TW487711B - Conjugates of lipophilic moieties and peptides - Google Patents

Description

487711 A7 B7 _ 五、發明説明（1 ) 發明領域 本發明係關於新穎之親脂性殘基與具3-12胺基酸之肽類 之共軛物。本發明亦關於含有作爲活性成分之此等新穎共 軛物之醫藥組合物。本發明之醫藥組合物較佳可用於治療 性無能或治療神經變性疾病。 發明背景 血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VDP)，一種普遍分 布於哺乳動物神經系統中之28胺基酸神經肽，具有強神經 營養性作用，可影響神經細胞功能。在中樞神經系統中， VIP之此種角色被轉譯爲發展效應、生長因子活性之展現、 以及神經元生存及功能之維持。神經元（其可釋出VEP)神經 支配全身之血管，以及肺部之氣管，同時，經釋出之乂正可 作爲一種強血管擴張劑，謗發平滑肌之鬆弛。放射配位體 結合分析、藥理實驗、分子選殖以及超反應性新穎衍生物 之發展已指明數種VDP受體位點之族群以及數種有效之醫療 用途。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 VIP、經修飾VIP、或親脂性VIP衍生物之兩種可能之醫療 用途已報導於申請人之先前專利IL 87055、EP 0354992及US 5，147,855，以及業經公開之專利申請案EP 0540969及EP 0620008 (其分別關於以經皮投藥之方式進行之男性性無能之治療 以及關於神經變性疾病之治療）。 VIP是一種血中半生期非常短之親脂性多肽（根據S.I·，Editor， Vasoactive intestinal peptide in: Advances in Peptide Hormone Research Series, Raven Press，New York，1-512(1982))，其具有下列序列、： -4 - l纸浪尺度適用中國國( CNS ) A4規格（210X 297公髮 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 487711 A7 B7 五、發明説明（2 ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

His-SefcAsp-Ala-Val-Phe-Tyr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-13 猶阳 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Leu-德宗 Lys - Gin - Met-Ala-Val-Lys-TLys-Tyr-Leu-Asn-25 27 28

Scr—iic^Lcu—Asri—NH〇 爲增進其生物可獲得率並提高其安定性，本發明以找出 兩種化學修飾報告於上述之專利案及申請案中。第一種係 親脂化，亦即，加入脂肪酸殘基，其設計用以增加VIP穿透、 生物膜但卻不損失活性之能力；因此，設計出硬脂醯基-VIP，一種使VIP與硬脂酸殘基於其N-端結合之分子（EP 0354992)。第二種修飾係將天然之胺基酸以非天然之胺基 酸取代，亦即，以正白胺酸對甲硫胺酸（VIP之胺基酸17)之 取代，其目標在使該分子對氧化具有安定性，並增加親脂 性；因此，設計出硬脂醯基-Nle- VIP ( Gozes et al.，Endocrinology， 134:2121-2125 (1994): Fauchere et al., Int. J. Peptide Protein Res.? 32:269-278 (1988); EP 0540969) 〇衍生自VIP序列第17-24位之未修飾VIP片 段在EP 025020中經描述作爲潰瘍抑制劑。 就任何物質作爲藥物之用途而言，其主要之障礙便是其 於體内之分布。報導於上述之EP 0354992及EP 0540969中，用 於經皮治療男性性無能之經修飾VIP或親脂性VIP，必需儘. 可能在短暫之時間内，穿過眞皮並到達勃起組織。 述於EP 0620008中，用於治療神經變性疾病之VIP、經修飾 VTP或親脂性γιρ，必需通過血腦屏障，以展現其對於腦細 胞之醫療效應。 _ ·5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 4頁)

訂 A7

經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 就冶療男性性無能及針對(^^^進行投藥以治療神經變性 疾病之目的而言，對於一方面具有完整VIP多肽之生理活性 ’一方面卻又具有較小之分子大小，因而可以改良該醫療 性化合物於目標組織之生物可獲得性。而且，由於小分子 内可降解之位置通常比大分子内少，小分子常具有較高之 降解穩定性。 發明摘要 本發明係基於意外發現與親脂性殘基綴合之VJP片段或經 G飾之VIP (其爲3-12胺基酸長）在性無能及/或神經變性疾 病之治療上具有生理活性。相對於完整νιρ分子的使用，使 用與親脂性殘基缓合之短生理活性肽的優點係爲體内較佳 又生物分布及生物可獲得性，以及較爲容易之製備。同時 ’本發明亦關於含有上述與親脂性殘基綴合之短VDp片段或 、經修飾之VIP之短的環狀肽，其除上述優點之外，尚有具相 對降解抗性之優點。 本發明係關於一種由肽類與親脂性殘基偶合之共軛物， 其中孩肽具有至少3且至多1 2個胺基酸殘基，該共軛物係 選自下列之式： ⑴ RrXrX1I-X1^XrNH-R2 ; (II) RrX3-Ser-X4-Leu-Asn-NH-R2 ; (III) Rr^-CH-CO-Lys-Lys-Tyr-Xr 丽-CH-CO-X6-N 财

I I (CH2)m---Z-(CH2)n —__________ - 6 _ 本紙張尺度家標準(CNS ) ( 2丨〇>< 297公釐) (請先閎讀背面之注意事項五 ^頁}

487711 A7 B7 五、發明説明（4 ) (i V ) RrXg-NH-CH-CO^X7-Ser.X4.Leu-Asn-NH-CH-CO«NH-R2 ；

I I (CH2)m-Z-(CH2)n 其中

Ri 或親脂性殘基； R2係Η、親脂性殘基、經X^Ser-X4-Leu-Asn-NHR2取代之親脂 性殘基，或由與XfXfXf-X^NHh偶合之1-3個不帶電之胺 基酸殘基所構成之間隔子； 條件爲&及化中至少有一個爲親脂性殘基； & 係一共價鍵、Ala、Va^ΑΐΗ-νΜ、Ι^Ι^^、04^3、Α1&-Ι^、να1-Lys、Ala-Val-Lys、Val-Ala-Lys或 Om ;

Xj’係 L-Lys、D-Lys或 Om ; X^myr、D-Tyr、Phe、Trp或對胺基苯丙胺酸殘基； X4 係 lie 或 Tyr ; X5係疏水性脂族胺基酸殘基； 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 \2係义5、义5次511、义5-563^、又5-11€、乂5-丁5^、又5-1^1^、乂5-!^^、\5-0-Ala、X5-Asn-Ser、X5-Asn-Ser-He、X5-Asn«Ser-Tyr、X5-Asn-Ser-Ile-Leu、X5-Asn-Ser-Tyr-Leu ^ X5-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn 或 X5-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn ; X3 係一共價鍵、Asn、X5、X5-Asn、Tyr-X5、Tyr-X5-Asn、Lys-X5 、Lys-X5-Asn、Lys-Tyr-X5、Lys-Tyr-X5-Asn、Lys-Lys-Tyr-X5、Lys-Lys，Tyr-X5-Asn、Val-Lys-Lys-Tyr-X5、Val-Ala-Lys-Lys-Ty^^^ Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn ； X6 係一共價鍵或 Asn、Ser、He、Tyr、Leu、Asn-Ser、Asn-Ser-He 本紙張尺度適用中®國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487711 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（5 ) 、Asn-Ser-Tyr、Asn-Ser-Ile-Leu、Asn-Ser_Tyr-Leu、Asn-Ser-Ile-Leu-Asn或 Asn-Ser-Leu-Asn ; X7係一共價鍵或Asn ; Xg 係一共價鍵、X5、Tyr、Lys、Tyr-X5、Lys-X5、Lys-Tyr-X5、 Lys-Lys-Tyr-X5、Val-Lys-Lys-Tyr-X5、Ala-Lys-Lys-Tyr-X5 或 Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5 ； Z 係-CONH-、-NHCO-、-S-S-、-S(CH2)tCO-NIl·或-NH-CO(CH2)tS-; m 係 1 或 2 (當 Z 係-CONH-、-S-S-或-S(CH2)tCO-NIl·)，或 m 係 2、 3 或 4 (當 Z 係-NHCO-或-NH-CO(CH2)tS-); η 係 1 或 2 (當 Ζ 係-NHCO-、-S各或-NH-CO(CH2)tS-)，或 η 係 2、3 或4(當 Ζ 係-CONH-或-S(CH2)tCO-NH-);而 t 係1或2， 限制條件爲除外共扼物硬脂醯基-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-De-Leu-AsnhNH；^ 。 上述由X5代表之疏水性脂族胺基酸可爲選自Ala、lie、Leu 、Met、Vd、Nva及Nle之D-或L-胺基酸殘基。 本發明共軛物之親脂性殘基於此定義爲具有至少3個碳原 子之飽和或不飽和之烴基或羧醯基，例如丙醯基、己醯基、 月桂酿基、椋摘醯基、硬脂醯基、油酿基、二十醯基、二十 二醯基、以及其分別對應之烴基，如丙基、己基、十二烷基 、十六燒基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基等等。較佳 者，該煙基或複酿基係飽和者，且具有3-22個碳原子。 「間隔子（spacer)」一詞係指不帶電之天然或非天然胺基 酸殘基，例如，丙胺酸、脯胺酸及胺基己酸。 本發明共軛物之實例爲親脂性殘基與下列肽類之共軛物： -8 - (請先閱讀背面之注意事項本頁) :裝-

