JP2009190998A - 共有結合で架橋された二本鎖核酸を合成するための化合物及びその製造法 - Google Patents

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Abstract

【課題】核酸合成法により種々の塩基配列をもつ、共有結合により架橋した二本鎖核酸を製造する方法に用いられる化合物の提供。
【解決手段】核酸合成に通常用いられている固相フォスフォルアミダイト法に利用でき、かつ核酸の塩基配列に特別な条件を付することなく、共有結合により架橋した二本鎖核酸の直接合成を可能とするヌクレオシドダイマーアミダイト（例えば、化合物１０）。
【選択図】図１

Description

本発明は、いずれか一端を共有結合により架橋させた二本鎖核酸を製造するために使用される化合物及びその製造法並びに該製造法に使用される化合物に関する。さらに詳しくは、本発明は２つの核酸塩基が共有結合したヌクレオシドダイマーアミダイトであって、第一のヌクレオシドの５’水酸基がジメチルトリチル基で保護されており、第一のヌクレオシドの３’位、並びに第二のヌクレオシドの５’位がジメチルトリチル基と異なる保護基で保護されており、第二のヌクレオシドの３’水酸基が亜リン酸化されている前記ヌクレオシドダイマーアミダイト及びその製造法並びに該製造法に使用される化合物に関する。
現在、疾病に関連する遺伝子を制御するための医薬として核酸医薬が注目を集めている。核酸医薬とは、目的とするＤＮＡやｍＲＮＡに相補的な塩基配列をもつ人工的に合成された核酸分子である。核酸医薬は、抗体や酵素などのタンパク質を用いたタンパク医薬と比べて、ターゲット分子に対して高い特異性と容易かつ安価な合成により得られるという有利な特徴を有する。このような核酸医薬としては、一本鎖核酸のアンチセンスや二本鎖核酸のデコイＤＮＡなどが注目されている。
アンチセンスは目的遺伝子のｍＲＮＡと特異的に結合する塩基配列をもった人工合成核酸である。アンチセンスを細胞内に導入すると、目的遺伝子と二本鎖を形成し、タンパク質の発現を抑制する。しかし、アンチセンスは目的遺伝子の発現を抑制するのみであり、複数の遺伝子の発現を抑制する用途としては不利である。
デコイＤＮＡは、遺伝子ではなく転写調節因子に結合する。すなわち、デコイＤＮＡは、デコイという名の如く、目的遺伝子に替わる囮となって転写調節因子と結合することにより、目的遺伝子の発現を抑制する。デコイＤＮＡは転写調節因子に関与することから、複数の遺伝子を同時に制御することが可能であり、一般にアンチセンスより高い効果を得ることが可能である（非特許文献１）。
デコイＤＮＡを核酸医薬として利用する場合、デコイＤＮＡは、機能する細胞の場所へ到達するまで二本鎖構造を保持することが望まれる。すなわち、デコイＤＮＡの二本鎖構造は、デコイＤＮＡが血液、細胞膜、細胞質などを通過しても安定に保持されていなければならない。二本鎖構造を安定化させる方法としては、熱力学的、物理学的及び生化学的な分解から二本鎖構造を保護するために、共有結合による架橋が有効と考えられている。この共有結合による架橋を実現するために、一般的に次の２つのアプローチが有力である。
第一のアプローチは、核酸鎖内にクロス架橋を作るために二価性試薬で二本鎖を処理して、該試薬によって付加された官能基間の反応により鎖内を架橋することを特徴とする、核酸合成の後に核酸を架橋する方法である（非特許文献２）。しかし、この方法は、合成される架橋二本鎖が低収率であり、複雑な操作及び精製段階を必要とする。第二のアプローチは、固相DNA合成法を用いて共有結合による架橋二本鎖核酸を合成する、直接合成法である（非特許文献３〜８）。
三宅隆、森下竜一、(2007)、日薬理誌、129、158-162 P. L. Fischhaber, et al., Cancer Res., 59, 4363-4368 (1999). E. A. Harwood, et al., J. Am. Chem. Soc., 121, 5081-5082 (1999). A. M. Noronha, et al., Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids, 20, 1303-1307 (2001) A. M. Noronha, et al., Biochemistry, 41, 8605-8612 (2002). C. J. Wilds, et al., J. Am. Chem. Soc., 126, 9257-9265 (2004) C. J. Wilds, et al., Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids, 24, 965-969 (2005). C. J. Wilds, et al., Can. J. Chem., 85, 249-256 (2007).
