mg，9.02μmol，分子8)溶解于甲醇(500μL)中。接下来，添加1.00M的氢氧化钠(11.0μL，11.0μmol)溶液。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1A级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(13.1mg，83％)。基于LC-MS的纯度为98％。
LRMS(m/z)：1748[M-H]1-
LC-MS r.t.(min)：1.781A
中间体23：
TFL-(DBCO)-(TCO)-(三价GalNAc)(分子20)
将TFL-(DBCO)-(TCO)-(Mal)(15.0mg，12.4μmol，分子4)溶解在乙腈(0.50mL)中。接下来，添加20mM碳酸氢铵的溶液(1.50mL)并将所得溶液直接转移到三价GalNAc-硫醇(22.7mg，13.0μmol，分子41)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，将反应混合物冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的粗标题产物。基于LC-MS的纯度为84％。
LRMS(m/z)：2409[M-546]1-，2955[M-1]1-
LC-MS r.t.(min)：2.631B
中间体24
TFL-(树状突(L-缩氨基脲-SO1861)4)-(TCO)-(三价GalNAc)(分子41)
将树状突(L-缩氨基脲-SO1861)4-叠氮化物(5.2mg，0.529μmol，分子40)和TFL-(DBCO)-(TCO)-(三价GalNAc)(1.5mg，0.5μmol，分子20)溶于DMF(2.00mL)中。将混合物振荡10min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS。3C将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(6.1mg，90％)。基于LC-MS的纯度为93％。
MS(m/z)：12781[M+H]+
TFL-(-树状突(L-缩氨基脲-SO1861)4)-(L-BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(分子42)
将TFL-(树状突(L-缩氨基脲-SO1861)4)-(TCO)-(三价GalNAc)(5.2mg，0.41μmol，分子41)和甲基四嗪-BNA寡聚物(2.7mg，0.5μmol，分子12)溶解在20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，将反应混合物冷冻并冻干过夜。将粗产物溶解于20mM碳酸氢铵(1mL)中，并使所得溶液直接经受制备型LC-MS。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(1.8mg，24％)。基于LC-MS的纯度为96％(区域异构体引起的多个(宽)峰)。
MS(m/z)：18336[M+H]+
使用与合成三官能接头(树状突(-L-缩氨基脲-SO1861)4)-(L-ApoB BNA寡聚物)-(三价GalNAc合成)(分子42)类似的方法；可以合成一种缀合物用于对照测试目的(分子42a)，其中ApoB BNA被替换为具有加扰ApoB核酸序列的BNA(分子12a)。
三官能接头-(树状突(-L-缩氨基脲-SO1861)8)-BNA寡聚物-三价-GalNAc合成(图40)
中间体25：
树状突(L-缩氨基脲-SO1861)8-胺(分子44)
将(2S)-N-[(1S)-1-{[2-(6-氨基-N-{2-[(2S)-2,6-双[(2S)-2,6-双(3-硫烷基丙酰胺基)己酰胺基]己酰胺基]乙基}己酰胺基)乙基]氨基甲酰基}-5-[(2S)-2,6-双(3-硫烷基丙酰胺基)己酰胺基]戊基]-2,6-双(3-硫烷基丙酰胺基)己酰胺甲酸酯(0.61mg，0.299μmol，分子43)溶解在1M NaOH和MeOH(1:1，v/v，3.00mL)的混合物中并且搅拌30min。接下来，添加溶解在THF中的5mL三甲基膦(2mg，24μmol)，并将混合物搅拌30分钟。接下来，添加溶解在20mM NH4HCO3和乙腈(3:1，v/v，3.00mL)中的SO1861-SC-Mal(30.54mg，0.014mmol，分子37)，并将反应混合物在室温下搅拌。在1.5小时后，使反应混合物经受制备型LC-MS。将对应于产物的3B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(4.6mg，81％)。基于LC-MS的纯度为95％。
MS(m/z)：19146[M+H]+
中间体26：
树状突(-L-SO1861)8-叠氮化物(分子45)
将树状突(L-缩氨基脲-SO1861)8-胺(5.4mg，0.28μmol，分子44)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(1.1mg，2.8μmol，分子18)溶解在DMF(1.00mL)中。接下来，添加DIPEA(1.302μL)，将混合物振荡1分钟，并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS。3C将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(4.35mg，80％)。基于LC-MS的纯度为93％。
MS(m/z)：19420[M+H]+
中间体27：
TFL-(树状突(L-缩氨基脲-SO1861)8)-(TCO)-(三价GalNAc)(分子46)
将树状突(L-缩氨基脲-SO1861)8-叠氮化物(10.3mg，0.529μmol，分子45)和TFL-(DBCO)-(TCO)-(三价GalNAc)(1.5mg，0.5μmol，分子20)溶于DMF(2.00mL)中。将混合物振荡10min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS。3C将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(8.75mg，74％)。基于LC-MS的纯度为91％。
MS(m/z)：22373[M+H]+
TFL-(树状突(L-缩氨基脲-SO1861)8)-(L-BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(分子47)
将TFL-(树状突(L-缩氨基脲-SO1861)8)-(TCO)-(三价GalNAc)(9.2mg，0.41μmol，分子46)和甲基四嗪-BNA寡聚物(2.8mg，0.5μmol，分子12)溶解在20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，将反应混合物冷冻并冻干过夜。将粗产物溶解于20mM碳酸氢铵(1mL)中，并使所得溶液直接经受制备型LC-MS。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(1.26mg，11％)。基于LC-MS的纯度为97％。
MS(m/z)：27928[M+H]+
使用与合成三官能接头(树状突(-L-缩氨基脲-SO1861)8)-(L-ApoB BNA寡聚物)-(三价GalNAc合成)(分子47)类似的方法；可以合成一种缀合物用于对照测试目的(分子47a)，其中ApoB BNA被替换为具有加扰ApoB核酸序列的BNA(分子12a)。
三价接头-(L-SPT001)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)合成(图41)
中间体28：
N-(2-羟基乙基)-2-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)乙酰胺(分子50)
向甲基四嗪-NHS酯(30.0mg，91.7μmol，分子48)在DMF(1.00mL)中的溶液中添加乙醇胺(11.1μL，0.184mmol，分子49)和三乙胺(25.5μL，0.183mmol)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在1小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈紫色固体的标题化合物(19.2mg，77％)。基于LC-MS的纯度为89％。
LRMS(m/z)：274[M+1]1+
LC-MS r.t.(min)：0.852
已在以下结合物上进行对TFL上的TCO封闭：
TFL-(L-腙-SPT001)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)(分子51)
TFL-(树状突(L-腙-SPT001)4)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)(分子52)
TFL-(树状突-(L-腙-SPT001)8)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)(分子53)
TFL-(L-缩氨基脲-SPT001)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)(分子54)
TFL-(树状突((L-缩氨基脲-SPT001)4)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)(分子55)
TFL-(树状突(L-缩氨基脲-SPT001)8)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)(分子56)
TFL-(L-腙-SPT001)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)(分子51)示例性地描述了该程序：
TFL-(L-腙-SPT001)-(封闭的TCO)-(三价GalNAc)(分子51)
将TLF-(DBCO)-(TCO)-(三价GalNAc)(36.8mg，12.5μmol，分子20)在DMF(2.0mL)中的溶液添加到SO1861-L-腙-叠氮化物(26.8mg，12.5μmol，分子3)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，添加N-(2-羟基乙基)-2-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)乙酰胺(4.08mg，14.9μmol，分子50)。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在30min后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(37.3mg，56％)。基于LC-MS的纯度为96％(区域异构体引起的双峰)。
LRMS(m/z)：2676[M-2]2-
LC-MS r.t.(min)：2.231B
三价接头-(封闭的DBCO)-(L-BNA寡聚物)-(三价GalNAc)合成(图42)
中间体29：
TFL-(封闭的DBCO)-(TCO)-(三价GalNAc)(分子58)
