CN104922659B - 防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂，是以Th2类细胞因子的受体为抗原制成的疫苗为有效成分；或：以Th2类细胞因子的可溶性受体为有效成分；或：以失去生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合活性的截短型Th2类细胞因子为有效成分；所述Th2类细胞因子为IL‑4、IL‑13、IL‑5、IL‑6或IL‑10；所述Th2类细胞因子的受体为IL‑4Rα、alpha‑1、alpha‑2、IL‑5受体、IL‑6受体或IL‑10受体。本发明新发现的Th2免疫反应的抑制剂对于肿瘤和慢性结核病具有较好的治疗效果，与白介素‑4治疗性疫苗相比，效果更为显著。

Description

防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及医药和生物技术领域，更具体的，本发明涉及一种用于防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂及其应用。

背景技术

Th细胞主要分为Th1细胞和Th2细胞两种，其中，Th1细胞主要参与细胞免疫和迟发型超敏性炎症反应；Th2细胞可辅助B细胞分化为抗体分泌细胞，参与体液免疫应答。

Th细胞在免疫系统中起到重要作用，申请人在专利“可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗”(CN102266551A)中研究发现：对于慢性传染病需要宿主产生坚强的Th1免疫反应才能清除病原体，这类慢性传染病的临床发病阶段大多数都表现为很强的二类(Th2)抗感染免疫反应，即以Th2抗感染免疫反应为主；而亚临床感染则大多数都表现为很强的Th1抗感染免疫反应，即以Th1抗感染免疫反应为主。进一步的研究证明，一类和二类免疫反应的产生并不是同步发生的，相辅相成的形式，而是相互抑制的，此起彼伏的形式。基于此，申请人提供了一种可用于治疗人或动物免疫相关性疾病的白介素-4治疗性疫苗，是以白介素-4的天然或人工合成的完整蛋白或蛋白片段做抗原制成疫苗，其作用机理为：通过给宿主注射白介素-4疫苗，使宿主体内产生白介素-4抗体，从而中和体内的白介素-4，降低宿主体内白介素-4的水平，达到了有效抑制Th2反应，促进Th1免疫反应的目的。

然而，能够实现抑制Th2反应，促进Th1免疫反应的物质和途径有多种，开发和研究新的Th2免疫反应抑制剂，用于肿瘤和慢性结核病的治疗具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂。

本发明的另一目的是提供该免疫抑制剂在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。

本发明的再一目的是提供该免疫抑制剂在制备治疗和/或预防慢性结核病的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂，是以Th2类细胞因子的受体为抗原制成的疫苗为有效成分；

或：以Th2类细胞因子的可溶性受体为有效成分；

或：以失去生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合活性的截短型Th2类细胞因子为有效成分。

所述Th2类细胞因子为IL-4、IL-13、IL-5、IL-6或IL-10；

所述Th2类细胞因子的受体为IL-4Rα、alpha-1(IL-13Rα1)、alpha-2(IL-13Rα2)、IL-5受体、IL-6受体或IL-10受体；

所述Th2类细胞因子的可溶性受体是指漂浮在宿主血液内具有与Th2类细胞因子结合活性的受体。

所述失去生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合活性的截短型Th2类细胞因子，是指根据Th2类细胞因子的全基因序列,利用基因工程技术手段,使其碳末端缺失若干个氨基酸,这种由存在基因序列缺失的mRNA所编码的蛋白质(或多肽)失去了生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合的活性，如将鼠IL-4碳末端118位后的氨基酸完全截去所产生的突变体IL-4T118即失去了IL-4活性，但仍具有与其相应的受体结合的活性。

以Th2类细胞因子的受体为抗原制成的疫苗作为有效成分的Th2免疫反应抑制剂，其作用机理为：以Th2类细胞因子的受体为抗原制成的疫苗能够在宿主体内产生抗Th2类细胞因子受体的抗体，起到封闭Th2类细胞因子的受体的作用，从而使宿主体内的Th2类细胞因子失去了与受体进行结合的位置，使Th2类细胞因子不能发挥正常的生理活性。

以Th2类细胞因子的可溶性受体为有效成分的Th2免疫反应抑制剂，其作用机理为：可溶性受体能够与受体竞争性结合Th2类细胞因子，由于可溶性受体漂浮于宿主血液内，不同于位于细胞表面的受体，使与可溶性受体结合的Th2类细胞因子不能发挥正常的生理活性。

