ES2968459T3

ES2968459T3 - Composiciones y métodos para escisión química y desprotección de oligonucleótidos unidos a superficie

Info

Publication number: ES2968459T3
Application number: ES19727252T
Authority: ES
Inventors: Xiaolin Wu; Randall Smith; Peyton Shieh; John M Beierle; Wayne N George; Elliot John Lawrence; Jie Mao; Xiaohai Liu
Original assignee: Illumina Cambridge Ltd; Illumina Inc
Current assignee: Illumina Cambridge Ltd; Illumina Inc
Priority date: 2018-05-15
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2024-05-09
Anticipated expiration: 2039-05-14
Also published as: PT3794012T; SG11201912274UA; EP4306532A3; JP2021500003A; KR20220130246A; AU2019271121B2; MX2022014502A; RU2019141655A; EP3794012A1; AU2023203187A1; EP4306532A2; KR20200026215A; US12084474B2; IL271446A; AU2021203934B2; RU2766688C2; CN111065645A; FI3794012T3; EP3794012B1; PL3794012T3

Abstract

Las realizaciones de la presente divulgación se refieren a métodos de preparación de plantillas para secuenciación de polinucleótidos. En particular, la divulgación se refiere a la linealización de polinucleótidos agrupados en preparación para la secuenciación mediante escisión de una o más primeras hebras de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados sobre un soporte sólido mediante un complejo de metal de transición, por ejemplo, un complejo de paladio o un complejo de níquel. La divulgación adicional se refiere a la linealización de polinucleótidos agrupados mediante la escisión de una o más segundas cadenas de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados sobre un soporte sólido que comprende un conector azobenceno mediante Na2S2O4. También se describen nucleótidos y oligonucleótidos que comprenden un grupo bloqueador de resto 3' fosfato, y métodos para eliminarlos usando un reactivo de fluoruro. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para escisión química y desprotección de oligonucleótidos unidos a superficie

Listado de secuencias en formato electrónico

La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias electrónico como un archivo de texto ASCII a través de EFS-Web. El listado de secuencias electrónico se proporciona como un archivo titulado ILLINC363WOSEQLIST.txt, creado y guardado por última vez el 10 de mayo de 2019, que tiene un tamaño de 2.806 bytes. La información en el listado de secuencias electrónico se incorpora en como referencia en la presente memoria en su totalidad.

Antecedentes

Campo

Las realizaciones de la presente descripción se refieren a métodos de preparación de moldes para secuenciación de polinucleótidos. En particular, la descripción se refiere a la linealización de polinucleótidos agrupados en preparación para secuenciación mediante escisión química de una o más primeras cadenas de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados sobre un soporte sólido, en algunos casos mediante reacción en presencia de un complejo de metal de transición, tal como un complejo de paladio o un complejo de níquel. Además, la descripción se refiere a la desprotección mediada químicamente de cebadores modificados sobre un soporte sólido.

Se conocen diversos métodos de secuenciación de ácidos nucleicos en la técnica. La patente US-5.302.509 describe un método para secuenciar un molde de polinucleótido que implica realizar múltiples reacciones de extensión usando una ADN-polimerasa o ADN-ligasa para incorporar sucesivamente polinucleótidos marcados complementarios de una cadena molde. En dicha reacción de “ secuenciación por síntesis” (SBS, por sus siglas en inglés), una nueva cadena de polinucleótidos de bases emparejadas con la cadena molde se construye en la dirección 5' a 3' mediante la incorporación sucesiva de nucleótidos individuales complementarios de la cadena molde. Los nucleósidos trifosfato del sustrato usados en la reacción de secuenciación se etiquetan en la posición 3' con diferentes etiquetas 3', permitiendo la determinación de la identidad del nucleótido incorporado a medida que se añaden los siguientes nucleótidos.

Para maximizar el rendimiento de las reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos, es ventajoso poder secuenciar múltiples moléculas molde en paralelo. Se puede lograr el procesamiento en paralelo de múltiples moldes con el uso de tecnología de matriz de ácidos nucleicos. Estas matrices consisten típicamente en una matriz de alta densidad de polinucleótidos inmovilizados sobre un material de soporte sólido.

Se han descrito varios métodos para la fabricación de matrices de ensayos nucleicos inmovilizados en la técnica. En ambos documentos WO 98/44151 y WO 00/18957, se describen métodos de amplificación de ácidos nucleicos que permiten que los productos de la amplificación queden inmovilizados sobre un soporte sólido para formar matrices que comprenden agrupaciones o “ colonias” formadas a partir de una pluralidad de cadenas de polinucleótidos inmovilizadas idénticas y una pluralidad de cadenas complementarias inmovilizadas idénticas. Las matrices de este tipo se denominan en la presente memoria “ matrices agrupadas” . Las moléculas de ácidos nucleicos presentes en las colonias de ADN de las matrices agrupadas preparadas según estos métodos pueden proporcionar moldes para reacciones de secuenciación, por ejemplo, como las descritas en el documento WO 98/44152. Los productos de reacciones de amplificación en fase sólida tal como los descritos en los documentos WO 98/44151 y WO 00/18957 se denominan estructuras “ puenteadas” formadas por hibridación de pares de cadenas de polinucleótidos inmovilizadas y cadenas complementarias inmovilizadas, estando ambas cadenas unidas al soporte sólido en el extremo 5'. Para proporcionar moldes más adecuados para la secuenciación de ácidos nucleicos se prefiere eliminar sustancialmente toda o al menos una parte de una de las cadenas inmovilizadas en la estructura “ puenteada” para generar un molde que sea al menos parcialmente monocatenario. Por lo tanto, la parte del patrón que es monocatenaria estará disponible para la hibridación con un cebador de secuenciación. El proceso de eliminación de toda o una parte de la cadena inmovilizada en una estructura de ácido nucleico bicatenaria “ puenteada” se denomina “ linealización” . Existen varias formas de linealización, que incluyen, aunque no de forma limitativa, escisión enzimática, escisión fotoquímica o escisión química. Se describen ejemplos no limitativos de métodos de linealización en la publicación PCT n°. WO 2007/010251 y la publicación US-2009/0088327, y en la publicación US-2009/0118128.

Se sabe que los métodos enzimáticos facilitan la escisión eficiente específica del sitio de oligonucleótidos o polinucleótidos para linealizar grupos de ADN bicatenarios y para desproteger los cebadores unidos a la superficie. Actualmente, las enzimas se han usado ampliamente en ambos tipos de reacciones en diversas aplicaciones de secuenciación. Sin embargo, existen ciertos problemas con los enfoques enzimáticos, que incluyen estabilidad enzimática, costes de producción de enzimas, requisitos específicos de almacenamiento y manipulación, variaciones en la actividad enzimática y alta intensidad de fondo en la lectura de secuenciación. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos alternativos de linealización y desprotección para la secuenciación efectiva del ADN. Sin embargo, existen muchas limitaciones en los tipos de reacción que pueden aplicarse a las etapas de linealización en este contexto, ya que los reactivos, condiciones y subproductos (a) deben ser compatibles con reacciones aguas arriba y aguas abajo, que incluye hibridación de oligonucleótidos y deshibridación, extensión de PCR de cebador y síntesis de ADN, (b) debe mostrar una buena estabilidad en condiciones ácidas, básicas y oxidativas, (c) debe efectuar una reacción química rápida y limpia, y (d) no debe interferir con los métodos de detección de nucleótidos. La presente descripción describe etapas de escisión química y desprotección que son alternativas efectivas que cumplen las limitaciones descritas anteriormente.

Resumen

La invención se define mediante el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Algunas realizaciones de la presente descripción se refieren a métodos para linealizar una pluralidad de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados, que comprende: proporcionar un soporte sólido que comprende polinucleótidos bicatenarios, en donde cada polinucleótido bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena y la segunda cadena se inmovilizan cada una al soporte sólido en sus extremos 5', y en donde cada primera cadena comprende un primer sitio de escisión capaz de experimentar escisión química en presencia de un complejo de metal de transición, en donde el complejo de metal de transición es un complejo de paladio o un complejo de níquel; poner en contacto los polinucleótidos bicatenarios con una solución acuosa del complejo de metal de transición, lo que de este modo escinde una o más primeras cadenas en el primer sitio de escisión, y genera uno o más primeros ácidos nucleicos escindidos y primeras cadenas inmovilizadas escindidas; y eliminar los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido. En tales métodos, la segunda cadena inmovilizada permanece en el soporte sólido después de la eliminación de los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido, y permanece hibridada con las primeras cadenas inmovilizadas escindidas. En algunas realizaciones, el complejo de paladio (Pd) es un complejo de Pd (0). En algunas realizaciones, el complejo de níquel (Ni) es un complejo de Ni (0). El primer sitio de escisión es un nucleósido o nucleótido modificado que comprende una fracción de fosfato de alilo.

También se describen, aunque no son parte de la invención, métodos de desprotección química de oligonucleótidos sobre un soporte sólido, que comprenden proporcionar un soporte sólido con una pluralidad de oligonucleótidos inmovilizados sobre el mismo, en donde cada uno de los oligonucleótidos comprende un grupo protector en el hidroxilo 3', tal como un nucleótido o nucleósido modificado que contiene un grupo fosfato que es capaz de experimentar desprotección química, o una fracción de fosfato terminal 3' modificado, y hacer reaccionar los oligonucleótidos con un reactivo de desprotección, lo que de este modo escinde el grupo protector (tal como una fracción de fosfato terminal 3' modificado) para producir oligonucleótidos inmovilizados con un grupo hidroxilo 3' libre. En algunos aspectos, el grupo protector es una fracción de fosfato terminal 3' con una estructura de Fórmula (I):

en donde la fracción de fosfato es un fosfato en el extremo 3' del oligonucleótido inmovilizado;

R1 es -NH<2>, -OH, -NHC(O)ORa o -OCH<2>OSi(Rb)<3>;

en donde Ra es alquilo C<1-4>, terc-butilo, alilo, bencilo o 9-fluorenilmetilo; y

cada Rb se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1-4>y fenilo; y

R2 es H, alquilo C<1-4>, un tetrahidrofurano opcionalmente sustituido o un nucleótido.

En algunos aspectos de Fórmula (I), R1 es -NHC(O)ORa. En algunos aspectos, Ra es 9-fluorenilmetilo, bencilo o alilo. En algunos aspectos, R1 es -OCH2OSi(Rb)3. En algunos aspectos, cada Rb es isopropilo. En algunos aspectos, cada Rb es independientemente metilo, etilo, terc-butilo o fenilo.

En algunos aspectos, el reactivo de desprotección es ion fluoruro (p. ej., TBAF, HF o CsF) o base leve (p. ej., hidróxido de sodio). En algunos aspectos, los oligonucleótidos inmovilizados son las primeras cadenas inmovilizadas escindidas generadas por la escisión química de las primeras cadenas como se describe en la presente memoria. Por lo tanto, en algunos aspectos, las primeras cadenas comprenden un nucleótido modificado que está presente en las primeras cadenas inmovilizadas escindidas después de escindir y eliminar los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido. Los métodos descritos en la presente memoria comprenden eliminar el grupo protector de hidroxilo 3' de las primeras cadenas inmovilizadas escindidas después de completar la lectura 1. En algunas realizaciones, las primeras cadenas inmovilizadas escindidas comprenden grupos fosfato terminales. En otros aspectos, los métodos comprenden bloquear el fosfato terminal 3' de las primeras cadenas inmovilizadas escindidas después de escindir y eliminar los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido. En algunos aspectos, el bloqueo es al hacer reaccionar el fosfato de terminal 3' con un grupo bloqueante antes de secuenciar las segundas cadenas inmovilizadas, y eliminar el grupo bloqueante después de completar la Lectura 1 para generar el grupo hidroxilo 3' de acuerdo con los métodos de escisión química descritos en la presente memoria. Los extremos 3' de las segundas cadenas permanecen hibridados con las primeras cadenas escindidas inmovilizadas durante y después de la reacción de desprotección.

En otros aspectos, el grupo protector de hidroxilo 3' es un grupo o fracción de fosfato, que está presente en las primeras cadenas inmovilizadas escindidas después de la primera escisión, y los métodos comprenden eliminar el grupo fosfato o la fracción en presencia de una enzima de desfosforilación tal como T4PNK. Los extremos 3' de las segundas cadenas permanecen hibridados con las primeras cadenas escindidas inmovilizadas durante y después de la reacción de desprotección enzimática.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además secuenciar las segundas cadenas inmovilizadas después de la eliminación de los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido. En algunos aspectos, la secuenciación comprende incorporar sucesivamente nucleótidos marcados complementarios a las segundas cadenas inmovilizadas y detectar los nucleótidos marcados después de cada incorporación sucesiva. En la secuenciación de extremos emparejados, se secuencian finalmente ambas cadenas de un ácido nucleico bicatenario, y en tales casos, la secuenciación de la segunda cadena inmovilizada se denomina en la presente memoria “ Lectura 1” .

En otras realizaciones, cada segunda cadena inmovilizada comprende un segundo sitio de escisión capaz de experimentar escisión química. En algunos aspectos, después de la secuenciación de las segundas cadenas (Lectura 1), y eliminar el grupo protector de hidroxilo 3' de las primeras cadenas escindidas inmovilizadas, los métodos comprenden además sintetizar los complementos a las segundas cadenas inmovilizadas para generar polinucleótidos bicatenarios derivados, en donde cada polinucleótido bicatenario derivado comprende una segunda cadena y una primera cadena derivada, en donde la primera cadena derivada y la segunda cadena se inmovilizan cada una al soporte sólido en sus extremos 5'. Los métodos de la descripción incluyen escindir una o más segundas cadenas en el segundo sitio de escisión, lo que de este modo genera uno o más segundos ácidos nucleicos escindidos y segundas cadenas inmovilizadas escindidas, y eliminar los segundos ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido. En tales métodos, las primeras cadenas derivadas inmovilizadas permanecen en el soporte sólido después de la eliminación de los segundos ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido, y permanecen hibridadas con las segundas cadenas inmovilizadas escindidas.

En algunas de tales realizaciones, el segundo sitio de escisión de la segunda cadena es capaz de experimentar escisión química, y la segunda cadena se escinde por una reacción química. Por ejemplo, el segundo sitio de escisión comprende uno o más enlaces de diol vecinos (que pueden escindirse por oxidación, tal como tratamiento con un reactivo peryodato), enlaces disulfuro (escindibles, por ejemplo, en condiciones reductoras tales como DTT, o en presencia de una fosfina), grupos orto-nitrobencilo (escindibles, por ejemplo, por fotólisis), enlaces de azobenceno (escindibles, por ejemplo, en presencia de Na2S2O4), enlaces de alquilo-selenio (escindibles, por ejemplo, por oxidación tal como peróxido de hidrógeno), enlaces de éter de sililo (escindible, por ejemplo, por ion fluoruro, ácido o base), o enlaces de carbamato de alilo (escindible, por ejemplo, en presencia de un complejo de paladio). En algunos aspectos, el enlace se selecciona de manera que la segunda escisión libera fracciones de hidroxilo. En algunos aspectos, la escisión elimina el sitio reactivo del enlazador (p. ej., la oxidación de un diol vecino deja dos compuestos carbonilo separados, y un diol ya no está presente). En algunos aspectos, el segundo sitio de escisión está en cualquier posición a lo largo de la segunda cadena, pero preferentemente está unido en la cadena principal cerca del extremo 5' de la segunda cadena (p. ej., cerca de la unión al soporte sólido). En algunas realizaciones, las condiciones de escisión química para escindir la primera cadena y la segunda cadena son diferentes, y la primera cadena y la segunda cadena no pueden escindirse por la misma condición de escisión (p. ej., los sitios de escisión son ortogonales). En algunos aspectos, ambas etapas de escisión no necesitan ser etapas de escisión química. Por ejemplo, las primeras cadenas pueden escindirse por reacción química, mientras que las segundas cadenas se escinden por reacción enzimática.

También se describen, aunque no son parte de la invención, métodos para linealizar una pluralidad de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados, que comprenden: proporcionar un soporte sólido que comprende polinucleótidos bicatenarios, cada polinucleótido bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena y la segunda cadena se inmovilizan en el soporte sólido en sus extremos 5', en donde cada primera cadena comprende un primer sitio de escisión, y en donde cada segunda cadena comprende un segundo sitio de escisión que comprende un enlazador de azobenceno; escindir una o más primeras cadenas en el primer sitio de escisión, y generar uno o más primeros ácidos nucleicos escindidos y primeras cadenas inmovilizadas escindidas; eliminar los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido; secuenciar las segundas cadenas inmovilizadas; volver a sintetizar primeras cadenas derivadas que son complementarias a las segundas cadenas; y escindir una o más segundas cadenas en el segundo sitio de escisión, y generar uno o más segundos ácidos nucleicos escindidos y segundas cadenas inmovilizadas escindidas. En algunos aspectos de tales métodos, las primeras cadenas derivadas inmovilizadas permanecen en el soporte sólido después de la eliminación de los segundos ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido, y permanecen hibridadas con las segundas cadenas inmovilizadas escindidas.

En algunos aspectos, los métodos comprenden además secuenciar las primeras cadenas derivadas inmovilizadas después de la eliminación de los segundos ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido. En algunos aspectos, la secuenciación comprende incorporar sucesivamente nucleótidos marcados complementarios a las primeras cadenas derivadas inmovilizadas y detectar los nucleótidos marcados después de cada incorporación sucesiva. En la secuenciación de extremos emparejados, se secuencian finalmente ambas cadenas de un ácido nucleico bicatenario, y en tales casos, la secuenciación de la primera cadena derivada inmovilizada se denomina en la presente memoria “ Lectura 2” .

También se describen, aunque no son parte de la invención, métodos para preparar una fracción bloqueante 3' que puede eliminarse mediante una reacción química en el método de secuenciación de extremos emparejados (descrito en la publicación US-2009/0088327). Los métodos comprenden: proporcionar un soporte sólido que comprende polinucleótidos bicatenarios, cada polinucleótido bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena y la segunda cadena se inmovilizan en el soporte sólido en sus extremos 5', y en donde cada primera cadena comprende un primer sitio de escisión; escindir una o más primeras cadenas en el primer sitio de escisión para generar uno o más primeros ácidos nucleicos escindidos y primeras cadenas inmovilizadas escindidas; e introducir una fracción bloqueante en 3' en el extremo 3' de las primeras cadenas inmovilizadas escindidas, en donde la fracción bloqueante 3' puede eliminarse mediante una reacción química. En algunas otras realizaciones, en lugar de introducir la fracción bloqueante 3' en el extremo 3' de las primeras cadenas inmovilizadas escindidas, la fracción bloqueante 3' se genera a partir del primer sitio de escisión después de dicha etapa de partición. En algunas realizaciones, la fracción bloqueante 3' comprende un nucleósido o nucleótido modificado que contiene la fracción de fosfato. En una de tales realizaciones, la fracción bloqueante 3' comprende un nucleósido modificado, el nucleósido modificado contiene un -CH<2>OH extra o -CH<2>OH protegido en la posición 5' del nucleósido. En otra de tales realizaciones, la fracción bloqueante 3' comprende un nucleósido modificado, el nucleósido modificado contiene un -CH<2>NH<2>extra o -CH<2>NH<2>protegido en la posición 5' del nucleósido. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además eliminar la fracción bloqueante 3' en una reacción química, por ejemplo, en una solución acuosa que comprende un agente de fluoruro o una base.

También parte de la invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas, es un soporte sólido que comprende una pluralidad de polinucleótidos de primera cadena inmovilizados sobre el mismo, cada polinucleótido de primera cadena comprende un primer sitio de escisión capaz de experimentar escisión química mediante un complejo de paladio o un complejo de níquel, en donde la pluralidad de primeros polinucleótidos de cadena se inmoviliza en el soporte sólido en sus extremos 5'. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende además una pluralidad de polinucleótidos de segunda cadena inmovilizados sobre el mismo, cada segundo polinucleótido de cadena comprende un segundo sitio de escisión, en donde la pluralidad de segundos polinucleótidos de cadena se inmoviliza en el soporte sólido en sus extremos 5'. En algunas realizaciones, el complejo de paladio es un complejo de paladio (0). El primer sitio de escisión comprende una funcionalidad alilo. En una realización, el primer sitio de escisión comprende un alildT. El primer sitio de escisión comprende además una fracción de fosfato, que permanece en la primera cadena inmovilizada escindida después de la escisión química. En una realización, la fracción de fosfato comprende la estructura de Fórmula (I). En algunas realizaciones, el segundo sitio de escisión puede escindirse mediante un método seleccionado del grupo que consiste en escisión química, fotoescisión, escisión enzimática o una combinación de los mismos. En una realización, el segundo sitio de escisión se escinde por una reacción de escisión química. En algunas de tales realizaciones, el segundo sitio de escisión puede comprender un enlazador de diol de Fórmula (VIII) o (VII Ia), o un enlazador de azobenceno de Fórmula (X) como se describe a continuación.

También se describen, aunque no son parte de la invención, nucleósidos o nucleótidos modificados y oligonucleótidos y métodos para preparar tales compuestos. En un aspecto, el nucleósido modificado o nucleótido modificado comprende la estructura de Fórmula (II):

en donde R es H, OH u OPG; R1 es H o PG; R2 es H, PG U -OR2 es un grupo fosfato; PG es un grupo protector de hidroxilo; La base es adenina, guanina, citosina, timina o uracilo, o un derivado de las mismas. En algunas realizaciones, el grupo fosfato puede estar cargado negativamente (p. ej., -PO<4>'). En un aspecto, el nucleósido o nucleótido modificado tiene la estructura de Fórmula (IIa):

En un aspecto es un nucleósido o nucleótido modificado que comprende la estructura de Fórmula (II') cuando el nucleósido o nucleótido modificado de Fórmula (II) se incorpora en un oligonucleótido o polinucleótido, donde el oxígeno 3' del nucleósido o nucleótido modificado con alilo se une covalentemente al extremo 5' de otro nucleótido (estructura no mostrada):

En algunas realizaciones, el grupo fosfato puede estar cargado negativamente (p. ej., -PO<4>").

También se describe, aunque no es parte de la invención, un oligonucleótido que comprende un nucleósido o nucleótido alílico, donde el oligonucleótido es un compuesto de Fórmula (III):

en donde cada base es independientemente adenina, guanina, citosina, timina o uracilo, o un derivado de las mismas; y el oligonucleótido se une opcionalmente a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el grupo fosfato puede estar cargado negativamente (p. ej., -PO<4>").

En algunos aspectos, el extremo 5' del oligonucleótido (en el asterisco) se une a un soporte sólido.

También se describe, aunque no es parte de la invención, un reactivo químico para incorporar un nucleótido de alilo en un polinucleótido, en donde el reactivo químico es un compuesto de Fórmula (IV):

en donde PG es H o un grupo protector de hidroxilo; y la base es adenina, guanina, citosina, timina o uracilo, o un derivado de las mismas.

En algunos aspectos, PG es un grupo protector que se puede escindir en condiciones ácidas suaves. En algunos aspectos, PG es tritilo o dimetoxitritilo (DMT).

También se describe, aunque no es parte de la invención, un método para preparar el compuesto de Fórmula (IV) que comprende: hacer reaccionar el compuesto de Fórmula A:

con un reactivo de Grignard de vinilo (tal como vinilMgCl o vinilMgBr), opcionalmente a temperatura ambiente, para formar el compuesto de fórmula B:

En algunos aspectos, el método comprende oxidar el compuesto de fórmula C (opcionalmente mediante una oxidación de Pfitzner-Moffatt, o usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) o N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), ácido dicloroacético (DCA) y DMSO):

para formar el compuesto de fórmula

En algunos aspectos, el método comprende hacer reaccionar el compuesto de fórmula D:

con TBDPSCl (cloruro de terc-butildifenilsililo) en presencia de una base (tal como imidazol) seguida de un ácido suave tal como PTSA (ácido p-toluenosulfónico) en un procedimiento de un solo recipiente sin aislar el intermedio bisprotegido, para formar el compuesto de fórmula C.

También se describe, aunque no es parte de la invención, un nucleósido o nucleótido que comprende una fracción bloqueante 3' de una estructura de Fórmula (I):

en donde R1 es -NH<2>, -OH, -NHC(O)ORa o -OCH2OSi(Rb)3; Ra es alquilo C<1-4>, terc-butilo, alilo, bencilo o 9-fluorenilmetilo; cada Rb se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1-4>y fenilo; y R2 es H, alquilo C<1-4>, un tetrahidrofurano opcionalmente sustituido o un nucleótido. En algunas realizaciones, el grupo fosfato puede estar cargado negativamente (p. ej., -PO<4>').

También se describe, aunque no es parte de la invención, un nucleósido o nucleótido modificado con fosfato 3' que comprende la estructura de Fórmula (V):

en donde

Ra es alquilo C<1-4>, terc-butilo, alilo, bencilo o 9-fluorenilmetilo;

La base es una adenina, guanina, citosina, timina o uracilo opcionalmente protegida, o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el grupo fosfato puede estar cargado negativamente (p. ej., -PO<4>"). En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (V) puede prepararse a partir de un compuesto de Fórmula (V'):

donde X es O u NH; R1' es OH (es decir, -O-TOM, -O-tritilo, -O-DMT, -OTMS, -O-TBDMS, -O-TIPS, -OBz) protegido o NH<2>(es decir, -NH-Boc, -NH-Fmoc, -NH-CBz, -NH-Alloc) protegido; y R1 es NH<2>u OH.

Además, pero no parte de la invención, es un oligonucleótido que comprende un nucleótido modificado con fosfato 3' de Fórmula (V), donde el oligonucleótido es un compuesto de Fórmula (VI):

en donde R1 es -NH<2>, -OH, -NHC(O)ORa o -OCH2OSi(Rb)3;

Ra es alquilo C<1-4>, terc-butilo, alilo, bencilo o 9-fluorenilmetilo;

cada Rb se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1-4>y fenilo;

cada base es independientemente una adenina, guanina, citosina, timina o uracilo opcionalmente protegida, o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se une opcionalmente a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el grupo fosfato puede estar cargado negativamente (p. ej., -PO<4>'). En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula (VI) se puede preparar a partir del compuesto de Fórmula (VI'):

En algunos aspectos de Fórmula (V) o (VI), R1 es -NHC(O)ORa. En algunos aspectos, Ra es 9-fluorenilmetilo, bencilo o alilo. En algunos aspectos, R1 es -OCH2OSi(Rb)3. En algunos aspectos, cada Rb es isopropilo. En algunos aspectos, cada Rb es independientemente metilo, etilo, terc-butilo o fenilo.

