KR20220049052A - Galnac 올리고뉴클레오티드 접합체를 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치료적으로 유용한 GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법을 포함한다. 상기 방법은 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 테트라알킬암모늄 염과 GalNAc 클러스터 화합물 또는 이의 염의 커플링 및 후속 정제를 포함한다.

Description

GALNAC 올리고뉴클레오티드 접합체를 위한 방법{PROCESS FOR GALNAC OLIGONUCLEOTIDE CONJUGATES}
본 발명은 GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체의 신규 제조 방법에 관한 것이다.
최근에, 올리고뉴클레오티드에 추가적인 기능을 부여하는, 예를 들어 생체 내의 특정한 기관 및 조직에 대한 치료용 올리고뉴클레오티드의 표적화를 가능하게 하는 비-뉴클레오티드 부분과의 올리고뉴클레오티드의 접합에 상당한 관심이 집중되었다. 간의 간세포를 표적으로 하기 위해, 아시알로당단백질 수용체에 결합할 수 있는 3 가의 GalNAc 접합 부분은 효과적인 치료 작용을 전달하면서, 투여량을 크게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 GalNAc 클러스터 안티센스 접합체는, 예를 들어 PCT 공개 WO 2012/083046 또는 미국 특허 출원 공개 US 2011/0207799 에 기재되어 있다.
이들 간행물은 GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법을 개시하고 있지만, 이들 방법은 기술적 규모의 합성에 대한 표준을 충족시키지 않는 것으로 밝혀졌다.
그러므로, 본 발명의 목적은 공업적 규모의 공정의 요건을 충족시키는 GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체의 개선된 제조 방법을 제공하는 것이다.
GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 고체 상 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 지방족 아민 염을 생성하는 단계;
b) 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하고, 암모니아의 존재하에서 보호기를 제거함으로써, 비-보호된 올리고뉴클레오티드의 암모늄 염을 제공하는 단계;
c) 올리고뉴클레오티드의 암모늄 염으로부터 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 테트라알킬암모늄 염으로의 염 교환 변화를 수행함으로써, 임의의 유리 암모니아 또는 잔류 지방족 아민을 제거하는 단계;
d) 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 테트라알킬암모늄 염을 GalNAc 클러스터 화합물 또는 이의 염과 커플링시키는 단계, 및 마지막으로
e) GalNAc-클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체를 정제하는 단계.
하기의 정의는 본원에서 본 발명을 설명하기 위해서 사용되는 다양한 용어의 의미 및 범위를 예시하고, 정의하기 위해서 제시된다.
키랄 탄소가 화학 구조에 존재할 때마다, 이 키랄 탄소와 관련된 모든 입체 이성질체는 순수한 입체 이성질체, 뿐만 아니라, 이의 혼합물로서 상기 구조에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
용어 "알킬" 은 1 내지 12 개의 탄소 원자의 1 가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 나타낸다. 특정한 구현예에 있어서, 알킬은 1 내지 7 개의 탄소 원자, 및 보다 특정한 구현예에 있어서, 1 내지 4 개의 탄소 원자를 가진다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸을 포함한다.
용어 "C1-12-알킬" 은 1 내지 12 개의 탄소 원자, 및 보다 특정한 구현예에 있어서, 1 내지 7 개의 탄소 원자의 1 가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소기를 나타낸다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸 및 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실 및 도데실 및 이의 이성질체를 포함한다.
용어 "지방족 아민" 은 모노-, 디- 또는 트리-C1-4-알킬아민을 나타내며, 여기에서 C1-4-알킬은 상기에서와 같이 정의되거나, 또는 시클릭 지방족 아민이다. 모노-, 디- 또는 트리-C1-4-알킬아민의 특정한 예는 에틸아민, 디에틸아민 또는 트리에틸아민이다. 시클릭 지방족 아민의 특정한 예는 피롤리딘과 같은 5-원 시클릭 지방족 아민, 또는 피페리딘 또는 모르폴린과 같은 6-원 시클릭 지방족 아민이다.
용어 "아미노-보호기" 는 아미노기를 보호하는 것으로 의도되는 기를 나타내며, 벤조일, 벤질옥시카르보닐, 카르보벤질옥시 (CBZ 또는 Z), 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (FMOC), p-메톡시벤질옥시카르보닐, p-니트로벤질옥시카르보닐, tert-부톡시카르보닐 (BOC) 및 트리플루오로아세틸을 포함한다. 이들 기의 추가의 예는 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapter 7; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5, 및 T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981 에서 확인된다.
용어 "히드록시-보호기" 및 용어 "에스테르-보호기" 는 히드록시기를 보호하는 것으로 의도되는 기를 나타내며, 에스테르- 및 에테르-형성 기, 특히 테트라히드로피라닐, 아실기, 카르바모일, 벤질 및 실릴에테르 (예를 들어, TBS, TBDPS) 기를 포함한다. 이들 기의 추가의 예는 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapters 2-3; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5, 및 T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981 에서 확인된다. C1-6-알킬 또는 페닐로 임의로 치환되는 아실기, 특히 C1-12-알킬카르보닐기, 보다 특히 C1-6-알킬카르보닐기가 바람직하다. 보다 바람직한 히드록시 보호기는 아세틸, 피발로일 또는 벤조일에서 선택될 수 있으며, 이로써 아세틸이 가장 바람직한 히드록시 보호기이다.
용어 "알칼리" 는 알칼리 금속 리튬, 나트륨 및 칼륨, 특히 나트륨 및 칼륨, 바람직하게는 나트륨을 포함한다.
용어 "알칼리토" 는 알칼리 토금속 칼슘 및 마그네슘, 그러나 특히 칼슘을 포함한다.
용어 5' 아미노 변성은 용어 5' 아미노-변성 올리고뉴클레오티드와 관련하여 사용되며, 아미노 링커로서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단기에 부착되는 링커에 공유 결합되는 반응성 아미노기를 결정한다. 링커는 바람직하게는 2 내지 12 개의 탄소 원자의 지방족 알킬, 또는 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 에틸렌 글리콜 링커이다.
따라서, 바람직한 5' 아미노-변성제는 임의로 아미노기 보호되는 아미노 C2-12-알킬 링커, 또는 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 링커에서 선택된다.
5' 아미노 변성 올리고뉴클레오티드에 대한 적합한 아미노 보호기는 트리플루오로아세틸 (TFA) 또는 모노메톡시트리틸 (MMT) 이다.
일반적으로, 아미노 링커는 상업적으로 입수 가능한 아미노 링커 포스포로아미다이트를 통해, 예를 들어 Sigma Aldrich 로부터의 TFA- 또는 MMT-C6-링커 포스포로아미다이트를 통해, 또는 Glen Research 로부터의 5' 아미노 변성제 TEG (트리에틸렌글리콜) CE 포스포로아미다이트를 통해 도입된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 당업자에 의해 2 개 이상의 공유적으로 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 분자로서 이해되는 것으로 정의된다. 치료적으로 유용한 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 7 - 30 개의 뉴클레오티드 길이로 합성된다.
올리고뉴클레오티드는 임의로 변성되는 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이의 조합으로 이루어질 수 있다.
LNA 뉴클레오시드 단량체는 뉴클레오티드의 리보오스 당 고리의 C2' 와 C4' 사이에 링커 기 (바이라디클 또는 브릿지라고 함) 를 포함하는 변성된 뉴클레오시드이다. 이들 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 브릿지된 핵산 또는 비시클릭 핵산 (BNA) 으로 명명된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "임의로 변성되는" 은, 당 부분 또는 핵 염기 부분의 하나 이상의 변성의 도입에 의해, 동등한 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드와 비교하여 변성된 뉴클레오시드를 지칭한다. 바람직한 구현예에 있어서, 변성된 뉴클레오시드는 변성된 당 부분을 포함하며, 예를 들어 하나 이상의 2' 치환된 뉴클레오시드 및/또는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 용어, 변성된 뉴클레오시드는 또한 본원에서 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변성된 "단위" 또는 변성된 "단량체" 와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드는, 일반적으로 2 개의 뉴클레오시드를 함께 공유적으로 커플링시키는 포스포디에스테르 (P=O) 및/또는 포스포로티오에이트 (P=S) 뉴클레오시드 사이의 연결에 의해 연결된다.
따라서, 일부 올리고뉴클레오티드에 있어서, 모든 뉴클레오시드 사이의 연결은 포스포디에스테르 (P=O) 로 이루어질 수 있고, 다른 올리고뉴클레오티드에 있어서, 모든 뉴클레오시드 사이의 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 로 이루어질 수 있으며, 또는 또다른 올리고뉴클레오티드에 있어서, 뉴클레오시드 사이의 연결의 서열은 다양하고, 포스포디에스테르 (P=O) 및 포스포로티오에이트 (P=S) 뉴클레오시드 사이 모두를 포함한다.
핵 염기 부분은 각각의 상응하는 핵 염기에 대한 문자 코드, 예를 들어 A, T, G, C 또는 U 로 표시될 수 있으며, 여기에서 각각의 문자는 임의로 동등한 기능의 변성된 핵 염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시된 올리고뉴클레오티드에 있어서, 핵 염기 부분은 LNA 뉴클레오시드에 대해 대문자 A, T, G 및 MeC (5-메틸 시토신) 로, 및 DNA 뉴클레오시드에 대해 소문자 a, t, g, c 및 Mec 로 설명된다. 변성된 핵 염기는 비제한적으로, tert.부틸페녹시아세틸, 페녹시아세틸, 벤조일, 아세틸, 이소부티릴 또는 디메틸포름아미디노와 같은 보호기를 가지는 핵 염기를 포함한다 (Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese of March 24, 2016 참조).
바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 임의로 변성되는 DNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이의 조합으로 이루어지며, 10 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이이다.
단계 a):
단계 a) 는 고체 상 지지체 상에 올리고뉴클레오티드 또는 이의 지방족 아민 염의 생성을 필요로 한다.
올리고뉴클레오티드 합성의 원리는 당업계에 충분히 공지되어 있으며, Wikipedia 와 같은 문헌 및 공공에서 충분히 설명되어 있다 (예를 들어, Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis, of March 15, 2016 참조).
오늘날, 대규모 올리고뉴클레오티드 합성은 컴퓨터 제어 합성기를 사용하여 자동적으로 수행된다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드 합성은 고체-상 합성이며, 여기에서, 조립되는 올리고뉴클레오티드는 이의 3'-말단 히드록시기를 통해 고체 지지체 물질에 공유 결합되고, 사슬 조립의 전체 과정에 걸쳐 이것에 부착된 상태로 유지된다. 적합한 지지체는 GE Healthcare 로부터의 Primer support 5G 또는 Kinovate 로부터의 NittoPhase®HL support 와 같은, 상업적으로 입수 가능한 거대 다공성 폴리스티렌 지지체이다.
올리고뉴클레오티드 합성은 원칙적으로 원하는 서열이 조립될 때까지, 성장 사슬의 5'-말단에 뉴클레오티드 잔기를 단계적으로 첨가하는 것이다.
일반적으로, 각각의 첨가는 합성 주기라고 하며, 원칙적으로 하기 단계의 화학 반응으로 이루어진다:
a1) 고체 지지체 상에서 보호된 히드록실기를 탈블로킹하는 단계;
a2) 활성화된 포스포르아미다이트로서 제 1 뉴클레오시드를 고체 지지체 상에서 유리 히드록실기와 커플링시키는 단계;
a3) 각각의 P-연결된 뉴클레오시드를 산화 또는 황화시켜, 각각의 포스포트리에스테르 (P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트 (P=S) 를 형성하는 단계;
a4) 임의로, 고체 지지체 상에서 임의의 미반응 히드록실기를 캐핑하는 단계;
a5) 고체 지지체에 부착된 제 1 뉴클레오시드의 5' 히드록실기를 탈블로킹하는 단계;
a6) 활성화된 포스포르아미다이트로서 제 2 뉴클레오시드를 커플링시켜, 각각의 P-연결된 이량체를 형성하는 단계;
a7) 각각의 P-연결된 디뉴클레오시드를 산화 또는 황화시켜, 각각의 포스포트리에스테르 (P=O) 또는 각각의 포스포로티오에이트 (P=S) 를 형성하는 단계;
a8) 임의로, 임의의 미반응 5' 히드록실기를 캐핑하는 단계;
a9) 원하는 서열이 조립될 때까지, 이전 단계 a5 내지 a8 을 반복하는 단계.
적용되는 포스포로아미다이트 단량체는 하기에서 제시되며, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타낸다.
Figure pat00001
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 지방족 아민 염의 형태로 제조된다.
지방족 아민 염은 각각의 지방족 아민으로 탈보호 단계 (2-시아노 에틸 P-보호기의 제거) 를 수행하여 수득된다.
적합한 지방족 아민은 상기에서 정의한 바와 같은 모노-, 디- 또는 트리-C1-4-알킬아민 또는 시클릭 지방족 아민이다.
바람직하게는 모노-, 디- 또는 트리-C1-4-알킬아민, 보다 바람직하게는 디-C1-4-알킬아민, 및 특히 디에틸아민이 사용된다.
따라서, 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 디에틸 아민 염의 형태로 제조된다.
단계 b):
단계 b) 는 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하고, 보호기를 제거하는 것을 필요로 한다.
지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단 및 보호기 (핵 염기 보호기 및 아미노 변성제 보호기) 의 제거는 수성 암모니아로 편리하게 수행되며, 이로써 올리고뉴클레오티드의 암모늄 염을 제공한다. 일반적으로, 진한 암모니아 수용액 및 40 ℃ 내지 80 ℃ 의 높은 반응 온도가 적용된다.