以失去生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合活性的截短型Th2类细胞因子为有效成分的Th2免疫反应抑制剂，其作用机理为：根据Th2类细胞因子的全基因序列,利用基因工程技术手段,使其碳末端缺失若干个氨基酸,一直到筛选出这种由存在基因序列缺失的mRNA所编码的蛋白质(或多肽)失去生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合活性的克隆基因为目的，如将鼠IL-4碳末端118位后的氨基酸完全截去所产生的突变体IL-4T118即失去了IL-4活性，但仍具有与其相应的受体结合的活性；利用这种已经失去生理活性但仍具有与Th2类细胞因子受体结合活性的截短型Th2类细胞因子与体内正常的有生理活性的Th2类细胞因子去竞争相同的受体,从而大大降低宿主体内的Th2类细胞因子与受体进行结合的机会，使Th2类细胞因子不能发挥正常的生理活性。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，该药物含有有效剂量的Th2免疫反应抑制剂。

本发明还提供了一种治疗慢性结核病的药物，以Th2免疫反应抑制剂为有效成分。

本发明还进一步提供了一种可用于防治肿瘤和/或慢性结核病的卵黄抗体，以Th2免疫反应抑制剂为有效成分制成疫苗，对母鸡进行免疫，收集免疫后母鸡所产的鸡蛋，制成ELISA效价高于1:15000的卵黄抗体。

该高免卵黄抗体的制备方法，步骤如下：

以Th2免疫反应抑制剂为有效成分制成疫苗，对母鸡进行免疫，免疫程序为：首免剂量为1头份/只；首免4周后进行二免，剂量为2头份/只；首免8周后三免，剂量为2头份/只；每头份疫苗中Th2免疫反应抑制剂的含量为30-40μg；二免和三免后20天测定免疫母鸡产蛋的卵黄抗体效价，ELISA效价高于1:15000判定为合格；否则，继续进行第4次免疫，免疫剂量为3头份/只，四免后20天测定免疫母鸡产蛋的卵黄抗体效价；收集ELISA效价高于1:15000的鸡蛋，制成高免卵黄蛋白粉，即得。

所述高免卵黄蛋白粉的制备，具体包括以下步骤：

(1)将收集的ELISA效价高于1:15000的鸡蛋的外壳进行消毒，打蛋收集蛋黄液；消毒采用体积分数为70％的乙醇；

(2)将步骤(1)的蛋黄液进行低温冷冻干燥或高温瞬间高压喷雾干燥，制成高免卵黄蛋白粉。

步骤(2)中，高温瞬间高压喷雾干燥的温度为160℃。

有益效果：

本发明在申请人前期研究的基础上，进一步发现了新的能够抑制Th2免疫反应的抑制剂，与白介素-4治疗性疫苗相比，虽然都能够降低宿主体内的Th2免疫反应，但作用机理完全不同，本领域技术人员并不能简单的由白介素-4治疗性疫苗推知得到。而且试验证明，新发现的Th2免疫反应的抑制剂对于肿瘤和慢性结核病具有较好的治疗效果，与白介素-4治疗性疫苗相比，效果更为显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：小鼠IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13基因重组疫苗的构建与疫苗制备

根据小鼠IL-4、IL-4Rα与IL-13的全基因或部分基因编码序列，分别设计一对合适的引物，通过RT-PCR方法分别扩增IL-4、IL-4S(包含IL-4抗原表位在内的一段由14个氨基酸组成的多肽)、IL-4Rα与IL-13全部或部分cDNA序列。然后，经过DNA序列测定，证明所扩增的cDNA序列准确无误后，再将IL-4、IL-4Rα与IL-4S、IL-13cDNA分别克隆至pET-30与pET-32表达载体的适当部位，并进一步将重组质粒以及pET-30或pET-32表达载体空白对照质粒转入适当表达用大肠杆菌菌株中，经过规模发酵，提取纯化小鼠IL-4、IL-4Rα蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白以及载体对照蛋白。将纯化小鼠IL-4、IL-4Rα蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照所表达的蛋白分别与油佐剂或铝胶佐剂等按适当比例混合后【根据纯化IL-4、IL-4Rα蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白的含量不同，对于油佐剂疫苗，可将油/蛋白水溶液的体积比控制在(1：1)～(3：1)；对于铝胶佐剂疫苗，可将铝胶/蛋白水溶液的体积比控制在(1：1)～(1：5)；要求每头份疫苗中IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照蛋白的量约为15-20μg；每头份疫苗的体积约为0.1ml；或根据兽医药典操作规程制备】，进一步匀浆乳化(按所用匀浆机的操作规程进行)制成实验用疫苗。

