JP7348922B2 - Ｂ型肝炎感染の治療用のＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡを低減させるための核酸分子 - Google Patents

Ｂ型肝炎感染の治療用のＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡを低減させるための核酸分子 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は、ＰＡＰ関連ドメイン含有５（ＰＡＰＤ５）及びＰＡＰ関連ドメイン含有７（ＰＡＰＤ７）の両方に相補的であり、単一のオリゴヌクレオチドを使用する場合ＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の両方の発現の阻害をもたらす核酸分子に関する。本発明はまた、ＨＢＶ感染症、特に慢性ＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用されるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７特異的核酸分子を提供する。またＨＢＶ感染症の治療及び／又は予防に使用するための医薬組成物も本発明に含まれる。
ＨＢＶ感染は、推定３億５千万人の慢性キャリアーに関係するいまだに世界中の大きな健康問題である。キャリアーの約２５％が慢性肝炎、肝硬変、又は肝臓癌で死亡している。Ｂ型肝炎ウイルスは、タバコに次いで２番目に重要な発癌物質であり、全ての原発性肝癌の６０％～８０％を引き起こす。ＨＢＶはＨＩＶの１００倍の感染力がある。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、エンベロープに包まれた、部分的に２本鎖のＤＮＡウイルスである。コンパクトな３．２ｋｂのＨＢＶゲノムは、コア、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、エンベロープ、及びＸタンパク質をコードする、４つの重複するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で構成されている。Ｐｏｌ ＯＲＦは最も長く、エンベロープＯＲＦはその中にあるが、Ｘ及びコアＯＲＦはＰｏｌ ＯＲＦと重複している。ＨＢＶのライフサイクルには２つの主なイベントがある：１）緩和された環状（ＲＣ ＤＮＡ）からの閉じた環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の生成、２）プレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の逆転写によるＲＣ ＤＮＡの生成。宿主細胞の感染前に、ＨＢＶゲノムはＲＣ ＤＮＡとしてビリオン内に存在する。ＨＢＶビリオンは、ヒト肝細胞の表面に存在する負に帯電したプロテオグリカンに非特異的に結合することにより（Schulze, Hepatology, 46, (2007), 1759-68）、及び肝細胞タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）受容体へのＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の特異的結合を介して（Yan, J Virol, 87, (2013), 7977-91）、宿主細胞に侵入することができることが確認されている。全てのＨＢＶウイルスｍＲＮＡはキャッピングされ、ポリアデニル化され、翻訳のために細胞質に排出される。細胞質では、新しいビリオンの組み立てが開始され、新生ｐｇＲＮＡがウイルスＰｏｌとともにパッケージ化されるため、１本鎖ＤＮＡ中間体を介したｐｇＲＮＡのＲＣ ＤＮＡへの逆転写が開始され得る。
肝細胞及び／又は肝内免疫細胞によるＨＢＶ感染に応答した抗ウイルス性サイトカインの分泌は、感染した肝臓のウイルス除去において中心的な役割を果たす。しかし、慢性感染患者は、ウイルスが宿主細胞認識システムとそれに続く抗ウイルス応答に対抗するために採用したさまざまなエスケープ戦略のため、弱い免疫応答しか示さない。
多くの観察により、いくつかのＨＢＶウイルスタンパク質が、ウイルス認識シグナル伝達システムとその後のインターフェロン（ＩＦＮ）抗ウイルス活性を妨害することにより、初期の宿主細胞応答に対抗できることが示された。これらの中で、空のＨＢＶサブウイルス粒子（ＳＶＰ、ＨＢｓＡｇ）の過剰分泌は、慢性感染患者（ＣＨＢ）で観察される免疫寛容状態の維持に関与すると考えられている。ＨＢｓＡｇ及びその他のウイルス抗原への持続的な曝露は、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞の欠失又は進行性の機能障害を引き起こす可能性がある（Kondo, Journal of Immunology (1993), 150, 4659-4671; Kondo, Journal of Medical Virology (2004), 74, 425-433; Fisicaro, Gastroenterology, (2010), 138, 682-93）。さらにＨＢｓＡｇは、直接相互作用によって単球、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞の機能を抑制することが報告されている（Op den Brouw, Immunology, (2009b), 126, 280-9; Woltman, PLoS One, (2011), 6, e15324; Shi, J Viral Hepat. (2012), 19, e26-33; Kondo, ISRN Gasteroenterology, (2013), Article ID 935295）。
ＨＢｓＡｇの定量は、慢性Ｂ型肝炎の予後と治療応答の重要なバイオマーカーである。しかしＨＢｓＡｇの消失とセロコンバージョンの達成は慢性感染患者ではめったに観察されないが、治療の究極的目標の１つである。ヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体などの現在の治療法は、ＨＢＶ ＤＮＡ合成を阻害する分子であるが、ＨＢｓＡｇレベルの低減を目的とするものではない。ヌクレオシド（ヌクレオチド）類似体は、長期間の治療でも、自然に観察されるものと同等の弱い（－１％～２％）ＨＢｓＡｇクリアランスしか示しない（Janssen, Lancet, (2005), 365, 123-9; Marcellin, N. Engl. J. Med., (2004), 351, 1206-17; Buster, Hepatology, (2007), 46, 388-94）。完全に又は部分的に組み込まれたＢ型肝炎ウイルスＤＮＡが、慢性感染者のＨＢｓＡｇ発現の原因であることが最近示された（Wooddell et all 2017 Sci. Transl. Med. Vol 9, Issue 409, eaan0241を参照）。
Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢＶエンベロープ抗原又はＨＢｅＡｇとも呼ばれる）は、Ｂ型肝炎感染細胞によって分泌されるウイルスタンパク質である。ＨＢｅＡｇは慢性Ｂ型肝炎感染症を引き起こし、活動性ウイルス性疾患及び患者の感染度のマーカーとして使用される。
Ｂ型肝炎ウイルスのプレコア又はＨＢｅＡｇの機能は完全にはわかっていない。しかしＨＢｅＡｇはウイルス持続性で重要な役割を果たすことがよく知られている。ＨＢｅＡｇは、免疫調節タンパク質として機能することにより、ＨＢＶの慢性化を促進すると考えられている。特に、ＨＢｅＡｇは分泌されたアクセサリータンパク質であり、細胞内ヌクレオシプシドタンパク質に対する宿主免疫応答を弱めるように思われる（Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141）。ＨＢｅＡｇは、ＨＢＶ持続性に寄与する免疫寛容物質として作用しており、可溶性ＨＢｅＡｇが胎盤を通過することを考えると、子宮内で機能している可能性がある（Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141）。さらに、ＨＢｅＡｇは、ｉ）細胞内シグナル伝達を制御する細胞遺伝子、及びｉｉ）ウイルス感染に対する自然免疫応答を弱めるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ－２）を、ダウンレギュレートする（Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141）。ＨＢｅＡｇが存在しない場合、ＨＢＶ複製はＴＬＲ２経路のアップレギュレーションを引き起こす（Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141）。従ってＨＢｅＡｇは、ウイルス／宿主相互作用を調節して宿主免疫応答に影響を与える重要な役割を担っている（Walsh, Virology, 2011, 411(1):132-141）。従ってＨＢｅＡｇ陽性患者集団のＨＢｅＡｇを低減すると、ＨＢＶ特異的免疫機能障害が逆転する可能性がある（Milich, 1997, J. Viral. Hep. 4: 48-59; Milich, 1998, J. Immunol. 160: 2013-2021）。さらに、分泌されたＨＢｅＡｇは、Ｔ細胞耐性の誘発において細胞内肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）よりもはるかに効率的であり、そしてＨＢｅＡｇとＨＢｃＡｇの間の分割Ｔ細胞耐性及びＨＢｃ／ＨＢｅＡｇ特異的Ｔ細胞耐性のクローン不均一性は、自然のＨＢＶ感染、特にプレコア陰性の慢性肝炎に重大な影響を及ぼす可能性がある（Chen, 2005, Journal of Virology, 79: 3016-3027）。
従って、ＨＢｓＡｇの分泌に加えてＨＢｅＡｇの分泌が低下すると、ＨＢｓＡｇ単独の分泌の阻害と比較して、慢性ＨＢＶ感染発症の阻害の改善がもたらされるであろう。さらに、ＨＢｅＡｇ陽性の母親からの母親－胎児及び新生児ＨＢＶ感染の症例で、急性感染から慢性感染への最も高い伝染率（＞８０％）が報告されている（Liaw, Lancet, 2009, 373: 582-592; Liaw, Dig. Dis. Sci., 2010, 55: 2727-2734; and Hadziyannis, 2011, Journal of hepatology, 55: 183-191）。従って、妊娠した母親のＨＢｅＡｇを低減することは、患者の感染度を下げるだけでなく、子供の慢性ＨＢＶ感染の発症も抑制する可能性がある。
従ってＨＢＶの治療において、ウイルス発現を阻害、特にＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌を阻害する医学的ニーズが満たされていない（Wieland, S. F. & F. V. Chisari. J Virol, (2005), 79, 9369-80; Kumar et al. J Virol, (2011), 85, 987-95; Woltman et al. PLoS One, (2011), 6, e15324; Op den Brouw et al. Immunology, (2009b), 126, 280-9）。
ＷＯ２０１７／０６６７１２では、テロメア疾患の治療と診断に関連するＰＡＰＤ５のダウンレギュレーションが記載されている。この目的のための５つのｓｈＲＮＡ構造が記載されている。
ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４９８０は、ＨＢＶ感染症を治療するために、核酸分子及びそのような分子の組み合わせを用いて、ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７を標的にすることを開示している。
発明の目的
本発明は、インビボ及びインビトロでＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の両方の発現を阻害することができる新規な核酸分子を特定する。１つの分子で２つの標的核酸を阻害する能力は、生産、標的細胞への送達の単純性、薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）の単純性、及び治療効果を達成するために必要な濃度に関して明確な利点がある。さらに、本発明は、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のノックダウンと、ＨＢｓＡｇ阻害などのＨＢＶ抗原阻害との間に相関関係があることを示す。
図は、以下を示す。
オリゴヌクレオチドが波線（Ａ－Ｄ）又は「オリゴヌクレオチド」（Ｅ－Ｈ）又はＴ2（Ｉ）として示され、アシアロ糖タンパク質受容体を標的とするコンジュゲート部分が３価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。化合物Ａ～Ｄは、ジリジン分岐体分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。化合物Ａ及びＢでは、オリゴヌクレオチドは、リンカーなしで、コンジュゲート部分を標的とするアシアロ糖タンパク質受容体部分に直接結合している。化合物Ｃ及びＤでは、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカーを介して、結合部分を標的とするアシアロ糖タンパク質受容体部分に結合している。化合物Ｅ～Ｉは、市販のトレブラー（trebler）分岐体分子、様々な長さと構造のスペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。 オリゴヌクレオチドが波線（Ａ－Ｄ）又は「オリゴヌクレオチド」（Ｅ－Ｈ）又はＴ2（Ｉ）として示され、アシアロ糖タンパク質受容体を標的とするコンジュゲート部分が３価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。化合物Ａ～Ｄは、ジリジン分岐体分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。化合物Ａ及びＢでは、オリゴヌクレオチドは、リンカーなしで、コンジュゲート部分を標的とするアシアロ糖タンパク質受容体部分に直接結合している。化合物Ｃ及びＤでは、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカーを介して、結合部分を標的とするアシアロ糖タンパク質受容体部分に結合している。化合物Ｅ～Ｉは、市販のトレブラー（trebler）分岐体分子、様々な長さと構造のスペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。 オリゴヌクレオチドが波線（Ａ－Ｄ）又は「オリゴヌクレオチド」（Ｅ－Ｈ）又はＴ2（Ｉ）として示され、アシアロ糖タンパク質受容体を標的とするコンジュゲート部分が３価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。化合物Ａ～Ｄは、ジリジン分岐体分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。化合物Ａ及びＢでは、オリゴヌクレオチドは、リンカーなしで、コンジュゲート部分を標的とするアシアロ糖タンパク質受容体部分に直接結合している。化合物Ｃ及びＤでは、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカーを介して、結合部分を標的とするアシアロ糖タンパク質受容体部分に結合している。化合物Ｅ～Ｉは、市販のトレブラー（trebler）分岐体分子、様々な長さと構造のスペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。 オリゴヌクレオチドが波線（Ａ－Ｄ）又は「オリゴヌクレオチド」（Ｅ－Ｈ）又はＴ2（Ｉ）として示され、アシアロ糖タンパク質受容体を標的とするコンジュゲート部分が３価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを示す。化合物Ａ～Ｄは、ジリジン分岐体分子、ＰＥＧ３スペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。化合物Ａ及びＢでは、オリゴヌクレオチドは、リンカーなしで、コンジュゲート部分を標的とするアシアロ糖タンパク質受容体部分に直接結合している。化合物Ｃ及びＤでは、オリゴヌクレオチドは、Ｃ６リンカーを介して、結合部分を標的とするアシアロ糖タンパク質受容体部分に結合している。化合物Ｅ～Ｉは、市販のトレブラー（trebler）分岐体分子、様々な長さと構造のスペーサー、及び３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。 ３価ＧａｌＮＡｃクラスター（ＧＮ２）の構造式。ＧＮ２は、本発明において結合部分として有用である。波線は、例えばＣ６アミノリンカーへの、又は直接オリゴヌクレオチドへの、クラスターの結合部位を示す。 例１のＨｅｌａ細胞におけるＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７のノックダウンと、例２のｄＨｅｐＲＧ細胞におけるＨＢｓＡｇの低下との相関関係を示す。 化合物番号（CMP ID NO:）２０＿１２の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２０＿１３の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２０＿１４の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２０＿１５の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２０＿１８の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２０＿３６の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２０＿３０の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 ヒトＨｅＬａ細胞株（Ａ）及び初代マウス肝細胞（ＰＭＨ、Ｂ）における、ヒト及びマウス転写物（表５）を標的とするオリゴヌクレオチドで達成されたインビトロＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の減少を示す。 化合物番号２０＿２０の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２０＿２１の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２１＿２の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２０＿２２の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２１＿３３の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 化合物番号２１＿３４の構造式。その医薬的塩には、１価若しくは２価の陽イオン、例えばＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、又は化合物と結合しているこれらの混合物が含まれる。 １つがＰＡＰＤ５を標的化し、１つがＰＡＰＤ７を標的とする２つの１０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドを用いて１回処理した後の、ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇに対するインビボでの経時的な作用。
定義
核酸分子
本明細書で使用される「核酸分子」又は「治療用核酸分子」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子（すなわち、ヌクレオチド配列）として当業者によって一般的に理解されているように定義される。本発明の方法において言及される核酸分子は、一般的に長さが５０ヌクレオチド未満の治療用オリゴヌクレオチドである。核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであるか若しくはそれを含んでもよく、又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、又はリボザイムなどの別のオリゴマー核酸分子であってもよい。核酸分子は、一般的に固相化学合成とそれに続く精製によって実験室で作成される組成物である。核酸分子の配列に言及する場合、核酸塩基部分、又はその修飾物の、又は共有結合したヌクレオチド若しくはヌクレオシドの配列又は順序を指す。本発明の核酸分子は人工であり、化学的に合成され、通常は精製又は単離される。本発明の核酸分子は、１つ以上の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施態様において、本発明の核酸分子は、長さが１２～５０ヌクレオチド、例えば１３～４０、例えば１４～３５、例えば１５～３０、例えば１６～２２、例えば１６～１８、又は１５～１７の連続ヌクレオチドを含むか又はそれらから成る。
いくつかの実施態様において、核酸分子又はその連続ヌクレオチド配列は、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６、又は１７ヌクレオチドを含むか又はそれらから成る。本明細書で与えられる範囲は、範囲の端点を含むことを理解されたい。従って、核酸分子が１０～３０ヌクレオチドを含むとされる場合、１０ヌクレオチドと３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
いくつかの実施態様において、連続ヌクレオチド配列は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２の連続ヌクレオチドを含むか又はそれらから成る。
核酸分子は、哺乳動物における標的核酸の発現を調節するためのものである。いくつかの実施態様において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子は、通常は標的核酸の発現を阻害するためのものである。
本発明の１つの実施態様において、核酸分子は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ物質から選択される。別の実施態様において、核酸分子は、高親和性修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの１本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施態様において、核酸分子はホスホロチオエート核酸分子である。いくつかの実施態様において、核酸分子はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
いくつかの実施態様において、核酸分子は、非ヌクレオシド部分（コンジュゲート部分）に結合され得る。
核酸分子のライブラリーは、変異体核酸分子の収集物として理解されるべきである。核酸分子のライブラリーの目的はさまざまである。いくつかの実施態様において、核酸分子のライブラリーは、核酸分子のライブラリー内の最も強力な配列を特定する目的で、ＰＡＰＤ５とＰＡＰＤ７の標的核酸間の共通の領域を標的とする重複核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで構成される。いくつかの実施態様において、核酸分子のライブラリーは、親又は先祖核酸分子の核酸分子設計変異体（子核酸分子）のライブラリーであり、核酸分子設計変異体は、親核酸分子のコア核酸塩基配列を保持する。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般的に理解されているように定義される。そのような共有結合したヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとも呼ぶことができる。オリゴヌクレオチドは、通常固相化学合成とそれに続く精製によって実験室で作成される。オリゴヌクレオチドの配列について言及する場合、核酸塩基部分の、又はその修飾物の、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの配列若しくは順序を指す。本発明のオリゴヌクレオチドは人工であり、化学的に合成され、通常は精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現を調節できるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に２本鎖ではないため、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは１本鎖である。１本鎖という用語は、当業者によって一般的に理解されている。特に本発明の１本鎖オリゴヌクレオチドは、自己相補性内部又は自己相補性間の程度がオリゴヌクレオチドの完全長の５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間２本鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の２本鎖）を形成できることが理解される。
本発明の１つの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅＨ動員オリゴヌクレオチドである。ＲＮＡｉ分子とは反対に、アンチセンスオリゴヌクレオチドも細胞の核内でも作用する。これは細胞の核内で作用するため、プレｍＲＮＡ配列及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的とするのに好ましい。
ＲＮＡｉ
本明細書において、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」という用語は、細胞の細胞質内のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介して、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングを誘導することができる短い２本鎖ＲＮＡ分子を指し、これらは、触媒性ＲＩＳＣ成分アルゴノート（argonaute）と相互作用する。ＲＮＡｉ分子の１つのタイプは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり、これは、転写後に相補的なｍＲＮＡを結合することにより、翻訳の分解と消失を引き起こす２本鎖ＲＮＡ分子である。低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、発現されるとＤＩＣＥＲ及びＲＮＡ低下サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介してｍＲＮＡを低減することができるヘアピン構造を有する人工ＲＮＡ分子である。ＲＮＡｉ分子は、目的の遺伝子のＲＮＡ配列に基づいて設計することができる。次に、対応するＲＮＡｉを化学的又はインビトロ転写により合成するか、ベクター若しくはＰＣＲ産物から発現させることができる。
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ分子は一般的に２０～５０ヌクレオチドの長さ、例えば２５～３５ヌクレオチドの長さであり、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡを処理すると考えられているダイサー（Dicer）として知られるエンドヌクレアーゼと相互作用し、これは次に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。ダイサー基質の有効な拡張形態は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３４９，８０９号及び米国特許第８，５１３，２０７号に記載されている。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する。ＲＮＡｉ物質は、修飾ヌクレオチド間結合及び高親和性ヌクレオシド、例えばＬＮＡ及びｃＥＴを含む２’－４’２環式リボース修飾ヌクレオシドなどを使用して化学修飾することができる。
連続ヌクレオチド配列
「連続ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書では用語「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と同義で使用される。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド配列を含み、任意選択的にさらなるヌクレオチド、例えば官能基を連続ヌクレオチド配列に結合させるために使用し得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であってもなくてもよい。
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの両方が含まれる。自然界では、ＤＮＡヌクレオチドやＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、互換的に「ユニット」又は「モノマー」と呼ばれることもある。
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」という用語は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入により、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施態様において、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。本明細書では、修飾ヌクレオシドという用語はまた、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「ユニット」又は修飾「モノマー」と同義で使用することもできる。未修飾のＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと呼ばれる。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域の修飾を有するヌクレオシドは、ワトソンクリック塩基対合が可能であれば、やはり一般的にＤＮＡ又はＲＮＡと呼ばれる。
修飾ヌクレオシド間結合
「修飾ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを共有結合させる、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されているように定義される。修飾ヌクレオシド間結合を有するヌクレオシドは、「修飾ヌクレオチド」とも呼ばれる。いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、本発明の核酸分子のヌクレアーゼ耐性を上昇させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合には、連続したヌクレオシド間にホスホジエステル結合を形成するリン酸基が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボで使用するためのオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域における、例えばギャップマー（gapmer）オリゴヌクレオチドのギャップ領域並びに修飾ヌクレオシドの領域における、ヌクレアーゼ切断に対する防御に役立ち得る。
ある実施態様において、核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、天然のホスホジエステルから、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性のある結合に修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）を使用することにより（両方とも当技術分野で周知である））決定することができる、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％、例えばオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％は修飾されている。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全ては、修飾されている。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基に結合するヌクレオシド、例えばコンジュゲートは、ホスホジエステルであってもよいことが、認識されるであろう。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全ては、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。
修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、及びボラノホスフェートを含む群から選択され得る。いくつかの実施態様において、修飾ヌクレオシド間結合は、本発明のオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ動員と適合性であり、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエート、又はボラノホスフェートである。
いくつかの実施態様において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合などのヌクレオシド間結合は硫黄（Ｓ）を含む。
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％はホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、又は例えば少なくとも９０％はホスホロチオエートである。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てはホスホロチオエートである。いくつかの実施態様において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の少なくとも１つは立体定義され、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも９０％は立体定義される。立体定義されたホスホロチオエート結合の合成は、例えばＷＯ２０１４／０１２０８１及びＷＯ２０１６／０７９１８１に記載されている。
いくつかの実施態様においてオリゴヌクレオチドは、１つ以上の中性ヌクレオシド間結合、特にホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ、アミド－３、ホルムアセタール、又はチオホルムアセタールから選択されるヌクレオシド間結合を含む。
さらなるヌクレオシド間結合は、ＷＯ２００９／１２４２３８（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。１つの実施態様においてヌクレオシド間結合は、ＷＯ２００７／０３１０９１（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているリンカーから選択される。特にヌクレオシド間結合は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）2－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）2－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）2－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）2－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）2－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）2－Ｓ－、－Ｏ－ＰＯ（ＲH）－Ｏ－、Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ3）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＲH）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ2ＣＨ2Ｓ－Ｒ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＢＨ3）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲH）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）2－ＮＲH－、－ＮＲH－Ｐ（Ｏ）2－Ｏ－、－ＮＲH－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＲH－ＣＯ－ＮＲH－から選択され得るか、及び／又はヌクレオシド間リンカーは、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＲH－、－ＮＲH－ＣＯ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＲH－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＮＲH－、－ＣＯ－ＮＲH－ＣＨ2－、－ＣＨ2－ＮＲHＣＯ－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｓ－、－ＣＨ2－ＳＯ2－ＣＨ2－、－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＲH－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＮＲH－ＣＯ－、－ＣＨ2－ＮＣＨ3－Ｏ－ＣＨ2－から成る群から選択することができ、ここで、ＲHは、水素及びＣ１－４アルキルから選択される。
ホスホチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、ギャップマーの領域Ｇ、又はヘッドマーやテールマーの非修飾ヌクレオシド領域などの標的核酸と２本鎖を形成するときに、ヌクレアーゼを動員できるアンチセンスオリゴヌクレオチド領域で、特に有用である。ただし、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域及び／又は親和性増強領域でも、例えばギャップマーの領域Ｆ及びＦ’、又はヘッドマーやテールマーの修飾ヌクレオシド領域などでも有用である。
