BR112019027944A2 - composições e métodos para clivagem química e desproteção de oligonucleotídeos ligados à superfície - Google Patents

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Abstract

modalidades da presente divulgação referem-se a métodos de preparação de modelos para sequenciamento de polinucleotídeos. em particular, a divulgação refere-se à linearização de polinucleotídeos agrupados em preparação para sequenciamento por clivagem de uma ou mais primeiras fitas de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados em um suporte sólido através de um complexo de metal de transição, por exemplo, um complexo de paládio ou um complexo de níquel. além disso, a presente divulgação refere-se à linearização de polinucleotídeos agrupados através de clivagem de uma ou mais segundas fitas de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados em um suporte sólido compreendendo um ligante azobenzeno clivado por na2s2o4. também são divulgados nucleotídeos e oligonucleotídeos compreendendo um grupo de bloqueio da porção fosfato 3' e métodos para remover o mesmo usando um reagente fluoreto.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA CLIVAGEM QUÍMICA E DESPROTEÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS LIGADOS À SUPERFÍCIE INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA AOS PEDIDOS PRIORITÁRIOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício da prioridade dos pedidos provisórios nos. US 62/671,816, depositado em 15 de maio de 2018, e US 62/788,045, depositado em 3 de janeiro de 2019, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM FORMATO ELETRÔNICO
[002] O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de Sequências Eletrônica como um arquivo de texto ASCII através da EFS-Web. A Listagem de Sequências Eletrônica é fornecida com um arquivo intitulado ILLINC363WOSEQLIST.txt, criado e salvo pela última vez em 10 de maio de 2019, o qual tem 2.806 bytes de tamanho. A informação na Listagem de Sequências Eletrônica é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES Campo
[003] Concretizações da presente divulgação se referem a métodos de preparação de modelos para o sequenciamento de polinucleotídeos. Em particular, a divulgação se refere à linearização de polinucleotídeos agrupados em preparação para o sequenciamento por clivagem química de uma ou mais primeiras fitas de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados em um suporte sólido, em alguns casos por reação na presença de um complexo de metal de transição, tal como um complexo de paládio ou um complexo de níquel. Além disso, a divulgação se refere à desproteção quimicamente mediada de iniciadores modificados em um suporte sólido.
[004] Diversos métodos de sequenciamento de ácido nucleico são conhecidos no estado da técnica. A patente norte americana nº US 5,302,509 descreve um método para o sequenciamento de um modelo de polinucleotídeo que envolve a realização de reações de múltiplas extensões usando uma DNA polimerase ou DNA ligase para incorporar, de forma bem sucedida, polinucleotídeos marcados complementares a uma fita modelo. Na referida reação de “sequenciamento por síntese” (SBS), uma nova fita de polinucleotídeo com bases pareadas à fita modelo é construída na direção 5’ para 3’ pela incorporação sucessiva de nucleotídeos individuais complementares à fita modelo. O substrato de nucleosídeo trifosfatos usados na reação de sequenciamento é marcado na posição 3’ com diferentes marcadores 3’, permitindo a determinação da identidade do nucleotídeo incorporado à medida que nucleotídeos sucessivos são adicionados.
[005] A fim de maximizar o rendimento das reações de sequenciamento de ácido nucleico, é vantajoso ser capaz de sequenciar múltiplas moléculas modelo em paralelo. O processamento em paralelo de múltiplos modelos pode ser alcançado com o uso de tecnologia de matrizes de ácido nucleico. Estas matrizes consistem tipicamente de uma matriz de alta densidade de polinucleotídeos imobilizados em material de suporte sólido.
[006] Diversos métodos para a fabricação de matrizes de ensaios nucleicos imobilizados foram descritos no estado da técnica. O WO 98/44151 e o WO 00/18957 descrevem ambos,
métodos de amplificação do ácido nucleico o qual permite que os produtos da amplificação sejam imobilizados em um suporte sólido a fim de formar matrizes compreendidas de agrupamentos ou “colônias” formadas a partir de uma pluralidade de fitas de polinucleotídeo idênticas imobilizadas e uma pluralidade de fitas complementares idênticas imobilizadas.
As matrizes deste tipo são aqui referidas como “matrizes agrupadas”. As moléculas de ácido nucleico presentes nas colônias de DNA nas matrizes agrupadas preparadas de acordo com estes métodos podem fornecer modelos para as reações de sequenciamento, por exemplo, tal como descrito no WO 98/44152. Os produtos das reações de amplificação em fase sólida tal como aqueles descritos no WO 98/44151 e no WO 00/18957 são denominados estruturas “em ponte” formadas pelo anelamento de pares de fitas de polinucleotídeo imobilizadas e fitas complementares imobilizadas, ambas as fitas estando ligadas ao suporte sólido na extremidade 5′. A fim de fornecer mais modelos adequados para o sequenciamento de ácido nucleico, é preferido remover substancialmente toda ou pelo menos uma porção de uma das fitas imobilizadas na estrutura “em ponte” a fim de gerar um modelo o qual é pelo menos parcialmente de única fita.
A porção do modelo o qual é de única fita estará, então, disponível para hibridização por um iniciador de sequenciamento.
O processo de remoção de todos ou uma porção de uma fita imobilizada em uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla “em ponte” é referida como “linearização”. Existem diversas formas para a linearização, incluindo, porém não limitada a, clivagem enzimática, clivagem fotoquímica ou clivagem química. Exemplos não limitativos de métodos de linearização são descritos na publicação do PCT nº WO 2007/010251 e publicação da patente norte americana nº US 2009/0088327 e na publicação da patente norte americana nº US 2009/0118128, os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
[007] Métodos enzimáticos são conhecidos por facilitar uma eficiente clivagem sítio-específica de oligonucleotídeos ou polinucleotídeos para linearizar agrupamentos de DNA fita dupla e para desproteger iniciadores ligados à superfície. Atualmente, enzimas têm sido extensivamente usadas em ambos os tipos de reações em diversas aplicações de sequenciamento. No entanto, existem determinadas questões com as abordagens enzimáticas, incluindo estabilidade enzimática, custos da produção das enzimas, armazenamento específico e requisitos de manuseio, variações na atividade enzimática e alta intensidade do fundo na leitura do sequenciamento. Portanto, existe uma necessidade de desenvolver métodos alternativos de linearização e desproteção para o sequenciamento eficaz do DNA. No entanto, existem muitas limitações para os tipos de reação que podem ser aplicadas às etapas de linearização neste contexto, como os reagentes, condições e subprodutos (a) devem ser compatível com reações à montante e à jusante, incluindo hibridização e deshibridização de oligonucleotídeos, extensão por PCR do iniciador e síntese de DNA, (b) devem exibir boa estabilidade sob condições ácidas, básicas e oxidativas, (c) devem efetuar uma reação química rápida e limpa e (d) não devem interferir com métodos de detecção de nucleotídeos. A presente divulgação descreve as etapas de clivagem química e desproteção que são alternativas eficazes que vão de encontro às limitações descritas acima.
SUMÁRIO
[008] Algumas concretizações da presente divulgação se referem a métodos de linearização de uma pluralidade de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados, compreendendo: prover um suporte sólido compreendendo polinucleotídeos de fita dupla, em que cada polinucleotídeo de fita dupla compreende uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeira fita e a segunda fita são, cada, imobilizadas no suporte sólido nas suas extremidades 5′, e em que cada primeira fita compreende um primeiro sítio de clivagem capaz de sofrer clivagem química na presença de um complexo de metal de transição, em que o complexo de metal de transição é um complexo de paládio ou um complexo de níquel; contatar os polinucleotídeos de fita dupla com uma solução aquosa do complexo de metal de transição, clivando assim uma ou mais primeiras fitas no primeiro sítio de clivagem, e gerar um ou mais primeiros ácidos nucleicos clivados e primeiras fitas imobilizadas clivadas; e remover os primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido. Nos referidos métodos, a segunda fita imobilizada permanece no suporte sólido após a remoção dos primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido, e permanece hibridizada nas primeiras fitas imobilizadas clivadas. Em algumas concretizações, o complexo de paládio
(Pd) é um complexo de Pd(0). Em algumas concretizações, o complexo de níquel (Ni) é um complexo de Ni(0). Em algumas concretizações, o primeiro sítio de clivagem compreende funcionalidade alil. Em algumas concretizações adicionais, o primeiro sítio de clivagem ainda compreende uma porção fosfato. Em algumas concretizações, o primeiro sítio de clivagem é um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado compreendendo uma porção de alil fosfato.
[009] A presente divulgação é também referida a métodos de desproteção química de oligonucleotídeos em um suporte sólido, compreendendo prover um suporte sólido com uma pluralidade de oligonucleotídeos imobilizados nos mesmos, em que os oligonucleotídeos compreendem, cada, um grupo de proteção no hidroxil 3ʹ, tal como um nucleotídeo ou nucleosídeo modificado contendo um grupo fosfato que é capaz de sofrer desproteção química, ou uma porção fosfato no terminal 3’ modificada, e reagir os oligonucleotídeos com um reagente de desproteção, clivando, assim, o grupo de proteção (tal como uma porção fosfato no terminal 3’ modificada) para produzir oligonucleotídeos imobilizados com um grupo hidroxil 3ʹ livre. Em alguns aspectos, o grupo de proteção é uma porção fosfato no terminal 3’ com uma estrutura de Fórmula (I): (I) em que a porção fosfato é um fosfato na extremidade 3ʹ do oligonucleotídeo imobilizado;
R1 é –NH2, –OH, –NHC(O)ORa ou –OCH2OSi(Rb)3; em que Ra é C1-4-alquil, tert-butil, alil, benzil, ou 9-fluorenilmetil; e cada Rb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em C1-4alquil e fenil; e R2 é H, C1-4-alquil, um tetrahidrofurano opcionalmente substituído, ou um nucleotídeo.
[0010] Em alguns aspectos da Fórmula (I), R1 é – NHC(O)ORa. Em alguns aspectos, Ra é 9-fluorenilmetil, benzil, ou alil. Em alguns aspectos, R1 é –OCH2OSi(Rb)3. Em alguns aspectos, cada Rb é isopropil. Em alguns aspectos, cada Rb é independentemente metil, etil, tert-butil, ou fenil.
[0011] Em alguns aspectos, o reagente de desproteção é íon fluoreto (por exemplo, TBAF, HF, ou CsF) ou base fraca (por exemplo, hidróxido de sódio). Em alguns aspectos, os oligonucleotídeos imobilizados são as primeiras fitas imobilizadas clivadas geradas pela clivagem química das primeiras fitas, tal como aqui descrito. Logo, em alguns aspectos, as primeiras fitas compreendem um nucleotídeo modificado que está presente nas primeiras fitas imobilizadas clivadas após a clivagem e remover os primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido. Os métodos aqui descritos compreendem remover o grupo de proteção hidroxil 3ʹ das primeiras fitas imobilizadas clivadas após o final da Leitura 1. Em algumas concretizações, as primeiras fitas imobilizadas clivadas compreendem grupo fosfato terminal. Em outros aspectos, os métodos compreendem bloquear o fosfato do terminal 3ʹ das primeiras fitas imobilizadas clivadas após a clivagem e remover os primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido. Em alguns aspectos, o bloqueio se dá pela reação do fosfato do terminal 3ʹ com um grupo de bloqueio antes do sequenciamento das segundas fitas imobilizadas, e remoção do grupo de bloqueio após o final da Leitura 1 para gerar o grupo hidroxil 3ʹ de acordo com os métodos de clivagem química aqui descritos. As extremidades 3ʹ das segundas fitas permanecem hibridizadas com as primeiras fitas clivadas imobilizadas durante e após a reação de desproteção.
[0012] Em outros aspectos, o grupo de proteção hidroxil 3ʹ é um grupo ou porção fosfato, o qual está presente nas primeiras fitas imobilizadas clivadas após a primeira clivagem, e os métodos compreendem remover o grupo ou porção fosfato na presença de uma enzima de desfosforilação tal como T4PNK. As extremidades 3ʹ das segundas fitas permanecem hibridizadas com as primeiras fitas clivadas imobilizadas durante e após a reação de desproteção enzimática.
[0013] Em algumas concretizações, os métodos ainda compreendem o sequenciamento das segundas fitas imobilizadas após a remoção dos primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido. Em alguns aspectos, o sequenciamento compreende incorporar, de forma bem sucedida, nucleotídeos marcados complementares às segundas fitas imobilizadas e detectar os nucleotídeos marcados após cada incorporação sucessiva. No sequenciamento de extremidades pareadas, ambas as fitas de um ácido nucleico de fita dupla são, em última análise, sequenciadas, e nos referidos casos, o sequenciamento da segunda fita imobilizada é aqui referido como “Leitura 1”.
[0014] Em outras concretizações, cada segunda fita imobilizada compreende um segundo sítio de clivagem capaz de sofrer clivagem química. Em alguns aspectos, após o sequenciamento das segundas fitas (Leitura 1), e remoção do grupo de proteção hidroxil 3ʹ das primeiras fitas clivadas imobilizadas, os métodos ainda compreendem sintetizar os complementos para as segundas fitas imobilizadas para gerar polinucleotídeos derivados de fita dupla, em que cada polinucleotídeo derivado de fita dupla compreende uma segunda fita e uma primeira fita derivada, em que a primeira fita derivada e a segunda fita são, cada, imobilizadas no suporte sólido nas suas extremidades 5ʹ. Os métodos da divulgação incluem clivar uma ou mais segundas fitas no segundo sítio de clivagem, gerando, assim, um ou mais segundos ácidos nucleicos clivados e segundas fitas clivadas imobilizadas, e remover os segundos ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido. Nos referidos métodos, as primeiras fitas derivadas imobilizadas permanecem no suporte sólido após a remoção dos segundos ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido, e permanecem hibridizadas às segundas fitas clivadas imobilizadas.
[0015] Em algumas das referidas concretizações, o segundo sítio de clivagem da segunda fita é capaz de sofrer clivagem química, e a segunda fita é clivada por uma reação química. Por exemplo, o segundo sítio de clivagem compreende uma ou mais ligações diol vicinais (as quais podem ser clivadas por oxidação, tal como tratamento com um reagente periodato), ligações bissulfeto (cliváveis, por exemplo, sob condições redutoras tal como DTT, ou na presença de uma fosfina), grupos orto-nitrobenzil (cliváveis, por exemplo, por fotólise), ligações azobenzeno (cliváveis, por exemplo, na presença de Na2S2O4), ligações alquil-selênio (cliváveis, por exemplo, por oxidação tal como peróxido de hidrogênio), ligações silil éter (cliváveis, por exemplo, por íon fluoreto, ácido, ou base), ou ligações alil carbamato (cliváveis, por exemplo, na presença de um complexo de paládio). Em alguns aspectos, a ligação é selecionada de modo que a segunda clivagem libera porções hidroxil.
Em alguns aspectos, a clivagem remove o sítio reativo do ligante (por exemplo, a oxidação de um diol vicinal deixa dois compostos carbonil separados, e um diol não está mais presente). Em alguns aspectos, o segundo sítio de clivagem está em qualquer posição ao longo da segunda fita, porém está preferencialmente ligado na estrutura próxima da extremidade 5’ da segunda fita (por exemplo, próxima da ligação ao suporte sólido). Em algumas concretizações, as condições da clivagem química para clivar a primeira fita e a segunda fita são diferentes, e a primeira fita e a segunda fita não podem ser clivadas pelas mesmas condições de clivagem (por exemplo, os sítios de clivagem são ortogonais). Em alguns aspectos, ambas as etapas da clivagem não precisam ser etapas de clivagem química.
Por exemplo, as primeiras fitas podem ser clivadas por reação enzimática, enquanto as segundas fitas são clivadas por reação química, ou as primeiras fitas podem ser clivadas por reação química, enquanto as segundas fitas são clivadas por reação enzimática.
[0016] Algumas concretizações adicionais da presente divulgação se referem a métodos de linearização de uma pluralidade de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados, compreendendo: prover um suporte sólido compreendendo polinucleotídeos de fita dupla, cada polinucleotídeo de fita dupla compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeira fita e a segunda fita são imobilizadas no suporte sólido nas suas extremidades 5′, em que cada primeira fita compreende um primeiro sítio de clivagem, e em que cada uma da segunda fita compreende um segundo sítio de clivagem compreendendo um ligante de azobenzeno; clivar uma ou mais primeiras fitas no primeiro sítio de clivagem, e gerar um ou mais primeiros ácidos nucleicos clivados e primeiras fitas imobilizadas clivadas; remover os primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido; sequenciar as segundas fitas imobilizadas; ressintetizar primeiras fitas derivadas os quais são complementares às segundas fitas; e clivar uma ou mais segundas fitas no segundo sítio de clivagem, e gerar um ou mais segundos ácidos nucleicos clivados e segundas fitas clivadas imobilizadas. Em alguns aspectos dos referidos métodos, as primeiras fitas derivadas imobilizadas permanecem no suporte sólido após a remoção dos segundos ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido, e permanecem hibridizadas às segundas fitas clivadas imobilizadas.
[0017] Em alguns aspectos, os métodos ainda compreendem sequenciar as primeiras fitas derivadas imobilizadas após a remoção dos segundos ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido. Em alguns aspectos, o sequenciamento compreende incorporar, de forma bem sucedida, os nucleotídeos marcados complementares às primeiras fitas derivadas imobilizadas e detectar os nucleotídeos marcados após cada incorporação sucessiva. No sequenciamento de extremidades pareadas, ambas as fitas de um ácido nucleico de fita dupla são, em última análise, sequenciadas, e nos referidos casos, o sequenciamento da primeira fita derivada imobilizada é aqui referido como “Leitura 2”.
[0018] Algumas concretizações da presente divulgação se referem a métodos de preparação de porção de bloqueio 3′ a qual pode ser removida por uma reação química no método de sequenciamento de extremidades pareadas (descrito na publicação norte americana nº US 2009/0088327, a qual é incorporada por referência em sua totalidade). Os métodos compreendem: prover um suporte sólido compreendendo polinucleotídeos de fita dupla, cada polinucleotídeo de fita dupla compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeira fita e a segunda fita são imobilizadas no suporte sólido nas suas extremidades 5′, e em que cada primeira fita compreende um primeiro sítio de clivagem; clivar uma ou mais primeiras fitas no primeiro sítio de clivagem para gerar um ou mais primeiros ácidos nucleicos clivados e primeiras fitas imobilizadas clivadas; e introduzir uma porção de bloqueio 3′ na extremidade 3′
das primeiras fitas imobilizadas clivadas, em que a porção de bloqueio 3′ pode ser removida por uma reação química. Em algumas outras concretizações, em vez de introduzir a porção de bloqueio 3′ na extremidade 3′ das primeiras fitas imobilizadas clivadas, a porção de bloqueio 3′ é gerada a partir do primeiro sítio de clivagem após a referida etapa de clivagem. Em algumas concretizações, a porção de bloqueio 3′ compreende um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado contendo uma porção fosfato. Na referida concretização, a porção de bloqueio 3′ compreende um nucleosídeo modificado, o nucleosídeo modificado contendo um–CH2OH extra ou –CH2OH protegido na posição 5′ do nucleosídeo. Em outra referida concretização, a porção de bloqueio 3′ compreende um nucleosídeo modificado, o nucleosídeo modificado contendo um–CH2NH2 extra ou –CH2NH2 protegido na posição 5′ do nucleosídeo. Em algumas concretizações, os métodos ainda compreendem remover a porção de bloqueio 3′ na reação química, por exemplo, em uma solução aquosa compreendendo um agente fluoreto ou uma base.
[0019] Algumas concretizações da presente divulgação se referem a um suporte sólido compreendendo uma pluralidade de polinucleotídeos da primeira fita imobilizados na mesma, cada polinucleotídeo da primeira fita compreendendo um primeiro sítio de clivagem capaz de sofrer clivagem química por um complexo de paládio ou um complexo de níquel, em que a pluralidade de polinucleotídeos da primeira fita é imobilizada no suporte sólido nas suas extremidades 5′. Em algumas concretizações,
o suporte sólido ainda compreende uma pluralidade de polinucleotídeos da segunda fita imobilizados na mesma, cada polinucleotídeo da segunda fita compreendendo um segundo sítio de clivagem, em que a pluralidade de polinucleotídeos da segunda fita é imobilizada no suporte sólido nas suas extremidades 5′. Em algumas concretizações, o complexo de paládio é um complexo de paládio (0). Em algumas concretizações, o primeiro sítio de clivagem compreende uma funcionalidade alil. Em uma concretização, o primeiro sítio de clivagem compreende um alildT. Em algumas concretizações adicionais, o primeiro sítio de clivagem ainda compreende uma porção fosfato, a qual permanece na primeira fita clivada imobilizada após a clivagem química. Em uma concretização, a porção fosfato compreende a estrutura da Fórmula (I). Em algumas concretizações, o segundo sítio de clivagem pode ser clivado por um método selecionado a partir do grupo que consiste em clivagem química, fotoclivagem, clivagem enzimática, ou uma combinação dos mesmos. Em uma concretização, o segundo sítio de clivagem é clivado por uma reação de clivagem química. Em algumas das referidas concretizações, o segundo sítio de clivagem pode compreender um ligante diol da Fórmula (VIII) ou (VIIIa), ou um ligante de azobenzeno da Fórmula (X) tal como descrito abaixo.
[0020] A divulgação está também direcionada para nucleosídeos ou nucleotídeos modificados e oligonucleotídeos e métodos de preparação dos referidos compostos. Em um aspecto, o nucleosídeo modificado ou nucleotídeo modificado compreende a estrutura da Fórmula
(II): (II) em que R é H, OH ou OPG; R1 é H ou PG; R2 é H, PG, ou –OR2 é um grupo fosfato; PG é um grupo de proteção hidroxil; Base é adenina, guanina, citosina, timina, ou uracila, ou um derivado das mesmas. Em algumas concretizações, o grupo fosfato pode estar negativamente carregado (por exemplo, -PO4-). Em um aspecto, o nucleosídeo ou nucleotídeo modificado apresenta a estrutura da Fórmula (IIa): (IIa).
[0021] Em um aspecto é um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado compreendendo a estrutura da Fórmula (II´) quando o nucleosídeo ou nucleotídeo modificado da Fórmula (II) está incorporado em um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo, em que o oxigênio 3′ do nucleosídeo ou nucleotídeo modificado com alil está covalentemente ligado à extremidade 5′ de outro nucleotídeo (estrutura não mostrada):
(II´).
[0022] Em algumas concretizações, o grupo fosfato pode estar negativamente carregado (por exemplo, -PO4-).
[0023] Em outro aspecto é um oligonucleotídeo compreendendo um alil nucleosídeo ou nucleotídeo, em que o oligonucleotídeo é um composto da Fórmula (III): (III) em que cada Base é independentemente adenina, guanina, citosina, timina, ou uracila, ou um derivado das mesmas; e o oligonucleotídeo está opcionalmente ligado a um suporte sólido. Em algumas concretizações, o grupo fosfato pode estar negativamente carregado (por exemplo, -PO4-).
[0024] Em alguns aspectos, a extremidade 5ʹ do oligonucleotídeo (no asterisco) está ligada a um suporte sólido.
[0025] A divulgação adicional se refere a um reagente químico para incorporar um alil nucleotídeo em um polinucleotídeo, em que o reagente químico é um composto da Fórmula (IV): (IV) em que PG é H ou um grupo de proteção hidroxil; e Base é adenina, guanina, citosina, timina, ou uracila, ou um derivado das mesmas.
[0026] Em alguns aspectos, PG é um grupo de proteção que é clivável sob condições ácidas fracas. Em alguns aspectos, PG é tritil ou dimetoxitritil (DMT).
[0027] Em alguns aspectos é um método de produção do composto da Fórmula (IV) compreendendo: reagir o composto da Fórmula A: Fórmula A com um reagente de Grignard vinil (tal como vinil MgCl ou vinil MgBr), opcionalmente em temperatura ambiente, para formar o composto da Fórmula B:
Fórmula B
[0028] Em alguns aspectos, o método compreende oxidar o composto da Fórmula C (opcionalmente por meio de uma oxidação de Pfitzner-Moffatt ou usando 1-etil-3-(3- dimetil aminopropil)carbodiimida (EDC) ou N,Nʹ-diciclohexil carbodiimida (DCC), ácido dicloroacético (DCA), e DMSO): Fórmula C para formar o composto da Fórmula A.
[0029] Em alguns aspectos, o método compreende reagir o composto da Fórmula D: Fórmula D com TBDPSCl (cloreto de tert-butildifenilsilil) na presença de uma base (tal como imidazol) seguido por um ácido fraco tal como PTSA (ácido p-tolueno sulfônico) em um procedimento em um frasco sem isolar o intermediário bi- protegido, para formar o composto da Fórmula C.
[0030] Em outro aspecto, é um nucleosídeo ou nucleotídeo compreendendo uma porção de bloqueio 3′ de uma estrutura da Fórmula (I): (I) em que R1 é –NH2, –OH, –NHC(O)ORa ou –OCH2OSi(Rb)3; Ra é C1-4 alquil, tert-butil, alil, benzil, ou 9- fluorenilmetil; cada Rb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em C1-4 alquil e fenil; e R2 é H, C1-4 alquil, um tetrahidrofurano opcionalmente substituído, ou um nucleotídeo. Em algumas concretizações, o grupo fosfato pode estar negativamente carregado (por exemplo, PO4-).
[0031] Em outro aspecto, é um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado com fosfato 3ʹ compreendendo a estrutura da Fórmula (V): (V) em que R1 é –NH2, –OH, –NHC(O)ORa ou –OCH2OSi(Rb)3; Ra é C1-4 alquil, tert-butil, alil, benzil, ou 9- fluorenilmetil;
cada Rb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em C1-4 alquil e fenil; e Base é uma adenina, guanina, citosina, timina, ou uracila opcionalmente protegida, ou um derivado das mesmas. Em algumas concretizações, o grupo fosfato pode estar negativamente carregado (por exemplo, PO4-). Em algumas concretizações, o composto da Fórmula (V) pode ser preparado a partir de um composto da Fórmula (V’): em que X é O ou NH; R1’ é OH protegido (isto é, -O-TOM, -O-tritil, -O-DMT, -OTMS, -O-TBDMS, -O-TIPS, -OBz) ou NH2 protegido(isto é, - NH-Boc, -NH-Fmoc, -NH-CBz, -NH-Alloc); e R1 é NH2 ou OH.
[0032] Em outro aspecto, é um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo modificado com fosfato 3ʹ da Fórmula (V), em que o oligonucleotídeo é um composto da Fórmula (VI): (VI)
em que R1 é –NH2, –OH, –NHC(O)ORa ou –OCH2OSi(Rb)3; Ra é C1-4 alquil, tert-butil, alil, benzil, ou 9- fluorenilmetil; cada Rb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em C1-4 alquil e fenil; cada Base é independentemente uma adenina, guanina, citosina, timina, ou uracila opcionalmente protegida, ou um derivado das mesmas. Em algumas concretizações, o oligonucleotídeo está opcionalmente ligado a um suporte sólido. Em algumas concretizações, o grupo fosfato pode estar negativamente carregado (por exemplo, PO4-). Em algumas concretizações, o composto da Fórmula (VI) pode ser preparado a partir do composto da Fórmula (VI’): em que X é O ou NH; R1’ é OH protegido (isto é, -O-TOM, -O-tritil, -O-DMT, -OTMS, -O-TBDMS, -O-TIPS, -OBz,) ou NH2 protegido (isto é, -NH-Boc, -NH-Fmoc, -NH-CBz, -NH-Alloc); e R1 é NH2 ou OH.
