WO2007026824A1

WO2007026824A1 - オリゴヌクレオチド類縁体

Info

Publication number: WO2007026824A1
Application number: PCT/JP2006/317224
Authority: WO
Inventors: Satoshi Obika; Takeshi Imanishi
Original assignee: Osaka University
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2006-08-31
Publication date: 2007-03-08

Abstract

　一般式（Ｉ）［化１］［式中、Ｒ１～Ｒ４は各々独立してＨであるか、あるいは置換されていてもよい、Ｃ１－４アルキル、ハロゲン、ＯＨ、Ｃ１－４アルキル－ＯＨ、Ｃ１－４アルキル－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、ＮＨ２、ＮＯ２、Ｎ（Ｃ１－４アルキル）２、Ｏ－Ｃ１－４アルキル、ＣＯＯＨ、ＳＨ、ＳＯ３Ｈ、Ｃ１－５アシル、Ｃ２－５アルケニル、Ｃ２－５アルキニル、Ｃ３－８シクロアルキル、Ｃ６－１０アリール、Ｃ７－１０アラルキルからなる群より選択される］で表されるヌクレオシド類縁体を含む、オリゴヌクレオチド類縁体、かかるオリゴヌクレオチド類縁体を用いて、試料中の標的二重鎖ＤＮＡ配列を検出する方法および標的二重鎖ＤＮＡと三重鎖を形成させる方法、ならびにかかるオリゴヌクレオチド類縁体を含む医薬組成物。

Description

明細書

オリゴヌクレオチド類縁体

技術分野

[0001] 本発明は、ヌクレオシド類縁体を含むオリゴヌクレオチド類縁体、かかるオリゴヌタレォチド類縁体を用いて、試料中の標的二重鎖 DNA配列を検出する方法および標的二重鎖 DNAと三重鎖を形成させる方法、および力かるオリゴヌクレオチド類縁体を含む医薬組成物などに関する。

背景技術

[0002] 近年、三重鎖形成オリゴヌクレオチド (TFO)を標的二重鎖 DNAと結合させることにより、遺伝子発現を細胞内で制御するアンチジーン法が広く用いられている。かかるアンチジーン法において、天然型 TFOを用いたのでは、生体内で酵素等に分解され易い、あるいは細胞膜透過性が低いなどの問題がある上に、ピリミジン'プリン塩基対を認識する天然型ヌクレオシドは存在しな、ので標的配列に制限が生じてヽた。そこで、天然型 TFOに代わる、オリゴヌクレオチド類縁体が開発され、用いられてきた。し力しながら、力かるオリゴヌクレオチド類縁体をもってしても、任意の標的配列と安定な三重鎖を形成することは困難であり、改良されたオリゴヌクレオチド類縁体が求められていた。

[0003] 本発明者らは、これまでに架橋型人工核酸 2' , 4' -ΒΝΑ(2' Ο, 4' C—メチレン架橋型核酸)が三重鎖核酸を強く安定化すること、さら〖こは 2 ピリドン型 2' , 4' ΒΝΑがピリミジン'プリン塩基対の 1つである CG塩基対認識能を有することを見出してきた (特許文献 1および非特許文献 1参照)。し力しながら、力かる 2—ピリドン型 2 ，， 4，一ΒΝΑを含むオリゴヌクレオチド類縁体を用いてアンチジーン法を行っても、標的遺伝子の働きを十分に抑えるなどの効果は得られていな力つた。

特許文献 1：特開平 10— 304889号公報

非特許文献 l : Obika S. et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2001 Jun 1;40(11):2079 -2081

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明の解決課題は、 CG塩基対を認識するヌクレオシド類縁体を含むオリゴヌクレオチド類縁体、力かるオリゴヌクレオチド類縁体を用いて、試料中の標的二重鎖 D NA配列を検出する方法および標的二重鎖 DNAと三重鎖を形成させる方法、ならびにかかるオリゴヌクレオチド類縁体を含む医薬組成物などを提供することである。課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、 2' , 4' BNA骨格にピリジン 2—ィル基を導入したヌクレオシド類縁体が高ヽ CG塩基対認識能を有すること、そして該ヌクレオシド類縁体を含むオリゴヌクレオチド類縁体が標的二重鎖 DN Aと安定な三重鎖を形成することを見出し、本発明を完成するに至った。

[0006] すなわち、本発明は、

(1)一般式 (I)

[化 1]

[式中、 R〜Rは各々独立して Hである力、あるいは置換されていてもよい、 C 了

1 4 1 -4 ルキル、ハロゲン、 OH、 C アルキル— OH、C アルキル— O— C アルキル、

1-4 1-4 1-4

NH、 NO、 N (C アルキル）、 O— C アルキル、 COOH、 SH、 SO H、 C ァ

2 2 1-4 2 1-4 3 1-5 シル、 C アルケニル、 C アルキニル、 C シクロアルキル、 C ァリール、 C

2-5 2-5 3-8 6-10 7- 1 ァラルキル力なる群より選択される]

0

で表されるヌクレオシド類縁体を含む、オリゴヌクレオチド類縁体、

(2)R〜Rがすべて Hである、（1)記載のオリゴヌクレオチド類縁体、 (3)式 (I)のピリジン環の窒素がォキシドを形成して、る、（1)または（2)記載のオリゴヌクレオチド類縁体、

(4)試料中の標的二重鎖 DNA配列を検出する方法であって、

(a) (1) - (3)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド類縁体を試料と接触させ、次に、

