TW201718617A - 人工核苷及人工核苷酸以及人工寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

提供以下述式(I)所表示之化合物及其鹽之人工核苷或人工核苷酸。式(I)中，Bx為嘧啶鹼基、硫酮基嘧啶鹼基或嘌呤鹼基，R1、R2、R3及R4為氫原子、C1-6烷基等，Z1及Z2為氫原子、羥基保護基、含磷基等。□

Description

人工核苷及人工核苷酸以及人工寡核苷酸
本發明係關於人工核苷及人工核苷酸以及人工寡核苷酸。
核酸醫藥係由形成與標的DNA或RNA互補的鹼基對之核酸(寡核苷酸)所構成的醫藥品，期待作為新穎的醫藥品。而，作為核酸醫藥使用的核酸單位，開發著改變天然型之核酸的構造的種種之人工核酸單位(人工核苷或其磷酸加成物之人工核苷酸)。例如S-OLIGO(硫代修飾)為核苷酸的磷酸基的氧原子取代為硫原子的化合物(Phosphorothioate)，期待應用於對巨細胞病毒之反意核酸藥物。又，2’,4’-BNA或2’,4’-LNA(以下、一併稱為「2’,4’-BNA/LNA」)為核酸單位的糖部分之2’位與4’位交聯的化合物的總稱，已知對標的核酸有高親和性(例如國際公開第98/39352號作為參考)。進一步，報告有於2’,4’-BNA之交聯構造導入醯胺鍵的醯胺型核酸衍生物(以下、記載為AmNA)(例如國際公開第2011/052436號作為參考)。該AmNA與2’,4’-BNA/LNA比較時，維持對核酸 鏈之親和性，且提升對核酸酶之耐性。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第98/39352號
[專利文獻2]國際公開第2011/052436號
但是已知S-OLIGO(硫代修飾)對標的核酸鏈之鍵結親和性難謂充分，在治療效果點上有問題。又，含有2’,4’-BNA/LNA的人工核酸如前述，對標的核酸鏈之親和性高，但對生體內存在之分解酵素的核酸酶之耐性不足，作為醫藥品的安定性點上有問題。進一步，關於含有AmNA的人工核酸，對核酸酶之耐性亦難謂充足，進而追求新構造的人工核酸。
本發明之目的在於提供核酸酶耐性優異的人工寡核苷酸以及可構成此之人工核苷及人工核苷酸。
本發明者們發現於2’,4’-BNA/LNA之交聯構造導入硫代醯胺鍵的化合物，可高度兼具對標的核酸的鍵結親和性與核酸酶耐性，完成本發明。即本發明包含以下態樣。
1.下述式(I)：
(式中，R1為氫原子或胺基保護基，Bx為嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基或2-硫酮基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基及2-硫酮基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)，Z1及Z2各自獨立，為氫原子、羥基保護基或含磷基，R2及R3各自獨立，為氫原子、鹵素原子、氰基、C1-6烷基或C2-6烯基(該C1-6烷基及C2-6烯基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷氧基及氰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)，R4為氫原子、鹵素原子、氰基或C1-6烷基。)所表示之化合物或其鹽。
2. Bx為嘌呤-9-基或2-側氧基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基及2-側氧基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代) 的1.記載之化合物或其鹽。
3. Bx為6-胺基嘌呤-9-基、2-胺基-6-羥基嘌呤-9-基、2-側氧基-4-胺基-1,2-二氫嘧啶-1-基、2-側氧基-4-胺基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基、2-側氧基-4-羥基-1,2-二氫嘧啶-1-基或2-側氧基-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基的1.或2.記載之化合物或其鹽。
4. R1為氫原子、C1-3烷基、乙醯基、苄基、tert-丁氧基羰基或苄基氧基羰基的1.~3.中任一項記載之化合物或其鹽。
5. R4為氫原子的1.~4.中任一項記載之化合物或其鹽。
6. R2及R3為氫原子的1.~5.中任一項記載之化合物或其鹽。
7. R1為甲基的1.~6.中任一項記載之化合物或其鹽。
8. Z1為氫原子或羥基保護基的1.~7.中任一項記載之化合物或其鹽。
9.羥基保護基為乙醯基、tert-丁基、tert-丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基矽烷基乙基、p-氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲醯基、p-苯基苯甲醯基、2,6-二氯苄基、乙醯丙醯基(levulinoyl)、二苯基甲基、p-硝基苄基、三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、tert-丁基二甲基矽烷基、tert-丁基二苯基矽烷基、三苯基矽烷基、三異丙基矽烷基、甲酸苯甲醯基、氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯 基、三甲基乙醯基、異丁醯基、9-芴基甲基氧基羰基、甲磺醯基、p-甲苯磺醯基、三氟甲磺醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基呫噸-9-基或9-(p-甲氧基苯基)呫噸-9-基的1.~8.中任一記載之化合物或其鹽。
10. Z2為氫原子或含磷基的1.~9.中任一項記載之化合物或其鹽。
11. Z2為氫原子、氰基乙氧基(二異丙基胺基)膦基或羥基氧膦基的1.~10.中任一項記載之化合物或其鹽。
12. Z2為羥基保護基的1.~9.中任一項記載之化合物或其鹽。
13.含有一個以上以下述式(II)：
(式中，R1為氫原子或胺基保護基，Bx為嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基或2-硫酮基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基及2-硫酮基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)，R2及R3各自獨立，為氫原子、鹵素 原子、氰基、C1-6烷基或C2-6烯基(該C1-6烷基及C2-6烯基為無取代或被鹵素原子、C1-6烷氧基及氰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)，R4為氫原子、鹵素原子、氰基或C1-6烷基。)所表示之核苷構造的寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽。
14. Bx為嘌呤-9-基或2-側氧基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基及2-側氧基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)的13.記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽。
15. Bx為6-胺基嘌呤-9-基、2-胺基-6-羥基嘌呤-9-基、2-側氧基-4-胺基-1,2-二氫嘧啶-1-基、2-側氧基-4-胺基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基、2-側氧基-4-羥基-1,2-二氫嘧啶-1-基或2-側氧基-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基的13.或14.記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽。
16. R1為氫原子、C1-3烷基、乙醯基、苄基、tert-丁氧基羰基或苄基氧基羰基的13.~15.中任一項記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽。
17. R4為氫原子的13.~16.中任一項記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽。
18. R2及R3為氫原子的13.~17.中任一項記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽。
19. R1為甲基的13.~18.中任一項記載之寡核苷酸、或 其製藥上所容許的鹽。
根據本發明，提供核酸酶耐性優異的人工寡核苷酸及可構成此之人工核苷及人工核苷酸。
[圖1]表示本實施形態之人工寡核苷酸的核酸外切酶耐性之圖。
[實施發明之最佳形態]
本說明書中使用的用語，除了特別說明之情形外，使用該領域通常使用的意思。以下說明本說明書中所使用的各用語。又，本說明書中各用語單獨使用或與其他用語一起使用時，在無特別記載下，具有相同意義。
本說明書中「n-」為正、「i-」為異、「sec-」為第二、「tert-」為第三、「m-」為間、「p-」為對。「Ph」為苯基、「Me」為甲基、「Pr」為丙基、「Bu」為丁基。
又，本說明書中「2-側氧基-嘧啶-1-基」及「2-硫酮基-嘧啶-1-基」係指各自省略「2-側氧基-1H-嘧啶-1-基」及「2-硫酮基-1H-嘧啶-1-基」之「1H」的記載者，「2-側 氧基-1,2-二氫嘧啶-1-基」及「2-硫酮基-1,2-二氫嘧啶-1-基」、以及「1H-嘧啶-2-酮-1-基」及「1H-嘧啶-2-硫酮-1-基」各自同義。進一步，此等的部分構造存在互變異構物時，以其中1個名稱代表全部的互變異構物。
經保護基取代的官能基係指官能基所具有之氫原子被保護基取代，而被保護的官能基。
「C2-9芳香族雜環」係指環內具有1個以上任意選自氧原子、硫原子及氮原子的相同或相異的雜原子，且構成環的碳原子數為2~9的芳香族的單環或縮合環，例如嘌呤、嘧啶、噻吩、呋喃、異苯並呋喃、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、噠嗪、吲哚嗪、吲哚、異吲哚、異喹啉、喹啉、萘啶、喹喔啉、喹唑啉及蝶啶等。
「C6-10芳香族碳環」係指構成環的原子全部為碳原子，且構成環的原子數為6~10之芳香族的單環或縮合環，例如苯及萘等。
「C2-9芳香族雜環式基」係指由前述「C2-9芳香族雜環」，除去1個任意位置之氫原子的1價取代基，可舉例如吡啶基、吡咯基、喹啉基、吲哚基、咪唑基、呋喃基及噻吩基等。
「C6-10芳香族碳環式基」係指由前述「C6-10芳香族碳環」，除去1個任意位置之氫原子的1價取代基，例如苯基及萘基等。
「鹵素原子」係指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
「C1-3烷基」係指碳數為1~3之直鏈或分枝狀的飽和的烴基，例如甲基、乙基、n-丙基、異丙基。
「C1-6烷基」係指碳數為1~6之直鏈或分枝狀的飽和的烴基，例如甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、異戊基、新戊基、n-己基及異己基等。