将1-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-11-醇(2.17mg，9.88μmol，分子57)在DMF(0.50mL)中的溶液添加到TFL-(DBCO)-(TCO)-(三价GalNAc)(14.6mg，4.94μmol，分子20)中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在2小时后，使反应混合物经受制备型MP-LC。将对应于产物的1C级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色固体的标题化合物(10.00mg，64％)。基于LC-MS的纯度为98％。
MS(m/z)：3175[M+H]+
LC-MS r.t.(min)：2.331B
三价接头-(封闭的DBCO)-(BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(分子59)
将TFL-(封闭的DBCO)-(TCO)-(三价GalNAc)(10.0mg，3.15μmol，分子58)和甲基四嗪-BNA寡聚物(10.0mg，1.83μmol，分子12)溶解在20mM碳酸氢铵/乙腈(3:1，v/v，1.00mL)的溶液中。将反应混合物振荡1min并在室温下静置。在3小时后，将反应混合物冷冻并冻干过夜。将粗产物溶解于20mM碳酸氢铵(1mL)中，并使所得溶液直接经受制备型LC-MS。将对应于产物的1B级分立即合并在一起、冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体的标题化合物(11.3mg，72％)。基于LC-MS的纯度为95％。
LRMS(m/z)：2149[M-4]4-，2866[M-3]3-
LC-MS r.t.(min)：2.921A
使用与合成三价接头-(封闭的DBCO)-(BNA寡聚物)-(三价GalNAc)(分子59)类似的方法；可以合成一种缀合物用于对照测试目的(分子59a)，其中ApoB BNA被替换为具有加扰ApoB核酸序列的BNA(分子12a)。
图43A和B显示了通过应用三官能接头(TFL)方法产生的所有缀合物‘缀合物C1’的概览。此外，已经合成并测试了根据本发明的包含单个GalNAc部分的缀合物。
细胞活力测定(CTG)
在处理后，将细胞在37℃下孵育72小时，然后根据制造商的说明(
Figure BDA0004177963000001911
2.0细胞活力测定，普洛麦格公司)通过CTG测定确定细胞活力。简言之，首先将细胞板平衡至室温持续30分钟。接下来，向含有120μL处理培养基的每个孔中添加120μL CTG溶液。将板短暂混合(10秒，600rpm)并在室温下避光孵育大约10分钟。随后，在Spectramax ID5板读取器(分子仪器公司(Molecular Devices))上测量发光信号。为了定量，将“仅培养基”孔的背景信号从所有其他孔中减去，然后通过将经处理的孔的背景校正信号除以未处理的孔的背景校正信号(x 100)计算经处理/未处理细胞的细胞活力百分比。
人原代肝细胞处理
将冷冻保存的原代人肝细胞(细胞生物技术有限公司(Cytes BiotechnologiesS.L.)，西班牙)在肝细胞解冻培养基(细胞生物技术有限公司，西班牙)中解冻。将细胞重悬于肝细胞铺板培养基(细胞生物技术有限公司，西班牙)中。将细胞接种到胶原I包被的板上，对于48或96孔板(Greiner BioOne公司)，密度为215.600个细胞/孔或66.600个细胞/孔。在开始处理前将细胞在37℃下预培养4-6小时，以允许细胞附接至细胞培养板。用315μl或108μl维持培养基(细胞生物技术有限公司，西班牙)替代铺板培养基，之后添加来自在PBS中的10倍浓缩储备溶液的缀合物。将板在37℃下孵育72小时，将其收获用于基因表达和细胞活力分析。
ApoB#02寡聚物序列
鼠和人序列兼容的ApoB#02(5’-GCattggtatTCA-3′)[SEQ ID NO:12]是BNANC寡核苷酸，并且由生物合成公司用5’-硫醇C6接头(其中BNANC碱基大写)和完全硫代磷酸化的主链合成(刘易斯维尔市(Lewisville)，德克萨斯州(Texas))。
从原代小鼠和人肝细胞进行RNA分离及基因表达分析
根据制造商的说明，使用TRI
Figure BDA0004177963000001921
溶液(赛默科技公司)从细胞分离RNA。使用标准方案使用iScriptTMcDNA合成试剂盒(伯乐公司)转化成cDNA。使用定量实时PCR测定(qRT-PCR)，使用iTaqTM通用/>
Figure BDA0004177963000001922
Green超混合物(伯乐公司)和Light Cycler 480(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，罗特克莱兹市(Rotkreuz)，瑞士)，用分别列于表A4(研究A)和表A7(研究B)中列出的特定DNA引物确定ApoB表达水平和特定肝细胞管家基因的水平。通过ΔCt方法进行分析以确定相对于2种肝细胞特异性管家对照mRNA的apoB表达。每个分析反应以一式三份进行。
表A4.用于小鼠原代肝细胞/肝组织分析的qPCR分析中的引物(研究A)
ApoB#02 正向 GCTAACACTAAGAACCAGAAGATC[SEQ ID NO:13]
反向 TGTCCGTCTAAGGATCCTGC[SEQ ID NO:14]
Mm PPIA 正向 GCGGCAGGTCCATCTACG[SEQ ID NO:15]
反向 GCCATCCAGCCATTCAGTC[SEQ ID NO:16]
Mm SDHA 正向 GAGGAAGCACACCCTCTCAT[SEQ ID NO:17]
反向 GGAGCGGATAGCAGGAGGTA[SEQ ID NO:18]
FACS分析
对于每种细胞系，将细胞以适当的密度接种在T75烧瓶中的补充有10％胎牛血清(PAN-Biotech GmbH公司)和1％青霉素/链霉素(PAN-Biotech GmbH公司)的DMEM(PAN-Biotech GmbH公司)中并孵育72-96小时(5％ CO2，37℃)，直到达到90％的汇合。接下来，将细胞胰蛋白酶化(TryplE Express，吉布科赛默科技公司(Gibco Thermo Scientific))成单个细胞、转移至15mL falcon管并离心(1,400rpm，3min)。弃去上清液，同时将细胞沉淀浸没。将500.000个细胞转移至圆底FACS管并用3mL冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)洗涤。将细胞以1800rpm、4℃离心3min并重悬于200μL冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)或200μL抗体溶液(含有在195μL冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)中的5μL抗体)中。将转铁蛋白受体使用PE抗人CD71(编号334106，生物传奇公司(Biolegend))染色，使用PE小鼠IgG2a、κ同种型对照FC(编号400212，生物传奇公司)作为其匹配的同种型对照。将ASGPR1受体使用PE抗人ASGPR1(编号130-122-963，美天旎公司(Miltenyi))染色并使用PE小鼠IgG1、同种型对照(编号130-113-762，美天旎公司)作为其匹配的同种型对照。将样品在4℃下孵育30min。之后用冷DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)将细胞洗涤2次，并在室温下使用在DPBS(无Mg2+和Ca2+，2％ FBS)中的2％ PFA溶液固定20min。用冷DPBS洗涤细胞1次并重悬于1000μL冷DPBS中用于FACS分析。使用希森美康公司(Sysmex)的Cube 8流式细胞仪系统(希森美康公司)和FCSExpress 7研究版软件分析样品。FACS分析的结果总结在表A3中。
C57BL/6J模型中三价GalNAc-缀合物的体内耐受性和功效
i.剂量施用和生命期。对治疗组每组8只C57BL/6J雄性小鼠(在研究A中，媒剂对照组中有14只小鼠)(在到达时的大约6-7周和给药时的大约8-9周)进行给药。将根据表A5和表A6在PBS中配制的化合物或单独的PBS(媒剂)以5ml/kg在尾静脉中(静脉内，iv)给药，剂量体积与个体体重对应。在适用的情况下，在三价GalNAc-ApoB缀合物之后立即将三价(GalNAc)3-SO1861(EMCH)以5ml/kg在尾静脉(iv)中共同施用。每周对动物进行称重，并在前48小时内每天进行2-3次临床观察，并在此后每天至少进行一次，直到研究结束。
ii.血清、肝和肾组织的采样。在给药之前(给药前)和指定的给药后时间点(例如给药后24小时、72小时、196小时、336小时、672小时)对血液采样，并使用标准程序从采集的血液中产生血清用于生物标志物分析。在相关的研究间给药后时间点，每个治疗组每个时间点处死3只动物(研究A中媒剂对照组中的6只动物)以收集末期出血并收集相关器官，例如肝和肾组织，用于进一步分析。在研究结束时，每组处死剩余的2只动物(研究A中对照组中的4只)。将一半的肝和一个肾脏冷冻并用于组织RNA分析。
表A5.三价GalNAc-缀合物的体内耐受性和功效的实验设计，研究A
Figure BDA0004177963000001941
表A6.三价GalNAc-缀合物的体内耐受性和功效的实验设计，研究B
Figure BDA0004177963000001942
Figure BDA0004177963000001951
肝组织中的生物标志物RNA分析
根据制造商的说明，使用
Figure BDA0004177963000001952
试剂(赛默科技公司)从冷冻的肝组织中分离mRNA。使用iScriptTMcDNA合成试剂盒(伯乐公司)转化成cDNA。使用定量实时PCR测定(qRT-PCR)，使用iTaqTM通用/>
Figure BDA0004177963000001953
Green超混合物(伯乐公司)和Light Cycler 480(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，罗特克莱兹市(Rotkreuz)，瑞士)，用分别列于表A4(研究A)和表A7(研究B)中列出的特定DNA引物确定ApoB表达水平和特定肝脏管家基因的水平。通过ΔCt方法进行分析以确定相对于2种肝特异性管家对照mRNA的apoB表达。每个分析反应以一式三份进行。
表A7.肝组织的qPCR分析中使用的引物(研究B)
ApoB#02 正向 GCTAACACTAAGAACCAGAAGATC[SEQ ID NO:13]
反向 TGTCCGTCTAAGGATCCTGC[SEQ ID NO:14]
Mm RPS17 正向 GTGCGAGGAGATCGCCATTA[SEQ ID NO:19]
反向 ATCCGCTTCATCAGATGCGT[SEQ ID NO:20]
Mm PPIA 正向 GCGGCAGGTCCATCTACG[SEQ ID NO：15]
反向 GCCATCCAGCCATTCAGTC[SEQ ID NO：16]
生物标志物分析apoB蛋白
根据制造商的说明，使用ApoB ELISA(ab230932，艾博抗公司(Abcam)，剑桥市(Cambridge)，英国)确定小鼠血清中的ApoB蛋白水平。
生物标志物分析胆固醇
分别使用来自贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)的LDL-胆固醇特异性两步AU480测定试剂盒，根据制造商的说明用光度测量来测量小鼠血清中的LDL-胆固醇。
生物标志物分析胆固醇
使用来自贝克曼库尔特公司的AU480测定试剂盒(光度测量)，根据制造商的说明测量血清丙氨酸转氨酶(ALT)的水平。
结果
(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02在C57BL/6J小鼠中的体内功效(研究A)
