JP5728086B2 - ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド並びにその合成方法 - Google Patents

ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド並びにその合成方法 Download PDF

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Description

本発明は、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド並びにその合成方法に関するものである。
オリゴヌクレオチドの化学合成とは、ヌクレオチドモノマー間における５’−３’リン酸ジエステル結合の形成を促すことによって、複数のヌクレオチド単位を連結してオリゴヌクレオチド鎖にする方法を指す。また、オリゴヌクレオチドの化学合成は、保護されたヌクレオチドの合成に関する。
現在のところ、オリゴヌクレオチドの一般的な合成方法は固相合成法である。先ず、４,４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）を用いてヌクレオチド上の５’−ＯＨを保護し、ベンゾイルを用いて塩基上のアミノ基を保護し、アミノホスホン酸化合物を用いて３’−ＯＨを活性化する。第１のヌクレオチドの３’−ＯＨと固相樹脂とを化合させ、５’−ＯＨ上の保護基を除去する。露出した５’−ＯＨと第２のヌクレオチドの３’−ＯＨ（アミノホスホン酸化合物によって活性化する）との間に亜りん酸トリエステルを形成させ、ヨウ素化を通して前記の亜りん酸トリエステルにリン酸トリエステルを形成させる。次に、トリクロロ酢酸を添加して第２のヌクレオチドの５’−ＯＨ上の保護基を除去する。この時点でオリゴヌクレオチド鎖は１ヌクレオチド単位だけ伸長しており、次の伸長反応ラウンドに投入可能である。数ラウンドの伸長反応によって全長オリゴヌクレオチド断片の合成が完了した後、濃水酸化アンモニウムを用いてオリゴヌクレオチド断片を固相樹脂から取り外す。脱保護及び精製の後、オリゴヌクレオチドを得る。
前記の固相合成法の利点は、（１）自動化（全ての合成反応が合成装置によって自動的に完了する）、（２）短い合成サイクル、（３）高収率（一段階の縮合反応の収率が通常９８％超である）にあるが、次のような欠点も有する。（１）小さい合成スケール（固相合成のスケールは通常は１００μｍｏｌ以下であり、製薬原料への利用要件を満たすにはほど遠い）、（２）高純度を達成困難（合成法の制約故に、得られるオリゴヌクレオチド中に目的外のオリゴヌクレオチド断片（塩基数Ｎ−１、Ｎ−２）が含まれることを避けられず、製薬用途にはむしろ有害である）、（３）大量の廃棄物（十分な反応を実現するためには、多くの場合、反応で実際に消費される数倍量のホスホラミダイト・モノマーを各合成サイクルにおいて添加する必要があり、過剰となる。サイクル後には、大量の有機溶媒を洗浄溶媒として使用して未反応のホスホラミダイト・モノマーを洗い流さなくてはならない）、（４）高コスト（反応に必要な固相担体とホスホラミダイト・モノマーとは高価であり、オリゴヌクレオチド合成が高コスト化する）。
生命活動においてオリゴヌクレオチドが有する重要な機能並びに核酸研究技術（特に、ＲＮＡ干渉技術）の急速な発展及びその潜在的な臨床応用価値故に、オリゴヌクレオチドの大スケール合成は重要な問題である。
本発明の課題は、従来のオリゴヌクレオチド合成法の欠点（例えば、小スケール及び高コスト）を克服し、オリゴヌクレオチドの大スケール合成のための方法を提供することである。
本発明は、式（１）で示されるヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドを提供する。
式（１）
上記式中、ＲはＨ又はＲ1であり、Ｒ1はトリチル、モノメトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、又はトリメトキシトリチルであり、
ｎは１〜１００の範囲の整数であり、
Ｂは、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基を示し、各繰り返し単位のＢは同一であるか又は異なっており、
Ｒ2は立体障害のあるシラン構造を有する基を示し、
Ｒ3はハロゲン原子、ニトロ、又はメトキシを示す。
上記式中、立体障害のあるシラン構造を有する基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシリコメタン（tert-butyl dimethyl chlorosilicomethane）基、フェニルジメチルクロロシリコメタン基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシリコメタン基、又はトリイソプロピルクロロシリコメタン基であってよい。
上記式中、アシルはベンゾイル、イソブチリル、又はアセチルであってよく、ハロゲン原子はＣｌ又はＢｒであってよい。
本発明が提供する式（１）の化合物において、ＲがＨである場合には式（１）はｘが１以上の次式（２）に相当し、ＲがＲ1である場合には式（１）は次式（４）に相当する。
本発明はさらに、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの液相合成のための方法を提供する。この方法はその特徴として、縮合剤の存在下且つ縮合反応の条件下で、第１の液体反応溶媒中で式（２）の化合物と式（３）の化合物とを接触させて、式（４）の化合物を得ることを含む。
式（２）
式（３）
式（４）
上記式中、
ｘは０〜５０の範囲の整数であり、ｙは１〜５０の範囲の整数であり、
Ｂ1及びＢ2は、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基をそれぞれ示し、各繰り返し単位のＢ1及びＢ2は同一であるか又は異なっており、
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の定義は式（１）の通りであり、
Ａ+はトリアルキルアンモニウムイオン又はジアルキルアンモニウムイオンを示す。
本発明の方法によって得られる、保護基が取り除かれたオリゴヌクレオチドは、生物活性を有することが可能であり、種々の用途（ＲＮＡ干渉等）に用いることができる。
ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの液相合成のための本発明の方法には、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの複数の保護基を組み合わせる方法が含まれる。立体障害のあるシラン構造を有する基によって２'-ＯＨが保護された前提条件で、固相担体を使用せずに、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの３’リン酸基をβ-シアノエチルによって直接的に保護する。その結果、β-シアノエチル基を除去した後に、式（４）の化合物はそのまま次の合成ラウンドに関与できる。合成生成物は固相合成法の脱保護法の場合と一致しているが、純度はより高い。
本発明によれば、反応は液相で起こるのでいかなる固相担体も必要でなく、数倍過剰量の基質が必要でないので原料が節約され、コストが削減される。本発明は保護されたヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド塩を原料として採用しており、その合成反応は反応フラスコ又は反応釜中で起こり、固体担体又は合成装置の制限が無く、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの大スケール合成が達成できる。
実施例１で得られた脱保護された２１量体ＲＮＡ（ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ）の質量分析グラフ図である。 実施例１で得られた２１量体ＲＮＡ（ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ）及び固相合成法によって得られた同一配列を有する生成物のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の図である。 実施例３のＲＮＡ干渉試験の結果を示す図である。 実施例１の合成計画の概念図である。 実施例２の合成計画の概念図である。
本発明は、式（１）で示されるヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドを提供する。
式（１）中、
ＲはＨ又はＲ1である。Ｒ1は保護基であって、５’−ＯＨを保護可能な任意の基であってよく、好ましくはトリチル、モノメトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、又はトリメトキシトリチルであってよく、
ｎは理論上は任意の正の整数であってよく、好ましくは１〜１００の範囲の整数であり、より好ましくは１〜５０の範囲の整数であり、更により好ましくは１〜３０の範囲の整数であってよく、
Ｂは、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基を示し、各繰り返し単位のＢは同一であるか又は異なっており、
Ｒ2は立体障害のあるシラン構造を有する基を示し、
Ｒ3はベンゼン環上の置換基（好ましくはハロゲン原子、ニトロ、又はメトキシ）を示し、各繰り返し単位のＲ3は同一であるか又は異なってよく、ベンゼン環上におけるＲ3の位置は限定されず、オルト位、メタ位、又はパラ位であってよい。
式（１）において、ｎ＝１の場合には式（１）はヌクレオチドを示し、ｎが１よりも大きい整数の場合には式（１）はオリゴヌクレオチドを示す。
式（１）において、立体障害のあるシラン構造を有する基は、立体障害と保護機能とを有するシラン基であってよい。好ましくは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシリコメタン（tert-butyl dimethyl chlorosilicomethane）基、フェニルジメチルクロロシリコメタン基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシリコメタン基、又はトリイソプロピルクロロシリコメタン基であってよい。より好ましくは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシリコメタン基であってよい。各繰り返し単位のＲ2は同一でも異なっていてもよい。
式（１）において、保護基としての各アシルは同一でも異なっていてもよく、それぞれベンゾイル、イソブチリル、又はアセチルであってよい。
式（１）において、ハロゲン原子はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであってよく、好ましくはＣｌ又はＢｒであってよく、より好ましくはＣｌであってよい。
本発明が提供する式（１）の化合物において、ＲがＨである場合には式（１）はｘが１以上の後述の式（２）に相当し、ＲがＲ1である場合には式（１）は後述の式（４）に相当し、ＲがＲ1である場合には式（１）は後述の式（６）に相当する。
本発明はさらに、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの液相合成の方法を提供する。この方法はその特徴として、縮合剤の存在下且つ縮合反応の条件下で、第１の液体反応溶媒中で式（２）の化合物と式（３）の化合物とを接触させて、式（４）の化合物を得ることを含む。
式（２）、（３）、又は（４）において、
ｘは理論上は任意の負でない整数であってよく、好ましくは０〜５０の範囲の整数であってよく、より好ましくは０〜２５の範囲の整数であってよく、更により好ましくは０〜１５の範囲の整数であってよい。ｙは理論上は任意の正の整数であってよく、好ましくは１〜５０の範囲の整数であってよく、より好ましくは１〜２５の範囲の整数であってよく、更により好ましくは１〜１５の範囲の整数であってよい。
Ｂ1及びＢ2は、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基をそれぞれ示し、各繰り返し単位のＢ1及びＢ2は同一であるか又は異なっている。アシルの定義は式（１）の通りである。
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3の定義は式（１）の通りである。
