CN1219938A - 亲脂组分和血管活性肠肽片段的缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有3－12个氨基酸残基的肽和亲脂部分(它们位于肽的N－或C－端)的新缀合物。本发明进一步涉及包含所说新缀合物的药物组合物,其能用于治疗男性阳痿或治疗神经变性疾病。

Description

亲脂组分和血管活性肠肽片段的缀合物
发明技术领域
本发明涉及亲脂部分和具有3-12个氨基酸的肽的新缀合物。本发明进一步涉及包含所说新缀合物作为活性组分的药物组合物。所说的药物组合物优选用于治疗男性阳痿或治疗神经变性疾病。
发明背景
血管活性肠肽(VIP)(其是广泛分布在哺乳动物神经系统中的28个氨基酸的神经肽)具有有效的神经营养作用，这一作用影响神经细胞的功能。在中枢神经系统中，VIP的作用被解释为发育效应，显示出生长因子活性并维持神经组织的生存和功能。神经元(其能释放VIP)，使全身的血管及肺脏的气管受神经支配，并且释放的VIP作为一种有效的血管舒张剂可使平滑肌舒张。放射配体结合分析，药理学实验，分子克隆以及超活性新衍生物的研制曾表明几类VIP的受体位点和几种潜在的治疗用途。
我们以前的专利IL 87055,EP 0354992和US 5,147,885以及出版的专利申请EP 0540969，以及EP 0620008报导了VIP和修饰VIP或亲脂VIP衍生物的两种可能的治疗用途，它们分别用于男性阳痿治疗(透皮给药)和神经变性疾病的治疗。
VIP是血清中的一种半衰期十分短的亲水肽(Said S.I.编，肽激素研究进展(Advances in Peptide Hormone Research Series),Raven出版社，纽约，1-512(1982)中题为“血管活性肠肽”的文章)，其具有下列序列：
 1   2   3   4   5   6   7  8   9    10  11  12
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Tyr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-
 13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24
Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-
 25  25  27  28
Ser-Ile-Leu-Asn-NH2
为提高其生物利用度并增加其稳定性，本发明发明人曾采取所说专利和申请中报导的两种化学修饰。第一种是亲脂化，即增加脂肪酸成分，以加强VIP穿透生物膜的能力而不丧失活性；这样就设计出了硬脂酰-VIP即VIP与硬脂酸(其在VIP的N-端)相结合的分子(EP 0354992)。第二种修饰是用非天然的氨基酸置换天然氨基酸，即，正亮氨酸取代甲硫氨酸(VIP的第17个氨基酸)，旨在提高分子抗氧化稳定性及增加亲脂性；这样，设计出了硬脂酰-Nle-VIP(Gozes等，内分泌学(Endocrinolgy)，134:2121-2125(1994)；Fauchere等，国际肽蛋白质研究杂志(Int.J.PetideProtein Res.),32:169-278(1988)；EP 0540969)。在EP 0225020中描述了VIP序列第17-24个位置的未修饰VIP片段作为溃疡抑制剂。
任何物质作为药物的主要障碍是它在体内的分布问题。上述EP0354992和EP 0540969所报导的用于皮肤施用治疗男性阳痿的修饰VIP或亲脂VIP必须透过真皮，并且尽可能在短时间范围内到达勃起组织。
EP 0620008所描述的用于治疗神经变性疾病的VIP，修饰VIP或亲脂VIP必须通过血脑屏障才能发挥它们对人脑细胞的治疗效应。
为治疗男性阳痿及通过CNS施用以治疗神经变性疾病，希望利用具有VIP全肽的生理活性且体积较小、因而能够提高治疗化合物在靶组织的生物利用度的分子。此外，通常小分子与较大的分子相比对降解总是更稳定，因为它们供降解利用的位点更少。
发明概要
本发明基于惊人地发现偶联亲脂组分的VIP短片段或修饰VIP(其长度为3-12个氨基酸)在治疗阳萎和/或治疗神经变性疾病中有生理活性。相对于利用全长VIP分子，利用偶联亲脂组分的具生理活性的短肽的优点是在体中更好的生物分布和更高的生物利用度并且容易制备。此外，本发明涉及包含VIP的或偶联亲脂组分的修饰VIP的所说短片段的短环肽，除上述有利特征之外的优点是相对来说具抗降解的能力。
本发明涉及偶联亲脂组分的肽缀合物，其中所说的肽至少具有3个且至多具有12个氨基酸残基，所说的缀合物选自下式。(ⅰ)R1-X1-X1′-X1″-X2-NH-R2；(ⅱ)R1-X3-Ser-X4-Leu-Asn-NH-R2；
Figure A9719497000081
Figure A9719497000082
其中R1是H或亲脂组分；R2是H，亲脂组分，被X3-Ser-X4-Leu-Asn-NHR2所取代的亲脂组分或与X1-X1′-X″-X2-NHR2偶联的由1-3个非荷电氨基酸残基组成的间隔基团，其条件是R1和R2至少一个是亲脂组分；X1是共价键，Ala,Val,Ala-Val,Val-Ala,L-Lys,D-Lys,Ala-Lys,Val-Lys,Ala-Val-Lys；Val-Ala-Lys或Orn；X1′是L-Lys,D-Lys或Orn；X1″是L-Tyr,D-Tyr,Phe,Trp或对氨基苯丙氨酸的残基；X4是Ile或Tyr；X5是疏水脂肪族氨基酸的残基；X2是X5,X5-Asn,X5-Ser,X5-Ile,X5-Tyr,X5-Leu,X5-Nle,X5-D-Ala,
X5-Asn-Ser,X5-Asn-Ser-Ile,X5-Asn-Ser-Tyr,X5-Asn-Ser-Ile-Leu,
X5-Asn-Ser-Tyr-Leu,X5-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn或
X5-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn；X3是共价键，Asn,X5,X5-Asn,Tyr-X5,Tyr-X5-Asn,Lys-X5,
Lys-X5-Asn,Lys-Tyr-X5,Lys-Tyr-X5-Asn,Lys-Lys-Tyr-X5,
Lys-Lys-Tyr-X5-Asn,Val-Lys-Lys-Tyr-X5,
Val-Ala-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn,或Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn；X6是共价键或Asn,Ser,Ile,Tyr,Leu,Asn-Ser,Asn-Ser-Ile,
Asn-Ser-Tyr,Asn-Ser-Ile-Leu,Asn-Ser-Tyr-Leu,Asn-Ser-Ile-Leu-
Asn或Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn；X7是共价键或Asn；X8是共价键，X5,Tyr,Lys,Tyr-X5,Lys-X5,Lys-Tyr-X5,
Lys-Lys-Tyr-X5,Val-Lys-Lys-Tyr-X5,Ala-Lys-Lys-Tyr-X5，或
Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5；Z是-CONH-,-NHCO-,-S-S-,-S(CH2)tCO-NH-或-NH-CO(CH2)tS-；m当Z是-CONH-,-S-S-，或-S(CH2)tCO-NH-时m是1或2，或当Z是-NH-CO-或-NH-CO(CH2)tS-时m是2,3或4；n当Z是-NH-CO-,-S-S-，或-NH-CO(CH2)tS-时n是1或2，当Z是-CONH-或-S(CH2)tCO-NH-时，n为2、3或4，并且t是1或2
其条件是排除缀合物硬脂酰-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
前面X5所代表的疏水脂肪族氨基酸可以是选自Ala,Ile,Leu,Met,Val,Nva和Nle的D-或L-残基。
本发明的缀合物的亲脂组分本文定义为饱和或不饱和烃基或羧酰基且其具有至少3个碳原子，如：丙酰，己酰基，月桂酰基，棕榈酰，硬脂酰，油酰基，二十烷酰基，二十二烷酰基及相应的烃基：丙基，己基，十二烷基，十六烷基，十八烷基，二十烷基，二十二烷基等。优选的烃基或酰基是饱和的并且具有3-22个碳原子。
术语″间隔基团″是指不带电荷的天然或非天然的氨基酸残基诸如丙氨酸，脯氨酸和氨基己酸。
本发明缀合物的例子是亲脂组分与下述肽的缀合物，得自VIP序列第20-23位置的Lys-Lys-Tyr-Leu序列的肽和/或第24-28位置的Asn-Ser-Ile-Ler-Asn序列的肽，或其修饰肽(其中氨基酸残基被取代，添加，缺失或化学修饰)或这两个序列的组合，例如：
               St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
             St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；
         St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
             St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
               St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；
                St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2；
            St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；
            St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2；
             St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
              Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
              Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
                  St-Lys-Tyr-Leu-NH2；
                St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2；
             St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
          St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
       St-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
             St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2；
          St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2；
     St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2；和
     St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2.