、1T .^---r · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487711 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 具序列Lys-Lys-Tyr-Leu之肽（衍生自VIP序列之第20-23位置）及/ 或具序列Asn-Ser-Ile-Leu-Asn之肽（衍生自VIP序列之第24-28位置） 、其經修飾之肽（其中胺基酸殘基經取代、加成、缺失或化 學修飾）、或此二序列之組合，例如：

St-Lvs-Lvs-Tvr-Leu-NHo ^ ^ ^

St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH^ ; St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ί St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 ί St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2 ;

St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2 » St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2 » St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2 » St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2 » St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 » Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 * Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ;

St-Lys-Tyr-Leu-NH2 »

Sl>Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2 ; St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ； St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 ί St-Tyr-Leu-Asn-Ser-He-Leu-Asn-NH2 * St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2 ;及 -9- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項本頁) -裝·

、1T 487711 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 ) St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2 ° 於下，符號「St」代表硬脂醯基，「Lau」代表月桂醯基， 而「Cap」代表己酸基。 本發明之另一方面係關於一種醫藥組合物，其含有作爲活 性成分之本發明活性共軛物，以及醫藥可接受之載體。 含有一種本發明共軛物，或含有述於EP0620008之共軛物81 Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asi>NH2 (於後稱爲「肽 6_1) 之本發明醫藥組合物可用於治療性功能障礙，如男性性無能 ，較佳係藉由經皮或尿道投藥。用於此目的之較佳共軛物爲 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ^ St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NTH^ ; St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ； St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 ； St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2 » St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2 ^ St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2 ^ St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2 ^ St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH:;及 St-Lys-Lys-Tyr，Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-He-Leii-Asn-NH2 o 本發明之醫藥組合物亦可用於治療神經變性疾病，例如 阿玆海默症、唐氏症、缺氧、因局部缺血、中風、中樞及 周園神經系統之遺傳性疾病而造成之行爲或認知功能減退 、因中樞及周圍神經系統之創傷而造成之行爲或認知功能 -10- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4^ ( 210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項w 本頁)

裝·

、1T -泉 7 7 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（8 ) 減退、因老年及與血液循環和神經元生存相關之神經疾病 而造成之認知功能減退。在本發明之内容中，「治療」一 詞係代表減輕、改善或消除此等疾病所顯現之諸等症狀， 更特定言之爲改善因此等疾病而損傷之認知功能。用於此 目的之較佳共輛物爲： St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ^ St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH^ ; St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH^ ; St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 J St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2 ; St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2 ; Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 » Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ^ St-Lys-Tyr-Leu-NH2 ϊ St-Lys-Tyr-Leu-NH2 ί St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2 ί St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ； St-Leu-Asn-Ser-De-Leu-Asn-NH2 ϊ St-Tyr-Leu-Asn-Ser-ne-Leu-Asn-NH2 » St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2 » St-Lys-Lys-Tyr_Leu-Asn-NH2 ; St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2 ^ St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asi^Ser-Ile-NH2 ;及 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2 o -11 - (請先閱讀背面之注意事項

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、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 487711 A7 B7 五、發明説明（9 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明醫藥組合物之選擇性投藥方式爲經皮下、經靜脈 内、經口、經鼻、經眼、藉腦室内唧筒、經尿道或經皮投 藥。 當本發明之醫藥組合物係用於治秦性無能時，尿道或經 皮投藥爲較佳者。就經皮投藥而言，載體較佳係選自可增 進活性成分 < 組織穿透力者。適當载體之實例爲橄欖油、 甘油、潤滑劑、硝化甘油及Sefs〇1™，以及其混合物。8故〇1 係1-甘油單己酸酯、丙二醇二癸酸酯、丙二醇二己酸酯、 甘油三己酸酯、及山梨糖醇單己酸酯之商品名（Nlkk0 Chemicals，Tokyo)，且其爲本發明組合物之較佳載體。在上述 諸等載體巾，1-甘油單己酸g旨及橄梗油係最佳纟。就尿遒 投藥而言，較佳係使用凝膠作爲載體。 本發明尚爲本發明共軛物之持續釋出提供一種經皮調劑 ，其含有裝載有該共軛物，並用於對皮膚投藥之敷料器。 如須要，該敷藥器中之共軛物可調配爲上述之醫藥組合物 類型。 相較於腸外投藥之方式，如皮下投藥，以經皮投藥治療男 性性無能之方式具有許多優點。就其中之一而言，其爲非手 術性者，且不會造成組織之破壞。同時，其不會造成陰莖異 常勃起或與其他投藥方式相關之灼痛。尚且，與海綿體注射 相較，經皮投藥係一種較爲謹愼及方便之頭藥形式。經皮投 藥使得持續緩釋裝置得以使用，纟可在不須漫長調劑=程之 情形下進行自發性之性行爲，因而大量減少了患病個 遭受之固窘。 -12- 本紙張尺度適用中關家標準（CNS ) M規格（卩淑297公幻 (請先閲讀背面之注意事項S·本頁)

裝 訂 7 7 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（10 ) 當本發明之組合物係作爲一種作用於中框神經系統之藥物 時，較佳係經鼻進行投藥，其可使該氣溶膠組合物經由嗅覺 神經（W0 91/07947)、經由眼之途徑（Chiao, G.C.Y·，（199〗）An. Rev. Pharmacol. Toxical. 31:457-67)或藉由其他如 W.M. Pardridge，Peptide Drug Delivery，Raven Press，N.Y. 1991所述之任何適當投藥方法穿透 至 CNS。 本發明之醫藥組合物亦可藉由腦室内之唧筒直接定向至 腦部。 本發明亦關於一種治療神經變性疾病或男性性無能之方 法，其係藉著對須要此種治療之宿主投予治療有效量之本 發明共轭物而進行。 本發明尚提供一種本發明之共軛物於製備醫藥組合物之 用途。 如任何熟習此項技術者可明瞭，上述式I所定義之共軛 物包括許多可能之共軛物。該等落於本發明之範圍之中者 以及該等在本發明醫藥組合物中定義爲「活性共耗物」者 係至少在下列一種分析中具有活性者： (1) 可在性無能之動物模型中（正常及經割除睪丸之動物）謗 發勃起之共耗物； (2) 具有可使經電阻斷之神經元免於死亡之活性之共軛物； (3) 可使培養物中未經處理之神經元免於天然性死亡之共軛 物； (4) 可使培養之神經元免於因類澱粉肽之25-35片段而造成 之死亡之共耗物； -13- (請先閲讀背面之注意事項

巧本頁)

