KR100493830B1 - 친지성부및혈관작용성장펩티드(vip)의프래그먼트의콘쥬게이트 - Google Patents

친지성부및혈관작용성장펩티드(vip)의프래그먼트의콘쥬게이트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3 내지 12개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 및 펩티드의 N- 또는 C-말단에 존재할 수 있는 친지성 부의 신규한 콘쥬게이트에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 남성의 임포턴스의 치료 또는 신경변성 질환의 치료용으로 사용될 수 있는 상기 신규한 콘쥬게이트를 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.

Description

친지성 부 및 혈관작용성 장 펩티드(ＶＩＰ)의 프래그먼트의 콘쥬게이트 {Conjugates of Lipophilic Moieties and Fragments of Vasoactive Intestional Peptide(VIP)}
본 발명은 친지성 부(lipophilic moiety) 및 3 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 펩티드의 신규한 콘쥬게이트에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 신규한 콘쥬게이트를 활성 성분으로서 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 남성의 임포턴스의 치료 또는 신경변성(neurodegenerative) 질환의 치료용으로 사용된다.
포유동물의 신경계에 널리 분포된 28개의 아미노산 신경펩티드인 혈관작용성 장 펩티드(VIP)는 신경 세포 기능에 영향을 미치는 강력한 향신경성 작용을 갖는다. 중추신경계에서 VIP의 상기 역할은 발달상의 효과, 성장 인자 활성의 발현 및 뉴우런의 생존 및 기능의 유지로 나타난다. VIP를 방출할 수 있는 뉴우런은 신체의 구석구석의 혈관 뿐 아니라 폐 기관을 자극하며, 방출된 VIP는 위 근육 이완을 비롯한 강력한 혈관 확장 신경으로서 작용한다. 방사성리간드 결합 평가분석법, 생리학적 실험, 분자 클로닝 및 슈퍼활성 신규 유도체의 개발로 인하여 여러 종류의 VIP 수용체 자리 및 여러개의 잠재적인 치료 용도를 알게 되었다.
VIP, 변형(modified) VIP 또는 친지성 VIP 유도체의 2가지 가능한 치료 용도는 본출원인의 이전의 특허 IL 87055, EP 0354992 및 US 5,147,855호 및 공개된 특허 출원 EP 0540969 및 EP 0620008에서 보고되었으며, 이 용도는 각각 경피 투여에 의해 남성의 임포턴스를 치료하거나 신경변성 질환을 치료하는 데에 관한 것이다.
VIP는 하기 서열을 갖는, 혈청에서 매우 짧은 반감기를 갖는 친수성 펩티드이다(S. I., Editor, Vasoactive intestinal peptide in: Advances in Peptide Hormone Research Series, Raven Press, New York, 1-512(1982) 참조).
VIP의 생물학적 유용성을 강화시키고 그의 안정성을 증가시키기 위하여, 본 발명자들은 상기 특허 및 출원에서 보고된 2개의 화학적 변형을 사용하였다. 첫번째는 활성을 상실하지 않고 생물학적 막을 투과하기 위한 VIP의 성능을 증대시키도록 고안된 친지성화, 즉 지방산 부(moiety)의 부가로서, 따라서, VIP의 N-말단에서 스테아르산 부와 VIP를 결합시킨 분자인 스테아로일-VIP가 고안되었다(EP 0354992). 두번째 변형은 산화에 대하여 분자를 안정화시키고, 또한 지방친화도를 증가시키는 것을 목적으로 하여 천연 아미노산을 비천연 아미노산으로 대체하는 것, 즉 메티오닌(VIP의 17번째 아미노산)을 노를류신으로 치환하는 것으로서, 따라서 스테아로일-Nle-VIP가 고안되었다(Gozes 등, Endocrinology, 134:2121-2125 (1994); Fauchere 등, Int. J. Peptide Protein Res., 32:269-278 (1988); EP 0540969). VIP 서열의 17-24 위치로부터 유래된 변형되지 않은 VIP 프래그먼트가 궤양 억제제로서 EP 0225020에 기술되어 있다.
약제로서 임의의 물질을 사용함에 있어서 주요한 장애물은 신체에서의 분포이다. 전술한 EP 0354992 및 EP 0540969에서 보고된 남성 임포턴스의 경피 치료용으로 사용된 변형 VIP 또는 친지성 VIP는 진피를 통하여 투과하여 가능하면 짧은 시간 안에 발기 조직에 도달하여야 한다.
EP 0620008에서 기술된 신경변성 질환을 치료하기 위하여 사용된 VIP, 변형 VIP 또는 친지성 VIP는 혈관 뇌 장벽을 통과하여 뇌 세포에 대한 치료 효과를 발휘하도록 해야 한다.
남성의 임포턴스를 치료하기 위한 목적 및 신경변성 질환의 치료를 위해 CNS로 투여하기 위한 목적으로 완전한 VIP 펩티드의 생리학적 활성을 가지면서도 크기가 보다 작아 표적 조직에서의 치료용 화합물의 생체이용율을 개선시킬 수 있는 분자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 더우기, 분자가 작을수록 때때로 큰 분자보다 변성에 대해 보다 안정한데, 이는 일반적으로 작은 분자들이 변성에서 이용될 수 있는 자리가 적기 때문이다.
<발명의 요약>
본 발명은 3-12개의 아미노산 길이를 갖는, 친지성 부에 콘쥬게이트된 VIP 또는 변형 VIP의 짧은 프래그먼트가 임포턴스 및(또는) 신경변성 질환의 치료 분야에서 생리학적으로 활성이 있다는 놀라운 발견을 근거로 한다. 완전한 VIP 분자를 사용하는 것에 비하여 친지성 부에 콘쥬게이트된 생리학적으로 활성인 짧은 펩티드를 사용하는 것의 잇점은 신체 내에서 생체분포 및 생체이용율이 더 좋다는 것이고, 또한 제조가 용이하다는 것이다. 더우기, 본 발명은 상기 장점 이외에 비교적 변성 방지성이 있는 잇점을 특징으로 하는 친지성 부에 콘쥬게이트된 VIP 또는 변형 VIP의 상기 짧은 프래그먼트를 함유하는 짧은 시클릭 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 3개 내지 12개의 아미노산 잔기를 가지면서 친지성 부에 커플링된 펩티드의 콘쥬게이트에 관한 것으로서, 상기 콘쥬게이트는 하기 식으로부터 선택된다:
R1-X1-X1'-X1"-X2-NH-R2
R1-X3-Ser-X4-Leu-Asn-NH-R2
상기식에서,
R1은 H 또는 친지성 부이고,
R2는 H, 친지성 부, X3-Ser-X4-Leu-Asn-NHR1에 의해 치환된 친지성 부, 또는 X1-X1'-X1"-X2-NHR1에 커플링된 비대전 아미노산의 1-3 잔기로 이루어진 스페이서이되, 단, R1 및 R2 중 적어도 하나는 친지성 부인 것을 조건으로 하고,
X1은 공유 결합, Ala, Val, Ala-Val, Val-Ala, L-Lys, D-Lys, Ala-Lys, Val-Lys, Ala-Val-Lys, Val-Ala-Lys 또는 Orn이고,
X1'는 L-Lys, D-Lys 또는 Orn이고,
X1"는 L-Tyr, D-Tyr, Phe, Trp 또는 p-아미노 페닐알라닌의 잔기이고,
X4는 Ile 또는 Tyr이고,
X5는 소수성 지방족 아미노산의 잔기이고,
X2는 X5, X5-Asn, X5-Ser, X5-Ile, X5-Tyr, X5-Leu, X5-Nle, X5-D-Ala, X5-Asn-Ser, X5-Asn-Ser-Ile, X5-Asn-Ser-Tyr, X5-Asn-Ser-Ile-Leu, X5-Asn-Ser-Tyr-Leu, X5-Asn-Ser-Ile-Asn 또는 X5-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn이고,
X3은 공유 결합, Asn, X5, X5-Asn, Tyr-X5, Tyr-X5-Asn, Lys-X5, Lys-X5-Asn, Lys-Tyr-X5, Lys-Tyr-X5-Asn, Lys-Lys-Tyr-X5, Lys-Lys-Tyr-X5-Asn, Val-Lys-Lys-Tyr-X5, Val-Ala-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn, 또는 Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn이고,
X6은 공유 결합 또는 Asn, Ser, Ile, Tyr, Leu, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Tyr, Asn-Ser-Ile-Leu, Asn-Ser-Tyr-Leu, Asn-Ser-Ile-Leu-Asn 또는 Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn이고,
X7은 공유 결합이거나 또는 Asn이고,
X8은 공유 결합, X5, Tyr, Lys, Tyr-X5, Lys-X5, Lys-Tyr-X5, Lys-Lys-Tyr-X5, Val-Lys-Lys-Tyr-X5, Ala-Lys-Lys-Tyr-X5 또는 Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5이고,
Z는 -CONH-, -NHCO-, -S-S-, -S(CH2)tCO-NH- 또는 -NH-CO(CH2)tS-이고,
Z가 -CONH-, -S-S- 또는 -S(CH2)tCO-NH-일 때 m은 1 또는 2이거나, 또는 Z가 -NH-CO- 또는 -NH-CO(CH2)tS-일 때 m은 2, 3 또는 4이고,
Z가 -NH-CO-, -S-S- 또는 -NH-CO(CH2)tS-일 때 n은 1 또는 2이거나, 또는 Z가 -CONH- 또는 -S(CH2)tCO-NH-일 때 n은 2, 3 또는 4이고,
t는 1 또는 2이되, 단,
콘쥬게이트 스테아로일-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn
-NH2는 제외한다.
X5에 의해 표현된 소수성 지방족 아미노산은 Ala, Ile, Leu, Met, Val, Nva 및 Nle로부터 선택된 D- 또는 L-아미노산의 잔기일 수 있다.
본원에서는 용어 "본 발명의 콘쥬게이트의 친지성 부"는 하기 설명 및 청구 범위에서 탄소 원자수가 3개 이상인 포화 또는 불포화 히드로카르빌 또는 카르복실산 아실 라디칼, 예를 들면 프로피오닐, 카프로일, 라우릴, 팔미토일, 스테아로일, 올레일, 에이코사노일, 독사노일 및 각각의 히드로카르빌 라디칼 프로필, 헥실, 도데실, 헥사데실, 옥타데실, 에이코사닐, 도코사닐 등으로 지칭될 것이다. 바람직하게는 히드로카르빌 또는 아실 라디칼은 포화되어 있으며 탄소수가 3 내지 22이다.
