JPH10509740A

JPH10509740A - カチオン性オリゴヌクレオチド、ならびに関連の合成および使用の方法

Info

Publication number: JPH10509740A
Application number: JP9508693A
Authority: JP
Inventors: トーマスホーン，; ロバートエル．レトシンガー，; タンジョーレナラヤナスワミーバラサブラマニアム，
Original assignee: カイロンコーポレイション; ノースウェスタンユニバーシティ
Priority date: 1995-08-04
Filing date: 1996-08-01
Publication date: 1998-09-22
Also published as: AU6897196A; JP2008013571A; EP0785942A1; US6017700A; AU702309B2; CA2201963A1; WO1997006183A1

Abstract

(57)【要約】カチオン性ヌクレオシド間結合を有する新規なオリゴヌクレオチドを提供する。このカチオン性ヌクレオシド間結合は、構造を有し、ここで、Ｗ、Ｘ、Ｙ，Ｚ、R¹、R²およびR³は本明細書中で規定される通りであり、P^*は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そしてさらにこのヌクレオシド間結合は立体的に均一である。これらのオリゴヌクレオチドの特定のものは、交互のアニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合(必ずしも立体的に均一ではない)を有し得る。この化合物を合成するための方法もまた提供し、同様に、例えばアンチセンスとしておよび核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいてこの化合物を使用するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】カチオン性オリゴヌクレオチド、ならびに関連の合成および使用の方法技術分野本発明は一般に核酸化学に関する。より詳細には、本発明は、カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、このようなオリゴヌクレオチドを調製するための方法および試薬に関する。本発明は、診断上または臨床上のモニター目的のためのアンチセンス治療および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける応用を有する。背景改変されたヌクレオシド間ホスホジエステル結合を含む配列特異的オリゴヌクレオチドは、治療的応用のためのアンチセンス分子、および診断または治療の効力のモニター応用のための核酸ハイブリダイゼーションプローブとしての有用性を有する。好結果のアンチセンス分子および核酸ハイブリダイゼーションプローブは、生理学的条件下で目的の一本鎖または二本鎖の標的核酸配列と特異的に結合しなければならない。このような分子およびプローブはまた、インタクトの細胞によって効果的に取り込まれなければならず、そしてヌクレアーゼ分解に対して抵抗性でなければならない。ホスホジエステル骨格が、これらの規準を満足する試みにおいて改変されてきた。例えば、ホスホジエステル骨格は、ホスホネート骨格(Millerら(1980)J.Bio l.Chem．255:9659-9665)、ホスホトリエステル骨格(Plessら(1977)Biochemistry 16:1239-1250)またはホスホロチオエート骨格(Stecら(1984)J.Am.Chem.Soc． 1 06 :6077-6079)で置換されてきた。オリゴヌクレオチド骨格改変に対する１つのアプローチは、ヌクレオシド間ホスホジエステル(「PDE」)結合の負の電荷を取り除いて中性骨格、例えば、メチルホスホネート(Vyazovkinaら(1994)Nucleic Acids Res．22:2404-2409)、ホスホ (Egholmら(1992)J.Am.Chem.Soc．114:1895-1897)を生成することであった。オリゴヌクレオチド骨格を改変するための別のアプローチは、アニオン性PDE 基をカチオン性基で置換することであった。カチオン性置換基は、ホスホルアミデート結合を介してヌクレオシド間リン原子に結合させてきた(Letsingerら(198 8)J.Am.Chem.Soc．110:4470-4471)。カチオン性基はまた、アニオン性酸素がリン−炭素結合を介してカチオン性基で置換されているホスホネート誘導体を介してオリゴヌクレオチドに導入され得る。従って、骨格が交互の(alternating)ホスホジエステルおよび立体異性体的に純粋な(2-アミノエチル)-ホスホネート結合からなるオリゴヌクレオチドの調製、ならびに(アミノメチル)-ホスホネートからなる骨格を含むオリゴヌクレオチドの調製は、それぞれ、Fathiら(1994)Nuc leic Acids Res．22:5416-5424およびFathiら(1994)Bioconjugate Chem．5:47-5 7に報告されている。 Patilら(1994)Biorg.Medicinal Chem.Lett．4:2663-2666は、立体異性体的に純粋な改変ジヌクレオシドを使用して、交互の立体調節されたアニオン性ホスホロチオエートおよびアニオン性PDE結合を有するデカチミジレートを合成する、ホスホロチオエートの立体異性体を含むオリゴチミジレートアナログの合成を報告した。 Peyrottesら(1994)Nucleosides & Nucleotides 13:2135-2149は、予め生成したダイマーを使用して、メトキシホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴマーを調製した。さらに、オリゴ(dT)と比較した場合、メトキシホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴマーは、ポリ(dA)またはポリ( Ａ)とハイブリダイズしたときの温度安定性の減少を示した。標準的なホスホジエステルヌクレオシド間結合のみを有するオリゴヌクレオチドより大きな標的核酸への親和性を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが当該分野において必要とされている。このようなオリゴヌクレオチドは、アンチセンス治療剤、および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして役立ち得る。発明の要旨従って、診断上または臨床上のモニター目的のためのアンチセンス治療薬および核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用なカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供することが本発明の目的である。カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを合成する方法を提供することが本発明の別の局面である。カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイを提供することが、本発明のなお別の目的である。本発明の１つの実施態様において、構造(Ｉ)を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが提供される。ここで、Ｗは、Ｏ、ＳおよびSeからなる群より選択される；ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵からなる群より独立して選択され、ここでR⁴ およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶(R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルである)からなる群より独立して選択される；Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷(R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルである)からなる群より選択され、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはNR⁷である； R¹は、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択される； R²およびR³は、Ｈ、C₁〜C₆アルキル、１〜４のNH₂基で置換されたC₁〜C6アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはR² およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得る；そしてここで、P^*は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そして、さらにこの結合は立体的に均一(stereouniform)である。本発明の別の実施態様において、交互のカチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供する。ここで、カチオン性ヌクレオシド間結合は構造(II)を有する。ここで、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、R¹、R²およびR³は上記の規定の通りであり、ただし、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり、ここでＰは、２つの異なる立体異性体的配置で存在し得るリン原子であってもよいしまたはそうでなくともよく、そしてさらにその結合は立体的に均一であってもよいしまたはそうでなくてもよい。本発明のなお別の実施態様において、以下の構造(II)を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを提供する。ここで、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、R¹、R²およびR³は上記の規定の通りであり、ただし、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳである。本発明のさらなる実施態様において、以下の構造(Ｉ)を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを作成するための方法を提供する。ここで、Ｗは、Ｏ、ＳおよびSeからなる群より選択される；ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵からなる群より独立して選択され、ここでR⁴ およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶(R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルである)からなる群より独立して選択される；Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷(R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルである)からなる群より選択され、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはNR⁷である； R¹は、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択される； R²およびR³は、Ｈ、C₁〜C₆アルキル、１〜４個のNH₂基で置換されたC₁〜C₆アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいは R²およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得る；そしてここで、P^*は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そして、さらにこの結合は立体的に均一であり、この方法は、 (ａ)カチオン性ヌクレオシド間結合および3'-O-TBDMS保護基を含む、保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーのポイントラセミ(point rasemic)混合物を合成する工程； (ｂ)必要に応じて、上記混合物に立体異性体を溶解する工程； (ｃ)工程(ｂ)において単離されたカチオン性ヌクレオチドダイマーを脱保護する工程； (ｄ)工程(ｃ)において提供された脱保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーを、Cl-P(N(iPr)₂)-O-BCEとの反応によって、対応する3'-O-CH₂CH₂CNホスホルアミダイト誘導体に変換する工程；および (ｅ)3'-O-CH₂CH₂CNホスホルアミダイト誘導体を、オリゴヌクレオチド鎖の保護されていないヒドロキシル含有末端ユニットに結合する工程、を含む。本発明のなお別の実施態様において、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを提供する。このアッセイは、 (ａ)少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程； (ｂ)このプローブを一本鎖分析物核酸にハイブリダイズさせて、標識された二重鎖を生成させる工程；および (ｃ)この標識された二重鎖を検出する工程、を含む。本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、以下の説明に部分的に記載され、そして以下を検討する際に部分的に当業者に明らかになるか、または本発明の実施によって学ばれ得る。