CN112888699B - 测序用核苷酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

提出了测序用核苷酸的制备方法，即制备式(I)所示化合物的方法，(1)将式(II)所示化合物与第一磷酸化试剂进行第一亲核取代反应，所述第一磷酸化试剂为三氯氧磷；(2)将第一亲核取代反应产物与第二磷酸化试剂进行第二亲核取代反应，以便获得式(I)所示化合物，所述第二磷酸化试剂不同于所述第一磷酸化试剂；其中，R1为H或OH，Base为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，R2为H或荧光标记物。

Description

测序用核苷酸的制备方法
优先权信息
无
技术领域
本发明涉及化学领域，具体地，本发明涉及测序用核苷酸的制备方法。
背景技术
DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是要测定腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)四个碱基的排列方式。随着人类基因组计划的开展，相关测序技术也得到了迅速发展。当前，测序技术已经成为现代生物学研究中重要的手段之一。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。
目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。在1975年，Sanger等人开创了第一代DNA测序技术，并在1977年完成了第一个基因组序列(噬菌体X174)的测序工作。但因其测序成本高，通量小等问题，使得de novo测序、转录组测序等应用难以普及，这也促进了人类对新型测序方法的探索。经过技术的不断积累，以Roche、illumina、ABI等公司推出了第二代测序方法。较之第一代方法，虽然第二代方法在测序准确度和读长上稍有让步，但因其实现了高通量，使得测序技术在疾病的诊断与治疗，物种生物学研究等领域有了广泛的应用。在有了二代测序技术的理论支持后，现阶段面临的问题之一便是如何提高测序的准确度与精确。测序用试剂，也即测序用核苷酸的纯度对测序结果准确度与精确度会有直接影响，因此现阶段亟需开发一种新型的高纯度的，且能够批量生产的测序用核苷酸。
发明内容
现有技术中的3’-羟基保护的核苷酸(dNTP)的工业化生产中，三磷酸化反应的产率低，杂质多，且反应产生的二磷酸与四磷酸杂质与产品性质相似，难以提纯分离。因此导致整体生产收率低，产品纯度也较低，从而影响测序结果的准确度与精确度。
为了解决上述问题，本申请提出了一种全新的氰基乙烯核苷酸的制备方法，该方法具有总产率高，反应条件简单，操作方便，产品便于纯化，重现性好，便于工业化大生产等优点，利用该方法可以批量、稳定的制备高纯的3’-氰基乙烯氧基核苷酸。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备式(I)所示化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将式(II)所示化合物与第一磷酸化试剂进行第一亲核取代反应，所述第一磷酸化试剂为三氯氧磷，其中，所述式(II)所示化合物预先与质子海绵(proton sponge)进行第一混合处理；(2)将第一亲核取代反应产物与第二磷酸化试剂进行第二亲核取代反应，以便获得式(I)所示化合物，所述第二磷酸化试剂不同于所述第一磷酸化试剂；
其中，R1为H或OH，Base为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，R2为H或荧光标记物。三氯氧磷与式(II)所示化合物进行第一亲核取代生成活性磷酸酯中间体，之后该活性磷酸酯中间体会与第二磷酸化试剂反应得到式(I)所示化合物。其中，三氯氧磷本身为磷酸化试剂，其活性大，但其容易生成很多副产物，如会直接取代羟基生成卤化物，而不会得到活性磷酸酯，发明人在反应中，开创性地引入了质子海绵做缚酸剂，质子海绵相较于其他有机及无机碱，碱性强且没有亲和性，且自身位阻较大，不会和反应原料及试剂发生副反应。在反应中结合质子后生产的产物与三磷酸化后的产品在DEAE柱上色谱行为相差大，不影响产物的进一步分离提纯，使得整个生产工艺成本更可控，重现性及操作性更好。由此，根据本发明实施例的方法具有总产率高，反应条件简单，操作方便，产品便于纯化，重现性好，便于工业化大生产等优点，利用该方法可以批量、稳定的制备高纯的3’-氰基乙烯氧基核苷酸及其衍生物。