以后，符号″St″代表硬脂酰，″Lau″代表月桂酰及″Cap″代表己酰基。
另一个方面，本发明涉及包含本发明活性缀合物(其作为活性组分)以及一种药学上可接受的载体的药物组合物。
包含本发明的缀合物或包含EP 0620008所描述的St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(下文″肽6″)缀合物的本发明药物组合物，可用于治疗性机能障碍如男性阳痿，优选通过皮肤或泌尿道施用。用于这一目的的优选缀合物是：
        St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
        St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；
      St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
        St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
        St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；
        St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2；
        St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2；
        St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2；
        St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；和St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
本发明药物组合物也可以用于治疗神经变性疾病，如阿耳茨海默氏综合症，唐氏综合症，低氧症，由于中枢和外周神经系统的局部缺血、中风、及遗传疾病而引起的运动机能或认知机能的衰退，由于中枢或外周神经系统受伤而引起的运动机能或认知机能的衰退，由于年老引起的认知机能的衰退和与血液循环和神经元存活相关的神经学上疾病。术语″治疗″在本发明此文中应理解为缓和、改善或根治那些疾病的症状，尤其是改善由于那些疾病而损伤的认知机能。用于这一目的的优选缀合物是：
        St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
        St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；
      St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
        St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
        St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；
        St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2；
        Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
        Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NHe；
         St-Lys-Tyr-Leu-NH2；
         St-Lys-Tyr-Leu-NH2；
        St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2；
      St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
      St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
      St-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
        St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；
        St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2；
      St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2；
     St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2；和
     St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2。
施用本发明药物组合物的可选择方式是皮下、静脉内、口内、鼻内、眼内、及通过脑室内的泵，通过泌尿道或透皮给药。
本发明的药物组合物在用来治疗阳痿时，优选泌尿道或透皮给药。用于透皮给药的载体优选那些能提高活性组分的组织透过性的载体。合适的载体例子是橄榄油、甘油、润滑剂、硝酸甘油、和SefsolTM，以及其混合物。SefsolTM是1-单辛酸甘油酯、丙二醇二癸酸酯、丙二醇二辛酸酯、三辛酸甘油酯和脱水山梨糖醇单辛酸酯的商标(Nikko Chemicals，东京)，并且它们是本发明组合物中的优选载体。在这些中，特别优选1-单辛酸甘油酯和橄榄油。对于泌尿道应用，优选凝胶作为载体。
为本发明缀合物的缓释，本发明进一步提供了包括载有所述缀合物并且适用于皮肤施用的涂药器的透皮给药器。
如果需要，涂药器中的缀合物可配制成上述药物组合物。
透皮施用治疗男性阳痿比肠胃外方式(如皮下)有几个优点。首先，它是非外科的，不需损伤组织。还有，它不造成其它施用方式引起的阴茎异常勃起或灼疼。此外，透皮施用与阴茎海绵体内注射方式相比更谨慎和更方便。透皮施用可利用连续缓慢的释放器，该释放器能允许自发的性行为而无需长时间的准备，这样解除了患者许多通常的困窘。
当本发明药物组合物用作中枢神经系统的药物时，优选通过鼻子施用它们(其能使气雾剂组合物通过嗅觉神经进入CNS(WO 91/07947))，或通过眼途径(Chiou,G.C.Y.,(1991)An.Rev.Pharmacol.Toxical.,31:457-67)或W.M Pardridge，肽药物运输(Peptide Drug Delivery,RavenPress N.Y.1991.)中所描述的任何其它合适的给药方法。
本发明的药物组合物也可通过脑室内泵直接作用于人脑。
本发明进一步涉及治疗神经变性疾病或男性阳痿的方法，包括给予需这种治疗的宿主治疗有效剂量的本发明缀合物。
本发明进一步提供了本发明缀合物在制备药物组合物中的应用。
如本领域任何技术人员将认识到的，上述式Ⅰ定义的缀合物包括大量可能的缀合物。落在本发明范围之内的和定义为本发明药物组合物中的″活性缀合物″的那些是那些在下列测定的至少一种中具有活性的缀合物：(1)在动物阳痿模型(正常和阉割动物)中能够引起勃起的缀合物；(2)具有保护电阻滞神经元不死亡活性的缀合物；(3)能保护培养中的未处理神经元免受天然发生的死亡的缀合物；(4)能够保护培养的神经元免受由β-淀粉样肽的25-35片段引起的死亡的缀合物；(5)在学习或记忆获得的适当实验中，能避免老龄动物或经致痴呆药剂处理动物的学习和记忆获得的衰退的缀合物，和能改善经致痴呆药剂处理的动物(例如，实施例中所描述的)对以前所获取任务的回忆的缀合物。(6)在动物局部缺血模型和/或中风模型中，能够避免或改善运动机能和认知机能衰退的缀合物；(7)能够保护神经元免受缺氧所造成损伤的缀合物；(8)在中枢和外周神经系统的遗传神经变性疾病模型中，能改善运动和认知机能的缀合物，这些模型有诸如：带有ApoE缺损的小鼠模型(细胞(Cell),71:343(1992))；淀粉样蛋白过份表达的转基因模型((自然(Nature),373:523(1995))；超氧化物岐化酶表达突变体的ALS模型(科学，264,1772(1994))，及16号染色体三体型的唐氏综合症模型；以及(9)在中枢和外周神经系统的损伤模型中能改善运动和认知机能的缀合物，这些模型诸如：大鼠核基底的损伤(PNAS,85:9481(1988))；东莨菪碱引起的腹侧海马处乙酰胆碱释放(PNAS,90:11287(1993))；NMDA引起的惊厥(脑研究(Brain Res.)448:(1988))。
在下文中，本发明将进一步参考一些非限制的附图和实施例进行说明。
附图简述
图1显示St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2浓度变化对经β-淀粉样肽处理的神经元的存活情况的作用；