発明の詳細な説明定義および名称：本発明を詳細に開示および記載する前に、本発明が特定のアッセイ方式、材料または試薬(これらはもちろん変化し得る)に限定されないことを理解すべきである。本明細書中で使用される用語は特定の実施態様を記載する目的のためだけであり、そして限定する意図はないことも理解すべきである。本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が明らかに別のことを示さない限り、複数の指示物を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「カチオン性ヌクレオシド間結合」を含むオリゴヌクレオチドに対する言及は、２またはそれ以上のカチオン性ヌクレオシド間結合を含む複数のポリヌクレオチドも含む、などである。本明細書および以下の請求の範囲において、以下の意味を有すると定義される多くの用語に対する言及がなされる：本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2'-デオキシ-Ｄ-リボースを含む)、ポリリボヌクレオチド(Ｄ-リボースを含む)、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ-グリコシドまたはＣ-グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格(例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸(PNA))およびポリモルホリノ(polymorpholino；Anti-Virals，Inc.(Corvallis , Oregon)からNeugene^TMポリマーとして市販されている))、および他の合成配列特異的核酸ポリマー(ポリマーが、DNAおよびRNAで見出されるように、塩基対合および塩基重層を可能にする配置でヌクレオベース(nucleobase)を含むことを提供する)を含む他のポリマーに対する一般名称である。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間で長さの違いは意図されず、そしてこれらの用語は互換的に使用される。これらの用語は分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語は二本鎖および一本鎖DNA、ならびに二本鎖および一本鎖のRNA、DNA ：RNAハイブリッド、およびPNAとDNAまたはRNAとの間のハイブリッドを含み、そして公知のタイプの改変体(例えば、当該分野において公知である標識、メチル化、「キャップ(cap)」、アナログでの１またはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変体)、ならびに非改変形態のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドもまた含まれる。ヌクレオチド間改変体は、例えば、非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート、など)を有する改変体および負に荷電した結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を有する改変体、3'-オキシリボース部分または3'-デオキシリボース部分の2'-O-ヌクレオチド間結合を含む改変体、ペンダント部分、例えば、タンパク質(ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリＬ-リジンなどを含む)を含む改変体、インターカレーター(例えば、アクリジン、プソラレンなど)を有する改変体、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力を有する金属など)を含む改変体、アルキル化剤を含む改変体、改変された結合(例えば、αアノマー核酸など)を有する改変体などである。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、改変された他の複素環式塩基も含む部分を包含することが理解される。このような改変は、メチル化プリンまたはメチル化ピリミジン、アシル化プリンまたはアシル化ピリミジン、あるいは他の複素環を包含する。さらに、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含む部分を包含する。改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドもまた糖部分に改変を含む。例えば、ここで、１またはそれより多いヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置換されているか、あるいはエーテル、アミンとして官能化されているなどである。名称「３'」は、ヌクレオシド間結合の構造的な表示において使用される場合、結合に対して５'側に位置するヌクレオシドのリボース部分の３'炭素との結合をいう。名称「５'」は、ヌクレオシド間結合の構造的な表示において使用される場合、結合に対して３'側に位置するヌクレオシドのリボース部分の５'炭素との結合をいう。しかし、上記に示すように、本発明を、骨格の一部分としてリボース糖を含むオリゴヌクレオチドに限定する意図はない。従って、当業者は、本明細書中に示されるような、カチオン性ヌクレオシド間結合を含む新規なオリゴヌクレオチドが、伝統的な３'および５'ヌクレオシド間結合に限定される必要はないことを理解する。用語「カチオン性」は、本明細書中で使用される場合、約９未満、好ましくは約８未満のpHで正の電荷を有する化学的部分をいう。より好ましくは、中性に近い水溶液中の場合、すなわち約pH４〜pH８の範囲、好ましくは約pH７、最も好ましくは約pH7.3において、カチオン性部分は陽子を得て正の電荷を帯びる。従って、「カチオン性ヌクレオシド間結合」は、上記の条件下で正に帯電している置換基化学部分を含むような結合である。「カチオン性オリゴヌクレオチド」は、本明細書中では、１またはそれより多いカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを示すために使用される。用語「アルキル」または「低級アルキル」は、本明細書で使用される場合、１〜６個の炭素原子の、分枝または非分枝の飽和炭化水素基(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル(「iPr」)、n-ブチル、イソブチル、t-ブチルなど)をいう。用語「アルキレン」または「低級アルキレン」は、本明細書で使用される場合、１〜６個の炭素原子を含む、二官能性の飽和分枝または非分枝炭化水素鎖をいい、そして例えば、メチレン(-CH₂-)、エチレン(-CH₂-CH₂-)、プロピレン(-CH₂- CH₂-CH₂-)、2-メチルプロピレン(-CH₂-CH(CH₃)-CH₂-)、ヘキシレン(-(CH₂)₃-)などを含む。用語「アルケニレン」または「低級アルケニレン」は、本明細書中で使用する場合、２〜６個の炭素原子および少なくとも１つの二重結合を含む、二官能性の分枝または非分枝の炭化水素鎖をいう。用語「アルキニレン」または「低級アルキニレン」は、本明細書中で使用する場合、２〜６個の炭素原子および少なくとも１つの三重結合を含む、二官能性の分枝または非分枝の炭化水素鎖をいう。用語「アリール」は、本明細書中で使用される場合、１〜５の芳香族環を含む、代表的には、ハロゲンおよびC₁〜C₆アルキルからなる群より選択される１またはそれより多い置換基で置換されていないかまたは置換されているかのいずれかの芳香族種をいう。用語「アリーレン」は二官能性芳香族部分をいい；「単環式アリーレン」はフェニレン基をいう。これらの基は上記で概説されるような４つまでの環置換基で置換されていてもよい。用語「複素環」はその従来の意味で使用され、複素原子(例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐおよびハロゲン)を含む置換または非置換の芳香族環式分子および非芳香族環式分子を包含する。このような複素環の例には、ピロール、ピロリジン、ピリジン、ピペリジン、モルホリン、キノリン、インドール、ピリミジン、ピペラジン、ピペコリン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、プリンなどが含まれる。これらの基はまた、上記で概説したように、置換されていてもよい。「精製(された)」または「均質な」とは、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列に言及する場合、同じタイプまたは立体異性体的配置の他の生物学的高分子が実質的に存在することなく、示された分子が存在することを意味する。用語「精製(された)」または「均質な」は、本明細書中で使用される場合、好ましくは少なくとも約90重量％、より好ましくは少なくとも約95重量％、そして最も好ましくは少なくとも約98重量％の同じタイプの生物学的高分子が存在することを意味する。用語「立体異性体」はその従来の意味で使用され、少なくとも１つの不斉的な原子を有する化学的化合物(この化合物は、同じ数および種類の原子ならびに同じ原子配置を有するが空間的な関係は異なる、２つまたはそれ以上の形態で存在し得る)をいう。不斉的なヌクレオシド間リン原子の場合、２つの可能な立体異性体的配置が存在する。用語「立体異性体的に純粋」または「立体化学的に純粋」とは、他の立体異性体が実質的に存在することなく１つの立体異性体が存在することを意味する。少なくとも１つの不斉的なヌクレオシド間リン原子を含む分子に言及する場合、この用語は、他の立体異性体的配置が実質的に存在することなく、その不斉的なヌクレオシド間リン原子の１つの立体異性体的配置が存在することを意味する。用語「立体化学的に純粋」は、本明細書中で使用される場合、好ましくは少なくとも約7 0重量％、より好ましくは少なくとも約80重量％、そして最も好ましくは少なくとも約90重量％の特定の立体異性体的配置のダイマーまたはオリゴヌクレオチドが、他の立体異性体的配置を除外して存在することを意味する。立体異性体の「分割」は、立体異性体が互いに分離されて立体異性体的に純粋な異性体を生成し得る手段を示す。「ポイントラセミ混合物(point racemic mixture)」または「ポイントラセミ化合物(polnt racemate)」は、本明細書中で、特定の不斉的なリン原子での両立体異性体が存在する立体異性体の混合物であると定義される。このような「ポイントラセミ混合物」は、代表的には、40％〜60％のオーダーの１つの立体異性体、およびこれに対応して60％〜40％の他の立体異性体を含むが、必ずしも必要ではない。しかし、一般的には、２つの立体異性体は概ね等量で存在する。例えば、不斉的なヌクレオシド間リンを有するダイマーでは、あるいは１つのこのような不斉的なリンを有するオリゴヌクレオチドでは、ポイントラセミ混合物は、一般的に、概ね等量の各立体異性体を含む。ヌクレオシド間結合が２つの異なる立体異性体的配置のうちの１つで存在し得るような、不斉的なリン原子を有する特定のカチオン性ヌクレオシド間結合に言及する場合、用語「立体的均一(stereouniform)」は、このヌクレオシド間結合を含むこのような分子の実質的な部分が、異なる立体異性体的配置で存在する結合を有することを意図する。「実質的な部分」は、好ましくは70％より大きい、より好ましくは80％より大きい、そして最も好ましくは90％より大きいこのようなヌクレオシド間結合が立体異性体的配置で存在することを意図する。立体異性体は、当該分野で公知の任意の種々の方法によって分割され得る。例えば、いくつかのラセミ混合物を、同様な立体異性体的配置の分子が、可視的に不斉的な結晶に集合する様式で結晶化させる。このような結晶は物理学的に分離されて、立体化学的に純粋な立体異性体を生成し得る。当該分野で周知である第２の方法は、ラセミ混合物が、第２の標準的な不斉的な分子と反応することを可能にする化学的手順を包含する。例えば、ラセミ化合物が酸である場合、光学的に活性なアミン(例えば、キニン、ブルシンまたはストリキニーネ)を使用してこの混合物を分割し得る。この方法は、標準的な物理学的手段(例えば、蒸留、結晶化、クロマトグラフィーなど)によって分離され得る２つの立体異性体を生成する。ヌクレオシド間リンに結合した置換基を含むオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間リンでのキラリティーによって決定される異性体が、実際にジアステレオマーである。なぜなら、オリゴヌクレオチド骨格の糖成分がキラルであるからである。ジアステレオマーは従来の方法(例えば、蒸留、結晶化、クロマトグラフィーなど)によって分離され得る。ジアステレオマーである立体異性体は、薄層クロマトグラフィー(「TLC」)、またはアキラルな媒体を使用するカラムクロマトグラフィーを使用して分離され得る。立体異性体のTLC分割は、固相(例えば、シリカ)を含む適切なTLCプレート上で行われ得る。これは、必要に応じてキラル試薬などを含み、そして立体異性体を分割するに効果的である。TLCによって分離された立体異性体は、TLC基質およびプレートの展開に使用された溶媒中におけるそれらの差分(differentdial)溶解性によって特徴付けられ得る。代表的には、差分溶解性は、特定の溶媒系におけるプレート上での化合物の移動を、プレートの展開に使用された溶媒系の移動に対して決定することによって表される。従って、プレートの展開後のプレート上の立体異性体の位置は、溶媒の先端の位置に対する、化合物が塗布されたスポットから移動した距離として表される。この比は、代表的には、立体異性体のR_f と呼ばれる。カラムクロマトグラフィーによる立体異性体の分割もまた、固相マトリックス(例えば、シリカゲル)を使用して行われ得る。これは、必要に応じて、当該分野において周知の技術および試薬を使用するキラル試薬を含む。より高いR_f、すなわち特定の溶媒系中のTLCプレート上でのより高い移動性を有するかまたはカラムから最初に溶出する立体異性体は、本明細書中では、「最初に溶出する」異性体と呼ばれる。