CN113248556B - 一种核酸枝接偶氮苯的组装体及制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种核酸枝接偶氮苯的组装体及制备方法及应用，将偶氮苯衍生物偶联到CpG寡脱氧核苷酸的末端得到所述的枝接核酸的偶氮苯分子；所述枝接核酸的偶氮苯分子在水溶液中加热组装得到核酸枝接偶氮苯分子的组装体；通过凝胶电泳、割胶、脱盐、紫外、质谱等表征手段对反应体系进行纯化和表征。在20℃‑100℃的碱性条件下，所述偶氮苯衍生物形成疏水核，疏水核的外围为柔性亲水的单链DNA；在酸性条件下，所述单链DNA变成“i‑motif”结构，所述核酸枝节偶氮苯的组装体解体。该组装体不仅可应用于药物负载等领域，利用DNA链的pH响应性，该组装体可应用于药物的可控释放。核酸枝节偶氮苯的组装体还可引入环糊精，使该组装体解体能应用于药物的可控释放。
Description
技术领域
本发明涉及有机分子合成领域，尤其涉及DNA纳米材料的自组 装领域，涉及影响两亲体的组装因素。
背景技术
自沃森和克里克证明了脱氧核糖核苷酸(DNA)的双螺旋结构开 始，人类逐渐揭开了DNA的神秘面纱。DNA作为遗传信息的载体一 直是科研人员研究的热点和难点。1982年，Seeman教授提出了“结 构DNA纳米技术”，利用碱基互补配对原则，构筑了一维、二维和三维的纳米结构，这些纳米结构可应用于生物医学、仿生和纳米材料等 领域。随着科研技术的进步，DNA合成技术的发展，通过固相合成法 和液相合成法，科研人员将有机分子加入到DNA纳米结构领域，成 功的实现了有机物与DNA链的共价连接。与DNA共价连接的有机分 子主要分为三类：一、高分子(polymer)和树枝状大分子(Dendron)； 二、生物大分子如多肽或蛋白质；三、有机小分子如荧光分子、脂类 分子等等。在组装过程的研究中，科研人员更倾向于选择DNA单链， 因DNA单链与DNA双链相比，具有更强的柔性，更易于组装体的形 成。
DNA还可以作为药物载体修饰到其他载体上，通过刺激响应控制 释放药物，相对于传统给药方式，药物的刺激响应控制释放具有主动 靶向功能，有利于提高药物疗效、降低毒副作用。
偶氮苯化合物在光照下会发生可逆的光致顺反异构化反应，因此 目前的研究公布了利用脂肪骨架将偶氮苯官能团楔入DNA序列，通 过照射不同波长的光，控制DNA双链的杂交与解链，实现了酶催化、 转录、扩增等生物过程的光控，还可以实现药物的刺激响应控制释放。
发明内容
本发明提供了利用偶氮苯作为两亲化合物的疏水片段，利用含有 14个碱基的且具有二级结构的稳定性强的DNA链作为两亲化合物的 亲水片段。此DNA链具有pH响应性，在酸性条件下形成“i-motif” 结构，在碱性条件下为柔性单链。因自组装形成的纳米结构含有DNA 链，所以组装体具有良好的生物相容性。并且利用疏水相互作用和碱 基互补配对原则，该组装体可应用于药物的负载，使疏水性药物分子 被两亲化合物的偶氮苯疏水片段包裹，而两亲化合物的亲水片段位于 外围形成球形胶束，便于运载药物，实现良好的细胞摄取。当引入环 糊精时可改变球形胶束中偶氮苯的疏水性，从而使球形胶束解体，使 药物释放。
本发明目的之一在于构筑一种生物相容性良好、无毒无害的纳米 组装体。
本发明目的之二在于构筑纳米组装体用来高效负载药物并且实 现药物的可控释放。
本发明目的之三在于构筑的纳米组装体能够有效被细胞摄取并 且高效释放药物。
为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种核酸枝接偶氮苯的组装体的制备方法，其特征在于，将偶氮 苯衍生物偶联到CpG寡脱氧核苷酸的末端得到所述的枝接核酸的偶 氮苯；所述枝接核酸的荧光分子在水溶液中加热组装得到核酸枝接偶 氮苯的组装体；
