CN101132809A - 治疗肾细胞癌的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用低剂量IL－2治疗肾细胞癌的方法。具体地说，本发明涉及治疗肾功能受损和/或对高剂量IL－2治疗不耐受患者的转移性肾细胞癌的方法。与高剂量IL－2治疗相比，本文所述治疗方案能显著抑制肿瘤生长，同时毒性和不良副作用减少。

Description

治疗肾细胞癌的方法
技术领域
本发明总体上涉及用IL-2治疗肾细胞癌的方法。具体地说，本发明涉及治疗肾功能受损或对高剂量IL-2治疗不耐受的肾细胞癌患者的方法。
背景
白介素-2(IL-2)是天然杀伤细胞(NK)和T-细胞增殖及功能的强效刺激物(Morgan等，(1976)Science 193：1007-1011)。该天然产生的淋巴因子单用或与淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)联用均显示具有抵御各种恶性肿瘤的抗肿瘤活性(参见，例如Rosenberg等，N.Engl.J.Med.(1987)316：889-897；Rosenberg，Ann.Surg.(1988)208：121-135；Topalian等，J Clin.Oncol.(1988)6：839-853；Rosenberg等，N.Engl.J.Med.(1988)319：1676-1680；和Weber等，J.Clin.Oncol.(1992)10：33-40)。已报道了用Proleukin(加利福尼亚，Emeryville的Chiron Corporation的一种可商品化购得的IL-2制剂)治疗转移性黑色素瘤和肾细胞癌患者中IL-2的抗肿瘤活性。其它疾病，包括淋巴瘤也显示对IL-2治疗有反应(Gisselbrecht等，Blood(1994)83：2020-2022)。然而，获得对肿瘤生长阳性治疗结果所用的高剂量IL-2常导致严重副作用，包括发热和寒颤、低血压和毛细血管渗漏(血管渗漏综合征或VLS)及神经学改变(参见，例如Duggan等，J Immunotherapy(1992)12：115-122；Gisselbrecht等，Blood(1994)83：2081-2085；Sznol和Parkinson，Blood(1994)83：2020-2022)。
转移性肾细胞癌(RCC)通常对化疗(单用一种药物或联用多种药物)耐受。采用免疫疗法，特别是用IL-2观察到更大成功。用高剂量静脉内IL-2治疗可在约15％患者中导致目标肿瘤反应(objective tumor responses)，其中一些持续时间长。然而，给予高剂量IL-2可伴有毛细血管渗漏综合征，这可导致严重的有时致命的低血压和器官灌注降低。这些毒性常将IL-2的应用限制于由给药经验丰富的医师诊治的高度选择性患者组。已探索单用合较低剂量的IL-2或联用其它生物药物，例如干扰素-α和皮下给药方案来致力于开发对该疾病更广泛适用的疗法(参见，例如Nieken等，Cancer Biother.Radiopharm.(1996)11：289-295；Sleijfer等，J.Clin.Oncol.(1992)10：1119-1123；Lessoni等，Anticancer Res.(2002)22：1061-1-1064；Tourani等，J.Clin.Oncol.(1998)16：2505；Schiller等，Cancer Res.(1993)53：1286-1292)。
仍需要能降低毒性同时提高疗效的治疗肾细胞癌患者的改进疗法。
发明概述
本发明提供用IL-2治疗肾细胞癌的有效方法。与以前高剂量IL-2治疗所用的剂量相比，该方法利用较低剂量的IL-2来降低毒性。如本文的实施例所述，该治疗方案能明显抑制肿瘤生长并降低不良副作用，为不能耐受高剂量IL-2治疗的患者提供了替代治疗方法。
在一方面，本发明提供治疗肾细胞癌人患者的方法。在某些实施方式中，患者肾功能受损。在某些实施方式中，肾细胞癌有转移。在某些实施方式中，患者不能耐受高剂量IL-2治疗。
在一个实施方式中，所述方法包括：a)每天分1-3剂给予1-52MIU剂量的IL-2，每周3-6天，重复1-24周；和b)停止IL-2给药1-4周。
在一个实施方式中，所述方法包括：a)每5天-1个月给予1-52MIU剂量的IL-2，重复1-24周，其中IL-2与聚乙二醇或聚氧乙烯化多元醇共价偶联；和b)停止IL-2给药1-4周。
在还有一实施方式中，所述方法包括：a)每天分1-3剂给予9-18MIU剂量的IL-2，每周3-6天，重复1-24周；b)停止IL-2给药1-4周；c)每天分1-3剂给予9MIU剂量的IL-2，每周3-6天，重复1-24周；和d)停止IL-2给药1-4周。
在还有另一实施方式中，所述方法包括：a)第一，在第一周内5天，每天给予18MIU剂量的IL-2；b)第二，每天给予9MIU剂量的IL-2，共2天，然后每周内3天，每天给予18MIU剂量的IL-2，重复5周；c)第三，停止IL-2给药3周；d)第四，每周内5天，每天给予9MIU剂量的IL-2，重复6周；和e)第五，停止IL-2给药3周。
在本文所述任一方法中，所述IL-2可以是重组产生的IL-2。所述IL-2可包括人IL-2或其变体，该变体包含的序列与人IL-2序列(SEQ ID NO：1)有至少约70-100％序列相同性，包括这些范围内的任何相同性百分比，例如70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％序列相同性。在某些实施方式中，IL-2是IL-2突变蛋白，例如但不限于Ala104Ser125IL-2；des-Ala1des-Pro2des-Thr3des-Ser4Ala104Ser125IL-2；和deS-Ala1des-Pro2des-Thr3des-Ser4des-Ser5des-Ser6IL-2。在一优选的实施方式中，所述IL-2突变蛋白是des-丙氨酰基-1，丝氨酸-125人白介素-2(阿地白介素)。
在某些实施方式中，所述IL-2偶联于聚乙二醇。示范性聚乙二醇包括但不限于：平均分子量为1,000-40,000道尔顿的聚乙二醇、平均分子量为2,000-20,000道尔顿的聚乙二醇和平均分子量为3,000-12,000道尔顿的聚乙二醇。
在其它实施方式中，所述IL-2共价偶联于聚氧乙烯化多元醇。示范性聚氧乙烯化多元醇包括但不限于：聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖和聚氧乙烯化甘油。在某些实施方式中，所述聚氧乙烯化多元醇是平均分子量为1,000-40,000的聚氧乙烯化甘油。
在本文所述的任一方法中，可给予对象多轮治疗足够长时间从而能至少获得部分肿瘤反应。在某些实施方式中，所述时间是至少6个月。在某些实施方式中，所述时间是至少12个月。在某些实施方式中，所述时间足以获得完全肿瘤反应。
在某些实施方式中，该治疗方法还包括多轮治疗，每轮包括：a)每天分1-3剂给予9MIU剂量的IL-2，每周3-6天，重复1-24周；和b)停止IL-2给药1-4周；给予所述对象的时间足以至少获得部分肿瘤反应。
在所述任何方法中，可通过皮下、腹膜内、肌肉内、静脉内、口服、肺部、鼻部、局部或透皮给药或通过输注或栓剂给予所述IL-2。在一优选的实施方式中，皮下给予所述IL-2。
本领域技术人员鉴于本文内容不难想出本发明的这些和其它实施方式。
附图简述
图1比较了按照实施例3所述给药方案的低剂量IL-2在肾功能正常(血清肌酸酐(SCr)≤1.5mg/dL)和受损(SCr＞1.5mg/dL)的肾细胞癌患者中的相对效力。图1显示无进展存活期(PFS)的对象百分比与时间(以年计)关系图和存活对象百分比与时间(以年计)关系图。
图2是描述按照实施例3所述给药方案，用低剂量IL-2治疗肾功能正常(血清肌酸酐(SCr)≤1.5mg/dL)和受损(SCr＞1.5mg/dL)的转移性肾细胞癌患者反应总比例的柱状图。淡阴影显示完全反应(CR)的对象百分数。浓阴影显示部分反应(PR)的对象百分数。
图3比较了IV期临床研究中，用本文所述低剂量IL-2治疗群体中患者特征(PS，肾切除术前)与病例对照组。肾细胞癌患者临床研究的病例对照组的描述可参见Pyrhonen等，(1999)J.Clin.Oncol.17：2859-2867；Motzer等，(1999)J.Clin.Oncol.17：2530-40；Ritchie等，(1999)Lancet 353：14-17；Kriegmair等，(1995)Urology 45：758-762；Jones等，(1993)Cancer Biother.8：275-288；Gleave等，(1998)New Engl.J.Med.338：1265-1271；Steineck等，(1990)Acta Oncol.29：155-162；和Osband等，(1990)Lancet 335：994-998。
图4比较了IV期临床研究中，用本文所述低剂量IL-2治疗群体中患者结果(ORR，PFS，1年的OS，2年的OS)与病例对照组。
图5比较了按照实施例3所述给药方案，用低剂量IL-2治疗的患者与用化疗替代IL-2治疗(Jones等，(1993)J.Clin.Oncol.12：2714-2722)的病例对照组患者的存活率。按照如下所示的风险因素分层Jones系统将患者再分成风险组：风险良好(0-1种风险因素)、中度风险(2种风险因素)和预后不佳(所有3种风险因素)。图5显示了各风险组中存活对象百分数与时间(以年计)关系图。用低剂量IL-2治疗对象的数据以实线表示。化疗治疗对象的数据以虚线表示。
发明详述
除非另有指出，可采用本领域技术人员已知的药学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学常规方法实施本发明。参考文献已全面解释了这些技术。参见，例如Handbook of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷，(D.M.Weir和CC.Blackwell编，Blackwell Scientific Publications)；A.LLehninger，Biochemistry(《生物化学》)(Worth Publishers，Inc.，最新版)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第二版，1989)；Methods In Enzymology(《酶学方法》)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)。
在本文的上下文中引用的所有出版物、专利和专利申请均全文纳入本文作为参考。
I.定义
描述本发明时会用到以下术语，这些术语的定义如下所示。
必须注意，除非另有明确指示，本说明书和附加的权利要求书中使用的单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数形式。因此，例如提及“一种化疗剂”包括两种或多种药物的混合物，等等。
本文所用的术语“IL-2”是衍生自淋巴因子的蛋白质，其由正常的外周血淋巴细胞产生，体内存在浓度低。IL-2由Morgan等，(1976)Science 193：1007-1008首次发现，因其能诱导被激活的T淋巴细胞增殖原先称为T细胞生长因子。其是报道分子量为13,000-17,000(Gillis和Watson(1980)J.Exp.Med.159：1709)的蛋白质，等电点为6-8.5。该定义包括全长IL-2蛋白及其生物学活性片段。该术语也包括IL-2的表达后修饰，例如糖基化、酰化、磷酸化等。此外，为本发明的目的，该术语“IL-2”指包含天然序列的修饰，例如缺失、添加和取代(通常是保守性的)的蛋白质，只要该蛋白保留了生物学活性，即抗肿瘤活性。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是意外的，例如通过产生该蛋白质的宿主突变或因PCR扩增错误所致。