Ａ+はトリアルキルアンモニウムイオン又はジアルキルアンモニウムイオンを示す。前記イオン中の複数のアルキル基は同一でも異なっていてもよく、それぞれが１〜６個の炭素原子（好ましくは１〜４個の炭素原子）を有してもよい。
前記縮合反応に用いる縮合剤及び前記縮合反応の条件は、当業者には公知であって、本発明では特に限定されない。例えば、縮合剤は、１−メシチレン−スルホニル−トリアゾール、１−メシチレン−スルホニル−（３−ニトロ）−トリアゾール、１−メシチレン−スルホニル−テトラゾール、１−トリイソプロピル−フェニル−スルホニル−トリアゾール、１−トリイソプロピル−フェニル−スルホニル−（３−ニトロ）−トリアゾール、及び１−トリイソプロピル−フェニル−スルホニル−テトラゾールの１つ又は複数であってもよい。第１の液体反応溶媒としては、ピリジン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジオキサン、及びテトラヒドロフランの１つ又は複数を用いてもよい。
前記縮合反応の条件には、次が含まれる。ｘが０に等しい（即ち式（２）の化合物が３−ヒドロキシプロピオニトリルである）場合、式（３）の化合物１ｍｏｌに対して、式（２）の化合物の量は１〜５ｍｏｌであってよく、好ましくは１．２〜３ｍｏｌ、より好ましくは１．５〜２ｍｏｌであってよい。ｘが１以上の場合、式（２）の化合物の量は０．３〜１．２５ｍｏｌであってよい。
式（３）の化合物１ｍｏｌに対して、縮合剤の量は２〜２０ｍｏｌであってよく、好ましくは２〜５ｍｏｌであってよい。
式（３）の化合物１ｍｏｌに対して、第１の液体反応溶媒の量は２〜５０Ｌであってよく、好ましくは２〜３０Ｌであってよい。
反応温度は０〜５０℃であってよく、好ましくは２０〜４０℃であってよい。反応時間は０．５〜１００時間であってよく、好ましくは１〜１０時間であってよい。
縮合反応が完了した後、縮合反応を停止してもよく、生成物を分離する。縮合反応の停止方法及び生成物の分離方法は当業者に公知であり、本発明では特に限定されない。
縮合反応の停止方法としては、例えば反応溶液と水とを０〜１５℃で５〜３０分間混合してよい。第１の液体反応溶媒１Ｌに対して、水の量は０．０５〜０．２Ｌであってよい。
縮合反応の停止方法としては、反応溶液と飽和炭酸水素ナトリウム溶液とを混合し、混合溶液を０〜５０℃で５〜１０分間撹拌してもよい。飽和炭酸水素ナトリウム溶液と第１の液体反応溶媒との容積比は０．０５〜０．２：１であってよい。
式（４）の化合物に対して後述の置換反応を行う必要がある場合、分離方法としては、反応を停止した後にロータリーエバポレーションによって反応溶液から溶媒を除去し、残渣を有機溶媒に溶解し、酸を用いてｐＨ値を３〜５に調節し、水で１回以上洗浄してもよい。第１の液体反応溶媒１Ｌに対して、有機溶媒の量は２〜２０Ｌであり、洗浄水の量は２〜２０Ｌである。無水硫酸ナトリウムを用いて有機相を乾燥した後、再度ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去し、常圧カラムによる分離後に生成物を得る。有機溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、及び酢酸エチルの１つ以上であってよい。酸は、１〜１０ｗｔ％のシュウ酸及び／又は酢酸であってよい。
式（４）の化合物に対して後述の加水分解反応を行うか全保護基を除去する必要がある場合、分離方法としては、反応を停止した後にロータリーエバポレーションによって反応溶液から溶媒を除去し、残渣を有機溶媒と混合し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加して洗浄し、乾燥、ろ過、濃縮し、常圧カラムで有機相を分離して生成物を得てもよい。有機溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、及び酢酸エチルの１つ以上であってよい。有機溶媒と第１の液体反応溶媒との容積比は２〜２０：１であってよい。洗浄は１回以上行ってよい。洗浄に用いる飽和炭酸水素ナトリウム溶液の総容積と第１の液体反応溶媒の容積との比は２〜２０：１であってよい。乾燥、ろ過、濃縮、及び常圧カラムによる分離の方法は当業者に公知であり、本明細書では詳しく説明しない。
従って本発明の第１の実施形態においては、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの本発明の液相合成法にはさらに次が含まれてもよい。第２の液体反応溶媒中で、トリアルキルアミン又はジアルキルアミンの存在下、加水分解条件下において、式（４）の化合物と水とを接触させ、加水分解反応を行ってβ−シアノエチルを取り外し、β−シアノエチルを取り外した加水分解生成物を得る。
加水分解反応の条件としては、式（４）の化合物１ｍｏｌに対して、トリアルキルアミン又はジアルキルアミンの量は１〜２００ｍｏｌ（好ましくは４０〜１５０ｍｏｌ）であってよく、第２の液体反応溶媒の量は５〜５０Ｌ（好ましくは５〜４０Ｌ）であってよく、水の量は２〜２０Ｌ（好ましくは２〜１５Ｌ）であってよい。反応温度は０〜５０℃であってよく、好ましくは１０〜３５℃であってよい。反応時間は０．２５〜２時間であってよく、好ましくは０．２５〜１時間であってよい。
好ましい第２の液体反応溶媒は、ピリジン及び／又はアセトニトリルである。
トリアルキルアミン又はジアルキルアミン中の複数のアルキル基は同一でも異なっていてもよく、それぞれが１〜６個の炭素原子を有する。例えば、トリアルキルアミンはトリメチルアミン、トリエチルアミン、及びジイソプロピルエチルアミンの１つ以上であってよく、ジアルキルアミンはジメチルアミン、ジエチルアミン、及びジイソプロピルアミンの１つ以上であってよい。
加水分解の完了後、加水分解反応で得られた生成物を分離することができる。分離法は当業者には公知であって、本発明においては特に限定されない。例えば、分離法には次が含まれてもよい。ロータリーエバポレーションによって反応溶液の溶媒を除去し、残渣を有機溶媒に溶解し、洗浄溶液を添加して洗浄し、分液によって有機相を得る。無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後、ロータリーエバポレーションによって溶媒を除去して生成物を得る。有機溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、又は酢酸エチルの１つ以上であってよい。有機溶媒と第２の液体反応溶媒との容積比は１〜１０：１であってよい。洗浄溶液は０．１〜１ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素トリエチルアミン（ＴＥＡＢ）水溶液又は飽和炭酸水素ナトリウム溶液であってよい。洗浄は１回以上実施してよい。洗浄に用いるＴＥＡＢ水溶液の総容積と第２の液体反応溶媒との比は、１〜１０：１であってよい。
次に、分離した加水分解生成物を式（３）の化合物として用いて、式（２）の化合物との間に前記の縮合反応を再度行う。
本発明の第２の実施形態においては、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの本発明の液相合成法にはさらに次が含まれてもよい。第３の液体反応溶媒中で、有機酸の存在下、置換反応条件下において、式（４）の化合物中のＲ1基を水素で置換し、Ｒ1基をＨで置換することによって生ずる生成物を得る。
置換反応の条件としては、式（４）の化合物１ｍｏｌに対して、有機酸の量は２〜２０ｍｏｌ（好ましくは２〜１０ｍｏｌ）であってよく、第３の液体反応溶媒の量は１０〜１５０Ｌ（好ましくは１０〜１３０Ｌ）であってよい。反応温度は−１０〜４０℃であってよく、好ましくは−１０〜３０℃であってよい。反応時間は１〜６０分であってよく、好ましくは１〜２０分であってよい。有機酸は、好ましくはメチルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、及びトリフルオロ酢酸の１つ以上であってよい。第３の液体反応溶媒は、ジクロロメタン、トリクロロメタン、アセトニトリル、及びメタノールの１つ以上であってよい。
置換反応の完了後、Ｒ1基をＨで置換することによって生じる生成物を分離することができる。分離法は当業者には公知であって、本発明においては特に限定されない。例えば、分離・精製法には次が含まれてもよい。置換反応で得られた混合物を水溶性アルカリを用いて中和し、分液によって有機溶媒を得、水溶性アルカリで１回以上洗浄する。乾燥、ろ過、濃縮を行い、常圧カラムで有機相を分離して、置換反応後の生成物を精製したものを得る。第３の液体反応溶媒１Ｌに対して、洗浄に用いる水溶性アルカリの量は０．２〜１Ｌであってよい。水溶性アルカリは飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素カリウム水溶液、又は飽和炭酸ナトリウム溶液であってよい。乾燥、ろ過、濃縮、及び常圧カラムによる分離の方法は当業者に公知であり、本明細書では詳しく説明しない。
次に、Ｒ1基をＨで置換することによって生じる生成物を分離したものを式（２）の化合物として用いて、式（３）の化合物との間に前記の縮合反応を再度行う。
ｘが１以上である場合、式（６）の化合物中のＲ1基をＨで置換することによって、式（２）の化合物を得ることができる。
式（６）
上記式中、ｘ、Ｂ1、Ｒ2、及びＲ3の定義は式（２）の通りであるが、ｘは１以上である。Ｒ1の定義は式（３）の通りである。
式（６）の化合物中のＲ1基をＨで置換する方法は、式（４）の化合物中のＲ1基をＨで置換する方法と同一であるが、式（４）の化合物の代わりに式（６）の化合物を用いる。
式（６）の化合物を合成する方法には、次が含まれる。式（５）の化合物を式（３）の化合物として用い、ｘが０に等しい式（２）の化合物（即ち３−ヒドロキシプロピオニトリル）との間に前記の縮合反応を行う。
式（５）
上記式中、ｘ、Ｂ1、Ｒ2、及びＲ3の定義は式（２）の通りであるが、ｘは１以上である。Ｒ1及びＡ+の定義は式（３）の通りである。
式（３）中のｙが式（５）中のｘに等しい場合には、式（３）は式（５）に等しい。
式（３）の化合物及び／又は式（５）の化合物を合成する方法は、開示文書ＰＣＴ／ＣＮ２００９／０７４１０１に詳しく記載されており、本明細書ではこれ以上説明しない。
長い断片の低分子核酸に関しては、本発明はモジュール式の合成計画を提供する。例えば、２１量体の核酸鎖を並列な４つの断片（５量体〜６量体）に分割し、それらをさらに短い並列な断片（２量体〜３量体）に分割する。短い２量体断片の合成後、それを用いて３量体を合成し、ｎ量体（ｎは標的長である）のオリゴヌクレオチド鎖に至ることが可能である。即ち理論上は、本発明が提供する方法によって、任意の長さのオリゴヌクレオチド鎖を合成することができる。以下の実施形態では、最長の４２量体のみを挙げて本発明を説明する。
本発明が提供する方法によれば、式（４）の完全に保護されたヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドを合成することができる。完全に保護されたヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの全保護基としては、アシル、β−シアノエチル、式（７）の基、式（４）のＲ1、及びＲ2が挙げられる。
式（７）
上記式中、Ｒ3の定義は式（４）と同一である。
完全に保護されたヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの全保護基は、２ステップで除去することができる。
ステップ１：第４の液体反応溶媒中で、第１の脱保護反応条件下で式（４）の化合物とアンモニア水とを接触させ、複数種類の保護基を取り外し、複数種類の保護基が取り外された生成物を得る。前記の複数種類の保護基とは、アシル、β−シアノエチル、及び式（４）中の式（７）の基を指す。
第４の液体反応溶媒は、ジオキサン、アセトニトリル、ピリジン、エタノール、及びメタノールの１つ以上であってよい。第１の脱保護反応条件には、次が含まれる。式（４）の化合物１ｇに対して、アンモニア水の量は０．０２〜０．５Ｌ（好ましくは０．０５〜０．３Ｌ）であってよく、第４の液体反応溶媒の量は０．０１〜０．２Ｌ（好ましくは０．０２〜０．１Ｌ）であってよい。反応温度は１０〜６０℃であってよく、好ましくは１０〜３０℃であってよい。反応時間は５〜１００時間であってよく、好ましくは１０〜６０時間であってよい。アンモニア水の濃度は２５〜２８質量％である。第１の脱保護反応が完了した後、減圧濃縮を行って溶媒を除去し、完全に乾燥してもよい。得られた固体は、複数種類の保護基が取り外された生成物である。