CpG寡脱氧核苷酸为：5'-TTTCCCCTAACCCC-3'；
偶氮苯衍生物的结构通式I为：
进一步地，将偶氮苯衍生物偶联到CpG寡脱氧核苷酸的末端的步 骤包括：
(1)取所述CpG寡脱氧核苷酸加入被惰性气体保护的5-乙硫基四唑 溶剂中；
(2)在惰性气体氛围下，将所述偶氮苯衍生物溶解在无水无氧的二 氯甲烷中，步骤(1)的体系中，在惰性气体保护状态下超声1min，静 置整晚；
(3)反应结束后依次用二氯甲烷、乙腈洗涤，氧化剂氧化，氧化结 束后继续用二氯甲烷、乙腈洗涤，浓氨水氨解，通过DNA浓缩仪浓 缩，最后通过割胶法纯化，得到枝接核酸的偶氮苯；
所述氧化剂为I2/THF/Py，氧化时间为2min。
优选地，所述偶氮苯衍生物的制备方法包括以下步骤：
(1)将4-甲氧基对偶氮苯酚、溴己醇、无水K2CO3按照1:1.58:1.2 的质量比混合和乙醇溶液置于干燥烧瓶中，加入KI做催化剂，80℃ 油浴加热，搅拌回流反应24h，趁热将反应液抽滤，在用乙醇溶液洗 涤滤饼至无色，收集滤液用冰乙醇沉淀，沉淀在60℃烘箱烘干，得 到4-甲氧基-4’-己醇氧基-偶氮苯；
(2)将步骤(1)制备的4-甲氧基-4’-己醇氧基-偶氮苯置于充满惰性 气体的烧瓶中，在惰性气体保护下，加入N,N-二异丙基乙胺和2-氰 基乙基二异丙基氯代亚磷酰胺，室温条件下搅拌反应一个小时；
(3)反应结束后加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，分别用饱和碳酸氢钠 溶液和饱和氯化钠溶液萃取，旋干，惰性气体保护，得到所述的偶氮 苯衍生物。
优选地，所述水溶液为水与四氢呋喃按体积比20：1配置的水溶 液，枝接核酸的偶氮苯在该水溶液中组装的条件为90℃加热30min。
进一步地，所述核酸枝接偶氮苯的组装体，其结构通式I为：
其中S1为单链DNA，单链DNA的核酸序列：5'-TTTCCCCTAACCCC-3'， 在20℃-100℃的碱性条件下，所述偶氮苯衍生物形成疏水核，疏水核 的外围为柔性亲水的单链DNA；在酸性条件下，所述单链DNA变成 “i-motif”结构，所述核酸枝偶氮苯的组装体解体。
进一步地，所述单链DNA链含有14个碱基。
进一步地，所述的核酸枝接偶氮苯的组装体应用于递送药物，其 步骤为：将所需吸附的疏水性药物分子或亲水性药物分子制成溶液， 将所述的核酸枝接偶氮苯的组装体从水中取出并浸入药物溶液中，得 到吸附疏水性药物分子或亲水性药物分子的两亲性晶体，将两亲性晶 体用于传递药物，所述两亲性晶体的释放条件为加入环糊精或者接受 紫外照射或加入酸性溶液，使两亲性晶体解体，释放药物分子。
在紫外和自然光照射的条件下，结构通式I的核酸枝接偶氮苯的 组装体的偶氮苯分别是顺式和反式的结构。
核酸枝接偶氮苯的组装体形貌为球形胶束，浸入药物溶液中后， 通过疏水-疏水相互作用，可将疏水药物分子DOX包裹在球形胶束的 内部，或通过碱基互补配对策略使亲水的DNA链负载亲水的药物分 子，通过加入环糊精使其与两亲体中偶氮苯进行主客体识别，从而使 组装体解体，使药物释放。
本发明的突出效果：
(1)生物体因为自身含有DNA，所以将DNA作为两亲化合物的 亲水部分，组装形成的两亲组装体具有良好的生物相容性，无毒无害 等特点，且形成的组装体更易被细胞摄取。
(2)本发明所选用的DNA链具有pH响应性，在酸性条件下能 够形成“i-motif”结构，使得两亲体中亲水部分所占比例减少，在碱 性条件下为柔性单链，因此利用DNA链的pH响应性可实现组装体的 形态变化，能够达到药物的可控释放。
