CN1254271C - 增强了药动学性质的杂合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及增强子肽序列，它们原本是得自各种逆病毒包膜(gp41)蛋白序列的，增强了它们所连接的任意核心多肽的药动学性质。本发明基于这样的发现，包含与核心多肽连接的增强子肽序列的杂合多肽具有增强了的药动学性质，例如延长了的半衰期。本发明进一步涉及用于增强任意核心多肽的药动学性质的方法，该方法借助于增强子肽序列与核心多肽的连接。用于实施发明的核心多肽可以包括任意药理学上有用的肽，它们例如可以作为治疗或预防试剂使用。

Description

增强了药动学性质的杂合多肽
本申请是1999年7月9日提交的No.09/350,641的部分继续申请，后者是1999年5月20日提交的No.09/315,304的部分继续申请，后者是1998年5月20日提交的No.09/082,279的部分继续申请，它们各自的完整内容全文引用在此作为参考文献。
1、介绍
本发明涉及增强子肽序列，它们原本是得自各种逆病毒包膜(gp41)蛋白序列的，增强了它们所连接的任意核心多肽的药动学性质。本发明在部分程度上基于这样的发现，包含与核心多肽连接的增强子肽序列的杂合多肽具有增强了的药动学性质，例如延长了的半衰期。本发明进一步涉及新颖的抗融合和/或抗病毒肽，包括含有这类增强子肽序列者，还涉及使用这类肽的方法。本发明进一步涉及用于增强任意核心多肽的药动学性质的方法，该方法借助于增强子肽序列与核心多肽的连接。用于实施发明的核心多肽可以包括任意药理学上有用的肽，例如可以作为治疗剂或预防剂使用。在非限制性实施方式中，得以证明发明的实例中，例如包含与增强子肽序列连接的HIV核心多肽的杂合多肽表明是有力的HIV-1、HIV-2和SIV感染的非细胞毒性抑制剂。另外，本发明的增强子肽序列已经与呼吸道合胞体病毒(RSV)核心多肽和促黄体激素受体(LH-RH)核心多肽连接。在每种情况下，都发现杂合多肽具有增强了的药动学性质，而且RSV杂合多肽表现出相当的抗RSV活性。
2、发明背景
多肽产品具有广泛的用途，作为治疗剂和/或预防剂用于疾病的预防和治疗。很多多肽能够调节生物化学或生理学过程，预防疾病或者减轻与疾病有关的症状。例如，诸如病毒或细菌多肽等多肽已经成功地作为疫苗，用于病理性疾病的预防。另外，肽类已经成功地作为治疗剂，用于疾病症状的治疗。这样的肽属于不同种类，例如激素、酶、免疫调节剂、血清蛋白和细胞因子。
多肽为了表现它们对靶部位的专属生物与治疗作用，在作用部位必须存在适当浓度的多肽。另外，一般必须保持它们的结构完整性。因此，用于治疗用途的多肽药物制剂受制于多肽的化学本性和特征，例如它们的大小与复杂性、它们的构象要求和它们经常伴随的稳定性与溶解度曲线。任何特定的治疗性肽的药动学取决于所述肽的生物利用度、分布和廓清率。
由于诸如肽和蛋白质等很多生物活性物质迅速被机体破坏，关键的是开发用于维持肽在血液循环中的稳态浓度的有效系统，增加这类肽的功效，和减少不利副作用的发生率与严重性。
3.1、发明概述
本发明首先涉及增强子肽序列，它们原本是得自各种逆病毒包膜(gp41)蛋白序列的，即HIV-1、HIV-2和SIV，增强了它们所连接的任意核心多肽的药动学性质。本发明基于这样的惊人结果，当所公开的增强子肽序列与任意核心多肽连接时，所得杂合多肽具有增强了的药动学性质，例如包括相对于单独的核心多肽而言延长了的半衰期和减少了的廓清率。本发明进一步涉及这样的杂合多肽和核心多肽，还涉及新颖的表现抗融合活性、抗病毒活性和/或调节涉及卷曲螺旋肽结构的细胞内过程的活性的肽。这样的肽含有增强子肽序列。
核心多肽可以包含任何可以引入活体系统的肽，例如任何能够起到治疗剂、预防剂或造影剂作用的肽，可用于疾病的治疗或预防或者用于诊断或预后方法，包括体内造影方法。这样的肽例如包括生长因子、激素、细胞因子、血管生成生长因子、细胞外基质多肽、受体配体、激动剂、拮抗剂或逆激动剂，肽定向剂、例如造影剂或细胞毒性定向剂，或表现抗融合和/或抗病毒活性的多肽，和起到抗原或免疫原作用的肽或多肽、例如包括病毒与细菌多肽。
本发明进一步涉及增强任意核心多肽的药动学性质的方法，借助于核心多肽与增强子肽序列的连接，生成杂合多肽。
本发明进一步涉及使用本文所公开的肽的方法，包括含有增强子肽序列的杂合多肽。例如，本发明的方法包括减少或抑制病毒感染的方法，例如HIV-1、HIV-2、RSV、麻疹、流感、副流感、Epstein-Barr和肝炎病毒感染，和/或病毒诱导的细胞融合。本发明的增强子肽序列另外可以用于延长核心多肽的体外或ex-vivo半衰期，该核心多肽已经附着有增强子肽序列，例如，增强子肽序列可以延长细胞培养物或细胞或组织样本中所附着的核心多肽的半衰期。
得以证明发明的实例中，含有与增强子肽序列连接的HIV核心多肽的杂合多肽表现出大大增强了的药动学性质，充当有力的HIV-1、HIV-2和SIV感染的非细胞毒性抑制剂。得以进一步证明发明的实例中，含有RSV核心多肽或促黄体激素多肽的杂合多肽表现出大大增强了的药动学性质。另外，RSV杂合多肽表现出相当的抗RSV活性。
3.2、定义
肽、多肽和蛋白质在本文中被定义为包含两个或多个氨基酸的有机化合物，这些氨基酸例如通过肽的酰胺键共价结合。肽、多肽和蛋白质还可以包括非天然氨基酸和如本文所述的任意修饰和另外的氨基与羧基。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”因此在本文中可互换使用。
本文所定义的肽序列是由关于如下氨基酸残基的单字母符号所代表的：
A(丙氨酸)
R(精氨酸)
N(天冬酰胺)
D(天冬氨酸)
C(半胱氨酸)
Q(谷氨酰胺)
E(谷氨酸)
G(甘氨酸)
H(组氨酸)
I(异亮氨酸)
L(亮氨酸)
K(赖氨酸)
M(甲硫氨酸)
F(苯丙氨酸)
P(脯氨酸)
S(丝氨酸)
T(苏氨酸)
W(色氨酸)
Y(酪氨酸)
V(缬氨酸)
X(任意氨基酸)
“增强子肽序列”被定义为具有下列共有氨基酸序列的肽：“WXXWXXXI”、“WXXWXXX”、“WXXWXX”、“WXXWX”、“WXXW”、“WXXXWXWX”、“XXXWXWX”、“XXWXWX”、“XWXWX”、“WXWX”、“WXXXWXW”、“WXXXWX”、“WXXXW”、“IXXXWXXW”、“XXXWXXW”、“KXWXXW”、“XWXXW”、“XWXWXXXW”、“XWXWXXX”、“XWXWXX”、“XWXWX”、“XWXW”、“WXWXXXW”或“XWXXXW”，其中X可以是任意氨基酸，W代表色氨酸，I代表异亮氨酸。正如下文所讨论的，本发明的增强子肽序列还包括与共有氨基酸序列不同、但是含有氨基酸取代、插入或缺失的肽序列，相对于单独的核心多肽的药动学性质而言，这些修饰不会取消肽增强与之连接的核心肽药动学性质的能力。
本文所用的“核心多肽”指的是任何可以引入到活体系统中的多肽，因而代表生物活性分子，例如任何能够起到药理学上可用于疾病治疗或预防的肽的作用的多肽。
本文所用的“杂合多肽”指的是任何包含氨基、羧基或氨基与羧基末端的增强子肽序列和核心多肽的多肽。通常，增强子肽序列是直接与核心多肽连接的。不言而喻的是，增强子肽也可以附着在间插氨基酸序列上，后者存在于增强子肽序列与核心肽之间。
本文所用的“抗融合”和“抗膜融合”指的是肽的抑制或减少两种或多种结构、例如细胞膜或病毒包膜或病毒毛之间的融合事件水平的能力，这是相对于在没有肽的存在下发生在这些结构之间的膜融合水平而言的。
本文所用的“抗病毒”指的是肽的抑制细胞经由细胞融合而被病毒感染或游离病毒感染的能力。这样的感染可能涉及膜融合，这发生在包膜病毒的情况下，或者另一种涉及病毒结构和细胞结构的融合事件，例如病毒毛与细菌膜在细菌接合期间的融合。
4、附图的简要说明
图1：杂合多肽。描绘了得自假定的N-末端与C-末端相互作用区的增强子肽序列，它与一类核心多肽连接。保守增强子肽序列为阴影部分。值得注意的是所示增强子肽序列可以使用N-末端、C-末端或N-与C-末端加成。进而，可以向核心多肽正向或反向加入各个增强子肽序列或其任何可能的组合，以增强肽的药动学性质。
图2A：得自各种包膜(gp41)蛋白序列的增强子肽序列，代表在所有目前已公开的HIV-1、HIV-2和SIV的分离序列中所观察到的N-末端相互作用区。最后的序列“WXXWXXXI”代表共有序列。
图2B：得自各种包膜(gp41)蛋白序列的增强子肽序列，代表在所有目前已公开的HIV-1、HIV-2和SIV的分离序列中所观察到的C-末端相互作用区。最后的序列“WXXXWXWX”代表共有序列。
图3：HIV-19320感染的SCID-HuPBMC小鼠组织中的HIV-1效价比较，效价是根据HuPBMC共培养测定中的P24水平测量的。该图显示体内T20与T1249病毒抑制作用的对比结果。
图4A-4B：IV注射2小时(图4A)和8小时(图4B)后的CD大鼠中T1249对T1387核心控制的血浆药动学曲线。T1387多肽是核心多肽，T1249多肽是与增强子肽序列连接的核心多肽。
图5：IV给药后的CD大鼠中T1249对T20控制的血浆药动学曲线。T1249多肽是核心多肽(T1387)与增强子肽序列连接的杂合多肽。T20：n＝4；T1249：n＝3.