ステップ２：第５の液体反応溶媒中、第２の脱保護反応条件下で、複数種類の保護基が取り外された生成物とトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ-３ＨＦ）とを接触させて、残りの種類の保護基を取り外し、全保護基が取り外された生成物を得る。残りの種類の保護基とは、Ｒ1及びＲ2である。Ｒ1及びＲ2の定義は、式（４）の定義と同一である。
第５の液体反応溶媒はジメチルスルホキシドである。第２の脱保護反応条件には、次が含まれる。複数種類の保護基が取り外された生成物１ｇに対して、ＴＥＡ-３ＨＦの量は０．００２〜０．０５Ｌ（好ましくは０．００５〜０．０３Ｌ）であり、第５の液体反応溶媒の量は０．００２〜０．０５Ｌ（好ましくは０．００５〜０．０３Ｌ）である。反応温度は４０〜８５℃であり、好ましくは５０〜７５℃である。反応時間は１〜５時間であり、好ましくは２〜４時間である。
脱保護反応の完了後、脱保護反応で得られた生成物を分離することができる。分離法は当業者には公知であって、本発明においては特に限定されない。例えば、分離法としては、予冷却したｎ−ブタノールを反応溶液に添加し、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心によって沈殿物を回収し、ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの粗生成物を得てもよい。
得られたヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの粗生成物は精製することができる。精製法は当業者には公知であって、本発明においては特に限定されない。例えば精製法としては、オクタデシルシランを結合した逆相シリカゲル充填（ＯＤＳ）クロマトグラフにヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの粗生成物を注入し、溶出物を回収し、凍結乾燥して標的生成物を得てもよい。
本発明の方法によって得られる保護基を取り外したオリゴヌクレオチドは、生物活性を有し、種々の用途（ＲＮＡ干渉等）に用いることができる。
本発明で用いる気体及び液体の容積とは、１標準気圧２０℃における容積を指す。
以下、実施形態によって本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲は実施形態の実施例に限定されるものではない。
実施例に用いた原料は次の入手方法によって得た。
保護された４種類のリボヌクレオチド（アデニンリボヌクレオチド（Ａ）、ウラシルリボヌクレオチド（Ｕ）、シトシンリボヌクレオチド（Ｃ）、及びグアニンリボヌクレオチド（Ｇ）。塩基の環外アミノをベンゾイルで保護し、２’ＯＨをｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリコメタン基で保護し、５’ＯＨを４，４’−ジメトキシトリチルで保護したもの）：保護されたヌクレオチドの全４種類は、上海吉瑪製薬技術有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＧｅｎｅＰｈａｒｍａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）より購入。
トリエチルアミン：天津市北方天医試薬工場より購入。
１，２，４−トリアゾール：アルファ・エイサー社（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）より購入。
２−フェニルジクロロホスフェート：アルファ・エイサー社（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）より購入。
１−メシチレン−スルホニル−（３−ニトロ）−トリアゾール（ＭＳＮＴ）：シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）より購入。
本実施例では、オリゴヌクレオチドを合成する。
合成標的：完全に保護された２１量体オリゴリボ−オリゴヌクレオチド
配列：ＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥ
注：鉤括弧内の４文字（Ａ、Ｕ、Ｃ、及びＧ）は、保護された４種類のリボヌクレオチドを示す。それらの環外アミノ基はベンゾイルを用いて保護されており、２’ＯＨはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリコメタン基で保護されている。それらの保護基、リン酸基、及び塩基間のフェノール−リン酸エステルは省略している。
鉤括弧の左側にある基は５’末端にある保護基（４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ））を示すが、ＯＨであってもよい。
鉤括弧の右側にある基は３’末端にある保護基（リン酸プロピオニトリル（ＯＥ））を示すが、リン酸基（ＰＯ-）であってもよい。
本実施形態の合成には、図４に示す合成計画の３０ステップが含まれる。
（１）式（３）の化合物のモノマーＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の合成
１Ｌの丸底フラスコに、１，２，４−トリアゾール（１３．８ｇ、２００ｍｍｏｌ）と無水ピリジン（３１．６ｇ、４００ｍｍｏｌ）とを加えて、ジクロロメタン（１３０ｍｌ）に溶解する。氷浴条件下で２−フェニルジクロロホスフェート（１９．６ｇ、８０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液６５ｍｌを滴下して、攪拌しながら０．５時間反応させる。保護されたアデニンリボヌクレオチド（３９．４ｇ、５０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液１５０ｍｌを滴下して、氷浴条件下で攪拌しながら２時間反応させる。その後、１ＭのＴＥＡＢ溶液１５０ｍｌを添加して、攪拌を１０分間継続する。１ＭのＴＥＡＢ溶液で３回洗浄した後（１回当たり９０ｍｌ）、無水Ｎａ2ＳＯ4を用いて全有機相を乾燥する。ろ過し、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、５４．０ｇの生成物が得られる。収率は１００％である。この収率は、保護されたアデニンリボヌクレオチドに基づいて計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトルを検出し、31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１Ｍ）δ−６．０９を得る。これは５価のホスホジエステルが有する31ＰＮＭＲの理論値（「テトラヒドロン（Tetrahedron）」、第３６巻、ｐ．３０７５−３０８５（１９８０年）参照）の範囲に当てはまっており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
ＥＳＩ−ＭＳで検出された生成物のＭ-は９７６．２９１５であり、標的生成物の理論Ｍ-値と十分に一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（２）式（３）の化合物のモノマーＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-の合成
ステップ（１）と同じ方法によって合成されるが、保護されたアデニンリボヌクレオチドの代わりに保護されたウラシルリボヌクレオチドを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的生成物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（３）式（３）の化合物のモノマーＤＭＴｒ［Ｇ］ＰＯ-の合成
ステップ（１）と同じ方法によって合成されるが、保護されたアデニンリボヌクレオチドの代わりに保護されたグアニンリボヌクレオチドを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的生成物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（４）式（３）の化合物のモノマーＤＭＴｒ［Ｃ］ＰＯ-の合成
ステップ（１）と同じ方法によって合成されるが、保護されたアデニンリボヌクレオチドの代わりに保護されたシトシンリボヌクレオチドを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的生成物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（５）式（２）の化合物のモノマーＨＯ［Ａ］ＯＥの合成
２５０ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-（１７．３ｇ、１６ｍｍｏｌ）を加えて、無水ピリジン（１００ｍｌ）に溶解する。３−ヒドロキシプロピオニトリル（１．７０ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した後、ＭＳＮＴ（１３．３ｇ、４４．８ｍｍｏｌ）を添加する。反応を２０℃で２時間継続する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により反応完了が示された後、水（１０ｍｌ）を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍｌ）に再溶解する。適当量の５ｗｔ％シュウ酸水溶液を添加してｐＨ値を３〜４に調節する。分液によって有機相を得て、水（１００ｍｌ）で１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を再度除去する。２ｗｔ％のｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）を含むＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝７：３）溶液（７００ｍｌ）を添加し、０℃で５分間激しく撹拌する。次に、この溶液を飽和ＮａＨＣＯ3溶液を用いて直ちに中和する。分液によって有機相を得、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（３００ｍｌ）でもう１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、生成物１０．９ｇが得られる。収率は９３．４％である。この収率は、ＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-に基づいて計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトルを検出し、31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１Ｍ）δ−７．６６、−７．７９を得る。これらは５価のホスホジエステルが有する31ＰＮＭＲの理論値に当てはまっており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
ＥＳＩ−ＭＳで検出された生成物のＭ-は７２８．１９５６であり、標的生成物の理論Ｍ-値と十分に一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（６）式（２）の化合物のモノマーＨＯ［Ｕ］ＯＥの合成
ステップ（５）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりにステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-を用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的生成物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（７）式（２）の化合物のモノマーＨＯ［Ｇ］ＯＥの合成