「C1-18烷基」係指碳數為1~18之直鏈或分枝狀的烴基，例如甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、異戊基、新戊基、n-己基、n-庚基、n-辛基、n-壬基、n-癸基、n-十一基、n-十二基、n-十八基等。
「C2-6烯基」係指任意位置具有1個以上之雙鍵的碳數為2~6之直鏈或分枝狀的烴基，例如乙烯基、烯丙基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、異丁烯基、異戊二烯基、丁二烯基、戊烯基、異戊烯基、戊二烯基、己烯基、異己烯基及己二烯基等。
「C2-18烯基」係指任意位置具有1個以上之雙鍵的碳數為2~18之直鏈或分枝狀的烴基，例如乙烯基、烯丙基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、異丁烯基、異戊二烯基、丁二烯基、戊烯基、異戊烯基、戊二烯基、己烯基、異己烯基、己二烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一烯基、十二烯基及十八烯基等。
「C1-6烷氧基」係指前述「C1-6烷基」鍵結於氧基的基。例如甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、異丙氧 基、n-丁氧基、tert-丁氧基、異丁氧基、sec-丁氧基、n-戊基氧基、異戊基氧基及n-己基氧基等。
「C2-6烯基氧基」係指前述「C2-6烯基」鍵結於氧基的基。例如乙烯基氧基、烯丙基氧基、丙烯基氧基、異丙烯基氧基、丁烯氧基、異丁烯氧基、異戊二烯氧基、丁二烯基氧基、戊烯氧基、異戊烯氧基、戊二烯基氧基、己烯基氧基、異己烯基氧基及己二烯氧基等。
「C1-6烷氧基羰基」係指前述「C1-6烷氧基」鍵結於羰基的基。例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、n-丙氧基羰基、異丙氧基羰基、n-丁氧基羰基、tert-丁氧基羰基、異丁氧基羰基、sec-丁氧基羰基、戊基氧基羰基、異戊基氧基羰基及n-己基氧基羰基等。
「C2-6烯基氧基羰基」係指前述「C2-6烯基氧基」鍵結於羰基的基。例如乙烯基氧基羰基、烯丙基氧基羰基、丙烯基氧基羰基、異丙烯基氧基羰基、丁烯氧基羰基、異丁烯氧基羰基、異戊二烯氧基羰基、丁二烯基氧基羰基、戊烯氧基羰基、異戊烯氧基羰基、戊二烯基氧基羰基、己烯基氧基羰基、異己烯基氧基羰基及己二烯氧基羰基等。
「C1-6烷基羰基」係指前述「C1-6烷基」鍵結於羰基的基。例如乙醯基、乙基羰基、n-丙基羰基、異丙基羰基、n-丁基羰基、tert-丁基羰基、異丁基羰基、sec-丁基羰基、戊基羰基、異戊基羰基及n-己基羰基等。
「C1-6鹵烷基」係指以1個以上之前述「鹵 素原子」取代前述「C1-6烷基」任意位置的氫原子而成的基。例如單氟甲基、單氟乙基、單氟丙基、2,2,3,3,3-五氟丙基、單氯甲基、三氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、2,2,2-三氯乙基、1,2-二溴乙基及1,1,1-三氟丙烷-2-基等。
「C1-6烷基胺基」包含C1-6單烷基胺基及C1-6二烷基胺基。「C1-6單烷基胺基」係指1個前述「C1-6烷基」鍵結於胺基的基。例如甲基胺基、乙基胺基及異丙基胺基等。「C1-6二烷基胺基」係指2個前述「C1-6烷基」鍵結於胺基的基。2個的烷基可為相同或相異。例如二甲基胺基、二乙基胺基、N,N-二異丙基胺基、N-甲基-N-乙基胺基及N-異丙基-N-乙基胺基等。
「C1-6烷基胺基羰基」為前述「C1-6烷基胺基」鍵結於羰基的基。
「C1-6烷基羰基氧基」為前述「C1-6烷基羰基」鍵結於氧基的基。
「C1-6烷基羰基胺基」為前述「C1-6烷基羰基」鍵結於胺基的基。
「C1-6烷氧基羰基胺基」為前述「C1-6烷氧基羰基」鍵結於胺基的基。
「羥基保護基」為核酸合成時可安定保護羥基之保護基，則不特別限制。具體上，為在酸性或中性條件下安定，且可藉由加氫分解、水解、電分解及光分解之化學方法開裂之保護基。作為羥基保護基，例如C1-6烷 基及C2-6烯基(C1-6烷基及C2-6烯基為無取代、或被由鹵素原子、C1-6烷氧基(C1-6烷氧基為無取代、或被選自下述取代基群A之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)、C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基(C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基為無取代、或被選自下述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)、及矽烷基所構成群選出的單獨或者相異的1~3的取代基取代。在此被2個以上之取代基取代時，2個以上之取代基可相互透過單鍵、氧原子鍵結)、甲醯基、脂肪族醯基、芳香族醯基、矽烷基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、四氫呋喃基、四氫硫代呋喃基、C6-10芳香族碳環式基、C2-9芳香族雜環式基(四氫吡喃基、四氫噻喃基、四氫呋喃基、四氫硫代呋喃基、C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基為無取代、或被選自下述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)、C1-6烷氧基羰基(C1-6烷氧基羰基為無取代、或被鹵素原子或三烷基矽烷基取代)、C2-6烯基氧基羰基、芳烷基氧基羰基(芳烷基氧基羰基為無取代、或被選自下述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代芳香族碳環)、脂肪族磺醯基、芳香族磺醯基以及被C6-10芳基氧基取代的C1-6烷基羰基。
在此，取代基群A為由鹵素原子、C1-6烷氧基、C2-6烯基氧基、氰基、硝基、羧基、胺甲醯基、胺基、羥基、C1-6烷基胺基、C1-6烷氧基羰基、C2-6烯基 氧基羰基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基胺基羰基、C1-6烷基羰基氧基、C1-6烷基羰基胺基、C1-6烷氧基羰基胺基及C6-10芳香族碳環式基所構成的取代基群。
在此取代基群B為由鹵素原子、C1-6烷基、C1-6鹵烷基、C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6烯基氧基、氰基、硝基、羧基、胺甲醯基、胺基、羥基、C1-6烷基胺基、C1-6烷氧基羰基、C2-6烯基氧基羰基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基胺基羰基、C1-6烷基羰基氧基、C1-6烷基羰基胺基、C1-6烷氧基羰基胺基及C6-10芳香族碳環式基所構成的取代基群。
又C6-10芳基氧基係指「C6-10芳香族碳環式基」鍵結於氧基的基。
脂肪族醯基係指前述C1-18烷基或C2-18烯基(C1-18烷基及C2-18烯基為無取代、或被選自前述取代基群A之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)鍵結於羰基的基，例如乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、三甲基乙醯基、戊醯基、異戊醯基、辛醯基、壬醯基、癸醯基、3-甲基壬醯基、8-甲基壬醯基、3-乙基辛醯基、3,7-二甲基辛醯基、十一醯基、十二醯基、十三醯基、十四醯基、十五醯基、十六醯基、1-甲基十五醯基、14-甲基十五醯基、13,13-二甲基十四醯基、十七醯基、15-甲基十六醯基、十八醯基、琥珀醯基、戊二醯基、己二醯基、氯乙醯基、二氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、甲氧基乙醯基、苄基羰基、(E)-2-甲基-2-丁烯醯基 等。
芳香族醯基係指C6-10芳香族碳環式基或C2-9芳香族雜環式基(C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基為無取代、或被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)鍵結於羰基的1價取代基，例如苯甲醯基、α-萘甲醯基、β-萘甲醯基、2-溴苯甲醯基、4-氯苯甲醯基、2,4,6-三甲基苯甲醯基、4-甲苯甲醯基、4-茴香醯基、2-羧基苯甲醯基、3-羧基苯甲醯基、4-羧基苯甲醯基、4-硝基苯甲醯基、2-硝基苯甲醯基、2-(甲氧基羰基)苯甲醯基、4-苯基苯甲醯基、2-吡啶基羰基、4-甲氧基-2-吡啶基羰基、3-吡啶基羰基、4-吡啶基羰基、2-嘧啶基羰基、4-嘧啶基羰基、5-嘧啶基羰基、3-嘧啶基羰基、4-嘧啶基羰基等。
「矽烷基」係指於矽原子鍵結有由氫原子、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基所構成群選出的單獨或者相異的3個取代基的一價取代基，例如三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、異丙基二甲基矽烷基、tert-丁基二甲基矽烷基、甲基二異丙基矽烷基、甲基二-tert-丁基矽烷基、三異丙基矽烷基、二苯基甲基矽烷基、二苯基-tert-丁基矽烷基、二苯基異丙基矽烷基、苯基二異丙基矽烷基等。在此，矽烷基鍵結於具有2個以上之羥基的分子的1個羥基時，構成矽烷基的3個取代基中1個取代基可取代於其分子的另外羥基的氧原子。
四氫吡喃基方面，可舉例如四氫吡喃-2-基等。被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代的四氫吡喃基方面，可舉例如3-溴四氫吡喃-2-基、4-甲氧基四氫吡喃-4-基等。
四氫噻喃基方面，可舉例如四氫噻喃-2-基等。被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代的四氫噻喃基方面，可舉例如4-甲氧基四氫噻喃-4-基等。
四氫呋喃基方面，可舉例如四氫呋喃-2-基等。四氫硫代呋喃基方面，可舉例如四氫硫代呋喃-2-基等。
脂肪族磺醯基係指C1-18烷基或C2-18烯基(該C1-18烷基及C2-18烯基為無取代、或被選自前述取代基群A之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)鍵結於磺醯基的基，例如甲磺醯基、三氟甲磺醯基等。
芳香族磺醯基係指C6-10芳香族碳環式基或C2-9芳香族雜環式基(該C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基為無取代或被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)鍵結於磺醯基的1價取代基，例如苯磺醯基、p-甲苯磺醯基等。
被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基所包含的C1-6烷氧基甲基方面，可舉例如甲氧基甲基、1,1-二甲基-1-甲氧基甲基、乙氧基甲基、n-丙氧基甲基、異丙氧基甲基、丁氧基甲基、tert-丁氧基甲基等。
