TW323284B - - Google Patents
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Description
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 c —οI===ρIΗ ο==
OCH3 -°l=pIH 0= CN IOIPIH 0= 或 323284 五、發明説明() 本發明有關一個製備天然或合成之核苷、核苷相似體 或寡核苷酸之方法(用至少兩個相同或相異之此種核苷單 體)。 序列已定之許多核苷酸現在都是利用亞磷酸三酯製程 來合成。在本方法中,-1個寡核苷酸之合成是由其3'端開 始逐步進行至5'之方向。合成之第一步是將^端之核苷酸 (其在5'羥基和(如有必要之話)在其核苷鹼基上帶有一 個保護基)鍵結到一個化學惰性之固相上。在5’之羥基上 之保護基隨後被除去。接著將其與一個有適當保護之核苷 之3'-胺基磷酸酯反應產生一內核苷酸鍵結,即所形成之亞 磷酸三酯其後被氧化成所要之核苷酸間之鍵。下一個合成 循環是開始於去除囿定在固相上之二核苷酸之5’-端保護 基。重覆此合成循環直到寡核苷酸鍵結到固相爲止。合成 之最後步驟是除去在核苷鹼基、羥基和核苷酸間鍵上之保 護基(Camthers,M.H·,Science 230: 281 - 285, 1985)。依據所使用之胺 基磷酸酯種類,典型上,合成時所使用之核苷或寡核苷酸 應含有如下列化學式之基 這個合成方法所遭遇到之問題是在胺基磷酸酯與固定 在固相上之核苷或寡核苷酸之自由羥基間之縮合反應。在 二^這個反應步驟中,#須不容許水份之存在。然而即使是使 用絕對溶劑亦無法完全保證不含任何水份。由於溶劑中之 水份無法完全去除,因此在固相寡核苷酸合成之耦合步驟 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(2Ι0Χ297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝· 訂 線- 經濟部中央標準局員工消费合作社印掣 S23284 A7 B7 五、發明説明() 中大量核苷胺基磷酸酯被轉化成核苷胺基磷酸酯水解產 物,例如核苷氰乙基膦酸氫酯。然而上面最後提及之這個 化合物並不參與耦合反應。雖然如此,爲了得到高耦合產 率,仍然必須使用大過量之胺基磷酸酯。在現代之DNA合 成器中,相對於固定在固相上之羥基化合物使用量,要使 用高到2到20倍過量之核苷胺基磷酸酯。反應後,核苷酸間 之鍵結最大產率爲所使用之胺基磷酸酯之20%。最少有8〇% 之核苷會以核苷胺基磷酸酯水解產物之型態被丟棄。這個 問題並不能經由改良所用之設備而完全獲得解決,例如使 用特殊之計量裝置(參照 Chemische Rundschau Nr. 37, Seite 11 (1992))。 柏令格(Bohringei:,M.P.,doctoral thesis of the Eidgenossische Technische Hochschule,ETH No. 9377, 1"1)將一個核苷相似體之甲 基胺基磷酸酯水解產物與氫氧化鈉溶液反應,得到包含一 個自由羥基之核苷相似體。然而,在他所使用之反應條件 下,核苷鹼基上之保護基會被除去。 由 Predvoditelev 等人(Predvoditelev,D.A·,Tyrganova^ M.A., Nifant'ev, E.E., Rogovin, Z.A., Zh. Prikl. Khim. 40: 171 - 177, 1967) > Nifiit'ev 等人{^5^丫,£丑,?比(1¥〇(1如16丫,0人,?1^^11(1〇,1.\^,乙11.05811· Khim. 51: 2435 - 2441,1981),Troev 和 Simeonov (Troev,K·,Simeo-nov, M.,Phosphorusand SulfUr 19: 363 367, 1984)和 Westheimer 等人 (Westheimei, F.H., Huang, S., Covitz, F., J. Am. Chem. Soc. 110: 181 - 185, I988)所提出有關於非核苷酸二烷基亞磷酸酯之轉酯化反應 中都有一個共同缺點,即當應用於受保護之核苷時,核鹼 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4规格(210X297公釐) 17 n J I— m」1 I m 1 - = —1 I I I n n l 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印^ S232S4 A7 _____B7____ 五、發明説明() 基之保護基會輕易地被除去。在這些方法中,因爲熱分解 反應之緣故(例如保護基之熱去除,特別是去三苯甲基 化),反應中所需之高溫妨礙這些方法廣泛應用。 另外一個方法是用四苯甲氧基鈦之路易士酸催化轉酯 化,這個反應在40°C下進行72小時後,可得到中等產率, 而鈦酸鹽水解之敏感度是其特別之缺點(Frcmeman,M.,Modfo, T.A.,Synthesis 201 - 204, 1991)。 令人驚訝之是,本發明提供一個方法可將核苷膦酸氫 酯或核苷亞膦酸氫酯轉化成帶有一個自由羥基之核苷,而 所形成之自由羥基曾帶有膦酸氫根或亞膦酸氫根官能。在 本發明之方法中,膦酸氫根或亞膦酸氫根官能以選擇性高 於其中醯基保護基選擇性地轉移到一個醇上。在所給予之 反應條件下,即使經過了許多天,這種去除之選擇性依然 很高使得核苷鹼基之保護基不會被去除。更進一步說,這 個方法可以得到高產率。本新穎方法將可在第一次就回收 過量之核苷(產生於人工或自動化寡核苷酸耦合反應)。 本發明特別提供一種製備天然或合成之核苷、核苷相 似體或寡核苷酸之方法,該方法係由至少兩個這樣的核苷 及/或核苷相似體,其在鹼性分子含有一未被取代或已取 代之核鹼基B自由基及一化學式爲RrO-之被保護羥基(¾ 中之心爲保護基),或其直接鍵結到一羥基之氧原子上或 經由一連接菡鍵結到一固相撐體上,由核苷單體或由在鹼 性分子上,除了上述自由蕋外,還附加一式I、la或lb 木紙怅尺度適川中丨MU?:冬((:NS ) A4IU4 ( 2ΐοκ2^公兑) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 -6 - 經濟部中央標準局貝工消於合作社印製 32^284 A7 B7 五、發明説明()
I I I 〇 〇 〇 0=4—〇-CH2CH2-CN (I) , 0=P—0CH3 (la)或 0=y—CH3 ⑽ Η Η Η 基之寡核苷酸,使該核苷或寡核苷酸與一過量之脂醇 '環 脂醇 '芳脂醇或含1-3〇個碳原子之芳醇、含2-5〇個碳原子 之多元醇或聚合多元醇,在有或無惰性溶劑存在下,在至 少一催化量之無機鹼或有機氮鹼(該鹼之ΡΚ値爲4-1〇者) 存在下反應,將式I、la或lb之基轉化成羥基-0Η而製備。 化學式I、la或lb之官能基可以接在核苷或寡核苷酸之 %或5’啦置,而Κ〇-官能基或固相撐體被接在5’_或位置。 化學式I之官能基較適合接在5^位置,化學式lb之官能基較 適合接在3HS置,而化學式la之官能基則接在3’-或5’啦置。 用於連接核苷酸鍵結並且適用於本發明方法之大多數 較適合帶有一個第二〇H基之核苷、核苷相似體或寡核苷酸 已經知道並且被詳細描述,例如參考Townsend之文獻 (Townsend, L.B., Hrsg., Chemistry of Nucleosides and Nucleotides 1, Plenum
Press, New York, 1988)或其可由已知之方法製備而得。一般而 言,它們可以是一個被或打斷之開鏈C結構或一個環 烴或一個具有一個核鹼基B之〇-或S-雜環結構。 '典型上,開鏈碳結構可能含有3到12個碳原子,而較適 合是含有3到6個碳原子。環烴或雜環結構可以是含有3到I2 (較適合者爲3到8,而最適合爲4或5)個碳原子之單環 系。它們也可以是含有5到I6 (較適合爲8到I6)個碳原子 之雙環或三環系。這些結構可進一步包含取代避,典型上 爲被保護之〇H越。 I- - - - Γ— - - 1 · 1 - » .1 .1 1 ^ I— I: I nf I m τ» (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙ίϋ尺度適用屮國阀家壮枣(CNS ) Λ4现格(210X297公;) 3^ό284 A7 B7 五、發明説明() 若核鹼基B是一個嘌呤殘基或其相似體,則它可能是 一個如化學式11、Ha、Hb、lie、lid或lie之自由基
R7 N N R9
(Ila) (lie) (He) t I HJ n^— I- I 1— ) mi ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 其中117是11、Cl、Br、1^2或011,而R*、仏和111()是各自獨立 之 Η、OH、SH、NH2、NHNH2、ΝΗΟΗ、含 1至 12 個碳原子之 ΝΗΟ-院基、F、Cl、Br、烷基或羥烷基或胺烷基或含1至12個 碳原子之烷硫基,其中羥基和胺基可不被取代或被一個保 護基或苯基、苯甲基、含1至20個碳原子之第一胺基或含2 至30個碳原子之第二胺基所取代,而R„是Η或CrC4院基。 較適宜之第一胺基包含1至12個碳原子,而最適宜者包 含1至6個碳原子,較適宜之第二胺基包含2至12個碳原 子,而最適宜者包含2至6個碳原子。 烷基、烷氧基、烷硫基、羥烷基和胺烷基(較適宜之 碳原子數爲1至6個)中具有代表性者例如爲甲基、乙基和 丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基 '癸基、十 本紙張尺度適用中國國家標隼(CNS ) Α4規格(210X 297公釐) 線- 經濟部中央標準局員工消费合作社印策 S232S4 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明() 一基和十二基等之異構物,和相當之烷氧基、烷硫基、羥 烷基和胺烷基。烷基、烷氧基、烷硫基'羥烷基和胺烷基 最適宜者爲包含1至4個碳原子。較適宜之烷基、烷氧基、 烷硫基、羥烷基和胺烷基爲甲基、乙基、正-及異丙基、正_、 異-及第三丁基、甲氧基、乙氧基、甲硫基和乙硫基 '胺甲 基、胺乙基、羥甲基和羥乙基。 第一胺基和第二胺基典型上,可以是如化學式 之自由基,其中Rm是Η或具有如R15之意義,但不相干,而 R15是烷基、胺烷基或羥烷基(含有1至2〇,較適宜者爲1至 12,最適宜者爲1至6個碳原子);羧烷基或碳烷氧烷基、 含有2至8個碳原子之碳烷氧基且其烷基部份含有1至6,較 適宜者爲1至4個碳原子;烯基含有2至20,較適宜者爲2至 12,而最適宜者爲2至6個碳原子;苯基、單或二-(CrC4院基 苯基或CrC4院氧基)苯基、苯甲基、單或二-(Q-Q院基苯甲 基或CrC4烷氧基)苯甲基;或1,2-、1,3-或1,4-咪唑基-CrC6烷 基,或Rh及R15合在一起爲四或五亞甲基、3-氧雜-1,5-亞戊 基、-CH2-NR16-CH2CH2-或-CH2CH2-NR16-CH2CH2-,其中 Rlel 是 Η 或
