CN1111249A - 三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基在核苷合成中作为保护基 - Google Patents

三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基在核苷合成中作为保护基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在其基本结构中带有被三-4，4′， 4″-叔丁基苯基甲基保护的伯羟基的核苷、核苷酸 和低聚核苷酸，还涉及一种所述核苷和核苷酸的制备 方法，也涉及一种低聚核苷酸的制备方法和所说的被 保护的核苷、核苷酸和低聚核苷酸的应用。

Description

本发明涉及在其基本结构中带有被三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基所保护的伯羟基的核苷，核苷酸和低聚核苷酸，还涉及所述的核苷和核苷酸的制备方法，低聚核苷酸的制备方法和所述的被保护的核苷，核苷酸和低聚核苷酸的使用。
由于低聚核苷酸具有与核酸（即反义低聚核苷酸）相互作用的能力和与此相关的生物活性，它们很受关注，在低聚核苷酸的合成之前，所使用的核苷和核苷类似物在它们的5′-位上用保护基进行保护。代表性的这些基团是苯基呫吨-9-基和三苯甲基保护基[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面体48：2223-2311（1992）]。就苯基呫吨-9-基以及二-对-茴香基苯基甲基（DMTr）和对-茴香基二苯基甲基（MMTr）而言，由于区域选择性差造成产率的降低，甚至在引入这些基团时也是这样。带有较长的O-烷基链的这些三苯甲基基团的另一个缺点是，尽管由它们形成的低聚核苷酸的色谱纯化变得更容易了，但被所述基团保护的核苷单体只具有较小的形成固体或晶状固体的趋势，因此严重地限制了它们的技术使用[Takenaka，S.，Dohtsu，K.，Takagi，M.，分析科学（Anal.Sci）8：3-7（1992）]。
三-4，4′，4″-甲氧基三苯甲基对低聚核苷酸的合成来说太不稳定并且可在亚磷酸三酯方法的偶合条件下被除去[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面体48：2233（1992）]。因为制备和消除的条件较复杂，特别是在其自动化合成中，所以4，4′，4″-三（苯甲酰氧基）三苯甲基（TBTr）和4，4′，4″-三（4，5-二氯苯二甲酰亚氨基）三苯甲基（CPTr）对一般性使用来说太麻烦[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面体48：2235（1992）]。其它的三苯甲基保护基团[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面体48：2236（1992）]使核苷单体仅以适度的产率进行衍生。衍生物的结晶通常是不可能的。
令人惊奇的是，现已发现通过用三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基（＝三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基或TTTr）保护5′-羟基能将核苷和核苷类似物制成易于纯化的无定形或晶状固体。还令人惊奇地发现在5′-位置上带有TTTr基团的低聚核苷酸基本上是易于纯化的，特别是用色谱方法如反相HPLC。
作为本发明的一个方面，本发明涉及带有取代的或未取代的核酸碱基B的残基和一个被保护的伯羟基的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或由至少两种这样的相同或不同的核苷酸和/或核苷酸类似物制得的低聚核苷酸，保护基是TTTr。
TTTr基团本身是已知的。Marvel等人[Marvel，C.S.，Kaplan，J.F.，Himel，C.M.，J.Am.Chem.Soc.63;1892～1896（1941）]公开了与烷基取代的六芳基乙烷的离解行为有关的TTTrCl，TTTrOH和TTTr基团的过氧化物。Ashton等人[Ashton，P.R.，Philip，D.，Spencer，N.，Stoddart，J.F.，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1124-1128（1992）]描述了TTTr基团在处于纳米范围的机制的建立中，尤其是在叫做rotaxanes和假rotaxanes的建立中作为保护基。
作为核酸化学中新的保护基，TTTr保护基的特点是它可以惊人地易于引入，可以比通常的DMTr和苯基呫吨-9-基高的区域选择性实现该基团的引入。核苷和核苷类似物经常可以不用色谱法而从反应混合物中分离出来，因此它们可以非常有利地用于大规模制备用于DNA合成（自动化合成）的核苷单元。此外，新的低聚核苷酸能够比那些带有通常的保护基的低聚核苷酸更容易地用已知的方法，比较方便的是用反相HPLC进行纯化。
TTTr基能与低聚核苷酸化学中标准的已知的保护基[Beaucage，S.L.，Iyer，R.，四面体48：表1～3（1992）]，比较方便的是与在核酸碱基中游离氨基的保护基同时使用，例如，与未取代的或取代的含有3～12，优选4～8，最好5或6个环碳原子的环烷基羰基一起使用，优选的是与环己烷羧基（CC）一起使用，或是与脒保护基，典型的是二甲基氨基亚甲基一起使用。本发明的核苷和核苷类似物适用于以固相方法，甚至以溶液方法合成低聚核苷酸。
在本发明范围内优选地带有用于连接核苷酸键的仲羟基的所有适宜的核苷，核苷类似物，核苷酸，核苷酸类似物或低聚核苷酸是已知的并在技术文献中，例如，在Townsedn，L.B.（Hrsg.），核苷和核苷酸化学1，Plenum    Press，New    York（1988）中有述，或者能用已知的方法制备。它们通常可以由一个被-O-或-S-间隔开的开链碳骨架组成或由一个碳环或带有一个核酸碱基B的O-或S-杂环结构组成。核苷可以是天然的或合成的核苷。
开链碳骨架可以适当地含有3～12，优选3～6个碳原子。碳环和杂环结构代表性地可以是含有3～12，优选3～8，最好4或5个环碳原子的单环系。它们也可以是含有5～16，优选8～16个碳原子的双环至四环系。这些结构可以进一步含有取代基，代表性的是被保护的羟基。
在本发明的优选实施方案中核苷是5元碳环或呋喃化合物。
如果核酸碱基B是一个嘌呤基或它的类似物，所说的基团可以是式Ⅰ，Ⅰa，Ⅰb，Ⅰc，Ⅰd或Ⅰe的基团
Figure 941153908_IMG6
Figure 941153908_IMG7
其中R1是H，Cl，Br，NH2或OH，R2，R3和R4各自独立地为H，OH，SH，NH2，NHNH2，NH2OH，1～12个碳原子的NHO-烷基，F，Cl，Br，1～12个碳原子的烷基或羟基烷基或氨基烷基或烷氧基或烷硫基，其中羟基和氨基是未取代的或被保护基取代的或是苯基，苄基，含有1～20个碳原子的伯氨基或含有2～30个碳原子的仲氨基，R5是H或C1-C4烷基。
伯氨基优选含有1～12，最好含有1～6个碳原子，仲氨基优选含有2～12，最好含有2～6个碳原子。
优选含有1-6个碳原子的烷基，烷氧基，烷硫基，羟基烷基和氨基烷基的说明性实例是甲基、乙基和丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基的异构体，以及相应的烷氧基、烷硫基、羟基烷基和氨基烷基。烷基、烷氧基、烷硫基、羟基烷基和氨基烷基优选地每个含有1～4个碳原子。优选地烷基、烷氧基、烷硫基、羟基烷基和氨基烷基是甲基、乙基、正-和异-丙基、正-、异-和叔-丁基、甲氧基、乙氧基、甲硫基和乙硫基、氨基甲基、氨基乙基、羟甲基和羟乙基。
伯氨基和仲氨基代表性地可以是式R6R7N的基团，其中R6是H或独立地具有R7的含义，R7是烷基部分含有1～20，优选1～12，最好1～6个碳原子的烷基、氨基烷基、羟基烷基;羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基部分含有2～8个碳原子，烷基部分含有1～6，优选1～4个碳原子;2～20，优选2～12，最好2～6个碳原子的链烯基;苯基、单或二（C1-C4烷基）苯基或二（C1-C4烷氧基）苯基、苄基、单或二（C1-C4烷基）苄基或二（C1-C4烷氧基）苄基;或1，2-，1，3-，或1，4-咪唑基-C1-C6烷基，或R6和R7合并为四-或五亚甲基，3-氧杂-1，5-亚戊基，-CH2-NR8-CH2CH2-或-CH2CH2-NR8-CH2CH2-，其中R8是H或C1-C4烷基。在氨基烷基中的氨基可以被1或2个C1-C4烷基或C1-C4羟烷基取代。在羟烷基中的羟基是游离的或用C1-C4烷基醚化的。
