BR112020013431A2 - processo para a preparação de conjugados de galnac-oligonucleotídeo - Google Patents

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Abstract

A invenção compreende um processo para a preparação de conjugados de GalNAc-oligonucleotídeo que compreende o acoplamento de um composto de aglomerado de GalNAc da fórmula I, ou sais, enantiômeros e/ou um estereoisômero correspondentes do mesmo, com um oligonucleotídeo na presença de um sal de O-dicarboximidourônio como agente de acoplamento.

Description

“PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE GALNAC- OLIGONUCLEOTÍDEO”
[001] A invenção refere-se a um processo para a preparação de conjugados de GalNAc-oligonucleotídeo que compreende o acoplamento de um composto de aglomerado de GalNAc da fórmula oH Cm aglomerado de GalNAc | ou de sais, enantiômeros e/ou um estereoisômero correspondentes do mesmo, com um oligonucleotídeo na presença de um sal de O-dicarboximidourônio como agente de acoplamento.
[002] O procedimento de acoplamento segue, em princípio, os métodos bem conhecidos e extensivamente descritos para a formação de uma ligação peptídica entre uma amina e um ácido carboxílico e, por via de regra, compreende uma ativação do ácido carboxílico e os acoplamentos subsequentes com a amina.
[003] As reações de acoplamento de um aglomerado de GalNAc e um oligonucleotídeo também são bem descritas na técnica. Publicações ilustrativas mais recentes são a Publicação de Pedido de Patente US 2011/0207799, a Publicação PCT WO 2017/021385 que se refere no exemplo 11 ao Pedido de Patente US publicado ou Publicação PCT WO 2018/215391.
[004] Os métodos do estado da técnica são, por via de regra, usando reagentes de acoplamento de diimida tais como DCC, DIC ou EDC ou sais de fosfônio, tais como PyBOP, exigem o uso adicional de bases orgânicas e normalmente são realizados em solventes apróticos polares, tais como em DMF ou DMSO. O acoplamento de oligonucleotídeos prefere condições aquosas; as condições do estado da técnica não são, portanto, favoráveis à aplicação.
[005] Além disso, o uso desses reagentes requer protonação dos sais metálicos de GalNAc antes da ativação. O ácido mais benéfico para esse fim foi o H3POs. No entanto, observou-se que o uso de H3PO. leva à fosforilação de unidades de açúcar GalNAc no produto conjugado. Estes produtos secundários fosforilados não podem ser separados por métodos usuais de purificação.
[006] Os processos do estado da técnica atendem aos requisitos para uma síntese em escala de laboratório. Com os GalNAc-oligonucleotídeos se tornando candidatos promissores de drogas, entrando em fases clínicas mais eficientes, são necessários processos de fabricação em larga escala, mais econômicos e aplicáveis comercialmente.
[007] São desejados processos particulares que não requerem protonação prévia de sais metálicos de GalNAc por H3PO;:, a fim de evitar produtos secundários fosforilados.
[008] Além disso, o excesso de aglomerado de GalNAc, que é usualmente empregado em um excesso de 3 vezes ou mais para garantir a conjugação completa do oligonucleotídeo limitante, precisa ser minimizado.
[009] O objetivo da presente invenção foi, portanto, melhorar substancialmente os processos conhecidos na técnica, particularmente para otimizar condições e parâmetros de reação, tanto para a ativação quanto para a etapa de acoplamento, e para minimizar a formação de produtos secundários.
[010] Verificou-se que o objetivo da invenção poderia ser alcançado com o novo processo para a preparação de conjugados de GalNAc- oligonucleotídeo que compreende o acoplamento de um composto de aglomerado de GalNAc da fórmula
OoH
CEEE aglomerado de GalNAc | ou de sais, enantiômeros efou um estereoisômero correspondentes do mesmo, com um oligonucleotídeo na presença de um sal de O-dicarboximidourônio como agente de acoplamento.
[011] As seguintes definições são apresentadas para ilustrar e definir o significado e o escopo dos vários termos usados para descrever a invenção aqui.
[012] Sempre que um carbono quiral estiver presente em uma estrutura química, pretende-se que todos os estereoisômeros associados a esse carbono quiral sejam abrangidos pela estrutura como estereoisômeros puros, bem como misturas dos mesmos.
[013] O termo “alquila” indica um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado monovalente de 1 a 12 átomos de carbono. Em formas de realização particulares, a alquila tem 1 a 7 átomos de carbono e, em formas de realização mais particulares, 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de alquila incluem metila, etila, propila, isopropila, n-butila, iso-butila, sec-butila ou terc- butila.
[014] O termo “alguila C217” também indica um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado monovalente de 2 a 12 átomos de carbono e, em formas de realização mais particulares, 4 a 8 átomos de carbono. Exemplos de alquila incluem etila, propila, isopropila, n-butila, iso- butila, sec-butila ou terc-butila e pentila, hexila, heptila, octila, nonila, decila, undecila e dodecila e seus isômeros.
[015] O termo “grupo protetor de hidróxi” e o termo “grupo protetor de éster” denotam grupos que pretendem proteger um grupo hidróxi e incluem grupos formadores de éster e éteri, em particular grupos tetrahidropiranila, acila, grupos carbamoila, benzila e sililéteres (por exemplo, TBS, TBDPS). Outros exemplos desses grupos são encontrados em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, 2º ed., John Wiley & Sons, Inc., Nova York, NY, 1991, capítulos 2-3; E. Haslam, “Protective Groups in Organic Chemistry, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, Nova York, NY, 1973, Capítulo 5, e T. W. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley e Sons, Nova York, NY, 1981. São preferidos os grupos acila, particularmente um grupo alquilcarbonila C1-12, mais particularmente um grupo alquilcarbonila C1-6 que é opcionalmente substituído por alquila C1-6 ou fenila. Grupos protetores de hidróxi mais preferidos podem ser selecionados a partir de acetila, pivaloila ou benzoíla, pelo que a acetila é o grupo protetor de hidróxi mais preferido.
[016] O termo “alcalino” abrange os metais alcalinos lítio, sódio e potássio, particularmente sódio e potássio, com preferência ao sódio.
[017] O termo “alcalino-terroso” abrange os metais alcalinos- terrosos cálcio e magnésio, mas particularmente o cálcio.
[018] O termo conjugado de aglomerado de GalNAc representa uma porção dirigida ao receptor de asialoglicoproteínas que pode ser usada para direcionar o composto oligonucleotíideco para hepatócitos e, consequentemente, para tratar doenças hepáticas. Tipicamente, a porção compreende galactosamina, preferencialmente N-acetilgalactosamina.
[019] Em uma forma de realização preferida, o termo conjugado de aglomerado de GalNAc compreende três porções de galactosamina, mais preferencialmente três porções de N-acetilgalactosamina, as quais estão ligadas a um ponto de ramificação central através de um ligante adequado.
[020] Os ligantes adequados que podem variar em comprimento, equilíbrio hidrofílico-hidrofóbico e geometria espacial são descritos, por exemplo, em Huang et al., Bioconjugate Chem. 2017, 28, 283-295.
