KR20200113206A - GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법 - Google Patents

GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 커플링제로서 O-디카르복스이미도우로늄 염의 존재 하에서 올리고뉴클레오티드와 하기 화학식의 GalNAc 클러스터 화합물 또는 이의 상응하는 염, 거울상이성질체 및/또는 입체이성질체를 커플링시키는 단계를 포함하는, GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 위한 방법을 포함한다:

Description

GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법
본 발명은 커플링제로서 O-디카르복스이미도우로늄 염의 존재 하에서 올리고뉴클레오티드와 하기 화학식의 GalNAc 클러스터 화합물 또는 이의 상응하는 염, 거울상이성질체 및/또는 입체이성질체의 커플링 단계를 포함하는 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 위한 방법에 관한 것이다:
[화학식 I]
Figure pct00001
대체로 커플링 과정은 아민 및 카르복실산 간 펩티드 연결의 형성에 대해 충분히 공지되고 광범위하게 기술된 방법을 따르며 보통은 카르복실산의 활성화 및 아민과의 후속 커플링을 포함한다.
GalNAc 클러스터 및 올리고뉴클레오티드의 커플링 반응은 또한 당분야에서 충분히 설명되어 있다. 보다 최근의 예시적인 공보는 미국 특허 출원 공개 공보 제2011/0207799호, 실시예 11에서 공개된 미국 특허 출원을 언급하는 PCT 공개 공보 WO2017/021385 또는 PCT 공개 공보 WO2018/215391이다.
최신 방법은 보통 디이미드 커플링 시약 예컨대 DCC, DIC 또는 EDC 또는 포스포늄 염 예컨대 PyBOP를 사용하고, 유기 염기의 추가 사용을 필요로 하며, 전형적으로 극성, 비양자성 용매 예컨대 DMF 또는 DMSO에서 수행된다. 올리고뉴클레오티드의 커플링은 수성 조건을 선호하므로, 최신 조건은 적용하는 것이 바람직하지 않다.
또한, 이들 시약의 사용은 활성화 이전에 GalNAc의 금속 염의 양자화를 필요로 한다. 이러한 목적에 가장 유리한 산은 H3PO4 인 것으로 확인되었다. 그러나, H3PO4 의 사용은 접합된 생성물의 GalNAc 당 유닛의 인산화를 초래한다는 것이 관찰되었다. 이들 인산화된 부산물은 일반적인 정제 방법으로는 분리할 수 없다.
최신 방법은 실험실 규모의 합성을 위한 요건을 충족한다. GalNAc 올리고뉴클레오티드가 임상 단계에 진입하는 유망한 약물 후보가 되려면, 보다 효율적이고, 보다 경제적이며 상업적으로 적용가능한 더 큰 규모의 제조 방법이 요구된다.
특히, 인산화된 부산물을 피하기 위해 H3PO4 에 의한 GalNAc의 금속염의 사전 양자화를 요구하지 않는 방법이 바람직하다.
뿐만 아니라, 제한된 올리고뉴클레오티드의 완전한 접합을 보장하기 위해 일반적으로 3배 이상 과량으로 적용되는 과량의 GalNAc 클러스터를 최소화시킬 필요가 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 특히 활성화 및 커플링 단계 둘 모두에 대한 반응 조건 및 매개변수를 최적화하고 부산물 형성을 최소화하기 위해서, 당분야에 공지된 방법을 실질적으로 개선시키는 것이었다.
본 발명의 목적은 커플링제로서 O-디카르복스이미도우로늄 염의 존재 하에서 올리고뉴클레오티드와 하기 화학식의 GalNAc 클러스터 화합물 또는 이의 상응하는 염, 거울상이성질체 및/또는 입체이성질체의 커플링 단계를 포함하는, GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 위한 신규한 방법에 의해 도달할 수 있다는 것을 발견하였다:
[화학식 I]
Figure pct00002
하기 정의는 본 명세서에서 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 다양한 용어의 의미 및 범주를 예시하고 정의하기 위해 기재된다.
키랄 탄소가 화학 구조에 존재할 때마다, 그 키랄 탄소와 연관된 모든 입체이성질체는 순수 입체이성질체를 비롯하여 이의 혼합물로서 구조에 포괄하고자 한다.
용어 "알킬"은 1개 내지 12개 탄소 원자의 1가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 기를 의미한다. 특정 실시형태에서, 알킬은 1개 내지 7개 탄소 원자, 보다 특정한 실시형태에서 1개 내지 4개 탄소 원자를 갖는다. 알킬의 예에는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸을 포함한다.
유사하게 용어 "C2-12-알킬"은 2개 내지 12개 탄소 원자, 보다 특정한 실시형태에서 4개 내지 8개 탄소 원자의 1가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 기를 의미한다. 알킬의 예에는 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸 및 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실 및 도데실 및 이의 이성질체가 포함된다.
용어 "히드록시-보호기" 및 용어 "에스테르 보호기"는 히드록시 기를 보호하고자 하는 기를 의미하고 에스테르- 및 에테르-형성기, 특히 테트라히드로피라닐, 아실 기, 카바모일, 벤질 및 실릴에테르 (예를 들어, TBS, TBDPS) 기를 포함한다. 이들 기의 추가 예는 [T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapters 2-3]; [E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5], 및 [T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981]에서 확인할 수 있다. 바람직하게는 아실 기, 특히 C1-12-알킬카르보닐 기, 보다 특히 C1-6-알킬 또는 페닐에 의해 임의로 치환되는 C1-6-알킬카르보닐 기이다. 보다 바람직한 히드록시 보호기는 아세틸, 피발로일 또는 벤조일로부터 선택될 수 있고, 그리하여 아세틸이 가장 바람직한 히드록시 보호기이다.
용어 "알칼리"는 알칼리 금속 리튬, 소듐 및 포타슘, 특히 소듐 및 포타슘, 바람직하게는 소듐을 포괄한다.
용어 "알칼리 토-"는 알칼리 토금속 칼슘 및 마그네슘, 특히 칼슘을 포괄한다.
용어 GalNAc 클러스터 접합체는 올리고뉴클레오티드 화합물을 간세포로 표적화시켜서, 그에 따라 간 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 아시알로글리코단백질 수용체 표적화 모이어티를 의미한다. 전형적으로, 모이어티는 갈락토사민, 바람직하게 N-아세틸갈락토사민을 포함한다.
