CN102344477A - 一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种式(1)所示的核苷酸和/或寡核苷酸及其液相合成方法。本发明提供的液相合成制备核苷酸和/或寡核苷酸的方法，包括了一种核苷酸和/或寡核苷酸保护基组合方法，通过在2’-羟基被位阻型硅烷结构的基团保护的前提下，用β-氰乙基直接保护核苷酸和/或寡核苷酸的3’磷酸基团，并在脱去β-氰乙基后能够直接参与下一轮的合成，合成反应在反应瓶或反应釜中进行，不受固相载体或合成仪的限制，可实现大规模制备寡核苷酸。
式(1)
Description
技术领域
本发明涉及一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法。
背景技术
化学合成寡核苷酸是指通过促使核苷酸单体间形成5’-3’磷酸二酯键，从而将多个核苷酸单元连接为寡核苷酸链的过程，其中涉及保护的核苷酸的合成。
目前通用的寡核苷酸合成方法采用的是固相合成法，首先将核苷酸上的5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护，碱基上的氨基用苯甲酰基保护，3’-OH用氨基亚磷酸化合物进行活化。将第一个核苷酸的3’-OH与固相树脂结合在一起，并脱去5’-OH上的保护基，使裸露的5’-OH与第二个核苷酸的用氨基亚磷酸化合物进行活化的3’-OH之间形成一个亚磷酸三酯，亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯，再加入三氯乙酸除去第二个核苷酸的5’-OH上的保护基。至此，寡核苷酸链已经延伸了一个核苷酸单元，并可投入下一轮延伸反应。经过若干轮的延伸反应，整个寡核苷酸片段合成完毕之后，用浓氢氧化铵将寡核苷酸片段从固相树脂上洗脱下来，经过脱保护和纯化得到寡核苷酸。
上述固相合成法的优点在于：1)自动化，合成反应全部由合成仪自动完成；2)合成周期短；3)产率高，单步的缩合反应一般产率大于98％。但是固相合成法也存在一些缺点：1)合成规模小，目前较大规模的固相合成规模一般不超过100微摩尔，远远满足不了用于药物原料的要求；2)难于达到高纯度，由于合成方法的限制，得到的寡核苷酸不可避免的含有碱基数N-1，N-2等非目标的寡核苷酸片段，这对于药物应用是十分不利的；3)浪 费严重，为充分反应，每个合成循环中，往往需加入数倍于反应实际消耗量的亚磷酰胺单体以达到过量，且循环结束后需使用大量有机溶剂作为冲洗溶剂，洗去未反应的亚磷酰胺单体，4)成本高，反应所需的固相载体和亚磷酰胺单体价格昂贵，使合成的寡核苷酸成本高昂。
因为寡核苷酸在生命活动中的重要功能和目前核酸研究技术的高速发展，尤其是RNA干扰技术的发展及其潜在的临床应用价值，大规模寡核苷酸的合成意义十分重大。
发明内容
本发明的目的是为了克服目前的寡核苷酸合成方法的合成规模小、成本高等缺点，提供一种能够大规模合成寡核苷酸的方法。
本发明提供了一种式(1)所示的核苷酸和/或寡核苷酸：
式(1)
其中，R为氢或R1，R1表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；
n为1-100的整数；
B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复 单元中的B相同或不同；
R2表示位阻型硅烷结构的基团；
R3表示卤素原子、硝基或甲氧基。
其中，所述位阻型硅烷结构的基团可以为叔丁基二甲基氯硅甲烷基、苯基二甲基氯硅甲烷基、叔丁基二苯基氯硅甲烷基或三异丙基氯硅甲烷基。
其中，所述酰基可以为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；卤素原子可以为氯或溴。
本发明提供的式(1)的化合物中，当R为H时，式(1)与如下所述的x大于等于1时的式(2)等价；当R为R1时，式(1)与如下所述的式(4)等价。
本发明还提供了一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的化合物与式(3)的化合物在第一液态反应介质中接触，得到式(4)的化合物；
式(2)
式(3)
式(4)
其中，
x为0-50的整数；y为1-50的整数；
B1和B2各自表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B1或B2相同或不同；
R1、R2和R3的定义如式(1)中所述；
A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。
本发明提供的方法得到的脱去保护基的寡核苷酸，可以具有生物活性，可以用于各种寡核苷酸的用途，例如RNA干扰。
本发明提供的液相合成制备核苷酸和/或寡核苷酸的方法，包括了一种核苷酸和/或寡核苷酸保护基组合方法，通过在2’-羟基被位阻型硅烷结构的基团保护的前提下，用β-氰乙基直接保护核苷酸和/或寡核苷酸的3’磷酸基团，而不使用固相载体，使得式(4)化合物在脱去β-氰乙基后能够直接参与下一轮的合成，且合成产物与固相合成法脱保护程序一致，纯度更高。
本发明由于在液相中进行反应，不需要使用固相载体，又由于底物不需数倍过量，节省了原料，降低了成本。本发明采用保护的核苷酸和/或寡核苷 酸盐作为原料，合成反应在反应瓶或反应釜中进行，不受固相载体或合成仪的限制，可实现大规模制备核苷酸和/或寡核苷酸。
附图说明
图1为实施例1得到的脱保护的二十一聚体核糖核酸CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU的质谱分析图。
图2为实施例1得到的脱保护的二十一聚体核糖核酸CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU与同序列的固相合成法产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图。
图3为实施例3的RNA干扰实验结果图。
图4为实施例1的合成策略示意图。
图5为实施例2的合成策略示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种式(1)所示的核苷酸和/或寡核苷酸：
式(1)
其中，
R为氢或R1，R1表示保护基团，可以为各种能够保护5’-羟基的基团，优选为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；
n理论上可以为任意正整数，优选为1-100的整数，更优选为1-50的整数，更进一步优选为1-30的整数；
B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B可以相同或不同；
R2表示位阻型硅烷结构的基团；
R3表示苯环上的取代基，优选为卤素原子、硝基或甲氧基，且各个重复单元中的R3可以相同或不同，其中R3在苯环上的位置没有限制，可以为邻位、间位或对位。
其中n＝1时，上述式(1)表示的是核苷酸，n为大于1的整数时，上述式(1)表示的是寡核苷酸。
在式(1)中，所述的位阻型硅烷结构的基团可以为各种具有位阻和保护功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基氯硅甲烷基、苯基二甲基氯硅甲烷基、叔丁基二苯基氯硅甲烷基或三异丙基氯硅甲烷基，更优选为叔丁基二甲基氯硅甲烷基，且各个重复单元中的R2可以相同或不同。
在式(1)中，作为保护基的各个所述酰基可以相同或不同，各自可以为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。
在式(1)中，所述的卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。
本发明提供的式(1)的化合物中，当R为H时，式(1)与如下所述的x大于等于1时的式(2)等价；当R为R1时，式(1)与如下所述的式(4)等价，而且，当R为R1时，式(1)与如下所述的式(6)等价。
本发明还提供了一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的化合物与式(3)的化合物在第一液态反应介质中接触，得到式(4)的化合物；
式(2)
式(3)
式(4)
其中，
x理论上可以为任意非负整数，优选为0-50的整数，更优选为0-25的整数，更进一步优选为0-15的整数；y理论上可以为任意正整数，优选为 1-50的整数，更优选为1-25的整数，更进一步优选为1-15的整数；
B1和B2各自表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B1或B2可以相同或不同；所述酰基的定义如式(1)中所述；
R1、R2和R3的定义如式(1)中所述；
A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子；所述的三烷基铵离子或二烷基铵离子中的各个烷基可以相同或不同，可以各自具有1-6个碳原子，优选具有1-4个碳原子。