ステップ（５）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりにステップ（３）で得られたＤＭＴｒ［Ｇ］ＰＯ-を用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的生成物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（８）式（２）の化合物のモノマーＨＯ［Ｃ］ＯＥの合成
ステップ（５）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりにステップ（４）で得られたＤＭＴｒ［Ｃ］ＰＯ-を用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的生成物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（９）式（４）の２量体ＤＭＴｒ［ＡＡ］ＯＥの合成
１００ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-（２．５９ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）とステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥ（１．４６ｇ、２．００ｍｍｏｌ）とを加える。無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解した後、ＭＳＮＴ（１．６６ｇ、５．６０ｍｍｏｌ）を添加する。反応を室温で２時間継続する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、２ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍｌ）に再溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3溶液で２回洗浄する（１回当たり３０ｍｌ）。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、生成物３．２６ｇが得られる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトルを検出し、31ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，１２１Ｍ）δ−７．３６、−７．４６、−７．５５、−７．９０を得る。これらは５価のホスホジエステルが有する31ＰＮＭＲの理論値に当てはまっており、生成物が実際に式（４）の構造を有することを示している。
ＥＳＩ−ＭＳで検出された生成物のＭ-は１６８７．６４であり、標的生成物の理論Ｍ-値と一致しており、生成物が実際に式（４）の構造を有することを示している。
（１０）２量体ＤＭＴｒ［ＡＡ］ＰＯ-の合成
ステップ（９）で精製したＤＭＴｒ［ＡＡ］ＯＥを、６０ｍｌのピリジン／トリエチルアミン／水（ｖ：ｖ：ｖ＝３：１：１）に溶解し、室温で３０分間撹拌する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、ロータリーエバポレーションによって反応溶液から溶媒を除去する。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に再溶解し、１ＭのＴＥＡＢ溶液で３回洗浄する（１回当たり５０ｍｌ）。分液によって有機相を得る。無水Ｎａ2ＳＯ4による乾燥後に、有機相から溶媒を除去し、生成物３．２０ｇを得る。ステップ（９）及びステップ（１０）の反応の総収率は、９３．９％である。この収率は、ＨＯ［Ａ］ＯＥから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（１１）２量体ＤＭＴｒ［ＧＧ］ＰＯ-の合成
ステップ（９）及びステップ（１０）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりにステップ（３）で得られたＤＭＴｒ［Ｇ］ＰＯ-を用い、ステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥの代わりにステップ（７）で得られたＨＯ［Ｇ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（１２）２量体ＤＭＴｒ［ＡＣ］ＰＯ-の合成
ステップ（９）及びステップ（１０）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥの代わりにステップ（８）で得られたＨＯ［Ｃ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（１３）２量体ＨＯ［ＡＵ］ＯＥの合成
５００ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-（１６．２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加える。無水ピリジン（１００ｍｌ）に溶解した後、ステップ（６）で得られたＨＯ［Ｕ］ＯＥ（７．５３ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を添加する。ＭＳＮＴ（１０．４ｇ、３５ｍｍｏｌ）を添加する。反応を室温で２時間継続する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、１０ｍｌの水を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍｌ）に再溶解する。適当量の５％シュウ酸水溶液を添加してｐＨ値を３〜４に調節する。分液によって有機相を得て、水（１５０ｍｌ）で１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を再度除去する。２ｗｔ％のトルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）を含むＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝７：３）溶液（７００ｍｌ）を添加し、０℃で５分間激しく撹拌する。次に、飽和ＮａＨＣＯ3溶液を用いて直ちに中和する。分液によって有機相を得、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（３００ｍｌ）でもう１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、生成物１２．９ｇが得られる。収率は８１．８％である。この収率は、ＨＯ［Ｕ］ＯＥから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１４）２量体ＨＯ［ＣＵ］ＯＥの合成
ステップ（１３）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりにステップ（４）で得られたＤＭＴｒ［Ｃ］ＰＯ-を用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１５）２量体ＨＯ［ＧＡ］ＯＥの合成
ステップ（１３）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりにステップ（３）で得られたＤＭＴｒ［Ｇ］ＰＯ-を用い、ステップ（６）で得られたＨＯ［Ｕ］ＯＥの代わりにステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１６）２量体ＨＯ［ＵＣ］ＯＥの合成
ステップ（１３）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりにステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-を用い、ステップ（６）で得られたＨＯ［Ｕ］ＯＥの代わりにステップ（８）で得られたＨＯ［Ｃ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１７）２量体ＨＯ［ＵＵ］ＯＥの合成
ステップ（１３）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりにステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-を用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１８）３量体ＤＭＴｒ［ＣＣＵ］ＰＯ-の合成
１００ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（４）で得られたＤＭＴｒ［Ｃ］ＰＯ-（３．１７ｇ、３．００ｍｍｏｌ）とステップ（１４）で得られたＨＯ［ＣＵ］ＯＥ（３．０９ｇ、２．５０ｍｍｏｌ）とを加える。無水ピリジン（２０ｍｌ）に溶解した後、ＭＳＮＴ（２．０８ｇ、７．００ｍｍｏｌ）を添加する。反応を室温で２時間継続する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、２ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に再溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3溶液５０ｍｌで洗浄する。分液によって有機相を得、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、精製された生成物が得られる。精製された生成物を、６０ｍｌのピリジン／トリエチルアミン／水（ｖ：ｖ：ｖ＝３：１：１）に溶解し、室温で３０分間撹拌する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、ロータリーエバポレーションによって反応溶液から溶媒を除去する。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に再溶解し、１ＭのＴＥＡＢ溶液で３回洗浄する（１回当たり５０ｍｌ）。有機相を分離し、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去する。生成物４．８９ｇが得られる。収率は８８．５％である。この収率は、ＨＯ［ＣＵ］ＯＥから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（１９）３量体ＨＯ［ＵＧＡ］ＯＥの合成
２５０ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-（１０．０ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）とステップ（１５）で得られたＨＯ［ＧＡ］ＯＥ（１２．０ｇ、８．７６ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（５０ｍｌ）に溶解する。ＭＳＮＴ（７．３１ｇ、２４．５ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加する。反応を室温で２時間継続する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、５ｍｌの水を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍｌ）に再溶解する。適当量の５％シュウ酸水溶液を添加してｐＨ値を３〜４に調節する。有機相を分離して、水（１００ｍｌ）で１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を再度除去する。２％ＴｓＯＨを含むＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝７：３）溶液（５５０ｍｌ）を添加し、０℃で５分間激しく撹拌する。次に、飽和ＮａＨＣＯ3溶液を用いて直ちに中和する。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（２００ｍｌ）で１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、生成物１３．０ｇが得られる。収率は７８．０％である。この収率は、ＨＯ［ＧＡ］ＯＥから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（２０）３量体ＨＯ［ＣＡＵ］ＯＥの合成