本文用术语“衍生自”来鉴定某分子的最初来源，但不表示对制备该分子方法的限制，这些方法可以是，例如化学合成或重组方法。
术语“变体”、“类似物”和“突变蛋白”指参比分子的生物学活性衍生物，其保留了所需活性，例如治疗本文所述肾细胞癌的抗肿瘤活性。术语“变体”和“类似物”通常指与天然分子相比，具有天然多肽序列和结构并含有一个或多个氨基酸添加、取代(通常是保守性的)和/或缺失的化合物，只要这些修饰不破坏生物学活性并且如下文所述与参比分子“基本上同源”。当两条序列比对时，这种类似物的氨基酸序列通常与参比序列具有高度序列同源性，例如50％以上、通常是60％-70％以上、甚至更特别80％-85％或更高，例如至少90％-95％或更高。如本文所解释的，类似物常包含相同数目的氨基酸，但可包含取代。术语“突变蛋白”还包括含有一个或多个氨基酸样分子(包括但不限于只含有氨基和/或亚氨基分子的化合物)的多肽、含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸等)的多肽、含有取代的连接键以及本领域已知的其它修饰(天然产生和非天然产生(例如，合成)的环化、支链分子等)的多肽。该术语也包括含有一个或多个N-取代的甘氨酸残基的分子(“拟肽”)和其它合成氨基酸或肽。(拟肽的描述可参见例如美国专利号5,831,005；5,877,278和5,977,301；Nguyen等，Chem Biol.(2000)7：463-473；Simon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：9367-9371)。所述类似物或突变蛋白最好至少具有与天然分子相同的抗肿瘤活性。下文描述本领域已知的制备多肽类似物和突变蛋白的方法。
如上所述，类似物通常包含保守性取代，即发生侧链相似的氨基酸家族内的那些取代。具体地说，氨基酸通常分为4个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)无电荷极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、色氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同分类为芳族氨基酸。例如，可以合理地预计分别用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸，或用结构上相关的氨基酸类似地保守性取代某氨基酸对生物学活性不会产生大的影响。例如，感兴趣的多肽可包含最多约5-10个保守性或非保守性氨基酸取代，或者甚至最多约15-25个保守性或非保守性氨基酸取代，或者是5-25之间的任何整数，只要该分子的所需功能维持完整。通过参考本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle图，本领域技术人员不难确定感兴趣分子中能耐受改变的区域。
“衍生物”指对感兴趣的天然多肽、该天然多肽的片段或它们各自的类似物的任何合适修饰，例如糖基化、磷酸化、聚合物偶联(如与聚乙二醇)、或添加其它外来部分，只要能保留该天然多肽所需的生物学活性。本领域通常有制备多肽片段、类似物和衍生物的方法。
“片段”指只由完整的全长序列和结构的一部分构成的分子。片段可以包含天然多肽的C-末端缺失、N-末端缺失和/或内部缺失。具体蛋白质的活性片段通常包含全长分子的至少约5-10个毗连氨基酸残基，优选全长分子的至少约15-25个毗连氨基酸残基，最优选全长分子的至少约20-25个或更多个毗连氨基酸残基，或者是5个氨基酸残基和全长序列之间的任何整数，只要所述片段保留了本文定义的生物学活性，例如抗肿瘤活性。
“基本上纯化的”通常指分离某物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物)，使该物质在其所处样品中占主要百分比。某样品中，基本上纯化的组分通常占该样品的50％、优选80％-85％、更优选90-95％。本领域熟知纯化感兴趣多核苷酸和多肽的技术，包括，例如离子交换层析、亲和层析和根据密度沉淀。
当“分离的”指多肽时，表示所述分子与天然发现该分子的完整生物已分离或离散，或者所述分子基本上不含相同类型的其它生物大分子。多核苷酸有关的术语“分离的”指完全或部分缺乏天然与其正常相连序列的核酸分子；或天然存在，但其中连接有异源序列的序列；或与染色体脱离的分子。
“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽部分间的相同性百分比。当两条核酸序列或两条多肽序列在确定长度上显示至少约50％、优选至少约75％、更优选至少约80％-85％、优选至少约90％、最优选至少约95％-98％序列相同性时，这些分子彼此“基本上同源”。本文所用的“基本上同源”也指显示与指定序列完全相同的序列。
“相同性”通常分别指两条多核苷酸或多肽序列间核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的精确一致性。相同性百分比可通过以下步骤直接比较两个分子(参比序列和与该参比序列的相同性％未知的序列)之间的序列信息来确定：比对序列，记下两条比对序列间的确切匹配数目，除以参比序列的长度并将结果乘以100。可用易得到的计算机程序来帮助分析，例如Dayhoff，M.O.的Atlas ofProtein Sequence and Structure(《蛋白质序列和结构图集》)，(M.O.Dayhoff编.，5增刊3：353-358，National biomedical Research Foundation，华盛顿，哥伦比亚特区)中的ALIGN，该程序采用了Smith和Waterman(Advances in Appl.Math.2：482-489，1981)的用于肽分析的局部同源性算法。确定核苷酸序列相同性的程序可用Wisconsin Sequence Analysis Package(威斯康星序列分析包)，第八版(得自Genetics Computer Group，Madison，WI)中，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖Smith和Waterman算法。采用生产商推荐的和以上威斯康星序列分析包中描述的默认参数不难使用这些程序。例如，具体核苷酸序列与参比序列的相同性百分比可用Smith和Waterman同源性算法确定，该算法采用默认评分表和6个核苷酸位置的空位罚分。
本发明内容中测定相同性百分比的另一方法是用John F.Collins和Shane S.Sturrok开发的，爱丁堡大学版权所有，由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)分销的MPSRCH程序包。这套程序包可用Smith-Waterman算法，其中评分表使用默认参数(例如，空位开放罚12分、空位延伸罚1分、一个空位罚6分)。产生“匹配”值数据反映了“序列相同性”。本领域通常知道采用默认参数计算序列之间相同性或类似性百分比的其它合适程序，例如另一比对程序是BLAST。例如，BLASTN和BLASTP可使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截取值＝60；预期值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50条序列；分拣标准＝高评分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的细节不难获得。
或者，可通过在同源区域之间形成稳定双螺旋的条件下杂交二多核苷酸，然后用单链特异性核酸酶消化并测定消化片段的大小来确定同源性。可在，例如具体系统规定的严谨性条件下用Sourthern杂交实验来鉴定基本上同源的DNA序列。本领域技术人员能确定合适的杂交条件。参见，例如Sambrook等，同上；DNA Cloning(《DNA克隆》)，同上；Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)，同上。
本文用于描述核酸分子的“重组体”指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，按照其来源或操作方法，所述多核苷酸不含与其天然相连的全部或部分多核苷酸。用于蛋白质或多肽的术语“重组体”指重组多核苷酸表达产生的多肽。如下文进一步描述的，通常克隆感兴趣的基因，然后在转化的生物中表达。宿主生物在表达条件下可表达外来基因产生蛋白质。
本文所用的“肾功能受损”指肾小球滤过率不足的患者。在本文这种患者的特征在于血清肌酸酐水平(SCr)大于1.5mg/dL。
“抗肿瘤活性”指使细胞增殖速率降低，因而使现有肿瘤或治疗期间产生的肿瘤的生长速率降低，和/或破坏现有赘生物(肿瘤)细胞或新形成赘生物细胞，因而在治疗期间减小了肿瘤的总体积。可利用动物模型，例如人肾细胞癌的异种模型来评估这种活性。动物模型的描述可参见，例如Pulkkanen等，In Vivo(2000)14：393-400和Everitt等，Toxicol.Lett.(1995)82-83：621-625。
“治疗有效剂量或用量”的IL-2或其变体指如本文所述给药时能引起阳性治疗反应，例如抗肿瘤活性的用量。
本文所用的术语“肿瘤反应”指所有可检测病灶减少或消除。肿瘤反应的标准以WHO Reporting Criteria(WHO报道标准)为基础[WHO OffsetPublicaion，48-World Health Organization，日内瓦，瑞士，(1979)]。每次评估时检测所有病灶的一维或两维测量值是理想的。当某器官中存在多个病灶时，不可能进行这种检测，在这种情况下，应最多选择6个代表性病灶(如果可得到)。
本文所用的术语“完全反应”(CR)指通过至少间隔4周的两次评估检测到所有临床可检测的恶性疾病消失。
本文所用的术语“部分反应”(PR)指通过至少间隔4周的至少两次连续评估检测到所有可检测病灶的最长垂直直径的乘积总和比基线降低50％或更多，所述疾病未见可评估疾病进展和任何新病灶的证据。评估应显示溶解性病灶(lytic lesion)的大小有部分降低，溶解性病灶再钙化或增殖病灶的密度降低。IL-2在转移性疾病部位导致短暂炎症不稀奇。各病灶显示体积增大不一定能取消PR认定，除非在间隔至少28天的连续两次检测中证明病灶增大。
本文所用的术语“进行性疾病”(PD)指间隔至少28天的至少连续两次评估检测到病灶大小的至少一个两维(最长垂直直径的乘积)或一维测量值增加25％或更多；任何可评估值显示病灶明显恶化；已消失的任何病灶再现；或出现新病灶。
本文所用的术语“稳定的疾病”(SD)或“无变化”指(a)通过两维检测病灶时所有可检测病灶的最长垂直直径的乘积总和降低小于约50％或增加小于约25％，和指(b)通过一维检测病灶时所有病灶的直径总和降低小于约50％或增加小于约25％。不应出现新的病灶。不存在完全反应、部分反应或进展。由于骨病灶对治疗的反应慢，应从开始治疗至少过去8周后才适用名称“无变化”。
本文所用的术语“无反应者”表示疾病稳定或反应微小的患者(肿瘤边界的缩小大于25％但小于50％)。
本文所用的术语“进展”表示与观察到的最小总和或基线相比，所有可检测病灶的乘积总和增加了25％(如果未降低的话)；任何可评估病灶明显恶化；已消失的任何病灶再现；或出现任何新的病灶或部位，包括不可评估疾病的新部位；和/或可能发生早期肿瘤红肿(initial tumor flare)(高钙血症、骨痛、皮肤病灶红斑)的情况中，症状必须持续4周或者必须有进展的其它证据。
本文所用的术语“总反应”表示考虑了恶性疾病所有部位的反应。在可检测疾病患者中，最差的反应应是总反应。不可检测病灶无变化不会降低可检测病灶的部分反应；即总反应将是部分反应。不可检测病灶无变化会降低可检测病灶的完全反应，即总反应将是部分反应。
本文所用的术语“反应持续时间”表示从首次证明最佳目标肿瘤反应到(病灶)进展的时间。