용어 "스페이서"는 비대전된 천연 또는 비천연 아미노산, 예를 들면 알라닌, 프롤린 및 아미노카프로산의 잔기를 의미한다.
본 발명의 콘쥬게이트의 예는 친지성 부 및 VIP 서열의 20 내지 23 위치에서 유래된 서열 Lys-Lys-Tyr-Leu의 펩티드 및(또는) 아미노산 잔기가 대체되거나,부가되거나, 삭제되거나 또는 화학적으로 변형된 그의 변형 펩티드 또는 VIP 서열의 24 내지 28 위치로부터 유래된 서열 Asn-Ser-Ile-Leu-Asn의 펩티드의 콘쥬게이트, 또는 하기와 같은 이들 서열의 2개의 조합이다:
하기에서, 기호 "St"는 스테아로일을 나타내고, "Lau"는 라우로일을 나타내고, "Cap"는 카프로일을 나타낸다.
본 발명의 또다른 면은 활성 성분으로서 본 발명의 활성 콘쥬게이트를 제약학상 허용가능한 담체와 함께 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 콘쥬게이트 또는 EP 0620008에 기술되어 있는 콘쥬게이트 St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(이하에서 "펩티드 6")을 함유하는 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 경피 또는 요로 적용에 의해 남성 임포턴스와 같은 성적 장애의 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 목적으로 사용되는 바람직한 콘쥬게이트는 하기와 같다.
또한 본 발명의 제약 조성물은 신경변성 질환, 예를 들면 알츠하이머병, 다운 증후군, 저산소증, 또는 국소 빈혈로 인한 운동 또는 인식 작용에서의 쇠락, 발작, 중추 신경계 및 말초 신경계의 유전병, 중추 신경계 또는 말초 신경계의 손상으로 인한 운동 또는 인식 작용의 쇠락, 노령으로 인한 인식 작용의 쇠락, 및 혈액 순환 및 뉴우런 생존과 관련된 신경학적 질환의 치료용으로 사용될 수 있다. 용어 "치료"는 본 발명의 문맥에서는 상기 질환에서 명백한 비정상적인 상태의 경감, 개선 또는 제거, 보다 구체적으로는 상기 질환에 의해 손상된 인식 작용의 개선으로서 이해되어야 한다. 이 목적을 위하여 사용된 바람직한 콘쥬게이트는 하기와 같다:
본 발명의 제약 조성물의 투여에 대한 선택적인 방식은 피하, 정맥 내, 경구, 코, 눈, 인트라셀리브로벤트리큘라(intracerebroventricular) 펌프에 의해, 요로 또는 경피 투여를 통하는 것이다.
본 발명의 제약 조성물이 임포턴스를 치료하기 위하여 사용되는 경우, 요로 또는 경피 투여가 바람직하다. 경피 적용의 경우, 담체는 활성 성분의 조직 투과를 증강시키는 담체 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 적당한 담체는 올리브유, 글리세린, 윤활제, 니트로글리세린 및 세프졸(Sefsol)TM 및 그의 혼합물을 예로 들 수 있다. 세프졸은 1-글리세릴 모노카프릴레이트, 프로필렌 글리콜 디데카노에이트, 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트, 글리세릴 트리카프릴레이트 및 소르비탄 모노카프릴레이트에 대한 상표명(일본 도쿄 소재의 니코 케미칼)이고, 이들은 본 발명에 따른 조성물 중의 바람직한 담체이다. 이들 중, 1-글리세릴 모노카프릴레이트 및 올리브유가 특히 바람직하다. 요로 적용의 경우 겔이 담체로서 사용되기에 바람직하다.
본 발명의 콘쥬게이트를 지속적으로 방출하기 위해 본 발명은 또한 피부에 적용하도록 조절되고 상기 콘쥬게이트가 적재된 어플리케이터(applicator)를 포함하는 경피용 디스펜서를 제공한다.
바람직하다면, 어플리케이터 중의 콘쥬게이트는 상기에서 구체화된 종류의 제약 조성물로 제형화될 수 있다.
경피 투여에 의해 남성의 임포턴스를 치료하면 피하 투여와 같은 비경구 투여의 방식에 비해 여러가지 장점을 나타낸다. 그 하나로는, 경피 투여는 비외과적이어서 조직 파괴를 수반하지 않는다. 더우기, 이는 다른 투여 방식과 관련된 지속 발기 또는 타는듯한 고통을 유발하지 않는다. 또한, 경피 적용은 인트라케이브노절(intracavenosal: i.c.) 주입에 비하여 보다 더 신중하고 편리한 방식이다. 경피 적용은 긴 준비를 필요로 하지 않고 자발적인 성적 활동을 가능하게 할 수 있는 연속적 서방성 장치를 사용할 수 있게 하여 고통받는 개인의 통상적인 당황함의 상당부분을 면하게 할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물이 중추 신경계에 작용하는 약으로서 사용되는 경우에, 코를 통하여 이들을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 후관 신경(WO 91/07947)을 통하여, 눈의 경로를 통하여(Chiou, G.C.Y., (1991) An. Rev. Pharmacol. Toxical., 31: 457-67) 또는 문헌[W.M. Pardridge, Peptide Drug Delivery, Raven Press, N.Y. 1991]에서 기술한 바와 같은 임의의 다른 적당한 투여 방법에 의해 CNS로의 에어로졸 조성물의 투과를 가능하게 한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 인트라세레브로벤튜리큘러(intracerebroventuricular) 펌프에 의해 뇌를 직접 목표로 삼을 수 있다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 본 발명의 콘쥬게이트를 신경변성 질환 또는 남성의 임포턴스의 치료가 필요한 환자에게 투여하여 이를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 여전히 추가로 제약 조성물의 제제에 대한 본 발명의 콘쥬게이트의 용도를 제공한다.
당업계의 숙련가에게 인식될 수 있는 바와 같이, 상기 화학식 I에서 정의된 바와 같은 콘쥬게이트는 다수의 가능한 콘쥬게이트를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 콘쥬게이트 및 본 발명의 제약 조성물 중의 "활성 콘쥬게이트"로서 정의된 콘쥬게이트는 하기 분석 중 적어도 하나에서 활성이 있는 콘쥬게이트이다:
(1) 임포턴스가 걸린 동물 모델(정상의 거세된 동물)에서 발기를 일으킬 수 있는 콘쥬게이트;
(2) 전기적으로 차단된 뉴우런을 치사로부터 보호하는 활성을 갖는 콘쥬게이트;
(3) 배양 상태에 있는 미처리된 뉴우런을 자연사로부터 보호할 수 있는 콘쥬게이트;
(4) β-아밀로이드 펩티드의 25-35 프래그먼트에 의해 유발된 치사로부터, 배양된 뉴우런을 보호할 수 있는 콘쥬게이트;
(5) 받아들일 수 있는 학습 및 기억 습득 평가로 시험하는 바와 같이 나이든 동물 또는 치매 유발 시약으로 처리된 동물의 학습 및 기억 습득의 퇴화를 피할 수 있게 하는 콘쥬게이트, 및 실시예 등에서 기술한 치매 유발 시약으로 처리된 동물에서 이전에 습득한 과업의 회상을 개선할 수 있는 콘쥬게이트;
(6) 국소 빈혈이 있는 동물 모델 및(또는) 발작이 있는 모델에서 운동 및 인식 작용의 쇠락을 피하거나 개선할 수 있는 콘쥬게이트;
(7) 산소의 부족으로 유발된 손상으로부터 뉴우런을 보호할 수 있는 콘쥬게이트;
(8) ApoE로부터 타격을 받은 마우스 모델(Cell, 71:343 (1992)), 아밀로이드 과대발현의 트랜스제닉(transgenic) 모델(Nature, 373:523 (1995)), 돌연변이의 슈퍼 산화물 디스뮤타아제(dismutase) 발현이 있는 ALS에 걸린 모델(Science, 264, 1772 (1994)) 및 염색체 16의 3염색체성인 다운 증후군에 걸린 모델과 같은 중추 및 말초 신경계의 유전성 신경변성 질환에 걸린 모델에서 운동 및 인식 작용을 개선할 수 있는 콘쥬게이트; 및
(9) 래트(rat)에서 신경핵 베이사리스(basalis)의 장애(PNAS, 85:9481 (1988); 복부 해마상 융기에서 스코폴아민 유발 아세틸콜린 방출(PNAS, 90:11287 (1993)); NMDA 유발 경련(Brain Res. 448: 115 (1988))과 같은 중추 및 말초 신경계의 손상이 있는 모델에서 운동 및 인식 작용을 개선시킬 수 있는 콘쥬게이트.
하기에서, 일부 비제한적인 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 더 설명할 것이다.
도 1은 β-아밀로이드 펩티드로 처리된 뉴우런의 생존에 대한, St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2의 농도 변화의 효과를 도시한다.
도 2는 알츠하이머병이 걸린 동물 모델에서 학습 및 기억력에 대한, St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2를 함께 갖는 AF64A (●) 및 콜린성의 차단항체 AF64A (○)의 효과를 도시한다.
도 3은 알츠하이머병이 걸린 동물 모델에서 학습 및 기억력에 대한, St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2를 함께 갖는 AF64A (▲) 및 콜린성의 차단항체 AF64A (●)의 효과를 도시한다.
도 4는 알츠하이머병이 걸린 동물 모델에서 기억 보유에 대한, 염수 대조군 (○), St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2를 함께 갖는 염수 (■), 콜린성 차단항체 AF64A (▲) 및 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2를 함께 갖는 AF64A (◆)의 효과를 도시한다.
도 5는 염수 (○), 염수 및 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 (■), 콜린성 차단항체 AF64A (▲) 및 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2를 함께 갖는 AF64A (◆)으로 처리된 동물의 운동 작용을 도시한다.
도 6은 비히클이 투여된 정상인 대조용 동물에서의 학습 및 기억력에 대한, 염수 (○) 및 콘쥬게이트 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala (□)의 투여 효과를 도시한다.