烷基的实例已在上文引述。氨基烷基的说明性实例是氨基甲基、氨基乙基、1-氨基丙-2-或-3-基、1-氨基丁-2-，-3-或-4-基、N-甲基-或N，N-二甲基-或N-乙基或N，N-二乙基-或N-乙-羟乙基-或N，N-二-2-羟乙基氨基甲基、-氨基乙基、-氨基丙基或-氨基丁基。羟基烷基代表性的是羟甲基、1-羟基-乙-2-基、1-羟基丙-2-或-3-基、1-羟基丁-2-、-3-或-4-基。羧基烷基的实例是羧甲基、羧乙基、羧丙基和羧丁基，烷氧羰基烷基代表性的是用甲基或乙基酯化了的烷氧羰基烷基。链烯基代表性地是烯丙基、丁-1-烯-3-或-4-基、戊-3-或-4-烯-1-或-2-基、己-3-或-4-或-5-烯-1-或-2-基。烷基-和烷氧基苯基及烷基-和烷氧基苄基的说明性实例是甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、二乙基苯基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、二乙基苄基、甲氧基苯基、二甲氧基苯基、乙氧基苯基、二乙氧基苯基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、乙氧基苄基、二乙氧基苄基。咪唑基烷基（其中烷基部分优选地含有2～4个碳原子）代表性地可以是1，2-，1，3-或1，4-咪唑基乙基或-正丙基或-正丁基。R8优选的是H、甲基或乙基。
伯氨基或仲氨基优选的实例是甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、烯丙基氨基、单一或二-（1-羟基-乙-2-基）氨基、苯基-或苄基氨基、乙酰基氨基或苯甲酰基氨基。
在一个优选的实施方案中R1是氢。在另一优选的实施方案中R4是氢。在一个进一步优选的实施方案中R2和R3互相独立地为H、F、Cl、Br、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲基氨基、二甲基氨基、苯甲酰基氨基、甲氧基、乙氧基和甲硫基。
除了嘌呤以外，嘌呤系列类似物的代表性实例是腺嘌呤、N-甲基腺嘌呤、N-苄基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲硫基腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、3-碳酰腺嘌呤、7-碳酰腺嘌呤、1-碳酰腺嘌呤、6-羟基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-甲硫基嘌呤、2-氨基-6-羟基嘌呤、3-碳酰-6-氯嘌呤、鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤。腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤和鸟嘌呤是特别优选的。
如果核酸碱基B是嘧啶类似物基团，则所说的基团是式Ⅱ、Ⅱa和Ⅱb的基团
Figure 941153908_IMG8
其中R5是H或C1-C4烷基，R6、R7和R9互相独立地具有前述给定的R2的含义，包括优选的定义，在式Ⅱb中NH2基上的氢原子可以被C1-C6烷基或苯甲酰基取代，式Ⅱ、Ⅱa和Ⅱb基团的二氢衍生物也是这样。优选地R6是H、C1-C6烷基或羟基烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲酰基氨基、单-或二-C1-C6烷基氨基，R7优选的是H、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基或C1-C6羟基烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲酰基氨基、单-或二-C1-C6烷基氨基。
R5优选的是H或甲基。R6优选的是H、F、Cl、Br、NH2、NHCH3、N（CH3）2或C1-C4烷基。R7优选的是H、C1-C4烷基，更优选的是甲基、或NH2、NHCH3或（CH3）2N。
嘧啶类似物的说明性实例是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。
在本发明的范围内，核酸碱基的保护基应该被认为是在本领域中公知的保护基。这样的保护基的代表性实例是：C1-C8烷基;单-或二-环C1-C12芳烷基;单-或二-环C7-C12芳烷氧基;单-或二-环C7-C12卤代芳烷基;二苯基甲基;被1～4个甲基或甲氧基取代的二苯基甲基;三苯基甲基;被1-6个甲基或甲氧基取代或被1-3个叔丁基取代的三苯基甲基;被苯基或萘基取代的呫吨基;-Si（R10）（R11）和（R12），其中（R10）、（R11）和（R12）互相独立地是C1-C20烷基、苄基或苯基;R-C（O）-，其中R是C1-C6烷基、苄基、被甲基、甲氧基或卤素取代的苄基;C1-C12烷氧基、被下列基团取代的C1-C12烷氧基：氟、苯氧基、被甲基、甲氧基或卤素取代的苯氧基、苄氧基或被甲基、甲氧基或卤素取代的苄氧基;R13-SO2-，其中R13是C1-C12烷基，C5-C6环烷基、苯基、被C1-C12烷基或卤素取代的苯基、苄基或被C1-C12烷基或卤素取代的苄基;C1-C12烷氧基乙酰基或是未被取代的或被一个或一个以上相同或不同的选自下面的基团取代的苯氧基乙酰基，这些基团是直链或支链的C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基、硝基和氰基;含有3-12个环碳原子的环烷基羰基;含有3～12个环碳原子的被C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的环烷基羰基;或脒保护基，例如，二甲基氨基亚甲基。
如上所述，优选的保护基是含有3～12，优选4～8，最好5或6个环碳原子的环烷基羰基，特别是环己烷羧基，和二甲基氨基亚甲基。
C1-C8烷基代表性的是甲基、乙基、正-或异丙基、正-、异-和叔丁基;单环C7-C12芳烷基代表性的是苄基、甲基苄基、二甲基苄基;单环或双环C7-C12芳烷氧基可以是甲氧基苄基、二甲氧基苄基;单环或双环C7-C12卤代烷基是溴代苄基;取代的二苯基甲基代表性的是二（甲基苯基）甲基，二（二甲基苯基）甲基、二（甲氧基苯基）甲基、二（二甲氧基苯基）甲基;取代的三苯基甲基代表性的是二（甲基苯基）甲基、三（二甲基苯基）甲基、三（甲氧基苯基）甲基、三（二甲氧基苯基）甲基，单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三-对-叔丁基苯基甲基;甲硅烷基代表性地包括三苯基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三正丙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、正辛基二甲基甲硅烷基和（1，1，2，2-四甲基乙基）二甲基甲硅烷基;R-C（O）-基团代表性的是乙酰基、三氟乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、甲基苯甲酰基、甲氧基苯甲酰基、氯代苯甲酰基、溴代苯甲酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、正-或异丙氧羰基或正-、异-或叔丁氧基羰基、或苯氧基羰基、苄氧基羰基、甲基苯氧基羰基或甲氧基苯氧基羰基或氯代苯氧基-或-苄氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、肉桂酰氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、三甲基甲硅烷基乙氧基羰基、氯代乙氧基羰基、溴代乙氧基羰基、吗啉代乙氧基羰基;R13-SO2-基团代表性的是甲基磺酰基、乙基磺酰基、丙基磺酰基、丁基磺酰基、苯基磺酰基、苄基磺酰基、对溴磺酰基、对甲氧磺酰基和对甲基苯基磺酰基;烷氧基乙酰基和苯氧基乙酰基代表性的是甲氧基乙酰基、乙氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、（对-甲基苯氧基）乙酰基、（对-叔丁基苯氧基）乙酰基。