C1-6烷氧基烷基氧基甲基係指被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基所取代的甲基，被C1-6烷氧基取代的C1-6烷氧基所取代的C1-6烷基所包含的C1-6烷氧基烷基氧基甲基方面，可舉例如2-甲氧基乙氧基甲基等。
經鹵素原子取代的被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基所包含的C1-6鹵烷基氧基甲基方面，可舉例如2,2,2-三氯乙氧基甲基、雙(2-氯乙氧基)甲基等。
被C1-6烷氧基取代的C1-6烷基所包含的C1-6烷氧基乙基方面，可舉例如1-乙氧基乙基、1-(異丙氧基)乙基等。
被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代的芳香族碳環式基方面，可舉例如4-氯苯基、2-氟苯基、4-甲氧基苯基、4-硝基苯基及2,4-二硝基苯基等。
被鹵素原子或三烷基矽烷基取代的C1-6烷氧基羰基方面，可舉例如2,2,2-三氯乙氧基羰基、2-三甲基矽烷基乙氧基羰基等。
芳烷基氧基羰基係指C6-10芳香族碳環式基或C2-9芳香族雜環式基鍵結於C1-6烷氧基羰基的烷基部分的1價取代基。
無取代、或被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代芳香族碳環的芳烷基氧基羰基方面，可舉例如苄基氧基羰基、4-甲氧基苄基氧基羰基、3,4-二甲氧基苄基氧基羰基、2-硝基苄基氧基羰基及4-硝 基苄基氧基羰基等。
Bx中之較佳羥基保護基，可舉例如C1-6烷基及C2-6烯基(該C1-6烷基及C2-6烯基為無取代、或被1~3個C6-10芳香族碳環式基(該C6-10芳香族碳環式基為無取代或被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)取代)、四氫吡喃基、脂肪族醯基、芳香族醯基、矽烷基以及C6-10芳香族碳環式基(該C6-10芳香族碳環式基被鹵素原子、C1-6烷氧基及硝基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)。進一步，較佳羥基保護基，可舉例如C1-6烷基(該C1-6烷基為無取代、或被1~3個C6-10芳香族碳環式基(該C6-10芳香族碳環式基為無取代或被由甲氧基及硝基獨立選出的1個以上之取代基取代)取代)、脂肪族醯基、芳香族醯基及矽烷基，尤佳的羥基保護基，可舉例如苯甲醯基及苄基。
「巰基保護基」為核酸合成時可安定保護巰基之保護基，則不特別限制。具體上，為在酸性或中性條件安定，且可藉由加氫分解、水解、電分解及光分解之化學方法開裂的保護基。
例如除前述作為「羥基保護基」列舉者外，亦包含形成二硫化物鍵的基。形成二硫化物鍵的基方面，可舉例如烷基硫基(甲硫基、乙基硫基、tert-丁基硫基)及經芳香族碳環式基取代的硫基(苄基硫等)等。
較佳巰基保護基為脂肪族醯基或芳香族醯基。更佳為 苯甲醯基。
「胺基保護基」為核酸合成時可安定保護胺基之保護基，則不特別限制。具體上，為在酸性或中性條件安定，且可藉由加氫分解、水解、電分解及光分解之化學方法開裂的保護基。
例如作為前述「羥基保護基」之保護基列舉者。
Bx中之胺基保護基，較佳為C1-6烷基、脂肪族醯基、芳香族醯基或被C6-10芳基氧基取代的C1-6烷基羰基，更佳為脂肪族醯基、芳香族醯基或被C6-10芳基氧基取代的C1-6烷基羰基，更較佳為異丁醯基、乙醯基、苯甲醯基或苯氧基乙醯基，尤佳為苯甲醯基。
本發明中之「羥基保護基」、「巰基保護基」及「胺基保護基」的導入及脫保護，可參考該業者熟知的Protective Groups in Organic Synthesis,Fourth edition、T.W.Greene著、John Wiley & Sons Inc.(2006年)等。
[人工核苷及人工核苷酸]
本實施形態的人工核苷及人工核苷酸為以下述式(I)所表示之化合物或其鹽。藉由糖部分之2’與4’間具有硫代醯胺交聯構造，可構成與對應Bx之核酸鹼基的鍵結親和性優異、核酸酶耐性優異的寡核苷酸。
R1為氫原子或胺基保護基。
Bx為嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基或2-硫酮基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基及2-硫酮基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)。
Z1及Z2各自獨立，為氫原子、羥基保護基或含磷基。
R2及R3各自獨立，為氫原子、鹵素原子、氰基、C1-6烷基或C2-6烯基(該C1-6烷基及C2-6烯基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷氧基及氰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)。
R4為氫原子、鹵素原子、氰基或C1-6烷基。
又，本實施形態中之人工核苷係指式(I)所表示之化合物中，Z1及Z2為氫原子的化合物，人工核苷酸係指式(I)所表示之化合物中，Z1及Z2的至少一者為含磷基的化合物。
R1中之胺基保護基方面，可舉例如前述「胺 基保護基」。例如C1-6烷基、C2-6烯基、甲醯基、脂肪族醯基、芳香族醯基、矽烷基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、四氫呋喃基、四氫硫代呋喃基、C1-6烷氧基甲基、C1-6烷氧基烷基氧基甲基、C1-6鹵烷基氧基甲基、C1-6烷氧基乙基、C1-6鹵烷基、C6-10芳香族碳環式基、C2-9芳香族雜環式基、C1-6烷氧基羰基、C2-6烯基氧基羰基、芳烷基氧基羰基、被C6-10芳基氧基取代的C1-6烷基羰基。
在此，C1-6烷基及C2-6烯基，可無取代、或被由C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基所構成群選出的單獨或者相異的1~3個取代基取代。四氫吡喃基、四氫噻喃基、四氫呋喃基、四氫硫代呋喃基、C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基可無取代、或被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代。C1-6烷氧基羰基可無取代、或被鹵素原子或三烷基矽烷基取代。芳烷基氧基羰基的芳香族碳環可無取代、或被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代。
較佳為R1中之胺基保護基為由C1-6烷基、C6-10芳香族碳環式基、脂肪族醯基、芳香族醯基、C1-6烷氧基羰基及C2-6烯基氧基羰基所構成群組中選出的至少1種。
R1較佳為氫原子、C1-3烷基、苯基、苄基、乙醯基、苯甲醯基、甲氧基羰基、烯丙基氧基羰基、tert- 丁氧基羰基或苄基氧基羰基，更佳為氫原子、C1-3烷基、乙醯基、苄基、tert-丁氧基羰基或苄基氧基羰基，更較佳為氫原子或C1-3烷基，尤佳為甲基。
Bx為嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基或2-硫酮基-嘧啶-1-基。嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基及2-硫酮基-嘧啶-1-基可無取代、或被由鹵素原子、C1-6烷基、胺基、羥基及巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代。在此胺基可無取代、或被胺基保護基取代。又羥基可無取代、或被羥基保護基取代。巰基可無取代、或被巰基保護基取代。
嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基及2-硫酮基-嘧啶-1-基，為構成人工核苷之鹼基部分的取代或者非取代的雜環式基，係指含核酸鹼基的殘基或其類似物的取代基。天然的核酸鹼基方面，可舉例如腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。核酸鹼基不限於彼等，可包含其他人工或天然的核酸鹼基。例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤等。
具體例，可舉例如以下。
Ra為氫原子或胺基保護基，Rb為氫原子或胺基保護基。
Ra中之胺基保護基的較佳形態、Rb中之胺基保護基的較佳形態，與前述Bx中之胺基保護基相同。
Ra較佳為氫原子、異丁醯基、乙醯基、苯甲醯基、苯氧基乙醯基，尤佳為氫原子。Rb較佳為氫原子、異丁醯基、乙醯基、苯甲醯基、苯氧基乙醯基，尤佳為氫原子。
Bx較佳為嘌呤-9-基或2-側氧基-嘧啶-1-基。嘌呤-9-基及2-側氧基-嘧啶-1-基可無取代、或被由鹵素原子、C1-6烷基、胺基、羥基及巰基所構成群選出的單獨 或者相異的1個以上之取代基取代。在此胺基可無取代、或被胺基保護基取代。又羥基可無取代、或被羥基保護基取代。巰基可無取代、或被巰基保護基取代。
具體例，可舉例如以下。
Ra及Rb之較佳形態同前述。
Bx較佳為6-胺基嘌呤-9-基(腺嘌呤殘基；III-5中Rb=H)、2-胺基-6-羥基嘌呤-9-基(鳥嘌呤殘基；III-6中Rb=H)、2-側氧基-4-胺基-1,2-二氫嘧啶-1-基(胞嘧啶殘基；III-4中Ra=H)、2-側氧基-4-胺基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基(5-甲基胞嘧啶殘基；III-3中Ra=H)、2-側氧基-4-羥基-1,2-二氫嘧啶-1-基(尿嘧啶殘基；III-2)及2-側氧基- 4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基(胸腺嘧啶殘基；III-1)所構成群組中選出的至少1種，更佳為6-胺基嘌呤-9-基、2-胺基-6-羥基嘌呤-9-基、2-側氧基-4-胺基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基及2-側氧基-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基所構成群組中選出的至少1種。
作為其他態樣，Bx更佳為2-側氧基-4-羥基-1,2-二氫嘧啶-1-基或2-側氧基-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基，尤佳為2-側氧基-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基。
Z1及Z2各自獨立，為氫原子、羥基保護基或含磷基。
Z1及Z2中之羥基保護基方面，可舉例如前述「核酸合成時可安定保護羥基之保護基」的羥基保護基。較佳為C1-6烷基、C2-6烯基、脂肪族醯基、芳香族醯基、四氫吡喃基、矽烷基、脂肪族磺醯基、芳香族磺醯基等。在此，C1-6烷基及C2-6烯基為無取代、或被由鹵素原子、C1-6烷氧基(C1-6烷氧基為無取代、或被選自前述取代基群A之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)、C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基(C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基為無取代、或被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)所構成群選出的單獨或者相異的1~3個取代基取代。又，Z1為矽烷基時，構成矽烷基的1個取代基可取代於3’位的氧原子，Z2為矽烷基時，構成矽烷基的1個取代基可取代於5’位的氧原子。