所述油佐剂为由94％(V/V)矿物油(10号白油)、6％(V/V)的Span-80、2％(g/V)硬脂酸铝加热溶解后形成的淡黄色油状液体；油佐剂为疫苗蛋白溶液与油佐剂经乳化而形成的粘稠的乳白色油包水型疫苗。一般采用注射接种，为现有技术中常用的产品，是目前在动物用灭活疫苗中使用较广的佐剂。

所述铝胶佐剂也为动物用灭活疫苗中使用较广的佐剂。

实施例2：小鼠可溶性IL-4Rα(sIL-4Rα)与截短型IL-4(IL-4-T118S)融合表达质粒的构建与表达

根据小鼠IL-4Rα与IL-4的全基因或部分基因编码序列，设计一对合适的引物，通过RT-PCR方法分别扩增主要IL-4RαcDNA序列(50个氨基酸)和IL-4的前118个氨基酸cDNA序列。然后，经过DNA序列测定，证明所扩增的cDNA序列准确无误后，再将其克隆至pET-32融合表达载体的适当部位，并进一步将重组质粒以及pET-32表达载体空白对照质粒转入适当表达用大肠杆菌菌株中，经过规模发酵，提取纯化小鼠sIL-4Rα与IL-4-T118S融合蛋白以及载体对照蛋白。

实施例3：小鼠IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13基因重组疫苗、小鼠sIL-4Rα与IL-4-T118S融合蛋白以及载体对照蛋白的安全性试验与过敏反应试验

按实施例1的方法,将纯化IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照所表达的蛋白用生理盐水(或PBS)适当稀释后与油佐剂或铝胶佐剂按1:1的体积比混合制备成IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白疫苗或载体对照蛋白疫苗。制备好的IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白疫苗分低(0.1ml，约1头份)、中(0.25ml，约2.5头份)、高(0.5ml，约5头份)三个不同剂量组分别免疫BALB/c小鼠,另设载体蛋白疫苗和PBS免疫对照组，每组5只BALB/c小鼠，皮下多点注射。间隔3周，分别进行第二次和第三次免疫注射。疫苗注射后分别观察小鼠有无不良反应、过敏、死亡等现象。结果表明：小鼠接种疫苗后发育良好，精神状态和食欲均正常，接种部位有一过性肿胀、发热等不良反应，尤其在高剂量组表现更为明显。对于油佐剂苗，高剂量组小鼠，由于疫苗吸收较慢，有轻度肉芽肿反应。

与上述疫苗的实验方法类似，将纯化的小鼠可溶性IL-4Rα(sIL-4Rα)与IL-4-T118S融合蛋白以及载体对照蛋白分低(0.5μg)、中(5μg)、高(50μg)三个不同剂量组，另设生理盐水对照组，每组5只BALB/c小鼠,于后腿肌肉或尾静脉注射。间隔3周，分别进行第二次和第三次注射。注射后分别观察小鼠有无不良反应、过敏、死亡等现象。结果表明：小鼠注射蛋白后发育良好，精神状态和食欲均正常，未发现明显不良反应。

实施例4：小鼠IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13基因重组疫苗、小鼠可溶性IL-4Rα(sIL-4Rα)与IL-4-T118S融合蛋白增强小鼠抗肿瘤活性的试验

按实施例1的方法,将纯化的IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照所表达的蛋白用生理盐水适当稀释后与铝胶佐剂按1:1的比例混合制备实验或对照疫苗。要求每头份疫苗中IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照蛋白的量约为15-20μg；每头份疫苗的体积约为0.1ml。给实验小鼠分别于肿瘤细胞接种前3周和1周腹腔(i.p.)接种实施例1所制备的IL-4、IL-4Rα蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白基因重组铝胶疫苗，另设载体蛋白铝胶疫苗和PBS免疫对照组。瘤接种后每隔3天检查一次肿瘤生长情况，实验60天结束。结果表明，IL-4、IL-4Rα蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白基因重组疫苗均能够显著降低肿瘤的发生率(见表1)。