在本发明的范围内，特别适宜的核苷或核苷酸具有下面式Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc和Ⅲd之一的结构：
Figure 941153908_IMG9
其中R14是氢或一个形成核苷酸连接基的基团，R15是氢或环己基羰基。
在本发明的范围内、特别适宜的核苷酸是那些在式Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc和Ⅲd中的R14是式Ⅳa、Ⅳb或Ⅳc的含磷基团的核苷酸
Figure 941153908_IMG10
它形成核苷酸连接基团，其中
Z1是氧或硫;
X、X′和X″互相独立地是带有负电荷的氧或硫，所带的反离子是Li、Na、K、Cs、叔或季铵;或
X′和X″互相独立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;
X'''是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;
Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基;
R18和R19互相独立地是氢、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基或C7-C20烷芳基;
在R18、R19和Rb定义中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未取代的或是被烷氧基、烷硫基、卤素、-CN，-NO2，苯基、硝基苯基或卤代苯基取代。
叔和季铵应被认为是指式RfRgRhRiN的离子，其中阳离子N可以是饱和的或不饱和的单环至三环系中的一员，Rf是烷基或氨基烷基，烷基部分是1～20，优选1～12，最好1～6个碳原子;羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基含有2～8个碳原子，烷基含有1～6，优选1-4个碳原子;含有2～20，优选2～12，最好2～6个碳原子的链烯基;苯基、单-或二（C1-C4烷基）苯基或二（C1-C4烷氧基）苯基、苄基、单-或二（C1-C4）苄基或二（C1-C4烷氧基）苄基;或1，2-，1，3-或1，4-咪唑基-C1-C6烷基;Rg、Rh和Ri互相独立地是氢或具有Rf的含意，或Rf和Rg合并成亚烷基、四-或五-亚甲基，3-氧杂-1，5-亚戊基、-CH2-NRe-CH2CH2-或-CH2CH2-NRe-CH2CH2-，其中Re是H或C1-C4烷基，Rh和Ri互相独立地具有Rf的含意。在氨基烷基中的氨基可以被1个或2个C1-C4烷基取代。
羧基烷基的说明性实例是羧甲基、羧乙基、羧丙基和羧丁基，烷氧羰基烷基代表性的是用甲基或乙基酯化的烷氧羰基烷基。链烯基代表性的是烯丙基、丁-1-烯-3-或-4-基、戊-3-或-4-烯-1-或-2-基、己-3-或-4-或-5-烯-1-或-2-基。烷基-和烷氧基苯基及烷基-和烷氧基苄基代表性的实例是甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、二乙基苯基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、二乙基苄基、甲氧基苯基、二甲氧基苯基、乙氧基苯基、二乙氧基苯基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、乙氧基苄基、二乙氧基苄基。咪唑基烷基（其中烷基部分优选含有2～4个碳原子）代表性地可以是1，2-、1，3-或1，4-咪唑基乙基或-正丙基或-正丁基。
作为烷基的R18、R19和Rb的说明性实例是甲基、乙基和丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基的异构体。作为芳基的R18、R19和Rb代表性的是苯基和萘基。作为链烯基的R18和R19代表性地是烯丙基和（C1-C4烷基）-CH＝CH-CH2-。作为芳烷基的R18、R19和Rb的说明性实例是苯基-CnH2n-，其中n是1～6的整数，优选苄基。作为烷芳基的R18、R19和Rb的代表性实例是单-、二-和三（C1-C4烷基）。优选的取代基是氯、溴、甲氧基、-NO2、-CN、2，4-二氯苯基和4-硝基苯基。Rb的代表性实例是2，2，2-三氯乙基、4-氯苯基、2-氯苯基和2，4-二氯苯基。
在一个特别优选的实施方案中，Rb是β-氰基乙基，R18和R19是二（异丙基），X'''是O。
核苷酸和低聚核苷酸可以通过连接基团以共价键键合于一种固体载体材料上，适宜的载体材料代表性地硅胶、可控多孔玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚氨基甲酸乙酯、聚烯烃、聚酰胺，聚醚和醚化或酰化的纤维素衍生物。根据对载体材料的选择，可以从二元羧酸、二氨基甲酸乙酯或烷氧基甲硅烷基氨基甲酸乙酯中衍生出连接基团。精制、载荷载体材料是商业上可得到的。
TTTr保护基的引入通常是按照Gait等人[Gait，M.J.，Matthes，H.W.D.，Singh，M.Sproat，B.S.，Titmas.，R.C.，in：Gassen，H.G.，Lang，A.（Hrsg.）基团片段的化学和酶促合成（Chemical    and    Enzymatic    Synthesis    of    Gene    Fragments）Verlag    Chemie，Weinheim    1-42（1982）]所描述的方法进行的。通常在引入TTTr基之前引入氨基保护基，优选酰基。为了做到这一点，未被保护的核苷能够在适宜的质子惰性、极性、碱性溶剂如吡啶、N-甲基吗啉、二甲基甲酰胺、乙腈或四氢呋喃中于室温下用三烷基氯硅烷，例如三甲基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷或三异丙基氯硅烷，或四烷基二硅氧烷，代表性的是1，1，3，3-四异丙基-1，3-二氯二硅氧烷处理进行完全的甲硅烷基化。甲硅烷基化后优选地与一种未取代的或取代的环烷基碳酰氯或与二甲基氨基亚甲基进行反应，此时只有核酸碱基的氨基官能团被酰化，接着用适宜的亲核试剂，代表性地用水溶液中的铵、
Figure 941153908_IMG11
优选氟化铵水溶液处理进行甲硅烷基的溶剂分解。除去溶剂后，酰化的核苷可以很容易地根据它们的溶解特性进行分离。
TTTr基团的引入可通过将优选酰化了的核苷与三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯，方便地在存在有空间位阻叔胺的适宜的质子惰性、极性、碱性溶剂如吡啶，N-甲基吗啉、二甲基甲酰胺、乙腈或四氢呋喃（优选吡啶）中进行反应来实现。离析物的溶解度特性使得产物很容易被分离。过量的三苯甲基化试剂用石油醚，优选地用40～60℃沸程的馏分经加热浸提来除去。
新的核苷能够用已知的方法进一步转化成氨基磷酸酯。H-膦酸酯或三酯衍生物。这些化合物适于低聚核苷酸的固相法合成和溶液法合成。
本发明的另一方面是涉及一种制备式（Ⅴ）的低聚核苷酸的方法
其中U和V是相同的或不同的天然或合成的核苷残基，m和n互相独立地为0或1～200的整数，m和n之和为2～200，该方法为
（a）将式Ⅵ化合物
其中R20是一个保护基，U′和V′具有U和V的含意，m′和n′相互独立地为0或1～199的整数，m′与n′之和为2～199，R21是式Ⅳa、Ⅳb或Ⅳc的含磷基团
Figure 941153908_IMG12
它形成核苷酸连接基团，其中
Z1是氧或硫;
X、X′和X″互相独立地是带有负电荷的氧或硫，所带的反离子是Li、Na、K、Cs、叔或季铵;或
X′和X″互相独立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;
X'''是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基，-ORb或-SRb;
Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基;
R18和R19互相独立地为氢、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基或C7-C20烷芳基;