本文所用的术语“存活”表示从首次给予IL-2到死亡的时间。
对于反应者，本文所用的术语“无进展存活期”(PFS)表示从首次给予IL-2到肿瘤进展、死亡或患者最后一次临床就诊(如果仍有反应的话)的时间。
II.本发明实施方式
详细描述本发明之前，应知道本发明不限于具体制剂或过程参数，因为这些当然可变。也应知道本文所用的术语只是为描述本发明的具体实施方式，而不是限制性的。
虽然可利用本文所述那些相似或等价的许多方法和材料来实施本发明，但本文所述的是优选的材料和方法。
本发明基于发现给予低剂量IL-2能安全有效地治疗肾细胞癌的新治疗方法。与高剂量IL-2治疗相比，本文所述的治疗方案能明显抑制肿瘤生长且毒性较低而不良副作用减少。
虽然本发明方法涉及治疗已有肿瘤，但应知道这些方法可用于预防治疗期间产生的其它肿瘤生长。本发明方法特别可用于治疗肾功能受损和/或不能耐受高剂量IL-2治疗的转移性肾细胞癌对象。
本发明方法所用的IL-2可以是天然或通过重组技术获得的，可以是任何来源，包括哺乳动物来源，例如小鼠、大鼠、家兔、灵长类、猪和人。本领域熟知的许多物种的IL-2序列包括但不限于以下序列：人IL-2(智人(Homo sapiens)；前体序列，GenBank登录号AAH66254(序列)残基21-153代表的成熟序列)；恒河猴IL-2(猕猴(Macaco mulatto)；前体序列，GenBank登录号P51498；GenBank登录号P51498序列残基21-154代表的成熟序列)；橄榄狒狒(olive baboon)IL-2(东非狒狒(Papio anubis)；前体序列，GenBank登录号Q865Y1；GenBank登录号Q865Y1序列残基21-154代表的成熟序列)；乌黑白眉猴(sooty mangabey)IL-2(白顶白睑猴(Cercocebus torquatus atys)；前体序列，GenBank登录号P46649；GenBank登录号P46649序列残基21-154代表的成熟序列)；食蟹弥猴IL-2(食蟹猴(Macaca fascicularis)；前体序列，GenBank登录号Q29615；GenBank登录号Q29615序列残基21-154代表的成熟序列)；白掌长臂猿(common gibbon)IL-2(白掌长臂猿(Hylobates lar)；前体序列，GenBank登录号ICGI2；GenBank登录号ICGI2序列残基21-153代表的成熟序列)；普通松鼠猴(common squirrelmonkey)IL-2(普通松鼠猴(Saimiri sciureus)；前体序列，GenBank登录号Q8MKH2；GenBank登录号Q8MKH2序列残基21-154代表的成熟序列)；奶牛IL-2(牛(Bos taurus)；前体序列，GenBank登录号P05016；GenBank登录号P05016序列残基21-155代表的成熟序列；也参见GenBank登录号NP-851340报道的变体前体序列；GenBank登录号NP-851340序列残基24-158代表的成熟序列)；水牛IL-2(中国水牛(Bubalus bubalis)；前体序列，GenBank Q95KP3；GenBank Q95KP3序列残基21-155代表的成熟序列)；马IL-2(马(Equuscaballus)；前体序列，GenBank登录号P37997；GenBank登录号P37997序列残基21-149代表的成熟序列)；山羊IL-2(山羊(Copra hircus)；前体序列，GenBank登录号P36835；GenBank登录号P36835序列残基21-155代表的成熟序列)；绵羊IL-2(绵羊(Ovis aries)；前体序列，GenBank登录号P19114；GenBank登录号P19114序列残基21-155代表的成熟序列)；猪IL-2(家猪(Sus scrofa)；前体序列，GenBank登录号P26891；GenBank登录号P26891(序列)残基21-154代表的成熟序列)；赤鹿(red deer)IL-2(马鹿(Cervus elaphus)；前体序列，GenBank登录号P51747；GenBank登录号P51747序列残基21-162代表的成熟序列)；狗IL-2(狗(Canis familiaris)；前体序列，GenBank登录号Q29416；GenBank登录号Q29416序列残基21-155代表的成熟序列)；猫IL-2(家猫(Felis catus)；前体序列，GenBank登录号Q07885；GenBank登录号Q07885序列残基21-154代表的成熟序列)；家兔IL-2(家兔(Oryctolagus cuniculus)；前体序列，GeniBank登录号O77620；GenBank登录号O77620序列的残基21-153代表成熟序列)；逆戟鲸IL-2(逆戟鲸(Orcinus orca)；前体序列，GenBank登录号O97513；GenBank登录号O97513序列残基21-152代表的成熟序列)；北方海象IL-2(象海豹(Mirounga angustirostris)；前体序列，GenBank登录号O62641；GenBank登录号O62641序列残基21-154代表的成熟序列)；家鼠IL-2(小鼠(Musmusculus)；前体序列，GenBank登录号NP_032392；GenBank登录号NP_032392序列残基21-169代表的成熟序列)；西方野生小鼠IL-2(小鼠(Mus spretus)；前体序列，GenBank登录号Q08867；GenBank登录号Q08867序列残基21-166代表的成熟序列)；挪威大鼠IL-2(褐家鼠(Rattus norvegicus)；前体序列，GenBank登录号P17108；GenBank登录号P17108(序列)残基21-155代表的成熟序列)；蒙古沙鼠IL-2(长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)；前体序列，GenBank登录号Q08081；GenBank登录号Q08081(序列)残基21-155代表的成熟序列)；上述GenBank登录号中公开的任何变体IL-2多肽；各份GenBank报道全文纳入本文作为参考。虽然可用任何来源的IL-2实施本发明，但优选IL-2衍生自人来源，特别是当接受治疗的对象是人时。在一些实施方式中，用于本发明方法的IL-2经重组产生，例如重组人IL-2蛋白，包括但不限于从微生物宿主获得的。
本发明方法所用的组合物可包含IL-2的生物学活性变体，包括任何物种IL-2的变体。这种变体应保留天然多肽的所需生物学活性，从而使得将含有变体多肽的药物组合物给予对象时的疗效与含有天然多肽的药物组合物相同。即，变体多肽以类似于天然多肽所观察到的方式在该药物组合物中用作治疗活性组分。本领域有测定变体多肽是否保留所需生物学活性，由此可在药物组合物中用作治疗活性组分的方法。可采用为检测天然多肽或蛋白质活性而专门设计的试验来测定生物学活性，所述试验包括本发明所述的试验。此外，可检验用生物学活性天然多肽产生的抗体与变体多肽结合的能力，能有效结合表明多肽的构象类似于天然多肽。
天然或天然产生的IL-2的合适生物学活性变体可以是以上定义的该多肽的片段、类似物和衍生物。
例如，可通过在克隆的编码感兴趣天然多肽的DNA序列中产生突变来制备该多肽的氨基酸序列变体。本领域熟知诱变与改变核苷酸序列的方法。参见，例如纳入本文作为参考的Walker和Gaastra编，(1983)，Techniques in Molecular Biology《(分子生物学技术)》，(MacMillan Publishing Company，纽约)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等，(1987)Methods Enzymol.154：367-382；Sambrook等，(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，(冷泉港，纽约)；美国专利号4,873,192；及该处引用的参考文献。不影响感兴趣多肽生物学活性的适当氨基酸取代的指导可见纳入本文作为参考的Dayhoff等，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质序列和结构图》)，(Natl.Biomed.Res.Found.，华盛顿，哥伦比亚特区)的模型。优选保守性取代，例如用具有相似特性的另一氨基酸取代一个氨基酸。保守性取代的例子包括但不限于：GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
本领域有关于通过残基取代、缺失或插入来改变IL-2蛋白区域的指导。参见，例如以下文献讨论的结构/功能关系和/或结合研究：Bazan(1992)Science257：410-412；McKay(1992)Science 257：412；Theze等(1996)Immunol.Today17：481-486；Buchli和Ciardelli(1993)Arch.Biochem.Biophys.307：411-415；Collins等(1988)Proc.Natl.Acad，Sci USA 85：7709-7713；Kuziel等(1993)JImmunol.150：5731；Eckenberg等(1997)Cytokine 9：488-498，这些文献的内容全文纳入本文作为参考。
在感兴趣IL-2多肽变体的构建中，制作修饰以使变体继续具有所需活性。在编码变体多肽的DNA中进行的任何突变显然不应将序列置于读框外，优选不产生可能产生二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利公布号75,444。
IL-2的生物学活性变体与用作比较基础的参比IL-2多肽分子，例如天然人IL-2的氨基酸序列有至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％-95％或更高、最优选至少约98％、99％或更高的氨基酸序列相同性。可用Smith-Waterman同源性检索算法以仿射空位检索测定序列相同性百分比，检索用的参数为空位开放罚分12、空位延伸罚分2和BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性检索算法的说明见Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.(1981)2：482-489。例如，变体可有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个残基，如6-10，少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基不同。
对于两条氨基酸序列的最佳比对，与参比氨基酸序列相比，变体氨基酸序列的毗连区段可具有相同数目的氨基酸、额外的氨基酸残基或删除的氨基酸残基。用于和参比氨基酸序列比较的毗连区段包含至少20个毗连氨基酸残基，可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可对保守残基取代或空位相关的序列相同性进行校正(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。感兴趣的天然IL-2多肽的生物学活性变体与天然多肽可有少至1-15个氨基酸、少至1-10个，如6-10个，少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基不同。