Z1及Z2中之羥基保護基，更佳為C1-6烷基、四氫吡喃基、脂肪族醯基、芳香族醯基或矽烷基。在此，C1-6烷基為無取代、或被由鹵素、C1-6烷氧基及C6-10芳香族碳環式基(C6-10芳香族碳環式基為無取代、或被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)所構成群選出的單獨或者相異的1~3個取代基取代。
Z1及Z2中之羥基保護基，更較佳為C1-6烷基或矽烷基。在此，C1-6烷基，可被由C6-10芳香族碳環式基(C6-10芳香族碳環式基為無取代、或被選自前述取代基群B之單獨或者相異的1個以上之取代基取代)所構成群選出的單獨或者相異的1~3個取代基取代。
Z2中之羥基保護基方面，矽烷基又更佳。
Z1及Z2中之含磷基係指含磷原子的基，為形成磷酸二酯構造或硫代磷酸酯構造包含的核苷間鍵結用的基。Z1及Z2中之含磷基方面，可使用該領域習知之含磷基，例如來自亞磷醯胺的基、來自H-磷酸酯的基、來自磷酸二酯的基、來自磷酸三酯的基等。
具體上，例如以下記載之式(Z2-1)~式(Z2-3)中任一所表示之基。
式(Z2-1)：-P(ORX1)(NRX2 2)
式中，RX1及RX2各自獨立，為C1-6烷基，該烷基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷氧基、氰基、C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代。
式(Z2-2)：-P(=RX3)(ORX4)2
式中，RX3為氧原子或硫原子，RX4各自獨立，為氫原子、羥基保護基、C1-6烷基、或C6-10芳香族碳環式基，該烷基為無取代、或被選自鹵素原子、C1-6烷氧基、氰基、C6-10芳香族碳環式基及C2-9芳香族雜環式基所構成的取代基群之單獨或者相異的1個以上之取代基取代，該芳香族碳環式基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷氧基、C1-6烷基及氰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代。
式(Z2-3)：-P(=RX5)H(ORX6)
式中，RX5為氧原子或硫原子。RX6為氫原子、羥基保護基、或芳香族碳環式基。
RX4及RX6中的「羥基保護基」，較佳為C1-6烷基、C1-6烯基、脂肪族醯基、芳香族醯基、被1~3個芳香族碳環式基所取代的甲基或芳香族碳環式基，該芳香族碳環式基可被選自鹵素原子、烷氧基或硝基之單獨或者相異的取代基取代。更佳保護基為苯甲醯基、苄基、2-氯苯基、4-氯苯基或2-丙烯基。
含磷基，較佳為式(Z2-4)~式(Z2-6)所表示之基任一所表示之基。
式(Z2-4)：-P(ORX1)(NRX2 2)
式中，RX1為C1-6烷基或氰基所取代的C1-6烷基，RX2為C1-6烷基。
式(Z2-5)：-P(=O)(OH)2
式(Z2-6)：-P(=O)H(OH)
含磷基更佳為氰基乙氧基(二異丙基胺基)膦基(式：-P(OC2H4CN)(N(i-Pr)2)所表示之基)或羥基氧膦基(式：-P(=O)H(OH)所表示之基)。
Z1，較佳為氫原子或羥基保護基。Z1為羥基保護基時，設定該羥基保護基被脫保護，用於本實施形態的人工寡核苷酸之製造。因此，羥基保護基為核酸合成時可安定保護羥基者，則不特別限制，保護基的種類、構造在各自的人工核苷酸及人工核苷中可為相同或相異。Z1更佳為氫原子、乙醯基、tert-丁基、tert-丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基矽烷基乙基、p-氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲醯基、p-苯基苯甲醯基、2,6-二氯苄基、乙醯丙醯基(levulinoyl)、二苯基甲基、p-硝基苄基、三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、tert-丁基二甲基矽烷基、tert-丁基二苯基矽烷基、三苯基矽烷基、三異丙基矽烷基、甲酸苯甲醯基、氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、三甲基乙醯基、異丁醯基、9-芴基甲基氧基羰基、甲磺醯基、p-甲苯磺醯基、三氟甲磺醯基、三苯基甲基(三苯甲基)、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMTr基)、三甲氧基三苯甲基、9-苯基呫噸-9-基(Pixyl基)或9-(p-甲氧基苯基) 呫噸-9-基(MOX基)。Z1更較佳為氫原子、苄基、三乙基矽烷基、tert-丁基二甲基矽烷基、tert-丁基二苯基矽烷基、三異丙基矽烷基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基，尤佳為氫原子、tert-丁基二甲基矽烷基或三苯甲基。
Z2，較佳為氫原子或含磷基，更佳為氫原子、式：-P(OC2H4CN)(N(i-Pr)2)所表示之基或式：-P(=O)H(OH)所表示之基。
作為其他樣態，製造上述式(I)所表示之化合物或其鹽的過程中，作為其中間體，以Z2為羥基保護基為佳。因此，羥基保護基為核酸合成時可安定保護羥基者，則不特別限制，保護基的種類、構造在各自的人工核苷酸及人工核苷中可為相同或相異。Z2為羥基保護基時，該羥基保護基，較佳為乙醯基、tert-丁基、tert-丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基矽烷基乙基、苄基、苯甲醯基、p-苯基苯甲醯基、2,6-二氯苄基、乙醯丙醯基(levulinoyl)、二苯基甲基、p-硝基苄基、三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、tert-丁基二甲基矽烷基、tert-丁基二苯基矽烷基、三苯基矽烷基、三異丙基矽烷基、甲酸苯甲醯基、氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、三甲基乙醯基、異丁醯基、9-芴基甲基氧基羰基、甲磺醯基、p-甲苯磺醯基或三氟甲磺醯基。該羥基保護基更佳為三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、tert-丁基二甲基矽烷基、tert-丁基二苯基矽烷基、三苯基矽烷 基或三異丙基矽烷基，尤佳為tert-丁基二甲基矽烷基。
R2及R3各自獨立，為氫原子、鹵素原子、氰基、C1-6烷基或C2-6烯基。在此C1-6烷基及C2-6烯基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷氧基及氰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代。
R2，較佳為氫原子、C1-3烷基，更佳為氫原子。R3，較佳為氫原子、C1-3烷基，更佳為氫原子。
R4為氫原子、鹵素原子、氰基或C1-6烷基。R4，較佳為氫原子、鹵素原子、氰基或C1-3烷基，更佳為氫原子。
式(I)所表示之化合物有存在異構物之情形。此時，本實施形態的化合物不限定為特定異構物，而包含全部可能的異構物(例如酮-烯醇異構物、亞胺-烯胺異構物、非對映異構物、光學異構物、旋轉異構物等)、消旋體及彼等的混合物。
式(I)所表示之化合物的1個以上之氫原子、碳原子及/或其他原子，各自可被氫原子、碳原子及/或其他原子的同位體取代。如此之同位體的例子，各自可舉例如2H、3H、11C、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F、123I及36Cl，同位體中包含氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘及氯。式(I)所表示之化合物亦包含被如此的同位體取代的化合物。以該同位體取代的化合物亦可用作為醫藥品，且包含式(I)所表示之化合物的全部的放射性標識體。又製造該「放射性標識體」用的「放射性標識化 方法」亦包含於本發明，可用作為代謝藥物動態研究、結合分析中之研究及/或診斷工具。
式(I)所表示之化合物的放射性標識體，可以該技術領域習知的方法調製。例如式(I)所表示之化合物的氚標識化合物，可藉由例如使用氚的觸媒的脫鹵素化反應，於式(I)所表示之特定化合物導入氚來調製。該方法，包含在適當觸媒、例如Pd/C之存在下、鹼的存在下或不存在下，使式(I)所表示之化合物適當經鹵素取代的前驅物與氚氣體進行反應。作為其他調製氚標識化合物用的適當方法方面，可參考文獻Isotopes in the Physical and Biomedical Sciences,Vol.1,Labeled Compounds(Part A),Chapter 6(1987年)。又，14C-標識化合物可藉由使用具有14C碳之原料來調製。
本發明含有式(I)所表示之化合物的可生成的鹽。該鹽方面，例如鹼金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等)、鹼土類金屬鹽(例如鈣鹽、鎂鹽等)、其他金屬鹽(例如鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等)、銨鹽、胺鹽(例如tert-辛基胺鹽、二苄基胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌嗪鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽等)、無機酸鹽(例如氟化氫酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、碘化氫酸鹽等之鹵素原子化氫酸 鹽、硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)、烷基磺酸鹽(例如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙烷磺酸鹽等)、芳基磺酸鹽(例如苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽等)、有機酸鹽(例如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等)、胺基酸鹽(例如甘胺酸鹽、賴胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天門冬胺酸鹽等)等。此等的鹽，可藉由通常進行的方法形成。
本發明之式(I)所表示之化合物或其鹽，有形成溶劑合物(例如水合物等)及/或結晶多形之情形，本發明亦包含如此之各種溶劑合物及結晶多形。「溶劑合物」相對於式(I)所表示之化合物，可與任意數目的溶劑分子(例如水分子等)配位。藉由將式(I)所表示之化合物或其鹽放置於大氣中，而有吸收水分、附著吸附水之情形或形成水合物之情形。又，藉由將式(I)所表示之化合物或其鹽進行再結晶，而有形成彼等的結晶多形之情形。