在R18、R19和Rb定义中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未取代的或是被烷氧基、烷硫基、卤素、-CN，-NO2，苯基、硝基苯基或卤代苯基取代的，
与式Ⅶ化合物进行反应
式Ⅶ中U″和V″具有U和V的含意，m″和n″互相独立地是0或1～198的整数，m″与n″之和为2～198，R22是
（ⅰ）式Ⅳb的基团，其中Z是氧或硫;X′和X″互相独立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、定义为Rb的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未被取代的或是被烷氧基、烷硫基、卤素、-CN、-NO2、苯基、硝基苯基或卤代苯基取代的;
（ⅱ）羟基保护基;或
（ⅲ）通过一个连接基团连接于固体载体材料上的连接键;
（b）如有必要，重复步骤（a）直到形成所需长度的低聚核苷酸，在每次偶合前除去保护基R20，将存在的任何游离羟基封端，然后将生成的亚磷酸酯氧化成磷酸酯，
（c）如果需要，除去或分离出低聚核苷酸，和
（d）除去剩余的保护基R20，
所说的保护基R20是TTTr。
本方法的一个特别优选的实施方案包括制备式V的低聚核苷酸，其中m与n之和为2～50，优选2～30。在低聚核苷酸中的核苷通常是通过酯基连接的。说明性实例是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸酯、膦酸氢酯、磷酸酯、碳酸酯和氨基甲酸酯。
该方法可用固相法或溶液法加以实施。两种方法本身均是已知的并且通常是在-20℃～100℃，优选10℃～60℃的温度范围内进行的，较方便的是在惰性溶剂存在下进行。隋性溶剂的说明性实例是乙腈、吡啶、二噁烷、二甲基甲酰胺、乙二醇二甲基醚、二乙二醇二甲基醚、氯仿、三氯乙烷、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、二丁基醚和二乙基醚。如果以固相法实施本方法，则较方便地用商业上可得到的DNA合成仪使用各制造商所述的并且同样能从相应生产厂家获得的试剂，如溶剂、封端溶液，氧化溶液、偶合试剂和脱三苯甲基化溶液，以及制得的式Ⅶ化合物进行合成。
关于R21的羟基保护基应被认为是指核酸碱基的保护基，不包括脒类化合物。
上文已叙述了固体载体材料。用饱和氨水溶液可以从载体材料上除去最终的低聚核苷酸，同时将低聚核苷酸的核酸碱基上的保护基除去。该方法也适用于同时除去环烷基羧酸保护基。
TTTr保护基可以方便地在酸性条件下除去，较方便的是使用二氯乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、乙酸、ZnBr2、三氟化硼二乙醚合物。
用已知的方法，方便的是使用乙酸酐、N-甲基咪唑或2，6-二甲基吡啶将存在的任何游离羟基封端。
用碘的水溶液或叔丁基过氧化氢的乙腈溶液可以方便地将亚膦酸酯氧化成磷酸酯。
最终的低聚核苷酸可用色谱法或电泳法加以分离。用反相HPLC分离是有利的。
另一方面，本发明涉及新的核苷，核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物和低聚核苷酸在制备式Ⅴ的低聚核苷酸化合物的方法中的应用。
对于低聚核苷酸的纯化来说使用TTTr基团是特别有利的。现已进一步发现新的被保护的低聚核苷酸的特点在于在中性水溶液缓冲剂体系中其稳定性比被通常的4，4′-二甲氧基三苯甲基保护的低聚核苷酸的稳定性大，因此在纯化过程中，特别是在HPLC纯化中，去三苯甲基化的损失较低。
下列实施例更说细地说明了本发明。
A：起始化合物的制备
实施例A1：N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷的制备
28克脱氧鸟苷溶于3×200毫升无水吡啶中，在真空下于50℃将溶液浓缩至干。用340毫升二异丙基乙基胺提取核苷并向溶液中加入127毫升三甲基氯硅烷。混合物在室温下搅拌2小时，然用用1小时加入100毫升无水四氢呋喃（THF）和20.4毫升环己烷碳酰氯的溶液。16小时后反应混合物冷却至0℃，用1小时加入100毫升甲醇，接着加入180毫升35%氟化铵水溶液。氟化物加完1小时后，在真空下于50℃蒸发除去挥发性成分。剩余的吡啶与2×200毫升甲苯共蒸发除去。粗产物与700毫升冰水一起搅拌30分钟，然后过滤。滤饼用700毫升沸腾的乙醇/水（7：3V/V）溶液处理。热过滤除去不溶物。题目化合物从冷却的滤液中析出，将其真空干燥。
1H-NMR（DMSO）：8.14：s，H8;6.21：t，1′;5.34，4.97：2Hs（宽）OH;4.88：m，3′;3.8：m，4′;2.5：2H：2′-，H1（CC基团）;2.26：m，2′;1.1-1.9：10H，m，CC基团。
实施例A2：N4-环己基羰基-2′-脱氧胞苷的制备
5.3克脱氧胞苷溶于3×100毫升无水吡啶中并在高真空下于55℃下浓缩至干。干燥的离析物溶于100毫升无水吡啶中并向溶液中加入25.4毫升三甲基氯硅烷。将混合物搅拌2小时，然后滴加6.3克环己烷碳酰氯在40毫升无水THF中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌18小时，然后，在用冰冷却的同时，慢慢加入20毫升甲醇。通过加入36毫升水从35%氟化铵水溶液中实施去甲硅烷基化。60分钟后，反应混合物在真空下于55℃浓缩至干。剩余的吡啶用2×100毫升水共蒸发除去。粗产物溶于100毫升水中并用3×100毫升正丁醇萃取，合并丁醇相，用硫酸钠干燥，并在真空下55℃浓缩至油状。油状物在500毫升乙醚中搅拌5小时，此时题目化合物的晶体析出。晶体用抽滤法收集并在高真空下干燥。
1H-NMR（CD3OD）：8.47d，H6;7.44：d，H5;6.22：q，1′;4.4，4.03：3′，4′;3.7-3.9：2H，m，5′;2.35～2.55：2H，m，2′，C-1，CC基团，2.07～2.25：m，2′;1.4-1.9，1.1-1.65：10H，m，CC基团。
实施例A3：N6-环己基羰基-2′-脱氧腺苷的制备
5.4克的脱氧腺苷溶于3×100毫升无水吡啶中，然后在高真空下于55℃将溶液浓缩至干。将干燥的离析物溶于100毫升无水吡啶中并向溶液中加入68毫升二异丙基乙基胺。然后加入25.4毫升三甲基氯硅烷。将混合物搅拌2小时，然后向混合物中滴加6.3克环己烷碳酰氯在40毫升无水THF中的溶液。反应混合物在室温下搅拌18小时，然后，在用冰冷却的同时，缓慢地加入20毫升甲醇。通过加入36毫升水从35%氟化铵的水溶液中实施去甲硅烷基化。60分钟后，反应混合物在真空下于55℃浓缩至干。粗产物溶于100毫升乙酸乙酯中并连接用100毫升碳酸氢钠水溶液和100毫升盐水萃取溶液。有机相用硫酸钠干燥并在真空下于55℃浓缩至油状。从二乙醚中沉淀制得题目化合物。
1H-NMR（CDCl3）：8.35，8.33，2s，腺嘌呤;6.25：t，1′;4.34：m，3′;3.78：m，4′;3.5：2H，m，5′;2.55，2.4，2.2：3H，3m，2′，C-1 CC基团;1.85-1.1：10H：m，CC基团。
N6-环己基羰基-2′-脱氧腺苷对用亚磷酸三酯法合成DNA的碘氧化的稳定性：1克N6-环己基羰基-2′-脱氧腺苷用含有3%碘、2%水、20%吡啶和75%THF的溶液处理22小时。22小时之后，反应混合物的薄层色谱表明未发生反应。
B：本发明化合物的制备
实施例B1：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷的制备
27克N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷溶于3×200毫升无水吡啶中，然后在高真空下于50℃将溶液浓缩至干。将核苷溶于600毫升无水吡啶中并向溶液中加入100毫升三乙胺，然后加入34.4克三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯。将反应混合物搅拌18小时并过滤除去沉淀。滤液在真空下于50℃浓缩至干。剩余物溶于600毫升二氯甲烷中并用2×500毫升冷的饱和碳酸氢钠溶液萃取，然后用500毫升盐水萃取。有机相用硫酸钠干燥，过滤除去盐，在100～200托下将滤液浓缩至干。产物悬浮于100毫升甲醇中。将悬浮液过滤并将滤液冷却至0℃，于是新鲜的产物析出。在500毫升石油醚中将产物剧烈搅拌2小时，用过滤法分离出题目化合物并在60℃/30～50托的真空干燥器中干燥。