ステップ（１９）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-の代わりにステップ（４）で得られたＤＭＴｒ［Ｃ］ＰＯ-を用い、ステップ（１５）で得られたＨＯ［ＧＡ］ＯＥの代わりにステップ（１３）で得られたＨＯ［ＡＵ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（２１）３量体ＨＯ［ＵＵＣ］ＯＥの合成
ステップ（１９）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１５）で得られたＨＯ［ＧＡ］ＯＥの代わりにステップ（１６）で得られたＨＯ［ＵＣ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（２２）３量体ＨＯ［ＡＵＵ］ＯＥの合成
ステップ（１９）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-の代わりにステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-を用い、ステップ（１５）で得られたＨＯ［ＧＡ］ＯＥの代わりにステップ（１７）で得られたＨＯ［ＵＵ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（２３）６量体ＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡ］ＰＯ-の合成
１００ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（１８）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵ］ＰＯ-（４．１８ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）とステップ（１９）で得られたＨＯ［ＵＧＡ］ＯＥ（３．００ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解する。ＭＳＮＴ（１．３１ｇ、４．４２ｍｍｏｌ）を添加する。反応を室温で３時間継続する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、２ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、生成物をカラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））によって精製する。精製された生成物を６０ｍｌのピリジン／トリエチルアミン／水（ｖ：ｖ：ｖ＝３：１：１）に溶解し、この溶液を室温で３０分間撹拌する。ＴＬＣにより反応完了が示され、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に再溶解し、１ＭのＴＥＡＢ溶液で３回洗浄する（１回当たり５０ｍｌ）。有機相を分離し、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去して生成物５．００ｇが得られる。収率は７９．３％である。この収率は、ＨＯ［ＵＧＡ］ＯＥから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（２４）５量体ＤＭＴｒ［ＡＣＵＵＣ］ＰＯ-の合成
ステップ（２３）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１８）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵ］ＰＯ-の代わりにステップ（１２）で得られたＤＭＴｒ［ＡＣ］ＰＯ-を用い、ステップ（１９）で得られたＨＯ［ＵＧＡ］ＯＥの代わりにステップ（２１）で得られたＨＯ［ＵＵＣ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（２５）５量体ＨＯ［ＧＧＣＡＵ］ＯＥの合成
２５０ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（１１）で得られたＤＭＴｒ［ＧＧ］ＰＯ-（５．７２ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）とステップ（２０）で得られたＨＯ［ＣＡＵ］ＯＥ（５．３０ｇ、２．８０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１５ｍｌ）に溶解する。ＭＳＮＴ（２．３４ｇ、７．８４ｍｍｏｌ）を添加する。反応を室温で２時間継続する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、１．５ｍｌの水を添加して反応を停止する。ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に再溶解する。適当量の５％シュウ酸水溶液を添加してｐＨ値を３〜４に調節する。有機相を分離して、水（５０ｍｌ）で１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を再度除去する。２％ＴｓＯＨを含むＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝７：３）溶液（１７０ｍｌ）を添加し、０℃で激しく撹拌する。この溶液を飽和ＮａＨＣＯ3溶液を用いて直ちに中和する。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（８０ｍｌ）で１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、生成物５．３ｇが得られる。収率は５９．６％である。この収率は、ＨＯ［ＣＡＵ］ＯＥから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（２６）５量体ＨＯ［ＡＡＡＵＵ］ＯＥの合成
ステップ（２５）と同じ方法によって合成されるが、ステップ（１１）で得られたＤＭＴｒ［ＧＧ］ＰＯ-の代わりにステップ（１０）で得られたＤＭＴｒ［ＡＡ］ＰＯ-を用い、ステップ（２０）で得られたＨＯ［ＣＡＵ］ＯＥの代わりにステップ（２２）で得られたＨＯ［ＵＵＣ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（２７）１１量体ＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵ］ＰＯ-の合成
１００ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（２３）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡ］ＰＯ-（４．８６ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）とステップ（２５）で得られたＨＯ［ＧＧＣＡＵ］ＯＥ（３．１８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解する。ＭＳＮＴ（０．８３ｇ、２．８０ｍｍｏｌ）を添加する。反応を室温で４時間継続する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、１ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液を添加して反応を停止する。ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）を添加し、５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で１回洗浄し、５０ｍｌの水で１回洗浄する。無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、精製された生成物を４０ｍｌのピリジン／トリエチルアミン／水（ｖ：ｖ：ｖ＝３：１：１）に溶解し、この溶液を室温で３０分間撹拌する。ＴＬＣにより反応完了が示され、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に再溶解し、１ＭのＴＥＡＢ溶液で３回洗浄する（１回当たり５０ｍｌ）。有機相を分離し、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去して生成物２．８９ｇが得られる。収率は４２．７％である。この収率は、ＨＯ［ＧＧＣＡＵ］ＯＥから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（２８）１０量体ＨＯ［ＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥの合成
１００ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（２４）で得られたＤＭＴｒ［ＡＣＵＵＣ］ＰＯ-（４．８６ｇ、１．４３ｍｍｏｌ）とステップ（２６）で得られたＨＯ［ＡＡＡＵＵ］ＯＥ（３．７０ｇ、１．１９ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解する。ＭＳＮＴ（０．９９ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）を添加する。反応を室温で４時間継続する。ＴＬＣにより反応完了が示された後、１ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液を添加して反応を停止する。ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）を添加し、５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で１回洗浄し、５０ｍｌの水で１回洗浄する。無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去する。カラムによる分離後、得られた生成物に２％ＴｓＯＨを含むＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝７：３）溶液（１５０ｍｌ）を添加し、０℃で１０分間激しく撹拌する。この溶液を飽和ＮａＨＣＯ3溶液を用いて直ちに中和する。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（５０ｍｌ）で１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、生成物４．６ｇが得られる。収率は６３．５％である。この収率は、ＨＯ［ＡＡＡＵＵ］ＯＥから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（２９）２１量体ＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥの合成
５０ｍＬの丸底フラスコに、ステップ（２７）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵ］ＰＯ-（２．８０ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）とステップ（２８）で得られたＨＯ［ＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥ（２．１７ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）とを加え、無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解する。ＭＳＮＴ（３２１ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を添加する。反応を室温で１０時間継続する。１ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液を添加して反応を停止する。ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）を添加し、５０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で１回洗浄し、５０ｍｌの水で１回洗浄する。無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、生成物２．４８ｇが得られる。収率は５０．１％である。この収率は、ＨＯ［ＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥから計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（４）の構造を有することを示している。
