CN116003496A - 经修饰的mRNA5`-帽类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了5’‑帽类似物，其可以提高转录、mRNA稳定性以及mRNA翻译效率和耐久性。本发明还涉及用于制备帽类似物和使用含有这种类似物的mRNA的方法，以及含有所述新的帽类似物的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及使用与信使RNA的5'末端互补的核酸对RNA的5'帽结构进行修饰，以影响所述RNA的5'帽结构的改变，从而调节其功能。因此，本发明一般地涉及动物细胞中的基因表达，特别是蛋白质表达。
背景技术
RNA降解是基因表达调控的关键过程。任何功能性mRNA，包括用于治疗的mRNA，都必须被保护以免受RNA降解机制的影响。然而，本质上的保护是暂时的，且可以通过适当的化学修饰来改善。近年来，体外转录(IVT)的mRNA已成为治疗性基因合成的有希望的途径。由于恰当的mRNA功能取决于其结构调节元件，包括mRNA的5'-帽和3'端的polyA修饰，因此这些元件在mRNA稳定性中起关键作用。因此，对5'-帽结构的合理修饰可以通过提高RNA稳定性和促进其细胞和体内翻译来提高mRNA治疗剂的效力(Nature Reviews DrugDiscovery,Vol.17,261)。
在真核生物中，mRNA上的7-甲基鸟苷5'-帽对于在体外和体内被蛋白质合成机制例如核糖体有效识别而言至关重要。在mRNA制造过程中，共转录方法相比于转录后5'-帽方法而言更适合体外转录，这是因为它简单且高效(Genes and Development,Vol.20,1838)。为了适用于共转录，已开发出含有7-甲基鸟苷以及5'-5'-三磷酸接头的二核苷酸和三核苷酸，称为cap-0、cap-1、ARCA和CleanCap，且目前已用于获批的mRNA COVID-19疫苗和其他多种目前处于临床试验阶段的mRNA(Nature,Vol.596,109)。已发表的关于5'-帽类似物的文献主要依靠7-甲基鸟苷(7mG)及其2'-和3'-取代基(US10925935B1,US9295717B2)、核苷酸间接头中的磷酸酯替换(US10570388B2)、诸如非桥接氧用硫部分的取代以得到硫代磷酸酯(US8153773B2)或诸如在
中延长的核苷酸(US10519189B2)。然而，需要i)提高IVT中的加帽效率，ii)增加对脱帽机制的抵抗力，以及iii)通过使用非天然核苷修饰来替代7mG或使用尚未被开发的三磷酸修饰来改善与T7或其他聚合酶的结合。因此，我们设计、合成和评价了一系列用于mRNA治疗程序的新型5'-帽结构，其具有多种性质：稳定性、转录和/或翻译有效性和耐久性。
发明内容
本公开提供了mRNA 5'帽类似物以及它们的制备和使用方法。本公开还提供了含有5'帽类似物的mRNA。
本发明的5'-帽类似物可以提高转录、mRNA稳定性以及mRNA翻译有效性和耐久性。
在一个方面，本公开提供了如下式(I)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐：
其中：
环B1和B2各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；
X1和X2独立地为-(C(R1)2)m-、-O-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-O-、-CH＝CH-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-CH＝CH-；其中m是0-6的整数；
Y为–(R2-P(O)-R2)p-，其中p为0、1或2；
R11、R12、R23和R24独立地为H、卤素、OR3或OR4；
R13、R14、R21和R22独立地为H、卤素、OR3、OR4或LNA；
每个R1独立地为H、卤素或C1-3烷基；
每个R2独立地为O、S、C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有一个或多个卤素、OH；
每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基；
每个R4独立地为
其中，每个B独立地为天然核碱基或修饰的核碱基且可为相同或不同的；
R31、R32、R43和R44各自独立地为H、卤素或OR4’；
R41和R42各自独立地为H、卤素、OR4’、LNA；
每个R4’独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基；
R5独立地为OH或SH；
R6独立地为O或S；
每个R5’独立地为OH或SH；
每个R6’独立地为O或S；
n为选自0-2的整数。
在另一方面，本公开提供了如下式(II)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：
其中：
环B1、B2、B3和B4各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；
每个R独立地选自H和C1-6烷基；
R1和R2各自独立地选自OR5和卤素；
每个R3独立地选自C1-6烷氧基、卤素和LNA；
每个R4独立地选自卤素和LNA；
每个R5独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基；和
n为选自0-1的整数。
本公开还提供了RNA分子，其5'端含有式(I)的化合物。
在另一方面，本公开所提供的RNA分子为mRNA分子。
在另一方面，本公开所提供的mRNA分子包含编码HPV E6-E7抗原多肽的多核苷酸序列，例如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
在另一方面，本公开提供了合成式(I)的化合物的方法。
在另一方面，本公开提供了体外合成RNA分子(例如mRNA)的方法。该方法可以包括使未修饰或修饰的ATP、未修饰或修饰的CTP、未修饰或修饰的UTP、未修饰或修饰的GTP、式(I)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐以及多核苷酸模板反应，该反应在RNA聚合酶的存在下，在有利于经所述多核苷酸模板的RNA聚合酶转录成一个或多个RNA拷贝的条件下进行，其中至少一些所述RNA拷贝掺入所述式(I)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐以得到RNA分子(例如mRNA)。
在另一方面，本公开提供了用于加帽RNA转录物的试剂盒。该试剂盒包括式(I)的化合物和RNA聚合酶。该试剂盒还可以包括一种或多种RNA分子、核糖核酸酶抑制剂、酶缓冲液和核苷酸缓冲液。
此外，本申请所述的化合物或方法可用于研究(例如，研究体外RNA转录物与某些酶的相互作用)和其他非治疗目的。
附图说明
图1提供了转染后24小时，在HeLa细胞中含有不同5'-帽的mRNA的GLuc蛋白表达。活性与New England Biolabs(NEB)和内部合成的Cap0和ARCA进行比较。Uncapped表示没有帽结构的mRNA，其不显示蛋白质表达。新化合物2显示出比NEB Cap0更高的剂量依赖性活性，并且与ARCA相比具有基本相似的活性。
图2显示了转染后24小时，在HeLa细胞中含有不同5'-帽的mRNA的GLuc蛋白表达。活性与New England Biolabs(NEB)和内部合成的Cap0进行比较。Uncapped表示没有帽结构的mRNA，其不显示蛋白质表达。新化合物11、12和13显示出与NEB Cap0相当的剂量依赖性活性，而化合物14没有活性。
图3提供了转染后24小时，在HeLa细胞中含有不同5'-帽的mRNA的GLuc蛋白表达。活性与New England Biolabs(NEB)和内部合成的Cap0进行比较。Uncapped表示没有帽结构的mRNA，其不显示蛋白质表达。含有5'-帽26和27的mRNA表现出剂量依赖性蛋白表达。新化合物26显示出比NEB Cap0更高的活性，而化合物27显示出比NEB Cap0稍低的活性。化合物31没有活性。
图4显示了转染后24小时，在HeLa细胞中含有不同5'-帽的mRNA的GLuc蛋白表达。活性与New England Biolabs(NEB)和内部合成的Cap0和ARCA进行比较。Uncapped表示没有帽结构的mRNA，其不显示蛋白质表达。含有5’-帽6的mRNA表现出剂量依赖性蛋白表达。新化合物6显示出比NEB Cap0更高的活性，并且活性与ARCA相当。
图5提供了转染后24小时，在HeLa细胞中含有不同5'-帽的mRNA的GLuc蛋白表达。活性与New England Biolabs(NEB)和内部合成的Cap0s进行比较。Uncapped表示没有帽结构的mRNA，其不显示蛋白质表达。含有5’-帽50的mRNA表现出剂量依赖性蛋白表达。新化合物50的活性略低于NEB Cap0。
图6显示转染后24小时，在HeLa细胞中含有不同5'-帽的mRNA的GLuc蛋白表达。活性与New England Biolabs(NEB)和内部合成的Cap0进行比较。Uncapped表示没有帽结构的mRNA，其不显示蛋白质表达。含有新的5'-帽1、17、19和19A的mRNA表现出剂量依赖性蛋白表达。新化合物1显示出比Cap0更高的活性。化合物17没有显示出活性，而化合物19和19A显示出比NEB Cap0稍低的活性。内部合成的Cap0显示出比商业NEB Cap0更高的活性。分析显示，内部合成的Cap0所具有的纯度高于商业Cap0。
图7A和7B显示了转染后24小时，Hela细胞中含有不同5'-帽的mRNA的Fluc蛋白的表达水平。当使用Lipofectamine MessengerMax(图7A)转染mRNA时，所有帽显示出剂量依赖性表达，并且所有内部合成的帽均显示出与对照Cleancap AG相似或显著更高(尤其是在中等剂量下)的表达；值得注意的是，GL-Cap5在不同的测试剂量下均表现出显著更高的表达水平。当使用内部合成的LNP制剂转染mRNA(图7B)时，帽的表达与Cleancap AG(Trilink)相当；在高剂量和中剂量下，GL-Cap5的表达显著高于所有其他测试的帽；在低剂量下，GL-Cap8表现出比Cleancap AG(Trilink)更强的表达。统计显著性:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图8显示了转染后24小时，Hela细胞中含有不同5'-帽的mRNA的Fluc蛋白的表达水平。使用Lipofectamine MessengerMax转染mRNA。在高剂量下，GL-Cap6显示出与对照Cleancap AG相似的表达水平，而GL-Cap2、GL-Cap3、GL-Cap4和GL-Cap9的表达水平略低。在中等剂量下，GL-Cap3和GL-Cap6的表达略低于Cleancap AG(无统计显著性)，而其他测试的帽的表达均明显低于Cleancap AG。在低剂量下，所有测试的帽均表现出类似的表达水平。统计显著性:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图9显示了转染后24小时，Hela细胞中含有不同5'-帽的mRNA的Fluc蛋白的表达水平。使用Lipofectamine MessengerMax转染mRNA，并将GL-Cap5的表达水平与另一个对照帽Cleancap AG(3’-OM)(Trilink)的表达水平进行比较。在所有剂量下，GL-Cap5均表现出与Cleancap AG(3’-OM)相似的表达水平。统计显著性:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图10显示了D-荧光素注射后，通过体内成像系统测定的含有不同5'-帽的mRNA的Fluc蛋白的体内表达水平(实验1)。将雌性C57BL/6小鼠肌肉内注射单剂量mRNA负载的LNP，并在6小时、24小时和48小时评估Fluc表达水平。在低剂量和高剂量方案(分别为上图和下图)下，注射GL-Cap5加帽的mRNA的小鼠的Fluc表达水平明显高于注射Cleancap AG mRNA的小鼠。GL-Cap5在测试的帽中表现出最强的表达水平，尤其是在注射后6h和24h。统计显著性:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图11显示了通过离体荧光素酶测定法测定的肌肉组织匀浆中含有不同5'-帽的mRNA的Fluc蛋白的表达水平(实验1)。在低剂量和高剂量方案(分别为左和右图)下，GL-Cap5-mRNA的Fluc表达水平均高于Cleancap AG mRNA。两种方案在不同时间点都观察到GL-Cap5的表达水平更高的趋势。
图12显示了通过D-荧光素注射后体内成像系统测定的含有不同5'-帽的mRNA的Fluc蛋白的体内表达水平(实验2)。将雌性C57BL/6小鼠肌肉内注射单剂量mRNA负载的LNP(0.1mg/kg)，并在6小时、24小时和48小时评估Fluc蛋白表达水平，以评估不同帽的活性。mRNA注射6小时后，与注射Cleancap AG mRNA的小鼠相比，注射GL-Cap5-和GL-Cap7加帽的mRNA的小鼠的Fluc表达水平显著更高；GL-Cap1组的蛋白表达也略高于Cleancap AG组，但无统计显著性。注射后24小时和48小时，与Cleancap AG对照组相比，所有GL-Cap组的Fluc表达水平均略高。统计显著性:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图13显示了通过D-荧光素注射后体内成像系统测定的(上图)以及通过离体荧光素酶测定法测定的(下图)受处理的小鼠的肝脏和肌肉(注射部位)组织中含有不同5'-帽的mRNA的Fluc蛋白表达水平(实验2)。总的来说，所有GL-Cap都显示出与Cleancap AG相当的表达水平(如GL-Cap5)和更好的表达水平(如GL-Cap1、7和8)。GL-Cap7和GL-Cap8组的表达水平最高。统计显著性:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图14显示了C3肿瘤模型上合成的5'-帽结构的肿瘤生长曲线。数据表示为平均值±SEM。
图15显示了C3肿瘤模型上合成的5'-帽结构的肿瘤生长曲线。数据表示为平均值±SEM。
图16A和16B显示了MC38肿瘤模型上合成的5'-帽结构加帽的IL12 mRNA剂量滴定的存活率。在图16A中，数据表示为平均值±SEM，且在图16B中，数据显示为Kaplan–Meier曲线。
图17显示了使用Lipofectamine MessengerMax将GL2288 mRNA转染Hela细胞24小时后通过细胞内染色评估的蛋白表达。
图18显示了使用内部制备的LNP制剂将GL2288 mRNA转染Hela细胞24小时后通过细胞内染色评估的蛋白表达。统计显著性:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图19显示了GL-Cap7-GL2288 mRNA和CleanCap-GL2288 mRNA在小鼠中诱导的特异性T细胞免疫应答的评估。
具体实施方式
mRNA由开放阅读框(ORF)、两侧的5'-和3'-非翻译区(5'UTR,3'UTR)、多聚腺苷单磷酸尾部(poly A)和含有倒置的N7-甲基鸟苷帽结构组成。它在化学和酶学上都不如相应的DNA稳定，因此在mRNA的核糖体募集后的蛋白质产生是暂时的。此外，为了产生靶蛋白，mRNA必须以所谓的“闭环”构象存在。虽然是活性闭环构象的一部分，但mRNA通过与真核起始因子4E(eIF4E)结合的帽以及通过经poly A结合蛋白(PABP)连接的poly A尾部与核糖体机制接触。所述eIF4E和PABP通过关闭该活性环的骨骼蛋白eIF4G连接。对mRNA环化形式的破坏导致蛋白质产生停止并最终导致mRNA本身的酶促降解，这主要通过脱帽酶系统DCP1/2的作用和/或通过poly-A核糖核酸酶(PARN)介导的去腺苷酸化。参见，例如，RichardJ.Jackson et al.,"The mechanism of eukaryotic translation initiation andprinciples of its regulation",Molecular Cell Biology,vol.1 10,1 13-127,2010。
帽结构是所有真核生物mRNA的关键特征。它通过真核起始因子4E(eIF4E)被核糖体复合物识别。缺少5'-帽末端的mRNA不被翻译机制识别并且不能产生靶蛋白(参见，例如，Colin Echeverria Aitken,Jon RLorsch:"A mechanistic overview of translationinitiation in eukaryotes",Nature Structural and Molecular Biology,vol.16,no.6,568-576,2012)。
在转录过程中产生的粗信使RNA(“初级转录物”)被5'-三磷酸终止，该5'-三磷酸在酶RNA-三磷酸酶的作用下转化为相应的5'-二磷酸。然后鸟苷酰转移酶将末端倒置的鸟苷一磷酸连接到5'-末端，并且N7MTase介导的末端倒置的鸟苷的N7-甲基化完成加帽过程。
