CN106620725A - 一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种集光学和光声于一体的双模态纳米分子影像探针及其制备方法和应用，其由核酸纳米结构‑金纳米棒‑量子点复合物形成，所述核酸纳米结构是利用DNA折纸技术构建的二维和/或三维纳米结构；所述金纳米棒为表面进行DNA修饰的金纳米棒。本发明制备的核酸纳米结构‑金纳米棒‑量子点复合物作为光学及光声成像探针，不但能够保证其偶联的光声学的吸收对比增强效果，而且负载的量子点具有很好的光学成像质量效果，可显著提高检测灵敏度并延长活体成像的检测时间，该材料制备方法工艺简单、成本低且方便易行。

Description

一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及光学光声成像领域，具体而言，本发明涉及了一种集光学和光声于一体的、以核酸纳米结构为基础自组装的双模态纳米分子影像探针及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的重要疾病，是威胁人类生命的头号杀手。面对全球恶性肿瘤发生率和死亡率的不断攀升，以及目前诊断和治疗方法的局限性，发展高效低毒的诊疗一体化治疗方法已成为迫在眉睫的重大问题。如何有效的利用较小侵入性且高灵敏度的分子影像手段进行恶性肿瘤的早期筛查和切除术中导航，如何进一步实现肿瘤诊断与治疗一体化，是现今癌症研究中的热点。
分子探针是成像成功的关键，它的合成和检测是分子影像学研究中最热门、最前沿的问题之一。而实际上，人们对探针的研究，没有一种完美的影像技术能够提供检测对象的所有信息，任何一种影像技术都存在自身优缺点；传统的分子探针中，同样也没有一种能够提供关于组织的所有结构、功能和分子信息。为了克服这些问题，人们开始研究多模态分子探针，使得在诊断、治疗和监测等方面可以获得全方位的信息，必将成为未来进行体内成像的重要工具。相对于传统高损伤的手术治疗和高毒性的放化疗治疗策略，利用纳米探针在活体进行光学(Optical imaging)及光声成像(Photoacoustic imaging)指导下的双模态的癌症诊疗一体化策略，以其对肿瘤较好的疗效和对机体较小的侵入损伤因而具有极其重要的应用前景。
核酸纳米材料具有结构精确可控、易于化学修饰、生物可降解等特点，是一种很有潜力的抗肿瘤分子影像探针，在药物高效靶向运输、多功能复合诊疗平台等方面有非常广阔的应用前景。研制高效、低毒、靶向、多功能的核酸纳米结构作为运输载体，有望为开发新一代抗肿瘤药物运输系统提供新思路、新途径和新手段，具有重大的实际意义。DNA折纸(DNA origami)是一种新颖而独特的DNA自组装纳米技术，为核酸纳米材料的制备提供了一个新的思路，现在被广泛用来从生物大分子脱氧核糖核酸(DNA)自下而上(Bottom-up)的制作各种纳米尺度的二维和三维的DNA图案和形状，它是利用一条长的单链核苷酸序列与若干条短的寡核苷酸序列通过碱基互补配对原则进行杂交形成预先设计的结构，通过这项技术，可以简单方便的制备结构复杂的二维或三维DNA纳米材料。因此，研制高效、低毒、靶向、可控的DNA折纸纳米结构作为药物运输载体，具有非常重大的实际意义。
贵金属纳米材料，由于其具有光声的特点而引起了广泛关注并成为了肿瘤治疗方面的另一研究热点，其中金纳米棒最具有一定的代表意义。金纳米棒近红外区域具有良好的等离子共振效应(Surface Plasmon Resonance，SPR)，能够被可见光或者近红外光诱导并将其转化为热量释放出来，可用来进行光热治疗；利用其等离子共振峰峰波长相近的双光子激光进行激发则产生双光子荧光和光声信号，可被用作活体诊断成像的造影剂。尽管利用贵金属纳米颗粒及其组装体作为造影剂进行光声成像和光热治疗有诸多的好处，如制备简单、形貌丰富、尺寸可控以及生物安全性等优势，但应用于肿瘤的早期检测和治疗的实践中，仍然存在许多的问题。如贵金属纳米材料结构大多尺寸较小，对于肿瘤区域没有主动选择性，限制其进一步应用。如果能够将贵金属纳米颗粒或其组装结构进行有效装载，并对纳米载体进行肿瘤细胞和组织靶向功能修饰，则既可以提高造影材料对肿瘤组织的有效递送，又可以避免纳米材料对正常组织和细胞的伤害，从而有效杀伤肿瘤；还可在同一纳米载体上同时装载成像试剂/化疗药物等，最终实现高效、低毒、靶向、影像探针导航的诊疗一体化纳米平台。
