JP2000512288A

JP2000512288A - オリゴヌクレオチド合成用中間体

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Publication number: JP2000512288A
Application number: JP10501337A
Authority: JP
Inventors: コリングウッド，スティーブン・ポール; モゼル，ハインツ・エルンスト; アルトマン，カール―ハインツ; ダグラス，マーク・エドワード
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1996-06-13
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2000-09-19
Also published as: CN1221423A; BR9709791A; CA2257453A1; EP0906327B1; DE69709098T2; AU2971997A; GB9612600D0; DE69709098D1; US6329519B1; WO1997047636A3; ATE210675T1; ZA975197B; WO1997047636A2; EP0906327A2

Abstract

(57)【要約】式［式中、Ｂ¹はヌクレオシド塩基の基であり、Ｒ¹は水素またはヒドロキシ保護基であり、Ｒ²は水素、ヒドロキシまたは２'ヌクレオシド修飾原子もしくは基であり、Ｒ³は置換もしくは非置換Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₄〜Ｃ₁₀シクロアルキルアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリールまたはＣ₇〜Ｃ₁₃アラルキル基であり、Ｚはハロゲンまたは式(式中、Ｒ⁴およびＲ⁵はそれぞれ独立に置換もしくは非置換Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₄〜Ｃ₁₀シクロアルキルアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリールまたはＣ₇〜Ｃ₁₃アラルキル基であるか、またはＲ⁴が当該基であって、Ｒ⁵が水素であるか、またはＲ⁴およびＲ⁵はそれらが結合する窒素原子と共に５員環ないし１３員環のヘテロ環を表わす)で示される基であるか、またはＺは式

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチド合成用中間体本発明はオリゴヌクレオチド用中間体である化学化合物およびそのような化合物のオリゴヌクレオチド調製における使用に関する。従って、本発明はその一側面において、式［式中、Ｂ¹はヌクレオシド塩基の基であり、Ｒ¹は水素またはヒドロキシ保護基であり、Ｒ²は水素、ヒドロキシまたは２'ヌクレオシド修飾原子もしくは基であり、Ｒ³は置換もしくは非置換Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₄〜Ｃ₁₀シクロアルキルアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリールまたはＣ₇〜Ｃ₁₃アラルキル基であり、Ｚはハロゲンまたは式II (式中、Ｒ⁴およびＲ⁵はそれぞれ独立に置換もしくは非置換Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₄〜Ｃ₁₀シクロアルキルアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリールまたはＣ₇〜Ｃ₁₃アラルキル基であるか、またはＲ⁴が当該基であって、Ｒ⁵が水素であるか、またはＲ⁴およびＲ⁵はそれらが結合する窒素原子と共に５員環ないし１３員環のヘテロ環を表わす)で示される基であるか、またはＺは式 (式中、Ｎｕｃは５'ヒドロキシ基を除いた後の天然もしくは合成ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド残基であり、その５'メチレンを介して表示した酸素原子に結合している)で示される基である］で示される化合物を提供する。Ｒ³、Ｒ⁴またはＲ⁵が置換されたアルキル、アルケニル、シクロアルキルアルキル、アリールまたはアラルキル基を表わすとき、当該基は、好ましくは、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシ、シアノ、ニトロまたはトリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ ヒドロカルビル)シリル、またはＲ³の場合には、Ｃ₁〜Ｃ₄アルキルスルホニルまたはＣ₆〜Ｃ₁₀アリールスルホニルにより置換されている。トリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ヒドロカルビル)シリル基が式Ｉの化合物に存在するとき、該基は、例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリ−ｎ−プロピルシリル、トリ−イソプロピルシリル、トリ−ｎ−ブチルシリル、トリ−イソブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、tert−ブチルジメチルシリルまたは１,１, ２,２−テトラメチルエチルジメチルシリル(テキシルジメチルシリル)などのトリアルキルシリル；トリフェニルシリルなどのトリアリールシリル；トリベンジルシリルなどのトリアリールアルキルシリル；フェニルジメチルシリル、フェニルジエチルシリル、フェニルジイソプロピルシリルまたはフェニル・ジ−tert− ブチルシリルなどのアリールジアルキルシリル；またはメチルジフェニルシリル、イソプロピルジフェニルシリルまたはtert−ブチルジフェニルシリルなどのアルキルジアリールシリルである。Ｒ³,Ｒ⁴またはＲ⁵がトリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ヒドロカルビル)シリル置換基を有する場合、該基は、好ましくは、トリ(Ｃ₁〜Ｃ₄ヒドロカルビル)シリル、とりわけ、トリメチルシリルである。トリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ヒドロカルビル)シリルとしてのＲ¹は、好ましくは、Ｃ₁〜Ｃ₆アルキルジ(Ｃ₆〜Ｃ₈アリール)シリル、とりわけ、tert−ブチルジフェニルシリル、または分枝Ｃ₂〜Ｃ₁₀ アルキルジ(Ｃ₁〜Ｃ₄アルキル)シリル、とりわけ、テキシルジメチルシリルである。Ｒ¹は望ましくない反応に対して５'−ヒドロキシ基を保護し得る如何なるヒドロキシ保護基であってもよい。そのような基は周知であり、Ｃ₁〜Ｃ₁₀脂肪族、例えば、アルキル基；Ｃ₃〜Ｃ₈脂環式、例えば、シクロアルキル基；Ｃ₆〜Ｃ₁₀ 芳香族、例えば、アリール基；Ｃ₇〜Ｃ₄₀芳香脂肪族、例えば、アラルキルまたはＣ₁〜Ｃ₄−アルコキシ置換アラルキル基；式−ＣＯＲまたは−ＳＯ₂Ｒ(式中、ＲはＣ₁〜Ｃ₁₀脂肪族基、Ｃ₃〜Ｃ₈脂環式基、Ｃ₆〜Ｃ₁₀芳香族基またはＣ₇〜Ｃ₄ ₀ 芳香脂肪族基；およびトリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ヒドロカルビル)シリル基を包含する。