图6：T20/T1249抗HIV-1/IIIb活性和细胞毒性对比。
图7：T1249与gp41构建体M41Δ178的直接结合。125I-T1249经过HPLC纯化至最大比活度。显示了与以0.5mg/ml固定在微量滴定皿中的M41Δ178(缺少T20氨基酸序列的gp41外结构域融合蛋白)的饱和结合。
图8：T1249缔合/解离的时间过程。结果证明125I-T1249和125I-T20具有近似的结合亲合性，为1-2nM。最初，125I-T1249的速率有时显著慢于125I-T20。在加入1/10总测定体积的未标记肽至最终浓度为10μm之后测量所结合的放射配体的解离。
图9：对T1249与M41Δ178结合的竞争。在单一浓度125I-T1249或125I-T20的存在下滴定未标记的T1249和T20。在未标记的肽之后立即加入配体，开始培养。
图10A-10B：CD大鼠中RSV杂合多肽T1301(10A)和T1302(10B)对T786的血浆药动学曲线。
图11A：噬斑减少测定。杂合多肽T1293能够抑制RSV感染，IC50为2.6μg/ml。
图11B：噬斑减少测定证明RSV杂合多肽T1301、T1302和T1303抑制RSV感染的能力。
图12A和12B：CD雄性大鼠中促黄体激素杂合多肽T1324对T1323的血浆药动学曲线。T1323多肽是促黄体激素核心多肽，T1324多肽是核心多肽与增强子肽序列连接的杂合多肽。
图13：得自各种核心多肽的杂合多肽序列。核心多肽序列以阴影显示。无阴影的氨基与羧基末端序列代表增强子肽序列。
图14A-B：单独的T1249(10μM，1℃；图14A)及其与来自gp41HR1结合结构域的45个残基肽(T1346)的组合在溶液(磷酸盐缓冲盐水pH7)中的圆二色性(CD)谱；实心方块(●)代表关于“无相互作用模型”所预言的理论CD谱，而实际CD谱是由实心圆(○)所代表的。
图15：聚丙烯酰胺凝胶电泳显示gp41构建体M41Δ178被蛋白酶-K消化的T1249保护作用；第1栏：引子标记物；第2栏：未处理的M41A178；第3栏：用蛋白激酶-K培养的M41A178；第4栏：未处理的T1249；第5栏：用蛋白激酶-K培养的T1249；第6栏：用T1249培养的M41Δ178；第7栏：在加入蛋白激酶-K之前T1249和M41Δ178的培养。
图16A-C：T1249在Sprague-Dawley白鼠中的药动学；图16A：T1249通过连续皮下输注单一剂量给药的药动学；图16B：T1249通过皮下注射(SC)或静脉内注射(IV)给药的血浆药动学；图16C：静脉内给药后T1249在淋巴和血浆中的动力学分析。
图17A-B：T1249在cynomolgus猴中的药动学；图17A：T1249经由皮下(SC)、静脉内(IV)或肌内(IM)注射单一0.8mg/kg剂量的血浆药动学；图17B：T1249按三种不同的剂量水平(0.4mg/kg、0.8mg/kg和1.6mg/kg)皮下给药的血浆药动学。
图18A-18D：肽DP397(□)、T649(○)和T1249(Δ)在各种HIV-1的T649耐药性毒株中所表现出来的抗病毒活性，这是在Magi-CCR-5感染性测定法中测定的；每幅图中的水平实线(上)和虚线(下)分别表示HIV-1感染减少50％和90％的水平；图18A：肽DP397、T649和T1249在HIV-1毒株RF-649中所表现出来的抗病毒活性；图18B：肽DP397、T649和T1249在HIV-1毒株DH012-649中所表现出来的抗病毒活性；图18C：肽DP397、T649和T1249在HIV-1毒株3’ETVQQQ中所表现出来的抗病毒活性；图18D：肽DP397、T649和T1249在HIV-1毒株SIM-649中所表现出来的抗病毒活性。
5、发明的详细说明
本文描述了这样的肽序列，称之为增强子肽序列，从各种逆病毒包膜(gp41)蛋白序列衍生，能够增强它们所连接的核心多肽的药动学性质。这样的增强子肽序列可以用在增强任意核心多肽的药动学性质的方法中，该方法借助于增强子肽序列与核心多肽的连接，形成杂合多肽，相对于单独的核心多肽而言增强了药动学性质。还可以体外延长已经附着有一条或多条增强子肽序列的核心肽的半衰期。例如，当出现在细胞培养物、组织培养物或患者样本中时，例如细胞、组织或其他样本，所附着的增强子肽序列可以延长核心多肽的半衰期。
本发明杂合多肽的核心多肽包含任何可以引入活体系统的肽，例如任何起到治疗剂或预防剂作用的肽，可用于疾病的治疗或预防，或者任何起到造影剂作用的肽，可用于体内使构造成像。
本文还描述了这样的肽，含有增强子肽序列，表现抗融合和/或抗病毒活性。本文进一步描述了利用这类肽的方法，包括减少或抑制病毒感染和/或病毒诱导细胞融合的方法。
5.1、杂合多肽
本发明的杂合多肽包含至少一条增强子肽序列和核心多肽。优选地，本发明的杂合多肽包含至少两条增强子肽序列和核心多肽，其中至少一条增强子肽在杂合多肽中呈递氨基给核心多肽，至少一条增强子肽序列在杂合多肽中呈递羧基给核心多肽。
本发明的增强子肽序列包含原本得自各种逆病毒包膜(gp41)蛋白序列的肽序列，包括HIV-1、HIV-2和SIV序列，及其下述特异性变异或修饰。核心多肽可以包含任何肽序列，优选为任何可以引入活体系统的肽序列，例如包括用于治疗、预防或造影目的的肽。
通常，杂合多肽的长度范围从约10至约500个氨基酸残基，其中长约10至约100个氨基酸残基是优选的，长约10至约40个氨基酸是最优选的。
尽管不希望拘泥于任何特定的理论，不过包膜蛋白的结构是这样的，位于该蛋白质C-末端区域的假定α-螺旋区据信与位于该蛋白质N-末端区域的亮氨酸拉链区缔合。在所有目前已公开的HIV-1、HIV-2和SIV的分离序列中所观察到的N-末端与C-末端增强子肽序列gp41区的排列确定了共有氨基酸序列。
确切地说，确定了下列代表共有增强子肽序列的共有氨基酸序列(下面按正向和反向列举共有序列，因为所述增强子肽序列能够被正向或反向利用)：“WXXWXXXI”、“WXXWXXX”、“WXXWXX”、“WXXWX”、“WXXW”、“WXXXWXWX”、“XXXWXWX”、“XXWXWX”、“XWXWX”、“WXWX”、“WXXXWXW”、“WXXXWX”、“WXXXW”、“IXXXWXXW”、“XXXWXXW”、“XXWXXW”、“XWXXW”、“XWXWXXXW”、“XWXWXXX”、“XWXWKX”、“XWXWX”、“XWXW”、“WXWXXXW”或“XWXXXW”，其中X可以是任意氨基酸，W代表色氨酸，I代表异亮氨酸。正向的共有氨基酸序列如图1和2所示。
通常，增强子肽序列的长度将为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基，其中长约4至约20个残基是优选的，长约4至约10个残基是更优选的，长约6至约8个残基是最优选的。
在发明的优选实施方式中，可以用于增强所得杂合多肽的药动学性质的增强子肽序列包含下列图2、13和表1所描绘的具体增强子肽序列。最优选的增强子肽序列是包含下列氨基序列者：“WQEWEQKI”和“WASLWEWF”。
举例来说，但不受其限制，下表1所列举的氨基酸序列代表了本发明增强子肽序列的增强子肽序列的优选实施方式。不言而喻的是，尽管下面描绘了正向的这些序列，不过反向的序列也打算落入本发明的范围。例如，尽管下面描绘了正向的增强子肽序列“WMEWDREI”，也打算包括它的反向，即“IERDWEMW”。
         表1
  WMEWDREIWQEWERKVWQEWEQKVMTWMEWDREINNMTWMEWDREIWQEWEQKVRYLEANINNMTWQEWEZKVRYLEANIWNWFIWQEWDREISNYTSLIWQEWEREISAYTSLIWQEWDREIWQEWEIWNWFWQEWWQAWWQEWEQKIWASLWNWFWASLFNFFWDVFTNWLWASLWEWFEWASLWEWFWEWFEWEWFIEWEWFIEWEWEWEWWASLWEWFWAGLWEWFAKWASLWEWF
  AEWASLWEWFWASLWAWFAEWASLWAWFAKWASLWAWFWAGLWAWFAEWAGLWAWFWASLWAWAEWASLWAWWAGLWAWAEWAGLWAWDKWEWFIEWASLWEWFIKWASLWEWFDEWEWFGGWASLWNWFGGWNWF
在另一种优选的实施方式中，特定的本发明增强子肽序列包含图2、13和表1所描绘的增强子肽序列，在一个、两个或三个位置表现保守氨基酸取代，其中相对于其对应的核心多肽而言，所述取代不会取消增强子肽序列增强杂合多肽的药动学性质的能力。
最优选地，这样的取代产生落入增强子肽序列共有序列之一的增强子肽序列。照此，一般在上文和图1和2所描绘的共有氨基酸序列中相当于“X”位置的氨基酸残基进行取代。“保守取代”指的是取代的氨基酸残基在电荷、大小和/或疏水性/亲水性特征上类似于被取代的氨基酸残基。这些氨基酸特征是本领域技术人员熟知的。
本发明进一步提供包含图1、2、13和表1氨基酸序列的增强子肽序列，它们是各不相同的，但是所述增强子肽序列包含一种或多种氨基酸加成(长度一般不超过15个氨基酸残基)、缺失(例如氨基-或末端-截头)或非保守取代，然而相对于没有这类增强子肽序列的核心多肽而言，它们不会取消所得增强子肽增加它们所连接的核心多肽的药动学性质的能力。
加成一般不超过约15个氨基酸残基，可以包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续氨基酸残基的加成。优选地，向原始增强子肽加入的氨基酸残基总数不超过约15个氨基酸残基，更优选地不超过约10个氨基酸残基，最优选地不超过约5个氨基酸残基。
缺失优选为总共不超过约3个氨基酸残基的缺失(连续或非连续的残基)，更多的缺失优选为2个氨基酸，最优选为单一氨基酸残基的缺失。一般来说，缺失将是对应于增强子肽共有序列“X”残基的氨基酸残基。
本发明的增强子肽序列还包含图2、13和表1所描绘的特定增强子肽序列，它们表现一种、两种或三种非保守的氨基酸取代，其中两种这样的取代是优选的，一种这样的取代是更优选的。“非保守”取代指的是取代的氨基酸残基在电荷、大小和/或疏水性/亲水性特征上不同于被代替的氨基酸残基。这些氨基酸特征是本领域技术人员熟知的。
另外，氨基酸取代不必、在某些实施方式中优选地不是局限于遗传编码的氨基酸。事实上，肽可以含有遗传上非编码的氨基酸。因而，除了天然存在的遗传编码的氨基酸以外，肽中的氨基酸残基还可以被天然存在的非编码的氨基酸和合成的氨基酸取代。这样的取代也可以存在于本发明杂合多肽的核心多肽内，无论它们是否存在于特定杂合多肽的一条或多条增强子序列中。
某些常见的提供有用取代的氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其他ω-氨基酸，例如3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；萘基丙氨酸(Nal)；4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰赖氨酸(AcLys)；2，4-二氨基丁酸(Dbu)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；对-氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)、高苯丙氨酸(hPhe)与高丝氨酸(hS er)；羟脯氨酸(Hyp)、高脯氨酸(hPro)、-甲基化氨基酸、环状氨基酸类似物(例如用于约束氨基酸残基成特定的构象状态，例如αα’-与ββ’-取代的环状氨基酸，例如1-氨基环戊烷羧酸(环亮氨酸)和β，β-环亚戊基-β-巯基丙酸；例如参见Hruby等1990《生物化学杂志》268：249-262)和类胨或寡聚类胨(N-取代的氨基酸，例如N-取代的甘氨酸；例如参见Simon等1972《美国国家科学院院报》89：9367-9371)。
尽管在大多数场合中，肽的氨基酸将被L-对映异构的氨基酸取代，不过取代并不限于L-对映异构的氨基酸。因而，“突变”或“改变”型的定义中也包括这样的场合，其中L-氨基酸被等同的D-氨基酸代替(例如L-Arg→D-Arg)或者被相同种类或子类的D-氨基酸代替(例如L-Arg→D-Lys)，反之亦然。这样的取代也可以存在于本发明杂合多肽的核心多肽内，无论它们是否存在于特定杂合多肽的一条或多条增强子序列中。
除了上述氨基酸取代以外，通过引入例如甲基或电子性质不同的假等排基团，可以进行侧链部分的代替(例如参见Hruby等1990《生物化学杂志》268：249-262)。进而，在氨基酸的相邻碳原子之间可以引入双键，通过引入共价键可以生成环状肽或类似物，例如在肽的N-与C-末端之间、在两条侧链之间或者在侧链与N-或C-末端之间生成酰胺键。这样的取代也可以存在于本发明杂合多肽的核心多肽内，无论它们是否存在于特定杂合多肽的一条或多条增强子序列中。
本发明的核心与杂合多肽还可以与一种或多种化学基团缀合。用于缀合的化学基团优选地没有显著的毒性或免疫原性，也就是说，用核心或杂合多肽缀合物所观察到的任何毒性或免疫原性没有显著(即小于50％)超过用对应的未经修饰的核心或杂合多肽所观察到的任何毒性或免疫原性。核心和/或杂合多肽的化学修饰打算影响该多肽的药动学性质。这些影响包括药物效力、稳定性、生物活性、廓清率、免疫原性和体内半衰期的减少或增加，以及对该多肽的分解代谢、运输和定位作用的影响。
在一种实施方式中，杂合多肽在核心和增强子多肽部分上都与一种或多种化学基团缀合。在另一种实施方式中，这样的修饰发生在杂合多肽的核心多肽或增强子肽部分上。在另外一种实施方式中，仅有杂合多肽的核心多肽部分被修饰。在另外一种实施方式中，核心多肽被一种或多种化学基团修饰，其中这样的核心多肽不是作为杂合多肽的一部分而存在的。例如，利用一种或多种化学基团可以修饰诸如T1387(Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2)等核心多肽。
可用于缀合的示范性化学基团包括非蛋白类聚合物，例如多元醇。其他化学基团包括蛋白质，例如白蛋白或免疫球蛋白，以及碳水化合物，例如天然存在于糖蛋白上的那些碳水化合物。葡聚糖、DL-氨基酸和聚乙烯吡咯烷酮也已用于修饰蛋白质。关于聚合物修饰的肽的评论，例如参见Burnham《美国医院药学杂志》51：210-18(1994)，全文引用在此作为参考文献。