、1T 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487711 A7 B7 五、發明説明（11) (5) 可使在可接受之記憶取得分析研究中受試之老年動物或 經癡呆謗發劑處理之動物避免產生學習及記憶取得退化 情形之共軛物，以及可在經癡呆謗發劑處理之動物身上 增進其重拾先前習得技巧之共軛物，舉例而言，如實例 所述； (6) 可在局部缺血之動物模型及/或中風之模型中避免或改 善行爲及認知功能減退之共軛物； (7) 可使神經元免於因缺乏氧氣而造成之損傷之共軛物； (8) 可在中樞及周圍神經系統遺傳性神經變性疾病之模型中 ，例如，具有經剔除ApoE之小鼠模型（Cell，71:343 (1992)); 類澱粉過表現之轉基因模型（Nature，373:523 (1995)) ; ALS之 模型，其爲過氧化物岐化酶過表現之突變種（Science，264, 1772 (1994))以及唐氏症之模型，其爲染色體16之三體種， 改善行爲及認知功能減退之共軛物； 及 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項本頁) (9) 可在中樞及周圍神經系統創傷之模型中，例如，大鼠之 橄欖下核病灶（PNAS，85:9481 (1988));腹海馬之茛菪胺謗發 性乙醯膽鹼釋出（PNAS，90:11287 (1993)) ; NMDA謗發性痙攣 (BrainRes，448:115 (1988))，改善行爲及認知功能減退之共軛 物0 下面將參考部分非限制性之圖式及實例，進一步説明本 發明。 圖式簡要説明 圖1顯示不同濃度之St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2對於經-類澱粉 -14- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 48 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（12 ) 肽處理之神經元存活之影響； 圖2顯示膽鹼能阻斷劑AF64A (〇）及AF64A加St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 (·)，在阿玆海默症之動物模型中，對於學習及記 憶之影響； 圖3顯示膽鹼能阻斷劑AF64A ( # )及AF64A加St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 (▲)，在阿玆海默症之動物模型中，對於學習及記 憶之影響； 圖4顯示食鹽水控制組（〇）；食 NH2 ( );膽鹼能阻斷劑 AF64A ( ▲)及 AF64A加 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 (♦)之投藥，在阿玆海默症之動物模型中，對於記 憶存留之影響； 圖5顯示經食鹽水（〇）；食鹽水加St-Lys-Lys-Tyr-I>Ala-NH2 ( );膽鹼能阻斷劑AF64A ( ▲)處理之動物，以及經及 AF64A與St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 ( ♦)處理之動物之行爲功能； 圖6顯示食鹽水（〇）以及St-Lys-Lys-Tyr-l>Ala-NH2 ( □)之投藥 ，對於經賦形劑投藥之正常控制組動物之影響； 圖7顯示食鹽水（❿）；食鹽水加St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ( ) ，·膽鹼能阻斷劑 AF64A ( ▲)及 AF64A 加 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ( ♦)之投藥，在阿玆海默症之動物模型中，對於先前習得 技巧（第一次游泳）之記憶存留之影響； 圖8顯示針對第二次游泳所進行與圖7相關之相同實驗； 圖9顯示與圖7相關之相同實驗，其測量動物在原有平台 區域中所花費之時間； 圖 1 0 顯示 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 (SKKYL-NH2)及食鹽水，對於 -15· 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

門本頁) 訂 487711 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（u) 正常新生小鼠（St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ( ▼);食鹽水（# ))，以 及對於 ApoE缺陷新生小鼠（APO E) ; ( St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ( ▲) ;食鹽水（♦))之前肢放置行爲學習之影響； 圖1 1顯示比較St-Nlei7-VIP-NH2及食鹽水，對於正常新生小 鼠（St-Nlen-VIP-NH2 (▼);食鹽水（_))，以及對於ApoE缺陷 新生小鼠（St-N丨ei7-VIP-NH2 (▲);食鹽水（♦))之前肢放置行 爲學習之影響； 圖 1 2 顯示 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 (SKKYL-NH2)及食鹽水，對於 正常新生小鼠（St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ( ▼);食鹽水（# ))，以 及對於 ApoE缺陷新生小鼠（APO E) ; ( St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ( ▲) ;食鹽水（♦))之懸崖規避學習之影響；

圖1 3顯示比較St-Nlei7-VIP-NH2，對於正常新生小鼠及ApoE 缺陷小鼠之懸崖規避學習之影響； 圖1 4顯示控制組及經St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2處理之Apo-E缺陷 小鼠之膽鹼乙醯基轉移酶活性； 圖1 5顯示經鼻投藥I25l-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2之大鼠腦萃取 物之HPLC分析； 圖 1 ό 顯示 DMSO 中之 St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(肽6)對E2及杯狀體數目之影響； 圖 1 7 顯示 DMSO 中之 St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 (肽 6 )及 st-A 丨 a-VaI-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 (肽 26)對杯狀體數目 及E2數目之影響； 圖 1 8 顯示 5% Sefsol™/ 20% 異丙醇中之 St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2對杯狀體數目及泣數目之影響（c =賦形劑控制組； E =實驗肽）； • 16 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閎讀背面之注意事項1 本頁)

、·! 487711 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7_ 五、發明説明（14 ) 圖1 9顯示Sefsol™/異丙醇中之St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2對杯狀 體數目及E2數目之影響（C =賦形劑控制組；E =實驗肽）； 圖 2 0 顯示 Se&ol™/ 異丙醇中之 St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 對杯 狀體數目及E2數目之影響（C =賦形劑控制組；E =實驗肽）； 圖 2 1 顯示 Sefsol™/ 異丙醇中之 St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2 對杯 狀體數目及E2數目之影響（C =賦形劑控制組；E =實驗肽）； 圖 2 2 顯示 Sefsol™/ 異丙醇中之 St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2 對 杯狀體數目及E2數目之影響； 圖 2 3 顯示 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 ( KKYO)及 St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2(KKYV)對杯狀體數目之影響； 圖 2 4 顯示 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 ( KKYO)及 St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2(KKYV)對第一杯狀體出現所須時間之影響； 圖 2 5 顯示 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 ( KKYO)及 St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2 ( KKYV)對E2數目之影響.； 圖2 6顯示St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2對杯狀體數目之影響； 圖 2 7 顯示 St-Lys-Lys-Tyr-Leu_PrcHPro-Asi>Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 對杯 狀體數目之影響； 圖28顯示局部投藥125I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2後之生物分布 情形； 圖 2 9 顯示經 I25i-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 (St-KKYL0NH2)局部投藥 動物之腸萃取物之HPLC分析；及 圖 3 0 顯示將 0.1 pg之 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2，以及 10 之 St-Lys- Lys-Tyr-Leu-NH2注射至海綿體時，其對陰莖血壓之影響。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

本瓦)

、1T 77 48 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（15 ) 發明詳述 A .線性肽之合成 使用自動肽類合成儀以取得一大群小型肽。本發明肽類 之合成係以自動方法，藉由ABMED AMS 422合成儀（ABIMED， Langenfeld，Germany)，由Fmoc策略使用市售可得之流程進行。 所有經保護之胺基酸衍生物皆係如該公司建議。因此，使 用下述之侧鏈保護：Lys，N- ε -1-丁氧羰基（Boc)，Tyr，Thr ，Sei·，Ο -第三丁基；Arg ; 2又5,7,8-五甲基苯幷二氫吡喃- 6-續醯基（PMC) ; Trp ; N^Boc ; Cys，S -三苯甲游基。使用 PyBOP ’亦即，苯幷三峰-1-基-氧基-三- it比哈淀基-鱗鐵六 氟磷酸作爲偶合劑。肽鏈係於4-( [2 ”，4"-二甲氧苯基 ]Fmoc 胺基乙基）苯氧樹月旨（JRink amide Resin，Nova，Switzerland)上 合成。 將肽鏈由樹脂上之終切割以及側鏈去保護作用係如下完 成··切割混合物·· 90% TFA，5%水，5%三乙矽烷。將該100 毫克，載有肽之樹脂與3毫升之切割混合物於用以進行固 相合成之反應管柱中放置30分鐘。30分鐘之後，將反應由 經切割之樹脂分離，並繼續3小時之切割。以冰第三丁基 甲基醚沈殿經切割之肽並進行離心（4°C，2000 rpm)。爲確 保最佳之沈澱，偶而加入石油醚（b.p. 40-60°C ; 1:1 v/v)。傾析 溶液’再將沈澱物溶解於水中，冷涞進行束乾處理以生成 白色粉末。以半製備性HPLC，於RP-8管柱上（Merck 7 μΜ ; 250 χ 10 mm)，使用介於35%乙腈於含有i% xfa之水中及〇 1% xfa 於含有75%乙腈之水中之間之線性梯度，以10毫升/分鐘之 _ -18- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