이어서, 미정제 올리고뉴클레오티드의 암모늄 염은 여과, 물 및/또는 지방족 알코올로의 세정 단계 및 증발에 의한 용매의 후속 제거에 의해, 반응 혼합물로부터 분리를 통해 수득될 수 있다.
단계 c):
단계 c) 는 올리고뉴클레오티드의 암모늄 염으로부터 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 테트라알킬암모늄 염으로의 염 교환 변화를 수행함으로써, 임의의 유리 암모니아 또는 잔류 지방족 아민을 제거하는 것을 필요로 한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 알칼리 금속 염이 형성된다. 이어서, 염 교환이 알칼리 금속 수산화물로 편리하게 수행된다.
적합한 알칼리 수산화물은 수산화 리튬, 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨, 그러나 바람직하게는 수산화 나트륨이다.
일반적으로, 염 교환은 수성 환경에서 실온 또는 약간 높은 온도에서 발생하며, 따라서 각각의 수산화물의 수용액이 바람직하게 적용된다.
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 알칼리 토금속 염이 형성된다. 이어서, 염 교환이 수성 알칼리 토금속 수산화물로 편리하게 수행된다.
적합한 알칼리 토금속 수산화물은 수산화 칼슘 또는 수산화 마그네슘, 그러나 바람직하게는 수산화 칼슘이다.
일반적으로, 염 교환은 수성 환경에서 실온 또는 약간 높은 온도에서 발생하며, 따라서 각각의 수산화물의 수용액이 바람직하게 적용된다.
바람직한 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염, 보다 바람직하게는 나트륨 염이 형성된다.
생성된 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염의 수용액의 후처리는, 임의의 유리 암모니아 또는 잔류 지방족 아민이 효과적으로 제거된다는 점에서 매우 중요하다.
그러므로, 하나의 방법에 따르면, 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염의 수용액은 물을 증발시킴으로써 단리될 수 있다. 2-메틸-2-부탄올과 같은 적합한 유기 용매의 도움으로 잔류하는 물의 공비 제거 및 후속 증발은 미정제 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염을 제공할 수 있다. 메탄올 또는 에탄올과 같은 지방족 알코올로의 추가의 소화, 여과, 및 각각의 지방족 알코올로의 세정은, 실질적으로 암모니아 및 잔류 지방족 아민이 없으며, 따라서 커플링 단계에 용이하게 적용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염을 수득하는 것을 가능하게 한다.
또다른 방법에 따르면, 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염의 수용액은, 증기 상의 pH 가 pH 7 에 도달할 때까지 연속적인 부분 증발 (일정한 부피 및 물의 첨가에 의함) 에 의해 단리될 수 있으며, 이로써 임의의 잔류하는 암모니아 및/또는 지방족 아민이 제거되었음을 나타낸다. 생성된 용액은, 실질적으로 암모니아 및 잔류 지방족 아민이 없으며, 따라서 용액 중의 커플링 단계에 용이하게 적용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염을 제공한다.
또다른 방법에 따르면, 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염의 수용액은, 예를 들어 수산화 나트륨, 염화 나트륨, 인산 나트륨 (pH 6-8) 및 이의 혼합물과 같은 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염 수용액에 대한 접선 흐름 여과 또는 크로스 흐름 여과에 의해 단리될 수 있다. 생성된 용액은, 실질적으로 암모니아 및 잔류 지방족 아민이 없으며, 따라서 용액 중의 커플링 단계에 용이하게 적용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염을 제공한다. 대안적으로, 메탄올 또는 에탄올과 같은 지방족 알코올로의 추가의 소화, 여과, 및 각각의 지방족 알코올로의 세정은, 실질적으로 암모니아 및 잔류 지방족 아민이 없으며, 따라서 커플링 단계에 용이하게 적용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염을 수득하는 것을 가능하게 한다.
상기에서 기술한 바와 같은 "연속적인 부분 증발" 방법 및 "접선 흐름 여과 또는 크로스 흐름 여과" 방법은 바람직하다.
또다른 방법에 따르면, 미정제 올리고뉴클레오티드의 암모늄 염은, 음이온-교환 크로마토그래피, 이어서 접선 흐름 여과 또는 크로스 흐름 여과를 통한 탈염화 및 농축에 의해 정제될 수 있다. 생성된 용액은, 실질적으로 암모니아 및 잔류 지방족 아민이 없으며, 따라서 용액 중의 커플링 단계에 용이하게 적용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염을 제공한다. 대안적으로, 이 용액의 동결 건조는, 실질적으로 암모니아 및 잔류 지방족 아민이 없으며, 따라서 커플링 단계에 용이하게 적용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염을 수득하는 것을 가능하게 한다.
정제 기술 "접선 흐름 여과 또는 크로스 흐름 여과" 및 "음이온-교환 크로마토그래피" 는 하기 단계 e) 에서 상세히 설명된다.
본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 테트라알킬암모늄 염이 형성된다. 이 경우에 있어서, 염 교환은 메탄올, 디메틸술폭시드, N,N'-디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리딘, N-에틸피롤리돈, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논 또는 이의 혼합물에서 선택되는 적합한 유기 용매 중에서, 테트라알킬암모늄 히드록사이드 또는 할라이드, 바람직하게는 테트라 C1-12-알킬암모늄 히드록사이드 또는 할라이드, 예컨대 테트라부틸 암모늄 히드록사이드 또는 테트라부틸 암모늄 브로마이드로 편리하게 수행된다. 바람직하게는, 메탄올 또는 디메틸 술폭시드 또는 이의 혼합물이 사용된다. 메탄올과 디메틸 술폭시드의 혼합물의 경우에 있어서, 메탄올은 증발에 의해 제거되어, 비양성자성 용액 중의 테트라알킬암모늄 염을 수득할 수 있다. 이 구현예는, 후속 커플링이 무수 조건하에서 수행되는 경우에 적합하다.
단계 d):
단계 d) 는 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 테트라알킬암모늄 염과 GalNAc 클러스터 화합물 또는 이의 염의 커플링을 필요로 한다.
GalNAc 클러스터 화합물, 이의 상응하는 염, 거울상 이성질체 및/또는 입체 이성질체는 하기 화학식을 가진다:
Figure pat00002
(식 중, R2 는 수소 또는 히드록시 보호기이고, n 은 0 내지 10 의 정수이다).
적합한 히드록시 보호기는 C1-6-알킬 또는 페닐로 임의로 치환되는 아실, 특히 C1-12-알킬카르보닐기, 보다 특히 C1-6-알킬카르보닐기이다. 아세틸, 피발로일 또는 벤조일이 보다 바람직하며, 이로써 아세틸은 가장 바람직한 히드록시 보호기이다.
n 은 바람직하게는 0 내지 5, 보다 바람직하게는 1 내지 3 의 정수이며, 그러나 2 가 바람직하다.
바람직한 구현예에 있어서, 화학식 I 의 GalNAc 클러스터 화합물은 화학식 Ia 의 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염이다:
Figure pat00003
(식 중, M+/++ 는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 양이온이며, 그러나 바람직하게는 나트륨이다).
GalNAc 클러스터 화합물은 다음과 같이 제조할 수 있다:
먼저 GalNAc 클러스터 화합물의 벤질에스테르 전구체는 하기 반응식 1 에 따라서 제조할 수 있다. 예를 들어 팔라듐/챠콜과 같은 수소화 촉매의 존재하에서, 수소에 의한 촉매적 수소화를 이용한 벤질에스테르의 후속 수소화 분해는, 화학식 I 의 아세틸-보호된 GalNAc 클러스터 산 유도체를 제공한다.
Figure pat00004
화학식 I 의 GalNAc 클러스터 염은 하기 반응식 2 에 따라서 제조할 수 있다.
Figure pat00005
올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 테트라알킬암모늄 염과 화학식 I 의 GalNAc 클러스터 화합물의 커플링 반응은, 제 1 단계에서 커플링제에 의한 GalNAc 클러스터 화합물의 활성화, 및 제 2 단계에서 아민 염기 및 유기 용매의 존재하에서, 활성화된 GalNAc 클러스터 화합물과 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염 또는 테트라알킬암모늄 염의 커플링을 포함한다.
커플링제는 DCC (N,N'-디시클로헥실카르보디이미드) 또는 EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드-하이드로클로라이드) 또는 TBTU (N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트), HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), 및 HOBt (1-히드록시벤즈트리아졸), HOSu (N-히드록시숙신이미드) 또는 HOAt (1-히드록시-7-아자벤조트리아졸) 에서 선택되는 첨가제, 및 TBTU/HOBt 또는 HBTU/HOAt 와 같은 이의 통상적인 조합에서 선택된다.
바람직한 구현예에 있어서, 커플링제는 EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드-하이드로클로라이드) 및 첨가제로서 HOSu (N-히드록시숙신이미드) 에서 선택된다.
GalNAc 클러스터가 알칼리 금속 염 또는 알칼리 토금속 염의 형태로 적용되는 경우에 있어서, 활성화는 산성 환경에서 수행되어야 한다. 적합한 산은 오르토-인산과 같은 무기 산 또는 메탄술폰산과 같은 유기 산이며, 적합한 극성 비양성자성 용매는 N,N'-디메틸 포름아미드이다. 반응 온도는 10 ℃ 내지 40 ℃ 에서 선택될 수 있다.
커플링을 위해, 아민 염기는 통상적으로 3 차 아민, 예컨대 트리에틸아민 또는 N-에틸디이소프로필아민, 피리딘 유도체, 예컨대 2,4,6-콜리딘 또는 DABCO (1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄), 그러나 바람직하게는 N-에틸디이소프로필아민이다. 반응은 극성 비양성자성 용매, 예컨대 아세토니트릴, 디메틸 술폭시드 또는 테트라히드로푸란 또는 이의 혼합물 중, 20 ℃ 내지 70 ℃ 의 범위의 반응 온도에서 일어난다.
대안적으로, n-프로필포스폰산 무수물 삼량체 (T3P) 또는 3-(디에톡시-포스포릴옥시)-1,2,3-벤조[d]트리아진-4(3H)-온 (DEPBT) 은 3 차 아민 염기, 예컨대 트리에틸아민 또는 N-에틸디이소프로필아민, 그러나 바람직하게는 N-에틸디이소프로필아민과 함께, 커플링제로서 선택된다.
반응 혼합물의 여과는 GalNAc-클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체 함유 여과액을 제공하며, 이는 후속 정제 단계에서 사용될 수 있다.
단계 e):
단계 e) 는 GalNAc-클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체를 정제하는 것을 필요로 한다.
이전 단계로부터 수득된 GalNAc-클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체의 정제는 본질적으로 크로마토그래피, 농축 및 단리의 단계를 포함한다. 크로마토그래피 및 농축 단계는 반복적으로 적용될 수 있다.
적합한 정제 절차는 하기 순서의 단계를 포함한다:
I. 크로마토그래피
II. 농축
III. 단리
또는
I. 크로마토그래피
II. 농축
III. 크로마토그래피
IV. 농축
V. 단리
또는
I. 크로마토그래피
II. 농축
III. 단리
IV. 크로마토그래피
V. 농축
VI. 단리.
순서 I. 내지 V. 를 포함하는 정제 절차가 바람직하다.
하기 순서의 단계를 포함하는 정제 절차가 더욱 바람직하다:
I. 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피
II. 접선 흐름 여과
III. 동결 건조 또는 분무 건조
또는
I. 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피
II. 접선 흐름 여과
III. 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피
IV. 접선 흐름 여과
V. 동결 건조 또는 분무 건조.
상기에서 언급한 정제 방법은 통상적이며, 본 발명의 분야에서의 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
용어 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피 방법 및 이의 조합을 포함한다.
음이온-교환 크로마토그래피는 샘플 용액의 하전된 이온과 사용된 완충 매질의 경쟁적인 상호 작용에 기초한다. 이것은 통상적인 상업적으로 입수 가능한 음이온-교환 수지, 바람직하게는 트리메틸암모늄-관능기를 갖는 것에 의해 수행될 수 있다. 이들 상 물질은, 예를 들어 GE Healthcare, Tosoh Bioscience, Bio-Rad 또는 Merck 로부터 수득할 수 있다. 특히 양호한 결과는 Tosoh Bioscience 로부터 입수 가능한 음이온-교환 수지 TSKgel Super Q-5PW (QAE) 에 의해 달성되었다.
역상 크로마토그래피는 정지상으로서 변성 실리카 겔 수착제와 같은 통상적인 상업적으로 입수 가능한 상 물질, 및 아세토니트릴과 같은 적합한 유기 용매 및, 적용 가능한 경우, 완충제에 의해 수행될 수 있다. 적합한 변성 실리카 겔 유형 상 물질은 Kromasil™C18, Kromasil™C8, YMC Triart C18 및 YMC Triart C8 에서 선택될 수 있다. 특히 양호한 결과는 YMC 로부터의 Triart Prep C8-S 에 의해 달성되었다.
용어 농축은 접선 흐름 여과 또는 증발 방법 및 이의 조합을 포함한다.