También se describe, aunque no es parte de la invención, un reactivo químico para introducir un nucleótido modificado con fosfato 3' en un polinucleótido, en donde el reactivo químico es un compuesto de Fórmula (VII):

en donde R1 es como se ha definido anteriormente; PG es H o un grupo protector de hidroxilo; y la base es una adenina, guanina, citosina, timina o uracilo opcionalmente protegida, o un derivado de la misma.

En algunos aspectos de Fórmula (VII), R1 es -NHC(O)ORa. En algunos aspectos, Ra es 9-fluorenilmetilo, bencilo o alilo. En algunos aspectos, R1 es -OCH2OSi(Rb)3. En algunos aspectos, cada Rb es isopropilo. En algunos aspectos, cada Rb es independientemente metilo, etilo, terc-butilo o fenilo.

También se describen, aunque no son parte de la invención, métodos para preparar enlazadores de diol para su incorporación en polinucleótidos. En algunos aspectos, el enlazador de diol es un enlazador de diol como se describe en la patente estadounidense n°. 8.715.966. En algunos aspectos, el enlazador de diol tiene una estructura de Fórmula (VIII):

OH

•VV O'HHÍ’I'* (VIII)

donde r es 2, 3, 4, 5 o 6;

s es 2, 3, 4, 5 o 6;

el oxígeno “ a” es el oxígeno de hidroxilo 3' de un primer nucleótido; y

el oxígeno “ b” es el oxígeno de hidroxilo 5' de un segundo nucleótido.

En algunos aspectos, el enlazador de diol tiene la estructura de Fórmula (Villa):

donde “ a” y “ b” son como se definieron anteriormente.

También se describen, aunque no son parte de la invención, métodos para preparar un reactivo químico para la incorporación de un enlazador de Fórmula (VIII) o (Villa) en un polinucleótido, donde el reactivo químico es un compuesto de Fórmula (IX):

donde r es 2, 3, 4, 5 o 6 (en algunos aspectos, r es 5);

s es 2, 3, 4, 5 o 6 (en algunos aspectos, s es 3); y

PG es un grupo protector que se puede eliminar en condiciones débilmente ácidas (por ejemplo, tritilo o dimetoxitritilo).

Breve descripción de los dibujos

LaFigura 1ilustra una realización de un flujo de trabajo de la química de secuenciación por síntesis (SBS) de Illumina. LaFigura 2Ailustra imágenes de Typhoon de una superficie de célula de flujo de alta densidad de cebador no modelada antes y después del tratamiento con un complejo de Pd (0), donde la superficie de la célula de flujo se injerta con cebadores modificados con alilo.

LaFigura 2Bes un gráfico de barras que demuestra el cambio en la densidad del cebador después del tratamiento con Pd(0) descrito en laFigura 2Aen comparación con la superficie de la célula de flujo injertada con cebadores de control sin la funcionalidad alilo.

LaFigura 3Aes un gráfico de barras que demuestra los resultados del ensayo de control de CC de la superficie de colorante TET (TET-QC) de una célula de flujo de densidad de cebador alta sin patrón injertada con cebadores P5 modificados con alilo y cebadores P7 estándar (canales 1-4), en comparación con la célula de flujo injertada con cebadores estándar P5/P7 (canales 5-8).

LaFigura 3Bilustra la imagen de Typhoon de la superficie de la célula de flujo después del TET-QC descrito en laFigura 3A.

LaFigura 4ilustra el % de tasa de error de los datos de secuenciación en un instrumento Miseq® de 2 canales usando la célula de flujo estándar y un nuevo tipo de célula de flujo.

LaFigura 5Ailustra las actividades de escisión de P15 de las formulaciones aisladas de Pd (C3Hs)Cl)2 en presencia con 1 a 10 equivalentes THP (10 mg/ml, N = 4 para cada condición) en comparación con una formulación de (Pd(C3H5)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM) y ascorbato de sodio (6 mM) (N = 2).

LaFigura 5Bilustra las actividades de escisión P15 de una formulación que contiene [Pd(C3Hs) (THP)<2>]Cl y 1 o más equivalentes THP (12 mM de Pd, N = 2 para cada condición) en comparación con una formulación de (Pd(C3Hs)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM) y ascorbato de sodio (6 mM) (N = 2).

LaFigura 6Amuestra intensidades de lectura 1 promedio de NovaSeq™ para 10 mM Pd(THM)4 en comparación con un reactivo Pd(0) generadoin situ.

LaFigura 6Bmuestra la tasa de error de PhiX promedio de NovaSeq™ para 10 mM Pd(THM)4 en comparación con un reactivo Pd(0) generadoin situ.

LaFigura 7muestra la actividad de escisión de P15 de Pd (THP)2-4 (10 mg/ml) en comparación con una formulación de (Pd(C3H5)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM) y ascorbato de sodio (6 mM).

LaFigura 8es un gráfico de barras de la intensidad fluorescente de la célula de flujo injertados con cebadores P 15/P7 después del tratamiento con Pd-THP o Ni-THP.

Descripción detallada de las realizaciones

Las estrategias de linealización química no enzimática son una alternativa atractiva para escindir las estructuras de polinucleótidos bicatenarios puenteadas por delante de cada lectura de secuenciación. En particular, los productos químicos a menudo se pueden almacenar durante períodos prolongados a temperatura ambiente y son relativamente económicos en comparación con las enzimas. La presente solicitud se refiere a métodos de linealización química de grupos de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados sobre un soporte sólido para generar un molde para secuenciación. Cada polinucleótido bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena. La primera cadena se genera al extender un primer cebador de extensión inmovilizado en el soporte sólido y la segunda cadena se genera al extender un segundo cebador de extensión inmovilizado en el soporte sólido. Cada una de la primera y la segunda cadena comprende un sitio de escisión. La primera cadena comprende un sitio de escisión que es capaz de escindirse por un complejo de paladio o un complejo de níquel, por ejemplo, un complejo de Pd(0) o un complejo de Ni(0). En una realización particular, el sitio de escisión está ubicado en la primera parte del cebador de extensión de la primera cadena. En una realización adicional, el sitio de escisión comprende un nucleósido de timina o un análogo de nucleótido que tiene una funcionalidad alilo. En algunas realizaciones, la segunda cadena comprende un sitio de escisión que incluye un enlazador de azobenceno que es capaz de ser escindido por un reactivo químico, por ejemplo, Na2S2O4. Alternativamente, la segunda cadena comprende un sitio de escisión que incluye un enlazador de diol que es capaz de ser escindido por un peryodato, por ejemplo, NaIO4. Los métodos descritos en la presente memoria pueden usarse como parte de una reacción de secuenciación por síntesis (SBS) en un sistema tal como los sistemas HiSeq®, MiSeq®o NextSeq® de Illumina (San Diego, CA).

LaFigura 1describe una realización de un flujo de trabajo estándar de la química Illumina SBS. Primero, se proporciona un soporte sólido que comprende una pluralidad de cebadores P5/P7 inmovilizados en la superficie del soporte sólido. Cada uno de los cebadores P5 y P7 tiene un sitio de escisión dentro de la secuencia. En una realización, el sitio de escisión en el cebador P5 es una desoxiuridina (U). En una realización, el sitio de escisión en el cebador P7 es un nucleótido de 8-oxo-guanina (oxo-G). Un conjunto de moléculas de ADN diana a secuenciar se hibrida con los cebadores de P5/P7 inmovilizados. Después de la hibridación, las moléculas de ADN diana originales se eliminan, dejando solo las copias complementarias de los polinucleótidos extendidos que contienen los cebadores P5/P7. Esta etapa también se conoce como etapa de “ siembra” . A continuación, los polinucleótidos P5/P7 extendidos se amplifican a través de un proceso denominado “ amplificación de puente” , que forman agrupaciones bicatenarias con ambas cadenas unidas al soporte sólido en el extremo 5'. Después de la etapa de “ agolpamiento” , se realiza la primera linealización para eliminar una porción de los polinucleótidos extendidos que contienen el cebador P5. En una realización, dicha eliminación se facilita mediante una reacción de escisión enzimática mediante el uso de una enzima USER para escindir la posición U en el cebador P5. Después de una primera ronda de SBS (Lectura 1), se lleva a cabo una resíntesis para formar los polinucleótidos bicatenarios de nuevo. A continuación, se realiza una segunda linealización para eliminar una porción de los polinucleótidos extendidos que contienen el cebador P7. En una realización, dicha eliminación se facilita mediante una reacción de escisión enzimática usando enzima FPG para escindir la posición oxo-G del cebador P7. A continuación se lleva a cabo una segunda ronda de SBS (Lectura 2) para secuenciar el ADN diana.

Los cebadores P5 y P7 se utilizan sobre la superficie de células de flujo comerciales comercializadas por Illumina Inc. para la secuenciación en las plataformas HiSeq®, MiSeq®, NextSeq® y Genome Analyzer®. Las secuencias cebadoras se describen en la publicación de patente estadounidense n.° 2011/0059865 A1.

Las secuencias de cebador P5 y P7 estándar para la secuenciación de extremos emparejados comprenden las siguientes:

P5: extremo emparejado 5'43'AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (sec. con núm. de ident. 1)

P7: extremo emparejado 5'43'

CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (sec. con núm. de ident. 2)

donde G* es 8-oxo-guanina.

Opcionalmente, uno o ambos de los cebadores P5 y P7 pueden incluir una cola de poli T. La cola de poli T generalmente está ubicada en el extremo 5' de las secuencias anteriores, pero en algunos casos puede estar ubicada en el extremo 3'. La secuencia poli T puede incluir cualquier cantidad de nucleótidos T, por ejemplo, de 2 a 20.

Las secuencias de cebador P5 y P7 estándar utilizadas en una célula de flujo recubierta con PAZAM con un espaciador de poli-T comprenden lo siguiente:

Cebador P5 con poli-T espaciador:5'-alquina-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC (sec. con núm. de ident. 3)

Cebador P7 con espaciador poli-T;

5'-alquina-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (sec. con núm. de ident.: 4)

donde G* es 8-oxo-guanina.

Las secuencias de cebadores adicionales incluyen un conjunto de cebadores P5 y P7 para SBS:

P5: lectura única: 5'43'AATGATACGGCGACCACCGA (sec. con núm. de ident. 7)

P7: lectura individual 5'^-3'CAAGCAGAAGACGGCATACGA (sec. con núm. de ident. 8)

Como se usa en la presente memoria, cuando los cebadores u oligos estándar P5/P7 se modifican para incorporar un primer o segundo sitio de escisión que es capaz de experimentar escisión química, por ejemplo, mediante un complejo de Pd o un complejo de Ni, la modificación de los cebadores P5/P7 puede referirse al reemplazo o sustitución de un nucleótido existente (o nucleósido) en la secuencia P5/P7 con una entidad química diferente, por ejemplo, un nucleótido modificado o análogo de nucleósido con funcionalidad específica para permitir la escisión química específica del sitio. La modificación también puede referirse a la inserción de una nueva entidad química en la secuencia existente de P5/P7, donde la nueva entidad química es capaz de experimentar una escisión química específica de sitio. En algunas realizaciones, los cebadores P5/P7 modificados se denominan cebadores P15/P17 respectivamente, comprenden los siguientes:

Cebador P155'43'

5'-Alquino-TTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC (sec. con núm. de ident. 5)

donde X = nucleósido de alilo T como se muestra en el Esquema 1.

Cebador P175'43'

5'-Alquino-TTTTTTYYYCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (sec. con núm. de ident. 6)

donde Y es un enlazador de diol sometido a escisión química, por ejemplo, por oxidación con un reactivo tal como peryodato, como se describe en la publicación US-2012/0309634.

En algunas realizaciones, el enlazador de diol comprende una Fórmula (VIII) o (VIIIa) como se describe en la presente memoria.

Definiciones

Los encabezados de secciones que se utilizan en la presente memoria tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el significado que entiende comúnmente un experto en la técnica. Además, el uso del término “ incluyendo” , así como otras formas, como “ incluyen” , “ incluye” e “ incluido” , no es limitativo. Además, el uso del término “ que tiene” , así como otras formas, como “tienen” , “ tiene” y “tenido” , no es limitativo. Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, ya sea en una expresión de transición o en el cuerpo de la reivindicación, se ha de interpretar que las expresiones “ que consta de” y “ que constan de” tienen un significado abierto. Es decir, las expresiones se han de interpretar como sinónimos de las expresiones “ que tiene(n) al menos” o “ que incluye(n) al menos” . Cuando se utiliza en el contexto de un proceso, la expresión “ que consta de” significa que el proceso incluye al menos las etapas citadas, pero puede incluir etapas adicionales. Cuando se utiliza en el contexto de un compuesto, composición o dispositivo, la expresión “ que consta de” significa que el compuesto, la composición o el dispositivo incluye al menos las características o los componentes citados, pero que también puede incluir características o componentes adicionales.

Como se utilizan en la presente memoria, las abreviaturas orgánicas comunes se definen de la siguiente manera:

Ac Acetilo

AczO Anhídrido acético

Aloc Aliloxicarbonilo

ac. Acuoso

BOC o Boc Terc-butoxicarbonilo

Bz Bencilo

°C Temperatura en grados centígrados

Cbz Benciloxicarbonilo

CVD Deposición química de Vapor

dATP Trifosfato de desoxiadenosina

dCTP Trifosfato de desoxicitidina

dGTP Tritrifosfato de desoxiguanosina

dTTP Trifosfato de desoxitimidina

ddNTP(s) Didesoxinucleótido(s)

DCM Cloruro de metileno

DMF Dimetilformamida

DMT o DMTr Dimetoxitritilo

EtOAc Acetato de etilo

FC Célula de flujo

Fmoc Fluorenilmetiloxicarbonilo

g Gramo(s)

h o hr Hora(s)

IPA Alcohol isopropílico

LCMS Cromatografía líquida-espectrometría de masas

ml Mililitro(s)

Ni Níquel

PE Éter de petróleo

PAZAM Relación de poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida) de cualquier acrilamida con respecto a azapa

Pd Paladio

ta Temperatura ambiente

SBS Secuenciación por síntesis

TBAF Fluoruro de tetra-n-butilamonio

TBDMS Tributildimetilsililo

TEA Trietilamina

TFA Ácido trifluoroacético

Terc, t Terciario

THF Tetrahidrofurano

THM T ris(hidroximetil)fosfina

THP T ris(hidroxipropil)fosfina

TIPS Triisopropilsililo

TLC Cromatografía en capa fina

TMS Trimetilsililo

TOM T riisopropilsililoximetilo

Tritilo Trifenilmetilo

mlMicrolitro(s)

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ unido covalentemente” o “ enlazado covalentemente” se refiere a la conformación de un enlace químico que se caracteriza por compartir pares de electrones entre átomos. Por ejemplo, una “ lámina de polímero unida covalentemente” , cuando se utiliza en referencia a la superficie de un sustrato, se refiere a una lámina de polímero que forma enlaces químicos con la superficie funcionalizada de un sustrato, en comparación con la unión a la superficie a través de otros medios, por ejemplo, la adhesión o la interacción electrostática.

Como se usa en la presente memoria, el término “ cebador de extensión” se refiere a un oligonucleótido o polinucleótido inmovilizado sobre un soporte sólido, donde el oligonucleótido o polinucleótido es capaz de unirse específicamente a una secuencia de una molécula de ácido nucleico monocatenario diana. Después de un proceso de hibridación, el oligonucleótido o polinucleótido se extiende para comprender una secuencia que es complementaria a la molécula de ácido nucleico diana. En algunos casos, el término “ cebador de extensión” se usa indistintamente con “ cebador de amplificación” .

Como se utiliza en la presente memoria, los términos “ ácido nucleico” y “ nucleótido” pretenden ser concordantes con su uso en la técnica e incluir especies naturales o análogos funcionales de los mismos. Los análogos de ácidos nucleicos funcionales particularmente útiles pueden hibridarse a un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o pueden utilizarse como un molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen una cadena principal que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un enlace de cadena principal alternativo que incluye cualquiera de una variedad de los conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos naturales suelen tener un azúcar de desoxirribosa (p. ej., en el ácido desoxirribonucleico (ADN)) o un azúcar de ribosa (p. ej., en el ácido ribonucleico (ARN)). Un ácido nucleico puede contener nucleótidos que tienen cualquiera de una variedad de análogos de estas fracciones de azúcar que se conocen en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden incluir nucleótidos naturales o no naturales. En este sentido, un ácido desoxirribonucleico natural puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, timina, citosina o guanina y un ácido ribonucleico puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en uracilo, adenina, citosina o guanina. En la técnica se conocen bases no naturales y útiles que pueden incluirse en un ácido nucleico o nucleótido. Los términos “ sonda” o “ diana” , cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico, pretenden ser identificadores semánticos para el ácido nucleico en el contexto de un método o composición expuesto en la presente memoria y no limita necesariamente la estructura o función del ácido nucleico más allá de lo que se indica explícitamente. Los términos “ sonda” y “ diana” pueden aplicarse de manera similar a otros analitos tales como proteínas, moléculas pequeñas, células o similares.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ polinucleótido” se refiere a ácidos nucleicos en general, incluyendo ADN (p. ej., ADNc de ADN genómico), ARN (p. ej., ARNm), oligonucleótidos sintéticos y análogos de ácidos nucleicos sintéticos. Los polinucleótidos pueden incluir bases naturales o no naturales, o combinaciones de las mismas y uniones de cadena principal naturales o no naturales, p. ej., fosforotioatos, PNA o 2'-O-metil-ARN, o combinaciones de los mismos. En algunos casos, el término “ polinucleótido” , “ oligonucleótido” u “ oligo” se usan indistintamente.

El término “ sitio de escisión” como se usa en la presente memoria se refiere a una posición en la secuencia de polinucleótidos donde una parte del polinucleótido puede eliminarse mediante una reacción de escisión. La posición del sitio de escisión se predetermina preferentemente, lo que significa la ubicación donde se produce la reacción de escisión se determina por adelantado, en lugar de la escisión en un sitio aleatorio donde la ubicación no se conoce por adelantado.

Como se usa en la presente memoria, el término “ soporte sólido” se refiere a un sustrato rígido que es insoluble en líquido acuoso. El sustrato puede ser no poroso o poroso. Opcionalmente, el sustrato puede ser capaz de tomar un líquido (p. ej., debido a la porosidad), pero típicamente será suficientemente rígido que el sustrato no se hinche sustancialmente cuando se recoge el líquido y no se contrae sustancialmente cuando el líquido se elimina mediante secado. Un soporte sólido no poroso es generalmente impermeable a líquidos o gases. Los soportes sólidos ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (p. ej., acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon™, olefinas cíclicas, poliimidas, nailon, cerámicas, resinas, Zeonor, sílice o materiales basados en sílice que incluyen silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, haces de fibras ópticas y polímeros. Los soportes sólidos particularmente útiles para algunas realizaciones son componentes de una célula de flujo o ubicados dentro de un aparato de célula de flujo. El soporte sólido puede tener una superficie plana, por ejemplo, una célula de flujo, o una superficie no plana, por ejemplo, una perla.

Donde un sustituyente se representa como un dirradical(es decir,tiene dos puntos de unión al resto de la molécula), debe entenderse que el sustituyente puede unirse en cualquier configuración direccional a menos que se indique lo contrario. Así, por ejemplo, un sustituyente representado como -AE- o

incluye el sustituyente orientado de manera que elAse une en el punto de unión más a la izquierda de la molécula, así como el caso en el queAse una en el punto de unión más a la derecha de la molécula.

Métodos de primera linealización química asistida por paladio (Pd) o níquel (Ni)

Algunas realizaciones de la presente descripción se refieren a métodos para linealizar una pluralidad de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados, que comprende: proporcionar un soporte sólido que comprende polinucleótidos bicatenarios, en donde cada polinucleótido bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena y la segunda cadena se inmovilizan cada una al soporte sólido en sus extremos 5', y en donde cada primera cadena comprende un primer sitio de escisión capaz de experimentar escisión química en presencia de un reactivo de escisión; poner en contacto los polinucleótidos bicatenarios con el reactivo de escisión, lo que de este modo escinde una o más primeras cadenas en el primer sitio de escisión, y genera uno o más primeros ácidos nucleicos escindidos y primeras cadenas inmovilizadas escindidas, y eliminar los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido. En algunos aspectos, el sitio de escisión es capaz de experimentar escisión en presencia de un complejo de Pd o un complejo de Ni. En algunos aspectos, el reactivo de escisión es una solución acuosa del complejo de Pd o el complejo de Ni. En algunos aspectos, el reactivo de escisión se preparain situ.

En algunas realizaciones de los métodos de linealización de Pd/Ni descritos en la presente memoria, cada primera cadena se extiende desde un primer cebador de extensión inmovilizado al soporte sólido. En algunas de tales realizaciones, el primer cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos que es una secuencia P5 o P7 como se describe en la presente memoria, o una secuencia que es complementaria a P5 o P7. En una realización, el primer cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos P5 (sec. con núm. de ident. 1). En una realización adicional, el primer cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos de espaciador P5 de poli-T (sec. con núm. de ident.:3). En una realización, el cebador de primera extensión es un cebador P5. En una realización adicional, el cebador de primera extensión es un cebador de espaciador P5 de poli-T. En realizaciones adicionales, el primer cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos que es una secuencia P5 o P7 como se describe en la presente memoria, o una secuencia que es complementaria a P5 o P7, en donde un nucleótido de la secuencia se reemplaza por un nucleótido modificado que es susceptible a la escisión en presencia de un complejo de paladio. En algunos aspectos, el primer cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos de P15 como se describe en la presente memoria (sec. con núm. de ident.:5).

En algunas realizaciones de los métodos de linealización de Pd/Ni descritos en la presente memoria, el primer cebador de extensión comprende el primer sitio de escisión. En algunas realizaciones adicionales, el primer sitio de escisión comprende un nucleótido o nucleósido modificado que es capaz de experimentar escisión química, por ejemplo, por el complejo de paladio. En algunas realizaciones, el nucleósido o nucleótido modificado tiene la estructura de Fórmula (II):

en donde R es H, OH u OPG; R1 es H o PG; R2 es H, PG U -OR2 es un grupo fosfato; PG es un grupo protector de hidroxilo; La base es adenina, guanina, citosina, timina o uracilo, o un derivado de las mismas. En algunas realizaciones, el grupo fosfato puede estar cargado negativamente (p. ej., -PO<4>"). En un aspecto, el nucleósido o nucleótido modificado tiene la estructura de Fórmula (IIa):

En algunas realizaciones, el primer sitio de escisión que incorpora la fracción de nucleósido o nucleótido modificado comprende la estructura de Fórmula (II'), donde el oxígeno 3' del nucleósido o nucleótido modificado con alilo se une covalentemente al extremo 5' de otro nucleótido (estructura no mostrada):

En algunas realizaciones adicionales, el nucleótido o nucleósido modificado puede marcarse además con un marcador detectable, por ejemplo, un marcador fluorescente. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado comprende un sustituyente de vinilo en el carbono 5' del nucleótido o nucleósido, que por lo tanto forma una fracción de alilo con respecto al grupo hidroxilo 5'. En algunas realizaciones, el grupo hidroxilo 5' se conecta a un fosfato 3' de un segundo nucleótido, de manera que la unidad de dinucleótido comprende un sitio de escisión con una fracción de fosfato de alilo. En algunas realizaciones, el nucleótido o nucleósido modificado es un análogo de nucleósido timina (T) o nucleótido. En algunas realizaciones adicionales, el grupo protector de hidroxilo 3' (o bloqueante), por ejemplo, una fracción de fosfato (como se muestra en la Fórmula (II')), permanece en las primeras cadenas inmovilizadas escindidas después de la escisión química de las primeras cadenas. En una de tales realizaciones, la fracción de fosfato 3' del segundo nucleótido se une covalentemente a la posición de carbono 5' del análogo de nucleósido modificado (es decir, el grupo fosfato incluye el hidroxilo 5' del nucleótido modificado). En algunas realizaciones, el sitio de escisión se ubica cerca del extremo 3' del primer cebador de extensión, por ejemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de distancia del extremo 3' del primer cebador de extensión. En algunas otras realizaciones, el sitio de escisión se ubica cerca del extremo 5' del primer cebador de extensión, por ejemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de distancia del extremo 5' del primer cebador de extensión. En algunos casos, para garantizar la resíntesis eficiente de ADN, el sitio de escisión se ubica preferentemente hacia el extremo 3' del primer cebador, por ejemplo, dentro de 2 a 8, o 3 a 7, o 4 a 6 nucleótidos de distancia. En una realización, el cebador de primera extensión es un cebador P5 y el primer sitio de escisión se ubica en la secuencia del cebador P5 (p. ej., el nucleótido modificado se incorpora en la secuencia del cebador P5, al añadir o reemplazar un nucleótido). Por lo tanto, la secuencia P5 descrita en el presente documento (sec. con núm. de ident.: 1 o sec. con núm. de ident.:3) se modifica para incluir el primer sitio de escisión que es capaz de experimentar escisión química por el complejo de Pd/Ni, que por lo tanto forma un cebador P5 modificado. En una realización, el cebador P5 modificado comprende o es un cebador P15 descrito en la presente memoria (sec. con núm. de ident.:5).