图2显示胆碱能阻断剂AF64A(○)和与St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2一起的AF64A(●)对老年痴呆症(Alzheimer)动物模型中的学习和记忆的作用；
图3显示胆碱能阻断剂AF64A(●)和与St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的AF64A(▲)对老年痴呆症动物模型中的学习和记忆的作用；
图4显示施用盐水对照(○)；与St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的盐水(■)；胆碱能阻断剂AF64A(▲)和与St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的AF64A(◆)在老年痴呆症的动物模型中对保持记忆的作用；
图5显示分别经盐水(○)；与St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的盐水(■)；胆碱能阻断剂AF64A(▲)和与St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的AF64A(◆)处理的动物的运动机能；
图6显示与载体一起施用盐水(○)和缀合物St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala(□)对正常对照动物的学习和记忆的作用；
图7显示在老年痴呆症动物模型中施用盐水(●)；与St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2一起的盐水(■)；胆碱能阻断剂AF64A(▲)和与St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2一起的AF64A(◆)对以前已学任务记忆保持的影响(第一次游泳)；
图8显示与图7相关描述相同的第二次游泳实验；
图9显示与图7相关描述相同的实验，即测量动物在平台过去所在区域中花费的时间；
图10显示St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(St-KKYL-NH2)和盐水对正常新生小鼠(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(▲)；盐水(○))及ApoE缺损的新生小鼠(APO E)(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(▲)；盐水(●))的前肢放置行为获知的作用；
图11显示St-Nle17-VIP-NH2和盐水对正常新生小鼠(St-Nle17-VIP-NH2()；盐水(●))及ApoE缺损的新生小鼠(St-Nle17-VIP-NH2(▲)；盐水(◆))的前肢放置行为获知的作用比较；
图12显示St-Lye-Lys-Tyr-Leu-NH2(St-KEYL-NH2)和盐水对正常新生小鼠(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2()；盐水(●))及ApoE缺损的新生小鼠(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(▲)；盐水(◆))的悬崖逃避获知的作用；
图13显示St-Nle17-VIP-NH2对正常新生小鼠及ApoE缺损的新生小鼠的悬崖逃避获知的作用比较；
图14显示对照组和经St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2处理的ApoE缺损小鼠的胆碱乙酰基转移酶活性；
图15显示经过鼻内施用127I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2的大鼠的脑提取物的HPLC分析；
图16显示DMSO中的St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(肽6)对杯状结构和E2数量的作用；
图17显示DMSO中的St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(肽6)和St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(肽26)对杯状结构和E2数量的作用；
图18显示5％SefsolTM/20％异丙醇中的St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2对杯状结构的数量和E2数量的作用(C=载体对照；E=实验肽)；
图19显示SefsolTM/异丙醇中的St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2对杯状结构的数量和E2数量的作用(C=载体对照；E=实验肽)；
图20显示SefsolTM/异丙醇中的St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2对杯状结构的数量和E2数量的作用(C=载体对照；E=实验肽)；
图21显示SefsolTM/异丙醇中的St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2对杯状结构的数量和E2数量的作用(C=载体对照；E=实验肽)；
图22显示SefsolTM/异丙醇中的St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2对杯状结构的数量和E2数量的作用(C=载体对照；E=实验肽)；
图23显示St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(KKYO)和St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2(KKYV)对杯状结构数量的作用；
图24显示St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(KKYO)和St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2(KKYV)对第一杯状结构潜伏期的作用；
图25显示St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(KKYO)和St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2(KKYV)对E2数量的作用；
图26显示St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2对杯状结构数量的作用；
图27显示St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2对杯状结构数量的作用；
图28显示局部施用125I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2后的生物分布情况；
图29显示局部施用125I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(St-KKYL-NH2)的动物的肠抽提物的HPLC分析；及
图30显示将0.1μg St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2和10μg St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2及载体注射入体腔内对阴茎血压的影响。
发明详述
A．合成线型肽
利用自动肽合成仪以获得一组短肽。本发明的肽合成是通过Fmoc策略用供应商的方案采用ABIMED AMS 422合成仪(ABIMED,Langenfeld，德国)的自动合成方法完成的。公司推荐了所有带保护基的氨基酸衍生物。这样则利用了下列侧链保护基：Lys,N-s-叔丁氧羰基(Boc),Tyr,Thr,Ser,O-叔丁基；Arg；2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(PMC)；Trp,Nin-Boc；Cys,S-三苯甲基，Asn,β-三苯甲基，PyBOP，即苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐用作偶联剂。肽链在4-([2″,4″-二甲氧苯基]Fmoc氨乙基)苯氧基树脂(Rink酰胺树脂，Nova，瑞士)上进行合成。