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、1T 487711 A7 B7 五、發明説明（16 ) 流速對粗製肽進行純化。於220 nm監測溶析。產率爲30-45%。 以分析性HPLC，於RP-18管柱上（Merck ; 250 X 4 mm)，確認產 物之純度。由胺基酸分析及後續之徹底酸水解反應可取得 各成分胺基酸之期望數値。 含有經此方法合成之線性肽之共轭物實例係列於前面第 9至〗1頁者，而下列之共軛物爲： 1. CapKKYLZZ* 29. StYLNSILN* 2. LauKKYLZ^ 30. StKKYLNle* 3. KKYLZ* 31. StKKYLO* 4. KKYLZZ* 32. StKKYLL* 5. KKYLB* 33. StKBYL* 6. KKYLZZZ^ 34. StBKYL* 7. NauNSILNZ* 35. StBBYL* 8. NSILNZ* 36. StKKFL* 9. NSILNZZ* 37. StKKOL* 10. CapNSILNZZ* 38. StKKYZ* 11. NSILNZZZ* 39. StKKWL* 12. NSILNB* 40. StKKXL* 13. KKYLZNSILN* 41. StKOraYl* 14· KKYLZZNSILN* * 42. StOmKYL* 15. KKYLZZZNSILN* 43. StOmOmYL* 16. KKYLBNSILN* 44. OIKKYL* 17. StKKYLXXXNSILN* 45. PropylKKYL* 18. StKKLYAAANSILN* 46. StKKYLAAKKYL* 19. StKKYLPNSILN* 47. StKKYLPPKKYL* 20. StKKYLPPNSILN* 48. StKKYLAcaKKYL* 21. StKYLNSILN* 49· StKKYLAm.LaurylKKYL 22. StKKYLNSILN* 50. StKKYLNle 木 23. StKKYLN* 51. StKKYLdA* 24. StKKYLNS* 52. StKKYLL* 25. StKKYLNSI* 53. CapKKYL* 26. StKKYLNSIL* 54. LauKKYL* 27. LauKKYLNSILN* 55. CapNSILN* 28. StKYLN* 56. LauNSILN* 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -19 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 487711 A7 B7 五、發明説明（17 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 其中Cap=己酸，Lau=月桂酸，St =硬脂酸，z：=胺基己酸 ，B =胺基月桂酸，X = d，lAla，0 = D-Ala，B = dK，Q = d Y， Z = dL，X = p =胺基Phe , * =酿胺，〇1 =油酸。 B.環狀肽之合成 I· 含有分子内醯胺鍵之環狀肽，亦即，如上所定義之 式III及IV中Z = -C0NH-或-NHCO-者，可，習知之固相合成製 備。因此，肽鏈可於固相支持物上合3成，同時亦於選擇進 行環化之位置併入適當之胺基及羧基侧鏈經保護胺基酸衍 生物。在肽鏈合成完成之後’該等保護基可選擇性地自其 對應之胺基及羧基儀除，而其他之保護基及肽類支持鍵則 不受影響。最後，可使用已知之方法將環狀肽自支持物上 切下，並同時進行側鏈殘基之去保護作用，而目標環狀肽 之技術完成。 Π.含有分子内雙硫鍵之環狀肽，亦即，如上所定義之 式m及IV中z = s-s者，可以習知之固相合成製備，同時亦於 選擇進行環化之位置併人適當之s•㈣護半麟酸或類半 胱胺酸殘基。在肽鏈合成完成之後，可進行兩種可能之環 化途徑：！.選擇性移除S_保護基，再進行支撑物上自由對 應兩SH-f能基之氧化反應以形成财鍵。可繼續以習知之 万法將產物自支撑物上移除並進行適當之色層分析純化。 2.將肽自支撑物上移除’並同時進行完整之側鏈去保護作 用，再於高稀㈣轉液中進行自以时能基之氧化反應 。兩種途徑皆可產生同樣之終目標產物。 豇含有分子内S-垸基鍵之環狀肽，亦即，如上所定義

(請先閱讀背面之注意事項

r本頁)

、1T 487711 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（18) 之式 m及 IV 中 Z = -S(CH2)tCO-NH 或-NH-CO(CH2)tS-者，可以習知 之固相合成製備。因此，可在肽鏈合成之過程中，於選擇 進行環化之位置併入具有適當胺基保護侧鏈之胺基酸殘基 ，以及適當之S -經保護半胱胺酸或類半胱胺酸殘基。經阻 斷之側鏈胺基可在溴醯化反應之後，選擇性進行去保護。 再使該肽於酸性條件下自支撑物上分離，並同時進行侧鏈 去保護作用。在中性或微鹼性之條件下，可使對應之自由 SH及經溴醯化之殘基在高稀釋度溶液中選擇性進行反應產 生目標環狀肽。 實例B 1 硬脂醯基-Lys-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asp-NH2 之合成 I__1 [上述通式（iii)，其中 x5= Leu ; X6=共價鍵；Z = -NH-CO-; m = 4，η = 1 ] 肽之合成係以手操作，於對-甲基二苯甲基胺（ΜΒΗΑ)樹 脂（其購自Nova，Switzerland)上進行。所有之溶劑、二氣甲燒 (CH2C12)、N-甲基吡咯啶酮（NMP)及二甲基亞颯（DMSO)皆 爲Merck，Germany之分析用產品。三氟乙酸（TFA)、二異丙基 乙胺（DIEA)及Ν，Ν*-二環己基碳二亞胺（DCC)係購自Aldrich, U.S A.。1-幾基苯并三也（HOBT)係自Nova^ Switzerland取得。所 有之經保護胺基酸衍生物（Boc-AA)皆係L -組態，且係由 Bachem，Switzerland取得。Να -胺基酸之官能基在整個合成過程 中皆由第三-丁氧羰基（t-Boc)基團保護。側鏈官能基則如下 經保護：Asp以9 -苐基甲基（Fm)保護，Lys以2 -氯-芊氧羰基 保護，且於肽鏈之第1位以9 -苐基甲氧羰基（Fmoc)保護， -21 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

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，·! 487711 A7 7 Β 五、發明説明（19 ) 而Tyr以2,6-二氯芊基保護。 合成之起始係使用DCC(0.42克，2亳莫耳）及ΗΟΒΤ(0·272克 ，2毫莫耳）作爲反應劑，將BooAsp (OFm) ( 0.82克，2毫莫耳） 與甲基二苯甲基胺樹脂（1克）偶合而進行。荷載量（0.39毫莫 耳/克）係以胺基酸分析測定。於CH2C12 ( 10亳升）中，與乙 酸酐及三乙胺（分別爲1毫升及0.5毫升）反應以遮蓋聚合物上 未反應之殘餘胺基。肽鏈之合成以Boc-Asp (OFm)-MBHA樹脂 開始，再根據表1所列之流程進行。 表1 ··手動式固相合成之流程 (請先閱讀背面之注意事項本頁) 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 步驟 反應劑/溶劑 時間（分） ______________1 TFA 於 CH2C12 ( 30% ν/ν)中 3 2 TFA 於 CH2C12 ( 50% ν/ν)中 20 3 ch2ci2 5x2 4 3% DIEA 於 CH2C12 ( ν/ν)中 5 5 3% DffiA 於 ΝΜΡ ( ν/ν)中 2 6 ΝΜΡ 5x2 7 茚三酮試驗 8 1.6毫莫耳 Boc Α.Α.+1.6毫升 IN 45 HOBT+1.6毫升 1NDCC (皆於ΝΜΡ中） 前活化-30分鐘；過濾並將聚合物(1克)加入溶液中 20 DMSO (終體積20% v/v) 9 DEEA(6毫莫耳於ΝΜΡ中） 10

