CN104262437A - 非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法 - Google Patents

非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法。本发明的技术方案要点为：非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法，包括以下步骤：（1）杂环并吡啶硫酮-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物的合成，（2）碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物的合成，（3）碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物的脱保护，（4）杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成。本发明操作简便易行、原料价廉易得、反应效率高且重复性好。

Description

非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法
技术领域
本发明属于核苷酸的化学合成技术领域，具体涉及一种非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法。
背景技术
非天然碱基对是一类新发现的能够独立于天然碱基对进行复制、转录和翻译蛋白质的核苷酸衍生物。非天然碱基对在DNA聚合酶催化下能够自身识别配对，正交于天然的A-T、G-C碱基对进行复制，在RNA聚合酶的催化下以包含非天然碱基的DNA为模板转录为带有非天然碱基的RNA，带有非天然碱基的RNA进一步与天然碱基一起编码氨基酸从而指导蛋白质合成。非天然碱基对的发现首次实现了对自然选择的基因密码（A、T（U）、G、C）在源头上的扩增，非天然碱基对在PCR技术、核酸定点标记、RNA探针、SELEX（指数富集的配基系统进化技术）以及编码非天然氨基酸等生物医学技术领域也展现出广阔的应用前景。
杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷酸与甲氧基萘脱氧核糖核苷酸组成的非天然碱基对TPT3-NaM是迄今为止复制效率和识别忠实性最高的非天然碱基对。杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷酸是制备功能性非天然碱基对核酸探针的关键中间体。本专利采用直接缩合杂环并吡啶硫酮和糖基供体制备杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物，通过对杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷或其衍生物后修饰方法制备碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物，再通过简便、廉价的脱保护和一锅法三磷酸化获得杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸盐及其衍生物。
参考文献：
【1】L. Li, M. Degardin, T. Lavergne, D. A. Malyshev, K. Dhami, P. Ordoukhanian, F. E. Romesberg. Natural-like Replication of an Unnatural Base Pair for the Expansion of the Genetic Alphabet and Biotechnology Applications.J. Am. Chem. Soc. , 2014, 136, 826.
【2】D.A. Malyshev, K. Dhami, T. Lavergne, T. Chen, N. Dai, J.M. Foster, I.R. Corrêa, F.E. Romesberg, A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet.  Nature , 2014 509, 385。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种操作简便易行、原料价廉易得、反应效率高且重复性好的非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法。
本发明的技术方案为：非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）杂环并吡啶硫酮-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物的合成
在反应釜中投入溶剂氯仿、杂环并吡啶硫酮或取代杂环并吡啶硫酮和双(三甲基硅基)三氟乙酰胺，室温搅拌1h，再降温至0℃，加入3,5-双（甲苯酰基）-1-氯-2-脱氧核糖和催化剂四氯化锡室温反应5h，加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应液至pH=7，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，蒸干溶剂，获得粗产物，粗产物使用石油醚-乙酸乙酯重结晶，得到杂环并吡啶硫酮-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物；
（2）碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物的合成
①碘代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物的合成，在反应釜中加入溶剂二氯甲烷、杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷或其衍生物和碘代试剂氯化碘，室温搅拌12h，加入硫代硫酸钠还原一氯化碘，蒸干溶剂后使用石油醚-乙酸乙酯柱层析分离，得到碘代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物，②氟代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物的合成，在反应釜中加入溶剂甲醇、Selectfluor氟试剂和杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷或其衍生物，加热回流8h后冷却至室温，加入三氟乙酸室温搅拌2h，蒸干溶剂，石油醚-乙酸乙酯柱层析分离，得到氟代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物，③炔代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物的合成，在反应釜中加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺、碘代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷或其衍生物、催化剂碘化亚铜与醋酸钯和端基炔类化合物，室温反应12h后，蒸干溶剂，石油醚-乙酸乙酯柱层析分离，得到炔代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物；