1H-NMR（CD3OD）7.95：H8，7.15：12H，TTTr;6.22：t，1′;4.47：m，3′;3.95：m，4′;2.65：m，2′;2.2～2.45：m，2′，H1（CC基团）;1.8-1.1：10H，m，CC基团;1.13：27H，2s，TTTr基团。
实施例B2：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷-3′-（氰乙基）二异丙基氨基磷酸酯的制备
在干氩气气氛下，向在800毫升无水乙腈中的27.7克5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷中加入20.6毫升二（二异丙基氨基氰乙基）膦和2.67克四唑，将混合物搅拌18小时。然后加入8毫升三乙胺并在真空下于50℃除去溶剂。粗产物溶于500毫升乙酸乙酯中并用2×500毫升冷的饱和碳酸氢钠萃取，然后用500毫升盐水萃取一次。有机相在真空下于50℃浓缩至干，产生一种油状物，它可以进一步直接用于N-甲基吗啉-5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷-3′-（氰乙基）硫代磷酸酯的制备（实施例B3）。为了纯化，将产物在硅胶上进行快速色谱。产物用正己烷：乙酸乙酯：N-甲基吗啉（30：69：1，V/V/V）进行洗脱。从合并的馏分中获得的题目化合物在真空下于50℃浓缩至干。在高真空下进一步蒸发溶剂剩余物得到白色泡沫体。
31P-NMR（CDCl3）：148.3，147.6;1H-NMR（CDCl3）：7.76，7.72：2s H8（鸟嘌呤）;7.38，7.2：12H，2m，TTTr基团;6.12：1′;4.65：m，3′;2.55，2.6;2t：CNE 1.22：27H，s，TTTr基团;1.1，0.98：12H，异丙基（amidite）。
实施例B3：N-甲基吗啉-5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷-3′-（O）-氰乙基硫代磷酸酯的制备
在干氩气气氛下，向在1200毫升无水乙腈中的92.2克5′-（三-叔丁基三苯甲基）-N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷中加入84毫升二（二异丙基氨基氰乙基）膦和422毫升0.5M四唑溶液，将混合物搅拌18小时。然后加入16毫升三乙胺并于50℃在真空下除去溶剂。粗产物溶于1200毫升乙酸乙酯中并用2×1200毫升冷的饱和碳酸氢钠萃取，然后用1200毫升盐水萃取一次。有机相在真空下于50℃浓缩至干，得到油状物。用10×200毫升甲苯浓缩能够除去产物中的一些杂质，因此得到白色泡沫状的粗氨基磷酸酯。粗氨基磷酸酯分两批进一步反应，为了进一步加工与200克粗amidite混合。粗amidite溶于1.2升乙腈中并加入3.7毫升水和77克四唑。将反应混合物搅拌30分钟，然后加入77克硫和1.2升吡啶。将反应液在室温搅拌17小时并于50℃在真空下浓缩至干。粗产物用600毫升1M N-甲基吗啉碳酸氢盐的水溶液和600毫升乙酸乙酯萃取，过滤除去析出的硫。有机相再用2×600毫升的1M N-甲基吗啉碳酸氢盐水溶液萃取一次。有机相用硫酸钠干燥并于50℃在真空下浓缩至干。粗产物然后用快速色谱提纯，所用的柱为4Kg硅胶（230～400目）柱。产物用乙酸乙酯：甲醇：N-甲基吗啉（90：9：1，V/V/V）洗脱。合并的产物馏分在真空下于50℃浓缩至干。油状产物在500毫升正戊烷中搅拌5小时，得到粉状的题目化合物。31P-NMR（CDCl3）：57.21，56.80ppm。
实施例B4：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷的制备
3.6克的胸腺嘧啶脱氧核苷溶于3×25毫升的无水吡啶中并在真空下于55℃浓缩。向如此获得的干燥产物中于0℃用1小时的时间加入14.8克三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯在25ml二氯甲烷中的溶液。反应混合物在室温下搅拌18小时，然后在高真空下浓缩。产生的白色泡沫状产物溶于100毫升二氯甲烷中并用2×100毫升冷的饱和碳酸氢钠水溶液萃取，然后用100毫升盐水萃取。用硫酸钠干燥有机相，然后浓缩至白色泡沫状。该泡沫状物从甲醇和水的混合物（70：30，V/V）中重结晶。抽滤白色晶状产物并在高真空下干燥。
1H-NMR：8.12：N3-H;7.65：H-6;7.25：12H，m，TTTr基团;6.45：t，1′;4.66：m，3′;4.03：4′;3.52-3.38：2H，m，5′;2.4：m，2′;1.56：3H，CH5 3;1.3：27H，s;TTTr基团。
实施例B5：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（氰乙基）二异丙基氨基磷酸酯的制备
57克的5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷溶于3×25毫升无水吡啶中，溶液在高真空下于50℃浓缩。这样获得的干燥离析物溶于1升无水乙腈中。向此溶液中加入50毫升二（二异丙基氨基）氰乙基膦和7.9克（113mmol）四唑。将反应混合物搅拌17小时。然后加入38毫升三乙胺。反应混合物在真空下于50℃浓缩。生成的油状产物溶于500毫升乙酸乙酯中并用2×500毫升冷的碳酸氢钠饱和水溶液萃取，然后用500毫升盐水萃取。有机相用硫酸钠干燥，然后浓缩至油状。将此油状物溶于1升由99%甲醇和1% N-甲基吗啉组成的溶液中。在连接搅拌和冰冷却下，慢慢地滴加水直至产物以白色晶体的形式析出。用过滤法分离出题目化合物并在高真空下用P4O10/KOH干燥。
1H-NMR（CDCl3）：7.75：2s，H6;7.33：12H，s，TTTr基团;1.48：m，1′;4.78：m，3′;4.16，4.23：2m，4′;3.95～3.3：2H，m：CNE基团，2H，m：异丙基（amidite），2H，m：5′;2.9-2.4：4H：2H，m：2′，2H，2t，CNE基团;1.45-1.15：42H：叔丁基，TTTr基团，CH3，amidite，CH5 3;31P-NMR：148.4，148.2。
实施例B6：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷-3′-（O）-氰乙基-（S）-2，4-二氯苄基硫代磷酸酯的制备
避光，于室温下将1.4克N-甲基吗啉-5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-N2-环己基羰基-2′-脱氧鸟苷-3′-（O）-氰乙基硫代磷酸酯与0.8毫升2，6-二甲基吡啶和1.95毫升2，4-二氯苄基氯在50毫升氯仿中搅拌4天。产物混合物在真空下于50℃浓缩至油状。此油状物溶于100毫升二氯甲烷中并连续用饱和碳酸氢钠水溶液洗两次和用100毫升盐水洗一次。有机相用硫酸钠干燥并在真空下浓缩至油状，将油状物在石油醚/吡啶中搅拌5小时。抽滤这样获得的固体题目化合物并用P4O10/KOH干燥。
31P-NMR（CDCl3）：27.0，27.6ppm;PD-MS：[M-DCB+ n]-＝936;[M+Na+]+＝1120;[TTTr]+＝412;[GCC]+＝263。
实施例B7：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（O）-氰乙基-（S）-2，4-二氯苄基硫代磷酸酯的制备
避光，在室温下将2.7克N-甲基吗啉5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（O）-氰乙基硫代磷酸酯与1.8毫升2，6-二甲基吡啶和4.4毫升2，4-二氯苄基氯在35毫升氯仿中搅拌4天。将混合物在真空下于50℃浓缩至油状。该油状物溶于100毫升二氯甲烷中并连续用碳酸氢钠饱和水溶液洗两次和用100毫升盐水洗一次。有机相用硫酸钠干燥并在真空下浓缩至油状，将此油状物在石油醚/吡啶中搅拌5小时。这样制得的固体标题化合物用抽滤法过滤并用P4O10/KOH干燥。
31P-NMR（DCCl3）：27.42;27.24;H1-NMR（CDCl3）：8.6：NH;7.52：H6;7.16：15H，m，TTTr;6.45：m，1′;5.23：m，3′;3.95-4.15：4H，m，CNE基，DCBn基;3.32：2H：m，5′;2.3.2.65：4H，m，CNE基;2′;1.2：30H，2s，TTTr基，CH5 3。