伴随侧链脱保护而完成从树脂上最后裂解肽链的操作如下：裂解混合物：90％TFA,5％水，5％三乙基甲硅烷。100mg载有肽的树脂与3ml切割混合物在用于固相合成的反应柱内温育30分钟。30分钟后，从裂解后的树脂中分离反应物，并继续裂解3小时。用冰预冷的叔丁基甲基醚沉淀裂解后的肽并离心(40℃,2000rpm)。为确保最佳沉淀，有时加入石油醚(b.p.40-60℃；1∶1v/v)。倒出溶液，用水溶解沉淀，并且冷冻并冻干以产生白色粉末。通过RP-8柱上进行半制备性HPLC(Merck 7μM；250×10mm)纯化粗肽，采用线型梯度(在含0.1％TFA的35％乙腈的水溶液至含0.1％TFA的75％乙腈水溶液之间)以10ml/分钟的流速洗脱。在220nm下监测洗脱。产量是30-45％。在彻底酸水解后，产品纯度由RP-18柱上的分析型HPLC(Merck 7μM；250X4mm)和氨基酸分析法进行确定，给出每一氨基酸组分的期望值。
包含线型肽(其由该方法合成)的缀合物例子是那些在上文5-9页所列出的那些，和下列缀合物：
1． CapKKYLZZ*       29．StYLNSILN*
2． LauKKYLZ*        30．StKKYLNle*
3． KKYLZ*           31．StKKYLO*
4． KKYLZZ*          32．StKKYLL*
5． KKYLB*           33．StKBYL*
6． KKYLZZZ*         34．StBKYL*
7． NauNSILNZ*       35．StBBYL*
8． NSILNZ*          36．StKKFL*
9． NSILNZZ*         37．StKKOL*
10．CapNSILNZZ*      38．StKKYZ*
11．NSILNZZZ*        39．StKKWL*
12．NSILNB*          40．StKKXL*
13．KKYLZNSILN*      41．StKOmYl*
14．KKYLZZNSILN*     42．StOmKYL*
15．KKYLZZZNSILN*    43．StOmOmYL*
16．KKYLBNSILN*      44．OlKKYL*
17．StKKYLXXXNSILN*  45．PropylKKYL*
18．StKKLYAAANSILN*  46．StKKYLAAKKYL*
19．StKKYLPNSILN*     47．StKKYLPPKKYL*
20．StKKYLPPNSILN*    48．StKKYLAcaKKYL*
21．StKYLNSILN*       49．StKKYLAm.LaurylKKYL*
22．StKKYLNSILN*      50．StKKYLNle*
23．StKKYLN*          51．StKKYLdA*
24．StKKYLNS*         52．StKKYLL*
25．StKKYLNSI*        53．CapKKYL*
26．StKKYLNSIL*       54．LauKKYL*
27．LauKKYLNSILN*     55．CapNSILN*
28．StKYLN*           56．LauNSILN*
其中Cap=己酸，Lau=月桂酸，St=硬脂酸；Z=氨基己酸，B=氨基月桂酸，X=d,1Ala,O=D-Ala；B=dK,O=dY,Z=dL,X=p=氨基Phe，*=酰胺，Ol=油酸。
B．合成环肽Ⅰ．包含分子内酰胺键的环肽(即上述式Ⅲ或Ⅳ定义的Z=-CONH2-或NH2CO-)可通过常规固相合成法而制备。这样，可在固相支持物上合成肽链，而在所选环化位置处掺入合适的氨基和羧基侧链带保护基的氨基酸衍生物。肽链合成完成后，可从对应的氨基与羧基官能团选择性地移去保护基，留下其它保护基和完整的肽-支持物键。利用已知肽偶联剂则可完成环化。最后，利用已知方法伴随侧链组分的脱保护从支持物上裂解环肽，并用层析技术纯化所需环肽。Ⅱ．包含分子内二硫键的环肽(即上述式Ⅲ或Ⅳ定义的Z=S-S)可通过常规固相合成法制备，而在所选环化位置处掺入合适的S-带保护基的半胱氨酸或高半胱氨酸残基。肽链合成完成后，可用两种可能的途径进行环化：1．通过选择性地撤除S-保护基及随之发生对应的游离SH-官能团在支持物上的氧化，而形成S′-S键。接下来进行从支持物上常规移走产物操作并进行适当的层析纯化。2．在高度稀释的水溶液中，伴随着侧链脱保护从支持物移走肽，其后为游离SH-官能团的氧化。两条途径均可得到相同的最后所需产物。Ⅲ．包含分子内S-烷基的环肽(即上述式Ⅲ或Ⅳ定义的Z=-S(CH2)t-NH或-NH-CO(CH2)tS-)可通过常规固相合成法而制备。这样，在肽链合成期间所选环化位置处掺入携带合适氨基保护侧链的氨基酸残基，和合适的S-带保护基的半胱氨酸或高半胱氨酸残基。接下来通过溴酰基化选择性地使保护的侧链氨基官能团脱保护。在酸性条件下伴随着侧链脱保护可从支持物上分离出所说的肽。在中性或微碱性条件下，则对应的游离SH部分和溴酰基部分在高稀释液中能选择性地相互作用从而提供所需环肽。
实施例B1[上述通式(ⅲ)，其中X5=Leu；X6=共价键，Z=-NH-CO-；m=4,n=1]
通过瑞士Nova所提供的对甲基二苯甲胺(MBHA)树脂可人工合成肽。所有溶剂，二氯甲烷(CH2Cl2)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)以及二甲基亚砜(DMSO)都是德国Merck的分析产品。三氟乙酸(TFA)，二异丙基乙胺(DIEA)和N,N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)购自美国Aldrich。1-羟苯并三唑(HOBT)购自瑞士Nova。所有带保护基的氨基酸衍生物(Boc-AA)均为L-构型，购自瑞士Bachem。Na-氨基酸官能团在整个合成中由叔丁氧羰基(t-Boc)保护。侧链官能团的保护基如下：Asp的保护基为9-芴基甲基(Fm),Lys的保护基为2-氯-苄氧基羰基，在肽链1位处的保护基为9-芴基甲氧基羰基，Tyr的保护基为2,6-二氯苄基。
利用DCC(0.42g 2mmol)和HOBT(0.272,2mmol)作为试剂通过连接Boc-Asp(OFm)(0.82g,2mmol)至甲基二苯甲胺树脂(1g)上从而启动合成反应。通过氨基酸分析测定载样(0.39mmol/g)。聚合物上未反应的剩余氨基在CH2Cl2(10ml)中通过与乙酸酐和三乙胺(相应为1ml和0.5ml)反应而封闭。用Boc-Asp(OFm)-MBHA树脂开始合成肽链，按表Ⅰ中所概述的方案进行。
表1：人工固相合成的方案。
步骤     试剂/溶剂 时间(分)
    1 溶于CH2Cl2中的TFA,(30％v/v) 3
    2 溶于CH2Cl2中的TFA(50％v/v) 20
    3  CH2Cl2, 5×2
    4 溶于CH2Cl2中的3％DIEA(v/v) 5
    5 溶于NMP中的3％DIEA(v/v) 2
    6  NMP 5×2
    7 茚三酮检验
    8 溶于NMP中的1.6mmolBocA.A.+1.6mL1N HOBT+1.6ml 1N DCC；预活化30分钟；过滤并加入溶液至聚合物(1g)中(DMSO中最终体积为20％v/v) 4520
    9  DIEA(6mmol，溶于NMP) 10
    10  NMP 5
    11  CH2Cl2, 3×2
    12 茚三酮检验
    13  10％Ac2O+3％DIEA，溶于CH2Cl2 5
    14 溶于CH2Cl2的10％Ac2O 10
    15  CH2Cl2 3×2
所有用于洗涤及反应的溶剂体积为10ml/g树脂。所有连接均利用Boc-氨基酸衍生物的HOBT活性酯而完成，所说的活性酯在每一连接步骤之前由DCC制备。进行连接所采用的Boc-氨基酸1-苯并三唑酯(Boc-AA-OBT)与延长中肽链的α-氨基的摩尔比分别为4∶1。连接反应通过在吡啶-水中的茚三酮的溶液中使几毫克聚合物(-3)加热沸腾2分钟进行监测。Boc-氨基酸连接重复两次以便确保完成反应。第二次连接时，利用一半量的Boc-AA-OBT。通常，在完成每个连接步骤后，剩余氨基在二氯甲烷中通过用乙酸酐(10％)和二异丙基乙胺(3％)处理树脂而被封闭，接着在二氯甲烷中用10％的乙酸进行处理。
在肽链合成完成后，通常通过溶于CH2Cl2的50％TFA移走Lys-1的t-Boc保护基，并且新的游离α-氨基通过利用DCC(0.42g,2mmol)和HOBT(0.27g,2mmol)作为试剂(方案)与硬脂酸(0.37g,2mmol)相连接。反应进行120分钟，并重复两次。利用DMF中的50％哌啶经1小时分别除去Asp6和Lys1的侧链保护基OFm与Fmoc。在用DMF(3×10ml)，二氯甲烷(3×10ml),CH2Cl2中的10％的DIEA(3×10ml),DMF(3×10ml)和CH2Cl2(3×10ml)洗涤后，在七倍过量的DIEA(2.8mmol)存在下，将树脂悬浮在7ml DMF中并与五倍过量(2mmol)的(苯并三唑基氧基)三(二甲基)氨基鏻六氟磷酸盐(BOP)相混合8小时。该操作后重复环化。茚三酮检验阴性显示环化的完成。根据方案用CH2Cl2洗涤完全合成的环肽-树脂，然后真空环境下用P2O5过夜干燥。用无水HF技术去掉保护基并从树脂上切割下肽。这样，0℃下在TeflonTM HF装置中，在1.5ml对甲苯硫酚和对甲酚(1∶1v/v)混合物的存在下用9ml的HF处理肽-树脂1小时。真空去除HF，用无过氧化物的醚(4×25ml)抽提树脂，然后过滤，干燥并用溶于水的50％的乙酸(3×25ml)提取。将含水滤液冻干则产生了硬脂酰 的粗粉末。