바람직한 실시형태에서 용어 GalNAc 클러스터 접합체는 적합한 링커를 통해서 중심 분지점에 연결된, 3개의 갈락토사민 모이어티, 보다 바람직하게 3개의 N-아세틸갈락토사민 모이어티를 포함한다.
길이, 친수성-소수성 균형 및 공간 기하학이 다양할 수 있는 적합한 링커는 예를 들어 [Huang et al., Bioconjugates Chem. 2017, 28, 283-295]에 기술되어 있다.
바람직한 링커는 하나 이상, 바람직하게 하나의 펩티드 작용기 (-CO-NH-) 를 알킬렌 사슬에 함유하는, 알킬렌 링커, 에틸렌 글리콜 링커 또는 알킬렌 링커이다.
다수 링커의 경우에, 예컨대 3개 N-아세틸갈락토사민 모이어티가 중심 분지점에 연결된 바람직한 실시형태에서, 개별 링커는 다양할 수 있지만, 바람직하게는 동일하다.
바람직한 링커는 에틸렌 글리콜 링커이다.
이러한 문맥에서 용어 알킬렌 링커는 "C2-12-알킬렌 가교", 특히 2개 내지 12개 탄소 원자, 보다 특정한 실시형태에서 4개 내지 8개 탄소 원자, 및 보다 더 특정한 실시형태에서 6개 탄소 원자의 2가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 기를 의미한다. 특정한 예에는 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌 또는 옥틸렌 및 이의 이성질체가 있지만, 바람직하게는 n-헥실렌이다.
용어 "에틸렌 글리콜 링커"는 가교 유닛으로서 1개 내지 10개 에틸렌 글리콜 유닛, 바람직하게 2개 내지 6개 에틸렌 글리콜, 보다 바람직하게 3개 에틸렌 글리콜 유닛을 함유할 수 있는, -(CH2)2-O- 유닛을 의미한다.
이러한 문맥에서 용어 "분지점"은 전형적으로 3개 갈락토스 유도체의 부착을 허용하고 올리고머에 분지점의 부착을 더 허용하는 소형 분자를 의미한다. 바람직한 분지점 분자는 디-리신이다. 디-리신은 3개 갈락토사민-링커-유도체가 부착될 수 있는 3개 아민 기 및 GalNAc 클러스터가 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있는 카르복실 기를 함유한다.
바람직한 실시형태에서 GalNac 클러스터 접합체는 하기 화학식 Ib의 화합물, 이의 상응하는 염, 거울상이성질체 및/또는 입체이성질체를 갖는다:
[화학식 Ib]
Figure pct00003
식 중, R1 은 수소 또는 히드록시 보호기, 바람직하게 수소 또는 아세틸, 보다 바람직하게 수소이고, n은 0 내지 10, 바람직하게 1 내지 5, 보다 바람직하게 2의 정수이다.
추가의 바람직한 실시형태에서, GalNac 클러스터 접합체는 하기 화학식 Ic의 화합물을 갖는다:
[화학식 Ic]
Figure pct00004
식 중, M+/++ 는 상기 정의된 바와 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 양이온, 바람직하게 알칼리 금속의 양이온이고, 보다 바람직하게 소듐의 양이온이다.
GalNAc 클러스터 접합체는 예를 들어 PCT 공개 공보 WO2017/021385에 기술된 방법에 따라서, 그리고 하기 반응식에 도시된 바에 따라서 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure pct00005
용어 5'아미노 변형된은 용어 5' 아미노-변형 올리고뉴클레오티드와 함께 사용되고, 아미노 링커로서, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단기에서 부착되는 링커에 공유 결합된 반응성 아미노 기를 결정한다. 링커는 바람직하게 2개 내지 12개 탄소 원자의 지방족 알킬 기이거나 또는 1개 내지 10개 에틸렌 글리콜 유닛을 함유하는 에틸렌 글리콜 링커이다.
따라서 바람직한 5' 아미노-변형제는 임의로는 아미노 기 보호된 아미노 C2-12-알킬 링커, 바람직하게 임의로는 아미노 기 보호된 아미노 C4-8-알킬 링커, 보다 바람직하게 C6-알킬 링커로부터 선택된다.
5'아미노 변형된 올리고뉴클레오티드에 적합한 아미노 보호기는 트리플루오로아세틸 (TFA) 또는 모노메톡시트리틸 (MMT)이다.
일반적으로, 아미노 링커는 상업적으로 입수가능한 아미노 링커 포스포로아미다이트 예컨대 예를 들어, Sigma Aldrich의 예를 들어 TFA- 또는 MMT-C6-링커 포스포로아미다이트 또는 Glen Research의 5' 아미노 변형제 TEG (트리에틸렌글리콜) CE 포스포로아미다이트를 통해서 도입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 올리고뉴클레오티드는 둘 이상의 공유 연결된 뉴클레오티드를 포함하는 분자로서, 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같이 정의된다. 치료적으로 가치있는 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위해서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 7개 내지 30개 뉴클레오티드, 바람직하게 10개 내지 25개 뉴클레오티드 길이로서 합성된다.
올리고뉴클레오티드는 임의로는 변형된 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.
LNA 뉴클레오시드 단량체는 뉴클레오티드의 리보스 당 고리의 C2' 및 C4' 사이에 링커 기 (바이라디클 (biradicle) 또는 가교라고도 함) 를 포함하는 변형된 뉴클레오시드이다. 이들 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교된 핵산이라고 하거나 또는 이환식 핵산 (BNA) 이라고 한다.
본 명세서에서 사용되는, 임의로는 변형되는- 은 당 모이어티 또는 뉴클레오염기 모이어티의 하나 이상의 변형의 도입을 통해서 동등한 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드와 비교해 변형된 뉴클레오시드를 의미한다. 바람직한 실시형태에서 변형된 뉴클레오시드는 변형된 당 모이어티를 포함하고, 예를 들어 하나 이상의 2' 치환된 뉴클레오시드 및/또는 하나 이상의 LNA 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 용어 변형된 뉴클레오시드는 또한 본 명세서에서 용어 "뉴클레오시드 유사체" 또는 변형된 "유닛" 또는 변형된 "단량체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드는 일반적으로 2개 뉴클레오시드를 함께 공유적으로 커플링시키는 포스포디에스테르 (P=O) 및/또는 포스포로티오에이트 (P=S) 뉴클레오시드간 연결에 의해 연결된다.