しかし、これまでに、核酸合成に通常用いられている固相フォスフォルアミダイト法に利用でき、かつ核酸の塩基配列に特別な条件を付することなく、共有結合により架橋した二本鎖核酸の直接合成を可能とする方法やその方法に用いられる化合物については知られていない。
したがって、本発明は、通常用いられている核酸合成法により種々の塩基配列をもつ、共有結合により架橋した二本鎖核酸を製造する方法及びその方法に用いられる化合物を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、上記化合物の製造法及びその製造法に用いる化合物を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸合成に通常用いられている固相フォスフォルアミダイト法に利用でき、かつ核酸の塩基配列に特別な条件を付することなく、共有結合により架橋した二本鎖核酸の直接合成を可能とするヌクレオシドダイマーアミダイトを製造することに成功した。さらに、本発明者らは、上記アミダイトを用いることによって、簡便に所望の塩基配列をもつ、共有結合により架橋した二本鎖核酸を合成し得ることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて完成された発明である。
すなわち、以下の発明が提供される。
［１］下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、Ｒ3はメチル基又はシアノエチル基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
［２］前記保護基がベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、tert-ブチル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、エトキシエチル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、tert-ブチルジフェニルシリル基、トリアルキルシリル基、トリアリールシリル基、およびテトラヒドロピランエーテル基からなる群から選ばれる保護基である、上記［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］下記式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩。
［４］第一の一本鎖核酸鎖の５’末端又は３’末端と第二の一本鎖核酸鎖の３’末端又は５’末端とを共有結合により架橋させた少なくとも一部が二本鎖である核酸鎖を製造するために使用される、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の化合物又はその塩。
［５］固相フォスフォルアミダイト法により、任意の塩基配列からなる核酸を合成する工程（Ａ）；
前記工程（Ａ）で得られる核酸と上記［１］〜［３］３のいずれかに記載の化合物とをカップリングさせる工程（Ｂ）；
前記工程（Ｂ）で得られる核酸の塩基配列を、前記工程（Ａ）で得られる核酸と一部または全部が相補的な配列で伸長させる工程（Ｃ）；及び
前記化合物の保護基を脱保護してカップリングさせる工程（Ｄ）
を含む、第一の一本鎖核酸鎖の５’末端又は３’末端と第二の一本鎖核酸鎖の３’末端又は５’末端とを共有結合により架橋させた少なくとも一部が二本鎖である核酸鎖を製造する方法。
［６］下記式（ＩＩＩ）で表される化合物
（式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイト若しくは２−メチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイトとを反応させる工程を含む、下記式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。
（式中、Ｒ3はメチル基又はシアノエチル基を表し、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ1、Ｒ2及びｎは上記式（ＩＩＩ）に準ずる。）
［７］下記式（ＩＶ）で表される化合物
（式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ＺはＤＭＴｒ、Ｙ1及びＹ2と異なる保護基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
におけるＺで表される保護基を脱保護して下記式（ＩＩＩ）の化合物
（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ1、Ｒ2及びｎは上記式（ＩＶ）に準ずる。）
を得る工程をさらに含む、上記［６］に記載の製造方法。
［８］下記式（Ｖ）で表される化合物
（式中、Ｘ2は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ2はジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ2は水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ＺはＤＭＴｒ及びＹ2と異なる保護基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
と下記式（ＶＩ）で表される化合物
（式中、Ｘ1は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1はジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1は水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、Ｒ4はフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
とを塩基性化合物の存在下で反応させて、下記式（ＩＶ）で表される化合物
（式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ1、Ｒ2、Ｚ及びｎは上記式（Ｖ）及び（ＶＩ）に準ずる。）
を得る工程をさらに含む、上記［６］又は［７］に記載の製造方法。
［９］前記塩基性化合物が１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンである、上記［８］に記載の製造方法。
［１０］下記式（ＶＩＩ）で表される化合物
とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイトとを反応させる工程
を含む、下記式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法。
［１１］下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物
における保護基であるテトラブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）を脱保護して下記式（ＶＩＩ）の化合物
を得る工程をさらに含む、上記［１０］に記載の製造方法。
［１２］下記式（ＩＸ）で表される化合物
と下記式（Ｘ）で表される化合物
とを塩基性化合物の存在下で反応させて、下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物