、1T -22- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 7 7 8 A7 B7 五、發明説明（20 ) !0 NMP 5 11 CH2C12 3x2 1 2 茚三酮試驗 13 10% Ac20 + 3% DBEA 於 CH2C12 中 5 14 10%Ac2O 於 CH2C12 中 10 15 CH2C12 3x2 所有用於清洗及反應之溶劑皆量測爲10毫升/克樹脂之 體積。所有之偶合皆使用Boc-胺基酸衍生物之HOBT活性酯 進行，其在每一偶合步驟之前先以DCC製備而得。使用4 : 1莫耳比之Boc-胺基酸1-羥基苯幷三唑酯（Boc-AA-OBT)及成 長肽鏈^ ·胺基進行偶合作用。偶合反應之監測係將數毫 克（〜3)之聚合物於莽三嗣之说症-水溶液中素潍2分鐘。重 複兩次Boc-胺基酸之偶合以確保反應之完成。在第二偶合 反應中，使用一半量之Boc-AA-OBT。在每一偶合步驟完成 之後，一律以二氯甲烷中之乙酸酐（10%)及二異丙基乙胺 (3%)三乙胺處理該樹脂以遮蓋殘餘胺基，再以二氯甲烷中 之10%乙酸處理。 在肽鏈合成完成之後，如常使用CH2C12中之50%TFA移除 Lys-Ι之t-Boc保護基，再使用DCC ( 0.42克，2毫莫耳）及HOBT (0.27克，2毫莫耳）作爲反應劑（Protocol)，使新的自由π -胺 基與硬脂酸（0.37克，2毫莫耳）進行偶合。反應持續120分鐘 並重複兩次。使用DMF中之六氫吡啶處理1小時分別移除 Asp6及Lys1上之OFm及Fmoc側鏈保護基。在以DMF ( 3 X 10毫升） -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7 7 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（21 ) 、二氯甲烷（3 X 10 毫升）、CH2C12 中之 10% DBEA ( 3 X 10毫升）、 DMF(3xl0毫升）及CH2Cl2(3xlO毫升）徹底清洗之後，將樹脂 懸浮於7毫升之DMF中，並與五倍過量（2毫莫耳）之（苯幷三 唑氧基）三（二甲基）胺基磷鑕六氟磷酸（BOP)反應劑，在七 倍過量（2.8毫莫耳）之DIEA存在下混合8小時。以下述方法 重複進行環化作用。陰性之茚三酮試驗指明環化作用之完 成。根據流程以CH2Cljfr洗完全合成之環狀肽-樹脂，再於 眞空下，於P205上乾燥隔夜。保護基之去阻斷作用及將該 肽自樹脂上切除之處理係以無水HF技術完成。因此，於 Teflon™ HF 裝置中（Multiple Peptide Sustem)，以 9 毫升之 HF，在 L5毫升之對-甲苯硫酚及對-甲苯酚（U v/v)混合物之存在下 ，於0 °C處理該肽-樹脂（1克）1小時。以眞空移除HF,，以不 含過氧化物之醚（4x25毫升）萃取該樹脂，過濾，乾燥並以 50%乙酸水溶液（3 x25毫升）進行萃取。凍乾該水性濾液以 生成硬脂醯基-Lys-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asp-NH2之合成之粗粉末。 I__I 將粗產物溶解於50%之乙酸水溶液中，並使用0.1N之乙酸 作爲溶析液，使其通過Sephadex G-25管柱（75 x2公分）。以分 光光度計於274 nm監測溶析。凍乾該水溶液生成不含芳香 族添加物（其係於HF-切割步驟加入以作爲清除劑）之肽。 產率爲50-70%。 再對經Sephadex-區分之產物進行高效液相層析（HPLC)純 化。然而，此亦可針對粗產物肽進行。以Merck RP-8管柱（7 μΜ ; 250 X 10 mm)完成純化。將肽於10%之乙腈水溶液中加入 ，並使用介於0.1% TFA於水中及0.1% TFA於含有75%乙腈之水 - 24- (請先閱讀背面之注意事項

本頁) 訂 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 7 7 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（22 ) 中之間之線性梯度，以10毫升/分鐘之流速進行溶析。搜集 溶析部分，並在以分析性HPLC檢測後進行分割。集中衍生 之部分並進行凍乾。純肽之產率爲30-35%。 以分析性HPLC ( Merck RP-18，250 X 4 mm管柱）及胺基酸分析 ，以及後續之徹底酸水解反應（6 N HC1)確認產物之純度， 其提供各成分胺基酸之期望數値。 以同樣之方式，使用對應之胺基酸衍生物，製備其他如 上所定義之式（iii)及（iv)中Z = -CONH-或-NHCO-之相關環狀衍生 物0 或者，此等環狀衍生物亦可以上述方法進行製備，再將 硬脂醯基或其他適當之親脂性殘基引入該分子之N端。 實例B 2 硬脂酿基 _ Cys-Lys-Lys-Tyr-Leu-Cys-NH2 之合成 I__1 [上述通式（iii)，其中X5=Leu ; X6爲共價鍵；Z = -S-S- ; n=] ，m = 1 ] 肽之合成係以手操作，於對-甲基二苯甲基胺（MBHA)樹 脂上（1克）根據前述實例進行。半胱胺酸殘基，1及6，係 使用Boc-Cys(S冰MeBzl)-OH作爲建構嵌段而引入肽鏈之中。在 完成鏈之合成及N端硬脂醯基之添加後，如上所述以無水 HF處理肽-樹脂。將凍乾取得之粗產物肽白色粉末（〜0.5毫 克/毫升）溶解於0.1%之乙酸中，並使該溶液通過無氧氮氣 鼓泡2小時以進行去氣。以濃NH4OH將溶液之pH調整至〜8.5 ，再將K3Fe(CN)6 ( 2.5當量）之水溶液（〜1N)緩慢逐滴加入。 在完成氧化劑之添加之後，將反應混合物於室溫下攪捽〜1 -25- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

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、1T 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 487711 A7 _B7__ 五、發明説明（23 ) 小時。再以旋轉蒸發法濃縮該溶液，並如上所述於Sephadex G-25管柱上區分粗環狀產物。再以Merck RP-8管柱進行HPLC 以完成純化（見前述實例）。純產物之產率爲3540%。根據 上述方法，使用 Boc-Cys(S斗MeBzl)-OH 及 Boc-類 Cys(S-4-MeBzl)-OH 作爲建構嵌段（其係被引入選擇進行環化之位置者），以製 備其他含有S-S内部橋键之環狀肽。 實例B 3 硬脂酸基 _ Cys-Lys-Lys-Tyr-Leu-Lys-NH^ 之合成

I I s ——ch2—co-1 [上述通式（iii)，其中X5=Leu ; X6=共價鍵；Z = 各(CH2)rCO-NH- ;m=l;n = 4;t=l] 肽之合成係以手操作，於對-甲基二苯甲基胺（MBHA)樹 脂上（1克）根據前述實例進行。使用Boc-Cys(S-4-MeBzl)-OH將 半胱胺酸殘基1引入肽鏈之中，而以BooLys(e-Fmoc)-OH將Lys-6引入。在完成鏈之合成及N端硬脂醯基之添加後，以DMF 中之20%六氫峨咬處理30分鐘以移除Lys-6上之e-Fmoc保護基 。再以 DMF ( 3 X 10 毫升）、CH2C12( 3 X 10 毫升）、CH2C12 中之 10% DTEA ( 3 X 〗0毫升）、DMF ( 3 X 10毫升）及 CH2C12 ( 3 X 10毫升）徹底 清洗樹脂。將樹脂懸浮於10毫升之DMF中，並與五倍過量 (2毫莫耳）之漠乙酸纤混合6小時。以DMF ( 3 X 10毫升）沖洗 樹脂，並重複反應。陰性之茚三酮試驗指明環化作用之完 成。再以DMF(3xl〇毫升）及CH2Cl2(3xlO毫升）清洗樹脂，眞 空乾燥，並使用苯甲醚（10%)作爲唯一之清除劑而以無水 HF進行處理。使用與前述實例相同之操作取得經溴乙醯化 _ -26- 本纸張尺度適用中國國家標準（Cns ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項 个頁)

訂 487711 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（24) 之粗產物。將白色粉末（〜0.5亳克/毫升）溶解於0.1%之乙酸 中，並以INNaOH將pH調整至〜7.0。在於室溫反應4小時後 ，以旋轉蒸發法濃縮該溶液（其如Elleman’s Reagent (Aldrich)指 明無自由SH-官能基}。如實例A所述，通過Sephadex G-25管 柱，再通過製備性HPLC以純化粗產物。純產物之產率爲25-30%。根據上述方法，在選擇進行環化之位置及其他位置 ，使用對應之胺基酸衍生物製備其他含有-S-(CH2)t-CO_NH-或 -NH-CCKCT^-S-内部橋鍵之環狀肽。 C .本發明之神經變性治療範疇 實例C 1 生物試驗-本發明共輕物對於經y?-類殿粉肽處理神經元之 生存之影響 方法 已知y?-類澱粉肽涉及阿玆海默症，且對於培養生長之神 經元而言係一種毒性物質（Pike et al.，J. of Neurosci·，13⑷51676-1687 (1993) ; Yankner et al.，Science，250:279-82 (1990) ; Gozes et al·，Proc. Natl· Acad. Sci. USA, 93:927432 (1996))。 稍微修飾 Forsythe and Westbrook (J. Physiol· Lo9rd. 365:515 (1988))所 述之技術以製備大鼠大腦皮層細胞培養物，其中使用大腦 皮層取代海馬體，而使用新生大鼠取代E16小鼠。將大腦 皮層細胞（0.5-15 X 105細胞/35毫米之孤）於鋪滿大腦皮層星 形細胞飼養培養物上進行平板培養（如Gozes et al·，J· Pharmacol. Exp. Therap.，257:959-966 (1991)所述）。培養基係含有5%之馬血 清及N3 [含有荷爾蒙混合物之培養基添加物，根據Romijn et -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