（3）碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物的脱保护
在反应釜中投入溶剂甲醇、碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷或其衍生物和碳酸钾，室温搅拌3h，滤除不溶物后蒸干溶剂，使用甲醇-二氯甲烷柱层析，得到脱保护的碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物；
（4）杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成
在反应釜中加入溶剂磷酸三乙酯、脱保护的碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷或其衍生物、三氯氧磷和质子海绵，0℃下搅拌反应2h后，加入焦磷酸四正丁基氨盐，继续反应1h，产物使用离子交换色谱分离，以1M的TEAB缓冲液洗脱，包含产物的洗脱液冷冻干燥后获得杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物。
本发明所述的非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法，其特征在于整个反应过程中的主要反应方程式为：
。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
（1）直接使用噻吩并吡啶硫酮或者呋喃并吡啶硫酮作为原料合成非天然碱基核苷，适用于结构多样的吡啶硫酮作为底物，原料易得，避免了对于核苷的硫化反应，简化合成步骤，适用于规模化生产；
（2）使用杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷或其衍生物为原料，直接进行碘化、氟化和偶联反应，低成本合成功能化杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物，该方法适用于基于活性筛选的结构多样化后修饰；
（3）使用碳酸钾作为杂环并吡啶硫酮3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物脱苯甲酰基试剂，原料廉价易得，制备成本低；
（4）使用磷酸三乙酯作为溶剂在低温下进行核苷三磷酸化，避免了使用各种保护基团和脱保护反应，反应选择性提高，简化合成步骤，制备成本低。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
(1)噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷的合成
在1L反应釜中投入800mL氯仿，再加入10g 噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮、15g 双(三甲基硅基)三氟乙酰胺，室温搅拌1h，再降温至0℃，加入28g 3,5-双（甲苯酰基）-1-氯-2-脱氧核糖、32mL 1M的四氯化锡二氯甲烷溶液室温反应5h，加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应液至pH=7，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，蒸干溶剂，获得粗产物，粗产物使用石油醚-乙酸乙酯重结晶，得到26g噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷。
噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CDCl3) δ 8.14-7.82 (m, 7H, Ar-H), 7.51 (dd, J = 7.5, 6.0 Hz, 1H, H-1’), 7.32-7.23 (m, 5H, Ar-H), 6.99 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 74-5.73 (m, 1H, H-4’), 4.92-4.83 (m, 2H, H-5’a, b), 4.78-4.77 (m, 1H, H-3’), 3.43-3.40 (m, 1H, H-2’a), 2.51 (s, 3H, Ar-CH3), 2.48 (s, 3H, Ar-CH3), 2.39-2.36 (m ,1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 173.5, 166.6, 144.9, 144.8, 139.5, 138.0, 134.5, 130.3, 130.0, 129.7, 129.5, 126.8, 124.7, 109.5, 91.4, 84.0, 75.0, 64.5, 39.4, 22.2, 22.1. HRMS (ESI+) m/z calcd for C28H26NO5S2 (M+H+) 520.1247, found 520.1241.
(2)2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷的合成
在1L反应釜中投入800mL氯仿，再加入11g 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮、15g 双(三甲基硅基)三氟乙酰胺，室温搅拌1h，再降温至0℃，加入28g 3,5-双（甲苯酰基）-1-氯-2-脱氧核糖、32mL 1M的四氯化锡二氯甲烷溶液室温反应5h，加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应液至pH=7，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，蒸干溶剂，获得粗产物，粗产物使用石油醚-乙酸乙酯重结晶，得到23g 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷。
2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CDCl3) δ 8.13-7.97 (m, 5H, Ar-H), 7.52-7.49 (m ,1H, H-1’), 7.37-7.29 (m, 4H, Ar-H), 6.99 (d, J = 1Hz, 1H, Ar-H), 6.91 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Ar-H), 5.73-5.71 (m , 1H, H-4’), 4.91-4.82 (m, 2H, H-5’a, b), 4.76-4.74 (m, 1H, H-3’), 3.41-3.37 (m, 1H, H-2’a), 2.68 (s, 3H, Ar-CH3), 2.52 (s, 3H, Ar-CH3), 2.49 (s, 3H, Ar-CH3), 2.39-2.34 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 172.1, 166.6, 154.0, 144.9, 144.7, 140.4, 130.3, 130.0, 129.7, 129.6, 127.0, 126.8, 122.7, 109.0, 91.2, 83.9, 75.0, 64.5, 39.4, 22.2, 22.1, 17.0. HRMS (ESI+) m/z calcd for C29H28NO5S2 (M+H+) 534.1403, found 534.1406.