しかし設計領域のそれぞれは、特にＬＮＡなどの修飾ヌクレオシドがヌクレアーゼ分解から結合を防御する領域において、ホスホジエステル結合などのホスホロチオエート以外のヌクレオシド間結合を含んでもよい。特に修飾ヌクレオシドユニット（一般的に非ヌクレアーゼ動員領域内）間に又はこれに隣接して、１つ又は２つの結合などのホスホジエステル結合を含めると、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能及び／又は生体内分布を修飾することができる（参照により本明細書に取り込まれるＷＯ２００８／１１３８３２を参照）。
１つの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合は全て、ホスホロチオエート及び／又はボラノホスフェート結合である。好ましくは、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間結合は全てホスホロチオエート結合である。
立体ランダムホスホロチオエート結合
ホスホロチオエート結合は、非架橋酸素の１つが硫黄で置換されたヌクレオシド間リン酸結合である。非架橋酸素の１つを硫黄で置換するとキラル中心が導入されるため、単一のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド内では、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合はＳ（Ｓｐ）又はＲ（Ｒｐ）立体異性体のいずれかでなる。そのようなヌクレオシド間結合は、「キラルヌクレオシド間結合」と呼ばれる。比較すると、ホスホジエステルのヌクレオシド間結合は、２つの非末端酸素原子を持っているため、非キラルである。
立体中心のキラリテイの指定は、Cahn, R.S.; Ingold, C.K.; Prelog, V. (1966). "Specification of Molecular Chirality". Angewandte Chemie International Edition. 5 (4): 385-415. doi:10.1002/anie.196603851で最初に公開された標準的カーン・インゴルド・プレローグ順位則（Cahn-Ingold-Prelog priority rule）（ＣＩＰ順位則）によって決定される。
標準的なオリゴヌクレオチド合成中に、カップリングと次の硫化の立体選択性は制御されない。このため、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の立体化学はランダムにＳｐ又はＲｐであり、そのため、従来のオリゴヌクレオチド合成によって生成されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、実際には２X個もの異なるホスホロチオエートジアステレオ異性体（Ｘはホスホロチオエートヌクレオシド間結合の数）で存在する可能性がある。そのようなオリゴヌクレオチドは、本明細書では立体ランダムホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと呼ばれ、立体定義ヌクレオシド間結合を含まない。従って、立体ランダムホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、非立体定義合成に由来する個々のジアステレオ異性体の混合物である。これに関連して、混合物は最大２X個の異なるホスホロチオエートジアステレオ異性体として定義される。
立体定義ヌクレオシド間結合
立体定義ヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチドにキラル中心を導入するヌクレオシド間結合であり、個々のオリゴヌクレオチド分子の集団内で、主にＲ又はＳのいずれか１つの立体異性体で存在する。
当該技術分野で使用される立体選択的オリゴヌクレオチド合成方法は、通常各ヌクレオシド間結合立体中心において少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％の立体選択性を提供し、従って最大約１０％、例えば約５％のオリゴヌクレオチド分子が代替的立体異性体形態を有し得ることを認識すべきである。
いくつかの実施態様において、各立体定義ホスホロチオエート立体中心の立体選択性は少なくとも約９０％である。いくつかの実施態様において、各立体定義ホスホロチオエート立体中心の立体選択性は少なくとも約９５％である。
立体定義ホスホロチオエート結合
立体定義ホスホロチオエート結合は、個々のオリゴヌクレオチド分子の集団内でＲｐ又はＳｐ配置のいずれかで化学合成されたホスホロチオエート結合であり、各立体中心において少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％の立体選択性を提供し、従って最大約１０％、例えば約５％のオリゴヌクレオチド分子が代替的立体異性体形態を有し得る。
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の立体配置を以下に示す。
ここで、３’Ｒ基は連続ヌクレオシド（５'ヌクレオシド）の３’位置を表し、５’Ｒ基は連続ヌクレオシド（３'ヌクレオシド）の５’位置を表す。
Ｒｐヌクレオシド間結合はまたｓｒＰとして表されてもよく、Ｓｐヌクレオシド間結合は、本明細書においてｓｓＰとして表されてもよい。
いくつかの実施態様において、各立体定義ホスホロチオエート立体中心の立体選択性は少なくとも約９７％である。いくつかの実施態様において、各立体定義ホスホロチオエート立体中心の立体選択性は少なくとも約９８％である。いくつかの実施態様において、各立体定義ホスホロチオエート立体中心の立体選択性は少なくとも約９９％である。
いくつかの実施態様において、立体選択的ヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチド分子の集団に存在するオリゴヌクレオチド分子の少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、又は（本質的に）全てにおいて、同じ立体異性体形態である。
立体選択性は、アキラル骨格（すなわちホスホジエステル）のみを有するモデル系で測定することができる。例えば、立体定義されたモノマーを次のモデルシステム「５’ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ３’」に結合させることにより、各モノマーの立体選択性を測定することができる。この結果は、５’ＤＭＴｒ－ｔ－ｓｒｐ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ３’又は５’ＤＭＴｒ－ｔ－ｓｓｐ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ－ｔ－ｐｏ３’となり、これらはＨＰＬＣを使用して分離することができる。立体選択性は、２つの可能な化合物からのＵＶ信号を積分し、これらの比率、例えば９８：２、９９：１、又は＞９９：１を与えることにより決定される。
特定の単一のジアステレオ異性体（単一の立体定義オリゴヌクレオチド分子）の立体純度％は、各ヌクレオシド間位置で定義された立体中心の結合選択性と、導入される立体定義ヌクレオシド間結合の数との関数になることが理解される。例えば、各位置での結合選択性が９７％である場合、１５個の立体定義ヌクレオシド間結合を有する立体定義オリゴヌクレオチドの得られる純度は０．９７15、すなわち、他のジアステレオ異性体の３７％と比較して６３％の所望のジアステレオ異性体になる。定義されアステレオシ性体の純度は、合成後、例えばイオン交換クロマトグラフイー又は逆相クロマトグラフイーなどのＨＰＬＣによる精製によって改善され得る。
いくつかの実施態様において、立体定義オリゴヌクレオチドは、集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が所望のジアステレオ異性体であるオリゴヌクレオチドの集団を指す。
別の言い方をすると、いくつかの実施態様において、立体定義オリゴヌクレオチドは、集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％が、所望の（特定の）立体定義ヌクレオシド間結合モチーフ（立体定義モチーフとも呼ばれる）から成るオリゴヌクレオチドの集団を指す。
立体ランダム及び立体定義ヌクレオシド間立体中心の両方を含む立体定義オリゴヌクレオチドの場合、立体定義オリゴヌクレオチドの純度は、定義された立体定義ヌクレオシド間結合モチーフを保持するオリゴヌクレオチドの集団の％に関して決定され、計算において立体ランダム結合は無視される。
核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションで水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含む。本発明の文脈において、核酸塩基という用語はまた、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションにおいて機能的である修飾された核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基、並びに天然に存在しない変異体の両方を指す。そのような変異体は、例えばHirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。
いくつかの実施態様において、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを、修飾プリン又は修飾ピリミジンに、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロシトシン、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロウラシル、２－チオウラシル、２’チオチミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基などの置換プリン又は置換ピリミジンに、変更することによって修飾される。
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵで示すことができる（各文字は、同等の機能を有する修飾核酸塩基を任意選択的に含むことができる）。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。任意選択的に、ＬＮＡギャップマーには、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを使用することができる。
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチド又は修飾核酸分子という用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド又は核酸分子を表す。「キメラ」という用語は、修飾されたヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチド又は核酸分子、特にギャップマーオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。
立体定義オリゴヌクレオチド
立体定義オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体定義ヌクレオシド間結合であるオリゴヌクレオチドである。
立体定義ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体定義ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であるオリゴヌクレオチドである。
立体定義ヌクレオシド間モチーフ
本明細書において立体定義モチーフとも呼ばれる立体定義ヌクレオシド間モチーフは、立体定義オリゴヌクレオチドにおける立体定義されたＲ及びＳヌクレオシド間結合のパターンを指し、５’－３’と表記される。例えば、立体定義オリゴヌクレオチド
5'-TsrP CssP AssP asrP csrP tssP tsrP tsrP cssP asrP cssP tsrP tssP CssP AssP G-3‘（配列番号１８）
は、ＲＳＳＲＲＳＲＲＳＲＳＲＳＲＳＳＳの立体定義ヌクレオシド間モチーフを有する。
立体定義オリゴヌクレオチドのサブライブラリーに関して、これらは、本来立体ランダムなバックグラウンド（任意選択的に、１つ以上の非キラルヌクレオシド間結合、例えばホスホジエステル結合を含む）で共通の立体定義ヌクレオシド間モチーフを含むであろう。
例えば、オリゴヌクレオチド
5'-Ts Cs As as csrP tssP tssP tsrP cs as cs ts ts Cs As G-3 （配列番号１８）
は、ＸＸＸＸＲＳＳＲＸＸＸＸＸＸＸの立体定義ヌクレオシド間モチーフを有し、ここで、Ｘは立体ランダムホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表す（化合物中で添字ｓとして表示）。この例では、最初の５’立体定義ヌクレオシド間結合は、５’末端から５番目のヌクレオシド間結合（位置４と５のヌクレオシド間）であり、従って上記のモチーフは（ヌクレオシド間結合）位置５で「ＲＳＳＲ」とも呼ばれることに留意されたい。
立体定義ヌクレオシド間モチーフ（立体定義モチーフ）が、一連の連続した立体定義ヌクレオシド間結合で構成されている（すなわち、連続ヌクレオシドの間に配置されている）場合、これは本明細書では、連続した立体定義ヌクレオシド間モチーフ（連続した立体定義モチーフ）と呼ばれる。連続した立体定義モチーフは、２つ以上の連続した立体定義ヌクレオシド間結合を含まなければならないことが理解されよう。
サブライブラリー混合物では、立体定義ヌクレオシド間モチーフも連続していない可能性があり、すなわち立体定義ヌクレオシド間結合は、１つ以上の立体ランダムなヌクレオシド間結合で分散されている。
例えば、化合物
5'-Ts CssP As as csrP tssP ts ts cs as cs ts tssP CsrP AssP G-3（配列番号１８）
は、非連続モチーフ ＸＳＸＸＲＳＸＸＸＸＸＸＳＲＳ を有する。
親オリゴヌクレオチド
親オリゴヌクレオチドは、定義された核酸塩基配列（モチーフ配列）を有するオリゴヌクレオチドである。本発明の方法において親オリゴヌクレオチドは、通常は１つ以上のライブラリーを作成することにより、本発明の方法を使用して改善されるオリゴヌクレオチドである。
通常はライブラリーは、親の核酸塩基配列と立体化学（通常は立体ランダム）を維持しながら、ヌクレオシド修飾物（設計ライブラリー）を変更することができる。
代わりにライブラリーは、核酸塩基配列（モチーフ配列）とヌクレオシド修飾パターン（設計）を維持しながら、親オリゴヌクレオチドの立体化学を変更することができる。そのようなライブラリーでは、１つ又はそれ以上（２＋）のヌクレオシド間結合の立体化学は立体定義され、親オリゴヌクレオチドの立体化学とは異なる。
いくつかの実施態様において、親オリゴヌクレオチドは、立体ランダムなホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、親オリゴヌクレオチドは、立体ランダムなホスホロチオエートオリゴヌクレオチドギャップマーである。
いくつかの実施態様において、親オリゴヌクレオチドは、共通の立体定義モチーフを含むサブライブラリーであり得る。
立体定義変異体（子オリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチドの立体定義変異体は、親オリゴヌクレオチドと同じ配列及びヌクレオシド修飾（すなわち、同じ配列及びヌクレオシド修飾の化学及び設計）を保持するが、例えば１つ以上の立体定義ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（立体定義されたホスホロチオエート変異体）のように１つ以上の立体定義ヌクレオシド間結合が異なるオリゴヌクレオチドである。
立体定義された変異体は、サブライブラリーであっても、完全に立体定義されたオリゴヌクレオチドであってもよい。
立体定義されたオリゴヌクレオチドのサブライブラリー
立体ランダムオリゴヌクレオチド及び立体定義オリゴヌクレオチドの両方を含むオリゴヌクレオチドは、本明細書ではサブライブラリーと呼ばれる。サブライブラリーは、完全に立体ランダムなオリゴヌクレオチドのジアステレオ異性体混合物のそれほど複雑ではない混合物であり、従って全ての可能なジアステレオ異性体のサブセットを表す。例えば理論的には、完全なホスホロチオエートの立体ランダム１６量体は２15（３２７６８）個のジアステレオ異性体の混合物であるが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の１つが立体定義されているサブライブラリーは、１００％の立体選択的な結合効率を仮定すると、ライブラリーの複雑さの半分（１６３８４個のジアステレオ異性体）、（２つの立体定義された結合＝８１９２個のジアステレオ異性体；３つの立体定義された結合＝４０９６個のジアステレオ異性体；４つの立体定義された結合＝２０４８個のジアステレオ異性体；５つの立体定義された結合＝１０２４個のジアステレオ異性体）を有するであろう。
完全に立体定義されたオリゴヌクレオチド
完全に立体定義されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内に存在する全てのキラルヌクレオシド間結合が立体定義されたオリゴヌクレオチドである。完全に立体定義されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内に存在する全てのキラルヌクレオシド間結合が立体定義されたホスホロチオエートヌクレオシド間結合であるオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施態様において、完全に立体定義されたオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合などの１つ以上の非キラルヌクレオシド間結合を含み、例えばホスホジエステル結合はギャップマーのフランキング領域内で、及び／又は末端ヌクレオシドを結合するときは、ギャップマー配列とコンジュゲート基を結合させるＤＮＡヌクレオシドの短い領域（生体切断可能リンカー）間で、使用できることが理解されよう。
完全に立体定義されたオリゴヌクレオチドのいくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド領域に存在する全てのヌクレオシド間結合、例えばＦ－Ｇ－Ｆ’ギャップマーは、立体定義ホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの立体定義ヌクレオシド間結合である。
相補性
「相補性」という用語は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン－クリック塩基対形成の能力を表す。ワトソン－クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）、及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含むことがあり、例えば５－メチルシトシンがしばしばシトシンの代わりに使用され、従って相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基間のワトソンクリック塩基対を含むことが理解されるであろう（例えばHirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol. 45 page 2055 and Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1を参照）。
本明細書で使用される「相補性％」という用語は、別の核酸分子（例えば、標的核酸）の所定の位置にある連続ヌクレオチド配列に対して、所定の位置で相補的である（すなわち、ワトソンクリック塩基対合する）核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列のパーセントのヌクレオチド数を指す。パーセントは、２つの配列の間で対を形成する（標的配列を５’－３’で、オリゴヌクレオチド配列を３’－５’で整列した場合）整列された塩基の数を、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。そのような比較において、整列しない（塩基対合しない）核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと呼ばれる。好ましくは、挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の相補性％の計算では考慮されない。
「完全に相補的」という用語は、１００％の相補性を指す。
以下は、標的核酸の領域と完全に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１２）の例である。
759 ctgtggatgcagatctgggaga 781 (配列番号１の759-781位)
||||||||||||||||
1 -3’-ACCTACGTCTAGACCC-5’--- 16 (配列番号１２)
同一性
本明細書で使用される「同一性」という用語は、別の核酸分子（例えば、標的核酸）の所定の位置にある連続ヌクレオチド配列に対して、所定の位置で同一である（すなわち、相補的ヌクレオシドとワトソンクリック塩基対合する能力で）核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列のパーセントのヌクレオチド数を指す。パーセントは、２つの配列の間で同一である整列された塩基の数を、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。同一性パーセント＝（一致数ｘ１００）／整列された領域の長さ。好ましくは、挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の相補性％の計算では考慮されない。
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドと標的核酸）が相対する鎖上の塩基対間で水素結合を形成し、こうして２本鎖を形成するものと理解されるべきである。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強さである。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と２本鎖形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）の観点から説明される。生理学的条件でＴｍは、親和性に厳密には比例しない（Mergny and Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537）。標準状態のギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連しており、ここでＲは気体定数、Ｔは絶対温度である。従ってオリゴヌクレオチドと標的核酸間の反応の非常に小さいΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液の濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７°Ｃである反応に関連するエネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは自発的な反応であり、自発的な反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Hansen et al., 1965,Chem. Comm. 36-38 and Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today に記載されている等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法を使用して実験的に測定できる。当業者は、ΔＧ°測定に市販の機器が利用可能であることを周知しているであろう。ΔＧ°はまた、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465 に記載されている最近傍モデルを使用して、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 及び McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405 により記載された適切に導かれた熱力学的パラメーターを使用して、数値的に推定することができる。ハイブリダイゼーションにより目的の核酸標的を調節する可能性を得るために、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さが１０～３０ヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドについて、－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施態様において、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態のギブス自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチドの長さであるオリゴヌクレオチドについて、－１０ｋｃａｌ未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、－２０ｋｃａｌ未満、－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズしてもよい。いくつかの実施態様においてオリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０ｋｃａｌ、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、又は－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
標的核酸
本発明によれば、同じオリゴヌクレオチドにより調節されるべき２つの標的核酸が存在する。これらの標的核酸は、ｉ）哺乳動物ＰＡＰＤ５をコードする核酸（標的核酸１）と、ｉｉ）哺乳動物ＰＡＰＤ７をコードする核酸（標的核酸２）である。標的核酸は、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ配列であり得る。適切には、標的核酸は、ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７タンパク質、特に哺乳類ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７、例えばヒト、サル、及びマウスのＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のプレｍＲＮＡ配列を提供するヒトＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７をコードする（例えば表１及び２を参照）。
いくつかの実施態様において、標的核酸は、配列番号１、３、及び／又は５、又はその天然に存在する変異体（例えば、哺乳動物ＰＡＰＤ５をコードする配列）から成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、標的核酸は、配列番号２、４、及び／又は６、又は１１、又はその天然に存在する変異体（例えば、哺乳類ＰＡＰＤ７をコードする配列）から成る群から選択される。
研究又は診断において本発明のオリゴヌクレオチドを使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。
インビボ又はインビトロでの適用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは通常は、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的核酸を発現している細胞内のＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的核酸の発現を阻害することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、通常はオリゴヌクレオチドの長さにわたって測定されたＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的核酸の保存領域に相補的であるが、任意選択的に１つ又は２つのミスマッチは除外され、そして任意選択的にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に連結し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’又はＤ’’）は除外される。例示的な標的核酸に関するさらなる情報は、表２に提供される。
標的配列
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチド又は核酸分子に相補的な核酸塩基配列を含む標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施態様において、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な標的核酸上の領域（すなわち、サブ配列）から成る。
本発明において標的配列は、ヒトＰＡＰＤ５及びヒトＰＡＰＤ７標的核酸の両方に存在する。従って標的配列は、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的核酸の両方に存在する２重特異的標的配列と呼ばれる場合がある。有利な実施態様において標的配列はまた、カニクイザル由来のＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７及び／又はマウス由来のＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７などの少なくとも１つの追加の種にも存在する。
本発明のオリゴヌクレオチド又は核酸分子は、本明細書に記載の標的配列などの標的核酸上の領域に相補的又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
オリゴヌクレオチドが相補的であるか又はハイブリダイズする標的核酸配列は、一般的に少なくとも１０ヌクレオチドの連続した核酸塩基のストレッチを含む。連続ヌクレオチド配列は、１０～５０ヌクレオチド、例えば１２～３０、例えば１３～２５、例えば１４～２０、例えば１５～１８の連続ヌクレオチドである。
天然に存在する変異体
「天然に存在する変異体」という用語は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７遺伝子又は転写物の変異体を指すが、例えば、同じアミノ酸をコードするコドンの多様性を引き起こす遺伝暗号の縮重により、又はプレｍＲＮＡの代替スプライシングにより、又は単一ヌクレオチド多型などの多型及び対立遺伝子変異体の存在により、異なっていてもよい。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対する十分な相補配列の存在に基づいて、標的核酸及びその天然に存在する変異体を標的とする場合がある。
いくつかの実施態様において、天然に存在する変異体は、例えば配列番号１、３、又は５から成る群から選択される標的核酸などの、哺乳動物ＰＡＰＤ５標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施態様において、天然に存在する変異体は、配列番号１のヒトＰＡＰＤ５標的核酸に対して少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施態様において、天然に存在する変異体は表３Ａに列記される多型である。
いくつかの実施態様において、天然に存在する変異体は、例えば配列番号２、４、又は６から成る群から選択される標的核酸などの、哺乳動物ＰＡＰＤ５標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施態様において、天然に存在する変異体は、配列番号２のヒトＰＡＰＤ７標的核酸に対して少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施態様において、天然に存在する変異体は表３Ｂに列記される多型である。
ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７遺伝子には多数の単一ヌクレオチド多型が知られており、例えば表３Ａ（ヒトＰＡＰＤ５ プレｍＲＮＡ開始／参照配列は配列番号１である）、及び表３Ｂ（ヒトＰＡＰＤ７ プレｍＲＮＡ開始／参照配列は配列番号２である）に開示されているものがある。
発現の調節
本明細書で使用される「発現の調節」という用語は、核酸分子の投与前のＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の量と比較して、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の量を変化させる核酸分子の能力の全体的な用語として理解される。あるいは発現の調節は、対照実験を参照することにより決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処理された個体若しくは標的細胞、又は非標的分子若しくは核酸分子（モック）で処理された個体若しくは標的細胞であることが一般的に理解されている。しかし、これは標準的な医療で治療されている個体でもよい。
調節の１つのタイプは、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子であり、例えばｍＲＮＡの分解、又は転写の遮断により、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の発現を阻害、ダウンレギュレート、低減、除去、停止、防止、軽減、低下、回避、又は終結する能力である。
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定した場合、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは修飾ヌクレオシド当たり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野で知られており、例えばＯｍｅやＭＯＥなどの２’置換ヌクレオシドなどの多くの２’糖修飾ヌクレオシド、及びロックされた核酸（ＬＮＡ）などの２’から４’架橋核酸が含まれる（例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213）。
糖の修飾
本発明の核酸分子は、修飾糖部分、すなわちＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較して糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含んでもよい。
主に親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などの核酸分子のいくつかの特性を改善することを目的として、リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが作製されている。
そのような修飾には、リボース環構造が、例えば一般的にリボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素間にビラジカル架橋を有するヘキソース環（ＨＮＡ）又は２環式環、又は一般的にＣ２炭素とＣ３炭素間に結合を欠く非結合リボース環（例えばＵＮＡ）を用いる置換により修飾されたものを含む。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）又は３環式核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）が含まれる。修飾されたヌクレオシドには、糖部分が、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合、非糖部分で置換されているヌクレオシドも含まれる。
糖修飾には、リボース環上の置換基を、水素以外の基、又はＲＮＡ又はＤＮＡヌクレオシドに自然に見られる－ＯＨ基に変更することによって行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’、又は５’位置で導入される。
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位置にＨ又は－ＯＨ以外の置換基を有する（２’置換ヌクレオシド）か、又はリボース環中の２’炭素と２番目の炭素の間に架橋を形成できる２’結合ビラジカル、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドを含む、ヌクレオシドである。
実際、２’置換ヌクレオシドの開発に多くの焦点が当てられており、多数の２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれると有益な特性を有することがわかっている。例えば２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに対する結合親和性の強化及び／又はヌクレアーゼ耐性の上昇をもたらす場合がある。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、及び Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937 を参照されたい。以下に、２’置換修飾ヌクレオシドの図を示す。
本発明に関して、２’置換はＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。
ロックされた核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、２’－糖修飾ヌクレオシドであり、これは、このヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を結合するビラジカル（「２’－４’ブリッジ」とも呼ばれる）を含み、又はリボース環のコンフォメーションを制限又はロックする。これらのヌクレオシドは、文献では架橋核酸又は２環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。リボースのコンフォメーションのロックは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の強化（２本鎖安定化）を引き起こす。これは、オリゴヌクレオチド／相補体２本鎖の融解温度を測定することにより、日常的に決定することができる。
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴマーの２’－糖修飾ヌクレオシド又はＬＮＡヌクレオシドは、式Ｉ又はＩＩの一般的構造を有する：
式中、Ｗは、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒa）－、－Ｃ（ＲaＲb）－から選択され、例えば、いくつかの実施態様において－Ｏ－から選択され；
Ｂは、核酸塩基又は修飾された核酸塩基部分を示し；