在研究A中，将C57BL/6J小鼠如所描述的治疗并根据表A5给药。如图35和图38、图41和图42中所述产生本研究中使用的缀合物，(GalNAc)3-ApoB#02、(GalNAc)3-SO1861、(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)。记录临床观察并分析功效和耐受性的不同生物标志物。
如图25所示，在24小时后，与媒剂给药组(n＝5只动物)相比，用0.1mg/kg ApoB#02BNA(ApoB#02)治疗的动物中的apoB RNA水平(即基因表达)没有显著降低，并且用1mg/kg或2mg/kg ApoB#02BNA给药的组中apoB RNA水平分别降低了大约15％和21％(所有n＝3只动物/组)。同样地，在24小时后，与媒剂对照相比，剂量为1mg/kg的(GalNAc)3-ApoB#02(对应于0.54mg/kg ApoB#02BNA)使ApoB表达降低了大约53％(n＝3只动物)，而与媒剂相比，单独的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02没有显示出显著的降低(n＝3)。相反，当0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861共同施用时，24小时后apoB表达已经容易地减少了约69％(n＝2只动物)；而0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02，当与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861共同施用时，与媒剂相比仍然表现出16％的轻微减少(n＝2只动物)。最值得注意的是，与给药后24小时的对照相比，用1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02BNA(对应于0.44mg/kg ApoB#02BNA)处理导致(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02BNA(EMCH)降低约77％和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02BNA(sc)降低90％(两组各n＝3只动物)。
在72小时后，与媒剂(n＝5只动物)相比，施用的最高剂量的ApoB#02BNA(2mg/kg)显示出39％的最大降低(n＝3只动物)，而1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02导致apoB表达降低68％(n＝3只动物)。再次，相比之下，当与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861共同施用时，剂量低10倍的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02导致apoB表达水平甚至降低82％(n＝3只动物)，而单独的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02仅显示出12％的降低(n＝3只动物)。用不同的1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02BNA缀合物处理导致(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02BNA(EMCH)降低约76％和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02BNA(sc)降低96％(两组各n＝3只动物)。效果是持久的，并且在336小时后，对于2mg/kg ApoB#2BNA，apoB表达水平降低30％(n＝2只动物)，并且对于1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02，apoB表达水平降低25％。载荷降低10倍的共同施用组(即0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861)仍然显示降低25％。用不同的1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02BNA缀合物处理导致(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02BNA(EMCH)降低约61％和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02BNA(sc)降低65％(两组各n＝3只动物)。总之，SO1861与载荷的缀合显著提高了效力。
如图26所示，肝中的apoB RNA下调(如图25所示)也转化为血清中的apoB蛋白减少。在24小时后，对于1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02(n＝8只动物，54％)并且同样也对于低10倍的(GalNAc)3-ApoB#02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861(即，0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861)(n＝8只动物，56％)的共同施用组，apoB蛋白水平降低超过50％；最明显的是，与对照(n＝14只动物)相比，对于1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)组(n＝8只动物，降低69％)和1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)组(n＝8只动物，降低83％)，它们降低。72小时后，虽然所有治疗组都显示apoB蛋白减少，但与媒剂对照相比，对于以下观察到最显著效果：1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)组的(n＝5只动物，降低95％)和1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)组(n＝5只动物，降低97％)，或当共同施用0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02和5mg/kg(GalNAc)3-SO1861时，导致apoB降低近90％(n＝5只动物)。在给药后72小时后，当与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861(n＝4只动物)共同施用时，即使0.01mg/kg的(GalNAc)3-ApoB#02也使ApoB蛋白降低大约25％，而单独的剂量高10倍的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02使apoB蛋白降低了35％(n＝5只动物)。对于所分析的所有治疗组，该效果是持久的并且在192和336小时时仍然可以观察到apoB蛋白减少；注意，0.1mg/kg ApoB#02(196小时)、0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861(196小时和336小时)和0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861(196小时)的水平没有报道。在192小时，1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02显示降低47％(n＝2只动物)，但1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)分别显示降低87％和90％(每组n＝2只动物)。在336小时，1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02显示降低28％(n＝2只动物)，但1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)分别仍然显示降低66％和65％(每组n＝2只动物)。
如图27所示，观察到的血清apoB蛋白减少(如图26所示)很好地转化为血清LDL-胆固醇(LDL-C)水平。在24小时后，与媒剂(n＝5只动物)相比，用0.1、1或2mg/kg ApoB#02BNA治疗的动物(n＝3只动物/组)中的LDL-C水平没有显著降低。与媒剂和ApoB#02BNA组相比，剂量为1mg/kg的靶向的(GalNAc)3-ApoB#02已在24小时内将LDL-C降低至平均2.7mg/dl(n＝3只动物)，即降低了53％。已观察到当与5mg/kg(GalNAc)3-SO1861共同施用时，剂量低10倍的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02在24小时内已将LDL-C同样降低至平均2.7mg/dl(n＝3只动物)，即降低了53％，而1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)显示分别降低66％和77％。在72小时后，与媒剂(n＝5只动物)相比，最高剂量的ApoB#02BNA(2mg/kg)显示出LDL-C降低约50％(n＝3只动物)，同时1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02的情况为降低72％(n＝3只动物)，并且剂量低10倍的0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861的情况为甚至降低78％(n＝3只动物)；1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)显示降低72％，而在1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)中，没有测量到高于LOD的LDL-C，即与对照相比apoB蛋白降低100％(所有n＝3只动物)。作用是持久的，并且在336小时后，对于2mg/kg ApoB#02BNA，LDL-C水平仍降低约40％(在所有组的n＝2只动物中)，并且对于1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02和对于0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861的共同施用组，LDL-C水平降低了48％，显示出在后者中基于施用的载荷的10倍改善的LDL-C降低。同样，在1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)组中观察到最显著的降低(降低74％)并且1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)组显示降低57％。
总之，这表明与SO1861组合，ApoB#02的效力显著增加，并有效诱导apoB RNA下调，即，C57BL/6J小鼠肝中的基因沉默，以及所有测量的功效的“下游”血清生物标志物，例如apoB蛋白和LDL-胆固醇。
(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02在C57BL/6J小鼠中的体内耐受性(研究A)
如图35、图38、图41和图42中所述产生本研究中使用的缀合物，(GalNAc)3-ApoB#02、(GalNAc)3-SO1861、(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)。