一方、より低いR_fを有するかまたはカラムから２番目に溶出する立体異性体は、本明細書中では、「２番目に溶出する」異性体と呼ばれる。リン原子での絶対的な立体化学は、Fathiら(1994)Nucleic Acids Res.(前出) によって記載されるように、Loschnerら(1990)Nucleic Acids Res．18:5083-508 8の2D-NMR法によって決定され得る。絶対的な立体化学的配置もまた、当該分野において周知である従来の方法(例えば、旋光分散(optical rotatory dispersio n)または円二色性(circular dichroism)測定)によって決定され得る。「随意の」または「必要に応じて」は、後に記載される事象または状況が生じてもよくまたは生じなくてもよいこと、ならびにその記載がその事象または状況が生じる例および生じない例を包含することを意味する。例えば、語句「必要に応じて置換されたアルキレン」は、アルキレン部分が置換されていてもよく、または置換されていなくてもよいこと、ならびにこの記載が置換されていないアルキレンおよび置換が存在するアルキレンの両方を包含することを意味する。新規なオリゴヌクレオチド本発明の新規なオリゴヌクレオチドは、以下の構造(Ｉ)を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を含む：構造(Ｉ)については、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、R¹、R²およびR³は上記の規定の通りである。この構造において、P^*は、例えば、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、ホスホチオエステルまたはアルキルアミノホスホネート結合中に存在する不斉的なリン原子を表す。オリゴヌクレオチドは、アニオン性および/またはカチオン性ヌクレオシド間結合の任意の組み合わせを含み得る。オリゴヌクレオチドにおいて、カチオン性ヌクレオシド間結合は、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、ホスホチオエステル、アルキルアミノホスホネート結合の任意の組み合わせであり得る。不斉的なリン原子の存在の結果として、カチオン性ヌクレオシド間結合は、２つの立体異性体的配置のうちの１つで存在し得る。オリゴヌクレオチドは、以下に記載および例示されるように、２つの立体異性体のうちのただ１つが予め決定された任意のヌクレオシド間結合に存在するよう、すなわちオリゴヌクレオチド中の予め決定されたヌクレオシド間結合が立体的均一であるように調製され得る。上記のように、ＷはＯ、ＳおよびSeであり得る。特に好ましい実施態様において、P^*が不斉的なリン原子であり、そしてこのような結合のそれぞれが立体的均一である場合、ＷはＳである。ＸおよびＹは、独立して、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵であり得、ここでR⁴およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶(R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルである)からなる群より独立して選択される。好ましくは、ＸおよびＹは独立してＯ、Ｓ、CH₂ 、NHであり、より好ましくは、ＸおよびＹは共にＯである。Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷(R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルである)であり得る。P^*が不斉的なリン原子であり、そして各カチオン性ヌクレオシド間結合が立体的均一であるとき、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはNR⁷である。好ましい立体的均一のカチオン性ヌクレオシド間結合において、ＺはＯまたはNHである。本発明の他の好ましい実施態様において、カチオン性ヌクレオシド間結合は立体的均一である必要はない。これらの実施態様において、Ｗ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳである。これらの実施態様のうちの１つのセットにおいて、オリゴヌクレオチドは、交互のカチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を含む。 R¹は、低級アルキレン、低級アルケニレン、低級アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択される。従って、例えば、R¹が結合である場合、ＺはNR²R³に直接結合している。R¹は、ヌクレオシド間リンとカチオン性中心との間のスペーサーを提供するよう選択され、そして核酸とハイブリダイズするための、カチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの親和性を最適化するよう選ばれ得る。R¹として有用な特に好ましい基には、(CH₂)₂または (CH₂)₃が含まれる。 R²およびR³は、Ｈ、低級アルキル、１〜４個のNH₂基で置換された低級アルキル、および単環式アリールの任意の組み合わせであり得る。あるいは、R²およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得る。P^*が不斉的なリン原子であり、そしてこのような結合のそれぞれが立体的均一である場合、R²およびR³は、Ｈ、CH₃、または１個のNH₂基で末端を置換された低級アルキルであることが好ましい。より好ましくは、R²およびR³はCH₂NH₂またはCH₂CH₂NH₂である。好ましい複素環には、ピロール、ピロリジン、ピリジン、ピペリジン、モルホリン、キノリン、インドール、ピリミジン、ピペラジン、ピペコリン、イミダゾール、ベンズイミダゾールおよびプリンが含まれ、これらはハロゲンまたはC₁〜C₆アルキルで置換されていなくてもあるいは置換されていてもよい。好ましい複素環には、イミダゾール、モルホリン、ピロリジン、ピペラジン、ピペコリン、メチルピペラジンが含まれる。一般には、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、R¹、R²およびR³は、生理学的な条件下で加水分解に対して化学的に非感受性であり、ヌクレアーゼに対して抵抗性であるオリゴヌクレオチドを提供し、そして/あるいは相補的なオリゴヌクレオチドと安定な二重鎖を形成するカチオン性ヌクレオシド間結合を、オリゴヌクレオチドに提供するよう選ばれる。１つの特に好ましい実施態様において、カチオン性ヌクレオシド間結合は下記の構造(II)を有するここで、P^*は不斉的なリン原子を表し、その結果、この結合は、ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合、最初に溶出した立体異性体の配置に対応する立体異性体的配置で存在する。本明細書中で開示しそして特許請求したオリゴヌクレオチドは、カチオン性ヌクレオシド間結合によって置換される、任意の割合のアニオン性PDE結合を有し得る。従って、オリゴヌクレオチドは、カチオン性ヌクレオシド間結合によって置換される、約１個程度のアニオン性PDE結合を含み得、そしてカチオン性結合で置換される100％程度のアニオン性PDE結合を有し得る。負電荷と正電荷との割合は所望の正味の電荷を有するオリゴヌクレオチドを生成するよう変化し得る。オリゴヌクレオチドは、そこに組み込まれるカチオン性ヌクレオシド間結合の数に依存して、全体的に正、中性、または負の電荷を有し得る。オリゴヌクレオチドは交互のアニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合を含むよう調製され得る。本明細書の下記の実施例４に記載するように、交互のアニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、 DNAまたはRNAと、アニオン性の対応物より安定な二重鎖を形成する。アニオン性およびカチオン性ヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチドじゅうにランダムに分布し得るか、またはアニオン性結合およびカチオン性結合のかたまりでオリゴヌクレオチド中に存在し得る。本発明の１つの好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド中の選択されたヌクレオシドの間に立体的均一なカチオン性ヌクレオシド間結合を有する。カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、従来のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して調製され得る。例えば、その結合において予め決定された立体異性体的配置を有するカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、所望のホスホトリエステル、ホスホルアミデートまたはアルキルアミノホスホネート結合を有するダイマーブロックを合成し、ダイマーブロックの立体異性体を分割し、そしてダイマーブロックの分割された立体異性体を、固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用してオリゴヌクレオチドに組み込むことによって調製され得る。最初に溶出する立体異性体または２番目に溶出する立体異性体のいずれかが、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。例えば、以下の２つの立体異性体構造(IVa)および(IVb)を有するカチオン性チミジレートダイマーは、実施例１に記載されそしてスキーム１に示されるように、5'-HO-T-O-t- ブチルジメチルジシリル(「TBDMS」)をジメトキシトリチル(「DMT」)-T-O-P(OCH₃)-N (iPr)₂と反応させることによって調製され得る。 (ここで、Ｔはチミジレートヌクレオシドを表す) DMT-T-O-P(OCH₃)-N(CHCH₃)₂(Ｖ)を、テトラゾール中で5'-HO-T-O-TBDMS(VI)と反応させた。この反応が本質的に終了した後、この反応混合物を濃縮し、CH₂Cl₂ で希釈し、そしてNaHCO₃および80％飽和NaClで抽出した。有機相を乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして粗ホスファイト−トリエステル中間体(VII)を生成した。この中間体を、ヨウ素の存在下で3-ジアミノプロピルアミンと反応させた。最終反応の生成物は、粗DMT-T-O-P(O)-(NH-(CH₂)-N(CH₃)₂)-O-T-O-TBDMS(IV aおよびIVb)のポイントラセミ混合物である。さらに、このポイントラセミ化合物は、カチオン性ヌクレオシド間結合(この結合の配置は立体特異的である必要はない)を有するオリゴヌクレオチドを調製するために使用され得る。カチオン性ホスホルアミデートヌクレオシド間結合を有するオリゴマーは、実施例６に記載される２段階法を用いて調製され得る。この反応は、メチルホスファイト−トリエステル結合を有する予め合成されたダイマーをジチオジピリジンで酸化して、活性化されたＳ-Pyr-ホスホロチオジエステルを得ることを包含する。新たに形成された立体異性体は分割され得、そしてその後Ｓ-Pyr基は3-ジメチルプロピルアミンのような反応アミンで置換されて、所望の立体化学的配置中に所望のホスホルアミデートジエステル結合を有するダイマーを生成する。上記および実施例６に記載の２段階法は、カチオン性ホスホルアミデート結合オリゴマーの固相合成のために使用され得る。鎖伸張の間、オリゴマーをアミン溶液に曝さず、そして反応の終了時にすべてのＳ-Pyr-ホスホロチオジエステル結合をホスホルアミデート結合に変換する。固相合成の間にヌクレオシド間結合を改変するこの方法は、ホスホルアミデート結合での立体特異性を生じない。カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを調製する他の方法は、当業者に明らかである。カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、核酸とで形成される二重鎖の安定性の増加の結果として、核酸に対するプローブとしての有用性を見出される。カチオン性および両性イオン性オリゴヌクレオチドは、核酸標的を含む二重鎖形成をさらに制御するために塩および/またはpHを使用する可能性を提供する。代表的には、オリゴヌクレオチドとRNA標的とのハイブリダイゼーションは、RNAにおける大規模な(extensive)２次構造および３次構造のために困難であり得る。しかし、低塩濃度で、これらの構造はよりずっと不安定である。RNA標的と、塩濃度によって制御され得る、すなわち低塩で安定な二重鎖を形成するカチオン性オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖形成を可能にする。例えば、増加した二重鎖安定性を有するオリゴヌクレオチドは、遺伝子研究、生物医学研究および臨床診断学において一般に使用される核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける有用性を見出される。基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖分析物核酸は、標識された一本鎖核酸プローブとハイブリダイズし、そして得られる標識された二重鎖を検出する。このようなアッセイにおけるハイブリダイゼーション工程は、適切なストリンジェンシー条件下で実施される。ストリンジェンシーは、熱力学的変数であるパラメータを変化させることによって制御され得る。このような変数は当該分野において周知であり、そしてホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、pH、有機溶媒含有量、および温度を含む。