[021] Os ligantes preferidos são os ligantes de alquileno, ligantes de etileno glicol ou ligantes de alquileno que contêm uma ou mais, preferencialmente uma funcionalidade peptídica (-CO-NH-) na cadeia alquileno.
[022] No caso de múltiplos ligantes, tal como na forma de realização preferida em que três porções de N-acetilgalactosamina estão ligadas a um ponto de ramificação central, os ligantes individuais podem variar, mas preferencialmente são os mesmos.
[023] O ligante preferido é o ligante de etileno glicol.
[024] O termo ligante de alquileno, neste contexto, significa uma “ponte de alquileno C2-12”, particularmente um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramíificado bivalente de 2 a 12 átomos de carbono, em uma forma de realização mais específica, de 4 a 8 átomos de carbono, e em uma forma de realização ainda mais particular, de 6 átomos de carbono. Exemplos particulares são butileno, pentileno, hexileno, heptileno ou octileno e seus isômeros, mas preferencialmente n-hexileno.
[025] O termo “ligante de etileno glicol” significa unidades - (CH2)2-O- que, como unidades de ponte, podem conter 1 a 10 unidades de etileno glicol, preferencialmente 2 a 6 unidades de etileno glicol, mais preferencialmente 3 unidades de etileno glicol.
[026] O termo “ponto de ramificação” neste contexto normalmente significa uma molécula pequena que permite a ligação dos três derivados da galactose e ainda permite a ligação do ponto de ramificação ao oligômero. A molécula de ponto de ramificação preferida é a di-lisina. A di-lisina contém três grupos amina através dos quais podem ser ligados três derivados ligantes de galactosamina e um grupo carboxila através do qual o aglomerado de GalNAc pode ser ligado ao oligonucleotídeo.
[027] Em uma forma de realização preferida, o conjugado de aglomerado de GalNAc tem a fórmula Ib 7 1 Oo R o À No1 O. R H;3C o dx AAA o o o H n NA 1
N HN o Oo 8 Id Ah Oo oO O. RÁ n N CH; H o NA oH
XY
ROSS É H Oo o
OC 1 [AD 2 Oo Oo Oo o o ou, |, dr lb
R SER! em que R' é hidrogênio ou um grupo protetor de hidróxi, preferencialmente hidrogênio ou acetila, mais preferencialmente hidrogênio e n é um número inteiro de O a 10, preferencialmente 1 a 5, mais preferencialmente 2, sais, enantiômeros e/ou um estereoisômero correspondentes do mesmo.
[028] Em uma outra forma de realização preferida, o conjugado de aglomerado de GalNAc tem a fórmula lc
Ho oH Ho o o /R o e R o A = JR o HN Ho o x o o Ho EMA INDO N, / H or qqr Ho - o N M o H o Doo O o HN. Ho o Ho A 1 OH H lc em que M*** é o cátion de um metal alcalino ou de um metal alcalino-terroso como definido acima, preferencialmente de um metal alcalino e, mais preferencialmente, sódio.
[029] O conjugado de aglomerado de GalNAc pode, por exemplo, ser preparado seguindo os métodos descritos na Publicação PCT WO 2017/021385 e como mostrado no esquema abaixo.
ESQUEMA 1: NH 1) 4,0 eq de T3P 50% em EA - Han. SxcHsSoS 12,0 eq de DIPEA 4 on CHs;CN/ 45 *C/ 2h mol o oÊ x. NH 1 PL W. OX ] 2 Co É A o O 2) 20 eq de NaOH 10,8M ,, o À Como Ho. MINO emulsão * O Na” CH;ON jo eq . so A“, Êo B o PINA
END E X + À A o: o oH SE i | ATLAS NH Como solução THF Yv
[030] O termo 5º amino modificado é usado em conexão com o termo oligonucleotídeo 5' amino-modificado e determina um grupo amino reativo ligado covalentemente a um ligante que, como ligante amino, está ligado ao grupo terminal 5' de um oligonucleotídeo. O ligante é, de preferência, um grupo alquila alifático de 2 a 12 átomos de carbono ou um ligante de etileno glicol contendo 1 a 10 unidades de etileno glicol.
[031] O modificador 5' amino preferido é, então, selecionado a partir de um ligante amino alquila C212 com grupo amino opcionalmente protegido, preferencialmente um ligante amino alquila Ca8 com grupo amino opcionalmente protegido, mais preferencialmente um ligante alquila Cs.
[032] Grupos protetores de amino adequados para oO oligonucleotíideo 5' amino modificado são trifluoroacetila (TFA) ou monometoxitritila (MMT).
[033] Por via de regra, o ligante amino é introduzido através de um fosforoamidito de ligante amino disponível comercialmente, tal como, por exemplo, através de fosforoamiditos de ligante de TFA ou MMT-Cs, por exemplo, da Sigma Aldrich ou através do modificador 5' amino fosforoamidito TEG (trietilenoglicol) CE da Glen Research.
[034] O termo oligonucleotídeo, como aqui utilizado, é definido como geralmente é entendido pelo técnico no assunto, como uma molécula compreendendo dois ou mais nucleotídeos covalentemente ligados. Para utilização como um oligonucleotídeo terapeuticamente valioso, os oligonucleotídeos são tipicamente sintetizados como 7 a 30 nucleotídeos, preferencialmente 10 a 25 nucleotídeos de comprimento.
[035] Os oligonucleotídeos podem consistir em monômeros de nucleosídeo de DNA, RNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos.
[036] Os monômeros de nucleosídeo de LNA são nucleosídeos modificados que compreendem um grupo ligante (referido como uma biradícula (biradicle) ou uma ponte) entre C2' e C4' do anel de açúcar ribose de um nucleotídeo. Estes nucleosídeos são também denominados ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA) na literatura.
[037] Opcionalmente modificado, como aqui utilizado, refere-se a nucleosídeos modificados em comparação com o nucleosídeo equivalente de DNA, RNA ou LNA pela introdução de uma ou mais modificações da porção açúcar ou da porção nucleobase. Em uma forma de realização preferida, o nucleosídeo modificado compreende uma porção de açúcar modificada e pode, por exemplo, compreender um ou mais nucleosídeos substituídos em 2º e/ou um ou mais nucleosídeos de LNA. O termo nucleosídeo modificado também pode ser usado aqui de forma intercambiável com o termo “análogo de nucleosídeo” ou “unidades” modificadas ou “monômeros” modificados.
[038] Os nucleosídeos de DNA, RNA ou LNA são, por via de regra, ligados por uma ligação internucleosídica de fosfodiéster (P=O) e/ou de fosforotioato (P=S) que acopla covalentemente dois nucleosídeos juntos.
[039] Por conseguinte, em alguns oligonucleotídeos todas as ligações internucleosídicas podem consistir em um fosfodiéster (P=O), em outros oligonucleotídeos todas as ligações internucleosídicas podem consistir em um fosforotioato (P=S) ou em ainda outros oligonucleotídeos a sequência de ligações internucleosídicas varia e compreende ambos os internucleosídeos de fosfodiéster (P=O) e de fosforotioato (P=S).