を得る工程をさらに含む、上記［１０］又は［１１］に記載の製造方法。
［１３］前記塩基性化合物が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンである、上記［１２］に記載の製造方法。
［１４］下記式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩。
（式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
［１５］下記式（ＶＩＩ）で表される化合物又はその塩。
［１６］下記式（ＩＶ）で表される化合物又はその塩。
（式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ＺはＤＭＴｒ、Ｙ1及びＹ2と異なる保護基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
［１７］下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物又はその塩。
［１８］下記式（ＶＩ）で表される化合物又はその塩。
（式中、Ｘ1は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1はジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1は水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、Ｒ4はフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
［１９］下記式（Ｘ）で表される化合物又はその塩。
本発明によれば、核酸合成に通常用いられている固相フォスフォルアミダイト法を利用して、所望の塩基配列を有する、共有結合により架橋した二本鎖核酸を製造することできる。すなわち、本発明によれば、水素結合を介して結合しているWatson-Crick型塩基対の代わりに共有結合で架橋された塩基対を導入することで、二本鎖構造が安定化された二本鎖核酸を製造することができる。核酸の高次構造には、二本鎖構造よりも複雑な三本鎖構造、四本鎖構造、それらが組み合わされて出来るより複雑な構造が存在する。これらのより複雑な構造の多くは、構造中に二本鎖構造を含んでおり、二本鎖構造を安定化する技術は、より複雑な構造の安定化にも利用できる。さらに、二本鎖構造が安定した二本鎖核酸を核酸医薬として用いることにより、癌や炎症などの細胞周期の異常に起因する疾病の治療又は予防が可能となる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
（式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、Ｒ3はメチル基又はシアノエチル基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
本明細書でいう「アルキル基」としては、例えば、炭素数１から６のアルキル基を挙げることができ、直鎖又は分岐鎖の何れでもよく、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などを挙げることができる。
本明細書でいう「アルコキシカルボニル基」としては、例えば、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基を挙げることができ、具体的にはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などを挙げることができる。
本明細書でいう「アルキルアミノ基」としては、例えば、炭素数１〜６のアルキルアミノ基を挙げることができ、具体的にはメチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基などを挙げることができる。
本明細書でいう「ジアルキルアミノ基」としては、例えば、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基を挙げることができ、具体的にはジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基などを挙げることができる。
本明細書にいう「それぞれ独立して」とは、それぞれの基が各基に依存しないことを意味する。例えば、Ｘ1及びＸ2がそれぞれ独立して炭素数１〜６のアルキル基を表す場合、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ別のアルキル基を表すこともあるし、同一のアルキル基を表すこともある。
本明細書にいう「ジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基」としては、ＤＭＴｒ基と異なれば特に制限されないが、例えば、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、tert-ブチル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、エトキシエチル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、tert-ブチルジフェニルシリル基、トリアルキルシリル基、トリアリールシリル基、およびテトラヒドロピランエーテル基からなる群から選ばれる保護基を挙げることができ、好ましくはアセチル基である。
本明細書にいう「ｎは２〜１０の整数」とは、アルケン基の炭素の数が２〜１０の整数であることを表し、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８、さらに好ましくは２〜６、特に好ましくは２〜５、最も好ましくは２〜４である。
本明細書にいう「塩」とは、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好ましい例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好ましい例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン］、tert−ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好ましい例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好ましい例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好ましい例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられる。酸性アミノ酸との塩の好ましい例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。上記した塩の中でも無機酸との塩および有機酸との塩が好ましく、さらに塩酸塩、トリフルオロ酢酸塩などが好ましい。
上記式（Ｉ）の化合物の具体例としては、例えば、下記の化合物が挙げられる：
上記式（Ｉ）中のＸ1が水素原子、Ｘ2がフッ素原子、Ｙ1がベンジル基、Ｙ2がtert−ブチル基、Ｒ1が水素原子、Ｒ2がシアノ基、Ｒ3がメチル基、及びｎが４である化合物；