(b)該オリゴヌクレオチドが三重鎖を形成するかを調べる、

を特徴とし、

該三重鎖の形成が、試料中に標的二重鎖 DNA配列が存在することを示す、方法

(5) (1)一（3)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド類縁体を標的二重鎖 DNAと結合させることを特徴とする、三重鎖形成方法、

(6) (1)一（3)のいずれか〖こ記載のオリゴヌクレオチド類縁体を含む、医薬組成物、

(7) (1) - (3)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド類縁体を必須構成成分として含む、標的二重鎖 DNA配列を検出するためのキット、

(8)医薬組成物の製造のための（1) (3)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド類縁体の使用、

(9) (1)一（3)のいずれか〖こ記載のオリゴヌクレオチド類縁体を投与することを特徴とする、疾病の処置または予防方法

を提供するものである。

発明の効果

本発明によれば、 CG塩基対を効率よく認識するヌクレオシド類縁体を含むオリゴヌクレオチド類縁体、カゝかるオリゴヌクレオチド類縁体を用いて、試料中の標的二重鎖 DNA配列を検出する方法および標的二重鎖 DNAと三重鎖を形成させる方法、ならびにカゝかるオリゴヌクレオチド類縁体を含む医薬組成物などが提供される。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は CG塩基対認識能が高ぐ遺伝子医薬品としての効果や安全性の向上を図ることができる。また、遺伝子診断に用いた場合にも、 SZN比の向上、すなわち信頼性 ·正確性の向上を図ることができる。

図面の簡単な説明 [0008] [図 1]図 1は、 TF07 (配列番号： 1)、 TF08 (配列番号： 2)、 TF09 (配列番号： 3)、 TFOl l (配列番号： 8)、 TF016 (配列番号： 4)および TF017 (配列番号： 5)の配列、ならびに dsDNA18 (センス配列は配列番号： 6、アンチセンス配列は配列番号： 9)および dsDNA22 (センス配列は配列番号： 10、アンチセンス配列は配列番号： 1 1)の配列を示す。

[図 2]図 2は、 dsDNA18に対する TF07の融解特性を示すグラフである。

[図 3]図 3は、 dsDNA(YZ = CG)に対する TF07および TF08の融解特性を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0009] 本発明は、 1の態様において、一般式 (I) [式中、 R〜Rは各々独立して Hである

1 4

力あるいは置換されていてもよい、 C アルキル、ハロゲン、 OH、 C アルキル一

1-4 1-4

OH、 C アルキル— O— C アルキル、 NH、 NO、 N (C アルキル）、 O— C

1-4 1-4 2 2 1-4 2 1 アルキル、 COOH、 SH、 SO H、 C ァシル、 C アルケニル、 C アルキニル

-4 3 1-5 2-5 2-5

、 C シクロアルキル、 C ァリール、 C ァラルキルからなる群より選択される]で

3-8 6-10 7-10

表されるヌクレオシド類縁体 (以下、 RPy^Bと表す)を含む、オリゴヌクレオチド類縁体に関するものである。

[0010] 「C アルキル」とは、炭素数 1〜4個の直鎖または分枝状アルキル、およびそれら

1-4

の構造異性体を意味し、例えば、メチル、ェチル、 n プロピル、 i プロピル、 n—ブチル、 t—ブチルなどが挙げられる。他の R基の表示についても同様である。さらに R 基は、例えば、ハロゲン、 OH、 SH、 C アルキル、 NH、 NO、 COOH、 SO H等

1 -4 2 2 3 の基により置換されていてもよい。 R〜Rは、例えば、標的配列等の因子に応じて選

1 4

択され得る力好ましくは、 R〜Rがすべて Hである力、あるいは R、 R、および R

1 4 1 3 4 が Hであって、 Rカチル、ハロゲンまたはプロピ-ルであり、より好ましくは、 R〜R

2 1 4 がすべて Hである力、あるいは R、 R、および Rが Hであって、 Rがメチルであり、最

1 3 4 2

も好ましくは、 R〜Rがすべて Hである。 RPy^Bのうち R〜Rがすべて Hであるものを

1 4 1 4

、以下において「Py^B」と表す。以下において、特記しないかぎり、 RPy^Bというときは P y^Bを包含するものとする。

[0011] 本発明のオリゴヌクレオチド類縁体において、 RPy^Bは少なくとも 1個含まれていればよぐ含まれる RPy^Bの R〜Rは同じであっても、あるいは異なっていてもよい。オリ

1 4

ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類縁体への RPy^Bの導入方法は、既知の方法、例えば、ホスホロアミダイト法、 H—ホスホネート法などを用いることができる。オリゴヌクレオチド類縁体の RPy^B以外の構成成分としては、例えば、天然型ヌクレオシド、ヌクレオシド類縁体、 2' , 4'—BNA、およびそれらの改変体または修飾体などが挙げられる。オリゴヌクレオチド類縁体における RPy^Bの位置はいずれであってもよぐ例えば、オリゴヌクレオチド類縁体を用いる目的、条件などに応じて、当業者は適宜選択することができる。

[0012] 本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、一般式 (I)のヌクレオシド類縁体のピリジン環の窒素がォキシドを形成しているものであってもよい。本明細書において、そのようなヌクレオシド類縁体を oxRPy^Bと称する。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体にお!ヽて、 RPy^B (または Py^B)の一部または全部が oxRPy (oxPy )であってもよい。 oxRP