[040] As porções de nucleobases podem ser indicadas pelo código de letra para cada nucleobase correspondente, por exemplo, A, T, G, C ou U, em que cada letra pode incluir, opcionalmente, nucleobases modificadas de função equivalente. Por exemplo, nos oligonucleotídeos exemplificados, as porções de nucleobases são descritas com letras maiúsculas A, T, G e VeC (5-
metil citosina) para o nucleosídeo de LNA e com letras minúsculas a, t, g, ce MeC para nucleosídeos de DNA. As nucleobases modificadas incluem, mas não estão limitadas a nucleobases que contêm grupos protetores, tais como terc.butilfenoxiacetila, — fenoxiacetila, — benzoíla, acetila, isobutirlia ou dimetilformamidino (ver Wikipedia, Phosphoramidit-Synthese, https://de wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese de 24 de março de 2016).
[041] De preferência, o oligonucleotídeo consiste em monômeros de nucleosídeo de DNA, RNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos e tem 10 a 25 nucleotídeos de comprimento.
[042] Os princípios da síntese de oligonucleotídeos são bem conhecidos na técnica e bem descritos na literatura e público para, por exemplo, a Wikipedia (veja, por exemplo, Oligonucleotide synthesis; Wikipedia, a enciclopédia livre; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis, de de março de 2016).
[043] Hoje em dia, a síntese de oligonucleotídeos em maior escala é realizada automaticamente usando sintetizadores controlados por computador.
[044] Por via de regra, a síntese de oligonucleotídeos é uma síntese em fase sólida, em que o oligonucleotídeo sendo montado é ligado covalentemente, por meio de seu grupo hidróxi 3'-terminal, a um material de suporte sólido e permanece ligado a ele durante todo o curso da montagem da cadeia. Suportes adequados são os suportes de poliestireno macroporoso disponíveis no mercado, como o suporte Primer 5G da GE Healtheare ou o suporte NittoPhase&OHL da Kinovate.
[045] A síntese de oligonucleotídeos é, em princípio, uma adição gradual de resíduos de nucleotídeos ao terminal 5' da cadeia de crescimento até que a sequência desejada seja montada.
[046] Por via de regra, cada adição é chamada de ciclo sintético e, em princípio, consiste nas reações químicas: a1) desbloquear o grupo hidroxila protegido no suporte sólido; a2) acoplar o primeiro nucleosídeo como fosforamidito ativado ao grupo hidroxila livre no suporte sólido; a3) oxidar ou sulfurar o respectivo nucleosídeo ligado a P para formar o respectivo fosfotriéster (P=O) ou o respectivo fosforotioato (P=S); as) opcionalmente, cobrir quaisquer grupos hidroxila não reagidos no suporte sólido; as) desbloquear o grupo hidroxila 5' do primeiro nucleosídeo ligado ao suporte sólido; as) acoplar o segundo nucleosídeo como fosforamidito ativado para formar o respectivo dímero ligado a P; a7) oxidar ou sulfurar o respectivo dinucleosídeo ligado a P para formar o respectivo fosfotriéster (P=O) ou o respectivo fosforotioato (P=S); as) opcionalmente, cobrir quaisquer grupos hidroxila 5' não reagidos; as) repetir as etapas anteriores de as a as até que a sequência desejada seja montada.
[047] Como descrito acima, o processo da presente invenção é caracterizado pelo acoplamento de um composto de aglomerado de GalNAc da fórmula OoH [Fra GalNAc | ou de sais, enantiômeros e/ou um estereoisômero correspondentes do mesmo, com um oligonucleotídeo na presença de um sal de O-dicarboximidourônio como agente de acoplamento.
[048] Os sais de O-dicarboximidourônio estão, por via de regra, disponíveis comercialmente ou podem ser sintetizados de acordo com processos conhecidos na literatura, por exemplo, Knorr et al., Tetrahedron Letters, vol. 30, nº 15, 1927-1930 (1989).
[049] De preferência, os sais de O-dicarboximidourônio são hexafluorofosfatos de O-dicarboximidourônio ou tetrafluoroboratos de O- dicarboximidourônio.
[050] Eles podem ser selecionados a partir de tetrafluoroborato de N,N,N' N”-tetrametil-O-(biciclo[2.2.1]hept-5-en-2,3-dicarboximido)urônio (TNTU) ou tetrafluoroborato de N,N,N N-tetrametil-O-(N-succinimidil)urônio (TSTU), mais preferencialmente de tetrafluoroborato de N,N,N' N'-tetrametil-O- (biciclo[2.2.1]hept-5-en-2,3 -dicarboximido)urônio (TNTU).
[051] Como alternativa, sais de ariltriazolurônio, tais como 2-(1H- Benzotriazol-1-i1)-1,1,3,3-tetrametilurônio-hexafluorofosfato (HBTU) ou [O-(7- Azabenzotriazol-1-il)-N, N, Nº, Ni=tetrametilurônio-hexafluorofosfato] (HATU), podem ser aplicados. No entanto, eles são menos preferidos.
[052] O processo é caracterizado por uma etapa inicial de ativação a) e uma etapa subsequente de acoplamento b).
ETAPA DE ATIVAÇÃO:
[053] Na etapa de ativação, o conjugado de GalNAc reage com o agente de acoplamento para formar um conjugado de GalNAc ativado. Este intermediário ativado pode ser isolado, mas, por via de regra, é processado adicionalmente in situ na etapa de acoplamento.
[054] O conjugado de GalNAc é, como descrito acima, aplicado preferencialmente na forma de um sal de metal alcalino-terroso ou de metal alcalino, mais preferencialmente como sal de sódio.
[055] Também é possível iniciar a partir de GalNac na forma de ácido carboxílico. Nesse caso, deve ser considerada a desprotonação prévia com uma base adequada, tal como uma amina terciária como a base de diisopropiletilamina.
[056] Geralmente 1,0 a 1,5 equivalentes, preferencialmente 1,0 a 1,3, mais preferencialmente 1,0 a 1,1 equivalentes do conjugado de GalNAc são suspensos em um solvente aprótico polar, adequadamente em N,N- dimetilformamida, dimetilsulfóxido ou N-metilpirrolidina, de preferência em N,N- dimetilformamida.
[057] 1,0 a 1,5 equivalentes, preferenciamente 1,0 a 1,3 equivalentes, mais preferencialmente 1,0 a 1,1 equivalentes do agente de acoplamento podem então ser adicionados.
[058] A reação de ativação pode ocorrer a uma temperatura de reação de O ºC a 40 ºC, mas preferencialmente de 20 ºC a 25 ºC durante 0,5 a 3 horas, preferencialmente durante 0,5 a 1,5 horas, mais preferencialmente 1 hora.
ETAPA DE ACOPLAMENTO:
[059] À mistura de reação obtida a partir da etapa de ativação, pode ser adicionada uma solução aquosa contendo 5% de G a 40% de G, preferencialmente de 10% de G a 20% de G do oligonucleotídeo. Alternativamente, a mistura de reação pode ser doseada para a solução aquosa do oligonucleotídeo.
[060] O pH da mistura de reação é convenientemente controlado entre 7,0 e 10,0, de preferência 8,3 e 9,3.
[061] O controle do pH pode ser alcançado adicionando um hidróxido alcalino ou um sal básico adequado ou misturas dos mesmos.