多元醇例如可以在一种或多种氨基酸残基上与核心或杂合多肽缀合，例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基。所用多元醇可以是任意水溶性聚(烯化氧)聚合物，可以具有直链或支链。适合的多元醇包括在一个或多个羟基位置上被化学基团取代的那些，例如具有一至四个碳的烷基。通常，多元醇是聚(亚烷基二醇)，例如聚(乙二醇)(PEG)，因而，为简便起见，其余的讨论涉及其中所用多元醇是PEG的示范性实施方式，使多元醇与核心或杂合多肽缀合的方法称为“聚乙二醇基化作用”。不过，本领域技术人员公认，利用本文关于PEG所述缀合工艺，还可以采用其他多元醇，例如聚(丙二醇)和聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。关于生物活性分子被PEG或其衍生物修饰的评论，例如参见Inada等《生物工程趋势》13：86-91(1995)，全文引用在此作为参考文献。
可以调整本发明核心或杂合多肽的聚乙二醇基化程度，与对应的非聚乙二醇基化的蛋白质相比，以可取地延长体内半衰期。聚乙二醇基化核心或杂合多肽的半衰期可以随着聚乙二醇基化程度的提高而增量延长。用PEG或PEG衍生物修饰蛋白质已经证明可取地增加药物的效力、生物活性、稳定性(包括对热、化学变性剂和蛋白水解作用的耐受性)、体内吸收/摄取和体内半衰期，以及可取地减少廓清率和免疫原性(美国专利No.6,025,325；Westerman等《国际癌症杂志》76：842-50(1998)；Conover等《人造器官》21：907-15(1997)；Tsutsumi等《药理学与实验治疗学杂志》278：1006-11(1996)；Kaneda等《发病与转移》15：156-62(1995)；Inada等《生物工程趋势》13：86-91(1995)；Paige等《药学研究》12：1883-88(1995)；Satake-Ishikawa等《细胞结构与功能》17：157-60(1992)；Tanaka等《癌症研究》51：3710-3714(1991)，全文引用在此作为参考文献)。
PEG的平均分子量可以从约500至约30,000道尔顿(D)；优选地从约1,000至约25,000D；更优选地从约4,000至约20,000D。在一种实施方式中，用平均分子量约5,000D的PEG(以下称“PEG(5000)”)进行聚乙二醇基化。在另一种实施方式中，采用具有各约10,000D的两条链的支链PEG。
商业上可得到的并且适用于本发明的PEG制剂是非同种的制剂，根据平均分子量销售。例如，PEG(5000)制剂通常含有分子量有微小差异的分子，通常+/-500D。有人已经描述了各种蛋白质聚乙二醇基化方法。例如参见美国专利No.4,179,337，全文引用在此作为参考文献，其中公开了大量激素和酶与PEG和聚丙二醇的缀合，制得生理活性的非免疫原性组合物。
PEG与蛋白质偶联的反应条件因靶蛋白、聚乙二醇基化作用的所需程度、所用PEG类型或衍生物和靶附着点而异。其他考虑包括PEG键的稳定性、反应性和抗原性。一般来说，具有至少一个末端羟基的PEG与偶联剂反应，生成具有末端反应性基团的活化PEG。同上。该反应性基团然后与蛋白质的α-与ε-胺反应，生成共价键。胺基能够与PEG的羟基缀合生成酰胺键。羧基能够与核心或杂合多肽的胺基缀合生成酰胺键，与PEG的羟基缀合生成酯。适宜的话，PEG分子的另一端可以被非反应性化学基团“阻滞”，例如甲氧基，生成例如烷基化PEG，例如甲氧基-PEG(MPEG)，这减少蛋白质分子的PEG-交联配合物的生成。
本领域已知的若干类型连接基团可以用于使核心、增强子或杂合多肽与PEG缀合。关于连接基团的实例，例如参见美国专利No.4,609,546；美国专利No.4,847,325；美国专利No.4,902,502；美国专利No.5,034,514；和美国专利No.5,122,614。在一种实施方式中，采用增强子肽序列作为连接基团。
适合的活化PEG可以通过大量常规反应加以制备。例如，按照Buckmann和Merr《大分子化学》182：1379-1384(1981)的方法，通过与N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的反应，从PEG-一甲基醚(商业上可从Union Carbide获得)制备PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯(M-NHS-PEG)。
另外，PEG末端羟基可以转化为氨基，例如通过与亚硫酰溴的反应生成PEG-Br，然后用过量氨进行氨解作用生成PEG-NH2。然后使用标准的偶联试剂，例如伍德沃德试剂K，使PEG-NH2与有关蛋白质缀合。此外，PEG-末端-CH2OH基可以转化为醛基，例如用MnO2氧化。使用诸如氰基硼氢化物等试剂，通过还原性烷基化作用，使醛基与蛋白质缀合。经由适当的键也可以使氨基酸的胺基与PEG缀合，例如尿烷基。非天然氨基酸正亮氨酸可以在其羧基上被活化为琥珀酰亚氨基酯，用于与蛋白质的氨基结合(Zalipsky等《国际肽与蛋白质研究杂志》30：740(1987)；Sartore等《应用生物化学与生物工程》27：45(1991))。关于聚乙二醇基化作用的一般评论，例如参见Zalipsky和Lee《聚(乙二醇)化学：生物技术与生物医学应用》J.M.Harris，Ed.，Plenum，NY，Chap.21(1992)，全文引用在此作为参考文献。
或者，适用于本发明的活化PEG例如但不限于丙烯酸酯PEG、醛PEG、烯丙基PEG、氨基PEG、氨基酸PEG、PEG的氨基酸酯、ω-氨基α-羧基PEG、苯并三唑碳酸酯、生物素PEG、t-Boc PEG、羰基咪唑PEG、羧甲基化PEG、环氧化物PEG、FMOC PEG、荧光素PEG、酰肼PEG、ω-羟基α-氨基PEG、ω-羟基α-羧基PEG、异氰酸酯PEG、马来酰亚胺PEG、PEG的异丁烯酸酯、NHS-马来酰亚胺、NHS-乙烯基砜、对-硝基苯基碳酸酯PEG、邻吡啶基二硫化物、PEG2、磷脂PEG、丙酸PEG、硅烷PEG、琥珀酸酯PEG、琥珀酰亚氨基丁酸酯PEG(SBA-PEG)、氨基酸PEG的琥珀酰亚氨基酯、羧甲基化PEG的琥珀酰亚氨基酯、琥珀酰亚氨基丙酸酯PEG(SPA-PEG)、琥珀酰亚氨基琥珀酸酯PEG(SS-PEG)、硫醇PEG、乙烯基砜PEG，它们可以从大量销售商购买。例如，Shearwater Polymers，Inc.(Huntsville，Ala.)销售的M-NHS-PEG是“SCM-PEG”，另外还有MPEG的琥珀酰亚氨基碳酸酯(“SC-PEG”)和MPEG琥珀酰亚氨基丙酸酯(“SPA-PEG”)。
包含杂种或核心多肽的特定氨基酸经过修饰，例如可以防止和/或促进某些氨基酸残基的聚乙二醇基化作用。在一种实施方式中，通过对能够被聚乙二醇基化的氨基酸残基进行修饰，可以使潜在的聚乙二醇基化位点灭活。例如，可以将核心或杂合多肽中所有具有游离氨基的氨基酸残基保护起来，由此防止在这些残基上的聚乙二醇基化作用。适合的保护基团包括但不限于叔丁氧羰基(t-Boc)和N-9-芴基甲氧羰基(Fmoc)。可以使用任意适合于肽合成的胺保护基团。若干这样的保护基团描述在Greene《有机合成中的保护基团》John Wiley &Sons，New York，1981，pp.323-334；Fields和Noble《国际肽与蛋白质研究杂志》35：161-214(1990)中，全文引用在此作为参考文献。如果需要的话，随后可以通过常规化学方法除去保护基团，例如Fmoc的情况下，在二甲基甲酰胺中用哌啶处理，或者在t-Boc的情况下，用三氟乙酸处理。
或者，例如通过位点定向的诱变，对聚乙二醇基化作用敏感的核心或杂合多肽的氨基酸残基可以用耐受聚乙二醇基化作用的氨基酸残基代替。而且，缺少对聚乙二醇基化作用敏感的氨基酸残基的增强子肽序列能够用于产生杂合多肽。
在另一种实施方式中，核心或杂合多肽的一种或多种氨基酸残基经过修饰，可以引入另外的聚乙二醇基化位点。例如对聚乙二醇基化作用敏感的一种或多种氨基酸残基可以被代替或者加入到多肽中，采用本领域任意已知方法，例如标准的合成技术，或者在重组技术的情况下，经由位点定向的诱变(Zoller等《核酸研究》10：6487(1987)；Carter等《核酸研究》13：4331(1986))。
核心或杂合多肽的聚乙二醇基化作用经过巧妙处理，也可以指向附着的位点或者影响聚乙二醇基化的程度。通过本领域任意已知方法，能够实现核心或杂合多肽可能的聚乙二醇基化位点仅有一部分被聚乙二醇基化。例如，反应条件可以控制聚乙二醇基化的程度，例如调节多肽与PEG的摩尔比、反应的持续时间或进行反应的温度。聚乙二醇基化多肽例如通过离子交换色谱法纯化后，例如通过SDS-PAGE分析可以评估聚乙二醇基化的程度。聚乙二醇基化蛋白质可以利用本领域所述任意贮存介质加以贮存，包括在-20℃下贮存在PBS缓冲液(pH 7.3)中。
这些方法可以结合起来，以控制核心或杂合多肽上的聚乙二醇基化位点数量和位置。在核心、增强子或杂合多肽的合成期间，将化学保护技术和聚乙二醇基化反应结合起来，可以实现有关特定氨基酸残基的聚乙二醇基化作用。在肽合成期间、在不同的点上将不同保护基团与保护或去保护作用结合使用，将为聚乙二醇基化作用定向任意氨基酸残基。因而，这种技术能够用于利用任意化学基团选择性修饰核心、增强子或杂合多肽内的任意部分或特定氨基酸残基。例如，使用第一种保护基团可以在化学上保护部分合成的寡肽，以防止对聚乙二醇基化作用敏感的氨基酸残基的聚乙二醇基化。然后使用第二种保护基团可以完成多肽的合成，该保护基团也将保护对聚乙二醇基化作用敏感的氨基酸残基。第二种保护基团应当比第一种更不稳定，以便一旦合成完成，能够选择性除去不稳定的保护基团，仅允许刚去保护的有关氨基酸残基被聚乙二醇基化(Greene《有机合成中的保护基团》John Wiley & Sons，New York，1981)。
在一种非限制性实例中，可以选择性修饰T1387(Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2)的任意一种对聚乙二醇基化作用敏感的氨基酸残基(即赖氨酸残基)。例如，可以合成KLDK，可以去保护赖氨酸残基的ε-NH2基团并聚乙二醇基化。然后完成肽的合成，得到核心多肽，三个赖氨酸残基中仅有两个被聚乙二醇基化。
在另一种非限制性实例中，T1387的多数N-末端赖氨酸残基可以这样修饰，合成NEYELQKLDK，用比较稳定的保护基团保护赖氨酸残基的ε-NH2基团。蛋白质合成完成后，其中多数N-末端赖氨酸的ε-NH2基团具有更不稳定的保护基团，然后选择性去保护N-末端赖氨酸并聚乙二醇基化。本领域技术人员应当清楚，诸如此类的策略能够用于选择性修饰核心、增强子或杂合多肽内的任何靶氨基酸残基。这样的保护基团和它们的不稳定性可以在本领域中找到，例如Greene《有机合成中的保护基团》John Wiley & Sons，New York，1981。
另外一种或多种氨基酸序列也可以与核心或杂合多肽缀合。所用氨基酸序列可以是任意证明半衰期长的氨基酸序列，或者任意可以在融合蛋白中证明半衰期长的氨基酸序列。在一种实施方式中，所用蛋白质是人来源的。在优选的实施方式中，该蛋白质是人白蛋白。不过，本领域技术人员公认利用本文所述关于白蛋白的缀合技术，也可以采用其他蛋白质，例如免疫球蛋白。例如，核心、增强子或杂合多肽可以与免疫球蛋白家族成员或免疫球蛋白片段缀合。在一种实施方式中，核心、增强子或杂合多肽与人IgG1 Fc结构域融合。
在另一种实施方式中，多肽是这样修饰的，附着非蛋白质类多元醇修饰和氨基酸序列修饰，例如使用PEG和白蛋白进行修饰。
氨基酸序列可以附着在核心、增强子或杂合多肽的C-末端或N-末端，或者作为侧链附着在多肽上。可以在多肽合成期间或之后向核心或杂合多肽加入氨基酸序列。或者，构建体经过设计，可以产生融合蛋白，以便重组氨基酸序列附着在核心和/或杂合多肽上。例如，白蛋白可以与核心多肽的两端之一融合。如果需要的话，然后可以将增强子肽序列放置在核心多肽的游离端和/或附着重组蛋白质的一端。在一种实施方式中，氨基酸序列可以是在核心与增强子多肽之间的连接基团的一部分或者充当连接基团。
已经显示蛋白质与氨基酸序列、例如白蛋白的融合修饰可取地提高药物效力、稳定性、生物活性和体内半衰期，以及可取地降低廓清率和毒性(Kratz等《药学文献》(Weinheim)331：47-53(1998)；Syed等《血液》89：3243-3252(1997)；Makride s等《药理实验疗法杂志》277：534-42(1996)；Breton等《欧洲生物化学杂志》231：563-69(1995)；Paige等《药学研究》12：1883-88(1995))。
白蛋白是非常多形的，以致已经鉴定了很多变体(Weitkamp等《人遗传学年鉴》37：219(1973))。白蛋白序列、例如人白蛋白序列对本领域技术人员来说是熟知的(例如参见美国专利No.5,876,969,全文引用在此作为参考文献)。能够用于这类蛋白质修饰的白蛋白序列例如包括前原型、全长型或其片段(例如参见Kratz等《药学文献》(Weinheim)331：47-53(1998)；Syed等《血液》89：3243-3252(1997)；Makrides等《药理实验疗法杂志》277：534-42(1996)；Breton等《欧洲生物化学杂志》231：563-69(1995)；Paige等《药学研究》12：1883-88(1995))。经由化学合成或重组技术或其组合，可以向本发明的多肽中加入白蛋白序列。
在一种非限制性实例中，全长人白蛋白可以经由重组技术以框架内方式与T1387(Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2)融合。
在另一种非限制性实例中，利用本领域已知的技术，例如Paige等《药学研究》12：1883-88(1995)，已被聚乙二醇基化的T1387(Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2)可以与还原的人白蛋白(可从Sigma Chemical，St.Louis获得)缀合。
利用标准的技术，可以试验经过修饰的多肽的生物活性，例如抗病毒活性。进而，还可以按常规方法测定经过修饰的多肽的特征，例如药动学或免疫原性属性。对经过修饰的多肽还可以进行体外和体内试验，以测定由修饰引起的生物反应变化。
                                    表2
  TNo. 序列
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不言而喻的是，表2和下节11实施例所列举的肽也打算落在本发明的范围内。正如上面所讨论的，表2和下列实施例所述那些已经不含增强子肽序列(也就是不代表杂合多肽)的肽可以如本文所提供的教导与增强子肽序列结合用于生成杂合多肽。进而，表2、图13和下节11实施例所示核心多肽和杂合多肽的核心多肽可以与本文所述的任意增强子肽序列结合，用于按常规方法产生另外的杂合多肽，后者也打算落在本发明的范围内。