8克5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（O）-氰乙基-（S）-2，4-二氯苄基硫代磷酸酯溶于25毫升3%二氯乙酸在二氯甲烷中的溶液中并将其加入到装有硅胶的快速色谱柱中。用二氯甲烷：甲醇：DCA（98：1：1，V/V/V）洗脱三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基甲基醚和三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基醇。此后用二氯甲烷：甲醇（9：1，V/V）洗脱产物。在真空下于55℃将馏分浓缩至油状。然后将此油状物溶于250毫升乙酸乙酯中，用5×250毫升1M乙酸钠水溶液洗至无二氯乙酸盐并用硫酸钠干燥。然后在真空下除去溶剂，得到胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（O）-氰乙基-（S）-2，4-二氯苄基硫代磷酸酯。
31P-NMR（CDCl3）28.15，27.79;1H-NMR（CDCl3）：8.48：NH;7.45，7.17：4H，DCBn基，H6;6.05：m，1′;5.13：3′，m;4.0-4.3：5H，DCBn基，4′，CNE基;3.78：m，5′;2.7：m，m，CNE基;2.35：2′;1.87：s，CH5 3。
实施例B8：三乙基铵5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（S）-二氯苄基硫代磷酸酯的制备
16克5′（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（O）-氰乙基-（S）-2，4-二氯苄基硫代磷酸酯溶于500毫升乙腈/三乙胺（9：1，V/V）的溶液中。两小时后将溶液在真空下浓缩，剩余物在500毫升乙醚中搅拌2小时。用抽滤法过滤产物并在高真空下干燥，得到题目化合物。
31P-NMR（CDCl3）：16.69;1H-NMR（CDCl3）：7.58：s，H6;7.15：15H，m，TTTr;6.34：m，1′;5.05：m，3′;3.85-4.1：3H，m，4′，DCBn;3.15：5′;2.92：6H，q，三乙胺;2.22，2.3;2′;0.9-1.35：m，39H，TTTr，三乙胺，CH5 3。
实施例B9：5′-（三4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-N6-吡咯烷基亚甲基-2′-脱氧腺苷的制备
233毫克N6-吡咯烷基亚甲基脱氧腺苷溶于3×10毫升无水吡啶中，然后将溶液在真空下浓缩至干，在此过程中温度不超过50℃。此后产物溶于10毫升无水吡啶中。在搅拌下，于0℃用1小时向此溶液中加入343.8毫克TTTrCl和10毫升二氯甲烷的溶液。60小时后将反应混合物浓缩至2毫升并将此剩余物转移至100毫升水中。沉淀溶于100毫升二氯甲烷中。有机相用2×100毫升碳酸氢钠饱和水溶液萃取，然后用100毫升盐水萃取。洗过的有机相用硫酸钠干燥。除去盐并将产物浓缩至干。固体产物在100毫升石油醚（高沸点）中研制1小时。用过滤法将产物分离，母液冷却至0℃并经过滤进一步分离产物。然后用0℃的冷的石油醚（高沸点）洗滤饼并在高真空下干燥得到题目化合物。
1H-NMR（CDCl3）：9.28：s，脒;8.62;s，腺嘌呤;7.4：12H，m，TTTr;6.62：m，1′;4.77：m，3′;4.22：m，4′;3.3，3.82：2m，4H，吡咯烷基;3.54：d，2H，5′;2.88，2.55：2m，2′;2H，2.06：m，4H，吡咯烷基;1.4：s，27H，TTTr。
实施例B10：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-N2-二甲基氨基亚甲基-2′-脱氧鸟苷的制备
967毫克N2-二甲基氨基亚甲基脱氧鸟苷溶于3×10毫升无水吡啶中，然后在真空下将溶液浓缩至干，此时温度不超过50℃。此后产物溶于10毫升无水吡啶中。在搅拌下于0℃用1小时向此溶液中加入2950毫克TTTrCl和10毫升二氯甲烷的溶液。60小时后将反应混合物浓缩至2～3毫升并将此剩余物转移至100毫升水中。沉淀溶于100毫升二氯甲烷中。有机相用2×100毫升碳酸氢钠饱和水溶液萃取，然后用100毫升盐水萃取。洗过的有机相用硫酸钠干燥。除去盐并将产物浓缩至干。固体产物在100毫升石油醚（高沸点）中研制1小时。用过滤法分离产物，将母液冷却至0℃并用过滤法进一步分离产物。然后用0℃冷的石油醚（高沸点）洗滤饼并在高真空下干燥得到题目化合物。
1H-NMR（DMSOD6）：11.2，8.46，7.75：2s，脒，鸟嘌呤;7.08：12H，m，TTTr;6.12：m，1′;5.22：s，OH;4.37：m，3′;3.75：m，4′;2.96：m，5H，5′，脒;2.89：s，3H，脒;2.5，2.15：2m，2′;1.08：s，27H，TTTr基。
实施例B11：N-（1-甲基-2-亚吡咯烷基）-5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）腺苷的制备
将50克干的腺苷，20克分子筛（3
Figure 941153908_IMG13
），800毫升无水甲醇和80毫升无水吡啶在室温下搅拌并加入29.04克蒸馏过的N-甲基吡咯烷酮二甲基乙缩醛。过滤除去分子筛。滤液在真空下浓缩。剩余物用3×100毫升乙腈提取、浓缩并干燥。将此物料溶于450毫升无水吡啶中并向溶液中加入50克分子筛（5 ）。将反应混合物在60℃下搅拌并加入100.3克固体三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯甲烷，搅拌15小时后，将反应温度升高到70℃保持5小时。过滤除去分子筛并将滤液浓缩至干。将剩余物加入到硅胶柱中（乙酸乙酯/甲醇/N-甲基吗啉20：2：0.1;直径8厘米）。收集含有题目化合物的馏分，浓缩并干燥。
1H-NMR（250MHz，CDCl3）：1.27（s，c.27H，3（CH3）3C-ar）;2.04（m，3H）;2.37（m，2H）;2.90～3.15（m，2H）;3.18（s，NCH3）;3.2-3.3（m，2H）;3.39（t，c.1H）;3.51（t-like m，J＝8，3H）;3.69（s，2H）;4.37（d-like m，J＝5，1H），4.45（br.s，1H）;4.82（t，J＝5，1H）;5.99（d，J＝7，H-C（1′）;6.72（br.s，1H）;7.20（s，12H）;8.23（s）和8.54（S）（H-C（2.8））。
实施例B12：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）-6-甲基尿嘧啶的制备
将40毫摩尔的6-甲基尿嘧啶溶于75毫升无水吡啶中。溶液加热到60℃并加入44毫摩尔固体三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯甲烷。在60℃搅拌6小时后，真空除去溶剂并用甲苯将剩余物浓缩一次，用乙腈浓缩两次。粗产物溶于600毫升氯代甲烷中并用200毫升饱和NaHCO3溶液洗。有机相用Na2SO4干燥并在真空下除去溶剂。剩余物溶于220毫升热的乙醇/水混合物（3：2）中并在0℃结晶。熔点：169～170℃。
1H NMR（250MHz，CDCl3）：1.29（s，c.27H，3（CH3）3C-ar）;1.38（s，3H，CH3C（5））;3.14（br.d，1H）;3.47（ABM体系，2H，H2C（5′））;4.22（d-like m，1H）和4.47（m，2H）（HC（2′，3′，4′）;5.13（br.s，1H）;5.96（d，J＝4，1H，HC（1′））;7.15-7.35（m，c.12H，H-（ar））;7.81（s，HC（6））;9.75（br.s，HN（3））。
实施例B13：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）尿苷的制备