도 7은 알츠하이머병이 걸린 동물 모델에서 이전에 학습한 과업(첫번째 헤엄)의 기억 보유에 대한, 염수 (●), 염수 및 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 (■), 콜린성 차단항체 AF64A (▲) 및 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2를 함께 갖는 AF64A (◆)의 투여 효과를 도시한다.
도 8은 두번째 헤엄(swim)에 대해 도 7과 관련하여 기술된 것과 동일한 실험을 도시한다.
도 9는 플랫폼이 존재하던 부위에서 동물에 의해 소비된 시간을 측정하는, 도 7과 관련하여 기술된 것과 동일한 실험을 도시한다.
도 10은 정상의 신생 마우스(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 (▲); 염수 (●)) 및 ApoE 결손 신생 마우스 (Apo E)(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 (▲); 염수 (○))에서 앞발을 놓는 행동 습득에 대한 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(St-KKYL-NH2) 및 염수의 효과를 도시한다.
도 11은 정상의 신생 마우스(St-Nle17-VIP-NH2 (▼) 및 염수 (●)) 및 ApoE 결손 마우스(St-Nle17-VIP-NH2 (▲)및 염수 (◆))에서 앞발을 놓는 행동 습득에 대한 St-Nle17-VIP-NH2 및 염수의 효과를 비교하기 위하여 도시한다.
도 12는 정상의 신생 마우스(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(▼) 및 염수 (●)) 및 ApoE 결손 신생 마우스(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 (▲) 및 염수 (◆))에서 벼랑 회피 습득에 대한 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(St-KKYL-NH2) 및 염수의 효과를 도시한다.
도 13은 정상의 신생 마우스 및 ApoE 결손 마우스에서 벼랑 회피 습득에 대한 St-Nle17-VIP-NH2의 효과를 비교하기 위하여 도시한다.
도 14는 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2로 처리된 Apo-E 결손 마우스 및 대조군의 콜린 아세틸 전이효소 활성을 도시한다.
도 15는 125I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2가 코내로 투여된 래트의 뇌 추출물의 HPLC 분석을 도시한다.
도 16은 E2 및 컵의 수에 대한, DMSO 중의 St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(펩티드 6)의 효과를 도시한다.
도 17은 컵의 수 및 E2의 수에 대한, DMSO 중의 St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(펩티드 6) 및 St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(펩티드 26)의 효과를 도시한다.
도 18은 컵의 수 및 E2의 수에 대한 5 % SefsolTM/20 % 이소프로판올 중의 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2의 효과를 도시한다(C=비히클 대조군, E=실험 펩티드).
도 19는 컵의 수 및 E2의 수에 대한 SefsolTM/이소프로판올 중의 St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2의 효과를 도시한다(C=비히클 대조군, E=실험 펩티드).
도 20은 컵의 수 및 E2의 수에 대한 SefsolTM/이소프로판올 중의 St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2의 효과를 도시한다(C=비히클 대조군, E=실험 펩티드).
도 21은 컵의 수 및 E2의 수에 대한 SefsolTM/이소프로판올 중의 St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2의 효과를 도시한다(C=비히클 대조군, E=실험 펩티드).
도 22는 컵의 수 및 E2의 수에 대한 SefsolTM/이소프로판올 중의 St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2의 효과를 도시한다.
도 23은 컵의 수에 대한, St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 (KKYO) 및 St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2 (KKYV)의 효과를 도시한다.
도 24는 제1 컵의 잠복기에 대한, St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 (KKYO) 및 St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2 (KKYV)의 효과를 도시한다.
도 25는 E2의 수에 대한, St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 (KKYO) 및 St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2 (KKYV)의 효과를 도시한다.
도 26은 컵의 수에 대한 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2의 효과를 도시한다.
도 27은 컵의 수에 대한 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2의 효과를 도시한다.
도 28은 125I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2의 국소 투여에 따른 생체분포를 도시한다.
도 29는 125I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(St-KKYL-NH2)로 국소 투여된 동물의 장내 추출물의 HPLC 분석을 도시한다.
도 30은 음경 혈압에 대한, 비히클, 0.1 ㎍의 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 및 10 ㎍의 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2의 신체 해면체로의 주입의 효과를 도시한다.
A. 선형 펩티드의 합성
작은 펩티드의 커다란 배터리를 얻기 위하여 자동식 펩티드 합성기를 이용하였다. 본 발명의 펩티드의 합성은 Fmoc 방법을 통하여 시판되는 프로토콜을 사용하는 ABIMED AMS 422 합성기(독일 란겐펠트 소재의 ABIMED사제)를 이용하는 자동 과정에 의해 달성되었다. 모든 보호된 아미노산 유도체가 회사에 의해 추천된 것과 같았다. 따라서, 하기 측쇄 보호를 이용하였다: Lys, N-엡실론-t-부틸옥시카르보닐(Boc), Tyr, Thr, Ser, O-t-부틸; Arg; 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐(PMC); Trp, Nin-Boc; Cys, S-트리틸, Asn, 베타-트리틸, PyBOP, 즉 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 커플링제로 사용하였다. 펩티드 쇄를 4-([2", 4"-디메톡시페닐] Fmoc 아미노에틸) 페톡시 수지(스위스 노바 소재의 링크 아미드 수지사제)상에 조립시켰다.
하기와 같이 측쇄 탈보호화와 함께 수지로부터 펩티드 쇄를 최종 절단하였다: 절단 혼합물: 90 % TFA, 5 % 물, 5 % 트리에틸실란. 펩티드와 함께 적재된 수지 100 mg을 고상 합성법에서 사용된 반응 컬럼 내부에서 3 ml 절단 혼합물을 사용하여 30 분 동안 배양하였다. 30 분 후에, 반응물을 절단된 수지로부터 분리하고 3시간 동안 더 절단시켰다. 절단된 펩티드를 얼음 냉각 tert-부틸메틸에테르로 침전시키고, 원심분리시켰다(4 ℃, 2000 rpm). 최적의 침전을 지속시키기 위하여, 석유 에테르(비점 40-60 ℃, 1:1 부피/부피)를 때때로 첨가하였다. 용액을 비스듬이 기울여 따르고, 펠렛을 물에 용해시키고 냉동하여 동결건조시켜 백색 분말상을 얻었다. 유속 10 ml/분으로 0.1 % TFA를 함유하는 물 중의 35 % 아세토니트릴 및 물 중의 75 % 아세토니트릴 중의 0.1 % TFA 사이의 선형 구배를 이용하여 중간 준비(semi-preparative) HPLC에 의해 RP-8 컬럼(Merck 7 μM; 250 x 10 mm) 상에서 조 펩티드를 정제하였다. 220 nm에서 용출을 모니터하였다. 수율은 30-45 %이었다. 분석 HPLC에 의해 RP-18 컬럼 상에서 생성물의 순도를 확인하고, 철저한 산 가수분해 후에 아미노산 분석을 하여 각 구성 아미노산의 기대값을 제공하였다.
본 방법에 의해 합성된 선형 펩티드 함유 콘쥬게이트는 이전의 5-9 페이지에서 나열된 콘쥬게이트 및 하기 콘쥬게이트를 예로 들 수 있다:
상기에서, Cap=카프론산, Lau=라우르산, St=스테아르산, Z=아미노카프로산, B=아미노라우르산, X=d, Ala, O=D-Ala; B=dK, O=dY, Z=dL, X=p=아미노Phe, *=아미드, Ol=올레산임.
B. 시클릭 펩티드의 합성
I. 분자내 아미드 결합, 즉 상기에서와 같은 화학식 III 및 IV에서 Z=-CONH- 또는 -NHCO-를 함유하는 시클릭 펩티드는 종래의 고상 합성을 통하여 제조할 수 있다. 따라서, 고리화를 위하여 선택된 위치에 적당한 아미노 및 카르복실 측쇄 보호 아미노산 유도체를 삽입하면서 펩티드 쇄를 고상 지지체 상에 조립시킬 수 있다. 펩티드 쇄 어셈블리의 완결에 이어 다른 보호기 및 펩티드-지지체 결합은 손상되지 않도록 하면서 상응하는 아미노 및 카르복실 관능기로부터 보호기를 선택적으로 제거시킬 수 있다. 이어서, 공지된 펩티드 커플링제를 사용하여 고리화를 수행할 수 있다. 마지막으로, 공지된 과정을 사용하여 측쇄부를 탈보호시킴과 더불어 지지체로부터 시클릭 펩티드를 절단시키고, 크로마토그래피 기술에 의해 목적하는 시클릭 펩티드를 정제할 수 있다.
II. 상기에서 정의한 바와 같은 화학식 III 및 IV에서 Z=S-S와 같은 분자내 이황화 결합을 갖는 시클릭 펩티드를 고리화를 위하여 선택된 위치에 적당한 S-보호 시스테인 또는 호모시스테인 잔기를 삽입하면서 종래의 고상 합성을 통하여 제조할 수 있다. 쇄 어셈블리의 완결 후에, 고리화에 대한 2개의 가능한 경로를 수행할 수 있다: 1. 결과로서 생기는 상응하는 유리된 2개의 SH-관능기의 지지체 상 산화로 S-보호기를 선택적으로 제거하여 S'-S 결합을 형성한다. 이 방법 후 지지체로부터 생성물을 통상적으로 제거한 후 적당한 크로마토그래피 정제를 행할 수 있다. 2. 완전한 측쇄 탈보호와 함께 지지체로부터 펩티드를 제거한 후 아주 묽은 수용액 중의 유리 SH-관능기를 산화시킬 수 있다. 2가지 경로는 동일한 최종 목적 생성물을 얻는다.
III. 전술한 바와 같이 화학식 III 또는 IV에서 Z=-S(CH2)tCO-NH 또는 -NH-CO(CH2)tS-와 같은 분자내 S-알킬 결합 함유 시클릭 펩티드를 통상적인 고상 합성법을 통하여 제조할 수 있다. 따라서, 펩티드 쇄 어셈블리 동안 적당한 아미노-보호 측쇄 및 적당한 S-보호 시스테인을 갖는 아미노산 잔기 또는 호모시스테인 잔기를 고리화를 위하여 선택된 위치에 삽입시킬 수 있다. 블록킹된 측쇄 아미노 관능기를 선택적으로 탈보호시킨 후 브로모아실화시킨다. 그 후, 산성 조건하에서 측쇄 탈보호와 함께 펩티드를 지지체로부터 분리할 수 있다. 중성 또는 약산성 조건 하에서, 상응하는 유리 SH 및 브로모아실화된 부분을 고 희석도에서 선택적으로 상호작용시켜 목적 시클릭 펩티드를 얻을 수 있다.