以上で、完全に保護された２１量体ＲＮＡであるＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥが液相合成法によって得られる。
（３０）脱保護
ステップ（２９）で得られた、完全に保護された２１量体ＲＮＡであるＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥ（１０ｍｇ）をジオキサン０．５ｍｌに溶解する。２５質量％アンモニア水（１ｍｌ）を添加し、この溶液を振とうして均一に混合し、室温に４０時間静置する。反応完了後、溶液を減圧濃縮して溶媒を除去し、完全に乾燥する。固体残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに再溶解し、１２５μｌのＴＥＡ-３ＨＦを添加する。均一に混合した後、溶液を６５℃に加熱して２．５時間反応させる。−２０℃に予冷却したｎ−ブタノール１ｍｌを添加する。オリゴヌクレオチドが沈殿する。遠心によって沈殿物を回収し、粗生成物３ｍｇを得る。逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフによって純化精製する。具体的な操作手順については文献を参照されたい（モレキュラークローニング（Molecular Cloning）、実験室マニュアル（A Laboratory Manual）、第３版、サイエンス・プレス社（２００２年９月出版））。凍結乾燥し、標的化合物１．６ｍｇを得る。
島津製作所のＡＸＩＭＡ-ＣＦＲｐｌｕｓ型ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析計を用いて、ステップ（３０）で得られた標的化合物の質量を分析する。得られた質量スペクトルを図１に示す。
質量分析の結果から、ステップ（３０）で得られたオリゴヌクレオチドが２つのピーク（それぞれ、ｍ／ｚ６７０１．９７及び３３５１．２２）を有することが示される。２つのピークは前記オリゴヌクレオチドの電荷数１のピーク及び電荷数２のピークであり、理論上の電荷数のピーク（ｍ／ｚ６７０２及び３３５１）と一致している。質量スペクトル中にその他の不純物ピークは存在しなかった。従って質量分析の結果から、ステップ（３０）で得られたオリゴヌクレオチドが正しい質量及び高純度を有することが示される。
ステップ（３０）で得られた生成物３００ｎｇ、ＲＮＡ固相合成装置（ＡＢＩ３９００）による固相合成で得られた生成物（標的配列５'-ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ-３'を有する。上海ジーンファーマ（Shanghai GenePharma）社）３００ｎｇ、及び上記の２つの生成物を等量ずつ混合した試料３００ｎｇを、ＰＡＧＥで検出する。検出結果を図２に示す。この結果から、同一配列を有するオリゴヌクレオチドを異なる２種類の方法で合成したものは、ＰＡＧＥ上で同じバンド位置を有することが分かる。これら２種類の試料を混合した後もバンド位置は同じであって、明らかな混入バンドは存在しなかった。この結果から、同一の標的配列を有するオリゴヌクレオチドを異なる２種類の方法で合成したものは、同じ電気泳動度を有することが分かる。
低分子ＲＮＡクローニング技術及びシーケンシング技術（Ｄ．Ｐ．バーテル（Bartel）著、セル（Cell）、第１１６巻、ｐ．２８１（２００４年））を適用し、タカラ社のスモールＲＮＡクローニングキット（製品番号ＤＲＲ０６５）を用いて、ステップ（３０）で得られた生成物のオリゴヌクレオチドをクローニングする。具体的な操作手順についてはキットの仕様書を参照されたい。首尾よくクローニングした後、インビトロジェン社に送付して塩基配列を決定する。操作手順については文献を参照されたい（Ｍ．Ｊ．ポス（Poth）ら著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」、第２６０巻、ｐ．９３２６（１９８５年））。
クローニング及びシーケンシングの結果は５'-ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ-３'であり、ステップ（３０）で得られた生成物の塩基配列が実際に標的配列であることが示される。
本実施例では、標的配列５'-ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ-３'を有する脱保護されたオリゴヌクレオチドを合成する。この標的配列と実施例１の生成物の塩基配列とは、部分的に逆相補的である。
本実施例の合成には、図５に示す合成計画の１９個のステップが含まれる。
（１）式（２）の２量体ＨＯ［ＡＡ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（１３）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（６）で得られたＨＯ［Ｕ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（２）２量体ＤＭＴｒ［ＧＵ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（９）及びステップ（１０）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりに実施例１のステップ（３）で得られたＤＭＴｒ［Ｇ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（６）で得られたＨＯ［Ｕ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（３）２量体ＤＭＴｒ［ＡＵ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（９）及びステップ（１０）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（６）で得られたＨＯ［Ｕ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（４）２量体ＤＭＴｒ［ＣＣ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（９）及びステップ（１０）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりに実施例１のステップ（４）で得られたＤＭＴｒ［Ｃ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（８）で得られたＨＯ［Ｃ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（５）２量体ＤＭＴｒ［ＵＣ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（９）及びステップ（１０）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［Ａ］ＰＯ-の代わりに実施例１のステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（８）で得られたＨＯ［Ｃ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（６）２量体ＤＭＴｒ［ＡＧ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（９）及びステップ（１０）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（７）で得られたＨＯ［Ｇ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（７）３量体ＤＭＴｒ［ＵＵＵ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（１８）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（４）で得られたＤＭＴｒ［Ｃ］ＰＯ-の代わりに実施例１のステップ（６）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（１４）で得られたＨＯ［ＣＵ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（１７）で得られたＨＯ［ＵＵ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（８）３量体ＨＯ［ＧＡＡ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（１９）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-の代わりに実施例１のステップ（３）で得られたＤＭＴｒ［Ｇ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（１５）で得られたＨＯ［ＧＡ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（１）で得られたＨＯ［ＡＡ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（９）３量体ＨＯ［ＡＵＧ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（１９）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-の代わりに実施例２のステップ（３）で得られたＤＭＴｒ［ＡＵ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（１５）で得られたＨＯ［ＧＡ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（７）で得られたＨＯ［Ｇ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１０）３量体ＨＯ［ＵＣＡ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（１９）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（５）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-の代わりに実施例２のステップ（５）で得られたＤＭＴｒ［ＵＣ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（１５）で得られたＨＯ［ＧＡ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（５）で得られたＨＯ［Ａ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１１）３量体ＨＯ［ＧＵＵ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（１９）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［Ｕ］ＰＯ-の代わりに実施例１のステップ（３）で得られたＤＭＴｒ［Ｇ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（１５）で得られたＨＯ［ＧＡ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（１７）で得られたＨＯ［ＵＵ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１２）６量体ＤＭＴｒ［ＵＵＵＧＡＡ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（２３）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（１