量子点(Quantum Dot)是20世纪90年代提出来的一个新概念。量子点一般为球形或类球形，又可称为纳米晶，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的纳米颗粒。量子点的粒径一般介于1-10nm之间，由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。作为一种新颖的半导体纳米材料，与传统的有机荧光染料相比，量子点具有许多独特的纳米性质和多种优势，如吸收光谱宽、发射光谱窄且对称；生物相容性好；具有很好的光稳定性，在较长时间的激发光照射下荧光强度都不会降低，因此，量子点可用于高灵敏度的检测和荧光显微镜下长时间持续的观测，使其作为一种新型的荧光探针在生物医学领域的应用得到了快速的发展。总而言之，量子点具有激发光谱宽且连续分布，而发射光谱窄而对称，颜色可调，光化学稳定性高，荧光寿命长等优越的荧光特性，是一种理想的荧光探针。量子点特殊的光学性质使得它在生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因组学、蛋白质组学、药物筛选、生物大分子相互作用等研究中有极大的应用前景。基于量子效应，量子点在太阳能电池，发光器件，光学生物标记等领域具有广泛的应用前景。
如何构建可控的微纳米结构作为光学及光声成像的分子影像探针是现今急需解决的核心问题之一，该探针需满足形态和粒径容易控制、化学结构容易修饰、生物相容性较好等必要条件。恰恰DNA纳米材料具有结构精确可控、易于功能化修饰、可生物降解等特点符合这些要求，是一种很有潜力的生物型材料，在构建功能型材料等方面有非常好的优势。DNA修饰后的金纳米棒，通过DNA之间的相互杂交连接到DNA折纸结构上，此外，量子点利用链霉亲和素与生物素相互反应连接到DNA折纸结构上。
通过上述分析，前期已有的发明都有关于核酸纳米结构用于药物载体、小动物光热治疗，但是目前尚无将核酸纳米材料作为载体将金纳米棒和量子点结合在一起的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针及其制备方法和应用。本发明所提供的双模态分子影像探针是集光学成像和光声成像于一体的，其利用核酸纳米结构将金纳米棒和量子点结合在一起，实现了双模态分子影像探针在动物水平上的光学及光声成像效果。
为达此目的，本发明采用了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针，该双模态分子影像探针为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物。
本发明提供的双模态分子影像探针能够促进光敏成分在肿瘤组织中的富集从而更有效的进行活体光声成像，同时由于其负载的量子点使其具有良好的光学成像质量，从而实现了集光学和光声成像于一体。
本发明中，所述核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物是由核酸纳米结构作为载体将金纳米棒和量子点结合在一起，从而得到该复合物。
本发明中，所述核酸纳米结构是利用DNA折纸技术构建的二维和/或三维纳米结构，其具体可以是通过脚手架链(scaffold chains)与辅助折叠的订书钉链(staplestrands)进行杂交而自组装形成的核酸纳米结构，所述脚手架链与所述订书钉链通过碱基互补配对原则进行杂交。
其中所述脚手架链可选自M13噬菌体基因组DNA、基于M13噬菌体基因组DNA进行改造的各种单链环状DNA、Lambda噬菌体基因组DNA、利用点突变技术和位点-延伸非依赖克隆(SLIC)技术从给定质粒大规模生产长度可调的单链环状DNA链、通过PCR得到的M13噬菌体基因组DNA片段、Lambda噬菌体基因组DNA片段和利用体外转录得到的RNA片段中的一种或至少两种的混合物。除此之外，还可使用其它脚手架链，只要其能够满足特定位点上的碱基互补配对，使订书钉链能够辅助脚手架链进行折叠自组装形成核酸纳米结构。优选地，所述脚手架链为M13噬菌体基因组DNA。
所述辅助折叠的订书钉链为人工合成的寡核苷酸序列，其选取5-20个位点延伸出了捕获序列，其捕获序列与后续DNA修饰金纳米棒采用的序列互补。
由此可见，优选的核酸纳米结构为M13噬菌体基因组DNA与人工合成的寡核苷酸序列通过碱基互补配对原则进行杂交自组装而形成。
优选地，使用DNA折纸技术可以将所述核酸纳米结构构建成三角形、长方形、纳米管状、四面体、巴基球形、纳米片状、带状或笼状。
本发明中，所述金纳米棒为表面进行寡核苷酸序列修饰的金纳米棒；除了该金纳米棒以外，还可以采用金纳米壳、表面包银的金纳米棒或金纳米笼等。