[0033] Em alguns aspectos da Fórmula (V) ou (VI), R1 é –NHC(O)ORa. Em alguns aspectos, Ra é 9-fluorenilmetil, benzil, ou alil. Em alguns aspectos, R1 é –OCH2OSi(Rb)3. Em alguns aspectos, cada Rb é isopropil. Em alguns aspectos,
cada Rb é independentemente metil, etil, tert-butil, ou fenil.
[0034] A divulgação também se refere a um reagente químico para introduzir um nucleotídeo modificado com fosfato 3ʹ em um polinucleotídeo, em que o reagente químico é um composto da Fórmula (VII): (VII) em que R1 é tal como definido acima; PG é H ou um grupo de proteção hidroxil; e Base é uma adenina, guanina, citosina, timina, ou uracila opcionalmente protegida, ou um derivado das mesmas.
[0035] Em alguns aspectos da Fórmula (VII), R1 é – NHC(O)ORa. Em alguns aspectos, Ra é 9-fluorenilmetil, benzil, ou alil. Em alguns aspectos, R1 é –OCH2OSi(Rb)3. Em alguns aspectos, cada Rb é isopropil. Em alguns aspectos, cada Rb é independentemente metil, etil, tert-butil, ou fenil.
[0036] A divulgação também se refere a métodos de produção de ligantes diol para a incorporação em polinucleotídeos. Em alguns aspectos, o ligante diol é um ligante diol tal como descrito na patente norte americana nº US 8,715,966. Em alguns aspectos, o ligante diol apresenta a estrutura da Fórmula (VIII):
(VIII) em que r é 2, 3, 4, 5, ou 6; s é 2, 3, 4, 5, ou 6; o oxigênio “a” é o oxigênio do hidroxil 3’ de um primeiro nucleotídeo; e o oxigênio “b” é o oxigênio do hidroxil 5’ de um segundo nucleotídeo.
[0037] Em alguns aspectos, o ligante diol apresenta a estrutura da Fórmula (VIIIa): (VIIIa) em que “a” e “b” são tal como definidos acima.
[0038] A divulgação se refere a métodos de produção de um reagente químico para a incorporação de um ligante da Fórmula (VIII) ou (VIIIa) em um polinucleotídeo, em que o reagente químico é um composto da Fórmula (IX): (IX) em que r é 2, 3, 4, 5, ou 6 (em alguns aspectos, r é 5); s é 2, 3, 4, 5, ou 6 (em alguns aspectos, s é 3); e PG é um grupo de proteção removível sob condições fracamente ácidas (por exemplo, tritil ou dimetoxitritil).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0039] FIG. 1 ilustra uma concretizaçãode um fluxograma da química do sequenciamento por síntese (SBS) de Illumina.
[0040] FIG. 2A ilustra imagens Typhoon de uma alta densidade do iniciador não-padronizado da superfície da célula de fluxo antes e após o tratamento com um complexo Pd(0), em que a superfície da célula de fluxo é enxertada com iniciadores modificados com alil.
[0041] FIG. 2B é um gráfico de barras que demonstra a mudança na densidade do iniciador após o tratamento com Pd(0) descrito na FIG. 2A quando comparado com a superfície da célula de fluxo enxertada com iniciadores controle sem a funcionalidade alil.
[0042] FIG. 3A é um gráfico de barras que demonstra Ensaio QC de fluorescência da superfície corada com TET (TET-QC) resulta de uma alta densidade do iniciador não- padronizado da célula de fluxo enxertada com iniciadores P5 modificados com alil e iniciadores P7 padrão (Canais 1 - 4), quando comparado à célula de fluxo enxertada com iniciadores P5/P7 padrão (Canais 5 - 8).
[0043] FIG. 3B ilustra a imagem Typhoon da superfície da célula de fluxo após o TET-QC descrito em FIG. 3A.
[0044] FIG. 4 ilustra a taxa de erro em % dos dados de sequenciamento em um instrumento de 2 canais Miseq® usando a célula de fluxo padrão e um novo tipo de célula de fluxo.
[0045] FIG. 5A ilustra as atividades da clivagem
P15 das Formulações isoladas a partir de Pd(C3H5)Cl)2 na presença de 1 a 10 equivalentes de THP (10 mg/mL, N = 4 para cada condição) quando comparado a uma formulação de (Pd(C3H5)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM), e ascorbato de sódio (6 mM) (N = 2).
[0046] FIG. 5B ilustra as atividades da clivagem P15 de uma formulação contendo [Pd(C3H5) (THP)2]Cl e 1 ou mais equivalentes de THP (12 mM Pd, N = 2 para cada condição) quando comparado a uma formulação de (Pd(C3H5)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM), e ascorbato de sódio (6 mM) (N = 2).
[0047] FIG. 6A mostra intensidades médias da Leitura 1 de NovaSeq™ para 10 mM de Pd(THM)4 quando comparado a um reagente de Pd(0) gerado in situ.
[0048] FIG. 6B mostra a taxa de erro média PhiX da NovaSeq™ para 10 mM de Pd(THM)4 quando comparado a um reagente de Pd(0) gerado in situ.
[0049] FIG. 7 mostra a atividade da clivagem P15 de Pd(THP)2-4 (10 mg/mL) quando comparado a uma formulação de(Pd(C3H5)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM), e ascorbato de sódio (6 mM).
[0050] FIG. 8 é um gráfico de barras da intensidade fluorescente da célula de fluxo enxertada com Iniciadores P15/P7 após o tratamento com Pd-THP ou Ni-THP.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES
[0051] Estratégias de linearização química não enzimática são uma alternativa atrativa para a clivagem de estruturas de polinucleotídeos de fita dupla em ponte a frente de cada leitura de sequenciamento. Em particular, agentes químicos podem, com frequência, ser armazenados por períodos prolongados em temperatura ambiente e são relativamente baratos quando comparado a enzimas.
O presente pedido se refere a métodos de linearização química de agrupamentos de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados em um suporte sólido para gerar um modelo para o sequenciamento.
Cada polinucleotídeo de fita dupla compreende uma primeira fita e uma segunda fita.
A primeira fita é gerada pela extensão de um primeiro iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido e a segunda fita é gerada pela extensão de um segundo iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido.
Cada uma da primeira e da segunda fita compreende um sítio de clivagem.
Em algumas concretizações, a primeira fita compreende um sítio de clivagem que é capaz de ser clivado por um complexo de paládio ou um complexo de níquel, por exemplo, um complexo de Pd(0) ou um complexo de Ni(0). Em uma concretização particular, o sítio de clivagem está localizado na porção do primeiro iniciador de extensão da primeira fita.
Em uma concretização adicional, o sítio de clivagem compreende um análogo de nucleosídeo ou nucleotídeo timina apresentando uma funcionalidade alil.
Em algumas concretizações, a segunda fita compreende um sítio de clivagem que inclui um ligante de azobenzeno que é capaz de ser clivado por um reagente químico, por exemplo, Na2S2O4. Alternativamente, a segunda fita compreende um sítio de clivagem que inclui um ligante diol que é capaz de ser clivado por um periodato, por exemplo, NaIO4. Os métodos aqui descritos podem ser usados como parte de uma reação de sequenciamento por síntese (SBS) em um sistema tal como os sistemas HiSeq®,
MiSeq® ou NextSeq® de Illumina (San Diego, CA).
[0052] FIG. 1 descreve uma concretizaçãode um fluxograma padrão da química SBS da Illumina. Primeiro, um suporte sólido compreendendo uma pluralidade de iniciadores P5/P7 imobilizados na superfície do suporte sólido é fornecida. Cada um dos iniciadores P5 e P7 apresenta um sítio de clivagem dentro da sequência. Em uma concretização, o sítio de clivagem no iniciador P5 é uma desoxiuridina (U). Em uma concretização, o sítio de clivagem no iniciador P7 é um nucleotídeo 8-oxo-guanina (oxo-G). Um conjunto de moléculas de DNA alvo para serem sequenciadas é hibridizado aos iniciadores P5/P7 imobilizados. Após a hibridização, as moléculas originais de DNA alvo são removidas, deixando apenas as cópias complementares dos polinucleotídeos estendidos contendo os iniciadores P5/P7. Esta etapa é também conhecida como uma etapa de “semeadura”. Então, os polinucleotídeos P5/P7 estendidos são amplificadas através de um processo denominado “amplificação em ponte”, que formam agrupamentos de fitas duplas com uma das fitas estando ligada ao suporte sólido na extremidade 5′. Após a etapa de “agrupamento”, a primeira linearização é realizada para remover uma porção dos polinucleotídeos estendidos contendo o iniciador P5. Em uma concretização, a referida remoção é facilitada por uma reação de clivagem enzimática usando uma enzima USER para clivar a posição U no iniciador P5. Após uma primeira rodada de SBS (Leitura 1), uma ressíntese é realizada para formar os polinucleotídeos de fita dupla novamente. Então, uma segunda linearização é realizada para remover uma porção dos polinucleotídeos estendidos contendo o iniciador P7. Em uma concretização, a referida remoção é facilitada por uma reação de clivagem enzimática usando uma enzima FPG para clivar a posição oxo-G de um iniciador P7. Então, uma segunda rodada de SBS é realizada (Leitura 2) para sequenciar um DNA alvo.
[0053] Os iniciadores P5 e P7 são usados na superfície de células de fluxo comerciais vendidas por Illumina, Inc. para o sequenciamento nas plataformas HiSeq®, MiSeq®, NextSeq® e Genome Analyzer®. As sequências de iniciador são descritas na publicação da patente norte americana nº US 2011/0059865 A1, a qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[0054] As sequências de iniciadores P5 e P7 padrão para o sequenciamento de extremidades pareadas compreende o seguinte: P5: pareado na extremidade 5′ → 3′ AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (SEQ ID NO. 1) P7: pareado na extremidade 5′ → 3′ CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (SEQ ID NO. 2) em que G* é 8-oxo-guanina.
[0055] Opcionalmente, um ou ambos os iniciadores P5 e P7 podem incluir uma cauda poli T. A cauda poli T está, em geral, localizada na extremidade 5′ das sequências acima mencionadas, porém, em alguns casos, pode estar localizada na extremidade 3′. A sequência poli T pode incluir qualquer número de nucleotídeos T, por exemplo, de 2 a 20.
[0056] As sequências de iniciadores P5 e P7 padrão usadas em uma célula de fluxo revestida com PAZAM com um espaçador poli T compreende o seguinte: Iniciador P5 com espaçador poli T: 5′-alquino-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (SEQ ID NO. 3) Iniciador P7 com espaçador poli T: 5′-alquino-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (SEQ ID NO: 4) em que G* é 8-oxo-guanina.
[0057] Sequências de iniciador adicionais incluem um conjunto de iniciadores P5 e P7 para uma única leitura de SBS: P5: única leitura: 5ʹ → 3ʹ AATGATACGGCGACCACCGA (SEQ ID NO. 7) P7: única leitura 5ʹ → 3ʹ CAAGCAGAAGACGGCATACGA (SEQ ID NO. 8)
[0058] Tal como aqui utilizado, quando os iniciadores ou oligos P5/P7 padrão são modificados para incorporar um primeiro ou segundo sítio de clivagem que é capaz de sofrer clivagem química, por exemplo, por um complexo de Pd ou um complexo de Ni, a modificação dos iniciadores P5/P7 pode se referir à troca ou substituição de um nucleotídeo (ou nucleosídeo) existente na sequência P5/P7 com uma diferente entidade química, por exemplo, um análogo de nucleotídeo ou nucleosídeo modificado com funcionalidade específica para permitir clivagem química sítio específica. A modificação pode também se referir à inserção de uma nova entidade química dentro da sequência P5/P7 existente, em que a nova entidade química é capaz de sofrer clivagem química sítio específica. Em algumas concretizações, os iniciadores P5/P7 modificados são referidos como iniciadores P15/P17, respectivamente, e compreendem o seguinte: Iniciador P15 5ʹ → 3ʹ 5'-alquino-TTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC (SEQ ID NO. 5) em que X = alil T nucleosídeo tal como mostrado no Esquema 1. Iniciador P17 5ʹ → 3ʹ 5'-alquino-TTTTTTYYYCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (SEQ ID NO. 6) em que Y é um ligante diol submetido à clivagem química, por exemplo, por oxidação com um reagente tal como periodato, tal como descrito na publicação nº US 2012/0309634, a qual é incorporada por referência em sua totalidade. Em algumas concretizações, o ligante diol compreende uma Fórmula (VIII) ou (VIIIa) tal como aqui descrito. Definições
[0059] Os títulos da seção aqui utilizados são para fins de organização apenas e não devem ser interpretados como limitativos da matéria objeto descrita.
[0060] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados apresentam o mesmo significado como comumente entendido por um técnico no estado da técnica. O uso do termo “incluindo” bem como outras formas, tais como “inclui”, “incluem” e “incluída/o”, não é limitativo. O uso do termo “apresentando” bem como outras formas, tais como
“apresenta”, “apresentam” e “apresentava” não é limitativo. Tal como aqui utilizado neste relatório descritivo, se numa frase de transição ou no corpo da reivindicação, os termos “compreende” e “compreendendo” devem ser interpretados como apresentando um significado aberto. Isto é, os termos acima devem ser interpretados de forma sinônima com as frases “apresentando pelo menos” ou “incluindo pelo menos”. Por exemplo, quando usado no contexto de um processo, o termo “compreendendo” significa que o processo inclui pelo menos as etapas citadas, porém, pode incluir etapas adicionais. Quando usado no contexto de um composto, composição ou dispositivo, o termo “compreendendo” significa que o composto, composição ou dispositivo inclui pelo menos as características ou componentes citados, porém, pode também incluir características ou componentes adicionais.
[0061] Tal como aqui utilizado, abreviações orgânicas comuns são definidas como segue: Ac Acetil Ac2O Anidrido acético Alloc Aliloxicarbonil aq. Aquoso BOC ou Boc tert-Butoxicarbonil Bz Benzil °C Temperatura em graus Centígrados Cbz Benziloxicarbonil CVD Deposição de vapor químico dATP Desoxiadenosina trifosfato dCTP Desoxicitidina trifosfato dGTP Desoxiguanosina trifosfato dTTP Desoxitimidina trifosfato ddNTP(s) Didesoxinucleotídeo(s) DCM Cloreto de metileno DMF Dimetilformamida DMT ou DMTr Dimetoxitritil EtOAc Acetato de etila FC Célula de fluxo Fmoc Fluorenilmetiloxicarbonil g Grama(s) h ou hr Hora(s) IPA Álcool isopropílico LCMS Cromatografia líquida - espectrometria de massa mL Mililitro(s) Ni Níquel PE Éter de petróleo PAZAM poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida) de qualquer acrilamida para a proporção Azapa Pd Paládio rt Temperatura ambiente SBS Sequenciamento por síntese TBAF Fluoreto de Tetra-n-butilamônio TBDMS Tributildimetilsilil TEA Trietilamina TFA Ácido trifluoroacético Tert, t terciário THF Tetrahidrofurano THM Tris(hidroximetil)fosfina
THP Tris(hidroxipropil)fosfina TIPS Tri-isopropilsilil TLC Cromatografia em camada delgada TMS Trimetilsilil TOM Tri-isopropilsililoximetil Tritil Trifenilmetil µL Microlitro(s)
[0062] Tal como aqui utilizado, o termo “covalentemente anexado” ou “covalentemente ligado” se refere à formação de uma ligação química que é caracterizada pelo compartilhamento de pares de elétrons entre átomos. Por exemplo, um revestimento de polímero covalentemente ligado se refere a um revestimento de polímero que forma ligações químicas com uma superfície funcionalizada de um substrato, quando comparado à ligação à superfície por outros meios, por exemplo, adesão ou interação eletrostática.
[0063] Tal como aqui utilizado, o termo “iniciador de extensão” se refere a um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo imobilizado em um suporte sólido, em que o oligonucleotídeo ou polinucleotídeo é capaz de se ligar especificamente a uma sequência de uma molécula de ácido nucleico de fita única alvo. Após um processo de hibridização, o oligonucleotídeo ou polinucleotídeo se estende para compreender a sequência que é complementar à molécula de ácido nucleico alvo. Em alguns casos, o termo “iniciador de extensão” é usado de forma intercambiável com “iniciador de amplificação”.
[0064] Tal como aqui utilizado, os termos “ácido nucleico” e “nucleotídeo” pretendem ser consistentes com seu uso no estado da técnica e para incluir espécies de ocorrência natural ou análogos funcionais dos mesmos.
Análogos de ácidos nucleicos funcionais particularmente úteis são capazes de hibridizar para um ácido nucleico de uma maneira específica para a sequência ou são capazes de ser usados como um modelo para a replicação de uma sequência de nucleotídeo particular.
Ácidos nucleicos de ocorrência natural, em geral, apresentam uma estrutura contendo ligações fosfodiéster.
Uma estrutura análoga pode apresentar uma ligação de estrutura alternativa incluindo qualquer uma de uma variedade daquelas conhecidas no estado da técnica.
Ácidos nucleicos de ocorrência natural, em geral, apresentam um açúcar desoxirribose (por exemplo, encontrado no ácido desoxirribonucleico (DNA)) ou um açúcar ribose (por exemplo, encontrado no ácido ribonucleico (RNA)). Um ácido nucleico pode conter nucleotídeos que apresentam qualquer um de uma variedade de análogos destas porções de açúcar que são conhecidas no estado da técnica.
Um ácido nucleico pode incluir nucleotídeos nativos ou não nativos.
Neste sentido, um ácido desoxirribonucleico nativo pode apresentar uma ou mais bases selecionada(s) a partir do grupo que consiste em adenina, timina, citosina ou guanina e um ácido ribonucleico pode apresentar uma ou mais bases selecionada(s) a partir do grupo que consiste em uracila, adenina, citosina ou guanina.
Bases não nativas úteis que podem ser incluídas em um ácido nucleico ou nucleotídeo são conhecidas no estado da técnica.
Os termos “sonda” ou “alvo”, quando usados em referência a um ácido nucleico, são pretendidos como identificadores semânticos para o ácido nucleico no contexto de um método ou composição aqui indicados e não necessariamente limitam a estrutura ou função do ácido nucleico além do que é explicitamente indicado de outra forma. Os termos “sonda” e “alvo” podem ser aplicados de forma similar aos outros analitos tal como proteínas, pequenas moléculas, células ou similares.
[0065] Tal como aqui utilizado, o termo “polinucleotídeo” se refere a ácidos nucleicos em geral, incluindo DNA (por exemplo, cDNA de DNA genômico), RNA (por exemplo, mRNA), oligonucleotídeos sintéticos e análogos de ácido nucleico sintéticos. Os polinucleotídeos podem incluir bases naturais ou não naturais, ou combinações das mesmas e ligações de estrutura naturais ou não naturais, por exemplo, fosforotioatos, PNA ou 2′-O-metil-RNA, ou combinações das mesmas. Em alguns casos, o termo “polinucleotídeo”, “oligonucleotídeo” ou “oligo” são usados de forma intercambiável.
[0066] O termo “sítio de clivagem” tal como aqui utilizado se refere a uma posição na sequência de polinucleotídeo em que uma porção do polinucleotídeo pode ser removida por uma reação de clivagem. A posição do sítio de clivagem é preferencialmente pré-determinada, o que significa que a localização em que a reação de clivagem acontece é determinada previamente, oposta da clivagem em um sítio aleatório em que a localização da qual não é previamente conhecida.
[0067] Tal como aqui utilizado, o termo “suporte sólido” se refere a um substrato rígido que é insolúvel em líquido aquoso. O substrato pode ser não poroso ou poroso. O substrato pode opcionalmente ser capaz de recolher um líquido (por exemplo, devido à porosidade), porém será tipicamente suficientemente rígido de modo que o substrato não inche substancialmente quando recolha o líquido e não contraia substancialmente quando o líquido é removido pela secagem. Um suporte sólido não poroso é, em geral, impermeável a líquidos ou gases. Exemplos de suporte sólidos incluem, porém não estão limitados a, vidro e vidro modificado ou funcionalizado, plásticos (por exemplo, acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, TeflonTM, olefinas cíclicas, poliimidas, etc.), nylon, cerâmicas, resinas, Zeonor, sílica ou materiais a base de sílica incluindo silicone e silicone modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos, feixes de fibras ópticas e polímeros. Suportes sólidos particularmente úteis para algumas concretizações são componentes de uma célula de fluxo ou estão localizados dentro de um aparelho de célula de fluxo. O suporte sólido pode apresentar uma superfície planar, por exemplo, uma célula de fluxo, ou uma superfície não planar, por exemplo, um grânulo.
[0068] Onde quer que um substituinte seja mostrado como um bi-radical (isto é, apresenta dois pontos de ligação ao resto da molécula), deve ser entendido que o substituinte pode ser ligado em qualquer configuração direcional a menos se indicado de outra forma. Logo, por
A exemplo, um substituinte mostrado como –AE– ou E inclui o substituinte sendo orientado de modo que o A está ligado ao ponto de ligação mais a esquerda da molécula bem como o caso no qual o A está ligado ao ponto de ligação mais a direita da molécula. Métodos de Primeira Linearização Química Assistida por Paládio (Pd) ou Níquel (Ni)
[0069] Algumas concretizações da presente divulgação se referem a métodos de linearização de uma pluralidade de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados, compreendendo: prover um suporte sólido compreendendo polinucleotídeos de fita dupla, em que cada polinucleotídeo de fita dupla compreende uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeira fita e a segunda fita são, cada, imobilizadas no suporte sólido nas suas extremidades 5’, e em que cada primeira fita compreende um primeiro sítio de clivagem capaz de sofrer clivagem química na presença de um reagente de clivagem; contatar os polinucleotídeos de fita dupla com um reagente de clivagem, clivando assim uma ou mais primeiras fitas no primeiro sítio de clivagem, e gerar um ou mais primeiros ácidos nucleicos clivados e primeiras fitas imobilizadas clivadas; e remover os primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido. Em alguns aspectos, o sítio de clivagem é capaz de sofrer clivagem na presença de um complexo de Pd ou um complexo de Ni. Em alguns aspectos, um reagente de clivagem é uma solução aquosa do complexo de Pd ou do complexo de Ni. Em alguns aspectos, um reagente de clivagem é preparado in situ.
[0070] Em algumas concretizações dos métodos de linearização por Pd/Ni aqui descritos, cada primeira fita é estendida a partir de um primeiro iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido. Em algumas das referidas concretizações, o primeiro iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo que é uma sequência P5 ou P7 tal como aqui descrita, ou uma sequência que é complementar a P5 ou P7. Em uma concretização, o primeiro iniciador de extensão compreende uma Sequência de nucleotídeo P5 (SEQ ID NO. 1). Em uma concretização adicional, o primeiro iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo P5 com espaçador poli T (SEQ ID NO. 3). Em uma concretização, o primeiro iniciador de extensão é um iniciador P5. Em uma concretização adicional, o primeiro iniciador de extensão é um iniciador P5 com espaçador poli T. Em concretizações adicionais, o primeiro iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo que é uma sequência P5 ou P7 tal como aqui descrita, ou uma sequência que é complementar a P5 ou P7, em que um nucleotídeo da sequência é substituído por um nucleotídeo modificado que é suscetível à clivagem na presença de um complexo de paládio. Em alguns aspectos, o primeiro iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo de P15 tal como aqui descrito (SEQ ID NO. 5).
[0071] Em algumas concretizações dos métodos de linearização Pd/Ni aqui descritos, o primeiro iniciador de extensão compreende o primeiro sítio de clivagem. Em algumas concretizações adicionais, o primeiro sítio de clivagem compreende um nucleotídeo ou nucleosídeo modificado que é capaz de sofrer clivagem química, por exemplo pelo complexo de paládio. Em algumas concretizações, o nucleosídeo ou nucleotídeo modificado apresenta a estrutura da Fórmula (II): (II) em que R é H, OH ou OPG; R1 é H ou PG; R2 é H, PG, ou –OR2 é um grupo fosfato; PG é um grupo de proteção hidroxil; Base é adenina, guanina, citosina, timina, ou uracila, ou um derivado das mesmas. Em algumas concretizações, o grupo fosfato pode estar negativamente carregado (por exemplo, -PO4-). Em um aspecto, o nucleosídeo ou nucleotídeo modificado apresenta a estrutura da Fórmula (IIa): (IIa).
[0072] Em algumas concretizações, o primeiro sítio de clivagem incorporando a porção do nucleosídeo ou nucleotídeo modificado compreende a estrutura da Fórmula (II´), em que o oxigênio 3′ do nucleosídeo ou nucleotídeo modificado com alil está covalentemente ligado à extremidade 5′ de outro nucleotídeo (estrutura não mostrada):
(II´).
[0073] Em algumas concretizações, o grupo fosfato pode estar negativamente carregado (por exemplo, -PO4-).
[0074] Em algumas concretizações adicionais, o nucleotídeo ou nucleosídeo modificado pode ainda ser marcado com um marcador detectável, por exemplo, um marcador fluorescente. Em algumas concretizações, o nucleotídeo modificado compreende um substituinte vinil no carbono 5′ do nucleotídeo ou nucleosídeo, logo, formando uma porção alil em relação ao grupo hidroxil 5′. Em algumas concretizações, o grupo hidroxil 5′ se conecta a um fosfato 3′ de um segundo nucleotídeo, de modo que a unidade dinucleotídeo compreende um sítio de clivagem com uma porção de alil fosfato. Em algumas concretizações, o nucleotídeo ou nucleosídeo modificado é um análogo de nucleosídeo ou nucleotídeo timina (T). Em algumas concretizações adicionais, o grupo de proteção (ou bloqueio) hidroxil 3′, por exemplo, uma porção fosfato (tal como mostrada na Fórmula (IIʹ)), permanece nas primeiras fitas imobilizadas clivadas após a clivagem química das primeiras fitas. Na referida concretização, a porção fosfato 3′ do segundo nucleotídeo está covalentemente ligado à posição carbono 5′ do análogo de nucleosídeo modificado (isto é, o grupo fosfato inclui o hidroxil 5′ do nucleotídeo modificado). Em algumas concretizações, o sítio de clivagem está localizado próximo da extremidade 3′ do primeiro iniciador de extensão, por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos de distância da extremidade 3′ do primeiro iniciador de extensão. Em algumas outras concretizações, o sítio de clivagem está localizado próximo da extremidade 5’ do primeiro iniciador de extensão, por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos de distância da extremidade 5′ do primeiro iniciador de extensão. Em alguns casos, para garantir a ressíntese eficiente do DNA, o sítio de clivagem está preferencialmente localizado em direção à extremidade 3′ do primeiro iniciador, por exemplo, dentro de 2 a 8, ou 3 a 7, ou 4 a 6 nucleotídeos de distância. Em uma concretização, o primeiro iniciador de extensão é um iniciador P5 e o primeiro sítio de clivagem está localizado na sequência do iniciador P5 (por exemplo, o nucleotídeo modificado é incorporado na sequência do iniciador P5, pela adição ou substituição de um nucleotídeo). Portanto, a sequência P5 aqui descrita (SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO. 3) é modificada para incluir o primeiro sítio de clivagem que é capaz de sofrer clivagem química pelo complexo de Pd/Ni, assim, formando um iniciador P5 modificado. Em uma concretização, o iniciador P5 modificado compreende ou é um iniciador P15 aqui descrito (SEQ ID NO. 5). Reagentes de Paládio
[0075] Em algumas concretizações dos métodos de linearização com Pd aqui descritos, o complexo de Pd usado no método de linearização química é solúvel em água. Em algumas das referidas concretizações, o complexo de Pd é um complexo de Pd(0). Em alguns casos, o complexo de Pd(0) pode ser gerado in situ a partir da redução de um complexo de Pd(II) por reagentes tais como alquenos, álcoois, aminas, fosfinas, ou hidretos metálicos. Fontes de paládio adequadas incluem Na2PdCl4, (PdCl(C3H5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, Pd(OAc)2, Pd(Ph3)4, Pd(dba)2 e Pd(TFA)2. Na referida concretização, o complexo de Pd(0) é gerado in situ a partir de Na2PdCl4. Em outra concretização, a fonte de paládio é dímero de cloreto de alil paládio(II) [(PdCl(C3H5))2]. Em algumas concretizações, o complexo de Pd(0) é gerado em uma solução aquosa pela mistura de um complexo de Pd(II) com uma fosfina. Fosfinas adequadas incluem fosfinas solúveis em água, tal como tris(hidroxipropil) fosfina (THP), tris(hidroximetil) fosfina (THM), 1,3,5-triaza-7-fosfa-adamantano (PTA), sal de dihidrato de potássio bis(p-sulfonatofenil) fenilfosfina, tris(carboxi etil) fosfina (TCEP) e sal trissódico de ácido trifenil fosfina-3,3’,3’’- trissulfônico.