好ましいストリンジェンシーの制御は、pHおよび塩濃度である。ストリンジェンシーは分析物配列の長さおよび性質に依存して変化し得る。この基本的なスキームの多様性は、正確性を向上させ、無関係(extraneous)の物質からの検出すべき二重鎖の分離を容易にし、そして/あるいは検出されるシグナルを増幅するように開発されてきた。１つのこのようなアッセイは、共有に譲渡されたUrdeaらの米国特許第4,868,105号に詳細に記載される(この開示は、本明細書中に参考として援用される)。さらに、塩濃度および/またはpHを変化させることによって二重鎖形成を制御する能力は、共有に譲渡されたCollinsらの米国特許出願第08/298,073号(この開示は、本明細書中に参考として援用する)に記載されるように、非特異的なハイブリダイゼーションに起因するバックグランドノイズを減少させるために、カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用とする。カチオン性ヌクレオシド間結合を含むハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの構築が有用性を見出す別の応用は、アンチセンス化合物の設計においてである。アンチセンス化合物は、例えば、Chingら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．86: 10006-10010、Broderら(1990)Ann.Int.Med．113:604-618、Loreauら(1990)FEBS Letters 274:53-56、ならびにPCT公開第WO91/11535号、第WO91/09865号、第WO91 /04753号、第WO90/13641号、第WO91/13080号、および第WO91/06629号に説明されるように、特定のタンパク質の産生を担うmRNAに結合し、そしてそのmRNAの生成を不能にするかまたは防ぐオリゴヌクレオチドである。従来のアンチセンス分子は、一般的に、種々のオリゴヌクレオチド種と反応し得る。三重構造(例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズしたアンチセンス分子)もまた、アンチセンス機能を提供し得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、これらを、アンチセンス分子として、天然に結合したオリゴヌクレオチドより望ましくする特性を有する。カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、天然に存在するオリゴヌクレオチドを加水分解するヌクレアーゼに対してより抵抗性である。従って、カチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、細胞中でより長い半減期を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、天然に存在する対応物より高い安定性で、細胞中の相補的なオリゴヌクレオチドと相互作用し得る。細胞中でのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドによるこの実質的に安定な複合体の形成は、遺伝子発現の選択的な阻害を可能にする。実験本発明の実施には、他に指示しない限り、当該分野の技術の範囲内である合成有機化学、生化学、分子生物学などの従来の技術を用いる。このような技術は文献に十分に記載されている。例えば、Sambrook、Fritsch および Maniatis、Mol ecular Cloning ：A Laboratory Manual 、第２版（1989）;Oligonucleotide Synt hesis （M.J.Gait ら編、1984）；Nucleic Acid Hybridization（B.D.Hamesおよび S.J.Higgins 編、1984）および一連の、Methods in Enzymology（Academic P ress、Inc．）を参照のこと。本明細書中で言及されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、前出および後出の両方とも、本明細書中で参考として援用される。本発明は、その好ましい特定の実施態様に関して記載されるが、上記の説明および以下の実施例は、本発明の範囲を例示するが、限定しないことを意図することが理解される。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明に関連する分野における当業者に明白である。以下の実施例において、使用された数字（例えば、量、温度など）に関して精確さを確実にするための努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。温度は常に℃で与えられ、他に示されなければ、圧力は大気圧かまたはほぼ大気圧である。 NMR 分光学。以下の実施例において、NMR スペクトルは Varian 300MHz 装置で記録した。³¹Ｐスペクトルは121MHz において、140ppm にセットされたトリメチルホスファイトに関して稼動させた。高速液体クロマトグラフィー。逆相高速液体クロマトグラフィー（「RP-HPLC 」）分析および精製を、0.1M 酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（pH7.5）中５％の CH₃CN への CH₃CN の０〜50％グラジエント（25分間）、流速１mL／分にて溶出させるSupelco LC-18 ５ミクロンカラム（25cm×4.6mm）で行った。実施例１カチオンダイマー DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-O-TBDMS の合成 5'-HO-T-O-TBDMS（VI）（3.7 グラム；10.4 ミリモル）およびテトラゾール（ 20ミリモル）を乾燥アセトニトリル（２×100mL）とともに共エバポレートし、そして残渣を乾燥アセトニトリル（50mL）に溶解した。DMT-T-O-P(OCH₃)-N(iPr)₂ （Ｖ）（10ミリモル）を、分液丸底フラスコ中の乾燥アセトニトリル（50mL）に溶解し、次いで、ゆっくり5'-HO-T-O-TBDMS／テトラゾール溶液に５分間の時間をかけて添加した。シリカプレート上の薄層クロマトグラフィー分析を、２回、５％メタノール／CH₂Cl₂で展開した。ここで、DMT 陽性産物は、5'-HO-T-O-TB DMS よりわずかに速く移動し、反応が５分以内に完了した様であることを示した。反応混合物を穏やかに濃縮して少量とし、400mL の CH₂Cl₂で希釈しそして有機相を５％NaHCO₃水溶液（400mL）および80％飽和 NaCl 水溶液（400mL）で抽出した。有機相を固体 NaSO₄で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして乾燥した。残渣をトルエン（100mL）およびアセトニトリル（２×200mL）とともに共エバポレートして、10グラムの粗製亜リン酸トリエステル中間体（VII）を得た。粗製中間体を、さらなる精製を行わずに直接使用して、アセトニトリル（200m L）に溶解した。希釈していない３−ジアミノプロピルアミン（10mL；16ミリモル）を溶液に直接添加し、続いて、急速撹拌しながら、ヨウ素（2.53 グラム；1 0 ミリモル）のアセトニトリル溶液（100mL）を滴下して加えた。添加するとヨウ素の紫色は直ちに消失し、僅かに黄色が、添加の完了後に残った。反応混合物を４℃で18時間放置した。次いで、反応混合物を少量まで穏やかに濃縮し、そして400mL のCH₂Cl₂で希釈した。この調製物の有機相を、15％の亜硫酸水素ナトリウム（300mL）、５％NaH CO₃水溶液（2×400mL）、そして80％飽和NaCl 水溶液（２×400mL）で抽出した。有機相を固体NaSO₄で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートして乾燥した。残渣を、トルエン（100mL）およびアセトニトリル（２×200mL）と共エバポレートし、12グラムの粗製DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-O-TBDMS（（IVa）および（IVb））を得た。生成物を、２％ TEA／CH₂Cl₂中のメタノール（０〜６％）のグラジエントを用いてシリカゲルクロマトグラフィー（２％トリエチルアミン（「TEA」）／CH₂Cl₂ の溶媒系中に注いだ「600mL」のMerckシリカゲル60）で分画し、100mLの画分を得た。画分16〜25をプールし、そして濃縮した。画分を上記のようにシリカゲルクロマトグラフィーにより、２％ TEA／CH₂Cl₂中のメタノールの長い（drawn-ou t）グラジエント（２％（８画分）、４％（16画分）、５％（16画分）および６％（16画分）メタノール）で繰り返し、50mLの画分を採取した。３つのプールを単離した：＃１、画分19〜22；＃２、画分23〜32；そして＃３、画分33〜40。各プールを濃縮し、そしてトルエンおよびアセトニトリルとともに共エバポレートして、以下の特性を有する３つのプールを得た。 DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-O-TBDMS の最初の精製物からのプール#2 を、さらにシリカゲルクロマトグラフィー（２％TEA／CH₂Cl₂の溶媒系中に注いだ「400mL」のMerckシリカゲル60）により、２％ TEA／CH₂Cl₂中のメタノールのグラジエント（２％（16個の50-mL画分）、３％（８×50mL、10×25mL）、４％（16×50mL）および５％（６×50mL））を用いて、分画した。以下のように、３つのプールを単離した：プール＃１、画分24〜34：最初に溶出する異性体、1.62 グラム；プール＃２、画分23〜32：異性体の混合物、0.73グラム；そしてプール＃３、画分33〜40：２番目に溶出する異性体、1.2グラム。 TBDMS 基の脱離は、テトラブチルアンモニウムフルオライド（「TBAF」）を用いて達成した。19mLのアセトニトリル中のシリカ精製した DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃ -N(CH₃)₂)-O-T-O-TBDMS（最初の精製物からのプール#1（1.14グラム；0.95ミリモル））を、５当量のTBAF（THF 中1Mの TBAF の５mL）で2.5時間処理し、その時間で、反応は事実上完結した。反応混合物を250mL の塩化メチレンで希釈し、そして５％NaHCO₃水溶液（250mL）および80％飽和NaCl水溶液（250mL）で抽出した。有機相を固体NaSO₄で乾燥し、濾過し、そして乾燥するまでエバポレートした。残渣をトルエン（100mL）およびアセトニトリル（２×200mL）とともに共エバポレートした。プール#1からの粗製 DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)-N(CH₂)₂)-O- T-O-Hを、シリカゲルクロマトグラフィー（２％TEA／CH₂Cl₂溶媒系中に注いだ「 250mL」のMerckシリカゲル60）により、２％ TEA／CH₂Cl₂中のメタノール（０〜 18％）のグラジエント（０％（４画分）、３％（４画分）、６％（８画分）、９％（８画分）、12％（８画分）、15％（８画分）、18％（８画分））を用いて精製し、50mLの画分を採取した。画分32〜40をプールした。プールした画分32〜40の濃縮により、純粋なDMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)- O-T-OH（最初に溶出する異性体；0.61グラム；0.57ミリモル）を得た。外部標準としてd₆-DMSOを用いたCH₂Cl₂中の³¹Ｐ NMR：8.3ppm（100％）；外部標準として d₆-DMSOを用いたCH₃CN中の³¹Ｐ NMR：8.87ppm（100％）。同様に、シリカ精製したDMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-O-TBDMS（最初の精製物からのプール#3（0.8グラム；0.7ミリモル））を、５当量のTBAFで処理した。DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-O-TBDMS（プール#1）についての上記のような、後処理（workup）および精製により、純粋な DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃ -N(CH₃)₂)-O-T-OH（より遅い異性体；0.57 グラム；0.53 ミリモル）を得た。³ ¹ ＰNMR（外部標準としてd₆-DMSOを用いたCH₂Cl₂）：8.57ppm（98％）。実施例２ DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-O-P(N(iPr)₂)-O-BCE の合成 DIPEA（5.7 ミリモル）を含有するCH₂Cl₂中の DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂ )-O-T-OH（最初に溶出する異性体；0.61 グラム；0.57 ミリモル）をCl-P(N(iPr )₂)-O-BCE（1.14ミリモル；２倍過剰）と反応させた、ここで、BCE は、β-シアノエチルである。反応の進行を、２％TEA／CH₂Cl₂中の８％メタノール中における TLC によりモニターした。反応混合物を４℃にて 18 時間放置した。反応混合物を 250mL の塩化メチレンで希釈し、そして５％NaHCO₃水溶液（250mL）および80％飽和NaCl水溶液（250mL）で抽出した。有機相を固体NaSO₄で乾燥し、濾過し、そして乾燥するまでエバポレートした。残渣をトルエン（50mL）およびアセトニトリル（２×100mL）とともに共エバポレートして、0.6 グラムを得た（0.47 ミリモル）。