Reactivos de paladio

En algunas realizaciones de los métodos de linealización de Pd descritos en la presente memoria, el complejo de Pd usado en el método de linealización química es soluble en agua. En algunas de tales realizaciones, el complejo de Pd es un complejo de Pd (0). En algunos casos, se puede generar el complejo de Pd(0)in situa partir de la reducción de un complejo de Pd(II) por reactivos tales como alquenos, alcoholes, aminas, fosfinas o hidruros metálicos. Las fuentes de paladio adecuadas incluyen Na2PdCl4, (PdCl(CaH5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(CaH5)(THP)2]Cl, Pd(OAc)<2>, Pd(Ph3)4, Pd(dba)<2>, y Pd(TFA)<2>. En una de tales realizaciones, se genera el complejo de Pd(0)in situa partir de Na<2>PdCk En otra realización, la fuente de paladio es el dímero de cloruro de alil paladio(II) [(PdCl(C3Hs))2]. En algunas realizaciones, el complejo de Pd(0) se genera en una solución acuosa al mezclar un complejo de Pd(II) con una fosfina. Las fosfinas adecuadas incluyen fosfinas solubles en agua, tales como tris(hidroxipropil)fosfina (THP), tris(hidroximetil)fosfina (THM), 1,3,5-triaza-7-fosfaadamantano (PTA), sal de potasio de dihidrato de bis (p-sulfonatofenil)fenilfosfina, tris(carboxietil)fosfina (TCEP) y sal trisódica de ácido trifenilfosfino-3,3',3''-trisulfónico.

En algunas realizaciones, el Pd(0) se prepara al mezclar un complejo de Pd(II) [(PdCl(C3Hs))2] con THPin situ.La relación molar del complejo de Pd(II) y el THP puede ser aproximadamente 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 o 1:10. En algunas realizaciones adicionales, se pueden añadir uno o más agentes reductores, tales como ácido ascórbico o una sal del mismo (p. ej., ascorbato de sodio).

En algunas realizaciones, el Pd(0) se prepara mezclando un precatalizador de Pd(II) tal como [Pd(C3Hs)(THP)]Cl, [Pd(C3H5) (THP)<2>]Cl con THP adicional. [Pd(CaH5)(THP)]Cl and [Pd(C3H5)(THP)2]Cl puede prepararse al hacer reaccionar (PdCl(C3H5))2 con 1 a 5 equivalentes de THP y pueden aislarse antes de su uso en la reacción de linealización química.

En algunas otras realizaciones, el complejo de PD(0) es Pd(THM)4, Pd(THP)<2>, Pd(THP)3, o PD(THP)4 o combinaciones de los mismos.

Reactivos de níquel

En algunas realizaciones de los métodos de linealización de Ni descritos en la presente memoria, el complejo de Ni usado en el método de linealización química es soluble en agua. En algunas de tales realizaciones, el complejo de Ni es un complejo de Ni (0). En algunos casos, se puede generar el complejo de Niin situa partir de la reducción de un compuesto de Ni(II) por reactivos tales como alquenos, alcoholes, aminas, fosfinas o hidruros metálicos. En algunas realizaciones, el compuesto de Ni(II) es NiCb. Las fosfinas adecuadas incluyen fosfinas solubles en agua, tales como tris(hidroxipropil)fosfina (THP), tris(hidroximetil)fosfina (THM), 1,3,5-triaza-7-fosfaadamantano (PTA), sal de potasio de dihidrato de bis (p-sulfonatofenil)fenilfosfina, tris(carboxietil)fosfina (TCEP) y sal trisódica de ácido trifenilfosfino-3,3',3"-trisulfónico. En una realización, el complejo de Ni se prepara al mezclar NiCb con 1 a 10 equivalentes de THP.

Algunas realizaciones de la presente memoria se refieren a un método para linealizar una pluralidad de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados, que comprende: proporcionar un soporte sólido que comprende polinucleótidos bicatenarios, cada polinucleótido bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde cada primera cadena se extiende desde un cebador P5 modificado inmovilizado al soporte sólido, cada segunda cadena se extiende desde un cebador P7 inmovilizado al soporte sólido, tanto la primera cadena como la segunda cadena se inmovilizan en el soporte sólido en sus extremos 5', en donde cada cebador P5 modificado comprende un primer sitio de escisión capaz de experimentar escisión química por un complejo de Pd(0); poner en contacto los polinucleótidos bicatenarios con una solución acuosa del complejo de Pd(0), lo que de este modo escinde una o más primeras cadenas en el primer sitio de escisión, y genera uno o más primeros ácidos nucleicos escindidos y primeras cadenas inmovilizadas escindidas; y eliminar los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido. En algunas realizaciones, el primer sitio de escisión comprende un nucleósido o nucleótido T modificado que tiene una funcionalidad alilo. El sitio de escisión puede incluir además una fracción bloqueante 3', por ejemplo, una fracción de fosfato, que permanece en la primera cadena después de la reacción de escisión de Pd para bloquear el 3'-OH de las primeras cadenas inmovilizadas escindidas. En alguna realización, la fracción bloqueante 3' comprende un nucleósido o nucleótido modificado que contiene un grupo fosfato, que puede desprotegerse mediante una reacción química o mediante una reacción enzimática. En una realización, el cebador P5 modificado comprende o es P15.

Desprotección 3'

Algunas realizaciones de la presente memoria se refieren a un método para eliminar un grupo protector de extremo 3' de un oligonucleótido, que comprende: proporcionar un soporte sólido que comprende una pluralidad de oligonucleótidos inmovilizados sobre los mismos en sus extremos 5', en donde cada uno de los oligonucleótidos comprende un grupo protector de extremo 3' que tiene una estructura de Fórmula (I) como se describe en la presente memoria; y poner en contacto los oligonucleótidos con un reactivo de desprotección, lo que de este modo escinde el grupo protector de extremo 3' para producir oligonucleótidos cada uno con un grupo hidroxilo extremo 3' libre. La fracción de fosfato modificado con extremo 3' que tiene la estructura de Fórmula (I):

en donde R1 es -NH<2>, -OH, -NHC(O)ORa o -OCH2OSi(Rb)3; Ra es alquilo C<1-4>, terc-butilo, alilo, bencilo o 9-fluorenilmetilo; cada Rb se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1-4>y fenilo; y R2 es H, alquilo C<1-4>, un tetrahidrofurano opcionalmente sustituido o un nucleótido.

En algunas realizaciones adicionales, el grupo protector comprende la estructura de Fórmula (V):

en donde la base es una adenina, guanina, citosina, timina o uracilo opcionalmente protegida, o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, uno o más grupos fosfato en la Fórmula (I) o (V) pueden cargarse negativamente (p. ej., PO<4>-).

En algunas realizaciones de Fórmula (I) o (V), R1 es -NHC(O)ORa. En algunas realizaciones, Ra es 9-fluorenilmetilo, bencilo o alilo. En algunas realizaciones, R1 es -OCH2OSi(Rb)3. En algunas realizaciones, cada Rb es isopropilo. En algunas realizaciones, cada Rb es independientemente metilo, etilo, terc-butilo o fenilo.

En algunas realizaciones, el grupo fosfato modificado de Fórmula (I) o (V) puede eliminarse mediante un reactivo de desprotección químico, tal como un reactivo que contiene fluoruro o una base. Los ejemplos no limitantes incluyen fluoruro de tetra-n-butilamonio (TBAF), HF, NH<4>F, CsF, NaOH y KOH, y una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones de los métodos de linealización de Pd/Ni descritos en la presente memoria, después de la primera linealización, la porción restante de las primeras cadenas inmovilizadas tiene un grupo hidroxilo de extremo 3 sin protección y los métodos incluyen además bloquear el extremo 3' de la porción restante de las primeras cadenas inmovilizadas escindidas después de la reacción de escisión de Pd/Ni. En una de tales realizaciones, el bloqueo comprende fosforilar el extremo 3' de las primeras cadenas inmovilizadas escindidas como un grupo protector de hidroxilo 3'. En algunas otras realizaciones, el extremo 3' de cada primera cadena inmovilizada escindida comprende un grupo protector. En algunas de tales realizaciones, el efecto bloqueante puede lograrse mediante una fracción de fosfato o una fracción de fosfato modificado que permanece en las primeras cadenas inmovilizadas escindidas después de la reacción de escisión, que sirve como un grupo bloqueante al 3'-OH de las primeras cadenas inmovilizadas escindidas. En algunas realizaciones, la fracción de fosfato modificado comprende la estructura de Fórmula (I) o (V) como se describe en la presente memoria.

El grupo fosfato o el grupo fosfato modificado se elimina antes de la resíntesis de ADN para generar primeras cadenas derivadas que son complementarias a las segundas cadenas inmovilizadas. En algunas realizaciones, el grupo protector del extremo 3' es un grupo fosfato, que puede eliminarse mediante una fosfatasa tal como T4PNK. En algunas otras realizaciones, el grupo protector del extremo 3' es un grupo fosfato modificado de Fórmula (I) o (V), que puede eliminarse mediante un reactivo que contiene fluoruro o una base, tal como fluoruro de tetra-n-butilamonio (TBAF), HF, NH4F, CsF, NaOH o KOH, o una combinación de los mismos.

Métodos de segunda linealización

En algunas realizaciones de los métodos de linealización de Pd/Ni descritos en la presente memoria, cada segunda cadena se extiende desde un segundo cebador de extensión inmovilizado al soporte sólido, y cada segunda cadena comprende un segundo sitio de escisión. En algunas de tales realizaciones, el segundo cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia P5 o P7 como se describe en la presente memoria, o una secuencia que es complementaria a P5 o P7. En una realización, el segundo cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos P7 (sec. con núm. de ident.: 2). En una realización adicional, el segundo cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos del espaciador P7 de poli-T (sec. con núm. de ident.:4). En algunos aspectos, el segundo cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos que es P5 o P7, con un nucleótido modificado incorporado (añadido a o reemplazando una base en la secuencia con una base que tiene un grupo protector de hidroxilo 3'). En una realización adicional, el segundo cebador de extensión comprende un cebador P17 (sec. con núm. de ident.:<6>). En una realización, el segundo cebador de extensión es un cebador P7. En una realización adicional, el segundo cebador de extensión es un cebador de poli-T espaciador P7. En otra realización, el segundo cebador de extensión es un cebador P17.

En algunas realizaciones de los métodos de linealización de Pd/Ni descritos en la presente memoria, el segundo cebador de extensión comprende el segundo sitio de escisión. En algunas de tales realizaciones, el segundo sitio de escisión no es capaz de experimentar escisión química por el complejo de paladio o el complejo de níquel. En algunos aspectos, el segundo sitio de escisión puede escindirse mediante un método seleccionado del grupo que consiste en escisión química, fotoescisión, escisión enzimática o una combinación de las mismas. En una realización, el segundo sitio de escisión puede escindirse mediante una reacción de escisión enzimática. En una realización, el segundo cebador de extensión es un cebador P7 descrito en la presente memoria (sec. con núm. de ident.:2 o sec. con núm. de ident.:4) y el segundo sitio de escisión es oxo-G. En alguna realización de este tipo, la enzima usada para la reacción de escisión es FPG.

En algunas otras realizaciones, el segundo sitio de escisión puede escindirse mediante una reacción de escisión química. En una de tales realizaciones, el segundo cebador de extensión comprende o es un cebador P7 modificado para incluir un nucleótido modificado que es susceptible a la escisión química de acuerdo con los modos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el segundo cebador de extensión comprende o es un cebador P17 descrito en la presente memoria (sec. con núm. de ident.:<6>) y el segundo sitio de escisión comprende uno o más enlaces de diol que pueden escindirse mediante tratamiento con peryodato, por ejemplo, peryodato de sodio. En algunas de tales realizaciones, el enlazador de diol comprende la estructura de Fórmula (VIII):

OH

a+o<V OH'W?i'> (VIII)

donde r es 2, 3, 4, 5 o<6>;

s es 2, 3, 4, 5 o<6>;

el oxígeno “ a” es el oxígeno de hidroxilo 3' de un primer nucleótido; y

el oxígeno “ b” es el oxígeno de hidroxilo 5' de un segundo nucleótido.

En algunas realizaciones, el enlazador de diol tiene la estructura de Fórmula (VIIIa):

donde “a” y “ b” son como se definieron anteriormente.

En algunas otras realizaciones, el segundo sitio de escisión comprende un enlazador de azobenceno, que puede ser escindido por un reactivo de escisión química, por ejemplo, Na<2>S<2>O<4>. En algunas de tales realizaciones, el enlazador de azobenceno comprende una estructura de Fórmula (X):

en donde R1 es H, hidroxilo o un hidroxilo protegido; R2 es H, alquilo C<1>-<6>, o alcoxi C<1>-<6>; cada R3 y R4 es independientemente H, halo, -C(O)OR5, o -C(O)NHR6; cada R5 y R6 es independientemente H, alquilo C<1>-<6>, o arilo C6-<10>; X es -C(O)-, -CH<2>-, o -C(O)NH-; y cada m1, m2 y m3 es independientemente 1,2, 3, 4, 5 o 6. En algunos aspectos, R1 es hidroxilo. En algunos otros aspectos, R1 es un hidroxilo protegido, tal como -OBz. En algunos aspectos, R3 es -C(O)OR5 En algunos aspectos, R3 es C(O)NHR6 En algunos de dichos aspectos, R5 y R6 son independientemente alquilo C<1>-<6>, tal como metilo, etilo, isopropilo o t-butilo. En algunos otros aspectos, R3 es H. En algunos aspectos, R2 es H. En algunos aspectos, R4 es H. En algunos aspectos, X es -CH<2>-. En algunos otros aspectos, X es -C(O)NH-. En algunos aspectos, m1 es 2, 3 o 4. En algunos aspectos, m2 es 1,2 o 3. En algunos aspectos, m3 es 1 ,2 o 3.

En algunas realizaciones del enlazador de azobenceno de Fórmula (X), un átomo de oxígeno de extremo está conectado además a un grupo fosfato, por ejemplo, con una estructura de Fórmula (Xa) o la Fórmula (Xb):

En algunos aspectos, el oxígeno “ a” es el oxígeno de hidroxilo 3' de un primer nucleótido. En algunos aspectos, el oxígeno “ b” es el oxígeno de hidroxilo 5' de un segundo nucleótido. En algunos otros aspectos, el oxígeno “ b” es el oxígeno de hidroxilo 3' de un primer nucleótido. En algunos otros aspectos, el oxígeno “ a” es el oxígeno de hidroxilo 5' de un segundo nucleótido.

El enlazador de azobenceno de Fórmula (Xa) o (Xb) puede incorporarse en un oligonucleótido o polinucleótido por un reactivo químico, donde el reactivo químico es un compuesto de fosforamidita de Fórmula (XIa) o (XIb):

donde R1-R4, X, m1, m2 y m3 se definen en (X); y

Algunas realizaciones adicionales de la presente memoria se refieren a un método para linealizar una pluralidad de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados, que comprenden: proporcionar un soporte sólido que comprende polinucleótidos bicatenarios, cada polinucleótido bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena, en donde la primera cadena y la segunda cadena se inmovilizan en el soporte sólido en sus extremos 5', en donde cada primera cadena comprende un primer sitio de escisión, y en donde cada segunda cadena comprende un segundo sitio de escisión que comprende un enlazador de azobenceno; escindir una o más primeras cadenas en el primer sitio de escisión, y generar uno o más primeros ácidos nucleicos escindidos y primeras cadenas inmovilizadas escindidas; eliminar los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido; secuenciar las segundas cadenas inmovilizadas; volver a sintetizar primeras cadenas derivadas que son complementarias a las segundas cadenas; y escindir una o más segundas cadenas en el segundo sitio de escisión, y generar uno o más segundos ácidos nucleicos escindidos y segundas cadenas inmovilizadas escindidas. En algunas realizaciones de tales métodos, cada primera cadena se extiende desde un primer cebador de extensión inmovilizado al soporte sólido, y en donde el primer cebador de extensión comprende el primer sitio de escisión. En algunas realizaciones de tales métodos, el primer sitio de escisión puede escindirse mediante un método seleccionado del grupo que consiste en escisión química, fotoescisión, escisión enzimática y una combinación de las mismas, por ejemplo, el primer sitio de escisión puede escindirse mediante los métodos de Pd/Ni descritos en la presente memoria, o un método enzimático (p. ej., UDG). En algunas de tales realizaciones, el primer cebador de extensión comprende P5, P5 modificado o P15. En algunas realizaciones, cada segunda cadena se extiende desde un segundo cebador de extensión inmovilizado al soporte sólido, y en donde el segundo cebador de extensión comprende el segundo sitio de escisión. En algunas de tales realizaciones, el enlazador de azobenceno comprende la estructura de Fórmula (X), (Xa) o (Xb) como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, el enlazador de azobenceno es escindido por Na2S2O4. En algunas realizaciones, la secuenciación de las segundas cadenas inmovilizadas comprende incorporar sucesivamente nucleótidos marcados complementarios a las segundas cadenas inmovilizadas y detectar los nucleótidos marcados. En algunas realizaciones, el extremo 3' de cada primera cadena inmovilizada escindida comprende un grupo protector, por ejemplo, un grupo fosfato o una fracción de fosfato modificado que comprende la estructura de Fórmula (I) o (V) como se describe en la presente memoria. El grupo protector puede eliminarse mediante una reacción enzimática (p. ej., enzima T4PNK) o una desprotección química, por ejemplo, un reactivo que contiene fluoruro o una base como se describe en la presente memoria para la desprotección de la fracción de fosfato modificado que comprende la estructura de Fórmula (I) o (V). En algunas realizaciones, el método comprende además eliminar los segundos ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido y secuenciar las primeras cadenas derivadas. En algunas realizaciones, las primeras cadenas derivadas inmovilizadas permanecen en el soporte sólido después de la eliminación de los segundos ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido, y permanecen hibridadas con las segundas cadenas inmovilizadas escindidas.

En algunas realizaciones del primer y segundo métodos de linealización descritos en la presente memoria, los polinucleótidos bicatenarios se inmovilizan en el soporte sólido a través de enlace covalente. En una realización, los polinucleótidos bicatenarios se unen covalentemente a un hidrogel o recubrimiento de polímero sobre el soporte sólido. En una realización, el recubrimiento de hidrogel o polímero comprende PAZAM. En algunas realizaciones, el hidrogel o el recubrimiento de polímero también se une covalentemente a la superficie del soporte sólido, por ejemplo, mediante reacción con un silano funcionalizado depositado sobre la superficie. En una realización, el silano funcionalizado es un silano derivado de norborneno. Los ejemplos no limitantes de recubrimientos de hidrogel o polímero sobre soporte sólido silanizado y métodos de injerto de polinucleótidos o cebadores para hidrogel o soporte sólido revestido con polímero se describen en las publicaciones estadounidenses n°. 2014/0079923 y 2015/0005447.

Soporte sólido injertado para linealización de Pd

Algunas realizaciones de la presente memoria se refieren a un soporte sólido que comprende una pluralidad de polinucleótidos de primera cadena inmovilizados sobre el mismo, cada primer polinucleótido de cadena comprende un primer sitio de escisión capaz de experimentar escisión química (p. ej., mediante un complejo de paladio o un complejo de níquel como se describe en la presente memoria), en donde la pluralidad de polinucleótidos de primera cadena se inmovilizan en el soporte sólido en sus extremos 5'.

En algunas realizaciones del soporte sólido descrito en la presente memoria, cada primera cadena comprende o se extiende desde un primer cebador de extensión inmovilizado al soporte sólido. En algunas de tales realizaciones, el primer cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia P5 o P7 como se describe en la presente memoria, o una secuencia que es complementaria a P5 o P7. En una realización, el primer cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos P5 (sec. con núm. de ident.

1). En una realización adicional, el primer cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos de espaciador P5 de poli-T (sec. con núm. de ident.:3). En una realización, el cebador de primera extensión es un cebador P5. En una realización adicional, el cebador de primera extensión es un cebador de espaciador P5 de poli-T. En algunas realizaciones, la secuencia P5 o P7 se modifica para incluir un nucleósido o nucleótido modificado que forma al menos parte del sitio de escisión.

En algunas realizaciones del soporte sólido descrito en la presente memoria, el primer cebador de extensión comprende el primer sitio de escisión. En algunas realizaciones adicionales, el primer sitio de escisión comprende un nucleótido o nucleósido modificado que es capaz de experimentar escisión química, por ejemplo por el complejo de paladio o el complejo de níquel. En algunas de tales realizaciones, el nucleótido o nucleósido modificado es un nucleósido de T o un análogo de nucleótido. En una de tales realizaciones, el sitio de escisión comprende un análogo de nucleósido T que comprende una funcionalidad alilo, por ejemplo, una sustitución de vinilo en la posición de carbono 5' del análogo de nucleósido T, lo que por lo tanto forma una fracción de alilo con respecto al grupo hidroxilo 5'. En algunas de tales realizaciones, el nucleósido o nucleótido modificado comprende la estructura de Fórmula (II) como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, el grupo hidroxilo 5' se conecta a un fosfato 3' de un segundo nucleótido, de manera que la unidad de dinucleótido comprende un sitio de escisión con una fracción de fosfato de alilo. En algunas de tales realizaciones, el nucleósido o nucleótido modificado comprende la estructura de Fórmula (II') como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, el primer cebador de extensión comprende o es cebador P15. En algunas realizaciones adicionales, el sitio de escisión también comprende una fracción protectora 3' (o bloqueante), por ejemplo, una fracción de fosfato, en el segundo nucleótido. La fracción bloqueante permanece en las primeras cadenas inmovilizadas escindidas después de la escisión química de las primeras cadenas. En una realización, la fracción de fosfato 3' del segundo nucleótido se une covalentemente a la posición de carbono 5' del análogo de nucleósido modificado (es decir, el grupo fosfato incluye el hidroxilo 5' del nucleótido modificado). En algunas realizaciones, el grupo bloqueante que permanece en las primeras cadenas inmovilizadas escindidas comprende la estructura de Fórmula (I) de (V) como se describe en la presente memoria, que puede eliminarse en un reactivo de desprotección química, tal como un compuesto que contiene fluoruro o una base. En algunas realizaciones, el grupo bloqueante que permanece en las primeras cadenas inmovilizadas escindidas es un grupo fosfato, que puede eliminarse por una fosfatasa (p. ej., T4PNK). En algunas realizaciones, el sitio de escisión se ubica cerca del extremo 3' del primer cebador de extensión, por ejemplo, dentro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de distancia del extremo 3' del primer cebador de extensión. En algunas otras realizaciones, el sitio de escisión se ubica cerca del extremo 5' del primer cebador de extensión, por ejemplo, dentro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de distancia del extremo 5' del primer cebador de extensión. En algunos casos, para garantizar la resíntesis eficiente de ADN, el sitio de escisión se ubica preferentemente hacia el extremo 3' del primer cebador, por ejemplo, dentro de 2 a 8, o 3 a 7, o 4 a 6 nucleótidos de distancia. En una realización, el cebador de primera extensión es un cebador P5 y el primer sitio de escisión se ubica en la secuencia del cebador P5 (p. ej., el nucleótido modificado se incorpora en la secuencia del cebador P5, al añadir o reemplazar un nucleótido). Por lo tanto, la secuencia P5 descrita en el presente documento (sec. con núm. de ident.:1 o sec. con núm. de ident.:3) se modifica para incluir el primer sitio de escisión que es capaz de experimentar escisión química por el complejo de Pd/Ni, que por lo tanto forma un cebador P5 modificado. En una realización, el cebador P5 modificado comprende o es un cebador P15 descrito en la presente memoria (sec. con núm. de ident.:5). En algunas realizaciones adicionales, el nucleótido o nucleósido modificado puede marcarse además con un marcador detectable, por ejemplo, un marcador fluorescente. El marcador detectable permite la cuantificación directa de la reacción de injerto inmediatamente después de la finalización.

En algunas realizaciones del soporte sólido descrito en la presente memoria, el complejo de Pd usado en el método de linealización química es soluble en agua. En algunas de tales realizaciones, el complejo de Pd es un complejo de Pd (0). En algunos casos, se puede generar el complejo de Pd(0)in situa partir de la reducción de un complejo de Pd(II) por reactivos tales como alquenos, alcoholes, aminas, fosfinas o hidruros metálicos. Las fuentes de paladio adecuadas incluyen Na2PdCl4, (PdCl(CaH5))2, [Pd(C3H5)(THP)]Cl, [Pd(CaH5)(THP)2]Cl, Pd(Pha)4, Pd(OAc)<2>, Pd(dba)<2>, y Pd(TFA)<2>. En una de tales realizaciones, se genera el complejo de Pd(0)in situ a partirde Na<2>PdCk En otra realización, la fuente de paladio es el dímero de cloruro de alil paladio(II) [(PdCl(C3H5))2]. En algunas realizaciones, el complejo de Pd(0) se genera en una solución acuosa al mezclar un complejo de Pd(II) con una fosfina. Las fosfinas adecuadas incluyen fosfinas solubles en agua, tales como tris(hidroxipropil)fosfina (THP), tris(hidroximetil)fosfina (THM), 1,3,5-triaza-7-fosfaadamantano (PTA), sal de potasio de dihidrato de bis (p-sulfonatofenil)fenilfosfina, tris(carboxietil)fosfina (TCEP) y sal trisódica de ácido trifenilfosfino-3,3',3''-trisulfónico. En algunas realizaciones, se puede generar Pd(0) al mezclar [(PdCl(CaHaM [Pd(CaH5)(THP)]Cl, o [Pd(CaH5)(THP)2]Cl con THPin situ.Se pueden añadir uno o más agentes reductores, tales como ácido ascórbico o una sal del mismo (p. ej., ascorbato de sodio). En algunas realizaciones, el complejo de Pd(0) es Pd(THM)4, Pd(THP)<2>, Pd(THP)3, o PD(THP)4 o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones del soporte sólido descrito en la presente memoria, el complejo de Ni usado en la linealización química es soluble en agua. En algunas de tales realizaciones, el complejo de Ni es un complejo de Ni (0). En algunos casos, se puede generar el complejo de Niin situa partir de la reducción de un compuesto de Ni(II) (tal como NiCb) mediante reactivos similares a los utilizados en la reducción de Pd(II) a Pd(0) como se describe en la presente memoria. En una realización, el complejo de Ni se prepara al mezclar NiCl<2>con 1 a 10 equivalentes de THP.