[0076] Em algumas concretizações, o Pd(0) é preparado pela mistura de complexo de Pd(II) [(PdCl(C3H5))2] com THP in situ. A proporção molar do complexo de Pd(II) e o THP pode ser de cerca de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 ou 1:10. Em algumas concretizações adicionais, um ou mais agentes redutores podem ser adicionados, tal como ácido ascórbico ou um sal do mesmo (por exemplo, ascorbato de sódio).
[0077] Em algumas concretizações, o Pd(0) é preparado pela mistura de pré-catalisador de Pd(II) tal como [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl com THP adicional. [Pd(C3H5)(THP)]Cl e [Pd(C3H5)(THP)2]Cl podem ser preparados pela reação de (PdCl(C3H5))2 com 1 a 5 equivalentes de THP e eles podem ser isolados antes do uso na reação de linearização química.
[0078] Em algumas outras concretizações, o complexo de Pd(0) é Pd(THM)4, Pd(THP)2, Pd(THP)3, ou PD(THP)4, ou combinações dos mesmos. Reagentes de Níquel
[0079] Em algumas concretizações dos métodos de linearização com Ni aqui descritos, o complexo de Ni usado no método de linearização química é solúvel em água. Em algumas das referidas concretizações, o complexo de Ni é um complexo de Ni(0). Em alguns casos, o complexo de Ni pode ser gerado in situ a partir da redução de um composto de Ni(II) por reagentes tais como alquenos, álcoois, aminas, fosfinas, ou hidretos metálicos. Em algumas concretizações, o composto de Ni(II) é NiCl2. Fosfinas adequadas incluem fosfinas solúveis em água, tal como tris(hidroxipropil) fosfina (THP), tris(hidroximetil) fosfina (THM), 1,3,5- triaza-7-fosfa-adamantano (PTA), sal de dihidrato de potássio bis(p-sulfonatofenil) fenilfosfina, tris(carboxi etil) fosfina (TCEP) e sal trissódico de ácido trifenil fosfina-3,3’,3’’-trissulfônico. Em uma concretização, o complexo de Ni é preparado pela mistura de NiCl2 com 1 a 10 equivalentes de THP.
[0080] Algumas concretizações da presente divulgação se referem a métodos de linearização de uma pluralidade de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados, compreendendo: prover um suporte sólido compreendendo polinucleotídeos de fita dupla, cada polinucleotídeo de fita dupla compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita, em que cada primeira fita é estendida a partir de um iniciador P5 modificado imobilizado no suporte sólido, cada uma segunda fita é estendida a partir de um iniciador P7 imobilizado no suporte sólido, ambas a primeira fita e a segunda fita são imobilizadas no suporte sólido nas suas extremidades 5′, em que cada iniciador P5 modificado compreende um primeiro sítio de clivagem capaz de sofrer clivagem química por um complexo de Pd(0); contatar os polinucleotídeos de fita dupla com uma solução aquosa do complexo de Pd(0), clivando assim uma ou mais primeiras fitas no primeiro sítio de clivagem, e gerar um ou mais primeiros ácidos nucleicos clivados e primeiras fitas imobilizadas clivadas; e remover os primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido.
Em algumas concretizações, o primeiro sítio de clivagem compreende um nucleosídeo ou nucleotídeo T modificado apresentando uma funcionalidade alil.
O sítio de clivagem pode ainda incluir uma porção de bloqueio 3′, por exemplo, uma porção fosfato, a qual permanece na primeira fita após a reação de clivagem com Pd para bloquear o -OH 3′ das primeiras fitas imobilizadas clivadas.
Em algumas concretizações, a porção de bloqueio 3′ compreende um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado contendo um grupo fosfato, o qual pode ser desprotegido por uma reação química ou por uma reação enzimática.
Em uma concretização, o iniciador P5 modificado compreende ou é P15. Desproteção 3’
[0081] Algumas concretizações da presente divulgação se referem a um método de remoção de um grupo de proteção da extremidade 3’ de um oligonucleotídeo, compreendendo: prover um suporte sólido compreendendo uma pluralidade de oligonucleotídeos imobilizados nos mesmos nas suas extremidade 5′, em que os oligonucleotídeos compreendem, cada, um grupo de proteção na extremidade 3’ apresentando uma estrutura da Fórmula (I) tal como aqui descrito; e contatar os oligonucleotídeos com um reagente de desproteção, assim clivando o grupo de proteção da extremidade 3’ para produzir oligonucleotídeos cada um com um grupo hidroxil na extremidade 3’ livre. A porção de fosfato modificada na extremidade 3′ apresenta a estrutura da Fórmula (I): (I) em que R1 é –NH2, –OH, –NHC(O)ORa ou –OCH2OSi(Rb)3; Ra é C1-4 alquil, tert-butil, alil, benzil, ou 9- fluorenilmetil; cada Rb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em C1-4 alquil e fenil; e R2 é H, C1-4 alquil, um tetrahidrofurano opcionalmente substituído, ou um nucleotídeo.
[0082] Em algumas concretizações adicionais, o grupo de proteção compreende a estrutura da Fórmula (V):
(V) em que Base é uma adenina, guanina, citosina, timina, ou uracila opcionalmente protegida, ou um derivado das mesmas. Em algumas concretizações, um ou mais grupos fosfato na Fórmula (I) ou (V) podem ser negativamente carregados (por exemplo, PO4-).
[0083] Em algumas concretizações da Fórmula (I) ou (V), R1 é –NHC(O)ORa. Em algumas concretizações, Ra é 9- fluorenilmetil, benzil ou alil. Em algumas concretizações, R1 é –OCH2OSi(Rb)3. Em algumas concretizações, cada Rb é isopropil. Em algumas concretizações, cada Rb é independentemente metil, etil, tert-butil, ou fenil.
[0084] Em algumas concretizações, o grupo fosfato modificado da Fórmula (I) ou (V) pode ser removido por um reagente químico de desproteção, tal como um fluoreto contendo reagente ou uma base. Exemplos não limitativos incluem fluoreto de tetra-n-butilamônio (TBAF), HF, NH4F, CsF, NaOH, e KOH, e combinações dos mesmos.
[0085] Em algumas concretizações dos métodos de linearização com Pd/Ni aqui descritos, após a primeira linearização, a porção remanescente das primeiras fitas imobilizadas apresentam um grupo hidroxil na extremidade 3’ não protegido e os métodos ainda incluem bloquear a extremidade 3′ da porção remanescente das primeiras fitas imobilizadas clivadas após a reação de clivagem com Pd/Ni.
Na referida concretização, o bloqueio compreende a fosforilação da extremidade 3′ das primeiras fitas imobilizadas clivadas como um grupo de proteção hidroxil 3′. Em algumas outras concretizações, a extremidade 3′ de cada uma das primeiras fitas imobilizadas clivadas compreende um grupo de proteção. Em algumas das referidas concretizações, o efeito do bloqueio pode ser alcançado por uma porção fosfato ou porção fosfato modificada que permanece nas primeiras fitas imobilizadas clivadas após a reação de clivagem, a qual serve como um grupo de bloqueio para o -OH 3′ das primeiras fitas imobilizadas clivadas. Em algumas concretizações, a porção fosfato modificada compreende a estrutura da Fórmula (I) ou (V) tal como aqui descrito.
[0086] O grupo fosfato ou grupo fosfato modificado é removido antes da ressíntese do DNA para gerar primeiras fitas derivadas que são complementares às segundas fitas imobilizadas. Em algumas concretizações, o grupo de proteção da extremidade 3′ é um grupo fosfato, o qual pode ser removido por uma fosfatase tal como T4PNK. Em algumas outras concretizações, o grupo de proteção da extremidade 3′ é um grupo fosfato modificado da Fórmula (I) ou (V), o qual pode ser removido por um reagente contendo fluoreto ou uma base, tal como fluoreto de tetra-n-butilamônio (TBAF), HF, NH4F, CsF, NaOH, ou KOH, ou combinações dos mesmos. Métodos de Segunda Linearização
[0087] Em algumas concretizações dos métodos de linearização com Pd/Ni aqui descritos, cada uma segunda fita é estendida a partir de um segundo iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido, e cada uma segunda fita compreende um segundo sítio de clivagem. Em algumas das referidas concretizações, o segundo iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo a partir do grupo que consiste em uma sequência P5 ou P7 tal como aqui descrita, ou uma sequência que é complementar a P5 ou P7. Em uma concretização, o segundo iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo P7 (SEQ ID NO. 2). Em uma concretização adicional, o segundo iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo P7 com um espaçador poli T (SEQ ID NO. 4). Em alguns aspectos, o segundo iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo que é P5 ou P7, com um nucleotídeo modificado incorporado (adicionado a ou substituindo uma base na sequência com uma base que apresenta um grupo de proteção hidroxil 3′). Em uma concretização adicional, o segundo iniciador de extensão compreende um iniciador P17 (SEQ ID NO. 6). Em uma concretização, o segundo iniciador de extensão é um iniciador P7. Em uma concretização adicional, o segundo iniciador de extensão é um iniciador P7 com espaçador poli T. Em outra concretização, o segundo iniciador de extensão é um iniciador P17.
[0088] Em algumas concretizações dos métodos de linearização com Pd/Ni aqui descritos, o segundo iniciador de extensão compreende o segundo sítio de clivagem. Em algumas das referidas concretizações, o segundo sítio de clivagem não é capaz de sofrer clivagem química pelo complexo de paládio ou o complexo de níquel. Em alguns aspectos, o segundo sítio de clivagem pode ser clivado por um método selecionado a partir do grupo que consiste em clivagem química, fotoclivagem, clivagem enzimática, ou uma combinação dos mesmos. Em uma concretização, o segundo sítio de clivagem pode ser clivado por uma reação de clivagem enzimática. Em uma concretização, o segundo iniciador de extensão é um iniciador P7 aqui descrito (SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 4) e o segundo sítio de clivagem é oxo-G. Em alguma referida concretização, a enzima utilizada para a reação de clivagem é FPG.
[0089] Em algumas outras concretizações, o segundo sítio de clivagem pode ser clivado por uma reação de clivagem química. Na referida concretização, o segundo iniciador de extensão compreende ou é um iniciador P7 modificado para incluir um nucleotídeo modificado que está suscetível à clivagem química de acordo com os modos aqui descritos. Em algumas concretizações, o segundo iniciador de extensão compreende ou é um iniciador P17 aqui descrito (SEQ ID NO. 6) e o segundo sítio de clivagem compreende uma ou mais ligações diol que podem ser clivadas pelo tratamento com periodato, por exemplo, periodato de sódio. Em algumas das referidas concretizações, o ligante diol compreende a estrutura da Fórmula (VIII): (VIII) em que r é 2, 3, 4, 5 ou 6; s é 2, 3, 4, 5, ou 6; o oxigênio “a” é o oxigênio do hidroxil 3’ de um primeiro nucleotídeo; e o oxigênio “b” é o oxigênio do hidroxil 5’ de um segundo nucleotídeo.
[0090] Em algumas concretizações, o ligante diol apresenta a estrutura da Fórmula (VIIIa): (VIIIa) em que “a” e “b” são tal como definidos acima.
[0091] Em algumas outras concretizações, o segundo sítio de clivagem compreende um ligante de azobenzeno, o qual pode ser clivado por um reagente de clivagem química, por exemplo, Na2S2O4. Em algumas das referidas concretizações, o ligante de azobenzeno compreende uma estrutura da Fórmula (X): (X) em que R1 é H, hidroxil, ou um hidroxil protegido; R2 é H, C1-6 alquil, ou C1-6 alcoxi; cada R3 e R4 é independentemente H, halo, –C(O)OR5, ou –C(O)NHR6; cada R5 e R6 é independentemente H, C1-6 alquil, ou C6-10 aril; X é –C(O)-, -CH2-, ou -C(O)NH-; e cada m1, m2 e m3 é independentemente 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.
[0092] Em alguns aspectos, R1 é hidroxil. Em alguns outros aspectos, R1 é um hidroxil protegido, tal como –OBz. Em alguns aspectos, R3 é –C(O)OR5. Em alguns aspectos, R3 é –C(O)NHR6. Em alguns outros aspectos, R5 e R6 são independentemente C1-6 alquil, tal como metil, etil, isopropil, ou t-butil. Em alguns outros aspectos, R3 é H. Em alguns aspectos, R2 é H. Em alguns aspectos, R4 é H. Em alguns aspectos, X é –CH2-. Em alguns outros aspectos, X é -C(O)NH-. Em alguns aspectos, m1 é 2, 3 ou 4. Em alguns aspectos, m2 é 1, 2 ou 3. Em alguns aspectos, m3 é 1, 2 ou
3.
[0093] Em algumas concretizações do ligante de azobenzeno da Fórmula (X), um átomo de oxigênio da extremidade está ainda conectado a um grupo fosfato, por exemplo, com uma estrutura de Fórmula (Xa) ou Fórmula (Xb): (Xa), (Xb)
[0094] Em alguns aspectos, o oxigênio “a” é o oxigênio do hidroxil 3’ de um primeiro nucleotídeo. Em alguns aspectos, o oxigênio “b” é o oxigênio do hidroxil 5’ de um segundo nucleotídeo. Em alguns outros aspectos, o oxigênio “b” é o oxigênio do hidroxil 3’ de um primeiro nucleotídeo. Em alguns outros aspectos, o oxigênio “a” é o oxigênio do hidroxil 5’ de um segundo nucleotídeo.
[0095] O ligante de azobenzeno da Fórmula (Xa) ou (Xb) pode ser incorporado em um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo por um reagente químico, em que o reagente químico é um composto de fosforamidita da Fórmula (XIa) ou (XIb): (XIa), (XIb) em que R1 - R4, X, m1, m2, e m3 são tal como definidos em (X); e PG é um grupo de proteção removível sob condições fracamente ácidas (por exemplo, tritil ou dimetoxitritil).
[0096] Algumas concretizações adicionais da presente divulgação se referem a um método de linearização de uma pluralidade de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados, compreendendo: prover um suporte sólido compreendendo polinucleotídeos de fita dupla, cada polinucleotídeo de fita dupla compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita, em que a primeira fita e a segunda fita são imobilizadas no suporte sólido nas suas extremidades 5′, em que cada primeira fita compreende um primeiro sítio de clivagem, e em que cada uma segunda fita compreende um segundo sítio de clivagem compreendendo um ligante de azobenzeno; clivar uma ou mais primeiras fitas no primeiro sítio de clivagem, e gerar um ou mais primeiros ácidos nucleicos clivados e primeiras fitas imobilizadas clivadas; remover os primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido; sequenciar as segundas fitas imobilizadas; ressintetizar as primeiras fitas derivadas as quais são complementares às segundas fitas; e clivar uma ou mais segundas fitas no segundo sítio de clivagem, e gerar um ou mais segundos ácidos nucleicos clivados e segundas fitas clivadas imobilizadas.
Em algumas concretizações dos referidos métodos, cada primeira fita é estendida a partir de um primeiro iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido, e em que o primeiro iniciador de extensão compreende o primeiro sítio de clivagem.
Em algumas concretizações dos referidos métodos, o primeiro sítio de clivagem pode ser clivado por um método selecionado a partir do grupo que consiste em clivagem química, fotoclivagem, clivagem enzimática, e uma combinação dos mesmos, por exemplo, o primeiro sítio de clivagem pode ser clivado por métodos com Pd/Ni aqui descritos, ou um método enzimático (por exemplo, UDG). Em algumas das referidas concretizações, o primeiro iniciador de extensão compreende P5, P5 modificado ou P15. Em algumas concretizações, cada uma segunda fita é estendida a partir de um segundo iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido, e em que o segundo iniciador de extensão compreende o segundo sítio de clivagem. Em algumas das referidas concretizações, o ligante de azobenzeno compreende a estrutura da Fórmula (X), (Xa) ou (Xb) tal como aqui descrito. Em algumas concretizações, o ligante de azobenzeno é clivado por Na2S2O4. Em algumas concretizações, o sequenciamento das segundas fitas imobilizadas compreende incorporar, de forma bem sucedida, nucleotídeos marcados complementares às segundas fitas imobilizadas e detectar os nucleotídeos marcados. Em algumas concretizações, a extremidade 3’ de cada uma das primeiras fitas imobilizadas clivadas compreende um grupo de proteção, por exemplo, um grupo fosfato ou uma porção fosfato modificada compreendendo a estrutura da Fórmula (I) ou (V) tal como aqui descrito. O grupo de proteção pode ser removido tanto por uma reação enzimática (por exemplo, enzima T4PNK) ou uma desproteção química, por exemplo, um fluoreto contendo reagente ou uma base tal como aqui descrita para a desproteção da porção fosfato modificada compreendendo a estrutura da Fórmula (I) ou (V). Em algumas concretizações, o método ainda compreende remover os segundos ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido, e sequenciar as primeiras fitas derivadas. Em algumas concretizações, as primeiras fitas derivadas imobilizadas permanecem no suporte sólido após a remoção dos segundos ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido, e permanecem hibridizadas às segundas fitas clivadas imobilizadas.
[0097] Em algumas concretizações do primeiro e do segundo métodos de linearização aqui descritos, os polinucleotídeos de fita dupla são imobilizados no suporte sólido através de ligação covalente. Em uma concretização, os polinucleotídeos de fita dupla são covalentemente ligados a um revestimento de hidrogel ou polímero no suporte sólido. Em uma concretização, o revestimento de hidrogel ou polímero compreende PAZAM. Em algumas concretizações, o revestimento de hidrogel ou polímero está também covalentemente ligado à superfície do suporte sólido, por exemplo, através da reação com um silano funcionalizado depositado na superfície. Em uma concretização, o silano funcionalizado é um silano derivado de norborneno. Exemplos não limitativos de revestimento de hidrogel ou polímeros em suporte sólido silanizado, e métodos de enxerto de polinucleotídeos ou iniciadores em hidrogel ou suporte sólido revestido com polímero são descritos nas publicações norte americanas nos. US 2014/0079923 e US 2015/0005447, as quais são incorporadas por referências em sua totalidade. Suporte Sólido Enxertado para Linearização com Pd
[0098] Algumas concretizações da presente divulgação se referem a suporte sólido compreendendo uma pluralidade de polinucleotídeos da primeira fita imobilizados na mesma, cada polinucleotídeo da primeira fita compreende um primeiro sítio de clivagem capaz de sofrer clivagem química (por exemplo, por um complexo de paládio ou um complexo de níquel tal como aqui descrito), em que a pluralidade de polinucleotídeos da primeira fita é imobilizada no suporte sólido nas suas extremidades 5ʹ.
[0099] Em algumas concretizações do suporte sólido aqui descrito, cada primeira fita compreende ou é estendida a partir de um primeiro iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido. Em algumas das referidas concretizações, o primeiro iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em uma sequência P5 ou P7 tal como aqui descrita, ou uma sequência que é complementar a P5 ou P7. Em uma concretização, o primeiro iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo P5 (SEQ ID NO. 1). Em uma concretização adicional, o primeiro iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo P5 com espaçador poli T (SEQ ID NO. 3). Em uma concretização, o primeiro iniciador de extensão é um iniciador P5. Em uma concretização adicional, o primeiro iniciador de extensão é um iniciador P5 com espaçador poli T. Em algumas concretizações, a sequência P5 ou P7 é modificada para incluir um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado que forma pelo menos parte do sítio de clivagem.
[00100] Em algumas concretizações do suporte sólido aqui descrito, o primeiro iniciador de extensão compreende o primeiro sítio de clivagem. Em algumas concretizações adicionais, o primeiro sítio de clivagem compreende um nucleotídeo ou nucleosídeo modificado que é capaz de sofrer clivagem química, por exemplo, pelo complexo de paládio ou o complexo de níquel. Em algumas das referidas concretizações, o nucleotídeo ou nucleosídeo modificado é um análogo de nucleosídeo ou nucleotídeo T. Na referida concretização, o sítio de clivagem compreende um análogo de nucleosídeo T compreendendo uma funcionalidade alil, por exemplo, uma substituição vinil na posição do carbono 5′ do análogo do nucleosídeo T, assim, formando uma porção alil em relação ao grupo hidroxil 5ʹ.
Em algumas das referidas concretizações, o nucleosídeo ou nucleotídeo modificado compreende a estrutura da Fórmula (II) tal como aqui descrito.
Em algumas concretizações, o grupo hidroxil 5ʹ se conecta a um fosfato 3ʹ de um segundo nucleotídeo, de modo que a unidade dinucleotídeo compreende um sítio de clivagem com uma porção de alil fosfato.
Em algumas das referidas concretizações, o nucleosídeo ou nucleotídeo modificado compreende a estrutura da Fórmula (IIʹ) tal como aqui descrito.
Em algumas concretizações, o primeiro iniciador de extensão compreende ou é o iniciador P15. Em algumas concretizações adicionais, o sítio de clivagem também compreende uma porção de proteção (ou de bloqueio) 3ʹ, por exemplo, uma porção fosfato, no segundo nucleotídeo.
A porção de bloqueio permanece nas primeiras fitas imobilizadas clivadas após a clivagem química das primeiras fitas.
Em uma concretização, a porção fosfato 3’ do segundo nucleotídeo está covalentemente ligada à posição carbono do análogo de nucleosídeo modificado (isto é, o grupo fosfato inclui o hidroxil 5ʹ do nucleotídeo modificado). Em algumas concretizações, o grupo de bloqueio permanece nas primeiras fitas imobilizadas clivadas compreendendo a estrutura da Fórmula (I) de (V) tal como aqui descrito, o qual pode removido em um reagente de desproteção química, tal como um composto contendo fluoreto ou uma base.
Em algumas concretizações, o grupo de bloqueio que permanece nas primeiras fitas imobilizadas clivadas é um grupo fosfato, o qual pode ser removido por uma fosfatase (por exemplo,
T4PNK). Em algumas concretizações, o sítio de clivagem está localizado próximo da extremidade 3′ do primeiro iniciador de extensão, por exemplo, dentro 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos de distância da extremidade 3′ do primeiro iniciador de extensão.
Em algumas outras concretizações, o sítio de clivagem está localizado próximo da extremidade 5’ do primeiro iniciador de extensão, por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleotídeos de distância da extremidade 5′ do primeiro iniciador de extensão.
Em alguns casos, para garantir a eficiente ressíntese do DNA, o sítio de clivagem está preferencialmente localizado em direção à extremidade 3′ do primeiro iniciador, por exemplo, dentro de 2 a 8, ou 3 a 7, ou 4 a 6 nucleotídeos de distância.
Em uma concretização, o primeiro iniciador de extensão é um iniciador P5 e o primeiro sítio de clivagem está localizado na sequência do iniciador P5 (por exemplo, o nucleotídeo modificado está incorporado na sequência do iniciador P5, pela adição a ou substituição de um nucleotídeo). Portanto, a sequência P5 aqui descrita (SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO. 3) está modificada para incluir o primeiro sítio de clivagem que é capaz de sofrer clivagem química pelo complexo de Pd/Ni, assim, formando um iniciador P5 modificado.
Em uma concretização, o iniciador P5 modificado compreende ou é um iniciador P15 aqui descrito (SEQ ID NO. 5). Em algumas concretizações adicionais, o nucleotídeo ou nucleosídeo modificado pode ainda ser marcado com um marcador detectável, por exemplo, um marcador fluorescente.
O marcador detectável permite a quantificação direta da reação de enxerto imediatamente após o final.
[00101] Em algumas concretizações do suporte sólido aqui descrito, o complexo de Pd usado no método de linearização química é solúvel em água. Em algumas das referidas concretizações, o complexo de Pd é um complexo de Pd(0). Em alguns casos, o complexo de Pd(0) pode ser gerado in situ a partir da redução de um complexo de Pd(II) por reagentes tais como alquenos, álcoois, aminas, fosfinas, ou hidretos metálicos. Fontes de paládio adequadas incluem Na2PdCl4, (PdCl(C3H5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(C3H5)(THP)2]Cl, Pd(Ph3)4, Pd(OAc)2, Pd(dba)2, e Pd(TFA)2. Na referida concretização, o complexo de Pd(0) é gerado in situ a partir de Na2PdCl4. Em outra concretização, a fonte de paládio dímero de cloreto de alil paládio(II) [(PdCl(C3H5))2]. Em algumas concretizações, o complexo de Pd(0) é gerado em uma solução aquosa pela mistura de um complexo de Pd(II) com uma fosfina. Fosfinas adequadas incluem fosfinas solúveis em água, tal como tris(hidroxipropil) fosfina (THP), tris(hidroximetil) fosfina (THM), 1,3,5-triaza-7-fosfa-adamantano (PTA), sal de dihidrato de potássio bis(p-sulfonatofenil) fenilfosfina, tris(carboxi etil) fosfina (TCEP) e sal trissódico de ácido trifenil fosfina-3,3’,3’’- trissulfônico. Em algumas concretizações, Pd(0) pode ser gerado pela mistura de [(PdCl(C3H5))2], [Pd(C3H5)(THP)]Cl, ou [Pd(C3H5)(THP)2]Cl com THP in situ. Um ou mais agentes redutores podem ser adicionados, tal como ácido ascórbico ou um sal do mesmo (por exemplo, ascorbato de sódio). Em algumas concretizações, o complexo de Pd(0) é Pd(THM)4,
Pd(THP)2, Pd(THP)3, ou Pd(THP)4, ou combinações dos mesmos.
[00102] Em algumas concretizações do suporte sólido aqui descritos, o complexo de Ni usado na linearização química é solúvel em água. Em algumas das referidas concretizações, o complexo de Ni é um complexo de Ni(0). Em alguns casos, o complexo de Ni pode ser gerado in situ a partir da redução de um composto de Ni(II) (tal como NiCl2) por reagentes similares àqueles usados na redução de Pd(II) a Pd(0) tal como aqui descrito. Em uma concretização, o complexo de Ni é preparado pela mistura de NiCl2 com 1 a 10 equivalentes de THP.