따라서, 일부 올리고뉴클레오티드에서, 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 (P=O) 로 이루어질 수 있거나, 다른 올리고뉴클레오티드에서, 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 로 이루어질 수 있거나, 또는 여전히 다른 올리고뉴클레오티드에서, 뉴클레오시드간 연결의 서열은 다양하고 포스포디에스테르 (P=O) 및 포스포로티오에이트 (P=S) 뉴클레오시드 둘 모두를 포함한다.
뉴클레오염기 모이어티는 각각의 상응하는 뉴클레오염기에 대한 글자 코드, 예를 들어 A, T, G, C 또는 U로 표시될 수 있으며, 여기서 각각의 글자는 임의로는 균등한 기능의 변형된 뉴클레오염기를 포함한다. 예를 들어, 예시적인 올리고뉴클레오티드에서, 뉴클레오염기 모이어티는 LNA 뉴클레오시드의 경우에 대문자 A, T, G 및 MeC (5-메틸 시토신) 로 기재되고 DNA 뉴클레오시드의 경우에 소문자 a, t, g, c 및 MeC로 기재된다. 변형된 뉴클레오염기는 보호기 예컨대 tert-부틸페녹시아세틸, 페녹시아세틸, 벤조일, 아세틸, 이소부티릴 또는 디메틸포름아미디노를 보유하는 뉴클레오염기를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다 (2016년 3월 24일자, Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese 참조).
바람직하게 올리고뉴클레오티드는 임의로는 변형된 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 10개 내지 25개 뉴클레오티드 길이이다.
올리고뉴클레오티드 합성의 원리는 당분야에 충분히 공지되어 있고 문헌에 충분히 기술되어 있으며 Wikipedia (예를 들어, 2016년 3월 15일자의 oligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/oligonucleotide_synthesis 참조) 등에 공개되어 있다.
요즘에는 더 큰 규모의 올리고뉴클레오티드 합성은 컴퓨터 제어 합성기를 사용해 자동으로 수행된다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드 합성은 고체상 합성이며, 여기서는 조립하려는 올리고뉴클레오티드가 이의 3'-말단 히드록시 기를 통해서, 고체 지지체 재료에 공유 결합되고, 사슬 조립의 전체 과정 동안 이에 부착된 채로 남아 있는다. 적합한 지지체는 GE Healthcare의 Primer 지지체 5G 또는 Kinovate의 NittoPhase®HL 지지체와 같은 상업적으로 입수가능한 거대다공성 폴리스티렌 지지체이다.
일반적으로 올리고뉴클레오티드 합성은 바람직한 서열이 조립될 때까지 늘어나는 사슬의 5'-말단에 뉴클레오티드 잔기를 단계적으로 부가하는 것이다.
일반적으로, 각 부가는 합성 사이클이라고 하며 일반적으로 화학 반응들로 이루어진다.
a1) 고체 지지체 상의 보호된 히드록실 기를 탈-차단시키는 단계,
a2) 활성화된 포스포르아미다이트로서 제1 뉴클레오시드를 고체 지지체 상의 유리 히드록실 기와 커플링시키는 단계,
a3) 개별 P-연결된 뉴클레오시드를 산화 또는 황화시켜서 개별 포스포트리에스테르 (P=O) 또는 개별 포스포로티오에이트 (P=S) 를 형성시키는 단계;
a4) 임의로는, 고체 지지체 상의 임의의 미반응된 히드록실 기를 캡핑시키는 단계;
a5) 고체 지지체에 부착된 제1 뉴클레오시드의 5' 히드록실 기를 탈-차단시키는 단계;
a6) 활성화된 포스포르아미다이트로서 제2 뉴클레오시드를 커플링시켜 개별 P-연결된 이량체를 형성시키는 단계;
a7) 개별 P-연결된 디뉴클레오시드를 산화 또는 황화시켜 개별 포스포트리에스테르 (P=O) 또는 개별 포스포로티오에이트 (P=S) 를 형성시키는 단계;
a8) 임의로는, 임의의 미반응된 5' 히드록실 기를 캡핑시키는 단계;
a9) 바람직한 서열이 조립될 때까지 이전 단계 a5 내지 a8 을 반복하는 단계.
상기 약술된 바와 같이, 본 발명의 방법은 커플링제로서 O-디카르복스이미도우로늄 염의 존재 하에서 올리고뉴클레오티드와 하기 화학식의 GalNAc 클러스터 화합물 또는 이의 상응하는 염, 거울상이성질체 및/또는 입체이성질체의 커플링 단계를 특징으로 한다:
[화학식 I]
Figure pct00006
O-디카르복스이미도우로늄 염은 일반적으로 상업적으로 입수가능하거나 또는 예를 들어 문헌 [Knorr et al, Tetrahedron Letters, Vol. 30, No.15, 1927-1930 (1989)]에 공지된 방법에 따라 합성할 수 있다.
바람직하게 O-디카르복스이미도우로늄 염은 O-디카르복스이미도우로늄 헥사플루오르포스페이트 또는 O-디카르복스이미도우로늄 테트라플루오로보레이트이다.
그들은 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(비시클로 [2.2.1] 헵트-5-엔-2,3-디카르복스이미도) 우로늄테트라플루오로보레이트 (TNTU) 또는 N,N,N,N-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜) 우로늄테트라플루오로보레이트 (TSTU), 보다 바람직하게 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(비시클로 [2.2.1] 헵트-5-엔-2,3-디카르복스이미도) 우로늄테트라플루오로보레이트 (TNTU) 로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 아릴트리아졸우로늄 염 예컨대 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄-헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 또는 [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄-헥사플루오르포스페이트] (HATU) 가 적용될 수 있다. 그러나, 그들은 덜 바람직하다.
방법은 초기 활성화 단계 a) 및 후속 커플링 단계 b)를 특징으로 한다.