Ｚは、隣接ヌクレオシドチド又は５’末端基へのヌクレオシド間結合を示し；
Ｚ*は、隣接ヌクレオシド又は３’末端基へのヌクレオシド間結合を示し；
Ｘは、－Ｃ（ＲaＲb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒa）2－、Ｓ－、－ＳＯ2－、－Ｎ（Ｒa）－、及び＞Ｃ＝Ｚから成るリストから選択された基を示す。
いくつかの実施態様において、Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、ＮＨ－、ＮＲaＲb、－ＣＨ2－、ＣＲaＲb、－Ｃ（＝ＣＨ2）－、及び－Ｃ（＝ＣＲaＲb）－から成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、Ｘは－Ｏ－である。
Ｙは、－Ｃ（ＲaＲb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒa）2－、－Ｓ－、－ＳＯ２－、－Ｎ（Ｒa）－、及び＞Ｃ＝Ｚから成る群から選択される基を示す。
いくつかの実施態様において、Ｙは、－ＣＨ2－、－Ｃ（ＲaＲb）－、－ＣＨ2ＣＨ2－、－Ｃ（ＲaＲb）－Ｃ（ＲaＲb）－、－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2－、－Ｃ（ＲaＲb）Ｃ（ＲaＲb）Ｃ（ＲaＲb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）－、及び－Ｃ（Ｒa）＝Ｎ－から成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、Ｙは、－ＣＨ2－、－ＣＨＲa－、－ＣＨＣＨ3－、ＣＲaＲb－から成る群から選択されるか、
又は－Ｘ－Ｙ－は、一緒に２価のリンカー基（ラジカルとも呼ばれる）を示し、一緒に－Ｃ（ＲaＲb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｃ（Ｒb）－、－Ｃ（Ｒa）＝Ｎ－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒa）２－、－Ｓ－、－ＳＯ2－、－Ｎ（Ｒa）－、及び＞Ｃ＝Ｚから成る群から選択される１、２、３、又は４つの基／原子から成る２価リンカー基を示す。
いくつかの実施態様において、－Ｘ－Ｙ－は、以下から成る群から選択されるビラジカルを示す：－Ｘ－ＣＨ2－、－Ｘ－ＣＲaＲb－、－Ｘ－ＣＨＲa－、－Ｘ－Ｃ（ＨＣＨ3）－、－Ｏ－Ｙ－、－Ｏ－ＣＨ2－、－Ｓ－ＣＨ2－、－ＮＨ－ＣＨ2－、－Ｏ－ＣＨＣＨ3－、－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ3ＣＨ3）－、－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－、ＯＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ 、－Ｏ－ＣＨ2ＯＣＨ2－、－Ｏ－ＮＣＨ2－、－Ｃ（＝ＣＨ2）－ＣＨ2－、－ＮＲa－ＣＨ2－、Ｎ－Ｏ－ＣＨ2、－Ｓ－ＣＲaＲb－、及び－Ｓ－ＣＨＲa－。
いくつかの実施態様において、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ2－又は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ3）－を示し、
式中、Ｚは－Ｏ－、－Ｓ－、及び－Ｎ（Ｒa）－から選択され、
Ｒa及び存在する場合Ｒbは、それぞれ独立して、水素、任意に置換されたＣ1-6－アルキル、任意に置換されたＣ2-6－アルケニル、任意に置換されたＣ2-6－アルキニル、ヒドロキシ、任意に置換されたＣ1-6－アルコキシ、Ｃ2-6－アルコキシアルキル、Ｃ2-6－アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ1-6－アルコキシカルボニル、Ｃ1-6－アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ－カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ－カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ－、及びジ（Ｃ1-6－アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ1-6－アルキル）－アミノ－カルボニル、アミノ－Ｃ1-6－アルキル－アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ1-6－アルキル）アミノ－Ｃ1-6－アルキル－アミノカルボニル、Ｃ１－６－アルキル－カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ1-6－アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ1-6－アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ1-6－アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここでアリール及びヘテロアリールは任意に置換されてもよく、２つのジェミナル置換基Ｒa及びＲbは一緒に任、意に置換されたメチレン（＝ＣＨ2）を示してもよく、ここで全てのキラル中心について、不斉基はＲ又はＳ配向でもよい。
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は、独立して、水素、任意に置換されたＣ1-6－アルキル、任意に置換されたＣ2-6－アルケニル、任意に置換されたＣ2-6－アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ1-6－アルコキシ、Ｃ2-6－アルコキシアルキル、Ｃ2-6－アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ1-6－アルコキシカルボニル、Ｃ1-6－アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ－カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ－カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ－、及びジ（Ｃ1-6－アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ1-6－アルキル）－アミノ－カルボニル、アミノ－Ｃ1-6－アルキル－アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ1-6－アルキル）アミノ－Ｃ1-6－アルキル－アミノカルボニル、Ｃ１－６－アルキル－カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ1-6－アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ1-6－アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ1-6－アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここでアリール及びヘテロアリールは任意に置換されてもよく、２つのジェミナル置換基は一緒に、オキソ、チオキソ、イミノ、又は任意に置換されたメチレンを示してもよい。
いくつかの実施態様において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は、メチルなどのＣ1-6アルキル、及び水素から独立して選択される。
いくつかの実施態様において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。
いくつかの実施態様において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は全て水素であり、Ｒ5及びＲ5*のいずれかは水素であり、Ｒ5及びＲ5*の他方は水素以外、例えばメチルなどのＣ1-6アルキルである。
いくつかの実施態様において、Ｒaは水素又はメチルである。いくつかの実施態様において、存在する場合Ｒbは、水素又はメチルである。
いくつかの実施態様において、Ｒa及びＲbの一方又は両方が水素である。
いくつかの実施態様において、Ｒa及びＲbの一方は水素であり、他方は水素以外である。
いくつかの実施態様において、Ｒa及びＲbの一方はメチルであり、他方は水素である。
いくつかの実施態様において、Ｒa及びＲbの両方がメチルである。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ2－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、及びＷＯ２００４／０４６１６０（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示されており、β－Ｄ－オキシＬＮＡ及びアルファ－Ｌ－オキシＬＮＡヌクレオシドとして一般的に知られているものを含む。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｓ－ＣＨ2－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６及びＷＯ２００４／０４６１６０（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－ＮＨ－ＣＨ2－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６及びＷＯ２００４／０４６１６０（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－又は－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ００／０４７５９９及び Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示されており、一般的に２’－Ｏ－４’Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として知られているものを含む。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ2－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の全て、及びＲ５とＲ5*の一方は水素であり、Ｒ５とＲ5*の他方は水素以外、例えばメチルなどのＣ1-6アルキルである。そのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２００７／１３４１８１（これは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲaＲb－であり、ここでＲa及びＲbの一方又は両方は水素以外、例えばメチルであり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の全て及びＲ５とＲ5*のいずれかは水素であり、Ｒ5及びＲ5*の他方は水素以外、例えばメチルなどのＣ1-6アルキルである。そのようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２０１０／００７７５７８（これは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は２価リンカー基－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ2ＯＣＨ3）－２’Ｏ－メトキシエチル２環式核酸－（Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81）を示す。いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、２価リンカー基－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）－２’Ｏ－エチル２環式核酸－（Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81）を示す。いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨＲa－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ１００３６６９８及びＷＯ０７０９００７１（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ2ＯＣＨ3）－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、当該技術分野において環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても知られており、ＷＯ０７０９００７１に開示されている。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、Ｒ又はＳ配向のいずれかの２価リンカー基－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ3）－を示す。いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は一緒になって、２価リンカー基－Ｏ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ3）－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。そのような６’メチルＬＮＡヌクレオシドは、当技術分野でｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、ＷＯ０７０９００７１（ベータ－Ｄ）及びＷＯ２０１０／０３６６９８（アルファ－Ｌ）（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、（Ｓ）ｃＥＴ又は（Ｒ）ｃＥＴ立体異性体のいずれかであり得る。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲaＲb－であり、ＲaもＲbも水素ではなく、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。いくつかの実施態様において、Ｒa及びＲbは両方ともメチルである。そのような６’２置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２００９００６４７８（これは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｓ－ＣＨＲa－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。そのような６’置換チオＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ１１１５６２０２（これは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。いくつかの６’置換チオＬＮＡの実施態様において、Ｒaはメチルである。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｃ（＝ＣＨ2）－Ｃ（ＲaＲb）－、例えば－Ｃ（＝ＣＨ2）－ＣＨ2－、又は－Ｃ（＝ＣＨ2）－ＣＨ（ＣＨ3）であり、ＷはＯであり、及びＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ５、Ｒ5*は全て水素である。そのようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ０８１５４４０１及びＷＯ０９０６７６４７（これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｎ（－ＯＲa）－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。いくつかの実施態様において、ＲaはメチルなどのＣ1-6アルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはＮ置換ＬＮＡとしても知られており、ＷＯ２００８／１５０７２９（これは参照により本明細書に取り込まれる）に開示されている。いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は一緒になって、２価リンカー基－Ｏ－ＮＲa－ＣＨ3－を示す（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）。いくつかの実施態様において、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は－Ｎ（Ｒa）－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。いくつかの実施態様において、ＲaはメチルなどのＣ1-6アルキルである。
いくつかの実施態様において、Ｒ5及びＲ5*の一方又は両方は水素であり、置換される場合、Ｒ5及びＲ5*の他方はメチルなどのＣ1-6アルキルである。そのような実施態様において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は全て水素であってもよく、ビラジカル－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ2－又は－Ｏ－Ｃ（ＨＣＲa）－、例えば－Ｏ－Ｃ（ＨＣＨ3）－から選択されてもよい。
いくつかの実施態様において、ビラジカルは－ＣＲaＲb－Ｏ－ＣＲaＲb－、例えばＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。いくつかの実施態様において、ＲaはメチルなどのＣ1-6アルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、コンフォメーション的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）としても知られており、ＷＯ２０１３０３６６８６８（これは参照により本明細書に取り込まれる）に開示されている。
いくつかの実施態様において、ビラジカルは－Ｏ－ＣＲaＲb－Ｏ－ＣＲaＲb－、例えばＯ－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－であり、ＷはＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、及びＲ5*は全て水素である。いくつかの実施態様において、ＲaはメチルなどのＣ1-6アルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、ＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238（これは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
指定されない限り、ＬＮＡヌクレオシドがベータ－Ｄ又はアルファ－Ｌ立体異性体であり得ることは認識されるであろう。
非限定例のＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81、及び Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238に開示されている。
ＬＮＡヌクレオシドの特定の例をスキーム１に示す。
スキーム１
実施例に示されるように、本発明のいくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド中のＬＮＡヌクレオシドはベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドである。
ヌクレアーゼ仲介分解
ヌクレアーゼ仲介分解とは、相補的ヌクレオチド配列と２本鎖を形成するときに、このような配列の分解を仲介することができるオリゴヌクレオチドを指す。
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは標的核酸のヌクレアーゼ仲介分解を介して機能する場合があり、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えばＲＮａｓｅＨを動員することができる。ヌクレアーゼ仲介機構を介して機能するオリゴヌクレオチド設計の例は、一般的に少なくとも５又は６個の連続したＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマー、及びテールマーの片側又は両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。
ＲＮａｓｅＨ活性と動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅＨ活性とは、相補的ＲＮＡ分子と２本鎖状態である場合に、ＲＮａｓｅＨを動員する能力を指す。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮａｓｅＨを動員する能力を決定するために使用され得るＲＮａｓｅＨ活性を測定するためのインビトロ方法を提供する。通常は、オリゴヌクレオチドが相補的標的核酸配列とともに提供されたときに、試験対象の修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを使用して、ＷＯ０１／２３６１３（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用して測定される初期速度（ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される）の、少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、又は２０％以上の初期速度を有するなら、オリゴヌクレオチドはＲＨａｓｅＨを動員することができると見なされる。ＲＨａｓｅＨ活性の測定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅＨ１が、Lubio Science GmbH, Lucerne, Switzerlandから入手できる。
ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよい。アンチセンスギャップマーは一般的に、ＲＮａｓｅＨに仲介される分解により標的核酸を阻害するために使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの異なる構造領域である、５'－フランク、ギャップ、及び３'－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ'を「５→３」方向に含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５'フランキング領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３'フランキング領域（Ｆ'）が両側に存在する。領域Ｆ及びＦ'中の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める（すなわち、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'中の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡ及び２'糖－ＭＯＥから独立して選択されるような高親和性２'糖修飾などの２'糖修飾ヌクレオシドである。
ギャップマー設計では、ギャップ領域の最も５'及び３'側のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオチシドであり、それぞれ５'（Ｆ）又は３'（Ｆ'）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置される。フランクは、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５'フランクの５'末端と３'フランクの３'末端に、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することでさらに定義できる。
領域Ｆ－Ｇ－Ｆ'は連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ'のギャップマー領域を含み得る。
ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ'の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１４～１７、例えば１６～１８ヌクレオシドであり得る。
例えば、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式：
F1-8-G5-16-F'1-8、例えばF1-8-G7-16-F'2-8
で表すことができるが、但し、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ'の全長は、少なくとも１２ヌクレオチド、例えば少なくとも１４ヌクレオチドの長さでなければならない。
領域Ｆ、Ｇ、及びＦ'は以下でさらに定義され、Ｆ－Ｇ－Ｆ'の式に組み込むことができる。
ギャップマー－ギャップ、領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがヒトＲＮａｓｅＨ１などのＲＮａｓｅＨを動員できるようにするヌクレオシドの領域（通常はＤＮＡヌクレオシド）である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡの間の２本鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。適切にはギャップマーは、長さが少なくとも５又は６個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５～１６個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６～１５個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７～１４個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８～１２個の連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば例えば８～１２個の連続ＤＮＡヌクレオチドを有し得る。ギャップ領域Ｇは、いくつかの実施態様において、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個の連続ＤＮＡヌクレオシドからなり得る。ギャップ領域のシトシン（Ｃ）ＤＮＡはメチル化されている場合があり、そのような残基は５－メチルシトシン（meＣ又はｃの代わりにｅが付いている）と注記されている。潜在的な毒性を減らすためにギャップにｃｇジヌクレオチドが存在する場合、ギャップ内のシトシンＤＮＡのメチル化は有利であり、修飾がオリゴヌクレオチドの有効性に大きな影響を与えるとは考えられない。
いくつかの実施態様において、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個の連続ホスホロチオエート結合ＤＮＡヌクレオシドからなり得る。いくつかの実施態様において、ギャップ内のヌクレオシド間結合は全てホスホロチオエート結合である。
従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で使用された場合、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾ヌクレオシドの例が数多くある。ギャップ領域内に含まれる場合にＲＮａｓｅＨを動員することができると報告されている修飾ヌクレオシドには、例えばアルファ－Ｌ－ＬＮＡ、Ｃ４'アルキル化ＤＮＡ（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９及びVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300に記載されており、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）、アラビノース由来のヌクレオシド、例えばＡＮＡ及び２'糖Ｆ－ＡＮＡ（Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661）、ＵＮＡ（ロック解除された核酸）（Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。ＵＮＡはロック解除された核酸であり、通常はリボースのＣ２とＣ３間の結合が除去されており、ロック解除された「糖」残基が形成される。そのようなギャップマーで使用される修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域に導入されると２'糖末端（ＤＮＡ様）構造をとり、すなわちＲＮａｓｅＨの動員を可能にするヌクレオシドである可能性がある。いくつかの実施態様において本明細書に記載のＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、ギャップ領域に導入されたときに２'糖末端（ＤＮＡ様）構造をとる１～３個の糖修飾ヌクレオシドを任意選択的に含んでもよい。
領域Ｇ－「ギャップブレーカー」
あるいは、ＲＮａｓｅＨ活性をいくらか保持しながら、ギャップマーのギャップ領域に３'末端コンフォメーションを付与する修飾ヌクレオシドの挿入に関する多数の報告がある。１つ以上の３'末端修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するそのようなギャップマーは、「ギャップブレイカー」又は「ギャップ破壊」ギャップマーと呼ばれる。例えば、ＷＯ２０１３／０２２９８４を参照。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨの動員を可能にするために、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持する。ＲＮａｓｅＨを動員するギャップブレイカーオリゴヌクレオチド設計の能力は、通常は配列特異的又は化合物特異的である。Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487を参照されたい。これは、場合によっては標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレイカー」オリゴヌクレオチドを開示している。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、３'末端コンフォメーションを与える修飾ヌクレオシド、例えば２'糖－Ｏ－メチル（ＯＭｅ）又は２'糖－Ｏ－ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、又はベータ－Ｄ ＬＮＡヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２'とＣ４'の間のブリッジはベータコンフォメーションにある）、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドであり得る。
上記の領域Ｇを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカー又はギャップ破壊ギャップマーのギャップ領域は、ギャップの５'末端（領域Ｆの３'ヌクレオシドに隣接）にＤＮＡヌクレオシドを有し、ギャップの３'末端（領域Ｆ'の５'ヌクレオシドに隣接）にＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊されたギャップを含むギャップマーは、通常はギャップ領域の５'末端又は３'末端のいずれかで、少なくとも３又は４つの連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
ギャップブレイカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計には、
F1-8-[D3-4-E1- D 3-4]-F'1-8
F1-8- [D 1-4-E1- D 3-4]-F'1-8
F1-8- [D 3-4-E1- D 1-4]-F'1-8
が含まれ ここで、領域Ｇはブラケット［Ｄn－Ｅr－Ｄm］内にあり、ＤはＤＮＡヌクレオシドの連続配列であり、Ｅは修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカー又はギャップ破壊ヌクレオシド）であり、Ｆ及びＦ'は本明細書で定義されるフランキング領域であるが、但し、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ'の全長は、少なくとも１２ヌクレオチド、例えば少なくとも１４ヌクレオチドの長さでなければならない。
いくつかの実施態様において、ギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも６個のＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のＤＮＡヌクレオシドを含む。上記のように、ＤＮＡヌクレオシドは連続していてもよいし、又は任意選択的に１つ以上の修飾ヌクレオシドが点在していてもよいが、但しギャップ領域ＧはＲＮａｓｅＨ動員を仲介できなければならない。
ギャップマー－フランキング領域、Ｆ及びＦ'
領域Ｆは、領域Ｇの５'ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に位置する。領域Ｆの最も３'側のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２'糖置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。
領域Ｆ'は、領域Ｇの３'ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に位置する。領域Ｆ'の最も５'側のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２'糖置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド、又はＬＮＡヌクレオシドである。
領域Ｆは、長さが１～８個の連続ヌクレオチドで、例えば１～６個、例えば２～６個、例えば３～４個の連続ヌクレオチドの長さである。有利には、領域Ｆの最も５'側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆの２つの最も５'側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆの最も５'側のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆの２つの最も５'側のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆの２つの最も５'側のヌクレオシドは２'糖置換ヌクレオシド、例えば２つの３'ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆの最も５'側のヌクレオシドは２'糖置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
領域Ｆ'は、長さが２～８個の連続ヌクレオチドで、例えば３～６個、例えば４～５個の連続ヌクレオチドの長さである。有利には、領域Ｆ'の最も３'側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆ'の２つの最も３'側のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆ'の２つの最も３'側のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆ'の最も３'側のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆ'の２つの最も３'側のヌクレオシドは２'糖置換ヌクレオシド、例えば２つの３'ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆ'の最も３'側のヌクレオシドは２'糖置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
領域Ｆ又はＦ'の長さが１の場合、これは有利にはＬＮＡヌクレオシドであることに注意されたい。
いくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列から成るか又はそれを含む。いくつかの実施態様において、独立して、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、２'糖－Ｏ－アルキル－ＲＮＡユニット、２'糖－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２'糖－アミノ－ＤＮＡユニット、２'糖－フルオロ－ＤＮＡユニット、２'糖－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥユニット、ＬＮＡユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、及び２'糖－フルオロ－ＡＮＡユニットから選択され得る。
いくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'は、独立して、ＬＮＡ及び２'糖置換修飾ヌクレオシドの両方を含む（混合ウィング設計）。
いくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'は、１種類のみの糖修飾ヌクレオシドから、例えばＭＯＥのみ、又はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡのみ、又はＳｃＥＴのみから成る。このような設計はまた、均一フランク又は均一ギャップマー設計とも呼ばれる。
いくつかの実施態様において、領域Ｆ又はＦ'の、あるいはＦ及びＦ'の、全てのヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドであり、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される。いくつかの実施態様において領域Ｆは、１～５、例えば２～４個、例えば３～４個、例えば１、２、３、４、又は５個の連続ＬＮＡヌクレオシドから成る。いくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'の全てのヌクレオシドはベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである。