附图说明
图1为根据本发明实施例的3’-氰基乙烯氧基腺嘌呤核苷酸制备提纯后分析HPLC图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。示例中的试剂、检测仪器等，如无特殊说明，可自配或者通过市售途径获取。
本发明中“室温”指的是温度由大约10℃到大约40℃。在一些实施例中，“室温”指的是温度由大约20℃到大约30℃；在另外一些实施例中，“室温”指的是20℃，22.5℃，25℃，27.5℃等等。
在本发明的上下文中，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％或10％差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值以内的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。每当公开一个数值范围中的一个下限，DL，和一个上限，DU，时，任何处于该公开了的范围之内的数值会被明确地公开。
本发明所述的所有反应步骤反应到一定程度如原料消耗大约大于70％，大于80％，大于90％，大于95％，或经检测反应原料已经消耗完毕后进行后处理，如冷却，收集，提取，过滤，分离，净化处理或其组合。可以通过常规的方法如薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)等方法检测反应程度。可以采用常规的方法对反应溶液进行后处理，例如，通过减压蒸发或常规蒸馏反应溶剂后收集粗产物，直接投入下一步反应；或直接过滤得到粗产物，直接投入下一步反应；或静置后，倾倒出上层清液得到粗产物，直接投入下一步反应；或选择适当的有机溶剂或其组合进行萃取，蒸馏，结晶，柱层析，润洗，打浆等纯化步骤。
本发明所述的各滴加过程以及所述的各步反应均在一定温度条件下进行，任何适合使用于各滴加过程或各反应过程的温度均包含在本发明中。另外，本领域的许多类似改动，等同替换，或等同于本发明所描述的温度及温度范围，均视为本发明的包含范围。本发明给出了各滴加过程较佳的温度或温度范围，以及各反应较佳的反应温度。
本发明所述的各反应步骤所使用的溶剂没有特别限制，任何在一定程度上能溶解起始原料并且不抑制反应的溶剂均包含在本发明中。另外，本领域的许多类似改动，等同替换，或等同于本发明所描述的溶剂，溶剂组合，及溶剂组合的不同比例，均视为本发明的包含范围。本发明给出了各反应步骤所使用的较佳的溶剂。
制备式(I)所示化合物的方法
在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备式(I)所示化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将式(II)所示化合物与第一磷酸化试剂进行第一亲核取代反应，所述第一磷酸化试剂为三氯氧磷，其中，所述式(II)所示化合物预先与质子海绵进行第一混合处理；(2)将第一亲核取代反应产物与第二磷酸化试剂进行第二亲核取代反应，以便获得式(I)所示化合物，所述第二磷酸化试剂不同于所述第一磷酸化试剂；
其中，R1为H或OH，Base为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，R2为H或荧光标记物。三氯氧磷与式(II)所示化合物进行第一亲核取代生成活性磷酸酯中间体，之后该活性磷酸酯中间体会与第二磷酸化试剂反应得到式(I)所示化合物。其中，三氯氧磷本身为磷酸化试剂，其活性大，但是三氯氧磷在反应过程中容易生成很多副产物，如会直接取代羟基生成卤化物，而不会得到活性磷酸酯，发明人在反应中开创性地引入了质子海绵做缚酸剂，质子海绵相较于其他有机及无机碱，碱性强且没有亲和性，且自身位阻较大，不会和反应原料及试剂发生副反应。在反应中结合质子后的产物与三磷酸化后的产物在DEAE柱上色谱行为相差大，不影响产物的进一步分离提纯，使得整个生产工艺成本更可控，重现性及操作性更好。由此，根据本发明实施例的方法具有总产率高，反应条件简单，操作方便，产品便于纯化，重现性好，便于工业化大生产等优点，利用该方法可以批量、稳定的制备高纯的3’-氰基乙烯氧基核苷酸及其衍生物。