활성화 단계:
활성화 단계에서, GalNAc 접합체는 커플링제와 반영하여 활성화된 GalNAc 접합체를 형성한다. 이러한 활성화된 중간체는 단리될 수 있지만 일반적으로 원 위치에서 커플링 단계에서 더욱 처리된다.
상기 약술된 바와 같이, GalNac 접합체는 바람직하게는 알칼리 토금속- 또는 알칼리 금속 염, 보다 바람직하게 소듐 염의 형태로 적용된다.
카르복실산 형태의 GalNac로부터 시작하는 것도 가능하다. 그러한 경우에 적합한 염기, 예컨대 3차 아민 예컨대 디이소프로필에틸아민 염기에 의한 사전 탈양자화가 고려되어야만 한다.
일반적으로, 1.0 내지 1.5 당량, 바람직하게 1.0 내지 1.3, 보다 바람직하게 1.0 내지 1.1 당량의 GalNac 접합체는 극성 비양자성 용매, 적합하게 N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 또는 N-메틸피롤리딘, 바람직하게 N,N-디메틸포름아미드에 현탁된다.
1.0 내지 1.5 당량, 바람직하게 1.0 내지 1.3 당량, 보다 바람직하게 1.0 내지 1.1 당량의 커플링제가 그 다음으로 첨가될 수 있다.
활성화 반응은 0℃ 내지 40℃, 바람직하게 20℃ 내지 25℃의 반응 온도에서, 0.5 내지 3시간 동안, 바람직하게 0.5 내지 1.5시간 동안, 보다 바람직하게 1시간 동안 수행될 수 있다.
커플링 단계:
활성화 단계로부터 수득된 반응 혼합물에, 5%G 내지 40%G, 바람직하게 10%G 내지 20%G의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 수용액을 첨가할 수 있다. 대안적으로, 반응 혼합물은 올리고뉴클레오티드의 수용액에 적량 배합될 수 있다.
반응 혼합물의 pH는 편의상 7.0 내지 10.0, 바람직하게 8.3 내지 9.3으로 제어된다.
pH 제어는 알칼리 히드록시드 또는 적합한 염기성 염 또는 이의 혼합물을 첨가하여 달성될 수 있다.
전형적으로, 소듐 히드록시드, 알칼리 수소 카보네이트 예컨대 소듐 수소 카보네이트 또는 알칼리 수소 포스페이트 예컨대 소듐 수소 포스페이트가 사용될 수 있다.
일반적으로 반응 온도는 0℃ 내지 40℃, 바람직하게 20℃ 내지 25℃ 범위이다.
완전한 전환은 1시간 내지 4시간 이후에 도달될 수 있다.
이후에 생성되는 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체를 분리할 수 있고 더욱 정제할 수 있다.
이전 단계에서 수득된 GalNAc-클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체의 정제는 본질적으로 침전 또는 크로마토그래피, 농축 및 단리 단계를 포함한다.
바람직한 실시형태에서 정제는 다음의 단계를 포함한다:
a) 알콜계 용매에 의한 침전 또는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피로부터 선택된 크로마토그래피 단계, 이어서
b) 접선 유동 여과로부터 선택된 농축 단계, 및
c) 동결건조, 여과 또는 분무 건조 또는 알콜계 용매에 의한 침전으로부터 선택된 단리 단계.
추가의 바람직한 실시형태에서, 정제는 다음의 단계를 포함한다:
a) 임의로는 음이온 교환 크로마토그래피와 조합된, 역상 크로마토그래피 단계, 이어서
b) 접선 유동 여과 단계, 및
c) 동결건조 단계.
상기 언급된 정제 방법은 본 발명의 분야의 당업자에게 일반적이고 충분히 공지되어 있다.
용어 침전은 일반적으로 적합한 용매의 도움으로 용액으로부터 고체의 형성을 의미한다. 본 발명의 문맥에서 적합한 용매는 알콜, 바람직하게 저급 알콜 예컨대 에탄올 또는 1-프로판올이다.
용어 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 방법 또는 역상 크로마토그래피 방법 및 이들의 조합을 포함한다.
음이온-교환 크로마토그래피는 적용된 완충 매질과 샘플 용액의 하전된 이온의 경쟁적 상호작용을 기반으로 한다. 이것은 통상의 상업적으로 입수가능한 음이온-교환 수지, 바람직하게 트리메틸암모늄-작용화된 것을 사용해 수행될 수 있다. 이들 상 재료는 예를 들어 GE Healthcare, Tosoh Bioscience, Bio-Rad 또는 Merck에서 입수할 수 있다. Tosoh Bioscience에서 입수가능한 음이온-교환 수지 TSKgel Super Q-5PW (QAE) 를 사용하여 특히 양호한 결과를 달성하였다.
역상 크로마토그래피는 정지상으로서 전통적인, 상업적으로 입수가능한 상 재료 예컨대 변형된 실리카 겔 흡착제 및 적합한 유기 용매 예컨대 아세토니트릴 및, 적용가능하다면 완충액을 사용해 수행될 수 있다. 적합한 변형 실리카 겔 유형의 상 재료는 Kromasil™C18, Kromasil™C8, YMC Triart C18 및 YMC Triart C8로부터 선택될 수 있다. 특히 양호한 결과는 YMC의 Triart Prep C8-S를 사용해 달성되었다.
용어 농축은 접선 유동 여과 방법 또는 증발 방법 및 이들의 조합을 포함한다.
접선 유동 여과 또는 십자류 여과에서 공급물은 투과 측면에 대해 정압으로 여과막 (접선으로) 을 통해 통과된다. 막 포어 크기보다 작은 재료의 일부분이 투과물 또는 여과물로서 막을 통해 통과하고, 그외 모든 것은 체류물로서 막의 공급 측면 상에 체류한다. 접선 유동 여과의 원리가 또한 나노 여과, 한외여과, 투석여과 및 미세여과 방법에 사용된다. 적합한 막은 예를 들어 Merck Millipore에서 상표명 Pellicon™으로 상업적으로 입수가능하다. 적합한 막은 ≤ 3kDA의 분자량 컷-오프 (MWCO) 를 갖는다. 각각 1 kDA 또는 3kDA의 MWCO를 갖는 Merck Millipore Pellicon 2 및 3 막이 바람직하다.