例如，第11节实施例所述肽DP397代表核心多肽，打算落在本发明的范围内。另外，包含DP397核心多肽加一种或多种本文所述增强子多肽序列的杂合多肽也打算落在本发明的范围内。
值得注意的是，尽管表2和图13所列举的大量多肽被描绘以经过修饰的、例如封锁的氨基和/或羧基末端或d-异构氨基酸(以括号内的残基表示)，不过任意包含如表2和图13所述原始氨基酸序列的多肽也打算成为本发明的一部分。
表2、图13和下节11实施例所示核心多肽序列本身以及包含这些核心多肽的杂合多肽能够表现出抗病毒和/或抗融合活性，和/或能够表现出调节涉及卷曲螺旋肽结构的细胞内过程的能力。另外，这样的肽也可以作为筛选方法的一部分，用于鉴定具有这类活性的化合物，包括肽。核心多肽序列例如是得自各病毒蛋白序列的那些。核心多肽序列例如也是其氨基酸序列得自一种以上病毒蛋白序列的那些(例如得自HIV-1、HIV-2和SIV的核心多肽)。
另外，这样的核心多肽能够表现氨基酸取代、缺失和/或插入，如上关于增强子多肽序列所讨论的。在其中核心多肽表现抗病毒和/或抗融合活性的场合中，这样的修饰优选地不会取消(本身或者作为杂合多肽的一部分)这种活性。
关于氨基酸缺失，优选的是所得核心多肽至少长约4-6个氨基酸残基。关于氨基酸插入，优选的插入不超过约50个氨基酸残基，更优选地不超过约15个氨基酸残基。也优选的是核心多肽插入是氨基-和/或羧基-末端插入。
本发明核心或杂合多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入是相当于在内源性蛋白质序列突变体、例如天然存在的突变体中所发现的氨基酸取代、缺失和/或插入的那些，特定的核心多肽即是得自该内源性蛋白质序列的。
例如，如果核心多肽是得自病毒蛋白的，并且这种核心多肽(本身或者作为杂合多肽的一部分)对该病毒或另一种病毒表现抗病毒活性，那么可能存在或者可能最终出现该病毒的变体(例如变体毒株)，相对于肽对病毒毒株的抗病毒作用而言该变体对肽表现一定程度的耐受性，原始的内源性核心多肽序列即是得自该病毒毒株的。
为了生成对这样的耐药性病毒毒株表现抗病毒活性的核心多肽，可以向原始核心多肽中引入修饰。确切地说，本领域技术人员利用标准的技术，能够容易分离耐药性病毒的隔离群。还可以按常规方法测定相当于原始核心多肽的耐药性病毒内的序列，并与原始核心多肽进行比较。
万一从突变体得到对应的序列，耐药性毒株不同于核心多肽的序列，可以向核心多肽中引入修饰，以便所得经过修饰的核心多肽具有与耐药性病毒中的相应区域相同的序列。
所得经过修饰的核心多肽本身或者作为杂合多肽的一部分，将对已耐受原始核心多肽的病毒毒株表现抗病毒性质。这样的方法因此能够用于鉴定这样的核心多肽，它们对耐受或者变得耐受其他核心多肽的抗病毒活性的病毒毒株表现抗病毒活性。
下节11实施例描述了这样一种方法在制备经过修饰的核心多肽中的成功应用的一种特定而非限制性实例，该核心多肽对耐受“母体”核心多肽的病毒毒株表现抗病毒活性。
在一种实施方式中，这类经过修饰的、对耐受“母体”核心多肽的毒株表现抗病毒活性的核心多肽是其中已经引入氨基酸取代、插入和/或缺失的那些，通过修饰“母体”核心多肽，存在于“母体”核心多肽中的N-糖基化或O-糖基化共有序列在所得经过修饰的核心多肽中已被取消。
例如，N-糖基化位点的共有序列是-N-X-S/T，其中S/T是丝氨酸或苏氨酸，X是除脯氨酸或天冬氨酸以外的任意氨基酸。因而，在一种实施方式中，表现这样一种共有序列的母体核心多肽经由氨基酸插入、取代和/或缺失得以修饰，以便这种共有序列在经过修饰的核心多肽中被取消。
这样的氨基-和/或羧基-末端插入是包含向内源性蛋白质序列插入氨基酸序列的氨基和/或羧基的那些，核心多肽即是得自该内源性蛋白质序列的。例如，如果核心多肽得自gp41蛋白，那么这样一种插入将包含氨基-和/或羧基-末端插入，这种插入包含与gp41核心多肽序列相邻的gp41氨基酸序列。这样的氨基和/或羧基末端插入通常可以向原始核心多肽插入约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基的氨基和/或羧基。
本发明的杂合多肽还可进一步包含另外的容易允许多肽检测的修饰。例如，杂合多肽能够进行直接或间接标记。肽标记技术对本领域技术人员来说是熟知的，包括但不限于放射性、荧光和比色技术。间接标记技术对本领域技术人员来说也是熟知的，包括但不限于生物素/抗生蛋白链菌素标记和间接抗体标记。
本发明进一步涉及增强子多肽序列与除肽以外的分子类型的缔合作用。例如，增强子肽序列可以与核酸分子(例如DNA或RNA)或任意类型的有机小分子连接，目的是增强所述分子的药动学性质。
5.2、肽的合成
本发明的增强子、核心和杂合多肽可以按照本领域熟知的技术加以合成或制备。例如参见Creighton，1983《蛋白质：结构与分子原理》W.H.Freeman and Co.，NY，全文引用在此作为参考文献。杂合多肽可以利用常规的逐步溶解或固相合成、片段缩合、Fmoc或Boc化学加以制备(例如参见《肽与蛋白质合成的化学方法》Williams等Eds.，1997，CRC Press，Boca Raton Florida和其中引用的参考文献；《固相肽合成：实用方法》Atherton & Sheppard，Eds.，1989，IRL Press，Oxford，England和其中引用的参考文献)。同样适用于氨基-和/或羧基-末端修饰。
一般来说，这些方法可以包括向生长中的肽链连续加入一种或多种氨基酸或适当保护的氨基酸。正常情况下，第一个氨基酸的氨基或羧基被适合的保护基团保护起来。通过在适合于生成酰胺键的条件下，在补充性基团(氨基或羧基)被适当保护的序列中加入下一个氨基酸，被保护或衍生的氨基酸然后可以附着在惰性固体载体上或者在溶液中加以利用。然后从该新加入的氨基酸残基中除去保护基团，然后加入(被适当保护的)下一个氨基酸，等等。在所有所需氨基酸已经按正确顺序连接之后，可以先后或同时除去其余保护基团和任何固体载体，以提供所需最终的多肽。通过简单地更改这种通用操作，有可能一次向生长中的链加入一个以上氨基酸，例如(在不使手性中心外消旋的条件下)将被保护的三肽与适当保护的二肽偶联，去保护后生成五肽。
典型的保护基团包括叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、苄氧羰基(Cbz)、对-甲苯磺酰(Tos)、2，4-二硝基苯基、苄基(Bzl)、联苯异丙氧基-羧基羰基、环己基、异丙基、乙酰基、邻-硝基苯基磺酰等。其中，Boc和Fmoc是优选的。
典型的固体载体一般是交联的聚合材料。它们包括但不限于二乙烯基苯交联苯乙烯类聚合物，例如二乙烯基苯-羟甲基苯乙烯共聚物、二乙烯基苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯基苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。这样的共聚物提供向肽链直接引入末端酰胺官能团的优点，在从载体上裂解该链时，该链保留了这种官能。
含有L-或D-氨基酸的多肽可以按这种方式合成。
多肽组合物可以通过定量氨基酸分析加以证实，每种肽的特定序列可以通过序列分析加以测定。
本发明的增强子、核心和杂合多肽可以通过本领域已知的技术加以纯化，例如正相与反相高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱、尺寸排阻、沉淀等。用于纯化特定多肽的实际条件将在部分程度上取决于合成策略和诸如电荷、疏水性、亲水性、溶解度、稳定性等因素，这对本领域技术人员来说将是显而易见的。
杂种、增强子和核心多肽也可以使用重组DNA技术加以制备。这里，按照本领域普通技术人员熟知的技术可以合成和/或克隆和表达编码本发明多肽的核苷酸序列。例如参见Sambrook等1989《分子克隆：实验室手册》1-3卷，Cold Spring Harbor Press，NY。
使用本领域技术人员公知的各种分子生物技术，可以得到编码有关多肽的DNA区段。例如，聚合酶链反应(PCR)可以用于产生编码有关蛋白质的DNA片段。或者，可以从商业来源获得DNA片段。
编码有关多肽的DNA可以按重组方法加工成各种宿主载体系统，也供大规模的DNA复制之用。这些载体可以被设计成含有用于定向编码杂合多肽的DNA序列转录和/或转译所必要的元件。
可以使用的载体包括但不限于得自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的那些。例如，可以使用诸如pcDNA3、pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13 mp系列载体等质粒载体。噬菌体载体可以包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R和EMBL系列噬菌体载体。可以采用的粘粒载体包括但不限于pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9系列载体。
或者，可以对重组病毒载体进行加工，病毒包括但不限于疱疹病毒、逆病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺伴随病毒或牛乳头状瘤病毒，或植物病毒，例如烟草花叶病毒和杆状病毒。
为了表达生物活性多肽，可以将编码蛋白质的核苷酸序列插入到适当的表达载体中，也就是含有用于所插入的编码序列的转录和转译所必要的元件的载体。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建杂合多肽编码序列与适当的转录/转译控制信号有效缔合的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术和合成技术。例如参见下述技术：Sambrook等1992《分子克隆：实验室手册》Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.和Ausubel等1989《分子生物学流行方案》GreenePublishing Associates & Wiley Interscience，N.Y.，它们各自全文引用在此作为参考文献。
编码有关杂种、增强子和核心多肽的核酸分子可以与各种不同的启动子/增强子元件有效缔合。启动子/增强子元件经过选择，可以优化治疗量蛋白质的表达。这些载体的表达元件可以在其强度和特异性上是各不相同的。根据所用的宿主/载体系统，可以使用大量适合的转录和转译元件的任意一种。启动子可以是这样一种形式，它与有关基因天然缔合。或者，DNA可以处在重组或异种启动子的控制之下，也就是在正常情况下不与该基因缔合的启动子。例如，组织特异性启动子/增强子元件可以用于调节特定细胞类型中转染DNA的表达。
表现出已知且可用的组织特异性的转录控制区实例包括但不限于对胰腺泡细胞有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等1984《细胞》38：639-646；Ornitz等1986《Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.》50：399-409；MacDonald，1987《肝脏病学》7：42S-51S)；对淋巴样细胞有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等1984《细胞》38：647-658；Adams等1985《自然》318：533-538；Alexander等1987《分子细胞生物学》7：1436-1444)；对肝脏有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等1987《基因与发育》1：268-276)；对肝脏有活性的α-胎蛋白基因控制区(Krumlauf等1985《分子细胞生物学》5：1639-1648；Hammer等1987《科学》235：53-58)；对肝脏有活性的α-1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等1987《基因与发育》1：161-171)；对髓样细胞有活性的β-珠蛋白基因控制区(Magram等1985《自然》315：338-340；Kolli as等1986《细胞》46：89-94)；对脑中少突胶质细胞有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区(Readhead等1987《细胞》48：703-712)；对骨骼肌有活性的肌浆球蛋白轻链-2基因控制区(Shani，1985《自然》314：283-286)；对下丘脑有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等1986《科学》234：1372-1378)。可以使用从生长在哺乳动物细胞中的病毒基因组分离的启动子(例如牛痘病毒7.5K、SV40、HSV、腺病毒MLP、MMTV、LTR和CMV启动子)，以及由重组DNA或合成技术所产生的启动子。
在有些场合中，启动子元件可以是组成型或诱导型启动子，能够在适当的条件下用于指导高水平的有关核苷酸序列的表达或者调节表达。处在组成型启动子控制之下的基因表达不需要诱导基因表达的特异性底物的存在，将发生在细胞生长的所有条件下。相形之下，受诱导型启动子控制的基因表达对诱导剂的存在与否有应答。
特异性起始信号也是所插入的蛋白质编码序列的充分转译所需要的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。在向适当的表达载体中插入包括起始密码子和相邻序列在内的完整编码序列的情况下，可以不需要另外的转译控制信号。不过，在仅有一部分编码序列被插入的情况下，必须提供外源性转译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与蛋白质编码序列的阅读框架同相，以确保完整插入片段的转译。这些外源性转译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，包括天然的和合成的。通过包含转录弱化序列、增强子元件等，可以提高表达的效率。
5.3、本发明的增强子肽序列、核心多肽和杂合多肽的用途
正如上文所讨论的，通过核心多肽与增强子肽序列连接生成杂合多肽，本发明的增强子肽序列能够用于增强任意核心多肽的药动学性质。所观察到的药动学性质的增强作用是相对于单独的核心多肽的药动学性质而言的。用于测定和鉴定诸如多肽等试剂的药动学性质的标准药动学特征参数和方法是本领域技术人员熟知的。这类方法的非限制性实例列在下文所提供的实施例中。
本发明的增强子肽序列另外能够用于延长已经附着增强子肽序列的核心多肽的体外或来自体内半衰期。例如，当所得杂合多肽存在于细胞培养物、组织培养物或患者样本(例如细胞样本、活组织检查样本或其他含有体液的样本)中时，增强子肽序列能够延长所附着的核心多肽的半衰期。