[00103] Em algumas concretizações do suporte sólido aqui descritos, o suporte sólido ainda compreende uma pluralidade de polinucleotídeos da segunda fita imobilizados na mesma, cada um dos polinucleotídeo da segunda fita compreendendo um segundo sítio de clivagem, em que a pluralidade de polinucleotídeos da segunda fita são imobilizados no suporte sólido nas suas extremidades 5′. Em algumas das referidas concretizações, cada polinucleotídeo da segunda fita compreende ou é estendido a partir de um segundo iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido. Em algumas das referidas concretizações, o segundo iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em uma sequência P5 ou P7 tal como aqui descrito, ou uma sequência que é complementar a P5 ou P7. Em uma concretização, o segundo iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo P7 (SEQ ID NO. 2). Em uma concretização adicional, o segundo iniciador de extensão compreende uma sequência de nucleotídeo P7 com um espaçador poli T (SEQ ID NO. 4). Em outra concretização, o segundo iniciador de extensão compreende uma sequência P15 (SEQ ID NO. 6). Em uma concretização, o segundo iniciador de extensão é um iniciador P7. Em uma concretização adicional, o segundo iniciador de extensão é um iniciador P7 com espaçador poli T.
Em algumas concretizações, o iniciador P7 ou iniciador P7 com espaçador poli T é modificado para remover a 8-oxo-guanina e inserir um ligante quimicamente clivável, por exemplo, uma ou mais unidades diol.
Ainda em outra concretização, o segundo iniciador de extensão é um iniciador P17. Em algumas concretizações, o segundo iniciador de extensão compreende o segundo sítio de clivagem.
Em algumas das referidas concretizações, as sequências P5, P7, ou P17 são modificadas para incluir um nucleotídeo modificado com um ligante clivável.
Em algumas concretizações adicionais, o segundo sítio de clivagem não é capaz de sofrer clivagem química pelo complexo de paládio ou o complexo de níquel usado na primeira reação de linearização química.
O segundo sítio de clivagem pode ser clivado por um método selecionado a partir do grupo que consiste em clivagem química, fotoclivagem química, clivagem enzimática, ou uma combinação dos mesmos.
Em uma concretização, o segundo sítio de clivagem pode ser clivado por uma reação de clivagem enzimática.
Na referida concretização, o segundo iniciador de extensão é um iniciador P7 aqui descrito (SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 4) e o segundo sítio de clivagem é oxo-G.
Em outra concretização, o segundo sítio de clivagem pode ser clivado por uma reação de clivagem química. Por exemplo, o segundo sítio de clivagem pode incluir uma ou mais ligações diol vicinais (as quais podem ser clivadas por oxidação, tal como tratamento com um reagente periodato), ligações bissulfeto (cliváveis, por exemplo, sob condições redutoras tal como DTT, ou na presença de uma fosfina), grupos orto- nitrobenzil (cliváveis, por exemplo, por fotólise), ligações azobenzeno (cliváveis, por exemplo, na presença de Na2S2O4), ligações alquil-selênio (cliváveis, por exemplo, por oxidação tal como peróxido de hidrogênio), ligações silil éter (cliváveis, por exemplo, por íon fluoreto, ácido, ou base), ou ligações alil carbamato (cliváveis, por exemplo, na presença de um complexo de paládio). Estas ligações são capazes de gerar pelo menos um grupo hidroxil livre após a clivagem química. Na referida concretização, o segundo iniciador de extensão compreende ou é um iniciador P17 aqui descrito (SEQ ID NO. 6) e o segundo sítio de clivagem compreende uma ou mais ligações diol as quais podem ser clivadas por oxidação, por exemplo, por tratamento com periodato de sódio. Em algumas concretizações, o ligante diol compreende a estrutura da Fórmula (VIII) ou (VIIIa) tal como aqui descrito. Em algumas concretizações, o ligante de azobenzeno compreende a estrutura da Fórmula (X), (Xa) ou (Xb) tal como aqui descrito.
[00104] Algumas concretizações da presente divulgação se referem a um suporte sólido compreendendo uma pluralidade de polinucleotídeos da primeira fita e uma pluralidade de polinucleotídeos da segunda fita imobilizados na mesma, cada polinucleotídeo da primeira fitas é estendido a partir de um iniciador P5 modificado imobilizado no suporte sólido, o iniciador P5 modificado compreendendo um primeiro sítio de clivagem; cada um dos polinucleotídeos de segunda fita é estendido a partir de um iniciador P7 imobilizado no suporte sólido, o iniciador P5 compreendendo um segundo sítio de clivagem; em que ambos os polinucleotídeos de primeira e segunda fita são imobilizados no suporte sólido na sua extremidade 5′, e em que o primeiro sítio de clivagem é capaz de sofrer clivagem química por um complexo de Pd ou um complexo de Ni, tal como um complexo de Pd(0) ou um complexo de Ni(0). Em algumas concretizações, o primeiro sítio de clivagem compreende um nucleosídeo T modificado apresentando uma funcionalidade alil tal como aqui descrita. O sítio de clivagem pode ainda incluir uma porção que pode atuar como um porção de bloqueio da extremidade 3′, por exemplo, um fosfato ou uma porção fosfato modificada, a qual permanece nos polinucleotídeos da primeira fita após a reação de clivagem com Pd/Ni para bloquear o -OH 3′ dos polinucleotídeos da primeira fita clivada imobilizada.
[00105] Em algumas concretizações do suporte sólido aqui descrito, os polinucleotídeos de primeira e de segunda fita são imobilizados no suporte sólido através de uma ligação covalente com um revestimento de polímero ou hidrogel em uma superfície do suporte sólido. Em uma concretização, o revestimento de hidrogel ou polímero compreende PAZAM. Em algumas concretizações, o revestimento de hidrogel ou polímero está também covalentemente ligado à superfície do suporte sólido, por exemplo, através da reação com um silano funcionalizado depositado na superfície. Em uma concretização, o silano funcionalizado é um silano derivado de norborneno. Em uma concretização, o suporte sólido compreende ou é uma célula de fluxo. Superfície do Suporte Sólido
[00106] Em algumas concretizações, a superfície do suporte sólido antes do enxerto do iniciador compreende ambas as regiões revestidas com moléculas funcionalizadas e regiões inertes sem revestimento. Em algumas das referidas concretizações, os revestimentos de molécula funcionalizada são revestimentos de hidrogel ou polímero. As regiões revestidas podem compreender sítios reativos, e logo, podem ser usadas para ligar moléculas através de ligação química ou outras interações moleculares, tal como hibridização ou reação covalente. Em algumas concretizações, as regiões revestidas (por exemplo, características reativas, canais, pastilhas, grânulos ou poços) e as regiões inertes (referidas como regiões intersticiais) podem alternar de modo a formar um padrão ou uma rede. Tais padrões podem ser em uma ou em duas dimensões. Em algumas concretizações, as regiões inertes podem ser selecionadas a partir de regiões de vidro, regiões metálicas, regiões de máscara ou regiões intersticiais, ou combinações das mesmas. Alternativamente, estes materiais podem formar regiões reativas. A inércia ou reatividade irão depender da química e dos processos usados no substrato. Em uma concretização, a superfície do suporte sólido compreende regiões de vidro. Em outra concretização, a superfície compreende regiões metálicas.
[00107] Em algumas concretizações, um suporte sólido aqui descrito é formado pelo menos em parte de uma célula de fluxo ou está localizado em uma célula de fluxo.
Em algumas das referidas concretizações, as células de fluxo ainda compreendem polinucleotídeos ligados à superfície do suporte sólido por meio de um revestimento de molécula funcionalizada, por exemplo, um revestimento de polímero ou hidrogel.
Em algumas concretizações, os polinucleotídeos estão presentes nas células de fluxo em agrupamentos de polinucleotídeo, em que os polinucleotídeos dos agrupamentos de polinucleotídeo estão ligados a uma superfície da célula de fluxo por meio do revestimento de hidrogel ou polímero.
Nas referidas concretizações, a superfície do corpo da célula de fluxo ao qual os polinucleotídeos estão ligados é considerada o suporte sólido.
Em outras concretizações, um suporte sólido separado apresentando uma superfície revestida com hidrogel ou polímero está inserida no corpo da célula de fluxo.
Em concretizações preferidas, a célula de fluxo é uma câmara de fluxo que está dividida em uma pluralidade de faixas ou uma pluralidade de setores, em que uma ou mais da pluralidade de faixas ou pluralidade de setores compreende uma superfície que está revestida com um revestimento de hidrogel ou polímero covalentemente ligado aqui descrito.
Em algumas concretizações das células de fluxo aqui descritas, os polinucleotídeos ligados dentro de um único agrupamento de polinucleotídeo apresentam a mesma sequência de nucleotídeo ou sequências de nucleotídeo similares.
Em algumas concretizações das células de fluxo aqui descritas,
os polinucleotídeos ligados de diferentes agrupamentos de polinucleotídeo apresentam diferentes sequências de nucleotídeo ou sequências de nucleotídeo não similares. Exemplos de células de fluxo e substratos para a produção de células de fluxo que podem ser usadas no método ou composição aqui indicados incluem, porém não estão limitados a, aquelas comercialmente disponíveis por Illumina, Inc. (San Diego, CA) ou descritas nas publicações norte americanas nos. US 2010/0111768 A1 e US 2012/0270305, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
PAZAM
[00108] Uma concretização do revestimento de hidrogel ou polímero da superfície do suporte sólido compreende PAZAM, um copolímero de poliacrilamida compreendendo as seguintes duas unidades de repetição: .
[00109] Em algumas concretizações, PAZAM é um polímero linear. Em algumas outras concretizações, PAZAM é um polímero levemente reticulado. PAZAM pode ser funcionalizado ou modificado para uso em uma composição ou método aqui indicado. A preparação de PAZAM e análogos do mesmo está descrita na patente norte americana nº US 9,012,022, a qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Grupos de Bloqueio 3′
[00110] Durante os ciclos SBS, a fim de garantir que apenas uma única incorporação ocorra, uma modificação estrutural (“grupo de proteção”) é adicionada para cada nucleotídeo marcado que é adicionado à cadeia de crescimento para garantir que apenas um nucleotídeo é incorporado. Após o nucleotídeo com o grupo de proteção ter sido adicionado, o grupo de proteção é, então, removido, sob condições reacionais as quais não interferem com a integridade do DNA a ser sequenciado. O ciclo de sequenciamento pode, então, continuar com a incorporação do próximo nucleotídeo marcado, protegido.
[00111] Para ser útil no sequenciamento do DNA, os nucleotídeos, e mais usualmente trifosfatos de nucleotídeo, em geral, requerem um grupo de proteção hidroxi 3' de modo a evitar que a polimerase usada para o incorporar na cadeia de polinucleotídeo continue a replicar, uma vez que a base é adicionada no nucleotídeo. Existem muitas limitações para os tipos de grupos que podem ser adicionados em um nucleotídeo e ainda ser adequado. O grupo de proteção deve evitar que moléculas de nucleotídeo adicionais sejam adicionadas à cadeia de polinucleotídeo enquanto seja simultaneamente facilmente removível da porção de açúcar sem causar dano à cadeia de polinucleotídeo. Além disso, o nucleotídeo modificado necessita ser tolerado pela polimerase ou outra enzima adequada usada para incorporá-lo na cadeia de polinucleotídeo. O grupo de proteção ideal, portanto, exibe estabilidade em longo prazo, é eficientemente incorporado pela enzima polimerase, causa o bloqueio da incorporação nucleotídeo secundários ou adicionais e apresenta a capacidade de ser removido sob condições fracas que não causam dano à estrutura do polinucleotídeo, preferencialmente sob condições aquosas.
[00112] Os grupos de proteção reversíveis foram previamente reportados. Por exemplo, Metzker et al., (Nucleic Acid Research, 22 (20): 4259 - 4267, 1994) descreve a síntese e uso de oito trifosfatos 5' de 2- desoxirribonucleosídeo modificados em 3' (dNTPs modificados em 3') e teste em dois ensaios de modelo de DNA para a atividade de incorporação. O WO 2002/029003 descreve um método de sequenciamento o qual pode incluir o uso de um grupo de proteção alil para bloquear o grupo -OH 3' em uma fita de DNA em crescimento em uma reação de polimerase. Outros grupos de proteção reversíveis e métodos de desproteção dos mesmos sob condições compatíveis de DNA incluem azidometil ou um grupo azidometil modificado, os quais são descritos na publicação dos pedidos internacionais nos. WO 2004/018497 e WO 2014/139596, e são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
[00113] Uma concretização do grupo de bloqueio -OH 3’ aqui descrito é um grupo fosfato, o qual pode ser removido por uma fosfatase. Marcadores detectáveis
[00114] Algumas concretizações aqui descritas se referem ao uso de marcadores detectáveis. A detecção pode ser realizada por qualquer método adequado, incluindo espectroscopia de fluorescência ou por outros meios ópticos. A marcação preferida é um fluoróforo, o qual, após a absorção de energia, emite radiação em um comprimento de onda definido. Muitos marcadores fluorescentes adequados são conhecidos. Por exemplo, Welch et al. (Chem. Eur. J. 5 (3): 951 - 960, 1999) descreve porções fluorescentes funcionalizadas com dansil as quais podem ser usadas na presente invenção. Zhu et al. (Cytometry 28: 206 - 211, 1997) descreve o uso dos marcadores fluorescentes Cy3 e Cy5, os quais podem também ser usados na presente invenção. Os marcadores adequados para uso são também descritos em Prober et al. (Science 238: 336 - 341, 1987); Connell et al. (BioTechniques 5 (4): 342 - 384, 1987), Ansorge et al. (Nucl. Acids Res. 15 (11): 4593 - 4602, 1987) e Smith et al. (Nature 321: 674, 1986). Outros marcadores fluorescentes comercialmente disponíveis incluem, porém não estão limitados a, fluoresceína, rodamina (incluindo TMR, vermelho texas e Rox), alexa, bodipy, acridina, cumarina, pireno, benzantraceno e as cianinas.
[00115] Em algumas concretizações, o marcador detectável pode ser usado no primeiro sítio de clivagem do polinucleotídeo que é capaz de sofrer clivagem com Pd nos métodos e no suporte sólido aqui descritos. Em particular, o primeiro sítio de clivagem pode compreender um nucleotídeo ou nucleosídeo modificado marcado. Esta abordagem pode, ainda, agilizar o fluxograma atual de produção da Illumina. Em uma concretização, o iniciador P5 modificado com alil aqui descrito pode ser modificado para incluir um marcador fluorescente que permite a quantificação direta da reação de enxerto imediatamente após seu final, eliminando o requisito de um ensaio de hibridização separado para realizar a referida etapa de quantificação. Ligantes para os Marcadores Detectáveis
[00116] Em algumas concretizações aqui descritas, a nucleobase do nucleotídeo ou nucleosídeo modificado pode estar ligada a um marcador detectável tal como descrito acima. Em algumas das referidas concretizações, os ligantes usados são cliváveis. O uso de um ligante clivável garante que o marcador pode ser, se requerido, removido após a detecção, evitando qualquer sinal interferente com qualquer nucleotídeo ou nucleosídeo marcado subsequentemente incorporado.
[00117] Em algumas outras concretizações, os ligantes usados são não cliváveis. Uma vez que, em cada caso em que um nucleotídeo marcado da invenção é incorporado, nenhum nucleotídeo precisa ser subsequentemente incorporado e, logo, o marcador não precisa ser removido do nucleotídeo.
[00118] Ligantes cliváveis são conhecidos no estado da técnica, e a química convencional pode ser aplicada para ligar um ligante a uma base de nucleotídeo e um marcador. O ligante pode ser clivado por qualquer método adequado, incluindo exposição a ácidos, bases, nucleófilos, eletrófilos, radicais, metais, agentes redutores ou oxidantes, luz, temperatura, enzimas etc. O ligante, tal como aqui discutido, pode também ser clivado com o mesmo catalisador usado para clivar a ligação do grupo de proteção -O- 3'. Ligantes adequados podem ser adaptados de grupos de proteção química padrão, tal como descrito em
Greene & Wuts, Grupos Protetores em Síntese Orgânica, John Wiley & Sons. Ligantes cliváveis adicionais adequados usados na síntese em fase sólida são descritos em Guillier et al. (Chem. Rev. 100: 2092 - 2157, 2000).
[00119] O uso do termo “ligantes cliváveis” não pretende implicar que o ligante completo é requerido para ser removido, por exemplo, da base de nucleotídeo. Quando o marcador detectável está ligado à base, o sítio de clivagem do nucleosídeo pode estar localizado em uma posição no ligante que garante que parte do ligante permanece ligada a base de nucleotídeo após a clivagem.
[00120] Quando o marcador detectável está ligado à base, o ligante pode estar ligado em qualquer posição na base de nucleotídeo desde que o pareamento de bases Watson- Crick ainda possa ser realizado. No contexto das bases de purina, é preferido se o ligante está ligado por meio da posição 7 da purina ou o análogo deazapurina preferido, por meio de uma purina modificada em 8, por meio de uma adenosina modificada no N-6 ou uma guanina modificada no N-
2. Para as pirimidinas, a ligação é preferencialmente por meio da posição 5 na citosina, timidina ou uracila e da posição N-4 na citosina.
[00121] Em algumas concretizações, o ligante pode consistir em funcionalidade similar àquela do grupo de proteção –OH 3’. Está irá tornar a desproteção e os processos de desproteção mais eficientes, uma vez que apenas um único tratamento será requerido para remover ambos o marcador e o grupo de proteção. Particularmente, ligantes preferidos são ligantes contendo azidas cliváveis por fosfina. Métodos de Clivagem
[00122] Diversos métodos de clivagem podem ser usados para clivar uma ou ambas as fitas da molécula de ácido nucleico de fita dupla na etapa de linearização, por exemplo, para a clivagem de um polinucleotídeo de segunda fita aqui descrito. Concretizações preferidas porém não limitativas de métodos de clivagem adequados são discutidas em maiores detalhes abaixo. A) Clivagem química
[00123] O termo “clivagem química” abrange qualquer método o qual utiliza um ácido não nucleico e reagente químico não enzimático a fim de promover/alcançar a clivagem de uma ou ambas as fitas da molécula de ácido nucleico de fita dupla. Se requerido, uma ou ambas as fitas da molécula de ácido nucleico de fita dupla pode incluir uma ou mais porções químicas de não nucleotídeo e/ou nucleotídeos não naturais e/ou ligações de estrutura não naturais a fim de permitir uma reação de clivagem química em um sítio de clivagem específico, preferencialmente um sítio de clivagem pré-determinado. Em uma concretização não limitativa, uma fita da molécula de ácido nucleico de fita dupla pode incluir uma ligação diol a qual permite a clivagem por tratamento com periodato (por exemplo, periodato de sódio). A ligação diol pode estar posicionada em um sítio de clivagem, a localização precisa da qual pode ser selecionada pelo usuário. Será apreciado que mais do que um diol poderia ser incluído no sítio de clivagem.
[00124] Unidades de ligante diol com base na química da fosforamidita adequados para incorporação em cadeias de polinucleotídeo estão comercialmente disponíveis por Fidelity Systems, Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Uma ou mais unidades de diol podem ser incorporadas em um polinucleotídeo usando métodos padrão para a síntese química automatizada do DNA. A fim de posicionar o ligante diol em uma distância ótima a partir do suporte sólido uma ou mais moléculas espaçadoras podem estar incluídas entre o ligante diol e o sítio de ligação ao suporte sólido. A molécula espaçadora pode ser uma porção química não nucleotídeo. Unidades de espaçadores adequadas com base na química da fosforamidita para uso em conjunto com os ligantes diol são também fornecidas por Fidelity Systems, Inc. O ligante diol é clivado por tratamento com um “agente de clivagem”, o qual pode ser qualquer substância a qual promove a clivagem do diol. O agente de clivagem preferido é periodato, preferencialmente periodato de sódio (NaIO4) aquoso. Após o tratamento com o agente de clivagem (por exemplo, periodato) para clivar o diol, o produto clivado pode ser tratado com um “agente de bloqueio” a fim de neutralizar espécies reativas geradas na reação de clivagem. Agentes de bloqueio adequados para esta finalidade incluem aminas, tal como etanolamina. Vantajosamente, o agente de bloqueio (por exemplo, etanolamina) pode ser incluído em uma mistura com o agente de clivagem (por exemplo, periodato) de modo que espécies reativas são bloqueadas assim que elas são formadas.
[00125] A combinação de uma ligação diol e agente de clivagem (por exemplo, periodato) para alcançar a clivagem de uma fita de um molécula de ácido nucleico de fita dupla é preferida para a linearização de moléculas de ácido nucleico em hidrogeis de poliacrilamida em suporte sólido uma vez que o tratamento com periodato é compatível com a integridade do ácido nucleico e com a química da superfície do hidrogel. No entanto, o método do diol pode também ser utilizado para a linearização de ácidos nucleicos imobilizados em outras superfícies, incluindo suportes revestidos com silano funcionalizado.
[00126] Em uma concretização adicional, a fita a ser clivada (ou o iniciador de amplificação a partir do qual esta fita é derivada se preparada por amplificação em fase sólida) pode incluir um grupo bissulfeto o qual permite a clivagem com um agente redutor químico, por exemplo, hidrocloreto de Tris (2-carboxietil)-fosfato (TCEP). B) Clivagem de sítios abásicos em uma molécula de fita dupla
[00127] Um “sítio abásico” é definido como uma posição do nucleosídeo em uma cadeia de polinucleotídeo a partir da qual o componente da base tenha sido removido. Sítios abásicos podem ocorrer naturalmente no DNA sob condições fisiológicas por hidrólise de resíduos de nucleosídeo, porém também podem ser formados quimicamente sob condições artificiais ou pela ação de enzimas. Uma vez formados, os sítios abásicos podem ser clivados (por exemplo, pelo tratamento com uma endonuclease ou outra enzima de clivagem de única fita, exposição ao calor ou álcali), prevendo meios para a clivagem sítio-específica de uma fita de polinucleotídeo.
[00128] Em uma concretização não limitativa, um sítio abásico pode ser criado em uma posição pré- determinada em uma fita de um polinucleotídeo de fita dupla e, então, clivada pela primeira incorporação de uma desoxiuridina (U) em um sítio de clivagem pré-determinado na molécula de ácido nucleico de fita dupla. Isto pode ser alcançado, por exemplo, pela inclusão de U em um dos iniciadores usados para o preparo da molécula de ácido nucleico de fita dupla por amplificação de PCR em fase sólida. A enzima uracila DNA glicosilase (UDG) pode, então, ser usada para remover a base uracila, gerando um sítio abásico em uma fita. A fita de polinucleotídeo incluindo o sítio abásico pode, então, ser clivada no sítio abásico por tratamento com endonuclease (por exemplo EndoIV endonuclease, AP liase, FPG glicosilase/AP liase, EndoVIII glicosilase/AP liase), calor ou álcali.
[00129] Sítios abásicos podem ser usados para gerar uma porção hidroxil 3′ livre para atuar como um iniciador de sequenciamento. Se ambos os iniciadores da amplificação são modificados de modo que eles possam ser sequencialmente clivados, a segunda clivagem pode ser usada para clivar a primeira fita da superfície. O primeiro (ou segundo) iniciador pode conter uma base uracila, que pode ser clivada por uma enzima (UDG), e o segundo (ou primeiro) iniciador pode conter uma base 8-oxo-guanina que pode ser clivada por uma segunda enzima FPG glicosilase ortogonal. A segunda clivagem do sítio abásico pode ser usada para deixar um iniciador de sequenciamento ligado à superfície, de modo que uma base G é incorporada como o primeiro ciclo de sequenciamento ou as fitas duplas clivadas podem ser desnaturadas para permitir a hibridização de um iniciador de sequenciamento em solução. C) Clivagem de ribonucleotídeos
[00130] A incorporação de um ou mais ribonucleotídeos em uma fita de polinucleotídeo a qual está, de outra forma, compreendida nos desoxirribonucleotídeos (com ou sem porções químicas não nucleotídeo adicionais, bases não naturais ou ligações de estrutura não naturais) podem fornecer um sítio para a clivagem usando um agente químico capaz de seletivamente clivar a ligação fosfodiéster entre um desoxirribonucleotídeo e um ribonucleotídeo ou usando uma ribonuclease (RNAse). Portanto, a invenção também abrange a produção de modelos de sequenciamento pela clivagem de uma fita (de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla) em um sítio contendo um ou mais ribonucleotídeos consecutivos usando tal agente de clivagem química ou uma RNase. Preferencialmente, uma fita a ser clivada contém um único ribonucleotídeo para fornecer um sítio pré-determinado para a clivagem química.
[00131] Agentes de clivagem química adequados capazes de seletivamente clivar a ligação fosfodiéster entre um desoxirribonucleotídeo e um ribonucleotídeo incluem íons metálicos, por exemplo íons de metais terras rara (especialmente La3+, particularmente Tm3+, Yb3+ ou Lu3+ (Chen et al., Biotechniques, 2002, 32: 518 - 520; Komiyama et al. Chem. Commun. 1999, 1443 - 1451)), Fe(3) ou Cu(3), ou exposição a pH elevado, por exemplo, tratamento com uma base tal como hidróxido de sódio. Por “clivagem seletiva da ligação fosfodiéster entre um desoxirribonucleotídeo e um ribonucleotídeo”, significa que o agente de clivagem química não é capaz de clivar a ligação fosfodiéster entre dois desoxirribonucleotídeos sob as mesmas condições. A composição da base dos ribonucleotídeo(s) é, em geral, não material, porém pode ser selecionada a fim de otimizar a clivagem química (ou enzimática). Para fins de exemplo, rUMP ou rCMP são, em geral, preferidas se a clivagem é realizada pela exposição de íons metálicos, especialmente íons de metais terrosos raros.
[00132] O(s) ribonucleotídeo(s) será(ão) tipicamente incorporado(s) em uma fita da molécula de ácido nucleico de fita dupla e pode(m) estar situados em uma região da mesma a qual é de única fita quando as duas fitas complementares da molécula de fita dupla são aneladas (isto é, em uma porção 5' suspensa). Em particular, se a molécula de ácido nucleico de fita dupla é preparada por amplificação por PCR em fase sólida usando iniciadores de amplificação senso e antissenso, um dos quais contém pelo menos um ribonucleotídeo, as enzimas DNA polimerase padrão usadas para a amplificação por PCR não são capazes de copiar os modelos de ribonucleotídeo. Sendo assim, os produtos da reação de PCR em fase sólida irão conter uma região 5' suspensa compreendendo o(s) ribonucleotídeo(s) e qualquer restante do iniciador de amplificação à montante do(s) ribonucleotídeo(s).
[00133] A ligação fosfodiéster entre um ribonucleotídeo e um desoxirribonucleotídeos ou entre dois ribonucleotídeos pode também ser clivada por uma RNase. Qualquer ribonuclease endocítica de especificidade de substrato adequada pode ser usada para esta finalidade. Se o(s) ribonucleotídeo(s) estão presentes em uma região a qual é de única fita quando as duas fitas complementares da molécula de fita dupla são aneladas (isto é, em uma porção 5' suspensa), então, a RNase será uma endonuclease a qual apresenta especificidade para os ribonucleotídeos contendo fitas únicas. Para a clivagem com ribonuclease, é preferido incluir dois ou mais ribonucleotídeos consecutivos, e preferencialmente de 2 a 10 ou de 5 a 10 ribonucleotídeos consecutivos. A sequência precisa dos ribonucleotídeos é, em geral, não material, exceto pelo fato de determinadas RNases apresentarem especificidade para a clivagem após determinados resíduos. RNases adequadas incluem, por exemplo, RNaseA, a qual cliva após os resíduos C e U. Assim, quando da clivagem com RNaseA, o sítio de clivagem deve incluir pelo menos um ribonucleotídeo com o C ou U.