根据本发明的实施例，所述第一亲核取代反应是在无水无氧的条件下进行的。由此，能减少副产物的生成，提高活性磷酸酯中间体的产率。
根据本发明的实施例，所述式(II)所示化合物与质子海绵的摩尔比为1:2。发明人发现，在该比例下，式(II)所示化合物与三氯氧磷的反应收率高，副产物少，且成本低。
根据本发明的实施例，所述第一混合处理是在三甲基磷酸酯(PO(OMe)3)溶剂中、在无水无氧的条件下进行的。发明人发现，PO(OMe)3对生产所用的核苷碱基具有较好的溶解性，可作为此类碱基的三磷酸化反应的通用溶剂。
根据本发明的实施例，所述式(II)所示化合物与PO(OMe)3的用量比为1g:20mL。发明人发现，反应所用的式(II)所示化合物，在PO(OMe)3中溶解性较好，可形成均一的溶液体系，从而更好地实现式(II)所示化合物的第一亲核取代反应。
根据本发明的实施例，在0℃的条件下，将所述三氯氧磷滴加至预先经过所述第一混合处理的式(II)所示化合物中。发明人发现，将三氯氧磷滴加到第一混合处理后的式(II)所示化合物中，能有效避免副产物的生成，进而有效提高活性磷酸酯中间体的产率。
根据本发明的实施例，所述式(II)所示化合物与三氯氧磷的摩尔比为1：(4-6)，优选1:5。发明人发现，当式(II)所示化合物与三氯氧磷摩尔比为1：(4-6)时，反应产率高，当式(II)所示化合物与三氯氧磷摩尔比为1：5时，反应产率更高。
根据本发明的实施例，所述第一亲核取代反应是在温度为0℃的条件下进行3小时。由此，能避免副产物的生成，且反应进行彻底。
根据本发明的实施例，所述第二亲核取代反应是在无水无氧的条件下进行的。由此，能避免活性磷酸酯中间体与水进行反应，提高式(I)所示化合物的收率。
根据本发明的实施例，所述第二磷酸化试剂为(Bu3N)2PPi。发明人发现，(Bu3N)2PPi中不含单磷酸盐杂质，进而不会从原料中引入单磷酸盐杂质，使得式(II)所示化合物的后期分离纯化更加简单，且三丁胺为非亲和性碱，能更好地进行第二亲核取代反应。
根据本发明的实施例，所述(Bu3N)2PPi预先在乙腈中进行溶解处理，所述溶解处理是在无水无氧条件下进行5-10分钟。发明人发现，乙腈对(Bu3N)2PPi具有较好的溶解性，可形成均一溶液体系，有利于反应的进行。并且(Bu3N)2PPi为固体，为了确保反应在均一体系中进行，先需将其在乙腈中预溶，形成均一溶液。
根据本发明的实施例，所述(Bu3N)2PPi与乙腈的用量比为3.63g:20mL。发明人发现，在上述比例下，可形成(Bu3N)2PPi/乙腈的均一溶液，且在上述比例下具有较为适当的试剂浓度，有利于与活性磷酸酯反应。
根据本发明的实施例，在所述溶解处理后、第二亲核取代反应前，进一步包括溶解处理后的(Bu3N)2PPi与三乙胺进行第二混合处理。发明人发现，三乙胺在此步反应中相较于其余碱，具有较好的反应效果。
根据本发明的实施例，所述式(II)所示的化合物与(Bu3N)2PPi的摩尔比为1：(1-3)，优选为1:2.5。发明人发现在上述摩尔比的条件下，反应收率更高，且杂质更少。
根据本发明的实施例，所述第二混合处理是在无水无氧、0℃的条件下进行的。
根据本发明的实施例，在温度为0℃、2～3min的条件下，将第一亲核取代反应后的反应混合液滴加到第二混合处理后的反应液中。由此，能有效避免副产物的生成。
根据本发明的实施例，所述第二亲核取代反应是在温度为0℃的条件下进行2小时。由此，能有效避免副产物的生成，且反应更彻底。
根据本发明的实施例，第二亲核取代反应后，进一步包括：将亲核取代反应产物进行淬灭处理，所述淬灭处理在是温度为0℃、1M TEAB的条件下进行30-60分钟。发明人发现，高于0℃淬灭，会导致体系温度升高过快，核苷碱基在较高温度下可能发生降解。同时，反应30-60分钟能确保反应充分进行。
根据本发明的实施例，进一步包括：将式(I)所示化合物进行纯化处理，所述纯化处理包括DEAE预纯化以及制备色谱纯化。由此，纯化处理简单，获得的式(I)所示化合物纯度高。
根据本发明的实施例，所述DEAE纯化的洗脱液为TBAB、TEAB或TEAA。发明人发现，在TBAB、TEAB或TEAA为洗脱液的洗脱条件下，具有更优的分离效果。根据本发明的实施例，所述制备色谱的条件如下所示：
色谱柱：C18反相色谱柱、分子排阻色谱柱；
柱温：25或30℃；
检测波长：254或280nm；
进样量：1000μL；
流动相为有机相/水相。由此，具有较好的分离效果，且适合工业化大生产。