使粗提品溶于50％的含水乙酸中，并利用0.1N的乙酸作洗脱剂使其流经SephadexG-25柱(75×2cm)。在274nm下用分光光度分析法监测洗脱液。将水溶液冻干而产生无芳香添加剂的肽，所说的添加剂在HF-切割步骤时添加作为清除剂。产率为50-70％。
然后对Sephadex分离产品通过高效液相层析(HPLC)进行纯化。但是也可对粗肽进行这一操作。通过Merck RP 8柱(7μM,250×10mm)完成纯化。将肽置于10％的乙腈水溶液中，并用线型梯度(其为从0.1％的TFA水溶液到含0.1％的TFA和75％乙腈的水溶液而建立的梯度)以10ml/分钟的流速进行洗脱。收集级分并在分析型HPLC检查之后进行分段。合并并冻干各级分。纯肽产率是30-35％。
在彻底酸水解(6N HCI)后，产物纯度由分析性HPLC(Merck RP-8,250×4mm柱)和氨基酸分析法进行测定，给出每种氨基酸成分的期望值。
上述式(ⅲ)和(ⅳ)的其它相关环状衍生物(其中Z为-NH2-CO-或-CO-NH-)使用对应的氨基酸衍生物，由完全相同的方法制备。
此外，环衍生物可由上述方法制备然后将硬脂酰或其它合适的亲脂组分掺入进分子N端。
实施例B2
Figure A9719497000221
[上述通式(ⅲ)，其中X5=Leu,X6是共价键，Z是-S-S-；n=1,m=1]
如上述实施例所概述的，在对甲基二苯甲胺(MBHA)树脂(1g)上人工合成所说的肽。用Boc-Cys(S-4-MeBz1-)-OH作为构件将半胱氨酸残基1和6掺入进肽链中。在完成链合成和添加N-端硬脂酰组分后，如上述用无水HF处理肽-树脂。将冻干后获得的粗肽白色粉末溶于0.1％的乙酸(约0.5mg/ml)中，并用无氧氮充气于溶液中使其冒泡2小时以去掉溶液中的气体。用浓NH4OH水溶液调整溶液pH至约8.5，并慢慢滴加K3Fe(CN)6(2.5当量)水溶液(约1N)。在添加氧化剂之后，室温下搅拌反应混合物1小时。然后用旋转蒸发使溶液浓缩，并如上述在葡聚糖凝胶G-25上分级分离环状粗产物。然后通过HPLC在Merck RP 8柱上完成纯化(参见以前的实施例)。纯化产物的产率是35-40％。在上述操作后，当用Boc-Cys(S-4-MeBzl)-OH和Boc-Homocys(S-4-MeBzl)-OH作为构件(其在所选择环化位点处被掺入)可制备其它包含S-S内部键的环肽。
实施例B3[上述通式(ⅲ)，其中X5=Leu；X6=共价键：Z=-S-(CH2)t-CO-NH-；m=1；n=4；t=1]
如上述实施例所概述的，在对甲基二苯甲胺(MBHA)树脂(1g)上人工合成所说的肽。用Boc-Cys(S-4-MeBzl)-OH将半胱氨酸残基1掺入进肽链中，而以Boc-Lys(ε-Fmoc)-OH引入Lys-6。在完成链合成和添加N-端硬脂酰组分后，经过在DMF中用20％哌啶处理30分钟除去Lys-6的保护基ε-Fmoc。用DMF(3×10ml)，二氯甲烷(3×10ml),CH2Cl2中的10％的DIEA(3×10ml),DMF(3×10ml)和CH2Cl2(3×10ml)彻底洗涤树脂。将树脂悬浮在10ml DMF中并与五倍过量(2mmol)的溴乙酸酸酐相混合6小时。用DMF(3×10ml)洗涤树脂并重复该反应。茚三酮检验阴性显示酰化反应完成。然后用DMF(3×10ml)和CH2Cl2(3×10ml)洗涤树脂，真空环境下干燥，并利用甲氧基苯(10％)作为唯一清除剂用无水HF处理树脂。利用以前实施例中所描述的相同操作获得溴乙酰化粗产物。然后将白色粉末(约0.5mg/ml)溶于0.1％乙酸中，并用1N NaOH调整pH至约7.0。室温下反应4小时后，溶液经Ellman试剂(Aldrich)表明无SH-官能团后则可用旋转蒸发进行浓缩。然后如实施例A中所描述的通过流经葡聚糖凝胶G-25柱纯化粗品，接着经制备型HPLC纯化。纯化产物的产率为25-30％。在上述操作后，用对应的氨基酸衍生物(在所选环化位点处和其它位置)可制备其它包含-S-(CH2)t-CO-NH-或-NH-CO-(CH2)t-S-内部键的环肽。
C．本发明的神经变性治疗方面
实施例C1生物试验-本发明缀合物对于β-淀粉样肽所处理的神经元存活的作用
方法
众所周知β-淀粉样肽与老年痴呆症疾病有关，并且是对培养基中所培育的神经元有毒的一种物质(Pike等，神经科学杂志(J.Of Neurosci,13(4),1676-1687(1993)；Yankner等，科学，250:279-282(1990)；Gozes等，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),93:927-432(1996))。
通过对Forsythe和Westbrook所描述的(生理学杂志(J.Physiol.Lord.)365:515,(1988))的一种技术稍作改变，制备大鼠脑皮层细胞培养物，其中用大脑皮质代替海马，并用新生大鼠代替E16小鼠。将大脑皮层细胞(1.5-15×105细胞/35mm平皿)铺在所述(Gozes等，J.Pharmacol.Exp.Therap.,257:959-966(1991))汇合脑皮层的胶质饲养培养基上。培养基是DMEM-(Dulbeco改进的Eagle培养基)，其包含5％的马血清和N3[一种包含激素混合物的培养基补充物，见Romijn等，脑研究，254:(4),583-589(1981)]。在体外培养八天后，培养物完全更换培养基，然后用β-淀粉样肽(氨基酸25-35)处理5天。
将β-淀粉样肽片段溶于水中，终浓度为2.5mM。用递增剂量的本发明缀合物进行实验(最初1mg与10μl DMSO混合，接着与另一个10μ1的DMSO混合以便完全溶解，并用PBS稀释以获得10-3M的贮存液)，在神经元倒板九天后，将该缀合物与25μM β-淀粉样肽(氨基酸25-35)一起加入至所分离的脑皮层中。将十μl缀合物溶液添加至1ml培养基中。处理持续时间为5天，不更换培养基。在培养基中14天后，固定细胞进行细胞免疫化学分析，并用抗NSE(神经元特异性烯醇化酶，一种神经元标记)的抗体进行标记。在60个区域总面积25mm2内对神经元细胞计数。如以前，不知道处理的类型即对神经元进行计数。每个值为3个培养皿的平均数±SEM。
结果如图1和表2中所示。图1显示五个独立实验(含对照，包括164,225,130,319,173个神经元)的总和。如图1所示，St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2是一种活性很高的缀合物，在10-13和10-9M间具有活性并且在10-12和10-10M间活性最高。经缀合物和β-淀粉样肽处理的细胞的细胞计数比未经处理的对照细胞的更高，这表明该缀合物能够保护细胞也能减少天然发生的死亡。
                    表2：
           神经元存活试验中的肽活性，
          抗β-淀粉样肽毒性的保护作用
                      肽 活性浓度(M) 神经元存活率(％) β-淀粉样肽处理后的存活率(％) 试验浓度
    1 St-Lys-Lys-Tyr-Lcu-NH2     10-13-10-9     80-110     52     10-13-10-9
    2 St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2     10-13     72     38     10-13-10-9
    3 St-Lys-Lys-Tyt-Val-NH2     10-15-10-12     67-117     44    10-15-10-11
    4 St-Lys-Lys-Tyr-Nlc-NH2     10-14-10-12     76-84     44    10-15-10-11
    5 Lau-Lys-Lys-Tyr-Lcu-NH2     10-11-10-10     83-84     63    10-13-20-9
    6 Cap-Lys-Lys-Tyr-Lcu-NH2     10-11     73     63    10-13-10-8
    7 St-Lys-Tyr-Lcu-NH2     10-11     96     53    10-13-10-9
    8 St-Val-Lys-Lys-Tyr-Lcu-NH2     10-12-10-8     70-92     53    10-13-10-8
    9 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nlc-NH2     10-13-10-10     95-100     36    10-13-10-9