[00134] Polinucleotídeos que incorporam um ou mais ribonucleotídeos podem ser prontamente sintetizados usando técnicas padrão para a síntese química de oligonucleotídeos com precursores de ribonucleotídeo adequados. Se a molécula de ácido nucleico de fita dupla é preparada por amplificação do ácido nucleico em fase sólida, então, é conveniente incorporar um ou mais ribonucleotídeos em um dos iniciadores a serem usados para a reação de amplificação. D) Fotoclivagem química
[00135] O termo “fotoclivagem” ou “fotoclivagem química” abrange qualquer método o qual utiliza energia luminosa a fim de alcançar a clivagem de uma ou ambas as fitas da molécula de ácido nucleico de fita dupla. Um sítio pré-determinado para a fotoclivagem química pode ser fornecido por uma unidade de espaçador químico não nucleotídeo em uma das fitas da molécula de fita dupla. Espaçadores cliváveis fotoquímicos adequados incluem o espaçador PC fosforamidita (4-(4,4'-dimetoxitritiloxi) butiramidometil)-1-(2-nitrofenil)-etil]-2-cianoetil-(N,N- diisopropil)-fosforamidita) fornecidos por Glen Research, Sterling, Virginia, Estados Unidos. A unidade de espaçador pode ser clivada pela exposição a uma fonte de luz UV. Esta unidade de espaçador pode, então, estar ligada na extremidade 5' de um polinucleotídeo, junto com um grupo tiofosfato o qual permite a ligação a uma superfície sólida, usando técnicas padrão para a síntese química de oligonucleotídeos. Convenientemente, esta unidade de espaçador pode ser incorporada em um iniciador de amplificação senso ou antissenso para ser usado para a síntese de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla fotoclivável por amplificação em fase sólida. E) Paradores de PCR
[00136] Em outra concretização, o ácido nucleico de fita dupla pode ser preparado por amplificação em fase sólida usando iniciadores senso e antissenso, um dos quais contém um “Parador de PCR”. Um “parador de PCR” é qualquer porção (nucleotídeo ou não nucleotídeo) a qual evita a leitura através da polimerase usada para amplificação, de modo que ela não possa copiar além daquele ponto. O resultado é que as fitas amplificadas derivadas pela extensão do iniciador contendo o parador de PCR irá conter uma porção 5' suspensa. Está porção 5' suspensa (além do parador de PCR) pode estar compreendida em desoxirribonucleotídeos de ocorrência natural, com ligações de estrutura predominantemente naturais, isto é, elas podem ser simplesmente uma extensão do DNA de única fita. A molécula pode, então, ser clivada na região 5’ suspensa com o uso de um reagente de clivagem (por exemplo, uma enzima) a qual é seletiva para a clivagem do DNA de única fita porém não do DNA de fita dupla, por exemplo, nucleasse de feijão mungo.
[00137] O parador de PCR pode ser essencialmente qualquer porção a qual evita a leitura através da polimerase a ser usada para a reação de amplificação. Paradores de PCR adequados incluem, porém não estão limitados a, hexaetileno glicol (HEG), sítio abásicos e qualquer nucleotídeo não natural ou modificado o qual evita a leitura através da polimerase, incluindo análogos de DNA tal como ácido nucleico de peptídeo (PNA).
[00138] Sítios abásicos estáveis podem ser introduzidos durante a síntese química de oligonucleotídeos usando unidades de espaçador adequadas contendo o sítio abásico estável. Para fins de exemplo, espaçadores de furano abásico (5'-O-dimetoxitritil-1',2'-didesoxirribose- 3'-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita) comercialmente disponíveis de Glen Research, Sterling, Virginia, Estados Unidos, podem ser incorporados durante a síntese química de oligonucleotídeos a fim de introduzir um sítio abásico. Tal sítio pode, então, prontamente ser introduzido em um iniciador de oligonucleotídeo a ser usado na amplificação em fase sólida. Se um sítio abásico é incorporado tanto em um iniciador de amplificação senso ou antissenso, o produto de amplificação resultante irá apresentar um 5' suspenso em uma fita a qual irá incluir o sítio abásico (na forma de única fita). O sítio abásico de única fita pode, então, ser clivado pela ação de um agente químico adequado (por exemplo, exposição a álcali) ou uma enzima (por exemplo, AP-endonuclease VI, Shida et al., Nucleic Acid Research, 1996, Volume 24, 4572 - 4576). F) Clivagem de ligantes de peptídeos
[00139] Um sítio de clivagem pode também ser introduzido em uma fita da molécula de ácido nucleico de fita dupla pelo preparo de uma estrutura conjugada na qual uma molécula de peptídeo está ligada a uma fita da molécula de ácido nucleico. A molécula de peptídeo pode, subsequentemente, ser clivada por uma enzima peptidase de especificidade adequada ou qualquer outro meio adequado de fotoclivagem química não enzimática ou química. Tipicamente, o conjugado entre o peptídeo e ácido nucleico será formado pela ligação covalente de um peptídeo a uma fita apenas da molécula de ácido nucleico de fita dupla, com a porção de peptídeo sendo conjugada à extremidade 5’ desta fita, adjacente ao ponto de ligação à superfície sólida. Se o ácido nucleico de fita dupla é preparado pela amplificação em fase sólida, o conjugado de peptídeo pode ser incorporado à extremidade 5’ de um dos iniciadores de amplificação. Obviamente, o componente de peptídeo deste iniciador não será copiado durante a amplificação por PCR; então, o produto de amplificação “em ponte” irá incluir um peptídeo 5' “suspenso” clivável em uma fita.
[00140] Conjugados entre peptídeos e ácidos nucleicos em que o peptídeo é conjugado à extremidade 5’ do ácido nucleico podem ser preparados usando técnicas em geral conhecidas no estado da técnica. Em uma referida técnica, os componentes peptídeo e ácido nucleico da sequência de aminoácido e nucleotídeo desejadas podem ser sintetizadas separadamente, por exemplo, pelas técnicas de síntese química automatizadas padrão e, então, conjugadas em solução aquosa/orgânica. Para fins de exemplo, o sistema OPeC™ comercialmente disponível de Glen Research é baseado na “ligação nativa” de um peptídeo funcionalizado com tioéster N terminal para um oligonucleotídeo cisteinil 5'. Pentafluorofenil S-benziltiosuccinato é usado na etapa final de acoplamento em matriz de peptídeo em fase sólida a base de Fmoc padrão. A desproteção com ácido trifluoroacético gera, em solução, peptídeos substituídos com um grupo S-benziltiosuccinil no N terminal. O-trans-4- (N-a-Fmoc-S-tert-butilsulfenil-1-cisteinil) aminociclohexil O-2-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamidita é usado na etapa final de acoplamento em matriz de oligonucleotídeo em fase sólida com fosforamidita padrão. A desproteção com solução de amônia aquosa gera oligonucleotídeos funcionalizados com 5'-S-tert-butilsulfenil-L-cisteinil em solução. O terminal tiobenzil do peptídeo modificado é convertido em um análogo de tiofenil pelo uso de tiofenol, enquanto o oligonucleotídeo modificado é reduzido usando a tris(carboxietil)fosfina. O acoplamento destes dois intermediários, seguido pela etapa de “ligação nativa”, leva à formação dos conjugados oligonucleotídeo - peptídeo.
[00141] A fita de conjugado contendo peptídeo e ácido nucleico pode estar covalentemente ligada a um suporte sólido usando qualquer técnica de ligação covalente adequada conhecida no estado da técnica a qual é compatível com a superfície escolhida. Por exemplo, a ligação covalente a uma superfície de hidrogel poliacrilamida em suporte sólido pode ser alcançada pela inclusão de um grupo tiofosfato na extremidade “livre” do componente de peptídeo (isto é, a extremidade não conjugada ao ácido nucleico). Se a estrutura do conjugado de peptídeo / ácido nucleico é um iniciador de amplificação a ser usada para amplificação por PCR em fase sólida, a ligação ao suporte sólido deve deixar a extremidade 3' do componente de ácido nucleico livre.
[00142] O componente de peptídeo pode ser projetado para ser clivável por qualquer enzima peptidase escolhida, das quais muitas são conhecidas no estado da técnica. A natureza da peptidase não está particularmente limitada, é necessário apenas que a peptidase clive em algum lugar no componente de peptídeo. De forma similar, o comprimento e sequência de aminoácido do componente de peptídeo não estão particularmente limitados, exceto pela necessidade de serem “cliváveis” pela peptidase escolhida.
[00143] O comprimento e sequência precisa do componente de ácido nucleico não está particularmente limitado, ele pode ser de qualquer sequência desejada. Se o componente de ácido nucleico é funcional como um iniciador em PCR em fase sólida, então, seu comprimento e sequência de nucleotídeo serão selecionados para permitir o anelamento do modelo a ser amplificado. Desnaturação
[00144] Em quaisquer concretizações do método utilizado para a clivagem, o produto da reação de clivagem pode ser submetido a condições de desnaturação a fim de remover as porções da(s) fita(s) clivada(s) que não estão ligada(s) ao suporte sólido. Condições de desnaturação adequadas serão evidentes para um leitor com habilidades na técnica em referência aos protocolos biológicos moleculares padrão (Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds., Ausubel et al.). A desnaturação (e subsequente re-anelamento das fitas clivadas) resulta na produção de um modelo de sequenciamento o qual é parcialmente ou substancialmente de única fita. Uma reação de sequenciamento pode, então, ser iniciada pela hibridização de um iniciador de sequenciamento na porção de única fita do modelo.
[00145] Em outras concretizações, o sequenciamento pode ser iniciado diretamente após a etapa de clivagem sem a necessidade de desnaturação para remover uma porção da(s) fita(s) clivada(s). Se a etapa de clivagem gera um grupo hidroxil 3′ livre em uma fita clivada ainda hibridizada para uma fita complementar, então, o sequenciamento pode proceder a partir deste ponto usando uma enzima polimerase de deslocamento da fita sem a necessidade de uma etapa de desnaturação inicial. Em particular, o sequenciamento do deslocamento da fita pode ser usado em conjunto com a geração do modelo por clivagem com endonucleases de corte, ou pela hidrólise de um sítio abásico com endonuclease, tratamento com calor ou álcali. Métodos de Sequenciamento
[00146] Em algumas concretizações, o suporte sólido e os métodos aqui descritos podem ser usados para a determinação de uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo. Nas referidas concretizações, o método pode compreender as etapas de (a) contatar uma polimerase de polinucleotídeo com agrupamentos de polinucleotídeo deslinearizados ligados a uma superfície de um substrato (por exemplo, por meio de qualquer um dos revestimentos de polímero ou gel aqui descritos); (b) prover nucleotídeos para a superfície do substrato de modo que um sinal detectável é gerado quando um ou mais nucleotídeos são utilizados pela polimerase de polinucleotídeo; (c) detectar sinais em um ou mais polinucleotídeos ligados (ou um ou mais agrupamentos produzidos a partir dos polinucleotídeos ligados); e (d) repetir as etapas (b) e (c), assim determinando uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo ligado ao substrato.
[00147] O sequenciamento do ácido nucleico pode ser usado para determinar uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo por diversos processos conhecidos no estado da técnica. Em um método preferido, o sequenciamento por síntese (SBS) é utilizado para determinar uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo ligado a uma superfície de um substrato (por exemplo, por meio de qualquer um dos revestimentos de polímero aqui descritos). No referido processo, um ou mais nucleotídeos são fornecidos para um polinucleotídeo modelo que está associado a uma polimerase de polinucleotídeo. A polimerase de polinucleotídeo incorpora o um ou mais nucleotídeos em uma fita de ácido nucleico recém-sintetizada que é complementar ao modelo de polinucleotídeo. A síntese é iniciada a partir de um iniciador de oligonucleotídeo que é complementar à porção do polinucleotídeo modelo ou a uma porção de um ácido nucleico universal ou não variável que está covalentemente ligada a uma extremidade do polinucleotídeo modelo. Como os nucleotídeos são incorporados contra o polinucleotídeo modelo, um sinal detectável é gerado que permite a determinação de qual nucleotídeo tinha sido incorporado durante cada etapa do processo de sequenciamento. Neste sentido, a sequência de um ácido nucleico complementar a pelo menos uma porção do polinucleotídeo modelo pode ser gerada, assim permitindo a determinação da sequência de nucleotídeo de pelo menos uma porção do polinucleotídeo modelo.
[00148] As células de fluxo fornecem um formato conveniente para acomodar uma matriz que é produzida pelos métodos da presente divulgação e que é submetida a um sequenciamento por síntese (SBS) ou outra técnica de detecção que envolve a distribuição repetida de reagentes em ciclos. Por exemplo, para iniciar um primeiro ciclo de SBS, um ou mais nucleotídeos marcados, DNA polimerase etc., podem ser fluídos em/através de uma célula de fluxo que acomoda uma matriz de ácido nucleico feita pelos métodos aqui indicados. Estes sítios de uma matriz em que a extensão do iniciador faz com que um nucleotídeo marcado seja incorporado podem ser detectados. Opcionalmente, os nucleotídeos podem ainda incluir uma propriedade de terminação reversível que ainda termina a extensão do iniciador uma vez que um nucleotídeo tenha sido adicionado a um iniciador. Por exemplo, um análogo de nucleotídeo que apresenta uma porção terminadora reversível pode ser adicionada a um iniciador de modo que a extensão subsequente não possa ocorrer até que um agente de desbloqueio seja distribuído para remover a porção. Logo, para as concretizações que utilizam terminação reversível, um reagente de desbloqueio pode ser distribuído para a célula de fluxo (antes ou após que a detecção ocorra). As lavagens podem ser realizadas entre as diversas etapas de distribuição. O ciclo pode, então, ser repetido n vezes para estender o iniciador em n nucleotídeos, assim detectando uma sequência de comprimento n. Exemplos de procedimentos SBS, sistemas fluídicos e plataformas de detecção que podem ser prontamente adaptadas para uso com uma matriz produzida pelos métodos da presente divulgação são descritos, por exemplo, em Bentley et al., Nature 456: 53 - 59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, e US 2008/0108082, cada um dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
[00149] Em algumas concretizações do método acima descrito, as quais empregam uma célula de fluxo, apenas um único tipo de nucleotídeo está presente na célula de fluxo durante uma única etapa do fluxo. Nas referidas concretizações, o nucleotídeo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em dATP, dCTP, dGTP, dTTP e análogos dos mesmos. Em outras concretizações do método acima descrito o qual emprega uma célula de fluxo, uma pluralidade de diferentes tipos de nucleotídeos está presente na célula de fluxo durante uma única etapa do fluxo. Nos referidos métodos, os nucleotídeos podem ser selecionados a partir de dATP, dCTP, dGTP, dTTP e análogos dos mesmos.
[00150] A determinação do nucleotídeo ou nucleotídeos incorporados durante cada etapa do fluxo para um ou mais dos polinucleotídeos ligados ao revestimento de polímero na superfície do substrato presente na célula de fluxo é alcançada pela detecção de um sinal produzido em ou próximo do modelo de polinucleotídeo. Em algumas concretizações do método acima descrito, o sinal detectável compreende um sinal óptico. Em outras concretizações, o sinal detectável compreende um sinal não óptico. Nas referidas concretizações, o sinal não óptico compreende uma mudança no pH em ou próximo de um ou mais do modelo de polinucleotídeos.
[00151] Aplicações e usos de substratos da presente divulgação foram aqui exemplificados em relação aos ácidos nucleicos. No entanto, será entendido que outros analitos podem ser ligados a um substrato aqui indicado e analisado. Um ou mais analitos podem estar presentes em ou sobre um substrato da presente divulgação. Os substratos da presente divulgação são particularmente úteis para a detecção de analitos, ou para realização de reações sintéticas com analitos. Logo, qualquer um de uma variedade de analitos que devem ser detectados, caracterizados, modificados, sintetizados ou similares pode estar presente em ou sobre um substrato aqui indicado. Exemplos de analitos incluem, porém não estão limitados a, ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, RNA ou análogos dos mesmos), proteínas, polissacarídeos, células, anticorpos, epítopos, receptores, ligantes, enzimas (por exemplo, quinases, fosfatases ou polimerases), candidatos a fármacos de pequenas moléculas, ou similares. Um substrato pode incluir múltiplas diferentes espécies de uma biblioteca de analitos. Por exemplo, as espécies podem ser diferentes anticorpos de uma biblioteca de anticorpos, ácidos nucleicos apresentando diferentes sequências de uma biblioteca de ácidos nucleicos, proteínas apresentando diferentes estruturas e/ou funções de uma biblioteca de proteínas, candidatos a fármacos de uma biblioteca combinatorial de pequenas moléculas e similares.
[00152] Em algumas concretizações, os analitos podem ser distribuídos para caracterizar um substrato de modo que eles sejam individualmente resolvíveis. Por exemplo, uma única molécula de cada analito pode estar presente em cada característica. Alternativamente, analitos podem estar presentes como colônias ou populações de modo que moléculas individuais não são necessariamente resolvidas. As colônias ou populações podem ser homogêneas em relação a conter apenas uma única espécie de analito (embora em múltiplas cópias). Tomando os ácidos nucleicos como um exemplo, cada característica em um substrato pode incluir uma colônia ou população de ácidos nucleicos e cada ácido nucleico na colônia ou população pode apresentar a mesma sequência de nucleotídeo (tanto fita única ou fita dupla). Tais colônias podem ser criadas por amplificação dos agrupamentos ou amplificação em ponte, tal como aqui previamente indicado. Múltiplas repetições de uma sequência alvo podem estar presentes em uma única molécula de ácido nucleico, tal como um concatêmero criado usando um procedimento de amplificação de círculo rolante. Logo, uma característica em um substrato pode conter múltiplas cópias de uma única espécie de um analito. Alternativamente, uma colônia ou população de analitos que estão em uma característica pode incluir duas ou mais diferentes espécies. Por exemplo, um ou mais poços em um substrato pode, cada, conter uma colônia misturada apresentando duas ou mais diferentes espécies de ácido nucleico (isto é, moléculas de ácido nucleico com diferentes sequências). As duas ou mais espécies de ácido nucleico em uma colônia misturada podem estar presentes em quantidades não desprezíveis, por exemplo, permitindo que mais do que um ácido nucleico seja detectado na colônia misturada.
EXEMPLOS
[00153] Concretizações adicionais são descritas em maiores detalhes nos exemplos a seguir, os quais não pretendem, de maneira alguma, limitar o escopo das reivindicações. Protocolo de Preparação da Superfície Geral
Silanização das Células de fluxo HiSeq® Limpas
[00154] Células de fluxo funcionalizadas com norborneno são produzidas por meio de um método de deposição de vapor químico (CVD) usando tanto uma câmara de silanização YES (Yield Engineering Systems) ou um dissecador. O processo CVD é tipicamente conduzido a 60°C por períodos entre 1 - 24 h.
Acoplamento PAZAM
[00155] A célula de fluxo silanizada pode, então, ser revestida e enxertada usando múltiplas opções de ferramentas. Por exemplo, um sistema de geração de aglomerados completamente automatizado cBot para o sequenciamento Illumina (disponível por Illumina) pode ser usado para realizar estas operações. Em um procedimento típico, a célula de fluxo é inicialmente enxaguada com IPA/H2O (1:1; 100 µL/min, 2 min). Em seguida, água DI é enxaguada através dos canais (100 µL/min, 2 min). Uma alíquota de solução de 0,5% em peso de PAZAM (aquosa) é preparada (suficiente para 8 canais). O polímero é fluído nos canais (100 µL/min, 2 min). A etapa de acoplamento com PAZAM é finalizada após 1 h a 60°C. Após o final desta etapa, os canais são enxaguados com água em prontidão para a etapa de enxertia seguinte. Após o final das etapas de revestimento de polímero, a célula de fluxo pode ser armazenada a 4°C em tampão (por exemplo, tampão salina –
citrato de sódio (SSC)). Alternativamente, a etapa de enxertia pode ser completada imediatamente após o revestimento com PAZAM. Enxerto de células de fluxos revestidas com PAZAM e QC
[00156] Este protocolo descreve o procedimento para o enxerto de uma célula de fluxo HiSeq® usando um sistema cBot (ILMN). O procedimento de enxerto forneceu uma superfície da célula de fluxo em que a sequência do oligo iniciador P5 modificado com alil e a sequência do iniciador P7 modificado com diol são covalentemente ligadas à superfície do PAZAM em uma proporção de aproximadamente 1:1. Uma mistura de enxerto típica é preparada após o procedimento Illumina padrão e é dependente da concentração do iniciador a ser utilizado. A concentração típica de iniciador empregada é de cerca de 1 - 20 µM, direcionando as densidades do iniciador entre 20 – 250.000 unidades (contagens fluorescência). A etapa QC é realizada após o procedimento Illumina padrão usando um sistema cBot antes do imageamento em um Typhoon (scanner plano de fluorescência).
[00157] Após a QC, os canais da célula de fluxo são enxaguados com 5x de SSC (60 µL/min, volume total = 300 µL/célula de fluxo) para remover o hidróxido de sódio (usado para realizar a etapa de desibridização).
[00158] A célula de fluxo enxertada é, então, armazenada a 4°C antes do uso em processos de bioquímica à jusante (agrupamento, sequenciamento). EXEMPLO 1
[00159] Neste exemplo, um oligonucleotídeo modificado compreendendo um análogo de nucleosídeo com timina modificada foi usado como um sítio específico para ser clivado eficientemente por reagentes químicos sob condições biológicas sem interferir nas propriedades de pareamento das duplas e propriedades de extensão do PCR.
[00160] Em particular, o oligonucleotídeo contém um único nucleosídeo com T modificado com um grupo vinil ligado na posição C 5’. Quando tratado com uma solução de Na2PdCl4 ou (PdAlilCl)2 e THP em tampão aquoso (in situ gerando um complexo de paládio (0)), o oligonucleotídeo foi clivado na posição T modificada com o oligo contendo um grupo fosfato mais curto na extremidade 3’ resultante. Esta reação é ilustrada no Esquema 1 abaixo, em que Nu representa um nucleófilo. Esquema 1.
[00161] A síntese do nucleosídeo fosforamidita com T modificado é descrita no Esquema 2. O material de partida está comercialmente disponível. A maioria das etapas da reação forneceram >70% de rendimento. O excelente rendimento do oligonucleotídeo de DNA final compreendendo o nucleosídeo T modificado foi também reportado. Esquema 2.
[00162] 5’-O-dimetoxitritil-timidina-3’-O-TBDPS (2). 5’-O-dimetoxitritil-timidina (1) (15 g, 1 eq, 27,54 mmol) foi secado sob vácuo forte por 1 h.
DCM anidro (300 mL) foi adicionado sob N2. A esta solução, foi adicionado, primeiro, imidazol (4,69 g, 2,5 eq, 69 mmol) como um sólido, então, cloreto de t-butil difenilsilil (9,1 mL, 1,3 eq, 35,8 mmol). A mistura reacional foi agitada sob N2 em temperatura ambiente por 1h.
O final da reação foi verificado por TLC. A reação foi finalizada com solução saturada de NaHCO3 (100 mL) e agitada por 5 min. O DCM (100 mL) foi adicionado à mistura reacional e a camada aquosa foi extraída com DCM 2 vezes. A camada orgânica foi lavada com solução saturada de NaHCO3 (200 mL), então, salmoura (200 mL). Após a secagem dos orgânicos combinados sobre MgSO4, o solvente foi removido sob vácuo e muito bem secado sob vácuo para fornecer 2 como uma espuma branca/amarela clara. O composto 2 foi usado bruto na próxima etapa. LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 782 (M-H+), (-ve) m/z 817 (M+Cl-). 1H NMR (CDCl3) δ 0,99 (s, 9H, tBu), 1,27 (s, 3H, Me), 1,96 - 2,06 (m, 1H, H-2’), 2,25 – 2,35 (m, 1H, H-2’), 2,80 (dd, J = 4, 12Hz, 1H, H-5’), 3,15 (dd, J = 4, 12Hz, 1H, H-5’), 3,71 (s, 6H, OMe), 3,96 – 4,01 (m, 1H, H-4’), 4,45 - 4,50 (m, 1H, H-3’), 6,42 (dd, J = 8, 12Hz, 1H, H-1’), 6,79 - 6,72 (m, 4H, aromático), 7,68 - 7,00 (m, 24H, aromático +CH), 8,01 (s, 1H, NH).
[00163] 3’-O-TBDPS-timidina (3). 5’-O- dimetoxitritil-timidina-3’-O-TBDPS (2) bruta (27,54 mmol como um máximo) foi dissolvida em MeOH anidro (300 mL) sob N2. TFA (10% em volume, 30 mL) foi adicionado e a reação foi agitada em temperatura ambiente sob N2 por 2 h 30 min. O final da reação foi acompanhado por TLC. A reação foi cuidadosamente finalizada com solução saturada de NaHCO3 (200 mL) e agitada em temperatura ambiente por 10 min. O MeOH foi removido sob vácuo. A mistura residual foi diluída com DCM (300 mL) e partição com solução saturada de NaHCO3. A fase aquosa foi extraída duas vezes com DCM, então, as fases orgânicas foram lavadas com solução saturada de
NaHCO3, secadas com MgSO4 e concentradas sob vácuo. O material bruto foi purificado por coluna (Biotage, 100 g Ultra-Si, PE/EtOAc) para fornecer o composto 3 como uma espuma branca (13,15 g, 99%). LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 479 (M-H+), (+ve) m/z 481 (M+H+). 1H NMR (d6 DMSO) δ 1,46 (s, 9H, tBu), 2,15 (s, 3H, Me), 2,35 - 2,53 (m, 2H, H2’), 3,57 - 3,67 (m, 1H, H5’), 3,77 - 3,87 (m, 1H, H5’), 4,30 - 4,36 (m, 1H, H4’), 4,80 - 4,86 (m, 1H, H3’), 5,41 (t, J = 5,2Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 8,7, 5,7Hz, 1H), 7,82 - 7,94 (m, 6H, aromático +CH), 8,00 - 8,05 (m, 5H, aromático), 11,73 (s, 1H, NH).
[00164] Síntese alternativa do Composto (3). 5’-O- dimetoxitritil-timidina (1, 40 g, 73,4 mmol) foi tratada com TBDPSCl (1,3 eq.) e imidazol (2,5 eq.), em DCM (0,127 M) em temperatura ambiente por 2 h, seguido por PTSA (3 eq.) em metanol (0,097 M) por 1 h, para fornecer o composto (3) com 100 % de rendimento em uma preparação em um frasco. Nenhum trabalho foi necessário após a etapa de sililação, as etapas de evaporação do solvente e de secagem ao longo da noite foram removidas, e a reação foi realizada com exposição ao ar. O uso de PTSA no lugar do TFA reduziu o rearranjo catalisado por ácido da ribose do nucleosídeo timidina.