在研究过程期间，如表A5中所述的所有治疗、剂量和剂量方案都具有良好的耐受性，并且未显示出治疗特定的不良反应发现或任何指示缀合物不耐受的特定临床观察。治疗组小鼠增加的体重与接受媒剂的小鼠相当。确定了血清ALT水平，并且结果在图28中显示。在研究时间段期间，媒剂小鼠的ALT水平的范围为平均47至61U/L/组(对于媒剂，n＝5只动物)。不同剂量组中的ALT水平在不同时间点瞬时增加，有时每只动物变异/组大，没有显示出特定的治疗关系或剂量关系(所有组在24小时和72小时分别为n＝3，除了0.01mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02+5mg/kg(GalNAc)3-SO1861外(其中两个时间点均为n＝2))。值得注意的是，在336小时后，所有给药组的ALT水平都回到基线并与媒剂对照相当(所有组均为n＝2)。
总之，这表明ApoB#02、(GalNAc)3-ApoB#02、(GalNAc)3-SO1861(单独或与(GalNAc)3-ApoB#02组合)和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)在应用的剂量和剂量方案中耐受性良好，特别是施用含有SO1861的缀合物(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)以及(GalNAc)3-SO1861与(GalNAc)3-ApoB#02的共同施用没有直接的耐受性问题，而在C57BL/6J小鼠模型中表现出高效力。
(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02的体外效力
靶向apoB的BNA、ApoB#02(SEQ ID NO:12)和SO1861-EMCH或SO1861-SC-Mal与三价-GalNAc((GalNAc)3)缀合以产生(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)(图35和图38)，(GalNAc)3-SO1861(图41)和(GalNAc)3-ApoB#02BNA(图42)并在原代人肝细胞以及HepG2(ASGPR+)和Huh7(ASGPR+/-)细胞系来评估它们对apoB RNA水平的影响。在原代肝细胞中，该评估显示(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)显示IC50＝1nM(相对ApoB#02BNA浓度)，而不含SO1861的(GalNAc)3-ApoB#02BNA显示IC50＝7nM(相对ApoB#02BNA浓度)，并且ApoB#02BNA转染(用RNAi-MAX)显示IC50＝8nM。单独的ApoB#02(没有任何转染剂)显示IC50＝400nM，而(GalNAc)3-SO1861对apoB RNA水平没有影响(图29A)。所有这些都表明(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02增强了ApoB#02BNA在人原代肝细胞中的细胞质递送，导致在低nM水平的ApoB#02BNA寡聚物时效力改善约10倍。
对于HepG2细胞(ASGPR1+)，仅(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)和(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)显示在测量浓度下的活性(分别为IC50＝40nM和IC50＝20nM)(图29B)，而在Huh7细胞中(ASGPR1+/-)，(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)在IC50＝100nM时显示活性，并且(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)在IC50＝40nM时显示活性(图29C)。
(GalNAc)3-dSPT4-ApoB#02和(GalNAc)3-dSPT8-ApoB#02的体外效力
靶向apoB的BNA、ApoB#02(SEQ ID NO:12)和SO1861-EMCH或SO1861-sc-Mal与三价-GalNAc((GalNAc)3)缀合(图1，图8)生产(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)(图35)、(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)(图38))、(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)((GalNAc)3-dSPT4-ApoB#02；图39)、(GalNAc)3-d(SO1861)8-ApoB#02(sc)((GalNAc)3-dSPT8-ApoB#02；图40)和(GalNAc)3-ApoB#02BNA(图42)并且缀合物在原代人肝细胞(图30)上进行了测试，以评估它们对apoB RNA水平的影响。在原代肝细胞中，该评估显示(GalNAc)3-d(SO1861)8-ApoB#02(sc)显示IC50为1.5nM(相对缀合物浓度)，而(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(EMCH)、(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)、(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)或(GalNAc)3-ApoB#02的效力较低(IC50在5和8nM之间)(图30)。这表明每个GalNAc缀合物中增加的SO1861分子的量增强了缀合物的效力，从而减少了降低apoB mRNA水平所需的ApoB#02BNA载荷的量。
(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02在C57BL/6J小鼠中的体内功效(研究B)
在研究B中，将C57BL/6J小鼠如所描述的治疗并根据表A6给药。如图38、图39、图40、图41、图42中所述生成本研究中使用的缀合物，(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)、(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)、(GalNAc)3-d(SO1861)8-ApoB#02(sc)、(GalNAc)3-ApoB#02和(GalNAc)3-SO1861)。记录临床观察并分析功效和耐受性的不同生物标志物。
如图31所示，72小时后，用基准2mg/kg ApoB#02BNA(53％，来自对照)处理的动物中的apoB RNA水平(即基因表达)降低，但在分别用(1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02+0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861)和1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)给药的组中甚至降低更多(分别降低至媒剂对照的24％和21％)，显示了当将SO1861加入缀合物时显著改善的效力(n＝每组3只动物)。此外，当增加每载荷的皂苷时，通过剂量减少10倍的载荷(0.173mg/kg(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)(指，简而言之，在图31中为简洁起见为0.1mg/kg)，也称为(GalNAc)3-dSPT4-ApoB#02(sc)或0.265mg/kg(GalNAc)3-d(SO1861)8-ApoB#02(sc)，也称为GalNAc3-dSPT8-ApoB#02(sc))，对应于相同的载荷剂量(0.044mg/kg ApoB02 BNA)(包含在0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)中)，但SO1861分别是4倍和8倍更多，apoB表达分别降低至74％和38％，对于0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)而言它是对照的89％，表明皂苷的增加显著增加了缀合物的效力。皂苷量的减少(0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861(sc)+0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02)产生较低的效力(与媒剂相比的71％apoB表达)。336小时后，表达下调的效果在1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)剂量组中仍然存在，并且是媒剂对照的49％(n＝3只小鼠)。
如图32所示，肝中的apoB RNA下调(如图31所示)也转化为血清中的apoB蛋白减少。各组的给药前水平范围为156-198μg/ml(每组n＝8)。给药后72小时，用基准2mg/kgApoB#02BNA处理的动物中apoB蛋白水平降低(平均值为57μg/ml，相比之下媒剂对照为156μg/ml),但在分别用(1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02+0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861)和1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)给药的组中甚至降低更多(分别降低至媒剂对照的18μg/ml和21μg/ml)，显示了当将SO1861加入缀合物时显著改善的效力(n＝每组8只动物)。与RNA水平一样，当增加每载荷的皂苷时，通过分别给药0.173mg/kg(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)或0.265mg/kg(GalNAc)3-d(SO1861)8-ApoB#02(sc)，血清apoB蛋白分别降低至89μg/ml和50μg/ml，同时对于0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)它是141μg/ml，表明皂苷的增加显著增加了缀合物在减少apoB蛋白方面的效力。皂苷量的减少(0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861(sc)+0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02)产生较低的效力(122μg/ml apoB蛋白。336小时后，蛋白质减少的效果在1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)剂量组中仍然存在并且是为59μg/ml，相比之下在媒剂对照中是143μg/ml(所有组中n＝5只小鼠)；在672小时，所有组(n＝2只小鼠)中的apoB蛋白水平在100-152μg/ml之间变化。