上記式（Ｉ）中のＸ1がメトキシカルボニル基、Ｘ2がカルボキサミド基、Ｙ1がピバロイル基、Ｙ2がベンゾイル基、Ｒ1が塩素原子、Ｒ2がメチル基、Ｒ3がシアノエチル基、及びｎが５である化合物；
上記式（Ｉ）中のＸ1がプロピル基、Ｘ2がシアノ基、Ｙ1がトリエチルシリル基、Ｙ2がtert−ブチルジフェニルシリル基、Ｒ1がメチルアミノ基、Ｒ2がジエチルアミノ基、Ｒ3がメチル基、及びｎが６である化合物；
上記式（Ｉ）中のＸ1が水素原子、Ｘ2が水素原子、Ｙ1がメチル基、Ｙ2がメチル基、Ｒ1が水素原子、Ｒ2が水素原子、Ｒ3がメチル基、及びｎが４である化合物；
上記式（Ｉ）中のＸ1がメチル基、Ｘ2がメチル基、Ｙ1がベンジル基、Ｙ2がベンジル基、Ｒ1が水素原子、Ｒ2が水素原子、Ｒ3がメチル基、及びｎが３である化合物；
上記式（Ｉ）中のＸ1がメチル基、Ｘ2がフッ素原子、Ｙ1がベンジル基、Ｙ2がベンジル基、Ｒ1が水素原子、Ｒ2が水素原子、Ｒ3がシアノエチル基、及びｎが６である化合物など。
上記式（Ｉ）で表される化合物の好ましい具体例としては、下記式（ＩＩ）で表される化合物を挙げることができる。
上記式（ＩＩ）で表される本発明の化合物は、例えば、下記に示される合成スキームにより製造することができる。
その概略は、チミジンを出発原料として、一般的な保護脱保護反応を組み合わせることにより化合物５を合成する。乾燥大気中において、ＤＢＵの存在下にジブロモエタンを用いた別の保護基を有する化合物６のアルキル化によって、Ｎ３−（２−ブロモエチル）化合物７を得ることができる。２つの保護されたチミジン化合物５及び７を乾燥大気中で塩基性化合物の存在下で架橋することで、高収率のチミジンダイマー化合物８を得ることができる。ＴＢＡＦによるチミジンダイマー化合物８の３’末端におけるＴＢ
ＤＭＳ基の脱保護から、化合物９を（３’−ＯＨ遊離化合物）を得ることでき、さらに
該化合物９から化合物１０（上記式（ＩＩ）で表される本発明の化合物）を得ることができる。さらに詳しくは、上記式（ＩＩ）で表される本発明の化合物は、例えば、実施例の記載に基づき製造することができる。
上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される本発明の化合物は、第一の一本鎖核酸鎖の５’末端又は３’末端と第二の一本鎖核酸鎖の３’末端又は５’末端とを共有結合により架橋させた少なくとも一部が二本鎖である核酸鎖を製造するために使用される。このような核酸鎖を製造する方法として、固相フォスフォルアミダイト法により、任意の塩基配列からなる核酸を合成する工程（Ａ）；前記工程（Ａ）で得られる核酸と上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物とをカップリングさせる工程（Ｂ）；前記工程（Ｂ）で得られる核酸の塩基配列を、前記工程（Ａ）で得られる核酸と一部または全部が相補的な配列で伸長させる工程（Ｃ）；及び前記化合物の２つの保護基を脱保護してカップリングさせる工程（Ｄ）を含む製造方法を挙げることができ、より詳しくは、実施例に記載の方法を挙げることができる。
本明細書にいう「工程（Ａ）で得られる核酸と一部または全部が相補的な配列」とは、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される本発明の化合物を挟んでその対称位置にある塩基同士が互いに相補的な配列のことを意味する。例えば、上記工程（Ａ）で得られる核酸の塩基配列が５’−ＣＡＧ−３’であり、本発明の化合物をＴ’−Ｔ’とした場合、上記工程（Ｃ）で得られる核酸としては５’−ＧＴＣ−Ｔ’−Ｔ’−ＣＡＧ−３’が挙げられる。
上記少なくとも一部が二本鎖である核酸鎖としては、センス−アンチセンスの関係にある二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡを含む核酸鎖であれば特に制限されないが、例えば、下記に示したＯＤＮ−１を挙げることができる。
上記少なくとも一部が二本鎖である核酸鎖を製造するために使用される材料、方法、装置等は、固相フォスフォルアミダイト法を利用したＤＮＡ又はＲＮＡ合成に通常用いられるものであれば制限されないが、例えば、実施例に記載のものを挙げることができる。固相フォスフォルアミダイト法としては、実施例に記載した方法以外にも、例えば、丹羽峰雄著 “DNAの化学合成法”（廣川 化学と生物 実験ライン 22）ISBN 4-567-18220-0（平成4年）、廣川書店の記載を参照できる。
上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される本発明の化合物を製造する方法には、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物、
（式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
好ましくは、下記式（ＶＩＩ）の化合物
とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイト若しくは２−メチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイトとを反応させる工程を含む。上記反応は、例えば、実施例の記載に基づいて実施することができる。
上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される本発明の化合物を製造する方法は、下記式（ＩＶ）で表される化合物、
（式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ＺはＤＭＴｒ、Ｙ1及びＹ2と異なる保護基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
好ましくは、下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物
のＺと表された保護基又はテトラブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）を脱保護して上記式（ＩＩＩ）又は（ＶＩＩ）の化合物を得る工程をさらに含むことができる。
本明細書にいう「ＤＭＴｒ、Ｙ1及びＹ2と異なる保護基」としては、ＤＭＴｒではなく、かつＹ1及びＹ2と異なる保護基であれば特に制限されないが、Ｙ1及びＹ2がＴＢＤＭＳと異なる保護基である場合は、ＴＢＤＭＳが好ましい。「ＤＭＴｒ、Ｙ1及びＹ2と異なる保護基」がＴＢＤＭＳである場合、その脱保護は、例えば、実施例の記載に基づいて行うことができる。
上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される本発明の化合物を製造する方法は、下記式（Ｖ）で表される化合物、
（式中、Ｘ2は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、、Ｙ2はジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ2は水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ＺはＤＭＴｒ及びＹ2と異なる保護基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
好ましくは、下記式（ＩＸ）で表される化合物
と下記式（ＶＩ）で表される化合物