好ましいＲ¹は水素またはオリゴヌクレオチドの合成に常用される５'−保護基であり、より好ましくは、水素、Ｃ₇〜Ｃ₄₀芳香脂肪族基またはトリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ ヒドロカルビル)シリル基、とりわけ、メトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリスtert−ブチルトリチルなどの置換もしくは非置換トリフェニルメチル基、またはtert−ブチルジフェニルシリルなどのＣ₁〜Ｃ₆アルキルジ(Ｃ₆〜Ｃ₈ アリール)シリル基、特に、ジメトキシトリチルまたはtert−ブチルジフェニルシリルである。２'ヌクレオシド修飾原子または基であるＲ²、すなわち、水素原子またはヒドロキシ基の代わりにヌクレオシドの２'位置に結合することのできる原子または基は、フッ素、塩素または臭素原子などのハロゲン原子；メチル、トリフルオロメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチルまたはデシルなどのＣ₁〜Ｃ₁₀非置換アルキル；フェニル、トリルまたはキシリルなどのＣ₆ 〜Ｃ₁₀アリール；ベンジルなどのＣ₇〜Ｃ₁₃アラルキル；アミノ；メチルアミノ、エチルアミノまたはオクチルアミノなどのＣ₁〜Ｃ₁₀アルキルアミノ；メチルチオ、エチルチオまたはオクチルチオなどのＣ₁〜Ｃ₁₀アルキルチオ；アチド；硝酸塩；亜硝酸塩；シアン化物；シアン酸塩；メタンスルホン酸塩；Ｃ₁〜Ｃ₁₀ アミノアルキルアミノ；式−ＯＲ⁶または−ＯＣＯＲ⁶(式中、Ｒ⁶はＣ₁〜Ｃ₃₀有機基である)で示される基；置換シリル；ＲＮＡ切断基；コレステリル基；接合体；リポーター基；介在基(インターカレーター)；オリゴヌクレオチドの薬物動態性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善する基である。好ましいＲ²は水素、ハロゲン、ヒドロキシまたは式−ＯＲ⁶または−ＯＣＯＲ⁶ (Ｒ⁶はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニルまたはｎ−デシルなどのＣ₁〜Ｃ₁₀アルキル基；ビニル、アリル、メタリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニルまたはデセニルなどのＣ₂〜Ｃ₁₀アルケニル基；シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メチルシクロペンチル、シクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、シクロヘプチルまたはシクロオクチルなどのＣ₃〜Ｃ₈シクロアルキル基；シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロヘキシルメチル、メチルシクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチルまたはジメチルシクロヘキシルエチルなどのＣ₄〜Ｃ₁₀シクロアルキルアルキル基；フェニル、オルト−、メタ−もしくはパラ−トリル、オルト −、メタ−もしくはパラ−キシリルまたはナフチルなどのＣ₆〜Ｃ₁₀アリール基；またはベンジル、フェニルエチル、ジフェニルメチルまたはトリフェニルメチルなどのＣ₇〜Ｃ₂₅アラルキルであり、そのいずれの基も非置換であるか、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシまたはシアノで置換されていてもよく、あるいはＲ²が式−ＯＲ⁶のものである場合には、Ｒ⁶はトリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ ヒドロカルビル)シリル基である)である。より好ましい態様において、Ｒ²は水素、ヒドロキシ、フッ素、式−ＯＲ⁶(式中、Ｒ⁶はＣ₁〜Ｃ₄アルキル基、Ｃ₂〜Ｃ₄ アルケニル基、Ｃ₇〜Ｃ₁₃アラルキル基または式−(Ｒ⁷−Ｏ)_n−Ｒ⁸(式中、Ｒ⁷ はＣ₁〜Ｃ₄アルキレン基；Ｒ⁸はＣ₁〜Ｃ₄アルキル基；ｎは１〜８である)で示される基である)で示される基であるか、あるいはＲ²は式−ＯＣＯＲ⁶(式中、Ｒ⁶ はＣ₁〜Ｃ₄アルキルまたはＣ₆〜Ｃ₈アリールである)でしめされる基である。とりわけ好ましい態様において、Ｒ²は水素、ヒドロキシ、フッ素、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、ベンジルオキシ、メトキシエトキシ、−Ｏ−(ＣＨ₂ＣＨ₂ Ｏ)₃ＣＨ_3'アセトキシまたはベンゾイルオキシである。Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキルとしてのＲ³,Ｒ⁴またはＲ⁵は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、ｎ−ノニルまたはｎ−デシルなどの直鎖もしくは分枝した基である。Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニルとしてのＲ³,Ｒ⁴またはＲ⁵は、例えば、ビニル、アリル、メタリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニルまたはデセニルなどである。Ｃ₄〜Ｃ₁₀シクロアルキルアルキルとしてのＲ³,Ｒ⁴またはＲ⁵は、例えば、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロペンチルエチル、メチルシクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、メチルシクロヘキシルメチル、メチルシクロヘキシルエチル、ジメチルシクロヘキシルメチルまたはジメチルシクロヘキシルエチルなどである。Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリールとしてのＲ³,Ｒ⁴またはＲ⁵は、例えば、フェニル、ｏ−トリル、ｍ−トリル、ｐ−トリル、ｏ−キシリル、ｍ − キシリルまたはｐ−キシリルなどである。Ｃ₇〜Ｃ₁₃アラルキルとしてのＲ³,Ｒ⁴ またはＲ⁵は、例えば、ベンジル、フェニルエチルまたはジフェニルメチルなどである。Ｒ³,Ｒ⁴またはＲ⁵としての上記の基のいずれもが上記のごとく置換もしくは非置換であってよい。Ｒ⁴およびＲ⁵が結合した窒素原子と共にヘテロ環を表わす場合、このヘテロ環は、例えば、ピロリジンのような５−員環、ピペリジン、２,６−ジメチルピペリジン、Ｎ−メチルピペラジン、モルホリンまたはチオモルホリン環などの６− 員環、ペルヒドロアゼピン環などの７−員環、ペルヒドロアゾシン環などの８− 員環、ペルヒドロアゾニン環などの９−員環、ペルヒドロアゼシン環などの１０ −員環、アザシクロウンデカン環などの１１−員環、アザシクロドデカン環などの１２−員環またはアザシクロトリデカン環などの１３−員環である。Ｒ³は、好ましくは、置換もしくは非置換のＣ₁〜Ｃ₄アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₅アルケニル、Ｃ₆〜Ｃ₈シクロアルキルアルキルまたはＣ₇〜Ｃ₉アラルキル基、とりわけ、メチル、エチル、２−シアノエチル、２,２,２−トリクロロエチル、アリル、ベンジルまたは２−(トリメチルシリル)エチルである。式ＩのＺが式IIで示される基であるとき、好ましい態様において、Ｒ⁴およびＲ⁵は独立に置換もしくは非置換のＣ₁〜Ｃ₄アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₅アルケニルＣ₆〜Ｃ₈シクロアルキルアルキルまたはＣ₇〜Ｃ₉アラルキルであるか、あるいはＲ⁴がＣ₁〜Ｃ₄アルキル、好ましくは、イソプロピルまたはtert−ブチルなどの分枝Ｃ₁ 〜Ｃ₄アルキル、またはベンジルなどのＣ₇〜Ｃ₉アラルキルであり、Ｒ⁵が水素であるか、あるいはＲ⁴およびＲ⁵が結合した窒素原子と共に環内に１または２個のヘテロ原子を有する５−員環もしくは６−員環のヘテロ環を表わす。