접선 흐름 여과 또는 크로스 흐름 여과에 있어서, 공급물은 투과물 측에 대해 양의 압력에서 필터 막을 가로 질러 (접선으로) 통과한다. 막 기공 크기보다 작은 물질의 비율은 투과액 또는 여과액으로서 막을 통과하고; 다른 모든 것은 잔류물로서 막의 공급 측에 잔류한다. 접선 흐름 여과의 원리는 또한 나노 여과, 한외 여과, 정용 여과 및 미세 여과 공정에서 사용된다. 적합한 막은, 예를 들어 Merck Millipore 로부터 상품명 Pellicon™ 으로 상업적으로 입수 가능하다. 적합한 막은 ≤ 3kDA 의 분자량 컷-오프 (MWCO) 를 가진다. 1 kDA 또는 3kDA 의 MWCO 를 각각 갖는 Merck Millipore Pellicon 2 및 3 막이 바람직하다.
용어 단리는 동결 건조, 침전, 분무 건조 및 증발 방법을 포함한다. 모든 이들 용어는 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
비-제한적인 구현예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure pat00006
여기에서, AM-C6 은 C6 아미노 링커를 나타내고; * 는 포스포르티오에이트 브릿지를 나타내며; A,G,T 및 MeC (5-메틸 시토신) 는 LNA 뉴클레오시드 단량체이고, a,t,c,g 는 DNA 뉴클레오시드 단량체이다.
비-제한적인 구현예에 있어서, GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체는 하기로 이루어진 군에서 선택될 수 있다:
Figure pat00007
여기에서, AM-C6 은 C6 아미노 링커를 의미하고; * 는 포스포르티오에이트 브릿지를 나타내며; A,G,T 및 MeC (5-메틸 시토신) 는 LNA 뉴클레오시드 단량체이고, a,t,c,g 는 DNA 뉴클레오시드 단량체이며, GN2 는 하기 화학식 (식 중, R 은 AM-C6-올리고뉴클레오티드 테일을 의미한다) 의 입체 이성질체 GN2a 또는 GN2b 의 형태, 또는 이의 혼합물로 발생할 수 있는 GalNAc 클러스터 부분이다.
Figure pat00008
본원에 개시된 화합물은 SEQ ID NO 1, 2, 3 및 4 로 이루어진 군에서 선택되는 핵 염기 서열을 가진다.
Figure pat00009
실시예
약어:
AcOH 아세트산
DMAP 4-(디메틸아미노)-피리딘
DMF N, N'-디메틸포름아미드
EtOH 에탄올
MeOH 메탄올
rt 실온
THF 테트라히드로푸란
TBME tert.-부틸 메틸 에테르
ACN 아세토니트릴
GalNAc 클러스터 화합물 전구체의 제조
빌딩 블록 A:
실시예 A1
벤질 (2S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥사노에이트
Figure pat00010
234.0 g (500.0 mmol) (2S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥산산을 500 ㎖ 디클로로메탄에 현탁시키고, 62.0 ㎖ (600 mmol, 1.2 eq) 벤질 알코올 및 3.05 g DMAP (25.0 mmol, 0.05 eq) 를 첨가하였다. 용액을 0-5 ℃ 로 40 min 동안 냉각시키고, 500 ㎖ 디클로로메탄 중의 108.0 g (525.0 mmol, 1.05 eq) N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드의 용액을 적하하였다. 백색 현탁액을 1 h 동안 0-5 ℃ 에서, 이어서 15 h 동안 실온에서 교반하였다. 현탁액을 G3 유리 필터 상에서 여과하고, 백색 필터 케이크를 총 250 ㎖ 디클로로메탄으로 부분적으로 세정하였다. 여과액을 650-10 mbar/1 h 에서 증발시켜 황색 오일을 수득하고, 이것을 2.0 L 에틸 아세테이트에 용해시키고, 2.0 L 0.5 M 염산, 2.0 L 1 M NaHCO3 및 1.0 L 염수로 추출하고, 유기 층을 40 ℃/150-10 mbar/5 h 에서 증발 건조시켜, 291.1 g 미정제 벤질 (2S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노) 헥사노에이트를 104 % 수율 및 96.4 % 순도 (HPLC 면적-%; 약 5 % 벤질 알코올을 함유한다) 의 백색 고체로서 수득하였다. 상기 물질을 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z = 459.22735 (M-boc+H)+.
실시예 A2
벤질 (2S)-2-아미노-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트 메탄술폰산 염
Figure pat00011
291.1 g 벤질 (500.0 mmol) (2S)-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)헥사노에이트 (HPLC 순도; 95.8 %; 약 5 % 벤질 알코올을 함유한다) 를 1.4 L THF 에 실온에서 용해시킨다. 10 min 이내에, 1.04 L 디에틸아민 (10.0 mol, 20 eq) 을 첨가하고, 연황색 용액을 2 h 동안 실온에서 교반하고, 이어서 40 ℃/200-10 mbar 에서 증발시키고, 200 ㎖ 아세토니트릴을 첨가하고, 다시 증발시켜, 디에틸아민을 40 ℃/100-10 mbar/1 h 에서 충분히 제거한다. 마지막으로, 268.1 g 황색 오일을 수득하고, 이것을 2.5 L 아세토니트릴에 용해시키고, 10 min 동안 실온에서 교반한다. 불용성 입자를 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 500 ㎖ 아세토니트릴로 세정한다. 여과액을 10 min 동안 34.0 ㎖ 메탄술폰산으로 20 ℃-25 ℃ 에서 적하 처리하였다. 형성된 백색 현탁액을 17 h 동안 실온에서 교반하고, G3 유리 필터 상에서 여과하였다. 필터 케이크를 500 ㎖ 아세토니트릴로 부분적으로 세정하였다. 백색 결정을 40 ℃/15 mbar/4 h 에서 건조시켜, 195.8 g 벤질 (2S)-2-아미노-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트 메탄술폰산 염을 91 % 수율 (2 단계) 및 99.3 % 순도 (HPLC 면적-%) 의 백색 결정으로서 수득하였다. MS: m/z = 337.2149 (M+H)+.
실시예 A3
벤질 (2S)-2-[[(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트
Figure pat00012
190.0 g (439.0 mmol) 벤질 (2S)-2-아미노-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트 메탄술폰산 염을 1.9 L THF 에 실온에서 현탁시켰다. 335 ㎖ (1.98 mol, 4.5 eq) N-에틸디이소프로필아민을 첨가하고, 이로써 온도를 15 ℃ 로 약간 감소시켰다. 다음에, 213 g (615 mmol, 1.4 eq) (S)-2,6-비스((tert-부톡시카르보닐)아미노)헥산산을 첨가하고, 백색 현탁액을 실온에서 20 min 동안 교반하였다. 390 ㎖ n-프로필포스폰산 무수물 (에틸 아세테이트 중의 시클릭 삼량체 50 % 로서의 T3P, 659 mmol, 1.5 eq) 을 20 min 동안 20-25 ℃ 에서 적하하였다 (냉각수 중탕에서 냉각시킴). 생성된 연황색, 탁한 용액을 실온에서 1.5 h 동안 교반하고, 분리 깔때기로 이동시키고, 1.9 L TBME 로 희석시키고, 1.9 L 물, 1.9 L 0.5 M 염산, 1.9 L 0.5 M NaOH, 1.9 L 물 및 1.9 L 염수로 추출하였다. 분리된, 여전히 탁한 유기 층을 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 필터를 100 ㎖ TBME 로 세정하고, 합쳐진 여과액을 40 ℃/100 mbar/1 h 에서 증발시키고, 1.0 L TBME (물을 공비 제거하기 위해서) 를 다시 첨가하고, 40 ℃/250-10 mbar/1 h 에서 증발시켜, 미정제 296.4 g 을 백색 고체 잔류물로서 수득하였다.
미정제 고체를 500 ㎖ 아세토니트릴로 처리하고, 탁한 용액을 60-65 ℃ 로 10 min 동안 가열하였다. 혼합물을 20-25 ℃ 로 냉각시키고, 10 min 동안 교반하고, 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 50 ㎖ 아세토니트릴로 세정하였다. 연황색 용액을 40 ℃/100-10 mbar/4 h 에서 증발시켜, 295 g 벤질 (2S)-2-[[(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트를 수율 101 % (HPLC 순도: 100 %, 부분 입체 이성질체 순도 (SS) 98.6 %) 의 회백색 고체로서 수득하고, 이것을 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z = 565.3741 (M-boc+H)+.
실시예 A4
벤질 (2S)-6-아미노-2-[[(2S)-2,6-디아미노헥사노일]아미노]헥사노에이트 트리-메탄술폰산 염
Figure pat00013
124.0 g (187 mmol) 벤질 (2S)-2-[[(2S)-2,6-비스(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노일]아미노]-6-(tert-부톡시카르보닐아미노)헥사노에이트를 1.25 L 아세토니트릴에 현탁시켰다. 61.0 ㎖ (935.0 mmol, 5.0 eq) 메탄술폰산을 20-25 ℃ 에서 10 min 동안 첨가하였다 (기체 발생). 생성된 주황색 현탁액을 40 min 이내에 55-60 ℃ 로 가열하고, 추가로 1 h 동안 55-60 ℃ 에서 교반하였다. 주황색-적색 유화액을 실온으로 냉각시키고 (디보케이션은 1H-NMR 로 제어하였다), 추가의 정제없이 A+B 조립 단계, 실시예 8 에서 사용하였다. MS: m/z = 365.2558 (M+H)+.
빌딩 블록 B:
실시예 B1a
벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트
Figure pat00014
30.0 g (200.0 mmol) 2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에탄올을 50 ㎖ DMF 에 20-25 ℃ 에서 용해시키고, 이어서 메탄올 중의 46.0 ㎖ 나트륨 메톡시드 25 % (200.0 mmol, 1.0 eq) 를 첨가하였다. 형성된 용액을 40 ℃/50 mbar/0.5 h 에서 증발시키고 (40 ㎖ 용액의 제거), 50 ㎖ DMF 를 다시 첨가하고, 40 ℃/20 mbar/0.5 h 에서 증발시켰다 (15 ㎖ 용액의 제거). 약간 젤리 같은 현탁액에, 50 ㎖ DMF 중의 13.9 g 브로모아세트산 (100 mmol, 0.5 eq) 의 용액을 20-25 ℃ 에서 첨가하고, 혼합물을 6 h 동안 교반하였다. 11.9 ㎖ 벤질 브로마이드 (100 mmol, 0.5 eq) 를 첨가하고, 혼합물을 추가로 16 h 동안 20-25 ℃ 에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 200 ㎖ 염수로 처리하고, 200 ㎖ TBME 로 추출하였다. 분리된 TBME 층을 200 ㎖ 염수로 추출하고, 이어서 분리된 TBME 층을 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 40 ℃/300-10 mbar/1 h 에서 증발시켜, 미정제 23.9 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 수득하였다.
크로마토그래피 (600 g 실리카 60 (0.063-0.2 ㎜), 이동상: 에틸 아세테이트) 후, 무색 오일로서 총 7.85 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 13 % 수율 및 99.0 % 순도 (HPLC 면적-%) 로 단리하였다. MS: m/z = 299.1517 (M+H)+.
실시예 B1b
벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트
Figure pat00015
11.2 g 칼륨 tert.-부틸레이트 (100.0 mmol, 0.5 eq) 를 70 ㎖ 2-메틸-2-부탄올에 현탁시키고 (가벼운 발열 35 ℃), 이어서 30.0 g (200.0 mmol) 2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에탄올을 5 min 동안 적하하였다. 적하 깔때기를 10 ㎖ 2-메틸-2-부탄올로 헹구고 (45 ℃ 로 온도 상승), 용액을 60-65 ℃ 로 가열하고, 11.6 g (100 mmol, 0.5 eq) 나트륨 클로로아세테이트를 첨가하고, 16 h 동안 60-65 ℃ 에서 교반하고, 이어서 11.9 ㎖ 벤질 브로마이드 (100 mmol, 0.5 eq) 를 첨가하고, 혼합물을 추가로 16 h 동안 60-65 ℃ 에서 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 이어서 50 ㎖ 물로 처리하고, 80 ㎖ TBME 및 40 ㎖ TBME 로 추출하였다. 합쳐진 TBME 층을 50 ㎖ 반-포화 염수로 세정하고, 유기 층을 40 ℃/300-10 mbar/1 h 에서 증발시켜, 미정제 27.0 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 수득하였다.
크로마토그래피 (270 g 실리카 60 (0.063-0.2 ㎜), 이동상: 에틸 아세테이트/n-헵탄 1/1 로 출발, 순수한 생성물이 보일 때, 이동상을 100 % 에틸 아세테이트로 변경) 후, 거의 무색 오일로서 총 11.4 g 벤질 2-[2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시]아세테이트를 19 % 수율 (나트륨 클로로아세테이트로부터 38 %) 및 99.0 % 순도 (HPLC 면적-%) 로 단리하였다.