[00165] 3’-O-TBDPS-5’aldeído-timidina (4). 3’-O- TBDPS-timidina (3) (5,16 g, 1,eq, 10,75 mmol) foi secado sob forte fluxo de vácuo durante a noite bem como 4Å MS., então, DCM anidro (250 mL) foi adicionado ao composto 3 e 4Å MS sob N2, e, então, resfriado para 4°C com um banho de gelo. Periodano de Dess Martin foi adicionado por porção sob N2 (3 x 1,823 g, 1,2 eq, 12,9 mmol) e a reação foi agitada a 4°C sob N2 por 1 h 30 min. A reação foi verificada por LCMS. A reação foi permitida aquecer em temperatura ambiente e a reação foi agitada sob N2 por 4 h, ou até o final da reação. Uma vez finalizada, uma solução de Na2SO3 foi adicionada à reação (100 mL) e agitada em temperatura ambiente por 10 min. As 2 fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída 2 vezes com DCM. A camada orgânica foi, então, lavada com Na2CO3 e solução saturada de NaHCO3, secada com MgSO4 e concentrada sob vácuo. O material bruto foi secado sob forte vácuo durante a noite, pronto para a próxima etapa. A co-evaporação com tolueno também pode ser realizada para melhorar a secagem. LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 477 (M-H+), (-ve) m/z 513 (M+Cl-), (+ve) m/z 479 (M+H+), (+ve) m/z 501 (M+Na+); (-ve) m/z 495 (hidrato -H+), (+ve) m/z 519 (hidrato +Na+).
[00166] Síntese alternativa de aldeído (4). O composto (3, 0,5 g) foi tratado com EDC (3 eq.) e DCA (0,5 eq.) em DMSO em temperatura ambiente por 6 h para fornecer o composto (4) por meio de uma oxidação Pfitzner-Moffat, sem super oxidação do ácido carboxílico que foi observada com o método de periodinano de Dess Martin (e requereu a adição de um grande excesso de reagente de Grignard na etapa subsequente para finalizar o contaminante do ácido carboxílico).
[00167] 3’-O-TBDPS-5’vinil-timidina (5). 3’-O-TBDPS- 5’aldeído-timidina (4) (5,16 g, 1 eq, 10,75 mmol) foi secado sob forte fluxo de vácuo durante a noite bem como 4A MS., então, THF anidro (150 mL) foi adicionado ao composto
3 e 4A MS sob N2. Uma solução de 1 M brometo de vinil magnésio em THF (21,5 mL, 2 eq, 21,5 mmol) foi adicionado muito lentamente em temperatura ambiente por 30 min. A reação foi agitada em temperatura ambiente sob N2 por 2 h, e verificada por LCMS. Se necessário, algum brometo de vinil magnésio extra pode ser adicionado gota a gota (0,3 eq, 3,22 mL) e a reação agitada por mais 1 h. Uma vez finalizada, uma solução de 1 M de AcOH em água (60 mL, pH = 6) foi adicionada à reação e agitada em temperatura ambiente por 10 min. A reação foi diluída com DCM e as 2 fases foram separadas. A fase aquosa foi extraída 2 vezes com DCM. As camadas orgânicas foram, então, lavadas 2 x com uma solução saturada de NaHCO3, secadas com MgSO4 e concentradas sob vácuo. O resíduo foi purificado por coluna (Biotage, 100 g kpSi, PE/EtOAc) para fornecer o composto 5 como uma espuma creme (2,01 g, 37% ao longo de 2 etapas). LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 505 (M-H+), (-ve) m\z 541 (M+Cl- ), (+ve) m/z 507 (M+H+). 1H NMR (400 MHz, Clorofórmio-d) δ 1,01 (d, J = 10,1 Hz, 9H, tBu), 1,80 (s, 3H, Me), 2,02 – 2,22 (m, 2H, H2’), 3,48 - 3,54 (m, 0,6H, H5’), 3,81 (t, J = 2,2 Hz, 0,6H, H4’), 3,97 – 4,02 (m, 0,4H, H4’), 4,13 – 4,22 (m, 0,4H, H5’), 4,33 – 4,50 (dm, 1H, H3’), 4,82 – 5,17 (m, 2H, CH2=CH-), 5,24 – 5,43 (m, 0,4H, CH2=CH-), 5,52 – 5,75 (m, 0,6H, CH2=CH-), 6,04 – 6,29 (ddd, J = 21,2, 8,3, 6,0 Hz, 1H, H1’), 7,26 – 7,46 (m, 7H, aromático +CH), 7,50 – 7,66 (m, 4H, aromático), 8,23 (s, 1H, NH).
[00168] Síntese alternativa de alil álcool (5). O aldeído (4) foi tratado com cloreto de vinil magnésio (2,5 eq.) em THF em temperatura ambiente para fornecer o composto (5). O uso do reagente cloreto no lugar de brometo reduziu a produção de um análogo brominado do produto desejado (14% no método acima) sem a introdução de uma variante do cloreto do produto desejado.
[00169] 3’-O-TBDPS-5’vinil-5’DMT-timidina (6). 3’-O- TBDPS-5’vinil-timidina (5) (2,01 g, 1 eq, 3,97 mmol) foi secada sob forte fluxo de vácuo durante a noite. AgNO3 foi adicionado e os sólidos foram secados sob vácuo forte por outros 30 min. DCM anidro foi adicionado sob N2 à reação, então, colidina (1,05 mL, 2 eq, 7,94 mmol) e por fim DMT-Cl (2,02 g, 1,5 eq, 5,96 mmol) como um sólido. A reação foi agitada em temperatura ambiente sob N2 por 3 h; o final foi verificado por TLC (PE/EtOAc, 6:4 + 1% de NEt3). A reação foi, então, diluída com DCM e filtrada em celite e o sólido foi lavado com mais DCM. A solução foi, então, particionada com 1% de H2SO4 (60 mL) e extraída com DCM. As camadas orgânicas foram lavadas 2 x com solução saturada de NaHCO3, secadas sobre MgSO4 e concentradas sob vácuo para fornecer o bruto 6 como uma espuma. Será usado sem purificação adicional na etapa seguinte. LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 807 (M-H+), (+ve) m/z 809 (M+H+).
[00170] Procedimento alternativo: Uma solução do composto (5, 6,7 g, 13,2 mmol) e 2,3,5-colidina em DCM anidro foi secada por 30 min em peneiras moleculares. A solução resultante foi, então, adicionada a um frasco contendo cloreto de 4,4’-dimetoxitrifenilmetil (6,7 g) e peneiras moleculares. O AgNO3 foi adicionado e a reação foi agitada por 1 h. A mistura resultante foi diluída com DCM (40 mL) e foi filtrada através de terra diatomácea,
rinsando com DCM (3 x 40 mL). O MeOH foi adicionado (240 mL) ao filtrado e a mistura foi agitada por 10 min, então, foi transferida em um funil de separação, lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (2 x 400 mL), secada (Na2SO4) e concentrada sob vácuo para fornecer o produto bruto como uma espuma amarela.
[00171] 5’Vinil-5’DMT-timidina (7). 3’-O-TBDPS- 5’alil-5’DMT-timidina (6) (1 eq, 3,97 mmol da etapa anterior) foi secada sob alto fluxo de vácuo. O THF anidro (12 mL) foi adicionado sob N2 e resfriado para 4°C. Uma solução de 1 M de TBAF em THF (4,37 mL, 1,1 eq, 4,37 mmol) foi adicionada gota a gota a 4°C. Após 5 min a 4°C, a reação foi permitida aquecer em temperatura ambiente e agitada sob N2 por 3 h. O final da reação foi acompanhado por TLC (PE/EtOAc, 3:7 + 1% de NEt3). A reação foi diluída com EtOAc e particionada com solução saturada de NaHCO3. A fase aquosa foi extraída com EtOAc, então, a fase orgânica foi lavada com solução saturada de NaHCO3, então, salmoura, secada sobre MgSO4 e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por coluna (Biotage, 25g KpSi, PE/EtOAc + 1% de NEt3) para fornecer o composto 7 como uma espuma branca (1,81 g, 80% ao longo de 2 etapas). LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 569(M-H+), (+ve) m/z 571(M+H+). 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 1,46 (s, 1H, Me), 1,65 (s, 2H, Me), 1,97 – 2,13 (m, 2H, H2’), 3,64 (m, 1H, H4’), 3,85 ( dd, J = 8,0, 4 Hz, 0,4H, H5’), 3,92 (dd, J = 8,0, 4 Hz, 0,6H, H5’), 4,31 – 4,45 (m, 1H, H3’), 4,55 – 4,86 (m, 2H, CH=CH2-), 5,27 (dd, J = 7,4, 4,8 Hz, 1H, OH), 5,52 – 5,71 (m, 1H, CH=CH2-), 6,11 (dt, J = 8,1, 5,8 Hz, 1H, H1’), 6,86 (dd, J = 8, 4 Hz,
4H, aromático), 7,13 – 7,35 (m, 7H, aromático + CH), 7,40 - 7,50 (m, 3H, aromático), 11,35 (s, 1H).
[00172] 5’Vinil-5’DMT-timidina-fosforamidita (8). 5’Vinil-5’DMT-timidina (800 mg, 1,4 mmol) foi secado sob alto fluxo de vácuo. DCM anidro (7 mL) foi adicionado sob N2 e agitado com peneiras moleculares por 10 min em temperatura ambiente. À solução, base de Hunig (0,74 mL, 4,2 mmol) foi adicionada e seguida por 2-cianoetil N,N- diisopropilcloro fosforamidita (407 µL, 0,52 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente sob N2 por 3 h. O final da reação foi acompanhado por TLC (PE/EtOAc, 4:6). A reação foi concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por coluna (Biotage, 25 g KpSi, PE/EtOAc + 1% de NEt3) para fornecer o composto 8 como uma espuma branca (930 mg). LC-MS (ES e CI): (-ve) m/z 770(M-H+), (+ve) m/z 771(M+H+). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0,96 – 1,27 (m, 21H), 1,50 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 1,66 (s, 3H), 2,02 – 2,37 (m, 3H), 2,58 – 2,74 (m, 2H), 2,78 (td, J = 5,8, 3,9 Hz, 1H), 3,46 – 3,69 (m, 6H), 3,76 – 3,93 (m, 2H), 3,96 – 4,10 (m, 2H), 4,61 (ddd, J = 17,5, 14,2, 8,6 Hz, 2H), 4,68 – 4,98 (m, 3H), 5,43 – 5,79 (m, 1H), 6,04 (dt, J = 9,6, 5,1 Hz, 1H), 6,13 (dt, J = 10,7, 6,9 Hz, 0H), 6,85 (ddt, J = 8,2, 5,2, 2,4 Hz, 6H), 7,09 – 7,34 (m, 11H), 7,34 – 7,50 (m, 4H), 11,37 (d, J = 6,1 Hz, 1H). 31P NMR (162 MHz, DMSO) δ 147,94, 147,16, 147,03. Análise da Eficiência da Clivagem
[00173] A eficiência da clivagem foi avaliada em uma alta densidade da superfície do PAZAM do iniciador (40 – 60 k). Uma célula de fluxo HiSeq® (não padronizada) foi preparada após procedimentos padrão aqui descritos. O silano derivado de norborneno foi depositado na superfície do substrato usando o método CVD, seguido por acoplamento click do polímero (PAZAM) à superfície do substrato seguido por um segundo procedimento de acoplamento click para enxertar a superfície do polímero com o oligos P7 modificados contendo o análogo de nucleosídeo T alil (5’- alquino-TTTTTTTTTXCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT, em que X indica o sítio em que o nucleosídeo T modificado descrito acima foi incorporado).
[00174] Os oligos P7 modificados foram enxertados na célula de fluxo PAZAM com densidade similar aos oligos P7 padrão. A eficiência de enxertia para o oligo P7 modificado foi também similar aos oligos P5 e P7 funcionalizados em 5' padrão. A superfície da célula de fluxo foi tratada com 1 mM de Na2PdCl4, 10 mM de THP em mistura de incorporação EA 1x (contendo 50 mM de etanolamina - HCl (pH 9,9), 50 mM de NaCl e 0,05 % de Chaps) a 60°C por 10 min. O ensaio TET-QC foi usado para demonstrar a clivagem bem sucedida dos oligos P5 com T modificado com alil a partir da superfície após o tratamento com o complexo de Pd(0) gerado in situ.
[00175] A FIG. 2A ilustra a imagem Typhoon da superfície da célula de fluxo antes e após o tratamento com Pd(0). A FIG. 2B mostra a mudança na densidade do iniciador antes e após o tratamento com Pd(0), comparando a superfície da célula de fluxo tratada com os oligos P5 modificados com o controle padrão. Em ambas as faixas da baixa densidade do iniciador e da alta densidade do iniciador, a superfície da célula de fluxo tratada com
Pd(0) enxertada com os oligos P5 modificados indicaram mudanças substanciais na intensidade fluorescente. Os resultados sugeriram uma clivagem muito eficiente (~ 95%, ensaio de fluorescência) usando este método. Em comparação, a superfície da célula de fluxo enxertada com oligo P5 padrão não mostrou muita variação na intensidade fluorescente, indicando que os oligos P5 padrão não foram clivados pelo complexo de Pd(0). Análise dos Resultados da Execução do Sequenciamento
[00176] A capacidade dos nucleosídeos T modificados com alil descritos acima em sofrer uma clivagem eficaz foi ainda analisada pela realização de uma curta execução de sequenciamento. Neste experimento, as células de fluxo foram fabricadas seguindo um método similar descrito acima. Portanto, o oligo alquino P5 com T modificado com alil e um oligo alquino P7 padrão foram enxertados em células de fluxo revestidas com PAZAM em diversas densidades da superfície do iniciador. Para garantir uma ressíntese eficiente, a posição da modificação alil foi trocada em direção a extremidade 3' do oligo P5 modificado. A sequência dos iniciadores de enxertia usados para a fabricação da célula de fluxo SBS é descrita como segue: P5: 5'-alquino-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC P7: 5'-alquino-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-oxo G)AT X = modificação alil, tal como descrito no Esquema 1.
[00177] As condições de clivagem típicas envolvem a incubação da superfície enxertada com P5-alil com uma solução de Na2PdCl4/THP a 60°C por 10 min. As superfícies
PAZAM tratadas com Pd(0) foram estáveis nestas condições e podem suportar diversas centenas de ciclos de sequenciamento. Em adição, nenhuma outra reação colateral foi detectada e a subsequente clivagem do oligo P7, tal como determinado indiretamente pela ressíntese PET, permanece não afetada, confirmando a ortogonalidade e especificidade da abordagem alil.
[00178] A FIG. 3A é um gráfico de barras que demonstra que o ensaio QC de fluorescência da superfície corada com TET (TET-QC) resulta de uma alta densidade da célula de fluxo do iniciador não-padronizado. Nos canais 1 - 4, a superfície foi enxertada com oligos P5 modificados com alil e oligos P7 padrão. Nos canais 5 - 8, a superfície foi enxertada com oligos P5/P7 padrão. Os resultados eram comparáveis entre os oligos P5 modificados e padrão. A FIG. 3B ilustra a imagem Typhoon da superfície da célula de fluxo após o TET-QC descrito na FIG. 3A. Novamente, nenhuma diferença visível entre os canais foi identificada uma vez que não mostraram sinal detectável. Os dados preliminares sugeriram que não existe diferença particular entre os oligos P5 modificados e os oligos P5 padrão em termos de densidade de agrupamento.
[00179] Foi também observado que a solução de clivagem contendo Na2PdCl4/THP era estável quando armazenada em temperatura ambiente por diversos dias e misturas envelhecidas ainda podem ser usadas para clivar os oligos P5 modificados com alil. EXEMPLO 2
[00180] Neste exemplo, o método de linearização com
Pd(0) e método de clivagem com diol aqui descritos foram testados em um novo tipo de célula de fluxo enxertada com iniciadores P15/P17 e dados de sequenciamento em um MiSeq® (configurado como um instrumento de 2 canais) foram coletados e comparados às células de fluxo padrão enxertadas com iniciadores P5/P7 e usaram a linearização enzimática descrita na FIG. 1. Ambas as novas células de fluxo e as células de fluxo padrão foram revestidas com polímero PAZAM e a densidade do iniciador na superfície objetivou ser de cerca de 200K para ambos os tipos de iniciadores.
[00181] O sequenciamento foi realizados para ambas as células de fluxo com mistura de incorporação NovaSeq™ e imageamento realizado a 20°C. Antes de cada etapa de linearização (Leitura 1 e Leitura 2), as células de fluxo foram tratadas com exo para remover qualquer excesso de iniciadores de superfície não utilizados. Para a linearização dos iniciadores de superfície padrão (P5/P7) foi feita uma Leitura 1 com a enzima USER (LMX1) a 38°C por 20 min de incubação e uma Leitura 2 com enzima FpG a 40°C por 20 min de incubação. Para a nova linearização com iniciadores P15/P17 de superfície foi feita, na Leitura 1, uma mistura com paládio contendo THP e ascorbato de sódio (6 mM/60 mM/6 mM) a 60°C por 2 min de incubação e uma Leitura 2 com uma mistura de periodato de sódio a 20°C por 10 min de fluxo. A biblioteca sequenciada apresentada nestes dados é PhiX e foram executados 2 x 151 ciclos. Os resultados do sequenciamento são resumidos na tabela abaixo.
Tipo Filtro de Taxa Taxa de passagem emp de Ciclo de emp de célula Densidade Alinhado Alinhado % de (PF) dos Ph/PPh erro intensidade Ph/PPh erro de (k/mm2) (%) R1 (%) R2 ressíntese agrupamentos R1 (%) 1 R2 (%) fluxo (%) R1 R2 (FC) FC 0,45 0,47 0,05 / 96,24 ± 0,06 / 94,86 ± P15/ 183 ± 37 90,57 ± 6,86 ± 3211 ± 288 ± 95,0 0,06 3,75 0,06 3,87 P17 0,03 0,01
106/145 0,36 0,52 FC P5/ 0,07 / 97,86 ± 0,1 / 96,06 ± 237 ± 2 89,37 ± 0,40 ± 3300 ± 40 ± 87 P7 0,06 0,08 0,08 0,21 0,01 0,02
[00182] Os dados de sequenciamento sugerem que a linearização química assistida por Pd(0) trabalhou bem no sequenciamento e, na métrica primária, são muito similares quando comparados aos padrões. O filtro de passagem dos agrupamentos (% PF), faseamento/pré faseamento (ph/ppH), % de alinhamento são equivalentes para ambos os iniciadores de superfície P5/P7 e P15/P17. A % de erro foi levemente mais alta na Leitura 1 para as células de fluxo enxertadas com P15/P17, porém foi ainda muito boa (tal como mostrado na FIG. 4) e as células de fluxo para as variações da célula de fluxo podem também ocorrer. A taxa de erro em % na Leitura 2 é comparável. Além disso, o tempo requerido para a linearização diminuiu em 2 vezes para a Leitura 2 e em 10 vezes para a Leitura 1 quando o novo tipo de célula de fluxo é usado. EXEMPLO 3
[00183] Neste exemplo, o nucleosídeo T alil descrito no Exemplo 1 pode ser ainda marcado com um marcador detectável (isto é, um marcador fluorescente) para ainda agilizar o fluxograma atual de produção da Illumina. Uma vez que o nucleosídeo T alil marcado com corante é incorporado nos oligos P5, ele permite a quantificação direta da reação de enxertia imediatamente após o final. No processo atual, esta etapa é realizada como um ensaio de hibridização separado.
[00184] A reação de clivagem com Pd(0) usando o nucleotídeo T modificado marcado com corante é ilustrada no Esquema 3, usando métodos sintéticos análogos àqueles descritos nos exemplos anteriores.
Esquema 3 EXEMPLO 4
[00185] Neste exemplo, um reagente de ligante diol foi preparado tal como mostrado no Esquema 4. O método melhora a síntese descrita na patente norte americana nº US 8,715,966. Esquema 4
[00186] Diol-1. O presente método remove o DMF como um solvente na síntese de Diol-1. O DMF complica as extrações aquosas devido a formação de emulsões e o particionamento indesejado do produto em uma fase aquosa e nos processos previamente reportados, sua remoção antes do trabalho consumiu muito tempo.
A mistura DMF/DCM anterior foi reposicionada com EtOAc, a qual reduziu o tempo do processo de 3 dias a 1 - 2 dias (incluindo cromatografia). Em adição, a formação do produto secundário bis-tritilado diminuiu o rendimento no método anterior.
Mudar a ordem de adição de reagentes da adição parcial de DMTr-Cl sólido à mistura de hexanodiol/DIPEA para a adição gota a gota de DIPEA líquido a uma mistura de hexanodiol/DMTr-Cl melhorou a seletividade da reação para o produto desejado em cerca de 10%. Em algumas concretizações, o produto desta reação pode ser usado bruto, sem cromatografia para remover o DMTr-OH e o produto secundário bis-tritilado.
[00187] Diol-3. O método de oxidação anterior usando TPAP/catalisador NMO levou à super oxidação do ácido carboxílico correspondente e requisitou até 3 - 4 dias. Aqui, TPAP/NMO foi substituído com TEMPO/lixívia em uma mistura bifásica de DCM e NaHCO3 aquoso. A lixívia foi adicionada gota a gota a uma mistura dos reagentes restantes, e a reação foi completada uma vez que a adição de lixívia foi feita. O produto foi isolado por extração aquosa, com super oxidação mínima e rendimentos de 66 – 92% e um processo geral mais rápido (1,5 dias). Em outras concretizações, a síntese de Diol-3 e Diol-4 pode ser transformado para remover a etapa de cromatografia do intermediário. O excesso de tBuOK pode ser requerido para neutralizar qualquer material de ácido carboxílico no material de partida.
[00188] Diol-2. O método anterior para a síntese de Diol-2 incluiu um refluxo de 48 h com algumas manipulações a 36 h para garantir a reação completa. Aumentar a concentração da reação permitiu uma redução no tempo do refluxo de 48 h a 12 - 24 h. No protocolo anterior, Diol-2 bruto foi extraído em água. A remoção da água foi requerida (como a etapa subsequente é sensível à umidade), a qual consumiu tempo em escala. A etapa foi melhorada pela extração de Diol-2 em DCM e lavagem com NaHCO3 aquoso para remover qualquer ácido acético e minimizar a remoção do solvente. O tempo do processo geral diminuiu de 3 dias para
2 dias. O produto foi armazenado como uma solução estoque em DCM. A solução foi armazenada sobre peneiras moleculares 3A durante a noite antes da reação com Diol-4.
[00189] Alternativamente, o Diol-2 pode ser hidrolisado para o álcool correspondente para simplificar a purificação. O álcool irá, então, ser usado na etapa subsequente para fornecer Diol-4 diretamente.
[00190] Diol-5. A etapa de purificação cromatográfica foi removida, economizando 1 dia no tempo do processo. Em adição, o DMF pode ser trocado por DCM para melhorar a eficiência do processo ao permitir uma diminuição nos volumes de solvente/solução de lavagem durante o trabalho aquoso.
[00191] Diol-6. A etapa de purificação cromatográfica pode ser removida.
[00192] Diol-7. A síntese do Diol-7 envolve dois processos de transformação, esterificação e desililação usando TBAF. No processo previamente reportado, a migração significativa de 1,4-acetil foi observada durante a desililação com TBAF, levando à formação de quantidades significativas do produto secundário indesejado, Diol-7M: .
[00193] Este material reduziu os rendimentos gerais e a pureza do Diol-7. Em adição, a realização do Diol-7M para a etapa subsequente produziu Diol-8M, com a fosforamidita no álcool secundário em vez de no álcool primário. A incorporação em um iniciador resultaria em um ligante não clivável. No presente método, a etapa TBAF foi tamponada com AcOH para remover NaOH indesejado dos lotes de TBAF comerciais. Muito AcOH leva à perda do grupo de proteção DMTr. A reação foi executada com 1,75 equivalente de AcOH, e pré mistura de TBAF e AcOH antes da exposição ao material de partida. Em adição, o método anterior incluiu a evaporação do THF antes do trabalho; o método atual removeu a etapa de evaporação e incluiu a neutralização cuidadosa da fase aquosa para o pH 7 para reduzir a degradação induzida pela base do produto. Por fim, a purificação cromatográfica após a etapa de esterificação foi removida.
[00194] Alternativamente, os procedimentos sintéticos para o Diol-5 ao Diol-7 podem ser transformados, eliminando etapas de cromatografia adicionais. Em suma, o processo pode ser executado para incluir três etapas de cromatografia em vez de seis e o material bruto seria purificado nos estágios do Diol-4, Diol-7 e Diol-8. EXEMPLO 5
[00195] Este exemplo descreve a síntese no monômero de A-TOM, uma porção fosfato modificada 3’ que serve como um grupo de proteção hidroxil. (TOM = tri-isopropilsililoximetil)
Etapa 1. Benzilação da Adenosina DMT (A-OBz).
[00196] N6-Benzoil-2’-Desoxi-5’-ODMT-D-adenosina (11,2 g, 17 mmol) e solvente (mistura piridina/DCM na proporção 1:3, 11 mL de piridina, 33 mL de DCM) foram misturados em temperatura ambiente para fornecer uma solução. O frasco da reação foi resfriado para 0°C e a este foi adicionado DMAP (0,41 g, 3,41 mmol) e cloreto de benzoíla (3,9 g (3,2 mL), 34,1 mmol). Agitado enquanto aquecia para a temperatura ambiente durante a noite (monitoramento por TLC do progresso da reação), resultando em uma mistura laranja muito pálida com algum precipitado sólido branco. O solvente foi removido in vacuo em temperatura <40°C. O resíduo foi diluído com AcOEt (~ 500 mL), lavado duas vezes com bicarbonato de sódio aquoso saturado (2 x 250 mL), água (250 mL) e secado sobre MgSO4. Após a evaporação dos solventes e uma co-evaporação com tolueno, uma espuma branca foi obtida e secada in vacuo para um peso constante. O material foi usado na etapa seguinte sem purificação. Etapa 2. Detritilação (A-OH).
[00197] A-OBz (13,69 g, não purificado, 17 mmol) foi dissolvido em mistura diclorometano/metanol (1:1, 300 mL) e resfriada a 0°C sob nitrogênio.
Ácido trifluoroacético (2,75 mL, 36 mmol) foi adicionado por meio de uma seringa.
A reação foi agitada enquanto era aquecida à temperatura ambiente por uma hora.
O progresso da reação foi monitorado por TLC.
A reação foi finalizada a 0°C pela adição de NaHCO3 sólido (3 g, 36 mmol). O solvente foi removido in vacuo em temperatura < 40°C e o resíduo foi diluído com AcOEt (~ 800 mL) e lavado cinco vezes com água (5 x 250 mL). A camada orgânica foi secada sobre MgSO4, filtrada e secada in vacuo para produzir uma espuma branca.
A purificação por coluna cromatográfica (gradiente de eluição com 1:1 éter de petróleo/acetato de etila para acetato de etila) resultou no produto alvo como um pó branco. (5,0 g, 60% de rendimento (2 etapas), Rf = 0,35 em 100% de acetato de etila) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,25 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,07 (ddt, J = 10,1, 7,0, 1,4 Hz, 4H), 7,75 – 7,68 (m, 1H), 7,68 – 7,62 (m, 1H), 7,62 – 7,51 (m, 4H), 6,64 (dd, J = 8,6, 5,9 Hz, 1H), 5,68 (dt, J = 6,1, 1,9 Hz, 1H), 5,28 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,31 (td, J = 4,4, 1,8 Hz, 1H), 3,72 (tdd, J = 11,8, 6,4, 4,7 Hz, 2H), 3,19 (ddd, J = 14,4, 8,7, 6,1 Hz, 1H), 2,75 (ddd, J = 14,1, 5,9, 1,8 Hz, 1H).
Etapa 3. Oxidação.