(3)偶氮苯分子作为两亲化合物的疏水部分，与其他有机小分 子比，具有较强的疏水性，且偶氮苯分子具有光响应性，在不同体系 中发挥重要的功能。
(4)环糊精可以提高偶氮苯分子的溶解度，改变核酸枝接偶氮 苯的组装体的亲水基团、疏水基团的比例，使核酸枝接偶氮苯的组装 体解体。
附图说明
图1：为CpG寡脱氧核苷酸原料和D18-PDI粗产物的凝胶电泳图，其 中左侧为CpG寡脱氧核苷酸原料的凝胶电泳图，右侧为D18-PDI粗 产物的凝胶电泳图；
图2：为图1的割胶产物的紫外吸收图；
图3：为枝接核酸的偶氮苯在加热温度分别为70℃的水溶液中组装 30min后的TEM表征图；
图4：为枝接核酸的偶氮苯在加热温度分别为90℃的水溶液中组装 30min后的TEM表征图；
图5：为枝接核酸的偶氮苯在加热温度分别为100℃的水溶液中组装 30min后的TEM表征图；
图6：为枝接核酸的偶氮苯在加热温度分别为90℃的水溶液中组装 30min后的TEM表征图；
图7：为枝接核酸的偶氮苯在加热温度分别为90℃的水溶液中组装 60min后的TEM表征图；
图8：为枝接核酸的偶氮苯在加热温度分别为90℃的水溶液中组装 90min后的TEM表征图；
图9：为枝接核酸的偶氮苯在加热温度分别为90℃的水溶液中组装 30min后的TEM表征图；
图10：为枝接核酸的偶氮苯在加热温度分别为90℃的V水/V二氯甲烷:20/1 溶液中组装30min后的TEM表征图；
图11：为枝接核酸的偶氮苯在加热温度分别为90℃的V水/V四氢呋喃:20/1 溶液中组装30min后的TEM表征图；
图12为组装体溶液中加入α-CD后的TEM表征图；
图13为组装体溶液中加入β-CD后的TEM表征图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下列实施例并不 限制本专利的权利范围。
实施例1
组装体
及其制备步骤： 1.偶氮苯衍生物的合成：
实验步骤S1：1.将6.16g的对甲氧基苯胺加入到15ml(50％) 的盐酸中，得到溶液A，再加入45mL水，在冰浴条件下将15mL NaNO2的水溶液缓慢滴加进去(A)。同时，将8g苯酚，4g NaOH 和4.3g NaHCO3溶于250ml水中，得到溶液B，在冰浴条件下剧烈 搅拌(B)。在冰浴条件下，将B在20min内缓慢滴加进入A，冰浴 下反应2h。反应结束后调节pH至2-3后抽滤，收集沉淀，水洗多次， 真空干燥(直接120℃烘箱干燥)，得到4-甲氧基对偶氮苯酚。
反应路线如下：
实验步骤S2：将上一步反应所得产物4-甲氧基对偶氮苯酚(5g)、 溴己醇(7.9g)和K2CO3(6g)溶于乙醇溶液中，加入少量KI(200mg) 做催化剂。80℃回流24h(可点板检测，大概7-9h反应就会完全反 应，展开剂为PE:EA＝2:1)。反应完成后趁热抽滤，用乙醇溶液洗涤滤饼至无色，收集滤液用冰乙醇沉淀，沉淀在60℃烘箱烘干，得到 4-甲氧基-4’-己醇氧基-偶氮苯(Azo)。
反应路线如下：
2.两亲化合物D18-Azo的合成
实验步骤S3：
1):①称取0.656g的Azo分子于24口圆底烧瓶中，抽真空充入氩 气。
②在氩气氛围下加入0.170ml N,N-二异丙基乙胺和0.140ml2-氰 基乙基二异丙基氯代亚磷酰胺，室温条件下搅拌一个小时。
③反应结束后加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，分别用饱和碳酸氢钠 溶液和饱和氯化钠溶液萃取，旋干，氩气保护，得到产物。