本发明的核心多肽和杂合多肽还能够作为方法的一部分，用于调制(例如减少、抑制、破坏、稳定或增强)融合事件。优选地，这样的肽表现抗融合或抗病毒活性。本发明的肽还能够表现调制涉及卷曲螺旋肽相互作用的细胞内过程的能力。
在特定的实施方式中，本发明的表现抗病毒活性的杂合多肽和核心多肽能够作为方法的一部分，用于减少病毒感染。这类抗病毒方法例如能够用于对抗人逆病毒，确切为HIV(人免疫缺陷病毒)，例如HIV-1和HIV-2，和人T淋巴细胞病毒(HTLV-I和HTLV-II)，和非人的逆病毒，例如牛造白细胞组织增生病毒、猫肉瘤与白血病病毒、猿免疫缺陷病毒(SIV)、肉瘤与白血病病毒、和绵羊进行性肺炎病毒。
本发明的抗病毒方法还能够用于对抗非逆病毒的病毒，包括但不限于呼吸道合胞体病毒(RSV)、犬瘟热病毒、新城病病毒、人副流感病毒、流感病毒、麻疹病毒、Epstein-Barr病毒、乙型肝炎病毒和Mason-Pfizer病毒。
上述病毒是包膜病毒。本发明的抗病毒方法还能够用于对抗非包膜病毒，包括但不限于细小核糖核酸病毒，例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、埃可病毒和柯萨奇病毒；乳多泡病毒，例如乳头状瘤病毒；细小病毒；腺病毒；和呼肠孤病毒。
采用本发明肽的方法所能够调制的其他抗融合活性包括但不限于神经递质经由细胞融合的交换和精子-卵子融合的调制作用。采用本发明肽的方法所能够改善的涉及卷曲螺旋相互作用的细胞内障碍例如是涉及细菌毒素的障碍。
经由标准的体外、来自体内和动物模型测定，能够常规地确定给定核心多肽或杂合多肽的抗融合或抗病毒活性，关于抗病毒活性，这些测定能够是对有关病毒具有特异性或部分特异性的，并且是本领域技术人员熟知的。
上述说明主要涉及本发明核心与杂合多肽的有关抗病毒与抗融合的活性。还能够采用本发明的杂合多肽作为任何意图在于核心多肽单独给药或使用的方法的一部分。使用杂合多肽作为这类方法的一部分在需要增加核心多肽药动学性质的场合中是特别优选的。例如，采用胰岛素作为某些类型糖尿病治疗的一部分。因此，还能够采用包含胰岛素或胰岛素片段作为核心多肽的杂合多肽作为用于改善糖尿病症状的方法的一部分，胰岛素对这类糖尿病是有益的。
除了上述治疗方法以外，进一步还能够采用本发明的肽作为用于防止障碍的预测方法的一部分，这些障碍包括但不限于涉及融合事件的障碍、涉及卷曲螺旋肽的细胞内过程和涉及细胞-细胞和/或病毒-细胞融合的病毒感染。例如，能够采用本发明的核心与杂合多肽作为防止病毒感染的预防方法的一部分。
进一步还能够采用本发明的杂合多肽作为诊断方法的一部分。这样的方法可以是体内方法或体外方法。任何能够采用特定核心多肽的诊断方法还能够使用杂合多肽进行，后者包含该核心多肽和允许该杂合多肽检测的修饰或原始氨基酸序列。这样的技术能够反映诊断方法上的进步，在于相对于单独核心多肽而言的杂合多肽半衰期增加能够增加采用该多肽的诊断操作的敏感性。这样的诊断技术包括但不限于成像法，例如体内成像法。在成像法的非限制性实例中，经由与杂合多肽结合，再(直接或间接)使所结合的杂合多肽成像，能够检测结合杂合多肽的核心多肽的结构。
5.4、药物制剂、剂量和给药方式
本发明的肽可以使用本领域熟知的技术给药。优选地，将各试剂配制后全身给药。用于制剂和给药的技术可以参见《Remington药物科学》最新版，Mack Publishing Co.，Easton，PA。适合的途径可以包括口服、直肠、阴道、肺(例如通过吸入)、透皮、透黏膜或肠道给药；肠胃外释放，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，等等其他。关于静脉内注射，可以将本发明试剂配制在水性溶液中，优选为生理学上可相容的缓冲液，例如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液，等等其他。另外，输注泵可以用于释放本发明的肽。关于透黏膜给药，在制剂中使用适合于所要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的。
在本发明肽或其他抑制剂的细胞内给药是优选的场合中，可以采用本领域普通技术人员熟知的技术。例如，可以将这样的试剂包封在脂质体或微球体内，然后如上所述给药。脂质体是具有水性内部的球形脂质双分子层。在形成脂质体之时存在于水性溶液中的全部分子都是被结合在水性内部中的。脂质体成分被保护不受外部微环境影响，并且因为脂质体与细胞膜融合，被有效释放至细胞质内。另外，由于它们的疏水性，在将小分子给药时，可以实现直接的细胞内给药。
使用本领域技术人员熟知的技术，可以在有关细胞内表达编码所要细胞内给药的本发明肽的核苷酸序列。例如，可以使用得自病毒的表达载体，病毒例如逆病毒、牛痘病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒，用于这类核苷酸序列向靶细胞群的释放和表达。这类载体的构建方法和表达构建体是熟知的。例如参见Sambrook等1989《分子克隆：实验室手册》Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor NY和Ausubel等1989《分子生物学流行方案》GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.。
通过本领域技术人员熟知的操作，可以测定本发明肽的有效给药剂量，所要考虑的参数例如生物半衰期、生物利用度和毒性。在特别优选的实施方式中，本领域技术人员利用所熟知的常规体外与体内研究数据测定有效的杂合多肽剂量范围。例如，体外细胞培养物的抗病毒活性测定法、例如下文第7节关于T1249所述的示范测定法将为本领域技术人员提供这样的数据，以便易于测定多肽阻滞一定量病毒感染性所必需的平均抑制浓度(IC)(例如50％为IC50；或90％为IC90)。然后，本领域技术人员利用一种或多种动物模型的药动学数据，能够选择适当的剂量，例如下节10关于T1249所述的示范性药动学数据，以便得到最低血浆浓度(Cmin)，它等于或大于所测定的IC值。
示范性多肽剂量可以低至0.1μg/kg体重，高至10mg/kg体重。更优选地，有效剂量范围是0.1-100μg/kg体重。关于本发明肽的其他示范性剂量包括1-5mg、1-10mg、1-30mg、1-50mg、1-75mg、1-100mg、1-125mg、1-150mg、1-200mg或1-250mg的肽。治疗学上的有效剂量指的是化合物足以导致患者的症状改善或存活延长的量。在细胞培养物或实验动物中通过标准的药学操作可以测定这类化合物的毒性和治疗功效，例如测定LD50(致50％群体死亡的剂量)和ED50(治疗学上对50％群体有效的剂量)。毒性与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，可以以LD50/ED50之比表示。治疗指数大的化合物是优选的。从这些细胞培养物测定和动物研究所得到的数据可以用于制订适用于人的剂量范围。这类化合物的剂量优选地位于包括ED50且很少或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所使用的剂型和所采用的给药途径。对于任何用在本发明方法中的化合物来说，最初可以从细胞培养物测定估计出治疗学上的有效剂量。在动物模型中可以制订出剂量，以实现循环血浆浓度范围包括在细胞培养物中所测定的IC50(例如供试化合物实现融合事件的半数最大抑制、例如病毒感染的半数最大抑制的浓度，这是相对于在没有供试化合物的存在下的事件数量而言的)。这样的信息可以用于更加精确地测定对人有用的剂量。血浆水平例如可以通过高效液相色谱(HPLC)或任何能够测量肽水平的生物学或免疫学测定法加以测量。
本发明的杂合多肽能够以单一方式、间歇、定期或连续给药。例如，本发明的多肽能够以单一方式给药，例如单一的皮下、单一的静脉内输注或单一的摄食。本发明的多肽还能够以多次间歇方式给药，包括定期给药。例如，在某些实施方式中，本发明的多肽在给药时可以是每周一次、每天一次、每天两次(例如每12小时一次)、每六小时一次、每四小时一次、每两小时一次或每小时一次。本发明的多肽还可以被连续给药，例如通过连续的皮下或静脉内输注泵，或者借助于皮下或其他植入物，允许患者连续吸收多肽。
本发明的杂合多肽还能够与至少一种其他治疗剂结合给药。尽管对HIV疗法来说不是优选的，不过可以伴随或循序进行其他类型疗法(例如癌症疗法)的给药，包括循环疗法(也就是说，将第一种化合物给药一段时间，然后将第二种抗病毒化合物给药一段时间，再重复这种顺序给药，目的是减少对其中一种疗法的耐受性的形成)。
在病毒、例如逆病毒感染的情况下，有效量的杂合多肽或其药学上可接受的衍生物可以与至少一种、优选为至少两种其他抗病毒剂结合给药。
以HIV感染为例，这样的抗病毒剂可以包括但不限于DP-107(T21)、DP-178(T20)、如表2所述得自HIV-1或HIV-2的任意其他核心多肽、其核心多肽至少在部分程度上得自HIV-1或HIV-2的任意其他杂合多肽、细胞因子、例如rIFNα、rIFNβ、rIFNγ；逆转录酶抑制剂，包括核苷与非核苷抑制剂，例如AZT、3TC、D4T、ddI、adefovir、abacavir和其他二脱氧核苷或二脱氧氟代核苷，或甲磺酸delaviridine、奈韦拉平、efavirenz；病毒mRNA加帽抑制剂，例如利巴韦林；HIV蛋白酶抑制剂，例如ritonavir、甲磺酸nelfinavir、amprenavir、沙奎那韦、甲磺酸沙奎那韦、indinavir或ABT378、ABT538或MK639；两性霉素B，它是一种具有抗HIV活性的脂质结合分子；和粟精胺，它是一种糖蛋白加工抑制剂。
本发明的杂种和/或核心多肽可以进一步在预防学上用于疾病的预防。杂种和/或核心多肽能够直接发挥预防疾病的作用，或者能够作为疫苗使用，其中宿主产生抗本发明杂合多肽的抗体，抗体然后起到中和病原生物体的作用，例如包括抑制病毒、细菌和寄生虫感染。
关于上述所有这样的治疗，各位医师可以鉴于患者的条件来选择确切的制剂、给药途径和剂量(例如参见Fingl等1975《治疗剂的药理学基础》Ch.1，p.1)。
应当注意，随访医师会知道如何与何时因毒性或器官功能障碍而终止、中断或调整给药。相反，随访医师还会知道如果临床反应不充分，那么调整治疗至更高的水平(预先排除毒性)。在有关癌性障碍的处置中，给药剂量的大小将因所要治疗的疾病的严重性和给药途径而异。剂量和可能的给药频率也将因各患者的年龄、体重和反应而异。在兽医中可以使用与上文讨论有可比性的程序。
在本发明的范围内，包括为实施发明而使用药学上可接受的载体，以将本文所公开的化合物配制成适合于全身给药的剂型。通过载体和适合的制造实践的适当选择，本发明的组合物、特别是所配制的溶液可以经过肠胃外方式给药，例如皮下注射、静脉内注射、皮下输注或静脉内输注，例如通过泵输注。使用本领域熟知的药学上可接受的载体，容易将化合物配制成适合于口服给药的剂型。这样的载体能够使本发明化合物配制成片剂、丸剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、淤浆剂、混悬液等，用于所要治疗的患者的口服摄食。
适用于本发明的药物组合物包括含有有效量活性成分的组合物，以实现其预期目的。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围之内，尤其根据本文所提供的详细内容。
除了活性成分以外，这些药物组合物还可以含有适合的药学上可接受的载体，包括赋形剂和助剂，它们有利于活性化合物被加工成在药学上能够使用的制剂。用于口服给药的制剂可以是片剂、锭剂、胶囊剂或溶液。关于肽的口服给药，可以按常规使用本领域技术人员熟知的技术，例如Emisphere Technologies。
本发明的药物组合物可以按本身已知的方式加以制造，例如借助于常规的混合、溶解、造粒、锭剂成型、研末、喷雾干燥、乳化、包封、包埋或冷冻干燥过程。
用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶性活性化合物的水溶液。另外，可以将活性化合物的乳液和悬液制成适当的油性注射混合物。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，脂质体或本领域已知用于制备脂质或亲脂性乳剂的其他物质。水性注射悬液可以含有增加悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。可选地，悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以便制备高度浓缩的溶液。
用于口服的药物制剂可以这样获得，将活性化合物与固体赋形剂混合，可选地研磨所得混合物，加工该颗粒混合物，如果需要的话加入适合的助剂，得到片剂或锭剂核心。适合的赋形剂确切地是填充剂，例如糖类，包括乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐，例如藻酸钠。
锭剂核心带有适合的包衣。为此，可以使用浓糖溶液，其中可以可选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羰乙烯凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛，漆用溶液，和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或锭剂包衣中加入染剂或色素，用于鉴别或区分活性化合物剂量的不同组合。
可以口服的药物制剂包括由明胶制成的推入配合式胶囊剂以及由明胶和增塑剂、例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊剂。推入配合式胶囊剂可以含有活性成分与下列成分的混合物：填充剂，例如乳糖；粘合剂，例如淀粉；和/或润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁；和可选的稳定剂。软胶囊剂中，活性化合物可以是溶解或悬浮在适合的液体中的，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。
在需要增强宿主免疫应答的场合中，可以将杂合多肽与一种适合的佐剂进行配制，目的是增强免疫应答。这样的佐剂可以包括但不限于矿质凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子；其他肽；油乳剂；和潜在有用的佐剂，例如BCG和小棒状杆菌。很多方法可以用于引入这里所述的疫苗制剂。这些方法包括但不限于口服、真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下和鼻内途径。