所述金纳米棒可使用本领域内任意已知方法制备。在一个优选的实施方案中，所述金纳米棒为表面进行巯基化DNA修饰的金纳米棒。
本发明中所述金纳米棒与所述核酸纳米结构通过寡核苷酸序列杂交偶联。
本领域的技术人员将会理解，本发明的金纳米棒的制备方法并不必然依赖于上述详细工艺及参数，此处给出的仅仅是较优的技术方案。本领域技术人员可以根据其经验制备所需的金纳米棒。
第二方面，本发明提供了如第一方面所述集光学和光声于一体的双模态分子影像探针的制备方法，其包括以下步骤：
(1)制备核酸纳米结构；
(2)制备金纳米棒；
(3)将步骤(1)得到的核酸纳米结构与步骤(2)得到的金纳米棒混合，以梯度循环的方式降温退火，得到负载有金纳米棒的核酸纳米结构，并进行电泳除去过量的金纳米棒；
(4)将量子点与步骤(3)得到的纯化后的负载有金纳米棒的核酸纳米结构混合，经孵育，得到核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物。
在本发明所述集光学和光声于一体的双模态分子影像探针的制备方法中，之所以能形成核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物，其中有两个重要的参数起到十分关键的作用，一是核酸纳米结构与金纳米棒的摩尔比，二是量子点与负载有金纳米棒的核酸纳米结构的摩尔比，尤其以后者为主。也就是说，本发明构成复合物的三种成分之间具有一定的配比关系，只有当同时满足核酸纳米结构与金纳米棒的摩尔比为1:(1-3)以及量子点与负载有金纳米棒的核酸纳米结构的摩尔比为(3-5):1时，其才能制备得到核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物，并使得该复合物具有相比单独采用这三种成分或任意两种成分得到的复合物，具有更优异的光声学吸收对比增强效果以及更好的光学成像质量。
优选地，本发明采用核酸纳米结构与金纳米棒的摩尔比为1:2以及量子点与负载有金纳米棒的核酸纳米结构的摩尔比为4:1的配比关系。由于在溶液状态下量子点和金纳米棒会存在相互作用的影响，容易导致金纳米棒高效地淬灭量子点，因此本发明对量子点与金纳米棒的摩尔比进行了优化，当二者的摩尔比为2:1时，其不仅保证了量子点与金纳米棒的DNA折纸复合结构完全组装，还保证了金纳米棒不会将量子点淬灭。
本发明的步骤(1)中，所述核酸纳米结构的制备方法包括以下步骤：
将订书钉链混合溶液加入到脚手架链溶液中，所述脚手架链与订书钉链的摩尔比为1:(2-50)，混匀；以90-100℃为起始温度进行降温退火至15-25℃，整个过程持续10h以上，制得所述核酸纳米结构。
所述脚手架链与订书钉链的摩尔比为1:(2-50)，例如1:2、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:18、1:20、1:25、1:28、1:30、1:40或1:50，优选为1:(5-30)，进一步优选为1:(10-25)。
所述降温退火的起始温度为90-100℃，例如90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或100℃，优选为93-96℃，进一步优选为95℃。
所述降温退火的终点温度为15-25℃，例如15℃、18℃、19℃、20℃、22℃或25℃，优选为18-22℃，进一步优选为20℃。
所述降温退火过程的持续时间为10h以上，例如10h、12h、14h、15h、18h、20h、25h、26h或28h，优选为10-26h，进一步优选为12-24h。
本发明步骤(2)中，所述金纳米棒通过以下方法制备：利用晶种诱导生长法制备金纳米棒；使用十六烷基三甲基溴化铵进行修饰；使用合成的巯基化寡核苷酸序列替代十六烷基三甲基溴化铵，由此完成金纳米棒的DNA表面修饰。
本发明步骤(3)中，所述核酸纳米结构与金纳米棒的摩尔比为1:(1-3)，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3，优选为1:2。
所述步骤(3)中的降温退火为从40-45℃(例如40℃、41℃、42℃、43℃或45℃)，逐渐降温退火至20-25℃(例如20℃、21℃、22℃、23℃或25℃)，此退火降温过程为一个循环，共30-60个循环(例如循环数为30、32、35、40、45、50、55或60)，优选30-45个循环，每摄氏度℃为一个梯度，每梯度保持3-5min(例如3min、3.5min、4min、4.5min或5min)。