실시예 B1
의 합성
[상기 화학식 III에서, X5=Leu; X6=공유결합; Z=-NH-CO; m=4, n=1임]
스위스의 노바(Nova)가 시판하는 p-메틸벤즈히드릴아민(MBHA) 수지 상에서 수동으로 펩티드의 합성을 수행하였다. 모든 용매, 염화메틸렌(CH2Cl2), N-메틸피롤리돈(NMP) 및 디메틸 술폭시드(DMSO)는 독일 머크(Merck)의 분석적 생성물이었다. 트리플루오로아세트산(TFA), 디이소프로필에틸아민(DIEA) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)는 미국 알드리치(Aldrich)로부터 구입하였다. 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT)은 스위스의 노바로부터 입수하였다. 모든 보호된 아미노산 유도체(Boc-AA)는 L-형이며, 스위스의 바켐(Bachem)으로부터 입수하였다. N-α-아미노산 작용기가 t-부틸옥시카르보닐(t-Boc)기에 의해 합성 과정 전체에 걸쳐 보호되었다. 측쇄 작용기는 하기와 같이 보호된다: 9-플루오르에닐메틸(Fm)에 의해 보호되는 Asp, 2-클로로-벤질옥시카르보닐에 의해 보호되는 Lys, 및 9-플루오르에닐메톡카르보닐(Fmoc)에 의해 보호되는 펩티드 쇄 중의 제1 위치 및 2,6-디클로로벤질에 의해 보호되는 Tyr.
시약으로서 DCC(0.42 g, 2 mmol) 및 HOBT(0.272 g, 2 mmol)를 사용하여 메틸벤즈히드릴 아민 수지(1g)에 Boc-Asp(OFm)(0.82 g, 2 mmol)을 커플링시켜서 합성을 개시하였다. 아미노산 분석에 의해 적재량(0.39 mmol/g)을 측정하였다. 중합체 상의 미반응 잔류 아미노기를 CH2Cl2(10 ml) 중의 아세트산 무수물 및 트리에틸아민(각각 1 ml 및 0.5 ml)과의 반응에 의해 캡핑시켰다. 하기 표 1에 개략된 프로토콜에 따라 펩티드 쇄 어셈블리를 Boc-Asp(OFm)-MBHA 수지로 개시하였다.
수동의 고상 합성에 대한 프로토콜
단계 시약/용매 시간(분)
1 CH2Cl2 중의 TFA(30 % v/v) 3
2 CH2Cl2 중의 TFA(50 % v/v) 20
3 CH2Cl2 5x2
4 CH2Cl2 중의 3% DIEA(v/v) 5
5 NMP 중의 3% DIEA(v/v) 2
6 NMP 5x2
7 닌히드린 시험
8 1.6 밀리몰 Boc A.A + 1.6 mL 1N HOBT + 1.6 mL 1N DCC (모두 NMP 중의 화합물); 예비활성화 - 30분; 여과 및 중합체(1g)에의 용액 부가 DMSO(최종 부피: 20 % v/v) 4520
9 DIEA (NMP 중의 6 밀리몰) 10
10 NMP 5
11 CH2Cl2 3x2
12 닌히드린 시험
13 CH2Cl2 중의 10% Ac2O + 3% DIEA 5
14 CH2Cl2 중의 10% Ac2O 10
15 CH2Cl2 3x2
모든 세척 및 반응용 용매를 10 ml/g 수지의 부피로 측량하였다. 각 커플링 단계 전에 DCC에 의해 제조된 Boc-아미노산 유도체의 HOBT 활성 에스테르를 사용하여 모든 커플링을 수행한다. 커플링을 위해 Boc-아미노산 1-히드록시벤조트리아졸 에스테르(Boc-AA-OBT) 및 성장하는 펩티드 쇄의 α-아미노기 각각을 4:1 몰비로 사용한다. 피리딘-물 중의 닌히드린 용액 중에 중합체 소량(약 3 mg)을 2 분 동안 비등시켜 커플링 반응을 모니터하였다. 반응을 확실히 종결시키기 위하여 Boc-아미노산의 커플링 반응을 2회 반복한다. 두 번째 커플링 반응에서, Boc-AA-OBT 양의 반을 사용한다. 일반적으로, 각 커플링 단계의 종료 후, 수지를 염화메틸렌 중의 아세트산 무수물(10%) 및 디이소프로필에틸아민(3%)으로 처리하고, 이어서 염화메틸렌 중의 10% 아세트산으로 처리하여 잔류 아미노기를 캡핑시켰다.
펩티드 쇄 어셈블리의 완료 후, Lys-1의 t-Boc 보호기를 일반적으로 CH2Cl2 중의 50% TFA로 제거하고, 시약으로서 DCC(0.42 g, 2 mmol) 및 HOBT(0.27 g, 2 mmol)을 사용하여 갓 유리된 α-아미노기를 스테아르산(0.37 g , 2 mmol)에 커플링시킨다(프로토콜). 반응을 120 분 동안 진행하고 2회 반복하였다. 각각 DMF 중의 50% 피페리딘을 1 시간 동안 사용하여 Asp6 및 Lys1의 OFm 및 Fmo 측쇄 보호기를 제거하였다. DMF(3 x 10 ml), 디클로메탄(3 x 10 ml), CH2Cl2 중의 10% DIEA(3 x 10 ml), DMF(3 x 10 ml) 및 CH2Cl2(3 x 10 ml)로 충분히 세척한 후, 수지를 7 ml DMF 중에 현탁하고, 8 시간 동안 DIEA의 7배 과량(2.8 mmol)의 존재하에서 (벤조트리아졸릴옥시)트리스(디메틸)아미노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP) 시약의 5 배 과량(2 mmol)과 혼합하였다. 정확하게 과정을 수행한 후 고리화를 반복하였다. 음의 닌히드린 시험은 고리화의 완료를 나타낸다. 프로토콜에 따라 완전히 조립된 시클릭 펩티드-수지를 CH2Cl2로 세척하고, 이어서 진공상태로 P2O5 상에서 철야 건조하였다. 수지로부터의 보호기의 탈블록화 및 펩티드의 절단을 무수 HF 기술에 의해 수행하였다. 즉, 1 시간 동안 0 ℃에서 1.5 ml의 p-티오크레졸 및 p-크레졸(1:1 v/v)의 혼합물의 존재하에서 테프론(Teflon)TM HF 장치(Multiple Peptide System)에서 9 ml HF로 펩티드-수지(1 g)를 처리하였다. 진공으로 HF를 제거하고 수지를 퍼옥시드 유리 에테르(4 x 25 ml)로 추출하고, 여과하고, 건조하고 50% 아세트산 수용액(3 x 25 ml)으로 추출하였다. 수성 여액의 동결건조에 의해 의 조 분말을 얻었다.
조 생성물을 50% 아세트산 수용액에 용해하고 용출액으로 0.1 N 아세트산을 사용하여 세파덱스(Sephadex) G-25 컬럼(75 x 2 cm)를 통과시켰다. 분광광도법에 의해 274 nm에서 용출화를 모니터하였다. 수용액의 동결건조에 의해, HF-절단 단계에서 스캐빈저로서 첨가된 방향족 첨가제가 유리된 펩티드를 얻었다. 수율은 50-70 % 였다.
이어서, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 정제를 세파덱스-분획화 생성물 상에서 수행하였다. 그러나, 이 과정은 조 펩티드 상에서 수행될 수 있다. 정제를 머크 RP-8 컬럼(7 μM, 250 x 10 mm) 상에서 수행하였다. 펩티드를 아세토니트릴 10 %에 가하고, 물 중의 0.1 % TFA 및 물 중의 75 % 아세토니트릴 중의 0.1 % TFA 사이의 선형 구배로, 10 ml/분의 유속으로 용출하였다. 분획물을 수집하고 분석적 HPLC에 의해 조사한 후 절단하였다. 유도된 분확물을 고이게 하고 동결건조하였다. 순수한 펩티드의 수율은 30-35 %이었다.
생성물의 순도를 분석적 HPLC(머크 RP-8, 250 x 4 mm 컬럼) 및 아미노산 분석, 이어서 완전한 산 가수분해(6 N HCl)에 의해 확인하여, 각 성분 아미노산의 기대치를 얻었다.
Z가 -NH-CO- 또는 -CO-NH-인 상기 화학식 III 및 IV의 다른 관련된 시클릭 유도체를, 해당하는 아미노산 유도체를 사용하여 정확히 동일한 방법에 의해 제조하였다.
별법으로, 시클릭 유도체를 상기한 방법에 의해 제조할 수 있고, 이어서 스테아로일 또는 다른 적합한 친지성 부를 N 말단에서 분자내로 도입하였다.
실시예 B2
의 합성
[상기 화학식 III에서, X5=Leu; X6=공유 결합; Z=-S-S-; n=1, m=1임]
전기의 실시예에 개략된 바와 같이 p-메틸벤즈히드릴아민(MBHA) 수지(1 g) 상에서 수동으로 펩티드의 합성을 수행하였다. 빌딩 블록(building block)으로서 Boc-Cys(S-4-MeBzl)-OH를 사용하여 시스테인 잔기, 1 및 6을 펩티드 쇄로 도입하였다. 쇄 어셈블리의 완료 및 N-말단 스테아로일 부의 부가 후, 상기한 바와 같이 펩티드-수지를 무수 HF로 처리하였다. 동결건조 후 얻은 조 펩티드의 백색 분말을 0.1 % 아세트산(약 0.5 mg/ml)에 용해하고 2 시간 동안 산소 유리된 질소를 통해 기포화시켜서 탈기시켰다. 진한 NH4OH 수용액(약 1N)를 사용하여 용액의 pH를 약 8.5로 조절하고 물 중의 약 1 N의 K3Fe(CN)6(2.5 당량) 용액을 천천히 적가하였다. 산화제 시약의 부가 완료 후, 반응 혼합물을 약 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 회전 증발하여 용액을 농축하고 상기한 바와 같이 세파덱스 G-25 상에서 조 시클릭 생성물을 분획화하였다. 이어서, 머크 RP-8 컬럼 상에서 HPLC에 의해 정제를 수행하였다(전기 실시예 참조). 순수한 생성물의 수율은 35-40 %였다. 상기 과정에 따라, 고리화를 위해 선택된 자리에 도입된 빌딩 블록으로서 Boc-Cys(S-4-MeBzl)-OH 및 Boc-Homocys(S-4-MeBzl)-OH를 사용하면서 S-S 내부 브리지를 포함하는 다른 시클릭 펩티드를 제조하였다.