本實施形態的人工核苷，包含例如式(I)中之Z1及Z2為氫原子之化合物。又，本實施形態的人工核苷酸，包含例如式(I)中之Z2為含磷基之化合物。
[人工寡核苷酸]
本實施形態的人工寡核苷酸，為含有1個以上的下述式(II)所表示之核苷構造的寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽。
式中，R1為氫原子或胺基保護基。
Bx為嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基或2-硫酮基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基及2-硫酮基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)。
R2及R3各自獨立，為氫原子、鹵素原子、氰基、C1-6烷基或C2-6烯基(該C1-6烷基及C2-6烯基為無取代或被鹵素原子、C1-6烷氧基及氰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)。
R4為氫原子、鹵素原子、氰基或C1-6烷基。
式(II)中之R1~R4及Bx與式(I)中之R1~R4及Bx同義，較佳態樣亦相同。
本實施形態的人工寡核苷酸於任意位置至少含有1個式(II)所表示之核苷構造。構成人工寡核苷酸的鹼基數不特別限制，例如2~50鹼基、較佳為8~30鹼基、更佳為8~12鹼基。
人工寡核苷酸中之式(II)所表示之核苷構造的位置及 數目不特別限制，可因應目的適當設計。例如可於寡核苷酸的3’末端或5’末端含有式(II)所表示之核苷構造。包含於3’末端時，例如成為以下式(IV)所表示之構造。
式(IV)中之R1~R4、Z2及Bx與式(I)中之R1~R4、Z2及Bx同義。
又，包含於5’末端時，例如成為以下式(V)所表示之構造。
式(V)中之R1~R4、Z1及Bx與式(I)中之R1~R4、Z1及Bx同義。
本實施形態的人工寡核苷酸的3’末端及/或5’末端可被修飾。藉由末端被修飾，可追蹤寡核苷酸、可改 善寡核苷酸的藥物動態或藥力學、可使寡核苷酸的安定性或鍵結親和性提升。末端修飾基，可由該領域習知修飾基因應目的等適宜選擇使用。作為末端修飾基，例如羥基的保護基、報道分子來源的基、膽固醇來源的基、磷脂質來源的基、色素分子來源的基、螢光分子來源的基等。
在此「來源的基」係指由對象分子除去氫原子、羥基等所形成的基。
又，本實施形態的人工寡核苷酸的3’末端及/或5’末端可含有磷酸酯部分。「磷酸酯部分」為含有磷酸酯構造及修飾磷酸酯構造之末端磷酸基。磷酸酯部分可位於任一末端，但以5’末端為佳。
磷酸酯部分，具體上，為式：-O-P(=O)(OH)2所表示之基或其修飾基。該修飾基中，磷酸酯部分之-O-及=O的1個以上可被硫原子或-N(RX)-取代，OH的1個以上可被氫原子、-SH、-N(RX)2、或烷基取代。在此RX為氫原子或胺基保護基。5’及/或3’末端基各自獨立，可含有取代或非取代的1~3的磷酸酯部分。
本發明之人工寡核苷酸含有至少1個式(II)所表示之核苷構造，則其他部分可與天然的核酸相同、亦可具有該領域習知之核苷酸的修飾。
例如人工寡核苷酸的磷酸部分方面，可舉例如天然的核酸所具有之磷酸二酯鍵、經修飾之磷酸部分的硫代磷酸酯鍵(S-OLIGO(硫代修飾))、甲基磷酸酯鍵(M-OLIGO)、硼烷磷酸酯鍵等。
人工寡核苷酸中的式(II)所表示之核苷構造以外的鹼基部分，可為前述「Bx」定義的任意核酸鹼基。
人工寡核苷酸中的式(II)所表示之核苷構造以外的具有糖部分之核苷方面，可舉例如天然的核糖或者去氧核糖、具有習知修飾的核糖或者去氧核糖等。習知修飾方面，例如2’-O-甲基化、2’MOE(2’-O-CH2-CH2-O-CH3)化、2’-O-胺基丙基(AP)化、2’-氟化及2’-O-甲基胺甲醯基乙基(MCE)化等。可舉例如經4’-CH2-O-2’(LNA、Locked nucleic acid)、AmNA(醯胺BNA)(Bridged nucleic acid、WO2011/052436作為參考)等之修飾。
又，人工寡核苷酸所含有的核苷間的鍵結，為該領域之習知鍵結，則可為不具有磷原子的鍵結。核苷間的鍵結，包含例如烷烴二基、非芳香族碳環來源的2價基、鹵烷烴二基、經鹵素取代的非芳香族碳環來源的2價基等，但不限於此等。核苷間的鍵結，包含例如矽氧烷來源的2價基、硫化物基、亞碸基、磺基、乙醯基來源的2價基、甲酸乙醯基來源的2價基、硫代甲酸乙醯基來源的2價基、伸甲基甲酸乙醯基來源的2價基、硫代甲酸乙醯基來源的2價基、烯基來源的2價基、氨基磺酸來源的2價基、伸甲基亞胺基、伸甲基肼基、磺酸酯來源的2價基、磺醯胺基、醯胺基。
本實施形態的人工寡核苷酸有存在異構物之情形。該場合，本實施形態不限定為特定異構物，包含全部可能的異構物(例如酮-烯醇異構物、亞胺-烯胺異構物、 非對映異構物、光學異構物、旋轉異構物等)、消旋體及彼等的混合物。
人工寡核苷酸的1個以上之氫、碳及/或其他原子，可各自被氫、碳及/或其他原子的同位體取代。同位體的例子、調製方法等與前述人工核苷及人工核苷酸相同。
本實施形態的人工寡核苷酸含有其製藥上所容許的鹽。該鹽的具體例，與前述人工核苷及人工核苷酸中之鹽相同。
人工寡核苷酸或其製藥上所容許的鹽，有形成溶劑合物(例如水合物等)及/或結晶多形之情形，本發明亦包含如此之各種溶劑合物及結晶多形。溶劑合物的具體例，與前述人工核苷及人工核苷酸相同。
人工寡核苷酸或其製藥上所容許的鹽，有形成前驅藥之情形，本發明亦包含如此之各種的前驅藥。前驅藥為具有可化學或代謝分解之基的人工寡核苷酸的衍生物，為經溶劑分解或生理學的條件下在體內成為藥學活性的人工寡核苷酸之化合物。前驅藥包含生體內之生理條件下受到酵素氧化、還原、水解等，轉換為人工寡核苷酸之化合物、經胃酸等水解轉換為人工寡核苷酸之化合物等。選擇適當的前驅藥衍生物之方法及製造方法，例如Design of Prodrugs,Elsevier,Amsterdam 1985之記載。前驅藥有其本身具有活性之情形。
人工寡核苷酸或其製藥上所容許的鹽具有羥 基時，例如藉由具有羥基之化合物與適當的醯基鹵化物、適當的酸酐、適當的磺醯基氯化物、適當的磺醯基無水物及混合的無水物進行反應或者使用縮合劑進行反應而製造的醯基氧基衍生物或磺醯基氧基衍生物的前驅藥。例如CH3COO-、C2H5COO-、tert-BuCOO-、C15H31COO-、PhCOO-、(m-NaOOCPh)COO-、NaOOCCH2CH2COO-、CH3CH(NH2)COO-、CH3N(CH3)COO-、CH3SO3-、CH3CH2SO3-、CF3SO3-、CH2FSO3-、CF3CH2SO3-、p-CH3O-PhSO3-、PhSO3-、p-CH3PhSO3-。
人工寡核苷酸可藉由使用式(I)所表示之化合物，以常法合成。例如可藉由市售核酸自動合成裝置(例如AppliedBiosystems公司製、(股)Gene design公司製等)容易地合成。合成法有使用亞磷醯胺的固相合成法、使用氫磷酸酯的固相合成法等。揭示於例如Tetrahedron Letters 22,1859-1862(1981)、國際公開第2011/052436號等。
式(II)所表示之核苷構造中的Bx，Bx具有取代基時，以取代基未被保護基保護為佳。例如以下所表示之基。
因此，式(I)所表示之化合物中的Bx具有被保護基保護的取代基時，寡核苷酸合成時以進行脫保護為佳。
人工寡核苷酸顯示對單股RNA之優異的鍵結親和性與核酸酶耐性。因此，認為人工寡核苷酸在體內之持續性非常好。因此，本實施形態的式(I)所表示之化合物，作為合成反意義寡核苷酸等之核酸醫藥品用的材料非常有用。利用本實施形態的人工寡核苷酸的核酸醫藥品，與無修飾、即、天然的核酸來源的核酸醫藥品相比，對標的分子的親和性高、生體內不易被分解、更安定地發揮效果。人工寡核苷酸藉由製作成具有因應標的基因的表現抑制序列，例如可抑制標的基因表現。
利用人工寡核苷酸的核酸醫藥品可治療、預防、改善之疾病，不特別限制，例如代謝性疾病、循環器官疾病、腫瘤、感染症、眼疾病、發炎性疾病、自體免疫 疾病、遺傳性罕見疾病等、基因表現為原因之疾病等。更具體上，高膽固醇血症、高三甘油酯血症、脊髓性肌萎縮、裘馨氏肌肉萎縮症、肌強直性型肌萎症、亨廷頓氏病、阿茲海默症、TTR型澱粉樣變性病、家族性澱粉樣性心肌症、多發性硬化症、庫隆氏疾病、發炎性大腸疾病、末端肥大症、第2型糖尿病、慢性腎病、RS病毒感染症、伊波拉出血熱、馬爾堡病毒、HIV、流行性感冒、B型肝炎、C型肝炎、肝硬化、慢性心衰竭、心肌纖維化、心房顫動、前列腺癌、黑色素瘤、乳癌、胰臟癌、大腸癌、腎細胞癌、膽管癌、子宮頸癌、肝癌、肺癌、白血病、非何傑金氏淋巴瘤、異位性皮膚炎、青光眼、高齡性黃斑部病變症等。因應前述疾病種類，將該疾病原因之基因設定為前述標的基因，進一步，因應前述標的基因之序列，可適當設定前述表現抑制序列。
除了人等之靈長類，種種其他哺乳類之疾病可藉由利用人工寡核苷酸的核酸醫藥品治療、預防、改善。例如不僅限於此，可治療包含齧齒類(例如小鼠等)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、或貓等哺乳類之種種疾病。又，利用人工寡核苷酸的核酸醫藥品亦可用於鳥類(例如雞)等之其他種中。
利用人工寡核苷酸的核酸醫藥品期望用於局部或者全身的治療、預防、改善、或可因應欲治療、預防、改善之領域，以種種方法投與。投與方法方面，可為例如局部(包含點眼、陰道內、直腸內、鼻腔內、經皮)、 經口地、或非經口地。非經口地投與方面，例如靜脈內注射或者點滴、皮下、腹腔內或者肌肉內注入、吸引或者吸入之肺投與、硬膜下腔內投與、腦室內投與等。
使利用人工寡核苷酸的核酸醫藥品進行局部投與時，可使用經皮貼片、軟膏、洗劑、乳霜、膠體、滴下劑、塞劑、噴霧劑、液劑、散劑等之製劑。
經口投與用組成物方面，例如散劑、顆粒劑、溶於水或者非水性媒體之懸濁液或溶液、膠囊、粉末劑、錠劑等。
非經口、硬膜下腔、或腦室內投與用組成物方面，例如包含緩衝液、稀釋劑及其他適當的添加劑之無菌水溶液等。
利用人工寡核苷酸的核酸醫藥品，可因應必要於核酸的有效量混合適合於其劑型的賦形劑、黏合劑、溼潤劑、崩散劑、潤滑劑、稀釋劑等之各種醫藥用添加劑而得到。注射劑的場合，可與適當的載體一起進行滅菌處理作成製劑。
賦形劑，可舉例如乳糖、白糖、葡萄糖、澱粉、碳酸鈣、結晶纖維素等。黏合劑，可舉例如甲基纖維素、羧基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、明膠、聚乙烯基吡咯啶酮等。崩散劑，可舉例如羧基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉、澱粉、褐藻酸鈉、瓊脂末、月桂基硫酸鈉等。潤滑劑，可舉例如滑石、硬脂酸鎂、Macrogol等。塞劑的基劑，可使用可可脂、Macrogol、甲基纖維素等。 又，調製成液劑、乳化性或懸濁性的注射劑之情形，可適當添加通常使用的溶解補助劑、懸濁化劑、乳化劑、安定化劑、保存劑、等張劑等。經口投與之場合，可添加矯味劑、芳香劑等。