所述步骤(3)中的电泳条件为：0.5-1％琼脂糖胶、电泳环境温度4-10℃、电泳缓冲液为0.5-1×TBE缓冲液并含5-11mM Mg2+、电泳电压为10-15V/cm、且电泳时间为30-50min。
本发明步骤(4)中，所述量子点与负载有金纳米棒的核酸纳米结构的摩尔比为(3-5):1，例如3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1，优选为4:1。
所述步骤(4)中的孵育在室温下进行，优选在18-25℃下进行。
所述步骤(4)中的孵育的时间为1-3h，例如1h、1.5h、2h、2.5h或3h，优选为2h。
第三方面，本发明还提供了如第一方面所述的集光学和光声于一体的双模态分子影像探针在制备活体光学和光声成像造影剂或肿瘤手术导航探针中的应用。
所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺癌或非何金氏淋巴瘤中的一种或至少两种的组合。
与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明所提供的双模态分子影像探针是集光学成像和光声成像于一体的，其利用核酸纳米结构将金纳米棒和量子点结合在一起，实现了双模态分子影像探针在动物水平上的光学及光声成像效果。
附图说明
图1为DNA折纸纳米结构-金纳米棒-量子点复合结构电镜图；
图2为注射核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物(Orgami-AuNR-QD)，核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物(Origami+AuNR+QD)样品后裸鼠的光学成像结果；
图3为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物(Orgami-AuNR-QD)，核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物(Origami+AuNR+QD)以及游离金纳米棒样品(AuNR)的仿体光声成像结果，其中图3-A为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物以及核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物样品的仿体光声成像结果，其每个成像结果的左侧圆环为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物样品，右侧为核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物样品，图3-B为游离金纳米棒样品的仿体光声成像结果，其左侧和中间的成像结果分别包括两个浓度的游离金纳米棒样品，右侧的成像结果中均为0.375nM的游离金纳米棒样品；
图4为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物(Orgami-AuNR-QD)，核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物(Origami+AuNR+QD)以及游离金纳米棒样品(AuNR)的光声成像数据的分析。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
器材：Mastercycler Pro梯度PCR仪(Eppendorf，德国)，5810R小型高速离心机(Eppendorf，德国)，UV-2450紫外-可见分光光度计(岛津，日本)，透射电镜(日立)，双光子荧光显微镜(Olympus，日本)，全自动化学发光/荧光图像分析系统，超纯水处理系统(Miilipore Reference-Q，德国)，等离子处理机(Emitch K100X，美国)。
原料：短链核苷酸序列(订书钉链，Nature，2006，440，297-302)购自上海英潍捷基生物技术有限公司，M13噬菌体基因组DNA购自New England Biolabs公司。量子点购自美国Life Technology公司。CTAB、氯金酸、硼氢化钠、硝酸银等其他原料均购自美国Sigma-Aldrich公司。