[062] Tipicamente, pode ser utilizado hidróxido de sódio, um hidrogenocarbonato alcalino como hidrogenocarbonato de sódio ou um hidrogenofosfato alcalino como hidrogenofosfato de sódio.
[063] A temperatura da reação, por via de regra, está na faixa de 0 ºC a 40 ºC, preferencialmente de 20 ºC a 25 ºC.
[064] A conversão completa pode ser alcançada após 1 a 4 horas.
[065] Depois disso, o conjugado de GalNAc-oligonucleotídeo resultante pode ser separado e purificado adicionalmente.
[066] A purificação do conjugado de aglomerado de GalNAc- oligonucleotídeo obtido das etapas anteriores compreende essencialmente as etapas de precipitação ou cromatografia, concentração e isolamento.
[067] Em uma forma de realização preferida, a purificação compreende a) uma precipitação com um solvente alcoólico ou uma cromatografia selecionada a partir de uma cromatografia de troca aniônica ou cromatografia em fase reversa seguida por b) uma etapa de concentração selecionada a partir de uma filtração em fluxo tangencial e c) uma etapa de isolamento selecionada a partir de liofilização, filtração ou secagem por pulverização ou uma precipitação com um solvente alcoólico.
[068] Em uma outra forma de realização preferida, a purificação compreende a) uma cromatografia em fase reversa, opcionalmente em combinação com uma cromatografia de troca aniônica, seguida por b) uma filtração em fluxo tangencial e c) uma liofilização.
[069] Os métodos de purificação mencionados acima são comuns e bem conhecidos dos técnicos no assunto da presente invenção.
[070] O termo precipitação significa a formação de um sólido a partir de uma solução geralmente com a ajuda de um solvente adequado. No contexto da presente invenção, solventes adequados são álcoois, de preferência álcoois inferiores, tais como etanol ou 1-propanol.
[071] O termo cromatografia compreende os métodos de cromatografia de troca aniônica ou cromatografia em fase reversa e combinações dos mesmos.
[072] A cromatografia de troca aniônica é baseada na interação competitiva de íons carregados da solução da amostra com o meio tampão empregado. Pode ser realizada com resinas de troca aniônica convencionais comercialmente disponíveis, preferencialmente aquelas com funcionalização com trimetilamônio. Esses materiais de fase podem ser obtidos, por exemplo, da GE Healthcare, Tosoh Bioscience, Bio-Rad ou Merck. Bons resultados particulares foram alcançados com a resina de troca aniônica TSKgel Super Q- 5PW (QAE), disponível na Tosoh Bioscience.
[073] A cromatografia em fase reversa pode ser realizada com materiais de fase tradicionais comercialmente disponíveis, tais como sorventes de sílica gel modificados como fase estacionária e solventes orgânicos adequados, tais como acetonitrila e, se aplicável, um tampão. Os materiais de fase do tipo sílica gel modificados adequados podem ser selecionados a partir de Kromasil"" C18, Kromasil"" C8, YMC Triart C18 e YMC Triart C8. Bons resultados particulares foram alcançados com o Triart Prep C8-S da YMC.
[074] O termo concentração compreende os métodos de filtração em fluxo tangencial ou evaporação e combinações dos mesmos.
[075] Na filtração em fluxo tangencial ou filtração em fluxo cruzado, a alimentação é passada através da membrana do filtro (tangencialmente) a pressão positiva em relação ao lado do permeado. Uma proporção do material que é menor que o tamanho do poro da membrana passa através da membrana como permeado ou filtrado; tudo o mais é retido no lado de alimentação da membrana como retentado. Os princípios da filtração em fluxo tangencial também são usados nos processos de nanofiltração, ultrafiltração, diafiltração e microfiltração. Membranas adequadas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, da Merck Millipore, sob o nome comercial Pellicon!V. Membranas adequadas têm um peso molecular de corte (MWCO) de < 3kDA. As membranas Merck Millipore Pellicon 2 e 3 com um MWCO de 1 kDA ou 3kDA, respectivamente, são preferidas.
[076] O termo isolamento compreende os métodos de liofilização, precipitação, secagem por pulverização e evaporação. Todos estes termos são bem conhecidos dos técnicos no assunto.
[077] A título ilustrativo, o oligonucleotídeo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*ttitc*a*c*t E VeC*A“G (Oligo 1) AM-C6-5'-caMeC*MeC*t*a*t*tta*a*c*a*-tc*A“G*A*MeC-3' (Oligo 2) AM-C6-5"-caG*VeC*G*t*a*ta*ta*g"a*g"a*G*G-3' (Oligo 3) em que AM-C6 significa um ligante amino C6; * significa pontes de fosforoticato; A, G, T e MºC (5-metil citosina) são monômeros de nucleosídeo de LNA e a, t, c, g são monômeros de nucleosídeo de DNA.
[078] Em uma forma de realização não limitativa, o conjugado de aglomerado de GalNAc-oligonucleotídeo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: GN2-AM-C6-5'-caT* Vec*A*a*c*tttcta*tcttMec*A*G (Composto 1) GN2-AM-C6-5'-caVeC*MeCrattttatatcta tcA"G*A*VeC3' (Composto 2)
GN2-AM-C6-5"-caG*VeC*G*t*a*a*a*g*a*g"a*G*G-3' (Composto 3) em que AM-C6 significa um ligante amino C6; * significa pontes de fosforoticato; A, G, T e MºC (5-metil citosina) são monômeros de nucleosídeo de LNA e a, t, c, g são monômeros de nucleosídeo de DNA e GN2 é a porção de aglomerado de GalNAc que pode ocorrer na forma dos estereoisômeros GN2a ou GN2b, ou misturas dos mesmos da fórmula abaixo, em que R significa a cauda de AM-C6-oligonucleotídeo. Ho oH Ho o o o/ 8 o oo a 4 TN o HN Ho o o Ho mom on od, JR À 4 H fo
HO N Ho o Não Po Io? Ho 97º, HN Ho “NA oH H GN2a Ho oH Ho o o o o o N oo HN Ho o Ho x EMI o, TR ” A H om
HO N Ho 9 Não Fo IAA oo Ho 9º, HN Ho no oHH GN2b
[079] Os compostos aqui revelados têm as seguintes sequências de nucleobases:
SEQ ID NO 1: catcaacttt cactteag SEQ ID NO 2: cacctattta acatcagac SEQ ID NO 3: cagcegtaaag agago.
EXEMPLOS
[080] Abreviações: DMF N,N'- dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido EtoH Etanol MeCN Acetonitrila Nac! Cloreto de sódio NaOAc Acetato de sódio NaOH Hidróxido de sódio TNTU Tetrafluoroborato de N,N,N' N'-tetrametil-O-(biciclo [2.2.1]hept-5-en-2,3-dicarboximido)urônio TSTU Tetrafluoroborato de N,N,N' N'-tetrametil-O-(N- succinimidil)urônio HCTU Hexafluorofosfato de O-(6-clorobenzotriazol-1-il)- N,N,N N-tetrametil urônio PyOAP Hexafluorofosfato — de —(7-azabenzotriazol-1-iloxi) tripirrolidino fosfônio HBTU Hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-11)-1,1,3,3- tetrametil urônio HATU 3-óxido hexafluorofosfato de 1-[Bis(dimetilamino) metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridínio. EXEMPLO 1
[081] GN2-AM-C6-5'-caT* Mec*A*a*tc*ttticta*tc*ttVeC*A*G (Composto 1).