いくつかの実施態様において、領域Ｆ又はＦ'の、あるいはＦ及びＦ'の、全てのヌクレオシドは２'糖置換ヌクレオシドであり、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、又は８個の連続したＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドから成る。いくつかの実施態様において、フランキング領域の１つのみが２'糖置換ヌクレオシドから、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドから成る。いくつかの実施態様において、５'（Ｆ）フランキング領域は、２'糖置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドから成り、一方３'（Ｆ'）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様において、３'（Ｆ'）フランキング領域は、２'糖置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドから成り、一方５'（Ｆ'）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。
いくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'の全ての修飾ヌクレオシドは、例えばβ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡ、又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択されるＬＮＡヌクレオシドであり、一方領域Ｆ又はＦ'あるいはＦ及びＦ'は、任意選択的にＤＮＡヌクレオシドを含む（交互のフランク、詳細についてはこれらの定義を参照）。いくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'の全ての修飾ヌクレオシドはベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、一方、領域Ｆ又はＦ'あるいはＦ及びＦ'は、任意選択的にＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい（交互のフランク、詳細についてはこれらの定義を参照）。
いくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'の最も５'側及び最も３'側のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド又はＳｃＥＴヌクレオシドである。
いくつかの実施態様において、領域Ｆと領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様において、領域Ｆ'と領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様において、領域Ｆ又はＦ'、Ｆ及びＦ'のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
さらなるギャップマー設計は、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ２００７／１４６５１１、及びＷＯ２００８／１１３８３２に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ'の一方又は両方がＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれから成るギャップマーである。ベータ－Ｄ－オキシギャップマーは、領域ＦとＦ'の一方又は両方がベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれから成るギャップマーである。
いくつかの実施態様において、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］1-5－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］1-5であり、ここで領域Ｇは、ギャップマー領域Ｇの定義で定義されている通りである。
いくつかの実施態様において、ＬＮＡはベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡであり、ギャップマーは次式を有する：
F2-5 LNA, 0-2 DNA-G7-11 DNA-F'3-5 LNA, 0-2 DNA。
ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ'がＭＯＥヌクレオシドから成るギャップマーである。いくつかの実施態様において、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］1-8－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］1-8、例えば［ＭＯＥ］2-7－［領域Ｇ］5-16－［ＭＯＥ］2-7、例えば［ＭＯＥ］3-6－［領域Ｇ］－［ＭＯＥ］3-6であり、ここで、領域Ｇはギャップマーの定義で定義されている通りである。５－１０－５設計を有するＭＯＥギャップマー（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）は、当技術分野で広く使用されている。
混合ウィングギャップマー
混合ウィングギャップマーは、領域Ｆ及びＦ'の一方又は両方が、２'糖置換ヌクレオシド、例えば２'糖－Ｏ－アルキル－ＲＮＡユニット、２'糖－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２'糖－アミノ－ＤＮＡユニット、２'糖－フルオロ－ＤＮＡユニット、２'糖－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥユニット、アラビノ核酸（ＡＮＡ）ユニット、及び２'糖－フルオロ－ＡＮＡユニットから成る群から独立して選択される２'糖置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含む。領域Ｆ及びＦ'の少なくとも一方又は領域Ｆ及びＦ'の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡから成る群から独立して選択される。領域Ｆ及びＦ'の少なくとも一方又は領域Ｆ及びＦ'の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施態様において、領域Ｆ及びＦ'の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡから成る群から独立して選択される。いくつかの混合ウィング実施態様において、領域Ｆ及びＦ'の一方又は両方は、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。
混合ウィングギャップマー設計は、ＷＯ２００８／０４９０８５及びＷＯ２０１２／１０９３９５に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
交互フランクギャップマー
交互のフランクを有するオリゴヌクレオチドは、フランクの少なくとも１つ（Ｆ又はＦ'）がＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、領域Ｆ又はＦ'のうちの少なくとも一方又は領域Ｆ及びＦ'の両方は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様において、フランキング領域Ｆ又はＦ'あるいはＦ及びＦ'の両方は少なくとも３つのヌクレオシドを含み、ここでＦ及び／又はＦ'領域の最も５'側及び３'側のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。
いくつかの実施態様において、領域Ｆ又はＦ'のうちの少なくとも一方あるいは領域Ｆ及びＦ'の両方は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様において、フランキング領域Ｆ又はＦ'あるいはＦ及びＦ'の両方は少なくとも３つのヌクレオシドを含み、ここでＦ又はＦ'領域の最も５'側及び３'側のヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。ＬＮＡとＤＮＡヌクレオシドの両方を含むフランキング領域は、ＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むため、交互フランクと呼ばれる。交互フランクＬＮＡギャップマーはＷＯ２０１６／１２７００２に開示されている。
交互フランク領域は、最大３個の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば１～２個あるいは１又は２又は３個の連続ＤＮＡヌクレオシドを含んでもよい。
交互フランクには、一連の整数として注記することができ、これは、例えばいくつかのＬＮＡヌクレオシド（Ｌ）が続くいくつかのＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）を表し、例えばである：
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2。
オリゴヌクレオチド設計では、これらはしばしば数で表され、例えば２－２－１は５'［Ｌ］2－［Ｄ］2－［Ｌ］３'を表し、１－１－１－１－１は５'［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］－［Ｄ］－［Ｌ］３'を表す。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのフランクの長さ（領域Ｆ及びＦ'）は、独立して３～１０個のヌクレオシド、例えば４～８個、５～６個のヌクレオシド、例えば４、５、６、又は７個の修飾ヌクレオシドなどであり得る。いくつかの実施態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドのフランクの一方のみが交互であり、他方はＬＮＡヌクレオチドで構成される。追加のエキソヌクレアーゼ耐性を付与するために、３'フランク（Ｆ'）の３'末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利な場合がある。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのいくつかの例は次のとおりである：
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
ただし、ギャップマーの全長は、少なくとも１２ヌクレオチド、例えば少なくとも１４ヌクレオチドでなければならない。
オリゴヌクレオチドの領域Ｄ'又はＤ”
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様において、ギャップマーＦ－Ｇ－Ｆ'、さらに５'及び／又は３'ヌクレオシドなどの標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなってもよい。さらなる５'及び／又は３'ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもなくてもよい。そのようなさらなる５'及び／又は３'ヌクレオシドは、本明細書において領域Ｄ'及びＤ”と呼ぶことができる。
領域Ｄ'又はＤ”の追加は、ギャップマーなどの連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分又は別の官能基に結合する目的で使用されてもよい。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と結合するために使用される場合、これは生体切断可能なリンカーとして機能し得る。あるいは、これはエキソヌクレオシーゼ防御を提供するため、又は合成若しくは製造を容易にするために使用されてもよい。
領域Ｄ'及びＤ”は、領域Ｆの５'末端又は領域Ｆ'の３'末端にそれぞれ結合させて、次の式Ｄ'－Ｆ－Ｇ－Ｆ'、Ｆ－Ｇ－Ｆ'－Ｄ”、又はＤ'－Ｆ－Ｇ－Ｆ'－Ｄ”の設計を生成することができる。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ'はオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ'又はＤ”はオリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
領域Ｄ'又はＤ”は、標的核酸に相補的又は非相補的であり得る１、２、３、４、又は５個の追加のヌクレオチドを、独立して含むか又はそれからなってもよい。Ｆ又はＦ'領域に隣接するヌクレオチドは、例えばＤＮＡやＲＮＡなどの糖修飾ヌクレオチドではなく、又はこれらの塩基修飾バージョンでもない。Ｄ'又はＤ'領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとして機能し得る（リンカーの定義を参照）。いくつかの実施態様において、追加の５'及び／又は３'末端ヌクレオチドはホスホジエステル結合で結合され、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ'又はＤ”としての使用に適したヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、ＷＯ２０１４／０７６１９５に開示されており、これには、例えば、ホスホジエステルで結合したＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は、ＷＯ２０１５／１１３９２２に開示されており、ここで、これらは単一のオリゴヌクレオチド内で複数のアンチセンス構築物（例えばギャップマー領域）を連結するために使用される。
１つの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ'及び／又はＤ”を含む。
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは以下の式により表され得る：
F-G-F'; 特に F1-8-G5-16-F'2-8
D'-F-G-F', 特に D'1-3-F1-8-G5-16-F'2-8
F-G-F'-D”, 特に F1-8-G5-16-F'2-8-D”1-3
D'-F-G-F'-D”, 特に D'1-3- F1-8-G5-16-F'2-8-D”1-3。
いくつかの実施態様において、領域Ｄ'と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施態様において、領域Ｆ'と領域Ｄ”との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。
１つ以上の非ヌクレオチド部分への本発明のオリゴヌクレオチドの結合は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み、又は安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善する可能性がある。いくつかの実施態様においてコンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、生物学的利用能、代謝、排泄、透過性、及び／又は細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改変又は増強する。特にコンジュゲートはオリゴヌクレオチドを、特定の器官、組織、又は細胞タイプに標的化し、こうしてその器官、組織、又は細胞使用リンにおけるオリゴヌクレオチドの有効性を高めることができる。同時にコンジュゲートは、非標的細胞タイプ、組織又は器官におけるオリゴヌクレオチドの活性を、例えば標的活性、又は非標的細胞タイプ、組織、又は器官における活性を低下させるのに役立ち得る。
ＷＯ９３／０７８８３及びＷＯ２０１３／０３３２３０（これらは参照により本明細書に組み込まれる）は、適切なコンジュゲート部分を提供する。さらに適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合できるものである。特に３価Ｎ－アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲへの結合に適しており、例えばＷＯ２０１４／０７６１９６、ＷＯ２０１４／２０７２３２、及びＷＯ２０１４／１７９６２０（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そのようなコンジュゲートは、腎臓でのオリゴヌクレオチドの存在を低減しながら、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取り込みを強化する働きをし、こうして同じオリゴヌクレオチドの非結合バージョンと比較して、結合オリゴヌクレオチドの肝臓／腎臓比を増加させる。
ある実施態様において、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬剤物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、又はそれらの組み合わせから成る群から選択される。
コンジュゲートリンカー
結合又はリンカーは、１つの化学基又は目的のセグメントを、１つ以上の共有結合を介して別の化学基又は目的のセグメントに結合する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接オリゴヌクレオチドに又は結合部分（例えば、リンカー又はテザー）を介して結合させ得る。リンカーは、１つの領域、例えばコンジュゲート部分を別の領域、例えばオリゴヌクレオチド（例えば、領域Ａ又はＣの末端）に共有結合させる役割を果たす。
本発明のいくつかの実施態様において、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に位置するリンカー領域を任意選択的に含むことができる。いくつかの実施態様において、コンジュゲートとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーは生体切断可能である。リンカーとオリゴヌクレオチドは、しばしばホスホジエステル結合を介して結合される。
生体切断可能リンカー（領域Ｂ）は、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件又は遭遇する条件に類似する条件下で切断可能な生理学的に不安定な結合を含むか又はそれから成る。生理学的に不安定なリンカーが化学変換（例えば切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化条件若しくは還元条件、又は薬剤などの化学条件、及び哺乳動物細胞で遭遇するか又はそれに類似する塩濃度が含まれる。哺乳類の細胞内条件にはまた、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳類細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。１つの実施態様において、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断を受けやすい。好ましい態様において、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１～１０個のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオシド、より好ましくは２～６個のヌクレオシド、最も好ましくは、少なくとも２つの連続ホスホジエステル結合、例えば少なくとも３又は４又は５個の連続ホスホジエステル結合を含む２～４個の結合ヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡである。
１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間のリンカーは、アンチセンス化合物の連続ヌクレオチド配列の５'又は３'末端にある２～５個の連続ホスホジエステル結合ヌクレオシドから成る生理学的に不安定なリンカーである。いくつかの実施態様において、連続ホスホジエステル結合は、配列ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、又はＧＧから成る群から選択される配列を有するジヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、連続するホスホジエステル結合は、配列ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＧＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＴＡＡ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＴＡ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＴＡＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＧＡ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＣＡＡ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＴＴ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、ＣＡＧ、ＧＴＡ、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＧＡ、ＧＧＴ、ＧＧＣ、又はＧＧＧのトリヌクレオチドである。特定の例において、３つの連続ホスホジエステル結合を有するホスホジエステル結合ＣＡジヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列とコンジュゲート部分との間の生体切断可能リンカーとして使用されてきた。生体切断可能リンカーを含むホスホジエステルは、ＷＯ２０１４／０７６１９５（参照により本明細書に組み込まれる）に、より詳細に記載されている。生体切断可能リンカーを有するコンジュゲート化合物では、標準と比較した場合に、オリゴヌクレオチドから、コンジュゲート部分の少なくとも約５０％がオリゴヌクレオチドから切断され、例えば少なくとも約６０％が切断され、例えば少なくとも約７０％が切断され、例えば少なくとも約８０％が切断され、例えば少なくとも約９０％が切断され、例えば少なくとも約９５％のコンジュゲート部分が切断される。
コンジュゲートはまた、非生体切断可能リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合されてもよく、又はいくつかの実施態様においてコンジュゲートは、生体切断可能リンカーに共有結合した非切断性リンカーを含んでもよい。必ずしも生体切断可能ではないリンカーは、主に、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチド又は生物分解性リンカーに共有結合するのに役立ち、コンジュゲート部分とオリゴヌクレオチドの間にある程度の距離を生成する可能性がある。いくつかのリンカーの例（領域Ｙ）には、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、６－アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸ又はＡＨＡ）、６－アミノヘキシルオキシ、４－アミノ酪酸、４－アミノシクロヘキシルカルボン酸、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミド－カプロエート）（ＬＣＳＭＣＣ）、スクシンイミジルｍ－マレイミド－ベンゾイレート（ＭＢＳ）、スクシンイミジルＮ－ｅ－マレイミドカプロイレート（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル６－（ベータ－マレイミド－プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジルＮ－（ａ－マレイミドアセテート）（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ベータ－アラニン（ベータ－ＡＬＡ）、フェニルグリシン（ＰＨＧ）、４－アミノシクロヘキサン酸（ＡＣＨＣ）、ベータ－（シクロプロピル）アラニン（ベータ－ＣＹＰＲ）、アミノドデカン酸（ＡＤＣ）、アリレンジオール、ポリエチレングリコール、アミノ酸などがある。非切断可能リンカーはまた、エチレングリコール、アミノ酸単位、又はアミノアルキル基などの繰り返し単位の鎖構造又はオリゴマーを含んでもよい。いくつかの実施態様において、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ6～Ｃ12アミノアルキル基を含むＣ2～Ｃ36アミノアルキル基などのアミノアルキルである。いくつかの実施態様において、リンカー（領域Ｙ）はＣ6アミノアルキル基（Ｃ６リンカーとも呼ばれる）である。コンジュゲートリンカー基は、アミノ修飾オリゴヌクレオチド及びコンジュゲート基上の活性化されたエステル基の使用を介して、オリゴヌクレオチドに日常的に結合され得る。アミノアルキルとオリゴヌクレオチドとの間の結合基は、例えば、ホスホロチオエート又はホスホジエステル、又は本明細書で言及される他のヌクレオシド結合基の１つであり得る。本発明のコンジュゲート化合物は、以下の領域Ｃ－Ｂ－Ａ（コンジュゲート部分－生体切断可能リンカー－オリゴヌクレオチド／連続ヌクレオチド配列）又はＣ－Ｙ－Ｂ－Ａ（コンジュゲート部分－非切断可能リンカー－生体切断可能リンカー－オリゴヌクレオチド／連続ヌクレオチド配列）から構成されてもよい。
治療
本明細書で使用される「治療」、「治療している」、「治療する」などの用語は、一般的に所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的又は完全に治癒するという点で治療的である。本明細書で使用される「治療」という用語は、被験体の疾患のあらゆる治療を包含し、以下を含む：（ａ）疾患を阻害する、すなわちＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの増加の阻害のようにその成長を停止させる；又は（ｂ）ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ産生の抑制のように、疾患を改善（すなわち緩和）する、すなわち疾患の退縮を引き起こす。従って、ＨＢＶ感染症を改善及び／又は阻害する化合物は、ＨＢＶ感染症を治療する化合物である。好ましくは、本明細書で使用される「治療」という用語は、すでに定義され現れたＨＢＶ感染の治療のように、すでに現れた障害の医学的介入に関する。
予防
本明細書において、用語「予防している」、「予防」、又は「予防する」は、予防的処置、すなわち、疾患を治癒させるおりも、予防することを目的とする手段又は操作に関する。予防とは、疾患又はその症状を完全又は部分的に予防するという点で、予防的である望ましい薬理学的及び／又は生理学的効果が得られることを意味する。従って、本明細書における「ＨＢＶ感染症の予防」には、被験体におけるＨＢＶ感染症の発生の予防、及びＨＢＶ感染の症状の発生の予防が含まれる。本発明では、特にＨＢＶに感染した母親の子供におけるＨＢＶ感染の予防が企図される。
患者
本発明の目的のために、「被験体」（又は「患者」）は脊椎動物であり得る。本発明の文脈において「被験体」という用語は、ヒト及び他の動物の両方、特に哺乳動物、及び他の生物を含む。すなわち本明細書で提供される手段及び方法は、ヒトの治療及び獣医学用途の両方に適用可能である。従って本明細書において、被験体は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ、又は霊長類などの動物であり得る。好ましくは、被験体は哺乳動物である。より好ましくは、被験体はヒトである。
ＨＢＶ感染
「Ｂ型肝炎ウイルス感染症」又は「ＨＢＶ感染症」という用語は、当技術分野で一般的に知られており、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ、肝臓に影響を及ぼす感染症を指す。ＨＢＶ感染症は急性又は慢性感染症である。一部の感染者は、最初の感染時に症状がなく、一部の感染者は嘔吐、黄ばんだ肌、疲労感、黒っぽい尿、及び腹痛を伴う病気を急速に発症する（“Hepatitis B Fact sheet N°204”. who.int. July 2014. Retrieved 4 November 2014）。多くの場合、これらの症状は数週間続き、死に至る可能性がある。症状が始まるまでに３０～１８０日かかる場合がある。出生前後に感染する人では、９０％が慢性Ｂ型肝炎感染を発症し、５歳以降に感染した人は１０％未満しか発症しない（“Hepatitis B FAQs for the Public - Transmission”, U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC), retrieved 2011-11-29、２０１１年１１月２９日に検索）。慢性疾患を有する人のほとんどは症状がない。しかし、最終的に肝硬変と肝臓がんが発症する可能性がある（Chang, 2007, Semin Fetal Neonatal Med, 12: 160-167）。これらの合併症により、慢性疾患の患者の１５～２５％が死亡する（“Hepatitis B Fact sheet N°204”. who.int. July 2014、２０１４年１１月４日検索）。本明細書において「ＨＢＶ感染症」という用語には、急性及び慢性のＢ型肝炎感染症が含まれる。「ＨＢＶ感染症」という用語には、ＨＢＶ感染症の初期感染の無症候期、症候期、並びに無症候性慢性期も含まれる。
化合物
本明細書において「化合物」という用語は、本発明によるＲＮＡｉ分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子、又はそのような核酸分子を含む任意のコンジュゲートを意味する。例えば本明細書では、化合物は、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
組成物
「組成物」という用語は、核酸分子化合物を記述するためにも使用され得る。核酸分子組成物は、２０％未満の不純物、好ましくは１５％又は１０％未満の不純物、より好ましくは９、８、７、又は６％未満の不純物、最も好ましくは５％未満の不純物を有する。不純物は、通常は１次核酸分子成分よりも１又は２ヌクレオチド短い（ｎ－１又はｎ－２）核酸分子である。
本発明は、非限定的な図面及び実施例を参照することによりさらに説明される。
発明の詳細な説明
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７は、ポリメラーゼβ様ヌクレオチジルトランスフェラーゼのスーパーファミリーに属する非標準的なポリ（Ａ）ポリメラーゼである。ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４９８１において、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７は、２つの小分子によるＨＢＶ感染中のＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の産生とＨＢＶ ＲＮＡの発現の阻害と、次にｓｉＲＮＡ化合物のプールによる確認により、ＨＢＶ感染症の阻害に関連する標的として同定された。ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４９８０において、ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７のいずれかを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載され、ＨＢＶ感染症のインビトロ阻害を達成するために組み合わされた。
本発明は、単一の核酸分子で両方の標的を阻害できるようにするために、ヒトＰＡＰＤ５及びヒトＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ間で共有される長さ１２～２２ヌクレオチドの標的配列を同定した。ヒトＰＡＰＤ５とヒトＰＡＰＤ７ プレｍＲＮＡの間に約４５００の共有標的部位がある。医薬的に許容し得る分子の生成に関して、オフターゲットの数、並びにインビボでの概念証明を可能にする他の種の保護、並びに有意な薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）モデル化などの他のパラメーターを考慮する必要がある。
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、インビトロ及びインビボでＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の両方の発現を阻害することができる新規のアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定した。このオリゴヌクレオチドは、ヒトＰＡＰＤ５及びヒトＰＡＰＤ７の両方に存在する長さ１６～２２ヌクレオチドの間の３つの標的部位の１つに相補的である。
阻害は、ＰＡＰＤ５をコードする標的核酸とＰＡＰＤ７をコードする標的核酸に、アンチセンスオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより達成される。有効であるために、同じ分子が２つの標的に同時にハイブリダイズする必要はないことが理解される。
標的核酸１は哺乳動物ＰＡＰＤ５配列、例えば配列番号１、３、及び５から成る群から選択される配列であり得る。
標的核酸２は哺乳動物ＰＡＰＤ７配列、例えば配列番号２、４、及び６から成る群から選択される配列であり得る。
いくつかの実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的１及び標的２を阻害又はダウンレギュレートすることにより、それらの発現を調節することができる。好ましくはそのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも５０％の発現の阻害、より好ましくは標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の阻害を引き起こす。いくつかの実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの発現レベルを、ＨｅＬａ細胞を使用してインビトロで少なくとも６５％～９８％、例えば７０％～９５％阻害することができ、この範囲の標的の低下は、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇなどのＨＢＶ抗原の低下と良好な相関を有するオリゴヌクレオチドを選択する観点から有用である。いくつかの実施態様において本発明の化合物は、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７タンパク質の発現レベルを、ＨｅＬａ細胞を使用してインビトロで少なくとも５０％阻害することができる。本明細書の「材料と方法」欄及び実施例は、ＨｅＬａ細胞中の標的ＲＮＡ阻害を測定するために使用できるアッセイを提供する。標的の調節は、オリゴヌクレオチドのギャップマー領域などの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列と、標的核酸の一方又は両方との間にミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７発現の所望の調節を示すのにまだ十分かもしれない。ミスマッチに起因する結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチドの長さの増加、及び／又はオリゴヌクレオチド配列内の標的への結合親和性を増加させ得る修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡを含む２'糖修飾ヌクレオシドなどの、結合親和性を増加させ得る修飾ヌクレオシドを含む。
本発明の態様は、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の両方の発現を阻害することができる１２～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１２～３２ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、配列番号１及び配列番号２の標的核酸又はその天然の変異体に対して、少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％など、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的な連続配列を含む。
１つの実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）であるか、又はいくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含み得る。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１及び配列番号２に存在する標的核酸領域に対して、少なくとも９３％相補的、例えば完全に（すなわち１００％）相補的な１２～２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４の標的核酸に対して、少なくとも９３％相補的、例えば完全に（すなわち１００％）相補的である。
いくつかの実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、及び配列番号６の標的核酸に対して、少なくとも９３％相補的、例えば完全に（すなわち１００％）相補的である。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の６４６６９～６９４２９位及び配列番号２の２９５１４～２９５３０位に対して１００％相補的である。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の６４６７０～６４６８５位及び配列番号２の２９５１５～２９５３０位に対して１００％相補的である。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の６９４１４～６９４２９位及び配列番号２の３０７３１～３０７４６位に対して１００％相補的である。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１の７５９～７８１位及び配列番号２の１０３２～１０５４位に対して１００％相補的である。
いくつかの実施態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１２～３２ヌクレオチド、例えば１４～２５、例えば１５～２２、例えば１６～２０の連続ヌクレオチドを含むか又はそれらから成る。