2)：①取0.001mmol的CpG寡脱氧核苷酸置于10ml梨形瓶中， CpG寡脱氧核苷酸为：5'-TTTCCCCTAACCCC-3'，加入0.1mmol的乙硫 基四唑，抽真空充入氩气。将上述反应步骤③得到的产物10中加入 3ml无水二氯甲烷，充分溶解，取1ml在氩气氛围下加入到装有CpG 寡脱氧核苷酸的瓶中，超声1分钟，静置整晚。
②反应结束后依次用二氯甲烷、乙腈洗涤，氧化剂氧化，氧化结 束后继续用二氯甲烷、乙腈洗涤，氨水氨解，浓缩，得粗产物I (D18-Azo)，进行下一步表征。
反应路线如下：
3).制备30％的聚丙烯酰胺胶来表征步骤2)中所得到的粗产物 I(图1右侧)和CpG寡脱氧核苷酸(图1左侧)，凝胶电泳条件为： 150V，3h，见附图1。
4).通过步骤3)的表征结果确认有新物质生成后，进行割胶纯 化，割胶条件为：400V，50min。
5).将割胶得到的产物通过C18-Nap-10脱盐柱进行脱盐。
6).将步骤(5)得到的产物进行紫外表征，即可看到在260nm 处的DNA链的特征吸收峰以及375nm处的Azo(偶氮苯衍生物)的 特征吸收峰，证明该产物为目标产物见附图3。
7).通过朗伯比尔定律定律测定浓度，100μM、100μL的 D18-Azo溶液，组装温度分别设定70℃、90℃、100℃，组装加热时 间设为30min，溶剂为水，通过TEM表征。见附图3-图5，由测试 结果可知，组装温度为90℃为最适温度，见附图3。组装温度为70℃ 时，由TEM图可清楚的看到没有组装体的形成，在温度为90℃时， 可以由TEM图看到有一定的组装体形成，且组装体尺寸在10nm左 右，在温度为100℃时，可能由于温度过高，破坏力DNA的结构，所以由TEM图未见到组装体的形成。
8).在组装温度为90℃，溶剂为水的条件下探索加热时间对组 装的影响，时间分别设为30min、60min、90min，自然冷却至室温， 静置过夜，进行TEM表征，见附图6-图8，由结果可知，加热30min 即可，所以加热时间为30min见附图7。随着加热时间的延长，组装 体尺寸未产生明显的差异，但由图6-图8可知，随着加热时间的延长， 形成组装体的数量减少，因此最终确认加热时间为30min。
9).在加热温度90℃，加热时间30min的条件下，探究溶剂对 组装过程的影响，分别选择水、V水/V二氯甲烷:20/1、V水/V四氢呋喃:20/1作 为溶剂，自然冷却至室温，静置过夜，进行TEM表征，见附图9-11， 由表征结果可知，在V水/V四氢呋喃:20/1条件下组装形貌最规整，见附 图9。对于不同的溶剂，溶剂极性不同，溶解疏水分子的能力不同， 两亲体中的疏水部分疏水性很强，不能溶于纯水中，所以在组装过程 中处于蜷缩的状态，导致亲疏水的比例发生改变，未能形成分散、规 整的组装体，只形成了杂乱的聚集体。对于二氯甲烷和四氢呋喃，都 能很好的溶解疏水分子，但由于二氯甲烷不能与水互溶，所以形成组 装体数量较少，而四氢呋喃能够与水混溶，所以在V水/V四氢呋喃:20/1 条件下形成了组装形貌规整尺寸单一的组装体。
环糊精对D18-Azo组装体体系的形貌调控：
10).90μL 100μM的D18-Azo组装体溶液中，加热90℃，30min， 形貌如图11，配置1ml 11.25mM的α-CD和β-CD，分别加入D18-Azo 组装体溶液，冷却至室温，静置过夜。加入环糊精后的D18-Azo组装 体形貌如图12-图13，组装体发生解体。
环糊精是水溶性的分子，当α-CD和β-CD与偶氮苯部分特异性 识别后，改变了两亲体原有的亲疏水比例，使得在新的亲疏水的比例 下，不足以支持组装体的形成，所以组装体解体。