[082] 9,8 g (1,53 mmol, teórico) do oligonucleotídeo 5º amino- modificado com a sequência AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*tttttiotatottt Mec*Aa*G (Oligo 1), dessalinizado por ultrafiltração, foram dissolvidos em NaHCO;3 aquoso (0,1 M, 60 ml, pH 8,3) e EtOH (1 ml) foi adicionado para evitar a formação de espuma.
[083] 2,71 g (1,84 mmol, Eq: 1,2) do conjugado de aglomerado de GalNAc da fórmula 1c com M*** = sódio ((2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R, 4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxi] etoxiletoxilacetillamino]-2-[(28)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido -4 ,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxilacetilJamino] hexanoillamino]hexanoato de sódio) foram suspensos em DMF (12,7 g, 13,5 ml) e TNTU (676 mg, 1,85 mmol, Eq: 1,21) foi adicionado. A suspensão branca foi agitada a 20-25 ºC durante 1 hora para proporcionar uma solução clara (15,49).
[084] A solução de GalNAc ativada preparada acima (12,8 g, 1,0 equivale em 9,8 g de oligo teórico) foi adicionada em um recipiente à solução aquosa de oligonucleotídeo e a agitação foi continuada por 1,5 horas quando o HPLC mostrou conversão completa.
[085] A mistura de reação foi purificada diretamente por RP- HPLC preparativa (YMC Triart C8-S 10 micrômetros, MeCN/ NãaOAc 0,2M em H20O, 45 ºC). As frações contendo o produto foram combinadas e ultrafiltradas e liofiizadas para proporcionar o produto como um pó branco liofilizado (7,5 9, 50%) com uma pureza por HPLC de 80,6% (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH3OH/ MeCN M hexafluoro-2-propanol/ hexilamina/ trietilamina, B: CH;OH/ MeCN) A identidade do produto foi determinada com UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY classe H, Detector Waters MS SQ classe H SQD, coluna: Waters
ACQUITY/UPLC Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1xX50 mm, gradiente A: 95% de água /2,5% de CH3OH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M / 16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5% de água/ 80% de CH3OH/ hexafluoro-2- propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trietilamina). UPLC-MS: m/z 7447,7 (esperado 7445,9). EXEMPLO 2
[086] GN2-AM-C6-5'-caT* MeCc*A*a*to*ttticta*to*tt MeCctA*G (Composto 1).
[087] 13,9 g (1,89 mmol, 87% de pureza) do oligonucleotídeo 5' amino-modificado com a sequência AM-C6-5"-caT* Mec*A*a*to*tttcia*totEVeC'A“G (Oligo 1), sendo dessalinizado por concentração da solução de NaOH, foram dissolvidos em NaHCOs; aquoso (0,1 M, 55 ml) e EtOH (2,5 ml) foi adicionado. O pH foi medido para ser 9,8.
[088] 3,35 g (2,27 mmol, Eq: 1,2) do conjugado de aglomerado de GalNAc da fórmula 1c com M*** = sódio ((28)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R, 4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxi] etoxiletoxilacetillamino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido 4 ,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxilacetiJamino] hexanoilJamino]hexanoato de sódio) foram suspensos em DMF (15,6 g, 16,5 ml) e TNTU (834 mg, 2,28 mmol, Eq: 1,21) foi adicionado. A suspensão branca foi agitada a 20-25 ºC durante 1 hora para proporcionar uma solução clara.
[089] A solução de GalNAc ativada preparada acima foi adicionada em um recipiente à solução aquosa de oligonucleotídeo e a agitação foi continuada por 1 hora quando o HPLC mostrou conversão completa.
[090] A mistura de reação foi triturada com 1-propanol (150 ml) e a suspensão foi agitada a 20-25 ºC por 30 minutos, e depois deixada em repouso por 30 minutos. O líquido foi decantado para deixar um óleo ao qual foi adicionado 1-propanol (100 ml) e a agitação foi continuada por 16 horas. À suspensão foi filtrada, o sólido amarelo lavado duas vezes com 1-propanol (25 ml) e seco sob vácuo para dar o produto como um sólido amarelo (14,8 g, 99% de recuperação) com uma pureza por HPLC de 57,1% (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH30H/ MeCN M hexafluoro-2-propanol/ hexilamina/ trietilamina, B: CH;OH/ MeCN). A identidade do produto foi determinada com UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY classe H, Detector Waters MS SQ classe H SQD, coluna: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotideos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, gradiente A: 95% de água /2,5% de CH3OH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5% de água/ 80% de CH3OH/ hexafluoro-2- propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trietilamina). UPLC-MS: m/z 7447,7 (esperado 7445,9). EXEMPLO 3
[091] GN2-AM-C6-5'-caT* Mec*A*a*tc*tttcia*tcttVeC*A*G (Composto 1).
[092] 12,2 g (1,9 mmol teórico) do oligonucleotídeo 5' amino- modificado com a sequência AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*ttitcta*tott e VeC*A*G (Oligo 1), sendo dessalinizado e purificado por IEX-HPLC, foram dissolvidos em NaHCO; aquoso (0,1 M, 55 ml) foi adicionado. O pH foi medido para ser 8,6.
[093] 3,37 g (2,28 mmol, Eq: 1,2) do conjugado de aglomerado de GalNAc da fórmula 1c com M*** = sódio ((2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R, 4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-]Joxietoxi] etoxiletoxilacetilJamino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido 4 ,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxilacetilJamino] hexanoilJamino]hexanoato de sódio) foram suspensos em DMF (15,6 g, 16,5 ml) e TNTU (839 mg, 2,30 mmol, Eq: 1,21) foi adicionado. A suspensão branca foi agitada a 20-25 ºC durante 1 hora para proporcionar uma solução clara.
[094] A solução de GalNAc ativada preparada acima foi adicionada ao longo de 5 minutos à solução aquosa de oligonucleotídeo e a agitação foi continuada por 2 horas. O HPLC mostrou conversão incompleta e adição de conjugado de aglomerado de GalNAc ativado (preparado a partir de sal de sódio de GalNAc (561 mg, 0,38 mmol, 0,2 equiv), DMF (2,6 ml) e TNTU (146 mg, 0,4 mmol, 0,21 equiv por 1 hora) foi adicionado à mistura de reação. Após 30 minutos adicionais, a mistura de reação foi triturada com 1-propanol (110 ml) e a suspensão foi agitada a 20-25 ºC por 30 minutos, e depois deixada em repouso por 30 minutos. O líquido foi decantado para deixar um óleo ao qual foi adicionado 1-propanol (100 ml) e a agitação foi continuada por 16 horas. A suspensão foi filtrada, o sólido amarelo lavado duas vezes com 1- propanol (25 ml) e seco sob vácuo para dar o produto como um sólido amarelo (14,9 g, 100% de recuperação) com uma pureza por HPLC de 75,4% (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH3OH/ MeCN M hexafluoro-2-propanol/ hexilamina/ trietilamina, B: CH3OH/ MeCN). A identidade do produto foi determinada com UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY classe H, Detector Waters MS SQ classe H SQD, coluna: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, gradiente A: 95% de água /2,5% de CH3OH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5% de água/ 80% de CHsOH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M/ 16,3 mmol! de trietilamina). UPLC-MS: m/z 7447,6 (esperado 7445,9).