En algunas realizaciones del soporte sólido descrito en la presente memoria, el soporte sólido comprende además una pluralidad de polinucleótidos de segunda cadena inmovilizados sobre el mismo, cada segundo polinucleótido de cadena comprende un segundo sitio de escisión, en donde la pluralidad de segundos polinucleótidos de cadena se inmoviliza en el soporte sólido en sus extremos 5'. En algunas de tales realizaciones, cada polinucleótido de la segunda cadena comprende o se extiende desde un segundo cebador de extensión inmovilizado al soporte sólido. En algunas de tales realizaciones, el segundo cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia P5 o P7 como se describe en la presente memoria, o una secuencia que es complementaria a P5 o P7. En una realización, el segundo cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos P7 (sec. con núm. de ident.: 2). En una realización adicional, el segundo cebador de extensión comprende una secuencia de nucleótidos del espaciador P7 de poli-T (sec. con núm. de ident.:4). En otro aspecto, el segundo cebador de extensión comprende una secuencia P15 (sec. con núm. de ident.:6). En una realización, el segundo cebador de extensión es un cebador P7. En una realización adicional, el segundo cebador de extensión es un cebador de poli-T espaciador P7. En algunas realizaciones, el cebador P7 o cebador de poli-T espaciador P7 se modifica para eliminar la 8-oxo-guanina e insertar un enlazador químicamente escindible, p. ej., una o más unidades de diol. En aun otra realización, el segundo cebador de extensión es un cebador P17. En algunas realizaciones, el segundo cebador de extensión comprende el segundo sitio de escisión. En algunas de tales realizaciones, las secuencias P5, P7 o P17 se modifican para incluir un nucleótido modificado con un enlazador escindible. En algunas realizaciones adicionales, el segundo sitio de escisión no es capaz de experimentar escisión química por el complejo de paladio o el complejo de níquel usado en la primera reacción de linealización química. El segundo sitio de escisión puede escindirse mediante un método seleccionado del grupo que consiste en escisión química, escisión fotoquímica, escisión enzimática o una combinación de las mismas. En una realización, el segundo sitio de escisión puede escindirse mediante una reacción de escisión enzimática. En una de tales realizaciones, el segundo cebador de extensión es un cebador P7 descrito en la presente memoria (sec. con núm. de ident. :2 o sec. con núm. de ident. :4) y el segundo sitio de escisión es oxo-G. En otra realización, el segundo sitio de escisión puede escindirse mediante una reacción de escisión química. Por ejemplo, el segundo sitio de escisión puede incluir uno o más enlaces de diol vecinos (que pueden escindirse por oxidación, tal como tratamiento con un reactivo peryodato), enlaces disulfuro (escindibles, por ejemplo, en condiciones reductoras tales como DTT, o en presencia de una fosfina), grupos orto-nitrobencilo (escindibles, por ejemplo, por fotólisis), enlaces de azobenceno (escindibles, por ejemplo, en presencia de Na2S2O4), enlaces de alquilo-selenio (escindibles, por ejemplo, por oxidación tal como peróxido de hidrógeno), enlaces de éter de sililo (escindible, por ejemplo, por ion fluoruro, ácido o base), o enlaces de carbamato de alilo (escindible, por ejemplo, en presencia de un complejo de paladio). Estos enlaces son capaces de generar al menos un grupo hidroxilo libre después de la escisión química. En una de tales realizaciones, el segundo cebador de extensión comprende o es un cebador P17 descrito en la presente memoria (sec. con núm. de ident.: 6) y el segundo sitio de escisión comprende uno o más enlaces de diol que pueden escindirse por oxidación, por ejemplo, mediante tratamiento con peryodato de sodio. En algunas realizaciones, el enlazador de diol comprende la estructura de Fórmula (VIII) o (VIIIa) como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, el enlazador de azobenceno comprende la estructura de Fórmula (X), (Xa) o (Xb) como se describe en la presente memoria.

Algunas realizaciones de la presente memoria se refieren a un soporte sólido que comprende una pluralidad de polinucleótidos de primera cadena y una pluralidad de polinucleótidos de segunda cadena inmovilizados sobre el mismo, cada polinucleótido de la primera cadena se extiende desde un cebador P5 modificado inmovilizado al soporte sólido, el cebador P5 modificado que comprende un primer sitio de escisión; cada polinucleótido de la segunda cadena se extiende desde un cebador P7 inmovilizado al soporte sólido, el cebador P5 comprende un segundo sitio de escisión; en donde tanto el primer como el segundo polinucleótidos de cadena se inmovilizan en el soporte sólido en su extremo 5', y en donde el primer sitio de escisión puede someterse a escisión química mediante un complejo Pd o un complejo de Ni, tal como un complejo Pd(0) o un complejo de Ni(0). En algunas realizaciones, el primer sitio de escisión comprende un nucleósido T modificado que tiene una funcionalidad alilo como se describe en la presente memoria. El sitio de escisión puede incluir además una fracción que puede servir como fracción bloqueante del extremo 3', por ejemplo, un fosfato o una fracción de fosfato modificado, que permanece en los polinucleótidos de la primera cadena después de la reacción de escisión de Pd/Ni para bloquear el 3'-OH de los polinucleótidos de primera cadena inmovilizados escindidos.

En algunas realizaciones del soporte sólido descrito en la presente memoria, el primer y el segundo polinucleótidos de cadena se inmovilizan en el soporte sólido a través de enlaces covalentes con un polímero o recubrimiento de hidrogel sobre una superficie del soporte sólido. En una realización, el recubrimiento de hidrogel o polímero comprende PAZAM. En algunas realizaciones, el hidrogel o el recubrimiento de polímero también se une covalentemente a la superficie del soporte sólido, por ejemplo, mediante reacción con un silano funcionalizado depositado sobre la superficie. En una realización, el silano funcionalizado es un silano derivado de norborneno. En una realización, el soporte sólido comprende o es una célula de flujo.

Superficie de soporte sólido

En algunas realizaciones, la superficie del soporte sólido antes del injerto de cebador comprende ambas regiones recubiertas con moléculas funcionalizadas y regiones inertes sin recubrimientos. En algunas de tales realizaciones, los recubrimientos de moléculas funcionalizadas son recubrimientos de hidrogel o polímero. Las regiones recubiertas pueden comprender sitios reactivos y, por lo tanto, se pueden usar para unir moléculas a través de enlaces químicos u otras interacciones moleculares, tales como hibridación o reacción covalente. En algunas realizaciones, las regiones recubiertas (p. ej., características reactivas, canales, almohadillas, perlas o depresiones) y las regiones inertes (denominadas regiones intersticiales) pueden alternarse para formar un patrón o una cuadrícula. Dichos patrones pueden ser de una o dos dimensiones. En algunas realizaciones, las regiones inertes pueden seleccionarse de regiones de vidrio, regiones de metal, regiones de máscara o regiones intersticiales o combinaciones de las mismas. Alternativamente, estos materiales pueden formar regiones reactivas. La inercia o la reactividad dependerán de la química y los procesos utilizados en el sustrato. En una realización, la superficie del soporte sólido comprende regiones de vidrio. En otra realización, la superficie comprende regiones metálicas.

En algunas realizaciones, un soporte sólido descrito en la presente memoria forma al menos parte de una célula de flujo o está ubicado en una célula de flujo. En algunas de dichas realizaciones, las células de flujo comprenden, además, polinucleótidos unidos a la superficie de soporte sólido a través del recubrimiento de molécula funcionalizada, por ejemplo, un recubrimiento de polímero o hidrogel. En algunas realizaciones, los polinucleótidos están presentes en las células de flujo en grupos de polinucleótidos, en donde los polinucleótidos de los grupos de polinucleótidos se unen a una superficie de la célula de flujo a través del recubrimiento de hidrogel o polímero. En dichas realizaciones, la superficie del cuerpo de la célula de flujo a la que se unen los polinucleótidos se considera el soporte sólido. En otras realizaciones, se inserta en el cuerpo de la célula de flujo un soporte sólido separado que tiene una superficie recubierta con hidrogel o polímero. En realizaciones preferidas, la célula de flujo es una cámara de flujo que está dividida en una pluralidad de carriles o una pluralidad de sectores, en donde uno o más de la pluralidad de carriles o la pluralidad de sectores comprende una superficie que está recubierta con un recubrimiento de hidrogel o polímero unida covalentemente descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones de las células de flujo descritas en la presente memoria, los polinucleótidos unidos dentro de un único grupo de polinucleótidos tienen la misma secuencia de nucleótidos o una similar. En algunas realizaciones de las células de flujo descritas en la presente memoria, los polinucleótidos unidos de diferentes grupos de polinucleótidos tienen secuencias de nucleótidos diferentes o no similares. Las células de flujo y los sustratos ilustrativos para la fabricación de células de flujo que se pueden usar en el método o la composición expuestos en la presente memoria incluyen, aunque no de forma limitativa, los disponibles en el mercado en illumina, Inc. (San Diego, CA) o descritos en la publicación estadounidense n.° 2010/0111768 A1 y 2012/0270305.

PAZAM

Una realización del recubrimiento de hidrogel o polímero de la superficie de soporte sólido comprende PAZAM, un copolímero de poliacrilamida comprende las siguientes dos unidades de repetición:

En algunas realizaciones, PAZAM es un polímero lineal. En algunas otras realizaciones, PAZAM es un polímero ligeramente reticulado. El PAZAM puede funcionalizarse o modificarse para su uso en una composición o método expuesto en la presente memoria. La preparación de PAZAM y análogos de la misma se describe en la Patente estadounidense n°. 9.012.022.

Grupos bloqueantes 3'

Durante los ciclos de SBS, para garantizar que solo se produzca una única incorporación, se añade una modificación estructural (“ grupo protector” ) a cada nucleótido marcado que se añade a la cadena de crecimiento para asegurar que solo se incorpore un nucleótido. Después de que se ha añadido el nucleótido con el grupo protector, el grupo protector se elimina, en condiciones de reacción que no interfieren con la integridad del ADN que se secuencia. El ciclo de secuenciación puede continuar con la incorporación del siguiente nucleótido marcado protegido.

Para ser útil en la secuenciación de ADN, los nucleótidos y, más habitualmente, los nucleótidos trifosfatos, generalmente requieren un grupo protector 3'-hidroxi para evitar que la polimerasa usada para incorporarlo a una cadena polinucleotídica continúe con la replicación una vez que se añade la base en el nucleótido. Existen muchas limitaciones en los tipos de grupos que pueden añadirse a un nucleótido y aún ser adecuados. El grupo protector debe evitar que se añadan moléculas de nucleótidos adicionales a la cadena de polinucleótidos mientras que simultáneamente se puede retirar fácilmente de la fracción de azúcar sin causar daño a la cadena de polinucleótido. Además, el nucleótido modificado debe ser tolerado por la polimerasa u otra enzima apropiada usada para incorporarlo a la cadena de polinucleótidos. Por lo tanto, el grupo protector ideal exhibe estabilidad a largo plazo, se incorpora eficientemente por la enzima polimerasa, causa el bloqueo de la incorporación de nucleótidos secundaria o adicional y tiene la capacidad de eliminarse en condiciones moderadas que no causan daños a la estructura polinucleotídica, preferiblemente en condiciones acuosas.

Se han informado previamente grupos protectores reversibles. Por ejemplo, Metzker y col., (Nucleic Acids Research, 22 (20): 4259-4267, 1994) describe la síntesis y el uso de ocho 2-desoxirribonucleósido 5'-trifosfatos modificados en 3' (dNTP modificados en 3') y las pruebas en dos ensayos de molde de ADN para la actividad de incorporación. El documento WO 2002/029003 describe un método de secuenciación que puede incluir el uso de un grupo protector de alilo para cubrir el grupo 3'-OH en una cadena de crecimiento de ADN en una reacción de polimerasa. Otros grupos protectores reversibles y métodos de desprotegerlos en condiciones compatibles con ADN incluyen azidometilo o un grupo azidometilo modificado, que se describen en las Publicaciones de Solicitud Internacional n°. WO 2004/018497 y WO 2014/139596.

Una realización del grupo bloqueante 3'-OH descrito en la presente memoria es un grupo fosfato, que puede eliminarse por una fosfatasa.

Marcadores detectables

Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren al uso de marcadores detectables. La detección se puede llevar a cabo mediante cualquier método adecuado, que incluye espectroscopía de fluorescencia o por otros medios ópticos. El marcador preferido es un fluoróforo, que, después de la absorción de energía, emite radiación a una longitud de onda definida. Se conocen muchos marcadores fluorescentes adecuados. Por ejemplo, Welch y col. (Chem. Eur. J. 5(3):951-960, 1999) describe fracciones fluorescentes funcionalizadas con dansilo que pueden usarse en la presente invención. Zhu y col. (Cytometry 28:206-211, 1997) describe el uso de los marcadores fluorescentes Cy3 y Cy5, que también se pueden usar en la presente invención. Los marcadores adecuados para su uso también se describen en Prober y col. Science 238:336-341 (1987); Connell y col. (BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge y col. (Nucl. Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) y Smith y col. (Nature 321:674, 1986). Otros marcadores fluorescentes disponibles comercialmente incluyen, aunque no de forma limitativa, fluoresceína, rodamina (que incluye TMR, textos como rojo y Rox), alexa, bodipy, acridina, cumarina, pireno, benzantraceno y cianinas.

En algunas realizaciones, el marcador detectable puede usarse en el primer sitio de escisión de un polinucleótido que es capaz de experimentar escisión de Pd en los métodos y el soporte sólido descrito en la presente memoria. En particular, el primer sitio de escisión puede comprender un nucleótido o nucleósido modificado marcado. Este enfoque puede agilizar adicionalmente el flujo de trabajo de fabricación de Illumina actualmente. En una realización, el cebador P5 modificado con alilo descrito en la presente memoria puede modificarse para incluir un marcador fluorescente que permite la cuantificación directa de la reacción de injerto inmediatamente después de que se completa, al eliminar el requisito de un ensayo de hibridación separado para realizar tal etapa de cuantificación.

Enlazadores para marcador detectable

En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, la nucleobase del nucleótido o nucleósido modificado puede unirse a un marcador detectable como se describió anteriormente. En algunas de tales realizaciones, los enlazadores usados son escindibles. El uso de un enlazador escindible asegura que el marcador pueda, si es necesario, eliminarse después de la detección, evitar cualquier señal interferente con cualquier nucleótido o nucleósido marcado incorporado posteriormente.

En algunas otras realizaciones, los enlazadores usados son no escindibles. Dado que en cada caso donde se incorpora un nucleótido marcado de la invención, no es necesario incorporar nucleótidos posteriormente y, por lo tanto, el marcador no necesita eliminarse del nucleótido.

Los enlazadores escindibles son conocidos en la técnica, y la química convencional puede aplicarse para unir un conector a una base de nucleótidos y un marcador. El enlazador puede ser escindido por cualquier procedimiento adecuado, que incluye exposición a ácidos, bases, nucleófilos, electrófilos, radicales, metales, agentes reductores u oxidantes, luz, temperatura, enzimas, etc. El enlazador como se analiza en la presente memoria también puede escindirse con el mismo catalizador usado para escindir el enlace de grupo protector 3'-O. Los enlazadores adecuados pueden adaptarse a partir de grupos protectores químicos estándar, como se describe en Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons. Otros enlazadores escindibles adecuados usados en la síntesis en fase sólida se describen en Guillier y col. (Chem. Rev. 100:2092-2157, 2000).

El uso del término “ enlazador escindible” no pretende implicar que se requiera eliminar el enlazador completo de,p. ej.,la base de nucleótido. Cuando el marcador detectable se une a la base, el sitio de escisión de nucleósidos puede ubicarse en una posición en el enlazador que asegura que parte del enlazador permanece unida a la base de nucleótidos después de la escisión.

Cuando el marcador detectable se une a la base, el enlazador puede unirse en cualquier posición sobre la base de nucleótidos siempre que aún pueda llevarse a cabo el apareamiento de bases de Watson-Crick. En el contexto de las bases de purina, se prefiere si el enlazador se une a través de la posición 7 de la purina o el análogo de deazapaurina preferido, a través de una purina modificada 8, a través de una adenosina modificada N-6 o una guanina modificada con N-2. Para pirimidinas, la unión es preferiblemente a través de la posición 5 en citosina, timidina o uracilo y la posición N-4 en citosina.

En algunas realizaciones, el enlazador puede consistir de la funcionalidad similar a la del grupo protector 3'-OH. Esto hará que los procesos de desprotección sean más eficientes, ya que solo se requerirá un solo tratamiento para eliminar tanto el marcador como el grupo protector. Los enlazadores particularmente preferidos son enlazadores que contienen azida escindibles con fosfina.

Métodos de escisión

Pueden usarse diversos métodos de escisión escindiendo una o ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico bicatenario en la etapa de linealización, por ejemplo, para la escisión de los polinucleótidos de la segunda cadena descritos en la presente memoria. Las realizaciones preferidas pero no limitativas de métodos de escisión adecuados se discuten con más detalle a continuación.

A) Escisión química

El término “ escisión química” abarca cualquier método que utilice un reactivo no nucleico y un reactivo químico no enzimático para promover/lograr la escisión de una o ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico bicatenario. Si se requiere, una o ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico bicatenario pueden incluir una o más fracciones químicas no nucleotídica y/o nucleótidos no naturales y/o enlaces de cadena principal no naturales para permitir una reacción de escisión química en un sitio de escisión específico, preferentemente un sitio de escisión predeterminado. En una realización no limitativa, una cadena de la molécula de ácido nucleico bicatenario puede incluir un enlace diol que permite la escisión por tratamiento con peryodato (p. ej., peryodato de sodio). El enlace diol puede colocarse en un sitio de escisión, cuya ubicación precisa puede seleccionarse por el usuario. Se apreciará que se podría incluir más de un diol en el sitio de escisión.

Las unidades de enlazador de diol basadas en fosforamidita con química adecuada para su incorporación en cadenas de polinucleótidos son comercializadas por Fidelity Systems, Inc. (Gaithersburg, MD, EE. UU.). Se pueden incorporar una o más unidades de diol en un polinucleótido mediante el uso de métodos estándar para la síntesis automatizada de ADN químico. Para colocar el enlazador de diol a una distancia óptima del soporte sólido, se pueden incluir una o más moléculas espaciadoras entre el enlazador de diol y el sitio de unión al soporte sólido. La molécula espaciadora puede ser una fracción química no nucleotídica. Las unidades espaciadoras adecuadas basadas en química de fosforamidita para su uso junto con enlazadores de diol también son suministradas por Fidelity Systems, Inc. El enlazador de diol se escinde por tratamiento con un “ agente de escisión” , que puede ser cualquier sustancia que promueva la escisión del diol. El agente de escisión preferido es peryodato, preferentemente peryodato de sodio acuoso (NaIO4). Después del tratamiento con el agente de escisión (p. ej., peryodato) para escindir el diol, el producto escindido puede tratarse con un “ agente de protección” para neutralizar las especies reactivas generadas en la reacción de escisión. Los agentes de protección adecuados para este propósito incluyen aminas, tales como etanolamina. Ventajosamente, el agente de protección (p. ej., etanolamina) puede incluirse en una mezcla con el agente de escisión (p. ej., peryodato) de manera que las especies reactivas se protejan tan pronto como se formen.

La combinación de un agente de unión y escisión de diol (p. ej., peryodato) para lograr la escisión de una cadena de una molécula de ácido nucleico bicatenario se prefiere para la linealización de moléculas de ácido nucleico en hidrogeles de poliacrilamida soportados en sólidos porque el tratamiento con peryodato es compatible con la integridad de ácido nucleico y con la química de la superficie de hidrogel. Sin embargo, el método de diol también puede usarse para la linealización de ácidos nucleicos inmovilizados en otras superficies, que incluyen soportes recubiertos con silanos funcionalizados.

En una realización adicional, la cadena a escindir (o el cebador de amplificación del que se deriva esta cadena si se prepara mediante amplificación en fase sólida) puede incluir un grupo disulfuro que permite la escisión con un agente reductor químico, por ejemplo, clorhidrato de Tris (2-carboxietil)-fosfato (TCEP).

B) Escisión de sitios abásicos en una molécula bicatenaria

Un “ sitio abásico” se define como una posición de nucleósido en una cadena de polinucleótidos a partir de la cual se ha retirado el componente base. Los sitios básicos pueden ocurrir naturalmente en el ADN en condiciones fisiológicas mediante hidrólisis de residuos de nucleósidos, pero también pueden formarse químicamente en condiciones artificiales o por la acción de enzimas. Una vez formados, los sitios abásicos pueden escindirse (p. ej., mediante tratamiento con una endonucleasa u otra enzima de escisión monocatenaria, exposición al calor o álcali), al proporcionar un medio para la escisión específica del sitio de una cadena polinucleotídica.

En una realización no limitativa, puede crearse un sitio abásico en una posición predeterminada en una cadena de un polinucleótido bicatenario y a continuación escindirse incorporando primero desoxiuridina (U) en un sitio de escisión predeterminado en la molécula de ácido nucleico bicatenario. Esto se puede lograr, por ejemplo, al incluir U en uno de los cebadores usados para la preparación de la molécula de ácido nucleico bicatenario mediante amplificación por PCR en fase sólida. La enzima uracilo ADN glicosilasa (UDG) se puede usar para eliminar la base de uracilo, al generar un sitio abásico en una cadena. La cadena polinucleotídica que incluye el sitio abásico puede escindirse entonces en el sitio abásico mediante tratamiento con endonucleasa (p. ej., endonucleasa EndoIV, AP liasa, FPG glicosilasa/AP liasa, EndoVIII glicosilasa/AP liasa), calor o álcali.

Pueden usarse sitios básicos para generar una fracción 3'-hidroxilo libre para actuar como cebador de secuenciación. Si ambos cebadores de amplificación se modifican de tal manera que pueden escindirse secuencialmente, la segunda escisión puede usarse para escindir la primera cadena de la superficie. El primer (o segundo) cebador podría contener una base de uracilo, que puede ser escindida por una enzima (UDG), y el segundo (o primer) cebador podría contener una base de 8-oxo-guanina que puede ser escindida por una segunda enzima ortogonal, FPG glicosilasa. La segunda escisión del sitio abásico podría usarse para dejar un cebador de secuenciación unido a una superficie, de manera que una base G se incorpore como el primer ciclo de secuenciación, o las cadenas dúplex escindidas pueden desnaturalizarse para permitir la hibridación de un cebador de secuenciación en solución.

C) Escisión de ribonucleótidos

La incorporación de uno o más ribonucleótidos en una cadena polinucleotídica que de otro modo está compuesta por desoxirribonucleótidos (con o sin fracciones químicas no nucleotídicas adicionales, bases no naturales o enlaces de cadena principal no naturales) puede proporcionar un sitio para la escisión mediante el uso de un agente químico capaz de escindir selectivamente el enlace fosfodiéster entre un desoxirribonucleótido y un ribonucleótido o mediante el uso de una ribonucleasa (ARNasa). Por lo tanto, la invención también abarca la producción de moldes de secuenciación por escisión de una cadena (de una molécula de ácido nucleico bicatenario) en un sitio que contiene uno o más ribonucleótidos consecutivos usando dicho agente de escisión química o una ARNasa. Preferentemente, la cadena a escindir contiene un solo ribonucleótido para proporcionar un sitio predeterminado para la escisión química.

Los agentes de escisión química adecuados capaces de escindir selectivamente el enlace fosfodiéster entre un desoxirribonucleótido y un ribonucleótido incluyen iones metálicos, por ejemplo iones metálicos de tierras raras (especialmente La3+, particularmente Tm3+, Yb3+ o Lu3+ (Chen y col, Biotechniques, 2002, 32: 518-520; Komiyama y col. Chem. Commun. 1999, 1443- 1451)), Fe(3) o Cu(3), o exposición a pH elevado, por ejemplo, tratamiento con una base tal como hidróxido de sodio. Por “ escisión selectiva del enlace fosfodiéster entre un desoxirribonucleótido y un ribonucleótido” se entiende que el agente de escisión química no es capaz de escindir el enlace fosfodiéster entre dos desoxirribonucleótidos en las mismas condiciones. La composición base del ribonucleótido o ribonucleótidos generalmente no es crucial, pero puede seleccionarse para optimizar la escisión química (o enzimática). A modo de ejemplo, generalmente se prefiere rUMP o rCMP si la escisión debe llevarse a cabo por exposición a iones metálicos, especialmente iones metálicos de tierras raras.

Típicamente, el o los ribonucleótidos se incorporarán en una cadena de la molécula de ácido nucleico bicatenario, y pueden situarse en una región de la misma que es monocatenaria cuando las dos cadenas complementarias de la molécula bicatenaria están hibridadas (es decir, en una porción sobresaliente 5'). En particular, si la molécula de ácido nucleico bicatenario se prepara mediante amplificación por PCR en fase sólida usando cebadores de amplificación directa e inversa, uno de los cuales contiene al menos un ribonucleótido, las enzimas de ADN polimerasa estándar usadas para la amplificación por PCR no son capaces de copiar moldes de ribonucleótidos. Por lo tanto, los productos de la reacción de PCR en fase sólida contendrán una región 5' sobresaliente que comprende el o los ribonucleótidos y cualquier resto del cebador de amplificación aguas arriba del o de los ribonucleótidos.

El enlace fosfodiéster entre un ribonucleótido y un desoxirribonucleótido, o entre dos ribonucleótidos también puede ser escindido por una ARNasa. Cualquier ribonucleasa endocítica de especificidad de sustrato apropiada puede usarse para este propósito. Si el o los ribonucleótidos están presentes en una región que es monocatenaria cuando las dos cadenas complementarias de la molécula bicatenaria están hibridadas (es decir, en una porción sobresaliente 5'), entonces la ARNasa será una endonucleasa que tiene especificidad para cadenas individuales que contienen ribonucleótidos. Para la escisión con ribonucleasa, se prefiere incluir dos o más ribonucleótidos consecutivos, y preferentemente de 2 a 10 o de 5 a 10 ribonucleótidos consecutivos. La secuencia precisa de los ribonucleótidos generalmente no es crucial, excepto que ciertas ARNasas tienen especificidad para la escisión después de ciertos residuos. Las ARNasas adecuadas incluyen, por ejemplo, ARNasa A, que escinde después de los residuos C y U. Por lo tanto, cuando se escinde con ARNasa A el sitio de escisión debe incluir al menos un ribonucleótido que es C o U.