とりわけ好ましい態様において、Ｒ⁴およびＲ⁵は独立にメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、アリルまたはベンジルであるか、あるいはＲ⁴およびＲ⁵が結合した窒素原子と共にピロリジン、ピペリジンまたはモルホリン環を表わす。式ＩのＺが式IIIの基であるとき、該残基Ｎｕｃは５'ヒドロキシ基を除去した後の天然もしくは合成ヌクレオシド残基であり、例えば、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジン、２−アミノアデノシン、６−Ｎ−ベンジルアデノシン、５−Ｎ−メチルシチジン、４−Ｎ−ベンゾイルシチジン、５−プロピニルシチジン、２−Ｎ−イソブチリルグアノシン、Ｎ−ベンジルオキシメチルチミジンまたは５−フルオロウラシルなど、あるいはそれから誘導されるジヌクレオチド、トリヌクレオチドまたは高次オリゴマーであるオリゴヌクレオチドであり、天然の連鎖、すなわち、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートなどのリン酸ジエステル、ヌクレオシド間連鎖またはその合成類似体、あるいはそのようなヌクレオシド間連鎖のＰ(III)前駆体である。式ＩのＢ¹は天然産ヌクレオシドに見出される塩基由来の基であり、例えば、窒素原子上に保護基が置換もしくは非置換したものであってもよく、該保護基は、例えば、アセチルのどの脂肪族アシル基、ベンゾイルまたはニトロベンゾイルなどの芳香族アシル基、またはベンジルオキシメチルなどのアラルキルオキシアルキル保護基により置換されたもの、あるいはそのような塩基の合成類似体である。ヌクレオチド化学で常用され、Ｂ¹の窒素原子上に存在してもよい他の型の保護基は、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミジン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミジンおよびＮ−メチルピロリジン・アミジン基などのアミジン基、およびアミノ基をカルバメート基に変換するtert−ブトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル基を包含する。このように、Ｂ¹はプリンまたはピリミジン由来の基であって、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル、あるいはそれら塩基の類似体、例えば、２−アミノアデニン、６−ヒドロキシプリン、５−メチルシトシン、５−プロピニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−プロピニルウラシルまたはジヒドロウラシル、あるいは、そのような基が窒素原子上に、例えば、上記のごとき保護基を置換した基である。Ｚが式IIIの基である場合の確かな好ましい態様において、Ｎｕｃとは上記のごときヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの残基であり、その末端３'位置が固相オリゴヌクレオチド合成に用いられる支持体などの固形支持体、例えば、長鎖アルキルアミノ基を有する制御多孔性ガラス(ＣＰＧ)などの不活性シリカ− ベース支持体にスクシニル基のようなリンカーを介して結合している。固形支持体はまた、支持体上で合成するオリゴヌクレオチドに対して３'末端修飾基として作用する基を有していてもよい。本発明化合物は可能な異性体の１つの形態、例えば、ジアステレオ異性体、光学異性体、そのラセミ化合物もしくは混合物としての形態でもよい。式Ｉの化合物の好ましい異性体は式IVの化合物である。（式中、Ｂ¹,Ｒ¹,Ｒ²およびＲ³は前記定義のとおりである）式Ｉのとりわけ好ましい特定化合物は後記実施例記載の化合物である。Ｚが式IIの基である場合の式Ｉの化合物は、Ｚがハロゲンである場合の式Ｉの化合物、すなわち、式 (式中、Ｂ¹,Ｒ¹,Ｒ²およびＲ³は前記定義のとおりであり、Ｙはハロゲンである) で表わされる化合物と式 (式中、Ｒ⁴およびＲ⁵は前記定義のとおりである)で表わされる化合物とを反応させることにより調製される。この反応は有機溶媒、例えば、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素中、ピリジンなどの第三級窒素塩基の存在下に−７８℃ないし５０℃の温度、好ましくは、−３０℃ないし２５℃で実施することができる。式Ｖの化合物は、式VIIの化合物を非酸化的にハロゲン化することにより調製することができる。（式中、Ｂ¹,Ｒ¹,Ｒ²およびＲ³は前記定義のとおりである）非酸化的ハロゲン化反応は、式VIIの化合物と非酸化的ハロゲン化試薬、例えば、トリフェニルジクロロホスホランまたはジクロロトリス(２,４,６−トリブロモフェノキシ)ホスホランなどのハロホスホランとを塩基、好ましくは、ピリジンなどの第三級窒素塩基の存在下に、有機溶媒(ピリジンでもよいが、好ましくは、クロロホルムなどのハロ炭化水素)中、−２０℃ないし６０℃の温度、好ましくは０℃ないし５０℃で実施することができる。式VIの化合物は市販品として入手可能であるか、既知手法により調製することができるアミンである。式VIIの化合物およびその調製法はＷＯ９６／０８５０３に記載されている。Ｚが式IIIで示される基である場合の式Ｉの化合物は、Ｒ¹がヒドロキシ保護基であり、Ｚが式IIで示される基である場合の式Ｉの化合物と、遊離の５'ヒドロキシ基を有する天然もしくは合成ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド(１つまたはそれ以上のＰ(III)前駆体分子内ヌクレオシド連鎖をもつオリゴヌクレオチドを包含する)と反応させることにより調製することができる。反応は溶液中または上記のように固体担体に結合させたヌクレオシドまたはヌクレオチドで実施することができる。該反応は、通常のオリゴヌクレオチド合成において、３' ホスホラミダイト基含有ヌクレオシドと遊離５'ヒドロキシ基含有ヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチド間のカップリング反応として知られる条件下および手法を用いて実施可能であることが見出されている(例えば、‘Oligonucleotide s and Analogues，A Practical Approach’ed．F．Eckstein，IRL Press，1991 参照)。このように、Ｚが式IIで示される基である場合の式Ｉの化合物は、テトラゾールまたは５−(４−ニトロフェニル)テトラゾールなどのアミン−プロトン化カップリング触媒(活性化剤)の存在下にヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと反応させ、Ｚが式IIIで示される基である式Ｉの化合物を生成させることができる。この反応は−２０℃ないし５０℃、好ましくは室温で実施することができる。Ｚが式IIIで示される基である場合の式Ｉの化合物は、Ｎｕｃのオリゴヌクレオチド残基よりも多いヌクレオシド単位を有するオリゴヌクレオチドの調製用中間体である。