    10 St-Lys-Lys-Tyr-Lcu-Asn-NH2     10-13-10-10     52-73     34-57    10-13-10-9
    11 St-Lys-Lys-Tyr-Lcu-Asn-Scr-NH2     10-13     83     52    10-13-10-9
    12 St-Lys-Lys-Tyr-Lcu-Asn-Scr-Ilc-NH2     10-9     123     57    10-13-10-9
    13 St-Lys-Lys-Tyr-Lcu-Asn-Scr-Ilc-Lcu-NH2     10-9     97     57    10-13-10-9
    14 St-Asn-Scr-Ilc-Leu-Asn-NH2     10-1110-10     68-103     40    10-13-10-9
    15 St-Scr-Ilc-Lcu-Asn-NH2     10-12-10-9     84-58     40    10-13-10-9
    16 St-Lcu-Asn-Scr-Ilc-Lcu-Asn-NH2     10-13-10-11     100-114     58    l0-13-10-9
    17 St-Tyr-Lcu-Asn-Scr-Ilc-Lcu-Asn-NH2     10-10-10-11     88-110     58    10-13-10-9
如表2中所示，与对照组比较，St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2缀合物(1)的几个修饰显示了保护神经元使之免受因β-淀粉样肽所造成死亡的类似活性。在某些情况下(其中与对照相比较，神经元存活超过100％)缀合物也能防止天然发生的死亡。令人注意的是，缀合物1中Leu被Val(3),D-Ala(3),Nle(4)取代，在N-端(8)或C-端(9,10,11,12,13)处氨基酸残基的增加，N-端(7)的氨基酸残基的缺失或亲脂组分硬脂酰被月桂酰(Lau)(5)或己酰基(Cap,6)置换，导致与St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2活性类似的缀合物。
实施例C2
本发明缀合物在老年痴呆症动物模型(Morris水迷宫)中对学习和记忆的作用
在体内胆碱能抑制作用模型中，用与塑料管(PE-20)相连的25G针，以0.21μl/分钟的速率，对18只雄鼠(Wistar,250-300g)进行脑室内注射(i.c.v)，对照组接受2μl/侧的生理盐水注射，实验动物接受3nmol/2μl/侧的胆碱能阻断剂(乙基胆碱吖丙啶鎓)的注射。
在AF64A注射后，开始药物处理7-10天。将动物划分为两个相等的组。对试验组每日通过鼻道施用溶于10％SefsolTM和40％异丙醇的St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2，浓度为10μg/40μl(每一个鼻孔施用20μl)。对照动物鼻内施用载体。在鼻道施用前，将大鼠用乙醚部分地麻醉。在药物施用七天后，另10天进行行为分析。在试验前1小时，通过鼻道施用药物。所有动物用50,000个单位的持久性抗生素长期处理(每隔两天)以避免感染。
按照Morris水迷宫方法(Morris等，自然，297:681-683,1982；Morris等，自然，319:774-776,1986)进行学习试验操作。Ⅰ．St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2的施用
将大鼠放置在环状水池中，池直径1.26m，深0.2m，装有清明的有机玻璃柱，且具有恰在水(22-24℃)表面下的13.3cm高的平台。在试验前1小时，每日由鼻道施用药物。记录每只大鼠到达平台的潜伏期(用秒计)，并将经过几天训练的变化做成图表，这反映了学习能力和记忆力。
如图2所示，用AF64A注射的对照动物(O)与用AF64A注射和鼻道施用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2的动物(●)相比较，到达平台的潜伏期改善较少。这些结果表明本发明的缀合物能够改善老年痴呆症的动物模型中的学习能力和记忆力。Ⅱ．St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2的施用
图3描述如上述的体内检测(AF64A-胆碱毒性试验)中St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(图中所注的KKYO)对老年痴呆症中学习能力和记忆力的作用。所获得的结果类似于上述那些，用AF64A注射的对照动物(●)与用鼻道施用AF64A和St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(▲)的动物相比较，到达平台的潜伏期改善较少。此外也进行了探针试验(Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国93:427-432,1996)，在这一试验中：在动物知道平台在水池中的位置后，撤走平台，记录动物在平台原来所在区域花费的时间，该段时间表明以前学习试验的记忆保持。如从图4所观察的，与用AF64A处理没有注射肽的动物相比，用St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2处理的动物显示更好的记忆保持能力。在这一试验后将平台放回水池中，但这次平台可被游泳的大鼠看见，并测量达到平台所需时间。在这种情况下，所测量的参数可能反映了运动缺陷。如图5所示，在各组间没有任何区别，因此总体上该试验测量了学习、记忆而不是运动机能的改变。
实施例C3
本发明缀合物对正常动物的学习和记忆的作用
重复实施例C2中所描述的实验，但这些动物用盐水注射代替AF64A，并且是正常的动物不是具类老年痴呆症的认知力遭损坏特性的动物。将动物划分为两组，一组只是鼻内施用载体(如上述的Sefsol+异丙醇)而另一组鼻内施用St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2。如图6所示，可观察到经肽处理的那组动物多少明显显示了更快地学习能力，这表明也可能提高未遭损坏的正常动物的认知机能。
实施例C4
本发明缀合物对记忆保持模型的作用
研制了一个新模型以评估动物对以前学习试验的记忆保持能力。首先教动物(N=5-10)在上述的水迷宫内找到水下平台。为了评价记忆保持力，让动物每日游泳(每天一次试验)以便学会找到暗藏的平台。一周后，挑选在学习试验中显示最高成绩的动物，进行实验。将AF64A或生理盐水注射到第三脑室，在复原一周后，如上述对动物鼻道施用肽St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2。在肽处理一周后，在水迷宫中再次试验动物，并如下重复学习任务(即找到平台)的记忆保持实验：将动物在平台上放置1分钟。然后放置在水中让其游到平台并测量到达平台所需的时间。图7总结了第一次游泳的结果。如该图所示，很明显用肽处理的动物能防止记忆丢失，并且对于用AF64A注射的动物(由于它们的行为方式与对照组类似)也能保持以前学习任务的记忆。
1分钟后，在平台上，将动物放回水中让其再游泳并找到暗藏的平台。图8显示第二次游泳的结果。由图可见，图8也显示用肽处理的动物的学习和记忆的改善。这一模型是肽活性和利于记忆保持的第一个实证。
最后，撤走平台和将动物在平台区域花费的时间在图9中记录下来。上面总结的结果，清楚地显示了St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2与学习、任务记忆和记忆保持的关系。
实施例C5
本发明缀合物对精神发育迟缓模型的作用
一种精神发育迟缓的模型：载脂蛋白E缺陷的小鼠：
近来发现小鼠载脂蛋白E缺陷(Plump等，细胞，71:343-363(1992))延迟了小鼠发育里程的获取。试验ApoE缺陷小鼠的行为里程发展，发现它们比对照动物(出生后2-5天)明显地延缓了前肢放置行为的获得(出生后11-13天)。在这些小鼠中还观察到获得离开悬崖行为也延迟一两天。
给8只新生正常小鼠注射(s.c.1.2μg-120μl)St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2或生理盐水。类似处理8只ApoE缺陷的新生小鼠。
图10和11显示了前肢放置行为获得的结果。可见用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2或已知的St-Nle17-VI-NH2(只用于比较)St-Nle17-VIP处理的ApoE缺陷小鼠，与未处理的ApoE缺陷小鼠相比较，其放置行为的获得被提高到与对照组水平基本相同的水平。