野生型5'-帽结构易受酶降解的影响，该降解是控制蛋白质表达的调节机制的一部分。根据该机制，酶促系统DCP1/2在帽结构的第二个和第三个磷酸基团之间进行焦磷酸水解，从而去除N7-甲基化鸟苷二磷酸部分，留下终止于5'-单磷酸基团的mRNA。这继而又很容易受到外切核酸酶的切割，并会导致剩余寡聚体的快速衰变。参见，例如，R.Parker,H.Song:"The Enzymes and Control of Eukaryotic Turnover",Nature Structural&Molecular Biology,vol.11,121 -127,2004。
本公开提供了新的mRNA帽类似物、制备这些帽类似物的合成方法及其用途。本公开还提供了结合本申请公开的帽类似物的新RNA分子(例如，mRNA)，其赋予有利于治疗发展的特性。
大多数mRNA治疗应用或临床候选药物采用7mG以及连同或不连同3'-取代作为头部核苷基团。
我们设计并合成了具有7mG类似物的5'-帽，并在体外生物学研究中对其进行了评价，以选择最佳的头部核苷基团。一旦确定了有效的头部核苷基团，我们将它们与具有未修饰或修饰的三磷酸接头的各种尾部核苷基团偶联，以改善与启动子的结合，从而提高体外转录产量和翻译效率。
5’-帽类似物
在一个方面，本公开的特征在于如下式(I)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐：
其中：
环B1和B2各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；
X1和X2各自独立地为-(C(R1)2)m-、-O-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-O-、-CH＝CH-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-CH＝CH-；其中m是0-6的整数；
Y为–(R2-P(O)-R2)p-，其中p为0、1或2；
R11、R12、R23和R24各自独立地为H、卤素、OR3或OR4；
R13、R14、R21和R22各自独立地为H、卤素、OR3、OR4或LNA；
每个R1独立地为H、卤素或C1-3烷基；
每个R2独立地为O、S、C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有一个或多个卤素、OH；
每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基；
每个R4独立地为
其中，每个B为相同或不同的，且独立地为天然核碱基或修饰的核碱基；
R31、R32、R43和R44独立地为H、卤素或OR4’；
R41和R42独立地为H、卤素、OR4’、LNA；
每个R4’独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基；
R5独立地为OH或SH；
R6独立地为O或S；
每个R5’独立地为OH或SH；
每个R6’独立地为O或S；
n为选自0-2的整数。
在某些实施方案中，环B1、B2和每个环B独立地选自
其中每个Ra独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其各自任选取代有一个或多个选自以下的取代基：卤素、C1-6烷氧基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；
每个Rb独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个Rc独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Rd独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Re独立地为H、O、S；
每个Rf独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个R5”独立地为O、S。
例如，环B1、环B2和每个环B独立地为核碱基或修饰的核碱基，其中所述核碱基选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，或所述修饰的核碱基选自次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-乙基鸟嘌呤、7-异丙基鸟苷、7-环丙基鸟苷、7-甲基-N1-甲基鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-甲基)鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-乙基)鸟苷、6-硫代鸟苷、7-甲基-(6-硫代)鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-甲基腺苷、7-甲基腺苷、7-甲基黄嘌呤、7-甲基次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或二氢尿苷。
例如，“胺保护基团”包括但不限于芴基甲基氧基羰基(“Fmoc”)、羧基苄基(“Cbz”)、叔丁基氧基羰基(“BOC”)、二甲氧基苄基(“DMB”)、乙酰基(“Ac”)、三氟乙酰基、邻苯二甲酰亚胺基团、苄基(“Bn”)、三苯甲基(三苯基甲基,Tr)、亚苄基胺基团或甲苯磺酰基(Ts)。
在某些实施方案中，X1和X2各自独立地为-(C(R1)2)m-、-O-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-O-、-CH＝CH-；其中每个R1独立地为H、F、Cl、Br、I或C1-3烷基，其中m为选自0-6的整数。
例如，X1和X2独立地为-CH2-O-、-O-CH2-、-CH2-CH2-、-O-CH(CH3)-、-CH(CH3)-O-或-CH＝CH-。
在某些实施方案中，Y为–(R2-P(O)-R2)p-，其中每个R2独立地为O、S、C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有一个或多个卤素或OH；其中p为0、1或2。
例如，Y选自
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24各自独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3；R13、R14、R21和R22各自独立地为H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基。
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24各自独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3；R13和R14各自独立地为H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；R21和R22任一者独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3，且另一者额OR4，其中
每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
R4独立地为
其中，每个B为相同或不同的，且独立地为核碱基或修饰的核碱基；
R31、R32、R43和R44各自独立地为H、F、Cl、Br、I或OR4’；
R41和R42各自独立地为H、F、Cl、Br、I、OR4’或LNA；
每个R4’独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
每个R5’独立地为OH或SH；
每个R6’独立地为O或S；
n为0、1或2。
例如，环B独立地为
其中每个Ra独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其各自任选取代有一个或多个选自以下的取代基：卤素、C1-6烷氧基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；
每个Rb独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个Rc独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Rd独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Re独立地为H、O或S；
每个f独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个R5”独立地为O或S。
例如，环B1、环B2和每个环B独立地为核碱基或修饰的核碱基，所述核碱基选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，或所述修饰的核碱基选自次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-乙基鸟嘌呤、7-异丙基鸟苷、7-环丙基鸟苷、7-甲基-N1-甲基鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-甲基)鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-乙基)鸟苷、6-硫代鸟苷、7-甲基-(6-硫代)鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-甲基腺苷、7-甲基腺苷、7-甲基黄嘌呤、7-甲基次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或二氢尿苷。
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24各自独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3；R13和R14各自独立地为H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；R21和R22任一者独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3，其中另一者为OR4，其中
每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
R4独立地选自：
在另一方面，本公开提供了如下式(Ia)或(Ib)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐：
在式(Ia)或(Ib)中，环B1和B2各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；
X1和X2独立选自-(C(R1)2)m-、-O-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-O-、-CH＝CH-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-CH＝CH-；其中m是0-6的整数；
Y为–(R2-P(O)-R2)p-，其中p为0、1或2；
R11、R12、R23和R24独立选自H、卤素、OR3或OR4；
R13、R14、R21和R22独立选自H、卤素、OR3、OR4或LNA；
每个R1独立地为H、卤素或C1-3烷基；
每个R2独立地为O、S或C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有一个或多个卤素或OH；
每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基；
每个R4独立地为
其中，每个B为相同或不同的且独立选自天然核碱基或修饰的核碱基；
R31、R32、R43和R44独立选自H、卤素或OR4’；
R41和R42独立选自H、卤素、OR4’或LNA；
每个R4’独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基；
R5独立地为OH或SH；
R6独立地为O或S；
每个R5’独立地为OH或SH；
每个R6’独立地为O或S；
n为选自0-2的整数。
在某些实施方案中，环B1、B2和每个环B独立地选自:
其中每个Ra独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基，其各自任选取代有一个或多个选自以下的取代基：卤素、C1-6烷氧基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；
每个Rb独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个Rc独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Rd独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Re独立地为H、O或S；
每个Rf独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个R5”独立地为O或S。
例如，环B1、环B2和每个环B独立地为核碱基或修饰的核碱基，其中所述核碱基选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，或所述修饰的核碱基选自次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-乙基鸟嘌呤、7-异丙基鸟苷、7-环丙基鸟苷、7-甲基-N1-甲基鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-甲基)鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-乙基)鸟苷、6-硫代鸟苷、7-甲基-(6-硫代)鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-甲基腺苷、7-甲基腺苷、7-甲基黄嘌呤、7-甲基次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或二氢尿苷。
例如，“胺保护基团”包括但不限于芴基甲基氧基羰基(“Fmoc”)、羧基苄基(“Cbz”)、叔丁基氧基羰基(“BOC”)、二甲氧基苄基(“DMB”)、乙酰基(“Ac”)、三氟乙酰基、邻苯二甲酰亚胺基团、苄基(“Bn”)、三苯甲基(三苯基甲基,Tr)、亚苄基胺基团或甲苯磺酰基(Ts)。
在某些实施方案中，X1和X2独立地选自-(C(R1)2)m-、-O-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-O-或-CH＝CH-；其中每个R1独立地为H、F、Cl、Br、I或C1-3烷基，其中m为选自0-6的整数。
例如，X1和X2独立地选自-CH2-O-、-O-CH2-、-CH2-CH2-、-O-CH(CH3)-、-CH(CH3)-O-或-CH＝CH-。
在某些实施方案中，Y为–(R2-P(O)-R2)p-，其中每个R2独立地为O、S或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选取代有一个或多个卤素或OH；且其中p为0、1或2。
例如，Y选自
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24独立选自H、F、Cl、Br、I或OR3；R13、R14、R21和R22独立选自H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基。
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24独立选自H、F、Cl、Br、I或OR3；R13和R14独立选自H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；R21和R22任一者独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3，且另一者为OR4，其中
每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
R4独立地为
其中，每个B为相同或不同的，且独立地为核碱基或修饰的核碱基；
R31、R32、R43和R44独立地为H、F、Cl、Br、I或OR4’；
R41和R42独立地为H、F、Cl、Br、I、OR4’或LNA；
每个R4’独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
每个R5’独立地为OH或SH；