Los polinucleótidos que incorporan uno o más ribonucleótidos pueden sintetizarse fácilmente mediante el uso de técnicas estándar para la síntesis química de oligonucleótidos con precursores de ribonucleótidos apropiados. Si la molécula de ácido nucleico bicatenario se prepara mediante amplificación de ácido nucleico en fase sólida, entonces es conveniente incorporar uno o más ribonucleótidos en uno de los cebadores a usar para la reacción de amplificación.

D) Escisión fotoquímica

El término “ fotoescisión” o “ escisión fotoquímica” abarca cualquier método que utilice energía lumínica para lograr la escisión de una o ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico bicatenario. Un sitio predeterminado para la escisión fotoquímica puede proporcionarse por una unidad de espaciador químico no nucleotídica en una de las cadenas de la molécula bicatenaria. Los espaciadores fotoquímicos adecuados incluyen la fosforamidita espaciadora de PC (4-(4,4'-Dimetoxitritiloxi)butiramidometil)-1-(2-nitrofenil)-etil]-2-cianoetil-(N,N-diisopropil)-fosforamidita) suministrada por Glen Research, Sterling, Virginia, EE. UU. La unidad separadora puede escindirse mediante exposición a una fuente de luz UV. Esta unidad espaciadora puede unirse al extremo 5' de un polinucleótido, junto con un grupo tiofosfato que permite la unión a una superficie sólida, usando técnicas estándar para la síntesis química de oligonucleótidos. Convenientemente, esta unidad espaciadora puede incorporarse en un cebador de amplificación directo o inverso para usarse para la síntesis de una molécula de ácido nucleico bicatenario fotoescindible mediante amplificación en fase sólida.

E) Tapones de PCR

En otra realización, el ácido nucleico bicatenario se puede preparar mediante amplificación en fase sólida usando cebadores directos e inversos, uno de los cuales contiene un “tapón de PCR” . Un “tapón de PCR” es cualquier fracción (nucleotídica o no nucleotídica) que evita la lectura de la polimerasa usada para la amplificación, de manera que no pueda copiar más allá de ese punto. El resultado es que las cadenas amplificadas derivadas por extensión del cebador que contienen el tapón de PCR contendrán una porción sobresaliente 5'. Este saliente 5' (distinto del propio tapón de PCR) puede comprender desoxirribonucleótidos naturales, con enlaces de cadena principal predominantemente naturales, es decir, puede ser simplemente un tramo de ADN monocatenario. Después, la molécula puede escindirse en la región sobresaliente 5' con el uso de un reactivo de escisión (p. ej., una enzima) que es selectiva para la escisión del ADN monocatenario pero no de ADN bicatenario, por ejemplo, nucleasa de frijol mung.

El tapón de PCR puede ser esencialmente cualquier fracción que evite la lectura de la polimerasa a usar para la reacción de amplificación. Los tapones de PCR adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, hexaetilenglicol (HEG), sitios abásicos y cualquier nucleótido no natural o modificado que evite la lectura de la polimerasa, incluyendo análogos de ADN tales como ácido nucleico peptídico (PNA).

Pueden introducirse sitios abásicos estables durante la síntesis de oligonucleótidos químicos mediante el uso de unidades espaciadoras apropiadas que contienen el sitio abásico estable. A modo de ejemplo, los espaciadores abásicos de furano (5'-O-Dimetoxitilil-1', 2'-Dioxiribosa-3'-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita) comercializados por Glen Research, Sterling, Virginia, EE. UU., pueden incorporarse durante la síntesis de oligonucleótidos químicos para introducir un sitio abásico. Por lo tanto, tal sitio puede introducirse fácilmente en un cebador oligonucleotídico para usarse en la amplificación en fase sólida. Si se incorpora un sitio abásico en el cebador de amplificación directo o inverso, el producto de amplificación resultante tendrá un saliente 5' en una cadena que incluirá el sitio abásico (en forma monocatenaria). A continuación, el sitio abásico monocatenario puede escindirse por la acción de un agente químico adecuado (p. ej., exposición a álcali) o una enzima (p. ej., AP-endonucleasa VI, Shida y col., Nucleic Acids Research, 1996, Vol.24, 4572-4576).

F) Escisión de enlazadores peptídicos

También puede introducirse un sitio de escisión en una cadena de la molécula de nucleico bicatenario preparando una estructura de conjugado en la que una molécula peptídica está unida a una cadena de la molécula de ácido nucleico. La molécula peptídica puede ser escindida posteriormente por una enzima peptidasa de la especificidad apropiada, o cualquier otro medio adecuado de escisión química no enzimática o fotoquímica. Típicamente, el conjugado entre péptido y ácido nucleico se formará uniendo covalentemente un péptido a una cadena solo de la molécula de ácido nucleico bicatenario, conjugando la porción peptídica al extremo 5' de esta cadena, adyacente al punto de unión a la superficie sólida. Si el ácido nucleico bicatenario se prepara mediante amplificación en fase sólida, el conjugado peptídico puede incorporarse en el extremo 5' de uno de los cebadores de amplificación. Obviamente, el componente peptídico de este cebador no se copiará durante la amplificación por PCR; por tanto, el producto de amplificación “ puenteado” incluirá un “ saliente” de péptido 5' escindible en una cadena.

Los conjugados entre péptidos y ácidos nucleicos en los que el péptido se conjuga con el extremo 5' del ácido nucleico se puede preparar usando técnicas generalmente conocidas en la técnica. En una técnica de este tipo, los componentes de péptido y ácido nucleico de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos deseadas pueden sintetizarse por separado, p. ej., mediante técnicas estándar de síntesis química automatizada, y a continuación conjugarse en solución acuosa/orgánica. A modo de ejemplo, el sistema OPeC™ comercializado por Glen Research se basa en la “ ligación nativa” de un péptido funcionalizado con tioesterasa N-terminal a un oligonucleótido 5'-cisteinilo. El sbenciltiosuccinato de pentafluorofenilo se usa en la etapa de acoplamiento final en el conjunto de péptido en fase sólida basado en Fmoc estándar. La desprotección con ácido trifluoroacético genera, en solución, péptidos sustituidos con un grupo S-benciltiosuccinilo N-terminal. Se usa O-trans-4-(N-a-Fmoc-S-terc-butilsulfenil-1-cisteinilo)aminociclohexil O-2-cianoetil-N, N-diisopropilfosforamidita en la etapa de acoplamiento final en el conjunto de oligonucleótido de fase sólida de fosforamidita estándar. La desprotección con solución acuosa de amoniaco genera en solución los oligonucleótidos funcionalizados con 5'-S-terc-butilsulfenil-L-cisteinilo. El terminal tiobenzoílo del péptido modificado se convierte en el análogo tiofenilo mediante el uso de tiofenol, mientras que el oligonucleótido modificado se reduce usando el tris(carboxietil)fosfina. El acoplamiento de estos dos intermedios, seguido de la etapa de “ ligación nativa” , conduce a la formación del conjugado oligonucleótido-péptido.

La cadena conjugada que contiene péptido y ácido nucleico puede unirse covalentemente a un soporte sólido mediante el uso de cualquier técnica de enlace covalente adecuada conocida en la técnica que es compatible con la superficie elegida. Por ejemplo, la unión covalente a una superficie de hidrogel de poliacrilamida soportada por sólidos puede lograrse mediante la inclusión de un grupo tiofosfato en el extremo “ libre” del componente peptídico (es decir, el extremo no conjugado con el ácido nucleico). Si la estructura del péptido/conjugado de ácido nucleico es un cebador de amplificación para usarse para la amplificación por PCR en fase sólida, la unión al soporte sólido debe dejar libre el extremo 3' del componente de ácido nucleico.

El componente peptídico puede diseñarse para ser escindible por cualquier enzima peptidasa elegida, de las cuales muchos se conocen en la técnica. La naturaleza de la peptidasa no está particularmente limitada, es necesario solo que la peptidasa se escinda en algún lugar en el componente peptídico. Similarmente, la longitud y la secuencia de aminoácidos del componente peptídico no está particularmente limitada, excepto por la necesidad de ser “ escindible” por la peptidasa elegida.

La longitud y la secuencia precisa del componente de ácido nucleico tampoco están particularmente limitadas, puede ser de cualquier secuencia deseada. Si el componente de ácido nucleico debe funcionar como un cebador en la PCR en fase sólida, entonces su longitud y secuencia de nucleótidos se seleccionarán para permitir el apareamiento con el molde a amplificar.

Desnaturalización

En cualquier realización del método utilizado para la escisión, el producto de la reacción de escisión puede someterse a condiciones de desnaturalización para eliminar la o las partes de la o las cadenas escindidas que no están unidas al soporte sólido. Las condiciones de desnaturalización adecuadas resultarán evidentes para el lector experto con referencia a protocolos de biología molecular convencionales (Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Current Protocols, eds Ausubel y col.). La desnaturalización (y posterior rehibridación de las cadenas escindidas) da como resultado la producción de un molde de secuenciación que es parcial o sustancialmente monocatenario. A continuación puede iniciarse una reacción de secuenciación mediante hibridación de un cebador de secuenciación con la parte monocatenaria del patrón.

En otras realizaciones, la secuenciación puede iniciarse directamente después de la etapa de escisión sin necesidad de desnaturalización para eliminar una parte de la(s) cadena(s) escindida(s). Si la etapa de escisión genera un grupo hidroxilo 3' libre en una cadena escindida aún hibridada con una cadena complementaria, entonces la secuenciación puede proceder desde este punto usando una enzima polimerasa de desplazamiento de cadena sin la necesidad de una etapa de desnaturalización inicial. En particular, la secuenciación de desplazamiento de cadena puede usarse junto con la generación de moldes por escisión con endonucleasas de mellado, o por hidrólisis de un sitio abásico con endonucleasa, calor o tratamiento alcalino.

Métodos de secuenciación

En algunas realizaciones, el soporte sólido y los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido. En dichas realizaciones, el método puede comprender las etapas de (a) poner en contacto una polinucleótido polimerasa con grupos de polinucleótidos deslinealizados unidos a una superficie de un sustrato (p. ej., a través de uno cualquiera de los recubrimientos de polímero o gel descritos en la presente memoria); (b) proporcionar nucleótidos a la superficie del sustrato de manera que se genere una señal detectable cuando la polinucleótido polimerasa utiliza uno o más nucleótidos; (c) detectar señales en uno o más polinucleótidos unidos (o una o más agrupaciones producidas a partir de los polinucleótidos unidos); y (d) repetir las etapas (b) y (c), lo que de este modo determina una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido unido a sustrato.

La secuenciación de ácidos nucleicos puede usarse para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido mediante diversos procesos conocidos en la técnica. En un método preferido, se utiliza la secuenciación por síntesis (SBS) para determinar una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido unido a una superficie de un sustrato (p. ej., a través de uno cualquiera de los recubrimientos poliméricos descritos en la presente memoria). En dicho proceso, se proporcionan uno o más nucleótidos a un polinucleótido molde que está asociado a una polinucleótido polimerasa. La polinucleótido polimerasa incorpora uno o más nucleótidos en una cadena de ácido nucleico recién sintetizada que es complementaria al molde de polinucleótido. La síntesis se inicia a partir de un cebador oligonucleotídico que es complementario a una porción del polinucleótido molde o a una porción de un ácido nucleico universal o no variable que está unido covalentemente a un extremo del polinucleótido molde. A medida que los nucleótidos se incorporan contra el polinucleótido molde, se genera una señal detectable que permite determinar qué nucleótido se ha incorporado durante cada etapa del proceso de secuenciación. De esta forma, se puede generar la secuencia de un ácido nucleico complementario a al menos una porción del polinucleótido molde, lo que permite la determinación de la secuencia de nucleótidos de al menos una porción del polinucleótido molde.

Las células de flujo proporcionan un formato conveniente para albergar una matriz que se produce mediante los métodos de la presente descripción y que se somete a secuenciación por síntesis (SBS) u otra técnica de detección que implica el suministro repetido de reactivos en ciclos. Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de SBS, uno o más nucleótidos marcados, ADN polimerasa, etc., pueden fluir hacia/a través de una célula de flujo que aloja una matriz de ácidos nucleicos fabricada mediante métodos expuestos en la presente memoria. Pueden detectarse aquellos sitios de una serie en los que la extensión del cebador provoca que se incorpore un nucleótido marcado. Opcionalmente, los nucleótidos pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que finalice la extensión adicional del cebador una vez que se haya añadido un nucleótido a un cebador. Por ejemplo, a un cebador se le puede añadir un análogo de nucleótido que tenga una fracción de terminación reversible, de modo que no se pueda producir la extensión posterior hasta que se suministre un agente desbloqueante para eliminar la fracción. Por lo tanto, para realizaciones que usan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la célula de flujo (antes o después de que se produzca la detección). Los lavados pueden llevarse a cabo entre los diversos pasos de suministro. El ciclo puede repetirse a continuación n veces para extender el cebador en n nucleótidos, detectando de esta manera una secuencia de longitud n. Los procedimientos de SBS, sistemas fluídicos y plataformas de detección ilustrativos que pueden adaptarse fácilmente para su uso con una matriz producida por los métodos de la presente memoria se describen, por ejemplo, en Bentley y col., Nature 456:53-59 (2008), documento WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082.

En algunas realizaciones del método descrito anteriormente que emplean una célula de flujo, hay presente solo un tipo único de nucleótido en la célula de flujo durante una única etapa de flujo. En dichas realizaciones, el nucleótido se puede seleccionar del grupo que consiste en dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos. En otras realizaciones del método descrito anteriormente que emplean una célula de flujo, hay presente una pluralidad de tipos diferentes de nucleótidos en la célula de flujo durante una única etapa de flujo. En dichos métodos, los nucleótidos se pueden seleccionar de dATP, dCTP, dGTP, dTTP y análogos de los mismos.

La determinación del nucleótido o nucleótidos incorporados durante cada etapa de flujo para uno o más de los polinucleótidos unidos al recubrimiento de polímero sobre la superficie de sustrato presente en la célula de flujo se logra mediante la detección de una señal producida en o cerca del molde de polinucleótido. En algunas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la señal detectable comprende una señal óptica. En otras realizaciones, la señal detectable comprende una señal no óptica. En dichas realizaciones, la señal no óptica comprende un cambio en el pH en o cerca de uno o más de los moldes de polinucleótidos.

Las aplicaciones y usos de los sustratos de la presente memoria se han ejemplificado en la presente memoria con respecto a ácidos nucleicos. Sin embargo, se entenderá que pueden unirse otros analitos a un sustrato expuesto en la presente memoria y analizarse. Uno o más analitos pueden estar presentes en o sobre un sustrato de la presente memoria. Los sustratos de la presente memoria son particularmente útiles para la detección de analitos, o para llevar a cabo reacciones sintéticas con analitos. Por lo tanto, cualquiera de una variedad de analitos que deben detectarse, caracterizarse, modificarse, sintetizarse o similares pueden estar presentes en o sobre un sustrato expuesto en la presente memoria. Los analitos ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, ácidos nucleicos (p. ej., ADN, ARN o análogos de los mismos), proteínas, polisacáridos, células, anticuerpos, epítopos, receptores, ligandos, enzimas (p. ej., quinasas, fosfatasas o polimerasas), fármacos farmacológicos de molécula pequeña o similares. Un sustrato puede incluir múltiples especies diferentes de una biblioteca de analitos. Por ejemplo, las especies pueden ser anticuerpos diferentes de una biblioteca de anticuerpos, ácidos nucleicos que tienen diferentes secuencias de una biblioteca de ácidos nucleicos, proteínas que tienen diferente estructura y/o función de una biblioteca de proteínas, fármacos candidatos a partir de una biblioteca combinatoria de moléculas pequeñas y similares.

En algunas realizaciones, los analitos se pueden distribuir a características sobre un sustrato de manera que sean individualmente resolubles. Por ejemplo, una sola molécula de cada analito puede estar presente en cada característica. Alternativamente, los analitos pueden estar presentes como colonias o poblaciones de manera que las moléculas individuales no se resuelvan necesariamente. Las colonias o poblaciones pueden ser homogéneas con respecto a contener solo una sola especie de analito (aunque en múltiples copias). Tomando los ácidos nucleicos como ejemplo, cada característica sobre un sustrato puede incluir una colonia o población de ácidos nucleicos y cada ácido nucleico en la colonia o población puede tener la misma secuencia de nucleótidos (ya sea monocatenaria o bicatenaria). Dichas colonias pueden crearse mediante amplificación de grupos o amplificación de puente como se expone anteriormente en la presente memoria. Múltiples repeticiones de una secuencia diana pueden estar presentes en una sola molécula de ácido nucleico, tal como un concatémero creado usando un procedimiento de amplificación por círculo rodante. Por lo tanto, una característica sobre un sustrato puede contener múltiples copias de una sola especie de un analito. Alternativamente, una colonia o población de analitos que están en una característica puede incluir dos o más especies diferentes. Por ejemplo, uno o más pocillos en un sustrato pueden contener cada uno una colonia mixta que tiene dos o más especies de ácido nucleico diferentes (es decir, moléculas de ácido nucleico con diferentes secuencias). Las dos o más especies de ácido nucleico en una colonia mixta pueden estar presentes en cantidades no despreciables, por ejemplo, al permitir que se detecte más de un ácido nucleico en la colonia mixta.

Ejemplos

Se describen otras realizaciones con más detalle en los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones.

Protocolo general de preparación de superficie

Silanización de células de flujo de HiSeq® limpias

Las células de flujo funcionalizadas con norborneno se producen mediante un método de Deposición Química de Vapor (CVD, por sus siglas en inglés) mediante el uso de una cámara de silanización YES (Yield Engineering Systems) o un desecador. Típicamente, el proceso de CVD se realiza a 60 °C durante períodos entre 1-24 h.

Acoplamiento de PAZAM

La célula de flujo silanizada puede recubrirse e injertarse usando múltiples opciones de herramientas. Por ejemplo, se puede usar un sistema de generación de grupos clónicos completamente automatizado para secuenciación de Illumina (comercializado por Illumina) para realizar estas operaciones. En un procedimiento típico, la célula de flujo se lava inicialmente con IPA/H<2>O (1:1; 100 pl/min, 2 min). A continuación, se enjuaga con agua desionizada a través de los canales (100 pl/min, 2 min). Se prepara una alícuota de una solución de PAZAM al 0,5 % en peso (ac.) (suficiente para 8 canales). El polímero fluye hacia los canales (100 pl/min, 2 min). La etapa de acoplamiento de PAZAM se completa durante 1 h a 60 °C. Después de completar esta etapa, los canales se purgan con agua en la lectura para la siguiente etapa de injerto. Después de completar las etapas de recubrimiento de polímero, la célula de flujo puede almacenarse a 4 °C en regulador (p. ej., regulador de solución salina-citrato de sodio (SSC)). Alternativamente, la etapa de injerto se puede completar inmediatamente después del recubrimiento con PAZAM.

Injerto de células de flujo recubiertas de PAZAM y OC

Este protocolo describe el procedimiento para injertar una célula de flujo de HiSeq® usando un sistema cBot (ILMN). El procedimiento de injerto proporcionó una superficie de célula de flujo donde el cebador oligo de secuencia P5 modificado con alilo y el cebador de secuencia P7 modificado con diol se unen covalentemente a la superficie de PAZAM en aproximadamente una relación 1:1. Se prepara una mezcla típica de injerto siguiendo el procedimiento estándar de illumina y depende de la concentración de cebador a usar. La concentración de cebador típica empleada es de aproximadamente 1-20 pM, las densidades de cebador dirigidas entre 20-250000 unidades (recuentos de fluorescencia). La etapa de<q>C se realiza después del procedimiento de Illumina estándar mediante el uso de un sistema de cBot antes de la formación de imágenes en un escáner de pizarra de Typhoon (de fluorescencia).

Después de QC, los canales de la célula de flujo se purgan con 5 x SSC (60 pl/min, volumen total = 300 pl/célula de flujo) para eliminar el hidróxido de sodio (usado para realizar la etapa de deshibridación).

Después, la célula de flujo injertada se almacena a 4 °C antes de su uso en procesos bioquímicos posteriores (agrupamiento, secuenciación).

Ejemplo 1

En este ejemplo, se usó un oligonucleótido modificado que comprende un análogo de nucleósido de timina modificado como sitio específico para ser escindido eficientemente por reactivos químicos en condiciones biológicas sin interferir con las propiedades de emparejamiento dúplex y las propiedades de extensión de PCR.

En particular, el oligonucleótido contiene un único nucleósido T modificado con un grupo vinilo unido en la posición 5'-C. Cuando se trata con una solución de Na<2>PdCLo (PdallCl)<2>y THP en regulador acuoso (al generarin situun complejo de paladio (0)), el oligonucleótido se escindió en la posición T modificada con el oligo más corto resultante que contenía un grupo fosfato en el extremo 3'. Esta reacción se ilustra en el Esquema 1 a continuación, en donde Nu representa un nucleófilo.

La síntesis de la fosforamidita de nucleosido T modificada se describe en el Esquema 2. El material de partida esta disponible comercialmente. La mayoría de las etapas de reacción dieron >70 % de rendimiento. También se informó un excelente rendimiento del oligonucleótido de ADN final que comprende el nucleósido T modificado.

Esquema 2.

S

5'-O-dimetoxitritil-timidina-3'-O-TBDPS (2).5'-O-dimetoxitritil-timidina(1)(15 g, 1 eq., 27,54 mmol) se secó a alto vacío durante 1 h. Se añadió DCM anhidro (300 ml) bajo N<2>. A esta solución se le añadió primero imidazol (4,69 g, 2,5 eq., 69 mmol) como un sólido y a continuación difenilsililcloruro de t-butilo (9,1 ml, 1,3 eq, 35,8 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo N<2>a ta durante 1 h. La finalización de la reacción se verificó mediante TLC. La reacción se inactivó con solución sat. de NaHCO3 (100 ml) y se agitó durante 5 min. Se añadió DCM (100 ml) a la mezcla de reacción y la capa acuosa se extrajo con DCM 2 veces. La fase orgánica se lavó con NaHCO3 sat. (200 ml) y a continuación con salmuera (200 ml). Después de secar los extractos orgánicos combinados sobre MgSO4, el solvente se eliminó al vacío y se secó muy bien al vacío para dar2como una espuma blanca/ligera. El Compuesto2se usó crudo en la siguiente etapa.LC-MS(ES y CI): (-ve) M/z 782 (M-H+), (-ve) M/z 817 (M+Cl- ).RMN de 1 H (CDC13) ó0,99 (s, 9H, tBu), 1,27 (s, 3H, Me), 1,96-2,06 (m, 1H, H-2'), 2,25 - 2,35 (m, 1H, H-2'), 2,80 (dd, J = 4, 12 Hz, 1H, H-5'), 3,15 (dd, J = 4, 12 Hz, 1H, H-5'), 3,71 (s, 6H, OMe), 3,96-4,01 (m, 1H, H-4'), 4,45 - 4,50 (m, 1H, H-3'), 6,42 (dd,J= 8, 12 Hz, 1H, H-1'), 6,79-6,72 (m, 4H, aromáticos), 7,68-7,00 (m, 24H, aromáticos+CH), 8,01 (s, 1H, NH).

3'-0-TBDPS-timidina (3).5'-O-dimetoxitritil-Timidin-3'-O-TBDPS bruto(2)(27,54 mmol como máximo) se disolvió en MeOH anhidro (300 ml) bajo N<2>. Se añadió TFA (10 % en vol, 30 ml) y la reacción se agitó a ta bajo N<2>durante 2 h 30 min. La finalización de la reacción fue seguida por TLC. La reacción se inactivó cuidadosamente con NaHCO3 sat. (200 ml) y se agitó a ta durante 10 min. MeOH se eliminó al vacío. La mezcla residual se diluyó con DCM (300 ml) y se repartió con NaHCO3 sat. La fase acuosa se extrajo dos veces con DCM, a continuación las fases orgánicas se lavaron con NaHCO3 sat., se secó con MgSO4 y se concentró al vacío. El material bruto se purificó en columna (Biotage, 100 g Ultra-Si, PE/EtOAc) para dar el compuesto3como espuma blanca (13,15 g, 99 %).LC-MS(ES y CI): (-ve) m/z 479 (M-H+), (+ve) m/z 481 (M+H+),RMN de1H (dsDMSO)ó 1,46 (s, 9H, tBu), 2,15 (s, 3H, Me), 2,35-2,53 (m, 2H, H2'), 3,57-3,67 (m, 1H, H5'), 3,77-3,87 (m, 1H, H5'), 4,30-4,36 (m, 1H, H4'), 4,80-4,86 (m, 1H, H3'), 5,41 (t, J= 5,2 Hz, 1H), 6,72 (dd, J= 8,7, 5,7 Hz, 1H), 7,82-7,94 (m, 6H, aromáticos+CH), 8,00-8,05 (m, 5H, aromáticos), 11,73 (s, 1H, NH).

Síntesis alternativa del Compuesto (3). 5'-O-dimetoxitritil-timidina (1, 40 g, 73,4 mmol) se trató con TBDPSCl (1,3 eq.) e imidazol (2,5 eq.), en DCM (0,127 M) a ta durante 2 h, seguido de PTSA (3 eq.) en metanol (0,097 M) durante 1 h, para proporcionar el compuesto (3) con un rendimiento del 100 % en una preparación en un solo recipiente. No se necesitó ningún tratamiento después de la etapa de sililación, la evaporación del disolvente y las etapas de secado durante la noche se retiraron y la reacción se realizó con exposición al aire. El uso de PTSA en lugar de TFA redujo la reordenación catalizada por ácido de la ribosa del nucleósido de timidina.