CrC4院基。胺烷基中之胺基可以被一個或兩個CrC4烷基或 CrC4羥烷基所取代。羥烷基中之羥基可以與CVQ院基反應而 被醚化。 在前面已例舉了烷基之實例。有代表性之胺烷基實例 爲胺甲基、胺乙基、1-胺丙-2-基或基、1-胺-丁-2-基或-3-基 或-4-基、N-甲基-或N,N-二甲基-或N-乙基•或N,N-二乙基或N-2-經乙基-或N,N-Z>2-羥乙基胺甲基或-胺乙基或-胺丙基或胺 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 1.17 — - is Η - - I - —w I i^i t I n 0— I - I..... i^i L: (請先閱讀背面之注意事項再填寫本 -9- 經濟部中央標隼局員工消費合作杜印製 A7 __ B7___ 五、發明説明() 丁基。羥烷基之實例爲羥甲基、1-羥-乙_2_基、1-羥-丙-2-或_3_ 基、1-羥-丁-2-基、-3-基或-4-基。羧烷基之實例爲羧甲基、羧 乙基、羧丙基和羧丁基;而碳烷氧烷基之實例爲該碳烷氧 烷基,其與甲基或乙基反應而被酯化。烯基典型上爲烯丙 基、丁-1-烯-3-基或-4-基、戊-3-或-4-烯-1-基或-2-基、己_3_或-4-或-5-稀-1-基或-2-基。烷苯基、烷氧苯基和烷苯甲基典型實例 爲甲苯基、二甲苯基、乙苯基、二乙苯基、甲苯甲基、二 甲苯甲基、乙苯甲基、二乙苯甲基、甲氧苯基、二甲氧苯 基、乙氧苯基、二乙氧苯基、甲氧苯甲基、二甲氧苯甲 基、乙氧苯甲基、二乙氧苯甲基。咪唑烷基(其中之烷基 部份較適宜含有2至4個碳原子者)典型上爲1,2-、1,3-或I,4-咪唑-乙基或-正丙基或-正丁基。〜較適宜爲H、甲基或乙 基。 第一胺基和第二胺基較適宜之例子爲甲胺基、乙胺 基、二甲胺基、二乙胺基、烯丙胺基、單或二-(1-羥烯-2-基) 胺基、苯胺基和苯甲胺基、乙醯胺基和苯甲酿胺基。 在本發明之較適宜之具體實施例中,心是氫。本發明 在另外較適宜之具體實施例中,是氫。本發明在更適宜 之具體實施例中,R8和心是互不相干之H、F、C1、BΓ、 OH、SH、NH2、NHOH、NHNH2、甲胺基、二甲胺基、苯甲醯 胺基、甲氧基、乙氧基和甲硫基。 嘌呤系列之相似體之代表實例,除了嘌呤以外,還有 腺嘌呤、N-甲基腺嘌呤、N-苯甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、 2-甲硫基腺嘌呤、2-胺基腺嘌呤、3-碳基腺嘌呤、7-碳基腺嘌 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公嫠)
In <|^1 n (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 .線 -10- 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 B2^284 A7 B7 五、發明説明() 呤、卜碳基腺嘌呤、6-羥基嘌呤、2-胺基-6-氯嘌呤、2_胺基-6-甲硫基嘌呤、2-胺基-6_羥基嘌呤、3_碳基-6-氯嘌呤、鳥嘌 呤、2-甲基鳥嘌呤。其中,腺嘌呤、2_胺基腺嘌呤和鳥嘌呤 是特別適宜者。 若核鹼基是一個嘧啶自由基相似體,則該自由基較適 宜是一個如化學式ΙΠ、Ilia和Illb之尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧 陡,
其中,R„是Η或CVC4院基,R12、R13和R3()爲各自獨立和前面 已提過之R8有相同之意義(包括較適宜之意義),化學式 Illb中之NH2基上之氫原子可以被CVQ烷基或苯甲醯基及化 學式III、Ilia和Illb之自由基之二氫衍生物所取代。較適宜之 R12是H、CVC6烷基或羥烷基' F' Cl、Br、NH2、苯甲醯胺 基、單或二-CrC6院胺基,而R13較適宜是H、CVQ烷基或CrC6 烷氧基或&-(:6經烷基、F、Cl、Br、NH2、苯甲醯胺基、單或 二《6院胺基。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
I IV— In adr 1^1 In n mJI 訂 線· -11 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明()
Ru較適宜是Η或甲基。R12較適宜是11、?、<:卜:61:、 NH2、NHCH3、N(CH3)2 或 CrC4烷基。R13 較適宜是 Η、(:「(:4烷 基,特別是甲基、或NH2、NHCH3或(CH3)2N。 嘧啶相似體之代表實例爲尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧 啶、5_氟尿嘧啶、氯尿嘧啶、5·溴嘧啶、二氫尿嘧啶、假 尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。 在本發明之範圍內,保護基之定義和化學上常見之保 護基之定義一樣。此種保護基之典型例子爲CrC8烷基;單 或二環(:7-(:12芳烷基;單或二環C7-C12芳烷氧基;單或二環C7-C12鹵芳烷基;二苯基甲基;被1至4個甲基或甲氧基所取代 之二苯基甲基;三苯基甲基;被1至6個甲基或甲氧基或1 至3個第三丁基所取代之三苯基甲基;被苯基或萘基所取代 之汕基;-Si^X^Xig,其中队)、(R5)和阢)是互不相干之CV C20院基、苯甲基或苯基;R_C(0)-,其中R是C「C6院基、苯甲 基、被甲基、甲氧基或鹵素所取代之苯甲基,CrC12烷氧 基、被苐基所取代之CrC12烷氧基、苯氧基、被甲基、甲氧 基或鹵素所取代之苯氧基;苯甲氧基或被甲基、甲氧基或 鹵素所取代之苯甲氧基;R17-S02-,其中R17是CrC12烷基、C5-Q環烷基、苯基、被Q-Cu烷基或鹵素所取代之苯基、苯甲 基或被^-(^烷基或鹵素所取代之苯甲基;CH:12烷氧乙醯基 或苯氧乙醯基(未被取代或可被一個或超過一個之相同或 不同之官能基所取代者,這些官能基係由包括直鏈或有支 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 丨_.---,----L丨裝——;——„——訂-----丨線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -12- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 — - - --- -·— 五、發明説明() 鍵之CrC6院基、CrC6齒院基、鹵素、CrC6院氧基、CrC6院硫 基、硝基和氰基之一組中選出者)。 Q-C8烷基典型實例爲甲基、乙基、正-和異丙基、正-、 異-和第三丁基;單環C7-C12#烷基典型上爲苯甲基、甲苯甲 基、二甲苯甲基;單或二環C7-C12芳烷氧基典型上爲甲氧苯 甲基、二甲氧苯甲基;單或二環C7-C12鹵烷基之實例爲溴苯 甲基;被取代之二苯基甲基典型上爲二(甲苯基)甲基、二 (二甲苯基)甲基、二(甲氧苯基)甲基和二(二甲氧苯基)甲基; 被取代之三苯基甲基典型上爲三(甲苯基)甲基、三(二甲苯 基)甲基、三(甲氧苯基)甲基、三(二甲氧苯基)甲基、單甲氧 三苯甲基、二甲氧三苯甲基和三-對第三丁基苯基甲基;矽 烷基典型上爲三苯矽烷基、三甲矽烷基、三乙矽烷基、三 正丙矽烷基、異丙基二甲矽烷基、第三丁基二甲矽烷基、 第三丁基二苯矽烷基、正辛基二甲矽烷基、(U,2,2-四甲基 乙基)二甲矽烷基;R-C(O)-官能基之實例爲乙醯基、三氟乙 醯基、丙醯基、丁醯基、戊醯基、己醯基、苯甲醯基、甲 苯甲醯基、甲氧苯甲醯基、氯苯甲醯基、溴苯甲醯基、甲 氧·、乙氧羰基、正-或異丙氧羰基或正-、異-或第三丁氧羰基 或苯氧羰基、苯甲氧羰基、甲-或甲氧-或氯苯氧羰基或氯苯 甲氧羰基或9-蒹基甲氧羰基;R17-S02-官能基典型上爲甲基 苯楓基、乙基苯砜基、丙基苯砜基、丁基苯砜基 '苯基苯 砜基、苯甲基苯碱基、對溴苯砜基、對甲氧基苯楓基和對 甲基苯砜基;烷氧乙醯基和苯氧乙醯基典型上爲甲氧乙醯 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) n · n —L VI m. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -13 - A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明() 基、乙氧乙醯基、苯氧乙醯基、(對甲苯氧基)乙醯基、(對 第三丁苯氧基)乙醯基。脒保護基也常被使用在核鹼基上。 核苷和寡核苷酸能夠以共價鍵方式’經由一個連接基 鍵結到一個固體撐體上。適合之撐體典型上爲矽膠、精密 孔玻璃、聚苯乙烯、聚丙醯胺、聚胺甲酸酯、聚烯、三聚 氰胺、聚醯胺、聚酯、聚醚、聚醇、環糊精、纖維素和醚 化或醯化之纖維衍生物、肝糖、澱粉、殼糖和聚葡萄胺 糖。視所選用之撐體而定,連接基可以爲二羧酸、二胺甲 酸酯或烷氧矽烷基胺甲酸酯。 本發明之方法可以在一個附加之溶劑下進行。若沒有 附加之溶劑,本新穎方法中所使用之液態醇、多元醇或聚 合多元醇即是溶劑。適宜之附加溶劑之條件爲在反應槽中 不會和醇、多元醇或聚合多元醇競爭。它們可以單獨使用 或至少與兩種溶劑混合在一起使用。在多元醇之例子中, 可以使用溶劑或溶解化劑(使得由於多元醇之膨脹,醇可 用於方法中)。這種溶劑之具代表性例子可從由醚、鹵化 烴、羧醯胺、內醯胺、亞砜、砜、芳烴、腈、脂烴和環脂 烴所組成之族群中選取,而較適宜者是醚、鹵化烴、腈、 羧醯胺和內醯胺。在本發明之範圍內,溶解化劑適合使用 鹽類,典型上爲醋酸銨和碳酸氫銨。 特別適宜之醚爲二丁醚'四氫呋喃、二喟烷、乙二醇 二乙醚和二甲醚、二甘醇二甲醚、二甘醇二乙醚或三甘醇 二甲醚,較適宜者是四氫呋喃、甲基第三丁基醚、二丁 I I - - 1*—I! I - 1^ 1 ^^1 ^1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨ox297公釐) • 14- 32S234 A7 B7 五、發明説明() 醚、二異丙醚或二Df烷。