従って、本発明は、式 (式中、Ｂ¹,Ｒ¹,Ｒ³およびＮｕｃは前記定義のとおりであり、Ｘは酸素またはイオウである)で示される化合物の製造法をも提供し、その要旨はＺが式IIIで示される基である式Ｉの化合物を酸化反応に付し、Ｘが酸素である式VIIIのオリゴヌクレオチドを形成するか、または硫化反応に付し、Ｘがイオウである式VIIIのオリゴヌクレオチドを形成することを特徴とする。式ＩにおいてＺが式IIIの基である化合物の酸化または硫化反応は、亜リン酸エステル・ヌクレオシド間の連鎖をそれぞれ酸化または硫化するために用いる方法により実施することができる。従って、式ＩにおいてＺが式IIIの基である化合物の酸化反応は、例えば、オリゴヌクレオチド合成において亜リン酸エステル・ヌクレオシド間の連鎖を酸化する反応として知られる条件および手法を用い、ヨードおよび水で処理するか、またはtert−ブチルヒドロペルオキシドなどのヒドロペルオキシドで処理することにより実施することができる。式ＩにおいてＺが式IIIの基である化合物の硫化反応は、例えば、オリゴヌクレオチド合成において亜リン酸エステル・ヌクレオシド間の連鎖を硫化する反応として知られる手法を用い、有機溶媒(通常、二硫化炭素)中三級アミンの存在下にイオウで処理するか、[３Ｈ]１,２−ベンゾジチオール−３−オン−１,１−ジオキシド(ビューケイジ(Beaucage)試薬)で処理するか、またはテトラエチルチウラムで処理することにより実施する。酸化反応、硫化反応とも一般に室温で実施する。従って、本発明は、他の側面において、保護された５'ヒドロキシ基と３'位に式 (式中、Ｒ³,Ｒ⁴およびＲ⁵は上記定義のとおりである)で示される基を有するヌクレオシドを、遊離の５'ヒドロキシ基を有する天然もしくは合成ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドとのヌクレオシド・カップリング反応に付し、式(式中、Ｒ³は上記定義のとおりである)で示されるヌクレオシド間の連鎖を有するオリゴヌクレオチド前駆体を形成させ、該前駆体を式 (式中、Ｒ³は上記定義のとおりであり、Ｘは酸素またはイオウである)で示されるヌクレオシド間の連鎖を有するオリゴヌクレオチドに変換するが、その場合、該前駆体を酸化することにより式ＸＩにおいてＸが酸素であるヌクレオシド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドとし、また、該前駆体を硫化することにより式ＸＩにおいてＸがイオウであるヌクレオシド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドとすることを特徴とするオリゴヌクレオチドの製造法を提供する。３'位に式IXの基を有するヌクレオシド、遊離の５'ヒドロキシ基を有するヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド、および当該反応を実施する方法はこれまでに記述したとおりである。Ｎｕｃが固形支持体に連結したヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの残基である式VIIIのオリゴヌクレオチドを処理して５'保護基Ｒ¹を除去し、得られる５'ヒドロキシ末端オリゴヌクレオチドを、所望の長さのオリゴヌクレオチドが得られるまで、保護５'ヒドロキシル基を有し、３'位に固形支持体に連結した式 VIIIの脱保護ジヌクレオチド上の遊離５'ヒドロキシ基と反応し得る、あるいは反応するように活性化されている基を有する天然もしくは合成ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドとの連続的カップリング反応に付す。このように、式VIII のオリゴヌクレオチドを、３'ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートまたはホスホジエステル基と保護５'ヒドロキシ基を有するヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドとカップルさせるか、式ＩにおけるＺが式IIの基である化合物とカップル反応させ、鎖長が延びたオリゴヌクレオチドを生じる。該鎖長延伸オリゴヌクレオチドは、所望の長さのオリゴヌクレオチドが得られるまで、更なる代替反応により次々に鎖長を延伸することができる。３'ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートまたはホスホジエステル基を有するヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを用いる場合、該カップリング反応はオリゴヌクレオチド合成において既知の手法を用い実施することができる。式ＩにおいてＺが式IIの基である化合物を用いる場合、該カップリング反応は上記のとおりに実施することができる。このように、３'ホスホラミダイトまたは式ＩにおいてＺが式IIの基である化合物を用いる場合、カップリング・サイクルは酸化または硫化工程を伴うが、一方、３' Ｈ−ホスホネートを用いる場合、酸化または硫化反応は鎖長延伸が完了して後に実施し、３'ホスホジエステルを用いる場合、酸化反応は必要ない。所望数のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドが合成された段階で、該オリゴヌクレオチドは常用の方法、例えば、トリフルオロ酢酸のような水性有機酸での処理によりジメトキシトリチル基などのヒドロキシ保護基を除去してもよい。オリゴヌクレオチドを固形支持体上で合成した場合には、この処理は支持体から該オリゴヌクレオチドを脱離する前または脱離した後に実施してもよい。脱離は例えば濃アンモニア水での処理のような常法を用いて実施し得るが、この処理に際して、該オリゴヌクレオチドの合成に用いた１つまたはそれ以上のヌクレオシドの環外窒素原子上に存在する保護基もまた除去される。脱保護により生成した末端５'ヒドロキシルは、例えば、BeaucageおよびIyer,(Tetrahedron 49，1925 〜63(1993))により記載された手法を用い、リン酸基または他の５'修飾基などの５'末端修飾基を導入するために反応させることができる。本発明を以下の実施例により説明する。各実施例の化合物およびその前駆体の式において、Ｅｔはエチル、Ｍｅはメチル、Ｔは１−チミニル、ｔ−Ｂｕはtert−ブチル、Ｐｈはフェニル、そしてＤＭＴｒはジメトキシトリチルである。各実施例に用いた化合物およびその前駆体は以下のように調製する。化合物Ａこの化合物はＷＯ９６／０８５０３の化合物８７であり、ＷＯ９６／０８５０３の実施例８４に記載のとおりに調製する。化合物Ｂ化合物Ａ(０.８５ｇ、１.２２mmol)を無水メタノール(１０ml)に溶かし、この溶液にナトリウムメトキシド(４.４Ｎメタノール溶液１.５ml)を加える。室温で１６時間かき混ぜた後、濃縮し、フラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー(グラジエント溶出−クロロホルム、メタノール、トリエチルアミン１００：２０：１〜１００：３５：１)により精製し、更に、生成物を水性０.５％トリエチルアミンの溶液としてダウエックス５０Ｗ−Ｘ２イオン交換カラム(トリエチルアミン型)を通して精製し、濃縮すると化合物Ｂを得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤ₃ＯＤ,１６２ＭＨｚ)δ２３.７ppm。化合物Ｃこの化合物はＷＯ９６／０８５０３の化合物８４であり、ＷＯ９６／０８５０３の実施例８１に記載のとおりに調製する。化合物Ｄ化合物Ｂ(５００mg、０.