EXEMPLO 4
[095] GN2-AM-C6-5'-caT* Mec*A*a*tc*tttciatcttPVeCc*A*G (Composto 1).
[096] 200 mg (0,027 mmol, 87% de pureza) do oligonucleotídeo 5' amino-modificado com a sequência AM-C6-5'-caT* MeC*A*a*c*ttitictato*t tMeC*A*G (Oligo 1), sendo dessalinizado por concentração da solução de NaOH, foram dissolvidos em NaHCO; aquoso (0,1 M, 0,79 ml) com um pH de 9,0.
[097] 40 mg (0,027 mmol, Eq: 1,0) do conjugado de aglomerado de GalNAc da fórmula 1c com M*** = sódio ((2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R, 4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxi] etoxiletoxilacetillamino]-2-[(28)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido -4 ,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxilacetilJamino] hexanoillamino]hexanoato de sódio) foram suspensos em DMF (0,2 ml) e TNTU (10 mg, 0,027 mmol, Eq: 1,0) foi adicionado. A suspensão branca foi agitada a 20-25 ºC durante 1 hora para proporcionar uma solução clara.
[098] A solução de GalNAc ativada preparada acima foi adicionada em um recipiente à solução aquosa de oligonucleotídeo e a agitação foi continuada por 1,5 horas.
[099] A mistura de reação foi triturada com 1-propanol (A4ml)e a suspensão foi agitada a 20-25 ºC por 10 minutos. O líquido foi decantado para deixar um óleo ao qual foi adicionado 1-propanol (4 ml) e a agitação foi continuada por 17 horas. A suspensão foi filtrada, o sólido amarelo lavado duas vezes com 1-propanol (1 ml) e seco sob vácuo para dar o produto como um sólido amarelo (150 mg, 70% de recuperação) com uma pureza por HPLC de 45,8% (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH3OH/ MeCN M hexafluoro-2-propanol/ hexilamina/ trietilamina, B; CH3OH/ MeCN). A identidade do produto foi determinada com UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY classe H, Detector Waters MS SQ classe H SQD, coluna: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, gradiente A: 95% de água /2,5% de CH3OH/ hexafluoro-2- propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5% de água/ 80% de CH3OH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trietilamina). UPLC-MS: m/z 7447,8 (esperado 7445,9). EXEMPLO 5
[0100] GN2-AM-C6-5'-caT* MeCc*A*a*tc*tttcta*tctttVeC*A*G (Composto 1).
[0101] O procedimento do Exemplo 4 foi seguido usando TSTU (9,9 mg, 0,027 mmol, 1,0 equiv) em vez de TNTU para fornecer o produto como um sólido amarelo (160 mg, 75% de recuperação) com uma pureza por HPLC de 56% (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH3OH/ MeCN M hexafluoro-2-propanol/ hexilamina/ trietilamina, B;: CH3OH/ MeCN). A identidade do produto foi determinada com UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY classe H, Detector Waters MS SQ classe H SQD, coluna: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, gradiente A: 95% de água /2,5% de CH3OH/ hexafluoro-2- propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5% de água/ 80% de CH3O0H/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trietilamina). UPLC-MS: m/z 7447,5 (esperado 7445,9).
EXEMPLO 6
[0102] GN2-AM-C6-5"-caG*MeC*G*t*a*a*a*g*a*g"a"*G*G-3" (Composto 3).
[0103] 0,5 g (0,08 mmol, 92% de pureza) do oligonucleotídeo 5' amino-modificado com a sequência AM-C6-5'- caG*MeC*G*tra*a*a*g"'a*'gia*G*G-3' (Oligo 3)) sendo dessalinizado por concentração da solução de NaOH, foram dissolvidos em NaHCO; aquoso (0,1 M, 1,98 ml, pH 8,3).
[0104] 147 mg (99,8 umol, 1,2 equiv) do conjugado de aglomerado de GalNAc da fórmula 1c com M*** = sódio ((28)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R, 4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxi] etoxiletoxilacetiljlamino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido 4 ,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxilacetilJamino] hexanoilJamino]hexanoato de sódio) foram suspensos em DMF (0,8 ml) e TNTU (36,7 mg, 0,10 mmol, Eq: 1,21) foi adicionado. A suspensão branca foi agitada a 20-25 ºC durante 1 hora para proporcionar uma solução clara.
[0105]A solução de GalNAc ativada preparada acima foi adicionada ao longo de 1 minuto à solução aquosa de oligonucleotídeo e a agitação foi continuada por 1 hora quando o HPLC mostrou conversão completa.
[0106] A mistura de reação foi triturada com 1-propanol (5 ml) e a suspensão foi agitada a 20-25 ºC por 30 minutos, e depois deixada em repouso por 30 minutos. O líquido foi decantado para deixar um óleo ao qual foi adicionado 1-propanol (2,5 ml) e a agitação foi continuada por 16 horas. À suspensão foi filtrada, o sólido amarelo lavado duas vezes com 1-propanol (0,9 ml) e seco sob vácuo para dar o produto como um sólido amarelo (560 mg, 96%) com uma pureza por HPLC de 60,9% (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH30H/ MeCN M hexafluoro-2-propanol/ hexilamina/ trietilamina, B: CH;OH/ MeCN) A identidade do produto foi determinada com UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY classe H, Detector Waters MS SQ classe H SQD, coluna: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotidecos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, gradiente A: 95% de água /2,5% de CH3OH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5% de água/ 80% de CH3OH/ hexafluoro-2-
propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trietilamina). UPLC-MS: m/z 6639,2 (esperado 6637,3). EXEMPLO 7
[0107] GN2-AM-C6-5"-caVeC*VeC*t*ra*tttra*ta*c*a*-t'c*A*G*A* MeC-3" (Composto 2).
[0108] 0,5 g (0,07 mmol teórico) do oligonucleotídeo 5' amino- modificado com a sequência AM-C6-5'-caMeC*MeC*tra*ttitiata*tota*t- trc*A*G*A*VeC-3' (Oligo 2), sendo dessalinizado por concentração da solução de NaOH, foram dissolvidos em NaHCO; aquoso (0,1 M, 2,0 ml, pH 8,3).
[0109] 131 mg (88,5 umol, 1,2 equiv) do conjugado de aglomerado de GalNAc da fórmula 1c com M*** = sódio ((2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R, 4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxi] etoxiletoxilacetiljamino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido —4 ,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxilacetilJamino] hexanoilJamino]hexanoato de sódio) foram suspensos em DMF (0,65 ml) e TNTU (32,6 mg, 0,09 mmol, Eq: 1,21) foi adicionado. A suspensão branca foi agitada a 20-25 ºC durante 1 hora para proporcionar uma solução clara.