3'-0-TBDPS-5'aldehído-timidina (4).3'-O-TBDPS-timidina (3) (5,16 g, 1 eq., 10,75 mmol) se secó bajo un carril de alto vacío durante la noche, así como 4 A MS. Después se añadió DCM anhidro (250 ml) al compuesto3y 4 A MS bajo N<2>y después se enfrió a 4 °C con una carga de hielo. Se añadió peryodano Dess Martin por porción bajo N<2>(3 x 1,823 g, 1,2 eq, 12,9 mmol) y la reacción se agitó a 4 °C bajo N<2>durante 1 h 30 min. La reacción se verificó mediante LCMS. La reacción se dejó calentar a ta y la reacción se agitó bajo N<2>durante 4 h, o hasta completar la reacción. Una vez completada se añadió una solución de Na2SO3 a la reacción (100 ml) y se agitó a ta durante 10 min. Las 2 fases se separaron y la fase acuosa se extrajo 2 veces con DCM. La fase orgánica después se lavó con Na2CO3 y NaHCO3 sat., se secó con MgSO4 y se concentró al vacío. El material bruto se secó a alto vacío durante la noche listo para la siguiente etapa. La coevaporación con tolueno también se puede hacer para mejorar la sequedad.LC-MS(ES y CI): (-ve) m/z 477 (M-H+), (-ve) m/z 513 (M+CL), (+ve) m/z 479 (M+H+), (+ve) m/z 501 (M+Na+); (-ve) m/z 495 (hidrato-H+), (+ve) m/z 519 (hidrato+Na+).

Síntesis alternativa de aldehído(4). El Compuesto (3, 0,5 g) se trató con EDC (3 eq.) y DCA (0,5 eq.) en DMSO a ta durante 6 h para proporcionar el compuesto (4) a través de una oxidación de Pfitner-Mofat, sin sobreoxidación al ácido carboxílico que se observó con el método de peryodinano de Dess-Martin (y requirió la adición de un gran exceso de reactivo de Grignard en la etapa posterior para inactivar el contaminante de ácido carboxílico).

3'-O-TBDPS-5'vinil-timidina (5). 3'-O-TBDPS-5'aldehído-timidina (4)(5,16 g, 1 eq, 10,75 mmol) se secó bajo carril de alto vacío durante toda la noche, así como también con 4A MS. Después se añadió THF anhidro (150 ml) al compuesto3y 4A MS bajo N2. Se añadió una solución de bromuro de vinilmagnesio 1 M en THF (21,5 ml, 2 eq., 21,5 mmol) muy lentamente a ta durante 30 min. La reacción se agitó a ta bajo N<2>durante 2 h, y se comprobó mediante LCMS. Si es necesario, se puede añadir algo de bromuro de vinil magnesio extra gota a gota (0,3 eq, 3,22 ml) y la reacción se agitó durante 1 h adicional. Una vez completada una solución de AcOH 1 M en agua (60 ml, pH=6) se añadió a la reacción y se agitó a ta durante 10 min. La reacción se diluyó con DCM y las 2 fases se separaron. La fase acuosa se extrajo 2 veces con DCM. A continuación, las fases orgánicas se lavaron 2 veces con NaHCO3 sat., se secó con MgSO4 y se concentró al vacío. El residuo se purificó en columna (Biotage, 100 g kpSi, PE/EtOAc) para dar el compuesto 5 como una espuma de crema (2,01 g, 37 % en 2 etapas).LC-MS(ES y CI): (-ve) m/z 505 (M-H+), (-ve) m\z 541 (M+Cf), (+ve) m/z 507 (M+H+).RMN de1H (400 MHz, Cloroformo-d)ó 1,01 (d,J= 10,1 Hz, 9H, tBu), 1,80 (s, 3H, Me), 2,02 - 2,22 (m, 2H, H2'), 3,48-3,54 (m, 0,6H, H5'), 3,81 (t,J= 2,2 Hz, 0,6H, H4'), 3,97-4,02 (m, 0,4H, H4'), 4,13-4,22 (m, 0,4H, H5'), 4,33-4,50 (dm, 1H, H3'), 4,82-5,17 (m,2H,CH2=CH-),5,24-5,43 (m, 0,4H, CH2=CH-), 5,52 5,75 (m, 0,6H, CH2=CH-), 6,04-6,29 (ddd,J= 21,2, 8,3, 6,0 Hz, 1H, H1'), 7,26-7,46 (m, 7H, Arom CH), 7,50-7,66 (m, 4H, Arom), 8,23 (s, 1H, NH).

Síntesis alternativa de alcohol alílico(5). Se trató aldehído(4)con cloruro de vinilmagnesio (2,5 eq.) en THF a ta para proporcionar el compuesto(5). El uso del reactivo de cloruro en lugar del bromuro redujo la producción de un análogo bromado del producto deseado (14 % en el método anterior) sin la introducción de una variante de cloruro del producto deseado.

3'-O-TBDPS-5'vinil-5'DMT-timidina (6).3'-O-TBDPS-5'viniltimidina (5)(2,01 g, 1 eq., 3,97 mmol) se secó bajo carril de alto vacío durante toda la noche. Se añadió AgNO3 y los sólidos se secaron a alto vacío durante otros 30 min. Se añadió DCM anhidro bajo N<2>a la reacción, a continuación colidina (1,05 ml, 2 eq, 7,94 mmol) y finalmente DMT-Cl (2,02 g, 1,5 eq, 5,96 mmol) como un sólido. La reacción se agitó a ta bajo N<2>durante 3 h; Se verificó la finalización mediante TLC (PE/EtOAc, 6:4 1 % NEt3). Después, la reacción se diluyó con DCM y se filtró sobre celite y el sólido se lavó con más DCM. A continuación, la solución se repartió con H<2>SO<4>al 1 % (60 ml) y se extrajo con DCM. Las fases orgánicas se lavaron 2 veces con NaHCO3 sat., se secaron sobre MgSO4 y se concentraron al vacío para dar el producto bruto6como una espuma. Se usará sin purificación adicional en la siguiente etapa.LC-MS(ES y CI): (-ve) m/z 807 (M-H+), (+ve) m/z 809 (M+H+).

Procedimiento alternativo: Una solución del compuesto(5,6,7 g, 13,2 mmol) y 2,3,5-colimidina en DCM anhidro se secaron durante 30 min en tamices moleculares. Después, la solución resultante se añadió a un matraz que contenía cloruro de 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo (6,7 g) y tamices moleculares. Se añadió AgNO3 y la reacción se agitó durante 1 h. La mezcla resultante se diluyó con DCM (40 ml) y se filtró a través de tierra de diatomeas, se enjuagó con DCM (3 x 40 ml). Se añadió MeOH (240 ml) al filtrado y la mezcla se agitó durante 10 min, después se transfirió a un embudo de decantación, se lavó con NaHCO3 sat. ac. (2 * 400 ml), se secó (Na2SO4), y se concentró al vacío para dar el producto bruto como una espuma amarilla.

5,Vinil-5'DMT-timidina (7). 3,-O-TBDPS-5,alil-5,DMT-timidina (6)(1 eq, 3,97 mmol de la etapa anterior) se secó en carril de alto vacío. Se añadió THF anhidro (12 ml) bajo N<2>y se enfrió a 4 °C. Se añadió gota a gota una solución de TBAF 1 M en THF (4,37 ml, 1,1 eq., 4,37 mmol) a 4 °C. Después de 5 min a 4 °C, la reacción se dejó calentar a ta y se agitó bajo N<2>durante 3 h. La finalización de la reacción fue seguida por TLC (PE/EtOAc, 3:7 1 % de NEt). La reacción se diluyó con EtOAc y se repartió con NaHCO3 sat. La fase acuosa se extrajo con EtOAc, a continuación la fase orgánica se lavó con NaHCO3 sat., después salmuera, se secó sobre MgSO4 y se concentró al vacío. El residuo se purificó en columna (Biotage, 25 g KpSi, PE/EtOAc 1 % NEt) para dar el compuesto7como una espuma blanca (1,81 g, 80 % en 2 etapas).LC-MS(ES y CI): (-ve) m/z 569(M-H+), (+ve) m/z 571(M+H+).RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6)ó 1,46 (s, 1H, Me), 1,65 (s, 2H, Me), 1,97-2,13 (m, 2H, H2'), 3,64 (m, 1H, H4'), 3,85 (dd,J=8,0, 4 Hz, 0,4 H, H'5), 3,92 (dd,J=8.0, 4 Hz, 0,6H, H5'), 4,31-4,45 (m, 1H, H3'), 4,55-4,86 (m, 2H,CH=CH2-),5,27 (dd,J=7,4, 4,8 Hz, 1H, OH), 5,52-5,71 (m, 1H, CH=CH2-), 6,11 (dt, J=8,1, 5,8 Hz, 1H, H1'), 6,86 (dd,J=8, 4 Hz, 4H, Arom.), 7,13 7,35 (m, 7H, Arom. CH), 7,40-7,50 (m, 3H, Arom.), 11,35 (s, 1H).

5'Vinil-5'DMT-Hispirimidina-fosforamidita (8). 5'Vinil-5'DMT-timidina(800 mg, 1,4 mmol) se secó en carril de alto vacío. Se añadió DCM anhidro (7 ml) bajo N<2>y se agitó con tamices moleculares durante 10 min a ta. A la solución, se le añadió base de Hunig (0,74 ml, 4,2 mmol) y se siguió de 2-cianoetil N, N-diisopropilcloroamidita (407 ul, 0,52 mmol). La reacción se agitó a ta bajo N<2>durante 3 h. La finalización de la reacción fue seguida por TLC (PE/EtOAc, 4:6). La reacción se concentró al vacío. El residuo se purificó en columna (Biotage, 25GKpSi, PE/EtOAc 1 % NEt<3>) para dar el compuesto8como una espuma blanca (930 mg).LC-MS(ES y CI): (-ve) m/z 770(M-H+), (+ve) m/z 771(M+H+).RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6)ó 0,96-1,27 (m, 21H), 1,50 (d,J= 5,9 Hz, 1H), 1,66 (s, 3H), 2,02-2,37 (m, 3H), 2,58-2,74 (m, 2H), 2,78 (td,J =5,8, 3,9 Hz, 1H), 3,46-3,69 (m, 6H), 3,76-3,93 (m, 2H), 3,96-4,10 (m, 2H), 4,61 (ddd,J= 17,5, 14,2, 8,6 Hz, 2H), 4,68-4,98 (m, 3H), 5,43-5,79 (m, 1H), 6,04 (dt,J= 9,6, 5,1 Hz, 1H), 6,13 (dt,J= 10,7, 6,9 Hz, 0H), 6,85 (ddt,J=8,2, 5,2, 2,4 Hz, 6H), 7,09-7,34 (m, 11H), 7,34-7,50 (m, 4H), 11,37 (d,J=6,1 Hz, 1H). 31P NMR (162 MHz, DMSO)ó147,94, 147,16, 147,03.

Análisis de eficiencia de escisión

La eficiencia de escisión se evaluó en una superficie de alta densidad de cebador PAZAM (40- 60 k). Una célula de flujo de HiSeq® (sin diseño) se preparó siguiendo los procedimientos estándar descritos en la presente memoria. Se depositó silano derivado de norborneno sobre la superficie del sustrato usando el método de CVD, seguido de acoplamiento de clic del polímero (PAZAM) a la superficie del sustrato seguido de un segundo procedimiento de acoplamiento de clic para injertar la superficie del polímero con los oligos P7 modificados que contenían el análogo de nucleósido de alilo T (5'-Alkyne-TTTTTTTTTXCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT (sec. con núm. de ident.:5), donde X indica el sitio donde se incorporó el nucleósido T modificado descrito anteriormente).

Los oligos P7 modificados se injertaron en la célula de flujo de PAZAM con una densidad similar a los oligos P7 estándar. La eficiencia del injerto para el oligo P7 modificado también fue similar a los oligos P5 y P7 funcionalizados con 5' estándar. La superficie de la célula de flujo se trató con 1 mM de Na2PdCl4, 10 mM de THP en la mezcla de incorporación de 1 x EA (que contiene etanol amina 50 mM-HCl (pH 9,9), NaCl 50 mM y 0,05 % de Chaps) a 60 °C durante 10 min. El ensayo TET-QC se usó para demostrar la escisión exitosa de los oligos P5 modificados con alilo T de la superficie después del tratamiento con el complejo de Pd(0) generadoin situ.

LaFigura 2Ailustra la imagen de Typhoon de la superficie de la célula de flujo antes y después del tratamiento de Pd(0). LaFigura 2Bmuestra el cambio en la densidad del cebador antes y después del tratamiento con Pd(0), al comparar la superficie de la célula de flujo tratada con los oligos P5 modificados con el control estándar. En los intervalos de densidad de cebador bajo y de densidad del cebador alto, la superficie de la célula de flujo tratada con Pd(0) injertada con los oligos P5 modificados indicó cambios sustanciales en la intensidad fluorescente. Los resultados sugirieron una escisión muy eficiente (-95 %, ensayo de fluorescencia) mediante el uso de este método. En comparación, la superficie de célula de flujo con oligo P5 estándar no mostró mucha variación en la intensidad fluorescente, lo que indica que los oligos P5 estándar no fueron escindidos por el complejo de Pd(0).

Análisis de resultados de ejecución de secuenciación

La capacidad del nucleósido de alilo T modificado descrito anteriormente para someterse a una escisión efectiva se analizó adicionalmente al realizar una ejecución de secuenciación corta. En este experimento, las células de flujo se fabricaron siguiendo un método similar descrito anteriormente. Por lo tanto, el oligo alquino P5 modificado con alilo-T y un oligo de alquino P7 estándar se injertaron sobre células de flujo recubiertas con PAZAM a varias densidades de cebador de superficie. Para garantizar una resíntesis eficiente, la posición de la modificación de alilo se desplazó más hacia el extremo 3' del oligo P5 modificado. La secuencia de los cebadores de injerto usados para la fabricación de células de flujo SBS se describe como sigue:

P5: 5'-Aquino-TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAGAXCTACAC (sec. con núm. de ident.: 5)

P7: 5'-Alquino-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-oxo G)AT (sec. con núm. de ident.: 4)

X= modificación alilo, como se describe en el Esquema 1.

Las condiciones típicas de escisión implican incubar la superficie de injerto de alilo-P5 con una solución de Na2PdCl4/THP a 60 °C durante 10 min. Las superficies de PAZAM tratadas con Pd(0) fueron estables en estas condiciones y pueden pasar para respaldar varios cientos de ciclos de secuenciación. Además, no se detectaron otras reacciones secundarias y la posterior escisión del oligo P7, como se determinó indirectamente por la resíntesis de PET, no se ve afectada confirma la ortogonalidad y especificidad del enfoque de alilo.

LaFigura 3Aes un gráfico de barras que demuestra los resultados del ensayo de control de CC de la superficie de colorante TET (TET-QC) de una célula de flujo de densidad de imprimación alta sin patrón. En los canales 1-4, la superficie se injertó con oligos P5 modificados con alilo y oligos P7 estándar. En los canales 5-8, la superficie se injertó con oligos estándar P5/P7. Los resultados fueron comparables entre los oligos P5 modificados y estándar. LaFigura 3Bilustra la imagen de Typhoon de la superficie de la célula de flujo después del TET-QC descrito en laFigura 3A.

Nuevamente, no se identificó ninguna diferencia visible entre los canales ya que ambos no mostraron ninguna señal detectable. Los datos preliminares sugirieron que no hay una diferencia particular entre los oligos P5 modificados y los oligos P5 estándar en términos de densidad de agrupamiento.

También se observó que la solución de escisión que contiene Na2PdCl4/THP fue estable cuando se almacenó a temperatura ambiente durante varios días y todavía se pueden usar mezclas envejecidas para escindir los oligos P5 modificados con alilo.

Ejemplo 2

En este ejemplo, el método de Pd(0) linealización y el método de escisión de diol descritos en la presente memoria se ensayaron en un nuevo tipo de célula de flujo injertada con cebadores P15/P17 y se recolectaron datos de secuenciación en un MiSeq®(configurado como un instrumento de 2 canales) y se compararon con la célula de flujo estándar injertada con cebadores P5/P7 y se usó la linealización enzimática descrita en laFigura 1.Tanto la nueva célula de flujo como la célula de flujo estándar se recubrieron con polímero de PAZAM, y la densidad del cebador en la superficie estaba dirigida a ser aproximadamente 200K para ambos tipos de cebadores.

La secuenciación se realizó para ambas células de flujo con mezcla de incorporación NovaSeq™ y la formación de imágenes se realizaron a 20 °C. Antes de cada etapa de linealización (Lectura 1 y Lectura 2), las células de flujo fueron exo-tratadas para eliminar cualquier exceso de cebadores de superficie no utilizados. Para los cebadores de superficie estándar (P5/P7) se realizó la linealización en la Lectura 1 con enzima USER (LMX1) a 38 °C durante 20 min de incubación y en la Lectura 2 con enzima FpG a 40 °C durante 20 min de incubación. Para los nuevos cebadores de superficie P15/P17 se realizó la linealización en la Lectura 1 con una mezcla de paladio que contenía THP y ascorbato de sodio (6 mM/60 mM/6 mM) a 60 °C durante 2 min de incubación y en la Lectura 2 con una mezcla de peryodato de sodio a 20 °C durante 10 min. La biblioteca secuenciada presentada en esos datos es PhiX, y las ejecuciones fueron 2 x 151 ciclos. Los resultados de la secuenciación se resumen en la tabla a continuación.

Los datos de secuenciación sugieren que la linealización química asistida por Pd(0) funcionó bien en la secuenciación y las métricas primarias son muy similares en comparación con las normas. El filtro que aprueba grupos (% PF), el ajuste de fase/preajuste de fase, el % de alineación son equivalentes tanto para los cebadores de superficie P5/P7 como P15/P17. El % de error fue ligeramente mayor en la Lectura 1 para la célula de flujo injertada con P15/P17 pero aún fue bastante favorable (como se muestra enFigura 4) y la célula de flujo a la variación de célula de flujo también puede producirse. El % de tasa de error en la lectura 2 es comparable. Además, el tiempo requerido para la linealización disminuye en 2 veces para la Lectura 2 y en 10 veces para la Lectura 1 cuando se usa el nuevo tipo de célula de flujo.

Ejemplo 3

En este Ejemplo, el nucleósido de alilo T descrito en el Ejemplo 1 puede marcarse adicionalmente con un marcador detectable (es decir, un marcador fluorescente) para agilizar más el flujo de trabajo de fabricación de Illumina actual. Una vez que el tinte de alilo T marcado con colorante se incorpora en los oligos P5, permite la cuantificación directa de la reacción de injerto inmediatamente después de la finalización. En el proceso actual, esta etapa se realiza como un ensayo de hibridación separado.

La reacción de escisión de Pd(0) usando el nucleótido T modificado marcado con colorante se ilustra en el Esquema 3, usando métodos sintéticos análogos a los descritos en los ejemplos anteriores.

En este ejemplo, se preparó un reactivo enlazador de diol como se muestra en el Esquema 4. El método mejora sobre la síntesis descrita en la patente estadounidense n°. 8,715,966.

Diol-1. El presente método elimina DMF como disolvente en la síntesis de Diol-1. La DMF complica las extracciones acuosas debido a la formación de emulsiones y la división indeseable de producto en la fase acuosa, y en el proceso informado anteriormente, su eliminación antes de la elaboración fue lenta. La mezcla de DMF/<d>C<m>anterior se reemplazó con EtOAc, lo que redujo el tiempo de proceso de 3 días a 1-2 días (incluida la cromatografía). Además, la formación del producto secundario bis-tritililado disminuyó el rendimiento en el método anterior. Cambio del orden de adición de reactivos de la adición en porciones de DMTr-Cl sólido a una mezcla de hexanodiol/DIPEA a la adición gota a gota de DIPEA líquido a una mezcla de hexanodiol/DMTr-Cl mejoró la selectividad de la reacción para el producto deseado en aproximadamente 10 %. En algunas realizaciones, el producto de esta reacción puede usarse en bruto, sin cromatografía para eliminar el DMTr-OH y el producto lateral bis-tritililado.

Diol-3 . El método de oxidación anterior usando TPAP/cat. NMO condujo a la sobreoxidación al ácido carboxílico correspondiente y necesitaron hasta 3-4 días. Aquí, TPAP/NMO se reemplazó con TEMPO/blanqueador en una mezcla bifásica de DCM y NaHCO3 ac. El blanqueador se añadió gota a gota a una mezcla de los reactivos restantes, y la reacción se completó una vez que se realizó la adición de blanqueador. El producto se aisló mediante extracción acuosa, con mínima oxidación y rendimientos de 66-92 %, y un proceso general más rápido (1,5 días). En otras realizaciones, la síntesis de Diol-3 y Diol-4 se puede expandir para eliminar la etapa de cromatografía intermedia. El exceso de tBuOK puede ser necesario para neutralizar cualquier material de ácido carboxílico en el material de partida.

Diol-2 . El método anterior para la síntesis de Diol-2 incluyó un reflujo de 48 h con algunas manipulaciones a 36 h para asegurar la reacción completa. El aumento de la concentración de reacción permitió una reducción en el tiempo de reflujo de 48 h a 12-24 h. En el protocolo anterior, el Diol-2 en bruto se extrajo en agua. Se requirió la eliminación del agua (ya que la etapa posterior es sensible a la humedad), lo que consume mucho tiempo. La etapa se mejoró mediante extracción Diol-2 en DCM y se lavó con NaHCO3 ac. para eliminar cualquier ácido acético y minimizar el tiempo de eliminación de solvente. El tiempo general del proceso disminuyó de 3 días a 2 días. El producto se almacenó como una solución madre en DCM. La solución se almacenó sobre tamices moleculares 3A durante la noche antes de la reacción de Diol-4.

Alternativamente, Diol-2 puede hidrolizarse al alcohol correspondiente para simplificar la purificación. El alcohol se usaría en la etapa posterior para proporcionar Diol-4 directamente.

Diol-5 . Se retiró la etapa de purificación por cromatografía, ahorrando 1 día en el tiempo de proceso. Además, la DMF puede cambiarse a DCM para mejorar la eficiencia del proceso al permitir una disminución en los volúmenes de solución de disolvente/lavado durante el tratamiento acuoso.

Diol-6 . La etapa de purificación por cromatografía se puede eliminar.

Diol-7 . La síntesis de Diol-7 implica dos procesos expandidos, esterificación y desililación usando TBAF. En el proceso previamente informado, se observó una migración significativa de 1,4-acetilo durante la desililación con TBAF, lo que condujo a la formación de cantidades significativas del producto secundario no deseado, Diol-7M:

Diol-7M

Este material redujo los rendimientos globales y la pureza de Diol-7. Además, el transporte de Diol-7M a la etapa posterior produjo Diol-8M, con la fosforamidita en el alcohol secundario en lugar de primario. La incorporación en un cebador daría como resultado un enlazador no escindible. En el presente método, la etapa de TBAF se reguló con AcOH para eliminar el NaOH no deseado a partir de lotes comerciales de TBAF. Demasiado AcOH conduce a la pérdida del grupo protector DMTr. La reacción se ejecutó con 1,75 eq. de AcOH y se premezcló con TBAF y AcOH antes de la exposición del material de partida. Además, el método anterior incluyó la evaporación de THF antes del trabajo; el método actual eliminó esa etapa de evaporación e incluyó una neutralización cuidadosa de la fase acuosa a pH 7 para reducir la degradación inducida por la base del producto. Finalmente, se ha retirado la purificación cromatográfica después de la etapa de esterificación.

Alternativamente, los procedimientos sintéticos Diol-5 a Diol-7 pueden plegarse, lo que elimina etapas adicionales de cromatografía. En resumen, el proceso puede ejecutarse para incluir tres etapas de cromatografía en lugar de seis, y el material crudo se purificaría en las etapas Diol-4, Diol-7 y Diol-8.

EJEMPLO 5

Este ejemplo describe la síntesis de un monómero de A-TOM, una fracción de fosfato 3' modificado que sirve como un grupo protector de hidroxilo. (TOM = tri-isopropilsililoximetilo)

Etapa 1. Benzosilación de la adenosina de DMT (A-OBz)

Se mezclaron N6-Benzoil-2'-desoxi-5'-ODMT-D-adenosina (11,2 g, 17 mmol) y solvente (mezcla de pmdina/DCM en relación 1:3, 11 ml de piridina, 33 ml de DCM) a temperatura ambiente para dar una solución. El matraz de reacción se enfrió a 0 °C y se añadió DMAP (0,41 g, 3,41 mmol) y cloruro de benzoilo (3,9 g (3,2 ml), 34,1 mmol). Se agitó mientras se calentaba hasta temperatura ambiente durante la noche (control por TLC del progreso de la reacción), lo que dio como resultado una mezcla de color naranja muy pálido con algo de precipitado sólido blanco. El solvente se eliminóin vacuoa temperatura <40 °C. El residuo se diluyó con AcOEt (~500 ml), se lavó dos veces con bicarbonato de sodio acuoso saturado (2 x 250 ml), agua (250 ml) y se secó sobre MgSO4. Después de la evaporación de los disolventes y una coevaporación con tolueno, se obtuvo una espuma blanca y se secóin vacuoa un peso constante. El material se usó en la siguiente etapa sin purificación.

Etapa 2. Destritilación (A-OH).