B B

y^Bの場合にも上の説明があてはまる。 oxRPy^Bのうち R〜Rがすべて Hであるものが

1 4

好ましぐこれを「oxPy^B」と表す。以下において、特記しないかぎり、 oxRPy^Bというときは ₀xPy^Bを包含するものとする。

[0013] 本発明のオリゴヌクレオチド類縁体に含まれる RPy^Bまたは oxRPyは、 2—ピリドン

B

型 2' , 4'—BNA (以下、 P^Bとする）と同様に CG塩基対の Cのァミノ基と水素結合 [化 2]

し、 2—ピリドン型 2' , 4'—BNAと比べて、ピリジン環が CG塩基対に近づくことでより強いファン 'デル'ワールス相互作用が生じるので、 RPy^Bまたは oxRPy^Bを含むオリゴヌクレオチド類縁体は、標的二重鎖 DNAとより安定な三重鎖を形成することができるという点で非常に優れている。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、標的遺伝子の検出や、アンチジーン法を適用する遺伝子治療において有用であり、核酸医薬としても有用である。

[0014] 本発明は、もう 1つの態様において、試料中の標的二重鎖 DNA配列を検出する方法であって、

(a) RPy^Bまたは ₀xRPy^Bを含むオリゴヌクレオチド類縁体を試料と接触させ、次に、

(b)該オリゴヌクレオチド類縁体が三重鎖を形成するかを調べる、

を特徴とし、

該三重鎖の形成が、試料中に標的二重鎖 DNA配列が存在することを示す、方法を提供するものである。

[0015] 本発明にお!/、て用いられる試料は、二重鎖 DNA配列を含むものであれば!/、ずれのものであってもよいが、例えば、患者から採取した血液試料または組織試料、あるいは培養細胞試料などが挙げられる。例えば、標的二重鎖 DNA配列が SNPを含むように選択し、患者由来試料中の該標的二重鎖 DNA配列を検出することにより、遺伝子診断やテーラーメード医療が容易にもたらされる。

[0016] 本発明のこの態様は、 RPy^Bまたは ₀xRPy^Bが高ヽ CG塩基対認識能を有すると、う知見に基づくものであるので、 RPy^Bまたは oxRPy^Bが CG塩基対と結合するようにその他の配列を選択すべきである。オリゴヌクレオチド類縁体の RPy^Bまたは oxRPy^B以外の配列は、結合すべき標的二重鎖 DNA配列に対して高い親和性を有するように設計され、合成されることが望ましい。オリゴヌクレオチド類縁体に含まれる RPy^Bまたは oxRPy^Bの個数、およびそれ以外の構成成分については、上述のとおりである。

[0017] 本発明のこの方法に用いるオリゴヌクレオシド類縁体の長さは、標的二重鎖 DNA の長さ、その塩基配列、三重鎖形成条件、所望の感度や選択性、および三重鎖形成の有無を調べる方法などの条件に応じて選択されるが、一般的には、 5〜30塩基、好ましくは、 10〜25塩基である。

[0018] オリゴヌクレオチド類縁体は、検出可能な標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、酵素標識等を有していてもよい。力かる標識を検出することで、三重鎖が形成された力どうかを調べ、試料が標的二重鎖 DNA配列を有する力否かを容易に決定できる。三重鎖が形成されたかどうかを調べる方法としては、これらの他に質量スペクトル法、紫外部吸収スペクトル法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)法などが挙げられる。

[0019] 本発明のこの方法におけるオリゴヌクレオチド類縁体と標的二重鎖 DNA配列との三重鎖形成のための反応条件、例えば、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシー、温度、 pH、塩濃度などは、標的二重鎖 DNA配列の配列、用いるオリゴヌクレオチド類縁体の配列、所望の感度や選択性、および三重鎖形成の有無を調べる方法などの条件に応じて適宜選択され得る。

[0020] 本発明は、別の態様にぉヽて、 RPy^Bまたは ₀xRPy^Bを含むオリゴヌクレオチド類縁体を標的二重鎖 DNAと結合させることを特徴とする、三重鎖形成方法に関するものである。本発明のこの方法にぉ、て用いるオリゴヌクレオチド類縁体の配列および長さ、含まれる RPy^Bまたは oxRPy^Bの個数、その他の構成成分、ならびに三重鎖形成のための反応条件については上述の通りである。

[0021] 本発明のこの態様における標的二重鎖 DNAはいずれのものであってもよい。例えば、標的二重鎖 DNAを疾患の原因遺伝子として既知のものから選択することにより、アンチジーン法などの遺伝子治療も可能となる。あるいは、本発明の三重鎖形成方法により、細胞での標的二重鎖 DNAの機能修飾または変異導入、遺伝子相同組換、および遺伝子発現の活性ィ匕なども可能になる。

[0022] 本発明は、なお別の態様にぉ、て、 RPy^Bまたは oxRPy^Bを含むオリゴヌクレオチド類縁体を含む、医薬組成物を提供するものである。オリゴヌクレオチド類縁体に含まれる RPy^Bまたは oxRPy^Bの個数、その他の構成成分につ!、ては上述の通りである。本発明の医薬組成物は、オリゴヌクレオチド類縁体を、例えば、疾患の原因遺伝子と結合するように選択することで、この疾患に対して治療または予防効果を有するものとなる。本発明の医薬組成物は、上記オリゴヌクレオチド類縁体以外に、例えば、賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤等の慣用の助剤などを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物の剤形および投与方法'経路は、いずれのものであってもよぐ例えば、疾病の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。