对于小鼠可溶性IL-4Rα(sIL-4Rα)与IL-4-T118S融合蛋白治疗组，给实验小鼠分别于肿瘤细胞接种当天和接种后每间隔4天于小鼠尾静脉注射5μg sIL-4Rα或IL-4-T118S融合蛋白或融合蛋白对照。瘤接种后每隔3天检查一次肿瘤生长情况，实验60天结束。结果表明，小鼠可溶性IL-4Rα(sIL-4Rα)与IL-4-T118S融合蛋白治疗组均能够显著降低肿瘤的发生率(见表1)。

表1：小鼠(C57BL/6，♀)IL-4、IL-4Rα蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白基因重组疫苗组、小鼠sIL-4Rα与IL-4-T118S融合蛋白治疗组均能增强小鼠抗肿瘤活性的试验结果(每组10只，数据为存活率％)

实施例5：小鼠IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13基因重组疫苗、小鼠可溶性IL-4Rα(sIL-4Rα)与IL-4-T118S融合蛋白防治慢性结核病的试验

按实施例1的方法,将纯化的IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照所表达的蛋白用生理盐水适当稀释后与铝胶佐剂按1:1的比例混合制备实验或对照疫苗。要求每头份疫苗中IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照蛋白的量约为15-20μg；每头份疫苗的体积约为0.1ml。给实验小鼠分别于卡介苗(BCG)接种前3周和1周腹腔(i.p.)接种实施例1所制备的IL-4、IL-4Rα蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白基因重组铝胶疫苗，另设载体蛋白铝胶疫苗和PBS免疫对照组。

对于小鼠可溶性IL-4Rα(sIL-4Rα)与IL-4-T118S融合蛋白治疗组，给实验小鼠分别于卡介苗(BCG)接种当天和接种后每间隔4天于小鼠尾静脉注射5μg sIL-4Rα或IL-4-T118S融合蛋白或融合蛋白对照。

适量卡介苗给小鼠皮下(s.c.)或静脉(i.v.)注射接种。接种后12～16周用高剂量重组BCG攻击(i.v.接种)，而后，10～12周取小鼠脾脏，研磨、过滤、离心，取适量单细胞悬浮液铺到琼脂版上，置入37℃培养箱中培养约3周，计数每个平板上菌落数量。结果表明，小鼠(C57BL/6，♀)IL-4、IL-4Rα蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白基因重组疫苗组、小鼠sIL-4Rα与IL-4-T118S融合蛋白治疗组均能够显著降低BCG的感染(见表2)。

表2：小鼠(C57BL/6，♀)IL-4、IL-4Rα蛋白与IL-4S、IL-13融合蛋白基因重组疫苗组、小鼠sIL-4Rα与IL-4-T118S融合蛋白治疗组均能增强小鼠预防慢性结核病的试验结果(每组10只，数据为每个平板上菌落平均数)

实施例6：抗小鼠与人IL-4、IL-4S、IL-4Rα和IL-13鸡卵黄抗体(蛋白粉)的制备

按实施例1的方法,分别将纯化的小鼠和人IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照所表达的蛋白用生理盐水适当稀释后与铝胶佐剂按1:1的比例混合制备实验或对照疫苗，要求每头份疫苗中IL-4、IL-4Rα蛋白或IL-4S、IL-13融合蛋白或载体对照蛋白的量约为30-40μg，每头份疫苗的体积约为0.5ml。免疫程序如下：选择刚开产的健康母鸡为实验动物，随机分组，每组50只。首免剂量为1头份/只；首免3周后二免，剂量为2头份/只；首免6周后三免，剂量为3头份/只；二免和三免后20天各组分别随机收集10枚蛋，测定卵黄抗体的效价，若ELISA效价高于1:15000判为合格；否则，继续进行第4次免疫，免疫剂量为剂量为4头份/只；四免后20天各组分别随机收集10枚蛋，测定卵黄抗体的效价，若ELISA效价高于1:15000判为合格。收集合格的鸡蛋，用低温冷冻干燥或瞬间高温喷雾干燥法制备高免卵黄蛋白粉，放置在低温干燥处，备用。