Se disolvió A-OBz (13,69 g, no purificado, 17 mmol) en una mezcla de diclorometano/metanol (1:1, 300 ml) y se enfrió a 0 °C bajo nitrógeno. Se añadió ácido trifluoroacético (2,75 ml, 36 mmol) a través de una jeringa. Se agitó la reacción mientras se calentaba hasta temperatura ambiente durante una hora. El progreso de la reacción supervisado por TLC. Se inactivó la reacción a 0 °C mediante la adición de NaHCO3 sólido (3 g, 36 mmol). Se eliminó el disolventein vacuoa temperatura <40 °C y el residuo se diluyó con AcOEt (~800 ml) y se lavó cinco veces con agua (5 x 250 ml). Se secó la capa orgánica sobre MgSO4, se filtró y secóin vacuopara producir una espuma blanca. La purificación por cromatografía en columna (elución en gradiente con éter de petróleo/acetato de etilo 1:1 a acetato de etilo) proporcionó el producto diana como un polvo blanco. (5,0 g, 60 % de rendimiento (2 etapas),Rf= 0,35 en acetato de etilo al 100 %) RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 811,25 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,07 (ddt, J= 10,1, 7,0, 1,4 Hz, 4H), 7,75 7,68 (m, 1H), 7,68-7,62 (m, 1H), 7,62-7,51 (m, 4H), 6,64 (dd,J=8,6, 5,9 Hz, 1H), 5,68 (dt,J= 6,1, 1,9 Hz, 1H), 5,28 (t,J= 5,7 Hz, 1H), 4,31 (td,J= 4,4, 1,8 Hz, 1H), 3,72 (tdd,J= 11,8, 6,4, 4,7 Hz, 2H), 3,19 (ddd,J= 14,4, 8,7, 6,1 Hz, 1H), 2,75 (ddd,J= 14,1, 5,9, 1,8 Hz, 1H).

E tapa 3. O x ida c ió n

Una solución de A-OH (1,0 g, 2,18 mmol) en diclorometano (50 ml) que contiene tamices moleculares (4 A) se enfrió a 0 °C bajo gas nitrógeno. En un matraz separado, se disolvió peryodinano de Dess-Martin (1,11 g, 2,61 mmol) en diclorometano (10 ml) sobre tamices moleculares. La solución de Dess-Martin se añadió a A-OH y se dejó calentar a temperatura ambiente. La reacción se monitoreó por LCMS y después de una hora la reacción se inactivó con una solución saturada de bicarbonato de sodio. La mezcla inactivada se diluyó con diclorometano (~250 ml) y se lavó con solución de bicarbonato sódico (100 ml) y agua (2x 100 ml). Se secó la capa orgánica sobre MgSO4, se filtró y secóin vacuopara producir una espuma blanca que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

Etapa 4. Reacción de Wittig (A-CH=CH?).

Se mezcló bromuro de metiltrifenilfosfonio (5,83 g, 16 mmol) con THF seco (40 ml) en un matraz de fondo redondo de dos bocas secado al horno que contenía barra de agitación, tamices moleculares y línea de nitrógeno. Un cuello del matraz retuvo ferc-butóxido de potasio en un tubo de adición de sólido. La solución se enfrió a 0 °C. Se añadió tercbutóxido de potasio girando el tubo de adición en la junta, al permitir que el sólido caiga en la solución de agitación sin exposición al aire o a abrir el sistema. La solución se volvió de blanco turbio a amarillo. Se agitó a 0 °C durante una hora. Nota: Todos los reactivos sólidos para esta etapa se secaron a alto vacío durante la noche en presencia de pentóxido de fósforo. Las jeringas, agujas, barras de agitación, tamices moleculares activados también se secaron en el mismo tanque.

El sólido amarillo se añadió a una solución de A-CHO (2,5 g, 5,44 mmol) en THF (15 ml) a 0 °C a través de una aguja de calibre ancho y una jeringa. El color cambió de amarillo a naranja. Se agitó a 0 °C durante tres horas, se controló mediante LCMS.

La reacción se completó al verter la mezcla de reacción en un matraz que contenía agua (300 ml) y AcOEt (300 ml) en un vaso de precipitados de 1 l a 0 °C. Se agitó durante diez minutos antes de transferirla a un embudo de decantación. Se lavó la fase orgánica con solución saturada de bicarbonato de sodio (3x 100 ml) y salmuera (100 ml). Se secó la capa orgánica sobre MgSO4, se filtró y secóin vacuopara producir una espuma marrón amarillenta. La purificación por cromatografía en columna (elución en gradiente con diclorometano a metanol al 5 %/DCM) proporcionó el producto diana como una espuma amarilla cremosa. (2,59 g, Rf = 0,53 en MeOH al 5 %/DCM) RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 611,21 (s, 1H), 8,77 (s, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,05 (d,J= 7,2 Hz, 2H), 7,65 (t,J= 7,4 Hz, 1H), 7,57 (q,J= 7,9, 7,3 Hz, 3H), 6,50 (t,J= 6,7 Hz, 1H), 6,06 (ddd,J= 17,2, 10,4, 6,7 Hz, 1H), 5,55 (d,J= 4,4 Hz, 1H), 5,29-5,10 (m, 2H), 4,42 (p,J= 4,2 Hz, 1H), 4,30 (dd,J= 6,7, 3,6 Hz, 1H), 2,94 (dt,J= 13,1, 6,4 Hz, 1H), 2,40 (ddd,J= 13,3, 6,5, 4,3 Hz, 1H).

E tapa 5. O x ida c ió n de d io l (A -O H O H ).

Una solución de A-CH<2>CH<2>(0,68 g, 1,49 mmol) en THF (7 ml) se colocó en un matraz equipado con una barra de agitación y bajo nitrógeno. Se pesó W-óxido de 4-metilmorfolina (0,262 g, 2,235 mmol) como un sólido y se añadió al matraz de reacción. También se añadió agua (7 ml). Se añadió tetróxido de osmio (solución al 4 % en agua, 285 pl, 0,045 mmol) al matraz de reacción. La reacción se calentó a 40 °C durante toda la noche. Se realizó un monitoreo con TLC y LCMS del progreso de la reacción. Se inactivó la reacción al añadir tiosulfato de sodio como un sólido. Se agitó la mezcla durante 30 minutos antes del tratamiento en acetato de etilo (150 ml) y solución de bicarbonato sódico. La capa orgánica se lavó tres veces con solución saturada de bicarbonato de sodio (3x 100 ml). Se secó la capa orgánica sobre MgSO4, se filtró y secóin vacuopara producir un para producir un sólido blanquecino que cristaliza lentamente. La purificación por cromatografía en columna (elución en gradiente con diclorometano a metanol al 10 %/DCM) proporcionó el producto diana como un aceite incoloro. (0.13 g, 19 % de rendimiento, Rf = 0.28 en 5 % MeOH/DCM) RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 611,25 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,73 (s, 1H), 8,07 (ddt,J= 9,6, 7,2, 1,4 Hz, 4H), 7,74 7,68 (m, 1H), 7,68-7,62 (m, 1H), 7,62-7,47 (m, 5H), 6,62 (dd,J= 8,9, 5,8 Hz, 1H), 5,82 (dt,J= 5,8, 1,5 Hz, 1H), 5,48 (d,J= 5,1 Hz, 1H), 4,69 (t,J=5,5 Hz, 1H), 4,31 (dd,J= 5,0, 1,5 Hz, 1H), 3,81 (p,J= 5,3 Hz, 1H), 3,48 (dh,J= 22,3, 5,5 Hz, 2H), 3,18 (ddd,J= 14,4, 9,0, 5,9 Hz, 1H), 2,70 (ddd,J= 14,4, 6,0, 1,5 Hz, 1H).

Etapa 6. Sililación (A-OHTOM).

Una solución de A-OHOH (0,128 g, 0,262 mmol) en DCM se disolvió en DCM (1,5 ml) en un matraz que contenía una barra de agitación y una línea de nitrógeno. Se añadieron dicloruro dedi-tercde butilestaño (80 mg, 0,262 mmol) y W,W-diisopropiletilamina (182 pl, 1,05 mmol) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió cloruro de tri-isopropilsililoximetilo (TOM-Cl, 79 pl, 0,341 mmol) a través de micropipeta. Se realizó un monitoreo con TLC y LCMS del progreso de la reacción. La reacción se dejó durante la noche a temperatura ambiente. El tratamiento de reacción se llevó a cabo en acetato de etilo (200 ml). Se lavó con solución saturada de bicarbonato de sodio (3x 100 ml). Se secó la capa orgánica sobre MgSO4, se filtró y se secó al vacío para producir un aceite amarillo/marrón. La purificación por cromatografía en columna (elución en gradiente con diclorometano a metanol al 8 %/DCM) proporcionó el producto diana como una espuma blanca-blanca (0,14 g, rendimiento del 79 %, Rf = 0,5 en MeOH al 5 %/DCM) RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe) 611,25 (s, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,73-8,65 (m, 1H), 8,06 (tt,J= 7,5, 1,4 Hz, 4H), 7,76-7,62 (m, 2H), 7,62-7,46 (m, 4H), 6,61 (dd,J= 8,9, 5,7 Hz, 1H), 5,82 (d,J= 5,7 Hz, 1H), 5,65 (d,J= 5,3 Hz, 1H), 4,84 (s, 2H), 4,27 (dd,J= 5,4, 1,5 Hz, 1H), 4,06-3,93 (m, 1H), 3,62 (ddd,J= 42,1, 10,3, 5,2 Hz, 2H), 3,22 (ddd,J= 14,7, 9,1, 5,8 Hz, 1H), 2,74-2,65 (m, 1H), 0,94 (m, 21H, TOM).

E tapa 7. T rit ila c ió n (A -T O M -D M T ).

Se colocaron A-OHTOM seco (0,14 g, 0,207 mmol), (cloruro de 4,4'-Dimetoxitrifenilmetilo (DMT-Cl, 0,105 g, 0,311 mmol) y nitrato de plata (53 mg, 0,311 mmol) en un matraz con DCM seco (1,5 ml) y colidina (2,4,6-trimetilpiridina) (55 pl, 0,414 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante tres horas. Se realizó un monitoreo con TLC y LCMS del progreso de la reacción. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (100 ml) y se filtró a través de un embudo de vidrio sinterizado. La solución de DCM se lavó con solución saturada de bicarbonato de sodio (5x 100 ml). La capa de DCM se secó sobre MgSO4, se filtró y secón vacuopara producir un aceite amarillo/marrón. La purificación por cromatografía en columna (elución en gradiente con diclorometano a metanol al 10 %/DCM) proporcionó el producto diana como un aceite amarillo viscoso (0,17 g, rendimiento del 85 %, Fr:-0,46 en 5 % de MeOH /DCM).

Etapa 8 (A-3'OH).

Una solución de A-TOM-DMT (56 mg, 56 pmol) en una mezcla de metanol y THF (4:5, 0,9 ml en total) se enfrió a 0 °C. Se añadió hidróxido de sodio (4M, 0,1 ml, exceso) y se agitó a 0 °C durante 15 minutos. Se supervisó la reacción con TLC y LCMS. La reacción se inactivó usando ácido acético (1 M, 0,5 ml), al asegurar que el pH no caiga por debajo de pH8. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (EA, 100 ml) y se lavó la solución con solución saturada de bicarbonato de sodio (3x 50 ml). Se secó la capa de EA sobre MgSO4, se filtró y se secóin vacuo.El residuo se purificó por cromatografía en columna (elución en gradiente con EA/éter de petróleo (25 %) al 100 % de EA) para dar una espuma blanca (0,02 g, 40 % de rendimiento, Fr:-0,38 en 100 % de EA).

Etapa 9. Formación de fosforamidita (monómero ATOM).

Se colocó A-3'OH (92 mg, 105 pmol) en un matraz que contenía tamices moleculares y una barra de agitación magnética antes de añadir THF (seco, 0,2 ml) a temperatura ambiente bajo gas nitrógeno. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (110 pl, 630 pmol) a la solución de THF. Finalmente, se añadió 2-cianoetil N,N-diisopropilclorofosfoamidita (38 pl, 169 pmol a través de una micropipeta. La reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno. La reacción se monitoreó mediante TLC. Cuando se completó la reacción, se retiró el disolventeinvacuo.El residuo se lavó con éter de petróleo (3x 20 ml) a temperatura ambiente. Después, el residuo se disolvió en DCM y se filtró para eliminar los tamices moleculares. Se secóin vacuode nuevo antes de la purificación por cromatografía en columna (elución en gradiente con EA/éter de petróleo (20 % ) al 75 % de EA) y proporcionó un aceite viscoso incoloro (80 mg, rendimiento del 70 %) RMN de 1H (400 MHz, DMSO-cfe)511,17 (s, 1H), 8,57 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,06-7,99 (m, 2H), 7,64 (td,J=7,1, 1,2 Hz, 1H), 7,58-7,46 (m, 4H), 7,36 (ddd,J= 15,4, 9,0, 2,8 Hz, 4H), 7,29 (t,J= 7,4 Hz, 2H), 7,27-7,17 (m, 1H), 6,92-6,83 (m, 4H), 6,34 (dd,J= 9,0, 5,9 Hz, 1H), 4,78-4,71 (m, 1H), 4,68 (q,J =6,6, 4,6 Hz, 1H), 4,52 (dd,J= 8,5, 4,9 Hz, 1H), 4,27 (d,J= 7,1 Hz, 1H), 3,85-3,69 (m, 8H), 3,62 (dp,J= 10,4, 6,7 Hz, 1H), 3,34-3,22 (m, 1H), 2,78 (td,J= 5,8, 1,9 Hz, 2H), 2,64 (td,J= 8,8, 4,7 Hz, 1H), 2,26-2,16 (m, 1H), 2,08 (d,J= 0,7 Hz, 6H), 1,21 (dd,J= 15,4, 5,6 Hz, 9H), 1,12 (d,J= 6,7 Hz, 6H), 0,99-0,88 (m, 2H), 0,83 (dd,J= 6,3, 4,5 Hz, 18H).

Ejemplo 6

Síntesis de dinucleótido de modelo (C-Tom-A),

Los compuestos C-amidita (125 mg, 0,15 mmol) y A-OH-Tm (64 mg, 0,1 mmol) se secaron sobre P<2>O<5>al vacío durante la noche y se disolvieron en acetonitrilo anhidro (1 ml). Bajo N<2>, se añadió etiltiotetrazol (ETT, 32,5 mg, 0,25 mmol). La mezcla se agitó a ta durante 15 min. TLC y LC-MS indicaron el consumo completo del material de partida A-OH-Tm. La solución de t-BuOOH en decano (5 M, 0,1 ml) y DCM (1 ml) se añadió a la mezcla de reacción y se agitó durante 15 min a ta. La mezcla de reacción se vertió en NaHCO3 ac. y la fase acuosa se extrajo con EtOAc. La fase orgánica combinada se evaporó y se trató con NaOH (0,1 M, 1 ml en H2O/THF/MeOH=1/4/5v/v a ta durante 1h. A continuación, la mezcla se trató con HCl (1 M) en THF/MeOH (5 ml/4 ml) durante 0,5 h. La mezcla de reacción se concentró y se realizó la partición en H<2>O y EtOAc. El producto deseado se recuperó de la fase acuosa y se purificó adicionalmente con RP HPLC (TEAB 0,1 M/CH CH<3>CN).

Estudio de escisión en el compuesto de modelo C-TOM-A,

Se trató una solución madre de C-TOM-A en diversas condiciones de desprotección. El progreso de la reacción se controló mediante RP HPLC. El Intermedio C-A es el compuesto en el que el grupo TOM se ha eliminado de C-TOM-A, pero el enlace de fosfato no se ha escindido. La Tabla 1 a continuación resume los resultados de la desprotección en diversas condiciones de reacción y reactivos de desprotección.

Tabla 1.

Ejemplo 7

En este ejemplo, se describen métodos alternativos para generar complejo de Pd(0) y sus actividades de escisión química se compararon con el complejo de Pd(0)in situgenerado a partir del dímero de cloruro de alil paladio(II) (Pd(C3H5)Cl)2 y THP como se describe en el Ejemplo 1. En contraste con el complejo de Pd(0)in situ,se prepararon algunos precatalizadores de paladio (II) y se aislaron antes de su uso en la reacción de linealización química, por ejemplo, la escisión química del cebador P15. Estos precatalizadores Pd(II) son inactivos en la forma aislada, pero pueden reducirse convenientemente al Pd(0) activoin situen presencia de THP. Estos precatalizadores de Pd alternativos pueden mejorar la estabilidad del producto y la vida útil más prolongada.

Método de preparación

(Pd(C3H5)Cl)2 se disolvió en tetrahidrofurano seco y se desgasificó bajo nitrógeno y se trató con 1 a 10 equivalentes de THP añadido como una solución de tetrahidrofurano. Se observó el deterioro y los aceites se aislaron al decantar el sobrenadante. El material se secó al vacío para obtener aceites viscosos de color amarillo a marrón o naranja. Estos materiales eran altamente solubles en agua. Cuando se añadieron 1 a 2 equivalentes de THP, una mezcla de [Pd(C3H5)(THP)]Cl y [Pd(C3Hs)(THP)2 ]Cl se aisló, ambos de los cuales son complejos de Pd(II). Cuando se añadieron 5 equivalentes de THP, se obtuvo una muestra limpia de [Pd(C3H5)(TEP)2]Cl. Estos dos complejos de Pd(II) se aislaron y caracterizaron. Cuando se añadieron 10 equivalentes de THP, se obtuvo el material Pd(0) que es activo para la linealización P15.

[Pd(C3H5)(THP)]Cl: RMN de 31P (162 MHz, D2O): d 14 ppm. RMN de 13C (101 MHz, D<2>O): d 118,7 (d, J = 5,0 Hz), 81,7 (d, J = 29 Hz), 62,1 (d, J = 15 Hz), 26,5 (s), 20,5 (d, J = 25,0 Hz) ppm. LC-MS: [AlilPd(THP)]+; Esperado: 355 Da, Encontrado: 355 Da.

[Pd(C3H5)(THP)2]Cl: RMN de 31P (162 MHz, D2O): d 10 (s) ppm. RMN de 13C (101 MHz, D<2>O): d 122,7 (t, J = 5,3 Hz), 71,2 (t, J = 14 Hz), 61,8 (t, J = 7,6 Hz), 26,7 (s), 22,1 (t, J = 13 Hz) ppm. LC-MS: [AlilPd(THP)<2>] ; Esperado: 563 Da, Encontrado: 563 Da.

Uso para escisión por P15

Materiales aislados del tratamiento de (Pd(C3H5)Cl)2 con 1, 2, 5 y 10 equivalentes THP se formularon en regulador acuoso a 10 mg/ml. La actividad de estas formulaciones hacia la escisión de P15 se evaluó mediante el uso de un ensayo basado en HPLC. En este ensayo, una solución de cebador P15 (10 pM) se trató con 10 % v/v de cada formulación, se incubó durante 10 minutos a 38 °C, después se inactivó mediante tratamiento con dilución y columna de centrifugación y se analizó por HPLC. El porcentaje de escisión se calcula a partir de la relación de las áreas de pico P15 y del producto de escisión.

Las formulaciones acuosas de [Pd(C3H5)(THP)]Cl y [Pd(C3H5)(TEP)2]Cl (obtenidas de la mezcla (Pd(C3H5)Cl)2 con 1 a 5 equivalentes THP) estaban inactivas para la escisión por P15 en ausencia de otros aditivos. Sin embargo, las formulaciones acuosas de material aisladas a partir de la mezcla (Pd(C3H5)Cl)2 con 10 equivalentes THP proporcionaron una actividad de escisión de P15 comparable a una mezcla de Pd preparadain situde (Pd(C3Hs)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM) y ascorbato de sodio (6 mM). Los resultados se muestran en laFigura 5A.Se observó que los precatalizadores de Pd(II) [Pd(C3H5)(THP)]Cl y [Pd(C3H5)(TEP)2]Cl se activaron convenientementein situo bien durante la preparación o bien en su punto de uso mediante tratamiento con solución acuosa adicional de THP. Se demostró que [Pd(C3H5)(THP)2]Cl se volvió activo cuando se trató con 1 o más equivalentes THP cuando se formulaba en solución acuosa (Pd 12 mM). El rendimiento de escisión P15 excedió el punto de muestra de referencia una mezcla de Pd(0) preparadain situde una mezcla de (Pd(C3H5)Cl)2(6 mM), THP (60 mM) y ascorbato de sodio (6 mM)(Figura 5B).

Ejemplo 8

En este ejemplo, un complejo de Pd(0) Pd(THM)4 aislable alternativo se preparó usando un ligando de fosfina tris(hidroximetil) fosfina (t Hm ). Su actividad de escisión se comparó con el complejo de Pd(0) generadoin situa partir del dímero de cloruro de alil paladio(II) (Pd(C3H5)Cl)2 y THP como se describe en el Ejemplo 1.

Preparación: Pd(THM)4 se preparó y aisló usando el protocolo descrito por Ellis, y col., Inorg. Chem., 1992, 31, 14. Se formuló una solución acuosa a una concentración de 10 mM y su rendimiento se evaluó en relación con el Pd(0) generado in situ usando (Pd(C3H5)Cl)2 (10 mM) y THP (100 mM).

Para demostrar la linealización inducida por Pd(0), la secuenciación se realizó en un instrumento NovaSeq™ usando un linfocito de flujo S4 injertado con cebadores de superficie P15/P7 (2 x 151 con ciclos de indexación duales). Se usó el flujo de trabajo de Xp con bibliotecas nano (carriles 1 y 3) y sin PCR (carriles 2 y 4) (insertos de 450 pb). Antes de leer la química de 1 SBS, la linealización se realizó mediante el uso de una mezcla de Pd compuesta por (Pd(C3Hs)Cl)2 (10 mM), THP (100 mM) y ascorbato de sodio (10 mM) [en los carriles 1-2]; o una solución acuosa de Pd(THM)4 (10 mM) [en los carriles 3-4]. La linealización de la lectura 2 se realizó usando un reactivo que contenía la enzima FpG. Se observó que las métricas de secuenciación fueron generalmente comparables para ambos métodos de linealización de Pd. Las altas intensidades de lectura 1 y porcentaje de resíntesis con Pd(THM)4 indicaron que se logró la linealización exitosa(Figura 6A).Las tasas de error humano y PhiX fueron comparables para ambos métodos(Figura 6B).Los resultados de la secuenciación se resumen en la tabla a continuación (Tabla 2).

Tabla 2.1

Ejemplo 9

En este ejemplo, se describe una ruta alternativa para la preparación del complejo de Pd(0) activo. Pd(THP)2-4 se preparó y se aisló haciendo reaccionar Pd(PPh3)4 con THP en una reacción de intercambio de ligando. Su actividad de escisión se comparó con el complejo de Pd(0) generadoin situa partir del dímero de cloruro de alil paladio(II) (Pd(C3H5)Cl)2 y THP como se describe en el Ejemplo 1.

Método de preparación

Bajo nitrógeno, se disolvió Pd(PPh3)4 en diclorometano desgasificado seco para dar una solución amarilla. Se añadió solución acuosa de THP (4,1equivalentes) para obtener una mezcla bifásica, que se agitó durante 2,5 horas. El color amarillo se transfirió desde la capa orgánica a la capa acuosa. La reacción se trató mediante sifón de la capa orgánica y enjuagó la fase acuosa con<d>C<m>adicional. La fase acuosa se secó a presión reducida y se evaporó conjuntamente con tetrahidrofurano, y el aceite naranja resultante se secó a alto vacío. El rendimiento fue casi cuantitativo. El análisis LC-MS del producto indicó la presencia de Pd(THP)<2>[Pd(THP)<2>+ H+; Esperado: 523 Da, Encontrado: 523 Da].

Uso para linealización P15

Se formuló Pd(THP)2-4 en regulador acuoso a 10 mg/ml, y su actividad de escisión P15 se evaluó usando un ensayo basado en placas. Este ensayo utiliza una placa de 96 pocillos injertados con cebadores de superficie P15/P17. Se usa un colorante fluorescente intercalante para cuantificar el ADN bicatenario presente antes y después de la lectura de 1 linealización; El porcentaje de escisión puede calcularse a partir de la cantidad de ADN bicatenario restante. Para las formulaciones de Pd(THP)2-4, la actividad de escisión de P15 fue comparable a una mezcla de Pd preparadain situde (Pd(C3H5)Cl)2 (6 mM), THP (60 mM) y ascorbato de sodio (6 mM)(Figura 7).Se observó que los dos métodos tenían un rendimiento de escisión comparativo.

Ejemplo 10

En este ejemplo, se preparó y ensayó el reactivo de escisión química basado en níquel alternativo en la escisión de una cadena de ADN que contenía nucleótidos de alilo dT.

Primero, tanto los ligandos de fosfina THP como THM se usaron en diversos equivalentes para reaccionar con NiCh en la preparación de complejos de níquel. La Ni-THP (relación 1:4 o 1:10) produjo el mismo producto de escisión que el reactivo que contiene paladio descrito en el Ejemplo 1. Curiosamente, Ni-THM donde el ligando de fosfina tiene una cadena de alquilo más corta (por lo tanto, un ángulo de cono más pequeño) no demostró la misma actividad de escisión cuando se complejó con níquel.

Se probó la actividad de escisión de Ni-THP sobre la superficie y se comparó con la de Pd-THP. El experimento se llevó a cabo en una célula de flujo de HiSeq™ injertada con cebadores P15/P7 y oligos trazadores. Los oligos trazadores tienen cuatro alildT en la secuencia y el marcador fluorescente 3'. Tras la escisión del alildT por los complejos de Ni-THP o Pd-THP, se eliminaría la señal fluorescente de la celda de flujo. La célula de flujo se injertó con P15/P7 1,1 pM y oligos de trazador adicionales del 5 % al 40 %, a continuación se escaneó en Typhoon para confirmar el éxito del injerto. La linealización química se realizó a 60 °C durante 10 min. Los carriles 1 a 4 se trataron con complejo de Pd-THP (generado in situ a partir de (Pd(C3H5)Cl)2 (10 mM), THP (100 mM) y ascorbato de sodio (10 mM) como control, los carriles 5 a 8 se trataron con un complejo de Ni-THP (1:10) 10 mM. La intensidad de la fluorescencia se obtuvo en Typhoon para evaluar el grado de linealización química. Disposición del carril: Trazador de 5 % = 55 nM (carriles 1, 5); Trazador de 10 % = 110 nM (carriles 2, 6); Trazador de 20 % = 220 nM (carriles 3, 7); Trazador de 40 % = 440 nM (carriles 4, 8). LaFigura 8muestra la intensidad fluorescente media normalizada antes y después de la escisión y Ni-THP ha demostrado una actividad de escisión eficiente que fue comparable a Pd-THP.