所述缩合反应所使用的缩合剂以及缩合反应的条件是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限制，例如，可以使用1-均三甲苯磺酰三唑、1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑、1-均三甲苯磺酰四唑、1-均三异丙基苯磺酰三唑、1-均三异丙基甲苯磺酰(3-硝基)-三唑和1-均三异丙基磺酰四唑中的一种或多种作为缩合剂；可以使用吡啶、二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种作为所述第一液态反应介质；
所述缩合反应条件可以包括：相对于1摩尔的式(3)的化合物，在x等于0时，即式(2)的化合物为3-羟基丙腈时，式(2)的化合物的用量可以为1-5摩尔，优选可以为1.2-3摩尔，更优选可以为1.5-2摩尔；在x大于等于1时，式(2)的化合物的用量可以为0.3-1.25摩尔。
相对于1摩尔的式(3)的化合物，缩合剂的用量可以为2-20摩尔，优选可以为2-5摩尔。
相对于1摩尔的式(3)的化合物，第一液态反应介质的用量可以为2-50升，优选可以为2-30升。
反应温度可以为0-50℃，优选可以为20-40℃；反应时间可以为0.5-100小时，优选可以为1-10小时。
缩合反应完成之后，可以终止缩合反应，并分离出产物。所述终止缩合反应的方法以及分离出产物的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限制。
例如，所述终止缩合反应的方法，可以为在0-15℃下，将反应溶液与水混合5-30分钟，相对于1升的第一液态反应介质，水的用量可以为0.05-0.2升。
所述终止缩合反应的方法，也可以为将反应溶液与饱和碳酸氢钠溶液混合，在0-50℃下，在搅拌条件下保持5-10分钟。饱和碳酸氢钠溶液与所述第一液态反应介质的体积比可以为0.05-0.2∶1。
所述分离的方法，在需要将式(4)的化合物进行如下所述的置换反应时，可以包括：将终止反应后的反应溶液旋转蒸除溶剂，再溶于有机溶剂，用酸调节pH值到3-5，用水洗涤一次或多次，相对于1升的第一液态反应介质，有机溶剂的用量为2-20升，洗涤用的水的用量为2-20升，用无水硫酸钠干燥有机相后，再次旋转蒸除溶剂，常压柱分离即得产物。所述的有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种，所述的酸可以是浓度为1-10重量％的草酸和/或醋酸。
所述分离的方法，在需要将式(4)的化合物进行如下所述的水解反应或脱去全部保护基时，可以包括将终止反应后的反应溶液旋转蒸除溶剂后与有机溶剂混合，加入饱和碳酸氢钠溶液进行洗涤，将有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。所述有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种。所述有机溶剂与所述第一液态反应介质的体积比可以为2-20∶1。所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的饱和碳酸氢钠溶液的总体积与所述第一液态反应介质的体积比可以为2-20∶1。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
因此，根据本发明的第一种实施方式，本发明所提供的液相合成核苷酸 和/或寡核苷酸的方法，还可以包括在第二液态反应介质中，在三烷基胺或二烷基胺存在下，在水解反应的条件下，将式(4)的化合物与水接触发生水解反应，脱去β-氰乙基，得到脱去β-氰乙基的水解后的产物。
其中，所述水解反应的条件可以包括：相对于1摩尔的式(4)的化合物，三烷基胺或二烷基胺的用量可以为1-200摩尔，优选为40-150摩尔；第二液态反应介质的用量可以为5-50升，优选为5-40升；水的用量可以为2-20升，优选为2-15升；反应温度可以为0-50℃，优选为10-35℃；反应时间可以为0.25-2小时，优选为0.25-1小时。
其中，所述的第二液态反应介质优选为吡啶和/或乙腈。
所述的三烷基胺或二烷基胺中的各个烷基相同或不同，并且各自具有1-6个碳原子。例如，所述三烷基胺可以为三甲胺、三乙胺和二异丙基乙基胺中的一种或多种，所述二烷基胺可以为二甲胺、二乙胺和二异丙基胺中的一种或多种。
所述水解反应完成之后，可以分离出水解反应后的产物。分离出水解反应后的产物的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限制，例如，该分离方法可以包括：将反应液旋转蒸除溶剂，再用有机溶剂溶解，加入洗涤溶液进行洗涤，分液得到有机相，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去溶剂，即可得到产物。所述有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或多种，所述有机溶剂与所述第二液态反应介质的体积比可以为1-10∶1。所述的洗涤溶液可以为0.1-1摩尔/升浓度的三乙胺碳酸氢盐(TEAB)水溶液或饱和碳酸氢钠溶液。所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的TEAB水溶液的总体积与所述第二液态反应介质的体积比可以为1-10∶1。
然后，可以将分离出的所述水解后的产物作为所述式(3)的化合物，与所述式(2)的化合物再次进行如前所述的缩合反应。
根据本发明的第二种实施方式，本发明所提供的液相合成核苷酸和/或 寡核苷酸的方法，还可以包括在第三液态反应介质中，在有机酸存在下，在置换反应条件下，将式(4)的化合物的R1基团置换为氢，得到R1基团被置换为氢的产物。
其中，所述的置换反应条件可以为：相对于1摩尔的式(4)的化合物，有机酸的使用量可以为2-20摩尔，优选为2-10摩尔；第三液态反应介质的用量可以为10-150升，优选为10-130升；反应温度可以为-10℃至40℃，优选为-10℃至30℃；反应时间可以为1-60分钟，优选为1-20分钟；所述有机酸优选选自甲苯磺酸、苯磺酸、三氯乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸中的一种或多种；所述的第三液态反应介质可以为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和甲醇中的一种或多种。
其中，所述的置换反应完成之后，可以分离出R1基团被置换为氢的产物。分离出R1基团被置换为氢的产物的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限制，例如，该分离纯化的方法可以包括用碱溶液中和置换反应所得的混合物，分液得到有机相，再用碱溶液洗涤一次到多次，将有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到纯化的置换反应后的产物。相对于1升的第三液态反应介质，洗涤用的碱溶液用量可以为0.2-1升，所述的碱溶液可以为饱和的碳酸氢钠水溶液、饱和的碳酸氢钾水溶液或饱和的碳酸钠溶液。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
然后，可以将分离出的R1基团被置换为氢后的产物作为所述式(2)的化合物，与所述式(3)的化合物再次进行如前所述的缩合反应。
当x大于等于1时，式(2)的化合物可以通过将式(6)的化合物的R1基团置换为氢而得到；
式(6)
其中，x、B1、R2、R3的定义如式(2)中所述，但x大于等于1；R1的定义如式(3)中所述。
所述的将式(6)的化合物的R1基团置换为氢的方法，按照将式(4)的化合物的R1基团置换为氢的方法进行，不同的是用式(6)的化合物代替式(4)的化合物。
所述式(6)的化合物的制备方法包括：将式(5)的化合物作为式(3)的化合物，与x等于0时的式(2)的化合物，即3-羟基丙腈，进行如前所述的缩合反应。
式(5)
其中，x、B1、R2和R3的定义如式(2)中所述，但x大于等于1；R1和A+的定义如式(3)中所述。
当式(3)中的y与式(5)中的x相等时，式(3)等价于式(5)。
所述的式(3)的化合物和/或式(5)的化合物的制备方法，已在公开文件PCT/CN2009/074101中有详细记载，在此不再赘述。
对于长片段的小核酸，本发明提供了模块化的合成策略，例如对于21聚的核酸链，将其拆分成4个并行的5-6聚的片段，5-6聚短片段再拆分成并行的更多的2-3聚短片段。经过合成所述的2聚短片段，然后可以合成所述的3聚到n聚(n为目的长度)的寡核酸链。因此，理论上，采用本发明提供的方法可以合成任意长度的寡核酸链，以下实施例仅以最长为42聚体为例对本发明进行说明。