실시예 B3
의 합성
[상기 화학식 III에서, X5=Leu; X6=공유 결합; Z=-S-(CH2)t-CO-NH-; m=1; n=4; t=1임]
전기의 실시예에 개략된 바와 같이 p-메틸벤즈히드릴아민(MBHA) 수지(1 g) 상에서 수동으로 펩티드의 합성을 수행하였다. Boc-Cys(S-4-MeBzl)-OH를 사용하여 펩티드 쇄로 시스테인 잔기 1을 도입하고, Boc-Lys(-Fmoc)-OH로서 Lys-6을 도입하였다. 쇄 어셈블리의 완료 및 N-말단 스테아로일 부의 부가 후, Lys-6의 -Fmoc 보호기를 DMF 중의 20% 피페리딘으로 30분 동안 처리하여 제거하였다. 이어서, DMF(3 x 10 ml), CH2Cl2(3 x 10 ml), CH2Cl2 중의 10% DIEA(3 x 10 ml), DMF(3 x 10 ml) 및 CH2Cl2(3 x 10 ml)를 사용하여 수지를 충분히 세척하였다. 수지를 10 ml DMF 중에 현탁하고, 6 시간 동안 브로모아세트산 무수물의 5배 과량(2 mmol)과 혼합하였다. 수지를 DMF(3 x 10 ml)로 세척하고 반응을 반복하였다. 음의 닌히드린 시험은 아실화 반응의 완료를 나타내었다. 이어서, 수지를 DMF(3 x 10 ml), 및 CH2Cl2(3 x 10 ml)로 세척하고, 진공 건조하고 유일한 스캐빈저로서 아니졸(10%)을 사용하여 무수 HF로 처리하였다. 전기 실시예에 기재된 바와 같은 동일한 처리법을 사용하여 조 브로모아세틸화 생성물을 얻었다. 이어서, 0.1 % 아세트산 중에 백색 분말(약 0.5 mg/ml)를 용해하고, 1 N NaOH에 의해 약 7.0으로 pH를 조절하였다. 실온에서 4 시간 동안 반응한 후, 엘만(Ellman) 시약(Aldrich)에 의해 나타내어지는 바와 같이 유리 SH-작용기가 없는 용액을 회전 증발에 의해 농축하였다. 이어서, 실시예 A에 기재된 바와 같이 조 생성물을 세파덱스 G-25 컬럼, 이어서 정제용 HPLC을 통과시켜 정제하였다. 순수한 생성물의 수율은 25 - 30% 였다. 상기 과정에 따라, 고리화를 위해 선택된 자리 및 다른 자리에서, 상응하는 아미노산 유도체를 사용하여 내부 -S-(CH2)-CO-NH- 또는 -NH-CO-(CH2)t-S-브리지를 포함하는 다른 시클릭 펩티드를 제조하였다.
C. 본 발명의 신경변성 치료적 측면
실시예 Cl
생물학적 시험 - β-아밀로이드 펩티드 처리된 뉴우런의 생존에 대한 본 발명의 콘쥬게이트의 효과
방법
β-아밀로이드 펩티드는 알츠하이머 질병에 관여하는 것으로 알려져 있고 배양 중에 성장하는 뉴우런에 대해 유독한 물질이다(Pike 등, J of Neurosci., 13(4), 1676-1687(1993); Yankner 등, Science, 250: 279-282(1990); Gozes 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 927-432(1996)).
포르시테(Forsythe) 및 웨스트브룩(Westbrook)에 의해 기재된 기술(J. Physiol, Lord. 365: 515, (1988))을 약간 변형하여, 해마상 융기 대신에 대뇌 피질을 사용하고 E16 마우스 대신에 신생 래트를 이용하여, 래트의 대뇌 피질 세포 배양체를 제조하였다. 문헌 [Gozes 등, J. Pharmacol. Exp. Therap., 257: 959-966(1991)]에 기재된 바와 같이, 대뇌 피질 세포(1.5 - 15 x 105 세포/35 mm 디쉬)를 융합성 대뇌 피질 성상 세포 사육 배양체 위에 플레이팅(plating) 시켰다. 배양 매질은 5% 말(馬) 혈청을 포함하는 DMEM(Dulbecon Modified Eagle Medium) 및 N3[문헌(Romijn 등, Brain Res., 254: (4), 583-589(1981))에 따른 호르몬 칵테일을 함유하는 매질 보충제]였다. 시험관내에서 8일 동안 성장시킨 후, 배양체는 매질이 완전히 변하였고, 그후 배양체를 5일 동안 β-아밀로이드 펩티드(아미노산 25-35)로 처리하였다.
β-아밀로이드 펩티드 프래그먼트를 2.5 mM의 최종 농도로 물에서 용해하였다. 뉴우런을 플레이팅하고 9일 후, 해리된 대뇌 피질 세포에, 25 μM β-아밀로이드 펩티드(아미노산 25-35)와 함께 부가된 본 발명의 콘쥬게이트의 투여량(1 mg을 초기에 10 μl DMSO와, 이어서 추가로 10 μl의 DMSO와 혼합하여 완전히 용해시키고 PBS로 희석하여 10-3 M의 원액을 얻음)을 증가시키면서 실험을 수행하였다. 10 μl의 콘쥬게이트 용액을 1 ml 배양 매질에 첨가하였다. 매질을 변화시키지 않은 채 5일 동안 처리를 지속하였다. 14일의 배양 후, 면역세포화학적 특성의 분석을 위하여 세포를 고착시키고 NSE(뉴우런 특이적 에놀라제, 뉴우런성 마커)에 대한 항체로 염색하였다. 뉴우런성 세포의 계수를 총면적 25 mm2의 60개의 필드에서 수행하였다. 이전처럼 처리 유형에 대한 지식없이 뉴우런을 계수하였다. 각 수치는 3개의 디쉬의 평균 ± SEM이다.
결과를 도 1 및 표 2에 나타낸다. 도 1은 164, 225, 130, 319, 172 뉴우런을 함유하는 대조군과 함께, 5개의 독립적인 실험에 대한 요약을 나타낸다. 도 1에서 확인가능한 바와 같이, St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2는 10-13 - 10-9 M에서 활성(최고 활성: 10-12 - 10-10 M)을 보여주는 매우 활성인 콘쥬게이트이다. 이 콘쥬게이트 및 β-아밀로이드 펩티드로 처리된 세포의 세포 계수량은, 미처리 대조 세포의 계수량보다 많아서, 이 결과는 이들 콘쥬게이트가 자연사에 대해서도 새포를 보호할 수 있음을 나타낸다.
뉴우런의 생존 분석에서의 펩티드 활성, β-아밀로이드 독성에 대한 보호:
펩티드 활성 농도(M) 뉴우런 생존율(%) β-아밀로이드 처리후 % 생존율 시험된 농도
1 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 10-13-10-9 80-110 52 10-13-10-9
2 St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2 10-13 72 38 10-13-10-9
3 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2 10-15-10-12 67-117 44 10-15-10-11
4 St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2 10-14-10-12 76-84 44 10-15-10-11
5 Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 10-11-10-10 83-84 63 10-13-10-9
6 Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 10-11 73 63 10-13-10-8
7 St-Lys-Tyr-Leu-NH2 10-11 96 53 10-13-10-9
8 St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 10-12-10-8 70-92 53 10-13-10-8
9 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2 10-13-10-10 95-100 36 10-13-10-9
10 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2 10-13-10-10 52-73 34-57 10-13-10-9
11 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2 10-13 83 52 10-13-10-9
12 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2 10-9 123 57 10-13-10-9
13 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2 10-9 97 57 10-13-10-9
14 St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 10-11-10-10 68-103 40 10-13-10-9
15 St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 10-12-10-9 84-58 40 10-13-10-9
16 St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 10-13-10-11 100-114 58 10-13-10-9
17 St-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2 10-13-10-11 88-110 58 10-13-10-9
표 2에서 알 수 있는 바와 같이, St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 콘쥬게이트(1)의 여러 가지 변형물은, β-아밀로이드에 의해 야기되는 치사로부터의 뉴론의 보호에 있어서 대조군과 비교해서 유사한 활성을 나타내었다. 일부 경우에(대조군과 비교해서 뉴우런의 생존율이 100%을 초과하는 경우), 콘쥬게이트는 또한 자연사에 대해서도 보호할 수 있었다. 현저하게는, Val(3), D-Ala(3), Nle(4)에 의한 콘쥬게이트 1의 Leu의 치환, N-말단(8) 또는 C-말단(9,10,11,12,13)에서 아미노산 잔기의 부가, N-말단(7)으로부터 아미노산 잔기의 제거 또는 라우로일(Lau, 5) 또는 카프로일(Cap, 6)에 의한 친지성 부 스테아로일의 치환에 의해 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2와 유사한 활성을 갖는 콘쥬게이트가 얻어졌다.
실시예 C2
알츠하이머의 동물 모델에서 학습 및 기억력에 미치는 본 발명의 콘쥬게이트의 효과(Morris Water Maze)
콜린성 억제에 대한 생체내 모델. 25G 바늘에 부착된 플라스틱 튜브(PE-20)을 사용하여 18 마리의 수컷 래트(Wistar, 250-300 g)에 인트라세레브로벤트리큘라로(i.c.v.) 0.21 μl/분의 속도로 주사하였다. 대조군은 염수 2 μl/사이드의 주사량을 수용하였고, 실험 동물은 콜린성 차단항체(에틸콜린 아지리듐) AF64A(3 nmol/2μl/사이드)의 주사액을 수용하였다.