本I) 、τ 7 48 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（25 ) al.，Brain Res·，254:(4)，583-589 (1981)]之 DMEM ( Dulbeco Modified Eagle Medium)。在活體外生長八天之後，完全替換該培養物之培 養基，再以Θ -類澱粉肽（胺基酸25-35)處理5天。 將/?-類澱粉肽片段溶於水中至終濃度2.5 mM。在平板培 養神經元9天之後，加入逐漸增加劑量之本發明共耗物（先 將1毫克與10微升之DMSO混合，再與另外10微升之DMSO混合 以達成完全溶解，以PBS稀釋取得ΙΟ-3 Μ之貯存溶液）以進行 實驗，並同時添加25 μΜ之々-類澱粉肽（胺基酸25-35)以分 散大腦皮層細胞。將10微升之共軛物溶液加入1毫升之培養 基中。處理期間爲5天，不替換培養基。在培養14天後，固 定細胞以進行免疫細胞化學分析，並以抗NSE (neuron specific enolase，神經元專一性烯醇化酶，一種神經元標記物）之抗體 染色。針對60個區域進行神經元細胞計數，總面積爲25 mm2 。亦在無前述處理之情況下進行神經元計數。每一數値皆爲 3皿之平均値土 SEM。 結果示於圖1及表2。圖1顯示五項獨立實驗之總値，各實 驗之控制組分別含有164、225、130、319、172神經元。如圖1 可見，St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2係一種具有高活性之共軛物，其具 有UHM0-9M之活性，且具有1(ΗΜ(Η〇Μ之峰活性。同時經此 共軛物及々-類澱粉肽處理之細胞計數高於未經處理之控 制組細胞計數，指出此種共軛物亦可保護細胞對抗天然發 生之死亡。 __ ·28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

π本頁) 、1Τ 487711

A B 五、發明説明（26 ) :<n¥

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r-I -29- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487711 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（27 ) 如表2可見，與控制組相較，St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2共軛物（1 ) 之許多修飾物皆顯示保護神經元免於因々-類澱粉肽而造成 之死亡之相似活性。在某些情況中（當神經元之存活率與 控制組相較超過100%時），該等共軛物亦可保護細胞對抗 天然發生之死亡。特別是在取代共軛物1之Leu爲Val ( 3 )、 D-Ala(3)、Nle(4)，於N端（8)或 C 端（9，10，11，12，13)作胺基酸 殘基添加，於N端（7)作胺基酸殘基缺失或取代親脂性殘 基硬脂醯基爲月桂醯基（Lau)(5)或己醯基（Cap，6)時，皆產 生具有類似性之共軛物。 實例C 2 本發明共軛物在阿玆海默症之動物模型中（Morris Water Maze) 對於學習及記憶之影響 活體内膽鹼能抑制模型。對18隻雄性大鼠（Wistar，250-300克） ，使用繫有25G針之塑膠導管（PE-20)，以〇·21微升/分鐘之速 率，經腦室（i.c.v.)進行注射，·控制組接受2微升/侧之食鹽水 注射，實驗組動物則接受膽鹼能阻斷劑（乙基膽鹼吖丙啶鑕 鹽）AF64A(3毫莫耳/2微升/侧）之注射。 藥物治療起始於AF64A注射之7_10天後。將試驗動物分成兩-相等之族群。試驗組每天接受以微克/ 40微升之濃度溶於 10% Sefsol™及 40% 異丙醇中之 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2的經鼻投藥（ 每鼻孔20微升）。控制組動物則接受賦形劑之經鼻投藥。在 經鼻投藥之前，先以二乙醚部分麻醉大鼠。在七天之投藥後 ，另外進行10天之行爲分析。在試驗前1小時進行經鼻投藥 。所有之試驗動物皆以50,000單位之耐久生物性抗生素進行 慢性處理（每兩天一次）以避免感染。 -30 * 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

π本頁) 、-5-口 487711 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（28) 學習試驗之流程係根據Morris Water Maze之流程進行（Morris et al.，Nature，297:681-683,1982 ; Morris etal.，Nature，319:774-7765 1986)。 I. St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2之投藥 將大鼠置於直徑1.26公尺、0.2公尺深、備有透明Plexiglas管 柱及一 13.3公分之平台（其正好位於水面下方）之環狀水池 中（水溫22-24°C )。每天在試驗前1小時經鼻進行投藥。記 綠每隻大鼠到達平台所耗之時間（秒），並對多日訓練後之 變化進行作圖，其反應出學習及記憶。 如圖2可見，注射AF64A之控制組動物（〇）在到達平台所 耗之時間方面，與注射AF64A並經鼻投藥St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 之試驗組動物（籲）相較，顯示較小之進步。此等結果指出 ，本發明之共軛物可在阿玆海默症之動物模型中改喜學習 及記憶之功能。 Π St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2之投藥 圖3顯示St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 (圖中以KKYO指明）在上述 之阿玆海默症活體試驗中（AF64A-膽鹼毒性試驗），對於學 習及記憶之影響。所得之結果與前述相似，僅以AF64A處 理之控制組動物（鲁）在到達平台所耗之時間方面，與注射 AF64A並經鼻投藥St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2之試驗組動物（▲)相 較，顯示較小之進步。亦進行另一探針試驗（Gozes et al.，Proc. Natl· Acad. Sci. USA 93:427432, 1996)。在此試驗中：當試驗動物 知道水池中平台之位置後，移除該平台，並記錄試驗動物 花費在先前平台位置區域之時間，此一時間代表先前研究 之記憶存留。如圖4可見，以St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2處理之 _ -31 - 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） (請先閱讀背面之注意事項

本頁) Ί. 487711 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（29 ) 動物，與未接受該肽之AF64A處理動物相較，具有較佳之記 憶存留。在此試驗之後，再將平台置回水池之中，惟此次 其係在游泳之大鼠可見之位置。測量到達平台所需之時間 。在此試驗中，量測之變數係可能之行爲缺陷。如圖5可 見各組之間並播差異，因此就整體而言，該試驗係測量 學習及記憶’而非行爲變化。 實例C 3 本發明共軛物對於正常動物之學習及記憶之影響 重複實例C 2所述之實驗，惟以食鹽水取代AF64A對動物 進行注射。因此，試驗動物爲正常動物，而不具有似阿玆 海默症之認知損傷。將試驗動物分爲兩組，其中之一僅經 鼻投予賦形劑（如上所述之Sefs〇l +異丙醇），而另一組則接 受St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2之經鼻投藥。如圖6可見，在經肽 類處理之試驗组中，觀察到明顯較快之學習情形，其指出 亦存在於未受損傷、正常動物身上之可能性認知功能進步 效應。 實例C 4 本發明共軛物在記憶存留模型中之影響 發展一種新模型以評估試驗動物對先前習得試驗之記惊 存留能力。首先，如上所述敎導試驗動物（N = 5-l〇)發現水 迷宮内浸於水中之平台。爲評估記憶之存留，讓試驗動物 每天游泳一次（每天一次試驗）以學習發現隱藏之平台。一 星期之後，選擇研究測驗中顯示最高分數之試驗動物進行 實驗。將AF64A或食鹽水注射至第三腦室，在一星期之恢 -32- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項

本頁) 訂 487711 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（30 ) ~~ ---- A^f ，如上所述以St-Lys-LyS-Tyr-Leu-NH2之經鼻投藥處理試 驗=物在一星期之肽類處理後，重新於水迷宮中對此等 試動物進行測試。習得技巧(亦即，*現平台之技巧)之 $留試驗係依下述方法重複··將試驗動物置於平台上!分 i然後’再將試驗動物置於水中以使其游向平台，記錄 =達平:所需又時間。第一次游泳之結果如圖7所摘述。 如圖中可見，以該肽進行處理之試驗動物明顯受到保護未 產生記憶流失之現象，且可以在AF64A之注射前皆留存研究 目標技巧之記憶，因其具有與控制組相同之行爲。 在平口上1分鐘後，再將試驗動物置於水中以進行另一次 (游泳並尋找隱藏之平台。圖8顯示第二次游泳之結果。如 其中可見，圖8亦顯示經肽類處理之試驗動物在學習及記憶 方面之進步。此一模型首先説明該肽類之活性及記憶存留之 增進情形。 ~ $ 最後，移除該平台，而試驗動物花費在原平台存在區域之 時間則示舆圖9。如上摘述之諸等結果清楚説明別伽以如 Leu-NH2涉及學習、運作記憶及記憶存留之過程。 實例C 5 本發明共軛物在智能障礙模型中之影響 支能·障礙模型：裁脂茶白]7,-缺陷小鼠.· 近來已發現，載脂蛋白 E( ApoE) ( Plump et al.，Cell，71:343-363 (1992))缺陷之小鼠在其發展之重要時期指標上，具有學習 延遲之現象。對ApoE缺陷小鼠進行行爲重要時期指標發展 試驗’發現其在前肢放置行爲之學習上，與控制組動物相 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項^^^^本頁) 丨II裝·