７１mmol)およびジシクロヘキシルカルボジイミド(１８９mg、０.９２mmol)を乾燥ＴＨＦ(５.４ml)に溶かし、この溶液に３−ヒドロキシプロピオニトリル(５８μｌ、０.８５mmol)をアルゴン下室温で加える。得られる溶液を５５℃で２時間加熱する。冷却後、混合物を濾過し、酢酸エチル( ２０ml)で希釈し、水および食塩水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥、濾過、濃縮する。得られる生成物をジクロロメタン(５ml)に採り、濾過、濃縮(この工程はジシクロヘキシル尿素を除去するために繰り返すことが必要)すると化合物Ｄが得られるが、このものはリンにおけるジアステレオ異性体の混合物として単離される。別途方法：化合物Ｂ(１２.３ｇ、１７.４mmol)およびジシクロヘキシルカルボジイミド(３.９４ｇ、１９.１mmol)をＴＨＦ(１２０ml)に溶かし、この溶液にアルゴン下３−ヒドロキシプロピオニトリル(１.４２ml、２０.８mmol)を加え、得られる混合物を６０℃で４時間加熱する。略半量まで濃縮し、等容量の酢酸エチルで希釈し、濾過して生成する沈殿を除去する。有機層は濾過物を酢酸エチルで洗浄後約２００mlとなるが、これを水(４ｘ８０ml)および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上乾燥し、濃縮する。得られる固形物をアセトニトリル(２００m l)に再溶解し、ヘキサン(６ｘ５０ml)で抽出する。アセトニトリル層を次いで濃縮し、高減圧下に乾燥すると化合物Ｄを得る。実測値：Ｃ６２.２％；Ｈ５.９％；Ｎ６.５％Ｃ₃₅Ｈ₃₈Ｎ₃Ｏ₈Ｐ・Ｈ₂Ｏとして計算値：Ｃ６２.０５％；Ｈ５.９５％；Ｎ６.２％³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(１６２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃)δ３７.５、３７.３pp m。化合物Ｅこの化合物はＷＯ９６／０８５０３の化合物１００であり、ＷＯ９６／０８５０３の実施例９８に記載のとおりに調製する。化合物Ｆ化合物Ｅ(０.４７ｇ、０.６０mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)(０.１４８ｇ、０.７２mmol)およびトリエチルアミン塩酸塩(０.２４ｇ、１. ８mmol)を無水クロロホルム(３ml)に溶かし、この溶液にアルゴン下３−ヒドロキシプロピオニトリル(８１μｌ、１.２mmol)を加える。得られる混合物を６０ ℃で４時間加熱する。次いで、この混合物を減圧下に濃縮し、酢酸エチル(５０m l)に採り、濾過する。得られる澄明溶液を水(３ｘ２０ml)および食塩水(８ｘ２０ml)で抽出する。硫酸ナトリウム上乾燥し、濾過、減圧下に濃縮するとＤＣＣを含む粗製生成物として得る。この粗製物をアセトニトリルに溶解し、ヘキサンで繰り返し抽出することでＤＣＣを除去する。実測値：Ｃ６３.３５％；Ｈ６.５０％；Ｎ８.８０％Ｃ₄₀Ｈ₄₆Ｎ₅Ｏ₇Ｐ・Ｈ₂Ｏとして計算値：Ｃ６３.４０％；Ｈ６.４０％；Ｎ９.２５％³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(１６２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃)δ３８.１、３７.４pp m。化合物Ｇ化合物Ｂ(１.０ｇ、１.４１mmol)をジクロロメタン(１５ml)に溶かし、この溶液にアルゴン気流下５℃でトリエチルアミン(９８μｌ、０.７１mmol)を添加し、次いで、メチルクロロホルメート(１４２μｌ、１.８４mmol)を滴下する。５分後、溶液を室温に戻し、４５分間かき混ぜる。混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、水洗、乾燥(Ｎａ₂ＳＯ₄)し、濃縮する。フラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー(溶出液：酢酸エチル：メタノール、１０：１)により精製すると、リンにおけるジアステレオマー混合物として化合物Ｇを得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、１６２ＭＨｚ)δ３７.３および３７. 化合物Ｈトリアゾール(２０.７ｇ、０.３mol)を乾燥ピリジンとの共蒸発(４ｘ５０ml) により注意深く乾燥し、次いで、ピリジン(８０ml)に溶かし、アルゴン下０℃に冷却する。トリエチルアミン(４１.８ml、０.３mol)を加え、混合物をオキシ塩化リン(６.８７ml、７５mmol)を添加しながらかき混ぜる。得られる溶液を０℃ で１５分間かき混ぜる。注意深く乾燥(３ｘ５０mlピリジンとの共蒸発)した化合物８３(ＷＯ９６／０８５０３の化合物、ＷＯ９６／０８５０３の実施例８０に記載のとおりに調製)(２０.６ｇ、３０mmol)をピリジン(５０ml)に溶かした溶液を滴下する。得られる強い着色溶液を室温に戻す。１８時間後、混合物を濃縮し、ＴＨＦ(３００ml)に溶解する。濃アンモニア(９０ml)を加え、混合物を室温で１８時間かき混ぜる。濃縮し、フラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー (グラジエント溶出、酢酸エチル＋１０％〜２５％メタノール)により精製すると、リンにおけるジアステレオ異性体混合物として化合物Ｈを得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤ₃ＯＤ,１６２ＭＨｚ)δ５０.０および４９. ５ppm。化合物Ｊ化合物Ｈ(７.８７ｇ、１１.５mmol)を乾燥ＴＨＦ(１１０ml)に溶かし、その溶液にアルゴン下、トリエチルアミン(６.４ml、４５.９mmol)を添加し、得られる溶液に塩化ベンゾイル(２.００ml、１７.２１mmol)を添加しながら−７０℃に冷却する。この溶液を室温に戻し、一夜かき混ぜる。得られる混合物を部分的に濃縮し、酢酸エチル中に溶解し、水で二度、次いで食塩水で一度洗浄する。この溶液をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、濃縮して、フラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー（グラジエント溶出、ヘキサン：酢酸エチル１：５〜純酢酸エチル)により精製すると、リンにおける２ジアステレオ異性体混合物として化合物Ｊを得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、１６２ＭＨｚ)δ４７.０および４６. ８ppm。実測値：Ｃ６１.８５％；Ｈ７.２５％；Ｎ５.１０％Ｃ₄₂Ｈ₅₆Ｏ₈Ｎ₃ＰＳｉ・３／２Ｈ₂Ｏとして計算値：Ｃ６１.７５％；Ｈ７. ３０％；Ｎ５.１５％化合物Ｋ化合物Ｊ(１４.５ｇ、１８.３４mmol)を乾燥ＴＨＦ(１６０ml)を溶かし、その溶液にフッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液(２０.２ml、２０.２mmol) をゆっくりと加える。その得られる溶液を室温で６時間かき混ぜ、黄色油状物を生じるまで蒸発し、次いで、フラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー( グラジエント溶出、酢酸エチル〜酢酸エチル：エタノール７：１)により精製すると、リンにおける２ジアステレオ異性体混合物として化合物Ｋを得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、１６２ＭＨｚ)δ４８.