(3)2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷的合成
在1L反应釜中投入800mL氯仿，再加入11g 噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮、15g 双(三甲基硅基)三氟乙酰胺，室温搅拌1h，再降温至0℃，加入28g 3,5-双（甲苯酰基）-1-氯-2-脱氧核糖、32mL 1M的四氯化锡二氯甲烷溶液室温反应5h，加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应液至pH=7，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，蒸干溶剂，获得粗产物，粗产物使用石油醚-乙酸乙酯重结晶，得到29g 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷。
2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CDCl3) δ 8.00-7.89 (m, 4H, Ar-H), 7.71(m, 1H, Ar-H), 7.49-7.48 (m, 1H, H-1’), 7.29-7.21 (m, 4H, Ar-H), 7.65-7.62 (m, 1H, Ar-H), 6.90 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Ar-H), 5.64-5.62 (m, 1H, H-4’), 4.85-4.74 (m, 2H, H-5’a), 4.68-4.67 (m, 1H, H-5’b), 3.38-3.34 (m, 1H, H-3’), 2.26 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.28-2.22 (m, 1H). 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 174.6, 166.6, 144.9, 144.8, 142.9, 142.7, 142.3, 130.3, 130.0, 129.7, 127.9, 127.0, 126.9, 126.8, 108.3, 100.0, 91.4, 84.0, 74.9, 64.5, 39.3, 22.2, 22.1, 16.3. HRMS (ESI+) m/z calcd for C29H28NO5S2 (M+H+) 534.1403, found 534.1404.
(4)2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷的合成
在1L反应釜中投入800mL氯仿，再加入11g -甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮、15g 双(三甲基硅基)三氟乙酰胺，室温搅拌1h，再降温至0℃，加入28g 3,5-双（甲苯酰基）-1-氯-2-脱氧核糖、32mL 1M的四氯化锡二氯甲烷溶液室温反应5h，加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应液至pH=7，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，蒸干溶剂，获得粗产物，粗产物使用石油醚-乙酸乙酯重结晶，得到26g 2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷。
2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CDCl3) δ 8.10-7.89 (m, 5H, Ar-H), 7.52-7.48 (m, 1H, H-1’),7.29-7.22 (m, 4H, Ar-H), 6.8 (d, J = 1Hz, 1H, Ar-H), 6.73 (d, J = 7.5 Hz, 1H,Ar-H), 5.65-5.62 (m, 1H, H-4’), 4.84-4.74 (m, 2H, H-5’a, b), 4.67-4.65 (m, 1H, H-3’), 3.36-3.32 (m, 1H, H-2’a), 2.44 (s, 3H, Ar-CH3), 2.43 (s, 3H, s, 3H, Ar-CH3), 2.41 (s, 3H, s, 3H, Ar-CH3), 2.27-2.21 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 166.6, 156.9, 153.9, 144.8, 130.3, 130.0, 129.8, 129.7, 127.9, 106.4, 96.0,83.9, 56.6, 39.5, 22.1, 12.6. HRMS (ESI+) m/z calcd for C29H28NO6S (M+H+) 518.1632, found 518.1638.
实施例2
(1) 4-碘-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷的合成
在1000mL反应釜中投入500mL二氯甲烷、7.3g 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷，缓慢滴加15mL 1M一氯化碘的二氯甲烷溶液，室温反应12h后，加入饱和硫代硫酸钠溶液至反应混合物变为无色，分液，有机相使用无水硫酸钠干燥后蒸干得到粗产物，粗产物使用石油醚-乙酸乙酯柱层析得到6.5g 4-碘-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷。
4-碘-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CDCl3) δ 8.26 (s, 1H, Ar-H), 7.99-7.82 (m, 5H, Ar-H), 7.40-7.37 (m, 2H, Ar-H, H-1’), 7.29-7.21 (m, 4 H, Ar-H), 6.71 (br, 1H, NH),6.95 (s, 1H, CHCl2), 5.65-5.64 (m, 1H, H-4’), 4.85-4.79 (m, 2H, H-5’a, b), 4.73 (m, 1H, H-3’), 4.26-4.11 (m, 2H, NHCH2), 3.38-3.34 (m, 1H, H-2’a), 2.44 (s, 3H, Ar-CH3), 2.40 (s, 3H, Ar-CH3), 2.31-2.25 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 173.3, 166.6, 164.1, 144.8, 139.0, 138.3, 133.4, 130.3, 130.1, 129.8, 129.7, 126.9, 124.3, 104.8, 91.8, 88.3, 84.5, 78.8, 75.2, 66.4, 64.7, 39.6, 31.3, 22.2. 22.1. HRMS (ESI+) m/z calcd for C33H29Cl2N2O6S2 (M+H+) 683.0839, found 683.0854.