投與係依照被治療之病態的重度與反應度，治療療程持續數日到數個月、或者、到治癒為止、或至病狀減退為止。最佳投與日程可由生體中之藥劑累積的測定來計算。該領域該業者，可決定最佳用量、投與法、及、重複頻率。最佳用量因個別核酸醫藥品的相對效力而變動，但一般可基於體外及體內動物實驗中之IC50或EC50計算。例如得知核酸的分子量(由核酸配列及化學構造推導)、與例如IC50之有效果的用量(由實驗導出)，以mg/kg表示之用量可依據通例算出。
進一步，本發明之人工寡核苷酸，為了改善、或預防前述標的基因表現為原因之疾病等，可以改善、或預防之有效用量程度投與。
本實施形態之人工寡核苷酸等可藉由以下所示之方法製造，但下述製造方法為一般的製造方法之一例，並不限制本實施形態之人工寡核苷酸等之製造方法。
式中，P1、P2及P3為羥基保護基，Z2為含磷基，其他記號同前述定義。
步驟I之起始物質的化合物A，可依據例如國際公開第2011/052436號等記載之方法合成。具體上具有多樣R1、R2、R3、R4及Bx的化合物A，可由以下記載之化合物A-1，組合使用該業者所習知的保護．脫保護反應(例如前述Protective Groups in Organic Synthesis,Fourth edition記載之反應)、氧化反應、還原反應(氧化反應、還原反應可參考例如Comprehensive Organic Transformations,Second Edition、R.C.Larock著、Wiley-VCH(1999年)等)等來合成。Bx為2-硫酮基-嘧啶-1-基(該2-硫酮基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)之化合物A-1，可由Bx為對應之2-側氧基-嘧啶-1-基的化合物，依 據Chemical Communications、第48卷、7313頁(2012年)來合成。
式中，P1及P2各自獨立為羥基保護基。其他記號同前述定義。
例如為了合成R2及R3為烷基之化合物A，首先將化合物A-1的2’位的胺基(NH)以胺基保護基保護後，經羥基的保護．脫保護反應，得到3’位的羥基被保護而5’位的羥基脫保護的化合物(化合物A-2)。接著，將化合物A-2的5’位的羥基氧化，使用對應R2的烷基金屬試藥或格里那試劑等，可導入所期望之R2。又若有必要，可再度將5’位的羥基氧化，使用對應R3之烷基金屬試藥或格里那試劑等，導入所期望之R3。藉由將得到的化合物的3’位之被保護的羥基脫保護，可合成化合物A。又，替代使經還原的化合物的3’位的被保護的羥基進行脫保護之反應，藉由使5’位的羥基以羥基保護基保護，可合成化合物B。
具有所期望之Bx及R4的化合物A-1，可使用對應所期望之Bx之鹼基及具有所期望之R4的糖衍生物，依據國際公開第2011/052436號記載之方法等該業者習知 方法來合成。從化合物A-1至合成化合物A為止的反應部位，尤其與R1、R4及Bx空間上遠離，故由前述化合物A-1至合成化合物A為止的反應，可使用多種的R1、R4及Bx構造。
(步驟I)保護反應
藉由將化合物A之3’位與5’位的羥基經該業者習知的保護反應以羥基保護基保護，可得到化合物B。化合物B的P1與P2可為相同或相異。P1與P2相同時，以一次之反應同時保護而可得到化合物B。P1與P2相異時，利用3’位與5’位的立體環境的差異，藉由先導入P1或P2的任一者後、導入另一者，可得到化合物B。該業者習知的保護反應，可參考前述Protective Groups in Organic Synthesis,Fourth edition等。
保護反應的一例，可舉例如溶劑中、鹼存在下、與羥基保護基的氯化物等反應之方法。更具體方法方面，可舉例如在咪唑等之有機鹼存在下、與三乙基矽烷基氯化物等之矽烷基鹵化物反應之方法。
又，保護反應的反應部位，尤其係為與R1、R4及Bx空間上遠離的3’位與5’位的羥基，對於多種的R1、R4及Bx構造，可適用上述保護反應。
(步驟II)硫代羰基化反應
藉由使化合物B以該業者習知的反應(例如勞森試藥 所致之反應)進行硫代羰基化，可得到化合物C。
硫代羰基化反應的具體一例，可舉例如溶劑中、使2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3-二硫雜-2,4-二磷雜環丁烷2,4-二硫化物反應之方法。
硫代羰基反應的反應部位，因為係與R1、R2、R3、R4及Bx在空間上遠離的側氧基，相對於多種的R1、R2、R3、R4及Bx構造，可適用上述硫代羰基化反應。
(步驟III)脫保護反應
藉由使化合物C以該業者習知的反應進行脫保護，可得到化合物D。該業者習知的脫保護反應，可參考前述Protective Groups in Organic Synthesis,Fourth edition等。
作為保護反應的一例的進行矽烷基保護基脫保護之反應方面，可舉例如溶劑中、使四丁基銨氟化物或氟化氫等進行反應之方法。
脫保護反應的反應部位，尤其係為與R1、R4及Bx在空間上遠離的3’位與5’位的羥基，所以相對於多種的R1、R4及Bx構造，可適用上述脫保護反應。
又，該業者已知各種核酸類似物的化學構造變換中之保護反應、脫保護反應有很大差異，該業者可利用對應各種的R1、R2、R3、R4及Bx構造及保護基的脫保護反應。
(步驟IV)5’位保護反應
藉由使化合物D的5’位的羥基經該業者習知的保護反應以羥基保護基選擇性地進行保護，可得到化合物E。5’位羥基的選擇性保護反應，一般該業者已知藉由利用大體積保護基而可達成。該業者習知的保護反應，可參考前述Protective Groups in Organic Synthesis,Fourth edition等。
5’位保護反應的一例，可舉例如溶劑中、鹼存在下、與各種三芳基甲基鹵化物等反應之方法。更具體方法方面，可舉例如在吡啶等之鹼存在下、與4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物等之三芳基甲基鹵化物反應之方法。
5’位保護反應的反應部位，尤其係為與R1、R4及Bx在空間上遠離的5’位的羥基，故相對於多種的R1、R4及Bx之構造，可適用上述保護反應。
又，P1與P2相異時，藉由作成在各自相異性質的條件(例如酸性條件下、鹼性條件下等)可脫保護的羥基保護基，使僅化合物C中之P1的羥基選擇性地脫保護，可得到化合物E。
(步驟V)磷酸化反應
藉由將化合物E的羥基經該業者習知的反應(例如使用單取代-氯(烷氧基)膦類或二取代-烷氧基膦類的反應)進行磷酸化，可得到化合物G。磷酸化反應的具體例，可舉例如溶劑中、使2-氰基乙基N,N,N’,N’-四異丙基亞磷醯二胺進行反應之方法、及、溶劑中、使參-(1,2,4-三唑基)亞 磷酸酯進行反應之方法等。
磷酸化反應的反應部位，因為係與R1、R2、R3、R4及Bx在空間上遠離的羥基，故相對於多種的R1、R2、R3、R4及Bx之構造，可適用上述磷酸化反應。
人工寡核苷酸可藉由使用化合物G及製造所期望之核苷酸配列的寡核苷酸類似物所需之市售亞磷醯胺試藥等，以核酸自動合成裝置(例如nS-8II(Gene design公司製))來合成。
[實施例]
接著舉實施例將本發明具體說明，但本發明不限於此等。又，實施例中、NMR為核磁共振頻譜，MS為質量分析之義。
記載有1H-NMR數據時，表示以300MHz(JNM-ECP300；日本電子(JEOL)公司製、或JNM-ECX300；日本電子(JEOL)公司製)進行測定，以四甲基矽烷為內部標準的訊號的化學位移δ(單位：ppm)(分裂圖型、積分值)。「s」為單峰、「brs」為寬峰、「d」為雙峰、「t」為三峰、「m」為多重峰、「CDCl3」為重氯仿、「CD3OD」為重甲醇、「DMF-d7」為重N,N-二甲基甲醯胺。
記載有31P-NMR數據時，表示以JNM-ECX300；日本電子(JEOL)公司製)測定，以磷酸為內部標準的訊號之化學位移δ(單位：ppm)。
MS未特別記載時，係用以下條件1，使用ESI(電噴霧離子化)法進行測定。「ESI+」為ESI正離子模式、「ESI-」為ESI負離子模式。
條件1：
裝置：AB SCIEX TripleTOF 5600
管柱：Waters X Brige C18(2.6μm、2.1×75mm)
管柱溫度：40℃
溶離液組成：將乙腈與水的混合比以2/98測定開始後、在12分鐘線性改變為98/2。之後3分鐘使乙腈與水的混合比固定於98/2。
流速：0.3mL/min、
檢出波長：254nm
在使用MALDI-TOF-MASS測定的MS測定，用以下條件2進行測定。
條件2：
裝置：Bruker autoflexIII SmartBeam
Matrix：10mg/mL 3-羥基吡啶羧酸水溶液in 1mg/mL檸檬酸氫二銨水溶液
Target plate：MTP AnchorChip 384 TF
測定模式：Reflector+負離子
以二氧化矽膠體滲透層析法的精製未特別記載時，使用山善製Hi-Flash管柱。
實施例1
核苷類似物：1-[(1R,3R,4R,7S)-1-{[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-5-甲基-3-(5-甲基-2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)-6-硫酮基-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-7-基](2-氰基乙基)二異丙基亞磷醯胺(化合物6)之合成
步驟1 化合物2的合成
氮環境下、於化合物1(依據國際公開第2011/052436號記載之方法進行合成)(600mg、2.0mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)中，加入咪唑(1.65g、24.2mmol)與tert-丁基二甲基氯矽烷(3.65g、24.2mmol)，進行19小時攪拌。反應液中加入20%氯化鈉水溶液，以乙酸乙酯進行萃取。將有機層以硫酸鎂進行乾燥後，將溶劑減壓餾去。使得到的粗產物以二氧化矽膠體層析法精製，得到化合物2(384mg、37%)之白色固體物。
1H-NMR：δ(300MHz；CDCl3)9.24(s、1H)、7.66(s、1H)、5.40(s、1H)、4.22(d、1H)、4.15(d、1H)、3.98(d、1H)、3.95(d、1H)、3.02(s、3H)、1.94(s、3H)、0.84-0.95(m、18H)、0.04-0.16(m、12H)。
步驟2 化合物3的合成
氮環境下、於化合物2(18mg、0.034mmol)之二氯甲烷溶液(2mL)中，加入2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3-二硫雜-2,4-二磷雜環丁烷2,4-二硫化物(40mg、0.1mmol)，在40℃進行24小時攪拌。將反應液濃縮，使得到的粗產物以二氧化矽膠體層析法精製，得到化合物3(7.1mg、38%)之白色固體物。
1H-NMR：δ(300MHz；CDCl3)8.61(s、1H)、7.67(s、1H)、5.36(s、1H)、4.36(d、2H)、4.22(d、1H)、4.01(d、1H)、3.39(s、3H)、1.96(s、3H)、0.83-0.91(m、18H)、0.04-0.18(m、12H)。
步驟3 化合物4的合成
氮環境下、於化合物3(130mg、0.24mmol)之四氫呋喃溶液(5mL)中，加入1M四丁基銨氟化物(TBAF)之四氫呋喃(THF)溶液(0.8ml、0.8mmol)，進行2小時攪拌。於反應液中加入飽和氯化銨水溶液，以乙酸乙酯進行萃取。將有機層以硫酸鎂進行乾燥後，將溶劑減壓餾去。使得到的粗產物以二氧化矽膠體層析法精製，得到化合物4(57.0 mg、79%)之白色固體物。
