TWI762732B - 用於降低PAPD5及PAPD7 mRNA以治療B型肝炎感染之核酸分子 - Google Patents

用於降低PAPD5及PAPD7 mRNA以治療B型肝炎感染之核酸分子 Download PDF

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Abstract

本發明係關於與PAP相關結構域蛋白5 (PAPD5)及PAP相關結構域蛋白7 (PAPD7)兩者互補的核酸分子，從而使得在使用單一核酸分子時抑制PAPD5及PAPD7兩者之表現。本發明亦提供用於治療和/或預防HBV感染，尤其慢性HBV感染之PAPD5及PAPD7特異性核酸分子。本發明亦包含一種適用於治療及/或預防HBV感染之醫藥組合物。

Description

用於降低PAPD5及PAPD7　mRNA以治療B型肝炎感染之核酸分子
本發明係關於與PAP相關結構域蛋白5 (PAPD5)及PAP相關結構域蛋白7 (PAPD7)兩者互補的核酸分子，從而使得在使用單一寡核苷酸時抑制PAPD5及PAPD7兩者之表現。本發明亦提供用於治療和/或預防HBV感染，尤其慢性HBV感染之PAPD5及PAPD7特異性核酸分子。本發明亦包含一種適用於治療及/或預防HBV感染之醫藥組合物。
HBV感染仍然係世界範圍內之主要健康問題，估計有3.5億慢性攜帶者。大約25%的攜帶者死於慢性肝炎、肝硬化或肝癌。B型肝炎病毒為繼菸草之後的第二最主要致癌物，其導致60%至80%的所有原發性肝癌。HBV的接觸傳染性比HIV高100倍。
B型肝炎病毒(HBV)係部分雙股的包膜DNA病毒。緊湊的3.2 kb HBV基因組由四個重疊的開放閱讀框架(ORF)組成，其編碼核心蛋、聚合酶(Pol)、包膜及X蛋白質。Pol ORF最長且包膜ORF位於其內，而X及核心ORF與Pol ORF重疊。HBV之生命週期具有兩個主要事件：1)自鬆弛環狀DNA (RC DNA)產生閉合環狀DNA (cccDNA)；及2)反轉錄前基因組RNA (pgRNA)以產生RC DNA。在感染宿主細胞之前，HBV基因組以RC DNA之形式存在於病毒粒子內。已經確定HBV病毒粒子能夠藉由以下方式進入宿主細胞：與人類肝細胞表面上所存在的帶負電蛋白聚糖非特異性結合(Schulze,Hepatology , 46, (2007), 1759-68)；以及與肝細胞牛磺膽酸鈉共運輸多肽(NTCP)受體之HBV表面抗原(HBsAg)特異性結合(Yan,J Virol , 87, (2013), 7977-91)。所有HBV病毒mRNA經加帽及聚腺苷酸化，且隨後輸出至細胞質以供轉譯。在細胞質中，起始新病毒之裝配，且初生pgRNA封裝有病毒Pol，使得可開始pgRNA經由單股DNA中間物至RC DNA之反轉錄。
回應於肝細胞及/或肝臟內免疫細胞受HBV感染之抗病毒細胞介素分泌在受感染肝臟之病毒清除中起主要作用。然而，慢性感染患者由於病毒用於抵抗宿主細胞識別系統及後續抗病毒反應之各種逃逸策略而僅顯示較弱免疫反應。
許多觀測結果顯示，若干HBV病毒蛋白可藉由干擾病毒識別信號傳導系統來抵抗初始宿主細胞反應且隨後抵抗干擾素(IFN)抗病毒活性。其中，認為HBV空亞病毒顆粒(SVP，HBsAg)之過度分泌參與維持在慢性感染患者(CHB)中所觀測到的免疫耐受狀態。持續暴露於HBsAg及其他病毒抗原可導致HBV特異T細胞缺失或進行性功能減弱(Kondo,Journal of Immunology (1993), 150, 4659-4671；Kondo,Journal of Medical Virology (2004), 74, 425-433；Fisicaro,Gastroenterology , (2010), 138, 682-93)。此外，已報導HBsAg藉由直接相互作用抑制免疫細胞，諸如單核球、樹突狀細胞(DC)及自然殺手(NK)細胞之功能(Op den Brouw,Immunology , (2009b), 126, 280-9；Woltman,PLoS One , (2011), 6, e15324；Shi,J Viral Hepat. (2012), 19, e26-33；Kondo,ISRN Gasteroenterology , (2013), 文章編號935295)。
HBsAg定量係慢性B型肝炎之預後及治療反應之重要生物標記。然而，很少在慢性感染患者中觀測到HBsAg降低及血清轉化之達成，其仍然係終極治療目標中之一者。諸如核苷(核苷酸)類似物之當前療法為抑制HBV DNA合成但並不用於降低HBsAg水準之分子。核苷(核苷酸)類似物甚至在長期治療的情況下僅顯示與天然觀測結果類似的較弱HBsAg清除率(1%至2%之間) (Janssen,Lancet , (2005), 365, 123-9；Marcellin,N. Engl. J. Med. , (2004), 351, 1206-17；Buster,Hepatology , (2007), 46, 388-94)。最近已證實，完全或部分整合的B型肝炎病毒DNA為慢性感染個人中HBsAg表現之來源(參見Wooddell等人2017 Sci. Transl. Med. 第9卷, 第409期, eaan0241)。
B型肝炎e抗原(亦稱為HBV包膜抗原或HBeAg)為B型肝炎感染細胞所分泌的病毒蛋白。HBeAg與慢性B型肝炎感染有關，且用作活動性病毒性疾病及患者感染程度之標記物。
B型肝炎病毒前核心區或HBeAg之功能並非完全已知的。然而，眾所周知HBeAg在病毒續存中起重要作用。認為HBeAg藉由充當免疫調節蛋白而促進HBV慢性化。特定言之，HBeAg為分泌型輔助蛋白，其似乎減弱對細胞內核衣殼蛋白之宿主免疫反應(Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141)。HBeAg充當促進HBV續存之免疫耐受原，且由於可溶性HBeAg穿過胎盤而有可能在子宮內活動(Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141)。此外，HBeAg下調i)控制細胞內信號傳導之細胞基因及ii)類鐸受體2 (TLR-2)，以抑制對病毒感染之先天性免疫反應(Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141)。在沒有HBeAg的情況下，HBV複製與TLR2路徑之上調相關(Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141)。因此，HBeAg在調節病毒/宿主相互作用以影響宿主免疫反應方面起重要作用(Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141)。由此，降低HBeAg陽性患者群體中之HBeAg可引起HBV特異性免疫功能障礙之逆轉(Milich, 1997, J. Viral. Hep. 4: 48-59；Milich, 1998, J. Immunol. 160: 2013-2021)。另外，分泌型HBeAg相比於細胞內肝炎核心抗原(HBcAg)在引發T細胞耐受方面明顯更高效，且HBeAg與HBcAg之間的分裂T細胞耐受以及HBc/HBeAg特異性T細胞耐受之純系異質性對於天然HBV感染且尤其對於前核心區陰性的慢性肝炎可具有重要意義(Chen, 2005, Journal of Virology, 79: 3016-3027)。
因此，與單獨抑制HBsAg分泌相比，除減少HBsAg分泌外亦減少HBeAg分泌將改良對形成慢性HBV感染之抑制。另外，已報導，在來自HBeAg陽性母親的母嬰及新生兒HBV傳播的情況下，急性感染至慢性感染之傳播率最高(＞80%) (Liaw, Lancet, 2009, 373: 582-592；Liaw, Dig. Dis. Sci., 2010, 55: 2727-2734；及Hadziyannis, 2011, Journal of hepatology, 55: 183-191)。因此，減少準母親之HBeAg不僅可降低患者之感染程度，且亦可抑制其子女形成慢性HBV感染。
因此，在HBV治療中，存在對抑制病毒表現，尤其對抑制HBsAg及HBeAg分泌之未滿足的醫療需要(Wieland, S. F. & F. V. Chisari. J Virol, (2005), 79, 9369-80；Kumar等人 J Virol, (2011), 85, 987-95；Woltman等人 PLoS One, (2011), 6, e15324；Op den Brouw等人 Immunology, (2009b), 126, 280-9)。
在WO 2017/066712中，已描述與端粒疾病之治療及診斷有關的PAPD5下調。已描述用於此目的之五種shRNA結構。
PCT/EP2017/064980揭示，用核酸分子及此類分子之組合靶向PAPD5或PAPD7以治療HBV感染。
本發明之目標 本發明鑑別出能夠在活體內及活體外抑制PAPD5及PAPD7兩者之表現的新穎核酸分子。用單一分子抑制兩種標靶核酸之能力就生產、至標靶細胞之遞送簡單性、藥物動力學/藥力學(PK/PD)簡單性及達成治療效益所需濃度而言具有明顯優勢。此外，本發明證實，PAPD5及PAPD7基因表現阻斷與HBV抗原抑制(諸如HBsAg抑制)之間存在相關性。
定義 核酸分子 如本文所使用，術語「核酸分子」或「治療性核酸分子」如熟習此項技術者一般所理解定義為包含兩個或更多個共價鍵聯核苷之分子(亦即，核苷酸序列)。本發明之方法中所提及之核酸分子通常為長度小於50個核苷酸之治療性寡核苷酸。核酸分子可為或包含反義寡核苷酸，或可為另一寡聚核酸分子，諸如CRISPR RNA、siRNA、shRNA、適體或核糖核酸酶。核酸分子為通常在實驗室中藉由固相化學合成隨後純化所製得的組合物。當提及核酸分子之序列時，提及共價鍵聯核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之核酸分子為人造的，且為化學合成的，並且通常經純化或分離。本發明之核酸分子可包含一或多個經修飾之核苷或核苷酸。
在一些實施例中，本發明之核酸分子包含以下或由以下組成：12至50個核苷酸長度，諸如13至40個，諸如14至35個，諸如15至30個，諸如16至22個核苷酸長度，諸如16至18個或15至17個連續核苷酸長度。
在一些實施例中，核酸分子或其連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：22個或更少核苷酸，諸如20個或更少核苷酸，諸如18個或更少核苷酸，諸如14、15、16或17個核苷酸。應理解，本文中所給出之任何範圍包括範圍端點。因此，若稱核酸分子包括10至30個核苷酸，則包括10個及30個核苷酸兩者。
在一些實施例中，連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個連續核苷酸長度。
核酸分子係用於調節哺乳動物中標靶核酸之表現。在一些實施例中，諸如用於siRNA、shRNA及反義寡核苷酸之核酸分子通常用於抑制標靶核酸之表現。
在本發明之一個實施例中，核酸分子係選自RNAi試劑，諸如siRNA或shRNA。在另一實施例中，核酸分子為單股反義寡核苷酸，諸如高親和力經修飾反義寡核苷酸。
在一些實施例中，核酸分子為硫代磷酸酯核酸分子。在一些實施例中，核酸分子包含硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
在一些實施例中，核酸分子可與非核苷部分(結合部分)結合。
核酸分子庫應理解為變體核酸分子之集合。核酸分子庫之目的可改變。在一些實施例中，出於鑑別核酸分子庫內最有效序列之目的，核酸分子庫包含具有靶向PAPD5標靶核酸與PAPD7標靶核酸之間的共同區域的重疊核鹼基序列的寡核苷酸。在一些實施例中，核酸分子庫為母體或上代核酸分子之核酸分子設計變體(子代核酸分子)庫，其中該等核酸分子設計變體保有母體核酸分子之核心核鹼基序列。
寡核苷酸 如本文所使用，術語「寡核苷酸」如熟習此項技術者一般所理解定義為包含兩個或更多個共價鍵聯核苷之分子。此類共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在實驗室中藉由固相化學合成隨後純化而製得。當提及寡核苷酸之序列時，提及共價鍵聯核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，並且通常經純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一或多個經修飾之核苷或核苷酸。
反義寡核苷酸 如本文所使用，術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由與標靶核酸雜交、尤其與標靶核酸上之連續序列雜交而調節標靶基因表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸基本上不為雙股，且因此不為siRNA或shRNA。較佳地，本發明之反義寡核苷酸係單股。術語單股為熟習此項技術者通常所理解。尤其應理解，本發明之單股寡核苷酸可形成髮夾結構或分子間雙螺旋結構(同一寡核苷酸之兩個分子之間的雙螺旋)，只要寡核苷酸之全長內之序列內或序列間自身互補程度小於50%。
在本發明之一個實施例中，反義寡核苷酸為募集RNaseH之寡核苷酸。與RNAi分子相反，反義寡核苷酸亦在細胞核中起作用。由於反義寡核苷酸在細胞核中起作用，因此靶向前體mRNA序列及反義寡核苷酸為較佳的。
RNAi 本文中，術語「RNA干擾(RNAi)分子」係指能夠經由細胞質中之RNA誘導沉默複合物(RISC)而誘導RNA依賴性基因沉默之較短雙股RNA分子，其中該等分子與催化性RISC組分AGO蛋白(argonaute)相互作用。一種RNAi分子為小干擾RNA (siRNA)，其為藉由在轉錄後結合互補的mRNA而使該等互補mRNA之轉譯降級及減少的雙股RNA分子。小髮夾RNA (shRNA)為具有髮夾結構之人工RNA分子，其在表現後能夠經由DICER及RNA誘導沉默複合物(RISC)而降低mRNA。RNAi分子可基於相關基因之RNA序列加以設計。對應的RNAi可隨後以化學方式或藉由活體外轉錄而合成，或由載體或PCR產物表現。
siRNA及shRNA分子之長度通常在20與50個核苷酸之間，諸如長度在25與35個核苷酸之間，且與被稱為Dicer之核酸內切酶相互作用，咸信該核酸內切酶將dsRNA加工成19至23個鹼基對的具有兩個特徵性鹼基3'懸垂物的短干擾RNA，該等短干擾RNA隨後併入至RNA誘導沉默複合物(RISC)中。US 8,349,809及US 8,513,207中已描述Dicer受質之有效擴展形式，該等文獻在此以引用之方式併入。在與恰當的標靶mRNA結合之後，RISC內之一或多種核酸內切酶使標靶裂解以誘導沉默。可使用經修飾之核苷酸間鍵聯及高親和力核苷，諸如經2'-4'雙環核糖修飾之核苷(包括LNA及cET)來對RNAi試劑進行化學修飾。
連續核苷酸序列 術語「連續核苷酸序列」係指寡核苷酸中與標靶核酸互補之區域。該術語在本文中可與術語「連續核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基元序列」互換使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸構成連續核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸包含連續核苷酸區域且可視情況包含其他核苷酸，例如可用以使官能基連接至連續核苷酸序列的核苷酸連接區域。核苷酸連接子區可與標靶核酸互補或可能不與其互補。
核苷酸 核苷酸係寡核苷酸及聚核苷酸之構築嵌段，且出於本發明之目的包括天然存在及非天然存在之核苷酸兩者。在本質上，核苷酸(諸如DNA及RNA核苷酸)包含核糖部分、核鹼基部分及一或多個磷酸酯基(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱作「單元」或「單體」。
經修飾之核苷 如本文所用之術語「經修飾之核苷」或「核苷修飾」係指與當量DNA或RNA核苷相比，藉由引入一或多個糖部分或(核)鹼基部分之修飾而經修飾的核苷。在一較佳實施例中，經修飾之核苷包含經修飾之糖部分。術語經修飾之核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾之「單元」或經修飾之「單體」互換使用。具有未經修飾之DNA或RNA糖部分之核苷在本文中稱為DNA或RNA核苷。若DNA或RNA核苷之鹼基區域中具有修飾的核苷允許Watson Crick鹼基配對，則其通常仍被稱為DNA或RNA。
經修飾之核苷間鍵聯 術語「經修飾之核苷間鍵聯」如熟習此項技術者一般所理解定義為除磷酸二酯(PO)鍵聯以外之鍵聯，其將兩個核苷共價地偶合在一起。具有經修飾核苷間鍵聯之核苷酸亦稱為「經修飾之核苷酸」。在一些實施例中，與磷酸二酯鍵聯相比，經修飾之核苷間鍵聯增加本發明之核酸分子之核酸酶耐受性。對於天然存在之寡核苷酸，核苷間鍵聯包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵之磷酸酯基。經修飾之核苷間鍵聯尤其適用於使寡核苷酸以及siRNA在活體內使用時穩定，且可用於防止本發明之寡核苷酸或siRNA中之DNA或RNA核苷區域(例如，間隔體寡核苷酸之間隔區域)以及經修飾核苷區域中之核酸酶裂解。
在一實施例中，例如反義寡核苷酸、shRNA或siRNA之核酸分子包含自天然磷酸二酯修飾成例如更能抵抗核酸酶攻擊之鍵聯的一或多個核苷間鍵聯。核酸酶耐受性可藉由使寡核苷酸在血清中培育，或藉由使用核酸酶耐受性分析(例如蛇毒液磷酸二酯酶(SVPD))測定，均在此項技術中熟知。能夠增強寡核苷酸之核酸酶耐受性之核苷間鍵聯稱為耐核酸酶核苷間鍵聯。在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少50%核苷間鍵聯經修飾，諸如寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少60%，諸如至少70%，諸如至少80%或諸如至少90%核苷間鍵聯經修飾。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵聯經修飾。將認識到，在一些實施例中，將本發明之寡核苷酸鍵聯至非核苷酸官能基(諸如結合物)之核苷可為磷酸二酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵聯係耐核酸酶核苷間鍵聯。
經修飾之核苷間鍵聯可選自包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及硼烷磷酸酯之群。在一些實施例中，經修飾之核苷間鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯)與本發明寡核苷酸之RNaseH募集相容。
在一些實施例中，核苷間鍵聯包含硫(S)，諸如硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
硫代磷酸酯核苷間鍵聯由於核酸酶耐受性、有益的藥代動力學及製造簡易性而為尤其適用的。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少50%核苷間鍵聯為硫代磷酸酯，諸如寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少60%，諸如至少70%，諸如至少75%，諸如至少80%或諸如至少90%核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。在一些實施例中，硫代磷酸酯核苷間鍵聯中之至少一者經立體限定，諸如寡核苷酸中之至少20%、30%、40%、50%、60%，諸如至少70%，諸如至少75%，諸如至少80%或諸如至少90%核苷間鍵聯經立體限定。立體限定的硫代磷酸酯鍵聯之合成例如描述於WO2014/012081及WO2016/079181中。
在一些實施例中，寡核苷酸包含一或多種中性核苷間鍵聯，特定言之選自磷酸三酯、膦酸甲酯、MMI、醯胺-3、甲縮醛或硫代甲縮醛之核苷間鍵聯。
其他核苷間鍵聯揭示於WO2009/124238 (以引用之方式併入本文中)中。在一實施例中，核苷間鍵聯係選自WO2007/031091 (以引用之方式併入本文中)中所揭示之連接子。特定言之，核苷間鍵聯可選自 -O-P(O)2 -O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2 -O-、-S-P(O)2 -O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2 -O-、-O-P(O)2 -S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2 -S-、-O-PO(RH )-O-、O-PO(OCH3 )-O-、-O-PO(NRH )-O-、-O-PO(OCH2 CH2 S-R)-O-、-O-PO(BH3 )-O-、-O-PO(NHRH )-O-、-O-P(O)2 -NRH -、-NRH -P(O)2 -O-、 -NRH -CO-O-、-NRH -CO-NRH -，及/或核苷間連接子可選自由以下組成之群：-O-CO-O-、-O-CO-NRH -、-NRH -CO-CH2 -、-O-CH2 -CO-NRH -、 -O-CH2 -CH2 -NRH -、-CO-NRH -CH2 -、-CH2 -NRH CO-、-O-CH2 -CH2 -S-、-S-CH2 -CH2 -O-、-S-CH2 -CH2 -S-、-CH2 -SO2 -CH2 -、-CH2 -CO-NRH -、 -O-CH2 -CH2 -NRH -CO -、-CH2 -NCH3 -O-CH2 -，其中RH 係選自氫及C1-4 -烷基。
耐核酸酶鍵聯(諸如硫代磷酸酯鍵聯)尤其適用於在與標靶核酸形成雙螺旋體時能夠募集核酸酶之反義寡核苷酸區域(諸如間隔體之區域G)，或頭體(headmer)及尾體(tailmer)之非經修飾核苷區域。然而，硫代磷酸酯鍵聯亦可適用於非核酸酶募集區域及/或親和力增強區域(諸如間隔體之區域F及F')，或頭體及尾體之經修飾核苷區域。
然而，尤其在經修飾核苷(諸如LNA)保護鍵聯免受核酸酶降解之區域中，設計區域中之每一者可包含除硫代磷酸酯以外的核苷間鍵聯，諸如磷酸二酯鍵聯。尤其在經修飾核苷單元之間或靠近經修飾核苷單元(通常在非核酸酶募集區域中)包括磷酸二酯鍵聯(諸如一個或兩個鍵聯)可調節寡核苷酸之生物利用率及/或生物分佈，參見WO2008/113832，其以引用之方式併入本文中。
在一實施例中，反義寡核苷酸中之所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯及/或硼烷磷酸酯鍵聯。較佳地，寡核苷酸中之所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
立體無規硫代磷酸酯鍵聯 硫代磷酸酯鍵聯為核苷間磷酸酯鍵聯，其中非橋接氧中之一者已經硫取代。用硫取代非橋接氧中之一者引入對掌性中心，且因此在單個硫代磷酸酯寡核苷酸內，每一硫代磷酸酯核苷間鍵聯將呈S (Sp)或R (Rp)立體同功異型物。此類核苷間鍵聯被稱為「對掌性核苷間鍵聯」。藉由比較，磷酸二酯核苷間鍵聯由於其具有兩個非末端氧原子而為非對掌性的。
立體中心之對掌性指定藉由標準Cahn-Ingold-Prelog規則(CIP優先規則)判定，其首先公佈於Cahn, R.S.；Ingold, C.K.；Prelog, V. (1966). 「Specification of Molecular Chirality」. Angewandte Chemie International Edition. 5 (4): 385-415. doi:10.1002/anie.196603851中。
在標準寡核苷酸合成期間，偶合及後續硫化之立體選擇性不受控。出於此原因，各硫代磷酸酯核苷間鍵聯之立體化學隨機為Sp或Rp，且因此，由傳統寡核苷酸合成產生之硫代磷酸酯寡核苷酸實際上可以多達2X 種不同硫代磷酸酯非對映異構體之形式存在，其中X為硫代磷酸酯核苷間鍵聯之數目。此類寡核苷酸在本文中被稱為立體無規硫代磷酸酯寡核苷酸，且不含有任何立體限定的核苷間鍵聯。因此，立體無規硫代磷酸酯寡核苷酸為來源於非立體限定合成之個別非對映異構體之混合物。在此上下文中，混合物定義為多達2X 種不同硫代磷酸酯非對映異構體。
立體限定的核苷間鍵聯 立體限定的核苷間鍵聯為向寡核苷酸中引入對掌性中心的核苷間鍵聯，該核苷間鍵聯在個別寡核苷酸分子群內主要以一種立體異構形式(R或S)存在。
應認識到，此項技術中所使用的立體選擇性寡核苷酸合成方法通常在各核苷間鍵聯立體中心處提供至少約90%或至少約95%的立體選擇性，且因此，至多約10% (諸如約5%)的寡核苷酸分子可具有不同的立體異構形式。
在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯立體中心之立體選擇性為至少約90%。在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯立體中心之立體選擇性為至少約95%。
立體限定的硫代磷酸酯鍵聯 立體限定的硫代磷酸酯鍵聯為在個別寡核苷酸分子群內以Rp或Sp組態化學合成的硫代磷酸酯鍵聯，諸如在各立體中心(Rp或Sp)處具有至少約90%或至少約95%的立體選擇性，且因此，至多約10% (諸如約5%)的寡核苷酸分子可具有不同的立體異構形式。
硫代磷酸酯核苷間鍵聯之立體組態提供於下方
Figure 02_image001
其中3' R基團表示相鄰核苷(5'核苷)之3'位置，且5' R基團表示相鄰核苷(3'核苷)之5'位置。
在本文中，Rp核苷間鍵聯亦可表示為srP，且Sp核苷間鍵聯可表示為ssP。
在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯立體中心之立體選擇性為至少約97%。在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯立體中心之立體選擇性為至少約98%。在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯立體中心之立體選擇性為至少約99%。
在一些實施例中，寡核苷酸分子群中存在的至少97%，諸如至少98%，諸如至少99%，或(基本上)所有寡核苷酸分子中之立體選擇性核苷間鍵聯呈相同立體異構形式。
可在僅具有非對掌性主鏈(亦即，磷酸二酯)之模型系統中量測立體選擇性，有可能藉由例如使立體限定單體與以下模型系統偶合而量測各單體之立體選擇性：「5' t-po-t-po-t-po 3'」。此偶合之結果隨後將得到：5' DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3'或5' DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3'，可使用HPLC對其進行分離。藉由以下方式測定立體選擇性：求來自兩種可能化合物之UV信號的積分，且得到此等積分之比，例如98:2、99:1或＞99:1。
將理解，特定單一非對映異構體(單一立體限定寡核苷酸分子)之立體純度%將取決於各核苷間位置處之經限定立體中心之偶合選擇性以及將引入的立體限定核苷間鍵聯之數目。藉助於實例，若各位置處之偶合選擇性為97%，則具有15種立體限定核苷間鍵聯之立體限定寡核苷酸之所得純度將為0.9715 ，亦即63%的所要非對映異構體相比於37%的其他非對映異構體。經限定非對映異構體之純度可在合成後藉由純化改良，例如藉由諸如離子交換層析法或逆相層析法之HPLC改良。
在一些實施例中，立體限定寡核苷酸係指如下寡核苷酸群，其中該群中之至少約40%，諸如至少約50%具有所要非對映異構體。
換言之，在一些實施例中，立體限定寡核苷酸係指如下寡核苷酸群，其中該群中之至少約40%，諸如至少約50%由所要(特定)立體限定核苷間鍵聯基元(亦稱為立體限定基元)組成。
對於包含立體無規及立體限定核苷間立體中心兩者之立體限定寡核苷酸，參考保留所定義的立體限定核苷間鍵聯基元之寡核苷酸群之百分比來測定立體限定寡核苷酸之純度，在計算時忽略立體無規鍵聯。