いくつかの実施態様において、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、長さが１２～２２、例えば１４～２０、例えば１６～２０、例えば１５～１８、例えば１６～１８、例えば１６～１７の連続ヌクレオチドを含むか又はそれらから成る標的核酸に対して相補的である。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２２個以下のヌクレオチド、例えば２０個以下のヌクレオチド、例えば１７個以下のヌクレオチドを含むか又はそれらから成る。本明細書で与えられる範囲は、範囲の端点を含むことを理解されたい。従って、オリゴヌクレオチドが１２～３２個のヌクレオチドを含むと言われている場合、１２個のヌクレオチドと３２個のヌクレオチドの両方が含まれる。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、長さ１２～３２のヌクレオチドを含むか又はそれから成り、配列番号７～１６から成る群から選択される配列に対して少なくとも９３％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、長さ１２～３２のヌクレオチドを含むか又はそれから成り、配列番号１７～１９から成る群から選択される配列に対して少なくとも９３％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１７又は１８の配列に対して少なくとも９３％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、長さ１２～３２のヌクレオチドを含むか又はそれから成る。
いくつかの実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列は、配列番号１９の配列に対して少なくとも９３％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、長さ１２～３２のヌクレオチドを含むか又はそれから成る。
さらなる態様において本発明は、アンチセンス鎖が、配列番号１７～１９から成る群から選択される配列に対して少なくとも９３％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有する、ｓｉＲＮＡ分子に関する。
さらなる態様において本発明は、その分子の領域が、配列番号１７～１９から成る群から選択される配列に対して少なくとも９３％の同一性、好ましくは１００％の同一性を有するｓｈＲＮＡ分子に関する。
連続核酸塩基配列（モチーフ配列）を修飾して、例えば標的核酸に対するヌクレアーゼ耐性及び／又は結合親和性を高めることができることが理解される。
高親和性修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるパターンは、一般的にオリゴヌクレオチド設計と呼ばれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを用いて設計される。有利には、高親和性修飾ヌクレオシドが使用される。
ある実施態様においてオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、又は少なくとも１６個の修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様においてオリゴヌクレオチドは、１～１０個の修飾ヌクレオシド、例えば２～９個の修飾ヌクレオシド、例えば３～８個の修飾ヌクレオシド、例えば４～７個の修飾ヌクレオシド、例えば６又は７個の修飾ヌクレオシドを含む。適切な修飾については、「定義」欄の「修飾ヌクレオシド」、「高親和性修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２'糖修飾」、及び「ロックされた核酸（ＬＮＡ）」に記載されている。
ある実施態様においてオリゴヌクレオチドは、２'糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２'糖－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２'糖－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２'糖－アルコキシ－ＲＮＡ、２'糖－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２'糖－アミノ－ＤＮＡ、２'糖－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２'糖－フルオロ－ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドから成る群から独立して選択される１つ以上の２'糖修飾ヌクレオシドを含む。１つ以上の修飾されたヌクレオシドがロックされた核酸（ＬＮＡ）であれば有利である。しばしば使用されるＬＮＡ ＬＮＡヌクレオシドはオキシ－ＬＮＡ又はｃＥＴである。
さらなる態様においてオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む。適切なヌクレオシド間修飾は、「定義」欄の「修飾ヌクレオシド間結合」に記載されている。連続するヌクレオチド配列内のなくとも７５％、例えば全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合であれば有利である。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドの連続配列中の全てのヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施態様において本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、又は８個のＬＮＡヌクレオシド、例えば２～６個のＬＮＡヌクレオシド、例えば３～７個のＬＮＡヌクレオシド、４～８個のＬＮＡヌクレオシド、又は３、４、５、６、７、又は８個のＬＮＡヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド中の修飾ヌクレオシドの少なくとも７５％はＬＮＡ修飾ヌクレオシドであり、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％の修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチド中の全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。さらなる実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡと、以下のＬＮＡヌクレオシドの１つ以上の両方を含むことができる：チオ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、ＳｃＥＴ、及び／又はベータ－Ｄ又はアルファ－Ｌ配向のいずれかのＥＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むことができる。さらなる実施態様において、全てのＬＮＡシトシンユニットは５－メチル－シトシンである。オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列のヌクレアーゼ安定性が、ヌクレオチド配列の５'末端に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド及び３'末端に少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを有することが有利である。
本発明の１つの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる。
本発明において、有利な構造設計は、「定義」欄の例えば「ギャップマー」、「ＬＮＡギャップマー」、「ＭＯＥギャップマー」、及び「混合ウィングギャップマー」、「交互フランクギャップマー」に記載されているギャップマー設計である。ギャップマー設計には、均一なフランク、混合ウィングのフランク、交互フランク、及びギャップブレーカー設計を有するギャップマーが含まれる。本発明では、本発明のオリゴヌクレオチドがＦ－Ｇ－Ｆ'設計を有するギャップマーであれば有利である。「定義」欄に記載されているＦ－Ｇ－Ｆ'設計に加えて、１つの設計は、Ｆ及びＦ'ウィング領域が独立して１～８個の２'糖修飾ヌクレオシドを含み、ＧがＲＮａｓｅＨを動員できる５～１６個のヌクレオシド間のギャップ領域であり得る。
いくつかの実施態様において、ギャップマーは、均一フランク又は交互フランクを有するＬＮＡギャップマーである。
本発明のいくつかの実施態様において、ＬＮＡギャップマーは、次の設計均一フランク設計から選択される：２－１１－３、２－１１－４、２－１２－２、２－１２－３、２－１３－２、２－９－６、３－１０－３、３－１０－４、３－１１－２、３－１１－３、３－１２－２、３－９－４、４－１０－２、４－１０－３、４－１１－２、４－７－５、４－８－４、４－９－３、５－１０－２、５－６－５、５－７－４、５－７－５、５－８－３、５－８－４、５－９－２、又は６－９－２。
本発明のいくつかの実施態様において、ＬＮＡギャップマーは、以下の交互のフランク設計から選択される：４－７－１－１－３、４－９－１－１－２、１－１－３－７－１－１－２、１－１－３－９－２、２－１－１－９－２、２－１－１－９－３。
表５及び７（「材料と方法」欄）は、各モチーフ配列の好適なデザインを列記する。
全ての場合において、「定義」欄の「オリゴヌクレオチドの領域Ｄ'又はＤ”」に記載されているように、Ｆ－Ｇ－Ｆ'設計にはさらに領域Ｄ'及び／又はＤ”が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマー領域の５'又は３'末端にＤＮＡユニットなどの１、２、又は３個のホスホジエステル結合ヌクレオシドユニットを有する。いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、２つの５'ホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオシドと、それに続く「定義」欄で定義されるＦ－Ｇ－Ｆ'ギャップマー領域から成る。「定義」欄に記載されているＤ'－Ｆ－Ｇ－Ｆ'－Ｄ”設計に加えて、１つの設計は、ａ）Ｆ領域の長さが１～６ヌクレオチドであり、２～５個の同一のＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ又はｃＥＴと、０～３個のＤＮＡヌクレオシドから成る、ｂ）Ｆ'領域の長さが２～６ヌクレオチドであり、２～５個の同一のＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ又はｃＥＴと、０～３個のＤＮＡヌクレオシドから成る、ｃ）Ｇ領域が５～１１、例えば７～１０個のＤＮＡヌクレオチドで構成される、ｄ）任意選択的に、領域Ｄ'は１～３のホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオシドで構成される、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。５'又は３'末端にホスホジエステル結合ＤＮＡユニットを含むオリゴヌクレオチドは結合に適しており、本明細書に記載のコンジュゲート部分をさらに含んでもよい。肝臓への送達については、ＡＳＧＰＲ標的化部分がコンジュゲート部分として特に有利である。詳細については、以下の「コンジュゲート」欄を参照されたい。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号７＿１～７＿８３（表５に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号８＿１～８＿８１（表５に列記されるオリゴヌクレオチド又はその医薬的に許容し得る塩を参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号９＿１～９＿１２（表５に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１０＿１～１０＿１８（表５に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１１＿１～１１＿２６（表５に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１２＿１～１２＿１５（表５に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１３＿１又は１３＿２（表５に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１４＿１～１４＿１３（表５に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１５＿１～１５＿２１（表５に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１６＿１～１６＿５（表５に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１７＿１～１７＿１８３（表７に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１８＿１～１８＿３１又は１８＿２５０～１８＿３６１（表７に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１８＿３２～１８＿２４９又は１８＿３６２～１８＿６１０（表７に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１９＿１～１９＿２２（表７に列記されたオリゴヌクレオチドを参照）を有するオリゴヌクレオチド化合物又はその医薬的に許容し得る塩から成る群から選択される。
本発明の１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１８＿１、１８＿５、１８＿１０、１８＿１５、１８＿１８、１８＿１９、１８＿２４、１８＿２７、１８＿３０、１８＿３４６、１８＿３４７、１８＿３５７、１７＿１０、１７＿１３７、及び１７＿１３９を有するオリゴヌクレオチド化合物から成る群から選択される。
本発明の１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１８＿１、１８＿１５、１８＿３０、１７＿１０、１７＿１３７、及び１７＿１３９を有するオリゴヌクレオチド化合物から成る群から選択される。
本発明のさらなる実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの立体定義されたヌクレオシド間結合、例えば立体定義ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み得る。
立体定義されたオリゴヌクレオチド変異体を生成する主な利点は、配列モチーフ全体の多様性を高め、親オリゴヌクレオチドと比較して医化学的特性が改善された立体定義されたオリゴヌクレオチドのサブライブラリーを含む立体定義されたオリゴヌクレオチドを選択できることである。
いくつかの実施態様において、改善された医化学的特性（又は改善された特性）は、強化された有効性、強化された比活性、強化された組織取り込み、強化された細胞取り込み、強化された有効性、変更された生体内分布、低下したオフターゲット作用、強化されたミスマッチ識別、低下した毒性、低下した免疫原性、変化した血清タンパク質結合、改善した作用持続時間、及び安定性の１つ以上から選択される。１つ以上の特性の改善は、立体ランダム親オリゴヌクレオチドなどの親オリゴヌクレオチドと比較して評価される。
いくつかの実施態様において、例えば強化されたＲＮａｓｅＨ活性、改善されたスプライス調節活性、又は改善されたマイクロＲＮＡ阻害などの、標的発現の調節に関与する細胞機構との改善された相互作用を介して、標的発現を調節するオリゴヌクレオチドの能力であり得る。
いくつかの実施態様において、改善された特性は、ＲＮａｓｅＨ特異性、ＲＮａｓｅＨ対立遺伝子識別（すなわち、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）及び／又はＲＮａｓｅＨ活性間の識別）である。いくつかの実施態様において、改善された特性は、ＲＮａｓｅＨ特異性、ＲＮａｓｅＨ対立遺伝子識別、及び／又はＲＮａｓｅＨ活性以外である。いくつかの実施態様において、改善された特性は、細胞内取り込みの改善である。いくつかの実施態様において、改善された特性は、細胞毒性又は肝毒性などの毒性の低下である。
親オリゴヌクレオチドと比較して１つ以上の改善された特性を示す立体定義されたオリゴヌクレオチド、又は他の立体定義されたオリゴヌクレオチドは、改善されたホスホロチオエート変異体と呼ばれる。
本発明のある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、化合物番号１８＿２２３、１８＿３６、１８＿１９６、１８＿１８８、１８＿２４３を有する化合物を有するオリゴヌクレオチドの群から選択される。
本発明のさらなる態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子は、これらを、２価又は３価のＧａｌＮＡｃクラスターなどのアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合することができるコンジュゲート部分に共有結合させることにより、肝臓を直接標的とすることができる。
コンジュゲート
ＨＢＶ感染は主に肝臓の肝細胞に影響を与えるため、非コンジュゲートオリゴヌクレオチドと比較して、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を増加させるコンジュゲート部分に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを結合させることが有利である。１つの実施態様において、肝臓標的化部分は、コレステロール若しくは他の脂質を含む部分、又はアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合することができるコンジュゲート部分から選択される。
いくつかの実施態様において本発明は、コンジュゲート部分に共有結合した本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを提供する。
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）コンジュゲート部分は、ガラクトース以上の親和性に等しいか又はそれ以上の親和性で、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧＲ標的化部分）に結合できる１つ以上の炭水化物部分を含む。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性が研究されている（例えば、Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686 を参照）か、又は当技術分野で一般的な方法を使用して容易に決定される。
１つの実施態様において、コンジュゲート部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクトサミンから成る群から選択される少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。
ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分を生成するために、ＡＳＰＧＲ標的化部分（好ましくはＧａｌＮＡｃ）をコンジュゲート足場に結合させ得る。一般的にＡＳＰＧＲ標的化部分は、足場と同じ側にあってもよい。１つの実施態様において、コンジュゲート部分はスペーサーに連結された２～４個の末端ＧａｌＮＡｃ部分から成り、スペーサーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合できる分岐体分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を連結する。
さらなる実施態様においてコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して１価、２価、３価、又は４価である。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。
コンジュゲート部分を構成するＡＳＰＧＲ標的化足場は、例えばＣ－Ｉ炭素を介してＧａｌＮＡｃ部分をスペーサーに連結することにより生成することができる。好ましいスペーサーは、柔軟な親水性スペーサーである（米国特許第５８８５９６８号；Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。好ましい柔軟な親水性スペーサーはＰＥＧスペーサーである。好ましいＰＥＧスペーサーはＰＥＧ３スペーサーである。分岐点は、２～３個のＧａｌＮＡｃ部分又は他のアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分の結合を可能にし、さらにオリゴヌクレオチドへの分岐点の結合を可能にする任意の小分子であり得、そのような構築物はＧａｌＮＡｃクラスター又はＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分と呼ばれる。例示的な分岐点群はジ－リジンである。ジリジン分子は、３つのアミン基を介して３つのＧａｌＮＡｃ部分又は他のアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分が結合できる３つのアミン基と、カルボキシル反応性基を介してジ－リジンがオリゴマーに結合できるカルボキシル反応性基を含む。Khorev, et al 2008 Bioorg. Med. Chem. Vol 16, pp. 5216 はまた、適切な３価分岐体の合成についても説明している。他の市販の分岐体は、１，３－ビス－［５－（４，４'－ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］プロピル－２－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］ホスホラミダイト（Glen Research Catalogue Number: 10-1920-xx）；トリス－２，２，２－［３－（４，４'－ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト（Glen Research Catalogue Number: 10-1922-xx）；及びトリス－２，２，２－１－［３－（４，４'－ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］メチレンオキシプロピル－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト；及び１－［５－（４，４'－ジメトキシ－トリチルオキシ）ペンチルアミド］－３－［５－フルオレノメトキシ－カルボニル－オキシ－ペンチルアミド］－プロピル－２－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト（Glen Research Catalogue Number: 10-1925-xx）である。
他のＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分には、例えば、ＷＯ２０１４／１７９６２０及びＷＯ２０１６／０５５６０１及びＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９０８０（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているもの、並びにＧａｌＮＡｃ部分が結合した小ペプチド、例えばＴｙｒ－Ｇｌｕ－ Ｇｌｕ－（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３；肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合するグリコトリペプチド（例えば、Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297 を参照）；リジンベースのガラクトースクラスター（例えば、L3G4; Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214）；及びコランベースのガラクトースクラスター（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体の炭水化物認識モチーフ）が含まれる。
ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分、特に３価のＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分は、当技術分野で知られている方法を使用してオリゴヌクレオチドの３'又は５'末端に結合させ得る。１つの実施態様において、ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの５'末端に連結される。
コンジュゲート部分（分岐体分子など）とオリゴヌクレオチドの間に、１つ以上のリンカーを挿入することができる。コンジュゲート部分とアンチセンスオリゴヌクレオチドの間に、任意選択的にＣ６リンカーなどの非切断可能リンカーと組み合わせて、生体切断可能リンカーを有することが有利である。リンカーは、「定義」欄の「コンジュゲートリンカー」に記載されているリンカーから選択することができ、特に生体切断可能な領域Ｄ'又はＤ”リンカーが有利である。
１つの実施態様において、コンジュゲート部分は、図１、特に図１Ｄに示されるような３価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。
本発明の１つの実施態様において、コンジュゲート化合物は「材料と方法」欄の表９の化合物の群から選択される。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～１２である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～１３である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～１４である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～１５である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～１６である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～１８である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～２０である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～２１である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～２２である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～３０である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～３５である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２０～３６である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２１～２である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２１～３３である。
本発明のある実施態様において、コンジュゲート化合物は化合物番号２１～３４である。
製造方法
さらなる態様において本発明は、ヌクレオチドユニットを反応させ、こうしてオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチドユニットを形成することを含む、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法を提供する。好ましくはこの方法は、ホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313 を参照）。さらなる実施態様において、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。さらなる態様において、本発明のオリゴヌクレオチド又は結合オリゴヌクレオチドを医薬的に許容し得る希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又は補助剤と混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
医薬組成物
さらなる態様において本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又はコンジュゲート化合物又はその塩、及び医薬的に許容し得る希釈剤、担体、塩、及び／又は補助剤を含む医薬組成物を提供する。一般的な医薬組成物は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート化合物を、希釈剤、担体、又は賦形剤を混合することにより調製される。
医薬的に許容し得る希釈剤には、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いくつかの実施態様において、医薬的に許容し得る希釈剤は、無菌のリン酸緩衝化生理食塩水である。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭ溶液の濃度で医薬的に許容し得る希釈剤中で使用される。
核酸分子については、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びこれらの適切な配合物を含むコンジュゲート化合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985 中に見いだされる。薬物送達方法の簡単な総説については、例えば、Langer (Science 249:1527-1533, 1990) を参照されたい。ＷＯ２００７／０３１０９１は、医薬的に許容し得る希釈剤、担体、及び補助剤のさらなる適切で好ましい例を提供する（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、ＷＯ２００７／０３１０９１に提供されている。
本発明による化合物は、それらの医薬的に許容し得る塩の形態で存在し得る。「医薬的に許容し得る塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持し、適切な非毒性有機若しくは無機酸又は有機若しくは無機塩基をから形成される、従来の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、及び硝酸などの無機酸に由来するもの、及びｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、及び４級アンモニウム水酸化物、例えば水酸化テトラメチルアンモニウムから誘導されるものが含まれる。塩への医薬化合物の化学修飾は、化合物の改善された物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性、及び溶解性を得るために、製薬化学者に公知の技術である。例えばこれは、Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435 or in Ansel, In: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed. (1995), pp. 196 and 1456-1457 に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の医薬的に許容し得る塩は、ナトリウム塩又はカリウム塩であり得る。
用途
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断薬、治療薬、及び予防薬のための研究試薬として利用され得る。
研究では、このようなオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えばインビトロ細胞培養物）及び実験動物におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７タンパク質の合成を特異的に調節することができ、こうして標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価が容易になる。一般的に標的の調節は、タンパク質を産生するｍＲＮＡを分解又は阻害することにより達成され、こうしてタンパク質の形成を防止するか、タンパク質を産生する遺伝子又はｍＲＮＡのモジュレーターを分解又は阻害する。
研究又は診断薬において本発明のオリゴヌクレオチドを使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。
また本発明には、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を発現している標的細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の発現を調節するためのインビボ又はインビトロの方法が含まれ、この方法は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物を有効な量で前記細胞に投与することを含む。
いくつかの実施態様において、標的細胞は哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、インビトロ細胞培養物又は哺乳動物の組織の一部を形成するインビボ細胞であり得る。好ましい実施態様において、標的細胞は肝臓に存在する。標的細胞は肝細胞であってもよい。
本発明の１つの態様は、医薬として使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物に関する。
本発明のある態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物は、ＨＢＶの増殖を阻害することができる。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のパラメーターの１つ以上に影響を与えることができるｉ）ウイルスＲＮＡの発現を低減；ｉｉ）ウイルスＲＮＡ（ＨＢＶ ＲＮＡ）に由来するウイルスＤＮＡ（ＨＢＶ ＤＮＡ）の産生を低減；ｉｉｉ）新しいウイルス粒子（ＨＢＶ粒子）の産生を低減；ｉｖ）ＨＢＶ抗原、特にＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの産生を低減。
例えば、ＨＢＶの増殖を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｉ）ウイルスＲＮＡ（ＨＢＶ ＲＮＡ）の発現を、対照と比較して少なくとも４０％、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減し得る；ｉｉ）ウイルスＤＮＡ（ＨＢＶ ＤＮＡ）の産生を、対照と比較して少なくとも４０％、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減し得る；ｉｉｉ）新しいウイルス粒子（ＨＢＶ粒子）の産生を、対照と比較して少なくとも４０％、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減し得る；又はｉｖ）ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの産生及び／又は分泌を、対照と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は一方又は両方の抗原の完全な枯渇まで、低減し得る。対照は、未処理の細胞又は動物、又は適切な対照で処理された細胞又は動物であり得る。
ＨＢＶの増殖の阻害は、ＨＢＶに感染したｄＨｅｐａＲＧ細胞又はＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞を使用してインビトロで、又は「材料と方法」欄で説明したＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルを使用して、マウスＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７に相補的なオリゴヌクレオチドについてインビボで測定することができる。ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇの分泌の阻害は、ＥＬＩＳＡにより、例えば製造業者の説明書に従ってCLIA ELISAキット（Autobio Diagnostic）を使用して製造業者の説明書に従って測定することができる。細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡの産生の阻害は、例えば「材料と方法」欄で説明されているようにリアルタイムＰＣＲにより測定することができる。試験化合物がＨＢＶの増殖を阻害するかどうかを評価するためのさらなる方法は、例えばＷＯ２０１５／１７３２０８又は「材料と方法」欄に記載されているＲＴ－ｑＰＣＲ；ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション法、又は免疫蛍光法により、ＨＢＶ ＤＮＡの分泌を測定する。
ＨＢｓＡｇ分泌の減少により、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物を、ＨＢＶ感染の発症の阻害に又は感染の治療に使用することができる。特に、ＨＢｅＡｇ分泌の阻害により、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物は、ＨＢｓＡｇの分泌のみを低下させる化合物と比較して、より効率的に慢性ＨＢＶ感染症の発症を阻害又は感染症を治療する。さらに、妊婦のＨＢｅＡｇを低下させると、子供の慢性ＨＢＶ感染症の発症も阻害される可能性がある。従って、ＨＢｅＡｇ分泌の減少により、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物は、慢性ＨＢＶ感染症の発症（ＨＢＶ感染した母親の子における慢性ＨＢＶ感染の発症など）を阻害し、ＨＢＶ感染者の感染性を低下させる。
従って、本発明の１つの態様は、ＨＢＶ感染個体におけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌を低下させるための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の使用に関する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物が、宿主ゲノムに組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡからのＨＢｓＡｇ発現を低下させることができれば有利である。