용어 단리는 동결건조, 침전, 분무 건조 및 증발 방법을 포함한다. 모든 이들 용어는 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
예시로서, 올리고뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (올리고 1)
AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' (올리고 2)
AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (올리고 3)
여기서, AM-C6은 C6 아미노 링커를 의미하고; *는 포스포르티오에이트 가교를 의미하고; A, G, T 및 MeC (5-메틸 시토신) 는 LNA 뉴클레오시드 단량체이며 a, t, c, g는 DNA 뉴클레오시드 단량체이다.
비제한적인 실시형태에서, GalNAc 클러스터 올리고뉴클레오티드 접합체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (화합물 1)
GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' (화합물 2)
GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (화합물 3)
여기서, AM-C6은 C6 아미노 링커를 의미하고; *는 포스포르티오에이트 가교를 의미하고; A, G, T 및 MeC (5-메틸 시토신) 는 LNA 뉴클레오시드 단량체이고 a, t, c, g는 DNA 뉴클레오시드 단량체이며, GN2는 하기 화학식의 입체이성질체 GN2a 또는 GN2b, 또는 이들의 혼합물의 형태로 존재할 수 있는, GalNAc 클러스터 모이어티이고, 하기 화학식에서 R은 AM-C6-올리고뉴클레오티드 꼬리부를 나타낸다:
[화학식 GN2a, GN2b]
Figure pct00007
본 명세서에 개시된 화합물은 하기의 뉴클레오염기 서열을 갖는다:
SEQ ID NO 1: catcaacttt cacttcag
SEQ ID NO 2: cacctattta acatcagac
SEQ ID NO 3: cagcgtaaag agagg
실시예
축약어:
DMF N, N'-디메틸포름아미드
DMSO 디메틸술폭시드
EtOH 에탄올
MeCN 아세토니트릴
NaCl 소듐 클로라이드
NaOAc 소듐 아세테이트
NaOH 소듐 히드록시드
TNTU N,N,N',N'-테트라메틸-O-(비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2,3-디카르복스이미도)우로늄테트라플루오로보레이트
TSTU N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트
HCTU O-(6-클로로벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트
PyOAP (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HATU 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트
실시예 1
GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (화합물 1)
한외여과를 통해 탈염된, 서열 AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (올리고 1) 을 갖는 9.8 g (1.53 mmol, 이론적) 의 5' 아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 수성 NaHCO3 (0.1M, 60 mL, pH 8.3) 에 용해시켰고 기포 형성을 피하기 위해서 EtOH (1 mL)을 첨가하였다.
M+/++ = 소듐인 화학식 1c의 2.71 g (1.84 mmol, Eq: 1.2) 의 GalNAc 클러스터 접합체 (소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트) 를 DMF (12.7 g, 13.5 mL) 에 현탁시켰고 TNTU (676 mg, 1.85 mmol, Eq: 1.21) 를 첨가하였다. 흰색 현탁액을 20-25℃에서 1시간 동안 교반하여 맑은 용액을 수득했다 (15.4 g).　
상기 제조된 활성화된 GalNAc 용액 (12.8 g, 9.8g의 이론적 올리고에 대해 1.0 equiv.) 을 1개 포트에서 수성 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였고 교반을 1.5시간 동안 계속하였고 이때 HPLC가 완전한 전환을 보였다.
반응 혼합물은 분취용 RP-HPLC (YMC Triart C8-S 10마이크로미터, H2O 중 MeCN/0.2M NaOAc, 45℃) 를 통해 직접 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하였고 한외여과하였으며 동결건조하여 흰색 동결건조된 분말로서 생성물 (7.5 g, 50%) 을 수득했고 HPLC 순도는 80.6% 였다 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN M 헥사플루오로-2-프로판올/헥실아민/트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN). 생성물의 정체는 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ 검출기 H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 μm 2.1x50 mm, 농도구배 A: 95% 물/2.5% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5% 물/80% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7447.7 (예상치 7445.9).
실시예 2
GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (화합물 1)
NaOH 용액으로부터 농축을 통해 탈염된, 서열 AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (올리고 1) 을 갖는, 13.9 g (1.89 mmol, 87% 순도) 의 5'아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 수성 NaHCO3 (0.1M, 55 mL) 에 용해시켰고 EtOH (2.5 ml) 를 첨가하였다. pH는 9.8로 측정되었다.
M+/++ = 소듐인 화학식 1c의 3.35 g (2.27 mmol, Eq: 1.2) 의 GalNAc 클러스터 접합체 (소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트) 를 DMF (15.6 g, 16.5 mL) 에 현탁하였고 TNTU (834 mg, 2.28 mmol, Eq: 1.21) 를 첨가하였다. 흰색 현탁액을 20-25℃에서 1시간 동안 교반하여 맑은 용액을 얻었다.
상기 제조된 활성화된 GalNAc 용액을 1개 포트에서 수성 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였고, 교반을 1시간 동안 계속하였고 이때 HPLC가 완전한 전환을 보였다.
반응 혼합물은 1-프로판올 (150 mL) 로 분쇄하였고 현탁액을 20-25℃에서 30분 동안 교반시킨 후, 30분 동안 정치시켰다. 액체를 디캔팅하여 오일을 남기고 여기에 1-프로판올 (100 mL) 을 첨가하였고 교반을 16시간 동안 계속하였다. 현탁액을 여과하였고, 노란색 고체를 2회 1-프로판올 (25 mL) 로 세척하였으며 진공 건조하여 노란색 고체로서 생성물 (14.8 g, 99% 회수율) 을 수득했으며 HPLC 순도는 57.1% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN M 헥사플루오로-2-프로판올/헥실아민/트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN) 였다. 생성물의 정체는 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ 검출기 H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 농도구배 A: 95% 물/2.5% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5% 물/80% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7447.7 (예상치 7445.9).
실시예 3
GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (화합물 1)
IEX-HPLC로 탈염 및 정제된, 서열 AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (올리고 1) 을 갖는, 12.2 g (1.9 mmol, 이론적) 의 5'아미노 변형된 올리고뉴클레오티를 수성 NaHCO3 (0.1 M, 55 mL)에 용해시켰고 첨가하였다. pH는 8.6으로 측정되었다.