核鹼基 術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中之嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明之上下文中，術語核鹼基亦涵蓋經修飾核鹼基，其可不同於天然存在之核鹼基，但在核酸雜交期間具有功能性。在此上下文中，「核鹼基」係指天然存在之核鹼基(諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤)以及非天然存在之變體兩者。此類變體例如描述於Hirao等人 (2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1中。
在一些實施例中，核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變成經修飾之嘌呤或嘧啶而經修飾，經修飾之嘌呤或嘧啶為諸如經取代之嘌呤或經取代之嘧啶，諸如選自以下之核鹼基：異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫基-尿嘧啶、2'硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
核鹼基部分可藉由各相應核鹼基之字母碼(例如A、T、G、C或U)指示，其中各字母可視情況包括具有相同功能之經修飾核鹼基。舉例而言，在例示性寡核苷酸中，核鹼基部分選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，對於LNA間隔體，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
經修飾之寡核苷酸 術語經修飾之寡核苷酸或經修飾之核酸分子描述包含一或多種糖經修飾核苷及/或經修飾核苷間鍵聯的寡核苷酸或核酸分子。術語「嵌合」為文獻中用於描述具有經修飾核苷之寡核苷酸或核酸分子(尤其間隔體寡核苷酸)之術語。
立體限定寡核苷酸 立體限定寡核苷酸為如下寡核苷酸，其中核苷間鍵聯中之至少一者為立體限定核苷間鍵聯。
立體限定硫代磷酸酯寡核苷酸為如下寡核苷酸，其中核苷間鍵聯中之至少一者為立體限定的硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
立體限定核苷間基元 立體限定核苷間基元(本文中亦稱為立體限定基元)係指立體限定寡核苷酸中立體限定的R及S核苷間鍵聯之模式，且以5'至3'書寫。舉例來說，立體限定寡核苷酸 5'-TsrP CssP AssP asrP csrP tssP tsrP tsrP cssP asrP cssP tsrP tssP CssP AssP G-3' (SEQ ID NO 18) 具有立體限定核苷間基元RSSRRSRRSRSRSSS。
就立體限定寡核苷酸之子庫而言，此等子庫在原本立體無規的背景(視情況具有一或多個非對掌性核苷間鍵聯，例如磷酸二酯鍵聯)中將含有共同的立體限定核苷間基元。
舉例而言，寡核苷酸 5'-Ts Cs As as csrP tssP tssP tsrP cs as cs ts ts Cs As G-3 (SEQ ID NO 18) 具有立體限定核苷間基元XXXXRSSRXXXXXXX，具有X表示立體無規硫代磷酸酯核苷間鍵聯(在化合物中顯示為下標s)。應注意，在此實例中，第一個5'立體限定核苷間鍵聯為自5'端起的第5個核苷間鍵聯(在位置4及5處之核苷之間)，且因此，上述基元在(核苷間鍵聯)位置5處亦稱為「RSSR」基元。
當立體限定核苷間基元(立體限定基元)在一系列相鄰立體限定核苷間鍵聯上形成(亦即，定位於連續核苷之間)時，其在本文中被稱為連續立體限定核苷間基元(連續立體限定基元)。將理解，連續立體限定基元必須包含兩個或更多個相鄰的立體限定核苷間鍵聯。
在子庫混合時，立體限定核苷間基元亦可為不連續的，亦即立體限定核苷間鍵聯由於一或多個立體無規核苷間鍵聯而分散。
舉例而言，化合物 5'-Ts CssP As as csrP tssP ts ts cs as cs ts tssP CsrP AssP G-3 (SEQ ID NO 18) 具有不連續基元XSXXRSXXXXXXSRS。
母體寡核苷酸 母體寡核苷酸為具有所限定核鹼基序列(基元序列)之寡核苷酸。在本發明之方法中，母體寡核苷酸通常為藉由使用本發明之方法經由建立一或多個庫而改良之寡核苷酸。
通常，庫可改變核苷修飾(設計庫)，而維持母體之核鹼基序列及立體化學(通常為立體無規的)。
替代地，庫可改變母體寡核苷酸之立體化學，而維持核鹼基序列(基元序列)及核苷修飾模式(設計)。在此類庫中，核苷間鍵聯中之一者或更多者(2+)之立體化學為立體限定的，且與母體寡核苷酸之立體化學不同。
在一些實施例中，母體寡核苷酸為立體無規的硫代磷酸酯寡核苷酸。在一些實施例中，母體寡核苷酸為立體無規的硫代磷酸酯寡核苷酸間隔體。
在一些實施例中，母體寡核苷酸可為包含共同立體限定基元之子庫。
立體限定變體(子代寡核苷酸) 寡核苷酸之立體限定變體為如下寡核苷酸，其保留與母體寡核苷酸相同的序列及核苷修飾(亦即，相同的序列及核苷修飾化學及設計)，但就一或多個立體限定核苷間鍵聯，諸如一或多個立體限定硫代磷酸酯核苷間鍵聯而言不同(立體限定硫代磷酸酯變體)。
立體限定變體可為子庫，或可為完全立體限定寡核苷酸。
立體限定寡核苷酸子庫 包含立體無規及立體限定寡核苷酸兩者之寡核苷酸在本文中被稱為子庫。子庫為完全立體無規寡核苷酸之非對映異構混合物之簡單化混合物，其由此表示所有可能非對映異構體之子集。舉例而言，理論上，完全硫代磷酸酯立體無規16聚體為215 (32768)種非對映異構體之混合物，而硫代磷酸酯核苷間鍵聯中之一者經立體限定的子庫將具有一半庫複雜度(16384種非對映異構體) (2個立體限定鍵聯= 8192種非對映異構體；3個立體限定鍵聯= 4096種非對映異構體，4個立體限定鍵聯= 2048種非對映異構體，5個立體限定鍵聯= 1024種非對映異構體)，假定100%的立體選擇性偶合效果。
完全立體限定寡核苷酸 完全立體限定寡核苷酸為如下寡核苷酸，其中寡核苷酸內存在的所有對掌性核苷間鍵聯為立體限定的。完全立體限定硫代磷酸酯寡核苷酸為如下寡核苷酸，其中寡核苷酸內存在的所有對掌性核苷間鍵聯為立體限定的硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
將理解，在一些實施例中，完全立體限定寡核苷酸可包含一或多個非對掌性的核苷間物，諸如磷酸二酯核苷間鍵聯，例如，可在間隔體之側接區域內及/或在連接末端核苷時(諸如，在連接間隔體序列與結合物基團之DNA核苷之較短區域(生物可裂解連接子)之間)使用磷酸二酯鍵聯。
在完全立體限定寡核苷酸之一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區域(諸如F-G-F'間隔體)中存在的所有核苷間鍵聯為立體限定核苷間鍵聯，諸如立體限定的硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
互補性 術語「互補性」描述核苷/核苷酸之Watson-Crick鹼基配對之能力。Watson-Crick鹼基對係鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。將理解，寡核苷酸可包含具有經修飾核鹼基之核苷，例如通常使用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶，且因而術語互補性涵蓋未經修飾及經修飾核鹼基之間的Watson Crick鹼基配對(參看例如Hirao等人 (2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1)。
如本文所用之術語「互補%」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中給定位置處連續核苷酸序列與獨立核酸分子(例如標靶核酸)之給定位置處之連續核苷酸序列互補(亦即與其形成Watson Crick鹼基對)的核苷酸數目的百分比。藉由如下方式計算該百分比：(當使標靶序列5'-3'與寡核苷酸序列3'-5'對準時)計數兩個序列之間形成對的對準鹼基，除以寡核苷酸中核苷酸之總數目且乘以100。在該比對中，未對準(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸稱為失配。較佳地，在連續核苷酸序列之互補%計算中不允許插入及刪除。
術語「完全互補」係指100%互補。
以下為與標靶核酸之區域完全互補的寡核苷酸(SEQ ID NO: 12)之實例。
Figure 02_image003
一致性 如本文所用之術語「一致性」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中給定位置處連續核苷酸序列與獨立核酸分子(例如標靶核酸)之給定位置處之連續核苷酸序列一致(亦即其與互補核苷形成Watson Crick鹼基對之能力一致)的核苷酸數目的百分比。該百分比藉由以下計算，計數在兩個序列之間一致的對準鹼基之數目，除以寡核苷酸中核苷酸之總數目且乘以100。一致性百分比= (匹配× 100)/對準區域之長度。較佳地，在連續核苷酸序列之互補%計算中不允許插入及刪除。
雜交 如本文所用之術語「雜交(hybridizing/hybridize)」應理解為兩個核酸股(例如寡核苷酸及標靶核酸)在對置股上之鹼基對之間形成氫鍵，由此形成雙螺旋體。兩個核酸股之間的結合親和力係雜交之強度。通常就熔融溫度(Tm )而言進行描述，該溫度定義為一半寡核苷酸與標靶核酸成雙螺旋時之溫度。在生理條件下Tm 不與親和力嚴格成比例(Mergny及Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準狀態吉布斯(Gibbs)自由能ΔG°係結合親和力之更精確表示，且經由ΔG°=-RTln(Kd )與反應之解離常數(Kd )相關，其中R係氣體常數且T係絕對溫度。因此，寡核苷酸與標靶核酸之間的反應的極低ΔG°反映寡核苷酸與標靶核酸之間的強雜交。ΔG°係與水性濃度為1 M、pH為7且溫度為37℃之反應相關之能量。寡核苷酸雜交至標靶核酸係自發反應，且對於自發反應ΔG°小於零。ΔG°可以實驗方式量測，例如藉由使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry；ITC)，如Hansen等人, 1965,Chem. Comm. 36-38及Holdgate等人, 2005,Drug Discov Today 中所描述。熟習此項技術者將知曉商業設備可供用於ΔG°量測。ΔG°亦可藉由使用如SantaLucia, 1998,Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465所描述之最近鄰模型，使用由Sugimoto等人, 1995,Biochemistry 34:11211-11216及McTigue等人, 2004,Biochemistry 43:5388-5405描述之恰當導出的熱力學參數而在數值上估計。為了具有藉由雜交調節本發明之寡核苷酸既定核酸標靶之可能性，本發明之寡核苷酸針對10至30個核苷酸長度之寡核苷酸雜交至ΔG°估計值低於-10千卡(kcal)之標靶核酸。在一些實施例中，雜交度或雜交強度藉由標準狀態吉布斯自由能ΔG°量測。針對8至30個核苷酸長度之寡核苷酸，寡核苷酸可雜交至ΔG°估計值低於-10千卡範圍、諸如低於-15千卡、諸如低於-20千卡及諸如低於-25千卡之標靶核酸。在一些實施例中，寡核苷酸雜交至ΔG°估計值為-10至-60千卡、諸如-12至-40、諸如-15至-30千卡或-16至-27千卡諸如-18至-25千卡的標靶核酸。
標靶核酸 根據本發明，存在將藉由同一寡核苷酸調節之兩種標靶核酸。該等標靶核酸為：i)編碼哺乳動物PAPD5之核酸(標靶核酸1)；及ii)編碼哺乳動物PAPD7之核酸(標靶核酸2)。舉例而言，標靶核酸可為基因、RNA、mRNA及前體mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。適當地，標靶核酸編碼PAPD5或PAPD7蛋白，特定言之哺乳動物PAPD5或PAPD7，諸如為人類提供前體mRNA序列之人類PAPD5或PAPD7 (參見例如表1及表2)，猴及小鼠PAPD5及PAPD7。
在一些實施例中，標靶核酸係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 5，其天然存在之變體(例如，編碼哺乳動物PAPD5之序列)。
在一些實施例中，標靶核酸係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及/或SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 11，或其天然存在之變體(例如，編碼哺乳動物PAPD7之序列)。 表1A.各種屬之PAPD5之基因組及裝配資訊.
Figure 107136344-A0304-0001
 表1B. 各種屬之PAPD7之基因組及裝配資訊.
Figure 107136344-A0304-0002
 Fwd =前向股。Rev=反向股。基因組座標提供前體mRNA序列(基因組序列)。
若在研究或診斷中採用本發明之寡核苷酸，則標靶核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。
對於活體內或活體外應用，本發明之寡核苷酸通常能夠抑制表現PAPD5及PAPD7標靶核酸之細胞中之PAPD5及PAPD7標靶核酸之表現。本發明之寡核苷酸的核鹼基之連續序列通常與PAPD5及PAPD7標靶核酸之保守區域互補，如在寡核苷酸之整個長度內所量測，視情況除一個或兩個失配之外，且視情況不包括可將寡核苷酸連接至視情況存在之官能基(諸如結合物)或其他非互補末端核苷酸(例如，區域D'或D'')之核苷酸類連接子區域。例示性標靶核酸之其他資訊提供於表2中。 表2.各種屬之PAPD5及PAPD7之序列詳情.
Figure 107136344-A0304-0003
標靶序列 如本文所使用之術語「標靶序列」係指標靶核酸中所存在的核苷酸序列，其包含與本發明之寡核苷酸或核酸分子互補的核鹼基序列。在一些實施例中，標靶序列由標靶核酸上與本發明寡核苷酸之連續核苷酸序列(亦即子序列)互補的區域組成。
在本發明中，標靶序列存在於人類PAPD5及人類PAPD7標靶核酸兩者中。因此，標靶序列可被稱作PAPD5及PAPD7標靶核酸兩者中所存在的雙特異性標靶序列。在有利實施例中，標靶序列亦存在於至少一種其他種屬中，諸如來自食蟹獼猴之PAPD5及PAPD7，及/或來自小鼠之PAPD5及PAPD7。
本發明之寡核苷酸或核酸分子包含與標靶核酸(諸如本文中所描述之標靶序列)上之區域互補或雜交的連續核苷酸序列。
與寡核苷酸互補或雜交的標靶核酸序列通常包含具有至少10個核苷酸之一段連續核鹼基。連續核苷酸序列介於10至50個核苷酸之間，諸如12至30個、諸如13至25個、諸如14至20個、諸如15至18個連續核苷酸。
天然存在之變體 術語「天然存在之變體」係指PAPD5或PAPD7基因或轉錄物之變體，其源自與標靶核酸相同之基因座，但可例如藉助於基因密碼之簡並而不同，該簡並導致大量密碼子編碼相同胺基酸，或歸因於前體mRNA之替代性拼接、或存在多形現象(諸如單核苷酸多形現象)及對偶基因變體而不同。基於存在寡核苷酸之充足互補序列，本發明之寡核苷酸可因此靶向標靶核酸及其天然存在之變體。
在一些實施例中，天然存在之變體與哺乳動物PAPD5標靶核酸(諸如選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5組成之群之標靶核酸)具有至少95%，諸如至少98%或至少99%同源性。在一些實施例中，天然存在之變體與人類PAPD5標靶核酸SEQ ID NO: 1具有至少99%同源性。在一些實施例中，天然存在之變體為表3A中所列的多形現象。
在一些實施例中，天然存在之變體與哺乳動物PAPD7標靶核酸(諸如選自由SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6組成之群之標靶核酸)具有至少95%，諸如至少98%或至少99%同源性。在一些實施例中，天然存在之變體與人類PAPD7標靶核酸SEQ ID NO: 2具有至少99%同源性。在一些實施例中，天然存在之變體為表3B中所列的多形現象。
已知PAPD5或PAPD7基因中之眾多單核苷酸多形現象，例如表3A (人類PAPD5前體mRNA起點/參考序列為SEQ ID NO: 1)及表3B (人類PAPD7前體mRNA起點/參考序列為SEQ ID NO: 2)中所揭示之彼等者。 表3A：PAPD5多形現象(天然存在之變體)
Figure 107136344-A0304-0004
 表3B：PAPD7多形現象(天然存在之變體)
Figure 107136344-A0304-0005
表現之調節 如本文所使用，術語「表現之調節」應被理解為與投與核酸分子前之PAPD5及PAPD7量相比，該核酸分子改變PAPD5及PAPD7之量的能力的總體術語。可替代地，表現之調節可藉由參考對照實驗來判定。通常應理解，對照物為用鹽水組合物處理之個體或標靶細胞，或用非靶向或核酸分子(模擬物)處理之個體或標靶細胞。然而，其亦可為用標準護理處理之個體。
一種調節為核酸分子(諸如反義寡核苷酸)例如藉由使mRNA降解或阻斷轉錄而抑制、下調、降低、去除、停止、預防、減輕、減少、避免或終止PAPD5及PAPD7之表現的能力。
高親和力經修飾核苷 高親和力經修飾核苷係經修飾之核苷酸，其在併入至寡核苷酸中時增強寡核苷酸對其互補標靶之親和力，例如如藉由熔融溫度(Tm )所量測。本發明之高親和力經修飾核苷較佳使得熔融溫度升高如下，每個經修飾核苷，在+0.5至+12℃之間、更佳在+1.5至+10℃之間且最佳在+3至+8℃之間。大量高親和力經修飾核苷為此項技術中已知的，且包括例如多種2'糖經修飾核苷，諸如2'經取代之核苷，如Ome及MOE以及2'至4'橋接核酸，諸如鎖核酸(LNA) (參見例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。
糖修飾 本發明之核酸分子可包含具有經修飾糖部分(亦即，與DNA及RNA中存在之核糖部分相比時糖部分之修飾)之一或多個核苷。
已製備眾多具有核糖部分之修飾之核苷，其首要目的在於改良核酸分子之某些特性，諸如親和力及/或核酸酶耐受性。
此類修飾包括其中核糖環結構經修飾之彼等，例如藉由用以下替代：己醣環(HNA)；或雙環，其通常在核糖環(LNA)上之C2與C4碳原子之間具有雙基團(biradicle)橋；或非連鎖核糖環，其通常缺乏C2與C3碳原子之間的鍵(例如UNA)。其他糖經修飾之核苷包括例如雙環己醣核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。經修飾核苷亦包括其中糖部分經非糖部分替代的核苷，例如在肽核酸(PNA)或N-嗎啉基核酸之情形下。
糖修飾亦包括經由將核糖環上之取代基改變成除氫以外之基團，或改變RNA或DNA核苷中天然發現之-OH基團而得到的修飾。取代基可例如在2'、3'、4'或5'位置處引入。
2'糖經修飾核苷. 2'糖經修飾核苷為2'位置處具有除H或-OH以外的取代基的核苷(2'經取代核苷)，或包含能夠在2'碳與核糖環中之第二碳之間形成橋鍵的2'鍵聯雙基團的核苷，諸如LNA (2'-4'雙基團橋接)核苷。
實際上，大量焦點已聚集在形成2'經取代核苷上，且已發現許多2'經取代核苷在併入至寡核苷酸中時具有有益特性。舉例而言，2'經修飾糖可向寡核苷酸提供增強的結合親和力及/或增加的核酸酶耐受性。2'經取代修飾之核苷之實例為2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟 -RNA及2'-F-ANA核苷。對於其他實例，請參看例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213，以及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。下方係一些2'經取代修飾核苷之圖示。
Figure 02_image005
關於本發明，2'經取代者不包括如LNA之2'橋接分子。
鎖核酸核苷(LNA). 「LNA核苷」為2'糖經修飾核苷，其包含鍵聯該核苷之核糖環之C2'與C4'的雙基團(亦稱為「2'-4'橋鍵」)，其限定或鎖定核糖環之構形。此等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。當LNA併入至互補RNA或DNA分子之寡核苷酸中時，核糖之構形鎖定與增加的雜交親和力(雙螺旋體穩定)相關聯。此可常規地藉由量測寡核苷酸/互補雙螺旋體之熔融溫度而測定。
在一些實施例中，本發明之寡聚物之2'糖經修飾核苷或LNA核苷具有式I或式II之通式結構：
Figure 02_image007
或
Figure 02_image009
式I 式II 其中W係選自-O-、-S-、-N(Ra )-、-C(Ra Rb )-，諸如，在一些實施例中-O-； B表示核鹼基或經修飾核鹼基部分； Z表示與相鄰核苷之核苷間鍵聯，或5'端基； Z*表示與相鄰核苷之核苷間鍵聯，或3'端基； X表示選自由以下組成之清單的基團：-C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-、 -C(Ra )=N-、-O-、-Si(Ra )2 -、-S-、-SO2 -、-N(Ra )-及＞C=Z。
在一些實施例中，X選自由以下組成之群：-O-、-S-、NH-、NRa Rb 、-CH2 -、CRa Rb 、-C(=CH2 )-及-C(=CRa Rb )-。
在一些實施例中，X為-O-。
Y表示選自由以下組成之群的基團：-C(Ra Rb )-、 -C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-O-、-Si(Ra )2 -、-S-、-SO2 -、-N(Ra )-及＞C=Z。
在一些實施例中，Y選自由以下組成之群：-CH2 -、 -C(Ra Rb )-、-CH2 CH2 -、-C(Ra Rb )-C(Ra Rb )-、-CH2 CH2 CH2 -、 -C(Ra Rb )C(Ra Rb )C(Ra Rb )-、-C(Ra )=C(Rb )-及-C(Ra )=N-。
在一些實施例中，Y選自由以下組成之群：-CH2 -、 -CHRa -、-CHCH3 -、CRa Rb - 或-X-Y-一起表示二價連接基團(亦稱為基團)，一起表示由選自由以下組成之群的1、2、3或4個基團/原子組成之二價連接基團：-C(Ra Rb )-、 -C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-O-、-Si(Ra )2 -、-S-、-SO2 -、-N(Ra )-及＞C=Z。
在一些實施例中，-X-Y-表示選自由以下組成之群的雙基團：-X-CH2 -、-X-CRa Rb -、-X-CHRa -、-X-C(HCH3 )-、-O-Y-、-O-CH2 -、-S-CH2 -、-NH-CH2 -、-O-CHCH3 -、-CH2 -O-CH2 、-O-CH(CH3 CH3 )-、-O-CH2 -CH2 -、OCH2 -CH2 -CH2 -、-O-CH2 OCH2 -、-O-NCH2 -、 -C(=CH2 )-CH2 -、-NRa -CH2 -、N-O-CH2 、-S-CRa Rb -及-S-CHRa -。
在一些實施例中，-X-Y-表示-O-CH2 -或-O-CH(CH3 )-。
其中Z選自-O-、-S-及-N(Ra )-，
且Ra 及(當存在時) Rb 各自獨立地選自氫、視情況經取代之C1-6 烷基、視情況經取代之C2-6 烯基、視情況經取代之C2-6 炔基、羥基、視情況經取代之C1-6 烷氧基、C2-6 烷氧基烷基、C2-6 烯基氧基、羧基、C1-6 烷氧基羰基、C1-6 烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、單及二(C1- 6 烷基)胺基、胺甲醯基、單及二(C1-6 烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6 烷基-胺基羰基、單及二(C1-6 烷基)胺基-C1-6 烷基-胺基羰基、C1-6 烷基-羰基胺基、胺甲醯胺基、C1-6 烷醯基氧基、磺醯基(sulphono)、C1-6 烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1-6 烷硫基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個成對取代基Ra 及Rb 一起可表示視情況經取代之亞甲基(=CH2 )，其中對於所有對掌性中心，可在R 或S 定向中發現不對稱基團。
其中R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C1-6 烷基、視情況經取代之C2-6 烯基、視情況經取代之C2-6 炔基、羥基、C1-6 烷氧基、C2-6 烷氧基烷基、C2-6 烯基氧基、羧基、C1-6 烷氧基羰基、C1-6 烷基羰基、甲醯基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基-羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、胺基、單及二(C1-6 烷基)胺基、胺甲醯基、單及二(C1-6 烷基)-胺基-羰基、胺基-C1-6 烷基-胺基羰基、單及二(C1-6 烷基)胺基-C1-6 烷基-胺基羰基、C1-6 烷基-羰基胺基、胺甲醯胺基、C1-6 烷醯基氧基、磺醯基、C1-6 烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫基、C1-6 烷硫基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個成對取代基一起可表示酮基、硫酮基、亞胺基或視情況經取代之亞甲基。
在一些實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 獨立地選自C1-6 烷基(諸如甲基)及氫。
在一些實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 皆為氫。
在一些實施例中，R1 、R2 、R3 皆為氫，且R5 及R5* 中之一者亦為氫且R5 及R5* 中之另一者不為氫，諸如C1-6 烷基(諸如甲基)。
在一些實施例中，Ra 係氫或甲基。在一些實施例中，(當存在時) Rb 係氫或甲基。
在一些實施例中，Ra 及Rb 中之一者或兩者係氫。
在一些實施例中，Ra 及Rb 中之一者係氫且另一者不為氫。
在一些實施例中，Ra 及Rb 中之一者係甲基且另一者係氫。