通过本发明所提供的方法，可以合成具有式(4)的全保护的核苷酸和/或寡核苷酸。所述全保护的核苷酸和/或寡核苷酸的全部保护基团包括：式(4)中的酰基、β-氰乙基和式(7)的基团、R1、R2，
式(7)
其中R3的定义与式(4)相同。
可以分2步将所述全保护的核苷酸和/或寡核苷酸脱去所述的全部保护基团：
第1步，将式(4)化合物在第四液态反应介质中，在第一脱保护反应条件下，与氨水接触，脱去部分类别的保护基团，得到脱去部分类别的保护基团的产物；所述的部分类别的保护基团为式(4)中的酰基、β-氰乙基和式(7)的基团中的一种或多种。
其中，所述的第四液态反应介质可以为二氧六环、乙腈、吡啶、乙醇和甲醇中的一种或多种；所述的第一脱保护反应条件包括，相对于1克的式(4)的化合物，氨水的用量可以为0.02-0.5L，优选为0.05-0.3L；第四液态反应介质的用量可以为0.01-0.2L，优选为0.02-0.1升；反应温度可以为10-60℃，优选为10-30℃；反应时间可以为5-100小时，优选为10-60小时；其中所述 氨水的浓度为25-28质量％。第一脱保护反应完成后，可以通过减压浓缩，除去溶剂至完全干燥，得到的固体即为脱去部分类别的保护基团的产物。
第2步，在第五液态反应介质中，在第二脱保护反应条件下，将所述脱去部分类别的保护基团的产物与三乙胺三氢氟酸(TEA·3HF)接触，脱去剩余类别的保护基，得到脱去全部保护基团的产物；所述剩余类别的保护基为R1和R2，其中R1和R2的定义与式(4)相同。
其中，所述的第五液态反应介质为二甲基亚砜；所述的第二脱保护反应条件包括：相对于1克的脱去部分保护基团的产物，三乙胺三氢氟酸的用量为0.002-0.05L，优选为0.005-0.03L；第五液态反应介质的用量为0.002-0.05L，优选为0.005-0.03L；反应温度为40-85℃，优选为50-75℃；反应时间为1-5小时，优选为2-4小时。
所述脱保护反应完成之后，可以分离出脱保护反应后的产物。分离出脱保护反应后的产物的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限制，例如，分离的方法可以为：向反应液中加入预冷的正丁醇，沉淀核苷酸和/或寡核苷酸，离心收集沉淀，得到核苷酸和/或寡核苷酸粗品。
可以对得到的核苷酸和/或寡核苷酸粗品进行纯化，纯化核苷酸和/或寡核苷酸粗品的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限制，例如，纯化的方法可以为：将核苷酸和/或寡核苷酸粗品上样于反相十八烷基硅烷键合硅胶填料(ODS)色谱，收集流出液，然后将流出液冷冻干燥，得到目标产物。
本发明提供的方法得到的脱去保护基的寡核苷酸，具有生物活性，可以用于各种寡核苷酸的用途，例如RNA干扰。
在本发明中所使用的气体和液体体积均指1个标准大气压下、20℃时的体积。
下面通过实施例更详细地描述本发明，但本发明的范围不限于实施例中 的举例。
实施例中所用到的原料的获取方式如下：
四种保护的核糖核苷酸，包括腺嘌呤核糖核苷酸(A)、尿嘧啶核糖核苷酸(U)、胞嘧啶核糖核苷酸(C)、鸟嘌呤核糖核苷酸(G)；其中以苯甲酰基保护碱基的环外氨基，以叔丁基二甲基硅甲烷基保护2’羟基，以二对甲氧三苯甲基保护的5’羟基；全部四种保护的核苷酸均购自上海吉玛制药技术有限公司。
三乙胺：购自天津市北方天医化学试剂厂；
1，2，4-三唑：购自Alfa Aesar；
2-氯苯基二氯代磷酸酯：购自Alfa Aesar；
1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑(MSNT)购自Sigma Aldrich。
实施例1
该实施例合成寡核苷酸。
合成目标：21聚的全保护寡核糖寡核苷酸
序列：DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OE
注：中括号内A、U、C、G四个字母表示四种保护的核糖核苷酸，其环外氨基已用苯甲酰基保护，2’位羟基已被叔丁基二甲基硅甲烷基保护，略去碱基之间的磷酸酯及磷酸苯酚酯保护基；
中括号左边的基团表示5’末端的保护基，为二对甲氧三苯甲基(DMTr)，中括号左边的基团也可以为羟基(HO)；
中括号右边的基团表示3’末端的磷酸丙腈酯保护基(OE)，中括号右边的基团也可以为磷酸盐(PO-)。
本实施例的合成按照如图4所示的合成策略分30个步骤完成。
(1)合成式(3)的化合物单体DMTr[A]PO-：
在1L圆底烧瓶中加入1，2，4-三唑(13.8g，200mmol)和无水吡啶(31.6g，400mmol)，用130ml二氯甲烷溶解，冰浴条件下滴加2-氯苯基二氯代磷酸酯(19.6g，80mmol)的二氯甲烷溶液65ml，搅拌反应0.5h，再滴加保护的腺嘌呤核糖核苷酸(39.4g，50mmol)的二氯甲烷溶液150ml，冰浴条件下搅拌反应2h后加入150ml浓度为1M的TEAB溶液，继续搅拌10分钟后，用1M浓度的TEAB溶液洗涤三次(每次90ml)后，全部有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸除去溶剂，得到产品54.0g，产率100％。产率是产物的重量与按保护的腺嘌呤核糖核苷酸计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱，得到数据为31PNMR(CDCl3，121M)δ-6.09，与五价磷酸二酯的31PNMR理论值范围相符(请见参考文献Tetrahedron，1980(36)，第3075-3085页)，证明该产物确实具有式(3)的结构。
用ESI-MS检测得到产物M-为976.2915，与目标产物的M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(2)合成式(3)的化合物单体DMTr[U]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护的尿嘧啶核 糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(3)合成式(3)的化合物单体DMTr[G]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护的鸟嘌呤核糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(4)合成式(3)的化合物单体DMTr[C]PO-
按照与步骤(1)相同的方法进行合成，不同的是，用保护的胞嘧啶核糖核苷酸代替保护的腺嘌呤核糖核苷酸。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(5)合成式(2)的化合物单体HO[A]OE：
在250ml圆底烧瓶中加入步骤(1)得到的DMTr[A]PO-(17.3g，16mmol)，无水吡啶(100ml)溶解后，加入3-羟基丙腈(1.70g，24mmol)，再加入MSNT(13.3g，44.8mmol)。20℃反应2h，薄层层析色谱(TLC)显示完全反应，加入水(10ml)终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于CH2Cl2(200ml)，加入适量5重量％的草酸水溶液调节pH值到3-4，分液得到有机相，再用水(100ml)洗一次，有机相无水Na2SO4干燥，再次旋蒸除去溶剂，加入2重量％的对甲苯磺酸(TsOH)的CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液(700ml)，0℃强烈搅拌5分钟，立即用饱和NaHCO3溶液中和，分液得到有机相，再用饱和NaHCO3溶液(300ml)洗一次，有机相用无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化得到产物10.9g，产率93.4％。产率是产物的重量与按DMTr[A]PO-计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱，得到数据为31PNMR(CDCl3，121M)δ-7.66，-7.79，与五价磷酸三酯的31PNMR理论值相符，证明该产物确实具有式(2) 的结构。
用ESI-MS检测得到该产物的M-为728.1956，与目标化合物的M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(6)合成式(2)的化合物单体HO[U]OE：
按照与步骤(5)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(2)得到的DMTr[U]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(7)合成式(2)的化合物单体HO[G]OE：