根据本发明的实施例，所述有机相包括选自甲醇、异丙醇、乙醇以及乙腈的至少之一，所述水相包括选自水、TBAB溶液、TEAB溶液以及TEAA溶液的至少之一。由此，洗脱效果好，纯化更加完全。
根据本发明的实施例，所述式(II)所示化合物是通过如下方式获得的：
将式(III)所示的化合物进行脱保护处理，以便获得式(II)所示化合物，
发明人使用叔丁基二甲基硅(TBS)来保护5’-OH，在反应过程中会产生酸，而TBS对于酸相对稳定，且TBS的脱除条件相对温和，不会造成核苷碱基分解。
根据本发明的实施例，所述脱保护处理是在Et3N·3HF的条件下进行12小时。
根据本发明的实施例，所述式(III)所示化合物是通过如下方式获得的：
将式(IV)所示化合物与三苯基磷乙腈进行Wittig反应，以便获得式(III)所示化合物，
由此，反应效率高。
根据本发明的实施例，所述Wittig反应是在无水无氧、温度为120℃的条件下进行12小时。
根据本发明的实施例，所述式(IV)所示化合物是通过如下方式获得的：
将式(V)所示化合物与甲酸进行缩合反应，以便获得式(IV)所示化合物，
由此，反应效率高。
根据本发明的实施例，所述缩合反应是在EDCI和DMAP作为缩合剂、DIEA作为催化剂、室温的条件下进行2-3小时。由此，反应效率高。
一般合成方法
在本说明书中，如果在化学名称和化学结构间存在任何差异，结构是占优的。
下面所描述的实施例，除非其他方面表明所有的温度定为摄氏度(℃)。除非其他方面表明，试剂购买于商品供应商如Sigma-Aldrich。
下面简写词的使用贯穿本发明：
TBS 三丁基硅烷
EDCI 1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIEA N,N-二异丙基乙胺
Et3N·3HF 三乙胺三氟化氢
(Bu3N)2PPi 三丁基焦磷酸铵
TEAB 三乙胺硼烷
DEAE 琼脂糖凝胶FF
TBAB 四丁基溴化铵
TEAA 三乙基铵醋酸盐
CH2Cl2 二氯甲烷
HCl 盐酸
NaCl 氯化钠
Na2SO4 硫酸钠
MeOH 甲醇
POCl3 三氯氧磷
PO(OMe)3 三甲基磷酸酯
TEA 三乙胺
TLC 薄层色谱法
Proton sponge 质子海绵
下列反应方案描述了制备本发明公开化合物的步骤。
本发明是一种新型具有可逆末端终止的测序用核苷酸的制备纯化方法，上述核苷酸及其衍生物的制备是按照如下步骤进行的：
其中，R1为H或OH，
Base为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，
R2为H或荧光标记物。
第一步：3’-氰基乙烯保护的核苷的制备
具体操作方法：在装有搅拌子的圆底烧瓶中，加入5’-TBS保护的脱氧核苷V，EDCI，与DMAP，以适宜溶剂溶解后。加入甲酸和DIEA，室温反应2至3小时。反应液处理、纯化可得化合物IV。
将化合物IV和三苯基磷乙腈混合后，以高沸点溶剂溶解后在氮气浴下120℃反应12小时。反应液处理、纯化可得化合物III。
加入化合物III以适宜溶剂溶解后，室温缓慢滴加Et3N·3HF。滴毕反应12小时，处理、纯化后可得3’-氰基乙烯保护的核苷II。
第二步：核苷的三磷酸化反应。
具体操作方法是：将预先干燥的化合物II与碱混合后，加入适宜的溶剂，密闭后再以氮气等惰性气体置换三次。冰浴搅拌5-10分钟，将POCl3缓慢滴加到反应体系中，然后维持在冰水浴中反应3小时。
另取反应容器，加入(Bu3N)2PPi，并溶于无水溶剂中，惰性气体置换三次，于冰浴中搅拌5-10分钟后加入碱，再将步骤1中的混合液在2-3分钟内滴加的反应体系中，滴加完毕后在冰水浴中反应2小时。反应完毕后，在冰浴搅拌下，利用的1M TEAB淬灭反应，继续反应30-60分钟。
第三步：三磷酸脱氧核苷酸的纯化
1、DEAE纯化
加入适量去离子水稀释反应液，利用预装DEAE(GE healthcare DEAE SephadexA-25)柱，以洗脱液梯度洗脱纯化(洗脱液可以是TBAB、TEAB、TEAA中的一种)，并采用UV监测馏分。
2、制备色谱纯化
经过DEAE纯化的样品，浓缩后再利用制备色谱进一步纯化。
流动相：有机相/水相
其中有机相可以是(不仅限于)：甲醇、异丙醇、乙醇、乙腈，其中的一种或几种；
水相可选用(不仅限于)：水、TBAB溶液、TEAB溶液、TEAA溶液，其中的一种或几种。
色谱柱：C18反相色谱柱、分子排阻色谱柱；
柱温：25或30℃；
检测波长：254或280nm；