在一些實施例中，Ra 及Rb 兩者均為甲基。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。此類LNA核苷揭示於WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352及WO2004/046160中，其皆以引用之方式併入本文中，且包括通常稱為β -D- 氧基 LNA 及α -L- 氧基 LNA 核苷之該等LNA核苷。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-S-CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。此類硫基 LNA 核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-NH-CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。此類胺基 LNA 核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH2 -CH2 -或-O-CH2 -CH2 -CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。此類LNA核苷揭示於WO00/047599及Morita等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76中，其以引用之方式併入本文中，且包括通常稱為2'-O-4'C-乙烯橋接核酸(ENA)之該等LNA核苷。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 中所有，及R5 及R5* 中之一者係氫，且R5 及R5* 中之另一者不為氫，諸如C1-6 烷基(諸如甲基)。此類5' 經取代 LNA核苷揭示於WO2007/134181中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CRa Rb -，其中Ra 及Rb 中之一者或兩者不為氫，諸如甲基，W係O，且R1 、R2 、R3 中所有，及R5 及R5* 中之一者係氫，且R5 及R5* 中之另一者不為氫，諸如C1-6 烷基(諸如甲基)。此類雙修飾 LNA 核苷 揭示於WO2010/077578中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-表示二價連接基團 -O-CH(CH2 OCH3 )- (2'O-甲氧基乙基雙環核酸--Seth等人, 2010, J. Org. Chem. 第75(5)卷第1569-81頁)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-表示二價連接基團-O-CH(CH2 CH3 )- (2'O-乙基雙環核酸--Seth等人, 2010, J. Org. Chem. 第75(5)卷第1569-81頁)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-係 -O-CHRa -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。此類6' 經取代 LNA核苷揭示於WO10036698及WO07090071中，其均以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH(CH2 OCH3 )-，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。此類LNA核苷在此項技術中亦稱為環狀 MOE (cMOE)且揭示於WO07090071中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-表示二價連接基團 -O-CH(CH3 )-，呈R或S組態。在一些實施例中，雙基團-X-Y-一起表示二價連接基團-O-CH2 -O-CH2 - (Seth等人, 2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CH(CH3 )-，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。此類6'甲基LNA核苷在此項技術中亦稱為cET 核苷 ，且可為(S)cET或(R)cET立體異構體，如揭示於WO07090071 (β-D)及WO2010/036698 (α-L)中，其均以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-O-CRa Rb -，其中Ra 或Rb 均不為氫，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。在一些實施例中，Ra 及Rb 均為甲基。此類6' 經二取代 LNA核苷揭示於WO 2009006478中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-S-CHRa -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。此類6' 經取代硫基 LNA核苷揭示於WO11156202中，其以引用之方式併入本文中。在一些6'經取代硫基LNA實施例中,Ra 係甲基。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-C(=CH2 )-C(Ra Rb )-，諸如-C(=CH2 )-CH2 -或-C(=CH2 )-CH(CH3 )-，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。此類乙烯基碳 LNA核苷揭示於WO08154401及WO09067647中，其均以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-N(-ORa )-，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。在一些實施例中,Ra 係C1-6 烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為N經取代LNA，且揭示於WO2008/150729中，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，雙基團-X-Y-一起表示二價連接基團-O-NRa -CH3 - (Seth等人, 2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙基團-X-Y-係-N(Ra )-，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。在一些實施例中,Ra 係C1-6 烷基，諸如甲基。
在一些實施例中，R5 及R5* 中之一者或兩者係氫，且在經取代時R5 及R5* 中之另一者係C1-6 烷基，諸如甲基。在此實施例中，R1 、R2 、R3 可皆為氫，且雙基團-X-Y-可選自-O-CH2 -或-O-C(HCRa )-，諸如 -O-C(HCH3 )-。
在一些實施例中，雙基團係-CRa Rb -O-CRa Rb -，諸如 CH2 -O-CH2 -，W係O且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。在一些實施例中,Ra 係C1-6 烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為構形受限核苷酸(conformationally restricted nucleotide；CRN)且揭示於WO2013036868中，其以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙基團係-O-CRa Rb -O-CRa Rb -，諸如 O-CH2 -O-CH2 -，W係O，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 中所有皆為氫。在一些實施例中,Ra 係C1-6 烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為COC核苷酸且揭示於Mitsuoka 等人, Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238中，其以引用之方式併入本文中。
將認識到，除非指定，否則LNA核苷可呈β-D或α-L立體異構形式。
非限制性的例示性LNA核苷揭示於WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth等人 J. Org. Chem. 2010, 第75(5)卷第1569-81頁，及Mitsuoka等人, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238中。
LNA核苷之某些實例呈現於方案1中。 方案1
Figure 02_image011
如實例中所說明，在本發明之一些實施例中，寡核苷酸中之LNA核苷係β-D-氧基-LNA核苷。
核酸酶介導之降解 核酸酶介導之降解係指當與互補核苷酸序列形成雙螺旋體時，能夠介導互補核苷酸序列之降解的寡核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸可經由核酸酶介導之標靶核酸之降解起作用，其中本發明的寡核苷酸能夠募集核酸酶，特定言之核酸內切酶，較佳地內切核糖核酸酶(RNase)，諸如RNase H。經由核酸酶介導之機制起作用之寡核苷酸設計之實例係通常包含具有至少5或6個連續DNA核苷之區域且藉由親和力增強核苷(例如間隔體、頭體及尾體)側接在一側或兩側的寡核苷酸。
RNase H活性及募集 反股寡核苷酸之RNase H活性係指當與互補RNA分子成雙螺旋體時，反義寡核苷酸募集RNase H之能力。WO01/23613提供用於測定RNaseH活性之活體外方法，其可用於測定募集RNaseH之能力。通常，當提供有互補標靶核酸序列時，認為寡核苷酸在具有如下初始速率(如以pmol/l/min為單位所量測)時能夠募集RNase H，該初始速率為使用與所測試的經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列但僅含有其中寡核苷酸中之所有單體之間為硫代磷酸酯鍵聯的DNA單體的寡核苷酸，且使用WO01/23613 (在此以引用之方式併入)之實例91至95所提供之方法測定的初始速率的至少5%，諸如至少10%，或超過20%。用於測定RHase H活性之重組人類RNase H1可購自Lubio Science GmbH, Lucerne, Switzerland。
間隔體 本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可為間隔體。反義間隔體通常經由RNase H介導之降解而用於抑制標靶核酸。間隔體寡核苷酸包含至少三個相異結構區域，5'-側接、間隔及3'-側接，F-G-F'，呈「5 -＞ 3」定向。「間隔」區域(G)包含使得寡核苷酸能夠募集RNase H的一段連續DNA核苷酸。間隔區域藉由包含一或多個糖經修飾核苷(有利地高親和力糖經修飾核苷)之5'側接區域(F)且藉由包含一或多個糖經修飾核苷(有利地高親和力糖經修飾核苷)之3'側接區域(F')側接。區域F及F'中之一或多個糖經修飾核苷增強寡核苷酸對標靶核酸之親和力(亦即，其為增強親和力的糖經修飾核苷)。在一些實施例中，區域F及F'中之一或多個糖經修飾核苷為2'糖經修飾核苷，諸如高親和力2'糖修飾，諸如獨立地選自LNA及2'-MOE。
在間隔體設計中，間隔區域之5'及3'最末核苷為DNA核苷，且定位成分別鄰近於5' (F)或3' (F')區域之糖經修飾核苷。側接區域可進一步經限定在距間隔區域最遠的末端處，亦即在5'側接區域之5'端及3'側接區域之3'端處具有至少一個糖經修飾核苷。
區域F-G-F'形成連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可包含具有式F-G-F'之間隔體區域。
間隔體設計F-G-F'之總體長度可為例如12至32個核苷，諸如13至24、諸如14至22個核苷，諸如14至17、諸如16至18個核苷。
藉助於實例，本發明之間隔體寡核苷酸可由下式表示： F1-8 -G5-16 -F'1-8 ，諸如 F1-8 -G7-16 -F'2-8 其限制條件為間隔體區域F-G-F'之總體長度為至少12個，諸如至少14個核苷酸長度。
區域F、G及F'在下文進一步加以定義，且可併入至F-G-F'式中。
間隔體--間隔，區域G 間隔體之區域G (間隔區域)為使得寡核苷酸能夠募集RNaseH (諸如人類RNase H1)之核苷區域，通常為DNA核苷。RNaseH為識別DNA與RNA之間的雙螺旋體且酶促裂解該RNA分子之細胞酶。適當地，間隔體可具有至少5或6個連續DNA核苷、諸如5至16個連續DNA核苷、諸如6至15個連續DNA核苷、諸如7至14個連續DNA核苷、諸如8至12個連續DNA核苷酸、諸如8至12個連續DNA核苷酸長度之間隔區域(G)。在一些實施例中，間隔區域G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續DNA核苷組成。在一些情況下，間隔區域中之胞嘧啶(C) DNA經甲基化，此類殘基標註為5-甲基-胞嘧啶(me C，或用e代替c)。當間隔中存在cg二核苷酸以降低潛在毒性時，間隔中之胞嘧啶DNA之甲基化為有利的，預期該修飾不會對寡核苷酸之功效具有顯著影響。
在一些實施例中，間隔區域G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續的硫代磷酸酯連接之DNA核苷組成。在一些實施例中，間隔中之所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯鍵聯。
儘管傳統間隔體具有DNA間隔區域，但存在用於間隔區域內時允許RNaseH募集的經修飾核苷之眾多實例。已報導在包括於間隔區域內時能夠募集RNaseH的經修飾核苷包括例如α-L-LNA、C4'烷基化DNA (如PCT/EP2009/050349及Vester等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300中所描述，兩者均以引用之方式併入本文中)、阿拉伯糖衍生之核苷類ANA及2'F-ANA (Mangos等人 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (未鎖定核酸) (如Fluiter等人, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039中所描述，其以引用之方式併入本文中)。UNA為未鎖定核酸，通常其中核糖之C2與C3之間的鍵已移除，從而形成未鎖定的「糖」殘基。此類間隔體中所使用之經修飾核苷可為在引入至間隔區域中時採用2'內接(類DNA)結構(亦即允許RNaseH募集之修飾)之核苷。在一些實施例中，本文中所描述之DNA間隔區域(G)可視情況含有1至3個在引入至間隔區域中時採用2'內接(類DNA)結構之糖經修飾核苷。
區域G--「間隔阻斷」 可替代地，存在許多將賦予3'內接構形之經修飾核苷插入至間隔體之間隔區域中但保留一定RNaseH活性的報導。間隔區域包含一或多個3'內接經修飾核苷之此類間隔體被稱為「間隔阻斷」或「間隔中斷」間隔體，參見例如WO2013/022984。間隔阻斷寡核苷酸在間隔區域內保留充分的DNA核苷區域，以允許RNaseH募集。間隔阻斷寡核苷酸設計募集RNaseH之能力通常為序列或甚至化合物特異性的，參見Rukov等人 2015 Nucl. Acids Res. 第43卷第8476-8487頁，其揭示募集RNaseH之「間隔阻斷」寡核苷酸，該等寡核苷酸在一些情況下提供標靶RNA之更特異性裂解。間隔阻斷寡核苷酸之間隔區域內所使用的經修飾核苷可例如為賦予3'內接構形之經修飾核苷，諸如2'-O-甲基(OMe)或2'-O-MOE (MOE)核苷，或β-D LNA核苷(核苷之核糖環之C2'與C4'之間的橋鍵呈β構形)，諸如 β-D-氧基LNA或ScET核苷。
如同上文所描述的含有區域G之間隔體一樣，間隔阻斷或間隔中斷間隔體之間隔區域在間隔之5'端(鄰近於區域F之3'核苷)處具有DNA核苷，且在間隔之3'端(鄰近於區域F'之5'核苷)處具有DNA核苷。包含中斷間隔之間隔體通常在間隔區域之5'端或3'端處保留至少3或4個連續DNA核苷之區域。
間隔阻斷寡核苷酸之例示性設計包括 F1-8 -[D3-4 -E1 - D3-4 ]- F'1-8 F1-8 - [D1-4 -E1 - D3-4 ]-F'1-8 F1-8 - [D3-4 -E1 - D1-4 ]-F'1-8 其中區域G在方括號[Dn -Er - Dm ]內，D為DNA核苷之連續序列，E為經修飾核苷(間隔阻斷或間隔中斷核苷)，且F及F'為如本文中所定義之側接區域，且限制條件為間隔體區域F-G-F'之總體長度為至少12、諸如至少14個核苷酸長度。
在一些實施例中，間隔中斷間隔體之區域G包含至少6個DNA核苷，諸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個DNA核苷。如上文所描述，DNA核苷可為連續的，或可視情況穿插有一或多個經修飾核苷，其限制條件為間隔區域G能夠介導RNaseH募集。
間隔體--側接區域F及F' 區域F緊鄰區域G之5' DNA核苷定位。區域F之3'最末核苷為糖經修飾核苷，諸如高親和力糖經修飾核苷，例如2'經取代核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。
區域F'緊鄰區域G之3' DNA核苷定位。區域F'之5'最末核苷為糖經修飾核苷，諸如高親和力糖經修飾核苷，例如2'經取代核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。
區域F為1至8個連續核苷酸長度，諸如1至6、諸如2至6、諸如3至4個連續核苷酸長度。有利地，區域F之5'最末核苷為糖經修飾核苷。在一些實施例中，區域F之兩個5'最末核苷為糖經修飾核苷。在一些實施例中，區域F之5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區域F之兩個5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區域F之兩個5'最末核苷為2'經取代核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，區域F之5'最末核苷為2'經取代核苷，諸如MOE核苷。
區域F'為2至8個連續核苷酸長度，諸如3至6、諸如4至5個連續核苷酸長度。有利地，區域F'之3'最末核苷為糖經修飾核苷。在一些實施例中，區域F'之兩個3'最末核苷為糖經修飾核苷。在一些實施例中，區域F'之兩個3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區域F'之3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區域F'之兩個3'最末核苷為2'經取代核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，區域F'之3'最末核苷為2'經取代核苷，諸如MOE核苷。
應注意，當區域F或F'之長度為一時，其有利地為LNA核苷。
在一些實施例中，區域F及F'獨立地由以下組成或包含以下：糖經修飾核苷之連續序列。在一些實施例中，區域F之糖經修飾核苷可獨立地選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟-ANA單元。
在一些實施例中，區域F及F'獨立地包含LNA及2'經取代修飾核苷兩者(混合翼設計)。
在一些實施例中，區域F及F'僅由一種糖經修飾核苷組成，諸如僅由MOE或僅由β-D-氧基LNA或僅由ScET組成。此類設計亦被稱為均一側接區域或均一間隔體設計。
在一些實施例中，區域F或F'或者F及F'中之所有核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些實施例中，區域F由1至5、諸如2至4、諸如3至4，諸如1、2、3、4或5個連續LNA核苷組成。在一些實施例中，區域F及F'中之所有核苷為β-D-氧基LNA核苷。
在一些實施例中，區域F或F'或者F及F'中之所有核苷為2'經取代核苷，諸如OMe或MOE核苷。在一些實施例中，區域F由1、2、3、4、5、6、7或8個連續OMe或MOE核苷組成。在一些實施例中，側接區域中僅一者可由2'經取代核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成。在一些實施例中，5' (F)側接區域由2'經取代核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而3' (F')側接區域包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些實施例中，3' (F')側接區域由2'經取代核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而5' (F)側接區域包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些實施例中，區域F及F'中之所有經修飾核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中區域F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替側接區域，更多細節參見此等者之定義)。在一些實施例中，區域F及F'中之所有經修飾核苷為β-D-氧基LNA核苷，其中區域F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替側接區域，更多細節參見此等者之定義)。
在一些實施例中，區域F及F'之5'最末及3'最末核苷為LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些實施例中，區域F與區域G之間的核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，區域F'與區域G之間的核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，區域F或F'或者F及F'之核苷之間的核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
其他間隔體設計揭示於WO2004/046160、WO2007/146511及WO2008/113832中，該等文獻在此以引用之方式併入。
LNA間隔體 LNA間隔體為如下間隔體，其中區域F及F'中之一者或兩者包含LNA核苷或由LNA核苷組成。β-D-氧基間隔體為如下間隔體，其中區域F及F'中之一者或兩者包含β-D-氧基LNA核苷或由β-D-氧基LNA核苷組成。
在一些實施例中，LNA間隔體具有式[LNA]1-5 -[區域G]-[LNA]1-5 ，其中區域G如間隔體區域G定義中所定義。
在一些實施例中，LNA為β-D-氧基-LNA，且間隔體具有式F2-5 LNA, 0-2 DNA -G7-11 DNA -F'3-5 LNA, 0-2 DNA 。
MOE間隔體 MOE間隔體為如下間隔體，其中區域F及F'由MOE核苷組成。在一些實施例中，MOE間隔體具有設計[MOE]1-8 -[區域G]-[MOE]1-8 ，諸如[MOE]2-7 -[區域G]5-16 -[MOE]2-7 ，諸如[MOE]3-6 -[區域G]-[MOE]3-6 ，其中區域G如間隔體定義中所定義。具有5-10-5設計之MOE間隔體(MOE-DNA-MOE)已廣泛用於此項技術中。
混合翼間隔體 混合翼間隔體為如下LNA間隔體，其中區域F及F'中之一者或兩者包含2'經取代核苷，諸如獨立地選自由2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基 -RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟-ANA單元組成之群之2'經取代核苷，諸如MOE核苷。在區域F及F'中之至少一者或區域F及F'兩者包含至少一個LNA核苷的一些實施例中，區域F及F'中之其餘核苷獨立地選自由MOE及LNA組成之群。在區域F及F'中之至少一者或區域F及F'兩者包含至少兩個LNA核苷的一些實施例中，區域F及F'中之其餘核苷獨立地選自由MOE及LNA組成之群。在一些混合翼實施例中，區域F及F'中之一者或兩者可進一步包含一或多個DNA核苷。
混合翼間隔體設計揭示於WO2008/049085及WO2012/109395中，該等文獻在此均以引用之方式併入。
交替側接區域間隔體 具有交替側接區域之寡核苷酸為如下LNA間隔體寡核苷酸，其中側接區域中之至少一者(F或F')包含除LNA核苷以外的DNA。在一些實施例中，區域F或F'中之至少一者或區域F及F'兩者包含LNA核苷及DNA核苷兩者。在此等實施例中，側接區域F或F'或者F及F'兩者包含至少三個核苷，其中F及/或F'區域之5'及3'最末核苷為LNA核苷。
在一些實施例中，區域F或F'中之至少一者或區域F及F'兩者包含LNA核苷及DNA核苷兩者。在此等實施例中，側接區域F或F'或者F及F'兩者包含至少三個核苷，其中F或F'區域之5'及3'最末核苷為LNA核苷，且包含LNA及DNA核苷兩者之側接區域被稱為交替側接區域，因為其包含交替的LNA-DNA-LNA核苷基元。交替側接區域LNA間隔體揭示於WO2016/127002中。
交替側接區域可包含至多3個連續DNA核苷，諸如1至2個或者1或2或3個連續DNA核苷。
交替側接序列可標註為表示LNA核苷(L)之數目接著表示DNA核苷(D)之數目的一系列整數，例如 [L]1-3 -[D]1-4 -[L]1-3 [L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2
在寡核苷酸設計中，此等者將通常表示為如下數字，使得2-2-1表示5' [L]2 -[D]2 -[L] 3'，且1-1-1-1-1表示5' [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3'。具有交替側接區域的寡核苷酸中之側接區域(區域F及F')之長度可獨立地為3至10個核苷，諸如4至8、諸如5至6個核苷，諸如4、5、6或7個經修飾核苷。在一些實施例中，間隔體寡核苷酸中之側接區域中僅一者為交替的，而另一者由LNA核苷酸構成。可為有利的係，在3'側接區域(F')之3'端處具有至少兩個LNA核苷以賦予額外核酸外切酶耐受性。具有交替側接區域的寡核苷酸之一些實例為： [L]1-5 -[D]1-4 -[L]1-3 -[G]5-16 -[L]2-6 [L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 -[G]5-16 -[L]1-2 -[D]1-3 -[L]2-4 [L]1-5 -[G]5-16 -[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2 其限制條件為間隔體之總體長度為至少12、諸如至少14個核苷酸長度。
寡核苷酸中之區域D'或D" 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含以下或由以下組成：與標靶核酸互補的寡核苷酸之連續核苷酸序列，諸如間隔體F-G-F'，及其他5'及/或3'核苷。該等其他5'及/或3'核苷可或可不與標靶核酸完全互補。此等其他5'及/或3'核苷在本文中可被稱為區域D'及D"。
可出於將連續核苷酸序列(諸如間隔體)連接至結合部分或另一官能基之目的而添加區域D'或D"。當用於連接連續核苷酸序列與結合部分時，其可充當生物可裂解連接子。替代地，其可用於提供核酸外切酶保護或提供合成或製造簡易性。
區域D'及D"可連接至區域F之5'端或區域F'之3'端，分別產生下式之設計：D'-F-G-F'、F-G-F'-D"或D'-F-G-F'-D"。在此情況下， F-G-F'為寡核苷酸之間隔體部分，且區域D'或D"構成寡核苷酸之獨立部分。
區域D'或D"可獨立地包含以下或由以下組成：1、2、3、4或5個其他核苷酸，該等核苷酸可與標靶核酸互補或不互補。鄰近於F或F'區域之核苷酸不為糖經修飾核苷酸，諸如DNA或RNA或此等者之鹼基經修飾型式。D'或D'區域可充當對核酸酶敏感的生物可裂解連接子(參見連接子之定義)。在一些實施例中，其他5'及/或3'端核苷酸與磷酸二酯鍵鍵聯，且為DNA或RNA。適用作區域D'或D"之核苷酸類生物可裂解連接子揭示於WO2014/076195中，藉助於實例，該等連接子包括磷酸二酯鍵聯之DNA二核苷酸。生物可裂解連接子於聚寡核苷酸構築體中之用途揭示於WO2015/113922中，其中該等連接子用於鍵聯單一寡核苷酸內之多個反義構築體(例如，間隔體區域)。
在一個實施例中，除構成間隔體之連續核苷酸序列以外，本發明之寡核苷酸亦包含區域D'及/或D"。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可由下式表示： F-G-F'；特定言之F1-8 -G5-16 -F'2-8 D'-F-G-F'，特定言之D'1-3 -F1-8 -G5-16 -F'2-8 F-G-F'-D"，特定言之F1-8 -G5-16 -F'2-8 -D"1-3 D'-F-G-F'-D"，特定言之D'1-3 - F1-8 -G5-16 -F'2-8 -D"1-3