具有IL-2活性的多肽的精确化学结构取决于许多因素。由于分子中存在可电离的氨基和羧基，可获得具体多肽的酸性或碱性盐，或中性形式。本文所用具有IL-2活性的多肽定义包括在合适环境条件下保留它们生物学活性的所有这种制品。此外，可用糖组分衍生(糖基化)或通过其它添加分子，例如脂质、磷酸、乙酰基等来扩增该多肽的一级氨基酸序列。也可通过与糖偶联来扩增。这种扩增在某些方面可通过生产性宿主的翻译后加工系统来实现；可在体外引入其它这样的修饰。在任何情况中，只要多肽的IL-2活性未受破坏，本文所用IL-2多肽的定义便包括这种修饰。在各种试验中，预计这种修饰可通过提高或降低多肽的活性从而定性或定量地影响其活性。此外，可通过氧化、还原或其它衍生方法来修饰链中的单个氨基酸残基，可切割该多肽得到保留活性的片段。这种不破坏活性的改变不应将这种多肽序列排除在本文所用感兴趣的IL-2多肽的定义之外。
本领域为多肽变体的制备和应用提供了基本指南。在制备IL-2变体过程中，本领域技术人员不难确定对天然蛋白的核苷酸或氨基酸序列的哪种修饰所产生的变体将适合用作本发明方法所用的药物组合物中的治疗活性组分。
本发明方法所用的IL-2或其变体可以是任何来源，但优选重组产生。“重组IL-2”或“重组IL-2变体”指通过如Taniguchi等(1983)Nature 302：305-310和Devos(1983)Nucleic Acids Research 11：4307-4323所述的重组DNA技术产生，具有与天然序列IL-2相当生物学活性的白介素-2或其变体，或如Wang等(1984)Science 224：1431-1433所述突变的IL-2。如本文所述，通常克隆IL-2的编码基因，然后在转化的生物中表达，优选微生物，最优选大肠杆菌。该宿主生物能在表达条件下表达外来基因以产生IL-2。也可在真核生物，例如酵母或人细胞中制备合成的重组IL-2。培养、收集、破裂细胞或从中提取IL-2的方法基本上描述于，例如美国专利号4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,798；4,748,234和4,931,543；这些专利全文纳入本文作为参考。
变体IL-2蛋白的例子可参见欧洲专利(EP)公布号EP 136,489(其公开了天然IL-2的氨基酸序列中一种或多种以下改变：Asn26到Gln26；Trp121到Phe121；Cys58到Ser58或Ala58；Cys105到Ser105或Ala105；Cys125到Ser125或Ala125；删除Arg120以后的所有残基；及其Met-1形式)；1983年10月13日提交的欧洲专利申请号83306221.9(1984年5月30日以公布号EP 109,748公布)描述的重组IL-2突变蛋白，该申请等同于比利时专利号893,016和共有的美国专利号4,518,584(该专利公开了重组人IL-2突变蛋白，其中按照天然人IL-2编号的125位半胱氨酸缺失或用中性氨基酸取代；丙氨酰基-ser125-IL-2；和des-丙氨酰基-ser125-IL-2)。也可参见美国专利号4,752,585(其公开了以下变体IL-2蛋白：ala104ser125IL-2、ala104IL-2、ala104 ala125IL-2、val104 ser125IL-2、val104IL-2、val104 ala125IL-2、des-ala1 ala104 ser125IL-2、des-ala1 ala104 IL-2、des-ala1 ala104 ala125 IL-2、des-ala1 val104 ser125 IL-2、des-ala1 val104 IL-2、des-ala1 val104 ala125 IL-2、des-ala1 des-pro2 ala104 ser125 IL-2、des-ala1des-pro2 ala104 IL-2、des-ala1 des-pro2 ala104 ala125 IL-2、des-ala1 des-pro2val104 ser125 IL-2、des-ala1 des-pro2 val104 IL-2、des-ala1 des-pro2 val104ala125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 ala104 ser125 IL-2、des-ala1 des-pro2des-thr3 ala104 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 ala104 ala125 IL-2、des-ala1des-pro2 des-thr3 val104 ser125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 val104 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 val104 ala125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4ala104 ser125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 ala104 IL-2、des-ala1des-pro2 des-thr3 des-ser4 ala104 ala125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4val104 ser125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 val104 IL-2、des-ala1des-pro2 des-thr3 des-ser4 val104 ala125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4des-ser5 ala104 ser125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 ala104IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 ala104 ala125 IL-2、des-ala1des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 val104 ser125 IL-2、des-alal des-pro2 des-thr3des-ser4 des-ser5 val104 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 val104ala125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 ala104 ala125IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 ala104 IL-2、des-ala1des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 ala104 ser125 IL-2、des-ala1 des-pro2des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 val104 ser125 IL-2、des-ala1 des-pro2 des-thr3des-ser4 des-ser5 des-ser6 val104 IL-2和des-a1al des-pro2 des-thr3 des-ser4des-ser5 des-ser6 val104 ala125 IL-2)和美国专利号4,931,543(其公开了本文实施例所用的IL-2突变蛋白：des-丙氨酰基-1，丝氨酸-125人IL-2以及其它IL-2突变蛋白)。
也可参见欧洲专利公布号EP 200,280(1986年12月10日公布)，其公开了104位甲硫氨酸被保守性氨基酸取代的重组人IL-2突变蛋白。例子包括以下突变蛋白：ser4 des-ser5 ala104 IL-2；des-ala 1des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5ala104 ala125 IL-2；des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 glu104 ser125IL-2；des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 glu104 IL-2；des-ala1 des-pro2des-thr3 des-ser4 des-ser5 glu104 ala125 IL-2；des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4des-ser5 des-ser6 ala 104ala 125IL-2；des-ala 1des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5des-ser6 ala104 IL-2；des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 ala104ser125 IL-2；des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glu104 ser125IL-2；des-ala1 des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glu104 IL-2；和des-ala1des-pro2 des-thr3 des-ser4 des-ser5 des-ser6 glu104 ala125 IL-2。也参见欧洲专利公布号EP 118,617和美国专利号5,700,913，其公开了用丙氨酸替代天然分子中发现的甲硫氨酸作为N-末端氨基酸的未糖基化人IL-2变体；删除了起始甲硫氨酸而使N-末端氨基酸是脯氨酸的未糖基化人IL-2；在N-末端甲硫氨酸和脯氨酸之间插入丙氨酸的未糖基化人IL-2变体。
其它IL-2突变蛋白包括WO 99/60128公开的(用组氨酸或异亮氨酸取代20位的天冬氨酸，用精氨酸、甘氨酸或异亮氨酸取代80位的天冬酰胺，或用亮氨酸或谷氨酸取代126位的谷氨酰胺)，据报道这些突变蛋白对表达T细胞受体的细胞(优选NK细胞)所表达的高亲和力IL-2受体有选择活性并且IL-2毒性降低；美国专利号5,229,109公开的突变蛋白(用丙氨酸取代38位的精氨酸，用赖氨酸取代42位的苯丙氨酸)，与天然IL-2相比，这些突变蛋白显示与高亲和力IL-2受体的结合降低但仍保留了刺激LAK细胞的能力；国际公布号WO00/58456公开的突变蛋白(天然IL-2中天然产生的(x)D(y)序列改变或缺失，其中D是天冬氨酸，(x)是亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸或缬氨酸，(y)是缬氨酸、亮氨酸或丝氨酸)，据称这些突变蛋白能减轻血管渗漏综合征；国际公布号WO00/04048公开的IL-2p1-30肽(对应于IL-2的前30个氨基酸，含有IL-2的完整a-螺旋A，能与IL-2受体的b链相互作用)，据报道这些突变蛋白能刺激NK细胞和诱导LAK细胞；和WO 00/04048公开的IL-2p1-30肽的突变形式(用赖氨酸取代20位的天冬氨酸)，据报道这些突变形式不诱导血管出血但保留了产生LAK细胞的能力。此外，可用聚乙二醇修饰IL-2以提高其溶解性并改变药物动力学分布(参见美国专利号4,766,106)。