每个R6’独立地为O或S；且
n为0、1或2。
例如，环B独立地为
其中每个Ra独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其各自任选取代有一个或多个选自以下的取代基：卤素、C1-6烷氧基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；
每个Rb独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个Rc独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Rd独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Re独立地为H、O或S；
每个Rf独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个R5”独立地为O或S。
例如，环B1、环B2和每个环B独立地为核碱基或修饰的核碱基，其中所述核碱基选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，或所述修饰的核碱基选自次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-乙基鸟嘌呤、7-异丙基鸟苷、7-环丙基鸟苷、7-甲基-N1-甲基鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-甲基)鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-乙基)鸟苷、6-硫代鸟苷、7-甲基-(6-硫代)鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-甲基腺苷、7-甲基腺苷、7-甲基黄嘌呤、7-甲基次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或二氢尿苷。
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3；R13和R14独立地为H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；R21和R22任一者独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3，且另一者为OR4，其中
每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
R4独立地选自：
在另一方面，本公开提供了如下式(Ia1)、(Ia2)、(Ia3)或(Ia4)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐：
在某些实施方案中，每个Ra独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其各自任选取代有一个或多个选自以下的取代基：卤素、C1-6烷氧基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；
每个Rb独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个Rc独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Rd独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个R5”独立地为O或S。
例如，“胺保护基团”包括但不限于芴基甲基氧基羰基(“Fmoc”)、羧基苄基(“Cbz”)、叔丁基氧基羰基(“BOC”)、二甲氧基苄基(“DMB”)、乙酰基(“Ac”)、三氟乙酰基、邻苯二甲酰亚胺基团、苄基(“Bn”)、三苯甲基(三苯基甲基,Tr)、亚苄基胺基团或甲苯磺酰基(Ts)。
在某些实施方案中，X1和X2独立选自-(C(R1)2)m-、-O-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-O-或-CH＝CH-；其中每个R1独立地为H、F、Cl、Br、I或C1-3烷基，其中m为选自0-6的整数。
例如，X1和X2各自独立地为-CH2-O-、-O-CH2-、-CH2-CH2-、-O-CH(CH3)-、-CH(CH3)-O-或-CH＝CH-。
在某些实施方案中，Y为–(R2-P(O)-R2)p-，其中每个R2独立地为O、S或C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有一个或多个卤素或OH；且其中p为0、1或2。
例如，Y选自
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3；R13、R14、R21和R22独立地为H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3；R13和R14独立地为H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；R21和R22任一者独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3，且另一者为OR4，其中，
每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
R4独立地为
其中，
每个B为相同或不同的，且独立地选自核碱基或修饰的核碱基，其中所述核碱基选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，或所述修饰的核碱基选自次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-乙基鸟嘌呤、7-异丙基鸟苷、7-环丙基鸟苷、7-甲基-N1-甲基鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-甲基)鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-乙基)鸟苷、6-硫代鸟苷、7-甲基-(6-硫代)鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-甲基腺苷、7-甲基腺苷、7-甲基黄嘌呤、7-甲基次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或二氢尿苷；
R31、R32、R43和R44独立选自H、F、Cl、Br、I或OR4’；
R41和R42独立选自H、F、Cl、Br、I、OR4’或LNA；
每个R4’独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
每个R5’独立地为OH或SH；
每个R6’独立地为O或S；
n为0、1或2。
在某些实施方案中，每个R4独立选自：
在另一方面，本公开提供了如下式(Ib1)、(Ib2)、(Ib3)或(Ib4)的化合物或其立体异构体、互变异构体或盐：
在某些实施方案中，每个Ra独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其各自任选取代有一个或多个选自以下的取代基：卤素、C1-6烷氧基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；
每个Rb独立地为H、NH2或C1-6烷基；
每个Rc独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个Rd独立地为H、C1-6烷基或胺保护基团；
每个R5”独立地为O或S。
例如，“胺保护基团”包括但不限于芴基甲基氧基羰基(“Fmoc”)、羧基苄基(“Cbz”)、叔丁基氧基羰基(“BOC”)、二甲氧基苄基(“DMB”)、乙酰基(“Ac”)、三氟乙酰基、邻苯二甲酰亚胺基团、苄基(“Bn”)、三苯甲基(三苯基甲基,Tr)、亚苄基胺基团或甲苯磺酰基(Ts)。
在某些实施方案中，X1和X2独立选自-(C(R1)2)m-、-O-(C(R1)2)m-、-(C(R1)2)m-O-或-CH＝CH-；其中每个R1独立地为H、F、Cl、Br、I或C1-3烷基，其中m为选自0-6的整数。
例如，X1和X2各自独立地为-CH2-O-、-O-CH2-、-CH2-CH2-、-O-CH(CH3)-、-CH(CH3)-O-或-CH＝CH-。
在某些实施方案中，Y为–(R2-P(O)-R2)p-，其中每个R2独立地为O、S或C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有一个或多个卤素或OH；且其中p为0、1或2。
例如，Y选自
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24各自独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3；R13、R14、R21和R22各自独立地为H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
在某些实施方案中，R11、R12、R23和R24各自独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3；R13和R14独立地为H、F、Cl、Br、I、OR3或LNA；R21和R22任一者独立地为H、F、Cl、Br、I或OR3，且另一者为OR4，其中，
每个R3独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
R4独立地为
其中，
每个B为相同或不同的，且独立地为核碱基或修饰的核碱基，其中所述核碱基选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，或所述修饰的核碱基选自次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-乙基鸟嘌呤、7-异丙基鸟苷、7-环丙基鸟苷、7-甲基-N1-甲基鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-甲基)鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-乙基)鸟苷、6-硫代鸟苷、7-甲基-(6-硫代)鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-甲基腺苷、7-甲基腺苷、7-甲基黄嘌呤、7-甲基次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或二氢尿苷；
R31、R32、R43和R44独立选自H、F、Cl、Br、I或OR4’；
R41和R42独立选自H、F、Cl、Br、I、OR4’或LNA；
每个R4’独立选自H、C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基任选取代有一个或多个F、Cl、Br、I、OH和C1-6烷氧基；
每个R5’独立地为OH或SH；
每个R6’独立地为O或S；
n为0、1或2。
在某些实施方案中，R4独立地选自：
在另一方面，本公开提供了如下式(II)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：
其中：
环B1、B2、B3和B4各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；
每个R独立地选自H和C1-6烷基；
R1和R2各自独立地选自OR5和卤素；
每个R3独立地选自C1-6烷氧基、卤素和LNA；
每个R4独立地选自卤素和LNA；
每个R5独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基；和
n为选自0-1的整数。
在某些实施方案中，环B1和B4各自独立地为鸟嘌呤(G)，且环B2和B3各自独立地为腺嘌呤(A)。
在某些实施方案中，R独立地选自H和甲基。
在某些实施方案中，R1和R2各自独立地选自OR5、F、Cl、Br和I，且每个R5独立地选自H和C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有C1-6烷氧基。
在某些实施方案中，R1和R2各自独立地选自OH、-O(CH2)2OCH3和F。
在某些实施方案中，R3独立地选自甲氧基、F和LNA。
在某些实施方案中，R4独立地选自F和LNA。
在另一方面，本公开提供了如下式(IIA)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：
其中：
环B1、B2、B3和B4各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；和
R3和R4各自独立地选自卤素和LNA。
在某些实施方案中，环B1和B4各自独立地为鸟嘌呤(G)，且环B2和B3各自独立地为腺嘌呤(A)。
在某些实施方案中，R3和R4各自独立地选自F和LNA。
在另一方面，本公开提供了如下式(IIB)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：
其中：
环B1、B2和B4各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；
R1和R2各自独立地选自OR5和卤素；和
每个R5独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基。
在某些实施方案中，环B1和B4各自独立地为鸟嘌呤(G)，且环B2为腺嘌呤(A)。
在某些实施方案中，R1和R2各自独立地选自OR5、F、Cl、Br和I，且每个R5独立地选自H和C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有C1-6烷氧基。
在某些实施方案中，R1和R2各自独立地选自OH、-O(CH2)2OCH3和F。
在另一方面，本公开提供了选自以下任一的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：
除非另有定义，否则本申请使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确规定。尽管与本申请所述的方法和材料相似或相同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但下面描述了合适的方法和材料。本申请提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用的方式并入本申请。本申请引用的参考文献不被认为是对于要求保护的本发明的现有技术。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是示例说明性的而不是限制性的。在本申请所公开的化合物的化学结构和名称发生冲突的情况下，以化学结构为准。
定义
为了本公开的目的，以下定义应当全部用于定义技术术语，并且还应当全部用于定义在权利要求中寻求保护的物质组成的范围。
本申请使用的术语“LNA”或“锁核酸”是指核苷酸单体的2'O和4'C之间的亚甲基桥，或是指糖类似物、核苷、核苷酸单体或核酸，其各自含有所述桥。例如，
或WO99/14226和Kore et al,J.AM.CHEM.SOC.2009,131,6364-6365中所描述的那些，将其每一个的内容通过引用的方式整体并入本申请。
本申请使用的术语“核碱基”是指含氮杂环部分，其是参与以序列特异性方式将一条核酸链与另一条互补链结合的氢键键合的核酸部分。最常见的天然存在的核碱基是：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。
术语“修饰的核碱基”是指可以替代核碱基的部分。所述修饰的核碱基模拟核碱基的空间排列、电子特性或一些其他物理化学特性，并保留以序列特异性方式将一条核酸链与另一条核酸链结合的氢键特性。修饰的核碱基可以与五种天然存在的碱基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤)中的至少一种配对，而不会显着影响寡核苷酸双链体的熔解行为、细胞内酶的识别或活性。术语“修饰的核苷”或“修饰的核苷酸”是指包含修饰的核碱基和/或本申请公开的其他化学修饰诸如修饰的糖、修饰的磷原子桥或修饰的核苷间键的核苷或核苷酸。
合适的核碱基的非限制性实例包括但不限于次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-乙基鸟嘌呤、7-异丙基鸟苷、7-环丙基鸟苷、7-甲基-N1-甲基鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-甲基)鸟苷、7-(氧杂环丁烷基-乙基)鸟苷、6-硫代鸟苷、7-甲基-(6-硫代)鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-甲基腺苷、7-甲基腺苷、7-甲基黄嘌呤、7-甲基次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和二氢尿苷。