实施例7：抗小鼠IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13鸡卵黄抗体(蛋白粉)增强小鼠防治肿瘤的试验

给实验小鼠分别于肿瘤细胞接种前1周开始饮水应用实施例6制备的高免卵黄抗体，按1％稀释，自由饮水，至实验结束为止。瘤细胞接种后每隔3天检查一次肿瘤生长情况，实验60天结束。结果表明，抗小鼠IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13鸡卵黄抗体(蛋白粉)均能够显著降低肿瘤的发生率(见表3)。

表3：抗IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13鸡高免卵黄抗体(蛋白粉)增强小鼠防治肿瘤的试验结果(C57BL/6母鼠，每组10只，数据为存活率％)

实施例8：抗人IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13鸡卵黄抗体(蛋白粉)防治慢性结核病的试验

给实验小鼠分别于卡介苗(BCG)接种前1周开始饮水应用实施例6制备的高免卵黄抗体，按1％稀释，自由饮水，至实验结束为止。

适量卡介苗给小鼠皮下(s.c.)或静脉(i.v.)注射接种。接种后12～16周用高剂量重组BCG攻击(i.v.接种)，而后，10～12周取小鼠脾脏，研磨、过滤、离心，取适量单细胞悬浮液铺到琼脂版上，置入37℃培养箱中培养约3周，计数每个平板上菌落数量。结果表明，抗小鼠IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13鸡卵黄抗体(蛋白粉)均能够显著降低BCG的感染(见表4)。

表4：抗IL-4、IL-4S、IL-4Rα与IL-13鸡高免卵黄抗体(蛋白粉)增强小鼠防治结核病的试验结果(母鼠，每组10只，数据为每个平板上菌落平均数)

SEQUENCE LISTING

<110> 刘永庆

<120> 防治肿瘤和/或慢性结核病的 Th2 免疫反应抑制剂及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> IL-4-T118S

<400> 1

Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala

1 5 10 15

Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln

20 25 30

Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys

35 40 45

Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr

50 55 60

Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr

65 70 75 80

Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln

85 90 95

Phe His Arg His Lys Gln Pro Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg

100 105 110

Asn Leu Trp Gly Leu Ala

115

Claims (4)

1.以IL-4的受体IL-4Rα为抗原制成的疫苗、IL-4Rα的可溶性受体或IL-4-T118S在制备治疗骨髓瘤或肥大细胞瘤的Th2免疫反应抑制剂中的应用；所述可溶性受体是指漂浮在宿主血液内具有与Th2类因子IL-4结合活性的受体；所述IL-4-T118S为失去生理活性但仍具有与IL-4类细胞因子受体结合活性的截短型IL-4类细胞因子，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，制备成卵黄抗体在制备治疗骨髓瘤或肥大细胞瘤的Th2免疫反应抑制剂中的应用；所述卵黄抗体是以IL-4的受体IL-4Rα为抗原制成的疫苗，对母鸡进行免疫，收集免疫后母鸡所产生的鸡蛋，制成ELISA效价高于1:15000的高免卵黄抗体。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述卵黄抗体的制备方法，步骤如下：以IL-4的受体IL-4Rα为抗原制成的疫苗，对母鸡进行免疫，免疫程序为：首免剂量为1头份/只；首免3周后进行二免，剂量为2头份/只；首免6周后三免，剂量为2头份/只；每头份疫苗中Th2免疫反应拮抗剂的含量为30-40μg；二免和三免后20天测定免疫母鸡产蛋的卵黄抗体效价，ELISA效价高于1:15000判定为合格；否则，继续进行第4次免疫，免疫剂量为4头份/只，四免后20天测定免疫母鸡产蛋的卵黄抗体效价；收集ELISA效价高于1:15000的鸡蛋，制成高免卵黄蛋白粉，即得。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述高免卵黄蛋白粉的制备，具体包括以下步骤：

(1)将收集的ELISA效价高于1:15000的鸡蛋的外壳进行消毒，打蛋收集蛋黄液；消毒采用体积分数为70％的乙醇擦拭；

(2)将步骤(1)的蛋黄液低温冷冻干燥或瞬间高温喷雾干燥，制成高免卵黄蛋白粉。