실시예 B2
벤질 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트
Figure pat00016
268.0 g 벤질 2-(2-(2-(2-히드록시에톡시)에톡시)에톡시)아세테이트 (900 mol) 를 2.4 L 디클로로메탄에 용해시켰다. 385.0 g (2S,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-2H-피란-2,4,5-트리일 트리아세테이트 (990 mmol, 1.1 eq) 및 12.0 ㎖ 트리플루오로메탄술폰산 (135 mmol, 0.15 eq) 을 첨가하였다. 현탁액을 딘-스타크 분리기 (50 ㎖, AcOH 의 제거) 로 가열 환류시켰다. 1 h 후, 4.50 ㎖ 트리플루오로메탄술폰산 (50.7 mmol, 0.05 eq) 및 50 ㎖ 디클로로메탄을 상기 주황색 현탁액에 첨가하고, 딘-스타크 분리기로부터의 용매 (50 ㎖) 를 배출시켰다. 30 분 마다 이 절차를 총 6 회 (3 h) 반복하였다. 총 4.5 h 후, 적색 용액을 10-15 ℃ 로 냉각시키고, 30 min 이내에 20-25 ℃ 에서 1.8 L 1 M 탄산 수소 나트륨 (1.8 mol, 2.0 eq) 의 용액에 첨가하였다 (CO2 발생, pH 7-8). 황색 유기 층을 분리하고, 40 ℃/600-10 mbar/3 h 에서 증발시켜, 585.4 g 의 미정제 벤질 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트를 황색 오일 (HPLC 순도: 87 %) 로서 수득하였다. 미정제 생성물을 700 ㎖ 아세톤에 용해시키고, 예압 실리카 컬럼 (3.0 ㎏ 실리카 60; 0.063-0.2 ㎜) 에 충전시켰다. 이동상으로서 n-헵탄/아세톤 (구배 5:1 내지 1:2) 을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 합쳐진 수집된 분획을 40 ℃/600-10 mbar 에서 증발시키고, 20-25 ℃/0.3 mbar/3 h 에서 건조시켜, 황색 오일로서 465.0 g 벤질 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트를 83 % 수율 및 100 % 순도 (HPLC 면적-%) 로 수득하였다. MS: m/z = 628.2627 (M+H)+.
실시예 B3
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세트산
Figure pat00017
아르곤 분위기 하에서, 456.0 g 벤질 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세테이트 (727 mmol) 를 1.4 L THF 에 용해시켰다. 4.56 g Pd/C 10 % 를 첨가하고, 아르곤 분위기를 수소 (1 bar) 로 대체시켰다. 검정색 현탁액을 20-25 ℃ 에서 2 h 동안 수소화시켰다. 수소 분위기를 아르곤으로 대체시키고, 검정색 현탁액을 여과하고, 필터 케이크를 총 400 ㎖ THF 로 부분적으로 세정하였다. 무색 여과액 (HPLC 순도: 71 % 및 27 % 톨루엔) 을 임의의 정제없이 A+B 조립 단계, 실시예 C1 에서 사용하였다. MS: m/z = 538.2191 (M+H)+.
빌딩 블록 A 및 B 의 조립
실시예 C1
벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트
Figure pat00018
실시예 4 로부터의 벤질 (2S)-6-아미노-2-[[(2S)-2,6-디아미노헥사노일]아미노]헥사노에이트 트리-메탄술포네이트 (180.0 mmol) 의 적색-주황색 용액 (~1.4 L) 을 3.60 L 아세토니트릴로 희석시켰다. 20-25 ℃ 에서, 365.0 ㎖ N-에틸디이소프로필아민 (2.16 mol, 12.0 eq) 을 5 min 이내에 첨가하였다. 형성된 점착성 슬러리에, 실시예 B3 로부터의 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세트산 (720 mmol, 4.0 eq) 의 용액 (~2.25 L) 을 20-25 ℃ 에서 10 min 이내에 첨가하였으며, 이로써 온도가 40 ℃ 로 약간 상승하였다. 45-50 ℃ 에서, 425 ㎖ n-프로필포스폰산 무수물 (T3P, 에틸 아세테이트 중의 삼량체 50 %, 720 mmol, 4.0 eq) 의 용액을 10 min 이내에 첨가하였다. 반응 용액을 1 h 동안 45-50 ℃ 에서 교반하였다. 연황색 용액을 20-25 ℃ 로 냉각시키고, 40 ℃/10 mbar/6 h 에서 증발시켜, 미정제 1.06 ㎏ 벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트 (HPLC 순도: 24.1 %) 를 수득하였다. 미정제 생성물을 3 부분으로 침전시켜, 메탄술폰산 N-에틸디이소프로필아민 및 잔류 T3P 를 제거하였다. 353 g 미정제 생성물을 7.0 L 2-프로판올에 용해시키고, 1 h 이내에 -25 ℃ 로 냉각시키고, 1 h 동안 -25 ℃ 에서 교반하고, 예냉 (-25 ℃) G3-유리-필터 (헹굼 없음) 상에서 여과하였으며, 침전된 생성물로부터의 일부가 반응기로부터의 유리-벽 상에 침착되었다. 모든 침전물을 총 1.0 L THF 로 필터 및 유리-벽으로부터 부분적으로 용해시켰다. 합쳐진 용액을 40 ℃/20 mbar/6 h 에서 증발시켜, 390.0 g 벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트 (HPLC 순도: 71.9 %) 를 수득하였으며, 이것을 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z = 1923.8438 (M+H)+.
실시예 C2
나트륨;(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노] 헥사노일]아미노]헥사노에이트
Figure pat00019
벤질 (2S)-6-아미노-2-[[(2S)-2,6-디아미노헥사노일]아미노]헥사노에이트 트리-메탄술포네이트 (12.2 mmol) 의 적색-주황색 용액 (~95 ㎖) 을 240 ㎖ 아세토니트릴로 희석시켰다. 20-25 ℃ 에서, 30.0 ㎖ N-에틸디이소프로필아민 (2.16 mol, 14.5 eq) 을 5 min 이내에 첨가하였다. 형성된 점착성 슬러리에, 2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세트산 (48.8 mmol, 4.0 eq) 의 용액 (~150 ㎖) 을 20-25 ℃ 에서 10 min 이내에 첨가하였으며, 이로써 온도가 40 ℃ 로 약간 상승하였다. 45-50 ℃ 에서, 28.8 ㎖ n-프로필포스폰산 무수물 (T3P, 에틸 아세테이트 중의 삼량체 50 %, 48.8 mmol, 4.0 eq) 의 용액을 10 min 이내에 첨가하였다. 반응 용액을 1 h 동안 45-50 ℃ 에서 교반하였다. 연황색 용액을 20-25 ℃ 로 냉각시키고, 40 ℃/10 mbar/6 h 에서 증발시켜, 미정제 73.6 g 벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트 (HPLC 순도: 32 %면적) 를 수득하였다.
68.0 g (11.0 mmol) 의 미정제 생성물을 340 ㎖ 메탄올에 용해시키고, 20.0 ㎖ (220 mmol, 20 eq) NaOH 10.8 M 을 상기 연황색 용액에 첨가하고, 온도를 32 ℃ 로 상승시키고, 반응 혼합물을 실온에서 2.5 h 동안 교반하였으며, 이로써 현탁액이 형성되었다 (pH 12.0). 현탁액을 여과하고, 필터 케이크를 100.0 ㎖ 메탄올로 세정하고, 여과액을 40 ℃/250-10 mbar/2 h 에서 증발시켜, 41.5 g 나트륨 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트를 수득하였으며, 이어서 이것을 분취용 역상 크로마토그래피로 정제하였다, 조건은 실험 C3 참조.
실시예 C3
나트륨;(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트
Figure pat00020
378.0 g (197.0 mmol, 미정제) 벤질 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트를 1.9 L 메탄올에 용해시켰다. 10 min 이내에, 200.0 mL 10.8 M 수산화 나트륨 용액 (2.16 mol, 11.0 eq) 을 20-25 ℃ 에서 첨가하였다. 이로써, 온도가 31 ℃ 로 상승하였다. 연황색 용액을 2 h 동안 20-25 ℃ 에서 교반하고 (pH 13.4), 이어서 80.0 mL 5 M 염화 암모늄 용액을 첨가하였다 (pH 10.7). 이어서, 연황색 용액을 20-25 ℃/100-20 mbar/5 h 에서 증발시키고, 20-0.5 mbar/1 h 에서 건조시켜, 미정제 543 g 나트륨 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트 (HPLC 순도: 40.1 %) 를 수득하였으며, 이어서 이것을 분취용 역상 크로마토그래피로 정제하였다.
컬럼: Triart C18-120 26 × 15 ㎝; 10 ㎛;
이동상: A: 2 mM NaHCO3 / B: 아세토니트릴;
구배:
Figure pat00021
온도 조절: 실온
검출: 220 ㎚
용액: 543 g 을 4500 ㎖ 2 mM NaHCO3 에 용해시키고, 여과함 (GF5) (= 5000 ㎖ (109 ㎎/㎖))
샘플 용액 / 주입: 1 회 200 ㎖ 샘플 = 21.8 g (25 회)
농축: 합쳐진 분획 (46 L) 을 110 L 물로 희석시키고, 이 용액을 3 부분으로 RP C18 컬럼에 펌핑하고, 물/MeOH 98/2 로 세정하고, 이어서 MeOH 로 용출시키고, 회전 증발기 상에서 농축시켜, 1.18 ㎏ 메탄올 용액을 수득한다. 분취용 HPLC 정제 단계의 1.18 ㎏ 메탄올 용액의 1/4, 즉, 295 g 을 40 ℃/20 mbar/1 h 에서 증발시키고, 이어서 20-25 ℃/0.35 mbar/14 h 에서 증발 건조시켜, 비정질 백색 분말로서 43.5 g 나트륨;(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트를 99.88 % HPLC 순도로 수득하였다. 상기 용액의 나머지 3/4 (885 g) 은 다음 단계에서 사용하였다. MS: m/z = 1452.684 (M-H)-.
GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조
실시예 1A
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6*-5'A(bz)*A(bz)*T*g(ibu)*c(bz)*t*a(bz)*c(bz)*a(bz)*a(bz)*a(bz)*a(bz)*c(bz)*MeC(bz)*MeC(bz)*A(bz)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support 5G UnyLinker 350 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 을 사용하여, 1.60 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 2.0 eq 의 DNA/LNA-포스포르아미다이트 및 3.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2A 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
BTT 활성화제 아세토니트릴 중의 0.3 M 5-벤질티오테트라졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 1B
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz)G(dmf)*MeC(bz)*G(dmf)*t*a(bz)*a(bz)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*G(dmf)*G(dmf)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support UnyLinker (Kinovate Nittophase®HL UnyLinker™400, USA) 를 사용하여, 1.90 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 1.5 eq 의 DNA/LNA-포스포르아미다이트 및 2.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2B 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
BTT 활성화제 아세토니트릴 중의 0.3 M 5-벤질티오테트라졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 1C
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz)G(ibu)*MeC(bz)*G(ibu)*t*a(bz)*a(bz)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*G(ibu)*G(ibu)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support UnyLinker (Kinovate Nittophase®HL UnyLinker™400, USA) 를 사용하여, 1.90 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 1.5 eq 의 DNA/LNA-포스포르아미다이트 및 2.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2C 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
BTT 활성화제 아세토니트릴 중의 0.3 M 5-벤질티오테트라졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 1D
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz)G(dmf)*MeC(bz)*G(dmf)*t*a(bz)*a(bz)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*G(dmf)*G(dmf)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support 5G UnyLinker 350 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 을 사용하여, 1.60 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 2.0 eq 의 포스포르아미다이트 및 3.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2D 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
BTT 활성화제 아세토니트릴 중의 0.3 M 5-벤질티오테트라졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 1E
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz)G(dmf)*MeC(bz)*G(dmf)*t*a(bz)*a(bz)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*G(dmf)*G(dmf)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support UnyLinker (Kinovate Nittophase®HL UnyLinker™400, USA) 를 사용하여, 0.20 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 1.5 eq 의 포스포르아미다이트 및 2.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (PADS), 비스-(페닐아세틸)-디술파이드 (ABCR, AB180887) 는 무수 아세토니트릴/3-피콜린 1/1 중의 0.2 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2E 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
BTT 활성화제 아세토니트릴 중의 0.3 M 5-벤질티오테트라졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 1F
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz)G(dmf)*MeC(bz)*G(dmf)*t*a(bz)*a(bz)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*g(ibu)*a(bz)*G(dmf)*G(dmf)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support UnyLinker (Kinovate Nittophase®HL UnyLinker™400, USA) 를 사용하여, 0.20 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 1.5 eq 의 DNA/LNA-포스포르아미다이트 및 2.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2F 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
DCI 활성화제 아세토니트릴 중의 0.25 M 4,5-디시아노이미다졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 1G
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'-c(bz)a(bz)MeC(bz)*MeC(bz)*t*a(bz)*t*t*t*a(bz)*a(bz)*c(bz)*a(bz)*-t*c(bz)*A(bz)*G(dmf)*A(bz)*MeC(bz)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support UnyLinker (Kinovate Nittophase®HL UnyLinker™400, USA) 를 사용하여, 1.90 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 1.5 eq 의 DNA/LNA-포스포르아미다이트 및 2.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2G 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
BTT 활성화제 아세토니트릴 중의 0.3 M 5-벤질티오테트라졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 1H
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'-c(bz)a(bz)MeC(bz)*T*A(bz)*a(bz)*t*t*g(ibu)*t*a(bz)*g(ibu)*t*-a(bz)*g(ibu)*t*a(bz)*MeC(bz)*T*MeC(bz)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support UnyLinker (Kinovate Nittophase®HL UnyLinker™400, USA) 를 사용하여, 1.90 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 1.5 eq 의 DNA/LNA-포스포르아미다이트 및 2.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2H 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
BTT 활성화제 아세토니트릴 중의 0.3 M 5-벤질티오테트라졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 1I
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'-c(bz)a(bz)MeC(bz)*MeC(bz)*t*a(bz)*t*t*t*a(bz)*a(bz)*c(bz)*a(bz)*-t*c(bz)*A(bz)*G(dmf)*A(bz)*MeC(bz)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support UnyLinker (Kinovate Nittophase®HL UnyLinker™400, USA) 를 사용하여, 0.2 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 1.5 eq 의 DNA/LNA-포스포르아미다이트 및 2.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, 활성화제 42, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2I 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
활성화제 42 아세토니트릴 중의 0.3 M 5-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-테트라졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 1J
이의 디에틸아민 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'-c(bz)a(bz)MeC(bz)*MeC(bz)*t*a(bz)*t*t*t*a(bz)*a(bz)*c(bz)*a(bz)*-t*c(bz)*A(bz)*G(dmf)*A(bz)*MeC(bz)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support UnyLinker (Kinovate Nittophase®HL UnyLinker™400, USA) 를 사용하여, 1.90 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 1.5 eq 의 DNA/LNA-포스포르아미다이트 및 2.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). DEA-wash 로서 공지된 방법에 의해 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성하여, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸아민 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험예 2J 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
DCI 활성화제 아세토니트릴 중의 0.7 M 디시아노이미다졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
실시예 2A
이의 나트륨 염으로서 AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' 의 제조.