本申请使用的"卤代"或"卤素"是指氟、氯、溴和碘。
术语“烷基”和“C1-6-烷基”意指直链或支链饱和烃链，其中最长链具有一至六个碳原子，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基和正己基。
术语“烯基”和“C1-6烯基”意指直链或支链不饱和烃链，其中最长链具有二至六个碳原子，诸如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基和支化烯基。
术语“炔基”和“C1-6炔基”意指含有至少一个三键的直链或支链不饱和烃链，其中最长链具有二至六个碳原子，诸如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基和支化炔基。
术语"烷氧基"和"C1-6烷氧基"包括与氧原子共价连接的取代和未取代的烷基、烯基和炔基。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基和己氧基。
本申请使用的“碳环”、"环烷基"和"碳环"意在包括具有指定碳数的任何稳定的单环或双环，其中任何碳可以是饱和或不饱和的。例如，C3-8环烷基意在包括具有3、4、5、6、7或8个碳原子的单环或双环。碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环丁烯基、环戊基、环戊烯基、环己基。
本申请使用的"杂环"、“杂环烷基”或"杂环基团"包括含有至少一个环杂原子(例如，N、O或S)的任何环结构(饱和或不饱和)。杂环包括杂环烷基。杂环烷基的实例包括但不限于吗啉、吡咯烷、四氢噻吩、哌啶、哌嗪、氧杂环丁烷、吡喃、四氢吡喃、氮杂环丁烷和四氢呋喃基团。
术语"胺保护基团"是指胺的保护基团。胺保护基团的实例包括但不限于芴基甲基氧基羰基(“Fmoc”)、羧基苄基(“Cbz”)、叔丁基氧基羰基(“BOC”)、二甲氧基苄基(“DMB”)、乙酰基(“Ac”)、三氟乙酰基、邻苯二甲酰亚胺基团、苄基(“Bn”)、三苯甲基(三苯基甲基,Tr)、亚苄基胺基团、甲苯磺酰基(Ts)。额外的胺保护基团也参见Chem.Rev.2009,109,2455-2504，将其全部内容通过引用的方式并入本申请。
术语“立体异构体”是指由相同原子组成，通过相同的键键合，但具有不同三维结构的化合物。本发明将涵盖各种立体异构体及其混合物。
术语“互变异构体”是指质子从分子的一个原子转移至相同分子的另一个原子而形成的异构体。本发明的化合物的所有互变异构形式也将包含在本发明的范围内。
本发明的化合物可能含有一个或多个手性碳原子，且因此可产生对映异构体、非对映异构体及其它立体异构形式。每个手性碳原子可以基于立体化学而被定义为(R)-或(S)-。本发明化合物包括所有可能的异构体，以及其外消旋体和光学纯形式。本发明的化合物的制备可以选择外消旋体、非对映异构体或对映异构体作为原料或中间体。光学活性的异构体可以使用手性合成子或手性试剂来制备，或者使用常规技术进行拆分，例如采用结晶以及手性色谱等方法。
术语“氘化物”是指化合物中的一个或多个有效氢原子被相应数目的氘原子取代。例如，本发明化合物的鸟嘌呤(G)上的–CH3可被氘代化为–CD3，即
本发明的化合物可用本领域普通技术人员已知的方式氘代，包括本发明如下所述的方法。
头部核苷基团修饰
头部基团修饰，包括核苷、糖和7-烷基修饰，总结在表1中。我们通过掺入2'-或3'-甲氧基乙基(MOE)对7mG进行糖修饰。2'-核糖上的甲氧基乙基修饰在用于反义应用的寡核苷酸中得到充分记载，其增加寡核苷酸对核酸酶的稳定性以及与靶标的杂交亲和力。然而，尚未探索其在mRNA 5'-帽结构中的效用。类似地，其他取代诸如2'-氟的效用在5'-帽结构中是未知的。此外，在一些实施方案中，我们还在5'-帽头部基团中用阿拉伯糖或2'-3'-取代的阿拉伯糖完全替换了核糖。此外，还使用对映异构体纯的L-鸟苷(LG)类似物代替D-鸟苷。具有这些修饰的代表性化合物具有以下结构：
表1.由头部核苷基团修饰得到的5’-帽类似物
在我们的核苷修饰中，7mG核苷头部基团被修饰为各种7-烷基化鸟苷基团。合理的是增加尺寸并在7-烷基末端添加一个额外的杂原子，以改善5'-帽类似物与其受体诸如eIF4E(真核翻译起始因子4E)之间的额外相互作用。具有各种7-烷基化鸟苷基团的代表性化合物具有以下结构：
采用鸟苷的核碱基类似物进行修饰，包括肌苷(I)、黄嘌呤核苷(X)和6-硫代鸟苷(6-thio-G)类似物。7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷(8-aza-G)类似物作为7mG的中性替代物特别受关注。5'-(R)-甲基修饰的核苷(5'-RmN；N＝G或A)可以类似地掺入。具有鸟苷的核碱基类似物的代表性化合物具有以下结构：
三磷酸接头修饰
7mG头部基团上的-磷酸酯被修饰为膦酸酯，并用作修饰帽类似物的构建块。合成了鸟苷的5'-乙烯基膦酸酯和5'-乙基膦酸酯，并通过镁介导的连接反应将其作为头部核苷基团或作为尾部核糖核苷基团类似物掺入帽结构中。采用与α-磷酸酯修饰相同的修饰。用亚甲基或二氯亚甲基替代磷酸酯间氧原子产生三磷酸类似物。四磷酸酯也可以连接最佳的头部和尾部基团。具有三磷酸酯接头修饰的代表性化合物具有以下结构(接头修饰总结于表2中)：
表2.具有三磷酸酯接头中的修饰的5’-帽类似物
| 化合物编号 | 序列 | MS(计算值) | MS(实测值) |
| 26 | 7-(5’乙烯基-G)pppG | 799.1 | 799.0 |
| 27 | 7mGppp(5’乙烯基-G) | 799.1 | 799.0 |
| 28 | 7mGCH2pppG | 801.1 | -- |
| 29 | 7m(3’-moe)GpCH2ppG | 859.2 | -- |
| 30 | 7m(3’-moe)GppCH2pG | 859.2 | -- |
| 31 | 7mGpppCH2G | 801.1 | 801.4 |
| 32 | 7mGpCCl2ppG | 869.0 | -- |
| 33 | 7mGppCCl2pG | 869.0 | -- |
| 34 | 7m(2’-F-araG)ppppG | 885.1 | -- |
| 34A | 7mGppp(s)G | 899.5 | -- |
| 34B | 7mGppp(s)A | 883.5 | -- |
| 34C | 7mGppp(s)ApG | 1148.7 | -- |
| 34D | 7mGppp(s-Sp)ApG | 1148.7 | -- |
| 34E | 7mGppp(s-Rp)ApG | 1148.7 | -- |
| 34F | 7mGppp(s)ApGpG | 1493.9 | -- |
| 34G | 7mGppp(s-Sp)ApGpG | 1493.9 | -- |
| 34H | 7mGppp(s-Rp)ApGpG | 1493.9 | -- |
尾部核苷基团修饰
为了在5'-帽结构的尾部核苷基团中引入修饰，我们利用DNA/RNA合成仪产生5'-磷酸化单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，以用于与合成的选定头部核苷基团连接。单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的焦磷酸化也通过固相寡核苷酸合成进行，其中标准方案略有修改，并且合成的核苷如下(汇总于表3):
表3.5’-磷酸化寡核苷酸构建块作为尾部核苷基团掺入；以及连接的5’-帽结构的实例
使用纯化为三乙胺(TEA)盐的适当5'-磷酸酯，与合适的咪唑活化的头部基团的连接反应提供5'-5'三磷酸酯连接的多核苷酸帽类似物。具有尾部核苷基团修饰的代表性化合物具有以下结构：
实施例
合成方法
5’-帽结构合成方案
实施例1
修饰核苷(3’-moeGMP)的单磷酸化
在装填有3'-moeG(100mg,0.29mmol)的具有隔板的氩气冲洗的4mL玻璃小瓶中加入磷酸三甲酯(TMP,1.0mL)，并将混悬液在冰浴中冷却至0℃且保持30min，之后经干燥注射器加入POCl3(35uL,1.3eq)。整个混合物在1min内变得澄清。在冰浴中继续搅拌3h，之后将其用水(30mL)淬灭并加入15mL TEAB(1.0M)调节pH为6。将混合物用DCM洗涤并弃去有机层(20mL x2)。将所得的水层稀释至250mL并加载至100mL DEAE柱上并用0-25％水/1.0M DEAB梯度洗脱。合并产品馏分，蒸发，并冷冻干燥，其为三乙铵盐，白色固体(0.28mmol,95％)。1HNMR(氧化氘,400Hz)δ8.13(s,1H),5.96(d,J＝8Hz,1H),4.40(m,1H),4.2(m,1H),4.0(m,2H),3.8(m,2H),3.7(m,2H),3.40(s,3H),3.2(q,J＝9Hz,12H),1.2(t,J＝9,18H).
2’-F-araGMP以类似的方法合成。
在装填有2'-氟-araG(100mg,0.35mmol)的具有隔板的氩气冲洗的4mL玻璃小瓶中加入磷酸三甲酯(TMP,1.0mL)并将混悬液在冰浴中冷却至0℃且保持30min，之后经干燥注射器加入POCl3(43uL,1.3eq)。整个混合物在1min内变得澄清。继续在冰浴中搅拌3h，之后将其用水(30mL)淬灭并加入15mL TEAB(1.0M)调节pH为6。将混合物用DCM洗涤并弃去有机层(20mL x2)。将所得的水层稀释至250mL并加载至100mL DEAE柱上并用0-25％水/1.0MDEAB梯度洗脱。合并产品馏分，蒸发，并冷冻干燥，其为三乙铵盐，白色固体(0.33mmol,95％)。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ8.06(s,1H),6.27-6.32(m,1H),5.20-5.35(m,1H),4.63-4.69(m,1H),4.04-4.19(m,3H).
(6-硫代-G)单磷酸酯以类似的方法合成。(240mg,45％)1H-NMR(氧化氘,400Hz)δ8.2(s,1H),5.9(d,J＝6.0Hz,1H),4.4(m,1H),4.2(m,1H),3.9(m,2H),3.1(q,J＝8Hz,6H),1.1(t,J＝8Hz,9H)ppm.31P NMR(氧化氘,162Hz)δ2.7(s,1P)ppm.
实施例2
通过一锅法合成的修饰核苷(3’moeGDP)的焦磷酸化
采用改良的文献方案。在2’moeG(1.0mmol)在TMP(2.0mL)中的0℃混悬液中加入POCl3，并将混合物在室温温热30min，之后起始物质完全溶解。将混合物冷却至0℃并加入三丁基胺(TBA,0.70mmol)，随后加入H3PO4-TBA盐在无水DMF(5.0mL x 1M)中的溶液。在0℃搅拌5min后，将其用60mL TEAB(0.5M)缓冲液淬灭30min。将混合物稀释至500mL并在100mLDEAE柱上纯化。合并产品馏分，浓缩，并冷冻干燥，其为三乙铵盐，白色蜡状固体:0.44g(0.55mmol,55％)。产物含有20％mol H3PO4并且可如原样使用。分析样品通过进一步HPLC上纯化获得，得到铵盐。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ8.14(s,1H),5.98(d,J＝8Hz,1H),4.7(m,2H),4.3(m,1H),4.2(m,2H),3.8(m,1H),3.7(m,1H),3.6(m,2H),3.30(s,3H).31PNMR(氧化氘,162Hz)δ-9.2(d,J＝20Hz,1P),-11.2(d,J＝20Hz,1P).
实施例3
鸟苷单磷酸酯的7-烷基化.7-(2-F-乙基)GMP
鸟苷单磷酸酯钠盐(0.50mmol)悬浮于DMSO(4mL)中，加入0.43g 1-氟-2-碘乙烷(2.5mmol)并将混合物在55℃搅拌保持48h。将混合物用水(50mL)稀释并用DCM(25mL x 2)洗涤。将水层经100mL DEAE柱纯化。合并产品馏分，浓缩，并冷冻干燥，其为白色粉末(35umol,7％)。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ6.13(d,J＝4Hz,1H),5.0(m,1H),4.7-4.9(m,4H),4.5(m,1H),4.4(m,1H),4.2(m,1H),4.1(m,1H),3.2(q,J＝9Hz,6H),1.2(t,J＝9,9H).
7m-2’-F-araGMP以类似的方法合成。
鸟苷单磷酸酯三乙铵盐(0.92mmol)悬浮于水(50mL)中并使用乙酸将所得的溶液的pH调节至4.0。历时2hr逐滴加入1.3mL(13.8mmol)硫酸二甲酯。在甲基化进行中，pH降低但使用1.0N NaOH溶液重新调节回至4.0。将反应混合物在室温搅拌3hr。将混合物用水(50mL)稀释并用DCM(100mL x 2)洗涤。将水层在100mL DEAE柱上纯化。合并产品馏分，浓缩，并冷冻干燥，其为白色粉末(0.9mmol,90％)。1HNMR(氧化氘,400Hz)δ6.51-6.55(m,1H),5.35-5.50(m,1H),4.68-4.74(m,1H),4.30-4.4.33(m,1H),4.11-4.4.20(m,5H).31P NMR(氧化氘,162Hz)δ3.85(s,1P).
7mXMP以类似的方法合成。(0.15mmol,30％)1H-NMR(氧化氘,400Hz)δ9.0(s,1H),6.0(d,J＝3.6Hz,1H),4.6(m,1H),4.4(m,2H),4.1-4.2(m,2H),4.0(s,3H)ppm.31P-NMR(氧化氘,162Hz)δ0.02(s,1P).
7mIDP以类似的方法合成。(0.21mmol,34％)1H-NMR(氧化氘,400Hz)δ8.2(s,1H),6.2(d,J＝2.8Hz,1H),4.6(m,1H),4.5(m,1H),4.3(m,2H),4.2(m,1H),3.8(s,1H),3.1(q,J＝8Hz,18H),1.2(t,J＝8Hz,27H).31P-NMR(氧化氘,162Hz)δ-7.6(d,J＝21Hz,1P),-11.1(d,J＝21Hz,1P).
实施例4
修饰的核苷磷酸酯(Im-7mGDP)的活化
在氮气惰性气氛下在室温向7mGDP TEA盐(1.8g,3.9mmol)在54mL二甲基甲酰胺中的溶液中先后加入咪唑(2.7g,39.5mmol,10.0eq)、三乙胺(0.8g,7.9mmol,2.0eq)、磷酸三苯基酯(3.1g,11.8mmol,3.0eq)和二-2-吡啶基二硫化物(2.6g,11.8mmol,3.0eq)。将所得的溶液在室温搅拌过夜。然后逐滴加入120mL丙酮(含有66mmol/L高氯酸钠)并在0℃搅拌30min。将所得的混合物滤过并用丙酮洗涤得到1.0567g(53％)7mGDP-Im，其为白色固体。1HNMR(400MHz,氧化氘)δ7.87(s,1H),7.53(s,1H),7.25(s,1H),6.95(s,1H),5.96(t,J＝3.7Hz,1H),4.52(d,J＝4.2Hz,1H),4.28(d,J＝4.5Hz,2H),4.15(s,1H),3.98(d,J＝4.8Hz,4H).31P NMR(162MHz,氧化氘)δ-11.9(d,J＝20Hz,1P),-19.9(d,J＝20Hz,2P).
在氮气惰性气氛下在室温向ADP TEA盐(147mg,0.2mmol)在7.5mL二甲基甲酰胺中的溶液中先后加入咪唑(163.3mg,2.4mmol,12.0eq)、三乙胺(40.4mg,0.4mmol,2.0eq)磷酸三苯基酯(314mg,1.2mmol,6.0eq)和二-2-吡啶基二硫化物(264mg,1.2mmol,6.0eq)。将所得的溶液在室温搅拌过夜。然后逐滴加入120mL丙酮(含有66mmol/L高氯酸钠)并在0℃搅拌30min。将所得的混合物滤过并用丙酮洗涤得到0.13mmol ADP-Im，其为白色固体。
在氮气惰性气氛下在室温向GTP TEA盐(0.413mg,0.5mmol)在7.5mL二甲基甲酰胺中的溶液中先后加入咪唑(0.408mg,6mmol,12.0eq)、三乙胺(101mg,1mmol,2.0eq)、磷酸三苯基酯(786mg,3mmol,6.0eq)和二-2-吡啶基二硫化物(660mg,3mmol,6.0eq)。将所得的溶液在室温搅拌过夜。然后逐滴加入120mL丙酮(含有66mmol/L高氯酸钠)并在0℃搅拌30min。将所得的混合物滤过并用丙酮洗涤得到288mg(90％)GTP-Im，其为白色固体。
7mIDP-Im以类似的方法合成。1H-NMR(氧化氘,400Hz)δ8.2(s,1H),7.9(s,1H),7.3(s,1H),6.9(s,1H),6.1(s,1H),4.5(m,1H),4.3(m,2H),4.2(m,1H),4.1(s,3H),4.0(m,1H)ppm.31P-NMR(氧化氘,162Hz)δ-11.9(d,J＝20Hz,1P),-19.8(d,J＝20Hz,1P).