2004年3月5日提交的美国临时申请系列号60/550,868公开了预计毒性降低的IL-2突变蛋白的其它例子，该份申请全文纳入本文作为参考。这些突变蛋白包含成熟的人IL-2的氨基酸序列，其中该成熟的人IL-2序列中用丝氨酸取代125位半胱氨酸，而且至少还有一个其它氨基酸取代，与相似用量的des-丙氨酰基-1，C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，该突变蛋白在相同试验条件下具有以下功能特征：1)维持或提高天然杀伤(NK)细胞的增殖，和2)诱导NK细胞产生的促炎细胞因子水平降低。在一些实施方式中，其它取代选自：T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、I24L、K32A、K32W、N33E、P34E，.P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65LP65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95P、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中的氨基酸残基位置按照成熟的人IL-2氨基酸序列编号。在其它实施方式中，这些突变蛋白包含成熟的人IL-2的氨基酸序列，其中该成熟的人IL-2序列中用丙氨酸取代125位半胱氨酸，而且至少还有一个其它氨基酸取代，从而使该突变蛋白具有这些相同的功能特征。在一些实施方式中，其它取代选自：T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、I24L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36.W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R，.E62T、E62Y；，K64D、K64E、K64G、K64L，.K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中的氨基酸残基位置按照成熟的人IL-2氨基酸序列编号。在其它实施方式中，这些突变蛋白包含成熟的人IL-2，其中在所述成熟的人IL-2序列中至少有一个其它氨基酸取代，从而使该突变蛋白具有这些相同的功能特征。在一些实施方式中，其它取代选自：T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、I24L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L3.6S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R，.E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L8QK、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中的氨基酸残基位置按照成熟的人IL-2氨基酸序列编号。美国临时申请系列号60/550,868公开的其它突变蛋白包括以上鉴定的突变蛋白，除了含有起始丙氨酸；成熟的人IL-2序列的1位残基缺失。
本文所用的术语IL-2也应包括IL-2融合体或偶联物，包括将IL-2与第二蛋白融合或与聚脯氨酸或水溶性聚合物共价偶联以降低给药频率或提高IL-2耐受性。例如，可采用本领域已知的方法将IL-2(或其本文定义的变体)与人白蛋白或白蛋白片段融合(参见WO 01/79258)。或者，可采用本领域已知的方法将IL-2与聚脯氨酸或聚乙二醇均聚物和聚氧乙烯化多元醇共价偶联，其中所述均聚物是未取代的或在一端用烷基取代，所述多元醇是未取代的(例如参见美国专利号4,766,106；5,206,344；4,894,226和5,830,452)。
本发明方法可利用含有IL-2作为治疗活性组分的任何药物组合物。本领域已知这种药物组合物；包括但不限于纳入本文作为参考的美国专利号4,745,180；4,766,106；4,816,440；4,894,226；4,931,544和5,078,997公开的。因此，可将本领域已知的含有IL-2或其变体的液体、冻干或喷雾干燥的组合物制备为水性或非水性溶液或混悬液，随后按照本发明方法给予对象。各种组合物含有IL-2或其变体作为治疗或预防活性组分。“治疗或预防活性组分”指专门掺入组合物的IL-2或其变体，当将该药物组合物给予对象时能在该对象体内产生对于疾病或病症的治疗或预防所需的治疗或预防反应。药物组合物优选包含适当的稳定剂、填充剂，或二者以尽可能减少与制备和保存期间蛋白质稳定性和生物学活性丧失相关的问题。
在本发明优选的实施方式中，本发明方法所用的含IL-2的药物组合物是含有稳定的单体IL-2或其变体的组合物，含有多聚IL-2或其变体的组合物，和含有稳定冻干的或喷雾干燥的IL-2或其变体的组合物。
2000年10月3日提交的PCT申请号PCT/USOO/27156公开了含有稳定的单体IL-2或其变体的药物组合物，其内容纳入本文作为参考。“单体”IL-2指在本文所述药物组合物中蛋白质分子基本上以其单体形式而不是凝聚形式存在。因此不存在IL-2的共价或疏水性寡聚物或凝聚物。简言之，以用量足以降低保存期间IL-2或其变体形成凝聚物的氨基酸碱配制这些液体组合物中的IL-2或其变体。氨基酸碱是一种氨基酸或氨基酸混合物，其中任何给定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。优选的氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。这些组合物还包含缓冲剂以将液体组合物的pH维持在能稳定IL-2或其变体的可接受范围内，其中所述缓冲剂是基本上不含其盐形式的酸、盐形式的酸或酸及其盐形式的混合物。所述酸宜选自琥珀酸、柠檬酸、磷酸和谷氨酸。本文将这类组合物称为稳定的单体IL-2药物组合物。
这些组合物中的氨基酸碱用于在液体药物组合物保存期间稳定IL-2或其变体以免形成凝聚物，而利用基本上不含其盐形式的酸、盐形式的酸或酸及其盐形式的混合物作为缓冲剂可导致液体组合物具有接近等渗的重量克分子渗透压浓度。该液体药物组合物还可掺有其它稳定剂(具体说是甲硫氨酸)，非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯80和EDTA来进一步稳定该多肽。据说这种液体药物组合物稳定，因为联合加入了氨基酸碱和基本上不含其盐形式的酸、盐形式的酸或酸及其盐形式的混合物导致该组合物与不联用这两种组分配制的液体药物组合物相比保存稳定性升高。
含有稳定的单体IL-2或其变体的这些液体药物组合物可以水性液体形式，或待以后使用的冷冻状态保存，或以后可重建为液体形式的干燥形式，或适合按照本发明方法给予对象的其它形式来使用。“干燥形式”指通过以下方式干燥的液体药物组合物或制剂：冷冻干燥(即，冻干；参见，例如Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.55：48-59)、喷雾干燥(参见Masters(1991)刊于Spray-Drying Handbook(《喷雾干燥手册》)(第五版；Longman Scientific andTechnical，Essez，英国)，第491-676页；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.75：1169-1206；和Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.11：12-20)，或空气干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25：459-470；和Roser(1991)Biopharm.4：47-53)。
含有非凝聚单体状态IL-2的IL-2制剂的其它例子包括Whittington和Faulds(1993)Drugs 46(3)：446-514所述的那些制剂。这些制剂包含重组IL-2产品，其中重组IL-2突变蛋白Teceleukin(氨基末端加有甲硫氨酸残基的非糖基化人IL-2)用0.25％人血清白蛋白(冻干粉末，用等渗盐水配制)配制，重组IL-2突变蛋白Bioleukin(氨基末端加有甲硫氨酸残基和用丙氨酸取代人IL-2序列中125位的半胱氨酸残基的人IL-2)与酸混合配制为0.1-1.0mg/ml的IL-2突变蛋白，其中该制剂的pH为3.0-4.0，最好不含缓冲液，电导率低于1000mmhos/cm(最好低于500mmhos/cm)。参见EP 373,679；Xhang等(1996)Pharmaceut.Res.13(4)：643-644；和Prestrelski等(1995)Pharmaceut.Res.12(9)：1250-1258。
共有的美国专利号4,604,377公开了含有多聚IL-2或其变体的药物组合物的例子，该份专利的内容纳入本文作为参考。“多聚”指药物组合物中存在的蛋白质分子以平均10-50个分子缔合成微凝聚形式。这些多聚物以松散结合、物理缔合的IL-2分子存在。冻干形式的这些组合物可以商品名Proleukin(Chiron Coiporation，Emeryville，加利福尼亚)而商品化购得。在该参考文献中公开的冻干制剂包含选择性氧化的、微生物产生的重组IL-2，其中重组IL-2与水溶性载体，例如占主要成分的甘露醇和足够量的十二烷基硫酸钠混合以确保重组IL-2在水中可溶。这些组合物适合于构建成胃肠外给予的水性注射液，在人患者中稳定且耐受良好。重建时，IL-2或其变体保留其多聚状态。本发明方法包括含有多聚IL-2或其变体的这种冻干或液体组合物。本文将这种组合物称为多聚IL-2药物组合物。
本发明方法也可利用含IL-2或其变体的稳定冻干或喷雾干燥的药物组合物，按照本发明方法给予可将这些组合物重建成液体或其它的合适形式。这些药物组合物公开于全文纳入本文作为参考的2000年11月28日提交的待批申请美国系列号09/724,810和2000年11月27日提交的国际申请PCT/US00/35452。这些组合物还可包含至少一种填充剂(bulking agent)、至少一种含量足以在干燥过程中稳定蛋白质的试剂，或二者。“稳定的”指IL-2蛋白或其变体在冻干或喷雾干燥得到固体或干粉形式的组合物后能保留其单体或多聚形式以及质量、纯度和效力等其它关键特性。在这些组合物中，用作填充剂的优选载体物质包括甘氨酸、甘露醇、丙氨酸、缬氨酸或它们的任何组合，最优选甘氨酸。根据所用的试剂，该制剂中填充剂的含量范围是0％-约10％(w/v)。用作稳定剂的优选载体物质包括任何糖或糖醇或任何氨基酸。优选的糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水苏糖、山梨醇、葡萄糖、乳糖、右旋糖或它们的任何组合，优选蔗糖。当稳定剂是糖时，其含量范围是约0％-约9.0％(w/v)、优选约0.5％-约5.0％、更优选约1.0％-约3.0％、最优选约1.0％。当稳定剂是氨基酸时，其含量范围是约0％-约1-0％(w/v)、优选约0.3％-约0.7％、最优选约0.5％。这些稳定的冻干或喷雾干燥组合物可任选包含甲硫氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐的一种，例如EDTA二钠或能保护IL-2或其变体以免甲硫氨酸被氧化的其它螯合剂。以此方式使用这些试剂描述于纳入本文作为参考的待批美国临时申请系列号60/157696。可用缓冲剂配制稳定的冻干或喷雾干燥组合物，这些组合物处于液相时(例如配制期间或干粉形式的组合物重建后)，所述缓冲剂可将该药物组合物的pH维持在可接受范围内，优选在约pH 4.0-pH 8.5之间。选择的缓冲液应使得它们与干燥方法相容，并且不影响蛋白质在加工期间及保存时的质量、纯度、效力和稳定性。
上述稳定的单体、多聚体和稳定的冻干或喷雾干燥的IL-2药物组合物代表了本发明方法所用的合适组合物。然而，本发明方法包括含IL-2或其变体作为治疗活性组分的任何药物组合物。
给药
利用低剂量IL-2或其变体给予治疗上有效的至少一轮治疗。“治疗有效轮次的治疗”指对于治疗肾细胞癌(特别是转移性肾细胞癌)个体，给予时能导致阳性治疗反应的一轮治疗。如本文所述，特别感兴趣的是用能提供抗肿瘤疗效的低剂量IL-2进行一轮治疗。“阳性治疗反应”指按本发明方法进行治疗的个体显示肾细胞癌的一种或多种症状有改善。