、1T 487711 A7 ----- 五、發明説明（31 ) ^~—- 較（出生後2·5天）具有明顯之证、居 頌艾延遲現象（出生後11-13天）。亦 在此等小鼠之懸崖規避行爲學習 跑疲糾、 巧予自上，觀察到兩天之延遲現 象0 對8隻新生之正常小鼠進彳恤•碼或食鹽水 之注射（S.c.，！.2微克/12〇微升）。亦對8隻獅缺陷之新生 小鼠進行類似之處理。 則肢放置行爲學習之結果如圖“及丨丨所示。如其中可 見’經 St-Lys-Lys-Tyr杨,2 或經已知之 St-Niei7‘viP-NH2 (其僅 作馬比較）處理之ApoE缺陷小鼠，在與未經處理之Ap〇E缺 陷小鼠相較之下，皆可改善其放置學習能力至基本上與控 制組相同之程度。 圖12及13顯示經上述處理之試驗動物之懸崖規避學習 行爲。如其中可見，經St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2或經已知之St_ NleUVIP-NH2 (其僅作爲比較）處理之Ap〇E缺陷小鼠顯示優於 正常控制组動物之懸崖規避學習能力，或類似於控制組動 物之懸崖規避學習能力。 實例C 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項}本頁) 本發明共軛物對載脂蛋白E缺陷小鼠膽鹼能活性之影響 根據 Fonnum，F.A·，！ nEUROCHEM·，24:413415, 1975所述之方法對 Αροβ缺陷小鼠進行其贍鹼能活性之分析。簡言之，其藉由 Chat活性之測量，對取自21天大之正常（控制组）及ApoE缺陷 小鼠之腦進行評估。膽鹼乙醯基轉移酶（Choline acetyl transferase，Chat)活性係如前述方法’以[14C]乙酷膽驗由膽 鹼及[14C] 6醯CoA合成之速率進行測定（參見其内容）。在 -34- _ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公瘦） 7 7 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（32 ) 無膽鹼存在之情形下測量非專一性之背景値。將每個腦部 (300-400毫克）於鐵氟龍勻漿器中，使用10體積含有300 mM Naa、30 mM EDTA及 0,5% Triton之 50 mM磷酸鹽缓衝液（pH = 7.4) 進行勻漿處理。將勻漿液於12000 g離心15分鐘，並將10微 升之上清液（進行三重實驗）與10微升含有：ΗμΜΜΟ乙醯-CoA ( 56 mCi/毫莫耳ΝΕΝ)、20 mM乙醯膽鹼、1.6 mM氣化膽 鹼、0.25 mM扁毒豆鹼及磷酸鹽緩衝液之溶液混合。於37°C 下進行15分鐘之反應。加入50微升製備於3 -庚酮中之15毫克 /毫升四苯硼以終止反應，並震盪混合30秒。在2分鐘之 離心後，收集20微升之有機層，再將其與閃爍液體混合， 並於貝他計數器中測量放射活性。 對經肽或食鹽水慢性注射之動物（21天大小）進行實驗。 注射係由皮下進行，該肽係溶解於DMSO中（100微克/ 30微 升），並以食鹽水稀釋以取得所欲濃度。第天：4微克肽 /20微升食鹽水；第5-10天·· 8微克肽/40微升食鹽水；第 11-14天：16微克肽/80微升食鹽水。 贍鹼能活性之結杲顯示ApoE缺陷小鼠之還原。經St-Lys-Lys-Tyr-Leιl-NH2投藥小鼠之膽鹼能活性示於圖1 4。該圖顯示 ，在與控制組之濃度比較之下，經St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2投藥 之ApoE缺陷小鼠顯示膽鹼乙醯基轉移酶活性之增加。 圖1 4指出，St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2可提升載脂蛋白E缺陷小 鼠之膽鹼能活性（在所有膽鹼乙醯基轉移酶活性之測定値 中，100%之活性代表669-758皮莫耳/毫克蛋白質/分）。 實例C 7 -35 - (請先閱讀背面之注意事項

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、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 7 7 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（33 ) St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 之生物分布 使用 Gozes et al·，Edocrinology，134:2121-2125 (1994)所述之氯胺 T 方法對St-Lys-Lys-Tyr-Leii-NH2進行放射性麟化作用，並將約7.8 x 106 cpm/ 2微升5% Sefsol™，20%異丙醇/大鼠之量對250-300隻 大鼠進行經鼻投藥。投藥30分鐘之後，殺死試驗動物並取出 額面皮質，秤重，並於加瑪計數器中測量放射活性。之後， 對放射活性樣本（含有1400cpm/克樣本）作勾漿化處理並進行 離心（5,400 g，25 分鐘）。使用 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NI^ 作爲標記物 ，對上清液進行HPLC分析（於部分25使用乙腈梯度進行溶析) 。在加瑪計數器中監測樣本之放射活性。 如圖15可見，原型之St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2可在投藥30分鐘 之後於腦部觀察得見，其指出，本發明之共軛物在經鼻投藥 之時可到達腦部。 D .本發明之性無能預防範疇 陰莖反射生物試驗 此等生物試驗係在經皮投予本發明共軛物後，測量睪丸 劃除大鼠之陰莖反射而進行。在第一型之生物實驗中，其 測量含有不同載體之組合物對陰莖反射之影響，而其發現 Sefsol™係最有效之載體。 (a )方法 性無能之動物模型 使用因割除睪丸而具有降低之性能力之大鼠。將雄性大 鼠（250-300克，約三個月大小）飼養於12小時光照，12小時黑 暗之循環中。在黑暗期中（黑暗起始後2-6小時）進行試驗。 -36- (請先閎讀背面之注意事項

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、1T 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 487711 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（34 ) — ^~^ · 對雄性大鼠進行睪丸切除，並在14-21天中（實驗之持誇 期間），連續以每日注射一次之形式，给予部分之筆固嗣 取代（4微克/ 100克體重）。手術一星期後進行實驗。 陰莖反射（勃起）之直接評估 使用一種利用陰莖内性反射測量技術的方法，其可在經 皮投藥之後直接評估陰莖之勃起。成功之複製大量依賴依 時間組織且功能相關之行爲單元的確切執行。在這些實驗 中’我們將重點放在勃起過程之終階段（陰莖之轉紅，伴 隨其膨脈及延長’以造成完整之勃起），並彳貞測第一 £2及 第一杯狀體出現所須之時間（Okumura，M.，et al·，Chem. Phar. Bull 37 1375(1989))。 爲進行試驗’將每一試驗動物身體之前部以疏鬆接觸之 圓柱（7公分直徑）包住而固定於仰臥位置。在將皮帶繞過 驅幹固定之後，使陰莖之龜頭自其鞘伸出，並以位於陰莖 後方之細木製裝置將其小心固定至與腹部垂直。試驗之時 間爲45分鐘。記錄E2及杯狀體出現所須之時間及數目，並予 以製圖。 E2之定義係爲完全勃起，其後可出現杯狀體，其中陰莖 之頂‘成爲杯狀結構，藉此結構之形成，龜頭便會張開 ’以致於陰莖之遠端部分會較其基部爲寬。此一終階段需 要E2 ’且其可能是射精之先決條件。使用此等所有參數， 可對党試大鼠之性活動進行可靠之測量。 偵測試驗動物45分鐘以測定E2之持續期，並計算勃起之總 時間（其可藉由單一勃起現象時間長度之測量取得，或將 (請先閲讀背面之注意事項