本発明のさらなる態様は、慢性ＨＢＶ感染症の発症を阻害又は感染症を治療するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の使用に関する。
本発明のさらなる態様は、ＨＢＶ感染者の感染性を低下させるための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の使用に関する。本発明の具体的な態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物は、ＨＢＶ感染した母親の子における慢性ＨＢＶ感染症の発症を阻害する。この母親は好ましくはＨＢｅＡｇ陽性である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物で治療される被験体（又は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物を予防的に投与される被験体）は、好ましくはヒト、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性及び／又はＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者、さらにより好ましくはＨＢｓＡｇ陽性かつＨＢｅＡｇ陽性のヒト患者である。前記ヒト患者は、妊婦、例えばＨＢｅＡｇ陽性及び／又はＨＢｓＡｇ陽性の妊婦、より好ましくはＨＢｅＡｇ陽性かつＨＢｓＡｇ陽性の妊婦である。
従って、本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の有効量を投与することを含む、ＨＢＶ感染症を治療及び／又は予防する方法に関する。
本発明はまた、薬剤、特にＨＢＶ感染又は慢性ＨＢＶ感染の治療又は予防、又はＨＢＶ感染者の感染力の低減に使用する薬剤の製造のための本発明の核酸分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の使用を提供する。好ましい実施態様において、薬剤は皮下投与用の剤形で製造される。
本発明はまた、薬剤が静脈内投与用の剤形である薬剤の製造のための、本発明の核酸分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、医薬組成物の使用を提供する。
本発明の核酸分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は医薬組成物は、併用療法で使用され得る。例えば本発明の核酸分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は医薬組成物は、他の抗ＨＢＶ剤、例えばインターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビル、又は最近出現している抗ＨＢＶ剤、例えばＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害剤、ＨＢｓＡｇ分泌阻害剤、ＨＢＶカプシド阻害剤、アンチセンスオリゴマー（例えばＷＯ２０１２／１４５６９７及びＷＯ２０１４／１７９６２９に記載）、ｓｉＲＮＡ（例えばＷＯ２００５／０１４８０６、ＷＯ２０１２／０２４１７０、ＷＯ２０１２／２０５５３６２、ＷＯ２０１３／００３５２０、ＷＯ２０１３／１５９１０９、ＷＯ２０１７／０２７３５０、及びＷＯ２０１７／０１５１７５に記載）、ＨＢＶ治療用ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ＨＢＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）、又はＨＢＶの治療及び／又は予防用のＴＬＲ２、３、７、８、又は９アゴニストと組み合わせることができる。
投与
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物は、良質な医学のための原則（good medical practice）と一致する方法で、処方、用量決定、及び投与される。これに関連して考慮すべき要因には、治療される具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、患者の年齢と性別、及び医療従事者が公知の他の要因が含まれる。本明細書において、「有効量」（「（治療的）有効用量」としても知られる）は、医師又は他の臨床医によって求められている被験体の生物学的又は医学的応答を誘発する化合物の量を意味する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物の「有効量」は、そのような考慮事項によって支配され、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇを阻害するのに必要な最小量である。例えば、そのような量は、受容者の細胞又は哺乳動物全体に対して毒性のある量よりも少ない場合がある。
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、又は１か月に１回でもよい。
本発明の核酸分子又は医薬組成物は、局所（例えば皮膚、吸入、眼、又は耳）又は経腸（例えば経口又は経消化管）、又は非経口（例えば静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、又は髄腔内）投与することができる。
好ましい実施態様において、本発明の核酸分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物、又は医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内注射又は注入を含む非経口経路により投与される。１つの実施態様において、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは静脈内投与される。ＧａｌＮＡｃコンジュゲート化合物では、皮下投与して、ＡＳＧＰ受容体の飽和を遅らせることが有利な場合がある。
併用療法
いくつかの実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療薬との併用療法で使用される。治療薬は、例えば、上記の疾患又は障害の標準治療であり得る。
例えば本発明のオリゴマー又はオリゴマーコンジュゲートは、他の活性物質、例えばアンチセンス（他のＬＮＡオリゴマーを含む）、ｓｉＲＮＡ（ＡＲＣ５２０など）、アプタマー、モルホリノ、又は他の抗ウイルス性のヌクレオチド配列依存性の作用機序を介して作用するオリゴヌクレオチドベースの抗ウイルス剤（配列特異的オリゴヌクレオチドベースの抗ウイルス剤など）と組み合わせて使用することができる。
さらに例えば、本発明のオリゴマー又はオリゴマーコンジュゲートは、インターフェロン（例えば、ペグ化インターフェロンアルファ）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ＧＳ－９６２０）、又は治療用ワクチンなどの免疫刺激性抗ウイルス化合物など、他の活性物質と組み合わせて使用することができる。
さらに例えば、本発明のオリゴマー又はオリゴマーコンジュゲートは、抗ウイルス活性を有する小分子などの他の活性物質と組み合わせて使用することができる。これらの他の活性物質は、例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド阻害剤（例えば、エンテカビル又はテノホビルジソプロキシルフマル酸塩）、キャプシド形成阻害剤、侵入阻害剤（例えば、Myrcludex B）であり得る。
特定の実施態様において、追加の治療薬は、ＨＢＶ剤、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）剤、化学療法剤、抗生物質、鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症（ＮＳＡＩＤ）剤、抗真菌剤、駆虫剤、抗吐き気剤、下痢止め剤、又は免疫抑制剤であり得る。
特定の関連する実施態様において、追加のＨＢＶ剤は、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）、リバビリン；ＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害剤；第２アンチセンスオリゴマー；ＨＢＶ治療ワクチン；ＨＢＶ予防ワクチン；ラミブジン（３ＴＣ）；エンテカビル（ＥＴＶ）；テノホビルジイソプロキシルフマル酸塩（ＴＤＦ）；テルビブジン（ＬｄＴ）；アデフォビル；又はＨＢＶ抗体療法（モノクローナル又はポリクローナル）であり得る。
他の具体的な関連する実施態様において、追加のＨＣＶ剤は、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－２ａ、及びインターフェロンアルファコン－１（ペグ化及び非ペグ化）；リバビリン；ペガシス；ＨＣＶ ＲＮＡ複製阻害剤（例えば、ViroPharmaのVP50406シリーズ）；ＨＣＶアンチセンス剤；ＨＣＶ治療ワクチン；ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤；ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤；又はＨＣＶモノクローナル若しくはポリクローナル抗体療法であり得る。
本発明の実施態様
本発明の以下の実施態様は、本明細書に記載の他の実施態様と組み合わせて使用することができる。
１． ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の両方の発現を阻害することができる、長さが１２～２２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、長さが１２～３２ヌクレオチドの核酸分子。
２． 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２の標的核酸に対して少なくとも９３％相補的である、実施態様１に記載の核酸分子。
３． 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号２の標的核酸に対して少なくとも１００％相補的である、実施態様１又は２に記載の核酸分子。
４． 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４の標的核酸に対して相補的である、実施態様１又は３に記載の核酸分子。
５． 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、及び配列番号６の標的核酸に対して相補的である、実施態様１又は３に記載の核酸分子。
６． 前記核酸分子が、配列番号１の７５９～７８１位及び配列番号２の１０３２～１０５４位に対して相補的である、実施態様１～３又は５に記載の核酸分子。
７． 前記核酸分子が、配列番号１の６４６６９～６９４２９位、及び配列番号２の２９５１４～２９５３０位に対して相補的である、実施態様１～４に記載の核酸分子。
８． 前記核酸分子が、配列番号１の６９４１４～６９４２９位、及び配列番号２の３０７３１～３０７４６位に対して相補的である、実施態様１～４に記載の核酸分子。
９． 実施態様１～８に記載の核酸分子は、－１５ｋｃａｌ未満のΔＧ°で、配列番号１及び配列番号２の標的核酸にハイブリダイズすることができる。
１０． 前記標的核酸がＲＮＡである、実施態様２～９に記載に核酸分子。
１１． 前記ＲＮＡがプレｍＲＮＡである、実施態様１０に記載の核酸分子。
１２． 前記核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡから選択される、実施態様１～１１に記載の核酸分子。
１３． 前記核酸分子が１本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施態様１～１１に記載の核酸分子。
１４． 前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１４個の連続ヌクレオチド、特に１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の連続ヌクレオチドを含むか又はそれから成る、実施態様１２又は１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１５． 前記連続ヌクレオチド配列が１４～２０個のヌクレオチドを含むか又はそれから成る、実施態様１２又は１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１６． 前記連続ヌクレオチド配列が、１６～１８個のヌクレオチドを含むか又はそれらから成る、実施態様１５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１７． 前記オリゴヌクレオチドが、長さ１４～２５のヌクレオチドを含むか又はそれから成る、実施態様１～１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１８． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さ１５～２２のヌクレオチドを含むか又はそれから成る、実施態様１７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１９． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さ１６～２０のヌクレオチドを含むか又はそれから成る、実施態様１７又は１８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２０． 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９から成る群より選択される配列を含むか又はそれから成る、実施態様１２～１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２１． 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６から成る群より選択される配列を含むか又はそれから成る、実施態様１２～２０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２２． 前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１７又は配列番号１８から選択される配列を含むか又はそれから成る、実施態様１２～２０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２３． 前記連続ヌクレオチド配列が配列番号１９を含むか又はそれから成る、実施態様１２～２０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２４． 前記連続ヌクレオチド配列が、それが相補的である標的核酸と比較して０～３個のミスマッチを有する、実施態様１２～２３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２５． 前記連続ヌクレオチド配列が、標的核酸と比較して１つのミスマッチを有する、実施態様２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２６． 前記連続ヌクレオチド配列が、標的核酸と比較して２つのミスマッチを有する、実施態様２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２７． 前記連続ヌクレオチド配列が、両方の標的核酸配列に対して完全に相補的である、実施態様２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２８． １つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、実施態様１２～２７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２９． 前記１つ以上の修飾ヌクレオシドが高親和性修飾ヌクレオシドである、実施態様２８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３０． 前記１つ以上の修飾ヌクレオシドが２'糖修飾ヌクレオシドである、実施態様２８又は２９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３１． 前記１つ以上の２'糖修飾ヌクレオシドが、２'糖－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２'糖－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２'糖－アルコキシ－ＲＮＡ、２'糖－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２'糖－アミノ－ＤＮＡ、２'糖－フルオロ－ＤＮＡ、２'糖－フルオロ－ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドから成る群から独立して選択される、実施態様３０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３２． 前記１つ以上の修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、実施態様２８～３１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３３． 前記修飾ＬＮＡヌクレオシドが、オキシ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、ｃＥＴ、及びＥＮＡから選択される、実施態様３２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３４． 前記修飾ＬＮＡヌクレオシドが、以下の２'糖－４'架橋－Ｏ－ＣＨ2－を有するオキシ－ＬＮＡである、実施態様３２又は３３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３５． 前記オキシ－ＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、実施態様３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３６． 前記修飾ＬＮＡヌクレオシドが以下の２'糖－４'架橋－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ3）－を有するｃＥＴである、実施態様３２又は３３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３７． 前記ｃＥＴが（Ｓ）ｃＥＴ、すなわち６'（Ｓ）メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、実施態様３６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３８． 前記ＬＮＡがＥＮＡであり、以下の２'糖－４'架橋－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－を有する、実施態様３２又は３３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３９． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施態様１２～３３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４０． 前記修飾ヌクレオシド間結合がヌクレアーゼ耐性である、実施態様３９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４１． 前記連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合の少なくとも７５％がホスホロチオエートヌクレオシド間結合又はボラノホスフェートヌクレオシド間結合である、実施態様３９又は４０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４２． 前記連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施態様３９又は４０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４３． 前記ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の少なくとも１つが立体定義されている、実施態様４１又は４２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４４． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨを動員することができる、実施態様１２～４３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４５． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列がギャップマーである、実施態様４４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４６． 前記ギャップマーが式５'－Ｆ－Ｇ－Ｆ'－３'を有し、ここでＦ及びＦ'ウィング領域が、実施態様３１～３８に記載の１～７個の２'糖修飾ヌクレオシドを独立して含むか又はそれから成り、ＧがＲＮａｓｅＨを動員することができる５～１６ヌクレオシドである、実施態様４５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４７． 前記各ウィング（Ｆ及びＦ'）が、ウィングの５'末端及び３'末端に少なくとも１つの２'糖修飾ヌクレオシドを有することを特徴とし、前記Ｇ領域が、ウィング領域に隣接した（例えばＧ領域の５'及び３'末端）少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドを有する、実施態様４６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４８． 領域Ｆ及びＦ'内の全ての２'糖修飾ヌクレオシドが同一のＬＮＡヌクレオシドである、実施態様４６又は４７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４９． 実施態様４６～４８に記載のオリゴヌクレオチド、ここで
ａ． Ｆ領域は１～６ヌクレオチドの長さで、１～５個の同一のＬＮＡヌクレオシドと０～３個のＤＮＡヌクレオシドから成り；そして
ｂ． Ｆ'領域は２～６ヌクレオチドの長さで、２～５個の同一のＬＮＡヌクレオシドと０～３個のＤＮＡヌクレオシドから成り；そして
ｃ． Ｇ領域は、ＲＮａｓｅＨを動員することができる５～１１ヌクレオチドであり；そして
ｄ． 任意選択的に、１～３個のホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオシドを含むＤ'領域はＦ領域の５'末端に位置する。
５０． 領域Ｆ及びＦ'が同一のＬＮＡヌクレオシドから成る、実施態様４７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５１． 領域Ｆ及びＦ'内の全ての２'糖修飾ヌクレオシドがオキシ－ＬＮＡヌクレオシドである、実施態様４６～４８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５２． 領域Ｆ又はＦ'の少なくとも一つが、２'糖－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２'糖－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２'糖－アルコキシ－ＲＮＡ、２'糖－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２'糖－アミノ－ＤＮＡ、及び２'糖－フルオロ－ＤＮＡから成る群から独立して選択される少なくとも１つの２'糖置換修飾ヌクレオシドをさらに含む、実施態様４６又は４７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５３． 領域Ｇ内のＲＮａｓｅＨ動員ヌクレオシドが、ＤＮＡ、アルファ－Ｌ－ＬＮＡ、Ｃ４'アルキル化ＤＮＡ、ＡＮＡ、及び２'糖Ｆ－ＡＮＡ、及びＵＮＡから独立して選択される、実施態様４６～５２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５４． 領域Ｇ内のヌクレオシドがＤＮＡ及び／又はアルファ－Ｌ－ＬＮＡヌクレオシドである、実施態様５３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５５． 領域Ｇが少なくとも７５％のＤＮＡヌクレオシドから成る、実施態様４６又は５３又は５４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５６． 領域Ｇ内の全てのヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドである、実施態様５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５７． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号７＿１～７＿８３、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５８． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号８＿１～８＿８１、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５９． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号９＿１～９＿１２、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６０． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１０＿１～１０＿１８、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６１． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１１＿１～１１＿２６、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６２． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１２＿１～１２＿１５、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６３． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１３＿１又は１３＿２、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６４． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１４＿１～１４＿１３、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６５． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１５＿１～１５＿２１、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６６． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１６＿１～１６＿５、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６７． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１７＿１～１７＿１８３、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６８． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１８＿１～１８＿３１、又は１８＿２５０～１８＿３６１、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６９． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１８＿１、１８＿５、１８＿１０、１８＿１５、１８＿１８、１８＿１９、１８＿２４、１８＿２７、１８＿３０、１８＿３４６、１８＿３４７、１８＿３５７、１７＿１０、１７＿１３７、及び１７＿１３９、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様６８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７０． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１８＿１、１８＿１５、１８＿２７、１８＿３０、１７＿１０、１７＿１３７、及び１７＿１３９から選択される、実施態様６９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７１． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１８＿３２～１８＿２４９又は１８＿３６２から１８＿６１０、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７２． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１８＿２２３、１８＿３６、１８＿１９６、１８＿１８８、及び１８＿２４３から選択される、実施態様７１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７３． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、化合物番号１９＿１～１９＿２２、又はその医薬的に許容し得る塩から選択される、実施態様１２～５５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７４． 請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子、又は請求項１２～５７のいずれか１項に記載に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分を含むコンジュゲート化合物。
７５． 前記コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬剤物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質、又はそれらの組み合わせから選択される、実施態様７４に記載のコンジュゲート化合物。
７６． 前記コンジュゲート部分がアシアロ糖タンパク質受容体に結合することができる、実施態様７４又は７５に記載のコンジュゲート化合物。
７７． 前記コンジュゲート部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクトサミンから成る群から選択される少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む、実施態様７６に記載のコンジュゲート化合物。
７８． 前記アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分がＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、実施態様７７に記載のコンジュゲート化合物。
７９． 前記コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して１価、２価、３価、又は４価である、実施態様７７又は７８に記載のコンジュゲート化合物。
８０． 前記コンジュゲート部分が、２～４個の末端ＧａｌＮＡｃ部分と、アンチセンス化合物に結合できる分岐体分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を連結するスペーサーとから成る、実施態様７９に記載のコンジュゲート化合物。
８１． 前記スペーサーがＰＥＧスペーサーである、実施態様８０に記載のコンジュゲート化合物。
８２． 前記コンジュゲート部分が３価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分である、実施態様７６～８１に記載のコンジュゲート化合物。
８３． 前記コンジュゲート部分が、図１の３価ＧａｌＮＡｃ部分の１つから選択される、実施態様７６～８２に記載のコンジュゲート化合物。
８４． 前記コンジュゲート部分が、図１Ｄの３価ＧａｌＮＡｃ部分である、実施態様８３に記載のコンジュゲート化合物。
８５． 核酸分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に位置するリンカーを含む、実施態様７４～８４に記載のコンジュゲート化合物。
８６． 前記リンカーが生理学的に不安定なリンカーである、実施態様８５に記載のコンジュゲート化合物。
８７． 前記生理学的に不安定なリンカーがヌクレアーゼ感受性リンカーである、実施態様８６に記載のコンジュゲート化合物。
８８． 前記生理学的に不安定なリンカーが、２～５個の連続ホスホジエステル結合から構成される、実施態様８６又は８７のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
８９． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、式Ｄ'－Ｆ－Ｇ－Ｆ'又はＦ－Ｇ－Ｆ'－Ｄ”を有し、ここでＦ、Ｆ'、及びＧが実施態様４６～５６で定義されるとおりであり、Ｄ'又はＤ'が、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を有する１、２、又は３個のＤＮＡヌクレオシドを含む、実施態様８６～８８に記載のコンジュゲート化合物。
９０． 少なくとも２つの連続ホスホジエステルヌクレオシド間結合がＣＡジヌクレオチドと結合している、実施態様８８又は８９に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
９１． 非結合核酸分子又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、肝臓対腎臓間の改善された細胞分布、又はコンジュゲート化合物の肝臓への改善された細胞取り込みを示す、実施態様７６～９０に記載のコンジュゲート化合物。
９２． 前記コンジュゲート化合物が、化合物番号２０＿１２、２０＿１３、２０＿１４、２０＿１５、２０＿１６、２０＿１８、２０＿２０、２０＿２１、２０＿２２、２０＿３０、２０＿３５、２０＿３６、２１＿２、２１＿３３、及び２１＿３４から成る群から選択される、実施態様７６～９１に記載のコンジュゲート化合物。
９３． 実施態様１～１１のいずれか１つに記載の核酸分子、実施態様１２～７３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、実施態様７４～９２に記載のコンジュゲート化合物、又はその許容される塩、及び医薬的に許容される希釈剤、担体、塩、及び／又は補助剤を含む医薬組成物。
９４． ヌクレオチドユニットを反応させ、こうしてアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチドユニットを形成することを含む、実施態様１２～７３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法。
９５． 前記連続ヌクレオチド配列を、実施態様７６～８４のいずれか１つに記載の非ヌクレオチド結合部分と反応させることをさらに含む、実施態様９４に記載の方法。
９６． 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを医薬的に許容し得る希釈剤、担体、塩、及び／又は補助剤と混合することを含む、実施態様９３に記載の組成物を製造する方法。
９７． ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を発現している標的細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７発現を調節するためのインビボ又はインビトロの方法であって、実施態様１～１１のいずれか１つに記載の核酸分子、実施態様１２～７３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は実施態様７４～９２のいずれか１つに記載のコンジュゲート化合物、又は実施態様９３に記載の医薬組成物を、有効量で前記細胞に投与することを含む上記方法。
９８． 前記ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７発現が、処理無しのレベルと比較して、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下している、実施態様９７に記載の方法。
９９． 実施態様１～１１のいずれか１つに記載の核酸分子、実施態様１２～７３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は実施態様７４～９２のいずれか１つに記載のコンジュゲート化合物、又は実施態様９３に記載の医薬組成物の治療又は予防有効量を、疾患に罹患している又は罹患しやすい被験体に投与することを含む、疾患を治療又は予防する方法。
１００． 被験体の疾患の治療又は予防用の医薬として使用するための、実施態様１～１１のいずれか１つに記載の核酸分子、実施態様１２～５７のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は実施態様７４～９２のいずれか１つに記載のコンジュゲート化合物、又は実施態様９３に記載の医薬組成物。
１０１． 被験体の疾患の治療又は予防用の医薬を調製するための、実施態様１～１１のいずれか１つに記載の核酸分子、実施態様１２～７３のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は実施態様７４～９２のいずれか１つに記載のコンジュゲート化合物の使用。
１０２． 前記疾患がＨＢＶ感染症又は慢性ＨＢＶ感染症である、実施態様９９～１０１に記載の方法、核酸分子、又は使用。
１０３． ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ及び／又は細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡ及び／又はＨＢＶ ＤＮＡの分泌が低下している、実施態様１０２に記載の方法、核酸分子又は使用。