因此，例如，“阳性治疗反应”可以是与治疗有关的疾病改善，和/或与治疗有关的疾病的一种或多种症状改善。因此，例如，阳性治疗反应指以下一种或多种疾病改善：(1)肿瘤体积降低；(2)癌细胞数目减少；(3)抑制(即，至一定程度减缓，优选停滞)肿瘤生长；(4)抑制(即，一定程度减缓，优选停滞)癌细胞渗入周围器官；(5)抑制(即，一定程度减缓，优选停滞)肿瘤转移；和(6)一定程度上缓解癌症相关的一种或多种症状。这种治疗反应可以进一步表征为一定程度的改善。因此，例如改善可以表征为完全反应。“完全反应”指对于开始研究时的所有初始异常或阳性部位，通过体检、实验室、核与放射显影研究(即，CT(计算机化断层显像)和/或MRI(磁共振成象))和其它非侵入性方法证实所有可检测或可评估疾病的所有症状或体征消失。或者，疾病的改善可归类为部分反应。“部分反应”指在至少28天中，与治疗前的测量值相比，所有可检测病灶的垂直直径乘积总和降幅大于50％，可评估的疾病无进展，也未形成任何新的病灶。
在本发明的某些实施方式中，含IL-2或其变体的药物组合物是缓释制剂或利用缓释装置给予的制剂。本领域熟知这种装置，包括例如透皮贴片和能以连续、稳定状态的方式长时间递送各种剂量药物的微型可植入泵从而实现非缓释药物组合物的缓释作用。
可按照本领域已知的任何医学上可接受方法给予含IL-2或其变体的药物组合物。合适的给药途径包括胃肠外给药，例如皮下(SC)、腹膜内(IP)、肌肉内(IM)、静脉内(IV)或输注、口服和肺部、鼻部、透皮和栓剂。当组合物经肺部递送给予时，可调整治疗有效剂量从而使血流中药物(例如IL-2或其变体)的可溶性水平等于用胃肠外(例如，SC、IP、IM或IV)给予治疗有效剂量获得的水平。在本发明的一些实施方式中，通过IM或SC注射给予含IL-2或其变体的药物组合物，特别是通过IM或SC注射至癌症治疗方案所用一种或多种治疗药物所给予的局部区域。
影响IL-2给予量的因素包括但不限于：给药方式、给药频率、所治疗的具体疾病、疾病的严重性、病史、患者是否同时用另一药物治疗、所治疗个体的年龄、身高、体重、健康状况和身体条件。随着所治疗对象体重增加，通常优选较高剂量的该药物。
为获得效力，在特定时间内IL-2的血液水平必须在某特定水平以上。效力依赖于剂量，较高水平的IL-2可得到较强的抗肿瘤效力。为尽可能降低毒性，特定时间内IL-2的血液水平必须低于确定水平，并且持续特定时间(必须有“休息期(rest period)”以清除IL-2)。即，在给予下一剂前，药物在某确定时间内必须低于某确定水平。两剂之间的休息期越短，毒性越大。
在某些实施方式中，治疗肾细胞癌患者的方法包括用低剂量IL-2(1-52MIU)进行一轮治疗，然后是休息期以使患者从IL-2的不良作用中“恢复”。可按照每日给药方案给予多剂量的IL-2或其变体，例如每天分1-3剂给予1-52MIU，或更优选9-18MIU的IL-2，每周3-6天，共1-24周，然后是休息期。休息期最好在给药方案之间为1-4周。此后可进行IL-2给药的新方案以再次加强免疫系统。在某些实施方式中，第二轮治疗包括每天分1-3次给予9MIU，每周3-6天，共1-24周，然后是休息期。
在某些实施方式中，治疗肾细胞癌患者的方法包括一轮治疗，用低剂量IL-2(9-18MIU)治疗6周，每周5天每天1次(qd×5天)，然后是不给予IL-2的1-4周“休息期”；和后一轮治疗，包括用9MIU剂量的IL-2治疗6周，每周5天每天1次，然后是不给予IL-2的1-4周休息期。在某些实施方式中，后一轮治疗重复多次，该轮次包括用9MIU剂量的IL-2治疗6周，每周5天每天1次，然后是不给予IL-2的1-4周休息期。
在一优选的实施方式中，通过以下方式治疗肾细胞癌患者：第一，在一周的5天每天给予18MIU剂量的IL-2；第二，在每周中，先每天给予9MIU剂量的IL-2，共2天，再每天给予18MIU剂量的IL-2，共3天，重复5周；第三，3周不给予IL-2；第四，每周的5天每天给予9MIU剂量的IL-2，重复6周；和第五，3周不给予IL-2。
在某些实施方式中，用于治疗肾细胞癌患者的IL-2与聚乙二醇或聚氧乙烯化多元醇共价偶联。在某些实施方式中，用与聚乙二醇或聚氧乙烯化多元醇共价偶联的IL-2的一轮治疗包括每5天-1个月给予1-52MIU的IL-2，重复1-24周，然后是休息期。
在某些实施方式中，采用本文所述任一方法给予患者多轮治疗的时间应足以获得部分肿瘤反应，例如该时间有至少6个月或至少12个月。该时间优选足以获得完全肿瘤反应。
在某些实施方式中，肾细胞癌患者的肾功能受损(SCr＞1.5mg/dL)，对高剂量IL-2治疗不耐受或不适合。可通过本文所述任一方法用低剂量IL-2治疗这种患者。
当按照上述给药方案治疗的患者显示部分反应，或在长期消退后复发时，可能需要后续治疗过程以实现疾病的完全消退。因此，在第一期治疗的停止期后，患者可以再接受一次或多次IL-2治疗。本文将治疗期之间的这种停止期称为中断时期。应知道中断时期的长度取决于任何先前IL-2治疗期所达到的肿瘤反应程度(即，完全还是部分)。
III.实验
下文是实施本发明的具体实施方式的实施例。提供这些实施例只是为了说明目的，而不是要以任何方式限制本发明的范围。
已努力确保所用数值(例如，用量、温度等)的精确性，但当然应考虑到一些实验失误和偏差。
实施例1
IV期人临床试验的IL-2药物组合物
所用的IL-2制剂由加利福尼亚，Emeryville的Chiron Corporation生产，商品名为Proleukin。该制剂中的IL-2是重组产生、非糖基化的人IL-2突变蛋白，称为阿地白介素，其与天然人IL-2氨基酸序列的区别在于删除了起始丙氨酸残基和用丝氨酸残基取代125位的半胱氨酸残基(称为des-丙氨酰基-1，丝氨酸-125人白介素-2)。如全文纳入本文作为参考的美国专利号4,931,543所述，用大肠杆菌表达该IL-2突变蛋白，然后用透析和阳离子交换层析纯化。按商品名Proleukin投入市场的该IL-2制剂提供为无菌、白色到灰白色无防腐剂的冻干粉末，每小瓶含1.3mg蛋白质(22MIU)。
实施例2
IV期人临床试验中用IL-2治疗转移性肾细胞癌患者的选择标准
以下选择标准适用于转移性肾细胞癌患者：
选择标准：
患者证实患有肾细胞癌(透明细胞的、乳头状、混合型或肉瘤样肿瘤)并有转移性疾病的证据；
进入研究4周内确定患者患有可检测或可评估的肿瘤疾病；
患者的Karnofsky体力状态≥60，对应于东部协作肿瘤组织(EasternCooperative Oncology Group)(ECOG)体力状态(PS)是0-2；
患者必须大于18岁；
血清肌酸酐水平低于1.8mg/dL证实患者具有足够的肾功能；
血红蛋白≥10gm/dl；白细胞≥4,000/ml；血小板≥100,000/ml；
促甲状腺激素(TSH)水平正常；和
患者愿意并能书面告知同意参与该项研究，包括全部所需的研究过程和随访。
排除标准
患者以前用Proleukin治疗过；
用计算机化断层显像(CT)和/或磁共振成象(MRI)扫描检测到患者的中枢神经系统中有活动性疾病；
已知患者对Proleukin的任一组分过敏；
患者正同时进行涉及药物研究的临床试验，或者患者在之前的4周内接受了试验用药；
患者以前接受过肾细胞癌的全身性治疗(已接受肾细胞癌手术的患者符合选择标准；已接受放疗至病灶指数消失(non-index lesion)的患者在完成放疗两周后对于研究合格)；
患者患有纽约心脏协会(New York Heart Association)(NYHA)定义的III或IV类心脏病；
已知患者患有自身免疫疾病，例如克罗恩病；
妇女患者处于妊娠期或哺乳期；和
患者患有转移性疾病，并且外科手术摘除转移灶后没有疾病证据。
实施例3
给予人的低剂量IL-2的IV期临床研究
临床研究设计与目标
设计的交替给药的白介素-2(ILIAD)的IV期临床研究是前瞻性、多中心、单臂、标签公开的研究以评估皮下给予转移性肾细胞癌患者低剂量Proleukin的效力和安全性。第一终点是客观反应率(objective response rate)(ORR)≥16％。第二终点包括完全反应(CR)和部分反应(PR)率，反应持续时间、无进展存活(PF)、总存活(OS)和不良反应发生率(AE)。参与者包括社区和科学机构的临床研究人员，大多数是社区临床医师。ILIAD筛选了270位患者，其中登记了267位。
临床前评估包括完整的病史、体检、全血细胞计数(CBC)、血清化学成分、促甲状腺激素(TSH)水平和适当的放射显影研究来证实转移性疾病的部位。治疗期间的评估包括先进行CBC、血清化学成分、TSH和体检，再开始新一轮治疗，各轮治疗的第4周前进行CBC，在各患者接触时评估AE。两轮后，在新的各轮治疗开始前需要作放射显影评估以前确定的转移性疾病部位。病例报告表格记录了转移性疾病的可评估面积和作出这种测定的方法。
ILIAD治疗方案
所有患者按照以下治疗时间表接受Proleukin：
  时间框架   Proleukin治疗
  1轮，1周   18MIU qd×5天
  1轮，2-6周   9MIU qd×2天+18MIU qd×3天
  1轮，7-9周   休息
  后续轮次1-6周   9MIU qd×5天
  后续轮次7-9周   休息
Proleukin以18百万国际单位(MIU)/天给予5天(1周，1轮)、以9MIU/天给予2天，然后以18MIU/天给予3天(2-6周，1轮)和以9MIU/天给予5天(1-6周，轮次≥2)。全部治疗轮次是9周，其中6周治疗，3周不治疗。治疗时间应持续至少两轮。研究人员可自行决定从研究中排除具有进行性疾病的患者，而有反应者继续治疗。每9周评估肿瘤反应直至疾病有进展，最多两年。评估第一年和第二年患者的存活。ILIAD意向治疗(intent-to-treat)(ITT)人群(n＝263位患者)接受至少一剂量的研究药物。
根据该方案规定的指导对毒性修改剂量。经历3级或更高级毒性的患者应停止治疗直至症状消失，随后将剂量减半。如果耐受，逐渐将剂量回升至所述方案剂量。研究人员自行决定剂量的回升速度和最终剂量。按照该方案，任何靶剂量应足够低从而患者能看门诊接受Proleukin，但也应足够高以确保全身性吸收(皮下给药的剂量范围一般是5-10MIU/天)。毒性持续两周以上的患者从该项研究中排除。
收集到总共270位患者的数据。270位患者中有3位未能筛选，4位登记了但从未给药。其余263位患者至少服用一剂量的研究药物，他们符合分析条件(意向治疗人群)。根据263位患者的给药记录，142位患者接受两轮研究药物(符合方案人群(per-protocol population))。65％的意向治疗患者和70.4％符合方案患者因疾病进展或复发而退出。
效力
两轮治疗后，研究人员评估患者的进展或反应(见下表)。反应类别是“完全反应”(CR)、“部分反应”(PR)、“进行性疾病”(PD)、“稳定疾病”(SD)和“未测定”(UD)。
研究人员将263位意向治疗患者中的6位(2.3％)评价为完全反应者，12位(4.6％)评价为部分反应者。48位意向治疗患者(18.3％)具有稳定疾病，156位(59.3％)具有进行性疾病状态。38位(14.4％)意向治疗患者视作未确定，3位(1.1％)未评价。总反应率(完全反应加上部分反应)是6.8％，95％可信限区间(CI)是4.1-10.6％。
研究人员将142位符合方案(即，接受两轮研究药物)患者中的6位(4.2％)评价为完全反应者，11位(7.7％)评价为部分反应者。总反应率(完全反应加上部分反应)是12.0％，95％可信限区间(CI)是7.1-18.5％。
研究人员对最佳反应的评估
  意向治疗(n＝263)   符合方案(N＝142)
  完全反应   6(2.3％)   6(4.2％)
  部分反应   12(4.6％)   11(7.7％)
  稳定疾病   48(18.3％)   37(26.1％)
  进行性疾病   156(59.3％)   87(61.3％)