进样量：1000μL。
下面介绍本发明的具体实施例。
实施例1
向500mL单口烧瓶中，加入化合物2(10g，27.36mmol)，EDCI(10.49g，54.72mmol)和DMAP(3.34g，27.36mmol)溶于CH2Cl2(200mL)。搅拌下加入HCOOH(2.52g，54.72mmol)和DIEA(10.49g，54.72mmol)，在15～25℃搅拌2-3h，TLC监测至反应完成后，向反应液中加1M HCl(100mL)和CH2Cl2 3*200mL萃取；合并有机相并用饱和NaCl洗涤，无水Na2SO4干燥。减压蒸馏，得淡黄色液体，粗品用CH2Cl2溶解，加入等质量的硅胶，旋干溶剂，利用快速柱层析色谱分离，洗脱剂梯度洗脱(V CH2Cl2:VMeOH＝1:0-15:1)，浓缩，得到白色固体化合物3(8.1g，收率75％)。
向500mL单口烧瓶中，加入化合物3(8.1g，20.58mmol)和三苯基磷乙腈(37.21g，123.5mmol)溶于甲苯(160mL)中，N2置换三次。后将反应加热至120℃，在氮气保护回流12h。LC-MS监测至反应完全。冷却到室温，减压旋出甲苯，加乙酸乙酯(100mL)，析出三苯氧膦固体，过滤除掉大部分三苯氧磷，收集滤液。向母液加入等质量的硅胶，旋干溶剂，得到层析样品。通过快速柱色谱分离，洗脱剂梯度洗脱(V CH2Cl2:V MeOH＝80:1-20:1)，得白色固体化合物4(6.9g，收率80％)。
向250mL单口烧瓶中，加入化合物4(6.9g，16.56mmol)，溶于四氢呋喃(140mL)。加入Et3N·3HF(16g，99.36mmol)，在15～20℃反应搅拌12h。TLC监测至反应完成后，减压除去溶剂。向反应液中加乙酸乙酯(100mL)，并用饱和碳酸氢钠溶液调节pH＝7，萃取分层，水相用乙酸乙酯(2*100mL)萃取。有机相合并后用饱和NaCl(2*100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂得到粗品。粗品通过快速柱色谱分离洗脱剂梯度洗脱(VCH2Cl2:VMeOH＝80:1-20:1)，得到淡黄色固体化合物5(3.5g，收率77％)。
在装有搅拌子的50mL三颈圆底烧瓶中，加入预先干燥的化合物5(1.00g，3.31mmol)和质子海绵(0.67g，6.62mmol)。用20ml干燥的PO(OMe)3溶解后，氮气置换三次。于冰浴下搅拌5-10分钟，再将POCl3(2.51g，16.60mmol)缓慢滴加到反应体系中，然后维持在冰水浴中反应3小时。
另取100mL的干燥圆底烧瓶，加入(Bu3N)2PPi(3.63g，6.62mmol)，并用20mL干燥的乙腈溶解。氮气置换三次后，冰浴冷却下加入TEA(1.68g，16.60mmol)。后将上步制备的反应混合液在2-3分钟内滴加到反应体系中，滴加完毕后在冰水浴中反应2个小时。HPLC监测反应完成后，在冰浴搅拌下，利用的1M TEAB淬灭反应，继续反应30-60分钟。
反应淬灭后加入去离子水1000mL稀释反应液，装DEAE(GE healthcare DEAESephadex A-25)柱，上完样后，依次用浓度分别为0.1M(500mL)，0.2M(500mL)，0.4M(1000mL)，0.6M(1000mL)，0.8M(500mL)，1M(500mL)的TEAB溶液洗脱纯化，并采用UV监测馏分。
收集经过DEAE纯化的样品，浓缩后再利用制备色谱进一步纯化。
制备纯化的条件如下：
制备色谱梯度方法见表1。
表1：
其中，A为纯化水，B为乙腈。
流动相：乙腈/水梯度洗脱；
色谱柱：C18反相柱；
柱温：30℃；
检测波长：240nm；
保留时间：20.0分钟；
进样量：2000uL。
经过制备纯化后，将纯化液浓缩后冷冻干燥，可得3’-氰基乙烯氧基腺嘌呤核苷酸化合物1共1.33g，最终纯度可达99.2％以上，总产率19.5％，质谱发现[M+]＝540.8。化合物1制备提纯后分析HPLC图见图1。
实施例2
发明人将按照实施例1的方法合成的dNTP用于测序。QC氰基乙烯保护的dNTPs，在研发机上进行同一张芯片上的QC实验：L01使用50％Cold3’-氰基乙烯保护的_dNTPs+50％Hot 3’-叠氮基保护的dNTP，L02使用50％Hot 3’-氰基乙烯保护的_dNTPs+50％Cold 3’-叠氮基保护的dNTP，切除试剂使用磷酸盐切除试剂(pH 9.3)，run SE25，其中Cold表示不带荧光染料，Hot表示带荧光染料。