M+/++ = 소듐인 화학식 1c의 3.37 g (2.28 mmol, Eq: 1.2) 의 GalNAc 클러스터 접합체 (소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트) 를 DMF (15.6 g, 16.5 mL) 에 현탁시켰고 TNTU (839 mg, 2.30 mmol, Eq: 1.21) 를 첨가하였다. 흰색 현탁액을 20-25℃에서 1시간 동안 교반하여 맑은 용액을 수득했다.
상기 제조된 활성화된 GalNAc 용액을 5분 동안 수성 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였고 교반을 2시간 동안 계속하였다. HPLC는 불완전한 전환을 보였고 추가의 활성화된 GalNAc 클러스터 접합체 (GalNAc 소듐 염 (561 mg, 0.38 mmol, 0.2 equiv), DMF (2.6 mL) 및 TNTU (146 mg, 0.4 mmol, 0.21 equiv, 1시간) 으로 제조됨) 를 반응 혼합물에 첨가하였다. 추가의 30분 이후에, 반응 혼합물은 1-프로판올 (110 mL) 로 분쇄하였고 현탁액을 20-25℃에서 30분 동안 교반하였으며, 그 다음으로 30분 간 정치시켰다. 액체를 디캔팅하여 오일을 남기고 여기에 1-프로판올 (100 mL) 을 첨가하였으며 교반을 16시간 동안 계속하였다. 현탁액을 여과하였고, 노란색 고체를 2회 1-프로판올 (25 mL) 로 세척하였으며 진공 건조하여 노란색 고체로서 생성물 (14.9 g, 100% 회수율) 을 수득했고 HPLC 순도는 75.4% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN M 헥사플루오로-2-프로판올/헥실아민/트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN) 였다. 생성물의 정체는 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ 검출기 H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 농도구배 A: 95% 물/2.5% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5% 물/80% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7447.6 (예상치 7445.9).
실시예 4
GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (화합물 1)
NaOH 용액으로부터 농축을 통해 탈염된, 서열 AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (올리고 1) 을 갖는, 200 mg (0.027 mmol, 87% 순도) 의 5'아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 pH 9.0의 수성 NaHCO3 (0.1M, 0.79 mL) 에 용해시켰다.
M+/++ = 소듐인 화학식 1c의 40 mg (0.027 mmol, Eq: 1.0) 의 GalNAc 클러스터 접합체 (소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트) 를 DMF (0.2 mL)에 현탁하였고 TNTU (10 mg, 0.027 mmol, Eq: 1.0) 를 첨가하였다. 흰색 현탁액을 20-25℃에서 1시간 동안 교반하여 맑은 용액을 수득했다.
상기 제조된 활성화된 GalNAc 용액을 1개 포트에 수성 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였고 교반을 1.5시간 동안 계속하였다.
반응 혼합물을 1-프로판올 (4 mL) 로 분쇄하고 현탁액을 20-25℃에서 10분 동안 교반하였다. 액체를 디캔팅하여 오일을 남기고 여기에 1-프로판올 (4 mL) 을 첨가하였으며 교반을 17시간 동안 계속하였다. 현탁액을 여과하고, 노란색 고체를 2회 1-프로판올 (1 mL) 로 세척하였으며 진공 건조하여 노란색 고체로서 생성물 (150 mg, 70% 회수율) 을 수득했으며 HPLC 순도는 45.8% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN M 헥사플루오로-2-프로판올/헥실아민/트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN) 였다. 생성물의 정체는 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ 검출기 H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 농도구배 A: 95% 물/2.5% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5% 물/80% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7447.8 (예상치 7445.9).
실시예 5
GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (화합물 1)
실시예 4의 절차를 TNTU 대신에 TSTU (9.9 mg, 0.027 mmol, 1.0 equiv) 를 사용하여 후속하여 노란색 고체로서 생성물 (160 mg, 75% 회수율) 을 수득했고 HPLC 순도는 56% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN M 헥사플루오로-2-프로판올/헥실아민/트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN) 였다. 생성물의 정체는 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ 검출기 H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 농도구배 A: 95% 물/2.5% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5% 물/80% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7447.5 (예상치 7445.9).
실시예 6
GN2-AM-C6-5'-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (화합물 3)
NaOH 용액으로부터 농축을 통해 탈염된, 서열 AM-C6-5'- caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g*a*G*G-3' (올리고 3) 을 갖는, 0.5 g (0.08 mmol, 92% 순도) 의 5'아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 수성 NaHCO3 (0.1M, 1.98 mL, pH 8.3) 에 용해시켰다.
M+/++ = 소듐인 화학식 1c의 147 mg (99.8 μmol, 1.2 equiv) 의 GalNAc 클러스터 접합체 (소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트) 를 DMF (0.8 mL)에 용해시켰고 TNTU (36.7 mg, 0.10 mmol, Eq: 1.21) 를 첨가하였다. 흰색 현탁액을 20-25℃에서 1시간 동안 교반하여 맑은 용액을 수득했다.
상기 제조된 활성화된 GalNAc 용액을 1분 동안 수성 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였고 교반은 1시간 동안 계속하였으며 이때 HPLC는 완전한 전환을 보였다.
반응 혼합물을 1-프로판올 (5 mL) 로 분쇄하였고 헌탁액을 20-25℃에서 30분 동안 교반한 후에, 30분간 정치시켰다. 액체를 디캔팅하여 오일을 남겼고 여기에 1-프로판올 (2.5 mL) 을 첨가하였으며 교반을 16시간 동안 계속하였다. 현탁액을 여과하였고, 노란색 고체를 2회 1-프로판올 (0.9 mL) 로 세척하였고 진공 건조하여 노란색 고체로서 생성물 (560 mg, 96%) 을 수득했으며, HPLC 순도는 60.9% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN M 헥사플루오로-2-프로판올/헥실아민/트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN) 였다. 생성물의 정체는 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ 검출기 H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 농도구배 A: 95% 물/2.5% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5% 물/80% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 6639.2 (예상치 6637.3).
실시예 7
GN2-AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' (화합물 2)
NaOH 용액으로부터 농축을 통해 탈염된, 서열 AM-C6-5'- caMeC*MeC*t*a*t*t*t*a*a*c*a*-t*c*A*G*A*MeC-3' (올리고 2) 를 갖는, 0.5 g (0.07 mmol 이론적) 의 5'아미노 변형된 올리고뉴클레오티드를 수성 NaHCO3 (0.1M, 2.0 mL, pH 8.3) 에 용해시켰다.