在一些實施例中，區域D'與區域F之間的核苷間鍵聯為磷酸二酯鍵聯。在一些實施例中，區域F'與區域D"之間的核苷間鍵聯為磷酸二酯鍵聯。
結合物 如本文所用之術語結合物係指共價鍵聯至非核苷酸部分(結合部分或區域C或第三區域)之寡核苷酸。
本發明之寡核苷酸與一或多個非核苷酸部分結合可例如藉由影響寡核苷酸之活性、細胞分佈、細胞吸收或穩定性而改良寡核苷酸之藥理學。在一些實施例中，結合部分藉由改良寡核苷酸之細胞分佈、生物利用率、代謝、分泌、滲透性及/或細胞吸收而調節或增強寡核苷酸之藥物動力學特性。特定言之，結合物可使寡核苷酸靶向特定器官、組織或細胞類型，且藉此增強寡核苷酸在該器官、組織或細胞類型中之效力。同時，同時，結合物可用於降低寡核苷酸在非標靶細胞類型、組織或器官中之活性，例如在非標靶細胞類型、組織或器官中之脫靶活性或活性。
WO 93/07883及WO2013/033230提供合適的結合部分，該等文獻在此以引用之方式併入。其他合適的結合部分為能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之彼等結合部分。特定言之，三價的N-乙醯基半乳胺糖結合部分適合結合於ASGPR，參見例如WO 2014/076196、WO 2014/207232及WO 2014/179620 (在此以引用之方式併入)。此類結合物用於增強肝對寡核苷酸之吸收，同時降低其在腎臟中之存在度，由此與相同寡核苷酸之非結合型式相比，增加經結合寡核苷酸之肝臟/腎臟比率。
在一實施例中，非核苷酸部分(結合部分)係選自由以下組成之群：碳水化合物、細胞表面受體配體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素(例如，細菌毒素)、維生素、病毒蛋白(例如，衣殼蛋白)或其組合。
結合物連接子 鍵聯或連接子係兩個原子之間的連接，該連接經由一或多個共價鍵將相關的一個化學基團或片段連接至相關的另一化學基團或片段。結合部分可直接或經由連接部分(例如連接子或繫栓)連接至寡核苷酸。連接子用於將一個區域(例如結合部分)連接至另一區域(例如寡核苷酸) (例如，區域A或C之末端)。
在本發明之一些實施例中，本發明之結合物或寡核苷酸結合物可視情況包含安置於寡核苷酸與結合部分之間的連接子區域。在一些實施例中，結合物與寡核苷酸之間的連接子係生物可裂解的。連接子及寡核苷酸通常經由磷酸二酯鍵聯而連接。
包含生理上不穩定鍵或由該鍵組成的生物可裂解連接子(區域B)在哺乳動物身體內通常遭遇之條件或類似於哺乳動物身體內遭遇之條件下可裂解。生理上不穩定連接子經歷化學轉化(例如裂解)之條件包括化學條件，諸如pH、溫度、氧化或還原條件或試劑，及哺乳動物細胞中發現的鹽濃度或類似於哺乳動物細胞中遇到的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中(諸如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)之酶活性之現狀。在一個實施例中，生物可裂解連接子對S1核酸酶裂解敏感。在一較佳實施例中，對核酸酶敏感的連接子包含1與10個之間核苷，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷，更佳2與6個之間核苷且最佳2與4個之間鍵聯核苷，該等核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵聯，諸如至少3或4或5個連續磷酸二酯鍵聯。較佳地，核苷係DNA或RNA。
在一個實施例中，寡核苷酸與結合部分之間的連接子為生理上不穩定的連接子，其在反義化合物之連續核苷酸序列之5'或3'末端處包含2至5個連續磷酸二酯鍵聯之核苷。在一些實施例中，連續磷酸二酯鍵聯為具有選自由以下組成之群之序列的二核苷酸：AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG。在一些實施例中，連續磷酸二酯鍵聯為具有以下序列之三核苷酸：AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC或GGG。在特定實例中，具有三個連續磷酸二酯鍵聯的磷酸二酯連接之CA二核苷酸已用作連續核苷酸序列與結合部分之間的生物可裂解連接子。含有生物可裂解連接子之磷酸二酯更詳細地描述於WO 2014/076195 (其在此以引用之方式併入)中。當與標準物對照比較時，在具有生物可裂解連接子之結合化合物中，至少約50%的結合部分與寡核苷酸斷裂，諸如至少約60%斷裂，諸如至少約70%斷裂，諸如至少約80%斷裂，諸如至少約85%斷裂，諸如至少約90%斷裂，諸如至少約95%的結合部分與寡核苷酸斷裂。
結合物亦可經由生物不可裂解連接子連接至寡核苷酸，或在一些實施例中結合物可包含共價連接至生物可裂解連接子的不可裂解連接子。不一定生物可裂解的連接子主要用於將結合部分共價連接至寡核苷酸或生物可裂解連接子，且潛在地在結合部分與寡核苷酸之間產生一定距離。一些實例連接子(區域Y)包括8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-l-甲酸丁二醯亞胺基酯(SMCC)、6-胺基己酸(AHEX或AHA)、6-胺基己氧基、4-胺基丁酸、4-胺基環己基甲酸、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-l-羧基-(6-醯胺基-己酸丁二醯亞胺基酯) (LCSMCC)、間順丁烯二醯亞胺基-苯甲醯丁二醯亞胺基酯(MBS)、N-e-順丁烯二醯亞胺基-己醯丁二醯亞胺基酯(EMCS)、6-(β-順丁烯二醯亞胺基-丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺基酯(SMPH)、N-(a-順丁烯二醯亞胺基乙酸丁二醯亞胺基酯) (AMAS)、4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸丁二醯亞胺基酯(SMPB)、β-丙胺酸(β-ALA)、苯基甘胺酸(PHG)、4-胺基環己酸(ACHC)、β-(環丙基)丙胺酸(β-CYPR)、胺基十二烷酸(ADC)、丙二烯二醇、聚乙二醇、胺基酸及其類似者。不可裂解連接子亦可包含鏈結構或重複單元之寡聚物，重複單元諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基。在一些實施例中，連接子(區域Y)係胺基烷基，諸如C2 -C36 胺基烷基，包括例如C6 至C12 胺基烷基。在一些實施例中，連接子(區域Y)為C6 胺基烷基(亦稱為C6連接子)。結合物連接基團可通常經由使用胺基經修飾寡核苷酸及結合基團上之活化酯基連接至寡核苷酸。胺基烷基與寡核苷酸之間的鍵聯基團可例如為硫代磷酸酯或磷酸二酯，或本文所提及的其他核苷鍵聯基團中之一者。本發明之結合化合物可包含以下區域C-B-A (結合部分-生物可裂解連接子-寡核苷酸/連續核苷酸序列)或C-Y-B-A (結合部分-不可裂解連接子-生物可裂解連接子-寡核苷酸/連續核苷酸序列)。
治療 術語「治療(treatment/treating/treat)」或其類似者在本文中一般用於意謂獲得所要藥理學及/或生理效應。此效應就部分或完全治癒疾病及/或該疾病引起之不良影響而言係治療性的。如本文所使用之術語「治療」涵蓋對個體之疾病的任何治療，且包括：(a)抑制疾病，亦即遏制其發展，如抑制HBsAg及/或HBeAg之增加；或(b)改善(亦即緩解)疾病，亦即引起疾病之消退，如抑制HBsAg及/或HBeAg產生。由此，改善及/或抑制HBV感染之化合物為治療HBV感染之化合物。較佳地，如本文所使用之術語「治療」係關於已出現病症之醫療干預，如已定義且出現的HBV感染之治療。
預防 本文中，術語「預防(preventing/prevention/prevent)」係關於防治性治療，亦即係關於目的為預防而非治癒疾病之量測或步驟。預防意謂獲得所要藥理學及/或生理效應，該效應就完全或部分預防疾病或其症狀而言係防治性的。因此，本文中「預防HBV感染」包括預防個體出現HBV感染及預防HBV感染之症狀出現。在本發明中，尤其涵蓋預防感染HBV之母親的孩子出現HBV感染。
患者 出於本發明之目的，「個體」(或「患者」)可為脊椎動物。在本發明之上下文中，術語「個體」包括人類及其他動物(特定言之哺乳動物)以及其他生物體。因此，本文所提供之手段及方法適用於人類治療及獸醫學應用。因此，在本文中個體可為動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、天竺鼠、雪貂、貓、狗、雞、綿羊、牛種屬、馬、駱駝或靈長類動物。個體較佳為哺乳動物。個體更佳為人類。
HBV感染 術語「B型肝炎病毒感染」或「HBV感染」為此項技術中通常已知的，且係指由B型肝炎病毒(HBV)引起且影響肝臟之感染性疾病。HBV感染可為急性或慢性感染。一些感染人員在最初感染期間不具有症狀，且一些感染人員出現噁心伴隨嘔吐、皮膚蠟黃、疲勞、尿黃及腹痛之快速發作(「Hepatitis B Fact sheet N°204」.who.int. 2014年7月. 2014年11月4日檢索)。通常，此等症狀持續若干週且可導致死亡。可能經30至180天出現症狀。在出生時被感染的彼等者中，90%形成慢性B型肝炎感染，而彼等感染者中少於10%在五歲後形成慢性B型肝炎感染(「Hepatitis B FAQs for the Public - Transmission」，美國疾病控制與預防中心(CDC)，2011-11-29檢索)。大部分患有慢性疾病之彼等者不具有症狀；然而，可最終發展成肝硬化及肝癌(Chang, 2007, Semin Fetal Neonatal Med, 12: 160-167)。此等併發症導致患有慢性疾病之彼等者中之15%至25%死亡(「Hepatitis B Fact sheet N°204」.who.int. 2014年7月, 2014年11月4日檢索)。本文中，術語「HBV感染」包括急性及慢性B型肝炎感染。術語「HBV感染」亦包括初始感染之無症狀階段、症狀階段以及HBV感染之無症狀慢性階段。
化合物 本文中，術語「化合物」意謂任何核酸分子，諸如根據本發明之RNAi分子或反義寡核苷酸，或包含此類核酸分子之任何結合物。舉例而言，本文中化合物可為靶向PAPD5及PAPD7之核酸分子，特定言之反義寡核苷酸。
組合物 術語「組合物」亦可用於描述核酸分子化合物。核酸分子組合物具有少於20%雜質，較佳少於15%或10%雜質，更佳少於9%、8%、7%或6%雜質，最佳少於5%雜質。雜質通常為比主要核酸分子組分短一個或兩個核苷酸(n-1或n-2)之核酸分子。
參考非限制性圖式及實例進一步描述本發明。
PAPD5及PAPD7為屬於聚合酶β類核苷酸基轉移酶之超家族的非典型聚(A)-聚合酶。在PCT/EP2017/064981中，PAPD5及PAPD7經鑑別為藉由在HBV感染期間利用兩種小分子抑制HBV表面抗原(HBsAg)之產生及HBV RNA之表現隨後用siRNA化合物池確認來抑制HBV感染之相關標靶。在PCT/EP2017/064980中，描述且組合靶向PAPD5或PAPD7之反義寡核苷酸，以達成HBV感染之活體外抑制。
本發明已鑑別出具有12至22個核苷酸長度之標靶序列，其在人類PAPD5 mRNA與人類PAPD7 mRNA之間共用，以便能夠利用單一核酸分子抑制兩個標靶。人類PAPD5與人類PAPD7前體mRNA之間存在大約4500個共用靶向位點。就產生醫藥上可接受分子而言，需要考慮其他參數，諸如脫靶數目，以及對其他種屬之保留以允許活體內概念驗證，以及有意義的藥物動力學/藥力學(PK/PD)建模。
本發明之寡核苷酸 本發明已鑑別出能夠在活體內及活體外抑制PAPD5及PAPD7兩者之表現的新穎反義寡核苷酸。該等寡核苷酸與人類PAPD5及人類PAPD7兩者中所存在的具有16與22之間核苷酸長度的三個靶向位點中之一者互補。
抑制係藉由使反義寡核苷酸與編碼PAPD5之標靶核酸及編碼PAPD7之標靶核酸雜交而達成。應理解，為了有效，同一分子不需要同時與兩個標靶雜交。
標靶核酸1可為哺乳動物PAPD5序列，諸如選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 5組成之群之序列。
標靶核酸2可為哺乳動物PAPD7序列，諸如選自由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 6組成之群之序列。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠藉由抑制或下調標靶1及標靶2之表現而調節其表現。較佳地，此調節相比於標靶之正常表現水準產生至少50%的表現抑制，更佳相比於標靶之正常表現水準產生至少60%、70%、80%、90%、95%或98%的抑制。在一些實施例中，使用HeLa細胞，本發明之寡核苷酸能夠抑制至少65%至98%，諸如70%至95%的PAPD5及PAPD7 mRNA活體外表現水準，此標靶降低範圍就選擇與HBV抗原降低(諸如HBsAg及/或HBeAg降低)具有良好相關性之寡核苷酸而言係有利的。在一些實施例中，使用HeLa細胞，本發明化合物可能夠抑制至少50%的PAPD5及PAPD7蛋白活體外表現水準。本文中之材料及方法部分以及實例提供可用於量測HeLa細胞中之標靶RNA抑制的分析。標靶調節藉由寡核苷酸之連續核苷酸序列(諸如間隔體區域)與標靶核酸之間的雜交觸發。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含寡核苷酸或連續核苷酸序列與標靶核酸中之一者或兩者之間的失配。儘管存在失配，但與標靶核酸之雜交仍可足以展現PAPD5及PAPD7表現之所需調節。由失配引起的結合親和力降低有利地可由寡核苷酸之長度增加及/或寡核苷酸序列內能夠增加與標靶之結合親和力的經修飾核苷之數目增加而補償。有利地，本發明之寡核苷酸含有能夠增加結合親和力之經修飾核苷，諸如2'糖經修飾核苷，包括LNA。
本發明之一態樣係關於一種具有12至32個核苷酸長度之反義寡核苷酸，其包含具有12至22個核苷酸長度的能夠抑制PAPD5及PAPD7兩者之表現的連續核苷酸序列。
在一些實施例中，該寡核苷酸包含與標靶核酸SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2或其天然變體至少90%互補，諸如至少91%、諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少94%、諸如至少95%、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少98%或100%與互補的連續序列。
在一個實施例中，本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列與標靶核酸之區域完全互補(100%互補)，或在一些實施例中可在寡核苷酸與標靶核酸之間包含一個或兩個失配。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸包含具有12至22個核苷酸長度的與SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2中存在之標靶核酸區域至少93%互補，諸如完全(或100%)互補的連續核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或連續核苷酸序列與標靶核酸SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4至少93%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸或連續核苷酸序列與標靶核酸SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6至少93%互補，諸如完全(或100%)互補。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸或該連續核苷酸序列與SEQ ID NO: 1上之位置64669至69429及SEQ ID NO: 2上之位置29514至29530 100%互補。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸或該連續核苷酸序列與SEQ ID NO: 1上之位置64670至64685及SEQ ID NO: 2上之位置29515至29530 100%互補。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸或該連續核苷酸序列與SEQ ID NO: 1上之位置69414至69429及SEQ ID NO: 2上之位置30731至30746 100%互補。
在一些實施例中，該反義寡核苷酸或該連續核苷酸序列與SEQ ID NO: 1上之位置759至781及SEQ ID NO: 2上之位置1032至1054 100%互補。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含以下或由以下組成：12至32個核苷酸長度，諸如14至25、諸如15至22、諸如16至20個連續核苷酸長度。
在一些實施例中，反義寡核苷酸中與標靶核酸互補的連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：12至22、諸如14至20、諸如16至20、諸如15至18、諸如16至18、諸如16至17個連續核苷酸長度。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：22或更少個核苷酸，諸如20或更少個核苷酸，諸如17或更少個核苷酸。應理解，本文中所給出之任何範圍包括範圍端點。因此，若稱寡核苷酸包括12至32個核苷酸，則包括12及32個核苷酸兩者。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 7至SEQ ID NO: 16組成之群之序列具有至少93%一致性，較佳100%一致性的12至32個核苷酸長度。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 17至SEQ ID NO: 19組成之群之序列具有至少93%一致性，較佳100%一致性的12至32個核苷酸長度。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18之序列具有至少93%一致性，較佳100%一致性的12至32個核苷酸長度。
在一些實施例中，反義寡核苷酸或連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 19之序列具有至少93%一致性，較佳100%一致性的12至32個核苷酸長度。
在另一態樣中，本發明係關於siRNA分子，其中反義股與選自由SEQ ID NO: 17至SEQ ID NO: 19組成之群之序列具有至少93%一致性，較佳100%一致性。
在另一態樣中，本發明係關於shRNA分子，其中分子之區域與選自由SEQ ID NO: 17至SEQ ID NO: 19組成之群之序列具有至少93%一致性，較佳100%一致性。
應理解，連續核鹼基序列(基元序列)可經修飾以例如增加核酸酶耐受性及/或與標靶核酸之結合親和力。
高親和力經修飾核苷酸併入至寡核苷酸序列中之模式一般稱為寡核苷酸設計。
本發明之寡核苷酸經設計成具有經修飾核苷及DNA核苷。有利地，使用高親和力經修飾核苷。
在一實施例中，寡核苷酸包含至少1個經修飾核苷，諸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16個經修飾核苷。在一實施例中，寡核苷酸包含1至10個經修飾核苷，諸如2至9個經修飾核苷，諸如3至8個經修飾核苷，諸如4至7個經修飾核苷，諸如6或7個經修飾核苷。合適的修飾描述於「定義」部分中之「經修飾核苷」、「高親和力經修飾核苷」、「糖修飾」、「2'糖修飾」及「鎖核酸(LNA)」中。
在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個糖經修飾核苷，諸如2'糖經修飾核苷。較佳地，本發明之寡核苷酸包含一或多個2'糖經修飾核苷，獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA及LNA核苷。當經修飾核苷中之一或多者為鎖核酸(LNA)時係有利的。經常使用的LNA核苷為氧基-LNA或cET。
在另一實施例中，寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷間鍵聯。合適的核苷間修飾描述於「定義」部分中之「經修飾核苷間鍵聯」中。當連續核苷酸序列內之至少75% (諸如所有)核苷間鍵聯為硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷間鍵聯時係有利的。在一些實施例中，寡核苷酸之連續序列中之所有核苷酸間鍵聯係硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含至少一個LNA核苷，諸如1、2、3、4、5、6、7或8個LNA核苷，諸如2至6個LNA核苷，諸如3至7個LNA核苷，4至8個LNA核苷，或3、4、5、6、7或8個LNA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸中之至少75%經修飾核苷為LNA核苷，諸如80%、諸如85%、諸如90%經修飾核苷為LNA核苷。在另一實施例中，寡核苷酸中之所有經修飾核苷係LNA核苷。在另一實施例中，寡核苷酸可同時包含β-D-氧基-LNA及以下LNA核苷中之一或多者：呈β-D或α-L組態之硫基-LNA、胺基-LNA、氧基-LNA、ScET及/或ENA，或其組合。在另一實施例中，所有LNA胞嘧啶單元係5-甲基-胞嘧啶。對於寡核苷酸或連續核苷酸序列之核酸酶穩定性有利的係，在核苷酸序列之5'端處具有至少1個LNA核苷，且在核苷酸序列之3'端處具有至少2個LNA核苷。
在本發明之一實施例中，本發明之寡核苷酸能夠募集RNase H。
在本發明中，有利的結構設計為間隔體設計，如「定義」部分中例如「間隔體」、「LNA間隔體」、「MOE間隔體」及「混合翼間隔體」、「交替側接區域間隔體」下所描述。間隔體設計包括具有均一側接區域、混合翼側接區域、交替側接區域及間隔阻斷設計之間隔體。在本發明中，當本發明之寡核苷酸為具有F-G-F'設計之間隔體時係有利的。除定義部分中所描述的F-G-F'設計以外，一個設計可為其中F及F'翼區域獨立地包含1至8個2'糖經修飾核苷，且G為具有5至16個核苷的能夠募集RNaseH的間隔區域。
在一些實施例中，間隔體為具有均一側接區域或具有交替側接區域的LNA間隔體。
在本發明之一些實施例中，LNA間隔體係選自以下均一側接區域設計：2-11-3、2-11-4、2-12-2、2-12-3、2-13-2、2-9-6、3-10-3、3-10-4、3-11-2、3-11-3、3-12-2、3-9-4、4-10-2、4-10-3、4-11-2、 4-7-5、4-8-4、4-9-3、5-10-2、5-6-5、5-7-4、5-7-5、5-8-3、5-8-4、 5-9-2或6-9-2。
在本發明之一些實施例中，LNA間隔體係選自以下交替側接區域設計：4-7-1-1-3、4-9-1-1-2、1-1-3-7-1-1-2、1-1-3-9-2、2-1-1-9-2、 2-1-1-9-3。
表5及表7 (材料及方法部分)列出各基元序列之較佳設計。
在所有情況下，F-G-F'設計可進一步包括如「定義」部分中「寡核苷酸中之區域D'或D"」下所描述的區域D'及/或D"。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸在間隔體區域之5'或3'端處具有1、2或3個磷酸二酯連接之核苷單元，諸如DNA單元。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸由以下組成：兩個5'磷酸二酯連接之DNA核苷，後接如「定義」部分中所定義之F-G-F'間隔體區域。除定義部分中描述的D'-F-G-F'-D"設計以外，一個設計可為如下反義寡核苷酸，其中a) F區域介於1至6個核苷酸長度之間，且由2至5個相同LNA核苷(諸如β-D-氧基LNA或cET)及0至3個DNA核苷組成；且b) F'區域介於2至6個核苷酸長度之間，且由2至5個相同LNA核苷(諸如β-D-氧基LNA或cET)及0至3個DNA核苷組成；且c) G區域由5至11、諸如7至10個DNA核苷酸組成；且d)視情況，區域D'由1至3個磷酸二酯連接之DNA核苷組成。在5'或3'端處含有磷酸二酯連接之DNA單元的寡核苷酸適用於進行結合，且可進一步包含如本文中所描述之結合部分。針對遞送至肝臟，靶向ASGPR之部分作為結合部分係尤其有利的，其他細節參見下文結合部分。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP ID NO: 7_1至CMP ID NO: 7_83 (參見表5中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 8_1至CMP-ID-NO: 8_81 (參見表5中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 9_1至CMP-ID-NO: 9_12 (參見表5中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 10_1至CMP-ID-NO: 10_18 (參見表5中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 11_1至CMP-ID-NO: 11_26 (參見表5中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 12_1至CMP-ID-NO: 12_15 (參見表5中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 13_1或CMP-ID-NO: 13_2 (參見表5中所列之寡核苷酸)之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 14_1至CMP-ID-NO: 14_13 (參見表5中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 15_1至CMP-ID-NO: 15_21 (參見表5中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 16_1至CMP-ID-NO: 16_5 (參見表5中所列之寡核苷酸)之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 17_1至CMP-ID-NO: 17_183 (參見表7中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 18_1至CMP-ID-NO: 18_31或CMP-ID-NO: 18_250至CMP-ID-NO: 18_361 (參見表7中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 18_32至CMP-ID-NO: 18_249或CMP-ID-NO: 18_362至CMP-ID-NO: 18_610 (參見表7中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
對於本發明之某些實施例，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 19_1至CMP-ID-NO: 19_22 (參見表7中所列之寡核苷酸)或其醫藥學上可接受之鹽之群。
在本發明之一實施例中，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 18_1、18_5、18_10、18_15、18_18、18_19、18_24、18_27、18_30、18_346、18_347、18_357、17_10、17_137及17_139之群。