实施例5
通过锌催化连接产生修饰的5’-帽类似物.(7-(2-F-乙基)-GpppG(13)
在4mL小瓶中，向GDP-咪唑(14mg,25μmol)、7-烷基化GMP-TEA(25μmol)和氯化锌(68mg,500μmol)的混合物中加入无水DMSO(500μL)，然后将整个混合物在35℃搅拌24h。将反应混合物用50mL水稀释并将混合物用树脂结合的Zn清除剂(QuadraPure IDA,0.5g)处理。将溶液滤过，浓缩，并经制备性-HPLC纯化，得到铵盐(4.8μmol)。将铵盐冷冻干燥两次并通过由NaClO4在丙酮中的溶液(50mg/mL,1mL)析出转化为钠盐，随后用丙酮洗涤得到白色固体(4.1μmol,16％)。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ8.06(s,1H),5.95(d,J＝4Hz,1H),5.84(d,J＝8Hz,1H),5.0(m,1H),4.7-4.9(m,4H),4.6(m,1H),4.5(m,2H),4.2-4.5(m,6H)。31P NMR(氧化氘,162Hz)δ-10.8(d,J＝20Hz,2P),-22.4(t,J＝20Hz,1P)。MS(m/z):实测值835.2[M+],计算值835.1[M+]
7m(2’-moe)GpppG(1)以类似的方法合成。1H-NMR(D2O,400MHz)δ7.91(s,1H),5.86(d,1H),5.70(d,1H),4.57(t,1H),4.40-4.10(m,9H),3.98(s,3H),3.85-3.82(m,2H),3.58(m 2H),3.28(s,3H)；31P-NMR(D2O,162MHz)δ-11.62(d,2P),-23.13(d,1P),MS(m/z):实测值861.1[M+],计算值861.1[M+]
7m(3’-moe)GpppG(2)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400MHz)δ8.02(s,1H),5.90(d,J＝4Hz,1H),5.81(d,J＝8Hz,1H),4.7(m,2H),4.5(m,2H),4.4(m,2H),4.2-4.4(m,4H),4.09(s,3H),3.8(m,2H),3.7(m,2H),3.42(s,3H).31P NMR(氧化氘,162Hz)δ-11.0(d,J＝20Hz,1P),-11.2(d,J＝20Hz,1P),-22.4(t,J＝20Hz,1P)。MS(m/z):实测值861.0[M+],计算值861.1[M+]
7m(2’-F-araG)pppG(6)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400MHz)δ8.01(s,1H),6.26(d,J＝8Hz,1H),5.80(d,J＝4Hz,1H),5.24-5.35(m,1H),4.63-4.65(m,2H),4.48-4.49(m,1H),4.26-4.36(m,6H),4.09(m,3H).31P NMR(氧化氘,162Hz)δ-10.9(d,J＝20Hz,2P),-22.6(t,J＝20Hz,1P)。MS(m/z):实测值806.0[M+],计算值806.1[M+]
7m(2’-F-araG)ppp(2’moeG)(7)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400MHz)δ7.99(s,1H),6.23(d,J＝8Hz,1H),5.81(d,J＝4Hz,1H),5.22-5.35(m,1H),4.47-4.66(m,3H),4.25-4.4(m,6H),4.08(m,3H),3.6-3.8(m,2H),3.4-3.54(m,2H),3.19(s,3H)。31P NMR(氧化氘,162Hz)δ-11.6(d,J＝20Hz,2P),-23.2(t,J＝20Hz,1P)。MS(m/z):实测值863.0[M+],计算值863.1[M+]
7-e-GpppG(11)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400MHz)δ8.03(s,1H),5.89(d,J＝4Hz,1H),5.80(d,J＝8Hz,1H),4.7(m,1H),4.3-4.6(m,7H),1.5(t,J＝8Hz,3H)。31PNMR(氧化氘,162Hz)δ-11.6(d,J＝20Hz,2P),-23.2(t,J＝20Hz,1P)。MS(m/z):实测值817.2[M+],计算值817.1[M+]
7-iPr-GpppG(12)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400MHz)δ8.07(s,1H),5.89(d,J＝4Hz,1H),5.82(d,J＝8Hz,1H),5.1(m,1H),4.8(m,1H),4.6(m,1H),4.5(m,2H),4.2-4.4(m,6H),1.6(t,J＝8Hz,6H)。31P NMR(氧化氘,162Hz)δ-10.9(m,2P),-22.6(t,J＝20Hz,1P)。MS(m/z):实测值832.0[M+],计算值831.1[M+]
7-(cPr-甲基)-GpppG(14)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400MHz)δ8.08(s,1H),5.96(d,J＝4Hz,1H),5.84(d,J＝8Hz,1H),4.8(m,1H),4.7(m,1H),4.5(m,2H),4.2-4.4(m,8H),1.5(m,1H),0.7(m,2H),0.5(m,2H).31P NMR(氧化氘,162Hz)δ-11.6(d,J＝20Hz,2P),-23.2(t,J＝20Hz,1P)。MS(m/z):实测值843.2[M+],计算值843.1[M+]
7mIpppG(17)以类似方法合成:1H NMR(氧化氘,400Hz)δ8.2(s,1H),8.0(m,1H),6.0(s,1H),5.7(s,1H),4.2-4.4(m,7H),4.1-4.2(m,6H)ppm。31P-NMR(氧化氘,162Hz)δ-11.5(d,J＝20Hz,2P),-23.2(t,J＝22Hz,1P)ppm。MS(m/z):实测值786.6[M-2H]-,计算值788.1[M+]
7mIppp(2’-moeA)(18)以类似方法合成:1H NMR(氧化氘,400Hz)δ8.3(s,1H),8.1(s,1H),8.0(s,1H),5.9(m,2H),4.5(m,1H),4.4-4.5(m,2H),4.3-4.4(m,4H),4.2(m,3H),4.0(s,1H),3.7(m,1H),3.6(m,1H),3.4(m,2H),3.0(s,3H)ppm。31P-NMR(氧化氘,162Hz)δ-11.5(d,J＝16Hz,2P),-23.2(t,J＝18Hz,1P)ppm.MS(m/z):实测值828.4[M-H]-,计算值829.1[M+]
7mIppp(6-硫代-G)(19)以类似的方法合成。1H-NMR(氧化氘,400Hz)δ8.1(s,1H),8.0(m,1H),6.0(d,J＝3.6Hz,1H),5.7(d,J＝6.4Hz,1H),4.6(m,1H),4.4(m,2H),4.3-4.4(m,2H),4.2(m,1H),4.1-4.2(m,3H),4.1(s,3H)ppm。31P-NMR(氧化氘,162Hz)δ-11.5(d,J＝18Hz,2P),-23.1(t,J＝18Hz,1P)ppm.MS(m/z):实测值804.4[M+],计算值804.1.[M+].
7mXpppG(20)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ8.8(s,1H),8.0(s,1H),6.8(s,1H),5.8(d,J＝5.6Hz,1H),4.6(m,1H),4.4(m,2H),4.2-4.4(m,4H),4.1-4.2(m,3H),3.9(s,3H)ppm.31P-NMR(氧化氘,162Hz)δ-11.5(d,J＝16Hz,2P),-23.1(t,J＝16Hz,1P)ppm.MS(m/z):实测值804.4[M+],计算值804.1[M+]
实施例6
经镁催化连接产生修饰的5’-帽类似物7-(5’-乙烯基-G)pppG(26)
采用改良的文献方案。在4mL小瓶中，向GDP-咪唑(14mg,25μmol)、修饰的GMP-TEA(25μmol)和氯化镁(24mg,250μmol)的混合物中加入无水DMSO(500μL)，然后将整个混合物在室温搅拌72h。将反应混合物加入至EDTA-TEA(0.05M 5mL)，稀释至40mL并在20mL DEAE柱上纯化。浓缩主峰物质并进一步经制备性-HPLC纯化得到铵盐(5.1mg)。将铵盐冷冻干燥两次并通过由NaClO4在丙酮中的溶液(50mg/mL,1mL)析出转化为钠盐，随后用丙酮洗涤，得到白色固体(2.2μmol)。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ7.99(s,1H),6.7(m,1H),6.3(t,J＝20Hz),5.88(d,J＝4Hz,1H),5.78(d,J＝8Hz,1H),4.7-4.9(m,2H),4.6(m,1H),4.5(m,1H),4.2-4.4(m,4H),4.08(s,3H)。31P NMR(氧化氘,162Hz)δ4.2(d,J＝18Hz,1P),-11.0(d,J＝18Hz,1P),-22.6(t,J＝18Hz,1P)。MS(m/z):实测值799.0[M+],计算值799.1[M+]
7mGppp(5’乙烯基-G)(27)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ7.89(s,1H),6.7(dt,J1＝16Hz,J2＝4Hz,1H),6.3(t,J＝16Hz,1H),5.7(m,2H),4.7(m,1H),4.6(m,1H),4.2-4.5(m,6H),4.05(s,3H)。31PNMR(氧化氘,162Hz)δ4.5(d,J＝20Hz,1P),-11.0(d,J＝20Hz,1P),-22.5(t,J＝20Hz,1P)。MS(m/z):实测值799.0[M+],计算值799.1[M+]
7mGpppCH2G(29)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ7.91(s,1H),5.9(d,J＝4Hz,1H),5.7(d,J＝8Hz,1H),4.7(m,1H),4.5(m,1H),4.3-4.5(m,5H),4.2(m,1H),4.14(s,3H),2.0(m,4H)。31P NMR(氧化氘,162Hz)δ18.3(d,J＝20Hz,1P),-11.6(d,J＝20Hz,1P),-23.2(t,J＝20Hz,1P)。MS(m/z):实测值801.4[M+],计算值801.1[M+]
实施例7
二核苷酸的5’-磷酸酯p(2’-omeA)rG(41)的固相合成.
将具有
孔径的商购Universal Base可控孔玻璃(CPG)固体支持物57mg(89.3μmol/g)置于配备有过滤器的柱上，并将柱安装在H-6DNA/RNA/LNA合成器(K&ALaborgeraete GbR)上。使用十个5μmol尺寸的管在5’-O-DMT-2’O-TBDMS-rGiBu CPG(500A)固体支持物进行二核苷酸的合成。在偶联步骤中，使过量的5’-O-DMT-2’-O-TBDMS/2’-O-Me-3’-O-亚磷酰胺(rAome Bz,rGiBu,来自NovoCom Bio)或二氰基乙基亚磷酰胺通过柱再循环14min。将3％(v/v)二氯乙酸在甲苯中的溶液用作脱三苯甲基化试剂，并将0.05M碘/吡啶用于氧化，10％(v/v)乙酸酐/乙腈用作Cap A并且将14％(v/v)N-甲基咪唑和10％(v/v)吡啶在乙腈中的混合物用作Cap B。最后，将固体支持物用乙腈洗涤并用氩气干燥。将产物从固体支持物上切下并用乙醇氨(氢氧化铵1:3v/v；2mL,55℃,6h)脱保护，蒸干并再次溶解于DMSO(500μl)中。使用三乙基三氢氟酸铵(TEA·3HF；620ul,65℃,2.5h)移去TBDMS基团，然后将混合物冷却并用0.10M TEAB(15ml)稀释。将产物通过离子交换色谱在DEAE Sephadex柱(梯度洗脱0–0.9M TEAB)上分离，在蒸发后得到p(2’-omeA)rG二核苷酸的三乙铵盐(19mg,53％)。1H NMR(400MHz,D2O):δ＝8.35(s,1H),8.12(s,1H),7.89(s,1H),6.02(d,J＝4.0Hz,1H),5.76(d,J＝8.0Hz,1H),4.70(t,J＝4.0Hz,1H),4.47(t,J＝4.0Hz,2H),4.42(t,J＝4.0Hz,1H),4.24(b,2H),4.14(d,J＝8.0Hz,2H),3.59(t,J＝4.0Hz,1H),3.37(t,J＝4.0Hz,1H),3.05(s,3H)；31P NMR(162MHz,D2O,25℃):δ＝0.46(s,1P),δ＝0.93(s,1P)ppm。MS(m/z):实测值705[M-H]-,计算值706.
p(2’-moeA)rG(42)以类似方法合成:(16mg,43％):1H-NMR(400MHz,D2O):δ＝8.35(s,1H),8.12(s,1H),7.89(s,1H),6.01(d,J＝8.0Hz,1H),5.76(d,J＝8.0Hz,1H),4.70(t,J＝4.0Hz,1H),4.47(t,J＝4.0Hz,2H),4.41(t,J＝4.0Hz,1H),4.24(b,2H),4.14(d,J＝8.0Hz,2H),3.59(t,J＝4.0Hz,1H),3.37(t,J＝4.0Hz,1H),3.00(t,J＝4.0Hz,4H),2.64(s,3H)；31P-NMR(162MHz,D2O):δ＝0.22(s,1P),δ＝0.84(s,1P)ppm.MS(m/z)实测值749[M-H]-计算值750.
p(2’-moeA)p(2’-moeG)(43)以类似方法合成:(2.1mg,59％).1H-NMR(400MHz,D2O):δ＝8.57(s,1H),8.13(s,1H),7.89(s,1H),6.08(d,J＝8.0Hz,1H),5.84(d,J＝4.0Hz,1H),4.84–4.87(m,1H),4.63(t,J＝4.0Hz,2H),4.52(t,J＝4.0Hz,1H),4.85(b,1H),4.47(b,1H),4.26(b,1H),4.12(d,J＝8.0Hz,1H),3.91(t,J＝4.0Hz,2H),3.69–3.76(m,2H),3.50–3.62(m,2H),3.39–3.43(m,2H),3.20–3.21(m,2H),3.09(s,3H),2.97(s,3H)；31P-NMR(162MHz,D2O):δ＝3.7(s,1P)ppm,δ＝0.7(s,1P)ppm；MS(m/z):实测值807[M-H]-,计算值808.