1H-NMR：δ(300MHz；CD3OD)7.85(s、1H)、5.40(s、1H)、4.39(d、2H)、4.12(d、1H)、3.93(d、1H)、3.37(s、3H)、1.89(s、3H)。
MS(ESI-)：[M-H-]312.0663
步驟4 化合物5的合成
氮氣流下、使以吡啶共沸的化合物4(233mg，0.74mmol)溶於無水吡啶(9.3mL)，加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(DMTCl；315mg，0.93mmol)，室溫下進行4小時攪拌。加入飽和碳酸氫鈉水，片刻攪拌後，以乙酸乙酯進行萃取，將有機層以水、飽和食鹽水洗淨後，以硫酸鎂乾燥。將溶劑餾去，使得到的粗產物以管柱層析法精製，得到化合物5(287mg：收率63%)之白色泡狀固體。
1H-NMR：δ(300MHz；CDCl3)7.73(s、1H)、7.75(d、2H)、7.20-7.37(m、7H)、6.83-6.87(m、4H)、5.37(s、1H)、4.41(s、1H)、4.36(s、1H)、4.02(d、1H)、3.79(s、6H)、3.72(d、1H)、3.38(s、3H)、1.67(s、3H)。
MS(ESI+)：[M+Na+]638.1929
步驟5 化合物6的合成
氮氣流下、將以吡啶、甲苯共沸的化合物5(287mg，0.48mmol)溶於無水乙腈/四氫呋喃(3/1(體積比))(5.6mL)，加入N,N-二異丙基胺(51μL、0.36mmol)、1H-四唑 (25mg、0.36mmol)、2-氰基乙基N,N,N’,N’-四異丙基亞磷醯二胺(286μL，0.66mmol)，室溫下進行5小時攪拌。加入飽和碳酸氫鈉水，片刻攪拌後，以乙酸乙酯進行萃取，將有機層以水、飽和食鹽水洗淨後，以硫酸鈉乾燥。將溶劑餾去，使得到的粗產物以管柱層析法精製，得到白色泡狀固體。將得到的白色泡狀固體溶於二氯甲烷，藉由添加至n-己烷進行再沉澱，得到化合物6(140mg：收率36%)之白色粉體。
31P-NMR：δ(300MHz；CDCl3)150.78、150.51
MS(ESI)：[M+H+]838.3057
實施例2 人工寡核苷酸的合成及精製
將含有實施例1所得的化合物6來源的核苷構造之人工寡核苷酸(化合物7~9：以下表1所示)以核酸自動合成裝置nS-8II(Gene design公司製)，以1.0μmol規模進行合成。
亞醯胺(amidite)單元(化合物6)溶解於四氫呋喃後使用。又，表1中，表示序列的字母係表示去氧核糖核苷酸的核酸鹼基，化合物6來源的核苷酸構造記載為X。X為以下述式(X)所表示之構造，式(X)中之T係指胸腺嘧啶殘基。
亞醯胺(amidite)單元(化合物6)與5’-末端的羥基之耦合時間由1.5分鐘(標準條件)延長為5分鐘。將5’-末端被DMTr基保護且被固相支持的寡核苷酸類似物以飽和氨水處理後，以Glen-PakTM(GLEN RESEARCH公司製)粗精製。將其以逆相HPLC(SHIMADZU LC-20ATVP，SHIMADZU SPD-20AVP，SHIMADZU CTO-20VP、作為分取管柱使用WatersXBridgeTM Prep C18 5μm(10mm×250mm))精製。
合成的人工寡核苷酸(化合物7、8)之純度以逆相HPLC確認，為97%(化合物7；序列編號1)、96%(化合物8；序列編號2)。
(HPLC分析條件)
管柱：WatersXBridgeTM C18 3.5μm，4.6mm×150mm
溶離液：含有0.1M的六氟異丙基醇與8mM的三乙基胺的水溶液/甲醇=95/5(3分鐘)→(17分鐘)→75/25(2分鐘)
流速：1.0mL/min
又，分子量以MALDI-TOF-MASS測定。結果如表1所示。
參考例1 醯胺交聯型(AmNA)寡核苷酸合成
參考WO2011/052436，合成醯胺交聯型亞醯胺(amidite)體(N2’-甲基-2’-胺基-3’-O-[2-氰基乙氧基(二異丙基胺基)膦基]-5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-N,4’-C-側氧基伸甲基胸苷)。與實施例2的人工寡核苷酸(化合物7)之合成同樣地，合成含有以下述式(Y)所表示之醯胺交聯型核苷構造的人工寡核苷酸(化合物C1；序列編號4)。在此式(Y)中之T係指胸腺嘧啶殘基。分子量以MALDI-TOF-MASS測定。結果如表2所示。又，表2中，將式(Y)所表示之醯胺交聯型核苷酸構造記載為Y，T為胸苷。
實施例3
核苷類似物：(1R,3R,4R,7S)-3-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-7-[(tert-丁基二甲基矽烷基)氧基]-1-{[(tert-丁基二甲基矽烷基)氧基]甲基}-5-甲基-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-6-硫酮(化合物12)之合成
步驟1 化合物11的合成
氮環境下、於化合物10(依據國際公開第2014/109384號記載之方法合成)(84mg、0.2mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(3mL)中，加入咪唑(200mg、3.0mmol)與tert-丁基二甲基氯矽烷(300mg、2.0mmol)，進行3小時攪拌。反應液中加入6%碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯進行萃取後、以20%氯化鈉水溶液洗淨。將有機層的溶劑減壓餾去。使得到的粗產物以二氧化矽膠體層析法精製，得到化合物11(42mg、39%)之白色固體物。
1H-NMR：δ(300MHz；CDCl3)8.33(s、1H)、8.15(s、1H)、6.10(brs、2H)、5.81(s、1H)、4.39(d、2H)、4.15(d、1H)、3.96(d、1H)、3.11(s、3H)、0.92(s、9H)、0.78(s、9H)、0.13(m、6H)、0.00(m、6H)。
步驟2 化合物12的合成
氮環境下、於化合物11(40mg、0.076mmol)與2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3-二硫雜-2,4-二磷雜環丁烷2,4-二硫化物(50mg、0.13mmol)中，加入甲苯(8mL)，在90℃進行30分鐘攪拌。將反應液濃縮，使得到的粗產物以二氧化矽膠體層析法精製，得到化合物12(38mg、91%)之白色固體物。
1H-NMR：δ(300MHz；CDCl3)8.32(s、1H)、8.16(s、1H)、6.24(brs、2H)、5.78(s、1H)、4.57(d、2H)、4.20(d、1H)、4.02(d、1H)、3.46(s、3H)、0.91(s、9H)、0.79(s、9H)、0.13(m、6H)、0.00(m、6H)。
MS(ESI)：[M+H+]551.2648
實施例4
核苷類似物：4-胺基-1-((1R,3R,4R,7S)-7-[(tert-丁基二甲基矽烷基)氧基]-1-{[(tert-丁基二甲基矽烷基)氧基]甲基}-5-甲基-6-硫酮基-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-基)-5-甲基嘧啶-2(1H)-酮(化合物14)之合成
步驟1 化合物14的合成
氮環境下、於化合物13(依據國際公開第2014/109384號記載之方法合成)(18mg、34.3μmol)、2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3-二硫雜-2,4-二磷雜環丁烷2,4-二硫化物(30mg、78.0μmol)中，加入甲苯(4mL)，在90℃進行30分鐘攪拌。將反應液濃縮，使得到的粗產物以二氧化矽膠體層析法精製，得到化合物14(14mg、75%)之白色固體物。
1H-NMR：δ(300MHz；CDCl3)7.61(s、1H)、5.35(s、1H)、3.98-4.40(m、4H)、3.36(s、3H)、1.92(s、3H)、0.78-0.96(m、18H)、0.00-0.17(m、12H)。
MS(ESI)：[M+H+]541.2666
實施例5
核苷類似物：2-胺基-9-((1R,3R,4R,7S)-7-[(tert-丁基二甲基矽烷基)氧基]-1-{[(tert-丁基二甲基矽烷基)氧基]甲基}-5-甲基-6-硫酮基-2-氧雜-5-氮雜雙環[2.2.1]庚烷-3-基)-1H-嘌呤-6(9H)-酮(化合物16)之合成
步驟1 化合物16的合成
氮環境下、於化合物15(依據國際公開第2014/109384號記載之方法合成)(30mg、54.5μmol)、2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3-二硫雜-2,4-二磷雜環丁烷2,4-二硫化物(200mg、520.0μmol)中，加入甲苯(4mL)，在90℃進行30分鐘攪拌。將反應液濃縮，使得到的粗產物以二氧化矽膠體層析法精製，得到化合物15(10mg、32%)之白色固體物。
1H-NMR：δ(300MHz；DMF-d7)10.77(brs、1H)、7.78(s、1H)、6.77(brs、2H)、5.82(s、1H)、5.11(s、1H)、4.76(s、1H)、3.93-4.13(m、2H)、3.46(s、3H)、0.78-0.86(m、18H)、0.00-0.16(m、12H)。
評估例1 熔解溫度(Tm)之測定
將實施例2合成的人工寡核苷酸之化合物9(反意義鏈)與正意鏈(3’-CGCAAAAAACGA-5’)退火處理後，藉由測定Tm值，可調查反意義的混成形成能。在國際公開第2011/052436號亦使用相同的方法，評估親和性。
控制組方面，利用核苷構造全為天然型之寡核苷酸 (化合物C0；序列編號5)。
將合成的寡核苷酸的單股(正意鏈及反意義鏈)各自以注射用水溶解，調製成1mM的濃度。採取經濃度調整的正意鏈及反意義鏈各自25μL進行混合，來調製終濃度0.5mM的溶液50μL。接著使用熱循環儀進行加熱及冷卻。首先上升至95℃直接放置5分鐘後，藉由毎分鐘下降1℃至30℃為止，進行退火。將經該作業完成2股一事以非改性聚丙烯醯胺膠體電泳動確認。
接著，使經退火的樣本以注射用水稀釋至260nm的吸光度成為2。混合該吸光度為2的樣本150uL、10xPBS(-)30μL、注射用水120μL，製作300μL之測定溶液。
於分光光度計(Shimadzu，UV-1650PC)內固定置入樣本的吸光槽後，使樣本溶液加熱至110℃，進一步15分鐘維持110℃後開始測定。溫度毎分鐘下降1℃至1℃為止，在每1℃間隔測定260nm中之紫外部吸收。之後，接著相反地從1℃開始每分鐘上升1℃，至110℃為止，每1℃間隔測定260nm中之紫外部吸收。表3中記載昇溫測定時之Tm值與降溫測定時之Tm值的平均值。表示表3中之序列的字母同表1。又，為了防止溫度上升所致之濃度變化，吸光槽使用附蓋者，且吸光槽室內為了防止結露而流通有氮氣。
由表3可明白，本實施形態的人工寡核苷酸，與對單股DNA之親和性比較，對單股RNA之親和性較高。因此，認為本實施形態之人工核苷及人工核苷酸可用於適用反意義法的寡核苷酸的合成。
評估例2 本發明之寡核苷酸的核酸酶耐性的評估