AF64A의 주사 후 7-10일 후에 약물 처리를 개시하였다. 동물을 동일한 2개의 군으로 나누었다. 시험 군은 매일 코로 투여된, 10% 세프솔(Sefsol)TM 및 40% 이소프로판올에 10 μg/40 μl(각 비공을 통해 20 μl씩 투여됨)의 농도로 용해된 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2를 수용하였다. 대조 동물은 코내로 투여된 비히클을 수용하였다. 래트는 코로 투여 전에 디에틸에테르에 의해 부분적으로 마취되었다. 약제 투여 후 7일 경과 후, 추가의 10일 동안 행동 유형을 분석하였다. 시험 1 시간 전에 코로 투여에 의해 약제를 가하였다. 감염이 방지되도록 경막생물성 항생 물질 50,000 단위로 모든 동물을 장기간(격일로) 처리하였다.
모리스 워터 메이즈(Morris Water Maze) 과정에 따라 학습 시험 과정을 수행하였다(Morris 등, Nature, 297: 681-683, 1982; Morris 등, Nature, 319: 774-776, 1986).
I. St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH 2 의 투여
13.3 cm 플랫폼을 물(22-24 ℃)의 표면 바로 아래에 닿게 하고, 투명한 플렉시유리 컬럼이 구비된, 직경이 1.26 m이고, 깊이가 0.2 m인 원형 풀에 래트를 놓았다. 시험 1 시간 전에 약제를 코로 투여하여 매일 가하였다. 플랫폼에 도달하는 잠복기(latency)를 각 래트에 대해 초단위로 기록하였고, 학습 및 기억력을 반영하는 훈련일에 대한 변화를 그래프화하였다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, AF64A(○)가 주사된 대조 동물이, AF64A가 주사되고 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(●)가 코로 투여된 동물에 비해서 플랫폼에 도달하는 잠복기에 있어서 보다 적은 정도로 향상되었음을 나타내었다. 이들 결과는 본 발명의 콘쥬게이트가 알츠하이머의 동물 모델에서 학습 및 기억력을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
II. St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH 2 의 투여
도 3은 상기한 바와 같이 알츠하이머의 생체내 시험(AF64A-콜린 독성 시험)에서 학습 및 기억력에 미치는 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(도면에서 KKYO로 나타냄)의 효과를 나타낸다. 얻어진 결과는 상기한 결과와 유사하게, 플랫폼에 도달하는 잠복기에 있어서 AF64A(●)만으로 처리된 대조 동물이, St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(▲)가 또한 코로 투여된 동물에 비해서 보다 적은 정도로 향상되었음을 나타내었다. 본 시험에서 추가의 프로브 시험을 또한 수행하였다(Gozes 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 427-432, 1996). 플랫폼이 물 풀 중에 존재하는 위치를 동물이 인지한 후에, 플랫폼을 제거하고, 플랫폼이 설치되어 있던 영역에서 동물이 보낸 시간을 기록한다. 이 시간은 이전에 연구된 시험 동물의 기억 보유력을 나타낸다. 도 4에서 관찰되는 바와 같이, St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2로 처리된 동물은, 펩티드를 수용하지 않은 AF64A에 비해 우수한 기억 보유력을 나타낸다. 이 시험 후에, 플랫폼을 물 풀에 다시 위치시키고, 이번에는 헤엄치는 래트가 이 플랫폼을 볼 수 있고, 플랫폼에 도달하기에 요구되는 시간을 측정한다. 이 경우 측정된 파라미터는 발생가능한 운동 신경의 결손이다. 도 5에서 확인 가능한 바와 같이, 이들 군 사이에, 즉 전체적으로 시험 측정된 학습 및 기억력 사이에 차이가 없고, 운동 신경의 변화가 없다.
실시예 C3
정상 동물의 학습 및 기억력에 미치는 본 발명의 콘쥬게이트의 효과
AF64A 대신에 염수가 동물에 주입되어 알츠하이머형 인식성 상해의 특징이 없는 정상 동물인 것을 제외하고는 실시예 C2에 기재된 실험을 반복하였다. 동물을 2 군으로 나누었다. 1군은 비히클(상기한 세프졸+이소프로판올)만이 코로 투여된 것이고, 다른 1군은 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2이 코내로 투여된 것이다. 도 6에서 확인 가능한 바와 같이, 펩티드 처리 군에서 명백하게 다소 빠른 학습력이 관찰되는데, 이는 손상되지 않은 정상 동물에서도 인식 작용의 개선이 가능함을 나타낸다.
실시예 C4
기억 보유력에 있어서 모델에 미치는 본 발명의 콘쥬게이트의 효과
동물의 미리 습득한 시험에 대한 기억 보유력을 평가하기 위해 새로운 모델을 개발하였다. 상기한 바와 같이 물 미로 중에서 잠수된 플랫폼을 발견하도록 동물(N=5-10)을 먼저 훈련시켰다. 기억 보유력의 평가를 위해, 숨겨진 플랫폼을 찾아내도록 동물을 매일 헤엄 훈련시켰다(매일 시험). 1주 후에, 연구 시험에서 최고의 점수를 나타낸 동물을 실험을 위해 선택하였다. AF64A 또는 염수를 뇌의 제3 실에 주사하고, 일주일의 회복기 후에 상기한 바와 같이 펩티드 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2를 코내로 투여하여 동물을 처리하였다. 1주일의 펩티드 처리 후, 물 미로에서 동물을 다시 시험하였고 학습된 과업(즉, 플랫폼을 찾음)의 기억 보유력에 대한 실험을 하기와 같이 반복하였다: 동물을 1 분 동안 플랫폼에 위치시켰다. 이어서, 플랫폼으로 헤엄치도록 물에 위치시키고 플랫폼에 도달하기 위해 요구되는 시간을 측정하였다. 첫번째 헤엄에 대한 결과를 표 7에 요약한다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군과 유사한 식으로 행동하므로 펩티드로 처리된 동물은 기억력 손실로부터 보호되고, AF64A의 주사 전에 연구된 과업에 대한 기억을 보유할 수 있음이 명백하다.
플랫폼에서 1 분 후, 더 헤엄치고 숨겨진 플랫폼을 찾아내도록 동물을 물에 다시 놓았다. 도 8은 두번째 헤엄에 대한 결과를 나타낸다. 이로부터 확인 가능한 바와 같이, 도 8은 펩티드로 처리된 동물에서의 학습 및 기억력의 향상을 나타낸다. 이 모델은 펩티드의 활성 및 기억 보유력의 촉진에 대한 1차적인 증명이다.
최종적으로, 플랫폼을 치우고 플랫폼 형태인 영역에서 동물이 보내는 시간을 도 9에 나타낸다. 상기에 요약된 결과는 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2는 학습력, 작업 기억력, 및 기억 보유력에 관여함을 명백히 나타낸다.
실시예 C5
정신적 지체에 있어서 모델에 미치는 본 발명의 콘쥬게이트의 효과
정신적 지체에 대한 모델: 아폴리포단백질 E-결핍성 마우스:
아폴리포단백질 E(ApoE)가 결핍된 마우스(Plump 등, Cell, 71: 343-363(1992))는 전개되는 중요한 사건의 습득에 있어서 지체되는 것으로 최근에 밝혀졌다. ApoE 결핍성 마우스를 동적인 중요한 사건의 전개에 대해 시험한 결과, 앞발을 놓는 행동에 있어서 대조용 동물(출생후 2-5일)과 비교하여 현저히 지체되는 것으로 밝혀졌다(출생후 11-13일). 또한, 이들 마우스의 경우 벼랑 회피 행동의 습득에 있어서 2일 지연되는 것이 관찰되었다.
8 마리의 갓 태어난 정상 마우스를 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 또는 염수로 주사하였다(s.c. 1.2 μg 120 μl). 8 마리의 ApoE 결핍성인 갓 태어난 마우스를 유사하게 처리하였다.
앞발을 놓는 행동의 습득에 대한 결과를 도 10 및 11에 나타낸다. St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 또는 공지의 St-Nle17-VIP-NH2(비교용에서만 나타냄)로 처리된 ApoE 결핍성 마우스에서 확인되는 바와 같이, St-Nle17-VIP는 그의 위치시키는 행동의 습득을 미처리된 ApoE 결핍성 마우스와 비교해서 대조군의 정도로 본질적으로 향상시켰다.
도 12 및 도 13은 상기와 같이 처리된 동물에서 벼랑 회피능력의 습득을 나타낸다. 이로부터 확인되는 바와 같이, St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2 또는 St-Nle17-VIP-NH2(비교용에서만 나타냄)로 처리된 ApoE 결핍성 마우스는 정상 대조군에 비해 훨씬 우수한 벼랑 회피능 습득 또는 대조군과 유사한 벼랑 회피 행동을 나타내었다.
실시예 C6
아폴리포단백질 E 결핍성 마우스에서 콜린 활성에 미치는 본 발명의 콘쥬게이트의 효과
문헌[Fonnum, F.A., J. Neurochem, 24: 413-415, 1975]에 기재되어 있는 바와 같이 콜린 활성에 대해 ApoE 결핍성 마우스를 평가하였다. 간략하게는, 쳇(Chat) 활성을 측정하여 21일된 정상(대조용) 및 ApoE-결핍성 마우스의 뇌를 평가하였다. 콜린으로부터의 [14C]아세틸콜린 및 [14C]아세틸CoA의 합성 속도를 측정하여, 콜린 아세틸 전이효소(Chat) 활성을 전술한 바와 같이 측정하였다(텍스트 참조). 콜린 부재시에 비특이적 바탕값을 측정하였다. 300 mM NaCl, 30 mM EDTA 및 0.5%의 트리톤을 함유한 50 mM의 포스페이트 완충액(pH=7.4)의 10 부피로 테프론 균질화기에서 각 뇌(300-400 mg)를 균질화하였다. 균질화물 12000 g을 15 분 동안 원심분리하고, 상청액 10 μl(3 개)를 14 μM 14C-아세틸-CoA(56 mCi/mmol NEN), 20 mM 아세틸콜린, 1.6 mM 염화콜린, 0.25 mM 에세린, 및 포스페이트 완충액을 함유하는 용액 10 μl와 혼합하였다. 반응을 37 ℃에서 15분 동안 수행하고, 3-헵타논 중에서 제조된 15 mg/ml의 테트라페닐보론 50 μl를 첨가하여 정지시키고, 30 초 동안 와류기에서 혼합하였다. 2분 후에 유기상의 20 μl를 마이크로퍼깅(microfuging)한 후 수집하고, 이어서 섬광액과 혼합하고 방사능을 베타-계수기에서 측정하였다.