实施例8
与修饰的单核苷酸尾部的连接反应.7mGppp(2’-moeA)(53)
在10mL瓶中，将Im-7mGDP钠盐(6mg,11μmol)、2’-moeAMP TEA盐(7mg,17μmol)、DMSO(1.0mL)和ZnCl2(20mg,147μmol)的混合物在室温搅拌48h。将混合物经EDTA-2Na在10mL水中的溶液(55mg,150μmol)淬灭。将溶液用100mL水稀释，使用TEAB缓冲液将pH调节至6.5并加载至柱(GE DEAE Fast Flow)上，流速为5mL/min，在260nm进行UV检测。将柱用0至1M TEAB缓冲液线性梯度洗脱，并收集馏分，蒸发并与100mL水共蒸发三次。经制备性-HPLC纯化得到产品(3mg,31％)。1H-NMR(D2O,400MHz)δ8.32(s,1H),8.11(s,1H),5.97(d,1H),5.78(d,1H),4.51-4.29(m,10H),3.95(s,3H),3.70-3.56(m,2H),3.40(m 2H),3.09(s,3H)ppm；31P-NMR(D2O,162MHz)δ-11.63(d,2P),-23.18(d,1P)ppm,MS(m/z):实测值845.0[M-H]+,计算值845.1
7mGppp(6mA)(50)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ8.39(s,1H),8.20(s,1H),6.03(d,J＝8Hz,1H),5.85(d,J＝4Hz,1H),4.7(m,1H),4.5(m,1H),4.2-4.5(m,8H),3.99(s,3H),3.11(s,3H)ppm.31PNMR(氧化氘,162Hz)δ-11.0(m,2P),-22.6(t,J＝20Hz,1P)ppm.MS(m/z):实测值801.0[M+],计算值801.1[M+]
7mGppp(6-硫代-G)(51)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400Hz)δ8.0(s,1H),5.8(d,J＝3.2Hz,1H),5.7(d,J＝4.8Hz,1H),4.5(m,1H),4.4(m,1H),4.3(m,1H),4.2-4.3(m,3H),4.1-4.2(m,3H)ppm.31P-NMR(氧化氘,162Hz)δ-11.6(d,J＝18Hz,2P),-23.2(t,J＝18Hz,1P)ppm.MS(m/z):实测值819.3[M+H]+,计算值818.1
7mGppp(2’moeG)(52)以类似方法合成:(4mg,22％).1H-NMR(D2O,400MHz)δ7.89(s,1H),5.80(d,1H),5.75(d,1H),4.51-4.44(m,3H),4.40-4.12(m,7H),3.98(s,3H),3.74-3.56(m,2H),3.40(m 2H),3.11(s,3H)；31P-NMR(D2O,162MHz)δ-11.6(d,J＝20Hz,2P),-23.2(t,J＝20Hz,1P),MS(m/z):实测值861.0[M-H]+,计算值861.1
实施例9
三核苷酸修饰的5’-帽类似物的连接产生7mGppp(2’-moeA)rG(55)
在10mL瓶中，加入Im-7mGDP钠盐(13mg,25μmol)、5’p-(2’-moeA)rG TEA盐(11.8mg,14.6μmol)、DMSO(1.5mL)和ZnCl2(72mg,500μmol)。将反应混合物在室温搅拌24h，随后经EDTA-2Na(185mg,550μmol)在水(10mL)中的溶液淬灭。将溶液用水稀释至100mL，并使用TEAB缓冲液将pH调节至6.5。将样品溶液加载至柱(GE DEAE Fast Flow)上，流速为5mL/min，在260nm进行UV检测；并将柱用0至1MTEAB缓冲液线性梯度洗脱，并收集馏分且使用旋转蒸发仪在35℃蒸发。然后将所得的残留物与100mL水共蒸发三次。冷冻干燥得到粗产物，将其经制备性-HPLC纯化得到2mg产物(收率17％)。1H NMR(氧化氘,400MHz)δ8.29(s,1H),8.06(s,1H),7.91(s,1H),5.92(d,1H),5.78(m,2H),4.48-4.13(m,15H),3.95(s,3H),3.67(m,1H),3.47(m,1H),3.32-3.14(m,2H),2.90(s,3H)；31P NMR(氧化氘,162MHz)δ-11.70(m,2P),-22.64(m,1P),-0.86(s,1P).MS(m/z):实测值1190[M-H]+.596[M/2]+,计算值1190.2
7mGppp-(2’-moeA)p(2’-moeG)(56)以类似的方法合成。1H NMR(氧化氘,400MHz)δ8.94(s,1H),832(s,1H),8.09(s,1H),7.86(s,1H),5.94(d,1H),5.80(m,2H),4.52-4.12(m,15H),3.96(s,3H),3.76-3.68(m,2H),3.64-3.58(m,1H),3.53-3.49(m,1H),3.44-3.41(m,2H),3.35-3.24(m,2H),3.12(s,3H),3.03(s,3)；31P NMR(氧化氘,162MHz)δ-11.35(m,2P),-22.58(m,1P),-0.82(s,1P),MS(m/z):实测值625[M/2]+,计算值1248.2
实施例10
合成7mGppp(锁)Ap(锁)ApG(GL-Cap 1)
合成p(锁)Ap(锁)ApG
在1L瓶中，一起加入p(锁)Ap(锁)A G-PS(1.60g，来自GENERAL Biosystems(Anhui)and Corporation Limited)和30％氨水溶液(350mL)，加热至40℃并搅拌20h。然后冷却至室温。将所得的混合物滤过并用水洗涤。将粗产物浓缩并用250mL水稀释。将水相在150mL DEAE柱上纯化。合并产物馏分，浓缩，并冷冻干燥，其为白色固体(405mg,388μmol)。MS(m/z)：实测值1047[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):δ8.11(s,1H),7.92(s,1H),7.63(s,1H),7.62(s,1H),7.38(s,1H),5.86(s,1H),5.62(d,J＝4.56Hz,1H),5.52(s,1H),5.10(s,1H),4.50(d,J＝5.32Hz,1H),4.31-3.99(m,13H),3.14-3.08(q,19H),1.20(t,30H).31PNMR(162MHz,D2O)δ0.84(S,1P),-2.07(S,1P),-2.15(S,1P).
合成7mGppp(锁)Ap(锁)ApG(GL-Cap 1)
在5mL小瓶中，向7m-GDP-咪唑(35.5mg,67μmol)、p(锁)Ap(锁)ApG TEA(62.7mg,60μmol)和氯化锌(240mg,1.8mmol)的混合物中加入无水DMSO(2mL)，然后将整个混合物在35℃搅拌20h。在0℃将反应混合物加入至EDTA二钠(804mg,8.0mmol)在100.0mL水的溶液中。将所得的水溶液调节至pH 6.0并加载至DEAE Sephadex柱上。使用0-1M TEAB的线性梯度洗脱期望产物并收集含有产物的馏分，蒸发并浓缩得到27mg白色固体。将粗产物在HPLC上纯化得到铵盐(16mg,10.77μmol)。收率18.0％。MS(m/z)：实测值1486[M+H+].1H NMR(400MHz,D2O):δ9.00(s,1H),8.00(s 1H),7.96(s,1H),7.64(s,1H),7.62(s,1H),7.38(s,1H),5.62(s,1H),5.61-5.55(m,3H),5.02(s,1H),4.70-3.99(m,19H),3.97(s,3H),31P NMR(162MHz,D2O)δ-2.12(s,2P),-11.44(d,2P),-22.71(t,1P).
实施例11
合成7mGppp(2’-F)Ap(2’-F)ApG(GL-Cap 2)
合成p(2’-F)Ap(2’-F)ApG
在1L瓶中，一起加入p(2’F)Ap(2’F)AG-PS(1.60g，来自GENERAL Biosystems(Anhui)and Corporation Limited)和30％氨水溶液(350mL)，加热至40℃并搅拌20h。然后冷却至室温。将所得的混合物滤过并用水洗涤。将粗产物浓缩并用250mL水稀释。将水相在150mL DEAE柱上纯化。合并产物馏分，浓缩，并冷冻干燥，其为白色固体(253mg,247μmol)。MS(m/z)：实测值1027[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):δ8.31(s,1H),7.89(s,2H),7.66(s,1H),7.620(s,1H),6.09(d,J＝14.36Hz,1H),5.99(d,J＝15.8Hz,1H),5.60 -5.48(m,2H),5.26-5.13(m,1H),4.61(m,14H),3.14-3.08(q,22H),1.20(t,32H).31P NMR(162MHz,D2O):δ1.33(S,1P),-1.40(s,1P),-1.76(S,1P).
合成7mGppp(2’-F)Ap(2’-F)ApG(GL-Cap 2)
在5mL小瓶中，向7m-GDP-咪唑(29.5mg,55μmol)、p(2’-F)Ap(2’-F)ApG TEA(50.6mg,49.5μmol)和氯化锌(200mg,1.5mmol)的混合物中加入无水DMSO(2mL)，然后将整个混合物在35℃搅拌20h。在0℃将反应混合物加入至EDTA二钠(670mg,1.8mmol)在100.0mL水的溶液中。将所得的水溶液调节至pH 6.0并加载至DEAE Sephadex柱上。使用0-1M TEAB的线性梯度洗脱期望产物并收集含有产物的馏分，蒸发并浓缩得到26mg白色固体。将粗产物在HPLC上纯化得到铵盐(9.3mg,6.3μmol)。收率12.80％。MS(m/z)：实测值1468[M+H+],1HNMR(400MHz,D2O):δ9.01(s,0.59H),8.27(s,1H),8.02(s,1H),7.99(s,1H),7.80(s,1H),7.69(s,1H),6.04(dd,J＝15.6,2H),5.83(d,J＝3.64,1H),5.60(d,J＝5.88,1H),5.46-5.29(m,2H),4.70-3.97(m,22H),31P NMR(162MHz,D2O)δ-1.38(s,1P),-2.13(s,1P),-11.26(d,2P),-22.58(t,1P).
实施例12
合成7mGppp(2’-F)Ap(锁)ApG(GL-Cap 3)
合成p(2’-F)Ap(锁)ApG
在1L瓶中，一起加入p(2’F)Ap(锁)ApG-PS(1.60g，来自GENERAL Biosystems(Anhui)and Corporation Limited)和30％氨水溶液(350mL)，加热至40℃并搅拌20h。然后冷却至室温。将所得的混合物滤过并用水洗涤。将粗产物浓缩并用250mL水稀释。将水相在150mL DEAE柱上纯化。合并产物馏分，浓缩，并冷冻干燥，其为白色固体(236mg,228μmol)。MS(m/z)：实测值1037[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):δ8.28(s,1H),7.88(s,1H),7.64(s,1H),7.57(s,1H),6.17(d,13.8Hz,1H),5.79(s,1H),5.66(s,1H),5.62(d,J＝4.52Hz,1H),4.61(d,J＝5.16Hz,1H),4.48(d,J＝6.52Hz,1H),4.32-4.01(m,11H),3.14-3.08(q,17H),1.20(t,26H).31P NMR(162MHz,D2O):δ0.17(s,1P),-1.30(S,1P),-2.09(s,1P).