對實施例2所合成的人工寡核苷酸(化合物7；SaNA)、參考例1所合成的人工寡核苷酸(化合物C1；AmNA)、將化合物7之X置換為天然型之核酸鹼基(T)的天然型寡核苷酸(nature)及化合物7之X置換為下述式(L)之構造的人工寡核苷酸(LNA)，探討對於將寡核苷酸從3’側分解之核酸外切酶的耐性。在此式(L)中之T係指胸腺嘧啶殘基。
使含750pmol之寡核苷酸的緩衝液溶液 (80μL)維持於37℃、5分鐘後，混合含有0.1μg之磷酸二酯酶I(Worthington Biochemical Corporation公司)之緩衝液溶液(20μL)。使寡核苷酸的殘存量藉由逆相HPLC經時測定。又，各時間中，將樣本立即移至90℃的油浴，維持5分鐘以使酵素惰性化後，測定寡核苷酸的殘存量。
使用的緩衝液之組成(終濃度)為Tris．HCl(參(羥基甲基)胺基甲烷鹽酸鹽、pH8.0)50mM、MgCl2 10mM，測定前充分脫氣。以HPLC之定量條件如以下所示。
(HPLC分析條件)
溶離液：含有0.1M的六氟異丙基醇與8mM的三乙基胺之水溶液/甲醇=95/5(3分鐘)→(17分鐘)→75/25(2分鐘)
流速：1.0mL/min
管柱：WatersXBridgeTM C18 3.5μm，4.6mm×150mm
管柱溫度：60℃
檢出：UV(260nm)
結果如圖1所示。圖1中「殘存寡核苷酸(%)」係指相對於0時點中之未分解寡核苷酸(9mer)的測定時點中之未分解寡核苷酸(9mer)之殘存率。
該結果，天然型寡核苷酸(nature)2分鐘後全部分解。人工寡核苷酸(LNA)在10分鐘後全部分解。人工寡核苷酸(化合物C1、AmNA)中亦在20分鐘後全部分解。另一方面，人工寡核苷酸(化合物7、SaNA)20分鐘後之殘存率為67%、40分鐘後之殘存率為52%。因此，可知本發明之寡 核苷酸具有大幅超越由非修飾之寡核苷酸或習知人工核苷酸調製的人工寡核苷酸(LNA或AmNA)之酵素耐性。因此，考量本實施形態的人工寡核苷酸在體內之持續性非常好，認為可用作為合成核酸醫藥品用的材料。
含該2’,4’-交聯型人工核苷酸之人工寡核苷酸，具有比天然型之核苷酸更優異的對單股RNA之鍵結親和性、與高於LNA及醯胺型交聯核酸(AmNA)之核酸酶耐性。尤其因具有非常高的酵素耐性，期待在核酸醫藥之應用。
日本專利申請2015-146682號(申請日：2015年7月24日)之揭示全體以參考資料記載於本說明書。本說明書記載之全部文獻、專利申請、及技術規格係參考個別文獻、專利申請、及技術規格而收錄一事為具體且與個別記載之場合相同程度地參考而收錄於本說明書。
[產業上的利用性]
由本發明之核苷類似物或核苷酸類似物調製的寡核苷酸，顯示優異的對單股RNA之鍵結親和性與核酸酶耐性。因此，認為該寡核苷酸在體內之持續性非常好，所以本發明之核苷類似物或核苷酸類似物，可用作為合成反意義寡核苷酸等之核酸醫藥品用的材料。
<110> NISSAN CHEMICAL INDUSTRIES,LTD.
<120> Artificial Nucleoside,Artificial Nucleotide and Artificial Oligonucieotide
<130> FP3987PCT
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence
<220>
<221> modified_base
<222> (9)..(9)
<223> 2’,4’-thioamide bridged
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<220>
<223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence
<400> 5

Claims (19)

  1. 一種以下述式(I)： (式中，R1為氫原子或胺基保護基，Bx為嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基或2-硫酮基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基及2-硫酮基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)，Z1及Z2各自獨立，為氫原子、羥基保護基或含磷基，R2及R3各自獨立，為氫原子、鹵素原子、氰基、C1-6烷基或C2-6烯基(該C1-6烷基及C2-6烯基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷氧基及氰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)，R4為氫原子、鹵素原子、氰基或C1-6烷基)所示之化合物或其鹽。
  2. 如請求項1記載之化合物或其鹽，其中， Bx為嘌呤-9-基或2-側氧基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基及2-側氧基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)。
  3. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，Bx為6-胺基嘌呤-9-基、2-胺基-6-羥基嘌呤-9-基、2-側氧基-4-胺基-1,2-二氫嘧啶-1-基、2-側氧基-4-胺基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基、2-側氧基-4-羥基-1,2-二氫嘧啶-1-基或2-側氧基-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基。
  4. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，R1為氫原子、C1-3烷基、乙醯基、苄基、tert-丁氧基羰基或苄基氧基羰基。
  5. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，R4為氫原子。
  6. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，R2及R3為氫原子。
  7. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，R1為甲基。
  8. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，Z1為氫原子或羥基保護基。
  9. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，羥基保護基為乙醯基、tert-丁基、tert-丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氫吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙 基、2-三甲基矽烷基乙基、p-氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲醯基、p-苯基苯甲醯基、2,6-二氯苄基、乙醯丙醯基(levulinoyl)、二苯基甲基、p-硝基苄基、三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、tert-丁基二甲基矽烷基、tert-丁基二苯基矽烷基、三苯基矽烷基、三異丙基矽烷基、甲酸苯甲醯基、氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、三甲基乙醯基、異丁醯基、9-芴基甲基氧基羰基、甲磺醯基、p-甲苯磺醯基、三氟甲磺醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、9-苯基呫噸-9-基或9-(p-甲氧基苯基)呫噸-9-基。
  10. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，Z2為氫原子或含磷基。
  11. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，Z2為氫原子、氰基乙氧基(二異丙基胺基)膦基或羥基氧膦基。
  12. 如請求項1或2記載之化合物或其鹽，其中，Z2為羥基保護基。
  13. 一種含有1個以上以下述式(II)： (式中， R1為氫原子或胺基保護基，Bx為嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基或2-硫酮基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基、2-側氧基-嘧啶-1-基及2-硫酮基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)，R2及R3各自獨立，為氫原子、鹵素原子、氰基、C1-6烷基或C2-6烯基(該C1-6烷基及C2-6烯基為無取代或被鹵素原子、C1-6烷氧基及氰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)，R4為氫原子、鹵素原子、氰基或C1-6烷基)所示之核苷構造的寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽。
  14. 如請求項13記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽，其中，Bx為嘌呤-9-基或2-側氧基-嘧啶-1-基(該嘌呤-9-基及2-側氧基-嘧啶-1-基為無取代、或被鹵素原子、C1-6烷基、胺基、以胺基保護基取代的胺基、羥基、以羥基保護基取代的羥基、巰基及以巰基保護基取代的巰基所構成群選出的單獨或者相異的1個以上之取代基取代)。
  15. 如請求項13或14記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽，其中，Bx為6-胺基嘌呤-9-基、2-胺基-6-羥基嘌呤-9-基、2- 側氧基-4-胺基-1,2-二氫嘧啶-1-基、2-側氧基-4-胺基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基、2-側氧基-4-羥基-1,2-二氫嘧啶-1-基或2-側氧基-4-羥基-5-甲基-1,2-二氫嘧啶-1-基。
  16. 如請求項13或14記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽，其中，R1為氫原子、C1-3烷基、乙醯基、苄基、tert-丁氧基羰基或苄基氧基羰基。
  17. 如請求項13或14記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽，其中，R4為氫原子。
  18. 如請求項13或14記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽，其中，R2及R3為氫原子。
  19. 如請求項13或14記載之寡核苷酸、或其製藥上所容許的鹽，其中，R1為甲基。
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