(2) 4-氟-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷的合成
在500mL反应釜中投入200mL二氯甲烷、5g 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷和4.2g selectfluor试剂，加热回流8h，冷却至室温，加入10mL三氟乙酸，室温搅拌2h，蒸干溶剂，粗产物使用石油醚-乙酸乙酯柱层析得到4.3g 4-氟-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷。
4-氟-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CDCl3) δ 8.11-7.85 (m, 6H, Ar-H), 7.40-7.39(m, 2H, Ar-H, H-1’), 7.28-7.21 (m, 4H, Ar-H), 5.64-5.63 (m, 1H, H-4’), 4.83 (m, 2H, H-5’a, b), 4.69 (m, 1H, H-3’), 3.34-3.29 (m, 1H, H-2’a), 2.44 (s, 1H, Ar-CH3), 2.40 (s, 3H, Ar-CH3), 2.30-2.26 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 170.9, 166.6, 166.5, 144.9, 144.8, 138.6, 130.3, 130.0, 129.9, 129.7, 129.7, 126.9, 126.7, 120.5, 116.3, 116.0, 100.0, 91.6, 84.3, 74.7, 64.3, 39.2, 22.2, 22.1. 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -142.9. HRMS (ESI+) m/z calcd for C28H25FNO5S2 (M+H+) 538.1153, found 538.1155.
(3) 4-炔基-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷的合成（炔基为2,2-二氯-N-炔丙基-乙酰胺）
氮气保护下在500mL 反应釜中投入200mL N,N-二甲基-甲酰胺、1g 4-碘-2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷、10mg 醋酸钯、57mg 碘化亚铜、0.5mL三乙胺和380mg 2,2-二氯-N-炔丙基乙酰胺室温搅拌12h，蒸干溶剂，粗产物使用石油醚-乙酸乙酯柱层析得到0.9g 4-炔基-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷。
4-炔基-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CD3OD) δ 8.69 (s, 1H, Ar-H), 8.06 (d, J = 5 Hz, 1H, Ar-H), 7.53 (d, J = 5 Hz, 1H, Ar-H), 7.30 (t, J = 5 Hz, 1H, H-1’), 6.33 (s, 1H, CHCl2 ), 4.47-4.46 (m, 1H, H-4’), 4.36 (s, 2H, NHCH2), 4.11-4.08 (m, 1H, H-3’), 3.97 (dd, J1 = 12 Hz, J2 = 3Hz, 2H, H-5’a, b), 2.79-2.74 (m, 1H, H-2’a), 2.21-2.16 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CD3OD) δ 172.9, 138.4, 134.3, 123.9, ,122.8, 104.7, 100.0, 91.2, 88.6, 77.1, 70.3, 66.4, 61.1, 41.7, 30.2. HRMS (ESI+) m/z calcd for C17H17Cl2N2O4S2 (M+H+) 447.0001, found 447.0020.
实施例3
(1) 噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷的合成
在500mL反应釜中投入200mL甲醇、2g 噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷和1g K2CO3，室温搅拌3h， 滤除不溶物后蒸干溶剂，使用甲醇-二氯甲烷柱层析，得到0.9g 噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷。
噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500Hz, CD3OD) δ 8.48 (d, J = 5Hz, 1H, Ar-H), 8.01 (d, J = 5 Hz, 1H, Ar-H), 7.40-7.38 (m, 2 H, Ar-H), 7.29 (d, J = 10 Hz, 1H, H-1’), 4.47-4.46 (m, 1H, H-4’), 4.10 (m, 1H, H-3’), 3.94-3.88 (m, 2H, H-5’a ,b), 2.77-2.76 (m, 1H, H-2’a), 2.19-2.14 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CD3OD) δ171.2, 144.7, 139.6, 137.6, 130.5, 124.2, 108.8, 90.7, 88.2, 70.1, 61.0, 41.3. HRMS (ESI+) m/z calcd for C12H14NO3S2 (M+H+) 284.041, found 284.0410.