³¹Ｐ NMR（外部標準として d₆-DMSO を用いた CH₃CN）：14 8.5 、148.3 、8.87ppm（積分：ホスホルアミダイト対ホスホルアミデートの比１／１）。 DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-OH（２番目に溶出する異性体；0.57 グラム；0.53ミリモル）を、同様の手順を用いて、BCEホスホルアミダイトに変換し、0.6 グラムの生成物を得た。³¹Ｐ NMR（外部標準としてd₆-DMSO を用いたCH₃ CN）：148.5 、148.3、9.07ppm（積分：ホスホルアミダイト対ホスホルアミデートの比１／１）。 DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-O-TBDMS の立体異性体を、TLC およびシリカ上のカラムクロマトグラフィーにより、容易に分離した。しかし、3'-O-TBD MS基の除去の後、それらをいずれの溶媒系におけるTLCによっても分割できなかった。 DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-O-P(N(iPr)₂)-(O-BCE)についてのNMRデータ。 (a)最初に溶出する異性体。¹Ｈ NMR（CDCl₃）δ（ppm）：9.0（s、1H、NH、Ｄにより交換可能）；7.48（s、1H、H6）；7.45（s、1H、H6）；7.45〜6.8（m、13 H、トリチル）；6.16（t、1H、H1'）；6.15（t、1H、H1'）；5.05（m、1H、H3' ）；4.16（m、1H、H3'）；4.1（m、1H、H4'）；4.05〜3.9（m、2H、H5'、5'）； 3.85（m、1H、H4'）；3.75（s、6H、OCH3）；3.28〜3.21（m、2H、H5'）；2.9〜 2.7（m、4H、NCH2）；2.46（m、2H、H2'）；2.3（s、6H）；2.06（m、2H、H2'）；1.74（s、3H、CH3）；1.7〜1.5（m、2H、CH2）；1.43（s、3H、CH3）；1.0（s 、9H）；0.0（s、6H）；³¹Ｐ NMR（CDCl₃）：8.75ppm。 (b)２番目に溶出する異性体：³¹Ｐ NMR（CDlI₃）：9.1ppm。 DMT-T-O-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-T-3'-O-P(N(iPr)₂)-O-BCEについてのNMRデータ。 (a)最初に溶出する異性体：³¹Ｐ NMR：148.5ppm、147.9ppm、8.75ppm（ホスホルアミダイト／ホスホルアミデートの積分比＝1:1）。 (b)２番目に溶出する：148.45ppm、147.96ppm、9.1ppm（ホスホルアミダイト／ホスホルアミデートの積分比＝1:1）。実施例３ 5'-O-DMT-U(2'-O-(CH₃))-3'-O-P(O)(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)- 5'-O-U(2'-O-(CH₃))-3'-OR の合成 5'-O-DMT-U(2'-O-(CH₃))-3'-O-P(O)(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-5'-O-U(2'-O-CH₃)-3 '-OR（ここでRはTBDMS、ＨまたはP(O-CH₂CH₂CN)-N(iPr)₂である）を、以下のように合成した。 7.9ミリモルの5'-O-DMT-U(2'-O-CH₃)-3'-O-P(O-CH₃)-N(iPr)₂（MW721）を、市販の5'-O-DMT-U(2'-O-CH₃)-3'-OH（ChemGenes（Waltham、MA）から購入した）から調製した。5'-O-U(2'-O-CH₃)-3'-O-TBDMS を、5'-O-DMT-U(2'-O-CH₃)-3'-OH（ Monomer Sciences（Huntsville、AL）から購入した）から調製した。5'-O-DMT-U (2'-O-CH₃)-3'-O-P(O-CH₃)-N(iPr)₂（MW7210）（7.9 ミリモル）と5'-O-U(2'-O- CH₂)-3'-O-TBDMS（８ミリモル）とを、テトラゾール（16ミリモル）の存在下で、まずカップリングして、十分に保護された誘導体を調製し、ホスファイトトリエステル中間体を得た。ホスファイトトリエステル中間体（VII）（実質的に実施例１に記載の通り、水性後処理（aqueous workup）の後に直接使用した）を、２倍過剰の3-ジメチルアミノプロピルアミンと混合し、そしてCH₃CN中の0.1Mヨウ素溶液80mLと反応させた。実施例１に記載の水性後処理の後、この反応で8.54 グラムの粗製生成物を得た。³¹Ｐ-NMR（外部標準としてd₆-DMSO を用いたCH₃CN において）：8.9および9.5ppm。実施例１および２の記載と同様にシリカゲルクロマトグラフィー（「700mL」のMerckシリカゲル60）による精製を行って、２つの画分プールを得た：最初に溶出する画分（画分番号32〜44、1.69グラム、³¹Ｐ-NMR 8.9ppm（100％））および画分番号47〜60、低速、1.62グラム、³¹Ｐ-NMR 8.9ppm（＞５％）、9.5ppm （80％）、10.2＋10.7ppm（合計18％）（正体不明）。実施例４立体規定ホスホルアミデート結合を交互に有するカチオン性オリゴマーの調製アニオン性および立体均一なカチオン性ホスホルアミデート結合を交互に有するオリゴヌクレオチドを、カチオン性の立体異性体的に純粋な Tp(+)T ダイマーホスホルアミダイトを取り込むことにより調製した。ここで、Tp(+)Tは、ヌクレオシド間のリン原子上のカチオン性ジメチルアミノプロピルアミド置換基を示し、そしてTp(-)Tは、従来のホスホジエステルヌクレオシド間結合を示す。以下のオリゴマーを、実施例１〜３に記載した方法を用いて合成した：(Tp(+) Tp)₇T（最初に溶出する異性体を用いる）；(Tp(+)Tp)₇T（２番目に溶出する異性体を用いる）；および(Tp(+)Tp)₇T（ポイントラセミ化合物、すなわち、任意の１位置における第１および２番目に溶出する異性体のランダム混合物）。カチオン性ダイマーを用いたオリゴマー合成を、Millipore Expedite DNA 合成装置上で、10 分間のカップリング工程を用いて行った。DMT-Tp(+)T BCE（最初に溶出する異性体または２番目に溶出する異性体、あるいはポイントラセミ化合物（ほぼ等量の第１および２番目に溶出する異性体））を、乾燥アセトニトリルに溶解して、0.1M の濃度にした。合成したオリゴマー配列は、７サイクルのダイマー付加によるDMT-(Tp(+)Tp)₇Tであった；最終DMTは取り出されなかった。 NH₄OH水溶液を用いて（１時間／20℃）、粗製オリゴマーを支持体から切断した。上清を濃縮し、そして残渣を 400 μL の水に再溶解した。20 分付近に１つの主要なピーク溶出を示したすべての場合、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による粗製オリゴマー生成物の分析を、実験のセクションに記載したように行った。完全長DMT生成物を逆相HPLC（「RP-HPLC」）により、100μL（約43Ａ₂₆₀単位）の注入により精製した。20 分付近のピーク溶出を集め（約1 mL）、そしてエバポレートして乾燥した。残渣を 200 μL の 80％酢酸水溶液に１時間再溶解して、5'-末端の DMT 基を除去した。酸溶液をエバポレートにより除去し、そして残渣を、100μL の80％酢酸水溶液に再溶解した。溶液を１時間室温にて放置し、次いで、エバポレートして乾燥した。残渣を約0.5mLの水に溶解した。水溶液を約0.5mL の酢酸エチルで２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。細かい粒子状の物質を遠心分離により除去した。脱トリチル化したオリゴマーを、最終的に RP- HPLCにより、上記と同じ手順を用いて精製した。実施例５異性体分解によるダイマーブロックの調製本実施例に記載する方法は、１つのモノマータイプを用いた、固体支持体上でのモノマー単位からのカチオン性オリゴマーの合成に使用し得る。この方法は、ヌクレオシドメチルホスホルアミダイトを用いて例証された。Ａ．ホスホロチオエートダイマーTp(S)T を、ピリジン中の２〜４倍過剰のMeS O₂-Cl で処理した。出発物質を完全に消費して、２つの新たな³¹Ｐ NMR シグナルを 67ppm／68ppm で得た。反応混合物をジメチルアミノプロピルアミン（「DM APA」）でクエンチしたとき、67ppm／68ppm のシグナルは、直ちに、72ppm／73p pmの新たなペアに置き替えられた；Nu-O-P-(O)(NH-R)-O-Nuに対応する、8.8ppm ／9.4ppmのシグナルは、観察されなかった。Ｂ．20℃にて、MeSO₂-Cl（20μ L；２倍過剰）を、ピリジン中の5'-O-DMT-T-O -P(S)O-O-5'-T-3'-O-TBDMS（0.2M 溶液の 0.6mL）に添加した。反応は、³¹Ｐ NM Rにより67／6ppmおよび67／0ppmの２つの新たなシグナルで判断されるように、数分で完了した。DMAPA（ホスホロチオエートに対して４倍過剰）を添加し、そして反応を進行させた。５分より短い時間の後、³¹Ｐ NMR は、67.6ppm および6 7.0ppmの２つのシグナルが完全に消失し、新たな73.5ppmおよび72.9ppmの、２つのシグナルに置き替えられたことを示した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、 NaHCO₃およびNaCl で抽出した。粗製生成物の TLC は、２つの DMT／糖陽性スポットを示し、これは、２％TEA／８％MeOH／90％CH₂Cl₂中で、5'-O-DMT-T-O-P(O) (NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O-5'-T-3'-O-TBDMSよりわずかに速く移動した。従って、反応は排他的に、いずれのＳ活性化を伴うことなくＯ活性化に導く。実施例６カチオン性ヌクレオシド間ホスホルアミデート結合を有するカチオン性ダイマーの調製本実施例は、カチオン性ホスホルアミデート結合したオリゴマーの２段階合成を記載する。この反応は、メチルホスファイト-トリエステル結合を、ジチオジピリジンで酸化して、活性化Ｓ-Pyr-ホスホロチオジエステルを得、続いてアミンで置換して所望のホスホルアミデートジエステル結合を得る工程を包含する。このスキームは、カチオン性ホスホルアミデート結合オリゴマーの固相合成に関して魅力的である。鎖延長の間、オリゴマーはアミン溶液に曝されず、そして反応の終了時にすべてのＳ-Pyr-ホスホロチオジエステル結合は、ホスホルアミデート結合に変換される。トリエチルアミン（0.1mL）を、CH₃CN 中の DMT-O^5'-T-O^3'-P(O-(CH₃))-O^5'-O^3' -TBDMS の溶液（0.3mL；0.2M）に添加した。CH₃CN 中の５倍過剰のジチオピリジン（0.3mL；1.0M）を添加し、そして反応を 20℃にて進行させた。反応の経過に続いてNMRを行った。出発物質の２つの立体異性体に対応する最初の 140ppm の２つのシグナルは、３時間後に消失し、そして DMT-O^5'-T-O^3'-PO(S-Pyr)-O^5'-T-O^3'-TBDMS の２つの立体異性体に対応する20.3ppm／20.6ppmの新たな２つのシグナルに置き換わった。 0.2mL の3-ジメチルプロピルアミンを、NMRチューブに直接加えた。約１時間後、20.3ppm／20.6ppm シグナルは、DMT-O^5'-T-O^3'-PO(NH-(CH₂)₃-N(CH₃)₂)-O^5' -T-O^3'-TBDMSの２つの立体異性体に対応する9.1ppm／8.8ppmの２つの新たなシグナルに置き換わった。薄層クロマトグラフィー分析により、ヌクレオチド的な物質のみが、実施例１に記載の方法により調製された化合物の純種のサンプルとともに共移動することを確認した。実施例７カチオン性ホスホルアミデート結合のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性への効果オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性へのカチオン性ヌクレオシド間結合の効果を、アニオン性およびカチオン性ホスホルアミデート結合を交互に有するオリゴヌクレオチドを用いて評価した。カチオン結合は立体異性体的に純粋であった。従って、カチオン性オリゴヌクレオチドを合成するのに用いたダイマーブロックは、実施例１に記載されたように調製した、立体異性体的に純粋な Tp(+)T ダイマーホスホルアミデートであった。ポイントラセミの[Tp(+)Tp(- )]₇T（ここでｐ(+)およびｐ(-)は上記に定義された通りである）を、Letsinger ら（1988）J.Am.Chem.Soc.110:4470〜4471 に記載された通りに合成した。[Tp(+ )Tp(-)]₇Tの構造を有するオリゴヌクレオチドアナログを、固体支持体上で、シリカゲルカラムから最初にまたは２番目に溶出する 5'-O-DMT-Tp(+)T-3'-P(N(iP r)₂-O-CH₂CH₂CN の純粋な立体異性体、あるいは最初に溶出する異性体と２番目に溶出する異性体とのポイントラセミ混合物のいずれかを用いて、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成した。各合成の生成物を、RP-HPLC によりDMT 形態で精製し、続いて80％酢酸水溶液で脱トリチル化した。最終生成物を貯蔵のために凍結乾燥した。陽性および陰性結合を交互に含有するカチオン性ホモチミジンオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を、ポリ（dA）およびポリ（Ａ）標的配列に対して評価した。15mM リン酸緩衝液（pH 7.3）において、Perkin Elmer Lambda ２ UV／Vis 分光光度計で、熱融解分析を行った。