실시예 1A 로부터의, 이의 디에틸아민 염으로서 미정제 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 180 ㎖ conc. aq. 수산화 암모늄 용액 30-32 % 로 처리하였다. 현탁액을 압력 안정 밀폐 플라스크 내에서 10 시간 동안 60 ℃ 에서 교반하였다. 현탁액을 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 60 ㎖ 물로 세정하였다. 황색 여과액을 40 ℃/300-10 mbar/2 h 에서 증발시켜, ~10.5 g 미정제 올리고를 암모늄 염으로서 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 5455.6. 총 13 개의 유사하게 제조한 1.6 mmol 배치를 상기의 것과 합하고 (총 새로운 배치 크기: 22.4 mmol), 하나의 둥근 바닥 플라스크 내에서 750 ㎖ 물에 용해시켰다. 황색 용액을 52.0 ㎖ 10.8 M NaOH (561.6 mmol) (pH 10) 로 처리하고, 용액을 40 ℃/100-10 mbar/2 h 에서 증발시키고, 잔류물을 100 ㎖ 물로 처리하고, 진공 40 ℃/100-10 mbar 에서 농축시켰으며, 이 절차를 총 4 회 반복하였다 (4 번째 증류액은 pH 7.0 을 가진다). 유성 잔류물을 100 ㎖ 2-메틸-2-부탄올로 처리하고, 40 ℃/50-10 mbar/2 h 에서 처리하여 (물의 공비 제거), 160 g 을 황색 고체로서 수득하였다. 미정제 생성물을 800 ㎖ 에탄올에 현탁시키고, 40-45 ℃ 로 15 min 동안 가온시키고, 황색 현탁액을 1 h 동안 20-25 ℃ 에서 교반하였다. 현탁액을 여과하고 (벤즈아미드, 이소부티릴아미드, 트리플루오로아세트아미드 및 기타 부산물의 제거), 필터 케이크를 160 ㎖ 에탄올로 부분적으로 세정하였다. 생성물을 40-45 ℃/10 mbar/3 h 에서 건조시켜, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' 130.5 g 을, 75.6 % 면적의 LC-순도 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 를 갖는 고밀도 황색 분말로서 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 5455.6. 생성물을 추가의 정제없이 실험예 3A 에서 사용하였다.
실시예 2B
이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 제조.
실시예 1B 로부터의, 이의 디에틸아민 염으로서 미정제 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 180 ㎖ conc. aq. 수산화 암모늄 용액 30-32 % 로 처리하였다. 현탁액을 압력 안정 밀폐 플라스크 내에서 10 시간 동안 60 ℃ 에서 교반하였다. 현탁액을 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 60 ㎖ 물로 세정하였다. 황색 여과액을 40 ℃/300-10 mbar/2 h 에서 증발시켜, ~10.5 g 미정제 올리고를 암모늄 염으로서 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 5197.6. 총 25 개의 유사하게 제조한 1.9 mmol 배치를 상기의 것과 합하고 (총 새로운 배치 크기: 47.5 mmol), 하나의 둥근 바닥 플라스크 내에서 1200 ㎖ 물에 용해시켰다. 주황색 용액을 68.0 ㎖ 10.8 M NaOH (734.4 mmol, 15.5 eq, pH 10) 로 처리하고, 용액을 40 ℃/200-50 mbar 에서 농축시켜, ~600 g 미정제 용액을 수득하고, 이것을 200 ㎖ 물로 처리하고, 동일한 부피를 진공 40 ℃/50 mbar 에서 증류 제거하였으며, 이 절차를 총 10 회 반복하였다 (총 2000 ㎖ 물을 제거하였고, 10 번째 증류액은 pH 7.0 을 가지며, 모든 암모니아는 제거하였다). 최대 47.5 mmol 생성물, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 를 함유하는 855 g 의 수득된 주황색 수용액을 추가의 정제없이 실험예 3B 에서 사용하였다. 2 × 20 개의 유사하게 제조한 1.9 mmol 배치 (2 × 38.0 mmol) 를 동일한 절차, 총 123.5 mmol 로 후처리하였다.
실시예 2C
이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 제조.
실험예 1C 의 물질로부터 출발하여, 실시예 2B 와 유사하게 표제 화합물을 제조하였다. 최대 1.9 mmol 생성물, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 를 함유하는 148 g 의 수득된 황색 수용액을 추가의 정제없이 실험예 3C 에서 사용하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 5197.6.
실시예 2D
이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 제조.
실시예 1C 로부터의, 이의 디에틸아민 염으로서 미정제 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 180 ㎖ conc. aq. 수산화 암모늄 용액 30-32 % 로 처리하였다. 현탁액을 압력 안정 밀폐 플라스크 내에서 10 시간 동안 60 ℃ 에서 교반하였다. 현탁액을 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 60 ㎖ 물/에탄올 3/1 로 세정하였다. 황색 여과액을 40 ℃/300-10 mbar/2 h 에서 증발시켜, ~10.5 g 미정제 올리고를 암모늄 염으로서 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 5197.6. 잔류물 10.2 g (1.6 mmol) 을 하나의 둥근 바닥 플라스크 내에서 250 ㎖ 물에 용해시켰다. 황색 용액을 2.22 ㎖ 10.8 M NaOH (24 mmol, 15 eq, pH 10) 로 처리하고, 용액을 40 ℃/200-50 mbar 에서 증발시켜 황색 오일을 수득하고, 이것을 10 ㎖ 물로 2 회 처리하고, 동일한 부피를 진공 40 ℃/50-10 mbar 에서 증류 제거하였다 (2 번째 증류액은 pH 7.0 을 가지며, 모든 암모니아는 제거하였다). 유성 잔류물을 30 ㎖ 2-메틸-2-부탄올로 처리하고, 40 ℃/10 mbar 에서 증발시켜, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 미정제 9.82 g 을 황색 고체 (모든 절단된 보호기를 함유함) 로서 수득하였으며, 이것을 추가의 정제없이 실험예 3D 에서 사용하였다.
실시예 2E
이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 제조.
실시예 1E 로부터의, 이의 디에틸아민 염으로서 미정제 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 25.0 ㎖ conc. aq. 수산화 암모늄 용액 30-32 % 로 처리하였다. 현탁액을 압력 안정 밀폐 플라스크 내에서 10 시간 동안 60 ℃ 에서 교반하였다. 현탁액을 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 20 ㎖ 물로 세정하였다. 황색 여과액을 40 ℃/300-10 mbar/2 h 에서 증발시켜, ~1.3 g 미정제 올리고를 암모늄 염으로서 수득하였다. 잔류물을 10 ㎖ 에 용해시키고, 물 중 0.28 ㎖ (3.0 mmol, 15 eq) 수산화 나트륨 32 % 로 처리하였다. 황색 용액을 40 ℃/100-15 mbar/1 h 에서 증발시켜, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 0.96 g 을 황색 고체 (모든 절단된 보호기를 함유함) 로서 수득하였다. 황색 고체를 4.8 ㎖ 에탄올에 현탁시키고, 1 시간 동안 40 ℃ 에서 교반하고, 20-25 ℃ 로 냉각시키고, 이 온도에서 1 시간 동안 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 필터 케이크를 1.0 ㎖ 에탄올로 세정하고, 40 ℃/15 mbar/1 h 에서 건조시켜, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 0.75 g 을 회백색 고체 (모든 절단된 보호기를 함유함) 로서 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 5197.6.
실시예 2F
이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 제조.
실시예 1F 로부터의, 이의 디에틸아민 염으로서 미정제 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 25.0 ㎖ conc. aq. 수산화 암모늄 용액 30-32 % 로 처리하였다. 현탁액을 압력 안정 밀폐 플라스크 내에서 10 시간 동안 60 ℃ 에서 교반하였다. 현탁액을 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 20 ㎖ 물로 세정하였다. 황색 여과액을 물 중 0.28 ㎖ (3.0 mmol, 15 eq) 수산화 나트륨 32 % 로 처리하였다. 황색 용액을 40 ℃/100-15 mbar/1 h 에서 증발시켜, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 0.65 g 을 황색 고체 (모든 절단된 보호기를 함유함) 로서 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 5197.6.
실시예 2G
이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 제조.
실험예 1G 의 물질로부터 출발하여, 실시예 2B 와 유사하게 표제 화합물을 제조하였다. 최대 15.2 mmol 생성물, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 함유하는 1720 g 의 수득된 주황색 수용액을 추가의 정제없이 실험예 3E 에서 사용하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6357.7.
실시예 2H
이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' 의 제조.
실험예 1H 의 물질로부터 출발하여, 실시예 2B 와 유사하게 표제 화합물을 제조하였다. 최대 15.2 mmol 생성물, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' 를 함유하는 1920 g 의 수득된 주황색 수용액을 추가의 정제없이 실험예 3F 에서 사용하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6748.8.
실시예 2I
이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 제조.
실시예 1I 로부터의, 이의 디에틸아민 염으로서 미정제 CF3CO-AM-C6-5'-c(bz)a(bz)MeC(bz)*T*A(bz)*a(bz)*t*t*g(ibu)*t*a(bz)*g(ibu)*t*-a(bz)*g(ibu)*t*a(bz)*MeC(bz)*T*MeC(bz)-3' 1.00 g 의 한외 여과 / 정용 여과를 통해 표제 화합물을 제조하고, 물 (150 mL) 에 용해시키고, 생성된 용액을 0.1 M NaOH (1.0 L), 이어서 0.1 M NaHCO3 (1.0 L) 및 1 M NaCl (1.0 L) 을 사용하여, 2 개의 Sartocon Slice Hydrosart 2KD 0.1 ㎡ 막이 장착된 Akta-Cross-Flow 상에서 정용 여과하였다. H2O (2.0 L) 로 최종 탈염 단계를 수행하였다. 생성된 용액을 감압하에서 농축시키고, EtOH (5 mL) 로 실온에서 1 시간 동안 분쇄하고, 여과하고, 진공하에서 건조시켜 (24 ℃/10 mbar/12 h), 표제 화합물을 이의 나트륨 염 (백색 고체, 410 ㎎, 40 % 수율) 으로서 수득하였다. 이 물질을 추가의 정제없이 실시예 3G 에서 사용하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6357.7.
실시예 2J
이의 암모늄 염으로서 AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 제조.
실험예 1J 의 물질로부터 출발하여, 실시예 2B 와 유사하게 표제 화합물을 제조하였다. 실시예 1J 로부터의, 이의 디에틸아민 염으로서 미정제 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 20 ㎖ conc. aq. 수산화 암모늄 용액 30-32 % 로 처리하였다. 현탁액을 압력 안정 밀폐 플라스크 내에서 10 시간 동안 45 ℃ 에서 교반하였다. 현탁액을 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 10 ㎖ 물로 세정하였다. 황색 여과액을 40 ℃/300-10 mbar/2 h 에서 증발시켜, 0.45 g 미정제 올리고를 암모늄 염으로서 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6357.7.
실시예 3A
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' 의 제조
Figure pat00022
GalNAc 활성화:
30.5 g (20.6 mmol) GalNAc-클러스터-나트륨 염을 300 ㎖ DMF 에 20-25 ℃ 에서 용해시키고, 300 ㎖ DMF 중의 1.22 ㎖ (18.1 mmol) aq. 오르토-인산 85 % 의 용액을 2 min 동안 첨가하였다. 5 min 후, 20-25 ℃ 에서, 2.61 g (22.7 mmol) N-히드록시숙신이미드를 약간 탁한 무색 용액에 첨가하고, 이어서 4.75 g (24.8 mmol) EDC·HCl (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드-하이드로클로라이드) 을 첨가하였다. 무색의 약간 탁한 용액을 3 h 동안 20-25 ℃ 에서 교반하고, 커플링 단계에서 사용하였다.
GalNAc 커플링:
900 ㎖ 메탄올, 30 ㎖ 물 및 20.7 ㎖ (119 mmol) N-에틸디이소프로필아민 중의, 이의 나트륨 염으로서 60.0 g (10.3 mmol) AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' (실시예 2A 로부터) 의 미리 형성된 용액을 40-45 ℃ 로 가온시키고, 이전에 제조된 활성화 용액에 1 min 이내에 첨가하였다. 형성된 황색 현탁액을 0.5 h 동안 40-45 ℃ 에서 교반하였다. 황색 현탁액에 100 ㎖ 물을 첨가하고, 현탁액을 유리 섬유 필터 상에서 여과하여, 68.2 % 면적의 LC-순도 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 를 갖는, 이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' 의 투명한 황색 용액을 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6891.3. 이어서, 이것을 실험예 4A 에서 정제하고, 단리하였다.