特別適合之鹵化烴是二氯甲烷、 氯仿、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷和1,1,2,2-四氯乙烷。 有用之醯胺爲N-烷化或N-二烷化醯胺。典型上爲N,N-二 甲基甲醯胺、N,N-二乙基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、四甲 脲和六甲基磷酸三醯胺。 較適宜之內醯胺可由γ-丁內醯胺、ε-己內醯胺、N-甲妣 咯啉酮、Ν-乙醯吡咯啉酮和Ν-甲基己內醯胺所組成之族群中 選取。在本發明之範圍內,更進一步適合之溶劑包括二甲 亞砜、二甲砜 '二乙諷、三亞甲楓、四亞甲楓、苯、有取 代基之苯(較適宜者是氯苯、鄰二氯苯、三氯苯、硝 苯、甲苯和二甲苯、乙腈、丙腈、苯甲腈、苯乙腈、戊 烷、石油醚、己烷、環己烷和甲基環己烷)^ 在本發明之方法中所使用之脂醇、環脂醇、芳脂醇或 芳醇、多元醇或聚合多元醇都是被當作受體。 經濟部中央樣準局負工消費合作社印裝 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本貰) 一個含1至20個碳原子之烷醇是適合被使用的,較適宜 者是含1至12個碳原子,而最適宜者是含1至6個碳原子之 烷醇,典型上一個有代表性之群體是由甲醇、乙醇、正-和 異丙醇、正-、異-和第三丁醇、戊醇、己醇、乙二醇、二甘 醇單甲醚和單乙醚所組成。在本發明之方法中,一個較適 宜之醇類副族群包括CrC4院醇。特別適宜之醇是甲醇。 另外,含有5至12(較適宜爲5至8)個環碳原子之帶有 烷基取代基之環烷醇也是適合使用之醇類。典型上可由環 戊醇、環己醇、甲基環己醇、環庚醇和環辛醇所組成之族 群中選取。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) -15· 經濟部中央橾隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明() 更進一步適合之受體之實例爲含有7至3〇 (較適宜爲7 至20)個碳原子之芳脂醇(較適宜從由未被取代或被烷基 或烷氧基所取代之苯甲基醇和β_苯乙醇所組成之族群中選 取);含有6至30(較適宜爲6至12)個碳原子之芳醇(較 適宜從由酚和未被取代或被烷基或烷氧基取代之萘酚所組 成之族群中選取);含有2至20個碳原子之多元醇(較適宜 從由乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、環己二 醇、二羥基甲基環己醇、二甘醇、三甘醇、多甘醇、三羥 甲基丙烷、異戊四醇、二異戊四醇、甘油和醣類所組成之 族群中選取);聚合多元醇(較適宜從由聚乙烯醇、聚醣 和羥烷基聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯所組成之族群中選 取)。烷基和烷氧基取代基較適宜含有1至4個碳原子。 在本發明之範圍內,醣類受體,典型上是指單醣和寡 醣類,例如單、雙、三、四和五醣類。在本發明之較適宜 之具體實施例中,單醣和寡醣類爲醛醣或酮醣。在本發明 之特別適宜之具體實施例中,單醣類爲醛戊醣、醛己醣、 酮戊醣或酮己醣。 典型上醛戊醣爲D-核糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-來蘇 糖;醛己醣典型上爲D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘 露糖、D-異葡萄糖、D-艾杜糖、D-半乳糖或D-太洛糖;酮戊 醣爲D-核酮糖、D-木酮糖;酮己糖爲D-阿洛酮糖、D-果糖、 D-山梨糖或D-塔格糖。 雙醣類典型上爲繭糖、麥芽糖、異麥芽糖、纖維雙 糖、龍膽貳糖、蔗糖或乳糖。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) -L---8-----1 i 裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 -16- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印聚 A7 ________ B7五、發明説明() 三醣類典型上爲棉子糖。 多醣類典型上爲纖維素、澱粉、聚葡萄糖、肝糖、聚 果糖、菊糖、聚甘露糖、聚木糖和聚阿拉伯糖。 一 /在本發明之方法中所使用之無機鹼較適宜由鹼金屬氧 化物、重金屬氧化物和氫氧化物(較適宜者是Si02或鹼錦) 所組成之族群中選取0 更ϋ一步適合之無機鹼必須爲在親核催化反應之條件 下可與其進行轉酯反應,而且它們可能是一個緩衝系中之 成份。它們較適合爲金屬或銨之氟化物、金屬或銨之醛后 酸鹽、酮肟酸鹽、羥肟酸鹽、硫酸鹽'磷酸鹽、膦酸鹽、 焦硫酸鹽、磺胺酸鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽和砜鹽,爲可溶 解於醇類或反應混合物中者。較適宜之金屬是指鹼金屬離 子,例如Na、Li+、κ+、邮和以。金屬之醛肟酸鹽、酮肟酸 鹽'羥Β酸鹽、磺胺酸鹽、砜鹽和膦酸鹽可包含氫原子或 crc:6院基或未被取代之苯基或被鹵素、Ci_c4院基、CrC4院氧 基、氰基或硝苯基所取代之苯基。氟化銨較適宜爲四(Crc6 烷基)氟化銨,典型上爲四(正丁基)氟化銨.HF。更進一步之 實例爲 CsF ' KF、CH3-C(0)-NH-0·和 Mg(CF3CO)2。硏究結果發現 將這些親核鹼和有機氮鹼以催化量放在一起使用是特別有 用的。 特別有用之有機氮驗爲由芳胺、芳族N-雜環和N-Q-Q院 基嗎啉所組成之族群中選取者。典型上代表性之化合物爲 咪唑、吡啶、N-甲基嗎啉、苯胺和鄰苯二胺與聚乙烯吡 啶。在本發明之方法中鹼之使用量可從一個催化量到較高 丨----r----厂裝------訂-----卜線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨0X297公釐) -17- A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明() 之量,典型上可高到相當量或過量。在本發明之範圍內, 一個催化量之定義是(以1莫耳核苷或寡核苷酸爲準)介於 0.01至20%莫耳之間,較適宜者是介於0.1至10%莫耳之間, 更適宜者是介於0.1至5%莫耳之間。 在本發明之方法中,每莫耳當量化學式I之官能基,較 適宜使用不低於100莫耳當量且高至1000莫耳當量或更高過 量受體之羥基。 本新穎方法之反應速率可藉由路易士酸之添加而顯著 地加快,基於1莫耳之核苷或寡核苷酸,路易士酸之用量爲 0.01至20%莫耳,較適宜者是0.1至10%莫耳,最適宜者是0.1 至5%莫耳。這個高反應速率是本方法之一大優點。較適合 使用之路易士酸爲金屬鹽類(Lici)、硼酸鹽或有機金屬錯合 物。在本新穎方法中,將有機氮鹼、親核無機鹼和路易士 酸一起使用是特別有利的,可得到一高選擇性。 反應在溫度範圍-2〇°C至+55°C間進行,較適宜之範圍是 15°C至35°C,且最適宜之溫度爲室溫。 反應時,可適當地將一個含有化學式I、la和lb自由基 之核苷或寡核苷酸加入由醇和鹼所組成之溶液或混合物 中,並且讓其反應完全。爲了單離所需之化合物,任何不 溶解之成份可利用過濾之方式除去,然後溶劑亦被除去。 殘留物可藉由傳統方法加以純化,例如結晶或層析法。在 本新穎方法之特別有利之具體實施例中,從寡核苷酸合成 過程所產生之廢液直接流入一由醇和鹼所組成之溶液或混 合物中,以便回收大過量使用之核苷酸成份。在這個方法 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) -18- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明() 中,將一個含有化學式I、la或lb自由基之化合物之廢液流 回反應溶液或混合物中,而廢液中之酸成份會被反應一開 始即存在於溶液或混合物中之大量過量之鹼所中和。在反 應期間,鹼之濃度會降低,而有必要之話,可以再補充。 這些酸成份較可能爲四唑或其它會影響亞磷酸三酯法中核 苷酸縮合反應之酸類。 對於反應混合物之處理,所形成之亞磷酸酯可以用傳 統氧化劑(例如Ι2/Η20/吡啶或S8/吡啶)加以處理而再得 到相當之磷酸酯或硫磷酸酯。將反應溶液蒸發後,將不再 有逆反應會發生,而所要之產物常常以萃取法分離而得, 且避免使用層析法。 硏究結果發現,使用萃取法時,可用檸檬酸鹽緩衝溶 液(pH約3-4)有效地去除有機氮鹼,例如咪唑。當在水溶 液介質中處理時,可得到幾乎完全之分離及良好之相分 離。 在本新穎方法之一個特別具體實施例中,若含有一個 H-膦酸根或H-亞膦酸根之核苷或寡核苷酸附著在一個固相撐 體上,並且在一有機氮鹼存在下被反應時,氰乙醇即被當 成一個受體使用。在本方法之具體實施例中,一個雙氰乙 基亞磷酸酯或氰乙基甲基亞膦酸酯會形成,而其與一弱鹼 性之聚合離子交換劑會進行不可逆反應。由於鹽之形成, 反應所得之磷化合物仍然連接在離子交換劑上而形成鹽 類,在此同時所形成之丙烯膪會被離子交換劑所吸附住。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標隼(CNS ) Μ規格(210X297公釐) -19- 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明() 本方法之具體實施例可避免在轉酯化期間逆反應之發生, 特別是可以避免使用大量過量之受體。 本發明可以下列實例更詳細地說明。在實例2、5及7中 所使用之流出液可以下述方法得到: 從一固相寡核苷酸合成反應器中產生之廢液可依照Gao 等人(Gao, H·,Gaffhey,B丄.,Jones,R.A.,Tetrahedron Lett·,1991)之方法 收集。從反應器中流出之廢液,將核苷分離後即直接個別 流進一個50毫升之甲醇/乙腈(2··1)溶液中。 實施1 :從二甲氧三苯甲基胸苷-3'-基-β-氰乙基二異丙基胺基 磷酸酯製備5'_二甲氧三苯甲基胸苷 在2〇-30°C下,將270毫克(3.86毫莫耳)四唑和9微升 (〇·5毫莫耳)水加入一 4毫升乙腈溶液(含有360毫克(0.4S 毫莫耳)二甲氧三苯甲基胸甘-3··基·β-氰乙基二異丙基胺基磷 酸酯)中。5分鐘後,胺基磷酸酯水解完成而得到5'-二甲氧 基三苯甲基胸苷_3’_氰乙基膦酸氫酯。 將4毫升甲醇和350毫克咪唑加入此溶液中。24小時 後,利用眞空蒸發法將反應溶液加以濃縮。將所得到之白 至微黃色固體溶入50毫升二氯甲烷。 使用50毫升水和50毫升碳酸氫鈉溶液萃取後,將有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。