９および４８. ８ppm。実測値：Ｃ５５.６５％；Ｈ７.００％；Ｎ７.３５％Ｃ₂₆Ｈ₃₈Ｏ₈Ｎ₃Ｐ・１／２Ｈ₂Ｏとして計算値：Ｃ５５.７０％；Ｈ７.００％；Ｎ７.５０％化合物Ｌ化合物Ｋ(２.４８ｇ、４.５０mmol)をトルエン(３ｘ２０ml)からの共蒸発により注意深く乾燥する。次いで、室温、アルゴン下にジクロロメタン(４５ml)を加え、更にエタノール(２.６２ml、４５mmol)を加える。得られる溶液をかき混ぜ、塩化トリメチルシリル(５.６９ml、４５.０mmol)を添加しながら−１５℃に冷却する。得られる混合物をアルゴンで十分に脱ガスし、ゆっくりと室温に戻す。室温で６時間かき混ぜた後、混合物をジクロロメタンで希釈し、炭酸水素ナトリウム溶液で二度洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥、濃縮すると、リンにおける２ジアステレオ異性体混合物として化合物Lを得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、１６２ＭＨｚ)δ３５.５および３４. ２ppm。実測値：Ｃ５５.５％；Ｈ６.１０％；Ｎ９.７０％Ｃ₂₀Ｈ₂₆Ｎ₃Ｏ₆Ｐとして計算値：Ｃ５５.１５％；Ｈ６.００％；Ｎ９.６５％化合物Ｍ化合物Ｌ(４.７９ｇ、１１.０mmol)を乾燥ピリジンとの共蒸発(６ｘ５０ml)により注意深く乾燥し、次いで、ピリジン(８０ml)に溶かし、トリエチルアミン( ３.１ml、２２mmol)を加え、更に室温、アルゴン下で塩化ジメトキシトリチル( ４.１０ｇ、１２.１mmol)を加える。室温、１６時間後、混合物を濃縮し、−２０℃で一夜貯蔵する。得られる固形物をＴＨＦ(５０ml)、トリエチルアミン(１５ml)および水(１０ml)に溶解し、室温で７時間かき混ぜる。得られる混合物を濃縮し、フラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー(グラジエント溶出、酢酸エチル：トリエチルアミン５０：１〜酢酸エチル：メタノール：トリエチルアミン５５：４５：２)により精製すると、化合物Ｍを得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、２０２ＭＨｚ)δ２２.４ppm。実測値：Ｃ６４.５％；Ｈ６.６５％；Ｎ６.４％Ｃ₄₅Ｈ₅₅Ｎ₄Ｏ₈Ｐ・３／２Ｈ₂Ｏとして計算値：Ｃ６４.５％；Ｈ６.９５％；Ｎ６.７％化合物Ｎ化合物Ｎは、出発原料として化合物Ｂの代わりに化合物Ｍを用い、アセトニトリル−ヘキサンによる分配を省略する以外は、化合物Ｄについて記載した代替方法により調製する。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、１６２ＭＨｚ)δ３７.２および３６. ８ppm。ＭＳ(ＦＡＢ)Ｍ／Ｚ７６３(ＭＨ⁺)。実施例１慎重に乾燥した化合物Ｃ(４０mg、７０μmol)をピリジン(８０μｌ、１mmol) 含有ジュウテリオクロロホルム(０.５ml)に溶かした溶液に、ジクロロトリフェニルホスホラン(１１３mg、３５０μmol)を加える。得られる混合物を振盪し、該ホスホランを溶解させ、次いで常温に放置する。反応の進行を³¹Ｐｎｍｒによりモニターする。生成物である化合物１は２０１ppmで共鳴する。１６時間後、追加のジクロロトリフェニルホスホラン(４５mg、１４０μmol)を加える。更に２４時間後、³¹Ｐｎｍｒは反応が９５％終了していることを示す。ジイソプロピルアミン(総量１５０μｌ、１.０７mmol)を−３０℃で粗製反応混合物に３０μ ｌずつ加える。得られる混合物を室温に戻し、ジクロロメタン(２０ml)で希釈し、脱イオン水(２ｘ１０ml)で二度洗浄し、乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）後、濃縮する。フラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー(グラジエント溶出、４：１〜２：１ヘキサン−酢酸エチル)により精製すると、化合物２を２ジアステレオ異性体の混合物として得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、１６２ＭＨｚ)δ１２３.０、１２２. ３。実施例２実施例１の手法を用い、化合物Ｄ(３０mg、４４μmol)を先ず化合物３に変換し、次いで、実施例１で用いたジイソプロピルアミンをピロリジン(５６μｌ、０.６７mmol)と置き換え、化合物４に変換する。実施例３ 5'-TTT tTC TCT CTC TCT-3'(式中、ｔは化合物４から誘導されるヌクレオシド単位を表わす)の配列を有するオリゴヌクレオチド１を標準固相ホスホラミダイト・オリゴヌクレオチド合成法(Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach，ed．F．Eckstein，IRL Press 1991)により調製するが、ただし、合成の適切な時点で通常の３'−ホスホラミダイト−置換ヌクレオシドの代わりに化合物４を用い、結果として式ＩのＺが式IIIの基である化合物(式中、ＮｕｃはオリゴヌクレオチドＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ残基を示す)を形成させ、次いで標準的酸化工程において酸化して、式VIIIのＸが酸素であるオリゴヌクレオチドとする；このオリゴヌクレオチドは更にカップリングしてオリゴヌクレオチド１とする。実施例４ビス(トリクロロメチル)カーボネート(１.０１ｇ、３.４０mmol)を乾燥ジクロロメタン(１０ml)に溶かし、この溶液にトリフェニルホスフィン(２.６８ｇ、１０.２１mmol)を乾燥ジクロロメタン(８ml＋７ml洗浄液)に溶かした溶液をアルゴン気流下、攪拌、５℃で加える。この混合物を直ちに室温まで５分で昇温し、次いでピリジン(１.２４ml)を添加し、混合物を完全に混合、５℃まで再冷却する。得られる淡褐色溶液に化合物Ｄ(３.４５ｇ、５.１１mmol)のピリジン(１.２４ ml)含有乾燥ジクロロメタン(１０ml＋５ml洗浄液)溶液を加える。添加終了後、溶液を室温まで昇温する。室温で１時間かき混ぜた後の混合物は化合物３(³¹Ｐｎｍｒδ２０６.７ppm)を含んでいる。この混合物を−３０℃に冷却し、ジイソプロピルアミン(３.５７ml、２７mmol)を５分間で加える。混合物は１０分を要して室温に戻し、次いで減圧下に半容量まで濃縮する。この溶液を直ちにフラッシュ・シリカクロマトグラフィーカラム(３００ｇ、シリカ)に移し、ヘキサン：テトラヒドロフラン：トリエチルアミン(２５：２５：１)で溶出する。一部精製物のフラクションを与える。不純フラクションは更にフラッシュ・シリカクロマトグラフィーに付し、ヘキサン：テトラヒドロフラン：ジクロロメタン：トリエチルアミン(２５：２５：１０：１)で溶出する。生成フラクションのすべてをプールし、濃縮すると化合物５が白色泡状物として、また、リンにおけるジアステレオ異性体の混合物として単離される。実測値：Ｃ６６.２％；Ｈ７.２５％；Ｎ７.５％Ｃ₄₁Ｈ₅₁Ｏ₇Ｎ₄Ｐとして計算値：Ｃ６６.３％；Ｈ６.９％；Ｎ７.５５％³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(１６２ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃)δ１２８.３、１２７. ８ppm。