按照与步骤(5)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(8)合成式(2)的化合物单体HO[C]OE：
按照与步骤(5)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(4)得到的DMTr[C]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(9)合成式(4)的二聚体DMTr[AA]OE：
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(1)得到的DMTr[A]PO-(2.59g，2.40mmol)，步骤(5)得到的HO[A]OE(1.46g，2.00mmol)，10ml无水吡啶溶解后，加入MSNT(1.66g，5.60mmol)，室温反应2h，TLC显示完全反应，加入2ml饱和NaHCO3溶液终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于50ml的CH2Cl2中，饱和NaHCO3溶液洗涤2次(每次30ml)，有机相用无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化，得到产品3.26g。
检测该产物的31PNMR谱，得到数据为31PNMR(CDCl3，121M)8-7.36，-7.46，-7.55，-7.90，与含有2个五价磷酸三酯结构的31PNMR理论值相符， 证明该产物确实具有式(4)的结构。
用ESI-MS检测得到该产物的M-为1687.64，与目标化合物的M-理论值相符，证明该产物确实具有式(4)的结构。
(10)合成二聚体DMTr[AA]PO-：
将步骤(9)纯化出的DMTr[AA]OE溶于60ml吡啶/三乙胺/水(v∶v∶v＝3∶1∶1)，室温搅拌30分钟，TLC显示完全反应，将反应液旋蒸除去溶剂后再溶于100ml的CH2Cl2中，用浓度为1M的TEAB溶液洗涤三次(每次50ml)，分液得到有机相，无水Na2SO4干燥有机相后除去溶剂，得到产品3.20g，步骤(9)和步骤(10)反应总产率93.9％。产率是产物的重量与按HO[A]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(11)合成二聚体DMTr[GG]PO-：
按照与步骤(9)和步骤(10)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用步骤(7)得到的HO[G]OE代替步骤(5)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(12)合成二聚体DMTr[AC]PO-：
按照与步骤(9)和步骤(10)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(8)得到的HO[C]OE代替步骤(5)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(13)合成二聚体HO[AU]OE：
在500ml圆底烧瓶中加入步骤(1)得到的DMTr[A]PO-(16.2g，15mmol)，100ml无水吡啶溶解后，加入步骤(6)得到的HO[U]OE(7.53g，12.5mmol)，加入MSNT(10.4g，35mmol)，室温反应2h，TLC显示完全反应，加入10ml 水终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于300ml CH2Cl2，加入适量5％的草酸水溶液调节pH值到3-4，分液得到有机相，再用150ml水洗涤一次，无水Na2SO4干燥有机相，再次旋蒸除去溶剂，加入2重量％的甲苯磺酸(TsOH)的CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液(700ml)，0℃强烈搅拌5分钟，立即用饱和NaHCO3溶液中和，分液得到有机相，再用饱和NaHCO3溶液(300ml)洗一次，有机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化得产品12.9g。产率81.8％。产率是产物的重量与按HO[U]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(14)合成二聚体HO[CU]OE：
按照与步骤(13)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(4)得到的DMTr[C]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(15)合成二聚体HO[GA]OE：
按照与步骤(13)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用步骤(5)得到的HO[A]OE代替步骤(6)得到的HO[U]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(16)合成二聚体HO[UC]OE：
按照与步骤(13)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(2)得到的DMTr[U]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用步骤(8)得到的HO[C]OE代替步骤(6)得到的HO[U]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(17)合成二聚体HO[UU]OE：
按照与步骤(13)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(2)得到的DMTr[U]PO-代替步骤(1)得到的DMTr[A]PO-。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(18)合成三聚体DMTr[CCU]PO-：
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(4)得到的DMTr[C]PO-(3.17g，3.00mmol)，步骤(14)得到的HO[CU]OE(3.09g，2.50mmol)，20ml无水吡啶溶解后，加入MSNT(2.08g，7.00mmol)，室温反应2h，TLC显示完全反应，加入2ml饱和NaHCO3溶液终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于100mlCH2Cl2，用50ml饱和NaHCO3溶液洗涤，分液得到有机相，用无水Na2SO4干燥有机相后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化。经纯化的产品溶于60ml吡啶/三乙胺/水(v∶v∶v＝3∶1∶1)，室温搅拌30分钟，TLC显示完全反应后，将反应液旋蒸除去溶剂后，再溶于100mlCH2Cl2，1M浓度的TEAB溶液洗涤三次(每次50ml)，分出有机相，无水Na2SO4干燥后除去溶剂，得产品4.89g，产率88.5％。产率是产物的重量与按HO[CU]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(19)合成三聚体HO[UGA]OE：
在250ml圆底烧瓶中加入步骤(2)得到的DMTr[U]PO-(10.0g，10.5mmol)，步骤(15)得到的HO[GA]OE(12.0g，8.76mmol)，50ml无水吡啶溶解后，分3次加入MSNT(7.31g，24.5mmol)，室温反应2h，TLC显示完全反应，加入5ml水终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于200ml CH2Cl2，加入适量5％的草酸水溶液调节pH值到3-4，分出有机相，再用100ml水洗一次，无水Na2SO4干燥有机相，再次旋蒸除去容积，加入550ml 2％的TsOH的CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液，0℃强烈搅拌5分钟后，立即用饱和 NaHCO3溶液中和，分出有机相，再用200ml饱和NaHCO3溶液洗一次，有机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化。得到产品13.0g，产率78.0％。产率是产物的重量与按HO[GA]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(20)合成三聚体HO[CAU]OE：