[0110]A solução de GalNAc ativada preparada acima foi adicionada ao longo de 1 minuto à solução aquosa de oligonucleotídeo e a agitação foi continuada por 2,5 horas quando o HPLC mostrou conversão incompleta e adição de conjugado de aglomerado de GalNAc ativado (preparado a partir de sal de sódio de GalNAc (32,7 mg, 0,02 mmol, 0,3 equiv), DMF (0,15 ml) e TNTU (8,3 mg, 0,02 mmol, 0,31 equiv durante 1 hora) foi adicionado à mistura de reação. Após 1 hora adicional, a mistura de reação triturada com 1-propanol (5 ml) e a suspensão foi agitada a 20-25 ºC por 30 minutos, depois deixada em repouso por 30 minutos. O líquido foi decantado para deixar um óleo ao qual foi adicionado 1-propanol (2,5 ml) e a agitação foi continuada por 16 horas. A suspensão foi filtrada, a sólido amarelo lavado duas vezes com 1-propanol (0,9 ml) e seco sob vácuo para dar o produto como um sólido amarelo (470 mg, 77,6%) com uma pureza por HPLC de 65,6% (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH3OH/ MeCN M hexafluoro-2-propanol/ hexilamina/ trietilamina, B: CH3OH/ MeCN). A identidade do produto foi determinada com UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY classe H, Detector Waters MS SQ classe H SQD, coluna: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, gradiente A: 95% de água /2,5% de CH3OH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5% de água/ 80% de CH3OH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trietilamina). UPLC-MS: m/z 7799,6 (esperado 7798,2). EXEMPLO 8 (EXEMPLO EM LARGA ESCALA)
[0111] GN2-AM-C6-5'-caT* MeCc*A*a*c*ttticta*o* te MeCc*A*G (Composto 1).
[0112] 1,77 kg de uma solução aquosa a 20% p/p, consistindo no oligonucleotídeo 5' amino modificado com a sequência AM-C6-5"-caT* MeC*A*a*c*tttcta*c*ttMeC*A*G (Oligo 1) que dessalinizou por ultrafiltração foram ajustados para pH 8,3-8,5 com NaHCO;.
[0113] 89,8 g (Eq: 1,1) do conjugado de aglomerado de GalNAc da fórmula 1c com M*** = sódio ((2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3- acetamido-4,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxi] acetillamino]-2-[[(2S)-2,6-bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-di- hidroxi-6-(hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxilacetilJamino]hexanoil] amino]lhexanoato de sódio) foram suspensos em DMF (450 ml) e TNTU (22,2 g, Eq: 1,1) foi adicionado. A solução amarelada foi agitada a 20-25 ºC durante 1 hora.
[0114]A solução de GalNAc ativada preparada acima foi adicionada ao longo de 5 minutos à solução aquosa de oligonucleotídeo e a agitação foi continuada por 2 horas. Quando o HPLC mostrou conversão incompleta, a solução adicional de GalNAc ativada foi preparada como acima, a partir do conjugado de aglomerado de GalNAc da fórmula 1c com M*** = sódio ((28)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-di-hidroxi-6- (hidroximetil)tetra-hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxilacetilJamino]-2-[[(28)-2,6- bis[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)tetra- hidropiran-2-ilJoxietoxiletoxiletoxilacetilJamino]hexanoilJamino]hexanoato de sódio) (8,2 g), TNTU (2,0 g) em DMF (41 ml). Esta solução foi adicionada à solução aquosa de oligonucleotídeo em um recipiente e a agitação foi continuada por mais uma hora a 20-25 ºC.
[0115] A mistura de reação foi purificada diretamente por RP- HPLC preparativa (YMC Triart C8-S 10 micrômetros, MeCN/ NãaOAc 0,2M em H20O, 45 ºC). As frações contendo o produto foram combinadas e ultrafiltradas e liofilizadas para proporcionar o produto como um pó branco liofilizado (210 g, 27%) com uma pureza por HPLC de 91,34% (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH30H/ MeCN M hexafluoro-2-propanol/ hexilamina/ trietilamina, B: CH;OH/ MeCN) A identidade do produto foi determinada com UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY classe H, Detector Waters MS SQ classe H SQD, coluna: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotíidecos BEH C18 130A 1,7 um 2,1xX50 mm, gradiente A: 95% de água /2,5% de CH3OH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M / 16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5% de água/ 80% de CH3OH/ hexafluoro-2- propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trietilamina). UPLC-MS: m/z 7447,7 (esperado 7445,9).
[0116]Ao analisar o GN2-AM-C6-5'-caT* MeC*A*ato*ttitio a*c*tEVMeC*A*G purificado por espectrometria de massas de alta resolução, não foram encontrados produtos secundários relacionados à fosforilação do açúcar GalNAc.
EXEMPLO DE COMPARAÇÃO (EM ANALOGIA AO EXEMPLO 3A DO DOCUMENTO WO 2018/215391)
[0117] GN2-AM-C6-5'-caT* MeCc*rA*a*tco*ttticta*to*tt MeCtA*G (Composto 1).
ATIVAÇÃO DE GALNAc:
[0118] 50,3 g (34,1 mmol, 1,6 equiv) de sal de sódio de aglomerado de GalNAc foram suspensos em 250 ml de DMF a 20-25 “C e uma solução de 1,63 ml (24,1 mmol, 1,13 equiv) de ácido fosfórico aquoso a 85% em 250 ml de DMF foi adicionada. Após 5 minutos a 20-25 ºC, 5,88 g (51,1 mmol, 2,40 equiv) de N-hidroxissuccinimida foram adicionados à solução incolor, seguido pela adição de 9,80 g (51,1 mmol, 2,40 equiv) de EDC.HCI (cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida) 1. A solução incolor ligeiramente turva foi agitada durante 4 horas a 20-25 ºC e utilizada na etapa de acoplamento.
ACOPLAMENTO DE GALNAcC:
[0119] Para 2,27 kg da solução contendo teoricamente 136,4 g (21,3 mmol, 1,0 equiv) de AM-C6-5'caT* MeCc*A*a*c*tttctato tt MeC*A*G-3' como seu sal de sódio, foi adicionado 42,8 ml (245 mmol, 11,3 equiv) de N- etildiisopropilamina e 900 mL de DMSO, a solução foi aquecida a 4045 “C e adicionada em 1 minuto à solução de GalNAc ativada de cima. A solução amarela foi agitada por 0,5 horas a 40 ºC para obter uma solução bruta de GalNACAM-C6-5'caT* Mec*A*a*c*tititicta*tottVec*A*G-3' como seu sal de sódio. O HPLC mostrou 53,0% da área em solução bruta (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos
BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH30H/ MeCN/ hexafluoro-2-propanol 0,2M/ hexilamina 0,05M/ trietilamina 0,04M, B: CH;OH/ MeCN 9:1. Esta solução foi armazenada a 4 “C até a purificação. O procedimento de acoplamento acima foi repetido duas vezes na mesma escala, as três misturas de reação individuais foram combinadas para purificação.