试剂：实验中所用的缓冲溶液有TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)和PBS缓冲溶液(pH7.4)。其中，1×TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)的组分为：4×10-2mol/L Tris，2×10-2mol/L乙酸，2.0×10-3mol/L EDTA和1.25×10-2mol/L醋酸镁；1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)的组成为：136.9×10-3mol/L(8.00g/L)NaCl，2.68×10-3mol/L(0.20g/L)KCl，9.75×10-3mol/L(1.56g/L)Na2HPO4·H2O和1.47×10-3mol/L(0.20g/L)KH2PO4；这些缓冲溶液所用的试剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司。
实施例1制备核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物
(1)核酸纳米结构的合成
将终浓度为10nM的M13噬菌体基因组DNA和终浓度为100nM的订书钉链及捕获订书钉链混合在终浓度为1×TAE/Mg2+(pH＝8.3)的溶液中，最终获得混合溶液的体积为100μL。控制上述混合溶液的温度从95℃逐步退温降火至20℃，整个降温过程控制在12小时以上，从而获得既定的核酸纳米结构。
(2)利用晶种诱导生长法，表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，还原剂为抗坏血酸，通过控制AgNO3浓度来制备金纳米棒(参见Chem Mater,2003,15(10):1957-62.)。具体方法如下：
(a)晶种的合成：取7.5mL浓度为100mM的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，50μL浓度为2％(w/v)的HAuCl4加入至20mL圆底烧瓶中。搅拌均匀后，迅速加入浓度为6mM预冷的NaBH41000μL，再次搅拌均匀，约2min，溶液颜色逐渐由无色变为棕黄色后，停止搅拌，将烧瓶移至30℃水浴中静置2小时，备用。
(b)金纳米棒的生长：在装有10mL浓度为100mM的CTAB的20mL圆底烧瓶中加入85μL浓度为2％(w/v)的HAuCl4，液体颜色为橙色。搅拌均匀后，在该混合液中加入80μL浓度为10mM的AgNO3，缓慢搅拌。再次搅拌均匀后，继续在高速搅拌的状态下加入60μL浓度为100mM的抗坏血酸，温柔振荡至溶液为无色。最后加入20μL步骤(a)合成的晶种溶液。搅拌均匀后，将溶液置于30℃温水浴中静置10小时，溶液为紫红色。
(c)金纳米棒的纯化：将合成的金纳米棒转移至15mL离心管内(8000rpm，30分钟)进行超速离心。倒掉上清溶液后，在离心管内加入10mL去离子水重新分散，再次以8000rpm的条件离心30min，反复数次后保留底部沉淀，即金纳米棒，加入20μL去离子水分散。通过紫外-可见分光光度计测定所获得的金纳米棒的浓度。
(d)利用巯基化DNA修饰金纳米棒，具体方法如下：
取200倍过量的TCEP(200mM)试剂对浓度为100μM巯基化DNA(ACGCTTTTTTTTTTTTTTT-SH，100μM)进行还原，反应时间为4小时，然后通过G-25体积排阻柱离心除去过量的TCEP。配制修饰缓冲溶液(89mM Tris base、89mM硼酸、2mM EDTA、500mMNaCl和0.01％SDS)，用pH计对溶液pH值进行监测，保证溶液pH值为5-6后，加入浓度高于金纳米棒1000倍的还原后的巯基化DNA，将上述溶液混合均匀后，在高效振动时加入金纳米棒，混合均匀后，静置于30℃水浴中过夜备用。
对于修饰了巯基化DNA的金纳米棒，放入离心机内进行离心(8000rpm，30min)，回收所得的金纳米棒，加入适量去离子水，重复上述离心过程，洗去过量的DNA。
(3)DNA折纸结构与金纳米棒的组装
将经过PCR仪器程序控温组装后的核酸纳米结构，利用离心柱(100kDa)纯化去除过量的DNA订书钉链和捕获链。将已修饰的金纳米棒和DNA折纸结构以2:1的比例进行混合，再次置于PCR仪器内对其进行控温退火，控温条件为：45℃-25℃为一个循环，每℃保持3min，重复20个循环以上，以保证修饰在金纳米棒上的DNA分子可以同DNA折纸结构上的捕获订书钉链杂交效果。
(4)量子点与载有金纳米棒的DNA折纸复合结构的组装
将4倍过量的量子点与载有金纳米棒的DNA折纸复合结构混合，在室温的条件下即可，孵育2小时，以保证在室温条件下生物素和链霉亲和素充分反应。