在本發明之一實施例中，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 18_1、18_15、18_30、17_10、17_137及17_139之群。
在本發明之另一實施例中，寡核苷酸可包含至少一個立體限定核苷間鍵聯，諸如立體限定硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
產生立體限定寡核苷酸變體之關鍵優勢為增加序列基元上之多樣性以及選擇包括立體限定寡核苷酸子庫之立體限定寡核苷酸的能力，該等變體相比於母體寡核苷酸而言具有改良的醫藥化學特性。
在一些實施例中，改良的醫藥化學特性(或改良的特性)係選自以下中之一或多者：效力增加、比活性增加、組織吸收增強、細胞吸收增強、功效增加、生物分佈改變、脫靶效應減少、失配鑑別增加、毒性降低、免疫原性降低、血清蛋白結合改變、作用持續時間改良及穩定性。以與母體寡核苷酸，諸如立體無規母體寡核苷酸相比較之形式評估一或多種特性之改良。
在一些實施例中，改良的特性可為寡核苷酸調節標靶表現之能力，諸如經由改良與涉及調節標靶表現之細胞機構之相互作用，藉助於實例提高RNase H活性、改良剪接調節活性或改良微RNA抑制。
在一些實施例中，改良的特性為RNaseH特異性、RNaseH對偶基因鑑別(亦即，單核苷酸多形現象(SNP)之間的鑑別)及/或RNaseH活性。在一些實施例中，改良的特性並非RNaseH特異性、RNaseH對偶基因鑑別及/或RNaseH活性。在一些實施例中，改良的特性為細胞內吸收改良。在一些實施例中，改良的特性為毒性降低，諸如細胞毒性或肝毒性降低。
相比於母體寡核苷酸或其他立體限定寡核苷酸展現一或多種特性改良的立體限定寡核苷酸被稱為改良的硫代磷酸酯變體。
在本發明之一實施例中，寡核苷酸係選自寡核苷酸化合物CMP-ID-NO: 18_223、18_36、18_196、18_188、18_243之群。
在本發明之另一態樣中，本發明之核酸分子(諸如反義寡核苷酸)可藉由共價連接至能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)之結合部分，諸如二價或三價GalNAc簇，而直接靶向肝臟。
結合物 由於HBV感染主要影響肝臟中之肝細胞，因此有利地將本發明之反義寡核苷酸結合至結合部分，該結合部分將增加寡核苷酸相比於非結合寡核苷酸至肝臟中之遞送。在一個實施例中，肝臟靶向部分係選自包含膽固醇之部分或能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之其他脂質或結合部分。
在一些實施例中，本發明提供一種結合物，其包含共價連接至結合部分之本發明反義寡核苷酸。
去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)結合部分包含能夠以等於或大於半乳糖之親和力結合至去唾液酸醣蛋白受體的一或多個碳水化合物部分(ASPGR靶向部分)。許多半乳糖衍生物對去唾液酸醣蛋白受體之親和力已經研究(參見例如：Jobst, S.T.及Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686)，或容易使用此項技術中典型的方法進行測定。
在一個實施例中，結合部分包含至少一個選自由以下組成之群之去唾液酸醣蛋白受體靶向部分：半乳糖、半乳胺糖、N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖及N-異丁醯基半乳胺糖。有利地，去唾液酸醣蛋白受體靶向部分為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。
為了產生ASGPR結合部分，可將ASPGR靶向部分(較佳GalNAc)連接至結合架構。一般而言，ASPGR靶向部分可位於架構之同一末端。在一個實施例中，結合部分由連接至間隔基之二至四個末端GalNAc部分組成，該間隔基將各GalNAc部分連接至可與反義寡核苷酸結合的分支鏈分子。
在另一實施例中，結合部分相對於去唾液酸醣蛋白受體靶向部分為單價、二價、三價或四價的。有利地，去唾液酸醣蛋白受體靶向部分包含N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)部分。
構成結合部分之ASPGR靶向架構可例如藉由經由C-l碳將GalNAc部分連接至間隔基而產生。較佳間隔基為可撓性的親水性間隔基(美國專利5885968；Biessen等人 J. Med. Chern. 1995 第39卷第1538-1546頁)。較佳可撓性的親水性間隔基為PEG間隔基。較佳PEG間隔基為PEG3間隔基。分支點可為允許連接二至三個GalNAc部分或其他去唾液酸醣蛋白受體靶向部分且進一步允許將分支點連接至寡核苷酸的任何小分子，此類構築體被稱為GalNAc簇或GalNAc結合部分。例示性分支點基團為二離胺酸。二離胺酸分子含有三個胺基及一個羧基反應性基團，可經由該等三個胺基連接三個GalNAc部分或其他去唾液酸醣蛋白受體靶向部分，且該二離胺酸可經由該羧基反應性基團連接至寡聚物。Khorev等人 2008 Bioorg. Med. Chem. 第16卷, 第5216頁亦描述合適的三價分支基團之合成。其他可商購的分支基團為1,3-雙-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基醯胺基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]胺基磷酸酯(Glen Research目錄號：10-1920-xx)；參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯(Glen Research目錄號：10-1922-xx)；及參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙氧基甲基]亞甲基氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯；以及1-[5-(4,4'-二甲氧基-三苯甲氧基)戊基醯胺基]-3-[5-茀甲氧基-羰基-氧基-戊基醯胺基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-胺基磷酸酯(Glen Research目錄號：10-1925-xx)。
其他GalNAc結合部分可包括例如WO 2014/179620及WO 2016/055601以及PCT/EP2017/059080 (在此以引用之方式併入)中所描述之彼等結合部分，以及連接有GalNAc部分之小肽，諸如Tyr-Glu-Glu-(胺基己基GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3；與肝細胞上之去唾液酸醣蛋白受體結合的醣三肽，參見例如Duff等人, Methods Enzymol, 2000, 313, 297)；基於離胺酸之半乳糖簇(例如L3G4；Biessen等人, Cardovasc. Med., 1999, 214)；以及基於膽烷之半乳糖簇(例如，去唾液酸醣蛋白受體之碳水化合物辨識基元)。
ASGPR結合部分，特定言之三價GalNAc結合部分可使用此項技術中已知之方法連接至寡核苷酸之3'或5'端。在一個實施例中，ASGPR結合部分連接至寡核苷酸之5'端。
一或多個連接子可插入在結合部分(諸如分支基團分子處之結合部分)與寡核苷酸之間。有利地，結合部分與反義寡核苷酸之間具有生物可裂解連接子，其視情況與諸如C6連接子之不可裂解連接子組合。該(等)連接子可選自「定義」部分中「結合連接子」下所描述之連接子，生物可裂解區域D'或D"連接子為尤其有利的。
在一個實施例中，結合部分為三價的N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)，諸如圖1中所示之彼等結合部分，尤其如圖1D中所示。
在本發明之一實施例中，結合化合物係選自材料及方法部分中之表9中之化合物之群。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO: 20_12。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_13。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_14。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_15。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_16。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_18。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_20。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_21。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_22。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_30。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_35。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 20_36。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 21_2。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 21_33。
在本發明之一實施例中，結合化合物為CMP-ID-NO 21_34。
製造方法 在另一態樣中，本發明提供用於製造本發明之反義寡核苷酸之方法，其包含使核苷酸單元反應且因此形成包含於寡核苷酸中之共價鍵聯連續核苷酸單元。較佳地，方法使用胺基磷酸酯化學方法(參見例如Caruthers等人, 1987, Methods in Enzymology 第154卷, 第287-313頁)。在另一實施例中，該方法進一步包含使連續核苷酸序列與結合部分(配位體)反應以將結合部分共價連接至寡核苷酸。在另一態樣中，提供用於製造本發明之組合物之方法，其包含混合本發明之寡核苷酸或經結合寡核苷酸與醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
醫藥組合物 在另一態樣中，本發明提供包含本發明之反義寡核苷酸及/或結合化合物或其鹽以及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑的醫藥組合物。典型的醫藥組合物係藉由混合本發明之反義寡核苷酸或結合化合物與稀釋劑、載劑或賦形劑而製備。
醫藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一些實施例中，醫藥學上可接受之稀釋劑係無菌磷酸鹽緩衝鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸用於濃度為50至300 µM溶液之醫藥學上可接受之稀釋劑中。
包含此等適合調配物之核酸分子、反義寡核苷酸及結合化合物見於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 第17版, 1985中。藥物遞送方法之簡要綜述參見例如Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。WO 2007/031091提供醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑之其他適合及較佳實例(該文獻在此以引用之方式併入)。WO2007/031091中亦提供適合之劑量、調配物、投藥途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物。
根據本發明之化合物可以其醫藥學上可接受之鹽之形式存在。術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留本發明化合物之生物效應及特性之習知酸加成鹽或鹼加成鹽，且由適合之無毒有機酸或無機酸或有機鹼或無機鹼形成。酸加成鹽包括例如衍生自無機酸之彼等鹽，該等無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、胺磺酸、磷酸及硝酸；及衍生自有機酸之彼等鹽，該等有機酸諸如對甲苯磺酸、水楊酸、甲磺酸、草酸、丁二酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、反丁烯二酸及其類似酸。鹼加成鹽包括衍生自氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉及氫氧化四級銨之彼等鹽，諸如氫氧化四甲基銨。醫藥化合物變成鹽之化學修改係醫藥化學家熟知之技術，以便獲得化合物之改良的物理及化學穩定性、吸濕性、流動性及溶解度。舉例而言描述於Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435或Ansel, In: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 第6版 (1995), 第196及1456-1457頁中。舉例而言，本文所提供之化合物的醫藥學上可接受之鹽可為鈉鹽或鉀鹽。
應用 本發明之寡核苷酸可用作例如，診斷、治療及預防之研究試劑。
在研究中，此類寡核苷酸可用以特異性調節細胞(例如活體外細胞培養物)及實驗動物中PAPD5及PAPD7蛋白質之合成，進而有助於對標靶之功能分析或評估其作為治療性干預之標靶的有效性。通常標靶調節藉由降低或抑制mRNA生成蛋白質，進而防止蛋白質形成來實現，或藉由降低或抑制基因或mRNA生成蛋白質的調節劑來實現。
若在研究或診斷中採用本發明之寡核苷酸，則標靶核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。
本發明亦涵蓋用於調節表現PAPD5及PAPD7之標靶細胞中之PAPD5及PAPD7表現的活體內或活體外方法，該方法包含向該細胞投與有效量的本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物。
在一些實施例中，標靶細胞係哺乳動物細胞，尤其人類細胞。標靶細胞可為活體外細胞培養物或形成哺乳動物中之組織的部分的活體內細胞。在較佳實施例中，標靶細胞存在於肝臟中。標靶細胞可為肝細胞。
本發明之一個態樣係關於適用作藥劑的本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物。
在本發明之一態樣中，本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物能夠抑制HBV之傳播。特定言之，反義寡核苷酸能夠影響以下參數中之一或多者：i)降低病毒RNA之表現；ii)降低衍生自病毒RNA (HBV RNA)之病毒DNA (HBV DNA)之產生；iii）降低新病毒粒子(HBV粒子)之產生；iv)降低HBV抗原，特定言之HBsAg及/或HBeAg之產生。
舉例而言，抑制HBV傳播之反義寡核苷酸可i)相比於對照物，降低至少40%，諸如50%、60%、70%、80%、或90%的病毒RNA (HBV RNA)表現；ii)相比於對照物，降低至少40%，諸如50%、60%、70%、80%或90%的病毒DNA (HBV DNA)產生；iii）相比於對照物，降低至少40%，諸如50%、60%、70%、80%或90%的新病毒粒子(HBV粒子)產生；或iv)相比於對照物，降低至少50%，諸如至少60%、70%、80%、90%的HBsAg及/或HBeAg產生及/或分泌，或甚至完全耗盡抗原中之一者或兩者。對照物可為未經處理之細胞或動物，或用恰當對照物處理之細胞或動物。
對HBV傳播之抑制可在活體外使用感染HBV之dHepaRG細胞或ASGPR-dHepaRG細胞進行量測，或使用如材料及方法部分中所描述的AAV/HBV小鼠模型在活體內針對與小鼠PAPD5及PAPD7互補的寡核苷酸進行量測。對HBsAg及/或HBeAg分泌之抑制可藉由ELISA來量測，例如藉由使用CLIA ELISA套組(Autobio Diagnostic)根據製造商之說明書來量測。對細胞內HBV mRNA產生之抑制可藉由例如材料及方法部分中所描述之即時PCR來量測。用於評估測試化合物是否抑制HBV傳播之其他方法為：例如如WO 2015/173208中所描述或如材料及方法部分中所描述，藉由RT-qPCR量測HBV DNA之分泌；北方墨點法(Northern Blot)；原位雜交；或免疫螢光。
由於HBsAg分泌減少，因此本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物可用於抑制患上HBV感染或用於治療HBV感染。特定言之，相比於僅減少HBsAg分泌之化合物，本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物由於抑制HBeAg分泌而更有效地抑制患上慢性HBV感染或治療慢性HBV感染。另外，降低準母親中之HBeAg亦可抑制其孩子患上慢性HBV感染。因此，由於HBeAg分泌減少，本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物抑制患上慢性HBV感染(諸如，感染HBV之母親的後代患上慢性HBV感染)且降低感染HBV之人員的感染程度。
因此，本發明之一個態樣係關於本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物之用途，其用於減少感染HBV之個體中之HBsAg及HBeAg的分泌。當本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物能夠降低整合至宿主基因組中之HBV DNA之HBsAg表現時係有利的。
本發明之另一態樣係關於本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物之用途，其用於抑制患上慢性HBV感染或治療慢性HBV感染。
本發明之另一態樣係關於本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物之用途，其用於降低感染HBV之人員的感染程度。在本發明之特定態樣中，本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物抑制感染HBV之母親的後代患上慢性HBV感染。該母親較佳為HBeAg陽性。
待用本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物治療(或防治性地服用本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物)之個體較佳為人類，更佳為HBsAg陽性及/或HBeAg陽性的人類患者，甚至更佳為HBsAg陽性且HBeAg陽性的人類患者。該人類患者可為準母親，例如HBeAg陽性及/或HBsAg陽性的準母親，更佳為HBeAg陽性且HBsAg陽性的準母親。
因此，本發明係關於治療及/或預防HBV感染之方法，其中該方法包含投與有效量的本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物。
本發明亦提供本發明之核酸分子、反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物之用途，其用於製造藥劑，特定言之用於治療或預防HBV感染或慢性HBV感染或者降低感染HBV之人員之感染程度的藥劑。在較佳實施例中，藥劑係以用於皮下投與之劑型製造。
本發明亦提供本發明之核酸分子、反義寡核苷酸、結合化合物、醫藥組合物之用途，其用於製造藥劑，其中該藥劑呈用於靜脈內投與之劑型。
本發明之核酸分子、反義寡核苷酸或醫藥組合物可用於組合療法中。舉例而言，本發明之核酸分子、反義寡核苷酸或醫藥組合物可與其他抗HBV試劑組合，該等其他試劑諸如用於治療及/或預防HBV之干擾素α-2b、干擾素α-2a及干擾素αcon-1 (聚乙二醇化及非聚乙二醇化)、利巴韋林(ribavirin)、拉米夫定(lamivudine) (3TC)、恩替卡韋(entecavir)、替諾福韋(tenofovir)、替比夫定(telbivudine) (LdT)、阿德福韋(adefovir)；或其他新出現的抗HBV試劑，諸如HBV RNA複製抑制劑、HBsAg分泌抑制劑、HBV蛋白殼抑制劑、反義寡聚物(例如，如WO2012/145697及WO 2014/179629中所描述)、siRNA (例如，WO 2005/014806、WO 2012/024170、WO 2012/2055362、WO 2013/003520、WO 2013/159109、WO 2017/027350及WO2017/015175中所描述)、HBV治療疫苗、HBV防治疫苗、HBV抗體治療劑(單株或多株)，或TLR 2、3、7、8或9促效劑。
投藥 本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物以與良好醫學實踐一致之方式調配、給藥及投與。在此上下文中考慮之因素包括所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、試劑遞送部位、投藥方法、投藥時程、患者之年齡及性別，以及醫學從業者已知的其他因素。本文中，「有效量」(亦稱為「(治療)有效劑量」)意謂將誘發個體之生物或醫學反應的化合物之量，該反應係醫生或其他臨床醫師所尋求的。本發明之反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物之「有效量」將由此等考慮因素決定，並且為抑制HBsAg及/或HBeAg所需的最少量。舉例而言，該量可低於對接受者之細胞具有毒性或對哺乳動物整體具有毒性的量。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組合物以0.1至15 mg/kg，諸如0.2至10 mg/kg，諸如0.25至5 mg/kg之劑量進行投與。投藥可為一週一次、每兩週一次、每三週一次或甚至每月一次。
本發明之核酸分子或醫藥組合物可表面(諸如，至皮膚、吸入、經眼或經耳)、或經腸(諸如，經口或經由胃腸道)或非經腸(諸如，靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內)投與。
在一較佳實施例中，本發明之核酸分子、反義寡核苷酸、結合化合物或醫藥組合物藉由包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注之非經腸途徑進行投與。在一個實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸結合物經靜脈內投與。就GalNAc結合之化合物而言，有利地可經皮下進行投與，以延遲ASGP受體之飽和。
組合療法 在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組合物用於與另一種治療劑組合治療。治療劑可例如為用於上文所描述之疾病或病症之標準護理。
藉助於實例，本發明之寡聚物或寡聚物結合物可與其他活性劑組合使用，該等活性劑諸如基於寡核苷酸之抗病毒劑，諸如基於序列特異性寡核苷酸之抗病毒劑，其經由反義(包括其他LNA寡聚物)、siRNA (諸如ARC520)、適體、嗎啉核酸或任何其他抗病毒的核苷酸序列依賴性作用模式而起作用。
藉助於其他實例，本發明之寡聚物或寡聚物結合物可與其他活性劑組合使用，該等活性劑諸如免疫刺激抗病毒化合物，諸如干擾素(例如，聚乙二醇化干擾素α)、TLR7促效劑(例如，GS-9620)或治療疫苗。
藉助於其他實例，本發明之寡聚物或寡聚物結合物可與其他活性劑組合使用，該等活性劑諸如具有抗病毒活性之小分子。此等其他活性劑可例如為核苷/核苷酸抑制劑(例如恩替卡韋或反丁烯二酸替諾福韋雙索酯)、衣殼化抑制劑、進入抑制劑(例如米魯德西B (Myrcludex B))。
在某些實施例中，另一治療劑可為HBV試劑、C型肝炎病毒(HCV)劑、化學治療劑、抗生素、鎮痛劑、非類固醇抗炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、止吐劑、止瀉劑或免疫抑制劑。
在特定相關實施例中，該另一HBV試劑可為干擾素α-2b、干擾素α-2a及干擾素αcon-1 (聚乙二醇化及非聚乙二醇化)、利巴韋林；HBV RNA複製抑制劑；第二反義寡聚物；HBV治療疫苗；HBV防治疫苗；拉米夫定(3TC)；恩替卡韋(ETV)；反丁烯二酸替諾福韋雙索酯(TDF)；替比夫定(LdT)；阿德福韋；或HBV抗體治療劑(單株或多株)。
在其他特定相關實施例中，該另一HCV試劑可為干擾素 α-2b、干擾素α-2a及干擾素αcon-1 (聚乙二醇化及非聚乙二醇化)；利巴韋林；佩格西施(pegasys)；HCV RNA複製抑制劑(例如，ViroPharma之VP50406系列)；HCV反義藥劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；或HCV單株或多株抗體治療劑。