Ｍ／Ｚ(ＥＳ⁺)７４３(Ｍ＋Ｈ)⁺ (ＥＳ^-)７４１(Ｍ−Ｈ)^- 実施例５化合物６および７を実施例４の方法に従って調製するが、ただし、化合物Ｄは化合物Ｆに置き換える。反応は同じモル量の試薬を用い実施するが、濃度は半分とする。調製の初期段階では、反応は１時間よりもむしろ２時間続行させて化合物６(³¹Ｐｎｍｒδ２０５.７ppm)を生じる。最終処理では粗製物を２度水洗し、濃縮し、フラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー(溶出液：酢酸エチル／メタノール１０：１＋２％Ｅｔ₃Ｎ)により精製すると化合物７を２ジアステレオマーの混合物として得る。実測値：Ｃ６３.８５％；Ｈ７.０５％；Ｎ９.５５％Ｃ₄₆Ｈ₅₉Ｎ₆Ｏ₆Ｐ・２Ｈ₂Ｏとして計算値：Ｃ６４.２５％；Ｈ７.３５％；Ｎ９.８０％³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、１６２ＭＨｚ)δ１２８.６、１２８. １ppm。Ｍ／Ｚ(ＥＳ⁺)８２３(ＭＨ⁺)実施例６化合物８および９を実施例４の方法に従って調製するが、ただし、化合物Ｄは化合物Ｇに置き換える。調製の初期段階では化合物８(³¹Ｐｎｍｒδ２０７.７pp m)を生じる。最終精製はフラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィーを繰り返し実施するが、先ず、ヘキサン／酢酸エチル２：１＋２％Ｅｔ₃Ｎで溶出し、次いで、ヘキサン／ジエチルエーテル１：３＋２％Ｅｔ₃Ｎで溶出すると化合物９を２ジアステレオマーの混合物として得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、２０２ＭＨｚ)δ１２８.８および１２７.８ppm。Ｍ／Ｚ(ＥＳ⁺)(７０４、７０５、７０６、ＭＨ⁺) (ＥＳ^-)(７０２、７０３、７０４、Ｍ−Ｈ^-)実施例７化合物１０を実施例６の方法に従って調製するが、ただし、実施例６で用いたジイソプロピルアミンをジメチルアミンに置き換え、中間体化合物８をＴＨＦ中ジメチルアミンの２.０モル溶液と反応させる。フラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー(溶出液：酢酸エチル／ヘキサン３：１＋２％Ｅｔ₃Ｎ)による最終精製で、化合物１０を２ジアステレオマーの混合物として得る。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、１６２ＭＨｚ)δ１４４.３および１４４.２ppm。実施例８化合物１１および１２を実施例１０の方法に従って調製するが、ただし、化合物Ｄは化合物Ｎに置き換える。この場合、最終生成物である化合物１２はフラッシュ・シリカ・カラムクロマトグラフィー(ヘキサン−ＴＨＦ−トリエチルアミン５０：５０：１)で精製する。³¹ Ｐｎｍｒ¹Ｈデカップリング(ＣＤＣｌ₃、１６２ＭＨｚ)δ１２８.１および１２７.６ppm。ＭＳ(ＥＳ⁺)８４６、８４７、８４８(ＭＨ)⁺ (ＥＳ^-)８４４、８４５、８４６(Ｍ−Ｈ)^- 実施例９〜１５以下の修飾オリゴヌクレオチドをホスホラミダイト法を用いる標準ＤＮＡ合成技術により調製した。すべてのカップリング反応を二重カップリングにより実施する；すなわち、オリゴヌクレオチド結合支持体を２〜３秒間ホスホラミダイト溶液または修飾溶液に触れさせた後、該溶液をモノマー溶液の新鮮バッチと置き換える。ホスホラミダイトとのカップリングの場合には、支持体を酸化またはチオ化(硫化)の前に洗浄する。式ＩのＺが式IIの基である修飾モノマー(ホスホラミダイトとしても知られる)とのカップリングの場合には、支持体を洗浄せずに直ちに酸化またはチオ化溶液に接触させる。この操作はPIII中間体結合支持体の潜在的水解を最小限とする。以下に示す修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列において、Ｔ、Ｃ、ＡおよびＧはそれらの通常の意味を有し、通常のホスホラミダイトモノマーから誘導されるものであり、ｔは化合物５から誘導されるヌクレオチド単位を示し、ｃは化合物７から誘導されるヌクレオチド単位を示し、化合物５および化合物７は合成の適切な時点で用いられる。硫化したヌクレオチド間連鎖はｓにより示される。他のすべてのヌクレオチド間連鎖は酸化される。実施例９ 5' TTTTtCTCTCTCTCT 3' ＴＯＦＭＳ実測値＝理論値＝４４２４.３実施例１０ 5' tttttCTCTCTCTCT 3' ＴＯＦＭＳ実測値＝４４１５.３理論値＝４４１５.９実施例１１ 5' GCGttttttttttGCG 3' ＴＯＦＭＳ実測値＝４８５９.８理論値＝４８６５実施例１２ 5' TTTTTTTTTTTTTTTtttT 3' ＴＯＦＭＳ実測値＝５７０９.３理論値＝５７１１.７実施例１３ 5' ttctcGsCsCsCsGsCsTsCsCstcctcC 3' ＴＯＦＭＳ実測値＝６０８６.６理論値＝７００１.５実施例１４ 5' tstscstscsGsCsCsCsGsCsTsCsCstscscstscsC 3' ＴＯＦＭＳ実測値＝６２１４.５理論値＝６２４６.１実施例１５ 5' tstscstscsGsCsTsGsGsTsGsAsGstststscsA 3' ＴＯＦＭＳ実測値＝６０９２.９理論値＝６１１４

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者アルトマン，カール―ハインツスイス、ツェーハー―4153ライナッハ、タネンヴェーク５番 (72)発明者ダグラス，マーク・エドワードイギリス、エスケイ10・５ビーアール、チェシャー、マックルズフィールド、ボーリントン、カンバーランド・ドライブ17番

Claims

【特許請求の範囲】１.式［式中、Ｂ¹はヌクレオシド塩基の基であり、Ｒ¹は水素またはヒドロキシ保護基であり、Ｒ²は水素、ヒドロキシまたは２'ヌクレオシド修飾原子もしくは基であり、Ｒ³は置換もしくは非置換Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₄〜Ｃ₁₀シクロアルキルアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリールまたはＣ₇〜Ｃ₁₃アラルキル基であり、Ｚはハロゲンまたは式 (式中、Ｒ⁴およびＲ⁵はそれぞれ独立に置換もしくは非置換Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₄〜Ｃ₁₀シクロアルキルアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリールまたはＣ₇〜Ｃ₁₃アラルキル基であるか、またはＲ⁴が当該基であって、Ｒ⁵が水素であるか、またはＲ⁴およびＲ⁵はそれらが結合する窒素原子と共に５員環ないし１３員環のヘテロ環を表わす)で示される基であるか、またはＺは式 (式中、Ｎｕｃは５’ヒドロキシ基を除いた後の天然もしくは合成ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド残基であり、その５'メチレンを介して表示した酸素原子に結合している)で示される基である］で示される化合物。２.該置換された基がハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ₁〜Ｃ₄アルコキシ、シアノ、ニトロまたはトリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ヒドロカルビル)シリルにより置換されている請求項１記載の化合物。３.