实验结果如下表2所示：
表2：
由上表2可知，根据本发明实施例的方法合成的3’-氰基乙烯保护的_dNTPs，质量均可以满足测序的要求，不论其是否带有荧光染料。
对比实施例1
发明人考察了质子海绵用量对于下列反应的产率的影响，其他反应条件与实施例1相同，具体实验中用到的质子海绵的量见表3，其中，化合物2的用量为1.0eq，三氯氧磷的用量为5.0eq，
表3：
质子海绵用量 dTMP
1.0eq 72.2％
1.5eq 88.59％
2.0eq 97.3％
2.5eq 96.9％
发明人发现，化合物2与质子海绵的摩尔比在1：2的条件下，收率更高，且成本低。
对比实施例2
发明人考察了实施例1中化合物5与三氯氧磷的摩尔比对反应产率的影响，其他反应条件与实施例1相同，三氯氧磷的用量见表4，其中，化合物5的用量为1eq，质子海绵用量为2.0eq，(Bu3N)2PPi用量为2.5eq，
表4：
其中，杂质1为二磷酸杂质，杂质2为四磷酸杂质。
发明人发现，实施例1中化合物5与三氯氧磷的摩尔比为1:5时，反应收率更高，杂质更少。
对比实施例3
发明人考察了实施例1中化合物5与(Bu3N)2PPi的摩尔比对反应产率的影响，其他反应条件与实施例1相同，(Bu3N)2PPi的用量见表5，其中，化合物5的用量为1eq，质子海绵用量为2.0eq，三氯氧磷用量为5.0eq，
表5：
(Bu3N)2PPi用量 二磷酸杂质 三磷酸产物 四磷酸杂质
1.0 - 46.1％ -
1.5 - 63.22％ 7.5％
2.5 - 93.7％ 2.1％
3.0 2.8％ 44.1％ 22.7％
发明人发现，实施例1中化合物5与(Bu3N)2PPi的摩尔比为1:2.5时，反应收率更高，杂质更少。
对比实施例4
发明人考察了实施例1中质子海绵与二异丙基乙胺、三乙胺做缚酸剂比对反应产率的影响，其他反应条件与实施例1相同，采用不同缚酸剂下原料的剩余率和三磷酸产物的收率见下表6。
表6：
缚酸剂 原料 三磷酸产物
质子海绵 - 93.7％
二异丙基乙胺 30.4％ 60.5％
三乙胺 55.3％ 32.2％
发明人发现，实施例1中使用质子海绵做缚酸剂时，原料反应更加彻底，反应收率更高，杂质更少。
对比实施例5
发明人考察了不同纯化方法对产品纯度的影响，其他反应条件与实施例1相同，不同纯化方法下对产品纯度的影响见下表7。
表7：
发明人发现，实施例1中使用DEAE和HPLC作为纯化方法时，纯化效率更高，产品纯度更高。
综上，根据本发明实施例的式(I)所示化合物是一种测序用核苷酸，可在温和条件下实现3’端保护基的快速断裂(利用一种内切酶，实现对3’-端保护基的切除)，通过3’-羟基的保护与暴露，以实现对整个测序流程的控制。因此将该类测序用核苷酸与四种荧光标记的该类测序用核苷酸联用后，可组成“可逆末端终止测序”试剂，应用于所有以二代测序技术为原理的测序平台上，利用本发明的方法获得的化合物对于后续测序结果影响小，测序结果的准确度高、精确度高，且本发明的方法具有总产率高，反应条件简单，操作方便，产品便于纯化，重现性好等优点，可以批量、稳定的制备该类核苷酸衍生物，适合工业化大生产。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (21)

1.一种制备式(I)所示化合物的方法，其特征在于，
(1)将式(II)所示化合物与第一磷酸化试剂进行第一亲核取代反应，所述第一磷酸化试剂为三氯氧磷，其中，所述式(II)所示化合物预先与质子海绵进行第一混合处理；
(2)将第一亲核取代反应产物与第二磷酸化试剂进行第二亲核取代反应，以便获得式(I)所示化合物，所述第二磷酸化试剂不同于所述第一磷酸化试剂，所述第二磷酸化试剂为(Bu3N)2PPi；
其中，R1为H，
Base为腺嘌呤，
R2为H；
所述式(II)所示化合物与质子海绵的摩尔比为1:1.5、1:2或1:2.5；
所述式(II)所示化合物与三氯氧磷的摩尔比为1:5；
所述式(II)所示化合物与(Bu3N)2PPi的摩尔比为1:2.5；
所述第一混合处理是在PO(OMe)3溶剂中、在无水无氧的条件下进行的；
所述(Bu3N)2PPi预先在乙腈中进行溶解处理，所述溶解处理是在无水无氧条件下进行5-10分钟；