图12和13显示上述处理的动物的悬崖逃避的获得。可见，用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2或St-Nle17-VI-NH2(只用于比较)处理的ApoE缺陷小鼠，与正常的对照小鼠相比较显示了更好的悬崖逃避的获得，或与对照类似的悬崖逃避行为。
实施例C6
本发明缀合物对载脂蛋白E缺陷小鼠的胆碱能活性的作用
如Fonnum F.A.，神经化学杂志(J.Neurochem)21:413-413,1975中所描述的，对Apo-E缺陷小鼠进行胆碱能活性试验。简言之，对21天大的正常(对照)小鼠和ApoE-缺陷小鼠通过测量Chat活性以评估其脑状态。如上述(参见正文)，胆碱乙酰转移酶(Chat)活性通过测量胆碱和[14C]乙酰CoA合成[14C]乙酰胆碱的速率而检测。在缺少胆碱的情况下，测量非特异性背景。在特氟隆匀浆器中，用10体积的50mM磷酸缓冲液(pH=7.4)(其包含300mM NaCl,30mM EDTA和0.5％triton)匀浆每个脑(300-400mg)。12000g离心匀浆物15分钟，将10μl上清液(三份)与10μ1溶液混合，该溶液包含：14μM 14C-乙酰基-CoA(56mCi/mmolNEN),20mM乙酰胆碱，1.6mM氯化胆碱，0.25mM毒扁豆碱，以及磷酸缓冲液。在37℃反应15分钟。通过添加在3-庚酮中制备的50μl的15mg/ml四苯基硼，并且涡旋混合30秒以终止反应。2分钟后收集20μl有机相，微离心，然后与闪烁液相混合，并用β-计数器测量放射活性。
对长期注射肽或生理盐水的21天龄的动物进行实验。注射采用皮下注射，用DMSO溶解肽(100μg/30μl)并用生理盐水稀释以获得所需浓度。1-4天：4μg肽/20μl生理盐水；5-10天：8μg/40μl生理盐水；11-14天：16μg/8μl生理盐水。
胆碱能活性的结果显示在Apo-E缺陷的小鼠上的减弱。施用St-Lys-Lys-Tyr-Leu的小鼠的胆碱能活性如图14所示。该图说明了：用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2处理的ApoE小鼠具有比对照组水平提高的胆碱乙酰转移酶活性。
图14表明St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2提高了载脂蛋白E缺陷小鼠的胆碱能活性(在所有胆碱乙酰转移酶活性试测中100％活性说明669-758pmol/mg蛋白/分钟)。
实施例C7
St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2的生物分布
通过利用氯胺T方法(如Gozes等，内分泌学(Endocrinology)134:2121-2125(1994))对St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2进行放射性碘标记，并对250-300g的大鼠鼻道施用约7.8X106cpm/2μl 5％SefsolTM，20％异丙醇/大鼠。药物施用30分钟后，处死动物取下额皮质称重并用γ计数器测定放射活性。此后匀浆放射性组织样品(其包含1400cpm/克样品)，并离心(5400g,25分钟)。然后用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2作标记(利用乙腈梯度在第25级分被洗脱)对上清液进行HPLC分析。在γ计数器中监测样品的放射活性。
如图15所示，在施用30分钟后在脑内观察到完整的St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2，这表明本发明缀合物通过鼻道施用时可到达脑部。
D．本发明的阳痿预防方面
阴茎反射的生物试验
该生物试验涉及在透皮施用本发明缀合物后，对阉割大鼠测量阴茎反射。在第一种类型的生物实验中，测量了用带有各种载体的组合物对阴茎反射的作用，发现SefsolTM是最有效的载体。(a)方法
阳痿动物模型
采用因阉割而减少了性潜能的大鼠。将雄鼠(250-300g，鼠龄约三个月)饲养在12小时亮，12小时黑暗的循环中。通常在黑暗期进行实验，即黑暗开始后的2-6小时。将雄鼠阉割，在连续的14-21天内(实验的持续时间)通过每日注射形式进行部分睾酮替代(4μg/100g体重)。外科手术一周后，进行实验。
阴茎反射(勃起)的直接评估
利用一种采用测量阴茎性反射这一技术的方法，这能直接评估在透皮施用药物后阴茎勃起的情况。成功的繁殖很大程度上取决于精确实施时间上安排的功能上相关的行为单元。在这些实验中，我们集中在勃起过程的最后的阶段(阴茎变红并膨胀和延伸，最后导致完成勃起)并监测第一个E2和第一个杯状结构的潜伏期(Okumura,M.，等，Chem.Pharm.Bull.37,1375(1989))。
为了试验，使每个动物处于仰卧姿势，并在其身体前端罩一个较松地固定的量筒(7cm直径)。在躯干周围用带子系好后，通过位于阴茎后的一个薄木制敷料器，使阴茎头从它的鞘中伸出并轻轻地保持垂直于腹部。观察员固定雄鼠的腿，并在整个试验过程中保持这一位置。实验持续时间为45分钟。对E2及杯状结构的数量和潜伏期进行记录并绘图。
E2定义为一种完全的勃起，其后可为杯状，其中阴茎尖端变成一种杯状结构，因为龟头张开以致阴茎远端部分比其根部更大。这一最后阶段是E2所要求的，并可能是射精的必要条件。利用所有参数可获得一种可靠的对所试验大鼠的性功能进行测量的方法。
E2的持续时间通过监测动物45分钟，并且通过测量单个勃起事件的长度或累加几个非连续勃起事件的长度统计勃起的全部时间。计算单个勃起事件的最小持续时间为半分钟。
实施例D1
本发明缀合物在阳痿大鼠模型中的作用
使缀合物溶于二甲基亚砜(DMSO)，浓度为10-3M，每次施用10μl。所用的大鼠是通过部分睾酮替代的阉割处理的大鼠(Gozes等，J.Clin.Inves.,90:810-814(1992))。简言之，阉割雄鼠(鼠龄为90-100天)后立即每日皮下注射4μg/100g BW睾酮，连续21天，即实验的持续时间。外科手术后一周开始实验。如上述测量阴茎反射。
图16显示肽6(St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2)与对照比较能显著提高杯状结构及E2的数量。图17描述肽6与肽26的比较。用本发明的其它缀合物大体上按上述过程重复实验，但肽溶于5％的SefsolTM和20％异丙醇中且其终浓度为每只动物7μg/10μ1。所试验的缀合物是：St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
结果如图18-27所示，这些结果表明所有试验的缀合物与对照相比能够改善所有被检测的阳痿参数(杯状结构数，E2数以及第一个杯状结构的潜伏期)。
实施例D2
局部施用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2后的生物分布
如上述对St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2进行放射性碘标记，并对250-300g大鼠的性器官局部施用约2.2×106cpm/2μl 5％SefsolTM，20％异丙醇/大鼠。在指定时间，处死动物对组织称重并用γ计数器测定放射活性。
结果如图28所示。这些结果表明透皮施用的缀合物能够穿透到动物的内部组织。
实施例D3
肠抽提物的HPLC分析
按实施例D2的说明进行实验。药物施用30分钟后，处死动物，取下肠称重并用γ计数器测定放射活性。此后匀浆放射性组织样品，并离心(5400g,25分钟)。然后用放射性碘标记的St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2作标记(利用乙腈梯度在第25级分被洗脱)对上清液进行HPLC分析。用γ计数器监测样品放射活性。
结果如图29所示。从图26和27的施用2.2×106cpm/g的结果可看出，施用后30分钟80,000cpm/g以上位于肠内。作为比较，利用等量放射标记的St-Nle17-VIP，仅仅在肠内获得3700cpm/g(Gozes等，内分泌学，134:2121-2125(1994))，这说明本发明的短缀合物比全长的28个氨基酸的缀合物具有更好的穿透性。
实施例D4
本发明缀合物对阳痿兔模型的作用
用Rompun和Ketavet麻醉新西兰白兔(其来自Yokneam，以色列)。此外耳静脉注射戊巴比妥10mg/kg。通过大团注射戊巴比妥(5-10mg/kg)保持麻醉。在温度可调节的环境下，将动物以仰卧姿势置于手术台上。刮去阴茎周围区域的毛，将20G的针插入到海绵体的左或右侧，并将导管连续到压力转换器上以便连续记录海绵体内(i.c.)的压力情况。所利用的转换放大器是PM-1000型(装有CWE)；系统1000电源(装有CWE)；软件：DI 200 PGH/PGL(DATA Q Instrument Inc.)。当要求注射时，将另一根导管置于海绵体另一侧以施用药物，两根导管均充满了血液。用0.5ml 2％的肝素冲洗用于记录血压的导管。将海绵体内血压升高以mmHg为单位用图表表示。