(2) 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷的合成
在500mL反应釜中投入200mL甲醇、2.1g 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷和1g K2CO3，室温搅拌3h， 滤除不溶物后蒸干溶剂，使用甲醇-二氯甲烷柱层析，得到0.8g 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷。
2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CD3OD) δ 8.48, (d, J = 7.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.42 (t, J = 5 Hz, 1H, H-1’), 7.20 (d, J = 5 Hz, 1 H, Ar-H), 7.12 (s, 1H, Ar-H), 4.51-4.48 (m, 1H, H-4’), 4.13 (d, J = 5 Hz, 1H, H-3’), 3.95 (dd, J1 = 30 Hz, J2 = 5 Hz, 2H, H-5’a, b), 2.81-2.78 (m, 1H, H-2’a), 2.67 (s, 3H, Ar-CH3), 2.21-2.16 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CD3OD) δ 171.1, 154.0, 144.1. 141.1, 131.1, 122.7, 108.8, 90.9, 88.5, 70.5, 61.4, 41.7, 15.4. HRMS (ESI+) m/z calcd for C13H16NO3S2 (M+H+) 298.0566, found 298.0566.
(3) 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷的合成
在500mL反应釜中投入200mL甲醇、2.1g 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷和1g K2CO3，室温搅拌3h，滤除不溶物后蒸干溶剂，使用甲醇-二氯甲烷柱层析，得到0.9g 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷。
2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CD3OD) δ 8.36 (d, J = 4 Hz, 1H, Ar-H), 7.58 (d, J = 1Hz, 1H, Ar-H), 7.35 (t, J = 4 Hz, 1H, H-1’), 7.22 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar-H), 4.07-4.06 (m, 1H, H-4’), 4.07 (d, J = 4 Hz, 1H, H-3’), 3.80 (dd, J1 = 24 Hz, J2 = 4Hz, 2H, H-5’a, b), 2.79-2.76 (m, 1H, H-2’a), 2.13-2.08 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 173.60, 143.29, 142.26, 142.23, 129.35, 126.11, 108.01, 91.14, 88.44, 70.37, 61.35, 41.59, 14.81.HRMS (ESI+) m/z calcd for C13H16NO3S2 (M+H+) 298.0566, found 298.0569.
(4) 2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷的合成
在500mL反应釜中投入200mL甲醇、2g 2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷和1g K2CO3，室温搅拌3h，滤除不溶物后蒸干溶剂，使用甲醇-二氯甲烷柱层析，得到0.7g 2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷。
2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CD3OD) δ 8.57 (d, J = 5 Hz, 1H, Ar-H), 7.42 (t, J = 4 Hz, 1H, H-1’), 7.13 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Ar-H), 6.80 (s, 1H, Ar-H), 4.50-4.47 (m, 1H, H-4’), 4.12 (d, J = 3.5 Hz, 1H, H-3’), 3.95 (dd, J1 = 30 Hz, J2 = 3 Hz, 2H, H-5’a, b), 2.81-2.77 (m, 1H, H-2’a), 2.50 (s, 3H, Ar-CH3), 2.18-2.14 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CD3OD) δ 172.9, 157.2, 154.5, 132.7, 131.3, 105.4, 100.8, 90.9, 88.5, 70.3, 61.3, 41.8, 12.7. HRMS (ESI+) m/z calcd for C13H16NO4S (M+H+) 282.0795, found 282.0790.
(5) 4-氟-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷的合成
在500mL反应釜中投入200mL甲醇、2g 4-氟-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷和1g K2CO3，室温搅拌3h，滤除不溶物后蒸干溶剂，使用甲醇-二氯甲烷柱层析，得到0.6g 4-氟-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷。
4-氟-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷1H NMR (500 Hz, CD3OD) δ 8.68 (d, J = 5 Hz, 1H, Ar-H), 8.12 (d, J = 5 Hz, 1H, Ar-H), 7.52 (d, J = 5 Hz, 1 H, Ar-H), 7.28 (t, J = 6.5 Hz, 1H, H-1’), 4.48 (m, 1H, H-4’), 4.10 (m, 1H, H-3’), 3.94 (dd, J1 = 35 Hz, J2= 3 Hz, 2 H, H-5’a, b), 2.78-2.75 (m, 1H, H-2’a), 2.24-2.19 (m ,1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CD3OD) δ 170.2, 150.2, 148.3, 139.0, 131.7, 131.6, 119.8, 117.8, 117.4, 91.5, 88.7, 70.1, 61.0, 41.5. 19F NMR (376 MHz, CD3OD) δ -145.3. HRMS (ESI+) m/z calcd for C12H13FNO3S2 (M+H+) 302.0315, found 302.0314.