８）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵ］ＰＯ-の代わりに実施例２のステップ（７）で得られたＤＭＴｒ［ＵＵＵ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（１９）で得られたＨＯ［ＵＧＡ］ＯＥの代わりに実施例２のステップ（８）で得られたＨＯ［ＧＡＡ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（１３）５量体ＨＯ［ＧＵＡＵＧ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（２５）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（１１）で得られたＤＭＴｒ［ＧＧ］ＰＯ-の代わりに実施例２のステップ（２）で得られたＤＭＴｒ［ＧＵ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（２０）で得られたＨＯ［ＣＡＵ］ＯＥの代わりに実施例１のステップ（９）で得られたＨＯ［ＡＵＧ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１４）５量体ＤＭＴｒ［ＣＣＵＣＡ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（２３）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（１８）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣ］ＰＯ-の代わりに実施例２のステップ（４）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（１９）で得られたＨＯ［ＵＧＡ］ＯＥの代わりに実施例２のステップ（１０）で得られたＨＯ［ＵＣＡ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（１５）５量体ＨＯ［ＡＧＧＵＵ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（２５）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（１１）で得られたＤＭＴｒ［ＧＧ］ＰＯ-の代わりに実施例２のステップ（６）で得られたＤＭＴｒ［ＡＧ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（２０）で得られたＨＯ［ＣＡＵ］ＯＥの代わりに実施例２のステップ（１１）で得られたＨＯ［ＧＵＵ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１６）１１量体ＤＭＴｒ［ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（２７）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（２３）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡ］ＰＯ-の代わりに実施例２のステップ（１２）で得られたＤＭＴｒ［ＵＵＵＧＡＡ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（２５）で得られたＨＯ［ＧＧＣＡＵ］ＯＥの代わりに実施例２のステップ（１３）で得られたＨＯ［ＧＵＡＵＧ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（３）の構造を有することを示している。
（１７）１０量体ＨＯ［ＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（２８）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（２４）で得られたＤＭＴｒ［ＡＣＵＵＣ］ＰＯ-の代わりに実施例２のステップ（１４）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵＣＡ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（２６）で得られたＨＯ［ＡＡＡＵＵ］ＯＥの代わりに実施例２のステップ（１５）で得られたＨＯ［ＡＧＧＵＵ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（２）の構造を有することを示している。
（１８）２１量体ＤＭＴｒ［ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（２９）と同じ方法によって合成されるが、実施例１のステップ（２７）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵ］ＰＯ-の代わりに実施例２のステップ（１６）で得られたＤＭＴｒ［ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（２８）で得られたＨＯ［ＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥの代わりに実施例２のステップ（１７）で得られたＨＯ［ＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥを用いる。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的化合物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分一致しており、生成物が実際に式（４）の構造を有することを示している。
以上で、完全に保護された２１量体ＲＮＡであるＤＭＴｒ［ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥが液相合成法によって得られる。
（１９）脱保護
脱保護は、実施例１のステップ（３０）と同じ方法によって実施する。ただし、実施例（１）のステップ（２９）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥの代わりに、実施例（２）のステップ（１８）で得られたＤＭＴｒ［ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥを用いる。
質量分析、電気泳動の結果、及びシーケンシングの結果は何れも、ステップ（１９）の生成物の塩基配列が実際に標的配列であることを支持している。
本実施例では、本発明の液相合成法で得られた生成物と固相合成法で得られた同一配列の生成物との間にある生物活性の一貫性を、ＲＮＡ干渉試験によって検出する。
実施例１の生成物と実施例２の生成物とを等量（５ｎｍｏｌ）混合し、７５℃に加熱し、温度を１０分間維持する。次に、自然に且つ徐々に室温まで冷却し、次の配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡを得る。
５’−ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ−３’
｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜
３’−ＵＵＧＧＡＡＣＵＣＣＧＵＡＵＧＡＡＧＵＵＵ−５’
既知の配列ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡを有するｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の標的遺伝子は、Ｂ型肝炎ウィルスＸタンパク質（ＨＢＶ-Ｘ）である。即ち理論的には、前記の二本鎖ｓｉＲＮＡはＨＢＸ遺伝子の発現を阻害する活性を有する。
本発明の液相合成法で得られた生成物と固相合成法で得られた同一配列の生成物とが、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるＨＢＶ-Ｘ遺伝子発現に対して示す阻害活性を、定量ＰＣＲによって検出する。
（１）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞の培養
ＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、及び３８０μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したもの）を用いて、２４穴培養プレートにＨｅｐＧ２．２．１５細胞（北京大学人民病院から購入）を１×１０5細胞／ウェルの濃度で接種し、インキュベータ内で培養する（温度３７℃、ＣＯ2濃度５％）。
（２）ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
インビトロジェン社から購入したリポフェクタミンTM２０００リポソームを用いて、実施例７で得られた二本鎖ｓｉＲＮＡ、固相合成法で合成した同一配列の二本鎖ｓｉＲＮＡ（上海ジーンファーマ社から購入）、文献で報告された陽性効果を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ（ＰＣ）（配列５'-ＵＣＡＣＣＡＵＡＣＵＧＣＡＣＵＣＡＧＧ-３'、ウー・イン（Wu Ying）ら著、「ＲＮＡ干渉の応用によるマウス急性Ｂ型肝炎ウィルス感染の治療（Apply RNA interference to treat acute hepatitis B virus infection of mice）」（２００５年））、及び無関係な二本鎖ｓｉＲＮＡ（ＮＣ）（いずれも上海ジーンファーマ社から購入）を比較する。これらを、本実施例のステップ（１）のＨｅｐＧ２．２．１５細胞にトランスフェクションする（トランスフェクション量＝０．０６ｎｍｏｌ／ウェル）。ｓｉＲＮＡトランスフェクションのブランクコントロールとしては、滅菌した脱イオン水を用いる。具体的な実施手順については、リポフェクタミンTM２０００の仕様書及び文献（ウー・インら著、「ＲＮＡ干渉の応用によるマウス急性Ｂ型肝炎ウィルス感染の治療」（２００５年））を参照されたい。
（３）本実施例のステップ（２）でｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅｐＧ２．２．１５細胞におけるＨＢＸ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、リアルタイムＰＣＲ法によって検出する。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部コントロールの遺伝子とした。用いたプライマーの配列は次の通りである。
具体的な実施手順については文献を参照されたい（モレキュラークローニング（Molecular Cloning）、第３版、サイエンス・プレス社（２００２年９月出版））。ｓｉＲＮＡの阻害活性は、次式を用いて計算する。
ｓｉＲＮＡの阻害活性＝１−（ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＨＢＶ遺伝子のコピー数／ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＧＡＰＤＨのコピー数）／（ブランクコントロールにおけるＨＢＶ遺伝子のコピー数／ブランクコントロールにおけるＧＡＰＤＨのコピー数）
細胞に対するｓｉＲＮＡ干渉試験の結果を図３に示す。ＨＢＶ-Ｘ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、無関係なｓｉＲＮＡのネガティブコントロール（ＮＣ）群では低下しない。しかし、液相合成生成物のｓｉＲＮＡ及び固相合成生成物のｓｉＲＮＡは、ＨＢＶ-Ｘ遺伝子発現の阻害に関してポジティブコントロール（ＰＣ）と同じ性能を有する。これは、実施例２で得られた液相合成生成物のｓｉＲＮＡと固相合成生成物のｓｉＲＮＡとが標的遺伝子の発現阻害に関して同じ生物活性を有することを示している。
本実施例では、４２量体オリゴヌクレオチドＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥを合成する。
（１）ＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＰＯ-の合成