[00198] Uma solução de A-OH (1,0 g, 2,18 mmol) em diclorometano (50 mL) contendo peneiras moleculares (4 Å) foi resfriada para 0°C sob gás nitrogênio. Em um frasco separado, periodinano de Dess-Martin (1,11 g, 2,61 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10 mL) sob peneiras moleculares. A solução de Dess-Martin foi adicionada ao A- OH e permitida aquecer para a temperatura ambiente. A reação foi monitorada por LCMS e, após uma hora, a reação foi finalizada com solução de bicarbonato de sódio saturada. A mistura finalizada foi diluída com diclorometano (~ 250 mL) e lavada com solução de bicarbonato de sódio (100 mL) e água (2 x 100 mL). A camada orgânica foi secada sobre MgSO4, filtrada e secada in vacuo para produzir uma espuma branca a qual foi usada na etapa seguinte sem purificação adicional. Etapa 4. Reação de Wittig (A-CH=CH2).
[00199] Brometo de metiltrifenilfosfônio (5,83 g, 16 mmol) foi misturado com THF seco (40 mL) em um balão de fundo redondo de duas bocas secado ao forno contendo barra de agitação, peneiras moleculares e fluxo de nitrogênio. Uma boca do frasco recebeu tert-butóxido de potássio em um tubo de adição de sólidos. A solução foi resfriada para 0°C. O tert-butóxido de potássio foi adicionado ao virar o tubo de adição na junção, permitindo que o sólido caísse na solução agitada sem exposição ao ar ou abertura do sistema. A solução torna-se de branco turvo para amarela e é agitada a 0°C por uma hora. Nota: todos os reagentes sólidos para esta etapa foram secados sob forte vácuo durante a noite na presença de pentóxido de fósforo. Seringas, agulhas, barras de agitação, peneiras moleculares ativadas também secadas no mesmo tanque.
[00200] O sólido amarelo foi adicionado a uma solução de A-CHO (2,5 g, 5,44 mmol) em THF (15 mL) a 0°C por meio de uma agulha de grande calibre e seringa. Mudança da cor de amarelo para laranja. Agitação a 0°C por três horas, monitorando por LCMS.
[00201] A reação de trabalho por despejar a mistura reacional em um frasco contendo água (300 mL) e AcOEt (300 mL) em um béquer de 1 L a 0°C. Agitação por dez minutos antes da transferência a um funil de separação. Lavagem da camada orgânica com solução de bicarbonato de sódio saturada (3 x 100 mL) e salmoura (100 mL). Secagem da camada orgânica sobre MgSO4, filtrada e secada in vacuo para produzir uma espuma marrom amarelada. A purificação por coluna cromatográfica (gradiente de eluição com diclorometano para 5% de metanol/DCM) produziu o produto alvo como uma espuma amarela cremosa. (2,59 g, Rf = 0,53 em 5% de MeOH/DCM) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,21 (s, 1H), 8,77 (s, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,05 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,57 (q, J = 7,9, 7,3 Hz, 3H), 6,50 (t, J = 6,7 Hz, 1H), 6,06 (ddd, J = 17,2, 10,4, 6,7 Hz, 1H), 5,55 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 5,29 – 5,10 (m, 2H), 4,42 (p, J = 4,2 Hz, 1H), 4,30 (dd, J = 6,7, 3,6 Hz, 1H), 2,94 (dt, J = 13,1, 6,4 Hz, 1H), 2,40 (ddd, J = 13,3, 6,5, 4,3 Hz, 1H). Etapa 5. Oxidação do diol (A-OHOH).
[00202] Uma solução de A-CH2CH2 (0,68 g, 1,49 mmol) em THF (7 mL) foi posicionada em um frasco ajustado com barra de agitação e sob nitrogênio. N-óxido de 4- metilmorfolina (0,262 g, 2,235 mmol) foi pesado como um sólido e adicionado ao frasco da reação. Água (7 mL) também foi adicionada. Tetróxido de sódio (4% solução em água, 285 μL, 0,045 mmol) foi adicionado ao frasco da reação. A reação foi aquecida a 40°C durante a noite. Monitoramento por TLC e LCMS do progresso da reação. Finalização da reação pela adição de tiossulfato de sódio como um sólido. Agitação da mistura por 30 minutos antes do trabalho em acetato de etila (150 mL) e solução de bicarbonato de sódio. A camada orgânica foi lavada três vezes com solução de bicarbonato de sódio saturada (3 x 100 mL). A camada orgânica foi secada sobre MgSO4, filtrada e secada in vacuo para produzir um sólido esbranquiçado de cristalização lenta. Purificação por coluna cromatográfica (gradiente de eluição com diclorometano a 10% de metanol/DCM) produziu o produto alvo como um óleo incolor. (0,13 g, 19% de rendimento, Rf = 0,28 em 5% de MeOH/DCM) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,25 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,73 (s, 1H), 8,07 (ddt, J = 9,6, 7,2, 1,4 Hz, 4H), 7,74 – 7,68 (m, 1H), 7,68 – 7,62 (m, 1H), 7,62 – 7,47 (m, 5H), 6,62 (dd, J = 8,9, 5,8 Hz, 1H), 5,82 (dt, J = 5,8, 1,5 Hz, 1H), 5,48 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 4,69 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 4,31 (dd, J = 5,0, 1,5 Hz, 1H), 3,81 (p, J = 5,3 Hz, 1H), 3,48 (dh, J = 22,3, 5,5 Hz, 2H), 3,18 (ddd, J = 14,4, 9,0, 5,9 Hz, 1H), 2,70 (ddd, J = 14,4, 6,0, 1,5 Hz, 1H). Etapa 6. Sililação (A-OHTOM).
[00203] Uma solução de A-OHOH (0,128 g, 0,262 mmol) em DCM foi dissolvida em DCM (1,5 mL) em um frasco contendo barra de agitação e fluxo de nitrogênio. Dicloreto de di- tert-butiltina (80 mg, 0,262 mmol) e N,N-diisopropiletil amina (182 μL, 1,05 mmol) foram adicionados em temperatura ambiente por 30 minutos. Cloreto de tri-iso-propil sililoximetil (TOM-Cl, 79 μL, 0,341 mmol) foi adicionado por meio de uma micropipeta. Monitoramento por TLC e LCMS do progresso da reação. Reação deixada durante a noite em temperatura ambiente. Trabalho de reação realizado em acetato de etila (200 mL). Lavado com solução de bicarbonato de sódio saturada (3 x 100 mL). Secagem da camada orgânica sobre MgSO4, filtrada e secada em vácuo para produzir um óleo amarelo/marrom. Purificação por coluna cromatográfica (gradiente de eluição com diclorometano para 8% de metanol/DCM) produziu o produto alvo como uma espuma amarelo - branca (0,14 g, 79 % de rendimento, Rf = 0,5 em 5 % de MeOH/DCM) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,25 (s, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,73 – 8,65 (m, 1H), 8,06 (tt, J = 7,5, 1,4 Hz, 4H), 7,76 – 7,62 (m, 2H), 7,62 – 7,46 (m, 4H), 6,61 (dd, J = 8,9, 5,7 Hz, 1H), 5,82 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 5,65 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,84 (s, 2H), 4,27 (dd, J = 5,4, 1,5 Hz, 1H), 4,06 – 3,93 (m, 1H), 3,62 (ddd, J = 42,1, 10,3, 5,2 Hz, 2H), 3,22 (ddd, J = 14,7, 9,1, 5,8 Hz, 1H), 2,74 – 2,65 (m, 1H), 0,94 (m, 21H, TOM). Etapa 7. Tritilação (A-TOM-DMT).
[00204] A-OHTOM seco (0,14 g, 0,207 mmol), (cloreto de 4,4’-dimetoxitrifenilmetil (DMT-Cl, 0,105 g, 0,311 mmol)
e nitrato de prata (53 mg, 0,311 mmol) foram posicionados em um frasco com DCM seco (1,5 mL) e colidina (2,4,6- trimetilpiridina) (55 μL, 0,414 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente por três horas. Monitoramento por TLC e LCMS do progresso da reação. A mistura reacional diluída com DCM (100 mL) e filtrada através de um funil de vidro sinterizado. A solução de DCM foi lavada com solução de bicarbonato de sódio saturada (5 x 100 mL). A camada de DCM foi secada sobre MgSO4, filtrada e secada em vácuo para produzir um óleo amarelo/marrom. Purificação por coluna cromatográfica (gradiente de eluição com diclorometano para 10% de metanol/DCM) produziu o produto alvo como um óleo amarelo viscoso (0,17 g, 85% de rendimento, Rf = 0,46 em 5% de MeOH/DCM). Etapa 8 (A-3’OH).
[00205] Uma solução de A-TOM-DMT (56 mg, 56 μmol) em uma mistura de metanol e THF (4:5, 0,9 mL total) foi resfriada para 0°C. O hidróxido de sódio foi adicionado (4 M, 0,1 mL, excesso) e agitado a 0°C por 15 minutos. A reação foi monitorada por TLC e LCMS. A reação foi finalizada usando ácido acético (1 M, 0,5 mL), garantindo que o pH não diminuísse para menos de pH 8. A mistura reacional foi diluída com acetato de etila (EA, 100 mL) e lavada com solução de bicarbonato de sódio saturada (3 x 50 mL). A camada EA foi secada sobre MgSO4, filtrada e secada in vacuo. O resíduo foi purificado por coluna cromatográfica (gradiente de eluição com EA/éter de petróleo (25%) para 100% EA) para fornecer uma espuma branca (0,02 g, 40% de rendimento, Rf = 0,38 em 100% de EA). Etapa 9. Formação de Fosforamidita (monômero ATOM).
[00206] A-3’OH (92 mg, 105 μmol) foi posicionado em um frasco contendo peneiras moleculares e uma barra de agitação magnética antes do THF (seco, 0,2 mL) ser adicionado em temperatura ambiente sob gás nitrogênio. N,N- diisopropiletilamina (110 μL, 630 μmol) foi adicionado à solução de THF. Por fim, 2-cianoetil N,N-diisopropil clorofosforamidita (38 μL, 169 μmol) foi adicionado por meio de uma micropipeta. A reação foi agitada em temperatura ambiente sob nitrogênio. A reação foi monitorada por TLC. Quando a reação foi finalizada, o solvente foi removido in vacuo. O resíduo foi lavado com éter de petróleo (3 x 20 mL) em temperatura ambiente. O resíduo foi, então, dissolvido em DCM e filtrada para remover as peneiras moleculares. Secada novamente in vacuo antes da purificação por coluna cromatográfica (gradiente de eluição com EA/éter de petróleo (20%) para 75% de EA) forneceu um óleo incolor viscoso (80 mg, 70% de rendimento) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,17 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,06 – 7,99 (m, 2H), 7,64 (td, J = 7,1, 1,2 Hz, 1H), 7,58 – 7,46 (m, 4H), 7,36 (ddd, J = 15,4, 9,0, 2,8 Hz, 4H), 7,29 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,27 – 7,17 (m, 1H), 6,92 – 6,83 (m, 4H), 6,34 (dd, J = 9,0, 5,9 Hz, 1H), 4,78 – 4,71 (m, 1H), 4,68 (q, J = 6,6, 4,6 Hz, 1H), 4,52 (dd, J = 8,5, 4,9 Hz, 1H), 4,27 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 3,85 – 3,69 (m, 8H), 3,62 (dp, J = 10,4, 6,7 Hz, 1H), 3,34 – 3,22 (m, 1H), 2,78 (td, J = 5,8, 1,9 Hz, 2H), 2,64 (td, J = 8,8, 4,7 Hz, 1H), 2,26 – 2,16 (m, 1H), 2,08 (d, J = 0,7 Hz, 6H), 1,21 (dd, J = 15,4, 5,6 Hz, 9H), 1,12 (d, J = 6,7 Hz, 6H), 0,99 – 0,88 (m, 2H), 0,83 (dd, J = 6,3, 4,5 Hz, 18H). EXEMPLO 6 Síntese do Dinucleotídeo (C-Tom-A) Modelo.
[00207] Os compostos C-amidita (125 mg, 0,15 mmol) e A-OH-Tom (64 mg, 0,1 mmol) foram secados sobre P2O5 sob vácuo durante a noite e dissolvidos em acetonitrila anidra
(1 mL). Sob N2, etiltiotetrazol (ETT, 32,5 mg, 0,25 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 15 min. A TLC e LC-MS indicaram o consumo completo do material de partida A-OH-Tom. A solução de t- BuOOH em decano (5 M, 0,1 mL) e DCM (1 mL) foi adicionada à mistura reacional e agitada por 15 min em temperatura ambiente. A mistura reacional foi despejada sobre NaHCO3 aquosa e a fase aquosa foi extraída com EtOAc. A fase orgânica combinada foi evaporada e tratada com NaOH (0,1 M, 1 mL em H2O/THF/MeOH = 1/4/5 v/v) em temperatura ambiente por 1 h. A mistura foi, então, tratada com HCl (1 M) em THF/MeOH (5 mL/4 mL) por 0,5 h. A mistura reacional foi concentradas e particionada em H2O e EtOAc. O produto desejado foi recuperado a partir da fase aquosa e ainda purificado com RP HPLC (TEAB 0,1 M/CH3CN). Estudo de Clivagem em Composto C-TOM-A Modelo.
[00208] Uma solução estoque de C-TOM-A foi tratada sob diversas condições de desproteção. O progresso da reação foi monitorado por RP HPLC. O intermediário C-A é o composto no qual o grupo TOM tenha sido removido do C-TOM- A, porém, a ligação fosfato não foi clivada. A Tabela 1 abaixo resume os resultados de desproteção sob diversas condições reacionais e reagentes de desproteção.
Tabela 1. Condições Resultados 60% do 0,5 mM de C-TOM-A, 0,5 M de TBAF, 1:1 intermediário C-A / THF/H2O, pH ~ 7 2,5 h 100% do 0,5 mM de C-TOM-A, 0,5 M de Et3N - intermediário C-A / 3HF, Et3N, pH ~ 7 2,5 h 80% do 0,5 mM de C-TOM-A, 0,25 M de NH4F, pH intermediário C-A / ~ 7 2,5 h 70% do 0,5 mM de C-TOM-A, 0,25 M de CsF, intermediário C-A / Tris-HCl, pH 7,4 2,5 h 70% do 0,5 mM de C-TOM-A, 0,25 M de CsF, intermediário C-A / Tris-HCl, pH 9 2,5 h 80% do 0,5 mM de C-TOM-A, 0,5 M de Et3N - intermediário C-A + 3HF, pH ~ 1 20% do produto / 1 h 50% do 0,33 mM de C-TOM-A, 0,17 M de NH4F, intermediário C-A + 0,33 M de NaOH, pH ~ 14 50% do produto / 1 h 0,33 mM de C-TOM-A, 0,33 M de CsF, Finalizada em 1 h 0,33 M de NaOH, pH ~ 14 0,5 mM de C-TOM-A, 1 M de NaOH, pH 14 Finalizada em 20
Condições Resultados min EXEMPLO 7
[00209] Neste exemplo, métodos alternativos para gerar o complexo de Pd(0) são descritos e as atividades da sua clivagem química foram comparadas à do complexo de Pd(0) gerado in situ a partir do dímero alil cloreto de paládio(II) (Pd(C3H5)Cl)2 e THP, tal como descrito no Exemplo 1. Diferente do complexo de Pd(0) gerado in situ, alguns pré catalisadores de paládio (II) foram preparados e isolados antes do uso na reação de linearização química, por exemplo, clivagem química do iniciador P15. Estes pré catalisadores Pd(II) são inativos na forma isolada porém podem ser convenientemente reduzidos para o Pd(0) ativo in situ na presença de THP. Estes pré catalisadores de Pd alternativos podem melhorar a estabilidade do produto e prolongar a validade. Método de preparação
[00210] (Pd(C3H5)Cl)2 foi dissolvido em tetrahidrofurano seco e desgaseificado sob nitrogênio e tratado com 1 a 10 equivalentes de THP adicionado como uma solução de tetrahidrofurano. A lubrificação foi observada e os óleos foram isolados por decantação do sobrenadante. O material foi secado sob vácuo para obter um óleo de amarelo a marrom ou óleos laranja viscosos. Estes materiais eram altamente solúveis em água. Quando 1 a 2 equivalentes de THP foram adicionados, a mistura de [Pd(C3H5)(THP)]Cl e [Pd(C3H5)(THP)2]Cl foi isolada, ambos os quais foram complexos de Pd(II). Quando 5 equivalentes de THP foram adicionados, uma amostra limpa de [Pd(C3H5)(THP)2]Cl foi obtida. Esses dois complexos de Pd(II) foram isolados e caracterizados. Quando 10 equivalentes de THP foram adicionados, o material de Pd(0) que é ativo para a linearização P15 foi obtido.
[00211] [Pd(C3H5)(THP)]Cl: 31P NMR (162 MHz, D2O): d 14 (s) ppm. 13C NMR (101 MHz, D2O): d 118,7 (d, J = 5,0 Hz), 81,7 (d, J = 29 Hz), 62,1 (d, J = 15 Hz), 26,5 (s), 20,5 (d, J = 25,0 Hz) ppm. LC-MS: [AlilPd(THP)]+; Esperado: 355 Da, Encontrado: 355 Da.
[00212] [Pd(C3H5)(THP)2]Cl: 31P NMR (162 MHz, D2O): d 10 (s) ppm. 13C NMR (101 MHz, D2O): d 122,7 (t, J = 5,3 Hz), 71,2 (t, J = 14 Hz), 61,8 (t, J = 7,6 Hz), 26,7 (s), 22,1 (t, J = 13 Hz) ppm. LC-MS: [AlilPd(THP)2]+; Esperado: 563 Da, Encontrado: 563 Da. Uso para a Clivagem P15
[00213] Materiais isolados a partir do tratamento de (Pd(C3H5)Cl)2 com 1, 2, 5 e 10 equivalentes de THP foram formulados em tampão aquoso a 10 mg/mL. A atividade destas formulações em direção a clivagem do P15 foi avaliada usando um ensaio a base de HPLC. Neste ensaio, uma solução de iniciador P15 (10 μM) foi tratada com 10% v/v de cada formulação, incubada por 10 minutos a 38°C, então, finalizada por diluição e tratamento com coluna spin e analisado por HPLC. A porcentagem da clivagem é calculada a partir da proporção de P15 e áreas de pico do produto da clivagem.
[00214] Formulações aquosas de [Pd(C3H5)(THP)]Cl e [Pd(C3H5)(THP)2]Cl (obtidas a partir da mistura de
(Pd(C3H5)Cl)2 com 1 a 5 equivalentes de THP) foram inativadas por clivagem do P15 na ausência de outros aditivos. No entanto, formulações aquosas de materiais isolados a partir da mistura de (Pd(C3H5)Cl)2 com 10 equivalentes de THP forneceram atividade da clivagem de P15 comparável a uma mistura de Pd preparada in situ de (Pd(C3H5)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM) e ascorbato de sódio (6 mM). Os resultados foram mostrados na FIG. 5A. foi observado que pré catalisadores de Pd(II) [Pd(C3H5)(THP)]Cl e [Pd(C3H5)(THP)2]Cl foram convenientemente ativados in situ tanto durante a preparação ou em seu ponto de uso pelo tratamento com solução aquosa de THP adicional. [Pd(C3H5)(THP)2]Cl foi demonstrado se tornar ativo quando tratado com 1 ou mais equivalentes de THP quando formulado em solução aquosa (12 mM Pd). O desempenho da clivagem de P15 excedeu o ponto da amostra de referência, uma mistura de Pd(0) preparada in situ a partir da mistura de (Pd(C3H5)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM), e ascorbato de sódio (6 mM) (FIG. 5B). EXEMPLO 8
[00215] Neste exemplo, um complexo de Pd(0) isolável alternativo Pd(THM)4 foi preparado pelo uso de um ligante de fosfina tris(hidroximetil)fosfina (THM). Sua atividade da clivagem é comparada àquela de um complexo de Pd(0) gerado in situ a partir de dímero de cloreto de alil paládio(II) (Pd(C3H5)Cl)2 e THP tal como descrito no Exemplo
1.
[00216] Preparação: Pd(THM)4 foi preparado e isolado usando o protocolo descrito por Ellis, et al., Inorg.
Chem., 1992, 31, 14. Uma solução aquosa foi formulada em uma concentração de 10 mM e seu desempenho foi avaliado em relação ao Pd(0) gerado in situ usando (Pd(C3H5)Cl)2 (10 mM) e THP (100 mM).
[00217] Para demonstrar a linearização induzida por Pd(0), o sequenciamento foi realizado em um instrumento NovaSeq™ usando uma célula de fluxo S4 enxertada com iniciadores de superfície P15/P7 (2 x 151 com ciclos de indexação duais). O fluxo de trabalho Xp foi usado com bibliotecas (inserções de 450 bp) de nano (faixas 1 e 3) e livre de PCR (faixas 2 e 4). Antes da Leitura 1 da química da SBS, a linearização foi realizada usando tanto uma mistura de Pd composta de (Pd(C3H5)Cl)2 (10 mM), THP (100 mM), e ascorbato de sódio (10 mM) [nas faixas 1 - 2]; ou uma solução aquosa de Pd(THM)4 (10 mM) [nas faixas 3 - 4]. A linearização da Leitura 2 foi realizada usando um reagente contendo a enzima FpG. Foi observado que a métrica de sequenciamento foi, em geral, comparável para ambos os métodos de linearização com Pd. As altas intensidades da Leitura 1 e porcentagem de ressíntese com Pd(THM)4 indicaram que uma linearização bem sucedida foi alcançada (FIG. 6A). Taxas de erros humanos e PhiX foram comparáveis para ambos os métodos (FIG. 6B). Os resultados do sequenciamento estão resumidos na tabela abaixo (Tabela 2). Tabela 2.
(PdCl(C3H5))2/THP Pd(THM)4 /ascorbato de sódio Métricas Desvio Desvio Média ± Média ± padrão padrão
(PdCl(C3H5))2/THP Pd(THM)4 /ascorbato de sódio Métricas Desvio Desvio Média ± Média ± padrão padrão Filtro de passagem (PF) dos 74,6925 ± 8,13 74,23 ± 8,90 agrupamentos (%) Taxa de erro 0,4725 ± 0,12 0,52 ± 0,11 R1 (%) Taxa de erro 0,43 ± 0,08 0,475 ± 0,08 R2 (%) Intensidade R1 1249,25 ± 179,06 1404,5 ± 119,50 do ciclo 1 Intensidade R2 1328,25 ± 195,68 1496 ± 140,01 do ciclo 1 Intensidade R3 1194,75 ± 160,90 1339 ± 101,82 do ciclo 1 Intensidade R4 1123 ± 125,10 1208 ± 86,27 do ciclo 1 Discrepâncias na Leitura 1 0,4525 ± 0,08 0,475 ± 0,09 (%) Discrepâncias na Leitura 2 0,5975 ± 0,10 0,615 ± 0,11 (%) Ressíntese (%) 89,8939 86,009 EXEMPLO 9
[00218] Neste exemplo, uma rota alternativa para a preparação do complexo de Pd (0) ativo é descrita. Pd(THP)2-4 foi preparado e isolado por reação de Pd(PPh3)4 com THP em uma reação de troca de ligante. A atividade da clivagem é comparada com aquela do complexo de Pd(0) gerado in situ do dímero de cloreto de alil paládio(II) (Pd(C3H5)Cl)2 e THP tal como descrito no Exemplo 1. Método de preparação
[00219] Sob nitrogênio, Pd(PPh3)4 foi dissolvido em diclorometano seco e desgaseificado para fornecer uma solução amarela. Solução aquosa de THP (4,1 equivalentes) foi adicionada para obter uma mistura bifásica, a qual foi agitada por 2,5 horas. A cor amarela foi transferida da camada orgânica para a camada aquosa. A reação foi trabalhada por desvio da camada orgânica e rinsagem da fase aquosa com DCM adicional. A fase aquosa foi secada sob pressão reduzida e co-evaporada com tetrahidrofurano e o óleo laranja resultante foi secado sob alto vácuo. O rendimento foi quase quantitativo. O produto da análise LC- MS indicou a presença de Pd(THP)2 [Pd(THP)2+ H+; Esperado: 523 Da, Encontrado: 523 Da]. Uso para Linearização P15
[00220] Pd(THP)2-4 foi formulado em tampão aquoso a 10 mg/mL e sua atividade da clivagem P15 foi avaliada usando um ensaio a base de placa. Este ensaio utiliza uma placa de 96 poços enxertada com iniciadores de superfície P15/P17. Um corante fluorescente intercalado é usado para quantificar o DNA de fita dupla presente antes e depois da linearização da Leitura 1; o percentual de clivagem pode ser calculado a partir da quantidade de DNA de fita dupla restante. Para formulações de Pd(THP)2-4, a atividade da clivagem P15 foi comparável a uma mistura de Pd preparada in situ de (Pd(C3H5)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM) e ascorbato de sódio (6 mM) (FIG. 7). Foi observado que os dois métodos apresentaram desempenhos de clivagem comparativos. EXEMPLO 10
[00221] Neste exemplo, reagentes de clivagem química a base de níquel alternativos foram preparados e testados na clivagem de uma fita de DNA contendo nucleotídeo dT alil.
[00222] Primeiro, ambos os ligantes de fosfina THP e THM foram usados em diversos equivalentes para reagir com NiCl2 na preparação de complexos de níquel. O Ni-THP (proporção de 1:4 ou 1:10) produziu o mesmo produto de clivagem que o reagente contendo paládio descrito no Exemplo 1. De forma interessante, o Ni-THM no qual o ligante de fosfina tinha uma cadeia de alquil mais curta (logo, menor ângulo cônico) não demonstrou a mesma atividade da clivagem quando complexado com níquel.
[00223] A atividade da clivagem de Ni-THP na superfície foi testada e comparada com aquela do Pd-THP. O experimento foi realizado em uma célula de fluxo HiSeq™ enxertada com iniciadores P15/P7 e oligos de rastreio. Os oligos de rastreio apresentam quatro alildT na sequência e marcador fluorescente 3’. Após a clivagem do alildT pelos complexos de Ni-THP ou Pd-THP, o sinal fluorescente da célula de fluxo seria eliminado. A célula de fluxo foi enxertada com 1,1 µM de P15/P7 e mais 5% a 40% de oligos de rastreio, então, escaneados em Typhoon para confirmar o sucesso da enxertia. A linearização química foi realizada a 60°C por 10 min. As faixas 1 a 4 foram tratadas com complexo de Pd-THP ((Pd(C3H5)Cl)2 gerado in situ (10 mM), THP (100 mM) e ascorbato de sódio (10 mM)) como controle, faixas 5 a 8 foram tratadas com 10 mM de complexo de Ni-THP (1:10). A intensidade de fluorescência foi, então, obtida em Typhoon para avaliar a extensão da linearização química. Disposição da faixa: 5% de rastreio = 55 nM (Faixas 1, 5); 10% de rastreio = 110 nM (Faixas 2, 6); 20% de rastreio = 220 nM (Faixas 3, 7); 40% de rastreio = 440 nM (Faixas 4, 8). A FIG. 8 mostra a intensidade fluorescente média normalizada antes e após a clivagem e Ni-THP demonstrou uma atividade da clivagem eficiente que foi comparável ao Pd- THP. EXEMPLO 11
[00224] Neste exemplo, um ligante a base de azo- areno alternativo como um ligante clivável bioortogonal para a linearização química por uma solução aquosa de ditionita de sódio (Na2S2O4) é descrita.