如图33所示，观察到的血清apoB蛋白减少(如图32所示)很好地转化为血清LDL-胆固醇(LDL-C)水平。给药后72小时，用基准2mg/kg ApoB#02BNA处理的动物中LDL-C水平降低(2mg/dl，相比之下媒剂对照为4mg/dl),但在分别用(1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02+0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861)和1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)给药的组中甚至降低更多(分别降低至0.7mg/dl和1.3mg/dlμg/ml)，显示了当将SO1861加入缀合物时显著改善的效力(n＝每组3只动物)。与RNA和apoB蛋白水平一样，当增加每载荷的皂苷时，通过分别给药0.173mg/kg(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)或0.265mg/kg(GalNAc)3-d(SO1861)8-ApoB#02(sc)，LDL-C分别降低至2.3mg/dl和1.3mg/dl，同时对于0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)它是4.3mg/dl，表明皂苷的增加显著增加了缀合物在减少LDL-C方面的效力。皂苷量的减少(0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861(sc)+0.1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02)产生较低的效力(3.7mg/dl LDL-C)。336小时后，LDL-C降低的效果在1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)剂量组(2mg/dl；n＝3只动物)和在(1mg/kg(GalNAc)3-ApoB#02+0.1mg/kg(GalNAc)3-SO1861)(其中它是3.3mg/dl(n＝3只动物))中仍然存在。显示效果的持久性；在672小时，所有组(n＝2只小鼠)的LDL-C水平在3-4mg/dl之间变化。
总之，这表明与SO1861组合，ApoB#02的效力显著增加，并有效诱导apoB RNA下调，即，C57BL/6J小鼠肝中的基因沉默，以及所有测量的功效的“下游”血清生物标志物，例如apoB蛋白和LDL-胆固醇。
(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02在C57BL/6J小鼠中的体内耐受性(研究B)
如图38、图39、图40、图41、图42中所述生成本研究中使用的缀合物，(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)、(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)、(GalNAc)3-d(SO1861)8-ApoB#02(sc)、(GalNAc)3-ApoB#02和(GalNAc)3-SO1861)。
在研究过程期间，如表A6中所述的所有治疗、剂量和剂量方案都具有良好的耐受性，并且未显示出治疗特定的不良反应发现或任何指示缀合物不耐受的特定临床观察或大体器官形态学。治疗组小鼠增加的体重与接受媒剂的小鼠相当。确定了血清ALT水平，并且结果在图34中显示。在72小时时，0.173mg/kg(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)组中的ALT水平似乎短暂增加，但在给药后336小时时恢复到媒剂对照水平；同样，它在0.265mg/kg(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)组中增加，但在给药后的稍后时间点恢复到媒剂水平。值得注意的是，1mg/kg(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)在给药后显示升高达至336小时，但在672小时时测量为166U/L(n＝2只老鼠)。
总之，该数据表明皂苷缀合物在所应用的剂量和剂量方案中具有良好的耐受性，特别是施用含有SO1861的缀合物(GalNAc)3-SO1861-ApoB#02(sc)、(GalNAc)3-d(SO1861)4-ApoB#02(sc)和(GalNAc)3-d(SO1861)8-ApoB#02(sc)，以及共同施用(GalNAc)3-SO1861与(GalNAc)3-ApoB#02没有直接的耐受性问题，同时在C57BL/6J小鼠模型中显示出高效力。
序列表
<110> 萨普雷姆技术公司（Sapreme Technologies B.V.）
<120> 皂苷、寡核苷酸和GALNAC的缀合物
<130> P6096514PCT
<150> NL 2026442
<151> 2020-09-10
<160> 20
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义BNA（HSP27）寡核酸序列
<400> 1
ggcacagcca gtggcg 16
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APOB BNA寡聚物
<400> 2
gcctcagtct gcttcgcacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APOB加扰BNA寡聚物
<400> 3
ggcctctcta caccgctcgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSP27引物正向序列
<400> 4
gcagtccaac gagatcacca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSP27引物反向序列
<400> 5
taaggcttta cttggcggca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApoB引物正向序列
<400> 6
agggtccggg aatctgatga 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApoB引物反向序列
<400> 7
tgggcacgtt gtctttcaga g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBMS引物正向序列
<400> 8
cacccacaca cagcctactt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBMS引物反向序列
<400> 9
gtacccacgc gaatcactct 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GUSB引物正向序列
<400> 10
gaaaatacgt ggttggagag ct 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GUSB引物反向序列
<400> 11
ccgagtgaag atcccctttt ta 22
<210> 12
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApoB#02
<400> 12
gcattggtat tca 13
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApoB#02正向序列
<400> 13
gctaacacta agaaccagaa gatc 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApoB#02反向序列
<400> 14
tgtccgtcta aggatcctgc 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mm PPIA正向序列
<400> 15
gcggcaggtc catctacg 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mm PPIA反向序列
<400> 16
gccatccagc cattcagtc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mm SDHA正向序列
<400> 17
gaggaagcac accctctcat 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mm SDHA反向序列
<400> 18
ggagcggata gcaggaggta 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mm RPS17正向序列
<400> 19
gtgcgaggag atcgccatta 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mm RPS17反向序列
<400> 20
atccgcttca tcagatgcgt 20

Claims (52)

1.一种寡核苷酸缀合物，该寡核苷酸缀合物包含至少一个皂苷，该至少一个皂苷共价连接至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体，其中该ASGPR的配体包含至少一个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分、优选地三个或四个GalNAc部分，更优选地三个GalNAc部分，更优选地该ASGPR的配体包含(GalNAc)3Tris或由其组成，并且进一步共价连接至寡核苷酸，其中该至少一个皂苷选自单糖链三萜皂苷和双糖链三萜皂苷。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是优选在该皂苷的苷元核心结构的位置C-23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的五环三萜皂苷。
3.如权利要求1或2所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是优选在该皂苷的苷元核心结构的位置C-23具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的单糖链或双糖链五环三萜皂苷。
4.如权利要求1-3中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷包含选自由以下组成的组的苷元核心结构：
2α-羟基齐墩果酸、
16α-羟基齐墩果酸、
常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)、
16α,23-二羟基齐墩果酸、
丝石竹皂苷元、
皂皮酸、
原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21,22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)、
23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16,22-二乙酸酯、
洋地黄皂苷配基、
3,16,28-三羟基齐墩果烷-12-烯、
丝石竹酸、
及
其衍生物，
优选地，该皂苷包含选自皂皮酸和丝石竹皂苷元或其衍生物的苷元核心结构，更优选地，该皂苷苷元核心结构是皂皮酸或其衍生物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自A组：