[0023] 本発明のオリゴヌクレオチド類縁体を遺伝子治療に使用してもよい。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体をそのまま、あるいは適当な公知のベクターに組み込んで患部の細胞に導入することができる。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体を、注射や点滴等の手段により対象の組織に直接導入してもよい。また、対象から取り出した細胞に公知の方法により本発明のオリゴヌクレオチド類縁体を導入して、その細胞を対象に戻してもよい。使用可能なベクターの種類や、細胞への導入方法は当業者に公知である。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体を用いる遺伝子治療に使用可能なベクターとしては、例えば、カチオン性リボソーム、ポリエチレンィミン、 HVJ—リボソーム等が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチド類縁体の細胞への導入方法としては、例えば、患部に直接注射する方法、点滴による方法、吸入による方法、点鼻や点眼による方法など、あるいは対象から得た細胞に遺伝子銃、エレクト口ポレーシヨン、カチォン性リボソームなどの公知の導入方法を適用すること等が挙げられる。

[0024] 本発明は、さらになお別の態様において、 RPy^Bまたは oxRPy^Bを含むオリゴヌタレォチド類縁体を必須構成成分として含む、標的二重鎖 DNA配列を検出するためのキットを提供するものである。本発明のキットにおいて、上記オリゴヌクレオチド類縁体は標識されたものであってもよい。本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチド類縁体のほかに標識、反応容器、検出用試薬を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、標的二重鎖 DNA配列を高感度かつ容易に検出でき、簡便かつ正確な SNP解析も行うことができる。

[0025] 本発明は、別の態様において、医薬組成物の製造のための RPy^Bまたは oxRPy^Bを含むオリゴヌクレオチド類縁体の使用を提供するものである。カゝくして製造された医薬組成物を用いて疾病の処置または予防をすることができる。

[0026] 本発明は、さらに別の態様において、 RPy^Bまたは oxRPy^Bを含むオリゴヌクレオシド類縁体を含む医薬組成物を投与することを特徴とする、疾病の処置または予防方法を提供するものである。

[0027] 以下に実施例を示して本発明をより具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。

[0028] 本発明のオリゴヌクレオチド類縁体の合成に用いた手段 '方法のうち、主なものを以下に説明する。その他の手段 ·方法も当業者に公知のものである。 [0029] 融点 (mp)は柳本微量融点測定器を用いて測定し、全て未補正である。旋光度は日本分光 DIP— 370型旋光度計を用いて測定した。赤外吸収 (IR)スペクトルは、日本分光 FTZIR— 200型分光光度計を用いて測定した。水素核磁気共鳴 ( — N MR)スペクトルは、日本電子 JNM— EX270型（270MHz)、 JNM— AL300型（30 OMHz)を用い、テトラメチルシラン（0. OOppm)、重クロ口ホルム（7. 26ppm)、重メタノール (4. 78ppm)を内部標準として測定した。炭素核磁気共鳴 (¹³C— NMR)スベクトルは、 JNM—EX270型（67. 5MHz)、 JNM—AL300型（75. 5MHz)を用い、重クロ口ホルム（77. Oppm)、重メタノール (49. Oppm)を内部標準として測定した。リン核磁気共鳴（³¹P— NMR)スペクトルは、ノリアン VXR— 200型（86. 4MHz )と日本電子 JNM— GX500型を用い、 5%リン酸—重水溶液 (0. OOppm)を内部標準として測定した。質量分析 (EI— MA及び FAB— MS)は日本電子 JMS— 600、日本電子 JMS— D300を用いて測定した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの吸着剤は E. Merck silica gel 60 (0. 063— 0. 200mm)、富士シリシァ化学 BW— 127Z H (0. 053 - 0. 150mm)を用いた。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーの吸着剤は富士シリシァ化学 BW— 300 (0. 038 - 0. 075mm)、富士シリシァ化学 F ー600 (平均0. 06mm)を用いた。アルミナカラムクロマトグラフィーの吸着剤は E. Merck aluminium oxide 90 active, neutral (0. 063— 0. 200mm)を用いた。 DNA合成機は Applied Biosystems Expedite™ 8909を用い、 0. 2 μ molのスケーノレで行った。高速液体クロマトグラフィー（HPLC)は SHIMADZU LC- 10AT 、 SHIMADZU SPD

VP

-10 A 、 SHIMADZU CTO- 10 を用いた。 HPLC分析カラムは Waters XTerra (登録

VP VP

商標） MS C 2.5 μ τη (4. 6x50mm)を、分取カラムは Waters XTerra (登録商標） M

18

S C 2.5 m ( 10x50mm)を用いて行った。 T測定は Beckman DU- 650、 Beckman

18 m

DU- 7400を用いて行った。 MALDI— TOF— MSは、 autoflex II型 MALDI- TOF- M S、 Applied Biosystems Voeyger (登球商標) DEあるヽ ίま Applied Biosystems Voyager System 6360を用いて測定した。

[0030] 上で説明した手段 ·方法は例示的なものであって、当業者はこれらの手段 ·方法を改変し、あるいは別法を用いて目的を達成することができる。

実施例 1 1. 2- (2-0, 4— C—メチレン一 β—D—リボフラノシル）ピリジンの製造

[化 3]

Obika S. et al.， Tetrahedron Lett., 41 8923-8927 (2000)に記載の方法に従い製造した 2— (3, 5—ジ一 O—ベンジノレ一 2— O, 4— C—メチレン一 13—D—リボフラノシル）ピリジン

[化 4]