(6) 4-炔基-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷的合成（炔基 = 2,2-二氯-N-炔丙基-乙酰胺）
在500mL反应釜中投入200mL甲醇、2g 4-炔基-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷和1g K2CO3，室温搅拌3h，滤除不溶物后蒸干溶剂，使用甲醇-二氯甲烷柱层析，得到0.8g 4-炔基-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷。
4-炔基-噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷的合成.1H NMR (500 Hz, CD3OD) δ 8.69 (s, 1H, Ar-H), 8.06 (d, J = 5 Hz, 1H, Ar-H), 7.53 (d, J = 5 Hz, 1H, Ar-H), 7.30 (t, J = 5 Hz, 1H, H-1’), 6.33 (s, 1H, CHCl2 ), 4.47-4.46 (m, 1H, H-4’), 4.36 (s, 2H, NHCH2), 4.11-4.08 (m, 1H, H-3’), 3.97 (dd, J1 = 12 Hz, J2 = 3Hz, 2H, H-5’a, b), 2.79-2.74 (m, 1H, H-2’a), 2.21-2.16 (m, 1H, H-2’b). 13C NMR (126 Hz, CD3OD) δ 172.9, 138.4, 134.3, 123.9, ,122.8, 104.7, 100.0, 91.2, 88.6, 77.1, 70.3, 66.4, 61.1, 41.7, 30.2. HRMS (ESI+) m/z calcd for C17H17Cl2N2O4S2 (M+H+) 447.0001, found 447.0020.
实施例4
(1)2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸的合成
在10mL反应釜中加入1mL磷酸三乙酯、500mg 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷、0.5mL三氯氧磷和530mg质子海绵，0℃下搅拌反应2h后，加入340mg焦磷酸四正丁基氨盐，继续反应1h，产物使用离子交换色谱分离，以1M TEAB缓冲液洗脱，包含产物的洗脱液冷冻干燥后获得432mg 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷-5’-三磷酸。
2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸31P NMR (162 MHz, D2O) δ -9.3 (d, J = 19.5 Hz, γ-P), -10.8 (d, J = 19.8 Hz, α-P), -22.4 (t, J = 20.0 Hz, β-P). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- calcd for C12H15NO12P3S2, 521.9, found, 521.9.
(2)2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸的合成
在10mL反应釜中加入1mL磷酸三乙酯、500mg 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷、0.5mL三氯氧磷和530mg质子海绵，0℃下搅拌反应2h后，加入340mg焦磷酸四正丁基氨盐，继续反应1h，产物使用离子交换色谱分离，以1M TEAB缓冲液洗脱，包含产物的洗脱液冷冻干燥后获得381mg 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸的合成。
2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸31P NMR 31P NMR (162 MHz, D2O) δ -10.8 (d, J = 19.8 Hz, γ-P), -11.5 (d, J = 20.1 Hz, α-P), -23.3 (t, J = 20.1Hz,β-P).MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- calcd for C13H17NO12P3S2, 536.3, found, 536.1.
(3)2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸的合成
在10mL反应釜中加入1mL磷酸三乙酯、500mg 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷、0.5mL三氯氧磷和530mg质子海绵，0℃下搅拌反应2h后，加入340mg焦磷酸四正丁基氨盐和2mL，继续反应1h，产物使用离子交换色谱分离，以1M TEAB缓冲液洗脱，包含产物的洗脱液冷冻干燥后获得222mg 2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷-5’-三磷酸。
2-甲基呋喃并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸31P NMR (162 MHz, D2O) δ -10.3 (d, J = 19.8 Hz, γ-P), -10.9 (d, J = 20.1 Hz, α-P), -22.8 (t, J = 19.4 Hz, β-P).MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- calcd for C13H17NO12P3S2-, 536.3, found, 536.7.