合成7mGppp(2’-F)Ap(锁)ApG(GL-Cap 3)
在5mL小瓶中，向7m-GDP-咪唑(48.3mg,87.5μmol)、p(2’-F)Ap(锁)ApG TEA(72.5mg,70μmol)和氯化锌(235mg,1.75mmol)的混合物中加入无水DMSO(2mL)，然后将整个混合物在35℃搅拌20h。在0℃将反应混合物加入至EDTA二钠(782mg,2.1mmol)在100.0mL水的溶液中。将所得的水溶液调节至pH 6.0并加载至DEAE Sephadex柱上。使用0-1M TEAB的线性梯度洗脱期望产物并收集含有产物的馏分，蒸发并浓缩得到24mg白色固体。将粗产物在HPLC上纯化得到铵盐(16mg,10.8μmol)。收率15.4％。MS(m/z)：实测值1477[M+H+]。1H NMR(400MHz,D2O):δ8.96(s,0.7H),8.33(s 1H),8.10(s,1H),7.79(s,1H),7.69(s,1H),7.65(s,1H),6.14(d,J＝13.32Hz,1H),5.74-5.68(m,3H),5.63(d,J＝5.68Hz,2H),4.70(s,2H),4.58(d,J＝5.48Hz,1H),4.50(d,J＝6.12Hz,1H),4.43-4.05(m,18H),3.90(s,3H),31P NMR(162MHz,D2O)δ-1.28(S,1P),-1.97(S,1P),-11.38(d,1P),-22.61(t,1P).
实施例13
合成7mGppp(锁)Ap(2’-F)ApG(GL-Cap 4)
合成p(锁)Ap(2’-F)ApG
在1L瓶中，一起加入p(锁)Ap(2’F)ApG-PS(1.60g，来自GENERAL Biosystems(Anhui)and Corporation Limited)和30％氨水溶液(350mL)，加热至40℃并搅拌20h。然后冷却至室温。将所得的混合物滤过并用水洗涤。将粗产物浓缩并用250mL水稀释。将水相在150mL DEAE柱上纯化。合并产物馏分，浓缩，并冷冻干燥，其为白色固体(265mg,256μmol)。MS(m/z)：实测值1037[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):δ8.13(s,1H),7.91(s,1H),7.85(s,1H),7.59(s,1H),7.58(s,1H),5.95(d,14.96Hz,1H),5.84(s,1H),5.55(d,J＝6.32Hz,1H),5.20-5.07(m,1H),5.06(d,J＝5.76Hz,1H),4.53(t,5.56Hz,1H),4.44-3.99(m,11H),3.14-3.08(q,17H),1.20(t,26H).31P NMR(162MHz,D2O):δ0.23(S,1P),-1.44(S,1P),-2.55(S,1P)
合成7mGppp(锁)Ap(2’-F)ApG(GL-Cap 4)
在5mL小瓶中，向7m-GDP-咪唑(45.5mg,82.5μmol)、p(锁)Ap(2’-F)ApG TEA(68.3mg,66μmol)和氯化锌(221mg,1.65mmol)的混合物中加入无水DMSO(2mL)，然后将整个混合物在35℃搅拌20h。在0℃将反应混合物加入至EDTA二钠(737mg,2.0mmol)在100.0mL水的溶液中。将所得的水溶液调节至pH 6.0并加载至DEAE Sephadex柱上。使用0-1M TEAB的线性梯度洗脱期望产物并收集含有产物的馏分，蒸发并浓缩得到34mg白色固体。将粗产物在HPLC上纯化得到铵盐(23mg,15.6μmol)。收率23％。MS(m/z)：实测值1477[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):δ9.03(s,0.58H),7.99(s 1H),7.90(s,1H),7.81(s,1H),7.56(s,1H),7.55(s,1H),5.93(d,J＝15.04Hz 1H),5.81(d,J＝4.28Hz 1H),5.55(d,J＝6.32Hz 1H),5.52(s,1H),5.17-5.04(m,1H),4.92(s,1H),4.70-4.01(m,23H),31P NMR(162MHz,D2O)δ-1.45(s,1P),-2.78(S,1P),-11.50(d,2P),-22.84(t,1P).
实施例14
合成7mGppp(锁)ApG(GL-Cap 5)
合成p(锁)ApG
在1L瓶中，一起加入p(锁)ApG-PS(2.0g，来自GENERAL Biosystems(Anhui)andCorporation Limited)和30％氨水溶液(350mL)，加热至40℃并搅拌20h。然后冷却至室温。将所得的混合物滤过并用水洗涤。将粗产物浓缩并用250mL水稀释。将水相在150mL DEAE柱上纯化。合并产物馏分，浓缩，并冷冻干燥，其为白色固体TEA盐(193mg,274μmol)。
MS(m/z)：实测值705[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):δ8.15(s,1H),7.92(s,1H),7.71(s,1H),5.92(s,1H),5.63(d,J＝4.4Hz,1H),4.95(s,1H),4.33-4.05(m,9H),3.14-3.00(q,16H),1.20(t,24H).31P NMR(162MHz,D2O)δ1.93(s,1P),2.29(S,1P).
合成7mGppp(锁)ApG(GL-Cap 5)
在5mL小瓶中，向7m-GDP-咪唑(140mg,228μmol)、p(锁)ApG TEA(160mg,227μmol)和氯化锌(915mg,6.84mmol)的混合物中加入无水DMSO(2mL)，然后将整个混合物在35℃搅拌20h。在0℃将反应混合物加入至EDTA二钠(3.0g,8.0mmol)在100.0mL水的溶液中。将所得的水溶液调节至pH 6.0并加载至DEAE Sephadex柱上。使用0-1M TEAB的线性梯度洗脱期望产物并收集含有产物的馏分，蒸发并浓缩得到106mg白色固体。将粗产物在HPLC上纯化得到铵盐(48.3mg,42μmol)。收率18.5％。MS(m/z)：实测值1144[M+H+].1H NMR(400MHz,D2O):δ9.05(s,1H),8.11(s,1H),8.01(s,1H),7.76(s,1H),5.80(d,J＝4.1Hz,1H),5.67(s,1H),5.62(d,J＝4.4Hz 1H),4.85(s,1H),4.70(m,2H),4.51-4.02(m,13H),4.00(s,3H).31P NMR(162MHz,D2O)δ-1.96(S,1P),-11.53(d,2P),-22.95(t,1P).
实施例15
合成7m-3’-MOEGppp(锁)ApG(GL-Cap 6)
在5mL小瓶中，向7m-2’-MOE-GDP TEA(20.7mg,40.1μmol)、p(锁)ApG-咪唑(32.0mg,40.1μmol)和氯化锌(164mg,1.2mmol)的混合物中加入无水DMSO(0.8mL)，然后将整个混合物在35℃搅拌20h。在0℃将反应混合物加入至EDTA二钠(580mg,1.6mmol)在100.0mL水的溶液中。将所得的水溶液调节至pH 6.0并加载至DEAE Sephadex柱上。使用0-1M TEAB的线性梯度洗脱期望产物并收集含有产物的馏分，蒸发并浓缩得到粗产物。将粗产物在HPLC上纯化得到铵盐(7.5mg,6μmol)。收率15％。MS(m/z)：实测值1203[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):δ8.99(s,1H),8.37(s 1H),7.90(s,1H),7.87(s,1H),7.66(s,1H),5.78(d,1H),5.60(m,2H),4.80(s,1H),4.54-4.14(m,17H),4.01(S,3H),3.7(m,2H),3.57(m,2H),3.32(s,3H),31P NMR(162MHz,D2O)δ-2.02(s,1P),-11.57(d,2P),-22.77(m,1P)
实施例16
合成7m-2’F-Gppp(锁)ApG(GL-Cap 7)
在5mL小瓶中，向7m-2’-F-GDP-咪唑(35mg,66μmol)、p(锁)ApG(60.0mg,85μmol)和氯化锌(228mg,1.7mmol)的混合物中加入无水DMSO(1.0mL)，然后将整个混合物在35℃搅拌20h。在0℃将反应混合物加入至EDTA二钠(830mg,2.1mmol)在100.0mL水的溶液中。将所得的水溶液调节至pH 6.0并加载至DEAE Sephadex柱上。使用0-1M TEAB的线性梯度洗脱期望产物并收集含有产物的馏分，蒸发并浓缩得到粗产物。将粗产物在HPLC上纯化得到铵盐(5μmol)。收率6％。MS(m/z)：实测值1147[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):8.03(s 1H),7.89(s,1H),7.68(s,1H),6.09(d,1H),5.68(s,1H),5.61(d,1H),5.32-5.19(m,1H),4.85(s,1H),4.57-4.00(m,17H),31P NMR(162MHz,D2O)δ-2.04(s,1P),-11.51(D,2P),-22.73(t,1P)
实施例17
合成7m-2-’MOE-Gppp(锁)ApG(GL-Cap 8)
在5mL小瓶中，向7m-2’-MOE-GDP-咪唑(43mg,76μmol)、p(锁)ApG(55mg,76μmol)和氯化锌(215mg,1.5mmol)的混合物中加入无水DMSO(1mL)，然后将整个混合物在35℃搅拌40h。在0℃将反应混合物加入至EDTA二钠(860mg,2.2mmol)在100.0mL水的溶液中。将所得的水溶液调节至pH 6.0并加载至DEAE Sephadex柱上。使用0-1M TEAB的线性梯度洗脱期望产物并收集含有产物的馏分，蒸发并浓缩得到粗产物。将粗产物在HPLC上纯化得到铵盐(4μmol)。收率5％。MS(m/z)：实测值1203[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):δ9.02(S,1H),8.16(s,1H),8.04(s 1H),7.80(s,1H),5.89(d,1H),5.76(s,1H),5.65(d,1H),4.86(s,1H),4.70-4.01(m,12H),4.61-4.57(m,2H),4.41-3.96(m,14H),31P NMR(162MHz,D2O)δ-1.32(S,1P),-11.50(d,2P),-22.74(t,1P).
实施例18
合成7m-3’-MOE-5’-RmGppp(2’-Ome)ApG(GL-Cap 9)
在4mL小瓶中，向7m-3’-MOE-5’-RmGDP-Im(25μmol)、pAmG-TEA(20μmol)和氯化锌(67mg,500μmol)的混合物中加入无水DMSO(500μL)，并将整个混合物在35℃搅拌24h。HPLC检测到～40％的转化，因此再搅拌额外的24h。将整个混合物用水(50mL)稀释，用结合的EDTA QuadraPure树脂(0.5g)处理，浓缩并经制备性-HPLC纯化。合并主峰的馏分，冻干两次，得到4.0μmol产物，其为铵盐。MS(m/z):实测值1219[M+H+],1H NMR(400MHz,D2O):δ9.27(S,1H),8.41(s 1H),8.19(s,1H),7.96(s,1H),6.05(d,1H),5.92(d,1H),5.85(d,1H),4.70-3.97(m,14H),4.08(S,3H),3.44(S,3H),3.30(S,3H),1.29(d,3H),31P NMR(162MHz,D2O)δ-1.12(S,1P),-11.30(d,2P),-21.31(t,1P).