鹽和任何殘留之咪唑以過濾方式 去除。利用蒸發法將粗產物濃縮並且利用急驟層析法(Still, \V.C·,Kahn, M·,Mitri A., J. Org. Chem. 43:2923, 1978)加以分離。將 產物部份合倂在一起濃縮後,溶入50毫升二氯甲烷中,然 I ^-'裝 n I ^ I I一 線 - »--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼(CNS ) A4規格(210X 297公釐) -20- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^23284 B7五、發明説明() 後用50毫升之1M碳酸氫三乙銨溶液萃取。將有機相在硫酸 鈉上予以乾燥。利用過濾方式除去鹽並且在眞空狀態下將 其濃縮至1毫升。加入200毫升正戊烷後將溶液冷卻到-20°C 後,沉澱即可完成。利用過濾方式將沉澱物分離出來後, 用50毫升正戊烷淸洗後在眞空狀態下,放在Ρ401(/Κ0Η上予 以乾燥。所得到之產物即爲5’_二甲氧三苯甲基胸苷(51-二甲 氧三苯甲基胸苷:431毫克,純度82·5%(乾基))。 實例2 :從廢液(得自一寡核苷酸合成反應器)製備5'-二甲 氧三苯甲基胸苷 在20-30°C下,將含有0.24毫莫耳5’-二甲氧三苯甲基胸甘 -3'-基-β-氰乙基膦酸酯之1〇〇毫升廢液(得自一DNA合成反應 器)流進5〇毫升含有1克咪唑之甲醇溶液中。反應一週後, 將反應溶液在眞空狀態下予以乾燥而得到白至微黃色之固 體,再溶入1〇〇毫升二氯甲烷中。經三次1〇〇毫升之1Μ NaH2P04/NaHP04(pH5.5)溶液萃取後,所有收集之水相再用50 毫升二氯甲烷予以萃取。將所有有機相合倂,二次用100毫 升碳酸氫鈉飽和水溶液加以萃取。碳酸氫鈉相再用50毫升 二氯甲烷加以萃取後,收集所有之有機相。將合倂之有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。隨後在5毫升苯中進行再結晶,並 且將溶液冷卻至-2〇°C以便再結晶完全。加入50毫升正己烷 後繼續在_2〇°C下再結晶20小時。利用過濾方式將產物分離 出來後用50毫升正己烷淸洗,然後在眞空狀態下,放在 Ρ4〇η/ΚΟΗ上予以乾燥。得到之產物即爲5’-二甲氧三苯甲基 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(2ΙΟΧ297公釐) -21 - 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 ____B7_____ 五、發明説明() 胸苷(5'-二甲氧三苯甲基胸苷:1W毫克,純度"%乾燥固 體中,含有100%核苷酸間耦合(在合成器中))。 實例3 :從2·異丁基二甲氧三苯甲基_2·-去氧鳥苷-3'-基-β-氰乙 基二異丙基胺基磷酸酯製備2-異丁基-5·-二甲氧三苯甲基-2·-去 氧鳥苷 在20 - 30°C下,將350毫克(5毫莫耳)四唑和1S微升 (1毫莫耳)水加入8毫升含有839毫克(1毫莫耳)2_異丁基 _5’_二甲氧三苯甲基-2'-去氧鳥苷氰乙基二異丙基胺基磷 酸酯之乙腈溶液中。5分鐘後,胺基磷酸酯水解完成而得到 5’_二甲氧三苯甲基鳥甘-3·-氰乙基隣酸氫酯。 將4毫升甲醇和350毫克咪唑加入此溶液中。24小時 後,利用眞空蒸發法將反應溶液加以濃縮。將所得到之白 至微黃色固體溶入5〇毫升二氯甲烷中。 使用50毫升水和50毫升碳酸氫鈉溶液萃取後,將有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。鹽和任何殘留之咪唑以過濾方式 去除。利用蒸發法將粗產物濃縮並且利用急驟層析法加以 分離。將產物部份收集在一起濃縮後溶入50毫升二氯甲烷 中,然後用5〇毫升之1Μ碳酸氫三乙銨溶液萃取。將有機相 在硫酸鈉上予以乾燥。利用過濾方式除去鹽並且在眞空狀 態下將其濃縮至1毫升。在室溫下,將濃縮後之產物溶液放 入5〇毫升正戊烷中予以沉澱。加入450毫升正戊烷後將溶液 冷卻到-2〇°C後,沉澱即可完成。利用過濾方式將沉澱物分 離出來後,用1〇〇毫升正戊烷淸洗後在眞空狀態下,放在 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂- -22- 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明() P4O10/KOH上予以乾燥。所得到之產物即爲異丁基_5·_二甲氧 三苯甲基-2-去氧鳥苷(2_異丁基-5·-二甲氧三苯甲基-2’-去氧鳥 苷:577毫克,純度9〇.3% (乾基))。 實例4 :從6-苯甲醯基-51-二‘甲氧三苯甲基_2'-去氧腺苷-3'-基-β-氰 乙基二異丙基胺基磷酸酯製備6-苯甲醯基-5'-二甲氧三苯甲基-2'_去氧腺苷 在20 - 30°C下,將350毫克(5毫莫耳)四唑和1S微升 (1毫莫耳)水加入8毫升含有857毫克(1毫莫耳)6-苯甲 醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2’-去氧腺甘-3’雀-β-氰乙基二異丙基胺 基磷酸酯之乙腈溶液中。5分鐘後,胺基磷酸酯水解完成而 得到5'-二甲氧三苯甲基腺芽-31-氰乙基膦酸氫酯。 將4毫升甲醇和350毫克咪唑加入此溶液中。24小時 後,利用眞空蒸發法將反應溶液加以濃縮。將所得到之白 至微黃色画體溶入5〇毫升二氯甲烷中。 使用50毫升水和50毫升碳酸氫鈉溶液萃取後,將有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。鹽和任何殘留之咪唑以過濾方式 去除。利用蒸發法將粗產物濃縮並且利用急驟層析法加以 分離。將產物部份收集在一起濃縮後溶入5〇毫升二氯甲烷 中,然後用50毫升之1Μ碳酸氫三乙銨溶液萃取。將有機相 在硫酸鈉上予以乾燥。利用過濾方式除去鹽並且在眞空狀 態下將其濃縮至1毫升。在室溫下,將濃縮後之產物溶液放 入50毫升正戊烷中予以沉澱。加入450毫升正戊烷後將溶液 冷卻到-20°C後,沉澱即可完成。利用過濾方式將沉澱物分 本紙張尺度適用中國國家標隼(CNS ) A4規格(210X297公釐〉 — -„---r----^—裝----,--訂------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -23 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印簟 A7 B7 _ 五、發明説明() 離出來後,用1〇〇毫升正戊烷淸洗後在眞空狀態下,放在 P4O10/KOH上予以乾燥。所得到之產物即爲6-苯甲醯基-5'-二甲 氧三苯甲基-2’·去氧腺苷(6_苯甲醯基-5L二甲氧三苯甲基-2’-去 氧腺苷:5泣毫克,純度85.5% (乾基))。 實例5 :從廢液(得自一寡核苷酸合成反應器)製備6_苯甲 醯基-5·-二甲氧三苯甲基_2'_去氧腺苷 在20-30°C下,將含有0.82毫莫耳6-苯甲醯基-5·-二甲氧三 苯甲基_2’_去氧腺苷基-P-氰乙基膦酸酯之300毫升廢液(得 自一DNA合成反應器)流進5〇毫升含有1克咪唑之甲醇溶液 中。反應一週後,將反應溶液在眞空狀態下予以乾燥而得 到白至微黃色之固體,再溶入1⑻毫升二氯甲烷中。利用三 次100毫升之1M NaH2P〇VNaHP04 (pH 5.5)溶液萃取後,所有收 集之水相再用50毫升二氯甲烷予以萃取。將有機相收集後 用二次100毫升碳酸氫鈉飽和水溶液加以萃取。碳酸氫鈉相 再用50毫升二氯甲烷加以萃取後,收集所有之有機相。將 * 收集之有機相在硫酸鈉上予以乾燥。利用蒸發法將粗產物 濃縮並且利用急驟層析法加以分離。將產物部份收集在一 起濃縮後溶入50毫升二氯甲烷中,然後用5〇毫升之1M碳酸 氫三乙銨溶液萃取。將有機相在硫酸鈉上予以乾燥。利用 過濾方式除去鹽並且在眞空狀態下將其濃縮至1毫升。在室 溫下,將濃縮後之產物溶液放入50毫升正戊烷中予以沉 澱。加入200毫升正戊烷後將溶液冷卻到-2〇°C後,沉澱即可 完成。利用過濾方式將沉澱物分離出來後,用5〇毫升正戊 ( CNS ) A4^ ( 21〇 X297^Jt ) ' -24- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ B7 _______ 五、發明説明() 烷淸洗後在眞空狀態下,放在P4〇h/K〇H上予以乾燥。所得 到之產物即爲6-苯甲醯基士二甲氧三苯甲基-2'-去氧腺苷(6-苯甲醯基-5·-二甲氧三苯甲基-2'-去氧腺苷:3δΟ毫克,純度 75·5%乾燥固體,含有100%核苷酸間耦合(在合成器 中))。 實例6 :從4-苯甲醯基-5'-二甲氧三苯甲基-2'-去氧胞甘-3'-基-β-氰 乙基二異丙基胺基磷酸酯製備4-苯甲醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2’-去氧胞苷 在20 - 30°C下,將350毫克(5毫莫耳)四唑和18微升 (1毫莫耳)水加入8毫升含有幻3毫克(1毫莫耳)4_苯甲 醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2·-去氧胞甘Α^-β-氰乙基二異丙基胺 基磷酸酯之乙腈溶液中。5分鐘後,胺基磷酸酯水解完成而 得到4-苯甲醯基-5·-二甲氧三苯甲基胞苷-3·-氰乙基膦酸氫酯。 將4毫升甲醇和350毫克咪唑加入此溶液中。24小時 後,利用眞空蒸發法將反應溶液加以濃縮。所得到之白至 微黃色固體溶入5〇毫升二氯甲烷中。 使用50毫升水和50毫升碳酸氫鈉溶液萃取後,將有機 相在硫酸鈉上予以乾燥。鹽和任何殘留之咪唑以過濾方式 去除。利用蒸發法將粗產物濃縮並且利用急驟層析法加以 分離。將產物部份收集在一起濃縮後溶入5〇毫升二氯甲烷 中,然後用50毫升之1Μ碳酸氫三乙銨溶液萃取。將有機相 在硫酸鈉上予以乾燥。利用過濾方式除去鹽並且在眞空狀 態下將其濃縮至1毫升。在室溫下,將濃縮後之產物溶液放 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210Χ297公釐) -------„-----< 1裝--^--,--訂-----一線-I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -25 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明() 入5〇毫升正戊烷中予以沉澱。加入45〇毫升正戊烷後將溶液 冷卻到-2〇°C後,沉澱即可完成。