カチオン性オリゴヌクレオチドの濃度は約５μ M であった。１℃／分の温度勾配で、260nm、280nm、および3 30nm において、吸光度の変化を測定した。Ｔ_mは、温度に対するＡ₂₆₀のプロットにおける最大傾斜領域の中点に対応する温度である。二重鎖形成についてのオリゴヌクレオチド配列および融解温度を表１および２に示す。表１および表２のハイブリダイゼーションデータは、速く溶出する立体異性体形態に対応する立体異性体的ホスホルアミデート結合を有するカチオン性オリゴヌクレオチドが、DNA標的と非常に安定な二重鎖を形成することを示す。加えて、試験したカチオン性オリゴヌクレオチド（最初に溶出する、またはポイントラセミ化合物）についての二重鎖安定性が示されたこれらのデータは、実質的に塩濃度非依存性であった。このハイブリダイゼーション挙動は、天然に発生する全アニオン性オリゴヌクレオチド（塩濃度に非常に依存するそのDNA標的と二重鎖を形成する）ときわめて異なる。一般的に、２番目に溶出する立体異性体に対応する立体異性体的ホスホルアミデート結合を有するカチオン性オリゴヌクレオチドは、DNA標的との安定な二重鎖を形成しない。例えば、この実験において、正常な全アニオン性オリゴヌクレオチド-ポリ（d A）二重鎖についてのＴ_mは、塩濃度が1.0Mから0.1Mまで、さらに塩添加なしまで下げられた場合、53℃から35℃まで、さらに25℃まで減少した。対照的に、最初に溶出する Tp(+)T 異性体から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドは、塩濃度非依存性である最高のＴ_m値を有した。塩がない場合でさえ（この条件下では、天然オリゴマーに対する二重鎖安定性の劇的な損失が観察された）、最初に溶出する Tp(+)T 異性体から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドで得られたＴ_m値は56℃であった。２番目に溶出する Tp(+)T 異性体から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドは、塩がない場合および0.1M NaCl の場合に、ポリ（dA）と安定な二重鎖を形成しなかった。1.0M NaCl の場合でさえ、２番目に溶出する異性体は、最初に溶出する異性体から調製されたカチオン性ヌクレオチドで得られたＴ_m値より低いＴ_m値（-17℃）を示した。Tp(+)T のポイントラセミ混合物から調製されたカチオン性オリゴヌクレオチドは、塩濃度が０および低い場合、中間の安定性を有する二重鎖DNA分子を形成した；しかし、ポイントラセミ化合物についてのＴ_m値は、塩非依存性であり、そして塩が添加されない場合、ポイントラセミ化合物で得られたＴ_m値は、全アニオン性オリゴヌクレオチドよりも大きかった。より高いＴ_m値を反映して、ポリ（Ａ）標的との二重鎖安定性は、最初に溶出するカチオン性オリゴマーについて、全アニオン性オリゴマーについてよりも高かった。２番目に溶出する異性体は、ポリ(Ａ)と安定な二重鎖を形成しなかったが、ポイントラセミ化合物は、中間の二重鎖安定性を示した。実施例８カチオン性ホスホトリエステル結合のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション特性への効果 (1)全標準ホスホジエステルヌクレオシド間結合（5'-TTTTTTTTTTTTTTT-3'）； (2)交互のアニオン性標準 PDE 結合およびカチオン性ホスホルアミデートヌクレオシド間結合、ここでカチオン性 N-置換基はジメチルアミノプロピルである（［Tp(N+)Tp(-)］₇T と表す）（Letsinger ら（1988）J.Am.Chem.Soc．110:4471 〜4472）；および(3)交互の標準 PDE 結合およびカチオン性ホスホトリエステルヌクレオシド間結合、ここでカチオン性置換基はジメチルアミノプロピル（「［ Tp(O+)Tp(-)₇T］」と表す）である（固体支持体上で、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成される）を有する３つのチミジンオリゴヌクレオチドを調製した。交互の陽性および陰性の結合を含有するカチオン性ホモチミジンオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を、ポリ（dA）に対して、実施例７に記載したように評価した。結果を表３に示す。表３のデータは、[Tp(O+)Tp(-)]₇Tオリゴマーが、塩濃度に非依存性であり、そして全アニオン性チミジン 15 マーよりも、10℃（0.1M NaCl）および 21℃（ NaClなし）高いＴ_mを有することを示す。加えて、[Tp(O+)Tp(-)]₇Tオリゴマーは、[Tp(N+)Tp(-)]₇Tオリゴマーよりも安定なポリ（dA）との二重鎖を形成する。実施例９チミジンおよび2'-O-メチルウリジン両性イオン性誘導体の二重鎖標的へのハイブリダイゼーション両性イオン性のチミジンおよび2'-0-メチルウリジン誘導体の二重鎖標的 d(T₁ ₅ C₄A₁₅)へのハイブリダイゼーションを研究し、このようなオリゴヌクレオチドの、二本鎖DNAについてのプローブとしての有用性を示した。他のオリゴマーの非存在下で、d(T₁₅C₄A₁₅)は、高安定性のdT.dA幹（stem）を有する自己相補的（ self-complementary）構造を形成する（0.1 M NaCl 中でＴ_m62℃；1 M NaCl中でＴ_m78℃）。すべての立体均一両性イオン性オリゴマーを、上記実施例１から６までに記載した手順、または Horn ら（1996） Tetrahedron Lett.37:743〜 745およびChaturvedi ら（1996）Nucleic Acids Res．24：2318〜2323に記載された手順を用いて調製した。上記のように、より高いＲ_fを有する立体異性体を、本明細書中で、「最初に溶出する」異性体と表し、より低いＲ_fを有する立体異性体を、本明細書中で、「２番目に溶出する」異性体と表す。オリゴチミジレート誘導体の二重鎖標的 d(T₁₅C₄A₁₅)に対する親和性は、プローブの電荷および立体化学ならびに溶液のイオン強度に強く依存する（表４）。両性イオン性異性体の１つ、d（T+T-）₇T(最初に溶出する)は、0.1M NaCl 中でさえ、標的との比較的安定な三本鎖複合体を形成した。d（T+T-）₇T(最初に溶出する)と d(T₁₅C₄A₁₅)との等モル混合物についての融解曲線は、両性イオン性鎖の二重鎖セグメントからの解離についての遷移（Ｔ_m24℃）、ならびに d(T₁₅C₄A₁₅ )の変性についての遷移（Ｔ_m68℃）を示した。そして０℃における d（T+T-）₇ T(最初に溶出する)のd(T₁₅C₄A₁₅)での滴定について滴定液対Ａ₂₆₀のプロットは、dT.dA.dT モチーフを有する複合体のために、２つのオリゴマーの等モル濃度での遷移点を示した（データは示さず）。同じ条件下で、dT₁₅も両性イオン性異性体オリゴマーd(T+T-)₇T（２番目に溶出する）もd(T₁₅C₄A₁₅)と顕著には相互作用しなかった。高塩溶液（0.1M NaCl）では、dT₁₅は、d(T₁₅C₄A₁₅)に結合した（Ｔ_m30℃）。d（T+T-）₇T(最初に溶出する)により形成した複合体の安定性はまた、塩濃度の増大とともに増加した（1.0M NaCl 中でのＴ_m32℃）。しかし、Ｔ_mの上昇は、全アニオン性プローブの場合よりも低かった。オリゴマーd(T+T-)₇Ｔ（２番目に溶出する）は、1M NaCl 中でさえも、d(T₁₅C₄A₁₅)と顕著に結合しなかった。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドプローブ中の2'-O-メチルウリジンによるチミジンの置換が、プローブとで形成される三本鎖複合体の安定性を増強することが示されている（Escude ら（1992）C.R.Acad.Sci.Paris III、315:521〜52 5）ので、立体異性体的オリゴマー(U'+U'-)₇dT（最初に溶出する）および(U'+U' -)₇dT（２番目に溶出する）を調製して、二本鎖標的への両性イオン性オリゴヌクレオチドの結合に対するこの置換体の効果を調べた。(U'+U'-)₇dT（最初に溶出する）（Ｔ_m35℃、0.1M NaCl）は、チミジンアナログ、d(T+T-)₇T（最初に溶出する）（Ｔ_m24℃、0.1M NaCl）よりも効果的にd(T₁₅C₄A₁₅)に結合した。異性体オリゴマー(U'+U'-)₇dT（２番目に溶出する）も、その対応するホスホジエステルコントロールU'₁₄dT も、これらの条件下ではd(T₁₅C₄A₁₅)と顕著に相互作用しなかった。三本鎖複合体についての結果とは対照的に、2'-O-メチルウリジン誘導体(U'+U'-)₇dT（最初に溶出する）は、ポリ（dA）の等価物への結合が、チミジンアナログd(T+T-)₇T（最初に溶出する）より効果的でないことが見出された。０ M NaCl、0.1M NaCl、および1.0M NaCl 溶液中での二本鎖複合体の形成についてのＴ_m値は、それぞれ、(U'+U'-)₇dT（最初に溶出する）について35℃ 、36℃、および41℃であり、そして d(T+T-)₇T（最初に溶出する）については、 58℃、58℃、および58℃であった（Horn ら、Tetrahedron Lett.前出を参照のこと）。混合 dT、dC オリゴマーd(T+T-)₂(T+C-)₅T（最初に溶出する）および d(T+T-)₂ (T+C-)₅T（２番目に溶出する）のデータを表５に示す。標的d[A₅(GA)₅T₄(TC)₅T₅ ]は、用いた条件（pH 7.0 においてＴ_m68℃、そして pH6.0 においてＴ_m67℃；0.1M NaCl）下で自己会合する。dT、dC ペンタデカマーは、d TまたはdU'ペンタデカマーがd(T₁₅C₄A₁₅)に結合する親和性よりも高い親和性で、d[A₅(GA)₅T₄(TC)₅T₅]に結合し、そして、dC を含有する三本鎖構造について予想された（Lipsett、M.N.、J.Biol.Chem．239:1256〜1260（1964））ように、親和性は、pH ６において、pH ７の場合よりも大きかった。両性イオン性プローブの１つ、d(T+T-)₂(T+C-)₅Tb（最初に溶出する）、および標的d[A₅(GA)₅T₄(TC)₅T₅ ]により、pH ７の低塩溶液（0.1M NaCl）中で、三本鎖複合体の熱的安定性が形成された。Ｔ_m値は、対応する全ホスホジエステルプローブによって形成された複合体についてのＴ_m値よりも23℃高かった。両性イオン性オリゴヌクレオチドの高い親和性が、配列ならびにイオン電荷およびリンにおける立体化学に依存することが、実験により示された。この実験で、d(T+T-)₇T（最初に溶出する）は、不適合の標的、d[A₅(GA)₅T₄(TC)₅T₅]とペアになり、そしてd(T+T-)₂(T+C-)₅Tb （最初に溶出する）は、同様に、d(T₁₅C₄A₁₅)とペアになった。これらの系のいずれもが、安定な三本鎖複合体を与えなかった（表４および５）。３つのペアの立体異性体的両性イオン性15マーをこの研究のために調製した。第１のペアはチミジンから誘導され、第２のペアは2'-O-メチルウリジンから誘導され、そして第３のペアはチミジンおよびデオキシシチジンから誘導された。それぞれの場合において、所定のオリゴマーにおけるすべてのホスホルアミデート結合は、同じ形状を有した。熱変性実験は、三本鎖複合体の形成におけるこれらの交互カチオン性−アニオン性オリゴヌクレオチドの関係が、改変されたリン酸結合のキラリティに非常に依存することを示した。それぞれの場合、立体異性体的なプローブの１つ（最初に溶出する異性体と表される）は、対応する全ホスホジエステルプローブが結合するよりも効果的に相補的二本鎖 DNA 標的に結合する。pH ７の0.1M NaCl 水溶液中におけるＴ_mの増強は、dTおよびdT、dC両性イオン性15マー(d(T+T-)₇T（最初に溶出する）および d(T+T-)₂(T+C-)₅T（最初に溶出する））について、20℃のオーダーであり、そして 2'-O-メチルウリジン誘導体((U'+U'-)₇dT（最初に溶出する）)について、約3 5℃である。1M NaCl 溶液中におけるＴ_mの増強は、比較して小さいが、しかし依然とし顕著である。プローブはいくつかのdCユニットを含むが、pH ７において、d(T+T-)₂(T+C-)₅T（最初に溶出する）の親和性が比較的高いことは注目すべきである。二本鎖標的に対するこの非対称的な混合塩基プローブの強力な結合は、２つのピリミジンおよび１つのプリン鎖から誘導された他の三本鎖複合体においてと同様に、第３の鎖がプリン鎖と平行に配向する構造と一致する。最初に溶出する立体異性体的オリゴマーでの結果と対照的に、リンにおける配置が反対であるホスホルアミデートオリゴマー（２番目に溶出する）は、二本鎖標的に対して非常に低い親和性を示した。異性体の絶対的配置がまだ確定的に指定されてなく、そして三本鎖複合体のジオメトリーについての構造的情報が限定されているので、これらの相違の理由についての推測は早尚である。しかしながら、興味深いことに、二本鎖DNAに対するオリゴヌクレオチドプローブの結合を有利にするホスホルアミデート連結における配置は、二本鎖複合体を得るための一本鎖標的への結合を有利にするものと同じである（Horn ら、Tetrahedron Let t.前出）。 Gryaznovらは、オリゴデオキシリボヌクレオチドN3'-P5'ホスホルアミデート誘導体がDNA二重鎖に結合して異常に安定なpyr.pur.pyrおよびpur.pur.pyr複合体を与えることを示している（Gryaznov ら、（1994）J.Am.Chem.Soc.116:314 3〜3144 および Gryaznov ら、（1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA、92:5798〜580 ）。Nielsen らは、「ペプチド核酸」（PNA）が、鎖侵入により、適切なDNA配列と相互作用してPNA.pur.PNA三本鎖セグメントを与えることを見出した（Nielsen ら、（1991）Science 254:1497〜1500；Cherny ら、（1993）Proc.Natl.Acad.S ci.USA、90:1667〜1670；およびNielsen ら、（1993）NucleicAcids Res．