１０４． ＨＢｓＡｇが、処理無しのレベルと比較して、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下している、実施態様１０２又は１０３に記載の方法、核酸分子、又は使用。
１０５． 前記被験体が哺乳動物である、実施態様９９～１０４に記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は使用。
１０６． 前記哺乳動物がヒトである、実施態様１０５に記載の方法、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は使用。
以下の例は本発明を例示する。
材料と方法
オリゴヌクレオチドモチーフ配列とオリゴヌクレオチド化合物
設計は、ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ'を指す。古典的なギャップマー設計、例えば３－１０－３では、フランク（Ｆ及びＦ'）内の全てのヌクレオチドは、同じ２'糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ、ｃＥＴ、又はＭＯＥ、及びギャップを形成する中央のＤＮＡストレッチ（Ｇ）で構成される。交互フランク設計のギャップマーでは、オリゴヌクレオチドのフランクは一連の整数として注記され、２'糖修飾ヌクレオシド（Ｍ）の数と後に続くＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）の数を示す。例えば２－２－１モチーフを有するフランクは５'［Ｍ］2－［Ｄ］2－［Ｍ］３'を表し、１－１－１－１－１モチーフは５'［Ｍ］－［Ｄ］－［Ｍ］－［Ｄ］－［Ｍ］３'を表す。両方のフランクとも、５'末端及び３'末端に２'糖修飾ヌクレオシドを有する。いくつかのＤＮＡヌクレオシド（通常は５～１６個）で構成されるギャップ領域（Ｇ）が、フランクの間に位置する。
表中の「オリゴヌクレオチド化合物」という見出しは、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、５－メチルシトシンＤＮＡは「ｅ」で表され、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
設計は、ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ'を指す。古典的なギャップマー設計、例えば３－１０－３では、フランク（Ｆ及びＦ'）内の全てのヌクレオチドは、同じ２'糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ、ｃＥＴ、又はＭＯＥ、及びギャップ（Ｇ）を形成する中央のＤＮＡストレッチ（Ｇ）で構成される。交互フランク設計のギャップマーでは、オリゴヌクレオチドのフランクは一連の整数として注記され、２'糖修飾ヌクレオシド（Ｍ）の数と後に続くＤＮＡヌクレオシド（Ｄ）の数を示す。例えば２－２－１モチーフを有するフランクは５'［Ｍ］2－［Ｄ］2－［Ｍ］３'を表し、１－１－１－１－１モチーフは５'［Ｍ］－［Ｄ］－［Ｍ］－［Ｄ］－［Ｍ］３'を表す。両方のフランクとも、５'末端及び３'末端に２'糖修飾ヌクレオシドを有する。いくつかのＤＮＡヌクレオシド（通常は５～１６）で構成されるギャップ領域（Ｇ）が、フランクの間に位置する。
表中の「オリゴヌクレオチド化合物」という見出しは、モチーフ配列の特定の設計を表す。大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、５－メチルシトシンＤＮＡは「ｅ」で表され、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
親オリゴヌクレオチドＣＭＰに関して：大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオチドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
立体定義／立体定義されたモチーフに関して：Ｘは立体ランダムホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し、Ｒは、説明欄で定義されている１つの立体異性体を表し、Ｓは他の立体異性体を表し、Ｈはオリゴヌクレオチドの３'末端の水素原子を表す。立体定義されたモチーフ中の最初の文字（Ｘ、Ｒ、又はＳ）は、オリゴヌクレオチドの５'末端からのヌクレオシド１と２との間のヌクレオシド間結合に対応する。
Ｃ６は６個の炭素を有するアミノアルキル基を表し、大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、下付き文字ｏはホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し、特に明記しない限り、他のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ＧＮ２は図２に示される３価のＧａｌＮＡｃクラスターを表し、Ｃ６は６個の炭素を有するアミノアルキル基を表し、大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、下付き文字ｏはホスホジエステルヌクレオシド結合を表し、特に明記しない限り、ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。分子の一部を表す化学図を図４～１７に示す。
ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデル
ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルでは、マウスは、ＨＢＶゲノム（ＡＡＶ／ＨＢＶ）を保持する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）で感染され、安定したウイルス血症と抗原血症を３０週間以上維持する（Dan Yang, et al. 2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71-78）。
特定の病原体を含まないオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（４～６週齢）は、ＳＬＡＣ（中国科学院上海実験動物センター（Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences）から購入し、動物飼育施設で個別に換気されたケージに収容される。WuXi IACUC［施設内動物管理と使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）、WUXI IACUCプロトコール番号R20131126-Mouse］に示される動物の管理と使用に関するガイドラインに従っている。マウスは３日間新しい環境に馴化させ、実験計画に従って群別化される。
組換えＡＡＶ－ＨＢＶをＰＢＳで注射１回につき２００μＬに希釈する。この組換えウイルスは、１．３コピーのＨＢＶゲノム（遺伝子型Ｄ、血清型ａｙｗ）を保有している。
０日目に、全てのマウスに尾静脈から、２００μＬのＡＡＶ－ＨＢＶ（１ｘ１０11 ベクターゲノム）を注射した。投与前２３日目（ＡＡＶ－ＨＢＶ注射の２３日後）に、ＨＢＶマーカーの血清レベルと体重に基づいて動物を群分けした。各群は、コーンコブが敷かれたポリカーボネート製のケージに収容した（最大５匹／ケージ）。低、中、高ＨＢＶ力価が広がり、群平均が群間平均と同様になった。動物群は、非結合でもＧａｌＮＡｃ結合されたオリゴヌクレオチドで処理することができる。全ての血清回収（０．１ｍｌ血液／マウス）は、動物をイソフルラン吸入で麻酔した後、眼窩後部の出血により行った。
ＨｅＬａ細胞株
ＨｅＬａ細胞株は、欧州認証済み細胞培養物保存機関（European Collection of Authenticated Cell Cultures：ECACC、#93021013）から購入し、３７°Ｃで５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で、供給業者の推奨どおりに維持した。アッセイでは、２，５００細胞／ウェルを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミンＡＱ、１％ＮＥＡＡ、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むイーグル最小必須培地（Sigma, M2279）中で９６マルチウェルプレートに接種した。
分化したＨｅｐａＲＧ細胞培養（ＨＢＶ感染無し）
ＨｅｐａＲＧ細胞（Biopredics International, Rennes, France, Cat# HPR101）を、ウィリアムＥ培地（Sigma W4128）、増殖培地添加物（Biopredics, Cat# ADD710）、及び１％（ｖ／ｖ）GlutaMAX-I（Gibco #32551）から成る完全ＨｅｐａＲＧ増殖培地で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７°Ｃで２週間培養した。
分化を開始するために、細胞を完全ＨｅｐａＲＧ増殖培地で２週間、完全にコンフルエントになるまで増殖させた。培地の半分を、ウィリアムＥ培地（Sigma W4128）、増殖培地添加物（Biopredics, Cat# ADD710）、及び１％（ｖ／ｖ）GlutaMAX-I（Gibco #32551）、及び最終濃度０．９％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯから成るＨｅｐａＲＧ分化培地と交換した。３日後、培地を完全分化培地（ＤＭＳＯの最終濃度１．８％（ｖ／ｖ））で完全に交換し、細胞を、７日毎に分化培地を更新して約２週間維持した。分化したＨｅｐａＲＧ細胞（ｄＨｅｐａＲＧ）は、胆管様細胞の単層に囲まれた肝細胞様細胞島を示した。化合物処理の前に、ｄＨｅｐａＲＧ細胞をコラーゲンＩをコーテイングした９６ウェルプレート（Corning BioCoat REF354407）に、１００μＬの完全分化培地に１ウェルあたり８０，０００細胞で接種した。細胞は、オリゴヌクレオチド処理前の播種後約１週間、９６ウェルプレート中で分化した表現型を回復させた。処理の６日後にＲＮＡを分離した。
ＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞
ＨｅｐａＲＧ細胞（Biopredics International, Rennes, France, Cat# HPR101）を、ウィリアムＥ培地（GIBCO）、増殖培地添加物（Biopredics, Cat# ADD711C）、及び１％（ｖ／ｖ）GlutaMAX-I（Gibco #32551）、及び１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Gibco, #15140）から成る完全ＨｅｐａＲＧ増殖培地中で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７°Ｃで２週間培養した。
分化を開始するために、０．９％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich, D2650）を増殖培地のコンフルエントな細胞に加えた。１週間後、培地を完全分化培地（１．８％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを補足したＨｅｐａＲＧ増殖培地）に交換し、ここで、分化培地を７日ごとに更新して細胞を約４週間維持した。分化したＨｅｐａＲＧ細胞（ｄＨｅｐａＲＧ）は、胆管様細胞の単層に囲まれた肝細胞様細胞島を示した。
ＨＢＶ感染及び化合物処理の前に、コラーゲンＩをコーテイングした９６ウェルプレート（Gibco, Cat# A11428-03）に、ｄＨｅｐａＲＧ細胞を１００μＬの完全分化培地に１ウェルあたり６０，０００細胞で接種した。細胞は、ＨＢＶ感染前の播種後約１週間、９６ウェルプレート中で分化した表現型を回復させた。
ｄＨｅｐａＲＧ細胞にＨＢＶ粒子をＭＯＩ３０で感染させた。ＨＢＶ粒子はＨＢＶ産生性ＨｅｐＧ２．２．１５細胞から産生された（Sells et al 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 1005-1009）。ｄＨｅｐａＲＧの培養条件、分化、及びＨＢＶ感染は既に記載されている（Hantz, 2009, J. Gen. Virol., 2009, 90: 127-135）。簡単に説明すると、４％ＰＥＧ－８０００及びウイルスストック（２０から３０ＧＥ／細胞）を含む完全分化培地（ウイリアムＥ培地（GIBCO）、増殖培地添加物（Biopredics, Cat #ADD711C）及び１％（ｖ／ｖ）GlutaMAX-I（Gibco #32551）及び１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Gibco, #15140）から成り、１．８％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを補足したＨｅｐａＲＧ培地）を加えた（１２０μＬ／ウェル）。感染の１日後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で４回洗浄し、実験中の４日目及び７日目に培地（完全分化培地）を交換した。
ＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ
ＨｅｐａＲＧ細胞株（Biopredics International, Rennes, France, Cat# HPR101）から、レンチウイルス法を使用して、ヒトＡＳＰＧＲ１及びＡＳＰＧＲ２を安定して過剰発現する細胞株を生成した。増殖中のＨｅｐａＲＧ細胞に、Sirion biotechがオンデマンドで生産した、ヒトＡＳＧＰＲ１及び２をコードするレンチウイルス（ＣＬＶ－ＣＭＶ－ＡＳＧＰＲ１－Ｔ２ａ＿ＡＳＧＰＲ２－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ）をＭＯＩ３００で、ＣＭＶプロモーターとピューロマイシン耐性遺伝子の制御下で形質導入した。形質した導入細胞を１μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて１１日間選択し、次に同じ濃度の抗生物質で維持して、導入遺伝子の安定した発現を確保した。ＲＴ－ｑＰＣＲ（ＡＳＧＰＲ１：非形質導入の８５６０倍、ＡＳＧＰＲ２：非形質導入の２３８９倍）によるｍＲＮＡレベルと、及びフローサイトメトリー分析によるタンパク質レベルの両方で、ＡＳＧＰＲ１／２の過剰発現を確認した。分化した細胞はＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞と呼ばれる。
ＡＳＧＰＲ－ＨｅｐａＲＧ細胞は、感染前の少なくとも２週間、１．８％ＤＭＳＯを使用して分化させた。上記のｄＨｅｐａＲＧ細胞のように、ＨＢＶ感染を行った。
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）
文献（Berry and Friend, 1969, J. Cell Biol; Paterna et al., 1998, Toxicol.Appl. Pharmacol.）に従って２工程灌流プロトコールの後に、ペントバルビタールで麻酔したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓から、初代マウス肝細胞を単離した。最初の工程は、ＨＢＳＳ＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．４ｍＭ ＥＧＴＡを用いて５分間、続いてＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＮａＨＣＯ3＋０．０４％ＢＳＡ（Sigma #A7979）＋４ｍＭ ＣａＣＬ2（Sigma #21115）＋０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼタイプ２（Worthington #4176）を用いて１２分間行った。肝細胞は、氷上で５ｍｌの冷ウイリアムＥ培地（ＷＭＥ）（Sigma #W1878、１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＡＴＣＣ＃３０－２０３０）を補足）中に捕捉された。
粗細胞懸濁液を、７０μｍのセルストレーナー、続いて４０μｍのセルストレーナー（Falcon #352350及び #352340）でろ過し、ＷＭＥで２５ｍｌまで満たし、５０ｘｇで室温で５分間遠心分離して、肝細胞をペレット化した。上清を除去し、肝細胞を２５ｍｌ ＷＭＥに再懸濁した。２５ｍｌの９０％パーコール溶液（Sigma #P4937；ｐＨ＝８．５～９．５）を添加し、５０ｘｇで２５°Ｃで１０分間遠心分離した後、上清と浮遊細胞を除去した。残りのパーコールを除去するために、ペレットを５０ｍＬ ＷＭＥ培地に再懸濁し、５０ｘｇで２５°Ｃで３分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを２０ｍＬ ＷＭＥに再懸濁し、細胞数と生存率を測定し（Invitrogen, Cellcount）、２５０，０００細胞／ｍｌに希釈した。２５，０００細胞／ウェルを、コラーゲン被覆９６ウェルプレート（PD Biocoat Collagen I #356407）に接種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２でインキュベートした。３～４時間後、細胞をＷＭＥで洗浄して、結合していない細胞を除去し、培地を交換した。接種の２４時間後、オリゴヌクレオチドを所望の濃度で添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ＲＮＡ分離（Qiagen, RNeasy 96）に続いて、標的遺伝子（ＰＡＰＤ５：Ｍｍ０１２４４１２１＿ｍ１ ＦＡＭ－ＭＧＢ、ＰＡＰＤ７：Ｍｍ０１３４９５１３＿ｍ１ ＦＡＭ－ＭＧＢ）及びハウスキーピング遺伝子（ＧｕｓＢＭｍ＿０１１９７６９８＿ｍ１、ＶＩＣ－ＭＧＢ）について、製造業者の説明書に従ってＴａｑＭａｎアッセイを使用して、１工程ＲＴ－ＱＰＣＲ（Quanta Bioscience、qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix）を行った。
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）自然感染アッセイ
ヒト化肝臓を有するキメラｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスからコラゲナーゼ灌流法により単離された初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、PhoenixBio（広島、日本）から入手した。細胞を、Phoenix Bioが提供する培地中のウェルあたり７ｘ１０Kd細胞の濃度で、Ｉ型コラーゲンをコーテイングした９６ウェルプレートに播種した（詳細については、Ishida et al 2015 Am J Pathol. Vol 185 page1275-1285 を参照）。ＨＢＶ遺伝子型Ｄは、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞培養上清から得られ、ＰＥＧ沈殿法を使用して濃縮された。ＰＨＨを、４％ＰＥＧ ８０００を含むＰＨＨ培地でＭＯＩ１０で感染させた後、細胞をＰＢＳで４回洗浄した。感染後１日目に、最終容量１２５μｌのＰＨＨ培地でオリゴヌクレオチドを細胞に送達した。感染後４日目及び７日目に細胞を再処理した。感染後１１日目に、上清及び細胞を採取した。上清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルを、ＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した（「材料と方法」欄；「ＨＢＶ抗原の測定」を参照）。製造業者のプロトコールに従って、MagNA PureロボットとMagNA Pure 96 細胞ＲＮＡ大容量キット（Roche, #05467535001）を使用して、細胞からｍＲＮＡを抽出した。「材料と方法」欄で説明されるようにリアルタイムＰＣＲを使用して、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの相対的発現レベルを分析した。
ＨＢＶ抗原測定
ＨＢＶ抗原の発現と分泌への影響を評価するために、１１日目に上清を回収した。ＨＢＶ増殖パラメーターであるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルを、ＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Autobio Diagnostic #CL0310-2, #CL0312-2）を使用して、製造業者のプロトコールに従って測定した。簡単に述べると、ウェルあたり２５μＬの上清をそれぞれの抗体被覆マイクロタイタープレートに移し、２５μＬの酵素コンジュゲート試薬を加えた。プレートをシェーカー上で室温で６０分間インキュベートした後、自動洗浄機を使用してウェルを洗浄緩衝液で５回洗浄した。２５μＬの基質Ａ及びＢを各ウェルに加えた。プレートをシェーカー上で室温で１０分間インキュベートした後、Envision 発光リーダー（Perkin Elmer）を使用して発光を測定した。
ＨＢＶ感染細胞からの細胞内ＨＢＶ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ
ＨＢＶ ｍＲＮＡを、ｑＰＣＲにより QuantStudio 12K Flex（Applied Biosystems）、TaqMan RNA-to-CT １工程キット（Applied Biosystems, #4392938）、ヒトＡＣＴＢ内部対照（Applied Biosystems, #4310881E）を使用して、技術的二重測定で定量した。Taqman 試薬を、以下の市販の ThermoFisher Sceintific プライマー（ＨＢＶ Ｐａ０３４５３４０６＿ｓ１、ＡＣＴＢ ４３１０８８１Ｅ）と一緒に使用した。参照遺伝子ＡＣＴＢ及びＰＢＳ処理細胞に対して標準化された比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を使用して、ｍＲＮＡ発現を分析した。
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ
処理された細胞又はホモジナイズされた組織試料から抽出されたＲＮＡについて、ＱＰＣＲを行った。ＲＮＡ／ＬＮＡ２本鎖の変性（９０°Ｃ、４０秒）後、１工程プロトコール（Quanta Bioscience からの qScript（商標） XLT One-Step RT-qPCR ToughMix（登録商標）, Low ROX（商標）, #95134-500）を用いて、２本鎖構成で以下の TaqMan プライマーアッセイ （ThermoFisher Scientific）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った：
ＰＡＰＤ５（Ｈｓ００２２３７２７＿ｍ１、ＦＡＭ－ＭＧＢ）
ＰＡＰＤ７（Ｈｓ００１７３１５９＿ｍ１、ＦＡＭ－ＭＧＢ）
提供者の推奨に従うハウスキーピング遺伝子ＧＵＳＢ（Ｈｕ＿４３２６３２０Ｅ、ＶＩＣ－ＭＧＢ）。
ＨＢＶ ＤＮＡ定量とウイルス粒子力価
ＨＢＶ ＤＮＡ抽出を、QIAamp UltraSens Virus キット（Qiagen, #53704）を製造業者のプロトコールに従って、以下の最適化を用いて行う。３０μＬと３μＬのウイルス試料を１ｍＬのＰＢＳに希釈後、緩衝液ＡＣを加える。最初の遠心分離工程は、最高速度及び４°Ｃで４５分間行われる。ＨＢＶ ＤＮＡは、二重測定でＰＣＲにより、QuantStudio 12K Flex（Applied Biosystems）、TaqMan 遺伝子発現マスターミックス（Applied Biosystems, #4369016）、上記表９に示したプライマーのプレミックス１：１：０．５、及び１００μＭで復元したプローブを用いて定量された。ｑＰＣＲは、以下の設定を使用して行われる：ＵＤＧインキュベーション（２分、５０°Ｃ）、酵素活性化（１０分、９５°Ｃ）、及びｑＰＣＲ（変性のために９５°Ｃで１５秒とアニーリングと伸長のために６０°Ｃで１分を、４０サイクル）。ゲノム等価計算は、既知の濃度のＨＢＶ遺伝子型Ｄプラスミド希釈液から作成された標準曲線に基づいている。
ＨＢＶ粒子力価は、処理細胞から単離された細胞内ｍＲＮＡのＱＰＣＲで、ＨＢＶコア特異的プライマー（Integrated DNA Technologies）（表１１）を使用して測定することができる。
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野で一般的に知られている。以下は、適用されるプロトコールである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、支持体、及び濃度に関してわずかに異なる方法によって生成されていてもよい。
オリゴヌクレオチドは、１μｍｏｌスケールで Oligomaker 48 についてホスホラミダイトアプローチを使用して、ウリジンユニバーサル支持体上で合成される。合成の最後に、アンモニア水を使用してオリゴヌクレオチドが、６０℃で５～１６時間、固体支持体から切断される。オリゴヌクレオチドは逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）又は固相抽出によって精製され、ＵＰＬＣによって特性評価され、分子量はＥＳＩ－ＭＳによってさらに確認される。
オリゴヌクレオチドの伸長：
アセトニトリル中の０．１Ｍの５'－Ｏ－ＤＭＴ保護アミダイト及びアクテイベーターとしてアセトニトリル中のＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）（０．２５Ｍ）の溶液を使用して、β－シアノエチル－ホスホラミダイトの結合（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、又はＬＮＡ－Ｔ）が行われる。最終サイクルでは、所望の修飾を施したホスホラミダイト、例えばコンジュゲート基を結合するためのＣ６リンカー又はコンジュゲート基自体を使用することができる。ホスホロチオエート結合の導入のためのチオール化は、キサンタン水素化物（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１Ｍ）を使用して行われる。リン酸ジエステル結合は、ＴＨＦ／ピリジン／水 ７：２：１中の０．０２Ｍヨウ素を使用して導入することができる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に一般的に使用されるものである。
固相合成後の結合では、固相合成の最後のサイクルで市販のＣ６アミノリンカーフォルホラミダイトを使用することができ、脱保護及び固相支持体からの切断後、アミノ結合脱保護オリゴヌクレオチドが単離される。コンジュゲートは、標準的な合成方法を使用して官能基の活性化を介して導入される。
ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物は、Phenomenex Jupiter C18（１０μ、１５０ｘ１０ｍｍ）カラムで分取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製される。０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ ８）及びアセトニトリルを、５ｍＬ／ｍｉｎの流量で緩衝液として使用することができる。回収された画分を凍結乾燥して、精製化合物が通常は白色固体として得られる。
略語：
ＤＣＩ：４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４'－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
イブ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフイー
Ｔmアッセイ：
オリゴヌクレオチド及びＲＮＡ標的（リン酸結合、ＰＯ）２本鎖を５００ｍｌのＲＮａｓｅフリー水で３ｍＭに希釈し、５００ｍｌの２ｘＴm緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と混合する。溶液を３分間９５°Ｃに加熱し、次に室温で３０分間アニールする。２本鎖融解温度（Ｔm）は、PE Templab ソフトウェア（Perkin Elmer）を使用して、ペルチェ温度プログラマーＰＴＰ６を備えたLambda 40 UV/VIS 分光光度計で測定する。温度を２０°Ｃから９５°Ｃに上昇させ、次に２５°Ｃまで低下させ、２６０ｎｍでの吸光度を記録する。融解とアニーリングの両方の１次導関数と極大値が使用して、２本鎖Ｔmが評価される。
実施例１
ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的化（２重特異的）アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性のスクリーニング
オリゴヌクレオチドスクリーニングは、配列番号１７、１８、及び１９を標的とする１６～１８量体のギャップマーを使用して行った。有効性試験は、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の両方を発現するＨｅＬａ細胞でのインビトロ実験で行った。
ＨｅＬａ細胞は、「材料と方法」欄に記載されているように培養した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドを加えた。オリゴヌクレオチドの最終濃度は５及び２５μＭであり、最終培養液量は１００μｌ／ウェルであった。オリゴヌクレオチド化合物の添加の３日後に細胞を採取し、製造業者の説明書に従って、PureLink Pro 96 ＲＮＡ精製キット（Ambion）を使用してＲＮＡを抽出した。
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡレベルは、「材料と方法」欄で説明されているようにリアルタイムＰＣＲで分析した。
ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの相対的発現レベルは、表１２に対照試料平均（ＰＢＳ処理細胞）の％として示されており、すなわち、値が低いほど阻害が大きくなる。
実施例２
ＨＢＶ感染ＨｅｐａＲＧ細胞におけるインビトロＥＣ５０と有効性
実施例１からの全てのオリゴヌクレオチドを、ＨＢＶに感染したｄＨｅｐａＲＧ細胞におけるＨＢＶ増殖パラメーターに対する効果について試験した。
比較のために、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＨＢＶ ｍＲＮＡを直接標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較した。ＨＢＶ標的化オリゴヌクレオチドは表１３に示される。
ＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞（「材料と方法」欄、「ＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞」に記載）を９６ウェルプレートで培養した。ＨＢＶ感染の１日後、 非支援取り込み（gymnosis）を使用して、オリゴヌクレオチドを３倍連続希釈（２０．００、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８、０．０３、０．０１μＭオリゴヌクレオチド）で細胞に添加した。合計４９個のオリゴヌクレオチドを試験した。実験は、ＰＢＳ対照を使用して三重測定で行った。オリゴヌクレオチド処理を４日目及び７日目に繰り返した。
感染後１１日目に、上清及び細胞を採取した。
上清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルを、ＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した（「材料と方法」欄、「ＨＢＶ抗原測定」を参照）。
ＨＢＶ増殖パラメーターであるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのＥＣ５０、最大ＫＤ（有効性）を、ｄｒｃパッケージ（ｖ３．０－１）のＲ関数ｄｒｍ（）を使用して計算し、４パラメーター対数ロジステイック関数を、オリゴヌクレオチド濃度の関数として目的の遺伝子の発現にフィッティングさせて、ＥＣ５０値と最大ノックダウン値を得た。結果は表１４に示され、対照試料平均（ＰＢＳ対照と非感染（ＮＩＦ））の％であり、次のように計算された［（試験値－平均ＰＢＳ）／（平均ＮＩＦ－平均ＰＢＳ）］＊１００））。
これらのデータから、かなりの数の化合物がＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇに大きな影響を与えることがわかる。配列番号１７及び１８のオリゴヌクレオチドモチーフを有する化合物は、配列番号１９のモチーフを用いて作製された化合物よりも効率的であると思われる。
図３では、ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を７０％以上減少させるオリゴヌクレオチドについて、ＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ細胞のＨＢｓＡｇを減少させるこれらのオリゴヌクレオチドの能力と高い相関があることもわかる。
実施例３
ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性のスクリーニング
異なる設計を使用して、配列番号１７、１８、及び１９のオリゴヌクレオチドモチーフの多様性を拡大する２９８個のオリゴヌクレオチドのさらなるライブラリーが生成された。有効性試験は実施例１に記載されているインビトロ実験で行ったが、スクリーニングが５μＭでのみ行われた。
ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの相対的発現レベルは、対照試料平均（ＰＢＳ処理細胞）の％として表１５に示されており、すなわち、値が低いほど阻害が大きくなる。
これらのデータから、配列番号１９を有するモチーフ配列に基づくＬＮＡ－ギャップマー設計は、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のノックダウンが非常に低い（０～１０％）ことがわかる。
実施例４
ＨｅＬａ細胞における選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロＥＣ５０と有効性。
実施例１及び３からの最高性能のオリゴヌクレオチドのＥＣ５０と有効性（ＫＤ）を、以下のオリゴヌクレオチド濃度、５０、１５．８１、５．００、１．５８、０．５０、０．１６、０．０５、及び０．０１６μＭで、同じアッセイを使用して決定した。
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現のＥＣ５０、最大ＫＤ（有効性）を、ｄｒｃパッケージ（ｖ３．０－１）のＲ関数ｄｒｍ（）を使用して計算し、４パラメーター対数ロジステイック関数を、オリゴヌクレオチド濃度の関数として目的の遺伝子の発現にフィッティングさせて、ＥＣ５０値と最大ノックダウン値を得た。結果を表１６に示す。
実施例５
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対するインビトロ効果
実施例３でスクリーニングされたオリゴヌクレオチドの選択物を、本質的に実施例２のアッセイを用いて以下の変更を加えて、ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧでスクリーニングした。スクリーニングは、ＨＢＶ感染したＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧで、以下の濃度、２０、６．６７、及び２．２２μＭのオリゴヌクレオチドで、表１７の比較分子を使用して行った。
比較のために、表１７の単一の標的化ＰＡＰＤ５と単一の標的化ＰＡＰＤ７オリゴヌクレオチドの組み合わせを、本発明のオリゴヌクレオチドと一緒に試験した。
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルの低下が表１８及び１９に示され、値が大きいほど、阻害が大きくなる。
これらのデータから、組み合わせ処理（２ｘ２０μＭ）と比較した場合、半分のオリゴヌクレオチド濃度（２０μＭ）を用いるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの低下に関して、最高性能の２重特異的ＰＡＰＤ５／ＰＡＰＤ７オリゴヌクレオチドがより有効であることがわかる。
実施例６
ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする立体定義されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性のスクリーニング
配列番号１８のモチーフ配列周りの多様性をさらに拡大するために、化合物番号１８＿１を有する立体ランダム親化合物に基づいて、立体定義されたオリゴヌクレオチドのライブラリーを作成した。
有効性試験は実施例１に記載されているインビトロ実験で行ったが、スクリーニングが１μＭで、一部は５μＭで行われた。
ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの相対的発現レベルは、親オリゴヌクレオチドの％として表２０に示されており、すなわち、値が大きいほど阻害が良くなる。
実施例７
ＨｅＬａ細胞における選択され立体定義されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロＥＣ５０と有効性。
実施例６からの最高性能のオリゴヌクレオチドのＥＣ５０及び有効性（ＫＤ）を、以下のオリゴヌクレオチド濃度、３３、１０．４４、３．３３、１．０４４、０．３３、０．１０４、０．０３３、及び０．０１μＭで、同じアッセイを使用して決定した。
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現のＥＣ５０、最大ＫＤ（有効性）を、ｄｒｃパッケージ（ｖ３．０－１）のＲ関数ｄｒｍ（）を使用して計算し、４パラメーター対数ロジステイック関数を、オリゴヌクレオチド濃度の関数として目的の遺伝子の発現にフィッティングさせて、ＥＣ５０値と最大ノックダウン値を得た。結果を表２１に示す。
これらのデータから、立体定義されたサブライブラリーと完全に立体定義された化合物の両方を用いて、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のノックダウンに関して、ＥＣ５０及び有効性の改善を達成できることがわかる。
実施例８
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする選択され立体定義されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対するインビトロ効果