将200毫摩尔核糖尿苷溶于375毫升无水吡啶中。溶液加热至60℃并加入220毫摩尔固体三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯代甲烷。在60℃搅拌6小时后，真空下除去溶剂，剩余物用甲苯浓缩一次，用乙腈浓缩两次。粗产物溶于600ml氯代甲烷中并用200毫升饱和碳酸氢盐溶液洗。剩余物溶于220毫升热的乙醇/水混合物（3：2）中并在0℃结晶。
1H-NMR（250MHz，CDCl3）：1.29（s，c.27H，3（CH3）3C-ar）;3.14（br.d，1H）;3.54（ABM体系，2H，H2C（5′））;4.18（d-like m，1H），4.33（m，1H）和4.45（q-like m，1H）（HC（2′，3′，4′）;5.23（d，J＝8，1H，HC（5））;5.35（br.s，1H）;5.91（d，J＝2，1H，HC（1′））;7.15-7.35（m，c.12H，H-（ar）;8.10（d，J＝8，1H，HC（6））;10.06（br.s，HN（3））。
实施例C1：5′-（5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（S）-2，4-二氯苄基亚硫酰胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（O）-氰乙基-（S）-2，4-二氯苄基硫代磷酸酯的制备
将3.2克胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（S）-二氯苄基-（O）-氰乙基硫代磷酸酯和5.85克5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（O）-氰乙基-（S）-2，4-二氯苄基硫代磷酸酯溶于4.25毫升无水N-甲基咪唑和8.1克三异丙基苯磺酰氯在125毫升无水吡啶的溶液中。混合物在室温搅拌2.5小时，然后加入10毫升水。反应混合物在55℃浓缩至油状。粗产物溶于500毫升乙酸乙酯中并连续用2×250毫升N-甲基吗啉碳酸氢盐水溶液萃取和用500毫升盐水萃取一次。有机相用硫酸钠干燥，除去盐后，真空下于55℃蒸发至干。产物溶于乙醚并从石油醚中析出。过滤将沉淀分离并从正戊烷中重结晶，得到固体题目化合物。
31P-NMR（CDCl3）：28.1，27.8，27.7，27.3（4-非对映异构体）;1H-NMR（CDCl3）：8.5-9，NH;7.58：1H，H6;7.26-7.4：16H，m，DCBn基，TTTr基，H6;6.44，6.15：2H，2m，1′;5.05-5.2;5.26-5.42：2H，2m，3′;4.05-4.45：8H，m，DCBn基，CNE基，5′，4′，3.3-3.5：2H，m，5′;2.65-2.75，2.38-2.6：6H，CNE基，2′;1.84：3H，s，CH5 3;1.3，s，30H，TTTr基，CH5 3。
实施例C2：5′-（三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基）胸腺嘧啶脱氧核苷-3′-（氰乙基）二异丙基氨基磷酸酯在用亚磷酸三酯法自动合成DNA中的应用
用商业上可得到的DNA合成仪（Applied    Biosystem    Inc，（ABI）使用制造商所述的试剂，即，乙腈，封端溶液，氧化溶液，偶合试剂（四唑）和脱三苯甲基化溶液，CDG-DMTrT载体进行合成。除了将脱三苯甲基化时间加倍外，实施生产厂家所述的合成方案。
进行下列合成：用TTTr amidite合成T10，T20和T30。作为对比，序列T10用已知的DMTr amidites使用相同的合成试剂进行合成。在全部低聚核苷酸的合成中，5′-末端保护基，即TTTr基或，在对照序列中，DMTr基，在最后的偶合步骤之后被留在聚合物上。当合成完全时，在55℃用15小时用饱和氨水溶液从载体上将低聚核苷酸除去。过滤掉CPG载体后，将产物溶液冻干。产物混合物溶于HPLC缓冲剂中，过滤并用商业上的C-18反相柱进行分离。
HPLC色谱图分析表明TTTr    amidites与已知的DMTr    amidites一样适用于用亚磷酸三酯法合成低聚核苷酸。在相同条件下，TTTr端基保护的低聚核苷酸在C-18反相HPLC柱上具有更长的保留时间，因此在使用TTTr基团时只需要一个较低的柱效就可分离不合格的序列。

Claims (27)

1、一种在其基本结构中带有未取代的或取代的核酸碱基B残基和一个被保护的伯羟基的核苷、核苷类似物，核苷酸、核苷酸类似物或从至少两种这样的相同或不同的核苷酸和/或核苷酸类似物制得的低聚核苷酸，所说的保护基为三-4，4′，4″-叔丁基苯基甲基。
2、根据权利要求1的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，它们均是额外地被一个含有3～12个环碳原子的环烷基羰基保护的并且是未取代的或是被C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的，或是被脒保护基取代的。
3、根据权利要求2的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中环烷基羰基含有3～12个环碳原子。
4、根据权利要求3的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中环烷基羰基含有5或6个环碳原子。
5、根据权利要求4的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中环烷基羰基是环己烷羧基。
6、根据权利要求1的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中核酸碱基B是式Ⅰ，Ⅰa，Ⅰb，Ⅰc，Ⅰd或Ⅰe的基团
其中R1是H、Cl、Br、NH2或OH，R2，R3和R4互相独立地为H、OH、SH、NH2、NHNH2、NHOH、NHO-1～12个碳原子的烷基、F、Cl、Br、1～12个碳原子的烷基或羟烷基或羟烷基或氨基烷基或烷氧基或烷硫基，在这些基团中的羟基和氨基是未取代的或是被一个保护基取代的，或是苯基、苄基、含有1～20个碳原子的伯氨基或含有2～30个碳原子的仲氨基，R5是H或C1-C4烷基。
7、根据权利要求6的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中伯氨基含有1～12个碳原子，仲氨基含有2～12个碳原子。
8、根据权利要求6的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中伯氨基和仲氨基是式R6R7N的基团，其中R6是H或独立地具有R7的含意，R7是每个均含有1～20个碳原子的烷基、氨基烷基、羟基烷基;羧基烷基或烷氧羰基烷基，其中烷氧羰基部分含有2～8个碳原子，烷基部分含有1～6个碳原子;2～20个碳原子的链烯基;苯基、单或二（C1-C4烷基）苯基或二（C1-C4烷氧基）苯基、苄基、单或二（C1-C4烷基）苄基或二（C1-C4烷氧基）苄基;或1，2-，1，3或1，4-咪唑基-C1-C6烷基，或R6和R7合并成为四或五亚甲基、3-氧杂-1，5-亚戊基、-CH2-NR8-CH2CH2-或-CH2CH2-NR8-CH2CH2-，其中R8是H或C1-C4烷基，在氨基烷基中的氨基可以是被一个或两个C1-C4烷基或C1-C4羟烷基取代的，在羟烷基中的羟基是游离的或是用C1-C4烷基醚化的。
9、根据权利要求7的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中伯氨基和仲氨基是甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、烯丙基氨基、一或二（1-羟基乙-2-基）氨基、苯基-和苄基氨基、乙酰基氨基、异丁酰基-和苯甲酰基氨基。
10、根据权利要求6的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中式Ⅰ、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe中的R1是氢。
11、根据权利要求6的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中式Ⅰd中的R4是氢。