GlcA-、
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-Ara-、
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-、
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-、
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、及
其衍生物，
或
·该皂苷包含与该苷元核心结构结合的糖链，该糖链选自B组：
Glc-；
Gal-；
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-；
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-；
Ara-；
Xyl-；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-，其中R1是4E-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-，其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-二-OAc-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-，其中R3是4E-甲氧基肉桂酸；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-；
(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-，其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-，其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-二-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-，其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-，其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-，其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-，其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-，其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-，其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-，其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸)；
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-；及
其衍生物，
或
·该皂苷是双糖链三萜苷，该双糖链三萜苷包含与该苷元核心结构结合的选自A组的第一糖链并且包含与该苷元核心结构结合的选自B组的第二糖链。
6.如权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷选自由以下组成的组：皂树树皮皂苷、川续断皂苷B、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷甲、商陆皂苷甲、商陆皂苷元、七叶皂苷盐、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-常春藤皂苷、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AE X55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-七叶素、七叶素Ia、茶籽皂苷I、茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、毛地黄皂苷、报春花酸1和AS64R，其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SO1832、SO1832衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、SO1861及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物或SO1861，或SO1832衍生物或SO1832。
7.如权利要求5或6所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含含有已衍生化的醛基团的苷元核心结构；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求5所定义的A组的糖链，该糖链包含已衍生化的羧基基团；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求5所定义的B组的糖链，该糖链包含已衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂皮皂素、皂苷集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904，其立体异构体、其衍生物、及其组合，优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21、QS-21衍生物、SO1861、SO1861衍生物、SO1832、SO1832衍生物、SA1641、SA1641衍生物、GE1741、GE1741衍生物、及其组合，更优选地该皂苷选自由以下组成的组：QS-21衍生物、SO1861衍生物、SO1861及其组合，最优选地该皂苷是SO1861衍生物或SO1861，或SO1832衍生物或SO1832。
9.如权利要求1-8中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是如权利要求4所述的皂皮酸皂苷或丝石竹皂苷元皂苷的皂苷衍生物，并由分子1表示：
Figure FDA0004177962990000071
其中
A1表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A1表示选自如权利要求5所定义的A组的糖链，更优选地A1表示选自如权利要求5所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成；
A2表示氢、单糖或直链的或支链的寡糖，优选地A2表示选自如权利要求5所定义的B组的糖链，更优选地A2表示选自如权利要求5所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团，如一个、两个、三个或四个乙酰氧基基团，
其中A1和A2中的至少一个不是氢，优选地A1和A2均为寡糖链；
并且R是丝石竹皂苷元中的氢或皂皮酸中的羟基；
其中该皂苷衍生物对应于该由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基团已被衍生化；
ii.当A1表示选自如权利要求5所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化；及
iii.当A2表示选自如权利要求5所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个、优选地全部已被衍生化。
10.如权利要求9所述的寡核苷酸缀合物，其中A1表示选自如权利要求5所定义的A组的糖链并且包含葡糖醛酸部分或由其组成，并且其中A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已被衍生化，和/或其中A2表示选自如权利要求5所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团，并且其中A2的至少一个乙酰氧基基团已被衍生化。
11.如权利要求9或10所述的寡核苷酸缀合物，其中该由分子1表示的皂苷是双糖链三萜皂苷。
12.如权利要求9-11中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷衍生物对应于该由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种、优选地一种或两种、更优选地一种：
i.该皂皮酸或丝石竹皂苷元的位置C23处的醛基团已通过以下衍生化：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.当A1表示选自如权利要求5所定义的A组的糖链并且A1包含葡糖醛酸部分或由其组成时，A1的葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD、或皂苷-Glu-AEM如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM；及
iii.当A2表示选自如权利要求5所定义的B组的糖链并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的乙酰氧基基团中的一个或多个、优选地全部已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化。
13.如权利要求9-12中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中A1是Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA并且/或者A2是Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc，优选地该由分子1表示的皂苷是3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-葡糖醛酸吡喃基皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4OAc-β-D-吡喃奎诺糖基-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选地该皂苷是以下中的任一个或多个：SO1861、SO1832、GE1741、SA1641和QS-21或其衍生物，最优选SO1861或其衍生物，或SO1832衍生物或SO1832。
14.如权利要求7-13中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基团：
-还原为醇；
-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中该BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或
-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中该KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求5所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AMPD如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD、或皂苷-Glu-AEM如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM；