6、实施例：包含增强子肽序列的共有氨基酸序列的鉴别
逆病毒gp41蛋白含有被称为α-螺旋区的结构域，位于蛋白质的C末端区域，还含有亮氨酸拉链区，位于蛋白质的N末端区域。所有目前已公布的HIV-1、HIV-2和SIV隔离群序列的、包含在gp41内的增强子肽序列区域的排列鉴别出图1所示共有氨基酸序列。
正如下列实施例所详细描述的，这样的序列代表增强子肽序列之处在于这些肽序列与各种不同核心多肽的键增强了所得杂合多肽的药动学性质。
7、实施例：起到HIV-1感染的有力抑制剂作用的杂合多肽
图13所述T1249是包含增强子肽序列与HIV核心多肽连接的杂合多肽。正如下文所证明的，T1249杂合多肽表现出增强了的药动学性质和有力对抗HIV-1、HIV-2和SIV隔离群的体外活性，在体外HuPBMC感染性测定以及HIV-1感染的体内HuPBMC SCID小鼠模型中具有增强了的对抗HIV-1临床隔离群的活性。在下述生物学测定中，比较了T1249与有力的抗病毒T20多肽的活性。美国专利No.5,464,933公开并要求保护T20多肽，已知也称DP-178，是得自HIV-1gp41蛋白序列的。
7.1、材料和方法
7.1.1、肽的合成和纯化
利用Fast Moc化学合成肽。一般地，除非另有注解，肽含有酰胺化的羧基末端和乙酰化的氨基末端。用反相HPLC进行纯化。
T1249(Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2)是一种39个氨基酸的肽(MW＝5036.7)，完全由天然存在的氨基酸组成，氨基末端被乙酰基封锁，羧基末端被氨基封锁，以增强稳定性。T1387是一种23个氨基酸的肽，缺少增强子肽序列(Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH2)。因而，T1387代表T1249杂合多肽的核心多肽。T1387在其氨基与羧基末端的封锁方式与T1249相同。
确切地说，利用标准的固相合成技术合成T1249。用质谱法确认HPLC痕迹中的主要峰是T1249。
T1249易于用反相色谱法纯化，条件是6英寸柱，装有C18、10微米、120A载体。
7.1.2、病毒
在含有10％胎牛血清的RPMI 1640中培养CEM细胞，在CEM细胞中繁殖HIV-1LAI病毒(Popovic，M.等1984《科学》224：497-508)。使被感染的CEM细胞上清液通过0.2μm滤器，使用AA5细胞系在微量感染性测定中估计感染效价，以支持病毒复制。为此，在96孔微量滴定皿内，将20μl连续稀释的病毒加入到20μl CEM细胞中，浓度为6×105/ml。每份病毒稀释液重复试验三次。每隔一天加入新鲜的培养液，将细胞培养七天。在感染后第7天，试验上清液样本的病毒复制，作为释放到上清液中的逆转录酶活性的证据。按照Reed与Muench公式计算TCID50(Reed，L.J.等1938《美国卫生学杂志》27：493-497)。
7.1.3、细胞融合测定
如前人所述，在96孔组织培养皿中，在最终体积为100μl的培养液(RPMI 1640，含有10％热灭活的FBS，补充有1％ L-谷氨酰胺和1％ Pen-Strep)中培养大约7×104 Molt-4细胞与被HIV-1LAI病毒慢性感染的1×104 CEM细胞(Matthews，T.J.等1987《美国国家科学院院报》84：5424-5428).加入体积为10μl的肽抑制剂，在37℃ 5％ CO2下培养细胞混合物达24小时。此时，在10×和40×放大率下通过显微镜检查计数多核巨细胞(合胞体，有五个细胞宽或更大)，以便在单一视野中可以见到整个孔。比较经过处理的细胞和被感染而未经处理的对照，结果以对被感染对照的抑制百分比表示。
7.1.4、MAG-CCR-5感染性测定
将大约1×106 Magi-CCR-5细胞(通过NIH AIDS研究与参考试剂程序AIDS，NIAID分部获得；Chackerian，B.等1997《病毒学杂志》71：3932-3939)接种在48孔组织培养皿中(大约2×104细胞/孔，体积为300μl/孔，选择性生长培养液由DMEM组成，补充有10％热灭活的FBS、1％ L-谷氨酰胺、1％ Pen/Strep、潮霉素B、Geneticin和嘌呤霉素)，在37℃ 5％ CO2下附着过夜。截至第二天，细胞融合30％。除去接种培养液，加入体积为50μl/孔的稀肽抑制剂(仅用在未经处理的对照中的培养液)，然后加入100μl/孔的稀病毒(所需输入病毒效价为100-200pfu/孔)。最后，向每孔中加入250μl选择性生长培养液，在37℃ 5％ CO2下培养平皿达2天。按照由NIAID所提供的方案用MAGI-CCR5细胞进行固定和染色。简言之，从平皿中除去培养液，向每孔中加入500μl固定剂。使平皿在室温下固定5分钟。除去固定剂，每孔用DPBS洗涤两次，向每孔中加入200μl染色溶液。然后在37℃ 5％ CO2下培养平皿达50分钟，除去染色溶液，每孔用DPBS洗涤两次。使平皿风干，然后用显微镜计数整个孔中的蓝色细胞。比较经过处理的孔与被感染而未经处理的对照，结果以对被感染对照的抑制百分比表示。
7.1.5、逆转录酶测定
微量逆转录酶(RT)测定改自Goff等(Goff，S.等1981《病毒学杂志》38：239-248)和Willey等(Willey，R.等1988《病毒学杂志》62：139-147)。将病毒/细胞培养物上清液调整至1％ Triton-X100。在96孔U形底微量滴定皿中，向50μl RT鸡尾酒(75mM KCl、2mM克利夫兰试剂、5mM MgCl2、5μg/ml poly A、0.25单位/ml oligodT、0.05％ NP40、50mM Tris-HCl，pH 7.8、0.5μM无放射性dTTP和10cCi/ml 32P-dTTP)中加入10μl上清液/Triton X-100样本，在37℃下培养90分钟。培养后，每孔取40μl反应混合物，在部分真空下转移至Schleicher and Schuell(S+S)斑点印迹仪中，其中含有带栅格的96孔滤垫(Wallac目录#1450-423)和滤器衬垫，用2×SSC缓冲液(0.3M NaCl和0.003M柠檬酸钠)饱和。在完全真空下，每孔用至少200μl 2×SSC洗涤4次。拆开歧管，取出带栅格的滤纸，用2×SSC洗涤3次。最后，在吸水纸上吸干滤膜，风干，密封在可热封的袋内。将样本放置在磷屏暗盒内，抹除磷屏(至少8分钟)，关闭。曝光16小时。从磷成像(Molecular Dynamics Phosphorimager)印迹恢复的、以体积报告格式产生的像素指数值(PIV)用于测定关于全部剂量抑制剂的受影响或被抑制的部分(Fa)，并与未经处理的、被感染的对照相比(用ImageQuant体积报告分析，关于背景进行校正)。
7.1.6、人PBMC感染性/中和作用测定
原型测定使用这样的细胞系，其中原代隔离群测定利用PBMC，从州际血库(Interstate Blood Bank)获得，用OKT3(0.5μg/ml)与CD28抗体(0.1μg/ml)的组合活化2-3天。将靶细胞结合在淋巴细胞分离培养液(LSM)上，洗涤，冷冻。在测定之前最少2-3天，根据需要融化细胞，如上所述活化。在该96孔格式测定中，细胞在5％ IL-2培养液中的浓度为2×106/ml，最终体积为100μl。在DPBS中制备肽储备溶液(1mg/ml)。在20％ FBS RPMI 1640/5％ IL-2完全培养液中进行肽的稀释。
7.1.7、HIV-1感染的体内HU-PBMC SCID模型
向雌性SCID小鼠(5-7周龄)腹膜内注射5-10×107成年人PBMC。重组两周后，在第0天用103 TCID50 HIV-1 9320(AZT-敏感性隔离群A018)IP感染小鼠。肽处理是IP和b.i.d.的，从第-1天开始并持续至第6天。在动物放血和组织收获(第7天，最后一次药物处理之后大约12-18小时)之后，通过每周与人PBMC胚细胞定量共同培养连续三周，测定血细胞、脾细胞、淋巴结和腹膜细胞中的感染程度。评价共同培养物上清液的HIV-1 p24抗原产生，作为病毒感染的量度(Immunotek Coulter试剂盒和方案)。
7.1.8、大鼠药动学研究
使用从Charles River实验室获得的250-300g雄性CD大鼠和双颈静脉导管。向一支颈静脉导管内注射体积为200μl的肽溶液(大约3.75mg/ml)，利用Edelhoch法(Edelhoch，1967《生物化学》6：1948-1954)测定给药溶液浓度，并根据动物体重加以调整，以便每只动物接受2.5mg/kg的剂量。按预定时间间隔(0、15、30分钟和1、2、4、6和8小时)采集大约250-300μl血液，加入到EDTA毛细注射管内。经过离心收集颗粒化细胞中的血浆，冷冻或者立即用于荧光HPLC分析。
7.1.9、血浆样本的荧光HPLC分析
将100μl血浆样本加入到900μl沉淀缓冲液(乙腈、1.0％ TFA、洗涤剂)中，导致大部分血浆蛋白的沉淀。在10,000rpm下离心10分钟后，收集400μl上清液，加入到600μl HPLC级水中。在由40％沉淀缓冲液和60％ HPLC水组成的稀释缓冲液中，根据每份样本所含有的肽的浓度进行连续稀释。除了样本稀释以外，在缓冲液以及血浆中进行给药溶液的连续稀释，用于产生有关峰面积与已知肽浓度的标准曲线。然后考虑所进行的全部稀释和注射上柱的量，将该曲线用于计算血浆中的肽浓度。
7.1.10、XTT方案
为了测量肽的细胞毒/静胞效应，在不同浓度肽的存在下进行XTT测定(Weislow，O.S.等1989《国家癌症研究院杂志》81：577-586)，目的是有效建立选择指数(SI)。在该项测定中，在有与没有连续稀释的肽的存在下培养细胞，然后加入XTT，测定TC50。在存活/代谢着的细胞中，XTT被还原为可溶性棕色染剂XTT-甲。读取吸光度，在有与没有肽的存在下的读数之间进行比较，利用Karber法测定TC50(例如参见Lennette，E.H.等编，1969《病毒与立克次氏体感染的诊断操作》美国公共卫生协会第四版，pp.47-52)。平板接种Molt 4、CEM(80,000细胞/孔)和这两种细胞类型的组合(分别为70,000和10,000)，与连续稀释的肽培养24小时，总体积为100μl。培养之后，向每孔中加入25μl XTT储备溶液(1mg/ml XTT、250μM PMS在含有5％ DMSO的完全培养基中的溶液)，在37℃下培养平皿。读取所显示的颜色，结果用于表示由含有肽的孔所产生的数值，以相对于未处理对照孔的百分率表示。
7.2、结果
7.2.1、抗病毒活性——融合测定
在使用混合有未感染Molt-4细胞的慢性感染CEM细胞所进行的病毒介导细胞-细胞融合测定中，直接比较T1249和T20，如下表3所示。对实验室隔离群、例如IIIb、MN和RF的T1249融合抑制作用与T20相当，比T20提高大约2.5-5倍。T1249也比T20更有活性地(提高3-28倍)对抗若干合胞体诱生的临床隔离群，包括AZT耐药性隔离群(G691-2)、AZT前处理隔离群(G762-3)和9320(用在HuPBMC-SCID研究中的隔离群)。特别是，T1249抗HIV-2NIHZ的效力比T20强800倍。
                                    表3
  病毒隔离群   T20(ng/ml)   n   T1249(ng/ml)   n   相差倍数
  HIV-1 IIIb   2.5   9   1.0   9   2.5
  HIV-1 G691-2(AZT-R)   406.0   1   16.0   1   25
  HIV-1 G762-3(Pre-AZT)   340.1   1   12.2   1   28
  HIV-1 MN   20.0   7   3.1   7   6
  HIV-1 RF   6.1   7   2.1   7   3
  HIV-1 9320   118.4   1   34.5   1   3
  HIV-2 NIHZ   3610.0   ＞10   4.3   2   840
7.2.2、抗病毒活性——Magi-CCR-5感染性测定
Magi-CCR-5感染性测定允许直接比较合胞体与非合胞体诱生的病毒隔离群，以及比较实验室与临床隔离群。该测定还直接测量病毒感染(感染之后的TAT表达，转活化LTR驱动的β-半乳糖苷酶产生)，完全不同于常用的间接测量感染性，例如p24抗原或逆转录酶产生。Magi-CCR-5感染性测定(见下表4)揭示，根据EC50和Vn/Vo＝0.1的抑制作用计算结果，在对抗全部所试验的隔离群上T1249始终比T20更有效。T1249在对抗临床隔离群HIV-1301714上显示显著的提高(＞25倍)，这是对T20最不敏感的隔离群之一。另外，T1249对抗SIV隔离群B670的效力比T20强至少100倍。这些数据以及融合数据提示，T1249是HIV-1、HIV-2和SIV的有效肽抑制剂。
                                            表4
                       T20                        T1249
  病毒隔离群   EC-50   Vn/Vo＝0.1   EC-50   Vn/Vo＝0.1   EC-50相差倍数   Vn/Vo＝0.1相差倍数
  HIV-1 IIIB   42   80   8   10   5   8
  HIV-1 9320   11   50   1   6   11   8
  HIV-1 301714(B亚型，NSI)   1065   4000   43   105   25   38
  HIV-1 G691-2(AZT-R)   13   200   0.3   20   43   10
  HIV-1 pNL4-3   166   210   1   13   166   16
  SIV-B670   2313   ＞10000   21   100   110   ＞100
7.2.3、抗病毒活性——HuPBMC感染性测定
在HuPBMC感染性测定(下表5)中直接比较T1249与T20，该测定代表公认的替代体外系统，用于预测体内抑制病毒所需的血浆药物浓度。这些比较揭示，T1249更有效地对抗迄今所试验的全部HIV-1隔离群，全部Vn/Vo＝0.1(在一个对数期减少病毒效价所需的剂量)的数值都减少到微克以下的浓度。很多对T20最不敏感的临床隔离群都对T1249表现10倍或以上的敏感性。值得注意的是用在HuPBMCSCID小鼠感染模型中的隔离群HIV-1 9320对T20的敏感性比T1249低46倍，说明与体内结果存在非常好的相互关系。