D18-Azo组装体的药物负载及释放的方案：
1)原理：D18-Azo在以上选择的条件下，组装形貌为球形胶束。 其胶束内部为疏水分子偶氮苯，外围为亲水的DNA链。
2)方案：以药物分子DOX为例：疏水药物分子DOX因具有疏水 性，所以自身不能溶解在水相溶液中，但可以通过疏水-疏水相互 作用，将DOX药物包裹在球形胶束的内部，并且通过加入环糊精 使其与两亲体中偶氮苯进行主客体识别，从而使组装体解体，使 药物释放。
3)另一方案：因为D18-Azo组装体的内部为疏水结构，外部为亲水 的DNA链，因此该组装体可通过碱基互补配对策略负载亲水的药 物分子，通过加入环糊精使其与两亲体中偶氮苯进行主客体识别， 从而使组装体解体，使药物释放。
Claims (5)
1.一种核酸枝接偶氮苯的组装体的制备方法，其特征在于，将偶氮苯衍生物偶联到CpG寡脱氧核苷酸的末端得到所述的枝接核酸的偶氮苯；所述枝接核酸的荧光分子在水溶液中加热组装得到核酸枝接偶氮苯的组装体；
CpG寡脱氧核苷酸为：5'-TTTCCCCTAACCCC-3'；
偶氮苯衍生物的结构通式I为：
；
所述核酸枝接偶氮苯的组装体的结构通式I为：
其中S1为单链DNA，单链DNA的核酸序列：5'-TTTCCCCTAACCCC-3'。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述偶氮苯衍生物偶联到CpG寡脱氧核苷酸的末端的步骤包括：
(1)取所述CpG寡脱氧核苷酸加入被惰性气体保护的5-乙硫基四唑溶剂中；
(2)在惰性气体氛围下，将所述偶氮苯衍生物溶解在无水无氧的二氯甲烷中，在步骤(1)的体系中，在惰性气体保护状态下超声1min，静置整晚；
(3)反应结束后依次用二氯甲烷、乙腈洗涤，氧化剂氧化，氧化结束后继续用二氯甲烷、乙腈洗涤，浓氨水氨解，通过DNA浓缩仪浓缩，最后通过割胶法，得到枝接核酸的偶氮苯；
所述氧化剂为I2/THF/Py，氧化时间为2min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述偶氮苯衍生物的制备方法包括以下步骤：
(1)将4-甲氧基对偶氮苯酚、溴己醇、无水K2CO3按照1:1.58:1.2的质量比混合和乙醇溶液置于干燥烧瓶中，加入KI做催化剂，80 ℃油浴加热，搅拌回流反应24 h，趁热将反应液抽滤，再用乙醇溶液洗涤滤饼至无色，收集滤液用冰乙醇沉淀，沉淀在60 ℃烘箱烘干，得到4-甲氧基-4’-己醇氧基-偶氮苯；
(2)将步骤(1)制备的4-甲氧基-4’-己醇氧基-偶氮苯置于充满惰性气体的烧瓶中，在惰性气体保护下，加入N,N-二异丙基乙胺和2-氰基乙基二异丙基氯代亚磷酰胺，室温条件下搅拌反应一个小时；
(3)反应结束后加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭，分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液萃取，旋干，惰性气体保护，得到所述的偶氮苯衍生物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶液为水与四氢呋喃按体积比20：1配置的水溶液，枝接核酸的偶氮苯在该水溶液中组装的条件为90℃加热30min。
5.如权利要求1~4任一一项所述的方法制备的核酸枝接偶氮苯的组装体，其特征在于，所述单链DNA链含有14个碱基。
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