利用過濾方式將沉澱物分 離出來後,用100毫升正戊烷淸洗後在眞空狀態下,放在 P401Q/K0H上予以乾燥。所得到之產物即爲4_苯甲醯基-5'-二甲 氧三苯甲基-2’-去氧胞苷(4-苯甲醯基_5'-二甲氧三苯甲基_2’-去 氧胞苷:527毫克,純度S3.2% (乾基))。 實例7 ·‘從廢液(得自一寡核苷酸合成反應器)製備4-苯甲 醯基_5'-二甲氧三苯甲基_2'-去氧胞苷 在2〇-3〇°C下,將含有0.27毫莫耳4·苯甲醯基-5'·二甲氧三 苯甲基-2'-去氧腺苷-3’-基-β-氰乙基膦酸酯之100毫升廢液(得 自一 DNA合成反應器)流進50毫升含有1克咪唑之甲醇溶液 中。反應一週後,將反應溶液在眞空狀態下予以乾燥而得 到白至微黃色之固體,再溶入1〇〇毫升二氯甲烷中。利用三 次1〇〇毫升之1Μ NaH2P〇4/NaHP04 (pH 5.5)溶液萃取後,所有收 集之水相再用50毫升二氯甲烷予以萃取。將有機相收集後 用二次100毫升碳酸氫鈉飽和水溶液加以萃取。碳酸氫鈉相 再用5〇毫升二氯甲烷加以萃取後,收集所有之有機相。將 收集之有機相在硫酸鈉上予以乾燥。利用蒸發法將粗產物 濃縮並且利用急驟層析法加以分離。將產物部份收集在一 起濃縮後溶入5〇毫升二氯甲烷中,然後用50毫升之1M碳酸 氫三乙銨溶液萃取。將有機相在硫酸鈉上予以乾燥。利用 過濾方式除去鹽並且在眞空狀態下將其濃縮至1毫升。在室 溫下,將濃縮後之產物溶液放入50毫升正戊烷中予以沉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) -26- 經濟部中央樣準局貝工消費合作杜印製 A7 ____B7___ 五、發明説明() 澱。加入200毫升正戊烷後將溶液冷卻到-20°C後,沉澱即可 完成。利用過濾方式將沉澱物分離出來後,用5〇毫升正戊 烷淸洗後在眞空狀態下,放在PAo/KOH上予以乾燥。所得 到之產物即爲4-苯甲醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2-去氧胞苷(4_ 苯甲醯基-5’-二甲氧三苯甲基-2'-去氧胞苷:163毫克,純度 91.5%乾燥固體,含有1〇〇%核苷酸間耦合(在合成器 中))。 實-例8 :從廢液(得自一寡核苷酸合成反應器)製備N-甲基-N-(5’-z:甲氧三苯甲基·3'_去氧胸苷_3'_基)·(5·_去氧胸苷-5·-基)乙醯 胺 將含有160毫克Ν-甲基-Ν-(5'-二甲氧三苯甲基-3'-去氧胸苷· 3'-基)-(3'_氰乙基-Η-膦醯基-5’-去氧胸基)乙醯胺之5毫升廢液 (得自一DNA合成反應器)流進50毫升含有1克咪唑之甲醇 溶液中。在20-25°C下,持續反應3天後,用5毫升水將反應 混合物稀釋<然後將包含30克碘、20毫升水、2〇〇毫升吡啶 及750毫升四氫呋哺之溶液加入反應混合物中,溶液加入之 量必須足夠使得碘之棕色至少能保留5分鐘。然後利用眞空 蒸發法將反應混合物濃縮成微黃色之固體,再溶入一由100 毫升之4〇%NaHS03水溶液及5〇毫升乙酸乙酯所組成之乳液 中。利用萃取法將水相分離出來後,再經二次50毫升碳酸 氫鈉水溶液萃取有機相。將萃取後之水相收集起來,再用 毫升乙酸乙酯萃取一次。將萃取後之有機相收集起來, 再用二次5〇毫升之1MMgS〇4水溶液萃取之。然後在2·克乾之 l»K— ^^^1 m> ^^^1 HI (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 線l· 本紙張尺度it财關家標準(CMS ) A4規格(210X2^^"y -27- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明() 硫酸鈉上予以乾燥。將鹽類過濾出來後,在眞空狀態下將 濾液濃縮至乾燥爲止。將乾燥後之固體溶入5毫升CH-C13/ 甲醇(9:1)溶液後,利用矽膠管柱予以層析分離。將產物部 份收集後,在高眞空狀態下予以乾燥。最後之產物,N-甲基 善(5'-二甲氧三苯甲基-3'-去氧胸苷I基)-(5'-去氧胸苷_5'-基)乙醯 胺以白色泡沬之形式沉澱出來,產量爲40毫克(爲理論値 之 31%) 〇 ^-NMR: (CDC13,標準=丁1^,(1[??111]):8.8:23,1^;7.7:3,111,116;7.45-7.2: DMTr; 7.09: s, 1H, Η6; 6.82: 2m, 4H, DMTr; 6.33: t, 1H, Γ; 6.15: t, 1H, 1'; 5.26 - 4.95: m,1H,3, atNRCH3,二種轉動異構物 3:1; 4.25 - 4: m,2H; 3.75: s,6H,DMTr; 3.63, 3.4, 3.25: 3m,4H; 2.9, 2.85: 2s,3H,CH3 of NRCH3,二種 轉動異構物:3:1; 2.65 - 2: m; 1.88: 2H,1.8: 1H,2s, CH35, 2 rotamers: 3:1; 1.5: 1H,1.45:2H,2s,CH35,二種轉動異構物:1:3。 實例9 :從廢液(得自一寡核苷酸合成反應器)製備5’-二甲 氧三苯甲基-N6-三甲基乙醯基-2’-(l-(2-氟苯基)-4-甲氧六氫吡啶-4-基)-腺苷 將含有160毫克N-甲基-N-(5’-二甲氧三苯甲基_3'-去氧胸苷-3'-基)-(3'-氰乙基-H-膦醯基-5’-去氧胸甘_5’-基)乙醯胺之5毫升廢液 (得自一 DNA合成反應器)流進50毫升含有1克咪唑之甲醇 溶液中。在20-25°C下,持續反應3天後,用5毫升水將反應 混合物稀釋。然後將包含3〇克碘、20毫升水、200毫升吡啶 及75〇毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中,溶液加入之 量必須足夠使得捵之棕色至少能保留5分鐘。然後利用眞空 裝 訂 線 (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(21〇X 297公釐) -28- 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印策 A7 _ 五、發明説明() 蒸發法將反應混合物濃縮成微黃色之固體,再溶入一由100 毫升之40% NaHS03水溶液及5〇毫升乙酸乙酯所組成之乳液 中。利用萃取法將水相分離出來後,再經二次5〇毫升碳酸 氫鈉水溶液萃取有機相。將萃取後之水相收集起來,再用 10毫升乙酸乙酯萃取一次。將萃取後之有機相收集起來, 再用二次50毫升之lMMgS04水溶液萃取之。然後在2克乾之 硫酸鈉上予以乾燥。將鹽類過濾出來後,在眞空狀態下將 濾液濃縮至乾燥爲止可得到320克之粗產物。將乾燥後之固 體溶入5毫升CH-C13/甲醇(9:1)溶液後,利用矽膠管柱予以 層析分離。將產物部份收集後,在高眞空狀態下予以乾 燥。最後之產物5'·二甲氧三苯甲基-N6-三甲基乙醯基-2'-(l-(2-氟苯基>4-甲氧六氫吡陡_4·基)-腺苷會以黃色油之形式沉殿出 來,產量爲223毫克(爲理論値之58%)。 iH-NMR: (CDC13,標準= TMS,d [ppm]): 8.69: s,1H,腺嘌呤;8.48: s,1H,腺 嘌玲;8.2: s,1H,腺曝玲;7·5 - 7.2: m,9H,DMTr; 7.12 - 6·88: m,4H,2-氟苯 基;6.83: 2m,4H,DMTr; 6.25: d,1H,Γ; 5.35: m; 4.43: m,1H; 4.3: m,1H; 3.76: s,6H; 3.5, 3.38; 2m,2H,5'; 3.15: m,1H,Fpmp; 2.96: m,2H; Fpmp; 2.78: s, 3H, CH3 of Fpmp, m, 1H, FPMP; 2.15 - 1.75: m, 4H, Fpmp; 1.4: 9H:piv 〇 實例10 :從5’·二甲氧三苯甲基-2HK2-氟苯基H-甲氧六氫吡陡-4-基)尿苷-3^基氰乙基二異丙基胺基磷酸酯水解產物製備5’-二 甲氧三苯甲基-2'-(l-(2-氟苯基)_4·甲氧六氫吡陡基)尿苷;與甲 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4说格(21〇Χ297公釐) r I 1· I 、裝 I I I -τ- I 訂*~ 」·^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -29- 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 2B284 A7 ____B7_五、發明说明() 醇及KF進行轉酯化反應;在操作時,Ι2/Η20當作驟冷溶液而 無12受體 將10毫升含有0· 138毫莫耳5'-二甲氧三苯甲基-2’-(l-(2-氟苯 基)-4-甲氧六氫吡啶-4-基)尿苷-3’-基-氰乙基-H-膦酸酯和0.694毫 莫耳四唑之乙膪溶液加入50毫升之0.1MKF之甲醇溶液中。 在20-25°C下,反應在2天內完成。用5毫升水稀釋反應混合 物。然後將一含有3〇克碘、20毫升水、200毫升吡啶及750 毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中,溶液加入之量必 須足夠使得碘之棕色至少能保留5分鐘。然後利用眞空蒸發 法將反應混合物濃縮成微黃色之固體,再溶入一由50毫升 水及50毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。收集所有之有機相 並且用四次50毫升水萃取之。收集所有之水相並且再一次 用10毫升乙酸乙酯萃取之。收集所有之有機相,用50毫升 NaCl飽和溶液萃取後,在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利用過 濾方式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-10毫升 乙酸乙酯中,然後慢慢地將溶液流進2〇〇毫升正戊烷中。產 ^ 物以白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後,用5〇毫升 正戊烷淸洗,然後在眞空狀態下,在P4〇10/KOH上乾燥24小 時,即可得到67.7毫克(理論値之69%)之5’-二甲氧三苯甲基 -2'-(1-(2·氟苯基)-4-甲氧六氫吡陡_4_基)尿苷(理-値之75%)。 ^-NMR: (CDC13,標準=TMS,d [ppm]): 7.75: d,1H,H6; 7.45 - 7_15: m, 9H, DMTr; 7.1 - 6.75: m, 4H, Fpmp, 2m, 4H, DMTr; 6.15: d, 1H, 1'; 5.2: d, 1H, H5; 4.74: m, 1H, 2'; 4.33: m, 1H, 3'; 4.15: m, 1H, 4'; 3.76:s, 6H, DMTr; 3.38: m, 2H, 5'; 3·12; s,3H,CH3 ofFpmp; 3.2 - 2.8: m, 4H,Fpmp; 2.15 - 1.8: m,4H。