M+/++ = 소듐인 화학식 1c의 131 mg (88.5 μmol, 1.2 equiv) 의 GalNAc 클러스터 접합체 (소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트) 를 DMF (0.65 mL) 에 현탁시켰고 TNTU (32.6 mg, 0.09 mmol, Eq: 1.21) 를 첨가하였다. 흰색 현탁액을 20-25℃에서 1시간 동안 교반하여 맑은 용액을 수득했다.
상기 제조된 활성화된 GalNAc 용액은 1분 동안 수성 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였고 교반을 2.5시간 동안 계속하였으며 이때 HPLC는 불완전한 전환을 보였고, 추가의 활성화된 GalNAc 클러스터 접합체 (GalNAc 소듐 염 (32.7 mg, 0.02 mmol, 0.3 equiv), DMF (0.15 mL) 및 TNTU (8.3 mg, 0.02 mmol, 0.31 equiv, 1시간) 으로 제조됨) 를 반응 혼합물에 첨가하였다. 추가의 1시간 이후에, 반응 혼합물은 1-프로판올 (5 mL) 로 분쇄하였고 현탁액을 20-25℃에서 30분 동안 교반한 후에, 30분간 정치시켰다. 액체를 디캔팅하여 오일을 남겼고 여기에 1-프로판올 (2.5 mL) 을 첨가하였으며 교반을 16시간 동안 계속하였다. 현탁액을 여과하였고, 노란색 고체를 2회 1-프로판올 (0.9 mL) 로 세척하였으며 진공 건조하여 노란색 고체로서 생성물 (470 mg, 77.6%) 을 수득했고, HPLC 순도는 65.6% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN M 헥사플루오로-2-프로판올/헥실아민/트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN) 였다. 생성물의 정체는 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ 검출기 H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 농도구배 A: 95% 물/2.5% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5% 물/80% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7799.6 (예상치 7798.2).
실시예 8 (대규모 실시예)
GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (화합물 1)
한외여과를 통해 탈염시킨, 서열 AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (올리고 1) 을 갖는 5' 아미노 변형된 올리고뉴클레오티드로 이루어진, 1.77 kg의 20% w/w 수성 용액을 NaHCO3 를 사용해 pH 8.3-8.5로 조정하였다.
M+/++ = 소듐인 화학식 1c의 89.8 g (Eq: 1.1) 의 GalNAc 클러스터 접합체 (소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸 테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸) 테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일]아미노]헥사노에이트) 를 DMF (450 mL) 에 현탁시켰고 TNTU (22.2 g, Eq: 1.1) 를 첨가하였다. 노르스름한 용액을 20-25℃에서 1시간 동안 교반하였다.
상기 제조된 활성화된 GalNAc 용액을 5분 동안 수성 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였고 교반을 2시간 동안 계속하였다. HPLC가 불완전한 전환을 보인 경우에, 추가의 활성화된 GalNAc 용액은 상기와 같이 DMF (41 mL) 중의 TNTU (2.0 g), M+/++ = 소듐인 화학식 1c의 GalNAc 클러스터 접합체 (소듐 (2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]-2-[[(2S)-2,6-비스[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디히드록시-6-(히드록시메틸)테트라히드로피란-2-일]옥시에톡시]에톡시]에톡시]아세틸]아미노]헥사노일] 아미노]헥사노에이트) (8.2 g)로부터 제조하였다. 이 용액을 1개 포트에서 수성 올리고뉴클레오티드 용액에 첨가하였고 교반을 추가의 1시간 동안 20-25℃에서 계속하였다.
반응 혼합물을 분취용 RP-HPLC (YMC Triart C8-S 10마이크로미터, H2O 중 MeCN/0.2M NaOAc, 45℃) 로 직접 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하였고 한외여과하였으며 동결건조하여 흰색 동결건조 분말로서 생성물 (210 g, 27%) 을 수득했고 HPLC 순도는 91.34% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN M 헥사플루오로-2-프로판올/헥실아민/트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN) 였다. 생성물의 정체는 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ 검출기 H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 농도구배 A: 95% 물/2.5% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5% 물/80% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7447.7 (예상치 7445.9).
고해상도 질량 분광법으로 정제된 GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G를 분석하였을 때, GalNAc-당 인산화와 관련된 부산물은 발견되지 않았다.
비교예 (WO 2018/215391의 실시예 3A와 유사)
GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G (화합물 1)
GalNAc 활성화:
50.3 g (34.1 mmol, 1.6 equiv) 의 GalNAc-클러스터-소듐 염을 250 mL DMF 중에 20-25℃에서 현탁하였고, 250 mL DMF 중 1.63 mL (24.1 mmol, 1.13 equiv) aq. 인산 85%의 용액을 첨가하였다. 20-25℃에서 5분 후에, 5.88 g (51.1 mmol, 2.40 equiv) 의 N-히드록시숙신이미드를 무색 용액에 첨가하였고, 이어서 9.80 g (51.1 mmol, 2.40 equiv) 의 EDC.HCl (N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드-히드로클로라이드)1을 첨가하였다. 무색의 약간 탁한 용액을 4시간 동안 20-25℃에서 교반하였고 커플링 단계에서 사용하였다.
GalNAc 커플링:
이의 소듐 염으로서 136.4 g (21.3 mmol, 1.0 equiv) 의 AM-C6-5'caT*MeC*A*a*c*t*t*t* c*a*c*t*t*MeC*A*G-3'을 이론적으로 함유하는 2.27 kg의 용액에, 42.8 mL (245 mmol, 11.3 equiv) 의 N-에틸디이소프로필아민 및 900 mL DMSO을 첨가하였고, 용액을 40-45℃로 승온시켰고 1분 안에 상기의 활성화된 GalNAc 용액에 첨가하였다. 노란색 용액을 0.5시간 동안 40℃에서 교반하여 이의 소듐 염으로서 GalNAcAM-C6-5'caT*MeC*A*a*c*t*t*t* c*a*c*t*t*MeC*A*G-3'의 미정제 용액을 수득하였다. HPLC는 미정제 용액 중에서 53.0% 면적을 보였다 (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/0.05M 헥실아민/0.04M 트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN 9:1). 이 용액은 정제 전까지 4℃에 저장하였다. 상기 커플링 과정을 동일한 규모로 2회 반복하였고 3개의 개별 반응 혼합물은 정제를 위해 합하였다.