本發明之實施例 本發明之以下實施例可與本文中所描述之任何其他實施例組合使用。 1. 一種具有12至32個核苷酸長度的核酸分子，其包含具有12至22個核苷酸長度的能夠抑制PAPD5及PAPD7兩者之表現的連續核苷酸序列。 2. 如實施例1之核酸分子，其中該連續核苷酸序列與標靶核酸SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2至少93%互補。 3. 如實施例1或2之核酸分子，其中該連續核苷酸序列與標靶核酸SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2至少100%互補。 4. 如實施例1或3之核酸分子，其中該連續核苷酸序列與標靶核酸SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4互補。 5. 如實施例1或3之核酸分子，其中該連續核苷酸序列與標靶核酸SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6互補。 6. 如實施例1至3或5之核酸分子，其中該核酸分子與SEQ ID NO: 1上之位置759至781及SEQ ID NO: 2上之位置1032至1054互補。 7. 如實施例1至4之核酸分子，其中該核酸分子與SEQ ID NO: 1上之位置64669至69429及SEQ ID NO: 2上之位置29514至29530互補。 8. 如實施例1至4之核酸分子，其中該核酸分子與SEQ ID NO: 1上之位置69414至69429及SEQ ID NO: 2上之位置30731至30746互補。 9. 如實施例1至8之核酸分子能夠以低於-15千卡之ΔG°與標靶核酸SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2雜交。 10. 如實施例2至9之核酸分子，其中該標靶核酸為RNA。 11. 如實施例10之核酸分子，其中該RNA為前體mRNA。 12. 如實施例1至11之核酸分子，其中該核酸分子係選自反義寡核苷酸、siRNA或shRNA。 13. 如實施例1至11之核酸分子，其中該核酸分子為單股反義寡核苷酸。 14. 如實施例12或13之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：至少14個連續核苷酸，特定言之15、16、17、18、19或20個連續核苷酸。 15. 如實施例12或13之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：14至20個核苷酸。 16. 如實施例15之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：16至18個核苷酸。 17. 如實施例1至16之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含以下或由以下組成：14至25個核苷酸長度。 18. 如實施例17之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含以下或由以下組成：15至22個核苷酸長度。 19. 如實施例17或18之反義寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含以下或由以下組成：16至20個核苷酸長度。 20. 如實施例12至19之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：選自由SEQ ID NO: 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 18及19組成之群之序列。 21. 如實施例12至20之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：選自由SEQ ID NO: 7、8、9、10、11、12、13、14、15及16組成之群之序列。 22. 如實施例12至20之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：選自SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18之序列。 23. 如實施例12至20之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 19。 24. 如實施例12至23之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與同其互補的標靶核酸相比具有零至三個失配。 25. 如實施例24之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與標靶核酸相比具有一個失配。 26. 如實施例24之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與標靶核酸相比具有兩個失配。 27. 如實施例24之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與兩個標靶核酸序列完全互補。 28. 如實施例12至27之反義寡核苷酸，其包含一或多個經修飾核苷。 29. 如實施例28之反義寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷為高親和力經修飾核苷。 30. 如實施例28或29之反義寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷為2'糖經修飾核苷。 31. 如實施例30之反義寡核苷酸，其中該一或多個2'糖經修飾核苷獨立地選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-DNA、2'-氟-ANA及LNA核苷。 32. 如實施例28至31之反義寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷為LNA核苷。 33. 如實施例32之反義寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷係選自氧基-LNA、胺基-LNA、硫基-LNA、cET及ENA。 34. 如實施例32或33之反義寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷為具有以下2'-4'橋鍵-O-CH2 -之氧基-LNA。 35. 如實施例34之反義寡核苷酸，其中該氧基-LNA為β-D-氧基-LNA。 36. 如實施例32或33之反義寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷為具有以下2'-4'橋鍵-O-CH(CH3 )-之cET。 37. 如實施例36之反義寡核苷酸，其中該cET為(S)cET，亦即6'(S)甲基-β-D-氧基-LNA。 38. 如實施例32或33之反義寡核苷酸，其中該LNA為具有以下2'-4'橋鍵-O-CH2 -CH2 -之ENA。 39. 如實施例12至33中任一者之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含至少一個經修飾核苷間鍵聯。 40. 如實施例39之反義寡核苷酸，其中該經修飾核苷間鍵聯係耐核酸酶的。 41. 如實施例39或40之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列內至少75%核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯或硼烷磷酸酯核苷間鍵聯。 42. 如實施例39或40之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸區內所有核苷間鍵為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 43. 如實施例41或42之反義寡核苷酸，其中該等硫代磷酸酯核苷間鍵聯中之至少一者係立體限定的。 44. 如實施例12至43之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸能夠募集RNase H。 45. 如實施例44之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸或該連續核苷酸序列為間隔體。 46. 如實施例45之反義寡核苷酸，其中該間隔體具有式5'-F-G-F'-3'，其中F及F'翼區域獨立地包含1至7個根據實施例31至38之2'糖經修飾核苷或由其組成，且G為具有5至16個核苷的能夠募集RNaseH的區域。 47. 如實施例46之反義寡核苷酸，其中各翼(F及F')之特徵在於在翼之5'末端及3'末端處具有至少一個2'糖經修飾核苷，且G區域鄰近於翼區域(例如，G區域之5'及3'末端)具有至少一個DNA核苷。 48. 如實施例46或47之反義寡核苷酸，其中區域F及F'中之所有2'糖經修飾核苷為相同的LNA核苷。 49. 如實施例46至48之寡核苷酸，其中 a. 該F區域介於1至6個核苷酸長度之間，且由1至5個相同LNA核苷及0至3個DNA核苷組成；且 b. 該F'區域介於2至6個核苷酸長度之間，且由2至5個相同LNA核苷及0至3個DNA核苷組成；且 c. G區域介於5至11個核苷酸之間，其能夠募集RNaseH，且 d. 視情況，具有1至3個磷酸二酯鍵聯DNA核苷之D'區域位於F區域之5'端處。 50. 如實施例47之反義寡核苷酸，其中區域F及F'由相同的LNA核苷組成。 51. 如實施例46至48之反義寡核苷酸，其中區域F及F'中之所有2'糖經修飾核苷為氧基-LNA核苷。 52. 如實施例46或47之反義寡核苷酸，其中區域F或F'中之至少一者進一步包含至少一個獨立地選自由以下組成之群之2'經取代修飾核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基 -RNA、2'-胺基-DNA及2'-氟-DNA。 53. 如實施例46至52之反義寡核苷酸，其中區域G中募集RNaseH之核苷獨立地選自DNA、α-L-LNA、C4'烷基化DNA、ANA及2' F-ANA及UNA。 54. 如實施例53之反義寡核苷酸，其中區域G中之核苷為DNA及/或α-L-LNA核苷。 55. 如實施例46或53或54之反義寡核苷酸，其中區域G由至少75% DNA核苷組成。 56. 如實施例55之反義寡核苷酸，其中區域G中之所有核苷為DNA核苷。 57. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 7_1至CMP ID NO: 7_83或其醫藥學上可接受之鹽。 58. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 8_1至CMP ID NO: 8_81或其醫藥學上可接受之鹽。 59. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 9_1至CMP ID NO: 9_12或其醫藥學上可接受之鹽。 60. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 10_1至CMP ID NO: 10_18或其醫藥學上可接受之鹽。 61. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 11_1至CMP ID NO: 11_26或其醫藥學上可接受之鹽。 62. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 12_1至CMP ID NO: 12_15或其醫藥學上可接受之鹽。 63. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 13_1或CMP ID NO: 13_2或其醫藥學上可接受之鹽。 64. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 14_1至CMP ID NO: 14_13或其醫藥學上可接受之鹽。 65. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 15_1至CMP ID NO: 15_21或其醫藥學上可接受之鹽。 66. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 16_1至CMP ID NO: 16_5或其醫藥學上可接受之鹽。 67. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 17_1至CMP ID NO: 17_183或其醫藥學上可接受之鹽。 68. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 18_1至CMP ID NO: 18_31或CMP ID NO: 18_250至CMP ID NO: 18_361或其醫藥學上可接受之鹽。 69. 如實施例68之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 18_1、18_5、18_10、18_15、18_18、18_19、18_24、18_27、18_30、18_346、18_347、18_357、17_10、17_137及17_139或其醫藥學上可接受之鹽。 70. 如實施例69之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 18_1、18_15、18_27、18_30、17_10、17_137及17_139。 71. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 18_32至CMP ID NO: 18_249或CMP ID NO: 18_362至CMP ID NO: 18_610或其醫藥學上可接受之鹽。 72. 如實施例71之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 18_223、18_36、18_196、18_188及18_243。 73. 如實施例12至55之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸係選自CMP ID NO: 19_1至CMP ID NO: 19_22或其醫藥學上可接受之鹽。 74. 一種結合化合物，其包含如實施例1至11中任一者之核酸分子或如實施例12至57中任一者之反義寡核苷酸，以及至少一個共價連接至該反義寡核苷酸之結合部分。 75. 如實施例74之結合化合物，其中該結合部分係選自碳水化合物、細胞表面受體配位體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素、維生素、病毒蛋白或其組合。 76. 如實施例74或75之結合化合物，其中該結合部分能夠與去唾液酸醣蛋白受體結合。 77. 如實施例76之結合化合物，其中該結合部分包含至少一個選自由以下組成之群之去唾液酸醣蛋白受體靶向部分：半乳糖、半乳胺糖、 N-甲醯基-半乳胺糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-丙醯基-半乳胺糖、N-正丁醯基-半乳胺糖及N-異丁醯基半乳胺糖。 78. 如實施例77之結合化合物，其中該去唾液酸醣蛋白受體靶向部分為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。 79. 如實施例77或78之結合化合物，其中該結合部分相對於去唾液酸醣蛋白受體靶向部分為單價、二價、三價或四價的。 80. 如實施例79之結合化合物，其中該結合部分由二至四個末端GalNAc部分及間隔基組成，該間隔基將各GalNAc部分連接至可與該反義化合物結合的分支基團分子。 81. 如實施例80之結合化合物，其中該間隔基為PEG間隔基。 82. 如實施例76至81之結合化合物，其中該結合部分為三價的N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)部分。 83. 如實施例76至82之結合化合物，其中該結合部分係選自圖1中之三價GalNAc部分中之一者。 84. 如實施例83之結合化合物，其中該結合部分為圖1D中之三價GalNAc部分。 85. 如實施例74至84之結合化合物，其包含位於該核酸分子或該反義寡核苷酸與該結合部分之間的連接子。 86. 如實施例85之結合化合物，其中該連接子為生理學上不穩定的連接子。 87. 如實施例86之結合化合物，其中該生理學上不穩定的連接子為對核酸酶敏感的連接子。 88. 如實施例86或87之寡核苷酸結合物，其中該生理學上不穩定的連接子包含2至5個連續磷酸二酯鍵聯。 89. 如實施例86至88之結合化合物，其中該反義寡核苷酸具有式D'-F-G-F'或F-G-F'-D"，其中F、F'及G如實施例46至56中所定義，且D'或D"包含1、2或3個具有磷酸二酯核苷間鍵聯之DNA核苷。 90. 如實施例88或89之寡核苷酸結合物，其中至少兩個連續磷酸二酯核苷間鍵聯與CA二核苷酸相關聯。 91. 如實施例76至90之結合化合物，其展現肝臟相比於腎臟中之經改良細胞分佈，或肝臟對結合化合物相比於非結合核酸分子或反義寡核苷酸之經改良細胞吸收。 92. 如實施例76至91之結合化合物，其中該結合化合物係選自由CPM ID NO 20_12、20_13、20_14、20_15、20_16、20_18、20_20、20_21、20_22、20_30、20_35、20_36、21_2、21_33及21_34組成之群。 93. 一種醫藥組合物，其包含根據實施例1至11中任一者之核酸分子、如實施例12至73之反義寡核苷酸、如實施例74至92之結合化合物或其可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。 94. 一種用於製造如實施例12至73之反義寡核苷酸的方法，其包含使核苷酸單元反應，由此形成包含於反義寡核苷酸中之共價鍵聯連續核苷酸單元。 95. 如實施例94之方法，其進一步包含使該連續核苷酸序列與如實施例76至84中任一者中所描述之非核苷酸結合部分反應。 96. 一種用於製造如實施例93之組合物的方法，其包含混合該反義寡核苷酸與醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。 97. 一種用於調節表現PAPD5及PAPD7之標靶細胞中之PAPD5及PAPD7表現的活體內或活體外方法，該方法包含向該細胞投與有效量的如實施例1至11中任一者之核酸分子、如實施例12至73中任一者之反義寡核苷酸或如實施例74至92中任一者之結合化合物或如實施例93之醫藥組合物。 98. 如實施例97之方法，其中相比於無任何治療情況下之水準，標靶細胞中之PAPD5及PAPD7表現降低了至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%。 99. 一種用於治療或預防疾病之方法，其包含向患有或易患上該疾病之個體投與治療或預防有效量的如實施例1至11中任一者之核酸分子、如實施例12至73中任一者之反義寡核苷酸或如實施例74至92中任一者之結合化合物或如實施例93之醫藥組合物。 100. 如實施例1至11中任一者之核酸分子、如實施例12至57中任一者之反義寡核苷酸或如實施例74至92中任一者之結合化合物或如實施例93之醫藥組合物，其適用作用於治療或預防個體之疾病的藥劑。 101. 一種如實施例1至11中任一者之核酸分子、如實施例12至73中任一者之反義寡核苷酸或如實施例74至92中任一者之結合化合物的用途，其係用於製備用以治療或預防個體之疾病的藥劑。 102. 如實施例99至101之方法、核酸分子或用途，其中該疾病為HBV感染或慢性HBV感染。 103. 如實施例102之方法、核酸分子或用途，其中HBsAg及/或HBeAg之分泌及/或細胞內HBV mRNA及/或HBV DNA減少。 104. 如實施例102或103之方法、核酸分子或用途，其中相比於無任何治療情況下之水準，HBsAg降低了至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%。 105. 如實施例99至104之方法、反義寡核苷酸或用途，其中該個體為哺乳動物。 106. 如實施例105之方法、反義寡核苷酸或用途，其中該哺乳動物為人類。
實例 該等實例說明本發明。
材料及方法 寡核苷酸基元序列及寡核苷酸化合物 表4：靶向人類及小鼠轉錄物之寡核苷酸基元序列之清單 藉由SEQ ID NO、基元序列以及該等基元序列在人類PAPD5轉錄物(SEQ ID NO: 1)及人類PAPD7轉錄物(SEQ ID NO: 2)上所靶向之位置指示序列。
Figure 107136344-A0304-0006
 基元序列表示寡核苷酸中存在的核鹼基之連續序列。 表5：寡核苷酸設計及特定反義寡核苷酸化合物之清單 藉由CMP ID NO且基於表4中之基元序列指示化合物。
Figure 107136344-A0304-0007
 設計係指間隔體設計F-G-F'。在典型間隔體設計(例如3-10-3)中，側接區域(F及F')中之所有核苷酸由相同的2'-糖經修飾核苷(例如LNA、cET或MOE)構成，且中間的一段DNA形成間隔(G)。在具有交替側接區域設計之間隔體中，寡核苷酸之側接區域標註為一系列整數，其表示2'糖經修飾核苷之數目(M)，接著為DNA核苷之數目(D)。舉例而言，具有2-2-1基元之側接區域表示5' [M]2 -[D]2 -[M] 3'，且1-1-1-1-1基元表示5' [M]-[D]-[M]-[D]-[M] 3'。兩個側接區域在5'及3'末端處具有2'糖經修飾核苷。由多個(通常5至16個) DNA核苷構成之間隔區域(G)位於側接區域之間。 表中之標題「寡核苷酸化合物」表示基元序列之特定設計。大小字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母表示DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，且5-甲基胞嘧啶DNA由「e」表示，所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 表6：靶向人類及食蟹獼猴之寡核苷酸基元序列之清單 藉由SEQ ID NO、基元序列(核鹼基序列)以及該等基元序列在人類PAPD5轉錄物(SEQ ID NO: 1)及人類PAPD7轉錄物(SEQ ID NO: 2)上所靶向之位置指示序列。
Figure 107136344-A0304-0008
 基元序列表示寡核苷酸中存在的核鹼基之連續序列。 表7：寡核苷酸設計及特定反義寡核苷酸化合物之清單 藉由CMP ID NO且基於表6中之基元序列指示化合物。
Figure 107136344-A0304-0009
Figure 107136344-A0304-0010
Figure 107136344-A0304-0011
Figure 107136344-A0304-0012
Figure 107136344-A0304-0013
Figure 107136344-A0304-0014
Figure 107136344-A0304-0015
Figure 107136344-A0304-0016
 設計係指間隔體設計F-G-F'。在典型間隔體設計(例如3-10-3)中，側接區域(F及F')中之所有核苷酸由相同的2'-糖經修飾核苷(例如LNA、cET或MOE)構成，且中間的一段DNA形成間隔(G)。在具有交替側接區域設計之間隔體中，寡核苷酸之側接區域標註為一系列整數，其表示2'糖經修飾核苷之數目(M)，接著為DNA核苷之數目(D)。舉例而言，具有2-2-1基元之側接區域表示5' [M]2 -[D]2 -[M] 3'，且1-1-1-1-1基元表示5' [M]-[D]-[M]-[D]-[M] 3'。兩個側接區域在5'及3'末端處具有2'糖經修飾核苷。由多個(通常5至16個) DNA核苷構成之間隔區域(G)位於側接區域之間。 表中之標題「寡核苷酸化合物」表示基元序列之特定設計。大小字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母表示DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，且5-甲基胞嘧啶DNA由「e」表示，所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 表8：立體限定變體之清單. 藉由序列基元及設計指示母體寡核苷酸化合物。母體化合物之核苷間鍵聯之立體限定基元示於序列及設計下方，且反映完全立體無規的硫代磷酸酯間隔體。母體之立體限定變體藉由母體化合物下方之CMP ID NO及立體限定基元列出。該表含有三種母體化合物，CMP ID NO: 18_1、18_347及18_12。
Figure 107136344-A0304-0017
Figure 107136344-A0304-0018
Figure 107136344-A0304-0019
Figure 107136344-A0304-0020
 關於母體寡核苷酸化合物：大小字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母表示DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 關於立體限定/立體限定基元：X表示立體無規硫代磷酸酯核苷間鍵聯，R表示如描述中所定義的一種立體異構形式，且S表示另一立體異構形式，H表示寡核苷酸之3'末端處的氫原子。立體限定基元中之第一個字母(X、R或S)對應於自寡核苷酸之5'端起核苷1與核苷2之間的核苷間鍵聯。 表9：寡核苷酸基元序列及具有5' ca生物可裂解連接子之反義化合物.
Figure 107136344-A0304-0021
 C6表示具有6個碳原子之胺基烷基，大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母表示DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，下標o表示磷酸二酯核苷間鍵聯，且除非另外指明，否則其他核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 表10：GalNAc結合之反義寡核苷酸化合物.
Figure 107136344-A0304-0022
 GN2表示圖2中所示的三價GalNAc簇，C6表示具有6個碳原子之胺基烷基，大小字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母表示DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，下標o表示磷酸二酯核苷鍵聯，且除非另外指明，否則核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。表示該等分子中之一些的化學圖式展示於圖4至圖17中。
AAV/HBV小鼠模型 在AAV/HBV小鼠模型中，小鼠感染攜載HBV基因組(AAV/HBV)之重組腺相關病毒(AAV)，維持穩定的病毒血症及抗原血症超過30週(Dan Yang等人 2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71-78)。
自SLAC (中國科學院之上海實驗動物中心)購買無特異性病原體之雄性C57BL/6小鼠(4至6週齡)，且將其圈養於獨立通氣籠具中之動物護理設施中。遵循如由WuXi IACUC (機構動物護理及使用委員會，WUXI IACUC方案編號R20131126-小鼠)指示之指導原則來護理及使用動物。使小鼠適應新環境3天，且根據實驗設計進行分組。
在PBS中稀釋重組AAV-HBV，每次注射200 µL。此重組病毒攜載HBV基因組(基因型D，血清型ayw)之1.3個複本。
第0天，所有小鼠經由尾部靜脈注入200 µL AAV-HBV (1×1011 個載體基因組)。給藥前第23天(AAV-HBV注射後23天)，基於HBV標記物之血清含量及體重將動物分組。將各組圈養在具有玉米芯草墊之聚碳酸酯籠具中(每個籠具至多5隻動物)。分散較低、中等及較高HBV效價值，確保各組之間的組平均值類似。可用寡核苷酸處理各動物組，該等寡核苷酸可未結合或經GalNAc結合。在藉由異氟醚吸入麻醉動物之後，藉由後眼眶放血進行所有血清採集(0.1 ml血液/小鼠)。
HeLa細胞株 自European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC，編號93021013)購買HeLa細胞株，且如供應商所建議保存在37℃、5% CO2 下之含濕氣培育箱中。對於分析，將2,500個細胞/孔接種在96多孔培養盤中，接種在具有10%胎牛血清(FBS)、2 mM麩醯胺酸水溶液、1% NEAA、25 µg/ml慶大黴素之伊格爾氏最低必需培養基(Eagle's Minimum Essential Medium) (Sigma，M2279)中。
分化HepaRG細胞培養(無HBV感染) 在37℃下，於具有5% CO2 之加濕氛圍中，在由William氏E培養基(Sigma W4128)、生長培養基補充劑(Biopredics，目錄號ADD710)及1% (v/v) GlutaMAX-I (Gibco，編號32551)組成之完全HepaRG生長培養基中，培養HepaRG細胞(Biopredics International, Rennes, France, 目錄號HPR101)2週。
為了起始分化，使細胞在完全HepaRG生長培養基中生長2週，直至該等細胞完全融合。將一半培養基更換為由William氏E培養基(Sigma W4128)、生長培養基補充劑(Biopredics，目錄號ADD720)及1% (v/v) GlutaMAX-I (Gibco，編號32551)組成之HepaRG分化培養基，DMSO之最終濃度為0.9% (v/v)。3天後，將全部培養基替換為完全分化培養基(DMSO之最終濃度為1.8% (v/v))，細胞在完全分化培養基中維持大約2週，每7天更新分化培養基。分化後的HepaRG細胞(dHepaRG)呈現為由單層類膽細胞包圍的類肝細胞島。在化合物處理之前，將dHepaRG細胞以80,000個細胞/孔接種至經膠原蛋白I塗佈之96孔培養盤(Corning BioCoat REF354407)中，接種在100 µL完全分化培養基中。在接種之後，寡核苷酸處理之前，使細胞在96孔培養盤中恢復其分化表現型，持續大約1週。處理後6天分離RNA。