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標隼(CMS ) A4洗格(2丨0X297公釐) -30- 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明() 實例11 :從5'-二甲氧三苯甲基-N4-苯甲醯基_2'-(1-(2-氟苯基)-4-甲 氧六氫吡陡-4-基)胞苷-3'-基氰乙基二異丙基胺基磷酸酯水解產 物製備5_-二甲氧三苯甲基-N4-苯甲醯基-2'-(l-(2-氟苯基)-4-甲氧 六氫吡啶_4·基)胞苷 將10毫升含有0.129毫莫耳5'-二甲氧三苯甲基-N4-苯甲醯 基-2'-(l-(2-氟苯基)-4-甲氧六氫吡啶-4-基)胞苷基-氰乙基-H-膦酸 酯和0.645毫莫耳四唑之乙腈溶液加入50毫升之0.1MKF之甲 醇溶液中。在2〇-25°C下,反應在2天內完成。用5毫升水稀 釋反應混合物。然後將一含有30克碘、20毫升水、200毫升 吡啶及75〇毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中,溶液加 入之量必須足夠使得碘之棕色至少能保留5分鐘。利用眞空 蒸發法將反應混合物濃縮成微黃色之固體,再溶入一由50 毫升水及50毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。收集所有之有 機相並且用四次50毫升水萃取之。收集所有之水相並且再 一次用1〇毫升乙酸乙酯萃取之。收集所有之有機相,用50 毫升NaCl飽和溶液萃取後,在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利 用過濾方式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-1〇 毫升乙酸乙酯中,然後慢慢地將溶液流進200毫升正戊烷 中。產物以白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後,用 5〇毫升正戊烷淸洗,然後在眞空狀態下,在Ρ4〇η/Κ〇Η上乾 燥24小時,即可得到S3毫克(理論値之09%)之义二甲氧三 苯甲基-Ν4-苯甲醯基·2’·(1-(2-氟苯基)-4-甲氧六氫吡啶-4-基)胞苷 (理論値之80%)。 -----------{ 1 裝---------J--計-----^ ^ L— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210x 297公釐) -31 - 五、發明説明( A7 B7 iH-NMR: (CDC13,標準=丁]\^,(1帥111]):8.28:(1,1氏7.82:(1,2氏62;7.6-7.23: m, 14H, Bz, DMTr; C; 7.03 - 6.77: d, 4H, DMTr, 2d, 4H, Fpmp; 4.66: 6, 1H, Γ; 4.38: 6, 1H, 2'; 4.17: m, 1H, 3', 3.74: s, 6H, DMTr; 3.48: m, 2H, 5'; 3.25 - 2.85: s, 3H, CH3, Fpmp, m, 4H, Fpmp; 2.18 - 1.95: m, 4H, Fpmp « I9F-NMR: (CDC13,標準=TFA, d [ppm]): -123.5。 經濟部中央樣隼局貝工消費合作社印裝 實例12 :從5’_二甲氧三苯甲基-N4-(4-第三丁苯氧乙醯基-r-去氧 胞基氛乙基二異丙基胺基磷酸酯水解產物製備5'-二甲氧 三苯甲基-N4-(4-第三丁苯氧乙醯基·2·_去氧胞苷 將4毫升含有200毫克5'-二甲氧三苯甲基_ν4-(4-第三丁苯 氧乙醯基-2’-去氧胞苷(得自5'-二甲氧三苯甲基-ν4·(4-第三丁 苯氧乙醯基-2'-去氧胞苷_3'-基氰乙基-η-膦酸酯水解產物)和2 毫莫耳四唑之乙腈溶液加入40毫升之〇.2M KF之甲醇溶液 中。在20-25°C下,去亞磷醯化反應在4小時內完成。在反 應混合物中加入1毫升卩比啶後再加入5〇毫克硫。在20- 25°C 下’將反應混合物攪拌60分鐘’過濾,然後倒入毫升水 中。所形成之乳液用三次30毫升乙酸乙酯萃取之。收集所 有之有機相,用50毫升NaCl飽和溶液萃取之,然後放在2克 乾之硫酸鈉上乾燥。利用過濾方式將鹽去除並在眞空狀態 下將濾液濃縮至全乾。將固體溶入1〇毫升乙酸乙酯中,然 後慢慢地將溶液流進3〇0毫升正戊烷中。產物以白色非結晶 狀沉澱出來。將沉澱物過濾後,用5〇毫升正戊烷淸洗,然 後在眞空狀態下,在P4〇10/K〇H上乾燥24小時,即可得到 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. ---訂 線 -32- 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 ___ 五、發明説明() 112.8毫克(理論値之72.1%)之5,-二甲氧三苯甲基-N4-(4-第三 丁苯氧乙釀基_2'-去氧胞甘。 實例13 :在裝有12/水之驟冷器中,伴隨檸檬酸緩衝劑,與 咪哩之轉酯化反應:從廢液(得自一寡核甘酸合成器)製 備5'-二甲氧三苯甲基-(3·Ν-三氟乙酿基胺丙基)-2'-去氧尿有r 將5毫升含有120毫克5’-二甲氧三苯甲基-(3·Ν-三氟乙酿基 胺丙基>2·-去氧尿甘-3’-基氰乙基—Η·膦酸酯之廢液(得自一 DNA 合成器中)流進8〇毫升甲醇溶液(每50毫升甲醇中含有1克 咪唑)中。在2〇 - 25°C下,讓反應持續進行3天。用8毫升水 稀釋反應混合物。然後將一含有30克碘、20毫升水、200毫 升n比啶和75〇毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中。溶液 加入量必須使得碘之棕色能維持至少5分鐘。利用眞空蒸發 法將反應混合物濃縮成一微黃色固體,而後溶入由50毫升 ρΗ:3·4之緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。緩衝劑 之成份爲:每升水溶液中含有24克Na0H、117克檸檬酸和35 克氯化鈉。將含有咪唑之水相分離出來,然後用二次50毫 升緩衝劑再將有機相萃取一次。然後所得之有機相再先後 用碳酸氫鈉飽和水溶液及50毫升氯化鈉飽和溶液萃取之。 將所得之有機相放在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利用過濾方 式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-10毫升乙酸 乙酯中,然後慢慢地將溶液流進25〇毫升正戊烷中。產物以 白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後,用50毫升正戊 烷淸洗’然後在眞空狀態下,在P401Q/K0H上乾燥24小時, 本紙張尺度適用中國國家標隼(CNS〉从規格(210x297公釐) --L---i-----1 1裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -33 - B7五、發明説明() 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 即可得80毫克(理論値之86%) A二甲氧三苯甲基-(3_N-三氟 乙醯基胺丙基>2'-去氧尿苷。 iH-NMR: (CDC13,標準=TMS,d [ppm]): 7.45 - 6.9: m,9H,DMTr; 6.73: 2m, 4H, DMTr; 6.48: 6, 1H, 1'; 4.56: m, 1H, 3'; 4.04: m, 1H, 4'; 3.7: s, 6H, DMTr; 3.5 - 3.4: 2m, 3.35 - 3.25: 2m, 2H, 5'; 2.97: s, 2H, NH2; 2.47 - 2.37: m, 1H, 2'; 2.35 - 2.2: m,1H, 2'; 1.82: m, m, 1H; 1.45 - 1_15: m, 4H,胺丙基。 實例14:從廢液(得自一寡核苷酸合成器)製備5’-二甲氧三 苯甲基_5_(丙炔-1-基)-2’-去氧尿苷 將5毫升含有250毫克(5'-二甲氧三苯甲基-5-(丙炔-1-基)-2'-去氧尿苷-3'-基)-氰乙基-H-膦酸酯之廢液(得自一 DNA合成器 中)流進67毫升甲醇溶液(每5〇毫升甲醇中含有1克咪唑) 中。在20-25°C下,讓反應持續進行3天。用8毫升水稀釋反 應混合物。然後將一含有3〇克碘、20毫升水、2〇0毫升吡啶 和750毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中。溶液加入量 必須使得碘之棕色能維持至少5分鐘。利用眞空蒸發法將反 應混合物濃縮成一微黃色固體,而後溶入由50毫升pH:3-4之 緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。緩衝劑之成份 爲:每升水溶液中含有24克NaOH、117克檸檬酸和35克氯化 鈉。將含有咪唑之水相分離出來,然後用二次50毫升緩衝 劑再將有機相萃取一次。然後所得之有機相再先後用碳酸 氫鈉飽和水溶液及50毫升氯化鈉飽和溶液萃取之。將所得 之有機相放在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利用過濾方式將鹽 去除並將濾液予以濃縮。將固體溶人5 -10毫升乙酸乙酯 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 -34- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明() 中,然後慢慢地將溶液流進25〇毫升正戊烷中。產物以白色 非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後,用50毫升正戊烷淸 洗,然後在眞空狀態下,在P/VKOH上乾燥24小時,即可 得I25毫克(理論値之6S%) 5'-二甲氧三苯甲基_5_(丙炔-1-基)-2'-去氧尿I。 ^-NMR: (CDC13,標準=TMS,d [ppm]): 7.95: s,1H,NH; 7.4 _ 7.15: m,10H, DMTr; 6.78: 2s, 4H, DMTr; 6.24: t, 1H, Γ; 4.5: m, 3'; 4.06: m, 4'; 3.75: s, 6H, DMTr; 3.28: m,2H,5’: 2.43: m,1H, 2'; 2.22: m,1H, 2’; 1.61: s,3H,丙炔基之 CH3。 實例15 :從廢液(得自一寡核苷酸合成器)製備5'-二甲氧三 苯甲基-5-(3-三氟胺丙炔-1-基)-2'-去氧尿苷 將5毫升含有200毫克51-二甲氧三苯甲基-5-(3-三氟胺丙炔-1-基K•去氧尿苷-3’-基氰乙基-H-膦酸酯之廢液(得自一 DNA合 成器中)流進78毫升甲醇溶液(每50毫升甲醇中含有1克咪 唑)中。在2〇-25°C下,讓反應持續進行3天。用7.8毫升水 稀釋反應混合物。然後將一含有3〇克碘、2〇毫升水、200毫 升吡啶和750毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物中。溶液 加入量必須使得碘之棕色能維持至少5分鐘。利用眞空蒸發 法將反應混合物濃縮成一微黃色固體,而後溶入由50毫升 pH: 3-4之緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混合成之乳液中。緩衝劑 之成份爲:每升水溶液中含有24克NaOH、117克檸檬酸和35 克氯化鈉。將含有咪唑之水相分離出來,然後用二次50毫 升緩衝劑再將有機相萃取一次。然後所得之有機相再先後 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標隼(CNS ) A4規格(210X297公釐) -35- S2S284 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明() 用碳酸氫鈉飽和水溶液及50毫升氯化鈉飽和溶液萃取之。 將所得之有機相放在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。利用過濾方 式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-10毫升乙酸 乙酯中,然後慢慢地將溶液流進250毫升正戊烷中。產物以 白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後,用50毫升正戊 烷淸洗,然後在眞空狀態下,在PA〇/KOH上乾燥24小時, 即可得113毫克(理論値之73%) 5'-二甲氧三苯甲基-5-(3-三氟 乙醯胺丙炔-1-基)·2'·去氧尿苷。 ^-NMR: (CDC13,標準=TMS,d [ppm]): 8.15: s,1H,NH; 7.4 - 7_15: 10H, DMTr, Η6; 6.26: t, 1Η, Γ; 4.53: m, 1H, 3'; 3.97: m, 2H, 5'; 3.73: s, 6H, DMTr; 3.3·· m, 2H,丙炔基之 CH3 ; 2.48: m,1H,2,; 2.25: m,1H, 2,。 實例16 :從廢液(得自一寡核苷酸合成器)製備N_(5'_二甲 氧三苯甲基_3'-去氧胸苷-3'-基)-N-丙基_(5’-去氧胸苷-5'-基)乙醯胺 將5毫升含有200毫克N-(5'-二甲氧三苯甲基-3’-去氧胸苷-3’-基)-N-丙基-(5’-去氧胸苷-3’-基氰乙基-H-膦醯-5’-基)乙醯胺之廢 液(得自一DNA合成器中)流進7S毫升甲醇溶液(每5〇毫 升甲醇中含有1克咪唑)中。在20 -25°C下,讓反應持續進 行3天。用7.8毫升水稀釋反應混合物。然後將一含有30克 碘、20毫升水、200毫升吡啶和750毫升四氫呋喃之溶液加 入反應混合物中。溶液加入量必須使得碘之棕色能維持至 少5分鐘。利用眞空蒸發法將反應混合物濃縮成一微黃色固 體,而後溶入由50毫升ρΗ··3-4之緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混 合成之乳液中。緩衝劑之成份爲:每升水溶液中含有24克 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 .線_ 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) -36- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 _五、發明説明() NaOH、1Π克檸檬酸和%克氯化鈉。將含有咪唑之水相分離 出來,然後用二次5〇毫升緩衝劑再將有機相萃取一次。然 後所得之有機相再先後用碳酸氫鈉飽和水溶液及50毫升氯 化鈉飽和溶液萃取之。將所得之有機相放在2克乾之硫酸鈉 上乾燥之。利用過濾方式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將 固體溶入5-1〇毫升乙酸乙酯中,然後慢慢地將溶液流進600 毫升正戊烷中。產物以白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物 過濾後,用50毫升正戊烷淸洗,然後在眞空狀態下,在 PPi。/KOH上乾燥24小時,即可得107毫克(理論値之66%) N-(5·-二甲氧三苯甲基-3’-去氧胸苷基)-N-丙基-(5'-去氧胸苷-5·-基) 乙醯胺。 W-NMR: (CDC13,標準=TMS,d [ppm]): 7.65: s,1H,H6; 7.4 - 7.15: m,9H, DMTr; 7.1: s, 1H, H6; 6.77: 2s, 4H, DMTr; 6.53: t, 1H, 1'; 6.13: t, 1H, Γ; 4.28: m, 1H, 3'; 4.1: m, 2H, 3', 4'; 3.72: s, 6H, DMTr, Μ, 1H; 3.52: m, 4', 1H; 3.5: d, 1H; 3.15 · 2_85: m,3H,5’,乙醯胺之CH2; 2.56: m,1H,2'; 2.45 - 2.25: m,3H, 2,,丙基之CH2; 2.2 - 2.1: 2H,2,; 1.83: s,3H,CH35; 1.45: s,3H,CH35; 1.22: m, 2H,丙基之CH2; 0.73: t 3H,丙基之CH3。 實例17:從廢液(得自一寡核苷酸合成器)製備5’-二甲氧三 苯甲基-2’·丙基-5-甲尿苷 將5毫升含有400毫克(5·-二甲氧三苯甲基-2'-丙基_5·•甲尿 苷)-3·-氰乙基-N,N-二異丙基胺基磷酸酯之廢液(得自一DNA 合成器中)流進100毫升甲醇溶液(每50毫升甲醇中含有1 克咪唑)中。在20-25°C下,讓反應持續進行7天。用20毫 (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I 1. I - -II _ -I L: I -1 __·I — I—- i . 訂 丨線_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) -37- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明() 升水稀釋反應混合物。然後將一含有3〇克碘、20毫升水、 2〇〇毫升吡啶和75〇毫升四氫呋喃之溶液加入反應混合物 中。溶液加入量必須使得碘之棕色能維持至少5分鐘。利用 眞空蒸發法將反應混合物濃縮成一微黃色固體,而後溶入 由5 0毫升pH: 3 -4之緩衝劑和40毫升乙酸乙酯混合成之乳液 中。緩衝劑之成份爲:每升水溶液中含有24克NaOH、117克 檸檬酸和35克氯化鈉。將含有咪唑之水相分離出來,然後 用二次50毫升緩衝劑再將有機相萃取一次。然後所得之有 機相再先後用碳酸氫鈉飽和水溶液及50毫升氯化鈉飽和溶 液萃取之。將所得之有機相放在2克乾之硫酸鈉上乾燥之。 利用過濾方式將鹽去除並將濾液予以濃縮。將固體溶入5-1〇毫升乙酸乙酯中,然後慢慢地將溶液流進600毫升正戊烷 中。產物以白色非結晶狀沉澱出來。將沉澱物過濾後,用 5〇毫升正戊烷淸洗,然後在眞空狀態下,在P4〇10/KOH上乾 燥24小時,即可得258毫克(理論値之86%)黃色油狀之5'-二 甲氧三苯甲基_2'-丙基_5_甲尿苷。 W-NMR: (CDC13,標準=TMS,d [ppm]): 8_45: s,1H, NH; 7.57: s,1H,H6; 7.45 - 7.15: m, 9H, DMTr; 6.75: 2s, 4H, DMTr; 5.9: d, 1H, 1'; 4.38: m, 1H, 3'; 4.0: m, 1H,4'; 3.95: m,1H,2,; 3.72: s, 6H,DMTr; 3.8 - 3.4: m, 2H,丙基;3.6 -3.3: 4m,2H,5’; 1.56: m,2H,丙基;1.88: t 3H,丙基。 實例18 :亞磷酸酯在一聚合物上之轉酯化反應(以甲醇爲 受體) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝·
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X 297公釐) 323284 經濟部中央標準局貝工消費合作社印袋 A7 B7 五、發明説明() 在20-30°C下,將685毫克控制孔玻璃(CPG)(其與胸苷-5'-氰乙基-H-膦酸酯衍生而得,且載負著核苷,密度爲%毫莫 耳/克)與1〇毫升含有2%N-甲基嗎啉之甲醇溶液反應。核 苷經由一琥珀醯基以共價鍵方式鍵結在控制孔玻璃上之3'_ 羥基。一小時後,137毫克之固體樣品從反應混合物中取 出。撐體用四次2毫升乙腈淸洗後,與含有30克碘、20毫升 水、200毫升吡啶及75〇毫升四氫呋喃之溶液反應一小時。 所得之固體依序用十次2毫升乙腈及十次2毫升乙醚淸洗。 將撐體乾燥後,在55-60°C下,用一濃氨水溶液加以處理, 然後將固體(已無核苷存在)過濾掉。濾液先凍乾並且溶 入0.1M,pH7之乙酸三乙銨中,然後用HPLC分析其成份。結 果檢測出一個含有胸苷-單磷酸酯 '胸苷和胸苷_5'-甲基磷 酸酯之混合物。胸苷_5'_單磷酸酯是由碘氧化及氨解反應後 之抽出物所產生的。胸苷-5’-甲基磷酸酯是在氧化及水解反 應操作中,由胸I·5-甲基膦酸酯在去亞磷醯基化過程中之 一個中間體所產生的。胸苷是在琥珀醯基連接基良化後, 由與聚合物鍵結之胸苷在去亞磷醯基化後之產物中所產生 的。剩下之撐體再進行%小時上述之氧化及氨解反應條 件。胸苷全然在撐體之濾液中得到,總產率約爲80%。 