按照与步骤(19)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(4)得到的DMTr[C]PO-代替步骤(2)得到的DMTr[U]PO-，用步骤(13)得到的HO[AU]OE代替步骤(15)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(21)合成三聚体HO[UUC]OE：
按照与步骤(19)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(16)得到的HO[UC]OE代替步骤(15)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(22)合成三聚体HO[AUU]OE：
按照与步骤(19)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(1)得到的DMTr[A]PO-代替步骤(2)得到的DMTr[U]PO-，用步骤(17)得到的HO[UU]OE代替步骤(15)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(23)合成六聚体DMTr[CCUUGA]PO-：
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(18)得到的DMTr[CCU]PO-(4.18g，1.89mmol)，步骤(19)得到的HO[UGA]OE(3.00g，1.58mmol)，10ml无 水吡啶溶解后，再加入MSNT(1.31g，4.42mmol)，室温反应3h，TLC显示完全反应后，加入2ml饱和NaHCO3溶液终止反应，旋蒸除去溶剂后柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化。将纯化后的产物溶于60ml吡啶/三乙胺/水(v∶v∶v＝3∶1∶1)，室温搅拌30分钟，TLC显示完全反应后，将反应液旋蒸除去溶剂后再溶于100ml CH2Cl2，1M浓度的TEAB溶液洗涤三次(每次50ml)，分出有机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，得产品5.00g，产率79.3％。产率是产物的重量与按HO[UGA]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(24)合成五聚体DMTr[ACUUC]PO-：
按照与步骤(23)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(12)得到的DMTr[AC]PO-代替步骤(18)得到的DMTr[CCU]PO-，用步骤(21)得到的HO[UUC]OE代替步骤(19)得到的HO[UGA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(25)合成五聚体HO[GGCAU]OE：
在250ml圆底烧瓶中加入步骤(11)得到的DMTr[GG]PO-(5.72g，3.36mmol)，步骤(20)得到的HO[CAU]OE(5.30g，2.80mmol)，15ml无水吡啶溶解后，加入MSNT(2.34g，7.84mmol)，室温反应2h，TLC显示完全反应，加入1.5ml水终止反应，旋蒸除去溶剂后重溶于100ml CH2Cl2，加入适量5％的草酸水溶液调节pH值到3-4，分出有机相，再用50ml水洗一次，无水Na2SO4干燥有机相，再次旋蒸除去容积，加入170ml 2％的TsOH的CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液，0℃强烈搅拌5分钟后，立即用饱和NaHCO3溶液中和，分出有机相，再用80ml饱和NaHCO3溶液洗一次，有机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶ v＝10∶1))纯化。得到产品5.3g，产率59.6％。产率是产物的重量与按HO[CAU]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(26)合成五聚体HO[AAAUU]OE：
按照与步骤(25)相同的方法进行合成，不同的是，用步骤(10)得到的DMTr[AA]PO-代替步骤(11)得到的DMTr[GG]PO-，用步骤(22)得到的HO[UUC]OE代替步骤(20)得到的HO[CAU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(27)合成十一聚体DMTr[CCUUGAGGCAU]PO-：
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(23)得到的DMTr[CCUUGA]PO-(4.86g，1.20mmol)，步骤(25)得到的HO[GGCAU]OE(3.18g，1.0mmol)，10ml无水吡啶溶解后，再加入MSNT(0.83g，2.80mmol)，室温反应4h，TLC显示完全反应，加入1ml饱和NaHCO3溶液终止反应，加入100mlCH2Cl2，再用50ml饱和NaHCO3溶液洗一次，再用50ml水洗一次，无水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化，纯化产品溶于40ml吡啶/三乙胺/水(v∶v∶v＝3∶1∶1)，室温搅拌30分钟，TLC显示完全反应，将反应液旋蒸除去溶剂后再溶于100mlCH2Cl2，1M浓度的TEAB溶液洗涤三次(每次50ml)，分出有机相，无水Na2SO4干燥有机相，除去溶剂，得产品2.89g，产率42.7％。产率是产物的重量与按HO[GGCAU]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(28)合成十聚体HO[ACUUCAAAUU]OE
在100ml圆底烧瓶中加入步骤(24)得到的DMTr[ACUUC]PO-(4.86g， 1.43mmol)，步骤(26)得到的HO[AAAUU]OE(3.70g，1.19mmol)，10ml无水吡啶溶解后，再加入MSNT(0.99g，3.33mmol)，室温反应4h，TLC显示完全反应，加入1ml饱和NaHCO3溶液终止反应，加入100ml CH2Cl2，再用50ml饱和NaHCO3溶液洗一次，再用50ml水洗一次，无水Na2SO4干燥有机相，旋蒸除去溶剂，过柱分离，得到的产品加入150ml 2％的TsOH的CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液，0℃强烈搅拌10分钟，立即用饱和NaHCO3溶液中和，分出有机相，再用50ml饱和NaHCO3溶液洗一次，有机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化得产品4.6g。产率63.5％。产率是产物的重量与按HO[AAAUU]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(29)合成二十一聚体DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OE：
在50ml圆底烧瓶中加入步骤(27)得到的DMTr[CCUUGAGGCAU]PO-(2.80g，0.39mmol)，步骤(28)得到的HO[ACUUCAAAUU]OE(2.17g，0.36mmol)，10ml无水吡啶溶解后，再加入MSNT(321mg，1.08mmol)，室温反应10h，加入1ml饱和NaHCO3溶液终止反应，加入100ml CH2Cl2，用50ml的饱和NaHCO3溶液洗一次，再用50ml水洗一次，无水Na2SO4干燥有机相，旋蒸除去溶剂，柱层析(淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化，得到产物2.48g，产率50.1％。产率是产物的重量与按HO[ACUUCAAAUU]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(4)的结构。
至此，用液相法合成得到了全保护的二十一聚体核糖核酸DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OE。
(30)脱保护：
将10mg步骤(29)得到的全保护的二十一聚体核糖核酸DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OE溶于0.5ml的二氧六环中，再加入1ml 25质量％浓度的氨水，振荡混匀，室温放置40h。反应完成后，减压浓缩，除去溶剂至完全干燥。将残余的固体重溶于100μl二甲基亚砜，再加入125μl三乙胺三氢氟酸(TEA·3HF)，混匀后，加热至65℃，反应2.5h后，加入1ml预冷至-20℃的正丁醇，沉淀寡核苷酸，离心收集沉淀，得到3mg粗品。经过反相ODS柱色谱精制纯化，具体的操作步骤参照文献(分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社2002年9月出版)进行，然后冷冻干燥，得到1.6mg目标产物。
用岛津AXIMA-CFR plus型MALDI-TOF质谱分析步骤(30)得到的目标产物的质量，得到如图1所示的质谱图。
质谱分析结果显示：步骤(30)得到的寡核糖核酸具有m/z为6701.97和3351.22的两个主峰，分别为该寡核糖核酸的单电荷峰和双电荷峰，与其理论电荷峰(m/z为6702和3351)一致，而且质谱图中无其它杂峰。因此，质谱分析结果表明：步骤(30)得到的寡核糖核酸质量正确，并且具有较高的纯度。
分别取300ng的步骤(30)产物和300ng的用ABI3900型RNA固相合成仪合成的，具有目标序列(5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU-3’)的固相合成产物(购自上海吉玛制药技术有限公司)，及两者等量混合的样品300ng进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测。胶图检测结果如图2所示。电泳结果显示：两种不同方法合成出的同一序列的寡核糖核苷酸，在胶图上条带位置相同，且将两个样品混合后的条带位置仍然相同，而且无明显杂带。证明两种不同方法合成出的同一目标序列的寡核糖核苷酸具有相同的电泳迁移率。
通过小RNA克隆测序技术(参考文献Bartel，D.P.，(2004)，细胞，第 116期，281页)，利用TaKaRa公司的小RNA克隆试剂盒(产品号：DRR065)克隆步骤(30)的产物的寡核苷酸，具体操作步骤参照该试剂盒说明书进行，克隆成功后，送至Invitrogen公司测定碱基序列，具体步骤参照文献(Poth，M.J等，(1985)，生物化学杂志，第260期，9326页)进行。
克隆测序结果如下：5’-CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU-3’，证明步骤(30)的产物的碱基序列确实为目标序列。
实施例2
该实施例合成脱保护的，并且具有目标序列为5’-UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU-3’的寡核苷酸。该目标序列与实施例1的产物的碱基序列互为部分反向互补序列。
本实施例的合成按照如图5所示的合成策略分19个步骤完成。
(1)合成具有式(2)的二聚体HO[AA]OE：
按照与实施例1中的步骤(13)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例1中的步骤(5)得到的HO[A]OE代替实施例1中的步骤(6)得到的 HO[U]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(2)合成二聚体DMTr[GU]PO-：
按照与实施例1中的步骤(9)和步骤(10)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例1中的步骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替实施例1中的步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用实施例1中的步骤(6)得到的HO[U]OE代替实施例1中的步骤(5)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(3)合成二聚体DMTr[AU]PO-：
按照与实施例1中的步骤(9)和步骤(10)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例1中的步骤(6)得到的HO[U]OE代替实施例1中的步骤(5)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(4)合成二聚体DMTr[CC]PO-：
按照与实施例1中的步骤(9)和步骤(10)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例1中的步骤(4)得到的DMTr[C]PO-代替实施例1中的步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用实施例1中的步骤(8)得到的HO[C]OE代替实施例1中的步骤(5)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(5)合成二聚体DMTr[UC]PO-：
按照与实施例1中的步骤(9)和步骤(10)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例1中的步骤(2)得到的DMTr[U]PO-代替实施例1中的步骤(1)得到的DMTr[A]PO-，用实施例1中的步骤(8)得到的HO[C]OE代替实施例1中的步骤(5)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(6)合成二聚体DMTr[AG]PO-：
按照与实施例1中的步骤(9)和步骤(10)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例1中的步骤(7)得到的HO[G]OE代替实施例1中的步骤(5)得到的HO[A]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(7)合成三聚体DMTr[UUU]PO-：
按照与实施例1中的步骤(18)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例1中的步骤(6)得到的DMTr[U]PO-代替实施例1中的步骤(4)得到的DMTr[C]PO-，用实施例1中的步骤(17)得到的HO[UU]OE代替实施例1中的步骤(14)得到的HO[CU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(8)合成三聚体HO[GAA]OE：
按照与实施例1中的步骤(19)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例1中的步骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替实施例1中的步骤(2)得到的DMTr[U]PO-，用实施例2中的步骤(1)得到的HO[AA]OE代替实施例1中的步骤(15)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(9)合成三聚体HO[AUG]OE：
按照与实施例1中的步骤(19)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例2中的步骤(3)得到的DMTr[AU]PO-代替实施例1中的步骤(2)得到的DMTr[U]PO-，用实施例1中的步骤(7)得到的HO[G]OE代替实施例1中的步骤(15)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(10)合成三聚体HO[UCA]OE：
按照与实施例1中的步骤(19)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例2中的步骤(5)得到的DMTr[UC]PO-代替实施例1中的步骤(2)得到的DMTr[U]PO-，用实施例1中的步骤(5)得到的HO[A]OE代替实施例1中的步骤(15)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(11)合成三聚体HO[GUU]OE：
按照与实施例1中的步骤(19)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例1中的步骤(3)得到的DMTr[G]PO-代替实施例1中的步骤(2)得到的DMTr[U]PO-，用实施例1中的步骤(17)得到的HO[UU]OE代替实施例1中的步骤(15)得到的HO[GA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(12)合成六聚体DMTr[UUUGAA]PO-：
按照与实施例1中的步骤(23)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例2中的步骤(7)得到的DMTr[UUU]PO-代替实施例1中的步骤(18)得到的DMTr[CCU]PO-，用实施例2中的步骤(8)得到的HO[GAA]OE代替实施例1中的步骤(19)得到的HO[UGA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(13)合成五聚体HO[GUAUG]OE：
按照与实施例1中的步骤(25)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例2中的步骤(2)得到的DMTr[GU]PO-代替实施例1中的步骤(11)得到的DMTr[GG]PO-，用实施例2中的步骤(9)得到的HO[AUG]OE代替实 施例1中的步骤(20)得到的HO[CAU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(14)合成五聚体DMTr[CCUCA]PO-：
按照与实施例1中的步骤(23)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例2中的步骤(4)得到的DMTr[CC]PO-代替实施例1中的步骤(18)得到的DMTr[CCU]PO-，用实施例2中的步骤(10)得到的HO[UCA]OE代替实施例1中的步骤(19)得到的HO[UGA]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(15)合成五聚体HO[AGGUU]OE：
按照与实施例1中的步骤(25)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例2中的步骤(6)得到的DMTr[AG]PO-代替实施例1中的步骤(11)得到的DMTr[GG]PO-，用实施例2中的步骤(11)得到的HO[GUU]OE代替实施例1中的步骤(20)得到的HO[CAU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(16)合成十一聚体DMTr[UUUGAAGUAUG]PO-：
按照与实施例1中的步骤(27)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例2中的步骤(12)得到的DMTr[UUUGAA]PO-代替实施例1中的步骤(23)得到的DMTr[CCUUGA]PO-，用实施例2中的步骤(13)得到的HO[GUAUG]OE代替实施例1中的步骤(25)得到的HO[GGCAU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(3)的结构。
(17)合成十聚体HO[ACUUCAAAUU]OE
按照与实施例1中的步骤(28)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例2中的步骤(14)得到的DMTr[CCUCA]PO-代替实施例1中的步骤(24)得到的DMTr[ACUUC]PO-，用实施例2中的步骤(15)得到的HO[AGGUU]OE 代替实施例1中的步骤(26)得到的HO[AAAUU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(2)的结构。
(18)合成二十一聚体DMTr[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE：
按照与实施例1中的步骤(29)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例2中的步骤(16)得到的DMTr[UUUGAAGUAUG]PO-代替实施例1中的步骤(27)得到的DMTr[CCUUGAGGCAU]PO-，用实施例2中的步骤(17)得到的HO[ACUUCAAAUU]OE代替实施例1中的步骤(28)得到的HO[ACUUCAAAUU]OE。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(4)的结构。
至此，用液相法合成得到了全保护的二十一聚体核糖核酸DMTr[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE。
(19)脱保护
按照实施例1中的步骤(30)相同的方法进行脱保护。不同的是，用实施例2中的步骤(18)得到的DMTr[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE代替实施例1中的步骤(29)得到的DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OE。
质谱分析、电泳结果和测序结果均支持步骤(19)的产物的碱基序列确实为目标序列。
实施例3
该实施例通过RNA干扰实验检测通过本发明提供的液相合成的方法得到的产物与固相合成法得到的同序列的产物的生物活性一致。
将实施例1和实施例2的产物等量(5nmol)混合，加热到75℃，维持10min，缓慢自然降温至室温，得到具有如下目标序列的双链siRNA。
已知序列为CCUUGAGGCAUACUUCAAA的小干扰RNA(siRNA)的靶基因为乙型肝炎病毒X蛋白(HBV-X)。因此上述双链siRNA理论上具有对HBX基因表达的抑制活性。
通过实施定量PCR检测通过本发明提供的液相合成的方法得到的产物与固相合成法得到的同序列的产物对HepG2.2.15细胞中HBV-X基因表达的抑制活性：
(1)HepG2.2.15细胞的培养
用含有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、380μg/ml G418的DMEM完全培养基，在24孔细胞培养板上以1×105个细胞/孔的密度接种HepG2.2.15细胞(购自北京大学人民医院)，在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中进行培养。
(2)siRNA的转染
使用Invitrogen公司的LipofectamineTM2000脂质体，将实施例7得到的双链siRNA、固相合成法合成的相同序列的双链siRNA(购自上海吉玛公司)、文献报道的一个的具有阳性效果的序列的双链siRNA(PC)(序列为5`-UCACCAUACUGCACUCAGG-3`，吴莹等，应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染，2005)以及无关双链siRNA对照(NC)(均购自上海吉玛公司)，按照0.06nmol/孔的转染量，转染到本实施例步骤(1)中所述的HepG2.2.15细胞中，并同时以灭菌去离子水作为siRNA转染的空对照。具体的操作步骤参照LipofectamineTM2000说明书及文献(吴莹等，应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染，2005)进行。
(3)通过Real Time-PCR方法检测本实施例步骤(2)中所述的转染了siRNA的HepG2.2.15细胞中HBX基因的mRNA表达量，同时设立人3-磷 酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参基因。所用引物的序列如下：
| 基因 | 上游引物 | 下游引物 |
| HBV-X | 5`-actctctcgtccccttctcc-3’ | 5`-ggtcgttgacattgcagaga-3’ |
| GAPDH | 5`-ctctgctcctcctgttcgac-3’ | 5`-acgaccaaatccgttgactc-3’ |
具体的操作步骤参照文献(分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社2002年9月出版)进行。根据下式计算siRNA抑制活性。
siRNA抑制活性＝1-(siRNA转染后的乙型肝炎病毒基因的拷贝数/siRNA转染后的GAPDH拷贝数)/(空对照孔乙型肝炎病毒基因的拷贝数/对照孔GAPDH拷贝数)。
细胞siRNA干扰实验结果如图3所示：阴性无关siRNA(NC)对照组中HBV-X基因的mRNA量没有被敲低，而液相合成产物siRNA和固相合成产物siRNA具有与阳性对照(PC)相同的抑制HBV-X基因表达的能力。证明实施例2得到的液相合成产物siRNA和固相合成产物siRNA，具有相同的抑制靶基因表达的生物活性。
实施例4
该实施例合成四十二聚体的寡核苷酸DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUUUUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE。
(1)合成DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]PO-
将实施例1中的步骤(29)得到的DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]OE 3.18g(0.24mmol)溶于10ml吡啶/三乙胺/水(v∶v∶v＝3∶1∶1)，室温搅拌30分钟，TLC显示完全反应，将反应液旋蒸除去溶剂后，再溶于100ml的CH2Cl2，1M浓度的TEAB溶液洗涤三次(每次50ml)，分出有机相，无水Na2SO4干燥有机相，除去溶剂，得产品2.64g。
(2)合成HO[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE
将实施例2中的步骤(18)得到的DMTr[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE 2.84g(0.2mmol)加入25ml 2％的TsOH的CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝7∶3)溶液，0℃强烈搅拌10分钟，立即用饱和NaHCO3溶液中和，分出有机相，再用25ml饱和NaHCO3溶液洗一次，有机相无水Na2SO4干燥后除去溶剂，柱层析(所用的淋洗剂为CH2Cl2/CH3OH(v∶v＝10∶1))纯化得产品2.56g。
(3)合成四十二聚体DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUUUUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE：
按照与实施例1中的步骤(29)相同的方法进行合成，不同的是，用实施例4中的步骤(1)得到的DMTr[CCUUGAGGCAUACUUCAAAUU]PO-代替实施例1中的步骤(27)得到的DMTr[CCUUGAGGCAU]PO-，用实施例4中的步骤(2)得到的HO[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE代替实施例1中的步骤(28)得到的HO[ACUUCAAAUU]OE。得到产品1.21g，产率30.1％，其中产率是产物的重量与按HO[UUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE计算的理论产量的百分比。
检测该产物的31PNMR谱和M-，产物的31PNMR谱和M-与目标化合物的31PNMR谱和M-理论值完全相符，证明该产物确实具有式(4)的结构。
至此，用液相法合成得到了全保护的四十二聚体核糖核酸DMTr[CUUGAGGCAUACUUCAAAUUUUUGAAGUAUGCCUCAAGGUU]OE。
Claims (17)
1.一种式(1)所示的核苷酸和/或寡核苷酸：
式(1)
其中，R为氢或R1，R1表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；
n为1-100的整数；
B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B相同或不同；
R2表示具有位阻型硅烷结构的基团；
R3表示卤素原子、硝基或甲氧基。
2.根据权利要求1所述的核苷酸和/或寡核苷酸，其中，R2为叔丁基二甲基硅甲烷基、苯基二甲基硅甲烷基、叔丁基二苯基硅甲烷基或三异丙基硅甲烷基。
3.根据权利要求1所述的核苷酸和/或寡核苷酸，其中，所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；所述卤素原子为氯或溴。
4.一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的化合物与式(3)的化合物在第一液态反应介质中接触进行缩合反应，得到式(4)的化合物；
式(2)
式(3)
式(4)
其中，
R1表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基；
x为0-50的整数；y为1-50的整数；
B1和B2各自表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B1或B2相同或不同；
R2和R3的定义与权利要求1相同；
A+表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；所述的三烷基铵离子或二烷基铵离子中的各个烷基相同或不同，并且各自具有1-6个碳原子。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述缩合剂为1-均三甲苯磺酰三唑、1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑、1-均三甲苯磺酰四唑、1-均三异丙基苯磺酰三唑、1-均三异丙基甲苯磺酰(3-硝基)-三唑和1-均三异丙基磺酰四唑中的一种或多种；所述第一液态反应介质为吡啶、二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种；
所述缩合反应的条件包括：相对于1摩尔的式(3)的化合物，缩合剂的用量为2-20摩尔，第一液态反应介质的用量为2-50L，在x等于0时式(2)的化合物的用量为1-5摩尔，在x大于等于1时式(2)的化合物的用量为0.3-1.25摩尔；反应温度为0-50℃；反应时间为0.5-100小时。
7.根据权利要求4-6中的任意一项所述的方法，其中，该方法还包括在第二液态反应介质中，在三烷基胺或二烷基胺存在下，在水解反应的条件下，将式(4)的化合物与水接触进行水解反应，得到脱去β-氰乙基的水解后的产物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述水解反应的条件包括：相对于1摩尔的式(4)的化合物，三烷基胺或二烷基胺的用量为1-200摩尔；第二液态反应介质的用量为5-50升；水的用量为2-20升；反应温度为0-50℃；反应时间为0.25-2小时。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第二液态反应介质为吡啶和/或乙腈；所述的三烷基胺或二烷基胺中的各个烷基相同或不同，并且各自具有1-6个碳原子。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，该方法还包括将所述水解后的产物作为所述式(3)的化合物，与所述式(2)的化合物再次进行所述的缩合反应。
11.根据权利要求4-6中的任意一项所述的方法，其中，该方法还包括在第三液态反应介质中，在有机酸存在下，在置换反应条件下，将式(4)的化合物的R1基团置换为氢，得到R1基团被置换为氢的产物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述的置换反应条件为：相对于1摩尔的式(4)的化合物，有机酸的使用量为2-20摩尔；第三液态反应介质的用量为10-150升；反应温度为-10℃至40℃；反应时间为1-60分钟；所述有机酸选自甲基苯磺酸、苯磺酸、三氯乙酸、二氯乙酸和三氟乙酸中的一种或多种；所述第三液态反应介质为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和甲醇中的一种或多种。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，该方法还包括将所述R1基团被置换为氢后的产物作为所述式(2)的化合物，与所述式(3)的化合物再次进行所述的缩合反应。
14.根据权利要求4所述的方法，其中，该方法还包括将所述式(4)化合物在第四液态反应介质中，在第一脱保护反应条件下，与氨水接触，脱去部分类别的保护基团，得到脱去部分类别的保护基团的产物；所述的部分类别的保护基团包括式(4)中的酰基、β-氰乙基和式(7)的基团，
式(7)
其中R3的定义与权利要求4相同；其中所述氨水的浓度为25-28质量％。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述第四液态反应介质为二氧六环、乙腈、吡啶、乙醇和甲醇中的一种或多种；所述的第一脱保护反应条件包括，相对于1克的式(4)的化合物，氨水的用量为0.02-0.5L；第四液态反应介质的用量为0.01-0.2L；反应温度为10-60℃；反应时间为5-100小时。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，该方法还包括在第五液态反应介质中，在第二脱保护反应条件下，将所述脱去部分类别的保护基团的产物与三乙胺三氢氟酸接触，脱去剩余类别的保护基，得到脱去全部保护基的产物；所述剩余类别的保护基为R1和R2，其中R1和R2的定义与权利要求4相同。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第五液态反应介质为二甲基亚砜；所述第二脱保护反应条件包括：相对于1克的脱去部分保护基团的产物，三乙胺三氢氟酸的用量为0.002-0.05L；第五液态反应介质的用量为0.002-0.05L；反应温度为40-85℃；反应时间为1-5小时。
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