感染HBV之dHepaRG細胞 在37℃下，於具有5% CO2之加濕氛圍中，在由William氏E培養基(GIBCO)、生長培養基補充劑(Biopredics，目錄號ADD711C)及1% (v/v) GlutaMAX-I (Gibco，編號32551)及1×青黴素/鏈黴素(Gibco，編號15140)組成之完全HepaRG生長培養基中，培養HepaRG細胞(Biopredics International, Rennes, France, 目錄號HPR101) 2週。
為了起始分化，向融合細胞上之生長培養基中添加0.9% (v/v) DMSO (Sigma-Aldrich，D2650)。一週後，將培養基替換為完全分化培養基(補充有1.8% (v/v) DMSO之HepaRG生長培養基)，細胞在完全分化培養基中維持大約4週，每7天更新分化培養基。分化後的HepaRG細胞(dHepaRG)呈現為由單層類膽細胞包圍的類肝細胞島。
在HBV感染及化合物處理之前，將dHepaRG細胞以60,000個細胞/孔接種至經膠原蛋白I塗佈之96孔培養盤(Gibco，目錄號A11428-03)中，接種在100 µL完全分化培養基中。在接種之後，HBV感染之前，使細胞在96孔培養盤中恢復其分化表現型，持續大約1週。
用MOI 30之HBV粒子感染dHepaRG細胞。HBV粒子由產生HBV之HepG2.2.15細胞產生(Sells等人 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 1005-1009)。先前已描述dHepaRG培養條件、分化及HBV感染(Hantz, 2009, J. Gen. Virol., 2009, 90: 127-135)。簡言之，添加含有4% PEG-8000及病毒原液(20至30 GE/細胞)之完全分化培養基(HepaRG生長培養基由William氏E培養基(GIBCO)、生長培養基補充劑(Biopredics，目錄號ADD711C)及1% (v/v) GlutaMAX-I (Gibco，編號32551)及1×青黴素/鏈黴素(Gibco，編號15140)組成，其補充有1.8% (v/v) DMSO) (120 μL/孔)。感染後一天，將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌四次，且在實驗期間的第4天及第7天更換培養基(完全分化培養基)。
感染HBV之ASGPR-dHepaRG 使用慢病毒方法自HepaRG細胞株(Biopredics International, Rennes, France, 目錄號HPR101)產生穩定過度表現人類ASGPR1及ASGPR2之細胞株。在CMV啟動子及耐嘌呤黴素基因之控制下，用藉由Sirion生物技術(CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro)按需要產生之慢病毒以MOI 300轉導編碼人類ASGPR1及2之增殖HepaRG細胞。經11天，選擇具有1 µg/ml嘌呤黴素之經轉導細胞，且隨後將其維持在相同濃度之抗生素中，以確保轉基因之穩定表現。藉由RT-qPCR在mRNA層級(ASGPR1：未經轉導之8560倍，ASGPR2：未經轉導之2389倍)且藉由流式細胞量測術分析在蛋白質層級確認ASGPR1/2過度表現。分化細胞被稱為ASGPR-dHepaRG細胞。
在感染前，使用1.8% DMSO使ASGPR-HepaRG細胞分化至少2週。如同上文所描述之dHepaRG細胞一般進行HBV感染。
原代小鼠肝細胞(PMH) 在根據文獻(Berry及Friend, 1969, J. Cell Biol；Paterna等人, 1998, Toxicol.Appl. Pharmacol.)之2步灌注方案後，自用戊巴比妥(Pentobarbital)麻醉之C57BL/6J小鼠之肝臟分離原代小鼠肝細胞。第一步為用HBSS + 15 mM HEPES + 0.4 mM EGTA灌注5 min，接著為用HBSS+20 mM NaHCO3 +0.04% BSA (Sigma，編號A7979) +4 mM CaCL2 (Sigma，編號21115)+0.2 mg/ml 2型膠原蛋白酶(Worthington，編號4176)灌注12 min。在冰上之5 ml冷William氏培養基E (WME) (Sigma，編號W1878，補充有1×青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸、10% (v/v) FBS (ATCC，編號30-2030))中捕獲肝細胞。
粗製細胞懸浮液經由70 µm細胞過濾器接著經由40 µm細胞過濾器(Falcon，編號352350及編號352340)過濾，填充WME直至25 ml，且在室溫下以50× g離心5 min以使肝細胞成離心塊。移除上清液且將肝細胞再懸浮於25 ml WME中。在添加25 ml 90% Percoll溶液(Sigma，編號P4937；pH=8.5-9.5)且在25℃下、以50× g離心10 min之後，移除上清液及浮置細胞。為了移除剩餘的Percoll，再次將離心塊再懸浮於50 mL WME培養基中，在25℃下以50× g離心3 min，且棄去上清液。將細胞離心塊再懸浮於20 mL WME中，測定細胞數目及生存力(Invitrogen，Cellcount)且將其稀釋至250,000個細胞/毫升。將25,000個細胞/孔接種在經膠原蛋白塗佈之96孔培養盤(PD Biocoat Collagen I，編號356407)上，且在37℃、5% CO2 下進行培育。3至4 h之後，用WME洗滌細胞以移除未附著之細胞，且更換培養基。接種後24 h，添加所要濃度之寡核苷酸，且在37℃、5% CO2 下培育細胞72小時。在使用TaqMan分析對標靶基因(PAPD5：Mm01244121_m1 FAM-MGB，PAPD7：Mm01349513_m1 FAM-MGB)及管家基因(GusB Mm_01197698_m1，VIC-MGB)進行一步RT-QPCR (Quanta Bioscience，qScript XLT 1步RT-qPCR ToughMix)之後，根據製造商之方案進行RNA分離(Qiagen，RNeasy 96)。
原代人類肝細胞(PHH)天然感染分析 藉由膠原蛋白酶灌注方法自具有人類化肝臟之嵌合uPA/SCID小鼠分離的原代人類肝細胞(PHH)係獲自PhoenixBio (Hiroshima，Japan)。將細胞以7× 104個細胞/孔之濃度接種在經I型膠原蛋白塗佈之96孔培養盤上，接種於Phoenix Bio所提供之培養基中(其他細節參見Ishida等人 2015 Am J Pathol. 第185卷第1275-1285頁)。HBV基因型D衍生自HepG2.2.15細胞培養物上清液，且使用PEG沈澱進行濃縮。在37℃下，在含有4% PEG 8000之PHH培養基中以MOI 10感染PHH 20 h，之後用PBS洗滌細胞4次。感染後第1天，在最終體積125 µl之PHH培養基中將寡核苷酸遞送至細胞中。感染後第4天及第7天再次處理細胞。感染後第11天，收集上清液及細胞。使用CLIA ELISA分析(參見材料及方法；HBV抗原量測)來評估上清液中之HBsAg及HBeAg水準。使用MagNA Pure自動機及MagNA Pure 96細胞RNA大體積套組(Roche，編號05467535001)，根據製造商之方案自細胞提取mRNA。使用如材料及方法部分中所描述之即時PCR來分析相對PAPD5及PAPD7 mRNA表現水準。
HBV抗原量測 為了評估對HBV抗原表現及分泌之影響，在第11天收集上清液。使用CLIA ELISA套組(Autobio Diagnostic，編號CL0310-2、編號CL0312-2)，根據製造商之方案來量測HBV傳播參數HBsAg及HBeAg水準。簡言之，將每孔25 µL上清液轉移至各別抗體塗佈之微量滴定盤中，且添加25 µL酶結合試劑。將培養盤在室溫下於振盪器上培育60 min，之後使用自動洗滌器用洗滌緩衝液將各孔洗滌五次。向各孔中添加25 µL受質A及B。將培養盤在室溫下於振盪器上培育10 min，之後使用Envision螢光讀取器(Perkin Elmer)來量測螢光。
來自感染HBV之細胞的細胞內HBV mRNA之即時PCR 使用QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems)、TaqMan RNA至CT 1步套組(Applied Biosystems，編號4392938)、人類ACTB內源性對照物(Applied Biosystems，編號4310881E)，藉由qPCR以技術重複方式量化HBV mRNA。Taqman試劑與以下市售ThermoFisher Sceintific引子(HBV Pa03453406_s1，ACTB 4310881E)一起使用。使用相對於參考基因ACTB且相對於經PBS處理之細胞正規化的比較循環臨限值2-ΔΔCt方法來分析mRNA表現。
PAPD5及PAPD7 mRNA表現之即時PCR 對自經處理細胞或均質化組織樣品提取之RNA進行QPCR。在RNA/LNA雙螺旋體變性(90℃，40秒)之後，用以下TaqMan引子分析(ThermoFisher Scientific)，在雙螺旋體設置中根據一步方案(qScript™ XLT一步RT-qPCR ToughMix®，來自Quanta Bioscience之Low ROX™，編號95134-500)進行即時PCR： PAPD5 (Hs00223727_m1，FAM-MGB) PAPD7 (Hs00173159_m1，FAM-MGB)， 遵循提供者建議之管家基因GUSB (Hu_4326320E，VIC-MGB)。
HBV DNA量化病毒粒子效價 使用QIAamp UltraSens病毒套組(Qiagen，編號53704)，根據製造商之方案進行HBV DNA提取，其最佳化如下。在添加緩衝液AC之前將30 µL及3 µL的病毒樣品稀釋至1 mL PBS中。以全速及4℃進行第一離心步驟，持續45 min。使用QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems)、TaqMan基因表現基本混合物(Applied Biosystems，編號4369016)以及上文表9中指示之引子與以100 µM復原之探針的1:1:0.5預混合物，藉由qPCR一式兩份地量化HBV DNA。使用以下設置進行qPCR：UDG培育(2 min，50℃)、酶活化(10 min，95℃)及qPCR (15秒40次循環，95℃：變性且1 min，60℃：黏接及擴展)。基因組當量計算係基於由具有已知濃度的HBV基因型D質體稀釋液產生的標準曲線。
可針對自經處理細胞分離的細胞內mRNA，在QPCR中使用HBV核心特異性引子(Integrated DNA Technologies) (表11)來測定HBV粒子效價。 表11：HBV核心特異性TaqMan探針
Figure 107136344-A0304-0023
 ZEN為內部抑止劑
寡核苷酸合成 寡核苷酸合成在此項技術中總體上已知。下方係可應用之方案。本發明之寡核苷酸可已藉由在裝置、載體及所用濃度方面略微改變方法而製備。
寡核苷酸使用胺基磷酸酯方法在Oligomaker 48上在尿苷通用載體上以1 μmol等級合成。在合成結束時，在60℃下使用氨水持續5至16小時使寡核苷酸自固體載體裂解。寡核苷酸藉由反相HPLC (RP-HPLC)或固相萃取純化，且藉由UPLC特徵化，且分子量藉由ESI-MS進一步確認。
寡核苷酸之延長 ： 使用0.1 M 5'-O-DMT受保護胺基酸酯於乙腈中之溶液及含DCI (4,5-二氰基咪唑)之乙腈(0.25 M)作為活化劑，進行β-氰基乙基-胺基磷酸酯(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA- C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA- G(dmf)或LNA-T)之偶合。對於最終循環，可使用具有所需修飾之胺基磷酸酯，例如用於連接結合基團之C6連接子或結合基團本身。用於引入硫代磷酸酯鍵聯之硫醇化藉由使用氫化黃原素(xanthane hydride) (0.01 M於9:1之乙腈/吡啶中)進行。磷酸二酯鍵聯可使用0.02 M碘於7:2:1之THF/吡啶/水中來引入。剩餘試劑係通常用於寡核苷酸合成之試劑。
對於後固相合成結合，在固相合成之最終循環中可使用市售C6胺基連接子胺基磷酸酯，且在去除保護基及自固體載體解離之後，胺基鍵聯之去保護寡核苷酸經分離。結合物經由使用標準合成方法活化官能基來引入。
藉由 RP-HPLC 進行 純化 ： 粗製化合物藉由製備型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10µ 150×10 mm管柱上純化。0.1 M pH 8之乙酸銨及乙腈以5 mL/min之流動速率用作緩衝液。將收集之部分凍乾，得到通常呈白色固體狀之經純化化合物。
縮寫 ： DCI： 4,5-二氰基咪唑 DCM： 二氯甲烷 DMF： 二甲基甲醯胺 DMT： 4,4'-二甲氧基三苯甲基 THF： 四氫呋喃 Bz： 苯甲醯基 Ibu： 異丁醯基 RP-HPLC： 反相高效液相層析
Tm 分析： 寡核苷酸及RNA標靶(磷酸酯鍵聯，PO)雙螺旋體在500 ml無RNase之水中稀釋至3 mM，且與500 ml 2× Tm -緩衝液(200 mM NaCl、0.2 mM EDTA、20 mM磷酸鈉，pH 7.0)混合。溶液加熱至95℃後保持3 min，且隨後使其在室溫下退火30 min。雙螺旋體熔融溫度(Tm )在配備有帕爾貼(Peltier)溫度程式設計器PTP6之Lambda 40 UV/VIS分光光度計上使用PE Templab軟體(Perkin Elmer)量測。溫度自20℃逐漸上升至95℃且隨後降至25℃，在260 nm下記錄吸光值。熔融及退火兩者之一階導數及局部最大值用以分析雙螺旋體Tm 。
實例1：靶向HeLa細胞中之PAPD5及PAPD7 (雙特異性)之反義寡核苷酸之活體外功效的篩檢 使用靶向SEQ ID NO: 17、18及19之16至18聚體間隔體來進行寡核苷酸篩檢。在表現PAPD5及PAPD7兩者之HeLa細胞中之活體外實驗中進行功效測試。
如材料及方法部分中所描述培養HeLa細胞。細胞培育24小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。寡核苷酸之最終濃度為5 µM及25 µM，最終培養物體積為100 µl/孔。添加寡核苷酸化合物後3天收集細胞，且使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)根據製造商之說明提取RNA。
藉由如材料及方法部分中所描述之即時PCR分析PAPD5及PAPD7 mRNA水準。
相對PAPD5 mRNA及PAPD7 mRNA表現水準以平均對照樣品(經PBS處理之細胞)之百分比形式展示於表12中，亦即，值越小，抑制越大。 表12：抗PAPD5/PAPD7化合物之活體外功效(藉由雙螺旋體QPCR進行單次實驗)。PAPD5及PAPD7 mRNA水準相對於HeLa細胞中之GUSB正規化，且以對照物(經PBS處理之細胞)之百分比形式展示。
Figure 107136344-A0304-0024
實例2：於感染HBV之HepaRG細胞中之活體外EC50及功效. 在感染HBV之dHepaRG細胞中測試實例1之所有寡核苷酸對HBV傳播參數之影響。
出於比較目的，將本發明之反義寡核苷酸與直接靶向HBV mRNA之反義寡核苷酸進行比較。靶向HBV之寡核苷酸展示於表13中。 表13：靶向HBV之對比寡核苷酸
Figure 107136344-A0304-0025
在96孔培養盤中培養感染HBV之dHepaRG細胞(描述於材料及方法部分中的感染HBV之dHepaRG細胞中)。HBV感染後一天，使用無助力吸取(gymnosis)，將寡核苷酸以三倍連續稀釋液(20.00、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08、0.03、0.01 µM寡核苷酸)添加至細胞中。總共測試49種寡核苷酸。實驗重複進行三次，PBS為對照物。在第4天及第7天重複寡核苷酸處理。
感染後第11天，收集上清液及細胞。
使用CLIA ELISA分析(參見材料及方法，HBV抗原量測)來評估上清液中之HBsAg及HBeAg水準。
使用來自drc套裝程式(v3.0-1)之R函數drm()來計算HBV傳播參數HBsAg及HBeAg之EC 50、最大KD (功效)，使四位參數的log-logistic函數與隨寡核苷酸濃度變化之相關基因表現擬合，以獲得EC50及最大基因表現阻斷之值。結果展示於表14中且為平均對照樣品之百分比(PBS對照物及非感染物(NIF)，計算如下[(測試值 - 平均PBS)/(平均NIF - 平均PBS)]*100))。 表14：抗PAPD5/PAPD7化合物針對感染HBV之dHepaRG細胞中之HBsAg及HBeAg的EC50及最大KD (3次之平均值).
Figure 107136344-A0304-0026
根據此等資料可看出，大部分化合物對HBsAg及HBeAg具有良好影響。具有寡核苷酸基元SEQ ID NO 17及18之化合物看起來比用基元SEQ ID NO: 19製備之化合物更高效。
在圖3中，亦可看出，對於使HeLa細胞中之PAPD5及PAPD7降低超過70%的寡核苷酸而言，與此等寡核苷酸降低感染HBV之dHepaRG細胞中之HBsAg的能力高度相關。
實例3：靶向HeLa細胞中之PAPD5及PAPD7之反義寡核苷酸之活體外功效的篩檢 產生具有298種寡核苷酸之另一庫，其使用不同設計擴展寡核苷酸基元SEQ ID NO: 17、18及19之多樣性。在如實例1中所描述之活體外實驗中進行功效測試，不同的係僅以5 µM進行篩檢。
相對PAPD5 mRNA及PAPD7 mRNA表現水準以平均對照樣品(經PBS處理之細胞)之百分比形式展示於表15中，亦即，值越小，抑制越大。 表15：抗PAPD5/PAPD7化合物之活體外功效(藉由雙螺旋體QPCR進行單次實驗)。PAPD5及PAPD7 mRNA水準相對於HeLa細胞中之GUSB正規化，且以對照物(經PBS處理之細胞)之百分比形式展示。
Figure 107136344-A0304-0027
根據此等資料可看出，基於基元序列SEQ ID NO: 19之LNA間隔體設計具有極低(0至10%)的PAPD5及PAPD7基因表現阻斷。
實例4：所選擇反義寡核苷酸在HeLa細胞中之活體外EC50及功效. 用以下寡核苷酸濃度50、15.81、5.00、1.58、0.50、0.16、0.05及0.016 µM，使用相同分析測定實例1及實例3中表現最佳的寡核苷酸之EC50及功效(KD)。
使用來自drc套裝程式(v3.0-1)之R函數drm()來計算PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC 50、最大KD (功效)，使四位參數的log-logistic函數與隨寡核苷酸濃度變化之相關基因表現擬合，以獲得EC50及最大基因表現阻斷之值。結果展示於表16中。 表16：抗PAPD5/PAPD7化合物針對HeLa細胞中之PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC50及最大KD.
Figure 107136344-A0304-0028
實例5：使用靶向PAPD5及PAPD7之所選擇反義寡核苷酸對感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞之活體外效應. 基本上使用具有以下改變的實例2之分析，在ASGPR-dHepaRG中對在實例3中篩檢的一系列寡核苷酸進行篩檢。在感染HBV之ASGPR-dHepaRG中，用以下寡核苷酸濃度20、6.67及2.22 µM及表17中之對比分子進行篩檢。
出於比較目的，將表17中PAPD5單靶向寡核苷酸及PAPD7單靶向寡核苷酸之組合與本發明之寡核苷酸一起測試。 表17：PAPD5及PAPD7單靶向寡核苷酸之組合
Figure 107136344-A0304-0029
HBsAg及HBeAg水準之降低展示於表18及表19中，值越大，抑制越大。 表18：三種濃度的抗PAPD5/PAPD7化合物在感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中對HBsAg之活體外功效(3次之平均值).
Figure 107136344-A0304-0030
 表19：三種濃度的抗PAPD5/PAPD7化合物在感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中對HBeAg之活體外功效(3次之平均值).
Figure 107136344-A0304-0031
根據此等資料可看出，與組合處理(2×20 µM)相比，表現最佳的雙特異性PAPD5/PAPD7寡核苷酸在具有一半寡核苷酸濃度時就HBsAg及HBeAg降低而言具有更佳效應。
實例6靶向HeLa細胞中之PAPD5及PAPD7之立體限定反義寡核苷酸之活體外功效的篩檢 為了甚至進一步擴展關於基元序列SEQ ID NO: 18之多樣性，基於具有CMP ID NO 18_1之立體無規母體化合物產生立體限定寡核苷酸庫。
在如實例1中所描述之活體外實驗中進行功效測試，不同的係以1 µM且一些以5 µM進行篩檢。
相對PAPD5 mRNA及PAPD7 mRNA表現水準以母體寡核苷酸之百分比形式展示於表20中，亦即，值越大，抑制越佳。 表20：立體限定的抗PAPD5/PAPD7化合物之活體外功效(藉由雙螺旋體QPCR進行單次實驗)。PAPD5及PAPD7 mRNA水準相對於HeLa細胞中之GUSB正規化，且以對照物(經PBS處理之細胞)之百分比形式展示。
Figure 107136344-A0304-0032
實例7：所選擇的立體限定反義寡核苷酸在HeLa細胞中之活體外EC50及功效. 用以下寡核苷酸濃度33、10.44、3.33、1.044、0.33、0.104、0.033及0.01 µM，使用相同分析測定實例6中表現最佳的寡核苷酸之EC50及功效(KD)。
使用來自drc套裝程式(v3.0-1)之R函數drm()來計算PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC 50、最大KD (功效)，使四位參數的log-logistic函數與隨寡核苷酸濃度變化之相關基因表現擬合，以獲得EC50及最大基因表現阻斷之值。結果展示於表21中。 表21：抗PAPD5/PAPD7化合物針對HeLa細胞中之PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC50及最大KD.CMP ID NO 18_1為立體無規母體化合物。
Figure 107136344-A0304-0033
根據此等資料可看出，立體限定子庫及完全立體限定化合物兩者均可達成關於PAPD5及PAPD7基因表現阻斷之EC50及功效之改良。
實例8：使用靶向PAPD5及PAPD7之所選擇立體限定反義寡核苷酸對感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞之活體外效應. 在感染HBV之dHepaRG-ASGPR細胞中，測試實例6中之一系列最有效寡核苷酸對HBV傳播參數之影響。
如實例5中所描述進行實驗。
HBsAg及HBeAg水準之降低展示於表22及表23中，值越大，抑制越大。 表22：三種濃度的抗PAPD5/PAPD7化合物在感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中對HBsAg之活體外功效(3次之平均值)。CMP ID NO 18_1為立體無規母體化合物。
Figure 107136344-A0304-0034
 表23：三種濃度的抗PAPD5/PAPD7化合物在感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中對HBeAg之活體外功效(3次之平均值)。CMP ID NO 18_1為立體無規母體化合物。
Figure 107136344-A0304-0035
實例9：使用靶向PAPD5及PAPD7之所選擇的GalNAc結合之反義寡核苷酸對感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞之活體外效應. 將實例1中之一系列最有效寡核苷酸與GalNAc結合部分結合，且在感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中測試其對HBV傳播參數之影響。
如實例2中所描述，使用感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞且在無對比寡核苷酸的情況下，評估GalNAc結合之寡核苷酸對HBsAg及HBeAg之EC50及功效(KD)。結果展示於表24中。
除實例2中之步驟以外，將所收集之細胞在PBS中洗滌一次，且在MagNA Pure溶解緩衝液(Roche，編號05467535001)中裂解，並且儲存在-80℃下。使用MagNA Pure 「96細胞RNA大體積套組」(Roche，編號05467535001)提取RNA，且如材料及方法部分中的PAPD5及PAPD7之即時PCR中所描述測定PAPD5及PAPD7 mRNA表現水準。使用來自drc套裝程式(v3.0-1)之R函數drm()計算EC50及功效(KD)，使四位參數的log-logistic函數與隨寡核苷酸濃度變化的相關基因表現擬合，以獲得EC50及最大基因表現阻斷之值。結果展示於表24A中。 表24：抗PAPD5/PAPD7化合物針對感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中之HBsAg及HBeAg之EC50及最大KD (3次之平均值)。
Figure 107136344-A0304-0036
根據此等資料可看出，藉由將GalNAc部分結合至寡核苷酸，EC50值改良至少40倍(應注意，本表以nM為單位，而表14以µM為單位)。舉例而言，與化合物18_05 (20_15之裸型式)相比，化合物20_15 (與GalNAc結合)之HBsAg降低改良176倍。 表24A：GalNAc結合之抗PAPD5/PAPD7化合物之活體外功效及效力(EC50)。PAPD5及PAPD7 mRNA水準相對於ASGPR-dHepaRG細胞中之GUSB正規化，且以對照物(經PBS處理之細胞)之百分比形式展示。
Figure 107136344-A0304-0037
根據此等資料可看出，大部分所選擇的靶向PAPD5及PAPD7的GalNAc結合之寡核苷酸能夠使mRNA水準降低至低於10%。
實例10：靶向dHepaRG細胞中之PAPD5及PAPD7之反義寡核苷酸之活體外功效的篩檢. 在dHepaRG細胞中對在HeLa細胞(實例1及實例3)中針對PAPD5及PAPD7基因表現阻斷篩檢的寡核苷酸進行篩檢，以證實在肝臟細胞株中之有效基因表現阻斷。
如材料及方法部分中所描述培養dHepaRG細胞。將以下寡核苷酸濃度50、15.81、5.00、1.58、0.50、0.16、0.05及0.016 µM用於最終培養物體積100 µl/孔中。添加寡核苷酸化合物後6天收集細胞，且使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)根據製造商之說明提取RNA。
藉由如材料及方法部分中所描述之即時PCR分析PAPD5及PAPD7 mRNA水準。使用來自drc套裝程式(v3.0-1)之R函數drm()來計算PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC 50、最大KD (功效)，使四位參數的log-logistic函數與隨寡核苷酸濃度變化之相關基因表現擬合，以獲得EC50及最大基因表現阻斷之值。
結果展示於表25中。 表25：抗PAPD5/PAPD7化合物針對dHepaRG細胞中之PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC50及最大KD.