(151mg, 0. 38mmol)のエタノール溶液（5. Oml)に、 20% 水酸化パラジウム一炭素粉末（148mg)、シクロへキセン（1. 9ml, 18. 8mmol)を加え、 2. 5時間加熱還流した。反応溶液を濾過し、減圧留去した。得られた粗成績体をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル:メタノール = 20 : 1)により精製し、白色粉末の表題ィ匕合物を得た (63mg, 75%) o

融点 123-125°C. [ α ] ²⁸—0.5 (c 1.10, MeOH). IR v (KBr): 3363, 2930, 1043 c

H NMR (CD OD) δ： 3.91, 3.92 (2H, AB, J = 13 Hz), 3.96, 4.05 (2H, AB, J = 8

3

Hz), 4.04 (IH, s), 4.28 (IH, s), 5.04 (IH, s), 7.31 (IH, dd, J = 5, 7 Hz), 7.66 (IH, d , J = 8 Hz), 7.86 (IH, ddd, J = 2, 7, 8 Hz), 8.49 (IH, dd, J = 2, 5 Hz). C-NMR (CD OD) δ： 59.3, 71.5, 73.6, 84.1, 85.1, 89.0, 122.1, 123.9, 138.7, 14

3

9.5, 159.8.

MS(EI): m/z 223 (M⁺, 4.5), 108 (100).元素分析計算値 C H NO 1/2H O: C, 56.

11 13 4 2

89; H, 6.08; N, 6.03.実測値： C, 56.67; H, 5.92; N, 5.92.

2. 2- [5-0- (4, 4，一ジメトキシトリチル） 2— O, 4— C—メチレン一 13— D—リボフラノシル]ピリジンの製造

[化 5]

窒素気流下、得られた 2— (2-0, 4 C—メチレン一 13—D—リボフラノシル)ピリジン（lOOmg, 0. 45mmol)のピリジン溶液（1. 9ml)に室温で塩化 4, 4，ージメトキシトリチル（197mg, 0. 58mmol)をカ卩え、 3時間撹拌した。反応溶液に飽和重曹水を加え、酢酸ェチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗成績体をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (_n—へキサン:酢酸ェチル = 1： 1)により精製し、白色粉末の表題化合物を得た（212mg, 90%)を得た。

融点： 68- 73°C [ α ] ²⁸—5.60 (c 0.77, CHC1 ). IR v (KBr): 3334, 3007, 2944, 160

D 3 max

5,1508, 1251, 1035 cm"¹.

JH NMR (アセトン— d ) δ： 3.42, 3.52 (2H, AB, J = 11 Hz), 3.78 (6H, s), 4.30 (1H,

6

s), 5.03 (1H, s), 6.89 (4H, J = 9 Hz), 7.20-7.43 (9H, m), 7.56 (2H, d, J = 8 Hz), 7.7 0 (lH,d, J = 8 Hz), 7.81 (1H, dd, J = 8, 8 Hz), 8.54 (1H, d, J = 5 Hz).

1³C NMR (アセトン— d ) δ： 55.5, 55.5, 61.4, 72.2, 73.5, 83.3, 85.3, 86.7, 87.5, 113

6

.9, 113.9, 113.9, 113.9, 121.4, 123.2, 127.5, 128.5, 128.5, 129.0, 129.0, 131.0, 131 .0, 131.0, 131.0, 136.7, 136.8, 137.4, 146.2, 149.8, 159.5, 159.5, 160.5. MS(FAB): m/z 548 (MNa⁺).元素分析計算値 C H NO H O: C, 73.14; H, 5.94; N

32 31 6 2

, 2.66.実測値： C, 66.55; H, 5.57; N, 2.44.

3. 2— [3— O— [2 シァノエトキシ（ジイソプロピルァミノ）ホスフイノ]— 5— O— (4, 4'—ジメトキシトリチル） 2— O, 4— C—メチレン一 13—D リボフラノシル]ピリジンの製造

[化 6]

窒素気流下、得られた 2— [5— O— (4, 4 '―ジメトキシトリチル）—2— O, 4-C- メチレン一 13— D リボフラノシル]ピリジン（211mg, 0. 40mmol)および N, N ジイソプロピルアンモ-ゥムテトラゾリド（97mg, 0. 48mmol)の無水ァセトニトリル一テトラヒドロフラン溶液（3 : 1, 10ml)に、 2 シァノエチル一 N, N, Ν' , Ν，一テトライソプロピルホスホロジアミダイト（0. 19ml, 0. 60mmol)を室温にて滴下し、 5時間撹拌した。溶媒を留去後、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー (n—へキサン:酢酸ェチル = 1 : 1)にて精製し、白色粉末の表題ィ匕合物を得た（256mg, 89%)。

³¹P-NMR (アセトン- d ) δ： 148.004, 148.645.

6

MS (FAB): m/z 726 (M⁺).

高分解能 MS (FAB): 726.3307 (M⁺,計算値 C H N O P: 725.81).