iii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求5所定义的B组的糖链，该糖链包含已通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或
iv.该皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选地衍生化i.、ii.和iii.中的两种衍生化的任何组合；
优选地，该皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含已通过与EMCH反应转化成腙键而衍生化的醛基团，其中该EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化。
15.如权利要求14所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是皂苷衍生物，其中
i.该皂苷衍生物包含苷元核心结构，该苷元核心结构包含已通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化为腙键而衍生化的醛基团，从而提供皂苷-Ald-EMCH，如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH；
ii.该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求5所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分的羧基基团已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化，从而提供皂苷-Glu-AEM，如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM；或
iii.该皂苷衍生物包含衍生化i.和ii.的组合。
16.如权利要求14所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中该苷元核心结构包含醛基团并且其中该皂苷衍生物包含糖链、优选地选自如权利要求5所定义的A组的糖链，该糖链包含羧基基团、优选地葡糖醛酸部分的羧基基团，该葡糖醛酸部分已通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化为酰胺键而衍生化。
17.如权利要求1-14中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是由分子2表示的皂苷衍生物：
Figure FDA0004177962990000111
或其中该皂苷是由分子3表示的皂苷衍生物：
Figure FDA0004177962990000112
18.如权利要求1-17中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该至少一个皂苷和该ASGPR的配体直接或经由至少一个接头共价连接，和/或其中该至少一个皂苷和该寡核苷酸直接或经由至少一个接头共价连接，和/或其中该ASGPR的配体和该寡核苷酸直接或经由至少一个接头共价连接，优选地，该至少一个皂苷、该ASGPR的配体和该寡核苷酸经由至少一个接头连接。
19.如权利要求1-18中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该至少一个GalNAc部分，优选三个GalNAc部分，该至少一个皂苷，优选1-16个皂苷部分，更优选1-8个皂苷部分，例如1、4或8个皂苷部分和该寡核苷酸经由三官能接头共价结合，优选地，该一个或多个GalNAc部分、该皂苷/皂苷部分和该寡核苷酸中的每一个共价结合到该三官能接头的单独臂上。
20.如权利要求19所述的寡核苷酸缀合物，其中该三官能接头是由式(XXI)表示的三官能接头：
Figure FDA0004177962990000121
21.如权利要求1-20中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该ASGPR的配体是由分子I’表示的(GalNAc)3Tris：
Figure FDA0004177962990000131
或其中该ASGPR的配体是由分子II’表示的单GalNAc：
Figure FDA0004177962990000132
22.如权利要求1-21中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该至少一个皂苷通过至少一个可切割接头共价结合至该ASGPR的配体，和/或其中该至少一个皂苷通过至少一个可切割接头共价结合至该寡核苷酸。
23.如权利要求19或20所述的寡核苷酸缀合物，其中该至少一个皂苷通过至少一个可切割接头共价结合至该三官能接头的臂上。
24.如权利要求22或23所述的寡核苷酸缀合物，其中该可切割接头在酸性条件、还原性条件、酶促条件和/或光诱导条件下经受切割，并且优选地该可切割接头包含选自以下的可切割键：在酸性条件下经受切割的腙键和酰肼键，和/或易被蛋白水解、例如由组织蛋白酶B进行蛋白水解的键，和/或在还原性条件下易于切割的键，如二硫键。
25.如权利要求22-24中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该可切割接头在酸性条件下，例如像存在于哺乳动物细胞、优选地人细胞的内体和/或溶酶体中的酸性条件下经受体内切割，优选地该可切割接头在pH 4.0-6.5下、并且更优选地在pH≤5.5下经受体内切割。
26.如权利要求1-25中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸缀合物包含1、2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个皂苷部分，或其间的任何数量的皂苷部分，例如7、9、12个皂苷部分，并且优选1、4或8个皂苷部分。
27.如权利要求1-25中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸缀合物包含1个皂苷部分或4个皂苷部分或8个皂苷部分。
28.如权利要求1-27中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该皂苷是SO1861、SO1832或QS-21，优选SO1861或SO1832。
29.如权利要求1-28中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸缀合物包含1或3个GalNAc部分，优选3个GalNAc部分。
30.如权利要求1-29中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是BNA、异种核酸、siRNA、反义寡核苷酸中的任一种。
31.如权利要求1-29中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸选自以下中的任何一个或多个：短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、抗发夹形微小RNA(miRNA)、单链RNA、适体RNA、双链RNA(dsRNA)、抗微小RNA(抗miRNA、抗miR)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA、反义DNA、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-O,4’-氨基乙烯桥接核酸(BNANC)、基于BNA的siRNA、以及基于BNA的反义寡核苷酸(BNA-AON)。
32.如权利要求1-29中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸选自以下中的任何一个或多个：抗miRNA、BNA-AON或siRNA，如基于BNA的siRNA，该siRNA选自化学修饰的siRNA、代谢稳定的siRNA、和化学修饰的代谢稳定的siRNA。
33.如权利要求1-32中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时能够沉默以下基因中的任何一个的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)、HSP27、甲状腺素转运蛋白(TTR)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/科信9型(PCSK9)、TMPRSS6、δ-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1)、抗凝血酶3(AT3)、乙醇酸氧化酶(GO)、补体组分C5(CC5)、乙型肝炎病毒(HBV)的X基因、HBV的S基因、α-1抗胰蛋白酶(AAT)、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和乳酸脱氢酶(LDH)，和/或是例如当存在于哺乳动物细胞内时能够靶向异常miRNA的寡核苷酸。
34.如权利要求1-32中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时能够沉默以下基因中的任何一个的寡核苷酸：载脂蛋白B(apoB)和HSP27。
35.如权利要求1-34中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：apoB、HSP27、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因的表达产物、HBV的S基因的表达产物、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，或例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时能够拮抗或恢复miRNA功能，如抑制致癌miRNA(onco-miR)或阻抑onco-miR的表达。
36.如权利要求1-34中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
37.如权利要求1-34中任一项所述的寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸是能够例如当存在于哺乳动物细胞内并且优选地当存在于人细胞内时靶向参与以下蛋白质中任何一个的表达的mRNA的寡核苷酸：apoB和HSP27。
38.一种药物组合物，其包含如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物，以及任选的药学可接受的赋形剂和/或任选的药学可接受的稀释剂。
39.如权利要求38所述的药物组合物或如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物，用作药物。
40.如权利要求38所述的药物组合物或如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AT3、GO、CC5、HBV的X基因、HBV的S基因、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA、CEBPA和LDH。