（式中、Ｘ1は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1はジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1は水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、Ｒ4はフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
好ましくは、記式（Ｘ）で表される化合物
とを塩基性化合物、好ましくは１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンの存在下で反応させて、上記式（ＩＶ）又は（ＶＩＩＩ）で表される化合物を得る工程をさらに含むことができる。上記反応は、例えば、実施例の記載に基づいて行うことができる。
本発明の別の側面によれば、本発明の化合物には、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を製造するために使用される、上記式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）又は（Ｘ）で表される化合物が含まれる。
上記式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）及び（Ｘ）で表される化合物などを用いて製造された上記式（Ｉ）や（ＩＩ）で表される本発明の化合物によれば、その高次構造の安定化向上をはかることができるという特性から、核酸医療への利用が期待できる。
例えば、上記式（Ｉ）や（ＩＩ）で表される本発明の化合物を導入することで、ｈｅｌｉｘ ＩＩが安定化され、リボザイムの活性が向上することが期待される。リボザイムとは、ＲＮＡを、特定の塩基配列の箇所で、切断する活性を有する小分子ＲＮＡである。その例として、ハンマーヘッド型リボザイムを示した（図４（ａ））。人工的に合成したリボザイムはウイルスや癌細胞のＲＮＡに選択的に結合しこれを切断する。抗ウイルス剤、抗がん剤の開発に用いるべく、研究が進められている。リボザイムが活性を示すには、ある高次構造を形成しなくてはならない。高次構造の基本単位は二本鎖構造であり、図ではｈｅｌｉｘと記されている。したがって、太矢印で示した部位に上記式（Ｉ）や（ＩＩ）で表される本発明の化合物を導入することで、ｈｅｌｉｘ ＩＩが安定化され、リボザイムの活性が向上することが期待される。
さらに、上記式（Ｉ）や（ＩＩ）で表される本発明の化合物は、アプタマーの安定化にも寄与し得る。アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）は、任意の小分子やタンパク質に、高選択的に結合する比較的短鎖の核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）である。図４（ｂ）に、トロンビンに結合するＤＮＡ ａｐｔａｍｅｒの基本構造を示した。このａｐｔａｍｅｒは手術後の拒絶反応の抑制に使用できる可能性がある。太矢印で示した部位に上記式（Ｉ）や（ＩＩ）で表される本発明の化合物を導入することでａｐｔａｍｅｒが安定化されると期待される。
本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
１．分析方法
ＴＬＣは、メルク・キーセルゲルＦ２５４プリコート・プレート（メルク、ドイツ）を用いて実施した。カラムクロマトグラフィーに使用されたシリカゲルは、シリカゲル６０Ｎ（球状、中性）（関東化学株式会社、日本）を用いた。エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、それぞれＪＭＳ−Ｔ１００ＣＳ（ＪＥＯＬ、日本）、及びＡＸＩＭＡ−ＣＦＲプラス（島津製作所株式会社、日本）を用いて実施した。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、内標準としてテトラメチルシランを用いたＥＣＡ５００（５００ＭＨｚ）スペクトロメーター（ＪＥＯＬ、日本）を用いて測定した。化学シフトはｐｐｍ（δ）で表し、シグナルはｓ（シングレット）、ｄ（ダブレット）、ｔ（トリプレット）、ｍ（マルチプレット）、又はｂｒ（広幅）で表した。すべての交換可能なプロトンを、Ｄ2Ｏ添加による消失により検出した。ＵＶ吸収スペクトルは、ＵＶ−１６５０ＰＣ分光光度計（島津製作所）で測定した。オリゴヌクレオチドの熱変性実験は、Ｔｍ分析システム（ＴＭＳＰＣ−８）（島津製作所）を備えたＵＶ−１６５０ＰＣ分光光度計で実施した。
下記合成スキームに記載の化合物を、以下に説明する。
２．化合物２の調製
乾燥ピリジンを用いた２度の共蒸発後、チミジン１（０．３１ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１０ｍＬ）で溶解した。溶液に、４，４’−ジメトキシトリチル塩化
物（５４２ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ、和光純薬）を加えた後、反応混合物を一晩、室温で維持した。ＥｔＯＨ（１ｍＬ）の追加後、反応混合物を２０分間、室温で維持した。次に、溶液を減圧下で濃縮した。残留物をＣＨＣｌ3及び飽和ＮａＨＣＯ3溶液で分液した後、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）及び濃縮した。残留物を、シリカゲル・カラム（２０ｇ、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１００：０〜１００：５）でクロマトグラフィ分離した。フラクションを混合した後濃縮し、黄色泡沫として化合物２（０．６６ｇ、１．２ｍｍｏｌ、９２％）を得た。
３．化合物３の調製
乾燥ピリジン中の化合物２（１．９ｇ、３．６ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（３７０ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を含む溶液を、減圧下で濃縮した。この操作を２度繰り返した後、残留物を乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）で溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル塩化物（６３０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ、信越化学）を溶液に加えた。反応混合物は２日間、室温で維持された。その後、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）を反応混合物に加え、混合物全体を２０分間、室温で維持した。反応混合物をＡｃＯＥｔ及び飽和ＮａＨＣＯ3溶液で分液した後、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）及び濃縮した。残留物はシリカゲル・カラム（３０ｇ、ＣＨＣｌ3）でクロマトグラフィ分離された。フラクションを混合した後濃縮し、黄色泡沫として化合物３（２．０ｇ、３．１ｍｍｏｌ、８６％）を得た。
４．化合物４の調製