41 48 3 7

実施例 2

Py^Bを含むオリゴヌクレオチド類縁体の製造

2— [3— O— [2 シァノエトキシ（ジイソプロピルァミノ）ホスフイノ]— 5— O— (4, 4 ，一ジメトキシトリチル） 2— O, 4— C—メチレン一 13—D リボフラノシル]ピリジン、活性化剤 5 ェチルチオ 1H テトラゾールを用い、 Applied Biosystems Expedite [ 登録商標] 8909 DNA合成機にて標準のホスホロアミダイト法 (スケール： 0. 2 /z mol ,トリチル OFF)を行い、 Py^Bを含むオリゴヌクレオチド類縁体 TF07および 16を合成した（図 1参照)。ここで Py^Bのカップリング時間は 5分間に延長した (天然アミダイトのカップリング時間は 90秒)。なお、 T及び ^mC (2，ーデォキシ 5—メチルシチジン）のアミダイト体は巿販（Proligo社)のものを用いた。合成した TF07および 16は 28%ァンモニァ水で室温下、 1. 5時間処理してカラム力もの切り出しを行い、引き続き 55°C 下、 8時間処理して脱保護を行った。 NENSORB [登録商標] PREPによる簡易精製後、逆相 HPLC[A液： 0. 1M 酢酸トリェチルアンモ -ゥム緩衝液 (TEAA) , pH7. 0 ; B液：ァセトニトリル: TEAA= 1 : 1、グラジェント： B液濃度 6〜14% (30分）； Waters XTerra [商標] MS C 2. 5 m (4. 6 X 50mm) ]にて精製した。 TF07および 16の

18

分子量をMALDI—TOF— MS (Applied Biosystems Voeyger [商標] DE)にて測定した。

MALDI—TOF— MSデータ：TF07に関し計算値 [M- H]_: 4476.04;実測値： 44 75.83 :TF016に関し計算値 [M- ΗΓ: 4475.07;実測値： 4475.04.

実施例 3

[0035] 核酸塩基としてピリジンォキシドを有する 2， , 4，一 BNAを導入したオリゴヌクレオチド誘導体の合成

[0036] 1.核酸塩基としてピリジンォキシドを有する 2' , 4' BNAの合成

ジオール体 4のピリジル基の窒素原子の酸ィ匕を検討した。まず、氷冷下で 4と m—クロロ過安息香酸をメタノール中で反応させたところ、 99%という高収率で目的化合物 7を得ることができた。次いで、トリェチルァミンと触媒量の DMAP存在下、 THF溶液中で 7の 5'位水酸基をジメトキシトリチルイ匕することで 8に変換した。続いて、定法に従いアミダイト体 9へと導くことに成功した（下記スキームならびに下記説明を参照のこと)。

[化 7] ¾(%S8 '3u¾ ·ΐΖΐ)8、つ ¾HC)T^("[^:OS= /—, : ^エ邈 έ 4 エ^マ (H 邈^氺雜 ^w ^ ^m "^ ^ ^m^^

-s)dv a

(louiuiog Ό

'Ζ Ί·£) -^ (8) (^Ά ^^ ^ ^ fi-a- ϋ ' -Ζ- ^ Ή-0-9]-2( ) [8S00]

WS 'Ν -LV 'Η ·90"½ 'D： Ρ画 d 'SZ'S 'Ν

•8S"S Ή -\Z'f 'D :0 HV ON^SIH"つ ^oj P。つ "P -(₊H ) OfZ ^ζ/ω :(8Vd) SSB^

'S'OSI 'Z^ Ί'βΖΙ 'Z^Zl 'Z^Zl '8·88 'Ζ 8 '9"6Ζ TS ' ·ΐΖ 'VS ： 9 (QO'QD

) 顺-つ _εΐ "(ΖΗ 'Ζ = ί 'PP 'Ηΐ) 6 ·8 '(^ΖΗ 8 'Ζ '2 = f 'ΡΡΡ 'Ηΐ) 98· '(ΖΗ 8 = ΓΡ

'Ηΐ) 99"Ζ '(ΖΗ Ζ 'S = f 'PP 'Ηΐ) l^L 'Ηΐ) WTS 'Ηΐ) SZ'f '(^s 'Ηΐ) Wf '(^H 8

= f '9V ΉΖ) 0'f '96·ε '(ZH ST = f '9V 'ΗΖ) Z6'£ 'ΐ6·ε： 9 (QO^QD) H N-H_T

。 S SZ '2Z6Z '068S :( !)腦 ^Λ HI '(Η0， '0·ΐ。） 90"ZS ["] ₀222-8ΐ2 din

) Λ^ ^ - Ν - ^ι^. ( /^ ^Δ^ fi - a - ϋ - Λ^- → ' -ζ) -ζ{^) [ζεοο] gj#£l9 ΝΟ HO \ fi .

4 マ - ¾ベ cl l NO HO HOOd (Ν ¾ΐ) (³'gj#£lOS、¾累 JH

-Ν%Ή dVPVa 10^J a(q'gj#£|9I、つ。 O H0⁹

6

ZZLl£/900Zdr/13d 白色粉末として得た。

mp 276-279°C. [ α ] ²⁸ 10.23 (c 0.7, CHC1 ). IR v (KBr): 3980, 3909, 3380, 2923

D 3 max

,1504, 1250 cm"¹. 1H-NMR (acetone— d ) δ： 3.42, 3.52 (2H, AB, J = 11 Hz), 3.78 (6

6

H, s), 4.30 (IH, s), 5.03 (IH, s), 6.89 (4H, J = 9 Hz), 7.20-7.43 (9H, m), 7.56 (2H, d, J = 8 Hz), 7.70 (IH, d, J = 8 Hz), 7.81 (IH, dd, J = 8, 8 Hz), 8.54 (IH, d, J = 5 H z). ¹³C— NMR (acetone— d ) δ ： 55.7, 62.0, 72.4, 80.1, 87.5, 88.0, 72.4, 73.9, 80.1,

6 C

87.5, 88.0, 126.6, 128.7, 129.2, 160.0. Mass (FAB): m/z 564 (MNa⁺). High- resoluti on mass (FAB): 564.1991 (MNa⁺, calcd for C H N O PNa: 564.1998).