[00225] Esquemas 5 e 6 ilustram a preparação de azo- fosforamiditas 1 e 2, respectivamente. Esquema 5
[00226] Composto 5. Sob N2, uma suspensão de metil 2-amino-5-iodobenzoato (4) (2,77 g, 10 mmol), Pd(PPh3)4 (1,159 mg, 1 mmol), CuI (381 mg, 2 mmol), Et3N (4,2 mL, 30 mmol) e propargil álcool (1,75 mL, 30 mmol) em DMF (20 mL) foram agitados em temperatura ambiente por 15 h.
A análise por TLC (éter de petróleo:acetato de etila 1:1) indicou o consumo total do material de partida.
A reação foi finalizada com 200 mL de solução saturada de NaCl.
Acetato de etila:éter de petróleo 1:1 (200 mL) foi adicionado à mistura e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila :éter de petróleo 1:1 três vezes.
Após a secagem dos orgânicos combinados sobre MgSO4, a solução foi concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo:acetato de etila 80:20 para acetato de etila), fornecendo o composto 5 como um óleo amarelo (1,88 g, 92%), 1H NMR (CDCl3)  3,78 (s, 3H), 4,25 (s, 2H, CCH2), 7,27 - 7,36 (m, 2H, aromático H), 7,58 - 7,65 (m, 1H, aromático H).
[00227] Composto 6. Sob N2, à solução do composto 5 (1,88 mg, 9,2 mmol) e imidazol (1,83 g, 27,6 mmol) em DMF seco (25 mL) foi adicionado cloreto de t-butildifenilsilil (1,06 g, 12 mmol). A reação foi acompanhada por TLC e completada após agitação por 1 hora em temperatura ambiente. A reação foi finalizada com solução saturada de NaHCO3 e extraída com acetato de etila:éter de petróleo 1:1 (2x). Após a secagem dos orgânicos combinados sobre MgSO4, o solvente foi removido sob vácuo. A mistura bruta foi, então, dissolvida em EtOH e tratada com EtSiH e Pd-C (10%). A mistura reacional foi refluxada sob N2 por 16 horas. A análise por TLC (éter de petróleo:acetato de etila 8:2) indicou o consumo completo do material de partida. A mistura reacional foi filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo para éter de petróleo:acetato de etila 1:1), fornecendo o composto 6 como um óleo amarelo (3,37 g, 82%). 1H NMR (CDCl3)  1,04 (s, 9H, 3xCH3), 1,70 - 1,77 (m, 2H, CH2), 2,56 (t, 2H, CH2), 3,58 (t, 2H, OCH2), 3,60 (s, 3H, OCH3), 6,62 - 6,65 (m, 1H, aromático H), 7,03 - 7,06 (m, 1 H, aromático), 7,27 - 7,63 (m, 11H, aromático H).
[00228] Composto 8. A uma suspensão de resorcinol (2,2 g, 20 mmol) e K2CO3 (2,76 g, 20 mmol) em DMF (40 mL), tert-butil 4-bromobutanoato (2,2 g, 10 mmol) foi adicionado sob N2. A mistura reacional foi agitada em temperatura ambiente por 15 h. A análise por TLC (éter de petróleo:acetato de etila 7:3) indicou o consumo de 90% do material de partida resorcinol. A reação foi finalizada com 300 mL de solução saturada de NaCl. Acetato de etila:éter de petróleo 1:1 (300 mL) foram adicionados à mistura reacional e a camada aquosa foi extraída com acetato de etila:éter de petróleo 1:1 três vezes. Após a secagem dos orgânicos combinados sobre MgSO4, a solução foi concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo para éter de petróleo:acetato de etila 50:50), fornecendo o composto 8 como um óleo amarelo (2,2 g, 88%). 1H NMR (CDCl3)  1,27 (s, 9H),1,91 - 1,98 (m, 2H, CH2), 2,22 (t, 2H, CH2), 3,27 (t, 2H, OCH2), 6,36 – 6,46 (m, 3 aromático H), 7,09 (t, 1 aromático H).
[00229] Composto 9. O composto 5 (450 mg, 1 mmol) foi dissolvido em uma solução de acetona/água (1:1) (2,5 mL). A mistura foi resfriada para 0°C e HCl concentrado (0,5 mL) foi adicionado. Após 5 minutos, nitrito de sódio (93 mg, 1,2 mmol) em água (1 mL) foi adicionado gota a gota e a mistura foi agitada por 1 hora a 0°C. Ao mesmo tempo, foram solubilizados o Composto 8 (252 mg, 1 mmol), Na2CO3 (210 mg, 2 mmol) e NaOH (160 mg, 4 mmol) em uma solução de acetona/água (1:1) (3 mL). A primeira solução foi adicionada gota a gota na segunda a 0°C. Após a adição ser finalizada, a mistura foi aquecida até temperatura ambiente e agitada por uma hora adicional. A mistura reacional foi neutralizada com 1 M de HCl e, então, extraída com DCM (3 x 50 mL). A fase orgânica foi secada sobre MgSO4, concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo para éter de petróleo:acetato de etila 1:1). O composto 9 foi obtido como um óleo laranja/vermelho (400 mg, 56%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,02 (s, 9H, 3xCH3), 1,27 (s, 9H),  1,69 - 1,76 (m, CH2), 1,91 - 1,97 (m, 2H,
CH2), 2,20 (t, 2H, CH2), 2,53 (t, 2H, CH2), 3,34 (t, 2H, OCH2), 3,54 (t, 2H, OCH2), 3,62 (s, 3H, OCH3), 6,36 - 6,46 (m, 4 aromático H), 7,00 - 7,06 (m, 1 H, aromático H), 7,09 (t, 1 aromático H), 7,27 - 7,63 (m, 11H, aromático H).
[00230] Composto 11. O composto 9 (3,55 g, 5 mmol) foi dissolvido em DCM (50 mL). A solução foi tratada com TFA (10 mL) em temperatura ambiente e agitada durante a noite. Então, TFA foi removido sob pressão reduzida e co- evaporado com tolueno. O resíduo foi particionado entre NaCl e DCM. A camada aquosa foi extraída com DCM 3 vezes. A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4 e concentrada. O produto bruto foi dissolvido em THF (15 mL) e tratada com TBAF (1 M, 5 mL). A reação foi monitorada por TLC (DCM/MeOH 90:10). O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi particionado entre NaCl e DCM (+ 10% de MeOH). A camada aquosa foi extraída com DCM (+ 10% de MeOH) 3 vezes. A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4 e concentrada. O resíduo foi co-evaporado com piridina 3x. o resíduo foi dissolvido em Py/CH3CN (10/10 mL) e base de Hunig (3,7 mL, 15 mmol), DMT-Cl (5,07g, 15 mmol) foram adicionados. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. O TLC (DCM:MeOH 95:5) indicou o final da reação. A mistura foi concentrada, dissolvida em DCM, e lavada com Na2CO3. A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4, concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo:acetato de etila 8:2 para acetato de etila + 1% de NEt3). O composto 11 foi obtido como um óleo laranja/vermelho (2,37 g, 66%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ
1,70 - 1,79 (m, 2H, CH2), 1,90 - 1,97 (m, 2H, CH2), 2,24 (t, 2H, CH2), 2,54 (t, 2H, CH2), 3,26 (t, 2H, OCH2), 3,58 (t, 2H, OCH2), 3,63 (s, 3H, OCH3), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79 - 6,89 (m, 4H, aromático), 7,03 - 7,06 (m, 1 H, aromático H), 7,10 (t, 1 aromático H), 7,13 - 7,63 (m, 13H, aromático H).
[00231] Composto 12. O composto 11 (1,05 g, 1,46 mmol) e DMAP (18 mg, 0,15 mmol) foram dissolvidos em 7 mL de piridina anidra sob N2. A mistura reacional foi, então, resfriada para 0°C e cloreto de benzoíla (0,5 mL, 4,4 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura reacional foi lentamente aquecida até a temperatura ambiente e agitada por uma hora durante a qual a solução se tornou turva. A análise por TLC indicou o consumo completo do material de partida. A reação foi finalizada com solução saturada de NaHCO3. A camada aquosa foi extraída com DCM 3 vezes. A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4, concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo:acetato de etila 8:2 para acetato de etila + 1% de NEt3) para fornecer o composto 12 como um óleo amarelo (930 mg, 78%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,69 - 1,76 (m, 2H, CH2), 1,91 - 1,97 (m, 2H, CH2), 2,20 (t, 2H, CH2), 2,53 (t, 2H, CH2), 3,24 (t, 2H, OCH2), 3,54 (t, 2H, OCH2), 3,62 (s, 3H, OCH3), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79 - 6,86 (m, 4H, aromático), 7,01 (t, 1 aromático H), 7,04 - 7,11 (m, 3 H, aromático H), 7,13 - 7,63 (m, 13H, aromático H), 7,94 - 8,36 (m, 3H, aromático H).
[00232] Composto 13. O composto 12 (340 mg, 0,5 mmol) foi dissolvido em 3 mL de DMF anidro sob N2 e base de
Hunig (0,26 mL, 1,5 mmol) foi adicionada. A mistura reacional foi, então, tratada com TSTU (196 mg, 0,65 mmol) e mantida em temperatura ambiente. Após 30 min, a análise por TLC (EtOAc) indicou que a reação foi finalizada. Então, 3-aminopropanol (38 µL, 0,5 mol) foi adicionado à mistura reacional e agitado em temperatura ambiente por 4 h. A análise por TLC indicou o consumo completo do material de partida. A reação foi finalizada com solução saturada de NaHCO3. A camada aquosa foi extraída com DCM 3 vezes. A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4, concentrada, co-evaporada com xileno (3x) e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo:acetato de etila 8:2 para acetato de etila + 1% de NEt3) para fornecer o composto 13 como um óleo laranja (320 mg, 73%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,67 - 1,79 (m, 4H, CH2), 1,91 - 1,97 (m, 2H, CH2), 2,20 (t, 2H, CH2), 2,53 (t, 2H, CH2), 3,24 (t, 2H, OCH2), 3,45 (t, 2H, OCH2), 3,51 (t, 2H, NCH2), 3,54 (t, 2H, OCH2), 3,69 (s, 3H, OCH3), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79 - 6,86 (m, 4H, aromático), 7,01 (t, 1 aromático H), 7,04 - 7,11 (m, 3 H, aromático H), 7,13 - 7,69 (m, 13H, aromático H), 7,94 - 8,40 (m, 3H, aromático H).
[00233] Composto 14. O composto 13 (320 mg, 0,36 mmol) foi secado sob alto fluxo de vácuo. DCM anidro (2 mL) foi adicionado sob N2 e agitado com peneiras moleculares por 10 min em temperatura ambiente. À solução, base de Hunig (0,19 mL, 1,1 mmol) foi adicionada e seguida por 2- cianoetil N,N-diisopropilcloro fosforamidita (102 mg, 0,43 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente sob N2 por 3h. A reação foi acompanhada por TLC (PE/EtOAc, 8:2). A reação foi concentrada para xarope sob vácuo. O resíduo foi purificado por coluna (éter de petróleo:acetato de etila 8:2 para acetato de etila, PE/EtOAc + 1% de NEt3) para fornecer o composto 1 como um óleo laranja (190 mg, 50%). O produto foi parcialmente decomposto na coluna. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0,96 – 1,27 (m, 12H), 1,68 - 1,79 (m, 4H, CH2), 1,91 - 1,97 (m, 2H, CH2), 2,20 (t, 2H, CH2), 2,53 (t, 2H, CH2), 2,58 – 2,74 (m, 2H, CH2CN), 3,24 (t, 2H, OCH2), 2,93 (m, 2H, NCH), 3,44 (t, 2H, NCH2), 3,42 - 3,54 (m, 4H, OCH2), 3,69 (s, 3H, OCH3), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79 - 7,01 (m, 5H, aromático), 7,04 - 7,11 (m, 3 H, aromático H), 7,13 - 7,69 (m, 13H, aromático H), 7,94 - 8,40 (m, 3H, aromático H). Esquema 6
[00234] Composto 15. Sob N2, uma solução de composto 14 (3,6 g, 20 mmol) e imidazol (3,72 g, 60 mmol) em DMF seco (25 mL) foi adicionado cloreto de t-butildifenilsilil (2,3 g, 26 mmol). A reação foi acompanhada por TLC e finalizada após agitação por 1 hora em temperatura ambiente. A reação foi finalizada com solução saturada de NaHCO3 e extraída com acetato de etila:éter de petróleo 1:1 (2x). Após a secagem, a camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4, a mistura reacional foi filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo para éter de petróleo:acetato de etila 1:1), fornecendo o composto 15 como óleo amarelado (7,19 g, 86%). 1H NMR (DMSO-d6)  0,99 (s, 9H, 3xCH3), 3,38 - 3,46 (m, 2H, NCH2), 3,92 (t, 2H, OCH2), 5,59 (s, 2H, NH2), 6,50 - 6,54 (d, 2 H, aromático H), 7,37 - 7,66 (m, 13H, aromático H), 8,05 (d, 1H, NH).
[00235] Composto 16. Sob N2, uma solução do composto 15 (840 mg, 2 mmol) em DCM seco (10 mL), foi adicionado nitrosil tetrafluoroborato (234 mg, 2 mmol) a 0°C. A reação foi acompanhada por TLC e o material de partida desapareceu após a agitação por 1 hora a 0°C. Então, o composto 8 (756 mg, 3 mmol) foi adicionado à mistura reacional. A mistura reacional foi lentamente aquecida até a temperatura ambiente e agitada por 4 h. A reação foi acompanhada por TLC. Ao final, a reação foi finalizada com solução saturada de NaHCO3 e extraída com DCM (2x). Após a secagem da camada orgânica combinada sobre MgSO4, a mistura reacional foi filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo para éter de petróleo:acetato de etila 1:1), fornecendo o composto 16 como um óleo laranja (1,12 g, 82%). 1H NMR (DMSO-d6)  0,99 (s, 9H, 3xCH3), 1,27 (s, 9H, 3x CH3), 1,91 - 1,98 (m, 2H, CH2), 2,22 (t, 2H, CH2), 3,27 (t, 2H, OCH2), 3,38 - 3,46 (m, 2H, NCH2), 3,92 (t, 2H, OCH2), 6,36 - 6,46 (m, 3 aromático H), 6,50 -
6,56 (d, 2 H, aromático H), 7,10 (t, 1 aromático H), 7,37 - 7,66 (m, 13H, aromático H), 8,06 (d, 1H, NH).
[00236] Composto 17. O composto 16 (1,1 g, 1,64 mmol) e DMAP (20 mg, 0,16 mmol) foram dissolvidos em 8 mL de piridina anidra sob N2. A mistura reacional foi, então, resfriada para 0°C e cloreto de benzoíla (0,17 mL, 1,5 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura reacional foi lentamente aquecida até a temperatura ambiente e agitada por uma hora durante o qual a solução se tornou turva. A análise por TLC indicou o consumo completo do material de partida. A reação foi finalizada com solução saturada de NaHCO3. A camada aquosa foi extraída com DCM 3x. A camada orgânica combinada foi lavada com H2SO4, secada sobre MgSO4 e concentrada. A mistura bruta resultante foi dissolvida em DCM (14 mL). A solução foi tratada com TFA (1,4 mL) em temperatura ambiente e agitada durante a noite. A reação foi monitorada por TLC (éter de petróleo:acetato de etila 1:1). O TFA foi removido sob pressão reduzida e co- evaporado com tolueno. O resíduo foi particionado entre NaCl e DCM. A camada aquosa foi extraída com DCM 3 vezes. A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4 e concentrada. O produto bruto foi dissolvido em THF (8 mL) e tratado com TBAF (1 M, 1,6 mL). A reação foi monitorada por TLC (DCM/MeOH 9:11). O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi particionado entre NaCl e DCM (+ 10% de MeOH). A camada aquosa foi extraída com DCM (+ 10% de MeOH) 3 vezes. A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4 e concentrada e purificada por cromatografia em gel de sílica (DCM para DCM:MeOH 9:1). O composto 17 foi obtido como um óleo laranja/vermelho (515 g, 64%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,56 - 1,64 (m, 2H, CH2), 2,01 (t, 2H, CH2), 3,24 (t, 2H, NCH2), 3,52 (t, 2H, OCH2), 4,25 (t, 2H, OCH2), 6,79 - 6,89 (m, 1H, aromático H), 7,03 - 7,06 (m, 1 H, aromático H), 7,13 - 7,63 (m, 10H, aromático H), 8,56 (t, 1H, NH).
[00237] Composto 18. O composto 17 (500 mg, 1 mmol) foi dissolvido em py/CH3CN (5/5 mL) e base de Hunig (0,87 mL, 5 mmol), DMT-Cl (1 g, 3 mmol) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. A TLC (DCM:MeOH 95:5) indicou o final da reação. A mistura foi concentrada, dissolvida em DCM, e lavada com Na2CO3. A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4, concentradas e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo:acetato de etila 8:2 para acetato de etila + 1% de NEt3). O composto 18 foi obtido como um óleo laranja/vermelho (653 mg, 83%). 1H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 1,16 - 1,24 (m, 2H, CH2), 2,01 (t, 2H, CH2), 3,24 (t, 2H, NCH2), 3,52 (t, 2H, OCH2), 3,69 (s, 6H, OMe), 4,25 (t, 2H, OCH2), 6,76 - 6,89 (m, 4H, aromático H), 7,03 - 8,23 (m, 21H, aromático H), 8,86 (t, 1H, NH).
[00238] Composto 19. O composto 18 (350 mg, 0,5 mmol) foi dissolvido em 3 mL de DMF anidro sob N2 e base de Hunig (0,26 mL, 1,5 mmol) foi adicionada. A mistura reacional foi, então, tratada com TSTU (196 mg, 0,65 mmol) e mantida em temperatura ambiente. Após 30 min, a análise por TLC (éter de petróleo:EtOAc 2:8) indicou que a reação foi finalizada. Então, 3-aminopropanol (38 µL, 0,5 mol) foi adicionado à mistura reacional e agitado em temperatura ambiente por 4 h. A análise por TLC indicou o consumo completo do material de partida. A reação foi finalizada com solução saturada de NaHCO3. A camada aquosa foi extraída com DCM 3x. A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4, concentrada, co-evaporada com xileno (3x) e purificada por cromatografia em gel de sílica (éter de petróleo:acetato de etila 8:2 para acetato de etila + 1% de NEt3) para fornecer o Composto 19 como um óleo laranja (223 mg, 52%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,67 - 1,79 (m, 4H, CH2), 1,91 - 1,97 (m, 2H, CH2), 2,05 (t, 2H, CH2), 2,53 (t, 2H, CH2), 3,24 (t, 2H, OCH2), 3,45 (t, 2H, OCH2), 3,51 (t, 2H, NCH2), 3,57 (t, 2H, OCH2), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79 - 6,86 (m, 4H, aromático), 7,01 (t, 1 aromático H), 7,04 - 7,11 (m, 3 H, aromático H), 7,13 - 7,69 (m, 13H, aromático H), 7,74 - 8,40 (m, 4H, aromático H), 8,76 (t, 1H, NH).
[00239] Composto 2. O composto 19 (223 mg, 0,26 mmol) foi secado sob alto fluxo de vácuo. DCM anidro (1,5 mL) foi adicionado sob N2 e agitado com peneiras moleculares por 10 min em temperatura ambiente. À solução, base de Hunig (0,14 mL, 0,78 mmol) foi adicionada e seguido por 2-cianoetil N,N-diisopropilcloro fosforamidita (76 µL, 0,34 mmol). A reação foi agitada em temperatura ambiente sob N2 por 3 h. A reação foi acompanhada por TLC (PE/EtOAc, 2:8). A reação foi concentrada para xarope sob vácuo. O resíduo foi purificado por coluna (éter de petróleo:acetato de etila 8:2 para acetato de etila + 1% de NEt3) para fornecer o Composto 2 como um óleo laranja (152 mg, 56%). O produto foi parcialmente decomposto na coluna. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0,96 – 1,27 (m, 12H), 1,68 - 1,79 (m, 4H,
CH2), 1,91 - 1,97 (m, 2H, CH2), 2,19 - 2,22 (m, 2H, CH2), 2,51 - 2,54 (m, 2H, CH2), 2,58 – 2,74 (m, 2H, CH2CN), 3,22 - 3,26 (m, 2H, OCH2), 2,93 (m, 2H, NCH), 3,44 (t, 2H, NCH2), 3,42 - 3,54 (m, 4H, OCH2), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79 - 7,01 (m, 5H, aromático), 7,04 - 7,11 (m, 3 H, aromático H), 7,13 - 7,69 (m, 13H, aromático H), 7,94 - 8,40 (m, 3H, aromático H ), 8,76 (t, 1H, NH).
[00240] Então, dois oligos curtos (oligo azo-1 e oligo azo-2) incorporando duas azo-fosforamiditas dos compostos 1 e 2, respectivamente, foram sintetizadas para avaliar a eficiência da clivagem. O oligo azo-1 apresenta absorção a 450 nm e uma cor laranja. Após a clivagem, a ligação azo é quebrada e resulta na perda da cor laranja. Após a adição de 0,1 M de solução de Na2S2O4 em temperatura ambiente, a cor laranja da solução de oligo desaparece instantaneamente, a qual indicou uma clivagem muito eficiente da ligação azo. A análise de HPLC do oligo azo-1 e os produtos de clivagem também confirmaram o mesmo resultado. A análise de HPLC do teste de clivagem do oligo azo-2 mostrou uma quebra limpa e imediata da ligação azo tratada por 0,1 M de solução de Na2S2O4 em temperatura ambiente. Oligo azo-1: 5´-GAX1CTA-3´ X1 = Oligo azo-2: 5´-GAX2CTA-3´
X2 =
[00241] Além disso, a compatibilidade de oligos azo- 1 com os reagentes de sequenciamento SBS foi também testada. Primeiro, 10 µM de oligo azo-1 (10 µL) foram incubados em 90 µL de mistura de incorporação (IMX), mistura de clivagem (CMS) e mistura de escaneamento (USM) a 60°C por 60 minutos. A análise de HPLC mostrou que oligo azo-1 era completamente estável em IMX, 90% de oligo azo-1 era decomposto em CMS e 50% de oligo azo-1 foi perdido em USM. Uma pequena melhoria foi observada para oligo azo-2. A degradação foi reduzida a 44% para oligo azo-2 quando comparado a 66% de degradação para oligo azo-1 quando ambos os oligos foram incubados a 60°C por 60 minutos em solução CMS (10 µL).

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Suporte sólido caracterizado pelo fato de que compreende polinucleotídeos de fita-dupla, em que cada fita- dupla compreende uma primeira fita e uma segunda fita imobilizados no mesmo, cada primeira fita compreende um primeiro sítio de clivagem capaz de sofrer clivagem química através de um complexo de metal de transição; em que o complexo de metal de transição é um complexo de paládio ou um complexo de níquel e em que a primeira fita e segunda fita são imobilizadas no suporte sólido em suas extremidades 5'.
2. Suporte sólido, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada polinucleotídeo de primeira fita compreende um primeiro iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido, opcionalmente, em que o primeiro iniciador de extensão compreende o primeiro sítio de clivagem, opcionalmente, em que o primeiro iniciador de extensão compreende uma sequência P5 ou uma sequência P5 modificada.
3. Suporte sólido, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de clivagem compreende um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado que é capaz de sofrer clivagem química através de um complexo de paládio ou através de um complexo de níquel, preferencialmente, em que o nucleosídeo ou nucleotídeo modificado compreende um grupo alil.
4. Suporte sólido, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de clivagem compreende o nucleosídeo ou nucleotídeo modificado que possui uma estrutura de Fórmula (II'): (II') em que ‘Base’ é adenina, guanina, citosina, timina ou uracila, ou um derivado das mesmas.
5. Suporte sólido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de clivagem gera uma porção de bloqueio 3' após a clivagem química.
6. Suporte sólido, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a porção de bloqueio 3' compreende uma porção fosfato com uma estrutura de Fórmula (I): (I) em que: - R1 é -NH2, -OH, -NHC(O)ORa ou -OCH2OSi(Rb)3; - Ra é C1-4-alquil, terc-butil, alil, benzil, ou 9- fluorenilmetil; - cada Rb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em C1-4-alquil e fenil; e - R2 é H, C1-4-alquil, um tetrahidrofurano opcionalmente substituído, ou um nucleotídeo;
ou Fórmula (V): (V) em que ‘Base’ é uma adenina, guanina, citosina, timina ou uracila opcionalmente protegida, ou um derivado das mesmas.
7. Suporte sólido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que cada polinucleotídeo da segunda fita compreende um segundo sítio de clivagem, e opcionalmente, um segundo iniciador de extensão imobilizado no suporte sólido, opcionalmente, o segundo iniciador de extensão compreende o segundo sítio de clivagem.
8. Suporte sólido, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o segundo sítio de clivagem não é capaz de sofrer clivagem química através de um complexo de paládio ou complexo de níquel, opcionalmente, o segundo sítio de clivagem é clivado através de uma clivagem química e em que o segundo sítio de clivagem compreende um ligante diol ou um ligante azobenzeno.
9. Método para linearização de uma pluralidade de polinucleotídeos de fita dupla imobilizados caracterizado pelo fato de que compreende: - prover o suporte sólido, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8; - contatar os polinucleotídeos de fita dupla com uma solução aquosa do complexo de metal de transição, clivando assim uma ou mais primeiras fitas no primeiro sítio de clivagem; - gerar um ou mais primeiros ácidos nucleicos clivados, e primeiras fitas imobilizadas clivadas; e - remover os primeiros ácidos nucleicos clivados a partir do suporte sólido.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o complexo de metal de transição é um complexo de paládio (0), preferencialmente, Pd(THP)2, Pd(THP)4, Pd(THM)4 ou combinações dos mesmos, opcionalmente, gerado in situ, ou um complexo de níquel (0), opcionalmente, gerado in situ a partir de um composto de níquel (II).
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o segundo sítio de clivagem é clivado por um método selecionado a partir do grupo que consiste em clivagem química, foto clivagem, clivagem enzimática e uma combinação das mesmas.
12. Nucleosídeo ou nucleotídeo modificado caracterizado pelo fato de que compreende uma estrutura de Fórmula (II): (II) em que R é H, OH ou OPG; - R1 é H ou PG; - R2 é H, PG, ou -OR2 é um fosfato; - PG é um grupo protetor hidroxila; e
- ‘Base’ é adenina, guanina, citosina, timina ou uracila, ou um derivado das mesmas; - ou de Fórmula (IIa): (IIa).
13. Oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende o nucleosídeo ou nucleotídeo modificado conforme definido na reivindicação 12, opcionalmente, em que o oligonucleotídeo possui uma estrutura de Fórmula (III): (III).
14. Nucleosídeo ou nucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma porção de bloqueio 3' de uma estrutura de Fórmula (I): (I) em que - R1 é -NH2, -OH, -NHC(O)ORa ou -OCH2OSi(Rb)3;
- Ra é C1-4-alquil, terc-butil, alil, benzil, ou 9- fluorenilmetil; - cada Rb é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em C1-4-alquil e fenil; - R2 é H, C1-4-alquil, um tetrahidrofurano opcionalmente substituído, ou um nucleotídeo; - ou de Fórmula (V): (V) em que ‘Base’ é uma adenina, guanina, citosina, timina ou uracila opcionalmente protegida, ou um seu derivado das mesmas.
15. Oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende um nucleotídeo conforme definido na reivindicação 14, opcionalmente, possuindo uma estrutura de Fórmula (VI): (VI)
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