펩티드 또는 염수가 장기간 동안 주사된 21일된 동물에서 실험을 수행하였다. 피하 주사하고, DMSO 중에서 펩티드를 용해하고(100 μg/30 μl) 염수로 희석하여 원하는 농도를 얻는다. 1 - 4일 째에 4 μg 펩티드/20 μl 염수; 5 - 10일 째에 8 μg/40 μl 염수; 11 - 14일 째에 16 μg/80 μl 염수.
콜린 활성의 결과는 ApoE 결핍성 마우스의 감소를 나타낸다. St-Lys-Lys-Tyr-Leu가 투여된 마우스의 콜린 활성을 도 14에 나타낸다. 수치는 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2로 처리된 ApoE 마우스를 나타내고, 이는 대조군의 수준에 비해 콜린 아세틸 전이효소 활성이 증가했음을 나타낸다.
도 14는 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2가 아폴리포단백질 E 결핍성 마우스에서 콜린성 활성의 증가를 나타낸다(100% 활성은 콜린 아세틸 전이효소 활성의 모든 측정에서 669-758 pmole/단백질 mg/분을 나타낸다.)
실시예 C7
St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH 2 의 생체분포
문헌[Gozes 등, Endocrinology, 134:2121-2125(1994)]에 기재된 콜라민 T 방법을 사용하여 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2을 방사성요오드화하였고, 250-300 g 래트에 약 7.8 x 106 cpm/2 μl 5% 세프졸TM, 20 % 이소프로판올/래트를 코내로 적용하였다. 약제를 투여하고 30분 후 동물을 치사하고 전두골 피질을 제거하고, 칭량하고 감마 계수기에서 방사능에 대해 계수하였다. 이후에, 방사성활성 조직 시료(1400 cpm/g 시료 함유)를 균질화하고 원심분리하였다(25분 동안 5,400 g). 마커로서 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2에 대해 상청액을 HPLC 분석하였다(25의 분획으로 아세토니트릴 구배를 사용하여 용출함). 감마 계수기에서 방사능에 대해 시료를 모니터하였다.
도 15에서 확인가능한 바와 같이, 적용후 30분 경과한 후 손상되지 않은 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2를 뇌에서 관찰할 수 있었다. 즉, 코로 투여될 때 본 발명의 콘쥬게이트가 뇌에 도달할 수 있음을 나타낸다.
D. 본 발명의 임포턴스 예방 측면
음경 반사작용에 대한 생물학적 시험
생물학적 시험은 본 발명의 콘쥬게이트를 경피 적용한 후 거세된 래트에서의 음경 반사작용의 측정을 포함하였다. 생물학적 실험의 제1 유형에서 다양한 담체를 포함한 조성물의 음경 반사작용에 미치는 효과를 측정하였고, 세프졸TM은 가장 효과적인 담체임이 밝혀졌다.
(a) 방법
임포턴스에 대한 동물 모델
거세로 인해 성적 능력이 감소된 래트를 사용하였다. 수컷 쥐(250-300 g, 약 3 달됨)를 12 시간 동안 광, 12 시간 동안 암의 주기로 유지시켰다. 암 기간의 개시 후 2 - 6시간 후에 암 기간 중에 실험을 계속 수행하였다. 수컷 래트를 거세하고, 14-21 일(실험 지속 기간) 동안 계속 매일 주사의 형태로 부분적인 테스토스테론 치환체(4 μg/100g 체중)를 투여하였다. 수술 후 1주일 동안 실험을 수행하였다.
음경 반사기능(발기)의 직접적인 평가
약제의 경피 투여 후 음경 발기를 직접적으로 평가할 수 있는, 음경에서 성기 기능반사를 평가하는 기술을 사용하는 과정을 이용하였다. 성공적인 재생은, 일시적으로 조직되고, 기능적으로 관련된 행동 단위의 정확한 수행에 주로 좌우된다. 이 실험에서, 본 실험자들은 발기 방법의 최종 단계(발기가 완료되도록 팽창 및 신장에 의해 수반되는 음경의 적색화)에 집중하였고, 제1 E2 및 제1 컵에 대한 잠복 시간을 모니터하였다(Okumura, M., 등, Chem. Pharm. Bull. 37, 1375(1989)).
시험을 위해서, 각 동물의 전방부를 느슨하게 맞추어진 실린더(직경: 7 cm)에 넣어 각 동물을 반듯이 눕힌 상태로 고정시켰다. 벨트를 몸통 둘레로 고정시킨 후, 귀두 음경을 그의 집(sheath)으로부터 밀어내고 음경의 후부에 배치시킨 얇은 목재의 어플리케이터를 사용하여 복부에 수직이 되도록 부드럽게 지탱시켰다. 관찰자가 수컷의 다리를 유지시키고, 이 위치를 시험 기간 중에 유지시켰다. 시험 지속 시간은 45분 이었다. E2 및 컵의 수 및 잠복기를 기록하고 플롯하였다.
E2는, 음경 끝이 컵형의 구조로 바뀌고 이에 의해 선(gland)이 불끈해져서(flare out) 음경이 그의 저부보다 말단 지점에서 폭이 더 넓어지게 되는, 컵에 의해 수반될 수 있는 완전 발기로 정의된다. 이와 같은 최종 단계는 E2를 필요로 하고, 아마도 사정을 위한 예비 필요 조건일 것이다. 모든 파라미터를 사용하여 시험된 래트의 성적 활성에 대한 확실한 측정치를 얻을 수 있다.
동물을 45 분 동안 모니터하고, 한번의 발기 증상발현의 길이를 측정하거나 몇번의 비연속적인 발기 증상발현을 함께 더하여 총 발기 시간을 계산함으로써 E2의 지속을 확인하였다. 단일 발기 1회분의 최소 기간을 30초로 하여 계산하였다.
실시예 D1
임포턴스에 걸린 래트 모델에서 본 발명의 콘쥬게이트의 효과
콘쥬게이트를 10-3 M의 농도로 디메틸술폭시드(DMSO)에서 용해하고, 적용시 10 μl를 사용하였다. 사용된 래트는 거세되고 부분적인 테스토스테론 치환 처리를 받았다(Gozes 등, J. Clin. Inves., 90: 810-814(1992)). 요약하면, 수컷 쥐(90-100일됨)를 거세하고 그 즉시 4 μg/100 g BW 테스토스테론을 실험 지속 기간인 연속적인 21일 동안 매일 s.c. 주사하였다. 수술하고 1 주 경과 후 실험을 개시하였다. 음경 반사작용을 상기와 같이 측정하였다.
도 16은 펩티드 6(St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn- NH2)가 대조군에 비해서 컵의 수 및 E2의 수를 현저히 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 도 17은 펩티드 26에 비교해서 펩티드 6을 나타낸다. 펩티드가 5% 세프졸TM 및 20% 이소프로판올 중에 펩티드를 용해하여 동물 당 7 μg/10 μl의 최종 농도가 되도록 한 것을 제외하고는, 실질적으로 상기한 바와 같이 본 발명의 다른 콘쥬게이트에 대한 실험을 반복하였다. 시험된 콘쥬게이트는 다음과 같았다: St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2; St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2;St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Leu-Asn-NH2;St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2;St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2;St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2;St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2.
상기 결과를 도 18 내지 27에 나타낸다. 이 결과는 모든 시험된 콘쥬게이트는, 대조군과 비교해서 확인된 모든 시험된 임포턴스 파라미터를 개선시킬 수 있음을 나타낸다(컵의 수, E2의 수, 제1 컵으로의 잠복기의 감소).
실시예 D2
St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH 2 의 국소 투여 후의 생체분포
St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2를 이전처럼 방사성요오드화하고, 약 2.2 x 106 cpm/2 μl 5% 세프졸TM, 20%의 이소프로판올/래트를 250-300 g 래트의 성 기관에 국소 적용하였다. 정해진 시간에 동물을 치사하였고, 조직을 칭량하고 감마 계수기에서 방사능을 계수하였다.
결과를 도 28에 나타낸다. 이 결과는 경피 투여된 콘쥬게이트는 동물의 내부 조직을 투과할 수 있음을 나타낸다.
실시예 D3
장 추출물의 HPLC 분석
실시예 D2에 나타낸 바와 같이 실험을 수행하였다. 약물 투여하고 30분 후 동물을 치사하였고, 장을 제거하여 칭량하고 감마 계수기에서 방사능을 계수하였다. 이후, 방사성 활성 조직 시료를 균질화하고 원심분리하였다(25분 동안 5,400 g). 이어서, 마커로서 방사성요오드화된 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2에 대해 상청액을 HPLC 분석하였다(25 분획으로 아세토니트릴 구배를 사용하여 용출함). 시료를 감마 계수기에서 방사능에 대해 모니터링하였다.
결과를 도 29에 나타낸다. 도 26 및 27의 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 적용 후 적용된 2.2 x 106 cpm/g 중 80,000 cpm/g 이상이 30 분 후에 장에 위치하였다. 비교컨대, 동일한 양의 방사성표지된 St-Nle17-VIP를 사용하여, 3700 cpm/g만을 장에서 얻었는데(Gozes 등, Endocrinology, 134: 2121-2125(1994)), 이는 본 발명의 짧은 콘쥬게이트는 완전한 28 아미노산 콘쥬게이트에 비해 보다 우수하게 투과됨을 보여준다.