41 48 3 8

[0039] (c) 2- [3— O— [2 シァノエトキシ（ジイソプロピルァミノ）ホスフイノ]— 5— O— (4, 4'—ジメトキシトリチル） 2— O, 4— C—メチレン一 13—D リボフラノシル]ピリジン —N—才キシド（9)の合成

窒素気流下、 5 (122mg, 0. 23mmol)及び N, N ジイソプロピルアンモ-ゥムテトラゾリド（54mg, 0. 27mmol)の無水ァセトニトリル溶液（6. Oml)に、 2 シァノエチル一 N, N, Ν' , Ν，一テトライソプロピルホスホロジアミダイト（86 ΐ, 0. 27mmol )を室温にて滴下し、 5時間撹拌した。溶媒を留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル:メタノール = 10 : 1)にて精製し、 9 (35mg, 21%)を白色粉末として得た。

mp 77-81°C. ³¹P- NMR (CDC1 ) δ ： 148.30, 148.47.

3 P

[0040] 2.核酸塩基としてピリジンォキシドを有する 2， , 4，一 BN Aを導入したオリゴヌクレオチド誘導体の合成

上記 1で合成したアミダイト体のオリゴヌクレオチドへの導入を行った（下記スキーム参照)。

[化 8]

[0041] オリゴヌクレオチド誘導体の合成は、アミダイト体 9を原料として用い、 DNA合成機 ( Applied Biosystems Expedite™ 8909)を用いて標準のホスホロアミダイト法により行つた。合成はすべて 0. 2 /z molスケールで行い、トリチル ONで終了した。合成したオリゴヌクレオチド 11 (TFOl l)は 28%アンモニア水（室温、 1. 5h)で処理し、固相カラムからの切り出しを行った。引き続き、 28%アンモニア水（55°C、 10h)で処理し、脱保護を行った。 NENSORB™ PREPによる簡易精製後、逆相 HPLC精製を行った。

[0042] 逆相 HPLCによるオリゴヌクレオチドの精製は以下の条件で行った。

移動相：

A液： 0. 1M 酢酸トリェチルアンモ -ゥム（TEAA)バッファー（pH7. 0)；

B液： 0. 1M TEAAバッファー：ァセトニトリル = 1 : 1

B液濃度 6— 11% (30分)のグラジェントとした。

カラム： Waters XTerra (登録商標） MS C 2.5 ^ m (10x50mm)

18

流速： 3. OmLZ分

カラム温度： 50°C

検出： UV (254nm)。

[0043] 得られた TFOl 1につ、て逆相 HPLCを用いて、純度確認を行った。オリゴヌタレォチドの純度確認は以下の条件で行った。

移動相：

A液： 0. 1M 酢酸トリェチルアンモ -ゥム（TEAA)バッファー（pH7. 0) B液： 0. 1M TEAAバッファー：ァセトニトリル = 1 : 1

B液濃度 6— 11 % (30分)のグラジェントとした。

カラム： Waters XTerra (登録商標） MS C 2.5 ^ m (4. 6x50mm)

18

流速： 1. OmLZ分

カラム温度： 50°C

検出： UV (254nm)。

その結果、単一のピークが認められ、純度良く TFOl lが得られていることを確認した (収率 11%)。

[0044] また、目的の塩基配列を有する TFOl lが合成されていることを確認するために、その分子量を MALDI—TOF— MSを用いて測定した。装置は Bruker Daltonics aut oflex IIを用いた。オリゴヌクレオチドの組成の確認を以下の条件に行った。 TFOとマトリックス（3—ヒドロキシピコリン酸又は 2, 4, 6—トリヒドロキシァセトフエノン一水和物：クェン酸三アンモ-ゥム = 1： 1)の混合溶液 1. O μ L· (TFO量： 20— lOOpmol)をサンプル上で乾燥させた。分子量の測定はネガティブモードで行った。その結果、理論値（M—H) _4492. 98に対して測定値（M—H)—4492. 72力得られ、良い一致を示した。以上より、今回合成したアミダイト体 9は DNA合成機を用いて問題なくオリゴヌクレオチドに導入可能であることが明らかになった。

実施例 4

[0045] TF07または TFOl 1と二重鎖 DNAとで形成された三重鎖の安定性の評価

TF07および TFO l lの三重鎖形成能を、 Tm値を測定することにより決定した。対照として P^B (2—ピリドン型 2 ' , 4 '— BNA)、 T (チミジン）をそれぞれ含む TF08、および TF09を、標的二重鎖 DNAとして dsDNA18を用いた。 Tm値の測定は以下に従ヽ行った。 1. TF07、 11、 8、または 9それぞれを、 140mM KC1、 10m M MgCl、 7mM リン酸ナ HJクム緩衝液（pH7. 0