21:19 7〜200）。立体均一カチオン性ホスホルアミデート誘導体は、二本鎖DNA標的に強力に結合するオリゴヌクレオチドアナログの別のファミリーを含む。これらの３つのファミリーは、物理的および化学的性質ならびに、疑いなく、生物学的系における挙動もまた、互いに異なるので、それらは、化学者に、特定のアプリケーションのための DNA 結合剤を調製（tailoring）する豊富な機会を提供する。実施例10 Horn ら（Tetrahedron Lett.前出）は、以前に、1M NaCl 溶液における d(T+T -)₇T（２番目に溶出する）とポリ（dA）との１／１ dT／dA 混合物について、26 0nm で得られた融解曲線の異常な特徴に言及した。融解曲線はＴ_m値で約 20℃異なる２つの遷移を示した。第１の遷移は、２つの d(T+T-)₇Ｔ（２番目に溶出する）.ポリ（dA）二重鎖セグメントの可逆的な不均化から生じて、dA.dA.dT モチーフおよび d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）の鎖を有する三重鎖を与えるようであり、そして第２の遷移は、遊離のポリ（dA）および d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）を与える三重鎖の可逆的解離を示す。いくつかの証拠がこの結論を支持する。 (i)２つの遷移が、280nm で測定した融解曲線、および260nm で測定した融解曲線において現れる（Chaturvedi ら、Nucleic Acids Res．前出、を参照のこと）。280nm 曲線中のより高い温度遷移は淡色（hypochromic）である。特徴的には、dT.dA 二重鎖および dT.dA.dT 三重鎖の解離についての遷移は、これらの波長で濃色（hyperchromic）である。この結果は、新規構造を有する複合体の解離を示す。 (ii)低塩溶液（０〜0.1M NaCl）中で得られた融解曲線は、塩濃度に非依存的な１つの遷移（Ｔ_m約22℃）を示した。塩濃度が増加するにつれて、第２の遷移が、次第により高い温度に現れた。第２の遷移についての塩依存性は、両性イオン性および２つのアニオン性鎖を含有する三本鎖複合体の解離についての予想と一致する。 (iii)オリゴマーの溶液を 80℃から０℃までゆっくり冷却することによって得られる会合曲線は、遷移が完全に可逆的であることを示した。さらなる試験として、1M NaCl 中のd(T+T-)₇T（２番目に溶出する）とポリ（dA）との1 dT／1 dA 混合物を 80℃から 25℃まで冷却し、そしてその低い方の温度で２時間保持してゆっくりと平衡化を起こさせた。その２時間の間には吸光度の変化は起こらなかった。これは、系がこの温度において安定であることを示している。次いで、温度が、低い方の遷移についての範囲を超えて 18℃までさらに下げられた場合、2 60nmでの吸光度は急速に低下し、そして２分間以内に平衡に達した。 (iv)１ dT／２ dA ヌクレオチド比の d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）とポリ（dA）との混合物を０℃から 80℃まで加熱すると、１つの遷移（Ｔ_m42℃；1M N aCl）が観察された。このことは、三本鎖複合体が過剰の d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）が存在しない場合、０℃で安定であることを例示している。 (v)これらの結果に一致して、1M NaCl（pH 7.0）中の d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）のポリ（dA）での滴定は、30℃においては、０℃における場合の２倍のポリ（dA）を消費し、そしてその遷移点は、30℃での１ dT／２ dA 複合体、および０℃での１ dT／１ dA 複合体の形成に対応した。コントロールとして、dT₁ ₅ をまた同じ条件下でポリ（dA）により滴定した。これらの実験は、遷移点が、1 .0M NaCl 中０℃、1.0M NaCl 中30℃、および0.1M NaCl 中０℃での滴定について、予想通り、それぞれ２ dT／１ dA、1 dT／1 dA、および1 dT／1 dAに対応することを示した。また、0.1M NaCl 中０℃での d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）の滴定は、１ dT／１ dA比を与えた。 (vi)1.0M NaCl 中で、d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）と、d(CCA₁₅CC)の１つまたは２つの等価物との混合物を加熱すると、１つの遷移（Ｔ_m26℃）が見られた。この結果は、ポリ（dA）の場合の第２の遷移の出現が、ポリ（dA）が dA.dA .dT 三本鎖複合体を安定化するヘアピン構造に折り畳まれ得るという事実に関連し得ることを示唆した。したがって、本発明者らは、d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）と、より短く、十分に規定されたオリゴマーd(A₁₅C₄A₁₅)（これも、ヘアピン構造に折り畳まれ得る）とのハイブリダイゼーションを試験した。形成した複合体はいくらかより不安定であった（1.0M NaCl 中で、不均化反応についてＴ_m約1 7℃、そして三重鎖の解離についてＴ_m約 32℃；Chaturvedi ら、Nucleic Acid R es．前出、を参照のこと）が、この標的は、実際に、ポリ（dA）の挙動を擬態した。d(A₁₅C₄A₁₅)単独についての加熱曲線との比較は、これらの遷移点が実際に、d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）とこの標的オリゴヌクレオチドとの相互作用を反映していることを示した。ポリ（dA）の場合と同様に、遷移は可逆的であった。 d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）およびポリ（dA）からの２つの異なる複合体の形成はさらに、CD スペクトルデータ（Chaturvedi ら、Nucleic Acids Res.、前出を参照のこと）により支持される。５℃、1M NaCl 中で、等濃度の dT およびdAユニットを含有するd(T+T-)₇T（２番目に溶出する）とポリ（dA）との混合物の CD スペクトルは、0.1M NaCl 中での、d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）とポリ（dA）との同じ組合せの CD スペクトル、ならびに0.1M NaCl 中および1 M NaCl 中のポリ（dT）.ポリ（dA）のスペクトルと非常に類似している。255nm〜 300nm の領域で観察される２つのピークおよび谷（trough）は特徴的であり（We lls ら（1970）J.Mol.Biol．54：465〜497を参照のこと）、そしてポリ（dT）. ポリ（dA）の二重鎖のサインとしての役割を果たす。これらのすべての系におけるスペクトルの類似は、塩基のスタッキングがすべての場合においてほとんど同じであることを示す。したがって、これらのデータは、５℃、1 M NaCl 中における、d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）およびポリ（dA）から誘導された複合体についての従来の二重鎖構造を示す。d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）とポリ（d A）との溶液を 27℃まで加温した場合、非常に異なるスペクトルが得られた。24 7nm における谷は深くなり、259nm におけるピークは減少し、268nmにおける谷は消失し、そして282nmにおけるピークは増大した。次いで、溶液を冷却したとき、27℃において得られたスペクトルは容易に、０℃において得られたスペクトルに戻った。これらの変化は、溶液を加熱および冷却する際に観察される UV吸収の変化によく相関する。さらに、27℃において得られるスペクトルは、遊離 d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）とポリ（dA）との混合物について予想されたスペクトルとかなり異なる。本発明者らは、27℃において得られたスペクトルが、ポリ（dA）およびd(T+T-)₇T（２番目に溶出する）から誘導されたdA.dA.dT三本鎖複合体の存在によるとする。この指摘は、27℃の1 M NaCl 中における、2 dA／1 dT 比のポリ（dA）および d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）のCDスペクトルが、27℃での、1 dA／dT 比のポリ（dA）およびd(T+T-)₇T（２番目に溶出する）について得られたスペクトルに類似しているであろうという予想、およびそれは５℃までの冷却の際に変化しないままであろうという予想に導く。これらの結果は実際に観察された。 27℃の１M NaCl 中における、オリゴマーd(T+T-)₇T（最初に溶出する）とポリ（dA）との1 dT／1 dA 混合物についての CD スペクトルは、ポリ（dT）.ポリ(d A)二重鎖のスペクトルに非常に類似している。d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）の場合と対照的に、dA.dA.dT 三重鎖の形成についての証拠は見つからなかった。CD スペクトルは、５℃に冷却する際に実際に変化せず、ポリ（dA）の第２の等価物の添加によって顕著に変化しなかった。これらの結果は、融解曲線からのデータを支持し、d(T+T-)₇T（最初に溶出する）が、ポリ（dA）と二重鎖を形成するが、dA.dA.dT三重鎖は形成しないことを示している。驚くべき平衡のセットが、1M NaCl 溶液において２番目に溶出するd(T+T-)₇T 異性体およびポリ（dA）または d（A₁₅C₄A₁₅）を含有する系について見出された。２番目に溶出するd(T+T-)₇T 異性体およびポリ（dA）を１ dT／１ dA の比で含有する系については、０℃において成分は二本鎖複合体を形成し；30℃においては成分はdA.dA.dT三本鎖複合体および遊離d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）の等価物として存在し；そして 50℃においては複合体は完全に解離する。状態間の遷移は、比較的鋭く（Ｔ_m22℃およびＴ_m42℃）、そして平衡は、溶液を加熱および冷却する際に共に急速に確立される。d（A₁₅C₄A₁₅）を含有する系は、同じスキームに適合するが、dC₄鎖はリンカーとして作用し、２つの dA₁₅セグメントの配向を容易にする。ホスホルアミデート結合の配置の重要性は、オリゴマーd( T+T-)₇T（最初に溶出する）が、d(T+T-)₇T（２番目に溶出する）とは対照的に、このタイプの三本鎖複合体を形成しなかったという事実によって示される。これらの平衡における２つの特徴は、いくつかの関連する先例がないわけではないが、通常ではない：(i)排他的に dA.dA.dT ３つ組元素（triad）を含有する安定な三本鎖複合体の形成；および(ii)二本鎖複合体の熱的に誘導された不均化による三本鎖複合体の形成。多くの pur.pur.pyr 三重鎖の例が報告されている（Lipsett，（1964）J.Biol.Chem．239：1256〜1260；Anna ら、（1989）Scienc e 241：456〜459；Beal ら、（1992）Nucleic Acids Res．20：2773〜2776；およびPilch ら、（1991）Biochemistry 30：6081〜6087、を代表的なケースとして参照のこと）が、記載されている dA.dA.dT の３つ組元素を含む安定な複合体はまた、dGユニットもプリン鎖の１つに含む。Pilchら、は「グアニン残基の存在は、短いpur.pur.pyr三重鎖の安定化に重大であるようである」と記載している（Pilch ら、Biochemistry、前出）。しかし、リボヌクレオチドファミリーについて、Broitman ら、（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:5120〜5124 は、三本鎖複合体、ポリ（Ａ）.ポリ（Ａ）.ポリ（Ｕ）を記載している。これは、ポリ（Ａ）の重合度が約28〜150の範囲にあるときに形成し得る。そしてLauceri ら、（1996）Angew.Chem.Int.Ed.Engl．35:215〜216は、低濃度のカチオン性ポルフィリンが、高分子量のポリ（Ａ）（＞400bp）からのポリ（Ａ）.ポリ（Ａ） .ポリ（Ｕ）三本鎖複合体の形成を誘導することを示している。熱的に誘導された不均化に関して、pyr.pur.pyr 複合体を与える例が、リボヌクレオチド［ポリ（Ａ）．ポリ（Ｕ）］（Miles ら、（1964）Biochem.Biophys.Res.Comm.14:129 〜136；Stevens ら（1964）Biopolymers 2：293〜314；および Broitman ら、Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA、前出）、およびデオキシリボヌクレオチドポリマー［ポリ（dTdC）.ポリ（dGdA）］（Lee ら、（1979）Nucleic Acids Res．6:3073〜30 91；Lee ら、（1984）Nucleic Acids Res．12：6603〜6613；および Hampel ら、（1991）Biochemistry 30：4455〜4459）の両方について報告されている。オリゴヌクレオチドd(T+T-)₇T（２番目に溶出する）を含むdA.dA.dT複合体の異常な安定性、およびその形成に導く不均化反応は、プローブ中の立体均一側鎖の存在を反映しなければならないようである。