(4)噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸的合成
在10mL反应釜中加入1mL磷酸三乙酯、500mg噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷、0.5mL三氯氧磷和530mg质子海绵，0℃下搅拌反应2h后，加入340mg焦磷酸四正丁基氨盐和2mL，继续反应1h，产物使用离子交换色谱分离，以1M TEAB缓冲液洗脱，包含产物的洗脱液冷冻干燥后获得375mg噻吩并[3,2-c]吡啶-7(6h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸。
(5)4-氟-2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸的合成
在10mL反应釜中加入1mL磷酸三乙酯、500mg 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷、0.5mL三氯氧磷和530mg质子海绵，0℃下搅拌反应2h后，加入340mg焦磷酸四正丁基氨盐和2mL，继续反应1h，产物使用离子交换色谱分离，以1M TEAB缓冲液洗脱，包含产物的洗脱液冷冻干燥后获得411mg 4-氟-2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸。
4-氟-2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸31P NMR (162 MHz, D2O) δ -10.9 (d, J = 20.0 Hz, γ-P), -11.6 (d, J = 21.1 Hz, α-P), -23.3 (t, J = 23.1 Hz, β-P).19F NMR (376 MHz, D2O) δ -138.5 (s). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]- calcd for C12H14FNO12P3S2-, 539.9, found, 540.1.
(6)4-炔基-2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸的合成 （炔基 = 2,2-二氯-N-炔丙基-乙酰胺）
在10mL反应釜中加入1mL磷酸三乙酯、500mg 2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷、0.5mL三氯氧磷和530mg质子海绵，0℃下搅拌反应2小时后，加入340mg焦磷酸四正丁基氨盐和2mL，继续反应1h，产物使用离子交换色谱分离，以1M TEAB缓冲液洗脱，包含产物的洗脱液冷冻干燥后获得337mg 4-炔基-2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸。
4-炔基-2-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-4(5h)-硫酮β-2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸31P NMR (162 MHz, D2O) δ -10.85 (d, J = 19.9 Hz, γ-P), -11.63 (d, J = 20.0 Hz, α-P), -23.07 (s), -23.26 (t, J = 19.7 Hz, β-P). MS (MALDI-TOF-, matrix: 9-aminoacridine) (m/z): [M-H]-calcd for C17H18Cl2N2O13P3S2-, 684.9, found, 685.0.
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围。

Claims (1)

1.非天然碱基单体-杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）杂环并吡啶硫酮-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物的合成
在反应釜中投入溶剂氯仿、杂环并吡啶硫酮或取代杂环并吡啶硫酮和双(三甲基硅基)三氟乙酰胺，室温搅拌1h，再降温至0℃，加入3,5-双（甲苯酰基）-1-氯-2-脱氧核糖和催化剂四氯化锡室温反应5h，加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应液至pH=7，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，蒸干溶剂，获得粗产物，粗产物使用石油醚-乙酸乙酯重结晶，得到杂环并吡啶硫酮-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物；
（2）碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物的合成
①碘代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物的合成，在反应釜中加入溶剂二氯甲烷、杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷或其衍生物和碘代试剂氯化碘，室温搅拌12h，加入硫代硫酸钠还原一氯化碘，蒸干溶剂后使用石油醚-乙酸乙酯柱层析分离，得到碘代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物，②氟代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物的合成，在反应釜中加入溶剂甲醇、selectfluor氟试剂和杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷或其衍生物，加热回流8h后冷却至室温，加入三氟乙酸室温搅拌2h，蒸干溶剂，石油醚-乙酸乙酯柱层析分离，得到氟代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物，③炔代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物的合成，在反应釜中加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺、碘代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷或其衍生物、催化剂碘化亚铜与醋酸钯和端基炔类化合物，室温反应12h后，蒸干溶剂，石油醚-乙酸乙酯柱层析分离，得到炔代杂环并吡啶硫酮-β-3,5-双（甲苯酰基）-2-脱氧核糖核苷及其衍生物；
（3）碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物的脱保护
在反应釜中投入溶剂甲醇、碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷或其衍生物和碳酸钾，室温搅拌3h，滤除不溶物后蒸干溶剂，使用甲醇-二氯甲烷柱层析，得到脱保护的碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷及其衍生物；
（4）杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物的合成
在反应釜中加入溶剂磷酸三乙酯、脱保护的碱基结构多样的杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷或其衍生物、三氯氧磷和质子海绵，0℃下搅拌反应2h后，加入焦磷酸四正丁基氨盐，继续反应1h，产物使用离子交换色谱分离，以1M的TEAB缓冲液洗脱，包含产物的洗脱液冷冻干燥后获得杂环并吡啶硫酮脱氧核糖核苷三磷酸及其衍生物；
整个反应过程中的主要反应方程式为：
。
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