  未能确定   38(14.4％)   0
  未确定   3(1.1％)   1(0.7％)
  总反应率(95％CI)   6.8(4.1-10.6)   12.0(7.1-18.5)
在263位意向治疗患者中，169位(64.3％)在2年随访期间死亡。在142位符合方案患者中，73位(51.4％)死亡。下表总结了存活的分析结果。
存活
  意向治疗(N＝263)   符合方案(N＝142)
  死亡数   169(64.3％)   73(51.4％)
  存活中值，以年计(95％C.I.)   1.08(0.97，1.27)   1.65(1.39，2.11)
  一年存活率(95％C.I.)   0.54(0.48，60)   0.74(0.67，0.81)
  两年存活率(95％C.I.)   0.32(0.26，0.38)   0.45(0.36，0.55)
肾功能亚组
通过比较肾功能正常(血清肌酸酐(SCr)≤1.5mg/dL)患者与肾功能受损(SCr＞1.5mg/dL)患者的ILIAD研究数据进行亚组分析。肾功能正常和受损亚组的比较分别显示肾切除术(73与70％)，PS＝0(28与23％)，PS＝1(59与60％)和PS＝2-3(13与17％)的频率相似。参见下表。
  ILIAD(ITT)   ILIAD(SCr≤1.5mg/dL)   ILIAD(SCr＞1.5mg/dL)
  可评估的患者   n＝263   n＝209   n＝53
  肾切除术，％   72   73   70
  PS＝0   27   28   23
  PS＝1   59   59   60
  PS＝2-3   14   13   17
比较肾功能正常与受损患者的效力
发现肾功能正常和受损的患者具有相似的结果。图1-3描述了实施上述方案后对肾功能正常(血清肌酸酐(SCr)≤1.5mg/dL)与肾功能受损(SCr＞1.5mg/dL)转移性肾细胞癌患者用较低剂量IL-2治疗后相对效力的比较。与肾功能正常的患者相比，肾功能受损患者的PR(5.7与4.3％)、ORR(7.6与6.7％)、中值PFS(0.34与0.33年)、PFS-1年(28与18％)、PFS-2年(16与10％)和OS-2年(39与31％)、CR(1.9与2.4％)发生率相似或较高。肾功能受损亚组的中值存活(1.0与1.1年)和OS-1年(52与55％)略低。比较肾(功能)亚组的疗效参见下表。
  ILIAD(ITT)   ILIAD(SCr≤1.5mg/dL)   ILIAD(SCr＞1.5mg/dL)
  可评估的患者   n＝263   n＝209   n＝53
  CR％   2.3   2.4   1.9
  PR％   4.6   4.3   5.7
  ORR％   6.8(4.1-10.3)   6.7(3.7-11.0)   7.6(2.1-18.2)
  中值反应持续时间，年   1.7(1.1-1.9)   1.5(1.0-1.7)   NE
  中值PFS，年   0.33(0.31-0.34)   0.33(0.30-0.34)   0.34(0.28-0.66)
  PFS 1年，％   20(15-25)   18   28
  PFS 2年，％   11(7-15)   10   16
  中值存活时间，年   1.1(1.0-1.3)   1.1(0.9-1.3)   1.0(0.9-2.5)
  OS-1年，％   54(48-60)   55   52
  OS-2年，％   32(26-38)   31   39
当以先前肾切除术和体力状态的肾功能亚组为对照时，PFS和OS维持相当。采用标准SAS程序产生的单变量无条件逻辑消退模型来评估ORR的优势比(odds ratio)和Wald 95％可信限区间。当以肾切除术(优势比＝0.52)、PS＝0(优势比＝0.57)和PS＝1(优势比＝0.63)为对照亚组时，肾功能受损患者的ORR在数值上低于肾功能正常患者。然而，这些差异在统计学上不显著，由于肾功能正常(n＝14)和肾功能受损(n＝4)亚组中反应者的数目少，故应小心解释。采用Cox正比危险回归模型获得PFS及OS的危险比和95％可信限区间。当以肾切除术(危险比＝0.86)、非肾切除术(危险比＝1.09)、PS＝0(危险比＝1.15)和PS＝1(危险比＝0.71)为对照亚组时，肾功能受损患者的PFS与肾功能正常患者相似。当以肾切除术(危险比＝0.92)、非肾切除术(危险比＝1.03)、PS＝0(危险比＝1.11)和PS＝1(危险比＝0.82)为对照亚组时，肾功能受损患者的存活率与肾功能正常患者相似。见下表。
ILIAD亚组的单变量评估
(SCr＞1.5与≤1.5mg/dL)
  ORR   优势比   95％Wald CI   患者数目
  肾切除术   0.52   0.11-2.39   189
  非肾切除术   NE   NE   73
  PS＝0   0.57   0.06-5.02   70
  PS＝1   0.63   0.07-5.42   155
  PFS   危险比   95％CI   患者数目
  肾切除术   0.86   0.58-1.27   189
  非肾切除术   1.09   0.61-1.93   73
  PS＝0   1.15   0.58-2.29   70
  PS＝1   0.71   0.47-1.07   155
  OS   危险比   95％CI   患者数目
  肾切除术   0.92   0.58-1.46   189
  非肾切除术   1.03   0.54-1.95   73
  PS＝0   1.11   0.46-2.68   70
  PS＝1   0.82   0.51-1.31   155
NE＝未评估
与病史对照比较
文献检索鉴定到以前未用免疫疗法治疗的肾细胞癌患者研究中使用安慰剂或假安慰剂对照组的8份出版物(Pyrhonen等，(1999)J.Clin.Oncol.17：2859-2867；Motzer等，(1999)J.Clin.Oncol.17：2530-40；Ritchie等，(1999)Lancet353：14-17；Kriegmair等，(1995)Urology 45：758-762；Jones等，(1993)CancerBiother.8：275-288；Gleave等，(1998)New Engl.J.Med.338：1265-1271；Steineck等，(1990)Acta Oncol.29：155-162；Osband等，(1990)Lancet 335：994-998)。在这些公布的研究中对照组的结果极为不同，最有可能是因为对照治疗(不治疗、激素治疗或化疗)、研究设计、患者选择标准和患者以前的治疗有差异。见下表。
病例对照数据
  Ritchie1999   Pyrhonen1999   Motzer1999   Gleave1998   Kriegmair1995   Jones1993   Steineck1990   Osband1990
可评估的患者   n＝168   n＝81   n＝274   n＝90   n＝35   n＝377   n＝30   n＝45
对照   MPA   VLB   化疗或激素疗法 安慰剂   MPA 化疗   MPA   CIM
  PS＝0   UK   UK   0   36   UK   37   UK   54
  PS＝1   UK   UK   71   55   平均值   63   UK   UK
  PS≥2   UK   UK   29   9   UK   0   UK   UK
肾切除术％   57   88   65   78   UK   79   90   75
中值年龄   55-65   62[39-77]   58[18-82]   62   66[47-79]   58[22-82]   62[40-77]   63(34-84)
  CR％   0   1.2   UK   3.3   0   0.80   3.3(0-17)   0
  PR％   7.1   1.2   UK   3.3   0   4.2   0   4.8
  ORR％   7.1   2.4   UK   6.6(2.7-14.5)   0   5.0(3-7)   3.3(0-17)   4.8
中值PFS，年   0.25   0.17   UK   0.16(0.14-0.32)   UK   UK   UK   UK
  PFS 1年，％   10   4.1   UK   4.0   UK   UK   UK   UK
  PFS 2年，％   1.1   4.1   UK   NE   UK   UK   UK   UK
中值存活时间，年   0.54   0.73   0.53(0.43-0.63)   1.3(0.5-1.5)   0.83   0.63   0.58   0.73
  OS-1年，％   31   38   UK   54   30   32   26   45
  OS-2年，％   12   19   UK   9   20   11   16   NE
圆括号中是95％CI，方括号中是范围
UK＝未知，NE＝未评估
MPA＝甲羟孕酮，VLB＝长春碱，CIM＝西米替丁
肾功能正常亚组、肾功能受损亚组和ILIAD ITT群的结果比病例对照组的大多数检测结果更可取。对于ILIAD肾功能亚组和ITT群，PS＝0、PS＝1和先前肾切除术的患者百分比接近该病例对照组范围的中值，提示ILIAD患者群与病例对照的相当(见图3)。相反，ILIAD ITT群和肾功能亚组在大多数效力结果(43/50，86％)数值上比病例对照的更可取(见图4)。与病例对照7/50(14％)的效力结果相比，肾功能亚组和ITT群的结果相同或数值较低：Steineck(1990)研究中的CR；Osband(1990)研究中的PR；Ritchie(1999)研究中的PR和ORR；Gleave(1998)研究中的CR、中值存活率和OS-1年。当终点比较时，对于大多数反应(16/21，76％)、PFS(8/8，100％)和存活率(19/21，90％)结果，ILIAD研究比病例对照更可取。
此外，通过风险组分层的ILIAD患者的存活率高于病例对照。将用低剂量IL-2治疗的患者的存活率与用化疗代替IL-2治疗患者的病例对照组(Jones等，同上所述)的存活率作比较。按照风险因素分层的Jones系统将患者再分为各风险组，该系统基于联合以下鉴定的风险因素：ECOG PS＞1、从诊断到治疗少于2年的时间、多个部位的转移灶。将患者再分为以下Jones风险组：风险良好(0-1种风险因素)、风险适度(2种风险因素)和预后不佳(所有3种风险因素)。图5显示了不同的各风险组存活对象百分比与时间(以年计)的关系图。与病例对照相比，在所有3个Jones风险组中，按照实施例3所述方案用低剂量IL-2治疗的患者的存活率数值较高。然而，ILIAD患者和病例对照之间存活率的差异看来随风险组变得不佳而降低。见下表。
  风险组   ILIAD(良好)   对照(良好)   ILIAD(中度)   对照(中度)   ILIAD(不佳)   对照(不佳)
  可评估患者   n＝70   n＝118   n＝125   n＝140   n＝63   n＝94
  中值存活时间，年   2.0(1.3-2.2)   0.96   1.1(0.93-1.5)   0.55   0.61(0.46-0.80)   0.43
  OS-1年，％   71(60-82)   46   5.5(44-64)   27   33(21-45)   14
  OS-2年，％   47(34-61)   17   32(22-41)   10   17(7-28)   8
圆括号中是95％CI
毒性