実施例１のステップ（２９）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥの３．１８ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌのピリジン／トリエチルアミン／水（ｖ：ｖ：ｖ＝３：１：１）に溶解し、室温で３０分間撹拌する。ＴＬＣにより反応完了が示され、ロータリーエバポレーションで溶媒を除去した後に、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に再溶解し、１ＭのＴＥＡＢ溶液で３回洗浄する（１回当たり５０ｍｌ）。有機相を分離し、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥する。溶媒を除去した後、生成物２．６４ｇが得られる。
（２）ＨＯ［ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥの合成
実施例２のステップ（１８）で得られたＤＭＴｒ［ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥの２．８４ｇ（０．２ｍｍｏｌ）を、２％ＴｓＯＨを含むＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝７：３）溶液２５ｍｌに添加し、０℃で１０分間激しく撹拌する。飽和ＮａＨＣＯ3溶液を用いて直ちに中和する。有機相を分離し、２５ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で１回洗浄する。有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を除去する。カラムクロマトグラフィー（用いる溶出剤はＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ（ｖ：ｖ＝１０：１））による精製後、生成物２．５６ｇが得られる。
（３）４２量体ＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥの合成
実施例１のステップ（２９）と同じ方法で合成する。ただし、実施例１のステップ（２７）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵ］ＰＯ-の代わりに実施例４のステップ（１）で得られたＤＭＴｒ［ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＰＯ-を用い、実施例１のステップ（２８）で得られたＨＯ［ＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵ］ＯＥの代わりに実施例４のステップ（２）で得られたＨＯ［ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥを用いる。生成物１．２１ｇが得られ、収率は３０．１％である。この収率は、ＨＯ［ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥに基づいて計算された理論生成量に対する生成物の重量のパーセンテージである。
生成物の31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-を検出する。標的生成物が有する31ＰＮＭＲスペクトル及びＭ-の理論値に十分当てはまっており、生成物が実際に式（４）の構造を有することを示している。
以上で、完全に保護された４２量体ＲＮＡのＤＭＴｒ［ＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡＵＵＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ］ＯＥが液相合成によって得られる。

Claims (16)

  1. 式（１）で示されるヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドであって、
    式（１）
    上記式中、Ｒは４，４’−ジメトキシトリチルであり、
    ｎは１〜１００の範囲の整数であり、
    Ｂは、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基を示し、各繰り返し単位のＢは同一であるか又は異なっており、
    Ｒ2はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリコメタン（tert-butyl dimethyl silicomethane）基、フェニルジメチルシリコメタン基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリコメタン基、又はトリイソプロピルシリコメタン基を示す、
    ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド。
  2. アシルがベンゾイル、イソブチリル、又はアセチルである、請求項１に記載のヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド。
  3. ヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドの液相合成のための方法であって、
    縮合剤の存在下且つ縮合反応の条件下で、第１の液体反応溶媒中で式（２）の化合物と式（３）の化合物とを接触させて、式（４）の化合物を得ることを含み、
    式（２）
    式（３）
    式（４）
    上記式中、Ｒ1 は４，４’−ジメトキシトリチルであり、
    ｘは０〜５０の範囲の整数であり、
    ｙは１〜５０の範囲の整数であり、
    Ｂ1及びＢ2は、アシルによって保護された環外アミノ基を有するグアニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するアデニン基、アシルによって保護された環外アミノ基を有するシトシン基、チミン基、又はウラシル基をそれぞれ示し、各繰り返し単位のＢ1及びＢ2は同一であるか又は異なっており、
    Ｒ2の定義は請求項１の定義と同一であり、
    Ａ+はトリアルキルアンモニウムイオン又はジアルキルアンモニウムイオンを示す、
    方法。
  4. アシルがベンゾイル、イソブチリル、又はアセチルであり、
    トリアルキルアンモニウムイオン又はジアルキルアンモニウムイオン中のアルキル基が同一であるか又は異なっており、それぞれが１〜６個の炭素原子を有する、
    請求項３に記載の方法。
  5. 請求項３または４に記載の方法であって、
    縮合剤が、１−メシチレン−スルホニル−トリアゾール、１−メシチレン−スルホニル−（３−ニトロ）−トリアゾール、１−メシチレン−スルホニル−テトラゾール、１−トリイソプロピル−フェニル−スルホニル−トリアゾール、１−トリイソプロピル−フェニル−スルホニル−（３−ニトロ）−トリアゾール、及び１−トリイソプロピル−フェニル−スルホニル−テトラゾールの１つ又は複数であり、
    第１の液体反応溶媒が、ピリジン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジオキサン、及びテトラヒドロフランの１つ又は複数であり、
    前記縮合反応の条件として、
    式（３）の化合物１ｍｏｌに対して、縮合剤の量が２〜２０ｍｏｌであり、第１の液体反応溶媒の量が２〜５０Ｌであり、ｘが０に等しい場合には式（２）の化合物の量が１〜５ｍｏｌであり、ｘが１以上の場合には式（２）の化合物の量が０．３〜１．２５ｍｏｌであり、
    反応温度が０〜５０℃であり、反応時間が０．５〜１００時間である、
    方法。
  6. 請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法であって、さらに、
    第２の液体反応溶媒中で、トリアルキルアミン又はジアルキルアミンの存在下、加水分解反応条件下において、式（４）の化合物と水とを接触させ、加水分解反応を行ってβ−シアノエチルを取り外した加水分解生成物を得ることを含む、方法。
  7. 請求項６に記載の方法であって、
    加水分解反応の条件として、
    式（４）の化合物１ｍｏｌに対して、トリアルキルアミン又はジアルキルアミンの量が１〜２００ｍｏｌであり、第２の液体反応溶媒の量が５〜５０Ｌであり、水の量が２〜２０Ｌであり、
    反応温度が０〜５０℃であり、反応時間が０．２５〜２時間である、
    方法。
  8. 請求項６または７に記載の方法であって、
    第２の液体反応溶媒がピリジン及び／又はアセトニトリルであり、
    トリアルキルアミン又はジアルキルアミン中の複数のアルキル基が同一であるか又は異なっており、それぞれ１〜６個の炭素原子を有する、
    方法。
  9. 請求項６〜８のいずれかに記載の方法であって、さらに、
    加水分解生成物を式（３）の化合物として用いて、式（２）の化合物との間に前記の縮合反応を再度行うことを含む、方法。
  10. 請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法であって、さらに、
    第３の液体反応溶媒中で、有機酸の存在下、置換反応条件下において、式（４）の化合物中のＲ1基を水素で置換し、Ｒ1基をＨで置換することによって生ずる生成物を得ることを含む、方法。
  11. 請求項１０に記載の方法であって、
    置換反応の条件として、
    式（４）の化合物１ｍｏｌに対して、有機酸の量が２〜２０ｍｏｌであり、第３の液体反応溶媒の量が１０〜１５０Ｌであり、反応温度が−１０℃〜４０℃であり、反応時間が１〜６０分であり、
    有機酸が、メチルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、及びトリフルオロ酢酸の１つ又は複数であり、
    第３の液体反応溶媒が、ジクロロメタン、トリクロロメタン、アセトニトリル、及びメタノールの１つ又は複数である、
    方法。
  12. 請求項１０または１１に記載の方法であって、さらに、
    Ｒ1基をＨで置換することによって生ずる生成物を式（２）の化合物として用いて、式（３）の化合物との間に縮合反応を再度行うことを含む、方法。
  13. 請求項３〜５のいずれかに記載の方法であって、さらに、
    第４の液体反応溶媒中で、第１の脱保護反応条件下で式（４）の化合物とアンモニア水とを接触させ、複数種類の保護基を取り外し、複数種類の保護基が取り外された生成物を得ることを含み、
    前記の複数種類の保護基が、アシル、β−シアノエチル、及び式（４）中の式（７）の基を指し、
    式（７）
    アンモニア水の濃度は２５〜２８質量％である、
    方法。
  14. 請求項１３に記載の方法であって、
    第４の液体反応溶媒が、ジオキサン、アセトニトリル、ピリジン、エタノール、及びメタノールの１つ又は複数であり、
    第１の脱保護反応条件として、
    式（４）の化合物１ｇに対して、アンモニア水の量が０．０２〜０．５Ｌであり、第４の液体反応溶媒の量が０．０１〜０．２Ｌであり、
    反応温度が１０〜６０℃であり、
    反応時間が５〜１００時間である、
    方法。
  15. 請求項１３または１４に記載の方法であって、さらに、
    第５の液体反応溶媒中、第２の脱保護反応条件下で、複数種類の保護基が取り外された生成物とトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ-３ＨＦ）とを接触させて、残りの種類の保護基を取り外し、全保護基が取り外された生成物を得ることを含み、
    前記残りの種類の保護基がＲ1及びＲ2であり、Ｒ1及びＲ2の定義が請求項３と同一である、
    方法。
  16. 請求項１５に記載の方法であって、
    第５の液体反応溶媒がジメチルスルホキシドであり、
    第２の脱保護反応条件として、
    複数種類の保護基が取り外された生成物１ｇに対してＴＥＡ−３ＨＦの量が０．００２〜０．０５Ｌであり、
    第５の液体反応溶媒の量が０．００２〜０．０５Ｌであり、
    反応温度が４０℃〜８５℃であり、
    反応時間が１〜５時間である、
    方法。
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