１．４％のトリクロロ酢酸を含むＣＨ2Ｃｌ2及びＭｅＯＨの混合物（１４：６ｖ／ｖ）に、化合物３（２．０ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３．５時間、氷浴上で撹拌した。反応混合物をＣＨＣｌ3及び飽和ＮａＨＣＯ3溶液で分液した後、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）及び濃縮した。残留物はシリカゲル・カラム（５０ｇ、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１００：０〜１００：５）でクロマトグラフィ分離された。フラクションを混合した後濃縮し、黄色泡沫として化合物４（０．９０ｇ、２．５ｍｍｏｌ、８３％）を得た。
５．化合物５の調製
乾燥ピリジンを用いた２度の共蒸発後、化合物４（０．１３ｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンに溶解した。溶解液に、４，４’−ジメトキシトリチル塩化物（５４２
ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ、和光純薬）を加えた後、反応混合物を一晩、室温で維持した。酢酸無水和物（４５μＬ、０．４８ｍｍｏｌ、１．３ｅｑ）を溶液に加えた。反応混合物は、一晩、室温で維持した。ＥｔＯＨ（１ｍＬ）の添加後、反応混合物を２０分間、室温で維持した。溶媒を蒸発し、残留物をＣＨＣｌ3及び飽和ＮａＨＣＯ3溶液で分液した後、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）及び濃縮した。残留物は、シリカゲル・カラム（１５ｇ、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１００：０〜１００：５）でクロマトグラフィ分離された。フラクションを混合した後濃縮し、白色固体として化合物５（０．１４ｇ、０．３４ｍｍｏｌ、９４％）を得た。
６．化合物６の調製
乾燥ピリジンを用いた２度の共蒸発後、化合物２（３．２ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（３０ｍＬ）に溶解した。その後、Ａｃ2Ｏ（６７０μＬ、７．１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）が溶液に加えられ、反応混合物は室温で２日間維持された。ＥｔＯＨ（２ｍＬ）の添加後、反応混合物は２０分間、室温で維持された。その後、溶媒を減圧下で蒸発し、残留物をＣＨＣｌ3及び飽和ＮａＨＣＯ3溶液で分液した後、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）及び濃縮した。残留物は、シリカゲル・カラム（５０ｇ、ＣＨＣｌ3）でクロマトグラフィ分離された。フラクションを混合した後濃縮し、黄色泡沫として化合物６（３．１ｇ、５．２ｍｍｏｌ、８８％）を得た。
７．化合物７の調製
乾燥ＣＨ3ＣＮ（１０ｍＬ）中に化合物６（５００ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を含む溶液に、１，２−ジブロモエタン（０．５９ｍＬ、６．９ｍｍｏｌ、８ｅｑ、和光純薬）および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（１３０μＬ、０．８７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ、和光純薬）を加えた。反応混合物は１時間、室温でＡｒ大気下で撹拌された。反応混合物をＡｃＯＥｔ及び飽和ＮａＨＣＯ3溶液で分液した後、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）及び濃縮した。残留物はシリカゲル・カラム（８ｇ、ｎ−Ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝９：１〜４：１）でクロマトグラフィ分離された。フラクションを混合した後濃縮し、黄色泡沫として化合物７（１９０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、３３％）を得た。化合物６（２９２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ、５９％）は白色泡沫として回収された。
1H-NMR(500MHz)(DMSO-d6)8.01(s,1H,H-6),7.79-7.29(m,13H,DMTrO-),6.65(t,1H,H-1',J=6.0H),5.71(m,1H,H-3'),4.59(t,2H,Br-CH2-,J=6.5Hz),4.51(m,1H,H-4'),4.14(S,6H,Ph-OCH3x2),3.98(t,2H,3N-CH2-,J=6.5Hz),3.75(m,1H,H-5'a),3.63(m,1H,H-5'b),2.91(m,1H,H-2'a),2.78(m,1H,H-2'b),2.40(s,3H,-OAc),1.89(s,3H,5-CH3).ESI-MScalcdforC35H37Br1N2O8+Na+:715.163,found715.158.
８．化合物８の調製
乾燥ＣＨ3ＣＮ（１５ｍＬ）中に化合物５（２５７ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）及び化合物７（５３７ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）を含む溶液に、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（１１６μＬ、０．７７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ、和光純薬）を添加した。反応混合物は５時間、７０℃でＡｒ大気下で撹拌された。反応混合物をＡｃＯＥｔ及び飽和ＮａＨＣＯ3溶液で分液した後、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）及び濃縮した。残留物はシリカゲル・カラム（１５ｇ、ＣＨＣｌ3）でクロマトグラフィ分離された。フラクションを混合した後濃縮し、白色泡沫として化合物８（４８８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、７４％）を得た。化合物６（２９２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ、５９％）は白色泡沫として回収された。
ESI-MScalcdforC53H66N4O14Si1+Na+:1033.423,found1033.416
９．化合物９の調製
ＴＨＦ（７ｍＬ）中の化合物８（２６７ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を含む溶液に、１Ｍテトラブチルアンモニウムフロリド（０．３５ｍＬ、０．３５ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ、アルドリッチ）を含むＴＨＦ溶液を加えた。反応混合物は１時間、室温で維持された。溶媒を蒸発した。残留物は、シリカゲル・カラム（１５ｇ、ｎ−Ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝１：１〜０：１）でクロマトグラフィ分離された。フラクションを混合した後濃縮し、白色泡沫として化合物９（１８７ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、８１％）を得た。
ESI-MScalcdforC47H52N4O14+Na+:919.337,found918.993.