実施例６からの最も有効なオリゴヌクレオチドの選択物を、ＨＢＶ感染ｄＨｅｐａＲＧ－ＡＳＧＰＲ細胞におけるＨＢＶ増殖パラメーターに対する効果について試験した。
実験は、実施例５に記載されているように行った。
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルの低下は表２２及び２３に示され、値が大きいほど、阻害が大きくなる。
実施例９
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする選択されたＧａｌＮＡｃ結合アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対するインビトロ効果
実施例１からの最も有効なオリゴヌクレオチドの選択物をＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分に結合し、ＨＢＶ感染ＡＳＰＧＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞におけるＨＢＶ増殖パラメーターに対するそれらの効果について試験した。
ＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇに対するＥＣ５０及び有効性（ＫＤ）の評価は、ＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞を使用して、比較オリゴヌクレオチドを使用せずに、実施例２に記載のように行った。結果を表２４に示す。
実施例２の操作に加えて、採取した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、MagNA Pure 溶解緩衝液（Roche #05467535001）で溶解し、－８０°Ｃで保存した。MagNA Pure “９６ 細胞性ＲＮＡ大容量キット”（Roche #05467535001）を使用してＲＮＡを抽出し、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現レベルを、「材料と方法」欄、「ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のリアルタイムＰＣＲ」に記載されているように測定した。ＥＣ５０及び有効性（ＫＤ）は、ｄｒｃパッケージ（ｖ３．０－１）のＲ関数ｄｒｍ（）を使用して計算し、４パラメーター対数ロジステイック関数を、オリゴヌクレオチド濃度の関数として目的の遺伝子の発現にフィッティングさせて、ＥＣ５０値と最大ノックダウン値を得た。結果を表２４Ａに示す。
これらのデータから、ＧａｌＮＡｃ部分をオリゴヌクレオチドに結合させることにより、ＥＣ５０値が少なくとも４０倍改善されることがわかる（この表はｎＭであるのに対し、表１４はμＭであることに注意されたい）。例えば、化合物２０＿１５（ＧａｌＮＡｃ結合）のＨＢｓＡｇの低下は、化合物１８＿０５（２０＿１５の裸バージョン）より１７６倍改善している。
これらのデータから、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする選択されたＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドの大部分は、ｍＲＮＡレベルを１０％未満に低下させ得ることがわかる。
実施例１０
ｄＨｅｐａＲＧ細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性のスクリーニング
ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のノックダウンについてスクリーニングされたオリゴヌクレオチド（実施例１及び３）をｄＨｅｐａＲＧ細胞においてスクリーニングして、肝臓細胞株における効率的なノックダウンを証明した。
ｄＨｅｐａＲＧ細胞は、「材料と方法」欄に記載されているように培養した。以下のオリゴヌクレオチド濃度、５０、１５．８１、５．００、１．５８、０．５０、０．１６、０．０５、及び０．０１６μＭを、１００μｌ／ｗｅｌｌの最終培養容量で使用した。オリゴヌクレオチド化合物を添加してから６日後に細胞を採取し、PureLink Pro 96 ＲＮＡ精製キット（Ambion）を使用して製造業者の説明書に従ってＲＮＡを抽出した。
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡレベルは、「材料と方法」欄に記載されているように、リアルタイムＰＣＲで分析した。ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現のＥＣ５０、最大ＫＤ（有効性）を、ｄｒｃパッケージ（ｖ３．０－１）のＲ関数ｄｒｍ（）を使用して計算し、４パラメーター対数ロジステイック関数を、オリゴヌクレオチド濃度の関数として目的の遺伝子の発現にフィッティングさせて、ＥＣ５０値と最大ノックダウン値を得た。
結果を表２５に示す。
これらのデータから、有効な標的の減少は肝細胞由来の細胞株でも記録できることがわかる。
実施例１１
ｄＨｅｐａＲＧ細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする立体定義アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性のスクリーニング。
ＨｅＬａ細胞におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のノックダウンについてスクリーニングされた立体定義オリゴヌクレオチド（実施例７）を、ｄＨｅｐａＲＧ細胞においてスクリーニングして、肝細胞株における効率的なノックダウンを証明した。
以下のオリゴヌクレオチド濃度、３３、１０．４４、３．３３、１．０４４、０．３３、０．１０４、０．０３３、及び０．０１μＭを用いて、実施例１０に記載のようにスクリーニングを行った。
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡレベルは、「材料と方法」欄で説明されているように、リアルタイムＰＣＲで分析した。ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現のＥＣ５０、最大ＫＤ（有効性）を、ｄｒｃパッケージ（ｖ３．０－１）のＲ関数ｄｒｍ（）を使用して計算し、４パラメーター対数ロジステイック関数を、オリゴヌクレオチド濃度の関数として目的の遺伝子の発現にフィッティングさせて、ＥＣ５０値と最大ノックダウン値を得た。
結果を表２６に示す。
これらのデータから、立体定義されたオリゴヌクレオチドは、肝細胞由来の細胞株における標的の減少にも有効であることがわかる。
実施例１２
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする選択されたＧａｌＮＡｃ結合アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対するインビトロ効果
実施例５からの最も有効なオリゴヌクレオチドの選択物をＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分に結合し、ＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞におけるＨＢＶ増殖パラメーターに対するそれらの効果について試験した。
比較の目的で、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、表１３に示すＨＢＶ標的化オリゴヌクレオチドのＧａｌＮＡｃ結合バージョンと比較し、ＧａｌＮＡｃ結合バージョンを表１３Ａに示す。
ＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇに対するＥＣ５０及び有効性（ＫＤ）の評価は、ＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞を使用して、実施例２に記載のように行った。結果を表２７に示す。
実施例２の操作に加えて、採取した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、MagNA Pure 溶解緩衝液（Roche #05467535001）で溶解し、－８０°Ｃで保存した。MagNA Pure “９６ 細胞性ＲＮＡ大容量キット”（Roche #05467535001）を使用してＲＮＡを抽出し、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現レベルを、「材料と方法」欄、「ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のリアルタイムＰＣＲ」に記載されているように測定した。ＥＣ５０及び有効性（ＫＤ）は、ｄｒｃパッケージ（ｖ３．０－１）のＲ関数ｄｒｍ（）を使用して計算し、４パラメーター対数ロジステイック関数を、オリゴヌクレオチド濃度の関数として目的の遺伝子の発現にフィッティングさせて、ＥＣ５０値と最大ノックダウン値を得た。結果を表２７Ａに示す。
表に示されている化合物は、表１０に記載されているように、Ｃ６リンカーに続くｃａジヌクレオチド中にホスホジエステル結合を有する。
予想どおり、２つのＨＢＶ標的化分子はＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７に対してほんのわずかの効果しかなかったため、それらのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇへの効果は、ＰＡＰＤ５又はＰＡＰＤ７を低下させる能力とは関係していない。試験した化合物の残りは、８５％未満の標的減少と、０．０９μＭ未満のＥＣ５０値を示しており、これは、表２７のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇで見られる効果とよく相関している。
実施例１３
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする選択されたＧａｌＮＡｃ結合アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞に対するインビトロ効果
ＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドの選択物をＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞でさらに試験し（「材料と方法」欄、「ＰＨＨ自然感染アッセイ」を参照）、自然のＡＳＧＰＲ発現を伴うインビトロシステムでの有効性を示した。使用したオリゴヌクレオチド濃度は、３倍連続希釈液（２０．００、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８、０．０３、０．０１μＭオリゴヌクレオチド）である。
ＨＢＶ増殖パラメーターＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇのＥＣ５０、最大ＫＤ（有効性）を、ｄｒｃパッケージ（ｖ３．０－１）のＲ関数ｄｒｍ（）を使用して計算し、４パラメーター対数ロジステイック関数を、オリゴヌクレオチド濃度の関数として目的の遺伝子の発現にフィッティングさせて、ＥＣ５０の値と最大低下を得た。結果を表２８に示す。
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現のＥＣ５０、最大ＫＤ（有効性）は、同じアルゴリズムを使用して計算した。結果を表２８Ａに示す。
表に示されている化合物は、表１０に記載されているように、Ｃ６リンカーに続くｃａジヌクレオチドにホスホジエステル結合を有する。
これらのデータから、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする選択されたＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドは、感染した初代ヒト肝細胞のＨＢＶ抗原分泌を低下させ得ることがわかる。
これらのデータから、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする選択されたＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドは、ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡにほとんど効果を与えないと思われる化合物２０＿１７を除き、ＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡに対する効果を維持しながら、標的を１１％以下に低減し得ることがわかる。
実施例１４
ＨｅＬａ細胞及びＰＭＨ細胞におけるヒト及びマウスＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする（２重特異的）アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性のスクリーニング
ヒトＨｅＬａ細胞株及び初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）のＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のヒト及びマウス転写物（表５）を標的とするギャップマーオリゴヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチドスクリーニングを行った。
ＨｅＬａ細胞でのスクリーニングは、実施例１に記載のように２５μＭの濃度で行った。
ＰＭＨ細胞でのスクリーニングは、５μＭオリゴヌクレオチドを使用して、「材料と方法」欄の「初代マウス肝細胞」に記載されているように行った。
図１１は、スクリーニングの結果を示し、各ドットは、表５の化合物、及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ（Ｙ軸）及びＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡ（Ｘ軸）を低下させるその能力を示す。ＨｅＬａ細胞（ヒト）では、ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡの低下とＰＡＰＤ７の間に良好な相関関係があるが、ＰＭＨ（マウス）細胞では、ＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの低下は、ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡの低下と比較してあまり効率的ではないようである。
マウス肝細胞におけるＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの適度な阻害の妥当な説明は、初代マウス肝細胞で発現されたＰＡＰＤ７の一次スプライシングされたｍＲＮＡ転写物が、オリゴヌクレオチドの結合部位の下流に転写開始部位を有することである。これは、初代マウス肝細胞で全体的トランスクリプトームショットガン配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）が行われるまで特定されなかった。
実施例１５
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を標的とする選択されたＧａｌＮＡｃ結合アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対するインビトロ効果
実施例２及び５からのオリゴヌクレオチドのさらなる選択物をＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分に結合し、ＨＢＶ感染ＡＳＰＧＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞のＨＢＶ増殖パラメーターに対する効果について試験した。
ＧａｌＮＡｃ結合オリゴヌクレオチドのＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇに対するＥＣ５０及び有効性（ＫＤ）の評価を、実施例２に記載のように、ＨＢＶ感染ＡＳＧＰＲ－ｄＨｅｐａＲＧ細胞を使用して行った。結果を表２９に示す。
実施例２の操作に加えて、採取した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、MagNA Pure 溶解緩衝液（Roche #05467535001）で溶解し、－８０°Ｃで保存した。MagNA Pure “９６ 細胞性ＲＮＡ大容量キット”（Roche #05467535001）を使用してＲＮＡを抽出し、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現レベルを、「材料と方法」欄、「ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７のリアルタイムＰＣＲ」に記載されているように測定した。ＥＣ５０及び有効性（ＫＤ）は、ｄｒｃパッケージ（ｖ３．０－１）のＲ関数ｄｒｍ（）を使用して計算し、４パラメーター対数ロジステイック関数を、オリゴヌクレオチド濃度の関数として目的の遺伝子の発現にフィッティングさせて、ＥＣ５０値と最大ノックダウン値を得た。結果を表２９Ａに示す。
実施例１６
選択された２重特異的ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的化オリゴヌクレオチドを使用した染色体に組み込まれたＨＢＶ ＤＮＡのＨＢｓＡｇ発現に対する効果
この実験では、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７に対して強力な力価を有するＧａｌＮＡｃ結合抗ＰＡＰＤ５／７オリゴヌクレオチドの選択が、染色体に組み込まれＨＢＶ ＤＮＡからＨＢｓ抗原を分泌するヒト肝細胞癌細胞株Ｈｅｐ３ＢからのＨＢｓ抗原及びｍＲＮＡ発現を低下させ得るかどうかを試験した。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（Knowles et al. 1980.Science 209 pp. 497-499）はＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６４）から購入し、１０％ＦＢＳを補足したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。細胞をコラーゲン被覆９６ウェルプレートにウェルあたり１．５ｘ１０5細胞の濃度で播種し、５％ＣＯ2の加湿雰囲気で３７℃で培養した。接種の１日後、２０μＭから始まる濃度及びその３倍連続希釈（２０．００、６．６７、２．２２、０．７４、０．２５、０．０８、０．０３、０．０１μＭオリゴヌクレオチド）を使用して、細胞にオリゴヌクレオチドを細胞に加えた。４日目と７日目に培地を交換して、処理を繰り返した。１１日目に、ＨＢｓＡｇ測定のために上清を採取し（「材料と方法」欄の「ＨＢＶ抗原測定」で説明したように行った）、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、２００μＬの MagNA Pure 溶解緩衝液を各ウェルに加え、ＲＮＡ抽出のためにプレートを－８０℃で保存した。
製造業者のプロトコールに従って、MagNA Pure ロボットとMagNA Pure ９６細胞性ＲＮＡ大容量キット（Roche, #05467535001）を使用して、溶解したＨｅｐ３Ｂ細胞から細胞内ｍＲＮＡを抽出した。ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡは、二重測定技術で個別のＲＴ－ｑＰＣＲにより、QuantStudio 12K Flex（Applied Biosystems）、TaqMan RNA-to-CT １工程キット（Applied Biosystems, #4392938）、ヒトＡＣＴＢ内部対照（Applied Biosystems, #4310881E）、及びＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ Ｔaqmanプライマーと試薬（Life Technologies、アッセイＩＤ Ｈｓ００９００７９０＿ｍ１（ＰＡＰＤ５）及びＨｓ００１７３１５９＿ｍ１（ＰＡＰＤ７）及びカスタムアッセイＩＤ ＡＰＭＦＷ４Ｇ（Small HB））を使用して定量した。ｑＰＣＲは以下の設定を使用して行った：ＵＤＧインキュベーション（１５分、４８°Ｃ）、酵素活性化（１０分、９５°Ｃ）、及びｑＰＣＲ（変性のために９５°Ｃで１５秒と、アニーリングと伸長のために６０°Ｃで１分とを、４０サイクル）。
ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓ ｍＲＮＡ、ＰＡＰＤ５、及びＰＡＰＤ７の低下のＥＣ５０と最大ＫＤ（生理食塩水の％で最大有効性）を、GraphPad Prism 7.02 non line fit を使用して計算した。結果を表３０及び３１に示す。
これらのデータから、試験した７つのオリゴヌクレオチドのうち４つが、組み込まれたＨＢ断片からのＨＢｓＡｇ及びＨＢｓ ｍＲＮＡ発現を生理食塩水対照の５５％未満に低下させ得ることがわかる。
実施例１７
非ヒト霊長類における選択された２重特異的ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的化オリゴヌクレオチドの効果
カニクイザルの肝臓におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡ発現の阻害を、ＲＮＡ配列決定によって定量化した。カニクイザルを、生理食塩水で週に１回で、又は化合物番号２０＿１２の１、３、又は１０ｍｇ／ｋｇ／週で、４週間処置した（１群あたり６匹、１、８、１５、２２、及び２９日目に合計５回投与）、そして２９日目に殺処分した（投与後４週間目）。並行して、カニクイザルを、生理食塩水で週１回で、又は化合物番号２０＿１２の１０ｍｇ／ｋｇ／週で再度４週間、合計５回投与したが、回復期間は４週間で、５６日目に殺処分した（４週間の投与＋４週間の回復）。
肝臓試料は、放血後２０分以内にRNA-Later（Qiagen cat. 76104）で回収された。Tissue Lyser II（Qiagen）を使用して、約１０ｍｇの組織を８００μＬの Magnapure 溶解緩衝液（Roche）に溶解した。次に、溶解物の３５０μＬのアリコートをMagnapure ９６デイープウェルプレートに移し、自動的に処理した。吸光分光法（Nanodrop, ThermoFischer）によってＲＮＡを定量化し、ＲＮＡインテグリティ（ＲＮＡインテグリティ番号、ＲＩＮによる）は、ＲＮＡ ６０００ナノチップを有するAgilent Bioanalyzer 2100（Agilent cat. 5067-1511）を使用して、マイクロ流体キャピラリーアレイ電気泳動によって制御された。
バーコードｃＤＮＡライブラリーの構築には、Ribo-Zero（商標）Gold rRNA Removal キット（Illumina cat. MRZG12324）とともに、TruSeq（商標）Stranded Total RNA キット（lllumina cat. 20020598）の入力として４００ｎｇの総ＲＮＡアリコートを使用した。ライブラリーのサイズ分布は、Agilent High Sensitivity ＤＮＡキット（cat. 5067-4627）を使用して電気泳動によって推定した。ライブラリーは、KAPA Library Quantification qRT-PCR キット（Kapa Biosystems cat. KK4824）を使用して定量化した。ライブラリーを等モル濃度でプールし、１１ｐＭに希釈した後、以下のようにIllumina HiSeq 4000 シーケンサーのフローセルに入れた。ライブラリーを、HiSeq PE Rapid Cluster Kit v2（lllumina cat. PE-402-4002）を使用して拡張した。増幅クラスターを保持するフローセルを、TruSeq Rapid SBS Kit-HS（Illumina cat. FC-402-4001）を用いてペアエンドリード（５０塩基対）を使用して配列決定した。HiSeq Sequencing Control ソフトウェア（ＨＣＳ）を使用して、リアルタイム画像分析とベースコールを行った。配列読み取りペアのFASTQファイルの作成に、CASAVAソフトウェアバージョン１．８を使用した。
得られたライブラリーの最小サイズは１７００万読み取りペアで、最大は１億１４００万読み取りペアであった。平均して、試料あたり５，０００万の読み取りペアがあり、中央値は試料あたり４，７００万の読み取りペアであった。GSNAP プログラムを使用してRefSeq/NCBIデータベースのカニクイザル転写物に、各ライブラリーの読み取りペアを割り当てて、遺伝子レベルの生カウントを生成した。これらはそれぞれのライブラリーサイズに標準化され（試料間比較用）、各転写物のデータはさらにそれぞれの転写物の長さに標準化された（転写物間比較用）。全ての試料について、これは標準化された単位ＲＰＫＭで転写物レベルの発現を生成した（転写物のキロベースあたりの読み取り、マッピングされた１００万読み取りあたり）。処置動物におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の値は生理食塩水処置動物に対して標準化され、対応する時点で結果が表３２に示されている。
それぞれのビヒクル対照群と比較して、結果は、化合物番号２０＿１２の全ての試験用量レベルで、主要群動物及び回復動物の両方で、肝臓におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを示している。ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、３及び１０ｍｇ／ｋｇの約８０％で、肝臓で飽和状態であった。ＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは用量に比例しており、１０ｍｇ／ｋｇでｍＲＮＡが６６％低下した。１０ｍｇ／ｋｇ／週を投与した回復動物では、ＰＡＰＤ５ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは７８％であった。ＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの場合、ダウンレギュレーションは５５％に達した。後者のデータは、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの阻害が、最後の投与後少なくとも４週間にわたって肝臓で持続したことを示している。
実施例１８
ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的化オリゴヌクレオチドの投与後のＨＢＶ感染マウスにおけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇに対する効果
本研究は、ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおいてＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７転写物が低下した時のＨＢＶ増殖パラメーターに対するインビボの効果を示すことを目的とする。
実施例１４及び図１１Ｂは、単一のオリゴヌクレオチドを使用してマウス細胞株におけるＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の両方を標的とすることは困難であることを示した。従って本試験では、表３３に列記されている２つのオリゴヌクレオチド［１つはマウスＰＡＰＤ５（化合物番号２２＿１）を標的とし、もう１つはマウスＰＡＰＤ７（合物番号２２＿１）を標的とする］が使用された。
ＧＮ２は図２に示される３価のＧａｌＮＡｃクラスターを表し、Ｃ６は６個の炭素を有するアミノアルキル基を表し、大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、下付き文字ｏはホスホジエステルヌクレオシド結合を表し、特に明記しない限り、ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
「材料と方法」欄で説明したＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルを使用した。マウス（３匹／群）に化合物２２＿１及び２３＿１の各１０ｍｇ／ｋｇの単回投与（６時間間隔で２回の個別の注射）、又は０日目に５ｍｌ／ｋｇの生理食塩水（対照）を皮下投与した。「材料と方法」欄で説明した方法を使用して、血清中のＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを３日ごとに測定した。標的のノックダウンを測定するために、２つの中間群のマウスを３日目と１４日目に殺処分し、残りのマウスを２７日目に殺処分した。殺処分後、ＰＢＳ灌流後に肝臓を除去した。灌流した肝臓を小さな断片に切断し、直接冷凍した。
セラミックビーズと１ｍｌの MagNA Pure 溶解緩衝液（Roche #05467535001）を含む２ｍｌチューブに凍結肝臓片を加えることにより、凍結肝臓片からｍＲＮＡを抽出した。TissueLyser（Qiagen）を使用して肝臓片をホモジナイズした。ＲＮＡを、MagNA Pure “９６細胞性ＲＮＡ大容量キット”（Roche #05467535001）を使用して組織ホモジネートから分離した。溶解物は－８０℃で保存可能である。ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡは、基本的に「材料と方法」欄で説明したｑＰＣＲを使用して測定し、TaqMan プライマーアッセイを以下のように変更して、以下の２つのアッセイ（ThermoFisher Scientific）を用いて行った。
ＧＵＳＢ及びＴＢＰは、ハウスキーピング遺伝子の下に示されているプライマーアッセイで測定されたＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡの標準化に使用されるハウスキーピング遺伝子である。
結果を以下の表３４、３５、３６に示す。さらに表３４のデータをさらに図１８Ａ及びＢに示す。
データは、１回の処理によるＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルのＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の標的化が、治療後最大２７日間、ＨＢｓＡｇの持続的な２ｌｏｇの低下をもたらすことを示している。
ＨＢｓＡｇに関して、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７の標的化により血清中のＨＢｅＡｇレベルが低下するが、ＨＢｓＡｇほど顕著ではない。
これらのデータから、ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７標的化オリゴヌクレオチドは、それぞれＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７ ｍＲＮＡレベルの低下をもたらし、ＡＡＶ／ＨＢＶマウスモデルにおいて十分に許容されることがわかる。

Claims (21)

  1. 以下の配列：
    TcAACtttcactTcAG
    （式中、
    大文字がβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字がＤＮＡヌクレオシドを表し；すべてのシトシンＬＮＡヌクレオシドが５－メチルシトシンであり；そしてすべてのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である）
    からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合されるコンジュゲート部分を含む、コンジュゲート化合物。
  3. 前記コンジュゲート部分がアシアロ糖タンパク質受容体に結合可能である、請求項２に記載のコンジュゲート化合物。
  4. 前記コンジュゲート部分が、３価N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）部分である、請求項３に記載のコンジュゲート化合物。
  5. 前記コンジュゲート部分が、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合する、請求項２～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  6. リンカーが、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと前記コンジュゲート部分との間に位置する、請求項２～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  7. 前記リンカーが生体切断可能リンカーである、請求項６に記載のコンジュゲート化合物。
  8. 前記生体切断可能リンカーが、S1ヌクレアーゼ感受性リンカーである、請求項７に記載のコンジュゲート化合物。
  9. 前記生体切断可能リンカーが、３つの連続するホスホジエステル結合を備えたホスホジエステルで結合されたシチジン－アデノシンジヌクレオチドである、請求項７又は８に記載のコンジュゲート化合物。
  10. Ｃ６アミノアルキル基が、前記コンジュゲート部分と前記生体切断可能リンカーとの間に位置する、請求項７～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  11. 前記コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体に結合可能であり、そして前記コンジュゲート部分が３価N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）部分であり；前記コンジュゲート部分が前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合し；ここで３つの連続するホスホジエステル結合を備えたホスホジエステル結合されたシチジン－アデノシンジヌクレオチドが、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記コンジュゲート部分との間に位置し；そしてここでC6アミノアルキル基が、前記コンジュゲート部分と、３つの連続するホスホジエステル結合を備えたホスホジエステル結合されたシチジン－アデノシンジヌクレオチドとの間に位置する、請求項１０に記載のコンジュゲート化合物。
  12. 前記コンジュゲート化合物が、以下の式：
    GN2-C6ocoaoTcAACtttcactTcAG;
    式中、
    大文字がβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを表し；
    すべてのシトシンＬＮＡヌクレオシドが５－メチルシトシンであり；
    小文字がＤＮＡヌクレオシドを表し；
    下付きのoがホスホジエステルヌクレオシド結合を表し；そして
    すべての他のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり；
    式中Ｃ6が６の炭素を有するアミノアルキル基を表し；及び
    ＧＮ２が以下の式：
    で示される３価ＧａｌＮＡｃクラスターを表し；
    式中の波線が、３価ＧａｌＮＡｃクラスターが、C6アミノアルキル基へとコンジュゲートする部位を指す、
    を有する、請求項２～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物。
  13. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物の医薬として許容される塩。
  14. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物の医薬として許容されるナトリウム塩。
  15. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は請求項２～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物の医薬として許容されるカリウム塩。
  16. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド；或いは請求項２～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物、或いは請求項１３～１５のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩と、医薬として許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物。
  17. 前記医薬として許容される希釈剤が、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. ＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７を発現する標的細胞においてＰＡＰＤ５及びＰＡＰＤ７発現を調節するためのインビトロ方法であって、前記方法が、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、請求項２～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物、又は請求項１３～１５のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩を、有効量で前記細胞に投与することを含む、前記方法。
  19. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド；請求項２～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物；請求項１３～１５のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩；或いは請求項１６又は１７に記載の医薬組成物を含む、HBV感染の治療用の医薬組成物。
  20. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド；請求項２～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物；請求項１３～１５のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩；或いは請求項１６又は１７に記載の医薬組成物を含む、慢性HBV感染の治療用の医薬組成物。
  21. 請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド；請求項２～１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート化合物；請求項１３～１５のいずれか一項に記載の医薬として許容される塩；或いは請求項１６又は１７に記載の医薬組成物を含む、HBV感染対象の感染性の低下のための医薬組成物。
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