實例19 :亞磷酸酯在一聚合物上之轉酯化反應(以氰乙醇 爲受體) 在2〇-30°C下,將毫克控制孔玻璃(CPG)(其與胸苷-5'-氰乙基-H-膦酸酯衍生而得,且載負著核苷,密度爲%毫莫 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -裝. 訂 線l· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨0X 297公釐) -39- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 ___ 五、發明説明() 耳/克)與10毫升含有10%N-甲基嗎啉之氰乙醇溶液反應。 核苷經由一琥珀醯基以共價鍵方式鍵結在控制孔玻璃上之 3'-羥基。100分鐘後,撐體用四次2毫升乙腈淸洗後,與含 有30克碘、20毫升水、200毫升吡啶及75〇毫升四氫呋喃之 溶液反應一小時。所得之固體依序用十次2毫升乙膪及十次 2毫升乙醚淸洗。將撐體乾燥後,在55 - 60°C下,用一濃氨 水溶液如以處理,然後將固體(已無核苷存在)過濾掉。 濾液先凍乾並且溶入〇.1Μ,ρΗ7之乙酸三乙銨中’然後用 HPLC分析其成份。結果檢測出一個含有5·-胸苷-單磷酸酯和 胸苷之混合物(比例爲3:97)。胸苷·5’_單磷酸酯是由碘氧化 及氨解反應後之抽出物所產生的。胸苷是在琥珀醯基連接 基皂化後,由與聚合物鍵結之胸苷在去亞磷醯基化後之產 物中所產生的。總產率約爲80%。 實例20 :亞磷酸酯在一聚合物上之轉酯化反應(在二-三氟 醋酸鎂存在下,以甲醇爲受體) 在20_3(TC下,將B9毫克控制孔玻璃(CPG)(其與胸苷_5’-氰乙基-H-膦酸酯衍生而得,且載負著核苷,密度爲36毫莫 耳/克)與10毫升含有0.1M Mg(OTf)2之N-甲咪唑/甲醇(1:9) 溶液反應。核苷經由一琥珀醯基以共價鍵方式鍵結在控制1 孔玻璃上之3'-羥基。3〇分鐘後,撐體用四次2毫升乙膪淸洗 後,與含有30克碘、20毫升水' 200毫升吡啶及750毫升四 氫呋喃之溶液反應一小時。所得之固體依序用十次2毫升乙 腈及十次2毫升乙醚淸洗。將撐體乾燥後,在55_6〇°C下’ ----------;_ 裝-- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張又度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2IOX297公楚) -40- 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 32 扣 84 A7 B7 五、發明説明() 用一濃氨水溶液加以處理,然後將固體(已無核苷存在) 過濾掉。濾液先凍乾並且溶入〇.1Μ,ρΗ7之乙酸三乙銨中, 然後用HPLC分析其成份。結果檢測出一個含有胸苷和胸苷-甲基磷酸酯之混合物。胸¥4-甲基磷酸酯是在碘氧化及水 解反應操作中,由胸甘-5-甲基-H-膦酸酯在去亞磷醯基化過程 中之一個中間體所產生的。胸苷是在琥珀醯基連接基皂化 後,由與聚合物鍵結之胸苷在去亞磷醯基化後之產物中所 產生的。胸苷與胸苷-5’-甲基磷酸酯之比例爲97:3。總產率約 爲 80%。 實例21 :亞磷酸酯在一聚合物上之轉酯化反應(在氯化鋰 存在下,以氰乙醇爲受體) 在20-3〇°C下,將139毫克控制孔玻璃(CPG)(其與胸苷_5'-氰乙基-H-膦酸酯衍生而得,且載負著核苷,密度爲36毫莫 耳/克)與1〇毫升含有0.1MUC1之N-甲嗎啉/氰乙醇(1:9)溶 液反應。核苷經由一琥珀醯基以共價鍵方式鍵結在控制孔 玻璃上之3’-羥基。30分鐘後,撐體用四次2毫升乙腈淸洗 後,與含有3〇克碘、20毫升水、2〇0毫升吡啶及*750毫升四 氫呋喃之溶液反應一小時。所得之固體依序用十次2毫升乙 腈及十次2毫升乙醚淸洗。將撐體乾燥後,在55-6〇°C下’ 用一濃氨水溶液加以處理,然後將固體(已無核苷存在) 過濾掉。濾液先凍乾並且溶入0.1M,PH7之乙酸三乙銨中’ 然後用HPLC分析其成份。結果檢測出一個含有胸甘和胸1-5'-磷酸酯之混合物。胸苷-5'-磷酸酯是在碘氧化及氨解反應操 本纸張尺度適用中國國家標隼(CNS ) A4規格(210X297公釐) ---1, 1 裝----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線l· -41 - ^28284 Μ Β7 五、發明説明() 作中,由胸苷-5-甲基-Η-膦酸酯在去亞磷醯基化過程中之一個 中間體所產生的。胸苷是在琥珀醯基連接基皀化後,由與 聚合物鍵結之胸苷在去亞磷醯基化後之產物中所產生的。 胸苷與胸甘_5'_磷酸酯之比例爲98:2。總產率約爲80%。 L —裝--J I 1 1_ -訂------^線 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210Χ 297公釐) -42-
Claims (1)
- 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 π、申請專利範圍 1· 一種製備天然或合成之核苷、核苷相似體或寡核苷酸之 方法(該寡核苷酸含至少兩天然或合成之核苷及/或核 苷相似體,該天然或合成之核苷或核苷柑似體之鹸性分 子含一未被取代或被取代之一核鹼基Β之自由基,該天 然或合成之核苷、核體或寡核苷酸在5’-位或在3’· 位帶有一式RrO"之保其中艮爲一保護基,在其它 位置爲一自由羥基,或該天然或合成之核苷、核苷相似 體或寡核苷酸係經由一羥基上之氧原子(位於5’-位或3’· 位)直接或經由一連結基鍵結在一固體撐體上,並在其 它位置帶有一自由羥基),該方法包括將式(0、(la)或 〇b),i J> + 0-CH2CH2-CN(I),0=4—0CH3 (la)或 Η Η H 之基(式(I)、(la)或(lb)之基係附在天然或合成之核苷、 核苷相似體或寡核苷酸之3啦而在5·-位有一式Rr〇之保 護之羥基,其中私爲一保護基,或一固體撐體,或式 0)、(la)或(lb)之基附在天然或合成之核苷、核苷相似體 或寡核苷酸之5,-位而在3’-位有一式Rr〇-之保護之羥基’ 其中禺爲一保護基,或一固體撐體)轉化成一羥基 -0H,該轉化反應係利用天然或合成之核苷、核苷相似 體或寡核苷酸(帶有式(I)、(la)或〇b)之基者)在有或無 自酸、鹵化烴、騰、竣酿胺及內酸胺一組中選出之惰性 溶劑存在下,與至少100莫耳當量且高達100°莫耳當量過 量之醇(選自含1-20個碳原子之烷醇、含5-12個碳原子之 --------一裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本萸) 訂- i 4 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS > A4規格(210X297公釐) -43 - 3 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製 3284 i! C8 ’ D8六、申請專利範圍 環烷醇、含7-30個碳原子之芳脂醇及含6·30個碳原子之芳 醇)之羥基(每募耳當量之式(I)、(la)或〇b)之基)反 應,反應係在至少一催化量之無機鹸或有機氮鹼存在下 (無機鹸係選自鹼性金屬氧化物、重金屬氧化物及氫氧 化物、金屬氟化物及氟化銨,有機氮鹼之pK値爲‘10, 且係選自芳胺、芳族Ν-雜環及Ν·垸基嗎啉,鹼之催化量 在0.01至20%莫耳範圍內),在-20°C至+55°C之溫度範圍 內進行。 2. 如申請專利範圍第1項之方法,其中之溶劑爲四氫呋喃 或二Df烷。 3. 如申請專利範圍第1項之方法,其中之溶劑係由乙_、 丙腈、苯甲膪及苯乙腈組成之一組中選取者。 4. 如申請專利範圍第1項之方法,其中反應係在15°C至35Ϊ 之溫度範圍內進行。 5·如申請專利範圍第4項之方法,其中反應係在室溫下進 行。 &如申請專利範圍第1項之方法,其中之醇係含1至20個碳 原子之烷醇。 I I— I— I— I— n HIL· 訂 n-^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS〉A4規格(210X297公釐) -44 - A8 B8 C8 D8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^、申請專利範圍 7. 如申請專利範圍第6項之方法,其中之醇係含1至6個碳 原子之烷醇。 8. 如申請專利範圍第6項之方法,其中之醇係由甲醇、乙 醇、正-及異丙醇、正-、異-及第三丁醇、戊醇、己醇、 乙二醇、二甘醇單甲-及單乙醚組成之一組中選取者》 9·如申請專利範圍第7項之方法,其中之醇係含1至4個碳 原子之烷醇。 10. 如申請專利範圍第8項之方法,其中之醇爲甲醇。 11. 如申請專利範圍第1項之方法,其中之醇係含5至8個碳 原子之環烷醇。 12. 如申請專利範圍第11項之方法,其中之醇係由環戊醇、 環己醇、甲基環己醇、環庚醇及環辛醇組成之一組中選 取者。 13. 如申請專利範圍第1項之方法,其中之醇係含7至20個碳 原子之芳脂醇。 14. 如申請專利範圍第13項之方法,其中之醇是由未被取代 或被烷基或烷氧基取代之苯甲醇及屮苯乙醇組成之一組 中選取者。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 .——絲 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) _ 45 - 323284 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A8 § -D8六、申請專利範圍 15. 如申請專利範圍第1項之方法,其中之醇係含6至12個碳 原子之芳醇。 16. 如申請專利範圍第15項之方法,其中之醇係由酚、萘酚 及未被取代或被烷基或烷氧基取代之酚或萘酚組成之一 組中選取者。 17·如申請專利範圍第1項之方法,其中之無機鹸係由鹼性 氧化鋁、鹸性二氧化矽及氟化鉀(KF)組成之一組中選取 者。 18. 如申請專利範圍第1項之方法,其中之有機氮鹸是由咪 唑、吡啶、聚乙烯吡啶、N-甲基嗎啉、苯胺及鄰二胺基 苯組成之一組中選取者。 19. 如申請專利範圍第1項之方法,其中使用親核性催化反 應之額外催化量之無機鹸。 20. 如申請專利範圍第1項之方法,其中使用額外催化量之 路易士酸。 21. 如申請專利範圍第1項之方法,其中之醇爲氰乙醇。 --------1 裝----訂-------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨0X297公釐〉 -46-
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