[0120] A mistura de reação foi purificada diretamente por RP- HPLC preparativa (YMC Triart C8-S 10 micrômetros, MeCN/ NaOAc 0,2M em H2O, 45 ºC). As frações contendo o produto foram combinadas e ultrafiltradas e liofiizadas para proporcionar o produto como um pó branco liofilizado (355 9, 30%) com uma pureza por HPLC de 90,35% (Sistema LC Agilent Technologies 1290 Infinity, Coluna: Waters ACQUITY/UPLC, Oligonucleotídeos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, 260 nm, gradiente A: Água/ CH3OH/ MeCN M hexafluoro-2-propanol/ hexilamina/ trietilamina, B: CH;OH/ MeCN) A identidade do produto foi determinada com UPLC-MS (Waters UPLC ACQUITY classe H, Detector Waters MS SQ classe H SQD, coluna: Waters ACQUITY/UPLC Oligonucleotídecos BEH C18 130A 1,7 um 2,1x50 mm, gradiente A: 95% de água /2,5% de CH3OH/ hexafluoro-2-propanol 0,2 M / 16,3 mmol de trimetilamina, B: 17,5% de água/ 80% de CH3OH/ hexafluoro-2- propanol 0,2 M/ 16,3 mmol de trietilamina). UPLC-MS: m/z 7447,7 (esperado 7445,9).
[0121]O GN2-AM-C6-5'caT* Mec*A*atotttiticiato tt MeC*A“G purificado foi analisado por espectrometria de massas de alta resolução. Um produto secundário com massa 7503,27984, atribuído a um produto modificado com diéster de fosfato, em que uma das três unidades de açúcar GalNAc foi modificada com um fragmento PO>z' foi encontrado em abundância de 0,67%. Um produto secundário com massa 7521,32758, atribuído a um produto modificado com monoéster de fosfato de estrutura Y, em que uma das três unidades de açúcar GalNAc foi modificada com um HPO;, foi encontrado em abundância de 0,79%.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE GALNAC-OLIGONUCLEOTÍDEO, caracterizado por compreender o acoplamento de um composto de aglomerado de GalNAc da fórmula oH Conjugado de aglomerado de o Fra oo | ou sais, enantiômeros e/ou um estereoisômero correspondentes do mesmo, com um oligonucleotídeo na presença de um sal de O- dicarboximidourônio como agente de acoplamento.
2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo conjugado de aglomerado de GalNAc compreender três porções de galactosamina ligadas a um ponto de ramificação central.
3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelas porções de galactosamina estarem ligadas ao ponto de ramificação central por meio de um ligante de alquileno, um ligante de etileno glicol ou um ligante de alquileno contendo uma ou mais funcionalidades peptídicas (-CO-NH-) na cadeia alquileno, mas de preferência por meio de um ligante de etileno glicol.
4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo conjugado de aglomerado de GalNAc possuir a fórmula lb
RR o á o
NY O. R HaC p dx o o +H o > o o | A A HN. O: Oo o. o Roo o To CH; H oH
EN A R o o N. H o o o [ DATA A Rº o ó n HN,. “IX À o N cH
EO RS
R NR em que R' é hidrogênio ou um grupo protetor de hidróxi e n é um número inteiro de O a 10, sais, enantiômeros e/ou um estereoisômero correspondentes do mesmo.
5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo conjugado de aglomerado de GalNAc possuir a fórmula lc Ho oH Ho. fe) o [A o TN oo Hd HO. o Oo ton dota, $ o HO N Mer o, CNN (DANDO O. o HN,. Ho o
DOS oH n em que M*** é o cátion de um metal alcalino ou de um metal alcalino-terroso.
6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo sal de O-dicarboximidourônio ser um hexafluorofosfato de O-dicarboximidourônio ou um tetrafluoroborato de O- dicarboximidourônio, de preferência tetrafluoroborato de N,N,N' N'-tetrametil-O- (biciclo[2.2.1]hept-5-en-2,3-dicarboximido)urônio (TNTU) ou tetrafluoroborato de N,N,N N-tetrametil-O-(N-succinimidil)urônio (TSTU).
7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo agente de acoplamento ser tetrafluoroborato de N,N,N' N”-tetrametil-O-(biciclo[2.2.1]hept-5-en-2,3- dicarboximido)urônio (TNTU).
8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por M ser sódio ou potássio, de preferência sódio.
9. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo oligonucleotideco ser um oligonucleotídeo 5' amino-modificado.
10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo modificador 5' amino ser selecionado a partir de um ligante amino alquila C2-12 com grupo amino opcionalmente protegido ou um ligante amino etileno glicol contendo 1 a 10 unidades de etileno glicol.
11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por um ligante amino alquila C212 com grupo amino opcionalmente protegido, de preferência um ligante amino alquila Ca-8 com grupo amino opcionalmente protegido ser selecionado.
12. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo oligonucleotídeo consistir em monômeros de nucleosídeo de DNA, RNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos e ter 7 a 30, de preferência 10 a 25 nucleotídeos de comprimento.
13. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender a) uma etapa de ativação, em que 1,0 a 1,5 equivalentes do conjugado de aglomerado de GalNAc de fórmula | são suspensos em um solvente aprótico polar, 1,0 a 1,5 equivalentes do agente de acoplamento são adicionados e a suspensão está a uma temperatura de reação de 0 *C a 40 ºC; e b) uma etapa de acoplamento, em que a mistura de reação da etapa a) é misturada com uma solução aquosa contendo 10% de G a 25% de G do oligonucleotídeo a um pH de 8,0 a 10,0 a uma temperatura de reação de 0ºCad4o"c.
14. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo solvente aprótico polar ser N .N-dimetilformamida, dimetilsulfóxido ou N-metilpirrolidina, preferencialmente N N-dimetilformamida.
15. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender adicionalmente uma etapa de purificação c).
16. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela purificação compreender a) uma precipitação com um solvente alcoólico ou uma cromatografia selecionada a partir de uma cromatografia de troca aniônica ou cromatografia em fase reversa seguida por b) uma etapa de concentração selecionada a partir de uma filtração em fluxo tangencial e c) uma etapa de isolamento selecionada a partir de liofilização, filtração ou secagem por pulverização ou uma precipitação com um solvente alcoólico.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA45496A (fr) 2016-06-17 2019-04-24 Hoffmann La Roche Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b
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TWI762732B (zh) * 2017-10-16 2022-05-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於降低PAPD5及PAPD7 mRNA以治療B型肝炎感染之核酸分子
PE20210346A1 (es) 2018-07-03 2021-02-25 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para modular la expresion de tau
GB2627637A (en) * 2020-03-04 2024-08-28 Verve Therapeutics Inc A method for reducing the risk of coronary disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2539451E (pt) 2010-02-24 2016-03-28 Arrowhead Res Corp Composições para entrega de arnsi dirigida ao alvo
SG11201702877TA (en) * 2014-10-10 2017-05-30 Hoffmann La Roche Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use
WO2016165831A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 Curevac Ag Lyophilization of rna
MX369556B (es) * 2015-08-06 2019-11-12 Hoffmann La Roche Procesos para la preparacion de derivados acidos de n-acetilgalactosamina (galnac).
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