                             表5
                               T20            T1249
  病毒隔离群(HIV-1)   Vn/Vo＝0.1(ng/ml)   Vn/Vo＝0.1(ng/ml)   相差倍数
  IIIB   250   80   3
  9320   6000   130   46
  301714(B亚型，NSI)   8000   700   11
  302056(B亚型，NSI)   800   90   9
  301593(B亚型，SI)   3500   200   18
  302077(A亚型)   3300   230   14
  302143(SI)   1600   220   7
  G691-2(AZT-R)   1300   400   3
7.2.4、抗病毒活性——T20耐药性实验室隔离群
在使用混合有未感染Molt-4细胞的慢性感染CEM细胞所进行的病毒介导细胞-细胞融合测定中，直接比较T1249和T20(下表6)。在对抗T20耐药性隔离群上T1249几乎比T20强200倍。
                                 表6
  病毒隔离群   T20(ng/ml)   n   T1249(ng/ml)   n   相差倍数
  HIV-1 pNL4-3 SM(T20耐药性)   405.3   3   2.1   3   193
在Magi-CCR-5测定中，在对抗T20耐药性隔离群上，例如pNL4-3SM和pNL4-3 STM(Rimsky，L.和Matthews，T.，1998《病毒学杂志》72：986-993)，T1249比T20强50,000倍之多(见下表7)。
                                        表7
                       T20                        T1249
  病毒隔离群(HIV-1)   EC-50   Vn/Vo-0.1   EC-50   Vn/Vo＝0.1   EC-50相差倍数   Vn/Vo-0.1相差倍数
  pNL4-3   166   210   1   13   166   16
  pNL4-3 SM(T20-R)   90   900   4   11   23   82
  pNL4-3 SM(T20-R)Duke   410   2600   4   11   103   236
  pNL4-3 STM(T20/T649-R)   ＞50000   ＞50000   1   13   ＞50000   ＞3846
在HuPBMC感染性测定中直接比较T1249和T20(见下表8)，评价对抗耐药性隔离群效力上的差异。在对抗耐药性隔离群pNL4-3SM上T1249的效力比T20强250倍以上。
                         表8
                            T20           T1249
  病毒隔离群(HIV-1)   Vn/Vo＝0.1(ng/ml)   Vn/Vo＝0.1(ng/ml)   相差倍数
  pNL4-3   3500   30   117
  pNL4-3 SM(T20-R)   ＞10000   40   ＞250
7.2.5、抗病毒活性——体内SCID-HuPBMC模型
在HIV-19320感染的HuPBMC-SCID小鼠模型中直接比较T1249与T20的体内抗病毒活性(图3)。用HuPBMC重组两周后，在第0天用在PBMC中通过的103TCID50HIV-1 9320(AZT-敏感的隔离群A018)IP感染小鼠。肽的处理是IP和b.i.d.的，总每日剂量为67mg/kg(T20)、20mg/kg(T1249)、6.7mg/kg(T1249)、2.0mg/kg(T1249)和0.67mg/kg(T1249)，从第-1天开始，持续8天。在动物放血和组织收获(第7天，最后一次药物处理之后大约12-18小时)之后，通过每周与人PBMC胚细胞定量共同培养连续三周，测定血细胞、脾细胞、淋巴结和腹膜细胞中的感染程度。评价共同培养物上清液的HIV-1p24抗原产生，作为病毒感染的量度。在T20处理的动物血液或淋巴组织中感染性病毒是不可检测的，不过在腹膜洗液和脾制备物中检测到病毒。在6.7mg/kg剂量的T1249下，所有腔室都是感染性病毒阴性的，说明比T20处理提高至少10倍。在2.0mg/kg剂量的T1249下，淋巴和脾都完全没有可检测的感染性病毒，与被感染的对照相比，腹膜洗液中的病毒效价减少2log10，血液中的病毒效价减少1log10。在最低0.67mg/kg剂量的T1249下，腹膜洗液和血液等同于被感染的对照；不过，在淋巴和脾组织中观察到感染性病毒效价下降至少1log10。总之，结果说明，在这些条件下，T1249体内30至100倍有效地对抗HIV-19320。
7.2.6、药动学研究——大鼠
插套管的大鼠用于进一步明确T1249的药动学轮廓。用T1249和T20通过颈静脉导管对250-300g雄性CD大鼠IV给药(图4A-5)。利用荧光HPLC评价所得血浆样本，以估计所提取血浆中的肽量。T1249的β-相半衰期和总AUC比T20大几乎三倍(图5)。
7.2.7、细胞毒性
体外观察到没有明显的T1249细胞毒性证据，如图6所证明。
另外，按167mg/kg(所试验的最高剂量)通过颈导管IV给药(2-3分钟内0.3ml)，T1249没有急性毒性(24小时内死亡)。
7.2.8、直接与gp41构建体M41Δ178结合
将T1249用125I进行放射标记，用HPLC纯化至最大比活度。按相同方式使T20碘化。图7显示与以0.5mg/μl固定在微量滴定皿上的M41Δ178(缺少T20氨基酸序列的截尾gp41外结构域融合蛋白)的饱和结合。非特异性结合被定义为在1μM未标记肽的存在下的放射性配体结合。特异性结合是总的结合与非特异性结合之差。结果证明，125I-T1249和125I-T20具有近似的结合亲合性，为1-2nM。线性逆向Scatchard绘图提示，每种配体与同一类位点结合。
在涂有0.5μg/ml M41Δ178的闪烁微量滴定皿上测定125I-T1249和125I-T20的结合动力学。图8显示缔合和解离的时间过程。在加入总测定体积十分之一的未标记肽至最终浓度为10μM之后测量所结合的放射性配体的解离。最初关于125I-T1249的开关速率显著慢于125I-T20。当用另一种未标记肽(也就是125I-T1249用T20)引发解离时，两种放射性配体的解离模式都没有变化。
为了进一步证明两种配体竞争相同的靶位点，在单一浓度125I-T1249或125I-T20的存在下滴定未标记的T1249和T20。在未标记的肽之后立即加入配体，开始培养。图9所示竞争曲线提示，尽管两种配体具有近似的结合亲合性，不过为完全竞争所结合的125I-T1249需要更高浓度的未标记T20或T1249。
7.2.9、直接与GP41的HR1区结合
圆二色性(CD)光谱学用于测量单独的T1249及其与来自gp41HR1(七次重复1)结合区的45个残基肽(T1346)的组合在溶液(磷酸盐缓冲盐水pH 7)中的二级结构。图14A阐述单独的T1249在溶液中的CD谱(10μM，1℃)。该谱是采取α-螺旋结构的肽的特点。确切地说，利用33种蛋白质谱的基础设置，使用单一的数值分解去卷积该谱，预测T1249(单独的溶液)的螺旋成分为50％。图14B阐述混合有T1346的T1249的代表性CD谱。实心方块(●)代表关于“无相互作用模型”所预言的理论CD谱，其中假设肽在溶液中不发生相互作用。实际的实验谱(○)明显不同于这种理论上的“无相互作用模型”谱，证明这两种肽的确发生相互作用，产生可测量的结构变化，在CD谱中观察到了这一点。
7.2.10、GP41内T1249结合区的蛋白酶保护
如上节7.2.8所述用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定和分析嵌合蛋白M41Δ178对蛋白酶-K消化的敏感性。结果阐述在图15中。
当M41Δ178(未处理；图15第2栏)或T1249(未处理；图15第4栏)各自用蛋白酶-K培养时(分别为图15第3栏和第5栏)，二者都被消化。不过，当在加入蛋白酶-K之前将T1249与M41Δ178培养时(图15第7栏)，保护了大约6500道尔顿的HR-1片段。被保护片段的测序结果证明，该片段相当于位于gp41外结构域内的一级序列区。被保护的片段涵盖用在上节7.2.9所述CD研究中的可溶性HR1肽(T1346)，并且进一步含有位于氨基末端上的另外七个氨基酸残基。这种保护作用可归因于T1249与包含在M41Δ178构建体中的、gp41的特异性序列的结合。
8、实施例：呼吸合胞体病毒杂合多肽
下列实施例描述增强了药动学性质的呼吸合胞体病毒(RSV)杂合多肽。另外，下列结果证明，RSV杂合多肽代表RSV感染的有效抑制剂。
8.1、材料和方法
8.1.1、肽——合成和纯化
利用标准的Fast Moc化学合成RSV多肽。一般来说，除非另有注解，肽含有酰胺化的羧基末端和乙酰化的氨基末端。用反相HPLC法进行纯化。
8.1.2、呼吸合胞体病毒噬斑减少测定
所有必要的肽的稀释均在清洁无菌的96孔TC平皿中进行。每种肽配备十一份稀释液和一个不含肽的对照孔。肽的最终浓度范围始于50μg/ml或100μg/ml，总计十一份两倍稀释液。在100μl 3％ EMEM中准备浓度为100PFU/孔的RSV，这是根据RSV的已知效价测定的。然后将病毒加入到所有孔中。
从Hep2细胞的一个分会合96孔平皿中除去培养基。将稀释平皿上的材料转移到细胞平皿上，从第1行开始，然后转移第12行、第11行等，直至转移完所有行。将平皿放回培养器内达48小时。
检查细胞，以确保对照孔内存在合胞体。除去培养基，向每孔中加入大约50μl的0.25％结晶紫甲醇溶液。立即用水清洗小孔，以除去过量染剂，自然干燥。利用解剖显微镜计数每孔中的合胞体数。
8.2、结果
利用含有增强子肽序列的RSV杂种肽T1301(Ac-WQEWDEYDASISQWNEKINQALAYIREADELWA WF-NH2)和T1302(Ac-WQAWDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELW AWF-NH2)所进行的药动学研究证明半衰期相对于核心肽T786(Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2)而言大大延长了，如图10A-10B所示。杂合多肽T1301、T1302和T1303(Ac-WQAWDEYDASISDVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH2)还显示半-大小相对于核心肽T1476(Ac-DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL-NH2)而言大大增加了。
试验了RSV杂合多肽T1301、T1302和T1303以及多肽T786和T1293抑制HEp2细胞的RSV噬斑形成的能力。如图11A和11B所示，所试验的两种杂种RSV多肽以及T786核心多肽都能够抑制RSV感染。惊人地是，还揭示T1293杂合多肽是一种有效的抗RSV化合物(图13)。
9、实施例：促黄体激素杂合多肽
这里所列举的实施例描述增强了药动学性质的促黄体激素(LH)杂种蛋白。利用上述方法合成和纯化下列LH杂种肽：核心肽T1323(Ac-QHWSYGLRPG-NH2)和杂合多肽T1324(Ac-WQEWEQKIQHWSYGLRPGWASLWEWF-NH2)，后者包含在其氨基和羧基末端上与增强子肽偶联的核心多肽T1323氨基酸序列。正如图12A和12B所证明的，与缺少增强子肽序列的T1323核心肽相比，T1324杂种肽表现显著延长的半衰期。
10、实施例：杂合多肽T1249的药理学
图13所述T1249是一种杂合多肽，包含与得自病毒序列混合物的核心多肽连接的增强子肽序列。正如上节7实施例所证明的，T1249杂合多肽表现增强了的药动学性质和有效对抗HIV-1的体外以及体内活性。在下列实施例中，进一步描述T1249在啮齿动物和灵长动物模型中的药理学性质。
10.1、材料和方法
10.1.1、对啮齿动物单一剂量给药
通过连续的皮下输注(SCI)、皮下(SC)注射或静脉内(IV)注射，将T1249对Sprague-Dawley白鼠按单一剂量给药。每个治疗组由雌雄各半的十八只大鼠组成。各组接受T1249主体药物物质的无菌制剂SCI给药，剂量为0.5、2.0或6.5mg/kg。一组接受50mM碳酸盐-碳酸氢盐pH 8.5给药作为对照。经由手术植入颈背皮下的聚氯乙烯/聚乙烯导管将肽给药12小时。两组通过肩胛内区皮下注射接受单一剂量的T1249，剂量为1.2或1.5mg/kg。两组通过静脉内注射接受单一剂量的T1249，剂量为1.5或5mg/kg。利用因各批给药而异的肽含量计算实际的T1249毫克数。
分析终点包括笼侧观察(死亡数和濒死数，每日两次)、临床观察、临床实验室参数、体重和尸体剖检。通过稀疏的取样技术，在12小时内，从每组雌雄各半的六只大鼠得到血样，给药后取样时间如下：0.5、1、2、4、6、8、10和12小时。利用PcAb ECLIA测定进行样本分析(Blaekburn，G.等1991《临床化学》37：1534-1539；Deaver，D.，1995《自然》377：758)。
关于T1249在大鼠中的血浆与淋巴药动学分析，在碳酸氢盐缓冲液中制备T1249的无菌溶液，按20mg/kg单一剂量将大丸剂进行侧尾静脉内注射。从留置颈静脉导管采集动物血液。在给药后立即取样，并且在给药后5、15和30分钟和1、2、4和6小时取样。关于淋巴液的分析，在给药前立即取样，并且在给药后前六小时内每20分钟取样。从直接放入胸淋巴导管内的导管收集淋巴液，如前人所述(Kirkpatrick和Silver，1970《手术研究杂志》10：147-158)。利用标准的T1249竞争性ELISA测定法测定血浆和淋巴液中的T1249浓度(Hamilton，G.，1991《固相免疫测定中的免疫化学》p.139，Butler，J.，ed.，CRC Press，Boston)。
10.1.2、对灵长动物单一剂量给药
通过皮下(SC)、肌内(IM)或静脉内(IV)注射，将T1249主体药物物质的无菌制剂对cynomolgus猴按单一剂量给药。在连续交叉设计中，一组动物由雌雄各半的四只动物组成，通过IV(0.8mg/kg)、IM(0.8mg/kg)或SC(0.4、0.8和1.6mg/kg)注射接受单一剂量的T1249大丸剂。两次给药之间隔开至少三天的洗出期。在给药之前立即在无菌磷酸盐缓冲盐水pH 7.4中再生冻干的T1249。利用因各批给药而异的肽含量计算实际的供试物毫克数。