실시예 D4
임포턴스에 걸린 래빗 모델에서 본 발명의 콘쥬게이트의 효과
신규한 질랜드 백색 래빗(이스라엘, 요크님산)을 롬펀(Rompun) 및 케타베트(Ketavet)로 마취하였다. 추가로, 펜토바르비탈 10 mg/kg을 귀 정맥내로 정맥내 투여하였다. 펜토바르비탈(5-10 mg/kg)을 큰 알약으로 주입하여 마취를 지속시켰다. 동물을 온도가 조절된 환경에서 수술 테이블에 반듯하게 누운 위치로 위치시켰다. 음경 주변의 부위를 자르고 20 게이지의 바늘을 왼쪽 또는 오른쪽 음경해면체 및 i.c. 압력의 연속 기록을 위해 압력 변환기에 연결된 도뇨관으로 삽입하였다. 사용된 변환기 증폭기는 모델 PM-1000(CWE 인코포레이티드); 시스템 100 파워 서플라이(CWE 인코포레이트디); 소프트웨어: DI 200 PGH/PGL(DATA Q 인스트루먼트 인크.)이었다. 주사가 요구될 때, 약제 투여를 위해 음경해면체의 다른 측면으로 제2의 도뇨관을 옮기었다(도뇨관 모두는 혈액으로 채워졌다). 혈압 기록을 위한 도뇨관을 0.5 ml의 2% 헤파린으로 씻어내었다. i.c. 혈압의 증가는 그래프 상에서 mm Hg로 표현된다.
도 30은 음경해면체에서 St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2의 주사로 얻어진 압력의 변화에 대한 예비 결과를 나타낸다. 여기서, 10 μg은 증가된 활성을 나타내었고, 음경 혈압이 75 mmHg(15-20 mmHg에서)로 증가되었고, 이 결과는 상기 콘쥬게이트가 직접 주사에 의해 음경 발기를 야기할 수 있음을 나타내었다.
E. 경피 적용을 위한 제약 조성물
담체인 세프졸 318TM와 함께 사용되는, 본 발명에 따라 친지성 콘쥬게이트화 펩티드의 경피 적용을 위한 연고제 조성물의 예는, 10% 세프졸 318TM (글리세릴 모노카프릴레이트) 714 μl 및 40% 이소프로판올 714 μl 당 펩티드 1 mg(최종 농도: 5% 세프졸, 20% 이소프로판올 및 약 0.7 mg/ml 펩티드)을 포함한다.

Claims (21)

  1. 하기 식으로부터 선택되고, 3개 이상 12개 이하의 아미노산 잔기를 가지면서 친지성 부(lipophilic moiety)에 커플링된 펩티드의 콘쥬게이트.
    <화학식 I>
    R1-X1-X1'-X1"-X2-NH-R2
    <화학식 II>
    R1-X3-Ser-X4-Leu-Asn-NH-R2
    <화학식 III>
    <화학식 IV>
    상기식에서,
    R1은 H 또는 탄소 원자수가 3 내지 22개인 포화 또는 불포화 히드로카르빌 또는 카르복실산 아실 라디칼인 친지성 부이고,
    R2는 H, 친지성 부, X3-Ser-X4-Leu-Asn-NHR1에 의해 치환된 친지성 부, 또는 X1-X1'-X1"-X2-NHR1에 커플링된 비대전 아미노산의 1-3개의 잔기로 이루어진 스페이서이되, 단 R1 및 R2 중 적어도 하나는 친지성 부이고, 상기 친지성 부 각각은 탄소 원자수가 3 내지 22개인 포화 또는 불포화 히드로카르빌 또는 카르복실산 아실 라디칼이며,
    X1은 공유 결합, Ala, Val, Ala-Val, Val-Ala, L-Lys, D-Lys, Ala-Lys, Val-Lys, Ala-Val-Lys, Val-Ala-Lys 또는 Orn이고,
    X1'는 L-Lys, D-Lys 또는 Orn이고,
    X1"는 L-Tyr, D-Tyr, Phe, Trp 또는 p-아미노 페닐알라닌의 잔기이고,
    X4는 Ile 또는 Tyr이고,
    X5는 소수성 지방족 아미노산의 잔기이고,
    X2는 X5, X5-Asn, X5-Ser, X5-Ile, X5-Tyr, X5-Leu, X5-Nle, X5-D-Ala, X5-Asn-Ser, X5-Asn-Ser-Ile, X5-Asn-Ser-Tyr, X5-Asn-Ser-Ile-Leu, X5-Asn-Ser-Tyr-Leu, X5-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn 또는 X5-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn이고,
    X3은 공유 결합, Asn, X5, X5-Asn, Tyr-X5, Tyr-X5-Asn, Lys-X5, Lys-X5-Asn, Lys-Tyr-X5, Lys-Tyr-X5-Asn, Lys-Lys-Tyr-X5, Lys-Lys-Tyr-X5-Asn, Val-Lys-Lys-Tyr-X5, Val-Ala-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn, 또는 Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn이고,
    X6은 공유 결합 또는 Asn, Ser, Ile, Tyr, Leu, Asn-Ser, Asn-Ser-Ile, Asn-Ser-Tyr, Asn-Ser-Ile-Leu, Asn-Ser-Tyr-Leu, Asn-Ser-Ile-Leu-Asn 또는 Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn이고,
    X7은 공유 결합이거나 또는 Asn이고,
    X8은 공유 결합, X5, Tyr, Lys, Tyr-X5, Lys-X5, Lys-Tyr-X5, Lys-Lys-Tyr-X5, Val-Lys-Lys-Tyr-X5, Ala-Lys-Lys-Tyr-X5 또는 Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5이고,
    Z는 -CONH-, -NHCO-, -S-S-, -S(CH2)tCO-NH- 또는 -NH-CO(CH2)tS-이고,
    Z가 -CONH-, -S-S- 또는 -S(CH2)tCO-NH-일 때 m은 1 또는 2이거나, 또는 Z가 -NH-CO- 또는 -NH-CO(CH2)tS-일 때 m은 2, 3 또는 4이고,
    Z가 -NH-CO-, -S-S- 또는 -NH-CO(CH2)tS-일 때 n은 1 또는 2이거나, 또는 Z가 -CONH- 또는 -S(CH2)tCO-NH-일 때 n은 2, 3 또는 4이고,
    t는 1 또는 2이되, 단,
    콘쥬게이트 스테아로일-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn
    -NH2는 제외한다.
  2. 제1항에 있어서, X5가 Ala, Ile, Leu, Met, Val, Nva 및 Nle로부터 선택된 D- 또는 L-아미노산의 잔기인 콘쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 친지성 부 R1이 탄소 원자수가 3 내지 22개인 포화 또는 불포화 히드로카르빌 또는 카르복실산 아실 라디칼인 콘쥬게이트.
  4. 제3항에 있어서, R1이 스테아로일(St), 카프로일(Cap) 및 라우로일(Lau)로부터 선택되는 콘쥬게이트.
  5. 제4항에 있어서,
    St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2,
    St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2,
    St-Ala-Val-Lys-Lyl-Tyr-Leu-NH2,
    St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2,
    St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2,
    St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2, 및
    St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2
    로 이루어진 군으로부터 선택된 콘쥬게이트.
  6. 제4항에 있어서,
    St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2,
    St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2, 및
    St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2
    로 이루어진 군으로부터 선택된 콘쥬게이트.
  7. 제4항에 있어서,
    Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2,
    Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2,
    St-Lys-Tyr-Leu-NH2,
    St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2,
    St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2,
    St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2,
    St-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2,
    St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2,
    St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2,
    St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2, 및
    St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2
    로 이루어진 군으로부터 선택된 콘쥬게이트.
  8. 제약학상 허용가능한 담체와 함께 활성 성분으로서 제1항에 따른 콘쥬게이트를 함유하는, 알츠하이머병, 다운 증후군, 국소 빈혈로 인한 운동 또는 인식 작용의 쇠락, 발작, 중추 신경계 및 말초 신경계의 유전병, 중추 신경계 또는 말초 신경계의 손상으로 인한 운동 또는 인식 작용의 쇠락, 및 혈액 순환 및 뉴우런 생존과 관련된 신경학적 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경변성 질병을 치료하기 위한 제약 조성물.
  9. 제약학상 허용가능한 담체와 함께 활성 성분으로서 제1항에 따른 콘쥬게이트를 함유하는, 남성의 임포턴스를 치료하기 위한 제약 조성물.
  10. 제5항 또는 제7항에 따른 콘쥬게이트로 이루어진 군으로부터 선택된 콘쥬게이트를 활성 성분으로 함유하는, 알츠하이머병, 다운 증후군, 국소 빈혈로 인한 운동 또는 인식 작용의 쇠락, 발작, 중추 신경계 및 말초 신경계의 유전병, 중추 신경계 또는 말초 신경계의 손상으로 인한 운동 또는 인식 작용의 쇠락, 및 혈액 순환 및 뉴우런 생존과 관련된 신경학적 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경변성 질환의 치료용 제약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 코 투여용으로 적합한 제약 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 코용 스프레이의 형태인 제약 조성물.
  13. 제약학상 허용가능한 담체와 함께, 제6항에 따른 콘쥬게이트 그리고 St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2, St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2, 및 St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2로 구성되는 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트를 활성 성분으로서 포함하는 남성의 임포턴스 치료용 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 경피 적용용으로 조절된 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 제약학상 허용가능한 담체가 1-글리세릴 모노카프릴레이트인 제약 조성물.
  16. 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 활성 성분으로서,
    St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2;
    St-Ala-Val-Lys-Lyl-Tyr-Leu-NH2;
    St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2;
    St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2; 그리고
    St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2로 구성되는 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트를 포함하는 남성의 임포턴스 치료용 제약 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 경피 적용에 적합한 제약 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 담체로서 1-글리세릴 모노카프릴레이트를 포함하고, 상기 콘쥬게이트가 St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2인, 남성의 임포턴스 치료용 제약 조성물.
  19. 제약학상 허용가능한 담체 및 제6항에 따른 콘쥬게이트들로 구성되는 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트를 포함하는, 알츠하이머병, 다운 증후군, 국소 빈혈로 인한 운동 또는 인식 작용의 쇠락, 발작, 중추 신경계 및 말초 신경계의 유전병, 중추 신경계 또는 말초 신경계의 손상으로 인한 운동 또는 인식 작용의 쇠락, 및 혈액 순환 및 뉴우런 생존과 관련된 신경학적 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경변성 질병 치료용 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 코 투여 형태인 제약 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 코용 스프레이 형태인 제약 조성물.
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