以核酸纳米结构为载体的金纳米棒和量子点组装产物的提纯
电泳纯化：制备1％的琼脂糖(1×TBE缓冲溶液，Agrose试剂)，在加热条件下溶解，加入2.5μL溴化乙锭对其预先染色。将修饰了DNA的金纳米棒、DNA折纸结构、DNA-金纳米棒-量子点加入至所制备的1％琼脂糖凝胶孔中，对上述产物进行电泳分离，电泳所需离子环境为0.5×TBE缓冲溶液，10mM Mg2+。电泳所需要的电压为85V，45min。在白光和紫外光下分别确定组合产物在琼脂糖凝胶中的位置，并对其进行拍照存储，切下目标条带，利用凝胶纯化柱在4℃以离心的方法得到纯净浓缩的产物。
采用透射电子显微镜对以核酸纳米结构为载体的量子点和金纳米棒组装产物的表征
碳支持膜(铜网)经等离子体处理机辉光溅射进行处理，滴加10μL上述纯化后的复合结构的产物，沉积至铜网10min后，吸弃多余液体，再次滴加浓度为0.7％的醋酸双氧铀对铜网进行负染，沉积30秒钟后，滤纸吸干醋酸双氧铀，待干燥后用透射电镜观察样品。以型号为HT7700的投射电子显微镜在80kV的条件下，对产物拍照表征。
如图1所示，图1为DNA折纸纳米结构-金纳米棒-量子点复合结构电镜图，从透射电子显微镜可见，DNA折纸纳米结构-金纳米棒-量子点复合结构形成良好，在组装和纯化过程的情况下，核酸纳米结构仍旧能够保持完好的形貌，无不利影响。
实施例2核酸纳米结构-金纳米棒-量子点的活体光学成像
将实施例1制备得到的核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物和对照组核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物两组样品各取100μL在5-6周雌性BALB/C裸鼠背部皮下进行给药处理，注射后利用小动物光学成像系统对裸鼠进行活体光学成像。
如图2所示为注射样品后裸鼠的光学成像结果。由图2可见，将量子点组装在载有金纳米棒的核酸纳米结构上的光学信号相对于没有进行组装而只是将核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合的情况下的光学信号显著，这说明经组装后，核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物相比核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物具有更强的光学信号。
实施例3核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物的仿体光声成像
图3所示为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物、核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物以及游离金纳米棒样品的仿体光声成像结果，分三组进行对比实验，分别为金纳米棒组(100μL)，核酸纳米结构-金纳米棒-量子点(100μL)复合物和核酸纳米结构、金纳米棒与量子点的混合物(100μL)加入到仿体内进行光声实验，分别在浓度为6nM、3nM、1.5nM、0.75nM、0.375nM的情况下对光声信号进行采集。其中图3-A为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物以及核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物样品的仿体光声成像结果，其每个成像结果的左侧圆环为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物样品，右侧为核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物样品，图3-B为游离金纳米棒样品的仿体光声成像结果，其左侧和中间的成像结果分别包括两个浓度的游离金纳米棒样品，右侧的成像结果中均为0.375nM的游离金纳米棒样品。
图4为对光声成像数据的分析，可以观察到与单独金纳米棒样品、核酸纳米结构、金纳米棒与量子点混合物类似，核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物信号可以较好的吻合，该结果进一步证明了核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物是一种良好的纳米探针材料，可以进行实时的光声成像，有望为肿瘤检测双模态分子影像探针提供基础，具有极大的应用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针，其特征在于，所述双模态分子影像探针为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物。