Ejemplo 11

En este ejemplo, se describe un enlazador basado en azo-areno alternativo como un enlazador escindible bioortogonal para la linealización química por una solución acuosa de ditionito de sodio (Na2S2Ü4).

Los Esquemas 5 y 6 ilustran la preparación de azo-fosforamidita1y2respectivamente.

Compuesto 5.Bajo N<2>, una suspensión de 2-amino-5-yodobenzoato de metilo(4)(2,77 g, 10 mmol), Pd(PPh3)4 (1,159 mg, 1 mmol), Cul (381 mg, 2 mmol), Et3N (4,2 ml, 30 mmol) y alcohol propargílico (1,75 ml, 30 mmol) en DMF (20 ml) se agitó a ta durante 15 h. El análisis por TLC (éter de petróleo: acetato de etilo 1:1) indicó el consumo completamente de material de partida. La reacción se inactivó con 200 ml de soluciónsat.de NaCl. Se añadió acetato de etilo: éter de petróleo 1: 1 (200 ml) a la mezcla y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo; éter de petróleo 1:1 tres veces. Después de secar los extractos orgánicos combinados sobre MgSO4, la solución se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (éter de petróleo: acetato de etilo 80: 20 a acetato de etilo), dando el Compuesto5como un aceite amarillo (1,88 g, 92 %). RMN de 1H (CDCb) ó 3,78 (s, 3H), 4,25 (s, 2H, eCCH)<2>), 7,27 7,36 (m, 2H, arom.H), 7,58-7,65 (m, 1H, arom.H).

Compuesto 6.Bajo N<2>, a una solución del Compuesto5(1,88 mg, 9,2 mmol) e imidazol (1,83 g, 27,6 mmol) en DMF seca (25 ml) se añadió t-butildifenilsililocloruro (1,06 g, 12 mmol). La reacción fue seguida por TLC y se completó después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con una soluciónsat.de NaHCO3 y se extrajo con acetato de etilo: éter de petróleo 1: 1 (2x). Después de secar los extractos orgánicos combinados sobre MgSO4, el disolvente se eliminó al vacío. Después, la mezcla en bruto se disolvió en EtOH y se trató con EtSiH y Pd-C (10 %). La mezcla de reacción se calentó a reflujo bajo N<2>durante 16 horas. El análisis por TLC (éter de petróleo: acetato de etilo 8: 2) indicó el consumo completo del material de partida. La mezcla de reacción se filtró, se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (éter de petróleo a éter de petróleo: acetato de etilo 1:1), dando el Compuesto6como un aceite amarillo (3,37 g, 82 %). RMN de 1H (CDCb) ó 1,04 (s, 9H, 3 x CH<3>), 1,70-1,77 (m, 2H, CH<2>), 2,56 (t, 2H, CH<2>), 3,58 (t, 2H, OCH<2>), 3,60 (s, 3H, OCH<3>), 6,62-6,65 (m, 1H, arom.H), 7,03-7,06 (m, 1 H, arom.), 7,27-7,63 (m, 11H, arom.H).

Compuesto 8.A una suspensión de resorcinol (2,2 g, 20 mmol) y K<2>CO<3>(2,76 g, 20 mmol) en DMF (40 ml) se añadió 4-bromobutanoato de terc-butilo (2,2 g, 10 mmol) bajo N<2>. La mezcla de reacción se agitó a ta durante 15 h. El análisis por TLC (éter de petróleo: acetato de etilo 7: 3) indicó el consumo del 90 % del material de partida resorcinol . La reacción se inactivó con 300 ml de soluciónsat.de NaCl. Se añadió acetato de etilo: éter de petróleo 1:1 (300 ml) a la mezcla de reacción y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo: éter de petróleo 1: 1 tres veces. Después de secar los extractos orgánicos combinados sobre MgSO4, la solución se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (éter de petróleo a éter de petróleo: acetato de etilo 50: 50), dando el Compuesto8como un aceite amarillo (2,2 g, 88 %). RMN de 1H (CDCb) ó 1,27 (s, 9H), 1,91-1,98 (m, 2H, CH<2>), 2,22 (t, 2H, CH<2>), 3,27 (t, 2H, OCH<2>), 6,36 6,46 (m, 3 arom.H), 7,09 (t, 1 arom.H)

Compuesto 9.El Compuesto5(450 mg, 1 mmol) se disolvió en una solución de acetona/agua (1:1) (2,5 ml). La mezcla se enfrió a 0 ° y se añadió HCl concentrado (0,5 ml). Después de 5 minutos de nitrito de sodio (93 mg, 1,2 mmol) en agua (1 ml) se añadió gota a gota y la mezcla se agitó durante 1 hora a 0 °C. Al mismo tiempo, se solubilizó el Compuesto8(252 mg, 1 mmol), Na2CO3 (210 mg, 2 mmol) y NaOH (160 mg, 4 mmol) en una solución de acetona/agua (1:1) (3 ml). La primera solución se añadió gota a gota a la segunda a 0 °C. Después de completar la adición, la mezcla se calentó hasta ta y se agitó durante una hora adicional. La mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1 M y después se extrajo con DCM (3x50 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se concentró y purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo a éter de petróleo: acetato de etilo 1: 1). El Compuesto9se obtuvo como un aceite naranja/rojo (400 mg, 56 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó 1,02 (s, 9H, 3 x CH<3>), 1,27 (s, 9H), ó 1,69-1,76 (m, CH<2>), 1,91-1,97 (m, 2H, CH<2>), 2,20 (t, 2H, CH<2>), 2,53 (t, 2H, CH<2>), 3,34 (t, 2H, OCH<2>), 3,54 (t, 2H, OCH<2>), 3,62 (s, 3H, OCH<3>), 6,36-6,46 (m, 4 arom.H), 7,00-7,06 (m, 1 H, arom.H), 7,09 (t, 1 arom.H), 7,27-7,63 (m, 11H, arom.H).

Compuesto 11.El Compuesto9(3,55 g, 5 mmol) se disolvió en DCM (50 ml). La solución se trató con TFA (10 ml) a ta y se agitó durante la noche. Después, TFA se retiró a presión reducida y se coevaporó con tolueno. El residuo se particionó entre NaCl y DCM. La capa acuosa se extrajo con DCM 3 veces. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4 y se concentró. El producto en bruto se disolvió en THF (15 ml) y se trató con TBAF (1 M, 5 ml). La reacción se monitoreó mediante TLC (DCM/MeOH 90:10). El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se particionó entre NaCl y DCM (+ 10 % de MeOH). La capa acuosa se extrajo con DCM (+ 10 % de MeOH) 3 veces. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4 y se concentró. El residuo se evaporó conjuntamente con piridina 3 veces. El residuo se disolvió en Py/CH3CN (10/10 ml) y se añadió la base de Hunig (3,7 ml, 15 mmol), DMT-Cl (5,07 g, 15 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 2 horas. TCL (DCM: MeOH 95:5) indicó la finalización de la reacción. La mezcla se concentró, se disolvió en DCM, y se lavó con Na2CO3. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (éter de petróleo: acetato de etilo 8:2 a acetato de etilo 1 % de NEts). El Compuesto11se obtuvo como un aceite naranja/rojo (2,37 g, 66 %). RMN de 1 H (400 MHz, DMSO-d6) ó 1,70-1,79 (m, 2H, CH<2>), 1,90-1,97 (m, 2H, CH<2>), 2,24 (t, 2H, CH<2>), 2,54 (t, 2H, CH<2>, 3,26 (t, 2H, OCH<2>), 3,58 (t, 2H, OCH<2>), 3,63 (s, 3H, OCH<3>), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79-6,89 (m, 4H, aromático), 7,03-7,06 (m, 1 H, arom.H), 7,10 (t, 1 arom.H), 7,13-7,63 (m, 13H, arom.H).

Compuesto 12.El Compuesto11(1,05 g, 1,46 mmol) y DMAP (18 mg, 0,15 mmol) se disolvió en 7 ml de piridina anhidra bajo N<2>. Después, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se añadió cloruro de benzoilo (0,5 ml, 4,4 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción se calentó lentamente hasta ta y se agitó durante una hora durante el cual la solución de tiempo se volvió turbia. El análisis por TLC indicó el consumo completo del material de partida. La reacción se inactivó con una soluciónsat.de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con DCM 3 veces. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se concentró y purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo: acetato de etilo 8:2 a acetato de etilo 1 % de NEt3) para dar el Compuesto12como un aceite amarillo (930 mg, 78 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó 1,69-1,76 (m, 2H, CH<2>), 1,91-1,97 (m, 2H, CH<2>), 2,20 (t, 2H, CH<2>), 2,53 (t, 2H, CH<2>), 3,24 (t, 2H, OCH<2>), 3,54 (t, 2H, OCH<2>), 3,62 (s, 3H, OCH<3>), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79-6,86 (m, 4H, aromático), 7,01 (t, 1 arom.H), 7,04-7,11 (m, 3 H, arom.H), 7,13-7,63 (m, 13H, arom.H), 7,94-8,36 (m, 3H, arom.H).

Compuesto 13.El Compuesto12(340 mg, 0,5 mmol) se disolvió en 3 ml de DMF anhidra bajo N<2>y base de Hunig (0,26 ml, 1,5 mmol). Después, la mezcla de reacción se trató con TSTU (196 mg, 0,65 mmol) y se mantuvo a ta. Después de 30 min, el análisis de TLC (EtOAc) indicó que la reacción se completó. A continuación, se añadió 3-aminopropanol (38 pl, 0,5 mol) a la mezcla de reacción y se agitó a ta durante 4 h. El análisis por TLC indicó el consumo completo del material de partida. La reacción se inactivó con una soluciónsat.de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con DCM 3 veces. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se concentró, se coevaporó con xileno (3x) y purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo: acetato de etilo 8:2 a acetato de etilo 1 % de NEt3) para dar el Compuesto13como un aceite naranja (320 mg, 73 %). RMN de 1 H (400 MHz, DMSO-d6) 51,67-1,79 (m, 4H, CH<2>), 1,91-1,97 (m, 2H, CH<2>), 2,20 (t, 2H, CH<2>), 2,53 (t, 2H, CH<2>), 3,24 (t, 2H, OCH<2>), 3,45 (t, 2H, OCH<2>), 3,51 (t, 2H, NCH<2>), 3,54 (t, 2H, OCH<2>), 3,69 (s, 3H, OCH<3>), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79-6,86 (m, 4H, aromático), 7,01 (t, 1 arom.H), 7,04-7,11 (m, 3 H, arom.H), 7,13-7,69 (m, 13H, arom.H), 7,94-8,40 (m, 3H, arom.H).

Compuesto 1.El Compuesto13se secó (320 mg, 0,36 mmol) en un carril de alto vacío. Se añadió DCM anhidro (2 ml) bajo N<2>y se agitó con tamices moleculares durante 10 min a ta a la solución, se añadió base de Hunig (0,19 ml, 1,1 mmol) y seguido de 2-cianoetilo N,N -diisopropilfosforamidita (102 mg, 0,43 mmol). La reacción se agitó a ta bajo N<2>durante 3 h. La reacción fue seguida por TLC (PE/EtOAc, 8:2). La reacción se concentró para dar jarabe al vacío. El residuo se purificó por columna (éter de petróleo:acetato de etilo 8:2 a acetato de etilo, PE/EtOAc 1 % de NEts) para dar el Compuesto1como un aceite naranja (190 mg, 50 %). El producto se descompuso parcialmente en la columna. RMN de 1 H (400 MHz, DMSO-d6) 50,96-1,27 (m, 12H), 1,68-1,79 (m, 4H, CH<2>), 1,91-1,97 (m, 2H, CH<2>), 2,20 (t, 2H, CH<2>), 2,53 (t, 2H, CH<2>), 2,58-2,74 (m, 2H, CH<2>CN), 3,24 (t, 2H, OCH<2>), 2,93 (m, 2H, NCH), 3,44 (t, 2H, NCH<2>), 3,42-3,54 (m, 4H, OCH<2>), 3,69 (s, 3H, OCH<3>), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79-7,01 (m, 5H, aromático), 7,04-7,11 (m, 3 H, arom.H), 7,13-7,69 (m, 13H, arom.H), 7,94-8,40 (m, 3H, arom.H).

Compuesto 15.Bajo N<2>, a una solución del Compuesto14(3,6 g, 20 mmol) e imidazol (3,72 g, 60 mmol) en DMF seca (25 ml) se añadió t-butildifenilsililocloruro (2,3 g, 26 mmol). La reacción fue seguida por TLC y se completó después de agitar durante 1 hora a ta. La reacción se inactivó con una soluciónsat.de NaHCO3 y se extrajo con acetato de etilo: éter de petróleo 1:1 (2x). Después de secar la capa orgánica combinada sobre MgSO4, la mezcla de reacción se filtró, se concentró y se purificó por cromatografía de gel de sílice (éter de petróleo a éter de petróleo: acetato de etilo: 1), dando el Compuesto15como un aceite blanquecino (7,19 g, 86 %). R<m>N de 1 H (DMSO-d6) 50,99 (s, 9H, 3 x CH<3>), 3,38-3,46 (m, 2H, NCH<2>), 3,92 (t, 2H, OCH<2>), 5,59 (s, 2H, NH<2>), 6,50-6,54 (d, 2 H, arom.H), 7,37-7,66 (m, 13H, arom.H), 8,05 (d, 1H, NH).

Compuesto 16.Bajo N<2>, una solución del Compuesto15(840 mg, 2 mmol) en DCM seco (10 ml) se añadió tetrafluoroborato de nitrosilo (234 mg, 2 mmol) a 0 °C. La reacción fue seguida por TLC y el material de partida desapareció después de agitar durante 1 hora a 0 °C. El Compuesto8(756 mg, 3 mmol) se añadió a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se calentó lentamente hasta ta y se agitó durante 4 h. La reacción se siguió por TLC. Después de la finalización, la reacción se inactivó con una soluciónsat.de NaHCO3 y se extrajo con DCM (2x). Después de secar la capa orgánica combinada sobre MgSO4, la mezcla de reacción se filtró, se concentró y se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (éter de petróleo a éter de petróleo: acetato de etilo 1:1), dando el Compuesto16como un aceite naranja (1,12 g, 82 %). RMN de 1 H (DMSO-d6) 50,99 (s, 9H, 3 x CH<3>), 1,27 (s, 9H, 3 x CH<3>), 1,91 1,98 (m, 2H, CH<2>), 2,22 (t, 2H, CH<2>), 3,27 (t, 2H, OCH<2>), 3,38-3,46 (m, 2H, NCH<2>), 3,92 (t, 2H, OCH<2>), 6,36-6,46 (m, 3 arom.H), 6,50-6,56 (d, 2 H, arom.H), 7,10 (t, 1 arom.H), 7,37-7,66 (m, 13H, arom.H), 8,06 (d, 1H, NH).

Compuesto 17.El Compuesto16(1,1 g, 1,64 mmol) y DMAP (20 mg, 0,16 mmol) se disolvió en 8 ml de piridina anhidra bajo N<2>. Después, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se añadió cloruro de benzoilo (0,17 ml, 1,5 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción se calentó lentamente hasta ta y se agitó durante una hora durante el cual la solución de tiempo se volvió turbia. El análisis por TLC indicó el consumo completo del material de partida. La reacción se inactivó con una soluciónsat.de NaHCOa. La capa acuosa se extrajo con DCM 3 veces. La capa orgánica combinada se lavó con H<2>SO<4>, se secó sobre MgSO4 y se concentró. La mezcla bruta resultante se disolvió en DCM (14 ml). La solución se trató con TFA (1,4 ml) a ta y se agitó durante una noche. La reacción se monitoreó mediante TLC (éter de petróleo: acetato de etilo 1:1). El TFA se retiró a presión reducida y se coevaporó con tolueno. El residuo se particionó entre NaCl y DCM. La capa acuosa se extrajo con DCM 3 veces. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4 y se concentró. El producto en bruto se disolvió en THF (8 ml) y se trató con TBAF (1 M, 1,6 ml). La reacción se monitoreó mediante TLC (DCM/MeOH 9:11). El solvente se eliminó bajo presión reducida y el residuo se particionó entre NaCl y DCM (+ 10 % de MeOH). La capa acuosa se extrajo con d Cm (+ 10 % de MeOH) 3 veces. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4 y se concentró y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (DCM a DCM:MeOH 9:1). El Compuesto17se obtuvo como un aceite naranja/rojo (515 g, 64 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) 51,56-1,64 (m, 2H, CH<2>), 2,01 (t, 2H, CH<2>), 3,24 (t, 2H, NCH<2>), 3,52 (t, 2H, OCH<2>), 4,25 (t, 2H, OCH<2>), 6,79-6,89 (m, 1H, arom.H), 7,03-7,06 (m, 1 H, arom.H), 7,13-7,63 (m, 10H, arom.H), 8,56 (t, 1H, NH).

Compuesto 18.El Compuesto17(500 mg, 1 mmol) se disolvió en py/CH3CN (5/5 ml) y base de Hunig (0,87 ml, 5 mmol), se añadió DMT-Cl (1 g, 3 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 2 horas. TCL (DCM: MeOH 95:5) indicó la finalización de la reacción. La mezcla se concentró, se disolvió en DCM, y se lavó con Na<2>CO<3>. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se concentró y purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo: acetato de etilo 8:2 a acetato de etilo 1 % de NEt3). El Compuesto18se obtuvo como un aceite naranja/rojo (653 mg, 83 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 1,16-1,24 (m, 2H, CH<2>), 2,01 (t, 2H, CH<2>), 3,24 (t, 2H, NCH<2>), 3,52 (t, 2H, OCH<2>), 3,69 (s, 6H, OMe), 4,25 (t, 2H, OCH<2>), 6,76-6,89 (m, 4H, arom.H), 7,03-8,23 (m, 21H, arom.H), 8,86 (t, 1H, NH).

Compuesto 19.El Compuesto18(350 mg, 0,5 mmol) se disolvió en 3 ml de DMF anhidra bajo N<2>y base de Hunig (0,26 ml, 1,5 mmol). Después, la mezcla de reacción se trató con TSTU (196 mg, 0,65 mmol) y se mantuvo a ta. Después de 30 min, el análisis de TLC (éter de petróleo: EtOAc 2:8) indicó que la reacción se completó. A continuación, se añadió 3-aminopropanol (38 pl, 0,5 mol) a la mezcla de reacción y se agitó a ta durante 4 h. El análisis por TLC indicó el consumo completo del material de partida. La reacción se inactivó con una soluciónsat.de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con DCM 3 veces. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se concentró, se coevaporó con xileno (3x) y purificó por cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo: acetato de etilo 8:2 a acetato de etilo 1 % de NEt3) para dar el Compuesto19como un aceite naranja (223 mg, 52 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 1,67-1,79 (m, 4H, CH<2>), 1,91-1,97 (m, 2H, CH<2>), 2,05 (t, 2H, CH<2>), 2,53 (t, 2H, CH<2>), 3,24 (t, 2H, OCH<2>), 3,45 (t, 2H, OCH<2>), 3,51 (s, 2H, NCH<3>), 3,57 (T, 2H, OCH<2>), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79-6,86 (m, 4H, aromático), 7,01 (t, 1 arom.H), 7,04-7,11 (m, 3 H, arom.H), 7,13-7,69 (m, 13H, arom.H), 7,74-8,40 (m, 3H, arom.H), 8,76 (T, 1H, NH).

Compuesto 2.El Compuesto19(223 mg, 0,26 mmol) se secó en un carril de alto vacío. Se añadió DCM anhidro (1,5 ml) bajo N<2>y se agitó con tamices moleculares durante 10 min a ta. A la solución, se añadió base de Hunig (0,14 ml, 0,78 mmol) y seguido de 2-cianoetilo W,W-diisopropilclorofosforamidita (76 ul, 0,34 mmol). La reacción se agitó a ta bajo N<2>durante 3 h. La reacción fue seguida por TLC (PE/EtOAc, 2:8). La reacción se concentró para dar jarabe al vacío. El residuo se purificó por columna (éter de petróleo:acetato de etilo 8:2 a acetato de etilo 1 % de NEts) para dar el Compuesto2como un aceite naranja (152 mg, 56 %). El producto se descompuso parcialmente en la columna. RMN de 1 H (400 MHz, DMSO-d6) 50,96-1,27 (m, 12H), 1,68-1,79 (m, 4H, CH<2>), 1,91-1,97 (m, 2H, CH<2>), 2,19-2,22 (m, 2H, CH<2>), 2,5-2,54 (m, 2H, CH<2>), 2,58-2,74 (m, 2H, CH<2>CN), 3,22-3,26 (m, 2H, OCH<2>), 2,93 (m, 2H, NCH), 3,44 (t, 2H, NCH<2>), 3,42-3,54 (m, 4H, OCH<2>), 3,71 (s, 6H, OMe), 6,79-7,01 (m, 5H, aromáticos), 7,04-7,11 (m, 3 H, arom.H), 7,13-7,69 (m, 13H, arom.H), 7,94-8,40 (m, 3H, arom.H), 8,76 (t, 1H, NH).

Después, dos oligos cortos (Oligo azo-1 y Oligo azo-2) que incorporan los dos compuestos azo-fosforamidita1y2respectivamente, se sintetizaron para evaluar la eficacia de escisión. El oligo azo-1 tiene una absorción a 450 nm y un color naranja. Después de la escisión, la unión azo se rompe y da como resultado la pérdida del color naranja. Después de añadir 0,1 M de una solución de Na2S2O4 a ta, el color naranja de la solución oligo desapareció instantáneamente, lo que indicó una escisión muy eficiente de la unión azo. El análisis por HPLC del oligo azo-1 y los productos de escisión también confirmaron el mismo resultado. El análisis por HPLC del ensayo de escisión de oligo azo-2 mostró una rotura limpia e instantánea de un enlace azo tratado con Na 0,1 M de una solución de Na2S2O4 a ta.

Oligo azo-1: 5'-GAX 1CTA-3'

Oligo azo-2: 5'-GAX2CTA-3'

Además, también se ensayó la compatibilidad de Oligo azo-1 con los reactivos de secuenciación SBS. Primero, se incubó 10 pM de Oligo azo-1 (10 pl) en 90 pl de mezcla de incorporación (IMX), mezcla de escisión (CMS) y mezcla de barrido (USM) a 60 °C durante 60 minutos. El análisis por HPLC mostró que Oligo azo-1 era completamente estable en IMX, 90 % de Oligo azo-1 se descompuso en CMS y 50 % de Oligo azo-1 se dejó en USM. Se observó una pequeña mejora para Oligo azo-2. La degradación se redujo al 44 % para el Oligo azo-2 en comparación con el 66 % de degradación para Oligo azo-1 cuando ambos oligos se incubaron a 60 °C durante 60 minutos en solución CMS (10 pl).

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un soporte sólido que comprende polinucleótidos bicatenarios, cada polinucleótido bicatenario comprende una primera cadena y una segunda cadena inmovilizada sobre la misma, cada primera cadena comprende un primer sitio de escisión capaz de experimentar escisión química mediante un complejo de paladio o un complejo de níquel, en donde el primer sitio de escisión comprende un nucleósido o nucleótido modificado que tiene una estructura de Fórmula (II'):

en donde la base es adenina, guanina, citosina, timina o uracilo, o un derivado de las mismas, y en donde la primera cadena y la segunda cadena se inmovilizan en el soporte sólido en sus extremos 5'.
2. El soporte sólido de la reivindicación 1, en donde cada polinucleótido de la primera cadena comprende un primer cebador de extensión inmovilizado al soporte sólido, opcionalmente en donde el primer cebador de extensión comprende el primer sitio de escisión opcionalmente en donde el primer cebador de extensión comprende una secuencia P5 o una secuencia P5 modificada.
3. El soporte sólido de la reivindicación 1 o 2, en donde el primer sitio de escisión genera una fracción bloqueante 3' después de la escisión química.
4. El soporte sólido de la reivindicación 3, en donde la fracción bloqueante 3' comprende una fracción de fosfato que tiene una estructura de Fórmula (I):

en donde R1 es -NH<2>, -OH, -NHC(O)ORa o -OCH<2>OSi(Rb)a; Ra es alquilo C<1-4>, terc-butilo, alilo, bencilo o 9-fluorenilmetilo; cada Rb se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1-4>y fenilo; y R2 es H, alquilo C<1-4>, un tetrahidrofurano opcionalmente sustituido o un nucleótido; o de Fórmula (V):

en donde la base es una adenina, guanina, citosina, timina o uracilo opcionalmente protegida, o un derivado de la misma.
5. El soporte sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde cada polinucleótido de la segunda cadena comprende un segundo sitio de escisión y opcionalmente un segundo cebador de extensión inmovilizado al soporte sólido, opcionalmente en donde el segundo cebador de extensión comprende el segundo sitio de escisión.
6. El soporte sólido de la reivindicación 5, en donde el segundo sitio de escisión no es capaz de experimentar escisión química por el complejo de paladio o el complejo de níquel opcionalmente en donde el segundo sitio de escisión es escindido por una escisión química y en donde el segundo sitio de escisión comprende un enlazador de diol o un enlazador de azobenceno.
7. Un método para linealizar una pluralidad de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados, que comprende: proporcionar el soporte sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 poner en contacto los polinucleótidos bicatenarios con una solución acuosa del complejo de metal de transición, lo que de este modo escinde una o más primeras cadenas en el primer sitio de escisión, y genera uno o más primeros ácidos nucleicos escindidos y primeras cadenas inmovilizadas escindidas; y eliminar los primeros ácidos nucleicos escindidos del soporte sólido.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el complejo de metal de transición es un complejo de paladio (0), preferiblemente Pd(THP)<2>, Pd(THP)4, Pd(THM)4, o combinaciones de los mismos opcionalmente generadosin situ,o un complejo de níquel (0) generado opcionalmentein situde un compuesto de níquel (II).
9. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde cada polinucleótido de la segunda cadena comprende un segundo sitio de escisión, que se escinde mediante un método seleccionado del grupo que consiste en escisión química, fotoescisión, escisión enzimática y una combinación de las mismas.