１０．化合物１０の調製
乾燥ピリジンを用いた２度の共蒸発後、化合物９（６１０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）は乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）に溶解された。溶解液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２００μＬ、１．２ｍｍｏｌ、１．７ｅｑ、和光純薬）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイト（５９μＬ、０．２６ｍｍｏｌ、１．３ｅｑ、和光純薬）を加えた。反応混合物は、２時間、室温でＡｒ大気下で撹拌された。ＥｔＯＨ（０．１ｍＬ）が反応混合物に加えられ、混合物全体は２０分間、室温で維持された。反応混合物を濃縮し、残留物をＣＨＣｌ3及び飽和ＮａＨＣＯ3溶液で分液した後、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）及び濃縮した。残留物はシリカゲル・カラム（１５ｇ、ｎ−Ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ：Ｅｔ3Ｎ＝８０：２０：０．１〜４０：６０：０．１）でクロマトグラフィ分離された。フラクションを混合した後濃縮し、白色泡沫として化合物１０（２８６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、３８％）を得た。化合物９（２９８ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、４９％）は白色泡沫として回収された。
ESI-MScalcdforC56H59N4O15P+Na+:1119.446,found1119.486.
１１．オリゴヌクレオチドの合成
架橋したヌクレオチド・ユニットを含むオリゴヌクレオチドは、製造業者によって推奨されたプロトコルに微細な改良を加えて、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズＭｏｄｅｌ３９４、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ）上で次の通りに合成された。
制御された孔質ガラス支持体（有限会社Genoglass、日本）に結合したＤＭＴｒで保護したシチジン（１μｍｏｌ）を開始点として、３’→５’方向にＡＣＴＧＧＴＡＡＣＧＴＣＡＣとＤＮＡ鎖を伸長させた後、化合物１０（ＣＨ3ＣＮ中の０．１Ｍ溶液）を添加して、より長い時間（３６０秒）カップリングさせた。化合物１０のカップリング後、さらにＧＴＧＡＣＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧとＤＮＡ鎖を伸長させた。
合成されたオリゴヌクレオチドは、通常のオリゴヌクレオチドの精製に使用される通常の操作によって脱保護され、及び精製された。すなわち、支持体に架橋されたオリゴヌクレオチドはそれぞれ、５時間、５５℃で濃縮アンモニアを用いて処理された。また、５’−末端におけるＤＭＴｒ基によって保護された遊離オリゴヌクレオチドは、０．
１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸バッファー（ｐＨ６．８）中で２３％〜３９％のＣＨ3ＣＮの線形勾配を使用して、Ｃ−１８シリカゲル・カラム（ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３、７．６×２６０ｍｍ、ＧＬサイエンス社、日本）を備えたＨＰＬＣによって精製された。フラクションは濃縮され、残留物は２０分間、室温で８０％ＡｃＯＨ水溶液で処理された。溶液は濃縮され、残留物は水で蒸発された。残留物は水に溶かされ、溶液はＥｔ2Ｏで洗浄された。水層を濃縮し、脱保護されたオリゴヌクレオチドを得た。試料の精製はＣ−１８シリカゲル・カラムを備えたＨＰＬＣによってモニターされた。
上記した通り、共有結合により架橋されたチミジンダイマーを含むオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ−１、図２）を、化合物１０及び通常のデノキシヌクレオチドの市販のアミダイトユニットを使用して、ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー上で合成できた。化合物１０のカップリング反応は、簡素なアミダイトユニットと同じく高収率でなされた。精製後に得られたＯＤＮ−１の２９のＯＤユニット（２６０ｎｍ）は、Ｃ−１８シリカゲル・カラム上のＨＰＬＣ解析によって単一ピークを示した（データなし）。
１２．熱変性試験
溶液は、それぞれ適切なバッファーに適切なオリゴヌクレオチドを含み、９０℃で加熱され、およびゆっくりと４℃にまで冷却された。各混合物の熱的誘導遷移は、ＵＶ−１６５０ＰＣ分光光度計を用いて２６０ｎｍでモニターされた。温度傾斜は１℃・ｍｉｎ-1だった。
共有結合により架橋されたチミジンダイマーを含むＯＤＮ−１が二本鎖を形成するかを確認するために熱変性試験を行った。熱的誘導遷移のプロファイルを図３に示した。ダイマーユニットのエチレン架橋が自由に回転できるので、ＯＤＮ−１中の鎖は、二本鎖構造を形成するために好ましいアンチパラレルな配向で配置され得る。ＯＤＮ−１と同じ配列を持つが、共有結合の架橋を欠く、コントロールの二本鎖ＣＤ−１と比べて、ＯＤＮ−１の二重螺旋構造ははるかに高い温度領域で融解した。ＯＤＮ−１及びＣＤ−１の間のＴm値の差は２６℃であった。その値は、ＯＤＮ−１の二本鎖螺旋構造が、二重螺旋構造の末端において共有結合的架橋チミジンダイマー残基を結合することによってのみ、顕著に安定化されたことを示した。
図１は、共有結合的架橋チミジンダイマー誘導体及びアミダイトユニット（化合物１０）の合成スキームを示す。 図２は、熱変性試験に用いた共有結合的架橋チミジンダイマーを有するヌクレオチド鎖（ＯＤＮ−１）及びコントロール二本鎖ヌクレオチド（ＣＤ−１）を示す。 図３は、ＯＤＮ−１及びＣＤ−１の熱変性測定結果を示す。１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）における、ＯＤＮ−１（２μＭ；開環）及びＣＤ−１（２μＭ；閉環）に対する、縦軸：相対的吸光度（２６０ｎｍ）、A=[(AtoC−A30oC)/(A90oC−A30oC)]、横軸：温度。 図４は、リボザイム及びアプタマーの安定化のための本発明の式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物の利用可能性の模式図を示す。

Claims (19)

  1. 下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
    （式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、Ｒ3はメチル基又はシアノエチル基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
  2. 前記保護基がベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、tert-ブチル基、メトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、エトキシエチル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、tert-ブチルジフェニルシリル基、トリアルキルシリル基、トリアリールシリル基、およびテトラヒドロピランエーテル基からなる群から選ばれる保護基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  3. 下記式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩。