2.如权利要求1所述的双模态分子影像探针，其特征在于，所述核酸纳米结构是利用DNA折纸技术构建的二维和/或三维纳米结构；
优选地，所述核酸纳米结构是通过脚手架链与辅助折叠的订书钉链进行杂交而自组装形成的核酸纳米结构。
3.如权利要求1或2所述的双模态分子影像探针，其特征在于，所述金纳米棒为表面进行寡核苷酸序列修饰的金纳米棒，优选为表面进行巯基化DNA修饰的金纳米棒。
4.如权利要求1-3之一所述的集光学和光声于一体的双模态分子影像探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备核酸纳米结构；
(2)制备金纳米棒；
(3)将步骤(1)得到的核酸纳米结构与步骤(2)得到的金纳米棒混合，以梯度循环的方式降温退火，得到负载有金纳米棒的核酸纳米结构，并进行电泳除去过量的金纳米棒；
(4)将量子点与步骤(3)得到的纯化后的负载有金纳米棒的核酸纳米结构混合，经孵育，得到核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述核酸纳米结构的制备方法包括以下步骤：
将订书钉链混合溶液加入到脚手架链溶液中，所述脚手架链与订书钉链的摩尔比为1:(2-50)，混匀；以90-100℃为起始温度进行降温退火至15-25℃，整个过程持续10h以上，得到所述核酸纳米结构；
优选地，所述脚手架链与订书钉链的摩尔比为1:(5-30)，优选1:(10-25)；
优选地，所述降温退火的起始温度为93-96℃，优选95℃；
优选地，所述降温退火的终点温度为18-22℃，优选20℃；
优选地，所述降温退火过程的持续时间为10-26h，优选12-24h。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述金纳米棒通过以下方法制备：利用晶种诱导生长法制备金纳米棒；使用十六烷基三甲基溴化铵进行修饰；使用合成的巯基化寡核苷酸序列替代十六烷基三甲基溴化铵，由此完成金纳米棒的DNA表面修饰。
7.如权利要求4-6之一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述核酸纳米结构与金纳米棒的摩尔比为1:(1-3)，优选为1:2；
优选地，所述降温退火为从40-45℃，逐渐降温退火至20-25℃，此退火降温过程为一个循环，共30-60个循环，优选30-45个循环，每摄氏度℃为一个梯度，每梯度保持3-5min；
优选地，所述电泳的条件为：0.5-1％琼脂糖胶、电泳环境温度4-10℃、电泳缓冲液为0.5-1×TBE缓冲液并含5-11mM Mg2+、电泳电压为10-15V/cm、且电泳时间为30-50min。
8.如权利要求4-7之一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述量子点与负载有金纳米棒的核酸纳米结构的摩尔比为(3-5):1，优选为4:1；
优选地，所述孵育在室温下进行，优选在18-25℃下进行；
优选地，所述孵育的时间为1-3h，优选2h。
9.如权利要求1-3之一所述的集光学和光声于一体的双模态分子影像探针在制备活体光学和光声成像造影剂或肿瘤手术导航探针中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺癌或非何金氏淋巴瘤中的一种或至少两种的组合。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108273056A (zh) * 2018-02-01 2018-07-13 中国科学院长春应用化学研究所 一种改性金纳米材料/核酸探针纳米体系及其制备方法、应用
CN108593558A (zh) * 2018-04-04 2018-09-28 深圳大学 一种用于Hg2+检测的光声检测探针及其制备方法
CN110311049A (zh) * 2019-07-03 2019-10-08 京东方科技集团股份有限公司 量子点显示基板及其制作方法、显示装置
CN110938422A (zh) * 2018-09-25 2020-03-31 Tcl集团股份有限公司 量子点的纯化方法