41.如权利要求38所述的药物组合物或如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物，用于在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27、apoB、TTR、PCSK9、TMPRSS6、ALAS1、AAT、miR-122、乙型肝炎病毒HbsAg、LDHA和CEBPA。
42.如权利要求37所述的药物组合物或如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物，用于根据权利要求40或41所述使用，其中所述使用是在治疗或预防其中表达产物涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中：HSP27和apoB，优选apoB，和/或用于在治疗或预防涉及以下基因中的任一个或多个的疾病或健康问题中使用：HSP27和apoB，优选apoB。
43.如权利要求39-42中任一项所述的药物组合物或寡核苷酸缀合物，用于治疗或预防癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、心血管疾病、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、AAT相关性肝病、急性肝卟啉病、TTR介导的淀粉样变性、遗传性TTR淀粉样变性(hATTR)、补体介导的疾病、乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、α1-抗胰蛋白酶缺乏、β地中海贫血或自身免疫性疾病。
44.如权利要求39-42中任一项所述的药物组合物或寡核苷酸缀合物，用于治疗或预防癌症如子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌或肝细胞癌，和/或高胆固醇血症等心血管疾病，优选高胆固醇血症。
45.如权利要求37所述的药物组合物或如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物，用于降低受试者的LDL-胆固醇。
46.一种体外或离体方法，用于将如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物从细胞的外部转移到所述细胞内，优选随后将如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物所包含的寡核苷酸转移到所述细胞的胞质溶胶中和/或细胞核中，该方法包括以下步骤：
a)提供在其表面表达ASGPR，优选ASGPR1的细胞，该细胞优选选自肝细胞、病毒感染的哺乳动物细胞和哺乳动物肿瘤细胞，其中优选所述细胞是人细胞；
b)提供如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物，用于转移到步骤a)中提供的细胞中；
c)使步骤a)的细胞体外或离体地与步骤b)的寡核苷酸缀合物接触，优选在液体介质中，从而实现该寡核苷酸缀合物从所述细胞的外部转移到所述细胞内，并且任选地并且优选地从而随后实现该寡核苷酸缀合物包含的寡核苷酸转移到所述细胞的胞质溶胶和/或细胞核中。
47.一种提供如权利要求1-37中任一项所述的寡核苷酸缀合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供至少一个包含共价结合的第一接头的皂苷部分，其中该第一接头包含至少一个用于与第二接头上的第二反应基团或第七接头上的第七反应基团共价结合的第一反应基团；
(b)提供包含共价结合的第三接头的寡核苷酸，其中该第三接头包含用于与第四接头上的第四反应基团或该第七接头上的第八反应基团共价结合的第三反应基团；
(c)提供至少一个包含共价结合的第五接头的GalNAc部分，其中该第五接头包含用于与第六接头上的第六反应基团或该第七接头上的第九反应基团共价结合的第五反应基团；以及
以下中的任何一个
(d1)通过在该第一反应基团和该第二反应基团之间形成共价键将该第一接头连接到该第二接头，通过在该第三反应基团和该第四反应基团之间形成共价键将该第三接头连接到该第四接头，通过在该第五反应基团和该第六反应基团之间形成共价键将该第五接头连接到该第六接头，并将该第二接头、第四接头和第六接头共价连接在一起，从而提供该寡核苷酸，
或
(d2)通过在该第一反应基团和该第七反应基团之间形成共价键将该第一接头连接到该第七接头，通过在该第三反应基团和该第八反应基团之间形成共价键将该第三接头连接到该第七接头，通过在该第五反应基团和该第九反应基团之间形成共价键将该第五接头连接到该第七接头，从而提供该寡核苷酸缀合物。
48.如权利要求47所述的方法，其中该第七接头是三官能接头，例如，如权利要求20所述的三官能接头。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中该至少一个皂苷部分是1-16个皂苷部分，优选1-8个皂苷部分，例如1、4或8个皂苷部分。
50.如权利要求47-49中任一项所述的方法，其中该皂苷是SO1861、SO1832、QS-21或其任何功能性衍生物，优选SO1861或SO1832。
51.如权利要求47-50中任一项所述的方法，其中该一个或多个皂苷部分通过腙键或缩氨基脲键共价连接。
52.如权利要求47-51中任一项所述的方法，其中该至少一个GalNAc部分是1-4个GalNAc部分，优选1或3个GalNAc部分。
CN202180070494.9A 2020-09-10 2021-09-09 皂苷、寡核苷酸和galnac的缀合物 Pending CN116437965A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL2026442 2020-09-10
NL2026442 2020-09-10
NL2027405 2021-01-26
NL2027405A NL2027405B1 (en) 2021-01-26 2021-01-26 Semicarbazone-based saponin conjugate
NLPCT/NL2021/050384 2021-06-18
PCT/NL2021/050384 WO2021261992A1 (en) 2020-06-24 2021-06-18 Conjugate of galnac and saponin, therapeutic composition comprising said conjugate and a galnac-oligonucleotide conjugate
PCT/NL2021/050549 WO2022055351A1 (en) 2020-09-10 2021-09-09 Conjugate of saponin, oligonucleotide and galnac

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116437965A true CN116437965A (zh) 2023-07-14

Family

ID=85573705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180070494.9A Pending CN116437965A (zh) 2020-09-10 2021-09-09 皂苷、寡核苷酸和galnac的缀合物

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4210760A1 (zh)
JP (1) JP2023542500A (zh)
KR (1) KR20230066384A (zh)
CN (1) CN116437965A (zh)
AU (1) AU2021339332A1 (zh)
CA (1) CA3192469A1 (zh)
IL (1) IL301214A (zh)

Also Published As

Publication number Publication date
CA3192469A1 (en) 2022-03-17
EP4210760A1 (en) 2023-07-19
IL301214A (en) 2023-05-01
AU2021339332A1 (en) 2023-03-23
JP2023542500A (ja) 2023-10-10
KR20230066384A (ko) 2023-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210110323A (ko) 개선된 세포 표적화 결합 분자
WO2021261992A1 (en) Conjugate of galnac and saponin, therapeutic composition comprising said conjugate and a galnac-oligonucleotide conjugate
US20230263897A1 (en) Conjugate of galnac and saponin, therapeutic composition comprising said conjugate and a galnac-oligonucleotide conjugate
WO2022055352A1 (en) Semicarbazone-based saponin conjugate
KR20230043111A (ko) Vhh를 포함하는 adc 또는 aoc, 및 사포닌 또는 리간드-사포닌 접합체를 포함하는 조합물
WO2022055351A1 (en) Conjugate of saponin, oligonucleotide and galnac
JP2022542075A (ja) 改良された治療濃度域をもつサポニン誘導体
CN116437965A (zh) 皂苷、寡核苷酸和galnac的缀合物
CN117881427A (zh) 皂苷、寡核苷酸和galnac的缀合物
JP2023532680A (ja) 改善された治療濃度域を有するサポニン誘導体
KR20230043117A (ko) 단일 도메인 항체, 사포닌 및 이펙터 분자의 접합체, 이를 포함하는 약학적 조성물, 상기 약학적 조성물의 치료 용도
US20230293562A1 (en) Therapeutic combination of galnac-oligonucleotide conjugate and saponin, and uses thereof
EP4355369A1 (en) Conjugate of saponin, oligonucleotide and galnac
US20240115712A1 (en) Semicarbazone-based saponin conjugate
US20240066045A1 (en) Semicarbazone-based saponin conjugate
WO2023038517A1 (en) Semicarbazone-based saponin conjugate
WO2023121447A1 (en) Conjugate of a single domain antibody, a saponin and an effector molecule, pharmaceutical composition comprising the same, therapeutic use of said pharmaceutical composition
KR20230043115A (ko) 히드라존에 기반한 사포닌 유도체

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination