CN103936805B - 一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种式（1）所示的核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法。本发明采用保护的核苷酸和/或寡核苷酸盐作为原料，合成反应在反应瓶或反应釜中进行，不受固相载体或合成仪的限制，可实现大规模制备核苷酸和/或寡核苷酸。

Description

一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法

技术领域

本发明涉及化学生物学领域，具体地，涉及一种核苷酸和/或寡核苷酸，以及该核苷酸和/或寡核苷酸的制备方法。

背景技术

化学合成寡核苷酸是指通过促使核苷酸单体间形成5’-3’磷酸二酯键，从而将多个核苷酸单元连接为寡核苷酸链的过程，其中涉及保护的核苷酸的合成。

合成寡核酸的方法有固相合成法和液相合成法，固相合成法通常使用亚磷酰胺缩合反应方式，液相合成法通常使用磷酸三酯缩合反应方式或者氢膦酸酯缩合反应方式。相比于固相合成法，液相合成具有中间体易鉴定，反应规模易方达的特点。因此，液相合成法更适用于规模制备寡核酸，这在合成生产医药用途的寡核酸上具有重要意义。

氢膦酸法合成寡核酸是一种高效的缩合方式，但是在应用液相氢膦酸法合成RNA的时候，缺少一种好的保护基用于保护核苷3’端，在文献中所报道的例如用乙酰丙酰基保护核苷3’端的方法只适用于合成DNA，当应用于合成RNA时，乙酰丙酰基的脱除条件会导致核糖核苷2’位保护基（如TBDMS）发生2’→3’的迁移反应，导致产率降低和产生副产物。

发明内容

本发明的目的是提供一种液相氢膦酸法合成RNA的方法，克服了目前的固相寡核苷酸合成方法的合成规模小、成本高等缺点，提供一种能够大规模合成寡核苷酸的方法。

本发明中设计了一种硼烷基掩蔽的氢膦酸三酯核苷酸，可以应用于液相氢膦酸法合成RNA中，这种硼烷基氢膦酸三酯核苷可经过脱保护直接得到氢膦酸单酯核苷，并应于缩合反应中，不会引起2’位保护基发生2’→3’的迁移反应。本发明可应用于液相法规模制备RNA。

本发明提供了一种式（1）所示的核苷酸和/或寡核苷酸：

式（1）

其中，R为氢或R₁，R₁表示三苯甲基或单甲氧基三苯甲基；

R₂和R₇各自独立地为具有位阻型硅烷结构的基团；

m为0-100的整数，n为0或1；

R₃和R₈各自独立地为环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的R₃相同或不同；

R₄为或-S-CH₂CH₂CN；R₄’为氢或R₄；

R₅和R₆各自独立地为-CH₂CH₂CN或R₉为-CH₃、卤素原子、-NO₂或-OCH₃。

本发明提供的式（1）的物质中，当R为H时，式（1）与如下所述的x大于等于1时的式（2）等价；当R为R₁时，式（1）与如下所述的式（4）等价。

本发明还提供了一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括：在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式（2）的物质与式（3）的物质在第一液态反应介质中接触进行缩合反应，得到式（4）的物质；

式（2）

式（3）

式（4）

其中，

x为0-50的整数；y为0-50的整数；

式（2）、式（3）和式（4）中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈的定义与式（1）中相同；

A⁺表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。

本发明还提供了一种核苷酸和/或寡核苷酸的制备方法，该方法包括：在第六液态反应介质中，将式（7）所示的物质与BH₃接触，得到式（8）所示的物质；

式（7）

式（8）

式（7）和式（8）中，n、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈的定义与式（1）中的定义相同。

本发明提供的方法得到的脱去保护基的寡核苷酸，可以具有生物活性，可以用于各种寡核苷酸的用途，例如RNA干扰。

本发明由于在液相中进行反应，不需要使用固相载体，又由于底物不需数倍过量，节省了原料，降低了成本。本发明采用保护的核苷酸和/或寡核苷酸盐作为原料，合成反应在反应瓶或反应釜中进行，不受固相载体或合成仪的限制，可实现大规模制备核苷酸和/或寡核苷酸。

具体实施方式

本发明提供了一种式（1）所示的核苷酸和/或寡核苷酸：

式（1）

其中，R为氢或R₁，R₁表示三苯甲基或单甲氧基三苯甲基；

R₂和R₇各自独立地为具有位阻型硅烷结构的基团；

m为0-100的整数，n为0或1；

R₃和R₈各自独立地为环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的R₃相同或不同；

R₄为或-S-CH₂CH₂CN；R₄’为氢或R₄；

R₅和R₆各自独立地为-CH₂CH₂CN或R₉为-CH₃、卤素原子、-NO₂或-OCH₃。

且各个重复单元中的R₉可以相同或不同，其中R₉在苯环上的位置没有限制，可以为邻位、间位或对位。

其中n=1时，上述式（1）表示的是核苷酸，n为大于1的整数时，上述式（1）表示的是寡核苷酸。

在式（1）中，所述的位阻型硅烷结构的基团可以为各种具有位阻和保护功能的硅烷基团，优选为叔丁基二甲基氯硅烷基、苯基二甲基氯硅烷基、叔丁基二苯基氯硅烷基或三异丙基氯硅烷基，更优选为叔丁基二甲基氯硅烷基，且各个重复单元中的R₂可以相同或不同。

在式（1）中，作为保护基的各个所述酰基可以相同或不同，各自可以为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基。

在式（1）中，所述的卤素原子可以为氟、氯、溴或碘，优选为氯或溴，更优选为氯。

本发明提供的式（1）的物质中，当R为H时，式（1）与如下所述的x大于等于1时的式（2）等价；当R为R₁时，式（1）与如下所述的式（4）等价。

本发明还提供了一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括：在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式（2）的物质与式（3）的物质在第一液态反应介质中接触进行缩合反应，得到式（4）的物质；

式（2）

式（3）

式（4）

其中，

x理论上可以为任意非负整数，优选为0-50的整数，更优选为0-25的整数，更进一步优选为0-15的整数；y理论上可以为任意正整数，优选为1-50的整数，更优选为1-25的整数，更进一步优选为1-15的整数；

式（2）、式（3）和式（4）中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、和R₈的定义如式（1）中所述；

A⁺表示三烷基铵离子或二烷基铵离子；所述的三烷基铵离子或二烷基铵离子中的各个烷基可以相同或不同，可以各自具有1-6个碳原子，优选具有1-4个碳原子。

其中，所述缩合反应所使用的缩合剂以及缩合反应的条件可以是本领域普通技术人员所熟知的，本发明对其没有特别的限制，例如，可以使用1-均三甲苯磺酰三唑、1-均三甲苯磺酰(3-硝基)-三唑、1-均三甲苯磺酰四唑、1-均三异丙基苯磺酰三唑、1-均三异丙基甲苯磺酰(3-硝基)-三唑和1-均三异丙基磺酰四唑中的一种或多种作为缩合剂。

其中，所述第一液态反应介质的选择可以是本领域普通技术人员所熟知的，只要能溶解参与反应的物料即可，本发明对其没有特别的限制，例如，可以使用吡啶、二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种作为所述第一液态反应介质。

其中，所述缩合反应条件可以包括：相对于1摩尔的式（3）的物质，式（2）的物质的用量可以为0.3-1.25摩尔。

其中，相对于1摩尔的式（3）的物质，缩合剂的用量可以为2-20摩尔，优选可以为2-5摩尔。

其中，相对于1摩尔的式（3）的物质，第一液态反应介质的用量可以为2-50升，优选可以为2-30升。

其中，上述缩合反应温度可以为0-50℃，优选可以为20-40℃；反应时间可以为0.5-100小时，优选可以为1-10小时。

根据本发明的一种优选实施方式，其中，该方法还可以包括如下步骤：

在第二液态反应介质中，将式（4）的物质与式（5）的物质接触，得到式（6）的物质；

式（5）

式（6）

其中，式（5）和式（6）中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈的定义与式（1）中的定义相同。

其中，相对于1摩尔的式（4）的物质，第二液态反应介质的用量可以为5-50L，式（5）的物质的用量可以为1-10摩尔；反应温度可以为零下50℃至50℃；反应时间可以为0.2-10小时。

其中，所述第二液态反应介质可以为吡啶或吡啶与二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶液。

所述第二液态反应介质可以与所述第一液态反应介质为同一介质，即，可以在式（2）的物质与式（3）的物质在第一液态反应介质中的接触结束后的物料中直接加入式（5）的物质。

上述反应完成之后，可以终止反应，并分离出产物。所述终止反应的方法以及分离出产物的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限制。

例如，所述终止反应的方法，可以为在0-15℃下，将反应溶液与水混合5-30分钟，相对于1升的第一液态反应介质，水的用量可以为0.05-0.2升。

所述终止反应的方法，也可以为将反应溶液与饱和碳酸氢钠溶液混合，在0-50℃下，在搅拌条件下保持5-10分钟。饱和碳酸氢钠溶液与所述第一液态反应介质的体积比可以为0.05-0.2：1。

所述分离的方法，在需要将式（6）的物质进行如下所述的置换反应时，可以包括：将终止反应后的反应溶液旋转蒸除溶剂，再溶于有机溶剂，用酸调节pH值到3-5，用水洗涤一次或多次，相对于1升的第一液态反应介质，有机溶剂的用量为2-20升，洗涤用的水的用量为2-20升，用无水硫酸钠干燥有机相后，再次旋转蒸除溶剂，常压柱分离即得产物。所述的有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种，所述的酸可以是浓度为1-10重量%的草酸和/或醋酸。

所述分离的方法，在需要将式（6）的物质进行如下所述的水解反应或脱去全部保护基时，可以包括将终止反应后的反应溶液旋转蒸除溶剂后与有机溶剂混合，加入饱和碳酸氢钠溶液进行洗涤，将有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到产物。所述有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种。所述有机溶剂与所述第一液态反应介质的体积比可以为2-20：1。所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的饱和碳酸氢钠溶液的总体积与所述第一液态反应介质的体积比可以为2-20：1。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

根据本发明的一种实施方式，本发明所提供的液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，该方法还包括如下步骤：

（1）在第三液态反应介质中，将式（6）的物质与烷基胺接触，以脱去R₅；

（2）在第四液态反应介质中，将脱去了R₅的式（6）的物质与氯代乙酸和甲氧基三苯甲醇接触，以脱去BH₃基团；

（3）在第三液态反应介质中，将脱去了R₅和BH₃基团的式（6）的物质与烷基胺接触，以脱去R₆。

优选情况下，R₅为-CH₂CH₂CN，R₆为或-CH₂CH₂CN。

其中，步骤（1）中，所述接触的条件可以包括：相对于1摩尔的式（6）的物质，烷基胺的用量为1-200摩尔；第三液态反应介质与烷基胺的体积比为1-10:1；反应温度为0-50℃；反应时间为1-30分钟。

步骤（2）中，所述接触的条件可以包括：相对于1摩尔的脱去了R₅的式（6）的物质，第四液态反应介质的用量为50-500L，氯代乙酸的用量为1-10mol，甲氧基三苯甲醇的用量为1-10mol；反应温度为零下20℃至30℃；反应时间为5-60分钟。

步骤（3）中，所述接触的条件可以包括：相对于1摩尔的脱去了R₅和BH₃基团的式（6）的物质，烷基胺的用量为1-200摩尔；第三液态反应介质与烷基胺的体积比为1-20:1；反应温度为0-50℃；反应时间为1-30分钟。

其中，所述第三液态反应介质可以为乙腈和/或吡啶，所述烷基胺中的各个烷基可以相同或不同，并且各自具有1-6个碳原子。优选所述烷基胺为三烷基胺和/或二烷基胺。例如，所述三烷基胺可以为三甲胺、三乙胺和二异丙基乙基胺中的一种或多种，所述二烷基胺可以为二甲胺、二乙胺和二异丙基胺中的一种或多种。所述第四液态反应介质优选为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃和甲苯中的至少一种。所述氯代乙酸可以为一氯乙酸和/或二氯乙酸。所述甲氧基三苯甲醇可以为4,4-二甲氧基三苯甲醇和/或4,4,4-三甲氧基三苯甲醇。

脱去了R₅、BH₃基团和R₆之后，可以分离出脱去了R₅、BH₃基团和R₆的式（6）的物质。脱去了R₅、BH₃基团和R₆的式（6）物质即相当于式（3）的物质。分离出式（3）的物质的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限制，例如，该分离方法可以包括：将反应液旋转蒸除溶剂，再用有机溶剂溶解，加入洗涤溶液进行洗涤，分液得到有机相，无水硫酸钠干燥后旋蒸除去溶剂，即可得到产物。所述有机溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或多种，所述有机溶剂与所述第二液态反应介质的体积比可以为1-10：1。所述的洗涤溶液可以为0.1-1摩尔/升浓度的三乙胺碳酸氢盐（TEAB）水溶液或饱和碳酸氢钠溶液。所述洗涤可以进行一次或多次，洗涤用的TEAB水溶液的总体积与所述第二液态反应介质的体积比可以为1-10：1。

然后，可以将脱去了R₅、BH₃基团和R₆的式（6）物质作为所述式（3）的物质，与所述式（2）的物质再次进行如前所述的缩合反应。

根据本发明的另一种实施方式，本发明所提供的液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，还可以包括在第五液态反应介质中，在三乙基硅烷和有机酸存在下，在置换反应条件下，将式（6）的物质的R₁基团置换为氢，得到R₁基团被置换为氢的产物。

其中，所述的置换反应条件可以包括：相对于1摩尔的式（6）的物质，有机酸的使用量可以为2-20摩尔，优选为2-10摩尔；三乙基硅烷的用量为10-150升，优选为10-130升；第五液态反应介质的用量可以为10-150升，优选为10-130升；反应温度可以为0℃至40℃，优选为零下10℃至30℃；反应时间可以为5-120分钟，优选为10-60分钟。

其中，所述有机酸优选选自甲苯磺酸、苯磺酸、三氯乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸中的一种或多种；所述的第五液态反应介质可以为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和甲醇中的一种或多种。

其中，所述的置换反应完成之后，可以分离出R₁基团被置换为氢的产物。分离出R₁基团被置换为氢的产物的方法是本领域普通技术人员熟知的，本发明对其没有特别的限制，例如，该分离纯化的方法可以包括用碱溶液中和置换反应所得的混合物，分液得到有机相，再用碱溶液洗涤一次到多次，将有机相干燥、过滤、浓缩、常压柱分离，即可得到纯化的置换反应后的产物。相对于1升的第三液态反应介质，洗涤用的碱溶液用量可以为0.2-1升，所述的碱溶液可以为饱和的碳酸氢钠水溶液、饱和的碳酸氢钾水溶液或饱和的碳酸钠溶液。所述干燥、过滤、浓缩、常压柱分离的方法已为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

然后，可以将分离出的R₁基团被置换为氢后的产物作为所述式（2）的物质，与所述式（3）的物质再次进行如前所述的缩合反应。

本发明还提供了一种核苷酸和/或寡核苷酸的制备方法，即BH₃基团的引入方法，该方法包括：在第六液态反应介质中，将式（7）所示的物质与BH₃接触，得到式（8）所示的物质；

式（7）

式（8）

式（7）和式（8）中，n、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈的定义与与式（1）相同。

其中，所述接触的条件可以包括：相对于1摩尔的式（7）的物质，BH₃的用量为1-20摩尔，第六液态反应介质的用量为5-50L；反应温度为零下50℃至50℃；反应时间为0.1-2小时。

其中，所述第六液态反应介质可以为四氢呋喃或乙腈。

其中，式（7）所示的物质可以按照已知的方法进行制备，也可以按照如下方法制备。

在R₅和R₆的选择相同的情况下，上述方法还可以包括：在第七液态反应介质中，将式（9）所示的物质与三卤化磷、2,6-二甲基吡啶、HOR₅和HOR₆接触，得到式（7）所示的物质；

式（9）

式（9）中，n、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈的定义与式（1）中相同，且R₅和R₆的选择相同。

其中，所述接触的条件可以包括：相对于1摩尔的式（9）的物质，三卤化磷的用量为1-2摩尔，2,6-二甲基吡啶的用量为3-25摩尔，HOR₅和HOR₆的总用量为2-12摩尔，第七液态反应介质的用量为5-50L；反应温度为零下78℃至零下20℃；反应时间为0.5-4小时。

其中，所述第七液态反应介质可以为四氢呋喃和/或乙腈。

在R₅和R₆的选择不同的情况下，上述方法还可以包括：在第七液态反应介质中，将式（9）所示的物质与三卤化磷、2,6-二甲基吡啶、和HOR₅接触，然后和HOR₆接，得到式（7）所示的物质；

式（9）

式（9）中，n、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈的定义与权利要求1-3中任意一项相同，且R₅和R₆的选择不同；

并且，相对于1摩尔的式（9）的物质，HOR₅用量为0.9-1.1摩尔、HOR₆用量为1-6摩尔。HOR₅和HOR₆是先后加入的，由此可以使R₅和R₆均引入到式（7）中。

其中，所述接触的条件可以包括：相对于1摩尔的式（9）的物质，三卤化磷的用量为1-2摩尔，2,6-二甲基吡啶的用量为3-25摩尔，第七液态反应介质的用量为5-50L；反应温度为零下78℃至零下20℃；反应时间为0.5-4小时。

其中，所述第七液态反应介质可以为四氢呋喃和/或乙腈。

在本发明中所使用的气体和液体体积均指1个标准大气压下、20℃时的体积。

下面通过实施例更详细地描述本发明，但本发明的范围不限于实施例中的举例。

实施例中所用到的原料的获取方式如下：

四种保护的核糖核苷酸，包括腺嘌呤核糖核苷酸（A）、尿嘧啶核糖核苷酸（U）、胞嘧啶核糖核苷酸（C）、鸟嘌呤核糖核苷酸（G）；其中以苯甲酰基保护碱基的环外氨基，以叔丁基二甲基硅烷基保护2’羟基，以二对甲氧三苯甲基保护的5’羟基；全部四种保护的核苷酸均购自上海吉玛制药技术有限公司。

实施例1

本实施例合成式（1）的物质，其中，m和n为0，R为三苯甲基，R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₇为叔丁基二甲基硅基，R₈为尿嘧啶，该式（1）的物质命名为Tr[U]BH₃。

将PCl₃（468mg,3.4mmol）溶于20ml第七液态反应介质（四氢呋喃），在-78℃下，加入2,6-二甲基吡啶(1.64g,15.3mmol)和溶于20ml第七液态反应介质的式（9）化合物（其中n为0、R₁为三苯甲基、R₇为叔丁基二甲基硅基且R₈为尿嘧啶，即5’-O-Tr-2’O-TBDMS-rU，购自上海吉玛制药技术有限公司，1.0g，1.7mmol)，维持5min。

然后，滴加入3-羟基丙腈（905mg,12.8mmol），维持20min。

然后，升温至-20℃，滴加入溶于第七液态反应介质（四氢呋喃，7ml）的BH₃（7mmol），在0℃维持30min后，加入10ml的饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应。二氯甲烷萃取反应液三次，每次50ml。合并萃取得到的有机相并用无水硫酸钠干燥萃取得到的有机相，除去干燥后的有机相中的溶剂后，过柱纯化（使用33体积%的乙酸乙酯的石油醚溶液为溶剂）。纯化的产物除去溶剂抽干后得到白色泡沫状产品化合物，重量为1.15g，产率86%。

该产品化合物的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)谱数据如下：δ9.46(s,1H),7.81(d,J=8.2Hz,1H),7.40–7.30(m,5H),6.07(d,J=5.6Hz,1H),5.34(dd,J=8.2,1.7Hz,1H),5.00–4.94(m,1H),4.56(t,J=5.0Hz,1H),4.38(d,J=2.8Hz,1H),4.34–4.31(m,1H),3.58(ddd,J=26.9,11.2,2.3Hz,1H),2.80(t,J=6.0Hz,1H),0.92(s,3H),0.17(s,1H),0.13(s,3H)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)谱数据如下：δ163.03,150.55,142.80,139.66,128.73,128.22,127.74,116.48,116.31,102.84,88.24,87.67,82.08,74.74,74.70,62.70,61.83,61.80,61.67,25.58,19.84,19.77,19.74,19.68,17.99,-4.81,-4.87；³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)谱数据如下：δ118.61(br)。ESI-MS质谱数据为：C₄₀H₄₉BN₄O₈PSi的计算值为783.3150，M^-测量值为783.2560。以上数据证明，该产品化合物确实为m和n为0，R为三苯甲基，R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₇为叔丁基二甲基硅基，R₈为尿嘧啶的式（1）的物质，即Tr[U]BH₃。

实施例2

本实施例合成式（3）的物质，其中，y为0，R₁为三苯甲基，R₇为叔丁基二甲基硅基，R₈为尿嘧啶，该式（1）的物质命名为Tr[U]PH，具体通过上述Tr[U]BH₃脱去R₅、BH₃基团和R₆来实现。

室温下，在第三液态反应介质（CH₃CN，30ml）中，将Tr[U]BH₃（784mg，1mmol）与三乙基胺（10ml）维持15min的接触。然后减压浓缩并抽干，即脱去了Tr[U]BH₃中的R₅（-CH₂CH₂CN）。

0℃下，在第四液态反应介质（二氯甲烷，170ml）中，将抽干后的固体产物与二氯乙酸（5mmol）和甲氧基三苯甲醇（735mg，2.1mmol）维持10min的接触。加入100ml的饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应。二氯甲烷萃取反应液2次，每次50ml。合并萃取得到的有机相并用无水硫酸钠干燥萃取得到的有机相，除去干燥后的有机相中的溶剂后，过柱纯化，即将脱去了R₅（-CH₂CH₂CN）的Tr[U]BH₃中的BH₃基团脱去。

然后，室温下，在第三液态反应介质（CH₃CN，30ml）中，在将纯化后的固体产物与三乙基胺（10ml）维持15min的接触。然后减压浓缩并抽干，并且过柱纯化，得到产物338mg，产率51%，即将脱去了R₅（-CH₂CH₂CN）和BH₃基团的Tr[U]BH₃中的R₆（-CH₂CH₂CN）也脱去。

该产物的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)谱数据如下：δ8.64-8.57(m,1H),7.87(d,J=8.1Hz,1H),7.42–7.24(m,15H),5.93(d,J=4.0Hz,1H),5.15(d,J=8.1Hz,1H),4.79(dt,J=9.6,4.8Hz,1H),4.47(t,J=4.2Hz,1H),4.41–4.35(m,1H),3.55(qd,J=11.1,2.4Hz,2H),2.93(q,J=7.3Hz,6H),1.23(t,J=7.3Hz,9H),0.89(s,9H),0.18(s,3H),0.14(s,3H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)谱数据如下：δ163.53,150.71,149.75,143.20,140.14,135.95,128.86,127.99,123.70,101.99,88.87,87.73,82.57,75.26,72.24,62.44,45.64,25.72,18.04,8.99,-4.71,-4.78；³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)谱数据如下：δ3.20。ESI-MS质谱数据为：C₃₄H₄₀N₂O₈PSi的计算值为663.7498，M^-测量值为663.5905。以上数据证明，该产物确实为y为0，R₁为三苯甲基，R₇为叔丁基二甲基硅基，R₈为尿嘧啶的式（3）的物质，即Tr[U]PH。

实施例3

本实施例合成式（2）的物质，其中，x为0，R₇为叔丁基二甲基硅基，R₈为尿嘧啶，该式（2）的物质命名为HO[U]BH₃，具体通过上述Tr[U]BH₃的R₁基团置换为氢来实现。

在0℃下，在第五液态反应介质（CH₂Cl₂，25ml）中，将Tr[U]BH₃（784mg，1mmol）与三乙基硅烷（Et₃SiH，25ml）和有机酸（三氟乙酸，1.5g）维持20min的接触。加入30ml的饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应。二氯甲烷萃取反应液2次，每次50ml。合并萃取得到的有机相并用无水硫酸钠干燥萃取得到的有机相，除去干燥后的有机相中的溶剂后，过柱纯化，得到白色泡沫状产物460mg，产率85%。

该产物的¹H NMR(400MHz,DMSO)谱数据如下：δ11.42(d,1H),7.91(d,J=8.2Hz,1H),5.92(d,J=7.0Hz,1H),5.76(dd,J=8.1,2.1Hz,1H),5.46(t,J=4.9Hz,1H),4.79(m,1H),4.47–4.43(m,1H),4.27–4.21(m,4H),3.67(dd,J=4.3,2.8Hz,2H),2.98(t,J=5.8Hz,4H),0.84(s,9H),0.07(s,3H),-0.00(s,3H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO)谱数据如下：δ163.24,151.19,140.30,118.41,103.16,86.71,84.14,77.67,73.96,62.47,60.97,25.92,19.56,18.10,-4.48,-4.89；³¹PNMR谱数据如下：(162MHz,DMSO)δ115.01-115-52(br)。ESI-MS质谱数据为：C₂₁H₃₅BN₄O₈PSi的计算值为541.2055，M^-测量值为541.1512。以上数据证明，该产物确实为x为0，R₇为叔丁基二甲基硅基，R₈为尿嘧啶的式（2）的物质，即HO[U]BH₃。

实施例4

本实施例合成式（6）的物质，其中，x为0，y为0，R₁为三苯甲基，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₈均为尿嘧啶，该式（6）的物质命名为Tr[UU]BH₃。具体通过Tr[U]PH和HO[U]BH₃的缩合以及R₄的引入来实现。

在0℃下，在第一液态反应介质中（无水吡啶，20ml）中，在缩合剂（叔丁基乙酰氯，600mg，5mmol）存在下，将Tr[U]PH（1.84g，2.4mmol）和HO[U]BH₃（1.09g,2mmol）下维持20min的接触，得到的反应液中含有x为0，y为0，R₁为三苯甲基，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₈均为尿嘧啶的式（4）的物质。

然后，在上述反应液中，加入R₄为即，加入式（5）的物质（2-(4-chlorophenylthio)isoindoline-1,3-dione，1.45g，5mmol），在0℃下维持接触20min。加入10ml的饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应。二氯甲烷萃取反应液2次，每次50ml。合并萃取得到的有机相并用无水硫酸钠干燥萃取得到的有机相，除去干燥后的有机相中的溶剂后，过柱纯化，得到产物2.24g，产率84%。

该产物的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)谱如下：δ9.75-9.37(m,2H),7.82–7.21(m,21H),6.06–5.98(m,1H),5.75–5.61(m,1H),5.50(dd,1H),5.29(ddd,1H),5.11-4.99(m,1H),4.73(td,1H),4.59-4.49(m,1H),4.47-4.35(m,4H),4.34-4.20(m,4H),4.17-4.02(m,2H),3.51(d,2H),2.84-2.62(m,4H),0.95-0.84(m,18H),0.21-0.03(m,12H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)谱如下：δ162.78,150.58,142.79,139.77,136.50,135.85,135.78,129.83,128.74,128.17,127.70,123.10,116.45,103.01,90.42,88.20,87.44,87.82,82.14,80.12,77.77,74.65,74.09,66.49,62.61,62.10,25.59,19.74,18.02,-4.82；³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)谱如下：δ119.98-118.31(br),23.94,22.79。ESI-MS质谱数据为：C₆₁H₇₇BClN₆O₁₅P₂SSi₂的计算值为1330.7428，M^-测量值为1330.2542。以上数据证明，该产物确实为x为0，y为0，R₁为三苯甲基，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₈均为尿嘧啶的式（6）的物质，即Tr[UU]BH₃。

实施例5

按照实施例2的方法，将Tr[UU]BH₃脱去R₅、BH₃基团和R₆，得到Tr[UU]PH，即y为1，R₁为三苯甲基，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（3）的物质。

该物质的收率为47%，实测的核磁数据和质谱数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO)：δ11.60–11.38(m,2H),7.75–7.25(m,21H),5.87(m,2H),5.64–5.37(m,2H),4.93(d,1H),4.65–4.50(m,1H),4.24(dd,6H),3.02(q,6H),1.24(m,9H),0.88–0.71(m,18H),0.10–-0.08(m,12H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ163.11,151.93,143.46,140.24,136.78,134.98,129.95,128.75,128.48,127.78,124.30,102.35,87.28,81.55,72.91,71.49,67.94,62.85,45.80,32.21,25.97,18.09,8.91,-4.74；³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ23.94,22.95,3.24,3.13。ESI-MS：C₅₅H₆₈ClN₄O₁₅P₂SSi₂的计算值1209.311，测量值M^-:1209.7773。

以上数据证明，该产物确实为y为1，R₁为三苯甲基，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（3）的物质，即Tr[UU]PH。

实施例6

按照实施例3的方法，将Tr[UU]BH₃的R₁基团置换为氢，得到HO[UU]BH₃，即x为1，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（2）的物质。

该物质的收率为84%，实测核磁数据和质谱数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ9.08(d,2H),7.77(d,1H),7.56(dt,2H),7.36(d,2H),7.29(d,1H),5.76(m,2H),5.65(m,2H),4.93(dt,1H),4.78(dt,1H),4.57(dd,1H),4.53–4.42(m,2H),4.40–4.32(m,2H),4.28(dd,4H),3.98–3.74(m,2H),2.78(td,4H),0.89(d,18H),0.16–0.06(t,12H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)：δ162.82,150.25,141.15,139.97,136.72,136.53,130.04,122.53,116.44,102.84,90.68,83.31,80.17,74.95,73.63,66.35,62.07,60.80,29.67,25.65,19.76,18.02,-4.80；³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)：δ119.02,25.86,24.86。ESI-MS：C₄₂H₆₃BClN₆O₁₅P₂SSi₂计算值1087.2867，测量值M^-:1087.1609。

以上数据证明，该产物确实为x为1，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（2）的物质，即HO[UU]BH₃。

实施例7

按照实施例3的方法，通过Tr[UU]PH和HO[UU]BH₃的缩合以及R₄的引入，得到Tr[UUUU]BH₃，即x和y为1，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（2）的物质。

实施例8

按照实施例2的方法，将Tr[UUUU]BH₃脱去R₅、BH₃基团和R₆，得到Tr[UUUU]PH，即y为3，R₁为三苯甲基，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（3）的物质。

实施例9

按照实施例3的方法，将Tr[UUUU]BH₃的R₁基团置换为氢，得到HO[UUUU]BH₃，即x为3，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（2）的物质。

实施例10

按照实施例3的方法，通过Tr[UUUU]PH和HO[UUUU]BH₃的缩合以及R₄的引入，得到Tr[UUUUUUUU]BH₃，即x和y为3，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（2）的物质。

实施例11

按照实施例2的方法，将Tr[UUUUUUUU]BH₃脱去R₅、BH₃基团和R₆，得到Tr[UUUUUUUU]PH，即y为7，R₁为三苯甲基，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（3）的物质。

实施例12

按照实施例3的方法，将Tr[UUUUUUUU]BH₃的R₁基团置换为氢，得到HO[UUUUUUUU]BH₃，即x为7，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（2）的物质。

实施例13

按照实施例3的方法，通过Tr[UUUUUUUU]PH和HO[UUUUUUUU]BH₃的缩合以及R₄的引入，得到Tr[UUUUUUUUUUUUUUUU]BH₃，即x和y为7，R₄为R₅和R₆为-CH₂CH₂CN，R₂和R₇均为叔丁基二甲基硅基，R₃和R₈均为尿嘧啶的式（2）的物质。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (19)

1.一种核苷酸和/或寡核苷酸，所述核苷酸和/或寡核苷酸如式(1)所示：

其中，R为氢或R₁，R₁表示三苯甲基或单甲氧基三苯甲基；

R₂和R₇各自独立地为具有位阻型硅烷结构的基团；

m为0-100的整数，n为0或1；

R₃和R₈各自独立地为环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的R₃相同或不同；

R₄为-S-CH₂CH₂CN；R₄’为氢或R₄；

R₅和R₆各自独立地为-CH₂CH₂CN或R₉为-CH₃、卤素原子、-NO₂或-OCH₃；

其中，具有位阻型硅烷结构的基团为叔丁基二甲基硅基、苯基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基或三异丙基硅基；所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；所述卤素原子为氯或溴。

2.一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括：

在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的物质与式(3)的物质在第一液态反应介质中接触进行缩合反应，得到式(4)的物质；

其中，式(2)、式(3)和式(4)中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈的定义与权利要求1中的相同；

x为0-50的整数；y为0-50的整数；

A⁺表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述缩合反应的条件包括：相对于1摩尔的式(3)的物质，缩合剂的用量为1-30摩尔，第一液态反应介质的用量为5-50L，式(2)的物质的用量为0.3-1.25摩尔；反应温度为-50℃至50℃；反应时间为0.2-10小时。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述酰基为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；所述的三烷基铵离子或二烷基铵离子中的各个烷基相同或不同，并且各自具有1-6个碳原子；所述缩合剂为氯磷酸二苯酯、双(2-氯苯基)磷酰氯和叔丁基乙酰氯中的一种或多种；所述第一液态反应介质为吡啶或吡啶与二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶液。

5.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括如下步骤：

在第二液态反应介质中，将式(4)的物质与式(5)的物质接触，得到式(6)的物质；

其中，式(5)和式(6)中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈的定义与权利要求1中的相同。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，相对于1摩尔的式(4)的物质，第二液态反应介质的用量为5-50L，式(5)的物质的用量为1-10摩尔；反应温度为零下50℃至50℃；反应时间为0.2-10小时。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二液态反应介质为吡啶或吡啶与二氯甲烷、乙腈、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种的混合溶液。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，该方法还包括如下步骤：

(1)在第三液态反应介质中，将式(6)的物质与烷基胺接触，以脱去R₅；

(2)在第四液态反应介质中，将脱去了R₅的式(6)的物质与氯代乙酸和甲氧基三苯甲醇接触，以脱去BH₃基团；

(3)在第三液态反应介质中，将脱去了R₅和BH₃基团的式(6)的物质与烷基胺接触，以脱去R₆；

其中，所述烷基胺中的各个烷基相同或不同，并且各自具有1-6个碳原子；所述烷基胺为三烷基胺和/或二烷基胺。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，R₅为-CH₂CH₂CN，R₆为或-CH₂CH₂CN。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，步骤(1)中，所述接触的条件包括：相对于1摩尔的式(6)的物质，烷基胺的用量为1-200摩尔；第三液态反应介质与烷基胺的体积比为1-10:1；反应温度为0-50℃；反应时间为1-30分钟；

步骤(2)中，所述接触的条件包括：相对于1摩尔的脱去了R₅的式(6)的物质，第四液态反应介质的用量为50-500L，氯代乙酸的用量为1-10mol，甲氧基三苯甲醇的用量为1-10mol；反应温度为零下20℃至30℃；反应时间为5-60分钟；

步骤(3)中，所述接触的条件包括：相对于1摩尔的脱去了R₅和BH₃基团的式(6)的物质，烷基胺的用量为1-200摩尔；第三液态反应介质与烷基胺的体积比为1-20:1；反应温度为0-50℃；反应时间为1-30分钟。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述第三液态反应介质为乙腈和/或吡啶；

所述第四液态反应介质为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃和甲苯中的至少一种；

所述氯代乙酸为一氯乙酸和/或二氯乙酸；

所述甲氧基三苯甲醇为4,4-二甲氧基三苯甲醇和/或4,4,4-三甲氧基三苯甲醇。

12.根据权利要求8或9所述的方法，其中，该方法还包括将脱去了R₅、BH₃基团和R₆的式(6)的物质，与所述式(2)的物质再次进行所述的缩合反应。

13.根据权利要求5所述的方法，其中，该方法还包括在第五液态反应介质中，在三乙基硅烷和有机酸存在下，在置换反应条件下，将式(6)的物质的R₁基团置换为氢，得到式(6)的物质的R₁基团被置换为氢的产物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述的置换反应条件为：相对于1摩尔的式(6)的物质，有机酸的使用量为2-20摩尔；三乙基硅烷的用量为10-150升；第五液态反应介质的用量为10-150升；反应温度为0℃至30℃；反应时间为5-120分钟。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述有机酸选自甲基苯磺酸、苯磺酸、三氯乙酸、二氯乙酸和三氟乙酸中的一种或多种；所述第五液态反应介质为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和甲苯中的一种或多种。

16.根据权利要求13或14所述的方法，其中，该方法还包括将式(6)的物质的R₁基团被置换为氢后的产物作为所述式(2)的物质，与所述式(3)的物质再次进行所述的缩合反应。

17.一种核苷酸和/或寡核苷酸的制备方法，该方法包括：在第六液态反应介质中，将式(7)所示的物质与BH₃接触，得到式(8)所示的物质；

式(7)和式(8)中，n、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈的定义与权利要求1中的相同。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述接触的条件包括：相对于1摩尔的式(7)的物质，BH₃的用量为1-20摩尔，第六液态反应介质的用量为5-50L；反应温度为零下50℃至50℃；反应时间为0.1-2小时。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述第六液态反应介质为四氢呋喃和/或乙腈。