2 )、 1. 5 Μ dsDNA18を含む溶液に添加し、サンプル溶液 (400ml)を調製した。次に、サンプル溶液を沸騰水中に浴し、 8時間かけて室温まで冷ました後、 4°Cで 2時間放置した。サンプル溶液を 5 °Cまで冷却し、さらに 5°Cに 20分間保った後、 260nmにおける吸光度を測定した。サンプル溶液を毎分 0. 5°Cの割合で 75°Cまで昇温させ、 0. 5°C間隔で吸光度を測定し、 Tm値を決定した。結果を表 1に示す。 dsDNA18の YZが CGのときの TF07 の Tm値は、 37°Cであった。これは、 CGに対する結合能を有することが分かっている P^Bまたは Tを含む、 TF08および 9の Tm値と比べて高いものであった。さらに、 YZが CGのときの Tm値は、 YZが AT、 GC、および TAのときの Tm値と比べて有意に高いこと、さらには、その差が TF08、および 9のものと比べて大きいことから、 TF07が高い選択性を有していることが分かった。さらに、 10°Cにおける吸光度（260nm)を 1として、三重鎖の融解曲線を描いた（図 2および図 3参照）。 TF07と dsDNA(YZ = C G)との三重鎖の融解曲線の立ち上がりは、 YZが AT、 GC、および TAのとき、ならびに TF08と dsDNA(YZ = CG)との三重鎖のものと比べて直線的であることから、 Py Bを含むオリゴヌクレオチド類縁体を用いた標的二重鎖 DNAの検出方法の感度は高いといえる。一方、 oxPy^Bを含む TFOl lも CG塩基対を含む標的二重鎖 DNAに対して 31°Cと高い Tm値を示し、 CG塩基対に対する親和性を有していることがわかつた。この値は、 P^Bを含む TF08の示す Tm値（33°C)に比べ、 2°C低いものの、 TF09 を 6°C上回るものであった。また、 TFOl lは TA塩基対を含む二重鎖 DNAに対して 12°Cと非常に低い Tm値を与えた。このこと力 TFOl lは CGと TAとの識別に優れていることがわかった。

[0046] TF07、 11、 8、および 9の Tm値（°C)

[表 1]

ォリゴヌクレオチド類縁体 γ z

A T G C C G T A

T F O 7 ( P y ^B ) 2 1 1 8 3 7 2 2

T F O 1 1 ( o x P y ^B ) 2 4 2 0 3 1 1 2

T F O 8 ( P ^B ) 2 3 1 9 3 3 1 4

T F O 9 ( T ) 4 4 2 0 2 5 1 7

[0047] lOmM MgClに代えて、 5mM スペルミンを用いることで、異なる条件下での TF

2

07の Tm値を測定した。上記同様、 dsDNAの YZが CGのときの TF07の Tm値は有意に高力つた (表 2)。さらにこれは、フルマツチ塩基対 TATまたは CGCを形成する場合の Tm値 59°C、 58°Cに匹敵するものであり、 TF07と dsDNA(YZ = CG)とで極めて強固な三重鎖が形成されていることが明ら力となった。また、 ₀xPy^Bを含む TF Oi lが CG塩基対に対して示した 51°Cという Tm値は、 Py^Bを含む TF07、 P^Bを含む TF08における Tm値 56°Cおよび 55°Cには満たなかったものの、塩条件が異なる場合においても _OXPy^B力 SCG塩基対を選択的に認識していることが明ら力となった。

TF07、 11、 8、および 9の Tm値（。C)

[表 2]

オリゴヌクレオチド類縁体 γ z

A T G C C G T A

T F O 7 ( P y 4 4 3 8 5 6 3 3

T F O 1 1 ( o x P y ^B ) 4 0 3 7 5 1 2 8

T F O 8 ( P ^B ) 3 9 3 7 5 5 3 6

T F O 9 ( T ) 5 9 3 5 4 4 3 3 実施例 5

[0049] TF016の CG塩基対を複数個有する二重鎖 DNAとの三重鎖形成能

TF016と CG塩基対を 3個有する dsDNA22との三重鎖形成能を調べるため、 TF 016の Tm値を測定した。対照として、 Py^Bの代わりに Tを含む TF017を用いた。 TF 017の Tm値は測定不能であつたのに対して、 TF016の Tm値は、 22°Cと高いことより、 CG塩基対を複数個有する二重鎖 DNAに対しても安定な三重鎖を形成できることがわかった。

産業上の利用可能性

[0050] 本発明は、遺伝子工学、生化学、検査試薬の製造、創薬、製薬等の分野において利用可能である。

Claims

請求の範囲 [1] 一般式 (I)

[化 1]

[式中、 R〜Rは各々独立して Hである力、あるいは置換されていてもよい、 C ァ

1-4 1-4 1-4

2-5 2-5 3-8 6-10 7- 1 ァラルキル力なる群より選択される]

0

で表されるヌクレオシド類縁体を含む、オリゴヌクレオチド類縁体。

[2] R〜Rがすべて Hである、請求項 1記載のオリゴヌクレオチド類縁体。

1 4

[3] 式 (I)のピリジン環の窒素がォキシドを形成して、る、請求項 1または 2記載のオリゴヌクレオチド類縁体。

[4] 試料中の標的二重鎖 DNA配列を検出する方法であって、

(a)請求項 1 3の、ずれ力 1項記載のオリゴヌクレオチド類縁体を試料と接触させ、次に、

(b)該オリゴヌクレオチドが三重鎖を形成するかを調べる、

を特徴とし、

[5] 請求項 1 3の、ずれか 1項記載のオリゴヌクレオチド類縁体を標的二重鎖 DNAと結合させることを特徴とする、三重鎖形成方法。

[6] 請求項 1 3の、ずれか 1項記載のオリゴヌクレオチド類縁体を含む、医薬組成物。

[7] 請求項 1― 3の、ずれか 1項記載のオリゴヌクレオチド類縁体を必須構成成分として含む、標的二重鎖 DNA配列を検出するためのキット。

[8] 医薬組成物の製造のための請求項 1 3の、ずれか 1項記載のオリゴヌクレオチド類縁体の使用。

[9] 請求項 1 3の、ずれか 1項記載のオリゴヌクレオチド類縁体を投与することを特徴とする、疾病の処置または予防方法。