CN113185973A (zh) * 2021-04-06 2021-07-30 上海交通大学 零维纳米碳材料/折纸结构脱氧核糖核酸复合材料的制备方法
CN113332484A (zh) * 2021-05-08 2021-09-03 海南大学 一种光热抗菌纳米纤维膜的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101666805A (zh) * 2009-07-15 2010-03-10 苏州纳米技术与纳米仿生研究所 特异性蛋白检测芯片的制备方法
CN103433483A (zh) * 2013-08-21 2013-12-11 江南大学 一种金纳米粒子-半导体量子点异质结构手性组装体的制备方法
CN103539065A (zh) * 2012-07-10 2014-01-29 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 构建纳米颗粒和纳米棒组合结构的方法及构建的组合结构
CN104324375A (zh) * 2014-08-26 2015-02-04 国家纳米科学中心 一种用于活体光声成像的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101666805A (zh) * 2009-07-15 2010-03-10 苏州纳米技术与纳米仿生研究所 特异性蛋白检测芯片的制备方法
CN103539065A (zh) * 2012-07-10 2014-01-29 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 构建纳米颗粒和纳米棒组合结构的方法及构建的组合结构
CN103433483A (zh) * 2013-08-21 2013-12-11 江南大学 一种金纳米粒子-半导体量子点异质结构手性组装体的制备方法
CN104324375A (zh) * 2014-08-26 2015-02-04 国家纳米科学中心 一种用于活体光声成像的核酸纳米结构载体-贵金属光敏造影剂复合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI ZHANG ET AL: "Construction of DNA-templated nanoparticle assemblies using click DNA ligation", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
YANG DU ET AL: "DNA-Nanostructure–Gold-Nanorod Hybrids for Enhanced In Vivo Optoacoustic Imaging and Photothermal Therapy", 《ADV. MATER.》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108273056A (zh) * 2018-02-01 2018-07-13 中国科学院长春应用化学研究所 一种改性金纳米材料/核酸探针纳米体系及其制备方法、应用
CN108593558A (zh) * 2018-04-04 2018-09-28 深圳大学 一种用于Hg2+检测的光声检测探针及其制备方法
CN110938422A (zh) * 2018-09-25 2020-03-31 Tcl集团股份有限公司 量子点的纯化方法
CN110311049A (zh) * 2019-07-03 2019-10-08 京东方科技集团股份有限公司 量子点显示基板及其制作方法、显示装置
WO2021000891A1 (zh) * 2019-07-03 2021-01-07 京东方科技集团股份有限公司 量子点显示基板及其制作方法、显示装置
CN113185973A (zh) * 2021-04-06 2021-07-30 上海交通大学 零维纳米碳材料/折纸结构脱氧核糖核酸复合材料的制备方法
CN113185973B (zh) * 2021-04-06 2023-04-28 上海交通大学 零维纳米碳材料/折纸结构脱氧核糖核酸复合材料的制备方法
CN113332484A (zh) * 2021-05-08 2021-09-03 海南大学 一种光热抗菌纳米纤维膜的制备方法

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