分析终点包括笼侧观察、身体检查和体重。关于研究的IV阶段，在下列时间点将血样收集在肝素化试管内：给药后立即、给药后0.25、0.5、1.5、3、6、12和24小时。关于研究的IM和SC阶段，在下列时间点将动物血样收集在肝素化试管内：给药后0.5、1、2、3、6、12和24小时。在收集后一小时内制备血浆样本，瞬间冷冻在液氮中。利用PcAb ECLIA测定进行样本分析(Blackburn，G.等1991《临床化学》37：1534-1539；Deaver，D.，1995《自然》377：758)。
10.1.3、过渡药动学研究
将六只cynomolgus猴随机分成三组，每组两只动物。通过大丸剂皮下注射将全部剂量的T1249给药，研究分为两个阶段。在第1阶段，第1、2和3组动物接受T1249主体药物物质的无菌制剂(也就是溶于碳酸盐-碳酸氢盐pH 8.5的T1249)，每日两次，连续四天(第1-4研究日)，剂量分别为0.2、0.6和2.0mg/kg/剂。第1阶段和第2阶段之间隔开十天的洗出期。在第2阶段，第1、2和3组动物接受T1249主体药物物质的无菌制剂(也就是水溶液pH 6.5加甘露糖醇)，每日两次，连续四天(第15-18研究日)，剂量分别为0.2、0.6和2.0mg/kg/剂。
在第1和15研究日采集用于药动学分析的血样，以评估单一剂量的药动学参数，在第4和18研究日采集用于药动学分析的血样，以评估稳态血浆药动学参数。在下列时间采集样本：给药前立即和给药后0.5、1.5、3.0、4.0、6.0、8.0和12.0小时。在第1和2阶段期间监测动物的临床体征和体重变化。
10.2、结果
10.2.1、对大鼠给药的T1249的药动学
大鼠模型用于进行T1249的血浆药动学和分布的初步评估。关于全部给药组的动物，体重、身体观察、血液学和临床化学参数或宏观病理学观察都没有因T1249给药而改变。
通过SCI接受T1249的大鼠在给药后大约四小时达到稳态血浆肽浓度。血浆稳态浓度(Cpss)和所计算的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)与给药剂量成正比，说明T1249所试验的0.5至6.5mg/kg剂量范围内显示线性药动学。关于SCI给药途径所计算的药动学参数和血浆浓度-时间曲线都分别列在表9和图16A中。
                                表9
  参数   剂量组
  0.5mg/kg   2.0mg/kg   6.5mg/kg
  Cpss(μg/ml)   0.80   2.80   10.9
  AUC(0-12h)(μg.h/ml)   7.99   25.9   120
T1249通过大丸剂IV注射给药导致在所试验的剂量内的线性剂量依赖性药动学。相形之下，SC注射T1249在所研究的剂量范围内不是剂量依赖性的。关于T1249的SC和IV给药所计算的药动学参数和血浆浓度-时间曲线分别显示在表10和图16B中。
                                        表10
  剂量组/给药
  (SC)   (IV)
  参数   1.2mg/kg   15mg/kg   1.5mg/kg   5.0mg/kg
  t1/2，终点(小时)tmax(小时)Cmax(μg/ml)AUC(0-12h)(μg.h/ml)AUC(0-∞)(μg.h/ml)   2.021.096.3727.027.6   2.001.8821.5107110   2.46-15.745.647.1   1.86-46.3118120
相对IV给药测定皮下对大鼠给药的T1249的生物利用度。结果如下表11所示。在低剂量(1.2mg/kg)下，皮下给药的T1249表现73％的相对生物利用度(FR)。关于在全部所检查的剂量下，在研究的全部12小时中，当高剂量(15mg/kg)给药的T1249浓度大于抑制90％ HIV感染性的浓度(IC90)时，相对生物利用度为30％。
                              表11
  途径   剂量(mg/kg)   AUC(0-∞)(μg.h/ml)   统一后的AUC(0-∞)(μg.h/ml)   FR(％)
  低剂量SCIV高剂量SCIV 1.21.5155 27.647.1110120 34.5(a)-36.5(b)- 73-30-
(a)通过AUC(0-∞)乘以1.25，从1.2mg/kg剂量统一为1.5mg/kg剂量。
(b)通过AUC(0-∞)除以3，从15mg/kg剂量统一为5mg/kg剂量。
关于T1249的血浆与淋巴浓度的动力学数据阐述在图16C和下表12中。T1249迅速穿入淋巴系统，在给药后大约一小时内与血浆药库建立平衡。在两种腔室之间建立平衡之后，药物的血浆与淋巴水平在五只动物中有四只相当于给药后三小时的水平。有一只动物的T1249淋巴浓度始终低于其他动物，不过这只动物的淋巴消除轮廓与该组其他成员不相上下。关于血浆和淋巴的消除相半衰期(t1/2)比较提示，T1249在这两种腔室之间经过是一种扩散控制过程。三小时后，淋巴系统似乎出现第二个更加迅速的消除相。这种差异可能是基于机理的(例如由于在淋巴中的再分布或加速的肽降解)或者由于其他因素。关于HIV-1的普通实验室毒株和原代临床隔离群，淋巴液中的T1249浓度在注射后六小时大于病毒感染性的IC90。
还评估了T1249穿入脑脊髓液(CSF)的程度。T1249浓度在所有可测量的时间点都低于检测下限(LOD；2.0ng T1249/ml CSF)，说明T1249在单一剂量给药后不穿透中枢神经系统。
                               表12
  参数   T1249
  血浆   淋巴
  t1/2，消除(小时)Cmax(μg/ml)AUC(0-6h)(μg.h/ml)AUC(0-∞)(μg.h/ml)Cl(ml/h)   2.6±0.412915065987.8   1.3±0.27133(a)/155(b)348(a)/411(b)390(a)/449(b)11.5
(a)所计算的平均值包括淋巴浓度显著低于该组其他动物但是具有相似动力学轮廓的一只动物(大鼠#1)。
(b)所计算的平均值排除大鼠#1。
10.2.2、对灵长动物给药的T1249的药动学
灵长动物模型用于评价与T1249的肠胃外给药有关的剂量水平与各种药动学参数之间的关系。在SC和IV给药后24小时检测通过所有给药途径所达到的大于6.0μg/ml的T1249血浆浓度和可量化的水平(也就是大于0.5μg/ml的水平)。关于所有给药途径，消除t1/2是相当的(关于IV、SC和IM给药，分别为5.4小时、4.8小时和5.6小时)。在整个24小时取样阶段的全部所测量的时间都观察到了超过HIV-1的实验室毒株和临床隔离群的IC90值的T1249血浆浓度。
图17A列举了0.8mg/kg T1249经由所有给药途径(SC、IV和IM)的肠胃外给药所得数据比较。图15B阐述了按三种不同的剂量水平(0.4mg/kg、0.8mg/kg和1.6mg/kg)SC注射T1249所得数据比较。图17B中的插图含有所计算的AUC-给药剂量图。
T1249在所给药的剂量范围内SC给药后，在cynomolgus猴中显示线性药动学，说明在该范围内没有发生廓清率机理的饱和。下表13提供了在T1249对cynomolgus猴肠胃外给药之后的药动学数据总结。血浆AUC值的比较说明，T1249的生物利用度相对于静脉内给药而言，肌内注射给药大约是64％，皮下注射给药大约是92％。
                                 表13
  参数   给药途径(剂量水平，mg/kg)
  SC(0.4)   SC(0.8)   SC(1.6)   IM(0.8)   IV(0.8)
  t1/2，终点(h)tmax(h)Cmax(μg/ml)AUC(0-24)(μg·h/ml)AUC(0-∞)(μg·h/ml)FR(％)   6.23±0.523.97±1.183.17±0.0937.5±6.640.9±8.2-   4.83±0.484.58±1.456.85±1.018.12±11.485.3±13.692.3   5.55±0.924.72±1.8113.3±2.55168±34.0181±44.0-   5.57±0.242.32±0.436.37±1.6956.4±12.359.5±13.164.4   5.35±0.95-26.7±0.2587.4±25.092.5±25.0-
10.2.3、过渡药动学研究
进行过渡药动学研究的目的是比较用在上述非临床试用中的T1249主体药物物质与经过配制的T1249药物产品的血浆药动学轮廓，后者将对实际的受治疗者或患者给药，例如用于治疗HIV感染。研究被设计成三种剂量水平T1249主体药物物质与三种剂量水平经过配制的药物产品的平行组单向交叉比较。在单一剂量给药和达到稳态之后评估血浆药动学。
T1249通过皮下注射给药在全部剂量组中都产生可测量水平的肽。关于T1249主体药物物质和经过配制的T1249药物产品，在初次给药后(第1和15天)和稳态时(第4和18天)，血浆浓度-时间曲线在全部剂量组内大致是平行的。此外，关于两种药物制剂，AUC(0-12hr)值与剂量水平成正比。关于药物产品所计算的AUC(0-12hr)值在单一剂量给药后是关于主体药物物质所计算的AUC(0-12hr)值的43％至80％，在稳态时是36％至71％。
在所试验的剂量水平和剂量体积下通过大丸剂皮下给药之后，T1249主体药物物质和药物产品证明在cynomulgus猴中具有近似的药动学轮廓。本项研究中的血浆浓度-时间曲线形状与从以前的cynomolgus猴研究所得曲线形状的直接比较提示，当T1249通过皮下注射给药时，存在药库效应。达到最大血浆浓度的时间(tmax)和t1/2延长提示了这一点。
这些结果说明，用在药理学程序中的主体药物物质经过配制，所得AUC值和其他动力学参数与在经过配制的药物产品给药之后所观察到的结果相当。这些观察结果说明，T1249的临床给药将导致患者完全暴露于T1249之下。
11、实施例：对T649耐药性HIV-1隔离群具有抗病毒活性的新颖核心多肽的分离
如这里所述，在一种具体而非限制性的实例中，生成经过修饰的核心肽，它对HIV毒株表现抗病毒活性，该毒株对未经修饰的“母体”核心肽是耐受性的。
表2所示肽T649是一种得自HIV-1 gp41蛋白某一区域的肽，这里称之为HR2。在耐受T649的HIV-1变体的研究中，编码耐药性变体gp41肽的HR2区的核酸的分离和测序揭示了在该区域内导致单一突变的突变：从天冬酰胺(N)变为赖氨酸(K)残基。
利用该结果，合成了新颖的多肽，这里称之为DP397，它含有已经引入上述N-至-K突变的T649氨基酸序列。T649和DP397肽如下所示，这两种肽之间的单一氨基酸差异如粗体所述：
T649：WMEWDREIN NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL
DP397：WMEWDREIN KYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL
注意到T649与DP397之间的差异位于潜在的N-葡基化位点(带下划线的部分)。因而，T649耐药性毒株的gp41中的突变取消了这种潜在的N-葡基化位点。
DP397核心多肽对耐受T649肽的HIV-1变体表现抗病毒活性。确切地说，DP397肽对四种HIV-1变体表现显著增加了的抗病毒活性，这是根据上节7.1.7所述Magi-CCR-5感染性测定法所测定的。进而，在某些实验中还发现相对于T1249肽而言，DP397肽对这些毒株表现增加了的抗病毒活性。
图18A-D显示暴露于T649耐药性变体下的被感染细胞数，是关于T649、DP397和T1249的肽浓度的函数。具体来说，图18A-B显示利用T649耐药性HIV-1毒株所进行的实验数据，这里分别称之为RF-649和DH012-649。这些毒株分别得自HIV-1RF和HIV-1DH012隔离群，在T649的存在下通过细胞培养产生T649耐药性变体。
图18C-D显示利用经过加工的T649耐药性HIV-1毒株所进行的实验数据，这里分别称之为3’ETVQQQ和SIM-649。毒株3’ETVQQQ是从这样的HIV-1LAI克隆体获得的，后者经过分子突变，在gp41蛋白的HR1结构域含有氨基酸序列ETVQQQ代替GIVQQQ。HR1是HIV-1 gp41蛋白与HR2结构域和T649肽结合的区域。毒株SIM-649是从这样的HIV-1LAI克隆体获得的，后者经过分子突变，在gp41蛋白的HR1结构域含有氨基酸序列SIM代替GIV，随后在T649的存在下通过细胞培养产生T649耐药性变体。
与T649相比，DP397肽对全部四种所检查的毒株表现出显著增加了的HIV-1感染抑制作用。进而，与T1249相比，DP397肽对RF-649毒株表现出增加了的HIV-1感染抑制作用(图18A)，在更高的浓度下对DH012-649毒株表现出增加了的HIV-1感染抑制作用(图18B)。
本发明并不限于这里所述具体实施方式的范围，这些实施方式仅打算阐述发明的各个方面，功能等价方法和组分都属于本发明的范围。甚至除了这里所示和所述内容以外，本发明的各种改进因上述说明和附图而对本领域技术人员来说将是显而易见的。这样的改进打算属于所附权利要求的范围。

Claims (5)

1.包含杂种多肽和药学上可接受的载体的药物组合物，其中：
(a)杂种多肽的至少一个氨基酸残基是多元醇-缀合的；
(b)杂种多肽包含核心多肽和与核心多肽的氨基末端、或羧基末端、或氨基末端和羧基末端两者连接的增强子肽序列；
(c)核心多肽含有氨基酸序列TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK；
(d)增强子肽序列含有氨基酸序列WQEWEQKI，WASLWEWF，WQEW，WQAW，WEWF，WASLWNWF，或WQEWEREI，所述氨基酸序列在增强子肽序列中不是由氨基酸W占据的位置具有零个或一个氨基酸取代。
2.权利要求1的药物组合物，其中杂种多肽是WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中多元醇是聚丙二醇、聚乙烯-聚丙烯二醇或聚乙二醇。
4.权利要求3的药物组合物，其中多元醇是直链多元醇。
5.权利要求3的药物组合物，其中多元醇是支链多元醇。
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