このキラリティーを有する両性イオン性オリゴマーの性質は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づく新規な自己アセンブリー系を設計するのに有用であることを証明し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者ホーン，トーマスアメリカ合衆国カリフォルニア 94708, バークレー，アーチストリート 1583エイ (72)発明者レトシンガー，ロバートエル. アメリカ合衆国イリノイ 60019，ウィルメッテ，サードストリート 316 (72)発明者バラサブラマニアム，タンジョーレナラヤナスワミーインド国マドラス 600102，アナネガーイースト，ドアナンバー60，ブロックジェイ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の構造(Ｉ)を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド：ここで、Ｗは、Ｏ、ＳおよびSeからなる群より選択され；ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵からなる群より独立して選択され、ここでR⁴ およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶からなる群より独立して選択され、ここで、R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷からなる群より選択され、ここで、R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはNR⁷であり； R¹は、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され； R²およびR³は、Ｈ、C₁〜C₆アルキル、１〜４個のNH₂基で置換されたC₁〜C₆アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいは R²およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得；そしてここで、P^*は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そして、さらに該結合は立体的に均一である。２．以下の構造(Ｉ)を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド：ここで、ＷはＳであり；ＸおよびＹはＯであり；ＺはNHであり； R¹は(CH₂)₃であり； R²およびR³はCH₃であり；そしてここで、P^*は、該ヌクレオシド間結合を含むヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物がシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して分割される場合、該結合が、最初に溶出した立体異性体の配置に対応する立体異性体的配置で存在するような、不斉的なリン原子を表す。３．カチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を交互に有するオリゴヌクレオチドであって、該カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造(II)を有する、オリゴヌクレオチド：ここで、Ｗは、Ｏ、ＳおよびSeからなる群より選択され；ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵からなる群より独立して選択され、ここでR⁴ およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶からなる群より独立して選択され、ここで、R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷からなる群より選択され、ここで、R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり； R¹は、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され； R²およびR³は、Ｈ、C₁〜C₆アルキル、１〜４個のNH₂基で置換されたC₁〜C₆アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいは R²およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され；そしてここで、Pは２つの異なる立体異性体的配置で存在していてもよいし、またはそうでなくてもよい不斉的なリン原子を表し、そして、さらに該結合は立体的に均一であってもよいしそうでなくてもよい。４．以下の構造(II)を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド：ここで、Ｗは、Ｏ、ＳおよびSeからなる群より選択され；ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵からなる群より独立して選択され、ここでR⁴ およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶からなる群より独立して選択され、ここで、R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷からなる群より選択され、ここで、R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり； R¹は、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され； R²およびR³は、Ｈ、C₁〜C₆アルキル、１〜４個のNH₂基で置換されたC₁〜C₆アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはR² およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され；そしてここで、Pは２つの異なる立体異性体的配置で存在していてもよいし、またはそうでなくてもよい不斉的なリン原子を表し、そして、さらに該結合は立体的に均一であってもよいしそうでなくてもよい。５．以下の構造(Ｉ)を有する少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを製造する方法：ここで、Ｗは、Ｏ、ＳおよびSeからなる群より選択され；ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵からなる群より独立して選択され、ここでR⁴ およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶からなる群より独立して選択され、ここで、R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷からなる群より選択され、ここで、R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはNR⁷であり； R¹は、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され； R²およびR³は、Ｈ、C₁〜C₆アルキル、１〜４個のNH₂基で置換されたC₁〜C₆アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいは R²およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得；そしてここで、P^*は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そして、さらに該結合は立体的に均一であり、ここで、該方法は、 (ａ)該カチオン性ヌクレオシド間結合および3'-O-TBDMS保護基を含む、保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーのポイントラセミ混合物を合成する工程； (ｂ)必要に応じて、該混合物中の該立体異性体を分割する工程； (ｃ)工程(ｂ)において単離された該カチオン性ヌクレオチドダイマーを脱保護する工程； (ｄ)工程(ｃ)において提供された該脱保護されたカチオン性ヌクレオチドダイマーを、Cl-P(N(iPr)₂)-O-BCEとの反応によって、対応する3'-O-CH₂CH₂CNホスホルアミダイト誘導体に変換する工程；および (ｅ)該3'-O-CH₂CH₂CNホスホルアミダイト誘導体を、オリゴヌクレオチド鎖の保護されていないヒドロキシル含有末端ユニットに結合する工程、を包含する、方法。６．以下の工程を包含する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ： (ａ)少なくとも１つのカチオン性ヌクレオシド間結合を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程； (ｂ)該プローブを一本鎖分析物核酸とハイブリダイズさせて標識された二重鎖を生成する工程；および (ｃ)該標識された二重鎖を検出する工程。７．前記カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造(Ｉ)を有する、請求項６に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイ：ここで、Ｗは、Ｏ、ＳおよびSeからなる群より選択され；ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵からなる群より独立して選択され、ここでR⁴ およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶からなる群より独立して選択され、ここで、R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷からなる群より選択され、ここで、R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯ、ＳまたはNR⁷であり； R¹は、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され； R²およびR³は、Ｈ、C₁〜C₆アルキル、１〜４個のNH₂基で置換されたC₁〜C₆アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいは R²およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合され得；そしてここで、P^*は２つの異なる立体異性体的配置で存在し得る不斉的なリン原子を表し、そして、さらに該結合は立体的に均一である。８．前記オリゴヌクレオチドプローブがカチオン性およびアニオン性ヌクレオシド間結合を交互に有し、ここで該カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造 (II)を有する、請求項６に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイ：ここで、Ｗは、Ｏ、ＳおよびSeからなる群より選択され；ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵からなる群より独立して選択され、ここでR⁴ およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶からなる群より独立して選択され、ここで、R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷からなる群より選択され、ここで、R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり； R¹は、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；そして R²およびR³は、Ｈ、C₁〜C₆アルキル、１〜４個のNH₂基で置換されたC₁〜C₆アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいは R²およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合される。９．前記カチオン性ヌクレオシド間結合が以下の構造(II)を有する、請求項６に記載の核酸ハイブリダイゼーションアッセイ：ここで、Ｗは、Ｏ、ＳおよびSeからなる群より選択され；ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、C(R⁴)R⁵からなる群より独立して選択され、ここでR⁴ およびR⁵はＨおよびC₁〜C₆アルキル、ならびにNR⁶からなる群より独立して選択され、ここで、R⁶はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり；Ｚは、Ｏ、Ｓ、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレンおよびNR⁷からなる群より選択され、ここで、R⁷はＨまたはC₁〜C₆アルキルであり、ただしＷ、ＸおよびＹがＯである場合、ＺはＯまたはＳであり； R¹は、C₁〜C₆アルキレン、C₂〜C₆アルケニレン、C₂〜C₆アルキニレン、単環式アリーレンおよび結合からなる群より選択され；そして R²およびR³は、Ｈ、C₁〜C₆アルキル、１〜４個のNH2基で置換されたC₁〜C₆アルキル、および単環式アリールからなる群より独立して選択されるか、あるいは R²およびR³は、５員環または６員環のアルキルまたはアリール環、またはＮ、ＯもしくはＳを含む複素環を形成するよう結合される。