실시예 3B
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 제조
Figure pat00023
GalNAc 활성화:
112.1 g (75.9 mmol) GalNAc-클러스터-나트륨 염을 640 ㎖ DMF 에 20-25 ℃ 에서 용해시키고, 640 ㎖ DMF 중의 4.48 ㎖ (66.4 mmol, 1.4 eq) aq. 오르토-인산 85 % 의 용액을 2 min 동안 첨가하였다. 5 min 후, 20-25 ℃ 에서, 13.1 g (114 mmol, 2.4 eq) N-히드록시숙신이미드를 약간 탁한 무색 용액에 첨가하고, 이어서 21.8 g (24.8 mmol, 2.4 eq) EDC·HCl (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드-하이드로클로라이드) 을 첨가하였다. 무색의 약간 탁한 용액을 4 h 동안 20-25 ℃ 에서 교반하고, 커플링 단계에서 사용하였다.
GalNac 커플링:
실험예 2B 로부터의 용액, 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 855 g (47.5 mmol) 을 3400 ㎖ 물로 희석시키고, 95.3 ㎖ (546 mmol) N-에틸디이소프로필아민 및 2100 ㎖ DMSO 를 첨가하고, 용액을 40-45 ℃ 로 가온시키고, 이전에 제조된 활성화 용액에 1 min 이내에 첨가하였다. 황색 용액을 0.5 h 동안 40-45 ℃ 에서 교반하여, 미정제 용액 중 HPLC, 46.9 % 면적 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 을 갖는, 이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caG*C*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 를 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6633.3. 이어서, 이것을 실험예 2B 로부터의 2 × 20 개의 유사하게 제조한 1.9 mmol 배치 (2 × 38.0 mmol) 와 함께 정제하고, 실험예 4B1 에서 단리하였다.
실시예 3C:
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 제조.
실험예 2C 의 물질로부터 출발하여, 실시예 3B 와 유사하게 표제 화합물을 제조하였다.
최대 1.5 mmol 생성물, 이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 함유하는 ~275 g 의 황색 용액을 수득하였다. 230 g 의 황색 용액을, ~115 g 의 용액 중량이 될 때까지 40 ℃/50 mbar 에서 회전 증발기로 농축시켰다. 농축된 황색 용액을 20-25 ℃ 로 냉각시키고, 20-25 ℃ 에서 30 min 분 동안 230 ㎖ 1-프로판올에 적하하였다. 형성된 백색 현탁액을 16 시간 동안 20-25 ℃ 에서 교반하고, G3 필터 상에서 여과하였다. 회백색 필터 케이크를 총 50 ㎖ 1-프로판올로 세정하고, 40 ℃/10 mbar 에서 1 시간 동안 건조시켜, HPLC 순도 50.3 % 면적 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 을 갖는, 이의 나트륨 염으로서 9.66 g 미정제 GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 를 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6633.3.
실시예 3D
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 제조.
실험예 2D 의 물질로부터 출발하여, 실시예 3B 와 유사하게 표제 화합물을 제조하였다.
GalNAc 활성화:
2.54 g (1.72 mmol) GalNAc-클러스터-나트륨 염을 24.0 ㎖ DMF 에 20-25 ℃ 에서 용해시키고, 24.0 ㎖ DMF 중의 0.100 ㎖ (1.50 mmol, 1.175eq) aq. 오르토-인산 85 % 의 용액을 2 min 동안 첨가하였다. 5 min 후, 20-25 ℃ 에서, 0.22 g (1.90 mmol, 2.2 eq) N-히드록시숙신이미드를 약간 탁한 무색 용액에 첨가하고, 이어서 0.40 g (2.06 mmol, 2.4 eq) EDC·HCl (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드-하이드로클로라이드) 을 첨가하였다. 무색의 약간 탁한 용액을 3 h 동안 20-25 ℃ 에서 교반하고, 커플링 단계에서 사용하였다.
GalNAc 커플링:
이의 나트륨 염으로서 실험예 2D 로부터의 고체의 4.75 g (0.859 mmol) AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 를 70 ㎖ 물에 용해시키고, 1.70 ㎖ (9.9 mmol) N-에틸디이소프로필아민 및 38 ㎖ DMSO 로 처리하고, 용액을 40-45 ℃ 로 가온시키고, 이전에 제조된 활성화 용액에 1 min 이내에 첨가하였다. 황색 용액을 0.5 h 동안 40-45 ℃ 에서 교반하여, 이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 170 g 용액을 수득하였다. 황색 용액을, 80 g 의 용액 중량이 될 때까지 40 ℃/50 mbar 에서 회전 증발기로 농축시켰다. 농축된 황색 용액을 20-25 ℃ 로 냉각시키고, 20-25 ℃ 에서 30 min 동안 160 ㎖ 1-프로판올에 적하하였다. 형성된 백색 현탁액을 2 시간 동안 20-25 ℃ 에서 교반하고, G3 필터 상에서 여과하였다. 필터 케이크를 총 30 ㎖ 1-프로판올로 세정하고, 40 ℃/20 mbar 에서 1 시간 동안 건조시켜, HPLC 순도 57.2 % 면적 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 을 갖는, 이의 나트륨 염으로서 6.05 g 미정제 GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 를 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6633.3. 이어서, 이것을 실험예 4C 및 실험예 4D 에서 정제하고, 단리하였다.
실시예 3E
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 제조
Figure pat00024
실험예 2G 의 물질로부터 출발하여, 실시예 3B 와 유사하게 표제 화합물을 제조하였다. 15.2 mmol 생성물, 이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 함유하는 ~3500 g 의 수득된 황색 용액을 추가의 정제없이 실험예 4E1 에서 사용하였다.
실시예 3F
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' 의 제조
Figure pat00025
실험예 2H 의 물질로부터 출발하여, 실시예 3B 와 유사하게 표제 화합물을 제조하였다. 최대 15.2 mmol 생성물, 이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' 를 함유하는 ~3500 g 의 수득된 황색 용액을 추가의 정제없이 실험예 4F1 에서 사용하였다.
실시예 3G
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 제조
실험예 2I 의 물질로부터 출발하여, 실시예 3B 와 유사하게 표제 화합물을 제조하였다. 황색 용액을, 4.9 g 의 용액 중량이 될 때까지 40 ℃/50 mbar 에서 회전 증발기로 농축시켰다. 농축된 황색 용액을 20-25 ℃ 로 냉각시키고, 20-25 ℃ 에서 5 min 동안 10 ㎖ 1-프로판올에 적하하였다. 형성된 백색 현탁액을 12 시간 동안 20-25 ℃ 에서 교반하고, G3 필터 상에서 여과하였다. 필터 케이크를 총 5㎖ 1-프로판올로 세정하고, 40 ℃/20 mbar 에서 1 시간 동안 건조시켜, HPLC 순도 57.2 % 면적 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 을 갖는, 이의 나트륨 염으로서 530 ㎎ 미정제 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7793.4.
실시예 4A
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' 의 정제 및 단리
실시예 3A 로부터의 용액을 Tosoh TSK Gel Super Q-5PW 가 패킹된 9 L 컬럼, 30㎛, 2 회 크로마토그래피 실행의 이온 교환 크로마토그래피 (IEX) 에 의해 정제하였다. 1.5 L 의 미정제 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 50 mM NaHCO3 pH 9.0 EtOH 80/20 (이동상 A) 에서 50 mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20 + 1.2 M NaCl (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00026
유속: 0.8 L/min
검출: 290 ㎚
온도: 20-25 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (9 L), 한외 여과 (UF) 에 의해 농축시켰다.
UF 를 2 × 0.57 (Millipore 로부터의 1.14 ㎡ Pellicon2 3kD 막) 상에서 수행하였다. 9 L 의 용액을 약 3 L 로 농축시키고, 20 L 물로 Amicon SP 20 UF 장치 상에서 정용 여과하여, 투과액의 최종 전도도를 35 μS/㎝ 로 하였다.
상기 용액을 리오가드 트레이 내의 Lyostar II 동결 건조기 상에서 하나의 동결 건조 주기로 동결 건조시켜, 43 g 건조 백색 분말을 수득하였다. 21-22 ℃ 및 38-42 % 상대 습도에서 4 일 동안 조건화시킨 후, 이의 나트륨 염으로서 총 46.4 g 의 GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' 를, 12.7 % 의 물 함량 및 90.2 % 순도 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 를 갖는 백색 비정질 분말로서 단리하였다.
링커 도메인의 2D-1H/13C-NMR 분광학의 도움으로, ~64 % 내지 ~36 % 의 에피머 비율 GN2a 대 GN2b (17 페이지 참조) 를 검출하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6891.3.
실시예 4B1
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' 의 정제
실시예 3B 로부터의 용액을 Tosoh TSK Gel Super Q-5PW 가 패킹된 9 L 컬럼, 30㎛, 47 회 크로마토그래피 실행의 IEX 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 0.4 L 의 미정제 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 50 mM NaHCO3 pH 9.0 EtOH 80/20 (이동상 A) 에서 50 mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20 + 1.2 M NaCl (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00027
유속: 0.8 L/min
검출: 290 ㎚
온도: 20-25 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (220 L), 한외 여과 (UF) 에 의해 농축시켰다.
UF 를 2 × 0.57 (Millipore 로부터의 1.14 ㎡ Pellicon2 3kD 막) 상에서 수행하였다. 220 L 의 용액을 약 3 L 로 농축시키고, 20 L 물로 Amicon SP 20 UF 장치 상에서 정용 여과하여, 투과액의 최종 전도도를 <50 μS/㎝ 로 하였다.
생성된 농축물은 직접 동결 건조시킬 수 있거나 (3-단계 공정), 또는 실시예 4B2 에서 기술하는 바와 같이 역상 크로마토그래피 (RP) 로 추가로 정제할 수 있다.
상기로부터의 용액을 2 개의 리오가드 트레이 내의 Lyostar II 동결 건조기 상에서 하나의 동결 건조 주기로 동결 건조시켜, 174 g 건조 백색 분말을 수득하였다.
21 ℃ 및 50 % 상대 습도에서 2 일 동안 조건화시킨 후, 이의 나트륨 염으로서 총 203.9 g 의 GN2-AM-C6*-5'-A*A*T*g*c*t*a*c*a*a*a*a*c*MeC*MeC*A-3' 를, 16.2 % 의 물 함량 및 89.0 % 면적의 순도 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 를 갖는 백색 비정질 분말로서 단리하였다. 링커 도메인의 2D-1H/13C-NMR 분광학의 도움으로, ~43.9 % 내지 ~56.1 % 의 에피머 비율 GN2a 대 GN2b (17 페이지 참조) 를 검출하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6633.3.
실시예 4B2
실시예 4B1 로부터의 1.6 g 의 동결 건조된 분말을 역상 크로마토그래피 (RP) 를 사용하여 추가로 정제하였다.
상기 물질을 16 ㎖ 0.2 M 나트륨 아세테이트에 용해시키고, YMC Triart prep C8-S, 10 ㎛ 250 × 30 ㎜ 컬럼 상에서 2 회 크로마토그래피 실행으로 분리하였다. 8 ㎖ 의 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 0.2 M 나트륨 아세테이트 (이동상 A) 에서 아세토니트릴 (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00028
유속: 30 mL/min
검출: 290 ㎚
온도: 20-25 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고, 농축시키고, Amicon Ultra-15 원심 분리 필터, 3kD 상에서 한외 여과 (UF) 에 의해 정용 여과하였다. 생성된 농축물을 동결 건조시켜, 실시예 4B1 에서 기술한 분석 방법으로 측정한 93.9 % a/a 의 순도를 갖는, 0.9 g 백색 비정질 분말을 수득하였다.
실시예 4C
크로마토그래피 정제의 순서는 상호 교환 가능하다. 역상 크로마토그래피 (RP), 이어서 이온 교환 크로마토그래피 (IEX) 로 시작하는 정제는, 먼저 IEX 및, 이어서 RP 크로마토그래피를 수행할 때와 동일한 수율 및 순도를 제공한다.
제 1 크로마토그래피 - RP: 실험예 3D 로부터의 1 g 을 10 ㎖ 0.2 M 나트륨 아세테이트에 용해시키고, YMC Triart prep C18-S, 10㎛ 250 × 4.6 ㎜ 컬럼 상에서 50 회 크로마토그래피 실행으로 역상 (RP) 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 0.2 ㎖ 의 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 0.2 M 나트륨 아세테이트 (이동상 A) 에서 아세토니트릴 (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00029
유속: 0.7 mL/min
검출: 310 ㎚
온도: 45 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (250㎖), 농축시키고 (150㎖), 0.1 ㎡ Millipore Pellicon II 막 (3 kDa) 이 장착된 GE 직교류 장치 상에서 한외 여과 (UF) 에 의해 1.5 L 물로 정용 여과하였다. 생성된 농축물을 동결 건조시켜, 실시예 4B1 에서 기술한 분석 방법으로 측정한 91.3 % a/a 의 순도를 갖는, 0.375 g 백색 비정질 분말을 수득하였다.
제 2 크로마토그래피 - IEX: 0.355 g 의 이 물질을 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 상기 물질을 10 ㎖ 50 mM 중탄산 나트륨 pH 9.0/EtOH 80/20 에 용해시키고, Tosoh TSK Gel Super Q-5PW 가 패킹된 컬럼, 30 ㎛ (10 × 220 ㎜), 50 mM NaHCO3 pH 9.0 EtOH 80/20 (이동상 A) 에서 50 mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20 + 1.2 M NaCl (이동상 B) 로의 선형 구배로 11 회 실행에서 정제하였다.