本頁) 、·ΙΤ -37- 77 8 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 ________B7 五、發明説明（36 ) 數次非連續性勃起現象之時間相加而取得）。單一勃起現 象之最短持續時間以半分鐘計。 實例D 1 本發明共軛物在性無能之大鼠模型中之影響 將共軛物以10_3M之濃度溶解於二甲基亞砜（DMSO)中， 並在每次投藥中使用10微升。使用之大鼠係經切除睪丸， 並經部分睪固酮取代處理（Gozes et al·，I Clin. Inves.，90:810-814 (1992))。簡言之，對雄性大鼠（9〇·100天大小）進行睪丸切除 ，並立刻以4微克/ 1〇〇克之BW睪固酮經皮下進行2 1天（即 實驗之持續期間）每日一次之注射。於手術一星期後開始 進行實驗。如上所述測量陰莖反射。 圖 Ιό 顯示肤 ό( St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Lei>Asn-Ser-Ile-Lei>Asn-NH2 ) 在與控制組相較之下，可顯著增進杯狀體數目及E2數目。 圖17顯示肽6與肽26之比較。亦以上述之方法，對其他本 發明之共軛物重複進行實驗，惟肽類係以7微克/ 10微升每 隻動物之終濃度溶解於5% Sefsol™及20%異丙醇中。經試驗 之共耗物爲：St-Lys-Lys-Tyr-TLeu-NH2 ; St-Ser-I〗e-Leu-Asn-NH2 ; St-Asn-Ser-De-Tyr-Leu-Asn-NH^ ί St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 * St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2 » St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2 ^ St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-De-Leu-Asn-NH2 0 結果示於圖18-27，且其指出，在與控制組相較之下， 所有試驗共輛物皆可改善所有經測定之試驗性無能指標（ 杯狀體數目、E2數目及第一杯狀物出現所須時間之減少） -38 - 本紙張尺度適用中國國家標準（dNS ) A4規格（2l〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 个頁)

訂 7 7 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（36 ) 實例D 2 局部投藥St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2後之生物分布 如上所述對St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2進行放射性破化作用，並 將約2.2\1〇6〇?111/2微升5%30{5〇11，2〇%異丙醇/大鼠之量對 250-300隻大鼠之性器官進行局部投藥。在指定時間殺死試驗 動物，對組織進行秤重，並於加瑪計數器中測量放射活性。 結果示於圖28。此等結果指出，經皮投藥之共軛物可穿透 試驗動物之内部組織。 實例D 3 小腸萃取物之HPLC分析 如實驗D2所述者進行實驗。於投藥30分鐘後殺死試驗 動物，切除小腸，秤重，並於加瑪計數器中測量放射活性 。再對具有放射活性之組織作勻漿處理並進行離心（5,400g， 25分鐘）。使用經放射性碘化之St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2作爲標記 物，對上清液進行HPLC分析（於部分25使用乙腈梯度進行溶 析）。在加瑪計數器中監測樣本之放射活性。 結果示於圖29。如可由圖26及27所示投藥2.2xl06cpm/克 之結果中得見者，在投藥30分鐘後，超過80,000 cpm/克皆 位於小腸中。爲進行比較，使用相同量之放射標記St-Nlen-VIP-NH2，而僅有3700 cpm /克在小腸中取得（Gozes et al” Endocrinology，134:2121-2125 (1994))，顯示本發明之短型共軛物較 完整之28胺基酸共軛物具有較佳之穿透能力。 實例D 4 本發明共軛物在性無能之兔模型中之影響 -39- (請先閲讀背面之注意事項

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、1T 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 487711 A7 B7 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 五、發明説明（37) 以Rompun及Ketavet麻醉組西蘭白兔（購自Yokneam，Israel)。 此外，將10亳克/公斤之戊巴比妥經靜脈内投藥至耳靜脈 中。以戊巴比妥（5-10毫克/公斤）之團塊注射以維持麻醉 狀態。將試驗動物以仰臥姿勢於溫度調控之環境下置於手 術台上。剃除陰莖周園區域之毛髮，將一 20號之針插入左 或右侧之海綿體中，並以導管連接至一壓力轉導器上，以 持續記錄海綿體内（i.c·)之壓力。所用之轉導放大器係Model PM-1000 (内建CWE) ; System 1000電源供應器（内建CWE);軟 體：DI 200 PGH/PGL ( DATA Q Tnstrument Inc，）。當須進行注射之 時，將一第二導管置入另一側之海綿體中以進行投藥，兩 導管皆充滿血液。以0.5毫升2%之肝素沖洗血壓記錄導管。 海缔體内血壓之上升於圖中以毫米汞柱（tnm Hg)表示。 圖30顯示由海綿體之St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2注射取得之血壓 變化初級結果。於此，10微克顯示劇增之活性，使陰莖血 壓增加到75毫米汞柱（自15-20毫米汞柱起始），其指出此種 共軛物亦可藉由直接注射而造成陰莖之勃起。 E .經皮投藥之醫藥組合物 使用Sefsol 318™作爲載體之本發明親脂性共軛肽經皮投藥 用軟膏組合物之實例之一包含：每714微升10% Sefso1 318™ ( 甘油單己酸酯）及714微升40%異丙醇中1毫克肽（终濃度：5% Sefeol，20%異丙醇及約0.7毫克/毫升肽）。 (請先閎讀背面之注意事項

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、1T -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐）

Claims (1)

1. 487711 8 8 8 8 ABCD 第86107759號專利申請案 中文申請專利範圍修正本(90年11月) 申請專利範固 公告

   一種由肽類與親脂性殘基偶合之共輛物，其中該肽具有 至少3且至多1 2個胺基酸殘基，該共軛物係選自下列之 式： (i) IVXrX^X广XrNH-R2 ; (ii) RpX3-Ser-X4-Leu-Asn-NH-R2 ; (iii) RrNH-CH-COLys-Lys-Tyr-XrNH-CH-COX6-NH-R2 ;及 (CH2)r -Z- (CH2)n 其中 Ri係H、硬脂醯基、月桂醯基或己醯基； R2 係11 ; X!係一共價鍵、Lys或Val-Lys ; Xi，係 Lys ; X〆，係Tyr ; X4 係 lie ; X5 係 L e u ; X^-Asn Λ X^-Asn-Scr Λ Χ^- X2 係 X5、Va卜 D-Ala、Nle、XrNle Asn-Ser-Ile或 X5-Asn-Ser-Ile-Leu ; X3 係一共價鍵、Asn、XrAsn 或 Tyr-XrAsn ; X6係一共價鍵； Z 係-NHCO-、-S-S-或-S(CH2)tC〇-NH-; m 係 1 (當 Z 係-S-S-或-S(CH2)tCO-NH-)，或 m 係 4 (當 Z 係-NHCO-)； n 係 1 (當 Ζ 係-NHCO-或-S-S-)，或 η 係 4 (當 Ζ 係-S(CH2)tC〇- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格（210 X 297公赞） 487711 Λ8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 NH-);而 t 係1 〇 2 .根據申請專利範圍第1項之共軛物，其中&係選自硬脂 醯基（St)、己酿基（Cap)及月桂酿基（Lau) 〇 3.根據申請專利範圍第2項之共軛物，其係選自： St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ： St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 ； St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 ! St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2 ； St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH];及 St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2。 4 .根據申請專利範圍第2項之共軛物，其係選自： Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ; Cap-Lys-Lys-Tyr_Leu-NH2 ; St-Lys-Tyr-Leu-NH2 ； St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2 ； St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 ； St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 ； St-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 ； St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2 ； St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2 ； St>Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2 ;及 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2 0 5. —種用於治療男性無能或神經變性疾病之醫藥組合物， -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐）

   其包含作為活性成分之根據申請專利範圍第1項之共軛 物’以及醫藥可接受之載體。 6·根據申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其係用於治療 性功能障礙，其包含選自根據申請專利範圍第3項之共 軛物所組成之群作為活性成分之共軛物及共軛物仏八心 Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser_Ile-Leu_Asn-NH2 )，以及醫藥可接受 之載體。 7·根據申請專利範圍第6項之醫藥組合物，其用於治療男 十生性無能。 8. 根據申請專利範圍第6或7項之醫藥組合物，其適用於經 皮投藥。 9. 根據申請專利範圍第8項之醫藥組合物，其中該醫藥可 接受載體係1 -甘油單己酸酯。 10·根據申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其係用於治療 神經變性疾病，其包含選自根據申請專利範園第3或4項 之共軛物所組成之群作為活性成分之共軛物。 11·根據申請專利範圍第1 〇項之醫藥組合物，其中該神經變 性疾病係選自阿兹海默症，唐氏症，因局部缺血、中 風、中樞及周圍神經系統之遺傳性疾病而造成之行為或 認知功能減退，因中樞或周圍神經系統之創傷或因與血 液循環或神經元生存相關之神經疾病而造成之行為或認 知功能減退所組成之群。 12.根據申請專利範圍第1 〇或1 1項之醫藥組合物，其適用 於經鼻投藥。 -3-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 487711 A 8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 13..根據申請專利範圍第1 2項之醫藥組合物，其係為噴鼻藥 霧之形式。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(C NS) A4規格（210 X 297公釐）