Ｒ¹が水素、Ｃ₇〜Ｃ₄₀芳香脂肪族基またはトリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ヒドロカルビル) シリル基である請求項１または２記載の化合物。４.Ｒ¹が水素、置換もしくは非置換のトリフェニルメチル基またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルジ(Ｃ₆〜Ｃ₈アリル)シリル基である請求項３記載の化合物。５.Ｒ¹がジメトキシトリチルまたはtert−ブチルジフェニルシリル基である請求項４記載の化合物。６.Ｒ²が水素、ハロゲン、ヒドロキシまたは式−ＯＲ⁶もしくは−ＯＣＯＲ⁶( 式中、Ｒ⁶が置換または非置換のＣ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₃ 〜Ｃ₈シクロアルキル、Ｃ₄〜Ｃ₁₀シクロアルキルアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリールまたはＣ₇〜Ｃ₂₅アラルキル基である)で表わされる基、またはトリ(Ｃ₁〜Ｃ₁₅ヒドロカルビル)シリル基である前記請求項のいずれかに記載の化合物。７.Ｒ²が水素、ヒドロキシ、フッ素、式−ＯＲ⁶[式中、Ｒ⁶はＣ₁〜Ｃ₄アルキル基、Ｃ₂〜Ｃ₄アルケニル、Ｃ₇〜Ｃ₁₃アラルキル基、または−(Ｒ⁷−Ｏ−)_n− Ｒ⁸(式中、Ｒ⁷はＣ₁〜Ｃ₄アルキレンであり、Ｒ⁸はＣ₁〜Ｃ₄アルキルであり、ｎは１〜８である)で示される基である]で示される基であるか、またはＲ²が式− ＯＣＯＲ⁶(式中、Ｒ⁶はＣ₁〜Ｃ₄アルキルまたはＣ₆〜Ｃ₈アリールである)で示される基である請求項６に記載の化合物。８.Ｒ²が水素、ヒドロキシ、フッ素、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、ベンジルオキシ、メトキシエトキシ、−Ｏ−(ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ)₃ＣＨ_3'アセトキシまたはベンゾイルオキシである請求項６に記載の化合物。９.Ｒ³が置換もしくは非置換のＣ₁〜Ｃ₄アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₅アルケニル、Ｃ₆ 〜Ｃ₈シクロアルキルアルキルまたはＣ₇〜Ｃ₉アラルキル基である前記請求項のいずれかに記載の化合物。１０.Ｒ³がメチル、エチル、２−シアノエチル、２,２,２−トリクロロエチル、アリル、ベンジルまたは２−(トリメチルシリル)エチルである請求項９に記載の化合物。１１.Ｚが式II(式中、Ｒ⁴およびＲ⁵は独立に置換もしくは非置換のＣ₁〜Ｃ₄アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₅アルケニル、Ｃ₆〜Ｃ₈シクロアルキルアルキルまたはＣ₇〜Ｃ₉ アラルキルであるか、あるいはＲ⁴がＣ₁〜Ｃ₄アルキルまたはＣ₇〜Ｃ₉アラルキルであり、Ｒ⁵が水素であるか、あるいはＲ⁴およびＲ⁵が結合した窒素原子と共に環内に１または２個のヘテロ原子を有する５−員環もしくは６−員環のヘテロ環を表わす)の基である前記請求項のいずれかに記載の化合物。１２.Ｒ⁴およびＲ⁵が独立にメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、アリルまたはベンジルであるか、あるいはＲ⁴およびＲ⁵が結合した窒素原子と共にピロリジン、ピペリジンまたはモルホリン環を表わす請求項１１に記載の化合物。１３.Ｚが式III(式中、Ｎｕｃは固形支持体に結合している)で示される基である請求項１〜１０に記載の化合物。１４.Ｚが塩素または臭素である請求項１に記載の化合物。１５.式（式中、Ｂ¹，Ｒ¹，Ｒ²、Ｒ³およびＺは前記定義のとおりである）で示される前記請求項のいずれかに記載の化合物。１６.Ｂ¹がチミニル、５−メチルシトシニルまたは窒素原子上に保護基の置換したチミニルもしくは５−メチルシトシニルであり、Ｒ¹がジメトキシトリチルまたはtert−ブチルジフェニルシリルであり、Ｒ²が水素であり、Ｒ³がメチル、エチルまたは２−シアノエチルであり、そしてＺが塩素または式II(式中、Ｒ⁴およびＲ⁵はそれぞれメチルまたはイソプロピルである)で示される基であるか、またはＺが式IIIで示される基である請求項１または請求項１５に記載の化合物。１７.式ＩにおいてＺがハロゲンである化合物を式（式中、Ｒ⁴およびＲ⁵は請求項１に記載のとおりである）で示される化合物と反応させることを特徴とする、Ｚが式IIで示される基である請求項１記載の化合物の製造法。１８.反応を有機溶媒中、第三級窒素塩基の存在下に−７８℃ないし５０℃の温度で実施することを特徴とする請求項１７に記載の方法。１９.式（式中、Ｂ¹，Ｒ¹，Ｒ²およびＲ³は請求項１に定義のとおりである）で示される化合物を非酸化的ハロゲン化試薬により非酸化的にハロゲン化することを特徴とする、式ＩにおいてＺがハロゲンである化合物の製造法。２０.該非酸化的ハロゲン化試薬がハロホスホランであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。２１.該ハロゲン化反応を有機溶媒中、塩基の存在下に−２０℃ないし６０℃ の温度で実施することを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。２２.Ｒ¹がヒドロキシ保護基であり、Ｚが式IIで示される基である請求項１の化合物を遊離の５'ヒドロキシル基含有天然もしくは合成ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドと反応させることを特徴とする請求項１に記載の化合物の製造法。２３.Ｚが式IIIで示される基である請求項１記載の化合物を酸化反応に付し、式VIIIにおいてＸが酸素であるオリゴヌクレオチドとするか、または硫化反応に付して、式VIIIにおいてＸがイオウであるオリゴヌクレオチドとすることを特徴とする式（式中、Ｂ¹、Ｒ¹,Ｒ³およびＮｕｃは請求項１に定義のとおりであり、Ｘは酸素またはイオウである）で示されるオリゴヌクレオチドの製造法。２４.保護された５'ヒドロキシ基と３'位に式（式中、Ｒ³，Ｒ⁴およびＲ⁵は請求項１に定義のとおりである）で示される基を有するヌクレオシドを、遊離の５'ヒドロキシ基を有する天然もしくは合成ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドとのヌクレオシド・カップリング反応に付し、式（式中、Ｒ³は請求項１に定義のとおりである）で示されるヌクレオシド間の連鎖を有するオリゴヌクレオチド前駆体を形成させ、該前駆体を式（式中、Ｒ³は上記定義のとおりであり、Ｘは酸素またはイオウである）で示されるヌクレオシド間の連鎖を有するオリゴヌクレオチドに変換するが、その場合、該前駆体を酸化することにより式ＸＩにおいてＸが酸素であるヌクレオシド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドとし、また、該前駆体を硫化することにより式ＸＩにおいてＸがイオウであるヌクレオシド間連鎖を有するオリゴヌクレオチドとすることを特徴とするオリゴヌクレオチドの製造法。２５.オリゴヌクレオチドの合成における請求項１記載の化合物の使用。２６.実施例のいずれかに実質的に記載した請求項１の化合物。２７.実施例１、２または４ないし８のいずれかに実質的に記載した請求項１７の方法。２８.実施例１、２、４、５、６または８のいずれかに実質的に記載した請求項１９の方法。２９.実施例３および９ないし１５のいずれかに実質的に記載した請求項２２、２３または２４の方法。