12、根据权利要求6的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中在式Ⅰ、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe中的R2和R3互相独立地是H、F、Cl、Br、OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲基氨基、二甲基氨基、苯甲酰基氨基、甲氧基、乙氧基和甲硫基。
13、根据权利要求6的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中B是嘌呤基或是如下嘌呤类似物的基团，包括腺嘌呤、N-甲基腺嘌呤、N-苯甲酰基腺嘌呤、2-甲硫基腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-羟基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-甲硫基嘌呤、鸟嘌呤和N-异丁酰基鸟嘌呤。
14、根据权利要求1的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中核酸碱基B是式Ⅱ、Ⅱa或Ⅱb的基团
Figure 941153908_IMG2
其中R5是H或C1-C4烷基，R6、R7和R9互相独立地是H、OH、SH、NH2、NHNH2、NHOH、NHO-1～12个碳原子的烷基、F、Cl、Br、烷基部分含有1～12个碳原子的烷基或羟基烷基或氨基烷基或烷氧基或烷硫基，羟基和氨基是未取代的或是被一个保护基取代的，或是苯基、苄基、1～20个碳原子的伯氨基或2～30个碳原子的仲氨基，在式Ⅱb中NH2基上的氢原子可以被C1-C6烷基或苯甲酰基取代，或它们的二氢衍生物。
15、根据权利要求14的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中R6是H、C1-C6烷基或C1-C6羟烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲酰基氨基、一或二-C1-C6烷基氨基。
16、根据权利要求14的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中R7是H、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基或C1-C6羟烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲酰基氨基、一或二-C1-C6烷基氨基。
17、根据权利要求1的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中R7是H、F、Cl、Br、NH2、NHCH3、（CH3）2N或C1-C4烷基。
18、根据权利要求16的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中R7是H、C1-C4烷基、NH2、NHCH3或（CH3）2N。
19、根据权利要求16的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中B是嘧啶基或是下列嘧啶类似物的基团，包括：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、二氢尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶。
20、根据权利要求1的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，它们具有下式Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc或Ⅲd之一的基团
其中R14是氢或形成核苷酸连接基的基团，R15是氢或环己基羰基。
21、根据权利要求20的核苷、核苷类似物、核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸，其中R14是式Ⅳa、Ⅳb或Ⅳc的含磷基团
Figure 941153908_IMG4
它形成核苷酸连接基团，其中
Z是氧或硫;
X、X′和X″互相独立地是带有负电荷的氧或硫，其反离子是Li、Na、K、Cs、叔或季铵;或
X′和X″互相独立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;
X'''是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;和;
Rb是C1-12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基;
R18和R19互相独立地是氢、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基或C7-C20烷芳基;
在R18、R19和R6的定义中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未取代的或是被烷氧基、烷硫基、卤素、-CN，-NO2，苯基、硝基苯基或卤代苯基取代的。
22、一种制备根据权利要求1的核苷或核苷类似物的方法，该方法包括在空间位阻叔胺存在下于适当的质子隋性、极性、碱性溶剂中使核苷或核苷类似物与三-4，4′，4″-叔丁基三苯甲基氯反应。
23、一种制备式V的低聚核苷酸的方法
其中U和V是相同或不同的、天然或合成的核苷残基，m和n互相独立地为0或1～200的整数，m与n之和为2～200，该方法包括
（a）使式Ⅵ化合物与式Ⅶ化合物反应，
式Ⅵ中R20是保护基，U′和V′具有U和V的含意，m′和n′互相独立地为0或1～199的整数，m′与n′之和为2～199，R21是式Ⅳa、Ⅳb或Ⅳc的含磷基团
Figure 941153908_IMG5
它形成核苷酸连接基团，其中
Z1是氧或硫;
X、X′和X″互相独立地是带有负电荷的氧或硫，所带反离子是Li、Na、K、Cs、叔或季铵;或
X′和X″互相独立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;
X'''是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基，-ORb或-SRb;
Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基;
R18和R19互相独立地是氢、C1-C12烷基、C2-C12链烯基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基或C7-C20烷芳基;
在R18、R19和R6的定义中的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未取代的或是被烷氧基、烷硫基、卤素、-CN，-NO2，苯基、硝基苯基或卤代苯基取代的，
式Ⅶ中U″和V″具有U和V的含意，m″和n″互相独立地是0或1～198的整数，m″与n″之和为2～198，R22是
（ⅰ）式Ⅳb的基团，其中Z是氧或硫;X′和X″互相独立地是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、-ORb或-SRb;Rb是C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C20芳烷基、C7-C20烷芳基、作为Rb定义的烷基、芳基、芳烷基和烷芳基是未被取代的或是被烷氧基、烷硫基、卤素、-CN、-NO2、苯基、硝基苯基或卤代苯基取代的;
（ⅱ）羟基保护基;或
（ⅲ）通过连接基团连接于固体载体材料上的连接键;
（b）如有必要，重复步骤（a）直到形成所需长度的低聚核苷酸，在每次偶合前除去保护基R20，将存在的任何游离羟基封端，然后将生成的亚磷酸酯氧化成磷酸酯，
（c）如果需要，除去或分离出低聚核苷酸，和
（d）除去剩余的保护基R20，
所说的保护基R20是TTTr。
24、根据权利要求23的方法，其中m与n之和为2～50。
25、根据权利要求23的方法，其中m与n之和为2～30。
26、根据权利要求1的核苷酸、核苷酸类似物或低聚核苷酸在式Ⅴ的低聚核苷酸的制备中的应用
其中U和V是相同或不同的天然或合成的核苷残基，m与n互相独立地为是0或1～200的整数，m与n之和为2～200。
27、根据权利要求2的化合物，其中脒保护基是二甲基氨基亚甲基。
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