实施例活性评估
试验例1
合成的5’-帽结构的体外活性的评价方法
合成的新的5’-帽结构经IVT掺入mRNA，然后评估在HeLa细胞中转染后的翻译效力。使用pGL-T7-hGLuc-30+70A(Kana-GGG-SAPI Plasmid Size:3704)将合成的新的5’-帽掺入到荧光素酶(Gluc)mRNA中。然后，将新的帽类似物的剂量反应与来自NEB的商购Cap0(m7G(5’)ppp(5’)G,cat no.S1404)进行比较。
简言之，使用High Yield T7 mRNA合成试剂盒将每个反应1μg GLuc(GGG质粒)模板进行体外转录。经共转录加入Cap0(NEB或其他类似物)。转录进行2小时，然后进行DNaseI处理15分钟。GTP与帽类似物的比例为1:4(2mM GTP,8mM帽)。预期mRNA长度:883/884nt。然后在DNase步骤后使用Monarch cleanup试剂盒将所述IVT mRNA纯化，使用Nanodrop对所述RNA进行定量，并将样品在2100生物分析仪上运行。还将约500ng mRNA在1％琼脂糖E-Gel(final volume 20μl)上运行以检查mRNA完整性。
使用2μl/ml Lipofectamine MessengerMax将样品(0.03至2μg/ml的剂量反应)以一式三份转染至HeLa细胞(10,000个细胞/0.1ml/96孔板)中以监测GLuc mRNA的功能(翻译)活性，在该mRNA中已经掺入不同的帽类似物24小时。未加帽的样品用作对照。监测培养上清液(20μl上清液+50μl底物，10分钟)中的Gluc蛋白水平。
代表性化合物的数据显示于图1-6中。这些数据表明化合物2、6和26具有比Cap0更高的活性和与ARCA相似的活性，而化合物11、12、13、27和50具有与Cap0相当或略低的活性。本公开中的头部和尾部核苷基团以及三磷酸接头修饰的排列和组合将允许新的和有效的5'-帽类似物。
试验例2
通过掺入合成的新的5’-帽结构制备mRNA
使用pGL-T7-AG-nUTR002-Fluc-HBB3UTR-30+70A BpiI(Kana-AGG-BpiI质粒大小：4856bp)将合成的新的5’-帽掺入到荧光素酶(Gluc)mRNA中。然后，将新的帽类似物的剂量响应与来自Trilink的市售帽类似物m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG(cat no.N-7113)进行比较。
简言之，使用High Yield T7 mRNA合成试剂盒(NEB,E2040S)将每个反应1μg GLuc(GGG质粒)模板进行体外转录。经共转录加入帽类似物。转录进行2小时，然后进行DNase I处理15分钟。NTP与帽类似物的比例为10:4(各10mM NTP，4Mm帽)。
预期mRNA长度:2008nt。然后使用DNA选择磁珠(Yeasen,12601ES56)将小规模的IVT mRNA纯化，使用POROSTMOligo(dT)25(Thermofisher,A47383)和Ultrafiltration use
Ultra-15(Merk,UFC910024)对大规模的IVT mRNA进行纯化，使用Nanodrop定量RNA，并在琼脂糖E-Gel上运行500ng的各个mRNA，在2100生物分析仪或CE(PA800)上运行mRNA以检查mRNA的完整性。HPLC用于检测纯度。DNAzyme PAGE用于检测加帽效率和polyA质量。大规模的mRNA增加了更多的QC(加帽/polyA尾部-LC-MS,Template DNA residual-qPCR,dsRNA-Elisa,pH)。
试验例3
体外评价合成的5’-帽结构
通过IVT将合成的新的5’-帽结构掺入到GL2288 mRNA中，然后评估转染后在HeLa细胞中的翻译效率。简言之，将HeLa细胞接种在96孔板(150000个细胞/0.1ml/孔)中。第二天(约80–90％汇合)，使用2μl/ml Lipofectamine MessengerMax(Thermo Scientific,cat#LMRNA015)或内部制备的脂质纳米颗粒(LNPs)，用100、25、6.25ng/ml的GL2288 mRNA样品转染细胞。将细胞再孵育24小时。为了监测GL2288mRNA的功能(翻译)活性，不同的5’-帽类似物已被掺入其中，通过使用对由GL2288 mRNA表达的蛋白特异的荧光团缀合抗体进行细胞内染色来评估蛋白表达。所有测定一式三份进行。使用双向ANOVA进行统计分析，然后进行未校正Fisher LSD多重比较检验。
代表性结果如图17和图18所示。如图17所示，CleanCap-GL2288 mRNA和GL-Cap7-GL2288 mRNA显示了类似的翻译效率，如靶蛋白的总细胞表达(a)以及通过记录为平均荧光强度的蛋白质表达水平(b)所示。如图18所示，在高剂量下，通过总蛋白表达水平评估，GL-Cap7-GL2288 mRNA的翻译效率显著高于CleanCap-GL2288。在中剂量和低剂量下，两种mRNA之间没有差异。
试验例4
评价合成的5’-帽结构
A.体外评价合成的5’-帽结构
如上所述，通过IVT将合成的新的5’-帽结构并入荧光素酶(Gluc)mRNA中，然后评估转染后HeLa细胞中的翻译效率。简言之，将HeLa细胞接种在96孔板(20000个细胞/0.1ml/孔)中。第二天(约80-90％融合)，使用2μl/ml Lipofectamine MessengerMax(ThermoScientific,cat#LMRNA015)或内部配制的脂质纳米粒(LNPs)，用25、50、100ng/孔的FlucmRNA样品转染细胞。将细胞再孵育24小时。为了监测已经掺入了不同5'帽类似物的FlucmRNA的功能(翻译)活性，通过向每个孔中加入60μl Bio-Lite荧光素酶测定系统(Vazyme,cat#DD1201-02)、在室温孵育板10分钟并使用多模平板读取器光度计测量发光，来评估Fluc蛋白的表达。对所有孔进行一式三份测定。使用双向ANOVA以及随后的未校正的Fisher's LSD进行统计分析。
B.体内评价合成的5’-帽结构
将7-8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分配到实验组，每组30只小鼠。每组设置6个实验条件：2个mRNA剂量(0.01、0.1mg/kg)和3个时间点6小时、24小时、48小时(5只小鼠/剂量/时间点)。进行单次肌肉内注射mRNA负载的LNP(注射体积40μl)。注射后6h、24h和48h，每组取5只动物/剂量进行体内组织和器官成像。将动物剃毛并腹腔注射200μL d-荧光素溶液(15mg/mL，DPBS中)d-荧光素，8分钟后使用异氟醚麻醉(5％诱导，2％纯氧维持)。在注射d-荧光素12分钟后，通过体内成像系统(IVIS)测量发射光。进行全身仰卧位和侧位成像。
全身成像后，对动物实施安乐死，并在实验1中收获腿部肌肉(注射部位)；在实验2中收获肌肉和肝脏。在注射d-荧光素后不到25分钟内通过IVIS测量组织/器官发射光。
接下来，通过均质化和Glo-裂解缓冲液1X(Abcam cat#ab6789)处理制备组织裂解液。将裂解液在4℃下以10000g离心15分钟，并将上清液用于总蛋白定量和荧光素酶活性评估。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(thermo Cat#23227)测定总蛋白浓度。然后，将50μl上清液与Bio-Lite荧光素酶测定系统(Vazyme DD1201-02)混合，并通过多模读板光度计测量发光。
代表性帽类似物的数据如图7-13所示。这些数据表明，在体外与对照Cleancap AG相比，如图7-9所示，帽GL-Cap5和GL-Cap7表现出更强的活性，而GL-Cap1、GL-Cap6和GL-Cap8表现出类似的至略强的活性，且GL-Cap2、GL-Cap3、GL-Cap4和GL-Cap9表现出稍弱的活性；在体内与Cleancap AG相比，如图10-13所示，GL-Cap5和GL-Cap7保持了显著更强的活性，而GL-Cap1和GL-Cap8表现出类似的活性。
试验例5
在C3肿瘤模型上评价合成的5’-帽结构
当C3肿瘤达到100mm3时，将我们的用CleanCap、GL-Cap5或GL-Cap1加帽的HPV E6/E7 mRNA序列(GL2281)(其中HPV E6/E7的编码序列为SEQ ID NO:2)以10μg/剂量立即进行肌肉内给药，其中第0天第一次给药，且第10天第二次给药。使用PBS和10μg CleanCap加帽的荧光素酶mRNA(FF荧光素酶)进行比较。
当C3肿瘤达到100mm3时，将我们的用CleanCap(CC)或GL-Cap7加帽的HPV E6/E7mRNA序列(GL2288)(其中HPV E6/E7的编码序列为SEQ ID NO:1)以不同剂量在第0天立即进行肌肉内给药。使用CleanCap加帽的荧光素酶mRNA(FF荧光素酶)进行比较。
如图14所示，所有三种加帽的GL2281 mRNA均显著抑制肿瘤生长(数据显示为平均值±SEM)。
如图15所示，所有加帽的GL2288 mRNA均显著抑制肿瘤生长(数据显示为平均值±SEM)，但在中剂量(0.05mg/Kg)，GL-Cap7加帽的mRNA相比于CC加帽的mRNA显示出更高的抗肿瘤效果。
试验例6
在MC38肿瘤模型上评价合成的5’-帽结构
一旦MC38肿瘤达到100mm3，将我们的GL-Cap9加帽的IL12 mRNA(GL-001)以0.3μg至10μg范围内的不同剂量在肿瘤内给药一次。使用最高剂量(10μg)的CleanCap加帽的荧光素酶mRNA和CleanCap加帽的Moderna IL12 mRNA(MD-001)作为比较。
如图16所示，所有剂量的GL-001均比MD-001更好地抑制肿瘤生长和提高存活率。具体地，最低剂量(0.3μg)的GL-001的效力足以将平均肿瘤体积(图16A)保持在250mm3以下并将第30天时存活率保持在70％。到第32天，所有给药10μg GL-001的小鼠均存活，与之相比，10μg MD-001给药组记录30％存活率(图16A中，数据显示为平均值±SEM，且在图16B中，数据表示为Kaplan-Meier曲线)。
试验例7
体内评价合成的5’-帽结构：GL2288 mRNA疫苗的免疫原性
将7-8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分配给实验组，每组5只。所有动物在第0天和第10天进行肌肉内疫苗接种：50μl PBS(作为对照组)、CleanCap-GL2288(3μg或10μg)或GL-Cap7-GL2288(3μg或10μg)。使用了两种LNP制剂，以下称为制剂1和制剂2。不同的组指定如下：CleanCap-GL2288-3μg-制剂1、CleanCap-GL2288-10μg-制剂1、GL-Cap7-GL2288-3μg-制剂1、GL-Cap7-GL2288-10μg-制剂1、CleanCap-GL2288-3μg-制剂2、CleanCap-GL2288-10μg-制剂2、GL-Cap7-GL2288-3μg-制剂2、GL-Cap7-GL2288-10μg-制剂2。
第二次注射后10天，处死动物并收集脾脏。按照标准方案，从脾脏制备单细胞悬浮液，并用于进行和INFγ酶联免疫斑点(ELISpot)测定。简言之，将100000个脾细胞接种到预先涂有抗小鼠INFγ抗体的ELISpot 96孔板中，并在37℃孵育过夜，其中不进行刺激或用跨越GL2288 mRNA表达的整个蛋白的肽库(15aa mers，11aa重叠)刺激。第二天，在去除细胞并洗涤板孔后，将生物素化细胞因子特异性检测抗体加入孔中2h。接着，洗涤孔并加入链霉亲和素酶缀合物以形成斑点。最后，添加比色底物，并在自动ELISpot读取器中对形成的斑点和底物的酶催化进行计数。结果表示为每百万个脾细胞的斑点形成单位(SFU)。
如图19所示，结果表明，在两种制剂以及两种方案(3μg和10μg)下，GL-Cap7-GL2288 mRNA与CleanCap-GL2288 mRNA相比均诱导更强的免疫应答，如通过以下评估：在小鼠脾细胞体外特异性刺激后的INFγELISpot测定(a)；和(b)ELISpot测定的代表性孔。
应当理解的是，虽然已经结合本公开的详细描述对其进行了描述，但是前述描述意在示例说明而不是限制由所附权利要求的范围限定的本公开的范围。其他方面、优势和修改也在以下权利要求的范围内。
Claims (22)
1.如下式(II)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：
其中：
环B1、B2、B3和B4各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；
每个R独立地选自H和C1-6烷基；
R1和R2各自独立地选自OR5和卤素；
每个R3独立地选自C1-6烷氧基、卤素和LNA；
每个R4独立地选自卤素和LNA；
每个R5独立地选自H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和/或C1-6烷氧基；和
n为选自0-1的整数。
2.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中环B1和B4各自独立地为鸟嘌呤(G)，且环B2和B3各自独立地为腺嘌呤(A)。
3.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中R独立地选自H和甲基。
4.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中R1和R2各自独立地选自OR5、F、Cl、Br和I，且每个R5独立地选自H和C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有C1-6烷氧基。
5.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中R1和R2各自独立地选自OH、-O(CH2)2OCH3和F。
6.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中R3独立地选自甲氧基、F和LNA。
7.权利要求1的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中R4独立地选自F和LNA。
8.如下式(IIA)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：
其中：
环B1、B2、B3和B4各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；和
R3和R4各自独立地选自卤素和LNA。
9.权利要求8的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中环B1和B4各自独立地为鸟嘌呤(G)，且环B2和B3各自独立地为腺嘌呤(A)。
10.权利要求8的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中R3和R4各自独立地选自F和LNA。
11.如下式(IIB)的化合物或其立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：
其中：
环B1、B2和B4各自独立地为核碱基或修饰的核碱基；
R1和R2各自独立地选自OR5和卤素；和
每个R5独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，其中所述C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基任选取代有一个或多个卤素、OH和C1-6烷氧基。
12.权利要求11的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中环B1和B4各自独立地为鸟嘌呤(G)，且环B2各自独立地为腺嘌呤(A)。
13.权利要求11的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中R1和R2各自独立地选自OR5、F、Cl、Br和I，且每个R5独立地选自H和C1-6烷基，其中所述C1-6烷基任选取代有C1-6烷氧基。
14.权利要求11的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，其中R1和R2各自独立地选自OH、-O(CH2)2OCH3和F。
15.选自以下任一的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐：
16.RNA分子，其5’端包含权利要求1-15中任一项的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐。
17.权利要求16的RNA分子，其为mRNA分子，且所述mRNA分子包含编码HPV E6-E7抗原多肽的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列)。
18.用于加帽RNA转录物的试剂盒，包括权利要求1-15中任一项的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐，和RNA聚合酶。
19.权利要求18的试剂盒，进一步包括RNA分子。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述RNA分子为mRNA分子，且所述mRNA分子包含编码HPVE6-E7抗原多肽的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列)。
21.加帽RNA转录物的方法，其使用权利要求1-15中任一项的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐。
22.表达蛋白的方法，包括使用权利要求1-15中任一项的化合物、立体异构体、互变异构体、氘代物或盐翻译加帽的RNA转录物。
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