구배:
Figure pat00030
유속: 1.3 mL/min
검출: 300 ㎚
온도: 30 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (150 ㎖), 0.1 ㎡ Millipore Pellicon II 막 (3 kDa) 이 장착된 GE 직교류 장치 상에서 한외 여과 (UF) 에 의해 1.5 L 물로 정용 여과하였다. 생성된 농축물을 동결 건조시켜, 실시예 4B1 에서 기술한 분석 방법으로 측정한 92.8 % a/a 의 순도를 갖는, 0.246 g 백색 비정질 분말을 수득하였다.
실시예 4D
제 1 크로마토그래피 - IEX: 실험예 3D 로부터의 1 g 을 10 ㎖ 0.2 M 나트륨 아세테이트에 용해시키고, Tosoh TSK Gel Super Q-5PW 가 패킹된 컬럼, 30 ㎛ (10 × 220 ㎜), 50 mM NaHCO3 pH 9.0 EtOH 80/20 (이동상 A) 에서 50 mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20 + 1.2 M NaCl (이동상 B) 로의 선형 구배로 34 회 실행에서 정제하였다.
구배:
Figure pat00031
유속: 1.3 mL/min
검출: 300 ㎚
온도: 30 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (250 ㎖), 농축시키고 (150 ㎖), 0.1 ㎡ Millipore Pellicon II 막 (3 kDa) 이 장착된 GE 직교류 장치 상에서 한외 여과 (UF) 에 의해 1.5 L 물로 정용 여과하였다. 생성된 농축물을 동결 건조시켜, 실시예 4B1 에서 기술한 분석 방법으로 측정한 87.7 % a/a 의 순도를 갖는, 0.292 g 백색 비정질 분말을 수득하였다.
제 2 크로마토그래피 - RP: 0.272 g 의 상기 물질을 3 ㎖ 0.2 M 나트륨 아세테이트에 용해시키고, YMC Triart prep C18-S, 10 ㎛ 250 × 4.6 ㎜ 컬럼 상에서 18 회 크로마토그래피 실행으로 역상 (RP) 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 0.18 ㎖ 의 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 0.2 M 나트륨 아세테이트 (이동상 A) 에서 아세토니트릴 (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00032
유속: 0.7 mL/min
검출: 310 ㎚
온도: 45 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (150 ㎖), 0.1 ㎡ Millipore Pellicon II 막 (3 kDa) 이 장착된 GE 직교류 장치 상에서 한외 여과 (UF) 에 의해 1.5 L 물로 정용 여과하였다. 생성된 농축물을 동결 건조시켜, 실시예 4B1 에서 기술한 분석 방법으로 측정한 93.7 % a/a 의 순도를 갖는, 0.19 g 백색 비정질 분말을 수득하였다.
실시예 4E1
실시예 3E 로부터의 용액을 Tosoh TSK Gel Super Q-5PW 가 패킹된 9 L 컬럼, 30 ㎛, 8 회 크로마토그래피 실행의 IEX 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 0.3-0.38 L 의 미정제 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 50 mM NaHCO3 pH 9.0 EtOH 80/20 (이동상 A) 에서 50 mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20 + 1.2 M NaCl (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00033
유속: 0.8 L/min
검출: 294 ㎚
온도: 20-25 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (48 L), 한외 여과 (UF) 에 의해 농축시켰다.
Sartorius 로부터의 2 × 0.1 ㎡ Sartocon Slice Hydrosart 막 상에서 UF 를 수행하였다. 48 L 의 용액을 1.4 L 로 농축시키고, GE 직교류 UF 장치 상에서 물로 정용 여과하여, 투과액의 최종 전도도를 <50 μS/㎝ 로 하였다.
상기 용액을 하나의 리오가드 트레이 내의 Lyostar II 동결 건조기 상에서 하나의 동결 건조 주기로 동결 건조시켜, 51 g 건조 백색 분말을 수득하였다. 21 ℃ 및 50 % 상대 습도에서 2 일 동안 조건화시킨 후, 이의 나트륨 염으로서 총 60.5 g 의 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를, 15.7 % 의 물 함량 및 85.4 % 면적의 순도 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 를 갖는 백색 비정질 분말로서 단리하였다. 링커 도메인의 2D-1H/13C-NMR 분광학의 도움으로, ~50.8 % 내지 ~49.2 % 의 에피머 비율 GN2a 대 GN2b (17 페이지 참조) 를 검출하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7793.4.
실시예 4E2
실시예 4E1 로부터의 0.5 g 의 동결 건조된 분말을 RP 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제하였다.
상기 물질을 3.3 ㎖ 0.2 M 나트륨 아세테이트에 용해시키고, YMC Triart prep C8-S, 10 ㎛ 250 × 4.6 ㎜ 컬럼 상에서 33 회 크로마토그래피 실행으로 분리하였다. 0.1 ㎖ 의 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 0.2 M 나트륨 아세테이트 (이동상 A) 에서 아세토니트릴 (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00034
유속: 0.7 mL/min
검출: 290 ㎚
온도: 45 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (100 ㎖), 물로 희석시키고 (400 ㎖), 농축시키고 (150 ㎖), Sartorius 로부터의 2 × 0.1 ㎡ Sartocon Slice Hydrosart 막이 장착된 GE 직교류 장치 상에서 한외 여과 (UF) 에 의해 1.5 L 물로 정용 여과하였다. 생성된 농축물을 동결 건조시켜, 실시예 4E1 에서 기술한 분석 방법으로 측정한 91.9 % a/a 의 순도를 갖는, 0.29 g 백색 비정질 분말을 수득하였다.
실시예 4E3
실시예 4E1 과 유사하게, 85.4 % a/a 의 순도를 갖는, 5.0 g 의 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 제조하고, 정제하였다. 이어서, 상기 물질을 실시예 4E2 와 유사하게, RP 크로마토그래피, UF 로 추가로 정제하고, 동결 건조를 통해 단리하여, 89.8 % a/a 의 순도를 갖는, 2.5 g 의 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 수득하였다. 상기 물질을 50 ㎖ 물에 용해시킨 후, 무색 용액을 Procept 분무 건조기 (120 ℃) 상에서 분무 건조시켜, 실시예 4E1 에서 기술한 분석 방법으로 측정한 89.5 % a/a 의 순도를 갖는, 1.8 g 의 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 수득하였다. LC/MS, NMR 및 EA (원소 분석) 기술에 의한 분석적 뒷받침은, 분무 건조 동안에 물질이 (부분) 분해되는 것을 발견하지 못했다. 그 결과, IEX 및/또는 RP 크로마토그래피 및 후속 UF 후의 물질 단리는 분무 건조 또는 동결 건조를 통해 수행될 수 있다.
실시예 4E4
55.4 % a/a 의 순도를 갖는 미정제 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 용액 (7.2 ㎖) - 실시예 3E 와 유사하게 제조함 - 을 14.4 ㎖ 0.2 M 나트륨 아세테이트로 희석시키고, YMC Triart C8 prep 120, 10 ㎛ 250 × 4.6 ㎜ 컬럼 상에서 36 회 크로마토그래피 실행으로 정제하였다. 이에 따라, 0.6 ㎖ 분획의 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 0.2 M 나트륨 아세테이트 (이동상 A) 에서 아세토니트릴 (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00035
유속: 0.7 mL/min
검출: 300 ㎚
온도: 45 ℃
표적 분획을 모으고 (50 ㎖), GE 직교류 UF 장치 상의 Sartorius 로부터의 0.1 ㎡ Sartocon Slice Hydrosart 막 상에서 한외 여과에 의해 농축시키고, 물로 정용 여과하여, 투과액의 최종 전도도를 <50 μS/㎝ 로 하였다. 용액을 동결 건조시켜, 실시예 4E1 에서 기술한 분석 방법으로 측정한 87.6 % a/a 의 순도를 갖는, 120 ㎎ 의 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 수득하였다.
실시예 4F1
실시예 3F 로부터의 용액을 Tosoh TSK Gel Super Q-5PW 가 패킹된 9 L 컬럼, 30 ㎛, 8 회 크로마토그래피 실행의 IEX 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 0.35 L 의 미정제 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 50 mM NaHCO3 pH 9.0 EtOH 80/20 (이동상 A) 에서 50 mM NaHCO3 pH 9.0/EtOH 80/20 + 1.2 M NaCl (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00036
유속: 0.8 L/min
검출: 294 ㎚
온도: 20-25 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (29 L), 한외 여과 (UF) 에 의해 농축시켰다.
Sartorius 로부터의 2 × 0.1 ㎡ Sartocon Slice Hydrosart 막 상에서 UF 를 수행하였다. 29 L 의 용액을 3.2 L 로 농축시키고, GE 직교류 UF 장치 상에서 물로 정용 여과하여, 투과액의 최종 전도도를 <50 μS/㎝ 로 하였다.
상기 용액을 2 개의 리오가드 트레이 내의 Lyostar II 동결 건조기 상에서 하나의 동결 건조 주기로 동결 건조시켜, 43 g 건조 백색 분말을 수득하였다.
21 ℃ 및 50 % 상대 습도에서 2 일 동안 조건화시킨 후, 이의 나트륨 염으로서 총 50.2 g 의 GN2-AM-C6-5'-caMeC*T*A*a*t*t*g*t*a*g*t*-a*g*t*a*MeC*T*MeC-3' 를, 16.4 % 의 물 함량 및 85.0 % 면적의 순도 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민) 를 갖는 백색 비정질 분말로서 단리하였다. 링커 도메인의 2D-1H/13C-NMR 분광학의 도움으로, ~49.3 % 내지 ~50.7 % 의 에피머 비율 GN2a 대 GN2b (17 페이지 참조) 를 검출하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 8184.4.
실시예 4F2
실시예 4F1 로부터의 0.5 g 의 동결 건조된 분말을 RP 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제하였다.
상기 물질을 3.3 ㎖ 0.2 M 나트륨 아세테이트에 용해시키고, YMC Triart prep C8-S, 10 ㎛ 250 × 4.6 ㎜ 컬럼 상에서 33 회 크로마토그래피 실행으로 분리하였다. 0.1 ㎖ 의 용액을 각각의 실행에서 적용하고, 0.2 M 나트륨 아세테이트 (이동상 A) 에서 아세토니트릴 (이동상 B) 로의 선형 구배로 용출시켰다.
구배:
Figure pat00037
유속: 0.7 mL/min
검출: 290 ㎚
온도: 45 ℃
용출 프로파일에 따라서 분획을 수집하였다. 분획을 모으고 (100 ㎖), 물로 희석시키고 (400 ㎖), 농축시키고 (150 ㎖), Sartorius 로부터의 2 × 0.1 ㎡ Sartocon Slice Hydrosart 막이 장착된 GE 직교류 장치 상에서 한외 여과 (UF) 에 의해 정용 여과하였다 (1.5 L 물). 생성된 농축물을 동결 건조시켜, 실시예 4F1 에서 기술한 분석 방법으로 측정한 91.9 % a/a 의 순도를 갖는, 0.29 g 백색 비정질 분말을 수득하였다.
실시예 5
이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 합성
단계 1: 이의 디에틸암모늄 염으로서 CF3CO-AM-C6-5'c(bz)a(bz) MeC(bz)*MeC(bz)*G(dmf)*t*a(bz)*t*t*t*a(bz)*a(bz)*c(bz)*a(bz)*t*c(bz)*A(bz)*G(dmf)*A(bz)-3'-UnyLinker 의 제조
명명법: A,G,T, Me C (5-메틸 시토신) = LNA; a,t,c,g = DNA; * = 부분 입체 이성질체 혼합물로서 포스포르티오에이트; AM-C6 = 아미노링커 C6; GN2 = GalNAc-클러스터; CF 3 CO = TFA = 트리플루오로아세틸; bz = 벤조일; ibu = 이소부티릴; dmf = 디메틸포름아미딘
AEKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 Primer Support UnyLinker (Kinovate Nittophase®HL UnyLinker™400, USA) 를 사용하여, 1.90 mmol 의 규모로 고체 상에서 표준 포스포르아미다이트 화학에 의해 표제 화합물을 제조하였다. 상응하는 포스포르아미다이트 및 TFA-보호된-아미노링커-포스포르아미다이트 (Link Technologies, Scotland, UK) 를 사용하여, LNA, 즉, 2'-OCH2-4' 브릿지된 뉴클레오티드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 및 DNA 뉴클레오시드 단량체 (Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany) 를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 일반적으로, 커플링 당 1.5 eq 의 DNA/LNA-포스포르아미다이트 및 2.0 eq 의 TFA-아미노링커-포스포르아미다이트를 사용하였다. 포스포로티올화 시약 (Xanthanhydride), 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온 (ABCR, AB251827) 을 무수 아세토니트릴/피리딘 1/1 중의 0.1 M 용액으로서 사용하였다. 모든 다른 표준 시약 용액 (DCA-debloc, BTT, Cap A, B1, B2, 산화제, DEA wash) 은 상업적으로 입수 가능하였다 (Sigma-Aldrich, Merck Millipore, EMP Biotech; 아래 세부 정보 참조). 무수 아세토니트릴 중의 디에틸아민 (DEA-wash) 으로 세정하여 2-시아노에틸기의 탈보호를 달성함으로써, 미정제 보호된 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 디에틸암모늄 염으로서 수득하였다. 이와 같이 수득된 표제 화합물을 추가의 작업없이 실험 2 에서 사용하였다.