在所述溶解处理后、第二亲核取代反应前，进一步包括溶解处理后的(Bu3N)2PPi与三乙胺进行第二混合处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一亲核取代反应是在无水无氧的条件下进行的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(II)所示化合物与质子海绵的摩尔比为1:2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(II)所示化合物与PO(OMe)3的用量比为1g:20mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在0℃的条件下，将所述三氯氧磷滴加至预先经过所述第一混合处理的式(II)所示化合物中。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一亲核取代反应是在温度为0℃的条件下进行3小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二亲核取代反应是在无水无氧的条件下进行的。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述(Bu3N)2PPi与乙腈的用量比为3.63g:20mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二混合处理是在无水无氧、0℃的条件下进行的。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在温度为0℃、2～3min的条件下，将第一亲核取代反应后的反应混合液滴加到第二混合处理后的反应液中。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二亲核取代反应是在温度为0℃的条件下进行2小时。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第二亲核取代反应后，进一步包括：将亲核取代反应产物进行淬灭处理，所述淬灭处理在是温度为0℃、1M TEAB的条件下进行30-60分钟。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：将式(I)所示化合物进行纯化处理，所述纯化处理包括DEAE预纯化以及制备色谱纯化。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述制备色谱的条件如下所示：
色谱柱：C18反相色谱柱、分子排阻色谱柱；
柱温：25或30℃；
检测波长：254或280nm；
进样量：1000μL；
流动相为有机相/水相。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述有机相包括选自甲醇、异丙醇、乙醇以及乙腈的至少之一，所述水相选自水。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(II)所示化合物是通过如下方式获得的：
将式(III)所示的化合物进行脱保护处理，以便获得式(II)所示化合物，
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述脱保护处理是在Et3N·3HF的条件下进行12小时。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述式(III)所示化合物是通过如下方式获得的：
将式(IV)所示化合物与三苯基磷乙腈进行Wittig反应，以便获得式(III)所示化合物，
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述Wittig反应是在无水无氧、温度为120℃的条件下进行12小时。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述式(IV)所示化合物是通过如下方式获得的：
将式(V)所示化合物与甲酸进行缩合反应，以便获得式(IV)所示化合物，
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述缩合反应是在EDCI和DMAP作为缩合剂、DIEA作为催化剂、室温的条件下进行2-3小时。
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