  4. 第一の一本鎖核酸鎖の５’末端又は３’末端と第二の一本鎖核酸鎖の３’末端又は５’末端とを共有結合により架橋させた少なくとも一部が二本鎖である核酸鎖を製造するために使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  5. 固相フォスフォルアミダイト法により、任意の塩基配列からなる核酸を合成する工程（Ａ）；
    前記工程（Ａ）で得られる核酸と請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物とをカップリングさせる工程（Ｂ）；
    前記工程（Ｂ）で得られる核酸の塩基配列を、前記工程（Ａ）で得られる核酸と一部または全部が相補的な配列で伸長させる工程（Ｃ）；及び
    前記化合物の保護基を脱保護してカップリングさせる工程（Ｄ）
    を含む、第一の一本鎖核酸鎖の５’末端又は３’末端と第二の一本鎖核酸鎖の３’末端又は５’末端とを共有結合により架橋させた少なくとも一部が二本鎖である核酸鎖を製造する方法。
  6. 下記式（ＩＩＩ）で表される化合物
    （式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
    とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイト若しくは２−メチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイトとを反応させる工程を含む、下記式（Ｉ）で表される化合物の製造方法。
    （式中、Ｒ3はメチル基又はシアノエチル基を表し、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ1、Ｒ2及びｎは上記式（ＩＩＩ）に準ずる。）
  7. 下記式（ＩＶ）で表される化合物
    （式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ＺはＤＭＴｒ、Ｙ1及びＹ2と異なる保護基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
    におけるＺで表される保護基を脱保護して下記式（ＩＩＩ）の化合物
    （式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ1、Ｒ2及びｎは上記式（ＩＶ）に準ずる。）
    を得る工程をさらに含む、請求項６に記載の製造方法。
  8. 下記式（Ｖ）で表される化合物
    （式中、Ｘ2は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ2はジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ2は水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ＺはＤＭＴｒ及びＹ2と異なる保護基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
    と下記式（ＶＩ）で表される化合物
    （式中、Ｘ1は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1はジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1は水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、Ｒ4はフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
    とを塩基性化合物の存在下で反応させて、下記式（ＩＶ）で表される化合物
    （式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｙ1、Ｙ2、Ｒ1、Ｒ2、Ｚ及びｎは上記式（Ｖ）及び（ＶＩ）に準ずる。）
    を得る工程をさらに含む、請求項６又は７に記載の製造方法。
  9. 前記塩基性化合物が１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンである、請求項８に記載の製造方法。
  10. 下記式（ＶＩＩ）で表される化合物
    とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロフォスフォルアミダイトとを反応させる工程
    を含む、下記式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法。
  11. 下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物
    における保護基であるテトラブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）を脱保護して下記式（ＶＩＩ）の化合物
    を得る工程をさらに含む、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 下記式（ＩＸ）で表される化合物
    と下記式（Ｘ）で表される化合物
    とを塩基性化合物の存在下で反応させて、下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物
    を得る工程をさらに含む、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
  13. 前記塩基性化合物が、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンである、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 下記式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩。
    （式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
  15. 下記式（ＶＩＩ）で表される化合物又はその塩。
  16. 下記式（ＩＶ）で表される化合物又はその塩。
    （式中、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ独立して水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1及びＹ2はそれぞれ独立してジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、ＺはＤＭＴｒ、Ｙ1及びＹ2と異なる保護基を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
  17. 下記式（ＶＩＩＩ）で表される化合物又はその塩。
  18. 下記式（ＶＩ）で表される化合物又はその塩。
    （式中、Ｘ1は水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、シアノ基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキサミド基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｙ1はジメチルトリチル基（ＤＭＴｒ）と異なる保護基を表し、Ｒ1は水素原子、シアノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルアミノ基、炭素数２〜６のジアルキルアミノ基又はチオール基を表し、Ｒ4はフッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表し、ｎは２〜１０の整数を表す。）
  19. 下記式（Ｘ）で表される化合物又はその塩。
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