Figure 107136344-A0304-0038
根據此等數據可看出，在肝細胞衍生之細胞株中亦可達成有效的標靶降低。
實例11：靶向dHepaRG細胞中之PAPD5及PAPD7之立體限定反義寡核苷酸之活體外功效的篩檢. 在dHepaRG細胞中對在HeLa細胞(實例7)中針對PAPD5及PAPD7基因表現阻斷篩檢的立體限定寡核苷酸進行篩檢，以證實在肝臟細胞株中之有效基因表現阻斷。
用以下寡核苷酸濃度33、10.44、3.33、1.044、0.33、0.104、0.033及0.01 µM，如實例10中所描述進行篩檢。
藉由如材料及方法部分中所描述之即時PCR分析PAPD5及PAPD7 mRNA水準。使用來自drc套裝程式(v3.0-1)之R函數drm()來計算PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC 50、最大KD (功效)，使四位參數的log-logistic函數與隨寡核苷酸濃度變化之相關基因表現擬合，以獲得EC50及最大基因表現阻斷之值。
結果展示於表26中。 表26抗PAPD5/PAPD7立體限定化合物針對dHepaRG細胞中之PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC50及最大KD
Figure 107136344-A0304-0039
根據此等數據可看出，立體限定寡核苷酸在肝細胞衍生之細胞株中亦有效降低標靶。
實例12：使用靶向PAPD5及PAPD7之所選擇的GalNAc結合之反義寡核苷酸對感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞之活體外效應. 將實例5中之一系列最有效寡核苷酸與GalNAc結合部分結合，且在感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中測試其對HBV傳播參數之影響。
出於比較目的，將本發明之反義寡核苷酸與表13中所展示的靶向HBV之寡核苷酸之GalNAc結合型式進行比較，該等GalNAc結合型式展示於表13A中。 表13A：靶向HBV之對比寡核苷酸
Figure 107136344-A0304-0040
使用感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞，如實例2中所描述評估GalNAc結合之寡核苷酸對HBsAg及HBeAg之EC50及功效(KD)。結果展示於表27中。
除實例2中之步驟以外，將所收集之細胞在PBS中洗滌一次，且在MagNA Pure溶解緩衝液(Roche，編號05467535001)中裂解，並且儲存在-80℃下。使用MagNA Pure 「96細胞RNA大體積套組」(Roche，編號05467535001)提取RNA，且如材料及方法部分中的PAPD5及PAPD7之即時PCR中所描述測定PAPD5及PAPD7 mRNA表現水準。使用來自drc套裝程式(v3.0-1)之R函數drm()計算EC50及功效(KD)，使四位參數的log-logistic函數與隨寡核苷酸濃度變化的相關基因表現擬合，以獲得EC50及最大基因表現阻斷之值。結果展示於表27A中。 表27：抗PAPD5/PAPD7化合物針對感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中之HBsAg及HBeAg之EC50及最大KD (3次之平均值)。
Figure 107136344-A0304-0041
表中所指示之化合物在C6連接子之後的ca二核苷酸中具有磷酸二酯鍵聯，如在表10中所指示。 表27A：GalNAc結合之抗PAPD5/PAPD7化合物之活體外功效及效力(EC50)。PAPD5及PAPD7 mRNA水準相對於ASGPR-dHepaRG細胞中之GUSB正規化，且以對照物(經PBS處理之細胞)之百分比形式展示。
Figure 107136344-A0304-0042
 Inf = 由於缺少劑量反應而無法計算EC50。
如所預期，兩種靶向HBV之分子對PAPD5及PAPD7之效應極不明顯，因此其HBsAg及HBeAg效應與其降低PAPD5或PAPD7之能力無關。其餘所測試化合物展示出低於85%之標靶降低及低於0.09 µM之EC50值，其與表27中所看到的對HBsAg及HBeAg之效應緊密相關。
實例13：使用靶向PAPD5及PAPD7之所選擇的GalNAc結合之反義寡核苷酸對感染HBV之PHH細胞之活體外效應. 在感染HBV之原代人類肝細胞中進一步測試一系列GalNAc結合之寡核苷酸(參見材料及方法部分；PHH天然感染分析)，以說明在具有天然ASGPR表現之活體外系統中之功效。所用的寡核苷酸濃度為三倍連續稀釋液(20.00、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08、0.03、0.01 µM寡核苷酸)。
使用來自drc套裝程式(v3.0-1)之R函數drm()來計算HBV傳播參數HBsAg及HBeAg之EC 50、最大KD (功效)，使四位參數的log-logistic函數與隨寡核苷酸濃度變化之相關基因表現擬合，以獲得EC50值及最大降低。結果展示於表28中。
使用相同演算法來計算PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC 50、最大KD (功效)。結果展示於表28A中。 表28：抗PAPD5/PAPD7化合物針對感染HBV之PHH細胞中之HBsAg及HBeAg之EC50及最大KD (3次之平均值)。
Figure 107136344-A0304-0043
表中所指示之化合物在C6連接子之後的ca二核苷酸中具有磷酸二酯鍵聯，如在表10中所指示。
根據此等資料可看出，所選擇的靶向PAPD5及PAPD7的GalNAc結合之寡核苷酸能夠降低受感染原代人類肝細胞中之HBV抗原分泌。 表28A：GalNAc結合之抗PAPD5/PAPD7化合物之活體外功效及效力(EC50)。PAPD5及PAPD7 mRNA水準相對於PPH細胞中之GUSB正規化，且以對照物(經PBS處理之細胞)之百分比形式展示。
Figure 107136344-A0304-0044
 NA = 由於技術誤差而未評估
根據此等資料可看出，所選擇的靶向PAPD5及PAPD7的GalNAc結合之寡核苷酸能夠使其標靶降低至11%或更低，化合物20_17除外，其展現為對PAPD5 mRNA具有極少效應，然而維持對PAPD7 mRNA之效應。
實例14 靶向HeLa細胞及PMH細胞中之人類及小鼠PAPD5及PAPD7 (雙特異性)之反義寡核苷酸之活體外功效的篩檢. 使用靶向人類HeLa細胞株及原代小鼠肝細胞(PMH)中之人類及小鼠PAPD5及PAPD7轉錄物的間隔體寡核苷酸(表5)進行寡核苷酸篩檢。
用25 µM之濃度，如實例1中所描述在HeLa細胞中進行篩檢。
使用5 µM寡核苷酸，如「材料及方法」部分中的「原代小鼠肝細胞」中所描述在PMH細胞中進行篩檢。
圖11展示篩檢結果，各圓點表示表5之化合物及其降低PAPD7 mRNA (Y軸)及PAPD5 mRNA (X軸)之能力。在HeLa細胞(人類)中，PAPD5及PAPD7 mRNA降低之間存在良好相關性，而在PMH (小鼠)細胞中，PAPD7 mRNA之降低與PAPD5 mRNA降低相比顯得不是很有效。
對小鼠肝細胞中之PAPD7 mRNA之抑制較小的可能合理解釋為，原代小鼠肝細胞中表現的PAPD7之原代剪接mRNA轉錄物之轉錄起始位點在寡核苷酸之結合位點下游。此觀點未經確定，除非對原代小鼠肝細胞進行全轉錄組鳥槍法測序(RNAseq)。
實例15：使用靶向PAPD5及PAPD7之所選擇的GalNAc結合之反義寡核苷酸對感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞之活體外效應. 將實例2及實例5中之另外一系列寡核苷酸與GalNAc結合部分結合，且在感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中測試其對HBV傳播參數之影響。
使用感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞，如實例2中所描述評估GalNAc結合之寡核苷酸對HBsAg及HBeAg之EC50及功效(KD)。結果展示於表29中。
除實例2中之步驟以外，將所收集之細胞在PBS中洗滌一次，且在MagNA Pure溶解緩衝液(Roche，編號05467535001)中裂解，並且儲存在-80℃下。使用MagNA Pure 「96細胞RNA大體積套組」(Roche，編號05467535001)提取RNA，且如材料及方法部分中的PAPD5及PAPD7之即時PCR中所描述測定PAPD5及PAPD7 mRNA表現水準。使用來自drc套裝程式(v3.0-1)之R函數drm()計算EC50及功效(KD)，使四位參數的log-logistic函數與隨寡核苷酸濃度變化的相關基因表現擬合，以獲得EC50及最大基因表現阻斷之值。結果展示於表29A中。 表29：抗PAPD5/PAPD7化合物針對感染HBV之ASGPR-dHepaRG細胞中之HBsAg及HBeAg之EC50及最大KD (3次之平均值)。
Figure 107136344-A0304-0045
 表29A：GalNAc結合之抗PAPD5/PAPD7化合物之活體外功效及效力(EC50)。PAPD5及PAPD7 mRNA水準相對於ASGPR-dHepaRG細胞中之GUSB正規化，且以對照物(經PBS處理之細胞)之百分比形式展示。
Figure 107136344-A0304-0046
實例16使用所選擇的靶向PAPD5及PAPD7的雙特異性寡核苷酸對來自染色體整合HBV DNA之HBsAg表現的效應
在本實驗中，測試針對PAPD5及PAPD7具有良好效力的一系列GalNAc結合之抗PAPD5/7寡核苷酸是否能夠降低人類肝細胞癌細胞株Hep3B中之HBs抗原及mRNA表現，該細胞株自染色體整合HBV DNA分泌HBs抗原。
自ATCC (ATCC HB-8064)購買Hep3B細胞(Knowles等人 1980.Science 209 第497-499頁)，且在補充有10% FBS之伊格爾氏最低必需培養基(EMEM)中進行培養。將細胞以1.5×105 個細胞/孔之濃度接種在經膠原蛋白塗佈之96孔培養盤上，且在37℃下於具有5% CO2 之加濕氛圍中進行培養。接種細胞後一天，使用以20 µM開始且三倍連續稀釋之濃度(20.00、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08、0.03、0.01 µM寡核苷酸)，向細胞中添加寡核苷酸。在第4天及第7天更換培養基，重複處理。在第11天，收集上清液以供進行HBsAg量測(如材料及方法部分中的HBV抗原量測中所描述進行)，且將細胞用PBS洗滌一次，且向各孔中添加200 μL MagNA Pure溶解緩衝液，並且將培養盤儲存在-80℃下以供進行RNA提取。
使用MagNA Pure自動機及MagNA Pure 96細胞RNA大體積套組(Roche，編號05467535001)，根據製造商之方案自溶解的Hep3B細胞提取細胞內mRNA。使用QuantStudio 12K Flex (Applied Biosystems)、TaqMan RNA至CT 1步驟套組(Applied Biosystems，編號4392938)、人類ACTB內源性對照物(Applied Biosystems，編號4310881E)以及PAPD5及PAPD7 mRNA Taqman引子及試劑(Life Technologies，分析ID Hs00900790_m1 (PAPD5)及Hs00173159_m1 (PAPD7)及自定義分析ID APMFW4G (Small HBs))，藉由獨立RT-qPCR以技術重複方式量化PAPD5及PAPD7 mRNA。使用以下設置進行qPCR：UDG培育(15 min，48℃)、酶活化(10 min，95℃)及qPCR (15秒40次循環，95℃：變性且1 min，60℃：黏接及擴展)。
使用GraphPad Prism 7.02非線擬合來計算HBsAg、HBs mRNA、PAPD5及PAPD7降低之EC 50及最大KD (呈鹽水%形式之最大功效)。結果展示於表30及表31中。 表30：抗PAPD5/PAPD7化合物針對Hep3B細胞中之染色體整合物所表現的染色體整合HBs mRNA及HBsAg之EC50及最大KD (3次生物學重複及2次技術重複之平均值)。
Figure 107136344-A0304-0047
 NA = 不適用 表31：抗PAPD5/PAPD7化合物針對Hep3B細胞中之PAPD5及PAPD7 mRNA表現之EC50及最大KD (3次生物學重複及2次技術重複之平均值)。
Figure 107136344-A0304-0048
根據此等資料可看出，七分之四的所測試寡核苷酸能夠使整合HBs片段之HBsAg及HBs mRNA表現降低至小於鹽水對照物之55%。
實例17 所選擇的靶向PAPD5及PAPD7之雙特異性寡核苷酸在非人類靈長類動物中之效應. 藉由RNA測序量化食蟹獼猴肝臟中PAPD5及PAPD7 mRNA表現之抑制。用鹽水或用每週1、3或10 mg/kg之化合物ID NO 20_12處理動物，每週一次，持續4週(每組6隻動物，在第1、8、15、22及29天共5次給藥)，且將該等動物在第29天(給藥後4週)處死。同時，用鹽水或每週10 mg/kg之化合物ID NO 20_12處理動物，每週一次，同樣持續4週，總共5次給藥，但具有4週恢復期且在第56天(4週給藥+4週恢復)處死。
在放血後20 min內，將肝臟樣本收集在RNA-Later (Qiagen，目錄號76104)中。使用Tissue Lyser II (Qiagen)將大約10 mg組織溶解在800微升Magnapure溶解緩衝液(Roche)中。隨後將350微升溶解物等分試樣轉移至Magnapure 96深孔培養盤中且自動處理。藉由吸收光譜法(Nanodrop，ThermoFischer)量化RNA，且使用具有RNA 6000奈米晶片之Agilent生物分析儀2100 (Agilent，目錄號5067-1511)，藉由微流毛細管陣列電泳控制RNA完整性(根據RNA完整性數目，RIN)。
對於帶條形碼的cDNA庫之建構，使用400 ng 總RNA等分試樣作為TruSeq™多股總RNA套組(lllumina，目錄號20020598)以及Ribo-Zero™ Gold rRNA去除套組(Illumina，目錄號MRZG12324)之輸入。使用Agilent高靈敏度DNA套組(目錄號5067-4627)，藉由電泳估計庫之大小分佈。使用KAPA庫量化qRT-PCR套組(Kapa Biosystems，目錄號KK4824)量化該等庫。將該等庫以等莫耳濃度合併且稀釋至11 pM，之後將其加載至Illumina HiSeq 4000測序儀之流槽上。使用HiSeq PE快速簇套組v2 (lllumina，目錄號PE-402-4002)擴展該等庫。用TruSeq快速SBS套組-HS (Illumina，目錄號FC-402-4001)，使用配對末端讀取(50鹼基對)對攜載經擴增簇之流槽進行測序。使用HiSeq測序控制軟體(HCS)進行即時影像分析及鹼基讀出。使用CASAVA軟體版本1.8產生序列讀取對之FASTQ檔案。
所獲得的最小庫大小為1700萬個讀取對，且最大大小為1.14億個讀取對。每樣品平均存在5000萬個讀取對，且每樣品之中值為4700萬個讀取對。使用GSNAP程式，將各庫之讀取對與RefSeq/NCBI資料庫之食蟹獼猴轉錄物進行比對，以產生基因層級原始計數。將此等資料相對於各別庫大小正規化(用於樣品間比較)，且針對各轉錄物，資料進一步相對於各別轉錄物長度正規化(用於轉錄物間比較)。對於所有樣品，以正規化單位RPKM (轉錄物之每千鹼基之讀數，每百萬映射之讀數)產生轉錄物層級表現。在相應時間點，使經處理動物中之PAPD5及PAPD7之值相對於鹽水處理之動物正規化，結果展示於表32中。 表32：用CMP ID NO 20_12處理的食蟹獼猴肝臟中之PAPD5及PAPD7 mRNA表現。
Figure 107136344-A0304-0049
 *相對於相同時間點之對照動物正規化
相對於各別媒劑對照組，結果顯示，在CMP ID NO 20_12之所有測試劑量水準下，主要組動物及恢復動物中之肝臟中的PAPD5及PAPD7 mRNA均下調。在3及10 mg/kg下，肝臟中PAPD5 mRNA之下調似乎飽和，大約80%。PAPD7 mRNA之下調為劑量相關的，在10 mg/kg下達到66%的mRNA降低。在以每週10 mg/kg給藥之恢復動物中，PAPD5 mRNA之下調為78%。PAPD7 mRNA之下調達到55%。後一數據表明，在最後一次給藥後，肝臟中之PAPD5及PAPD7 mRNA抑制保持至少4週。
實例18 在投與靶向PAPD5及PAPD7之寡核苷酸後對感染HBV之小鼠中之HBsAg及HBeAg之效應 本研究打算證明在降低AAV/HBV小鼠模型中之PAPD5及PAPD7轉錄物時，對HBV傳播參數之活體內效應。
實例14及圖11B顯示，使用單一寡核苷酸靶向小鼠細胞株中之PAPD5及PAPD7兩者具有挑戰性。因此在本研究中，使用表33中所列的兩種寡核苷酸之組合，一種靶向小鼠PAPD5 (CMP ID NO: 22_1)且一種靶向小鼠PAPD7 (CMP ID NO: 22_1)。 表33：靶向小鼠PAPD5 (SEQ ID NO: 5)或小鼠PAPD7 (SEQ ID NO: 6)之寡核苷酸
Figure 107136344-A0304-0050
GN2表示圖2中所示的三價GalNAc簇，C6表示具有6個碳原子之胺基烷基，大小字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母表示DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，下標o表示磷酸二酯核苷鍵聯，且除非另外指明，否則核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
使用材料及方法部分中所描述的AAV/HBV小鼠模型。在第0天，小鼠(每組3隻)經皮下給予單次劑量10 mg/kg的化合物22_1及23_1中之每一者(間隔6小時兩次單獨注射)或給予5 ml/kg之鹽水(對照)。使用「材料及方法」部分中所描述的方法，每3天量測血清中之HBsAg及HBeAg。為了量測標靶基因表現阻斷，在第3天及第14天處死兩個中間組小鼠，且在第27天處死其餘小鼠。處死後，在PBS灌注後移除其肝臟。將經灌注肝臟切成較小塊片且直接冷凍。
藉由將冷凍肝臟塊片添加至含有陶瓷珠及1 ml MagNA Pure溶解緩衝液(Roche，編號05467535001)之2 ml試管中，自該等塊片提取mRNA。使用TissueLyser (Qiagen)使肝臟塊片均質化。使用MagNA Pure 「96細胞RNA大體積套組」(Roche，編號05467535001)分離RNA與組織均質物。可將溶解物儲存在-80℃下。基本上使用如材料及方法部分中所描述之qPCR來量測PAPD5及PAPD7 mRNA，其中TaqMan引子分析中具有以下改變，該改變利用以下兩個分析(ThermoFisher Scientific)進行：
Figure 107136344-A0304-0051
GUSB及TBP為管家基因，其用於正規化用管家基因下方所指示之引子分析量測的PAPD5及PAPD7 mRNA。
結果展示於下方表34、表35及表36中。表34中之資料進一步呈現於圖18A及圖18B中。 表34 用靶向PAPD5及PAPD7之寡核苷酸處理的AAV/HBV小鼠中之HBsAg (Log10 IU/血清mL數)
Figure 107136344-A0304-0052
資料顯示，用單一處理劑靶向AAV/HBV小鼠模型中之PAPD5及PAPD7引起HBsAg之持續2對數下降，持續長達處理後27天。 表35 用靶向PAPD5及PAPD7之寡核苷酸處理的AAV/HBV小鼠中之HBeAg (Log10 IU/血清mL數)
Figure 107136344-A0304-0053
與HBsAg一樣，靶向PAPD5及PAPD7引起血清中之HBeAg水準降低，儘管不如HBsAg那般顯著。 表36：在用靶向PAPD5及PAPD7之寡核苷酸(各自10 mg/kg)單次給藥處理後AAV/HBV小鼠(第3天及第14天3隻動物，且第27天5隻動物)中之PAPD5及PAPD7 mRNA以及ALT水準(第0天11隻動物，第14天8隻動物，且第27天5隻動物)。
Figure 107136344-A0304-0054
根據此等資料可看出，靶向PAPD5及PAPD7之寡核苷酸分別引起PAPD5及PAPD7 mRNA水準降低，且在AAV/HBV小鼠模型中具有良好耐受性。
諸圖展示：圖 1 ：說明例示性反義寡核苷酸結合物，其中寡核苷酸表示為波浪線(A至D)或「寡核苷酸」(E至H)或T2 (I)，且靶向去唾液酸醣蛋白受體之結合部分為三價N-乙醯基半乳胺糖部分。化合物A至D包含二離胺酸分支鏈分子、PEG3間隔基及三個末端GalNAc碳水化合物部分。在化合物A及B中，寡核苷酸在沒有連接子的情況下直接連接至靶向去唾液酸醣蛋白受體之結合部分。在化合物C及D中，寡核苷酸經由C6連接子連接至靶向去唾液酸醣蛋白受體之結合部分。化合物E至I包含市售的三倍分支鏈分子及具有變化長度及結構之間隔基以及三個末端GalNAc碳水化合物部分。圖 2 ： 三價GalNAc簇(GN2)之結構式。GN2適用作本發明中之結合部分。波浪線說明簇與(例如) C6胺基連接子或直接與寡核苷酸之結合位點。圖 3 ： 展示實例1之Hela細胞之PAPD5及PAPD7基因表現阻斷與實例2之dHepRG細胞之HBsAg降低之間的相關性。圖 4 ： CMP ID NO: 20_12之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 5 ：CMP ID NO: 20_13之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 6 ： CMP ID NO: 20_14之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 7 ： CMP ID NO: 20_15之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 8 ： CMP ID NO: 20_18之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 9 ： CMP ID NO: 20_36之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 10 ： CMP ID NO: 20_30之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 11 ： 靶向人類HeLa細胞株(A)及原代小鼠肝細胞(PMH，B)中之人類及小鼠轉錄物的寡核苷酸(表5)所達成的活體外PAPD5及PAPD7降低之圖示。圖 12 ： CMP ID NO: 20_20之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 13 ： CMP ID NO: 20_21之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 14 ： CMP ID NO: 21_2之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 15 ： CMP ID NO: 20_22之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 16 ： CMP ID NO: 21_33之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 17 ： CMP ID NO: 21_34之結構式。其醫藥鹽包括與該化合物相關聯之單價或二價陽離子(諸如Na+ 、K+ 及Ca2+ )或此等陽離子之混合物。圖 18A 至圖 18B ： 在用10 mg/kg的兩種寡核苷酸(一種靶向PAPD5且一種靶向PAPD7)單次處理後，在活體內隨時間推移對AAV/HBV小鼠模型中之HBsAg及HBeAg之影響。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司(F.Hoffmann-La Roche AG)
<120> 用於降低PAPD5及PAPD7 mRNA以治療B型肝炎感染之核酸分子
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
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<210> 2
<211> 44042
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
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<212> DNA
<213> 食蟹獼猴
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n為a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (71318)..(71417)
<223> n為a、c、g或t
<400> 3
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<210> 4
<211> 49960
<212> DNA
<213> 食蟹獼猴
<400> 4
Figure 107136344-A0305-02-0328-149
Figure 107136344-A0305-02-0329-150
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Figure 107136344-A0305-02-0351-172
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Figure 107136344-A0305-02-0355-178
Figure 107136344-A0305-02-0356-179
Figure 107136344-A0305-02-0357-180
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Figure 107136344-A0305-02-0360-183
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 5
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Figure 107136344-A0305-02-0364-189
Figure 107136344-A0305-02-0365-190
Figure 107136344-A0305-02-0366-191
Figure 107136344-A0305-02-0367-192
Figure 107136344-A0305-02-0368-193
Figure 107136344-A0305-02-0369-194
Figure 107136344-A0305-02-0370-195
Figure 107136344-A0305-02-0371-196
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Figure 107136344-A0305-02-0374-199
Figure 107136344-A0305-02-0375-200
Figure 107136344-A0305-02-0376-201
Figure 107136344-A0305-02-0377-202
Figure 107136344-A0305-02-0378-203
Figure 107136344-A0305-02-0379-204
Figure 107136344-A0305-02-0380-205
Figure 107136344-A0305-02-0381-206
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Figure 107136344-A0305-02-0383-208
Figure 107136344-A0305-02-0384-209
Figure 107136344-A0305-02-0385-210
Figure 107136344-A0305-02-0386-211
Figure 107136344-A0305-02-0387-212
Figure 107136344-A0305-02-0388-213
Figure 107136344-A0305-02-0389-214
Figure 107136344-A0305-02-0390-215
Figure 107136344-A0305-02-0391-216
Figure 107136344-A0305-02-0392-217
Figure 107136344-A0305-02-0393-218
Figure 107136344-A0305-02-0394-219
Figure 107136344-A0305-02-0395-220
Figure 107136344-A0305-02-0396-221
Figure 107136344-A0305-02-0397-222
Figure 107136344-A0305-02-0398-223
Figure 107136344-A0305-02-0399-224
Figure 107136344-A0305-02-0400-225
Figure 107136344-A0305-02-0401-226
Figure 107136344-A0305-02-0402-228
<210> 6
<211> 36659
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 6
Figure 107136344-A0305-02-0402-230
Figure 107136344-A0305-02-0403-231
Figure 107136344-A0305-02-0404-232
Figure 107136344-A0305-02-0405-233
Figure 107136344-A0305-02-0406-234
Figure 107136344-A0305-02-0407-235
Figure 107136344-A0305-02-0408-236
Figure 107136344-A0305-02-0409-237
Figure 107136344-A0305-02-0410-238
Figure 107136344-A0305-02-0411-239
Figure 107136344-A0305-02-0412-240
Figure 107136344-A0305-02-0413-241
Figure 107136344-A0305-02-0414-242
Figure 107136344-A0305-02-0415-243
Figure 107136344-A0305-02-0416-244
Figure 107136344-A0305-02-0417-245
Figure 107136344-A0305-02-0418-246
Figure 107136344-A0305-02-0419-247
Figure 107136344-A0305-02-0420-248
Figure 107136344-A0305-02-0421-249
Figure 107136344-A0305-02-0422-250
Figure 107136344-A0305-02-0423-251
Figure 107136344-A0305-02-0424-252
Figure 107136344-A0305-02-0425-253
Figure 107136344-A0305-02-0426-254
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 7
Figure 107136344-A0305-02-0427-256
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 8
Figure 107136344-A0305-02-0427-257
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 9
Figure 107136344-A0305-02-0427-258
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 10
Figure 107136344-A0305-02-0427-259
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 11
Figure 107136344-A0305-02-0428-260
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 12
Figure 107136344-A0305-02-0428-261
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 13
Figure 107136344-A0305-02-0428-262
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 14
Figure 107136344-A0305-02-0428-263
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 15
Figure 107136344-A0305-02-0429-264
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 16
Figure 107136344-A0305-02-0429-265
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 17
Figure 107136344-A0305-02-0429-266
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 18
Figure 107136344-A0305-02-0429-267
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 19
Figure 107136344-A0305-02-0429-268
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 20
Figure 107136344-A0305-02-0430-269
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 21
Figure 107136344-A0305-02-0430-270
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 22
Figure 107136344-A0305-02-0430-271
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 23
Figure 107136344-A0305-02-0430-272
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引子
<400> 24
Figure 107136344-A0305-02-0431-273
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引子
<400> 25
Figure 107136344-A0305-02-0431-274
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 探針
<220>
<221> ZEN
<222> (9)..(10)
<223> 內部抑止劑
<400> 26
Figure 107136344-A0305-02-0431-275
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 27
Figure 107136344-A0305-02-0432-276
<210> 28
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 28
Figure 107136344-A0305-02-0432-277
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 29
Figure 107136344-A0305-02-0432-278
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 30
Figure 107136344-A0305-02-0432-279
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 31
Figure 107136344-A0305-02-0432-280
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 32
Figure 107136344-A0305-02-0433-281
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 33
Figure 107136344-A0305-02-0433-282
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸基元
<400> 34
Figure 107136344-A0305-02-0433-283

Claims (22)

  1. 一種反義寡核苷酸，其具有序列TcAACtttcactTcAG；其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷；小寫字母表示DNA核苷；所有胞嘧啶LNA核苷皆為5-甲基胞嘧啶；且所有核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
  2. 一種結合化合物，其包含如請求項1之反義寡核苷酸及連接至該反義寡核苷酸之結合部分。
  3. 如請求項2之結合化合物，其中該結合部分可結合至去唾液酸醣蛋白受體。
  4. 如請求項3之結合化合物，其中該結合部分為三價N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)部分。
  5. 如請求項2至4中任一項之結合化合物，其中該結合部分係共價連接至該反義寡核苷酸。
  6. 如請求項2至4中任一項之結合化合物，其中一連接子位於該反義寡核苷酸與該結合部分之間。
  7. 如請求項6之結合化合物，其中該連接子為生理學上不穩定的連接 子。
  8. 如請求項7之結合化合物，其中該生理學上不穩定的連接子為S1核酸酶裂解敏感連接子。
  9. 如請求項7之結合化合物，其中該生理學上不穩定的連接子為具有三個連續磷酸二酯鍵聯的磷酸二酯連接之胞苷-腺苷二核苷酸。
  10. 如請求項7之結合化合物，其中一C6胺基烷基位於該結合部分與該生理學上不穩定的連接子之間。
  11. 如請求項10之結合化合物，其中該結合部分為可結合至去唾液酸醣蛋白受體，且其中該結合部分為三價N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)部分；其中該結合部分係共價連接至該反義寡核苷酸；其中一具有三個連續磷酸二酯鍵聯的磷酸二酯連接之胞苷-腺苷二核苷酸位於該反義寡核苷酸與該結合部分之間；以及，其中一C6胺基烷基位於該結合部分與該具有三個連續磷酸二酯鍵聯的磷酸二酯連接之胞苷-腺苷二核苷酸之間。
  12. 如請求項2至4中任一項之結合化合物，其具有下式：GN2-C6ocoaoTcAACtttcactTcAG；其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷；所有胞嘧啶LNA核苷皆為5-甲基胞嘧啶；小寫字母表示DNA核苷；下標o表示磷酸二酯核苷間鍵聯；所有其他核苷間鍵聯皆為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其中C6表示具有6個碳 原子之胺基烷基；以及其中GN2表示如圖2所示的三價GalNAc簇；其中圖2中之波浪鍵結線表示C6胺基烷基與三價GalNAc簇之結合位點。
  13. 一種如請求項1之反義寡核苷酸或如請求項2至12中任一項之結合化合物之醫藥學上可接受之鹽。
  14. 一種醫藥學上可接受之鹽，其係如請求項1之反義寡核苷酸或如請求項2至12中任一項之結合化合物之醫藥學上可接受之鈉鹽。
  15. 一種醫藥學上可接受之鹽，其係如請求項1之反義寡核苷酸或如請求項2至12中任一項之結合化合物之醫藥學上可接受之鉀鹽。
  16. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之反義寡核苷酸；或如請求項2至12中任一項之結合化合物；或如請求項13至15中任一項之醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
  17. 如請求項16之醫藥組合物，其中該醫藥學上可接受之稀釋劑係無菌磷酸鹽緩衝鹽水。
  18. 一種用於調節表現PAPD5及PAPD7之標靶細胞中之PAPD5及PAPD7表現的活體外方法，該方法包含向該標靶細胞投與有效量的如請求項1之反義寡核苷酸；或如請求項2至12中任一項之結合化合物；或如請求項13 至15中任一項之醫藥學上可接受之鹽。
  19. 一種如請求項1之反義寡核苷酸、如請求項2至12中任一項之結合化合物或如請求項13至15中任一項之醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以調節表現PAPD5及PAPD7之標靶細胞中之PAPD5及PAPD7表現的藥劑。
  20. 一種如請求項1之反義寡核苷酸、如請求項2至12中任一項之結合化合物或如請求項13至15中任一項之醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療個體之HBV感染的藥劑。
  21. 一種如請求項1之反義寡核苷酸、如請求項2至12中任一項之結合化合物或如請求項13至15中任一項之醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療個體之慢性HBV感染的藥劑。
  22. 一種如請求項1之反義寡核苷酸、如請求項2至12中任一項之結合化合物或如請求項13至15中任一項之醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以降低感染HBV之個體之感染程度的藥劑。
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