研究人员将不良反应测定为与研究治疗方法“不相关”、“可能相关()”或“多半相关(probably related)”。最常发生的不良反应是疲倦(41.1％的患者)、然后是寒颤(36.9％)、恶心(36.5％)、发热(32.7％)、呕吐NOS(22.1％)和厌食(20.9％)。在至少10％患者中观察到以下治疗相关的不良反应(见下表)：
  意向治疗(N＝263)
  优选的术语   患者(％)
  疲倦   108(41.1)
  寒颤   97(36.9)
  恶心   96(36.5)
  发热   86(32.7)
  呕吐NOS   58(22.1)
  厌食   55(20.9)
  腹泻NOS   49(18.6)
  注射部位反应NOS   48(18.3)
  皮炎NOS   41(15.6)
  肌痛   28(10.6)
低剂量Proleukin的肾毒性低于高剂量Proleukin。对于SCr升高超过基线的患者，高剂量Proleukin治疗显示可导致明显的肾毒性，第一轮治疗中检测到平均峰值SCr＞4mg/dL，第二轮治疗中是＞6mg/dL(Belldegrun等，1987)。对于SCr在正常基线的患者，观察到平均峰值SCr有较低但仍惊人的上升(升至3mg/dL)。60％的肾功能受损患者的SCr水平在30天内回复至基线，与之相比，肾功能正常的患者是98％。这些结果提示高剂量Proleukin在肾功能受损患者中产生的肾毒性高于肾功能正常患者。相反，低剂量Proleukin在治疗期间只导致SCr略微上升(通常＜2mg/dL)，在肾功能正常和受损亚组之间相当。各亚组罕见SCr升高＞3mg/dL。SCr偏差在此范围(＜3mg/dL)内的患者估计不会有严重症状或需要特殊治疗。
肾功能正常和受损患者亚组之间的不良反应(AE)的频率和等级通常相当。与正常亚组相比，肾功能受损亚组的严重不良反应(SAE)(26与30％)、AE(77与89％)和药物相关AE(76与81％)的总数略低。肾功能受损亚组中导致中断的AE数略高(30与25％)。在正常和肾功能受损亚组中，AE的最高百分比是3级(42与34％)，然后分别是2级(33与23％)、4级(9与13)、1级(4与8％)和5级(1与0％)。
肾功能正常和肾功能受损亚组之间最常见的不良反应(各亚组报道有＞10％的患者)通常相当，分别包括疲倦(43与45％)、寒颤(38与36％)、发热(39与23％)、注射部位反应(18与21％)、恶心(39与36％)、呕吐(25与19％)、腹泻(20与19％)、皮炎NOS(18与11％)、厌食(23与19％)、咳嗽(20与9％)、呼吸困难NOS(13与26％)、失眠(9与17％)、关节痛(12与13％)、肌痛(11与9％)、下肢水肿(8与17％)、体重降低(11与4％)和低血压NOS(6与11％)。
肾功能亚组之间LD Proleukin的肾毒性相似。通过比较各轮治疗期间SCr水平与基线检测值来评估LD Proleukin的肾毒性。虽然在治疗期间大量患者的峰值SCr水平略微上升，但在肾功能受损亚组中只有5位患者，肾功能正常亚组中有8位患者观察到峰值SCr＞2.0mg/dL。峰值SCr＞3.0mg/dL不常见，只在肾功能受损亚组的1位患者，肾功能正常亚组的2位患者中观察到。
结论
对于治疗肾功能受损的转移性肾细胞癌患者(其对高剂量IL-2治疗不适合)，低剂量白介素-2看来安全而有效。IV期临床研究的结果表明低剂量Proleukin在肾功能正常和肾功能受损的患者中均能产生相似的应答率、无进展存活期(PFS)和总存活率(OS)。用低剂量Proleukin治疗肾功能正常和肾功能受损患者的效力结果通常高于病例对照组报道的。肾功能亚组之间低剂量Proleukin(造成)的肾毒性相似，远低于用高剂量Proleukin的肾功能受损患者中观察到的。
实施例4
给予低剂量IL-2治疗转移性肾细胞癌
将IL-2制剂给予组织学诊断患转移性肾细胞癌的患者。该制剂中IL-2的浓度约为22MIU。皮下注射给予该IL-2制剂。治疗包括9-周两轮次。第一轮包括用9-18MIU的低剂量IL-2治疗6周，每天1次，每周5天(qd×5d)，然后是3周休息期。第二轮包括用9MIU的低剂量IL-2治疗6周，每天1次，每周5天(qd×5d)，然后是3周休息期。在有反应患者中重复几轮治疗。
虽然说明并描述了本发明的优选实施方式，但应该知道可对其作出各种变化，而不脱离本发明的构思和范围。
                序列表
<110> L.伊莱亚斯(Elias，Laurence)
      G.维瑟雷尔(Witherell，Gary)
<120> 治疗肾细胞癌的方法
<130> PP023880.0002
<150> 60/647,496
<151> 2005-01-27
<160> 1
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<210> 1
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25              30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Ash Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr AIa Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130

Claims (30)

1.一种治疗肾细胞癌人患者的方法，其中所述患者的肾功能受损，所述方法包括：
a)每天分1-3剂给予1-52 MIU剂量的IL-2，每周3-6天，重复1-24周；和
b)停止IL-2给药1-4周。
2.一种治疗肾细胞癌人患者的方法，其中所述患者的肾功能受损，所述方法包括：
a)每5天-1个月给予1-52MIU剂量的IL-2，重复1-24周，其中所述IL-2与聚乙二醇或聚氧乙烯化多元醇共价偶联；和
b)停止IL-2给药1-4周。
3.一种治疗肾细胞癌人患者的方法，所述方法包括：
a)每天分1-3剂给予9-18MIU剂量的IL-2，每周3-6天，重复1-24周；
b)停止IL-2给药1-4周；
c)每天分1-3剂给予9MIU剂量的IL-2，每周3-6天，重复1-24周；和
d)停止IL-2给药1-4周。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)第一，在第一周内5天每天给予18MIU剂量的IL-2；
b)第二，每天给予9MIU剂量的IL-2，共2天，然后每周内3天每天给予18MIU剂量的IL-2，重复5周；
c)第三，停止IL-2给药3周；
d)第四，每周内5天每天给予9MIU剂量的IL-2，重复6周；和
e)第五，停止IL-2给药3周。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述IL-2是重组产生的IL-2，其包含的氨基酸序列与人IL-2的氨基酸序列至少有70％的序列相同性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述IL-2包含的氨基酸序列与人IL-2的氨基酸序列至少有80％的序列相同性。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述IL-2包含的氨基酸序列与人IL-2的氨基酸序列至少有90％的序列相同性。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述IL-2包含的氨基酸序列与人IL-2的氨基酸序列至少有95％的序列相同性。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述IL-2是IL-2突变蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述IL-2是des-丙氨酰基-1，丝氨酸-125人白介素-2(阿地白介素)。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述IL-2选自Ala104 Ser125 IL-2；des-Ala1 des-Pro2 des-Thr3 des-Ser4 Ala104 Ser125 IL-2；和des-Ala1 des-Pro2des-Thr3 des-Ser4 des-Ser5 des-Ser6 IL-2。
12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述IL-2与聚乙二醇偶联。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇的平均分子量为1,000-40,000道尔顿。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇的平均分子量为2,000-20,000道尔顿。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇的平均分子量为3,000-12,000道尔顿。
16.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述IL-2与聚氧乙烯化多元醇共价偶联。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯化多元醇选自聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖和聚氧乙烯化甘油。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯化多元醇是聚氧乙烯化甘油。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯化多元醇的平均分子量为1,000-40,000道尔顿。
20.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述肾细胞癌有转移性。
21.如权利要求3所述的方法，其特征在于，给予所述对象多轮治疗方法的时间足以至少获得部分肿瘤反应。
22.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括多轮治疗，其包括：
a)每天分1-3剂给予9MIU剂量的IL-2，每周3-6天，重复1-24周；和
b)停止IL-2给药1-4周；给予所述对象的时间足以获得至少部分肿瘤反应。
23.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述时间是至少6个月。
24.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述时间是至少12个月。
25.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，获得完全肿瘤反应。
26.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述IL-2通过皮下、腹膜内、肌肉内、静脉内、口服、肺部、鼻部、局部或透皮给药或通过输注或栓剂给予。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述IL-2通过皮下给予。
28.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述患者的肾功能受损。
29.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述患者对高剂量IL-2治疗不耐受。
30.IL-2在制备按以上任一项权利要求所述治疗肾细胞癌人患者的药物中的应用。
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PB01 Publication
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