표준 시약 용액
DCA-deblock 톨루엔 중의 3 % 디클로로아세트산 (v/v)
BTT 활성화제 아세토니트릴 중의 0.3 M 5-벤질티오테트라졸
Cap A 아세토니트릴 중의 20 % 1-메틸이미다졸 (v/v)
Cap B1 아세토니트릴 중의 40 % 아세트산 무수물 (v/v)
Cap B2 아세토니트릴 중의 60 % 피리딘 또는 2,6-루티딘 (v/v)
산화제 0.05 M 물/피리딘/요오드 10/90/1.27 (v/v/w)
티올화 피리딘/MeCN 1:1 (v/v) 중의 0.1 M 3-아미노-1,2,4-디티아졸-5-티온
DEA wash 아세토니트릴 중의 20 % 디에틸아민 (v/v)
단계 2: 이의 나트륨 염으로서 AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 제조
실험 1 로부터의, 이의 디에틸암모늄 염으로서 미정제 중합체-지지체 결합된 UnyLinker-LNA-올리고-뉴클레오티드를 180 ㎖ conc. aq. 수산화 암모늄 용액 30-32 % 로 처리하였다. 현탁액을 압력 안정 밀폐 플라스크 내에서 10 시간 동안 60 ℃ 에서 교반하였다. 현탁액을 유리 섬유 필터 상에서 여과하고, 60 ㎖ 물로 세정하였다. 황색 여과액을 40 ℃/300-10 mbar/2 h 에서 증발시켜, ~14.5 g 미정제 올리고를 암모늄 염으로서 수득하였다. 생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Dedector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6362.1. 총 51 개의 유사하게 제조한 1.9 mmol 배치 및 2 개의 3.8 mmol 배치를 상기의 것과 합하고 (총 새로운 배치 크기: 106.7 mmol), 둥근 바닥 플라스크 내에서 4.0 L 물에 용해시켰다. 주황색 용액을 189 ㎖ 10.8 M NaOH (2.04 mol, 19.1 eq) 로 처리하였다. 침전된 고체를 여과 제거하고, 200 ㎖ 물로 세정하고, 여과액을 40 ℃/200-60 mbar 에서 농축시켜 ~1.5 ㎏ 미정제 용액을 수득하고, 이것을 2 L 물로 처리하고, 동일한 부피를 진공 40 ℃/50 mbar 에서 증류 제거하였으며, 이 절차를, 증류액이 암모니아의 부재를 나타내는 pH 7-7.5 에 도달할 때까지 반복하였다. 현탁액을 물로 희석시켜 10 ㎏ 의 현탁액을 수득하고, 이것을 다시 여과하고, 고체를 200 ㎖ 의 물로 세정하여, 9.67 ㎏ 의 갈색 용액 (이론적인 7.4 % 의 미정제 생성물 (w/w) 을 함유함) 을 수득하였으며, 이것을 추가의 정제없이 여러 배치에서 사용하였다.
단계 3: 이의 나트륨 염으로서 1, RO7191863-001, GN2-AM-C6-5'caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 제조
GalNAc 활성화:
82.6 g (55.9 mmol) GalNAc-클러스터-나트륨 염을 600 ㎖ DMF 에 20-25 ℃ 에서 용해시키고, 600 ㎖ DMF 중의 3.3 ㎖ (48.9 mmol, 1.13 eq) aq. 인산 85 % 의 용액을 2 min 동안 첨가하였다. 5 min 후, 20-25 ℃ 에서, 9.66 g (83.9 mmol, 1.94 eq) N-히드록시숙신이미드를 무색 용액에 첨가하고, 이어서 16.1 g (84 mmol, 1.94 eq) EDC·HCl (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드-하이드로클로라이드)1 를 첨가하였다. 무색의 약간 탁한 용액을 4 h 동안 20-25 ℃ 에서 교반하고, 커플링 단계에서 사용하였다.
GalNAc 커플링:
이의 나트륨 염으로서 292 g (43.3 mmol) AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 이론적으로 함유하는 실험예 2 로부터의 3.95 ㎏ 의 용액에, 70.3 ㎖ (402 mmol) N-에틸디이소프로필아민 및 1.98 L DMSO 를 첨가하고, 용액을 40-45 ℃ 로 가온시키고, 상기로부터의 활성화된 GalNAc 용액에 1 min 이내에 첨가하였다. 황색 용액을 0.5 h 동안 40-45 ℃ 에서 교반하여, 이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 미정제 용액을 수득하였다. HPLC 는 미정제 용액에서 56.5 % 면적을 나타냈다 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 260 ㎚, 구배 A: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민, B: 물/CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/트리에틸아민).
이 용액을 정제할 때까지 4 ℃ 에서 보관하였다. 보관 시, 잔류 벤즈아미드의 침전이 발생하였으며, 이것을 정제 전에 여과 제거하였다. 이 절차를 동일한 규모로 한번 및 절반 규모로 한번 반복하고, 3 개의 개별 반응 혼합물을 정제를 위해 합하였다.
단계 4: 이의 나트륨 염으로서 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 의 정제 및 단리
GalNAc 커플링 반응으로부터 수득된 용액을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 15 ㎝ ID DAC 컬럼을 2.5 ㎏ YMC Triart prep C8-S 로 80 bar 컬럼 압력으로 패킹하였다. 공급 용액은, 미정제 커플링 반응물을 0.2 M 나트륨 아세테이트 용액 50/50 v/v 로 희석시키고, 구배 용출 (주입: 400 ㎖ 공급 용액. 구배: A: 0.2 M 나트륨 아세테이트, B: 아세토니트릴) 에 의해 77 회 실행으로 완전히 분리하여 제조하였다.
구배:
Figure pat00038
표적 피크의 용출 후 구배를 중단하였다.
유속: 700 mL/min
검출: 300 ㎚
온도: 45 ℃
크로마토그램은 구배 및 분획 커트를 나타낸다. 주요 표적 분획은 c4 와 c5 사이에서 수집하였으며, 사이드 분획은 다른 커트 사이에서 수집하였다.
모든 분획은 풀에서 수집하였다.
c2 와 c3 사이에서 수집한 풀 1 은 제거하였으며, 다른 풀은 2 × Pellicon 3 Kassetten 0.57 ㎡ 상에서 한외 여과에 의해 농축 및 탈염시켰다.
농축: 입구 압력: 3.0 bar; 출구 압력: 0.5 bar; 투과 흐름: 200 ㎖/min
탈염: 입구 압력: 3.0 bar; 출구 압력: 0.5 bar; 투과 흐름: 50 ㎖/min
70 L 의 주요 표적 풀을 3 L 로 농축시키고, <100 μS/㎝ 의 전도도로 정용 여과하고, 2 개의 리오가드 내에서 동결 건조시켜, 188 g 의 동결 건조된 분말 (88.70 % a/a) 을 수득하였다. 그러나, 최종 농도에서, 상기 물질은 막을 통과하기 시작하였다.
사이드 분획 풀을 합하고, 이전과 같이 농축 및 정용 여과하고, 별도로 동결 건조시켜, 120 g 동결 건조된 분말 (88.62 % a/a) 을 수득하였다.
균일한 물질을 수득하기 위해서, 두 배치를 합하고, 3 L 의 물에 용해시키고, 다시 동결 건조시켜, 305 g 동결 건조된 분말 (88.80 % a/a) 을 수득하였다.
상기 물질은 흡습성이 높기 때문에, 중량이 일정하게 될 때까지, 리오가드를 기후 챔버 내에서 21 ℃ 및 50 % 상대 습도에서 동결 건조시킨 후에 조건화시켰으며, 이는 48 시간 후에 달성되었다.
조건화 후, 90.35 % 순도 및 16 % 의 물 함량을 갖는, 이의 나트륨 염으로서 총 355 g 의 GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*A*G*A*MeC-3' 를 30.7 % 의 전체 수율로 단리하였다. 생성물의 순도는 HPLC (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity Series LC129; 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜; 컬럼 온도: 80 ℃; 샘플러 온도: 15 ℃; 유속: 0.4 mL/min; 검출: 210 ㎚ / 260 ㎚; 이동상 A: 200 mM 헥사플루오로-2-프로판올 + 5 mM 헥실아민 + 4 mM 트리에틸아민 + 40 μL H3PO4; 이동상 B: 90 % MeOH / 10 % 아세토니트릴) 로 결정하였다.
구배:
Figure pat00039
생성물의 확인은 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ Detector H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1 × 50 ㎜, 구배 A: 95 % 물/2.5 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5 % 물/80 % CH3OH/0.2 M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7793.4.
SEQUENCE LISTING <110> F.Hoffmann-La Roche Ltd <120> Downstream Process for GalNAc oligonucleotide conjugates <130> Case 33656-WO-1 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Sequence <400> 1 aatgctacaa aaccccca 18 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Sequence <400> 2 cagcgtaaag agagg 15 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Sequence <400> 3 cacctattta acatcagac 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Sequence <400> 4 cactaattgt agtagtactc 20

Claims (10)

  1. 하기의 단계를 포함하는 GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법:
    a) 고체 상 지지체에 결합된 디-C1-4-알킬아민 염의 형태의 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계;
    b) 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 절단하고, 수성 암모니아의 존재하에서 보호기를 제거함으로써, 비-보호된 올리고뉴클레오티드의 암모늄 염을 제공하는 단계;
    c) 알칼리 금속 수산화물로, 올리고뉴클레오티드의 암모늄 염으로부터 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염으로의 염 교환 변화를 수행함으로써, 임의의 유리 암모니아 또는 잔류 지방족 아민을 제거하는 단계;
    여기에서, 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염의 수용액이 형성되고,
    하기에 의해서, 수용액으로부터 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염의 단리가 일어남:
    a1) 물의 증발, 및 유기 용매의 도움으로, 잔류하는 물의 후속 공비 제거 또는
    b1) 증기 상의 pH 가 pH 7 에 도달할 때까지, 연속적인 부분 증발 (일정한 부피 및 물의 첨가에 의함) 또는
    c1) 알칼리 금속 염 수용액에 대한 접선 흐름 여과 또는
    d1) 음이온-교환 크로마토그래피, 이어서 접선 흐름 여과를 통한 탈염 및 농축
    d) 올리고뉴클레오티드의 알칼리 금속 염을 하기 화학식 I 의 GalNAc 클러스터 화합물, 이의 상응하는 염, 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체와 커플링시키는 단계,
    Figure pat00040

    (식 중, R2 는 수소 또는 히드록시 보호기이고, n 은 0 내지 10 의 정수이다) 및 마지막으로
    e) GalNAc-클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체를 정제하는 단계로서, 하기 순서의 단계를 포함하는 단계:
    I. 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피
    II. 접선 흐름 여과
    III. 동결 건조 또는 분무 건조
    또는
    I. 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피
    II. 접선 흐름 여과
    III. 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피
    IV. 접선 흐름 여과
    V. 동결 건조 또는 분무 건조, 그리고
    여기에서, 올리고뉴클레오티드가 DNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이의 조합으로 이루어지며, 10 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이인 5' 아미노-변성 올리고뉴클레오티드이고,
    5' 아미노-변성제가 임의로 아미노기 보호되는 아미노 C2-12-알킬 링커 또는 1 내지 10 개의 에틸렌 글리콜 단위를 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 링커에서 선택됨.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 a) 에서 디-C1-4-알킬아민 염이 디에틸 아민 염인 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 화학식 I 의 GalNAc 클러스터 화합물이 하기 화학식 Ia 의 알칼리 금속 염인 제조 방법:
    Figure pat00041

    (식 중, M+/++ 는 알칼리 금속의 양이온이다).
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 알칼리 금속이 나트륨인 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d) 에서의 올리고뉴클레오티드와 GalNAc 클러스터 화합물 또는 이의 염의 커플링이, 제 1 단계에서 커플링제에 의한 GalNAc 클러스터 화합물의 활성화, 및 제 2 단계에서 아민 염기 및 유기 용매의 존재하에서, 활성화된 GalNAc 클러스터 화합물과 올리고뉴클레오티드의 커플링을 포함하는 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 커플링제가 DCC (N,N'-디시클로헥실카르보디이미드), EDC (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드-하이드로클로라이드), TBTU (N,N,N',N'-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트) 또는 HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 에서 선택되는 커플링제와, HOBt (1-히드록시벤즈트리아졸), HOSu (N-히드록시숙신이미드) 또는 HOAt (1-히드록시-7-아자벤조트리아졸) 에서 선택되는 첨가제의 조합인 제조 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 아민 염기가 3 차 아민이고, 유기 용매가 극성 비양성자성 용매이며, 반응 온도가 20 ℃ 내지 70 ℃ 의 범위인 제조 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 커플링제가 3 차 아민과 함께, n-프로필포스폰산 무수물 (T3P) 또는 3-(디에톡시-포스포릴옥시)-1,2,3-벤조[d]트리아진-4(3H)-온 (DEPBT) 인 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 하기에서 선택되는 제조 방법:
    Figure pat00042

    (여기에서, AM-C6 은 C6 아미노 링커를 의미하고; * 는 포스포르티오에이트 브릿지를 나타내며; A,G,T 및 MeC (5-메틸 시토신) 는 LNA 뉴클레오시드 단량체이고, a,t,c,g 는 DNA 뉴클레오시드 단량체이다).
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체가 하기에서 선택되는 제조 방법:
    Figure pat00043

    (여기에서, AM-C6 은 C6 아미노 링커를 의미하고; * 는 포스포르티오에이트 브릿지를 나타내며; A,G,T 및 MeC (5-메틸 시토신) 는 LNA 뉴클레오시드 단량체이고, a,t,c,g 는 DNA 뉴클레오시드 단량체이며, GN2 는 GalNAc 클러스터이다).
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