图30显示经St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2注射后所获得的海绵体压力变化的初步结果。这里10μg显示提高的活性，且阴茎血压上升至75mmHg(从15-20mmHg)，这表明通过直接注射这一缀合物也可影响阴茎勃起。
E．用于透皮施用的药物组合物
一种用Sefsol 318TM作载体的用于透皮施用的亲脂偶联肽的本发明软膏组合物的例子，包括：每1mg肽714μl 10％Sefsol 318TM(单辛酸甘油酯)和714μl 40％异丙醇(终浓度：5％Sefsol,20％异丙醇和约0.7mg/ml肽)。

Claims (16)

1．一种偶联了亲脂组分的肽缀合物，其中所说的肽至少具有3个且至多具有12个氨基酸残基，所说的缀合物选自下式：
(ⅰ)R1-X1-X1′-X1″-X2-NH-R2；
(ⅱ)R1-X3-Ser-X4-Leu-Asn-NH-R2；
Figure A9719497000021
其中R1是H或亲脂组分；R2是H，亲脂组分，被X3-Ser-X4-Leu-Asn-NHR2所取代的亲脂组分或与X1-X1′-X1″-X2-NHR2偶联的由1-3个非荷电氨基酸残基组成的间隔基团，其条件是R1和R2至少一个是亲脂组分；X1是共价键，Ala,Val,Ala-Val,Val-Ala,L-Lys,D-Lys,Ala-Lys,Val-Lys,Ala-Val-Lys；Val-Ala-Lys或Orn；X1′是L-Lys,D-Lys或Orn；X1″是L-Tyr,D-Tyr,Phe,Trp或对氨基苯丙氨酸的残基；X4是Ile或Tyr；X5是疏水脂肪族氨基酸的残基；X2是X5,X5-Asn,X5-Ser,X5-Ile,X5-Tyr,X5-Leu,X5-Nle,X5-D-Ala,
X5-Asn-Ser,X5-Asn-Ser-Ile,X5-Asn-Ser-Tyr,X5-Asn-Ser-Ile-Leu,
X5-Asn-Ser-Tyr-Leu,X5-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn或
X5-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn；X3是共价键，Asn,X5,X5-Asn,Tyr-X5,Tyr-X5-Asn,Lys-X5,
Lys-X5-Asn,Lys-Tyr-X5,Lys-Tyr-X5-Asn,Lys-Lys-Tyr-X5,
Lys-Lys-Tyr-X5-Asn,Val-Lys-Lys-Tyr-X5,
Val-Ala-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn,或Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn；X6是共价键或Asn,Ser,Ile,Tyr,Leu,Asn-Ser,Asn-Ser-Ile,
Asn-Ser-Tyr,Asn-Ser-Ile-Leu,Asn-Ser-Tyr-Leu,Asn-Ser-Ile-Leu-
Asn或Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn；X7是共价键或Asn；X8是共价键，X5,Tyr,Lys,Tyr-X5,Lys-X5,Lys-Tyr-X5,
Lys-Lys-Tyr-X5,Val-Lys-Lys-Tyr-X5,Ala-Lys-Lys-Tyr-X5，或
Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5；Z是-CONH-,-NHCO-,-S-S-,-S(CH2)tCO-NH-或-NH-CO(CH2)tS-；m当Z是-CONH-,-S-S-,或-S(CH2)tCO-NH-)时，m是1或2；当Z是-NH-CO-或-NH-CO(CH2)tS-时，m是2、3或4；n当Z是-NH-CO-,-S-S-，或-NH-CO(CH2)tS-时，n是1或2；当Z是-CONH-或-S(CH2)tCO-NH-时；n为2、3或4，并且t是1或2其条件是排除缀合物硬脂酰-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
2．按照权利要求1的缀合物，其中X5是选自Ala,Ile,Leu,Met,Val,Nva和Nle的D-或L-氨基酸的残基。
3．按照权利要求1和2的缀合物，其中亲脂组分R1选自至少具有5个碳原子的饱和或不饱和烃基或羧酰基。
4．按照权利要求3的缀合物，其中R1选自：硬脂酰(St)，己酰基(Cap)和月桂酰(Lau)。
5．按照权利要求4的缀合物，其选自下组：
           St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
        St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；
   St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
     St-Asn-5er-Ile-Leu-Asn-NH2；
     St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；
     St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；和
       St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
6．按照权利要求4的缀合物，其选自下组：
     St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2；
     St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2；和St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
7．按照权利要求4的缀合物，其选自下组：
      Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
      Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
       St-Lys-Tyr-Leu-NH2；
       St-Lys-Tyr-Leu-NH2；
      St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2；
    St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；
   St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
 St-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
     St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2；
    St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2；
  St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2；和
  St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2。
8．一种药物组合物，其包含按照权利要求1的作为活性组分的缀合物，及药学上可接受的载体。
9．一种用于治疗性功能障碍的药物组合物，其包含作为活性组分的选自按照权利要求5或6的缀合物及缀合物St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2的缀合物，及药学上可接受的载体。
10．按照权利要求9的药物组合物，其用于治疗男性阳痿。
11．按照权利要求9或10的药物组合物，其适于透皮给药。
12．按照权利要求11的药物组合物，其中药学上可接受的载体是1-单辛酸甘油酯。
13．按照权利要求8的药物组合物，其用于治疗神经变性疾病，并包含选自作为活性组分的按照权利要求5或7的缀合物的缀合物。
14．按照权利要求13的药物组合物，其中神经变性疾病选自下列疾病：老年痴呆症，唐氏综合症，因局部缺血、中风、中枢和外周神经系统的遗传疾病而造成的运动或认知机能衰退，因中枢或外周神经系统的损伤或与血液循环和神经元存活有关的神经元紊乱而造成的运动或认知机能的衰退。
15．按照权利要求13或14的药物组合物，其适于鼻内给药。
16．按照权利要求15的药物组合物，其为鼻内喷雾剂。
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