반응 혼합물은 분취용 RP-HPLC (YMC Triart C8-S 10마이크로미터, H2O 중 MeCN/0.2M NaOAc, 45℃)로 직접 정제하였다. 생성물-함유 분획을 합하였고 한외여과하였으며 동결건조하여 흰색 동결건조 분말로서 생성물 (355 g, 30%) 을 수득했고 HPLC 순도는 90.35% (LC-System Agilent Technologies 1290 Infinity, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 260 nm, 농도구배 A: 물/CH3OH/MeCN M 헥사플루오로-2-프로판올/헥실아민/트리에틸아민, B: CH3OH/MeCN) 였다. 생성물의 정체는 UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY H-class, Waters MS SQ 검출기 H-class SQD, 컬럼: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotides BEH C18 130A 1.7 ㎛ 2.1x50 mm, 농도구배 A: 95% 물/2.5% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리메틸아민, B: 17.5% 물/80% CH3OH/0.2M 헥사플루오로-2-프로판올/16.3 mmol 트리에틸아민) 로 결정하였다. UPLC-MS: m/z 7447.7 (예상치 7445.9).
정제된 GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*t*t*t*c*a*c*t*t*MeC*A*G는 고해상도 질량 분광법으로 분석하였다. 포스페이트 디에스테르 변형된 생성물에 의한 것으로서, 3개 GalNAc 당 유닛 중 하나가 PO2 - 단편에 의해 변형된 것인, 질량 7503.27984의 부산물이 0.67% 존재비로 발견되었다. 구조 Y의 포스페이트 모노에스테르 변형된 생성물에 의한 것으로서, 3개 GalNAc 당 유닛 중 하나가 HPO3 - 에 의해 변형된 것인, 질량 7521.32758의 부산물이 0.79% 존재비로 발견되었다.
<110> F.Hoffmann-La Roche Ltd. <120> Process for the preparation of GalNAc oligonucleotide conjugates <130> P34628 WO <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 catcaacttt cacttcag 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 cacctattta acatcagac 19 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 cagcgtaaag agagg 15

Claims (16)

  1. 커플링제로서 O-디카르복스이미도우로늄 염의 존재 하에서 올리고뉴클레오티드와 하기 화학식의 GalNAc 클러스터 화합물 또는 이의 상응하는 염, 거울상이성질체 및/또는 입체이성질체를 커플링시키는 단계를 포함하는, GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00008
  2. 제 1 항에 있어서, GalNAc 클러스터 접합체는 중심 분지점에 연결된 3개의 갈락토사민 모이어티를 포함하는 것인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 갈락토사민 모이어티는 알킬렌 링커, 에틸렌 글리콜 링커, 또는 알킬렌 사슬에 하나 이상의 펩티드 작용기 (-CO-NH-)를 함유하는 알킬렌 링커를 통해서, 바람직하게는 에틸렌 글리콜 링커를 통해서 중심 분지점에 연결되는 것인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, GalNac 클러스터 접합체는 하기 화학식 Ib의 화합물, 이의 상응하는 염, 거울상이성질체 및/또는 입체이성질체를 갖는 것인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00009

    [식 중, R1 은 수소 또는 히드록시 보호기이고 n은 0 내지 10의 정수임].
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, GalNac 클러스터 접합체는 하기 화학식 Ic의 화합물을 갖는 것인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00010

    [식 중, M+/++ 는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 양이온임].
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, O-디카르복스이미도우로늄 염은 O-디카르복스이미도우로늄 헥사플루오르포스페이트 또는 O-디카르복스이미도우로늄 테트라플루오로보레이트, 바람직하게 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(비시클로 [2.2.1] 헵트-5-엔-2,3-디카르복스이미도) 우로늄테트라플루오로보레이트 (TNTU) 또는 N,N,N,N-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜) 우로늄테트라플루오로보레이트 (TSTU)인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 커플링제는 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(비시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2,3-디카르복스이미도)우로늄테트라플루오로보레이트 (TNTU)인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, M은 소듐 또는 포타슘, 바람직하게 소듐인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 5' 아미노-변형 올리고뉴클레오티드인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 5'아미노-변형제는 임의로는 아미노 기 보호된 아미노 C2-12-알킬 링커 또는 1개 내지 10개 에틸렌 글리콜 유닛을 함유하는 아미노 에틸렌 글리콜 링커로부터 선택되는 것인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 임의로는 아미노 기 보호된 아미노 C2-12-알킬 링커, 바람직하게 임의로는 아미노 기 보호된 아미노 C4-8-알킬 링커가 선택되는 것인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 임의로는 변형된 DNA, RNA 또는 LNA 뉴클레오시드 단량체 또는 이들의 조합으로 이루어지고, 7개 내지 30개, 바람직하게 10개 내지 25개 뉴클레오티드 길이인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 1.0 내지 1.5 당량의 화학식 I의 GalNAc 클러스터 접합체를 극성 비양자성 용매에 현탁시키고, 1.0 내지 1.5 당량의 커플링제를 첨가하며, 현탁은 0℃ 내지 40℃의 반응 온도에서 수행되는 것인, 활성화 단계, 및
    b) 단계 a)의 반응 혼합물은 0℃ 내지 40℃의 반응 온도에서, 8.0 내지 10.0의 pH의, 10%G 내지 25%G의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 수성 용액과 혼합되는 것인 커플링 단계
    를 포함하는 것인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 극성 비양자성 용매는 N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 또는 N-메틸피롤리딘, 바람직하게 N,N-디메틸포름아미드인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 정제 단계 c)를 추가로 포함하는 것인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 정제는
    a) 알콜계 용매에 의한 침전 또는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피로부터 선택되는 크로마토그래피 단계, 이어서
    b) 접선 유동 여과로부터 선택되는 농축 단계, 및
    c) 동결건조, 여과 또는 분무 건조 또는 알콜계 용매에 의한 침전으로부터 선택되는 단리 단계
    를 포함하는 것인 GalNAc 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법.
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